(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第６染色体長腕ｑ２５領域のうち、濾胞性リンパ腫形質転換遺伝子（ＴＦＬ遺伝子）のｍＲＮＡをコードする領域のＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブを被検試料中の染色体に、該プローブを該ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下で接触させ、ついで該ＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションシグナルを測定することにより、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１領域に存在するがん抑制遺伝子の欠失を検出することを含んでなり、ここでＴＦＬ遺伝子のｍＲＮＡをコードする領域は、配列番号１若しくは配列番号３に記載の塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡをコードする領域である、悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項２】
被検試料において、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が正常試料と比較して多いときに、該被検試料は悪性リンパ腫由来の試料であると判定する請求項１に記載の悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項３】
前記プローブが、ＰＡＣプローブＲＰ１−２８１Ｈ８である請求項１に記載の悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項４】
前記プローブが、配列表の配列番号１または配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡの相補的ＤＮＡである請求項１に記載の悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項５】
前記プローブが蛍光標識プローブであり、前記ハイブリダイゼーションシグナルを測定することが、蛍光を測定することにより行われる、請求項１に記載の悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項６】
被検試料が、リンパ球を含む試料、リンパ節生検試料、またはリンパ節や腫瘍細胞や腫瘍細胞を含む組織由来の標本である請求項１に記載の悪性リンパ腫の検査方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡからなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項８】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡを含有する組換えベクターからなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項９】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体からなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項１０】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされるタンパク質からなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項１１】
配列表の配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質からなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項１２】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされるタンパク質、あるいは配列表の配列番号２若しくは配列番号４に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質を特異的に認識する抗体からなる悪性リンパ腫の検出用試薬。
【請求項１３】
配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換えベクター、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質または配列表の配列番号２若しくは配列番号４に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質、および前記タンパク質を特異的に認識する抗体のうち１つまたは２つ以上を含んでなる悪性リンパ腫の検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１上に存在するがん抑制遺伝子の欠失を検出することを特徴とするがん検出方法に関する。さらに本発明は、上記遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質、該タンパク質を認識する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
濾胞性リンパ腫（以下、ＦＬと略称することがある）は、初期には進行が比較的遅いリンパ腫であるが、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（以下、ＤＬＢＣＬと略称することがある）への形質転換により、より急速に進行する例が多い。
【０００３】
ＦＬの特徴としてｔ（１４；１８）（ｑ３２；２１）転座が報告されており、それにより１８ｑ２１のＢＣＬ２遺伝子と１４ｑ３２の免疫グロブリン重鎖（ＩＧＨ）とが近接する（非特許文献１）。その結果、ＢＣＬ２脱制御とそれに続くアポトーシス阻害が生じて、ＦＬの発症に寄与すると考えられる。その他にも染色体異常、例えば、＋７、ｄｅｌ（１）（ｐ３６）、ｄｅｌ（６）（ｑ）およびｄｅｌ（１０）（ｑ２２−２４）がＦＬの形態学的経過に関連していることが明らかにされている（非特許文献２）が、それらの分子的重要性については未だ完全には解明されていない。
【０００４】
本発明者らは、ＦＬからＤＬＢＣＬへの形質転換過程で転座ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２３）が生じることを見出しており、さらに該転座がＦＬからＤＬＢＣＬへの形質転換に極めて重大な役割を果たすことを示唆している（非特許文献３）。そしてこの知見から、免疫グロブリンκ遺伝子座（以下、ＩＧＫと略称することがある）の遺伝子転座の結果６ｑ２３の未知の遺伝子が脱制御されるかもしれないと推定した。
【０００５】
第６染色体長腕（６ｑ）の欠失は、リンパ腫、肺がん、乳がんおよび卵巣がん等の腫瘍の発症において重要な役割を果たすと推定されている（非特許文献４−６）。６ｑ２３−２６欠失を有するＦＬは、ＤＬＢＣＬへの形質転換のリスクが高く、また予後因子が不良であることが報告されている（非特許文献７）。
【０００６】
【非特許文献１】クヌートセン（Ｋｎｕｔｓｅｎ，Ｔ．）、「キャンサー  サーベイズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ）」、１９９７年、第３０巻、ｐ．１６３−１９２。
【非特許文献２】ホースマンら（Ｈｏｒｓｍａｎ，Ｄ．Ｅ，ｅｔ  ａｌ．）、「ジーンズ、クロモゾームス  アンド  キャンサー（Ｇｅｎｅｓ，  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ）」、２００１年、第３０巻、ｐ．３７５−３８２。
【非特許文献３】ヤマモトら（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．）、「キャンサー  ジェネティクス  アンド  サイトジェネティクス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００３年、第１４７巻、ｐ．１２８−１３３。
【非特許文献４】オフィットら（Ｏｆｆｉｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９３年、第８２巻、ｐ．２１５７−２１６２。
