(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤痢菌およびＥＩＥＣから選択される第１の侵襲性グラム陰性細菌から得られる、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ並びに７２ＫＤａおよび８４ＫＤＡ高分子量タンパク質を含むＩｎｖａｐｌｅｘ  ５０を含む組成物の使用であって、赤痢菌、ＥＩＥＣ、サルモネラ属、エルシニア属、腸病性大腸属、リケッチア属、クラミジア属、ブルセラ属、エールリヒア属、エドワードシエラ属、カンピロバクター属およびナイセリア属から選択され、前記第１の侵襲性グラム陰性細菌と異なる第２の異種の侵襲性グラム陰性細菌の種または血清型による感染に対する治療用および／または病気予防用薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
前記Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が、フレクスナー赤痢菌、ゾンネ赤痢菌、ボイド赤痢菌および志賀赤痢菌からなる群から選ばれる赤痢菌属の種から得られる、請求項１の使用。
【請求項３】
前記Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０がＥＩＥＣから得られる、請求項１の使用。
【請求項４】
前記第２の侵襲性グラム陰性細菌が、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ＥＩＥＣ、サルモネラ属（チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の種を含む）、エルシニア属（仮性結核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉ））、腸病原性大腸菌、リケッチア属、クラミジア属、ブルセラ属、エールリヒア属、エドワードシエラ属、カンピロバクター属およびナイセリア属からなる群から選ばれる、請求項１の使用。
【請求項５】
ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ並びに７２ＫＤａおよび８４ＫＤＡ高分子量タンパク質を含むＩｎｖａｐｌｅｘ  ５０を含む、第１の赤痢菌による感染から保護するためのワクチンであって、第２の異種の赤痢菌またはＥＩＥＣから得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含むワクチン。
【請求項６】
第１の赤痢菌属による感染に対する免疫性を提供する薬剤の製造のための請求項５に記載されるワクチンの使用。
【請求項７】
前記ワクチンが、経口的、直腸的、皮下、皮内または筋肉内、鼻腔内および経皮からなる群から選択される投与様式に調製される、請求項６の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌の１つまたは複数の異種の種または菌株に対する免疫応答を
対象者において生じさせる際に使用される、グラム陰性細菌に由来する組成物Ｉｎｖａｐ
ｌｅｘに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性赤痢はヒト下痢疾患の主要な原因の１つである。１億６千万人を越える患者が、
毎年、特に開発途上国において発生し、百万人を越える患者が死亡していると推定される
（Ｋｏｔｌｏｆｆら、１９９９、ＷＨＯ、７７、６５１〜６６６）。疾患の原因となる最
も一般的な赤痢菌属の種は、フレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ゾンネ赤痢
菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）およびボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）である。工業化諸国で
は、毎年、約１５０万人の細菌性下痢患者が発生していると推定される（Ｋｏｔｌｏｆｆ
ら、１９９９、上掲）。工業化諸国における細菌性赤痢の発生率が低いことは、成人集団
は免疫がなく、感受性であることを意味する。このことは、アメリカの軍隊または旅行者
が、赤痢菌属について風土病的な地域に行ったときに容易に明らかになる。抗生物質が細
菌性赤痢に対して有効であるが、最新の抗生物質に対してさえも、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌ
ｌａ  ｓｐｐ．）における抗生物質耐性が絶えず出現していること（Ｈｏｇｅら、１９９
８、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２６：３４１〜３４５）により、赤痢菌属によ
る疾患を防ぐことを助ける効果的なワクチンが必要であることが強調される。
【０００３】
赤痢菌属の病理発生は、結腸上皮に侵入し、結腸上皮内に定着し、結腸上皮内の細胞内
で複製するこの生物の能力のためである。赤痢菌による宿主細胞への侵入は、多くの異な
る細菌タンパク質が関与する複雑な多因子的事象である。赤痢菌属の重要な毒性タンパク
質に対する遺伝子の多くが１４０Ｍｄａｌの大きなプラスミドにコードされる。侵入プラ
スミド抗原と呼ばれる、プラスミドにコードされるタンパク質の多く（ＩｐａＡ、Ｉｐａ
Ｂ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤのタンパク質）（Ｂｕｙｓｓｅら、１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１６９、２５６１〜２５６９）が、不可欠な毒性因子である。Ｓｉｐタンパ
ク質と呼ばれる類似するタンパク質がサルモネラ属のメンバーによって作られる（Ｋａｎ
ｉｇａら、１９９５、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９５、３９６５〜３９７１）。宿主細胞
に接触または結合したとき、赤痢菌属の様々なインベイシン（ｉｎｖａｓｉｎ）により、
宿主細胞による細菌の包み込みおよび内在化をもたらす食作用的事象が誘導される。最近
の報告では、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが、赤痢菌属培養物の増殖培地に見出され得る複合
体を形成することが確認されている（Ｍｅｎａｒｄら、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３
、５２９３〜５３０２；Ｗａｔａｒｉら、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４、２４６１〜
２４７０）。この複合体の成分が侵入プロセスに関与しているが、実際の機構は明らかに
されていない（Ｍｅｎａｒｄら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：５１５〜５２５）。さらに
、精製されたＩｐａＣは、宿主細胞に結合し、宿主細胞による無毒性赤痢菌属細菌の取り
込みに関係することが示されている（Ｍａｒｑｕａｒｔら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．
、６４：４１８２〜４１８７、１９９６）。ＬＰＳとともに、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよび
ＩｐａＤは、赤痢菌属細菌による感染の後、感染者が応答する知られている主要な抗原で
ある（Ｌｉら、１９９３、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２５、５６９〜５
７７；Ｏａｋｓら、１９８６、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５３、５７〜６３；ｖａｎ
ＤｅＶｅｒｇら、１９９２、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６６、１５８〜１６１）
。赤痢菌属細菌を感染させたサルまたはヒトは、主にＩｐａＢおよびＩｐａＣに対する抗
体を産生し、また、ＩｐａＡ、ＩｐａＤおよびＶｉｒＧ（細胞間の伝染に関与する、プラ
スミドにコードされる別の毒性タンパク質）に対する抗体をも高頻度で産生する（Ｏａｋ
ｓら、１９８６、上掲）。
【０００４】
赤痢菌属−宿主の相互作用の結果としてもたらされるこれらの炎症性かつ特異的な免疫
応答は、病原体を中和し、排除しようとする際に不可欠な毒性成分に向けられていると考
えられる。生じる免疫性により、同種の血清型による将来の感染に対する保護がもたらさ
れる（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ、１９９１、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、１３４：６１
４〜６２７；Ｆｏｒｍａｌら、１９９１、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６４：５３３
〜５３７）。Ｉｐａタンパク質に対する抗体の機能は完全には理解されていないが、Ｉｐ
ａＣまたはＩｐａＢに対するモノクローナル抗体を用いて赤痢菌属またはＥＩＥＣの侵入
性を阻害することが可能である（Ｍｉｌｌｓら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．
、５６：２９３３〜２９４１；Ｓｈａｉｋｈら、１９９５、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．、１２５：２４７〜２５３）。より近年には、ＩｐａＣのカルボキシ末端
に対するＭａｂにより、ＩｐａＣ誘導のアクチン重合が、透過処理された宿主細胞におい
て阻害されることが示された（Ｖａｎ  Ｎｈｉｅｕら、１９９９、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１７
４：１９９０〜２００１）。ＩｐａＣのエピトープマッピングにより、これらのエピトー
プ領域に応答する感染サルは、重篤な疾患を発症する可能性がより低いこと（Ｔｕｒｂｙ
ｆｉｌｌら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：３９２７〜３９３５）、そ
してこれらの３つのエピトープ領域の１つ（領域ＩＩＩ）がアクチン重合ドメインと同時
に局在化すること（Ｖａｎ  Ｎｈｉｅｕら、１９９９、上掲）が示されている。そうであ
るとしても、保護免疫性を、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって測定されるよ
うなインベイシン類のいずれかに対する特定の抗体応答と相関させることはこれまででき
なかった。対照的に、数多くの研究では、ＬＰＳが不可欠なワクチン成分であると結論さ
れており（Ｆｅｒｒｅｃｃｉｏ、１９９１、上掲；Ｆｏｒｍａｌ、１９９１、上掲；Ｍａ
ｌｌｅｔら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６３：２３８２〜２３８６；Ｏｒ
ｒら、１９９３、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６１：２３９０〜２３９５；Ｐｈａｌｉ
ｐｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：７６９〜７７８）、しかし、自身
によって送達されるＬＰＳが保護的でないこともまた明かである（Ａｄａｍｕｓら、１９
８０、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３０：３２１〜３２４；Ｍａｌｌｅｔ、１９９５、
上掲）。このことは、天然の感染に匹敵し得る保護的な免疫応答を誘発する様式でＬＰＳ
を提示することが、成功した赤痢菌属ワクチンには必要であることを示唆している。しか
し、赤痢菌属に対する保護的な免疫応答のためにＬＰＳのみに依存するワクチンは、同種
の攻撃には効果的であるが、異種の赤痢菌属種に対する保護をもたらすその潜在的能力が
限られており、このため、多価ワクチンを作製するために一価ワクチンを組み合わせるこ
とが必要になる。残念ながら、微々たる明かな交差保護とともに、赤痢菌属の血清型が優
位であるために、広い反応性を有するＬＰＳ型赤痢菌属ワクチンを設計することはこれま
で困難であった。
【０００５】
本発明者らの方法は、天然の毒性構造にある赤痢菌属のＬＰＳおよびタンパク質抗原（
Ｉｐａタンパク質を含む）から構成される亜細胞ワクチンであるＩｎｖａｐｌｅｘを使用
することである。Ｉｎｖａｐｌｅｘにより、不可欠な抗原が粘膜免疫系に送達され、それ
により、Ｉｎｖａｐｌｅｘが単離された赤痢菌属の菌株による感染に対する保護的な免疫
応答が（アジュバントの非存在下で）刺激される。生じた免疫応答は、ＬＰＳおよびイン
ベイシンに対する抗体が産生される点で天然の感染を模倣する（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ＆Ｏ
ａｋｓ、２０００、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６８、６６２４〜
６６３２）。二価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンを用いた実験を行っているとき、本発明者ら
は、驚くべきことに、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が、異種のグラム陰性細菌（すなわち、Ｉｎ
ｖａｐｌｅｘの供給源とは異なるグラム陰性細菌）による感染に対する保護をもたらし得
ることを発見した。これは、グラム陰性細菌の異種菌株に対する保護をもたらし得る赤痢
菌属ワクチンを最初に明らかにするものである。
【０００６】
Ｉｎｖａｐｌｅｘの単離および精製、ならびに同種の細菌（すなわち、Ｉｎｖａｐｌｅ
ｘが調製された細菌）による感染に対するワクチンとしてのその使用が、米国特許第６，
２４５，８９２号および同第６，２７７，３７９号に記載される（それらの内容はその全
体が参考として本明細書により組み込まれる）。
【０００７】
簡単に記載すると、Ｉｎｖａｐｌｅｘが、ＩｐａＣを赤痢菌属の水抽出物から単離およ
び精製することを目指した初期の実験のときに単離された。通常、ＩｐａＣは増殖培養培
地から抽出される。本発明者らは、水抽出物、すなわち、振とうしながら細菌を滅菌水中
でインキュベーションすることから得られる溶液を使用することを選んだ。これは、Ｉｐ
ａＣの量がそのような抽出物ではより大きくなると仮定したからである。本発明者らが知
る限り、グラム陰性細菌の侵入性に関与するタンパク質は、以前には、グラム陰性細菌の
水抽出物からは１つも単離されていなかった。本発明者らが驚いたことには、水抽出物を
