(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈ１７細胞クローンの製造方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件下で、混合リンパ球培養反応を行い、Ｔｈ１７細胞への分化が認められた培養系から細胞を回収する工程、
を含み、
混合リンパ球培養反応開始時の培養系における末梢血単核球の細胞密度が、マイクロカルチャープレート（ＮＵＮＣ社１６３１１８）で換算して５×１０２〜５×１０4個／ウェルとなる細胞密度である、当該方法。
【請求項２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件が、ＩＬ−６及びＴＧＦβが培養系に含まれる培養条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）工程（ａ）により回収された細胞を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程、をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）により回収された細胞を、限界希釈法により、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程、をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件が、ＩＬ−２３及び抗原提示能を有する細胞が培養系に含まれている培養条件である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示能を有する細胞が、工程（ａ）においてＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導した抗原提示細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示能を有する細胞が、放射線照射された末梢血単核球の形態で培養系に提供されている、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
実質的に純粋なＴｈ１７細胞クローンからなる細胞集団であって、当該Ｔｈ１７細胞クローンがＩＬ−１７を産生するがＩＬ−５およびＩＦＮγを産生しない、当該細胞集団。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により製造しうる、実質的に純粋なＴｈ１７細胞クローンからなる細胞集団。
【請求項１０】
Ｔｈ１７細胞クローンが、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞由来である、請求項８又は９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
被検物質が、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で、混合リンパ球培養反応を行い、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を検出する工程であって、混合リンパ球培養反応開始時の培養系における末梢血単核球の細胞密度が、マイクロカルチャープレート（ＮＵＮＣ社１６３１１８）で換算して５×１０２〜５×１０4個／ウェルとなる細胞密度である、工程及び
（ｂ’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化が修飾されたか否かを評価する工程、を含む方法。
【請求項１２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で、混合リンパ球培養反応を行い、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を検出する工程であって、混合リンパ球培養反応開始時の培養系における末梢血単核球の細胞密度が、マイクロカルチャープレート（ＮＵＮＣ社１６３１１８）で換算して５×１０２〜５×１０4個／ウェルとなる細胞密度である、工程、
（ｂ’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化が修飾されたか否かを評価する工程、及び
（ｃ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化の修飾をもたらした被検物質を選択する工程、を含む方法。
【請求項１３】
被検物質が、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ’’）請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞集団を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で培養し、Ｔｈ１７細胞の活性を検出する工程、及び
（ｂ’’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、Ｔｈ１７細胞の活性が修飾されたか否かを評価する工程、を含む方法。
【請求項１４】
Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ’’）請求項８〜１０のいずれかに記載の細胞集団を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で培養し、Ｔｈ１７細胞の活性を検出する工程、
（ｂ’’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、Ｔｈ１７細胞の活性が修飾されたか否かを評価する工程、及び
（ｃ’’）Ｔｈ１７細胞の活性の修飾をもたらした被検物質を選択する工程、を含む方法。
【請求項１５】
