(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
体外受精を行うためのシャーレであって、
前記シャーレは、第１の壁面と第１の底面を備え、
前記第１の底面は
精子懸濁液を収容する精子収容部と、
前記精子収容部と離間して配置されてなり、第２の壁面及び前記第１の底面よりも低い位置にあり、かつ透明な第２の底面を有する精子確認部
を具備する体外受精用シャーレ。
【請求項２】
前記第１の底面の外周の形状が、円である請求項１に記載の体外受精用シャーレ。
【請求項３】
前記精子確認部は、前記第１の底面の外周の形状の中心点に対して、前記精子収容部と点対称の位置に配置されてなる請求項２に記載の体外受精用シャーレ。
【請求項４】
前記精子収容部及び前記精子確認部は、前記第１の壁面と離間して配置されてなる請求項１に記載の体外受精用シャーレ。
【請求項５】
さらに、前記第１の底面には、前記精子収容部から前記精子確認部へと連結する疑似卵管経路の描画指示手段を具備してなる請求項１に記載の体外受精用シャーレ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外受精用シャーレ及び体外受精用シャーレを用いた体外受精方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外受精とは、卵管閉塞等の女性側因子、良好な精子の数が少ない等の男性側因子、又はその両方の因子に起因する不妊症例に対し行われる施術であり、患者から採取した卵子と精子を体外で受精させる施術である。
【０００３】
体外受精は、培養液で満たしたシャーレの底中央に卵を載置し、次いで調整済みの精子を振りかけて行うのが一般的手法である。しかしながら、この系では、原因は不明であるが、精子がシャーレの壁面方向に移動する傾向があるため、受精が成功しにくいという問題がある。
【０００４】
この点について具体的に説明する。通常は１〜２ｍｌ程度の培養液に卵と精子を入れ、卵に進入した精子で受精を図る。すなわち、確率的に卵に接触した精子のみが受精に寄与する。一方、生理的には子宮腔内を遡上した精子は卵管に進入する。通常、ヒトは一回に一個排卵し、どちらかの卵管内で精子の遡上を待つ。卵管内腔は狭く、顆粒膜細胞に包まれた卵は２〜３ｍｍの大きさ（柔らかく変形自由）であり、卵管を塞栓している。すなわち、卵管に進入した精子は強制的に卵に突き当たる。膣に射精された精子のうち、卵の近傍に到達する精子は５０匹程度とされるが、この解剖学的構造がある故に少ない精子数で受精が可能となっている。以上の観点から、シャーレ内における人工的受精において、卵に対して精子を面状に配置すると多量の精子が必要であり、できうるならば卵と精子を線状に配置するべきであることを離解するべきである。
【０００５】
また、精子数が少ない症例を対象とする顕微授精は、一般向けには一匹でも精子がいれば受精、妊娠可能であるとしているが、精子懸濁液から精子を補足して、穿刺するには実際にはかなりの精子数が必要である。今回申請する擬似卵管においては、顕微授精よりさらに必要な精子数は少なくなる。
【０００６】
ヒト射精精液中の精子は機能的に極めて多様であり、精子の最も象徴的な機能である運動能においても、運動精子であることが他の全ての機能の正常性を保証するものではない。従って、人工的な授精に供する精子は、種々の方法で精液からこの機能良好精子を選別し、用いなくてはならない。当然、複数の手法を組み合わせて精子選別を行うと、回収率は低下する。授精に必要な精子数を少なくできる擬似卵管は、媒精の限界点を低下させることが可能である。精子機能の全てを把握できない現状では、精子が自身の力で卵に進入する媒精は、人為的に卵に精子を穿刺する顕微授精に比して安全性が高いのは言をまたない。
【０００７】
一方、特許文献１では、精子が液流に逆らって泳ぐ特性に注目し、液流を発生させて、体外受精を試みる装置が開示されている。しかしながら、特許文献１の装置は、顕微鏡を利用することができないため、体外受精終了の確認ができないという問題がある。従来の、方法では精液から直接運動精子を得て、媒精しているが、ヒト精液は射精に際して必ず細菌汚染を受け、また性感染症をはじめとする重要なウィルス感染源である。媒精に際して、細菌、ウィルスの除去が確認されている精子懸濁液以外は、媒精に用いることは禁忌である。
【０００８】
【特許文献１】特表２００４−５３０４８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、体外受精において、受精率が高く、かつ体外受精終了の確認が可能な体外受精用シャーレを提供することである。生理的な卵管を擬して、できる限り運動精子と卵の接触効率を高め、ひいては受精率の向上を目指す。さらに卵が精子に暴露されたことが確認できる授精環境を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