ゲルろ過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの様々な分離技術
にかけたとき、ＩｐａＣが水抽出物から検出され得るときには常に、ＩｐａＢ、ＩｐａＤ
およびＬＰＳもまた同じ画分に検出されることが見出された。本発明者らは、この複合体
を単離し、特徴づけるための方法を設計することにした。様々なＩｎｖａｐｌｅｘ調製物
が毒性の侵襲性赤痢菌属細菌から単離される。粗混合物が、水を用いて赤痢菌属細菌から
抽出される。この水抽出物は多くのタンパク質およびリポ多糖（ＬＰＳ）からなる。その
後、この水抽出物材料をＦＰＬＣイオン交換カラムに負荷し、これにより、Ｉｎｖａｐｌ
ｅｘ（ｉｎｖａｓｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０と呼ばれる２
つの重要なタンパク質ピークが分離される。Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅ
ｘ５０を含有する画分が集められる。本発明者らは、複合体が、ＬＰＳに加えて、Ｉｐａ
Ｂ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤを含む多くのタンパク質から構成されることを見出した。Ｉｐａ
タンパク質およびＬＰＳを含有するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ
５０調製物は、完全に天然の立体配置および環境で一定の構造を形成する。Ｉｎｖａｐｌ
ｅｘ５０はまた、ＶｉｒＧ*と、以前には記載されていない７２ｋＤａおよび８４ｋＤａ
のポリペプチドとを含有する。Ｉｐａタンパク質およびＶｉｒＧとは異なり、７２ｋＤａ
および８４ｋＤａのポリペプチドは毒性プラスミドにコードされておらず、それにもかか
わらず、Ｉｎｖａｐｌｅｘと会合するタンパク質はそれぞれが、赤痢菌属のすべての種の
間において高度に保存されており、従って、赤痢菌属のすべての種に共通する、広い反応
性を有する抗原を表す。
【０００８】
Ｉｎｖａｐｌｅｘを使用して、動物が免疫化されたとき、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、感染時
にグラム陰性細菌によって提示される天然構造に対する免疫応答をもたらす。Ｉｎｖａｐ
ｌｅｘ調製物で免疫化されたマウスおよびモルモットは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４調製物お
よびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物に存在するいくつかの異なる抗原（水抽出物抗原、Ｉｐ
ａＣおよびＬＰＳを含む）に対するＩｇＡおよびＩｇＧの顕著な血清応答を示した。これ
らの２つのＩｎｖａｐｌｅｘ調製物は、ともに粘膜免疫系を刺激するという点で類似して
いたが、最も考えられることには抗原含有量が異なるために、生じた免疫応答の特異性が
異なっていた。これらの動物は、いずれかのＩｎｖａｐｌｅｘを用いた免疫化によって同
種のグラム陰性細菌による攻撃から保護された。いずれかのＩｎｖａｐｌｅｘで免疫化さ
れた動物は、苦痛または毒性の認められる徴候を何ら示さなかった。
【０００９】
ワクチンとしてのその有効性に加えて、本発明者らは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ製造物が、関
係のない混合されたタンパク質を、これらのタンパク質に対する免疫応答を増強する様式
で送達し得ることを見出した。従って、赤痢菌属のＩｎｖａｐｌｅｘ製造物は、細菌性赤
痢に対するワクチンとして、そして毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）またはカンピロバクター
属などの他の粘膜病原体に対するアジュバントとして、その両方で使用される可能性を有
する。
【００１０】
マウスの致死的肺モデルを使用して、本発明らは、フレクスナー赤痢菌２ａから得られ
たＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が同種の攻撃に対して保護的である
ことを見出している。ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０はマウスを保護したが、ゾン
ネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４は保護しなかった。これは、おそらくは、ＬＰＳおよび
Ｉｐａタンパク質のその量が低いためであると考えられる。免疫化された動物（フレクス
ナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖ
ａｐｌｅｘ５０）は、ＬＰＳおよび水抽出物タンパク質に対する抗体を産生した。これは
、ヒトにおける天然感染の後に生じる応答と非常に類似する応答である。ＬＰＳ、Ｉｐａ
ＢおよびＩｐａＣが不足しているゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウ
スは、Ｉｐａタンパク質またはＬＰＳに対する検出可能な抗体を産生しなかった。これら
の結果は、効果的なＩｎｖａｐｌｅｘワクチンは、保護的な免疫応答を刺激するために十
分な量のインベイシン類およびＬＰＳを有しなければならないことを示唆していた。
【００１１】
効果的な一価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンを組み合わせて、フレクスナー赤痢菌２ａ／ゾ
ンネ赤痢菌の成功した二価ワクチンが作製された。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ
２４／ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の二価ワクチンで免疫化されたマウスは、フレ
クスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃から保護された（フレクスナー赤
痢菌２ａ（８７％の保護、ｐ＜０．００１）、ゾンネ赤痢菌（１００％の保護、ｐ＜０．
００１））。この保護レベルは、同種保護のために使用される一価成分に匹敵していた。
フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４／ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の二価組
合せ物で免疫化されたマウスは、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳおよび
水抽出物（ｖｉｒ＋）に対する血清ＩｇＡ抗体応答および血清ＩｇＧ抗体応答を発達させ
た。これは、一価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンにより誘発される応答と非常に類似している
。一価のフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌ
ｅｘワクチンはいずれも、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかった。
【００１２】
上記に述べられた二価ワクチン研究の一部として、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅ
ｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫化されたコントロール
マウス群が異種の抗原で刺激された。例えば、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４
で免疫化されたマウスがゾンネ赤痢菌で刺激された。この実験では、フレクスナー赤痢菌
Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスの３０％のみがゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃
を生き延びただけであった（ｐ＝０．０５２）。しかし、驚くべきことに、ゾンネ赤痢菌
Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたマウスはフレクスナー赤痢菌の致死的な攻撃から保
護された（８９％の生存、ｐ＜０．００１）（下記の表１を参照のこと）。ＬＰＳが、保
護免疫性のための重要な標的抗原であると考えられており、そして赤痢菌属の種の間にお
ける大きな抗原性の違いがＬＰＳであるので、異種保護は、典型的には、赤痢菌属ワクチ
ンについては予測されていない。しかし、赤痢菌属のすべての種に存在するＩｐａＢ、Ｉ
ｐａＣ、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａを含む保存されたタンパク質の存在は、ゾンネ赤痢
菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより誘発されるこの交差保護的な異種免疫性において
極めて重要な役割を果たしていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウスを、フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０からなるいずれかの一価ワクチン；フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の混合物からなる二価ワクチン、あるいは生理的食塩水で免疫化した。免疫化マウスおよびコントロールマウスは致死量のフレクスナー赤痢菌２ａ（左側の３つの群）またはゾンネ赤痢菌（右側の３つの群）で鼻腔内に攻撃された。感染マウスは、感染後１４日までの死亡についてモニターされた。
【図２】フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌を感染させたＩｎｖａｐｌｅｘ免疫化マウスにおける体重の減少および回復。フレクスナー赤痢菌２ａ（ｆｌｅｘ  ｃｈａｌｌ）またはゾンネ赤痢菌（ｓｏｎ  ｃｈａｌｌ）のいずれかを感染させた後、マウスの体重を１４日間にわたり毎日測定した。この研究で使用された群には、フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌で攻撃されたフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（２４ｆｌｅｘ）免疫化マウス；フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌のいずれかで攻撃されたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（５０ｓｏｎ）免疫化マウス；生理的食塩水で免疫化され、いずれかの病原体で攻撃されたマウス；そして未処置のコントロールマウスが含まれる。
【図３】同種または異種の攻撃に対する一価Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンの保護能。マウスにフレクスナー赤痢菌２ａ（ｃｈａｌｌ  ｆｌｅｘ）またはゾンネ赤痢菌（ｃｈａｌｌ  ｓｏｎｎｅｉ）のいずれかを感染させた後、死亡を１４日間にわたり毎日記録した。この研究で使用された群には、フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌で攻撃されたフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（２４ｆｌｅｘ）免疫化マウス；フレクスナー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌のいずれかで攻撃されたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（５０ｓｏｎ）免疫化マウス；生理的食塩水で免疫化され、いずれかの病原体で攻撃されたマウス；そして未処置のコントロールマウスが含まれる。
【図４】リポ多糖の存在を明らかにするためにプロテイナーゼＫ（ＰＫ）の存在下または非存在下で処理されたＩｎｖａｐｌｅｘ調製物を示す銀染色ポリアクリルアミドゲル。フレクスナー赤痢菌２ａ由来のＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物（それぞれの処理について２つの調製物）が左側の２つのパネルに示され、右側の２つのパネルはゾンネ赤痢菌由来のものである。ＬＰＳ（ＰＫ処理レーンを参照のこと）が染色され、フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４、フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０、およびゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０に存在する。ＬＰＳは、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４では著量で染色されない。従って、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４は、ＬＰＳ含有量が、フレクスナー赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０に見出される含有量と比較して少ない。
【図５】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図６】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図７】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図８】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図９】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図１０】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図１１】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図１２】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０の一価ワクチンのいずれかを用いた免疫化により誘導される抗体レベル。抗原および抗体イソ型には、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図５、ＩｇＧについては図６）；ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（ＩｇＡについては図７、ＩｇＧについては図８）；水抽出物／ＩｇＡレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図９、ｖｉｒ−水抽出物については図１０）；および水抽出物／ＩｇＧレベル（ｖｉｒ＋水抽出物については図１１、ｖｉｒ−水抽出物については図１２）が含まれる。
