(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本として実験小動物を搭載し、前記標本の観察方向に交差する方向に移動可能なステージと、
該ステージの前記観察方向に交差する方向の位置情報を検出する位置検出器と、
前記ステージ上に搭載された標本に対して、励起光を照射する第１の光源および照明光を照射する第２の光源と、
前記観察方向に光軸が沿うように前記ステージに対向配置され、前記励起光の照射による標本からの蛍光または前記照明光の照射による前記標本からの戻り光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記蛍光または前記戻り光を結像させる結像レンズと、
該結像レンズにより結像された前記蛍光または前記戻り光の像を撮影して前記標本の蛍光画像または戻り光画像を取得する撮像装置と、
少なくとも前記戻り光画像について、前記ステージを前記観察光軸に交差する方向の複数の位置に移動させながら各位置で前記撮像装置により画像取得させる画像取得制御部と、
前記撮像装置により取得された前記蛍光画像および複数の前記戻り光画像と前記位置検出器により検出された位置情報とを対応づけて記憶する画像記憶部と、
該画像記憶部により記憶された前記蛍光画像および複数の前記戻り光画像を、これらの画像に対応づけて記憶されている位置情報に基づいて合成処理する画像処理部とを備え、
前記第１の光源が、前記励起光を、前記対物レンズを介して該対物レンズと同軸で前記標本に照射し、
前記第２の光源が、前記照明光を、前記対物レンズを介することなく、前記対物レンズの光軸に対して斜め方向から前記標本に照射する生体観察装置。
【請求項２】
前記対物レンズと前記結像レンズとの間に、開口径を変更可能な絞り装置を備える請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項３】
前記対物レンズの標本への合焦を検出する合焦検出部と、
該合焦検出部による検出結果に基づいて、前記対物レンズの焦点を標本に一致させるように、前記ステージを前記対物レンズの光軸に沿う方向に移動させるオートフォーカス装置とを備える請求項１に記載の生体観察装置。
【請求項４】
前記対物レンズと前記結像レンズとの間に、ズーム倍率を変更するズーム機構を備え、
前記画像記憶部が、前記ズーム倍率を前記蛍光画像、前記戻り光画像および位置情報に対応づけて記憶する請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項５】
フォーカス位置を変えた複数の前記蛍光画像および前記戻り光画像を取得する動作パターンを有する動作記憶部と、
フォーカスプロジェクション機能を有する画像処理部とを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項６】
前記撮像装置はＣＣＤカメラであり、該ＣＣＤカメラの撮像範囲を変更する機能を備え、更に取得した前記撮像範囲を記録する情報記録部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項７】
前記画像処理部が、記憶された画像の一部をトリミングし合成処理する機能を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項８】
前記画像処理部が、デコンボリューション機能を有する請求項１から請求項７のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項９】
前記戻り光画像は、前記照明光の照射に基づいて得られる前記標本からの反射光の明視野画像である請求項１から請求項８のいずれかに記載の生体観察装置。
【請求項１０】
前記画像処理部で合成された蛍光画像は、輝度値に合わせて色を変化させる画像処理が施されている請求項１から請求項９のいずれかに記載の生体観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、対物レンズおよび結像レンズを切り替えて、幅広い倍率を実現することで標本内の蛍光物質の分布の観察と鮮明で定量性のよい蛍光物質の画像の取得とを両立することができる観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
また、明視野画像と発光画像とをそれぞれ取得して記憶しておき、両画像を重ね合わせた画像を自動的に作成し、標本内の蛍光物質の分布を表示する撮像装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。