Ｔｈ１７細胞の活性が、ＩＬ−１７遺伝子又はＲＯＲｇｔ遺伝子の発現である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘルパーＴ細胞の一種であるＴｈ１７細胞のクローン並びにその製造及び利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーＴ細胞には各種のサブセットが存在する。細胞免疫を司るＴｈ１、液性免疫を制御するＴｈ２はその代表例である（非特許文献１）。関節リウマチ（ＲＡ）のような臓器特異的自己免疫疾患はＴｈ１型の疾患であり、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような全身性自己免疫疾患はＴｈ２型の疾患であることが提唱されてきた（非特許文献２）。Ｔｈ１細胞はインターロイキン(ＩＬ)-１２の刺激によって分化し、インターフェロン(ＩＦＮ)-γを主として産生する細胞であり、Ｔｈ２細胞はＩＬ-４刺激によって分化し、ＩＬ-４、ＩＬ-５などを産生する細胞である。ところが、実際にＲＡの主要な病変部位である関節滑膜及び関節液を解析すると、ＩＦＮ-γは殆ど検出できない。また臨床的には明らかにＲＡとＳＬＥの合併する症例が少なからず存在する。さらに、ＲＡは骨が破壊される疾患であるが、破骨細胞の分化はＩＦＮ-γの存在下では強く抑制される（非特許文献３）。また、実験性アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)などでもＴｈ１細胞の移入により病気が誘導できることから、長年に渡ってＴｈ１型の疾患であることが提唱されてきた。しかしＩＬ-１２やその受容体のノックアウトマウスでも病気が誘導できること、Ｔｈ２アジュバントの使用によりより重篤な病態が誘導できることなどから、ＲＡやＥＡＥがＴｈ１型の疾患であるという概念には修正が必要である可能性が示唆された。
【０００３】
近年、Ｔｈ１７細胞がこのような矛盾を説明するサブセットとして注目されている。このＴ細胞はＩＦＮ-γを殆ど産生せず、ＩＬ-１７を多量に産生すると同時に破骨細胞の分化を試験管内で促進する。ＲＡ患者関節液中にＩＬ-１７を検出した報告と併せて考えると（非特許文献４）、ＲＡはＴｈ１型の疾患と言うよりもむしろＩＬ-１７産生Ｔｈ細胞型の疾患であることが示唆される。また、ＥＡＥにおいても、ＩＬ−１７がＥＡＥ病態の悪化をもたらすことが明らかにされた（非特許文献５、６）。昨年、ＩＬ−２３により分化させたＩＬ−１７産生細胞がＴｈ１、Ｔｈ２とは独立したサブセットとして報告され（非特許文献７、８）、Ｔｈ１７の概念がほぼ確立した。さらにＴｈ１７分化に必要なサイトカインとしてＴＧＦ-β及びＩＬ−６が報告されるに至り（非特許文献９、１０）、このＴｈサブセットについての基礎生物学における知見が急速に集積しつつある。このような状況を考慮すると、各種自己免疫疾患はＴｈ１/Ｔｈ２の二元論で考えるべきではなく、Ｔｈ１７を加えた三次元的な枠組みの中で捉えることが妥当であると考えられる。
【０００４】
しかしながら、Ｔｈ１７細胞に関する研究を飛躍的に進歩させるために不可欠なクローン化Ｔｈ１７細胞株については、これまで、その樹立に成功していなかった。
【特許文献１】特開平10-262656
【特許文献２】特開平10-117772
【非特許文献１】Mosmann et al., J. Immunol. 136(7):2348-57, 1986
【非特許文献２】Smolen et al., Scand. J.Rheumatol. 25(1):1-4, 1996
【非特許文献３】Takayanagi et al., Nature.408(6812):600-5, 2000
【非特許文献４】Kotake et al., J. Clin. Invest.  103(9):1345-52, May 1999
【非特許文献５】Langrish et al., J. Exp. Med. 201:233-40, 2005
【非特許文献６】Komiyama et al., J. Immunol. 177:566-73, 2006
【非特許文献７】Harrinhton et al., Nature Immunol.6(11); 123-32, 2005
【非特許文献８】Park et al., Nature Immunol.6(11); 133-41, 2005
【非特許文献９】Mangan et al., Nature.441(7090):231-4, 2006
【非特許文献１０】Bettelli et al., Nature.441(7090):235-8, 2006
【非特許文献１１】Laurence et al., Immunity.26:371-381, 2007
【非特許文献１２】Matushita et al., J. Immunol.158:5685-5691, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、クローン化されたＴｈ１７細胞株を樹立することにある。さらなる本発明の目的は、Ｔｈ１７細胞クローンの樹立のための手法や樹立したＴｈ１７細胞クローンを用いて、Ｔｈ１７細胞の誘導相と効果相を修飾する活性の評価やスクリーニングの方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これまでのＴ細胞クローンの取得方法としては、主として、自己抗原又は非自己抗原による刺激を受けた個体から採取した末梢血単核球を、２４穴又は９６穴プレートなどにおいて、一度、該抗原で刺激し、次いで、約１週間後に増殖してきた細胞を培地中に極うすい密度に希釈し、プレート上の一穴当たり、増殖する細胞が最大１個しか入らないように自己の抗原提示細胞と供に播種して培養し（限界希釈法）、増殖した細胞を回収する方法が用いられてきた（例えば、特許文献１、２）。しかしながら、限界希釈法を利用した試みでは、これまでＴｈ１７細胞クローンの取得には成功してこなかった。
【０００７】