【図１３】ウエスタンブロット。ウエスタンブロットで使用された抗血清には、ＩｐａＢに対するモノクローナル抗体（２Ｆ１）、ＩｐａＣに対するモノクローナル抗体（２Ｇ２）およびＩｐａＤに対するモノクローナル抗体（１６Ｆ８）、そしてすべてのＩｐａタンパク質（ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤ）およびＶｉｒＧに対する抗体を含有するサル回復期血清プール（Ｍ２１３）が含まれた。ウエスタンブロットのために使用されたモルモット血清は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物から得られた。
【図１４】ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットにおけるＩｇＡ抗体分泌細胞（ＡＳＣ）。２週間の間隔で与えられたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の３回の鼻腔内用量（２５μｇ）で免疫化されたモルモットから得られた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を様々な赤痢菌属抗原とインキュベーションして、様々な赤痢菌属抗原に対するＩｇＡを分泌する循環Ｂ細胞の数を測定した。血液が最後の免疫化の１週間後に集められた。１００万細胞あたりのＡＳＣ数が示される。ＰＢＬは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（Ｓｏｎ  ＬＰＳ）、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｓｏｎ  ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｆｌｅｘ  ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（Ｆｌｅｘ  ＩＶＰ２４）およびフレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（Ｆｌｅｘ  ＬＰＳ）を含む５つの異なる赤痢菌属抗原とインキュベーションされた。
【図１５】すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＬＨ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするために、このウエスタンブロットにおいて使用された（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＬＨ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印によって示される。
【図１６】すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてフレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＲＳ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするために、このウエスタンブロットにおいて使用された（レーンは抗原含有物により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＲＳ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印によって示される。
【図１７】ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
【図１８】フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、その後、フレクスナー赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
【図１９】赤痢菌属細菌の表面におけるＩｎｖａｐｌｅｘ５０の交差反応性タンパク質抗原の同定。表面タンパク質が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質に対する抗体を（他のタンパク質抗原に対する抗体もまた一緒に）含有する回復期の抗血清を完全な無傷の毒性赤痢菌属細菌とインキュベーションすることによって同定された。短時間のインキュベーション、および非特異的に結合した抗体を除くための洗浄を行った後、表面抗原に結合した抗体を低いｐＨのグリシン緩衝液で溶出した。溶出された抗体溶液をｐＨ７．４に中和し、続いてウエスタンブロットで使用した。「アフィニティー精製、１：３」でのレーン；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であり、右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物である。「全細胞、１：３００」でのレーン；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であり、右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物である。表面タンパク質抗原の本質的には同じセットが、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（左側パネル）またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（右側パネル）のいずれかで免疫化されたモルモットから得られたアフィニティー精製の抗血清によって認識された。各パネルの中央レーンは、示された標準物のサイズ（ｋＤａ単位）を有する分子量マーカーである。
【図２０】赤痢菌属Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０から単離された高分子量複合体（ＨＭＭＣ−５０）の特徴づけ（図２０Ａ、ＢおよびＣ）。高分子量複合体（ＨＭＭＣ）がサイズ排除クロマトグラフィーによってＩｎｖａｐｌｅｘ調製物から単離される。パネルＡには、抗ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０モルモット血清でプローブされた赤痢菌属ＨＭＭＣ−５０のウエスタンブロットが示される。この抗血清は、ＨＭＭＣ−５０に存在する、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢ、５８ｋＤａおよびＩｐａＣのバンドと反応する。パネルＢは、ＩｐａＢおよびＩｐａＣに対するモノクローナル抗体でプローブされたＨＭＭＣ−５０のウエスタンブロットである。ＩｐａＢおよびＩｐａＣのバンドが示される。パネルＣは、典型的なＬＰＳバンド形成パターンを示す、プロテイナーゼＫで処理されたＨＭＭＣ−５０の銀染色ゲルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（要約）
本明細書には、グラム陰性細菌の同種の種（すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘが調製さ
れた種）による感染から保護するために効果的であり、かつグラム陰性細菌の異種の種（
すなわち、当該Ｉｎｖａｐｌｅｘに寄与しなかった種）による感染に対して効果的である
グラム陰性ワクチンＩｎｖａｐｌｅｘ５０が記載される。
【００１５】
Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンの潜在的な利点には、下記が含まれる。ａ）Ｉｎｖａｐｌｅ
ｘは、遺伝的変化を必要とすることなく任意の赤痢菌属の種または毒素原性大腸菌から抽
出され得る非感染性の物質である；ｂ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは、小動物における鼻内経路に
よって送達されたとき、安全かつ有効である；ｃ）Ｉｎｖａｐｌｅｘは、赤痢菌属の多数
の種に対する、広い反応性を有する異種免疫性を刺激する潜在的能力を有する；ｄ）Ｉｎ
ｖａｐｌｅｘは一次ワクチンまたは二次（追加免疫）ワクチンとして使用することができ
る；ｅ）多価のＩｎｖａｐｌｅｘワクチンを容易に製造し、評価することができる；ｆ）
Ｉｎｖａｐｌｅｘのアジュバント様性質のために、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、ＥＴＥＣまたは
カンピロバクター属などの他の粘膜病原体に由来する抗原を送達することができ、これに
より、腸病原体に対する真の多価ワクチンをもたらす。
【００１６】
従って、本発明の１つの目的は、グラム陰性細菌の血清型または菌株に由来するＬＰＳ
、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の７２ｋＤａ成分、
およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の８４ｋＤａ成分を、同種または異種のグラム陰性細菌に対
する保護抗体を動物において誘発させるために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能
な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含むグラム陰性ワクチンを提供することである。
これらのワクチン成分のいずれかの供給源は、任意の赤痢菌から単離されたＩｎｖａｐｌ
ｅｘ５０などの天然の供給源であり得るか、または例えば、単離された組換えタンパク質
およびＬＰＳまたはその一部分を、それらの天然の立体配置において、適正な化学量論的
割合で組み合わせることによる組換え供給源であり得る。ワクチンは、同じ種もしくは血
清型の赤痢菌属もしくはグラム陰性細菌に由来する成分、または異なる種および血清型の
赤痢菌属もしくはグラム陰性細菌に由来する成分を含み得ることが理解される。
【００１７】
従って、本発明の１つの目的は、赤痢菌属の種または血清型に由来するＩｎｖａｐｌｅ
ｘを、同種の赤痢菌属の種、および／またはＩｎｖａｐｌｅｘの供給源に対して異種の１
つ以上の種もしくは菌株に対する保護抗体を対象体において誘発するために効果的な量で
含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアまたは賦形剤を含む赤痢菌属ワクチ
ンを提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、１つ以上のグラム陰性細菌から得られるＩｎｖａｐｌｅｘを、Ｉ
ｎｖａｐｌｅｘの供給源に対して同種または異種である細菌に対する保護抗体を対象体に
おいて誘発するために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリア
または賦形剤を含むグラム陰性細菌に対するワクチンを提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、細胞浸入性大腸菌（ＥＩＥＣ）のワクチンで、ＥＩＥＣから得ら
れるＩｎｖａｐｌｅｘ５０を、ＥＩＥＣの同種株および異種株に対する保護抗体を対象体
において誘発するために効果的な量で含み、かつ薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリ
アまたは賦形剤を含むワクチンを提供することである。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、グラム陰性細菌の同種または１つ以上の異種の種もしくは
菌株による感染に対する保護をもたらし得るワクチンを調製する方法で、グラム陰性細菌
からＩｎｖａｐｌｅｘ５０を単離することを含む方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的および利点が下記の説明から明らかになる。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、天然の構造を形成するために一緒に複合体化したＬＰＳとの組合せでインベ
イシン類を含み、１つ以上の異種の赤痢菌属の種に対する保護的な免疫原として１つの赤
痢菌属の種に由来するＩｎｖａｐｌｅｘの使用を記載する。
【００２３】
Ｉｎｖａｐｌｅｘは、Ｉｎｖａｐｌｅｘが単離された細菌、および／またはグラム陰性
細菌の少なくとも１つの他の異なる菌株もしくは単離体もしくは種による感染から保護す
るためにグラム陰性細菌の任意の菌株から調製することができる。グラム陰性細菌には、
フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、
ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）、ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（
Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ＥＩＥＣ、サルモネラ属（チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）
、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の種を含む）、エルシニア属（仮性結
核菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉ））、腸病原性大腸菌、リケッチア属
、クラミジア属、ブルセラ属、エールリヒア属、エドワードシエラ属、カンピロバクター
属およびナイセリア属が含まれるが、これらに限定されない。これらはすべてが、グラム
陰性の構造体を有する侵襲性細菌である（すなわち、これらは、内膜または細胞質膜と、
内膜を囲む外膜とを有する）。
【００２４】
野生型の毒性グラム陰性細菌に加えて、Ｉｐａタンパク質の過剰量を発現する変異体、
より多くのＩｎｖａｐｌｅｘの産生をもたらし得る変異体などのこれらの生物の変異体も
有用であり得る。Ｉｐａタンパク質の合成は赤痢菌属細菌では高度に調節されている。遺
伝子ｖｉｒＦが、他の遺伝子が関与するようにこの調節に関与している（Ｓａｋａｉら、
１９８８、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２、５８９〜５９７）。上記および下記にお
