(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳化抽出によりポリマーで被覆され抗癌剤を含む生物分解性ミクロスフェアの調製方法であって、
ポリマーを添加する前に激しく攪拌しながら抗癌剤を、共溶媒なしに有機溶媒中に分散させる工程、
ポリマーを添加し、室温で２から４時間一定速度の撹拌を維持し、次いで、温度を１５分間１から５℃との間に下げる工程、
エマルジョンを得るために、水相と有機相を同じ温度にして、水相と得られた有機相を混合する工程、
水を添加することにより有機溶媒を抽出する工程、及び
得られたミクロスフェアの懸濁液を濾過する工程、
を含む、生物分解性ミクロスフェアの調製方法。
【請求項２】
有機溶媒がジクロロメタンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水相及び有機相が混合されるときに、水相及び有機相が２℃に等しい温度を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
有機相がポリマーを11％含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
水相／有機相の比率が100／3に等しいことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
水相と有機相とからなるエマルジョンが少なくとも３分間混合されることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒の抽出に必要とされる水が、エマルジョン／水の容量比が1／3に等しくなるような割合で添加されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒の抽出に必要とされる水の温度が４℃であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
有機溶媒中に分散される前に抗癌剤が粉砕され、それにより抗癌剤の結晶サイズが15と50μｍとの間であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抽出水が添加された後に、得られる懸濁液が不活性雰囲気下で濾過されることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ミクロスフェアが凍結乾燥されていることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、グリア芽細胞腫の治療のための抗癌剤を放出する生物分解性ミクロスフェアの使用に関する。
【０００２】  グリア芽細胞腫は、全米希少疾病患者団体によって列挙された希少疾患のグループに属する。
【０００３】  悪性グリア腫瘍は、その系列（series）によれば、頭蓋内の腫瘍の13から22％に相当する中枢神経系の一次腫瘍である。組織学的観点から、2種の悪性グリア腫瘍は、実際、未分化な星状細胞腫及びグリア芽細胞腫に区別され、後者はこれらの腫瘍の最も未分化な形を表す。
【０００４】  現在、悪性グリア腫瘍に対する有効な治療法はない。グリア芽細胞腫を患っている患者の生存期間は、たとえ化学療法及び放射線療法を手術と組み合わせても1年を超えない。
【０００５】  悪性グリア腫瘍の治療法、主に3つの現象によって制限される。
【０００６】  第1は、中枢神経系を身体の他の部分と隔離する血液脳関門（BBB）の存在である。このBBBは、サイズが小さい脂溶性分子のみを通過させる。他の分子は、中枢神経系に到達するためには非常に高用量を投与されなければならず、相当な全身性副作用という代償を払うことになる。
【０００７】  グリア腫瘍の治療効果を制限する第2の要因は、これらの腫瘍の浸潤性である。脳は高機能器官であるから、腫瘍学的な語義において相容れない手術をすることは不可能である。最も完全な切除の可能性は、巨視的に完全な切除であって、切除の空洞の壁に浸潤した多数の腫瘍細胞を残す。更に、多くの著者は、手術され、放射線療法で治療された悪性グリア腫瘍の90％は、最初の腫瘍の部位から2センチメートル以内の距離で再発することを示した。
【０００８】  グリア腫瘍の治療効果を制限する最後の要因は、低い治療指数である。腫瘍細胞は、例えば、放射線治療又は特定の抗癌剤が原因となる攻撃に対して非常にもろく傷つき易い、いわば正常組織の背後で保護される。従って、正常神経細胞を破壊せずに腫瘍細胞を破壊することは困難である。
【０００９】  グリア腫瘍の治療において達成された進歩は不十分である（Kornblith PL, Walker M, Chemotherapy for malignant gliomas. J. Neurosurg, 68: 1-17, 1988; Shapiro WR, Green SB, Burger PC, Selker RG, VanGilder JC, Robertson JT, Mahaley SM, A randomized comparison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5-fluorouracil, for newly diagnosed patients with malignant glioma, J. Neurosurg. 76: 772-781, 1992）。
【００１０】  現在、外科的切除の後の従来のグリア芽細胞腫の治療は、外部からの放射線療法に基く。1年以上の生存期間を達成することは不可能である。放射線療法を1−（2−クロロエチル）−3−シクロヘキシル−1−ニトロソウレア（BCNU）を用いる化学療法と組み合わせることは、未分化星状細胞腫にのみ有効である。生存期間の変更なしで18ヶ月の時点での生存者の割合を上昇させるのみであるから、これはわずかな寄与でしかない。更に、免疫療法はそれ自身この領域においては確立されておらず、遺伝治療はまだ立証されていない。
