(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体。
(I)配列番号３で表されるポリペプチド。
(II)配列番号９で表されるポリペプチド。
【請求項２】
H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体。
(I)配列番号４で表されるポリペプチド。
(II)配列番号１０で表されるポリペプチド。
【請求項３】
抗体が、ファージ抗体，ファージ抗体の可溶化フォーム，又はモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
ファージ抗体，又はファージ抗体の可溶化フォーム中の、２つの可変領域の間に、ペプチドリンカーを有していることを特徴とする、請求項３記載の抗体。
【請求項５】
ペプチドリンカーが、(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）であることを特徴とする、請求項４記載の抗体。
【請求項６】
ニワトリ抗体のL鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項３乃至５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
２つの可変領域が、ファージのコート蛋白質g3pとの融合蛋白質として発現していることを特徴とする、請求項４乃至６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、ニワトリ抗体のＨ鎖定常領域の少なくとも一部，及びL鎖定常領域を含むモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３記載の抗体。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
【請求項１０】
配列番号２７又は２８の遺伝子を含むことを特徴とする、請求項９記載の遺伝子。
【請求項１１】
H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント。
(I)配列番号３で表されるポリペプチド。
(II)配列番号９で表されるポリペプチド。
【請求項１２】
H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント。
(I)配列番号４で表されるポリペプチド。
(II)配列番号１０で表されるポリペプチド。
【請求項１３】
(I)と(II)の間に、ペプチドリンカーを有していることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の単鎖可変領域フラグメント。
【請求項１４】
ペプチドリンカーが、(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）であることを特徴とする、請求項１３記載の、単鎖可変領域フラグメント。
【請求項１５】
請求項１１乃至１３のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子。
【請求項１６】
配列番号２７又は２８の配列を含むことを特徴とする、請求項１５記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子，ニワトリ抗体のL鎖定常領域Ｃλをコードする遺伝子，ファージのコート蛋白g3pをコードする遺伝子geneIIIを含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント発現用ベクター。
【請求項１８】
geneIIIの上流に、単鎖可変領域フラグメントが可溶化する際に必要な配列を含むことを特徴とする、請求項１７記載の、単鎖可変領域フラグメント発現用ベクター。
【請求項１９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の抗体，又は請求項１１乃至１４のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメントを含むことを特徴とする、ヒト又は齧歯類のapoB蛋白質の検出用キット。
【請求項２０】
請求項１乃至８のいずれかに記載の抗体，又は請求項１１乃至１４のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメント，及びレクチン酸化低密度リポ蛋白質受容体−１又はその誘導体を含むことを特徴とする、ヒト又は齧歯類の酸化低密度リポ蛋白質の検出用キット。
【請求項２１】
請求項１９又は２０記載のキットを用いることを特徴とする、ヒト又は齧歯類から抽出した生体成分中の，或いは齧歯類生体中の、apoB蛋白質，低密度リポ蛋白質，又は酸化低密度リポ蛋白質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体，その材料物質（遺伝子，ポリペプチド等），低密度リポ蛋白質（Low-densitylipoprotein：LDL）や酸化低密度リポ蛋白質（oxLDL）の関与する疾患の、診断・分析等への利用が可能なapoB蛋白質，LDL，又はoxLDLの検出キット，及びそれらの検出方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
LDLは、１分子のapoB蛋白質と種々の脂質から構成される粒子で、血管を介して肝臓からの全身の細胞に、細胞膜やホルモンの合成に必要なコレステロールの運搬を担う蛋白質である。LDLは、いわゆる悪玉コレステロールと呼ばれるように、メタボリックシンドロームと密接な関係のある粒子である。
【０００３】
従って、ヒトのLDLの検出は、高脂血症をはじめとして、脳卒中，狭心症，心筋梗塞等の急性冠症候群(ACS：acute coronary syndrome)などの診断的意義があることから、極めて重要である。
【０００４】
現在、我が国の死亡原因の第２位は、心疾患，第３位は脳疾患であり、また糖尿病や慢性腎不全等の様々な疾患に伴って、アテローム性動脈硬化症が進行することから、循環器系疾患診断におけるLDL，中でも特に、oxLDLの検出の重要性が指摘されている。
【０００５】
従来、LDLの検出は、主として、総コレステロール値及び高密度リポ蛋白質（High-densitylipoprotein：HDL）値から割り出されていた。
【０００６】
oxLDLの検出については、ヒトの場合、酸化フォスファチジルコリン特異的マウスモノクローナル抗体と、ヒトapoB蛋白質特異的ポリクローナル抗体よる、サンドイッチELISAで行われてきた。
【０００７】
一方、病態モデル動物としては、マウス等の齧歯類が広く用いられているが、このような循環器系疾患のモデル動物の利用に際しても、酸化LDLの検出が必要となってくる。
【０００８】
ところが、マウスのapoBに対するモノクローナル抗体がなかなか開発されないという現状のため、マウスoxLDLやマウスLDLの確立された検出方法というものが無く、一部、マウスapoB蛋白質特異的ポリクローナル抗体が実験的に活用され始めているに過ぎない。
【０００９】
従って、高脂血症や動脈硬化その他の疾患モデルマウスにおいて、より正確なマウスapoBの検出が可能なモノクローナル抗体の開発が望まれていた。
【００１０】
ところで、近年、ニワトリの産生する抗体の多様性を利用して、哺乳類の産生する蛋白質に対する抗体を、効率的に得る方法が開発されている（特許文献１，非特許文献１）。
【００１１】
これは、哺乳類由来の蛋白質は、他の哺乳類に免疫しても、免疫対象となる哺乳類が本来有する同種の蛋白質との相同性が高いため、抗体を産生できる可能性が低いのに対し、哺乳類由来蛋白質を、ニワトリに免疫すると、その相同性の低さにより、抗体を産生できる確率が高いことを利用するものである。
【００１２】
しかも、ニワトリは、偽V遺伝子が機能的V遺伝子領域内部に移動する、いわゆる遺伝子変換（gene conversion）を起こすことから、多種多様な抗体が産生されることが知られており、特定の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を数多くの候補抗体の中から効率的に探すのには適している。
【００１３】
しかしながら、ニワトリ抗体でマウスのapoB蛋白質に対する抗体を得ようとする試みは、従来無かった。
【００１４】
一方、遺伝子工学技術を用いて、組換抗体（リコンビナント抗体）を、ファージのコート蛋白質中に発現させる、いわゆるファージディスプレイという技術が開発されている（非特許文献２）。
【００１５】
そして更に、抗体遺伝子から単離した、L鎖可変領域（VL領域）及びH鎖可変領域（VH領域）遺伝子をシャッフリングさせることによって、この２つの領域の多様な組合せである、一本鎖の遺伝子断片（single chain Fragment of variable region：scFv）を得、この一本鎖遺伝子をファージのコート蛋白質遺伝子と連結することによって、融合蛋白質としてファージ表面に発現させる方法が開発されている（非特許文献３）。
【００１６】
本発明者等は、上記の方法に従って、ニワトリに、ヒトLDLを免疫し、産生された様々な抗体の、L鎖可変領域（VL領域）及びH鎖可変領域（VH領域）各々の遺伝子を取り出し、人工的に多数の組合せを産み出すことで、効率的に多数の新たなファージ抗体を製造した。
そして、これら多数の抗体の中から選択した、“ヒトLDLに対して高い特異性を有する”抗体が、“ヒトoxLDLに対しても高い特異性を有する”こと，つまり、これらの抗体が、LDLやoxLDLに含まれる“apoＢ蛋白質に対する抗体”であることを見出し、更に、選抜された抗体の中に、驚くべきことに、マウスやラット等の齧歯類のLDLに対しても高い特異性を有するものが存在することを見出し、本発明に到達した。
【００１７】
これは、マウスのapoB蛋白質に対するモノクローナル抗体が、従来、どうしても取れなかったことから考えると、画期的な出来事であった。
【００１８】
ヒトと齧歯類のapoB蛋白質のいずれにも特異性を有する抗体は、病態モデルでの検出結果をもとに、より正確なヒトの疾患の判断ができ、同じ診断キットで診断が可能となるため、非常に有意義な抗体である。
【００１９】
【特許文献１】特開2005-278633号公報
【非特許文献１】FEMS Immunol. Med. Microbiol. 23, 189-194，1999, Matsuda, H. et al.[A chicken monoclonal antibody with specificity for the N-terminal of human prion protein.]
【非特許文献２】Nature349,293-299(1991),Winter,G.,etal.
