(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び／又は、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を用いて製造された冷凍パン生地。
【請求項２】
パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するＧＭＫＹ７９株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４３６）である請求項１に記載の冷凍パン生地。
【請求項３】
パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するＧＭＫＹ８０株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−４３７）である請求項１に記載の冷凍パン生地。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載に記載の冷凍パン生地を焼成してなるパン。
【請求項５】
配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び／又は、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を含むパン生地を冷凍した後、焼成することを特徴とする製パン方法。
【請求項６】
配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び／又は、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換することを特徴とするパン酵母の冷凍耐性を向上させる方法。
【請求項７】
配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子、及び／又は、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子を用いて形質転換させてなるパン酵母を用いてパン生地を作製することを特徴とするパン生地の冷凍耐性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冷凍耐性を賦与又は強化したパン酵母、及びそれに係る遺伝子並びに該冷凍耐性パン酵母を用いてなる冷凍パン生地及び冷凍生地製パン法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冷凍生地製パン法とは、製パン工程の途中でパン生地を一時冷凍し、必要に応じて解凍、焼成する製パン法である。この製法では、パン生地冷凍中の輸送、貯蔵が可能であるため、主に深夜、早朝に行われる製パン作業の労働条件の改善に有効である。また、焼きたてパンの需要や、多品種少量生産にも対応できることから、広く普及している。しかしながら、生地を冷凍することにより、生地中のパン酵母は致命的な傷害を受けるため、通常の製パン法による製品の品質には及ばないという欠点がある。そのため、製品価値のあるパンを得るためには、冷凍傷害を受けにくい酵母、すなわち冷凍耐性を有する酵母が必要である。近年では、イーストメーカー各社において、様々な冷凍耐性パン酵母が開発され、機能は向上してきている。しかし、まだまだ充分ではなく、更なる機能向上のために冷凍耐性のメカニズムに関する研究が行われているが、未だ解明には至っていない。
【０００３】
冷凍耐性パン酵母に関する従来技術としては、トレハラーゼをコードする遺伝子ＮＴＨ１、ＡＴＨ１を不活性化（遺伝子破壊）することにより、細胞内のトレハロースを高蓄積させた酵母（特許文献１、特許文献２）、脂肪酸不飽和化酵素をコードするＯＬＥ１遺伝子の量を増加させることにより、細胞内の不飽和脂肪酸の割合を増加させた酵母（特許文献３）、アルギニン分解酵素をコードするＣＡＲ１遺伝子を不活性化することによって、特定アミノ酸を高蓄積させた酵母（特許文献４）、ＹＬＲ０２３Ｃ遺伝子及び／又はＹＭＲ１２６Ｃ遺伝子の発現量を上昇させた酵母（特許文献５）等が知られている。
【０００４】
上記のように、酵母の冷凍耐性には複数の遺伝子が関与することが示唆されており、上記した遺伝子以外にも幾つかの遺伝子が関与していると考えられる。