本発明者は、Ｔｈ１７細胞クローン取得の不成功の理由が、これまでの本発明者の経験から、(i)抗原による刺激を受けた個体から採取した末梢血単核球においては、既に、抗原刺激により分化したメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性細胞）の存在比率が高く、未だ抗原刺激されておらず、サイトカイン等の存在下でＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７へ分化を人為的に方向付けることができるナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ４５ＲＯ陰性細胞）の存在比率が極めて低いこと、及び、(ii)抗原刺激により分化したメモリーＴ細胞においても、メモリーＴｈ１細胞やメモリーＴｈ２細胞が主であり、メモリーＴｈ１７細胞の存在比率が少ないこと、にあるのではないかと考え、Ｔｈ１７細胞クローン取得のための発想を以下のように転換した。
【０００８】
まず、生体内ですでに抗原により刺激を受けた末梢血単核球を利用する手法ではなく、混合リンパ球培養反応（以下、単に「ＭＬＲ」と称することがある）に着目した。ＭＬＲは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）のＨＬＡ-ＤＲと何らかの自己抗原を認識して誘導されるＣＤ４Ｔ細胞の分裂増殖反応である。しかしながら、ＭＬＲは、これまで、主としてＨＬＡ型(ＨＬＡ-ＤＲ型)が異なるか否かを判定するなどの目的で利用されてきており、その自己抗原の同定が難しいことや、そのクローンが直接病気に関与していないことなどから、Ｔｈ細胞クローンの取得への利用は考えられていなかった。
【０００９】
このような状況の中で、本発明者は、ＭＬＲにおいては、(i)ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞がその活性の大部分を担っている点、及び、(ii)特定されない種々の自己抗原の刺激を受けた種々のＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化し分化するため、従来の特定の抗原による刺激の場合と比較して、Ｔｈ細胞の頻度が高いと考えられる点、に着目し、ＭＬＲにおいても、もし、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導できる培養条件及び分化誘導したＴｈ１７細胞を増殖維持できる培養条件を新たに確立できたなら、クローン化されたＴｈ１７細胞株を樹立できる可能性があるのではないかと考えた。
【００１０】
とはいえ、単に、分化誘導や増殖維持に適した条件で培養を行い、培養系中にＴｈ１７細胞を出現させたとしても、単一の細胞に由来するクローンではなく、種々のＴｈ１７細胞が混在した状態となってしまい、クローン化が困難であると考えられる。その一方で、単に、従来のような限界希釈法により培養を行ったのでは、ＭＬＲにおいては、これまでナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化の誘導の実験は行われておらず、活性化してＴｈ１７細胞への分化が誘導されるナイーブＴ細胞の割合の低さが予測できないことから、効率的にクローン化された細胞を取得できないことも考えられる。そこで、本発明者は、クローン化された細胞の取得に適したＭＬＲの培養開始時における末梢血単核球数（プレートの一穴あたりの細胞数）の特定をも試みた。そして、種々の条件下で検討した結果、ＭＬＲにおいて分化してきた細胞がクローンである確立が高いと考えられる条件を確立することにも成功した。さらに、本発明者は、これにより得られた細胞クローンは、ＭＬＲに用いた抗原提示細胞と特定のサイトカイン等の存在下で継代維持することが可能であることをも見出した。
【００１１】
このように、ＭＬＲの利用というＴｈ１７細胞クローン取得のための手法における発想転換と、ＭＬＲを利用する場合の種々の培養条件の創意工夫による新たな確立の結果、本発明者は、遂に、世界で初めて、クローン化されたＴｈ１７細胞株の樹立に成功するに至った。さらに、本発明者は、Ｔｈ１７細胞クローンの樹立のための手法や樹立したＴｈ１７細胞クローンを利用すれば、Ｔｈ１７細胞の誘導相と効果相を修飾する活性の評価やスクリーニングが可能であることを見出すに至り、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は、クローン化されたＴｈ１７細胞株並びにその製造及び利用に関するものであり、より詳しくは、以下に記載の発明を包含するものである。
[１]  Ｔｈ１７細胞クローンの製造方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件下で、混合リンパ球培養反応を行い、Ｔｈ１７細胞への分化が認められた培養系から細胞を回収する工程、
を含む方法。
[２]  ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件が、ＩＬ−６及びＴＧＦβが培養系に含まれる培養条件である、請求項１に記載の方法。
[３]  混合リンパ球培養反応開始時の培養系におけるプレート一穴あたりの末梢血単核球数が５×１０２〜５×１０4個である、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]  （ｂ）工程（ａ）により回収された細胞を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程、をさらに含む、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]  （ｃ）工程（ａ）又は工程（ｂ）により回収された細胞を、限界希釈法により、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程、をさらに含む、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]  Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件が、ＩＬ−２３及び抗原提示能を有する細胞が培養系に含まれている培養条件である、[４]又は[５]に記載の方法。
[７]  抗原提示能を有する細胞が、工程（ａ）においてＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導した抗原提示細胞である、[６]に記載の方法。
[８]  抗原提示能を有する細胞が、放射線照射された末梢血単核球の形態で培養系に提供されている、[６]又は[７]に記載の方法。