【非特許文献３】Journal of Molecular Biology, 222, 581-597(1991), Marks, J.D. et al.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の目的とするところは、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質のいずれにも特異性を有する抗体、遺伝子、単鎖可変領域フラグメント、発現用ベクター、検出用キット、及び検出方法を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上述の目的は、下記第一の発明乃至第二十一の発明によって達成される。
【００２２】
第一の発明：H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体。
(I)配列番号３で表されるポリペプチド。
(II)配列番号９で表されるポリペプチド。
【００２３】
第二の発明：H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体。
(I)配列番号４で表されるポリペプチド。
(II)配列番号１０で表されるポリペプチド。
【００２４】
第三の発明：
抗体が、ファージ抗体，ファージ抗体の可溶化フォーム，又はモノクローナル抗体であることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載の抗体。
【００２５】
第四の発明：ファージ抗体，又はファージ抗体の可溶化フォーム中の、２つの可変領域の間に、ペプチドリンカーを有していることを特徴とする、第三の発明に記載の抗体。
【００２６】
第五の発明：ペプチドリンカーが、(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）であることを特徴とする、第四の発明に記載の抗体。
【００２７】
第六の発明：ニワトリ抗体のL鎖定常領域を含むことを特徴とする、第三乃至第五の発明のいずれかに記載の抗体。
【００２８】
第七の発明：２つの可変領域が、ファージのコート蛋白質g3pとの融合蛋白質として発現していることを特徴とする、第四乃至第六の発明のいずれかに記載の抗体。
【００２９】
第八の発明：抗体が、ニワトリ抗体のＨ鎖定常領域の少なくとも一部，及びL鎖定常領域を含むモノクローナル抗体であることを特徴とする、第三の発明に記載の抗体。
【００３０】
第九の発明：第一乃至第八の発明のいずれかに記載の抗体をコードする遺伝子。
【００３１】
第十の発明：配列番号２７又は２８の遺伝子を含むことを特徴とする、第九の発明に記載の遺伝子。
【００３５】
第十一の発明：H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント。
(I)配列番号３で表されるポリペプチド。
(II)配列番号９で表されるポリペプチド。
第十二の発明：H鎖の可変領域に下記（I）を含み、L鎖の可変領域に下記（II）を含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント。
(I)配列番号４で表されるポリペプチド。
(II)配列番号１０で表されるポリペプチド。
【００３６】
第十三の発明：(I)と(II)の間に、ペプチドリンカーを有していることを特徴とする、第十一又は十二の発明に記載の単鎖可変領域フラグメント。
【００３７】
第十四の発明：ペプチドリンカーが、(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）であることを特徴とする、第十三の発明に記載の、単鎖可変領域フラグメント。
【００３８】
第十五の発明：第十一乃至第十三の発明のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子。
【００３９】
第十六の発明：配列番号２７又は２８の配列を含むことを特徴とする、第十五の発明に記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子。
【００４０】
第十七の発明：第十五又は第十六の発明に記載の単鎖可変領域フラグメントをコードする遺伝子，ニワトリ抗体のL鎖定常領域Ｃλをコードする遺伝子，ファージのコート蛋白g3pをコードする遺伝子geneIIIを含むことを特徴とする、単鎖可変領域フラグメント発現用ベクター。
【００４１】
第十八の発明：geneIIIの上流に、単鎖可変領域フラグメントが可溶化する際に必要な配列を含むことを特徴とする、第十七の発明に記載の、単鎖可変領域フラグメント発現用ベクター。
【００４５】
第十九の発明：第一乃至第八の発明のいずれかに記載の抗体，又は第十一乃至第十四の発明のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメントを含むことを特徴とする、ヒト又は齧歯類のapoB蛋白質の検出用キット。
【００４６】
第二十の発明：第一乃至第八の発明のいずれかに記載の抗体，又は第十一乃至第十四の発明のいずれかに記載の単鎖可変領域フラグメント，及びレクチン酸化低密度リポ蛋白質受容体−１（LOX-1）又はその誘導体を含むことを特徴とする、ヒト又は齧歯類のoxLDLの検出用キット。
【００４７】
第二十一の発明：第十九又は第二十の発明に記載のキットを用いることを特徴とする、ヒト又は齧歯類から抽出した生体成分中の，或いは齧歯類生体中の、apoB蛋白質又はoxLDLの検出方法。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の遺伝子を発現させたポリペプチド又は本発明のポリペプチド或いは本発明の抗体は、ヒトと齧歯類の両方のapoB蛋白質に対して特異性を有するため、ヒト疾患の試験と疾患モデルによる実験のいずれにおいても、apoB蛋白質の検出系を構築する等して、活用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
［本発明の抗体（第一の発明〜第八の発明）］
本発明のヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体は、H鎖及びL鎖の可変領域のうち少なくとも１つに、下記（I）及び／又は下記（II）を含むことを特徴としている。
【００５０】
下記（I），（II）は、Ｈ鎖及びL鎖のいずれの可変領域に用いても良いが、（I）をVH鎖とし、（II）鎖をVL鎖とすることが好ましい。
また、Ｈ鎖及びL鎖の可変領域の一方が、（I）又は（II）であれば良いが、両方とも（I）又は（II）から選択されることが好ましく、その際には、一方が(I)であれば、他方は(II)から、逆に一方が(II)であれば、他方は(I)からというように、別のグループから選択することが好ましい。
【００５１】
(I)配列番号１乃至６のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチド，からなる群から選択されるポリペプチド。
【００５２】
(II)配列番号７乃至１２のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド。
【００５３】
上記で、１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０の、６、１０、１１、１４、１７、３５、４０、４３、６２、６６、６７、９１番目のアミノ酸が、変化している配列番号１２が、程度の差こそあれ、同様の特異性を得ていることから考えて（図２のファージ抗体＃２０（配列番号４と１０のポリペプチドを含む）のデータ，及びファージ抗体＃２４（配列番号６と１２のポリペプチドを含む）のデータ参照）、少なくとも、これらの位置については、他のアミノ酸に置換しても良いと考えられる。
【００５４】
特に、これらの置換されたアミノ酸のうち、下記のポジションで変化した前後のアミノ酸には、それぞれ、
各ポジションでのアミノ酸の特徴（類似点）
１０（共に疎水性アミノ酸）
１１（共に極性・無電荷アミノ酸）
４０（共に疎水性アミノ酸）
４３（共に疎水性アミノ酸）
６２（共に極性・無電荷アミノ酸）
６７（共に極性・無電荷アミノ酸）
９１（共に疎水性アミノ酸）
等の共通点が見られることから、これらのポジションにおける極性や電荷等の性質が類似するアミノ酸への置換であれば、これ以外の置換でも、同様の特異性が得られると考えられる。
【００５５】
(I)及び(II)の組合せとしては、下記(1)乃至(6)のいずれかが好ましい。
（尚、下記で、＃とは、ファージ抗体を表し、HUCとはモノクローナル抗体を表す。）
(1)配列番号１及び配列番号７（下記実施例１の＃２，実施例２のHUC２）
(2)配列番号２及び配列番号８（下記実施例１の＃７，実施例２のHUC７）
(3)配列番号３及び配列番号９（下記実施例１の＃１６，実施例２のHUC１６）
(4)配列番号４及び配列番号１０（下記実施例１の＃２０，実施例２のHUC２０）
(5)配列番号５及び配列番号１１（下記実施例１の＃２２，実施例２のHUC２２）
(6)配列番号６及び配列番号１２（下記実施例１の＃２４，実施例２のHUC２４）
【００５６】
尚、上記の配列番号１〜１２のポリペプチドを発現させるための遺伝子配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号１３〜２４の配列を有する遺伝子等が具体的な例として挙げられ、これらをベースに、一部の塩基を同じアミノ酸をコードする塩基と置換したもの等であっても良い。
また、配列番号１〜１２のポリペプチドの変異体を発現させるための遺伝子配列としては、同様に、配列番号１３〜２４の配列を有する遺伝子等をベースとして、ポリペプチドに起こっている変異に対応するような塩基に置換すれば良い。