【非特許文献５】ザングら（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．）、「ヒューマン  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９８年、第１０３巻、ｐ．７２７−７２９。
【非特許文献６】ベイリー−ウイルソンら（Ｂａｉｌｅｙ−Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．）、「アメリカン  ジャーナル  オブ  ヒューマン  ジェネティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００４年、第７５巻、ｐ．４６０−４７４。
【非特許文献７】チリーら（Ｔｉｌｌｙ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９４年、第８４巻、ｐ．１０４３−１０４９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がん、特に悪性リンパ腫（または、悪性リンパ腫をはじめとした種々のがん）の検出に有用な遺伝子を見出し、該遺伝子を利用するがん検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題解決のために鋭意研究を重ね、悪性リンパ腫において認められるｔ（２；６）の切断点をクローニングし、そして染色体２ｑ１２に位置する免疫グロブリンκ遺伝子座が染色体６ｑ２５に位置するがん抑制遺伝子と推定される遺伝子と融合することを見出した。そして、がん抑制遺伝子と推定される本遺伝子の欠失ががんの発生、増悪・進展および形質転換の一因となり得ると推定した。また、本遺伝子の欠失の検出方法を、ＦＩＳＨ解析を利用することにより確立し、さらに本遺伝子の欠失の検出方法を利用するがん検出方法を見出した。
【０００９】
さらに本発明者らは、本遺伝子の単離・同定に成功し、該遺伝子によりコードされるタンパク質および該タンパク質を認識する抗体を取得した。
【００１０】
本発明はこれらの成果に基づいて達成したものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、ヒト第６染色体長腕ｑ２５領域ＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブを被検試料中の染色体に、該プローブを該ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下で接触させ、ついで該ＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションシグナルを測定することにより、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１領域に存在するがん抑制遺伝子の欠失を検出することを含んでなるがん検出方法に関する。
【００１２】
また本発明は、被検試料において、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が正常試料と比較して多いときに、該被検試料はがん由来の試料であると判定する前記がん検出方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、前記プローブが、ＰＡＣプローブＲＰ１−２８１Ｈ８である前記がん検出方法に関する。
【００１４】
さらにまた本発明は、前記プローブが、配列表の配列番号１または配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡの相補的ＤＮＡである前記がん検出方法に関する。
【００１５】
また本発明は、前記プローブが蛍光標識プローブであり、ヒト第６染色体長腕ｑ２５領域ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが蛍光である前記がん検出方法に関する。
【００１６】
さらに本発明は、被検試料が、リンパ球を含む試料、リンパ節生検試料、またはリンパ節や腫瘍細胞や腫瘍細胞を含む組織由来の標本である前記がん検出方法に関する。
【００１７】
さらにまた本発明は、（ｉ）配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡ、
（ｉｉ）上記（ｉ）記載のＤＮＡと７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、および
（ｉｉｉ）上記（ｉ）記載のＤＮＡの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの変異を有するＤＮＡ、
から選択されるＤＮＡに関する。
【００１８】
また本発明は、前記ＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。
【００１９】
さらに本発明は、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
【００２０】
さらにまた本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法に関する。
【００２１】
また本発明は、前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質に関する。
【００２２】
さらに本発明は、配列表の配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列で表される前記タンパク質に関する。
【００２３】
さらにまた本発明は、前記タンパク質を特異的に認識する抗体に関する。
【００２４】
また本発明は、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、前記タンパク質、前記抗体のうち１つまたは２つ以上を含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、がん、特に悪性リンパ腫（または、悪性リンパ腫をはじめとした種々のがん）の検出を容易に実施し得る方法を提供できる。
【００２６】
また、本発明により、がん抑制遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質および該タンパク質を認識する抗体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明に係る遺伝子は、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１（６ｑ２５．１）に存在する遺伝子であり、がん抑制遺伝子であると推定される。本明細書において、本遺伝子を濾胞性リンパ腫形質転換遺伝子（以下、ＴＦＬ遺伝子と略称する）と称する。
【００２８】
遺伝子は、遺伝情報を担う構造単位で、遺伝形質を規定する因子であり、高分子ＤＮＡでの一定の領域の塩基配列により規定される遺伝の作用単位として定義される。染色体上の遺伝子は、タンパク質構造配列部分であるエキソンとエキソン間に介在するアミノ酸配列情報を持たない配列部分であるイントロンとで構成される。真核生物では、遺伝情報を担う部分のＤＮＡから転写により前駆体ｍＲＮＡが生じる。次いで、前駆体ｍＲＮＡに存在するイントロンに由来する部分が切除され（スプライシング）、エキソンのみが連結されて成熟ｍＲＮＡが生じる。成熟ｍＲＮＡの遺伝情報はリボソーム上で読み取られ（翻訳）、タンパク質が生合成される。
【００２９】
本明細書において、「遺伝子」は遺伝情報を担う構造単位を有する核酸を意味する。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもあり得る。例えば、遺伝子には、染色体上に存在しエキソンとイントロンとから構成されるＤＮＡ、前駆体ｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ、および成熟ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡであるｃＤＮＡが包含される。
【００３０】
「がん抑制遺伝子」とは、その失活や優性ネガティブ変異によりがん化に寄与する遺伝子をいう。高発がん家系において、高頻度に染色体におけるその欠失やヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）が認められる。「欠失」とは細胞の染色体やＤＮＡの一部が欠け、失われることをいう。「ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）」とは、ある座位において、対立染色体の一方の情報が失われることをいう。
