(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分：
（ａ）Ｎ末端；
（ｂ）イソロイシンジッパー（ＩＺ）三量体コイルドコイルペプチド；
（ｃ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合するのに十分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの一部、ここで、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に結合するのに十分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルの一部は、配列番号：１８の配列を含む；及び
（ｄ）Ｃ末端；
をこの順に含んでなる可溶性三量体コイルドコイルペプチドであって、前記イソロイシンジッパー（ＩＺ）三量体コイルドコイルペプチドが配列番号：１１のコイルドコイルに由来する、可溶性三量体コイルドコイルペプチド。
【請求項２】
（ａ）ＩＺＮ１７（配列番号：３２）；（ｂ）ＩＺＮ２３（配列番号：３３）；及び（ｃ）ＩＺＮ３６（配列番号：３４）から選ばれるペプチドからなる、請求項１記載の可溶性三量体コイルドコイルペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載の可溶性三量体コイルドコイルペプチドを含有してなる医薬組成物。
【請求項４】
治療用又は予防用である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＨＩＶ感染の治療用又は予防用である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＨＩＶにｉｎ  ｖｉｖｏで接触し、結合して、細胞内へのＨＩＶウイルス侵入を低減又は阻止するための、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＨＩＶ−１感染を抑制するための、請求項１又は２記載の可溶性三量体コイルドコイルペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、２０００年９月２２日に出願された米国出願第09/668,072号の継続出願及び１９９９年７月３０日に出願された米国出願第09/364,497号の一部継続出願であり、１９９９年５月３日に出願された米国出願第60/132,295号、１９９８年９月１８日に出願された米国仮出願第60/101,058号、１９９８年９月１４日に出願された米国出願第60/100,265号、並びに１９９８年７月３０日に出願された米国出願第60/094,676号の利益を特に主張するものである。全ての上記引用出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府支援
本明細書に記載の研究は、その全部又は一部に対し、国立健康研究所から助成番号P01 GM56552 号により出資されたものである。米国政府は本発明の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
ＨＩＶは、世界中のＡＩＤＳ伝染を担うウイルスである。ＨＩＶ感染の初期段階には、ウイルス膜の標的細胞膜との融合、ウイルス内容物の細胞の細胞質への注入過程が関係する。ウイルス側では、融合活性を担う分子複合体は、表面タンパク質ｇｐ１２０及び貫膜タンパク質ｇｐ４１を含む。ｇｐ１２０が標的細胞上のタンパク質ＣＤ４及びコレセプター(coreceptor)と相互作用し、その結果、ｇｐ４１に、そのアミノ末端（融合ペプチド領域）が標的細胞膜へ挿入されるような立体構造的変化が生ずると、現在仮定されている。この構造的再配列が、余り分かっていないメカニズムを通してウイルス膜と細胞膜との融合を促進する。
【０００４】
発明の要約
本明細書は、可溶性三量体コイルドコイル及びＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド領域の全部又は一部を含有してなるキメラペプチドを開示する。これらの分子は、ヒト細胞等の細胞へのＨＩＶ浸入を阻害する安定な三量体コイルドコイルである。かかるペプチドは、さらに評価され、強力な抗ＨＩＶ治療用分子、従って、治療用分子又は薬物として働くそれらの能力が示されうる。
【０００５】
本件特許出願は、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含む。１若しくは複数のカラーの図面を有する本件特許のコピーは、請求および必要な料金の納付に基づいて特許商標庁(Patent and Trademark Office) により提供されるであろう。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、可溶性ＩＱ（又はＩＮ）ペプチドと呼ぶ可溶性ペプチドに関する。かかるペプチドは、本明細書に記載の条件下、安定な三量体コイルドコイル（らせん）構造にホールディングされ、ヒト細胞等の哺乳動物細胞のＨＩＶ感染を阻害する。特定の態様では、可溶性ＩＱペプチドは、本明細書に記載の条件下、ヒト細胞のＨＩＶ感染のＤ−ペプチドインヒビターにも結合する。１つの態様では、可溶性ＩＱペプチドは、三量体コイルドコイルペプチド及びＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル（ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド）の一部を含有してなる；該成分は、以下の「順番」で存在する：Ｎ−末端−三量体コイルドコイルペプチド−ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル−Ｃ−末端。三量体コイルドコイルペプチドは、酵母転写活性化因子であるＧＣＮ４；モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）；ＧＣＮ４−ｐＩＩ、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、及びＡＢＣヘテロ三量体等の様々な供給源に由来しうる（該供給源中のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を含みうる）。また、Tanakaらが記載するイソロイシンジッパー（ＩＺ）、又はこの「ＩＺ」配列の誘導体等の他の設計された三量体コイルドコイルに由来しうる。三量体コイルドコイルペプチドがイソロイシンジッパーに由来するこれらの態様では、それらはＩＺペプチドと呼ばれる。他方、ＨＩＶ由来の三量体コイルドコイルペプチドを含みうる。目的のコイルドコイルの３つの例は以下の通り：
0005180422.tif 000002
変異を有する、Tanakaら由来の「ＩＺ」分子：
0005180422.tif 000003
【０００７】
本発明のＩＱペプチドを含むアミノ酸残基は、得られるＩＱペプチド（それらが存在するＩＱペプチド）が安定で、可溶性で、らせんであり、三量体であり、かつヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害するという条件下、それが由来する三量体コイルドコイルペプチド中、連続又は非連続であるアミノ酸残基、及び／又はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド中、連続又は非連続であるアミノ酸残基でありうる。ＩＱペプチドのいずれか又は両方の成分の非連続アミノ酸残基が存在するＩＱペプチドの態様において、ＩＱペプチドに含まれる残基は、連続でありうるか、又はリンカーにより分離若しくは連結されうる。該リンカーは、例えば、該成分が由来するペプチド中の２つのアミノ酸残基間に存在しない１若しくは複数のアミノ酸残基でありうる。他方、「リンカー」は、化学的リンカー又は合成リンカーでありうる。成分自体（又はアミノ酸配列をコードする１若しくは複数の核酸分子）が、それが存在する供給源から（例えば、それが除去されうるタンパク質の一部として等、ペプチドが存在する細胞から）得られ、又は単離され／分離されるならば、或いはペプチドの配列と同じ若しくは実質的に同じであるアミノ酸配列又は核酸配列を含むように、組換えＤＮＡ法、化学合成又は任意の他の方法により生産されるならば、本発明のＩＱペプチドの成分は、他のペプチド（例えば、三量体コイルドコイル又はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド）に「由来する」と考えられる。すなわち、該用語は広く解釈されることを意図しており、成分が物理的に、言及するペプチド由来であることは必要でない。
