(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素とタンパクとを接触させる工程を含むタンパクの分解方法であって、
前記酵素は、化学的に修飾されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシンであり、該Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓサブチリシンは、位置６２のアスパラギン、位置１５６のセリン、位置１６６のセリン、及び、位置２１７のロイシンからなる群より選択される１つのアミノ酸がシステインで置換されたものであり、該システインの硫黄基に、糖、ピラゾール及びビオチンのいずれかの分子が結合しており、
前記タンパクは、前記糖、前記ピラゾール及び前記ビオチンに結合するものであることを特徴とする方法（ただし、ヒトの治療方法を除く）。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記システインの硫黄基に結合した分子が前記ビオチンであり、前記タンパクがアビジン又は抗ビオチンＩｇＧである方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記システインの硫黄基に結合した分子がピラゾールであり、前記タンパクがアルコールデヒドロゲナーゼである方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記システインの硫黄基に結合した分子が糖であり、前記タンパクがレクチンである方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記糖がマンノース、グルコース、ガラクトース、及び、ラクトースからなる群より選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法第１１９条および／または同第１２０条の下で適切であるとして提供される、１９９９年４月２８日に出願されたＵＳＳＮ６０／１３１，３６２の優先権および利益を主張する。ＵＳＳＮ６０／１３１，３６２は、すべての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって資金援助された研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する言及）
［適用なし］
（発明の分野）
本発明は、キメラ分子の分野に関する。詳細には、本発明は、標的の触媒性アンタゴニスト（例えば、レセプター、酵素、レクチンなど）として作用する新規なキメラ分子を提供する。
【０００３】
（発明の背景）
キメラ分子において、そのネイティブな状態で別々に存在する２以上の分子は、互いに結合してその構成分子のすべての所望の機能を有する単一の分子を形成する。しばしば、キメラ分子の構成分子の１つは「標的化分子」である。この標的化分子は、その対応する標的に特異的に結合する抗体のような分子であり、そしてこの標的化分子によって、キメラ分子は、標的化分子が指向される標的（例えば、エピトープ）を有する細胞および組織に特異的に結合（これらを特異的に標的化）する。
【０００４】
キメラ分子の別の成分は、「エフェクター分子」であり得る。このエフェクター分子とは、キメラ分子が特異的に指向される標的に特異的に輸送される分子をいう。
【０００５】
エフェクター部分に付着された標的化部分を含むキメラ分子は、広範な種々の状況において使用されてきた。従って、例えば、細胞毒性の「エフェクター分子」に結合された標的化部分を含むキメラ分子は、しばしば、腫瘍細胞を標的化および殺傷するために使用されてきた（例えば、Ｐａｓｔａｎら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−３５４（１９９２）を参照のこと）。血管形成インヒビターに付着された標的化部分を含む他のキメラ分子は、腫瘍増殖および／または増殖を阻害するために使用されてきた。逆に、血管形成インデューサーは、アテローム性動脈硬化症の処置のために提案されてきた。キメラ分子の他の用途には、イントラボディーの送達、細胞内で発現され、次いで細胞内タンパク質に結合する抗体、ベクターの特異的送達（例えば、遺伝子治療）、または組織特異的リポソームの作製が含まれてきた。
【０００６】
代表的には、標的化部分によって認識される標的は、エフェクター分子の作用の所望の部位ではない。従って、例えば、癌を処置するために使用されるキメラサイトトキシンの場合において（例えば、ＩＬ４−ＰＥ、Ｂ１ＦｖＰＥ３８など、例えば、ＢｅｎｈａｒおよびＰａｓｔａｎ（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、１：１０２３−１０２９、Ｔｈｒｕｓｈら（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９−７１などを参照のこと）、標的化部分は、特異的に、細胞の表面上の標的に結合する。次いで、このキメラ分子は細胞中に内部移行し、そしてエフェクター分子（例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素）が細胞の細胞質に輸送され、ここでそれはその特徴的な活性を発揮する（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素の場合におけるＡＤＰリボシル化）。
【０００７】
同様に、標的化されたリポソームは、代表的には、レセプター媒介プロセスを通してかまたは脂質の作用を通して内部移行する。標的化されたイントラボディーベクターおよび遺伝子治療ベクターもまた、細胞内での発現のために内部移行される。さらに、標的化されたキメラ分子の設計における共通の目的は、結合特異性およびアビディティーの増大であった。アビディティーおよび特異性を増大させることによって、所定の結果を達成するためのキメラ分子の濃度が減少すると一般的に考えられている。従って、その標的からのキメラ分子の放出は、一般的には、望ましくないと見られている。
【０００８】
キメラ分子は、代表的には、内部移行され（標的化細胞の場合において）、そしてエフェクター分子の活性は、特異的に認識される標的以外の分子に指向されるので、キメラ分子は、代表的には、「化学量論的」な様式で作用する。すなわち、各キメラ分子は、本質的に、その「基質」との相互作用に際して消費され、そしてキメラ分子の活性は、引き続く反応のためには利用可能ではない。結果として、キメラ分子は、効力のために比較的高レベルで維持されなければならない。そして、再び発生するキメラ部分の問題（特に、インビボ適用において）は、治療的に有意な時間にわたって上昇したキメラ分子のレベルを維持することが不可能なこと、および利用されなければならない高度な投薬量によって引き起こされる毒性（例えば、非特異的）の増大である。
【０００９】
これらの問題を解決する際の試みは、キメラの免疫原性を減少させること（例えば、ヒト化抗体、抗体フラグメント、小さな融合タンパク質などを使用することによって）またはキメラ分子を「マスキング」すること（例えば、「ステルス」リポソーム）に焦点を合わせてきた。特に、免疫原性の減少に対する起動力、腫瘍浸透の改善などは、キメラ分子における化学的にカップリングした部分の代わりに融合タンパク質の使用の増加をもたらした（例えば、Ｐａｓｔａｎ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−３５４；Ｔｈｒｕｓｈ（１９９６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：４９−７１；ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＰａｓｔａｎ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９８：２７−４５などを参照のこと）が、キメラの実際の化学量論または反応速度論には取り組んでいない。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、キメラ分子の設計に対する新規なアプローチを提供する。１つの実施形態において、本発明の分子は、標的分子に特異的に結合し、そして結合した分子を分解する。好ましい実施形態において、このことは、標的分子の活性（例えば、生物学的活性）の損失を生じ、そしてまた、キメラ分子の放出を生じ、その結果、別の標的を見つけてかつそれを分解することができる。この様式において、キメラ分子は「再生され」、そして本質的に触媒性である。単一のキメラ分子は、本質的に無限の数の標的を攻撃および分解し得るので、本発明のいわゆる「触媒性アンタゴニスト」は、比較的低い投薬量で高度に有効である。
【００１１】
従って、１つの実施形態において、本発明は、標的分子（例えば、酵素、レセプターなど）の触媒性アンタゴニストを提供する。このアンタゴニストは、標的分子に特異的に結合する標的化部分を含み、そしてその標的化部分は、標的分子を分解して、そのコグネイトリガンドに対する標的分子の結合を減少させる酵素に付着されている。特定の好ましい実施形態において、標的分子の分解はまた、標的分子へのアンタゴニストの結合を減少させる。従って、これらの実施形態において、アンタゴニストは、標的から放出されて、それによってそのアンタゴニストが別の標的分子に結合およびそれを分解することを可能にする。
【００１２】
特に好ましい実施形態において、その標的化部分は、システインの硫黄基を通して酵素と結合されており、そしてそのシステインは、酵素中に天然に存在するシステインであるか、または酵素中に導入されたシステインである（例えば、酵素中ではシステイン以外のネイティブなアミノ酸で置換されている）。特定の好ましい実施形態において、そのシステインは、酵素の基質結合部位を含むサブ部位において、またはその近傍でシステイン以外のネイティブなアミノ酸で置換されているシステインである。いくつかの実施形態において、そのシステインは、基質結合部位を形成するアミノ酸で置換されているシステインである。
【００１３】
好ましい酵素には、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクダーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ、およびキチナーゼが含まれるがこれらに限定されない。特に好ましい実施形態において、この酵素はセリンヒドロラーゼである。なおさらに好ましい実施形態において、この酵素はサブチリシンタンパク質型セリンヒドロラーゼ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）であり、このシステインは、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位、およびＳ２サブ部位からなる群より選択されるサブ部位中またはその部位の近傍のアミノ酸で置換される。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、この酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓサブチリシンである。好ましい実施形態において、このシステインは、サブチリシン中のアミノ酸で置換され、ここでそのアミノ酸は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓサブチリシン中の参照残基に対応し、ここで、その参照残基は、残基１５６、残基１６６、残基２１７、残基２２２、残基６２、残基９６、残基１０４、残基１０７、残基１８９、および残基２０９からなる群より選択される残基、またはその残基の近傍にある。
【００１５】
別の実施形態において、酵素はキモトリプシンタイプのセリンプロテアーゼであり、システインは成熟トリプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＴＰＰ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＴｙｒ９４、Ｌｅｕ９９、Ｇｌｎ１７５、Ａｓｐ１８９、Ｓｅｒ１９０、Ｇｌｎ１９２、Ｐｈｅ４１、Ｌｙｓ６０、Ｔｙｒ１５１、Ｓｅｒ２１４、およびＬｙｓ２２４からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１６】
なお別の実施形態においては、酵素はα／βタイプのセリンヒドロラーゼであり、システインはＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａリパーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＴＣＡ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＴｒｐ１０４、Ｌｅｕ１４０、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１５４、Ｇｌｕ１８８、Ａｌａ２２５、Ｌｅｕ２７８、およびＩｌｅ２８５からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１７】
なお別の実施形態において、酵素はアスパルチルプロテアーゼである。より好ましくは、酵素はペプシンタイプのプロテアーゼであり、システインは成熟ヒトペプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＰＳＮ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＴｙｒ９、Ｍｅｔ１２、Ｇｌｕ１３、Ｇｌｙ７６、Ｔｈｒ７７、Ｐｈｅ１１１、Ｐｈｅ１１７、Ｉｌｅ１２８、Ｓｅｒ１３０、Ｔｙｒ１８９、Ｉｌｅ２１３、Ｇｌｕ２３９、Ｍｅｔ２４５、Ｇｌｎ２８７、Ｍｅｔ２８９、Ｌｅｕ２９１、およびＧｌｕ２９４からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１８】
さらになお別の実施形態において、酵素はシステインプロテアーゼである。より好ましくは、酵素はパパインであり、システインは成熟パパイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＢＱＩ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＡｓｎ１８、Ｓｅｒ２１、Ａｓｎ６４、Ｔｙｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｇｌｎ１１２、Ｇｌｎ１４２、Ａｓｐ１５８、Ｔｒｐ１７７、およびＰｈｅ２０７からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００１９】
特定の実施形態において、酵素はメタロプロテアーゼであり、システインは成熟ヒトマトリクスメタロプロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  ８３０Ｃ）中の参照残基に対応するアミノ酸で置換されている。ここで、参照残基はＬｅｕ１１１、Ｐｈｅ１７５、Ｔｙｒ１７６、Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８４、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１４、Ａｓｐ２３１、Ｌｙｓ２３４、およびＩｌｅ２４３からなる群より選択される残基にあるかまたはその近傍にある。
【００２０】
特定の実施形態において、触媒アンタゴニスト標的化部分は標的を指向している。標的は細胞の表面上の分子（例えば、レセプター、リガンド、細胞壁の成分、細胞膜の成分などを形成する分子）である。特定の実施形態において、標的化部分は、抗原、炭水化物、核酸、脂質、配位複合体、糖、ビタミン、デンドリマー、およびクラウンエーテルを含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素の同族リガンドである。別の特に好ましい実施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素のインヒビターである。
【００２１】
特定の好ましい実施形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、パパイン、サブチリシン、ペプシン、トリプシン、メタロプロテアーゼなど）であり、標的化部分は、炭水化物、ビタミンまたはビタミンアナログ、酵素インヒビター、ペプチド、小さな有機分子である薬剤、およびビオチンからなる群より選択されるリガンドである。別の実施形態において、酵素はプロテアーゼであり、標的化部分はレセプターである。
【００２２】
特定の好ましい実施形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、パパイン、サブチリシン、ペプシン、トリプシン、メタロプロテアーゼなど）であり、標的化部分は、ピラゾールである酵素インヒビター、ビオチン、レクチンに結合するリガンド（例えば、コンカナバリンＡ）、炭水化物（例えば、チオエチルＤ−マンノピラノシド）である。１つの特に好ましい実施形態において、標的化部分は土壌に特異的に結合し、酵素はその土壌の成分を分解する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は標的分子を分解する方法を提供する。この方法は、標的分子を、その標的分子に特異的に結合する標的化部分を含む触媒アンタゴニストと接触させる工程を包含する。ここで、標的化部分は標的分子を分解する酵素に付着されている。好ましい実施形態において、標的分子の分解がアンタゴニストを遊離させ、これによりアンタゴニストが別の標的分子に結合しそして分解することが可能になる。好ましい実施形態において、標的化部分はシステイン上のイオウ基を介して酵素に結合されている。好ましいアンタゴニスト分子は、上記の触媒アンタゴニスト分子を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
なお別の実施形態において、本発明は、変化した基質特異性を有する酵素（すなわち、再指向化酵素）を提供する。この酵素は好ましくは、その酵素の基質結合部位を含むサブサイトに付着している標的化部分を含む。好ましい実施形態において、標的化部分は、酵素のサブ部位中のシステインのイオウを介してその酵素に結合している。システインはネイティブのシステインであってもよく、またはシステインは、酵素のサブ部位中のシステインではないネイティブのアミノ酸で置換されている。好ましい酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リソザイム、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆転写酵素、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ、およびキチナーゼを含むが、これらに限定されない。
【００２５】
特に好ましい実施形態において、酵素はセリンヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）である。サブチリシンにおいて、システインは好ましくは、Ｓ１サブ部位、Ｓ１’サブ部位およびＳ２サブ部位からなる群より選択されるサブ部位にあるかまたはその近傍にあるアミノ酸で置換されている。種々の酵素においてシステインの置換に特に好ましい部位は、上記のものであるがこれらに限定されない。同様に、特に好ましい標的および標的化部分は、上記のものを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において、標的化部分はレセプターまたは酵素のインヒビターであり、他の実施形態において、標的化部分は成長因子、サイトカインおよびレセプターリガンドからなる群より選択される。特定の実施形態において、酵素はプロテアーゼであり、標的化部分は炭水化物、ビタミンまたはビタミンアナログ、酵素インヒビター、ペプチド、小さな誘起分子である薬剤、およびビオチンからなる群より選択されるリガンドである。１つの特に好ましい実施形態において、酵素はプロテアーゼ（例えば、サブチリシン、パパイン、ペプシンなど）であり、標的化部分はレセプター、ピラゾールである酵素インヒビター、ビオチン、レクチンに結合するリガンド（例えば、コンカナバリンＡ）、または炭水化物（例えば、チオエチルＤ−マンノピラノシド）である。１つの実施形態において、標的化部分は土壌に特異的に結合し、酵素はその土壌の成分を分解する。
【００２６】
なお別の実施形態において、本発明は特定の標的に酵素の活性を指向させる方法を提供する。この方法は、変化した基質特異性を有する酵素を提供する工程であって、この酵素は、その酵素の基質結合領域内のサブ部位に付着している標的化部分を含む、工程；および標的を酵素と接触させ、それにより酵素が標的に特異的に結合し、これにより標的にその酵素の活性が限局される工程を包含する。好ましい酵素は、上記の「再指向化」酵素を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明はまた、レセプターまたは酵素のインヒビターとして作用する薬物の活性を増強させる方法を提供する。この方法は、ヒドロラーゼをその薬物に、その薬物がレセプターまたは酵素に結合したときヒドロラーゼがそのレセプターまたは酵素を分解するように付着させり工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は薬物の投与治療ウインドウを増大させる。１つの特に好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはセリンヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）である。特定の好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはメタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼなどである。
【００２８】
本発明はまた、酵素またはレセプターを阻害する方法を提供する。この方法は、酵素またはレセプターを、その酵素またはレセプターの同族リガンドを分解する酵素に付着しているリガンドであって、その酵素またはレセプターに結合するリガンドを含むキメラ分子と接触させる工程を包含する。したがって、リガンドは酵素またはレセプターに連結し、そこで同族リガンドを自由に分解し、それにより、同族リガンドがレセプターを活性化することもその酵素の基質として作用することも妨げる。好ましい実施形態において、キメラ分子は、酵素またはレセプターのインヒビターに付着したヒドロラーゼ（例えば、プロテアーゼ）を含む。好ましいヒドロラーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、ペプシンタイププロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼを含むがこれらに限定されない。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明は、例えばＨｉｆｕｍｉら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８８：３２３により記載されるような触媒抗体を含まない。
【００３０】
（定義）
本明細書中で使用する場合、用語「触媒性アンタゴニスト」とは、特定の生物学的活性を有する分子の活性を阻害し得、かつ／または特定の生物学的活性を有さない分子を単に分解し得る酵素をいう。この阻害は、「標的」分子の機能の遮断または破壊であり得る。好ましい実施形態において、この阻害または妨害物は、標的分子の部分的または完全な分解によるものであり得る。「触媒性アンタゴニスト」は、アンタゴニストが、標的細胞との相互作用によってそれ自体消耗されないか、または有意に変化（すなわち、永久的変化）されない事実の長所によって、触媒性である。従って、好ましい実施形態において、標的分子の分解は、究極的に、別の標的分子を自由に攻撃できるような触媒性アンタゴニストの放出を生じる。この反応は、好ましくは、化学量論以下（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）（触媒性アンタゴニストと標的の比が１未満）であり、そして単一の触媒性アンタゴニストは、多数の標的分子を自由に分解する。
【００３１】
「標的分子」とは、触媒性アンタゴニストまたは本明細書中に記載される特異的に指向された酵素によって特異的に結合される分子をいう。触媒性アンタゴニストが使用される場合、標的分子は、このアンタゴニストによって部分的または完全に分解される。
【００３２】
「標的化部位」とは、化学分子において標的分子に特異的に結合する部分をいう。標的化部位を酵素に結合する前は、この標的化部位は標的化分子である。好ましい実施形態において、この標的化部位は、同族の結合パートナー対の１つである。
【００３３】
用語「特異的に結合する」は、標的化部位およびその同族の結合パートナーの相互作用を言及する場合、分子（例えば、タンパク質および他の生物製剤）の異種集団の存在下での標的化部位または同族分子の存在の決定因である結合反応をいう。従って、例えばレセプター／リガンド結合対の場合、リガンドは、分子の複合体混合物からそのレセプターを特異的および／または優先的に選択し、また逆も同様である。この結合は、イオン性相互作用、共有結合的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用などが挙げられるが、これらに限定されない種々の機構の１つ以上によるものであり得る。
【００３４】
用語「結合パートナー」、または「結合パートナー」のメンバー、あるいは「同族のリガンド」とは、他の分子に特異的に結合し、抗体／抗原、レクチン／炭水化物、核酸／核酸、レセプター／レセプターリガンド（例えば、ＩＬ−４レセプターおよびＩＬ−４）、アビジン／ビオチンなどのような結合複合体を形成する分子をいう。
【００３５】
用語リガンドは、別の分子に特異的に結合する分子をいうように使用される。一般に、リガンドは、レセプターに結合する可溶性分子（例えば、ホルモンまたはサイトカイン）である。レセプターのより広い意味が使用される場合（例えば、シグナル伝達の意味が存在しない場合）、結合対のどのメンバーがリガンドおよびその「レセプター」であるかに関する決定は、しばしば、ある程度恣意的である。これらの場合、代表的には、この結合対の２つのメンバーのうち、より小さなものがリガンドと呼ばれる。従って、レクチン−糖相互作用において、糖がリガンドである（これが遥かに大きな分子に結合していたとしても、糖類という認識である）。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、その１つ以上のアミノ酸残基が、天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーにあてはまる。この用語はまた、ポリペプチドを作製するアミノ酸に結合する伝統的なペプチド結合における改変体を含む。タンパク質はまた、糖タンパク質（例えば、富ヒスチジン糖タンパク質（ＨＲＧ）、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ  抗原（ＬｅY）など）を含む。
【００３７】
用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または本明細書の文法上同意義なものは、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドをいう。本発明の核酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、そして一般にリン酸ジエステル結合を含むが、以下に概略が説明されるように、いくつかの場合において、含まれる核酸アナログは、交替性の幹を有し得、これは例えばホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸の幹および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７を参照のこと）を含む。他のアナログ核酸は、以下を含むものが挙げられる：陽性の幹（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７）；非イオン性幹（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））ならびに非リボース幹（米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびに第６章および第７章，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏ��ｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、に記載されるものを含む）。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸はまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．１６９−１７６頁を参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ  ２，１９９７，３５頁に記載される。リボース−ホスフェート幹の改変は、標識のような追加部分の追加を容易にするために、またはこのような分子の生理学的環境における安定性および半減期を増加するために、行われ得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「残基」は、天然の、合成の、または改変されたアミノ酸をいう。
【００３９】
用語酵素は、それ自体が永久的に変化されることなく、他の物質における化学的変化を触媒し得るタンパク質を含む。この酵素は、野生型の酵素または改変体酵素であり得る。本発明の範囲内の酵素としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プロテアーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ペプチダーゼ、ラクタマーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、スルファターゼ、リゾチーム、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、リアーゼ、シクラーゼ、逆トランスクリプターゼ、ヒアルロニダーゼ、アミラーゼ、セレブロシダーゼ（ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅｓ）、キチナーゼなど。
【００４０】
「変異体酵素」は、アミノ酸残基をシステイン（または他の）残基で置換することによって、変化された酵素である。
【００４１】
「化学的に修飾された」酵素は、酵素中の部位で普通は見出されない置換基を有するように誘導された酵素である。誘導体化は、代表的には翻訳後の修飾であり、時折インビボで行われるが、より代表的にはエキソビボで行われる。
【００４２】
「化学的に修飾された変異体酵素」または「ＣＭＭ」は、そのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基（好ましくはシステイン）で置換され、そしてこの置換残基が、この残基において普通は見出されない置換基を有するように化学的に誘導された、酵素である。
【００４３】
用語「チオール側鎖基」、「チオール含有基」、および「チオール側鎖」は、交換可能に使用され得る用語であり、そしてシステインのチオール水素を置換するために使用される基を含む。通常、このチオール側鎖基は硫黄原子を含み、この原子を介して、このチオール側鎖基はシステインのチオール硫黄に結合する。用語「置換基」は、代表的には、システインと本明細書中に記載されるメタンスルホン酸試薬との反応によって形成されたジスルフィド結合を通して、システインに結合したままである基をいう。この用語置換基は、好ましくは、まさに結合したまま残っている基（そのチオール基を除く）をいうが、この置換基はまた、チオール側鎖基全体もいい得る。この違いは、文脈により明らかである。
【００４４】
「酵素の結合部位」は、酵素の基質結合表面を横切る一連のサブ部位からなる（ＢｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｅｃｈｔｅｒ（１９７０）Ｐｈｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ  ２５７：２４９−２６４）。サブ部位に対応する基質残基は標識されたＰであり、そしてそのサブ部位は標識されたＳである。慣習によって、サブ部位は、標識されたＳ1、Ｓ2、Ｓ3、Ｓ4、Ｓ1’、およびＳ2’である。サブ部位の議論は、Ｓｉｅｚｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｅｒｉｎｇ，４：７１９−７３７、およびＦｅｒｓｈｔ（１９８５）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２９−３０において見出され得る。好ましいサブ部位は、Ｓ1、Ｓ1’、およびＳ2’を含む。
【００４５】
句「アミノ酸＃＃」または「ＸＸサブ部位中のアミノ酸＃＃」は、参照される位置（例えば、Ｓ1サブ部位にあるＢ．ｌｅｎｔｕｓサブチリシンのアミノ酸１５６）におけるアミノ酸、および関連する酵素における対応する（相同な）位置のアミノ酸を含む。
【００４６】
酵素の残基（アミノ酸）は、それが相同であるか（すなわち、三次構造または四次構造のいずれかにおける位置に対応する）またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン中の残基の特定の残基もしくは一部と類似である（すなわち、化学的に化合させるか、反応させるか、または相互作用させるための同じかまたは類似の官能基の能力を有する）場合に、参照される酵素（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の残基に等価である。
【００４７】
一次構造に対する相同性を確立するために、対象酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼなど）のアミノ酸配列は、参照酵素（例えば、サブチリシン型セリンプロテアーゼの場合においては、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の一次配列、および特に、配列が既知のそのファミリー（例えば、サブチリシン）のすべての酵素において不変であることが知られている一連の残基と、直接比較される。保存された残基を整列させた後に、アラインメントを維持するために、必要な挿入および欠失を可能にし（すなわち、任意の欠失および挿入を通して保存性残基の除去を避ける）、参照酵素（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の一次構造における特定のアミノ酸残基に等価な残基が規定される。保存された残基のアラインメントは、好ましくは、このような残基を１００％保存するべきである。しかし、７５％より高いアラインメントまたは５０％程度の低い保存性残基もまた、等価な残基を規定するために適切である。触媒性の三つ組の保存性（例えば、Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１）は、セリンヒドロラーゼについて維持されるべきである。
【００４８】
保存された残基は、他の関連する酵素において対応する等価なアミノ酸残基を規定するために使用され得る。例えば、２つ（参照および「標的」）の配列が、保存された残基の最大の相同性を産生するために整列される。参照配列と比較して、「標的」配列には、多数の挿入および欠失が存在し得る。従って、例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシンと比較して、サーミターゼ（ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）配列中に多数の欠失が見られる（例えば、米国特許第５，９７２，６８２号を参照のこと）。従って、サーミターゼにおける、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシンのＴｙｒ２１７の等価なアミノ酸は、５，９７２，６８２特許の図５Ｂ−２中のＴｙｒ２１７の下に示される特定のリジンである。
【００４９】
特定の「等価な」残基は、異なるアミノ酸によって置換されて、変異カルボニルヒドロラーゼを生じ得る。なぜなら、それらは、一次構造において等価であるからである。
【００５０】
三次構造がＸ線結晶解析によって決定された特定の酵素についての三次構造のレベルでの相同な等価な残基は、参照配列（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）および問題の配列（標的配列）の特定のアミノ酸残基の２以上の主鎖の原子の原子配位（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、およびＯとＯ）が、アラインメント後に０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内であると規定される。アラインメントは、最良のモデルが、参照配列に対して問題の酵素の非水素タンパク質原子の原子配位の最大の重複を与えるように配向されかつ位置決めされた後に達成される。最良のモデルは、利用可能な最高の分解能で実験的な回折データについて最小のＲ因子を与える結晶学的モデルである。
【００５１】
【数１】
0005180417.tif 000002