【００３１】
ＴＦＬ遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列で表されるＤＮＡまたは配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡ、および該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡが好ましく例示できる。これらＤＮＡはＴＦＬ遺伝子のスプライスバリアントである。
【００３２】
「スプライスバリアント」とは、選択的スプライシングにより１つの遺伝子から生成する２種類以上の成熟ｍＲＮＡをいう。選択的スプライシングとは前駆体ｍＲＮＡにおけるスプライシングの際、エキソンと切除されるイントロンとの間のスプライス部位の位置や組み合わせが変化し、２種類以上の成熟ｍＲＮＡが生成することをいう。
【００３３】
ＴＦＬ遺伝子の塩基配列には個体間で自然突然変異等により生じ得る相違があることが予想されるが、ＴＦＬ遺伝子にはこのような相違のあるＤＮＡも包含される。ＴＦＬ遺伝子には、例えば配列番号１または配列番号３に示す塩基配列と通常、塩基配列の全体で７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるＤＮＡが包含される。また、ＴＦＬ遺伝子には、配列番号１または配列番号３に示す塩基配列において１個以上、例えば１個乃至１００個、好ましくは１個乃至３０個、より好ましくは１個乃至２０個、さらに好ましくは１個乃至１０個、さらにより好ましくは１個乃至５個、特に好ましくは１個乃至３個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるＤＮＡが包含される。
【００３４】
配列番号１に示す塩基配列で表されるＤＮＡは、エキソン１（第１−３０５番目）、エキソン２（第３０６−４４４番目）、エキソン３（第４４５−６８０番目）、エキソン４（第６８１−７８７番目）およびエキソン５ａ（第７８８−１５８４番目）の塩基配列を含み、配列番号２に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質をコードする。また、配列番号１に示す塩基配列で表されるＤＮＡの塩基配列の第１５８番目、第４０４番目および第４１８番目にはＣ／Ｔ多型が存在し、それにより該ＤＮＡによりコードされるタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列の第５３番目、第１３５番目および第１４０番目のアミノ酸残基にそれぞれプロリンからロイシン、セリンからフェニルアラニンおよびプロリンからセリンへの置換が生じる。
【００３５】
配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡは、エキソン１（第１−３０５番目）、エキソン２（第３０６−４４４番目）、エキソン３（第４４５−６８０番目）、エキソン４（第６８１−７８７番目）、エキソン５ｂ（第７８８−８８６番目）、エキソン６（第８８７−９１１番目）およびエキソン７（第９１２−９６３番目）の塩基配列を含み、配列番号４に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質をコードする。また、配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡの塩基配列の第１５８番目、第４０４番目および第４１８番目にはＴ／Ｃ多型が存在し、それにより該ＤＮＡによりコードされるタンパク質（配列番号４）のアミノ酸配列の第５３番目、第１３５番目および第１４０番目のアミノ酸残基にそれぞれロイシンからプロリン、フェニルアラニンからセリンおよびセリンからプロリンへの置換が生じる。
【００３６】
ＴＦＬ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば次の方法により取得することができる。正常ヒトリンパ節から抽出したｍＲＮＡを対象とし、ＴＦＬ遺伝子の一部をプライマーとして用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、得られたｃＤＮＡを適当なプラスミドにクローン化し、得られたｃＤＮＡクローンからＴＦＬ遺伝子を含むものを選択することにより取得できる。プライマーとして配列番号７に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドと配列番号８から１０から選択されるいずれか１に示す塩基配列で表されるポリヌクレオチドとの組み合わせを例示できる。あるいは、ＴＦＬ遺伝子の全部またはその一部の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをプローブとして、適当なヒト由来細胞株から常法に従って調製したｃＤＮＡライブラリーや公知のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ＴＦＬ遺伝子を取得できる。
【００３７】
ＴＦＬ遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、ＴＦＬタンパク質と称することがある）は、ジンクフィンガーモチーフＣ−ｘ８−Ｃ−ｘ５−Ｃ−ｘ３−Ｈ型を有している。該モチーフは通常、ＤＮＡ結合に役割を果たしており、時々ｍＲＮＡの３´非翻訳領域中のＡＵリッチエレメント（以下、ＡＲＥと略称する）に結合する。興味深いことに、多くのＡＲＥ結合タンパク質（以下、ＡＢＰと略称する）は細胞分裂あるいは細胞増殖期関連制御に関係する（バローら（Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）、「ヌクレイック  アシッヅ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００６年、第３３巻、ｐ．７１３８−７１５９０）。
【００３８】
これら知見から、ＴＦＬタンパク質がＡＢＰとして細胞増殖を制御する可能性が浮上した。さらに、ＴＦＬタンパク質のホモログＺＣ３Ｈ１２Ｄが心筋細胞のアポトーシスを惹き起こしたことが報告されている（ゾウら（Ｚｈｏｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）、「サーキュレーション  リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００６年、第９８巻、ｐ．１１７７−１１８５）。
【００３９】
総合すれば、ＴＦＬ遺伝子はリンパ腫細胞の増殖および／または生存を調節する極めて重大な役割を担うと考えることができる。
【００４０】
さらに最近、ＴＦＬ遺伝子のホモログＺＣ３Ｈ１２Ｄの散発性肺がんへの関連がそのヘテロ接合性の消失により示された（ワングら（Ｗａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００７年、第６７巻、ｐ．９３−９９）。また、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ遺伝子がコドン１０６においてＡ／Ｇ非同義的（ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｕｓ）一塩基多型を有し、そしてＺＣ３Ｈ１２ＤのＡ対立遺伝子の過剰発現はインビトロおよびインビボの両方において腫瘍抑制機能を及ぼすことが報告されている。
【００４１】
本発明においては、形質転換ＦＬにおいて、ＴＦＬ遺伝子とＩＧＫ遺伝子の６ｑ２５における転座を同定した。ＴＦＬ遺伝子のエキソン１およびエキソン２を含む５´領域は、ＩＧＫ遺伝子のＶκおよびＣκ領域と置換した。転座により短縮された遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子座の１つ並びにＢＣＬ２、ＢＣＬ６およびＭＹＣ等のがん原遺伝子に関連する転座を有する他のＢ細胞リンパ腫（クッパース（Ｋｕｐｐｅｒｓ，Ｒ．）、「ネイチャー  レビューズ  キャンサー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ）」、２００５年、第５巻、ｐ．２５１−２６２）において観察される遺伝子と同様、発現される可能性も否定できない。遺伝子転座によるＴＦＬ遺伝子の機能障害または機能消失はＦＬの形質転換に関連すると推定される。
