(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列表配列番号２に示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミド。
【請求項５】
前記組換えプラスミドが図１の制限酵素地図にて特定されるｐＣＤＡ００３である請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項６】
更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡがベクターに挿入された、請求項４記載の組換えプラスミド。
【請求項７】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、及び／又は、補酵素再生能を有する酵素をコードするＤＮＡである請求項６に記載の組換えプラスミド。
【請求項８】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとして、アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有する酵素をコードするＤＮＡが挿入された請求項７記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素、又はフェニルアラニン脱水素酵素である請求項７又は８記載の組換えプラスミド。
【請求項１０】
前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
前記組換えプラスミドが、図７の制限酵素地図にて特定されるｐＦＴＬＢＤＡ、又は図８の制限酵素地図にて特定されるｐＦＴＰＢＤＡである請求項８に記載の組換えプラスミド。
【請求項１２】
請求項４記載の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１３】
前記形質転換体がエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）またはＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）である請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ以外の酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが導入された請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、及び／又は補酵素再生能を有する酵素をコードするＤＮＡである請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとして、アミノ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された請求項１５に記載の形質転換体。
【請求項１７】
前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素、又はフェニルアラニン脱水素酵素である請求項１５又は１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素である請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１９】
請求項４記載の組換えプラスミド、及び、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入断片として含む組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項２１】
前記微生物が、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の形質転換体、又は、キャンディダ属に属する微生物である、請求項２０に記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項２２】
Ｌ−アミノ酸または２−オキソ酸の製造方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式（１）：
【化１】
0005291934.tif 000014
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（２）：
【化２】
0005291934.tif 000015
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は、一般式（３）：
【化３】
0005291934.tif 000016
（式中、Ｒは前記と同じ）で表される２−オキソ酸を製造する方法。
【請求項２３】
環状Ｌ−アミノ酸又は環状イミンの製造方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式（４）：
【化４】
0005291934.tif 000017
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させ、一般式（５）：
【化５】
0005291934.tif 000018
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸、又は、一般式（６）：
【化６】
0005291934.tif 000019
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状イミンを製造する方法。
【請求項２４】
請求項１２又は１３に記載の形質転換体を用いる、請求項２２又は２３記載の製造方法。
【請求項２５】
Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（１）：
【化７】
0005291934.tif 000020
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（２）：
【化８】
0005291934.tif 000021
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法。
【請求項２６】
環状Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、請求項１に記載のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（４）：
【化９】
0005291934.tif 000022
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、一般式（５）：
【化１０】
0005291934.tif 000023
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸脱水素酵素が、ロイシン脱水素酵素又はフェニルアラニン脱水素酵素である、請求項２５又は２６記載の製造方法。
【請求項２８】
前記補酵素再生能を有する酵素が、ギ酸脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２９】
請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる請求項２５又は２８記載の製造方法。
【請求項３０】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の３酵素を共発現する形質転換体を用いる、請求項２９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生産する新規なＤ−アミノ酸オキシダーゼ、これをコードするＤＮＡ、及びＤ−アミノ酸オキシダーゼを生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を用いたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法、また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いた効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法に関するものである。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
日本国特許出願２００５−２２４５０５号（２００５年８月２日出願）および日本国特許出願２００６−１１９４０８号（２００６年４月２４日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００３】
Ｌ−アミノ酸の製造方法としては、抽出法、化学合成法、発酵法、酵素的合成法など種々の方法が知られている。抽出法では蛋白質加水分解物からの大規模な精製設備が必要となる。化学合成法で製造されるアミノ酸は通常ラセミ体であるため、光学活性体を製造するためには、高価な分割剤、不斉触媒等を必要とする。発酵法では生成物濃度が低く、抽出法同様大規模な精製設備を必要とし、また、非天然型のアミノ酸の合成には適していない。酵素的合成法は安価な生体触媒を利用することにより、これらの問題点を回避して、より低コストで効率のよい製造方法を提供可能である。
Ｌ−アミノ酸の酵素的合成法としては、例えばラセミ体のアミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させる方法が知られている。【０００４】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（酵素番号［ＥＣ１．４．３．３］）は、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸、およびアンモニアを生成する酵素である。このＤ−アミノ酸オキシダーゼは、例えばラセミ体アミノ酸を立体選択的に酸化して、Ｌ−アミノ酸および２−オキソ酸を生成するなど、産業上有用な活性を持つことが知られている。また、Ｌ−アミノ酸は医薬品等の合成中間体や甘味料として有用な化合物である。【０００５】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを産生する微生物としては、例えばトリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特許文献１）、フザリウム  オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（特許文献２）、キャンディダ  トロピカリス（Candida tropicalis）（非特許文献１）等が知られており、各々の酵素は精製、単離され、その性質が明らかにされている。また、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の形質転換体での発現に関しては、例えば、トリゴノプシス  バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特許文献３）、フザリウム  ソラニ（Fusarium solani）（特許文献４）、ロドトルーラ  グラシリス（Rhodotorula gracilis）（特許文献５）、キャンディダ  ボイディニー（Candida boidinii）（非特許文献２）由来の遺伝子について知られている。これら形質転換体によりＤ−アミノ酸オキシダーゼを高生産するためには、多くの場合、発現を抑制した状態で培養した後、誘導物質を添加するなどの手段で酵素を高生産化させる方法が知られている。【０００６】
また、キャンディダ属に含まれるキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）に関しては、粗酵素液の状態でＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性があることが知られている（非特許文献３）。【０００７】
さらに、Ｌ−アミノ酸の酵素的合成法としては、例えばラセミ体のアミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を作用させて、Ｌ−アミノ酸を製造する立体反転反応による製造方法が知られている（非特許文献４、５）。しかし、非特許文献４、５に開示の方法では、高価な市販酵素や微生物から精製された酵素を使用する必要があり、工業的に使用するには課題を抱えていた。【０００８】
この課題に対しては、例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体を育種、培養し、ラセミ体アミノ酸に作用させてＬ−アミノ酸を製造する方法が知られている（特許文献６）。しかしながら、この特許文献６に記載されている実施例によると、当該形質転換体を用いた反応により生成するＬ−アミノ酸の濃度は約２５ｍＭと、工業的に製造を行なうには低い濃度である。
【特許文献１】特公昭６２−５０１６７７号公報
【特許文献２】特開平１１−３１８４３９号公報
【特許文献３】特開昭６３−７１１８０号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第ＥＰ３６４２７５号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ９７／０４０１７１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ０５／０９０９５０号公報
【非特許文献１】"Some Properties of Peroxisomeassociated D-Amino Acid Oxid  ase from Candida tropicalis", Agricul. and Biol. Chemistry, 1986年, 50巻, 10  号, 2637頁
【非特許文献２】"Characterization and High-level Production of D-Amino Acid Oxidase in Candida boidinii", Biosci. Biotechnol. Biochem., 2001年, 65巻, 3号, 627頁
【非特許文献３】"Production of D-Amino Acid Oxidase by Candida tropicalis", J. Ferment. Technol., 1977年, 55巻, 1号, 13頁
【非特許文献４】"Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to the L-Enantiomer", J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1990年, 13巻, 947頁
【非特許文献５】"Enzymatic synthesis of chiralintermediates for Omapatrilat,an antihypertensive drug", Biomolecular Engineerin, 2001年, 17巻, 167頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼは、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、過酸化水素、２−オキソ酸およびアンモニアを生成する酵素である。さらに、このＤ−アミノ酸オキシダーゼをアミノ酸脱水素酵素と組み合わせるか、またはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせることで、ラセミ体アミノ酸が、ケト酸あるいはイミノ酸を経て、Ｌ−アミノ酸へと定量的に変換される立体反転反応に利用できる有用な酵素である。【００１０】
本発明の目的は新規のＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供することにある。また、本発明の目的は、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列、その遺伝子の塩基配列を明らかにし、当該酵素を生産する能力を有する微生物あるいは形質転換体を提供することにある。【００１１】
また、本発明の好適な実施形態の目的は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを高生産し、かつアミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を同時に生産する形質転換体を提供することにある。【００１２】
さらに本発明は、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼあるいは形質転換体を利用した効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題に鑑み、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）からＤ−アミノ酸オキシダーゼを単離、精製し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の単離、ならびに宿主微生物での発現を達成し、高活性な形質転換体を育種した。本発明で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼの場合、発現の抑制と誘導物質の添加などの手段を用いることなく形質転換体を培養した場合でも、高生産が可能であった。本発明で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを単独、あるいはアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素と組み合わせてラセミ体アミノ酸に作用させることにより、２−オキソ酸又はＬ−アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。【００１４】
更に本発明者らは鋭意研究した結果、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素をコードする各遺伝子を有する形質転換体を育種した。通常、複数の異なる酵素遺伝子を有する形質転換体では、個々の酵素遺伝子を単独で有する形質転換体に比べて、各酵素の生産量は低下することが予想される。しかし、驚くべきことに、本発明の好適な実施形態におけるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のみを有する形質転換体に比べて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの培養液当たりの活性値が５０倍以上にまで向上することを見出した（後述の実施例１２に対応）。【００１５】