参照配列（例えば、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓサブチリシン）の特定の残基と機能的に類似である等価な残基は、問題のアミノ酸配列（例えば、関連するサブチリシン）の残基として規定される。この問題のアミノ酸配列は、本明細書中に記載されるような参照配列の特定の残基に規定され、そしてそれに起因する様式で、タンパク質構造、基質結合、または触媒を変化させるか、修飾するか、またはそれに寄与するように、コンホメーションを採用し得る。さらに、これらは、問題の配列（その三次構造がｘ線結晶解析によって得られた）の残基であり、ここで、所定の残基の主鎖の原子が、相同な位置を占めることに基づく等価性の判断基準を満たさないかもしれないが、その残基の主鎖の原子の少なくとも２つの原子配位が、参照配列の残基の対応する側鎖の原子の０．１３ｎｍであるという程度で類似の位置を占める。三次元構造は、上記に概説したように整列される。この手順の例示については、米国特許第５，９７２，６８２号を参照のこと。
【００５２】
「参照残基」とは、特定の酵素において特定され、そして、例えば、以下に記載するように、参照酵素がそのメンバーであるようなファミリーの他のメンバーにおいて等価な残基を同定するための「参照点」として働く残基をいう。従って、句「成熟ヒトタンパク質Ｘにおける参照残基に対応するアミノ酸」とは、同じタンパク質ファミリーの他のメンバーにおけるタンパク質Ｘの参照残基に等価な（または相同な）残基をいう。さらに、対象配列がタンパク質Ｘである場合には、この句は参照残基それ自体をいう。
【００５３】
「セリンヒドロラーゼ」は、加水分解反応において求核試薬として働く活性セリン側鎖を利用する加水分解酵素である。この用語は、ネイティブのおよび合成のセリンヒドロラーゼ、ならびに、例えば、合成目的のために逆反応を行うように操作された酵素を包含する。セリンペプチダーゼのファミリーは、ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＲａｗｌｉｎｇｓ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２４４：１９−６１、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．によって特徴付けられている。
【００５４】
「α／βセリンヒドロラーゼ」は、コムギ胚芽カルボキシペプチダーゼＩＩを含む、酵素に対する構造的相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリーをいう（例えば、Ｌｉａｍら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：９７９６−９８１２；Ｏｌｌｉｓら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５：１９７−２１１を参照のこと）。
【００５５】
用語「アスパルチルプロテアーゼ」（アスパラギン酸プロテアーゼとしてもまた知られる）は、触媒活性にアスパラギン酸に直接依存しているプロテアーゼである。アスパルチルプロテアーゼのファミリーは、当業者に公知の多くの刊行物によって特徴付けられている（例えば、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ（１９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４８：１０５−１２０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５６】
用語「システインプロテアーゼ」は、当業者の慣用的な用法を伴って、一貫して本明細書中で使用され得る。システインプロテアーゼのファミリーは、当業者に公知の多くの刊行物によって特徴付けられている（例えば、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２４：４６１−４８６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５７】
用語「メタロプロテアーゼ」は、当業者の慣用的な用法を伴って、一貫して本明細書中で使用され得る。メタロプロテアーゼのファミリーは、当業者に公知の多くの刊行物によって特徴付けられている（例えば、ＲａｗｌｉｎｇｓおよびＢａｒｒｅｔｔ（１９９５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２４８：１８３−２２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．を参照のこと）。
【００５８】
「サブチリシン型セリンプロテアーゼ」とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の酵素との構造的な相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリーをいい、これには、サブチリシンＢＰＮ’が含まれる（Ｂｏｔｔら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７８９５−７９０６；ＳｉｅｚｅｎおよびＬｏｕｉｓｅ（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：５０１−５２３；ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＲａｗｌｉｎｇｓ（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１９−６１、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓ．Ｄ．）。サブチリシンは、細菌または真菌のプロテアーゼであり、これは、一般的には、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を切断するように作用する。本明細書中で使用される場合、「サブチリシン」は、天然に存在するサブチリシンおよび組換えサブチリシンを意味する。一連の天然に存在するサブチリシンは、種々の微生物種によって産生され、そしてしばしば分泌されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は、完全に相同なわけではない。しかし、このシリーズのサブチリシンは、同じかまたは類似の型のタンパク質分解活性を示す。このクラスのセリンプロテアーゼは、触媒性の三つ組として規定される共通のアミノ酸配列を共有する。このことは、キモトリプシン関連セリンプロテアーゼのクラスからこのクラスを区別するものである。サブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼは、触媒性の三つ組（アスパラギン酸、ヒスチジン、およびセリンを含む）を有する。サブチリシン関連プロテアーゼにおいては、これらのアミノ酸の相対的な順番は、アミノ末端からカルボキシ末端に読まれ、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。しかし、キモトリプシン関連プロテアーゼにおいては、その相対的な順番は、ヒスチジン−アスパラギン酸−セリンである。従って、本明細書中のサブチリシンは、サブチリシン関連プロテアーゼの触媒性三つ組を有するセリンプロテアーゼをいう。
【００５９】
「キモトリプシンセリンプロテアーゼファミリー」とは、γキモトリプシンを含む酵素に対する構造的な相同性に基づくセリンヒドロラーゼのファミリーをいう（ＢｉｒｋｔｏｆｔおよびＢｌｏｗ（１９７２）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６８：１８７−２４０）。
【００６０】
「樹状ポリマー」は、規則的な樹状分枝を示すポリマーであり、コアへのまたはコアからの、連続的または世代的な、分枝の層の付加によって形成される。用語樹状ポリマーは、「デンドリマー」を含み、これは、コア、少なくとも１つの内部分枝層、および表面分枝層によって特徴付けられる（例えば、Ｐｅｔａｒら、６４１−６４５頁、Ｃｈｅｍ．（ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ）（１９９４年８月）を参照のこと）。デンドロンは、焦点から発する分枝を有するデンドリマーの種であり、これは、直接的にまたは連結部分を通してのいずれかで、コアに結合されるかまたはコアに結合され得、デンドリマーを形成する。多くのデンドリマーは、共通のコアに結合された２以上のデンドロンを含む。しかし、用語デンドリマーは、単一のデンドロンを包含するために広く用いられる。
【００６１】
樹状ポリマーには、対称的および非対称的な分枝デンドリマー、カスケード分子、アルボロール、デンススターポリマーなどが含まれるがこれらに限定されない。ＰＡＭＡＭデンススターデンドリマー（米国特許第５，７１４，１６６号に開示される）は、分枝アームが等しい長さであるという点で対称的である。分枝は、先行する世代の分枝上の末端アミン基の窒素原子に存在する。リジンに基づくデンドリマーは、分枝アームが異なる長さであるという点で非対称的である。１つの分枝はリジン分子のε窒素に存在し、一方、別の分枝はα窒素に存在する。これは、先の世代の分枝に分枝を結合させる反応性カルボキシル基に隣接する。
【００６２】
分枝層の規則的な連続的付加によって形成されないとしても、過剰分枝ポリマー（例えば、過剰分枝ポリオール）は、樹状ポリマーと等価であり得、ここで、その分枝パターンは、デンドリマーのパターンの規則的なアプローチの程度を示す。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１以上のポリペプチドからなるタンパク質または糖タンパク質をいう。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これは次には、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ規定する。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、各対は１つの「軽鎖（約２５ｋＤ）」および１つの「重鎖（約５０〜７０ｋＤ）」を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識の原因である約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）とは、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれいう。
【００６４】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在するか、または種々のペプチダーゼを用いる消化によって産生される、多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中で、ジスルフィド結合の下（すなわち、Ｆｃドメインに向かって）で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２を生成し、Ｆａｂのダイマーそれ自体は、ジスルフィド結合によってＶH−ＣH１に結合された軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を切断し得、それによって（Ｆａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’モノマーに転換する。Ｆａｂ’モノマーは、実質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載については、Ｐａｕｌ（１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化によって規定されるが、当業者は、このようなフラグメントが、化学的に、組換えＤＮＡ技術を利用することによって、または「ファージディスプレイ」法（例えば、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）によってのいずれかで、デノボ合成され得ることを理解する。好ましい抗体には、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体）が含まれ、ここで可変重鎖および可変軽鎖が互いに結合されて（直接的にまたはペプチドリンカーを介して）、連続的なポリペプチドを形成する。
【００６５】
用語「炭水化物」とは、モノ−、オリゴ−、およびポリ−サッカリド、ならびに、カルボニル基の還元による（アルジトール）か、１以上の末端基のカルボン酸への酸化によるか、または水素原子、アミノ基、チオール基、もしくは類似のヘテロ原子基による１以上のヒドロキシ基の置換による、モノサッカリド由来の物質を含む。これはまた、これらの化合物の誘導体を含む。用語「糖」が、しばしば、モノサッカリドおよび低級オリゴサッカリドに適用される。親のモノサッカリドは、３以上の炭素原子を有する、ポリヒドロキシアルデヒドＨ−［ＣＨＯＨ］n−ＣＨＯまたはポリヒドロキシケトンＨ−［ＣＨＯＨ］ｎ−ＣＯ−［ＣＨＯＨ］m−Ｈである。総称「モノサッカリド」（オリゴサッカリドまたはポリサッカリドに対するものとして）は、他のこのような単位へのグリコシド結合のない、単一の単位をいう。これには、アルドース、ジアルドース、アルドケトース、ケトース、およびジケトース、ならびにジオキシ糖およびアミノ糖、およびそれらの誘導体もまた含まれるが、但し、親の化合物が（潜在的な）カルボニル基を有することが条件である（例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔ（１９９６）Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１９１９−２００８を参照のこと）。最も小さいものは、グルコース、リボース、およびトレオースのようなモノサッカリドである。炭水化物には、オリゴサッカリドおよびポリサッカリド（例えば、デンプン、セルロース、グリコーゲン）および炭水化物アナログ（例えば、ＯＨがＨ、Ｆ、ＮＨ2、またはＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ3）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
用語「汚れ（ｓｏｉｌ）」または「染み（ｓｔａｉｎ）」とは、目的の物質（例えば、織物）上の外来性の物質の蓄積をいう。「汚れ」または「染み」は、生物学的活性を有し得ないが、下にある物質を変色および／または分解するように働き得る。「汚れ」は、裸眼に見える必要はない。裸眼には見えないが、臭いを引き起こすかまたは細菌増殖を支持する外来性物質の沈着もまた、本願の状況においては、「汚れ」として見なされる。代表的な染みまたは汚れには、草の染み、血液の染み、ミルクの染み、卵、卵白などが含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
用語「低有機分子」とは、製薬で一般的に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子をいう。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい低有機分子は、そのサイズが約５０００Ｄａまでであり、より好ましくは約２０００Ｄａまで、そして最も好ましくは約１０００Ｄａまでである。
【００６８】
用語「の近く」または「に隣接して」とは、特定のアミノ酸残基についての位置を示すために使用される場合（例えば、残基１４９に隣接して）、その残基に先行するかもしくはその残基の後でのいずれかで「参照残基」に共有結合しているか、または参照残基とファンデルワールス接触している残基をいう。
【００６９】
（詳細な説明）
（触媒性アンタゴニスト）
本発明は、基本的には異なるモードの活性を利用して、キメラ分子の活性にしばしば関連する投薬量の問題、活性および持続性の問題を回避する、新規なキメラ分子を提供する。１つの実施形態において、そのキメラ分子は、標的分子の触媒性アンタゴニストである。本発明の触媒性アンタゴニストは、好ましくは、標的化部分によって特異的に結合された分子を分解する酵素に付着された標的化部分を含む。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、標的化部分（例えば、レセプター）によって認識される標的に結合し、次いで、キメラの酵素成分は、標的のすべてまたは一部を分解する。これは、好ましくは、標的の活性の減少または損失を生じ、そしてキメラ分子の放出を生じる。次いで、このキメラ分子は、別の標的分子を攻撃および分解できる。
【００７０】
従って、キメラ分子が１回のみ有効である（例えば、エフェクター活性の消費および／または内部移行および／またはキメラの溶解に起因する）代表的なキメラ分子と違って、本発明のキメラ分子は、本質的に無限の数の標的を攻撃および分解できる。好ましい実施形態において、本発明のアンタゴニストは、従って、各基質分子（標的）の分解後に事実上、効果的に再生された（再度利用可能にされた）触媒である。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、実質的に化学量論以下である。
【００７１】
結果として、本発明の触媒性アンタゴニストは、キメラ分子または伝統的なインヒビターよりもはるかに低い濃度で有効である。結果的に、本発明の触媒性インヒビターを含む処方物（例えば、界面活性剤）は、有意に低い濃度のインヒビターを利用し得、そしてより低いコストで作られ得る。インビボ適用において、本発明の触媒性インヒビターは、より低い濃度でより高い活性を提供するので、「伝統的な」キメラ分子よりもよりも、より長い有効な血清半減期およびより低い毒性を示すことが期待される。
【００７２】
本発明の触媒性アンタゴニストは、標的分子を分解し、そして／またはその標的分子の活性を阻害することが望まれる場合の、広範な種々の状況において有用である。従って、例えば、エキソビボ適用において触媒性アンタゴニストは、特定の分子を特異的に標的化および分解するために使用され得る。従って、例えば、清掃作業において、本発明のキメラ分子は、汚れの成分（例えば、タンパク質成分、脂質成分など）を特異的に標的化および分解するために利用され得る。化学合成プロセスまたは生化学的合成プロセスにおいては（例えば、分析的または工業的調製物において、バイオリアクターにおいてなど）、あらかじめ選択された分子が特異的に分解される。従って、例えば、バイオリアクター中の特定の酵素活性（例えば、グリコシル化）を除去することが所望される場合、本発明の触媒性アンタゴニストは、標的化部分として、活性（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）を媒介する酵素についての基質を含む。リアクター中の酵素（レセプター）は、標的化部分に結合し、そしてキメラの酵素成分（例えば、ヒドロラーゼ）は、酵素を分解してその活性を減少させるかまたは除去し、そしてまた、それ自体が酵素結合部位から離れて、それによって、別の標的酵素を攻撃することができる。
【００７３】
例えば、リパーゼまたはヒドロラーゼに結合した細菌表面に存在するレクチンに対して指向される、例えば、標的化部分を有する本発明のキメラ分子は、有効な抗微生物薬剤であり、おして広範な種々の殺菌剤において使用され得る。
【００７４】
生物学的系（例えば、インビトロまたなインビボ）において、本発明のキメラ分子は、広範な種々のレセプターおよび／または酵素、および／または中間体のシグナル伝達物質に結合およびアンタゴナイズ／阻害するために使用され得る。広範な種々の薬物は、細胞のレセプターの活性を阻害することによって作用する。従って、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）は、エストロゲンレセプターに結合しこれをブロックし、β遮断薬（例えば、ジゴキシン）は、高血圧および心筋梗塞後の管理において使用され、ヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニスト（シメチジン、ラニチジン）は、食道逆流疾患の処置において使用され、選択的セロトニン（５−ＨＴ）再取り込みインヒビター（例えば、Ｐｒｏｚａｃ、Ｚｏｌｏｆｔ、Ｐａｘｉｌなど）は、鬱病の治療において使用される、などである。本発明のキメラアンタゴニストは、有効なレセプターアンタゴニストとして作用する、レセプターを分解し得る酵素に結合された標的化部分として、例えば、標的レセプターまたは非コグネイトリガンドによって結合されたコグネイトリガンド（例えば、レセプターによる模倣または薬物結合）を含む。
【００７５】
「一時的に」標的レセプターをブロックする、単純な「競合的」インヒビターとは異なり、本発明の触媒性アンタゴニストは、レセプターを有効に分解する。従って、一旦結合し分解すると、そのレセプターは、何らかの修復機構を欠き、再度機能するようではない。従って、等しい濃度においては、本発明の触媒性アンタゴニストは、「伝統的な」競合的インヒビターよりも、はるかに高い活性の程度、および／または活性の持続時間を生じる。この状況において、酵素（例えば、細胞内酵素）もまた、そのコグネイト基質についてのレセプターとして見なされ得ることもまた、理解される。従って、本発明の触媒性アンタゴニストは、標的酵素を同様に分解するために使用され得る。この例において、標的化部分として、標的酵素によって分解または変化されない分子を使用することが好ましい。酵素の既知の競合的インヒビターは、この状況において良好な標的化部分である。
【００７６】
なお別の実施形態において、本発明は、化学的アンタゴニスト（例えば、レセプターおよび／または酵素の）を含み、これには、その酵素および／またはレセプターに結合するコグネイトリガンドを分解する酵素に付着されたレセプターまたは酵素に結合する標的化部分を含む。酵素またはレセプターのインヒビターは、その標的酵素またはレセプターに、キメラ分子を含む酵素を結合またはアンカーさせる。レセプターまたは酵素のコグネイトリガンドが接近した場合、酵素が分解を行いそれによってそのレセプター上の活性をブロックする。再度、キメラ分子には永続的な変化がないので、このプロセスは、「触媒性」である。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明の触媒性アンタゴニストは、化学的にカップリングされたキメラ分子である。その標的化部分は、好ましくは、酵素の両端のいずれか（アミノ末端もしくはカルボキシ末端または末端アミノ酸のＲ基を通して）に、直接的に、またはリンカーを介してカップリングされるか、またはより好ましくは、酵素中の非末端アミノ酸に、直接的に、またはリンカーを介してカップリングされる。特定の好ましい実施形態において、本発明の触媒性アンタゴニストは、化学修飾した変異体（ＣＭＭ）酵素を含む。化学修飾した変異体酵素は、ネイティブなアミノ酸残基が異なるアミノ酸（例えば、標的化部分のカップリングのために適切な反応部位を生じるシステイン）で置換されている酵素である。従って、本発明の好ましいキメラ分子は、融合タンパク質よりはむしろ、化学的にカップリングされる。
【００７８】
本発明における化学的にカップリングされた標的化部分の使用は、多数の利点を生じる。標的化部分は、ペプチドまたはタンパク質に限定されないが、むしろ多数のリガンドにいずれかであり得、これらには、既知の薬物、ビタミン、炭水化物、レクチンなどが含まれるがこれらに限定されない。標的化部分は、代表的には、タンパク質よりも小さいので、これらは、免疫原性がより弱く、そしてより高い組織浸透性を有する。さらに、標的化部分は、しばしば、種々の低有機分子であるので、それらは、生理学的な状況においてそれらのコンホメーションおよび特異性を保持し、そして代表的には、インビボでの分解をより受けにくい。本発明のキメラ分子は、多数の他の利点を提供する。それらは、「標準的な」化学を用いて化学的に結合体化されるので、より容易に作製および／または変化される。さらに、その分子は、代表的な「治療的」融合タンパク質（例えば、イムノトキシン）よりも小さく、そしてより増加した血清半減期を有することが期待される。さらに、特定の実施形態において、その分子は、存在するレセプターおよび／または酵素を実際に破壊／分解するので、単回の投薬がより長時間持続する効果を有することが期待される。なぜなら、被験体生物は、その機能を回復させるために、レセプターおよび／または酵素を実際に置換させなければならないからである。
【００７９】
（ＩＩ．再標的化酵素活性）
多くの適用において、本発明の触媒性アンタゴニストは、ネイティブではない物質（酵素的成分に対して）に作用するようにか、またはより代表的には、酵素活性が標的分子の部位に局在化するようにかのいずれかで「再指向」された酵素とみなされ得る。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、変化した物質特異性を有する酵素を提供し、ここで、この酵素は、酵素の基質結合部位を含む副部位（ｓｕｂｓｉｔｅ）に付着した標的化部分を含む、キメラ分子の成分である。
【００８０】
伝統的に、標的化されたキメラ分子は、標的化部分／ドメインをエフェクター部分の目的の活性部位からいくらか離して位置させるよう設計される。エフェクター部分の活性部位にあまりに近く位置する標的化部分は、このエフェクターの適切な機能を妨害する（例えば、立体障害により）と、一般的に考えられた。
【００８１】
本発明のキメラ分子を含む標的化部分が、酵素の基質結合部位を含むアミノ酸残基に結合し得ることは、本発明の驚くべき発見であった。さらに、標的化部分を酵素の基質結合部位のアミノ酸残基に付着させることにより、この基質結合部位が、標的化部分により結合される標的に近く隣接する。
【００８２】
本発明の方法に従って、化学的に結合した変異体を使用し、化学的部分を単に変化させることにより単一の酵素を任意の標的に指向する、用途の広い方法が提供される。このことは、特定の標的特異的酵素を作製するために過剰の改変（例えば、変異誘発技術による）が必要とされた伝統的な方法より有意に有利である。
【００８３】
従って、酵素の活性は、以下の２つの方法の一方または両方により、「再指向」される：第一に、酵素の活性が、標的化部分を特定の予め選択した標的に結合させることにより、「特異的に局在化」され得る。従って、この酵素は、特定の細胞型、特定の酵素、特定のレセプターなどに、特異的に指向され得る。第二に、標的化部分の存在により生成される酵素における変更を利用し、そして／または標的化分子が基質結合部位を標的に近く近接させるという事実を利用して、酵素は、その通常の基質ではない標的に対して、有意な活性を示し得る。
【００８４】
再指向された酵素は、広範な種々の観点で有用である。例えば、標的化部分は、選択的な分解のために、酵素を特定の標的に再指向／局在化させるように選択され得る。例えば、界面活性剤の場合には、標的化部分は、「土壌」（例えば、卵）の特定のクラスに特異的に結合するよう選択され得、これによって、適切な分解酵素（例えば、プロテアーゼ）をその基質に指向する。
【００８５】
薬学的適用において、いくつかの実施形態において、再標的化された酵素は、酵素を特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に指向させる標的化部分を含み得、ここで、この再標的化された酵素（例えば、チミジンキナーゼ（ｔｋ））は、特定の薬物（例えば、ガンシクロビル（ｇａｎｃｌｏｖｉｒ）のようなサイトトキシン）を活性化させる。他の実施形態において、酵素は、アバンダンスを越える特定の代謝産物（例えば、テイ−サックス病のような保存疾患におけるように）を含む細胞に、再標的化され得る。新たな部位において、再指向された酵素は、「誤った（ｍｉｓｓｉｎｇ）」酵素活性を与え、これによって状態を処置する。これらの例は、単に例示的であり、そして他のものとともに、以下にさらに詳細に議論される。
【００８６】
本明細書中に提供される教示の観点から、触媒性アンタゴニストは、再標的化された酵素であり得るが、そうである必要はないことが明らかである。対照的に、再標的化された酵素は、触媒性アンタゴニストとして作用し得るが、必ずしも触媒性アンタゴニストとは限らない、再標的化された酵素が存在する。
【００８７】
いかなる場合においても、好ましい実施形態において、再標的化された酵素および触媒性アンタゴニストは、標的化部分を選択すること、酵素（エフェクター部分）を選択すること、およびこれら２つを化学的に結合体化させてキメラ分子を形成することにより、作製される。
【００８８】
標的化部分および酵素の選択、ならびにこれらの結合体化は、以下に詳細に記載される。
【００８９】
（ＩＩ．標的および標的化部分の選択）
好ましい実施形態において、標的の事実上あらゆる同種の結合パートナー（例えば、レセプターおよび／または酵素および／またはレクチン）が、本発明の分子の標的化部分として使用され得る。さらに、同種の結合パートナーではないが標的分子により特異的に結合される分子（例えば、レセプターまたは酵素）もまた、本発明のキメラ分子の標的化部分として使用され得る。
【００９０】
標的化部分の選択は、そのキメラ分子（例えば、触媒性アンタゴニスト）が利用されるべき適用に依存する。標的化部分は、広範な種々の分類スキームに従って、グループ化および／または同定され得る。従って、例えば、これらは、分子の型（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ペプチド模倣物、抗体、ハプテン、エピトープ、炭水化物、単糖類、寡糖類、多糖類、糖模倣物、核酸、遺伝子、脂質、配位錯体、金属、糖、酵素、酵素原、補酵素、補因子、補酵素アナログ、補因子アナログ、ビタミン、ビタミンアナログ、クラウンエーテル、クラウンエーテルアナログ、単環式リガンドおよび多環式リガンド、複素環式リガンド、キラルリガンド、エナンチオマー濃縮したリガンド、ならびに上記のものの任意の多価またはデンドリマー改変体）に従ってグループ化され得るか、あるいはこれらは、標的の性質に従ってグループ化され得る。
【００９１】
好ましい標的としては、レセプター、酵素、およびレクチンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例においては、これらの標的のうちの１つに結合する標的化部分をいうことが簡単である。従って、例えば、セロトニンまたはセロトニンアナログは、標的化部分であり得る。同様に、標的化部分は、これらが結合する標的により参照され／同定され得る。従って、標的化部分としてのセロトニンアナログは、セロトニンレセプターに特異的に結合する薬物または化合物に含まれる。
【００９２】
例示により、上記カテゴリーのいくつかの好ましい標的を、以下に議論する。しかし、記載される実施形態は、本質的に例示的であり、限定するとは意図されない。
【００９３】
（Ａ）レセプターのための標的化部分）
レセプターは、特に本発明の触媒性アンタゴニストのための、非常に効果的な標的を提供する。レセプターは、代表的に、同種のリガンドを特異的に結合し、そして広範な種々の生物学的プロセスに関与する。代表的に、レセプターは、細胞からの信号伝達、あるいは細胞からの分子の流入または流出を媒介する。特に、信号伝達の変換器として、レセプターは、広範な種々のプロセス（増殖および形質／分化の調節、遺伝子発現および特定の分子の生成、細胞増殖、免疫応答のエレメント、種々の生物学的カスケード（例えば、炎症性応答、凝固応答など）などが挙げられるが、これらに限定されない）に関与する。
【００９４】
その結果として、レセプターは、長期にわたって、薬物のための良好な標的であると認識されており、そして広範な種々の薬物は、特定のレセプター活性のアゴニストおよび／またはアンタゴニストである（例えば、表１を参照のこと）。代表的に、これらの薬物は、比較的小さな有機分子であり、そしてそれ自体で、本発明のキメラ分子のための標的化部分として良好な候補である。
【００９５】
【表１】
0005180417.tif 000003
0005180417.tif 000004
0005180417.tif 000005
0005180417.tif 000006
0005180417.tif 000007
0005180417.tif 000008
しかし、標的化部分は、公知の医薬品である必要はない。インヒビターまたはアゴニストが公知であり、そのインヒビターまたはアゴニストが承認された医薬品ではない、多数のレセプターが存在する。
【００９６】
今までのところは、レセプターのための均一な分類が存在しない。しかし、上に示したように、非常に多くのレセプターがシグナル伝達レセプターであり、そしてこの群において、シグナル伝達レセプターは、以下の３つの一般的クラスに入る：
第一のクラスは、形質膜を貫通し、そして内因性の酵素活性を有する、レセプターを含む。このようなレセプターとしては、チロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦ、インスリン、ＥＧＦおよびＦＧＦレセプター）、チロシンホスファターゼ（例えば、Ｔ細胞およびマクロファージのＣＤ４５［クラスター決定基−４５］タンパク質）、グアニル酸シクラーゼ（例えば、ナトリウム配設増加性ペプチドレセプター）、ならびにセリン／スレオニンキナーゼ（例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＭＡＰキナーゼ、アクチビンおよびＴＧＦ−βレセプター）であるものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、レセプターのいくつかのファミリーは、内因性の酵素活性を欠くが、直接のタンパク質−タンパク質相互作用により、細胞内チロシンキナーゼに結合する。
【００９７】
タンパク質をコードするレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、代表的に、以下の４つの主要なドメインを含む：細胞外リガンド結合ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、細胞内調節ドメイン、および膜貫通ドメイン。ＲＴＫのチロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列は、ＡＴＰ結合領域および基質結合領域において、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）のアミノ酸配列に、非常に保存される。いくつかのＲＴＫは、キナーゼドメイン内への非キナーゼドメインアミノ酸の挿入を有し、キナーゼインサートと称される。ＲＴＫタンパク質は、これらの細胞外部分における構造的特徴（これには、システインリッチドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、ロイシンリッチドメイン、クリングルドメイン、カドヘリンドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型反復、ジスコイジン（ｄｉｓｃｏｉｄｉｎ）Ｉ様ドメイン、酸性ドメイン、およびＥＧＦ様ドメインが挙げられる）（ならびにキナーゼインサートの存在または非存在）に基づいて、ファミリーに分類される。これらの種々の細胞外ドメインの存在に基づいて、ＲＴＫは、少なくとも１４の異なるファミリーに副分割された。代表的なＲＴＫとしては、Ｉ  ＥＧＦレセプター、ＮＥＵ／ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、インスリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＰＤＧＦレセプター、ｃ−Ｋｉｔ、ＦＧＦレセプター、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプター、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および散乱因子（ＳＣ）レセプター、ニューロトロフィンレセプターファミリー（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ）およびＮＧＦレセプターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
第二のクラスは、細胞の内側で、ＧＴＰ結合タンパク質およびＧＴＰ加水分解タンパク質（Ｇ−タンパク質と称する）に結合するレセプターを含む。Ｇ−タンパク質に結合したレセプター（ＧＰＣＲ）は、形質膜にまたがるために十分な長さ（代表的に、２０〜２８アミノ酸残基）である、７つの疎水性ドメインにより代表的に特徴付けられる、内在性膜タンパク質のスーパーファミリーである。このクラスの例としては、−アドレナリン作用性レセプター、臭気物質レセプターおよびペプチドホルモンのためのレセプター（例えば、グルカゴン、アンギオテンシン、バソプレシンおよびブラジキニン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
第三のクラスは、細胞内に見られ、そしてリガンド結合の際に、リガンド−レセプター複合体が遺伝子転写に直接影響を与える核に移動するレセプターを含む。これらのレセプターとしては、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリー（例えば、糖質コルチコイド、ビタミンＤ、レチン酸および甲状腺ホルモンレセプター）が挙げられるが、これらに限定されない。これは、細胞質内に存在し、そして親油性ステロイド／甲状腺ホルモンを結合する、タンパク質のクラスである。リガンドの結合の際に、ホルモン−レセプター複合体は、核に転座し、そしてホルモンレセプターエレメント（ＨＲＥ）と呼ばれる特定のＤＮＡ配列に結合する。この複合体の、ＨＲＥへの結合は、会合した遺伝子の変更された転写速度を生じる。
【０１００】
