(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸生産能を有し、
プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性およびピルビン酸カルボキシラーゼ活性が該酵素の非改変株と比較して増強するように改変され、かつ、
遺伝子破壊によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変されたコリネ型細菌。
【請求項２】
コハク酸生産能を有し、
プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が該酵素の非改変株と比較して増強するように改変され、
遺伝子破壊によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変され、かつ、遺伝子破壊により、アセテートキナーゼ活性、ホスホトランスアセチラーゼ活性、アセチル−CoAハイドロラーゼ活性、およびピルベートオキシダーゼ活性が低減化するように改変されたことによって酢酸の生成が低減したコリネ型細菌。
【請求項３】
さらに、プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された、請求項２に記載のコリネ型細菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載されたコリネ型細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取する事を特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項５】
前記コリネ型細菌あるいはその処理物を嫌気的雰囲気下で有機原料に作用させることを特徴とする、請求項４に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項６】
前記コリネ型細菌あるいはその処理物を炭酸水素ナトリウムの存在下、有機原料に作用させることを特徴とする、請求項４または請求項５に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項７】
前記有機原料が、グルコースまたはシュークロースである、請求項４〜６のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネ型細菌等の有機酸生産菌、およびそれを用いたコハク酸などの有機酸の製造に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、静止菌体として酸素を通気せずに有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とする有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた有機酸の発酵生産などが報告されていたが（例えば、特許文献５参照）、さらなる有機酸発酵プロセスの開発が求められていた。【０００４】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼとも呼
ばれる）については、コリネ型細菌において活性が確認されたという報告（非特許文献２）や、遺伝子がクローニングされたという報告（非特許文献３）がある。また、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減した微生物を用いたアミノ酸の製造法が開示されている（特許文献６）。
しかしながら、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性を増強させた細菌を用いて有機酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−１９６８８７号公報
【特許文献６】国際公開第９５／３４６７２号パンフレット
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
【非特許文献２】Shiio I, Ujigawa-Takeda K.  1980. Presence and regulation of α-ketoglutarate dehydrogenase complex in a glutamate-producing bacterium, Brevibacterium flavum. Agric. Biol. Chem. 44:1897-1904.
【非特許文献３】Usuda Y,Tujimoto N,Abe C,Asakura Y,Kimura E,Kawahara Y, O, Matsui H.  1996. Molecular cloning of the Corynebacterium glutamicum ('Brevibacterium lactofermentum' AJ12036) odhA gene encoding a novel type of 2-oxoglutaratedehydrogenase. Microbiology. 142:3347-54.
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、より生産効率の高いコハク酸などの有機酸の製造方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸などの有機酸の生成速度、あるいは、収率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）コハク酸生産能を有し、プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性およびピルビン酸カルボキシラーゼ活性が該酵素の非改変株と比較して増強するように改変され、かつ、遺伝子破壊によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変されたコリネ型細菌。
（２）コハク酸生産能を有し、プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が該酵素の非改変株と比較して増強するように改変され、遺伝子破壊によりラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減化するように改変され、かつ、
遺伝子破壊により、アセテートキナーゼ活性、ホスホトランスアセチラーゼ活性、アセチル−CoAハイドロラーゼ活性、およびピルベートオキシダーゼ活性が低減化するように改
変されたことによって酢酸の生成が低減したコリネ型細菌。
（３）さらに、プラスミドを用いた形質転換、染色体上への遺伝子導入およびプロモーター置換から選択される手段により、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強するように改変された、（２）のコリネ型細菌。
（４）（１）〜（３）のいずれかのコリネ型細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによってコハク酸を生成させ、該コハク酸を採取する事を特徴とするコハク酸の製造方法。
（５）前記コリネ型細菌あるいはその処理物を嫌気的雰囲気下で有機原料に作用させることを特徴とする、（４）のコハク酸の製造方法。
（６）前記コリネ型細菌あるいはその処理物を炭酸水素ナトリウムの存在下、有機原料に作用させることを特徴とする、（４）または（５）のコハク酸の製造方法。
（７）前記有機原料が、グルコースまたはシュークロースである、（４）〜（６）のいずれかのコハク酸の製造方法。