これまで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子と、少なくとも１つ以上のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチド（例えば、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生酵素）の遺伝子を有する形質転換体において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子のみを有する形質転換体に比べて著しく向上したという例は知られていない。例えば、前述の特許文献６（国際公開第ＷＯ０５／０９０９５０号公報）においても、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体において、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子のみを有する形質転換体に比べて向上したという事例は示されていない。【００１６】
上記各遺伝子を有する形質転換体が、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を単独で有する形質転換体と比較してＤ−アミノ酸オキシダーゼの活性が顕著に向上することは、本発明者独自の試みによって見出された。そして、本発明の好適な実施形態で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体をラセミ体アミノ酸に作用させることにより、効率的にＬ−アミノ酸を製造することが可能となり、本発明を完成するに至った。【００１７】
即ち、本発明は、以下の１または複数の特徴を有する。
［１］本発明の特徴の一つは、キャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、下記の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（１）分子量
分子量約２５２,０００
サブユニットの分子量約４２,０００；
（２）作用温度の範囲
温度範囲  少なくとも２０℃〜６０℃；
（３）作用ｐＨの範囲
ｐＨ範囲  少なくとも６〜１０．５。
［２］本発明の特徴の一つは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と６９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
［３］本発明の特徴の一つは、前記［１］又は［２］のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
［４］本発明の好適な実施形態のＤＮＡは、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
（ｄ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列表配列番号２に示される塩基配列と６７％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［５］本発明の特徴の一つは、前記［３］又は［４］のＤＮＡをベクターに挿入して得られる組換えプラスミドである。
［６］本発明の好適な実施形態の組換えプラスミドは、更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡがベクターに挿入された組換えプラスミドである。
［７］本発明の特徴の一つは、前記［５］の組換えプラスミドで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体である。
［８］本発明の好適な実施形態は、更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ以外の酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが導入された［７］の形質転換体である。
［９］本発明の特徴の一つは、前記［１］又は［２］のポリペプチドを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物中に当該ポリペプチドを蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法である。
［１０］本発明の特徴の一つは、前記［１］又は［２］のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式（１）：【００１８】
【化１】
0005291934.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（２）：【００２０】
【化２】
0005291934.tif 000003
【００２１】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸、又は、一般式（３）：【００２２】
【化３】
0005291934.tif 000004
【００２３】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表される２−オキソ酸を製造する方法である。
［１１］本発明の特徴の一つは、［１］又は［２］のポリペプチド、又は当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、一般式（４）：【００２４】
【化４】
0005291934.tif 000005
【００２５】
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させ、一般式（５）：【００２６】
【化５】
0005291934.tif 000006
【００２７】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸、又は、一般式（６）：【００２８】
【化６】
0005291934.tif 000007
【００２９】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状イミンを製造する方法である。
［１２］本発明の特徴の一つは、［１］又は［２］のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（１）：【００３０】
【化７】
0005291934.tif 000008
【００３１】
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。）で表されるラセミ体アミノ酸に作用させ、一般式（２）：【００３２】
【化８】
0005291934.tif 000009
【００３３】
（式中、Ｒは前記と同じ）で表されるＬ−アミノ酸を製造する方法である。
［１３］本発明の特徴の一つは、［１］又は［２］のポリペプチド、又は、当該ポリペプチドを生産する能力を有する微生物を、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素の存在下で、一般式（４）：【００３４】
【化９】
0005291934.tif 000010
【００３５】
（式中、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖）で表される環状アミノ酸に作用させることを特徴とする、一般式（５）：【００３６】
【化１０】
0005291934.tif 000011
【００３７】
（式中Ｒ’は上記と同じ）で表される環状Ｌ−アミノ酸の製造方法である。
［１４］本発明の特徴の一つは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産量向上方法であって、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡ、及び、少なくとも１種の当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡで、宿主微生物を形質転換することを特徴とする方法である。
［１５］本発明の特徴の一つは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡと、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとを挿入断片として含み、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのみを挿入断片として含む組換えプラスミドに比べてＤ−アミノ酸オキダーゼの生産量が向上した組換えプラスミドである。
［１６］本発明の特徴の一つは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及び、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体であって、前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡのみで形質転換された形質転換体に比べてＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性が向上した形質転換体である。
［１７］本発明の特徴の一つは、［１６］の形質転換体を培養し、培養物中にＤ−アミノ酸オキシダーゼを蓄積させ、これを採取することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造方法である。
［１８］本発明の特徴の一つは、［１６］の形質転換体を、前記式（１）で表されるラセミ体アミノ酸、又は、前記式（４）で表される環状アミノ酸に作用させ、前記式（２）で表されるＬ−アミノ酸、又は、前記式（５）で表される環状Ｌ−アミノ酸を製造する方法である。【００３８】
本発明のその他の特徴およびその効果は、以下の実施形態および図面によって明らかにされる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は上述の構成からなり、新規なＤ−アミノ酸オキシダーゼを効率よく製造することができる。また、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、または、当該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを生産する形質転換体、または微生物を利用することで、効率良くＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンを製造することができる。【００４０】
本発明の好適な実施形態では、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を生産する形質転換体を利用することで、効率良くＬ−アミノ酸を製造することができる。これらの好適な実施形態によれば、各酵素を生産する形質転換体を別々に培養する必要がなく、反応の基質となるラセミ体アミノ酸の種類によっては、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産量が不十分なため大量の培養液を必要とする等の技術的課題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＣＤＡ００３の構成を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼのＤ−Ｐｈｅに対するＫｍ値を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼの作用温度と相対活性との関係（至適温度を含む）を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼの作用ｐＨと相対活性との関係（至適ｐＨを含む）を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼの処理温度と残存活性との関係（温度安定性を含む）を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼの処理ｐＨと残存活性との関係（ｐＨ安定性を含む）を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、ロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴＬＢＤＡの構成を示す図である。
【図８】図８は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、フェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴＰＢＤＡの構成を示す図である。
【図９】図９は、本発明の実施形態としてのロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴＬＢの構成を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態としてのフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＦＴＰＢの構成を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態としてのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＳＴＮＤＡの構成を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。【００４３】
１．ポリペプチド
まず、本発明の実施形態としてのポリペプチドについて説明する。実施形態としてのポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下のような理化学的性質を有することを特徴とする。
１）作用
酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化し、２−オキソ酸、過酸化水素、およびアンモニアを生成する。
２）分子量
分子量約２５２,０００
サブユニットの分子量約４２,０００；
３）Ｄ−フェニルアラニンに対するＫｍ値
約１．７ｍＭ；
４）作用温度の範囲
温度範囲  少なくとも約２０℃〜約６０℃、  至適温度  約４０℃〜約５０℃；
（温度範囲とは酵素が好適に作用する温度範囲であり、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度である。本酵素は上記温度範囲以外の温度でも作用する。）
５）作用ｐＨの範囲
ｐＨ範囲  少なくとも約６〜約１０．５、  至適ｐＨ約８．５〜約９．５；
（ｐＨ範囲とは酵素が好適に作用するｐＨ範囲であり、至適ｐＨは酵素が最も好適に作用するｐＨである。本酵素は上記範囲以外のｐＨでも作用する。）
６）温度安定性
４０℃以下で安定；
７）ｐＨ安定性
ｐＨ７．８〜８．７で安定；
８）比活性（１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する）
純粋酵素１ｍｇあたり    ４４．８ｕｎｉｔ（３０℃）。【００４４】
実施形態のＤ−アミノ酸オキシダーゼは、他のＤ−アミノ酸オキシダーゼと比べて、例えば以下のような異なる性質を有している。
（ａ）  至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが７．５〜８であるフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（特開平１１−３１８４３９）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、至適温度、至適ｐＨが異なる。
（ｂ）  分子量４３，０００のサブユニットからなるホモ２量体構造であるトリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsis variabilis）（特公昭６２−５０１６７７、特開招６３−７１１８０）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性３１．６％）。
（ｃ）  分子量３８，０００の単量体構造であるキャンディダ・ボイディニー（Candida boidinii）（Biosci. Biotechnol. Biochem.、2001年、65巻、3号、627項； Yeast、2000年、16巻、1217頁）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性６０．１％）。
（ｄ）分子量４１，０００のホモ２量体構造であるロドトルーラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）（ＷＯ９７／０４０１７１； Protein expression and purification、1998年、14巻、289頁）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、酵素の構造が異なり、またアミノ酸配列でも大きく異なる（アミノ酸配列相同性２８．９％）。
（ｅ）フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）（ＥＰ３６４２７５）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、アミノ酸配列で大きく異なる（アミノ酸配列相同性２９．０％）。
（ｆ）分子量３９，０００の単量体構造であるキャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）（Agricul. and Biol. Chemistry、1986年、50巻、10号、2637項）のＤ−アミノ酸オキシダーゼとは、酵素の構造が異なる。【００４５】
なお、実施形態における「相同性」は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。ここでは、例示としてＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７遺伝情報処理ソフトウェア／Ｗｉｎｄｏｗｓ版（ゼネティックス社製）のホモロジー検索を使用した。【００４６】
２．Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性測定
実施形態において、ポリペプチドのＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ペルオキシダーゼを用いた酵素法で定量することができる。酵素法による過酸化水素の定量は次のように実施する。【００４７】
