(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のアデノシン三リン酸加水分解酵素活性（ＡＴＰａｓｅ活性）を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＴＰを接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、かつ該ＲＮＡは下記群；
（１）ｐｏｌｙＡ（ポリアデニル酸）、
（２）ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、および
（３）ｐｏｌｙＩＣ（ポリイノシン酸およびポリシチジル酸からなる２本鎖ＲＮＡ）、
より選ばれる少なくともいずれか１種のＲＮＡである、同定方法。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）存在下、該蛋白質と２本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、かつ該２本鎖ＲＮＡは配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡである、同定方法。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびＣＩＰ２９（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２９ｋＤａ）存在下、該蛋白質と２本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、かつ該２本鎖ＲＮＡは配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡである、同定方法。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、該蛋白質と２本鎖ＲＮＡを用い、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、該２本鎖ＲＮＡは配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡと配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡであってその５´末端がＡｌｅｘａ６８０標識されている１本鎖ＲＮＡ（Ａｌｅｘａ６８０標識１本鎖ＲＮＡ）とからなる２本鎖ＲＮＡであり、
かつ該同定方法は下記（１）および（２）の工程；
（１）該蛋白質と該２本鎖ＲＮＡを含む反応溶液において、該蛋白質と該２本鎖ＲＮＡとの接触を、被験化合物、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびＣＩＰ２９（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２９ｋＤａ）が存在し、かつ該反応溶液に含まれる該蛋白質量と該反応溶液に含まれる該２本鎖ＲＮＡ量のモル比が８００：１である条件下で行う工程、
および
（２）前記（１）の工程における接触後、該反応溶液に含まれる該２本鎖ＲＮＡとＡｌｅｘａ６８０標識１本鎖ＲＮＡとを、４℃の温度条件下、１２．５％の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離する工程、
を含む、同定方法。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法であって、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および／またはアデニルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）並びに被験化合物存在下、該蛋白質と１本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、かつ該１本鎖ＲＮＡは配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡである、同定方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とアデニルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＭＰ−ＰＮＰを接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、
かつ該ＲＮＡは配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡである、同定方法。
【請求項７】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはアデニルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）が有する活性であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物存在下、該蛋白質とＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰ、および、該蛋白質と１本鎖ＲＮＡをそれぞれ接触させる工程を含み、
ここで該蛋白質は該ポリヌクレオチドを含有する組み換え型バキュロウイルスを導入したＳｆ９細胞を培養し次いでその培養物から回収される蛋白質であり、かつ該１本鎖ＲＮＡは配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡである、同定方法。
【請求項８】
ヒト肺組織由来の被験組織が肺癌由来であるか否かを判定する方法であって、被験組織における配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの発現量を測定し、該被験組織における該ポリヌクレオチドの発現が正常な対照組織との比較において１．７７倍以上である場合、該被験組織は肺癌由来であると判定することを特徴とする判定方法。
【請求項９】
ヒト肝臓組織由来の被験組織が肝臓癌由来であるか否かを判定する方法であって、被験組織における配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの発現量を測定し、該被験組織における該ポリヌクレオチドの発現が正常な対照組織との比較において１．７４倍以上である場合、該被験組織は肝臓癌由来であると判定することを特徴とする判定方法。
【請求項１０】
ヒト肺組織由来の被験組織が肺癌由来であるか否かを判定する方法であって、以下の工程を含む判定方法：
（１）被験組織から核酸を調製する工程、
（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記（１）で調製した核酸から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび／またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅する工程、
（３）前記（２）で増幅したポリヌクレオチドの量を測定する工程、および
（４）該被験組織における該ポリヌクレオチドの発現が正常な対照組織との比較において１．７７倍以上である場合、該被験組織は肺癌由来であると判定する工程。
【請求項１１】
ヒト肝臓組織由来の被験組織が肝臓癌由来であるか否かを判定する方法であって、以下の工程を含む判定方法；
（１）被験組織から核酸を調製する工程、
（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記（１）で調製した核酸から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび／またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅する工程、
（３）前記（２）で増幅したポリヌクレオチドの量を測定する工程、および
（４）該被験組織における該ポリヌクレオチドの発現が正常な対照組織との比較において１．７４倍以上である場合、該被験組織は肝臓癌由来であると判定する工程。
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、以下の群から選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いるＰＣＲである、請求項１０または１１に記載の判定方法；
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせ、並びに
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デッドボックス  ポリペプチド  ３９（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）  ｂｏｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ３９；以下、ＤＤＸ３９と略称する）遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、ＤＤＸ３９と略称する）の機能を調節する化合物の同定方法、該化合物の用途、並びにＤＤＸ３９遺伝子またはＤＤＸ３９の検出を手段とする疾患の検査方法に関する。より詳しくは、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のアデノシン三リン酸加水分解酵素活性（以下、ＡＴＰａｓｅ活性と略称する）を阻害する化合物の同定方法に関する。また本発明は、該蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに本発明は、該蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法に関する。また本発明は、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）またはＡＴＰ類縁体が有する活性であって、該蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに本発明は、該蛋白質と非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法に関する。また本発明は、前記化合物を含有してなるＲＮＡヘリカーゼ阻害剤に関する。さらに本発明は、前記化合物および／または前記ＲＮＡヘリカーゼ阻害剤を含有してなる抗癌剤に関する。さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの被験組織における発現の検出を手段とする癌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＤＸ３９は、肺癌由来の蛋白質として見出された蛋白質であり、ＤＥＡＤボックス（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ）モチーフを有することが知られている。ＤＤＸ３９には、現在３つのアイソザイムが報告されており、各アイソザイムのアミノ酸配列および各アイソザイムをコードする遺伝子の塩基配列がＧｅｎＢａｎｋに登録され公開されている。各アイソザイムのアミノ酸配列のアクセッション番号は、ＡＡＨ０１００９、ＡＡＨ１０４５５およびＡＡＨ３２１２８である。また、各アイソザイムをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号はそれぞれ、ＢＣ００１００９、ＢＣ０１０４５５およびＢＣ０３２１２８である。【０００３】
ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフを有する蛋白質（以下、ＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質と称する）の多くはＲＮＡヘリカーゼである。ＲＮＡヘリカーゼは、二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡの二重構造を巻き戻す酵素であり、翻訳、ＲＮＡスプライシング、蛋白質合成およびリボゾーム合成等、様々な役割に携わっている。ＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質の多くは、ＡＴＰａｓｅ活性を有することからＡＴＰ依存性のＲＮＡヘリカーゼであり、ＡＴＰを加水分解することによりＲＮＡの巻き戻し活性を呈すると考えられている（非特許文献１−３）。【０００４】
ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフは、８つのモチーフ、一般的にモチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶおよびモチーフＶＩと称されるモチーフから構成される（非特許文献４−６）。モチーフＩは、ＡＴＰａｓｅ  Ａモチーフとも称され、ＡＴＰとの結合に関与すると考えられている。モチーフＩａおよびモチーフＩｂはＲＮＡ結合に関与すると考えられている。モチーフＩＩは、ＡＴＰａｓｅ  Ｂモチーフとも称され、ＡＴＰ加水分解および該分解とヘリカーゼ活性との共役に関与すると考えられている。モチーフＩＩＩはＲＮＡの巻き戻しに関与すると考えられている。モチーフＩＶおよびモチーフＶはＲＮＡとの結合に関与すると考えられている。モチーフＶＩはＲＮＡとの結合およびＡＴＰ加水分解に関与すると考えられている。【０００５】
ＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質として、ｅＩＦ−４Ａ（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ａ）が知られている。ｅＩＦ−４ＡとＤＤＸ３９の相同性は３４．６％である。ｅＩＦ−４Ａは、メッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと称する）二次構造の巻き戻しに不可欠なＲＮＡヘリカーゼであり、翻訳における開始複合体の形成に関与している。ｅＩＦ−４ＡアンチセンスＤＮＡにより弱い細胞増殖阻害（１０％程度）が観察されたことが報告されている（非特許文献７）。また、ｅＩＦ−４Ａと複合体を形成して補助因子として作用するｅＩＦ−４ＥやｅＩＦ−４Ｇの強制発現により増殖促進が観察されたことが報告されている（非特許文献８および９）。ｅＩＦ−４ＥおよびｅＩＦ−４ＧはＲＮＡヘリカーゼではなく、ｅＩＦ−４Ａの補助因子としての作用以外に別の機能も知られている。ｅＩＦ−４ＥとＤＤＸ３９の相同性は２０％である。一方、ｅＩＦ−４ＧとＤＤＸ３９の相同性はみられない。【０００６】
ＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質としてまた、ｒｃｋ／ｐ５４が知られている。ｒｃｋ／ｐ５４とＤＤＸ３９の相同性は３６．３％である。ｒｃｋ／ｐ５４は、ｍＲＮＡの構造変化に作用するＲＮＡヘリカーゼであり、特定の癌遺伝子の蛋白質合成を促進して発癌に関わっていると考えられている。ｒｃｋ／ｐ５４の強制発現により増殖抑制が観察されたことが報告されている（非特許文献１０）。【０００７】
【非特許文献１】オー（Ｏｈ  Ｊ．Ｙ．）ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第２７巻、第１３号、ｐ．２７５３−２７５９。
【非特許文献２】オカナミ（Ｏｋａｎａｍｉ，Ｍ．）ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９８年、第２６巻、第１１号、ｐ．２６３８−２６４３。
【非特許文献３】ボーデッカー（Ｂｏｅｄｄｅｋｅｒ  Ｎ．）ら、「ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第２５巻、第３号、ｐ．５３７−５４４。
【非特許文献４】ポーズ（Ｐａｕｓｅ  Ａ．）ら、「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９３年、第１３巻、第１１号、ｐ．６７８９−６７９８。
【非特許文献５】ポーズ（Ｐａｕｓｅ  Ａ．）ら、「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９２年、第１１巻、第７号、ｐ．２６４３−２６５４。
【非特許文献６】ロカク（Ｒｏｃａｋ  Ｓ．）ら、「ネイチャー  レヴューズ  モレキュラー  セル  バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第５巻、第３号、ｐ．２３２−２４１。
【非特許文献７】エバール（Ｅｂｅｒｌｅ  Ｊ．）ら、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）」、２００２年、第８６巻、第１２号、ｐ．１９５７−１９６２。
【非特許文献８】ベネデッティ（Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９０年、第８７巻、第２１号、ｐ．８２１２−８２１６。
【非特許文献９】フクチ−シモゴーリ（Ｆｕｋｕｃｈｉ−Ｓｈｉｍｏｇｏｒｉ  Ｔ．）ら、「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第５７巻、第２２号、ｐ．５０４１−５０４４。
【非特許文献１０】アカオ（Ａｋａｏ  Ｙ．）ら、「フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、１９９８年、第４２９巻、第３号、ｐ．２７９−２８３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＤＤＸ３９遺伝子は、肺癌ｃＤＮＡライブラリーより同定された。しかし、ＤＤＸ３９遺伝子と癌との機能的な関与については未だ報告されていない。また、ＤＤＸ３９はＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質であるが、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼとしての機能に関する報告はない。【０００９】