さらに、標本全体を納めた蛍光画像により、蛍光画像の経時的対比観察を行う観察装置が知られている（例えば、特許文献３参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３１６３６２号公報
【特許文献２】特表２００３−５３６０５２号公報
【特許文献３】米国特許第５６５０１３５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の観察装置では、蛍光物質の分布を示す画像と、鮮明で定量性のよい蛍光物質の画像とを関連づけることができないという不都合がある。
また、特許文献２の撮像装置および特許文献３の観察装置では、標本全体を撮影したマクロ像により観察するので、鮮明で定量性のよい蛍光観察を行うことができないという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本内の蛍光物質の分布を観察でき、かつ、その蛍光物質を鮮明で定量性のよい画像データとして取得することができる生体観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本として実験小動物を搭載し、前記標本の観察方向に交差する方向に移動可能なステージと、該ステージの前記観察方向に交差する方向の位置情報を検出する位置検出器と、前記ステージ上に搭載された標本に対して、励起光を照射する第１の光源および照明光を照射する第２の光源と、前記観察方向に光軸が沿うように前記ステージに対向配置され、前記励起光の照射による標本からの蛍光または前記照明光の照射による前記標本からの戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記蛍光または前記戻り光を結像させる結像レンズと、該結像レンズにより結像された前記蛍光または前記戻り光の像を撮影して前記標本の蛍光画像または戻り光画像を取得する撮像装置と、少なくとも前記戻り光画像について、前記ステージを前記観察光軸に交差する方向の複数の位置に移動させながら各位置で前記撮像装置により画像取得させる画像取得制御部と、前記撮像装置により取得された前記蛍光画像および複数の前記戻り光画像と前記位置検出器により検出された位置情報とを対応づけて記憶する画像記憶部と、該画像記憶部により記憶された前記蛍光画像および複数の前記戻り光画像を、これらの画像に対応づけて記憶されている位置情報に基づいて合成処理する画像処理部とを備え、前記第１の光源が、前記励起光を、前記対物レンズを介して該対物レンズと同軸で前記標本に照射し、前記第２の光源が、前記照明光を、前記対物レンズを介することなく、前記対物レンズの光軸に対して斜め方向から前記標本に照射する生体観察装置を提供する。
【０００７】
上記発明においては、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に、開口径を変更可能な絞り装置を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記対物レンズの標本への合焦を検出する合焦検出部と、該合焦検出部による検出結果に基づいて、前記対物レンズの焦点を標本に一致させるように、前記ステージを前記対物レンズの光軸に沿う方向に移動させるオートフォーカス装置とを備えていてもよい。
【０００８】
また、上記発明においては、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に、ズーム倍率を変更するズーム機構を備え、前記画像記憶部が、前記ズーム倍率を画像および位置情報に対応づけて記憶することとしてもよい。
【０００９】
また、上記発明においては、前記撮像素子がＣＣＤカメラであり、該ＣＣＤカメラの撮像範囲を変更する機能を備え、更に取得した撮像範囲を記録する情報記録部を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記画像処理部が、記憶された画像の一部をトリミングし合成処理する機能を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記画像処理部が、デコンボリューション機能を備えていてもよい。
【００１０】
また、上記発明においては、前記画像処理には少なくとも明視野画像と蛍光画像を重ねあわせる処理が含まれてもよい。