【００４２】
このように、ＴＦＬ遺伝子はがん抑制遺伝子と推定され、その機能障害または機能消失ががんの発生、増悪・進展および形質転換に関連すると考えられる。したがって、ＴＦＬ遺伝子の欠失を検出することにより、該遺伝子が欠失しているがんの検出が可能になる。
【００４３】
本発明に係るがん検出方法は、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１（６ｑ２５．１）領域に存在するがん抑制遺伝子、すなわちＴＦＬ遺伝子の欠失を検出することを特徴とする。
【００４４】
ＴＦＬ遺伝子の欠失の検出は、ＴＦＬ遺伝子の遺伝情報を担う構造単位を有する核酸、例えば染色体上に存在するＴＦＬ遺伝子やそのｍＲＮＡ、あるいはＴＦＬタンパク質の発現を測定することにより実施できる。
【００４５】
染色体上に存在するＴＦＬ遺伝子を測定する方法として、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション解析法（以下、ＦＩＳＨ解析法と略称することがある）やサザンブロット法が挙げられる。ＦＩＳＨ解析法は安全かつ簡便で、しかも短時間で結果を得ることができるという利点を有する。一方、サザンブロット法は、精度が高いという利点を有するが、定量性に欠け、手技が煩雑である。
【００４６】
ＦＩＳＨ解析法は、クローン化された遺伝子やＤＮＡ断片を非放射性化合物で標識してプローブとして用い、該プローブと染色体ＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせ、該プローブと染色体ＤＮＡとの分子雑種形性部位を標識化合物を検出することにより直接染色体上に検出する方法である。非放射性化合物として、例えば蛍光化合物を好適に用いることができる。プローブを蛍光化合物により標識した場合、プローブと染色体ＤＮＡとの分子雑種形性部位は該蛍光化合物の蛍光を測定することにより検出できる。蛍光化合物以外の非放射性化合物として、ビオチンを例示できる。ビオチンを標識化合物として用いる場合は、ビオチン化デオキシウリジン三リン酸（ビオチン−ｄＵＴＰ）またはビオチン化デオキシアデノシン三リン酸（ビオチン−ｄＡＴＰ）でプローブを標識する。この場合、プローブと染色体ＤＮＡとの分子雑種形性部位は、ビオチンに親和性の高いアビジンを蛍光化合物で標識して、ビオチン−ｄＵＴＰまたはビオチン−ｄＡＴＰに結合させ、該蛍光化合物を測定することにより検出できる。非放射性化合物としてその他、ジゴキシゲニンを例示できる。ジゴキシゲニンを標識化合物として用いる場合は、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ）またはジゴキシゲニン標識デオキシアデノシン三リン酸（ジゴキシゲニン−ｄＡＴＰ）でプローブを標識する。標識は、ニックトランスレーション法、ランダムプライムラベリング法またはＰＣＲラベリング法等の公知の標識方法により実施できる。プローブと染色体ＤＮＡとの分子雑種形性部位は、蛍光標識した抗ジゴキシゲニン抗体により、または抗ジゴキシゲニン抗体と該抗体を認識する蛍光標識二次抗体により検出することができる。蛍光化合物として、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、テキサスレッドＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ，米国）、４´，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、Ｃｙ３およびＣｙ５等を例示できるが、これらに限定されない。
【００４７】
ＦＩＳＨ解析法は、中期または前中期染色体を標的にする検出方法であるのみならず、インターフェイスＦＩＳＨとして間期核を標的として検出可能であることが知られている。インターフェイスＦＩＳＨ解析法は、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中の細胞の増殖が認められない場合や増殖程度が低い場合等でも適用できるため、有用である。インターフェイスＦＩＳＨ解析法は、他のＦＩＳＨ解析法と同様の手法により実施できる。
【００４８】
ＴＦＬ遺伝子の欠失の検出は、具体的には例えば、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１領域ＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブを被検試料中の染色体に、該プローブを該ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下で接触させ、ついで該ＤＮＡへの該プローブのハイブリダイゼーションシグナルを検出することにより実施できる。被検試料において、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が観察されたときに、該被検試料はがん由来の試料であると判定できる。
【００４９】
ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１（６ｑ２５．１）領域ＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブとして、ＰＡＣクローンプローブＲＰ１−２８１Ｈ８を例示できる。ＲＰ１−２８１Ｈ８は、ヒト第６染色体長腕ｑ２５．１−２５．３上のＤＮＡにハイブリダイゼーションする。ＲＰ１−２８１Ｈ８は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＬ０３１１３３．１［ｇｉ：３６７６１８９］として登録されており、例えばオークランドチルドレンズ  ホスピタル（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）やＲＺＰＤ  ジャーマン  リソース  センター  フォー  ゲノム  リサーチから入手できる。
【００５０】
６ｑ２５．１領域ＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブとして、その他、配列番号１または配列番号３に示す塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補的ＤＮＡを例示できる。
【００５１】
被検試料は、細胞、組織、および細胞を含む試料が例示できる。例えば、悪性リンパ腫の検出に有用な被検試料としてリンパ球、リンパ節生検試料、リンパ節標本および血液等が例示できる。肺がんの検出に有用な被検試料として、気管支標本、肺生検試料および喀痰試料が例示できる。気管支標本の例には、気管支分泌物、洗浄液、洗浄、吸引および擦過が包含される。リンパ節生検試料や肺およびその他全身の組織の生検試料は、外科手術や針による穿刺等の採取方法により得ることができる。
【００５２】
ＦＩＳＨ解析法においては、被検試料から細胞を当業者に周知である技術を用いて調製して用いる。例えば、細胞は、リンパ節生検試料から公知の方法で採取し、遠心分離により沈殿させて細胞ペレットにし、次いで適当なバッファーに再けん濁することにより調製することができる。バッファーとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を好ましく例示できる。また、細胞ペレットを得るために細胞けん濁液を遠心分離した後、細胞を例えば酸アルコール溶液、酸アセトン溶液、あるいはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒドで固定することができる。固定剤として中性緩衝ホルマリン溶液も用いることができる。固定した細胞を用いるときには、固定剤の大部分を遠心分離等により除去し、バッファーにけん濁して用いる。調製した細胞または固定した細胞は、該細胞を含有するけん濁液をスライド上に滴下することにより、スライド上に展開させて用いることができる。このとき、細胞がスライド上で重なり合わないように細胞けん濁液をスライドに展開する。
【００５３】