【００１１】  血液脳関門の浸透圧破壊（osmotic rupture）、脳脊髄液への注射、頚動脈内の注入及び皮下の貯蔵器を用いる腫瘍内投与のような抗癌剤の局所濃度の上昇を目的とするいくつかの技術に対する実験が実施された（Tamargo RJ 及びBrem H, Drug delivery to the central nervous system, Neurosurgery Quarterly, 2:259-279, 1992）。これらの技術のうちどれも患者の生存期間を上昇させることはできず、いくつかは毒性が強いことがわかった。
【００１２】  過去数年にわたって、ガレヌス製剤における研究によって、分解に対して活性物質を保護し、与えられた期間にわたって局所での放出を制御することができ、同時に全身性副作用を軽減する移植可能なポリマーシステムを発展させることができた。これらの移植可能なポリマーシステムの利点によって、最近、いくつかのチームの中枢神経系の病理におけるそれらの使用の研究が促進されている（Langer R, Polymer implants for drug delivery in the brain, J. Controlled Release, 16:53-60, 1991）。特に、悪性グリオーマの腫瘍切除壁に移植されたそのようなシステムは、腫瘍の再発を遅延させ、患者の生存を延長させる。再発の90％の原因となる分離された悪性細胞は、手術の後に残された空洞の周りに消えずに残り、再発は手術の場所から2センチメートル以内に起こる。この領域内において、神経組織は機能的であり、血液脳関門はまだ無傷であり、従来の化学療法及び放射線療法の作用は制限される。
【００１３】  活性分子を放出する様々な移植可能なポリマーシステムは開発され、動物で試験されている。
【００１４】  PCPP-SA（ポリ［1,3−ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン−コ−セバシン酸］）から構成され、BCNU（GLIADEL（登録商標））を放出する生物分解性ウエハのシステムは、臨床研究における控えめな結果にもかかわらず、開発された（Brem H, Polymers to treat brain tumors, Biomaterials 11: 699-701, 1990; Brem H ,Mahaley MS, Vick NA, Black KL, Schold SC, Eller TW, Cozzens JW, Kenealy JN, Interstitial chemotherapy with drug polymer implants for the treatment of recurrent gliomas, J. Neurosurg 74: 441-446, 1991; Brem H, Walter KA, Langer R, Polymers as controlled drug delivery devices for the treatment of malignant brain tumors, Eur J Pharm Biopharm, 39 (1): 2-7, 1993; Brem H, Piantadosi S,Burger PC,Walker M, et al., Placebo-controlled trial of safety and efficacy of intraoperative controlled delivery by biodegradable polymers of chemotherapy for recurrent glioma, Lancet, 345: 1008-1012, 1995）。
【００１５】  BCNUを放出するミクロスフェアは開発されたが、動物における試験の結果は、比較的有望でない（Torres Al, Boisdron-Celle M, Benoit JP, Formulation of BCNU-loaded microspheres: influence of drug stability and solubility on the design of the microencapsulation procedure, J. Microencapsulation, 13: 41-51, 1996; Painbeni T, Venier-Julienne MC, Benoit JP, Internal morphology of poly(D,L-lactide-co-glycolide) BNCU-loaded microspheres. Influence on drug stability, Eur. J. Pharm. Biopharm, 1998,45,31-39）。
【００１６】  本発明の主題は、グリア芽細胞腫の治療のために、抗癌剤を放出する移植可能な生物分解性ミクロスフェアの使用である。これらのミクロスフェアの使用は、放射線療法及び手術と組み合わせられる。腫瘍の切除後、抗癌剤を放出する生物分解性ミクロスフェアが組織内注入により手術部位に移植される。次いで、介入から最大7日間以内に放射線療法が行われる。
【００１７】  これらのミクロスフェアを使用することにより、本出願人は、グリア芽細胞腫を患う患者の生存期間を倍増することに、全く有利に成功した。特に、本発明のミクロスフェアの使用により、少なくとも９０週間の生存期間を達成できる。
【００１８】  その結果、本発明は、ミクロスフェアがグリア腫瘍の切除後の手術部位に移植されることが意図される、グリア芽細胞腫を治療するために放射線療法と同時に、別々に又はその間にわたり使用されることが意図される医薬品を製造するための、放射線増感性の抗癌剤を放出する生物分解性ミクロスフェアの使用に関し、該抗癌剤を含む該ミクロスフェアが抗癌剤の放出を遅らせ、このように治療される患者について少なくとも約90週、好ましくは約130週、さらにより好ましくは160週の生存期間を達成する目的で実質空間において治療的有効濃度を長い間維持するポリマーで被覆されていることを特徴とする、使用。