【０００５】
変異型のプロリン合成酵素を高発現させることによりプロリンを高蓄積させた酵母（非特許文献１）や、グリセロール分解酵素をコードする遺伝子を不活性化することにより、細胞内のグリセロールを高蓄積させた酵母（非特許文献２）も報告されている。
【０００６】
通常実用パン酵母の冷凍耐性は、パン生地を冷凍保存した後でも発酵力が充分保持されている事で「冷凍耐性有り」と評価出来る。しかしながら上記の如き従来技術では、遺伝子操作が容易ではあるがパン生地でのガス発生量（所謂、発酵力）が実用レベルに無い実験室酵母を用いて冷凍耐性を検証しており、パン生地でのガス発生量を指標とせず、生菌数あるいは僅かな液系発酵を指標とする冷凍耐性試験に過ぎなかったり、また実用パン酵母を用いていても、実際の発酵力は低くなっており、これらの技術で得られた実用パン酵母の冷凍耐性は充分でなかった。従って、実際のパン生地系での冷凍耐性の強化あるいは賦与への応用が可能な知見や技術の開発が求められている。
【０００７】
また、特に最近の技術として、冷凍耐性に関する多くの遺伝子を一度にスクリーニングすることを目的とした解析も行われている（非特許文献３）。この報告は、遺伝子破壊株ライブラリーを用いた全遺伝子網羅的な解析であり、比較的緩慢な冷凍条件（−２５℃）で冷凍耐性を評価しているため、多くの遺伝子が冷凍耐性に関わることを示している。但しこの報告においても、各遺伝子破壊菌株の冷凍耐性は、液系での冷凍後菌体生存率を指標に評価されているに過ぎず、実用冷凍耐性の改良に応用できる遺伝子のスクリーニングあるいは絞り込みができていなかった。さらには、上記遺伝子破壊株ライブラリーを用いたスクリーニングにおいて、その条件がドライアイス・エタノールバス（−８０℃）を使用するような過酷な冷凍条件ではなく、冷凍耐性への影響が大きい遺伝子、即ち実用機能レベルで有用な冷凍耐性を特には選別できていなかった。
【特許文献１】特開平１０−１１７７７１号公報
【特許文献２】特開平１１−１６９１８０号公報
【特許文献３】特開２０００−３７１８５号公報
【特許文献４】特開２００１−２３８６６５号公報
【特許文献５】特開２００３−１４４１３７号公報
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, 2003, Nov;69(11):6527-32
【非特許文献２】Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, Nov;66(1):108-14
【非特許文献３】FEMS Yeast Research, 2007, Mar;7(2):244-53
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、実用パン酵母の冷凍耐性形質に関連する遺伝子を明らかにし、冷凍耐性を賦与あるいは強化したパン酵母を作製することである。さらには、冷凍耐性パン酵母の新規な作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、実用パン酵母の遺伝子としてＫＴＲ１遺伝子やＭＮＴ３遺伝子を発現させたパン酵母は、冷凍耐性が上がることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の第一は、配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子に関する。本発明の第二は、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子に関する。本発明の第三は、上記記載のＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子によりコードされ、パン酵母の発酵において冷凍耐性を賦与又は強化するタンパク質に関する。本発明の第四は、上記記載のＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなる冷凍耐性遺伝子によりコードされ、パン酵母の発酵において冷凍耐性を賦与又は強化するタンパク質に関する。本発明の第五は、上記記載のＫＴＲ１遺伝子及び／又は上記記載のＭＮＴ３遺伝子を用いて形質転換させてなる、冷凍耐性を賦与または強化したパン酵母に関する。