また、上記発明においては、前記画像処理部で合成された蛍光画像は、輝度値に合わせて色を変化させる画像処理が施されていてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、標本内の蛍光物質の分布を観察でき、かつ、その蛍光物質を鮮明で定量性のよい画像データとして取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置１について、図１〜図４を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体観察装置１は、図１に示されるように、観察装置本体２と、該観察装置を制御する制御部２１と、該制御部２１に所定の動作プログラムを供給する動作記憶部２２と、画像制御部３と、表示部４とを備えている。観察装置本体２は、実験小動物、例えば、マウスのような標本Ａを搭載するステージ５と、観察光学系６と、該観察光学系６を収容して遮光するケース７とを備えている。
【００１３】
観察光学系６は、明視野観察用の可視光を出射する可視光源８と、蛍光観察用の励起光を出射する励起光源９と、可視光源８からの可視光を標本Ａへと導く光伝達部材１０と、励起光源９からの励起光を標本Ａへと導く投光管１１と、標本Ａの合焦位置を調節するフォーカス機構１２と、観察倍率を調節するズーム光学系１３と、可視光および励起光をステージ５上の標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る可視光の反射光および蛍光を集光する対物レンズ１４と、該対物レンズ１４で集められた光の光束径を変更可能な絞り１５と、対物レンズ１４により集光された反射光および蛍光を励起光から分岐するダイクロユニット１６と、対物レンズ１４により集光されたダイクロユニット１６により分岐された反射光および蛍光を集光させて結像させる結像レンズ１７と、該結像レンズ１７によって結像された標本Ａの像を撮影する撮像装置１８とを備えている。
【００１４】
ステージ５は電動ステージであり、フォーカス機構１２は電動フォーカスである。ステージ５およびフォーカス機構１２は、制御部２１からの信号により動作する他に、外部の操作ユニット２０からの信号により任意の位置に移動することができるようになっている。
操作ユニット２０はステージ５を操作するジョイスティックとフォーカス機構１２を操作するハンドルとを備えている。
【００１５】
さらに、ステージ５は位置検出器１９を備えている。位置検出器１９により検出される位置情報は、情報記録部３ａへと送られるようになっている。また、図２に示されるように、ステージ５の上面５ａには該上面５ａとは異なる色の指示線５ｂにより観察範囲が示されている。指示線５ｂの内部には保温手段が設けられ、標本Ａを３７℃付近に保持することができるようになっている。また、指示線５ｂの短辺のやや内側には標本Ａへの麻酔や酸素ガスを送り込むためのマウスピースを保持する保持機構が備えられている。
【００１６】
ケース７は、標本Ａ付近に、ドアによって開閉され、標本Ａを出し入れするための開口部２３を有している。
ダイクロユニット１６は、励起光を反射し、蛍光および反射光を透過させるダイクロイックミラー１６ａと、該ダイクロイックミラー１６ａを挟んで、励起光源９側および結像レンズ１７側にそれぞれ配置され、特定の波長の光を選択的に透過させるバンドパスフィルタ１６ｂ，１６ｃとを備えている。ダイクロイックミラー１６ａおよびバンドパスフィルタ１６ｂ，１６ｃの特性は観察する蛍光物質の波長特性に合わせて調整されている。
【００１７】
ダイクロユニット１６は、例えば、回転ターレット機構により光軸上に挿脱可能に設けられている。特性の異なるダイクロユニット１６を複数保持し、任意に観察光学系６に挿脱することにしてもよい。さらに、励起光源９側のバンドパスフィルタ１６ｂ，１６ｃの特性を可視域全体（例えば、４００〜６００ｎｍ）とし、ダイクロイックミラー１６ａをハーフミラーとすれば、励起光源９を可視光源として利用することも可能である。
【００１８】
制御部２１は、観察装置本体２のフォーカス機構１２、ステージ５、絞り１５、ズーム光学系１３、ダイクロユニット１６の挿脱、撮像装置１８、可視光源８および励起光源９を制御することができるようになっている。これらはいずれも電気的に制御可能であり、制御部２１からの電気信号により動作させることができる。
【００１９】
画像制御部３は、撮像装置１８により取得された画像に、観察装置本体２からの情報とステージ５の位置検出器１９からの情報とを対応づける情報記録部３ａと、情報を対応づけられた画像を記憶する画像記憶部３ｂと、画像を処理する画像処理部３ｃとを備えている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る生体観察装置１の動作について、図３を参照して説明する。
