(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、マウス嗅覚受容体群Ａの中から特定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  １個の嗅覚細胞を得る工程
（ｂ）  工程（ａ）において得られた１個の嗅覚細胞からｍＲＮＡを抽出する工程
（ｃ）  工程（ｂ）において抽出されたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得る工程、
（ｄ）  （配列番号：０１）によって表されるフォワードプライマー、および（配列番号：０２）によって表されるリバースプライマーを用いるＰＣＲ法によって、工程（ｃ）において得られたｃＤＮＡを増幅する工程、ここで、
配列番号：０１は、Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｋ（グアニン又はチミン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｍ（アデニン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｉ（イノシン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）であり、かつ
配列番号：０２は、Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｇ（グアニン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）であり、
（ｅ）  工程（ｄ）において増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体をコードする遺伝子配列に含まれる１つの遺伝子配列と一致するかどうかを判定する工程、
（ｆ）  工程（ｅ）においてｃＤＮＡの遺伝子配列が前記１つの遺伝子配列と一致する場合には、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体は、工程（ｅ）においてｃＤＮＡの遺伝子配列と一致する前記１つの遺伝子配列に対応する嗅覚受容体であると判定される工程、
ここで、マウス嗅覚受容体群Ａは以下のマウス嗅覚受容体を含む：
（マウス嗅覚受容体群Ａ）：
Olfr17、Olfr33、Olfr62、Olfr67、Olfr155、Olfr156、Olfr157、Olfr159、Olfr290、Olfr420、Olfr544、Olfr545、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr560、Olfr564、Olfr566、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708、Olfr713、Olfr1030、およびOlfr1402。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程を更に具備する：
工程（ａ）および工程（ｂ）の間に、１個の嗅覚細胞の細胞膜を破砕する工程。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
工程（ａ）において、嗅覚細胞を含有する試料溶液から１個の嗅覚細胞が抽出される。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
マウス嗅覚受容体群Ａは、以下のマウス嗅覚受容体を含むマウス嗅覚受容体群Ｂから選択される。
（マウス嗅覚受容体群Ｂ）：
Olfr 17、Olfr 33、Olfr 67、Olfr156、Olfr157、Olfr290、Olfr420、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr564、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708およびOlfr1030
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嗅覚受容体は、三量体Ｇタンパク質結合型受容体（以下、「ＧＰＣＲ」という）であり、より具体的には、嗅覚受容体は、三量体Ｇタンパク質結合型７回膜貫通型受容体の１種である。
【０００３】
図４は、細胞膜への匂い分子の刺激が電気信号に変換されるメカニズムを示す。
【０００４】
嗅覚受容体は、細胞膜上に発現している膜タンパク質である。当該細胞膜は、主に、脂質二重膜からなる。脂質二重膜は、各層が高密度に並んだリン脂質分子からなる二層の構造を有している。この脂質二重膜が、図４の中央に模式的に示されている。図４において、脂質二重膜の上側が細胞外側であり、他方、脂質二重膜の下側が細胞内側である。当該嗅覚受容体の近傍に、三量体Ｇタンパク質が配置されている。
【０００５】
当該三量体Ｇタンパク質は、αサブユニット（Ｇαｏｌｆ）、βサブユニット（Ｇβ）、およびγサブユニット（Ｇγ）から構成されるヘテロ三量体である。細胞は、アデニル酸シクラーゼを含有する。図４では、アデニル酸シクラーゼは、記号「ＡＣ」で記述されている。アデニル酸シクラーゼは、正確には、膜貫通型タンパク質である。タンパク質ＲＴＰ１Ｓは、嗅覚受容体が細胞膜に発現することを補助する機能を有する。なお、このタンパク質ＲＴＰ１Ｓは、上記メカニズムとは直接的には関連しない。
【０００６】
