(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトアビジンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）および（ｂ）をこの順に含有する、方法：
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）であって、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
【化１】
0005149992.tif 000013
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、工程および
前記基材上にストレプトアビジンを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記ストレプトアビジンのアミノ基との間の反応により、以下の化学式（ＩＩ）によって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
【化２】
0005149992.tif 000014
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する、方法：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）であって、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有する、工程および
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間でペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに以下の工程（ａｂ）を具備する、方法：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１-エチル-３-（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride）混合液により活性化する工程（ａｂ）。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに以下の工程（ａ１ａ）を具備する、方法：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
【請求項５】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１に記載の方法
【化３】
0005149992.tif 000015
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、方法。
【請求項１０】
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびストレプトアビジンを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記ストレプトアビジンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記ストレプトアビジンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化２】
0005149992.tif 000016
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
【請求項１１】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１０に記載のセンサ
【化３】
0005149992.tif 000017
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）。
【請求項１２】
請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、センサ。
【請求項１３】
請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、センサ。
【請求項１４】
請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、センサ。
【請求項１５】
請求項１０に記載のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、センサ。
【請求項１６】
センサを用いて試料に含まれる標的物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する、方法：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびストレプトアビジンを備えたセンサを用意する工程（ａ）であって、ここで
前記自己組織化膜および前記ストレプトアビジンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記ストレプトアビジンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化２】
0005149992.tif 000018
（式中、Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、工程、
前記センサに前記試料を供給し、前記ストレプトアビジンに前記標的物質を結合させる工程（ｂ）、および
前記結合された標的物質またはその量から試料に含まれる標的物質を検出または定量する工程（ｃ）。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）は、以下の工程（ｂ１）および工程（ｂ２）を具備する、方法：
前記ストレプトアビジンに抗体を結合させる工程（ｂ１）であって、ここで、
前記抗体は、ビオチンにより修飾されている、工程および
前記抗体に、前記標的物質を結合させる工程（ｂ２）。
【請求項１８】
前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、請求項１６に記載の方法
【化３】
0005149992.tif 000019
（式中、Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す。）。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はストレプトアビジンを自己組織化膜上に固定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含有される標的物質を検出または定量するために、バイオセンサが用いられる。ストレプトアビジンとビオチンとの間の高い親和性がバイオセンサにおいて利用され得る。具体的には、ストレプトアビジンが当該バイオセンサに固定されている。標的物質はビオチン分子により修飾されている。当該標的物質が当該バイオセンサに供給されると、ストレプトアビジンとビオチンとの間の高い親和性のために、標的物質がバイオセンサに固定される。
【０００３】
特許文献１は、ストレプトアビジンとビオチンとの間の高い親和性を利用した従来のバイオセンサを開示している。図２は、特許文献１の図７に開示されたバイオセンサを示す。
【０００４】
