(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（c）のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
（a）配列番号：２または４記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（c）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含み、分化段階の全般にわたり、プルキンエ細胞のマーカーとして有用であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項２】
以下の（a）または（b）に記載のポリヌクレオチドからなる、プルキンエ細胞を識別するためのプローブ又はプライマー。
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2283位から2672位、または2955位から3014位の塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項５】
以下の（a）〜（c）のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
（a）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（b）配列番号：２または４記載の塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むポリペプチド
（c）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含み、分化段階の全般にわたり、プルキンエ細胞のマーカーとして有用であるポリペプチド
【請求項６】
以下の（a）または（b）に記載の単離されたポリペプチドに結合しうる抗体を含有する、プルキンエ細胞を識別又は分離するための試薬。
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2283位から2672位、または2955位から3014位の塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるポリペプチド
【請求項７】
以下の（a）または（b）に記載の単離されたポリペプチドに結合しうる抗体を含む、プルキンエ細胞の識別又は分離用キット。
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2283位から2672位、または2955位から3014位の塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるポリペプチド
【請求項８】
以下の（a）または（b）に記載の単離されたポリペプチドに結合しうる抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別又は分離する方法。
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2283位から2672位、または2955位から3014位の塩基配列からなるポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるポリペプチド
【請求項９】
配列番号：２記載の塩基配列の357位から485位、924位から1478位、1689位から3128位、3321位から3380位の塩基配列、またはその相補鎖と相補的な塩基配列の少なくとも連続した15〜50塩基長からなるポリヌクレオチドからなる、プルキンエ細胞を識別するためのプローブ又はプライマー。
【請求項１０】
配列番号：１５，１６，１７，１８，２７，２８のいずれかに記載のポリヌクレオチドからなる、プルキンエ細胞を識別するためのプローブ又はプライマー。
【請求項１１】
請求項５に記載のポリペプチドに結合しうる抗体を含有する、プルキンエ細胞を識別又は分離するための試薬。
【請求項１２】
請求項５に記載のポリペプチドに結合しうる抗体を含む、プルキンエ細胞の識別又は分離用キット。
【請求項１３】
請求項５に記載のポリペプチドに結合しうる抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別又は分離する方法。
【請求項１４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を含有する、プルキンエ細胞を識別又は分離するための試薬。
【請求項１５】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を含む、プルキンエ細胞の識別又は分離用キット。
【請求項１６】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別又は分離する方法。
【請求項１７】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の836位から924位からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を含有する、プルキンエ細胞を識別又は分離するための試薬。
【請求項１８】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の836位から924位からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を含む、プルキンエ細胞の識別又は分離用キット。
【請求項１９】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の836位から924位からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別又は分離する方法。
【請求項２０】
請求項４に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体または培養上清からタンパク質を回収する工程を含む、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】
被検体に請求項２、９または１０に記載のプローブ又はプライマーを接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法。
【請求項２２】
請求項２、９または１０に記載のプローブ又はプライマーを含有する、プルキンエ細胞を識別するための試薬。
【請求項２３】
請求項２、９または１０に記載のプローブ又はプライマーを含む、プルキンエ細胞識別用キット。
【請求項２４】
以下の（a）〜（c）のいずれかに記載の単離されたポリペプチドに結合しうる抗体。
（a）配列番号：３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（b）配列番号：４記載の塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むポリペプチド
（c）配列番号：３記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含み、分化段階の全般にわたり、プルキンエ細胞のマーカーとして有用であるポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプルキンエ細胞特異的に発現するCorl2およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は非常に多様な神経細胞が複雑なネットワークを形成することで機能している。その破綻は各種神経疾患に繋がるが、治療法として移植またはin vivoでの再生治療が検討されつつある。上記治療法において大切なことは、まず、多種の神経細胞を正確に識別することである。また、各神経細胞の分化メカニズムに関する理解がなければ、再生を制御することは困難である。【０００３】
小脳は、平衡、姿勢、随意運動の調節など、運動機能を円滑に遂行するために機能する。小脳腫瘍や慢性アルコール症による小脳虫部の変性などにより、小脳機能が破綻すると、運動失調や平衡障害を来たす。このような障害に対し、失われた神経細胞を補い、ネットワークが再構築することができれば、機能回復が可能になると期待される。【０００４】
小脳には、プルキンエ細胞をはじめ、５種類ほどの神経細胞が存在する。それぞれの神経細胞が器官発生プログラムに従い正しくネットワークを形成することで、神経伝達が行われる。そのため、再生治療においては、移植材料中の細胞集団を詳細に同定することが、治療効果および安全面において重要となる。また、必要な神経細胞のみをin vitroおよびin vivoで分化誘導することも治療効果向上のために重要と考えられ、その際に個々の神経細胞を詳細に同定することは必須である。【０００５】
