(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
含水試料（３）、特に生物試料を加圧下で急速凍結する装置（１）であって、試料（３）を収容した試料ホルダ（３０）が挿入され、耐圧密閉状態を確立するべく密閉されるように構成された高圧チャンバ（１１）を備えて構成され、冷媒を前記高圧チャンバ（１１）の内部に、その中に設置された試料ホルダ（３０）の位置に向かって供給できる装置において、
前記高圧チャンバ（１１）が、外から供給される光を前記試料ホルダ（３０）に設置された前記試料（３）へと方向付けることのできる耐圧窓（２０）を含む観察窓構造（２）を有することを特徴とする装置。
【請求項２】
前記窓（２０）は、外から前記高圧チャンバに供給される光を透過させる高耐圧性材料で作製された窓要素を含んで実現され、前記窓要素（２０）は前記高圧チャンバに設置された耐圧および耐熱の窓支持手段（２２）によって保持される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記高圧チャンバに、外から前記高圧チャンバに供給される光を透過させる材料から少なくとも部分的に作製された試料ホルダ（３０）が設置される、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記試料ホルダ（３０）は試料支持手段（３３）と少なくとも１つの透明な外郭部品（３１、３２）とを備えて構成され、前記試料支持手段（３３）は前記試料（３）を受けるための開口部（３７）を有し、前記少なくとも１つの外郭部品（３１、３２）は冷媒用通路を有し、前記試料支持手段（３３）は、前記試料ホルダ（３０）に取り付けたときに、前記少なくとも１つの外郭部品（３１、３２）により包囲され、前記少なくとも１つの外郭部品の前記通路は、外側の穴から前記試料支持手段の前記開口部の領域へと続く、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記観察窓構造（２）は光路を有し、その軸は前記試料（３）の位置と一直線になり、これを通じて、光源（７３）に接続されるように構成された導光手段（２３）を前記窓（２０）まで移動させることができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記試料に供給される光のための光源（７３）を制御するように構成された制御ユニットをさらに備え、前記チャンバ内に冷媒を供給する冷媒回路のセンサまたは切替要素（７１、７１ａ）のための出力を前記制御ユニットに接続でき、前記光源は、前記センサにより供給されるトリガ信号から調整可能な時間間隔で作動されるように構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
含水試料（３）、特に生物試料を高圧チャンバ（１１）内で急速凍結する方法であって、
− 前記高圧チャンバ（１１）の耐圧窓を通じて光を前記試料（３）に照射するステップと、
− 加圧下で前記試料（３）を凍結液体に曝露させるステップと、
を有し、
光は、前記試料を前記凍結液体に曝露させるための作動信号に基づき、事前決定可能な時間相関に従って放射される、方法。
【請求項８】
前記試料（３）はまず、照射に使用される光を少なくとも部分的に透過させる試料ホルダ（３０）に設置され、前記試料を収容した前記試料ホルダ（３０）が前記高圧チャンバに設置され、所定の位置にロックされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記作動信号は、前記試料を前記凍結液体に曝露させるための切替手段（８５、７１、７１ａ、７１ｂ）から、または前記切替手段に割り当てられる切替信号から得られ、前記作動信号は、場合によっては調整可能な遅延時間を含め、前記試料を照射するためのトリガ信号として使用される、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、試料を収容した試料ホルダを挿入でき、耐圧密閉状態を確立するように密閉できる高圧チャンバを使用して、含水試料、特に生物試料を加圧下で急速凍結する装置に関し、この装置においては、冷媒を高圧チャンバへと供給し、その中に設置された試料ホルダの位置に向けて供給できる。本発明はさらに、この装置に適した高圧凍結方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上記のような種類の高圧凍結装置は特許文献１に記載されており、この装置では上記に加えて、初期応力を付与した空気圧シリンダを使い、高圧化が特に急速に行われる。