インサイチューハイブリダイゼーションの前に、染色体プローブおよび細胞内に含まれる染色体ＤＮＡを各々変性させる。また、細胞内に含まれる染色体ＤＮＡを検出する場合は、細胞にプロテアーゼ消化による予備処理を施すこともできる。染色体プローブが一本鎖核酸として調製される場合、プローブの変性は必要とされない。変性は、典型的には、高いｐＨ、熱（例えば約７０℃〜約９５℃の温度）、ホルムアミドおよびテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物のような有機溶媒、またはその組み合わせの存在下でインキュベーションすることにより行う。染色体ＤＮＡの変性は、例えば、７０℃より上の温度（例えば約７３℃）と７０％のホルムアミドおよび２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含有する変性バッファーとの組み合わせにより行うことができるできる。染色体プローブの変性は、例えば、約７３℃で約５分間加熱することにより行うことができる。
【００５４】
プローブと染色体ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、染色体プローブおよび細胞内に含まれる染色体ＤＮＡの変性に用いた化学物質または条件を取り除いた後に、ハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下で実施する。「ハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件」は、プローブと標的染色体ＤＮＡ間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さおよび長さ、並びにインキュベーションの塩濃度、温度および長さにより異なる。例えば、インサイチューハイブリダイゼーションは、一般的に、１−２×ＳＳＣ、５０％−５５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション促進剤（例えば１０％硫酸デキストラン）、および非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するためのブロッキングＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファーにおいて行う。一般に、上記のようなハイブリダイゼーション条件は、約２５℃〜約５５℃の温度で約０．５時間〜約９６時間のインキュベーションにて実施される。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、約３２℃〜約４５℃で約２時間〜約１６時間にて実施される。
【００５５】
標的領域の他のＤＮＡへの染色体プローブの非特異的結合は、一連の洗浄により排除できる。各洗浄における温度および塩濃度は、所望のストリンジェンシーにより決まる。例えば、高いストリンジェンシー条件では、０．２−２×ＳＳＣ、および約０．１％〜約１％のノニデットＰ−４０（ＮＰ４０）のような非イオン性界面活性剤を用いて、約６５℃〜約８０℃で洗浄を実施できる。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を下げることによりまたは洗浄の塩濃度を上げることにより低くすることができる。
【００５６】
プローブの染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーションシグナルを測定することにより行う。ハイブリダイゼーションシグナルとは、プローブと染色体ＤＮＡとがハイブリダイゼーションしたことを示す指標を意味し、プローブにあらかじめ標識された化合物により測定することができる。ＦＩＳＨ解析法では上記したように、ハイブリダイゼーションシグナルは一般的に蛍光シグナルとして測定される。蛍光シグナルの測定方法は当業者にはよく知られており、用いる蛍光の種類に応じて公知の技術を選択し実施できる。
【００５７】
プローブの染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションシグナルの測定結果により、細胞内の標的染色体領域ＤＮＡの欠失、本発明においては６ｑ２５領域ＤＮＡの欠失を評価する。染色体は対をなしているため、正常細胞では１つの標的染色体ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションシグナルは２つ観察される。一方、対をなす染色体の一方で標的染色体ＤＮＡが欠失している場合、観察されるハイブリダイゼーションシグナルは１つとなり、染色体の両方で標的染色体ＤＮＡが欠失している場合、ハイブリダイゼーションシグナルは観察されない。したがって、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が観察されたときに、６ｑ２５領域ＤＮＡが欠失していると判定できる。
【００５８】
６ｑ２５領域には本発明に係るがん抑制遺伝子が存在するため、本領域の欠失はがんの発生、増悪・進展および形質転換に関連すると考えられる。したがって、６ｑ２５領域ＤＮＡが欠失していると判定された染色体を含む被検試料はがん由来の試料であると判定できる。具体的には、被検試料において、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数（２つ）未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が正常試料と比較して多いときに、該被検試料はがん由来の試料であると判定できる。判定は、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数（２つ）未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が認められる細胞の、評価した全細胞に対する割合を指標にして行うことができる。評価する細胞数を多くすれば検出の感度が上昇するため、評価する細胞数を多くすることにより評価基準を低く設定することができる。ハイブリダイゼーションシグナルの測定は、一般的に、複数個の細胞、例えば約１００個以上、好ましくは約２００個以上、より好ましくは約３００個以上、さらに好ましくは約４００個以上、さらにより好ましくは約５００個以上の細胞において評価する。評価した細胞の約１５％以上、好ましくは約１０％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは約３％以上、さらにより好ましくは約２％以上の細胞において、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数（２つ）未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が観察されたときに、６ｑ２５領域ＤＮＡが欠失していると判定できる。評価基準の設定は、複数個の正常細胞における染色体のハイブリダイゼーションシグナルを測定し、正常染色体で観察されるハイブリダイゼーションシグナルの数（２つ）未満のハイブリダイゼーションシグナルを示す染色体が観察される細胞の割合を算出してその値を評価基準として用いることにより行うことができる。
【００５９】
このように、本発明においては、６ｑ２５領域ＤＮＡの欠失を検出するＦＩＳＨ解析法を確立し、さらに６ｑ２５領域ＤＮＡの欠失を検出することを特徴とするがん検出方法を提供する。第６染色体長腕（６ｑ）の欠失は、リンパ腫、肺がん、乳がんおよび卵巣がん等の腫瘍の発症において重要な役割を果たすと推定されている（非特許文献４−６）。また、ＴＦＬタンパク質のホモログＺＣ３Ｈ１２Ｄが散発性肺がんに関連することがそのヘテロ接合性の消失により示された（ワングら（Ｗａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００７年、第６７巻、ｐ．９３−９９）。したがって、本発明に係るがん検出方法はＴＦＬ遺伝子の欠失に関連する悪性腫瘍、例えば悪性リンパ腫、散発性肺がん等の肺がん、乳がんおよび卵巣がんの診断に極めて有用である。
【００６０】
本発明に係るがん検出方法における６ｑ２５領域ＤＮＡの欠失の検出は、ＦＩＳＨ解析法以外にサザンブロット法によっても実施できる。サザンブロット法は、染色体を制限酵素で切断して断片化し、アガロースゲルで電気泳動してアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡとした後、ゲルをニトロセルロース膜に吸着させ、次いで標的遺伝子に結合するＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを用いて該１本鎖ＤＮＡとプローブとの２本鎖を形成させ、形成された分子雑種を検出する方法である。プローブとして、配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるＤＮＡを好ましく例示できる。本方法により、標的遺伝子の有無を検出するできる。プローブとして、蛍光化合物や放射性同位体で標識されたものを用い、標識化合物を検出することにより、分子雑種を検出できる。サザンブロット法は、当業者によく知られており、公知の技術により実施できる。
