(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された組換え哺乳動物ウリカーゼを含む組成物であって、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態で存在し、該ウリカーゼの１０％未満が非四量体の凝集体形態であり、該ウリカーゼはキメラである、組成物。
【請求項２】
前記キメラウリカーゼは、ブタ肝臓ウリカーゼ配列の一部およびヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の一部を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キメラウリカーゼはブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
単離された組換え哺乳動物ウリカーゼを含む組成物であって、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態で存在し、該ウリカーゼは配列番号１のアミノ酸配列における２９１位のアルギニン残基がリジンで置換され（Ｒ２９１Ｋ）、３０１位のスレオニン残基がセリンで置換されている（Ｔ３０１Ｓ）組換えブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）である、組成物。
【請求項５】
単離された組換え哺乳動物ウリカーゼを含む組成物であって、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態で存在し、該ウリカーゼは、配列番号２のアミノ酸配列における９７位のチロシン残基がヒスチジンで置換されている（Ｙ９７Ｈ）ヒヒ肝臓ウリカーゼの配列を有する、組成物。
【請求項６】
前記ウリカーゼはアミノ末端およびカルボキシル末端を含み、前記ウリカーゼは一方の末端または両方の末端が短縮されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
非結合体ウリカーゼと比較して、尿酸分解活性を保持し、かつ、インビボ半減期が延長した尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）の結合体を含む組成物であって、該結合体は、ポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）に結合した精製組換え哺乳動物ウリカーゼを含み、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態であり、該ＰＥＧは約１０ｋＤａと約６０ｋＤａとの間の平均分子量を有する、組成物。
【請求項８】
前記ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ、ウシ肝臓ウリカーゼ、またはヒツジ肝臓ウリカーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ウリカーゼはキメラウリカーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ、ウシ肝臓ウリカーゼ、ヒツジ肝臓ウリカーゼ、またはヒヒ肝臓ウリカーゼのアミノ酸配列を実質的に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
非結合体ウリカーゼと比較して、尿酸分解活性を保持し、かつ、インビボ半減期が延長した尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）の結合体を含む組成物であって、該結合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した精製組換えウリカーゼを含み、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態であり、該ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ配列、ウシ肝臓ウリカーゼ配列、ヒツジ肝臓ウリカーゼ配列、またはヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の少なくとも一部を含み、該ＰＥＧは約１０ｋＤａと約６０ｋＤａとの間の平均分子量を有する、組成物。
【請求項１２】
前記ウリカーゼは、ブタ肝臓ウリカーゼ配列の一部およびヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の一部を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウリカーゼはブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウリカーゼは、配列番号１のアミノ酸配列における２９１位のアルギニン残基がリジンで置換され（Ｒ２９１Ｋ）、３０１位のスレオニン残基がセリンで置換されている（Ｔ３０１Ｓ）ブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ウリカーゼは、配列番号２のアミノ酸配列における９７位のチロシン残基がヒスチジンで置換されている（Ｙ９７Ｈ）ヒヒ肝臓ウリカーゼの配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ウリカーゼはアミノ末端およびカルボキシル末端を含み、前記ウリカーゼは一方の末端または両方の末端が短縮されている、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウリカーゼは、アミノ末端から少なくとも最初の６個のアミノ酸が欠失することにより、アミノ末端が短縮されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＰＥＧは約１０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＥＧは約２０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＰＥＧは約３０ｋＤａの平均分子量を有する、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＰＥＧの平均共有結合鎖数が、ウリカーゼサブユニットあたり２〜１０鎖である、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧの平均共有結合鎖数が、ウリカーゼサブユニットあたり３〜８鎖である、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＰＥＧの平均共有結合鎖数が、ウリカーゼサブユニットあたり４〜６鎖である、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＰＥＧの鎖は、ウレタン結合、第二級アミン結合、およびアミド結合からなる群から選択される結合を介してウリカーゼと共有結合している、請求項７〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＰＥＧは直鎖である、請求項７〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＰＥＧは分岐している、請求項７〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ウリカーゼの９５％より多くが四量体形態で存在する、請求項７〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
体液または組織における尿酸レベルを低下させるための薬学的組成物であって、該組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した精製組換えウリカーゼおよび薬学的に受容可能なキャリアを含み、該ウリカーゼの９０％より多くが四量体形態であり、該ウリカーゼはブタ肝臓ウリカーゼ配列、ウシ肝臓ウリカーゼ配列、ヒツジ肝臓ウリカーゼ配列、またはヒヒ肝臓ウリカーゼ配列の少なくとも一部を含み、該ＰＥＧは約１０ｋＤａと約６０ｋＤａとの間の平均分子量を有する、薬学的組成物。
【請求項２９】
前記組成物は凍結乾燥によって安定化され、再構成の際、迅速に溶解して非経口投与に適切な溶液が得られる、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の循環寿命を延長し、かつタンパク質の免疫原性を減少させるタンパク質の化学修飾に関する。より詳細には、本発明は、尿酸分解活性を失うことなく尿酸酸化酵素の免疫原性を実質的に排除する、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）と尿酸酸化酵素との結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
[政府権利の記載] 本出願中に記載された研究の一部は、国立衛生研究所の助成金ＤＫ４
８５２９の支援を用いて行われた。従って、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
[発明の背景] この背景の節に含まれる記載は、先行技術の承認から構成されていない代
わりに、本発明が行われた際の先行技術の記載に対する本発明者ら自身の主観的なコメントおよび解釈を反映する。これらの解釈は、個人的な以前に開示されていない本発明に関する洞察を含み得るが、洞察自体が先行技術の一部ではない。
【０００４】
尿酸酸化酵素（ウリカーゼ、Ｅ．Ｃ．１．７．３．３）は、尿酸のより可溶な生成物で、より容易に排泄されるプリン代謝産物であるアラントインへの酸化を触媒する酵素である。ヒトは、高等な霊長類の進化過程で必要なウリカーゼ遺伝子のいくつかの変異の結果として酵素活性ウリカーゼを産生しない（非特許文献１）。結果として、感受性を示す個体では、血液（高尿酸血症）および尿（高尿酸尿症）における過剰濃度の尿酸により、有痛性の関節炎（痛風）、外観を損なう尿酸蓄積物（痛風結節）、および腎不全を発症し得る。何人かの罹患個体では、アロプリノール（尿酸合成のインヒビター）などの利用可能な薬物は、治療を制限する副作用を示すか、これらの病状を適切に軽減しない（非特許文献２）。ウリカーゼ注射により、少なくとも一時的に高尿酸血症および高尿酸尿症を軽減することができる。しかし、ウリカーゼはヒトにおいて外来タンパク質であるので、アスペルギルス フラバス由来の非修飾タンパク質の最初の注射でさえ治療患者の数％でアナフ
ィラキシー反応（非特許文献３）および長期にわたる治療または断続的な治療の有用性を制限する免疫原性反応を誘導している（非特許文献４）。
【０００５】
高尿酸血症に一部適切に利用可能な治療は、数十年間、認識されている（非特許文献５）。同様に、重篤な痛風を罹患した患者の一定の群が注射可能なウリカーゼの安全で有効な形態から利益を得ることができる可能性が長年認識されている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。動物の器官由来のウリカーゼは、安全な注射による投与に適合する溶媒にほぼ不溶である（特許文献１）。植物または微生物由来の一定のウリカーゼは、医学的に受容可能な溶媒により可溶である。しかし、微生物酵素の注射によって、生命に危険を及ぼすようなアレルギー反応またはウリカーゼの不活化および／または循環からのクリアランスの促進を引き起こし得る免疫学的応答を即座に誘導する（非特許文献１４）。ブタおよびヒヒを含む哺乳動物または昆虫（例えば、ドロソフィラ メラノガスターまた
はドロソフィラ シュードオブスキュラなど（非特許文献１５）由来のウリカーゼの推定
アミノ酸配列に基づく酵素は、生理学的ｐＨでの免疫原性および不溶性に問題があり臨床用の適切な候補ではなかった。
【０００６】
ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（両方ともＰＥＧと呼ばれる）とタンパク質の共有結合による修飾を使用してタンパク質の半減期を延長し、免疫原性を減少させている（特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１６）。循環寿
命が延長し、そして／または免疫原性が増大する一方で機能的活性が保護されている結合体を作製するための高分子量のＰＥＧとのカップリングは、別の酵素であるスーパーオキシドジムスターゼ（非特許文献１７、特許文献５、特許文献６）および他の型のタンパク質、例えば、サイトカイン（非特許文献１８、非特許文献１９）については以前に示されていた。ウリカーゼのＰＥＧ以外のポリマーとの結合体も記載されている（特許文献７）。
【０００７】
ほぼ全ての報告されたＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅ）ウリカーゼ（すなわち、ＰＥＧとウリカーゼとの共有結合）は、最初にＰＥＧをアミノ末端残基および利用可能なリシン残基を含むアミノ基に結合させることを意図した。一般的に使用されるウリカーゼでは、それぞれの４つの同一のサブユニット中のリシンの総数は、２５（アスペルギルス フラバス
（特許文献８））と２９（ブタ（非特許文献２０））との間である。リシンのいくつかは、酵素の天然の形態においてＰＥＧ化に利用できない。ウリカーゼの免疫原性の減少に最も一般的なアプローチは、低分子量のＰＥＧの多数の鎖に結合させることであった。これにより、得られた結合体の酵素活性が常に大きく減少している。
【０００８】
以前、研究者は、ウリカーゼ注射を用いてｉｎ ｖｉｖｏでの尿酸のアラントインへの変
換を触媒させていた（非特許文献３）。これは、フランスおよびイタリアでの、真菌アスペルギルス フラバス由来のウリカーゼ（Ｕｎｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））を使用して血
液学的悪性腫瘍の細胞傷害性治療に関連する高尿酸血症を予防または一時的に正常にし、痛風患者の重篤な高尿酸血症を一時的に軽減することを基礎としている（非特許文献２２、非特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５）。その循環寿命が短いために、Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名）は、毎日注射する必要がある。さらに、その免疫原性のために長期治療にあまり適さない。
【０００９】
５ｋＤａ ＰＥＧにカップリングしたキャンディダ ユティリス ウリカーゼ調製物の一回
の静脈内注射により、５人のヒト被験体での血清尿酸塩（平均注射前血清尿酸塩濃度は６．２ｍｇ／ｇＬであり、これは正常範囲内である）が検出不可能なレベルまで減少した（非特許文献９）。４週間後、被験体にさらに注射を行ったが、その反応については報告されなかった。第２の（および最後の）注射後、比較的感度の低いゲル内拡散アッセイではウリカーゼに対する抗体は検出されなかった。この引例は、ヒト患者または実験動物の慢性または亜慢性治療の結果を報告していなかった。
【００１０】
５ｋＤａ ＰＥＧに結合させたアースロバクター プロトフォーミア（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｆｏｒｍｉａｅ）由来のウリカーゼ調製物を使用して、注射前の血清
尿酸塩濃度が１５ｍｇ／ｄＬである１人のリンパ腫患者で高尿酸血症が一時的に調節された（非特許文献１２）。患者が危篤状態でかつ治療の継続時間が短かった（１４日間に４回の注射）ので、結合体の長期の効果または安全性を評価することができなかった。
【００１１】
本出願では、用語「免疫原性」は、ＰＥＧ修飾または非修飾ウリカーゼの調製物（抗原）の注射組成物による免疫応答の誘導をいい、「抗原性」は、抗原と前から存在する抗体との反応をいう。集合的に、抗原性および免疫原性を、「免疫反応性」という。ＰＥＧ−ウリカーゼの以前の研究では、免疫反応性を、１）ＰＥＧ−ウリカーゼと予め形成した抗体とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの反応、２）誘導された抗体合成の測定、および３）反復注射後
のクリアランスの促進速度を含む種々の方法で評価した。
【００１２】
種々のリンカーを介したＰＥＧの様々な数の鎖のカップリングによっていくつかの供給源由来のウリカーゼの免疫原性を排除するという以前の試みは、一部成功している。ＰＥＧ−ウリカーゼは、最初、ＦＦ ＤａｖｉｓならびにＹ． Ｉｎａｄａおよび同僚によって開示された（非特許文献６、特許文献１１、非特許文献７、特許文献１２、特許文献１３）
。特許文献１１で開示された結合体は、不特定の供給源のウリカーゼと２，０００倍モル過剰の７５０ダルトンのＰＥＧとの反応によって合成され、これは、多数のポリマー分子が各ウリカーゼサブユニットに付着しているらしいということを示した。'３３７特許は
、種々のポリペプチドホルモンおよび酸化還元酵素を含む酵素、ウリカーゼは、３つの例のうちの１つの活性で水溶性の、非免疫原性の結合体を得るための５００〜２０，０００ダルトンの、好ましくは５００〜５，０００ダルトンの分子量のＰＥＧまたはポリ（プロピレングリコール）のいずれかとのカップリングを開示している。さらに、'３３７特許
は、酵素分子あたり１０〜１００のポリマー鎖のカップリングおよび酵素活性の少なくとも４０％の保持を強調している。ウリカーゼの利用可能なアミノ基へのＰＥＧのカップリング範囲、残基特異性尿酸分解活性、または結合体の免疫反応性の試験結果は報告していなかった。
【００１３】
ウリカーゼのＰＥＧ化に関する１３報の引例からのデータを表１にまとめる。これらの結果のうちのいくつかも、図１Ａ〜図２Ｂにグラフで示した。これらの刊行物のうち７報は、キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼへの種々の鎖数のＰＥＧとのカップリング
によってｉｎ ｖｉｔｒｏで測定された尿酸分解活性の有意な減少が記載されている。ブ
タ肝臓ウリカーゼへの多数の鎖の５ｋＤａ ＰＥＧのカップリングは、同一のグループに
よるＣｈｅｎの刊行物およびシンポジウムの報告の両方に記載の結果と類似であった（非特許文献１１、非特許文献６）。
【００１４】
表１にまとめた研究のうち７報でＰＥＧ化によるウリカーゼの免疫反応性の減少および５報で消失が報告されていた。後者の５報の研究のうち３報では、免疫反応性の消失（多くとも初期活性の１５％、２８％、または４５％）は、尿酸分解活性の顕著な減少に関連していた（非特許文献７（１５％活性）； 非特許文献１１（２８％活性）； 非特許文献８（４５％活性）。４番目の報告では、ＰＥＧは、６１％の利用可能なリシン残基にカップリングされたと報告されているが、残基の比活性は記載されていなかった（非特許文献１０）。しかし、２人の同一の科学者を含み同一の方法を使用した研究チームは、このカップリングの範囲が２３％〜２８％しか活性を残していないことを他で報告していた。非特許文献１１、非特許文献１０は、ウリカーゼの免疫原性を実質的に減少させるために、ＰＥＧを利用可能なリシン残基の約６０％にカップリングさせるべきであることを示す（表１）。ウリカーゼの免疫原性が消失したと報告した５番目の刊行物は、ＰＥＧカップリングの範囲、残存尿酸分解活性、またはＰＥＧ−タンパク質結合の性質を開示していない（非特許文献２３）。
【００１５】
ＰＥＧとウリカーゼ中のリシン残基のより小さな画分との結合は減少したが、実験動物における免疫反応性は消失しなかった（非特許文献２４：カップリングしたアミノ基の２８％〜４５％、非特許文献２５：カップリングしたアミノ基の３８％）。対応する付加物の残存尿酸活性は、最初の値の＜３３％（非特許文献２４）〜６０％（非特許文献２５）の範囲であった。非特許文献２４では、５ｋＤａ ＰＥＧに加えて７．５ｋＤａおよび１０
ｋＤａのＰＥＧを用いてＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を合成した。得られた全ての結合体は、いくらか免疫原性および抗原性を示し、酵素活性の顕著な減少が示された（表１、図１Ａ〜図１Ｂ）。
【００１６】
５人のヒトに各々安全に２回投与したキャンディダ ユティリス由来のウリカーゼのＰＥ
Ｇ化調製物は、最初の活性の１１％しか保持されないと報告された（非特許文献９）。数年後、アースロバクター プロトフォーミア由来のＰＥＧ修飾ウリカーゼを、進行性リン
パ腫および重篤な高尿酸血症を罹患した１人の患者に４回投与した（非特許文献１２）。その酵素調製物の残存活性が測定されていないが、非特許文献１２では、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、最初のＰＥＧ−ウリカーゼ注射から２６日後の患者の血清中に抗ウリカーゼ抗体か存在しないことを示した。
【００１７】
表１にまとめたように、ＰＥＧ化ウリカーゼの以前の研究は、触媒活性がその免疫反応性を実質的に減少させるのに十分な数のＰＥＧ鎖のカップリングよって顕著に減少することを示す。さらに、ＰＥＧ−ウリカーゼのほとんどの以前の調製物は、新規の抗原決定基を誘導し、ウサギにおける抗体の形成を誘導することが示されている塩化シアヌールであるトリアジン誘導体（２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン）で活性化したＰＥＧを用いて合成されていた（非特許文献２４）。
【００１８】
【表１】
0005291235.tif 000002
【００１９】
【表２】
0005291235.tif 000003
【００２０】
【表３】
0005291235.tif 000004
【００２１】
【表４】
0005291235.tif 000005
【００２２】
特許文献１４は、抗原性の減少および「改良された延長」作用を示す１〜１２ｋＤａの分子量のＰＥＧで誘導体化されたウリカーゼを含む修飾タンパク質ならびにこのような誘導体化ペプチドの作製法を開示している。しかし、鎖の数、酵素アッセイ、生物学的試験、
または「改良された延長」の意味についての開示はない。特許文献１２および特許文献１３は、ＰＥＧ−トリアジンまたはｂｉｓ−ＰＥＧ−トリアジン（表１でＰＥＧ2と示す）
でそれぞれ調製したウリカーゼ結合体を開示している（非特許文献７、８）。第１の型の結合体では、ＰＥＧの分子量は２ｋＤａおよび５ｋＤａであり、第２の型では、５ｋＤａのＰＥＧのみを使用した。非特許文献７は、４３％の利用可能なリシンの直鎖５ｋＤａ 
ＰＥＧでの修飾後に１５％の尿酸分解活性の回復を報告し、特許文献８は、それぞれ４６％または３６％のリシンのＰＥＧ2での修飾後に３１％または４５％の尿酸分解活性の回
復を報告した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、３４：７８〜８４
【非特許文献２】Ｈａｎｄｅ, ＫＲ． ｅｔ ａｌ．、１９８４、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．、７６：４７〜５６； Ｆａｍ， ＡＧ．、１９９０、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ'ｓ Ｃｌｉｎ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．、４：１７７〜１９２
【非特許文献３】Ｐｕｉ， Ｃ−Ｈ．ｅｔ．ａｌ．、１９９７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１１：１８１３〜１８１６
【非特許文献４】Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、１０：７１１〜７１２； Ｌｅａｕｓｔｉｃ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９８３、Ｒｅｖ． Ｒｈｕｍ． Ｍａｌ． Ｏｓｔｅｏａｒｔｉｃ．、５０：５５３〜５５４
