(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体と、インスリンを生産するように遺伝子的に改変された一次セルトーリ細胞を含む糖尿病治療用の医薬組成物。
【請求項２】
医薬上許容される担体と、第ＩＸ因子を生産するように遺伝子的に改変された一次セルトーリ細胞を含む血友病Ｂ治療用の医薬組成物。
【請求項３】
医薬上許容される担体と、Ｂ−ＵＧＴを生産するように遺伝子的に改変された一次セルトーリ細胞を含むクリグラー−ナジャー（ＣＮ）病治療用の医薬組成物。
【請求項４】
医薬上許容される担体と、ヘモグロビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｐ５３、網膜芽細胞腫抑制因子（ＲＢ）、肥満細胞成長因子（ＭＧＦ）、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１、第ＸＩＩＩ因子、またはドーパミンを生産するように遺伝子的に改変された一次セルトーリ細胞を含む哺乳動物の健康を改善するための医薬組成物。
【請求項５】
前記セルトーリ細胞が、トランスジェニック動物から単離されたものであり、且つ、ラット、マウス、ブタ、またはウシ由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記セルトーリ細胞がブタ由来である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記セルトーリ細胞が、生体外遺伝子導入によって、遺伝子的に改変された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記セルトーリ細胞がヒト、ラット、マウス、ブタ、またはウシ由来である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記セルトーリ細胞がブタ由来である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  病気に罹った患者への健康な器官または細胞の移植片は、しばしば、外来性組織または細胞に応答して開始された免疫応答のため組織(body)により拒絶される。遺伝子治療時に投与された遺伝子的に改変された細胞は、しばしば、同様の免疫応答に遭遇する。本発明は細胞移植の方法を提供し、ここに、免疫学的特権部位が創製され、このように、慣用的移植および遺伝子治療に関連した拒絶を軽減する。
【０００２】  具体的には、本発明は、生物学的因子またはその中間体を生産するように遺伝子的に操作されたセルトーリ細胞の治療上有効量を個体に導入することを含み、ここに、前記セルトーリ細胞は免疫学的特権部位を創製することを特徴とする生物学的因子またはその中間体を個体に供給するための組成物および方法を提供する。また、生物学的因子を生産する遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を含む医薬組成物も提供される。
【０００３】  ある種の慢性病は患部器官中の機能的細胞を破壊する。そのような病気を持った個体は、しばしば、ホメオスタシスを維持するのに必要な蛋白質または他の生物学的産物を生産することができず、通常、生存するには多数の外来性物質を必要とする。病気に罹った個体の生命を救うために、個体への健康な器官または細胞の移植が必要になる場合がある。このタイプの治療は、一般に、致命的な疾患を治癒するための最終的な選択肢と考えられている。しかしながら、そのような移植は、しばしば、外来性組織または細胞に応答して開始された免疫応答のため組織によって拒絶される。現在、この免疫応答と戦うための唯一頼みとするものは、慢性非特異的免疫抑制剤を投与することである。しばしば、非特異的免疫抑制剤を使用すると、感染、高血圧、腎不全および腫瘍増殖に対する感受性が増大する等の望ましくない副作用が伴う。
【０００４】  細胞および器官移植の分野において、Ｓｅｌａｗｒｙらは、睾丸から単離して異種部位に移植した場合に、セルトーリ細胞を用いて人工的特権環境(Artificial Privileged Environments)を創製できることを証明した。特権環境は、同種異系および異種間セルトーリ細胞を共に用いて創製されてきた。ＲａｊｏｔｔｅおよびＫｏｒｂｕｔｔ，１９９７  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：３１７−３２２。同様に、ラットセルトーリ細胞同種異系片およびブタセルトーリ細胞異種移植片は、サイクロスポリンＡ免疫抑制なしにラット脳において少なくとも２カ月間生存することが示されている。Ｓａｐｏｒｔａ，Ｓ．ら，１９９７  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １４６（２）：２９９−３０４。また、Ｓｅｌａｗｒｉらは、セルトーリ細胞と共移植した場合、ラット腎臓嚢に入れた島細胞の免疫保護を示した。糖尿病ラットモデルにおける長期島生存および機能的回復が示されている。Ｓｅｌａｗｒｙ，Ｈ．ら，１９９３  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２：１２３−１２９。最近、セルトーリ細胞が睾丸にその免疫特権状態を供する全部または一部を担う免疫抑制因子Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）を発現することが示唆されている。Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｐ．Ｒ．ら，１９９７  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６（２）：１９１−１９３；Ｓａｐｏｒｔａ，Ｓ．ら，前掲。
【０００５】  遺伝子治療の間における遺伝子的に改変された細胞の免疫拒絶もまた依然として問題である。前記問題を克服するために、自己細胞、すなわち、患者自身の細胞を用いることができる。事実、現在認可されているヒト遺伝子治療プロトコルのほとんどは自己細胞の遺伝子改変に依存する。しかしながら、そのような細胞は、患者の病気状態のため得るのは困難であり得、しばしば、収穫中に破壊される。収穫で生き延びた細胞は、しばしば、インビトロで増殖させるのが困難であり、複雑な培養条件および精製法を必要とする。
【０００６】  従って、生物学的因子を生産するように遺伝子的に改変された細胞が容易に入手でき、かつインビトロでより容易に操作される対象において生物学的因子を生産するための組成物および方法に対する要望がある。加えて、慢性免疫抑制を要する免疫応答をトリガしない同種異系および異種間細胞を受容する対象において、生物学的因子を生産するための組成物および方法に対する要望が存在する。
【０００７】  本発明は、生物学的因子またはその中間体を生産するように遺伝子的に操作されたセルトーリ細胞の治療上有効量を個体に導入することを含み、ここに、セルトーリ細胞は免疫学的特権部位を創製することを特徴とする生物学的因子またはその中間体を個体に供給するための組成物および方法を提供する。
【０００８】  また、本発明は、生物学的因子または前記生物学的因子の中間体を生産するように遺伝子的に形質転換されたセルトーリ細胞の治療上有効量を、治療を必要とする対象に投与することを含み、ここに、前記セルトーリ細胞が免疫学的特権部位を創製することを特徴とする生物学的因子の欠乏に由来する病気を治療する方法を提供する。
【０００９】  好ましくは、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞は移植により投与される。移植は異種移植片または同種移植片によることができる。
【００１０】  また、本発明は、医薬上許容される担体と混合された、生物学的因子またはその中間体を生産するために、遺伝子的に形質転換されたセルトーリ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】  また、生物学的因子またはその中間体を生産するために、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を含有するのに適した第１の容器を含む区画化キットが提供される。
【００１２】  また、生物学的因子またはその中間体についてのコーディング配列に作動可能に連結したセルトーリ細胞で機能するプロモータを５’ないし３’方向に含むベクターも、本発明によって提供される。さらに、このベクターは、セルトーリ細胞で機能する３’末端配列および／またはシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含むこともできる。前記シグナル配列は、前記プロモータ配列から下流であって、生物学的因子または中間体についてのコーディング配列の上流に位置する。
【００１３】  また、前記目的のベクターを含むセルトーリ細胞も提供される。