【０００８】
可溶性ＩＱペプチドがＧＣＮ４三量体コイルドコイルペプチドであるＩＱ領域を含む態様では、それらをＩＱＮペプチドと呼ぶ。ＩＱＮペプチドは、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ（米国仮出願第60/101,058号明細書；Eckert D.M. et al., J. Mol. Biol., 284:859-865(1998)では以前ＧＣＮ４−ｐＩＱと呼ばれる）の全部又は一部、又は可溶性の増加した変異を含む修飾タンパク質等のＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの全部または一部の修飾バージョン、並びにＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの全部又は一部を含有してなる。典型的には、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの全残基と同等及びそれを含む、５以上（例えば、７、８、９又は１０）のＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド由来のアミノ酸残基は、ＩＱペプチドのＨＩＶ  ｇｐ４１成分を含有してなるであろう。
【０００９】
本発明の可溶性ＩＱＮペプチドは、特定の態様では、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド（領域）に結合するのに充分なＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの一部、及びＧＣＮ４三量体コイルドコイルペプチドの充分な一部又は得られるＩＱＮペプチドが可溶性三量体（らせん）コイルドコイルである、ＧＣＮ４ペプチドの修飾バージョンを含有してなる。さらなる態様では、ＩＱＮペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のポケット又はキャビティーを形成するアミノ酸残基（Ｎ−ペプチドのポケット含有残基）を含むＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの一部を含有する。さらなる態様では、ＩＱＮペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のポケット又はキャビティーを形成するアミノ酸残基を含有しない。しかしながら、それらは、ＨＩＶ  ｇｐ４１由来のアミノ酸残基を含有する。（例えば、ＩＱＮ２３、ＩＱＮ３６及びＩＱＮ２６参照）。
【００１０】
ＩＱペプチドの名称では、ＩＱペプチド中に存在するＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド又はＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの修飾バージョン由来のアミノ酸残基の数をいう。例えば、ＨＩＶ  ｇｐ４１の１７アミノ酸残基が、本明細書に記載のＩＱＮ１７ペプチドに含まれる。先に説明するように、ＩＱペプチドの三量体コイルドコイルペプチド成分はアミノ酸組成（同一性及び数／長さ）においてＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド部分との結合の際、可溶性三量体らせん（コイルドコイル）ＩＱペプチドの形成に至るのに充分でなければならない。本発明のＩＱＮペプチドの特定の態様では、「ＧＣＮ４部分」と呼ぶ三量体コイルドコイルペプチドは、ＧＣＮ４の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸残基を含む。ＩＱＮペプチドの成分に存在するアミノ酸残基は、得られるＩＱＮペプチドが、本明細書に記載のような、ヒト細胞のＨＩＶ感染のインヒビターであるという条件下、ＧＣＮ４転写活性化因子（又はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ）及びＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド、又は該活性化因子若しくは該Ｎ−ペプチドの修飾バージョンそれぞれにおいて、連続又は非連続であるアミノ酸残基に相当しうる。本発明のＩＱ及びＩＺペプチドは、連続ペプチドとして、又はそれらが形成された後に結合若しくは連結される成分として生産されうる。本明細書で使用する、用語「結合（joined）」又は「そのような様式で結合」又は「組み込み(incorporated)」には、いずれかのアプローチによりアミノ酸残基を取り込むことを含む。
【００１１】
例えば、ＩＱＮペプチドのＧＣＮ成分は、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ、所望により（例えば、ＩＱＮ１７（配列番号：１）の場合のように、可溶性を増大させるため）修飾物由来の連続したアミノ酸残基を含みうる。他方、得られるＩＱＮペプチドのＧＣＮ４成分中、それらが非連続又は連続である様式で結合された、ＧＣＮ４活性化因子中（又はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ中）、連続でないアミノ酸残基がＩＱＮペプチド中に取り込まれうる。同様に、本発明のＩＱＮペプチドのＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド成分のアミノ酸残基は、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチド中、連続的に又は非連続的に存在するアミノ酸残基でありえ、得られるペプチド中、それらは連続又は非連続の様式でＩＱＮペプチド中に取り込まれうる。非連続のアミノ酸残基が使用される態様では、それらは、成分及びＩＱＮペプチドのそれぞれの機能／特性を保持する必要があるならば、１以上の「リンカー」分子により分離されうる。例えば、ＧＣＮ４又はＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ペプチドの２つのアミノ酸残基間に通常存在する１若しくは複数の残基以外の１若しくは複数のアミノ酸残基を、ＩＱＮペプチド中、２つのアミノ酸残基を連結又は結合するのに使用しうる。他方、例えば、リンカーは化学的リンカー又は合成リンカーでありうる。本明細書に記載される条件下、ＩＱＮペプチドは安定構造にホールディングされ、ＨＩＶ−１感染のペプチドインヒビターに結合し、及びヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害することが示された。例えば、ＩＱＮ１７及びＩＱＮ２３は、安定構造にホールディングされ、ＨＩＶ−１感染のインヒビターであることが以前示されているＤ−ペプチドに結合し、及びヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害することが示された。ＩＱＮ３６並びに「ＩＱ」領域が短縮されているＩＱＮ１７のバージョンも記載されている。これらの短縮バージョンは、治療的に有効である可能性がある。というのは、例えば、それらは、より大きなペプチドより、より簡単により低コストに生産されるからである。
【００１２】
ＩＱＮペプチドの特定の態様はＩＱＮ１７である。ＩＱＮ１７は、可溶性増大のための３つの変異を含むＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの２９残基、及びＨＩＶの１７残基を含む；全長４５残基の融合タンパク質を形成する、２つのタンパク質間で１残基の重複が存在する。ＧＣＮ４−ｐＩｑＩの配列は、