プルキンエ細胞は、完成した小脳内では、その局在や形態から容易に識別することが可能である。また、プルキンエ細胞の分子マーカーとしてカルビンディン（Calbindin）およびRORalphaが知られており、これらマーカーを併用することでプルキンエ細胞を確実に同定することが可能である。しかし、カルビンディンは成熟したプルキンエ細胞に発現するマーカーであり、未熟な小脳やin vitroで分化誘導した細胞集団中からプルキンエ細胞を同定するには適さない。また、RORalphaは発生後の比較的未熟なプルキンエ細胞に発現するとされているものの、小脳内でみてもプルキンエ細胞以外でも発現が認められ、特異性は低い。したがって、分化直後のプルキンエ細胞特異的マーカーが同定されれば、移植材料の純度検定や、in vitroでのプルキンエ細胞分化誘導法の開発などに有用と考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、プルキンエ細胞特異的な新規マーカーを見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者らは胎児期脳領域に特異的に発現する新規遺伝子の単離を試みた。まず、12.5日胚マウス中脳腹側領域と背側領域から全RNAを調製してサブトラクション(N-RDA)法を実施し、cDNA断片を得た。該cDNA断片についてホモロジー検索を行ったところ、機能未知なタンパク質をコードする遺伝子（Genbank,accession No.: XM_355050）との相同性が見られた。しかし、このデータバンク登録配列はゲノム配列から予想した配列であったため、本発明者らは上記遺伝子の全長cDNA配列のクローニングに取り組んだ。マウス12.5日胚の脳から作製したcDNAライブラリーについてRACE法を行い、得られた増幅断片の塩基配列を解析したところ、1008アミノ酸をコードすることが確認され、この遺伝子をCorl2と命名した。このCorl2について改めてホモロジー検索を行ったところ、上記登録配列：XM_355050とは約850残基について相同性が認められたが、残りの約150残基については全く相同性が認められないことが示され、本発明者らによって得られたCorl2は新規遺伝子であることが明らかになった。【０００８】
続いて本発明者らは、新規遺伝子Corl2について、マウス各種臓器における発現解析をRT‐PCR法により実施した。その結果、Corl2は脳特異的であることが明らかになり、また成体よりも胎児期の方が高い発現を示すことがわかった。小脳におけるCorl2の発現をさらに解析するため、抗Corl2ポリクローナル抗体を作製し免疫染色を実施した。その結果、12.5日胚における結果からは、Corl2はプルキンエ細胞前駆細胞に発現することが示唆され、生後12日小脳における結果からは、Corl2がプルキンエ細胞層に特異的に発現することが明らかとなり、Corl2は分化段階全般にわたりプルキンエ細胞マーカーとして有用であることが示された。すなわち、本発明はCorl2およびその利用に関し、具体的には下記の発明を提供するものである。
（１）以下の（a）〜（d）のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド
（a）配列番号：２または４記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（c）配列番号：２または４記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（d）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列のうち１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２）以下の（a）〜（d）のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2285位から2669位、または2956位から3013位のいずれかによってコードされるポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（c）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（d）配列番号：２に記載の塩基配列の2285位から2669位、または2956位から3013位のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）上記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（４）上記（１）もしくは２に記載のポリヌクレオチド、または上記（３）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（５）以下の（a）〜（d）のいずれかに記載の単離されたポリペプチド
（a）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（b）配列番号：２または４記載の塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むポリペプチド
（c）配列番号：１または３記載のアミノ酸配列のうち１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（d）配列番号：２または４記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（６）以下の（a）〜（d）のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド
（b）配列番号：２に記載の塩基配列の2285位から2669位、または2956位から3013位のいずれかによってコードされるポリペプチドを含むポリペプチド
（c）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の643位から772位、867位から886位、または989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（d）配列番号：２に記載の塩基配列の2285位から2669位、または2956位から3013位のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる塩基配列によってコードされるポリペプチドを含むポリペプチド
（７）配列番号：２または４記載の塩基配列またはその相補鎖と相補的な塩基配列の少なくとも連続した15塩基長からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（８）少なくとも連続した15塩基長からなるポリヌクレオチドが、配列番号：１５，１６，１７，１８，２７，２８のいずれかに記載のポリヌクレオチドである、上記（７）に記載のポリヌクレオチド、
（９）上記（５）または（６）に記載のポリペプチドに結合しうる抗体、
（１０）以下の（a）または（b）のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる、上記（９）に記載の抗体
（a）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド
（b）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入および／または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列の836位から924位からなるポリペプチドを含むポリペプチドに結合しうる、上記（９）に記載の抗体、
（１２）上記（４）に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体または培養上清からタンパク質を回収する工程を含む、上記（５）または（６）に記載のポリペプチドの製造方法、
（１３）被検体に上記（７）または（８）に記載のポリヌクレオチドを接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法、
（１４）被検体に上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法、
（１５）被検体に上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を分離する方法、
（１６）上記（７）もしくは（８）に記載のポリヌクレオチドまたは上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を含有する、プルキンエ細胞を識別するための試薬、
（１７）上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を含有する、プルキンエ細胞を分離するための試薬、
（１８）上記（７）もしくは（８）に記載のポリヌクレオチドまたは上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を含む、プルキンエ細胞識別用キット、