好ましい実施態様は、パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するＧＭＫＹ７９株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−４３６）である上記記載のパン酵母、或いは、パン酵母が、サッカロミセス・セレビシエに属するＧＭＫＹ８０株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−４３７）である上記記載のパン酵母、に関する。本発明の第六は、上記記載のＫＴＲ１遺伝子及び／又は上記記載のＭＮＴ３遺伝子を用いて形質転換することを特徴とするパン酵母の冷凍耐性を向上させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、実用パン酵母の冷凍耐性形質に関連する遺伝子を明らかにでき、冷凍耐性を賦与あるいは強化したパン酵母の作製することが可能となる。さらには、冷凍耐性パン酵母の新規な作製方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。本発明の冷凍耐性遺伝子は、配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子、或いは、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子又は該遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子からなり、該遺伝子は、パン酵母の発酵において冷凍耐性を賦与又は強化するタンパク質をコードする。そして、該遺伝子を用いた形質転換体であるパン酵母において、該遺伝子を高発現させることで冷凍耐性が賦与または強化されている。
【００１３】
サッカロミセス・セレビシエには、約６０００個の遺伝子があり、そのうち生存にとって必須な遺伝子約１２００個を除いた４７９２個の遺伝子を１つ宛破壊した４７９２種類の遺伝子破壊株（4792 yeast deletion strains）が販売されている。本発明者らは、この実験室株由来の単一遺伝子破壊株セット（以降、遺伝子破壊株ライブラリーと呼ぶ）から、冷凍耐性遺伝子をスクリーニングした。具体的には、各遺伝子破壊菌株に対して、冷凍後のコロニー生育度合いを目視評価する一次スクリーニングと、冷凍後の生菌数を計測評価する二次スクリーニングを実施し、冷凍耐性への影響が明確な破壊株すなわち冷凍耐性遺伝子を選択した。冷凍条件は、約−８０℃にもなるドライアイス・エタノールバスで冷凍処理を施すことにより冷凍耐性への影響が大きい遺伝子のスクリーニングを行った。
【００１４】
これにより、遺伝子破壊により明確に冷凍感受性となる菌株があることを確認し、これまでに報告の無かった新たな冷凍耐性遺伝子を複数個スクリーニングできた。スクリーニングされた遺伝子の内、ＫＴＲ１遺伝子及びＭＮＴ３遺伝子は、タンパク質への糖鎖付加に関わるタンパク質をコードする遺伝子として報告があり（Glycobiology, 1999, Oct;9(10):1045-51）、糖鎖付加は、タンパク質の活性制御に重要な役割を果たしていることが知られていたが、前記のようなＫＴＲ１遺伝子あるいはＭＮＴ３遺伝子の破壊による冷凍耐性の低下、即ちＫＴＲ１遺伝子やＭＮＴ３遺伝子が冷凍耐性に関与することは本発明により初めて明かとなった。
【００１５】
従って、変異等により活性を向上させたＫｔｒ１タンパク（ＫＴＲ１遺伝子がコードするタンパク質）又はＭｎｔ３タンパク（ＭＮＴ３遺伝子がコードするタンパク質）を用いるか、或いはＫｔｒ１タンパク又はＭｎｔ３タンパクの量、即ちＫＴＲ１遺伝子又はＭＮＴ３遺伝子の発現量を増加させることで、パン酵母の冷凍耐性を賦与または強化することができる。そのためには、ＫＴＲ１遺伝子及び／又はＭＮＴ３遺伝子を用いて形質転換したり、各遺伝子のプロモーターを強化したりすることなどが好ましい。その中でも、ＫＴＲ１遺伝子及び／又はＭＮＴ３遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換することが操作上容易なため好ましい。
【００１６】
