(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光部位と、アミン類反応部位と、フッ素性部位とを有する蛍光誘導体化試薬において、前記蛍光誘導体化試薬が一般式 [I]：
【化１】
0005130540.tif 000020
（式中、Ｒｆは炭素原子数４ないし１０個の直鎖状もしくは分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を意味し、ｎは０または１ないし６の整数を意味する）
または一般式 [II]：
【化２】
0005130540.tif 000021
（式中、Ｒ１は炭素原子数１ないし１０個の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基またはアルコキシ基を意味し、Ｒｆおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表される多環化合物であることを特徴とする蛍光誘導体化試薬。
【請求項２】
請求項１に記載する蛍光誘導体化試薬において、前記蛍光誘導体化試薬が、
化学構造式［Iａ］：
【化３】
0005130540.tif 000022
で表されるF-trap ピレンまたは
化学構造式［IIａ］：
【化４】
0005130540.tif 000023
で表されるF-trap クマリンであることを特徴とする蛍光誘導体化試薬。
【請求項３】
一般式 [I]：
【化５】
0005130540.tif 000024
（式中、Ｒｆは炭素原子数４ないし１０個の直鎖状もしくは分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を意味し、ｎは０または１ないし６の整数を意味する）または一般式［II］：    
【化６】
0005130540.tif 000025
（式中、Ｒ１は炭素原子数１ないし１０個の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基またはアルコキシ基を意味し、Ｒｆならびにｎは前記と同じ意味を有する）で表される蛍光誘導体化試薬をアミン類またはアミノ酸関連物質と反応させて、反応式［Iｂ］：    
【化７】
0005130540.tif 000026
（式中、Ｒ２は炭素原子数１ないし２０個の直鎖状もしくは分岐状アルキル基を意味し、Ｒｆならびにｎは前記と同じ意味を有する）または反応式［IIｂ］：    
【化８】
0005130540.tif 000027
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒｆならびにｎは前記と同じ意味を有する）に従って誘導体化することを特徴とする蛍光誘導体化方法。
【請求項４】
請求項３に記載の蛍光誘導体化方法において、前記蛍光誘導体化試薬が、一般式［IIａ］：    
【化９】
0005130540.tif 000028
で表されるF-trap ピレンまたは  一般式［IIａ］：
【化１０】
0005130540.tif 000029
で表されるF-trap クマリンであることを特徴とする蛍光誘導体化方法。
【請求項５】
請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の蛍光誘導体化試薬または請求項３もしくは４に記載の誘導体化方法を用いて、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を誘導体化して分離測定することを特徴とする試料中のアミン類やアミノ酸関連物質の測定方法。
【請求項６】
請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の蛍光誘導体化試薬または請求項３もしくは４に記載の誘導体化方法を用いて、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を誘導体化したときに過剰に残存する未反応試薬を親フッ素性吸着剤により選択的に除去することを特徴とする除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、蛍光誘導体化試薬および蛍光誘導体化方法に関し、更に詳細には、フルオラスタグを有する蛍光誘導体化試薬、それを用いた蛍光誘導体化方法および試料中のアミン類もしくはアミノ酸関連物質の分離測定方法ならびに残存未反応試薬の除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中には、アミン類ならびにアミノ酸関連物質を含む数多くの生体成分が含まれている。生体試料中に極微量含まれる生体成分の分析においては、微量の試料を用いて高感度にかつ高精度に分析することが要求されている。そのため、様々な分析機器ならびに分析方法が採用されているが、そのなかでも高速液体クロマトグラフィー （HPLC) は、近年、多成分を同時に測定することができる有用な分離・分析方法の一つとして、医療、食品、環境などの多様な分野で幅広く使用されている。 HPLC による検出は、分析対象物質の物理的ならびに化学的性質に基づいていて、吸光度、示差屈折率、電気化学、質量分析、蛍光、化学発光などの各検出器などが用いられている。これらの検出法は、測定する試料の種類や状態、分析対象物質の化学的性質や濃度などにより適宜選択するのがよい。しかし、これら検出法は、測定対象物質が各測定器に対して強い応答を示す場合には、測定は可能であるが、測定に十分な応答を示さない場合とか、全く応答を示さない場合には、そのままでは測定は不可能である。
