(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法であって、
下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩＩ）で表されるγ−ポリグルタミン酸に結合させた２種類以上の異なるシアロ糖鎖含有ポリマーを、複数のウエルを有するプレートにおいて、前記ウエル毎、あるいは前記ウエルの列毎に異なる種類の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを固定し、または、異なる種類の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを２種類以上の担体のそれぞれの表面に固定して、前記シアロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウイルスサンプルを接触させ、それぞれの結合度合いを測定し、
それらの結果を比較してインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別することを特徴とする、インフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
【化１】
0005130598.tif 000020
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【化２】
0005130598.tif 000021
0005130598.tif 000022
（式（ＩＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【請求項２】
前記結合度合いの測定が、前記ウイルスに対する抗ウイルス抗体を用いた免疫学的測定法による測定である請求項１記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
【請求項３】
２種類以上の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを含む溶液を前記１つの担体に接触させ、または、異なる前記シアロ糖鎖含有ポリマーを含む複数の溶液を２種類以上の担体の何れかに接触させ、この状態で紫外線を照射した後、前記液を除去することにより、前記シアロ糖鎖含有ポリマーを前記担体に固定する請求項１または２に記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
【請求項４】
前記インフルエンザウイルスは、エーテル処理で不活性化されている請求項１乃至３の何れか一に記載のインフルエンザウイルス変異によるトリからヒトへの感染宿主の変化を判別する方法。
【請求項５】
下記式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化１】
0005130598.tif 000023
0005130598.tif 000024
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【請求項６】
下記式（ＩＩＩ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化２】
0005130598.tif 000025
（式（ＩＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【請求項７】
γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーの製造法であって、
（工程１）
糖転移酵素を用いて目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
（工程２）
工程１で合成したシアロ糖鎖とγ−ポリグルタミン酸とを化学的に結合させる工程
（工程３）
工程２で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするγ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程を含み、
前記γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーは、下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩＩ）で表されるγ−ポリグルタミン酸に結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーであるγ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーの製造法。
【化１】
0005130598.tif 000026
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【化２】
0005130598.tif 000027
0005130598.tif 000028
（式（ＩＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【請求項８】
請求項１記載又は２記載の判別方法に用いる担体であって、下記式（Ｉ）または下記式（ＩＩＩ）で表されるシアロ糖鎖をγ−ポリグルタミン酸に結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを紫外線照射することで表面に固定した担体。
【化１】
0005130598.tif 000029
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【化２】
0005130598.tif 000030
0005130598.tif 000031
（式（ＩＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）
【請求項９】
前記担体が複数のウエルを有し、異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーが複数固定されている請求項８記載の担体。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のウイルスのレセプター糖鎖認識特異性又はその変異を判別する方法に用いるキットであって、請求項８又は９記載の担体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法、該方法に使用可能な新規なシアロ糖鎖含有ポリマー及び担体並びにそれらの効率的な製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、通常の風邪のような軽い症状のものもあれば、スペイン風邪のような重篤な症状にいたる場合もある。また、最近、鳥インフルエンザが問題になっているように、インフルエンザは、人獣共通の感染症である。インフルエンザウイルスの宿主域は、多くの動物種に及ぶことが知られている。例えば、Ａ型ウイルスは、ヒトの他に、カモ等の野生水鳥、七面鳥、ニワトリ、ウズラ等の家禽、ブタ、ウマ、ウシ、フェレット、クジラ、アザラシ等の動物を宿主とする。【０００３】
インフルエンザウイルスの外皮は、ＨＡ（血赤球凝集素：ヘマグルチニン）およびＮＡ（ノイラミニダーゼ）の２種の酵素タンパクの突起で被われている。ＨＡは血球凝集性の抗原で、宿主細胞に吸着・侵入する際にその細胞表面にあるシアル酸を含むレセプター糖鎖と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれるときに重要な役割を果たしている。【０００４】
インフルエンザウイルスの抗原性は、ＨＡとＮＡの組み合わせで決まり、Ａ，Ｂ，Ｃの３型に大別される。Ａ型には、さらに香港型など４種の亜型があることが知られている。Ａ型では、従来より１０年程度の周期で異なった亜型が登場したり、また同じ亜型でも年々少しずつ抗原性が変わっていく（抗原シフト）ことが知られている。このため抗原型に完全に適合したワクチンの生産が難しく、その予防効果が問題となっている。【０００５】
一方、インフルエンザウイルスの型の分類は、上記のように抗原性による分類の他、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合性の違いによる分類がある（非特許文献１）。この分類は、レセプター糖鎖末端のシアル酸の結合様式の相違に基づくものであり、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖の認識性、結合性若しくは親和性の高低の相違に基くものである。【０００６】
例えば、高病原性Ａ型トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１亜型、Ｈ９Ｎ１、Ｈ７Ｎ７など）は、「ＳＡα２−３Ｇａｌβ−（ＳＡ：シアル酸）」の結合様式を強く認識するが、「ＳＡα２−６Ｇａｌβ−」の結合様式への認識性、結合性若しくは親和性は低い。一方、ヒトＡ型およびＢ型のインフルエンザウイルスは、「ＳＡα２−６Ｇａｌβ−」の結合様式を強く認識するが、「ＳＡα２−３Ｇａｌβ−」の結合様式への認識性、結合性若しくは親和性が低い。【０００７】
トリインフルエンザウイルスがヒトへ感染するか否かの可能性を評価判定するための最も効果的な方法は、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合性を確認する方法である。すなわち、トリインフルエンザウイルスがヒトへ感染した場合であっても、その感染宿主の変異は遺伝子上の変異に反映されるとは限らない。しかし、レセプター糖鎖への結合性の変異は、感染するためには必須であることから、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性又はその変異を簡便に判別することができれば、インフルエンザウイルスの型の判別に加え、ウイルスの変異による感染宿主の変化や流行拡大の可能性をも予測することができる。【０００８】
従来、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法としては、共鳴ミラー法を用いた方法がある（特許文献１）。この方法では、共鳴ミラー装置のキュベット内にインフルエンザウイルスに対するレセプター糖鎖を固定し、前記レセプター糖鎖にインフルエンザウイルス検体を反応させる。そして、前記レセプター糖鎖とインフルエンザウイルスとの結合により生じる共鳴角度変化を結合曲線に表し、レスポンス強度をモニタリングする。前記レスポンス強度により、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖の認識特異性が判別できるとされている。【０００９】
しかしながら、この方法では、レセプター糖鎖を担体へ固定することが面倒である。すなわち、レセプター糖鎖として糖セラミド（シアリル（２−３）ネオラクトテトラオシルセラミド（トリ型）、シアリル（２−３）ラクトテトラオシルセラミド（トリ型）、シアリル（２−６）ネオラクトテトラオシルセラミド（ヒト型）、シアリル（２−６）ラクトテトラオシルセラミド（ヒト型）等）を使用し、これら糖セラミドとインフルエンザウイルスと結合しない糖脂質とをさらに混合し、この混合糖脂質をキュベット内の底面に固定化させるという極めて煩雑かつ複雑な方法で固定化レセプター糖鎖を調製している。さらに、共鳴ミラー装置という特殊で大型の装置を用いる必要がある。このため、大規模研究施設では使用できるが、例えば、患者が発生した現場、空港、養鶏場、駅等のフィールド、病院等の臨床現場で使用することは困難であった。【００１０】
最近、毒性の強いトリインフルエンザウイルスが世界的に流行し、このトリインフルエンザウイルスがヒトからヒトへ感染するウイルス（新型インフルエンザウイルス）へと変異し、世界的な流行（パンデミック）を引き起こす可能性も指摘されている。このため、安価で、かつ簡易な器具で容易にインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別可能な方法の早急な開発が熱望されている。【００１１】
【非特許文献１】「ウイルス感染における糖鎖認識プロセス」（鈴木康夫、「生化学」第７６巻、第３号、ｐｐ．２２７−２３３，２００４）
【特許文献１】特開２００１−２６４３３３号公報
【特許文献２】特開２００３−７３３９７号公報
【特許文献３】特開平１０−３１０６１０号公報
【特許文献４】特表２００３−５３５９６５号公報
【特許文献５】特表平１１−５０３５２５号公報
【特許文献６】特開２００４−１１５６１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、安価で、かつ簡易な器具で容易に、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖の認識特異性を判別する方法を開発すべく、ＥＬＩＳＡ法、免疫クロマトグラフィー法等の免疫学的測定法の応用を試みた。【００１３】
しかし、免疫学的測定法を応用したインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法を確立するためには、次に挙げるような様々な課題を解決する必要性があることが明らかとなった。（１）レセプター糖鎖含有化合物の選別（課題１）、（２）レセプター糖鎖含有化合物の効率的な製造法の確立（課題２）、（３）レセプター糖鎖含有化合物を担体に固定化するための方法の確立（課題３）、（４）測定結果よりインフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性の判別、宿主の変異を予想し、サーベーランス用の試薬あるいはキットとしての有用性の確認（課題４）など。【００１４】
より具体的に、それぞれの課題には、以下に示す問題があり、これらを解決することなしに、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法の確立は不可能であった。【００１５】
（課題１）
従来、インフルエンザウイルスが結合可能なレセプター糖鎖含有化合物としては、種々報告されているものの（特許文献２〜４）、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性を判別する方法に好適なレセプター糖鎖含有化合物に関しては報告がない。さらに、測定時の安全性を考慮すると、不活化したウイルスサンプルが使用可能であることが必須である。しかし、不活化したウイルスサンプルを、望ましくは濃縮などの処理をしなくて用いた場合でも、そのようなサンプルと結合可能なレセプター糖鎖含有化合物がどのようなものかに関しては、まったく不明である。【００１６】
（課題２）
レセプター糖鎖含有化合物の一例としてシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を合成する方法として特許文献２に開示された方法が挙げられる。この方法では、βガラクトシダーゼの糖転移反応を利用してｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−ラクトサミニドを合成し、ｐ−ニトロフェニル基をｐ−アミノフェニル基へと還元する。その後、ポリグルタミン酸と縮合させ、ラット由来のシアリルトランスフェラーゼを用いてオリゴ糖部分をシアリル化することにより目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得していた。【００１７】
しかし、この方法は、次のような欠点を有し、産業的には満足できる方法ではなかった。（１）合成収率が極めて悪い、（２）基質特異性の関係で、糖転移酵素として微生物由来の酵素は使用できず、調製が非常に面倒な高価な動物由来のものしか使用できない、（３）ポリグルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率を制御するのが難しく、大過剰のｐ−アミノフェニル化されたオリゴ糖が必要であったり、シアロ糖鎖をポリグルタミン酸と直接縮合する場合、副反応を抑えるために、カルボキシル基を保護する必要がある、（４）ポリグルタミン酸骨格がプロテアーゼやペプチダーゼにより分解されるため、用いるシアリルトランスフェラーゼとしては精製酵素を用いる必要がある。【００１８】
（課題３）
レセプター糖鎖含有化合物を担体に固定化する方法としては、適当なリンカーを用いる方法が一般的である（特許文献５及び６）。しかし、リンカーを用いる方法は、簡便な方法とは言えず、かつ化学反応であって、好ましくない副反応が生じるため、好ましい方法とは言えない。さらに、レセプター糖鎖含有ポリマーとしてシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を使用する場合を例に挙げれば、シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸の担体への結合法に関しては、まったく報告されていない。【００１９】
（課題４）
現在まで、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への認識特異性の判別、ウイルス変異による感染宿主の変化を予想可能とする試薬あるいはキットは報告されていないし、市販もされていない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得、本発明を完成させた。（１）免疫学的測定等を応用してウイルスを捕捉する際、シアロ糖鎖単独ではなく、シアロ糖鎖とポリマーの複合体であるシアロ糖鎖含有ポリマー、特にシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸が好適であり、不活化したウイルスサンプルでも使用可能である、（２）このシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸は、合成スキームを変更し、三糖を合成後、最後にポリグルタミン酸と縮合することで、効率的に合成できる、（３）シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸の担体への固定化法としては、適当なリンカー等を用いて結合させる方法ではなく、シアロ糖鎖含有ポリマーを含む液を担体と接触させ、続けて紫外線照射することで、シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を担体表面に効率よく固定化できる。また、（４）できあがった固定化シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を用い、インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖への結合特異性をＥＬＩＳＡ法を応用した方法で検討した結果、その結合度合いを測定することによりウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別できること、及びウイルス変異による感染宿主の変化を判別できることを見出した。すなわち、上記検討の結果、２種類以上のシアロ糖鎖含有ポリマーを１つの担体の表面に固定した担体もしくは異なるシアロ糖鎖含有ポリマーをそれぞれの担体の表面に固定した２種類以上の担体を用い、前記２種類以上のシアロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウイルスサンプルを接触させ、それぞれの結合度合いを測定し、それらの結果を比較すれば、ウイルス変異による感染宿主の変化を判別できることを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りである。【００２１】
〔１〕ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法であって、シアロ糖鎖含有ポリマーを表面に固定した担体に、前記ウイルスサンプルを接触させ、その結合度合いを測定することにより前記ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別する方法。【００２２】
〔２〕ウイルス変異による感染宿主の変化を判別する方法であって、２種類以上のシアロ糖鎖含有ポリマーを１つの担体の表面に固定した担体もしくは異なるシアロ糖鎖含有ポリマーをそれぞれの担体の表面に固定した２種類以上の担体を用い、前記２種類以上のシアロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウイルスサンプルを接触させ、それぞれの結合度合いを測定し、それらの結果を比較してウイルス変異による感染宿主の変化を判別することを特徴とする、ウイルス変異による感染宿主の変化を判別する方法。【００２３】
〔３〕前記シアロ糖鎖含有ポリマーにおける前記シアロ糖鎖が、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルガングリオ系糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）およびシアリルラクトース糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ−）からなる群から選択される少なくとも一つの糖鎖である上記〔１〕又は〔２〕記載の判別方法。【００２４】
〔４〕前記シアロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマーが、ポリグルタミン酸である上記〔１〕又は〔２〕記載の判別方法。【００２５】