【非特許文献５】Ｋｉｓｓｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．、１９６８、Ｎａｔｕｒｅ、２１７：７２〜７４
【非特許文献６】Ｄａｖｉｓ，ＦＦ． ｅｔ ａｌ．、１９７８、ＧＢ Ｂｒｏｕｎ，ｅｔ ａｌ．編、Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第４巻、１６９〜１７３、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献７】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．、１９７９、Ｅｎｚｙｍｅ、２４：２６１〜２６４
【非特許文献８】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ、２６：４９〜５３
【非特許文献９】Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｌａｎｃｅｔ、２（８２４１）：２８１〜２８３
【非特許文献１０】Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２１９、３５２〜３５４
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ， ＲＨ−Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９８１、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．、６６０：２９３〜２９８
【非特許文献１２】Ｃｈｕａ， ＣＣ． ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ａｎｎ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ．、１０９：１１４〜１１７
【非特許文献１３】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ＭＬ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６：２９０〜２９３
【非特許文献１４】Ｄｏｎａｄｉｏ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｌｅａｕｓｔｉｃ， ｅｔ ａｌ．、１９８３
【非特許文献１５】Ｗａｌｌｒａｔｈ， ＬＬ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：５１１４〜５１２７
【非特許文献１６】Ｓａｉｆｅｒ， ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．、３６６：３７７〜３８７
【非特許文献１７】Ｓｏｍａｃｋ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２〜１３：５３３〜５６２
【非特許文献１８】ＪＭ． Ｈａｒｒｉｓ， ｅｔ ａｌ編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０、１５５〜１６９、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＳａｉｆｅｒ， ＭＧＰ． ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｐｏｌｙｍ． Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８：５７６〜５７７
【非特許文献１９】Ｓｈｅｒｍａｎ， ＭＲ． ｅｔ ａｌ．、１９９７
【非特許文献２０】Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：９４１２〜９４１６
【非特許文献２１】Ｐｏｔａｕｘ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．、１９７５、Ｎｏｕｖ． Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄ．、４：１１０９〜１１１２
【非特許文献２２】Ｌｅｇｏｕｘ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．、１９９２、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６７：８５６５〜８５７０
【非特許文献２３】ＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０、１８２〜１９２、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ中のＶｅｒｏｎｅｓｅ， ＦＭ． ｅｔ ａｌ．、１９９７
【非特許文献２４】Ｔｓｕｊｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７：７２５〜７３０
【非特許文献２５】Ｙａｓｕｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、３８：２０５３〜２０５６
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第３，６１６，２３１号
【特許文献２】米国特許第４，１７９，３３７号
【特許文献３】米国特許第４，７６６，１０６号
【特許文献４】米国特許第４，８４７，３２５号
【特許文献５】米国特許第５，２８３，３１７号
【特許文献６】米国特許第５，４６８，４７８号
【特許文献７】米国特許第４，４６０，６８３号
【特許文献８】米国特許第５，３８２，５１８号
【特許文献９】米国特許第５，３８２，５１８号
【特許文献１０】米国特許第５，５４１，０９８号
【特許文献１１】米国特許第４，１７９，３３７号
【特許文献１２】日本国特許第５５−９９１８９号
【特許文献１３】日本国特許第６２−５５０７９号
【特許文献１４】日本国特許第３−１４８２９８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
以前の研究では、ウリカーゼの免疫原性および／または抗原性の顕著な減少がＰＥＧ化によって行われる場合、この減少は尿酸分解活性の実質的な欠失に常に関連していることを教示している。生物医薬の安全性、便利さ、費用有効性全てにとって、効能の減少、およびそれによる投薬量増加は悪影響である。従って、血液および尿を含む体液中の尿酸レベルの上昇を低下させるための安全で有効な代替手段が必要である。本発明によれば、非修飾酵素の尿酸分解活性の全てまたはほぼ全てを保持する実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼが得られる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の１つの実施形態は、非結合体ウリカーゼの尿酸分解活性の少なくとも約７５％を
保持し、免疫原性を実質的に減少させた尿酸酸化酵素（ウリカーゼ）の結合体である。この実施形態は、各サブユニットが、直鎖または分岐鎖であり、各ＰＥＧ分子が約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の分子量であり得る平均２〜１０鎖のＰＥＧが共有結合し得る精製ウリカーゼを含む。本発明のこの態様のウリカーゼは、組換え体であり得る。組換えの有無にかかわらず、ウリカーゼは哺乳動物起源であり得る。この実施形態の１つの態様では、ウリカーゼは、ブタ、ウシ、またはヒツジの肝臓のウリカーゼであり得る。この実施形態の別の態様では、ウリカーゼはキメラであり得る。キメラウリカーゼには、ブタ肝臓および／またはヒヒ肝臓ウリカーゼを含み得る。例えば、キメラウリカーゼは、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）または変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含むブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）（図６の配列および図７〜図１２の生理学的および免疫学的研究の結果を参照のこと）であり得る。あるいは、ウリカーゼは、チロシン９７がヒスチジンで置換されて、ウリカーゼの比活性が少なくとも約６０％増加し得るヒヒ肝臓ウリカーゼであり得る。本発明のウリカーゼは、起源が何であろうと、アミノ末端もしくはカルボキシル末端のいずれかまたは両末端が短縮された形態でもあり得る。同様に、ウリカーゼは、真菌または細菌ウリカーゼであり得る。この実施形態の１つの態様では、真菌または細菌ウリカーゼは、アスペルギルス フラバス、アースロバクター グロビフォルミス、またはキャンディダ ユティリス由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組
換え形態であり得る。あるいは、ウリカーゼは、無脊椎動物ウリカーゼ、例えば、ドロソフィラ メラノガスターまたはドロソフィラ シュードオブスキュラ由来のウリカーゼの天然に存在する形態または組換え形態であり得る。本発明のウリカーゼはまた、植物ウリカーゼ、例えば、ダイズ根粒グリシン マックス由来のウリカーゼの天然に存在する形態ま
たは組換え形態であり得る。ＰＥＧは、約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の平均分子量であり、好ましくは、ＰＥＧは、約１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間の平均分子量であり、より好ましくは、ＰＥＧは、約２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間の平均分子量、例えば、３０ｋＤａであり得る。共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブユニットあたり２〜１０鎖であり、好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブユニットあたり３〜８鎖であり、より好ましくは、共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、ウリカーゼサブユニットあたり４〜６鎖であり得る。この実施形態の１つの態様では、ウリカーゼは、四量体であり得る。ＰＥＧ鎖を、ウレタン（カルバメート）結合、第２級アミン結合、および／またはアミド結合を介して共有結合し得る。ウリカーゼが本明細書中に記載の任意のウリカーゼの組換え形態である場合、組換え形態は、天然に存在する形態の配列を実質的に有し得る。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、上記のＰＥＧ−ウリカーゼ結合体および薬学的に受容可能なキャリアの任意を含む、体液中の尿酸レベルの低下用の薬学的組成物である。組成物を、凍結乾燥によって安定化し、再構成の際、迅速に溶解して非経口投与に適切な溶液を得ることができる。
【００２８】
本発明はまた、哺乳動物の体液および組織中の尿酸レベルの低下法を提供する。この方法は、尿酸減少有効量のＰＥＧ−ウリカーゼを哺乳動物に投与する工程を含む。前記ＰＥＧ−ウリカーゼは、薬学的に受容可能なキャリア中に各サブユニットが直鎖または分岐鎖ＰＥＧの平均２〜１０鎖に共有結合している２つまたはそれ以上のサブユニットを含む精製ウリカーゼを含み、各ＰＥＧ分子は約５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の分子量を有する。前記哺乳動物はヒトであり得る。投与工程は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、または腹腔内経路での注射またはエアゾール化処方であり得る。尿酸レベルの上昇は、血液、尿、および／または他の体液および組織で起こり、痛風、痛風結節、腎不全、臓器移植、および悪性疾患に関連し得る。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、複数の形態のウリカーゼを含む溶液からの四量体の単離法およびその方法による生成物である。最初、溶液は、四量体ウリカーゼおよびウリカーゼ凝集
