(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
資化成分と発酵処理用微生物との接触により発酵させて、これにより生じた発酵成分をコーヒー生豆に付与させる発酵工程を包含するコーヒー生豆の処理方法であって、
前記発酵工程において、乳酸及びリン酸のうち少なくとも何れか一方を用いて酢酸を産生する微生物の増殖を抑制するｐＨ２．４〜４．７の範囲内に調整し、当該ｐＨの範囲内で前記資化成分と前記発酵処理用微生物としてのゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する不完全菌類とを接触させるコーヒー生豆の処理方法。
【請求項２】
前記コーヒー生豆が、コーヒー果実から単離された状態、又はコーヒー果実内に存在する状態の少なくとも何れか一方にある請求項１に記載のコーヒー生豆の処理方法。
【請求項３】
前記ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する不完全菌類が、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体である請求項１に記載のコーヒー生豆の処理方法。
【請求項４】
前記資化成分が、果汁又はコーヒー果肉である請求項１又は２に記載のコーヒー生豆の処理方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のコーヒー生豆の処理方法により得られたコーヒー生豆。
【請求項６】
請求項５に記載のコーヒー生豆を焙煎処理したコーヒー焙煎豆。
【請求項７】
請求項６に記載のコーヒー焙煎豆を原料として用いて得られたコーヒー飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、資化成分と発酵処理用微生物との接触により発酵させて、これにより生じた発酵成分をコーヒー生豆に付与させる発酵工程を包含するコーヒー生豆の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒー飲料の製造工程を簡単に説明すると、まず、コーヒー果実（コーヒーノキと呼ばれるアカネ科の植物の果実）からその外皮及び果肉部分を取り除いて、コーヒー生豆を単離する（精製工程）。得られたそのコーヒー生豆について焙煎処理（ロースト）を施すことによりコーヒー焙煎豆が得られる（焙煎工程）。尚、コーヒー特有の味覚や香りの素となる成分（以下、コーヒー香味成分と称する）はこの焙煎工程において生成される。あとはそのコーヒー焙煎豆を粉砕し、熱湯等によりコーヒー香味成分を抽出した抽出液をコーヒー飲料として提供する。
現在、コーヒー飲料は、嗜好飲料としてその需要が増大するなかで、コーヒー飲料に対する消費者の嗜好もまた多様化しており、コーヒー香味についての様々な改善が求められている。
そうした消費者のニーズに対応すべく、コーヒー香味を改善する方法の一つとして、コーヒー生豆と、微生物（酵母など）と、及びその微生物により資化される資化成分とを接触させて発酵処理を実施した後、微生物の発酵により産生されたアルコール類やエステル類等を吸収したコーヒー生豆を分離回収して焙煎し、その焙煎豆を原料としてコーヒー飲料を製造する方法がある（特許文献１参照）。
上述した特許文献１に開示される方法においては、発酵処理後のコーヒー生豆に、アルコール類やエステル類等に起因する醸造香といった独特の香りが付与される。さらに、そのコーヒー生豆の焙煎豆から得られるコーヒー飲料については、前述の醸造香に加えてボディ感（コクや飲み応え、風味の膨らみを示す）が増しており、新たな良質の香味を有するコーヒー飲料を製造することができる。
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２００５／０２９９６９Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、この方法においては、微生物による発酵処理を実施する際、コーヒー果実の棲み付き菌等による雑菌汚染が問題となる場合が生じていた。特に酢酸産生能を有する雑菌（例えば、酢酸菌等）により汚染された場合、コーヒー生豆が雑菌によって産生された酢酸を吸収してしまい、その焙煎豆から得られるコーヒー飲料の官能品質を著しく低下させる虞がある。【０００４】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、コーヒー生豆について微生物による発酵処理を実施する際、酢酸を産生する雑菌の汚染を防止して、コーヒー飲料に新たに良質な香味を付与することのできるコーヒー生豆の処理方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るコーヒー生豆の処理方法の第１特徴構成は、資化成分と発酵処理用微生物との接触により発酵させて、これにより生じた発酵成分をコーヒー生豆に付与させる発酵工程を包含するコーヒー生豆の処理方法であって、前記発酵工程において、乳酸及びリン酸のうち少なくとも何れか一方を用いて酢酸を産生する微生物の増殖を抑制するｐＨ２．４〜４．７の範囲内に調整し、当該ｐＨの範囲内で前記資化成分と前記発酵処理用微生物としてのゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する不完全菌類とを接触させる点にある。
【０００６】
コーヒー生豆（種子）は、コーヒー果実の最も内側に存在しており、発芽に備えて吸水する性質がある。また、酵母等に代表されるある種の微生物は、有機化合物（資化成分）を分解（発酵）してアルコール類、有機酸類、エステル類等（以下、発酵成分と称する）を産生することが知られている。
従って、資化成分の存在下においてある種の微生物（発酵処理用微生物）による発酵を行うと、産生された発酵成分は、水分と共にコーヒー生豆に吸収される。その結果、このようにして得られたコーヒー生豆を焙煎することにより、焙煎工程にて生成される従来のコーヒー香味成分に加えて、発酵により産生された発酵成分に由来する新たな香味成分を含むコーヒー焙煎豆を得ることが可能であり、そのコーヒー焙煎豆から抽出されたコーヒー飲料には新たな良質の香味が付与される。【０００７】