〔５〕前記結合度合いの測定が、前記ウイルスに対する抗ウイルス抗体を用いた免疫学的測定法による測定である上記〔１〕又は〔２〕記載の判別方法。【００２６】
〔６〕前記ウイルスサンプルが、インフルエンザウイルスのサンプルである上記〔１〕又は〔２〕記載の判別方法。【００２７】
〔７〕下記式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化１】
0005130598.tif 000002
（Ｉ）
0005130598.tif 000003
（ＩＩ）
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）【００２８】
〔８〕下記式（ＩＩＩ）で表され、γ−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化２】
0005130598.tif 000004
（ＩＩＩ）
0005130598.tif 000005
（ＩＶ）
（式（ＩＩＩ）中Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）【００２９】
〔９〕下記式（Ｖ）で表され、α−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化３】
0005130598.tif 000006
（Ｖ）
0005130598.tif 000007
（ＶＩ）
（式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＶＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＶＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はフェニレンを除く炭化水素を示す。）
（式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＶＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＶＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はフェニレンを除く炭化水素を示す。）【００３０】
〔１０〕下記式（ＶＩＩ）で表され、α−ポリグルタミン酸にシアロ糖鎖を結合させたシアロ糖鎖含有ポリマー。
【化４】
0005130598.tif 000008
（ＶＩＩ）
0005130598.tif 000009
（ＶＩＩＩ）
（式（ＶＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＶＩＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＶＩＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はフェニレンを除く炭化水素を示す。）【００３１】
〔１１〕以下の工程からなる、シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法。
（工程１）
糖転移酵素を用いて目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
（工程２）
工程１で合成したシアロ糖鎖とポリグルタミン酸とを化学的に結合させる工程
（工程３）
工程２で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程【００３２】
〔１２〕シアロ糖鎖が、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルガングリオ系糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）およびシアリルラクトース糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ−）からなる群から選択される少なくとも一つの糖鎖である上記〔１６〕記載の製造法。【００３３】
〔１３〕〔１〕記載又は〔２〕記載の判別方法に用いる担体であって、シアロ糖鎖含有ポリマーを表面に固定した担体。【００３４】
〔１４〕シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルガングリオ系糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）およびシアリルラクトース糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ）からなる群から選択される少なくとも一つのシアロ糖鎖をポリグルタミン酸に結合させたシアロ糖鎖含有ポリマーを紫外線照射することで表面に固定した担体。【００３５】
〔１５〕前記担体が複数のウエルを有し、異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーが複数固定されている上記〔１３〕又は〔１４〕記載の担体。【００３６】
〔１６〕上記〔１〕又は〔２〕記載のウイルスのレセプター糖鎖認識特異性又はその変異を判別する方法に用いるキットであって、上記〔１４〕記載の担体を含むキット。
〔１７〕担体が複数のウエルを有し、１つの担体に異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーが複数固定されたものである、上記〔１６〕記載のキット。【００３７】
〔１８〕２つ以上の担体を含有し、異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーがそれぞれの担体に固定されたものである、上記〔１６〕記載のキット。【００３８】
〔１９〕前記シアロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマーが、α−ポリグルタミン酸である〔４〕記載の判別方法。
〔２０〕前記インフルエンザウイルスが、不活化されたインフルエンザウイルスである〔６〕記載の判別方法。
〔２１〕グルタミン酸単位重合度が１０〜１０，０００である〔７〕〜〔１０〕いずれかに記載のシアロ糖鎖含有ポリマー。
〔２２〕グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が１０〜８０％である〔７〕〜〔１０〕に記載のシアロ糖鎖含有ポリマー。
〔２３〕ポリグルタミン酸が、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸である〔１１〕記載の製造法。
〔２４〕グルタミン酸単位重合度が１０〜１０，０００である〔１１〕記載の製造法。
〔２５〕グルタミン酸残基に対するシアロ糖鎖の導入率が１０〜８０％である〔１１〕記載の製造法。
〔２６〕前記シアロ糖鎖含有ポリマーの前記シアロ糖鎖が、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルガングリオ系糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）およびシアリルラクトース糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの糖鎖である〔１３〕記載の担体。
〔２７〕前記ポリグルタミン酸が、α−ポリグルタミン酸又はγ−ポリグルタミン酸である〔１３〕又は〔１４〕記載の担体。
〔２８〕担体が複数のウエルを有するプレートである〔１３〕又は〔１４〕記載の担体。
〔２９〕さらに、前記ウイルスに対する抗ウイルス抗体を含む〔１６〕記載のキット。
〔３０〕〔１３〕ないし〔２９〕のいずれかに記載の担体の製造方法であって、前記担体に、シアロ糖鎖含有ポリマーを含む液を接触させ、この状態で紫外線を前記担体に照射し、その後、前記液を除去することにより、前記担体表面に前記シアロ糖鎖含有ポリマーを固定する担体の製造方法。
【発明の効果】
【００３９】
このように、本発明の判別方法は、シアロ糖鎖含有ポリマー、特にシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を固定した担体を用い、これにウイルスを接触させ、その結合度合いを、免疫学的方法等で測定することにより被検ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別するものである。本発明の判別方法は、簡易な器具で容易に実施でき、本発明によってたとえば、インフルエンザウイルスのヒト感染型かトリ感染型かの判別に加え、ウイルス変異による感染宿主の変化や流行の可能性をも予測することが初めて可能となった。【００４０】
従来、シアロ糖鎖含有ポリマー自体、あるいはシアロ糖鎖の担体への結合法は種々報告されている（特許文献２〜６）。しかし、本発明のように、不活性化したウイルスサンプルを用いてもウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別できるとした報告はなく、また判別可能であるとも考えられておらず、本発明者らによって初めて達成されたことである。【００４１】
また、本発明のシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸及びその製造法は、安価な原料を使用し、かつ効率的な方法である。このため、本発明のシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸、それを固定化した担体試薬及びキットのコストを大幅に下げることが可能で、多額の経費を必要とせず検査をすることができ、発展途上国のような国でも本発明のキット等は使用可能である。【００４２】
さらに、本発明のウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別するため担体及びキットは、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的測定法や生物学的測定方法等を応用することが可能であるため、担体の調製が容易で、判定操作も簡単である。このため、本発明はどこでも実施することが可能であり、また大型の装置を使用する必要もなく、養鶏場、屠殺場、病院、空港、駅など発生現場からサンプルが持ち込まれる近場の各種検査施設で使用可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】は、本発明の一実施例におけるトリＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。
【図２】は、前記実施例におけるヒトＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。
【図３】は、前記実施例におけるヒトＢ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。
【図４】は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、△はＰｏｌｙ（Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図５】は、トリＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、△はＰｏｌｙ（Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図６】は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、△はＰｏｌｙ（Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図７】は、トリＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、△はＰｏｌｙ（Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図８】は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はより高分量のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はより高分子量のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図９】は、トリＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はより高分子量のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はより高分子量のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）の結果を示す。
【図１０】は、ヒトＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、□はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  α−ＰＧＡ）、■はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  α−ＰＧＡ）のそれぞれの結果を示す。
【図１１】は、前記実施例におけるトリＡ型インフルエンザウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を示すグラフである。○はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、●はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）、□はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  α−ＰＧＡ）、■はＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  α−ＰＧＡ）のそれぞれの結果を示す。
【図１２】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１３】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１４】は、Ｐｏｌｙ（ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１５】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１６】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１７】は、Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１８】は、Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図１９】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図２０】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図２１】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【図２２】は、Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲチャートを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下、説明の都合上、（１）新規なシアロ糖鎖含有ポリマー、（２）シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法、（３）シアロ糖鎖含有ポリマーを担体へ固定化した試薬及びキット、（４）ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法の順で、本発明を詳細に説明する。【００４５】
（１）新規なシアロ糖鎖含有ポリマー
本発明の判別方法で使用可能なシアロ糖鎖含有ポリマーとしては、公知のシアロ糖鎖含有ポリマー以外にも、以下の新規のシアロ糖鎖含有ポリマーも使用可能である。この新規のシアロ糖鎖含有ポリマーは、公知のポリマーより極めて安価に調製することができ、しかも天然のムチンと類似の構造を有するため、本発明の判別方法に好適である。【００４６】
そのような、新規のシアロ糖鎖含有ポリマーの具体例としては、下記式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、および（ＶＩＩ）のものを例示することができる。シアロ糖鎖含有ポリマー中、シアロ糖鎖置換グルタミン酸残基と未置換グルタミン酸残基とは、任意の比率で混在し、その比率は糖残基置換度（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（ＤＳ））で示す。【００４７】
【化１】
0005130598.tif 000010
（Ｉ）
0005130598.tif 000011
（ＩＩ）
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）【００４８】
【化２】
0005130598.tif 000012
（ＩＩＩ）
0005130598.tif 000013
（ＩＶ）
（式（ＩＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＶ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＩＶ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒは炭化水素を示す。）【００４９】
【化３】
0005130598.tif 000014
（Ｖ）
0005130598.tif 000015
（ＶＩ）
（式（Ｖ）中、Ｚは水酸基又は式（ＶＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＶＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はフェニレンを除く炭化水素を示す。）【００５０】
【化４】
0005130598.tif 000016
（ＶＩＩ）
0005130598.tif 000017
（ＶＩＩＩ）
（式（ＶＩＩ）中、Ｚは水酸基又は式（ＶＩＩＩ）で表されるシアロ糖鎖結合部位であり、ｎは１０以上の整数を示す。式（ＶＩＩＩ）中、Ａｃはアセチル基、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｒ’はフェニレンを除く炭化水素を示す。）【００５１】
式中、Ｒ又はＲ’で表される炭化水素としては、炭素数１〜２０のものが好ましく、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれでもよい。具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基等が挙げられる。【００５２】
ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖のものが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基等の直鎖アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、２−エチルヘキシル基等の分枝鎖アルキル基が挙げられる。【００５３】
アルケニル基の具体例としてはビニル基、プロペニル基、アリル基等が挙げられる。アルキニル基の具体例としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。シクロアルキル基としては、炭素数３〜１０のものが挙げられ、特に炭素数３〜８のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。【００５４】
アリール基としては炭素数６〜１４のもの、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、炭素数７〜１４のアラルキル基、具体的にはベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基としてはＣ３−Ｃ８シクロアルキル置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、例えばシクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルエチル基、シクロペンチルエチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。【００５５】
また、当該炭化水素は置換基を有していても良く、そのような置換基としては、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基、アルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、カルボキシル基等が挙げられる。カルボキシル基はエステル化されていてもよい。【００５６】