【００５７】
本発明において、齧歯類とは、例えばマウス，ラット，ウサギ，ハムスター，モルモットなどを意味する。
【００５８】
本発明において、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体としては、ファージ抗体，ファージ抗体の可溶化フォーム，モノクローナル抗体等が含まれる。
以下、各々の抗体について、詳細に説明する。
【００５９】
（Ａ）本発明のファージ抗体
（１）本発明のファージ抗体の基本構成
ファージ抗体とは、抗体のH鎖及びL鎖の２つの可変領域を一本鎖として有するscFv（single chain Fragment of variable region）が、ファージのコート蛋白質との融合蛋白質として、ファージ粒子表面に発現しているものを言う。
本発明のファージ抗体の構成要素であるscFvは、後述の本発明のscFv遺伝子によって発現させることができる。
【００６０】
（２）ペプチドリンカー
本発明のファージ抗体に含まれるscFvは、VH領域とVL領域の２つの可変領域を含んでいれば良いが、更に、この間に、ペプチドリンカーを含んでいることが好ましい。
融合蛋白質として、ファージ粒子表面に発現した際に、VH領域とVL領域が、有る程度離れおり、立体構造上、自由度がある方が、それぞれの抗原認識部位が、ヒト又は齧歯類のapoB蛋白質と結合し易いからである。
【００６１】
ペプチドリンカーとしては、有る程度の長さを有し、それ自体がVH領域，VL領域，その他の抗体中の配列と相互作用しないものであれば、特に限定されないが、例えば、５〜２０アミノ酸が好ましい。
Argを導入したものなど、様々なリンカーペプチドが開発されているが、好ましいのは、GSリンカーと呼ばれる(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）である。
尚、ペプチドリンカーとVL鎖との間に、更に、例えばAsp-Val等のような、数個のアミノ酸からなるスペーサーを有していても良い。
【００６２】
尚、VH領域とVL領域の間にペプチドリンカーが組み込まれたファージ抗体は、ファージ抗体を製造する遺伝子において、VH遺伝子とVL遺伝子の間に、ペプチドリンカー（及び必要に応じて、上記のスペーサー）に相当する遺伝子を組み込むことによって製造することができる。
【００６３】
（３）検出用タグ（Cλ）
本発明のファージ抗体は、更に、ニワトリ抗体のL鎖定常領域（Cλ）を含んでいることが好ましい。VH鎖とVL鎖の組合せだけでも、抗原となるヒト及び齧歯類のapoB蛋白質との特異性は有するが、Cλを含んでいれば、公知のCλ認識抗体（抗ニワトリIgY抗体等）を用いて、「apoB蛋白質と結合したファージ抗体」を検出することができ、Cλが、いわゆる検出用タグの役割を果たすからである。
【００６４】
ニワトリ抗体のL鎖定常領域（Cλ）は、正常ニワトリ脾細胞から合成したｃＤＮＡをもとにＰＣＲでニワトリＣλ鎖を増幅させることによって、製造することができる。
【００６５】
Cλの組み込み位置は、VL鎖の後、即ち、scFvの後が好ましい。
【００６６】
尚、scFvの後にCλが組み込まれたファージ抗体は、ファージ抗体を製造する遺伝子において、scFv遺伝子の後に、Cλ遺伝子を組み込むことによって製造することができる。
【００６７】
（４）VH鎖とVL鎖の順序
VH鎖とVL鎖の順序は必ずしも限定されないが、VL鎖には、上述の通り、Cλを連結しておくことが好ましい為、その場合には、VH鎖とVL鎖の間隔が開きすぎないように、まずVH鎖にペプチドリンカー（及び必要に応じて、スペーサー）をつなぎ、その後に、VL鎖（及びCλ）を繋ぐのが好ましい。
【００６８】
（５）コート蛋白質
本発明のファージ抗体は、２つの可変領域が、ファージのコート蛋白質との融合蛋白質として発現していることが好ましい。
このコート蛋白質は、当該コート蛋白質をコードする遺伝子を、本発明の抗体を発現する遺伝子に組み込むことで、発現させることができる。
【００６９】
組み込む位置は、例えば図８で表される通り、scFv遺伝子の後であれば良いが（図中、geneIIIで表されているのが、後述するコート蛋白質g3pの遺伝子である。）、ファージ抗体がＣλを含む場合には、Cλの後が好ましい。
【００７０】
コート蛋白質としては、g3pの他、g6g，g7p，g8p，g9p等が挙げられ、g3pやg8pが好ましく用いられる。比較的弱い特異性のファージ抗体で良い場合には、１個のファージ当たり、約３０００分子の融合蛋白質を発現できるg8pの遺伝子を用いることができるが、強い特異性を有するファージ抗体だけを選抜したい場合には、１個のファージに５分子しか発現しないため融合蛋白質も１〜５分子しか発現しない、g3pの遺伝子（geneIII）を用いることが好ましい。
【００７１】
本発明のファージ抗体は、scFv遺伝子を、これらのコート蛋白質遺伝子と結合させておくことによって、コート蛋白質との融合蛋白質として、scFvを、ファージ粒子の表面に発現させることができるのである。
【００７２】
（６）本発明のファージ抗体の用途
本発明のファージ抗体は、それ自体、検出用キット等の材料等として、ヒト及び齧歯類のいずれのapoB蛋白質の検出にも用いることができる他、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対する特異性を有するモノクローナル抗体を製造する際の、VH鎖及びVL鎖の好ましい組合せの選択用モデルとして用いることができる。
【００７３】
また、実際にモノクローナル抗体を製造する際に、ファージ抗体に含まれる遺伝子を鋳型として、適当なプライマーを選択したPCR法等を用いることにより、モノクローナル抗体用の、VH鎖遺伝子，L鎖（完全長）遺伝子を増幅することもできる。
【００７４】
（７）本発明のファージ抗体の製造方法
本発明のファージ抗体は、公知のファージ抗体の製造方法によって製造することができるが、例えば次のようにして、製造することができる。
【００７５】
まず、後述する本発明のscFv遺伝子を、ファージのコート蛋白質遺伝子が予め組み込まれたプラスミドに組み込み、ファージミドベクターを製造する。
【００７６】
尚、ファージミドベクターは、例えば公知のプラスミドpPDS内のマウスCκ鎖を、ニワトリCλ鎖に置換したプラスミドに、scFv遺伝子を導入することによって、製造することができる。
【００７７】
次に、ファージミドベクターを、大腸菌等に感染させ形質転換した後、ヘルパーファージを、当該大腸菌に感染させる。ヘルパーファージとは、感染に必要なg3pおよびファージの形態形成に必要な残りの蛋白質を供給できるファージであり、scFvとg3pとの融合蛋白質とともにファージ粒子を形成する。
【００７８】
ヘルパーファージとしては、VCSM13 (STRATAGENE社製)，ExAssist (STRATAGENE社製)その他の、公知のものを用いることが出来るが、VCS M13が好ましいものとして挙げられる。
【００７９】
これによって、表面に、コート蛋白質との融合蛋白質としてscFvが発現されたファージ粒子が完成し、これがファージ抗体となる。
【００８０】
（Ｂ）本発明のファージ抗体の可溶化フォーム
（１）本発明のファージ抗体の可溶化フォームの基本構成
ファージ抗体の可溶化フォームとは、scFv及びCλ蛋白質が、ファージのコート蛋白質から遊離して、可溶化されたものである。
【００８１】
（２）本発明のファージ抗体の可溶化フォームの製造方法
ファージ抗体の可溶化フォームは、上記の、scFv発現ベクターの、Ｃλ鎖遺伝子とgeneIIIの間に、例えばTAG（アンバー配列）等のストップコドンを挿入しておくことによって、製造することができる。
このようなベクターとしておくことによって、通常はsupＥの大腸菌株を用いることによりファージディスプレイ抗体を発現するが、例えば大腸菌 SOLR(Stratagene社）あるいはHB2151等の、ノンサプレッサー大腸菌等で培養すれば、培養上清や培養菌体中に、可溶型抗体が分泌させることができる。
【００８２】
可溶化フォームを分泌させる際の培養条件としては、大腸菌において、蛋白質を発現させる際の、一般的な条件で良く、例えば、蛋白質を発現させる際に用いられるIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）等を添加したLB培地等を用い、通常の培養温度より低めの30℃前後で行うことができる。
【００８３】
（３）本発明のファージ抗体の可溶化フォームの用途
本発明のファージ抗体の可溶化フォームは、上述の本発明のファージ抗体と同様、それ自体、検出用キット等の材料等として、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質のいずれの検出にも用いることができる他、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対する特異性を有するモノクローナル抗体を製造する際の、VH鎖及びVL鎖の好ましい組合せの選択用モデルとして用いることができる。
【００８４】
（Ｃ）本発明のモノクローナル抗体
（１）本発明のモノクローナル抗体の基本構成
本発明のモノクローナル抗体は、H鎖及びL鎖の可変領域のうち少なくとも１つに、上記の（I）及び／又は下記（II）を含むものである。
【００８５】
（２）定常領域
本発明のモノクローナル抗体は、更に定常領域として、ニワトリ抗体のＨ鎖定常領域の少なくとも一部，及びL鎖定常領域を含んでいることが好ましい。
【００８６】
