(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グァバの葉及び／又は果実の、水及び親水性溶媒より選ばれる１種以上の溶媒を用いた抽出液に含まれ、ブチル基を担持した充填剤を固定相とする疎水性クロマトグラフィーを用い、流速1mL/minで、0.02mol/Lのリン酸二水素一ナトリウム水溶液と0.02mol/Lのリン酸三ナトリウム水溶液による直線勾配を与えながら溶出し、260nmにおける吸光度を測定した場合に、３番目の単一ピークとして回収される画分である分子量5,000以上のポリフェノール類、からなるα−アミラーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
ポリフェノール類が、次の物理化学的性質を有するものである請求項１記載のα−アミラーゼ活性阻害剤。
(a) 構成元素として、炭素を49.6%、水素を4.6%、及び窒素を0.6%含有する。
(b) 分子量が5,000〜100,000である。
(c) 赤外線吸収スペクトル：3428cm-1付近、1705cm-1付近、1615cm-1付近及び
1220cm-1付近に強い赤外線吸収を示す。
(d) 固体炭素核磁気共鳴スペクトル：糖のシグナル（76ppm付近）、芳香族シグナル（115.0ppm付近）、フェノールシグナル（144及び156ppm付近）及びエステルカルボニルシグナル（168ppm付近）に相当する共鳴スペクトルを示す。
(e) 以下の条件の液体クロマトグラフ法分析により、10分付近に単一ピークを示す。
カラム：ブチル基を化学結合した硬質合成ポリマー系逆相分配型ゲルを充填したカラム(昭和電工製 Shodex Asahipak C4P-50 4D、 内径4.6mm、長さ150mm、又はこれと同等品)
流速：1.5mL/分
カラム温度：40℃付近の一定温度
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：260nm）
移動相：
A液：0.02mol/LのNaH2PO4を含むアセトニトリル／水混液(15：85(v/v)による溶液（pH 4.6）
B液：0.02mol/Lの Na3PO4を含むアセトニトリル／水混液(15：85(v/v)による溶液（pH 11.4）
分析法：次の表に基づき、ステップグラジエント分析を行う。
【表１】
0005354833.tif 000007
【請求項３】
更にα−グルコシダーゼ阻害活性を有するものである請求項１又は２記載のα−アミラーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
ダイエット飲食品製造のための請求項１〜３のいずれか１項記載のα−アミラーゼ活性阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、グァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ  Ｌｉｎｎ．）由来のポリフェノール類（以下、「グァバポリフェノール類」ともいう）を有効成分とするα−アミラーゼ活性阻害剤及びこれを含有する飲食品に関する。
【背景技術】  近年、摂取カロリーの過多が生活習慣病の原因となっていることから、摂取カロリーの制限が求められているが、摂取した食物が生体内でエネルギーに変換されるのを阻止し得る物質があれば、食事量を減らさずにダイエットできる。特にデンプンを始めとする炭水化物の消化を抑えることは肥満の予防・治療に有効であると考えられ、デンプンの消化酵素であるα−アミラーゼの活性を阻害する物質が近年注目されている。
中央アメリカ原産の潅木であるグァバは、その果実、根及び葉が民間で生薬として糖尿病や下痢止めに用いられているが、最近、その葉を水又は親水性溶媒により抽出して得られたエキスに、α−アミラーゼ活性阻害作用があることが見出され、健康飲料（特公昭６０−３６７４６号）やダイエット飲食品（特開平７−５９５３９号）として使用され得ることが報告されている。
しかしながら、当該グァバ抽出エキスには、セスキテルペンやタンニン等様々な成分が含まれ、そのα−アミラーゼ阻害活性は十分なものでなく、優れたダイエット効果を発揮できるものではなかった。