次に、上記メカニズムが説明される。匂い分子が当該嗅覚受容体に結合する。当該結合は、三量体Ｇタンパク質をαサブユニット（Ｇαｏｌｆ）とβγ複合体とに分離させる。当該βγ複合体は、サブユニットＧβおよびＧγからなる。分離したＧαｏｌｆは、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を活性化させる。活性化したアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）に変換する。
【０００７】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、イオンチャネル（具体的には、例えば、環状ヌクレオチド感受性イオンチャネル（ＣＮＧ））を活性化する。当該活性化は、細胞内から細胞外へ、または細胞外から細胞内へイオンが輸送されることをもたらす。このイオンの輸送の度合いが、電気信号として測定され得る。
【０００８】
マウスは、およそ１３００種類の嗅覚受容体を含有する。嗅覚受容体は、「Ｏｌｆｒ n」と言われる。ここで、ｎは、一般的には自然数である。例えば、「Ｏｌｆｒ２９０」という名称を有する嗅覚受容体が知られている。
【０００９】
１個の嗅覚細胞は、１種類の嗅覚受容体を含む。１個の嗅覚細胞は、２種類以上の嗅覚受容体を含まない。
【００１０】
嗅覚受容体をコードする遺伝子配列を用いてトランスフェクトされた細胞内に嗅覚受容体が発現されていない場合には、１個の嗅覚細胞を取得した当業者は、その１つの嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定できない。
【００１１】
この問題を解決するため、非特許文献１は、配列番号：０３および配列番号：０４によって表される一対のプライマー、配列番号：０３および配列番号：０５によって表される一対のプライマー、または配列番号：０３および配列番号：０６によって表される一対のプライマーを用いて、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、Olfr 480、Olfr 544, Olfr 545, Olfr 586, Olfr 642, Olfr 661, Olfr 672, Olfr 690, Olfr 744, およびOlfr 749の中から特定する方法を開示している。
【００１２】
非特許文献２は、配列番号：０７および配列番号：０８により表される一対のプライマーを用いて、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体が、Olfr 16であるかどうかを判定する方法を開示している。
【００１３】
非特許文献３は、配列番号：０３および配列番号：０９によって表される一対のプライマーを用いて、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、Olfr 1056、Olfr 1366、およびOlfr 1484の中から特定する方法を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Bettina Malnic, Junzo Hirono, Takaaki Sato, B. Buck, (1999) Cell, 96, 713 - 723
【非特許文献２】Touhara K., Sengoku S., Inaki K., Tsuboi A., Hirono J., Sato T., Sakano H., Haga T. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 4040
【非特許文献３】Hamana H., Hirono J., Kizumi M., Sato T., Chem. Senses (2003) 28 (2): 87-104.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定する新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、マウス嗅覚受容体群Ａの中から特定する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）  １個の嗅覚細胞を得る工程
（ｂ）  工程（ａ）において得られた１個の嗅覚細胞に含有されるｍＲＮＡを抽出する工程
（ｃ）  工程（ｂ）において抽出されたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得る工程、
（ｄ）  （配列番号：０１）によって表されるフォワードプライマー、および（配列番号：０２）によって表されるリバースプライマーを用いるＰＣＲ法によって、工程（ｃ）において得られたｃＤＮＡを増幅する工程、ここで、
配列番号：０１は、Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｋ（グアニン又はチミン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｍ（アデニン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｉ（イノシン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）であり、かつ
配列番号：０２は、Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｇ（グアニン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）であり、