酵素溶液を適宜希釈し、５０ｍＭ  ＤＬ−フェニルアラニン、０．８０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１．３１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、６ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（TOYOBO Inc.社製）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる発色液と１：５で混合し、３０℃で３０分間反応させ、５５５ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量する。実施形態では、特に明記しない場合を除き、本方法を用いてＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を測定した。【００４８】
３．微生物
実施形態のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物から取得できる。本発明で用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。【００４９】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産能力を有する微生物としては、例えば、公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、アースロバクター属（Arthrobacter）、アスペルギルス属（Aspergillus）、キャンディダ属（Candida）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、クルブラリア属（Curvularia）、エクソフィアラ属（Exophiala）、フサリウム属（Fusarium）、ジベレラ属（Gibberella）、ハンセヌラ属(Hansenula)、クオエッケラ属(Kloeckera)、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）、ニューロスポラ属（Neurospora）、ピキア属（Phichia）、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、バーチシリウム属（Verticillium）、及びヤロヴィア属(Yarrowia)等が挙げられる。【００５０】
なかでもキャンディダ（Candida）に属する微生物が好ましく、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）がより好ましく、更に好ましくは、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株である。【００５１】
なお、実施形態のポリペプチドを生産する微生物は、上述した微生物の野生株であっても良いし、変異改良された変異株であってもよい。変異株は、ＵＶ照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の薬剤による処理といった当業者に周知の方法で取得することができる。【００５２】
本発明のポリペプチドを生産する微生物を培養する培地としては、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。【００５３】
更に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの生産を増強させるような物質、例えば、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を少量添加することもできる。これらＤ−アミノ酸オキシダーゼ生産増強物質の培地中濃度は、０．００１重量％以上、１０重量％以下、好ましくは０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。【００５４】
培養は通常好気的に行い、温度として１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下の範囲、ｐＨとしては３以上、１１以下、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲が用いられ、培養時間は１日以上、５日間以下程度で行い得る。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００５５】
培養終了後に培養液から遠心分離などにより菌体を集め、超音波破砕などの手段により菌体を破砕して粗酵素液を得る。この粗酵素液を、塩析法、カラムクロマトグラフィー法などにより精製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。【００５６】
４．アミノ酸配列
本発明のポリペプチドは、上記のように微生物から取得される天然酵素であってもよいし、遺伝子組換え技術を利用して生産される組換え酵素であってもよい。天然酵素としては、配列表の配列番号１に示されるポリペプチドをあげることができる。【００５７】
また、本発明の実施形態としてのポリペプチドは、配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよいし、配列番号１に示されるアミノ酸配列と６９％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。【００５８】
「数個のアミノ酸」とは、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは、５、４、３、または２個以下である。【００５９】
また、「Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチド」とは、上記の活性測定条件において、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドのことをいう。【００６０】
５．ＤＮＡ
本発明の実施形態としての「ＤＮＡ」について説明する。本発明のＤＮＡは、上記のようなポリペプチドをコードするＤＮＡであればよい。配列表の配列番号２で示されるＤＮＡであってもよいし、配列表配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。【００６１】
「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドがＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは５０塩基以下であり、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０アミノ酸以下、最も好ましくは、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下である。【００６２】
また、配列番号２で示される塩基配列と６７％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。【００６３】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｄ−アミノ酸オキサダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。【００６４】
ここで「配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際に、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、特異的にハイブリッドを形成し得るＤＮＡを言う。【００６５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００６６】
本発明のＤＮＡ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子）は、前述したようなＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物から取得することができる。目的のＤＮＡを取得するには、例えば以下の方法によることができる。【００６７】
まず、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物より精製されたＤ−アミノ酸オキシダーゼにリジルエンドペプチダーゼ等のプロテアーゼを作用させて適当な大きさのポリペプチドに消化した後、ＨＰＬＣ等を用いて得られたポリペプチドを精製し、気相プロテイン・シークエンサーなどで、内部アミノ酸配列を決定する。次に既知Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの相同配列部位にもとづいて設計したＤＮＡプライマーを合成する。【００６８】
次に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの起源となる微生物より、染色体ＤＮＡを単離する。染色体ＤＮＡは、培養された細胞から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）等を用いて得られる。この染色体ＤＮＡを鋳型に、上記のＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、目的遺伝子の一部を取得できる。【００６９】
次に、既に取得した部分遺伝子のさらにＮ末側とＣ末側をコードするＤＮＡ断片を、インバースＰＣＲ法により取得することができる（例えばNucleic Acids Res., 16, 8186 (1988)を参照）。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、部分遺伝子の塩基配列とあわせることで、翻訳開始部位から終止コドンまでを含むと推定されるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の全長塩基配列を得る。【００７０】
得られた塩基配列の解析から、染色体ＤＮＡより得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子中にイントロンの存在が推定される場合は、以下に示すような方法でイントロンを除去したＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を取得することができる。【００７１】
まず、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの起源となる微生物を培養して得た菌体から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、全ＲＮＡを鋳型に相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製する。インバースＰＣＲ法により得られた上記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子全長配列のＮ末端、Ｃ末端部分の塩基配列からプライマーを設計する。設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、イントロンを含まない全長配列からオープンリーディングフレームを決定する。決定されたオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列に基づいて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ酵素の内部アミノ酸配列を含むことを確認すればよい。【００７２】
６．形質転換体・ベクター
上記方法によって取得したＤＮＡ、または該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えプラスミドを用いることにより、宿主微生物を形質転換し形質転換体を得ることができる。【００７３】
宿主、ベクターとしては、「組換えＤＮＡ実験指針」（科学技術庁研究開発局ライフサイエンス課編：平成８年３月２２日改定）に記載の宿主―ベクター系を用いることができる。例えば、宿主としては、エシェリヒア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属またはストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物を用いることができる。【００７４】
ベクターは上記の宿主内で自律複製できる微生物由来のプラスミド、ファージまたはその誘導体が使用できる。なかでも、宿主微生物としてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、ベクターとして当該微生物中で自律複製できるベクターを用いるのが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＳＣ１０１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ、又はｐＵＣＮＴ、若しくはそれらの誘導体を挙げることができる。それらの誘導体とは、酵素の生産量上昇、プラスミド安定化を目的として、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＳＤ配列、複製開始部位（ｏｒｉ）、その他の調節などに関わる遺伝子を改質したもの、また、薬剤耐性、クローニング部位の制限酵素サイトを改質したものなどを指す。【００７５】
形質転換体の一例として、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株から上記のようにして取得したＤＮＡをｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３参照）に組み込んだ組換えプラスミドｐＣＤＡ００３を用いてエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１、およびＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）、およびＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）を得ることができる。【００７６】
本発明で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）は、２００６年７月１０日に受領番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９として（原寄託日２００５年７月１９日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、また、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）は、２００６年７月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番１号）に寄託されている（原寄託日２００５年６月２８日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００７７】
なお、本発明で用いた組換えＤＮＡ技術は当該分野において周知であり、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)に記載されている。【００７８】
７．形質転換体等の培養
本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼを生産しうる上記形質転換体等を培養することにより当該酵素を大量に生産することができ、Ｌ−アミノ酸又は２−オキソ酸の製造に利用することができる。【００７９】
微生物の培養は、通常の培地を用いて行えば良い。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源および無機塩類などの栄養素を含む通常の培地で良い。これに、ビタミン、アミノ酸などの有機微量栄養素を添加すると、好ましい結果が得られる場合が多い。炭素源としては、グルコースやシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア水、アンモニアガス、尿素、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、鉄塩、硫酸塩、塩素などが用いられる。【００８０】
培養は温度範囲２５℃から４０℃で行えるが、２５℃から３７℃が特に好ましい。また、ｐＨは４から８で培養できるが、５から７．５が好ましい。また、回分式、連続式のいずれの培養方法でもよい。【００８１】
必要に応じてイソプロピル−１−チオ−β―Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）、ラクトース等の添加等の酵素誘導のための処理を行なうこともできる。【００８２】
８．Ｌ−アミノ酸等の製造方法
実施形態で得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼを使用することによる、効率的なＬ−アミノ酸、２−オキソ酸、又は環状イミンの製造方法について説明する。２−オキソ酸は、ラセミ体アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ、Ｄ−アミノ酸を酸化することにより得ることができる（光学分割反応）。本反応においてＤ−アミノ酸から２−オキソ酸に至るまでの中間体としてイミノ酸が生成すると推測されるが、イミノ酸は加水分解反応により、すぐに２−オキソ酸へと変換され、最終的に２−オキソ酸のみが得られる。環状イミンは環状アミノ酸にＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させることで得ることができる。Ｌ−アミノ酸は、前記分割反応の残基質として得ることも可能であるし、前記反応で生成する２−オキソ酸、イミノ酸、あるいは環状イミンを、さらにアミノ酸脱水素酵素に接触せしめ、反応させることにより、Ｌ−アミノ酸へと変換することもできる（立体反転反応）。【００８３】
９．アミノ酸脱水素酵素
ここで、アミノ酸脱水素酵素とは、アンモニアの存在下、２−オキソ酸又は環状イミンを還元的にアミノ化する活性を有する酵素であり、例えばフェニルアラニン脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼを挙げることができる。本発明で用いるアミノ酸脱水素酵素としては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。【００８４】
微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、公知の当該酵素の生産能力を有する微生物である、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、スポロサルシナ属（Sporosarcina）、サーモアクチノマイセス属（Thermoactinomyces）、マイクロバクテリウム属（Microbacterium）、ハルモナス属（Halomona）、クロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）、ニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）などが挙げられる。【００８５】