[９]  実質的に純粋なＴｈ１７細胞クローンからなる細胞集団。
[１０]  Ｔｈ１７細胞クローンが、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞由来である、[９]に記載の細胞集団。
[１１]  [１]〜[８]のいずれかに記載の方法により製造しうる、[９]に記載の細胞集団。
[１２]  被検物質が、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で、混合リンパ球培養反応を行い、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を検出する工程、及び
（ｂ’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化が修飾されたか否かを評価する工程、を含む方法。
[１３]  ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で、混合リンパ球培養反応を行い、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を検出する工程、
（ｂ’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化が修飾されたか否かを評価する工程、及び
（ｃ’）ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化の修飾をもたらした被検物質を選択する工程、を含む方法。
[１４]  被検物質が、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有するか否かを評価する方法であって、
（ａ’’）[９]〜[１１]のいずれかに記載の細胞集団を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で培養し、Ｔｈ１７細胞の活性を検出する工程、及び
（ｂ’’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、Ｔｈ１７細胞の活性が修飾されたか否かを評価する工程、を含む方法。
[１５]  Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ’’）[９]〜[１１]のいずれかに記載の細胞集団を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で培養し、Ｔｈ１７細胞の活性を検出する工程、及び
（ｂ’’）被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、Ｔｈ１７細胞の活性が修飾されたか否かを評価する工程、及び
（ｃ’’）Ｔｈ１７細胞の活性の修飾をもたらした被検物質を選択する工程、を含む方法。
[１６]  Ｔｈ１７細胞の活性が、ＩＬ−１７遺伝子又はＲＯＲｇｔ遺伝子の発現である、[１４]又は[１５]に記載の方法。
【００１３】
なお、本発明において、「ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞」とは、抗原と一度も遭遇したことがなく、プロフェッショナル抗原提示細胞による抗原提示を受けた際にヘルパーＴ細胞に分化しうるＣＤ４陽性Ｔ細胞を意味する。サイトカイン環境などの相違により、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞のいずれのＴ細胞へ分化するかが決定づけられる。
【００１４】
また、「Ｔｈ１７細胞」とは、ヘルパーＴ細胞のうち、ＩＬ−６、ＴＧＦ−βなどのサイトカインの存在下でナイーブＴ細胞から分化し、分化後はＩＬ−１７を産生する細胞を意味する。
【００１５】
また、「メモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞」とは、抗原との再会によって迅速で大きな免疫反応を誘導できる性質を有するＣＤ４陽性Ｔ細胞を意味する。ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ陽性ＣＤ４５ＲＯ陰性であるのに対し、メモリーＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陰性ＣＤ４５ＲＯ陽性である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、簡便かつ効率よくＴｈ１７細胞クローンを取得する方法が確立され、そしてＴｈ１７細胞クローン株が世界で初めて樹立されたことにより、以下のような、種々の研究上の、又は、産業上の応用が可能となる。
【００１７】
例えば、Ｔｈ１細胞においてはＣＸＣＲ３、Ｔｈ２細胞においてはＣＣＲ４といった特異的マーカーが同定されているが、本発明において、Ｔｈ１７細胞クローンが得られたことにより、Ｔｈ１７細胞特異的マーカーを効率的に同定することが可能となる。このようなマーカーが明らかになれば、それに対する抗体を用いてＴｈ１７細胞をソーティングしたり、あるいは、各種疾患におけるＴｈ１７細胞の組織分布状態を明らかにしたり、さらには、それら抗体を抗体医薬として開発したりといった応用が可能となる。
【００１８】
また、Ｔｈ１７細胞への分化やＴｈ１７細胞の活性を修飾する物質の試験管内での評価やスクリーニングが可能となる。これにより、例えば、Ｔｈ１７細胞に直接作用して、その活性を増強したり抑制したりする薬剤の評価やスクリーニングや、さらには、樹状細胞（ＤＣ）に作用してＤＣ１７というべき状態に樹状細胞を変化させる物質の評価やスクリーニングが可能となる。
【００１９】
さらに、Ｔｈ１７細胞と他の細胞集団との相互作用の解析も可能となる。例えば、Ｔｈ１７細胞やＤＣ１７細胞が、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、肥満細胞、表皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞などの細胞と相互作用すると、双方の細胞における活性の変化がもたらされうるが、このような相互作用の解析は、各種疾患の病因解析や治療法の開発に貢献すると考えられる。