体を含み得る。本方法は、約９と１０．５との間のｐＨ（例えば、１０．２）で少なくとも１つの分離カラムに溶液を添加する工程と、ウリカーゼ凝集体を実質的に含まない溶出液の画分を回収し、単離した四量体ウリカーゼを含み得る画分を同定する工程と、単離した四量体ウリカーゼ画分をプールする工程とを含み得る。分離カラムは、イオン交換、サイズ排除、または任意の他の有効な分離の性質に基づき得る。本方法はまた、四量体ウリカーゼの存在および／またはウリカーゼ凝集体の非存在を同定するための画分の分析を含み得る。例えば、このような分析には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、他のクロマトグラフィー法、光散乱、遠心分離、および／または電気泳動が含まれ得る。この実施形態の１つの態様では、精製四量体ウリカーゼは、約１０％未満のウリカーゼ凝集体を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのキャンディダ ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図１Ｂ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのキャンディダ ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図２Ａ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのブタ肝臓由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図２Ｂ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのブタ肝臓由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図３Ａ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのＰＥＧ化ブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図３Ｂ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのＰＥＧ化ＰＢＣウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図４Ａ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのアスペルギルス フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図４Ｂ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのアスペルギルス フラバス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図５Ａ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのＰＥＧ化組換えダイズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図５Ｂ】サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのＰＥＧ化組換えダイズ根粒ウリカーゼによる活性の保持率を示す図である。
【図６】ブタおよびヒヒの配列を比較した、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（ＰＢＣウリカーゼ）、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方を短縮したＰＢＣウリカーゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）、および変異Ｒ２９１ＫおよびＴ３０１Ｓを含むブタウリカーゼ（ＰＫＳウリカーゼ）の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図７】各々４回または５回のＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼの腹腔内注射から２４時間後の、最初の注射から２４時間後と比較したマウス血清中のウリカーゼ活性を示す図である。
【図８】ウリカーゼ欠損マウスの血清中に注射されたＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼ活性と血清および尿中の尿酸濃度との間の反比例関係を示す図である。
【図９】ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスにおける尿濃縮欠損の重篤度の減少を示す図である。
【図１０】ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスにおける腎性尿崩症の重篤度の減少を示す図である。
【図１１】ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで処理したウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスにおける、磁気共鳴顕微鏡で視覚化された、尿酸誘導性腎症の重篤度の減少を示す図である。
【図１２】四量体および八量体が共にサブユニットあたり１０ｋＤａの５〜６つのＰＥＧ鎖に結合した場合、四量体と比較した、ＰＢＣウリカーゼ八量体を注射したＢＡＬＢ／ｃマウスの循環からのクリアランスの促進を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、水溶性ポリマー（好ましくは、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド））とウリカーゼとの改良された結合体を提供する。本発明はまた、改良結合体の薬学的組成物を提供する。これらの結合体は、実質的に非免疫原性であり、非修飾酵素の尿酸分解活性の少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９５％またはそれ以上を保持する。水溶性ポリマーに適切なウリカーゼには、細菌、真菌、および植物および動物、脊椎動物および無脊椎動物の組織から単離された天然に存在する尿酸酸化酵素ならびにウリカーゼの組換え体、変異、雑種および／またはウリカーゼの短縮した酵素活性変異体が含まれる。本発明での使用に適切な水溶性ポリマーには、直鎖および分岐鎖ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）、全てＰＥＧとして公知が含まれる。分岐ＰＥＧの例は、米国特許第５，６４３，５７５号の主題である。直鎖ＰＥＧの好ましい例は、一般式ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ｎは、約１００〜約２，３００で変化する、モノメトキシＰＥＧである。
【００３２】
１つの好ましい哺乳動物ウリカーゼは、組換えブタ−ヒヒキメラウリカーゼであり、これは、ブタ肝臓およびヒヒ肝臓ウリカーゼの部分配列からなり、この両配列はＷｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９で最初に決定された。このようなキメラウリカーゼの１つの例は、最初にブタウリカーゼ配列（配列番号１）由来の２２５アミノ酸および最後にヒヒウリカーゼ配列（配列番号２）由来の７９アミノ酸を含む（ブタ−ヒヒウリカーゼ（すなわちＰＢＣウリカーゼ）、図６を参照のこと）。このようなウリカーゼの別の例は、ブタ配列（配列番号１）の残基７〜２２５およびヒヒ配列（配列番号２）の残基２２６〜３０１を含む。これは、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方が短縮されたＰＢＣウリカーゼの等価物である（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ、図６を参照のこと）。このようなキメラウリカーゼの別の例は、最初にブタ配列（配列番号１）由来の２８８アミノ酸および最後にヒヒ配列（配列番号２）由来の１６アミノ酸を含む。後者の配列は、残基２９１のアルギニンのリシン（Ｋ）への置換および残基３０１のトレオニンのセリン（Ｓ）への置換を有する２つの位置のみでブタ配列と異なるので、この変異をブタ−Ｋ−ＳまたはＰＫＳウリカーゼという。ＰＫＳ、ＰＢＣ、およびＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴウリカーゼはそれぞれ、リシン残基を一つ多く有するので、ブタまたはヒヒの配列より潜在的なＰＥＧ化部位を一つ多く含む。
【００３３】
ＰＢＣウリカーゼ、ＰＫＳウリカーゼ、および組換えヒヒ様ウリカーゼを含む種々の哺乳動物ウリカーゼのｃＤＮＡをサブクローン化し、標準的な方法を用いてエシェリヒア コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用の最適条件を同定した。Ｅｒｌｉｃｈ， ＨＡ．編、
１９８９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。組換えウリカーゼを、抽出し、精製し、それらの安
定性および活性を標準的なアッセイの改変を用いてアッセイした。Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，
Ｉ．、１９６５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２４０：２４９１〜２４９４、Ｎｉｓ
ｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９、および実施例１を参照のこと。
【００３４】
本発明の１つの実施形態では、ウリカーゼを、生物学的に安定で、無毒性の共有結合を介して、比較的少数のＰＥＧ鎖に結合させることができる。このような結合には、ウレタン（カルバメート）結合、第２級アミン結合、およびアミド結合が含まれ得る。このような結合体に適切な種々の活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕ
ｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬから市販されている。
【００３５】
例えば、ウリカーゼへのウレタン結合を、ＰＥＧのスクシニミジルカーボネート（ＳＣ）または４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）誘導体の存在下でのウリカーゼのインキュベーションによって形成させることができる。ＳＣ−ＰＥＧを、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６１２，４６０号に記載の手順を用いて合成することができる。ＮＰＣ−ＰＥＧを、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， ＦＭ．ｅｔ ａｌ．、１９８５、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１４１〜１５２および本明細書中で参考として援用される米国特許第５，２８６，６３７号に記載の方法に従って、ＰＥＧと４−ニトロフェニルクロロホルメートとの反応によって合成することができる。'６３７
