(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルファチド及び／又は硫酸化プロテオグリカンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、
重鎖及び軽鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が、
重鎖
【化１】
0005354823.tif 000006
である、
上記モノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖及び軽鎖の可変領域内のフレームワーク領域の配列が、
重鎖
【化２】
0005354823.tif 000007
軽鎖
【化３】
0005354823.tif 000008
である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
定常領域の配列が、重鎖についてはヒトＩｇＧ１であり、軽鎖についてはＣκである、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３に記載のモノクローナル抗体のいずれかを含む、医薬組成物。
【請求項５】
薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３に記載のモノクローナル抗体のいずれかを含む、アテローム硬化性病変の診断において有用な試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜３に記載のモノクローナル抗体のいずれかを含む、アテローム性動脈硬化症の治療において有用な医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３に記載のモノクローナル抗体のいずれかを含む、イディオタイプワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルファチド及び硫酸化プロテオグリカンを特異的に、且つ高い親和性で認識する、新規なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）に関する。また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はこれらの抗体に由来する断片を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、本発明のＡｂ又はその断片を含む、心血管疾患の診断において有用な試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
３０年を超える、マウスＭＡｂを得るためのハイブリドーマ技術の開発（Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７、（１９７５））の後、これらが疾病の診断及び基礎研究において非常に有用であることは明らかにされているが、ヒトの治療法に登録されているものは、わずか２０のＡｂのみである（Ｐｈａｒｍａ  Ｖｉｔａｅ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｂｓ  Ｕｐｄａｔｅ、６〜３６３、２００８）。これは、主に、患者に注射された場合に、血液中におけるそれらの半減期が短いこと、並びに、これらのＡｂがマウス由来のものであるため、ヒトの免疫系による、及びさらに免疫応答による、マウスのエフェクター機能の認識が乏しいことに起因する（ヒト抗マウスＡｂの頭字語である、ＨＡＭＡ応答）。いくつかの研究によって、外因性の抗体を投与した後に、患者において生じる免疫応答が非常に強く、初期治療後の抗体の治療上の有用性を大幅に解消し得ることが示されている。さらに、Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １５：４２〜５２（１９９４）の報告によると、患者にマウスＭＡｂを投与した後、次に無関連のマウスＡｂを用いて治療することは、交差反応性のＨＡＭＡ応答に起因して、効果的でない可能性があるか、又はその上、危険であり得る。
【０００３】
上記の情報から、容易に且つ経済的に得られ、治療用製剤の製造及び他の用途に適した、ヒトにおいて免疫原性の低い治療的Ａｂの型を得ることが必要となる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．ら、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５〜９２（１９８９）。
【０００４】
マウス又はラットから得られるＡｂをヒト化し、それによって、ヒトに注射された場合のこれらの外因性タンパク質に対する異種応答を低減させるための、いくつかの方法が開発されている。免疫原性を低減させるための第１の試みの１つは、マウスタンパク質の可変ドメインがヒト分子の定常ドメインに付着している「キメラ」Ａｂを生成して、免疫原性の低減だけではなく、免疫エフェクター機能の活性化も達成することである。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）。これらのキメラ分子は、抗原の結合に関して元の抗体の特徴を維持しているが、その定常領域は免疫原性ではない（Ｅｓｔａｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｓ  ｑｕｉｍｅｒｉｃａｓ  ｍａｎｔｉｅｎｅｎ  ｌａｓ  ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃａｓ  ｄｅｌ  ａｎｔｉｃｕｅｒｐｏ  ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｅｎ  ｒｅｌａｃｉｏｎ  ｃｏｎ  ｌａ  ｕｎｉｏｎ  ａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｏ  ｙ  ｓｕ  ｒｅｇｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔｅ  ｎｏ  ｅｓ  ｉｎｍｕｎｏｇｅｎｉｃａ）。これらのキメラ分子は、抗原の結合に関して元の抗体の特徴を維持しているが、その定常領域は免疫原性ではない。