【０００３】
生物および工業試料の高圧凍結用として本出願人が考案した装置は現在、「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」の名称で市販され、成功を収めている。「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」によれば、最高２１００バールの高圧下の液体窒素を使い、わずか数ミリ秒で試料を−１００℃未満の低温まで冷却できる（凍結保存／凍結処理）。この場合、試料の厚さは最大２００μｍであり、急速冷却工程によって凍結処理中に硝子化され、すなわち、結晶化が試料の微細構造の劣化、また時には破壊の原因にさえもなりうるために、氷晶の生成が大いに抑制される。
【０００４】
「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」においては、凍結工程中の高圧条件下で試料を保持するために試料カートリッジが使用される。試料カートリッジは高強度プラスチックで作製され、３つの構成要素、具体的には、冷却液を案内するために使用できる通路を有する２つの半円筒と、試料を受けるように設計された開口部を有する支持板を含む。試料の位置での圧力は冷却液によって発生させ、その目的のために２１００バールに加圧される。
【０００５】
図８は、「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」に基づく、本発明による凍結システムにも使用可能な高圧凍結システム９の基本構造を示す。試料カートリッジ８９は、装填装置９５によって高圧チャンバ９０の中へと導入される。高圧チャンバ９０は、凍結工程に備えて、ロッキングピン９４で装填装置９５をロックすることによって密閉される。凍結工程は、加圧液体窒素（ＬＮ２）を導入することによって実行され、これはカートリッジ８９の内部空間に急速に供給される。この目的のために、システム９には冷媒の供給源８が設けられている。冷媒供給源８において、ＬＮ２は冷媒タンク８１から、下流に逆流防止弁８３が設置された冷媒ポンプ８２を介して、圧縮空気により作動される増圧器８４へと案内される。ここで、使用される冷媒ＬＮ２が、たとえば２１００バールの標的圧力まで増圧される。増圧器８４の出口は、供給ラインにより、高圧弁８５を介して高圧チャンバ９０に接続される。高圧弁８５は、高圧チャンバ９０が開いているときにその内部に加圧ＬＮ２を急速に供給し、カートリッジ８９の中に保持されている試料をごく短時間で高圧凍結するように設計される。圧力センサ９１と温度センサ９２が冷却工程をモニタする。チャンバ９０内の圧力は、出口開口部９３（騒音低減化手段を備える出口）を通じて逃がすことができ、それによって凍結保存された試料を取り出せる。
【０００６】
この高圧チャンバでは、別の液体（「充填液」）、たとえばアルコール（特にエタノール）を供給することも選択でき、前記充填液はタンク８６から、下流に逆流防止弁８８が設置されたポンプ／計量システム８７を介して高圧チャンバ９０へと供給される。用途により、たとえばアルコールを使って凍結工程の前にチャンバを満杯にすることができ、冷却工程が始まるとＬＮ２がアルコールと入れ替わる。多くの場合、アルコールの使用により、ＬＮ２供給時により急速に圧力を高めることができるという利点が得られる。しかしながら、充填液の使用は必須ではなく、これは特に、アルコールと接触させるべきではない種々の試料があるからである。本明細書に記載の装置では、特に、アルコール等の充填液を使用しなくても、良好な冷却結果を実現できる。
【０００７】