従って、本発明の第１特徴構成によれば、前記発酵工程において、酢酸を産生する微生物（以下、酢酸産生菌と称する）の増殖を抑制するｐＨ（以下、増殖抑制ｐＨと称する）である２．４〜４．７の範囲内で前記資化成分と前記発酵処理用微生物とを接触させるので、発酵処理中の酢酸の産生を抑え、発酵処理用微生物の増殖を促すことができる。また、酢酸産生菌による資化成分の浪費が抑制される分、発酵処理用微生物による資化成分の利用効率が高まり、コーヒー飲料に新たな良質の香味を付与する発酵成分の産生量を増加させることができる。その結果、上記従来技術において得られるコーヒー生豆と比べて、より発酵成分の含有量が高く、尚且つより酢酸含有量の低い、さらに上質のコーヒー生豆を得ることができる。
ｐＨ調整は、後述する実施例の記載から明らかなように、様々な態様で実施することが出来る。例えば、比較的大量の水（例えば、コーヒー果実と等重量程度の量）に薄い濃度で発酵処理用微生物を懸濁させた懸濁液を用意しておき、その懸濁液にｐＨ調整剤を添加してそのｐＨを増殖抑制ｐＨに調整する。次いで、発酵させるべきコーヒー果実をその懸濁液中に浸漬して引き上げることで接触させた後、発酵工程を実施することができる（尚、この場合の主な資化成分は、コーヒー果実の果肉である）。または、コーヒー果実からコーヒー生豆を分離精製する水洗式の精製工程において、コーヒー果実を水槽に沈めて不純物を除去する際、予めｐＨ調整剤を添加して増殖抑制ｐＨに調整した水槽を用意し、収穫したコーヒー果実と発酵処理用微生物とをその水槽に加えて、発酵工程を実施することができる（尚、この場合の主な資化成分は、コーヒー果実の果肉である）。
ｐＨ調整剤は、乳酸及びリン酸のうち少なくとも何れか一方を使用し、発酵液のｐＨを、酢酸産生菌の増殖を抑制することが可能なｐＨ（増殖抑制ｐＨ）まで下げる。酢酸産生菌の増殖を抑制し、尚且つ発酵処理後のコーヒー生豆の品質になんら悪影響を与えない酸として、乳酸及びリン酸のうち少なくとも何れか一方が特に有効であるという事実は、本発明者らの鋭意研究の結果、初めて見出した。しかも、乳酸及びリン酸は、安価で且つ入手も容易で、食品添加物としても利用されているので人体にも害はなく安全である。
ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する不完全菌類として、例えば、ゲオトリクム  キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム  レクタングラタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｔｕｍ）、又はゲオトリクム  クレバニ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｋｌｅｂａｈｎｉｉ）を使用して発酵処理する。本法によれば、新たな香味成分（発酵成分）をコーヒー生豆に付与することが可能である。特に上記微生物を使用して得られたコーヒー生豆を原料として用いることにより、焙煎工程にて生成される従来のコーヒー香味とバランスのとれた（アルコール臭の抑えられた）華やかでリッチなエステリー香を有し、且つボディ感のある味わいを与えるコーヒー飲料を得ることができる。
【０００８】
本発明の第２特徴構成は、前記コーヒー生豆が、コーヒー果実から単離された状態、又はコーヒー果実内に存在する状態の少なくとも何れか一方にある点にある。【０００９】
本発明の第２特徴構成によれば、後述する実施例１に記載されているように、前記コーヒー生豆が精製処理を受ける等してコーヒー果実から単離された状態で存在しているときに前記発酵工程をおこなうと、例えば、資化成分として他種の果実や果汁を用いたり、資化成分と発酵処理用微生物とコーヒー生豆とを接触させる際の順序を適宜変更したりする等、他種の設定を選択できる。或いは、実施例２〜４に記載されているように、前記コーヒー生豆がコーヒー果実内に存在する状態で存在しているときに前記発酵工程を行うと、資化成分となるコーヒー果肉とコーヒー生豆とが近接した状態で微生物による発酵がおこる。従って、発酵によって生じたアルコール類やエステル類などの発酵成分が前記生豆に移行しやすくなる。【００２２】
本発明の第３特徴構成は、前記ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する不完全菌類が、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体である点にある。
【００２３】
本発明の第３特徴構成に係るコーヒー生豆の処理方法においては、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）（以下、ＳＡＭ２４２１と称する）を使用する。ＳＡＭ２４２１は、本発明者らによってコーヒー果実から分離された新規微生物である。この微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００５年３月２２日付で受託された。ＳＡＭ２４２１を使用することによって、コーヒー生豆に新たな香味成分（発酵成分）が付与されて、より華やかでリッチなエステリー香を有し、且つボディ感のある味わいを与えるコーヒー飲料を得ることができる。尚、本発明においては、ＳＡＭ２４２１もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体を適宜使用することが可能である。例えば、変異体としては、自然突然変異によるものや人為的に突然変異を誘発（放射線や突然変異物質による処理）したもの、また形質転換体としては、ＳＡＭ２４２１若しくはその変異体に、外来の遺伝子を導入したものなどから、より発酵能の優れた（あるいは、取扱いが容易である等の特徴を持つ）株を分離して使用することが可能である。
【００２４】
本発明の第４特徴構成は、前記資化成分が、果汁又はコーヒー果肉である点にある。
【００２５】
本発明の第４特徴構成によれば、資化成分として果汁を用いる場合は、例えば、ぶどう果汁、桃果汁、りんご果汁などを適用することができる。また、コーヒー果肉（糖分やその他の栄養分を含む部分）は、コーヒー果実からコーヒー生豆を得るための精製工程で得られる副産物であり、通常は破棄されるものであるが、本発明において資化成分として有効利用することが可能であるため、外来の資化成分を用意する必要がなく、原料コストが増大する虞もない。
【００２６】