いて本明細書中に引用される文書はすべて、それらを示すことによってその全体が本明細
書により組み込まれる。さらに、その生物がトキシン（例えば、シガトキシン）を産生し
ないようにトキシン遺伝子に変異を有する細菌からＩｎｖａｐｌｅｘを調製することは有
益であり得る。ｔｏｘ−株から調製されたＩｎｖａｐｌｅｘは、トキシンによる潜在的な
混入が除かれるので、潜在的に安全性がより大きい。
【００２５】
増大したＩｎｖａｐｌｅｘレベルを、インベイシンタンパク質の分泌を刺激する化学物
質の存在下でこの複合体を抽出することによって達成することができる。そのような化学
物質には、コンゴーレッド、エバンスブルーおよびダイレクトオレンジが含まれる（Ｂａ
ｈｒａｎｉ，Ｆ．Ｋ．、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６５：４００５〜４０１０、１９
９７）。これらの化学物質は水抽出時または細菌増殖時に加えることができる。
【００２６】
インベイシンタンパク質（赤痢菌属に対するＩｐａタンパク質、または他の侵襲性細菌
における類似するタンパク質）を単離するためには、インベイシンタンパク質が細菌によ
って発現されなければならない。インベイシンタンパク質が表面に発現されないか、また
は全く発現されない場合、Ｉｎｖａｐｌｅｘは存在しない。例えば、ゾンネ赤痢菌では、
Ｉ型培養物が毒性であるので、Ｉ型培養物を使用しなければならない。ＩＩ型培養物は、
毒性プラスミドにおける大きい自発的欠失のためにＩｐａタンパク質を発現しない。さら
に、Ｉｎｖａｐｌｅｘは、インベイシンタンパク質をコードする遺伝子が加えられ、その
遺伝子を発現させる細菌から単離することができる。そのような細菌は、インベイシンタ
ンパク質を以前から含有し、かつ発現してもよく、またはそうでなくてもよく、そしてＩ
ｎｖａｐｌｅｘの精製の容易さなどの特定の目的のために、または低下したトキシン産生
などの好都合な性質のために選ばれる。
【００２７】
赤痢菌属細菌の表面におけるＩｐａタンパク質の提示は、ｓｐａ遺伝子座またはｍｘｉ
遺伝子座における遺伝子を変異させることによって低下させることができる。ｓｐａ／ｍ
ｘｉ遺伝子変異体はＩｐａタンパク質を正常な量で作るが、Ｉｐａタンパク質が生物の外
部に提示または分泌されない。以前には、低下した量のＩｐａＢおよびＩｐａＣが、ｓｐ
ａ変異体における水抽出物に存在することが示されている（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎら、１
９９２、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４、１９９０〜２００１）。
【００２８】
無毒性培養物を使用することの可能性を克服するためには、Ｉｎｖａｐｌｅｘの供給源
として使用される培養物が試験され、毒性であることを証明することが重要である。これ
は、通常、セレニー（Ｓｅｒｅｎｙ）試験（下記の「材料および方法」および「実施例」
に記載されるようなモルモットにおける角結膜炎）によって行われる。毒性を保証する別
の手段は、赤色であるコロニー（またはコンゴーレッド色素と結合するコロニー）がほぼ
常に毒性であるコンゴーレッド培地で赤痢菌属細菌の培養物を増殖させることである。無
毒性の培養物をもたらす自然変異は珍しくないので、毒性の評価は、赤痢菌属細菌の培養
物に関して極めて重要である。いくつかの培養物が部分的に毒性であり得るとしても、収
量が損なわれるが、Ｉｎｖａｐｌｅｘを単離することは可能であることが理解される。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、Ｉｎｖａｐｌｅｘをグラム陰性細菌から単離およ
び精製するための方法に関する。本発明の方法では、Ｏａｋｓら（１９８６、Ｉｎｆｅｃ
ｔ  Ｉｍｍｕｎ．、５３、５７〜６３）によって記載される水抽出技術の改善が使用され
る。これらの改善は、水抽出調製物を調製するための時間を最小限にすることによって機
能的生成物の収量を増大させることを目的とした。これらの改善には、Ｉｎｖａｐｌｅｘ
を濃縮することができるイオン交換カラムを使用することが含まれ、それにより、イオン
交換カラムへの負荷に先立って時間のかかる限外ろ過工程によって水抽出物を濃縮しなけ
ればならないことが除かれる。限外ろ過は、タンパク質分解的な分解がその間に生じるこ
とがある一晩かけて行われることが多かった。Ｉｐａタンパク質は極めて不安定であり、
かなり急速に分解する。別の改善は、タンパク質を抽出するために使用される水の量であ
る。本発明の方法では、以前（Ｏａｋｓら、１９８６、上掲）に使用された１／１０の比
率の代わりに、培養物を増殖させるために使用された培地の体積の１／２０である体積の
水が使用される。例えば、赤痢菌属細菌が２０リットルの培地で増殖させられる場合、１
リットルの水が抽出のために使用される。他の改変には、超遠心分離前および／または超
遠心分離後の両方で、水抽出物を０．４５ｕｍまたは０．２２ｕｍのメンブランでろ過す
ることが含まれる。この工程により、細菌が水抽出物材料から除かれ、生細菌を含有する
可能性が一層小さくなる。この工程は、ヒトでの試験において使用される任意の製造物に
ついては必須である。また、Ｏａｋｓ（１９８６、上掲）に記載された最初の手法では、
非常に強力で、危険なプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフ
ルオリド）が使用された。このプロテアーゼ阻害剤は、毒性であるので、もはや使用され
ない。複合体中のタンパク質の分解を最小限に抑えるために、水抽出物は、タンパク質分
解的な分解を最小限に抑えるために氷上で保たれる。
【００３０】
本発明の方法は、細菌細胞を集める工程、滅菌水中で細胞を抽出する工程、膜断片を水
抽出物から分離し、捨て、これにより、Ｉｎｖａｐｌｅｘを含有する溶液を得る工程、そ
してＩｎｖａｐｌｅｘを溶液から単離する工程を含む。グラム陰性細菌を培養で増殖させ
ることは当業者には知られている。一般的な参照文献については、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８１、Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｐ．Ｇｅｐｈａｒｄら編）を参照されたい。増殖に関する
培地および条件が、赤痢菌属については下記の「材料および方法」に詳しく議論される。
増殖後、細菌細胞は、滅菌水、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、規定生理的食塩水（０．１
５ＭのＮａＣｌ）、またはＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の画分が所
望のカラムに結合することを条件が可能にする限り、他の緩衝液においても抽出される。
【００３１】
抽出溶液に界面活性剤を含まないことが好ましい。これは、界面活性剤は、イオン交換
カラムで一貫した様式で挙動しないことがある混合ミセル（様々なタンパク質を含有する
ミセル）を形成する傾向があるからである。界面活性剤はまた、Ｉｎｖａｐｌｅｘ製造物
を妨害し得る内在性膜タンパク質を可溶化する。最後に、界面活性剤はＩｎｖａｐｌｅｘ
を破壊または変性させることがあり、そして複合体の個々の成分をすべて可溶化すること
がある。滅菌水は、当分野で知られている方法によって、例えば、０．１０ミクロン、０
．２２ミクロンまたは０．４５ミクロンのフィルターでろ過することによって調製するこ
とができる。水に対する細菌細胞の濃度は、好ましくは、１ｍｌの水または緩衝液に対し
て１×１０7個〜約２×１０12個の細胞であり、より好ましくは１×１０8個〜約２×１０
11個の間である。
【００３２】
抽出時間は、長すぎる場合には製造物の分解が生じることがあり、そして短すぎる場合
には生成物の収量が悪くなるので、好ましくは調節される。
【００３３】
プロテアーゼ阻害剤を、最終製造物のタンパク質分解を低下させることを助けるために
抽出工程のときに加えることができる。添加され得るプロテアーゼ阻害剤の例には、フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が含まれる。セリンプロテアーゼ阻害剤な
どの他のプロテアーゼ阻害剤を利用することができるが、それらは、通常、少し毒性であ
る。Ｉｎｖａｐｌｅｘが生細胞に投与されることになるならば、プロテアーゼ阻害剤の毒
性のために、プロテアーゼ阻害剤を使用しないか、または投与に先立ってプロテアーゼ阻
害剤を溶液から除くことが好ましい。しかし、ＩｎｖａｐｌｅｘがＥＬＩＳＡ試薬のため
に使用されることになるならば、プロテアーゼ阻害剤を溶液中に存在させることが好まし
いという事実のために、プロテアーゼ阻害剤を溶液中に残すことができる。
【００３４】
次に、細胞および膜断片が、遠心分離、ろ過、マイクロろ過、限外ろ過などの当分野で
知られている方法によって溶液から除かれる。しかしながら、限外ろ過が、溶液をイオン
交換クロマトグラフィーに供する前に小さい膜断片を除くためには好ましい。抽出後、複
合体は、複合体混合物における粒子を分離するために好適な任意の技術によって細胞破片
から分離することができる。その後、複合体は、アニオン交換クロマトグラフィーまたは
カチオン交換クロマトグラフィーまたは他の単離技術によって精製することができる。そ
のような単離技術には、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、電気泳
動、等電点フォーカシング、免疫吸着、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相
互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティーク
ロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、
高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）、迅速ＬＣ（ＦＰＬＣ）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ
ィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるが、これに限定されない。アニオン
交換体には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）｛−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｈ（ＣＨ２ＣＨ
３）２｝；四級アミノエチル（ＱＡＥ）｛−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋Ｈ（Ｃ２Ｈ５）−ＣＨ２
ＣＨＯＨ−ＣＨ３｝；および四級アンモニウム（Ｑ）｛−ＯＣＨ２ＣＨＯＨ−ＣＨ３ＣＨ
ＯＨ−ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）Ｃ３｝が含まれる。そのような官能基は、粒子サイズがそれ
ぞれ異なる様々な担体に結合させられるが、担体材料に関してもまた異なる。担体材料の
例には、モノビーズ、親水性ポリスチレン／ジビニルベンゼンの１０ｕｍのビーズ｛すな
わち、Ｍｏｎｏ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓｕｌａ、スェーデン）｝；ミニビーズ
、親水性ポリマーの３ｕｍのビーズ｛すなわち、Ｍｉｎｉ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝
；１５ｕｍ＆３０ｕｍの単分散型の親水性化された剛直ポリスチレン／ジビニルベンゼン
ビーズ｛すなわち、Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝；セファロース、３４ｕｍ〜５０ｕｍの
高架橋度のアガロースビーズ｛すなわち、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およ
びＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）｝；セファロース・ファースト
・フロー、９０ｕｍのアガロースビーズ｛すなわち、Ｑセファロース・ファースト・フロ
ー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）｝；セファロース・ビッグ・ビーズ、１００ｕｍ〜３００ｕｍ
のアガロースビーズ｛すなわち、Ｑセファロース・ビッグ・ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）｝が含まれる。
【００３５】
塩化物イオン（Ｃｌ−）は、アニオン交換クロマトグラフィーのための優れた対イオン
であり、この場合、緩衝液の選択は、要求されるｐＨ間隔に依存する。Ｔｒｉｓは、７．
６〜８．０の効果的な緩衝化範囲を有するが、使用され得る他の緩衝液には、Ｎ−メチル
−ジエタノールアミン（ｐＨ８．０〜８．５）、ジエタノールアミン（ｐＨ８．４〜８．
８）、１，３−ジアミノプロパン（ｐＨ８．５〜９．０）、エタノールアミン（ｐＨ９．
０〜９．５）、および潜在的にはピペラジン（ｐＨ９．５〜９．８）が含まれる。これら
の緩衝液は、低濃度（通常的には２０ｍＭ）で使用されるが、５０ｍＭもの高濃度にする
ことができる。
【００３６】
免疫原性および機能が損なわれていないようにＩｎｖａｐｌｅｘの天然構造が維持され
、多量の希薄なタンパク質溶液を負荷し、濃縮することが可能になり、そして緩衝液が生
物学的に適合し、そして方法が、製造物の分解を最小限に抑えるために迅速であり、かつ
処理工程をほとんど必要としない限り、他のカラムまたは方法を使用することができる。
【００３７】
各カラムを赤痢菌属の特定の血清型および菌株に対して専用にすることが好ましい。最
終製造物における最適なタンパク質濃度は、１ｍｌあたり約１０回分の用量である。しか
し、範囲は、１ｍｌあたり０．１用量（２．５ｕｇ／ｍｌのタンパク質濃度）もの低さか
ら、溶解性が維持される限り、１ｍｌあたり５０００用量（１２５ｍｇ／ｍｌのタンパク
質濃度）のはるかにより大きいレベルにまですることができ、すなわち、高すぎて沈殿を
生じさることがなく、かつ低すぎて、ろ過を、過度な費用および時間がかかるものにしな
い濃度にすることができる。
【００３８】
理想的ではあるが、本発明者らは、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０
のピーク画分において０．２５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌを達成している。タンパク質濃
度が０．２５ｍｇ／ｍｌ未満である場合、遠心分離またはタンジェンシャルフローによる