【００１４】  本発明は対象において生物学的因子を生産するための組成物および方法を提供する。前記組成物および方法は対象による免疫破壊からそれ自体を保護し、それにより、慢性免疫抑制の必要性を排除する。
【００１５】  本発明によると、セルトーリ細胞、男性睾丸の圧倒的な細胞を用いて、蛋白質のような生物学的因子をインビボで生産させる。生物学的因子を生産するのに使用する前記セルトーリ細胞は、遺伝子的に改変されており、エクスビボ遺伝子トランスファーによって創製され、あるいはセルトーリ細胞で生物学的因子を発現するトランスジェニック動物から単離される。次いで、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞は、生物学的因子が対象で生産されるように前記対象に導入される。また、得られた移植セルトーリ細胞は、所望の生物学的因子を生産することに加えて、移植部位において免疫特権環境を創製する。
【００１６】  好ましくは、導入の経路は、腎臓被膜下空間、皮下面、肝臓被膜下空間、脳、肝臓門静脈または大網嚢のような部位への皮下移植による。また、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞は、血管系との接触を可能とし、セルトーリ細胞を局所化させ、セルトーリ細胞を長期に生存させる生体適合性デバイスに入れることもできる。また、そのようなデバイスは、免疫系による拒絶からの、さらなる保護も提供する。そのような生体的合成デバイスの例は、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらに発行された米国特許第５，１８２，１１１号に記載される。アルギン酸塩または熱可塑性カプセルおよび中空繊維のような免疫−単離デバイスもまたインビボにて遺伝子的に改変された細胞を収容することができる。そのようなデバイスはＣｈａｎｇ，Ｐ．Ｌ．１９９７  ＩＥＥＥ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９月／１０月、１４５−１５１頁において調べられている。
【００１７】  本発明によると、セルトーリ細胞において生物学的因子を発現するトランスジェニック動物は、無限数の現在利用できるシステムを用いて作成することができる。例えば、生物学的因子または中間体についてのコーディング配列に作動可能に連結したセルトーリ細胞で機能するプロモータを有する発現構築体を用いて、ミクロ粒子衝撃およびエレクトロポレーションによって生きたマウスの睾丸をトランスフェクトすることができる。Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｔ．ら，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．２３３（１）：４５−４９。また、そのような構築体を、Ｈｏｇａｎら（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているように標準的な手法によって、前核にミクロ注入することもできる。
【００１８】  本発明は、治療上有効量の生物学的因子またはその中間体を供給することによって個体の一般的健康、幸福または外観を改善するのに有用であるか、または生物学的因子の欠乏に由来する病気を治療するのに有用である。
【００１９】  本発明によって定義されるように、生物学的因子は、細胞の代謝およびホメオスタシスに必要な蛋白質または非蛋白質化合物である。さらに、本発明によると、生物学的因子は特定の病気に罹った対象において存在せず、欠乏しているまたは改変された蛋白質または非蛋白質化合物である。本明細書中で用いるように、用語「蛋白質」は、限定されるものではないが、ペプチドおよびポリペプチドを含む。生物学的因子は、セルトーリ細胞の免疫抑制および成長増強特性を増強する蛋白質であり得る。生物学的因子は非蛋白質化合物である場合、セルトーリ細胞は遺伝子工学により作成されて、非蛋白質化合物の生合成経路中の１以上の工程に必要な蛋白質である酵素のような蛋白質を生産させる。このように、セルトーリ細胞は、非蛋白質生物学的因子に対する蛋白質中間体を生産するように作成することができる。
【００２０】  セルトーリ細胞の組換えにより生産された蛋白質は、無数の構造、治療的もしくは生物学的機能的蛋白質、すなわち、生物学的機能性蛋白質が発現される、あるいはそれに対してそれが投与される細胞の細胞メカニズムに影響するポリペプチドまたは蛋白質を含むことができる。例えば、生物学的に機能性蛋白質は、生物学的機能性蛋白質が発現されるセルトーリ細胞の細胞メカニズムに影響する蛋白質であり得る。また、生物学的機能性蛋白質は、哺乳動物において過小生産される蛋白質の増大した量を提供することによって、あるいは哺乳動物に存在し得る望まれない分子を阻害または逆作用する蛋白質を提供することによって、失われた蛋白質を供給することにより哺乳動物の健康を改善する蛋白質でもあり得る。また、生物学的因子は、個体の健康および幸福を維持するかまたは改良するのを助ける因子でもあり得、例えば、食欲を刺激し、または減少させるペプチドを含む。
【００２１】  生物学的機能性蛋白質は、細胞の正常な増殖または修復に必須の蛋白質であり得る。生物学的機能性蛋白質は、癌、アテローム性動脈硬化症、鎌状細胞貧血およびサラセミアのような病気と戦うのに有用なものであり得る。そのような生物学的機能性蛋白質の実施例はヘモグロビン（α、βまたはγ−グロビン）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）のような造血系成長因子である。もう１つの実施例は、癌、特に腫瘍を治療するのに用いることができる分子である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。また、腫瘍サプレッサーｐ５３および網膜芽腫（ＲＢ）も考慮される。肥満細胞成長因子（ＭＧＦ）およびインターロイキン１−１１のような種々のサイトカインもまた、本発明の遺伝子的た改変されたセルトーリ細胞による生産で考えられる蛋白質である。（血友病Ａの治療用の）第ＸＩＩＩ因子、（血友病Ｂの治療用の）第ＩＸ因子、（免疫保護を提供するセルトーリ細胞の能力を増強するための）ＩＬ−２、（糖尿病の治療用の）インスリン、および（パーキンソン病の治療用の）ドーパミンもまた、本発明によるセルトーリ細胞によって生産することができる蛋白質の実施例である。
【００２２】  Ｂ−ＵＧＴは、クリグラー−ナジヤー（ＣＮ）病の治療のために対象の遺伝子的に改良されたセルトーリ細胞によって作成することができる蛋白質のさらにもう１つの実施例である。哺乳動物は、通常、ビリルビン（ヘモグロビン分解の最終産物）をグルクロン酸で抱合し、前記分子をより水溶性かつ排泄可能とする肝臓酵素であるビリルビン  ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（Ｂ−ＵＧＴ）を有する。クリグラー−ナジャー（ＣＮ）病を持つ患者はＢ−ＵＧＴが欠乏し、高血清中レベルのビリルビンが蓄積する。ＧｕｎｎラットもまたＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼの遺伝的欠乏のためビリルビン抱合できない。組換えＢ−ＵＧＴを発現するＧｕｎｎラット繊維芽細胞は、Ｇｕｎｎラットに腹腔内移植され、その結果遺伝子血管が修正される。
【００２３】  このように、組換えＤＮＡ手段を通じて生産できるいずれの蛋白質も、対象の遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞による生産で、および本発明の方法での使用で考えられる。所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列の調製のための多くのよく知られた手法が存在する。例えば、種々の長さのオリゴヌクレオチドは公知の手法によって合成することができる。いくつかのそのようなオリゴヌクレオチドはより長い二本鎖分子に組み立てることができる。別法として、所望のクローニング配列を有するＤＮＡ分子は、逆転写酵素の作用（ｃＤＮＡクローニング）のために鋳型として所望のポリペプチドに関連するメッセンジャーＲＮＡを用い、酵素逆転写酵素の使用によって合成することができる。所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を調製するためのもう１つの可能性は、遺伝子バンクまたはライブラリーから得られたゲノムＤＮＡ断片のクローニングである。多くの実施例において、注目する蛋白質をコードするＤＮＡは商業的に入手できる。