具体的には、ＫＴＲ１遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換体であるＧＭＫＹ７９株が、ＮＩＴＥ  Ｐ−４３６（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。また、ＭＮＴ３遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換体であるＧＭＫＹ８０株が、ＮＩＴＥ  Ｐ−４３７（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。これらの株は、何れも発現量が形質転換前の１０倍以上に増加している。即ち、前記株を用いてパン生地を作製することで、冷凍耐性の高いパン生地が得られる。また、対照となる前記タンパク質の非高発現株としてプラスミドｐＥＵＡを用いた形質転換体であるＧＭＫＹ７８株が、ＮＩＴＥ  Ｐ−４３５（受託番号）として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００１７】
なお、ＫＴＲ１遺伝子及びＭＮＴ３遺伝子は、パン酵母の冷凍耐性に寄与していることが認められたが、それぞれの遺伝子の相補鎖にハイブリダイズ可能な遺伝子も、ＫＴＲ１遺伝子やＭＮＴ３遺伝子と同等以上の冷凍耐性を発現できる限り有効である。
【００１８】
（冷凍耐性の規定と評価方法）
冷凍耐性パン酵母とは、一般に冷凍による傷害を受けにくいパン酵母のことを言う。本発明における冷凍耐性とは、［１］ドライアイス・エタノールバスなどによる−８０℃での急速冷凍−解凍後の菌体生存率（冷凍耐性度）が、液系評価法で対照となる非破壊株と比較して２０％以上高い場合を冷凍耐性、同様に２０％以上低い場合を冷凍感受性、或いは、［２］１週間冷凍−解凍後の生地のガス残存率（冷凍耐性度）が、生地系評価法で対照となる非高発現株と比較して２０％以上高い場合を冷凍耐性、同様に２０％以上低い場合を冷凍感受性とする。ここで液系評価法とは、スクリーニングした遺伝子破壊株について、ＹＰＤ寒天培地上に生育したコロニー数をカウントすることにより冷凍後の生存率を測定する方法である。詳細には、ＹＰＤ培地に適量の菌体を植菌して一晩前培養した後、培養液を新しいＹＰＤ培地に植菌し、一晩本培養した後、培養液をマイクロチューブ２本に分注し、１本は滅菌水で適宜希釈して、ＹＰＤ寒天培地に塗布し、もう１本はドライアイス・エタノールバスで冷却後、冷凍庫で冷凍保存する。１日冷凍後、解凍した培養液サンプルを、滅菌水で適宜希釈して、ＹＰＤ寒天培地に塗布し、冷凍前及び冷凍後のサンプルを塗布した寒天培地に生育したコロニーをカウントし、冷凍後の菌体生存率（冷凍後サンプルのコロニー数／冷凍前サンプルのコロニー数）を指標として冷凍耐性の評価を行う。上記のような液系生存率による評価法では、実用機能レベルの発酵力を持たない株でも冷凍耐性を評価できるので、遺伝子破壊株ライブラリーから実用パン酵母まで、様々な菌株の冷凍耐性評価に有効に用いることができる。
【００１９】
こういった生存率を指標とする液系冷凍耐性評価は、発酵力や増殖性が実用レベルに無い上記の如きライブラリー株を直接かつ効率的に評価し得る数少ない方法といえるが、生地系評価との発酵環境の違いは歴然としており、正確なスクリーニングのためには適正な試験条件の設定が重要である。更には、液系評価に留まること無く、より正確で実際に即した生地系発酵力評価を実施することにより実用パン酵母としての冷凍耐性が評価できる。
【００２０】
実用パン酵母の生地系での冷凍耐性は、ファーモグラフII（ＡＴＴＯ）を用い、冷凍前および解凍後の生地からのガス発生量により評価できる。
【００２１】
（実用株へのウラシル要求性の賦与）
実用株（実用パン酵母）の形質転換を実施するに当たり、遺伝子導入の成否を判定するための選択マーカーが必要となる。実用パン酵母にウラシル要求性を賦与するには、菌体を５−ＦＯＡ（５-フルオロオロチン酸）寒天培地に塗布し、３０℃で培養し、生育したコロニーを選抜すればよい。
【００２２】
（遺伝子高発現株の作製）