開口部２３を介して標本Ａをステージ５上にセットし、ドアを閉じることによって開口部２３を閉鎖し、可視光源８により照明された標本Ａを撮像装置１８で取得するライブ画像を観察しながら、フォーカス機構１２を動作させ、ピント合わせを行う。ライブ画像を取得する際には、得られた画像は情報記録部３ａおよび画像記憶部３ｂを通過し、リアルタイムに取得画像が表示部４に表示される。
【００２１】
その際、絞り１５は、光束径を小さく制限している。ピントが合ったら動作記憶部２２に記憶されたプログラムを起動させ、それぞれが連続して隣り合う複数の明視野像を取得する。撮像装置１８で取得された画像は、情報記録部３ａに送られ、ステージ５の位置情報と観察装置本体２の情報が対応づけられて、画像記憶部３ｂに記憶される。
【００２２】
複数の画像の取得および記録が終わったら、その複数の画像は画像処理部３ｃに送られて、画像に対応づけて記憶されているステージ５の位置情報を基にして１枚の画像に合成される。合成された画像は、画像記憶部３ｂに記憶されるとともに表示部４に表示される。
【００２３】
次に、可視光源８をＯＦＦにし、励起光源９をＯＮにして蛍光像を観察する。その際、ダイクロユニット１６は観察する蛍光の特性に合わせた所望のものをセットする。また、絞り１５は最大開放とする。明視野像の観察同様、撮像装置１８で蛍光像を観察しながらピント合わせを行う。
【００２４】
ピントが合ったら、操作ユニット２０を操作しステージ５を作動させ、観察したい蛍光物質が視野の中心にくるように位置合わせする。その後、蛍光物質の大きさに合わせてズーム光学系１３を操作し、所望の倍率に設定する。標本Ａの移動、倍率の設定が行われた後は、もう一度ピント合わせを行う。
【００２５】
位置合わせ、倍率設定およびピント合わせが終わったら、撮像装置１８で蛍光画像を取得する。撮像装置１８で取得された画像は情報記録部３ａに送られ、ステージ５の位置情報と観察装置本体２の情報が対応づけられて画像記憶部３ｂに記憶されるとともに表示部４に表示される。
【００２６】
さらに、画像処理部３ｃにより、画像記憶部３ｂに記憶された複数の画像が呼び出されて重ね合わせる合成処理が行われる。画像処理部３ｃにおいて画像が重ね合わせられる際には、画像に対応づけて記憶されている位置情報および倍率情報を用いて合成が行われる。合成された画像は画像記憶部３ｂに記憶されるとともに表示部４により表示される。
【００２７】
この一連の作業は、制御部２１への開始信号入力により、ウィザード機能により導かれ、半自動的に実行される。蛍光画像は輝度値に合わせて色を変化させてレインボー表示することにしてもよい。
【００２８】
図４を用いて図３のフローチャートをさらに詳しく説明する。
図４（ａ）は図３のフローチャートのステップＳ１〜Ｓ１１の説明に使用する。
まず、標本Ａの大きさを４０×１４０ｍｍと仮定すると、観察の視野範囲は４５×６０ｍｍで撮像装置１８が２／３インチ型ＣＣＤカメラとすると、投影倍率は０．１４倍程度となる。
【００２９】
ステップＳ１において、観察者はステージ５に設けられた指示線５ｂに従って標本Ａをセットする。ステップＳ２の「明視野セットＯＮ」は、可視光源８をＯＮにし、ダイクロユニット１６を観察光学系６から離脱させた状態を示す。ステップＳ１１の「明視野セットＯＦＦ」はその逆である。
【００３０】
ステップＳ３は、絞り１５を調節して、対物レンズ１４の後側のアフォーカル光学系の光束径を１０ｍｍ（５０％）程度に絞る。ステップＳ４では、観察者が操作ユニット２０を用いてピント合わせを行う。
【００３１】
Ｎ＝１として、まず、ステージ５を第１ポジションに移動する（ステップＳ５）。
すると、ステージ５の位置検出器１９が座標（０，０）を認識する。この状態で撮影が行われ（ステップＳ６）、取得された画像に、左上端の座標（０，０）が対応づけられる。さらに、観察装置本体２の倍率情報を把握することにより画像の左下端の座標（０，６０）、右上端の座標（４５，０）、右下端の座標（４５，６０）が対応づけられる（ステップＳ７）。このようにして、座標が対応づけられた画像は画像記憶部３ｂに記憶される（ステップＳ８）。
【００３２】
次に、Ｎ＝２にインクリメントされ、ステージ５が、プログラムされた動作量Ｘ＝０ｍｍ，Ｙ＝６０ｍｍ移動することにより第２ポジションに移動する（ステップＳ５）。