（８）（４）〜（７）のいずれかの方法によりコハク酸を製造する工程、及び前記工程で得られたコハク酸を原料として重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プラスミドpC3.14の構築手順を示す図。
【図２】プラスミドpODH3.2の構築手順を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細菌は、有機酸生産能を有し、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（以下、ODHとも呼ぶ）活性が非改変株と比較して増強するように改変された細菌である。
本発明において、「有機酸の生産能」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中に有機酸を蓄積する能力をいう。また、「有機酸」とは、TCA回路の代謝中間体の有機酸が挙げられ、例えば、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、シス−アコニット酸などが挙げられるが、この中でもコハク酸、リンゴ酸、フマル酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。
このような細菌は、本来的に有機酸生産能を有する細菌又は育種により有機酸生産能を付与された細菌において、ODH活性を増強する改変を行ったものでもよいし、ODH活性を増強する改変を行うことにより有機酸生産能を有するようになったものでもよい。育種により有機酸生産能を付与する手段としては、例えば、変異処理、遺伝子組換え処理などが挙げられるが、より具体的には、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような改変などが挙げられる。
なお、本発明に用いる細菌は２種類以上の有機酸を生産する能力を有するものであってもよい。【００１０】
本発明の製造法に使用できる細菌は、有機酸生産能を有すれば特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、エシェリヒア属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌及びリゾビウム属細菌が好ましく、この中ではコリネ型細菌がより好ましい。
例えば、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コリなどが挙げられ、ラクトバチルス属細菌としてはラクトバチルス・ヘルヴェチカスが挙げられ（J Appl Microbiol, 2001, 91, p846-852）、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス、バチルス・ステアロサーモフィルス等が挙げられ、リゾビウム属細菌としては、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などが挙げられる。
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium  flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium  ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium  lactofermentum）に分類される細菌が挙げられる。【００１１】
本発明に用いる細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びコリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
また、親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。【００１２】
本発明の細菌は、上記のような有機酸生産能を有する細菌を、ODH活性が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、ODH活性増強のための改変を行った後に有産生産能を付与する改変を行ってもよい。
ここで、「ODH活性」とは、２−オキソグルタル酸（α−ケトグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性をいい、「ODH活性が増強する」とは、ODH非改変株と比較してODH活性が増強していることをいう。ODH活性は、ODH非改変株と比較して、単位菌体重量当たり1.5倍以上増強されていることが好ましく、２倍以上増強されていることがより好ましい。なお、ODH活性は、Shiioらの方法（Isamu Shiio and Kyoko Ujigawa-Takeda, Agric.Biol.Chem.,44(8),1897-1904,1980）に従って測定することができる。【００１３】
ODH遺伝子を用いたODH活性を増強させるための改変は、例えば、プラスミドなどを用いた形質転換、相同組換えなどによる染色体上へのODH遺伝子の組み込み、ODH遺伝子発現調節配列の改変などによって行うことができる。
プラスミドなどを用いた形質転換や相同組換えなどによってODH遺伝子を宿主細菌に導入する場合に用いることのできるODH遺伝子としては、宿主細菌に導入したときにODH活性を増加させる遺伝子、すなわち、ODH活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である限り特に限定されないが、例えば、配列番号３に示す塩基配列を有するコリネ型細菌由来のODH遺伝子（odhA）を挙げることができる。ODH遺伝子は、ODH活性を有するタンパク質をコードする限り、上記塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログ遺伝子であってもよい。
ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物又は動植物由来のODH遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のODH遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基いてODH活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらは、例えば、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。【００１４】
上述したようなODH遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でODHの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、ODH遺伝子を発現させるためのプロモーターはODH遺伝子自身のプロモーターであってもよいが、宿主細菌で機能しうる他の強力なプロモーターに置換してもよい。例えば、ｔａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターなどの大腸菌由来のプロモーターが挙げられる。【００１５】
コリネ型細菌にODH遺伝子を導入する場合、用いることができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１、国際公開第９５／３４６７２号パンフレットに記載のｐＰＫ４等を挙げることができる。それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。【００１６】