【０００３】
これら検出法に対して、分析対象物質の応答が不充分な場合とか、応答しない場合には、かかる分析対象物質が測定できるように、化学反応などにより検出器に対して強い応答を示す物質へ変換して、例えば、蛍光を発するように蛍光誘導体に変換する必要がある。このように蛍光誘導体に変換することが、いわゆる蛍光誘導体化（ラベル化または標識）と呼ばれていて、またそれに使用する試薬は誘導体化（ラベル化）試薬と呼ばれている。このような誘導体化は、特に、複雑なマトリックスからなる試料中に存在する微量の目的成分である分析対象物質を分析するために極めて有用な手法である。
【０００４】
近年、この誘導体化法および誘導体化試薬の開発が進み、一部では日常的に用いられつつある。この中でも、蛍光誘導体化が、その高感度性ならびに高選択性などの理由から汎用されていて、蛍光法が誘導体化の主流となっている。この蛍光検出法は、特定波長の光（励起光）を照射し、それを吸収した目的成分より発する蛍光を検出する方法である。その光エネルギーを蛍光として発する蛍光物質はごく一部であるので、この蛍光検出法は他の検出法に比べて選択性が高く、高感度であるといえる。
【０００５】
また、このような蛍光誘導体化試薬のほとんどは、同一分子内に、目的物質を標識するための反応部位と蛍光発生に関与する蛍光部位とが共存している。かかる蛍光部位を構成する多くの蛍光団が開発されている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、従来の蛍光誘導体化法および蛍光誘導体化試薬はそれぞれ一長一短があり、更に高感度でかつ高選択性の蛍光誘導体化法ならびに蛍光誘導体化試薬の開発が要請されている。
【０００６】
そこで、それらの問題点を解決するために、無蛍光性試薬を使用する新しい発蛍光誘導体化法の開発や、特殊な蛍光現象、例えば、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動、エキシマー蛍光などを導入した誘導体化法の開発が試みられている。このうち、エキシマー蛍光誘導体化法は、ピレンなどの多環芳香族蛍光分子が互いに近接して、励起光を吸収して励起状態となった分子同士が会合して形成した励起２量体（エキシマー）が発光するエキシマー蛍光現象を誘導体化に導入した蛍光誘導体化法である。このエキシマ
ー蛍光誘導体化法は、従来の誘導体化法では困難であった対象物質１分子当たり１個の発光団が導入された誘導体と複数個導入された誘導体とを分光的に識別することができる（非特許文献４）。
【０００７】
しかし、これまで報告されている蛍光誘導体化試薬のほとんどは、過剰に残存した未反応の試薬自身からも蛍光が発せられるため、目的成分の検出が妨害されるという問題点があった。また、試薬自身は無蛍光性でアミン誘導体のみが蛍光を発する発蛍光誘導体化試薬も市販されているが、蛍光団が持つ特殊な発光機構を利用するため、使用できる蛍光団の種類に制限があり、実用上必ずしも満足できるものばかりではなかった。
【非特許文献１】Ohkura, Y., et al., J. Chromatogr. B, 659,85-107 (1994)
【非特許文献２】Yamaguchi, M., et al., "Reagentsfor FluorescenceDetection", ed. by Toyooka, T/,John Wiley and Sons Ltd., New York, 1999,pp. 99-166
【非特許文献３】Fukushima, K., et al., J. Pharm. Biomed. Anal.,30,1655-1687 (2003)
【非特許文献４】吉田秀幸、YAKUGAKU ZASSHI 123(8) 691-696 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明者らは、特にアミン類ならびにアミノ酸関連物質を特異的に分析できかつクロマトグラム上に未反応の試薬ピークが現れない蛍光誘導体化試薬ならびに蛍光誘導体化法を鋭意研究した結果、クロマトグラム上に試薬ピークが検出されないF−trap
という新しい概念に基づく蛍光誘導体化法を見出して、この発明を完成した。
さらに、本発明者らは、このF−trap という新概念に基づいてアミン用の誘導体化試薬としてF−trap 誘導体を合成して、このF−trap 誘導体が HPLC を妨害しないことを確認した。
【０００９】
したがって、この発明は、蛍光部位と、アミン類反応部位と、フルオラスタグと呼ばれるフッ素性部位を有する蛍光誘導体化試薬を提供することを目的としている。