（１９）上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体を含む、プルキンエ細胞分離用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Corl2タンパク質の構造および近縁遺伝子との関係を示す図である。図1Aの百分率は、当該領域の相同性を示す。
【図２】各種成体組織におけるCorl2 mRNA発現の観察結果を示す図である。
【図３】Corl2の12.5日胚マウス脳領域における発現を、免疫染色によって検討した図である。
【図４】Corl2の生後12日マウス小脳領域における発現を、免疫染色によって検討した図である。図中の矢じりは、プルキンエ細胞を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、新規タンパク質Corl2をコードするポリヌクレオチドに関する。Corl2はプルキンエ細胞特異的に発現するタンパク質である。本発明者らによって、Corl2 cDNAが初めて単離された。マウスCorl2のアミノ酸配列を配列番号１、マウスCorl2の塩基配列を配列番号２に示す。配列番号２において、開始コドンは357位から359位のATG、終止コドンは3381位から3383位のTAAである。また、ヒトCorl2の推定アミノ酸配列を配列番号３、ヒトCorl2の推定塩基配列を配列番号４に示す。配列番号４において、開始コドンは1位から3位のATG、終止コドンは3043位から3045位のTAAである。【００１１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、2以上のヌクレオチドが結合したものであって、一般にいう「オリゴヌクレオチド」を含み、DNAおよびRNAの両方を含む。また本明細書において「ポリペプチド」とは、2以上のアミノ酸が結合したものであって、一般にいう「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」を含む意味である。本明細書において「単離」とは、人為的な処理により、天然に存在する状態とは異なる状態に置かれていることを意味する。【００１２】
Corl2をコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法で調製することができる。例えば、マウスまたはヒト小脳の組織、あるいはマウスまたはヒト胚からmRNAを調製し、配列番号２または４に記載の塩基配列を基にプライマーを合成し、RT-PCR法により調製することができる。また例えば、マウスまたはヒト小脳cDNAライブラリーから、配列番号２または４に記載の塩基配列あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行って調製することができる。さらに、配列番号２または４に記載の塩基配列を市販の核酸合成装置を用いて合成して調製することも可能である。【００１３】
またCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。Corl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、配列番号２または４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。また、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列に１または複数個のアミノ酸が付加、欠失、挿入、および／または置換されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも、Corl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに含まれる。これらは、ラット、マウス、モルモット、ヤギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、チンパンジー、ヒト等の哺乳類、好ましくはマウスまたはヒトにおけるCorl2の天然の変異体、各種動物（例えば、鳥類、ラット、モルモット、ヤギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、チンパンジー等の哺乳類）におけるCorl2のホモログまたはオーソログあるいはこれらの変異体、さらにはSNPを有するCorl2やSNPを有する上記ホモログ，オーソログ，これらの変異体、人工的に創製された変異体に相当する。【００１４】
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸(Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val)、非荷電性アミノ酸(Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, His, Lys)、中性アミノ酸(Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)、脂肪族アミノ酸(Ala, Gly)、分枝アミノ酸(Ile, Leu, Val)、ヒドロキシアミノ酸(Ser, Thr)、アミド型アミノ酸(Gln, Asn)、含硫アミノ酸(Cys, Met)、芳香族アミノ酸(His, Phe, Trp, Tyr)、複素環式アミノ酸(His, Trp)、イミノ酸(Pro, 4Hyp)等に分類することができる。中でも、Ala、Val、Leu及びIleの間、Ser及びThrの間、Asp及びGluの間、Asn及びGlnの間、Lys及びArgの間、Phe及びTyrの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸がCorl2の抗原性を有していれば良い。
このような配列番号:1または3のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換および／または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection8.1-8.5)、Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。【００１５】
本発明において、付加、欠失、挿入、および／または置換されるアミノ酸の数は、Corl2と同等の機能を有する限りまたはCorl2とクロスリアクションする限り、特に制限はない。通常は、全アミノ酸数の10％以内、好ましくは全アミノ酸数の3％以内、より好ましくは全アミノ酸数の1％以内、さらに好ましくは、9個以下、より好ましくは6個以下、最も好ましくは1または2個である。【００１６】
本発明のCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の手段により調製することができる。例えば、マウスまたはヒト小脳cDNAライブラリーから、配列番号２または４に記載の塩基配列あるいはその一部をプローブとしてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行って調製することができる。【００１７】
上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。【００１８】
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。【００１９】
また本発明のCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２または４記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドに、PCRによる変異導入法やカセット変異法などの当業者に周知の遺伝子改変方法を施し、部位特異的にまたはランダムに変異を導入することによって、調製することができる。または配列番号２または４記載の塩基配列に変異を導入した配列を、市販の核酸合成装置によって合成することも可能である。【００２０】
本発明のCorl2をコードするポリヌクレオチドおよびCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プルキンエ細胞の識別に利用することができる。配列番号２または４記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、プルキンエ細胞中のCorl2 mRNAと相補的に結合するため、これら本発明のポリヌクレオチドをプローブとして、小脳や胚等の検体に接触させ、in situハイブリダイゼーション法等を行えば、プルキンエ細胞の識別が可能になる。特にCorl2は成体のみならず胚の段階においても発現することから、分化段階全般にわたる識別マーカーとして利用可能である。検体は、成体組織であれば切片として使用するが、胚であればwhole mountで使用することも可能である。Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプローブとして使用する際には、周知の標識物質、例えば、ジゴキシゲニン（DIG）、 ビオチン、 フルオレセインといった非放射性物質または35S や 33P等の放射性物質で標識することができる。【００２１】