本発明の課題は、ＤＤＸ３９と疾患との関連およびＤＤＸ３９の機能を明らかにし、さらに該疾患に適用し得る医薬の開発のために、ＤＤＸ３９の機能を調節する化合物の同定方法を提供することである。また別の課題は、ＤＤＸ３９および／またはＤＤＸ３９をコードする遺伝子の検出を手段とする該疾患の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力した。そして、ＤＤＸ３９遺伝子のｃＤＮＡ、すなわち配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドを取得し、１）ＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が癌組織や癌細胞において対照となる正常組織や正常細胞と比較して高いこと、２）ＤＤＸ３９遺伝子の強制発現により細胞増殖が促進されること、３）インビトロにおいて、ＤＤＸ３９遺伝子産物がＲＮＡと結合すること、４）インビトロにおいて、ＤＤＸ３９遺伝子産物とＲＮＡの結合をＡＴＰまたはその類縁体が増強すること、５）インビトロにおいて、ＤＤＸ３９遺伝子産物がＡＴＰａｓｅ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性をそれぞれ示すこと、および６）ＤＤＸ３９遺伝子産物が細胞核内のスペックルに局在することを明らかにした。そして、これらの成果により本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＴＰを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００１２】
また、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物および以下の群より選ばれる少なくともいずれか１種のＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＴＰを接触させる工程を含む、同定方法に関する：
（１）重合ＲＮＡ、および
（２）トランスファーＲＮＡ（以下、ｔＲＮＡと略称する）。【００１３】
さらに、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物および以下の群より選ばれる少なくともいずれか１種のＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＴＰを接触させる工程を含む、同定方法に関する：
（１）ｐｏｌｙＡ（ポリアデニル酸）、
（２）ｔＲＮＡ、および
（３）ｐｏｌｙＩＣ（ポリイノシン酸およびポリシチジル酸からなる２本鎖ＲＮＡ）。【００１４】
さらにまた、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物並びに配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ存在下、該蛋白質とＡＴＰを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００１５】
また、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびＡＴＰ存在下、該蛋白質とある２本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００１６】
さらに、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物、ＡＴＰおよびＣＩＰ２９（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２９ｋＤａ）存在下、該蛋白質とある２本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００１７】
さらにまた、本発明は、前記ある２本鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡである、前記同定方法に関する。【００１８】
また、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物、ＡＴＰおよびＣＩＰ２９存在下、該蛋白質とある２本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含み、かつ、該２本鎖ＲＮＡが配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡである、同定方法に関する。【００１９】
さらに、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法であって、ＡＴＰおよび／またはＡＴＰ類縁体並びに被験化合物存在下、該蛋白質とある１本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００２０】
さらにまた、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法であって、ＡＴＰおよび／またはアデニルイミド二リン酸（以下、ＡＭＰ−ＰＮＰと略称することがある）並びに被験化合物存在下、該蛋白質とある１本鎖ＲＮＡを接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００２１】
また、本発明は、前記ある１本鎖ＲＮＡが、配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡである、前記同定方法に関する。【００２２】
さらに、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とある非水解性ＡＴＰ類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物およびＲＮＡ存在下、該蛋白質と該非水解性ＡＴＰ類縁体を接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００２３】
さらにまた、本発明は、ＡＴＰまたはあるＡＴＰ類縁体が有する活性であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物存在下、該蛋白質とＡＴＰまたは該ＡＴＰ類縁体、および該蛋白質とある１本鎖ＲＮＡをそれぞれ接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００２４】
また、本発明は、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰが有する活性であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法であって、被験化合物存在下、該蛋白質とＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰ、および、該蛋白質とある１本鎖ＲＮＡをそれぞれ接触させる工程を含む、同定方法に関する。【００２５】
さらに、本発明は、前記ある１本鎖ＲＮＡが配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡである、前記同定方法に関する。【００２６】
さらにまた、本発明は、ヒト肺組織由来の被験組織が肺癌由来であるか否かを判定する方法であって、被験組織における配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。【００２７】
また、本発明は、ヒト肝臓組織由来の被験組織が肝臓癌由来であるか否かを判定する方法であって、被験組織における配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。【００２８】
さらに、本発明は、ヒト肺組織由来の被験組織が肺癌由来であるか否かを判定する方法であって、以下の工程を含む判定方法に関する：
（１）被験組織から核酸を調製する工程、
（２）ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称することがある）により、前記（１）で調製した核酸から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび／またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅する工程、および
（３）前記（２）で増幅したポリヌクレオチドの量を測定する工程。【００２９】
さらにまた、本発明は、ヒト肝臓組織由来の被験組織が肝臓癌由来であるか否かを判定する方法であって、以下の工程を含む判定方法に関する；
（１）被験組織から核酸を調製する工程、
（２）ＰＣＲにより、前記（１）で調製した核酸から、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび／またはその部分配列からなるポリヌクレオチドを増幅する工程、および
（３）前記（２）で増幅したポリヌクレオチドの量を測定する工程。【００３０】
また、本発明は、前記ＰＣＲが、以下の群から選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの組み合わせをプライマーとして用いるＰＣＲである、前記判定方法に関する；
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせ、並びに
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドおよび配列表の配列番号６に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの組み合わせ、
に関する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、ＤＤＸ３９の機能を調節し得る次に示す化合物の同定方法を提供できる：ＤＤＸ３９のヌクレオシド三リン酸加水分解酵素（以下、ＮＴＰａｓｅと略称することがある）活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物、ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であってＤＤＸ３９とＲＮＡとの結合を増強する活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物。【００３２】
本同定方法により得られた化合物は、ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する。また、本同定方法により得られた化合物は、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する。本発明は、ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物を含有してなるＮＴＰａｓｅ活性阻害剤を提供できる。さらに本発明は、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物を含有してなるＲＮＡへリカーゼ活性阻害剤を提供できる。【００３３】
本同定方法により得られた化合物は、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、その結果、細胞増殖を阻害する。したがって、本同定方法により得られた化合物は、癌疾患の予防および／または治療のための医薬の有効成分として使用できる。【００３４】
本発明は、被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現量を測定することにより被験組織が癌組織由来であるか否かを判定する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）の発現量が、肺扁平上皮癌組織（左パネル）および転移性肝臓癌組織（右パネル）において、正常組織と比較して高いことを説明する図である。遺伝子の発現パターンは、マイクロアレイによる組織別遺伝子発現データベース（バイオエクスプレス）を使用して解析した。本遺伝子の発現強度（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）および扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）において、正常肺（ｎｏｒｍａｌ  ｌｕｎｇ）組織と比較して高い。また、本遺伝子の発現強度は、繊維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）肝臓組織、原発巣肝臓癌（ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｏｍａ）、転移性肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）において、正常肝臓（ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ）組織と比較して高い。括弧内の数値はサンプル数を示す。各ドットはアレイでの強度を、各バーはその平均値を示す。（実施例１）
【図２】本遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と、該アミノ酸配列中に保存されているＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質に共通のモチーフ（四角い枠で示す）を示す図である。各モチーフは一般的に、アミノ酸配列のＮ末端側から順に、モチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶおよびモチーフＶＩと称される。（実施例２）
【図３】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）の発現量（下段のパネル）が、肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６（左パネル）および非分化型肝癌細胞ＨＬＥ（右パネル）において、正常細胞と比較して高いことを説明する図である。図中、ＨＮＢＥは正常気管支細胞、ＲＥＲＦは肺腺癌細胞、ＨＮＨは正常肝細胞、およびＨｅｐＧ２は分化型肝細胞である。上段の左右のパネルはいずれも、対照であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ３ＰＤＨと略称する）遺伝子の各細胞内での発現量を示す。（実施例３）
【図４−Ａ】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質が細胞増殖を促進したことを説明する図である。本遺伝子をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞では、空ベクターをトランスフェクションしたもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、形成されたコロニーの数およびその面積が増加した。左パネルは、１２穴プレート中でベクターをトランスフェクションした細胞を使用して検討した結果を、右パネルは、２４穴プレート中でベクターをトランスフェクションした細胞を使用して検討した結果を示す。図中、黒カラムは形成されたコロニー数を、白カラムはコロニーが占める面積（Ａｒｅａ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ））を示す。（実施例４）
【図４−Ｂ】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質が細胞増殖を促進したことを説明する図である。本遺伝子をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のコロニーと、空ベクターをトランスフェクションした細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）のコロニーについて、代表的なコロニー像を示す。（実施例４）
【図５】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質がＲＮＡに結合することを示す図である。本蛋白質をジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブ（ＤＩＧ−ＲＮＡ  ｐｒｏｂｅ）に添加して調製した試料ではＲＮＡを示すバンド（その位置を矢印で示す）に加えて、本蛋白質とＲＮＡとの複合体を示すバンド（その位置を矢頭で示す）が検出されたのに対し、本蛋白質を添加しなかった試料ではＲＮＡを示すバンドのみが検出された。本図はまた、本蛋白質とＲＮＡとの複合体を示すバンドのシグナルが、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰの添加により、ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）非添加のときと比較して増加したことを示す。（実施例５）
【図６】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質の細胞内局在を示す図である。ＧＦＰと表示したパネルは、本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質とモンスターＧＦＰとの融合体の蛍光像を示す。Ｈｏｅｃｈｓｔと表示したパネルは核の染色像を示す。ｍｅｒｇｅと表示したパネルは両者の合成像を示す。（実施例６）
【図７】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質がＲＮＡヘリカーゼ活性を示したこと、本蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性がＣＩＰ２９により増強されたこと、および本蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性はＡＴＰ依存性であることを説明する図である。本蛋白質により、ＡＴＰの存在下で、２本鎖ＲＮＡのシグナルが減少し、代わって１本鎖ＲＮＡのシグナルが増加した（レーン３）。本蛋白質に加えてＣＩＰ２９を添加すると、ＡＴＰの存在下で、２本鎖ＲＮＡのシグナルの減少および１本鎖ＲＮＡのシグナルの増加がさらに亢進した（レーン４）。これに対し、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加せず、ＣＩＰ２９のみを添加したときには、ＡＴＰの存在、非存在に拘らず、１本鎖ＲＮＡのシグナルは検出されなかった（レーン５、８）。また、ＡＴＰ非存在下では、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加しても、ＣＩＰ２９の添加、非添加に拘らず、１本鎖ＲＮＡのシグナルは検出されなかった（図７のレーン６、７）。１本鎖ＲＮＡの移動位置はレーン１で確認した。２本鎖ＲＮＡを用い、本蛋白質およびＣＩＰ２９を添加せずにＡＴＰ存在下で反応を行ったときは、２本鎖ＲＮＡを示すシグナルが検出された（レーン２）。図の左側に、２本鎖ＲＮＡおよび１本鎖ＲＮＡの位置を模式図で示した。図の下段に、２本鎖ＲＮＡの巻き戻し比率（％  ｄｕｐｌｅｘ  ｕｎｗｉｎｄ）を示した。（実施例７）
