(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された生体検体中のＥＢ１(End-binding protein 1)を癌予後予測マーカーとして検出又は定量することを特徴とする肝細胞癌の検査方法。
【請求項２】
生体検体が、肝細胞癌を含む生体検体である請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
ＥＢ１の検出又は定量を、免疫学的手法により行う請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
免疫学的手法が、免疫組織染色である請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
生体検体中のＥＢ１を検出又は定量するための抗ＥＢ１抗体を含む請求項１〜４のいずれか１に記載の肝細胞癌の検査方法に用いる癌予後予測検査用試薬。
【請求項６】
生体検体中のＥＢ１を検出又は定量するための抗ＥＢ１抗体と、ＥＢ１と抗ＥＢ１抗体の反応を検出しうる標識を含む請求項１〜４のいずれか１に記載の肝細胞癌の検査方法に用いる癌予後予測検査用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌の予後を判断するための新規肝細胞癌マーカー及び当該マーカーを用いた肝細胞癌の検査方法に関する。より詳しくは、肝細胞癌を患う患者の予後を予測するための検査方法に関し、さらには検査のための検査用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は世界的に一般的かつ悪性度の高い悪性腫瘍のうちの１つで、癌による死因で３番目に挙げられる。肝細胞癌はアジアとアフリカでは大きな健康問題となっている。また、最近の研究によると肝細胞癌の発生率は、最近の数十年間の間で米国と英国で増加しているようである。
【０００３】
癌の診断にはＸ線ＣＴやＭＲＩなどの画像診断のほか、特定の癌に特異的に発現する癌マーカーや血液、組織中に漏出する癌マーカーなどを検出する方法も汎用されている。肝癌のマーカーとしては、ＡＦＰ(α-fetoprotein)やＰＩＶＫＡ-II (protein induced by vitamin K absence or antagonist-II)などが知られている。
【０００４】
肝細胞癌は、化学療法や放射線治療に抵抗性を示し、手術が唯一の完全寛解療法とされてきた。予後不良症例を事前に予測することができれば、手術以外の治療方法や、手術後の治療についてもより効果的な治療方法を選択し、過度な治療を避けることができる。このような予後予測マーカーとして実用化のレベルに至ったものはない。
【０００５】
なお、癌マーカーにおいては、診断マーカー、予後予測マーカー、治療奏効性予測マーカーなどの種類が挙げられる。例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤に対する感受性を予測する治療奏効性予測マーカーとして、KCIP-1, CD98, DRF1, LASP-1, APC-binding protein EB1など各種マーカーが開示されている報告がある（特許文献１）。しかしながら、特許文献１に記載される治療奏効性予測マーカーは、薬剤に関連するマーカーであって、本明細書に記載される癌患者の予後を予測するマーカーとは検査の目的や用途が全く異なるものである。
【０００６】
肝細胞癌の予後については、癌細胞の分化の程度、門脈侵襲の有無などの病理学的所見に応じて判断するのが一般的である。特に低分化型肝細胞癌のほうが高分化型細胞癌に比べて、予後が悪い傾向がある。しかしながら、生検により得られた検体について癌細胞の分化程度を判断するのは、必ずしも容易ではなく、また肝細胞癌の分化程度と予後について、明確に解明されているわけではない。肝細胞癌に関し、これまで有効な予後予測マーカーについては全く報告されていなかったが、予後を予測しうるマーカーは、癌診断後の治療方法を選択する上の重要な判断基準となるため、強く望まれている。
【０００７】
なお、ＥＢ１はEnd-binding protein 1又はAPC-binding protein EB1と呼ばれるものであり、腫瘍抑制遺伝子産物APC（adenomatous polyposis coli）に結合するタンパク質として発見された公知のタンパク質である（非特許文献１; LK Su et al 1995）。これまでにＥＢ１は肝細胞癌組織（非特許文献２；Fujii et al 2005）、食道癌組織（非特許文献３；Wang et al 2005）、胃癌組織（非特許文献４；Nishigaki et al 2005）において高発現していることが報告されている。しかしながら、予後の予測に関し、ＥＢ１の単独マーカーとしての利用はどの腫瘍についても報告されていない。特に肝細胞癌におけるＥＢ１の予後予測能に関するものは何ら報告されていない。
【特許文献１】US2007/0212738米国出願
【非特許文献１】Su LK, Burrell M, Hill DE, Gyuris J, Brent R, Wiltshire R, Trent J, Vogelstein B,Kinzler KW. APC binds to the novel protein EB1 Cancer Res. 1995 Jul 15;55(14):2972-7.