【００１９】  本発明の文脈において使用されるミクロスフェアは、好ましくは親水性及び／又は血液脳関門を通過しない抗癌剤を含む。好都合には、抗癌剤は中枢神経毒性を示さない。この抗癌剤は、好ましくは分裂している細胞に作用する。
【００２０】  抗癌剤は、放射線増感性抗癌化合物又は、前記抗癌化合物が、例えば５−フルオロウラシル（5-FU）、カルボプラチン及びシスプラチンのようなプラテン類、ドセタクセル(docetaxel)及びパクリタクセル(paclitaxel)のようなタクサン類(taxanes)、ゲムシタバイン(gemcitabine)、VP16、マイトマイシン、ヨードクスウリジン、イリノテカン、トポテカン及びカンプトテシンのようなトポイソメラーゼ１インヒビター、BCNU、ACNU又はMCNUのようなニトロソウレア類、メトトレキセート、ブレオマイシン、アドリアマイシン、サイトキサン及びビンクリスチン、IL2、IL6、IL12及びIL13のような免疫調節性サイトカイン及びインターフェロンから選ばれる少なくとも１種の放射線増感性抗癌化合物を含む抗癌化合物の混合物からなる。
【００２１】  抗癌剤は、好ましくは５-FUである。
【００２２】  ５-FUは、長期間存在する、よく知られた抗有糸分裂剤である。それは、血液脳関門を非常に少ししか通過しない親水性の分子であり、そのため、局所投与によりその活性が増大する（Bourke RS, West CR,Chheda G et al., Kinetics of entry and distribution of 5-fluorourasil in CSF and brain following intravenous injection in primate, Cancer Res,33:1735-1746,1973; Gerosa MA,Dougherty DV,Wilson CB, Rosenblum ML,Improved treatment of a brain tumor model,Part2:Sequential therapy with BCNU and 5-fluorouracil, J.Neurosurg.58:368,1983;Kotsilimbas DG,Karpf R, Meredith S, Scheinberg LC, Evaluation of parenteral 5-FU on experimental brain tumors, Neurology,16:916-918,1966;Levin VA,Edwards MS,Wara WM,Allen J,Ortega J,Vestnys P,5-fluorouracil and 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea (CCNU) followed by hydroxyurea, misonidazole and irradiation for brain stem gliomas: a pilot study of the brain tumor research center and the children cancer group, Neurosurgery,14:679-681,1984;Oda Y, Tokuriki Y, Tsuda E, Handa H, Kieler J, Trial of anticancer pellet in malignant brain tumors, 5-FU and urokinase embedded in silastic. Proceeding of the 6th European Congress of Neurosurgery, Acta neurochirurgica, Suppl.28:489-490,1979; Penn RD, Kroin JS, Harris JE, Chiu KM, Braun DP, Chronic intratumoral chemotherapy of a rat tomor with cisplatin and fluorouracil, Appl. Neurophysio,46:240-244,1983;Shapiro WR, Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: Evaluation of 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea, vincristine and 5-fluorouracil,J.Nat.Cancer Institute, 46(2),359-368,1971;Shapiro WR, Green SB, Burger PC, Selker RG, VanGilder JC, Robertson JT, Mahaley SM, A randomized comparison of intra-arterial versus intravenous BCNU with or without intravenous 5-fluorouracil, for newly diagnosed patients with malignant glioma, J. Neurosurg, 76:772-781, 1992;Soloway AH, Mark VH, Dukat EG et al., Chemotherapy of brain tumors. I-Transplanted murine ependymoblastomas, Cancer Chemother Rep., 36:1-4, 1964）。