好ましくはバチルス属（Bacillus）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくは、バチルス  バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１由来の酵素が挙げられる。バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９はフェニルアラニン脱水素酵素を生産する微生物であり、欧州特許第ＥＰ２５６５１４号およびBisci.Biotechnol.Biochem.、1995年、59巻、10号、1994頁で公知である。【００８６】
また、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１は、ロイシン脱水素酵素を生産する微生物であり、公知のバチルス・サチルス（Bacillus subtilis ）のロイシン脱水素酵素とアミノ酸残基数が同じであり、アミノ酸配列で１００％一致する。遺伝子配列では１０９５塩基中、１４塩基が異なっている。バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）の遺伝子配列は、Nature、1997年、390巻、249頁およびＮＣＢＩデータベースのアクセッションナンバーＣＡＢ１４３３９で公知である。また、ピロリン−２−カルボン酸レダクターゼがニューロスポラ属（Neurospora）、エシェリヒア属（Escherichia）、アエロバクター属（Aerobactor）に属する微生物で生産されることは、Methods Enzymol.、1962年、5巻、882頁で述べられている。【００８７】
アミノ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株からアミノ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。【００８８】
１０．補酵素再生系（補酵素再生能を有する酵素）
上記アミノ酸脱水素酵素による反応は、ＮＡＤＨのような還元型の補酵素を必要とし、当該反応の進行に伴い、補酵素ＮＡＤＨは酸化型に変換される。この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有する酵素、および、当該酵素の基質となる化合物を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびアミノ酸脱水素酵素と共存させて当該反応を行うことにより、補酵素の使用量を大幅に削減できる。【００８９】
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又はグルコース脱水素酵素などを使用できる。【００９０】
好適には、ギ酸脱水素酵素が使用される。ギ酸脱水素酵素としては、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、キャンディダ属（Candida）、クロイッケラ属（Kloeckera）、ピキア属（Pichia）、リポマイセス属（Lipomyces）、シュードモナス属（Pseudomonas）、モラキセラ属（Moraxella）、ハイホマイクロビウム属（Hyphomicrobium）、パラコッカス属（Paracoccus）、チオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）等が挙げられる。【００９１】
好ましくはチオバシラス属（Thiobacillus）、アンシロバクター属（Ancylobacter）に属する微生物由来の酵素が挙げられる。さらに好ましくはチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）、アンシロバクター・アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来の酵素が挙げられる。【００９２】
ギ酸脱水素酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えばＷＯ０３／０３１６２６記載のように、ギ酸脱水素酵素活性を示す菌株からギ酸脱水素酵素遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知である。【００９３】
このようにして得られたギ酸脱水素酵素を高生産する形質転換体としてはＷＯ０３／０３１６２６記載の、チオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７２）又はエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）、又はＷＯ０２／４６４２７記載の、アンシロバクター・アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）ＫＮＫ６０７Ｍ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３５）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＡ００１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３３４）を挙げることができる。【００９４】
これら形質転換体によるアミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素の生産、前述のアミノ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるアミノ酸脱水素酵素の生産、あるいはギ酸脱水素酵素活性を示す菌株によるギ酸脱水素酵素の生産は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号公報に記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行なえば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。【００９５】
１１．カタラーゼの添加
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応には、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加しない場合にも反応は進行し、生成物を得ることができるが、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ反応で生成する過酸化水素により基質あるいは生成物が分解され、収率が低下する可能性がある。カタラーゼを添加することで、そのような基質あるいは生成物の分解を抑えることができ、収率の向上が期待できる。カタラーゼは過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。【００９６】
カタラーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物である、マイクロコッカス属（Micrococcus）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）等がある。また、市販の酵素も使用することもできる。市販酵素としては例えば、Catazyme25L（Novozyme社製）、CATALASE（Beef Liver）（P-L Biochemcals,Inc.社製）がある。【００９７】
１２．形質転換体等のバリエーション
本発明において使用するＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、補酵素再生能を有する酵素、カタラーゼは、それぞれの酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよいし、複数の酵素遺伝子を導入した形質転換体を育種し、培養して生産したものを使用してもよい。【００９８】
本発明において、生産されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素、およびカタラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、微生物もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。【００９９】
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。【０１００】
本発明の好適な実施形態としての、上記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例としてＤ−アミノ酸オキシダーゼを挙げると、後述の実施例に示される方法等に従い、同活性を示す菌株からＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成し、これを用いて、特に限定されないが、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の宿主微生物を形質転換することにより形質転換体を得ることができる。【０１０１】
さらに、複数の酵素遺伝子を有する形質転換体を育種することにより、各酵素を同一の菌体で生産することが可能となる。複数の酵素遺伝子を有する形質転換体を育種する方法としては、同一のベクターに複数の酵素遺伝子を挿入した組換えプラスミドを形質転換する方法、それぞれの酵素遺伝子を異なる複製開始部位（ｏｒｉ）、及び異なる薬剤耐性遺伝子を有する別々のベクターに挿入し、得られた複数の組換えプラスミドを同一の宿主微生物に形質転換する方法等を挙げることができる。【０１０２】
上記に述べた方法により、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のみを有する形質転換体に比べて、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの培養液当たりの活性値が１．３倍以上、２倍以上、１０倍以上、さらには５０倍以上に向上した、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の遺伝子を有する形質転換体を育種することが可能である（後述の実施例１２に対応）。【０１０３】
ベクターとしては前記「６．形質転換体・ベクター」の項で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子用として例示したベクターが同様に使用できる。【０１０４】
１３．Ｌ−アミノ酸等の生産
本発明の光学分割反応によるＬ−アミノ酸、２−オキソ酸又は環状イミンの生産、又は立体反転反応によるＬ−アミノ酸の生産は以下の方法で行なうことができる。【０１０５】
両酵素反応の基質として、前記一般式（１）で表されるラセミ体アミノ酸において、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基を表す。上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数１〜２０のアルキル基としては、特に限定されず、例えば、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、カルバモイルメチル基、２−カルバモイルエチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、メルカプトメチル基、２−メチルチオエチル基、（１−メルカプト−１−メチル）エチル基、４−アミノブチル基、３−グアニジノプロピル基、４（５）−イミダゾールメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、クロロメチル基、メトキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−アミノプロピル基、２−シアノエチル基、３−シアノプロピル基、４−（ベンゾイルアミノ）ブチル基、又は、２−メトキシカルボニルエチル基、などが挙げられる。【０１０６】
置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−ヒドロキシベンジル基、２−フルオロベンジル基、３−フルオロベンジル基、４−フルオロベンジル基、又は、３，４−メチレンジオキシベンジル基等が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、または４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。【０１０７】
また、前記一般式（４）で表される環状アミノ酸において、Ｒ’は置換基を有してもよい炭素数２〜７のアルキル鎖である。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。【０１０８】
１４．光学分割反応
分割反応では、上記基質に前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを作用させ、水性溶媒中で反応を行なう。上記反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。また、反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。【０１０９】
１５．立体反転反応
立体反転反応では、上記基質に前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、前述のアミノ酸脱水素酵素および補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。反応にはカタラーゼを添加してもよい。カタラーゼを添加することでＤ−アミノ酸オキシダーゼの反応で生成する過酸化水素を分解し、基質あるいは生成物の分解を抑えることができる。【０１１０】
また、上記反応にＦＡＤを添加してもよい。ＦＡＤはＤ−アミノ酸オキシダーゼの補酵素であり、添加することにより、反応の効率が向上することが期待できる。ＦＡＤの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、１当量以下、さらに好ましくは０当量以上、０．１当量以下である。【０１１１】
また、上記立体反転反応にはＮＡＤ等の補酵素を添加してもよい。ＮＡＤ等の補酵素を添加しない場合にも、微生物中に存在するＮＡＤ等の補酵素により反応が進行する場合もあるが、ＮＡＤ等の補酵素を添加することで、反応の効率が向上することが期待できる。ＮＡＤ等の補酵素の添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．００００１当量以上、０．１当量以下、さらに好ましくは０．０００１当量以上、０．０１当量以下である。補酵素添加量の上限は特に制限されないが、経済性の点から、通常は２当量以下、好ましくは０．１当量以下、より好ましくは０．０１当量以下である。【０１１２】
また、上記立体反転反応にアンモニア又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．１当量以上、１．５当量以下である。【０１１３】
上記光学分割および立体反転反応の基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、上記分割および立体反転反応における反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、１２以下、好ましくはｐＨ６以上、１１以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質は一括添加してもよいし、分割添加してもよいし、連続的に添加してもよい。上記分割および立体反転反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。【０１１４】
本発明の分割および立体反転反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。【０１１５】
１６．立体反転反応のバリエーション
次に、立体反転反応のより好適な実施態様として、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素を用いたラセミ体アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造方法について説明する。本実施態様では、ラセミ体のアミノ酸と前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素とその基質となる化合物を同時に存在させ、水性媒体中で反応を行なう。【０１１６】
本実施態様では、カタラーゼを添加してもよい。カタラーゼとしては、前記「１１．カタラーゼ」の項で挙げたものを使用することができる。【０１１７】
本発明において、形質転換体を培養することにより生産されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素は、酵素自体として用いることができるほか、形質転換体もしくはその処理物としても用いることができる。ここで、形質転換体の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。【０１１８】
また、本発明におけるＤ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の酵素遺伝子を導入した形質転換体を酵素反応に用いた場合、培養によって得られた菌体を未破砕のまま使用することにより、反応収率の向上、及び／又は反応時間の短縮を図ることができる（後述の実施例１３、１４に対応）。【０１１９】
この「未破砕」または「菌体を破砕せずに用いる」という概念には、菌体に対して物理的または化学的処理のいずれも施さない場合だけでなく、その菌体の細胞の膜透過性を高めるために当業者に周知の処理（例えば、乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理、アセトン乾燥処理、またはトルエン、界面活性剤等の添加処理）を施す場合も含む。【０１２０】
更にそれらの各酵素は、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。【０１２１】
また、上記反応にＦＡＤおよび／またはＮＡＤ等を添加してもよい。ＦＡＤ、ＮＡＤ等の添加量は、前述の通りである。【０１２２】
また、上記立体反転反応にアンモニア、又はその塩を添加してもよい。アンモニアの添加濃度としては、基質に対して、好ましくは０当量以上、１０当量以下、さらに好ましくは０．３当量以上、２当量以下、さらに好ましくは０．８当量以上、１．５当量以下である。【０１２３】