このようなプラスミドベクターの適当な部位にODH遺伝子を挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を形質転換することにより、ODH遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等の公知の方法によって行うことができる。
なお、ODH活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上にODH遺伝子を多コピー組み込んで高発現化させることによっても行うことができる。
以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、ODH活性の増強を達成することができる。【００１７】
また、ODH活性の増強は、宿主染色体上でプロモーターを置換することによっても達成しうる。プロモーター領域の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６などから得ることができる。置換するプロモーターの種類は宿主細菌で機能しうるものであれば特に制限されないが、嫌気的条件下での転写活性抑制されないプロモーターが好ましく、例えば、大腸菌で用いられるtacプロモーターや、ｔｒｃプロモーターなどが挙げられる。
プロモーター置換の方法としては、例えば、後述の実施例に示すようなsacB遺伝子を用いる方法（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69-73）が挙げられる。【００１８】
本発明においては、酢酸生産が低減するように改変された有機酸生産菌において、ODH活性を増強するように改変してもよい。酢酸生産が低減するように改変された有機酸生産菌においては、２−オキソグルタル酸が副生することがある。ODHは、２−オキソグルタル酸を酸化的に脱炭酸し、サクシニル-CoAを生成する反応を触媒するため、ODH活性を増強することによって、２−オキソグルタル酸の副生が低下し、目的の有機酸の生成量が増加する。
酢酸生産が低減するような改変としては、たとえば、アセテートキナーゼ（以下、ACKとも呼ぶ）、ホスホトランスアセチラーゼ（以下、PTAとも呼ぶ）、アセチル−CoAハイドラーゼ（以下、ACHとも呼ぶ）、ピルベートオキシダーゼ(以下、POXBとも呼ぶ)の活性を低減するような改変が挙げられる。
酢酸はオキサロ酢酸及びオキサロ酢酸誘導体生合成経路の中間体であるアセチル−CoAから生成されるため、酢酸合成経路をブロックして酢酸の副生を低減させるためには、上記酵素のいずれか一つあるいは全ての活性を低下させることが好ましい。【００１９】
「PTA活性」とは、アセチル−CoAにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「PTA活性が低下するように改変された」とは、PTA活性が、非改変株、例えば野生株の比活性よりも低くなったことをいう。PTA活性は非改変株と比較して、菌体当たり30％以下に低下していることが好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることがより好ましい。また、PTA活性は完全に消失していてもよい。PTA活性が低下したことは、Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969)）により、PTA活性を測定することによって確認することができる。【００２０】
「ACK活性」は、アセチルリン酸とADPから酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACK活性が低下するように改変された」とは、ACK活性が、非改変株、例えば野生株の比活性よりも低くなったことをいう。ACK活性は非改変株と比較して、菌体当たり30％以下に低下していることが好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることがより好ましい。また、ACK活性は完全に消失していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACK活性を測定することによって確認することができる。【００２１】
なお、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムに分類されるものも含む）においては、Microbiology. 1999 Feb;145 (Pt 2):503-13に記載されているように、両酵素はｐｔａ−ａｃｋオペロンにコードされているため、pta遺伝子を破壊した場合は、PTA及びACKの両酵素の活性を低下させることができる。【００２２】
pta遺伝子の破壊は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）にしたがって行うことができる。pta遺伝子としては、例えば、配列番号７の塩基番号１〜１３８３からなる塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上のpta遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。【００２３】
なお、ACK単独で活性低下させる場合、ack遺伝子を用いて改変してもよい。ack遺伝子としては、例えば、配列番号７の塩基番号１３８６−２５７９番目の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、染色体上のack遺伝子と相同組換えを起こす程度に、該配列に対して相同性を有する遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
なお、本発明において使用する細菌は、ODH活性を増強する改変に加え、上記改変のうちの2種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。【００２４】
「ACH活性」は、アセチル−CoAと水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACH活性が低下するように改変された」とは、ACH活性が、非改変株、例えば野生株の比活性よりも低くなったことをいう。ACH活性は非改変株と比較して、菌体当たり50％以下、好ましくは30％以下、さらに望ましくは10％以下に低下されていることが好ましい。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ACH活性が低下したことは、Gergely,J.,らの方法（Gergely,J., Hele,P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334）を参考にしてACH活性を測定することによって確認することができる。なお、コリネ型細菌のACHをコードする遺伝子の例としては、GenBankに登録のコリネバクテリウム・グルタミカムの配列（GenBank Accession No.NC_003450のNCgl2480（NC_003450の2729376..2730884番目の相補鎖））が挙げられる（WO2005/113744）。コリネバクテリウム・グルタミカムのach遺伝子の配列を配列番号１４の１０３７−２５４５に示す。また、染色体上のach遺伝子と相同組換えを起こす程度に、該配列に対して相同性を有する遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。【００２５】