Ｈ鎖定常領域の少なくとも一部とは、例えば、Ｈ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされた領域（Δ７aa-H鎖），H鎖のCH2領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされた領域（ΔCH2-H鎖），Ｈ鎖のCH3領域とCH4領域をともに欠失するようにデザインされた領域（ΔFc-H鎖）等が挙げられる。
【００８７】
これらは、哺乳類のIgGより分子量が大きいニワトリ抗体分子を、哺乳類中の蛋白質の検出等に、より有効に利用するため、不必要なアミノ酸領域を削除あるいは改変して、哺乳類のIgGの分子量に近づけたものである。
【００８８】
このようなH鎖定常領域を削除あるいは改変したモノクローナル抗体は、例えば、特許文献１（特開2005-278633号公報）に記載の方法に従い、目的とするモノクローナル抗体のH鎖用のプライマーを設計し、これを用いてPCR増幅する方法によって、製造することができる。
【００８９】
（３）本発明のモノクローナル抗体の用途
本発明のモノクローナル抗体は、上述の本発明のファージ抗体等と同様、それ自体、検出用キット等の材料等として、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質のいずれの検出にも用いることができる。
【００９０】
（４）本発明のモノクローナル抗体の製法
本発明のモノクローナル抗体は、例えばファージ抗体を鋳型として増幅した、VH鎖遺伝子やVL鎖遺伝子を、公知のニワトリ抗体を鋳型として得られた、モノクローナル抗体に必要な他の領域の遺伝子を含むプラスミドベクターに導入し、各々のベクターを適当な動物細胞中で、発現させること等によって、製造することができるが、本発明の可変領域と、公知の抗体の定常領域とを用いる場合には、全配列が分かっているため、遺伝子組み換え技術や、アミノ酸の結合技術等によって、目的とする抗体を、遺伝子から、あるいはポリペプチド自体を、人工的に合成することもできる。
【００９１】
［本発明の抗体をコードする遺伝子（抗体遺伝子）（第九の発明〜第十の発明）］
（１）本発明の抗体をコードする遺伝子の構成
本発明の抗体をコードする遺伝子は、配列は特に限定されず、また、必要な遺伝子が、例えば、H鎖とL鎖が、別のプラスミド中に存在する等、１つの遺伝子中に存在していなくても良い。
【００９２】
本発明の抗体をコードする遺伝子としては、具体的には、例えば、下記（III）及び／又は下記（IV）を含むものが挙げられる。
【００９３】
下記（III），（IV）は、Ｈ鎖可変領域及びL鎖可変領域のいずれの遺伝子として用いても良いが、（III）をVH鎖用遺伝子とし、（IV）鎖をVL鎖用遺伝子とすることが好ましい。
【００９４】
（III）配列番号１３乃至１８からなる群から選択される遺伝子
（IV）配列番号１９乃至２４からなる群から選択される遺伝子
【００９５】
ここで、配列番号１３，１４，１５，１６，１７，１８で表される遺伝子は、それぞれ、配列番号１，２，３，４，５，６で表されるポリペプチドに対応し、配列番号１９，２０，２１，２２，２３，２４で表される遺伝子は、それぞれ、配列番号７，８，９，１０，１１，１２で表されるポリペプチドに対応するものである。
【００９６】
中でも、下記の(III)及び(IV)の組合せを含む遺伝子が、好ましい。
【００９７】
配列番号１３，１９
配列番号１４，２０
配列番号１５，２１
配列番号１６，２２
配列番号１７，２３
配列番号１８，２４
【００９８】
（２）本発明の抗体をコードする遺伝子の製造方法
上記の本発明の抗体をコードする遺伝子は、天然又は合成した抗体のmRNAから、RT−PCR等で、cDNAとして得る方法，天然の抽出遺伝子から適当なプローブを用いて選択する方法，遺伝子組み換え技術を用いて、天然からの抽出遺伝子を改変する方法，又は一から人工的に合成する方法等によって得ることができる。
本発明において、遺伝子とは、DNA，RNAの他、これらのハイブリッドも含まれ、一本鎖，二本鎖のものも含まれる。
【００９９】
［本発明のポリペプチド］
（１）本発明のポリペプチドの構成
本発明の、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体を製造する材料となりうるポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれかで表されるポリペプチド，又はその配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドを含むことを特徴とするものである。
【０１００】
このうち、配列番号１乃至６のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチド，からなる群から選択されるポリペプチドは、主に、抗体のVH鎖を形成するために好ましく用いられ、配列番号７乃至１２のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドは、主に、抗体のVL鎖を形成するために好ましく用いられるが、VH鎖とVL鎖が逆であっても構わない。
【０１０１】
上記で、１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドとしては、例えば、配列番号１０の、６、１０、１１、１４、１７、３５、４０、４３、６２、６６、６７、９１番目のアミノ酸が、変化している配列番号１２が、程度の差こそあれ、同様の特異性を得ていることから考えて、少なくとも、これらの位置については、他のアミノ酸に置換しても良いと考えられる。
【０１０２】
特に、これらのポジションで変化した前後のアミノ酸には、それぞれ、下記のような、各ポジションでのアミノ酸の特徴（類似点）等の共通点が見られることから、極性や電荷等の性質が類似するアミノ酸への置換が好ましいと考えられる。
【０１０３】
１０（共に疎水性アミノ酸）
１１（共に極性・無電荷アミノ酸）
４０（共に疎水性アミノ酸）
４３（共に疎水性アミノ酸）
６２（共に極性・無電荷アミノ酸）
６７（共に極性・無電荷アミノ酸）
９１（共に疎水性アミノ酸）
【０１０４】
上記のポリペプチドから、VH鎖及びVL鎖を選択して、抗体に用いる場合、次の組み合わせが好ましい。
【０１０５】
(1)配列番号１及び配列番号７（下記実施例１の＃２，実施例２のHUC２）
(2)配列番号２及び配列番号８（下記実施例１の＃７，実施例２のHUC７）
(3)配列番号３及び配列番号９（下記実施例１の＃１６，実施例２のHUC１６）
(4)配列番号４及び配列番号１０（下記実施例１の＃２０，実施例２のHUC２０）
(5)配列番号５及び配列番号１１（下記実施例１の＃２２，実施例２のHUC２２）
(6)配列番号６及び配列番号１２（下記実施例１の＃２４，実施例２のHUC２４）
【０１０６】
（２）本発明のポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは、アミノ酸を酵素的に結合させるペプチド合成方法によっても製造することができるが、後述する本発明のポリペプチドをコードする遺伝子から発現させることができ、例えば当該遺伝子を、抗体用のベクターに組み込むことによって、発現させることができる。
【０１０７】
（３）本発明のポリペプチドの用途
本発明のポリペプチドは、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対する特異性を利用して、上述の本発明の抗体の材料として，あるいはそれ自身で、apoB蛋白質の選択用のツールとして用いることも可能である。
【０１０８】
［本発明の遺伝子（ポリペプチド遺伝子）］
（１）本発明の、“ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体を製造するためのポリペプチド”をコードする遺伝子は、配列は特に限定されないが、具体的には、例えば、配列番号１３乃至２４のいずれかの配列を含む遺伝子等が挙げられる。
【０１０９】
ここで、配列番号１３，１４，１５，１６，１７，１８で表される遺伝子は、それぞれ、配列番号１，２，３，４，５，６で表されるポリペプチドに対応し、配列番号１９，２０，２１，２２，２３，２４で表される遺伝子は、それぞれ、配列番号７，８，９，１０，１１，１２で表されるポリペプチドに対応するものである。
【０１１０】
（２）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法
上記の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、天然又は合成した抗体のmRNAから、RT−PCR等で、cDNAとして得る方法，天然の抽出遺伝子から適当なプローブを用いて選択する方法，遺伝子組み換え技術を用いて、天然からの抽出遺伝子を改変する方法，又は一から人工的に合成する方法等によって得ることができる。
【０１１１】
（３）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の用途
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対する特異性を有する、上述の本発明の抗体の材料として用いられる。
【０１１２】
［本発明の単鎖可変領域フラグメント（scFv）（第十一の発明〜第十四の発明）］
【０１１３】
（１）本発明のscFvの構成
本発明のscFvは、下記(I)及び(II)を含むことを特徴とするものである。
【０１１４】
(I)配列番号１乃至６のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチド，からなる群から選択されるポリペプチド。
(II)配列番号７乃至１２のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド。