【００２３】  5-FUの活性はこのように持続した投与により増加する。5-FUは、核酸合成を妨げることにより作用する薬剤である。研究により、マウス悪性グリオーマ細胞（L9）の30〜50％のみ、及びヒト悪性グリオーマ細胞の14〜44％のみが、与えられた瞬間に分裂していることが示された。加えて、グリア芽細胞腫の細胞周期の持続期間は長い（L9グリオーマで20時間、ヒトグリア芽細胞腫で3から7日間）。ここで、５-FUの血漿中のクリアランスは速い（半減期30分）（Neuwelt EA, Barnett PA, Frenkel EP, Chemotherapeutic agent permeability to normal brain and delivery to avian sarcoma virus-induced brain tumors in the rodent:observation on problems of drug delivery, Neurosurgery, 14:154-160,1984）。従って、５-FUは、全身投与又は局所注入を介して多数の悪性細胞を破壊しない。
【００２４】  5-FUは、本質的に、速い更新を受ける組織に活性であり、例外的に神経毒性がある。5-FUは、増殖及び再生を保証するために、速く成長することが特に必要な組織の核酸合成を妨げる。これは、勿論、有糸分裂が正常状態では稀であり、グリアの集団間でのみ起こる大脳組織のケースではない。一般的ルートによる投与を制限する5-FUの毒性は、本質的に、血液学的なもの及び胃腸のものである。5-FUの神経学的副作用はめったに発表されないが、比較的知られていないそれらの原因病理は、おそらく多要因性である（5-FU異化代謝産物によるクレブス回路の遮断又は既に存在するチアミン欠乏の増悪）（Aoki N, Reversible Ieukoencephalopathy caused by 5-fluorouracil derivatives, presenting as akinetic mutism, Surg Neurol, 25:279-282, 1986; Moore DH, Fowler WC, Crumpler LS, 5-fluorouracil neurotoxicity, case report, Gynecol Oncology, 36:152-154, 1990）。
【００２５】  最後に、5-FUは放射線増感性である（Koutcher JA, Alfieri AA, Thaler H et al., Radiation enhancement by biochemical modulation and 5-FU, Int. J.Radit, Biol. Phys.,39:1145-1152,1997）。
【００２６】  すでに1960年代には、動物モデル及びインビトロでの腫瘍細胞において、これらの分離された各治療における5-FU／放射線療法の組み合わせの優位性が示されていた（Bagshaw M, A possible role of potentiation in radiation therapy, Amer J. Roentgenol, 85:822-833,1961; Vietti T, Eggerding F, Valeriote F, Combined effect of X-radiation and 5-fluorouracil on survival of transplanted leukemic cells, J.Natl. Inst., 47:865-870,1971）。この相乗作用は、腫瘍細胞集団の同調及び5-FUによる細胞修復メカニズムの減少によるものと考えられている。放射線療法と抗ピリミジン薬（5-FUまたはBrudR）との組み合わせば、既にヒトで試みられている（Goffman TE,Dachowski LJ, Bobo H et.al., Long term follow-up on national cancer institute phase I/II study of glioblastoma multiforme treated with iododeoxyuridine and hyperfractionated irradiation, J. Clinical Oncology, 10:264-268,1992）。
【００２７】  明快な有効性の欠如は、薬剤の全身経路の投与によるものと、もう一度説明されるかもしれない。
【００２８】  抗癌剤が5-FUである場合には、実質空間の濃度を反映する脳脊髄液中の当該抗癌剤の濃度は3と20ng/mlとの間である。
【００２９】  本発明の文脈において使用されるミクロスフェアに含まれる抗癌剤の神経毒性を抑えるために、神経保護性の化合物が抗癌剤に有利に添加され得る。この神経保護性化合物は、例えば、NGF又はBDNFのようなペプチド成長因子から選ばれるものである。
【００３０】  本発明の文脈において使用される生物分解性ミクロスフェアは、抗癌剤の放出を遅くし、実質空間において少なくとも３週間、好ましくは少なくとも４週間、治療上有効な濃度を維持するポリマーで被覆される。
【００３１】  ポリマーは、エチルセルロース、ポリスチレン、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ（d,l-乳酸）及びポリ（d,l-乳酸-コ-ダリコール酸）から選ばれる。
【００３２】  ポリマーは、好ましくはポリ（d,l-乳酸-コ-グリコール酸）すなわちPLAGAであり、これは、徐放性ガレヌス製剤の処方で許容される生物分解性ポリマーである（大スケールの臨床使用が認められないPCPP-SAとは異なる）。
【００３３】  ポリ（d,l-乳酸-コ-グリコール酸）は、好ましくは50:50 PLAGA（すなわち、乳酸とグリコール酸とを等量含む。）、例えばBI Chimie（フランス）により供給されるRosomer（登録商標）RG 506である。Rosomer RG 506は、重量平均分子量が72000、多分散指数が1.8、固有粘度が0.80 dl/g（25℃における、クロロホルム中での0.1%ポリマー溶液）を有する。