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症及びその結果は、世界人口に対する大きな影響力を有し、先進国における（Ｍｅｌｉａｎ，Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５５：７７５、１９９９）、また数年前からはキューバにおける（ＯＭＳ、２００４、Ａｎｕａｒｉｏ  Ｅｓｔａｄｉｓｔｉｃｏ、ＭＩＮＳＡＰ、２００７）、罹患率及び死亡率の主な原因である。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症は、心筋及び脳の梗塞、壊疽、並びに手足の機能の喪失の病因の大きな一因となる、多因子性の慢性炎症性疾患である。Ｇｒｅａｖｅｓ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１８０〜１８１（２００１）；Ｒｏｓｓ，Ｒ．ら、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  １３８（５  Ｐｔ  ２）：Ｓ４１９〜２０（１９９９）。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の主な原因の１つは、高コレステロール血症である。動脈壁を通過している低分子量リポタンパク質（ＬＤＬ）は、プロテオグリカンとの相互作用によって、動脈内膜の細胞外マトリクス内に捕捉され、酸化修飾を受ける。動脈内膜のプロテオグリカンに結合しているリポタンパク質は、それらのアテローム形成能力を増大させる、酸化及び酵素加水分解などの、脂質部分及びタンパク質部分の両方における変化を、より受けやすい。ＡｐｏＢ−１００は、それを介してプロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖に結合し得る、複数の塩基性アミノ酸の存在を共通して有するいくつかの領域を含有する。Ｃａｍｅｊｏ，Ｇ．，Ｅ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３９：２０５〜２２、（１９９８）；Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｙ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｌｉｐｉｄｏｌ  １２：２８９〜９６（２００１）；Ｃａｍｅｊｏ，Ｇ．，Ｕ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ３：３〜９（２００２）。
【０００８】
グリコサミノグリカン上の負の電荷の密度は、ＬＤＬとの相互作用に影響し、これには、硫酸化の程度が、ＬＤＬとプロテオグリカンとの相互作用に影響する。Ｓａｍｂａｎｄａｍ  Ｔ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏａｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ、１１：５６１〜５６８（１９９１）。
【０００９】
さらに、酸化されたＬＤＬは、マクロファージによって、これらの細胞の表面上のスカベンジャー受容体を介して内在化されて、細胞内でのコレステロールの蓄積をもたらし、その後、泡沫細胞を形成させ得る。これらの事象は、単球／マクロファージ、肥満細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＮＫＴの関与を伴う、炎症性応答を開始するための主なステップに相当する。Ｃａｍｅｊｏ，Ｇ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３９（２）：２０５〜２２（１９９８）；Ｈｕｒｔ−Ｃａｍｅｊｏ，Ｅ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｃｌｉｎ  ４２  Ｓｕｐｐｌ  １：４３〜７３（２００１）；Ｓｋａｌｅｎ，Ｋ．，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：７５０〜７５４（２００２）。
【００１０】
マクロファージの表面上に存在するプロテオグリカンが、最終的には泡沫細胞の形成を生じさせる、酸化されたＬＤＬのこれらの細胞への結合、及びこれらの粒子の内在化又は組み込みに関与することを実証する、実験的証拠が存在する。Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３１：７４３〜７５２（１９９８）。
【００１１】
抗血栓剤及び脂質低減剤の使用と組み合わせて、より健康なライフスタイルを送ることが、心血管系の事象の発症リスクの低減に対する影響を有していることは確かであるが、これらの戦略は、依然として、これらのリスクを完全に解消するには不十分である。
【００１２】
上述したように、アテローム性動脈硬化症は、その発症において複数の抗原が重要である、多因子性の炎症性疾患であり、したがって、この疾患に対する、より優れた治療的影響を得ることを目的として、能動免疫療法及び受動免疫療法のための種々の戦略が開発されている。
【００１３】
これらの戦略の１つは、ＨＤＬ−コレステロールと心血管疾患との間の逆相関に起因する、ＨＤＬを増大させる治療法である。ＣＥＴＰは、ＨＤＬの代謝における鍵となる酵素であり、その活性が低減するとＨＤＬのレベルが増大するため、治療法の潜在的な標的であると考えられる。ＣＥＴＰに結合し、その機能を阻害し得るＡｂを誘発するワクチンを用いる戦略は、ＷＯ１９９７／０４１２２７及びＷＯ２００６／１３３１９６において記載されている。しかし、ＣＥＴＰ阻害剤であるトルセトラピブを用いる第ＩＩＩ相臨床試験の失敗を示す最近の研究によって、この戦略について疑問が投げかけられている。Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９、１１８：２５０６〜１４（２００８）；Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｐ、１１：７６〜８０（２００９）。
【００１４】