【０１１５】
（２）ペプチドリンカー
本発明のscFvは、VH領域とVL領域の２つの可変領域を含んでいれば良いが、scFvがファージ抗体に用いられる際には、更に、これらの間に、ペプチドリンカーを含んでいることが好ましい。
融合蛋白質として、ファージ粒子表面に発現した際に、VH領域とVL領域が、有る程度離れおり、立体構造上、自由度がある方が、それぞれの抗原認識部位が、ヒト又は齧歯類のapoB蛋白質と結合し易いからである。
【０１１６】
ペプチドリンカーとしては、上述のファージ抗体のところで説明した通り、有る程度の長さを有し、それ自体がVH領域，VL領域，その他の抗体中の配列と相互作用しないものであれば、特に限定されないが、例えば、５〜２０アミノ酸が好ましい。
Argを導入したものなど、様々なリンカーペプチドが開発されているが、好ましいのは、GSリンカーと呼ばれる(GGGGS)3（配列番号３１のペプチド）である。
尚、ペプチドリンカーとVL鎖との間に、更に、例えばAsp-Val等のような、数個のアミノ酸からなるスペーサーを有していても良い。
【０１１７】
（３）本発明のscFvの製造方法
本発明のscFvは、アミノ酸を酵素的に結合させるペプチド合成方法によっても製造することができるが、後述する本発明のscFvをコードする遺伝子から発現させることができ、例えば当該遺伝子を、scFv発現用のベクターに組み込むことによって、発現させることができる。
尚、VH領域とVL領域の間にペプチドリンカー（及び必要に応じてスペーサー）が組み込まれたscFvは、scFvをコードする遺伝子において、VH遺伝子とVL遺伝子の間に、ペプチドリンカー（及びスペーサー）に相当する遺伝子を組み込むことによって製造することができる。
【０１１８】
本発明のscFvは、ペプチド合成の他、後述の遺伝子から製造することができる。
【０１１９】
（４）本発明のscFvの用途
本発明のscFvは、本発明の抗体の材料として用いることができる。
【０１２０】
［本発明のscFvをコードする遺伝子（第十五の発明〜第十六の発明）］
scFvをコードする遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、配列番号２５乃至３０のいずれかの配列を含むことを特徴とする遺伝子等が挙げられる。
配列番号２５（実施例１の＃２の遺伝子）
配列番号２６（実施例１の＃７の遺伝子）
配列番号２７（実施例１の＃１６の遺伝子）
配列番号２８（実施例１の＃２０の遺伝子）
配列番号２９（実施例１の＃２２の遺伝子）
配列番号３０（実施例１の＃２４の遺伝子）
【０１２１】
［本発明のscFv発現ベクター（第十七の発明〜第十八の発明）］
（１）本発明のscFv発現ベクターの構成
本発明のscFv発現ベクターは、上記本発明のscFvをコードする遺伝子，Ｃλ遺伝子，geneIIIを含むことを特徴とするものである。
尚、ファージ抗体の可溶化フォームを製造する場合には、geneIIIの上流に、scFVの可溶化に必要な配列として、例えばTAG（アンバー配列）等を導入する。
【０１２２】
尚、このscFv発現ベクターは、ファージ粒子の構成に必要な遺伝子の全てを有している訳では無いので、ファージミドベクターに属し、後述する様に、ヘルパーファージとともに用いる必要がある。
【０１２３】
（２）フレームとなるプラスミド
本発明のscFv発現ベクターは、プラスミド等を基本枠として、上記の必須構成成分の遺伝子を組み込むことによって製造できる。
【０１２４】
プラスミドとしては、公知のものを用い、適当な遺伝子と置換する等して用いることができる。
例えば、公知のpPDS中の、Cκ遺伝子を、Cλ遺伝子に置き換えたものが使用できる。
【０１２５】
（３）本発明のscFv発現ベクターの製造方法
上記の基本となるプラスミドに、適当な制限酵素等を利用して、上記のscFv遺伝子，Cλ遺伝子，geneIIIを組み込むことによって製造することができる。
【０１２６】
例えば、上記のpPDS中の、Cκ遺伝子を、Cλ遺伝子に置き換えたプラスミド等が挙げられる（以下、このベクターを「pLPDS」と記載することがある。）。
【０１２７】
このscFv発現ベクター（pLPDS）は、例えば、図８の模式図で表される（図８は、pLPDSに、scFvを組み込んだものである）。
【０１２８】
（４）本発明のscFv発現ベクターの用途
本発明のscFv発現ベクターは、本発明のファージ抗体を製造するための材料として用いることができる。
【０１２９】
（５）本発明のscFv発現ベクターの使用方法
本発明のscFv発現ベクターを、サプレッサーを持つ宿主菌株に形質転換した後、当該宿主細胞に更にヘルパーファージを導入することによって、scFvがコート蛋白質（g3p等）との融合蛋白質としてファージ表面に発現された（ファージディスプレイ）、ファージ粒子（ファージ抗体）を製造することができる。
【０１３０】
サプレッサーを持つ菌株としては、大腸菌XLI-Blue等が、挙げられる。
【０１３１】
ヘルパーファージとしては、VCSM13 (STRATAGENE社製)，ExAssist (STRATAGENE社製)その他の、公知のものを用いることが出来るが、VCS M13が好ましいものとして挙げられる。
【０１３２】
［本発明のファージ抗体の製造方法］
本発明の、ヒト及び齧歯類の両方のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体を製造する方法は、以下の様なステップを有する方法によって、実施することができる。
【０１３３】
（ステップ１）ヒトのLDLを動物に免疫するステップ。
（ステップ２）ステップ１で免疫した動物の産生する抗体の、ＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子を得るステップ。
（ステップ３）ステップ２で得られたＶＨ領域とＶＬ領域の遺伝子の、複数の組み合わせからなる単鎖可変領域フラグメント遺伝子を製造するステップ。
（ステップ４）単鎖可変領域フラグメント遺伝子を、ファージミドベクターに組み込むステップ。
（ステップ５）ステップ４で得られたベクターを、宿主に導入するステップ。
（ステップ６）更にヘルパーファージを感染させるステップ。
（ステップ７）ファージディスプレイされてファージ抗体を製造するステップ。
（ステップ８）ステップ７で得られた抗体から、ヒト及び齧歯類の両方のapoB蛋白質に対して特異性を有する抗体を選択するステップ。
【０１３４】
上記のステップは、必ずしも、この数字の順番に行わなければならないというものでは無く、例えば、ステップ５とステップ６を入れ替えることは可能である。
【０１３５】
ステップ１において、ヒトLDLを免疫する動物としては、ニワトリが好ましい。
【０１３６】
ステップ８において、特定の特異性を有する抗体だけを選択する方法として、パニング選択という方法が挙げられる。
このパニング選択とは、複数のファージ抗体から、標的蛋白質に対するファージを選別する操作であるが、基本的には、固定化した標的蛋白質に、ファージ抗体群を反応させ、結合しなかったファージを洗浄により除去し、結合したファージだけを溶出して大腸菌に感染させて増殖させる，という操作を、数回繰り返す事によって、標的蛋白質だけに特異性を有するファージを濃縮する方法である。
【０１３７】
［本発明のモノクローナル抗体の製造方法］
（１）本発明のモノクローナル抗体の製造に用いられる構成要素
本発明のモノクローナル抗体は、上記の方法によって選抜されたファージ抗体に含まれるVH鎖とVL鎖の組合せを、モノクローナル抗体のVH鎖及びVL鎖として有するものである。
具体的なVH鎖及びVL鎖としては、例えば、下記（I）及び／又は下記（II）等が挙げられる。
【０１３８】
下記（I），（II）は、Ｈ鎖及びL鎖のいずれの可変領域に用いても良いが、（I）をVH鎖とし、（II）鎖をVL鎖とすることが好ましい。
【０１３９】
(I)配列番号１乃至６のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチド，からなる群から選択されるポリペプチド。
(II)配列番号７乃至１２のいずれかで表されるポリペプチド，及びこれらの配列中の１乃至数個のアミノ酸が、置換，欠失，付加，挿入されたポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチド。
が挙げられ、(I)及び(II)の好ましい組合せとしては、下記(1)乃至(6)のいずれかである。
【０１４０】
(1)配列番号１及び配列番号７
(2)配列番号２及び配列番号８
(3)配列番号３及び配列番号９
(4)配列番号４及び配列番号１０
(5)配列番号５及び配列番号１１
(6)配列番号６及び配列番号１２
【０１４１】
（２）VH領域又はVL領域遺伝子の、ベクターへの導入
本発明のモノクローナル抗体は、上記で選抜したファージ抗体の遺伝子と同じ配列を有する遺伝子を、公知のニワトリ抗体の定常領域遺伝子を含む、プラスミド等のようなベクターに組み込み、CHO細胞等の動物細胞中で発現させることによって製造されるが、VH，VL，CH，CLとして、全て配列の明らかなものを使用することから、ペプチド合成等によって、直接合成することも可能である。
【０１４２】
尚、通常は、VH領域遺伝子とVL領域遺伝子は、各々別のベクターに組み込んで用いられるが、同一のベクター中に組み込んで、各々発現させても良い。
【０１４３】
［本発明のヒト又は齧歯類のapoB蛋白質の検出用キット（第十九の発明）］
本発明のヒト又は齧歯類のapoB蛋白質の検出用キットは、本発明の抗体，又は本発明の単鎖可変領域フラグメントを含むことを特徴としている。
【０１４４】
