(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールを含有する細胞への核酸導入用組成物。
【請求項２】
コレステロールを組成物中の全脂質量に対して０モル％を超えて５０モル％以下含むものである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリドの含有量が、組成物中の全脂質量に対して４０〜６０モル％である請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの比（モル比）が、２：３〜１６：１である請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
さらに核酸を含有するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
脂質膜構造体を形成しているものである請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
リポソームを形成しているものである請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
凍結乾燥物である請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項記載の組成物をイン・ビトロまたはイン・ビボ（ヒトを除く）で細胞に適用することを特徴とする核酸の細胞への導入方法。
【請求項１０】
核酸導入剤を製造するための、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１１】
下記の（１）〜（３）の工程：
（１）標的核酸を導入した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における標的核酸の発現量を測定する工程、
（３）上記（２）の測定量が、対照細胞の標的核酸の発現量よりも大きいか又は小さい被験物質を選択する工程、
を有する標的核酸の発現増加又は抑制物質のスクリーニング方法において、標的核酸の細胞への導入及び／又は被験物質の当該細胞への接触を請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を用いて行うことを特徴とする標的核酸の発現増加又は抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞内へ導入するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子などの核酸を細胞内に導入する方法として、カチオン性脂質単独またはこれを含むリポソームと核酸とが形成する複合体を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。実際、この方法用の試薬として、例えば、「リポフェクトアミン」、「リポフェクチン」、「トランスフェクタム」、「ジーントランスファー」、「リポフェクトアミン２０００」などが市販されている。【０００３】
しかしながら、これら市販の試薬には、次のような問題点が指摘されている。ａ）製剤としての保存安定性が悪く、リポソーム等を用いた遺伝子の細胞内導入・発現において再現性が悪い。ｂ）細胞培養のための培地中に添加する血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）中で非常に不安定であり、細胞を培養している血清入り培地をいったん無血清培地に置き換え、導入後また血清入り培地に戻すという煩雑な手順が用いられている。また最近では、血液中あるいは体内においても非常に不安定であることが明らかになりつつある。ｃ）市販品の多く（例えば、リポフェクトアミン、リポフェクチン、リポフェクトアミン２０００）は既に脂質が水に分散した形でのみ提供されており、ここに外から遺伝子水溶液を添加する手順となっているが、これでは、リポソームの外側に遺伝子が結合した複合体は製造することができても、遺伝子を内封したリポソームを製造することは不可能である。また、リポフェクトアミン２０００はカチオン性脂質の過酸化物形成を避けるため、過剰な撹拌、振盪ができず、細心の注意が必要であるといった煩雑さを有する。ｄ）細胞毒性が非常に強い。【０００４】
このように、遺伝子などの核酸をカチオン性脂質単独またはリポソームを用いて細胞内に導入させる試薬はいくつか販売されてはいるが、多くの問題をかかえている。
【特許文献１】特開平２−１３５０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞毒性が低く、被導入核酸の細胞内導入性および細胞内での発現を改善した核酸導入用組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、低細胞毒性、核酸の細胞内導入性、ひいては細胞内での発現を改善する方法について鋭意検討した結果、下記式（Ｉ）【０００７】
【化１】
0005325576.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素数１２〜２２の飽和または不飽和の炭化水素基を意味し、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を意味し、ｍは１〜１０の整数を意味し、Ｘはハロゲン原子を意味する。）
で表される化合物およびリン脂質を遺伝子などの核酸とともに投与または細胞に供給することにより、低細胞毒性で、核酸が効率良く導入されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）上記式（Ｉ）で表される化合物およびリン脂質を含有する細胞への核酸導入用組成物。
（２）さらにコレステロールおよび／またはコレスタノールを組成物中の全脂質量に対して０〜５０モル％含むものである（１）記載の組成物。
（３）式（Ｉ）で表される化合物の含有量が、組成物中の全脂質量に対して４０〜６０モル％である（１）または（２）記載の組成物。
（４）式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質の比（モル比）が、２：３〜１６：１である（１）〜（３）のいずれか１つに記載の組成物。
（５）式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２が、炭素数１２〜１８のアルキル基またはアルケニル基を意味し、Ｒ３がメチル基を意味し、ｍが１を意味するものである（１）〜（４）のいずれか１つに記載の組成物。
（６）式（Ｉ）中、Ｘが塩素原子または臭素原子を意味するものである（１）〜（５）のいずれか１つに記載の組成物。
（７）リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸から選ばれる１種または２種以上である（１）〜（６）のいずれか１つに記載の組成物。