（ｅ）  工程（ｄ）において増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体をコードする遺伝子配列に含まれる１つの遺伝子配列と一致するかどうかを判定する工程、
（ｆ）  工程（ｅ）においてｃＤＮＡの遺伝子配列が前記１つの遺伝子配列と一致する場合には、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体は、工程（ｅ）においてｃＤＮＡの遺伝子配列と一致する前記１つの遺伝子配列に対応する嗅覚受容体であると判定される工程、
ここで、マウス嗅覚受容体群Ａは以下のマウス嗅覚受容体を含む：
（マウス嗅覚受容体群Ａ）：
Olfr17、Olfr33、Olfr62、Olfr67、Olfr155、Olfr156、Olfr157、Olfr159、Olfr290、Olfr420、Olfr544、Olfr545、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr560、Olfr564、Olfr566、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708、Olfr713、Olfr1030、およびOlfr1402。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定する新規な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１の概略図を示す。
【図２】図２は、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１による電気泳動写真を示す。
【図３】図３は、参考例の概略図を示す。
【図４】図４は、細胞膜への匂い分子の刺激が電気信号に変換されるメカニズムを示す。
【図５】図５は、配列番号：０３〜配列番号：０６を示す。
【図６】図６は、配列番号：０７〜配列番号：０９を示す。
【図７】図７は、配列番号：１０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態が説明される。
【００２０】
（用語の定義）
本明細書において用いられる用語「マウス嗅覚受容体群Ａ」は、マウス嗅覚受容体Olfr17、Olfr33、Olfr62、Olfr67、Olfr155、Olfr156、Olfr157、Olfr159、Olfr290、Olfr420、Olfr544、Olfr545、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr560、Olfr564、Olfr566、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708、Olfr713、Olfr1030、およびOlfr1402を意味する。
【００２１】
本明細書において用いられる用語「マウス嗅覚受容体群Ｂ」は、マウス嗅覚受容体Olfr 17、Olfr 33、Olfr 67、Olfr156、Olfr157、Olfr290、Olfr420、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr564、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708およびOlfr1030を意味する。
【００２２】
本明細書において、大文字の「Ｏ」を有する「Ｏｌｆｒ」とは、嗅覚受容体を意味する。
【００２３】
本明細書において、小文字の「ｏ」を有する「ｏｌｆｒ」とは、嗅覚受容体をコードする遺伝子配列を意味する。
【００２４】
本明細書を読んだ当業者は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、マウス嗅覚受容体群Ａの中から特定することができる。残念ながら、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体がマウス嗅覚受容体群Ａに含まれない嗅覚受容体（例えば、Ｏｌｆｒ  ２）である場合には、当業者は、嗅覚受容体を特定できない。
【００２５】
一般的に、嗅覚受容体は１個の嗅覚細胞の細胞膜を貫通するように、嗅覚受容体は１個の嗅覚細胞に含まれる。
【００２６】
（工程（ａ））
まず、１個の嗅覚細胞が用意される。１個の嗅覚細胞が、嗅覚細胞を含有する試料溶液から抽出されることが望ましい。より具体的には、ペトリ皿上に試料溶液が供給される。ペトリ皿上に供給された試料溶液に含有される１個の嗅覚細胞が、顕微鏡を用いて見出される。見出された１個の嗅覚細胞が、毛細管に回収される。このようにして、１個の嗅覚細胞が単離される。１個の嗅覚細胞は、マウス由来である。
【００２７】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）において得られた１個の嗅覚細胞からｍＲＮＡが抽出される。より具体的には、１個の嗅覚細胞の細胞膜が細胞溶解液を用いて破壊され、嗅覚細胞からｍＲＮＡを抽出する。細胞溶解液は、タカラバイオ（株）より、商品名：CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit Ver2として入手可能なキットに含まれている。
【００２８】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）において抽出されたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡが得られる。ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを得るために、タカラバイオ（株）より、商品名：CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit Ver2として入手可能なキットが用いられる。