【図８】本遺伝子（ＤＤＸ３９遺伝子）によりコードされる蛋白質によりＡＴＰから遊離されるリン酸量が、ＲＮＡ非存在下（図中、Ｎｏ  ＲＮＡと表記）では殆ど検出されなかったのに対し、ＰｏｌｙＡ、ｔＲＮＡ、またはＰｏｌｙＩＣの存在下では顕著に増加したことを示す図である。縦軸は、遊離リン酸量（Ｒｅｌｅａｓｅｄ  Ｐｉ）を示す。（実施例８）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。【００３７】
本発明において、癌細胞で発現が亢進している遺伝子の同定を組織別遺伝子発現データベースを利用して実施し、該遺伝子として公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッション番号ＢＣ００１００９として登録されているＤＤＸ３９遺伝子を見出した。ＤＤＸ３９遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＡＡＨ０１００９として登録されている。【００３８】
ＤＤＸ３９遺伝子のｃＤＮＡをヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより取得し、該ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。本ｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に、本ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。本ｃＤＮＡの塩基配列および本ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列はそれぞれ、ＤＤＸ３９遺伝子（アクセッション番号ＢＣ００１００９）のオープンリーディンフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列および該遺伝子によりコードされる推定アミノ酸配列と同一であった。【００３９】
本ｃＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列（配列番号２）には、ＲＮＡヘリカーゼ活性をもつ、いわゆるＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質のモチーフが保存されていた（図２）。ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフは、８つのモチーフ、一般的にはモチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶ、およびモチーフＶＩと称される８つのモチーフから構成されている。該アミノ酸配列（配列番号２）において、モチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶ、およびモチーフＶＩはそれぞれ、第８８番目から第９５番目、第１２０番目から第１２７番目、第１７１番目から第１７４番目、第１９５番目から第１９８番目、第２２７番目から第２２９番目、第２８９番目から第２９１番目、第３４７番目から第３５０番目、および第３７０番目から第３８１番目に保存されている。モチーフＩはＡＴＰとの結合に関与すると考えられる。モチーフＩａおよびモチーフＩｂはＲＮＡ結合に関与すると考えられる。モチーフＩＩはＡＴＰ加水分解に関与すると考えられる。モチーフＩＩＩはＲＮＡの巻き戻しに関与すると考えられる。モチーフＩＶおよびモチーフＶはＲＮＡとの結合に関与すると考えられる。モチーフＶＩはＲＮＡとの結合およびＡＴＰ加水分解に関与すると考えられる。【００４０】
本発明において、インビトロにおいてＤＤＸ３９遺伝子産物がＡＴＰａｓｅ活性およびＡＴＰ依存性のＲＮＡヘリカーゼ活性をそれぞれ示すことを実証した（実施例７および８）。したがって、ＤＤＸ３９遺伝子産物はＡＴＰ依存性のＲＮＡヘリカーゼであるＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質である。また、本発明において、ＤＤＸ３９遺伝子産物は細胞核内のスペックルに局在することを実証した（実施例６）。さらに、本発明において、ＤＤＸ３９遺伝子産物の強制発現により細胞増殖が促進されることを実証した（実施例４）。【００４１】
スペックルはクロマチン間顆粒群（ｉｎｔｅｒｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）とも呼ばれている。スペックルには、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング因子が局在している。すなわち、スペックルはスプライシング因子の貯蔵庫だと考えられる。これらから、ＤＤＸ３９遺伝子産物は生体内でそのＲＮＡヘリカーゼ活性を介してスプライシングを促進していると考えることができる。【００４２】
ｍＲＮＡの代謝が促進されれば、当然、蛋白質の産生も増強される。蛋白質の産生を翻訳を介して増強するｅＩＦ４複合体やＳ６キナーゼ等は癌化や増殖に関与することが知られている。これらから、ＤＤＸ３９も、転写やスプライシング作用の促進を介して、特定のあるいは一般の蛋白質産生を増強することにより癌細胞の増殖に関与していると考えることができる。【００４３】
ＤＤＸ３９遺伝子の発現強度は、癌組織や癌細胞において正常組織や正常細胞と比較して高かった。具体的には、肺扁平上皮癌組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比は、正常肺組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して２．０２であった。肺腺癌組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比は、正常肺組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して１．７７であった。また、原発巣肝臓癌および転移性肝臓癌におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比はそれぞれ、正常肝臓組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して１．７４および２．３０であった。このように、ＤＤＸ３９遺伝子の発現は、肺癌や肝臓癌、特に扁平上皮癌や転移性肝臓癌において亢進していることが明らかになった。他の癌組織において同様に調査した結果、正常組織に対するＤＤＸ３９遺伝子の平均発現量の比は、乳癌では１．７５、大腸癌では１．５３、胃癌では１．５９、腎臓癌では１．６４、膵癌では１．６８、前立腺癌では１．２０であった。また、肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６および非分化型肝癌細胞ＨＬＥにおけるＤＤＸ３９遺伝子の転写産物量は、正常気管支細胞ＨＮＢＥあるいは正常肝細胞ＨＮＨにおけるＤＤＸ３９遺伝子の転写産物量と比較して多かった。【００４４】
ＤＤＸ３９はそのＲＮＡヘリカーゼ活性を介して特定のあるいは一般の蛋白質産生を増強することにより癌細胞の増殖に関与していると考えることができる。したがって、ＤＤＸ３９の機能を阻害することにより、ＤＤＸ３９により惹き起こされる蛋白質産生の増強を介した細胞増殖を阻害できる。細胞増殖の阻害により、ひいては癌細胞の増殖を阻害できる。【００４５】
ＤＤＸ３９の機能の阻害は、具体的には、ＤＤＸ３９の機能を阻害する化合物を使用することにより実施できる。ＤＤＸ３９の機能を阻害する化合物を使用することにより、ＤＤＸ３９により惹き起こされる蛋白質産生の増強を介した細胞増殖を阻害でき、ひいては癌細胞の増殖を阻害できる。【００４６】
また、ＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が癌組織や癌細胞において正常組織や正常細胞と比較して高いことから、組織または細胞におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現強度を測定することにより、該組織または該細胞が癌組織由来であるか否かの判定を実施できる。【００４７】
これらに基づいて本発明は、ＤＤＸ３９の機能を阻害する化合物の同定方法、ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性阻害剤、ＤＤＸ３９のＲＮＡへリカーゼ活性阻害剤、および被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現量を測定することにより被験組織が癌組織由来であるか否かを判定する方法を提供する。【００４８】
ここで「ＤＤＸ３９の機能を阻害する」とは、ＤＤＸ３９の機能を低減させる、または消失させることを意味する。【００４９】
「ＤＤＸ３９の機能」とは、ＤＤＸ３９が本来備えている働きを意味する。一般的に蛋白質は、他の物質、例えば他の蛋白質と接触して相互作用することによりその機能を発現する。【００５０】
「ＤＤＸ３９の機能」として、具体的には、ＤＤＸ３９がＡＴＰａｓｅ活性を有するＲＮＡヘリカーゼであることから、ＡＴＰａｓｅおよびＲＮＡヘリカーゼとしての機能を例示できる。ＡＴＰａｓｅとしての機能をＡＴＰａｓｅ活性と称する。ＲＮＡヘリカーゼとしての機能をＲＮＡヘリカーゼ活性と称する。活性とは、機能が高い状態にあることを意味する。【００５１】
ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性の発現とその増強には、ＤＤＸ３９のＡＴＰ結合活性、ＤＤＸ３９のＡＴＰａｓｅ活性、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性が関与する。ＤＤＸ３９は、ＲＮＡに結合し、ＲＮＡヘリカーゼ活性、すなわちＲＮＡの巻き戻し活性を呈する。ＤＤＸ３９は、ＡＴＰと結合し、ＡＴＰａｓｅ活性を呈する。ＤＤＸ３９は、そのＲＮＡヘリカーゼ活性を示す際、ＤＤＸ３９に結合しているＡＴＰを加水分解することにより、ＲＮＡヘリカーゼ活性を呈すると考える。【００５２】
ＲＮＡ非存在下の場合と比べて、ＲＮＡ存在下においてＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰａｓｅ活性が増強された。このことから、ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合によりＤＤＸ３９の構造変化が生じ、その構造変化によりＤＤＸ３９のＡＴＰ結合活性が増強し、その結果、ＤＤＸ３９のＡＴＰａｓｅ活性が増強したと考えられる。【００５３】
一方、ＡＴＰまたはその類縁体の非存在下の場合と比べ、ＡＴＰまたはその類縁体の存在下において、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性が増強した。このことから、ＡＴＰまたはその類縁体はＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性を増強する活性を有すると考えられる。ＡＴＰまたはその類縁体とＤＤＸ３９の結合によりＤＤＸ３９の構造変化が生じ、その構造変化により、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性が増強すると考えられる。さらに、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性の増強により、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性も増強すると考えられる。【００５４】
ＤＤＸ３９の機能として、ＲＮＡとの結合活性、ＡＴＰやその類縁体との結合活性、ＡＴＰａｓｅ活性、ＲＮＡヘリカーゼ活性を例示できる。これらの機能がＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性に関与していることから、これら機能を阻害する化合物がＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し得る。ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害することにより、ＤＤＸ３９を発現する細胞の増殖を阻害できる。【００５５】
ＤＤＸ３９の機能としてまた、細胞増殖促進活性を挙げることができる。ＤＤＸ３９は、細胞増殖促進活性により、癌細胞の増殖に関与すると考えられる。したがって、ＤＤＸ３９の細胞増殖促進活性を阻害することにより、癌細胞の増殖を阻害できる。【００５６】
「ＤＤＸ３９遺伝子の発現」とは、ＤＤＸ３９をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡ（ＤＤＸ３９  ｍＲＮＡ）に転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＤＤＸ３９）のアミノ酸配列として翻訳されることをいう。【００５７】
本発明の一態様は、ＤＤＸ３９の機能を阻害する化合物の同定方法に関する。本発明に係る同定方法として、次の同定方法を挙げることができる：ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性、例えばＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法；ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法；ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法；ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法；ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法。これら同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。【００５８】
「ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性」とは、ＤＤＸ３９が有する、ヌクレオチドを基質としてこのγ位のリン酸基を加水分解し、ヌクレオシド二リン酸と無機リン酸に分解する活性を意味する。ヌクレオチドの加水分解によりエネルギーが生じ、該エネルギーはＤＤＸ３９の機能に使用される。【００５９】
「ＤＤＸ３９のＡＴＰａｓｅ活性」とは、ＤＤＸ３９が有する、ＡＴＰを基質としてこのγ位のリン酸基を加水分解し、アデノシン二リン酸と無機リン酸に分解する活性を意味する。ＡＴＰの加水分解によりエネルギーが生じ、該エネルギーはＤＤＸ３９の機能に使用される。【００６０】
「ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性」とは、ＤＤＸ３９が１本鎖ＲＮＡまたは２本鎖ＲＮＡに作用して、それらＲＮＡの螺旋構造を巻き戻す活性を意味する。【００６１】
「ヌクレオチド類縁体」とは、ヌクレオチドと構造上類似する化合物を意味する。ヌクレオチド類縁体として、ＡＴＰ類縁体を例示できる。「ＡＴＰ類縁体」とは、ＡＴＰと構造上類似する化合物を意味する。ＡＴＰ類縁体としてアデニルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、５´［γ−チオ］トリフォスフェート（ＡＴＰ−γ−Ｓ）を例示できる。【００６２】
「非水解性ヌクレオチド類縁体」とは、ヌクレオチドと構造上類似する化合物であって、ＮＴＰａｓｅ活性を有する酵素によっては加水分解されない化合物を意味する。非水解性ヌクレオチド類縁体として、非水解性ＡＴＰ類縁体を例示できる。「非水解性ＡＴＰ類縁体」とは、ＡＴＰ類縁体であって、ＡＴＰａｓｅ活性を有する酵素によっては加水分解されない化合物を意味する。非水解性ＡＴＰ類縁体として、アデニルイミド二リン酸（ＡＭＰ−ＰＮＰ）、５´［γ−チオ］トリフォスフェート（ＡＴＰ−γ−Ｓ）を例示できる。【００６３】
「ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合」とは、ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体が複合体を形成するように、水素結合または静電的相互作用等の非共有結合により、ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体が相互作用することを意味する。該複合体は、ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体のみならず他の分子種（例えば、ＲＮＡ等）を含むものでもよい。【００６４】
「ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性」とは、ＤＤＸ３９とＲＮＡが複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により、ＤＤＸ３９とＲＮＡが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＤＤＸ３９とＲＮＡがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、ＤＤＸ３９を構成するアミノ酸、またはＲＮＡを構成するヌクレオチドの中に、ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。該複合体は、ＤＤＸ３９とＲＮＡのみならず他の分子種（例えば、ＡＴＰ等）を含むものでもよい。【００６５】
「ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合を増強する活性」とは、ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合反応の速度を速める、あるいはＤＤＸ３９とＲＮＡの結合により形成される複合体を安定化する作用により、該複合体の量を増加させること意味する。【００６６】
「ＤＤＸ３９の細胞増殖促進活性」とは、細胞内でＤＤＸ３９遺伝子が発現することまたはＤＤＸ３９遺伝子の発現が増加することにより、ＤＤＸ３９遺伝子が発現していないときまたはＤＤＸ３９遺伝子の発現が増加していないときと比較して、該細胞が増加することを意味する。【００６７】
本発明に係る同定方法の実施には、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質が使用される。「ＤＤＸ３９に由来する蛋白質」とは、ＤＤＸ３９またはその相同物を意味する。好ましくは、ＤＤＸ３９が使用される。ＤＤＸ３９は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、具体的には配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。「ＤＤＸ３９の相同物」とは、ＤＤＸ３９とその配列において相同性を有し、且つＤＤＸ３９と同様の機能を有する蛋白質を意味する。例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、具体的には配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質とその配列において相同性を有し、且つ該蛋白質と同様の機能を有する蛋白質を意味する。配列の相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが適当である。さらにより好ましくは、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフを有する蛋白質が望ましい。また、ＤＤＸ３９の相同物には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表され、かつ配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の機能を有する蛋白質が包含される。変異アミノ酸の数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個である。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の機能を有する蛋白質、より好ましくはＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフを有する蛋白質である限りにおいて特に制限されない。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【００６８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質は、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変が可能である。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等により付加して標識化したものであってよい。好ましくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。さらに好ましくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の機能が阻害されないような標識化が好ましい。標識化に使用される物質（標識物質）は、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片、ビオチンあるいは放射性同位元素等を例示できるが、これらに限定されない。標識物質は、１種類または複数種類を組み合せてＤＤＸ３９に由来する蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出や精製が容易に実施でき、また、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の機能、例えばＤＤＸ３９に由来する蛋白質と他の物質との結合、より具体的にはＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡとの結合の測定が実施できる。【００６９】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、クマ、またはウサギ等の哺乳動物由来の蛋白質のいずれであってもよい。好ましくは、ヒト由来の蛋白質が使用される。【００７０】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質は、化学合成産物、無細胞系合成産物、遺伝子工学的手法により細胞内で発現させたもの、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。好ましくは精製されたＤＤＸ３９に由来する蛋白質を使用することが、本同定方法への夾雑物質の影響を排除するために適当である。【００７１】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質は、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成方法として、例えば、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、およびウッドワード法等を例示できる。【００７２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の取得はまた、該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的な遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス）により実施できる。例えば、ＤＤＸ３９遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、ＤＤＸ３９遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを使用して、該ｃＤＮＡライブラリーからＤＤＸ３９  ｃＤＮＡを増幅する。得られたＤＤＸ３９  ｃＤＮＡの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、ＤＤＸ３９を取得できる。【００７３】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の取得は、具体的には例えば、該蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを適当な宿主にトランスフェクションして取得した形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から該蛋白質を回収することにより実施できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現されるＤＤＸ３９に由来する蛋白質自体あるいはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生されたＤＤＸ３９に由来する蛋白質自体あるいはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して該蛋白質を抽出する。また、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液自体、または遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液が使用される。【００７４】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の精製および／または分離は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび透析法等の公知の方法を例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作製し、該抗体により特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが推奨される。【００７５】
ＤＤＸ３９をコードする遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドを例示できる。ＤＤＸ３９の相同物をコードする遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと相同性を有し、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいていずれも使用できる。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが適当である。さらにより好ましくは、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフのコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。また、ＤＤＸ３９の相同物をコードする遺伝子として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの塩基配列において１個以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドが包含される。変異ヌクレオチドの数は、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜数個である。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の機能を有する蛋白質である限り特に制限されない。このような変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよく、誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば、成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して、変異の導入を実施できる。また、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施することもできる。【００７６】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子は、その発現あるいはそれによりコードされる蛋白質の機能、例えばＤＤＸ３９に由来する蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであり得る。本ポリヌクレオチドに付加することのできる遺伝子は、具体的には、ＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、あるいはＨｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子を例示できる。これら遺伝子から選択した１種類または複数種類の遺伝子を組合せて本ポリヌクレオチドに付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするために有用である。【００７７】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、クマ、またはウサギ等の哺乳動物由来の遺伝子のいずれであってもよい。好ましくは、ヒト由来の遺伝子が使用される。【００７８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子の取得は、ＤＤＸ３９遺伝子の配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）により容易に実施できる。【００７９】
ＤＤＸ３９遺伝子の取得は、具体的には、ＤＤＸ３９遺伝子の発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより実施できる。ｃＤＮＡの起源として、ＤＤＸ３９遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えば肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６および非分化型肝癌細胞ＨＬＥ等を例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー、例えばヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーを使用することもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、ＤＤＸ３９遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を使用して所望のクローンを選択できる。具体的には、ＤＤＸ３９遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブを使用するプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで使用されるプローブとして、ＤＤＸ３９遺伝子の配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。好ましく使用できるプライマーとして、次のポリヌクレオチドの組み合わせを例示できる：配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ；配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ；配列表の配列番号７および配列番号８に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ；並びに配列表の配列番号１０および配列番号１１に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせ。ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについてＤＤＸ３９の発現の確認を行い、さらにＤＤＸ３９の機能を指標にして実施できる。蛋白質発現系として、自体公知の発現系がいずれも利用できるが、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である（マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４）。【００８０】
ＤＤＸ３９遺伝子の取得には、ＰＣＲによるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４）。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡの単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。【００８１】
かくして得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（マキサム（Ｍａｘａｍ  Ａ．Ｍ．）ら、「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を使用して実施できる。【００８２】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。【００８３】
ベクターＤＮＡには、所望の遺伝子の機能が発揮されるように該遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも所望の遺伝子とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。かかる遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。【００８４】
ベクターＤＮＡに所望の遺伝子を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、所望の遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が利用できる。あるいは、所望の遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。【００８５】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子を含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、該遺伝子によりコードされる蛋白質の製造に有用である。また、このような形質転換体は、ＤＤＸ３９の細胞増殖活性を阻害する化合物の同定方法に使用できる。本形質転換体には、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡの１種類または複数種類をさらに導入できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡとして、例えば、形質転換内で所望のＲＮＡを転写により生じさせることのできるＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを挙げることができる。このようなベクターＤＮＡとＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターにより形質転換して得られる形質転換体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を細胞内で阻害する化合物の同定方法に使用できる。【００８６】