【００３４】  PLAGAは、疎水性共重合体であり、その分解は加水分解反応により起こり、正常な生化学的基質である乳酸とグリコール酸を生じる。これらは、好気的な解糖の最後にＣＯ2及びＨ2Ｏに代謝される。既に長く確立された研究により、呼吸器経路がこれら二つの基質を排除する主経路であることが示されている。PLAGAの生分解速度は、乳酸及びグリコール酸のそれぞれの比率に依存する。PLAGAは完全に生体適合性であり、穏やかな異物反応を引き起こす（Visscher GE,RL Robinson, HV Mauding, Fong JW, Pearson JE, Argentieri GJ, Biodegradation of and tissue reaction to 50:50 poly(DL-lactide-co-glycolide) microcapsules, J.Biomed. Mat. Res.19:345-365, 1985）。PLAGAは、手術用縫合糸の構成要素であり（Frazza EJ, Schmidt EE, A new absorbable suture. J.Biomed. Mater. Res.,5:43-58, 1971）、皮下に移植できるガレニック形態（galenic form）である（Jalil R, Nixon JR, Biodegradable poly(lactic acid) and poly(lactide-co-glycolide) microcapsules: problems associated with preparative techniques and release properties (Review), J. Microencapsulation, 7:297-325, 1990）。50:50 PLAGAのミクロスフェアは、γ線照射により滅菌され得、及び、一旦げっ歯類の脳に定位手術により移植されると２ヶ月以内に完全に生物分解され、非特異的な星状細胞及び組織球タイプの穏やかな反応のみを引き起こすことが実証された（Menei P, Daniel V, Montero-Menei C, Brouillard M, Pouplard-Barthelaix A, Benoit JP:Biodegradation and brain tissue reaction to poly(DL-lactide-co-glycolide) microspheres, Biomaterials 14:470-478,1993; Menei P, Croue A, Daniel V, Pouplard-Barthelaix A, Benoit JP:Fate and biocompatibility of three types of microspheres implanted into the brain, J.Biomed Mat Res,28,1079-1085, 1994）。後者の結果は、Kou JH, Emmett C, Shen P ら（Bioerosion and biocompatibility of poly(d,l-lactic co-glycolic acid) implants in brain, J Control Release, 43, 123-130, 1997）により確認された。
【００３５】  本発明の生物分解性ミクロスフェアは、平均直径が48±20μｍ、好ましくは46±7μｍである。それらは、抗癌剤を15から35重量％、好ましくは5-FUを19から27％、さらにより好ましくは5-FUを20％及びポリマーを65から85重量％含む。
【００３６】  本発明の文脈において、5-FUを運ぶ50:50PLAGAのミクロスフェアが特に好ましい。
【００３７】  インビトロで、5-FUを運ぶ50:50 PLAGAのミクロスフェアは、5-FUを21日間放出できる。インビボでは、これらのミクロスフェアがウサギの皮下に移植されると、血漿中の5-FUのプラトー濃度が23日間得られる。さらにインビボ及びげっ歯類の脳において、少なくとも19日目までミクロスフェア中に5-FUの結晶が見える。ウサギでは、PLAGA-5-FUミクロスフェア（7mg/kgの5-FU）を脳内に移植した後、血漿中には5-FUの痕跡も検出されない。このことにより、実質的には全身の循環内には薬剤が通過していないことの示唆が導かれる。
【００３８】  げっ歯類における、5-FUの総用量が17mg/kgとなるようなPLAGA-5-FUミクロスフェアの脳内移植の後に、全身毒性の兆候も臨床的又は組織学的神経毒性の兆候も観察されなかった。24Gyの分割線量で、5-FUミクロスフェア／脳放射線療法の組み合わせば、完全に許容されている（Menei P, Vectorisation dans le SNC par implantation stereotaxique de microspheres, These d'Universite en Sciences Pharmaceutiques, Universite d'Angers, 1995）。最後に、ラットで成長した悪性グリオーマ(C6グリオーマ)に定位手術により移植されたこれらのミクロスフェアは、有意に死亡率を減少させる（Menei P, Boisdron-Celle M,Croue A, Guy G, Benoit JP, Effect of stereotactic implantation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microsheres in normal and C6-glioma bearing rats, Neurosurgery, 39:117-124, 1996）。
【００３９】  有利には、ミクロスフェアは滅菌溶液に懸濁され、得られる懸濁液は腫瘍の切除後に手術部位の壁内に注入される。
【００４０】  滅菌溶液は、好ましくは以下のものを含む。
−1と1.5質量／容量％との間、好ましくは1.25質量／容量％の粘度調節剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム
−0.5と1.5％との間、好ましくは1％の界面活性剤、例えばポリソルベート80（登録商標）、及び
−3.5と4.5％との間、好ましくは4％の等張剤、例えばマンニトール。