【００２０】
また、Ｔｈ１７細胞クローンを利用すれば、Ｔｈ１７細胞の分化メカニズムを分子レベルで解析する上でも大きく貢献すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜Ｔｈ１７細胞クローンの製造方法＞
本発明における、Ｔｈ１７細胞クローンの製造方法は、混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）を利用することを特徴とするものである。これまでＴｈ１７細胞クローンの取得において、ＭＬＲを利用しようとする発想はなく、ＭＬＲに着目した点が、本発明者によるＴｈ１７細胞クローンの取得の成功における大きな鍵となった。本発明者は、種々の検討を行なった結果、ＭＬＲにおいてＴｈ１７細胞を分化誘導させることが可能であることを見出すと供に、ＭＬＲを利用してＴｈ１７細胞クローンの取得を行なうための培養条件を確立することにも成功した。従って、本発明のＴｈ１７細胞クローンの製造方法は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件下で、混合リンパ球培養反応を行い、Ｔｈ１７細胞への分化が認められた培養系から細胞を回収する工程（工程（ａ））を含むものである。
【００２２】
本発明において「混合リンパ球培養反応」とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）のＨＬＡ-ＤＲと何らか自己抗原を認識して誘導されるＣＤ４陽性Ｔ細胞の分裂増殖反応を意味する。混合培養する異なる個体由来の末梢血単核球は、異なるＨＬＡ−ＤＲを発現していることが必要であるが、各個体のＨＬＡ−ＤＲが具体的にどのタイプであるかは問われず、最終的に取得したいＴｈ１７細胞クローンに応じて、適宜選択すればよい。
【００２３】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件としては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化の誘導に有効なサイトカインが含まれる培養条件であり、好ましくはＩＬ−６及びＴＧＦβが培養系に含まれる培養条件である。より好ましくは、さらに、ＩＬ−１β及び／又はＴＮＦαが含まれている培養条件である。
【００２４】
本発明のＴｈ１７細胞クローンの製造方法においては、Ｔｈ１７細胞クローンの取得の効率を高めるために、混合リンパ球培養反応開始時の培養系（培養プレート上の一穴あたり）における末梢血単核球数が５×１０２〜５×１０4個の条件であることが好ましい。５×１０２未満では、培養プレート上のウェルにおける陽性率は１％以下となり、Ｔｈ１７細胞クローンの取得には、非効率となってしまう。一方、５×１０4を超えると、培養プレート上のウェルにおける陽性率が１００％となり、各ウェルにおいて増殖した細胞が単一クローンではなくなる確立が高くなり、効率的なＴｈ１７細胞クローンの取得という本発明の目的に適合しなくなってしまう。より好ましい条件は、１０3〜１０4個の条件であり、３×１０3〜６×１０3個の条件が最も好ましい。これら条件は、本発明において、通常、用いられるマイクロカルチャープレートなどの小容量のウェルを用いた場合に特に適した条件であり、９６穴プレートなどのそれより容量の大きいウェルを用いた場合には、同じ細胞数では、細胞密度が低下し、これにより細胞の分化や増殖に影響を与えることもあり得る。この場合には、その影響に応じて細胞数を適宜調整すればよく、このような変更もまた本発明の範囲内である。上記の条件は、これまでの他の目的で利用されてきたＭＬＲにおける細胞数と比較すると極低い条件であり、このような条件を新たに確立したこともまた、本発明の重要な鍵となった。
【００２５】
なお、培養温度や培養期間は、適宜調節すればよいが、一般的には、培養温度は、３７度程度であり、培養期間は、５〜１０日である。
【００２６】
上記のような条件でＭＬＲを行い、細胞の増殖が認められたウェルから、細胞を回収することにより、Ｔｈ１７細胞クローンを効率的に取得することができる。
【００２７】
上記工程（ａ）により回収された細胞は、その段階では、ＭＬＲにおけるいずれの個体由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞から分化したＴｈ１７細胞クローンであるは不明である。従って、その確認実験を必要に応じて行ってもよい。例えば、工程（ａ）において用いた異なる個体（以下、便宜のため、異なる個体をそれぞれ「個体Ａ」、「個体Ｂ」と称することがある）由来の末梢血単核球に含まれる抗原提示細胞を、それぞれ、工程（ａ）により回収された細胞と共に培養し、その結果、個体Ａの抗原提示細胞が含まれる培養系において細胞の増殖が認められれば、工程（ａ）で回収された細胞は、個体Ｂ由来であることが確認される。一方、個体Ｂの抗原提示細胞が含まれる培養系において細胞の増殖が認められれば、工程（ａ）で回収された細胞は個体Ａ由来であることが確認される（図１参照）。
【００２８】
−継代培養−
本発明においては、工程（ａ）により回収された細胞の継代を行なう目的等のために、工程（ａ）により回収された細胞を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程（工程（ｂ））、をさらに含んでもよい。
【００２９】
Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件としては、Ｔｈ１７細胞の増殖を維持するためのサイトカイン及び抗原提示能を有する細胞による刺激が存在する培養条件である。サイトカインは、好ましくはＩＬ−２３であり、抗原提示能を有する細胞は、好ましくは、工程（ａ）においてＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導した抗原提示細胞である。抗原提示能を有する細胞は、放射線照射された末梢血単核球の形態で培養系に提供することが可能であり、簡便でもある。抗原提示能を有する細胞としては、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、あるいは腫瘍化させたＢ細胞を用いたり、ＨＬＡ-ＤＲを発現させた繊維芽細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞などの形質転換細胞で代用することも可能である。