宿主として、適当な原核生物および真核生物をいずれも使用できる。適当な原核生物として、大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。適当な真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を例示できる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ヒトＦＬ細胞およびヒト２９３細胞を例示できる。好ましくは哺乳動物細胞が使用される。より好ましくはヒト由来細胞が使用される。【００８７】
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を例示できるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等の方法を例示できる。【００８８】
ＲＮＡは、一般的な化学合成法や、一般的な遺伝子工学的手法により取得できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置により取得できる。【００８９】
本発明に係る同定方法の一態様は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法により同定された化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合阻害剤の有効成分として使用できる。【００９０】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法は、調べようとする化合物（被験化合物）存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡを接触させる工程を含む。【００９１】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法は、より詳しくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡの結合を測定できる実験系において、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡを接触させ、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合を測定する。次いで、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合と、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合を比較する。被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合と比較し、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合が低減または消失する場合、該被験化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害すると判定できる。【００９２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡの結合を測定できる実験系は、インビトロの実験系でもよく、インビボの実験系でもよい。【００９３】
本同定方法に用いるＲＮＡはＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合する限り特に限定されないが、１本鎖ＲＮＡが好ましく用いられる。１本鎖ＲＮＡとして、配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡを例示できる。その他、本同定方法に用いるＲＮＡとして、ポリアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）等の重合ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ポリイノシン酸およびポリシチジル酸からなる２本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩＣ）、並びに、配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡを例示できる。【００９４】
「重合ＲＮＡ」とは、あるヌクレオチドがリボースの３´−５´間のホスホジエステル結合で重合した１本鎖ＲＮＡポリマー、および、あるヌクレオチドがリボースの３´−５´間のホスホジエステル結合で重合した１本鎖ＲＮＡポリマーと該１本鎖ＲＮＡポリマーの相補的塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡポリマーとがハイブリダイゼーションしてなる２本鎖ＲＮＡを意味する。【００９５】
このような重合ＲＮＡとして、ポリアデニル酸（ポリ（Ａ）と略称されることもある）、ポリグアニル酸（ポリ（Ｇ）と略称されることもある）、ポリウリジル酸（ポリ（Ｕ）と略称されることもある）、ポリイノシン酸（ポリ（Ｉ）と略称されることもある）、ポリシチジル酸（ポリ（Ｃ）と略称されることもある）等を例示できる。さらに、ポリアデニル酸およびポリウリジル酸からなる２本鎖ＲＮＡ、ポリイノシン酸およびポリシチジル酸からなる２本鎖ＲＮＡ、および、ポリグアニル酸およびポリシチジル酸からなる２本鎖ＲＮＡを例示することもできる。【００９６】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合の検出は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合により形成される複合体を検出することにより実施できる。複合体の検出は、ゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法により、またはこれらの方法を組合わせて実施できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡとの複合体の検出のために、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質またはＲＮＡを予め標識物質で標識しておき、ＤＤＸ３９とＲＮＡの結合反応後、該標識物質を検出することにより、該結合の検出を容易に実施できる。標識物質は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質またはＲＮＡに結合させることができる標識物質であって、且つＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を阻害しない物質である限りにおいていずれも使用できる。具体的には、タグペプチド類、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、放射性同位元素、例えば３２Ｐ等といった公知の標識物質を例示できる。標識物質の検出方法は公知の方法により実施できる。例えば、タグペプチドは抗タグペプチド抗体、ＤＩＧの検出は抗ＤＩＧ抗体を使用して実施できる。放射性同位元素の検出はその放射活性を測定することにより実施できる。【００９７】
本同定方法を実施する際、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡの結合を増強する物質を混在させることが好ましい。【００９８】
本発明において、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰを混在させることにより、ＤＤＸ３９遺伝子産物とあるＲＮＡの結合を示すシグナルが増強された（実施例５）。すなわち、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰにより、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡ結合活性は増強する。このことから、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰポケットにＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰが結合することにより、ＤＤＸ３９遺伝子産物の構造が変化し、その結果、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡ結合活性が増強すると考えることができる。ＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡ結合活性が増強することにより、ＤＤＸ３９遺伝子産物とＲＮＡとの複合体の検出が容易になる（実施例５）。【００９９】
このように、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡの結合を増強する物質として、ＡＴＰまたはＡＴＰ類縁体を例示できる。ＡＴＰ類縁体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を増強するＡＴＰ類縁であることが好ましい。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を増強するＡＴＰ類縁として、ＡＭＰ−ＰＮＰ以外に、ＡＴＰ−γ−Ｓを例示できる。【０１００】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡの結合を増強する物質を１種または２種以上混在させることもできる。【０１０１】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物の同定方法を以下に例示する。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質およびＤＩＧ標識ＲＮＡを反応させ、反応後にＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体を、電気泳動により、ＤＩＧ標識ＲＮＡと結合していないＤＤＸ３９に由来する蛋白質およびＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡと分離する。分離後、抗ＤＩＧ抗体を用いて、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体およびＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡを検出できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡと比較し、泳動の移動度が小さい性質を有する。本性質を利用することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体を検出することができる（実施例５）。【０１０２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡの反応前に反応液に被験化合物を添加できる。あるいは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡの反応の際に反応液に被験化合物を添加してもよい。【０１０３】
被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体の量が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体の量と比較して、減少または消失する場合、該被験化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害すると判定できる。【０１０４】
その他、一方を固相化し、他方を標識物質で標識化して使用して結合反応を行い、標識物質を定量的に測定する方法により本同定方法を実施できる。例えば、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質を固相化し、ＲＮＡを標識物質で標識化して使用して、被験化合物存在下、結合反応を行い、標識物質を定量的に測定することができる。標識物質として、ビオチンを例示できる。ビオチン化されたＲＮＡは、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いて測定することができる。アルカリフォスファターゼの代わりにパーオキシダーゼ等の他の酵素で標識されたストレプトアビジンを用いてもよい。その他の標識物質として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）や、ＣＹ５等のカルボシアニン類等の蛍光物質を例示できる。【０１０５】
本発明に係る同定方法の一態様は、ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法により得られる化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合阻害剤の有効成分として使用できる。【０１０６】
ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法は、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体、および、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある１本鎖ＲＮＡをそれぞれ接触させる工程を含む。【０１０７】
ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害する化合物の同定方法は、より詳しくは、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体の結合、および、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある１本鎖ＲＮＡの結合を可能にする実験系において、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ヌクレオチドまたは該ヌクレオチド類縁体、および、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該１本鎖ＲＮＡをそれぞれ接触させ、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合を測定する。次いで、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合と、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合とを比較する。被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該ＲＮＡの結合と比較して、低減または消失する場合、該被験化合物は、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害すると判定できる。【０１０８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体の結合、および、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある１本鎖ＲＮＡの結合を可能にする実験系は、インビトロの実験系でもよく、インビボの実験系でもよい。【０１０９】
ヌクレオチドとして、ＡＴＰを好ましく例示できる。ヌクレオチド類縁体として、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＴＰ−γ−Ｓを好ましく例示できる。【０１１０】
用いる１本鎖ＲＮＡは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合する限り制限されないが、配列表の配列番号９に記載の塩基配列で表されるＲＮＡを例示できる。【０１１１】
本同定方法は、例えば、次の方法で実施できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰ、および、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡをそれぞれ反応させ、反応後にＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体を、電気泳動により、ＤＩＧ標識ＲＮＡと結合していないＤＤＸ３９に由来する蛋白質およびＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡと分離する。分離後、抗ＤＩＧ抗体により、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体およびＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡを検出できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と結合していないＤＩＧ標識ＲＮＡと比較し、泳動の移動度が小さい性質を有する。本性質を利用することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体を検出することができる（実施例５）。【０１１２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰ、およびＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡのそれぞれの反応前に反応液に被験化合物を添加できる。あるいは、これらの反応の際に反応液に被験化合物を添加してもよい。【０１１３】
被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体の量が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＤＩＧ標識ＲＮＡを含む複合体の量と比較して、減少または消失する場合、該被験化合物は、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰが有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を増強する活性を阻害すると判定できる。【０１１４】