特許文献１の図７に関する記述によれば、当該バイオセンサは、生体分子の活性をスクリーニングするために用いられる。当該バイオセンサは、単層７、親和性タグ８、アダプター分子９、およびタンパク質１０を具備している。単層７は、化学式Ｘ−Ｒ−Ｙによって表される自己組織化膜から構成される（段落番号００８０、００８２、００８４、００８５を参照）。Ｘ、Ｒ、およびＹの一例は、それぞれ、ＨＳ−、アルカン、およびカルボキシル基である（００８４、００８５、および０１０９、０１１９）。
親和性タグ８およびアダプター分子９は、それぞれストレプトアビジンおよびビオチンから構成され得る（段落番号０１１８を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ００／０４３８２号公報（特開２００２−５２０６１８号公報に相当）（段落００８０、００８２、００８４、００８５、００９５、および０１０９、０１１９参照）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
標的物質の検出感度または定量精度を向上させるためには、当該バイオセンサに固定されるストレプトアビジンの量を増やすことが必要とされる。
【０００７】
本発明者は、自己組織化膜に１分子のアミノ酸を結合させ、そしてストレプトアビジンを固定することによって、単位面積あたりのストレプトアビジンの固定量が著しく増加されるという知見を見いだした。本発明はこの知見を元に完成された。
【０００８】
本発明の目的は、自己組織化膜上に固定されるストレプトアビジンの量を増加させる方法、及び当該方法により固定されたストレプトアビジンを有するセンサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以下の項目［１］〜［２２］は、上記課題を解決する。
［１］ストレプトアビジンを自己組織化膜上に固定する方法であって、以下の工程（ａ）および（ｂ）をこの順に含有する、方法。
１分子のアミノ酸および自己組織化膜を具備する基材を用意する工程（ａ）であって、
ここで、前記１分子のアミノ酸は、以下の化学式（Ｉ）により表されるペプチド結合により前記自己組織化膜に結合しており、
【化１】
0005149992.tif 000002
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、工程、および
前記基材上にストレプトアビジンを供給し、前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基と前記ストレプトアビジンのアミノ基との間の反応により、以下の化学式（ＩＩ）によって表されるペプチド結合を形成する工程（ｂ）
【化２】
0005149992.tif 000003
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
［２］項目１の方法であって、前記工程（ａ）は、以下の工程（ａ１）および（ａ２）を具備する、方法：
自己組織化膜を表面に具備する基材を用意する工程（ａ１）であって、ここで、前記自己組織化膜は一端にカルボキシル基を有する、工程および
前記１分子のアミノ酸を前記基材に供給し、前記化学式（Ｉ）により表される前記自己組織化膜の一端の前記カルボキシル基と前記１分子のアミノ酸のアミノ基との間でペプチド結合を形成する工程（ａ２）。
［３］項目１の方法であって、前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）との間にさらに以下の工程（ａｂ）を具備する、方法：
前記１分子のアミノ酸のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１-エチル-３-（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸
塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride）混合液により活性化する工程（ａｂ）。
［４］項目２の方法であって、前記工程（ａ１）および前記工程（ａ２）との間にさらに以下の工程（ａ１ａ）を具備する、方法：
前記自己組織化膜のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide）および１-エチル-３-（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride）混合液により活性化する工程（ａ１ａ）。
［５］前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目１の方法。
【化３】
0005149992.tif 000004
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
［６］項目１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、方法。
［７］項目１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、方法。
［８］項目１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、方法。
［９］項目１の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、方法。
［１０］自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびストレプトアビジンを備えたセンサであって、
前記自己組織化膜および前記ストレプトアビジンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記ストレプトアビジンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化２】
0005149992.tif 000005
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、センサ。
［１１］前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目１０のセンサ
【化３】
0005149992.tif 000006
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）。
［１２］項目１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、センサ。
［１３］項目１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、センサ。
［１４］項目１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、センサ。
［１５］項目１０のセンサであって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、センサ。
［１６］センサを用いて試料に含まれる標的物質を検出または定量する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｃ）をこの順で具備する、方法：
自己組織化膜、１分子のアミノ酸、およびストレプトアビジンを備えたセンサを用意する工程（ａ）であって、ここで
前記自己組織化膜および前記ストレプトアビジンの間には前記１分子のアミノ酸が挟まれており、