【非特許文献２】Fujii K, Kondo T, Yokoo H, Yamada T, Iwatsuki K, Hirohashi S. Proteomic study of human hepatocellular carcinoma using two-dimensional difference gel electrophoresis with saturation cysteine dye. Proteomics. 2005 Apr;5(5):1411-22.
【非特許文献３】Wang Y, Zhou X, Zhu H, Liu S, Zhou C, Zhang G, Xue L, Lu N, Quan L, Bai J, Zhan Q, Xu N. Overexpression of EB1 in human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) may promote cellular growth by activating beta-catenin/TCF pathway. Oncogene. 2005 Oct 6;24(44):6637-45.
【非特許文献４】Nishigaki R, Osaki M, Hiratsuka M, Toda T, Murakami K, Jeang KT, Ito H, Inoue T, Oshimura M. Proteomic identification of differentially-expressed genes in human gastric carcinomas. Proteomics. 2005 Aug;5(12):3205-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、肝細胞癌の予後を判断するための新規肝細胞癌マーカー及び当該マーカーを用いた肝細胞癌の検査方法を提供することを課題とする。さらには当該マーカーを用いて検査するための検査用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために、生体検体から取得した肝細胞癌を含む各種肝細胞からレーザーマイクロダイセクションを用いて細胞を回収し、タンパク質を抽出した後、蛍光二次元電気泳動法と質量分析装置にて予後に関係するタンパク質を解析した。解析の結果、ＥＢ１(End-binding protein 1)に着目し、ＥＢ１と肝細胞癌患者の予後との関係を調べた結果、ＥＢ１が陽性の場合には陰性の場合に比べて５年生存率が有意に低いことが確認され、ＥＢ１が肝細胞癌の予後判断のために有意な癌マーカーとなりうることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．生体から生体検体を分離し、当該生体検体中のＥＢ１(End-binding protein 1)を癌予後予測マーカーとして検出又は定量することを特徴とする肝細胞癌の検査方法。
２．生体検体が、肝細胞癌を含む生体検体である前項１に記載の検査方法。
３．ＥＢ１の検出又は定量を、免疫学的手法により行う前項１又は２に記載の検査方法。
４．免疫学的手法が、免疫組織染色である前項３に記載の検査方法。
５．生体検体中のＥＢ１を検出又は定量するための抗ＥＢ１抗体を含む前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
６．生体検体中のＥＢ１を検出又は定量するための抗ＥＢ１抗体と、ＥＢ１と抗ＥＢ１抗体の反応を検出しうる標識を含む前項１〜４のいずれか１に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の肝細胞癌の検査方法によると、肝癌細胞がＥＢ１陽性症例での術後５年生存率は２２．６％であったのに対し、ＥＢ１陰性症例では６０．９％であり、陽性症例は陰性症例に比べて有意に予後不良であった。更に、ＥＢ１と肝細胞癌の予後に相関される他の臨床病理学因子について多変量解析により解析した結果、術後生存、術後再発ともにＥＢ１は肝細胞癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。
【００１２】
ＥＢ１を単一のマーカーとして用いる本発明の肝細胞癌の検査方法によると、肝細胞癌患者の予後を予測することが可能になる。肝細胞癌と診断された患者について、生検などで肝癌細胞を採取した際や手術で切除された肝細胞癌検体を、本発明の検査方法により検査することで、予後を判断することができ、適切な治療方法を選択することができる。つまり、ＥＢ１を単一のマーカーとして用いることにより、技術的に簡便に迅速に低いコストで実用的に肝細胞癌患者の予後を予測し、治療方針を立てることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の肝細胞癌の検査方法は、癌マーカーとしてＥＢ１を検出又は定量することによる。本発明におけるＥＢ１とは、上記背景技術の欄で示したように公知のタンパク質であり特に限定されないが、例えば非特許文献１〜４に示されるタンパク質をいう。そのアミノ酸配列は、出願時において、Swissprot detabase Accession No. Q15691に掲載されているものを一例としてあげることができるが、いわゆるＥＢ１タンパク質であれば、上記掲載されている配列からなるタンパク質に限定されるものではない。
【００１４】