本同定方法を実施することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体の結合競合体を取得できる。このような競合体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体の結合阻害剤の有効成分として使用できる。このような競合体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＡＴＰの結合を拮抗的に阻害するため、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性阻害剤として使用できる。【０１１５】
また、本同定方法を実施することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を阻害する化合物を取得できる。このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合阻害剤の有効成分として使用できる。【０１１６】
本発明に係る同定方法の一態様は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法により、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合競合体を獲得できる。このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチド（例えばＡＴＰ）の結合阻害剤として使用できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＡＴＰの結合を阻害することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を減弱させることができるため、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性阻害剤として使用できる。【０１１７】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法は、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体を接触させる工程を含む。【０１１８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物の同定方法は、より詳しくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を測定できる実験系において、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体を接触させる。次いで、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体の結合と、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を比較する。被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体の結合が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体の結合と比較して、低減または消失する場合、該被験化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質と該非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害すると判定できる。【０１１９】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を測定できる実験系は、インビトロの実験系でもよく、インビボの実験系でもよい。【０１２０】
非水解性ヌクレオチド類縁体として、ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＴＰ−γ−Ｓを好ましく例示できる。【０１２１】
本発明において、ＲＮＡによりＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰａｓｅ活性が増強することを実証した（実施例８）。したがって、ＲＮＡによりＤＤＸ３９遺伝子産物の構造が変化し、その結果、ＤＤＸ３９遺伝子産物とＡＴＰの結合が増強すると考えることができる。よって、本同定方法を実施する際、ＲＮＡを混在させることが好ましい。このようなＲＮＡとして、ｐｏｌｙＡ等の重合ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の生体内ＲＮＡ、並びにｐｏｌｙＩＣを好ましく例示できる。これらのＲＮＡを１種または２種以上混在させ、本同定方法を実施することができる。【０１２２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と非水解性ヌクレオチド類縁体の結合の検出は、一般的に行われているＡＴＰ結合アッセイにより実施できる（アラタニ（Ａｒａｔａｎｉ  Ｓ）ら、「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００１年、第２１巻、第１４号、ｐ．４４６０−４４６９）。【０１２３】
本同定方法は、例えば、次の方法で実施できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体とを反応させ、該非水解性ヌクレオチド類縁体が結合しているＤＤＸ３９に由来する蛋白質と、該非水解性ヌクレオチド類縁体が結合していないＤＤＸ３９に由来する蛋白質および該非水解性ヌクレオチド類縁体とを分離する。次いで、該非水解性ヌクレオチド類縁体が結合しているＤＤＸ３９に由来する蛋白質を検出する。非水解性ヌクレオチド類縁体が結合しているＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出は、非水解性ヌクレオチド類縁体を標識物質で予め標識しておくと容易に実施できる。標識物質として、放射性同位元素（例えば３２Ｐ）を例示できる。あるいは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質が、標識化されたＤＤＸ３９に由来する蛋白質である場合、非水解性ヌクレオチド類縁体が結合しているＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出や分離が容易になる。例えば、ＧＳＴ融合のＤＤＸ３９に由来する蛋白質を用いる場合、グルタチオンセファロースビーズを用いて非水解性ヌクレオチド類縁体が結合しているＤＤＸ３９に由来する蛋白質の分離操作とその検出を容易に行うことができる。【０１２４】
本同定方法は、具体的には、次に例示する方法で実施できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＧＳＴとの融合蛋白質をグルタチオンセファロースに結合させた後、［３２Ｐ］ＡＭＰ−ＰＮＰを反応させ、反応後にビーズを適当な緩衝液により洗浄する。次いで、［３２Ｐ］ＡＭＰ−ＰＮＰが結合している該グルタチオンセファロースに結合させた融合蛋白質を３２Ｐの放射活性を測定することにより検出する。被験化合物は、該グルタチオンセファロースに結合させた融合蛋白質と［γ−３２Ｐ］ＡＭＰ−ＰＮＰの反応に添加し、これらに接触させてもよいし、反応前に、該グルタチオンセファロースに結合させた融合蛋白質および／または［γ−３２Ｐ］ＡＭＰ−ＰＮＰと予め接触させてもよい。被験化合物を該グルタチオンセファロースに結合させた融合蛋白質および／または［γ−３２Ｐ］ＡＭＰ−ＰＮＰと接触させた場合、接触させない場合と比較して、放射活性が減少または消失する場合、該被験化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＡＭＰ−ＰＮＰの結合を阻害すると判定できる。【０１２５】
本発明に係る同定方法の一態様は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法により得られる化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性阻害剤の有効成分として使用できる。【０１２６】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法は、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるヌクレオチドを接触させる工程を含む。【０１２７】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法は、より詳しくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を測定できる実験系において、被験化合物存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるヌクレオチドを接触させ、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を測定する。次いで、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性と、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質の該ＮＴＰａｓｅ活性とを比較する。被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質の該ＮＴＰａｓｅ活性が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質の該ＮＴＰａｓｅ活性と比較して、減弱または消失する場合、該被験化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質の該ＮＴＰａｓｅ活性を阻害すると判定できる。【０１２８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を測定できる実験系は、インビトロの実験系でもよく、インビボの実験系でもよい。【０１２９】
本発明において、ＲＮＡ非存在下の場合と比較して、ＲＮＡ存在下において、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰａｓｅ活性が増強することを実証した（実施例８）。したがって、ＲＮＡがＤＤＸ３９遺伝子産物と結合することにより、ＤＤＸ３９遺伝子産物の構造が変化し、その結果、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰａｓｅ活性が増強すると考えることができる。よって、本同定方法を実施する際、ＲＮＡを混在させることが好ましい。このようなＲＮＡとして、ｐｏｌｙＡ等の重合ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡ等の生体内ＲＮＡ、並びにｐｏｌｙＩＣを好ましく例示できる。また、配列表の配列番号１２に記載の塩基配列で表されるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３に記載の塩基配列で表されるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡを例示できる。これらのＲＮＡを１種または２種以上混在させ、本同定方法を実施することができる。【０１３０】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性の検出は、一般的に行われている方法で実施できる。このような方法として、比色法（チャン（Ｃｈａｎ  Ｋ．Ｍ．）ら、「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８６年、第１５７巻、第２号、ｐ．３７５−３８０）や蛍光法を例示できる。蛍光法は遊離リン酸を簡便に測定できる方法であるため、好ましく蛍光法を例示できる。蛍光法は、例えば市販のアッセイキットを使用して実施できる。市販のアッセイキットとして、モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製のＰｉＰｅｒＴＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを例示できる。また、活性炭を使用する方法も例示できる（非特許文献２）。【０１３１】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性の検出は、具体的には、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるヌクレオチドを反応させ、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性により該ヌクレオチドから遊離したリン酸を検出することにより実施できる（実施例８）。あるいは、予めγ位のリン酸基を３２Ｐで標識したヌクレオチドを基質として使用してＤＤＸ３９に由来する蛋白質と反応させ、反応後に活性炭を添加し、遠心処理を行うことにより未反応のヌクレオチドを除去し、次いで、上清中の遊離リン酸の放射活性を測定することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を検出することができる。【０１３２】
あるヌクレオチドとして、ＡＴＰを好ましく例示できる。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性として、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を好ましく例示できる。ヌクレオチドとしてＡＴＰを使用することにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。【０１３３】
本発明に係る同定方法の一態様は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法により得られる化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤の有効成分として使用できる。【０１３４】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法は、被験化合物およびヌクレオチド存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡを接触させる工程を含む。【０１３５】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法は、より詳しくは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を測定できる実験系において、被験化合物およびヌクレオチド存在下、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とあるＲＮＡを接触させ、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を測定する。次いで、被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性と、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性とを比較する。被験化合物存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性が、被験化合物非存在下におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性と比較して、減弱または消失する場合、該被験化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害すると判定できる。【０１３６】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を測定できる実験系は、インビトロの実験系でもよく、インビボの実験系でもよい。【０１３７】
本同定方法を実施する際、基質として用いるＲＮＡは２本鎖ＲＮＡであることが好ましい。２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡヘリカーゼ活性の測定に一般的に使用されている２本鎖ＲＮＡをいずれも使用することができる。２本鎖ＲＮＡはその一方が標識されているものが好ましい。標識物質として、放射性同位元素、好ましくは３２Ｐ、蛍光物質、好ましくはＡｌｅｘａ６８０を例示できる。蛍光物質の蛍光像は蛍光分析装置、例えばオデッセイ赤外イメージングシステムにより検出できる。【０１３８】
２本鎖ＲＮＡの調製は、自体公知の方法で実施できる。まず、２本鎖ＲＮＡを構成する２本の１本鎖ＲＮＡを取得する。２本鎖ＲＮＡの巻き戻しを容易にするため、２本鎖を構成するそれぞれの１本鎖同士の結合エネルギーを小さくすることが好ましい。２本の１本鎖ＲＮＡの一方は、他方と比較して短いことが好ましい。短い１本鎖ＲＮＡを短鎖と称する。もう一方の１本鎖ＲＮＡは、短鎖に対する相補結合部位を含み、且つ該短鎖と比較して長い１本鎖ＲＮＡであることが好ましい。このような長い１本鎖ＲＮＡを長鎖と称する。短鎖および長鎖はいずれも一般的な化学合成法またはインビトロトランスクリプション法（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法）により取得できる。２本鎖ＲＮＡにおいて一方の鎖が標識されているものを調製する場合、短鎖ＲＮＡを標識することが好ましい。標識は、放射性同位元素あるいは蛍光物質等を用いた一般的に行われている方法により実施できる。次いで、短鎖と長鎖を適当な条件下でアニーリングさせることにより、２本鎖ＲＮＡを取得できる。アニーリングの条件として、ＴＥバッファー中で短鎖と長鎖をモル比１：１．２５の割合で混合し、９５℃で５分間加熱した後、室温で放置するといった条件を例示できる。【０１３９】
２本鎖ＲＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１２で表される塩基配列からなるＲＮＡおよび配列表の配列番号１３で表される塩基配列からなるＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡを例示できる。【０１４０】