このようなレセプターを結合するリガンドは、当業者に周知である。これらとしては、Ａ2レセプターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０２６，３１７号を参照のこと）、５ＨＴ１レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２５，３７４号および同第６，０２５，３６７号を参照のこと）、アテローム性動脈硬化症の予防のための、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）レセプターブロッカー（例えば、米国特許第６，０２５，３６９号を参照のこと）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター−γのモジュレーター（例えば、米国特許第６，０２２，８９７号を参照のこと）、エンドセリンレセプターアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２２，８８６号および同第６，０２０，３４８号を参照のこと）、部位１におけるヒト成長ホルモンレセプターに対する増加した親和性を有する、ヒト成長ホルモン改変体（例えば、米国特許第６，０２２，７１１号を参照のこと）、ヒトニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターのアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２０，３３５号を参照のこと）、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０２２，５２３号を参照のこと）、アデノシンレセプターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０２０，３２１号を参照のこと）、インターロイキンレセプター（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１３Ｒなど）アンタゴニスト、増殖因子レセプターに特異的な結合薬剤（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦおよびそのアナログまたは模倣物）、ＩｇＡレセプターに特異的な結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１８，０３１号を参照のこと）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテートレセプター複合体のストリキニーネ非感受性グリシン調節部位のアゴニスト（例えば、米国特許第６，０１７，９５７号を参照のこと）、インテグリンレセプターアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０１７，９２６号を参照のこと）、アンドロゲンレセプターモジュレーター化合物（例えば、米国特許第６，０１７，９２４号を参照のこと）、ＰＣＰレセプターリガンド（例えば、米国特許第６，０１７，９１０号を参照のこと）、トロンビンレセプターアンタゴニストとしてのアゾールペプチド模倣物（例えば、米国特許第６，０１７，８９０号を参照のこと）、ＮＰＹ  Ｙ２レセプターアゴニスト（例えば、米国特許第６，０１７，８７９号を参照のこと）、ＮＦ−κＢのレセプターアクチベーター（例えば、米国特許第６，０１７，７２９号を参照のこと）、ＴＮＦレセプターのアンタゴニスト、ソマトスタチンレセプター結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１７，５０９号を参照のこと）、ヒトヒスタミンＨ2レセプター、ブラジキニン結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１５，８１２号を参照のこと）、グルタメートレセプターアンタゴニスト（例えば、米国特許第６，０１５，８００号を参照のこと）、イミダゾリンレセプター、トランスフェリンレセプター、ベンゾジアゼピンレセプター結合薬剤（例えば、米国特許第６，０１５，５４４号を参照のこと）、ｇａｂａ脳レセプターリガンド（例えば、米国特許第６，０１３，７９９号を参照のこと）、���ューロテンシンＮＴ１およびＮＴ２レセプター、ＣＸＣＲ２レセプター、ＣＣＲ５レセプター、マクロファージマンノースレセプターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明のキメラ分子のための良好な標的を提供する他のレセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＳＰ−Ｋレセプター、基質Ｋレセプター、タキキニン２レセプター、α１−アドレナリンレセプター亜型Ａ、α１−アドレナリンレセプター亜型Ｂ、α２−アドレナリンレセプター亜型Ａ、β１−、β２−、β３−アドレナリンレセプターδレセプター、κレセプター、μレセプター、ＡＣＴＨレセプター、アンギオテンシンレセプター、アデノシンレセプター、ボンベシンレセプター、ガストリン放出ペプチドレセプター、ブラジキニンレセプター、Ｃ５ａレセプター、カルシトニン遺伝子関連ペプチドレセプター、カルシトニンレセプター、ＣＣＫ−Ａレセプター、コルトコトロピン放出因子レセプター、ドパミンレセプター、ＥＰ２レセプター、ＥＰ３レセプター、ＥＴＡレセプター、ＥＴＢレセプター、ＦＳＨレセプター、ＧＡＢＡレセプター、ガラニンレセプター、グルカゴンレセプター、グルカゴン様ペプチド−１レセプター、性腺刺激ホルモンレセプター、成長ホルモン放出ホルモンレセプター、ヒスタミンＨ１レセプター、ヒスタミンＨ２レセプター、ロイコトリエンＢ４レセプター、メラトニンレセプター、ＭＳＨレセプター、ムスカリン様Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４レセプター、ニューロテンシンレセプター、甲状腺傍ホルモンレセプター、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチドレセプター、血小板活性化因子レセプター、プロスタサイクリンレセプター、Ｐ２Ｕプリノセプター（ｐｕｒｉｎｏｃｅｐｔｏｒ）、Ｐ２Ｙプリノセプター、ロドプシン、セクレチンレセプター、ソマトスタチンレセプター、ＳＳＴＲレセプター、ＶＩＰレセプター、バソプレシンレセプター、エストロゲンレセプター、神経ペプチドレセプター、Ｔ細胞レセプターなど。
【０１０２】
（Ｂ）酵素および抗体のための標的化部分）
他の実施形態において、本発明のキメラ分子において使用される標的化部分は、酵素または抗体により特異的に結合される部分である。広範な種々の酵素、これらの基質およびその相補的インヒビターは、当業者に公知である。さらに、これらの酵素の多くは、広範な種々の病理における薬物のための、良好な標的を提供する。
【０１０３】
例えば、カスパーゼは、酵母およびぜん虫からヒトまでの動物において細胞自殺を誘発し得る、酵素の顕著な、そして複雑に調節される網目構造である。カスパーゼは、多数の疾患（虚血性脳傷害、または発作を含む）における、プログラムされた細胞死を媒介することが公知である。心臓「発作」の間に生じる心臓細胞死は、いくつかのカスパーゼの活性化により起こると考えられる。さらに、ＹＶＡＤ−ｃｍｋとして公知の実験的なカスパーゼインヒビターの投与は、この生化学的カスケードをブロックし、そしてまた心臓組織を保護し、心筋死の量を３０％を超えて劇的に減少させることが、実証されている。プロテアーゼ（酵素）に付着したカスパーゼ特異的薬剤を標的化部分として含む、本発明の触媒性アンタゴニストは、カスパーゼを特異的に標的化および分解し得る。これは、心筋亀裂骨折の間および後の心臓組織、ならびに発作の間および後の脳組織の保護を与えることが、予測される。カスパーゼに特異的に結合する薬剤（例えば、ＹＶＡＤ−ｃｍｋ、および種々の保護されたカスパーゼ基質）は、当業者に公知である。
【０１０４】
別の例においては、酵素ＧＡＲＦＴ（グリシンアミド−リボヌクレオチド−ホルミル−トランスフェラーゼ）は、腫瘍細胞がＤＮＡの必須の構成要素であるプリンを合成する生化学経路における酵素である。ＧＡＲＦＴの作用のブロッキングは、プリンの合成および引き続く腫瘍ＤＮＡ分子の構築を阻害する。肝臓細胞を例外として、すべての通常のヒト組織は、代替的な経路（プリン回収経路）を経由してプリンを獲得し得る。ＧＡＲＦＴのインヒビターは腫瘍細胞に対して選択性を示し、他の化学療法剤よりも骨髄に対する毒性がより顕著ではない。ＧＡＲＦＴを分解し得るプロテアーゼに付着した部分を標的化するＧＡＲＦＴを含有する本発明の触媒アンタゴニストは、同様の腫瘍選択性を示すと予想される。一つの適した標的化部分はＡＧ２０３７（Ａｇｏｕｒｏｎによって製造される）であり、これは前臨床研究において用いられる。ＡＧ２０３７は構造に基づいた設計を用いて作られて、強力かつ選択的なＧＡＲＦＴの阻害を示したが、初期ＧＡＲＦＴインヒビターの副作用において重要であると考えられている膜タンパクであるｍＦＢＰに対する結合を妨げた。ＡＧ２０３７は種々のマウス癌モデル中で十分に耐性があり、マウスにおいて増殖させた同じ腫瘍で研究した場合、広範囲なスペクトルの抗腫瘍効力を示し、これは、パクリタキセルの効力と少なくとも同等であった。
【０１０５】
なお別の例において、細胞間酵素であるジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）は良好な標的を提供する。ＤＨＯＤＨは、ウリジレート（ＵＭＰ）のデノボの生合成に関与する４番目の連続した酵素である。活性化したＴ細胞は迅速なデノボのピリミジン生合成を必要とするので、この酵素は免疫応答の活性化に重要であることが知られており、このことは、この酵素を移植および自己免疫疾患の介入のための良好な標的にしている。この酵素を標的化する１つの化合物である、レフルノミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ）は、大人のレフルノミドの活性な慢性関節リウマチの治療のために米国食品医薬品（ＦＤＡ）によって承認されており、または、関連したＤＨＯＤＨ特異的薬剤は、ＤＨＯＤＨ酵素を分解し同様の治療結果を提供する酵素に付着した標的化部分として使用され得る。別の公知のインヒビターである、ブレキナルナトリウムが免疫抑制の多くの動物モデル中で効力を示しているが、狭い治療的有効血中濃度投与量のために、移植についての臨床試験では成功していない。本発明の触媒性アンタゴニスト中で標的化部分として使用される場合、治療的有効血中濃度投与量が改善することが期待される。なぜなら、この分子は低い濃度でも有効であるからである。概して、本発明に従って、触媒性アンタゴニストに競合インヒビターとして働く薬剤の転換は、より低い濃度でのより高い効力のために改善した治療的有効血中濃度投与量を示すと考えられる。
【０１０６】
なおさらに別の例においては、本発明の触媒性アンタゴニストは、遺伝性の気腫の処置において有用である。気腫の遺伝形はα−１プロテイナーゼインヒビター欠損または略して「α−１」と呼ばれる。この疾患を有する人々は主要なタンパク質、α−１プロテイナーゼインヒビターに欠損がある。α−１プロテイナーゼインヒビターは血中の主要なタンパク質であり、おもに肝細胞で作られるが、いくつかの白血球においてもまた作られる。それはエラスターゼと呼ばれる強力な酵素の効果をブロックすることによって肺を保護する。エラスターゼは通常は白血球によって運搬され、細菌を殺傷することおよび肺に吸い込まれた小さな小片を中和化することによって、肺の繊細な組織を保護する。一旦この酵素の保護的な作業が終わると、更なる行動がα−１プロテイナーゼインヒビターによってブロックされる。α−１プロテイナーゼインヒビターなしでは、エラスターゼは肺の気嚢を破壊し得る。
【０１０７】
このように、例えばプロテアーゼに付着した（例えば、プロラスチンと呼ばれる薬物）α−１プロテイナーゼインヒビター結合部分を含有する本発明の触媒性アンタゴニストは、同様のまたはより良好な治療的利点を与えるα−１プロテイナーゼを分解する。
【０１０８】
抗体はまた、本発明の触媒性アンタゴニストについての有用な標的を提供する。このように例えば、αＧａｌエピトープ特異的な抗体を標的化しかつ、拮抗する（例えば、分解する）触媒性アンタゴニストは免疫応答（例えば、異種移植片に対して）を有意に減少させることが期待されている。次いで、１つの実施形態ではαＧａｌエピトープは、本発明のキメラにおける標的化部分として使用され得る。それはプロテアーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着し得、そして抗体によって結合される場合、その抗体を分解し、それによって抗体媒介性の免疫応答を阻害する。
【０１０９】
同様に、特に、異種移植片が異なる種に由来する場合、触媒性アンタゴニストは標的化部分として異種移植片としてＭＨＣ（またはその構成成分）を使用し得る。もし酵素成分がヒドロラーゼ（例、プロテアーゼ）である場合、触媒性インヒビターは特異的に免疫系のエフェクター細胞のレセプターを消化する（例えば、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）が異種移植片に対して特異的に指向された細胞でのみ）。触媒性アンタゴニストは、一般的に宿主の免疫系を損なうことなしに、特異的な耐性を異種移植片に付与する。
【０１１０】
本発明の触媒性アンタゴニストについて良好な標的である他の抗体は、自己免疫応答および／または他のアレルギー反応において産生される抗体である。これらの例においては、標的化部分は、自己免疫またはアレルギー応答を媒介する抗体によって認識されるエピトープを有する分子である。標的化部分に付着した、例えば、ヒドロラーゼによる抗体の分解は、自己免疫応答に関連した病理的症状を減少させる。種々の自己免疫応答において抗体によって認識される特定のアレルゲンおよび基質は、当業者に周知であり、容易に本発明のキメラ分子に組み込まれ得る。
【０１１１】
上記に提供された例示の多くは、インビボでの適用を指向しているが、本発明はそのようには限定されていない。広範な種々のエキソビボの適用において酵素およびまたは抗体を、阻害するのは望ましいことが認識されている。これらの適用には、種々の細胞培養、バイオリアクターもしくは発酵技術、または種々のエキソビボ合成プロセス（例えば、研究室プロセスおよび／または商業的プロセス）、抗微生物剤／殺菌剤などを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
（Ｃ  レクチンおよび糖の標的化部分）
別の実施形態では、特定のレクチンに結合する標的化部分を選択する。レクチンは特異的な単糖またはオリゴ糖に特異的な結合部位を有する、多数の植物、動物および細菌の供給源から得られるタンパク質である。例えば、コンカナバリンＡおよび小麦胚芽のアグルチニンは、糖タンパクの研究の分析用および調製薬剤として広範に使用されている。
【０１１３】
レクチンはまた、真核細胞および細菌細胞の表面にも存在する。真核細胞において、レクチンは、しばしば細胞−細胞の相互作用に関与する。細菌細胞においては、レクチンはしばしば細菌の標的／宿主への接着を媒介し、多くの場合では、そのような接着が、細菌が宿主細胞に感染するのに必要とされる。
【０１１４】
さらに、細菌の接着および非生物学的表面の汚染が、医学、歯科および食料科学分野での重大な問題となっている。最も有害な効果は医学で生じており、そこでは移植または経皮性の医療機器の不全がおもに表面に結合した細菌感染から生じている。細菌の表面との相互作用／吸着はしばしばレクチンによって媒介される（しばしば付着因子といわれる）。表面に吸着する細菌は、それ自体を表面に結合させるために、頻繁に外部多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）マトリックスを分泌する。外部多糖類マトリックスに固定された、このねばねばした細菌層はバイオフィルムとして知られている。現在、インビボでのバイオフィルム感染に対して治療法は存在しない。なぜなら、細菌はどんな抗菌剤または抗生物質処理に対しても耐性であるからである。
【０１１５】
バイオフィルムの形成はまた、広範な種々の商業的合成系においても問題である。しばしば発酵容器およびほかのバイオリアクターは、バイオフィルムによって汚染される。バイオフィルムはまた、多くの化学プロセス（特に「消化しうる」有機試薬を含むプロセス）のために使用される装置中で増殖し、そしてこの装置を汚染する。このようにして、バイオフィルムは、しばしばフィルター、導管、分離器および他の装置を汚染する。
【０１１６】
特定の実施形態において、本発明の触媒性アンタゴニストは、種々のレクチンを抑制／分解するために用いられる。従って、例えば、ヒドロラーゼに付着した糖および多糖類を含有する触媒性アンタゴニストは、特異的に標的分子に結合するレクチンを標的化しかつ分解する。そのような触媒性アンタゴニストは、実施例において例証される。
【０１１７】
細菌表面のレクチン／付着因子を分解することは、細菌の表面に結合する能力に干渉し、それによって、細菌が宿主細胞に侵入することまたはバイオフィルムを生成することを妨げる。
【０１１８】
関連した実施形態において、多くの細菌および細菌毒素がガングリオシド、酸スフィンゴ糖脂質に結合し、そして宿主細胞に侵入することが知られている。これらの中で最も知られているのは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによって生成されるエンテロトキシンであるコレラ毒素であり、これは、ガングリオシドＧＭ１に結合することが知られている。他のガングリオシド結合細菌毒素には、破傷風毒素（ＧＤ１ｂ）、ボツリヌス毒素（ＧＴ１ｂおよびＧＱ１ｂ）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＧＭ２）によって生成されるデルタ毒素を含まれる。Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによって生成されるシガ毒素、および腸出血性大腸菌によって生成されるベロ毒素は、例えば、ガラビオシド（Ｇａ２Ｃｅｒ）およびセラミドトリへキソサイド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）のような糖鎖にα−１，４ガラビオース部分を有する中性の酸スフィンゴ糖脂質に結合する。
【０１１９】
多くの病原菌もまた、コロニー形成および感染のために宿主細胞表面の酸スフィンゴ糖脂質に結合する。従って、尿路感染を起こす尿路疾患病原性大腸菌は、糖鎖の非還元末端にα−１，４ガラビオース部分を有する酸スフィンゴ糖脂質に結合し得る（Ｇｂ３Ｃｅｒなど）。尿路疾患の病原性大腸菌はまたグロボシド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）およびフォッサマン糖脂質に結合し得、その両方が糖鎖の内側にα−１，４ガラビオース部分を有する。大腸菌は細菌の細胞表面に存在する線毛によって酸スフィンゴ糖脂質に結合し、それは繊維や毛髪に似ている。線毛の１番上にはレクチンによって特徴づけられる付着因子がある。付着因子のいくつかの種類は、それらの糖特異性に関して、確認されてきた。それらはマンノースに特異的な大腸菌のＩ型付着因子、これもまたα−１，４ガラビオース部分に特異的な大腸菌であるＰ型付着因子、およびシアリルガラクトース部分に特異的である大腸菌のＳ型付着因子である。Ｐ型付着因子のアミノ酸配列はシガ毒素の配列に類似していると報告された。なぜなら、両方ともが酸スフィンゴ糖脂質のα−１，４ガラビオース部分を認識するからである。皮膚病を引き起こすＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍは、結合エピトープとして、酸スフィンゴ糖脂質のラクトシル部分を認識する。これらの細菌はラクトシルセラミドに強く結合し、例えば、アシアロＧＭ１（ＧＡ１）およびアシアロＧＭ２（ＧＡ２）のようなアイソレセプターにもまた結合する。ほとんど全ての酸スフィンゴ糖脂質が共通のラクトシル部分を有しているので、Ｐｕｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｕｍはほとんど全ての酸スフィンゴ糖脂質に結合すると想定され得る。しかし、細菌は、これらがラクトシル部分を有していても、セラミド中の２ヒドロキシ基および１ヒドロキシ脂肪酸からなるどの酸スフィンゴ糖脂質に対しても結合するというわけではない。この事実は細菌の結合エピトープがまた、糖鎖のラクトシル部分に加えて、セラミド構造に依存していることを示している。淋病を起こすＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅもまたラクトシル部分を有した酸スフィンゴ糖脂質に結合する。
【０１２０】
前述を考慮すると、酸スフィンゴ糖脂質（例えば、グリコシダーゼ、セレブロシダーセなど）を分解する酵素に付着した、種々の酸スフィンゴ糖脂質および／または種々の付着因子（例えば、マンノースに特異的な大腸菌のＩ型付着因子、α−１，４ガラビオース部分に特異的な大腸菌のＰ型付着因子およびサイアリルガラクトースに特異的な大腸菌のＳ型付着因子）に特異的に結合する標的化部分を有する触媒性アンタゴニストは、細菌感染を妨げ、細菌の生産した毒素（例えば、コレラ毒素）の急性効果をブロックするために、効果的な治療法を提供することが期待される。
【０１２１】
レクチン、特に膜糖タンパク質もまた、種々の炎症プロセスに関わっている（例えば、慢性関節リウマチ、関節炎敗血症ショック、心筋梗塞などに関連した炎症プロセス）。例えば、Ｌｅｃ−ＣＡＭまたはセレクチンは内皮、白血球および血小板の表面に発現され、炎症の部位の白血球の内皮の接着に影響を及ぼす。内皮細胞および血小板顆粒のヴァイデル−パラーデ体に貯蔵されたＧＭＰ−１４０（Ｐ−セレクチン）は、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１によって刺激されたとき数分以内に細胞の表面に輸送され、内皮、血小板、白血球の間の相互作用に関与する。ＥＬＡＭ−１（Ｅ−セレクチン）は、刺激された内皮、例えば、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１によって、デノボ合成され、その後、白血球の補充を増強する。ＬＡＭ−１（Ｌ−セレクチン）はリンパ球が高内皮リンパ節細静脈に結合するのを調節し、好中球およびリンパ球の表面にこれらの細胞が局在し傷害を起こすのを調節する。
【０１２２】
さらに、インテグリン、αおよびβサブユニットのへテロダイマーから成る接着分子のファミリー；細胞−マトリックスおよび細胞−細胞の接着の調節に作用する。これらの分子は構造では膜貫通であり、従って外部の／表面の刺激を細胞内細胞骨格に繋げるまたは「統合する」。β２インテグリン：ＣＤ１１／ＣＤ１８分子としてもまた知られている、は接着特異性を与え、化学走性の刺激による食細胞の活性化を媒介する。
【０１２３】
インテグリン（例えば、ＭＯ−１、白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）およびｇｐ１５０，９５）の表面での発現は；食細胞の損傷部位への局在を援助し；欠損状態は細胞の感染に対する感受性の増強を生じる。
【０１２４】
細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）は：白血球が組織を傷害するための局在を補助する；サイトカイン刺激の内皮および白血球の表面に発現され；好中球およびマクロファージの細胞膜に存在するＬＦＡ−１およびＭＯ−１に結合する。血管細胞の接着因子−１（ＶＣＡＭ−１）は：リンパ球、単球、好酸球、好塩基球のＶＬＡ−４白血球レセプターに結合する。
【０１２５】
これら全ての分子はまた、本発明の触媒性アンタゴニストに適した標的を提供する。前述の本発明のレクチン標的の触媒性アンタゴニストの例証は示例的なものであり、制限することを意図しない。多くの他のレクチン標的が当業者に周知である。
【０１２６】
本明細書中に記載された（および他の）標的および標的化部分が逆転し得ることは理解される。従って、糖の代わりに標的化部分が、特に触媒性アンタゴニスト（あるいは再標的化された酵素）を糖または糖負荷の標的に指向させるレクチンであり得る。このように、分子は特定の細菌に存在し、かつその細菌に特徴的な糖に標的化される。１つの実施形態では、糖指向の触媒性アンタゴニストは効果的な微生物殺菌剤となる。
【０１２７】
上述のように、そのような分子は、本発明のキメラ分子の単糖またはオリゴサッカリドなどを標的化部分を用いることによって標的化され得る。さらに、デンドリマーもまた標的化部分として使用され得る。このように酵素の多機能化（例えば、触媒性アンタゴニストまたは再標的化された酵素のいずれか）はデンドリマー標的化部分を用いることにより達成され得、それによって、多機能酵素（キメラ分子）を作製するために分岐した結合構造が利用され得る。
【０１２８】
例えば、複数マンノースを含有するキメラおよび修飾した糖部分を含む、多グリコシル化が行なわれ得る。このことはレクチンと標的化酵素（例えば、ヒドロラーゼ）との間の親和性の増加および結合親和性の利点を付与し得る。これはまた、例えば、複数のビオチン分子を複数同時発生的なビオチン−アビジン作用を誘導する標的化部分に取り込むことによって、複数同時発生的な部位の標的化を可能にする。デンドリマー標的化部分（酵素にカップリングする前）は、好ましくは、ペンタエリトリトールに由来する単純な分枝を有するメタンチオスルホネート、例えば：
【０１２９】
【化１】
0005180417.tif 000009
図１に例示されているような非常に複雑な分枝デンドリマー試薬までを含む。高度に分枝した分枝またはデントリマーは１９７８年にＶｏｇｔｌｅによって最初に合成された（Ｂｕｈｌｅｉｅｒら、１９７８、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１７８）。中心核に対して多岐部位を含む同一のビルディングブロックの付着は、高度の均質性および制御を用いて成され得る。それぞれの分枝は官能基を含んでいるが、化学変化の後に、なお別の分枝ビルディングブロックに連結され得る。この様式において、分枝化の層ごとに迅速に高度に機能化した分子を生成する（Ｂｏｓｍａｎら、１９９９、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９９：１６６５−１６８８）。
【０１３０】
（Ｄ  他の多方面にわたるリガンドの標的化）
本明細書中で提供された教示を用いて、本発明のキメラ分子による標的化のための広範な種々の他の部分は、当業者に明らかである。例えば、本明細書中に記載された再指向された酵素は、種々の薬物送達ストラテジーにおいて使用され得る。標的化部分は特定の細胞種または組織（例えば、癌細胞）に特異的に結合するように指向され得る。酵素成分は、不活性型（例えば、無毒性プロドラッグ）を活性化型（例えば、サイトトキシン）に転換する活性から選択され得る。本発明の再標的化された酵素は、従って、キメラ分子によって結合された細胞に対するプロドラッグ／ドラッグの活性を局在化する。多数の細胞特異的マーカーが当業者に公知である。これらには、ＬｅｗｉｓＹ抗原（腫瘍細胞）、Ｇ２５０抗原（腎臓細胞癌細胞）、ＩＬ−１３レセプター（腫瘍細胞）などが含まれるが、それらに限定されない。この適用での使用のための適切な酵素の一つの例は、チミジンキナーゼである（例えば、Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）またはＶａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒチミジンキナーゼ（ＶＺＶＴＫ））。チミジンキナーゼは、抗ウイルスヌクレオシドアナログをその活性型に代謝する際に補助し、従って、ヌクレオシドアナログ前駆体（例えば、ＡＺＴまたはｄｄＣ）をそれらの活性型に活性化する際に有用である。さらにｔｋ含有細胞はガンシクロビル（ｇａｎｃｌｏｖｉｒ）と接触させた場合に死滅する。
【０１３１】
従って、１つの実施形態では、本発明の再指向された酵素はチミジンキナーゼ標的になり得る、例えば、ＣＣＲ５レセプターおよび／またはＣＣＲ３レセプターを発現する細胞に対して（および従ってＨＩＶ感染に対して感受性となる傾向にある）。これらの細胞に対するｔｋ再指向は、ＡＺＴまたはｄｄＣの前駆体を活性型に活性化させる。
【０１３２】
別の実施形態では、ｔｋ酵素は腫瘍細胞を標的し得る（例えば、腫瘍特異的抗原を介して）。次いで、ガンシクロビルの治療は腫瘍細胞の死を生じる。
【０１３３】
本発明の再標的された酵素を用いて活性型へと転換され得る他のプロドラッグの例には、５−ＦＵまたはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）のインヒビター（ＧＷ７７６Ｃ８５）を含むが、それらに限定されない。
【０１３４】
さらに別の例は、プロドラッグホスフェニトイン（比較的溶解しやすいプロドラッグ）であり、これはホスファターゼによって比較的不溶性のフェニトイン（活性な鎮痙薬に変化される。同様に、デピベフリン（ｄｅｐｉｖｅｆｒｉｎ）はエステラーゼによって、アドレナリン作用性の、緑内障の治療において有用なエピネフィリンに転換される。
【０１３５】
本発明の再標的化した酵素はまた、特にインビボの治療剤として利用される場合、「自己防衛」のポリペプチドとして作用する。そのような実施形態では、キメラ分子の有機分子（例えば、標的化部分）の構成成分は、キメラ分子のエフェクター（酵素）成分を立体的に遮蔽しかつ保護し得る。この考えは、キメラ分子の重要な位置の近くに付着したかさ高い基が、例えば、キメラの残りの切断部位上での別の試薬の攻撃を妨げて、従って寿命が延びるということである。例えば、タンパク質の糖はプロテイナーゼに対する安定性を増加させ、例えば、糖が阻害するので、そのプロテイナーゼは好ましいアミド結合に裂け目を切断できない（例えば、Ｒｕｄｄら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：１７−２２を参照のこと）。特定の実施形態においては、有機分子は防御的機能だけでなく機能性を標的化することの両方を提供する「２つの任務」を行ない得る。
【０１３６】
さらに別の実施形態においては、本発明の再標的化酵素は酵素置換治療で、特に、蓄積症の治療において、利用され得る。蓄積病は、代謝産物を分解させる酵素の不活性または代謝産物を創造する酵素の過度の活性のいずれかに起因して、代謝産物（例えば、脂質、タンパク質、複雑な炭化水素）の増加した蓄積によって起こる。蓄積症には、グリコーゲン蓄積病Ｉ、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）、ＭＰＳ  ＩＶ  Ｂ（Ｍｏｒｑｕｉｏ  Ｂ）、ＧＭ２ガングリオシドーシス（Ｏ，Ｂ，ＡＢ，Ｂ１改変体）、ニーマン−ピック病（Ａ，ＢおよびＣ）、異染性白質萎縮症（アリールスルファターゼＡおよびＳＡＰ−１欠損）、クラッベ病、ファブリー病、ゴシェ病、ウォルマン病（コレストロールエステル蓄積症）、ＭＰＳＩ（ハーラーおよびシェイエ症候群）、ＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳＩＩＩＡ，Ｃ，およびＤ（サンフィリポＡ，ＣおよびＤ）、ＰＳＩＩＩＢ（サンフィリポＢ）、ＭＰＳＩＶ  Ａ（モルキオＡ）、ＭＰＳＶＩ（マロトー−ラミー症候群）、ＭＰＳＶＩＩ（β−グルクロニダーゼ欠損）、多発性スルファターゼ欠損症、ムコリピドーシスＩ（シアリドーシス）、ムコリピドシスＩＩおよびＩＩＩ、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、フコース蓄積症、シアリン酸蓄積症、ガラクトシアリドーシス、アスパチルグリコサミン尿シスチン症が含まれるがこれらに限定されない。蓄積症は、「失われた」酵素活性を補充することによって処置され得る。
【０１３７】
例えば、ゴシェ病は脾臓細胞に指向したグルコセレブロシダーゼの使用によって治療され得る。同様にスーパーオキシドジスムターゼは抗酸化剤などとして肝臓に指向され得る。
【０１３８】
（ＩＩＩ．酵素の選択（エフェクター分子））
事実上どの酵素も本発明のキメラ分子中で利用され得る。キメラ分子が触媒性アンタゴニストである場合、酵素は標的化部分によって特異的に結合される基質を分解する能力のある酵素から選択される。そのような酵素にはプロテアーゼ、セルラーゼ、ヌクレアーゼ（エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ）、アミラーゼ、リパーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼなどを含むがそれらに限定されない。
【０１３９】
キメラ分子が、その活性が新しい場所および／または基質に指向される酵素である場合、酵素はその基質を分解する酵素であり得るが、必ずしもそうである必要はない。このように、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヌクレアーゼ（エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ）、アミラーゼ、リパーゼ、アルドラーゼ、ケトラーゼ、グリコシダーゼなどに加えて、再指向された酵素もまた、例えば、イソメラーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼなどの酵素を含み得る。
【０１４０】
本発明の触媒性アンタゴニスト中での使用のために好ましい酵素は、ヒドロラーゼである。本発明の触媒性アンタゴニスト中での使用のために特に好ましい酵素は、セリンヒドロラーゼである。セリンヒドロラーゼは、ヒドロラーゼの１種であり、セリン、ヒスチジンおよびカルボキシル基の付いたアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれか）からなる触媒性の三つ組構造を有するヒドロラーゼによって特徴付けられる。この酵素はカルボン酸の誘導体（エステル、ペプチドおよびアミドを含むがそれに限定されない）の加水分解およびその微視的な逆反応をも触媒する。
【０１４１】
本発明に含有される好ましいセリンヒドロラーゼには、トリプシン−キモトリプシンプロテアーゼ、サブチリシンプロテアーゼおよびα／βヒドロラーゼを含まれる。特に好ましい実施形態では、酵素はプロテアーゼであり、より好ましくはサブチリシンである（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｓのサブチリシン）。サブチリシンはセリンエンドプロテアーゼ（分子量約２７，５００）であり、これは、広範な種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種から大量に分泌される。サブスチリシンのタンパク質配列を少なくとも４つの異なるＢａｃｉｌｌｕｓ種から決定した（例えば、Ｍａｒｋｌａｎｄら（１９７１）５６１−６０８頁、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｂｏｙｅｒ  Ｐ．Ｄ．編、Ａｃａｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第ＩＩＩ巻、頁；Ｎｅｄｋｏｖら（１９８３）Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６４：１５３７−１５４０を参照のこと）。サブスチリシンＢＰＮ’（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｇｏｅｆａｃｉｅｎｓ由来）の２．５Åの分解能までの三次元結晶解析構造もまた報告されている（Ｗｒｉｇｈｔら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２１、２３５−２４２；Ｄｒｅｎｔｈら（１９７２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７−１８１）。これらの研究は、サブスチリシンは遺伝的に哺乳動物のセリンプロテアーゼには関係していないが、同様の活性部位構造を有することを示す。共有結合したペプチドインヒビター（Ｒｏｂｅｒｔｕｓら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：２４３９−２４４９）、生成物複合体（Ｒｏｂｅｒｔｕｓら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：４２９３−４３０３）および遷移状態アナログ（Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：７１２０−７１２６；Ｐｏｕｌｏｓら（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１、１０９７−１１０３）を含有する、報告されたサブスチリシンのＸ線結晶構造はまた、サブスチリシンの活性部位および推定の基質結合裂溝（ｃｌｅｆｔ）に関しての情報を提供してきた。さらに、サブスチリシンの２２２番目のメチオニンの側鎖が過酸化水素によってメチオニンスルホキシドに転換されたという少なくとも１つの報告（Ｓｔａｕｆｆｅｒら（１９６５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：５３３３−５３３８）と同様に、サブスチリシンに関する多数の反応速度論的研究および化学修飾的研究が報告されてきた（Ｐｈｉｌｉｐｐら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：５−３２；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ（１９７６）Ｃａｒｌｓｂｅｒａ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４１：２３７−２９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ，同書）。
【０１４２】