の特許に記載の方法を、類似の化学量論的性質を維持するために反応物質の濃度を調節することによってより高分子量のＰＥＧに適用する。ＮＰＣ−ＰＥＧの別の合成法は、Ｂｕｔｔｎｅｒ， Ｗ，ｅｔ ａｌ．に付与された、東ドイツ特許明細書第ＤＤ２７９ ４８６
Ａ１号に記載されている。
【００３６】
ウリカーゼに対するアミド結合を、ＰＥＧのカルボン酸誘導体のＮ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｓｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を用いて得ることができる。第
２級アミン結合を、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニルＰＥＧ（トレシルＰＥＧ； Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を用いるか、ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およびシアノホウ酸水素ナトリウムを用いた還元アル
キル化によって形成することができる。
【００３７】
５ｋＤａと３０ｋＤａとの間の分子量のＰＥＧを含む結合体では、非修飾酵素の尿酸分解活性を少なくとも７５％保持しながらサブユニットあたりカップリングするＰＥＧ鎖の最大数は、ダイズウリカーゼで２鎖からＰＢＣウリカーゼで１０鎖以上の範囲であった。（実施例１のアッセイ条件および図１Ａ〜図５Ｂの結果を参照のこと）。後者のＰＥＧ化の範囲は、全アミノ基の約１／３に相当する。本発明の１つの実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりにカップリングするＰＥＧ鎖の平均数は、２と１０との間である。好ましい実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりに共有結合するＰＥＧ鎖の平均数は、３と８との間である。より好ましい実施形態では、ウリカーゼサブユニットあたりに共有結合するＰＥＧの平均の鎖数は、４と６との間である。別の実施形態では、カップリング反応に使用するＰＥＧの分子量は、５ｋＤａと１００ｋＤａとの間、好ましくは１０ｋＤａと６０ｋＤａとの間、より好ましくは２０ｋＤａと４０ｋＤａとの間、例えば、３０ｋＤａである。
【００３８】
ウリカーゼの所与の形態へのカップリング用のＰＥＧの最適な分子量および鎖の数の選択に影響を与え得るいくつかの因子が存在する。一般に、尿酸分解活性の実質的な損失を伴わない免疫原性の減少または除去には、高分子量のＰＥＧの比較的少ない鎖と比較してより低分子量のＰＥＧの比較的多い鎖のカップリングが必要であり得る。例えば、サブユニットあたり６鎖の２０ｋＤａ ＰＥＧまたはサブユニットあたり４鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧのいずれかが最も有効であり得る。同様に、ウリカーゼのそれぞれ異なる形態は、サイズおよび鎖の数の両方によって異なる至適性を有し得る。図１Ａ〜図５Ｂを参照のこと。
【００３９】
ＰＥＧ結合によって、フランスおよびイタリアのＳａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒｏｐで販売
されている真菌ウリカーゼ（Ｕｒｉｃｏｚｙｍｅ（商品名））における安定剤として使用される８−アザキサンチンなどの基質アナログまたはインヒビターを添加することなく、生理学的ｐＨの緩衝液中で全ての試験ウリカーゼを可溶で安定にする。ＰＢＣウリカーゼの２つの異なる結合体、一方は、サブユニットあたり約６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを含み
、他方は、サブユニットあたり約２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧを含むは、マウス血清中での
３７℃で１ヶ月を超えるインキュベーション後、有意な活性を保持した。さらに、本発明のいくつかの結合体は、マウスでの循環半減期が２日間を超えるのに対して、ＰＥＧ修飾
哺乳動物および細菌ウリカーゼについての以前の報告では約８時間または２４時間の半減期であった。Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｆｕｅｒｔｇｅｓ， Ｆ．ｅｔ ａｌ
．、１９９０、Ｊ． Ｃｏｎｔｒ． Ｒｅｌｅａｓｅ、１１：１３９〜１４８； Ｆｕｊｉ
ｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．、１４：６２３〜６２９。注射したタンパク質薬物の半減期が長いほど費用効果も高く、患者の服薬遵守も改善され得る。半減期の延長はまた、身体内でより耐性を示す生成物の指標である。
【００４０】
ＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体を酵素の精製四量体（３５ｋＤａの４つのサブユニット）から調製する場合、結合体は、マウスで顕著に減少した免疫原性を示し（図７）、それに対して、より大きな形態の酵素（例えば、３５ｋＤａサブユニットの八量体、図１２を参照のこと）のＰＥＧ結合体では中程度の免疫原性を示し、非修飾酵素では非常に高い免疫原性を示した。ウリカーゼ欠損マウスへの本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの反復注射により、２ヶ月以上にわたって高尿酸血症が消失し、尿酸関連損傷に対する腎臓の構造および機能を保護した（図８〜図１１）。
【００４１】
ＰＢＣウリカーゼと１０ｋＤａ ＰＥＧとの完全に活性な結合体（図３Ａ〜図３Ｂ）の注
射により、ホモ接合性のウリカーゼ欠損マウスの高尿酸血症が劇的に減少した（図８）。尿中の尿酸レベルもまた、ＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼで治療した全てのウリカーゼ欠損マウスにおいて劇的に減少した。ウリカーゼ欠損マウスに、図８でのデータを得るために使用したものと類似のＰＥＧ−ウリカーゼ調製物を用いた一連の注射を投与した。正常な条件下で１２時間の水分枯渇させた尿の重量オスモル濃度の測定（図９）および水分消費および尿の排出（図１０）によって示されるように、この治療により、未治療の遺伝的に類似したマウスでの対応する測定と比較して、尿濃縮欠損の重篤度が減少した。磁気共鳴顕微鏡で視覚化したところ、本発明のＰＥＧ−ウリカーゼを用いたホモ接合性ウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）「ノックアウト」マウスの生後１０日目から開始した１０週間の治療により、腎臓構造の尿酸塩誘導破壊の重篤度が減少したこともまた示された（図１１）。顕微鏡法については、Ｈｅｄｌｕｎｄ， ＬＷ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｆｕｎｄ. 
Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、１６：７８７〜７９７； ＪＣ Ｇｏｒｅ編、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第４巻、１８
７〜２１９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ中のＪｏｈｎｓｏｎ， Ｇ
Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９９２を参照のこと。
【００４２】
天然に存在するウリカーゼまたは組換えウリカーゼの精製調製物は、通常、四量体（１４０ｋＤａ）に加えて酵素の凝集体の混合物を含む。四量体形態である各ウリカーゼ調製物の割合は、一般に、約２０％〜９０％で変化する。いくつかの他のタンパク質の非ＰＥＧ化凝集体の免疫原性が高いにもかかわらず（例えば、Ｍｏｏｒｅ， ＷＶ，ｅｔ ａｌ．、１９８０、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．、５１：６９１〜６
９７を参照のこと）、ＰＥＧ−ウリカーゼの以前の研究は、凝集体の含有率を制限するいかなる作業も記載されていないことから、これは、ＰＥＧ修飾凝集体の潜在的な免疫原性が考慮されていないことが示唆される。本発明者らの観察に基づいて、このような凝集体はその前のＰＥＧ−ウリカーゼ合成に使用された酵素調製物に存在していたようである。凝集体の存在により、非免疫原性結合体の調製作業をより困難にしていたのかもしれない。ＰＥＧ化ウリカーゼに対する以前の試みで認められた尿酸分解活性の大部分の損失は、カップリングした多数の低分子のＰＥＧ鎖に関連するようでもある。それに対して、本明細書中に記載のウリカーゼ精製法およびＰＥＧ化法により、サブユニットあたり１０鎖ものＰＥＧの共有結合が可能となる一方で、少なくとも一定のウリカーゼ、例えば、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼおよびアスペルギルス フラバス由来の酵素の７５％を超える尿酸
分解活性が保持される（図３Ａおよび図４Ａを参照のこと）。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、酵素の実質的に全ての四量体形態の凝集体形態を、９と１０．５との間のｐＨ（好ましくは１０．２）でのイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、実質的にウリカーゼの四量体調製物を生じるＰＥＧ結合の前に、取り除くことができる。分離用カラムからの各画分中のウリカーゼの分子量を、任意のサイズ依存分析、例えば、ＨＰＬＣ、従来のサイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離、光散乱、キャピラリー電気泳動、または非変性緩衝液でのゲル電気泳動を含む、によってモニターすることができる。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、１４０ｋＤａの形態の酵素のみを含む画分をプールしてＰＥＧへの結合に使用した。イオン交換クロマトグラフィーを用いて単離した四量体ウリカーゼについて、検出可能な凝集体を含まない実質的な四量体の量を含むイオン交換カラム由来の画分を、サイズについて分析して決定することができる。従って、プールしたウリカーゼの少なくとも９０％が四量体形態であり得る。従って、所望でない凝集体は、全単離ウリカーゼの約１０％、５％、２％、またはそれ以下の少なさであり得る。
【００４４】
本明細書中で示した結果は、広範囲にＰＥＧ化された場合でさえ、四量体を超えるＰＢＣウリカーゼの形態は、マウスにおいて免疫原性が高いことを示す（図１２）。さらに、ウリカーゼ凝集体のＰＥＧで１回注射されたマウスでは、ＰＥＧ化四量体またはＰＥＧ化凝集体のいずれかのその後の注射における尿酸分解活性は、循環から迅速に取り除かれた。それに対して、感度の高い酵素免疫抗体法で測定したところ、５％未満の凝集体を含むウリカーゼから調製した結合体を、そのクリアランス速度の促進（図７）および検出可能な抗体形成を起こさず再度多くの回数を再注射することができた。高度に精製した四量体ウリカーゼの使用により、本発明の改良結合体と以前に記載されたＰＥＧ−ウリカーゼ調製物とをさらに区別する。それに対して、以前の何人かの研究者によって使用されたウリカーゼ調製物中の凝集体の有意な比率（例えば、＞１０％）の存在により、免疫原性を抑制するための試みで多数のＰＥＧ鎖をカップリングすることができた。従って、得られた結合体の酵素活性は、実質的に減少した。他の実施形態では、本発明は、このような結合体ウリカーゼの調製物がその尿酸分解活性の少なくとも７５％を保持し、実質的に非免疫原性である限り、非四量体形態、例えば、ウリカーゼ二量体、におけるＰＥＧ化ウリカーゼが明白に意図される。