サイズ排除ろ過（１００００〜１００，０００のｍｗカットオフ、より好ましくは３０，
０００のｍｗカットオフ）によって濃縮しなければならない。
【００３９】
下記の「材料および方法」に記載される方法を使用して、最大量のＩｐａＢおよびＩｐ
ａＣを含有する画分が、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０をもたらす２
４％緩衝液および５０％緩衝液でイオン交換カラムから溶出された画分に見出された。
【００４０】
この方法では、他のグラム陰性細菌との使用のために最小限に改変する必要がある。例
えば、他のイオン交換カラムを使用することができ、そして異なる抗体を、標的抗原につ
いてプローブするために使用しなければならない。例えば、ＳｉｐＢおよびＳｉｐＣに対
する抗体を、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）から得られる複合体を含
有するピーク画分を同定するために使用しなければならない。エルシニア属では、抗ＹＯ
Ｐタンパク質抗体が必要である（ＣｏｒｎｅｌｉｚおよびＷｏｌｆ−Ｗａｔｚ、１９９７
、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２３、８６１〜８６７）。
【００４１】
Ｉｎｖａｐｌｅｘを製造するための他の方法では、天然の立体配置を有する複合体を形
成させるために、個々のインベイシンタンパク質がＬＰＳと組み合わせられる方法が含ま
れる。さらに、インベイシン／ＬＰＳ複合体を、上記および下記に記載されるような精製
技術によってＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の画分における他の成分
からさらに精製することができる。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、グラム陰性細菌に対する異種保護のためのワクチ
ンに関する。本発明のワクチンは、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＤ、ＶｉｒＧ、
Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の７２ｋＤａ成分、およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の８４ｋＤａ成分
を天然の立体配置で含むグラム陰性細菌由来のＩｎｖａｐｌｅｘ５０を含む。本発明のワ
クチンは、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが単離されたグラム陰性細菌とは異種のグラム陰性
細菌、すなわち、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが単離されたグラム陰性細菌とは異なるグラ
ム陰性細菌による感染から保護するために、対象体を免疫化するために使用することがで
きる。本発明のワクチンは、上記または下記に詳しく記載される方法を使用してＩｎｖａ
ｐｌｅｘ５０を単離することによって、あるいは組換えタンパク質を単離し、それらを組
み合わせて、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０様の組成物を形成させることによって調製することが
できる。１つ以上の単離されたＩｎｖａｐｌｅｘが、当分野で知られている方法によって
、哺乳動物への投与のために調製される。そのような方法には、溶液を滅菌するためにろ
過すること、溶液を希釈すること、アジュバントを加えること、および溶液を安定化させ
ることを挙げることができる。本発明の具体的な利点の１つが、Ｉｎｖａｐｌｅｘ調製物
は、アジュバントまたはキャリアなどの免疫増強剤とともに投与される必要がないという
ことである。Ｉｎｖａｐｌｅｘ自体がそのような免疫増強剤として機能するからである。
この特徴は、本発明の組成物で、免疫増強剤の使用を排除するものではない。そのため、
１つの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上のＩｎｖａｐｌｅｘと、１つ以上
のアジュバントまたはキャリアとを含むことができる。
【００４３】
アジュバントは、典型的には、特定の抗原に対する動物の免疫応答を一般には高める物
質である。好適なアジュバントには、フロイントアジュバント、他の細菌細胞壁成分、ア
ルミニウムに基づく塩、カルシウムに基づく塩、シリカ、ポリヌクレオチド、トキソイド
、血清タンパク質、ウイルスのコートタンパク質、他の細菌由来調製物、γ−インターフ
ェロン、ブロック共重合体アジュバント（Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバ
ント（ＣｙｔＲｘ（商標），Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバン
ト（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
、ＭＯ）から入手することができる）など）、ならびにサポニン類およびその誘導体（Ｑ
ｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓ（デンマーク）から入手す
ることができる）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
キャリアは、典型的には、処置されている動物において治療組成物の半減期を増大させ
る化合物である。好適なキャリアには、ポリマーの制御放出配合物、生分解性インプラン
ト、リポソーム、オイル、エステルおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されな
い。
【００４５】
ワクチンは、輸送および貯蔵における容易さのために、乾燥された形態でグラム陰性細
菌に対するワクチンを製造するために凍結乾燥することができる。乾燥された組成物は経
口送達のために使用することができる。Ｉｎｖａｐｌｅｘはまた、ワクチンが投与される
生物によって許容される等張性の緩衝液などの薬学的に受容可能な賦形剤と混合すること
ができる。そのような賦形剤の例には、水、生理的食塩水、リンゲル液、デキストロース
溶液、ハンクス液、および他の水性の生理学的平衡塩溶液が含まれる。非水性ビヒクル、
例えば、固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどもまた使用するこ
とができる。他の有用な配合物には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビト
ールまたはデキストランなどの粘度増強剤を含有する懸濁物が含まれる。賦形剤はまた、
等張性および化学的安定性を高める物質などの添加剤の少量を含有することができる。緩
衝液の例には、リン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が含まれ、一方、
保存剤の例には、チメロサール、ｍ−クレゾールまたはｐ−クレゾール、ホルマリンおよ
びベンジルアルコールが含まれる。標準的な配合物は、液体の注射剤、または注射用の懸
濁物もしくは溶液として好適な液体に溶解され得る固体のいずれかにすることができる。
従って、非液体の配合物において、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブ
ミン、および／または無菌の水もしくは生理的食塩水が投与前に添加され得る保存剤を含
むことができる。
【００４６】
さらに、ワクチンは、添加された抗原がワクチンの有効性を妨げず、副作用および有害
な反応が付加的または相乗的に増大しない限り、上記に記載された１つ以上のＩｎｖａｐ
ｌｅｘと、少なくとも１つの他の抗原とを含有する混合ワクチンの形態で調製することが
できる。ワクチンは、ワクチンの溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善し得る化学的
成分と組み合わせることができる。あるいは、そのような成分はワクチンの毒性を低下さ
せることができ、またはワクチンの何らかの望ましくない副作用などを除去もしくは弱化
させることができる。そのような作用を媒介し得る様々な成分がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示されている。そ
のような成分を分子に結合させるための様々な手法が当分野では広く知られている。
【００４７】
ワクチンは、密封されたバイアルまたはアンプルなどに貯蔵することができる。本発明
のワクチンは、一般には、鼻腔内投与されるスプレー剤の形態で、あるいは点鼻剤、吸入
剤、扁桃での塗布物、または経口投与されるカプセル、液剤、懸濁剤もしくはエリキシル
剤によって投与することができる。ワクチンが乾燥形態である場合、ワクチンは、投与前
に、滅菌された蒸留水または脱イオン水に溶解または懸濁される。
【００４８】
一般に、ワクチンは、中和抗体を産生させ、感染または疾患からの保護を生じさせるた
めに効果的な用量で、経口投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与または筋肉内投与によっ
て、しかし、好ましくは、鼻腔内投与または経口投与、直腸投与および膣投与によって対
象体に投与することができる。本発明の組成物を使用する粘膜ワクチン接種は、血清中に
殺菌性の抗体を誘導することに加えて、粘膜表面に分泌性抗体を誘導するので、効果的な
ワクチン接種経路であると考えられる。
【００４９】
対象体により、動物、鳥類、魚類、およびヒトを含む哺乳動物が意味される。ワクチン
は、単回用量調製物の形態であり得るか、または集団ワクチン接種計画のために使用され
得る多回用量フラスコであり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐ
Ａ、Ｏｓｏｌ編、１９８０）；およびＮｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｖｏｌｌｅｒら編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒ
ｋ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、１９７８）がワクチンの調製方法および使
用方法について参照される。効果的な様式で組成物を投与するための受け入れられ得るプ
ロトコルには、個々の用量サイズ、投薬回数、投薬頻度、および投与様式が含まれる。そ
のようなプロトコルの決定は当業者によって達成され得る。Ｉｎｖａｐｌｅｘ組成物の好
ましい単回用量は約０．１ｕｇ／ｋｇ体重〜約１００ｕｇ／ｋｇ体重である。追加免疫剤
が、生物の免疫応答がもはや効果的に変化しないとき、好ましくは投与される。そのよう
な組成物は、最初の投与の後、約２週間後〜数年後に投与することができる。好ましい投
与スケジュールは、生物の体重１ｋｇあたり約０．５ｕｇ〜約１０ｕｇの組成物が約１ヶ
月〜約６ヶ月の期間にわたって約１回〜約４回投与されるスケジュールである。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、患者におけるグラム陰性感染症状を低下させる方法
で、上記に記載されるように、Ｉｎｖａｐｌｅｘに対するポリクローナル抗体、またはＩ
ｎｖａｐｌｅｘに対するモノクローナル抗体の組合せのいずれかで、効果的な量のＩｎｖ
ａｐｌｅｘ抗体（ヒトにおいて作製される抗体を含む）を前記患者に投与することによる
方法に関する。患者にＩｎｖａｐｌｅｘ抗体が与えられるとき、投与される投薬量は、患
者の年齢、体重、身長、性別、全体的な医学的状態、以前の病歴などのような要因に依存
して変化する。一般には、約１ｐｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲にあ
る上記化合物の投薬量を受容者に与えることが望ましい。しかし、より少ない投薬量また
はより多い投薬量を投与することができる。
【００５１】
本発明はまた、上記に記載されるような医薬品（予防用医薬品、すなわち、ワクチン、
または治療用医薬品、すなわち、治療剤）を、使用法が印刷されているか、またはグラム
陰性細菌の感染により引き起こされる状態を防止もしくは処置するために患者に医薬品を
投与することに関する添付物を伴う容器（好ましくは、充填済みのシリンジまたはガラス
製バイアル）に含むキットを提供する。
【００５２】
下記には、本発明の範囲を限定するためではなく、例示目的のためだけに提供される本
発明の実施例が記載される。当業者には自明である、当分野で通常的に遭遇する様々な条
件およびパラメーターの他の好適な改変および適合化は、本発明の精神および範囲に含ま
れる。
【００５３】
下記の方法および材料が下記の実施例において使用された。
［実施例］
【００５４】
（材料および方法）
細菌の増殖および菌株。本研究において使用された赤痢菌属菌株はＷＲＡＩＲコレクシ
ョンの一部である。使用された菌株には、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌ
ｅｘｎｅｒｉ）２ａ（２４５７Ｔ）、ゾンネ赤痢菌（Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ）（Ｍｏｓｌｅｙ
）、およびボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）２、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−Ｗ
、Ｖｉｒ＋）、フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−５５、Ｖｉｒ−）、フレクスナー赤痢
菌２ａ（Ｍ４２−４３ａ、Ｖｉｒ−）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）１（
Ｕｂｏｎ）、そして細胞侵入性大腸菌Ｑ１５２が含まれる。コンゴーレッドＴＳＡ平板で
増殖する単離された赤色の赤痢菌属コロニーを使用して、５０ｍｌのＰｅｎＡｓｓａｙ（
抗生物質培地＃３、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）培
養液に３７℃で接種した。４時間増殖させた後、１０ｍｌの対数期培養物を１リットルの
事前に加温（３７℃）されたＰｅｎＡｓｓａｙ培養液のそれぞれに加えた。これらの１リ
ットル培養物を振とうインキュベーターで３７℃において一晩インキュベーションした。
【００５５】
赤痢菌属タンパク質の水抽出。Ｏａｋｓらによって記載された最初の水抽出法の改変を
使用して、赤痢菌属のインベイシン複合体が単離される材料を調製した。典型的には、毒
性赤痢菌属細菌の４リットルの一晩培養物を水抽出物の１回の回分処理のために使用した