一部の著者は、アテローム硬化性プラークの形成を阻害するための、酸化されたＬＤＬを免疫原として用いたワクチンを記載している。Ｐａｌｉｎｓｋｉ  Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２１〜２５（１９９５）；Ａｍｅｌｉ  Ｓら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１６：１０７４〜７９（１９９６）；Ｆｒｅｉｇａｎｇ  Ｓ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：１９７２〜８２  ９（１９９８）；Ｚｈｏｕ  Ｘ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１：１０８〜１４（２００１）；Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．ら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １３８：１４７〜５２（１９９８）；Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎ  Ｇ．Ｎ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３：８７９〜８４（２００３）；ＵＳ２００８／００７０２６５Ａ１。
【００１５】
別の戦略は、アテローム硬化性病変の形成を予防し得るか又は低減させ得る免疫応答を誘発することを目的とした、酸化されたアポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩの特異的断片に基づいた予防用及び治療用ワクチンの開発である（ＷＯ２００１／０６４００８、ＷＯ２００３／０２０７６５、ＷＯ２００４／０８０３７５、及びＷＯ２００４／０８１０４５）。
【００１６】
記載されている別のワクチンアプローチは、Ｔ細胞のアルファ／ベータ受容体と相互作用するＡｂを誘発してアテローム硬化性病変の形成を予防するための、ＭＤＡ又は４−ＨＮＥなどのアルデヒドにコンジュゲートしたペプチドに基づくものである（ＷＯ２００１／０６８１１９）。
【００１７】
一部の著者は、アテローム硬化性プラークの発症を予防するための、アテローム性動脈硬化症における病原体に対するワクチンの重要性を唱えている（ＷＯ１９９８／０３３５１０、ＵＳ００６２９１４３７Ｂ１、ＵＳ６４７１９６５Ｂ１、ＵＳ００６８０８７１３  Ｂ１）。
【００１８】
食品コレステロールの摂取により生じるアテローム性動脈硬化症を遅らせるか、又はその重症度を低減させるための、別の提案された戦略は、ステロールに対するワクチンの使用である（ＵＳ２００２／００１８８０８Ａ１）。
【００１９】
治療的ツールとしての受動免疫療法はまた、アテローム性動脈硬化症において重要な役割を有し得る。Ａｐｏ  Ｂ１００の酸化された又は修飾された断片に対するヒトＡｂを用いることによる、アテローム性動脈硬化症を治療又は予防するための受動免疫化が、記載されている（ＵＳ００５１９６３２４ａ、ＵＳ２００７／００９８７２５Ａ１、ＵＳ２００８／００７５７１６Ａ１）。
【００２０】
さらに、ホスホリルコリンに対する特異的Ａｂでの受動免疫化が、アテローム性動脈硬化症を治療又は予防するための治療的組み合わせとして提案されている（ＵＳ２００７／０２８６８６８Ａ１、ＵＳ２００７／０１２２４１９Ａ１）。
【００２１】
記載されている別の戦略は、ヒトＭ−ＣＳＦに特異的に結合するＡｂ又は抗原結合断片の使用である（ＵＳ２００７３２６４１４Ｂ２）。
【００２２】
血管内皮への単球の接着を予防し、それによりこれらの細胞による内皮及び周辺組織への侵入を予防するＭＡｂの使用は、この疾患のための別の治療的アプローチである（ＵＳ００５５４１２９６Ａ）。
【００２３】
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の阻害剤として、ひいては血小板凝集の阻害剤としてのモノクローナルＡｂの使用が記載されている（ＷＯ１９９９／０５２５５１、ＵＳ００５９７６５３２Ａ）。
【００２４】
さらに、受動免疫療法において用いるために、ヒトモノクローナルＡｂが、ＣＩＩＩアポリポタンパク質の防御的ペプチドエピトープに対して得られた（ＷＯ２００４／０８１０４６）。
【００２５】
また、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の使用は、抗アテローム効果を有し得る。Ｕｄｉ  Ｎら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７：４４５〜４５２（２００８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
低用量で投与された場合にアテローム硬化性病変の形成を阻害する能力及びこれらの硫酸化分子に対する抗体応答を誘発する能力を有する、スルファチド及び硫酸化グリコサミノグリカンと反応するか又はマクロファージ及びアテローム硬化性病変を認識するキメラＭＡｂは、記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、硫酸化された、及び硫酸化プロテオグリカン又はそれらに由来する断片を認識するように特徴付けされたモノクローナルＡｂに関する。
【００２８】
本発明の抗スルファチドＡｂ及び抗硫酸化プロテオグリカンＡｂは、好ましくは、モノクローナルである。本発明の範囲内にはまた、本明細書において提供される抗スルファチドＡｂ及び抗硫酸化プロテオグリカンＡｂのＦａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、及びＦ（ａｂ’）２などのＡｂ断片が含まれる。これらのＡｂ断片は、酵素消化などの従来の手段によって生じさせることができるか、又は、組換え技術によって生産することができる。これらのＡｂ断片は、キメラであり得るか又はヒト化されていてよい。これらの断片は、本明細書において説明される診断的及び治療的目的に有用である。本発明はまた、実質的に純粋なＡｂ及び断片の実施形態を含む。
【００２９】
特定の実施形態において、本発明のＡｂは、重鎖及び軽鎖の可変領域の以下の配列によって特徴付けされる。
【００３０】
重鎖：
【化１】
0005354823.tif 000002
【００３１】
軽鎖：
【化２】
0005354823.tif 000003
【００３２】
さらに、本発明の抗体は、重鎖についてはヒトＩｇＧ１の定常領域を、且つ軽鎖についてはヒトＣκを含む。
【００３３】