本発明のシアロ糖鎖含有ポリマーは、塩型、遊離酸型のいずれであってもよい。塩型としては、例えは、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）；有機塩基塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩等）等が挙げられる。また、水和物あるいはアルコール等との溶媒和物であってもよい。【００５７】
また、本発明のシアロ糖鎖含有ポリマーの分子量は、例えば、２０００〜５００万の範囲である。グルタミン酸単位重合度（ｎ）は、例えば、１０〜１００００の範囲である。グルタミン酸残基に対するシアリルオリゴ糖の導入率は、１０〜８０％の範囲である。【００５８】
このようなシアロ糖鎖含有ポリマーの具体的化合物としては、たとえば、以下の化合物が例示される。【００５９】
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  α−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  α−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  α−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／  α−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
・Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／  γ−ＰＧＡ）
（ＰＧＡ：ポリグルタミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ：シアル酸、ＬａｃＮＡｃ：Ｎ−アセチル−ラクトサミン、Ｌａｃ：ラクトース）【００６０】
（２）シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法
シアロ糖鎖含有ポリマーを低コストで大量に調製するためには、用いる酵素が未精製品であることが望ましい。ただし、そのような粗酵素を合成反応に使用するためには、反応基質としてポリグルタミン酸に結合したオリゴ糖を用いることは好ましくない。したがって、シアロ糖鎖（シアリルオリゴ糖）を合成した後、最終段階でシアロ糖鎖とポリグルタミン酸とを縮合させることが望ましい。また、微生物由来の酵素は、動物由来酵素と比較して大腸菌等を宿主として大量に生産することが容易であるが、微生物由来の糖転移酵素を用いる場合は糖ペプチドや糖タンパク質を糖受容体とすることができないことが多い。このため、この点でもシアリルオリゴ糖を合成した後に、ポリグルタミン酸との縮合を行うことが望ましい。【００６１】
したがって、本発明のシアロ糖鎖含有ポリマーの製造法は、次の工程からなることを特長とする。
（工程１）
糖転移酵素を用いて非還元末端にシアル酸を含む目的とするシアロ糖鎖を合成する工程
（工程２）
工程１で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合させる工程
（工程３）
工程２で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程【００６２】
（工程１）
工程１は、糖受容体（たとえは、糖−パラニトロフェノール、５−アミノアルキル化糖等）と糖供与体（各種糖ヌクレオチド）を含有する反応系に合目的な糖転移酵素を添加して、目的とするシアロ糖鎖を合成する工程である。【００６３】
反応系に添加する糖転移酵素としては、糖ヌクレオチドの糖残基を糖受容体に転移させる活性を有するものであればよく、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ等があげられる。【００６４】
これらの酵素は目的とする酵素活性を有する限りどのような形態であってもよい。酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆるＤＮＡ組換え技術を用いた酵素生産で得ることが最も都合がよい。【００６５】
酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができる。当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより、目的の酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。【００６６】
微生物の菌体処理物としては、一般的な処理法に従って菌体を処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。菌体の一般的な処理法としては、機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などが挙げられる。【００６７】
酵素調製物としては、上記菌体処理物から得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。粗酵素または精製酵素は、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施すことによって得られる。【００６８】
糖ヌクレオチドおよび糖受容体は、それぞれ市販の製品を使用することができる。使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。なお、糖受容体として５−アミノアルキル化糖を使用する場合には、後述する実施例に示すように、セルラーゼの逆反応を利用して、糖類の水酸基をアルキルアミノ化することも可能である。【００６９】
シアロ糖鎖の合成は、上記の糖受容体及び糖ヌクレオチドを含有する反応系に、糖転移酵素を０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは、０．０１〜１０ユニット／ｍｌ程度になるようにそれぞれ添加し、５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。【００７０】
このようにして製造したシアロ糖鎖は、オリゴ糖の通常の分離精製手段を用いて単離精製できる。例えば、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィーやイオン交換カラムクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。【００７１】
（工程２）
工程２は、工程１で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合させる工程である。【００７２】
工程１で、糖受容体としてｐ−ニトロフェニル基を有する糖受容体を使用した場合には、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換後、糖受容体として５−アミノアルキル化糖を使用した場合には、アミノ基の保護基を常法により脱保護した後、トリエチルアミンやトリブチルアミンなどの塩基存在下、ポリグルタミン酸を縮合剤と処理して、シアロ糖鎖含有ポリマーを製造する。【００７３】
ｐ−ニトロフェニル基の還元反応に用いる条件としては、通常、芳香族ニトロ基の還元に適用する条件であればよい。具体例としては、水やメタノール、エタノールなどの有機溶媒中で、水素あるいはギ酸アンモニウム、シクロヘキセンなどの水素供与剤存在下、パラジウム炭素と処理することで実施できる。【００７４】
原料ポリマーとして用いるポリグルタミン酸は、α−型、γ−型のいずれであってもよい。【００７５】
縮合工程は、有機溶媒（ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドなど）中、原料ポリマーを塩基（トリエチルアミンやトリブチルアミンなど）存在下、カルボキシル基の活性エステル化剤（クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルやジスクシミジルカーボネート、カルボニルジイミダゾールなど）で処理した後、５−アミノアルキル化糖又は上記還元反応の生成物と反応処理することで実施される。【００７６】
５−アミノアルキル化糖又は上記還元反応の生成物の使用量は、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーの糖置換率に応じて添加すればよく、通常、ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して０．１当量以上あればよい。また、縮合反応に用いる塩基の使用量は、ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して１当量以上あればよい。【００７７】
縮合反応は−１０℃〜１００℃で実施することができる。また、必要に応じて４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンや１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールなどの一般的にアシル化反応の触媒を添加してもかまわない。【００７８】
（工程３）
工程３は、工程２で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程である。
工程２で合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。【００７９】
（３）シアロ糖鎖含有ポリマーを担体へ固定化した試薬
シアロ糖鎖含有ポリマーを固定化するための担体としては、特に制限されず、例えば、プレート、微粒子等が使用可能である。前記プレートとしては、例えば、ウエルを有するプレート（例えば、マイクロタイタープレート）、薄層クロマトグラフィー用シリカゲルプレート等があげられる。前記微粒子としては、例えば、ビーズ、チップ等があげられる。前記担体の材質は、特に制限されず、各種の紙、合成樹脂、金属、セラミックス、ガラス等が使用できる。その中でも特に、紫外線照射により、シアロ糖鎖含有ポリマーを担体に固定できる、ウエルを有するプレート（たとえば、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ，Ｌａｂｃｏａｔ２５０３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）などが望ましい。【００８０】
シアロ糖鎖含有ポリマーにおける前記シアロ糖鎖は、例えば、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）、シアリルガングリオ系糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−）およびシアリルラクトース糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌ１−４Ｇｌｃ−）があげられる。これらのなかでも、シアリルラクト系Ｉ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−）およびシアリルラクト系ＩＩ型糖鎖（ＳＡα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−）が好ましい。また、本発明の前記シアロ糖鎖含有ポリマーにおいて、シアル酸は、シアル酸の誘導体であってもよい。なお、「ＳＡ」又は「Ｎｅｕ５Ａｃ」は、「シアル酸（Ｎ−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）」を示す。【００８１】
前記シアロ糖鎖において、末端のシアル酸の結合様式は、例えば、「ＳＡα２−３Ｇａｌβ１−」（以下、「２−３型」という）、「ＳＡα２−６Ｇａｌβ１−」（以下、「２−６型」という）および「ＳＡα２−８Ｇａｌβ１−」（以下、「２−８型」という）があげられる。【００８２】
シアロ糖鎖含有ポリマーにおける前記ポリマーは、特に制限されず、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアクリルアミド、及びポリスチレン等の化学合成ポリマー、フェツイン等の天然糖タンパク質、並びに糖鎖含有脂質等が使用できる。前記糖鎖含有脂質としては、脂質部分が脂肪酸及びその誘導体を持つ化学合成糖脂質、シリアルパラグロボシド、シアリルラクトテトラオシルセラミド等の天然ガングリオシドまたは糖脂質、並びに化学合成ガングリオシドまたは糖脂質等が挙げられる。その中でも特にポリグルタミン酸が好ましく、α−型、γ−型のいずれであってもよい。【００８３】
前記シアロ糖鎖含有ポリマーの具体例としては、シアリルオリゴ糖をポリグルタミン酸に導入して得られるシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸がある。その分子量は、例えば、２０００〜５００万の範囲であり、グルタミン酸単位重合度は、例えば、１０〜１００００の範囲であり、グルタミン酸残基に対するシアリルオリゴ糖の導入率は、１０〜８０％の範囲である。シアリルオリゴ糖をポリグルタミン酸に導入して得られるシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸としては、前記した新規なシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸以外にも、例えば下記の公知のシアロ糖鎖含有ポリマーがある。
（２−３型）
ポリ［パラ−アミノフェニル（Ｎ−アセチルノイラミニル−（２−３）−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド）−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸］［Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／Ｇｌｎ−ｃｏ−Ｇｌｕ）］
（２−６型）
ポリ［パラ−アミノフェニル（Ｎ−アセチルノイラミニル−（２−６）−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド）−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸］［Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／Ｇｌｎ−ｃｏ−Ｇｌｕ）］【００８４】
このようなシアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸は、上記した本発明の製造法以外にも、公知の方法により調製できる。具体的には、βガラクトシダーゼの糖転移反応により合成したパラニトロフェニル配糖体（パラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド）をポリグルタミン酸に導入し、さらに、α２、３−（Ｎ）−及びα２、６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを用いて、導入したオリゴ糖をシアリル化することにより調製することもできる。この調製方法の具体例は、参考例として後述する。βガラクトシダーゼの糖転移反応によりパラニトロフェニル配糖体を合成する方法としては、Ｔ．ウスイ（Ｔ．Ｕｓｕｉ）ら［カーボハイドレート  リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ）、第２４４巻、第３１５〜第３２３頁（１９９３）］の方法が挙げられる。パラニトロフェニル配糖体をポリグルタミン酸に導入する方法としては、Ｘ．ゼン（Ｘ．Ｚｅｎｇ）ら［カーボハイドレート  リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ）、第３１２巻、第２０９頁〜第２１７頁（１９９８）］の方法が挙げられる。オリゴ糖をシアリル化する方法としては、Ｘ．ゼン（Ｘ．Ｚｅｎｇ）ら［アーチブス  バイオケミストリー  バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、第３８３巻、第２８〜第３７頁（２０００）］の方法が挙げられる。【００８５】
シアロ糖鎖含有ポリマーの担体への固定化は、疎水結合、イオン結合、共有結合等を用いて行うことも可能である。たとえば、シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を、ウエルを有する合成樹脂プレート（例えば、マイクロタイタープレート）に固定化する場合には、紫外線照射処理が最も効果的で、簡便な方法である。【００８６】
ここで、前記担体に、ある特定の物質を固定する場合は、その物質を含む溶液を担体に接触させ、前記液を除去した後、紫外線を照射するのが一般的である。しかしながら、この方法では、シアロ糖鎖含有ポリマーを担体に固定することができないことを本発明者等は突き止めた。そして、この問題を解決するために、一連の研究を続けたところ、シアロ糖鎖含有ポリマーを含む溶液を前記担体に接触させ、この状態で紫外線を照射した後、前記液を除去すれば、シアロ糖鎖含有ポリマーを担体表面に固体できることを、見出した。【００８７】
具体的には、シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を含む液をプレートと接触させ、この状態で紫外線を前記担体に照射する。その後、前記液を除去することにより、前記担体表面に前記シアロ糖鎖含有ポリグルタミン酸を固定化することができる。なお、紫外線照射処理において、紫外線の強度、プレートまでの距離により反応時間が異なるので予め条件を設定することが好ましい。【００８８】
このようにして調製したシアロ糖鎖含有ポリマーを固定した担体は、ウイルスの非特異的吸着を防止するために、ブロッキング処理されていることが望ましい。前記ブロッキング処理は、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂ＢＳＡ、卵白アルブミン、カゼイン、市販のブロッキング剤などを用いて実施することができる。【００８９】
（４）ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性の判別方法及びキット
本発明の判別方法において、前記結合度合いの測定は、ＥＬＩＳＡ法、免役クロマトグラフィー法、免役凝集法など免疫学的測定法を応用して行うことが可能である。例えば、より高感度に測定するためには、サンドイッチ型の免疫学的測定法による測定を好適な例として挙げることができる。サンドイッチ型の免疫学的測定法では、前記ウイルスに対する抗ウイルス１次抗体と、前記抗ウイルス１次抗体に対する標識２次抗体もしくは標識プロテインＡとを用いればよい。しかし、サンドイッチ型の免疫学的測定法に限定されるものではなく、前記担体として、ビーズ等の微粒子担体を使用することで、凝集の程度により前記結合度合いを測定することも可能である。さらに、免疫学的測定法以外の方法によるウイルス特異的成分の検出法（例えば、ウイルススパイクタンパク質であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの検出、それらが持つ生物活性の検出など）も利用可能であることも明らかである。【００９０】
上述したサンドイッチ型免疫学的測定法をより具体的に説明すれば、前記抗ウイルス１次抗体は、特に制限されず、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。前記ポリクローナル抗体としては、例えば、抗インフルエンザウイルスウサギ血清がある。また、モノクローナル抗体としては、例えば、Ａ型ウイルスのヌクレオプロテインに対するモノクローナル抗体のような全てのＡ型ウイルスと反応するものがある。なお、抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ウサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、イヌ抗体、ヒツジ抗体等のさまざまの由来のものが使用できる。抗体のクラスも特に制限されず、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥの全てが適用できる。【００９１】
前記標識２次抗体もしくは標識プロテインＡの標識は、特に制限されず、例えば、酵素標識（例えば、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、蛍光標識、放射能標識等がある。なお、抗体の由来は、特に制限されず、例えば、ウサギ抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヤギ抗体、イヌ抗体、ヒツジ抗体等のさまざまの由来のものが使用できる。抗体のクラスも特に制限されず、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥの全てが適用できる。前記標識２次抗体としては、酵素標識ウサギＩｇＧ抗体が好ましい。【００９２】
本発明において、判別対象となるウイルスは、特に制限されず、用いるシアロ糖鎖含有ポリマーに対応し、様々なウイルスに適用可能である。例えば、インフルエンザウイルス、パラミクソウイルス群、パラインフルエンザウイルス群、ロタウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ポリオーマウイルス等が例示される。前記インフルエンザウイルスとしては、高病原性Ａ型トリインフルエンザウイルス、ヒトＡ型インフルエンザウイルスおよびヒトＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。【００９３】