本発明に係るコーヒー生豆の特徴構成は、上記コーヒー生豆の処理方法により得られる点にある。
【００２７】
本構成に係るコーヒー生豆は、コーヒー飲料に新たな良質の香味を付与する発酵成分を含む。
【００２８】
本発明に係るコーヒー焙煎豆の特徴構成は、上記コーヒー生豆を焙煎処理した点にある。
【００２９】
本構成に係るコーヒー焙煎豆は、焙煎工程にて生成される従来のコーヒー香味成分に加えて、発酵により産生された発酵成分に由来する新たな香味成分を含む。
【００３０】
本発明に係るコーヒー飲料の特徴構成は、上記コーヒー焙煎豆を原料として用いて得られる点にある。
【００３１】
本構成に係るコーヒー飲料は、従来のコーヒー香味に加えて、発酵により産生された発酵成分に由来する新たな良質の香味を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
〔実施形態〕
（コーヒー果実）
本発明におけるコーヒー果実とはコーヒーノキの果実を意味し、その構造を概していえば、コーヒー生豆（種子）、果肉（糖分やその他の栄養分を含む部分）及び外皮からなるものである。より詳細には、最も内側にコーヒー生豆が存在し、その周りが順に、銀皮（シルバースキン）、内果皮（パーチメント）、果肉、外皮で覆われている。品種としては、アラビカ種、ロブスタ種、リベリカ種などが適用可能であり、また、産地についても、ブラジル産、エチオピア産、ベトナム産、グアテマラ産などが適用可能であるが、特に限定されるものではない。尚、本実施形態で使用し得るコーヒー果実には、未乾燥及び乾燥状態のものがあり、コーヒー生豆を１とした場合の重量比は、それぞれ１粒あたり、「コーヒー果実（未乾燥）：乾燥コーヒー果実：コーヒー生豆＝６：４：１」である。【００３３】
（コーヒー生豆）
コーヒー果実からコーヒー生豆を単離するための精製工程には、非水洗式と水洗式の二種類が知られている。
非水洗式とは、コーヒー果実を収穫後、そのまま乾燥させたものを脱穀して外皮、果肉、内果皮、銀皮等を除去し、コーヒー生豆を得る方法である。
水洗式とは、コーヒー果実を収穫後、水槽に沈めて不純物を除去し、果肉除去機で外皮及び果肉を除去してから、水中に沈めて粘着物を溶かして除去し、さらに、水洗した後に乾燥させたものを脱穀して内果皮、銀皮を除去してコーヒー生豆を得る方法である。
非水洗式の精製工程は操作が容易であるが、主に気候が乾燥している地域で適用される。一方、水洗式の精製工程は、主に多雨の地域で適用される。尚、１粒のコーヒー果実からコーヒー生豆は１粒或いは２粒採取される。【００３４】
（資化成分）
本発明における発酵工程にて使用される資化成分としては、例えば、果肉、果汁、糖類、穀物類、培地などが挙げられるが、好ましくは果汁又はコーヒー果肉である。但し、本発明でいうコーヒー果肉とは、便宜的に、コーヒー果実（未乾燥又は乾燥状態を問わない）において、そのコーヒー生豆と外皮以外の全ての部分を意味する。【００３５】
コーヒー果肉は、精製工程を経ていないコーヒー果実の状態のもの（必要に応じて、ナイフ等で表面に傷を付けて、果肉を一部露出させても良い）を使用しても良く、あるいは、精製工程にてコーヒー生豆と分離されたときに得られる果肉の状態で使用することも可能である。また、コーヒー果肉は、未乾燥のものであってもよいし、乾燥させたものであってもよい。尚、コーヒー果肉に限らず、必要に応じて、ぶどう果肉、サクランボ果肉、桃果肉などの他の果肉を使用することも可能であり、コーヒー果肉を含めたこれらの果肉を単独か、あるいは任意に組み合わせて使用しても良い。【００３６】
上述した果肉以外の資化成分としては、果汁（例えば、ぶどう、桃、リンゴ等）、糖類（例えば、サトウキビや甘藷等の植物からとれる単糖、二糖、多糖等）、穀物類（例えば、麦芽を糖化させた麦汁など）、培地等が挙げられるが、微生物が資化可能な成分であれば特に限定されず、果肉を含めたこれらの資化成分を単独か、あるいは任意に組み合わせて使用しても良い。【００３７】
（コーヒー果肉の露出方法）
コーヒー果実をそのまま用いて、中のコーヒー果肉を資化成分として使用する場合には、発酵速度を増加させるために、コーヒー果実表面の少なくとも一部にコーヒー果肉を露出させる方法が好適である。【００３８】
コーヒー果肉を露出させる方法としては、収穫したコーヒー果実に鋭利な刃物等で傷を付けても良いし、脱穀装置等を用いて外皮に切れ目が入るようにコーヒー果実に圧力をかけるようにしても良いが、このとき中のコーヒー生豆にまで傷をつけないようにする。また、皮むき機等を使用して、コーヒー果実の外皮のみを剥いて果肉を露出するようにしても良い。尚、コーヒー果実を収穫する際、偶然に傷がついてその果肉の少なくとも一部が露出してしまったものについては、特に上述の果肉の露出操作を行う必要はない。また、精製工程にてコーヒー生豆と分離されたときに得られるコーヒー果肉を使用する場合にも、特に上述の果肉の露出操作を行う必要はなく、別途コーヒー生豆を加えて発酵を行う。【００３９】
（発酵処理用微生物）
本発明で用いる発酵処理用微生物としては、前記増殖抑制ｐＨにおいて、上述したような資化成分を資化（発酵）することが可能な微生物（耐酸性を有する微生物）であれば、特に限定されない。
具体的な微生物としては、酵母、乳酸菌、不完全菌類などが挙げられる。これらの微生物は、入手が容易であり、取り扱い性の容易さから好適に用いることができる。
酵母は、食品としての安全性の面から、食品での使用実績のあるワイン発酵用酵母やビール発酵用酵母といった醸造用酵母を好適に用いることができる。ワイン発酵用酵母としては、例えば、市販の乾燥酵母である、Ｌａｌｖｉｎ  Ｌ２３２３株（以下Ｌ２３２３と称する：セティカンパニー社）やＣＫ  Ｓ１０２株（以下Ｓ１０２と称する：Ｂｉｏ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社）などを用いることができる。通常は、Ｌ２３２３は赤ワイン醸造用、Ｓ１０２はロゼワイン醸造用に用いられる。このように酵母を用いた場合、醸造香といった特徴のある香味を添加することができる。【００４０】
乳酸菌は、発酵乳、乳酸菌飲料、チーズ発酵乳等の製造に用いられる公知の菌であれば、適用可能である。例えばラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の乳酸菌が好適に例示される。【００４１】