本発明は、本発明の抗スルファチド抗体及び抗硫酸化プロテオグリカン抗体又はそれに由来する断片を含む、医薬組成物を含めた組成物を包含する。本明細書において用いられる場合、組成物は、スルファチド及び硫酸化プロテオグリカンに結合する１つ又は複数のＡｂを含む。
【００３４】
これらの組成物は、さらに、緩衝溶液又はアジュバントを含めた薬学的に許容できる賦形剤などの適切な担体を含み得、これらは技術水準において周知である。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖の可変領域配列を以下に示すＭＡｂを含む、医薬組成物に関する。
【００３６】
重鎖：
【化３】
0005354823.tif 000004
【００３７】
軽鎖：
【化４】
0005354823.tif 000005
【００３８】
第３の態様において、本発明は、本発明のＡｂ又はそれに由来する断片の１つを含む、アテローム硬化性病変の診断において有用な試薬キットに関する。より特徴的には、試薬のセットは、上記の重鎖及び軽鎖の可変領域の配列を有するＭＡｂを含む。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、心血管疾患、特にアテローム硬化性病変の形跡を示す心血管疾患を治療するための、本発明のＡｂの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】抗ＳＯ３キメラＭＡｂによるスルファチドの認識を示す図である。様々な濃度の抗ＳＯ３キメラＭＡｂ及びアイソタイプ対照キメラＭＡｂを、スルファチドで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに、メタノール内で４μｇ／ｍＬの濃度で添加した。反応性を、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトガンマ鎖抗血清で検出した。生成物の４０５ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーで定量した（＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図２】抗ＳＯ３キメラＭＡｂによるヘパリンの認識を示す図である。様々な濃度の抗ＳＯ３キメラＭＡｂ及びアイソタイプ対照キメラＭＡｂを、ヘパリンで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに、ＨＢＳＳ内で１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。反応性を、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトガンマ鎖抗血清で検出した。生成物の４０５ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーで定量した（＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図３】抗ＳＯ３キメラＭＡｂによるＪ７７４細胞系の認識を示す図である。細胞を、１０μｇ／ｍＬのビオチン化されたＡｂと共にインキュベートした。反応を、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗血清で顕在化させ、フローサイトメトリーによって分析した。
【図４】抗ＳＯ３キメラＭＡｂによるヒトのアテローム硬化性プラークの認識を示す図である。ホルマリン内に固定されパラフィン内に包埋された、ヒト大動脈の断片（４μｍ）を、ビオチン化された抗ＳＯ３キメラＡｂ及びアイソタイプ対照Ａｂと共にインキュベートした。反応を、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体で顕在化させた。抗ＳＯ３−ＭＡｂによって認識されるエピトープを、濃い茶色で示し、細胞の核を、ヘマトキシリンで対比染色した（４００×）。
【図５】抗ＳＯ３キメラＭＡｂで免疫化することにより誘発される、ヘパリンに対するＡｂ応答を示す図である。抗ＳＯ３キメラＭＡｂを用いる免疫化スキームの０日目及び４９日目にＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた血清試料を、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。各記号は、マウスの血清で得られた値である。ｐｌ及びｈｌは、それぞれ、免疫前及び過免疫である（＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーのＵ検定）。
【図６】ウサギのリポファンジンモデルにおけるアテローム硬化性病変の発症における、抗ＳＯ３キメラＭＡｂでの治療の効果を示す図である。異なる研究群の代表であるウサギ胸部大動脈の組織学的切片。（Ａ）群１、未治療動物、変化を伴わない、動脈の正常な構造を示す。（Ｂ）群２、リポファンジンで治療した動物、筋肉と弾性線維とコラーゲン線維との間での細胞外物質の蓄積、及び組織構造の歪みを伴う、動脈内膜の肥厚が観察される。（Ｃ及びＤ）群３、抗ＳＯ３キメラＭＡｂで免疫化し、後にリポファンジンを投与した動物、明らかな組織の損傷又は内膜の肥厚は観察されなかった。ヘマトキシリン−エオシン染色、１８０×。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
抗体という用語は、全体を通して、ＭＡｂを言い、より特徴的には、マウスＭＡｂ又はキメラＡｂを言う。
【００４２】
抗体の獲得：
全体を通して、本発明の抗スルファチドＭＡｂ及び抗硫酸化プロテオグリカンＭＡｂは、天然の又は合成の由来源から得られた糖脂質抽出物で免疫化されたマウスから、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）において最初に記載されたハイブリドーマ法によって得ることができる。免疫化されたマウスから得られる脾臓細胞を、骨髄腫細胞Ｐ３．Ｘ６３Ａｇ８  ６．５．３と融合し、記載された選択培地において培養し、ＥＬＩＳＡによる培養物の上清における免疫グロブリンの検出によって生産クローンを選択する。