従って、本発明の目的は、グァバ抽出液の中から特に優れたα−アミラーゼ阻害活性を有し、より有効なダイエット効果を発揮する成分及びこれを含有する飲食品を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、グァバ抽出物中の高分子成分について鋭意研究を行った結果、グァバ葉又は果実の水性抽出物を限外濾過して得られる分子量５０００以上の画分を、特定の疎水性クロマトグラフィーを用いて分画して得られるポリフェノール類に高いα−アミラーゼ阻害活性があることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、グァバの葉及び／又は果実を水及び親水性溶媒より選ばれる１種以上の溶媒より抽出し、該抽出液から限外濾過法を用いて分子量５０００未満の物質を除去した後、ブチル基を担持した充填剤を固定相とする疎水性クロマトグラフィーを用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液と０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸三ナトリウム水溶液による濃度勾配を与えながら溶出し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した場合に、３番目の単一ピークとして確認される画分を回収して得られるポリフェノール類を有効成分とするα−アミラーゼ活性阻害剤及び次の物理化学的性質を有するポリフェノール類を有効成分とするα−アミラーゼ活性阻害剤を提供するものである。
（ａ）構成元素として、炭素を４９．６％、水素を４．６％、及び窒素を０．６％含有する。
（ｂ）分子量が５，０００〜１００，０００である。
（ｃ）赤外線吸収スペクトル：３４２８ｃｍ−１付近、１７０５ｃｍ−１付近、１６１５ｃｍ−１付近及び１２２０ｃｍ−１付近に強い赤外線吸収を示す。
（ｄ）固体炭素核磁気共鳴スペクトル：糖のシグナル（７６ｐｐｍ付近）、芳香族シグナル（１１５．０ｐｐｍ付近）、フェノールシグナル（１４４及び１５６ｐｐｍ付近）及びエステルカルボニルシグナル（１６８ｐｐｍ付近）に相当する共鳴スペクトルを示す。
（ｅ）以下の条件の液体クロマトグラフ法分析により、１０分付近に単一ピークを示す。
カラム：ブチル基を化学結合した硬質合成ポリマー系逆相分配型ゲルを充填したカラム（昭和電工製  Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  Ｃ４Ｐ−５０  ４Ｄ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、又はこれと同等品）
流速：１．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃付近の一定温度
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
移動相：
Ａ液：０．０２ｍｏｌ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４を含むアセトニトリル／水混液（１５：８５（ｖ／ｖ）による溶液（ｐＨ４．６）
Ｂ液：０．０２ｍｏｌ／ＬのＮａ３ＰＯ４を含むアセトニトリル／水混液（１５：８５（ｖ／ｖ）による溶液（ｐＨ１１．４）
分析法：次の表に基づき、ステップグラジエント分析を行う。
0005354833.tif 000002
また本発明は、上記α−アミラーゼ活性阻害剤を含有する飲食品を提供するものである。
また本発明は、ダイエット飲食品製造のための上記ポリフェノール類の使用を提供するものである。
更に本発明は、上記飲食品を摂取することを特徴とするダイエット方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のポリフェノール類は、以下に示す工程１〜３により得ることができる。
１）工程−１
グァバの葉及び／又は果実を水及び親水性溶媒より選ばれる１種以上の溶媒より抽出し、グァバ抽出液を得る。
本発明において用いられるグァバは、フトモモ科バンジロウ属に属するグァバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ  Ｌｉｎｎ．）であり、その産地は特に限定されるものではなく、東南アジア、南アジア、南米、北米等の熱帯、亜熱帯地域において広く自生又は栽培されているものを使用することができる。本発明においては当該グァバの葉又は果実が用いられ、これらは生、半乾燥又は乾燥品のいずれでもよいが、特に乾燥した葉が好ましい。また、果実を用いる場合は未成熟な幼果である蕃果を用いるのが好ましい。これらの原料は粉砕して用いるのが好ましく、例えば葉の場合は３〜５ｍｍ程度の大きさに切断したものを用いるのが好適である。また、風味を改善するために、乾燥後焙煎したものを用いてもよい。
抽出溶媒には、水及び親水性溶媒より選ばれる１種以上の溶媒が用いられるが、斯かる親水性溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、アセトン、プロピレングリコール等が挙げられ、これらを２種以上を混合して用いてもよく、また水と任意の割合で混合した含水溶媒の形で用いることもできる。操作性及び安全性を考慮すれば最も好ましい溶媒は水である。