本発明において、ＥＢ１に着目した経緯は、以下の検討による。国立がんセンター病院から倫理委員会の承諾を得て合計４５の生体検体を得た。これらの検体には、（１）正常肝７症例、（２）肝細胞癌患者の非癌肝（背景肝）１１症例、（３）高分化型肝細胞癌６例、（４）中分化型肝細胞癌１４例、（５）低分化型肝細胞癌７例の肝細胞を含む。上記肝細胞を含む生体検体について、レーザーマイクロダイセクションを用いて肝細胞を回収し、タンパク質を抽出した後、蛍光二次元電気泳動(2D-DIGE)と質量分析装置にて予後に関係するタンパク質を解析した。
【００１５】
これにより得られた、約5000個のタンパク質スポットから、各群間の比較において、（１）Wilcoxon検定 p<0.01、（２）平均値の値が３倍以上の差、（３）ｐ値の低い順番に上位２０番目まで、という基準でタンパク質スポット１２０個を選別した。質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、ＥＢ１に由来するタンパク質スポットが、１２０個のスポット中に含まれていた。このＥＢ１に由来するタンパク質スポットの濃度は、正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌では低かったが、中分化型肝細胞癌、低分化型肝細胞癌では高い傾向にあった（図１、２）。そこで、ＥＢ１と肝細胞癌との関係について解析を行った結果、ＥＢ１の発現の有無により肝細胞癌の予後に影響を及ぼすことが確認された。
【００１６】
本明細書において、生体から取得した検体を生体検体といい、各種検査や試験に供するために前処理された検体を試料ということとする。本発明の肝細胞癌の検査方法に供するための生体検体は、肝細胞癌患者の組織や血液に由来するものであればよく、好ましくは肝癌細胞を含む検体であれば良い。生体検体は、患者から採取された検体であり、本発明の検査方法のために取得した検体であってもよいが、他の検査に供するために取得した検体や、手術により採取した検体であってもよい。例えば検体を免疫組織染色検査に供する場合、検査に供する試料として、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を用いることができる。また、例えば検体をウェスタンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲに供する場合、試験に供する試料として、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液又はｍＲＮＡ抽出液を用いることができる。
【００１７】
本発明の肝細胞癌の検査方法において、ＥＢ１を癌マーカーとして検出又は定量する方法は、生体検体中のＥＢ１を確認可能な方法であれば良く、特に限定されない。各生体検体におけるＥＢ１は、以下に例示する通り任意の方法で検出又は定量することができる。なお、ＥＢ１の検出又は定量は、単にＥＢ１の有無を検出するものであってもよく、またＥＢ１の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。ＥＢ１発現は、タンパク質レベルで検出又は定量してもよく、またｍＲＮＡレベルで検出又は定量してもよい。
【００１８】
ＥＢ１発現のタンパク質レベルでの検出又は定量は、免疫学的手法によるのが簡便であり、好適である。例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出又は定量との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により行うことができる。また、ｍＲＮＡレベルでの検出又は定量は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（好ましくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ等により行うことができる。
【００１９】
免疫組織染色法は自体公知の方法を採用することができ、特に限定されないが、その具体例を以下に示す。肝細胞癌患者から分離した生体検体を常法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに包埋をしてミクロトームにて厚さ４μｍ程度の組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用する。切片試料はキシレン処理で完全にパラフィンを除き、１００％から徐々に濃度を下げたアルコール溶液にくぐらせ親水化し水洗する。その後、抗体の浸透性を高めるために耐熱ガラス容器に入れたｐＨ６．０のクエン酸緩衝液中に切片試料を漬け、オートクレーブにて１２１℃で１０分間熱処理し抗原を賦活化する。室温まで放置し冷却し流水で緩衝液を水洗後、ＣＳＡ２キット (catalyzed signal amplification (CSA) system(DAKO社)を用い、免疫組織染色を行う。内因性ペルオキシダーゼ活性、非特異的反応をブロッキングした後、切片試料を抗ＥＢ１抗体を滴下し常温で１５分間反応させる。洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体(DAKO社)、増幅試薬及び抗蛍光ＨＲＰ(DAKO社)を用いてそれぞれ１５分間反応させる。洗浄後、ＤＡＢ溶液 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAKO社)を用いて発色を行う。なお洗浄にはＴＢＳＴ(DAKO社)を用いる。流水にて洗浄後、ヘマトキシリン液にて検体の細胞核を染色する。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせ脱水し、検体上に封入剤を滴下しカバーグラスを被せて顕微鏡にて観察する。顕微鏡下では肝細胞癌の細胞のＥＢ１タンパク質は茶褐色の発色として観察される。以下に説明するように、その発色により陽性陰性の判定を行うことができる。