本発明における他の特に好ましいヒドロラーゼの使用は、α／βヒドロラーゼ、セリンヒドロラーゼ酵素のトリプシン／キモトリプシンファミリー、アスパルチルプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、リゾチーム、および他のグリコシダーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
（ＩＶ．キメラ分子の構築）
好ましい実施形態において、キメラの触媒性アンタゴニストおよび／または本発明の再指向された酵素は、所望の酵素を化学的に標的化部分に結合体化することによって（直接的にまたはリンカーを介して）作製した。化学的に結合体化したキメラ分子を調製するための多数の方法が知られているが（例えば、欧州特許出願番号１８８、２５６号；米国特許第４，６７１，９５８；同第４，６５９，８３９号；同第４，４１４，１４８号；同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；同第４，５８９，０７１号；同第４，５４５，９８５号；および同第４，８９４，４４３号；Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：４０７１−４０７５；Ｔｈｏｒｐｅら（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔ，Ｔｈｏｒｐｅら（１９８２）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１６８−１９０頁；Ｗａｌｄｍａｎｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７などを参照のこと）、好ましい実施形態において、酵素を含有するアミノ酸残基上の利用可能なＲ基（例えば、ＮＨ2、Ｎ、ＮＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＨなど）と反応し得る反応基を用いて、標的化部分を誘導体化／機能化した。特に好ましい実施形態において、標的化部分は、メタンチオスルホネート試薬として誘導体化され、これは、次いで、システインのＳＨ基と反応して、システイン上のチオール水素の代わりにカップリングされた標的化部分を提供し得る。連結は直接的にまたはリンカー介してであり得る。
【０１４４】
特定の実施形態において、標的化部分が付着するシステインは、酵素中のネイティブなシステインであるが、しかし、より好ましい実施形態では、このシステインは、酵素中で異なるネイティブなアミノ酸残基の代わりに置換されたシステインである。このように修飾された酵素は、必要に応じて、変異体酵素といわれる。標的化部分が化学的に変異体酵素にカップリングされた本発明のキメラ分子は、必要に応じて、化学的修飾変異体（ＣＭＭ）といわれる。
【０１４５】
代表的には、一旦連結されるべき標的化部分と酵素が選択されると、例えば、上記のように、標的化部分の付着のための酵素の中の位置（残基）が同定される。この残基がすでにシステインではないところでは、システインはネイティブな残基と置換される。標的化部分またはそこに付着するリンカーは、メタンチオスルホメートとして誘導体化され、これは、次いで、本明細書中に記載されるように、システインのＳＨ基と反応し得る。変異体酵素の調製および標的化部分のカップリングについての詳細なプロトコールは、以下および実施例中に提供された。
【０１４６】
（Ａ）化学修飾変異体酵素の生成）
（１）修飾残基の選択）
概して、修飾が対象酵素の活性の望ましいレベルを保持している限り、酵素の事実上どの残基も、標的化部分を誘導するための突然変異誘発（例えば、システインの置換）および化学修飾のために選択され得る。代表的には、このことは、決定的な基質相互作用をブロックしないかまたは対象酵素のフォールディング／コンホメーションを劇的に変化させない位置での置換を行なうことによって達成される。
【０１４７】
標的化部分の導入のための適当な部位は、置換システイン、そして必要に応じて、付着した標的化部分、および所望の活性の酵素をアッセイすることによって決定され得る。コンビナトリアル化学および高処理能力スクリーニングシステムにおける現在の進歩によって、そのような修飾およびスクリーニングは、単なる慣用的な実験によって達成され得る。
【０１４８】
しかしより好ましい実施形態では、酵素中（例えば、セリンヒドロラーゼ）の修飾／置換のための残基は合理的に選択される。好ましい部位は、酵素のサブ部位から離れて配置した領域および部位を決定する、重要なコンホメーションにはない、部位を含む。しかし、他の好ましい実施形態において、特に基質特異性および／または活性を強化するかまたはさもなくば変化させることが望まれる場合、修飾のために選択された好ましいアミノ酸残基は、酵素の基質結合領域の近くまたはその中の重要な差別的部位であることが予想される残基を含む。そのような残基は、サブ部位残基が系統的に変異誘発され、そしてそのような変異誘発の結合特異性および／または酵素活性に対する効果が決定される、変異誘発実験から決定される。さらに、酵素単独、または基質、基質複合体、もしくはインヒビターとの複合体中での結晶構造の調査から、および／あるいは予測されるタンパク質の折りたたみまたは、タンパク質モデリングソフトウェア（例えば、Ｑｕａｎｔａ，Ｃｅｒｉｕｓ，Ｉｎｓｉｇｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）およびＦｒｏｄｏ（ａｃａｄｅｍｉｃ  ｓｏｆｔｗｅｒｅ））を用いて決定したタンパク質−タンパク質相互作用から、重要な残基を同定し得る。ＢｅｒｇｅｒおよびＳｃｈｅｃｈｔｅｒによって定義されたサブ部位での相互作用を変化させるように配置された側鎖は、酵素の結晶学的モデルに基づいて選択され得、必要であれば、特定の酵素の構造の情報が入手できない場合に、相同な酵素が外挿され得る。Ｂ．ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンにおいて、部位６２、部位１５６、部位１６６、部位２１７、および部位２２２は重要な基質特異性を決定する部位である。さらなる関連部位は、サブチリシンの位置９６，位置１０４、位置１０７、位置１８９、および位置２０９部分を含み、関連酵素での相同位置を含む。好ましい実施形態において、特定の場合において、他のサブ部位の残基の変化はまた劇的な効果を生じ得ることが理解されるが、このような残基は、代表的には、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ４、Ｓ１’、Ｓ２’、またはＳ３’サブ部位に存在する。
【０１４９】
１つの特に好ましい実施形態において、そこではセリンヒドロラーゼはサブチリシン型セリンヒドロラーゼであり、変異のために好ましい残基は、Ｓ１サブ部位の残基１５６および残基１６６、Ｓ１’サブ部位の残基２１７および残基２２２、Ｓ２サブ部位の残基６２、ならびに、Ｌｅｕ９６、Ｖａｌ１０４、Ｉｌｅ１０７、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２０９または他のサブチリシン型セリンプロテナーゼの相同位置またはその近傍の残基（好ましくはサブ部位中の位置）を含むがこれらに限定されない。
【０１５０】
他の好ましい実施形態としては、そこではセリンヒドロラーゼはトリプシン−キモトリプシン型セリンヒドロラーゼであり、変異に好まれる残基は、トリプシン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ｅｎｔｒｙ  １ＴＰＰ）のチロシン９４、ロイシン９９、グルタミン１７５、アスパラギン１８９、セリン１９０、グルタミン１９２、ロイシン１１１、フェニルアラニン１７５、チロシン１７６、セリン１８２、ロイシン１８４、フェニルアラニン１８９、チロシン２１４、アスパラギン酸２３１、リシン２３４、およびイソロイシン２４３、または他のキモトリプシン型（トリプシン−キモトリプシン型）セリンプロテナーゼの相同部位またはその近くの残基（好ましくはサブ部位中の部位）、を含むがそれらに限定されない。
【０１５１】
さらに別の好ましい実施形態において、そこではセリンヒドロラーゼがα／βセリンヒドロラーゼであり、変異のために好ましい残基は、次の残基またはその近くを含むがそれに限定されない：トリプシン１０４、スレオニン１３４、ロイシン１４４、バリン１５４、イソロイシン１８９、アラニン２２５、ロイシン２７８およびイソロイシン１８５、ここでこれらはＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｉｃａリパーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  Ｅｎｔｒｙ  １ｔｃａ）の残基またはα／β型セリンヒドロラーゼの相同位置（好ましくは、サブ部位中の位置）の残基である。
【０１５２】
好ましくは、システインによって置換された酵素中のアミノ酸はアスパラギン、ロイシン、メチオニン、またはセリンから成る群より選択される。より好ましくは、置換されるアミノ酸は、酵素のサブ部位（好ましくは、Ｓ１，Ｓ１’またはＳ２サブ部位）にまたはその近くに存在する。より好ましくは、サブチリシン中の置換されるアミノ酸は、Ｎ６２、Ｌ２１７、Ｍ２２２、Ｓ１５６、Ｓ１６６、部位１０４、部位１０７（Ｓ４）、部位９６（Ｓ２）、部位１８９（Ｓ２’）および部位２０９（Ｓ１’／Ｓ３’）またはそれらのホモログであり、ここで数字のついた位置は、Ｂａｃｉｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから天然に生じるサブチリシンに、または例えばＢａｃｉｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓのサブチリシンのような他のサブチリシンの等価なアミノ酸残基に対応する。
【０１５３】
本発明のキメラ分子は、セリンヒドロラーゼに限られるものではない。特に好ましい実施形態では、他の酵素に加えて、本発明は他のキメラプロテナーゼを含む。そのようなプロテナーゼはアスパチルプロテナーゼ、システインプロテナーゼ、メタロプロテナーゼなどを含むが、それらに制限されない。
【０１５４】
プロテアーゼが、例えば、ペプシンなどのアスパチルプロテナーゼであるときは、好ましい残基は、次の残基またはその残基の近くに相当するアミノ酸（例えば、相同する部位で）を含むがそれに限定されない。チロシン９、メチオニン１２、グルタミン１３、グリシン７６、スレオニン７７、フェニルアラニン１１１、フェニルアラニン１１７、セリン１２７、イソロイシン１２８、セリン１３０、チロシン１８９、イソロイシン２１３、グルタミン酸２３９、メチオニン２４５、グルタミン２８７、メチオニン２８９、アスパラギン２９０、ロイシン２９１、およびグルタミン酸２９４。ここではこれらの「参照」の残基は成熟したヒトのペプシンの残基である（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＰＳＮ）。
【０１５５】
プロテアーゼが、システインプロテナーゼであるときは、変異に好ましい残基は、次の残基または近くの残基に相当するアミノ酸（例えば、相同する部位で）を含むがそれに限定されない。アスパラギン１８、セリン２１、アスパラギン６４、チロシン６７、トリプシン６９、グルタミン１１２、グルタミン１４２、アスパラギン酸１５８、トリプシン１７７およびフェニルアラニン２０７。ここでは、これらの参照残基は成熟したパパインの残基である（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  １ＢＱＩ）。
【０１５６】
プロテアーゼが、メタロプロテナーゼであるときは、変異に好ましい残基は、次の残基または近くの残基に相当するアミノ酸（例えば、相同する部位で）を含むがそれに限定されない。ロイシン１１１、フェニルアラニン１７５、チロシン１７６、セリン１８２、ロイシン１８４、フェニルアラニン１８９、チロシン２１４、アスパラギン酸２３１、リシン２３４およびイソロイシン２４３。ここではこれらの「参照」の残基は成熟したヒト基質メタロプロテナーゼの残基である（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  ８３０Ｃ）。
【０１５７】
（２）システインの導入）
酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ）の１以上の本来の残基をシステインと交換することは、当業者に周知の慣用的な方法を用いて、なされ得る。１つの好ましい実施形態では、本明細書中に記載される変異体は、目的の野生型の酵素をコードするＤＮＡの部位特異的変異誘発によって最も効率的に調製された（例えば、Ｂａｔｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｓサブチリシン）。部位特異的変異誘発または非ランダム変異誘発は、当業者に公知である。そのような方法は、アラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１０８１−１０８５）、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発（Ａｄｅｌｌｍａｎら、１９８３、ＤＮＡ、２，１８３）、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｅｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ，３４４：３１５）および結合変異誘発（Ｌａｎｄｎｅｒら、ＷＯ  ８８／０６６３０）を含むがそれに限定されない。
【０１５８】
本発明の１つの実施形態では、置換したアミノ酸残基（例えば、システイン）を、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、オリゴヌクレオチド媒介変異誘発によって、選択した位置へ導入した。このアプローチでは、所望のネイティブな酵素（例えば、サブチリシン）をコードした遺伝子は適切なプラスミドによって運搬される。さらに好ましくは、プラスミドは発現ベクターである（例えば、ｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、ｐＥＴ、ｐＨＹ４のシリーズからのプラスミド）。プラスミドは当業者によって、利便性のためまたは所望通りに選択され得る。
【０１５９】
部位特異的変異誘発のために、選択した変異部位を含むフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによって対象酵素をコードした遺伝子から切断して、修飾ＰＣＲ法における鋳型として使用する（Ｈｉｇｕｃｔｉら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，７３５１−７３６７を参照のこと）。各標的置換のために所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを、５’および３’ＰＣＲ隣接プライマー間の鎖伸長を開始するために、ミスマッチプライマーとして使用した。この方法は２つのＰＣＲ反応を含んでいる。最初のＰＣＲでは所望の塩基置換を含むＤＮＡフラグメントを生成するために、ミスマッチプライマーおよび５’プライマーを使用した。このフラグメントを電気泳動によって、プライマーから分離した。精製後、所望の塩基置換を含む完全なＤＮＡ画分を生成するために、新しい５’プライマーとして、２回目のＰＣＲで、３’プライマーと一緒に使用した。変異を配列決定によって確認した後、次いで、変異フラグメントをもともとのフラグメントの位置に挿入して戻した。
【０１６０】
別のアプローチにおいて、カセット変異誘発が、本発明のシステイン変異の構築および確認を容易にするために使用され得る。まず、セリンヒドロラーゼをコードした遺伝子を獲得し、全体または一部を配列決定した。次いで、発現された酵素での１以上のアミノ酸の変異を作製することが望まれしい点を同定する。遺伝子の短いセグメントを、発現される場合に所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドと置換するための制限部位の存在のために、これらの点に隣接する配列を評価する。そのような制限部位は、好ましくはセリンヒドロラーゼ遺伝子中にある、遺伝子断片の置換を容易にするための独特な部位である。しかし、制限消化によって生成した遺伝子フラグメントは適切な配列で再び組み立てられ得るならば、ヒドロラーゼ遺伝子において過度に重複しない任意の便利な制限部分が用いられ得る。もし制限部位が選択された点から便利な距離内の位置に存在しない場合（例えば、１０〜１５ヌクレオチド）、そのような部位は、最終構築で読み枠およびコードアミノ酸のどちらも変化しないようなやり方で、遺伝子のヌクレオチドを置換することによって生成される。適切な隣接領域の位置を決定すること、および２つの便利な制限部位配列に到達するための必要な変化を評価する仕事は、余剰な遺伝子コード、遺伝子の制限酵素地図および多くの異なる制限酵素によって、慣用的に行なわれる。もし便利な隣接制限部位が利用可能である場合、上記の方法は、部位を含んでいない隣接領域と関連においてのみ、使用される必要がある。
【０１６１】
所望の配列に一致させるためにその配列を変化させるために、遺伝子の変異を行なった。例えば、一般的に周知の方法に従って、Ｍ１３プライマー伸長をおこなった。一旦遺伝子がクローニングされると、変異される配列に隣接する制限部位を同種の制限酵素で消化し、エンド終末相補性オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子に連結した。突然変異生成は、この方法によって大いに単純化された。なぜなら、全てのオリゴヌクレオチドは同じ制限部位を有するように合成され得ること、および制限部分を作製するのにどの合成リンカーも必要がないからである。
【０１６２】
適当なＤＮＡ配列コンピューター検索プログラムは、潜在的な５’および３’の便利な隣接部位を発見する仕事を単純化する。より望ましい実施形態において、制限部位の作製において導入されるどの変異でも最終構造のアミノ酸コード配列に対して、影響がない（ｓｉｌｅｎｔ）。標的コドンの５’側の制限部位の候補としては、配列は、好ましくは、候補酵素の切断の５’側の認識配列の１つを除く、少なくとも全てのヌクレオチドを含む遺伝子の中に存在する。例えば、平滑切断の酵素ＳｍａＩ（ＣＣＣ／ＧＧＧ）は、もし近くの５’側配列がＮＣＣ、ＣＮＣまたはＣＣＮを含んでいれば、良好な５’側候補となる。さらに、もしＮがＣに代えられる必要がある場合、この変化は好ましくは、アミノ酸配列をインタクトに保つ。制限部分を導入するのに、永続的にサイレントな変異が必要な場合において、滅多に使用されないコドンの導入は避けたほうが良い。同様の状況のＳｍａＩが、ＮＧＧ、ＧＮＧまたはＧＧＮ配列が存在しなければならないという点を除き、３’側側面部位に適用し得る。候補酵素の位置決定のための判断基準は、平滑切断の酵素で最も緩く、４塩基突出酵素は最も厳しい。概して、多くの候補部位が手に入る。
【０１６３】
特に好ましい、目的酵素にシステイン変異を導入する方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ（ＳＢＬ）のサブチリシン遺伝子に関して例示されている。好ましい実施形態では、ＳＢＬ遺伝子を変異誘発（例えば、米国特許５，１８５，２５８号を参照のこと）のためにバクテリオファージベクター（例えば、Ｍ１３ｍｐ１９ベクター）にクローニングした。オリゴヌクレオチド指向変異誘発をＺｏｌｌｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１００：４６８−５００に記載された方法に従って行なった。変異配列を、次いでクローニングし、切断し、そして、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ宿主の発現プラスミド（例えば、プラスミドＧＧ２７４）に再導入した。ＰＥＧ（５０％）を安定剤として加えた。
【０１６４】
このように得られた粗タンパク質濃縮物を、小さい分子量のコンタミナントを除去するために、ｐＨ  ５．２緩衝液（例えば、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５ｍＭ  ＣａＣｌ2）を用いてＳｅｐｈａｄｅｘTMＧ−２５  ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘを通して純化した。ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎからの集めた画分を次いで、上に記載の酢酸ナトリウム緩衝液中の強陽イオン交換コラム（例えば、ＳＰ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMＦＦ）にアプライし、ＳＢＬをもう１段階の勾配０−２００ｍＭ  塩化ナトリウム酢酸緩衝液ｐＨ  ５．２で溶解した。塩を含まない酵素粉末を、次の溶解液のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ純水に対する透析および後に凍結乾燥して得た。
【０１６５】
変異型および野生型酵素の純度は、０℃、３０分間、０．１Ｍ  ＨＣｌでインキュベートすることによって変性させ、均一ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確かめた（例えば、ＰｈａｓｔTMｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。ＳＢＬの濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８−２５４に基づいたＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）色素試薬キットを用いて決定した。酵素の比活性を以下および実施例中に記載されたように決定した。当業者は、必要であれば、上記のプロトコルを他の酵素との使用のために慣用的に修飾し得ることを理解する。部位特異的なタンパク質修飾の他のプロトコルは当事者に周知であり、例えば、米国特許第５，９３２，４１９号および同第５，７８９，１６６号；同第５，７０５，４７９号；同第５，６３５，４７５号；同第５，５５６，７４７号；同第５，３５４，６７０号；同第５，３５２，７７９号；同第５，２８４，７６０号および同第５，０７１，７４３号に記載されている。
【０１６６】
さらに、部位特異的変異誘発のためのキットは市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｏｍｅｒTMＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｔｏｙｏｂｏを参照のこと）。
【０１６７】
（３）連結部分の最大活用）
シトシンの導入および標的化部分のカップリングのために、多数の特に好ましい部位が本明細書中に示される。位置は、「参照」酵素に関して示され、同じファミリー中の関連する酵素中の「相同の」部位（例えば、本明細書中に記載されたように）が決定され得る。しかし、特定の酵素のためのカップリング部位、標的化部分の組み合わせを最大化することが望ましくあり得る。
【０１６８】
本発明は、化学的にカップリングしたした標的化部分を利用するので、これは、比較的簡単に、最大で慣用的な実験で達成され得る。システインは、例えば、目的参照部位の近くの位置に、導入され、次いで、標的化部分を本明細書中で記載したように容易に結合体化され得る。得られたキメラは次いで、望ましい活性のために試験され得る。
【０１６９】
タンパク質全体はそれぞれの変化のために再操作する必要はない。なぜなら、特に好ましい部位はすでに本明細書中で教示されており、比較的少数の部位がどの特定のキメラ分子を最大化するのか検索しなければならない。
【０１７０】
（４）他の連結方法）
好ましい実施形態では、標的化部分の化学カップリングは、対象の酵素において天然に存在するかまたは導入されたか（例えば、部位特異的変異誘発によって）のいずれかで。システインに向けられたものである。しかし、本発明のキメラ分子はシステインを通して結合した分子に制限される必要はない。特定の実施形態において、結合は事実上どの他のアミノ酸を通してもし得る（例えば、セリン、グリシン、チロシンなど）。結合体化は、存在するＲ基（他のカップリング化学を用いて）を通してなされ得るか、または別のスルフヒドリル基（ＳＨ）がＲ基および標的化部分に導入され（連結され）得、例えば、実施例に例示されたように、メタンチオスルホネート試薬とてで誘導体化された標的化部分がカップリングされ得る。
【０１７１】
（５）変異酵素の発現）
好ましい実施形態では、変異酵素は宿主細胞の異種核酸より発現される。発現された酵素は、次いで単離され、必要であれば精製する。宿主細胞および発現ベクターの選択はかなり酵素の選択とその供給源にかなり依存する。
【０１７２】
有用な発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの安定した統合、または宿主細胞のゲノムから独立して宿主細胞中でのベクターの自律的複製を可能とする要素を含有しており、および好ましくは、形質転換した宿主細胞の容易な選択を可能にする１以上の表現型マーカーを含んでいる。発現ベクターはまた、プロモーター、リボソーム結合部分、翻訳開始シグナル、および必要に応じて、リプレッサー遺伝子、選択マーカーまたは種々のアクチベーター遺伝子コードする制御配列を含み得る。発現されたタンパク質の分泌を可能にするため、シグナル配列を含んだヌクレオチドが遺伝子のコード配列の前に挿入され得る。コントロール配列の向きでの発現のために、本発明に従って、使用される変異酵素をコードする遺伝子またはｃＤＮＡを、適切な読み枠のコントロール配列に作動可能なように連結した。
【０１７３】
部位特異的変異誘発によって得た変異遺伝子を含むベクターは、次いで、それぞれ適当な宿主細胞を形質転換し、発現するために使用した。適当な宿主細胞は例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓのような細菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなイースト菌、マウス線維芽細胞のような哺乳動物細胞または昆虫細胞を含む。好ましくは、細菌の発現系を用いる。最も好ましくは、宿主はＢａｃｉｌｌｕｓである。タンパク質の発現は、外来プラスミドの高レベル発現のために好ましい条件下で形質転換宿主細胞を培養するために、選択した宿主細胞および発現ベクターなどの要因に従って、当業者に周知の方法で行なう。
【０１７４】
ペプチドのクローニングおよび発現の方法は当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ（第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１７５】
上に示されたように、１つの特定の好ましい発現系は、プラスミドＧＧ２７４であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ宿主中で発現される。
【０１７６】
（Ｂ）標的化部分の酵素への結合）
（１）変異残基の修飾のための置換基の選択）
広範囲の標的化部分はシトシンに連結され、対象の酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ）に導入され得る。上に示されたように、標的化部分は酵素の望ましい使用に依存して選択される。さらに上に示されたように、適当な標的化部分は、レセプターによって結合された部分、抗体および酵素によって結合された標的化部分、レクチンによって結合された標的化部分、および種々の他の標的化部分を含むがそれに限定されない。特定の特に好ましい実施形態では、標的化部分は特異的にレセプターおよび／または酵素によって結合される薬剤およびプロドラッグである。
【０１７７】
（２）標的化部分のシステインへの結合）
システインのＲ基は便利な比較的反応性のあるチオール基（−ＳＨ）を提供し、望ましい標的化部分をシステインに連結させるのに利用される。より好ましい実施形態では、目的の標的化部分が提供され、メタンチオスルホネート試薬として誘導体化される。それはシステインと反応すると、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によってシステインに共有結合される目的の置換基を生じる。
【０１７８】
好ましい実施形態では、メタンチオスルホネート試薬を用いた化学修飾は、Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：５２６５−５２５５およびＤｅＳａｎｔｉｓら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：５９６８−５９７３によって記載されたように行なわれる。手短には、メタンチオスルホネート（ＭＴＳ）試薬の１Ｍ溶液を２００μＬの、７０ｍＭ  ＣＨＥＳ，５ｍＭ  ＭＥＳ，２ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ  ９．５中のシステイン変異体溶液（５−１０  ｍｇ／ｍＬ，３．５ｍＬ）に加えた。ＭＴＳ試薬は３０分間にわたって２分割して加えた。反応溶液は２０℃で、上下逆にして連続的に混合した。反応は次の比活性（例えば、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて）によって、または無残渣チオールの試験（例えば、Ｅｌｌｍａｎ試薬）によってモニターした。一旦反応が完了すると、反応液は、５ｍＭ  ＭＥＳおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ  ６．５を用いて、ＳｅｐｈａｄｅｘTMＰＤ−１０  Ｇ２５カラムにローディングした。タンパク質画分を次いで、１ｍＭ  ＣａＣｌ2に対して透析し、透析液を透析乾燥した。特に好ましい実施形態では、この画分はｐＨ  ６．５  ＭＥＳに対して透析され、次いで、瞬時に凍結を行う。
【０１７９】
特定の例では、システインに結合される標的化部分が反応基を負っているところでは、反応基は、結合の間、望まない反応を避けるために、適当な阻害／保護基で誘導体化され得る。同様に、セリンヒドロラーゼが１以上の誘導体化されていないシステインを含むときは、システインは他のアミノ酸（例えば、突然変異生成を標的とした部分を通って）と置換され、そして／またはこれらのシステインのチオール基は適当な保護基で誘導される（例えば、ベンジル、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ＭＯＭ、アセチル、チオカルボネート、チオカルバメートおよびその他の基）。阻害／保護基の使用は当業者にとって周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，１９９９，４５４−４９３頁を参照のこと）。
【０１８０】
特に好ましい実施形態では、システインは酵素に導入／置換されるが、ある実施形態では、他のアミノ酸（例えば、リシン、ヒスチジンなど）が導入され得、そしてある実施形態では、標的化部分はこれらの残基に結合し得る。
【０１８１】
多くの標的化部分の誘導体化およびそれらの変異体酵素への結合は、本明細書中に提供される実施例によって例示される。
【０１８２】
（Ｃ）望ましい活性のための化学的にキメラな分子のスクリーニング）
本発明のキメラ分子は典型的に、活性や目的の活性についてスクリーニングされる。目的の活性は、キメラ分子の望ましい使用に依存する。従って、例えば、本発明の触媒性アンタゴニストの場合では、キメラ分子は２つの機能でアッセイされる：１）標的の活性を減少させるかまたは除去する能力（例えば、標的が生物学的に活性な場合）、または、単純に部分的にまたは完全に標的を分解する能力（例えば、標的が生物学的に活性でない場合）；および２）標的が分解された後、標的から放出され、他の標的を分解する能力。あるいは、キメラ分子は、単に活性（例えば、分解を行なう能力）について、化学量論以下の様式でアッセイされ得る。
【０１８３】
特定のアッセイの詳細は、キメラ分子の標的によって変化する。種々の分子（例えば、タンパク質、炭水化物、核酸など）の分解および／または種々のレセプターおよび／または抗体の阻害のための多くのアッセイが当業者に周知である。例えば、ある実施形態では、細胞表面レセプター上の分子活性は、レセプターを発現する細胞を提供する工程、およびキメラ分子の存在下または非存在下でレセプターの活性をを測定することによって決定され得る。レセプターアッセイは、一般的に、対象のレセプターをコードするＲＮＡを組み込んだ卵母細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ）で行われる。レセプター活性は電子化学的活性の測定（例えば、パッチクランプを通してなど）、レセプター基質の取りこみ、などによってモニターされる。そのような方法は当業者に周知であり、例えば、Ｒａｃｋｅら（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３３（１，２）：１３２−１３６に詳細に記載されている。リガンド結合、酵素活性の変化などについてのアッセイもまた、当業者に周知である。さらに、多くの適切なアッセイが実施例に提供されている。
【０１８４】
（Ｖ．触媒性アンタゴニストおよび／または再方向付け（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）酵素の例示的な用途）
前述の考察から、本発明のキメラ分子の多数の適用／用途が当業者に明らかである。さらに、多数の特定の実施形態および適用が、標的化部分の考察において記載される。しかし、さらに例示するために、多数の特定の特に好ましい実施形態を以下で考察する。
【０１８５】
（（Ａ）標的化された破壊に基づく治療剤）
上記に示すように、本発明の触媒性アンタゴニストは、広範な数の病理において治療剤として用いられ得る。このような触媒性アンタゴニストとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルスの感染および／または複製のインヒビター、細菌の感染および／またはバイオフィルム形成のインヒビター、免疫応答のモジュレーター、自己免疫応答のモジュレーター、炎症応答のインヒビターなど。より一般的に、上記に示すように、本発明の触媒性アンタゴニストを用いて、薬剤がレセプターを阻害および／または拮抗することによって作用する場合、既存の薬剤を置換し得る。
【０１８６】
上記では、広範な種々の薬剤が、レセプターまたはレセプター媒介活性のアンタゴニストとして作用することが説明された。これらの薬剤は代表的に、特定のレセプターおよび／または酵素を特異的に結合する。本発明の触媒性アンタゴニストにおける、このような薬剤の、標的化部分としての使用は、これらが、標的のレセプターおよび／または酵素を分解する酵素（例えば、セリンヒドロラーゼ）に付着している場合、薬物を本質的に触媒性にする。従って、化学量論様式で作用する（単一の薬物分子が単一のレセプターをブロック／拮抗する）代わりに、触媒性アンタゴニストへと変換された場合、新たな薬物は、化学量論以下の様式（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）で作用する（単一の分子が、本質的に無限の数のレセプターを拮抗し得る）。さらに、薬物単独（ここで、このレセプターはしばしば、薬物が遊離された場合に活性を回復する）とは対照的に、本発明の触媒性アンタゴニストによって結合されたレセプターは、分解される（それゆえ、この触媒性アンタゴニストを遊離して別のレセプターへと作用させる）。このレセプターは分解されるので、このレセプターはその活性を回復しない。従って、この触媒性アンタゴニストは、より低い投与量でさらに高い効力を提供し、そして特定の投与量で、より長期に持続する活性を提供すると期待される。
【０１８７】
従って、１つの実施形態では、本発明は、薬物の活性を改善する方法を提供する。この方法は、薬物が結合する標的（例えば、レセプター）を分解し得る酵素へとこの薬物を付着させる工程を含む。この状況において好ましい酵素としては、ヒドロラーゼが挙げられ、さらにより好ましくは、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼなど）が挙げられる。
【０１８８】
しかし、標的化部分は薬物に制限される必要はないことが上記で説明された。広範な種々の他の標的化部分もまた適切であり、そして広範な種々の治療状況において有用な触媒性アンタゴニストを提供する。従って、例えば、１つの実施形態では、標的化部分は、通常、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）に見出される、ＣＣＲ５レセプターおよび／またはＣＸＣＲ２レセプターに特異的に結合する分子であり得る。ＣＣＲ５レセプターおよびＣＸＣＲ２レセプターはＨＩＶによる細胞の感染に関与し、そしてこれらのレセプターのうちの１以上が欠損したヒトは代表的に、ＨＩＶ感染に対する耐性を示す。例えば、適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）に付着されたＣＣＲ５特異的標的化剤および／またはＣＸＣＲ２特異的標的化剤を含む触媒性アンタゴニストによる、これらのレセプターのうちのいずれかまたは両方の標的化された破壊／阻害は、ＨＩＶ感染に対する標的細胞の耐性を増加させる。
【０１８９】
別の実施形態では、Ｎ結合型タンパク質グリコシル化に関与するグリコシダーゼは、適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着されて（例えば、Ａｚａ−糖標的化部分を用いて）特異的に標的化され得る。このような触媒性アンタゴニストは、ＨＩＶ、ヘルペス、他のウイルス、および種々の癌の処置において有用なものである。
【０１９０】