「POXB活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「POXB活性が低下するように改変された」とは、POXB活性が、非改変株、例えば野生株の比活性よりも低くなったことをいう。POXB活性は非改変株と比較して、菌体当たり50％以下に低下していることが好ましく、30％以下に低下していることがより好ましく、10％以下に低下していることが特に好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。POXB活性が低下したことは、Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E. JR, J.Bacteriol.151,1279-1289(1982)）により、POXB活性を測定することによって確認することができる。なお、コリネ型細菌のpoxB遺伝子の例としては、GenBankに登録されている配列（GenBank Accession No． NC_003450の2776766-2778505番目の相補鎖）が挙げられる（WO2005/113745）。コリネバクテリウム・グルタミカムのpoxB遺伝子の配列を配列番号１６の９９６−２７３５に示す。また、染色体上のpoxB遺伝子と相同組換えを起こす程度に、該配列に対して相同性を有する遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。
なお、ach遺伝子及びpoxB遺伝子の破壊は、上述のpta遺伝子の破壊と同様に、公知の方法により行うことができる。【００２６】
本発明の細菌は、ODH活性の増強に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、LDHとも呼ぶ）活性が低減化するように改変された細菌であってもよい。このような細菌は、有機酸がコハク酸である場合に特に有効である。このような細菌は、例えば、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、さらに該細菌をODH遺伝子を用いて改変することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減化のための改変と、ODH活性増強のための改変はいずれを先に行ってもよい。【００２７】
「LDH活性が低減された」とは、LDH遺伝子非改変株と比較してLDH活性が低下していることをいう。LDH活性は、非改変株と比較して、菌体当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、LDH活性は完全に消失していてもよい。LDH活性が低減されたことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりLDH活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のLDH活性の低減した株の具体的な製造方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。【００２８】
また、本発明に用いる細菌は、ODH活性の増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、PCとも呼ぶ）の活性が増強するように改変された細菌であってもよい。「PC活性が増強される」とは、PC活性が野生株又は親株等の非改変株に対して好ましくは１００％以上、より好ましくは３００％以上増加していることをいう。PC活性は例えば、NADHの減少を測定する方法（ＷＯ２００５／０２１７７０）により測定することができる。このような細菌は、例えば、ODH遺伝子の発現増強されたコリネ型細菌に、ＰＣ遺伝子を導入することにより得ることができる。なお、ＰＣ遺伝子の導入とODH活性増強のための改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。【００２９】
PC遺伝子の導入は、例えば、特開平１１−１９６８８８号公報に記載の方法と同様にして、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより行うことができる。具体的なＰＣ遺伝子遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のPC遺伝子（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927（配列番号５））などを用いることができる。ＰＣ遺伝子は、ＰＣ活性を実質的に損なうことがない限り、配列番号５の塩基配列において、一部の塩基が他の塩基と置換されていてもよく、又は欠失していてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明に用いることができる。さらに、配列番号５の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号５の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。【００３０】
また、コリネバクテリウム・グルタミカム以外の細菌、または他の細菌又は動植物由来のＰＣ遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す細菌または動植物由来のＰＣ遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーンションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
なお、PC活性の増強は上述したようなODHの活性増強と同様の方法にて行うことができる。【００３１】
２．有機酸の製造方法
本発明の有機酸の製造方法は、上記細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させ、有機酸を生成させ、これを採取する事を特徴とする有機酸の製造方法である。製造する有機酸は上述した有機酸であるが、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はピルビン酸が好ましく、コハク酸がより好ましい。【００３２】
有機酸の製造に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。種培養に用いる培地は、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。種培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収した後に、有機酸の製造反応に用いることが好ましい。なお、種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって有機酸を製造してもよいし、予め増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても有機酸を製造してもよい。【００３３】
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。【００３４】
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本細菌が資化してコハク酸などの有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース又はシュークロースが好ましく、特にグルコースが好ましい。【００３５】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸などの有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。【００３６】
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本細菌が資化してコハク酸などの有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が挙げられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。【００３７】