すると、ステージ５の位置検出器１９が座標（０，６０）を認識する。この状態で撮影が行われ（ステップＳ６）、取得された画像に、左上端の座標（０，６０）が対応づけられる。さらに、観察装置本体２の倍率情報を把握することにより画像の左下端の座標（０，１２０）、右上端の座標（４５，６０）、右下端の座標（４５，１２０）が対応づけられる（ステップＳ７）。このようにして、座標が対応づけられた画像は画像記憶部３ｂに記憶される（ステップＳ８）。
この動作をＮ＝６となるまで繰り返すと、図４（ａ）に示される第１ポジションから第６ポジションまでの６枚の画像が画像記憶部３ｂに記憶される。
【００３３】
そして、第１ポジション〜第６ポジションまでの６枚の画像が画像記憶部３ｂから読み出されて、画像処理部３ｃにより、それぞれの角の座標が一致するように重ね合わせられて１枚の合成画像が生成される（ステップＳ９）。その合成された画像の４隅の座標は、左上端の座標（０，０）、右上端の座標（９０，０）、左下端の座標（０，１８０）、右下端の座標（９０，１８０）が画像に対応づけられて画像記憶部３ｃに記憶され、表示部４に表示される（ステップＳ１０）。
【００３４】
次に、「明視野セットＯＦＦ」を実行し（ステップＳ１１）、励起光源９をＯＮにし、ダイクロユニット１６を選択可能とする（ステップＳ１２）。観察者は制御部２１から信号を送り所望のダイクロユニット１６を観察光学系６に選択配置する。
【００３５】
次いで、絞り１５を開いて開口径を２０ｍｍ（１００％）程度に設定し（ステップＳ１３）、ピント合わせを行う（ステップＳ１４）。
観察者は操作ユニット２０を用いて標本Ａの平面位置を操作し、制御部２１からの信号によりズーム光学系１３を操作することにより、蛍光物質Ｂを所望の位置および大きさで撮影できるように設定する（ステップＳ１５）。
【００３６】
そして、再度ピント合わせを行った後（ステップＳ１６）、画像取得（ステップＳ１７）、位置検出器１９からの位置情報と観察装置本体２からの倍率情報とを基にして画像の４隅の位置情報を画像に対応づけて記憶する（ステップＳ１８，Ｓ１９）。例えば、図４（ｂ）に示されるように、ステージ５を移動して観察範囲の左上端を（３３．７５，７５）に設定し、ズームを２倍とした場合には、画像の左上端は（４５，９０）と記憶される。ここで、ステップＳ１６〜Ｓ２０の蛍光画像取得処理は観察者により所望の回数（複数回）行われる。
【００３７】
この後に、ステップＳ１０およびステップＳ１９において記憶された画像が呼び出され（ステップＳ２０）、ステップＳ１０において合成された明視野画像に、ステップＳ１９において記憶された蛍光画像が重ね合わせられる（ステップＳ２１）。その際、ステップＳ１０において画像に対応づけて記憶されている座標と、ステップＳ１９において画像に対応づけて記憶されている座標とが一致するように画像が重ね合わせられる。そして、図４（ｃ）に示されるように重ね合わせられた画像が画像記憶部３ｂに記憶され、表示部４に表示される（ステップＳ２２）。
【００３８】
このように、本実施形態に係る生体観察装置１によれば、正確な明視野画像を取得することができるとともに、その明視野画像に鮮明な蛍光画像を正確な位置に重ね合わせた画像を得ることができる。これにより、標本Ａ内の蛍光物質を鮮明に観察でき、かつ、標本Ａ内での蛍光物質の分布を定量的に観察することができるという利点がある。
【００３９】
なお、本実施形態においては、単一の標本Ａを搭載する指示線５ｂを有するステージ５を例示したが、これに代えて、図５に示されるように、複数の標本Ａを搭載するための複数の指示線５ｂ〜５ｄを有するステージ１０５を採用してもよい。指示線５ｂ〜５ｄは、１５ｍｍ程度の間隔をあけてＸ方向に配列されている。
【００４０】
標本Ａをセットするときには、指示線５ｂ〜５ｄに従って３つの標本Ａをセットする。そして、動作記憶部２２のプログラムが図６に示されるようにポジション１〜１８までを取得するよう設定されている。その他の動作は図３のフローチャートと同様である。
【００４１】
これにより、３つの標本Ａが平行に並んだ明視野画像に、観察者が所望する蛍光物質の画像を重ね合わせた画像を取得することができる。
このように構成することで、上記実施形態と同様の効果が得られるとともに、さらに同時に３つの標本Ａの画像を得ることでスループットの向上や標本Ａ間での比較を行うことができるという利点がある。
【００４２】
また、本実施形態においてはダイクロユニット１６として、ダイクロイックミラー１６ａと、バンドパスフィルタ１６ｂ，１６ｃとを備えるものを採用したが、チューナブルフィルタ４０１を組み合わせたものを採用してもよい。