【００２０】
ＥＢ１発現の検出又は定量の結果は、２種類の段階（陽性及び陰性）に分類することができる。ＥＢ１発現の分類は、検出又は定量方法に応じて、十分な経験を有する病理医、臨床医、検査技師又は検査施設が行うことが好ましい。例えば、ＥＢ１発現の分類は、免疫組織染色法を用いる場合は病理医が行うことができ、ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合は検査技師が行うことができる。
【００２１】
なお、ＥＢ１発現の分類は、患者からの生体検体におけるＥＢ１の発現量を、コントロールにおけるＥＢ１の発現量と比較することにより行うことが好ましい。ＥＢ１発現の結果を分類する段階の数に応じて、複数のコントロールを用いることが好ましい。例えば、ＥＢ１発現の結果を２種類の段階（陽性及び陰性）に分類する場合は、それぞれの段階に対応した２種類のコントロール（ＥＢ１陽性コントロール及びＥＢ１陰性コントロール）を用いることが好ましい。また、コントロールの１つとして、健常者又は予後良好な肝細胞癌患者に由来するコントロールを用いることが好ましい。
【００２２】
免疫組織染色法により、ＥＢ１発現の結果を陽性及び陰性の２種類の段階に分類する場合、免疫組織染色の結果を例えば以下のように判定することができる。肝細胞癌の細胞の細胞質の染色強度を、「陽性染色あり」及び「染色なし」の２段階に分類し、ＥＢ１陽性と陰性の判定をする。癌細胞の半分以上が染色性を示す場合、陽性と判定することができる。
【００２３】
本発明は、肝細胞癌を患う患者の予後を予測するための検査用試薬並びに検査用試薬キットも含まれる。当該キットにより、患者から得られた生体検体におけるＥＢ１の発現を検出又は定量することができる。すなわち、タンパク質レベルでＥＢ１の発現を検出又は定量するための検査用試薬キットとして、免疫学的手法、例えば免疫組織染色やウェスタンブロット法などに使用される検査用キットが挙げられる。免疫学的手法により検査を行う場合には、少なくとも抗ＥＢ１抗体が検査用試薬に含まれる。抗ＥＢ１抗体は、ＥＢ１の発現を検出しうる抗体であればよく、特に限定されないが、例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。また検査用試薬キットには、上記抗体のほか検出用に用いる標識を含んでいてもよい。キットには、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
【実施例】
【００２４】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００２５】
（実施例１）ウェスタンブロット法によるＥＢ１の確認
正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌、低分化型肝細胞癌を３例ずつ、計１５症例の生体検体について、ＥＢ１に対する特異抗体（抗ＥＢ１抗体）を用いてウェスタンブロット法によりＥＢ１の発現を調べた。各生体検体は手術検体から取得したものであり、国立がんセンターの倫理委員会の審査及び承認を得たものである。
ウェスタンブロット法を行う前に、各生体検体について以下の前処理を行った。
【００２６】
１）タンパク質の回収
各症例の手術検体から肝細胞を含む組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた組織をマルチビーズショッカーTM（安井機器、大阪）にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出用緩衝液（６Ｍ ウレア、２Ｍ チオウレア、３％ ＣＨＡＰＳ、１％ TritonX-100）を加えてタンパク質を抽出した。
【００２７】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗ＥＢ１抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体 (GE Healthcare Biosciences社)を用いた。１次抗体は２００倍希釈し、２次抗体は１０００倍希釈した。検出にはＥＣＬキット（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS-3000TM （富士フィルム社）及び ImageQuantTM software (GE Healthcare社)により解析した。
【００２８】
３）結果
ウェスタンブロット法による解析の結果、蛍光二次元電気泳動法と同様に、正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌では低発現であったが、中分化肝細胞癌、低分化型肝細胞癌では高発現の傾向にあった（図３）。
【００２９】
（実施例２）免疫組織染色によるＥＢ１の確認
ＥＢ１の予後予測能を検証する目的で、抗ＥＢ１抗体を用いた免疫組織染色を肝細胞癌１４５症例の検体について行った。
【００３０】
１）免疫組織染色