特定の研究開発分野にとっては、特に光刺激を通じて得られた状態を分析することによって、特に可視領域の光による刺激の後の試料の挙動を分析することが重要である。この種の分析は、たとえば植物細胞やシアノバクテリア等の生物試料について実行される。しかしながら、通常の条件下（すなわち、生物母材の通常の生息条件下、一般に周囲温度と周囲圧力）では光刺激後の状態は持続時間が短く、したがって、試料の一時的な刺激後の状態を定着させるために別の手段が必要となる。冒頭に記した凍結保存はこの目的に適しており、なぜなら、氷晶を形成させずに生物試料を硝子化できる高圧下での試料の急速凍結が望ましいからである。しかしながら、公知の高圧凍結装置では、試料には高圧チャンバの外でなければ光を照射できず、これは高圧チャンバの内部には光が届かない、または十分に届かないことによる。しかしながら、試料を高圧チャンバ内に装填するための工程には数秒間かかり、装置の限界によってこれを短縮することが難しいため、試料を装填するために必要な時間は分析対象の光刺激後の状態の持続時間よりはるかに長く、これが、公知の装置で試料の光刺激後に十分に短時間で凍結処理を実行することが難しい、または不可能な理由である。
【０００８】
「高圧」とは、本明細書において、水の融点を顕著に（たとえば、数℃）低下させるような圧力範囲に関するものと理解する。その状態図によれば、純水の融点の最大限の低下は２０４５バールで起こり、この圧力レベルでの融点は−２２℃まで下がる。しかしながら、一般には２０４５バールというこの数値より低い圧力でも十分であり、特にこれは、純水がもちろん生物試料中に存在しないからである。本発明者らが行った実験では、２０００バール未満の圧力レベル、具体的には約１６００バールで良好な凍結保存結果が得られた。したがって、ここで考慮される圧力範囲は数百バール、好ましくは１０００〜２２００バールの間である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＤＥ １００ ２５ ５１２ Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえ本発明は、簡単な方法により、強力な光パルスで試料を光刺激し、その直後に刺激後の試料を凍結保存することが可能な高圧凍結装置を提供する問題に対応する。この点において、刺激と凍結工程の間の時間間隔と刺激条件が最大限に再現可能に調整できることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この問題は冒頭に記載の種類の装置によって解決され、この装置においては、本発明によれば、高圧チャンバは耐圧窓を持つ観察窓構造を有し、これを通じて光を外から供給し、試料ホルダの中に設置された試料に向かって方向付け、またはそれを照射するようにすることが可能である。
【００１２】
本発明は、高圧条件下での光刺激と凍結の間の時間を望ましい程度に短くすることは、高圧チャンバ内に装填された試料を光刺激することによって実現できるという考えに基づく。このようにして、光刺激後の状態を十分に急速に保護することができ、不要な遅延を考慮しなくてよい。したがって、本発明によれば、たとえば極低温電子顕微鏡の中で光刺激後の試料を分析することが可能となり、場合によっては、実際の分析の前に極低温超ミクロトームでの超薄切片の作成等の追加の準備ステップを実行してもよい。
【００１３】
本発明の１つの特に有利な発展形態において、窓は、高圧に耐えられる材料で作製され、外から高圧チャンバに供給される光を少なくとも部分的に（特に光が入る領域で）透過させる窓要素を含むように実施され、窓要素は高圧チャンバ内に設置された耐圧性および耐熱性の窓支持手段により保持される。
【００１４】
さらに、高圧チャンバに、外から高圧チャンバへと供給される光を透過させる材料で作製された試料ホルダを設けると有利であるかもしれない。この場合、試料ホルダ（試料カートリッジ）は、試料キャリアと少なくとも１つの透明な外殻部品を有していてもよく、試料キャリアは試料を受けるための開口部を有する。さらに、少なくとも１つの外郭部品には冷媒用通路が設けられていてもよく、試料キャリアは取り付けられた試料ホルダの中で少なくとも１つの外郭部品によって包囲され、少なくとも１つの外郭部品の通路は外側の穴から試料キャリアの開口部領域へと続く。これによって試料を試料ホルダ内の同じ位置で光刺激し、その後凍結保存することができ、その結果、光刺激後の状態を確実に保存できる。試料カートリッジ内に試料を設置することにより、刺激／保存工程全体を通じて試料カートリッジは所定の位置に安定に保持され、また、試料カートリッジが「チャンバ内のチャンバ」を形成し、これによって冷媒は試料の位置へと標的を絞って案内され、その結果、急速な冷却工程が確実に行われる。