溶媒の使用量は特に限定されるものではないが、グァバ葉を用いる場合、葉と抽出溶媒の比率は１：２０（重量）、果実（蕃果）を使用する場合は、果実（蕃果）１に対し約１０重量倍の溶媒を使用することが好ましい。
グァバ葉を用いた抽出は、使用する溶媒によっても異なるが、水の場合には、５０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃の温度で、５〜６０分、好ましくは５〜２５分間抽出するのが好ましい。
また、果実（蕃果）を用いる場合は、６０〜１００℃の温度で、１０〜６０分間抽出するのが好ましい。
上記抽出に際して、抽出溶媒に重曹等のアルカリを加えてｐＨを上げて抽出してもよく、希鉱酸（例えば、希塩酸）又は有機酸（例えば、コハク酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸）を加え、弱酸性にして抽出してもよい。
抽出工程終了後、抽出液を冷却し、遠心分離等によって不純物を分離除去することが好ましい。このようにして得られたグァバ抽出液は適当な濃度に濃縮又は稀釈してもよい。
２）工程−２
工程−１で得られたグァバ抽出液から限外濾過法を用いて分子量５０００未満の低分子物質を除去する。
用いられる限外濾過法は、加圧式濾過装置を使用する方法、透析法、遠心法等が適用でき、これらを組み合わせて行ってもよい。
透析法による場合、グァバ抽出液を分子量５０００未満の物質を透過させるセルロースエステルやセロファン等の半透膜の透析チューブ内に封入し、水又は希薄な緩衝液からなる透析外液中で、時々透析外液を交換しながら又は流水中で１〜７日間、好ましくは２〜３日間透析することによって、低分子物質を透析外液中に拡散させて除去する。
３）工程−３
工程−２で得られた分子量５０００以上の画分をブチル基を担持した充填剤を固定相とする疎水性クロマトグラフィーを用いて、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液と０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸三ナトリウム水溶液による濃度勾配を与えながら溶出する。
疎水性クロマトグラフィーの固定相に用いられる充填剤は、官能基としてブチル基が担持され、十分な機械的強度を有していれば特に制限はないが、例えばポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、セルロース誘導体等を例示することができる。
移動層には、０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液と０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸三ナトリウム水溶液が用いられ、濃度勾配を与えて溶出する。
流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出したときの分離パターンを、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより検出し、３番目に単一ピークとして確認される画分を回収し、常法により減圧乾燥又は凍結乾燥することにより本発明のポリフェノール類を得ることができる。
上記の如くして得られる水溶性画分の物理化学的性質は以下の通りである。
（元素分析）
元素分析は常法に従って行った。結果を表２に示す。
0005354833.tif 000003
該画分は、窒素含量が少なく、タンパク質の含有はないものと考えられる。
（分子量）
常法に従い多角度光散乱検出器を用いたＧＰＣ−ＨＰＬＣ分析による分子量測定を行った結果、該画分の分子量は５，０００〜１００，０００、平均分子量は７０，０００であった。
（構成成分の分析）
糖含有量は試料を４ｍｏｌ／Ｌ−トリフルオロ酢酸中で１００℃、２時間加熱分解後、常法に従いアルドノニトリルアセテート誘導体とし、ガスクロマトグラフ分析より算出した。その結果、グルコース２．１％、アラビノース２．０％、ガラクトース１．３％、マンノース０．４％、ラムノース０．３％及びキシロース０．３％が検出された。
（没食子酸、エラグ酸及びプロアントシアニジン含有量）
没食子酸及びエラグ酸含有量は、試料を硫酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムを含むブタノール・塩酸混液（９５：５  ｖ／ｖ）中で、１００℃、２４時間加熱分解後、ＨＰＬＣ分析して求めた。没食子酸は０．６％、エラグ酸は５．２％であった。プロアントシアニジン含有量は、試料を同一の試薬を用いて９５℃、４０分間加熱分解して得られた分解液の吸光度から算出した。プロアントシアニジンはシアニジン換算で６．８％であった。