0005180422.tif 000004
である。この態様では、ＨＩＶ配列は：
0005180422.tif 000005
である。ＩＱＮ１７の配列は：
0005180422.tif 000006
である。提示した配列では、ａｃはＮ−末端アセチル基を表し、ａｍはＣ−末端アミド基を表わす。ＩＱＮ１７は、本明細書に記載のように、ヒト細胞のＨＩＶを阻害することが示された。
【００１３】
ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックス（配列番号：２）の１７アミノ酸残基をそれぞれ含むが、ＩＱＮ１７に存在するより短いＧＣＮ成分を含むＩＱＮ１７の短縮バージョンも本発明の主題である。これらの短縮ＩＱＮ１７ペプチドの特定の例は以下の通り：
ａ）短縮ＩＱＮ１７＃１、（配列番号：５）、中にＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの以下の８アミノ酸残基が存在：EIARIKKL（配列番号：19）；
ｂ）短縮ＩＱＮ１７＃２（配列番号：６）、中にＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの以下の１５アミノ酸残基が存在：KQKKIENEIAAIKKL （配列番号：20）及び
ｃ）短縮ＩＱＮ１７＃３（配列番号：７）、中に以下の非ＨＩＶの１５アミノ酸残基が存在  KIKKIENEIARIKKL （配列番号：21）。これはＩがＱに変異したＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ’であり、ＧＣＮ４−ｐＩＩ’と呼ぶ。
ｄ）短縮ＩＱＮ１７＃４（配列番号：８）、中にＧＣＮ４−ｐＩQ ｐの以下の２１アミノ酸残基が存在：KIEEIESKQKKIENEIARIKKL（配列番号：22）及び
ｅ）短縮ＩＱＮ１７＃５（配列番号：９）、中に以下の非ＨＩＶの２１アミノ酸残基が存在：KIEEIESKIKKIENEIARIKK （配列番号：23）。
【００１４】
本発明の他の特定の態様はＩＱＮ２３である。ＩＱＮ２３バージョン１と呼ぶ１つの態様は以下の配列を有する：
0005180422.tif 000007
ＩＱＮ２３バージョン１において、ＧＣＮ４成分中に２９アミノ酸残基、およびＨＩＶ  ｇｐ４１成分中に２３アミノ酸残基が存在する（合計５２アミノ酸残基）。ＩＱＮ２３バージョン２と呼ぶＩＱＮ２３の第２の態様は、ｇｐ４１のＮ−ペプチドの２３アミノ酸残基及びそのＧＣＮ成分中に２９アミノ酸残基も含むが、ＩＱＮ２３バージョン１とはアミノ酸残基１７と１８（及び１５位のＬがＥに変更されている）で異なる。バージョン１では、これらの２つの残基はそれぞれＹとＨであり、バージョン２では、それらはそれぞれ共にＫである。３つの修飾が行われている−Ｌ、Ｙ及びＨ。これらは、ＩＱＮ１７をより可溶性にした同じ３つの修飾である。２つの「バージョン」はＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ及びＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ’と呼ぶ。ＩＱＮ２３バージョン２の配列は以下の通り：
0005180422.tif 000008
本明細書に記載のように、ＩＱＮ２３（両バージョン）はＩＱＮ１７より、より効果的にＨＩＶ感染を阻害する。
【００１５】
本発明のＩＱＮペプチドの他の特定の態様はＩＱＮ３６である。ＩＱＮ３６には、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの３０アミノ酸残基及びＨＩＶの３６アミノ酸残基が存在する。ＩＱＮ３６（配列番号：４）の配列を図２に示す。ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ成分の配列は：
0005180422.tif 000009
であり、ＨＩＶアミノ酸残基は：
0005180422.tif 000010
である。ＩＱＮ３６の配列は：
0005180422.tif 000011
である。
【００１６】
ＩＱＮ１７のバリアントである広範な種々の融合タンパク質が生産されえ、ＨＩＶの阻害に使用されうる。融合タンパク質としては、単一の連続分子として構成されるタンパク質、又は続いて共に結合若しくは連結されている成分として構成されるタンパク質が挙げられる。任意の広範な種々のバリエーションが、これらがコイルドコイルの三量体状態を変化させない条件下、ＩＱＮ１７のＧＣＮ４−ｐＩｑＩ成分において作られえ、該方法において使用されうる。例えば、ＧＣＮ４成分のアミノ酸組成は、コイルドコイルの三量体状態が維持されるという条件下、１以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾及び／又は欠失により変えられうる。例えば、ＩＱＮ１７のＡｓｐ残基（コイルドコイルの「ｆ−位」における）は、天然に存在する任意のアミノ酸により置換されうる。（O'Neil and DeGrado, Science 250:646 (1990)）。他方、融合タンパク質のこの成分は、モロニーマウス白血病ウイルス（Fass, D. et al. Nature Struct. Biology, 3:465 (1996)）由来のタンパク質、ＧＣＮ４−ｐＩＩ（Harbury et al., Nature, 317:80, 1994）又はＡＢＣヘテロ三量体（Nautiyal and Alber, Protein Science 8:84 (1999) ）、又はTanakaらにより開示されるイソロイシンジッパー等の、他のタンパク質のコイルドコイル領域の三量体バージョンでありうる。
【００１７】
また、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＮペプチドのＣ−末端部分である融合タンパク質成分のアミノ酸組成において変化させ、細胞のＨＩＶ感染を防ぐのに使用される種々の融合タンパク質を生産することができる。Ｃ−末端部分は、１以上のアミノ酸残基の付加、置換、修飾及び／又は欠失により変化させうる。融合タンパク質のいずれかの成分又は両方の成分のアミノ酸組成を変化させることができ、コイルドコイルの三量体状態が維持されるという条件下、変化が可能なアミノ酸残基の数若しくは型に制限はない。多くの態様においてポケットが存在するが、ｇｐ４１のポケット又はキャビティーが含まれることは必ずしも必要でない。
【００１８】
全ての態様において、薬物の制御された放出若しくは時間放出（緩慢な放出、投与又は挿入の一定時後における放出）は、例えば、薬物を緩慢に放出する、又は規定時間後に放出する組成物に薬物を取り込むことにより影響されうる。他方、薬物は、薬物をその投与若しくは（例えば、血液、膣、口又は直腸へ）適用後直ちに若しくはすぐに放出する組成物に取り込まれうる。複合放出（例えば、ある薬物は挿入後直ちに若しくは直ぐに放出され、ある薬物は挿入後経時的に若しくは一定時に放出される）はまた効果的でありうる（例えば、挿入後直ちに若しくは直ぐに放出若しくは送達が生ずるもの及び／又は放出若しくは送達が緩慢なもの及び／又は一定時後に放出が生ずるものの、２以上の材料からなる組成物を製造することによる）。例えば、ＨＩＶキャビティーに結合する１若しくは複数の薬物を、米国特許第4,707,362 号に教示されるもの等の徐放性組成物に取り込みうる。クリーム、泡、ゲル又は坐剤も産児制限目的に使用されるものでありうる（例えば、殺精子薬又は他の避妊薬剤を含む）。しかしながら、それは必ずしも必要でない（ｅ．ａ．抗ＨＩＶ薬物を送達することが、単独で、又は抗細菌薬物若しくは抗真菌薬物又は滑剤等の他の非避妊薬剤と組み合わせて、単独で使用されうる）。本発明の抗ＨＩＶ薬物はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックス  コイルドコイルに結合する１若しくは複数の薬物を、使用条件下に放出されうる様式でコーティングした、又はそれらに取り込んだ避妊装置（例えば、コンドーム、子宮キャップ、ペッサリー）の使用を通して個体に投与されうる。１若しくは複数の薬物の放出は、上記するように、直ちに、緩慢に又は一定時に生じうる。その結果、それらはＨＩＶと接触し、結合し、細胞へのウイルス浸入を低減又は防ぐ。