。細菌細胞を遠心分離によって集め、（０．４５ｕｍのメンブランでろ過された）滅菌脱
イオン水に、１リットルの一晩培養物あたり５０ｍｌの容量で懸濁し、その後、振とう式
の水浴（約２００ｒｐｍ）で２時間、３７℃でインキュベーションした。水による抽出の
後、細胞を１６０００×ｇで３０分間の４℃での遠心分離によって集めた。上清を集め、
１００，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離して、膜断片をペレット化した。水抽出物
の１回の回分処理について１００，０００×ｇの上清のすべてをまとめて、−７０℃で保
存した。水抽出物は、可能なときには氷上に保たれ、プロテアーゼ阻害剤は手順のときに
使用されなかった。
【００５６】
水抽出物の特徴づけ。水抽出物の各回分処理物の総タンパク質含有量をビシコニン酸ア
ッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって
測定した。水抽出物を、ＩｐａＢに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍａｂ  ２Ｆ１
、Ｍｉｌｌｓら、１９８８、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６、２９３３）およびＩｐ
ａＣに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍａｂ  ２Ｇ２、Ｍｉｌｌｓら、１９８８、
上掲）を使用するウエスタンブロットまたはスポットブロットによってＩｐａＢおよびＩ
ｐａＣの存在について分析した。これらのＩｐａタンパク質について陽性である水抽出物
のみをインベイシン複合体の精製のために使用した。
【００５７】
ＦＰＬＣ（迅速タンパク質液体クロマトグラフィー）。イオン交換クロマトグラフィー
を使用して、インベイシン複合体画分を水抽出物から単離した。５ｍｌのアニオン交換Ｈ
ｉＴｒａｐ（商標）Ｑまたは５０ｍｌのＨｉＬｏａｄ（商標）２６／１０Ｑセファロース
・ハイ・パーフォーマンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，
Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のいずれかのカラムを、周囲温度で、２０ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）（ｐＨ９．０）（緩衝液Ａ）で平衡化させた。負荷前に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．２Ｍ
、ｐＨ９．０）を水抽出物サンプルに２０ｍＭの最終濃度に加え、その後、水抽出物の２
０ｍｌ〜９００ｍｌ（約８ｍｇ〜３００ｍｇの総タンパク質）を、５ｍｌのカラムについ
ては２ｍｌ／分の流速で、５０ｍｌのカラムについては６ｍｌ／分の流速でカラムに負荷
した。負荷後、カラムを少なくとも６倍のカラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。すべての溶
出を、２４％緩衝液Ｂのステップ、その後、５０％緩衝液Ｂのステップからなるステップ
グラジエントで行い、最後に、カラムを１００％緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）で洗浄した。カラムを通過するタンパク質を２８０ｎｍ
でモニターし、マッキントッシュ・コンピューター・オペレーティングシステム用のＰｏ
ｗｅｒＣｈｒｏｍデータ収集および分析ソフトウエア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって記録した。２ｍｌ〜２．５ｍｌの画分をポリ
プロピレンチューブに集め、直ちに−７０℃に置いた。２８０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ
Ｄ２８０）が前回の緩衝液ステップに対するベースラインに戻った後、緩衝液ステップを
変えた。緩衝液Ｂ希釈液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）であった。１００
％緩衝液Ｂでの洗浄の後、カラムは緩衝液Ａで再び平衡化され、その後、次回の操作が行
われた。本研究で使用された各カラムは赤痢菌属の特定の血清型および菌株に対して専用
であった。
【００５８】
各画分をＩｐａＣおよびＩｐａＢの存在についてスポットブロットによって分析した。
２４％緩衝液Ｂにおいて最大量のＩｐａＢおよびＩｐａＣを含有する画分（通常、１また
は２）を、５０％緩衝液ＢにおけるピークＩｐａタンパク質画分がそうであるようにまと
めて、操作用のＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０をそれぞれ得た。Ｉｎ
ｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の処理物は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩ
ｐａＤの含有量（ウエスタンブロットによって決定される）、ＬＰＳ含有量（ゲルの銀染
色分析（下記参照）によって決定される）、ならびに総タンパク質組成に関して比較的類
似していると決定されると、一緒にされ、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ
５０の特定の「ロット」として特定され、−８０℃で保存された。
【００５９】
水抽出物およびＬＰＳのＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡにおいて使用された抗原には、フレク
スナー赤痢菌５のｖｉｒ＋株（Ｍ９０Ｔ−Ｗ）およびｖｉｒ−株（Ｍ９０Ｔ−５５）から
得られた水抽出物、そしてフレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌のいずれかに由来
する精製ＬＰＳが含まれる。抗原を炭酸塩のコーティング緩衝液（０．２Ｍ炭酸塩、ｐＨ
９．８）で希釈し、ポリスチレンの９６ウエルの抗原プレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）に１ｕｇ／ウエルの濃度で加え
た。一次抗体をカゼイン（２％カゼイン／Ｔｒｉｓ−生理的食塩水緩衝液、ｐＨ７．５）
で希釈し、抗原コーティングプレートとともに２時間インキュベーションした。０．０５
％ツイーン２０を含むＰＢＳ（１０．７５ｍＭのリン酸ナトリウム、１４５ｍＭのＮａＣ
ｌ）で４回洗浄した後、プレートを、アルカリホスファターゼでコンジュゲート化された
市販の抗モルモットＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧまたは抗マウスＩｇＡ（Ｋｉｒｋｇａｒ
ｄ＆Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でプローブした。ＥＬＩＳＡ基質は
パラ−ニトロフェニルホスファート（０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ2および０．０２％の
アジ化ナトリウムを含有する１０％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）において１
ｍｇ／ｍｌ）であった。Ｏ．Ｄ．をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社（Ｍｅｎｌｏ  
Ｐａｒｋ、ＣＡ）のＥＬＩＳＡプレート読取り装置で４０５ｎｍにおいて測定した。
【００６０】
表面に露出したタンパク質に対する抗体のアフィニティー精製。ニトロセルロースディ
スクをトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）平板の表面に置き、寒天表面に付着させた。１コ
ロニーの毒性フレクスナー赤痢菌５（Ｍ９０Ｔ−Ｗ）を１．０ｍｌの０．９％生理的食塩
水に懸濁して、これをニトロセルロースメンブランの表面全体に広げ、多数の単離された
コロニーを、３７℃で一晩増殖させた後に得た。ディスクを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ／０．９％生理的食塩水（Ｔｒｉｓ−生理的食塩水）で洗浄した後、アジ化ナトリウム
を含有する２％カゼイン溶液で少なくとも３０分間ブロッキングした。ゾンネ赤痢菌Ｍｏ
ｓｌｅｙから得られたＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、かつ３ｘ１０8個のゾンネ赤
痢菌５３Ｇで眼内に攻撃された動物から得られた回復期のモルモット血清を２％カゼイン
増量液で１：３００に希釈し、ニトロセルロースディスクと室温で４時間インキュベーシ
ョンした。その後、それぞれのニトロセルロースディスクを徹底的に洗浄し、続いて抗体
の溶出を最少量の０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で３０分間行った。溶出された抗体を
集め、Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ７．４に中和した。アフィニティー精製された抗体を２％カゼ
イン増量液での１：３の希釈で使用して、ウエスタンブロットをプローブした。
【００６１】
電気泳動およびウエスタンブロット。ウエスタンブロットを、以前に記載されるように
行った。ウエスタンブロットにおいて使用された抗血清には、ＩｐａＢに対するモノクロ
ーナル抗体（２Ｆ１）、ＩｐａＣに対するモノクローナル抗体（２Ｇ２）、およびＩｐａ
Ｄに対するモノクローナル抗体（１６Ｆ８、Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌら、１９８８、上掲）、
そしてすべてのＩｐａタンパク質（ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤ）およ
びＶｉｒＧに対する抗体を含有するサル回復期血清プール（Ｍ２１３）が含まれた。ウエ
スタンブロットのために使用されたモルモット血清は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎ
ｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物から得られた（図１３）。これらの血清は０日目（
採血前）および４２日目（免疫化後１４日目）に集められた。血清は、ウエスタンブロッ
トのために１／３００で希釈された。
【００６２】
銀染色を使用して、ゲルへの負荷の前にプロテイナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）で処理されたサンプルにおけるＬＰＳを染色した。
【００６３】
Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０の免疫原性および保護能。Ｉｎｖａ
ｐｌｅｘ画分がＢａｌｂ／ｃＢｙＪマウスにおいて免疫応答を促進する能力を、１０匹〜
１５匹のマウスからなる群で試験した。各マウスは、フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾン
ネ赤痢菌から得られた５ｕｇのＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０で、０
日目、１４日目および２８日目に鼻腔内に免疫化された。二価ワクチンが、等量のフレク
スナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０を
組み合わせることによって組み立てられた（用量あたり各５ｕｇ）。生理的食塩水が、コ
ントロール動物を免疫化するためにを使用された。２５ｕｌの総抗原容量が、ミクロピペ
ットで外側の鼻孔に付けられた５滴〜６滴の小さい液滴で送達された。血液を、０日目、
２８日目および４２日目に、すべてのマウスからの尾採血によって採取した。
【００６４】
フレクスナー赤痢菌２ａまたはゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４または
Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで最後の免疫化を行った３週間後、マウス（１５匹／群
）は、マウス肺モデルについて記載されるように致死量のフレクスナー赤痢菌２ａ（２４
５７Ｔ）（１．０ｘ１０7ｃｆｕ／３０ｕｌ）またはゾンネ赤痢菌（８．０ｘ１０6ｃｆｕ
／３０ｕｌ）で鼻腔内に攻撃された。生理的食塩水で免疫化されたコントロールマウスが
それぞれの攻撃因子について操作された。動物の二連の群を、フレクスナー赤痢菌２ａま
たはゾンネ赤痢菌のいずれかでの平行した攻撃のために、それぞれの一価ワクチン、二価
ワクチン、または生理的食水で免疫化した。
【００６５】
マウスへの攻撃用量は、赤痢菌属細菌について最適な侵襲性の時期である対数期の増殖
時に集められ、その後、液体窒素中で保存されていたフレクスナー赤痢菌２ａまたはゾン
ネ赤痢菌の凍結ロットから調製された（Ｏａｋｓ、未発表データ）。鼻腔内の免疫化また
は攻撃の前に、マウスはケタミン塩酸塩（４０ｍｇ／ｋｇ）（Ｋｅｔａｓｅｔ（登録商標
）、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇ
ｅ、Ｉｏｗａ）およびキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、Ｂａ
ｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、Ｋａｎｓａｓ）の混合物で麻酔
された。
【００６６】
統計学的分析。統計学的コンピューター計算をＳｔａｔｖｉｅｗプログラム（ＳＡＳ  
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）により行った。フィッシャーの直説法
を保護実験のために使用し、ウィルコクスンの符号付順位検定を血清学的データの分析の
ために使用した。線形回帰を用量応答実験データの分析のために使用した。
【実施例１】
【００６７】
赤痢菌属Ｉｎｖａｐｌｅｘ（インベイシン複合体）が、無傷の毒性赤痢菌属細菌を水で
抽出し、その後、水抽出物のアニオン交換クロマトグラフィーによって調製される。０．
２４ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＣｌのステップグラジエントで溶出されたピーク
部分には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳが含有される（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ、２００