【００４３】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有するＡｂを生産するハイブリドーマ細胞を同定した後、Ａｂ生産クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングすることができ、細胞培養物を成長させる標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｂｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的に適した培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、腹水腫瘍の形で、動物においてインビボで成長させることができる。
【００４４】
サブクローンによって分泌されるＭＡｂを、免疫グロブリンを精製するための従来の手順、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーによって、培養培地、腹水、又は血清から適切に分離する。
【００４５】
本発明のＡｂはまた、マウスの免疫グロブリン遺伝子を適正に操作する遺伝子操作技術によって得ることができる。例えば、本発明のキメラＡｂは、技術水準において記載されているもの、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（２００３））；ｌａ  ｓｅｒｉｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｉｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ、及びＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編（１９８８）ＡＢＳ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｙ  Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））において記載されているものの中でも、増幅、クローニング、遺伝子配列決定、及び消化などの、遺伝子を操作するための従来の技術によって、マウスモノクローナルＡｂを生産する細胞から精製されるＲＮＡから得ることができる。
【００４６】
Ａｂの可変領域のｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ連鎖反応の頭字語）は、マウスＡｂをコードするＲＮＡから実施することができ、ｃＤＮＡを合成し、ＶＫ及びＶＨの可変領域をＰＣＲによって増幅し、これは、技術水準における目的のために記載された従来の技術に従って行うことができる。
【００４７】
重鎖及び軽鎖のそれぞれについてのＰＣＲ産物を、それぞれ、遺伝子配列決定に用いるベクター内にクローニングする。得られたクローンを、この目的のために記載された方法のいずれかを用いて、例えば、製造者の仕様書に従ってＴ７  ＤＮＡポリメラーゼを用いるジデオキシヌクレオチド法を用いて、配列決定する。
【００４８】
重鎖の可変領域ＶＨ及び軽鎖の可変領域ＶＫの遺伝子を、中間構築物の酵素制限によって得、キメラ遺伝子を構築するための従来の技術に従って、それぞれの発現ベクター内にクローニングする。このような目的のためには、組換えタンパク質、特にＭＡｂの効率的な発現のために記載されたいずれのベクターも有用である。
【００４９】
キメラＡｂの発現のために、ＮＳ０細胞を用いることができ、これに、Ａｂ遺伝子を含有するそれぞれの発現ベクター内のＤＮＡ構築物をエレクトロポレーションする。これらの細胞を選択培地内で成長させる。免疫グロブリン生産クローンの検出を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いる、培養物の上清における測定によって実施する。
【００５０】
所望の特異性及び機能を有するＡｂの選択：
特定の実施形態において、本発明のＡｂは、技術水準における、この目的のために記載された様々な技術によって、例えばＥＬＩＳＡによって検出することができる。
【００５１】
本発明の特定の実施形態において、生産されるＡｂの生物学的活性が分析される。いくつかの実施形態において、本発明のＡｂを、それらの抗原結合活性について試験する。
【００５２】
特殊性で知られており、且つ本明細書において用いられ得る、抗原結合アッセイには、とりわけ、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、二重抗体免疫アッセイ（サンドイッチ）、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫アッセイ、及びタンパク質Ａ免疫アッセイなどの技術を用いる、直接的結合アッセイ又は競合的結合アッセイが含まれる。抗原結合についての例示的なアッセイは、実施例の節において、後に含まれる。
【００５３】
さらに、本発明において、ヒト大動脈組織切片におけるアテローム硬化性プラークを認識し得るＡｂを生産するクローンを同定することができ、これは、技術水準における、記載されている従来の免疫組織化学的技術を用いて行うことができる。
【００５４】
別の態様において、本発明のＡｂによる、マウスにおける抗ヘパリン応答を誘発する能力を測定することができる。このためには、異なる群の動物を本発明のＡｂで免疫化し、これらの動物の血清試料を、抗ヘパリンＡｂの存在について試験する。
【００５５】
さらなる態様において、本発明のＡｂの抗アテローム硬化性効果を測定することができ、このために、リポファンジンを用いる、ウサギにおけるアテローム硬化性病変の誘発モデルを用いることができる。（Ｔａｋａｃｓ  Ｅ、Ｈａｒｓｉｎｇ  Ｊ、Ｆｕｚｅｓｉ  Ｓ、Ｊｅｌｌｉｎｅｋ  Ｈ．１９８６、「リポファンジンの投与後のウサギにおけるアテローム性動脈硬化症の発症（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．）」、Ｍｏｒｐｈｏｌ  Ｉｇａｚｓａｇｕｇｙｉ  Ｏｒｖ  Ｓｚ．２６：９９〜１０５；Ｎｏａ  Ｍ及びＭａｓ  Ｒ（１９９２）．「アテロミクソルと、リポファンジンを用いて誘発されるウサギにおけるアテローム硬化性病変（Ａｔｅｒｏｍｉｘｏｌ  ｙ  ｌｅｓｉｏｎ  ａｔｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃａ  ｅｎ  ｃｏｎｅｊｏｓ  ｉｎｄｕｃｉｄａ  ｐｏｒ  ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ．）」、Ｐｒｏｇｒｅｓｏｓ  ｅｎ  Ｃｉｅｎｃｉａｓ  Ｍｅｄｉｃａｓ、６：１４〜１９）。