【００１９】
本発明の融合タンパク質は、（非ＨＩＶ起源またはＨＩＶ起源の）タンパク質のコイルドコイル領域の可溶性三量体形態またはバージョンなどのコイルドコイルの可溶性三量体形態またはバージョン、およびＣ−ペプチド領域に結合するのに十分な、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドのＣ−末端の部分を含有する。１つの態様では、Ｎ−ペプチドのＣ−末端の部分は、Ｃ−ペプチド領域に結合するのに十分なアミノ酸残基を含有し、ＨＩＶコイルドコイルキャビティーまたは疎水性ポケット（Ｎ−ペプチドのポケット含有残基）を含む。ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、他のＨＩＶ株、または他の種（例えば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルスまたはビスナウイルス）由来の株のものでありうる。例えば、ＨＩＶ−２配列 LLRLTVWGTKNLQARVT（配列番号：26）、ＳＩＶ配列 LLRLTVWGTKNLQTRVT（配列番号：27）またはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶにおけるインバリアント残基を含有する配列〔LL XLTVWGXK-'UQXR-XX（配列番号：28）（式中、アミノ酸残基L,T,V,W,G,K,Q およびR は、アミノ酸残基に使用される一文字コードであり、X は、任意のアミノ酸残基でありうる）で表される〕。本発明の主題はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケットの可溶性三量体モデルであり、それはＤ−ペプチドまたはＬ−ペプチドであり得、可溶性三量体コイルドコイルおよびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル領域のポケットを形成するアミノ酸残基を含有するのに十分な、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチド領域の部分を含有する。Ｄ−ペプチドまたはＬ−ペプチドは、可溶性三量体コイルドコイルとして、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ；ＧＣＮ４−ｐＩＩ；モロニーマウス白血病ウイルスまたはＡＢＣヘテロ三量体を含有しうる。ポケットのアミノ酸残基を含有するのに十分な、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの部分である成分は、例えば、ＨＩＶ−１の LLQLTVWGIKQLQARIL（配列番号：18）；ＨＩＶ−２の LLRLTVWGTKNLQARVT（配列番号：26）；ＳＩＶの LRLTVWGTKNTLQTRVT（配列番号：27）、または LLXLTVWGXKXLQXRXX（配列番号：29）であるこれらのインバリアント残基を含有しうる。
【００２０】
本発明の１つの態様は、成分が、タンパク質のコイルドコイル領域の三量体バージョン（ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉなど）、およびＮ−ヘリックスキャビティーの全部または一部を含むか、あるいは含まないＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルである、融合タンパク質である。すなわち、本発明の融合タンパク質は、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉのコイルドコイル領域の三量体形態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分を含有し得、ここで、ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分は、ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスキャビティーの一部または全部を含むか、あるいは含まない。例えば、ＧＣＮＬ４−ｐＩQ Ｉ由来の残基およびＮ３６由来の残基を含む融合タンパク質が、作製されうる。ＩＱＮ２４ｎと表示される融合タンパク質は、可溶性の増加のための３つの変異を含有するＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの２９残基、およびＮ３６のＮ−末端由来の２４残基（SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT）（配列番号：30）を含む；大腸菌における組換え発現のために、余分のMet 残基がＮ−末端に含まれる。例えば、融合タンパク質は、（配列番号：30）のアミノ酸配列を含有するＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドの部分を含有しうる。ＩＱＮ２４ｎの配列は：MRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKLISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT （配列番号：31）である。この融合タンパク質は、化学合成または組換えDNA 法を含む種々の方法により、またはＮ−末端およびＣ−末端がブロックされない場合は大腸菌における組換え発現により、作製されうる。ＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルの超らせんパラメーターは、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルとほとんど同一であるので、得られる融合タンパク質分子ＪＱＮ２４ｎは、三量体（凝集していない）としてｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイルの一部を与える、長い三量体コイルドコイルを形成することが予測される。
【００２１】
ｇｐ４１疎水性ポケットに対するこの問題を解決するための本明細書に記載の同一の戦略は、ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックスコイルドコイル領域の可溶性三量体モデルの開発に一般に適用されうる。かかる三量体モデル（ＩＱＮ１７を含むが、例えばｇｐ４１のポケット残基を含まないペプチドも含む）は、インヒビターとして使用されうる。
【００２２】
任意の広い範囲のバリエーションが、これらの変化がコイルドコイルの三量体状態を変えない条件で、本明細書に記載の融合タンパク質（例えば、ＩＱＮ１７またはＩＱＮ２４ｎ）のＧＣＮ４−ｐＩＱＩ成分において作製され得、該方法において使用される。変化はまた、バリアント（例えば、ＩＱＮ１７またはＩＱＮ２４ｎのバリアント）を製造するためのＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ３６ペプチド由来の部分である融合タンパク質成分のアミノ酸組成においてなされうる。コイルドコイルの三量体状態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドコイルドコイルに対応する融合タンパク質の表面の構造が維持される条件で、可能なアミノ酸残基変化の数またはタイプは限定されない。ＨＩＶ  ｇｐ４１−ペプチドの部分である融合タンパク質成分は、Ｎ−ヘリックスキャビティーの全てまたは一部を含みうるか、あるいは含みえない。例えば、Ｎ５１、Ｎ３６、ＤＰ−１０７の他の部分、またはＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎ−ヘリックス領域の他の領域は、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉ（またはタンパク質のコイルドコイル領域の他の三量体バージョン）に融合され、三量体（凝集していない）らせんコイルドコイル融合タンパク質を作製し得、該方法において使用されうる。コイルドコイルの三量体状態およびＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドコイルドコイルに対応する融合タンパク質の表面の構造が維持される条件で、設計および作製されうる融合タンパク質の数またはタイプは限定されない。かかる融合タンパク質は、コイルドコイルの７個リピート位または超らせんパラメーターを評価するなどの当業者に公知の方法を用いて設計および作製されうる。