ＫＴＲ１遺伝子及びＭＮＴ３遺伝子の少なくとも一つを高発現させるには、該遺伝子を含む多コピー型プラスミドで酵母を形質転換するか、該遺伝子を酵母で効率良く機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて酵母を形質転換するか、あるいは酵母で効率良く機能する他のプロモーター配列を、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列と置換、或いは該遺伝子の上流側に挿入すればよい。また、ＫＴＲ１及び／又はＭＮＴ３遺伝子をより活性の高いものと置換してもよい。
【００２３】
（遺伝子発現量の規定と測定方法）
酵母では、各遺伝子の発現量は、様々なストレスを与えることにより変化することが知られている。例えば、浸透圧ストレス下では、細胞内の浸透圧を高めるために、グリセロール合成に関わる遺伝子の発現量が増加する。同様に、冷凍ストレス環境下では、冷凍ストレス緩和に関わる遺伝子の発現量が増加していると考えられる。従って、冷凍耐性遺伝子を高発現することにより、酵母の冷凍耐性を向上させることが可能であると推察される。ここで、本発明において遺伝子高発現とは、遺伝子発現量が元株の５倍以上、好ましくは１０倍以上に増加した株を高発現株と定義する。遺伝子の発現量の比較は、転写されたｍＲＮＡの量又は翻訳されたタンパク質の量を比較することにより行うことができる。ｍＲＮＡの検出を行うには、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ等が用いられる。同様に、タンパク質の検出を行うには、ウェスタン解析を用いればよく、発現するタンパクに対する抗体を取得し、ＲＩもしくは蛍光ラベルを比較できる系の使用が望ましい。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するにおいて、ＫＴＲ１遺伝子およびＭＮＴ３遺伝子が、パン酵母の冷凍耐性形質の賦与あるいは強化に関与する遺伝子である事を示すが、本発明は以下の実施例により何ら制限されない。
【００２５】
本発明で用いた培地、プラスミド、ＤＮＡ、種々の酵素、大腸菌、酵母などの取り扱いに関する常法は、以下の参考文献に詳しく記載されており、本発明ではこれらに従い実施した。
参考文献１：「酵母遺伝子実験マニュアル」  大矢禎一監訳  丸善
参考文献２：「バイオ実験イラストレイテッド  １  分子生物学実験の基礎」  中山広樹、西方敬人著  秀潤社
参考文献３：「バイオ実験イラストレイテッド  ２  遺伝子解析の基礎」  中山広樹、西方敬人著  秀潤社
参考文献４：「バイオ実験イラストレイテッド  ３  本当にふえるＰＣＲ」  中山広樹著  秀潤社
参考文献５：「バイオマニュアルシリーズ１０  酵母による遺伝子実験法」  山本正幸編、羊土社
【００２６】
（実施例１）  遺伝子破壊株ライブラリーからの冷凍耐性遺伝子スクリーニング
遺伝子破壊株ライブラリーを、ＹＰＤ培地を用いてマイクロプレートで静置培養し、培養液をドライアイス・エタノールバスにより５分間冷却後、−８０℃の冷凍庫で１日冷凍保存した。冷凍前後の培養液を適宜希釈して、それぞれＹＰＤ寒天培地にスポットし、増殖の様子を目視することにより、冷凍後の増殖が著しく低下した菌株を冷凍感受性株として一次スクリーニングした。一次スクリーニングした遺伝子破壊株については、改めて二次スクリーニングで冷凍後の生存率を測定した。ＹＰＤ培地５ｍｌに適量の菌体を植菌して３０℃で一晩前培養した後、培養液５０μｌを新しいＹＰＤ培地５ｍｌに植菌し、３０℃で一晩本培養した。培養液を１ｍｌずつ１．５ｍｌマイクロチューブ２本に分注し、１本は滅菌水で適宜希釈して、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。もう１本は−８０℃のドライアイス・エタノールバスで５分間冷却後、−８０℃の冷凍庫で冷凍保存した。１日冷凍後、２５℃で１５分間静置して解凍した培養液サンプルを、滅菌水で適宜希釈して、ＹＰＤ寒天培地に塗布した。冷凍前及び冷凍後のサンプルを塗布した寒天培地に生育したコロニーをカウントし、冷凍後の菌体生存率（冷凍後サンプルのコロニー数／冷凍前サンプルのコロニー数）を指標として冷凍耐性の評価を行った。図１に示すように、ＹＯＲ０９９Ｗ、ＹＩＬ０１４Ｗ、ＹＢＬ０９０Ｗ、ＹＫＬ１２６Ｗ、ＹＤＲ１１９Ｗの何れか一つの遺伝子の破壊株は非破壊株と比べて冷凍後の生存率が２０％以上低下していた。このことから、これら５つの遺伝子は、冷凍耐性に関連していることが示唆された。
【００２７】