反応液には、上記した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有させる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１〜５００ｍＭ、好ましくは２〜３００ｍM、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。【００３８】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であり、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。【００３９】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。【００４０】
細菌の種培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸などの有機酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。【００４１】
以上のような細菌反応により、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸又はピルビン酸などの有機酸が反応液中に生成蓄積する。反応液（培養液）中に蓄積した有機酸は、常法に従って、反応液より採取することができる。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、有機酸を採取することができる。【００４２】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法により有機酸を製造した後に、得られた有機酸を原料として重合反応を行うことにより有機酸含有ポリマーを製造することができる。
近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【実施例１】
【００４３】
＜ＯＤＨプラスミド増強株作製＞
（Ａ）ＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。【００４４】
（Ｂ）ＯＤＨ遺伝子のクローニングと増強用プラスミドの構築
プロモーター領域を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体Ｅ１コンポーネントの遺伝子（ｏｄｈＡ）の取得は上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６の１１７２４９８．．１１７６２７１の相補鎖）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１０秒、６８℃で５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝バイオ）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約４．４ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｓｅＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、約４．４ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＯＤＨ１．０と命名した。【００４５】
（Ｃ）ｐＴＺ４と和合性を有するコリネ型細菌発現ベクターの構築
（ｉ）ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子の導入
ｐＴＺ４と共存可能なコリネ型細菌ベクターは、ｐTZ４と和合性を示す複製領域を持つプラスミドベクターｐＣ３（Ｐｌａｓｍｉｄ  ３６  ６２（１９９６））のカナマイシン耐性遺伝子をストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって構築した。なお、ｐＴＺ４とは、後述のＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株に導入されているＰＣ増幅用プラスミドのオリジナルプラスミドである。
ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子（大腸菌Ｔｎ７）の取得は、同遺伝子を有する植物形質転換用バイナリーベクターｐＬＡＮ４２１（Plant Cell Reports 10, 286 (1991)）を鋳型としたPCRによって行った。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、（配列番号１０および配列番号１１で示した合成DNA）、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で６０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、９３７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＮｒｕＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝バイオ）により両末端を平滑化したＤＮＡ断片の末端を、上記で調製したストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンをＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、配列番号１０および配列番号１１の合成DNA をプライマーとした上記PCRによって解析した結果、ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが確認され、これをｐＣ３と命名した。
次に、ｐＣ３を制限酵素ＢａｍＨIおよびＰｖｕIIで切断して調製したＤＮＡ断片をクレノウフラグメントにて末端を平滑化し、これにｐBglIIリンカー（宝バイオ：CAGATCTG）を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーから、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素BglIIにて切断されるプラスミドを選抜し、これをｐＣ３．１と命名した。【００４６】
（ii）マルチクローニングサイトの導入
大腸菌プラスミドｐＴ7Ｂｌｕｅ（Novagen社）を鋳型としてLacZマルチクローニングサイトを含むα−ペプチド遺伝子を配列番号１２および配列番号１３で示す合成DNAをプライマーとしたPCRにより調製した。
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１０ng、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、５７７７ｂｐの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、回収後同ＤＮＡ断片を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝バイオ）により５'末端をリン酸化した。