【００２３】
ＩＱＮ１７は、抗ＨＩＶ治療剤、予防剤、またはＨＩＶ感染を防ぐための薬物、他の抗ＨＩＶ治療薬または予防薬を同定（スクリーニング）または設計するための試薬、およびＨＩＶ感染を防ぐ抗体を惹起するための免疫原として有用である。
【００２４】
出願人は、Ｎ−ペプチドの部分が、可溶性三量体コイルドコイルであるＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉの付加により溶解されうることを示している。得られた分子は、生理学的条件下で安定であり、ＩＱＮ１７がＨＩＶ  ｇｐ４１のＣ−ペプチド領域に構造的に相補的である表面を与えるように、正しくホールディングされる。さらに、ＩＱＮ１７および類似の分子は、ｇｐ４１のＣ−ヘリックス領域に結合し、その機能を阻害する能力について評価されうる。ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコアは、より高度に保存され（アミノ酸組成に関して）、したがってＩＱＮ１７およびそのバリアントは、種々の臨床ＨＩＶ株に対して広く中和され、したがって、治療に有用であるようである。
【００２５】
ＩＱＮ１７は、ｇｐ４１エクトドメインの公知の構造に基づき、１つの態様では、可溶性三量体コイルドコイルに結合され（またはそれを有するより大きな分子に存在する）、曝露されたＮ−ペプチドのペプチド結合部位を有するＮ−ヘリックスコアの実質的な部分にホールディングされるように配置される、３つのＮ−ペプチドからなる。
【００２６】
ＩＱＮ１７タンパク質は、種々の方法により、作製されうる。例えば、それは、化学的に合成されうる。代替的には、それは、公知の方法および発現システムを用いて、完全なＩＱＮ１７タンパク質をコードする単一ＤＮＡでありうるＩＱＮ１７タンパク質コードＤＮＡを発現させることにより、作製されうる。代替的には、タンパク質合成方法を使用して、ＩＱＮ１７タンパク質を作製しうる。
【００２７】
ＩＱ（ＩＮ）ペプチドは、Ｎ−ヘリックスおよび融合コイルドコイル成分の両方において広範囲の配列を有し得、Ｌ−アミノ酸残基、Ｄ−アミノ酸残基および修飾アミノ酸残基からなりうる。ＩＱＮ１７は、らせんおよび融合コイルドコアのアミノ酸残基の他に、アミノ酸残基を含みうる（例えば、分子を安定化させるため）。本明細書に記載のＩＱＮ１７は、安定性および活性を増強するために変更されうる。融合コイルドコイルおよびＮ−ヘリックスの正確な境界におけるマイナーチェンジは、ＩＱＮ１７の安定性、収率および活性にかなりの影響を有しうるようである。
【００２８】
現在構築されているように、ＩＱＮ１７は、３つのＣ−ペプチド結合部位の部分を曝露する。ＩＱＮ１７（または関連する分子）におけるＣ−ペプチド結合部位のより長いセグメントを曝露するための戦略は、ＩＱＮ１７のＮ−ペプチド領域の伸長を伴う。
【００２９】
ＩＱＮ１７は、種々の状況において有用である。本明細書に記載されるように、ＩＱＮ１７は、ウイルス膜融合の強力なインヒビターであり、したがって、ウイルスが細胞に侵入する前に、ウイルスに作用する（ＨＩＶ感染細胞に作用する現在実施されている治療と異なっている）。ＩＱＮ１７は、非常に可溶性であり、本明細書に記載の条件下で安定であることが示されている。そのサイズが腎臓における迅速な濾過を妨げるであろうことを予期することが、妥当である。さらに、ＩＱＮ１７「単量体」よりも少ない程度で濾過される分子を製造するために、ＩＱＮ１７二量体が、ジスルフィド架橋により作製されうる。したがって、二量体が、Ｃ−ペプチドと比較した場合に、増強したバイオアベイラビリティーを有することを予期することが、妥当である。
【００３０】
ＩＱＮ１７は、ウイルスが細胞に侵入することを防ぎ、ウイルス侵入後のウイルスタンパク質を標的にする標準療法とは異なっており、したがって、ＩＱＮ１７は、感染を防ぐか、または感染が生じる程度を低減するために予防的に使用されうる。かかる治療用としての１つの使用は、ＨＩＶで汚染された針が共有される病院またはセッティング(settings)で起こりうるような注射針を誤ってさした刺傷の事象におけるものである。
【００３１】
本発明の１つの態様では、ＩＱＮ１７は、個体におけるＨＩＶ感染を低減するために使用される。この態様では、ＩＱＮ１７は、ＩＱＮ１７それ自身として、または適切な宿主細胞またはベクターにおけるＩＱＮ１７コードＤＮＡの発現を介してのいずれかで、個体細胞のＨＩＶ感染を低減する（全体としてまたは部分的に）のに十分な量で個体に投与される。すなわち、ＨＩＶ感染を低減するのに十分なＩＱＮ１７の用量（効果用量）は、細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する（全体としてまたは部分的に）様式（例えば、注射、局所投与、静脈内経路による）で投与される。１つの態様では、個体にＩＱＮ１７タンパク質を発現する細胞を導入することにより、効果用量を提供するために、遺伝子療法適用が使用される。ＩＱＮ１７は、さらなる感染を低減するためにＨＩＶ感染個体に投与されうるか、または感染を低減するために非感染個体に投与されうる。
【００３２】
ＩＱＮ１７の血清安定性は、その治療可能性を確かめるための公知の方法を用いて試験されうる。
【００３３】
ＩＱＮ１７の融合コイルドコイルの外側表面は、例えば、バイオアベイラビリティーを増加するため、毒性を減少するため、および免疫クリアランスを避けるために変更されうる。ＩＱＮ１７は強力な阻害活性を示し、ＧＣＮ４−ｐＩQ Ｉは示さず、それは阻害の原因である曝露されたＮ−ペプチド領域である。分子の残りは、Ｎ−ペプチドを示すための骨格を提供する。したがって、この骨格は、ＩＱＮ１７の阻害活性に不利な影響を与えることなく修飾されうる。骨格の修飾は、いくつかの利点を提供しうる。第１に、それは、ＩＱＮ１７の多数の投与が必要とされる手順を容易にするであろう。例えば、ＩＱＮ１７が抗ＨＩＶ治療剤として使用される場合、多数の投薬が必要とされる可能性がある。延長された投与後、個体はＩＱＮ１７に対する抗体を産生し、それは身体からそのクリアランスを増加するようである。ＩＱＮ１７の多数のバージョンの利用可能性は、先に存在する抗体を避けることによりこの問題を回避するのを助けるであろう。第２に、例えば、骨格があまり免疫原性でない外部表面上にグリコシル化部位を導入することにより、ＩＱＮ１７のバージョンを設計することが可能であろう。
【００３４】
らせんヘアピンの三量体（ＴＯＨ）は、多くのウイルス膜融合タンパク質の共通の特徴である(Singh,M. ら、J. Mol. Biol. 290, 1031-1041(1999)) 。それは、インフルエンザ、エボラＳＶ５（サルパラインフルエンザウイルス５）、およびＲＳＶ（ヒト呼吸器シンシチアル(syncitial) ウイルス）において観察されている。さらに、レトロウイルス、パラミクソウイルスおよびフィロウイルスファミリーの多くの他のメンバーが、このモチーフを含むことが予想される。同様の構造が、関連する脊椎動物小胞融合タンパク質において観察されており、精子−卵、受精タンパク質において見出されうる。本明細書に記載の基礎戦略は、融合を阻害するために、任意のこれらのシステムに適用されうる。
【００３５】
本発明は、以下の実施例により説明され、それはいかなる限定も意図しない。
【００３６】
実施例１  IQN/ペプチド相互作用およびIQN ペプチドによる膜融合の阻害の特異性の評価