【００２４】  いくつかの例において、組換え生産された蛋白質は、生産されたセルトーリ細胞に効果を発揮するにおいて有益である。ＩＬ２はそのような蛋白質の例である。しかしながら、他のほとんどの例において、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の組換えにより生産された蛋白質は、そのような蛋白質が他の非−セルトーリ細胞に到達した場合のみ役に立つ。このように、本発明の好ましい実施形態において、組換え生産蛋白質はセルトーリ細胞膜を横切ってセルトーリ細胞の外に輸出される、すなわち、分泌される。本発明のこの態様において、組換え生産蛋白質はそのＮ−末端にシグナルペプチド（Ｎ−末端リーダー配列）を有するであろう。シグナルペプチドは、それが生産されるセルトーリ細胞の外部への、および細胞間空間および周囲の細胞の毛細血管への組換え生産蛋白質の輸送を可能とする。一旦セルトーリ細胞の外へ輸送されると、組換え生産細胞は対象の循環系に侵入する。
【００２５】  シグナルペプチドは、それからプロモータが由来する同一遺伝子、例えば、ＦＳＨＲによってコードされ得る。本発明のこの実施形態において、組換え生産蛋白質は、最もしばしば、キメラ蛋白質である。また、組換え生産蛋白質の天然シグナルペプチドも使用することができる。さらにもう１つの実施形態において、シグナルペプチドは、組換え生産蛋白質以外の蛋白質、またはその対応する遺伝子が発現ベクターのためのプロモータを提供する蛋白質からのものであってよい。多くの異なる蛋白質はそれらのＮ−末端にシグナルペプチドを有する。当業者であれば、シグナルペプチドをコードする、シグナル配列として知られている多くの異なる配列を認識している。そのようなシグナル配列は、セルトーリ細胞からの組換え生産蛋白質の分泌を確実にするための、本発明の発現ベクターへの取り込みで有用である。
【００２６】  所望の生物学的因子を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞は、まず、Ｃｈａｎｇら，１９８７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１２７６８−１２７７９に記載されているもののような当該分野で知られている方法を用いて単離される。セルトーリ細胞は、慣用的技術を用い、ライディヒ細胞、周細管性細胞および生殖細胞のような他の睾丸細胞から分離することができる。例えば、ライディヒ細胞は、トリプシンおよびＤＮａｓｅのような消化剤を用いて組織懸濁液から取り出すことができる。残りの細胞懸濁液は、次いで、数回の遠心によって洗浄する。ペレットをコラゲナーゼに再懸濁し、インキュベートし、遠心によって洗浄して睾丸内の周細管性細胞を排除する。
【００２７】  睾丸生殖細胞は、ペレットをヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅと共にインキュベートすることによって取り出すことができる。遠心による数回の洗浄の後、セルトーリ細胞を遺伝的形質転換のために収集することができる。セルトーリ細胞を単離する同様の方法は、Ｓｅｌａｗｒｙ，Ｈ．Ｐ．およびＣａｍｅｒｏｎ、Ｄ．Ｆ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２：１２３−１２９；およびＫｏｒｂｕｔｔ，Ｇ．Ｓ．，ら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：３１７−３２２に記載されている。
【００２８】  また、確立されたセルトーリ細胞系を用いて、本発明により生物学的因子を生産することもできる。例えば、不滅化ラットセルトーリ細胞系（ＳｅｒＷ３）が確立されている。Ｐｏｇｎａｎ，Ｆ．ら，１９９７  Ｃｅｌｌ  ＢｉｏｌｏｇｙおよびＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １３：４５３−４６３。新鮮な一次ラットセルトーリ細胞は、異種細胞を不滅化するがそれを形質転換しないことが知られているシミアンウイルスのＴ抗原（ＳＶ４０）で不滅化された。前記ＳｅｒＷ３  セルトーリ細胞系は、培養中の一次細胞または睾丸片中のセルトーリ細胞と同様の構造的および生化学的特性を有する。Ｐｏｇｎａｎ  Ｆ．、前掲。また、９３ＲＳ２として知られている思春期前ラットセルトーリ細胞も最近開発されている。Ｊｉａｎｇ，Ｃ．ら，１９９７  Ｊ．Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ  １８（４）：３９３−３９９。また、条件により不滅化されたセルトーリ細胞系もＨ−２Ｋｂ−ｔｓＡ５８トランスジェニックマウスから確立されている。Ｗａｌｔｈｅｒ  Ｎ．ら，１９９６  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２５：４１１−４２１。
【００２９】  本発明により、一次または培養されたセルトーリ細胞を用いて生物学的因子を生産することができる。一次細胞または培養細胞であるかを問わず、本発明のセルトーリ細胞はラット、ヒト、ブタ、ネズミ、ウシまたは他の種のような種から得ることができる。これらの距離をおいて関連するセルトーリ細胞は「普遍的」生物学的因子生産細胞として機能する。というのは、投与に際し、そのような細胞は、距離をおいて関連したまたは関連しない受容体対象においてさえ免疫拒絶をトリガしないからである。
【００３０】  本発明によると、単離されたセルトーリ細胞は遺伝子的に改変して、いずれかの数のよく知られた方法を用いて所望の生物学的因子を生産することができる。例えば、特定の蛋白質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を、まず、セルトーリ細胞内で複製できるベクター内に入れる。このように、本発明は、セルトーリ細胞における蛋白質の発現用のベクターも提供する。前記ベクター内では、特定の蛋白質についてのコーディング配列は、セルトーリ細胞を含めた、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イノシシまたはヒツジ細胞で機能するプロモータにその５’末端にて作動可能に連結している。好ましい実施形態において、ベクターは、コーディング配列の３’末端に作動可能に連結した３’末端配列も含有する。
【００３１】  本発明のベクターは、当業者に知られた標準的な技術によって構築することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、または広く利用できる組換えＤＮＡ技術の膨大な実験マニュアルのいずれかで見い出すことができる。種々の戦略がＤＮＡの断片を連結するのに利用でき、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、それは当業者によって容易に決定することができる。
【００３２】  本発明のベクターは、ベクターの増殖、単離およびサブクローニングを促進するための他の配列；例えば、細菌および宿主細胞中での増殖および選択を可能とする選択マーカ遺伝子および複製起点を含有することもできる。選択マーカ遺伝子は、細菌中での増殖のためのアンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性遺伝子または哺乳動物細胞中での選択のためのネオマイシン、ヒグロマイシンまたはゼオシン抵抗性を含むことができる。構造、治療もしくは生物学的機能性蛋白質をコードする異種遺伝子についての配列、ならびに選択マーカおよびレポータ遺伝子についての配列は当業者によく知られている。レポータ遺伝子の実施例はＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、およびβ−ガラクトシダーゼを含む。「異種遺伝子」とは、セルトーリ細胞に人工的に導入されるコーディング配列またはその部分を意味する。
【００３３】  誘導性発現系が現在利用でき、ここに、外因的に投与された因子は遺伝子発現を誘導するように機能する。かかる系は、本発明の発現ベクターで形質転換されているセルトーリ細胞の選択で特に有用である。Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから入手できるＲＥＶ  ＴＥＴ−ＯＮＴＭおよびＲＥＶ  ＴＥＴ−ＯＦＦＴＭシステム、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能なＥｃｄｙｓｏｎｅ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍがこの点において特に助けになる。
【００３４】  セルトーリ細胞で機能するプロモータは当業者に知られている。例えば、トランスフェリンまたはクラステリンについてのプロモータを用いることができる。所望の生物学的因子または中間体の発現をセルトーリ細胞のみに限定するために、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）プロモータを使用することができる。本発明のベクターで用いることができる他のプロモータ、末端配列を含めた、上流５’調節配列および３’調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアン４０（ＳＶ４０）、モロニーネズミ白血病（ＭｏＭＬＶ）ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）、エプスタン−バールウイルス（ＥＢＶ）からの配列を含む。