ｐＣ３．１を制限酵素PstＩおよびHpaＩで切断後、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝バイオ）により末端を平滑化したDNA断片を、上記で調製したα−ペプチドの遺伝子断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ）を用いて結合した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬX-Galおよび５０μｇ／ｍLスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたコロニーの中から青色を呈するもの選抜し、液体培養後、定法によりプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドDNAは、挿入したLacZマルチクローニングサイトに由来するEcoRVの切断部位を有することが確認され、これをｐＣ３．１４と命名した（図１に構築手順を示す）。【００４７】
次に、上記ｐＯＤＨ１．０を制限酵素ＳｓｅＩおよびＢａｍＨＩで切断して生じた約４．４ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、上記プラスミドｐＣ３．１４を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ）を用いて連結した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した白色コロニーを常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｓｅＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、約４．４ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＯＤＨ３．２と命名した（図２）。【００４８】
（Ｄ）ＯＤＨプラスミド増強株の作製
ＯＤＨ増強用プラスミドｐＯＤＨ３．２のブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株（ＰＣ遺伝子が増強され、ＬＤＨ遺伝子が破壊された株：特開２００５−９５１６９：ＷＯ２００５／２１７７０）への導入は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によってそれぞれ行い、得られた形質転換体をストレプトマイシン１０μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育したそれぞれの株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＯＤＨ３．２を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。【００４９】
（Ｅ）ＯＤＨ酵素活性測定
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むA培地１００ｍｌで終夜培養を行った。得られた培養液50 mlを4℃で4,000rpm x 10 分の遠心分離により回収後、30 mlの100 mM TES-NaOH buffer (pH 7.5) で2回洗浄した。洗浄後の菌体は、10 mlのBufferA (100 mM TES-NaOH buffer (pH 7.5), 30% glycerol) に懸濁した。菌体懸濁液1 ml を破砕用15 ml ファルコンに移し、ガラスビーズ1 mgを加え、バイオラプター（コスモバイオ製）で4℃に冷却しながら超音波破砕 (Highレベルで1 分破砕, 2 分休止のサイクルを１サイクルとしてこれを7サイクル)を行った。この菌体破砕液を4℃で18,000 x g, 5 min遠心してビーズを除去後、さらに18,000 x g, 25 minの遠心を行い、得られた上清を粗酵素画分としてODH酵素活性測定に供した。なお、タンパク濃度の測定はBSA濃度を指標とし、Protein Assay (BIO-RAD, #500-0006 )を用いて行った。
ODH活性測定は、Agric. Boil. Chem., 44(8), 1897-1904, 1980, I Shiio and K Ujigawa-Takedaに記載の方法を参考に、以下の通りに行った。まず、終濃度100 mM TES (DOJINDO, #344-02653)-NaOH buffer (pH 7.7), 0.2 mM coenzyme A（和光, #306-50481), 0.3 mM thiamin pyrophosphate (SIGMA, #C-8754), 5 mM 2-oxoglutarate (SIGMA, #305-72-6), 3 mM L-cysteine (和光, #033-05272), 5 mM MgCl2, 1 mM 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (和光, #44047000)になるよう反応液を調製した。測定用キュベットに反応液を移した後、粗酵素液の添加により反応を開始し３６５ｎｍでの吸光度（A365）の上昇を測定した。1Uは１分間にA365が１増加する時の酵素量とした。上記測定法によるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株のＯＤＨ比活性は０．０２８U/mg-蛋白質であった。なお親株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、同活性は０．００９U/mg-蛋白質であり、ＯＤＨ遺伝子プラスミド増強株では約３倍にＯＤＨ活性が増加していることが確認された。
【実施例２】
【００５０】
＜ＯＤＨプラスミド増強株評価＞
（Ａ）アンモニア嫌気条件
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液：５０μＬ、無菌濾過した２％ストレプトマイシン水溶液：５０μＬを添加し、実施例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス１５ｇ、カザミノ酸１５ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液：５００ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液：１．５ｍＬ、無菌濾過した２％ストレプトマイシン水溶液：１．５ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を１００ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．５に保ち、通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で１６時間本培養を行った。
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍｌ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．６に保ち、無通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約４７時間で反応を終了した。
その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株は、ＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と比較して、コハク酸収率が３．４％増大し、コハク酸の生産量に対するアミノ酸生産量が４７％減少した。すなわち、ＯＤＨの増強により、明らかなコハク酸収率向上、アミノ酸収率低減の効果が見られた。【００５１】
（Ｂ）ナトリウム嫌気条件