アッセイを行ない、gp41のC 領域と相互作用し、かつ融合タンパク質の機能を阻害するIQN17 の能力を評価した。IQN17 およびIQN23 および GCN4-pIQ I による膜融合の阻害を、細胞系アッセイを用いて評価した。タンパク質IQN17 、IQN23 および GCN4-pIQ I を、5 ％FCS を有する修飾DMEM培地中に連続希釈し、スライドチャンバーに等分する。Tat プロモーターの制御下で、CD4 およびコレセプターを発現し、かつβガラクトシダーゼ遺伝子を含むヒーラ細胞(4×104 ) を、添加する。gp160 (gp120/gp41 に対する前駆体タンパク質) を発現するCHO 細胞(2×104 ) およびTat もまた添加する。400 μl のミニ培養物を37℃で8 〜24時間インキュベートする; 融合細胞（シンシチウム）は、βガラクトシダーゼを転写および翻訳するであろう。細胞をグルタルアルデヒド中で固定し、X-gal/Fe溶液に１時間曝露する。P-ガラクトシダーゼを含むシンシチウムは、青緑に変色する。このアッセイにおいて、IQN17 は、IC50が20〜80nMを有するシンシチウム形成の有効な阻害を説明する。
【００３７】
IQN17 、IQN23 および GCN4-pIQ I の阻害可能性を、ウイルス融合実験において再現した。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むようにHIV を修飾し、CD4 およびコレセプターを発現する HOS細胞と37℃にて6 時間希釈タンパク質の存在下で混合する(Chan ら、Cell, 93, 681-684(1998))。ウイルス溶液を交換し、HOS 培養物を新鮮な培地中で48時間より多くインキュベートする。ルシフェラーゼ活性をルミノメーター(luminometer) で測定する。このアッセイにおいて、IQN17 は、約250nM のIC50でルシフェラーゼ活性を阻害する；IQN23 は、約80nMのIC50でルシフェラーゼ活性を阻害する。再度、 GCN4-pIQ I は、評価できる阻止が約10μM まで無いことを示す。
【００３８】
実施例２  感染の阻害の評価
材料および方法
ペプチド合成および精製。フィードバックモニタリングを用いてグレードアップしたPE Biosystems 431Aペプチドシンセサイザーで全ペプチドを化学的に合成した。標準Fmoc/HBTU 化学(Fields ら、1991) を、それぞれの連結後、DMSO/NMP樹脂膨潤および無水酢酸キャッピングを用いて改変した。Reagent K を用いてPE Biosystems Pal 樹脂からペプチドを切断した。各ペプチドは、アセチル化 N末端および C末端アミドを有する。
【００３９】
IQN17 の配列は、以前に記載されたものである(Eckert ら) ： Ac-RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKLLQLTVWGIKQLQARIL -NH2（配列番号：１）。最初の29残基は、非天然の設計された三量体コイルドコイルであり、最後の17残基は、HXB2 gp41 のN ペプチド領域に由来する（下線）。IQN17 の N末端から連続した7 個を除去し、次第に短縮した３つのペプチドを得た：
0005180422.tif 000012
IQ22N17 およびIQ15N17 ペプチドのより安定なバージョンを、グルタミン残基をイソロイシンへ変更することにより作製した。これらのペプチドを、それぞれII22N17 およびII15N17 と呼ぶ。また、より長いIQN17 誘導体を、コロイドコイルレジスター(register)に手をつけないように注意して、HXB2 gp41 N-ペプチド領域由来の追加の残基を挿入することにより作製した。これらのペプチドは、IQN23(Ac-RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKLIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL -NH2) （配列番号：２）、IQN36( Ac-RMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKLISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2) （配列番号：４）およびIQN26(Ac-RMKQIEDKIEEIESKQYKIENEIARIKKLIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH-NH2 （配列番号：13）である。最後に、全く異なる設計三量体コイルドコイルがgp41由来残基に N末端で配置されるIQN17 のさらなる誘導体を作製した。コイルドコイルは、Tanakaらに記載された設計に基づいたが、e 位およびg 位における有意な変更およびa 位におけるI からQ への置換を有する。このペプチドの配列は、IZN17 と呼び、 Ac-IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)（配列番号：32）である。阻害活性について研究されているさらなるペプチドは、IZN23(Ac-IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)（配列番号：33）、IZN36(Ac-IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEISGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)（配列番号：34）およびIZN26:(Ac-YGGIKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEKEIVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH-NH2)（配列番号：14）である。
【００４０】
樹脂からの切断後、各ペプチドをSephadex G-25 カラム(Pharmacia) で脱塩し、凍結乾燥した。次に、それを５％酢酸中で再懸濁させ、逆相高速液体クロマトグラフィー装置(Waters, Inc.)でVydac C18 調製用カラムにかけて精製した。0.1 ％トリフルオロ酢酸の存在下に水−アセトニトリルグラジエントを用いてカラムからペプチドを溶出させ、次に凍結乾燥した。各ペプチドの分子量を、MALDI-TOF マススペクトロメトリー(PerSeptive Biosystems) を用いて確認した。
【００４１】
円偏光二色性。Aviv62 DS 円偏光二色性スペクトロメーターで、全てのCD測定を行なった。 PBS(50mM のリン酸ナトリウム、150mM の塩化ナトリウム[pH7.4])中10μM のペプチド溶液に対し、5 秒の平均時間を用いて1cm 通過長のキュベット中200 〜260nm の標準スキャンを行なった。未処理のシグナルを、ペプチド濃度（Ｍ）、通過長（mm）およびアミノ酸の数で割ることにより、平均残基楕円率（θ）を計算した。Chenら(Biochemistry, 13, 1974, p3350) に従って、らせん度率を計算した。PBS 中10μM のペプチド溶液の熱変性スキャンを、222nm で記録した。4 ℃で開始して2 ℃の間隔で1.5 分の平衡時間および60秒の平均時間を用いて、ペプチドを加熱した。
【００４２】
沈降平衡。An-60 Tiローターを備えたベックマンXL-A解析超遠心機で全測定を記録した。凍結乾燥したペプチドを水中で再懸濁させ、ペプチド濃度を測定した(Edelhoch, 1967)。溶液を100 〜200 μM に希釈し、次にPBS に対して一晩透析した。透析後、濃度を再度測定し、透析バッファーを用いて適切な希釈を行なった。19,000〜25,000RPM の範囲の速度で、試料を遠心分離した。
【００４３】