ここで、キットには、サンドイッチELISAの際に、本発明の抗体や単鎖可変領域フラグメントと対になって、apoB蛋白質を挟み込むための物質として、酸化フォスファチジルコリン特異的マウスモノクローナル抗体の他、ヒトLOX-1（hLOX-1）のようなLOX-1，又はその誘導体等も含めることができる。
【０１４５】
キットには、この他、apoB蛋白質に結合した本発明の抗体を検出するための二次抗体や、二次抗体に結合させた標識を検出するための基質等を含むことができる。
【０１４６】
二次抗体としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識抗ニワトリIgY抗体等が挙げられる。IgYとは、動物のIgGに相当する、ニワトリのイムノグロブリンである。
【０１４７】
HRP検出用の基質としては、発色基質OPD（オルトフェニレンジアミン）や発色基質TMB（テトラメチルベンジジン）等が挙げられる。
このキットによって、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質が検出できるため、LDL又はoxLDLが関与する疾患の診断も可能となる。
【０１４８】
［本発明のヒト又は齧歯類のoxLDLの検出用キット（第二十の発明）］
本発明のヒト又は齧歯類のoxLDLの検出用キットは、上記のapoB蛋白質の検出用キットにおいて、サンドイッチELISAの際に、本発明の抗体や単鎖可変領域フラグメントと対になって、oxLDLを挟み込むための物質として、hLOX-1又はその誘導体等を用いることを特徴としている。
このキットによって、ヒト及び齧歯類のoxLDLの特異的な検出ができるため、oxLDLが関与する疾患の診断も可能となる。
【０１４９】
［本発明のapoB蛋白質又はoxLDLの検出方法（第二十一の発明）］
本発明の、ヒト又は齧歯類から抽出した生体成分中の，或いは齧歯類生体中の、apoB蛋白質又はoxLDLの検出方法は、上記の本発明のキットを用いることを特徴とする。
【０１５０】
ヒト又は齧歯類から抽出した生体成分としては、ヒト又は齧歯類由来の組織，細胞，細胞抽出成分，体液等が挙げられる。
【０１５１】
組織としては、脾臓，リンパ節等が挙げられる。
【０１５２】
細胞としては、脾細胞，リンパ細胞，抗体産生細胞等が挙げられる。
【０１５３】
体液としては、血液、血清、血漿、尿、汗等が挙げられる。
【０１５４】
検出の容易性などを考慮すると、生体試料としては体液、特に血清・血漿が好ましい。
【実施例】
【０１５５】
［実施例１：ファージ抗体の製造（ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有するポリペプチドを発現するＶＨ鎖遺伝子とＶＬ鎖遺伝子の組み合わせの取得）］
【０１５６】
（１）ニワトリへの免疫
ヒトLDLをニワトリに免疫した。
【０１５７】
（２）RT-PCRによる、ニワトリ抗体の、様々なＶＨ領域とＶＬ領域の遺伝子（ｃDNA）の回収
【０１５８】
（３）単鎖可変領域フラグメント（scFv）遺伝子の製造
上記（２）で得られたＶＨ領域とＶＬ領域の遺伝子の複数の組合せを、リンカー（(GGGGS)3）（配列番号３１のペプチド）をコードする遺伝子及びスペーサー（Asp-Val）をコードする遺伝子を介して結合させ、scFv遺伝子を製造する。
【０１５９】
（４）ファージミドベクターの製造
ニワトリのCλと、g3p遺伝子をプラスミド（社製）に組み込んだプラスミド（pPDS）に、（３）のscFvを導入し、ファージミドベクターpLPDSを製造した。
【０１６０】
（５）大腸菌への感染
上記（４）で製造したファージミドベクターを、大腸菌（E.coli(XL1-Blue)）に形質転換した。
【０１６１】
（６）ヘルパーファージの感染
ファージミドベクターには、ファージ粒子を精製する遺伝子が揃っていないため、ヘルパーファージを同じ大腸菌に感染させた。
ヘルパーファージとしては、VCSM13 (STRATAGENE社製)を用いた。
【０１６２】
（７）ファージディスプレイによる抗体（ファージ抗体）の製造
ファージミドベクターとヘルパーファージを感染させた大腸菌を、約３０℃で培養し、scFvを融合蛋白質として発現するファージ１４種を採取した。
【０１６３】
（８）パニング選択による、ヒトのapoB蛋白質に特異性を有するファージ抗体の選抜
ヒトLDLを固定化し、採取したファージ抗体を反応させ、結合しなかったファージを洗浄した。結合したファージを溶出し、大腸菌に再度感染させ、増殖させた。この操作を５回繰り返し、ヒトLDLに特異性を有するファージ抗体を選抜したところ、６種類のファージ抗体を収集することができた。
選抜された６種のファージ抗体を、以下、＃２，＃７，＃１６，＃２０，＃２２，＃２４と記載する。
ここで、
＃２は、配列１＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番号７
＃７は、配列２＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番号８
＃１６は、配列３＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番号９
＃２０は、配列４＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番号１０
＃２２は、配列５＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番１１
＃２４は、配列６＋ペプチドリンカー＋スペーサー＋配列番号１２
である。
【０１６４】
［試験例１：サンドイッチELISAによるファージ抗体の特異性の確認］
上記で選択されたファージ抗体の、ヒトapoB蛋白質，マウスVLDL/LDL，及びマウスHDLに対する特異性を、ELISAによって、確認した。
尚、VLDLとは、超低密度のリポ蛋白質である。
【０１６５】
（サンドイッチELISAの条件）
蛋白質吸着プレートに、リコンビナントhLOX-1（rhLOX-1）を吸着させ、ここに特異性を確認する対象であるヒトapoB蛋白質，マウスVLDL/LDL，又はマウスHDLのいずれかを含む試料溶液を添加した。
【０１６６】
上記で得られた６種類のファージ抗体を各々添加し、二次抗体としては、HRPで標識した、抗ニワトリIgＹ抗体を用いた。
【０１６７】
この試験方法の模式図を図１に示す。模式図中では、特異性を確認する対象である蛋白質の代表として、ヒトapoB蛋白質を記載し、当該蛋白質を認識するファージ抗体の代表として、＃20を記載してある。
【０１６８】
特異性は、490nmの吸光度（二次抗体の標識であるHRPの、発色基質OPDの検出波長）によって評価し、その結果を図２に表す。
【０１６９】
図２において、６種類のファージ抗体＃２，＃７，＃１６，＃２０，＃２２，＃２４の、特異性の結果を示す。
図２の結果から、特にファージ抗体＃１６及び＃２０が、ヒトと齧歯類の両方のapoB蛋白質に対する特異性に優れていることが分かる。
【０１７０】
尚、この６種類のファージ抗体が有するscFvの遺伝子配列は、配列番号２５乃至３０で表されるものであった。
【０１７１】
配列番号２５：No.１３＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.１９
配列番号２６：No.１４＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.２０
配列番号２７：No.１５＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.２１
配列番号２８：No.１６＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.２２
配列番号２９：No.１７＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.２３
配列番号３０：No.１８＋ペプチドリンカー遺伝子＋スペーサー遺伝子＋No.２４
上記で、No.とは、配列番号を意味する。
【０１７２】
ファージ抗体の特異性は、同じ可変領域（VH及びVL）のセットを有するモノクローナル抗体の特異性と共通する傾向が強いので、上記配列番号２５乃至３０で表されるscFv遺伝子がコードする２つの可変領域を持つモノクローナル抗体，即ち、下記の組合せのポリペプチド配列を有するモノクローナル抗体は、同様に、ヒトと齧歯類のapoB蛋白質に対する特異性を有するものと考えられる。
【０１７３】
(1)配列番号１及び配列番号７（下記実施例２のHUC２）
(2)配列番号２及び配列番号８（下記実施例２のHUC７）
(3)配列番号３及び配列番号９（下記実施例２のHUC１６）
(4)配列番号４及び配列番号１０（下記実施例２のHUC２０）
(5)配列番号５及び配列番号１１（下記実施例２のHUC２２）
(6)配列番号６及び配列番号１２（下記実施例２のHUC２４）
【０１７４】
［実施例２：完全抗体の製造］
実施例１で得られた、＃２，＃７，＃１６，＃２０，＃２２，＃２４の６種の、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質に対して特異性を有するファージ抗体と同様のVH鎖及びVL鎖の組合せを用い、同様の特異性を有するモノクローナル抗体を製造した。
これらのモノクローナル抗体を、HUC２，HUC７，HUC１６，HUC２０，HUC２２，HUC２４とした。
【０１７５】
具体的には、上記実施例１で得られたファージ抗体を鋳型として増幅した、VH鎖遺伝子やVL鎖遺伝子を、公知のニワトリ抗体を鋳型として得られた、モノクローナル抗体に必要な他の領域の遺伝子を含むプラスミドベクターに導入し、各々のベクターを適当な動物細胞中で、発現させることによって、製造した。