【００３５】  クロステリン遺伝子はマウス、ラットおよびヒトにおいて研究されている。Ｈｅｒａｕｌｔら，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６３７７−６３８３；Ｗｏｎｇら，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５０２１−５０３１，Ｗｏｎｇら，１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：９１７−９２５；Ｊｏｒｄａｎ−Ｓｔａｒｃｋら、１９９４、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３５：１９４−２１０；ＲｏｓｅｍｂｌｉｔおよびＣｈｅｎ，１９９４  Ｊ．Ｍｏ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３：６９−７６。前記遺伝子は異なるレベルで男性生殖組織で発現され、セルトーリ細胞で最も高度に発現される。Ｒｏｓｅｍｂｌｉｔら、１９９６  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １６：２８７−２９６。アンドロゲンおよびｃＡＭＰはクロステリン遺伝子発現を負に調製することがラットおよびマウスで見い出されている。Ｐｉｇｎａｔａｒｏら，１９９２  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０（５）：２７４５−２７５０。ラットからのプロモータおよび５’フランキング配列のようなクロステリン調節配列はヌクレオチド−２６６および＋５４の間に位置するとして同定されている。潜在的陰性調節ＤＮＡエレメントは−２６６ないし−７１４および−７１４ないしー１２９８のような上流位置に存在することができる。Ｒｏｓｅｍｂｌｉｔら，１９９６，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １６（３）：２８７−２９６。ヒトクロステリン遺伝子プロモータ領域は公表されている。Ｍｉｃｈｅｌら、１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８：４５−５０；Ｗｏｎｇら  １９９４  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２１：９１７−９２５。哺乳動物クロステリンプロモータの間で、比較的適度な保存が存在し；相同性のほとんどは、非常に基部側ドメイン内に制限され、上流領域は完全に発散している。Ｍｉｃｈｅｌ，前掲。
【００３６】  ＦＳＨ受容体（ＦＳＨＲ）遺伝子からのプロモータは、本発明の発現ベクターで用いることができる。ＦＳＨＲ遺伝子発現は睾丸のセルトーリ細胞および卵巣の顆粒層細胞に限定される。Ｇｒｏｍｏｌｌら，１９９６  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３５：３０８−３１１。このように、この組織特異的プロモータは本発明の組成物および方法でかなり有用である。前記ＦＳＨＲ遺伝子は単離されており、マウス、ラットおよびヒトで特徴付けられている。Ｇｏｅｔｚら、１９９６  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（５２）：３３３１７−３３３２４。ラットにおいて、プライマー伸長およびＳ１ヌクレアーゼ実験は２つの主要な転写開始部位を突き止めており；転写開始部位に対して１つは−８０におけるものであり、１つの−９８におけるものである。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）に作動可能に連結した転写開始部位から５’側の８３０ｂＰのＤＮＡを構成するキメラ遺伝子を利用する一過性発現実験は、前記遺伝子のこの部分がラットセルトーリ細胞において転写プロモータとして作用することを示した。Ｈｅｃｋｅｒｔ，Ｌ．Ｌ，ら，１９９２  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．６（１）：７０−８０。
【００３７】  ヒトＦＳＨＲ遺伝子は５４ｋｂであり、１０のエクソンおよび９のイントロンよりなる。前記遺伝子は１８アミノ酸の単一ペプチドを含めた６９５アミノ酸をコードする。コアプロモータ領域は翻訳開始コドンおよび２２５ｂｐ上流の間に位置する。ラットおよびマウスにおけるように、ヒト遺伝子において、コンセンサスＣＡＡＴまたはＴＡＴＡボックスはこのプロモータ領域内には位置しない。Ｇｒｏｍｏｌｌら，前掲。ヒトＦＳＨＲ遺伝子のプロモータ領域は良好にマップされており、保存されたコンセンサスＥボックス配列およびイニシエーター−様領域（ＩｎＲ）配列よりなることが示されている。ＥボックスおよびＩｎＲを含む−１４３ないし−３０にわたる１１４−塩基対領域は、７５％より大きいプロモータ機能を付与するのに十分であると示されている。しかしながら、ＩｎＲにおける突然変異の結果、ＦＳＨＲプロモータ活性のかなりの減少となる。Ｇｏｅｔｚ，前掲。ヒトＦＳＨＲ遺伝子の５’フランキング領域の配列も公表されている。１４８６ｂｐの５’フランキング領域を含有する遺伝子構築体で一過的にトランスフェクトすると、ＣＡＴ遺伝子、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、一次ラットセルトーリ細胞、およびヒト顆粒層−ルテイン細胞に作動可能に連結した、（その欠失を含めた）ＦＳＨＲ遺伝子はＣＡＴのかなりの発現を指令した。プロモータ基部領域は−２２５ないし−１ｂｐの領域に割り当てられている。Ｇｒｏｍｏｌｌら，１９９４  ＭｏｌｅｃｕｌａｒおよびＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０２：９３−１０２。
【００３８】  本発明の組成物および方法で有用なもう１つの調節配列はトランスフェリン遺伝子プロモータを含む。トランスフェリン、鉄−輸送蛋白質は肝臓において高レベルで発現されるが、脳、睾丸のセルトーリ細胞、乳腺および胎児筋肉のような他の器官ではより低いレベルで発現される。セルトーリ細胞は睾丸トランスフェリンを合成し、それを分泌する。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら，１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３１）：２３３９９−２３４０８；Ｇｕｉｌｌｏｕら，１９９１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１５）：９８７６−９８８４；Ｓｋｉｎｎｅｒら，１９８０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：９５２３−９５２５。ヒト遺伝子は単離され、調節配列は同定されている。Ａｄｒｉａｎら，１９８６  Ｇｅｎｅ  ４９：１６７−１７５。一過性発現系における５’−欠失分析は、−１２５／＋３９の領域をプロモータ基部領域として示した。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら，１９８９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７１５３−７１６０。−５２ないし＋３０ＴＡＴＡボックスにわたる領域は、基礎レベルの転写を活性化するのに十分である。Ｇｕｉｌｌｏｕら，１９９１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９８７６−９８８４。セルトーリ細胞における転写活性化は、ＤＮＡ−結合蛋白質と、ＰＲＩ−ＴＡＴＡボックスカップルまたはＰＲＩ−ＰＲＩＩカップルとの相互作用を含む。Ｇｕｉｌｌｏｕら、１９９１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９８７６−９８８４。トランスフェリンプロモータは、セルトーリエレメント１（ＳＥ１）およびセルトーリエレメントに（ＳＥ２）と命名された２つの臨界的応答エレメントを含有することも見い出されている。配列決定分析を通じ、ＳＥ２はＥ−ボッススエレメントを含有することが見い出されている。Ｅ−ボックス応答エレメントは基本的−ラセン−ループ−ラセン（ｂＨＬＨ）に応答することが証明されている。ｂＨＬＨ転写蛋白質は、細胞分化の誘導および進行に関与する転写因子のクラスである。Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｊ．ら，１９９７  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８（２）：６６７−６７５。