適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン、ペプシンなど）に付着された糖標的化部分を含む触媒性アンタゴニストは、広範な種々の状態（炎症応答（例えば、関節炎、敗血症性ショック、心筋梗塞などに関連する）、細胞に対する細菌結合およびその後の感染（例えば、潰瘍に関連するＨ．ｐｙｌｏｒｉ感染）を含む）の処置において有用である。標的化部分がＧａｌα（１，４）Ｇａｌである場合、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ感染がブロックされ得る。さらに、レクチン指向性触媒性アンタゴニストを用いて、バイオフィルム形成をインビボまたはエキソビボで阻害し得る。
【０１９１】
なお別の実施形態では、標的化部分は、シアル酸糖（または模倣物（例えば、Ｒｉｌｅｎｚａ（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ））など）であり得る。適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）に付着された場合、触媒性アンタゴニストは、ウイルス（例えば、インフルエンザ）のシアリダーゼ活性を特異的に標的化し得る。
【０１９２】
本発明のキメラ触媒性アンタゴニストをまた用いて、過剰増殖性細胞および／または侵襲性細胞（例えば、転移細胞）を特異的に標的化し得る。種々の酵素（例えば、特に、マトリックスメタロプロテアーゼ）は、侵襲性細胞において非常に活性が高いことが公知である。これらの酵素は、多数の標的化部分（例えば、クラウンエーテル）を用いて特異的に標的化され得る。適切なヒドロラーゼ（例えば、サブチリシン）に付着された場合、触媒性アンタゴニストは、標的酵素（例えば、メタロプロテアーゼ）を分解し、それにより、細胞が、例えば、基底膜を侵襲する能力を妨害または除去し、それによって癌の進行を遅くする。
【０１９３】
本発明の触媒性アンタゴニストをまた用いて、種々の免疫プロセスを標的化および変更し得る。従って、例えば、異種移植由来のＭＨＣ複合体を用いることによって、例えば、Ｔ細胞レセプターに指向された標的を用いて、その抗原に対して指向された免疫応答を開始する免疫細胞を阻害することが可能である。関連の実施形態では、α−Ｇａｌエピトープ二糖（Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ）を標的化部分として用い得、そして（例えば、サブチリシンに付着された場合）α−Ｇａｌエピトープ特異的抗体に結合してこの抗体を特異的に阻害し、それによって異種移植片の宿主拒絶を緩和し得る。同様に、公知のアレルゲン（例えば、種々の花粉またはこのようなアレルゲンに存在するエピトープ）は、標的に対する標的化部分として用いられ得、このような抗原を特異的に認識するＴ細胞および／または抗体を阻害し得る。このことは、このようなアレルゲンに対するアレルギー反応を緩和する。
【０１９４】
（（Ｂ）薬物送達ストラテジー）
上記で示したように、キメラ分子は、種々の薬物送達ストラテジーにおいて用いられて、治療的活性を目的の細胞、器官または組織に特異的に標的化し得る。特定の実施形態では、上記のように、プロドラッグをそれらの活性な形態へと変換し得る酵素は、これらの酵素を所望の活性部位（例えば、腫瘍細胞）へと局在させる標的化部分（例えば、腫瘍細胞特異的部分）へと付着され、種々のプロドラッグが当業者に公知であり、そしてこれらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：チミジンキナーゼによって活性化されるガンシクロビル、ホスファターゼによってフェニトインへと変換されるホスフェニトイン（ｐｈｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、エステラーゼによってエピネフリンへと変換されるデピベフリン（ｄｅｐｉｖｅｆｒｉｎ）など。
【０１９５】
別の例の「薬物送達」ストラテジーは、存在しない、代表的には内因性活性を補充する活性を有する酵素を送達するために標的化キメラ分子を使用する。従って、例えば、グルコセレブロシダーゼが、ゴシェ病またはテイ−サックス病の処置において例えば、脾細胞に対して指向され得る。同様に、スーパーオキシドジスムターゼは、肝組織へと標的化されてそこで抗酸化活性を提供し得るように、肝細胞特異的標的化部分へと付着され得る。
【０１９６】
（（Ｃ）他の実施形態）
他の特に好ましい実施形態では、本発明のキメラ分子を用いて、予め選択した特定の分子を、その分子が生物学的活性を有そうが有さまいが、標的化および破壊し得る。従って、例えば、種々の土壌またはよごれ（ｓｔａｉｎ）の成分（例えば、乳汁、血液、卵、ガラスよごれ、油よごれなど）が特異的に標的化され得る。例えば、アビジン／卵タンパク質は、例えば、その部位へとプロテアーゼを特異的に指向させるためにビオチンを標的化部分として用いることによって特異的に標的化され得る。このよごれは、分解／消化され、それにより、基礎となる基質から遊離される。このような特異的標的化キメラは、種々の洗浄処方物において格別である。
【０１９７】
（ＶＩ．薬学的処方物）
本発明の治療的キメラ分子（例えば、治療的触媒性アンタゴニスト）は、静脈内投与、非経口投与、局所投与、経口投与、または（例えば、エアゾールまたは経皮による）局部投与に有用である。特に好ましい投与形態としては、動脈内注射、より好ましくは腹腔内肝臓動脈内注射、または脳へと組成物を送達することが所望される場合（例えば、脳腫瘍の処置のため）、頸動脈または頸動脈系の動脈（例えば、後頭動脈、耳介動脈、側頭動脈、大脳動脈、顎動脈など）が挙げられる。キメラ分子は代表的に、薬学的に受容可能なキャリア（賦形剤）と合わされて、薬理学的組成物を形成する。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、組成物を安定化するように作用するか、または薬剤の吸収を増加もしくは減少させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物を含み得る。生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、以下が挙げられ得る：炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、抗有糸分裂剤のクリアランスもしくは加水分解を減少させる組成物、または賦形剤もしくは他の安定剤および／もしくは緩衝剤。
【０１９８】
他の生理学的に受容可能な化合物としては、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または微生物の増殖もしくは作用を妨げるために特に有用である保存剤が挙げられる。種々の保存剤が周知であり、そしてこれらとしては、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理学的に受容可能な化合物を含む、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、例えば、キメラ分子の投与経路およびその薬剤の特定の物理化学的特徴に依存することを認識する。
【０１９９】
薬学的組成物は、投与方法に依存して種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位投薬形態としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤および菓子錠剤が挙げられる。経口投与される場合、キメラ分子は、好ましくは、消化から保護されることが認識される。これは代表的に、対象分子を組成物と複合体化してこの分子を酸性および酵素的加水分解に耐性にすることによるか、またはキメラ分子薬剤を適切な耐性キャリア（例えば、リポソーム）中にパッケージングすることによるかのいずれかによって達成される。消化から化合物を防御する手段は当該分野で周知である（例えば、治療的薬剤の経口送達のための脂質組成物を記載する米国特許第５，３９１，３７７号を参照のこと）。
【０２００】
本発明の特定のキメラ分子は、水溶液中にごくわずかに可溶性であり得る。好ましい実施形態では、これらの組成物は、所望の部位へと直接送達される（例えば、外科手順の間の注射、カニューレ挿入または直接適用による）か、これらは受容可能な賦形剤中に可溶化されるかのいずれかである。
【０２０１】
本発明の薬学的組成物は、薬剤を例えば、外科的創傷に局所投与して、初期腫瘍、新生物性および転移性の細胞ならびにそれらの前駆体を処置するために有用である。別の実施形態では、この組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与または体腔もしくは器官腔への投与）のために有用である。投与のための組成物は通常、薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、水溶性キメラ分子についての水性キャリア）に溶解されたキメラ分子薬剤の溶液を含む。種々のキャリア（例えば、緩衝化生理食塩水など）が用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、そして一般には望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要に応じて薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整および緩衝化剤、張度調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。
【０２０２】
これらの処方物中のキメラ分子の濃度は、広範に変化し得、そして主に流体の容量、粘度、体重などに基づいて、選択される特定の投与形態および患者の必要性に従って選択される。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のような刊行物に、より詳細に記載される。
【０２０３】
代表的な化学治療についての投薬量は、当業者に周知である。さらに、このような投薬量は代表的に、性質が補助的（ａｄｖｉｓｏｒｉａｌ）であり、そして特定の治療状況、患者の寛容性などに依存して調整され得る。組成物の単一または複数の投与は、必要に応じて、そして患者によって寛容化される、投薬量および頻度に依存して投与され得る。いずれにせよ、この組成物は、患者を効果的に処置するために充分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。
【０２０４】
治療的キメラ分子の場合、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物についての投薬量は、１日に患者１人あたり約０．０１である。特に、薬物が閉鎖部位（例えば、体腔または器官の腔）へと投与され、そして血流中には投与されない場合、１日に患者１人あたり０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇの投薬量が使用され得る。
【０２０５】
（ＶＩＩ．キット）
ある実施形態において、本発明は本発明のキメラ分子の創造および／または使用のためのキットを提供する。１つの実施形態において、このキットは、酵素におけるシステインにカップリングするためのメタンスルホネートとして誘導体化された１以上の標的化部分を含む１以上の容器を含む。さらに、またはその代わりに、キットは、メタンスルホネート誘導体化標的化部分へのカップリングのために用意された挿入されたシステインを有する、１以上の酵素、より好ましくは変異酵素を含み得る。このような様式で提供される場合、キットは、特定の用途のために所望のキメラ分子を当業者が組み立てるのを可能にする。従って、例えば、１つの代表的なキットは、複数のメタンスルホネート誘導体化標的化部分およびカップリングに適した１以上の酵素を含み得る。次いで、所望の酵素は、所望の標的化部分と（本明細書中に記載されるように）反応させられて、所望のキメラ分子を産生する。このようなキットはさらに、代表的なカップリング反応において利用される１以上の試薬を含み得る。
【０２０６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の１以上のキメラ分子（例えば、触媒性アンタゴニストおよび／または再方向付け酵素）を提供する。このキメラ分子は、乾燥物（例えば、凍結乾燥粉末）として、または溶液中におよび／またはエマルジョンとして提供され得る。特定の実施形態では、キメラ分子は、薬理学的賦形剤中に、または薬理学的賦形剤と共に提供され得、そして必要に応じて単位投薬形式で提供され得る。
【０２０７】
キットは、必要に応じて、本明細書中で記載される用途を促進するための任意の試薬および／または装置を含み得る。このような試薬としては、緩衝剤、有機溶媒、標識、標識抗体、バイオリアクター、細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０８】
さらに、キットは、本発明のキメラ分子の組み立てのための、および／またはそれらの使用のための指示（すなわち、プロトコル）を含む説明書を含み得る。説明書は代表的に、記載物または印刷物を含むが、これらはそのようなものには限定されない。このような指示を記憶し得、そして一般使用者にそれを通信し得る任意の媒体は、本発明によって意図される。このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられるがこれらに限定されない。このような媒体としては、このような説明書を提供するインターネットサイトに対するアドレスが挙げられ得る。
【０２０９】
（実施例）
以下の実施例は、請求された本発明を例示するために提供され、限定するためではない。以下の実施例は、本発明の多数のキメラ分子の構築および評価を詳述する。特に、実施例１〜４は、本発明の触媒性アンタゴニストの高度な特異的選択性を証明し、ここで標的部分は公知の酵素インヒビターである。実施例５〜７は、キメラ分子が結合タンパク質レクチンコンカナバリンＡに対して標的化されるキメラ分子の構築および評価を詳述する。実施例８〜１０は、キメラ分子が結合タンパク質アビジンに対して標的化されるキメラ分子の構築および評価を詳述する。実施例１１および１２は、キメラ分子がモノクローナル抗ビオチン抗体ＩｇＧに対して標的化されるキメラ分子の構築および評価を詳述する。実施例１３は、これらの実施例のそれぞれの化学量論を詳述する。
【０２１０】
（インヒビターによる酵素の標的化：合成およびＳＢＬへのＨＬＡＤＨインヒビターの結合および得られるＳＢＬ−Ｓ−ピラゾールＣＭＭのキャラクタリゼーション）
種々の酵素標的の分解のために種々の酵素標的にＳＢＬを指向するために、本発明者らは、本発明者らの組み合わせた部位に指向された変異誘発化学修飾によって、ＳＢＬにそれらの酵素のための特異的なインヒビターを結合することを決定した（（ＣＭＭ）アプローチ表２）。
【０２１１】
好ましい実施形態において、このアプローチのための標的部分として選択されたインヒビターは、標的酵素の強力なインヒビター／分解剤であるが、ＣＭＭの弱いインヒビターである。この実施例において、４−ピラゾール誘導体によって強力に阻害されるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を、標的酵素として選択し、標的として選択されたインヒビターはＡＤＨを阻害することで公知のピラゾールであった。この場合の修飾されたＣＭＭは、サブチリシン（ＳＢＬ）であった。
【０２１２】
１実施形態において、ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＬＡＤＨ）を、標的酵素として選択した。幾つかの四置換ピラゾールは、ＨＬＡＤＨの合理的な選択的インヒビターとして記載される（ＴｈｅｏｒａｌｌおよびＹｏｎｅｔａｎｉ（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，３８８：５３７−５５３；Ｔｈｅｏｒｅｌｌら（１９６９）Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，２３：２５５−２６０；Ｔｏｌｆら（１９７９）Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ  ３３：４８３−４８７；Ｔｏｌｆら（１９８２）Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．Ｂ，１０１−１０７）。４位に長鎖の疎水性アルキル置換基を有するピラゾール誘導体は、ＨＬＡＤＨ活性を特に強力に阻害する。この置換基の結合親和性、従って４−ピラゾールの阻害力は、アルキル鎖長が６個の炭素原子まで増加するにつれて増加する。４−ヘキシルピラゾールは、ＫI＝０．５ｎｍを有するウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（ＬＡＤＨ）を阻害することが公知である。それ故に、本発明者らは、４位にメタンスルホニル−ヘキシル側鎖を有するピラゾール−ＭＴＳ試薬を合成することを決定した。このＭＴＳ−ピラゾール試薬の合成は、スキーム１１（図３）によって例示される。
【０２１３】
（ＭＴＳ−ピラゾールの合成）
４−ヨードピラゾール（１）のｎ−ＢｕＬｉによる水素−金属交換、および過剰の１，６−ジブロモヘキサン（２）とのカップリングは、４−（６−ブロモ）−ヘキシルピラゾール（３）を提供した。化合物３を精製する試みは、部分的にのみ成功した。粗ブロミド３のメタンチオ硫酸ナトリウムとの反応は、１６％の全体収率でＭＴＳ−ピラゾール４を提供した。全収率が低いにもかかわらず、最適化に向けた試みがなされなかった。なぜなら、これはおそらく保護基の使用を必要とするからであった。従って、ＭＴＳ−ピラゾール４は、スキーム１１（図３）に概略されるように、簡単な二工程の反応順序で合成され得る。
【０２１４】
（ピラゾールによるＳＢＬ−ＷＴの阻害）
ピラゾールを用いる修飾がどのくらいＳＢＬの触媒活性に影響をおよぼすかを決定するため、本研究者は、本研究者らの標準基質ｓｕｃ−ＡＡＰＦｐＮＡおよび標準条件（ｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯを含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ）を用いるＷａｌｅｙ（Ｗａｌｅｙ（１９８２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｊ．，２０５：６３１）の方法を使用して、ＳＢＬ−ＷＴについてＫI測定を実施した。非置換のピラゾールは、有意にＳＢＬ−ＷＴを阻害しなかった（ＫM＝０．７３±０．０５ｍＭ、ｋcat＝１５３±４ｓ-1、ｋcat／ＫM＝２０９±１５ｍＭｓ-1、ＫI＝９７．２±７．２ｍＭ）。ＭＴＳ−ピラゾール４を用いるＳＢＬ−ＷＴのＫIの決定のための同じ方法を使用する試みは、ピラゾール化合物の不溶性のため失敗した。
【０２１５】
（ピラゾール−ＣＭＭの修飾およびキャラクタリゼーション）
Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７Ｃ、Ｓ１６６ＣおよびＳ１５６Ｃを、ＭＴＳ−ピラゾール試薬４を用いて、ｐＨ９．５での反応、次いで標準プロトコルによって修飾した。全ての場合において、得られる酵素は、修飾後活性であり、アミダーゼ速度論（基質ｓｕｃ−ＡＡＰＦｐＮＡ）およびＥＳＭＳのついてのデータを表２に示す。
【０２１６】
（表２．ピラゾール−ＣＭＭについてのｖ速度論的定数）
【０２１７】
【表２】
0005180417.tif 000010
a測定問題により、現在まで得られなかった。
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯ中の初期速度の方法によって複製中で決定された速度定数。［Ｓ］＝０．０１２５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝１．５×１０-8Ｍ〜９．０×１０-8Ｍ。
【０２１８】
それは全てのピラゾール−ＣＭＭの中で最も小さなＫM値を有するが、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ピラゾールＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴの場合より約９倍小さく、最も低いｋcat／ＫMを示す。
【０２１９】
Ｓ１５６−およびＬ２１７−Ｓ−ピラゾールＣＭＭのｋcatは、両方とも非常に似ており、ＷＴ酵素の場合より約２．５倍小さかった。しかし、これらの基質結合特性は、わずかに異なっていた：Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、ＳＢＬ−ＷＴより良好に結合した。一方でＬ２１７Ｃ−Ｓ−ピラゾールのＫMは、ＷＴ酵素のＫMより大きい。
【０２２０】
Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、他のピラゾールＣＭＭに比べてわずかにより活性であり、そのｋcatは、ＳＢＬ−ＷＴと比較してちょうど１．５倍小さい。しかし、それは、全てのピラゾール−ＣＭＭの中で最も大きなＫMを有し、そのｋcat／ＫM値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して約２倍小さかった。
【０２２１】
（実験的詳細）
（４−（６−メタンチオスルホニル）ヘキシルピラゾール（ＭＴＳ−ピラゾール）（４））
Ｎ2下、−７８℃において、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の４−ヨードピラゾール（１）（２．００ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中の２．５Ｍ溶液、１２．４ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を滴下した。０．５時間後、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の１，６−ジブロモヘキサン（２）（５．０３ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくり加えた。添加を完了した際、この反応混合物を室温まで加温し、一晩撹拌した。水（５０ｍＬ）を加え、層を分離し、水層をＡｃＯＥｔ（４×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ4）。溶媒のエバポレーションおよび減圧下での後の乾燥によって、褐色油状物として５．０３ｇの粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：ＡｃＯＥｔ、勾配溶出、９５：５〜５５：４５）による分離によって、０．８１０ｇ（３４％）の４−（６−ブロモ）−ヘキシルピラゾール（３）を黄色油状物として得た。
【０２２２】
【数２】
0005180417.tif 000011
＊シグナルは二重の強度を有する。両方のＮＭＲスペクトルは不純物によるさらなるシグナルを含む。ブロモ−化合物３は、さらに精製されず、特徴付けした。さらに２．４１ｇ（４８％）のジブロミド２は再単離され得る。
【０２２３】
ＮａＳＳＯ2Ｍｅ（０．３１９ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中の粗ブロミド２（０．４００ｇ、ｍａｘ．１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に加え、得られる溶液を窒素下５０℃で加熱した。１６時間後、水（１０ｍＬ）およびＡｃＯＥｔ（１０ｍＬ）を加え、これらの層を分離し、水層をＡｃＯＥｔ（４×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥した（ＭｇＳＯ4）。溶媒をエバポレートし、後に減圧下で乾燥し、０．３５０ｇの粗生成物を黄色油状物として得た。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：ＡｃＯＥｔ、勾配溶出、８：２〜０：１）により分離して、０．２１５ｇ（２工程にわたって１６％）の４−（６−メタンチオスルホニル）−ヘキシルピラゾール（４）を無色の固体として得た。
【０２２４】
【数３】
0005180417.tif 000012
（標準修飾プロトコール）
フラッシュ凍結溶液として保存されたＳＢＬ変異体の修飾のための一般的手順：
約２５ｍｇの酵素を含有する変異体酵素（Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７ＣまたはＳ１６６Ｃ）の１．２５ｍＬの凍結されたアリコートを解凍し、ポリプロピレン試験管中の１．２５ｍＬの修飾緩衝液（以下を参照のこと）に加えた。この溶液に、１００μＬの０．２Ｍ  ＭＴＳ試薬溶液を加えた。この混合物をシールし、撹拌し、そして室温でエンドオーバーエンド（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）回転子上に置いた。修飾が完了した際（スクシニル−ＡｌａＡｌａＰｒｏＰｈｅ−ｐ−ニトロアニリド［ε410＝８８００Ｍ-1ｃｍ-1］（Ｂｏｎｎｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１０２６−１０３０）を、一定の活性を示す０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯ、ｐＨ８．６を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の基質として使用する特異的活性アッセイ、および溶液中に遊離のチオールが存在しないことを示すＥｌｌｍａｎ試薬（Ｅｌｌｍａｎら（１９６１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：８８−９５）（ε412＝１３６００Ｍ-1ｃｍ-1）を用いる滴定によって決定した）、追加の５０μＬの修飾試薬溶液を加え、この混合物をさらに１０分間エンドオーバーエンド回転子上に戻した。この反応溶液を、事前に充填し、事前に平衡化したＧ−２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＰＤ１０カラムに注入し、３．５ｍＬのＱｕｅｎｃｈ  Ｂｕｆｆｅｒで溶出した（以下を参照のこと）。この溶出液を４℃で、１０ｍＭ  ＭＥＳ，１ｍＭ  ＣａＣｌ2  ｐＨ５．８（２＿１Ｌ、２＿４５分）に対して透析した。得られる透析液を液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−１８℃で保存した。
【０２２５】
【化２】
0005180417.tif 000013
全てのＣＭＭの遊離チオール含量を、０．２５Ｍ、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液中のＥｌｌｍａｎ試薬を用いる滴定によって分光学的に決定した。全ての場合において、遊離チオールは検出されなかった。修飾した酵素を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｐｈｓｔ−システムで、カソードに向かって泳動するｐＨ４．２の非変性勾配（８−２５％）ゲルによって分析し、単一のバンドとして現れた。ＥＳ−ＭＳ分析の前に、５％アセトニトリル、ランニング緩衝液としての０．０１％ＴＦＡを有するＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣマトリクス（Ｐｈａｒｍａｃｉａからの１７−０７２７−２０）上のＦＰＬＣ（ＢｉｏＲａｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）によってＣＭＭを精製し、１段階勾配の８０％アセトニトリル、０．０１％ＴＦＡで溶出した。
【０２２６】
（凍結乾燥した粉末として保存されたＳＢＬ変異体の修飾のための一般的手順）
この手順を、Ｓ１５６Ｃにのみ使用し、これを二量化を防止するために凍結乾燥した粉末として保存した。ポリプロピレン試験管内に、約２５〜３０ｍｇの凍結乾燥したＳ１５６Ｃを秤量した。これを以下の修飾緩衝液（２．５ｍＬ）中に溶解した。
【０２２７】
【化３】
0005180417.tif 000014
ＭＴＳ試薬を加え、次いで適切なクエンチ緩衝液を使用して、フラッシュ凍結変異体溶液に関して反応を続けた。
【０２２８】
（ＳＢＬ結合体のアミダーゼ速度論分析のための一般的方法）
０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、１％ＤＭＳＯ、ｐＨ８．６（ε410＝８８００Ｍ-1ｃｍ-1）（Ｂｏｎｎｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１０２６−１０３０）を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の９個の濃度（０．１２５ｍＭ−３．０ｍＭ）のスクシニル−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質で決定した初期速度データのカーブフィッティング（ＧｒａＦｉｔ（登録商標３．０３））によって２５（±０．２）℃で、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数を測定した。
【０２２９】
（ＳＢＬ結合体のエステラーゼ速度論分析のための一般的方法）
低い基質近似を使用して決定された特異性定数を、０．００５ｖｏｌ％Ｔｗｅｅｎ−８０、ＤＭＳＯ中の１ｖｏｌ％３７．５ｍＭ  Ｅｌｌｍａｎ試薬を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．６中の基質として、１５μＭまたは３０μＭのスクシニル−ＡＡＰＦ−ＳＢｎを使用して、Ｅｌｌｍａｎ試薬（ε４１２＝１３６００Ｍ−１ｃｍ−１）を使用して、間接的に測定した。
【０２３０】
０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ＤＭＳＯ中の１ｖｏｌ％３７．５ｍＭ  Ｅｌｌｍａｎ試薬を含有する０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．６中のＥｌｌｍａｎ試薬を間接的に使用して、スクシニル−ＡＡＰＦ−ＳＢｎ基質の８個の濃度（３１．２５μＭ−２．０ｍＭ）で決定した初期速度データのカーブフィッティング（Ｇｒａｆｉｔ（登録商標）３．０３）によって２５℃で、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数を測定した。
【０２３１】
（実施例２）
（初期ＨＬＡＤＨ標的化アッセイ：超化学量論（ｓｕｐｒａｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）ピラゾール−ＣＭＭによるＨＬＡＤＨの標的化そして次ぐ分解の評価）
ピラゾール−ＣＭＭのＨＬＡＤＨに対する標的化は、ＣＭＭのピラゾール部分による阻害に起因したＡＤＨ活性における減少から明白である。
【０２３２】
それゆえ、ピラゾール−ＣＭＭの非存在および存在におけるＨＬＡＤＨの触媒活性を調査した。コントロールは、ＳＢＬ−ＷＴを用いて実行した。使用したＣＭＭおよびＷＴの量は、ＰＭＳＦ滴定によって測定する場合、等量の活性な酵素に対して計算した。シクロヘキサノールを、ＨＬＡＤＨ基質として、そしてＮＡＤ+を補因子として使用した。図４は、この「標的化アッセイ」の結果を示す。
【０２３３】
予想されるように、ＳＢＬ−ＷＴは、ＨＬＡＤＨの活性に有意に影響与えず、ところが全てのピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨを阻害した。ほとんど有効な阻害は、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ピラゾール（表面曝露される側鎖を有する唯一のＣＭＭ）によって生じた。Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ピラゾールおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、非常に類似した阻害力を示した。驚くべきことに、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ピラゾールは、ＨＬＡＤＨを非常に強力に阻害したが、その修飾された側鎖は、Ｓ1ポケットに埋もれている。これは、ピラーゾール部分がその結合ポケットの外側に結合するコンフォメーションを採るという点から、合理的に説明され得る。これらの結果は、本発明者らの修飾された酵素がインヒビターを介して別の酵素を標的化する能力を明らかに証明する。
【０２３４】
ピラゾールインヒビターを介したＣＭＭとＨＬＡＤＨの標的化された結合は、選択的加水分解を導くべきである。ＨＬＡＤＨの加水分解が起こる場合、ＨＬＡＤＨのオキシドレダクターゼ活性は、本発明者らのＣＭＭを用いたあるインキュベーション時間の後に、減少されるか、または根絶されるべきである。これを証明するために、上記のような「標的化活性」が、４時間のインキュベーション後に再び実行された。残存するＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールを基質として添加することによって決定された。この結果は、図５に示す。
【０２３５】
（ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための実験）
６つのキュベットを表３に示すように充填した。
【０２３６】
表３．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための設定
【０２３７】
【表３】
0005180417.tif 000015
aアッセイ緩衝液：０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ９．０。
bアッセイ緩衝液中の溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）。
cアッセイ緩衝液中の溶液（３３．２ｍｇ／ｍＬ）。
dＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４）中の溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５２．４％活性）。
eこの量は、等濃度の活性な酵素に関して計算している（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦｐＮＡを用いた初期運動速度によって測定した場合）。
fＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）中に溶解された凍結乾燥された酵素。
【０２３８】
ＨＬＡＤＨの添加の前に、このキュベットを２分間、分光光度計中で平衡化した。ＨＬＡＤＨを添加し、そしてＡ340を３００秒間に渡って２０秒毎に測定した。この測定は、２重で実行した。結果は、表４に示す。
【０２３９】
表４．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する結果。
【０２４０】
【表４】
0005180417.tif 000016
（ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する実験）
６つのエッペンドルフバイアルを、表５に示すように充填した。
【０２４１】
表５．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイのための設定
【０２４２】
【表５】
0005180417.tif 000017
aアッセイ緩衝液：０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ９．０。
bアッセイ緩衝液中の溶液（３３．２ｍｇ／ｍＬ）。
cＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．４）中の溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）。
dＭｉｌｌｉ−Ｑ水中のスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ジスルフィド結合有するリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液。
eこの量は、等濃度の活性な酵素に関して計算された（ＰＭＳＦ滴定によって測定された場合）。
fＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）中に溶解された凍結乾燥された酵素。
【０２４３】
これらの溶液は、サーモスタット制御された温浴中、３５℃で４時間インキュベートされた。各エッペンドルフバイアルの６５０μＬ溶液を、キュベット中、２ｍＬのアッセイ緩衝液と混合した。分光光度計における２分間の平衡化、そしてオートゼロにした後、シクロヘキサノール（３００μＬ）を添加し、そして３００秒間に渡って２０秒毎にＡ340を測定した。測定は、２重で実施し、そして表６に示す。
【０２４４】
表６．ＨＬＡＤＨ標的化アッセイに関する結果
【０２４５】
【表６】
0005180417.tif 000018
aデコイタンパク質の無しおよび有りでのコントロール測定の平均。
bデコイタンパク質なし。
cデコイタンパク質あり。
【０２４６】
（実施例３）
（アルカリホスファターゼの存在下におけるＨＬＡＤＨの標的化およびＨＬＡＤＨの破壊）
種々の酵素標的の分解のためにサブチリシン（例えば、ＳＢＬ）をそれらに配向させるために、本発明者らは、図３に示されるような本発明者らの結合部位指向型変異誘発化学修飾（ＣＭＭ）手段によって、サブチリシンに対するこれらの酵素に特異的なインヒビターを添付させることを決定した。
【０２４７】