本実施態様では、前述の一般式（１）で表されるラセミ体アミノ酸、及び一般式（４）で表される環状アミノ酸を基質として用いることができ、その仕込み濃度、反応温度、反応ｐＨ等の条件も前述の通りである。【０１２４】
１７．生成物の単離
生成したＬ−アミノ酸、２―オキソ酸、又は環状イミンの単離は、常套分離方法、例えば、抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法や、それらの組み合わせにより分離、精製することができる。
【実施例】
【０１２５】
実施例および参考例の一覧は以下の通りである。
実施例１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの単離・精製
実施例２：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの性質
実施例３：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの内部アミノ酸配列決定
実施例４：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の単離
実施例５：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
実施例６：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例７：精製Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを利用した分割反応によるＬ−アミノ酸又は２−オキソ酸の合成
実施例８：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性菌を利用した分割反応によるＬ−アミノ酸合成
実施例９：形質転換体を利用した分割反応によるＬ−アミノ酸又は２−オキソ酸の合成
（１）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸の合成
（２）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸の合成
（３）ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンからＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンの合成
（４）ＤＬ−ノルバリンからＬ−ノルバリンおよび２−オキソ吉草酸の合成
（５）β−クロロ−ＤＬ−アラニンからβ−クロロ−Ｌ−アラニンの合成
実施例１０：形質転換体を利用したＬ−アミノ酸の合成
（１）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンの合成
（２）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンの合成
（３）ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンからＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンの合成
（４）ＤＬ−ノルバリンからＬ−ノルバリンの合成
（５）ＤＬ−ロイシンからＬ−ロイシンの合成
参考例１：フェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例２：ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
実施例１１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の活性を有する形質転換体の作成
［１］Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
［２］Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
［３］Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
［４］Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
実施例１２：形質転換体を用いたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産
実施例１３：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したＬ−ノルバリンの合成
実施例１４：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成
比較例１：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用したＬ−ノルバリンの合成
参考例３：ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例４：ロイシン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例５：フェニルアラニン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例６：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の育種。【０１２６】
以下に本発明の具体的な実施例を示す。しかし、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【０１２７】
（実施例１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの単離・精製
キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株を、試験管内で滅菌した６ｍｌの培地（グルコース１．６５％、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4０．５％、ＫＨ2ＰＯ4０．２５％、ＭｇＳＯ4０．１％、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．００２％、コーンスティープリカー０．１％、滅菌前ｐＨ５．２）に植菌して３０℃で１２時間、好気的に振とう培養した。この培養液４ｍｌを２Ｌ坂口フラスコ内で滅菌した４００ｍｌの培地（シュークロース１．６５％、ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4０．５％、ＫＨ2ＰＯ4０．２５％、ＭｇＳＯ4０．１％、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ０．００２％、コーンスティープリカー０．１％、ＦＡＤ０．０００５％、Ｄ−アラニン０．０８９％、滅菌前ｐＨ５．２、ただし、ＦＡＤおよびＤ−アラニンは０．０２μｍフィルターにてろ過滅菌後、別に添加した。）に植菌して２５℃で２２時間、好気的に振とう培養した。【０１２８】
培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に硫酸アンモニウムを４０から６０％飽和で加えた時に塩析する沈殿を遠心分離で取得した。この画分を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解、同緩衝液で透析後、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分に終濃度１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＬ（東ソー社製）にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  ６ｍｌ（アマシャムファルマシア社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行ない、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、同緩衝液で０Ｍから０．４Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。ここで得られた活性画分を限外濾過膜(分画分子量１０，０００)を用いて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）にアプライしてＦＰＬＣによるゲルろ過を行い、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。ここで得られた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。【０１２９】
（実施例２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの性質
実施例１で得られた精製Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの性質を以下のように調べた。
[比活性]
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性測定は、反応で生成する過酸化水素を、ぺルオキシダーゼを用いた酵素法で定量することによりおこなった。酵素法による過酸化水素の定量は次のように実施した。５０ｍＭ  ＤＬ−フェニルアラニン、０．８０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１．３１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、６ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｉｎｃ．社製）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる発色液２５０μｌと適宜希釈した酵素液５０μｌを混合し、３０℃で３０分間反応させ、５５５ｎｍの吸光度を測定し、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量した。このとき１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔと定義した。また、タンパク質の定量は、ＢＳＡを標準タンパク質としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で行った。精製したＤ−アミノ酸オキシダーゼの比活性は４４．８ｕｎｉｔ／ｍｇタンパク質（３０℃）であった。【０１３０】
また、以下に示す酵素の性質を調べる際のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、次のように実施した。１００ｍＭ  ＤＬ−フェニルアラニンおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる基質溶液２５０μｌを３０℃（作用温度の範囲、至適温度を調べる際には各温度）で５分間保温後、適宜希釈した酵素液５０μｌと混合し、３０℃（作用温度の範囲、至適温度を調べる際には各温度）で５分間反応させた後、３Ｎ  ＨＣｌを１０μｌ添加して反応を停止した。その後、３０℃にて５分間保温した、０．８０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン、１．３１ｍＭ  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジン、６ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｉｎｃ．社製）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）からなる発色液５００μｌを、前記反応液１００μｌと混合し、５５５ｎｍの吸光度を測定、予め作成した検量線に基づき、反応液中に生成した過酸化水素量を定量した。【０１３１】
[Ｋｍ値の測定]
Ｄ−Ｐｈｅを基質として、様々な基質濃度で活性測定を行ない、Ｄ−Ｐｈｅに対するＫｍ値を求めた。図２に示す結果から、Ｄ−Ｐｈｅに対するＫｍ値は約１．７（１．６以上、１．８以下）ｍＭであった。図２において、横軸は基質濃度の逆数、縦軸は活性の逆数である。【０１３２】
[作用温度の範囲・至適温度]
作用温度の範囲と至適温度を調べた。３０℃での活性を１００％とした場合の各温度での相対活性を図３に示した。本酵素は少なくとも検討した２０〜６０℃の範囲でよく作用し、至適温度は４０℃〜５０℃であった。【０１３３】
[作用ｐＨの範囲・至適ｐＨ]
作用ｐＨの範囲と至適ｐＨを調べた。ｐＨ６．０から７．５の範囲ではリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ７．５から８．８の範囲ではＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を、ｐＨ８．８から１０．５までの範囲では炭酸ナトリウム緩衝液を使用し、ｐＨ８．０での活性を１００％とした場合の各ｐＨでの相対活性を図４に示した。本酵素は少なくとも検討したｐＨ６〜１０．５の範囲で作用し、至適ｐＨは８．５〜９．５であった。【０１３４】
[温度安定性]
本酵素の温度安定性を、各温度で１０分間処理した後の残活性で調べたところ、図５に示すように４０℃以下で安定であった。【０１３５】
[ｐＨ安定性]
ｐＨ安定性について調べた。本酵素を３０℃、１６時間、各ｐＨで処理した後の残活性をｐＨ８．０の活性を１００％として示したのが図６である。なお、ｐＨ６．２から８．１の範囲ではリン酸カリウム緩衝液を、ｐＨ７．６から８．７の範囲ではＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を、ｐＨ８．７から１０．４までの範囲では炭酸ナトリウム緩衝液を使用した。本酵素はｐＨ７．８〜８．７の間で比較的安定であった。【０１３６】
[分子量の測定]
ゲルろ過クロマトグラフィー法により標準タンパク質の溶出時間と比較して分子量を測定したところ、約２５２,０００（２３０,０００以上、２８０，０００以下）であった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により標準タンパク質との移動度と比較してサブユニット分子量を測定したところ、約４２，０００（３９，０００以上、４５，０００以下）であり、本発明のＤ−アミノ酸オキシダーゼは同一のサブユニットからなる６量体構造であった。【０１３７】
[基質特異性]
精製Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの基質特異性を調べた。前記酵素活性測定における基質ＤＬ−フェニルアラニンをそれぞれの基質に変更し、酵素活性を測定した。表１は、Ｄ−Ｐｈｅに対する活性を１００％としたときの相対活性値を示す。
表１：相対活性値【０１３８】
【表１】
0005291934.tif 000012
【０１３９】
（実施例３）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの内部アミノ酸配列決定
実施例１で精製したＤ−アミノ酸オキシダーゼにリジルエンドペプチダーゼを４Ｍの尿素存在下で作用させた。生成したポリペプチド断片を逆相ＨＰＬＣで精製した後、気相プロテイン・シークエンサーを用いてＤ−アミノ酸オキシダーゼの内部アミノ酸配列を決定した。【０１４０】
（実施例４）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の単離
実施例１と同様の方法でキャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株を培養して得た菌体から、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。【０１４１】
次いで、既知Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ配列相同部位にもとづいて設計したＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１：配列表の配列番号３、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−２：配列表の配列番号４）を用いて、先に得た染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＥｘ  ｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．２５μｌ、１０×Ｅｘ  ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各１μｌを添加し、さらに脱イオン水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９４℃、６０秒）、アニーリング（４０℃、６０秒）、伸長反応（７２℃、６０秒）を３０サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。【０１４２】
その結果、目的のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の一部、塩基数約７５０ｂｐ（部分遺伝子と称す）のＤＮＡ断片を取得した。【０１４３】
次に、目的遺伝子の全長を取得するために以下の操作を行った。上記部分遺伝子において、酵素のＮ末端側、Ｃ末端側それぞれの部分に相当する塩基配列にもとづき、部分遺伝子の外側方向へ向けたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−３：配列表の配列番号５、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−４：配列表の配列番号６）を合成した。このプライマーを用い、先に得た染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩで分解したものをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて環化させて得たＤＮＡを鋳型に、インバースＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件はアニーリング温度を５７℃としたこと以外は、上記と同様にして行なった。【０１４４】
これにより、既に取得した部分遺伝子のさらに外側の遺伝子部分を含む塩基数約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定後、先の部分遺伝子の塩基配列と合わせることで、配列表の配列番号７に示す開始コドンから終止コドンまでを含むＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。その塩基配列の解析から、染色体ＤＮＡより得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子は、２個のエキソンと１個のイントロンを含んでいた。【０１４５】