（８）リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミンである（１）〜（６）のいずれか１つに記載の組成物。
（９）リン脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである（１）〜（６）のいずれか１つに記載の組成物。
（１０）Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリド、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールを含有する細胞への核酸導入用組成物。
（１１）さらに核酸を含有するものである（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の組成物。
（１２）核酸が、ショートオリゴヌクレオチドである（１１）記載の組成物。
（１３）脂質膜構造体を形成しているものである（１）〜（１２）のいずれか１つに記載の組成物。
（１４）リポソームを形成しているものである（１）〜（１３）のいずれか１つに記載の組成物。
（１５）凍結乾燥物である（１）〜（１４）のいずれか１つに記載の組成物。
（１６）（１１）〜（１５）のいずれか１つに記載の組成物をイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞に適用することを特徴とする核酸の細胞への導入方法。
（１７）核酸導入剤を製造するための、（１）〜（１５）のいずれか１つに記載の組成物の使用。
（１８）下記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程：
（ｉ）標的核酸を導入した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｉｉ）被験物質を接触させた細胞における標的核酸の発現量を測定する工程、
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の測定量が、対照細胞の標的核酸の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程、
を有する標的核酸の発現抑制物質のスクリーニング方法において、標的核酸の細胞への導入及び／又は被験物質の当該細胞への接触を（１）〜（１５）のいずれか１つに記載の組成物を用いて行うことを特徴とする標的遺伝子の発現抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組成物を用いれば、低細胞毒性で、核酸を効率良く細胞に導入できる。従って、本発明の組成物は、核酸導入用試薬または医薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の核酸導入用組成物は、被導入核酸と共に用いて、該核酸を細胞へ導入するための組成物であるが、少なくとも、上記式（Ｉ）で表される化合物およびリン脂質を含有するものであればよく、被導入核酸を含有するもの（核酸含有組成物）、および被導入核酸を含有しないものが包含される。【００１２】
本発明の組成物に係る式（Ｉ）で表される化合物中の置換基について説明する。
式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素数１２〜２２の飽和または不飽和の炭化水素基を意味するものであり、具体的には、ドデシル基、トリデシル基、ヘキサデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、オレイル基、リノレリル基、リノレニル基などを挙げることができる。Ｒ１およびＲ２としては、同一のものが好ましい。式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２としては、炭素数１２〜１８のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、具体的には、ドデシル基、ヘキサデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、オレイル基などを好ましいものとして挙げることができる。本発明においては、炭素数１２〜１８のアルケニル基がより好ましい。【００１３】
Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基を意味するものであり、炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基などを挙げることができ、中でもメチル基が好ましい。炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基を挙げることができる。【００１４】
ｍは１〜１０の整数を意味するものであり、ｍは１または１０が好ましい。
Ｘはハロゲン原子を意味するものであり、塩素原子、臭素原子などを挙げることができる。【００１５】
本発明の組成物に係る式（Ｉ）で表される化合物は公知化合物であり、公知の方法（例えば、特開平６−２００３３６号公報参照）により製造することができるほか、相互薬工株式会社より、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（製品名：ＤＣ−３−１２Ｄ）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｌ−グルタメート  クロリド（製品名：ＤＣ−３−１２Ｌ）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオクタデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（製品名：ＤＣ−３−１８Ｄ）、Ｎ−ω−トリメチルアンモニオデカノイルデヘキサデシル−Ｄ−グルタメート  ブロミド（製品名：ＤＣ−１２−１２Ｄ）、Ｎ−ω−トリメチルアンモニオデカノイルデヘキサデシル−Ｌ−グルタメート  ブロミド（製品名：ＤＣ−１２−１２Ｌ）などが市販されており、このものを用いてもよい。本発明においては、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−グルタメート  ハライドが好ましく、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリドが特に好ましい。【００１６】
本発明の組成物に係る一般式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、本発明の組成物中の全脂質量に応じて適宜決定すればよいが、全脂質量に対して２０〜８０モル％とするのが好ましく、４０〜６０モル％とするのがより好ましい。【００１７】
本発明の組成物に係るリン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合せて用いることができる。
このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンを単独または組み合せて用いるのがより好ましく、ホスファチジルエタノールアミンを用いるのが特に好ましい。なお、これらリン脂質の脂肪酸残基としては、特に限定されるものではなく、炭素数１２〜１８の飽和または不飽和脂肪酸残基が挙げられ、パルミトイル基、オレオイル基、ステアロイル基、リノレイル基等が好ましい。本発明に係るリン脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが特に好ましい。【００１８】
また、本発明の組成物においては、コレステロールおよび／またはコレスタノールなどのステロール類をさらに配合することができ、その配合量としては、組成物中の全脂質量の０〜５０モル％が好ましく、１６〜５０モル％がより好ましい。【００１９】
上記リン脂質の本発明の組成物への配合量は、全脂質量に応じて適宜検討すればよいが、一般式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質の比（モル比）が２：３〜１６：１であることが好ましく、１．３：１〜４：１であることがより好ましい。【００２０】
本発明の組成物においては、（イ）一般式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質の比（モル比）が１．３：１〜４：１であるものが好ましく、（ロ）一般式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質の比（モル比）が１．３：１〜４：１であり、かつ一般式（Ｉ）で表される化合物の含有量が本発明の組成物中の全脂質量に対して４０〜６０モル％であるものがより好ましく、（ハ）一般式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質の比（モル比）が１．３：１〜４：１であり、一般式（Ｉ）で表される化合物の含有量が本発明の組成物中の全脂質量に対して４０〜６０モル％であり、かつステロール類の配合量が本発明の組成物中の全脂質量の１６〜５０モル％がさらに好ましい。【００２１】
本発明の組成物に適用される被導入核酸としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどのショートオリゴヌクレオチドや、酵素、サイトカイン等の生理活性物質、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子等を挙げることができる。【００２２】
本発明の組成物において、一般式（Ｉ）で表される化合物の含有量は、核酸を細胞内に導入するのに充分な量であればよく、核酸の種類、用途、組成物の形態等に応じて適宜決定すればよいが、例えば、核酸２００ｎｇに対して一般式（Ｉ）で表される化合物１２５〜２０００ｐモル含むものが好ましく、２５０〜１０００ｐモル含むものがより好ましい。また、リン酸基換算で１モルのｓｉＲＮＡに対して一般式（Ｉ）で表される化合物０．１〜１０モル含むものが好ましく、０．５〜２モル含むものがより好ましい。例えば、２７ｍｅｒのｓｉＲＮＡを用いる場合、ｓｉＲＮＡ１モルに対して一般式（Ｉ）で表される化合物５．４〜５４０モル含むものが好ましく、２７〜１０８モル含むものがより好ましい。【００２３】
本発明の組成物は、一般式（Ｉ）で表される化合物とリン脂質やこれらのほかに所望によりステロール類を含んだ単なる混合物としての形態でもよいし、一般式（Ｉ）で表される化合物、リン脂質およびステロール類との組み合わせで脂質膜構造体を形成した形態でもよい。【００２４】
当該脂質膜構造体の形態は、特に限定されないが、例えば、乾燥した脂質混合物形態、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。【００２５】
このうち、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、例えば、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。これらのうちリポソームが好ましい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍ〜５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５〜１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５〜１０ｎｍであり、これらが層を形成しているものが好ましい。【００２６】
以下に、各種の脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
１）乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。【００２７】
２）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【００２８】
水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）等を加えてもよい。この水系溶媒（分散媒）に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０〜８．０）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。【００２９】
ここで、糖または多価アルコールの濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、例えば、糖（水溶液）は、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール（水溶液）は、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体の構成成分として用いるジ（Ｃ１２−１６アルキル）ジメチルアンモニウムハライドおよびリン脂質、所望によりステロール類を含む全脂質の濃度は、０．２〜５０ｍＭが好ましく、１〜１０ｍＭがさらに好ましい。【００３０】
３）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥または凍結させた形態は、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥または凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に核酸含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために核酸を効率よく脂質膜構造体に保持させることができる長所がある。【００３１】
凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖（水溶液）やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。【００３２】
本発明の核酸導入用組成物は、被導入核酸を含有させた組成物（核酸含有組成物）とすることができるが、以下にこの場合の組成物について説明する。【００３３】
組成物の形態としては、一般式（Ｉ）で表される化合物、リン脂質と核酸やこれらのほかに所望によりステロール類などを含んだ単に混合物として存在していてもよいし、一般式（Ｉ）で表される化合物、リン脂質およびステロール類との組み合わせで形成された脂質膜構造体と核酸とが混合した形態でもよいし、さらに脂質膜構造体に核酸が保持された形態でもよい。ここで、「保持」とは、核酸が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、および／または脂質層の表面に存在することを意味する。脂質膜構造体が、例えばリポソームなどの微粒子である場合には、微粒子内部に核酸を封入することもできる。【００３４】
また、脂質膜構造体の形態は、前述の脂質膜構造体と同様に、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。【００３５】
以下に、各種の脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
１）混合乾燥物形態とする場合には、例えば、脂質膜構造体の構成成分と核酸とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させて混合物を得て、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥に付することにより製造することができる。【００３６】
２）脂質膜構造体と核酸を含む水系溶媒に分散した形態とする場合には、その製造方法としてはいくつかの方法が知られており、脂質膜構造体における核酸の保持様式や混合物の性状などに応じて、下記２−１〜２−５のように適宜の製造法を選択することができる。【００３７】
２−１）製造法１
上述の混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。この方法の場合、まず、脂質膜構造体の構成成分と核酸との混合乾燥物を作るために、脂質膜構造体と核酸を有機溶媒に溶解する必要があるが、脂質膜構造体の構成成分と核酸との相互作用を最大限に利用できる長所がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、核酸は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、この製造方法を用いると核酸の脂質膜構造体への保持率を高くできる長所がある。【００３８】
２−２）製造法２
脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る核酸に適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にも核酸を保持できる長所がある。【００３９】
２−３）製造法３
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、または層状構造物などの脂質膜構造体に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。対象となる核酸としては、水溶性のものを利用できる。既にでき上がっている脂質膜構造体に外部から核酸を添加する方法であることから、核酸が高分子の場合には、核酸は脂質膜構造体の内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造法３を用いると、核酸がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）を形成することが知られている。この製造法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における核酸の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。したがって、製造法１や製造法２に比べて比較的容易に製造することができる。【００４０】
２−４）製造法４
水系溶媒に分散した脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物に、さらに核酸を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造法３と同様に対象となる核酸としては、水溶性のものを利用できる。製造法３との相違点は、脂質膜構造体と核酸との存在様式にあり、この製造法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶媒に、さらに糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。ここで、核酸を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体を再構築することができる。この時、核酸が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。【００４１】
製造法３では、核酸が高分子の場合には、核酸は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造法４はこの点で大きく異なる。すなわち、核酸の一部または全部は脂質膜構造体内部に取り込まれる。この製造法４は、脂質膜構造体単独の分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の核酸の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。従って、製造法１や製造法２に比べて比較的製造が容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥または噴霧乾燥を行うため、製剤（核酸含有組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を核酸の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せること、高分子の核酸であっても、脂質膜構造体内部に核酸を保持させ易いことなどの長所がある。【００４２】
２−５）その他
脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した形態を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などを採用できる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【００４３】