【００２９】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、配列番号：０１によって表されるフォワードプライマー、および配列番号：０２によって表されるリバースプライマーを用いるＰＣＲ法によって、工程（ｃ）において得られたｃＤＮＡが増幅される。
【００３０】
配列番号：０１は、Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｋ（グアニン又はチミン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｍ（アデニン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｉ（イノシン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｇ（グアニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）である。
【００３１】
配列番号：０２は、Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ａ（アデニン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｃ（シトシン）−Ｉ（イノシン）−Ｃ（シトシン）−Ｙ（チミン又はシトシン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ａ（アデニン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）−Ｉ（イノシン）−Ｇ（グアニン）−Ｇ（グアニン）−Ｒ（グアニン又はアデニン）−Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）である。
【００３２】
１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体である場合、ｃＤＮＡが工程（ｄ）においてＰＣＲ法により増幅される。一方、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体ではない場合、ｃＤＮＡが工程（ｄ）においてＰＣＲ法により増幅されない。ｃＤＮＡが工程（ｄ）において増幅された場合、次の工程（ｅ）が実施される。
【００３３】
（工程（ｅ））
工程（ｅ）では、工程（ｄ）において増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体をコードする遺伝子配列に含まれる１つの遺伝子配列と一致するかどうかが判定される。
【００３４】
具体的には、工程（ｄ）において増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が解析される。次いで、解析された遺伝子配列が、ＢＬＡＳＴ検索法によって、複数の公知の遺伝子配列ｏｌｆｒの中から、解析された遺伝子配列と一致する１つの遺伝子配列が見出される。ＢＬＡＳＴ検索法については、以下のホームページを参照せよ：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。なお、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる各嗅覚受容体をコードする遺伝子配列は公知である。
【００３５】
例えば、工程（ｄ）において増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が、ＢＬＡＳＴ検索法によって、遺伝子配列ｏｌｆｒ２９０に一致する場合、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体は、Ｏｌｆｒ２９０であると判定される。
【００３６】
（工程（ｆ））
このようにして、工程（ｅ）において、ｃＤＮＡの遺伝子配列が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体をコードする遺伝子配列に含まれる１つの遺伝子配列と一致する場合には、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体は、工程（ｅ）においてｃＤＮＡの遺伝子配列と一致する１つの遺伝子配列に対応する嗅覚受容体であると判定される。
【００３７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
【００３８】
（嗅覚細胞を含有する試料溶液の調製）
１匹のマウスＣ５７／ＢＬ６Ｊ（雌）が、日本エスエルシーより購入された。マウスは、３〜５週齢であった。
【００３９】
生理食塩水（大塚製薬より入手）により１０倍に希釈された麻酔剤（ベントバルビタールナトリウム、１００マイクロリットル、共立製薬より入手）が、１ミリリットルの注射針を用いて、マウスの腹腔に注射された。マウスは５分間、静置された。
【００４０】
麻酔剤が作用したことを確認した後、ハサミを用いて、マウスが断頭された。
【００４１】
マウス組織が壊死することを防ぐために、マウスの頭部が、５０ミリリットルの容積を有するビーカー内に作製されたＣａ2+フリーリンガー溶液のシャーベット中にすばやく浸漬された。マウスの頭部は、シャーベット中に５分間、浸漬された。
【００４２】