【００４１】  ミクロスフェアは、好ましくは、注入の直前に即座に懸濁される。この懸濁液は、好ましくは、前記記載した滅菌溶液3mlと生物分解性ミクロスフェアを700から800mg含む。
【００４２】  グリア芽細胞腫の診断が確定し、グリア腫瘍の肉眼的切除を行った後、ミクロスフェアの懸濁液が、各cm2について少なくとも2cm、好ましくは２と3cmとの間の深さで、手術部位の壁内に移植される。
【００４３】  抗癌剤が５-FUである場合には、注入される懸濁液の総用量は、50と200mgとの間の5-FU量に相当する。
【００４４】  放射線療法を腫瘍の容積に集中させ、照射される容積は全方向に少なくとも２cmのマージンをもって手術前腫瘍を含み、50 Gyと60GYとの間の総線量が照射される。
【００４５】  放射線療法は、好ましくは手術後2日と7日との間に開始される。４と８週間との間の期間にわたり、50 Gyと60 Gyの間の総線量が、例えば毎週5フラクションの割合で展開される。
【００４６】  放射線療法は、好ましくは約６週間、再度好ましくは６．５週間で１週当たりフラクションの割合で60 Gyの総線量で実施される。
【００４７】  腫瘍切除の直後にミクロスフェアが注入された後に、腫瘍の再発の場合には、１又はそれ以上の新たなミクロスフェアの注入が定位手術により行われてよい。
【００４８】  本発明の文脈で使用されるミクロスフェアは、Boisdron-Celle M, Menei P, Benoit JP: Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres, J Pharm Pharmacol, 47, 108-114, 1995により説明された方法のバリエーションに従って、乳化抽出技術により調製され得る。
【００４９】  本発明はまた、本発明の文脈で使用されるポリマーで被覆され、抗癌剤を含むミクロスフェアの調製方法に関するものである。この方法の主要な工程は、抗癌剤及びポリマーを有機溶媒に分散させた有機相を調製することにある。有機相と水相とが乳化されて、次いで水の添加により有機溶媒が抽出される。最後に、得られたミクロスフェア懸濁液が濾過される。
【００５０】  本発明の方法は、先ず第一に、ポリマーを添加する前に激しく攪拌しながら抗癌剤を有機溶媒中に分散させることを特徴とする。
【００５１】  先行技術の方法の適応に従って、有効成分が遊星ボールミル内で粉砕される。得られる結晶のサイズは、15と50μmとの間である。カプセル化される結晶サイズ及びそれらの分散は、実際、カプセル化の程度及びインビトロでの放出速度論の制御の本質的基準である。
【００５２】  次いで、ポリマーを添加する前に、ホモジナイズ用のロッドで攪拌しながら丸底試験管内で、有効成分が有機溶媒、好ましくはジクロロメタンに懸濁される。
【００５３】  ホモジナイズにより粉砕バッチ間の差が減少し、有効成分の結晶サイズが小さくなる均一な懸濁液が得られる。
【００５４】  有機相は、共溶媒なしに溶媒中で調製される。共溶媒がないことにより、乳化相中のポリマーの沈殿が遅くなり、それにより得られる粒子は多孔性が少なくなる。
【００５５】  有効成分分散液が第１の反応器内に移される。
【００５６】  ポリマーは、8と13％との間、好ましくは11％に等しい質量割合で添加される。得られる有機相は、2〜4時間一定速度で撹拌しつつ室温に維持され、次いで、１と5℃との間、好ましくは2℃で約15分間維持される。室温でより長い期間有機相を撹拌することにより、溶媒中でのポリマーの全体の溶解が確実になる。
【００５７】  水相は、第２の反応器内で調製され、好ましくは有機相と同じ温度、好ましくは約2℃に維持される。水相及び有機相の温度の低下は、それらの粘度の増加及びカプセル化の程度の増加を引き起こす。水相は、例えば、10％のPVA水溶液である。
【００５８】  ２つのカバーで覆われた反応器が使用され、冷却液が二つの反応器内を連続して循環する。有機相及び水相の温度は、この２相が共に混合されるとき、有利には同じ、好ましくは2℃に等しい。温度の良好な管理により、粒子サイズ、有効成分の溶解速度及び溶媒の抽出速度が、効果的に一度に調整される。
【００５９】  有機相が、第１の反応器から第２の反応器内に移される。水相／有機相の容量比は、80／3と120／3との間、好ましくは100／3に等しい。
【００６０】  得られるエマルジョンは、少なくとも３分間、好ましくは３から６分間、さらにより好ましくは５分間撹拌される。この期間の選択は、放出速度論、特に24〜48時間の間のバースト効果に直接相関する。
【００６１】  十分な乳化時間と結びついた共溶媒の欠如により、表面に存在するかよく被覆されていない有効成分が溶解し、初期相の放出速度論がよりよく制御される。
【００６２】  有機溶媒を抽出するために、水が、エマルジョン／水の容量比が1／4と1／２との間、好ましくは1／3に等しくなるようにエマルジョンに添加される。抽出水の温度は、１と５℃との間、好ましくは４℃に等しい。
【００６３】  乳化及び抽出工程は、バッチ間の変化性を制限し、時間を節約するように、同じ反応器内で行われる。抽出水の温度は、有効成分の過度の溶解を制限するために低い。
【００６４】  得られるミクロスフェア懸濁液は、数分間混合され、次いで、不活性雰囲気下でろ過される。不活性雰囲気下で作業することにより、生成物のコンタミネーションの危険性を制限できる。
【００６５】  前記説明した方法により得られ得るミクロスフェアは、有利には凍結乾燥される。
【００６６】  10mlの滅菌水が２から５ｇのミクロスフェア粉末（濾過ケーキ）に添加される。この混合物は、−40℃で冷凍され、次いで、凍結乾燥機内に導かれる。凍結乾燥は１８時間続く。操作の最後に二次乾燥温度が10℃より低く維持されるべきである。
【００６７】  乾燥時でさえ、ミクロスフェアは＋４℃で貯蔵されるべきである。