０、上掲）。これらのピーク部分は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０
と呼ばれる。両方のＩｎｖａｐｌｅｘピーク部分はモルモットにおいて保護的である。Ｉ
ｎｖａｐｌｅｘの２つの形態の共通する成分には、ＬＰＳ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩ
ｐａＤが含まれる。しかし、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、ＶｉｒＧ*、そして以前には記載
されていない７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドを含むさらなる抗原性タンパク
質を含有する。７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドに対する抗体が、フレクスナ
ー赤痢菌またはゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモッ
トにおいて産生され、そして、これらのタンパク質は、赤痢菌属のすべての種および細胞
侵入性大腸菌の間で血清学的に交差反応し得る（図１３、図１５、図１６）。７２ｋＤａ
および８４ｋＤａのポリペプチドは毒性プラスミドにコードされていない。
【００６８】
Ｉｎｖａｐｌｅｘの両方の形態が、赤痢菌属の４つの種のすべてから、そしてまた細胞
侵入性大腸菌からも単離される。しかし、ゾンネ赤痢菌の場合、少数の特有の違いが認め
られる。ゾンネ赤痢菌から得られたＩｎｖａｐｌｅｘ２４は、赤痢菌属の他の種から単離
されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４と比較して、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳの量が不足し
ている。対照的に、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、タンパク質含有量およびＬ
ＰＳ含有量に関して、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０と非常に類似している
。ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌および細胞侵入性大腸菌から単離されたＩｎｖａｐｌｅｘ２
４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘと類似してい
る。サイズ排除クロマトグラフィーによるＩｎｖａｐｌｅｘのさらなる特徴づけにより、
ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳのみを含有するフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ
２４において高分子量の複合体（ＨＭＭＣ、推定されるサイズは１００万ダルトン〜２０
０万ダルトンの間である）が同定された。類似する高分子量ピーク成分がフレクスナー赤
痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０から単離されたが、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＬＰＳに加え
て、これにはまた、７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプチドが含有される。興味深い
ことに、この高分子量複合体（図１３におけるＨＭＭＣ複合体またはＨｉＭＷ複合体）は
、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４では見出されておらず、しかし、ゾンネ赤痢菌の
Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０には存在する（図２０）。ＨＭＭＣがＩｎｖａｐｌｅｘ製造物の機
能的な抗原性成分であるかどうかは未だ明らかにされていない。
【実施例２】
【００６９】
今日まで、本発明者らの研究では、フレクスナー赤痢菌２ａから得られたＩｎｖａｐｌ
ｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０がマウス致死肺モデルにおいて同種の攻撃に対して
保護的であることが示されている（Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ＆Ｏａｋｓ、２０００、上掲；Ｏ
ａｋｓ、１９９９、上掲）。ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０もまたマウスにおいて
保護をもたらすが、ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４は保護をもたらさない。免疫化
された動物（フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４またはＩｎｖａｐｌｅｘ５０、
ゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０）はＬＰＳおよび水抽出物に対する抗体を産生し、
これは、ヒトにおける天然感染の後に生じる応答と非常に類似する応答である。ＬＰＳ、
ＩｐａＢおよびＩｐａＣが不足しているゾンネ赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化さ
れたマウスは、Ｉｐａタンパク質またはＬＰＳに対する検出可能な抗体を産生せず、攻撃
から保護されなかった。これらの結果は、Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンが保護的であるため
には、保護的な免疫応答を生じさせるために十分な量のインベイシン類およびＬＰＳを有
することが必要であることを示している。
【００７０】
他の実験において、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎ
ｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫化されたマウスが異種の病原体で攻撃された。例えば
、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマウスがゾンネ赤痢菌で攻撃
された。これらの実験では、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化されたマ
ウスの３０％のみがゾンネ赤痢菌の致死的な攻撃を生き延びただけであった（ｐ＝０．０
５２）。しかしながら、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたマウスはフレ
クスナー赤痢菌の致死的な攻撃から保護された（８９％が生存した（ｐ＜０．００１））
（表１および図１〜図３）。図２における体重の減少および回復の結果は、フレクスナー
赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０のいずれかで免疫
化されたマウスが同種の病原体による感染の１日後〜３日後に回復し始めることを示して
いる。異種の病原体で攻撃された免疫化マウス（例えば、フレクスナー赤痢菌２ａで攻撃
されたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０免疫化マウス）もまた、初期の体重減少の後に
回復した。
【００７１】
これらの結果は、赤痢菌属の異種の種（フレクスナー赤痢菌２ａ）に対する保護がゾン
ネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより達成され得ることを示している。これらの
結果は、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより刺激される保護免疫性が、フレクスナー赤
痢菌およびゾンネ赤痢菌の両方に共通するタンパク質に向けられ得ることを示唆している
。そうであるならば、類似する保護免疫性がボイド赤痢菌および志賀赤痢菌に対して可能
になり得る。
【００７２】
異種保護は、典型的には、赤痢菌属ワクチンについては予測されていない。これは、Ｌ
ＰＳが、保護免疫性に対する重要な標的抗原であると考えられ、そして赤痢菌属の種の間
における主要な抗原性の違いがＬＰＳであるからである。しかし、赤痢菌属のすべての種
に存在する、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを含む保存されたタンパク質の存在は、ゾンネ赤痢
菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンにより誘発されるこの交差保護的な異種免疫性において
極めて重要な役割を果たしていると考えられる。さらに、Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、Ｉｎ
ｖａｐｌｅｘ２４と比較したとき、少数のさらなる抗原を有する。具体的には、７２ｋＤ
ａおよび８４ｋＤａのポリペプチドがＩｎｖａｐｌｅｘ５０には存在しており、これらは
種間において免疫原性であり、かつ交差反応性である。上記に記載された異種の攻撃研究
における免疫応答の評価（図５〜図１２）は、フレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２
４で免疫化された動物が、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳおよび水抽出物（ｖｉｒ＋）に対す
る著しい血清ＩｇＡ免疫応答および血清ＩｇＧ免疫応答を発達させたことを示している。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンで免疫化されたマウスは、ゾンネ赤痢菌ＬＰ
Ｓ、そしてまた水抽出物に対するＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を産生した。フレクスナー
赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンはいずれ
も、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかった。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ
５０で免疫化された動物のウエスタンブロット分析により、ＩｐａＢおよび８４ｋＤａの
抗原に対する抗体が産生され、これに対して、フレクスナー赤痢菌２４については、Ｉｐ
ａＢおよびＩｐａＣに対する抗体のみがウエスタンブロットで認められたことが示される
（図１３）。
【００７３】
【表１】
0005149242.tif 000002
【００７４】
上記に記載された異種の攻撃研究における免疫応答の評価（図５〜図１２）は、フレク
スナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ２４で免疫化された動物が、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳ
および水抽出物（ｖｉｒ＋）に対する著しい血清ＩｇＡ免疫応答および血清ＩｇＧ免疫応
答を発達させたことを示している。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０ワクチンで免疫化
されたマウスは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ、そしてまた水抽出物に対するＩｇＡ抗体およびＩ
ｇＧ抗体を産生した。フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンまたはゾンネ赤痢菌
Ｉｎｖａｐｌｅｘワクチンはいずれも、異種のＬＰＳに対する抗体の産生を刺激しなかっ
た。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化された動物のウエスタンブロット分析に
より、ＩｐａＢおよび８４ｋＤａの抗原に対する抗体が産生され、これに対して、フレク
スナー赤痢菌２４については、ＩｐａＢおよびＩｐａＣに対する抗体のみがウエスタンブ
ロットで認められたことが示される（図１３）。
【実施例３】
【００７５】
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化されたモルモットにおけるＩｇＡ抗体分泌
細胞（ＡＳＣ）。
２週間の間隔で与えられたゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０の３回の鼻腔内用量（２
５μｇ）で免疫化されたモルモットから得られた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を様々な赤痢
菌属抗原とインキュベーションして、様々な赤痢菌属抗原に対するＩｇＡを分泌する循環
Ｂ細胞の数を測定した。血液が最後の免疫化の１週間後に集められた。１００万細胞あた
りのＡＳＣ数が示される。ＰＢＬを、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳ（Ｓｏｎ  ＬＰＳ）、ゾンネ赤
痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（Ｓｏｎ  ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅ
ｘ５０（Ｆｌｅｘ  ＩＶＰ５０）、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４（Ｆｌｅｘ
ＩＶＰ２４）およびフレクスナー赤痢菌ＬＰＳ（Ｆｌｅｘ  ＬＰＳ）を含む５つの異な
る赤痢菌属抗原とインキュベーションした。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化
されたモルモットは、ゾンネ赤痢菌ＬＰＳおよびゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０に対
する抗体を分泌する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を産生し、しかしフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖ
ａｐｌｅｘ５０およびフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４に対する抗体を分泌する
抗体分泌細胞をも産生するが、フレクスナー赤痢菌ＬＰＳに対する抗体を分泌する抗体分