【００６１】
ＴＦＬ遺伝子の欠失の検出はその他、ＴＦＬ  ｍＲＮＡ発現やＴＦＬタンパク質発現を測定することにより実施できる。ＴＦＬ  ｍＲＮＡ発現の測定は、プローブを用いたＲＮＡブロット解析により実施できる。プローブとして配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるＤＮＡを好ましく例示できる。ＴＦＬタンパク質発現の測定は、特異抗体を用いたウエスタンブロット解析や組織の免疫染色により実施できる。また、フローサイトメトリー法で細胞レベルでの発現を調べることも可能である。ＲＮＡブロット解析、ウエスタンブロット解析、組織の免疫染色、フローサイトメトリー法による解析手法はいずれも当業者にはよく知られており、公知の技術により実施できる。
【００６２】
ＴＦＬタンパク質に対する特異抗体は、該タンパク質を抗原として用いて作製できる。抗原は、ＴＦＬタンパク質またはその断片でもよい。ＴＦＬタンパク質に特異的な抗体を作成するためには、該タンパク質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。本発明に係る抗体はＴＦＬタンパク質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。ＴＦＬタンパク質を特異的に認識するとは、例えば該タンパク質に結合するが、該タンパク質以外のタンパク質は結合しないか、弱く結合することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
【００６３】
抗体の生産方法は、当業者にはよく知られており、自体公知の抗体作製法により実施できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体を取得できる。担体やアジュバントは、周知のものから適宜選択して用いることができる。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収法として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から採取した抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）と、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）とを融合させて作製したハイブリドーマを用いて生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成し、次いでクローン化する。クローン化した数々のハイブリドーマから、本発明に係るタンパク質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
【００６５】
ＴＦＬタンパク質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該タンパク質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。
【００６６】
ＴＦＬ遺伝子を含むＤＮＡ、例えば、（ｉ）配列表の配列番号１若しくは配列番号３に示す塩基配列、または該塩基配列の相補的塩基配列で表されるＤＮＡ、（ｉｉ）上記（ｉ）記載のＤＮＡと７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、および（ｉｉｉ）上記（ｉ）記載のＤＮＡの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの変異を有するＤＮＡ、上記ＤＮＡから選択されるＤＮＡによりコードされるタンパク質、例えば配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列で表されるタンパク質、該タンパク質を認識する抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として用いることができる。
【００６７】
その他、本発明に係るＤＮＡを含有する組換えベクターや、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体も本発明において提供でき、これらは試薬等として用いることができる。組換えベクターは、本発明に係るＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより取得できる。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、当業者によく知られたベクターＤＮＡから適宜選択して用いることができ、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれを用いることもできる。本発明に係るＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質の製造に有用である。ベクターＤＮＡに本発明に係るＤＮＡを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ＤＮＡを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、本発明に係るＤＮＡに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。形質転換体は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる。本発明に係るＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質の製造に有用である。宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、自体公知の手段を応用して実施できる。例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。
【００６８】
本発明に係るＤＮＡ、タンパク質、抗体、組換えベクター、形質転換体等を試薬として用いる場合、これらのうちの少なくとも１種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各物質の性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係るがん検出に用いることができる。該試薬はその他、本発明に係るＤＮＡまたはタンパク質の異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。
【００６９】
本発明はさらに、本発明に係るＤＮＡ、タンパク質、抗体、組換えベクター、形質転換体のうち１つまたは２つ以上を含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本発明に係るＤＮＡやタンパク質を検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。本試薬キットは、本発明に係るがん検出方法に用いることができる。さらに、本試薬キットは、本発明に係るがん検出方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして用いることができ、また、本発明に係るがん検出方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして用いることができる。
【００７０】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、この実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００７１】
悪性リンパ腫患者で認められるｔ（２；６）の切断点をクローニングするために、まず悪性リンパ腫患者であってｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２３）が認められる患者のリンパ節から抽出したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。