【００６８】  本発明はまた、1から1.5質量／容量％の粘度調節剤、0.5から1.5％の界面活性剤及び3.5〜4.5％の等張剤を含む滅菌溶液と、抗癌剤を放出する生物分解性ミクロスフェアとからなる懸濁液にも関するものであり、該ミクロスフェアはポリマーで被覆され、前記説明されたものであり、前記説明した方法により必要に応じて得られ、ミクロスフェアの割合は滅菌溶液の200から300mg/ml、好ましくは230から270mg/mlを表す。
【００６９】  ミクロスフェアは、好ましくは15から35重量％の抗癌剤及び65％から85重量％のポリマーからなる。
【００７０】  ポリマーは、有利にはポリ（d,l-乳酸-コ-グリコール酸）であり、好ましくは乳酸及びグリコール酸を等量含む。
【００７１】  滅菌溶液は、好ましくは1.25重量／容量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム、1％ポリソルベート80及び４％のマンニトールを含む。
【００７２】  本発明は、以下の実施例により、制限されない方法で説明される。
実施例１
Boisdron-Celle M, Menei P及びBenoit JP（Preparation of biodegradable 5-fluorouracil-loaded microspheres, J Pharm Pharmacol, 47, 108-114, 1995）によって記載された方法の変法に従い、溶媒技術の乳化抽出を用いてミクロスフェアを製造した。
【００７３】 5-ＦＵの粉砕
5-ＦＵをピルベリゼッテ７（Pulverisette 7）（フリッチュ社  （Fritsch））のような遊星型ボールミル中で粉砕する。8.5ｇの5-ＦＵを７個のビーズを含むビーカー中に導入する。粉砕を速度７で10分間持続する。粉末を層流フード下にて回収する。得られた結晶は大きさが15〜50μmであり、二つのフラクション：細かいフラクション（粒子経１μm未満）及び粗いフラクション（30μm超）に分けられる。
【００７４】 有機溶媒中での5-ＦＵの分散
粉砕した5-ＦＵを丸底試験管中でウルトラ−ツラックスマシーン（Ultra-Turrax machine）のようなホモジナイザーを用いて13500rpmで３分間撹拌しながら45mlのジクロロメタンに分散する。
【００７５】 有機相の調製
5-ＦＵ分散液を150mlの被覆された冷却反応器へ移す。PLAGAをそこへ添加し、PLAGA／ジクロロメタン比率を11％に等しくする。有機相をパドルを用いて450rpm、20℃で４時間、次いで２℃で15分間撹拌する。反応器内の温度を低温保持装置を用いて0.1℃の範囲内で一定に維持する。
【００７６】 エマルジョンの調製
1500mlのオートクレーブ処理された10％ＰＶＡ水溶液を調製し、６リットル容の被覆された冷却反応器中にて２℃で維持する。次いで、最初の反応器の底部バルブを開くことによって、有機相をこの反応器中に移す。有機相を５〜10秒かけて水相へ注ぎ、水相をパドルを用いて375rpmで回転させて撹拌する。水相／有機相の体積比率は100／３である。
【００７７】  エマルジョンを４分45秒間撹拌する。
【００７８】 抽出
エマルジョンを用意し、４℃で4.5lの抽出水を、エマルジョン／水の体積比が１／３に等しくなるようにエマルジョンに注ぐ。抽出を２分持続する。
【００７９】 濾過
第２反応器の全内容物を、底部を介してステンレススチールタンクへ移し、次いで窒素雰囲気下に置く。懸濁液を細孔直径３μmのフィルターで濾過する。
【００８０】  全懸濁液をフィルターに通した後、濾過ケーキを３リットルの滅菌水で２回洗浄する。
【００８１】  得られたミクロスフェアにおける抗癌剤のカプセル封入の程度は20％である。篩いにかけた後、ジクロロメタンの除去を、オーブン中にて48時間行った。次いで、ミクロスフェアをひとまとめにし、19 kGyのγ線照射により滅菌する。さらに、滅菌後に、カプセル封入の程度の監視を行う。次いで、溶媒の微量残渣の定量を行う。0.5％のジクロロメタシ残渣レベルが有利に検出される。得られたミクロスフェアの無菌性及びインビトロ放出速度論をモニターする。
【００８２】  得られたミクロスフェアは23±3.5％の有効成分を有する。
【００８３】  前述のプロトコルにしたがっていくつかのバッチを調製し、全てのバッチの集合にわたり48±20μmの平均粒子サイズが算出され、これは46±７μm（調製されたバッチの平均の平均）に相当する。
【００８４】  得られたミクロスフェアは、23±3.5％の有効成分及び48±20μmの平均サイズを有する。
【００８５】  実施例２
実施例１の溶媒技術の乳化−抽出を用いてミクロスフェアを調製する。
【００８６】 −  5-ＦＵの粉砕
実施例１と同様な手順を行い、４ｇの5-ＦＵを粉砕する。
【００８７】  得られた結晶は大きさが15〜50μmであり、二つのフラクション：細かいフラクション（粒子サイズ１μm未満）及び粗いフラクション（30μm超）に分けられる。
【００８８】 −  有機溶媒中での5-ＦＵの分散
粉砕した5-ＦＵを丸底試験管中でウルトラ−ツラックスマシーン（Ultra-Turrax machine）のようなホモジナイザーを用いて13500rpmで3.5分間撹拌しながら40mlのジクロロメタンに分散する。
−  有機相及びエマルジョンを実施例１と同様に調製する。
−  抽出及び濾過を実施例１と同様に行う。
得られたミクロスフェアの特性
5-ＦＵ含有量：22％
大きさ：46±７μm
19 kGyの放射線滅菌から24時間後のバースト作用：40±４％。
【００８９】  実施例３
実施例１の50：50 PLAGA／5-ＦＵミクロスフェアを用いてフェーズＩ／IIオープンパイロット臨床研究を行う。
【００９０】  得られたミクロスフェアを、
−  1.25％重量／体積のカルボキシメチルセルロースナトリウム（クーパー（Cooper））、
−  １％のポリソルベート８０、
−  ４％のマンニトール、及び
−  注射剤として十分な量の水
を含有する溶液中に即時懸濁し、総体積3mlを得る。