HIV 感染性アッセイ。IQN17 および誘導体の阻害活性をHIV ルシフェラーゼアッセイにおいて測定した(Chen ら、1994) 。とりわけ、HXB2 gp160遺伝子を有する発現ベクターであるpCMVHXB2に加えて、env におけるフレームシフト変異およびnef 遺伝子(NL43LucR-E-) を置換したルシフェラーゼを含むHIV-1 ゲノムを用いて293T細胞を同時トランスフェクトすることにより、ウイルスを作製した。得られたウイルスは、そのゲノムがエンベロープ遺伝子を欠如するために、１回の感染に対して生存可能であるのみである。細胞残骸を低速遠心分離により除去した。残りのウイルス上清を用いて、潜在的阻害ペプチドの存在下にHOS-CD4 ／融合細胞を感染させた(N.Landau, National Institutes of Health AIDS Reagent Program)。感染２日後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性をWallac AutoLumat LB953ルミノメーター(Gaithersburg, MD)でモニターした。データをラングミュア方程式〔［y=k/(1+[ペプチド]/IC50) ］、式中、y=ルシフェラーゼ活性であり、k はスケーリング定数(scaling constant)である〕に適合させることにより、IC50（ウイルス感染の半分が阻害されるペプチド濃度）を計算した。
【００４４】
結果
N ペプチドのポケット形成領域は、コイルドコイル三量体として阻害する。融合生成(fusogenic)gp41 のＸ線結晶構造は、３つのらせんC ペプチドで囲まれた Nペプチドのコイルドコイル三量体を示す。３つの疎水性側鎖が各C ペプチドパックに由来する Nペプチドの塩基の疎水性ポケットは、抗HIV-1 化合物に対する重要な標的であることを示している。IQN17 は、C ペプチドの不在下で、正しい三量体コイルドコイル構造でこの疎水性ポケットを正確に存在させるように設計されたキメラ分子である(Eckert ら) 。設計した三量体コイルドコイルである GCN4-pIQ I'を、N ペプチドの17残基のN 末端に融合した。これらの17残基はN ペプチドのポケット領域に広がる。コイルドコイルは、7 残基の特徴的なリピート（a 〜g で示す）からなり、最初の(a) 位および４番目の(d) 位は、典型的に疎水性側鎖により占められる。GCN4部分およびN ペプチド部分を、正しいコイルドコイルレジスターで注意深く融合した。ここで、本発明者らは、このキメラ分子の阻害活性をアッセイし、この活性がコイルドコイル構造に依存することを決定した。
【００４５】
２つの合成ペプチドを比較した：疎水性ポケットを含有するN ペプチドの17残基を含むN17 、およびIQN17 。N17 は、溶液にするのは困難である−それは沈澱する。それゆえ、それは、分離した三量体コイルドコイルではないようである。代替的に、IQN17 は、容易に溶解する。それは20μM で十分にらせんであり、かつ分離した三量体種である。IQN17 は、極めて安定であり、100 ℃を超える融解温度を有する。両方のペプチドをウイルス感染を阻害する能力に対してアッセイした。N17 は、感染を阻害するが、約10μM のIC50を有する。IQN17 は、約2 桁低い濃度で感染性を阻害し、約180nM のIC50を有する。したがって、N ペプチドのN17 領域の阻害活性は、三量体コロイドコイル構造において非常に増加する。
【００４６】
IQN17 のポケットは、阻害活性を含む。IQN17 のIQ部分が阻害活性の全てまたはいくらかの原因である可能性を排除するために、２つの対照分子を調査した。これらのペプチドは、 GCN4-pIQ I'およびIQN17(G572D)である。 GCN4-pIQ I'は、IQN17 のIQ部分のみからなる。IQN17(G572D)は、疎水性ポケットの内側における変異を含む。グリシン残基をアスパラギン酸に変更し、別の疎水性環境への変更を導入する。これらの分子は両方とも円偏光二色性により測定されるようにらせんであり、したがって構造的に正しい対照として役に立つ。感染性アッセイにおいて、それは阻害活性を有するとしてもほとんどない。 GCN4-pIQ I'は、試験したいずれの濃度においても阻害せず（これまでに10μM まで）、IQN17(G572D)のIC50は、約20μM である。それゆえ、IQN17 の疎水性ポケットは、IQN17 の阻害活性の原因であり、IQ部分は正しい構造でポケットを存在させるために役に立つ。
【００４７】
IQN17 の阻害能力は、その安定性に相関する。１連のペプチドを調査して、コイルドコイル構造およびIQN17 の阻害活性に分子のIQ部がどれくらい必要であるかを決定した。 IQN17の N末端から 7残基群を逐次除去し、38、31および24アミノ酸長のペプチドを作製した( それぞれIQ22N17 、IQ15N17 およびIQ8N17) 。IQ22N17 は、10μM で特徴的なαヘリックスCDスペクトルを示し、222nm で約−36,000deg cm2 dmol-1の最小値を有する。驚くことではないが、それは野生型IQN17 より非常に低い安定性であり、10μM で80℃以下の融解温度を有した(IQN17は、同じ濃度で100 ℃を超える融解温度を有する) 。IQ15N17 は、IQ22N17 より7 残基短かく、222nm で約−27,000deg cm2 dmol-1の最小値を有するわずかに少ないらせんである。また、208nm での最小値は、222nm での最少値よりわずかに低く、このペプチドの部分的なアンホールディングを意味する。その熱安定性は、IQ22N17 より約10℃低い。最後に、IQ8N17の円偏光二色性研究は、222nm より208nm で非常に低い最小値を示し、このペプチドがほとんどらせんでないことを意味する。それはまた、最初の２つのペプチドより非常に安定性が低い。これらのペプチドのそれぞれの阻害活性は、10μM でIQ22N17 がIQN17 と同程度らせんであるという事実にもかかわらず、野生型IQN17 の阻害活性よりも有意に低い。ウイルス感染性に対するIQ22N17 のIC50は、およそ 1μM であり、２つのより短い分子のIC50は、10μM に近い（N17 の阻害活性に非常に類似）。IQ22N17 は、IQN17 より非常に安定性が低いので、IQN17 が阻害能力を表すようなより低い濃度でアンホールディングされているようである。
【００４８】
安定性の低下が、IQ22N17 およびIQ15N17 の阻害活性にネガティブに影響するかどうかを決定するために、上記２つの分子のIQ部分の位置のグルタミンをイソロイシンに変異した 2つのさらなるペプチドを作製した。三量体コイルドコイルのコアにおけるイソロイシンからグルタミンへの変異は、コイルドコイルの安定性を激しく低減することが、以前示された(Eckert, Malashkevich, Kim) 。これらのさらなるペプチドを、II22N17 およびII15N17 と呼ぶ。II22N17 は、10μM で非常にらせんであり、約−41,000deg cm2 dmol-1の222nm 最小値を有する。II15N17 は、わずかに少ないらせんであり、約−33,000deg cm2 dmol-1の最小値を有する。IQ15N17 を用いたのと同様、208nm の最少値は、222nm の最少値よりもわずかに低い。これらのペプチドの安定性およびその阻害活性は、グルタミンバージョンと比較して増加する。10μM では、II22N17 は100 ℃でさえ融解せず、そのIC50は約170nM である。II15N17 はIQ15N17 よりも安定であり、そのIC50は約 3μM である。それゆえ、ペプチドの阻害活性は、コイルドコイル構造の安定性に相関するようにみえる。
【００４９】
Nペプチド領域の長さの増加は、阻害能力を必ずしも増加しない。IQN17 はgp41のC ペプチド領域に対する結合部位を有するので、ウイルス膜融合のプロセスの間にこの領域に結合することにより阻害するのであろう。したがって、N ペプチド領域の長さを伸長し、それによりC ペプチド結合域を増加することにより、阻害活性を改良することが可能である。この仮説を試験するために、２つのさらなるペプチド、IQN23 およびIQN36 を構築した。それらは、それぞれ 7個および19個のgp41由来のさらなる残基をN 末端でポケット領域に有する。分析用超遠心分離研究は、これらのペプチドがIQN17 より凝集しやすいことを示す（20μM でIQN23 に対して3.3 およびIQN36 に対して3.5 のMobs/Mcalcを有する）。IQN23 のIC50は約30nMであり、IQN36 は約50nMのIC50を有する。N36 は、ちょうどIQN36 のgp41領域であり、比較としておよそ 1μM のIC50を有する。17〜23のgp41残基の増加により、阻害活性において約6 倍の増加があった。同様に、17〜36の残基の増加により、3 倍の増加がある。しかしながら、IQN23 は、IQN36 より有効である。それゆえ、阻害活性は、N ペプチド残基の追加のみにより増加するのではない。C ペプチド結合エネルギーと凝集状態との間の兼ね合いがあるようである。N ペプチド領域が長くなるほど、分子はより凝集しやすく、したがって、それは分離した三量体C ペプチド結合部位をほとんど表わさない。