チューナブルフィルタ４０１は、図７（ａ）に示されるように、ダイクロイックミラー１６ａおよびバンドパスフィルタ１６ｂを支持するダイクロユニット４０２と結像レンズ１７との間に配置され、標本Ａから発せられ、ダイクロイックミラー１６ａを通過した蛍光の透過波長を選択するようになっている。
【００４３】
チューナブルフィルタ４０１は電気信号により透過波長を変更できるフィルタであり、その透過波長は制御部２１からの信号により変化するようになっている。この場合には、画像処理部３ｃには取得された画像の部分的波長特性を分析し蛍光要素を識別するアンミキシング機能が備えられている必要がある。
【００４４】
また、図３の画像取得ステップＳ１７においては、チューナブルフィルタ４０１によって取得蛍光波長をシフトした複数の画像が取得される。さらに、重ね合わせステップＳ２１においては、画像の重ね合わせとともに、複数の蛍光画像をアンミキシング処理することにより蛍光要素が識別される。これにより、鮮明な画像の取得と、蛍光要素の識別とを行うことができる。
【００４５】
また、図７（ｂ）に示されるように、チューナブルフィルタ４０１を励起光源９とダイクロユニット４０３との間に配置してもよい。この場合には、ダイクロユニット４０３はダイクロイックミラー１６ａとバンドパスフィルタ１６ｃとを有している。チューナブルフィルタ４０１により励起波長を変更することで波長分析を行うことができる。このようにすると、蛍光の透過波長が変化しないので蛍光画像の色収差によるピントズレが発生しないという利点がある。
【００４６】
また、図７（ｃ）に示されるように、ダイクロユニット４０２，４０３に代えて、ハーフミラー４０４と、該ハーフミラー４０４と励起光源９との間およびハーフミラー４０４と結像レンズ１７との間に配置されたチューナブルフィルタ４０１とを配置してもよい。この場合、ダイクロイックミラー１６ａを多数備える必要がないので、挿脱せずに済むという利点がある。なお、図７（ｄ）に示されるように、ハーフミラー４０４に代えてダイクロイックミラー１６ａを備えるダイクロユニット４０５を配置した場合には、励起波長と蛍光波長に合わせてダイクロユニット４０５を挿脱することにしてもよい。これにより、励起波長と蛍光波長とを自由に選択でき、所望の蛍光色素に適した蛍光画像を取得することができる。
【００４７】
次に、本発明の第２の実施形態に係る生体観察装置２０１について図８および図９を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る生体観察装置１と構成を共通する箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００４８】
本実施形態に係る生体観察装置２０１は、図８に示すように、ズーム光学系１３を備えず、焦点距離の異なる複数の対物レンズ１４，２０３を切替可能に備えている。これらの対物レンズ１４，２０３はレボルバ２０４によって保持されることにより、観察光学系６に選択的に挿脱されるようになっている。
【００４９】
ここで、対物レンズ１４，２０３は、図９に示されるような視野範囲を有している。対物レンズ１４は、図９（ｂ）に示されるように、標本Ａ中の蛍光物質Ｂを観察するための対物レンズ２０３よりも狭い視野範囲の高倍率のものである。例えば、視野範囲は２２．５ｍｍ×３０ｍｍで倍率は０．３倍程度である。
【００５０】
一方、対物レンズ２０３は、図９（ａ）に示されるように、標本Ａ全体を観察できる対物レンズ１４よりも視野範囲の広い低倍率のものである。例えば、視野範囲は１２０ｍｍ×１８０ｍｍで投影倍率は０．０５倍程度である。
【００５１】
本実施形態に係る生体観察装置２０１を用いた観察時のフローチャートを図１０に示す。
明視野観察時のステップＳ１〜Ｓ１０においては、新たなステップＳ２０１においてライブ画像を見ながら位置調整と倍率選択が行われる。位置調整は操作ユニット２０により行い、このときの対物レンズとしては、視野範囲が広く、低倍率の対物レンズ２０３が選択される。
第１の実施形態における、ステージ５の移動と撮影とを繰り返すステップＳ５、および画像合成のステップＳ９は含まれていない。
【００５２】
次に、蛍光観察時のステップＳ１１〜Ｓ１９においては、新たなステップＳ２０２において、倍率選択時にズームに変えてレボルバ２０４の作動による対物レンズ２０３，１４の切替が行われる。このとき、対物レンズとしては、視野範囲が狭く、高倍率の対物レンズ１４が選択される。
本実施形態によれば、図９（ｃ）に示されるように、明視野画像に鮮明な蛍光画像を正確な位置に重ね合わせた画像を得ることができ、標本Ａ内での蛍光物質の分布を定量的に観察することができるという第１の実施形態と同様の効果の他、明視野画像の取得を簡略化することができ、より短時間に画像の取得を行うことができるという利点がある。