（赤外線吸収スペクトル）
測定は、試料をＢａＦ２結晶に挟み圧延し、透過法で行った。得られた赤外線吸収スペクトルによれば、該画分は波数３４２８ｃｍ−１付近、１７０５ｃｍ−１付近、１６１５ｃｍ−１付近及び１２２０ｃｍ−１付近に強い吸収を示すことが確認された。この赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
（固体炭素核磁気共鳴スペクトル（固体１３Ｃ−ＮＭＲ））
測定は、常法である交差分極マジックアングルスピニング法（ＣＰ−ＭＡＳ）で行った。得られたＣＰ−ＭＡＳのスペクトルでは糖、芳香族、フェノール、エステルカルボニル等のシグナルが観察され、この画分はエラジタンニンの集合体を主体とするポリフェノール類であることが確認された。ＣＰ−ＭＡＳのスペクトルを図２に示す。
上記グァバポリフェノール類は、後記実施例に示すように優れたα−アミラーゼ阻害作用を有すると共に、α−グルコシダーゼ阻害活性も併せ持つ。従って、当該ポリフェノール類を食品に配合すれば、デンプンからデキストリンやマルトースへの分解が強く抑制され、更に二糖類（マルトース、イソマルトース、スクロース）からグルコースへの分解も抑制されることから、血糖値の上昇抑制及び抗肥満作用を有する飲食品とすることができる。
本発明の飲食品の形態としては、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、飲料等が挙げられ、具体的には錠剤、カプセル、顆粒等の形態、クッキー、ゼリー、スナック類等の菓子の形態、ふりかけ、パン、うどん等の形態；清涼飲料、ジュース、乳酸菌飲料等のドリンク剤の形態とすることができる。
斯かる飲食品には、本発明のポリフェノール類に、更に食品として通常用いられている種々の素材を併用することができる。具体的には、ブドウ糖、ショ糖、果糖、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、水溶性大豆多糖類、ジェランガム、アラビアガム、キサンタンガム、カラギーナン、グアーガム等の安定化剤等が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類や乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、パントテン酸カルシウムや各種マグネシウム、亜鉛化合物等のミネラル類、ハーブエキス等を配合することも可能である。
本発明のポリフェノール類を飲食品に含有せしめる場合のポリフェノール類の含有量は、その剤形によっても異なるが、０．００５〜０．５重量％とすることが好ましく、該飲食品の１日あたりの摂取量は該ポリフェノール類として５〜５００ｍｇ、特に１０〜１００ｍｇとするのが好ましい。
【実施例】  次に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  グァバ抽出エキスの調製
（１）グァバ葉（中国、広西省産）を乾燥し、１２１℃で１５分で焙煎した後、５ｍｍ程度に細断した。この茶葉１００ｋｇを８０℃の熱水２０００ｋｇに入れ、２５分間抽出を行った。抽出液を３０℃以下に冷却し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離で清澄化し、グァバ葉抽出液を得た。
（２）蕃果抽出液は、蕃果１に対し約１０重量倍の溶媒を使用し、９０℃で、２５分間抽出することにより得られた。
（３）得られたグァバ葉抽出液に蕃果抽出液を約０．１〜０．２％の割合で配合し、グァバ抽出エキスを得た。
【実施例２】  グァバポリフェノール類の調製
分画分子量５０００の限外濾過膜を用いて、実施例１で調製したグァバ抽出エキスから分子量５０００以上の画分を得た。次にこの画分から分画分子量６０００〜８０００の透析膜を用いて得られた透析内液を凍結乾燥して粗精製ポリフェノール類を得た。得られた粗精製ポリフェノール類を、０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液に溶解し、充填剤にブチル基を結合したマクロプレップカラムを用いて、疎水性クロマトグラフィーにより精製した。