不完全菌類としては、例えば、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属のゲオトリクム  キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム  レクタングラタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｔｕｍ）、及びゲオトリクム  クレバニ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｋｌｅｂａｈｎｉｉ）等であり、より好ましくは、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）若しくはその変異体、又はそれらの形質転換体である。【００４２】
ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する微生物を単離し得る単離源としては、土壌、植物、空中、繊維、木材、ハウスダスト、飼料、河川、サイレージ、食品、果実、穀類、肥料、工場排水、堆肥、排泄物、消化管などが挙げられるが、好ましくは、果実（コーヒー果実）である。【００４３】
単離方法としては、例えば、コーヒー果実を滅菌水中で攪拌し、その上澄み液を、適当な抗生物質を含有する寒天培地に塗末して培養し、発生したコロニーを単離する等の方法が挙げられるが、適当な菌体保存施設等から直接購入することも可能である。【００４４】
尚、本発明でいう変異体とは、自然突然変異によるもの、もしくは人為的に突然変異を誘発（放射線や突然変異物質による処理等）させることにより得られたものを含み、ＤＮＡの塩基配列が野生株（ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００））と比べて変化したものをいう。【００４５】
（１）自然突然変異（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）
微生物が通常の環境下で正常に生育しているときに発生する突然変異を、自然突然変異という。自然突然変異の主な原因は、ＤＮＡ複製時の誤りと、内在性の突然変異原物質（ヌクレオチドアナログ）であると考えられている（真木，「自然突然変異と修復機構」，細胞工学  Ｖｏｌ．１３  Ｎｏ．８，ｐｐ．６６３−６７２，１９９４）。【００４６】
（２）人為的な突然変異
２−１．放射線や突然変異原物質（ｍｕｔａｇｅｎ）による処理
紫外線やＸ線などの放射線処理、あるいはアルキル化剤のような人工的な突然変異原物質処理によって、ＤＮＡに損傷が生じる。その損傷は、ＤＮＡ複製の過程で突然変異に固定される。【００４７】
２−２．ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法の利用
ＰＣＲ法は、試験管内でＤＮＡを増幅するため、細胞内の突然変異抑制機構の一部が欠けており、高頻度に突然変異の誘発が可能である。また、遺伝子シャフリング法（Ｓｔｅｍｍｅｒ，”Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３７０，  ｐｐ．３８９−３９１，  Ａｕｇ．  １９９４  ）と組み合わせることで、有害突然変異の蓄積を避け、複数の有益突然変異を遺伝子に蓄積することができる。【００４８】
２−３．ミューテーター（ｍｕｔａｔｏｒ）の利用
ほとんどすべての生物では、突然変異抑制機構によって、自然突然変異の発生率が非常に低いレベルに保たれている。この突然変異抑制機構には、１０種類以上の遺伝子が関与した複数の段階が存在する。これらの遺伝子の１つあるいは複数が破壊された個体は、高い頻度で突然変異を発生するので、ミューテーターと呼ばれている。また、これらの遺伝子は、ミューテーター遺伝子と呼ばれている（真木，「自然突然変異と修復機構」，細胞工学  Ｖｏｌ．１３  Ｎｏ．８，  ｐｐ．６６３−６７２，  １９９４；  Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ．  ａｌ．，”Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ”，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７  Ｎｏ．１，  ｐｐ．２９−３６，  Ｊａｎ．  １９９９）。【００４９】
また、本発明でいう形質転換体とは、他種の生物の持つ遺伝子（外来遺伝子）を新規微生物（ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００））若しくはその変異体に人工的に導入したものを意味する。製法としては、例えば、外来遺伝子を適当な発現ベクター内に組み込み、その発現ベクターを、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法で導入する。【００５０】
微生物が乾燥したものである場合は、それぞれの適した方法にそって覆水を行うことができる。例えば、乾燥酵母を用いる場合、３７〜４１℃に加温した水に２０〜３０分懸濁してから用いることができる。【００５１】
本発明における微生物の使用量は、香味の添加の効果が得られれば特に限定されないが、培養時間やコストを考え、適宜設定できる。例えば、コーヒー生豆重量あたりでは、酵母及び乳酸菌の場合では１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｇ〜１．０×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇが適当であり、不完全菌の場合は、１．０ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇが適当である。【００５２】
（酢酸を産生する微生物）
本発明における酢酸を産生する微生物（酢酸産生菌）としては、例えば、アルコール酸化能を有するアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属及びグルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属等の酢酸菌類が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、酢酸を主として産生し得るが、他に有機酸（クエン酸、コハク酸、リンゴ酸など）やアルコール等の種々の有機化合物をも産生し得る微生物を含む。【００５３】