３）上記の脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる形態とする場合には、凍結乾燥や噴霧乾燥等する方法を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。脂質膜構造体と核酸との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖（水溶液）や多価アルコール（水溶液）を添加した溶媒を用いるのが好ましい。【００４４】
斯くして得られる本発明の組成物を用いれば、細胞内に核酸を効率良く導入することができる。従って、本発明の組成物は、核酸導入用試薬や医薬等の核酸導入剤として使用できる。例えば、イン・ビトロの場合には、標的細胞を含む懸濁液に本発明の核酸含有組成物を添加したり、当該核酸含有組成物を含有する培地で標的細胞を培養する等の手段により、当該標的細胞に核酸を導入できる。また、イン・ビボの場合には、本発明の核酸含有組成物をヒトまたは非ヒト動物に投与すればよい。投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよく、経口投与の剤形としては、通常知られているものでよく、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、通常知られているものでよく、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。好ましくは、非経口投与である。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。【００４５】
また、本発明の核酸導入用組成物は、下記の（１）〜（３）の工程：
（１）標的核酸を導入した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における標的核酸の発現量を測定する工程、
（３）上記（２）の測定量が、対照細胞の標的核酸の発現量よりも大きいか又は小さい被験物質を選択する工程、
を有する標的核酸の発現増加又は抑制物質のスクリーニング方法において、標的核酸の細胞への導入及び／又は被験物質の当該細胞への接触（導入）に使用することができる。【００４６】
ここで、標的核酸としては、例えば疾患に関係する遺伝子やこれを含むプラスミドＤＮＡ等が挙げられ、被験物質としては、例えば分子量1万未満、好ましくは100〜2000の低分子化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、siＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等のショートヌクレオチド等が挙げられる。
核酸発現量の測定は、ノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法等の公知の方法、又はＤＮＡアレイを利用した測定方法等により行うことができる。
また、対照細胞としては、被験物質を接触させない細胞、或いは標的核酸に影響を及ぼさないショートヌクレオチド又は任意の物質を導入した細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。【００４８】
実施例１
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−３−１２Ｄ））、コレステロール（和光純薬株式会社製）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ；日本油脂株式会社製）を４０％、３０％、３０％の配合比率（モル比）でクロロホルムに溶解させ、これを減圧乾固させて脂質混合物とした。この脂質混合物に９％スクロース溶液を加え、６５℃加温下、ソニケーターで間接的に超音波照射することでＤＣ−３−１２Ｄ濃度２．５ｍＭのリポソーム粗分散液を得た。次に、リポソームの粒子径を揃えるため、孔径０．２２μｍのフィルターを２枚重ねてイクストリューダーにセットし、約６５℃加温、加圧下、イクストルージョン（押し出し濾過）した。さらに、孔径０．１μｍのフィルターを用いて同様にイクストリュージョンし、これを空のリポソーム分散液とした。このリポソーム分散液を２ｍＬバイアルに１ｍＬずつ分注し、凍結乾燥し、凍結乾燥リポソーム（調製例１）を得た。また、ＮＩＣＯＭＰ  ３８０ＺＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて、得られた調製例１の平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００４９】
実施例２
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリドにかえて、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｌ−グルタメート  クロリド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−３−１２Ｌ））を用いた以外は実施例１と同様にして凍結乾燥リポソーム（調製例２）を得、平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００５０】
実施例３
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリドにかえて、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオクタデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−３−１８Ｄ））を用いた以外は実施例１と同様にして凍結乾燥リポソーム（調製例３）を得、平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００５１】
実施例４
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリドにかえて、Ｎ−ω−トリメチルアンモニオデカノイル−デヘキサデシル−Ｄ−グルタメート  ブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１２−１２Ｄ））を用いた以外は実施例１と同様にして凍結乾燥リポソーム（調製例４）を得、平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００５２】
実施例５
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリドにかえて、Ｎ−ω−トリメチルアンモニオデカノイル−デヘキサデシル−Ｌ−グルタメート  ブロミド（相互薬工株式会社製（製品名：ＤＣ−１２−１２Ｌ））を用いた以外は実施例１と同様にして凍結乾燥リポソーム（調製例５）を得、平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００５３】