前記ストレプトアビジンが、以下の化学式（ＩＩ）によって表される２つのペプチド結合により自己組織化膜に結合しており、
【化２】
0005149992.tif 000007
（式中、Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
前記１分子のアミノ酸は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される、工程；
前記センサに前記試料を供給し、前記ストレプトアビジンに前記標的物質を結合させる工程（ｂ）、および
前記結合された標的物質またはその量から試料に含まれる標的物質を検出または定量する工程（ｃ）。
［１７］項目１６の方法であって、
前記工程（ｂ）は、以下の工程（ｂ１）および工程（ｂ２）を具備する、方法：
前記ストレプトアビジンに抗体を結合させる工程（ｂ１）であって、ここで、
前記抗体は、ビオチンにより修飾されている、工程および
前記抗体に、前記標的物質を結合させる工程（ｂ２）。
［１８］前記化学式（ＩＩ）が以下の化学式（ＩＩＩ）により表される、項目１６の方法。
【化３】
0005149992.tif 000008
（式中、Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
［１９］項目１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンからなる群から選択される、方法。
［２０］項目１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、方法。
［２１］項目１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群から選択される、方法。
［２２］項目１６の方法であって、前記１分子のアミノ酸が、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンからなる群から選択される、方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、単位面積あたりに固定されるストレプトアビジンの量の著しい増加を達成する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明による方法の概略図を示す。
【図２】図２は、特許文献１の図７である。
【図３】図３は、従来技術による方法の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１を参照しながら、本発明の実施の形態が、以下、説明される。
【００１３】
（実施の形態１）
図１は、ストレプトアビジンを自己組織化膜に固定するための本発明による方法を示す。
【００１４】
基材１は、好ましくは金基板である。金基板の一例は、表面に金を具備する基板である。具体的には、金基板は、ガラス、プラスチック、または二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）の表面に金をスパッタすることにより形成された基板であり得る。
【００１５】
まず、アルカンチオールを含有する溶液に基材１は浸漬される。好ましくは、浸漬前に基材１は洗浄される。当該アルカンチオールは、末端にカルボキシル基を有する。当該アルカンチオールとしては、炭素数６〜１８の第１級アルカンチオールを好ましく使用できる。このようにして、基材１上に自己組織化膜２が形成される。
【００１６】
アルカンチオールの好ましい濃度はおよそ１〜１０ｍＭである。アルカンチオールを溶解する限り、溶媒は限定されない。好ましい溶媒の一例は、エタノール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド(ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ)）、およびジオキサン（ｄｉｏｘａｎｅ）である。好ましい浸漬時間はおよそ１２〜４８時間である。
【００１７】
次に、自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される。自己組織化膜２の上端に位置するカルボキシル基(-COOH)とアミノ酸３のアミノ基(-NH2)とが反応して、以下の化学式（Ｉ）によって表されるペプチド結合を形成する。
【００１８】
【化１】
0005149992.tif 000009
（式中、Ｒは前記一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
【００１９】
化学式（Ｉ）においては、１分子のアミノ酸３が自己組織化膜２と結合する。
【００２０】
アミノ酸３は、システイン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、アスパラギン、メチオニン、セリン、トリプトファン、ロイシン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、スレオニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびバリンからなる２０種類のアミノ酸から選択される。すなわち、化学式（Ｉ）において、Ｒはこれら２０種類のアミノ酸の側鎖である。
自己組織化膜２にアミノ酸３が供給される際に、２種類以上のアミノ酸が同時に供給さ
れ得る。すなわち、自己組織化膜２にアミノ酸３を含有する溶液が供給される際に、当該溶液は２種類以上のアミノ酸３を含有し得る。後述するストレプトアビジンのアミノ酸３への均一な結合を考慮すれば、当該溶液は１種類のみのアミノ酸を含有することが好ましい。
【００２１】
続いて、ストレプトアビジン４が供給される。ストレプトアビジン４の５’末端のアミノ基が、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。ストレプトアビジン４に含有されるリシンのアミノ基も、アミノ酸３のカルボキシル基と反応する。このようにして、以下の化学式（ＩＩ）中に示される２つのペプチド結合が形成され、センサを得る。
【００２２】
【化２】
0005149992.tif 000010
（式中、Ｒは前記１分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
【００２３】
１分子のストレプトアビジン４は、１つの５’末端のみを有する一方、１分子のストレプトアビジン４は、多数のリシン基を有する。従って、ほとんど全ての化学式（ＩＩ）は、詳細には、以下の化学式（ＩＩＩ）によって表される。
【００２４】
【化３】
0005149992.tif 000011
（式中、Ｒは一分子のアミノ酸の側鎖を示す。）
【００２５】
得られたセンサは、試料に含有される標的物質を検出または定量するために用いられる。
【００２６】
具体的には、当該標的物質を特異的に結合し得る抗体がセンサ上に供給され、ストレプトアビジン４に当該抗体を結合させる。すなわち、抗体はストレプトアビジン４に補足される。当該抗体は、ビオチンにより修飾されていることが好ましい。なぜなら、ストレプトアビジンは、ビオチンに対して高い親和性を有するからである。次に、試料をセンサに供給し、試料に含有される標的物質、すなわち抗原を、当該抗体に結合させる。
【００２７】