（ｐＨ調整工程）
本発明の発酵工程において、資化成分に発酵処理用微生物を接触させる際に、酢酸を産生する微生物の増殖を抑制可能なｐＨの範囲としては、ｐＨ２〜５が好ましく、ｐＨ２．４〜４．７が特に好ましい。従って、資化成分と発酵処理用微生物とが接触する環境がこのｐＨの範囲内にならない場合、ｐＨ調整剤を用いてｐＨを調整することが好ましい。
ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、リン酸等の酸が挙げられるが、好ましくは乳酸又はリン酸である。尚、他のｐＨ調整剤として、これらの酸の塩を使用することも可能であるし、あるいは、これらの酸とその塩とを含有する緩衝液を用いることも可能である。
ｐＨ調整工程は、資化成分と発酵処理用微生物とが接触する前であっても、後であっても実施できる。好ましくは、資化成分と発酵処理用微生物とが接触する前に実施することによって、前記発酵工程を、資化成分と発酵処理用微生物との接触開始時から雑菌の繁殖が抑えられる状態で開始することが出来る。【００５４】
（発酵工程）
１．微生物と資化成分との接触方法
本発明において、発酵工程において微生物と資化成分とを接触させる方法には、例えば以下の方法が挙げられる。
（ａ）直接法
直接法は、コーヒー生豆の存在下において微生物を資化成分に直接接触させる方法である。例えば、ナイフ等で表面に傷を付けてコーヒー果肉を一部露出させたコーヒー果実（又は、精製工程にてコーヒー生豆と分離されたときに得られるコーヒー果肉とコーヒー生豆との混合物）に、ｐＨ調整剤を用いてそのｐＨを増殖抑制ｐＨに調整した水に上記発酵処理用微生物を懸濁した懸濁液を、噴霧あるいは散布して直接接触させて発酵させる。あるいは、比較的大量の水（例えば、コーヒー果実と等重量程度の量）に薄い濃度で発酵処理用微生物を懸濁させた懸濁液を用意しておき、その懸濁液にｐＨ調整剤を添加してそのｐＨを増殖抑制ｐＨに調整する。次いで、発酵させるべきコーヒー果実をその懸濁液中に浸漬して引き上げることで接触させた後、発酵させる。
特に、一部果肉を露出させたコーヒー果実を用いて発酵させる場合、微生物が露出部分からコーヒー果実内に浸入し易くなり、しかも資化される糖分等が果肉中に高濃度で局在するので効率良く発酵が進むと共に、すぐ近傍にコーヒー生豆が存在するので発酵により産生されたアルコール類やエステル類等の発酵成分が速やかにコーヒー生豆中に移行する。尚、乾燥させたコーヒー果実（もしくはコーヒー果肉）を使用する場合は、適度に水分を含ませた状態で発酵させても良い。【００５５】
（ｂ）間接法
間接法は、発酵液を備える発酵槽を用意して、ｐＨ調整剤を使用して増殖抑制ｐＨに調整された発酵液中にコーヒー生豆、資化成分、及び発酵処理用微生物を添加し、発酵液中に溶出する資化成分に発酵処理用微生物を接触させる方法である。例えば、発酵処理用微生物と、ナイフ等で表面に傷を付けてコーヒー果肉を一部露出させたコーヒー果実（又は精製工程にてコーヒー生豆と分離されたときに得られるコーヒー果肉とコーヒー生豆との混合物）とを、予め増殖抑制ｐＨに調整された発酵液中に添加して発酵させる。この場合、果肉が露出しているので発酵液中に果肉中の糖分等が溶出し易くなっており、発酵処理用微生物による発酵が促進される。【００５６】
２．発酵条件
微生物の発酵条件については、酢酸を産生する微生物の増殖を抑制するｐＨの範囲内で前記資化成分と前記発酵処理用微生物とを接触させる条件に少なくとも一時的におかれることを満たせば（例えば、かかるｐＨ範囲になるように調整した後に本工程を開始する、発酵成分の産生が活発に行われる時期にかかるｐＨ範囲になるように調整する等）、特に限定されない。必要に応じて発酵に適した条件（例えば、使用する微生物の種類やその菌量（初期菌数）、資化成分の種類や量（濃度）、温度、湿度、酸素又は二酸化炭素濃度、発酵時間等）を適宜設定することができる。また他にも例えば、上記の資化成分以外にも、必要に応じて窒素源や炭素源を補うための市販の栄養培地などを補助的に添加することもできる。【００５７】
本発明における発酵工程においては、雑菌（酢酸産生菌を含む）汚染防止のため、雑菌の増殖を抑えるように温度、二酸化炭素濃度等といった条件をそれぞれ単独か、又は適宜任意に組み合わせて制御して発酵させてもよい。例えば、１５〜３０℃といった低温環境下にて発酵させたり、あるいは二酸化炭素濃度（又は酸素濃度）を上げて、より嫌気的（又は好気的）な条件下で発酵を実施するなどしても良い。【００５８】
また、本発明における発酵工程においては、上記の発酵条件（例えば、使用する微生物の種類やその菌量（初期菌数）、資化成分の種類や量（濃度）、温度、湿度、ｐＨ、酸素又は二酸化炭素濃度、発酵時間等）を自動及び／又は手動で制御可能な設備・装置（例えば、恒温槽、タンク、貯蔵庫等）にて発酵工程を行うこともできる。【００５９】
尚、発酵工程に要する時間は限定されず、添加される香味の質・強さによって、あるいは、微生物や資化成分によって、適宜、選択すればよい。また、資化成分の枯渇を目安に、発酵工程を終了してもよい。【００６０】
発酵工程を終了するには、加熱滅菌、水洗、天日干し、資化成分とコーヒー生豆との分離、又は焙煎といった処理を単独で実施するか、あるいは任意に組み合わせて実施して終了させることができる。例えば、乾燥機を用いる場合、５０〜６０℃で１〜３日程度乾燥させることにより、発酵を終了させることができる。【００６１】
尚、本発明において、微生物（２種類以上の微生物を選択して、それらを同時に使用することも可能）や発酵条件をそれぞれ適宜選択して、任意に組み合わせることによって、コーヒー生豆に様々な香味を添加することも可能である。【００６２】
３．発酵工程の一例
ここでは、コーヒー果実を用いて発酵を行う例を説明する。
本発明は、例えば、コーヒー生豆の精製工程中に発酵工程を行うことができる。【００６３】
非水洗式の精製工程では、例えば、コーヒー果実を収穫し、上記の直接法により発酵処理用微生物を接触させて発酵させた後、乾燥させる。【００６４】