【００１５】
特に、耐圧窓により、光を適当な光源から必要な光強度で直接放射させることができる。あるいは、たとえばグラスファイバケーブル等で実現される導光手段を外から観察窓に挿入することが可能であり、導光手段の端を観察窓に押し付ける。これによって、選択可能な波長および／または強度および／またはパルス幅の光を、導光手段を介して試料へと案内することが可能となる。この目的のために、観察窓構造は、有利な態様として、光路の役割を果たす開口部を有していてもよく、その軸は試料の位置と一直線になり、光源に接続可能な導光手段を窓まで移動させることができる。
【００１６】
時間的に固定された一連の刺激／保存工程を確実に実現するために、試料に供給される光のための光源を制御するように設計された制御ユニットを、好都合な態様として、装置に関連付けてもよく、冷媒回路のセンサまたは切替手段の出力を制御ユニットに接続してもよく、光源をセンサ用のトリガ信号からの調整可能な時間間隔で作動させることができる。
【００１７】
本発明の他の態様は、含水試料、特に生物試料を高圧チャンバ内で急速に凍結する方法に関し、この方法は、
−試料に高圧チャンバの耐圧窓を通じて光を照射するステップと、
−試料を加圧下（特に高圧条件下）で低温液体、たとえば液体窒素に曝露させるステップと、
を含み、光は、低温液体への試料の曝露を作動させる信号に基づいて、設定可能な時間相関に従って放射される。
【００１８】
この場合、試料が（少なくとも光が通過する領域において）照射中に使用される光を透過させる試料ホルダの中に保持される場合、試料を保持する試料ホルダを高圧チャンバ内に設置し、所定の位置にロックすることが有利であろう。さらに、作動信号は、試料を低温液体に曝露させるための切替手段から、または前記切替手段に関する切替信号から得てもよく、このように得られた信号はその後、試料への照射を行うためのトリガ信号として使用することができ、その際、場合によっては調整可能な時間遅延を考慮に入れてもよい。
【００１９】
以下に、本発明および関連する好ましい形態と、さらなる発展形態を、添付の図面群に描かれている例示的で非限定的な実施形態に基づいて詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】例示的実施形態による高圧凍結システムの斜視図である。
【図２】図１のシステム、特にその中の観察窓の斜視断面図である。
【図３】図２の斜視断面図の部分拡大図である。
【図４】試料カートリッジの斜視図である。
【図５】図４の試料カートリッジの分解図である。
【図６】試料支持板の縦断面を示す斜視図である。
【図７】光刺激の制御を示すブロック図である。
【図８】先行技術による高圧凍結システムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
例示的実施形態は、「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」のレイアウトに基づき、その発展形態となる高圧冷却システムに関する。図８に関して上述した高圧冷却システムの基本的構造はまた、例示的実施形態の装置にも使用される。しかしながら、強調すべき点として、本発明はこの例示的実施形態または前述のライカの装置に基づくもののような高圧凍結システムに限定されず、特許請求の範囲に記された発明的概念に基づく刺激／保存工程の他の実施例も含む。
【００２２】