Ｃａ2+フリーリンガー溶液は、以下の表１に示される組成を有していた。
【００４３】
【表１】
0005354122.tif 000002
【００４４】
Ｃａ2+フリーリンガー溶液に含有されるこれらの試薬は、和光純薬（株）より入手された。Ｃａ2+フリーリンガー溶液は、７．２のｐＨを有していた。
【００４５】
このようにして冷却されたマウスの頭部が、深型ペトリ皿に中に用意されたＣａ2+フリーリンガー溶液のシャーベットへ移された。その後、マウスの頭部が冷却されながら、マウスの頭部に含まれる嗅上皮組織が単離された。
【００４６】
単離された嗅上皮組織は、氷上で冷却されたＣａ2+フリーリンガー溶液に分散された。このＣａ2+フリーリンガー溶液は、表１に示される試薬だけでなく以下の表２に示される試薬をも有していた。このようにして、嗅上皮サンプル溶液が得られた。
【００４７】
【表２】
0005354122.tif 000003
【００４８】
次に、嗅上皮サンプル溶液が、ローテーター(アズワン社から入手、商品名：MTR-103)を用いて室温で穏やかに攪拌された。この攪拌中では、タンパク質分解酵素であるパパインによって、タンパク質の分解反応が進んだ。
【００４９】
５分後、表３に示される試薬を含有するリンガー溶液（１６００マイクロリットル）が嗅上皮サンプル溶液に添加され、パパインの酵素反応を停止した。
【００５０】
【表３】
0005354122.tif 000004
【００５１】
Ｃａ2+フリーリンガー溶液は、７．２のｐＨを有していた。
【００５２】
嗅上皮サンプル溶液は、セルストレーナー（ＢＤファルコン社より入手、３５マイクロメートルメッシュ）に、２回、通された。このようにして、大きな組織片が除去され、嗅覚細胞懸濁液を得た。
【００５３】
得られた嗅覚細胞懸濁液は、１０００ｒｐｍの遠心分離に５分間、供された。上澄み液が除去された後に、３ミリリットルのリンガー溶液が新たに添加された。このようにして、嗅覚細胞サンプル溶液が得られた。
【００５４】
（工程（ａ）：１個の嗅覚細胞の単離）
嗅覚細胞サンプル溶液が、６０ミリメートルの直径を有する培養ペトリ皿（ＢＤファルコン社より入手）に供給された。その後、嗅覚細胞サンプル溶液は、３７℃の温度下で３０分間、静置された。このようにして、嗅覚細胞が、培養ペトリ皿上に吸着された。
【００５５】
この培養ペトリ皿から、１個の嗅覚細胞が、顕微鏡（オリンパス社より入手、商品名：ＩＸ−８１）を用いて回収された。より詳細には、ガラス管（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．より入手、商品名：Ｂ１５０−８６−１０）がキャピラリープラー（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．より入手、商品名：Ｐ−９７／ＩＶＦ）を用いて尖らせられた。このガラス管の尖った先端は、１０マイクロメートルの直径を有していた。
【００５６】
次に、ガラス管の尖った先端に、毛細管現象により表４に示される組成を有するリンガー溶液が充填された。
【００５７】
【表４】
0005354122.tif 000005
【００５８】
ガラス管は、マニピュレーター（ナリシゲより入手、商品名：ＭＭＮ−１）に接続されたマイクロインジェクター（エッペンドルフ社より入手、商品名：セルトラムＶａｒｉｏ）に組み込まれた。培養ペトリ皿に吸着された１個の嗅覚細胞が、顕微鏡を用いて発見された後、ガラス管の尖った先端が、マニピュレーターを用いて、１つの嗅覚細胞の近傍に手動で配置された。その後、１つの嗅覚細胞が、マイクロインジェクターによってガラス管に毛細管現象によって回収された。
【００５９】
（工程（ｂ）：ｍＲＮＡの抽出）
回収された１つの嗅覚細胞から、ｍＲＮＡが抽出された。この抽出は、タカラバイオ（株）より商品名「ＣｅｌｌＡｍｐ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２」として入手可能なキットを用いて行われた。このキットは、次の工程（ｃ）においても用いられた。
【００６０】
より詳細には、回収された１つの嗅覚細胞は、キットに添付されている細胞溶解液（４．５マイクロリットル）を含有するＰＣＲチューブに吐出された。７０℃の温度下で９０秒間、ＰＣＲチューブは放置された。このようにして、ＰＣＲチューブ内にｍＲＮＡが得られた。
【００６１】
（工程（ｃ）：ｃＤＮＡの合成）
工程（ｂ）において得られたｍＲＮＡから、上記キットに添付されているマニュアルに従って、ｃＤＮＡが合成された。このようにして、ｃＤＮＡを含有する水溶液（２５マイクロリットル）を得た。この水溶液に、２２５マイクロリットルの精製水が添加された。
【００６２】
（工程（ｄ）：ｃＤＮＡの増幅）
工程（ｃ）において得られたｃＤＮＡ、配列番号：０１によって表されるフォワードプライマー、および配列番号：０２によって表されるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲが行われた。
【００６３】
表５は、このＰＣＲにおいて用いられた溶液の組成を示す。
【００６４】
【表５】
0005354122.tif 000006
【００６５】
表６は、このＰＣＲのプロトコールを示す。
【００６６】
【表６】
0005354122.tif 000007
【００６７】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液の一部がアガロースゲルを用いる電気泳動に供された。このようにして、嗅覚受容体をコードする遺伝子の一部が増幅されていることが確認された。
【００６８】