測定に使用するウイルスサンプルは、不活化処理したウイルスサンプルであってもよい。たとえば、エーテル処理により不活化したウイルス培養発育鶏卵漿尿液を濃縮することなく、そのまま用いても本発明方法で測定可能である。【００９４】
測定手順自体は、採用した手段の公知の手段に準じて行えばよい。たとえば、免疫学的測定法を応用した場合には、固定化シアロ糖鎖含有ポリマーと被検ウイルスサンプルを反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに標識抗体を反応させる（ツーステップ法）か、固相抗体、被検試料及び標識抗体を同時に反応させ（ワンステップ法）る。そして、以後のそれ自体公知の方法によりサンプル中のウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を検出することができる。【００９５】
なお、免疫学測定法の詳細については、たとえば以下の文献を参照すればよい。
（１）入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
（２）石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
（３）臨床病理  臨時増刊  特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
（４）「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）【００９６】
（５）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．７０」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐａｒｔ  Ａ））
（６）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．７３」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐａｒｔ  Ｂ））
（７）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．７４」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐａｒｔ  Ｃ））
（８）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．８４」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐａｒｔ  Ｄ：  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））
（９）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．９２」
（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐａｒｔ  Ｅ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））
［（５）〜（９）はアカデミックプレス社発行］【００９７】
高病原性Ａ型トリインフルエンザウイルスは、２−３型のシアロ糖鎖を強く認識する一方、２−６型のシアロ糖鎖の認識、結合性若しくは親和性が低い。これとは逆に、ヒトＡ型およびヒトＢ型インフルエンザは、２−６型のシアロ糖鎖を強く認識する一方、２−３型のシアロ糖鎖の認識、結合性若しくは親和性が低い。したがって、本発明方法において、２−３型および２−６型の双方のシアロ糖鎖含有ポリマーを用い、それぞれのシアロ糖鎖含有ポリマーに対する結合度合いを測定し、それらを比較することで、トリ感染型インフルエンザとヒト感染型インフルエンザとの判別が可能である。【００９８】
また、本発明の判別方法において、例えば、前記担体として、２種類以上の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを表面に固定した担体を用いてもよい。この場合、２種類以上の前記シアロ糖鎖含有ポリマー毎に前記ウイルスの結合度合いを測定し、それらの結果を比較することで、前記ウイルスのレセプター糖鎖認識特異性、すなわち前記ウイルスの感染型を判別し、またその変異による感染宿主の変化を検出することができる。すなわち、複数のウエルを有するプレートにおいて、前記ウエル毎、あるいはウエルの列毎に異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーを固定したものを用いる。そして、各ウエルにウイルスを供給し、各ウエルの認識特異性を比較することで、ウイルスの感染型及びその変異による感染宿主の変化を判定する。これ以外にも、例えば、複数の担体において、前記担体毎に異なる種類のシアロ糖鎖含有ポリマーを固定したものを準備する。このように２種類以上の前記シアロ糖鎖含有ポリマーを結合させた担体毎に前記ウイルスの結合度合いを測定し、それらの結果を比較して前記ウイルスの感染型及びその変異による感染宿主の変化を検出する。この場合、前記担体としては前述したとおり、ビーズ等の微粒子担体を使用することができ、担体ごとにウイルスを供給し、微粒子担体間の認識特異性を、例えば凝集の程度により比較することで、ウイルスの感染型を判定してもよい。【００９９】
つぎに、本発明のキットは、前記シアロ糖鎖含有ポリマーを固定した担体に加え、さらに、担体に捕捉されたウイルスを検出するための抗ウイルス抗体（例えば、ウイルスに対する抗ウイルス１次抗体と抗ウイルス１次抗体に対する標識２次抗体もしくは標識プロテインＡ）を含むことが好ましい。前記抗体については、前述のとおりである。【０１００】
（実施例）
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例によって、なんら制限されない。
＜ＨＰＬＣ＞
サンプルはすべて０．４５μｌのフィルターで濾過した後、分析した。分析条件は下記に示したものを用いた。
カラム      ：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ６０（φ４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度  ：４０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：２１０ｎｍ
溶媒        ：９０％  ＣＨ３ＣＮ
あるいは、
カラム      ：ＹＭＣ  Ｐｒｏ  Ｃ１８ＲＳ（φ６．０×１５０ｍｍ）
カラム温度  ：４０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：３００ｎｍ
溶媒        ：２０％  ＭｅＯＨ−５０ｍＭ  ＴＥＡＡ【０１０１】
＜ＮＭＲ＞
分析機器    ：ＪＥＯＬ  ＥＸ−２７０  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，
ＪＥＯＬ  ｌａｍｄａ  ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−５００  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
外部標準    ：ＴＰＳ［ｓｏｄｉｕｍ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］
溶媒        ：Ｄ２Ｏ
温度        ：２５℃あるいは６０℃
サンプル管  ：φ３または５ｍｍ【０１０２】
（略称）
ｐＮＰ：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ
Ｌａｃ：Ｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）
ＬａｃＮＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）
Ｎｅｕ５Ａｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ：ＣＭＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ
γ−ＰＧＡ：γ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ
ＢＯＰ：Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  
ＨＯＢｔ：１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒａｔｅ
ＰＢＳ：１０  ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）
ＴＰＳ：Ｓｏｄｉｕｍ  ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ
ＤＰ：Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（γ−ポリグルタミン酸重合度）
ＤＳ：Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（ＤＰを１００%とした場合の糖残基置換度%）
ＩＰＴＧ：Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ
ｄＡＴＰ：２’−ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄＧＴＰ：２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄＣＴＰ：２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄＴＴＰ：２’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ５´−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
Ｐｄ−Ｃ：Ｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｏｎ  ｃａｒｂｏｎ
ＤＭＦ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ
Ｅｔ３Ｎ：Ｔｒｉｅｔｈｙａｍｉｎｅ
ｐＮＰＣＦ：ｐａｒａ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃｈｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎ
ＤＭＳＯ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ
ＡＰ：Ａｌｋａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ【０１０３】
実施例１：３’−ＳＬＮ−αＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ））および６’−ＳＬＮ−αＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ））の調製【０１０４】
下記式（ＩＸ）に示す合成経路で３’−ＳＬＮ−αＰＧＡおよび６’−ＳＬＮ−αＰＧＡを調製した。
0005130598.tif 000018
（ＩＸ）【０１０５】
（１）β１，４−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（β１，４−ＧａｌＴ）の調製
β１，４−ＧａｌＴの調製は、野口らの方法（特開２００２−３３５９８８）に記載されている発現プラスミドｐＴＧＦ−Ａを用いて行った。ｐＧＴＦ−Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５０ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。菌体濃度が４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で１６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるβ１，４−ＧａｌＴ活性は特開２００５−３３５９８８号公報に記載されている方法で測定した。【０１０６】
（２）α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（α２，３−ＳｉａＴ）の調製
α２，３−ＳｉａＴの調製は、野口らの方法（特開２００２−３３５９８８）に記載されている発現プラスミドｐＭａｌ−ｓｉａＴを用いて行った。ｐＭａｌ−ｓｉａＴを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５０ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。菌体濃度が４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で１６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ，２０分）により菌体を回収し、５ｍｌの緩衝液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去し、得られた上清画分を酵素液とした。酵素液におけるα２，３−ＳｉａＴ活性は特開２００５−３３５９８８号公報に記載されている方法で測定した。【０１０７】
（３）α２，６−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （α２，６−ＳｉａＴ）の調製
フォトバクテリウム・ダムセラ  ｓｕｂｓｐ．ｄａｍｓｅｌａ（ＮＢＲＣ  Ｎｏ．１５６３３又はＡＴＣＣ  ３３５３９）からの染色体ＤＮＡは次の手順により調製した。まず、該菌の凍結乾燥菌体を１００μＬの５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０），２０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁したのちに１０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を添加して室温で５分静置により溶菌させる。そして、この溶菌液からフェノール抽出ならびにエタノール沈殿により得られた沈殿を２０μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解することにより、該菌から染色体ＤＮＡを調製した。【０１０８】
以上のように調製したＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）を常法に従って合成した。これら２種類のプライマーを用い、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのβ−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードするｂｓｔ遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１２２８５）を含む領域のＤＮＡを増幅した。【０１０９】
プライマー（Ａ）：５’−ＧＴＧＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＣＧＣＡＣＴＴ−３’  
プライマー（Ｂ）：５’−ＡＧＧＴＣＧＣＣＡＣＡＴＴＴＡＣＧＡＴＧ−３’  【０１１０】
ＰＣＲ法によるｂｓｔ遺伝子を含む領域のＤＮＡ増幅は、反応液１００μｌをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（４７℃、１分）、及び伸長反応（７２℃、２分）からなるステップを３６回繰り返すことにより行った。前記反応液は、１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）を１０μｌ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰを含み、鋳型ＤＮＡを０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を２．５ｕｎｉｔｓ、含むものとした。【０１１１】
増幅後のＤＮＡを、文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２））の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）を使って、ＰＣＲ法によりフォトバクテリウム・ダムセラのｂｓｔ遺伝子を増幅した。【０１１２】
プライマー（Ｃ）：５’−ＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＡＡＴＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＧＣ−３’
プライマー（Ｄ）：５’−ＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＣＡＴＣ−３’【０１１３】
ＰＣＲ法によるｂｓｔ遺伝子の増幅は、反応液１００μｌをＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社）を用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５２℃、１分）、及び伸長反応（７２℃、２分）からなるステップを３０回繰り返すことにより行った。前記反応液は、１０ｘＰｙｒｏｂｅｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）を１０μｌ、濃度０．２ｍＭのｄＡＴＰ、濃度０．２ｍＭのｄＧＴＰ、濃度０．２ｍＭのｄＣＴＰ、濃度０．２ｍＭのｄＴＴＰを含み、鋳型ＤＮＡを０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）各々０．２μＭ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）を２．５ｕｎｉｔｓ、含むものとした。【０１１４】
遺伝子増幅後、ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、１．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６（特開２００１−１０３９７３）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐ１２−６−ｐｓｔΔＮを単離した。【０１１５】
プラスミドｐ１２−６−ｐｓｔΔＮを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１５％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養した。５時間後培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに１８℃で２０時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を回収し、２．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５））に懸濁して懸濁液を得た。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて懸濁液を氷冷下で超音波処理し（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００ｘｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。【０１１６】
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるα２，６シアリルトランスフェラーゼ活性を測定した。その結果、０．４４  ｕｎｉｔｓ／ｍｉｎ／ｍｌ  酵素液であった。【０１１７】
なお、α２，６シアリルトランスフェラーゼ活性は、以下に示す方法でＣＭＰ−ＮｅｕＡｃとＮ−アセチルラクトサミンから６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃへの転換活性を測定、算出したものである。すなわち、濃度２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．５）、濃度５０ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、濃度１０ｍＭのＮ−アセチルラクトサミンにα２，６シアリルトランスフェラーゼ酵素標品を添加して３７℃で１０分反応させる。反応液を３分間の煮沸にて反応を停止し、ＨＰＡＥＣ−ＣＤ（Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）による糖分析を行う。分離にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を用い、溶出液として（Ａ）濃度０．１ＭのＮａＯＨ溶液と（Ｂ）濃度０．１ＭのＮａＯＨ，濃度０．５Ｍの酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（０−１０分：Ｂ＝０％、１０−２５分：Ｂ＝４５％、２５−３０分：Ｂ＝１００％）を用いる。ＨＰＡＥＣ−ＣＤ分析結果から反応液中のＬａｃＮＡｃ消費量および６’−ＳｉａｌｙｌＬａｃＮＡｃの生成量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＮｅｕＡｃをＮ−アセチルラクトサミンに転移させる活性を１ｕｎｉｔとする。【０１１８】