【００４５】
本発明の別の実施形態によれば、非変異酵素のものと比較して予想外に潜在性が増加した変異ヒヒ肝臓ウリカーゼが得られる。この改良霊長類ウリカーゼを、従来の組換えＤＮＡ技術によって調製した。ヒヒウリカーゼにおける１つのアミノ酸残基の置換（９７位のトリプシンからヒスチジンへの置換）によって比活性が実質的に増加したことが特に予想外であった。エシェリヒア コリで発現させた場合、変異タンパク質は誘導した組換えヒヒ
酵素より少なくとも６０％高い比活性を有することが見出された。
【００４６】
別の実施形態では、アミノ末端での最初の少なくとも６アミノ酸および／またはカルボキシル末端の最後の少なくとも３アミノ酸が発現タンパク質から欠失している短縮変異体ブタまたはブタ−ヒヒキメラウリカーゼの発現によって、比活性が増加し、そして／または非ＰＥＧ化酵素の溶解性が改良される（図６を参照のこと）。カルボキシル末端短縮した組換えウリカーゼは、ペルオキシソーム標的配列の除去により、ＰＥＧ化の前に溶解性を改良し得る。Ｍｉｕｒａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、２２３：１４１〜１４６を参照のこと。
【００４７】
本発明のＰＥＧ−ウリカーゼ結合体は、哺乳動物、好ましくはヒトの体液および組織中の尿酸レベルの低下に有用であるので、痛風、痛風結節、腎不全、臓器移植、および悪性疾患を含む病状に関連する尿酸レベルの上昇の治療に有用であり得る。ＰＥＧ−ウリカーゼ結合体を、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、および腹腔内経路の多数の経路のいずれかによって過剰な尿酸レベルの哺乳動物に注射することができる。あるいは、結合体を、エアゾ
ール化および吸入させることができる。Ｐａｔｔｏｎ， ＪＳ．、１９９６、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１９：３〜３６および米国特許第５，４５８，１３５号を参照のこと。本発明のＰＥＧ−ウリカーゼの有効用量は、尿酸レベルおよび個体のサイズに依存する。本発明のこの態様の１つの実施形態では、ＰＥＧ−ウリカーゼを、約１０μｇ〜約１ｇの範囲の量で薬学的に受容可能な補形薬または希釈剤と共に投与する。好ましい実施形態では、投薬量は、約１００μｇと５００ｍｇとの間である。より好ましくは、結合体ウリカーゼを、約１ｍｇと１００ｍｇとの間の量、例えば、５ｍｇ、２０ｍｇ、または５０ｍｇで投与する。実施形態の投薬量を投与した質量を、結合体中のタンパク質量という。
【００４８】
ＰＥＧ−ウリカーゼを含む薬学的処方物を、Ｇｅｎｎａｒｏ， ＡＲ，編、１９９０、Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｅ
ａｓｔｏｎ，ＰＡ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．などに記載の従来技術によって調製することができる。注射可能な溶液の調製物用の適切な補形薬には、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、乳酸化リンガー溶液、水、ポリオール、およびグリセロールが含まれる。非経口注射用の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な滅菌水溶性または非水溶性液体、分散剤、懸濁剤、または乳化剤、ならびに使用直前の滅菌注射溶液または分散剤への再構成用の滅菌粉末を含む。これらの処方物は、更なる成分（例えば、防腐剤、可溶化剤、安定剤、潤滑剤、乳化剤、緩衝液、抗酸化剤、および希釈剤など）を含み得る。
【００４９】
ＰＥＧ−ウリカーゼを、体液中の尿酸レベルの上昇を継続的に調節するための個体への移植用の放出調節組成物として供給することもできる。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、再生コラーゲン、ポリ−Ｌ−リシン、アルギン酸ナトリウム、ゲル化ガム、キトサン、アガロース、多重層リポソーム、および他の多数の従来の蓄積処方物は、生物活性組成物とともに処方することができる生侵食性および生分解性物質を含む。これらの物質は、移植または注射された場合、段階的に崩壊し、周辺組織に活性物質を放出する。例えば、ＰＥＧ−ウリカーゼのカプセル化の方法の１つは、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，６５３，９７４号に開示の方法を含む。生侵食性で生分解性の他の蓄積処方物の使用が本発明で明白に意図される。ＰＥＧ−ウリカーゼの送達用の注入ポンプおよび基質包括システムもまた、本発明の範囲内である。ＰＥＧ−ウリカーゼはまた、ミセルまたはリポソームに有利に封入され得る。リポソームカプセル化技術は、当該分野で周知である。例えば、Ｌａｓｉｃ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．編、１９９５、Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００５０】
本発明のＰＥＧ−ウリカーゼ薬学的組成物により、例えば、臓器移植レシピエントの尿酸塩誘導性腎不全の危険性の高い患者（Ｖｅｎｋａｔａｓｅｓｈａｎ， ＶＳ． ｅｔ ａｌ
．、１９９０、Ｎｅｐｈｒｏｎ．、５６：３１７〜３２１を参照のこと）およびいくつかの悪性疾患患者における血液透析の必要性が減少する。結晶尿酸塩を大量に蓄積した患者（痛風結節）では、このような組成物は、現在利用可能な治療より、迅速に生活の質を改善する。
【００５１】
以下の実施例は、上記で開示の種々の態様を例示するものであって、本発明を決して限定するものではない。これらの実施例は、いくつかのサイズおよび組成の活性化（すなわち、電気親和性）ＰＥＧ誘導体と、天然に存在するブタ、真菌、もしくは細菌のウリカーゼまたは組換えのダイズ、ブタ、またはブタ−ヒヒキメラウリカーゼとのカップリングによって調製されるＰＥＧ−ウリカーゼを記載する。活性、溶解性、安定性、薬学的動力学、薬物動態学、および免疫学的研究の結果を含む。図８〜図１１のデータにより、高尿酸血症および高尿酸尿症を治療し抗尿酸血症および抗尿酸尿症が発症して重篤な腎損傷を引き起こす動物モデルにおける腎臓の構造および機能を保護する本発明のＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼの能力が証明される。Ｗｕ， Ｘ． ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：７４２〜７４６。これらの実施例は、非修飾酵素の尿酸分解活性を少なくとも約７５％保持するウリカーゼの実質的に非免疫原性な結合体の作製のための当業者へのガイダンスを提供する。
【実施例】
【００５２】
［実施例１］
ウリカーゼの四量体形態の精製 ウリカーゼの四量体形態（分子量約１４０ｋＤａ）を、
分離用のサイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィー、その後の分析用サイズ排除クロマトグラフィーでブタ肝臓ウリカーゼ溶液から精製した。ブタ肝臓ウリカーゼは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ２３５０もしくはＵ３３７７またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、
ＩＮから得た。
【００５３】
分離用および分析用サイズ排除クロマトグラフィーを、ｐＨ１０〜１０．５（好ましくは１０．２）で、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中で、公知の分
子量のタンパク質で予め較正しているＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムで行った。Ｓｕｐ
ｅｒｄｅｘを、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪか
ら得た。所望のｐＨを維持し、後のＰＥＧカップリングに使用される化学的性質に適合可能な任意の緩衝液を使用することができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。分離カラム由来の溶出液のＵＶ吸収を、２８０ｎｍでモニターし、所望の四量体の分子量に対応するがより高い分子量種を含まない溶出液のウリカーゼ含有部分を、実施例２に記載の実質的に非免疫原性ＰＥＧ−ウリカーゼの合成に使用するために回収した。あるいは、ウリカーゼの四量体形態を、他のサイズ排除媒体、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ性溶液に適合し、適
切なサイズ分画範囲を有する任意の他の媒体を使用して単離することができる。このような媒体は、容易に利用可能であり、当該分野で周知である。
【００５４】
イオン交換クロマトグラフィーを、ｐＨ１０〜１０．５、好ましくは１０．２で、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で行った。ＰＥＧカップリングの化学的性質に適合し、所望のｐＨを維持することができる任意の緩衝液を十分に低いイオン強度で使用して、ウリカーゼをカラムに吸着させることができる。このような緩衝液は、当該分野で周知である。溶出液のＵＶ吸収を、注いだ緩衝液のイオン強度の増加、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液中の０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配によってイオン交換樹脂からウリ
カーゼが溶出している間、２８０ｎｍでモニターした。次いで、サイズ排除ＨＰＬＣを使用して、実質的に非免疫原性のＰＥＧ−ウリカーゼの合成用の、検出可能な凝集体を含まない、所望のウリカーゼの四量体を含む溶出液の画分を同定した。あるいは、ウリカーゼの四量体形態を、他のイオン交換体、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）など、または弱アルカリ性溶液に適合する任意の他の媒体を使用して単離することができる。このような媒体は容易に利用可能であり、当該分野で周知である。
【００５５】
ウリカーゼ活性を、標準的な方法の改変を用いてアッセイした。例えば、Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ、 １９６５； Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９を参照のこと。尿酸溶液を、毎日新たに調製した５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２中に調製して６〜１５０μＭの最終アッセイ濃度にした。ウリカーゼ調製物を、アッセイにおけるアルブミンの最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ａ−７０３０）を含むこのホウ酸緩衝液中で希釈した。酵素の種々の希釈物とマイクロプレートリーダー中のマイクロタイタープレートのウェル中の基質との混合後、２５℃での尿酸の消失速度を、３分間に４秒毎を２９２ｎｍで監視した。１０％と４０％との間の基質が３分以内に消費されるサンプル
から、少なくとも２０データポイントを使用して、１分間あたりの吸光度の最大減少速度を計算した。ウリカーゼ活性の１国際単位（ＩＵ）を、１分間に１μモルの尿酸を消費した酵素量と定義する。比活性を、ＩＵ／ｍｇタンパク質と示す。図１Ａ〜図５Ｂの相対的なウリカーゼ活性のデータのいくつかを、アッセイにおいて１００μＭの尿酸を使用して得た。１００μＭの尿酸での速度（Ｖ100）についての他の結果を、各酵素調製物につい