実施例６
Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリドにかえて、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジオレイル−Ｄ−グルタメート  クロリド（特開平６−２００３３６号公報の製造例１の化合物、以下、ＤＣ−３−１８：１Ｄと略す。）を用いた以外は実施例１と同様にして凍結乾燥リポソーム（調製例６）を得、平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表２に示した。【００５４】
表１に調製例１〜６の組成を示した。【００５５】
【表１】
0005325576.tif 000003
【００５６】
【表２】
0005325576.tif 000004
【００５７】
試験例１  ＣＨＯ細胞への核酸導入試験
以下の配列のｓｉＲＮＡの水溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＦ１２Ｈａｍ培地で６．２５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別に調製例１中のＤＣ−３−１２Ｄ濃度が約１ｍＭとなるように適量の水を加え復水した。
ｓｅｎｓｅ  ５'−ＡＣＡＵＣＡＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−ＡＧ−３'（配列番号１）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ３'−ＵＡ−ＵＧＵＡＧＵＧＣＡＵＧＣＧＣＣＵＵＡＵＧＡＡＧＣＵ−５（配列番号２）
この液をＦ−１２ＨＡＭ培地で２０．８倍および１２５倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体を形成させた。この時、ｓｉＲＮＡ由来のアニオン量とＤＣ−３−１２Ｄ由来のカチオン量の比は、それぞれ約６および１となる。さらにこれらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地とした。ＣＨＯ（ｐＭＡＭ−ｌｕｃ）細胞（ＪＣＲＢ０１３６．１、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）の培地をｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約４１時間培養後、培地を１μＭデキサメサゾン、１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６〜８時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性をスコア化（−：視野の８５〜１００％程度を細胞が占めており、毒性による損傷の痕跡も認められない、±：視野の８５〜１００％程度を細胞が占めているが、一部に毒性による損傷の痕跡が認められる、＋：視野の７０〜８０％程度を細胞が占めている、＋＋：視野の５０〜７０％程度を細胞が占めている、＋＋＋：視野の５０％程度未満しか細胞が占めていない）し、結果を表３に示した。培地除去後、ＰＢＳで洗浄した。ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、調製例２〜６についても同様に実施し、ノックダウン率（％）を式（１）に基づき算出した。結果を表３に示した。【００５８】
式（１）：１００×（ｓｉＲＮＡ添加時のルシフェラーゼ活性値／ｓｉＲＮＡ無添加時のルシフェラーゼ活性値）【００５９】
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン２０００（商品名：インビトロジェン社）を用いて、ノックダウン率の評価を行った。
ｓｉＲＮＡ溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＦ−１２ＨＡＭ培地で２．５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別にリポフェクトアミン２０００（商品名：インビトロジェン社）をＦ−１２ＨＡＭ培地で５０倍希釈した。さらにこの液にこれと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を加え、ｓｉＲＮＡ／リポフェクトアミン２０００含有培地とした。この培地２０μＬを別途培養中のＣＨＯ（ｐＭＡＭ−ｌｕｃ）細胞（培地量：１００μＬ）に添加し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約４１時間培養後、培地を１μＭデキサメサゾン、１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２−Ｈａｍ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約７時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を前述のようにスコア化した。培地除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。１×ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は、スコアにすると−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、３８（％）であった。【００６０】
試験例２  ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
以下の配列のｓｉＲＮＡの水溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＤＵＬＢＥＣＣＯ'Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＥＡＧＬＥ'Ｓ  ＭＥＤＩＵＭ（以下、ＤＭＥＭ）培地で６．２５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別に調製例１中のＤＣ−３−１２Ｄ濃度が約１ｍＭとなるように適量の水を加え復水した。
ｓｅｎｓｅ  ５'−ＡＣＡＵＣＡＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ−ＡＧ−３'（配列番号３）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ３'−ＵＡ−ＵＧＵＡＧＵＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ−５（配列番号４）【００６１】