【００５６】
医薬組成物：
１つの実施形態において、本発明は、１つ又は複数の本発明のＡｂを含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、抗体を含む組成物はさらに、薬学的に許容できる賦形剤を含む。
【００５７】
１つの態様において、本発明は、１つ又は複数の本発明のＡｂを含み、且つさらに緩衝溶液を含み得る、試薬キットを提供する。１つの実施形態において、溶液緩衝液は薬学的に許容できるものである。１つの実施形態において、Ａｂを含む組成物はまた、担体分子を含み、この担体分子は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容できるものである。１つの実施形態において、試薬キットはまた、組成物の投与又は使用（例えば、対象へのＡｂ）のための指示を含む。
【００５８】
本発明のＡｂを含む医薬組成物は、それらの保存のために、所望の程度の純度を有するＡｂと担体分子、場合による賦形剤、又は生理学的に許容できる安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版（２０００））とを混合することによって、水性溶液、凍結乾燥物、又は他の凍結乾燥された製剤の形態で調製される。許容できる媒体、賦形剤、又は安定剤は、採用される全ての用量及び濃度でレシピエントにとって無毒である。
【００５９】
本発明のＭＡｂは、意図された目的のために効果的な量で組み合わされて、医薬組成物内に存在する。
【００６０】
インビボで投与するための製剤は、無菌でなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を介した濾過によって達成される。
【００６１】
１つの態様において、本発明は、心血管疾患などの障害の治療的及び／又は予防的治療のための薬剤の調製における本発明のＡｂの使い方を示す。
【００６２】
本発明のＡｂは、アテローム硬化性病変を治療するため、阻害するため、進行を遅らせるため、発病を予防する／遅らせるため、１つ又は複数の抗原性分子の発現及び／又は活性に関連する疾患、障害、又はプロセスを改善又は予防するために用いることができる。
【００６３】
本発明に従うと、これらのＡｂの治療的用量は、１投与当たり１０マイクログラムから１０ｍｇの間にわたり、好ましくは１投与当たり１００マイクログラムから１ｍｇの間にわたる。
【００６４】
本発明のＭＡｂ（単数又は複数）は、非経口経路、皮下経路、腹腔内経路、肺内経路、及び鼻腔内経路を含む、且つ、局所的治療のために所望により病変内経路を含む、あらゆる適切な手段によって投与される。
【００６５】
別の態様において、本発明は、心血管疾患などの障害を診断するための試薬キットを提供する。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を例示することを意図したものである。
【００６７】
以下の実施例において、用いられる全ての制限酵素又は修飾酵素並びに試薬及び材料は、別段の特定がない限り、市販の由来源から得た。
【００６８】
（例１）
抗ＳＯ３キメラＭＡｂによるウシ脳スルファチドの認識
ＥＬＩＳＡを用いて、ＰｏｌｙＳｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃを、メタノール内で４μｇ／ｍＬの濃度の、５０μＬ／ウェルのウシ脳スルファチド溶液で被覆し、溶媒を、３７℃で９０分間にわたりインキュベートすることによって蒸発させた。次に、プレートを、１％ウシ血清アルブミン（ＳＡＢ）を含有する２００μＬ／ウェルのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、室温で１時間にわたりブロックした。その後、ＰＢＳ内で異なる濃度の、５０μＬ／ウェルの抗ＳＯ３キメラ抗体を添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで洗浄し、５０μＬ／ウェルの、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトガンマ鎖抗血清を添加した。プレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートした後、それを再び洗浄し、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）内の１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスフェートからなる、１００μＬ／ウェルの基質溶液を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、反応生成物の吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍで測定した。
【００６９】
陰性対照として、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体の９８位で重鎖の可変領域のＲをＳで置き換えることによって改変されたキメラＭＡｂを用いた。図１は、異なるキメラＭＡｂのスルファチドに対する反応性を示す。グラフは、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体が、わずか０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度でもスルファチドを認識することを示す。逆に、９８位で改変されたキメラＭＡｂはいずれの反応性も示さない。
【００７０】
（例２）
ヘパリン認識試験
次に、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体が、スルファチドよりも複雑な硫酸化分子を認識するかどうかを評価した。この研究のために、硫酸化グリコサミノグリカンのモデルとして用いられる、高度に硫酸化された分子であるヘパリンを選択した。
【００７１】