このうち、タンパク質への糖鎖付加に関わる遺伝子として報告があるＫＴＲ１遺伝子（ＹＯＲ０９９Ｗ）とＭＮＴ３遺伝子（ＹＩＬ０１４Ｗ）の両遺伝子については、新たな機能性として非常に興味深く、これらを詳細解析すると共に遺伝子高発現効果をパン生地系で評価することとした。
【００２８】
（実施例２）  ＫＴＲ１遺伝子高発現プラスミドの作製
高発現プロモーターを含むプラスミドのプロモーター部分、例えば市販のプラスミドｐＡＵＲ１２３を制限酵素ＢａｍＨIで切断して得られるＡＤＨ１プロモーター及びＡＤＨ１ターミネーターの配列部分（ＰＡＤＨ１−ＴＡＤＨ１）約１．０ｋｂを、多コピー型のプラスミド、例えば市販のプラスミドｐＥＳＣ-ＵＲＡ（ＴＯＹＯＢＯ）を制限酵素ＰｖｕIIで切断して得られる配列約５．３ｋｂと連結し、多コピー型高発現プラスミドｐＥＵＡ約６．３ｋｂを作製した（図２）。
【００２９】
遺伝子のクローニングは、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）を用いた方法が常法となっている。データベース菌株の染色体を鋳型とし、配列番号３、４に示したプライマーを用いたＰＣＲにより、配列番号１に示すサッカロミセス・セレビシエのＫＴＲ１遺伝子を取得した。ＫＴＲ１遺伝子の５’末端に付加したＫｐｎIと３’末端に付加したＳａｌIの両制限酵素切断部位の間約１．１ｋｂを、ｐＥＵＡの同制限酵素ＫｐｎI、ＳａｌI切断部位に挿入し、ＫＴＲ１遺伝子高発現プラスミドｐＥＵＡＫ１約７．４ｋｂを作製した（図３）。
【００３０】
（実施例３）  ＭＮＴ３遺伝子高発現プラスミドの作製
配列番号５、６に示したプライマーを用いたＰＣＲにより、配列番号２に示すサッカロミセス・セレビシエのＭＮＴ３遺伝子を取得し、ＭＮＴ３遺伝子の５’末端に付加したＫｐｎIと３’末端に付加したＳａｌIの両制限酵素切断部位の間約１．９ｋｂを、ｐＥＵＡの同制限酵素ＫｐｎI、ＳａｌI切断部位に挿入する以外は実施例２と同様にして、ＭＮＴ３遺伝子高発現プラスミドｐＥＵＡＭ１約８．２ｋｂを作製した（図４）。
【００３１】
（実施例４）ウラシル要求性実用パン酵母の作製
ウラシル要求性実用パン酵母は、以下のようにして作製した。二倍体実用パン酵母をＹＰＤ寒天培地に塗布し、紫外線を３０秒間照射後、３０℃で１日培養した。生育した菌体をレプリカ法により５−ＦＯＡ寒天培地に移しとり、３０℃で３〜４日培養し、生育したコロニーを選抜することにより取得した。ウラシル要求性が賦与（ＵＲＡ３欠損変異）されたことは、ウラシル要求性を相補、すなわちＵＲＡ３を含有するプラスミドＹＣｐ５０を用いて形質転換することにより、ウラシルを含有しないカザミノ酸培地で生育できるようになることで確認した。また、要求性の相補株では、野生型の二倍体実用パン酵母と同等の増殖性、発酵力を持つことも確認した。
【００３２】
（実施例５）  実用パン酵母でのＫＴＲ１遺伝子高発現菌株の作製と該遺伝子の発現量測定
実施例２で作製したプラスミドと実施例４で作製した宿主を用いて、酢酸リチウム法に準ずる方法によりＫＴＲ１高発現プラスミド（ｐＥＵＡＫ１）で形質転換したＧＭＫＹ７９株と、非高発現プラスミド（ｐＥＵＡ）で形質転換したＧＭＫＹ７８株を作製した。
【００３３】
プラスミドの導入の確認は、形質転換株からＤＮＡ（染色体及びプラスミド）を抽出し、これを鋳型として、配列番号７、８に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のＤＮＡサイズを測定することにより確認した。
【００３４】
プラスミドの導入が確認できた遺伝子高発現実用パン酵母について、ＫＴＲ１遺伝子の発現量を測定した。菌体を表１の培地を用いて試験管で培養し、常法［ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）プロトコール参照］に従い約５×１０７個の細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【００３５】
【表１】
0005230224.tif 000002
【００３６】