【００３０】
また、抗原提示能を有する細胞として放射線照射したＰＢＭＣを添加した場合、それが産生するＩＦＮγやＩＬ−２（非特許文献１１）は、Ｔｈ１７細胞の増殖を阻害する可能性がある。従って、培養条件は、ＩＦＮγやＩＬ−２の作用を抑制する培養条件であることが好ましい。このようなＴｈ１７細胞の抑制を回避するためには、例えば、抗ＩＦＮγ抗体や抗ＩＬ−２抗体を培養系に添加すればよい。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化自体や分化したＴｈ１細胞の増殖自体を阻害するような培養条件を用いることも可能であろう。
【００３１】
なお、培養温度や培養期間は、適宜調節すればよいが、一般的には、培養温度は、３７度程度であり、培養期間は、５〜１０日である。
【００３２】
−限界希釈−
本発明のＴｈ１７細胞クローンの製造方法においては、回収された細胞が単一のＴｈ１７細胞クローンである確率をさらに高めるために、工程（ａ）又は工程（ｂ）により回収された細胞を、限界希釈法により、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件下で培養し、細胞の増殖が認められた培養系から細胞を回収する工程（工程（ｃ））、をさらに含んでもよい。ここで「限界希釈法」とは、細胞を培地中に極うすい密度に希釈し、プレート上の一穴当たり、平均１個以下の増殖細胞が入るように抗原提示細胞とともに播種することでクローン細胞を得る方法であり、この工程（ｃ）を経ることにより、得られたクローンは、ほぼ１００％の確率で、Ｔｈ１７細胞のクローンとなる。
【００３３】
なお、培養温度や培養期間は、適宜調節すればよいが、一般的には、培養温度は、３７度程度であり、培養期間は、５〜１０日である。
【００３４】
＜Ｔｈ１７細胞クローン＞
本発明は、世界で初めて、クローン化されたＴｈ１７細胞株を樹立したものである。従って、本発明は、実質的に純粋なＴｈ１７細胞クローンからなる細胞集団を提供する。ここで「実質的に純粋な」とは、細胞集団が、単一のＴｈ１７細胞クローンを少なくとも９０％以上含む状態にあることを意味する。本発明の細胞集団は、好ましくは単一のＴｈ１７細胞クローンを９５％以上含むものであり、さらに好ましくは９９％以上（例えば、９９．９％以上、９９．９９％以上、１００％）含むものである。ここで細胞集団に含まれる単一のＴｈ１７細胞クローン以外の細胞としては、Ｔｈ１７細胞への分化や増殖維持に用いる細胞（放射線照射末梢血単核球を用いた場合には、その中に含まれるＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｂ細胞、あるいはマクロファージや樹状細胞）が考えられる。但し、Ｔｈ１７細胞の増殖維持を行なっている期間は、Ｔｈ１７細胞のみが増殖し、放射線照射末梢血単核球は徐々に死んでいく。これにより、単一のＴｈ細胞の存在比率は、次第に、１００％に近づいていく。
【００３５】
本発明の細胞集団に含まれるＴｈ１７細胞クローンは、好ましくはナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞由来である。ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞は、本発明の方法において、メモリーＣＤ４Ｔ細胞と異なり、人為的にＴｈ１７細胞への分化誘導を行なうことが可能であるため、Ｔｈ１７細胞クローンの取得において好適に用いることができる。
【００３６】
本発明の細胞集団は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス・ラット、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギなど）由来であり、ヒトへの応用研究（例えば、ヒトに対する医薬開発）の観点において、最も好ましくはヒト由来である。また、本発明の細胞集団は、上記本発明のＴｈ１７細胞クローンの製造方法により製造された細胞集団であってもよく、他の手法により製造されたものであってもよい。例えば、本発明のＴｈ１７細胞クローンを用いれば、上記の通り、その特異的マーカー蛋白質（例えば、細胞表面マーカー蛋白質）を同定することが可能となるが、このようなマーカーを利用して分離されたＴｈ１７細胞クローンもまた、本発明に含まれる。
【００３７】
＜Ｔｈ１７細胞の誘導相及び効果相を利用したアッセイ＞
−誘導相を利用したアッセイ（図２参照）−
本発明においては、混合リンパ球培養反応を利用して、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導し、効率的にＴｈ１７細胞クローンを作製することが可能となる。このＴｈ１７細胞の誘導相に被検物質を添加して、Ｔｈ１７細胞の分化への影響を調べることにより、被検物質がＴｈ１７細胞への分化を修飾するか否かを評価することが可能である。従って、本発明は、このような、被検物質が、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有するか否かを評価する方法を提供する。本発明の評価方法は、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を誘導する培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で、混合リンパ球培養反応を行い、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を検出する工程（工程（ａ’））、及び、被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化が修飾されたか否かを評価する工程（工程（ｂ’））を含む。
【００３８】