水洗式の精製工程では、例えば、コーヒー果実を収穫し、水槽に沈めて不純物を除去する際、水槽中の水のｐＨを適当なｐＨ調整剤を用いて増殖抑制ｐＨに調整し、上記の間接法により発酵処理用微生物とコーヒー果実とをその水槽（発酵槽）に添加して発酵させる。【００６５】
尚、本発明はまた、コーヒー果実の収穫前に、木に生っている状態で果肉を露出させて上記直接法により発酵させてもよい。【００６６】
発酵工程を終了したコーヒー果実は、その後、水等で発酵処理用微生物を洗い流して分離してからか、あるいは発酵処理用微生物を付着させたままで、通常の精製工程に沿って果肉が除去され、脱穀されてコーヒー生豆が分離される。【００６７】
このようにして分離されたコーヒー生豆は、通常の方法で焙煎処理することが可能であり、焙煎度合の異なる種々のコーヒー焙煎豆（ライトロースト〜イタリアンロースト）を得ることができる。【００６８】
得られたコーヒー焙煎豆は、粉砕して加水し、濾材により濾過抽出することによってレギュラーコーヒーとして飲用に供することができるほか、工業用原料としてインスタントコーヒー、コーヒーエキス、缶コーヒーなどに使用することが可能である。【００６９】
以下、本発明について、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７０】
資化成分としてマスト（ワインの醸造原料液）を用い、乳酸の添加の影響を検討した。
２０００ｍｌ容の三角フラスコに、チリ産赤ブドウ濃縮液を水で希釈して、比重１．０８４（１５℃）とした赤マストを１０００ｇ添加した。得られた赤マスト液のｐＨは５．０であった。これに、乳酸を７３０ｐｐｍとなるように添加したところ、ｐＨが４．０となった（試料１）。コントロールとして、乳酸を添加しないものを準備した（比較例１）。
発酵処理用微生物として、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）（以下、ＳＡＭ２４２１と称する）を、乾燥重量として０．１ｇを定法に従い復水して添加した。そこへ３００ｇのコーヒー生豆（ブラジル産サントスＮｏ．２）を添加し、２３℃で７２時間静置し発酵させた。
７２時間後の発酵液を観察した結果、乳酸を添加した試料（試料１）では、ＳＡＭ２４２１以外の菌の繁殖は認められず、また、発酵液に良好な香味を呈した。【００７１】
一方、乳酸を添加しないこと以外は同様の方法で得られた試料（比較例１）では、発酵の終盤で、雑菌と思われる微生物の繁殖が認められ、良好な醸造香のほかに、若干の酸臭が認められた。【００７２】
次に、得られた発酵液の上澄み液をサンプリングして成分分析を行った。コーヒー豆の品質に悪影響を与える代表的な雑菌として酢酸産生菌があることから、上澄み液中の酢酸濃度を液体クロマトグラフィーで分析して酢酸産生菌の増殖の有無を判断した（即ち、酢酸産生菌が増殖すると、酢酸産生量が増加して、酢酸濃度が高くなるとものと判断する）。併せて、ＳＡＭ２４２１の生育に良否については、発酵成分であるピルビン酸を指標として、上澄み液中のピルビン酸濃度を液体クロマトグラフィーで測定して評価した（即ち、ＳＡＭ２４２１が増殖すると、ピルビン酸の産生量が増加して、ピルビン酸濃度が高くなるとものと判断する）。
液体クロマトグラフィー分析の装置は、島津製作所のＨＰＬＣ一式を用いた。カラムとしてはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈを用い、電気伝導度検出器  ＣＤＤ−６Ａで検出した。カラムオーブンの温度は４０℃とし、ｐ−トルエンスルホン酸を含むＴｒｉｓバッファーで反応と溶出を行った。絶対検量線で定量した。液体クロマトグラフィーの結果を以下の表１〜表２に示す。【００７３】
【表１】
0005149619.tif 000002
【００７４】
【表２】
0005149619.tif 000003
【００７５】
このように、乳酸を添加した試料では、比較例よりも酢酸の濃度は低く、また、ピルビン酸の濃度は高かった。すなわち、発酵液に乳酸を添加することによって、雑菌の繁殖を抑え、意図的に添加した微生物（発酵処理用微生物）の増殖・発酵を促進させることがわかった。【００７６】
次に、コーヒー焙煎豆の評価を行った。発酵後の発酵液からコーヒー生豆を取り出し、水切りしたのち、固形分を当量の脱イオン水で洗浄することで除去し、コーヒー生豆を約３００ｇ得た。得られたコーヒー生豆のうち１００ｇを家庭用全自動珈琲豆焙煎機（ＣＲＰＡ−１００  トータス株式会社）で深煎りボタン操作により焙煎した。焙煎時間は約２５分程度であった。次いで、コーヒー官能専門のパネラー５名によって、コーヒー焙煎豆の官能評価を行った。試料１及び比較例１の各コーヒー焙煎豆３０ｇを粉砕せずにそのままの形状で専用の官能グラスに入れ、ガラスの蓋をした。官能時に蓋をずらし、エステリー香、酢酸臭の２種類を評価した。弱い（１点）、やや弱い（２点）、中程度（３点）、やや強い（４点）、強い（５点）の５段階で、０．５点きざみで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表３に示す。試料１のコーヒー焙煎豆は比較例１に比べて、良好な香りであった。【００７７】
【表３】
0005149619.tif 000004
【００７８】
上記試料１及び比較例１のコーヒー焙煎豆を用いてコーヒー抽出液を調製した。各コーヒー焙煎豆を細挽きにし、粉砕豆１２ｇに対して熱湯を１００ｇ加えて攪拌した。カップテストの定法に従って、浮き上がったコーヒーを取り除き、上澄み液の官能評価を行った。コーヒー専門パネラー５名により実施した。評価項目は、香り（エステリー香、醸造香）及び味（ボディ感、酸味）の４種類とした。非常に弱い（１点）、から非常に強い（５点）までを０．１点刻みで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表４に示す。比較例１に比べて、実施例１のコーヒー抽出液は、香り、味ともに良好なものであった。
【００７９】
【表４】
0005149619.tif 000005
【実施例２】
【００８０】
コーヒー果実を用いて、乳酸の添加の影響を検討した。コーヒー果実（沖縄県産）１０００ｇを５０００ｍｌ容三角フラスコにとり、１０００ｍｌの水を添加した。このときのｐＨは５．５であった。これに乳酸を３０００ｐｐｍとなるように添加し、ｐＨを２．６とした（試料２）。コントロールとして、乳酸を添加しないものを準備した（比較例２）。【００８１】