【００５３】
次に、本発明の第３の実施形態に係る生体観察装置３０１について、図１１を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、第１の実施形態に係る生体観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５４】
本実施形態に係る生体観察装置３０１は、ステージ５を対物レンズ１４の光軸に沿う方向に移動させるフォーカス機構１２がなく、結像レンズ１７を光軸に沿う方向に移動させる直動機構３０３を有している。直動機構３０３は、例えば、駆動源となるモータ、レールおよびスライダを備える直動ガイドと、モータからの駆動力を直動ガイドに伝達するラック・ピニオン機構からなる（図示略）。結像レンズ１７はスライダに固定されており、レールは観察装置本体３０２に固定されている。また、直動ガイドは操作ユニット２０に接続され、操作ユニット２０からの信号によっても作動させられるようになっている。
【００５５】
この機構により結像レンズ１７を対物レンズ１４の光軸に沿う方向に移動させることによりピント合わせを行うことができる。
このように、本実施形態に係る生体観察装置３０１によれば、第１の実施形態に係る生体観察装置１と同様の効果が得られるとともに、さらにピント合わせを行う際に、像の大きさが変化する不都合を低減し、定量性の高い観察を行うことができるという利点がある。
【００５６】
本発明の第４の実施形態に係る生体観察装置４０１について、図１２を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明においても、第１の実施形態に係る生体観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５７】
本実施形態に係る生体観察装置４０１において、撮像装置１８の撮像素子４０２はその一部の機能を無効化することができる。図１３の斜線部分を無効化したとすると撮像素子４０２では点線部分の画像が取得される。更に、無効化した部分の情報は画像と一緒に情報記録部３ａに送られ点線部分の領域情報が取得画像に追加される。また、フォーカス機構１２の位置情報は位置検出器４０３によって情報記録部３ａへ伝えられる。
【００５８】
次に本実施形態における観察時のフローチャートを図１４に示す。標本セットステップＳ１からピント合わせステップＳ４、ステージ５のポジション移動ステップＳ５（Ｎ＝１）までは第１の実施形態と同じであるがその後にＺポジション移動のフロー（ステップＳ４０１）が追加される。これは、Ｚポジションの異なる幾つかの画像を取得する為の物で、後にプロジェクション処理（ステップＳ４０３）する為のリファレンス画像となる。例えば、ピント位置から上下に２段階づつ移動させて画像取得するフローとし、移動ステップ量を１ｍｍとすると、Ｓ４で合わせたピント位置Ｐに対してＺ１＝Ｐ＋２ｍｍ、Ｚ２＝Ｐ＋１ｍｍ、Ｚ３＝Ｐ、Ｚ４＝Ｐ−１ｍｍ、Ｚ５＝Ｐ−２ｍｍといった形になる。
【００５９】
続いて、Ｚポジション移動ステップＳ４０１と撮像ステップＳ６の間に撮像範囲設定ステップＳ４０２が設けられ、ここで撮像素子４０２上で無効化する領域が設定される。限定されて撮像された画像は無効化領域（撮像領域）とＺポジションの情報などを情報記録部３ａで加えられ画像記憶部３ｂに記憶される。一連の観察動作は動作記憶部２２に記憶されており、制御部２１を通じてステージ５や撮像装置１８などが動作し、次のポジションにおいて撮像する。
【００６０】
そして、第６ポジションまでの画像取得が終わった後、画像処理部３ｃにてプロジェクション処理ステップＳ４０３が実行される。ここでは各Ｚポジション毎の画像からその輝度値情報を元にピントの合っている部分を抜出し１枚の画像に合成する。よって、各ポジションの画像は、標本Ａに凸凹があってもピントボケのない鮮明な画像となる。
【００６１】
プロジェクション処理ステップＳ４０３が終わった後、その画像を各ポジションのＸＹ座標位置に合わせて合成する。ここで、ＸＹ座標と撮像素子４０２の無効化領域は連動して、それぞれの画像が位置ずれなく貼り合わせられるように動作記憶部２２で設定されている。
【００６２】
その後の蛍光観察のステップもピント、位置、倍率の設定までは第１の実施形態と同じであるが、撮像ステップＳ１７の前にはＺポジション移動（ステップＳ４０１）が追加されており、その後にはプロジェクション処理ステップＳ４０３が行なわれる。Ｚポジションの移動ステップ量などは必ずしも明視野観察の時と同じである必要はないが基本的には同じ動作原理である。プロジェクション処理ステップＳ４０３に関しては明視野観察での処理と同様である。