図１は、例示的実施形態による高圧凍結システム１の全体を斜視図で示す。公知の種類の高圧チャンバ１１は、寒剤、この場合は液体窒素（ＬＮ２）のための高圧ライン１２と、カートリッジ（図２と４）のためのホルダ１３を有する。「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」からすでに知られているように、ホルダ１３は試料カートリッジと共にチャンバ１１の中に挿入され、所定の位置に固定され、チャンバの内部空間はホルダのガスケット（図示せず）によってきつく密閉される。チャンバの縦軸は水平に延び、これに沿ってホルダが挿入される。図１はまた、チャンバ１１に取り付けられ、チャンバの内部の温度を測定するセンサ１４を示しており、センサ１４の反対側には、チャンバ内部の圧力レベルを測定するためのセンサ（図１には示されず）がある。これに加えて、逆流防止弁を有するアルコール供給源が符号１５で示されている。
【００２３】
図１はまた、チャンバ１１の両側のロッキング装置用筐体２７を示している。筐体２７には、冒頭部分に記載のロッキングピン９４（図８）と、前記ピンを作動させる空気圧シリンダが格納されており、図１と２にはその空気供給用接続部２８が示されている。ロッキングピンおよび／または空気圧シリンダは、センサ（図２には示されていない図７の要素７１ｂ）によってモニタされ、そこからの信号は、ロックが適正に行われたことを確認する役割を果たす。これによって、凍結工程は確実に、チャンバがロックされなければ実行できないようになる。この目的のために、空気圧シリンダのうちの１つのピストンには、たとえば磁石を取り付けてもよく、これはピストンが作動されたときにセンサ７１ｂのリード接点を作動させる。リード接点を有するこのようなセンサは、空気圧シリンダの筐体２７の外側の適当な位置（たとえば、外側の溝）に容易に取り付け、位置付けることができる。図の実施形態において、決まったタイミングシーケンスが設定され、その中ではロックが適正に行われたことを確認するセンサ７１ｂからの信号によって凍結工程が開始され、場合によってはその前にシステムにより誘導される、および／または追加的に調整可能な遅延が設けられてもよい。
【００２４】
本発明によれば（「ライカＥＭ ＨＰＭ１００」とは異なり）、高圧チャンバ１１に観察窓構造２が設けられ、これによってチャンバ１１内に設置された試料に、まさにその位置において、外から放射される光、たとえば白色光または青色光（最大波長４６０ｎｍ）を照射することが可能となる。
【００２５】
図２と３の斜視断面図は観察窓構造２を示している。切断面は垂直であり、観察窓の中心軸を通り、チャンバの縦軸に対して垂直である。観察窓構造２は、チャンバ１１の窓用開口部１９の中に保持され、螺合接続によって所定の位置に固定される。観察窓２０はインサート２２によって保持され、これは中央開口部２１を有する管状の基本形状を有し、その軸は窓２０の中心軸と一致する。インサート２２は、窓用開口部１９と共に窓２０のための窓支持手段を形成する。
【００２６】
開口部２１は、インサートの軸に沿って延び、光路の役割を果たし、導光手段２３の一端を収容し、この端は好ましくは窓２０に突き当たる。光路の軸はそれゆえ、光が導光手段２３を通って放射される方向を決定し、カートリッジ３０内に保持される試料３に向けられ、この例示的実施形態に示されているように、チャンバ１１の縦軸に対して垂直であってもよい。
【００２７】
インサート２２は、それ自体が管状の基本形状の外側に肩部２５を有する窓ホルダ２４と、前記肩部と相互作用する保持ねじ２６を含む。保持ねじは、チャンバ内の開口部の雌ねじに螺合されて、肩部２５を圧迫し、その結果、窓２０は確実に耐圧的に取り付けられる。
【００２８】
観察窓２０としては、たとえばいわゆるビューイングセルを使用してもよく、その一例はSitec ７４０．０１ビューイングセル（Sitec-Sieber Enginnering AG，Aschbach，Switzerland）であり、これは窓要素として無色サファイヤを有する。この種のビューイングセルは、観察窓の気密性と耐圧および耐熱性に関する本発明の要求事項を満たしており、視野幅は６〜２８ｍｍである。
【００２９】