発酵処理用微生物として、ゲオトリクム  スピーシーズ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）ＳＡＭ２４２１（国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３００）を、乾燥重量として１ｇを定法に従い復水して添加した。２３℃で７２時間静置し発酵させた。７２時間後の発酵液を観察した結果、乳酸を添加した試料（試料２）では、ＳＡＭ２４２１以外の菌の繁殖は認められず、また、発酵液に良好な香味を呈した。【００８２】
一方、乳酸を添加しないこと以外は同様の方法で得られた試料（比較例２）では、発酵の終盤で、雑菌と思われる微生物の繁殖が認められ、良好な醸造香のほかに、若干の酸臭が認められた。【００８３】
次に、得られた発酵液の上澄み液を経時的（２４時間、４８時間、７２時間）にサンプリングして成分分析を行った。
上記実施例１と同様に、コーヒー豆の品質に悪影響を与える代表的な雑菌として酢酸産生菌があることから、上澄み液中の酢酸濃度を液体クロマトグラフィーで分析して酢酸産生菌の増殖の有無を判断した。併せて、ＳＡＭ２４２１株の生育に良否については、発酵成分であるピルビン酸を指標として、上澄み液のピルビン酸濃度を液体クロマトグラフィーで測定して評価した。
液体クロマトグラフィー分析の装置は、島津製作所のＨＰＬＣ一式を用いた。カラムとしてはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈを用い、電気伝導度検出器  ＣＤＤ−６Ａで検出した。カラムオーブンの温度は４０℃とし、ｐ−トルエンスルホン酸を含むＴｒｉｓバッファーで反応と溶出を行った。絶対検量線で定量した。液体クロマトグラフィーの結果を表５〜表６に示す。【００８４】
【表５】
0005149619.tif 000006
【００８５】
【表６】
0005149619.tif 000007
【００８６】
このように、乳酸を添加した試料では、比較例よりも酢酸の濃度は低く、また、ピルビン酸の濃度は高かった。すなわち、発酵液に乳酸を添加することによって、雑菌の繁殖を抑え、意図的に添加した微生物（発酵処理用微生物）の増殖・発酵を促進させることがわかった。【００８７】
次に、コーヒー焙煎豆の評価を行った。発酵後のコーヒー果実を発酵液から取り出し、水切りしたのち、５５℃の乾燥器で４８時間乾燥させた後、パルピングマシーンを用いて果肉や果皮を取り除き、コーヒー生豆約２５０ｇを得た。得られたコーヒー生豆のうち１００ｇを家庭用全自動珈琲豆焙煎機（ＣＲＰＡ−１００  トータス株式会社）で深煎りボタン操作により焙煎した。焙煎時間は約２５分程度であった。【００８８】
次いで、コーヒー官能専門のパネラー５名によって、コーヒー焙煎豆の官能評価を行った。試料２及び比較例２の各コーヒー焙煎豆３０ｇを粉砕せずにそのままの形状で専用の官能グラスに入れ、ガラスの蓋をした。官能時に蓋をずらし、エステリー香、酢酸臭の２種類を評価した。弱い（１点）、やや弱い（２点）、中程度（３点）、やや強い（４点）、強い（５点）の５段階で、０．５点きざみで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表７に示す。試料２のコーヒー焙煎豆は比較例２に比べて、良好な香りであった。【００８９】
【表７】
0005149619.tif 000008
【００９０】
上記比較例２及び試料２のコーヒー焙煎豆を用いてコーヒー抽出液を調製した。各コーヒー焙煎豆をそれぞれ細挽きにし、粉砕豆１２ｇに対して熱湯を１００ｇ加えて攪拌した。カップテストの定法に従って、浮き上がったコーヒーを取り除き、上澄み液の官能評価を行った。コーヒー専門パネラー５名により実施した。評価項目は、香り（エステリー香、醸造香）及び味（ボディ感、酸味）の４種類とした。非常に弱い（１点）、から非常に強い（５点）までを０．１点刻みで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表８に示す。比較例２に比べて、試料２のコーヒー抽出液は、香り、味ともに良好なものであった。
【００９１】
【表８】
0005149619.tif 000009
【実施例３】
【００９２】
メキシコ産冷凍コーヒー果実を用いて乳酸添加の効果を確認した。発酵処理用微生物として、市販の乾燥ワイン酵母を用い直接法により発酵した。乾燥ワイン酵母（ラルビンＬ２３２３、セティカンパニーより購入）１５ｇを復水し活性化した後、１０００ｍｌの水に植菌した。そこへ、解凍したメキシコ産冷凍コーヒー果実１ｋｇを添加して酵母と接触させた。この後、笊を使用して酵母溶液とコーヒー果実を分離し、２Ｌ容のボトルに移して、静置して３日間発酵させた。乳酸の添加を確認するための実験区としては、酵母溶液（１Ｌ）に乳酸を３０００ｍｇ添加したもの（試料３）を用いた。コーヒー果実添加後の酵母溶液のｐＨは、乳酸無添加のもの（比較例３）で５．８、乳酸を３０００ｐｐｍとなるように添加したもの（試料３）で４．７であった。
上記比較例３及び試料３にて得られた発酵終了時のコーヒー果実の果肉中に含まれる酢酸の含有量について評価した。
上記比較例３及び試料３にて得られた発酵終了後のコーヒー果実（３粒〜５粒）から果肉を取り出し、その果肉から絞り取った果汁を水で２０倍希釈して果汁希釈液を調製した。次いで、液体クロマトグラフィーで、その果汁希釈液中の酢酸の濃度（ｐｐｍ）を測定した。
液体クロマトグラフィー分析の装置は、島津製作所のＨＰＬＣ一式を用いた。カラムとしてはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈを用い、電気伝導度検出器  ＣＤＤ−６Ａで検出した。カラムオーブンの温度は４０℃とし、ｐ−トルエンスルホン酸を含むＴｒｉｓバッファーで反応と溶出を行った。絶対検量線で定量した。【００９３】
【表９】
0005149619.tif 000010
【００９４】
酢酸産生菌（コーヒー豆の品質に悪影響を与える代表的な雑菌）がコーヒー果実中で増殖すると、酢酸産生量が増加して果肉中に含まれる酢酸含有量が増加し、その結果、果汁中の酢酸濃度が高くなる。比較例３の果肉中の酢酸濃度は試料３の果肉中の酢酸濃度のとものに比べて非常に高い。従って、この点からも、試料３において酢酸産生菌の増殖が抑制されていることがわかる。【００９５】