（４）３’−ＳＬＮ−ｐＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ）の合成
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭのＧｌｃＮＡｃ−ｐＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ＧｌｃＮＡｃ），３０ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ，５．０％（ｖ／ｖ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，０．１Ｕ／ｍｌのβ１，４−ＧａｌＴを含む溶液７５ｍｌを３７℃で６時間インキュベーションした。この反応液に２０ｍＭのＭｎＣｌ２，３０ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，１Ｕ／ｍｌのアルカリホスファターゼ（タカラバイオ社），０．２２Ｕ／ｍｌのα２，３−ＳｉａＴを添加して１００ｍｌにした。反応液は３７℃で２０時間インキュベーションした後、５分間煮沸し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ，  ２０分）して上清を回収した。【０１１９】
合成液をＯＤＳカラム（３４０ｍＬ，５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで平衡化）に吸着させ、５−１０％ＭｅＯＨ−５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで目的物を溶出した。３’−ＳＬＮ−ｐＮＰ溶出フラクションを回収し、回収した溶出フラクションを濃縮後、水で５回共沸し、炭酸水素トリエチルアミンを除去した。ＯＤＳカラム回収液を１５０ｍＬとし、ＤＥＡＥカラム（３３０ｍＬ）に吸着し、０．０５Ｎ炭酸水素アンモニウム水溶液で溶出し、３’−ＳＬＮ−ｐＮＰ溶出フラクションを回収した。これを濃縮し、さらに水で５回共沸し、炭酸水素アンモニウムを除去した。残渣にＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を加え共沸脱水した。これを真空乾燥し（５０℃、３ｈ）、３’−ＳＬＮ−ｐＮＰを９６３ｍｇ（７９％，残留ＭｅＯＨ０．８分子含む）を得た。【０１２０】
（得られた３’−ＳＬＮ−ｐＮＰのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ８．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．１６−３．５９（１９Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．５Ｈｚ），２．０４（３Ｈ，ｓ），２．０２（３Ｈ，ｓ），１．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ）【０１２１】
（５）６’−ＳＬＮ−ｐＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ）の合成
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭのＧｌｃＮＡｃ−ｐＮＰ，３０ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ，５．０％（ｖ／ｖ）Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，０．１Ｕ／ｍｌのβ１，４−ＧａｌＴを含む溶液７５ｍｌを３７℃で６時間インキュベーションした。この反応液に２０ｍＭのＭｎＣｌ２，３０ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，１Ｕ／ｍｌのアルカリホスファターゼ（タカラバイオ社），０．２２Ｕ／ｍｌのα２，６−ＳｉａＴを添加して１００ｍｌにした。反応液は３７℃で２０時間インキュベーションした後、５分間煮沸し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ，２０分）して上清を回収した。【０１２２】
合成液をＯＤＳカラム（３００ｍＬ，５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで平衡化）に吸着させ、５−１０％ＭｅＯＨ−５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで目的物を溶出した。６’−ＳＬＮ−ｐＮＰ溶出フラクションを回収し、回収した溶出フラクションを濃縮後、水で５回共沸し、炭酸水素トリエチルアミンを除去した。ＯＤＳカラム回収液を１５０ｍＬとし、ＤＥＡＥカラム（３００ｍＬ）に吸着し、０．０５Ｎ炭酸水素アンモニウム水溶液で溶出し、６’−ＳＬＮ−ｐＮＰ溶出フラクションを回収した。これを濃縮し、さらに水で５回共沸し、炭酸水素アンモニウムを除去した。残渣にＭｅＯＨ（２０ｍＬ）を加え共沸脱水した。これを真空乾燥し（５０℃、２ｈ）、６’−ＳＬＮ−ｐＮＰを１．０５ｇ（８６％，  残留ＭｅＯＨ０．８分子含む）を得た。【０１２３】
（得られた６’−ＳＬＮ−ｐＮＰのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ８．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，１０．５Ｈｚ），４．０４−３．５６（１８Ｈ，ｍ），２．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．４Ｈｚ），２．０６（３Ｈ，ｓ），２．０４（３Ｈ，ｓ），１．７５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ）【０１２４】
（６）３’−ＳＬＮ−ｐＡＰ（ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ）の合成
３’−ＳＬＮ−ｐＮＰ（５０３ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ（５０ｍｇ）、ギ酸アンモニウム（３７８ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ）を加え室温で攪拌した。２時間後にＨＰＬＣ分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放系とし、室温で２１時間攪拌した。Ｐｄ−Ｃをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水（３ｍｌ）−トリエチルアミン（１ｍｌ×１，０．５ｍｌ×２）で３回共沸して３’−ＳＬＮ−ｐＡＰ−Ｅｔ３Ｎ塩とした後、ＤＭＦ（３ｍＬ）で３回共沸脱水し、残渣をＤＭＦの２．４ｍＬ溶液（０．２５Ｍ）に調製した。【０１２５】
（アンモニウム塩のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ６．９７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．１，９．９Ｈｚ），４．０４−３．５８（１８Ｈ，ｍ），２．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．５Ｈｚ），２．０５（３Ｈ，ｓ），２．０５（３Ｈ，ｓ），１．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ）【０１２６】
（７）６’−ＳＬＮ−ｐＡＰ（ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ）の合成
６’−ＳＬＮ−ｐＮＰ（５０２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）を蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ（５０ｍｇ）、ギ酸アンモニウム（３７８ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ）を加え室温で攪拌した。２．５時間後にＨＰＬＣ分析を行い、原料が完全に消失していることを確認した後、反応を開放系とし、室温で２１時間攪拌した。Ｐｄ−Ｃをろ過して除き、ろ液を濃縮後、水（３ｍｌ）−トリエチルアミン（１ｍｌ×１，０．５ｍｌ×２）で３回共沸して６’−ＳＬＮ−ｐＡＰ−Ｅｔ３Ｎ塩とした後、ＤＭＦ（３ｍＬ）で３回共沸脱水し、残渣をＤＭＦの２．４ｍＬ溶液（０．２５Ｍ）に調製した。【０１２７】
（アンモニウム塩のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ６．９７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．０３−３．５４（１９Ｈ，ｍ），２．６９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１２．４Ｈｚ），２．０７（３Ｈ，ｓ），２．０４（３Ｈ，ｓ），１．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ）【０１２８】
（８）３’−ＳＬＮ−αＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ））の合成
αＰＧＡ（１３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ  ａｓ  ｇｌｕ  ｕｎｉｔ），Ｅｔ３Ｎ（１７μｌ，０．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍｌ）に溶解し、０℃でＤＭＡＰ（１．２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ），ｐＮＰＣＦ（２４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加え、同温で１ｈ攪拌した。３’−ＳＬＮ−ｐＡＰ（０．２５Ｍ，０．４ｍｌ，０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液およびＨＯＢｔ（３１ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），Ｅｔ３Ｎ（１４μｌ，０．１ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、室温で２４時間攪拌した。反応液に水（２００μｌ）を加えた後、１Ｎ−ＮａＯＨ（１．６ｍｌ）を加えて、室温で１時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）で除いた。【０１２９】
上清１．５ｍｌを透析チューブに入れ、２００ｍｌの蒸留水で透析した。３’−ＳＬＮ−αＰＧＡ液を回収し、エバポレーター濃縮（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０Ｆ，８ｍｌ）にかけた。サンプルをアプライした後、超純水１０ｍｌで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、１０００ｍｌの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−８Ｘ，３ｍｌ）にかけた。吸着後３０ｍｌの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した（４０〜４５ｍｌ）。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、凍結乾燥（棚温２０℃、一晩）して３７．４ｍｇの３’−ＳＬＮ−αＰＧＡを得た。得られた３’−ＳＬＮ−αＰＧＡについて、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき糖残基置換度を求めた結果、６８％と算出された（図１２参照）。
糖残基置換度（%）＝（Ａ×１００）／（Ｃ−（３Ａ／４）−４Ｂ）【０１３０】
（得られた３’−ＳＬＮ−αＰＧＡのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６０℃）：δ７．２６（ｂｒｓ），６．９３（ｂｒｓ），５．００（ｂｒｓ），４．５７（ｂｒｓ），４．１２（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），４．０７−３．５０（ｍ），２．７８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），２．４１（ｂｒｓ），２．２９−１．９２（ｍ），１．８１（ｔ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ）【０１３１】
（９）６’−ＳＬＮ−αＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／α−ＰＧＡ））の合成
αＰＧＡ（１３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ  ａｓ  ｇｌｕ  ｕｎｉｔ），Ｅｔ３Ｎ（１７μｌ，  ０．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍｌ）に溶解し、０℃でＤＭＡＰ（１．２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ），ｐＮＰＣＦ（２４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加え、同温で１時間攪拌した。６’−ＳＬＮ−ｐＡＰ（０．２５Ｍ，０．４ｍｌ，０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液およびＨＯＢｔ（３１ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），Ｅｔ３Ｎ（１４μｌ，０．１ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、室温で１９時間攪拌した。反応液に水（２００μｌ）を加えた後、１Ｎ−ＮａＯＨ（１．６ｍｌ）を加えて、室温で１ｈ攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）で除いた。【０１３２】
上清１．５ｍｌを透析チューブに入れ、２００ｍｌの蒸留水で透析した。６’−ＳＬＮ−αＰＧＡ液を回収し、エバポレーター濃縮（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０Ｆ，８ｍｌ）にかけた。サンプルをアプライした後超純水１０ｍｌで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、１０００ｍｌの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−８Ｘ，３ｍｌ）にかけた。吸着後３０ｍｌの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した（４０〜４５ｍｌ）。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、凍結乾燥（棚温２０℃、一晩）して３９．６ｍｇの６’−ＳＬＮ−αＰＧＡを得た。得られた６’−ＳＬＮ−αＰＧＡについて、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき、糖残基置換度を求めた結果、６６％と算出された（図１３参照）。
糖残基置換度（%）＝（Ａ×１００）／（Ｃ−（３Ａ／４）−４Ｂ）【０１３３】
（得られた６’−ＳＬＮ−αＰＧＡの）ＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６０℃）：δ７．２８（ｂｒｓ），６．９７（ｂｒｓ），５．０６（ｂｒｓ），４．４７（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），４．００−３．５５（ｍ），２．７１（ｄｄ，Ｊ＝４．２，１２，２Ｈｚ），２．４１（ｂｒｓ），２．２９−１．９０（ｍ），１．７１（ｔ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ）【０１３４】
実施例２：３’−ＳＬＮ−γＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ））および６’−ＳＬＮ−γＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ））の調製【０１３５】
（１）ＬＮ−ｐＮＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ＬａｃＮＡｃ）の合成
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ−ｐＮＰ，３０ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ，５．０％（ｖ／ｖ）  Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，０．１Ｕ／ｍｌ  β１，４−ＧａｌＴを含む溶液７５ｍｌを３７℃で６時間インキュベーションした後、５分間煮沸し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ，２０分）して上清を回収した。これをＯＤＳカラム（６０ｍＬ，５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで平衡化）に吸着させ、５−１０％ＭｅＯＨ−５０ｍＭ炭酸水素トリエチルアミンで目的物を溶出した。ＬＮ−ｐＮＰ溶出フラクションを回収し、濃縮後、水で５回共沸し、炭酸水素トリエチルアミンを除去した。これを真空乾燥し（５０℃、３ｈ）、ＬＮ−ｐＮＰを３０７ｍｇ得た。【０１３６】
（得られたＬＮ−ｐＮＰのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ８．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．１２−３．５７（１２Ｈ，ｍ），２．０３（３Ｈ，ｓ）【０１３７】
（２）ＬＮ−ｐＡＰ（ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ−ＬａｃＮＡｃ）の合成
ＬａｃＮＡｃ−ｐＮＰ（５５０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を水−メタノール（１０：１，４４ｍｌ）に溶解し、１０％パラジウム炭素触媒（５５ｍｇ）、ギ酸アンモニウム（５５０ｍｇ，８．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌した。反応懸濁液をろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をＯＤＳカラム（８０ｍＬ）に吸着し、５％メタノールで目的物を溶出した。溶媒を留去し、ＬＮ−ｐＡＰを５１３ｍｇ（９９％）得た。【０１３８】
（得られたＬＮ−ｐＡＰのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ６．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．０２−３．５４（１２Ｈ，ｍ），２．０５（３Ｈ，ｓ）【０１３９】
（３）ＬＮ−γＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ））の合成