次に、常法［ライトサイクラーＲＮＡマスターＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ）プロトコール参照］に従い、リアルタイムＰＣＲによりＫＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ量、すなわち遺伝子の発現量を測定した。ＫＴＲ１の検出には配列番号９、１０に示したプライマーを用いた。また、ハウスキーピング遺伝子としてＴＤＨ１を用い、検出には配列番号１１、１２に示したプライマーを用いた。
【００３７】
その結果、図５−ａに示すように、ＫＴＲ１遺伝子の高発現株では、非高発現株と比べ、ＫＴＲ１遺伝子のｍＲＮＡ量が充分増加していた。
【００３８】
（実施例６）  実用パン酵母でのＭＮＴ３遺伝子高発現菌株の作製と該遺伝子の発現量測定
実施例３で作製したプラスミドと実施例４で作製した宿主を用いて、酢酸リチウム法に準ずる方法によりＭＮＴ３高発現プラスミド（ｐＥＵＡＭ１）で形質転換したＧＭＫＹ８０株を作製した。プラスミドの導入の確認およびｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、実施例５と同様にして行った。
【００３９】
次に、ＭＮＴ３遺伝子のｍＲＮＡ量、すなわち遺伝子の発現量を測定については、ＭＮＴ３の検出に配列番号１３、１４に示したプライマーを用いる以外は、実施例５と同様にして行った。
【００４０】
その結果、図５−ｂに示すように、ＭＮＴ３遺伝子の高発現株では、非高発現株と比べ、ＭＮＴ３遺伝子のｍＲＮＡ量が充分量増加していた。
【００４１】
（実施例７）  ＫＴＲ１遺伝子高発現実用パン酵母の冷凍耐性評価
実施例５で作製したＫＴＲ１遺伝子高発現実用パン酵母は、表１の培地を用いて坂口フラスコで培養した。得られたそれぞれの培養酵母を吸引ろ過して、水分含量約７０％の固体状にした。これを表２の配合でパン生地に加えて混捏した。
【００４２】
【表２】
0005230224.tif 000003
【００４３】
混捏後、２０ｇに分割し、３０℃で６０分の前発酵をとった後、１つは３８℃で１２０分間のガス発生量（冷凍前）をファーモグラフIIで測定した。残りは−２０℃で冷凍貯蔵し、１，２週間後、生地を解凍（２５℃、３０分）した。解凍後の生地も冷凍前の生地と同様に、３８℃で１２０分間のガス発生量（冷凍１Ｗ、２Ｗ）をファーモグラフIIで測定した。その結果は、表３に示す。上記の培養酵母について、冷凍前と解凍後の生地からのガス発生量から、冷凍耐性度を算出した。その結果は、図６に示す。
【００４４】
（実施例８）  ＭＮＴ３遺伝子高発現実用パン酵母の冷凍耐性評価
実施例６で作製したＭＮＴ３遺伝子高発現実用パン酵母を用いた以外は、実施例７と同様にして固体状の培養酵母を得、冷凍耐性度を算出した。その結果は、表３及び図６に示す。
【００４５】
【表３】
0005230224.tif 000004
【００４６】
以上の結果より、ＫＴＲ１遺伝子やＭＮＴ３遺伝子を高発現させることで冷凍耐性が向上し、より実用性の高いパン酵母を作製することができた。更には新規な冷凍耐性パン酵母の作製方法を提供することができた。
【００４７】
加えて、ＫＴＲ１遺伝子やＭＮＴ３遺伝子が糖鎖付加に関連する遺伝子であることから、本発明の遺伝子以外にも糖鎖付加に関連する遺伝子が冷凍耐性に関与していることを示唆できたものと言える。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】各遺伝子破壊株の液系での生存率測定の結果である。非破壊株に対する各遺伝子破壊株の生存率の比を示したものである。
【図２】ｐＥＵＡの作製図である。
【図３】ｐＥＵＡＫ１の作製図である。
【図４】ｐＥＵＡＭ１の作製図である。
【図５】リアルタイムＰＣＲによる各遺伝子のｍＲＮＡ量測定の結果である。ハウスキーピング遺伝子に対する各遺伝子のｍＲＮＡ量の比を示したものである。
【図６】各菌株を用いて作製したパン生地を前発酵６０分とった後、１、２週間冷凍貯蔵し、冷凍前及び解凍後の生地からの１２０分間のガス発生量をファーモグラフIIで測定した結果である。それぞれの菌株において、冷凍前のガス発生量を１００％として、これに対する冷凍１週間及び冷凍２週間のガス発生量の割合を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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