［１］  体外受精を行うためのシャーレであって、
前記シャーレは、第１の壁面と第１の底面を備え、
前記第１の底面は
精子懸濁液を収容する精子収容部と、
前記精子収容部と離間して配置されてなり、第２の壁面及び前記第１の底面よりも低い位置にあり、かつ透明な第２の底面を有する精子確認部
を具備する体外受精用シャーレ、
［２］  前記第１の底面の外周の形状が、円である［１］に記載の体外受精用シャーレ、
［３］  前記精子確認部は、前記第１の底面の外周の形状の中心点に対して、前記精子収容部と点対称の位置に配置されてなる［２］に記載の体外受精用シャーレ、
［４］  前記精子収容部及び前記精子確認部は、前記第１の壁面と離間して配置されてなる［１］に記載の体外受精用シャーレ、
［５］  さらに、前記第１の底面には、前記精子収容部から前記精子確認部へと連結する疑似卵管経路の描画指示手段を具備してなる［１］に記載の体外受精用シャーレ、
及び、［６］  シャーレを用いた体外受精方法であって、
前記シャーレは、第１の壁面と第１の底面を備え、
前記第１の底面は
精子懸濁液を収容する精子収容部と、
第２の壁面及び前記第１の底面よりも低い位置に配置した透明な第２の底面を有する精子確認部を具備するものであり、
（１）前記精子収容部及び前記精子確認部内を培養液で満たす第１ステップと、
（２）培養液を用いて前記第１の底面上に前記精子収容部から前記精子確認部へと連結するように疑似卵管経路を描画する第２ステップと、
（３）培養液全体を、ミネラルオイルで覆う第３ステップと、
（４）前記精子確認部近傍の疑似卵管経路を形成する培養液に卵子を配置する第４ステップと、
（５）前記精子収容部に精子懸濁液を展開することにより、体外受精を開始する第５ステップと、
（６）前記精子確認部に精子が存在することを確認することにより、体外受精を終了する第６ステップを含む体外受精方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の体外受精用シャーレ及び体外受精方法は、培養液が卵管に類似した線状に配置されて精子が効率よく卵子にたどり着くことができ、高い受精率を実現する。つまり、少ない精子数であっても効率よく受精することができるために、結果として顕微授精を回避できる可能性が高くなる。また、体外受精終了の確認が可能となるために、迅速に次の作業（例えば、受精卵を培養する作業）に移行することができる。特に、精子収容部２に配置した精子はswim upした後に擬似卵管内を運動するため、精子収容部２に配置する精子は全てが運動精子である必要はない。さらに、従来は、いったんswim upした精子を回収し、濃度調整した上で懸濁液を調製し、卵をここに添加したが、本法ではswim upした精子は拡散することなく擬似卵管内を進むため、効率よく媒精が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明について図面を用いて説明する。図１は、本発明の体外受精用シャーレの外観図である。
【００１３】
本発明の体外受精用シャーレは、まず、第１の壁面１１と第１の底面１２を備える。本発明の体外受精用シャーレは、第１の壁面１１と第１の底面１２により、液体を収容することが可能である点において、通常のシャーレと何ら相違はない。但し、収容される液体は、主としてミネラルオイルであることを付記しておく。
【００１４】
第１の底面１２は、培養液を用いて疑似卵管経路（後述する）を描画する領域となる。したがって、第１の底面１２は、平滑な面であることが望ましいが、必ずしも平滑な面であることに限定されるものではない。
【００１５】
本発明の体外受精用シャーレの基本的な形状は、第１の壁面１１と第１の底面１２による。第１の壁面１１の高さは、液体、主にミネラルオイルを収容するのに十分な高さであれば、特に限定されるものではないが、例えば、５〜３０ｍｍ、好ましくは１０〜２０ｍｍである。また、第１の底面１２の外周の形状は、従来の体外受精に用いられるシャーレの底面の外周の形状と同形状、つまり、円を基本とするが、必ずしも限定されるものではない。第１の底面１２の外周の形状が円である場合、その半径は、例えば、約１０〜５０ｍｍ、好ましくは約１５〜３０ｍｍである。
【００１６】
上記第１の底面１２には、精子収容部２と、当該精子収容部２と離間して配置されてなる精子確認部３を具備する。
【００１７】