（工程（ｅ））
ＰＣＲ溶液の他の一部が、他のアガロースゲルを用いる電気泳動に供された。その後、アガロースゲルに紫外線が照射され、ＰＣＲ反応物に由来した複数のバンドを得た。次いで、各バンドを含有する部分のアガロースゲルが単離された。単離されたアガロースゲルに含有される遺伝子断片は、フィルターカラム（ＧＬサイエンスから入手、商品名：ＭｏｎｏＦａｓ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて精製された。精製された遺伝子断片に、配列番号：０１によって表されるフォワードプライマーが添加された。次いで、遺伝子断片の遺伝子配列が解析された。その結果、遺伝子断片は、配列番号：１０によって表される遺伝子配列から構成されたことがわかった。
【００６９】
配列番号：１０によって表される遺伝子配列を特定するために、ＢＬＡＳＴ検索法が用いられた。ブラスト検索法の詳細のためには、以下のホームページを参照せよ：（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）が用いられた。
【００７０】
その結果、配列番号：１０によって表される遺伝子配列は、遺伝子配列ｏｌｆｒ２９０と同一であった。
【００７１】
（工程（ｆ））
従って、工程（ａ）において得られた１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体は、嗅覚受容体Ｏｌｆｒ２９０として特定された。
【００７２】
（比較例１）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される１対のプライマーに代えて、配列番号：０３および配列番号：０４によって表される１対のプライマーが用いられたこと以外は、実施例１と同一の実験が行われた。
【００７３】
（比較例２）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される１対のプライマーに代えて、配列番号：０５および配列番号：０７によって表される１対のプライマーが用いられたこと以外は、実施例１と同一の実験が行われた。
【００７４】
（比較例３）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される１対のプライマーに代えて、配列番号：０６および配列番号：０７によって表される１対のプライマーが用いられたこと以外は、実施例１と同一の実験が行われた。
【００７５】
図２は、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１における６００塩基対の近くでの電気泳動の写真を示す。
【００７６】
図２において、カラム１、カラム２、カラム３、およびカラム４は、それぞれ、比較例１、比較例２、比較例３、および実施例１に対応する。図２におけるカラム０は、分子量マーカーに対応する。
【００７７】
図２に示されるように、実施例１においてのみ、６００塩基対の近くでバンドが観察された。このことは、配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマーのみが、遺伝子配列ｏｌｆｒ２９０を増幅できることを意味する。
【００７８】
（参考例１）
配列番号：０１および配列番号：０２により表される一対のプライマーによって、どの嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが増幅されるかを検討するために、以下の参考例が実施された。
【００７９】
結論を先に言えば、配列番号：０１および配列番号：０２により表される一対のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅される嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒは、「嗅覚受容体遺伝子群Ａ」として以下の表７に列記される。
【００８０】
（表７）
（嗅覚受容体遺伝子群Ａ）
Olfr17、Olfr33、Olfr62、Olfr67、Olfr155、Olfr156、Olfr157、Olfr159、Olfr290、Olfr420、Olfr544、Olfr545、Olfr548-ps1、Olfr559、Olfr560、Olfr564、Olfr566、Olfr569、Olfr582、Olfr584、Olfr585、Olfr606、Olfr617、Olfr618、Olfr619、Olfr630、Olfr646、Olfr648、Olfr652、Olfr665、Olfr666、Olfr668、Olfr690、Olfr702、Olfr708、Olfr713、Olfr1030、およびOlfr1402
（全３８種類）
【００８１】
表７の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒは、マウス嗅覚受容体群Ａの嗅覚受容体Ｏｌｆｒに対応する。
【００８２】
（マウスゲノムＤＮＡの調製）
１匹のマウスC57/BL6J（雌）が、日本エスエルシーより購入された。マウスは、３〜５週齢であった。マウスの尻尾が切り離された。切り離されたマウスの尻尾は、およそ１ミリメートルの長さを有していた。
【００８３】
マウスゲノムＤＮＡが、切り離されたマウスの尻尾から、キット（QIAGEN社より入手、商品名：DNeasy Blood & Tissue Kit）を用いて調製された。
【００８４】
このマウスゲノムＤＮＡ、配列番号：０１によって表されるフォワードプライマー、および配列番号：０２によって表されるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲが実施された。