パラフィン包埋組織切片試料について、ＣＳＡ染色 (catalyzed signal amplification (CSA) system(DAKO社)の使用説明書の指示に従い、免疫組織染色を行った。通常の方法に従い脱パラフィン処理した切片試料を、１０ｍＭクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)中で１０分間１２１℃オートクレーブ滅菌した。切片試料を、５００倍希釈のウサギ抗ＥＢ１ポリクローナル抗体(Santa Cruz社)、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体(DAKO社)、増幅試薬及び抗蛍光ＨＲＰ(DAKO社)を用いて標識した。免疫組織染色のために更にＤＡＢ染色 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAKO社)を行った。
【００３１】
免疫組織染色によるＥＢ１染色の結果を図４に示す。高分化型癌細胞、中分化型癌細胞及び低分化型癌細胞について確認した。低分化型癌細胞において特に染色が認められた（図４）。ＥＢ１の陽性又は陰性の判断は、２名の熟練者によりなされ、癌細胞のうち、５０％以上がＥＢ１染色されたものをＥＢ１陽性とし、５０％未満のものをＥＢ１陰性と判断した。
【００３２】
２）ＥＢ１の発現と予後の確認
免疫組織染色を行った１４５症例のうち、ＥＢ１陽性症例は４０例、陰性症例は１０５例であった。ＥＢ１陽性症例は中分化肝細胞癌、低分化型肝細胞癌に多い傾向にあった（表１）。予後との関連を検討した結果、術後５年生存率はＥＢ１陽性症例では２２．６％であったのに対し、ＥＢ１陰性症例では６０．９％であり、陽性症例は陰性症例よりも有意に予後不良であった(p<0.0001)（図５Ａ）。また術後５年無再発生存率に関してもＥＢ１陽性症例は７．８％であったのに対し、ＥＢ１陰性症例は２９．９％であり、陽性症例は陰性症例よりも有意に再発が多く認められた(p<0.0001)（図５Ｂ）。
【００３３】
【表１】
0005130465.tif 000002
【００３４】
肝細胞癌患者１４５症例のＥＢ１の発現と臨床病理学的背景の関連を表２に示した。ＥＢ１の発現は統計学的に有意な確からしさ（p<0.01）をもってステージ、分化度、門脈侵襲、肝内転移などの肝細胞癌に重要な臨床病理学的背景に相関することが分かった。また、単変量解析と多変量解析を用いて肝細胞癌の予後に相関するとされている他の臨床病理学的因子(門脈浸潤など)もＥＢ１とあわせて予後に対する影響を検討した結果を表３に示した。多変量解析の結果、肝硬変、門脈侵襲、肝内転移、ＥＢ１が独立した予後因子であることが分かった。腫瘍側因子としては、ＥＢ１は術後生存、術後再発に関し最も強力（ハザード比2.289）なマーカーとなりうることが明らかとなった。
【００３５】
【表２】
0005130465.tif 000003
【００３６】
【表３】
0005130465.tif 000004
【００３７】
（参考例１）二次元電気泳動及び質量分析による解析
本発明において、ＥＢ１を肝細胞癌予後予測マーカーとして選別するに至った経緯として、二次元電気泳動及び質量分析を行い、肝細胞癌の予後に影響を及ぼすタンパク質を選別した。その内容について、以下に具体的に示す。
【００３８】
１）試料調製
レーザーマイクロダイセクション（mmi CellCutTM、NIPPN TechnoCluster社）を用いて細胞を回収し、タンパク質抽出用緩衝液（６Ｍ ウレア、２Ｍ チオウレア、３％ ＣＨＡＰＳ、１％ TritonX-100）を加えてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ５TM、GE Healthcare Biosciences社）で標識した。標識は以下のように行った。（１）終濃度３０ｍＭとなるようにｐＨ８．０のトリス緩衝液を加え、次に（２）１ｎｍｏｌのＴＥＣＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロライド，Sigma社）を加え、（３）３７℃で６０分間処理した。次に、（４）Ｃｙ５蛍光色素を４ｎｍｏｌ加えて、３７℃で３０分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質試料から等量ずつタンパク質試料を集めて混合し、内部コントロール試料とした。内部コントロール試料を蛍光色素（サチュレーションダイＣｙ３TM、GE Healthcare Biosciences社）で上記と同様に標識した。Ｃｙ５で標識した個別のサンプルとＣｙ３で標識した内部コントロール試料を混合し、ウレア可溶化液で最終容量４２０μｌとした。その際、終濃度が６５ｍＭとなるようにジチオスレイトール（DDT）を、２％となるようにとアンフォラインTM（GE Healthcare Biosciences社）を加えた。Ｃｙ５で標識した個別試料とＣｙ３で標識した内部コントロール試料を混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
【００３９】
２）二次元電気泳動
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル（２４ｃｍ、ｐＩ４−７、GE Healthcare Biosciences社）と、Multiphor IITM（GE Healthcare Biosciences社）を使用した。泳動するタンパク質試料でイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は40000Vhで行った。二次元目の泳動は９−１５％のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、二次元泳動装置を使用した。泳動は泳動装置一台につき１８Ｗで１０時間、１５℃で行った。