抗ヘパリン反応性のためのアッセイは、わずかに変更した、Ｓｋａｌｅｎ，Ｋ．Ｍ．ら（Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：７５０〜７５４、２００２）により開発された、ビグリカンのためのＥＬＩＳＡ技術に基づいて行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）内で１０μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）のヘパリン（Ｓｉｇｍａ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＨＢＳＳで３回洗浄し、次に、１％ＳＡＢを含有するＨＢＳＳ（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ）で、室温で１時間にわたりブロックした。プレートを０．０２％のＨＢＳＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＨＢＳＳ−Ｔ）で３回洗浄し、室温で１時間の間、結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）内で４０μｇ／ｍＬの初期濃度から、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体の連続希釈物を添加した。陰性対照として、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体の９８位で重鎖の可変領域のＲをＳで置き換えることによって改変されたキメラＡｂを用いた。プレートをＨＢＳＳ−Ｔで２回洗浄し、次に、０．１％ＳＡＢを含有するＨＢＳＳ−Ｔ内で、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトガンマ鎖抗血清と共に、室温で１時間にわたりインキュベートした。所要の洗浄を行い、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）内に溶解した基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートを用いて、反応物を発色させた。生成物の４０５ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｃａ、Ａｕｓｔｒｉａ）で定量した。
【００７２】
図２に示すように、抗ＳＯ３キメラモノクローナル抗体は、ヘパリンに対する高い反応性を有していた。逆に、アイソタイプ対照として用いた改変されたキメラＡｂは、研究した濃度のいずれにおいても反応性を示さなかった。
【００７３】
（例３）
フローサイトメトリーによるＪ７７４細胞系の認識
単球及びマクロファージは、アテローム性動脈硬化症などの炎症性プロセスにおいて重要である（Ｏｓｔｅｒｕｄ  Ｂ  Ｂｊｏｒｋｌｉｄ  Ｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ８３：１０６９〜１１１２、２００３）。これらの細胞はプロテオグリカンを合成し、マクロファージによる、酸化されたＬＤＬを泡沫細胞の形成に組み込むための手段のいくつかが、細胞膜のプロテオグリカンを伴うことが示されている（Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  Ｂら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３１：７４３〜７５２、１９９８）。
【００７４】
抗ＳＯ３キメラＡｂがマクロファージを認識し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、８％ウシ胎児不活化血清（ＳＦＴ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）において培養したマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４を用いて、フローサイトメトリー実験を実施した。
【００７５】
細胞（１試験管当たり０．５×１０６個）を、２０μＬ／試験管の不活化ウサギ血清と共に３７℃で１０分間にわたりインキュベートして、Ｆｃガンマ受容体をブロックした。その後、氷浴内で３０分間にわたり、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）内で１０μｇ／ｍＬで、共にビオチン化された抗ＳＯ３キメラＭＡｂ及びアイソタイプ対照である改変されたキメラＡｂを添加した。細胞を洗浄した後、これらを、１／２００希釈のストレプトアビジン−フルオレセインイソチオシアネート複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に、氷浴内で３０分間にわたりインキュベートした。細胞を洗浄し、１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ内に再懸濁し、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。
【００７６】
図３に示すように、アイソタイプ対照として用いたキメラＡｂは、細胞系Ｊ７７４を認識しなかった。逆に、抗ＳＯ３キメラＡｂは、細胞の９３．７％を認識した。
【００７７】
（例４）
ヒト大動脈におけるアテローム硬化性プラークの認識
抗ＳＯ３キメラＡｂの認識の免疫組織化学的決定を、ホルマリン内に固定しパラフィン内に包埋したヒト大動脈の断片で実施した。４μｍの組織切片を用い、それをシラン処理したスライド上に載せ、６８℃で１２時間にわたりインキュベートした。組織切片をキシロール内で脱パラフィンし、濃度を低減させていったエタノール内で水和させた。次に、それを蒸留水内で５分間にわたり洗浄し、ＰＢＳ内で洗浄した。１００℃の温度に設定した恒温槽を用いて、抗原の賦活化を行った。シトレート緩衝液（ｐＨ６．０）内に浸したプレートを槽内に３０分間にわたり維持し、次に、電子レンジを用いて、シトレート緩衝液（ｐＨ６．８）内で１０分間にわたり沸騰した。スライスを２０分間にわたり放置して冷却し、次に、蒸留水及びＰＢＳで洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを、３％Ｈ２Ｏ２溶液で、室温で１０分間にわたり阻害し、ＰＢＳで洗浄し、ビオチン化された抗ＳＯ３キメラＡｂ及びアイソタイプ対照Ａｂを、５０μｇ／ｍＬの濃度で、室温で３０分間にわたり添加した。