イントロンを除いたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を取得するために以下の操作をおこなった。まず、実施例１と同様の方法でキャンディダ  インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株を培養して得た菌体から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて調製した全ＲＮＡを鋳型に、TaKaRa RNA LA PCR Kit (AMV) Ver.1.1（ＴａＫａＲａ社製）を用いて相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製した。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃＩの切断部位を結合させた配列を持つプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−５：配列表の配列番号８、Ｐｒｉｍｅｒ−６：配列表の配列番号９）を用いて、この間のＤＮＡを、ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、イントロンを除く配列表配列番号２に示されるオープンリーディングフレームのＤＮＡ断片を取得した。【０１４６】
ＰＣＲの条件は、鋳型としたｃＤＮＡの使用量を５０ｎｇ、アニーリング温度を６０℃としたこと以外は、後述の実施例１０−１と同様にして行なった。【０１４７】
得られたＤＮＡ断片がコードすると推定されるアミノ酸配列が、実施例３で決定したＤ−アミノ酸オキシダーゼの内部アミノ酸配列を含むことを確認し、取得したＤＮＡ断片が実施例１の精製酵素をコードする遺伝子であることを確認した。【０１４８】
（実施例５）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を発現する組換えプラスミドの作成
実施例４で得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｃＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書に基づいて当業者が製造可能）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、図１の制限酵素地図で表され、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計されたｐＣＤＡ００３を取得した。【０１４９】
（実施例６）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを用いた形質転換体の作成
実施例５で得られたプラスミドｐＣＤＡ００３をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１およびＪＭ１０９のコンピテントセルと混合することで形質転換を行い、培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ、寒天１５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）にプレーティングして、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを含有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）またはＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）をコロニーとして取得した。【０１５０】
得られた形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２３から２９時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液０．０５ｍｌを用いて、実施例２に示す方法でＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を測定したところ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性が確認された。【０１５１】
また、上記得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、アンピシリン１００ｍｇ、脱イオン水にて１ｌにメスアップ、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドｐＣＤＡ００３を回収した。【０１５２】
なお、形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）は、２００６年７月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９として（原寄託日２００５年７月１９日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、また形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）は、２００６年７月１０日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８として（原寄託日２００５年６月２８日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番１号）に寄託されている。【０１５３】
（実施例７）精製Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを利用した分割反応によるＬ−アミノ酸又は２−オキソ酸の合成
実施例１で精製したＤ−アミノ酸オキシダーゼ２５μｇ、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを使用して、３０℃で１３時間反応した後、反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ＋（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）、溶離液：ＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）、流速：０．９ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、４７．５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。また、反応液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝３／１で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、２−オキソ酸を定量した。【０１５４】
ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８ＡＲII（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝５／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、反応収率４４．４ｍｏｌ％でフェニルピルビン酸が生成した。【０１５５】
（実施例８）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性菌を利用した分割反応によるＬ−アミノ酸合成
実施例１と同様の方法で培養したキャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株の培養液４ｍｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、２ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁してガラスビーズにより物理的に菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１２５μｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１．２５ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）０．０５μｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２５μｌを使用して、３０℃で１６時間反応した後、反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析した。【０１５６】
ＨＰＬＣ分析は実施例７に示す条件で実施した。その結果、５４．５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度９３．７％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。【０１５７】
（実施例９）形質転換体を利用した分割反応によるＬ−アミノ酸又は２−オキソ酸の合成
実施例６で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）又はＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。それらの粗酵素液を、ＤＬ−フェニルアラニン、ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニン、ＤＬ−ノルバリン、または、β−クロロ−ＤＬ−アラニンのそれぞれに作用させて、対応するＬ−アミノ酸、又は２−オキソ酸を合成した。以下、各合成反応の実施例を示す。【０１５８】
（９−１）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸の合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）の培養液１０ｍｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液１００μｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．９５ｍｌを使用して、３０℃で１８時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。【０１５９】
ＨＰＬＣ分析は実施例７と同条件で実施した。その結果、５０．８ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。また、反応液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝３／１で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、２−オキソ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例７に示す条件で実施した。その結果、反応収率４１．９ｍｏｌ％でフェニルピルビン酸が生成した。【０１６０】
（９−２）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンおよびフェニルピルビン酸の合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液５０μｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．９５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。【０１６１】
ＨＰＬＣ分析は実施例７と同条件で実施した。その結果、４９ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。また、反応液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝３／１で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、２−オキソ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例７に示す条件で実施した。その結果、反応収率４８ｍｏｌ％でフェニルピルビン酸が生成した。【０１６２】
（９−３）ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンからＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンの合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分の菌体から実施例（９−２）と同様に調製した粗酵素液５０μｌ、ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．９５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析した。【０１６３】
ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ＋（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）、溶離液：ＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、５１ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンが得られた。【０１６４】
（９−４）ＤＬ−ノルバリンからＬ−ノルバリンおよび２−オキソ吉草酸の合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分の菌体から実施例（９−２）と同様に調製した粗酵素液５０μｌ、ＤＬ−ノルバリン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．９５ｍｌを使用して、３０℃で１時間反応した。反応液を２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液／メタノール＝１９／１で１０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。【０１６５】
ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ３（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、野村化学社製）＋ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）、溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液／メタノール＝１９／１、流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２５４ｎｍ。その結果、５０．３ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。また、反応液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝３／１で１０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、２−オキソ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８ＡＲII（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝１９／１、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２１０ｎｍ。その結果、変換率５８．８ｍｏｌ％で２−オキソ−吉草酸が生成した。【０１６６】
（９−５）β−クロロ−ＤＬ−アラニンからβ−クロロ−Ｌ−アラニンの合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分の菌体から実施例（９−２）と同様に調製した粗酵素液５０μｌ、β−クロロ−ＤＬ−アラニン５ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．９５ｍｌを使用して、３０℃で１時間反応した。反応液を２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液／メタノール＝１９／１で５倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は、実施例（９−４）と同条件で実施した。その結果、４７．１ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度９９．２％ｅｅのβ−クロロ−Ｌ−アラニンが得られた。【０１６７】
（実施例１０）形質転換体を利用したＬ−アミノ酸の合成
実施例６で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）、およびＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）を各培養液から遠心分離により集菌し、それぞれ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を培養液から遠心分離により集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。また、後述する方法で得たフェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を各培養液から遠心分離により集菌し、それぞれ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。それらの粗酵素液を、ＤＬ−フェニルアラニン、ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニン、β−クロロ−ＤＬ−アラニン、ＤＬ−ノルバリン、またはＤＬ−ロイシンのそれぞれに作用させて、立体反転反応により対応するＬ−アミノ酸を合成した。【０１６８】
ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液は次のようにして得た。ギ酸脱水素活性を有する形質転換体であるエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴ００２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７３）を、試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。また、後述する参考例１に示す方法で育種したフェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体、および後述する参考例２に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の培養液のそれぞれは次のようにして得た。フェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体およびロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体のそれぞれを、試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種して、３０℃で２４時間振とう培養した。【０１６９】
（１０−１）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンの合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）の培養液１０ｍｌ分、前記のフェニルアラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ+０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１３時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で５０倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。【０１７０】
（１０−２）ＤＬ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニンの合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分、前記のフェニルアラニン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られた粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ+０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析によるアミノ酸の定量は実施例７と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−フェニルアラニンが得られた。【０１７１】
（１０−３）ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンからＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンの合成
上記実施例（１０−２）と同様に調製した各形質転換体の粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ−４−フルオロ−フェニルアラニン１０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＮＡＤ+０．１８ｍｇ、ギ酸アンモニウム７．０ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８５ｍｌを使用して、３０℃で１９時間反応した。反応液をＨＣｌＯ4水溶液（ｐＨ１．５）で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例（９−３）と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸１０３ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−４−フルオロ−フェニルアラニンが得られた。【０１７２】
（１０−４）ＤＬ−ノルバリンからＬ−ノルバリンの合成
前記のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の培養液１０ｍｌ分、前記のロイシン脱水素酵素活性形質転換体の培養液１０ｍｌ分、前記のギ酸脱水素酵素活性形質転換体培養液１０ｍｌ分の各菌体を、遠心分離により集菌し、それぞれ１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離し、上清を粗酵素液として回収した。得られたエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の粗酵素液１００μｌ、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の各粗酵素液をそれぞれ５０μｌ、ＤＬ−ノルバリン５０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１０μｌ、ＮＡＤ+０．８９ｍｇ、ギ酸アンモニウム１６．１ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌを使用して、３０℃で３時間反応した。反応液を２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液／メタノール＝１９／１で１００倍希釈して、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。ＨＰＬＣ分析は実施例（９−４）と同条件で実施した。その結果、対ラセミ体アミノ酸９５．６ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。【０１７３】
（１０−５）ＤＬ−ロイシンからＬ−ロイシンの合成
上記１０−４と同様に調製したエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３８）の粗酵素液３０μｌ、ロイシン脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液２５μｌ、およびギ酸脱水素酵素活性形質転換体の粗酵素液１００μｌ、ＤＬ−ロイシン５０ｍｇ、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１０μｌ、ＮＡＤ+０．８９ｍｇ、ギ酸アンモニウム１６．１ｍｇ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌを使用して、３０℃で６時間反応した。反応液をＭｉｌｌｉＱ水にて５０倍希釈後、１ＮＨＣｌにて反応を停止し、遠心上清をＨＰＬＣで分析し、アミノ酸を定量した。【０１７４】
ＨＰＬＣ分析は次に示す条件で実施した。カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）、溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ4水溶液／２−プロパノ−ル＝１９／１、流速：０．９ｍｌ／ｍｉｎ．、カラム温度：３０℃、検出：２５４ｎｍ。その結果、対ラセミ体アミノ酸１０３．１ｍｏｌ％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ロイシンが得られた。【０１７５】
（参考例１）フェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株を滅菌した培地（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌後、３０℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、Ｍａｒｍｕｒ法を用いて染色体ＤＮＡを得た。Bisci. Biotechnol. Biochem.、1995年、59巻、10号、1994頁で公知であるバチルス・バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株のフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子の塩基配列を基に、遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｓｔＩを結合させたＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−７：配列表の配列番号１０、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−８：配列表の配列番号１１）を設計し、前記染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件はアニーリング温度を５０℃としたこと以外は、後述の実施例１１−１と同様にして行なった。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書に基づいて当業者が製造可能）とをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、フェニルアラニン脱水素酵素を大量に発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、フェニルアラニン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。【０１７６】
（参考例２）ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）ＮＢＲＣ３３４１株を滅菌した培地Ｃ（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌後、３０℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、Ｍａｒｍｕｒ法（J.Mol.Biol.,3,208(1961)参照）を用いて得た染色体ＤＮＡを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−９：配列表の配列番号１２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１０：配列表の配列番号１３）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件はアニーリング温度を５０℃としたこと以外は、後述の実施例１１−１と同様にして行なった。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＴ（ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）のＮｄｅＩサイトを破壊したプラスミドベクター）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを取得した。【０１７７】
得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを回収した。【０１７８】
（実施例１１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸脱水素酵素、及び補酵素再生能を有する酵素の活性を有する形質転換体の作成
（１１−１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
実施例６で得られた、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼを発現できるように設計された発現プラスミドｐＣＤＡ００３を鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１１：配列表の配列番号１４、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１２：配列表の配列番号１５）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇにＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．２５μｌ、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＢｕｆｆｅｒII（タカラバイオ社製）５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ溶液４μｌ、２０μＭプライマー水溶液各２μｌを添加し、さらに脱イオン水を加えて総量が５０μｌになるように調整した反応液を調製し、熱変性（９６℃、３０秒）、アニーリング（６０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、９０秒）を２５サイクル繰り返した後、４℃まで冷却することにより行なった。【０１７９】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、後述の参考例４で得られたロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＬＢをそれらの酵素で切断した断片とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計された図７に示すプラスミドｐＦＴＬＢＤＡを取得した。【０１８０】
得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセル（タカラバイオ社製）と混合し形質転換を行なうことで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢＤＡ）を育種した。【０１８１】
（１１−２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
後述の参考例４で得られたロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＬＢ、及び後述の参考例６で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを発現できるように設計されたプラスミドｐＳＴＮＤＡの両者を、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ, ｐＳＴＮＤＡ）を育種した。【０１８２】
（１１−３）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
実施例６で得られた、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現できるように設計された発現プラスミドｐＣＤＡ００３を鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１３：配列表の配列番号１６、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１４：配列表の配列番号１７）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は実施例１１−１と同様にして行なった。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、後述の参考例５で得られたフェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＰＢをそれらの酵素でした断片とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。リガーゼ反応で得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行ない、得られた形質転換体のうち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素と同方向になるように挿入されたプラスミドを保持しているものを、プラスミドのＤＮＡ配列をシークエンスすることにより選択した。この結果、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現するように設計された図８に示すプラスミドｐＦＴＰＢＤＡを取得した。【０１８３】
このプラスミドｐＦＴＰＢＤＡをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し、再度形質転換を行なうことで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢＤＡ）を育種した。【０１８４】
（１１−４）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体の作成
後述の参考例５で得られたフェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＰＢ、及び後述の参考例６で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼを発現できるように設計されたプラスミドｐＳＴＮＤＡの両者をエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢ, ｐＳＴＮＤＡ）を育種した。【０１８５】
（実施例１２）形質転換体を用いたＤ−アミノ酸オキシダーゼの生産
実施例１１、後述の参考例６、及び実施例６にて得られた各形質転換体のそれぞれを、滅菌した表２に示す各培地に植菌後、３０℃で２４時間振とうして好気的に培養した。【０１８６】
得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して超音波により菌体を破砕した後、遠心分離により菌体由来の不溶物を除去して、形質転換体のＤ−アミノ酸オキシダーゼ酵素液を取得した。得られた酵素液を用いて、以下に示す方法でＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を測定した結果を表２に示す。【０１８７】
この結果より、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を単独で有する形質転換体エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）、及びエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＳＴＮＤＡ）に比べて、同Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子と共にロイシン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢＤＡ）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ, ｐＳＴＮＤＡ）、及び同Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子と共にフェニルアラニン脱水素酵素遺伝子、及びギ酸脱水素酵素遺伝子を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢＤＡ）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢ, ｐＳＴＮＤＡ）が高いＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を示した。