また本発明のCorl2およびCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組み換えによるCorl2およびCorl2に類似するポリペプチドの生産に利用することができる。Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記ポリペプチドの生産に用いる場合には、上記ポリヌクレオチドを適当なベクターに挿入して用いることができる。また上記ポリペプチドはそのまま発現させてもよいが、ポリペプチドの回収の効率化を目的として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよい。ベクターは、使用する翻訳系および目的に適合するものを選択することができ、翻訳系は、原核細胞系、真核細胞系、無細胞系のいずれでも使用可能である。例えば、原核細胞系の宿主として大腸菌を用いる場合は、pET、pPRO、pCAL、pBAD、pGEX等からベクターを適宜選択して、目的のポリペプチドを生産することができる。また、真核細胞系として昆虫細胞や動物細胞を宿主とする場合は、AcNPV等のバキュロウイルス発現系を使用してもよい。上記のようにして発現させた組換えポリペプチドは、公知方法によって精製することができる。例えば、ヒスチジンやグルタチオンS‐トランスフェラーゼ（GST）との融合ポリペプチドとして発現させた場合は、ニッケル樹脂カラムやグルタチオンカラムによる精製が可能である。【００２２】
本発明は、上述の本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と相補的である部分ポリヌクレオチドに関する。このような部分ポリヌクレオチドは、後述するプルキンエ細胞識別方法およびその試薬におけるプライマーまたはプローブとして利用することができる。また上記部分ポリヌクレオチドは、上述の、Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドの調製、およびこれらをコードするポリヌクレオチドの調製に利用することができる。上記部分ポリヌクレオチドはDNAでもRNAでもよい。また上記部分ポリヌクレオチドの長さは、プローブまたはプライマーとして利用できる限り制限はなく、上述の本発明のポリヌクレオチドの全長と同じ塩基長であってもよい。例えば、ポリヌクレオチドの全長と同じ塩基長であってもプローブとして利用可能な場合がありうる。通常は１５塩基長以上であるが、あえてより具体的な長さを提示するならば、好ましくは、１５塩基長以上５０塩基長以下、より好ましくは１５塩基以上３０塩基長以下である。上記部分ポリヌクレオチドは、必要に応じて、配列番号２または配列番号４に記載の塩基配列のうち、他のタンパク質（Corl1等）との相同性の低い部分を含む配列として設計することができる。例えば、配列番号２記載の塩基配列の357位から485位、924位から1478位、1689位から3128位、3321位から3380位の配列の一部を含む配列とすることができる。上記配列は、それぞれ、配列番号1記載のアミノ酸配列において、1位から43位、190位から374位、445位から924位、989位から1008位の配列に相当する。また配列番号１５、１６、１７、１８、２７，２８に記載されたポリヌクレオチドは、実施例のとおり、Corl2単離や増幅に利用できる上記部分ポリヌクレオチドの具体例である。本発明の部分ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２または４記載の塩基配列を基に核酸合成装置によって調製することができる。【００２３】
本発明は、Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドに関する。Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドは、上述のとおり、これら本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用い、公知の遺伝子組み換えタンパク質生産方法により調製することができる。また、前記ポリペプチドは、後述する本発明の抗体をプローブとし、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドの中からウエスタンブロット法により調製することができる。Corl2およびCorl2に類似するポリペプチドは、後述する抗Corl2抗体の製造に用いることができる。【００２４】
また本発明は、本発明のポリペプチドに結合しうる抗体に関する。本抗体は、Corl2に特異的に結合するものであれば、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもよく、またFab, Fab’, F(ab’)2, Fv等の抗体断片であってもよい。これらの抗体は、いずれも当業者に周知の手段によって調製することができる。ポリクローナル抗体であれば、本発明のCorl2もしくはCorl2に類似するポリペプチドまたはこれらの部分ポリペプチドを抗原として、ウサギ、マウス、ヤギ等の動物を免疫し、末梢血を採血して調製することができる。モノクローナル抗体であれば、本発明のCorl2もしくはCorl2に類似するポリペプチドまたはこれらの部分ポリペプチドを抗原として動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ、あるいはウシ、この中でも好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギを免疫し、該動物の脾臓またはリンパ節の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、このハイブリドーマから産生される抗体を回収して調製することができる。抗原とするCorl2の部分ポリペプチドとしては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の643位から772位のポリペプチド、867位から886位のポリペプチド、989位から1008位のポリペプチド、配列番号：２に記載の塩基配列の2285位から2669位または2956位から3013位のいずれかによってコードされるポリペプチド、これらに類似するポリペプチドを用いることができる。あるいは上記ポリペプチドの一部であって5アミノ酸残基以上、好ましくは10アミノ酸残基以上のポリペプチドを用いることができる。また、上記のみならず、上記部分ポリペプチドを含むポリペプチドまたはその一部を抗原として本発明の抗体を調製してもよく、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の44位から772位のポリペプチド、44位から886位のポリペプチド、44位から1008位のポリペプチド、643位から886位のポリペプチド、643位から1008位のポリペプチド、867位から1008位のポリペプチド、965位から1008位のポリペプチド、またはこれらポリペプチドの一部であって5アミノ酸残基以上、好ましくは10アミノ酸残基以上のポリペプチドを用いることができる。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の836位から924位を含むポリペプチドは、本発明の抗体を調製するための抗原として好適に用いることができる。【００２５】
また配列番号：１に記載のアミノ酸配列の1位から43位、190位から374位、または445位から924位、989位から1008位のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド、および上記ポリペプチドを含むポリペプチドを抗原として、本発明の抗体を好適に調製することができる。またはこれらポリペプチドの一部であって5アミノ酸残基以上、好ましくは10アミノ酸残基以上のポリペプチドを用いて、本発明の抗体を調製してもよい。【００２６】
本発明の抗体は、プルキンエ細胞に特異的に発現するCorl2と抗原抗体反応により結合することから、免疫組織染色法、ウエスタンブロット等によるプルキンエ細胞の識別に用いることができる。また本発明の抗体は、後述するプルキンエ細胞の分離方法に用いることもできる。【００２７】