あるいは、透明な工業用ダイヤモンドブロックを観察窓として使用してもよい。たとえば、ダイヤモンドブロックを耐圧性螺合接続部にはんだ付けしてもよく、このためにダイヤモンド材料を真空下でろう付けすることができ、これによって信頼性の高い接続が行われる。螺合接続部とダイヤモンドブロックを含むこのようなユニットを、本発明による観察窓２０として使用できる。透明なダイヤモンドの代わりに、ダイヤモンド、サファイヤ等、使用される光領域の耐圧性と透明性に関する要求事項を満たすどのような高強度材料も使用可能である。
【００３０】
留意すべき点として、観察窓２０と光路２１と異なり、チャンバ１１の残りの構造は光不透過性であり、これは、残りの構造がたとえば鋼鉄またはアルミニウム製の構成要素からなり、使用してもよいプラスチック部品（たとえば密閉手段）はすべて光不透過性プラスチックまたはゴムで作製されるからである。これによって、光刺激後の破壊的な光による試料への不要な影響がすべて排除される。
【００３１】
図４は、ホルダ１３の末端部品１６の中に保持されている試料カートリッジ３０を示す。図５は、カートリッジ３０の分解図を示す。末端部品１６は、たとえば高級鋼で作製され、カップの形状（カップの向きは縦軸に水平であり、したがって、この例示的実施形態において水平である）に構成され、観察窓２０の位置に対応する側に窪み１７を有する。末端部品１６は、平凹形状の２つの対向するインサート部品１８（これも鋼鉄で作製される）を含む。インサート部品１８は、柔軟な舌状部材としての役割を果たし、試料カートリッジの部品を一体に保持するためにばね効果を発生させる。観察窓のための空間を作るために、インサート部品１８は相互にずらされ、他の実施形態においては、これらの要素を垂直方向に取り付けることができる。
【００３２】
カートリッジ３０は、カバー部品３１とベース部品３２を含む。支持板３３が、カートリッジの部品３１と３２の間に位置付けられる。図４では、支持板３３がよく見えるように、カバー部品３１は一点鎖線でのみ示されている。カバー部品３１とベース部品３２は、実質的に半円筒形の基本形状を有しており、ベース部品３２の平坦な内面に、および場合によってはカバー部品３１の平坦な内面にも、通路３４が設けられ、これは縦方向に延び、その中で冷媒を試料へと案内できる。その結果、ＬＮ２は両側から試料３に流れることができ、急速な冷却が促進される。図の実施形態において、ＬＮ２の供給をさらに改善するために、通路３４は２つの端面の各々から設けられる。これによって、ＬＮ２はカートリッジ３０の中、より具体的には実質的にカートリッジの縦軸に沿って、図５の破線の矢印Ｌの方向に流れることができる。ホルダ１３において（カップの中の、その「底面」の付近またはその中に）、開口部が設けられ、これはチャンバ１１の外側にある出口開口部２９の上方へと続き、したがって、ＬＮ２と入れ替わった気体または液体（エタノール等の多用途充填液を含む）のための出口９３としての役割を果たす。開口部２９へのこの出口通路は、特定の量のＬＮ２（０．２５Ｌ）がカートリッジ内を流れることができるが、凍結保存に必要な時間（約３００〜５００ミリ秒）内では圧力が低下しないような寸法とされ、チャンバの充填物は、チャンバ１１内部の圧力の解放によって出口開口部２９から排出される。入れ替えられた流体の出口のためのこのような開口部がない場合、ＬＮ２の急速な供給によって所望の圧力とすることはできるが、急速冷却はできない。
【００３３】
カートリッジの部品３１と３２には横方向の切欠き３５を設けてもよく、これらはたとえば、カートリッジが縦方向に移動するのを阻止し、および／または構成要素を相互に関して固定するために、各ペアが相互に反対側に配置される。
【００３４】
カートリッジ３０の構成要素３１、３３は透明プラスチック、たとえばポリカーボネートまたはポリスチレン等で作製される。少なくともカバー部品３１は透明材料で作製し、扱いやすさのために（また、混同の可能性も考慮して）、ベース部品３３も透明材料で作製することが賢明である。支持板３３は、たとえばＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）で作製され、それによって加工が容易となる。これらの材料は、使用される圧力と温度範囲での耐圧性と低温挙動の点で高い安定性を有し、それと同時に、光刺激に使用される光範囲、この場合は４００ｎｍより長い波長について十分な透過性を有する。半円形であることもまた光学的に有利であり、これは、光の焦点を試料に当てることができるからである。