【００４０】
３）タンパク質検出
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー（Typhoon TrioTM、GE Healthcare Biosciences社）に載せてスキャンした。
【００４１】
４）発現解析
読み込んだ画像を画像解析ソフトDeCyderTM（GE Healthcare Bio-sciences社）で解析した。
【００４２】
５）タンパク質同定
ａ．ゲル内消化法
全自動スポット回収装置ProHunterTM（AsOne社）を用いて、ゲルから９６穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素（トリプシン）で３７℃にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、６０％アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
ｂ．質量分析
ペプチドの質量を測定するためにＬＴＱTM（サーモエレクトロン社）を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotTMを使用した。
【００４３】
６）結果
上記方法により二次元電気泳動を行った結果、約5000個のタンパク質スポットが得られた（図６）。これにより得られた、約5000個のタンパク質スポットから、各群間の比較において、（１）Wilcoxon検定 p<0.01、（２）平均値の値が３倍以上の差、（３）ｐ値の低い順番に上位２０番目まで、という基準でタンパク質スポット１２０個を選別した。質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、ＥＢ１に由来するタンパク質スポットが、１２０個のスポット中に含まれていた。このＥＢ１に由来するタンパク質スポットの濃度は、正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌では低かったが、中分化型肝細胞癌、低分化型肝細胞癌では高い傾向にあった（図１、２）。そこで、ＥＢ１に着目し、ＥＢ１が肝細胞癌の予後予測マーカーとなりうるかについて検討した。これにより、上記実施例２の結果が得られ、予後予測マーカーとして希望しうることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上詳述したように、本発明の肝細胞癌の検査方法によると、肝癌細胞がＥＢ１陽性症例での術後５年生存率は２２．６％であったのに対し、ＥＢ１陰性症例では６０．９％であり、陽性症例は陰性症例に比べて有意に予後不良であった。更に、多変量解析により解析した結果、ＥＢ１と肝細胞癌の予後に相関される他の臨床病理学因子について、術後生存、術後再発ともに相関することが確認され、ＥＢ１は肝細胞癌の予後判断のための強力なマーカーとなることが確認された。
【００４５】
ＥＢ１を単一のマーカーとして用いる本発明の肝細胞癌の検査方法によると、肝細胞癌患者の予後を予測することが可能になる。肝細胞癌と診断された患者について、生検などで肝癌細胞を採取した際や手術で切除された肝細胞癌検体を、本発明の検査方法により検査することで予後を判断することができ、適切な治療方法を選択することができる。つまり、ＥＢ１を単一のマーカーとして用いることにより、技術的に簡便に迅速に低いコストで実用的に肝細胞癌患者の予後を予測し、治療方針を立てることが可能になる。
【００４６】
なお、免疫組織染色による手法は、肝細胞癌の分化度を判断するのに比べて検体の取扱いが容易であり、大量の検体を取り扱うことができる。また、予後の予測により適切な治療方法を選択することで、患者に対する経済的、肉体的に過度の負担が軽減化され、医療費の節減にも繋がるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】二次元電気泳動により、正常肝細胞、肝細胞癌患者の非癌細胞（背景肝）、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌及び低分化型肝細胞癌におけるＥＢ１の発現を確認した図である。
【図２】二次元電気泳動により、正常肝細胞、肝細胞癌患者の非癌細胞（背景肝）、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌及び低分化型肝細胞癌におけるＥＢ１の発現量を確認した図である。
【図３】ウェスタンブロット法により、正常肝細胞、肝細胞癌患者の非癌細胞（背景肝）、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌及び低分化型肝細胞癌におけるＥＢ１の発現を確認した図である。（実施例１）
【図４】免疫組織染色により、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌及び低分化型肝細胞癌におけるＥＢ１の発現を確認した図である。（実施例２）
【図５】ＥＢ１発現の陽性及び陰性の場合の生存率の違いを示す図である。（実施例２）
【図６】二次元電気泳動による約5000のタンパク質スポットを示す図である。（参考例）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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