精子収容部とは、体外受精において、培養液及び／又は精子懸濁液を収容するための容積を有する部分をいう。精子収容部２は、第１の底面１２に対しては窪みといえる。その形状は、培養液及び／又は精子懸濁液を収容することができる限りにおいては、特に限定されるものではないが、有底形状であることが好ましい。精子収容部２の内容積は、培養液及び／又は精子懸濁液を収容することができれば、特に限定されるものではない。精子収容部２の内容積の例としては、約０．０１ｍＬ〜０．３ｍＬ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍＬである。
【００１８】
一方、精子確認部とは、精子収容部から後述する疑似卵管経路（培養液）を泳いできた精子が最終的に到達する部分であり、ここに精子が存在することを実態顕微鏡で確認して卵が運動精子に暴露されたこと確認する部分をいう。このため、精子確認部３は培養液を収容するための容積を有する。精子確認部３は、精子収容部２と同様に、第１の底面１２に対しては窪みといえる。精子確認部３の具体的構造としては、第２の壁面３１及び第１の底面１２よりも低い位置にあり、かつ透明な第２の底面３２を有する。ここで、第２の底面３２は透明であるために、精子確認部３に収容された培養液の状態を実態顕微鏡で視認することができる。精子確認部３の内容積は、培養液を収容することができれば、特に限定されるものではない。精子収容部の内容積の例としては、約０．０１ｍＬ〜０．３ｍＬ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍＬである。精子収容部の内容積に応じて、第２の壁面３１の高さ、第２の底面３２の形状及び面積は適宜設定される。
【００１９】
上述の精子収容部２及び精子確認部３の配置は、第１の底面１２において、互いに離間して配置していればよい。但し、意匠的に美観があり、第１の底面１２において疑似卵管経路の描画が行い易い観点から、精子収容部２及び精子確認部３は、第１の底面の外周の形状の中心点に対して、点対称の位置に配置されていることが望ましい。本発明において疑似卵管経路とは、培養液で構成されてなる卵管を模倣した経路あって、精子が泳ぐことができる経路をいう。疑似卵管経路の形成に関しては後述する。
【００２０】
また、精子収容部２に配置した精子はswim upした後に擬似卵管内を運動できるように、精子収容部２及び精子確認部３は、それぞれ第１の壁面１１に対しても離間して配置されていることが望ましい。具体的には、第１の壁面１１と精子収容部２との最短距離、及び、第１の壁面１２と精子確認部３との最短距離は、それぞれ少なくとも１．０ｍｍ以上、具体的には約１．０〜５．０ｍｍの範囲にあればよい。
【００２１】
本発明の変形例として、第１の底面１２には、精子収容部２から精子確認部３へと連結する疑似卵管経路の描画指示手段を具備してもよい。描画指示手段の例としては、第１の底面１２における印字及び溝が挙げられる。この場合、疑似卵管経路は、描画指示手段に従って描画すればよい。
【００２２】
また、本発明の他の変形例として、精子収容部２も有底形状とし、その底面は透明とし、当該精子収容部２の内容積が、精子確認部３の内容積と異にする態様が挙げられる。これにより、作業者は、採取された精子（精子懸濁液）の量に応じて、精子収容部２と精子確認部３との位置づけを逆転させて使用することもできる。
【００２３】
以上に説明した本発明の体外受精用シャーレを構成する材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル及びポリカーボネート等の汎用樹脂やガラスが挙げられる。これらの材料は、精子確認部３の第２の底面３２が透明である限りにおいては特に限定されるものではないが、材料が安価であり、成型品の強度が高い観点から、ポリスチレンが好ましい。また、体外受精用シャーレの製造方法としては、上述の各構成が同時かつ一体に成型できる観点から、例えば、射出成型、圧縮成型及び押出成型等が挙げられる。これらの製造方法の中でも、本発明の体外受精用シャーレの製造が最も容易である観点から、射出成型が好ましいが、本発明はこれらの製造方法に限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、上述した体外受精用シャーレを用いた体外受精方法にも及ぶ。体外受精方法は、以下の６ステップを含むものである。
（１）精子収容部２及び精子確認部３内を培養液で満たす第１ステップと、
（２）培養液を用いて第１の底面１２上に精子収容部２から精子確認部３へと連結するように疑似卵管経路を描画する第２ステップと、
（３）培養液全体を、ミネラルオイルで覆う第３ステップと、
（４）前記精子確認部近傍の疑似卵管経路を形成する培養液に卵子を配置する第４ステップと、
（５）前記精子収容部に精子懸濁液を展開することにより、体外受精を開始する第５ステップと、
（６）前記精子確認部に精子が存在することを確認することにより、体外受精（媒精）を終了する第６ステップ