この液をＤＭＥＭ培地で２８．８倍、１１５倍および２１５倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体を形成させた。この時、ｓｉＲＮＡ由来のアニオン量とＤＣ−３−１２Ｄ由来のカチオン量の比は、それぞれ約４、１および０．５となる。さらにこれらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地とした。ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）の培地をｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約１８時間培養後、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、０．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化し、結果を表３に示した。培地除去後、ＰＢＳで洗浄した。ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。また、調製例２〜６についても同様に実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表３に示した。【００６２】
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン２０００（商品名：インビトロジェン社）を用いて、ノックダウン率の評価を行った。
ｓｉＲＮＡ溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＤＭＥＭ培地で２．５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別にリポフェクタミン２０００をＤＭＥＭ培地で１００倍希釈した。さらにこの液にこれと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を添加し、ｓｉＲＮＡ／リポフェクトアミン２０００含有培地とした。この培地２０μＬを別途培養中のＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）の培地（１００μＬ）に添加し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約１８時間培養後、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、０．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７および１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。１×ＰＬＢで細胞を溶解後ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は、スコアにすると−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、９（％）であった。【００６３】
【表３】
0005325576.tif 000005
【００６４】
表３からわかるように、本発明に係る調製例６は特に優れた核酸導入効率（ノックアウト率）および低細胞毒性を示した。中でも、リポフェクトアミン２０００と比較しても細胞種によらず、高い核酸導入効率および低細胞毒性を示した（リポフェクトアミン２０００はＨｅＬａ細胞に高い核酸導入効率を示すものの、ＣＨＯ細胞に対しては不十分である。）。したがい、Ｒ１およびＲ２において、アルケニル基を有する化合物は優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示すことがわかった。【００６５】
実施例７
調製例６と同様にして、表４に示す凍結乾燥リポソーム（調製例７〜２２）を得た。また、実施例１と同様にして平均粒子径およびゼータ電位を測定した。結果を表５に示した。【００６６】
【表４】
0005325576.tif 000006
【００６７】
【表５】
0005325576.tif 000007
【００６８】
試験例３  ＣＨＯ細胞への核酸導入試験
試験例１で用いたｓｉＲＮＡ溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＦ−１２ＨＡＭ培地で６．２５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別に調製例６〜２２中のＤＣ−３−１８：１Ｄ濃度が約１ｍＭとなるように適量の水を加え復水した。この液をＦ−１２ＨＡＭ培地で１４．４倍、１９．２倍および５６．７倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体を形成させた。この時、ｓｉＲＮＡ由来のアニオン量とＤＣ−３−１８：１Ｄ由来のカチオン量の比は、それぞれ約８、６および２となる。さらにこれらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地とした。ＣＨＯ（ｐＭＡＭ−１ｕｃ）細胞（ＪＣＲＢ０１３６．１、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）の培地をｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約４１時間培養後、培地を１μＭデキサメサゾン、１０％ＦＢＳ含有Ｆ−１２ＨＡＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６〜８時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。１×ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表６に示した。
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン２０００（商品名：インビトロジェン社）を用いて、試験例１と同様に細胞毒性のスコア化およびノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、５４（％）であった。【００６９】
【表６】
0005325576.tif 000008
【００７０】
試験例４  ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