なお、ここで使用する用語「フルオラス (fluorous)」とは、「親フルオロカーボン性の」という意味の造語であって、「フルオラスタグ」は、分子中にフッ素結合を豊富に含む領域を持つ標識部分を意味している。
【００１０】
この発明の好ましい態様は、一般式 [I]：
【００１１】
【化１１】
0005130540.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒｆは炭素原子数４ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を意味し、ｎは０または１ないし６の整数を意味する）
または一般式 [II]：
【００１３】
【化１２】
0005130540.tif 000003
（式中、Ｒ１は炭素原子数１ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のアルキル基またはアルコキシ基を意味し、Ｒｆおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表される多環化合物である蛍光誘導体化試薬を提供することを目的としている。
【００１４】
この発明のさらに好ましい態様は、化学構造式［Iａ］：
【００１５】
【化１３】
0005130540.tif 000004
で表されるF-trap ピレンまたは化学構造式［IIａ］：
【００１６】
【化１４】
0005130540.tif 000005
で表されるF-trap クマリンであることからなる蛍光誘導体化試薬を提供することを目的としている。
【００１７】
また、この発明は、別の形態として、上記蛍光誘導体化試薬 [I] 、[II] 、[Iａ] または [IIａ] を使用して、アミン類もしくはアミノ酸関連物質の誘導体化方法、またはアミン類もしくはアミノ酸関連物質を分離測定することからなるアミン類もしくはアミノ酸関連物質の測定方法を提供することを目的としている。
【００１８】
さらに、この発明は、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を蛍光誘導体化試薬または誘導体化方法を用いて誘導体化したとき、過剰に残存する未反応試薬を親フッ素性吸着剤により選択的に除去することからなる除去方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成するために、この発明は、蛍光部位と、アミン類反応部位と、フルオラスタグと呼ばれるフッ素性部位を有する蛍光誘導体化試薬を提供する。
【００２０】
この発明は、その好ましい態様として、一般式 [I]：
【００２１】
【化１５】
0005130540.tif 000006
（式中、Ｒｆは炭素原子数４ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を意味し、ｎは０または１ないし６の整数を意味する）
または一般式［II］：
【００２２】
【化１６】
0005130540.tif 000007
（式中、Ｒ１は炭素原子数１ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のアルキル基またはアルコキシ基を意味し、Ｒｆおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表される多環化合物である蛍光誘導体化試薬を提供する。
【００２３】
この発明は、そのさらに好ましい態様として、化学構造式［Iａ］：
【００２４】
【化１７】
0005130540.tif 000008
で表されるF-trap ピレンまたは化学構造式［IIa］：
【００２５】
【化１８】
0005130540.tif 000009
で表されるF-trap クマリンであることからなる蛍光誘導体化試薬を提供する。
【００２６】
また、この発明は、別の形態として、上記蛍光誘導体化試薬を使用して、アミン類またはアミノ酸関連物質を分離測定することからなるアミン類またはアミノ酸関連物質の測定方法を提供することを目的としている。
【００２７】
さらに、この発明は、更に別の形態として、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を蛍光誘導体化試薬または誘導体化方法を用いて誘導体化したとき、過剰に残存する未反応試薬を親フッ素性吸着剤により選択的に除去する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２８】
この発明に係る蛍光誘導体化試薬ならびに蛍光誘導体化方法は、生理活性アミン類、アミノ酸、ペプチド類などの試料中に含まれているアミン類やアミノ酸関連物質を、試料中に残存する蛍光誘導体化試薬と未反応の妨害を受けることなく高感度かつ網羅的に分離・検出することができるという大きな効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
この発明に係る蛍光誘導体化試薬は、蛍光部位と、アミン類反応部位と、フルオラスタグであるフッ素性部位とから構成されている。
【００３０】