【００６３】
その後の画像呼び出しステップＳ２０で明視野画像を呼び出し、明視野画像と蛍光画像を重ねあわせ、画像表示するステップは第１の実施形態と同様である。
これにより、画像の中で標本Ａの凸凹によりピントがあっていない領域を補正し、視野周辺のボケを排除した、画像全体にピントの合った鮮明な画像を得る事ができる。また、撮像する領域を制限している為、撮像時間を短くできる。
【００６４】
本実施形態ではＣＣＤカメラの撮像素子４０２を無効化する方法で画像周辺を排除したが、ＣＣＤカメラでは第１の実施形態通り画像を取得して、画像の後処理で画像周辺をトリミング処理してもよい。この場合、後からトリミング処理する事を考慮してＸＹポジションの移動座標を動作記憶部２２で設定する必要がある。
【００６５】
次に第４の実施形態の変形例を図１５のフローにより説明する。装置構成は図１２と同じである。観察時のフローチャートにおいてプロジェクション処理ステップＳ４０３ではなく、デコンボリューション処理ステップＳ５０１が画像処理部３ｃにて行なわれる。
デコンボリューション処理を行う事によって、複数のＺポジションの画像は３Ｄ画像に再構築される。各Ｚポジション間の未知の空間は各画像の輝度分布から推測され３Ｄ画像とする。同様に蛍光観察でも取得画像はデコンボリューションされ、最終的には標本Ａ内の蛍光物質のＸＹＺの位置情報と蛍光物質の体積情報が取得できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の生体観察装置のステージを示す平面図である。
【図３】図１の生体観察装置の動作を説明するフローチャートである。
【図４】図３のフローチャートに従う動作により取得される画像例を示す図であり（ａ）標本の全体画像、（ｂ）標本中の蛍光物質の画像および（ｃ）全体画像と蛍光物質の画像との合成画像をそれぞれ示している。
【図５】図１の生体観察装置のステージの変形例を示す平面図である。
【図６】図５のステージを有する生体観察装置により取得される画像例を示す図である。
【図７】図１の観察装置におけるダイクロユニットの変形例を示す図である。
【図８】本発明の第２の実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図９】図８の生体観察装置により取得される画像例を示す図であり（ａ）標本の全体画像、（ｂ）標本中の蛍光物質の画像および（ｃ）全体画像と蛍光物質の画像との合成画像をそれぞれ示している。
【図１０】図８の生体観察装置の動作を説明するフローチャートである。
【図１１】本発明の第３の実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図１２】本発明の第４の実施形態に係る生体観察装置を示す全体構成図である。
【図１３】撮像素子の撮像領域を示す図である。
【図１４】図１２の生体観察装置の動作を説明するフローチャートである。
【図１５】図１２の生体観察装置の動作の変形例を説明するフローチャートである。
【符号の説明】
【００６７】
Ａ  標本
１，２０１，３０１，４０１  生体観察装置
３ｂ  画像記憶部
３ｃ  画像処理部
５，１０５  ステージ
８  可視光源（光源）
９  励起光源（光源）
１２  フォーカス機構（オートフォーカス装置）
１３  ズーム光学系（ズーム機構）
１４，２０３  対物レンズ
１５  絞り（絞り装置）
１７  結像レンズ
１８  撮像装置
１９  位置検出器
【図１】
0005185704.tif 000002
【図２】
0005185704.tif 000003
【図３】
0005185704.tif 000004
【図４】
0005185704.tif 000005
【図５】
0005185704.tif 000006
【図６】
0005185704.tif 000007
【図７】
0005185704.tif 000008
【図８】
0005185704.tif 000009
【図９】
0005185704.tif 000010
【図１０】
0005185704.tif 000011
【図１１】
0005185704.tif 000012
【図１２】
0005185704.tif 000013
【図１３】
0005185704.tif 000014
【図１４】
0005185704.tif 000015
【図１５】
0005185704.tif 000016