【００９１】  溶液を、121℃、20分間のオートクレーブ、次いで5kGy〜25kGy、好ましくは19 kGyの線量でのガンマ線照射による放射線滅菌によって、プレ滅菌する。
【００９２】  泡の形成を回避しなければならないため、この懸濁液の調製は慎重に行う。ミクロスフェアがシリンジ中に沈殿し、閉塞する傾向を有するため、調製後、懸濁液を速やかに注入する。
【００９３】  グリア腫瘍の肉眼的切除術後、ミクロスフェア懸濁液を手術部位の壁に、注射あたり各cm2あたり100μlの割合で、２〜３センチメートルの深さで移植する。
【００９４】  注入は、１mlシリンジ及び18 ga（1.3×45mm）のカテーテル（インサイト（登録商標）  バイアロンTM）で行い、脳組織中に懸濁液を注入するための、傾斜のない先端にフォームを有するプラスチックカテーテル（unbeveled foam-tippedplastic catheter）のみを保持するために、その金属マンドレルを除去する。必要とされる数の１mlシリンジを使用する。勾配付き針での懸濁液の注入は、血腫の危険及びミクロスフェアの逆流を導く。カテーテルは、その直径が、脳組織を傷つけないように十分に小さく、ミクロスフェア懸濁液によって閉塞されないように十分に大きくあるべきである。
【００９５】  注入は非常に穏やかに行われるべきであり、カテーテルは、ミクロスフェアの逆流を回避するため、除去される前に数分間、適所に残存するべきである。再吸収可能な止血性の圧迫ガーゼ（サージカル（登録商標）又はスポンゲル（登録商標））の断片１cm2を注入部分に当てる。
【００９６】  本研究に含まれる患者は、18〜68才であり、腫瘍歴がなく、60より大きいKarnofsky指数を有し、支持グリア芽細胞腫を誘起するイメージング及び病歴を有し、肉眼的な完全な切除術を経験し、それらの術中の組織学的な検査（WHO基準に従って行われる：壊死、血管増殖、核多形性及び有糸分裂活性）はグリア芽細胞腫の診断を確認する。
【００９７】  患者を除外する基準は次のとおりである：代謝性欠損、妊娠、他の事前の癌病理学。
【００９８】  5-フルオロウラシルの用量増加（：年代順に、70、132及び264mg）の影響を研究するため、３グループを最初に想定し、試験を受けるグループによって治療の耐性が観察された後に次のグループの治療が開始された。
【００９９】  132mgの5-ＦＵを受ける患者におけるグレードII神経学的毒性の発生によって、プロトコルを中止するルールに従い、治療の段階的拡大を中止し、その後の患者は同じ132mgの投与を受けた。
【０１００】  従来の外部放射線療法（10MVのエネルギーで術前MRIにて評価された腫瘍体積に集中される）を、術後２〜７日目の間に始める。1.8Gyの33フラクション中の総線量60Gyを、6.5週間で５フラクションの割合で適用する。照射された体積は、放射状に少なくとも２センチメートルのマージンで術前の腫瘍を包含する。
【０１０１】  患者を臨床的及び放射線学的にモニターする：肉眼的に完全な切除及び臨床的評価を確認するために72時間後のスキャンをD10、D20及びD30について行う。MRIをD10及びD30について行う。最後に、CSF及び血液中の5-ＦＵの評価を、72時間の時点でD10、D20及びD30について行う。毒性（神経学的、血液学的、粘膜及び心臓病学的）を、WHOに由来する基準におけるグレードで評価する。１ヶ月経過後、患者は、２ヶ月毎に臨床的に観察され、３ヶ月毎にMRIを受ける。
【０１０２】  軽い術後の貧血、白血球増加及び軽いリンパ球減少が全ての患者において観察された。
【０１０３】  薬理学的研究は、30日を越える間に脳脊髄液（CSF）中の5-ＦＵの持続された放出、及びより低レベルで、全身の循環への分子の一時的な通過を確認した。5-ＦＵの相当な濃度は、移植後一ヶ月のCSF中にまだ存在する。
【０１０４】  CSF中の5-ＦＵの放出のプロフィールは、70及び132mg用量についてそれぞれ10及び20日目にピークを示す。血漿中の5-ＦＵレベルは、患者の半分において10日目から検出可能ではなかった。
【０１０５】  全身耐性は、治療を受けた全ての患者において優れている。CSFの化学性又は細胞性において変化は観察されなかった。132mgで治療された患者における放射線療法の間の脳浮腫の発現は、連続される用量の段階的増大を許容しなかった。
【０１０６】  このように、４人の男性及び４人の女性を含み、平均年齢48.5歳でKarnofsky指数が90より大きい８人の患者が研究に含まれた。３人の第１グループは70mg用量を受け、５人の第２グループは132mgを受けた。
【０１０７】  生存に関する予備試験結果は、少数の患者が原因で統計的に解釈できなかった。しかしながら、それらは非常に有望であった。最終的な評価で、治療を受けた第１グループ（70mg）中、３人の患者が61、114及び125週目に死亡した。114週目に死亡した患者がグリア芽細胞腫の肺転移で死亡したことに注目されるべきである。治療を受けた第２グループ（132mg）中、３人の患者が31、59及び82週目に死亡し、これら予備試験結果の立案の時点で159及び172週目でいまだ寛解であった。
【０１０８】  患者の生存中央値は98週である（同様の診断基準を充足する患者の文献におけるそれは50.6週である（Devaux BC, O'Fallon JR, Kelly PJ, Resection, biopsy and survival in malignant glial neoplasms, J Neurosurg, 78: 767-775, 1993））。８人の患者中５人、すなわち62％は、18ヶ月の時点で生存しているのに対し、文献において本試験の包含基準を充足する患者の文献における18ヶ月の生存は20％である（Devaux BC, O'Fallon JR, Kelly PJ, Resection, biopsy and survival in malignant glial neoplasms, J Neurosurg, 78: 767-775, 1993）。