具体的には、この発明の蛍光誘導体化試薬は、
一般式 [I]：
【００３１】
【化１９】
0005130540.tif 000010
（式中、Ｒｆは炭素原子数４ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のフッ素原子で完全にもしくは部分的に置換されたフルオラスアルキル基を意味し、ｎは０または１ないし６の整数を意味する）
または一般式［II］：
【００３２】
【化２０】
0005130540.tif 000011
（式中、Ｒ１は炭素原子数１ないし１０個の直鎖状もしくか分岐状のアルキル基またはアルコキシ基を意味し、Ｒｆおよびｎは前記と同じ意味を有する）
で表される多環化合物である。
【００３３】
更に具体的には、この発明の蛍光誘導体化試薬は、化学構造式［Iａ］：
【００３４】
【化２１】
0005130540.tif 000012
で表されるF-trap ピレンまたは化学構造式［IIa］：
【００３５】
【化２２】
0005130540.tif 000013
で表されるF-trap クマリンである。
【００３６】
この発明に係る誘導体化試薬［Iａ］および［IIａ］は、例えば、１−ピレン酪酸または７−メトキシクマリン−４−酢酸を、４−（3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10−ヘプタデカフルオロデシルチオ）フェノールと、N，N’-ジイソプロピルカルボジイミドとN，N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）を用いて、テトラヒドロフランなどの溶媒の存在下で、室温などの条件下において合成することができる。
【００３７】
また、この発明に係る蛍光誘導体化方法は、この発明の蛍光誘導体化試薬が、例えば、下記化学反応式 [Ib]：
【００３８】
【化２３】
0005130540.tif 000014
（式中、Ｒ２は炭素原子数１ないし２０個の直鎖状もしくは分岐状アルキル基を意味し、Ｒ１、Ｒｆならびにｎは前記と同じ意味を有する）
または下記化学反応式 [IIb]：
【００３９】
【化２４】
0005130540.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒｆならびにｎは前記と同じ意味を有する）
に従って、試料中のアミン類またはアミノ酸関連物質のアミノ基と反応して、試料中のアミン類またはアミノ酸関連物質が誘導体化され疎フッ素性の蛍光性アミン誘導体を生成すると同時に、フルオラスタグであるフッ素性部位が脱離して親フッ素性のフルオラスタグ含有反応副生成物が生成する。
【００４０】
このようにして得られた蛍光誘導体化試薬ならびにそれを用いた誘導体化方法は、試料中のアミン類やアミノ酸関連物質を緩和な条件下で誘導体化することができると共に、その誘導体化と同時にフルオラスタグを脱離する。このようにフルオラスタグが脱離するため、未反応の試薬のみがフルオラスタグを有していることになる。したがって、このフルオラスタグを有する化合物は、市販の親フッ素性シリカゲルなどの吸着剤で容易に選択的に吸着分離して除去することができる。その結果、この発明の蛍光誘導体化試薬ならびに誘導体化方法は、アミン類ならびにアミノ酸関連物質のみを選択的に誘導体化することができることから、アミン類ならびにアミノ酸関連物質を選択的にかつ高感度に分離・分析することができる。
【００４１】
この発明に係る蛍光誘導体化試薬ならびに誘導体化方法によって高感度にかつ高選択的に誘導体化することができるアミン類ならびにアミノ酸関連物質としては、アミン類としては、例えば、エチルアミン（C2）、プロピルアミン（C3）、n-ブチルアミン（C4）、n-ペンチルアミン（C5）、n-ヘキシルアミン（C6）、n-ヘプチルアミン（C7）、n-オクチルアミン（C8）、n-ノニルアミン（C9）、n-デシルアミン（C10）、n-アミノウンデカン（C11）、n-ドデシルアミン（C12）、n-テトラデシルアミン（C14）、n-ヘキサデシルアミン（C16）等の脂肪族アミン類などが挙げられ、またアミノ酸関連物質としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンなどが挙げられる。
【実施例１】
【００４２】
（F-trap ピレンの合成）
F-trap ピレンの合成スキームを下記化学反応式 [Ic]の通りである。1-ピレン酪酸（288
mg、1 mmol）および4-（3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ）フェノール（286 mg、0.5 mmol）を7 mLの脱水テトラヒドロフラン（THF）に溶解し、N，N’-ジイソプロピルカルボジイミド（155 μL、1 mmol）、およびN，N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）（61 mg、0.5 mmol）を加え、20時間室温で撹拌した。反応液に100 mLの酢酸エチルを加えた後、30mLの0.1 M塩酸および水でそれぞれ3回ずつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン：酢酸エチル＝4：1）で精製し、白色粉末のF-trapピレン［4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェニル4-(ピレン-1-イル)ブタノエート］を得た（236 mg、収率56.1 ％）。