【０１７６】
H鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターは、より具体的には、以下の条件に従って、RT-PCR法やオーバーラップPCR等を用いて製造した。
【０１７７】
＜H鎖発現ベクターの調製＞
1.VH領域の増幅
scFv抗体遺伝子を保有する大腸菌懸濁液またはファージ抗体を鋳型として使用した。
【０１７８】
(プライマー配列) 
【０１７９】
センスプライマー;VH-bivalent-F
5’-CCCCACAGGGCTGATGGCGGCCGTGACGTTGGACG-3’（配列番号３２）
【０１８０】
アンチセンスプライマー;3-15HR1
5’-ACGATGACTTCGGTCCCGTG-3’ （配列番号３３）
【０１８１】
(PCR反応組成) 
10xKOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25 μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase (東洋紡社製) 1 μl, 鋳型1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０１８２】
(PCR 条件) 
94°C 2 分を１回、(94°C 15秒、62°C 30 秒、68°C 30秒) を35回、68°C 2 分を１回、4°C 一定
【０１８３】
2.CH1領域の増幅
HUC2-13 (非特許文献１や、特開2001-238676等に記載されている、公知の抗ヒトプリオン蛋白質（PrP）抗体産生ハイブリドーマ) よりRNAを抽出し、Oligo-dT プライマー法によりcDNA を合成し、鋳型として使用した。
【０１８４】
尚、HUC2-13は、非特許文献１等に記載の方法で製造することができる。
【０１８５】
具体的には、チミジンキナーゼ欠損,ウアバイン耐性のニワトリＢ細胞株ＭｕＨ１と、プリオン蛋白質を免疫したニワトリ脾臓細胞を細胞融合した、哺乳動物プオリンタンパクPrPの２５−２９残基を認識する抗PrPニワトリモノクローナル抗体HUC2-13産生ハイブリドーマを作製する。そしてこれを、１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum）（SIGMA）含有ＩＭＤＭ（Iscove's modified Dullbecco's medium）（GIBCO BRL）培地を用い、３８．５℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養し、その培養上清から抽出することによって、HUC2-13モノクローナル抗体を製造した。
【０１８６】
(プライマー配列) 
【０１８７】
センスプライマー; 3-15 HF1
5’-CACGGGACCGAAGTCATCGT -3’（配列番号３４）
【０１８８】
アンチセンスプライマー; CH1-R Hinc II
5’-GACCTGCACCTCCGGGGGTACAGGC -3’（配列番号３５）
【０１８９】
(PCR反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25 μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, 鋳型cDNA 1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０１９０】
(PCR条件) 
VHと同一
【０１９１】
3.H鎖リーダー配列の増幅
HUC2-13 よりDNA を抽出し、鋳型として用いた。
【０１９２】
(プライマー配列) 
【０１９３】
センスプライマー; HUC2-HF4
5’- TTGGTACCACCACCATGAGCCCACTCGTCTCC -3’（配列番号３６）
【０１９４】
アンチセンスプライマー; VH-leader-R
5’-CGCCATCAGCCCTGTGGGGA -3’（配列番号３７）
【０１９５】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, 鋳型DNA 1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０１９６】
(PCR 条件) 
VH と同一
【０１９７】
4. オーバーラップPCR によるH 鎖遺伝子の増幅
上記1-3 の遺伝子を鋳型にオーバーラップPCR してH 鎖遺伝子を調製した。
【０１９８】
(プライマー配列) 
【０１９９】
センスプライマー; HUC2-HF4（配列番号３６）
【０２００】
アンチセンスプライマー; CH1-R Hinc II（配列番号３５）
【０２０１】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, VH, CH1, リーダー配列遺伝子各0.125 pmol, H2O 合計50 μl になるように添加した。
【０２０２】
(PCR 条件) 
94°C 2 分を１回、(94°C 15秒、62°C 30 秒、68°C 1分) を35回、68°C 2 分を１回、4°C 一定
【０２０３】
5. 制限酵素処理、ベクターへのライゲーション
得られたH鎖遺伝子断片は、Kpn I (New England Biolabs 社製) およびHind III (同社) により制限酵素処理した。制限酵素処理は試薬添付の説明書に従って行った。
また、HUC2-13 H 鎖遺伝子全長を挿入してあるpcDNA4/myc-His (A) (Invitrogen 社製) (あらかじめベクターの持つHind III をセルフライゲーションにより欠失させたもの) も同様に同制限酵素で処理し、得られたH 鎖遺伝子断片をLigation High (東洋紡社製) を用いてライゲーションした。ライゲーションは、試薬添付の説明書に従った。
【０２０４】
＜L 鎖発現ベクターの調製＞
1. VL 領域の増幅
scFv 抗体遺伝子を保有する大腸菌懸濁液またはファージ抗体を鋳型として使用した。
【０２０５】
(プライマー配列) 
【０２０６】
センスプライマー; VL-bivalent-F
5’- AGGTTCCCTGGTGCAGGCAGCAGTGACTCAGCCGC -3’（配列番号３８）
【０２０７】
アンチセンスプライマー; 3-15 LR1
5’- AGGACGGTCAGGGTTGTCC -3’（配列番号３９）
【０２０８】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase (東洋紡社製) 1 μl, 鋳型1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０２０９】
(PCR 条件) 
94°C 2 分を１回、(94°C 15秒、62°C 30 秒、68°C 30秒) を35回、68°C 2 分を１回、4°C 一定
【０２１０】
2. Cλ 領域の増幅
CH1 と同様、HUC2-13 由来cDNA を鋳型として使用した。
【０２１１】
(プライマー配列) 
【０２１２】
センスプライマー; 3-15 LF1
5’- GGACAACCCTGACCGTCCT-3’（配列番号４０）
【０２１３】
アンチセンスプライマー; HUC2-LR4
5’- TCTCTAGATTAGCACTCGGACCTCTTCAG-3’（配列番号４１）
【０２１４】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, 鋳型cDNA 1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０２１５】
(PCR 条件) 
VL と同一
【０２１６】
3. L鎖リーダー配列の増幅
H 鎖リーダー配列と同様、HUC2-13 由来DNA を鋳型として用いた。
【０２１７】
(プライマー配列) 
【０２１８】
センスプライマー; HUC2-VLF3
5’- ATATATAAGCTTGCCATGGCCTGGGCTCCTCTCCT -3’（配列番号４２）
【０２１９】
アンチセンスプライマー; VL-leader-R
5’ TGCCTGCACCAGGGAACCTG-3’（配列番号４３）
【０２２０】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, 鋳型DNA 1 μl, H2O 31.8 μl (合計50 μl) 
【０２２１】
(PCR 条件) 
VL と同一
【０２２２】
4. オーバーラップPCR によるL 鎖遺伝子の増幅
上記1-3 の遺伝子を鋳型にオーバーラップPCR してL 鎖遺伝子を調製した。
【０２２３】
(プライマー配列) 
センスプライマー; HUC2-VLF3（配列番号４２）
アンチセンスプライマー; HUC2-LR4（配列番号４１）
【０２２４】
(PCR 反応組成) 
10 x KOD plus buffer 5 μl, 2 mM dNTP 5 μl, 25 mM MgSO4 3.2 μl, 25μM 各プライマー1.5 μl, KOD plus DNA polymerase 1 μl, VH, CH1, リーダー配列遺伝子各0.125 pmol, H2O 合計50 μl になるように添加した。
【０２２５】
(PCR 条件) 
H 鎖遺伝子のオーバーラップPCR と同条件
【０２２６】
5. 制限酵素処理、ベクターへのライゲーション
得られたL鎖遺伝子断片は、Hind III (New England Biolabs 社製) およびXba I (同社) により制限酵素処理した。制限酵素処理は試薬添付の説明書に従って行った。