【００５０】
N ペプチドのポケット領域は、阻害活性に必要でない。ポケット領域が、キメラN ペプチド分子の阻害能力に必要であるかどうかを決定するために、さらなるペプチドIQN26 を作製した。このペプチドは、疎水性ポケットに N末端でN ペプチド領域の26残基を含む。円偏光二色性研究は、それがらせんであることを示し、沈降平衡研究は、それがわずかに凝集することを示す。それは有効な阻害活性を有している。したがって、N ペプチド領域は、コイルドコイル形成において妨げられる場合、疎水性ポケット領域の不在下でさえ阻害活性を有する。
【００５１】
代替的なより安定なペプチドであるIZN17 は、より有効なインヒビターである。本発明者らは、分子のIQ部分を他の三量体設計コイルドコイルと置き換えたさらなるIQN17 誘導体を研究した。イソロイシンジッパーに対して「IZ」と名付けたこのコイルドコイルは、Tanakaらにより記載された設計に基づくが、e 位およびg 位における数個の変更ならびに a位でのイソロイシンからグルタミンへの置換を有する。得られたペプチドをIZN17 と名付ける。IZN17 は、それぞれ円偏光二色性および沈降平衡により決定されるように、20μM でらせんであり、かつ分離した三量体である。興味深いことに、IZN17 は、ウイルス感染性アッセイにおいて、およそ5.6nM のIC50を有し、したがって、IQN17 より非常に良好なインヒビターである。この効力の増加に対して 2つの可能性のある理由がある。第１に、IZN17 は、IQN17 より安定であるようであり、したがって、より低い濃度で折りたたまれたままである。両方のペプチドが100 ℃を超えて融解するが、熱非折りたたみ(thermal unfolding) 遷移が、変性剤の存在下で見られうる。2M GuHClにおいて、IZN17 の熱変性温度は、IQN17 よりも10℃高い。第２に、IZN17 は、IZとgp41の間の配列における一致のため、gp41 Nペプチド領域由来の２つのさらなる残基を含む。これは、gp41のC ペプチド領域に対する結合エネルギーの増加を提供しうる。
【００５２】
IZN23 、IZN36 およびIZN26 の阻害活性は、本明細書に記載のものなどの公知の方法を用いて試験されうる。これらのペプチドは、HIV-1 感染の有効なインヒビターであるようである。
【００５３】
以下の表は、キメラコイルドコイルN ペプチドに対する生物物理学データおよび阻害活性を要約する。第１列（θ222nm ）は、円偏光二色性データであり、各ペプチドのらせん度を示す。数が小さいほど、よりらせんである。第２列は、融解温度であり、ペプチドの半分が折りたたまれていない温度を意味する。次の列（Ｍobs ／Ｍcalc）は、ペプチドのオリゴマー状態を意味し、3.0 は分離した三量体である。最終列は、各ペプチドがウイルス感染に対する最大阻害能力の半分にある濃度である。
【００５４】
【表１】
0005180422.tif 000013
【００５５】
多くのこれらの値は、１つの実験の結果であり、したがって試験的なものである。結果は、実験を繰り返すことにより、確認される必要があろう。n.d.は、測定していないことを意味する。
【００５６】
説明：
表１は、本明細書において研究されたすべてのペプチドを列挙する。第１列は、ペプチドの名称を示す。第２列は、PBS 中20μM のペプチド溶液の222nm での楕円率である。第３列は、PBS 中10μM のペプチド溶液の熱変性の中点を列挙する。第４列は、単量体ペプチドについての計算分子量に対する、分析用超遠心分離により観察されたPBS 中20μM ペプチド溶液の分子量の比を示す。最終列は、ウイルス感染性の半分が阻害されるペプチドの濃度(IC50)を示す。
【００５７】
本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は形態および詳細について種々の変更を行なうことができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、HIV gp41の構造配置である。らせん領域（７個リピート(heptad repeats)）を灰色で示し、N-(N36) およびC-(C34,DP178) ペプチドの相対位置を示す。らせん領域のリボン図において、N ペプチドは明るい灰色であり、C ペプチドは暗い灰色である。
【図２】  図２は、IQペプチドのアミノ酸配列である（配列番号：１〜９）。
【図３】  図3A〜3Bは、それぞれIQN17 のヘリカルホイール図（図3A）；IQN17 のCDスペクトル（図3B）；ならびにIQN17 に対する分析用超遠心分離データ（図3C）を示す。「XLA 」は、本明細書において分析用超遠心分離のことを言う。
【図４】  図4A〜4Eは、IQN ペプチドの不在下（図4A）、80nM（図4B）もしくは320nM （図4C）のIQN17 の存在下、または80nM（図4D）もしくは320nM （図4E）のIQN23 の存在下に行なったシンシチウムアッセイの結果の写真である。
【図５】  図５は、ウイルス感染性アッセイにおけるIQN17 およびIQN23 の阻害活性のグラフ図である。
【図６】  図６は、ウイルス感染性アッセイにおけるN36 および GCN4-pIQ I の阻害活性のグラフ図である。与えられた結果は、N36 およびGCN-pIQ I の両者による阻害活性の欠如を明瞭に示す。
【図７】  図７は、HIV 膜融合に対するワーキングモデルである(Chan & Kim 1988) 。HIV-1 env の天然状態( 「天然」) において、融合ペプチドおよびgp41のN ペプチド領域は曝露されていない。細胞レセプター(CD4およびコレセプター) との相互作用の後、構造変化により、一過性のプレヘアピン中間体（「プレヘアピン」）の形成を生じ、融合ペプチド領域（赤線）は細胞膜に挿入され、gp41のN ペプチド領域（「N 」で示す）のコイルドコイルが曝露される。しかしながら、gp41のC-ペプチド領域（「C 」で示す）は、コイルドコイルとの相互作用のために束縛され、利用できない。したがって、外因性のC-ペプチドは、プレヘアピン中間体に結合し、かつ優性ネガティブ様式で融合を阻害しうる（「阻害」）。インヒビターの不在下で、プレヘアピン中間体は、ヘアピン構造に変形し、膜融合（「ヘアピン／融合」）が生じるが、ヘアピン形成が膜融合それ自体より先であるかどうかはわかっていない。挿入図は、HIV-1 gp41コアのペプチドバージョンであるN36/C34 の2.0 ÅＸ線結晶構造を描く(Chan ら、1997) 。３つの中央のN-ペプチドは、表面図として本明細書に示されるコイルドコイル、およびコイルドコイル三量体の表面の保存溝(conserved grooves) に沿った３つのらせんC-ペプチドパックを形成する。N-ペプチドコイルドコイルの表面に、３つの対称関連疎水性ポケットがある（陰付）。
【図８】  図８は、キメラペプチドが、２つの部分：１）設計された三量体コイルドコイルのうちの１つ（ GCN4-pIQ I またはIZ）（配列番号：10および11）ならびに２）gp41の4 つの領域のうちの１つ（配列番号：12）からなることを示すグラフ図である。
【図９】  図９は、IQN17 およびIZN17 の存在下での細胞／細胞融合アッセイの結果を示すシンシチウム数対濃度（nM）のグラフである。
【図１０】  図10は、IQN26 のアミノ酸配列（配列番号：13）である。
【図１１】  図11は、IZN26 のアミノ酸配列（配列番号：14）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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