てのミカエリス定数（ＫM）および最大速度（Ｖmax）から、以下の式を用いて計算した。
【００５６】
【数１】
0005291235.tif 000006
【００５７】
[実施例２] 四量体ブタウリカーゼへのＰＥＧカップリング ０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．２中の四量体ウリカーゼ溶液に、１０〜２００モルの種々のサイズ（５ｋＤａ〜３０ｋＤａ）の活性化モノメトキシＰＥＧ誘導体、例えば、４−ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ−ＰＥＧ）を、各モルのウリカーゼサブユニット（分子量３５ｋＤａ）に添加した。これらまたは他の適切な活性化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒから購入可能である。これらのＰＥＧのタンパク質へのカップリングの指示は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｕｍｅｒｓのカタログ、インターネットｗｗｗ．ｓｗｐｏ
ｌｙｍｅｒｓ．ｃｏｍ、およびＪＭ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．編、１９９７、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８０、Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで得られる。カップリング反応を、ＰＥＧカップリングの範囲を経時的に顕著に変化するまで０〜８℃で進行させても差し支えなかった。次いで、未処理ＰＥＧを、クロマトグラフィーおよび／または限外濾過によって反応生成物から取り除いた。
【００５８】
ウリカーゼのサブユニットあたりにカップリングしたＰＥＧ鎖の数を、Ｋｕｎｉｔａｎｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５８８：１２５〜１３
７；Ｓａｉｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．、１９９７、およびＳｈｅｒｍａｎ， ｅｔ ａｌ．、１
９９７に記載の方法の適用によって同定した。簡単に述べれば、分離用イオン交換またはサイズ排除カラムからのＰＥＧ化反応混合物または画分の部分を、０．１Ｍ ＮａＣｌを
含む１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０．２中、室温でＴＳＫ ５，０００ｐＷXL
カラムによる分析用サイズ排除ＨＰＬＣによって特徴づけた。ＨＰＬＣカラムを、ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡから得た。タンパク質およびＰＥＧを、紫外線吸収および屈折率検出器によって監視した。結合体中のタンパク質量を、適切な非修飾ウリカーゼ標準と比較した紫外線吸光度から計算した。次いで、結合体中のＰＥＧの量を、屈折率に対するタンパク質の寄与として回収した屈折率の領域から、適切なＰＥＧ標準の屈折率ピークの領域と比較して計算した。
【００５９】
図２Ａは、サブユニットあたりの結合したＰＥＧ鎖の数の関数としてのブタ肝臓由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等のデータ（黒三角、□）をＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１のデータと比較する。大きな円内のデータポイントは、Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１による非免疫反応性であると報告されている結合体を示す。図２Ａに示すように、サブユニットあたり６鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧまたはサブ
ユニットあたり７鎖までの５ｋＤａ ＰＥＧを有する四量体ブタウリカーゼ結合体は、非
修飾酵素活性の少なくとも７５％を保持した。５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧの鎖数
（サブユニットあたり約４鎖まで）の増大に伴う非活性の明白な増加により、結合体と比較して非修飾酵素の相対的不溶性または不安定性に影響を与え得る。図２Ｂに示すように、サブユニットあたり平均３鎖を超える３０ｋDaＰＥＧとブタウリカーゼ結合体は、Ｃｈ
ｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって免疫反応性を阻害するのに十分であると見出されている量よりも多いＰＥＧを含む。
【００６０】
[実施例３] 四量体組換えＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体の性質 組換えブタ−ヒヒキメラ（ＰＢＣ）ウリカーゼｃＤＮＡを、ｐＥＴ３ｄ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化し、得られたプラスミド構築物を、エシェリヒア コ
リ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、発現させた。こ
れらの手順を、分子生物学分野で周知の方法を用いて行った。Ｅｒｌｉｃｈ、１９８９；
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．、１９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．編
、１９９７、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓを参照のこと。
【００６１】
図６は、ブタ（配列番号１）およびヒヒ（配列番号２）配列と比較した、ＰＢＣウリカーゼ（配列番号１のアミノ酸１〜２２５および配列番号２のアミノ酸２２６〜３０４）の推定アミノ酸配列を示す。ブタ配列の残基と異なるヒヒ配列の残基を太字で示す。ブタおよびヒヒの配列は、Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．、１９８９によって最初に同定され、本発明で確認した。配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋ配列において最初のメチオニン残基が存在しない以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｐ１６１６４と同一である。配列番号２は、ＧｅｎＢａｎｋ配列の最初のメチオニン残基が存在せず、残基１５３でヒスチジンがトレオニンに変更されている（図６の残基１５４）以外は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ｐ２５６８９と同一である。
【００６２】
ＰＢＣウリカーゼの四量体形態を、実施例１および実施例２に記載のように単離して種々の分子量のＰＥＧにカップリングした。５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１９ｋＤａ、３０ｋＤａ
ＰＥＧで調製した結合体は、サブユニットあたり１０鎖までのＰＥＧを含んでいた。少
なくとも１０ｋＤａのＰＥＧで調製した結合体は、組換えウリカーゼの最初の比活性の９５％以上を保持した（図３Ａ〜図３Ｂ）。
【００６３】
サブユニットあたり約６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを有する四量体ＰＢＣウリカーゼの結合
体の以下の性質を図に示す：免疫原性の欠如（図７）および１）高尿酸血症および高尿酸尿症の治療（図８）、。２）尿濃縮欠損（図９）の重篤度の減少、および３）腎性尿崩症（図１０）の重篤度の減少におけるウリカーゼ欠損マウスの効率。さらに、このＰＥＧ−ウリカーゼにより、磁気共鳴顕微鏡（図１１）で視覚化したところ、尿酸関連腎障害の重篤度が減少した。
【００６４】
図７は、最初の注射から２４時間後の値と比較した、ＰＥＧ−ウリカーゼの４〜５回の腹腔内注射から各２４時間後のマウス血清におけるＰＢＣウリカーゼ活性を示す。ＰＥＧ結合体を、ＰＥＧ活性化の２つの異なる技術を用いてＰＢＣウリカーゼの３つの異なる調製物から調製した。１つの調製物（●）を、ウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスで試験し、他の２つ（△、■）を正常なＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した。最も免疫反応性のある調製物（△）は、ＰＥＧのスクシニミジルカーボネート誘導体（ＳＣ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平均７鎖の５ｋＤａ ＰＥＧにカップリングした未知量のウリカー
ゼ凝集体を含む精製ＰＢＣウリカーゼから調製した。本明細書中で参考として援用されるＺａｌｉｐｓｋｙに付与された米国特許第５，６１２，４６０号。中程度の免疫反応性のある調製物（■）は、ＰＥＧの４−ニトロフェニルカーボネート誘導体（ＮＰＣ−ＰＥＧ）を用いて、サブユニットあたり平均２鎖の１９ｋＤａ ＰＥＧに対して１１％の凝集体
を含むＰＢＣウリカーゼ調製物のカップリングによって調製した。Ｓｈｅｒｍａｎ，ｅｔ
ａｌ．、１９９７。最も低い免疫反応結合体（●）を、５％未満の凝集ウリカーゼを含
むｐＢＣウリカーゼ調製物へのサブユニットあたり平均６鎖の１０ｋＤａ ＮＰＣ−ＰＥ
Ｇのカップリングによって調製した。
【００６５】
図８は、血清および尿中の尿酸濃度とウリカーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスの血清中の注射されたＰＥＧ−ウリカーゼの活性との間の反比例関係を示す。注射から０時間および７２時間で、酵素サブユニットあたり平均６鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧに結合したＰＢＣウ
リカーゼが０．４３ＩＵ含まれていた。
【００６６】
図９は、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により、尿濃縮欠損の重篤度が減少したことを示す。正常なマウスウリカーゼ遺伝子（ｕｏｘ＋／−）の１コピーを含む２匹のマウス、６匹の未処理ホモ接合性ウリカーゼ欠損マウス（ｕｏｘ−／−）、および３日目と７２日目との間に９５ｍＩＵまたは１９０ｍＩＵのＰＥＧ−ウリカーゼを１０回注射した６匹のホモ接合性ウリカーゼ欠損マウスについて尿重量オスモル濃度データの平均および標準偏差を示す。各遺伝的背景のマウスの尿の回収前に、水を任意に摂取する（黒塗りのバー）か、１２時間水を枯渇させた。
【００６７】
図１０は、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により、異常に高い水の消費および異常に高い尿の排出によって特徴づけられる腎性尿崩症の重篤度が減少したことを示す。マウスの遺伝的背景および処理プロトコールは図９と同一である。毎日の水の消費（黒塗りのバー）および尿排出（斜線のバー）の平均および標準偏差を、６匹のマウスの３群として示す。
【００６８】
図１１は、磁気共鳴顕微鏡で視覚化したところ、ウリカーゼ欠損マウスのＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼでの治療により、尿酸誘導性腎症の重篤度が減少したことを示す。３群のマウスの遺伝的背景および処理プロトコールは図９および図１０と同一であった。磁気共鳴顕微鏡法を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｄｕｋｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒ
ｏｌｉｎａで行った。
【００６９】
図８〜図１１にまとめた結果に加えて、全てのウリカーゼ欠損マウスの尿中の尿酸レベルがＰＥＧ修飾ＰＢＣウリカーゼ治療後に劇的に減少したことを示した。最後に、図１２は、ＰＢＣウリカーゼの異なるＰＥＧ修飾形態である、八量体形態（分子量＝２８０ｋＤａ）では、広範にＰＥＧ化した場合でさえマウスで免疫原性を示すことを示す。この特性は、一回の腹膜内注射から５日以内にＰＥＧ修飾八量体のクリアランスの促進に反映されている。同一のマウスに、同用量の同一のＰＥＧ−ウリカーゼ調製物を８日目及び１５日目に再注射した。第２および第３の注射から２４時間後、尿酸分解活性はＰＥＧ化八量体を注射したマウスの血清において検出不可能であったが、ＰＥＧ化四量体注射のマウスの血清では容易に検出された。第１の注射後に認められたＰＥＧ化八量体のクリアランス促進（図１２）と組み合わせたこれらの所見から、酵素のＰＥＧ化前に四量体より大きなウリカーゼ形態の全てを取り除くことの有用性が支持される。
【００７０】
[実施例４] キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 キャンディダ ユティリス由来のウリカーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｕ１８７８）またはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ、カタログ番号ＵＲＹＷ）のいずれかから得た。実施例１および実施例２に記載のように、四量体形態を単離し、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または３０ｋＤａのＰＥＧを用いてＰＥＧ結合体を合成した（図１Ａ〜図１Ｂ）。図１Ａは、サブユニットあたりのカップリングしたＰＥＧ鎖数の関数としてのキャンディダ ユティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等のデー
タ（黒三角、●、□）を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９； Ｎｉｓｈｉ
ｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｄａｖｉｓ
， ｅｔ ａｌ．、１９８１； Ｔｓｕｊｉ， ｅｔ ａｌ．、１９８５； Ｙａｓｕｄａ， 
ｅｔ ａｌ．、１９９０、およびＦｕｊｉｔａ， ｅｔ ａｌ．、１９９１と比較する。大
きな円内のデータポイントは、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９７９もしくは１９８１によって非抗原性であり、またはＣｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．、１９８１によって非免疫反応性であると報告された結合体を示す。
【００７１】
図１Ｂは、サブユニットあたりの結合したＰＥＧの総量の関数としてのキャンディダ ユ
ティリス由来のＰＥＧ化ウリカーゼによる活性の保持率を示す。本発明者等のデータ（黒三角、●、□）を、図１Ａと同一の報告データと比較する。大きな円内のデータポイントは、図１Ａと同一の意味である。
【００７２】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、サブユニットあたり平均６鎖の５ｋＤａもしくは３０ｋＤａのＰＥＧまたは平均９鎖の１０ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体は、非修飾酵素活性
の少なくとも７５％を保持した。付着した３０ｋＤａ ＰＥＧの鎖数（サブユニットあた
り５または６鎖まで）の増加に伴う比活性の明らかな増加は、結合体と比較して非修飾酵素の相対的な不溶性または不安定性に影響を与え得る。
【００７３】
[実施例５] アスペルギルス フラバス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 アスペルギルス フラバス由来のウリカーゼを、Ｓａｎｏｆｉ Ｗｉｎｔｈｒｏｐ（Ｇｅｎｔｉｌｌｙ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。実施例２に記載のように、種々の分子量のＰＥＧとの結合体を合成した（図４Ａ〜図４Ｂ）。アスペルギルス フラバス由来の酵素とサブユニ
ットあたり平均１２鎖までの５ｋＤａ ＰＥＧまたは平均７鎖までの３０ｋＤａ ＰＥＧとのカップリングによって調製した結合体は、この真菌ウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持した。
【００７４】
[実施例６] ダイズウリカーゼのＰＥＧ結合体 ダイズ根粒由来の組換えウリカーゼ（ノジュリン３５とも呼ばれる）を調製し、Ｋａｈｎ ａｎｄ Ｔｉｐｔｏｎ（Ｋａｈｎ， Ｋ．
、ｅｔ ａｌ．、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：４７３１〜４７３８）に
記載のように精製し、Ｄｒ．Ｔｉｐｔｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＯ）から得た。実施例１および実施例２に記載のように、四量体を単離し、種々の分子量のＰＥＧで結合体を調製した（図５Ａ〜図５Ｂ）。キャンディダ ユティリス（図１Ａ）、ブタウリカーゼ（図２Ａ）、ブタ−ヒヒキメラウリカーゼ（
図３Ａ）、およびアスペルギルス フラバスからのウリカーゼ（図４Ａ）に対して、ダイ
ズ酵素は、最初の尿酸分解活性の少なくとも７５％を保持する、サブユニットあたり約２鎖の５ｋＤａまたは３０ｋＤａ ＰＥＧとのカップリングを許容した。
【００７５】
[実施例７] アースロバクター グロビフォルミス由来のウリカーゼのＰＥＧ結合体 アー
スロバクター グロビフォルミス由来のウリカーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カ
タログ番号Ｕ７１２８）から得た。日本国特許第９−１５４５８１を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のように、四量体を単離し、５ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＰＥＧ
との結合体を調製した。サブユニットあたり平均３を超える鎖の５ｋＤａ ＰＥＧを有す
る結合体は、最初の比活性の６０％未満を維持した一方、サブユニットあたり平均２鎖の３０ｋＤａ ＰＥＧを有する結合体は、最初の比活性の少なくとも８５％を維持した。
【００７６】
[実施例８] アミノ短縮ブタおよびＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、アミノ末端の最初の６つのアミノ酸を欠失させた組換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア コリに発現させ、精製する。実施例１および実
施例２に記載のように、アミノ短縮ウリカーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性結合体を作製する。
【００７７】
[実施例９] カルボキシル末端またはアミノ末端とカルボキシル末端の両末端が短縮した
ブタおよびＰＢＣウリカーゼのＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、カルボキシル末
端の最後の３つのアミノ酸を欠失させた組換えブタおよびＰＢＣウリカーゼを、標準的技術によってエシェリヒア コリに発現させ、精製する。このカルボキシ末端の欠失は、ペ
ルオキシソーム標的シグナルが取り除かれるので、非修飾酵素の溶解性が促進し得る。Ｍｉｕｒａ， ｅｔ ａｌ．、１９９４を参照のこと。実施例１および実施例２に記載のように、カルボキシ短縮ウリカーゼのＰＥＧ結合体を合成して最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性結合体を作製する。アミノ末端での６つの残基およびカルボキシ末端での３つの残基が短縮された組換えＰＢＣウリカーゼ（ＰＢＣ−ＮＴ−ＣＴ）の配列を、図６に示す。実施例１、実施例２、および実施例３に記載のように、このウリカーゼを発現させ、精製してＰＥＧ化して、最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性の結合体を作製する。
【００７８】
[実施例１０] ＰＥＧ付着部位数を増加させたブタウリカーゼ変異体のＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、ＰＥＧ付着部位の潜在的な数を１つまたは複数のアルギニン残基のリシンとの置換によって増加させた組換えブタウリカーゼを調製する。Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ， ＭＳ． ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８８：７１８５〜７１８９を参照のこと。残基２９１のアルギニンをリシンと置換し、残基３０１のトレオニンをセリンと置換したこのような変異（ＰＫＳウリカーゼ）の１つのアミノ酸配列の例を、図６に示す。実施例１および実施例２に記載のように、ＰＥＧを、このウリカーゼに結合して、組換えウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に非免疫原性の結合体を作成する。
【００７９】
[実施例１１] 組換えヒヒウリカーゼ変異のＰＥＧ結合体 実施例３に記載のように、分子生物学の標準的方法を使用して、第９７位にアミノ酸置換（チロシンのヒスチジンへの置換）を有する組換えヒヒウリカーゼを構築する（図６のヒヒ配列を参照のこと）。実施例１および実施例２に記載のように、組換えヒヒウリカーゼ変異体の四量体のＰＥＧ結合体を合成して、組換えウリカーゼの最初の比活性の少なくとも７５％を保持する実質的に免疫原性が減少した結合体を作製する。
【００８０】
[実施例１２] キャンディダ ユティリス、アスペルギルス フラバス、およびアースロバ
クター グロビフォルミス由来のＰＥＧ結合体の免疫原性 キャンディダ ユティリス、ア
スペルギルス フラバス、およびアースロバクター グロビフォルミス由来のウリカーゼを、それぞれ、実施例４、実施例５、および実施例７に記載のように得る。実施例１および実施例２に記載のように、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または３０ｋＤａのＰＥＧを用いて、ＰＥＧ結合体を合成する。これらの結合体の免疫原性は、実質的に減少または消失する。
【図１Ａ】
0005291235.tif 000007
【図１Ｂ】
0005291235.tif 000008
【図２Ａ】
0005291235.tif 000009
【図２Ｂ】
0005291235.tif 000010
【図３Ａ】
0005291235.tif 000011
【図３Ｂ】
0005291235.tif 000012
【図４Ａ】
0005291235.tif 000013
【図４Ｂ】
0005291235.tif 000014
【図５Ａ】
0005291235.tif 000015
【図５Ｂ】
0005291235.tif 000016
【図６】
0005291235.tif 000017
【図７】
0005291235.tif 000018
【図８】
0005291235.tif 000019
【図９】
0005291235.tif 000020
【図１０】
0005291235.tif 000021
【図１２】
0005291235.tif 000022
【図１１】
0005291235.tif 000023
【配列表】
0005291235000001.app