【００４３】
【化２５】
0005130540.tif 000016
【００４４】
得られたF-trapピレンの核磁気共鳴スペクトルの分析結果は次の通りであった。
1H-NMR（600
MHz、CDCl3） δ 2.32
(2H, m), 2.69 (2H, t, J=7.0 Hz), 3.08 (2H, t, J=8.2 Hz), 3.49 (2H, t, J=7.6
Hz), 7.03 (2H, d, J=4.6 Hz), 7.36(2H, d, J=4.6 Hz), 7.88 (1H, d, J=7.6 Hz),
7.99 (1H, t, J=7.6 Hz), 8.03 (4H,s), 8.12 (1H, d, J=4.6 Hz), 8.16 (1H, d, J=6.7
Hz), 8.31 (1H, d, J=9.2 Hz)。
【実施例２】
【００４５】
（F-trapクマリンの合成）
F-trapクマリンの合成スキームは下記化学反応式 [IIc] の通りである。7-メトキシクマリン-4-酢酸（117 mg、0.5 mmol）および4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ）フェノール（286 mg、0.5 mmol）を7 mLの脱水テトラヒドロフラン（THF）に溶解し、N，N’-ジイソプロピルカルボジイミド（93 μL、0.6 mmol）、およびDMAP（61 mg、0.5 mmol）、を加え、3時間室温で撹拌した。反応液に100 mLの酢酸エチルを加えた後、30mLの0.1 M塩酸および水でそれぞれ3回ずつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；ヘキサン： 酢酸エチル＝2：1）で精製し、白色粉末のF-trapクマリン［4-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,10-ヘプタデカフルオロデシルチオ)フェニル2-(7-メトキシ-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル)アセテート］を得た（99 mg、収率25.1 ％）。
【００４６】
【化２６】
0005130540.tif 000017
【００４７】
得られたF-trapクマリンの核磁気共鳴スペクトルの分析結果は次の通りであった。
1H-NMR（600
MHz、CDCl3） δ 2.39
(2H, m), 3.08 (2H, t, J=7.9 Hz), 3.10 (2H,s), 3.95 (3H, s), 6.33 (1H, s), 6.87
(1H, s), 6.88 (1H, d, J=8.9 Hz), 7.02 (2H,d, J=8.9 Hz), 7.35 (2H, d, J=8.9 Hz),
7.56 (1H, d, J=8.9 Hz)。
【実施例３】
【００４８】
（F-trapピレンによるアミンの誘導体化分析）
被検体試料であるアミン溶液200 μLにピリジン1.4 mLおよび5 mM F-trapピレンのTHF溶液400 μLを加えて90℃、１時間加熱する。反応液100 μLをフルオラス固相抽出カートリッジ（F-SPE）（2 g、フルオラステクノロジーズ社製）に添加する。カートリッジを水4 mL で洗浄後、80％（v/v）メタノール4 mLで溶出し、その20 μLをHPLCに注入した。HPLC分析条件は次の通り。カラム：COSMOSIL 5C18-AR-II (内径4.6
mm×長さ15 cm、ナカライテスク社製)、移動相：80％（v/v）アセトニトリル（0-10 min）、アセトニトリル-水-THF（8：1：1、v/v）（10-40 min）のグラジエント溶出、流速1.0mL/min、蛍光検出：励起波長 345 nm、蛍光波長 375 nm。
【００４９】
１３種の脂肪族アミン（エチルアミン（C2）、プロピルアミン（C3）、n-ブチルアミン（C4）、n-ペンチルアミン（C5）、n-ヘキシルアミン（C6）、n-ヘプチルアミン（C7）、n-オクチルアミン（C8）、n-ノニルアミン（C9）、n-デシルアミン（C10）、n-アミノウンデカン（C11）、n-ドデシルアミン（C12）、n-テトラデシルアミン（C14）、n-ヘキサデシルアミン（C16））を上記操作に従って誘導体化分析した際のクロマトグラムを図４示す。
【００５０】
40分以内に13種類全てのアミン誘導体の蛍光ピークが検出された。このとき、未反応の試薬のピークが26分付近に僅かに観測されたが、アミン誘導体の分離・定量を妨害しなかった。一方、図４には、上記操作のうちフルオラス固相抽出操作を行わなかった以外は同様に操作したときのクロマトグラムを示す。図３とは異なり、26分付近に未反応の試薬ピークが大きく出現し、n-テトラデシルアミン（C14）の分離・定量を大きく妨害していた