γＰＧＡ（６．５ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ  ａｓ  ｇｌｕ  ｕｎｉｔ）を１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファ，ｐＨ１０．０（０．５ｍｌ）に溶解し、ＬＮ−ｐＡＰ（６０．０ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）の１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファ溶液（０．４ｍｌ）およびＨＯＢｔ（６．５ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ），ＢＯＰ試薬（５０．７ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（１．４ｍｌ）をそれぞれ加え、室温で２４時間攪拌し反応させた。得られた反応液に２．３ｍｌのＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸バッファ（ｐＨ７．５）および１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）を加えて、氷上で２時間攪拌した。生じた沈殿を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）で除いた。上清４．６ｍｌにＰＢＳ１．５ｍｌを添加して沈殿が生じないのを確認した後、エバポレーター濃縮（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０Ｆ，８ｍｌ）にかけた。サンプルをアプライした後超純水１０ｍｌで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、１０００ｍｌの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収してエバポレーター濃縮で（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、凍結乾燥（棚温２０℃、一晩）して１９．０ｍｇのＬＮ−γＰＧＡを得た。得られたＬＮ−γＰＧＡについて、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき、糖残基置換度を求めた結果、５０％と算出された（図１４参照）。
糖残基置換度（%）＝（Ａ×１００）／（Ｂ−（３Ａ／４））【０１４０】
（得られたＬＮ−γＰＧＡのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６０℃）：δ７．３０（ｂｒｓ），６．９７（ｂｒｓ），５．０５（ｂｒｓ），４．５０−３．６４（ｍ），２．８４（ｂｒ），２．４３−１．９２（ｍ）【０１４１】
（４）３’−ＳＬＮ−γＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃβ−ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ））の合成
５０ｍＭ  カコジル酸バッファ（ｐＨ６．０），２．５ｍ  ＭｎＣｌ２，８ｍｇ  ＬａｃＮＡｃ−γＰＧＡ，３０ｍＭ  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，２０Ｕ／ｍｌ  ＡＰ，０．０２Ｕ／ｍｌ  α２，３−ＳｉａＴ（Ｒａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ，ＣＡＬＢＩＣＨＥＭ社）を含む溶液１．０５ｍｌを３７℃で４４時間インキュベーションした後、３分間煮沸し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分）して上清を回収した。上清をゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０Ｆ，８ｍｌ）にかけた。サンプルをアプライした後超純水８ｍｌで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、１０００ｍｌの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−８Ｘ，３ｍｌ）にかけた。吸着後３０ｍｌの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した（４５ｍｌ）。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、凍結乾燥（棚温２０℃、一晩）して９．０ｍｇの３’−ＳＬＮ−γＰＧＡを得た。得られた３’−ＳＬＮ−γＰＧＡについて、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき、シアリル化率を求めた結果、９９％と算出された（図１５参照）。
シアリル化率（%）＝（Ｂ×１００）／（Ａ／４））【０１４２】
（得られた３’−ＳＬＮ−γＰＧＡのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６０℃）：δ７．３５（ｂｒｓ），７．０３（ｂｒｓ），５．１２（ｂｒｓ），４．５８（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．１３−３．５４（ｍ），２．７７（ｄ，Ｊ＝１２，０Ｈｚ），２．５３−１．９１（ｍ），１．８０（ｔ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ）【０１４３】
（５）６’−ＳＬＮ−γＰＧＡ（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ／γ−ＰＧＡ））の合成
５０ｍＭ  カコジル酸バッファ（ｐＨ６．０），２．５ｍ  ＭｎＣｌ２，８ｍｇ  ＬａｃＮＡｃ−γＰＧＡ，３０ｍＭ  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ，０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，２０Ｕ／ｍｌ  ＡＰ，０．０２Ｕ／ｍｌ  α２，６−ＳｉａＴ（Ｒａｔ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ，ＣＡＬＢＩＣＨＥＭ社）を含む溶液１．０５ｍｌを３７℃で４４時間インキュベーションした後、３分間煮沸し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分）して上清を回収した。上清をゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０Ｆ，８ｍｌ）にかけた。サンプルをアプライした後超純水８ｍｌで溶出し、アプライから全量を回収した。回収サンプルを透析チューブに入れ、１０００ｍｌの蒸留水および超純水で透析した。透析サンプルを回収し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−８Ｘ，３ｍｌ）にかけた。吸着後３０ｍｌの超純水で溶出し、吸着液から全量を回収した（４５ｍｌ）。回収液をエバポレーター濃縮で（バス温４０℃）で０．８ｍｌとし、凍結乾燥（棚温２０℃、一晩）して７．４ｍｇの６’−ＳＬＮ−γＰＧＡを得た。得られた６’−ＳＬＮ−γＰＧＡについて１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき、シアリル化率を求めた結果、９９％と算出された（図１６参照）。
シアリル化率（%）＝（Ｂ×１００）／（Ａ／４））【０１４４】
（得られた６’−ＳＬＮ−γＰＧＡのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６０℃）：δ７．３６（ｂｒｓ），７．０５（ｂｒｓ），５．１４（ｂｒｓ），４．４９−４．３９（ｍ），４．１６（ｂｒｓ），４．０１−３．５５（ｍ），２．７１（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ），２．５９−１．８１（ｍ），１．７１（ｔ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ）【０１４５】
実施例３
（１）酵素
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ＸＬ−５２２）は、ナガセケムテックスより購入した。α２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、α２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）は、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社より購入した。アルカリフォスファターゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より購入した。【０１４６】
（２）基質
Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌは、和光純薬（株）より購入した。γ−ＰＧＡ、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、ＬａｃＮＡｃは市販品を必要より精製して使用した。【０１４７】
（３）試薬
Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏは、和光純薬（株）より購入した。ＢＯＰ、ＨＯＢｔ、およびＢＳＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。【０１４８】
（４）酵素活性測定法
＜Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性＞
Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼの酵素活性測定法はＬａｃβ−ｐＮＰからのｐＮＰの遊離量を定量して行った。１０ｍＭ  Ｌａｃβ−ｐＮＰ（２５μｌ）と５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（７０μｌ）とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を１００μｌとし、４０℃で２０分間反応を行った。経時的に反応液から１０μｌとり、予め９６穴マイクロプレートに分注しておいた１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液（１９０μｌ）と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐＮＰを定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量と定義した。【０１４９】
＜Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性＞
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ中に夾雑するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性測定法はＧａｌβ−ｐＮＰからのｐＮＰの遊離量を定量して行った。１０ｍＭ  Ｇａｌβ−ｐＮＰ（２５μｌ）と５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（２５μｌ）とを混合し、適当量の酵素を加えて全量を１００μｌとし、４０℃で２０分間反応を行った。経時的に反応液から１０μｌとり、予め９６穴マイクロプレートに分注しておいた１．０Ｍ炭酸ナトリウム溶液（１９０μｌ）と混合し、反応停止後、直ちにプレートリーダーを用い４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐＮＰを定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量と定義した。【０１５０】
（５）酵素の調製
＜Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ  由来セルラーゼの部分精製＞
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼの粗酵素溶液（１０００ｍｌ，８７５ｋＵ）を２５%飽和硫安で処理後、高速微量遠心機（ＫＵＢＯＴＡ  １７２０；ＲＡ−２００Ｊ  ローター使用、ＫＵＢＯＴＡ製）を用いて４℃で遠心分離を行い（６０１０ｇ×２０ｍｉｎ）上清を回収した。これを、７５%飽和硫安で処理し、同様の条件で遠心分離後、生じた沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した。分画分子量３００００の限外ろ過膜（ＰＭ−３０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて脱塩後、凍結乾燥を行い、７．８ｇの酵素粉末を得た。そのうち１．０ｇを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィー（φ２．６×１８ｃｍ）に供した。カラムを１０００ｍｌの同緩衝液で洗浄後、６００ｍｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液でステップワイズ溶出を行った。カラム吸着部を限外ろ過により脱塩、濃縮後、凍結乾燥を行い、部分精製酵素（０．７ｇ，０．７０Ｕ／ｍｇ）を得た。【０１５１】
＜Ｇａｌ−ａｍｉｄｉｎｅ  ｇｅｌを用いたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの除去＞
部分精製酵素（５０ｍｇ，Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性  ３５Ｕ，Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性  １９Ｕ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０（１．０ｍｌ）に溶解し、予め同溶媒で平衡化しておいたＧａｌ−ａｍｉｄｉｎｅアフィニティーカラムクロマトグラフィー（φ１．２×１．７ｃｍ）に供した。流速１０ｍｌ／ｈにおいて各エッペンドルフチューブに１ｍｌずつ分取して、非吸着部を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０（３０ｍｌ）で洗浄した。吸着部を１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０（２０ｍｌ）で溶出し、さらに０．５Ｍ  ｍｅｔｈｙｌ  β−Ｇａｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０（１０ｍｌ）で溶出した。タンパク質の検出は２８０ｎｍの吸光度を測定することで行い、Ｌａｃβ−ｐＮＰおよびＧａｌβ−ｐＮＰの加水分解活性を測定した。それぞれの画分を分画分子量３００００の限外ろ過膜（ＰＭ−３０，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮後、凍結乾燥を行い、非吸着部よりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素（Ｌａｃβ−ｐＮＰ加水分解活性３２Ｕ，Ｇａｌβ−ｐＮＰ加水分解活性０．３Ｕ）を得た（Ｔａｂｌｅ．１）。なお、以後の反応には全てβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを除去した部分精製酵素を用いた。【０１５２】
これらの酵素等を用い、下記式（Ｘ）に示す合成経路で下記に記載する手順でＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃａα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ）およびＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃａα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ）を調製した。
0005130598.tif 000019
（Ｘ）【０１５３】
（６）５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌの化学合成
はじめに、５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（１０ｇ，９７ｍｍｏｌ）にピリジン（２０ｍｌ）を加えて溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルオロ酢酸（２５ｍｌ，１８０ｍｍｏｌ）を滴下しながら添加し反応を開始させた。反応開始から５分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝８：２）で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加えて反応を停止させ、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２００ｍｌを加えて反応液を中和した。反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を３回程度繰り返したのち、反応液をアセトンで溶解し、多量に存在する炭酸水素ナトリウムを析出させた。これをろ過後、濃縮し、クロロホルム：アセトン＝８：２で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ４．５×３５ｃｍ）に供した。約２５ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝８：２）で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌを収量１８ｇ、収率９４%で得た。これを１Ｈ−ＮＭＲに供した。
（５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ３．５９（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−α），  ３．３３（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  １．６５−１．４８（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３６（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１５４】
（７）５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅの合成
基質としてｌａｃｔｏｓｅ（５４．３ｇ，１５１ｍｍｏｌ）と５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（３０．０ｇ，１５１ｍｍｏｌ）とを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（１５１ｍｌ）に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したＴ．  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（４５００Ｕ）を加えて反応を開始させた。反応を追跡するために反応液１０μｌを経時的に採取し、１９０μｌの脱塩水を加えた後、１００℃で１０分間煮沸して反応を停止させ、０．４５μｍフィルターでろ過した後、ろ液をＨＰＬＣにより分析した。反応液を激しく振とう（２００ｒｐｍ）し、４０℃で１２０時間反応を行った。その後、１００℃、１０分間の煮沸により反応を停止させた。反応液を濃縮後、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ  カラムクロマトグラフィー（φ４．５×５０ｃｍ）に供し同溶媒で溶出し、２３ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取してＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して１Ｈ−ＮＭＲにより構造解析した結果、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅを収量８４９ｍｇ、収率１．０%で得た。
（５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．４８（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４５（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ３．３４（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ３．３２（１Ｈ，  Ｈ−２），  １．７１−１．５７（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．４２（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１５５】
（８）５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅの合成