【００８５】
このＰＣＲにおいて用いられたDNA polymeraseは、タカラバイオ社より商品名「LA-Taq with GC Buffer 」として入手された。
【００８６】
鋳型ｃＤＮＡの代わりに、５ナノグラム／マイクロリットルの濃度を有するマウスゲノムＤＮＡが添加されたこと以外は、表５に示されるＰＣＲ溶液と同様のＰＣＲ溶液が調製された。この溶液が、上記ＰＣＲにおいて用いられた。
【００８７】
ＰＣＲにおいて用いられたプロトコールは、表６に示されるプロトコールと同じであった。
【００８８】
このようにして、ＰＣＲ産物を得た。
【００８９】
得られたＰＣＲ産物の一部が、アガロースゲルを用いる電気泳動に供された。
【００９０】
電気泳動後、アガロースゲルに紫外線が照射され、ＰＣＲ産物に由来したバンドを見出した。その後、そのバンドを含むアガロースゲルの一部分が単離された。
【００９１】
単離されたアガロースゲルの一部分に含有されているＰＣＲ産物はフィルターカラム（ＧＬサイエンスから入手、商品名：ＭｏｎｏＦａｓ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて精製された。
【００９２】
精製されたＰＣＲ産物は、様々な種類の遺伝子断片から構成された。各遺伝子断片の遺伝子配列を決定するために、これらの遺伝子断片が発現プラスミドへ挿入され大腸菌によるＴＡクローニングが行われた。ＴＡクローニングの詳細が、以下、説明される。
【００９３】
精製されたＰＣＲ産物の一部、プラスミド（タカラバイオより入手、商品名：ｐＭＤ２０−Ｔ）、およびリガーゼ（タカラバイオより入手、商品名：ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ１）が精製水に混合された。混合後、混合物は１６℃の温度下で３０分間放置された。このようにして、精製されたＰＣＲ産物、すなわち、精製された遺伝子配列が挿入されたプラスミドが調製された。
【００９４】
これらのプラスミドを含有する水溶液に、大腸菌水溶液（大腸菌として東洋紡より入手、商品名：ＤＨ５α）が添加され、混合液を得た。その後、混合液は４℃の温度下で１５分放置された。さらに、混合液は、４２℃の温度下で９０秒放置された。最後に、混合液は、４℃の温度下で３分間、放置された。このようにして、大腸菌はプラスミドによって形質転換された。
【００９５】
プラスミドによって形質転換された大腸菌は、ＬＢプレート（InvivoGen 社、商品名「fas-am-x」）上で３７℃の温度下で１５時間、培養された。
【００９６】
ＬＢプレートは、以下の表８に示される組成を含有する培地を有していた。
【００９７】
【表８】
0005354122.tif 000008
【００９８】
培養後、ＬＢプレート上に形成された白色のコロニーが回収された。回収されたコロニーの数は、およそ１１０であった。各コロニーは、１００マイクログラム／マイクロリットルの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ液体培地中で、３７℃の温度下で１５時間、培養され、大腸菌溶液を得た。
【００９９】
遺伝子断片が挿入されたプラスミドが、大腸菌溶液から、プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社より入手、商品名：ＤｉｒｅｃｔＰｒｅｐ  ９６  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いて精製された。
【０１００】
精製されたプラスミド水溶液の一部に、プライマー（タカラバイオから入手、商品名：Ｍ１３）が添加された。その後、プラスミド水溶液は、ＰＣＲ産物に含まれる遺伝子配列を解析するため、グライナージャパン社に委託された。
【０１０１】
グライナージャパン社によって解析された遺伝子配列を元に、ＢＬＡＳＴ検索によって、増幅された嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが特定された。その結果、表７に示される３８種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが増幅されたことがわかった。
【０１０２】
（参考比較例１）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対に代えて、配列番号：０３および配列番号：０４によって表される一対のプライマー対が用いられたこと以外は、参考例１と同様の実験が行われた。
【０１０３】
その結果、４７種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが増幅されたことがわかった。これらの４７種類の遺伝子配列は、以下の表９に「嗅覚受容体遺伝子群Ｃ１」として示される。
【０１０４】
（表９）
（嗅覚受容体遺伝子群Ｃ１）
olfr16、olfr30、olfr53、olfr90、olfr92、olfr132、olfr136、olfr155、olfr159、olfr160、olfr164、olfr287、olfr288、olfr317、olfr333、olfr374、olfr457、olfr483、olfr498、olfr517、olfr535、olfr713、olfr715、olfr764、olfr769、olfr796、olfr944、olfr977-ps1、olfr982、olfr998、olfr1096、olfr1097、olfr1098、olfr1099、olfr1120、olfr1130、olfr1162、olfr1178、olfr1208、olfr1261、olfr1294、olfr1297、olfr1348、olfr1349、olfr1359、olfr1393、およびolfr1507