また、種々の被検査物質を用いて、これら物質がＴｈ１７細胞への分化を修飾するか否かを評価し、評価した物質の中から、Ｔｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有するものを選択することにより、Ｔｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有する物質のスクリーニングを行うことが可能である。従って、本発明は、このようなナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、上記評価方法により被検物質が、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化を修飾する活性を有するか否かを評価し（工程（ａ’）と（ｂ’））、さらに、ナイーブＴ細胞からＴｈ１７細胞への分化の修飾をもたらした被検物質を選択する工程（工程（ｃ’））を含む。
【００３９】
−効果相を利用したアッセイ（図３参照）−
本発明によりＴｈ１７細胞クローンを作製することが可能となることから、Ｔｈ１７細胞クローンを利用して、適確に、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を評価することが可能となる。従って、本発明は、このような、被検物質が、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有するか否かを評価する方法を提供する。本発明の評価方法は、本発明の実質的に純粋なＴｈ１７細胞クローンからなる細胞集団を、Ｔｈ１７細胞の増殖が維持される培養条件に、被検物質の存在という条件が加えられた培養条件の下で培養し、Ｔｈ１７細胞の活性を検出する工程（工程（ａ’’））、及び被検物質が存在しない場合（対照）と比較して、Ｔｈ１７細胞の活性が修飾されたか否かを評価する工程（工程（ｂ’’））を含む。
【００４０】
また、種々の被検査物質を用いて、これら物質がＴｈ１７細胞の活性を修飾するか否かを評価し、評価した物質の中から、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有するものを選択することにより、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有する物質のスクリーニングを行うことが可能である。従って、本発明は、このようなＴｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有する物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、上記評価方法により被検物質が、Ｔｈ１７細胞の活性を修飾する活性を有するか否かを評価し（工程（ａ’’）と（ｂ’’））、さらに、Ｔｈ１７細胞の活性の修飾をもたらした被検物質を選択する工程（工程（ｃ’’））を含む。
【００４１】
上記誘導相及び効果相を利用した方法に用いる「被検物質」としては、特に制限はなく、上記評価やスクリーニングに用いたい所望の物質を本発明において用いることができる。例示すれば、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物、粒子、微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００４２】
上記誘導相を利用した方法における「Ｔｈ１７細胞への分化の修飾」としては、Ｔｈ１７細胞への分化の阻害及び促進の他、該分化の質的な変化が含まれる。質的な変化としては、例えば、Ｔｈ１７細胞以外の細胞への変化を例示することができる。
【００４３】
上記効果相を利用した方法における「Ｔｈ１７細胞の活性」としては、検出可能な活性であれば特に制限はないが、例えば、ＩＬ−１７遺伝子やＲＯＲｇｔ遺伝子の発現（転写レベル及び翻訳レベル）を挙げることができる。これら発現は、転写レベルであれば、例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより検出することができ、翻訳レベルであれば、例えば、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳや電気泳動により検出することができる。また、さらなる「Ｔｈ１７細胞の活性」としては、他の細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、肥満細胞、表皮細胞、マクロファージ、線維芽細胞など）との相互作用や、この相互作用による他の細胞の変化（例えば、細胞死、増殖、蛋白発現の変化、寿命の延長など）を挙げることもできる。「Ｔｈ１７細胞の活性の修飾」には、これらＴｈ１７細胞の活性の阻害及び促進の他、該活性の質的な変化が含まれる。Ｔｈ１７細胞の活性の質的な変化としては、例えば、上記一般的な活性に加えて、新たな活性（例えば、キラー活性や、Ｂ細胞に作用して免疫グロブリンのクラススイッチを誘導する活性）を獲得することや、ヘルパー活性が変化することが挙げられる。
【００４４】
−医療への応用−
上記方法において同定された、Ｔｈ１７細胞への分化やＴｈ１７細胞の活性を阻害する物質は、Ｔｈ１７の過剰反応に起因する疾患や、Ｔｈ１７と相互増強的に作用するＴｈ２の過剰反応に起因する疾患の予防や治療への応用が考えられる。ここで、Ｔｈ２過剰反応又はＴｈ１７過剰反応とは、ヘルパーＴ細胞におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７のバランスが、それぞれ、異常にＴｈ２又はＴｈ１７に偏向した状態のことをいい、これら過剰反応に起因する疾患としては、従来から、例えば、アレルギー性疾患や多くの全身性自己免疫疾患などが知られている。また、近年、本発明者によって、従来Ｔｈ１過剰反応に起因すると考えられていた多発性硬化症動物モデル等の疾患が、実際はＴｈ２又はＴｈ１７の過剰反応に起因する疾患であることが示された（特願２００６−２１１８８１）。したがって、前記Ｔｈ２又はＴｈ１７の過剰反応に起因する疾患としては、従来からＴｈ２又はＴｈ１７の過剰反応に起因する疾患として知られているアレルギー性疾患や多くの全身性自己免疫疾患に加え、更に、従来はＴｈ１過剰反応に起因するとされていた、多発性硬化症や関節リウマチ等の疾患も挙げることができる。