後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Ａｎａｃｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を同一の時点及び温度で添加した。最後に、組織切片を、１ｍＬの基質緩衝液内の３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の新鮮な混合物溶液と共に、３から５分間にわたりインキュベートした。対比実験を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンを用いて実施し、試料を、増大させていったアルコール濃度内で脱水し、キシロール内で透徹し、最後に、永久的な媒質プレートであるＥｕｋｉｔｔ（Ｋｉｎｄｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．）内に載せた。白色光のマイクロスコープ（Ｌｅｉｃａ）を用いて評価を行った。
【００７８】
図４は、抗ＳＯ３キメラＡｂが、大動脈内に存在するアテローム硬化性病変の試料といかに強く反応したかを示す。脂質を有するマクロファージ又は泡沫細胞との反応性、及び病変の脂質コアとの反応性が観察された（反応性は、濃い茶色で示されている）。この図は、アイソタイプ対照として用いたＡｂがいかにヒト大動脈切片を認識しなかったかを示す。
【００７９】
（例５）
抗ＳＯ３キメラＡｂによるマウスにおける抗ヘパリン応答を誘発する能力
ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いた。これらに、２００μＬ内の５０μｇの抗ＳＯ３キメラＡｂを皮下投与した。免疫化は、全４回の投薬を完了するまで、１４日ごとに行った。抗ＳＯ３キメラＡｂは、アジュバント又は担体タンパク質を伴わずに投与した。血清試料を０日目及び４９日目（４回目の投薬の７日後）に採取した。
【００８０】
免疫化した動物の血清における抗ヘパリンＡｂの存在を、ヘパリン（１０μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）で被覆したＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いる、例２において記載したＥＬＩＳＡ技術を用いて測定した。マウスの血清を、結合緩衝液内での１／１００希釈、１００μＬ／ウェルで試験した。二次抗体として、アルカリホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清及びＩｇＭ抗血清を用いた。
【００８１】
図５は、０日目及び４９日目に採取したマウス血清でのアッセイの結果を示す。いずれの動物においても、免疫前血清（０日目）においては抗ヘパリンＡｂの存在は検出されなかった。逆に、マウスを抗ＳＯ３キメラＡｂで免疫化した後、これらの血清Ａｂの存在は検出された。この結果は、抗ＳＯ３キメラＡｂが、ヘパリンを強力に認識するだけではなく、この分子に対する応答を誘発する驚くべき能力（ワクチン効果）を有することを示す。
【００８２】
（例６）
抗ＳＯ３キメラＡｂの抗アテローム硬化性の効果
抗ＳＯ３キメラＡｂがインビボで生物学的効果をもたらし得るかどうかを評価するために、本発明者らは、以前に記載されている、リポファンジンを用いる、ウサギにおけるアテローム硬化性病変の誘発モデルを用いた（Ｔａｋａｃｓ  Ｅら、Ｍｏｒｐｈｏｌ  Ｉｇａｚｓａｇｕｇｙｉ  Ｏｒｖ  Ｓｚ．２６：９９〜１０５、１９９８；Ｎｏａ  Ｍ＆Ｒ．Ｍｏｒｅ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６：１４〜１９、１９９２）。
【００８３】
各５頭からなる３つの群に分けられた１５頭のニュージーランドウサギを用いた。群１には治療は行わなかった（陰性対照）。群２には、８日間にわたり毎日、１ｋｇ当たり２ｍＬの２０％リポファンジン（Ｂｒａｕｎ）を静脈内投与した。群３には、ＰＢＳ内の１００μｇの抗ＳＯ３キメラＡｂを、７日間の間隔で３回皮下投薬し、最後の免疫化の日に、群２の動物において用いたものと同一のスキームで、リポファンジンの毎日の投与を開始した。全てのウサギを、リポファンジンを最後に投薬した１日後に麻酔下で屠殺し、群１の陰性対照動物を、同一の日に屠殺した。大動脈を動物から採取し、巨視的及び微視的なアテローム硬化性病変の存在を決定するための病理学的研究を行った。
【００８４】
治療を行わなかった群１のウサギの大動脈は、肉眼的な病変を示さなかった。１ｋｇ当たり２ｍＬのリポファンジンを８日間にわたり投与した群２のウサギから得られた全ての大動脈において、肉眼的な病変が観察された。予め抗ＳＯ３キメラＡｂを３回投薬し、次にリポファンジンを投与したウサギの大動脈においては、巨視的な病変はなかった。
【００８５】
微視的な病変の研究のために、大動脈の断片をホルマリン内で固定し、パラフィン内に包埋した。４μｍの組織切片を用い、シラン処理したスライド上に載せ、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。白色光のマイクロスコープ（Ｌｅｉｃａ）を用いて評価を行った。
【００８６】
治療を行わなかったウサギの大動脈の組織切片を評価すると、図６に示すように、全てが、変化を伴わない、動脈の正常な構造を示した。リポファンジンを投与した群の全てのウサギから得られた大動脈切片において、筋肉と弾性線維とコラーゲン線維との間での細胞外物質の蓄積、及び組織構造の歪みを伴う、内膜の肥厚の存在という、特徴的な病変が観察された。逆に、抗ＳＯ３キメラＡｂを３回投薬し、次にリポファンジンを投与した３頭のウサギから得られた試料においては、微視的な病変は観察されなかった。残りの２頭のウサギの組織から得られた試料においては変化が観察され、変化は、線維間での細胞外物質の蓄積を伴う、動脈壁のいくつかの区域におけるいくつかの個別の肥厚にあった。内膜の肥厚はなかった。
【図１】
0005354823.tif 000009
【図２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0005354823.tif 000015
【図３】
0005354823.tif 000016
【図４】
0005354823.tif 000017
【配列表】
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