本発明は、被検体に本発明の部分ポリヌクレオチドを接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法に関する。この識別方法は、配列番号２または４記載の塩基配列またはその相補鎖と相補的である15塩基長以上のポリヌクレオチド、あるいは配列番号１５, １６, １７, １８, ２７, ２８に記載のポリヌクレオチドを用い、プルキンエ細胞が含まれる可能性のある組織または細胞集団、例えば小脳、胚の中から、プルキンエ細胞を特異的に識別する方法である。上述のとおり、配列番号２または４記載の塩基配列またはその相補鎖と相補的である15塩基長以上のポリヌクレオチドおよび配列番号１５, １６, １７, １８, ２７, ２８に記載のポリヌクレオチドは、プルキンエ細胞中のCorl2 mRNAと相補的に結合する。Corl2は成体のみならず胚の段階においても発現する。上記部分ポリヌクレオチドを用いた本発明の識別方法は、成体も含めた分化段階全般にわたってプルキンエ細胞を識別できる点において、特に優れた方法である。具体的な例として、本発明の部分ポリヌクレオチドをプローブとしたin situハイブリダイゼーション法を挙げることができる。本発明の部分ヌクレオチドをプローブとしたin situハイブリダイゼーション法は、より具体的には、（a）被検体に、標識物質で標識された本発明の部分ポリヌクレオチドを接触させる工程、（b）被検体と結合した標識物質からのシグナルを検出する工程、を含むin situハイブリダイゼーション法の場合の被検体は、成体組織または胚の切片あるいはwhole mountである。組織または胚からの切片および固定は、パラホルムアルデヒド等を用いて周知の方法によって行うことができる。プローブとする本発明の部分ポリヌクレオチドは、DNAでもRNAでもよく、その長さについては、「部分ポリヌクレオチドの長さ」について上述したとおりである。さらにプローブとする本発明の部分ポリヌクレオチドは、周知の標識物質、例えば、ジゴキシゲニン（DIG）、 ビオチン、 フルオレセインといった非放射性物質または35S や 33P等の放射性物質で標識されたものでもよい。切片を貼り付けたスライドグラスに上記プローブをのせてハイブリダイゼーションを行い、プローブからのシグナルを検出することにより、組織中のプルキンエ細胞を識別することができる。また本発明の方法の別の例として、本発明の部分ポリヌクレオチドをプライマーまたは／およびプローブとしたin situ PCR法を挙げることができる。in situ PCRは固定した細胞あるいは組織切片上でPCRを行う方法である。in situ PCRには、標識プライマーや標識ヌクレオチドを用いて目的遺伝子を増幅し、増幅物中の標識を検出する方法（直接法）と、目的遺伝子の増幅後に標識プローブを用いて、in situハイブリダイゼーションによって検出する方法（間接法）とがある。上記直説法は、より具体的には、（a）被検体に、標識物質で標識された本発明の部分ポリヌクレオチドを接触させ、検体中の目的遺伝子の増幅を行う工程、（b）増幅物中の標識物質からのシグナルを検出する工程、を含む。また、上記間接法は、（a)被検体に、本発明の部分ポリヌクレオチドを接触させ、目的遺伝子を増幅する工程、（b）上記（a）工程で得られた増幅物に、標識物質で標識した本発明の部分ポリヌクレオチドを接触させ、標識物質からのシグナルを検出する工程、を含む。PCRは、スライドグラス上で行ってもよく、チューブ等の液相中で行ってもよい。手順の一例を簡単に説明すると、組織等をスライドグラス上にパラホルムアルデヒド等で固定した後、試薬を浸透させるためのプロテアーゼ処理を行う。プライマー、標識ヌクレオチド、DNAポリメラーゼ等をスライドグラスに添加してカバーフィルムで覆い、PCR反応を行う。反応停止後、洗浄して標識のシグナルを検出すれば、目的遺伝子を識別することができる。また本発明の方法には、小脳、胚、または培養細胞等のプルキンエ細胞を含むと予想される細胞集団から周知方法によりポリヌクレオチドを抽出し、該ポリヌクレオチドを被検体とし、上記ポリヌクレオチドをプローブとして、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションを行う方法も含まれる。【００２８】
本発明の方法は、小脳関連疾患またはプルキンエ細胞関連疾患治療のための治療材料の純度検定等に用いることができる。またin vitroでのプルキンエ細胞の分化誘導において、プルキンエ細胞の確認に用いることができる。プルキンエ細胞の生理機能解明等に使用することができる。【００２９】
また本発明は、被検体に本発明の抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法に関する。本発明の方法は、本発明の抗体とプルキンエ細胞中のCorl2の抗原抗体反応を利用して、プルキンエ細胞が含まれる可能性のある組織または細胞集団、例えば小脳、胚の中から、プルキンエ細胞を特異的に識別する方法である。上述した本発明の抗体は、プルキンエ細胞に特異的に発現するCorl2と抗原抗体反応により結合することから、免疫組織染色法等によるプルキンエ細胞の識別に用いることができる。本発明の「被検体に本発明の抗体を接触させる工程を含む、プルキンエ細胞を識別する方法」は、より具体的には、（a）被検体に、標識物質で標識された本発明の抗体を接触させる工程、（b）被検体と結合した標識物質からのシグナルを検出する工程、を含む。免疫組織染色法の場合を説明する。被検体は小脳等の組織、胚、または培養細胞等の細胞集団である。小脳等の組織を、ホルムアルデヒド等の周知方法で固定して切片を作成する。該切片を、標識した抗Corl2抗体と接触させて抗原抗体反応を行い、シグナルを検出する。または、該切片を一次抗体である抗Corl2抗体と接触させ、次に、標識された二次抗体と接触させて、シグナルを検出する。プルキンエ細胞のみが標識抗体によるシグナルを発するため、プルキンエ細胞の識別が可能となる。本発明の方法の別の例としては、本発明の抗体をプローブとするウエスタンブロット法を挙げることができる。このウエスタンブロット法は、公知の方法に従って行うことができる。
ここで、本発明における「標識物質」とは、前記抗体に物理化学的結合等により結合させることで、それらの存在を検出可能にするために用いられる物質を意味し、具体的には、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジンあるいは放射性同位体等である。さらに具体的には、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β‐D‐ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース‐6‐ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク質、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、3H、14C、125I若しくは131I等の放射性同位体、ビオチン、アビジン、または、アクリジニウム誘導体等の化学発光物質が挙げられる。【００３０】
本発明の方法は、小脳関連疾患またはプルキンエ細胞関連疾患治療のための治療材料の純度検定等に用いることができる。プルキンエ細胞の生理機能解明等に使用することができる。【００３１】
また本発明は、プルキンエ細胞の分離に関する。本発明の方法は、上述した本発明の抗体を分離手段として用い、被検体を抗体と接触させることを特徴とする。本発明の分離方法は、より具体的には、（a）被検体を、固定化された本発明の抗体に接触させる工程、（b）本発明の抗体に結合した細胞を、抗体から分離する工程、を含む。本発明の方法の一つの態様として、本発明の抗体を固定化したカラムを用いた、アフィニティークロマトグラフィー法を挙げることができる。被検体としては、小脳等のプルキンエ細胞を含む組織からトリプシン処理等の公知の方法によって調製した細胞培養液を挙げることができる。または、神経幹細胞等から再生技術によって再生させた細胞も本発明の被検体となり得る。該細胞培養液を、抗Corl2抗体を固定化したアフィニティーカラムに通し、溶離液中の塩濃度、pHや有機溶媒量等を変化させて細胞を溶出（分離）することにより、プルキンエ細胞を調製することができる。また別の態様としては、本発明の抗体を用いた磁気細胞分離方法を挙げることができる。上記抗Corl2抗体を磁気ビーズに固定し、被検体であるプルキンエ細胞を含む細胞培養液を、該抗体固定化磁気ビーズと接触させる。細胞集団のうちプルキンエ細胞のみが抗体固定化磁気ビーズに結合するため、プルキンエ細胞の分離が可能となる。あるいは、本発明の抗体を標識してプルキンエ細胞を含む細胞集団に接触させ、セルソーターによりプルキンエ細胞を分離することもできる。【００３２】
本発明の方法は、小脳関連疾患またはプルキンエ細胞関連疾患治療のための治療材料の調製や精製等に利用可能である。プルキンエ細胞の生理機能解明等に使用することができる。【００３３】
さらに本発明は、プルキンエ細胞の識別方法に用いる試薬に関する。本発明の試薬には、本発明の部分ポリヌクレオチドまたは本発明の抗体のいずれかが有効成分として含まれる。本発明の試薬は、上述のプルキンエ細胞の識別のために使用される。また小脳関連疾患やプルキンエ細胞関連疾患の検査のために用いられる場合もありうる。試薬中の部分ポリヌクレオチドの長さは、上述の「部分ポリヌクレオチドの長さ」のとおりである。試薬中の本発明の部分ポリヌクレオチドまたは抗体は、標識が施してあってもよい。また、本発明の試薬において、部分ポリヌクレオチドまたは抗体の形態について特に制限はなく、例えば、適当な溶媒に本発明の抗体を分散させた液状試薬であってもよく、本発明の抗体が磁性ビーズ等に固定化された状態の試薬であってもよい。本発明の試薬は、必要に応じて、プルキンエ細胞の識別方法を行う際に使用する他の試薬、説明書、器具などともにキットとすることもできる。【００３４】