対象疾患としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、自己免疫性筋炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、慢性ＧＶＨＤ、１型糖尿病、糸球体腎炎、癌、などを例示することができる。一方、上記方法において同定された、Ｔｈ１７細胞への分化やＴｈ１７細胞の活性を促進する物質は、感染症の予防や治療に用いうる。Ｔｈ１７細胞自体も、感染症の予防や治療に用いることが考えられる。また、上記方法において同定されたＴｈ１７細胞への分化やＴｈ１７細胞の活性を質的に変化させる物質は、その変化の種類に応じて、その変化により予防や治療の効果が期待できる疾患への応用が可能である。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４６】
[実施例１]  ＭＬＲを誘導する細胞密度の調整
ＭＬＲにおいて、複数のクローンが同じ培養環境に存在すると、それらから産生されるサイトカインがＴｈ１７の分化を阻害する可能性があるのではないかと本発明者は考えた。そこで、マイクロカルチャープレート（ＮＵＮＣ社１６３１１８）を用いて、ＭＬＲを誘導する細胞密度を調整した。種々の細胞密度で検討を行った結果、３×１０３個のＨＬＡ-ＤＲの異なるアロのＰＢＭＣ（個体Ａ:ＨＬＡ-ＤＲＢ１*０４０５／０４０５、個体Ｂ:ＨＬＡ-ＤＲＢ１*１５０２／１４０５）を、１０％ ヒト血清／ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社）を用いて混合培養したとき、Ｔ細胞の増殖を認めるウェル（陽性率）は１０％程度となることが明らかとなった（５×１０２未満では、陽性率は１％以下となり、Ｔｈ１７細胞クローンの取得には、非効率であり、一方、５×１０4を超えると陽性率が１００％となり初期から準クローン性増殖を行うという目的に適合しなかった）。本発明者は、ウェル当たり５×１０２以上で５×１０4以下の条件（例えば、３×１０3個の条件）が、ＰＢＭＣに含まれるＣＤ４陽性Ｔ細胞のクローン性増殖に適しているとして、以下に３×１０3個の条件でＭＬＲを行った。なお、ヒト血清はウシ胎児血清（ＦＣＳ）に置き換えることも可能である。
【００４７】
[実施例２]  ＭＬＲを利用したＴｈ１７細胞クローン株の樹立
（１）  実施例１で見出された条件下で、培養液中にＩＬ-１β（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.,１０ ｎｇ/ｍｌ）, ＩＬ−６（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.,２０ ｎｇ/ｍｌ）, ＴＮＦα（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.,１０ ｎｇ/ｍｌ）, ＴＧＦβ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.,１ ｎｇ/ｍｌ）を添加し、ＭＬＲにより７日間培養した。
【００４８】
（２）  ７日目に個体Ａと個体ＢのＰＢＭＣを４５Ｇｙ放射線照射してＩＬ-２３（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓ,１０ ｎｇ/ｍｌ）と抗ヒトＩＬ-２抗体を添加し、ここに（１）で増殖を認めた細胞を２分割して加えた。この培養に用いた培養プレートは９６穴平底プレートであり、細胞密度は１．５×１０５／ウェルであった（細胞密度は０．５〜３．０×１０５/ウェルであればよい）。また、照射する放射線は２０−１００Ｇｙであればよい。
【００４９】
（３）  １３日目に培養上清の一部を回収し、ＩＬ−１７濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。
【００５０】
（４）  １４日目にＩＬ−１７産生性のウェルから細胞を回収し、（４）で増殖を認めた抗原提示細胞を用いて限界希釈法（非特許文献１２）によるクローニングを行った。
【００５１】
（５）  同様の操作をＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞の誘導性の環境でも行った。前者で用いたサイトカインは、ＩＬ-１２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.）と抗ＩＬ-４抗体（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ.,
１ ｕｇ/ｍｌ）、後者で用いたサイトカインは、ＩＬ-４（ＰｒｉｍｍｕｎｅＫＫ, ５０ ｎｇ/ｍｌ）と抗ＩＦＮγ抗体（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ, ＩＮＣ., １ ｕｇ/ｍｌ）であった。
【００５２】
（６）  このようにして得たヒトＴ細胞クローンのサイトカイン産生性（抗原提示細胞添加後６日目の培養上清を用いてＥＬＩＳＡにて測定）を表１に示した。
【００５３】
【表１】
0005180526.tif 000002
【００５４】
Ｗ１１０．１はＩＬ−１７を多く産生するがＩＬ−５やＩＦＮγを産生しないＴｈ１７細胞であった。これは１週間ごとに抗原提示細胞（放射線照射したＰＢＭＣ）、ＩＬ−２３、抗ヒトＩＬ−２抗体を添加することにより継代維持可能であり、細胞株が樹立された。なお、Ｍ９７．１とＷ１０．１は、それぞれＴｈ１細胞とＴｈ２細胞であった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明における、Ｔｈ１７細胞クローン株の樹立の流れの一例を示す図である。
【図２】本発明における、Ｔｈ１７細胞の誘導相を修飾する活性の試験管内スクリーニング方法の一例を示す図である。
【図３】本発明における、Ｔｈ１７細胞の効果相を修飾する活性の試験管内スクリーニング方法の一例を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
0005180526.tif 000005