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液：５０μＬ、無菌濾過した２％ストレプトマイシン水溶液：５０μＬを添加し、実施例１の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。
硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス１５ｇ、カザミノ酸１５ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液：５００ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液：１．５ｍＬ、無菌濾過した２％ストレプトマイシン水溶液：１．５ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を１００ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸アンモニウムを用いて７．５に保ち、通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で１６時間本培養を行った。
硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍｌ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の本培養により得られた培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％グルコース溶液２００ｍＬを１Ｌのジャーファーメンターに入れて混合し、３５℃に保温した。ｐＨは２Ｍ炭酸ナトリウムを用いて７．６に保ち、無通気、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後約４７時間で反応を終了した。
その結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＯＤＨ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株は、ＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と比較して、コハク酸収率が３．８％増大し、コハク酸生産量に対する酢酸生産量が２７％減少した。すなわち、ＯＤＨの増強により、明らかなコハク酸収率向上、酢酸収率低減の効果が見られた。
【実施例３】
【００５２】
＜酢酸生成が低減化された株のODH増強効果＞
（Ａ）ODH増幅株の作製
酢酸の生成が低減化された株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼの増強効果を確認した。酢酸生成が低減化された株として、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256（コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869）のラクテートデヒドロゲナーゼ（ldh）、アセチル−CoAハイドロラーゼ（ach）、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ（ack）、ピルビン酸オキシダーゼ（poxB）活性を低減化した株（2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)株）を用いた（国際公開WO2005/113744、WO2005/113745号パンフレット）。
ODH増幅用プラスミドとして、ODH遺伝子を含むpPKS-X (国際公開WO95/34672号パンフレット)を、また対照としてそのベクターであるpPK4(国際公開WO95/34672号パンフレット)を用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex寒天培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)に寒天1.5%を含む）に塗布し、31.5℃で約24時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。酢酸低減株にODH増幅プラスミドを導入した株を2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)/pPKS-X、ベクターを導入した株を2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)/pPK4と名づけた。【００５３】
（Ｂ）ODH 増幅株によるコハク酸生産
上述のODH増幅プラスミド導入株（2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)/pPKS-X）、ベクター導入株（2256Δ(ldh,pta,ack,ach,poxB)/pPK4）をCM-Dex寒天培地にて培養し、得られた菌体をシード培地 3ml（グルコース 20g/L、(NH4)2SO4 14g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、尿素 4g/L、FeSO4・7H2O 0.02g/L、MnSO4・7H2O 0.02g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、イーストエキストラクト  1g/L、カザミノ酸  1g/L）に接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約8時間振とう培養を行った。
その後、その試験管にメイン培地 3ml（グルコース200g/Lをフィルターろ過したものに、乾熱滅菌した炭酸マグネシウムを終濃度143g/Lとなるように混合）を接種し、通気を防ぐためシリコン栓で密栓し、31.5℃で約48時間振とうしつつコハク酸生産培養を行った。生成したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはRezex ROA-Organic Acid H+（Phenomenex）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simadzu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。各菌株について、複数検体の評価を行った平均の結果を表１に示した。Yield（％）は糖に対するコハク酸の収率、α-KG/SA(%)は、培養液中のコハク酸（SA）に対するα-ケトグルタル酸（α-KG）の濃度比を示す。【００５４】
【表１】
0005180060.tif 000002
【００５５】
ODH増幅株である2256Δ(ldh,pta,ack,poxB,ach)/(pPKS-X) 株では対照株である2256Δ(ldh,pta,ack,poxB,ach)/(pPK4) 株に比べて、収率は平均で約3％の向上が認められ、副生物のα-KGは約1/2の減少が認められた。このことから、酢酸の生成が低減するように改変されたコハク酸生産菌において、ODH活性を増強することにより、副生α-KGが低下し、コハク酸の生成量が増加することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸などの有機酸を製造することができる。得られたコハク酸などの有機酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られた有機酸を原料として重合反応を行うことにより有機酸含有ポリマーを製造することもできる。
【図１】
0005180060.tif 000003
【図２】
0005180060.tif 000004
【配列表】
0005180060000001.app