基質としてＮ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（２０．０ｇ，５２．２ｍｍｏｌ）と５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌ（１５．６ｇ，７８．４ｍｍｏｌ）とを１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０（５２．２ｍｌ）に溶解し、そこへガラクトシダーゼを除去したＴ．  ｒｅｅｓｅｉ由来セルラーゼ（６２００Ｕ）を加えて反応を開始させた。反応を追跡するために反応液１０μｌを経時的に採取し、１９０μｌの脱塩水を加えた後、１００℃で１０分間煮沸して反応を停止させ、０．４５μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣにより分析した。反応液を激しく振とう（２００ｒｐｍ）し、４０℃で１４４時間反応を行った。その後、１００℃、１０分間の煮沸により反応を停止した。反応液を濃縮後、水で平衡化（５．０ｍｌ／ｍｉｎ）した活性炭−セライトクロマトグラフィー（φ４．５×１００ｃｍ）に供した。まず、０%（５．０Ｌ）−２５%（５．０Ｌ）のエタノール直線濃度勾配法により、基質として用いたＬａｃＮＡｃを溶出した。６０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションをＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度で測定した。ＬａｃＮＡｃを含む画分を濃縮することで、ＬａｃＮＡｃを回収量１７．２ｇ、回収率８６%で得た。次に８０%エタノール（５．０Ｌ）に切り換え吸着部を溶出した。６０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションを２１０ｎｍの吸光度で測定した。続いて、目的画分を含む画分を濃縮し、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ  カラムクロマトグラフィー（φ４．５×５０ｃｍ）に供し同溶媒で溶出し、２８ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取してＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。目的画分を含む画分を濃縮し、重水に溶解して１Ｈ−ＮＭＲにより構造解析した結果、５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅを収量３２２ｍｇ、収率１．１%で得た。
（５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．５１（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４６（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ３．３１（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．０２（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ），  １．５７（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３４（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１５６】
（９）５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅの合成
５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（１０４ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．２ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（φ２．５×４８ｃｍ）に供した。約２．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅを収量８２ｍｇ、収率９６%で得た。これを１Ｈ−ＮＭＲに供した。  
（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：δ４．４９（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４５（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ３．３０（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−２），  ２．９７（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  １．６７（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．４７（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１５７】
（１０）５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅの合成
５−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ（１００ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．２ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（φ２．５×５５ｃｍ）に供した。約２．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はＮ−アセチル基に由来する２１０ｎｍの吸光度と、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色とを用い生成物を確認した。目的物を含む画分を濃縮し、目的物である５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅを収量８２ｍｇ、収率９９%で得た。これを１Ｈ−ＮＭＲに供した。    
（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．５２（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ２．７７（ｔ，  ２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．０３（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ），  １．５４（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３５（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１５８】
（１１）Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）の合成
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：７７０００，１６．５ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（１．３ｍｌ）に溶解後、予めＤＭＳＯ（３．５ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（１３０ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１６ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ（１４０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ｐＨ１０．０（０．９ｍｌ）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（φ１．７×５．０ｃｍ，  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供した。また、糖残基置換度（%）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンの積分比（Ａ）と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した（図１７）。その結果、糖残基置換度６９%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量２９．６ｍｇで得た。【０１５９】
糖残基置換度（%）＝（４×１００）／（Ａ−（Ｂ／６））
（Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：δ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４５（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３４−４．２２（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．３１（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−２），  ３．２０（２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．４２（２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．２０−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  １．６３（２Ｈ，  Ｈ−ｄ），  １．５２（２Ｈ，  Ｈ−ｂ），  １．３５（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１６０】
（１２）Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）の合成
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：７７０００，１５．１ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（１．３ｍｌ）に溶解後、予めＤＭＳＯ（３．５ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（１１９ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ（１４０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（０．９ｍｌ）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（φ１．７×５．０ｃｍ，  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供した。また、糖残基置換度（%）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンの積分比（Ａ）と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）をに示す式にあてはめ算出した（図１８）。その結果、糖残基置換度６１%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量１７．０ｍｇで得た。【０１６１】
また、より高分子量のアシアロ型二糖含有糖鎖ポリペプチドを合成するため、上記と同様の組成でγ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：９９００００，１５．０ｍｇ）を用いて行った結果、糖残基置換度５８%のＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量２４．０ｍｇで得た。糖残基置換度は、次の式により求めた。【０１６２】
糖残基置換度（%）＝（４×１００）／（Ａ−（Ｂ／６×３））
（Ｐｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．５１（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３０−４．２１（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．１８（２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．４０（２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．１８−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  ２．０２（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ），  １．５２（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３５（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１６３】
（１３）Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）の合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［６９%，  ２１０ｋＤａ］５．５ｍｇをＬａｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．５ｍＭ、ＢＳＡ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のＧｌｃ（Ｈ−２）プロトンの積分比と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのアグリコン部位のプロトン２個分の積分比の和（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率６９%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量６．７ｍｇで得た（図１９）。シアリル化率は、次の式により求めた。【０１６４】
シアリル化率（％）＝（Ｂ×１００）／（Ａ／３）
（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．５３（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３５−４．１９（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．３０（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−２），  ３．２０（２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．７６（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ｅｑ），  ２．４１（２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．２０−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  ２．０３（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ’’），  １．８２（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ａｘ），  １．６３（２Ｈ，  Ｈ−ｄ），  １．５３（２Ｈ，  Ｈ−ｂ），  １．３６（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１６５】
（１４）Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／γ−ＰＧＡ）の合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［６９%，  ２１０ｋＤａ］５．５ｍｇをＬａｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．５ｍＭ、ＢＳＡ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、糖鎖由来のＧｌｃ（Ｈ−２）プロトンの積分比と５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−ｌａｃｔｏｓｉｄｅのアグリコン部位のプロトン２個分の積分比の和（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率５７%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／γ−ＰＧＡ）を収量６．８ｍｇで得た（図２０）。【０１６６】
シアリル化率（％）＝（Ｂ×１００）／（Ａ／３）
（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｌａｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４３（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３２−４．２０（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．３２（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−２），  ３．２０（２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．７１（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ｅｑ），  ２．４１（２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．２０−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  ２．０３（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ’’），  １．７５（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ａｘ），  １．６３（２Ｈ，  Ｈ−ｄ），  １．５２（２Ｈ，  Ｈ−ｂ），  １．３５（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１６７】
（１５）Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）の合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［６１%，  ２１０ｋＤａ］５．０ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．５ｍＭ、ＢＳＡ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン２個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率９６%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量６．４ｍｇで得た（図２１）。【０１６８】
また、受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［５８%，  ２６００ｋＤａ］５．０ｍｇを用いて上記と同様の方法でシアリル化を行ったところ、シアリル化率１００%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量６．０ｍｇで得た。シアリル化率は、次の式で求めた。【０１６９】
シアリル化率（％）＝（Ｂ×１００）／（Ａ／２）
（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ２７０  ＭＨｚ）：δ４．５３（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４７（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３５−４．２０（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．１８（２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．７３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ｅｑ），  ２．４０（２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．２０−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  ２．０３（ｓ，  ３Ｈ×２，  −ＮＨＡｃ，  −ＮＨＡｃ’’），  １．８２（ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ａｘ），  １．５２（２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３０（２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１７０】