【００２５】
本発明の体外受精方法では、擬似卵管の両側の窪み（精子収容部２及び精子確認部３）を出発点と終着点として用いる。その際、精子収容部２又は精子確認部３の大きさを変えてあるのは、精液の状態に従って精子調製法を選択する際、最終的に得られた精子数で、精子を入れる側の穴を大小変化させることにより、媒精効率の向上を図る。さらに下記のように反対側の穴に精子が出現したことは、卵が精子に曝されたことを顕微鏡下に確認できる利点を有している。以下にこの６ステップについて説明する。
【００２６】
（１）第１ステップ
第１ステップでは、精子収容部２及び精子確認部３内を培養液で満たす。使用する培養液は、体外受精に使用する培養液であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＨＵＥＣＭ培地（ニプロ社製）及びＨＴＦ培地等が挙げられる。
【００２７】
（２）第２ステップ
第２ステップでは、培養液を用いて第１の底面１２上に精子収容部２から精子確認部３へと連結するように疑似卵管経路を描画する。描画に用いる器具は、例えば、ピペット及びスパチュラなどが挙げられるが、本発明はこれらの器具に限定されるものではない。また、第１の底面１２上で描画された疑似卵管経路（培養液）は、精子収容部２に満たされた培養液、及び、精子確認部３に満たされた培養液と一体となる。描画される疑似卵管経路の形状は、特に限定されるものではないが、その全長は約１０〜１００ｍｍであることが好ましい。また、従来技術において精子は、シャーレの壁面方向に移動する傾向にあるため、疑似卵管経路は第１の壁面１１と離間するように形成することが望ましい。具体的には、疑似卵管経路と第１の壁面１１との最短距離は、それぞれ少なくとも１．０ｍｍ以上、具体的には約１．０〜５．０ｍｍの範囲にあればよい。使用する培養液は、体外受精に使用する培養液であれば、特に限定されるものではない。但し、第１ステップで使用した培養液と同じものであることが望ましい。実際に本発明の体外受精用シャーレにて疑似卵管経路を形成した状態の写真を図２に示す。但し、疑似卵管経路の形状、本数等は任意で設置できる。通常は、精子を節約するため、流路は１本とし、ここに卵を直線上に配置する。
【００２８】
（３）第３ステップ
第３ステップでは、培養液全体を、ミネラルオイルで覆う。ミネラルオイルは、鉱物油とも言われ、培養液（疑似卵管経路を形成するものを含む）の揮発を防止するために使用される。ミネラルオイルは、例えば、シグマ社及びメルク社から購入することができる。
【００２９】
（４）第４ステップ
第４ステップでは、精子確認部３近傍の疑似卵管経路を形成する培養液に卵子を配置する。卵子は、ヒトから採取され、必要に応じて洗浄されたものである。卵子を採取する器具としては、主にＡＰニードル（ニプロ社製）が挙げられる。
【００３０】
（５）第５ステップ
第５ステップでは、精子収容部２に精子懸濁液を展開することにより、体外受精を開始する。精子は、ヒトから採取され、必要に応じて洗浄されたものである。精子懸濁液とは、精子の濃縮液及び精子の分散液を含む。精子の濃縮物は、例えば、ＳＦＮＴキット（ニプロ社製）を用いて調製することができる。一方、精子の分散液は、採取した精子に上述の培養液やコロイドシリカ液を用いて分散させる。
【００３１】
（６）第６ステップ
第６ステップでは、精子確認部３に精子が存在することを確認することにより、体外受精を終了する。精子確認部３における精子が存在することを確認は、顕微鏡で確認することができる。精子確認部３の第２の底面３２が透明であるために、顕微鏡を用いて精子確認部３内の様子を観察することができる。顕微鏡で精子確認部３に精子が存在するということは、精子確認部３近傍の疑似卵管経路を形成する培養液に配置された卵子にも精子が到達していると言える。したがって、顕微鏡で精子確認部３に精子が存在することの確認を以て、体外受精（媒精）を終了する。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、例えば、生殖補助技術（ＡＲＴ）での体外受精に実施されうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の体外受精用シャーレの外観図である。
【図２】本発明の体外受精用シャーレにて疑似卵管経路を形成した状態の写真である。疑似卵管経路の形状、本数等は任意で設置できる。通常は、精子を節約するため、流路は１本とし、ここに卵を直線上に配置する。
【符号の説明】
【００３４】
１１  第１の壁面
１２  第１の底面
２    精子収容部
３    精子確認部
３１  第２の壁面
３２  第２の底面
【図１】
0005115320.tif 000002
【図２】
0005115320.tif 000003