泌細胞を産生しない（図１４）。このことは、ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０が異種
の免疫応答を刺激することを示す本発明者らのデータを裏付けている。
【実施例４】
【００７６】
すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩ
ｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモ
ルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＬＨ）が、フレクスナー赤痢菌２ａ、ゾンネ赤痢
菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性大腸菌に由来する
Ｉｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプローブするためにウ
エスタンブロットにおいて使用された（図１５）（レーンは抗原含有物により表示される
）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎｖａｐｌｅｘが負
荷された。ＧＰ６ＬＨ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、７０
ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤痢菌属タンパク質
に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレクスナー赤痢菌５
Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。最も左側のレーン
には、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる。タンパク質サン
プルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットされた。赤痢菌属抗
原がブロットの右手側に矢印により示される。
【実施例５】
【００７７】
すべての赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ）および細胞侵入性大腸菌から得られるＩ
ｎｖａｐｌｅｘ５０に共通する交差反応性抗原。
フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてフレクスナー赤痢菌２
ａで攻撃されたモルモットから得られた免疫血清（ＧＰ６ＲＳ）が、フレクスナー赤痢菌
２ａ、ゾンネ赤痢菌（Ｍｏｓｌｅｙ）、志賀赤痢菌１、ボイド赤痢菌２および細胞侵入性
大腸菌に由来するＩｎｖａｐｌｅｘ２４調製物およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０調製物をプロ
ーブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（図１６）（レーンは抗原含有物
により表示される）。このウエスタンブロットの各レーンには、１５μｇの示されたＩｎ
ｖａｐｌｅｘが負荷された。ＧＰ６ＲＳ抗血清には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、
７２ｋＤａ、７０ｋＤａ、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質を含むいくつかの赤
痢菌属タンパク質に対する抗体が含有される。フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋およびフレ
クスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−の全細胞溶解物がブロットの左側の２つのレーンに示される。
最も左側のレーンには、事前に染色された分子サイズ標準物（ＭＷマーカー）が含まれる
。タンパク質サンプルは９％アクリルアミドゲルで最初に分離され、その後、ブロットさ
れた。赤痢菌属抗原がブロットの右手側に矢印により示される。
【実施例６】
【００７８】
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞侵入性大腸菌
に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。
ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、続いてゾンネ赤痢菌で攻撃されたモ
ルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質の存在につい
て赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロットにおいて使用された（
図１７）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセルロースにブロットし、その
後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示されるような赤痢菌属の異な
る菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−）の両方の赤痢菌属菌株が
使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよびＩｐａＤを発現する。Ｖｉ
ｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マーカーのすぐ左側のレーンに
は、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐｌｅｘ２４およびＩｎｖａ
ｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（フレクスナー赤痢菌５Ｖｉ
ｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、ＩｐａＢおよびＩｐａＣを
特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた。これらのコントロールに
より、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位置が明瞭に示される。分子
量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサイズによって示
される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣの特異的なタン
パク質が示される。
【実施例７】
【００７９】
フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種および細胞
侵入性大腸菌に存在するタンパク質抗原を認識する抗体を刺激する。
フレクスナー赤痢菌２ａのＩｎｖａｐｌｅｘ５０で免疫化され、その後、フレクスナー
赤痢菌２ａで攻撃されたモルモットから集められた血清が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａ
のタンパク質の存在について赤痢菌属の様々な菌株をプローブするためにウエスタンブロ
ットにおいて使用された（図１８）。全細胞溶解物（ＷＣＬ）を電気泳動し、ニトロセル
ロースにブロットし、その後、抗血清と反応させた。各レーンには、レーンの上部に示さ
れるような赤痢菌属の異なる菌株が含まれる。毒性（Ｖｉｒ＋）および無毒性（Ｖｉｒ−
）の両方の赤痢菌属菌株が使用された。Ｖｉｒ＋プラス株は、ＩｐａＢ、ＩｐａＣおよび
ＩｐａＤを発現する。Ｖｉｒ−株はこれらのＩｐａタンパク質を発現しない。分子量マー
カーのすぐ左側のレーンには、フレクスナー赤痢菌２ａに由来する精製されたＩｎｖａｐ
ｌｅｘ２４およびＩｎｖａｐｌｅｘ５０が含まれる。ゲルの最も右手側の２つのレーン（
フレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ＋ＷＣＬおよびフレクスナー赤痢菌５Ｖｉｒ−ＷＣＬ）が、
ＩｐａＢおよびＩｐａＣを特異的に認識するモノクローナル抗体混合物でプローブされた
。これらのコントロールにより、これらのゲルにおけるＩｐａＢおよびＩｐａＣの存在位
置が明瞭に示される。分子量標準物が、９７ｋＤａ、４３ｋＤａ、３０ｋＤａおよび１８
ｋＤａのサイズによって示される。矢印により、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、ＩｐａＢおよ
びＩｐａＣの特異的なタンパク質が示される。
【実施例８】
【００８０】
赤痢菌属細菌表面におけるＩｎｖａｐｌｅｘ５０の交差反応性タンパク質抗原の同定。
赤痢菌属細菌の表面に局在化する抗原と反応し得る抗体を精製するために抗体の表面ア
フィニティー精製を使用して、細菌の表面において接近可能なエピトープを有するとして
ゾンネ赤痢菌およびフレクスナー赤痢菌のＩｎｖａｐｌｅｘ５０に見出される新しく記載
される抗原を同定することが可能である。そのような表面露出抗原は、感染宿主における
細菌の抗体媒介による殺傷または除去のための標的であると考えられる。
【００８１】
表面タンパク質が、８４ｋＤａおよび７２ｋＤａのタンパク質に対する抗体を（他のタ
ンパク質抗原に対する抗体もまた一緒に）含有する回復期の抗血清を完全な無傷の毒性赤
痢菌属細菌とインキュベーションすることによって同定された。短時間のインキュベーシ
ョン、および非特異的に結合した抗体を除くための洗浄を行った後、表面抗原に結合した
抗体を低いｐＨのグリシン緩衝液で溶出した。溶出された抗体溶液をｐＨ７．４に中和し
、続いてウエスタンブロットにおいて使用した（図１９）。ブロットにおいて、アフィニ
ティー精製された血清によって認識されるタンパク質バンドのすべてが表面露出であると
考えられた。図１９におけるウエスタンブロット（「アフィニティー精製、１：３」での
レーン；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であ
り、右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物であ
る）は、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、６４ｋＤａ、ＩｐａＢおよびＩｐａＣが赤痢菌属の表
面に露出していたことを示している。いくつかのタンパク質が、アフィニティー精製前の
抗血清中の抗体により認識される（「全細胞、１：３００」での２つのレーンを参照のこ
と；左側のレーンは毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−Ｗ株の全細胞溶解物であり、
右側のレーンは非毒性フレクスナー赤痢菌５のＭ９０Ｔ−５５株の全細胞溶解物である）
が、これらのタンパク質は、アフィニティー精製された血清により認識されなかった。こ
のことは、これらのタンパク質におけるエピトープは赤痢菌属の表面に露出しておらず、
従って、このアフィニティー精製技術によって回収されなかったことを示している。表面
タンパク質抗原の本質的には同じセットが、フレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（
左側パネル）またはゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０（右側パネル）のいずれかで免疫
化されたモルモットから得られたアフィニティー精製の抗血清によって認識された。各パ
ネルの中央レーンは、示された標準物のサイズ（ｋＤａ単位）を有する分子量マーカーで
ある。
【実施例９】
【００８２】
赤痢菌属Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０から単離された高分子量複合体（ＨＭＭＣ−５０）の特
徴づけ。高分子量複合体（ＨＭＭＣ）がサイズ排除クロマトグラフィーによってＩｎｖａ
ｐｌｅｘ調製物から単離される。図２０のパネルＡには、抗ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅ
ｘ５０モルモット血清でプローブされた赤痢菌属ＨＭＭＣ−５０のウエスタンブロットが
示される。この抗血清は、ＨＭＭＣ−５０に存在する、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ、Ｉｐａ
Ｂ、５８ｋＤａおよびＩｐａＣのバンドと反応する。図２０のパネルＢは、ＩｐａＢおよ
びＩｐａＣに対するモノクローナル抗体でプローブされたＨＭＭＣ−５０のウエスタンブ
ロットである。ＩｐａＢおよびＩｐａＣのバンドが示される。図２０のパネルＣは、典型
的なＬＰＳバンド形成パターンを示す、プロテイナーゼＫで処理されたＨＭＭＣ−５０の
銀染色ゲルである。
【００８３】
異種免疫性がゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０によって誘導されるという予想外の発
見は拡張される。これらの研究は、異種免疫性の原因となる重要な抗原を同定しようとす
るものである。ゾンネ赤痢菌Ｉｎｖａｐｌｅｘ５０およびフレクスナー赤痢菌Ｉｎｖａｐ
ｌｅｘ５０は、赤痢菌属のすべての種と交差反応し得る抗体を誘導した（図１７、図１８
および図２０）。この血清の特異性には、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、８４ｋＤａ、７２ｋＤａ
、６４ｋＤａおよび５８ｋＤａのタンパク質に対する抗体が含まれる。現在、候補となる
タンパク質には、Ｉｐａタンパク質、そしてまた７２ｋＤａおよび８４ｋＤａのポリペプ
チドが含まれる。さらに、赤痢菌属の表面抗原に対してアフィニティー精製された抗体を
使用して、下記のタンパク質が赤痢菌属の表面に突き止められた：ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、
８４ｋＤａ、７２ｋＤａおよび６４ｋＤａのタンパク質。インベイシン類および他のタン
パク質がほぼもっぱらＩｎｖａｐｌｅｘのＨＭＭＣに存在することにより、これらのタン
パク質が研究のために単離され得る手段が提供される。
【図１】
0005149242.tif 000003
【図２】
0005149242.tif 000004
【図３】
0005149242.tif 000005
【図４】
0005149242.tif 000006
【図５】
0005149242.tif 000007
【図６】
0005149242.tif 000008
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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