本発明者らの予備的な標的は、ピラゾールによって阻害されるＨＬＡＤＨである。デコイタンパク質（スクランブルＲＮａｓｅ  Ａ）の存在および非存在下で、ＨＬＡＤＨを選択的に破壊するピラゾール−ＣＭＭの能力をまた、探索した（以下の実施例を参照のこと）。
【０２４８】
本実施例は、強力なデコイタンパク質としての活性な酵素（アルカリホスファターゼ（ＡＰ））の存在下におけるさらなる実験を記載する。これは、細胞中でいくつかの酵素が存在するインビボ刺激を模倣し、そして、ここで、本発明者らは、１つの酵素（ＨＬＡＤＨ）の破壊は標的化するが他（例えば、ＡＰ）は影響されないままにする。
【０２４９】
消化実験は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールを代表的なＣＭＭとして使用して実施した。消化混合物中の種類の濃度は（存在する場合）、以下：
ＨＬＡＤＨ                ２．６２μＭ（１．０当量の活性部位*）
ＡＰ                      ２．７４μＭ（１．０５当量の活性部位*）
Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール    ３．４０μＭ（１．３当量の活性部位）
であった。ＨＬＡＤＨおよびＡＰが、両方とも二量体であることに注意する。ＭＷ：ＨＬＡＤＨ：３９４９２Ｄａ／サブユニットＡＰ：５７０９９Ｄａ／サブユニット］。
【０２５０】
ＨＬＡＤＨ活性は、定期的に消化混合物の一部を取り除き、そしてシクロヘキサノールをシクロヘキサノンに酸化するそのアリコートの能力を評価することによってモニターした。反応コースは、シクロヘキサノールが酸化されたとして３４０ｎｍにおいて、ＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変化を観察することによってモニターした。
【０２５１】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性は、定期的に消化混合物の一部を取り除き、そしてｐ−ニトロフェニルホスフェートを無機ホスフェートおよびｐ−ニトロフェノレートに加水分解するそのアリコートの能力を評価することによってモニターした。反応コースは、４０５ｎｍにおいて、ｐ−ニトロフェノレートの出現を観察することによってモニターした。
【０２５２】
（結果）
Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール、ＡＰおよび／またはＨＬＡＤＨを含む６つのバイアルを調製した。各バイアルのＨＬＡＤＨ（表７）およびＡＰ（表８）の活性は（適用可能な場合）、定期的に評価した（実験を参照のこと）。
【０２５３】
表７．初期活性に対するインキュベーション後のＨＬＡＤＨ活性
【０２５４】
【表７】
0005180417.tif 000019
*ＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールが酸化されたとして３４０ｎｍにおけるＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換をモニターすることによって評価した（実験を参照のこと）。３５℃でのインキュベーション。
【０２５５】
表８．初期値に対するインキュベーション後のアルカリホスファターゼ活性
【０２５６】
【表８】
0005180417.tif 000020
*ＡＰ活性は、４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロフェニルホスフェートからｐ−ニトロフェノレート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｌｏａｔｅ）放出をモニターすることによって評価した（実験を参照のこと）。３５℃でのインキュベーション。＃ＡＰおよびＡＰ＋Ｓ１６６Ｃ−ピラゾール実験は、３時間および７２時間の時点で実施した。
【０２５７】
このデータはまた、図６、図７、図８および図９にグラフで示す。
【０２５８】
データ（表７）、図６および図８は、ＨＬＡＤＨ活性が、ＡＰ単独またはＡＰの存在下でアッセイされた場合に定常なままであることを示す。また、ＡＰ活性は、基本的には、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールＣＭＭの存在下で影響されなかった（予想されたように；表２、図３および図５）。しかし、Ｓ１６６ＣピラゾールＣＭＭの存在下におけるＨＬＡＤＨの活性は、急速かつ全体的に失われる（表１、図２および図４）。
【０２５９】
さらに、ＡＰおよびＨＬＡＤＨは、活性または触媒機能を互いに妨害しなかった（表７、表８、図６、図７、図８および図９）。
【０２６０】
（実験の詳細）
（材料）
１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を含有するｐＨ９．０  １Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０アッセイ緩衝液）：
グリシン（０．１モル）は、水（約８００ｍＬ）に溶解し、そしてＭｇＣｌ2（ＭＱ水中の１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を添加した。ｐＨを、約５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いて９．０に調整し、そして混合物を１Ｌにした。
【０２６１】
ｐＨ７．４  ０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４  ＴＲＩＳ）：
ＴＲＩＳの溶液は、ｐＨ７．４に中和し、次いで０．０５Ｍに希釈した。
【０２６２】
３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．０１ｍＭ  Ｚｎ2+を含有する、ｐＨ７．８  ０．０５Ｍ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８緩衝液）：
トリエタノールアミン（０．０５モル、７．５ｇ）、ＮａＣｌ（３モル、１７５．５ｇ）、ＭｇＣｌ２（０．１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ２（０．１ｍＬの１Ｍ溶液）を、ＭＱ水（約９００ｍＬ）に溶解した。ｐＨを、約２Ｎ  ＨＣｌを用いて７．４に調整し、そして生じた溶液を１Ｌにした。
【０２６３】
０．０５％Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を含有するｐＨ８．６の約０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６緩衝液）：
ＭｇＣｌ2（ＭＱ水中の０．１ｍＬの１Ｍ溶液）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の０．１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を、１００ｍＬ容量フラスコに添加し、このフラスコを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むｐＨ８．６  ０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液を用いて印まで作製した。
【０２６４】
ＨＬＡＤＨ溶液：
ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−９５８９、ＥＣ１．１．１．１、８ｍｇの約５０％ｗ／ｗタンパク質）を、ｐＨ７．４  ＴＲＩＳ（０．８ｍＬ）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２６５】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）溶液：
アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ７１３０２３、ＥＣ３．１．３．１、５０％ｗ／ｖグリセロール：緩衝液中に受け入れられた場合約９５０μＬ）を、ｐＨ７．８緩衝液（約１５ｍＬ）を用いて希釈し、そしてセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）濃縮機を用いてその本来の体積の１０〜２０％に４℃で濃縮した。さらなる１５ｍＬのｐＨ７．８緩衝液を添加し、そしてそのサンプルをもう１回濃縮した。この工程は、希釈のために、ｐＨ９．０アッセイ緩衝液を用いてさらに３回繰り返した。３回目の濃縮の後、この濃縮物（約１．８５ｍＬ）を集め、そして氷上で保存した。この手順は、ＨＬＡＤＨに対する基質であるグリセロールを除去するために必要であった。
【０２６６】
ＮＡＤ+溶液：
３３．２ｍｇ／ｍＬのＮＡＤ+をｐＨ９．０のアッセイ緩衝液に溶解した。
【０２６７】
シクロヘキサノール溶液：
ｐＨ９．０アッセイ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬのシクロヘキサノール。
【０２６８】
ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（ＰＮＰＰ溶液）：
２０ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェートを含有する錠剤（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−２７６５）を、ｐＨ８．６緩衝液（２０ｍＬ）に溶解した。
【０２６９】
ピラゾール−ＣＭＭ：
ＭＥＳ保存緩衝液（ｐＨ５．８  １０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2）中のＳ１６６Ｃ−ピラゾール（１．７６ｍｇ／ｍＬ）。
【０２７０】
（ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ）
６つのエッペンドルフバイアルを、表９に示すように充填した。
【０２７１】
表９．ＨＬＡＤＨ活性アッセイのための設定。
【０２７２】
【表９】
0005180417.tif 000021
ＣＭＭは、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールであった。
【０２７３】
バイアルは、以下の表に示される時間に対して３５℃でインキュベートした。時間が進行するにつれてＨＬＡＤＨおよびホスファターゼ活性をアッセイするために、アリコートを定期的に取り除いた。
【０２７４】
溶液の一部（６５μＬ）を、インキュベーションバイアルから取り除き、次いで、ｐＨ９．０アッセイ緩衝液（２００μＬ）を含むマイクロキュベットに注入した。このキュベットを２５℃で２分間インキュベートし、次いで、シクロヘキサノール溶液（３０μＬ）を添加した。次いで、３４０ｎｍにおける吸光度を３００秒間モニターし、そして０．２吸光度単位まで秒当たりのＯ．Ｄ．変化を記録した。
【０２７５】
（アルカリホルファターゼ活性のアッセイ）
一部（２０μＬ）をインキュベーションバイアルから取り除き、次いでｐＨ８．６緩衝液（９８０μＬ）に注入した。この混合物をボルテックスした。１０μＬをその混合物から取り除き、そして２５℃でインキュベートした９９０μＬのＰＮＰＰ溶液を含むキュベットに注入した。４０５ｎｍにおける吸光度変化を１５０秒間モニターし、そして１吸光度単位までの秒当たりのＯ．Ｄ．変化を記録した。
【０２７６】
（実施例４）
（化学量論以下のピラゾール−ＣＭＭを用いたＨＬＡＤＨの標的化）
化学量論：
実験は、表１０に例示されるように、２当量のＨＬＡＤＨ二量体（４当量の活性部位）を１当量のピラゾール−ＣＭＭまたはＷＴ−ＳＢＬに用いることによって実施した。
【０２７７】
表１０．化学量論
【０２７８】
【表１０】
0005180417.tif 000022
条件：
反応は、ｐＨ９．０、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ、３５℃で実施した。
【０２７９】
結果：
ＨＬＡＤＨ溶液を、ＷＴ−ＳＢＬ、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１５６Ｃ−ピラゾールの存在下でインキュベートした。コントロール実験は、任意のＳＢＬベースの酵素の非存在下（ＨＬＡＤＨ単独）で実施した。４つの混合物のＨＬＡＤＨ活性は、定期的にアッセイした（実験を参照のこと）−表１１を参照のこと。
【０２８０】
表１１．ピラゾール−ＣＭＭの有りまたは無しでのインキュベーション後のＨＬＡＤＨ活性。
【０２８１】
【表１１】
0005180417.tif 000023
*ＨＬＡＤＨ活性は、シクロヘキサノールが２５℃、ｐＨ９．０で酸化されたとして３４０ｎｍでＮＡＤ+のＮＡＤＨへの変換をモニターすることによって評価した（実験を参照のこと）。
【０２８２】
考察：
ピラゾール−ＣＭＭの添加によって生じるＨＬＡＤＨ活性における最初の低下は、ＣＭＭがＨＬＡＤＨを標的化し、それゆえＨＬＡＤＨを阻害する能力を反映している。Ｓ１５６Ｃ−ピラゾール、そしてより少ない程度でＳ１６６Ｃ−ピラゾールは、明らかに、インキュベーションの際にＨＬＡＤＨ活性に劇的な減少を引き起こす。ピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨに関して化学量論の量よりも少なく使用された−４当量のＨＬＡＤＨ活性部位：１当量のピラゾール−ＣＭＭ。しかし、これらは、２５％より多くのＨＬＡＤＨ活性の減少を素早く引き起こした。確かに、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールの場合、ＨＬＡＤＨ活性は、２０時間に渡って６７％から５％へ減少することが見出され、これは、ピラゾール部分の最大阻害効果に加えた１３．５倍のＨＬＡＤＨ活性の減少を示す。ＷＴ−ＳＢＬは、ピラゾール−ＣＭＭと比較した場合の増強されたアミダーゼ特異的活性にもかかわらず、同じ２０時間に渡って単に１．４倍のＨＬＡＤＨ活性の減少しか引き起こさない。
【０２８３】
要約：
ピラゾール−ＣＭＭは、ＨＬＡＤＨを標的化し、そしてＨＬＡＤＨを触媒的に破壊することが見出される。
【０２８４】
実験材料：
ｐＨ９．０  ０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する０．１Ｍ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０アッセイ緩衝液）：
グリシン（０．１モル）を、水（約８００ｍＬ）に溶解した。Ｔｗｅｅｎ８０の溶液（ＭＱ水中に５０ｍＬの０．１％ｖ／ｖ）を添加し、そしてｐＨを約５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いて９．０に調整した。この混合物をＭＱ水を用いて１Ｌにした。
【０２８５】
ｐＨ７．４  ０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４  ＴＲＩＳ）：
ＴＲＩＳ（３０２．９ｍｇ、２．５ｍモル）を、ＭＱ水（約４０ｍＬ）に溶解した。ｐＨを、約１Ｍ  ＨＣｌ溶液を用いて７．４に調整し、そして混合物の体積をＭＱ水を用いて５０ｍＬにした。
【０２８６】
ＨＬＡＤＨ溶液：
ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−９５８９、ロット５８Ｈ７００４、ＥＣ１．１．１．１、８．４５ｍｇの５２．４％ｗ／ｗタンパク質−製造者らのＢｉｕｒｅｔ滴定に従う）を、ｐＨ７．４  ＴＲＩＳ（０．８４５ｍＬ）に溶解し、活性タンパク質の５．２４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２８７】
ＨＬＡＤＨ濃度の確認：
ＨＬＡＤＨ（５０μＬ）溶液をｐＨ７．４  ＴＲＩＳ（４５０μＬ）に添加し、１０倍希釈溶液を得た。ブラッドフォード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質測定は、この２重サンプルで実施し、そして０．６１６ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。これを最初のＨＬＡＤＨ保存液中の６．１６ｍｇ／ｍＬの濃度に変換した。本発明者らは、タンパク質濃度が過大評価されるよりも、むしろ下であることを確実にするために、５．２４ｍｇ／ｍＬのより低い値が正確であると考える。
【０２８８】
ＮＡＤ+溶液：
ＮＡＤ+（３３２ｍｇ）を、ｐＨ９．０  アッセイ緩衝液（１０ｍＬ）に溶解し、３３．２ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２８９】
シクロヘキサノール溶液：
シクロヘキサノール（１００ｍｇ）をｐＨ９．０  アッセイ緩衝液（１０ｍＬ）に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０２９０】
（サブチリシン溶液：）
ＷＴ−ＳＢＬ（１．８８ｍｇの乾燥粉末、７３％  ｗ／ｗの活性なタンパク質）をｐＨ５．８の１０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2「保存緩衝液」（５００μＬ）に溶解して、活性なＷＴ−ＳＢＬの２．７４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾールをＰＭＳＦで予め滴定した：これらの濃度はそれぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬおよび３．６２ｍｇ／ｍＬであった。
【０２９１】
（実験の詳細：）
（ＨＬＡＤＨ加水分解アッセイ：）
４本の５ｍＬのファルコンチューブを、表１２に従って充填した。
【０２９２】
【表１２】
0005180417.tif 000024
このチューブを、各チューブについて「時間０」の値を得るために各チューブのＨＬＡＤＨ活性がアッセイされるまで氷上で保持した（アッセイプロトコルについて以下を参照のこと）。次いで、このチューブを、水浴で３５℃にてインキュベートした。定期的に、７００μＬの反応混合物を各ファルコンチューブから取り出し、そのアリコートを個々のエッペンドルフチューブ中に入れ、そしてこのエッペンドルフチューブを氷上で保存した。次いで、各エッペンドルフチューブの内容物をＨＬＡＤＨ活性についてアッセイした（以下を参照のこと）。
【０２９３】
（ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ：）
反応混合物の一部（６５０μＬ）を、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液（２．００ｍＬ）を含むキュベット中に注入した。このキュベットを２５℃にて２分間インキュベートし、次いで、シクロヘキサノール溶液（３００μＬ）を添加した。１０秒間の遅延後、３４０ｎｍでの吸光度を３００秒間モニターした。０．２吸光度単位までの１秒あたりのＯ．Ｄ．変化を用いて、初速度を算出した。
【０２９４】
（結果）
結果を表１３にまとめる。
【０２９５】
【表１３】
0005180417.tif 000025
（実施例５：化学量論以下のレベルのＣＭＭでＳ１５６Ｃ−ピラゾール−ＣＭＭおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾール−ＣＭＭを用いたアルカリホスファターゼの存在下でのＨＬＡＤＨの標的化）
（化学量論）
実験を、１当量のピラゾール−ＣＭＭまたはＷＴ−ＳＢＬに対して２当量のＨＬＡＤＨダイマー（４当量の活性部位）を用いて行った；仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼを、全ての実験において「活性な酵素」デコイ（ｄｅｃｏｙ）タンパク質として用いた。仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼは、１つのサブユニットあたり分子量６６ｋＤおよび６８ｋＤという２つのアイソザイムから構成される。両方のアイソザイムは、ダイマーであり、従って、本発明者らは、本発明者らの計算において各ダイマーについておよその分子量は１３４ｋＤであると仮定する。用いた化学量論を表１４に示す。
【０２９６】
【表１４】
0005180417.tif 000026
（条件）
（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2、３５℃を有する、ｐＨ９．０の０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ）
４つの実験を同時に行った：４つ全ての実験を、４本のバイアルの各々の中に存在するＨＬＡＤＨおよびＡＰを用いて行った（すなわち、これらは、加水分解についての基質として直接競合する）。さらに、各バイアルは、以下のうちの１つを含んでいた：緩衝液（ＳＢＬを添加せず）、ＷＴ−ＳＢＬ、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１６６Ｃ−ピラゾール。
【０２９７】
（結果：）
ＨＬＡＤＨとアルカリホスファターゼとの混合物を各々含むバイアルを、ＷＴ−ＳＢＬ、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１５６Ｃ−ピラゾールの存在下でインキュベートした。コントロール実験を、ＳＢＬベースの酵素（ＳＢＬなし）の全くの非存在下で行った。４つの混合物のＨＬＡＤＨ活性およびアルカリホスファターゼ活性を、定期的にアッセイして、ＨＬＡＤＨに対するＣＭＭ  対  アルカリホスファターゼの信頼性を決定した（実験を参照のこと）−表１５、表１６、図１１および図１２を参照のこと。（データをまた、付録における「ＳＢＬを添加せず」時間＝０ｈの値と比較して示して、ＨＬＡＤＨに対するピラゾールＣＭＭの阻害効果を実証する）。
【０２９８】
【表１５】
0005180417.tif 000027
【０２９９】
【表１６】
0005180417.tif 000028
（考察）
アルカリホスファターゼは明らかに、ＷＴ−ＳＢＬまたはピラゾール−ＣＭＭによる加水分解に対して非常に感受性というわけではない。ＨＬＡＤＨ活性は、ＳＢＬの非存在下またはＷＴ−ＳＢＬの存在下でインキュベーションしたとき顕著に減少するわけではない。しかし、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールまたはＳ１６６Ｃ−ピラゾールの存在下では、ＨＬＡＤＨ活性は迅速に減少することが見られる。
【０３００】
（まとめ）
ピラゾール−ＣＭＭは、アルカリホスファターゼの存在下でＨＬＡＤＨを標的化し、そして触媒的に破壊することが見られる。アルカリホスファターゼは、ＷＴ−ＳＢＬおよびピラゾール−ＣＭＭの加水分解作用によって影響を受けない。
【０３０１】
（実験）
（材料）
（０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を有するｐＨ９．０の０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ、Ｍｅ2+およびＺｎ2+を有するｐＨ９．０アッセイ緩衝液）：）
グリシン（０．１ｍｏｌ）を、水（約８００ｍＬ）中に溶解した。塩化マグネシウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を、グリシン溶液に対して添加した。Ｔｗｅｅｎ  ８０の溶液（ＭＱ水中の０．１％  ｖ／ｖ、５０ｍＬ）をこの混合物に添加し、そしてｐＨを約５Ｍ  ＮａＯＨ溶液で９．０に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０２】
（１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を有するｐＨ９．０の０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０透析緩衝液））
グリシン（０．１ｍｏｌ）を、水（約８００ｍＬ）に溶解した。塩化マグネシウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬの０．１Ｍ溶液）を、このグリシン溶液に添加し、そしてこの混合物のｐＨを約５Ｍ  ＮａＯＨ溶液で９．０に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０３】
（ｐＨ７．４の０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４  ＴＲＩＳ））
ＴＲＩＳ（３０２．９ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をＭＱ水（約４０ｍＬ）に溶解した。ｐＨを約１Ｍ  ＨＣｌ溶液で７．４に調整し、そしてこの混合物の容量をＭＱ水で５０ｍＬにした。
【０３０４】
（１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を有するｐＨ７．４の０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４透析緩衝液））
ＴＲＩＳ（６．０５７ｇ、０．０５ｍｏｌ）をＭＱ水（約８００ｍＬ）に溶解した。塩化マグネシウム溶液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および塩化亜鉛溶液（１ｍＬの０．１Ｍ溶液）をこのＴＲＩＳ溶液に添加し、そしてこの混合物のｐＨを約１Ｍ  ＨＣｌ溶液で７．４に調整した。この混合物をＭＱ水で１Ｌにした。
【０３０５】
（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、１ｍＭ  Ｍｇ2+および０．１ｍＭ  Ｚｎ2+を有するｐＨ８．６の約０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６緩衝液））
ＭｇＣｌ2（ＭＱ水中の１Ｍ溶液、０．１ｍＬ）およびＺｎＣｌ2（ＭＱ水中の０．１Ｍ溶液、０．１ｍＬ）を１００ｍＬメスフラスコに添加し、そしてこのフラスコを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎを含むｐＨ８．６の０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液でその印までにした（標準的なアミダーゼ反応速度緩衝液）。
【０３０６】
（ＨＬＡＤＨ溶液）
ウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−９５８９、ロット５８Ｈ７００４、ＥＣ１．１．１．１、３．７７ｍｇの５２．４％  ｗ／ｗタンパク質（製造業者のビウレット滴定による））をｐＨ７．４  ＴＲＩＳ（０．３７７ｍＬ）中に溶解して、活性なタンパク質の５．２４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０７】
（ＮＡＤ+溶液）
ＮＡＤ+（３９．１５ｍｇ）をｐＨ９．０アッセイ緩衝液（１．１７９ｍＬ）に溶解して３３．２ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０８】
（シクロヘキサノール溶液）
シクロヘキサノール（１００ｍｇ）をｐＨ９．０アッセイ緩衝液（１０ｍＬ）に溶解して１０ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３０９】
（サブチリシン溶液）
ＷＴ−ＳＢＬ（１．８８ｍｇの乾燥粉末、７３％  ｗ／ｗ活性なタンパク質）をｐＨ５．８の１０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2の「貯蔵緩衝液」（５００μＬ）に溶解して活性なＷＴ−ＳＢＬの２．７４ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。この溶液をｐＨ５．８の１０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2の「貯蔵緩衝液」で４倍希釈して、０．６８５ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３１０】
Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾールをＰＭＳＦで予め滴定した：それらの濃度はそれぞれ、２．５ｍｇ／ｍＬおよび３．６２ｍｇ／ｍＬであった。これらのストック溶液をｐＨ５．８の１０ｍＭ  ＭＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2の「貯蔵緩衝液」で４倍希釈して、それぞれ、Ｓ１５６Ｃ−ピラゾールおよびＳ１６６Ｃ−ピラゾールの０．６３ｍｇ／ｍＬおよび０．９１ｍｇ／ｍＬ溶液を得た。
【０３１１】
（ｐ−ニトロフェニルホスフェート溶液（ＰＮＰＰ溶液））
２つの錠剤（各々２０ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−２７６５）を含む）を、ｐＨ８．６緩衝液（４０ｍＬ）に溶解した。この溶液を氷上で保存した。
【０３１２】
（アルカリホスファターゼの透析）
仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−７９２３、ロット１２８Ｈ１２１０および１７Ｈ０２０４）の２本のバイアルを、ｐＨ７．４の透析緩衝液（０．５ｍＬ）と混合した。この混合物を、２×５００ｍＬのｐＨ７．４の透析緩衝液（１×４ｈ、次いで１×一晩）、次いで２×５００ｍＬのｐＨ９．０の透析緩衝液（２×２ｈ）に対して透析した。次いで、総タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ技術（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定し、そして２．３６ｍｇ／ｍＬであることがわかった。
【０３１３】
（実験の詳細）
４本の１．５ｍＬエッペンドルフチューブを表２２に従って充填した。
【０３１４】
【表１７】
0005180417.tif 000029
各チューブからアリコートを取り出して最初のＨＬＡＤＨ活性およびアルカリホスファターゼ活性を確立するまではこれらのチューブを氷上で保持した。これらの活性を用いて、各チューブについて「時間０」の値を得た（アッセイプロトコルについては以下を参照のこと）。次いで、これらのチューブを３５℃にて水浴でインキュベートした。定期的に、反応混合物のアリコートを、ＨＬＡＤＨ活性およびアルカリホスファターゼ活性をアッセイするために各エッペンドルフチューブから取り出した。
【０３１５】
（ＨＬＡＤＨ活性のアッセイ）
溶液の一部（６５μＬ）をインキュベーションバイアルから取り出し、次いで、ｐＨ９．０のアッセイ緩衝液（２００μＬ）を含むマイクロキュベット中に注入した。このキュベットを２５℃にて２分間インキュベートし、次いで、シクロヘキサノール溶液（３０μＬ）を添加した。次いで、３４０ｎｍでの吸光度を１２０秒間モニターし、そして０．２吸光度単位までの１秒間あたりのＯ．Ｄ．の変化を記録した。
【０３１６】
（アルカリホスファターゼ活性のアッセイ）
一部（１０μＬ）をインキュベーションバイアルから取り出し、次いで、ｐＨ８．６の緩衝液（４９０μＬ）に注入した。この混合物をボルテックスした。１０μＬを混合物から取り出し、そして２５℃にインキュベートした９９０μＬのＰＮＰＰ溶液を含むキュベットに注入した。４０５ｎｍでの吸光度の変化を１２０秒間モニターし、そして１．０吸光度単位までの１秒間あたりのＯ．Ｄ．の変化を記録した。
【０３１７】
（結果）
結果を表１８および表１９に例示する。
【０３１８】
【表１８】
0005180417.tif 000030
【０３１９】
【表１９】
0005180417.tif 000031
（実施例５：炭水化物で修飾されたセリンヒドロラーゼの合成）
特定のレクチンを給餌した動物の混入は、その栄養価をかなり低下させる（Ｇａｔｅｌ（１９９４）Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｌ  ４５：３１７−３４８；Ｍｏｇｒｉｄｇｅら（１９９６）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉ．７４：１８９７−１９０４；Ｐｕｓｚｔａｉら（１９９７）Ｇ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ７７，９３３−９４５）。特に、ダイズベースの給餌へのマンノース結合レクチンの混入は、実質的な精製を伴わない粗給餌の効果的使用を妨げる。
【０３２０】
有用なグリコシル化ＣＭＭの調製を目的として、本発明者らは、例えば、レクチンに指向されたプロテアーゼとして用いるための多数のグリコシル化ＣＭＭの調製を可能にする異なる炭水化物を保有する１１の単糖および二糖メタンチオスルホネートを調製した（図１３）。化学的に結合体化された炭水化物部分を有する多数の化学的に修飾された酵素は、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｏｉｅｔｙ」との発明の名称のＰＣＴ出願ＷＯ  ００００１７１２に記載される。
【０３２１】
（実施例６：マンノシル化ＳＢＬを用いた標的化レクチン分解アッセイ）
本実施例は、糖が修飾されたＣＭＭがレクチンコンカナバリンＡを以下に模式的に示す様式で分解する能力のスクリーニングを、本発明者らが開始することを可能にした、非常に効果的なレクチンアッセイを記載する（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。
【０３２２】
表面に露出した糖基を含むＳ１５６Ｃ−糖ＣＭＭを最初に選択した。各アッセイについて、ビオチン化レクチンを、ｇｌｙｃｏ−ＣＭＭと共にインキュベートし、そしてＧＧ３６−ＷＴと共にインキュベートしたサンプルと比較した。比較を可能にするために、等量の活性な酵素を用いた。これらのサンプルをまた、デコイに対するレクチンについてのこれらの酵素の選択性を測定するために、デコイタンパク質であるジスルフィド結合スクランブルＲＮａｓｅＡ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ＲＮａｓｅＡ）を伴ってまたは伴わずにの両方でインキュベートした。
【０３２３】
小さなタンパク質フラグメント（＜３０００Ｄａ）（タンパク質分解産物）を、サイズ排除膜を用いて、より大きなタンパク質から分離した。レクチンのフラグメントをビオチンを用いて標識し、一方、非レクチンフラグメントを標識しない。遊離されるビオチン化フラグメントのレベルをＨＡＢＡ／アビジン試験を用いて、そして総タンパク質フラグメント濃度のレベルをＡ280を用いての両方でモニタリングすることによって、本発明者らは、レクチン分解の量およびデコイに対するレクチンの選択性を定性的に判断し得る。最初のスクリーニングの結果を図１５Ａおよび図１５Ｂ、図１５Ｃおよび図１５Ｄに示す。
【０３２４】
ＧＧ３６−ＷＴおよび２つのＣＭＭであるＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（図１５Ａおよび図１５Ｂ）およびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）の両方が、レクチンコンカナバリンＡを迅速に分解し得ることは明白である。ＧＧ３６−ＷＴによる、より速い加水分解速度は、Ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−Ｅｔ−ＭａｎおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4についてのそれぞれ１１２ｓ-1ｍＭ-1および８５ｓ-1ｍＭ-1と比較した、２０９ｓ-1ｍＭ-1というＧＧ３６についてのｋcat／ＫM）に対する、より高いｋcat／ＫM値と一致する。
【０３２５】
図１５Ａ〜図１５Ｄのより詳細な実験は、以下を示す：
ａ）遊離したビオチンレベル（レクチン分解を示す）は、互いに類似する。デコイの存在は、ＧＧ３６−ＷＴ分解およびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ分解の両方のレベルをわずかに低下させる。
【０３２６】
ｂ）デコイの存在下でＧＧ３６−ＷＴは、２１０分後に、デコイなしよりもさらに１８％多い総タンパク質を産生する。対照的に、デコイの存在下でのＳ１６６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎは、さらにほんの７％多い総タンパク質を産生する−それゆえ、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎのより高い選択性は、総タンパク質吸光度の変化を１１％低下させた。
【０３２７】
ｃ）さらに、放出されたビオチンレベル（レクチン分解を示す）は互いに類似する。
【０３２８】
ｄ）ＧＧ３６−ＷＴおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃは両方とも、デコイなしよりもデコイの存在下でより多くの総タンパク質を２１０分後に産生する（これらの条件下では、ＷＴについてはさらに７％多く、そしてＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃについてはさらに５％多い）。これらの類似のレベルは、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃの選択性がコンカナバリンＡについてほとんどまたは全くないことを示す。
【０３２９】
このわずかな、しかし刺激的な、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎの選択性の作製は、保護されていないマンノース基の導入と一致する。なぜなら、マンノース基は、コンカナバリンＡの天然のリガンドであるからである。充分に保護されたＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4によって示される選択性がより低いこと／ないことは、レクチンによる正確な認識のための、マンノースの、保護されていないヒドロキシル基の重要性と一致する。