次に、コーヒー焙煎豆の評価を行った。上述の発酵後のコーヒー果実について、パルピングマシーンを用いて果肉や果皮を取り除き、コーヒー生豆約２５０ｇを得た。得られたコーヒー生豆のうち１００ｇを家庭用全自動珈琲豆焙煎機（ＣＲＰＡ−１００  トータス株式会社）で深煎りボタン操作により焙煎した。焙煎時間は約２５分程度であった。次いで、コーヒー官能専門のパネラー５名によって、コーヒー焙煎豆の官能評価を行った。比較例３及び試料３の各コーヒー焙煎豆３０ｇを粉砕せずにそのままの形状で専用の官能グラスに入れ、ガラスの蓋をした。官能時に蓋をずらし、エステリー香、酢酸臭の２種類を評価した。弱い（１点）、やや弱い（２点）、中程度（３点）、やや強い（４点）、強い（５点）の５段階で、０．５点きざみで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表１０に示す。試料３のコーヒー焙煎豆は比較例３に比べて、良好な香りであった。【００９６】
【表１０】
0005149619.tif 000011
【００９７】
上記比較例３及び試料３のコーヒー焙煎豆を用いてコーヒー抽出液を調製した。各コーヒー焙煎豆をそれぞれ細挽きにし、粉砕豆１２ｇに対して熱湯を１００ｇ加えて攪拌した。カップテストの定法に従って、浮き上がったコーヒーを取り除き、上澄み液の官能評価を行った。コーヒー専門パネラー５名により実施した。評価項目は、香り（エステリー香、醸造香）及び味（ボディ感、酸味）の４種類とした。非常に弱い（１点）、から非常に強い（５点）までを０．１点刻みで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表１１に示す。比較例３に比べて、試料３のコーヒー抽出液は、香り、味ともに良好なものであった。
【００９８】
【表１１】
0005149619.tif 000012
【実施例４】
【００９９】
コーヒー果実を用いて、リン酸の添加の影響を検討した。コーヒー果実（沖縄県産）１０００ｇを３０００ｍｌ容三角フラスコにとり、１０００ｍｌの水を添加した。このときのｐＨは５．５であった。リン酸を３０００ｐｐｍとなるように添加し、ｐＨを２．４とした（試料４）。コントロールとして、リン酸を添加しないものを準備した（比較例４）。
発酵処理用微生物として、ゲオトリクム  キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ  ＩＡＭ１２７００株（東京大学分子細胞生物学研究所から購入、以下ＩＡＭ１２７００と称する）を、乾燥重量として１ｇを定法に従い復水して添加した。２３℃で７２時間静置し発酵させた。７２時間後の発酵液を観察した結果、リン酸を添加した試料では、ＩＡＭ１２７００以外の菌の繁殖は認められず、また、発酵液に良好な香味を呈した。
一方、リン酸を添加しないこと以外は同様の方法で得られた試料（比較例４）では、発酵の終盤で、雑菌と思われる微生物の繁殖が認められ、良好な醸造香のほかに、若干の酸臭が認められた。
次に、得られた発酵液の上澄み液をサンプリングして、その最終組成を分析した。コーヒー豆の品質に悪影響を与える代表的な雑菌として酢酸産生菌があることから、上記実施例１と同様に、上澄み液中のリン酸及び酢酸の濃度を液体クロマトグラフィーで分析して酢酸産生菌の増殖の有無を判断した。
液体クロマトグラフィー分析の装置は、島津製作所のＨＰＬＣ一式を用いた。カラムとしてはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈを用い、電気伝導度検出器  ＣＤＤ−６Ａで検出した。カラムオーブンの温度は４０℃とし、ｐ−トルエンスルホン酸を含むＴｒｉｓバッファーで反応と溶出を行った。絶対検量線で定量した。液体クロマトグラフィーの結果を表１２に示す。
【０１００】
【表１２】
0005149619.tif 000013
【０１０１】
このように、リン酸を添加した試料（試料４）では、比較例４よりも酢酸濃度は低く（即ち、酢酸産生量は少量）、雑菌の繁殖を抑えていることがわかった。【０１０２】
次に、コーヒー焙煎豆の評価を行った。発酵後のコーヒー果実を発酵液から取り出し、水切りしたのち、５５℃の乾燥器で４８時間乾燥させた後、パルピングマシーンを用いて果肉や果皮を取り除き、コーヒー生豆約２５０ｇを得た。得られたコーヒー生豆のうち１００ｇを家庭用全自動珈琲豆焙煎機（ＣＲＰＡ−１００  トータス株式会社）で深煎りボタン操作により焙煎した。焙煎時間は約２５分程度であった。次いで、コーヒー官能専門のパネラー５名によって、コーヒー焙煎豆の官能評価を行った。比較例４及び試料４の各コーヒー焙煎豆３０ｇを粉砕せずにそのままの形状で専用の官能グラスに入れ、ガラスの蓋をした。官能時に蓋をずらし、エステリー香、酢酸臭の２種類を評価した。弱い（１点）、やや弱い（２点）、中程度（３点）、やや強い（４点）、強い（５点）の５段階で、０．５点きざみで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表１３に示す。試料４のコーヒー焙煎豆は比較例４に比べて、良好な香りであった。【０１０３】
【表１３】
0005149619.tif 000014
【０１０４】
上記比較例４及び試料４のコーヒー焙煎豆を用いてコーヒー抽出液を調製した。各コーヒー焙煎豆をそれぞれ細挽きにし、粉砕豆１２ｇに対して熱湯を１００ｇ加えて攪拌した。カップテストの定法に従って、浮き上がったコーヒーを取り除き、上澄み液の官能評価を行った。コーヒー専門パネラー５名により実施した。評価項目は、香り（エステリー香、醸造香）及び味（ボディ感、酸味）の４種類とした。非常に弱い（１点）、から非常に強い（５点）までを０．１点刻みで評価した。５名の評価点の平均値で表した。結果を表１４に示す。比較例４に比べて、試料４のコーヒー抽出液は、香り、味ともに良好なものであった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、精製や焙煎といったコーヒー果実の加工処理業を始めとして、本発明によって処理されたコーヒー生豆の焙煎豆から種々の製品（レギュラーコーヒー、インスタントコーヒー、缶コーヒー、コーヒーアロマ等）を製造する、コーヒー飲料類の製造業においても非常に有用であり、このような産業のさらなる発展に寄与するものである。