また本発明は、プルキンエ細胞の分離方法に用いる試薬に関する。本発明の試薬には、本発明の抗体が有効成分として含まれる。試薬中の本発明の抗体は、標識が施してあってもよい。また、本発明の試薬において、抗体の形態について特に制限はなく、例えば適当な溶媒に本発明の抗体を分散させた液状試薬でもよく、本発明の抗体を磁性ビーズまたはカラム等に固定化させた状態の試薬でもよい。本発明の試薬は、必要に応じてキットとすることができ、該キットには、本発明のポリヌクレオチドまたは抗体の他、必要に応じて、上記プルキンエ細胞の分離方法を行う際に使用する他の試薬、説明書、器具などを含めることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例1］  Corl2の単離
胎児期脳領域特異的に発現する遺伝子を単離するために、12.5日胚マウス中脳腹側領域と背側領域で発現の異なる遺伝子をサブトラクション(N-RDA)法により同定した。単離した断片の一つは機能未知なタンパク質をコードするcDNA断片であった。【００３６】
１‐１． アダプターの調製
N-RDA法用アダプター：ad2，ad3，ad4，ad5，ad13を調製した。アダプター1種についてオリゴヌクレオチド２種を作製してアニーリングさせ、100μMに調製した。アダプターの配列を下記に示す。
アダプターad2
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt    （配列番号５）
ad2A: acggaatgatgt    （配列番号６）
アダプターad3
ad3S: gtccatcttctctctgagactctggt    （配列番号７）
ad3A: accagagtctca    （配列番号８）
アダプターad4
ad4S: ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt    （配列番号９）
ad4A: acacactcacag    （配列番号１０）
アダプターad5
ad5S: ccagcatcgagaatcagtgtgacagt    （配列番号１１）
ad5A: actgtcacactg    （配列番号１２）
アダプターad13
ad13S: gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt    （配列番号１３）
ad13A: acgatcgacagt    （配列番号１４）【００３７】
１‐２．cDNA合成
日本SLCより入手したマウス12.5日胚より中脳腹側および中脳背側領域を切り出した。RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて全RNAを調製し、cDNA synthesis kit (TAKARA)を用いて二本鎖cDNAを合成した。制限酵素RsaIで消化したのち、アダプターad2を付加し、ad2Sをプライマーとして、15サイクルのPCRでcDNAを増幅した。増幅条件は72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を15サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。N-RDA法におけるPCRは、すべて以下の反応液組成で行った。
10×ExTaq                  5μl
2.5mM dNTP                4μl
ExTaq                    0.25μl
100μM primer              0.5μl
cDNA                       2μl
蒸留水                  38.25μl【００３８】
１‐３．Driverの作製
ad2Sを付加して増幅した中脳背側のcDNAを、さらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。１回のサブトラクションに3μgずつ使用した。【００３９】
１‐４．Testerの作製
ad2Sを付加して増幅した中脳腹側のcDNAをさらに5サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を5サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用いてcDNAを精製し、RsaI消化した。60ngのRsaI消化cDNAにアダプターad3を付加した。【００４０】
１‐５．サブトラクション1回目
上記1-3及び1-4で作製したTesterおよびDriverを混合し、エタノール沈殿した後に、1xPCR buffer 1μlに溶解した。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 1μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAを、ad3Sをプライマーとして10サイクルのPCRで増幅した後（72℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を10サイクル行った）、Mung Bean Nuclease (TAKARA)で消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。精製したcDNAを、さらに13サイクルのPCRで増幅した。増幅条件は94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を13サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。【００４１】
１‐６．均一化
サブトラクション1回目で増幅したcDNA 8ngに2xPCR buffer 1μlを加えた。98℃5分の後、1xPCR buffer+1M NaCl 2μlを加えた。さらに98℃5分の後、68℃で16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたcDNAをRsaIで消化し、Qiaquick PCR purification kitで精製した。精製したcDNAを、ad3Sをプライマーとして11サイクルのPCRで増幅した後（94℃で2分インキュベートし、その後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で2分の反応を11サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした）RsaIで消化し、アダプターad4を付加した。【００４２】
１‐７．サブトラクション2回目
上記1-6でad4を付加したcDNA 20ngをTesterとして、上記1-3のDriverと混合し、さらに、上記1-5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにアダプターad5を付加した。【００４３】
１‐８．サブトラクション3回目
上記1-7でad5を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記1-3のDriverと混合し、さらに、上記1-5と同様の方法でサブトラクションを行った。最終的にRsaI消化したcDNAにアダプターad13を付加した。【００４４】
１‐９．サブトラクション4回目
上記1-8でad13を付加したcDNA 2ngをTesterとして、上記1-3のDriverと混合し、以下、上記1-5と同様の方法でサブトラクションを行った。増幅したcDNAをpCRII (Invitrogen)にクローニングし、ABI3100シーケンスアナライザー（Aplied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析した。【００４５】
［実施例２］  Corl2 cDNA全長配列決定
N-RDA法で得られたcDNA断片の配列からBlast検索を行った結果、この遺伝子は機能未知なタンパク質をコードする遺伝子（Genbank,accession No.: XM_355050）であると考えられた。しかし、この登録配列はゲノム配列からのmRNA予想配列であったので、E12.5マウス脳cDNA libraryよりRACE法で全長cDNA配列をクローニングすることにした。