【０３３０】
（実験）
１０個の使い捨てエッペンドルフバイアルを表２０に示すように充填する。
【０３３１】
【表２０】
0005180417.tif 000032
これらの溶液を、サーモスタットによって制御された水浴中で３５℃に温めた。示されたインキュベーション時間の後、適切なバイアルの内容物を各々、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＳＲ３  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＷＣＯ  ３０００、２ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水によって予め清浄にし、３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離した）の頂部に置き、３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。次いで、得られた濾液を表２１および表２２に示すようにアッセイした。
【０３３２】
【表２１】
0005180417.tif 000033
【０３３３】
【表２２】
0005180417.tif 000034
（実施例７）
（他のグリコシル化ＣＭＭを使用するレクチン分解アッセイおよびより高いおとりタンパク質濃度を有するマンノシル化ＳＢＬのレクチン分解アッセイ）
以前に報告されたＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎ（Ａｃ）4に加えて、レクチンアッセイを他のグリコシル化ＣＭＭに対して実施した。さらに、より高いレベルのおとり濃度でのＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎの選択性を調べた。データは、Ｓ−ＥｔＭａｎＡｃについてと同様に、他の糖グルコース、ガラクトースおよびラクトースは、ほとんどまたは全く選択性を示さないことを示した。５倍レベルの高いおとり濃度を有するＳ１５６Ｃ−Ｓ−ＥｔＭａｎに挑戦することによって、このマンノシル化ＣＭＭの選択性は、おとりを有する、および有しない総タンパク質レベルにおいて、約１２％の差異に減少した。
【０３３４】
（実験：）
（レクチンアッセイ方法）
１０の使い捨てエッペンドルフバイアルを、表２３に示されるように満たした。
【０３３５】
【表２３】
0005180417.tif 000035
aレクチン−アッセイ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ８．６。
bＭｉｌｌｉ  Ｑ水中でのビオチニル化コンカナバリンＡ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の５ｍｇ／ｍＬ。
cＭｉｌｌｉ  Ｑ水中でのＳｃｒａｍｂｌｅｄ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）を有するリボヌクレアーゼＡの５ｍｇ／ｍＬ。
d２０ｍＭ，１ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ５．５中のグリコ−ＣＭＭ（ＰＭＳＦによって決定される）と同じ濃度に希釈された、凍結乾燥されたＧＧ３６−ＷＴの溶液。
【０３３６】
これらの溶液は、サーモスタッド制御水浴中で３５℃に加温された。示されたインキュベーション時間の後、適切なバイアルの内容物を、それぞれ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＳＲ３  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ  ３０００，３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離されたＭｉｌｌｉ  Ｑ水の２ｍＬで先に洗浄された）に配置し、そして３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。得られた濾液を、次いで、表２４、表２５および表２６に示されるようにアッセイした。
【０３３７】
【表２４】
0005180417.tif 000036
a１ｍＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水を用いて調製された８００μＬのＨＡＢＡ／Ａｖｉｄｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）。
b２００μＬのレクチン−アッセイ濾液の添加後
cＭｉｌｌｉ  Ｑ水ブランク（１ｍＬ）と比較された、７００μＬのＭｉｌｌｉ  Ｑで希釈された３００μＬのレクチン−アッセイ濾液に対する値。
dサンプルに対する吸光度におけるＨＡＢＡ／ドロップと希釈のみによって引き起こされる吸光度のドロップ（コントロール）との間の計算値。
【０３３８】
【表２５】
0005180417.tif 000037
a,b,c,dは上記の通り。
【０３３９】
【表２６】
0005180417.tif 000038
a,b,c,dは上記の通り。
【０３４０】
（レクチンのないコントロール）
コンカナバリンの１００μＬアリコートを１００μＬのＭｉｌｌｉ  Ｑ水で置き換えること以外、方法１のように、アッセイを実施した。結果を表２７に示す。
【０３４１】
【表２７】
0005180417.tif 000039
a,b,c,dは上記の通り。
【０３４２】
（レクチンアッセイ方法２）
１０の使い捨てエッペンドルフバイアルを表２８に示されるように満たした。
【０３４３】
【表２８】
0005180417.tif 000040
aレクチン−アッセイ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ８．６。
bＭｉｌｌｉ  Ｑ水中でのビオチニル化コンカナバリンＡ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の５ｍｇ／ｍＬ。
cＭｉｌｌｉ  Ｑ水中でのＳｃｒａｍｂｌｅｄ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）を有するリボヌクレアーゼＡの５ｍｇ／ｍＬ。
d２０ｍＭ，１ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ５．５中のグリコ−ＣＭＭ（ＰＭＳＦによって決定される）と同じ濃度に希釈された、凍結乾燥されたＧＧ３６−ＷＴの溶液。
【０３４４】
全てのさらなる決定を、方法１のように実施し、そして結果を表２９に示す。
【０３４５】
【表２９】
0005180417.tif 000041
a,b,c,dは方法１の通り。
【０３４６】
（実施例８）
（ビオチン−ＭＴＳの合成）
標的化ステラテジーを明確に実証するためのモデル系としてビオチンのアビジンへの強力な結合を開発するために、ビオチン−ＭＴＳ試薬１を合成した。
【０３４７】
選択した合成ストラテジーにおいて（図１６、スキーム７）、本発明者らは、以前の研究が、分子のこの部分の機能化が、アビジンに対する親和性を保存することを示したように（Ｇｒｅｅｎ（１９７５）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２９：８５−１３３；Ｇｒｅｅｎ（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４：５１−６７）、メタンチオスルホネートを導入するポイントとしてビオチンのカルボン酸基を選択する。
【０３４８】
ＮａＢＨ4を使用するＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（３）（文献の方法（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７：１４０６−１４１０）に従って６１％の収率で（＋）−ビオチン（２）から合成された）を還元する最初の試みは、乏しい１５％の収率の（＋）−ビオチノール（４）を与えたのみであった。対照的に、（＋）−ビオチン（２）のＬｉＡｌＨ４での直接的な還元は、４を適切な収率で与えた（ＦｌａｓｔｅｒおよびＫｏｈｎ（１９８１）Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．１８：１４２５−１４３６）。ＴＨＦが（＋）−ビオチンの非常に低い収率を与えるのみであるので、溶媒としてのエーテルの使用は、この完全の成功に対して重要である。
【０３４９】
ビオチノール（４）は、本発明者らの確立された調製手順に従って、対応する第１級メシレートおよびブロミドを介して標的ビオチン−ＭＴＳに合成された。ＭｓＣｌの使用は、第１級クロリドの競合形成の結果として、メシレートの中程度の収率に導くのみであった。結果的に、ビオチノール（４）は、ピリジン／ＤＣＭ中のメシル無水物（ｍｅｓｙｌｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、次いで、還流アセトン中のＬｉＢｒおよび最終的に、ＤＭＦ中のＮａＳＳＯ2Ｍｅで処理されて、３工程で５４％の収率で、標的ビオチン−ＭＴＳ１をえた（（＋）−ビオチン（２）からの３７％の全収率）。この合成をスケールアップする試みは、収率の減少を与えた。
【０３５０】
（実験：）
（ヒドロキシスクシンアミドエステル（３）を介する（＋）−ビオチノール）
１，１’−ジカルボニルイミダゾール（３６０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）の（＋）−ビオチン（２）（５４０ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液にＮ2下で添加し、そして得られた溶液をＣＯ2の展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）が中断するまで（約３０分）、加熱した。この溶液を、室温に冷却し、さらに２時間攪拌し、その時間の間に、固体が、溶液から沈澱した。ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２６０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そしてこの混合物を攪拌した。さらなる６時間後、反応溶媒を除去し、そして残渣を最初にプロパン−２−オール（ｍｐ１８７〜１８７℃）から再結晶し、次いで、ＤＭＦ／プロパン−２−オールから再結晶して、３（４５７ｍｇ、６１％）を白色固体として得た；ｍｐ１９７〜２０１℃（ＤＭＦ／プロパン−２−オール）［文献、Ｂｅｃｋｅｒら（１９７１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６８：２６０４−２６０７；文献、Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ（１９９０）Ｏｒｇ．Ｐｒｅｐ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｌ．２２：１１９−１２１，ｍｐ２１０℃］；
【０３５１】
【数４】
0005180417.tif 000042
ＮａＢＨ４（５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を、窒素下、ＴＨＦ／ＨＭＰＡ（４０：１，４１ｍＬ）中で攪拌された３（１７０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。４．５時間後、反応溶媒の体積を減少させ、そして得られた残渣を水でクエンチした。残渣をさらに真空下で乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3，１：１９）により精製して、４（１７ｍｇ、１５％）を白色固体として得た。
【０３５２】
（５−（［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンチルメタンチオスルホネート［（＋）−ビオチンＭＴＳ］（１））
（＋）−ビオチン（２）（１９６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、窒素下で、８０℃に注意深く加温することによって、ピリジン（５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、窒素下で、新たに蒸留した乾燥エーテル（２５ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ4（１９６ｍｇ、５．１５ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下した。３０分後、得られた混合物を加熱して還流した。さらなる４０分後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3，１：９）は、出発物質（Ｒｆ０．４５）からの主生成物（Ｒｆ０．３５）の形成を示した。この反応系を冷却し、そして残るＬｉＡｌＨ4を水の滴下によってクエンチした。発泡が消えた後、さらなる水（１００ｍＬ）を添加し、そして溶媒を除去した。残渣を、真空下で一晩乾燥し、次いで、フラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3、１：１９）により精製して、（＋）−ビオチノール［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα］−テトラヒドロ−４−（５−ヒドロキシペンチル）−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン（４）（１２８ｍｇ、６９％）［５３９０６−３６−８］を白色固体としてえた；ｍｐ  １６８−１７２［文献、米国特許第２，４８９，２３７号、ｍｐ  １７４．５−１７５．５（ＭｅＯＨ）］；［α］２８Ｄ＝＋９１．２（ｃ０．４３，ＭｅＯＨ）［文献、［α］２８Ｄ＝＋８４．７（ｃ１、ＭｅＯＨ）］；
【０３５３】
【数５】
0005180417.tif 000043
Ｍｓ2Ｏ（７８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）がピリジン／ＤＣＭ（１：１、４ｍＬ）中の４（８０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で添加した。１４時間後、溶媒を除去した。残渣をＣＨＣ１3（３０ｍＬ）に溶解し、洗浄し（水（１０ｍＬ）、ブライン（１０ｍＬ））、乾燥し（ＭｇＳ０4）、濾過し、そして、溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3，１：５０）によって精製し、メシレート［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα）］−テトラヒドロ−４−［５−（メタンスルホニル）ペンチル］−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン（８３ｍｇ，７７％）を黄色の油状物として得た；スケールアップは、メシレートを薄黄色の固体として提供した；ｍｐ１３４−１３６；ＩＲ（フィルム）３４３２（ＮＨ），１７０２  （アミドＩ），１６３６（アミドＩＩ）ｃｍ-1；
【０３５４】
【数６】
0005180417.tif 000044
ＬｉＢｒ（８０ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を、アセトン（２ｍＬ）中のメシレート（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素下で添加し、そして得られた溶液を還流下で加熱した。１４時間後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3，１：９）は、出発物質（Ｒｆ  ０．４５）の生成物への転換を示した。溶媒を除去し、そして残渣をエーテル（３０ｍＬ）と水（１０ｍＬ  ）との間に分配した。水分画をさらに、臭化物がより可溶性であるＣＨＣｌ3（３０ｍＬ  ２）で抽出した。有機分画を合わせ、乾燥し（ＭｇＳ０4）、濾過し、そして溶媒を除去して、粗臭化物［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα）］−テトラヒドロ−４−（５−ブロモペンチル）−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン（２８  ｍｇ、７４％）を黄色の油状物として得、これを次の行程で直接使用した。スケールアップは、生成物を薄黄色の固体として提供した；ｍｐ  １５７〜１５９。
【０３５５】
ＮａＳＳＯ2Ｍｅ（１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の粗臭化物（２４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、得られた溶液を５０℃で窒素下で加熱した。１９時間後、ｔｌｃ（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3，１：９）は、出発物質（Ｒｆ  ０．４５）からの主生成物（Ｒｆ  ０．３５）の形成を示した。溶媒を除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣ１3、１：１９、次いで３：９７）の繰り返しによって、１（２５ｍｇ，９４％，（＋）−ビオチン（２）から３７％）をアモルファスな固体として得た；スケールアップは、１を薄黄色の固体として提供した；［α］D26＋４２．１（ｃ，ＣＨＣ１3中０．６２）；ＩＲ（フィルム）３２１５  （ＮＨ），１６９９（Ｃ＝Ｏ），１３１０，１１２９（Ｓ−ＳＯ2）ｃｍ-1；
【０３５６】
【数７】
0005180417.tif 000045
（実施例９）
（ビオチン−ＣＭＭの調製および特徴付け）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＭＴＳ試薬１を使用して、Ｎ６２Ｃ、Ｌ２１７Ｃ、Ｓ１６６Ｃ、およびＳ１５６Ｃ変異体のビオチニル化ＣＭＭを、標準的なプロトコルに続いてｐＨ９．５での反応によって、調製した。全ての場合において、得られた酵素は、修飾後活性であった。
【０３５７】
（ビオチン−ＣＭＭのアミダーゼ速度論）
アミダーセ速度論およびＥＳＭＳについてのデータが、表３０に示される。
【０３５８】
【表３０】
0005180417.tif 000046
０．１Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ  ８．６，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０，１％  ＤＭＳＯ中の初期速度の方法によって、２連で決定した速度定数。
［Ｓ］＝０．１２５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝１．４  １０-8Ｍ〜２．４  １０-8Ｍ。
【０３５９】
全てのビオチン−ＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴ（ｋcat／ＫM＝２０９  １５）より小さい触媒活性を有した。
【０３６０】
Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭに対する値は、類似し、そしてＳＢＬ−ＷＴと比較してｋcatの減少を示し、ここで、ｋMの変化は無視できる。
【０３６１】
Ｓ１６６Ｃ変異体のビオチン−ＭＴＳ試薬を用いる修飾は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、４倍低いｋcat／ＫMを与えた。Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭはまた、全てのビオチニル化ＣＭＭｓの最も低いｋcat／ＫMを有した。ｋcatおよびＫMの両方は、このＣＭＭについて変更される。
【０３６２】
Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、わずかに減少したｋcatを有し、そして全てのビオチン−ＣＭＭの最も高いＫMを有するが、それは、これらビオチニル化ＣＭＭのなおも最も活性なものである。
【０３６３】
（ビオチン−ＣＭＭのエステラーゼ速度論）
エステラーゼ速度論動力学を、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ＳＢｎを基質として用いる標準のプロトコルに従って、ビオチン−ＣＭＭについて実行した。結果を、表３１に示す。
【０３６４】
【表３１】
0005180417.tif 000047
０．１Ｍ  ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ  ８．６，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０，１％  ＤＭＳＯ中の初期速度の方法によって、２連で決定した速度定数。［Ｓ］＝０．０１５ｍＭ〜３ｍＭ、［Ｅ］＝０．８×１０-9Ｍ〜１．２×１０-9Ｍ。
【０３６５】
エステラーゼ活性についてのｋcat／ＫM結果が、アミダーゼ速度論と比較して同じ傾向につづく。
【０３６６】
Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、最も小さいｋcat／ＫMを示し、これは、ＳＢＬ−ＷＴに対して約４倍低い。
【０３６７】
ビオチン−ＣＭＭは、唯一の例外としてＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭを有するＳＢＬ−ＷＴ比較して、約４倍低いｋcatを有する。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭのｋｃａｔは、ＳＢＬ−ＷＴに対して約２倍小さく、そして従って、他のビオチン−ＣＭＭと比較して２倍高い。しかし、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、全てのビオチニル化ＣＭＭの最も活性なのもではない。なぜなら、それは、最も高いＫM値を有するからである。Ｓ１５６-Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンは、非常に類似しており、ＳＢＬ−ＷＴに対して約３倍小さいが、ｋcatおよびＫMは、大きな差異を示す。
【０３６８】
ビオチン−ＣＭＭのＫM値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭに対してより高かった。ところが、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭおよびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンに対する値は、ＳＢＬ−ＷＴと比較して、約２倍小さい。
【０３６９】
Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンＣＭＭは、全てのビオチニル化ＣＭＭの最も小さいＫMを有し、そしてＳＢＬ−ＷＴより２．６倍小さい。それはまた、ビオチン−ＣＭＭの最も小さいｋcatを有するが、それは、最も高い触媒活性を有し、この活性は、ＳＢＬ−ＷＴよりなお１．８倍小さい。
【０３７０】
（実施例１０）
（結合タンパク質の標的化−アビジンのビオチン-ＣＭＭを用いる標的かおよび加水分解）
ビオチニル化タンパク質は、ビオチンが、高分子の表面から分離される場合のみに、アビジンに結合することが文献から公知であり、ビオチンは少なくとも５つのメチレン基によって共有結合されている（Ｇｒｅｅｎ（１９７０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８Ａ：４１８４２４）。さらに、Ｗｉｌｃｈｅｋらは、蛋白分解性酵素が、アビジンを切断し得ないことを観測した。プロテアーゼが、ビオチニル化されていない場合でさえ、アビジンは切断されない（Ｂａｙｅｒら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１１２７４−１１２７９）。
【０３７１】
このプロジェクトにおける本発明者らのゴールは、ただそれを論証しもするために、本発明者らの新しいビオチン−ＣＭＭのアビジンへの標的化を確立することだけでなく、ＣＭＭが、アビジン蛋白分解を触媒し得ることを立証するとこである。ＳＢＬ−ＷＴ（これは、アビジンを複合体化し得ないが、非選択的なプロセスにおいてアビジンを加水分解し得る）を、比較のために使用する。
【０３７２】
グリコシル化ＣＭＭでのレクチン分解を立証するために、以前に使用された比色定量法が、標的アビジンへの合成ビオチン−ＣＭＭのアビジンを標的化する能力をアッセイするために使用された。本発明者らは、ＨＡＢＡ／アビジン試薬からのＨＡＢＡの放出（これは、５００ｎｍでの吸光度の増加によって検出された）を測定した。全てのビオチニル化ＣＭＭを試験し、そして使用したＣＭＭの量を、ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて、ｋcat／ＫMに基づいて互いに比較して等しい触媒活性について補正した。それゆえ、アビジンを標的化する、本発明者らのビオチン−ＣＭＭの能力の差異が議論され得る。
【０３７３】
アビジンを標的化するだけでなく、加水分解する本発明者らのビオチン−ＣＭＭの能力を調べるために、本発明者らは、本発明者らのビオチニル化ＣＭＭを用いるアビジンの標的化についてのアッセイおよびアビジンの加水分解についてのアッセイを分離することに決定した。
【０３７４】
上記のように、標的化は、ＨＡＢＡ／アビジン溶液からのＨＡＢＡの放出を、５００ｎｍで測定することによって、明確に証明され得る。ここで、本発明者らは、この方法をアビジンについての標的化アッセイのために使用することに興味があるのみであるので、本発明者らは、ＨＡＢＡ放出を５分間にわたって測定した。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについてのみ、導入されたビオチン側鎖は、表面曝露され、従って、アビジンの結合に対して容易にアクセス可能であるという事実に関わらず、驚くべきことに、全てのビオチン−ＣＭＭは、ＨＡＢＡ／アビジンの緩衝化溶液に添加され場合、即座のＨＡＢＡ放出を引き起こす。その表面曝露のために、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン他のＣＭＭと比較して、最も高いＨＡＢＡ放出を生じた。
【０３７５】
本発明者らは、ＳＢＬ−ＷＴの溶液（同じ触媒活性について計算された濃度）との比較および（＋）−ビオチンの添加［（ＰＭＳＦ−値の決定によって）ビオチン−ＣＭＭの各々の１つにおいて期待される濃度と同じ濃度に希釈された］によって、標的化プロセスを制御した。
【０３７６】
立体配置の理由のために、（＋）−ビオチンは、本発明者らのＣＭＭのビオチン化側鎖より、アビジンに結合するためにより利用しやすいので、本発明者らは、ビオチン／ＷＴ混合物と比較して、全てのビオチン−ＣＭＭについてのより小さな、または最良の場合には、同じＨＡＢＡ放出を予測した。
【０３７７】
Ｓ１６６Ｃ−、Ｎ６２Ｃ−およびＬ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチンにより、本発明者らの予測が確かになったが、Ｓ１５６Ｃ  ＣＭＭは、強烈により高いＨＡＢＡ放出を与えた。
【０３７８】
従って、本発明者らは、凍結乾燥によりＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン溶液の全タンパク質量を決定し、そして再びビオチン量を決定した（Ｂ２ａ）。この場合、ビオチン／ＷＴ混合物についてのＨＡＢＡ放出がＳ１５６Ｃ  ＣＭＭより高く、そして本発明者らは、ＣＭＭ溶液中にビオチン基を有する不活性酵素があり得ることを示唆する。
【０３７９】
ＳＢＬ−ＷＴおよびビオチン−ＣＭＭによりそれぞれ触媒されたアビジン加水分解の決定のために、本発明者らは、レクチンアッセイ法を採用し、そして３０００Ｄａ未満の加水分解フラグメントについてＡ280で測定した。このＣＭＭは標的化アッセイにおいて最良の酵素であることが判明したので、このレクチンアッセイをＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについて行った。比較を可能にし、そして非選択的加水分解を実証するために、ＳＢＬ−ＷＴを、ビオチン−ＣＭＭ溶液と同じ触媒活性に希釈した溶液として使用した。
【０３８０】
ＨＡＢＡ／アビジンおよび酵素を用いた最初の測定により、おそらくＨＡＢＡにより生じた異常が明らかになり、従って、本発明者らは、アビジン単独でこのアッセイを行うことを決定した。アビジン加水分解の選択性を決定するために、上記のレクチンアッセイと同様に、デコイタンパク質、ジスルフィドスクランブルＲＮＡｓｅＡ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ＲＮＡｓｅＡ）を使用した。溶液をそれぞれ１時間および４時間インキュベートし、そして加水分解産物である小さなタンパク質フラグメント（３０００Ｄａ未満）をサイズ排除膜を用いてにより分離した。Ａ２８０の測定により、総タンパク質フラグメント濃度が与えられ、従って、これは、アビジン加水分解の指標である。
【０３８１】
ＳＢＬ−ＷＴおよびＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンの両方もまたアビジンを加水分解し得る。酵素濃度は、標準的アミダーゼ基質であるｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを用いて等しい触媒活性に対して計算されるので、加水分解値は直接比較され得る。従って、本発明者らは、アビジンがＳＢＬ−プロテアーゼにより加水分解されるのみならず、ビオチン化プロテアーゼによってより効率的に加水分解されることもまた実証し得る。Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンは、ＧＧ３６−ＷＴより、２４０分後に４５％を超えるタンパク質フラグメントを生じる。デコイタンパク質の存在下で［０．０５ｍｇ，デコイ（１）］、生成された総タンパク質の量は、ＷＴ酵素に関して強烈に増加した（２４０分後に２７％）。それに対して、総タンパク質の産生量は、ビオチン−ＣＭＭに関しては有意に変化しなかった。しかし３倍高いレベルのデコイタンパク質［０．１５ｍｇ，デコイ（２）］が、総タンパク質の産生量を増大させることにおいてＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについて生じた（２４０分後に３８％）。このことは、アビジンについての選択性の減少を示す。異なる量のビオチンを添加したＧＧ３６−ＷＴについてのコントロールとともに行った研究において、差異はかなり小さかった。
【０３８２】
（実験）
（アビジン標的化アッセイ（ＨＡＢＡの置換））
１２の使い捨てキュベットを表３２に示すように満たした（ビオチンおよび酵素添加測定（Ａ500）の前）：
【０３８３】
【表３２】
0005180417.tif 000048
a  アッセイ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．６。
b  １０ｍＬのミリＱ水で調製したＨＡＢＡ／アビジン試薬（Ｓｉｇｍａ）。
c  ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）。
d  アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
e  １０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８（ＰＭＳＦ較正した）中で凍結乾燥したＧＧ３６−ＷＴの溶液。
f  アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．５３４ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
g  アッセイ緩衝液中の活性Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．２６０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
h  アッセイ緩衝液中の活性Ｌ２１７Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３５９ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
i  アッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン２００μＬのタンパク質量（凍結乾燥により決定された）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
【０３８４】
ビオチンおよび酵素を添加する前に、Ａ500が安定化するまで（５〜１０分）キュベットを分光光度計中で平衡化した。ビオチンおよび酵素をそれぞれ添加し、Ａ500を５分間測定した。表３３は、アッセイ結果を示す：
【０３８５】
【表３３】
0005180417.tif 000049
a  酵素（およびビオチン）を添加する前のＨＡＢＡ／アビジンおよび緩衝液の混合物。
b  酵素（およびビオチン）を添加して５分後の値。
c  サンプルに対する吸光度におけるＨＡＢＡ／アビジン低下と希釈単独により生じた吸光度（コントロール）の低下との間の差異から計算した。
【０３８６】
（Ｓ１５６Ｃ−ビオチンのみに対して測定した（Ａ280測定を介した）アビジン加水分解アッセイ）
２０の使い捨てエッペンドルフバイアルを表３４に示すように満たした。
【０３８７】
【表３４】
0005180417.tif 000050
a  アッセイ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．６。
b  ミリＱ水中のアビジン（Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇ／ｍＬ溶液。
c  ミリＱ水中のを含有するＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液。
d  ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．８）。
e  １０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中のビオチン−ＣＭＭと同じ触媒活性（ｓＡＡＰＦＮＡでの初期速度論により決定された）に希釈した凍結乾燥ＧＧ３６−ＷＴの溶液。
f  アッセイ緩衝液中の活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ）２００μＬと同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
g  アッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン２００μＬのタンパク質量（凍結乾燥により決定された）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
【０３８８】
サーモスタット制御水浴中で、示された時間の間、これらの溶液を３５℃でインキュベートした。次いで、適切なバイアルの内容物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＳＲ３  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ  ３０００、２ｍＬのミリＱ水により３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離して予めきれいにした）の上に各々配置し、そして３７５０ｒｍで６０分間遠心分離した。次いで、得られた濾液を表３５に示すようにアッセイした。
【０３８９】
【表３５】
0005180417.tif 000051
a  ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、３００μＬのミリＱ水で希釈したアビジン加水分解アッセイ濾液７００μＬについての値。
【０３９０】
（アビジンなしのコントロール）
アビジンの１００μＬのアリコートを１００μＬのミリＱ水で置き換えたことを除いて、アビジン加水分解アッセイのようにアッセイを行った；Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンおよびより多量のデコイタンパク質［０．１５ｍｇ、デコイ（２）］についての測定をアビジンなしのコントロールのように反復しなかった（表３６を参照のこと）。
【０３９１】
【表３６】
0005180417.tif 000052
a  上記のとおり。
【０３９２】
（Ｓ１６６Ｃ−ビオチン、Ｌ２１７Ｃ−ビオチンおよびＮ６２Ｃ−ビオチンを用いた（Ａ280測定を介した）アビジン加水分解アッセイ）
アビジン加水分解アッセイを、以前に報告したＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンに加えて、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンおよびＳ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンについても行った。比較のために、本発明者らは、Ｓ１５６Ｃ  ＣＭＭについての結果を再び報告する。
【０３９３】
Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンは、ＳＢＬ−ＷＴより、２４０分後に７２％を超えるタンパク質フラグメントを生じる。デコイタンパク質［０．０５ｍｇ］の存在下で生成された総タンパク質の量はＷＴ酵素に関して強烈に増加する（２４０分後に２３％）に対して、ビオチン  ＣＭＭに関しては、総タンパク質の産生量は、有意に変化しない。
【０３９４】
Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンは、２４０分後にＳＢＬ−ＷＴとほぼ同じ量のタンパク質フラグメントを提供する。しかし、デコイの存在下では、Ｎ６２Ｃ  ＣＭＭは、２４０分後に５％を超えるタンパク質放出を与えるに過ぎず、従って、ＳＢＬ−ＷＴ（２４０分後に２３％を超えるタンパク質フラグメント）より明らかにより選択的である。この結果は、ビオチン部分に曝された表面を含むＳ１５６Ｃ  ＣＭＭと比較して、Ｎ６２Ｃ  ＣＭＭによるタンパク質加水分解全体があまり効率的でないので、Ｎ６２Ｃ  ＣＭＭのビオチン側鎖が利用しにくいことを示唆する。しかし、Ｎ６２  ＣＭＭにおいてビオチン側鎖が触媒中心に隣接しているので、そのアビジン加水分解選択性は、Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンとほぼ同じくらい効率的である。
【０３９５】
Ｓ１６６Ｃ  ＣＭＭは、ＳＢＬ−ＷＴと比較して７％を超えるタンパク質放出を与えるが、デコイタンパク質の存在下ではかなり非選択的である［２４０分後のＳＢＬ−ＷＴに関して２３％と比較すると、１８％タンパク質フラグメント］。この酵素は、「アビジン標的化アッセイ」において二番目に最良なビオチン−ＣＭＭであることが判明したが、「アビジン加水分解アッセイ」に対してはＮ６２Ｃ  ＣＭＭよりあまり選択的でない。おそらくＳ1ポケットに埋没したビオチン側鎖は、アビジン標的化には利用可能であるが、アビジン加水分解の有効性および選択的触媒についてはコンホメーション的にあまり都合が良くない。
【０３９６】
（実験）
１４の使い捨てエッペンドルフバイアルを表３７に示すように満たした。
【０３９７】
【表３７】
0005180417.tif 000053
a  アッセイ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．６。
b  ミリＱ水中のアビジン（Ｓｉｇｍａ）の５ｍｇ／ｍＬ溶液。
c  ミリＱ水中のｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液。
d  ２００μＬのＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）。
e  １０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中のビオチン−ＣＭＭと同じ触媒活性（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡでの初期速度論により決定された）に希釈した凍結乾燥ＧＧ３６−ＷＴの溶液（ビオチン−ＣＭＭの濃度はｆを参照のこと）。
f  Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．３２９ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．２６０ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチン（０．５３４ｍｇ／ｍＬ）；ビオチン−ＣＭＭの濃度は、同じ触媒活性（ｓｕｃｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡでの初期速度論により決定された）に対して計算した；１０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８中の溶液。
g  活性ビオチン−ＣＭＭの２００μＬ（Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンについては、０．０６０ｍｇ／ｍＬ  ビオチン、Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンについては、０．０４７ｍｇ／ｍＬ  ビオチン、Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンについては０．０９７ｍｇ／ｍＬ  ビオチン）と、またはアッセイ緩衝液中のＳ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチン２００μＬのタンパク質量（凍結乾燥により決定された；０．６４９ｍｇ／ｍＬ  ビオチン）と同じ濃度に（１０μＬ中で）希釈したｄ−ビオチン（Ｓｉｇｍａ）の溶液。
【０３９８】
サーモスタット制御水浴中で、示された時間の間、これらの溶液を３５℃でインキュベートした。次いで、適切なバイアルの内容物をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＳＲ３またはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＹＭ−３  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ  ３０００、２ｍＬのミリＱ水により３７５０ｒｐｍで９０分間遠心分離して予めきれいにした）の上に各々配置し、そして３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。次いで、得られた濾液をアッセイし、そして結果を表３８、表３９、表４０、表４１、および表４２に示す。
【０３９９】
【表３８】
0005180417.tif 000054
a  ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、アビジン加水分解アッセイ濾液の７００μＬ（３００μＬのミリＱ水で希釈した）に対して三連で決定した値。
【０４００】
【表３９】
0005180417.tif 000055
a  ミリＱ水ブランク（１ｍＬ）と比較して、アビジン加水分解アッセイ濾液の７００μＬ（３００μＬのミリＱ水で希釈した）に対する値。
b  １００μＬのデコイタンパク質の代わりに３００μＬを使用した。
【０４０１】
【表４０】
0005180417.tif 000056
a  上記の通り。
【０４０２】
【表４１】
0005180417.tif 000057
a  上記の通り。
【０４０３】
【表４２】
0005180417.tif 000058
a  上記の通り。
b  活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。
c  活性Ｎ６２Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。
d  活性Ｓ１６６Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。
e  総タンパク質量（活性および不活性酵素）について計算した活性Ｓ１５６Ｃ−Ｓ−ビオチンと同じビオチン量。
【０４０４】
（実施例１１：ハプテン修飾サブチリシンを使用する標的化抗体）
酵素の標的化分解の延長として、本発明者らは、ＳＢＬによる抗体のハプテン特異的分解（ｈａｐｔｅｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄｅａｔｉｏｎ）に焦点を当てた。この実施例は、抗ビオチン抗体／ビオチン系を用いた抗体標的化を示す。
【０４０５】
（ビオチンＭＴＳおよびビオチン化ＣＭＭの調製）
抗ビオチンをＳＢＬで標的化するために、本発明者らは、本発明者らの変異酵素にビオチン−ＭＴＳ試薬を結合させた。ビオチン−ＭＴＳの合成を、実施例８に概説されるように行った。ＣＭＭの各々を、標準的プロトコルに従って調製した（例えば、実施例９に記載）。全てのＣＭＭをＭＡＬＤＩ技術を用いて特徴付けした。この技術は、±０．２〜０．５％の大きさで方法依存性誤差を有する。結果を表４３および表４４に示す。
【０４０６】
【表４３】
0005180417.tif 000059
新たなビオチン化ＣＭＭのアミダーゼ活性を決定した。そしてこの活性は、上記の実施例９に記載のように同じ傾向を示す。この結果を表４４に示す。
【０４０７】
【表４４】
0005180417.tif 000060
（ビオチン化ＣＭＭについての抗ビオチンに対する標的化アッセイ）
ビオチンに対する（抗ビオチン）抗体は、何も結合していない（ｆｒｅｅ）抗体または酵素結合体のいずれかとして市販されている。本発明者らは、本発明者らのモデル標的抗体として、アルカリホスファターゼに結合体化した抗ビオチンを選択した。標準的な酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を用いて、本発明者らは、本発明者らのＣＭＭが抗体を標的化する能力を示し得た。実験を、図１７に模式的に概説する。
【０４０８】
本発明者らの最初のアッセイシリーズを、ポリスチレン９６ウェルプレートで（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ，５６４〜５９７頁）、ＥＬＩＳＡ技術を用いて行った（図１７）。ＣＭＭをプレート表面に４℃で一晩固定化した［ポリスチレンプレートに対するタンパク質の代表的な結合は、約１００ｎｇ／ウェル（３００ｎｇ／ｃｍ2）である］。本発明者らの場合、酵素溶液で各ウェルを十分に満たさなかったので、あまり多くのタンパク質は結合していない。プレート上の残りの結合部位をＢＳＡでブロックした後、非結合タンパク質（緩く結合した抗体およびＢＳＡ）をＴｗｅｅｎを含むリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳＴ）で２回洗い流した。（Ｔｗｅｅｎをこの緩衝液において使用して、結合していないポリスチレン表面に抗体が結合することを妨げた）。次いで、抗ビオチンを各ウェルに添加し、そして４℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで（４回）洗浄して、緩い、結合していないタンパク質を除去し、次いで、グリシン緩衝液、ｐＨ１０．４で（２回）洗浄して、リン酸緩衝化生理食塩水を洗い流し、そしてアルカリホスファターゼ活性のためにｐＨを最適化した。ビオチン−ＣＭＭ／抗ビオチン結合をアッセイするために、抗体に結合体化したアルカリホスファターゼの酵素活性を使用した。ホスファターゼ基質［グリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）中のｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ＰＮＰＰ）の溶液]を添加し、そして反応を４℃で行った。ｐ−ニトロフェノレートの放出を９６ウェルプレートを用いて視覚的に決定した（図１７）。
【０４０９】
９６ウェルの結果から、本発明者らは、ＰＮＰＰ基質の量が、本発明者のビオチン−ＣＭＭの抗ビオチンに対する標的化能力の差異を実証するために非常に重要であることを見い出した。多量の基質を使用して、本発明者らは、異なるＣＭＭ間を区別することが出来なかった。なぜなら、全て、３０分以内に明黄色を生じたからである。しかし、この色の変化が、この場合において非常に迅速であったので、本発明者らは、プレート上のＳ１５６Ｃ−ビオチンの位置をなお識別し得た。
【０４１０】
本発明者らはまた、ＷＴ−ＳＢＬおよびＣＭＭ−ＳＢＬに対するインヒビターとしてＰＭＳＦを使用して（ＳＢＬは、抗ビオチンを加水分解して、ネガティブな結果を導き得るので）、コントロール反応を行った。ＰＭＳＦを含む反応とＰＭＳＦを含まない反応との間には、差異が見い出されなかった。従って、本発明者らは、以下の実験からこの試薬を除外した。
【０４１１】
９６ウェルプレート実験についてのプロトコールおよび条件と、同じプロトコルおよび条件を使用して、後者の実験を、ポリスチレンキュベット中で行い、そしてＰＮＰＰ（１ｍＬ中、１５０μＬ）から放出されたｐ−ニトロフェノレートの吸収（Ａ405）を、分光光度的にモニターした（表４５）。高い希釈度のＰＮＰＰを使用したので、この反応を、長時間モニターした。キュベットを使用するこのアッセイの結果は、９６ウェルプレートからの結果と必ずしも一致しないことに留意すべきである。これは、おそらく、９６ウェルプレートが、タンパク質結合用に開発されているという事実に起因した。このアッセイの結果を、表３７に示す。
【０４１２】
【表４５】
0005180417.tif 000061
全てのＣＭＭは、ＷＴと比較した場合に、ｐ−ニトロフェノレートのより高い放出を生じた。Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが、最も高いｐ−ニトロフェノレート放出（３０時間後で、ＷＴよりも８６．５％高い）を誘導することが見い出され、これは、Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが、抗ビオチンＩｇＧ標的化について最も有能なＣＭＭであることを示す。
【０４１３】
さらなる実験は、ＰＮＰＰの濃度を増加して（１ｍＬ中、３００μＬ）、観察時間を短縮し得るということを示唆した。ｐ−ニトロフェノレート放出の傾向は、低いＰＮＰＰ濃度のアッセイの場合と同じである。この結果を、表４６に示す。
【０４１４】
【表４６】
0005180417.tif 000062
全てのビオチン化ＣＭＭは、ＷＴと比較して、ｐ−ニトロフェノレート放出の増加を生じた。従って、ビオチン−ＣＭＭの抗ビオチンに対する結合は、生じたはずである。これらのアッセイの結果（表３７および表３８）は、本発明者らのビオチン化ＣＭＭがビオチン−抗体を標的化する能力を、明らかに実証する。
【０４１５】
（ビオチン化ＣＭＭによる抗ビオチンの「加水分解」アッセイ）
次に、本発明者らは、本発明者らのＣＭＭが抗ビオチンを選択的に加水分解する能力を実証することに取り組んだ。本発明者らは、ＳＢＬ媒介アビジン加水分解の間のタンパク質フラグメントの放出をモニターするために、首尾よく使用されるアプローチを採用した。等濃度の活性酵素（ＰＭＳＦ力価測定によって決定されるように）を、これらの実験において使用したことに留意すべきである。これらの酵素および抗ビオチンＩｇＧを、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．６）中、３５℃で、６０分間および２４０分間インキュベートした。以前に報告されたように、サイズ排除膜を使用して、タンパク質フラグメントを粗加水分解物から分離した。２８０ｎｍでの吸収の測定によって、これらの放出されたタンパク質フラグメントの濃度が与えられた。この結果を、表４７に示す。
【０４１６】
【表４７】
0005180417.tif 000063
これらの結果（１つ（Ｌ２１７Ｃ−ビオチン）を除く）は、本発明者らのＣＭＭが、抗ビオチンをＷＴよりも良好に加水分解し得ることを明確に実証する。これらの結果はまた、全てのビオチン化ＣＭＭが抗ビオチンを標的化することを示す標的化の結果（ｐ−ニトロフェノレート放出についてのＡ405アッセイ）に対応し、従って、ＷＴよりも高いｐ−ニトロフェノレート放出を生じた。
【０４１７】
加水分解が、抗ビオチンに特異的に対するものであったか否かを決定するために、本発明者らは、ＲＮＡａｓｅをデコイ（おとり）タンパク質として使用する、ビオチンアッセイ実験を再度採用した。ＷＴと比較した各ＣＭＭ加水分解についての結果を、表４８、表４９、表５０および表５１に示す。
【０４１８】
【表４８】
0005180417.tif 000064
【０４１９】
【表４９】
0005180417.tif 000065
【０４２０】
【表５０】
0005180417.tif 000066
【０４２１】
【表５１】
0005180417.tif 000067
a表中の数は、バックグラウンド反応のＡ２８０で補正する。
【０４２２】
これらの実験は、ＣＭＭ触媒反応についての、デコイタンパク質の存在下と非存在下で行われた反応の間の加水分解の程度における差異が、ＷＴ触媒反応についての差異よりはるかに小さいことを示す。従って、予期されたように、本発明者らのビオチン化ＣＭＭは、ＷＴよりも、より特異的に抗ビオチンを加水分解する。抗ビオチンを含まない（ＳＢＬ−ＣＭＭおよびＲＮＡａｓｅのみ）、ならびにＳＢＬ−ＣＭＭおよびＴｒｉｓ緩衝液単独を含む（ＲＮＡａｓｅおよび抗ビオチンを含まない）、コントロール実験を行った。バックグラウンド吸収は、全ての場合において有意ではなかった。
【０４２３】
（実験：）
（５−（［３ａＳ−（３ａα，４β，６ａα）］−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンチルメタンチオスルホネート［（＋）−ビオチン−ＭＴＳ］）
このビオチン−ＭＴＳを、実施例８に記載の手順に従って調製した。
【０４２４】
（材料）
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を、１Ｌの水中、８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇのＫＨ2ＰＯ4から調製し、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．２に調整し、そして室温で保存した。１０％のアジ化ナトリウム溶液を、１００ｍＬ水中、１０ｇのＮａＮ3から調製し、室温で保存した。ＰＢＳ溶液中の３％  ＢＳＡを、１００ｍＬ水中、３ｇのウシ血清アルブミン（フラクションＶ）から調製し、次いで、０．２ｍＬの１０％ＮａＮ3溶液を添加し、４℃で保存した。Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳＴ）溶液を、１ＬのＰＢＳ溶液中、０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ  ８０から調製した。抗ビオチン溶液（１：３０，０００）溶液を、５０ｍＬの３％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中、１６．６７μＬの抗ビオチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ−６５６１クローンＢＮ−３４、濃度１．１５ｍｇ／ｍＬ）から調製し、４℃で保存した。０．１Ｍグリシン緩衝溶液（ｐＨ１０．４）を、１Ｌの水中、７．５１ｇのグリシン、２０３ｍｇの  ＭｇＣｌ2  Ｈ2Ｏ、１３６ｍｇのＺｎＣｌ2から調製した。このｐＨを、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ１０．４に調整した。ｐ−ニトロフェニルホスフェートの１ｍｇ／ｍＬ溶液を、２０ｍＬの０．１Ｍグリシン緩衝液中、１錠のＰＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−２７６５）（２０ｍｇ）から調製し、４℃で保存した。０．０６ＭのＰＭＳＦ溶液を、４４９．２μＬのＥｔＯＨ中、４７．２ｍｇのαートルエンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）から調製し、０℃で保存した。以下の酵素を使用した：ＷＴ（１ｍｇ／ｍＬ）、Ｎ６２Ｃ−ビオチン（０．９７ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ１５６Ｃ−ビオチン（０．７１ｍｇ／ｍＬ）、Ｓ１６６Ｃ−ビオチン（１．０９ｍｇ／ｍＬ）、およびＬ２１７Ｃ−ビオチン（１．０ｍｇ／ｍＬ）。全ての酵素を、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．８）に溶解した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．６）は、１００ｍＬ水中、１．２１ｍｇのＴｒｉｓからなった。このｐＨを、濃ＨＣｌでｐＨ８．６に調整した。リボヌクレアーゼＡ（５ｍｇ／ｍＬ）は、１ｍＬ水中、５ｍｇのリボヌクレアーゼＡ（乱雑された（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ジスルフィド結合を有する。Ｓｉｇｍａ  Ｒ−２６３８）からなる。
【０４２５】
（ポリスチレン９６ウェルプレートを使用する、抗ビオチンに対するＣＭＭ−ＳＢＬの標的化アッセイ）
５０μＬの各酵素溶液を、図１８に示されるように、ポリスチレン９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。全ての反応を２回行って、結果の再現性を確かめた。
【０４２６】
このプレートを、４℃で一晩インキュベートした。残存する酵素溶液を、ピペットを使用して除去した。次いで、ＢＳＡ／ＰＢＳ（３％、１００μＬ）を、各ウェルに添加し、そしてプレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。ＢＳＡ溶液を除去し、そしてプレートをペーパータオルの層上に振り打ちつけて、プレートを乾燥させた。ＰＭＳＦ（１０μＬ）を、１、３、５、７、９、１１列のＡおよびＢ行に添加した。この手順の後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し（２×）、そして上記のように乾燥させた。抗ビオチン溶液（３０μＬ）を、１、３、５、７、９、１１列のＣおよびＤ行を除く、各ウェルに添加し、プレートを、４℃で２時間維持して、酵素による抗体のタンパク質分解を最小化した。抗ビオチン溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳＴで洗浄して（４×）、結合されていない抗体を除去し、そして結合されていない抗体を除去するために乾燥させた。このリン酸緩衝液を除去し、グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ１０．４）でプレートを洗浄し（２×）、そしてその後乾燥させることによって、ｐＨをアルカリホスファターゼ活性について調整した。次いで、グリシン緩衝液およびＰＮＰＰ溶液を、以下の様式でウェルに添加した：
１．１、３、５、７、９、１１列のＡ行およびＢ行（すでに、１０μＬのＰＭＳＦ溶液で処理されている）を、４０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰで満たした。
２．２、４、６、８、１０、１２列のＡ行およびＢ行を、５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰで満たした。
３．２、４、６、８、１０、１２列のＣ行およびＤ行を、２５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ＋２５μＬのグリシン緩衝液で満たした。
４．２、４、６、８、１０、１２列のＥ行およびＦ行を、１２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ＋３７．５μＬのグリシン緩衝液で満たした。
５．２、４、６、８、１０、１２列のＧ行およびＨ行を、６μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰ＋４４μＬのグリシン緩衝液で満たした。
６．１、３、５、７、９、１１列のＣ行およびＤ行を、５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＮＰＰで満たした。
【０４２７】
アッセイの結果を、以下のように要約し得る：
１、２および３行における反応物は、全ての酵素についてほぼ瞬時に黄色に変わった。１５分後、Ｓ１５６Ｃ−ビオチンについての４行における反応物が、薄黄色に明らかに変色し始めた。Ｓ１６６Ｃ−は、２０分後に変色し始めた。Ｎ６２Ｃ−は、１時間後に変色し始めた。１．５時間後、ＷＴおよびＬ２１７Ｃ−については変色は見られなかった。Ｓ１５６Ｃ−についての６行における反応物は、２時間後に変色を生じた。全ての反応物が、４℃で一晩のインキュベーション後に強い黄色を有した。
【０４２８】
（ポリスチレンキュベットを使用する、抗ビオチンに対するＣＭＭ−ＳＢＬの標的化アッセイ）
酵素および抗ビオチンの固定およびキュベットの洗浄工程は、９６ウェルプレートについて記載された様式と類似の様式で行った。２つの異なる濃度のＰＮＰＰを使用した。実験は２連で行い、以下の表５２に示すデータは、平均の結果である：
【０４２９】
【表５２】
0005180417.tif 000068
aグリシン緩衝液は使用して、バックグラウンド吸収をオートゼロにした。
【０４３０】
（ビオチン−ＣＭＭおよびＷＴでの抗ビオチンの「加水分解アッセイ」）
エッペンドルフバイアルを、表４３に従って満たした。次いで、これらのバイアルを、サーモスタット制御水浴中、３５℃で、６０分間および２４０分間インキュベートした。次いで、各バイアルの内容物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３フィルター（Ａｍｉｃｏｎ，ＭＷＣＯ  ３０００（２ｍＬ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて、３７５０ｒｐｍで９０分間遠心して予めリンスした））の上に配置し、３７５０ｒｐｍで６０分間遠心分離した。次いで、濾液を、Ａ280（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて０点調節した）を測定することによってアッセイした。結果を、表５３に示す。
【０４３１】
【表５３】
0005180417.tif 000069
a  １ｍｇの活性酵素を、各実験に使用した（ＷＴ＝１１．５μＬ、Ｎ６２Ｃ−＝１１．８μＬ、Ｓ１５６Ｃ−＝１６．２μＬ、Ｓ１６６Ｃ−＝１０．６μＬ、Ｌ２１７Ｃ−＝１１．５μＬ）。ＰＭＳＦ力価測定によって決定されるような各酵素の濃度は、「材料選択」に記載される。
b  データは、実際の吸収を示す（データは、対応するバックグラウンド吸収から実際の吸収を差し引くことによって補正する）。
【０４３２】
（実施例１２）
（ビオチン化ＣＭＭへの曝露後の抗ビオチンの残留結合能力についてのアッセイ）
（抗ビオチン分解）
Ｓ１５６Ｃ−ビオチンが抗ビオチンＩｇＧを破壊する能力を、微小分配（ｍｉｃｒｏ−ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）実験を使用して試験した。２つのコントロール実験もまた、データを検証するために実施した。
【０４３３】
抗体−ＣＭＭ（１：１、分子：分子）混合物のアリコートを、インキュベートしたバイアル（ｐＨ８．６、３５℃）から定期的に回収し、そしてビオチン溶液を、このアリコートに添加した。ＣＭＭの立体的なかさ高さが、この抗体の他の利用可能な結合部位への第２のＣＭＭ分子の接近をブロックするので、ただ１つのＣＭＭ分子のみが、各抗体分子に結合することが予測された。しかし、分子ビオチンは、これが第２の抗体結合部位への結合を可能にするほどに十分に小さいはずである。抗体結合部位が分解されるにつれて、利用可能な結合部位がより少なくなり、より多くの結合されないビオチンを生じる。３０００  ＭＷＣＯ膜を使用して、結合されていないビオチンを、この高分子から分離し、そしてこのビオチン濃度を、ＨＡＢＡ／アビジンシステムを使用してアッセイした。
【０４３４】
さらに、ビオチン（ハプテン）のみを含む、コントロール実験を行った。ＣＭＭの添加前に、抗体をビオチン（ハプテン）と共にプレインキュベートする場合の実験もまた、研究した。Ａ500の観察された値の減少は、この抗体の結合能力の減少に対応する（図１９）。
【０４３５】
（抗ビオチン結合部位の破壊を証明するためのアッセイ）
（実験：）
アルカリホスファターゼに結合体化されたモノクローナル抗ビオチンＩｇＧ（クローンＢＮ−３４、Ｓｉｇｍａ、免疫グロブリン濃度１．３ｍｇ／ｍＬ）を、全ての研究について使用した。これらの研究に使用したＴＲＩＳ緩衝液は、本発明者らのアミダーゼ反応速度論研究で使用した標準緩衝液であった（０．１Ｍ、ｐＨ８．６、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ）。
【０４３６】
ＴＲＩＳ（ｐＨ８．６）中のビオチン（１．９４ｍｇ／ｍＬ）溶液を、調製した。この溶液の１０μＬを、７７９．５μＬのＴＲＩＳに添加した（この溶液は、本明細書を通してＢ／７９と称する）。ＴＲＩＳ（７００．５μＬ）および抗ビオチン（３７．５μＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ免疫グロブリン、アルカリホスファターゼ標識した）を含む、エッペンドルフバイアルを調製した。Ｓ１５６Ｃ−ビオチン（１２．１５μＬ、０．７１ｍｇ／ｍＬ）を、このバイアルに添加した。このバイアルをボルテックスし、そして水浴中（３５℃）に配置した。アリコート（１７０μＬ）を、このバイアルから周期的に回収し、Ｂ／７９（２０μＬ）を、各アリコートに添加し、次いで、この混合物を、予めリンスしたＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターに移した。このフィルターを遠心分離し（１時間、３７５０ｒｐｍ、４℃、２×）、そして濾液を収集した。以下のＨＡＢＡ／アビジンシステムを使用して、この濾液を、ビオチン含量についてアッセイした：７０μＬの濾液を、７０μＬのＨＡＢＡ／アビジン試薬に添加し、そしてこの混合物のＡ500の読取り値を、１３０μＬキュベットを使用して観察した。結果を、以下の表５４に作表した。
【０４３７】
【表５４】
0005180417.tif 000070
（コントロール実験）
ＴＲＩＳ（ｐＨ８．６）中のビオチン（１．９４ｍｇ／ｍＬ）溶液を、調製した。この溶液を、２０倍希釈した（本明細書を通してＢ／２０と称する）。エッペンドルフバイアルを、表５５に従って満たし、３５℃で種々の時間でインキュベートした。
【０４３８】
【表５５】
0005180417.tif 000071
インキュベーション後、各バイアルの内容物を、予めリンスしたＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター（ＭＷＣＯ  ３０００）に移し、そしてこれらのフィルターを遠心分離した。濾液を、ＨＡＢＡ／アビジン試薬を使用して分光光度的にアッセイした：５００μＬの濾液を、５００μＬのＨＡＢＡ／アビジン試薬に添加し、Ａ500値を、１ｍＬキュベットを使用して測定した。結果を、表５６に示す。
【０４３９】
【表５６】
0005180417.tif 000072
（実施例１３）
（上記の標的化された分解の実施例の化学量論）
種々の実験において、以下の触媒アンタゴニストが、化学量論的に機能することが見い出された：ピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例２）、ＡＰの存在下のピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例３）、化学量論以下の（ｓｕｂｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）ピラゾールＣＭＭ−ＨＬＡＤＨ（実施例４）、糖ＣＭＭ−ビオチン化Ｃｏｎ  Ａ（実施例７および８）、ビオチンＣＭＭ−アビジン、およびビオチンＣＭＭ−抗ビオチンＩｇＧ。
【０４４０】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみであること、およびこれらの観点における種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして本出願の精神および本文、ならびに特許請求の範囲内に含まれることが理解されるべきである。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、標的化部分としてデンドリマーを使用する、本明細書の種々のキメラ分子を図示する。
【図２】  図２は、インヒビターを用いて酵素を標的化するＳＢＬを図示する。
【図３】  図３は、ＭＴＳ−ピラゾール４の合成のためのスキーム１１を図示する。
【図４】  図４は、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ標的化アッセイの結果を図示する。
【図５Ａ】  図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｂ】  図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｃ】  図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図５Ｄ】  図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、ＳＢＬ−ピラゾールキメラ分子についてのＨＬＡＤＨ分解アッセイの結果を図示する。
【図６】  図６は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールのありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物についてのＨＬＡＤＨ活性を示す。
【図７】  図７は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールのありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物についてのＡＰ活性を示す。
【図８】  図８は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物についてのＨＬＡＤＨ活性を示す。
【図９】  図９は、Ｓ１６６Ｃ−ピラゾールありまたはなしでのＨＬＡＤＨ／ＡＰ混合物についてのＡＰ活性を示す。
【図１０】  図１０は、化学量論以下のピラゾール−ＣＭＭによるＨＬＡＤＨ分解を示す。
【図１１】  図１１は、アルカリホスファターゼの存在下におけるピラゾール−ＣＭＭによるＨＬＡＤＨ分解を示す。
【図１２】  図１２は、ＨＬＡＤＨの存在下におけるピラゾール−ＣＭＭによるアルカリホスファターゼ分解を図示する。
【図１３】  図１３は、調製された１１のモノ−およびジサッカリドメタンチオスルホネートを示す。
【図１４Ａ】  図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−ＷＴによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１４Ｂ】  図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−ＷＴによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１４Ｃ】  図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃは、糖によって修飾されたＧＧ３６−ＷＴによる選択的レクチン分解を図示する。
【図１５Ａ】  図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する。
【図１５Ｂ】  図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する。
【図１５Ｃ】  図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する。
【図１５Ｄ】  図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、および図１５Ｄは、レクチンアッセイの間の＜３０００ＭＷタンパク質フラグメントの形成の時間経過のプロットを図示する。
【図１６】  図１６は、ビオチン−ＭＴＳ試薬１の合成のための合成スキーム７を図示する。
【図１７】  図１７は、ビオチン化ＣＭＭの抗ビオチンに対する標的化をアッセイするための標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を図示する。
【図１８】  図１８は、９６ウェルプレートにおける、ハプテン修飾したサブチリシンを使用する、抗ビオチンについての標的化アッセイを図示する。
【図１９】  図１９は、時間の関数としてのビオチン−ＣＭＭによる抗ビオチン分解のプロットである。
【図１】
0005180417.tif 000073
【図２】
0005180417.tif 000074
【図３】
0005180417.tif 000075
【図４】
0005180417.tif 000076
【図５Ａ】
0005180417.tif 000077
【図５Ｂ】
0005180417.tif 000078
【図５Ｃ】
0005180417.tif 000079
【図５Ｄ】
0005180417.tif 000080
【図６】
0005180417.tif 000081
【図７】
0005180417.tif 000082
【図８】
0005180417.tif 000083
【図９】
0005180417.tif 000084
【図１０】
0005180417.tif 000085
【図１１】
0005180417.tif 000086
【図１２】
0005180417.tif 000087
【図１３】
0005180417.tif 000088
【図１４Ａ】
0005180417.tif 000089
【図１４Ｂ】
0005180417.tif 000090
【図１４Ｃ】
0005180417.tif 000091
【図１５Ａ】
0005180417.tif 000092
【図１５Ｂ】
0005180417.tif 000093
【図１５Ｃ】
0005180417.tif 000094
【図１５Ｄ】
0005180417.tif 000095
【図１６】
0005180417.tif 000096
【図１７】
0005180417.tif 000097
【図１８】
0005180417.tif 000098
【図１９】
0005180417.tif 000099