最後に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析法のような一般的な分析法を使用して、標的物質が検出または定量される。ＱＣＭ（水晶発振子マイクロバランス測定法：Quarts Crystal Microbalance）のような他の分析法も用いられ得る。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例および比較例は、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２９】
（比較例）
図３に示されるように、金表面上に形成された自己組織化されたアルカンチオールの上端に位置するカルボキシル基に、直接、ストレプトアビジンがアミドカップリング反応により結合され、ストレプトアビジンを固定した。手順及び結果が以下に記述される。
【００３０】
[試料溶液の調製]
１０ｍＭの最終濃度を有する１６−メルカプトヘキサデカン酸（16-Mercaptohexadecanoic acid）の試料溶液が調製された。溶媒はエタノールであった。
【００３１】
［自己組織化膜の形成］
基材１として、ガラス上に金が蒸着された金基板（ＧＥヘルスケア社製；ＢＲ−１００４−０５）が用いられた。当該基材１は、濃硫酸および３０％過酸化水素水を含有するピラニア溶液で１０分間洗浄した。さらに純水を用いて洗浄して乾燥した。当該ピラニア溶液を構成する濃硫酸と３０％過酸化水素水との体積比は３：１であった。
続いて、金基板は試料溶液中に１８時間浸漬され、金基板の表面に自己組織化膜を形成した。最後に、純水により基材１は洗浄され、乾燥された。
【００３２】
［ストレプトアビジンの固定］
自己組織化膜を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基にストレプトアビジンが結合され、ストレプトアビジンが固定された。
具体的には、０．１Ｍ  ＮＨＳ(N-Hydroxysuccinimide)および０．４Ｍ  ＥＤＣ(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)の３５μｌの混合液により、１６−メルカプトヘキサデカン酸の上端に位置するカルボキシル基が活性化された。その後、３５μｌのストレプトアビジン（２５０ｕｇ／ｍｌ）が５μｌ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基はストレプトアビジンのアミノ基にカップリングされた。
【００３３】
（実施例１）
自己組織化膜の形成とストレプトアビジンの固定との間に、一分子のアミノ酸としてグリシンが供給されたこと以外は、比較例と同様に、実験が行なわれた。手順及び結果は以下に記述される。
【００３４】
［アミノ酸（グリシン）の固定化］
自己組織化膜２を形成する１６−メルカプトヘキサデカン酸(16-Mercaptohexadecanoic
acid)の上端に位置するカルボキシル基にグリシンが結合され、グリシンを固定した。
具体的には、比較例と同様にカルボキシル基が活性化された後に、３５μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ８．９）が５μＬ／分の流速で添加された。このようにして、１６−メルカプトヘキサデカン酸のカルボキシル基がグリシンのアミノ基にカップリングされた。
【００３５】
［ストレプトアビジンの固定］
続いて、グリシンのカルボキシル基にストレプトアビジンが結合され、ストレプトアビジンを固定した。具体的には、上記と同様にグリシンのカルボキシル基が活性化された後に、３５μｌのストレプトアビジン（濃度：２５０μｇ／ｍｌ）が５μＬ／分の流速で添
加された。このようにして、グリシンのカルボキシル基は、ストレプトアビジンの５’末端のアミノ基またはストレプトアビジンに含有されるリシンのアミノ基にカップリングされた。
【００３６】
［固定量の比較］
SPR装置Biacore3000（GEヘルスケア社製）により、実施例１および比較例におけるストレプトアビジンの固定量が測定された。
本明細書において用いられる用語「固定量」とは、単位面積あたりに固定されたストレプトアビジンの量を意味する。
比較例で測定された固定量と実施例１で測定された固定量の比は、２５．６：１であった。
【００３７】
（実施例２〜２０）
グリシンに代え、それぞれ、スレオニン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、トロプトファン、システイン、ヒスチジン、アラニン、リシン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、およびチロシンが供給された。実施例１と同様に各固定量を測定した。これらのアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸である。表１は、測定された固定量を示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
当業者は以下のことを表１から理解するであろう。
２０種類のアミノ酸が用いられた場合、比較例と比較して固定量が増加する。さらに、用いられるアミノ酸に応じて、固定量は変化する。
【００４０】
リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタ
ミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、およびバリンが好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、５以上であるからである。
【００４１】
リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、ロイシン、およびトリプトファンがより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、１０以上であるからである。
【００４２】
リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、セリン、アスパラギン酸、およびアスパラギンがさらにより好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、平均値（１７．８％）よりも高いからである。
【００４３】
リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、グルタミン酸、チロシン、アラニン、およびセリンが最も好ましい。なぜなら、これらのアミノ酸のうち一のアミノ酸が供給された際には、測定された固定量はそれぞれ、２０以上であるからである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、単位面積あたりに固定されるストレプトアビジンの量を著しく増加させ得る。このことにより、バイオセンサの感度を向上させることが可能になる。当該バイオセンサは、臨床現場において患者由来の生体試料に含有される抗原または抗体の検出または定量を必要とする検査および診断に用いられ得る。
【符号の説明】
【００４５】
１：金基材
２：アルカンチオール
３：アミノ酸
４：ストレプトアビジン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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