試験例２で用いたｓｉＲＮＡ溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＤＭＥＭ培地で６．２５倍希釈しｓｉＲＮＡ希釈溶液とした。別に調製例６〜２２中のＤＣ−３−１８：１Ｄ濃度が約１ｍＭとなるように適量の水を加え復水した。この液をＤＭＥＭ培地で２８．８倍、５７．７倍、１１５倍および５００倍に希釈した。各々の液にこれらと等量のｓｉＲＮＡ希釈溶液を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体を形成させた。さらにこれらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地とした。ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）の培地をｓｉＲＮＡ／リポソーム複合体含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約１８時間培養後、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、０．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６時間培養後、顕微鏡下で細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、ＰＢＳで洗浄した。ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施した。式（１）に基づきノックダウン率（％）を算出した。結果を表７に示した。
別に、陽性コントロールとして、リポフェクトアミン２０００（商品名：インビトロジェン社）を用いて、試験例２と同様に細胞毒性のスコア化およびノックダウン率（％）を算出した。結果、細胞毒性は−であったが細胞中に白色の斑点が認められた。ノックダウン率は、１０（％）であった。【００７１】
【表７】
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【００７２】
表６および７から明らかなように、本発明に係る調製例６、８、９、１２、１５、１８、１９および２０は優れた核酸導入効率および低細胞毒性を示した。中でも、調製例６、８、１２、１５および２０が好ましく、調製例６、８、１２および１５がさらに好ましいことがわかった。【００７３】
核酸の導入においては、導入効率および細胞毒性の観点から、本発明に係る一般式（Ｉ）で表される化合物、リン脂質、コレステロール等の濃度を適宜検討することで、より優れた核酸導入組成物を提供でき得ることがわかった。【００７４】
試験例５  ＨｅＬａ細胞への核酸導入試験
核酸封入型リポソームと核酸コンプレックス型リポソームにおける核酸導入効率につき、比較検討を行った。
（１）核酸封入型リポソームの評価
調製例６中のＤＣ−３−１８：１Ｄ濃度が約１ｍＭになる様に、試験例２で用いたｓｉＲＮＡ水溶液（３４．３ｐｍｏｌ／μＬ、１８．５ｐｍｏｌ／μＬ、４．６ｐｍｏｌ／μＬ）を加えて復水し、同時にｓｉＲＮＡ封入型リポソームを形成させた。この液をＤＭＥＭ培地で４２８．６倍、２３０．８倍、５７．７倍に希釈した。これらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡ封入型リポソーム含有培地とした。ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）の培地をｓｉＲＮＡ封入型リポソーム含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約１８時間培養後、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、０．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６時間培養後、顕微鏡下に細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。１×ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を測定した。結果を表８に示した。【００７５】
（２）核酸コンプレックス型リポソームの評価
前記（１）で用いたｓｉＲＮＡ水溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）をＤＭＥＭ培地で希釈し、８０．２ｆｍｏｌ／μＬ、８０．３ｆｍｏｌ／μＬ、８１．４ｆｍｏｌ／μＬのｓｉＲＮＡ含有ＤＭＥＭ培地とした。別に調製例６中のＤＣ−３−１８：１Ｄ濃度が約１ｍＭになる様に適量の水を加えて復水した。この液を８０．２ｆｍｏｌ／μＬ、８０．３ｆｍｏｌ／μＬ、８１．４ｆｍｏｌ／μＬ  ｓｉＲＮＡ含有ＤＭＥＭ培地で４２８．６倍、２３０．８倍、５７．７倍に希釈し、同時にｓｉＲＮＡコンプレックス型リポソームを形成させた。これらの液にこれらと等量の２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加、混合し、ｓｉＲＮＡコンプレックス型リポソーム含有培地とした。ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＨｅＬａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社）の培地をｓｉＲＮＡコンプレックス型リポソーム含有培地と交換し、トランスフェクションを開始した。３７℃、５％ＣＯ２で約１８時間培養後、培地を１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、０．５μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７および１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換した。３７℃、５％ＣＯ２で約６時間培養後、顕微鏡下に細胞の観察を行い、細胞毒性を試験例１と同様にスコア化した。培地除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄した。１×ＰＬＢで細胞を溶解後、ルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして上記ｓｉＲＮＡ溶液に代え水を用いて同様の実験を実施し、式（１）に基づきノックダウン率（％）を測定した。結果を表８に示した。【００７６】
【表８】
0005325576.tif 000010
【００７７】
表８から明らかなように、リポソーム凍結乾燥製剤に直接ｓｉＲＮＡ溶液を添加した封入型リポソームはリポソームの添加量によらず、コンプレックス型と比較して高いノックダウン効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の組成物を用いると、低細胞毒性で、核酸が効率良く導入されるため、核酸導入用試薬や医薬等の核酸導入剤として有用である。
【配列表】
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