マウス12.5日胚より間脳、中脳、後脳を含む脳領域を切り出した。RNeasy mini kit (Qiagen)を用いて全RNAを調製し、superscriptII choice system (Invitrogen)を用いてcDNA合成を行った。二本鎖cDNAにBstXI/EcoRI adapter (Invitrogen)を付加した後、BstXI消化したpCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングし、cDNA libraryを作製した。【００４６】
RACEは以下の方法で行った。まず、cDNA library DNAに対して、プライマーはCorl2 F1（配列番号１５） / TAU2（配列番号１９）、Corl2 R1 （配列番号１７）/ TAD3（配列番号２１）の二通りの組み合わせを用いて、１回目のPCRを行った。PCRの増幅条件は、94℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で5分の反応を25サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。PCRは以下の反応液組成で行った。
10×buffer                         5μl
2.5mM dNTP                       4μl
ExTaq (TAKARA)                 0.25μl
100μM primer                    0.5μl
cDNA                             1μl(10ng)
DMSO                           3.75μl
蒸留水                            35μl【００４７】
次に、１回目のPCR産物を蒸留水で100倍に希釈した物を鋳型に用いて、２回目のPCRを行った。プライマーは、Corl2 F2 （配列番号１６）/ TAU4（配列番号２０）、Corl2 R2 （配列番号１８）/ TAD4（配列番号２２）の二通りの組み合わせを用いた。PCRの増幅条件は、94℃で5分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で5分の反応を25サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。PCRは以下の反応液組成で行った。
10×buffer                         5μl
2.5mM dNTP                       4μl
ExTaq (TAKARA)                 0.25μl
100μM primer                    0.5μl
1回目のPCR産物（100倍希釈）      1μl
DMSO                           3.75μl
蒸留水                            35μl【００４８】
増幅したPCR産物をpCRII (Invitrogen)にクローニングし、ABI3100シーケンスアナライザー（Aplied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析した。その結果、1008アミノ酸をコードすることが確認され、この遺伝子をCorl2と命名した。マウスCorl2のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。また、プライマーの配列を下記に示す。
Corl2 F1: ACGTCAATGGCTTACCAGACTCCAAG    （配列番号１５）
Corl2 F2: TGTTCTTCCGTGGAGGAGATGGCTTC    （配列番号１６）
Corl2 R1: CTTGAGAAGAGTGTTGGAGATCTGCG    （配列番号１７）
Corl2 R2: ATGGGAATGCCATAGAGGATCACCTG    （配列番号１８）
TAU2: GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTC    （配列番号１９）
TAU4: CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC    （配列番号２０）
TAD3: AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG    （配列番号２１）
TAD4: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG    （配列番号２２）【００４９】
Corl2アミノ酸配列（配列番号１）からBlast検索によりホモロジーサーチを行った。上述のマウス（Genbank, accession No.: XM_355050）の他、チンパンジー（accession No.: XM_512119）、ラット（accession No.: XM_225708）、Gallus gallus（ニワトリ）（accession No.: XM_414700，BX950351，BX929292）で、ゲノム配列からのCorl2予想mRNAおよびタンパク質配列が登録されていた。しかし、登録されているマウスとラットの予想アミノ酸配列は、約1000アミノ酸のうち850残基程度は正しく予想されていたが、約150残基は抜けており、代わりにまったく異なる配列がC末端につながっていた。アミノ酸配列における具体的な相同性は、下記のとおりである。
配列番号１の1位から643位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号１の644位から772位はNCBI登録配列XM_355050では欠失している。
配列番号１の773位から866位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号１の867位から886位はNCBI登録配列XM_355050と異なる配列である。
配列番号１の887位から965位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号１の966位の位置にNCBI登録配列XM_355050では22アミノ酸の挿入がある。
配列番号１の966位から988位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号１の989位から1008位はNCBI登録配列XM_355050と異なる配列である。
また、塩基配列における相同性は下記のとおりである。
配列番号２の1位から69位はNCBI登録未登録である（新規）。
配列番号２の70位から2284位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号２の2285位から2669位はNCBI登録配列XM_355050で欠失している。
配列番号２の2670位から2955位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号２の2956位から3013位はNCBI登録配列XM_355050と異なる配列である。
配列番号２の3014位から3252位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号２の3253位の位置にNCBI登録配列XM_355050では66塩基の挿入がある。
配列番号２の3253位から3320位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号２の3321位の位置にNCBI登録配列XM_355050では211塩基の挿入がある。
配列番号２の3321位から3878位はNCBI登録配列XM_355050と同一である。
配列番号２の3879位から4129位はNCBI登録配列XM_355050では未登録である。
チンパンジーと鳥のアミノ酸配列では、N末端側の一部のみに配列番号１との相同性が認められたが、残りはまったく相同性の無い配列であった。ヒトについては、3'側の部分cDNA配列が幾つか登録されていたが（accession No.: AK027108，AL136667，CR614259，CR599998，CR596209）、予想アミノ酸配列の登録はなかった。そこで、blast searchでhumanゲノム配列から探し出し、イントロン配列の5’および3’側末端を予測し、エキソンを繋ぎ合わせたところ、マウスとほぼ同じ長さのORFが得られた。アミノ酸配列も良く保存されており、特にギャップも認められないことから、ヒトのCorl2配列をほぼ決定できたと考えられる。ヒトCorl2アミノ酸配列を配列番号３に、ヒトCorl2塩基配列を配列番号４に示す。
【００５０】
また、Corl2はCorl1（GenBank Accsession No.AB185113）と特に高い相同性を示し、他にもSki, SnoN, Dachと相同性の高いタンパク質であることが明らかになった（図１）。これらは、いずれもシステインリッチの部分を含む。また、Corl1およびCorl2は、CH1、CH2と呼ばれる領域を有する（図１）。システインリッチおよびCH1領域、CH2領域の位置を、下記に記す。