【００３９】  ヒトトランスフェリン遺伝子からの調節配列の６７０−ｂｐセグメントがＣＡＴ遺伝子または３つの異なるアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）対立遺伝子に作動可能に連結した遺伝子構築体で形質転換したトランスジェニックマウスは、それらの脳の異なる部分においてかかる遺伝子の発現を呈した。Ｂｏｗｍａｎ，Ｂ．Ｈ．，ら、１９９５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（２６）：１２１１５−１２１１９。また、マウストランスフェリン遺伝子の５’フランキング領域が単離され、トランスジェニックマウスにおけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現を駆動するのに用いられてきた。
【００４０】  当業者であれば、クラステリン、ＦＳＨＲ、およびトランスフェリン遺伝子の全てまたは一部をサブクローンし、プロモータおよび５’および３’調節配列のような各調節領域を単離するのに必要な方法に精通している。例えば、クラステリン、ＦＳＨＲ、またはトランスフェリン遺伝子プロモータおよび上流調節配列は、過剰のエクソヌクレアーゼＩＩＩ−媒介欠失を介して、過剰の５’フランキング配列または下流コーディング配列のいずれかまたは双方を有するマウス、ラット、ウシ、ブタ、またはヒトゲノムクローンから創製させることができる。これは、適当に調製されたＤＮＡをエクソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）で消化し、消化の間の時間間隔にアリコットを取り出すことによって達成される。ＤＮＡの得られた成功した小さな断片を配列決定して、欠失の正確な終点を決定することができる。エクソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）を用いてそのような欠失シリーズを創製するいくつかの商業的に入手可能なシステムがある。例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，「Ｅｒａｓｅ−Ａ−Ｂａｓｅ」システム。別法として、ＰＣＲプライマーは、所望のプライマーおよび５’調節領域の直接的増幅を可能とすると規定することができる。
【００４１】  ３’末端配列を含めたクラステリン、ＦＳＨＲまたはトランスフェリン３’調節配列は、前記した同一のｅｘｏＩＩＩ媒介欠失方法を介して、過剰の３’フランキング配列または上流コーディング配列のいずれかまたは双方を有するマウス、ラット、ウシ、ブタまたはヒトゲノムクローンから単離することができる。
【００４２】  前記５’および３’調節配列ならびに所望の蛋白質および単位ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、種々の手法によって発現ベクターの調製のために修飾することができる。例えば、前記したように調製されたＤＮＡの端部を酵素ＤＮＡリガーゼで、特異的制限エンドヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含有する短い二本鎖ＤＮＡ分子（いわゆるリンカー分子）に連結することができる。前記連結に続いてのこれらの分子の特異的制限エンドヌクレアーゼでの消化は、調製されたＤＮＡ配列の末端に特異的制限ヌクレアーゼ認識部位に対応する末端を生じさせるであろう。
【００４３】  このように、本発明は、５’ないし３’方向に：セルトーリ細胞で機能サるプロモータおよび生物学的因子または中間体についてのコーディング配列を含む組換え発現ベクターも提要する。もう１つの実施形態において、目的のベクターは５’ないし３’の方向に：セルトーリ細胞で機能するプロモータ，生物学的因子または中間体についてのコーディング配列および終止配列を含めた３’調節配列を含む。さらにもう１つの実施形態において、５’ないし３’方向に：セルトーリ細胞で機能するプロモータ、シグナル配列、および生物学的因子または中間体についてのコーディング配列を含むベクターが提供される。さらにもう１つの実施形態において、５’ないし３’方向に：セルトーリ細胞で機能するプロモータ、シグナル配列、生物学的因子または中間体についてのコーディング配列および終止配列を含む３’調節配列を含むベクターが提供される。他の実施形態は、前記プロモータに加えてさらなる５’調節配列を持つ前記で示されたベクターのいずれかを含む。
【００４４】  次いで、目的のベクターをセルトーリ細胞に導入することができる。ＤＮＡのセルトーリ細胞への導入は種々のよく知られた手法を介して達成することができる。例えば、目的のベクターは、前記したような生物学的因子または中間体についてのコーディング配列に作動可能に連結したセルトーリ細胞で機能するプロモータに加えて、パッケージング、逆転写、および宿主ゲノムへの組込に必要なウイルス配列を含むことができる。そのような配列を有するベクターは、それから組換えビリオンを生産することができるヘルパー細胞にトランスフェクトするのに有用である。次いで、目的のベクターを含有するビリオンを用いてセルトーリ細胞をトランスフェクトする。
【００４５】  リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリカチオンまたは脂質での複合体形成、エレクトロポレーション、粒子衝撃および核へのマイクロインジェクションのような物理的／化学的技術を用いてＳ細胞をトランスフェクトすることもできる。好ましくは、目的のベクターのセルトーリ細胞への導入はリポソームを用いて達成される。
【００４６】  リポフェクション試薬は商業的に入手可能である。例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手可能なＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＲ（登録商標）システム。この方法において、正に荷電したおよび中性の脂質は、目的の負に荷電したＤＮＡベクター構築体と複合体化するリポソームを形成する。ＤＮＡ−リポソーム複合体は一次または培養セルトーリ細胞に適用され、エンドサイトーシスによって摂取される。エンドソームは膜の破壊を受け、ＤＮＡ構築体はセルトーリ細胞内に放出される。前記ＤＮＡは核ポアを通じてセルトーリ細胞の核に侵入し、セルトーリ細胞の染色体への組込または相同組換えを促進する。
【００４７】  遺伝子構築体のセルトーリ細胞への導入の後、適当な抗生物質を用いて細胞を選択する。次いで、適当なアッセイを用い、異種遺伝子の発現の検出を行う。発現を検出するのに用いるアッセイは、異種配列の性質に依存する。例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼによって例示されるレポータ遺伝子を通常は用いて、キメラ構築体の転写および翻訳能力を評価する。トランスジェニック生物においてレポータ酵素を感度良く検出するために標準的なアッセイが利用できる。例えば、ＣＡＴアッセイを使用することができ、これは薄層クロマトグラフィーによってモノおよびジアセチル化クロラムフェニコール誘導体を検出する。前記クロラムフェニコール誘導体はホスホールイメージングによって定量することができる。
【００４８】  レポータ遺伝子、βーガラクトシダーゼを含むベクターで形質転換したセルトーリ細胞は、発光により切断されたガラクトシダーゼ部位を検出することによって同定することができる。この方法はルミノメータまたはシンチレーションカウンターを用いて最良に行われる。
【００４９】  哺乳動物のような対象に、所望の生物学的因子または中間体を生成させるように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の導入は、慣用的技術によって達成される。好ましい実施形態において、導入は皮下移植による。移植のための好ましい位置の実施例は腎臓被膜下空間、肝臓被膜下空間、大網嚢、皮下面、脳および肝臓門静脈を含む。免疫特権環境は、同種異系および異種間セルトーリ細胞いずれかを用いて移植の部位に創製することができる。
【００５０】  本発明によると、外因性生物学的因子は、移植されたセルトーリ細胞が治療上有効量の生物学的因子を生産するまで、遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の移植に続いて投与することができる。例えば、糖尿病の治療においては、移植されたセルトーリ細胞が治療上有効量のインスリンを生産するまで、インスリン−生産セルトーリ細胞の移植に続いてインスリンを投与することができる。