【００３５】
図６は、垂直面に沿った支持板３３の縦断面を示しており、その中で、試料３を収容するように設計された空間が断面において開かれた状態で示されている。支持板３３は、両側に切欠き３６を有し、各切欠きはカバーおよびベース部品３１、３２の切欠き３５の一方に対応しており、その中央に円形の開口部３７を有し、その中で試料３がたとえばサファイヤで作製された２枚のディスク３８間に保持される。ディスク間の距離は、スペーサリング３９を使って調整可能である。サファイヤディスク３８はまた、試料３を保護する役割も果たし、これは、そうでなければ、冷却に必要なＬＮ２の急速な流れがそれと一緒に試料を移動させてしまうからである。サファイヤディスク３８の厚さはたとえば１１０μｍであり、開口部３６の直径は６ｍｍである。直径３ｍｍの開口部を有する１つの変化形においては、５０μｍの、より薄いディスクで十分でありうる。ここではサファイヤの材料が好ましいが、これは、それが高い安定性を特徴とし、細胞培養とバクテリアにとって良好な基板となるからである。さらに、サファイヤには高い伝熱性という別の利点もあり、これによって試料の急速冷却が確実に行われる。
【００３６】
カートリッジ３０の全体は、好ましくは５００ミリ秒の時間内に必要な圧力（たとえば、２０００バール＝２００ＭＰａ）まで上昇させて、保持することができ、同じ時間内に試料３の急速凍結が実現されるような寸法とされる。
【００３７】
図７は、光刺激のトリガ制御システム７のブロック図を示し、これによって、刺激の光パルスと凍結工程を、時間に関して、場合によってはコンピュータ制御により制御できる。ＬＮ２の取入弁は、たとえばリード接点として実現されるセンサ７１によりモニタされる。センサは、たとえば取入弁が開いて、圧力の上昇と冷却工程が始まったときに作動し、試料の光刺激をトリガする。実際の圧力／冷却工程は、取入弁が開いた後、特定の時間が経過してから始まり、この時間間隔は事前に決定可能であり（たとえば、オシロスコープのモニタに基づいて温度センサによって取られた測定値を使用する。この目的のために、温度センサはそれに対応する単位時間当たりの分解能を有していなければならない）、ここで示されている場合においては、たとえば約３０ミリ秒である。光刺激の開始はセンサ信号によって直接トリガされ、したがって、照射時間は上記の時間、この場合は３０ミリ秒に対応する。
【００３８】
冷却システム８の切替のための他の構成要素に接続された他のセンサ７１ａにより、凍結前に異なる長さの照射時間を設けることができる。図の実施形態においては、ロッキングピン９４の作動（より正確には、ロックを確認する信号）もタイミングとして選択でき、これが可能であるのは、前述のようにロックが凍結工程の開始をトリガするためである。たとえば、ロッキングピンを作動させるための空気圧シリンダ２８の１つに取り付けられたセンサ７１ｂにより、遅延時間はたとえば約５００ミリ秒となる。ブロック図では、センサ７１、７１ａ、７１ｂはいくつでも接続できるセンサの例として示されている。もちろん、センサ信号ではなく、電気作動式の弁からの切替信号をトリガ制御システム７の作動用入力信号として使用することも適当かもしれない。
【００３９】
センサ７１は、場合によっては別のセンサと共に、プログラム可能なＬＥＤ光源７３のトリガ入力に接続され、その際、取り付けられたセンサのうちの１つを選択するために使用される接続配電盤７２を介する。光源７３は、前述のように、トリガ信号が作動されるとすぐに、グラスファイバ導光手段を介して光パルスを発生する。このようにして、光パルスの遅延時間と持続時間をプログラム可能な光源７３の中で、コンピュータ７４により、制御インタフェース、たとえばこの場合は公知の種類のシリアルＲＳ２３２接続を介して自由に調整できる。遅延時間は、センサの作動と加圧および冷却工程の開始との間の時間の長さを短くするため、すなわちそれぞれ３０または５００ミリ秒未満の所望の数値とするために使用される。
【００４０】