マウス  Corl1  システインリッチ  配列番号２３記載のアミノ酸配列の52位から197位
CH1  配列番号２３記載のアミノ酸配列の338位から401位
CH2  配列番号２３記載のアミノ酸配列の826位から881位
マウス  Corl2  システインリッチ  配列番号１記載のアミノ酸配列の44位から189位
CH1  配列番号１記載のアミノ酸配列の375位から444位
CH2  配列番号１記載のアミノ酸配列の925位から988位
マウスSki  システインリッチ  配列番号２４記載のアミノ酸配列の101位から260位
マウスSnoN  システインリッチ  配列番号２５記載のアミノ酸配列の143位から302位
マウスDach1  システインリッチ  配列番号２６記載のアミノ酸配列の184位から352位
上記のSki, SnoN, Dachはいずれも転写調節のコファクターと考えられている分子である。Skiは当初癌遺伝子として同定され、その後の解析により、転写調節因子Smadに結合してTGFbetaシグナルを阻害する因子であることが明らかにされている。現在ではSmad以外にも多くの転写調節因子と結合することが知られており、DNAのメチル化による転写抑制等の多くの現象で転写抑制を制御する因子と考えられている。最初はヒトから単離されたが、その後、マウス、ラットなど他の哺乳類でも同定されている。SnoNもSkiと類似した機能を担っていると考えられている。Dachは、Eya, Sixという転写因子に結合し、これらとともに、転写を制御するコファクターであると考えられている。Eya, Sixにも幾つかのファミリーが存在し、発生過程を中心に様々な組織で機能していると考えられている。さらに、Corl1およびCorl2と相同性のあるショウジョウバエの遺伝子（Genbank,accession No.: CG11093）も見出され（図１）、Corl2が進化上保存された機能を有することが示唆された。【００５１】
［実施例３］  Corl2の発現解析
３‐１．成体マウス組織におけるCorl1およびCorl2の遺伝子レベル発現解析
生体マウス組織（脳、肺、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、胸腺、卵巣、睾丸）におけるCorl1、Corl2の遺伝子レベルの発現をRT-PCRにより解析した。またマウス12.5日胚の脳における発現も解析した。各組織全RNA(Promega)に対して、RNA PCR kit (TAKARA)を用いて1本鎖cDNAを合成し、鋳型に用いた。PCRの増幅条件は、94℃で2分インキュベートした後、94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で30秒の反応をCorl1およびCorl2は35サイクル、G3PDHは25サイクル行い、最後に72℃で2分インキュベートした。PCRは以下の反応液組成で行った。
10×buffer                         1μl
2.5mM dNTP                     0.8μl
ExTaq                          0.05μl
100μM primer                    0.1μl
cDNA                             1μl
蒸留水                         7.05μl
使用したプライマー配列を下記に示す。
Corl2 F3: GGACATGGCTTCTTCATCACAGATTC    （配列番号２７）
Corl2 R3: GTAACTGTTGCACCATCTCTTCTCGG    （配列番号２８）
Corl1 F2: ATGCAGAGAGCATCGCTAAGCTCTAC    （配列番号２９）
Corl1 R2 AAGCGGTTGGACTCTACGTCCACCTC    （配列番号３０）
G3PDH F1: ACGACCCCTTCATTGACCTCAACTAC    （配列番号３１）
G3PDH R1: CCAGTAGACTCCACGACATACTCAGC    （配列番号３２）
上記解析の結果、Corl2は成体では脳に特異的に発現していることが明らかになった（図２）。また、脳での発現は成体よりも胎児期の方が高いことも明らかとなった（図２）。【００５２】
３‐２．  Corl2の小脳における発現解析
Corl2の小脳における発現について、タンパク質レベルで解析を行った。小脳は、12.5日胚および生後12日のものを用いた。
本発現解析を行うにあたり、抗Corl2ポリクローナル抗体を作製した。まず免疫に必要な抗原であるCorl2の836-924 アミノ酸にあたる領域とGSTの融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターをE.coli(JM109株)に導入した後、IPTGによって発現誘導し、グルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。融合タンパク質をウサギに数回免疫した後に採血し、その血清から免疫に用いたGST-Corl2抗原によるaffinity精製を行うことによって、抗Corl2ポリクローナル抗体を得た。【００５３】
上記ポリクローナル抗体を用い、以下のプロトコールによって免疫染色を行った。マウス12.5日胚および生後12日小脳を摘出し、4%PFA/PBS(-)で4℃、2時間固定したのち、10%ショ糖/PBS(-)で4℃、8時間、その後20%ショ糖/PBS(-)で4℃、一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ12umの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で1時間乾燥させ、0.1%TritonX-100/PBS(-)で5分間、PBS(-)で5分間湿潤させた。その後、ブロッキング（25%ブロックエース/PBS(-)）を室温、30分間行い、一次抗体を室温、1時間反応させた後、さらに4℃で一晩反応させた。その後、0.1%TritonX-100/PBS(-)で、室温で10分間の洗浄を4回行った。次に蛍光標識した２次抗体を室温、20分間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(-)によって室温で10分間の洗浄を2回行い、封入した。蛍光シグナルは共焦点顕微鏡で検出した。抗カルビンディン抗体および抗RORalpha抗体はSanta cruz社より購入した。【００５４】
12.5日胚における免疫染色の結果を図３に示す。抗Corl2抗体を用いた免疫染色の結果、Corl2の核内局在が認められた。また、発現パターンとしては12.5日胚では、中脳（mesencephalon）、間脳（diencephalon）の腹側の一部の神経細胞、後脳（metencephalon）および髄脳（myelencephalon）の背側の一部の神経細胞、髄脳の腹側の一部の神経細胞に限局していた。後脳の背側領域は生後小脳組織の発生する領域で、小脳を構成する各種神経細胞の多くはこの領域に由来する。BrdU投与による神経細胞の発生時期検定実験の結果、プルキンエ細胞は11日胚から13日胚前後に発生することが明らかにされている。したがって、12.5日胚におけるCorl2の発現は、Corl2がプルキンエ細胞前駆細胞に発現することを示唆している。【００５５】
生後12日の小脳において、Corl2はプルキンエ細胞層に限局して発現していた（図４、図中の矢じりはプルキンエ細胞を示す。）。さらにCorl2発現細胞は全て、プルキンエ細胞マーカーであるカルビンディンおよびRORalpha共陽性であったことから、Corl2はプルキンエ細胞に特異的に発現していることが明らかになった。図４に示すようにRORalphaは、カルビンディンに比べ発生段階の初期から発現するとされているが、プルキンエ細胞以外の細胞にも発現が認められる。これに比べてCorl2はプルキンエ細胞に特異的であり、プルキンエ細胞の産生される12.5日胚において既に発現が認められることから、Corl2は全ての分化段階のプルキンエ細胞を識別するのに有用なマーカーであると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によって、新規遺伝子Corl2が提供された。Corl2遺伝子は、プルキンエ細胞に高い特異性をもって発現するため、優れたプルキンエ細胞マーカーとなる。また、Corl2は分化段階全般にわたってプルキンエ細胞マーカーとして利用できるため、移植材料の純度検定や、in vitroでのプルキンエ細胞分化誘導法の開発などにおける価値は極めて高いものがあり、再生医療の実用化推進に果たすCorl2の効果は大きいと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0005180582.tif 000004
【図４】
0005180582.tif 000005
【配列表】
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