（１６）Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）の合成
受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［６１%，  ２１０ｋＤａ］５．０ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２２．５ｍＭ、ＢＳＡ０．１%、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調整した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅのアグリコン部位のプロトン２個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（Ｂ）、３位アキシャルプロトンの積分比（Ｃ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率９７%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量６．１ｍｇで得た（図２２）。【０１７１】
また、受容体基質としてＰｏｌｙ（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ／  γ−ＰＧＡ）［５８%，  ２６００ｋＤａ］５．０ｍｇを用いて上記と同様の方法でシアリル化を行ったところ、シアリル化率１００%のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）を収量６．０ｍｇで得た。シアリル化率は次の式で求めた。【０１７２】
シアリル化率（％）＝（（Ｂ＋Ｃ）／２×１００）／（Ａ／２）
（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ  β−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ  ／  γ−ＰＧＡ）のＮＭＲ）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ５００  ＭＨｚ）：δ４．５５（ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１），  ４．４５  （ｄ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．３３−４．２１（１Ｈ，  Ｈ−α），  ３．１９  （２Ｈ，  Ｈ−ｅ），  ２．６７（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ｅｑ），  ２．４０  （２Ｈ，  Ｈ−γ），  ２．１８−１．９８（２Ｈ，  Ｈ−β），  ２．０６  （ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ’’），  ２．０３（ｓ，  ３Ｈ，  −ＮＨＡｃ），  １．７４  （ｔ，  １Ｈ，  Ｈ−３’’ａｘ），  １．５６−１．５１  （２Ｈ×２，  Ｈ−ｂ，  ｄ），  １．３１  （２Ｈ，  Ｈ−ｃ）【０１７３】
実施例４
参考例の方法で調製した下記の２種類のシアル糖鎖含有ポリマー（ｓｉａｌｙｌ−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）をミクロタイタープレートに下記の方法により吸着させた。まず、９６穴ミクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ，Ｌａｂｃｏａｔ２５０３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に、前記シアル糖鎖含有ポリマーのＰＢＳ溶液を１００μｌづつ加えた（倍々希釈：２００μｇ／ｍｌ、ＰＢＳを最大濃度として倍々希釈する）。つぎに、前記プレートを、室温に１時間放置後、紫外線照射装置（ＶＩＬＢＥＲ  ＬＯＵＲＭＡＴ，Ｆｒａｎｃｅ）のガラス面上に前記プレートを置き、紫外線（２５４ｎｍ）を１分間照射した。照射後、ウエル内のシアル糖鎖含有ポリマー溶液を、前記プレートを斜めにして捨てた。そして、前記プレートに２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｇｒａｄｅ９６％）を１００μｌ加え、室温で１時間ブロッキング処理した。【０１７４】
その後、各ウエルを１００μｌのＰＢＳで５回洗浄し、３種類の不活性化したインフルエンザウイルス（トリＡ型ウイルス：Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｋ  Ｋｏｎｇ／２４／７６（Ｈ３Ｎ２），３２ＨＡＵ（赤血球凝集価）；ヒトＡ型ウイルス：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２），３２ＨＡＵ；ヒトＢ型ウイルス：Ｂ／Ｌｅｅ／４０）を含有するＰＢＳ液を１００μｌ加え、４℃で１２時間ゆっくり振盪しながら放置した。ＰＢＳで３回洗浄後、各ウエルに５０μｌの抗インフルエンザウイルスウサギ抗血清（１０００倍希釈）を加え、４℃で２時間、ゆっくり振盪した。各ウエルに５０μｌのｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−結合プロテインＡ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｎ．Ｖ．  Ｃａｐｐｅｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｕｒｎｏｕｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ＰＢＳで１０００倍希釈）を加え、４℃で２時間ゆっくり振盪した。各ウエルをＰＢＳで３回洗浄後、５０μｌの基質試薬（０．０１％Ｈ２Ｏ２含有オルソフェニレンジアミン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）溶液）を加え、室温で１０分間放置し、次いで、５０μｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えて反応を停止させた。そして、各ウエルの発色を４９２ｎｍ（対照：６３０ｎｍを対照）で比色定量した。【０１７５】
その結果、トリＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２４／７６）（Ｈ３Ｎ２）については図１のグラフに示し、ヒトＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）（Ｈ３Ｎ２）については図２のグラフに示し、ヒトＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／Ｌｅｅ／４０））については、図３のグラフに示す。図１〜図３において、グラフ縦軸は、波長４９２ｎｍの吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ａｔ  ４９２ｎｍ）を示し、グラフ横軸は、シアル糖鎖含有ポリマー濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。また、図１〜図３において、「ＳＡα２，３−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ」は、下記の２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーを示し、「ＳＡα２，６−ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ」は、下記の２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーを示す。【０１７６】
シアロ糖鎖含有ポリマー
（２−３型）
Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）
（２−６型）
Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ【０１７７】
図１のグラフに示すように、前記トリＡ型インフルエンザウイルスは、２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低かった。また、図２のグラフに示すように、前記ヒトＡ型インフルエンザウイルスは、２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低かった。そして、図３グラフに示すように、前記ヒトＢ型インフルエンザウイルスは、２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低かった。【０１７８】
実施例５
各種シアロ糖鎖結合ポリグルタミン酸ポリマー（２μｇ／ｍｌ）をＰＢＳ液で倍々希釈後、マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ；  Ｌａｂｃｏａｔ  ２５０３，  Ｃａｍｂｒｉｇｅ，  ＭＡ）の各ウエルに１００μｌずつ加えた。つぎに、前記プレートを４℃に２時間静置後、紫外線照射装置のガラス面上に前記プレートを置き、紫外線（２５４ｎｍ）を１０分間照射した。照射後、ウエル内のシアロ糖鎖含有ポリマー溶液を捨て、各ウエルに２％ＢＳＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）もしくは０．１％ブロックエース（大日本製薬）２５０μｌを加え、４℃に一晩ブロッキング処理した。その後、各ウエルを２５０μｌのＰＢＳ液で５回洗浄し、エーテル処理で不活性化したインフルエンザウイルス（トリＡ型ウイルス：Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３），  １２８ＨＡＵ；ヒトＡ型ウイルス：Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２），  １２８  ＨＡＵ）のＰＢＳ懸濁液を５０μｌ各ウエルに加え、４℃に５時間放置した。各ウエルを０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ液２５０μｌで５回洗浄後、０．１％ＢＳＡもしくは０．０１％ブロックエースで１０００倍に希釈した抗インフルエンザウイルスウサギ抗血清を各ウエルに５０μｌずつ加え、４℃に２時間静置した。各ウエルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ液２５０μｌで５回洗浄後、０．１％ＢＳＡもしくは０．０１％ブロックエースで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識プロティンＡを各ウエルに５０μｌずつ加え、４℃に２時間静置した。各ウエルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ液２５０μｌで５回洗浄後、１００μｌの基質溶液（Ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ４ｍｇ，０．０１％Ｈ２Ｏ２含有１００ｍＭクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．０）を加え、室温で１５−２０分間放置後、１Ｎ硫酸水溶液を各ウエルに５０μｌ加え反応を停止した。各ウエルの発色を４９２ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）にて測定した。【０１７９】
その結果を、図４〜図１１に示すように、トリインフルエンザウイルスは、２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低かった。一方、ヒトインフルエンザウイルスは、２−６型のシアロ糖鎖含有ポリマーを強く認識したが、２−３型のシアロ糖鎖含有ポリマーに対しての認識性は低かった。そして、それぞれのシアロ糖鎖含有ポリマーに対する結合曲線の傾きを求めることで、ウイルスの変異による感染宿主の変化が起きているか否かの判定をすることができる。【０１８０】
参考例
（１）パラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ］の調製
２．４ｇの乳糖および２．３ｇのパラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチルグルコピラノシド（シグマ社）を、２０％アセトニトリルを含む２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解し（１２ｍＬ）、２０単位のバチルスサーキュランス由来β−ガラクトシダーゼ（大和化成社）を加え４０℃で６時間反応させる。その後、反応液を９５℃、１０分間加熱して反応を停止させた後に遠心し、上清を回収する。上清液をトヨパールＨＷ−４０Ｓカラム（商品名、５×１００ｃｍ、東ソー社）に供し、溶出液を分画採取し（２０ｍＬ／本）、その一部を３００ｎｍの吸光度を測定してパラ−ニトロフェニル残基を定量し、さらにフェノール−硫酸法による４８５ｎｍの吸光度を測定し、炭化水素を定量する。パラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド含む画分（１２０ｍＬ）を集めて採取し、濃縮後、メタノールを徐々に添加する。析出した沈殿を濾取し、減圧乾燥して２９２ｍｇのパラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニドの結晶を得る。【０１８１】
（２）パラ−アミノフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド［Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ］の調製
前記（１）で得られたパラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド１００ｍｇを２０ｍＬのメタノールに溶解し、その溶液にギ酸アンモニウム３００ｍｇおよび１０％パラジウム／活性炭末２０ｍｇを加えて、４０℃で反応を行う。その際、反応を高速液体クロマトグラフィーで経時的に追跡する。４０分後に、パラ−ニトロフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニドのピークが消滅したことを確認後、反応液を室温に戻して反応を停止する。反応液を順次、セライト、濾紙により濾過し、濾液は濃縮後、予め１２％メタノールで平衡化したクロマトレクス−ＯＤＳ  ＤＭ１０２０Ｔカラムクロマトグラフィーに供する。溶出液を分画採取し（３０ｍＬ／本）、２１０ｎｍ、３００ｎｍの両吸収の一致したアミノ還元二糖誘導体と予想されるピーク画分を濃縮、凍結乾燥し、７０．７ｍｇのパラ−アミノフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニドの結晶を得る。【０１８２】
（３）ポリ（パラ−アミノフェニルトルＮ−アセチル−β−ラクトサミニド−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸）［Ｐｏｌｙ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）］の調製
α−ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（シグマ社）２０ｍｇを０．４ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、予め０．２ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解したヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム１６０ｍｇと１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物１８ｍｇを添加し、室温下２０分間攪拌する。さらに前記（２）で得られたパラ−アミノフェニル−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド６０ｍｇをジメチルスルホキシド０．４ｍＬに溶解して添加し、室温下２４時間攪拌する。その反応液をセファデックスＧ−２５カラム（商品名、２．０×２６ｃｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社）に供し、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）で溶出する（流速１．０ｍＬ／分）。溶出液を分画採取し（２．０ｍＬ／本）、その一部をフェノール−硫酸法による４８５ｎｍの吸光度を測定し、炭化水素を含む画分を集めて採取する（１３ｍＬ）。その溶液を、ＹＭ−３メンブランを装着した限外ろ過器（アミコン社）で濃縮し（２ｋｇ／ｃｍ２）、さらに凍結乾燥し、４６ｍｇの標品を得る。【０１８３】
（４）ポリ［パラ−アミノフェニル（Ｎ−アセチルノイラミニル−（２−３）−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド）−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸］［Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）］の調製
前記（３）で得られたポリ（パラ−アミノフェニルトル−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸）［Ｐｏｌｙ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）］１０ｍｇとシチジン５’−モノホスフォ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム１５ｍｇ、さらに２５０ｍＭ塩化マンガン１０μＬと１０％牛血清アルブミン１０μＬおよびアルカリホスファターゼ２μＬを、５０ｍＭカコジル酸バッファー（ｐＨ６．０）９５０μＬに溶解し、３０ミリ単位のα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラットリコンビナント、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来、カルビオケム社）を添加して３７℃で４８時間反応を行なう。この反応液をセファデックスＧ−２５カラム（２．０ｘ２６ｃｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社）に供し、１０．９ｍｇの最終生成物を得る。【０１８４】
（５）ポリ［パラ−アミノフェニル（Ｎ−アセチルノイラミニル−（２−６）−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド）−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸］［Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）］の調製
前記（３）で得られたポリ（パラ−アミノフェニルトル−Ｎ−アセチル−β−ラクトサミニド−Ｌ−グルタミン−ｃｏ−グルタミン酸）［Ｐｏｌｙ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＡＰ／α−ＰＧＡ）］５ｍｇとシチジン５’−モノホスフォ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム７．５ｍｇ、さらに２５０ｍＭ塩化マンガン５μＬと１０％牛血清アルブミン５μＬおよびアルカリホスファターゼ１μＬを、５０ｍＭカコジル酸バッファー（ｐＨ６．０）４７４μＬに溶解し、１５ミリ単位のα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼ（ラット肝由来、カルビオケム社）を添加して３７℃で４８時間反応を行なう。この反応液をセファデックスＧ−２５カラム（商品名、２．０×２６ｃｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社）に供し、６．３ｍｇの最終生成物を得る。【０１８５】
以上のように、本発明によれば、簡単な装置若しくは器具で容易にウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別できる。したがって、本発明によれば、例えば、検査施設や病院等の臨床現場においても、的確にウイルスのレセプター糖鎖認識特異性を判別でき、その用途は広い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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