【００５１】  生物学的因子または中間体を生産するセルトーリ細胞は、所望の部位への外科的暴露に続く非経口投与または皮下投与のような、対象に細胞を導入できるいずれかの技術を用いて移植することができる。移植に先立って、慣用的技術に従い局所または一般的麻酔を用い、受容体哺乳動物を麻酔する。例えば、哺乳動物を麻酔した後、セルトーリ細胞を組織塊に注射し、それにより免疫特権部位を創製することができる。好ましい実施形態において、治療すべき対象は哺乳動物である。なお、さらに好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００５２】  本発明によると、生物学的因子または中間体を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の導入の結果、やはり、治療された対象において免疫学的特権部位が創製される。本発明によって規定される免疫学的特権は、移植された細胞に応答して生産された免疫応答が、移植されたセルトーリ細胞によって生じた免疫抑制剤により抑制される対象中の部位である。
【００５３】  本明細書中で用いるように、用語「同種異系」とは、同一種の２つの遺伝的に類似しない対象の組織または細胞をいう。用語「異種間」とは、異なる種の２つの遺伝子的に類似しない対象の組織または細胞をいう。本発明で用いる用語「同種移植片」とは、同一種の２つの遺伝子的に類似しない対象の間での組織または細胞の移動を記載する。本発明における用語「異種移植片」は異なる種の２つの対象の間の組織または細胞の移動を記載する。
【００５４】  セルトーリ細胞は免疫学的特権部位を生じさせるのに有効な量で導入される。そのような有効量は、移植された遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の免疫拒絶を妨げる量と定義される。免疫拒絶は、例えば、組織学的に、あるいは細胞によって生産された生物学的因子の機能的評価によって測定することができる。
【００５５】  生物学的因子を生産する遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞は治療上有効量で導入される。「治療上有効量」とは、所望の効果を生じさせるのに有効な量を意味する。例えば、食欲を刺激するペプチドの場合、治療上有効量は食欲を刺激する量である。食欲を抑制するペプチドの場合、治療上有効量は、食欲を抑制する量である。特定の病気の場合には、「治療上有効量」は、前記病気を治療するのに有効なその量である。本発明の目的では、用語「治療する」または「治療」は、治療される病気状態の生理学的効果の発生を妨げ、阻害し、減少させおよび／または前記効果を軽減することを含む。
【００５６】  当業者であれば、当該分野で知られた方法によって、生物学的因子または中間体を生産する細胞の適当な量を決定することができる。セルトーリ細胞の量は、細胞によって生産される因子の量、および所望の効果を生じさせ、または病気を治療するのに必要な因子の公知の治療上有効量に依存する。遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の正確な治療上有効量は、患者の年齢、体重、治療すべき特定の病気、病気の段階、および状態を考慮して医師によって決定され得る。対象の遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を含む治療組成物は、好ましくは、用量当たり少なくとも約１×１０１ないし約１×１０１０の量で投与されるべきであると一般に言うことができる。
【００５７】  生物学的因子または中間体を生産する遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞の移植後、セルトーリ細胞が確立され、免疫特権部位を生じるような時間の間、免疫抑制剤を投与することができる。そのような免疫抑制剤は、例えば、サイクロスポリン、タクロリムス、デスペルグアリンおよび、例えばＴ細胞に対するモノクローナル抗体を含む。好ましい実施形態において、免疫抑制剤はサイクロスポリンである。もう１つの好ましい実施形態において、サイクロスポリンは０．５ｍｇないし２００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量にて投与される。最も好ましい実施形態において、サイクロスポリンは５ｍｇないし４０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量にて投与される。
【００５８】  より一般的には、免疫抑制剤は、移植されたセルトーリ細胞が機能的になるようにするのに十分な時間投与することができる。この時間は、セルトーリ細胞の移植に先立っての時点またはその直後の時点から、細胞が治療上有効量の生物学的因子または中間体を生産できる時点まで拡大される。好ましい実施形態において、免疫抑制剤を投与する十分な時間は、セルトーリ細胞の移植に続いて約４０ないし約１００日である。より好ましい実施形態において十分な時間は約５０−６０日である。
【００５９】  本発明の１つの実施形態は、インスリンを生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を腎臓被膜下空間に移植することによるＩ型およびＩＩ型糖尿病を治療する方法に指向される。本発明のもう１つの実施形態において、第ＩＸ因子を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を腎臓被膜下空間に移植することによる血友病Ｂを治療する方法が提供される。本発明のさらにもう１つの実施形態において、ビリルビンＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（Ｂ−ＵＧＴ）を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を腎臓被膜下空間に移植することによるクリグラ−ナジャー（ＣＮ）病を治療する方法が提供される。
【００６０】  本発明のもう１つの態様は、生物学的因子または中間体を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態において、セルトーリ細胞はラット、ネズミ、ブタ、ウシまたはヒトセルトーリ細胞である。本明細書中で用いるように、医薬上許容される担体はいずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗−菌類剤、等張剤等を含む。そのような媒体および剤の使用は当該分野でよく知られている。
【００６１】  また、本発明は病気の治療用のキットにも指向される。１つの実施形態において、前記キットは、治療すべき個体において存在しない、低レベルで生産される、または欠乏している生物学的因子またはその中間体を生産するように遺伝子的に改変されたセルトーリ細胞を、所望の効果を生じるかまたは病気を治療するのに有効な量で含有するのに適した第１の容器を受容するように区画化される。好ましい実施形態において、セルトーリ細胞はラット、ネズミ、ウシ、ブタ、またはヒトであり、１０１ないし１０１０細胞の量にて供される。より好ましい実施形態において、セルトーリ細胞は１０５ないし１０１０細胞の量で供される。もう１つの好ましい実施形態において、生物学的因子または中間体を生産するセルトーリ細胞は、前記因子または中間体をコードするＤＮＡで形質転換されている細胞である。
【００６２】  以下の特別な実施例によって本発明をさらに説明するが、前記実施例は本発明の範囲を限定する意図のものではない。
【００６３】  （実施例１）
セルトーリ細胞は標準的な技術を用い、Ｌｅｗｉｓラットから単離し、２ないし７日間培養する（Ｓｅｌａｗｒｙ，Ｈ．Ｐ．およびＣａｍｅｒｏｎ，Ｄ．Ｆ．，１９９３  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２：１２３−１２９；Ｋｏｒｂｕｔｔ，Ｇ．Ｓ．ら，１９９７  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：３１７−３２２）。例えば、１５ないし２１日齢Ｌｅｗｉｓラットからの睾丸をＨａｎｋｓの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に収集し、ハサミで１ｍｍ片に切断し、ＨＢＳＳ中のコラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｔｙｐｅ  Ｖ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３７℃にて１０分間消化する。前記消化物を、１ミリモル／ＥＤＴＡおよび０．５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）（ＨＢＳＳ／ＥＤＴＡ）を含有するカルシウム−およびマグネシウム−フリーＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳ／ＥＤＴＡ中のトリプシン（２５μｇ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で３７℃にて１０分間消化し、ＨＢＳＳ中で４回洗浄し；最終細胞ペレットを、１０ミリモル／ｌ  Ｄ−グルコース、２ミリモル／ｌ  Ｌ−グルタミン、５０マイクロモル／ｌ  イソブチルメチルキサンチン、０．５％ウシ血清アルブミン、１０ミリモル／ｌ  ニコチンアミド、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５％Ｌｅｗｉｓラット血清（加熱不活化せず）を補足したＨＡＭのＦ１０培地に再懸濁する。前記組織を５００−μｍメッシュを通し、無組織培養−被覆ペトリ皿に入れ、移植前に３７℃にて４８時間インキュベートする（５％ＣＯ２）。
【００６４】  ＣＭＶプロモータおよびβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子を含有する発現ベクターを用いてセルトーリ細胞をトランスフェクトする。例えば、（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能な）ｐＣＭＶｂｅｔａは、真核生物翻訳シグナルを持つ全長Ｅ．ｃｏｌｉベーター−ガラクトシダーゼ遺伝子と共に、ヒトサイトメガロウイルス初期遺伝子プロモータ、イントロン（スプライセドナー／スプライセアクセプター）およびＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルを含有する。別法として、ＳＶ４０プロモータ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能なｐＣＡＴ３）の制御下にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を構成する発現ベクターを用いてセルトーリ細胞をトランスフェクトする。
【００６５】  培養中の約２ないし７日後、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のリポフェクション方法を用い、製造業者によって提供された指示に従い、セルトーリ細胞をトランスフェクトする。Ｗｈａｌｅｙら、（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：３０４６−３０５３に記載された超浸透圧保存（１０％グリセロール）とカップリングさせたリン酸カルシウム法も用いることができる。
【００６６】  トランスフェクションに続き、発現ベクターによって形質転換されたセルトーリ細胞を選択するために適切なアッセイを使用する。例えば、ＣＡＴ遺伝子でトランスフェクトしたセルトーリ細胞は、Ｇｏｒｍａｎら，（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（９）：１０４４−１０５１に記載されたアッセイのような、モノおよびジアセチル化クロラムフェニコール誘導体を検出するＣＡＴアッセイを受ける。前記クロラムフェニコール誘導体はホスホールイメージングによって定量することができる。
【００６７】  ｌａｃＺ遺伝子でトランスフェクトしたセルトーリ細胞は、発光を用い、切断されたガラクトシダーゼ部位を検出することによって同定される。この目的では、ルミノメータまたはシンチレーションカウンターが最良に適する。トランスフェクトされたセルトーリ細胞はプレート当たり５×１０５細胞にて平板培養される。細胞は三連で平板培養され、０、２、４、８、１２、１８、２８および４２日にアッセイされる。もし発現が予測されるものよりも低ければ、ｐＣＡＰエンハンサーを取り込むことによって発現ベクターを改変することができる。
【００６８】  遺伝子構築体が安定に取り込まれた細胞の選択の後、選択された細胞を培養にて増殖させる（約１５−２１日）。増殖の後、細胞を移植のために収集する。
【００６９】  （実施例２）
次いで、実施例１からの収集されたセルトーリ細胞をプールし、正常ラットにおいて、腎臓被膜下空間に移植する。安定にトランスフェクトされた細胞を移植するのに使用された移植プロトコルは、Ｒａｊｏｔｔｅら，（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：３１７−３２２に記載された島細胞およびセルトーリ細胞の移植に使用されたものと同一である。例えば、各受容体は、約５．５±０．３ないし１１±０．４×１０６間のトランスジェニックセルトーリ細胞を受け取る。細胞をＰＥ−５０のようなポリエチレンチューブに吸引し、遠心によってペレット化し、麻酔下（例えば、ハロタン−麻酔下）動物の左側腎臓被膜下空間下に温和に入れる。各動物に移植したトランスジェニックセルトーリ細胞の数は、移植前に各細胞調製物の三連の代表的なアリコットのＤＮＡ含有量を測定することによって評価し、計算は、新たに単離された睾丸細胞が細胞当たり約２０ｐｇ  ＤＮＡを含有するという発見に基づく。従って、睾丸細胞当たり２０ｐｇ  ＤＮＡ当たりに移植された全ＤＮＡ含有量は睾丸細胞の数に等しい。
【００７０】  所定数のラットは、遺伝的に改変されたセルトーリ細胞での移植を受ける。同系移植片（Ｌｅｗｉｓラットに移植されたＬｅｗｉｓラット形質転換セルトーリ細胞）および同種移植片（Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットに移植されたＬｅｗｉｓラット形質転換セルトーリ細胞）は共に行われる。対照として、Ｌｅｗｉｓラットは、腎臓被膜下に移植された未形質転換セルトーリ細胞の同系移植片および同種移植片を共に受け取る。また、対照として、Ｌｅｗｉｓラット膵臓組織から単離した島をＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈ受容体に移植する。
【００７１】  移植されたセルトーリ細胞を持つラットの一部を、移植後種々の時点における組織学的調査のために犠牲にする。移植後時点はほぼ５、１０、１５、２０、３０、５０および９０日である。組織学的調査は各時点において三連で行う。
【００７２】  例えば、クルステリン用に免疫組織化学染色を用い、異なる移植片を含有する腎臓組織を組織学的に調べて、セルトーリ細胞が依然として生きている、すなわち、拒絶されていないこと、およびβ−ガラクトシダーゼが継続して生産されていることを保証する。
【００７３】  （実施例３）
アルカリ性ホスフアァーゼ遺伝子を構成するレトロウイルスベクターでＬｅｗｉｓラットセルトーリ細胞をトランスフェクトする。Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なＲｅｔｒｏＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システムが特に有用である。実施例２に記載された選択および増殖の後、トランスフェクトされたセルトーリ細胞を実施例２に記載されたようにＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットに移植する。
【００７４】  （実施例４）
ブタセルトーリ細胞はＫｏｒｂｕｔｔら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：３１７−３２２およびＳｅｌａｗｒｙ（１９９３）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２：１２３−１２９に記載されている方法と同様に単離する。睾丸はハサミおよびピンセットで最近死んだブタから摘出する。ゲンタマイシンのような抗生物質を補足した、ほぼ１００ｍｌのＨａｎｋｓの平衡塩溶液＋ＣａＣｌ２（ＨＢＳＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するビーカーに睾丸を入れる。
【００７５】  睾丸組織片は睾丸から摘出する。白膜は前記組織から摘出し、約１．４５ないし１．６３ｇのより小さなアリコットを得る。実質はハサミでミンチし、約１．４５および１．６３ｇの睾丸を５０ｍｌ遠心管に入れ、試料を遠心によってＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２で２回洗浄する。各洗浄の全容量は３５ないし４０ｍｌの間であり、試料は１０００ｒｐｍにて約３分間遠心する。