（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性活性測定方法）
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性測定は、実施例２に示す方法で行った。【０１８８】
【表２】
0005291934.tif 000013
【０１８９】
（実施例１３）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したＬ−ノルバリンの合成
実施例１１−１で得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢＤＡ）を、滅菌した培地Ａ（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリン０．０１％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしアンピシリンは滅菌後に添加する）に植菌後、３３℃で４８時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁した。ラセミ体ノルバリン１００ｍｇに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性１３ｕ分の上記菌体懸濁液、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）２μｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ２μｌ、ＮＡＤ０．５９ｍｇ、及びギ酸アンモニウム４３ｍｇを添加し、さらに５Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して２ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて３０℃にて振とうし、２Ｎ硫酸にて８．０にコントロールしながら８時間反応した。生成したＬ−ノルバリンの収率、及び光学純度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した結果、ラセミ体に対し９３．３％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。【０１９０】
この結果より、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体とロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用した後述の比較例１と比較して、菌体を破砕しなくとも高い反応性を示すことが示された。
（ＨＰＬＣ分析条件）カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、住化分析センター社製）、移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液／メタノール＝９５／５、流速：１ｍｌ／分、カラム温度：３０℃、検出：２５４ｎｍ【０１９１】
（実施例１４）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体を利用したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの合成
実施例１３と同様の方法にて培養した形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢＤＡ）の培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁して菌体懸濁液とした。この懸濁液の一部を超音波処理にかけることにより菌体を破砕して、粗酵素液を調製した。【０１９２】
ラセミ体ｔｅｒｔ−ロイシン５０ｍｇに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性２０ｕ分の上記菌体懸濁液、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）５μｌ、ＮＡＤ０．７９ｍｇ、及びギ酸アンモニウム１９ｍｇを添加し、さらに５Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して１ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて３０℃にて振とうし、２Ｎ硫酸にて８．０にコントロールしながら４２時間反応した。生成したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率及び光学純度を実施例３と同様の方法にて分析した結果、ラセミ体に対し９３．３％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが得られた。【０１９３】
また、菌体懸濁液の代わりに上記粗酵素液を同量使用した場合は、ラセミ体に対し９３．３％の反応収率で、光学純度８３．２％ｅｅのＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンが得られた。これらの結果から、粗酵素液を使用する場合よりも、未破砕の菌体（菌体懸濁液）を使用する場合のほうが反応性が向上することがわかった。【０１９４】
（比較例１）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用したＬ−ノルバリンの合成
実施例６で得られた、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３９）を、滅菌した培地Ａに植菌後、３７℃で３０時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波処理にかけることにより菌体を破砕して、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを含む粗酵素液を得た。また、後述する参考例４に示す方法で育種したロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を、滅菌した培地Ａに植菌後、３３℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、脱イオン水にて菌体濃度が培養液の１０倍になるように懸濁した。懸濁液の一部を超音波により菌体を破砕して、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を含む粗酵素液を得た。【０１９５】
ラセミ体ノルバリン５０ｍｇに、上記エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＣＤＡ００３）の菌体懸濁液を実施例１３の場合と同量、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を実施例１３の場合と同量、カタラーゼ（Ｃａｔａｚｙｍｅ２５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）１μl、ＮＡＤ０．３０ｍｇ、及びギ酸アンモニウム１６ｍｇを添加し、さらに５Ｍアンモニア水溶液を用いてｐＨを８．０に調整した後、脱イオン水を添加して１ｍｌになるよう反応液を調製した。この反応液を試験管に入れて３０℃にて振とうし、２Ｎ硫酸にて８．０にコントロールしながら９時間反応した。生成したＬ−ノルバリンの収率及び光学純度を実施例３と同様の方法にて分析した結果、ラセミ体に対し７８．３％の反応収率で、光学純度４７．９％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。【０１９６】
また、各形質転換体の菌体懸濁液の代わりに粗酵素液を同量使用して同様の反応を行なった場合は、ラセミ体に対し７９．５％の反応収率で、光学純度１００％ｅｅのＬ−ノルバリンが得られた。この結果から、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性を有する形質転換体と、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素の活性を有する形質転換体とを利用したＬ−ノルバリンの製造においては、未破砕の菌体を使用すると反応性が低下することが示された。【０１９７】
（参考例３）ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
チオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）ＫＮＫ６５ＭＡ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７１）の培養菌体から国際公開第ＷＯ０３／０３１６２６号に記載の方法に従って得た染色体ＤＮＡを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１５：配列表の配列番号１８、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１６：配列表の配列番号１９）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件はアニーリング温度を５０℃としたこと以外は、実施例１１−１と同様にして行なった。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報の明細書の記載に基づいて当業者が製造可能）とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドをエシェリヒア  コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体を育種した。【０１９８】
得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを回収した。【０１９９】
（参考例４）ロイシン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
参考例２で得られたロイシン脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドをＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切断し、ロイシン脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて回収し、回収したそのＤＮＡ断片と、参考例３で得られたギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを同酵素で切断した断片とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、ロイシン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を大量に発現できるように設計された図９に示すプラスミドｐＦＴＬＢを取得した。【０２００】
得られたプラスミドｐＦＴＬＢをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、ロイシン脱水素酵素活性及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を育種した。【０２０１】
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＬＢ）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、ロイシン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＬＢを回収した。【０２０２】
（参考例５）フェニルアラニン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体の育種
バチルス・バディウス（Bacillus badius）ＩＡＭ１１０５９株を滅菌した培地（トリプトン１．０％、イーストエキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０）に植菌後、３０℃で４８時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌して得た培養菌体から、Ｍａｒｍｕｒ法を用いて得た染色体ＤＮＡを鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１７：配列表の配列番号２０、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−１８：配列表の配列番号２１）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件はアニーリング温度を５０℃としたこと以外は、実施例１１−１と同様にして行なった。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで切断し、そのＤＮＡ断片と、参考例３で得られたギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドを同酵素で切断した断片とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、フェニルアラニン脱水素酵素及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計された図１０に示すプラスミドｐＦＴＰＢを取得した。【０２０３】
得られたプラスミドｐＦＴＰＢをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで、フェニルアラニン脱水素酵素活性、及びギ酸脱水素酵素活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢ）を育種した。【０２０４】
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＦＴＰＢ）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ａに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミド抽出を行い、フェニルアラニン脱水素酵素、及びギ酸脱水素酵素を発現できるように設計されたプラスミドｐＦＴＰＢを回収した。【０２０５】
（参考例６）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体の育種
ベクタープラスミドｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）を鋳型に、ＤＮＡプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ−１９：配列表の配列番号２２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ−２０：配列表の配列番号２３）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は実施例１１−１と同様にして行なった。ＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＮｅｄＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて再結合することで、同ベクタープラスミドのマルチクローニングサイト近傍にＮｅｄＩサイトが挿入されたベクタープラスミドを取得した。【０２０６】
得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことで得られた形質転換体を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、クロラムフェニコール０．０１％、脱イオン水に溶解、滅菌前ｐＨ７．０、ただしクロラムフェニコールは滅菌後に添加する）に植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドを回収した。【０２０７】
次いで、実施例６で得られた、キャンディダ・インターメディア（Candida intermedia）ＮＢＲＣ０７６１株由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼを発現できるように設計された発現プラスミドｐＣＤＡ００３を制限酵素ＮｄｅＩとＳａｃＩで切断し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴａＫａＲａＲＥＣＯＣＨＩＰ（タカラバイオ社製）を用いて回収し、回収したそのＤＮＡ断片と、同酵素で切断した上記方法で得られたプラスミドとを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合することで、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを発現できるように設計された図１１に示すプラスミドｐＳＴＮＤＡを取得した。【０２０８】
得られたプラスミドをエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１のコンピテントセルと混合し形質転換を行なうことでＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＳＴＮＤＡ）を得た。得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＨＢ１０１（ｐＳＴＮＤＡ）を、試験管内にて滅菌した６ｍｌの培地Ｃに植菌後、３７℃で２４時間、振とうして好気的に培養した。得られた培養液から遠心分離により菌体を集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドｐＳＴＮＤＡを回収した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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