【０１０５】
（参考比較例２）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対に代えて、配列番号：０５および配列番号：０７によって表される一対のプライマー対が用いられたこと以外は、参考例１と同様の実験が行われた。
【０１０６】
その結果、２６種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが増幅されたことがわかった。これらの２６種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒは、以下の表１０に「嗅覚受容体遺伝子群Ｃ２」として示される。
【０１０７】
（表１０）
（嗅覚受容体遺伝子群Ｃ２）
olfr2、olfr6、olfr32、olfr62、olfr119、olfr141、olfr155、olfr159、olfr220、olfr544、olfr545、olfr560、olfr566、olfr1010、olfr1095、olfr1126、olfr1129、olfr1130、olfr1150、olfr1257、olfr1274、olfr1342、olfr1347、olfr1348、olfr1402、およびolfr1506
【０１０８】
（参考比較例３）
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対に代えて、配列番号：０６および配列番号：０７によって表される一対のプライマー対が用いられたこと以外は、参考例１と同様の実験が行われた。
【０１０９】
その結果、４３種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが増幅されたことがわかった。これらの４３種類の嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒは、以下の表１１に「嗅覚受容体遺伝子群Ｃ３」として示される。
【０１１０】
（表１１）
（嗅覚受容体遺伝子群Ｃ３）
olfr22、olfr23、olfr24、olfr49、olfr51、olfr62、olfr70、olfr133、olfr136、olfr138、olfr141、olfr228、olfr350、olfr373、olfr374、olfr382、olfr386、olfr389、olfr392、olfr393、olfr395、olfr397、olfr459、olfr483、olfr701、olfr711、olfr790、olfr796、olfr854、olfr860、olfr1126、olfr1129、olfr1155、olfr1328、olfr1338、olfr1342、olfr1355、olfr1424、olfr1425、olfr1491、olfr1496、olfr1507、およびolfr1509
【０１１１】
配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対のみによって増幅され得る嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒが、以下の式に基づいて抽出された。以下、用語「嗅覚受容体遺伝子群Ｂ」は、配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対のみによって増幅される嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒを含む。
嗅覚受容体遺伝子群Ｂ＝嗅覚受容体遺伝子群Ａ−（嗅覚受容体遺伝子群Ｃ１＋嗅覚受容体遺伝子群Ｃ２＋嗅覚受容体遺伝子群Ｃ３）
【０１１２】
言うまでもないが、嗅覚受容体遺伝子群Ｂに含まれる嗅覚受容体遺伝子ｏｌｆｒは、配列番号：０１および配列番号：０２によって表される一対のプライマー対以外のプライマー対では増幅されない。嗅覚受容体遺伝子群Ｂは、マウス嗅覚受容体群Ｂに対応する。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定する新規な方法を提供する。
【要約】      （修正有）【課題】１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を特定する新規な方法が提供される。【解決手段】１個の嗅覚細胞に含まれる嗅覚受容体を、マウス嗅覚受容体群Ａの中から特定する方法であって、特定の配列によって表されるフォワードプライマー、および他の特定の配列によって表されるリバースプライマーを用いるＰＣＲ法によって、１個の嗅覚細胞に含有されるｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡの遺伝子配列が、マウス嗅覚受容体群Ａに含まれる嗅覚受容体をコードする遺伝子配列に含まれる１つの遺伝子配列と一致するかどうかを判定する。【選択図】図１【図１】
0005354122.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005354122.tif 000012
【図５】
0005354122.tif 000013
【図６】
0005354122.tif 000014
【図７】
0005354122.tif 000015
【配列表】
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