光源７３は、好ましくは光強度の高いＬＥＤまたは半導体レーザの形態で実現してもよい。たとえば、光源はLED Engin，Inc．（San Jose，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なＬＺ１型（たとえば、波長４６０ｎｍの青色光用ＬＺ１ ００Ｂ２００）のＬＥＤ光源とすることができる。好適なプログラム可能光源の一例は、Schott AG（Mainz，Germany）製造の「Schott ＬＬＳ」である。この種の光源は、調整可能なパルス繰り返し数とパルス幅、高い光強度（最高２７５ｌｍ）および各種の波長のパルスを生成し、あらゆる従来のタイプの光ファイバに適合し、コンピュータを介したプログラミングと制御を可能にするインタフェースを含む。上述の光源は、この例示的実施形態では青色であるが、赤色、暗赤色（すなわち、長波長の赤）、橙色（短波長の赤）、黄色、緑色、短波長の青色、白色、ＩＲ、ＵＶ等、各種の光のために選択して使用でき、カートリッジ３０の透明材料は、場合によっては、使用される光に基づいて適当に調整してもよい。
【００４１】
それゆえ、この例示的実施形態を利用する代表的な例において、本発明により高圧条件下で凍結を行う試料の一連の準備工程は以下のとおりである。
−支持板に試料を位置付け、カートリッジを組み立てる。
−カートリッジをホルダに装填する。
−ホルダをカートリッジと共に高圧チャンバ内に挿入し、ホルダをロックする。
−光刺激の後に凍結保存を実行する。
−（前述のように出口開口部を介して、または圧力逃がし弁を開くことによって）圧力を逃がす。
−カートリッジを取り外し、（カートリッジに入ったままか、そこから取り外された）試料についてさらに準備を行う。
【００４２】
他の実施形態では、個々のステップを選択された用途に応じて変更してもよい。
【００４３】
光刺激の後の実際の凍結保存は、観察窓を通じて光で試料を刺激するステップと、その後、チャンバ内への冷媒（ＬＮ２）の流入を（たとえば、取入弁を開くことによって）開始することにより、試料の高圧保存を行うステップを含む。これら２つの工程は、所定の時間相関に従って、相互に関して開始される。
【００４４】
上記の２つの事象のタイミングを、事前決定可能な時間遅延を含めて同期化するためには、高圧凍結システムの具体的な機器関連の詳細事項を利用することが適当であるかもしれない。たとえば、説明した実施形態では、一定の持続時間の遅延によって一般に光刺激のための十分な時間が得られ、この遅延が冷媒システム８の作動（たとえば、取入弁８５の開放）と冷却工程の開始との間に発生するという上述の事実を利用してもよい。したがって、光刺激は、上述のような冷却媒体供給源８の作動によってトリガされる。その結果、２つの事象のシーケンスが５００ミリ秒未満という非常に短い時間間隔内で実行される。
【００４５】
もちろん、具体的に記した本発明にさまざまな改変を加え、また、これをさらに発展させることができ、これらは説明した例示的実施形態に限定されず、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲から逸脱しない。たとえば、ＬＮ２の代わりの凍結液体として、各用途に適した他の公知の寒剤のいずれを使用することもできる。光刺激は、単色または所望の光スペクトルの、あらゆる種類の所望の光の照射によって実行でき、可視範囲だけでなく、ＩＲおよび／またはＵＶ光も必要に応じて使用可能である。刺激光はまた、光源から直接（すなわち、導光手段を用いずに）放射させてもよく、この場合、光源を窓インサートの開口部に直接設置してもよい。
【符号の説明】
【００４６】
１  急速凍結装置
２  観察窓構造
３  試料
７  トリガ制御システム
８  冷媒システム
１１  高圧チャンバ
２０  窓
２２  窓支持手段
２３  導光手段
３０  試料ホルダ
３１  カバー部品
３２  ベース部品
３３  支持板
７１、７１ａ、７１ｂ  センサ
７３  光源
８５  取入弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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