【００７２】
ゲノムＤＮＡは、既報記載の方法（非特許文献３）でリンパ節から抽出した。サザンブロット分析は以下のように実施した。ＤＮＡプローブとして、ＩＧＫ遺伝子の接合領域（Ｊκ ）を含む１．８ｋｂのゲノム断片または定常領域（Ｃκ）を含む３２３ｂｐ断片由来のＤＮＡプローブを、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて合成した。
【００７３】
フォワードプライマー：５´−ＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴ−３´（配列番号５）
リバースプライマー：５´−ＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡ−３´（配列番号６）
【００７４】
その結果、Ｊκプローブでは再構成バンドは検出されなかったが、Ｃκプローブでは生殖系列（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）のバンドに加えてその他に２つのバンドが検出された（図１-Ａ）。
【００７５】
次いで、悪性リンパ腫患者由来のリンパ節より抽出したゲノムＤＮＡを用いて、転座切断点のクローニングを下記のように実施した。
【００７６】
悪性リンパ腫患者由来のリンパ節より抽出したゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで完全に消化して、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。再構成バンドに相当する７ｋｂと１２ｋｂとの間の分画を回収した。抽出したＤＮＡをＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）にライゲーションし、ゲノムライブラリーを構築した。Ｃκプローブを用いてプラークハイブリダイゼーション法により上記ゲノムライブラリーをスクリーニングした。クローンニングしたＤＮＡの配列決定はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）により実施した。
【００７７】
その結果、７個のクローンが単離された（図１-Ｂ）。ヌクレオチド配列決定により５個のクローンは同一であることが判明した。すなわち、３つの別個のクローンが得られた（図２-Ａ）。
【００７８】
クローンＩは、第２染色体上の正常に再構成されたＩＧＫ遺伝子を含む７．６ｋｂ断片であった。クローンＩＩは、部分的に欠失したクローンＩと６ｑ２５由来の８６５ｂｐ断片とからなる６．７ｋｂ断片であった。すなわち、このクローンはＩＧＫ遺伝子の転座切断点を含んでいた。このように、真の切断点は６ｑ２３でなく６ｑ２５に位置していた。８６５ｂｐ断片のヌクレオチド配列は６ｑ２５に位置するＴＦＬ遺伝子の第２イントロンの一部であった。ＴＦＬ遺伝子は、ヒトゲノムデータベースでＺＣ３Ｈ１２Ｄと称されるものである。ＩＧＫ遺伝子の切断点は、Ｖκ１−３３とＶκ３−３４との間に位置していた。ＴＦＬ遺伝子はＩＧＫ遺伝子とｄｅｒ（６）ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２５）により「ヘッド−トゥー−ヘッド」の形で融合していた。両遺伝子間には１つのヌクレオチド（Ｔ）が挿入されていることが判明した（図２-Ｂ）。クローンＩＩＩは、一部分が欠失したクローンＩＩと５ｑ３４の二重特異性ホスファターゼ  １（ＤＵＳＰ１）由来の１９４６ｂｐ断片とからなる５．３ｋｂ断片であった。
【００７９】
上記結果から、悪性リンパ腫患者で認められるｔ（２；６）の切断点は、第２染色体では２ｐ１２のＩＧＫ遺伝子のＶκ１−３３とＶκ３−３４との間に、また第６染色体では６ｑ２５に位置していることが明らかになった。
【実施例２】
【００８０】
インターフェイスＦＩＳＨ解析により、悪性リンパ腫患者由来のリンパ節試料について、ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２５）の検出を実施した。
【００８１】
解析用プローブは、ＰＡＣプローブであるクローンＲＰ１−２８１Ｈ８（オークランドチルドレンズ  ホスピタルより入手、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。ＦＩＳＨ解析プロトコルは、既報記載の方法（チビレッティら（Ｔｉｂｉｌｅｔｔｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９６年、第５６巻、ｐ．４４９３−４４９８）に若干の変更を加えて用いた。
【００８２】
具体的には、間期細胞を乗せたスライドをプロテアーゼ消化による予備処理に付し、そしてホルムアルデヒド固定した後に変性処理した。プローブをニックトランスレーションキット（Ｒｏｃｈｅ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてビオチン化１６−ｄＵＴＰで標識し、そしてｃｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｖｙｓｉｓ社、ＩＬ、ＵＳＡ）と混合した後、上記スライド上の試料とハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションしたプローブの検出は、Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００８３】
少なくとも１００個の細胞を各試料について調べた。単一シグナルを示す細胞数が１０％以上の場合を、欠失の同定のカットオフポイントに設定した。
【００８４】
その結果、悪性リンパ腫患者由来のリンパ節試料において測定した細胞の総数の３０％が単一シグナルを示した（図３の右図）。これに対し、正常コントロールでは、一方のみ陽性の細胞が常に１０％以下であった（図３の左図）。
【００８５】
このように、ＦＩＳＨ解析により、悪性リンパ腫患者由来のリンパ節試料におけるＴＦＬ遺伝子欠失の検出に成功した。悪性リンパ腫患者におけるＴＦＬ遺伝子欠失はＧバンド分析では検出されていない。
【実施例３】
【００８６】
ＴＦＬ  ｃＤＮＡのクローニングを実施した。正常ヒトリンパ節からｍＲＮＡを常法に従って抽出し、該ｍＲＮＡを対象として下記プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００８７】
５´−ＡＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣ（配列番号７）
３´−ＴＴＡＧＧＧＣＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣＣ（配列番号８）
３´−ＣＴＡＧＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＣＧＣＧＧ（配列番号９）
【００８８】
その結果、２つの別個のｃＤＮＡ、ＴＦＬｐ５８およびＴＦＬｐ４１を単離した。
【００８９】
得られたｃＤＮＡを、ｐＱＢＩ２５（タカラ、日本）を基にした哺乳動物発現プラスミドに常法に従ってクローン化した。該プラスミドとして、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグを有するもの、またはこれらタグを有さないものを用いた。次いで、各プラスミドをＢａＦ３細胞に一過性にトランスフェクションし、該細胞におけるｃＤＮＡの発現を抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を用いてイムノブロット分析で検出した。
【００９０】
３´非翻訳領域（ＵＴＲ）を特定するために、上記プライマー（配列番号７）と下記プライマーとを用いて上記同様にｃＤＮＡを増幅した。
【００９１】
３´−ＡＣＴＣＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号１０）
【００９２】
その結果、３´非翻訳領域（ＵＴＲ）がさらに長いＴＦＬｐ５８ｃＤＮＡを単離した。
【００９３】
さらに、ＴＦＬ遺伝子のスプライスバリアントを同定するために、上記ｃＤＮＡ断片を用いてヒト白血球ラージインサートｃＤＮＡライブラリ（クロンテック、ＣＡ、米国）をスクリーニングした。
【００９４】