カラムの２倍容量の０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液で洗浄後、カラムの２倍量の０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素一ナトリウム水溶液と０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸三ナトリウム水溶液の直線勾配により溶出し、次いで０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸三ナトリウム水溶液で溶出した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成するとともに、アミラーゼ阻害活性を測定した（図３）。この溶出曲線より、最後に溶出する単一ピークに阻害活性が認められた。得られた単一ピークに相当する画分を電気透析した後、凍結乾燥し、精製グァバポリフェノール類とした。
得られた精製グァバポリフェノール類を、上記（ｅ）に示す条件で測定した結果を図４に示す。本条件による測定おいて本発明の精製ポリフェノール類は単一のピークとして観察された。
【実施例３】  α−アミラーゼ阻害活性
実施例１及び実施例２で得られたグァバ抽出エキス及び精製グァバポリフェノール類がα−アミラーゼに及ぼす影響を検討した。
α−アミラーゼ阻害活性は常法により測定した。すなわち、α−アミラーゼはブタ膵液由来のものを用い０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した。基質溶液は８％可溶性デンプンと０．０８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した。反応は酵素、基質溶液、試験溶液又は対照として水を混合し、３７℃７分間行った。１００℃で反応を停止後、アラビノースを内部標準物質として、生成したマルトースをＨＰＬＣで測定した。阻害活性は下式により算出した。結果を表３に示す。
阻害活性（％）＝｛１−試料中の生成マルトース量／対照中の生成マルトース量｝×１００
0005354833.tif 000004
表３に示したように、本発明の精製グァバポリフェノール類はグァバ抽出エキスに比べ高い阻害活性を示した（約３０％高い阻害効果を示した）。
【実施例４】  α−グルコシダーゼ阻害活性
実施例１及び実施例２で得られたグァバ抽出エキス及び精製グァバポリフェノール類がα−グルコシダーゼの一つであるマルターゼに及ぼす影響を検討した。  マルターゼ阻害活性は常法により測定した。すなわち、マルターゼはラット腸管アセトン粉末（ＳＩＧＭＡ社製）を９倍量の５６ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でホモゲナイズしてその遠心上清を粗酵素液とした。基質溶液はマルトースの終濃度が１％になるよう２２４ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した。反応は酵素、基質溶液、試験溶液又は対照として水を混合し、３７℃５分間行った。１００℃で反応を停止後、アラビノースを内部標準物質として、生成したグルコース量をＨＰＬＣで測定した。阻害活性は下式により算出した。結果を表４に示す。
阻害活性（％）＝（１−試料中の生成グルコース量／対照中の生成グルコース量）×１００
0005354833.tif 000005
【実施例５】  実施例２で得られた精製グァバポリフェノールを用いて以下に示す配合でパンを作成した。
［特許］
0005354833.tif 000006
この製品は特徴的なハーブ風味があり、味も良好であり、通常のパンに比べて遜色のないものであった。
【産業上の利用可能性】  本発明のα−アミラーゼ活性阻害剤は、グァバ抽出エキスに比べて極めて優れたα−アミラーゼ阻害活性を有すると共にα−グルコシダーゼ阻害活性を併せ持ち、これを飲食品に含有せしめれば血糖値抑制作用及び抗肥満作用を有する飲食品が得られる。すなわち、ふりかけやウドン、パン、クッキー等デンプンを多く含む食品にこれを混ぜることで血糖値の高い人、あるいは高脂血症の人に適したダイエット飲食品を提供できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、グァバポリフェノール類の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
図２は、グァバポリフェノール類のＣＰ−ＭＡＳのスペクトルを示す図である。
図３は、粗精製グァバポリフェノール類の溶出曲線を示す図である。
図４は、グァバポリフェノール類の液体クロマトグラフ分析の結果を示す図である。
【図１】
0005354833.tif 000008
【図２】
0005354833.tif 000009
【図３】
0005354833.tif 000010
【図４】
0005354833.tif 000011