また、pcDNA3.1/myc-His (A) (Invitrogen 社製) も同様に同制限酵素で処理し、得られたL 鎖遺伝子断片をLigation High (東洋紡社製) を用いてライゲーションした。ライゲーションは、試薬添付の説明書に従った。
【０２２７】
得られたモノクローナル抗体を、HUC２，HUC７，HUC１６，HUC２０，HUC２２，HUC２４と名付けた（数字は、同じVH及びVLが含まれるファージ抗体＃２，＃７，＃１６，＃２０，＃２２，＃２４と対応している。）
【０２２８】
［試験例２：サンドイッチELISAによるモノクローナル抗体によるoxLDL検出］
【０２２９】
実施例１と同様の、rhLOX-1を固相化したプレートを用いるサンドイッチELISAにおいて、hLOX-1と対になってoxLDLを挟み込む抗体として、ファージ抗体に替えて、HUC20モノクローナル抗体を用いた。
ヒトoxLDL又はヒトLDL（＝nLDL（normal LDL）：非酸化LDL）を抗原に用いた検出試験を、それぞれ行った。
【０２３０】
この試験方法の模式図を図３に示す。
【０２３１】
固相化したrhLOX-1は、ヒトoxLDLに特異的に結合し、ヒトnLDLには、殆ど結合しないため、oxLDLを含む試料の場合だけ、本発明のモノクローナル抗体（HUC20）によって、抗原が検出されることになる。
【０２３２】
抗体の特異性は、450nmの吸光度（二次抗体の標識である、HRPの発色基質TMBの検出波長）によって評価し、その結果を図４に表す。
【０２３３】
図４から分かる通り、本発明のモノクローナル抗体は、oxLDLを含む試料溶液からは、rhLOX-1に結合したoxLDLを効果的に検出できたが、nLDLを含む試料溶液からは、殆どnLDLを検出出来なかった。
【０２３４】
［試験例３：サンドイッチELISAによるヒト血漿中のoxLDL検出］
また、ヒトの血漿中のoxLDL量を、上記と同様の検出方法を用いて測定したところ、312ng/mlであることが確認できた。
【０２３５】
［試験例４：サンドイッチELISAによるマウス血漿中のoxLDL検出］
更に、普通餌（Normal chow）マウスと、高脂肪餌（HF chow）マウスの血漿中のoxLDLについても、上記と同様の検出方法を用いて測定した。結果を下記表１に示す。
【０２３６】
【表１】
0005298299.tif 000002
【０２３７】
尚、表１中の、「ApoEKO」とは、動脈硬化症モデルとして公知の、Apoリポ蛋白質E遺伝子ノックアウトマウスを表し、「１１ｗ」とは、１１週齢を表し、「２ｗ」とは「２週間」を表す。
【０２３８】
表１の結果から、確かに、野生型マウスの場合も、普通餌と高脂肪餌では、血中のoxLDL量に差があり、動脈硬化モデルマウスの場合には、その差が更に大きいことが確認できた。
このことは、oxLDLが、高脂肪餌によって引き起こされ、動脈硬化の原因となっていると言う、近年の見解と一致するものであった。
【０２３９】
［試験例５：モノクローナル抗体の特異性の確認（ウェスタンブロッティング分析）］
実施例２で製造したモノクローナル抗体のうち、ファージ抗体の特異性試験（試験例１）で、ヒトapoB蛋白質と強く反応した＃16，＃20に対応する、IgY型に改変したモノクローナル抗体HUC16及びHUC20について、ウェスタンブロッティングにより、oxLDL，nLDLとの反応性を確認した。
結果を図５に示す。
【０２４０】
図５から分かる通り、HUC16抗体，HUC20抗体ともに、ヒト及びマウスのoxLDL及びLDLに対し、強い反応性を示したが、マウスHDLに対しては反応しなかった。
【０２４１】
［試験例６：脳卒中発症高血圧ラットにおける、ビタミンE食投与時のoxLDL量の検出］
脳卒中発症高血圧ラット（SHR-SP）ラット（１群６匹）に、低ビタミンＥ食又は高ビタミンE食を、７日間与えた。
【０２４２】
各々の、プラズマ（血漿）中のoxLDLを、本発明のモノクローナル抗体（HUC20）を用いた、上記と同様のサンドイッチELISAによって測定したところ、図６の結果が得られた。
【０２４３】
図６から分かる通り、過酸化脂質を分解すると言われているビタミンＥを多く摂取したラットでは、プラズマ中のoxLDLが有意に低いことが、本発明の抗体によって、裏付けられた。
またこの結果は、本発明のモノクローナル抗体が、マウス以外の齧歯類であるラットのapoB蛋白質にも結合している事をも示すものである。
【０２４４】
［試験例７：ApoEKOマウスの組織中のoxLDLの検出］
２４週齢のApoEKOマウス（雄）の大動脈の付け根（aortic root）２箇所（図７の上段及び下段）において、連続スライス切片を用い、公知の各種方法及び、本発明のモノクローナル抗体（HUC20）を用いた本発明の検出方法によって、apoB蛋白質の検出を行った。
結果を図７に示す。
【０２４５】
図中、「Oil Red O」とあるのは、脂質を検出するアザ色素の一種を用いた実験結果であるとの意味である。
【０２４６】
「anti-macrophage」とあるのは、抗マクロファージ抗体を用いて、oxLDLの受容体であるLOX-１を発現すると言われているマクロファージを、検出した結果であるとの意味である。
【０２４７】
「anti-apoB HUC20」とあるのは、本発明のモノクローナル抗体（HUC20）で、apoBを検出した結果であるとの意味である。
【０２４８】
尚、本発明のapoBに特異性を有する抗体の場合、oxLDLのみならず、LDLにも反応するが、動脈硬化部位における検出であることから、殆どがoxLDLであったと考えられる。
【０２４９】
「LOX1  ligand」とあるのは、本モデルマウス中に存在するoxLDLと反応させた「外来LOX-１」を、検出した結果であるとの意味である。
【０２５０】
図７から分かる通り、本発明のモノクローナル抗体を用いた、本発明のoxLDLの検出方法によって検出したoxLDLの位置は、従来の方法によってLDLやoxLDLの存在が推定される位置に一致していた。
【０２５１】
つまり、本発明の検出方法が、齧歯類生体中のoxLDLの検出方法としても、有用であることが裏付けられた。
【０２５２】
上記試験例１〜７の結果から、本発明のファージ抗体及びモノクローナル抗体，及び本発明の検出キット，本発明の検出方法が、apoB蛋白質を有するリポ蛋白質（LDLやoxLDL）の検出に有用であり、特に、rhLOX-1等のようなoxLDLを特異的に認識する受容体等との組合せによって、oxLDLだけを、特異的に認識することも可能であることが分かった。また、ヒトのみならず、マウスやラット等の齧歯類のapoB蛋白質をも検出できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２５３】
本発明は、ヒト及び齧歯類のapoB蛋白質を特異的に認識する抗体及びその材料遺伝子，並びに抗体の製造方法に関するものであり、oxLDLの関与する疾患の、診断・分析等への利用が可能な技術である。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】本発明のファージ抗体を用いた、サンドイッチELISAの原理を示す模式図である。図中の、「HRP-anti IgY」とは、HRP標識抗ニワトリIgY抗体を意味している。rhLOX-1と対になってヒトapoB蛋白質を挟み込んでいる#20は、６種類のファージ抗体の代表を示す。
【図２】rhLOX-1を固相化したプレートを用いたサンドイッチELISAによる、ファージ抗体の特異性確認試験結果を示す図である。縦軸は、HRPの発色基質OPDの検出波長（490nm）の吸光度によって評価した。
【図３】本発明のモノクローナル抗体（HUC20）を用いた、サンドイッチELISAの原理を示す模式図である。図中の、「HRP-anti IgY」とは、HRP標識抗ニワトリIgY抗体を意味している。
【図４】rhLOX-1を固相化したプレートを用いるサンドイッチELISAによる、完全抗体の特異性確認試験結果を示す図である。縦軸は、HRPの発色基質TMBの検出波長（4５0nm）の吸光度によって評価した。
【図５】ウェスタンブロッティング分析による、モノクローナル抗体の特異性確認試験結果を示す図である。
【図６】SHR-SPラットにおける、ビタミンE食投与時のoxLDL量の検出結果を示す図である。尚、図中の＊は、ｐ＜０．０５で有意差有りということを表し、＊＊は、ｐ＜０．０１で有意差有りということを表す。
【図７】本発明の検出方法による、ApoEKOマウスの組織中のapoB蛋白質の検出結果を示す図である。
【図８】scFv遺伝子を、プラスミドpLPDSに組み込んだ、本発明のscFv発現ベクター（ファージミドベクター）の構造を示す模式図である。VH遺伝子とVL遺伝子の間にあるのは、ペプチドリンカーである。
【図９】配列番号１〜１２を表す図である。
【図１０】配列番号１３〜１８を表す図である。
【図１１】配列番号１９〜２４を表す図である。
【図１２】配列番号２５〜２７を表す図である。図中の太字斜体は、ペプチドリンカー(GGGGS)3及び、スペーサー配列(DV)をコードする遺伝子を表す。
【図１３】配列番号２８〜３０を表す図である。図中の太字斜体は、ペプチドリンカー(GGGGS)3及び、スペーサー配列(DV) をコードする遺伝子を表す。
【図１】
0005298299.tif 000003
【図２】
0005298299.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005298299.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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