その結果、さらに２つのサイズの異なるｃＤＮＡを単離した。単離したすべてのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、少なくとも２つのスプライスバリアントとしてＴＦＬｐ５８およびＴＦＬｐ４１ｃＤＮＡの塩基配列（それぞれ配列番号１および配列番号３）を確定した。
【実施例４】
【００９５】
ＴＦＬ遺伝子によりコードされるタンパク質を認識する抗体を作成した（オペロン  バイオテクノロジーズ、東京、日本）。
【００９６】
抗原として、実施例３で単離したｃＤＮＡクローンのうちＴＦＬｐ４１によりコードされる全長タンパク質（アミノ酸１−３２１：ただしアミノ酸１−２９８はＴＦＬｐ５８と共通の配列である）並びにＴＦＬｐ５８およびＴＦＬｐ４１に共通のＮ末端断片（アミノ酸１−８８）をいずれもＮ末端グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグと融合させて用いた。
【００９７】
具体的には、ＴＦＬｐ４１タンパク質のオープンリーディングフレームを含むプラスミドおよびＴＦＬｐ４１タンパク質のＮ末端断片をコードする領域を含むプラスミドのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、それぞれｐＧＥＸ２ＴＬベクターの同じ部位に挿入した。ＧＳＴタグ融合タンパク質をＢＬ２１形質転換細胞中で発現させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。４ｍｇのＧＳＴタグ融合タンパク質を含むゲルを用いて雌ウサギ２匹に２週間間隔で６回注射した。最後の注射から７日後にウサギから採血し、遠心処理により血清を採取した。ＴＦＬｐ４１全長タンパク質に対する抗血清はさらにヒトＴＦＬｐ４１タンパク質を用いてアフィニティー精製した。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明に係るがん検出方法、特に悪性リンパ腫の検出方法は、医薬分野に著しく寄与するものである。また、本発明において見出された悪性リンパ腫におけるｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２５）は、リンパ腫細胞の増殖および／または生存を調節する極めて重大な役割を担うと考えられ、ゆえに悪性リンパ腫およびがんを惹き起こす多種多様な工程を解明する研究や、抗がん医薬の開発にも寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１−Ａ】ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２３）を有する悪性リンパ腫患者由来のリンパ節から抽出したゲノムＤＮＡについてＩＧＫ遺伝子のサザンブロット分析を行った結果を示す図である。Ｊκプローブを用いたハイブリダイゼーションでは生殖系列のバンドのみが認められたが、Ｃκプローブを用いたハイブリダイゼーションで生殖系列のバンド（矢頭）に加えて２本の再構成バンド（矢印）が認められた。図中、Ｐａｔｉｅｎｔはリンパ腫患者を指し、Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌは健常人を指す。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩはそれぞれ、ゲノムＤＮＡ試料を各制限酵素で処理したことを示す。
【図１−Ｂ】ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２５）により形成されたキメラ遺伝子のクローニングの結果を示す図である。３種の異なったクローン、ｃｌｏｎｅ＃１、ｃｌｏｎｅ＃２およびｃｌｏｎｅ＃３が、Ｃκプローブを用いたゲノムライブラリーのスクリーニングにより単離された。それぞれの抽出されたプラスミドはＢａｍＨＩで消化した。矢印はベクターのバンドを示す。
【図２−Ａ】ＴＦＬキメラ遺伝子の構造を示す模式図である。上段から、第２染色体上の生殖系列ＩＧＫ遺伝子（Ｉｇκ  ｇｅｎｅ）の制限地図、クローンＩ（Ｃｌｏｎｅ  Ｉ）：第２染色体上の再構成されたＩＧＫ遺伝子、クローンＩＩ（Ｃｌｏｎｅ  ＩＩ）：ｄｅｒ（６）ｔ（２；６）（ｐ１２；ｑ２５）によるＩＧＫとＴＦＬとのキメラ遺伝子、クローンＩＩＩ（Ｃｌｏｎｅ  ＩＩＩ）：第６染色体上のＴＧＫ、ＴＦＬおよびＤＵＳＰ１キメラ遺伝子、および第６染色体上のＴＦＬ遺伝子を示す。ＩＧＫ遺伝子に付した下線はサザンブロット分析に用いたプローブの位置を示す。水平の白矢印はＺＣ３Ｈ１２ＤまたはＩＧＫの転写の方向を示し、そして垂直の黒矢印は切断点接合部を示す。ＩＧＫ、ＴＦＬおよびＤＵＳＰ１に関するゲノムはそれぞれ黒、白および灰色の横太線で示す。ＩＧＫおよびＴＦＬの読み取り枠は黒枠および線影枠で示し、ＴＦＬの非コード領域は白枠で示す。
【図２−Ｂ】切断点を包含するヌクレオチド配列および該配列と第２染色体（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２）および第６染色体（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ６）の関連生殖系列相対配列とを並列して示す図である。切断点接合部の塩基配列を示す解析クロマトグラムを示す。
【図３】間期核ＦＩＳＨ解析により、悪性リンパ腫患者由来のリンパ節細胞におけるＴＦＬ遺伝子欠失を検出した結果を示す図である。左図（Ａ）は、正常コントロール試料を示しており、９０％以上の核について二重陽性シグナルが認められた。右図（Ｂ）は、悪性リンパ腫患者のリンパ腫細胞試料を示しており、単一陽性細胞（白矢印）数が３０％以上に達した。本症例では染色体異常ｔ（２；５）が同定されていたが、６ｑ欠失はＧバンド分析では同定されていなかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１：（１５８）．．（１５８）Ｃ／Ｔ多型部位であり、それにより配列番号２に示すアミノ酸配列の第５３番目においてプロリンからロイシンへの置換を生じる。
配列番号１：（４０４）．．（４０４）Ｃ／Ｔ多型部位であり、それにより配列番号２に示すアミノ酸配列の第１３５番目においてセリンからフェニルアラニンへの置換を生じる。
配列番号１：（４１８）．．（４１８）Ｃ／Ｔ多型部位であり、それにより配列番号２に示すアミノ酸配列の第１４０番目においてプロリンからセリンへの置換を生じる。
配列番号１：（１）．．（３０５）エキソン１
配列番号１：（３０６）．．（４４４）エキソン２
配列番号１：（４４５）．．（６８０）エキソン３
配列番号１：（６８１）．．（７８７）エキソン４
配列番号１：（７８８）．．（１５８４）エキソン５ａ
配列番号３：（１５８）．．（１５８）Ｔ／Ｃ多型部位であり、それにより配列番号４に示すアミノ酸配列の第５３番目においてロイシンからプロリンへの置換を生じる。
配列番号３：（４０４）．．（４０４）Ｔ／Ｃ多型部位であり、それにより配列番号４に示すアミノ酸配列の第１３５番目においてフェニルアラニンからセリンへの置換を生じる。
配列番号３：（４１８）．．（４１８）Ｔ／Ｃ多型部位であり、それにより配列番号４に示すアミノ酸配列の第１４０番目においてセリンからプロリンへの置換を生じる。
配列番号３：（１）．．（３０５）エキソン１
配列番号３：（３０６）．．（４４４）エキソン２
配列番号３：（４４５）．．（６８０）エキソン３
配列番号３：（６８１）．．（７８７）エキソン４
配列番号３：（７８８）．．（８８６）エキソン５ｂ
配列番号３：（８８７）．．（９１１）エキソン６
配列番号３：（９１２）．．（９６３）エキソン７
配列番号５：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
配列番号６：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
配列番号７：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
配列番号８：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
配列番号９：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
配列番号１０：プライマー用に設計されたポリヌクレオチド
【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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