【００７６】  ３０ｍｌのＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２をペレットに添加し、続いて３３ｍｇのコラゲナーゼを添加する。試料および培地をフラスコに移し、滅菌ガーゼおよびホイルで蓋をし、３７℃のシェイカー／水浴に１５分間入れ（ほぼ６．５を設定するシェイカー）。細胞を５０ｍｌの遠心管に移し、Ｈａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２で２回洗浄する。細胞に４００μｌトリプシン（２ｍｇ／ｍｌの保存溶液）、２００μｌ  ＤＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌの保存溶液）、４０ｍｌのＨａｎｋｓ（カルシウムまたはマグネシウムを含まない、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加する。細胞および培地をフラスコに移し、３７℃にて震盪水浴に１０分間入れ、次いで、細胞および培地を５０ｍｌ遠心管に移し、Ｈａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２で３回洗浄する。最終の洗浄の後、２０ｍｌの培地１９９（Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）＋５％ウマ血清＋抗生物質［ここでは、「培地１９９」という］を管に添加し、ペレットを再懸濁し懸濁液を５００ミクロンの細胞コレクターを通じてビーカーに注ぐ。さらに１０ｍｌの培地１９９を細胞上に注ぐ。細胞の通過は、１０ｍｌシリンジのプランジャーで温和に押すことによって促進される。さらに１０ｍｌの培地１９９を細胞上に注ぎ、前記プロセスを反復する。細胞をさらに１０ｍｌの培地１９９（全容量＝５０ｍｌ）で希釈する。この時点で、試料を位相／コントラスト顕微鏡下において、調製物中のセルトーリ細胞の圧倒性および一体性を確認することができる。
【００７７】  ＤＮＡ含有量に対する相関に基づいて細胞数を見積もるために（実施例２参照）、２ｍｌの細胞懸濁液を取り出して小さなプラスチック遠心管に入れ、２００ｒｐｍにて１０分間遠心し、培地を取り出し、得られたペレットを前記管中に残る培地に再懸濁する。ＤＮＡ分析に先立ち、試料は−５０℃の冷凍室に入れることができる。
【００７８】  非粘着性Ｆａｌｃｏｎ１００１プレートまたは粘着性プレート（Ｆａｌｃｏｎ３００３）いずれかに３ｍｌ細胞懸濁液および１２ｍｌの培地１９９を添加する。加えて、０．２ｍｌの抗生物質／抗真菌剤を各プレートに添加した。プレートを３７℃および２％ＣＯ２のインキュベーターに入れる。細胞を２ないし７日間培養する。
【００７９】  別法として、前記方法を以下のように変更する。３０ｍｌのＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２をミンチした睾丸実質に添加する工程後、３３ｍｇのコラゲナーゼを添加する代わりに、（２ｍｇ／ｍｌ  保存からの）３０ｍｇのトリプシンおよび（１ｍｇ／ｍｌ保存からの）０．６ｍｇのＤＮａｓｅを添加し、懸濁液をエルレンマイアーフラスコのようなフラスコに移す。前記フラスコを３７℃にて震盪水浴に３０分間入れる。この工程に続き、懸濁液を５０ｍｌの遠心管に移し、細胞をＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２で３回洗浄する。０．０１％大豆トリプシン阻害剤＋０．８ｍｌ  ＤＮａｓｅを含有する４０ｍｌの１Ｍグリシン＋２ｍＭ  ＥＤＴＡに細胞を再懸濁する。懸濁液を室温にて１０分間インキュベートする。インキュベーション工程に続き、細胞を遠心によってＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２で３回洗浄する。最後の遠心の後、細胞を４０ｍｌのＨａｎｋｓ＋ＣａＣｌ２＋０．２ｍｇのＤＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ保存）および４０ｍｇコラゲナーゼに懸濁させる。懸濁液をエルレンマイヤーフラスコのようなフラスコに移し、３７℃の水浴中で１０分間震盪する。細胞を５０ｍｌ遠心管に移した後、細胞をＨａｎｋｓで３回洗浄する。３０ｍｌの培地１９９をペレットに移し、細胞を再懸濁し、５００ミクロンの細胞コレクターを通してビーカーに注ぐ。細胞の通過は、１０ｍｌシリンジのプランジャーで温和に押すことによって促進される。さらに２０ｍｌの培地１９９を細胞上に注ぎ、前記プロセスを反復する。細胞を最終容量５０ｍｌに再懸濁し、セルトーリ細胞の存在および一体性につき位相／コントラスト顕微鏡下で調べることができる。
【００８０】  ＤＮＡ含有量分析については（実施例２参照）、２ｍｌの細胞懸濁液を取り出して小さなプラスチック遠心管に入れ、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、培地を取り出し、得られたペレットを前記管に残る培地に再懸濁させる。細胞を−５０℃の冷凍室に貯蔵する。
【００８１】  非粘着性プレートに５ｍｌの細胞＋さらに１０ｍｌの培地１９９を摂取させる。粘着性プレートに３ｍｌの細胞および１２ｍｌの培地１９９を摂取させる。全プレートに０．２ｍｌの抗生物質／抗真菌剤を摂取させ、プレートを３７℃および２％ＣＯ２にてインキュベートする。
【００８２】  実施例に記載したように発現ベクターでのリポフェクチン法を介し、あるいは実施例３に記載されたレトロウイルスシステムを介して、ブタセルトーリ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされたブタセルトーリ細胞を、実施例２に記載されたようにＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈラットの腎臓被膜下空間に移す。移植片を実施例２に記載されたようにアッセイする。
【００８３】  （実施例５）
ヒト第ＩＸ因子遺伝子を発現するようにマウス、ラットおよびブタセルトーリ細胞を遺伝子的に改変する。セルトーリ細胞をトランスフェクトするのに用いた構築体は、ＣＭＶプロモータ、ラット、マウスまたはブタトランスフェリン遺伝子プロモータ、ヒトトランスフェリン遺伝子プロモータ、ラット、マウスまたはブタＦＳＨＲ遺伝子プロモータ、およびヒトＦＳＨＲ遺伝子プロモータのようなプロモータの制御下にあるヒト第ＩＸ因子遺伝子を含有する。
【００８４】  ラットセルトーリ細胞で機能するプロモータを含む発現ベクターは、ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡについてのｃＤＮＡに作動可能に連結している。ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡはＰａｌｍｅｒら，１９８９  Ｂｌｏｄｄｋ  ７３：４３８−４４５に記載されている。最初に、ＣＭＶプロモータを使用する。トランスフェクトされたセルトーリ細胞を、正常ラット（対照）および第ＩＸ因子欠陥ラットへの移植で用いる。血友病Ｂ遺伝子治療についての第ＩＸ因子−欠陥マウスモデルは、凝固第ＩＸ（ＦＩＸ）因子遺伝子が相同組換えによって破壊されている場合に開発された。Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，１９９７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（２１）：１１５６３−１１５６６。同一実験を、ラットセルトーリ細胞よりはむしろブタセルトーリ細胞を用いて反復し、続いてラットに移植する。第３の実験において、ヒト第ＩＸ因子についてのｃＤＮＡに作動可能に連結したラットトランスフェリン、クラスタリン、またはＦＳＨ受容体遺伝子のもののようなセルトーリ細胞−特異的プロモータを用いてラットセルトーリ細胞をトランスフェクトし、続いてラットに移植する。第４の実験において、ヒト第ＩＸ因子についてのｃＤＮＡに作動可能に連結したラットトランスフェリン、クラスタリン、またはＦＳＨ受容体遺伝子のもののようなセルトーリ細胞−特異的プロモータを用いてブタセルトーリ細胞をトランスフェクトし、続いてラットに移植する。
【００８５】  移植の後、５、１０、１５、２０、３０、５０および９０日の時間間隔で移植片を調べ、Ｗａｎｇ，Ｌ．，１９９７，前掲に記載されている免疫組織化学によって第ＩＸ因子生産につきアッセイする。
【００８６】  （実施例６）
Ｇｕｎｎラットは、ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼの遺伝子的欠乏のためビリルビンをコンジュゲートすることができない。その結果、Ｇｕｎｎラットを先天性酵素欠乏のモデルとして用いて、移植された細胞の代謝活性をテストすることができる。Ｓｅｐｐｅｎ  Ｊ．ら，１９９７  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．８（１）：２７−３６。
【００８７】  この実験において、マウス、ラットおよびブタセルトーリ細胞を、ラットトランスフェリン、クラスタリンまたはＦＳＨ受容体遺伝子のようなラットで機能するプロモータの制御下にあるビリルビンＵＤＴ−グルクロニルトランスフェラーゼ（Ｂ−ＵＧＴ）遺伝子（Ｓｅｐｐｅｎ，Ｊ．１９９７  前掲）を有する遺伝子構築体でトランスフェクトし、Ｇｕｎｎラットに移植する。
【００８８】  Ｂ−ＵＧＴを発現するセルトーリ細胞が細胞培養培地に存在するビリルビンをグルクロニル化することが判明した後、細胞をＧｕｎｎラットの腎臓被膜および／または肝臓被膜下に移植する。セルトーリ細胞移植によって修正されたＢ−ＵＧＴ欠乏を呈する動物は、胆汁中の正常血清ビリルビン濃度およびビリルビングルクロニドの存在によって検出される。