。以上の結果より、フルオラス固相抽出操作により未反応試薬のみが選択的に除去できることが示された。図３と図４のクロマトグラムのピーク面積の比からフルオラス固相抽出操作により未反応試薬の除去率を算出した。このとき、未反応試薬は少なくとも99.95％以上が除去された。
【００５１】
表１にはフルオラス固相抽出に用いる溶出液の組成を変化させたときのF-trapピレンの除去率を示した。親フッ素性溶媒（メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドなど）と疎フッ素性溶媒（水、ジメチルスルホキシド）を組み合わせることで、未反応試薬のみを最大99.97 ％以上の除去率で固相抽出カートリッジ中に吸着させることが可能であった。
【００５２】
【表１】
0005130540.tif 000018
【実施例４】
【００５３】
（F-trapクマリンによるアミンの誘導体化分析）
被検体試料であるアミン溶液200 μLに20 %ピリジンのアセトニトリル溶液1.4mLおよび5 mM F-trapクマリンのTHF溶液400 μLを加えて90℃、10分間加熱する。反応液100 μLをフルオラス固相抽出カートリッジ（F-SPE）（2 g、フルオラステクノロジーズ社製）に添加する。カートリッジを水4 mL で洗浄後、70 ％（v/v）アセトニトリル4 mLで溶出し、その20 μLをHPLCに注入した。HPLC分析条件は次の通り。カラム：COSMOSIL 5C18-AR-II
(内径4.6 mm×長さ15 cm、ナカライテスク社製)、移動相：アセトニトリル水溶液のグラ
ジエント溶出（0 - 30 min）（40 - 90％（v/v））、流速1.0 mL/min、蛍光検出：励起波長345 nm、蛍光波長 375 nm。
【００５４】
１３種の脂肪族アミン（エチルアミン（C2）、プロピルアミン（C3）、n-ブチルアミン（C4）、n-ペンチルアミン（C5）、n-ヘキシルアミン（C6）、n-ヘプチルアミン（C7）、n-オクチルアミン（C8）、n-ノニルアミン（C9）、n-デシルアミン（C10）、n-アミノウンデカン（C11）、n-ドデシルアミン（C12）、n-テトラデシルアミン（C14）、n-ヘキサデシルアミン（C16））を上記操作に従って誘導体化分析した際のクロマトグラムを図５示す。
【００５５】
40分以内に13種類全てのアミン誘導体の蛍光ピークが検出された。このとき、未反応の試薬のピークが32分付近に僅かに観測されたが、アミン誘導体の分離・定量を妨害しなかった。一方、図６には、上記操作のうちフルオラス固相抽出操作を行わなかった以外は同様に操作したときのクロマトグラムを示す。図５とは異なり、25分に試薬由来のピークと32分付近に未反応の試薬ピークが大きく出現し、n-テトラデシルアミン（C12）の分離・定量を大きく妨害していた。以上の結果より、フルオラス固相抽出操作により未反応試薬のみが選択的に除去できることが示された。図５と図６のクロマトグラムのピーク面積の比からフルオラス固相抽出操作により未反応試薬の除去率を算出した。このとき、未反応試薬は少なくとも99.99 ％以上が除去されることが分かった。
【００５６】
表２にはフルオラス固相抽出に用いる溶出液の組成を変化させたときのF-trapクマリンの除去率を示した。親フッ素性溶媒（メタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドなど）と疎フッ素性溶媒（水、ジメチルスルホキシド）を組み合わせることで、未反応試薬のみを最大99.99 ％以上の除去率で固相抽出カートリッジ中に吸着した。
【００５７】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５８】
この発明に係る蛍光誘導体化試薬ならびに蛍光誘導体化方法は、試料中に含まれる生理活性アミン類、アミノ酸、ペプチド類などのアミン類やアミノ酸関連物質を分離・検出することができることから、例えば、医療、食品、環境などの分野で利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】F-trap ピレンによる１３種の脂肪族アミンの誘導体化分析結果を示すクロマトグラムを示す図（実施例３）。
【図２】F-trap ピレンによる１３種の脂肪族アミンの誘導体化分析操作においてフルオラス固相抽出操作を行わなかった場合を比較したクロマトグラムを示す図（実施例３）。
【図３】F-trapクマリンによる１３種の脂肪族アミンの誘導体化分析結果を示すクロマトグラムを示す図（実施例４）。
【図４】F-trapクマリンによる１３種の脂肪族アミンの誘導体化分析操作においてフルオラス固相抽出操作を行わなかった場合を比較したクロマトグラムを示す図（実施例４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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