本発明において、ＡＴＰ存在下においてＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡヘリカーゼ活性を検出した（実施例７）。このことから、ＤＤＸ３９遺伝子産物のＡＴＰａｓｅ活性によりＡＴＰが加水分解され、その加水分解により発生したエネルギーによりＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡヘリカーゼ活性が増強されると考えることができる。ＡＴＰ以外の他のヌクレオチド存在下においても、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を検出できると考える。ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法を実施する際、混在させるヌクレオチドとして、ＡＴＰを好ましく例示できる。【０１４１】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物の同定方法において、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の補助因子を反応液に加えることが好ましい。「ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の補助因子」とは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質によるＲＮＡ巻き戻しに関与する因子であって、該ＲＮＡ巻き戻しに必要な因子および／または該ＲＮＡ巻き戻しの促進に必要な因子を意味する。このような補助因子として、マグネシウムイオン等のイオン類、ポリＡやポリｄＴ等のヌクレオチド類、および蛋白性補助因子を例示できる。【０１４２】
本発明において、ＣＩＰ２９（ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２９ｋＤａ）およびＡＴＰ存在下におけるＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡヘリカーゼ活性は、ＡＴＰ存在下であってＣＩＰ２９非存在下おけるＤＤＸ３９遺伝子産物のＲＮＡヘリカーゼ活性と比較して、増強していることを明らかにした（実施例７）。したがって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の補助因子として、ＣＩＰ２９（ＮＣＢＩ  コード番号  ＧＩ：３２１２９１９９、アクセッション番号  ＮＰ＿１４９０７３）を好ましく例示できる。ＣＩＰ２９として、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を例示できる。【０１４３】
ＣＩＰ２９遺伝子の取得は、一般的な遺伝子工学的方法により実施できる。具体的には、市販のヒト肺ｃＤＮＡライブラリーを用い、ＣＩＰ２９遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲによりＣＩＰ２９遺伝子を取得できる。ＣＩＰ２９の取得も一般的な遺伝子工学的方法により実施できる（実施例７）。【０１４４】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の検出は、一般的に行われている方法により実施できる（非特許文献２）。【０１４５】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の検出は、具体的には、以下に例示する方法により実施できる。まず、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質と２本鎖ＲＮＡを反応させる。次いで、２本鎖ＲＮＡが巻き戻されて生じる１本鎖ＲＮＡの検出を行う。１本鎖ＲＮＡの検出は、非変性ポリアクリルアミドを使用した電気泳動により、２本鎖ＲＮＡと該１本鎖ＲＮＡとを分離することにより実施できる。このとき、２本鎖ＲＮＡを形成する２本の１本鎖ＲＮＡのうち一方が標識されている場合、標識物質を検出することにより１本鎖ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡを容易に検出できる。１本鎖ＲＮＡと２本鎖ＲＮＡは、それぞれの移動度の差により区別できる。１本鎖ＲＮＡが検出された場合、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性が発現したと判定できる（実施例７）。【０１４６】
本発明に係る同定方法において、被験化合物として、化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＤＤＸ３９に由来する蛋白質の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を例示できる。また、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合部位の一次構造や立体構造、あるいはＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチドまたはその類縁体との結合部位の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被験化合物として好適である。さらに、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質においてそのＲＮＡヘリカーゼ活性やＮＴＰａｓｅ活性に関与する部位の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被験化合物として好適である。【０１４７】
本発明の一態様は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物を含有するＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤に関する。【０１４８】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物は、本発明に係る同定方法により取得できる。【０１４９】
本発明に係る同定方法では、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物；ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を増強する活性を阻害する化合物；ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物；ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物；および／またはＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物を取得することができる。【０１５０】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡとの結合はＤＤＸ３９に由来する蛋白質がＲＮＡヘリカーゼとしてＲＮＡに作用するために必要である。そのため、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物は、該結合の阻害によりＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する。したがって、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤の有効成分として使用することができる。【０１５１】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体が有する活性であって、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡ結合活性を増強する活性を阻害する化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とＲＮＡの結合を阻害する。そのため、このような化合物はＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する。したがって、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤の有効成分として使用することができる。【０１５２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質とヌクレオチド、例えばＡＴＰの結合を阻害する。したがって、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性阻害剤の有効成分として使用することができる。一方、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性に要するエネルギーを産生する。そのため、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する。すなわち、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤の有効成分として使用することができる。【０１５３】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性阻害剤の有効成分として使用できる。さらに、このような化合物は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤の有効成分として使用することができる。【０１５４】
本発明に係るＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＮＴＰａｓｅ活性阻害剤として、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性阻害剤を好ましく例示できる。【０１５５】
ＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤として、６−Ａｍｉｎｏ−１−（２−ｄｅｏｘｙ−ａ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏｐｅｎｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）−４，５，ｄｉｈｙｄｒｏ−８Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｅ］［１，３］ｄｉａｚｅｐｉｎｅ−４，８−ｄｉｏｎｅおよびその誘導体が知られている。本阻害剤は、ＡＴＰａｓｅ阻害剤であり、ＡＴＰａｓｅ活性の阻害によりＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害するものである。【０１５６】
ＲＮＡヘリカーゼ活性阻害剤は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を減弱するため、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質により惹き起こされる蛋白質産生の増強を介した細胞増殖を阻害でき、ひいては癌細胞の増殖を阻害できる。【０１５７】
本発明のまた別の一態様は、被験組織におけるＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子の発現量を測定することにより被験組織が癌組織由来であるか否かを判定する方法に関する。【０１５８】
ＤＤＸ３９遺伝子の発現強度は、癌組織や癌細胞において正常組織や正常細胞と比較して高かった。したがって、被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現量を測定することにより、被験組織が癌組織由来であるか否かを判定することができる。また、ＤＤＸ３９遺伝子によりコードされる蛋白質の相同物をコードする遺伝子は、該蛋白質の相同物が該蛋白質と同様にＲＮＡヘリカーゼ活性を有し、細胞増殖に寄与すると考えられることから、その発現が癌疾患に寄与すると考える。したがって、ＤＤＸ３９の相同物をコードする遺伝子の被験組織における発現量を測定することにより、被験組織が癌組織由来であるか否かを判定することができる。【０１５９】
具体的には、肺扁平上皮癌組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比は、正常肺組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して２．０２であった。肺腺癌組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比は、正常肺組織内におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して１．７７であった。また、原発巣肝臓癌および転移性肝臓癌におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量の比はそれぞれ、正常肝臓組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現平均量に対して１．７４および２．３０であった。このように、ＤＤＸ３９遺伝子の発現は、肺癌や肝臓癌、特に扁平上皮癌や転移性肝臓癌において亢進していることが明らかになった。他の癌組織において同様に調査した結果、正常組織に対するＤＤＸ３９遺伝子の平均発現量の比は、乳癌では１．７５、大腸癌では１．５３、胃癌では１．５９、腎臓癌では１．６４、膵癌では１．６８、前立腺癌では１．２０であった。また、肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６および非分化型肝癌細胞ＨＬＥにおけるＤＤＸ３９遺伝子の転写産物量は、正常気管支細胞ＨＮＢＥあるいは正常肝細胞ＨＮＨにおけるＤＤＸ３９遺伝子の転写産物量と比較して多かった。【０１６０】
本発明に係る被験組織の判定方法は、ヒト肺組織由来の被験組織が肺癌由来であるか否かの判定に好ましく使用できる。ヒト肺組織由来の被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が、正常な対照組織との比較において、好ましくは１．７７倍以上である場合、該被験組織は肺癌由来であると判定できる。肺扁平上皮癌組織および肺扁平上皮癌細胞におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が高いことから、本判定方法は肺扁平上皮癌の判定により好ましく使用される。【０１６１】
本被験組織の判定方法はまた、ヒト肝臓組織由来の被験組織が肝臓癌由来であるか否かの判定に好ましく使用できる。ヒト肝臓組織由来の被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が、正常な対照組織との比較において、好ましくは１．７４倍以上である場合、該被験組織は肝臓癌由来であると判定できる。転移性肝臓癌組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現強度が高いことから、本判定方法は転移性肝臓癌の判定により好ましく使用される。【０１６２】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子の発現量の測定は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいはＤＤＸ３９に由来する蛋白質の存在を検出すること、および／またはその存在量を決定することにより実施できる。正常な対照組織との比較において、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいはＤＤＸ３９に由来する蛋白質の存在の変化およびその量的変化を検出できる。【０１６３】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡの検出および定量は、自体公知の遺伝子検出法により実施できる。具体的には、ノザンブロット法、ＰＣＲおよびドットブロット法等を例示できる。ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを使用する方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＲＴ−ＰＣＲと略称する）を挙げることができるが、その他、当該分野で使用される種々のＰＣＲの変法を適応できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した測定を適応できる。このような遺伝子検出法において、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子のみに特異的にハイブリダイゼーションできるＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとはＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子のみを特異的に増幅できるＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プローブまたはプライマーとして、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。例えば、ＤＤＸ３９遺伝子またはその断片を増幅するためのプライマー、あるいはＤＤＸ３９遺伝子を検出するためのプローブとして、具体的には、配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを使用するが、非標識であってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、種々の方法が知られており、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等を例示できる。【０１６４】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子の発現量の測定は、具体的には、以下に例示する方法で実施できる。まず、被験組織から核酸、好ましくはＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子を含む核酸、例えば、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子のｃＤＮＡを調製し、ＰＣＲにより該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを増幅し、次いで、増幅された該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを定量する。被験組織からＤＤＸ３９に由来する蛋白質をコードする遺伝子のｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを調製する方法は、公知の遺伝子工学的手法をいずれも使用できる。例えば、被験組織から、全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡを使用して逆転写反応によりｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを取得できる。ＰＣＲにより該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを増幅する方法は、該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡに特異的なプライマーを使用して実施できる。ＤＤＸ３９遺伝子特異的なプライマーとして、配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの組み合わせを例示できる。増幅された該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを定量する方法として、アガロースゲルを使用した電気泳動により増幅された該ｃＤＮＡおよび／またはその部分ＤＮＡを、他のｃＤＮＡと分離し、次いでエチジウムブロマイドといった色素によりｃＤＮＡを染色することにより検出する方法を例示できる。その他、一般的に使用されているｃＤＮＡの検出方法をいずれも利用できる。【０１６５】
ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出および定量は、一般的な蛋白質検出法あるいは定量法により実施できる。例えば、抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を使用して、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出および定量を実施できる。蛋白質検出法あるいは定量法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等を挙げることができる。その他、競争結合アッセイ等を利用することもできる。具体的には、被験組織から常法により調製した試料について、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質に対する特異抗体を使用して免疫沈降を行い、ウエスタンブロット法またはイムノブロット法でＤＤＸ３９に由来する蛋白質の解析を行うことにより、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出および定量を実施できる。また、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質に対する特異抗体を使用して免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中のＤＤＸ３９に由来する蛋白質の検出および定量を実施できる。抗体は、ＤＤＸ３９に由来する蛋白質またはその断片を使用して自体公知の抗体作成法により取得できる。【０１６６】
被験組織は、特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の試料を例示できる。所望により被験組織から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ＰＣＲまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。【０１６７】
本発明に係る被験組織の判定方法は、被験組織が癌組織由来であるか否かを判定できるため、癌疾患の検査方法に使用できる。本判定方法は癌疾患の診断等に有用である。【０１６８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１６９】
（肺扁平上皮癌細胞において発現が亢進している遺伝子の同定）
正常細胞と比較し、癌細胞において発現が亢進している遺伝子の同定を、組織別遺伝子発現データベース（バイオエクスプレス、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社製）のマイクロアレイデータベースを利用して実施した。マイクロアレイデータベースには正常肺組織１３０サンプル、肺扁平上皮癌組織５１サンプルの発現プロファイルデータが含まれている。発現プロファイルデータはアフィメトリクス  ヒト遺伝子オリゴチップＨＧ−Ｕ１３３（プローブセット２０１５８４＿ｓ＿ａｔ）を使用した各細胞内の発現データベースとして格納されている。正常肺組織内での発現量よりも肺扁平上皮癌組織内での発現量が多い遺伝子のうち、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）に遺伝子の全長の塩基配列が登録されている遺伝子を選択した。【０１７０】
その結果、正常肺組織内での発現量よりも肺扁平上皮癌組織内での発現量が多い遺伝子として、１つの遺伝子を選択した。マイクロアレイデータベースの本遺伝子のプローブ配列情報に相当する遺伝子として、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）中に、ＤＤＸ３９遺伝子としてその塩基配列が登録されている遺伝子を見出した。【０１７１】
１３０サンプルの正常肺組織内における本遺伝子の発現平均量に対する５１サンプルの肺扁平上皮癌組織内における本遺伝子の発現平均量の比は２．０２で、有意水準は４．８×１０−２４であった。参考のため、さらに正常肺組織内における本遺伝子の発現平均量と、肺腺癌組織７４サンプルでの本遺伝子の発現平均量の比を求めたところ、その値は１．７７（有意水準３．１×１０−９）であった。この結果から、本遺伝子は、肺癌の中でも特に扁平上皮癌で顕著に発現が亢進している遺伝子であると判断された（図１Ａ左）。【０１７２】
また、正常肝臓組織６４サンプル、繊維化肝臓組織６３サンプル、原発巣肝臓癌２５サンプルおよび転移性肝臓癌２７サンプルを使用して本遺伝子の発現平均量を比較した。その結果、繊維化肝臓組織では１．３５倍（有意水準７．７×１０−１３）、原発巣肝臓癌では１．７４倍（有意水準３．６×１０−８）程度の発現亢進が認められたが、転移性肝臓癌では２．３０倍（有意水準２．３×１０−１３）と顕著な発現亢進が認められた（図１Ａ右）。【０１７３】
他の癌組織における本遺伝子の発現平均量の、正常組織における本遺伝子の発現平均量に対する比を同様に調査した結果、乳癌の場合は１．７５倍（有意水準２．２×１０−２３）、大腸癌の場合は１．５３倍（有意水準６．１×１０−２７）、胃癌の場合は１．５９倍（有意水準１．３×１０−１０）、腎臓癌の場合は１．６４倍（有意水準１．６×１０−２４）、膵癌の場合は１．６８倍（有意水準６．６×１０−１７）、前立腺癌の場合は１．２０倍（有意水準７．０×１０−８）であった。
【実施例２】
【０１７４】
（遺伝子の取得）
実施例１において正常肺組織内での発現量よりも肺扁平上皮癌組織内での発現量が多い遺伝子として選択した遺伝子は、公共ヌクレオチドデータベース（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）中に、ＤＤＸ３９遺伝子としてその塩基配列が登録されていた。そこで、配列の確認と発現用ベクター構築のため、本遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行った。【０１７５】
具体的にはまず、本遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。プライマーは、次の２種類の組み合わせのプライマーを使用した：配列表の配列番号３および配列番号４に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用する組み合わせ；並びに配列表の配列番号５および配列番号６に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用する組み合わせ。鋳型は胸腺ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、酵素はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用し、反応系には５％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。ＰＣＲは、９４℃２分処理後、１サイクルを９４℃３０秒、６８℃４分として４０サイクル行い、続いて６８℃３分処理という条件で実施した。各プライマーの組み合わせを使用してＰＣＲにより得られた増幅産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へライゲーションした。以降、前者の組み合わせのプライマーを使用したＰＣＲ増幅産物により得られたベクターを遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター１、後者の組み合わせのプライマーを使用したＰＣＲ増幅産物により得られたベクターを、遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター２と呼称する。得られた組換えベクターに含まれる遺伝子に係るＤＮＡの塩基配列の決定をＡＢＩ３１００を使用して実施した。【０１７６】
その結果、両ベクターから決定されたＤＮＡ配列に差異はなく、本遺伝子に係るＤＮＡの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列であることが判明した。本遺伝子に係るＤＮＡの塩基配列は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＢＣ００１００９として登録されているＤＤＸ３９遺伝子塩基配列のオープンリーディンフレームの配列と同一配列である。また、このＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＡＡＨ０１００９として登録されているアミノ酸配列と同一配列である。【０１７７】
このＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）には、ＲＮＡヘリカーゼ活性をもつ、いわゆるＤＥＡＤ  ｂｏｘ蛋白質のモチーフが保存されていた（図２）。ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフは、８つのモチーフ、一般的にはモチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶ、およびモチーフＶＩと称される８つのモチーフから構成されている。該アミノ酸配列（配列番号２）において、モチーフＩ、モチーフＩａ、モチーフＩｂ、モチーフＩＩ、モチーフＩＩＩ、モチーフＩＶ、モチーフＶ、およびモチーフＶＩはそれぞれ、第８８番目から第９５番目、第１２０番目から第１２７番目、第１７１番目から第１７４番目、第１９５番目から第１９８番目、第２２７番目から第２２９番目、第２８９番目から第２９１番目、第３４７番目から第３５０番目、および第３７０番目から第３８１番目に保存されている。モチーフＩはＡＴＰとの結合に関与すると考えられる。モチーフＩａおよびモチーフＩｂはＲＮＡ結合に関与すると考えられる。モチーフＩＩはＡＴＰ加水分解に関与すると考えられる。モチーフＩＩＩはＲＮＡの巻き戻しに関与すると考えられる。モチーフＩＶおよびモチーフＶはＲＮＡとの結合に関与すると考えられる。モチーフＶＩはＲＮＡとの結合およびＡＴＰ加水分解に関与すると考えられる。これらモチーフは、既報（非特許文献４−６）の参照とモチーフ検索により見出した。
【実施例３】
【０１７８】
（正常細胞および癌細胞内における発現量比較）
正常細胞および癌細胞における本遺伝子の発現を、各細胞から常法により調製した全ＲＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲにより解析し比較した。正常細胞として、正常気管支細胞ＨＮＢＥおよび正常肝細胞ＨＮＨをカンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ）社より購入して使用した。癌細胞として、肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６、肺腺癌細胞ＲＥＲＦ、分化型肝癌細胞ＨｅｐＧ２および非分化型肝癌細胞ＨＬＥをそれぞれ東レ株式会社、九州癌センター、アメリカンティシューコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）およびヒューマンサイエンス財団より購入して使用した。ＱＧ５６細胞およびＲＥＲＦ細胞は１０％  牛胎仔血清（ＦＣＳ、岩城硝子社製）を含むＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した。一方、ＨＬＥ細胞およびＨｅｐＧ２細胞は１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した。また、ＨＮＢＥ細胞はＢＥＢＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）で、ＨＮＨ細胞はＨＢＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）で培養した。【０１７９】
具体的にはまず、これらの細胞から、アイソゲン（日本ジーン社製）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。０．５μｇの全ＲＮＡについて、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を使用して３０℃１０分間、４２℃３０分間、９９℃５分間、５℃５分間の条件下で逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で得られたｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、得られたｃＤＮＡの１／１０が溶解している溶液を使用し、プライマーを加えてＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して実施した。プライマーは、配列表の配列番号７および配列番号８に記載の各塩基配列からなるポリヌクレオチドをそれぞれセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用した。反応条件は、９４℃２分処理後、１サイクルを９４℃３０秒、６４℃３０秒、７２℃２分として３０サイクル行い、最後に７２℃３分処理した。反応液を１％  アガロースゲルによる電気泳動に供試した。電気泳動後、エチジウムブロマイド染色によりＰＣＲ増幅産物を検出した。対照として、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現の検出を同様の方法で実施した。その結果を、図３に示す。【０１８０】
肺扁平上皮癌細胞ＱＧ５６および非分化型肝癌細胞ＨＬＥにおける本遺伝子の転写産物量（それぞれ図３左下パネルおよび右下パネル）は、正常気管支細胞ＨＮＢＥあるいは正常肝細胞ＨＮＨにおける本遺伝子の転写産物量（それぞれ図３左下パネルおよび右下パネル）と比較して多いことが明らかになった。一方、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の転写産物量は、正常大腸細胞および大腸癌細胞間で有意な差異が認められなかった（それぞれ図３左上パネルおよび右上パネル）。
【実施例４】
【０１８１】
（本遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞増殖促進活性）
本遺伝子を細胞に強制発現させ、本遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞増殖に及ぼす効果を検討した。【０１８２】
発現ベクターとして、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。本遺伝子に係るＤＮＡを組込んだ発現ベクターは、本遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター２（実施例２参照）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断して得られたＤＮＡフラグメントと、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクターとを混合することにより調製した。得られた発現ベクターを、以降、本遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクターと呼称する。【０１８３】
次に、１２穴および２４穴のプレート上に、１０％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地を使用してＨｅＬａ細胞（三重大学より供与）を播種し、サブコンフルエント状態になるまで培養した。培養後、培地をオプティＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に交換した。培地交換後、０．４μｇないしは０．７μｇの本遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクターを、リポフェクトアミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してリポフェクション法により、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。対照として、本遺伝子が組込まれていないｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクター（空ベクターと呼称する）を、リポフェクトアミンプラスを使用してリポフェクション法により、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。翌日、細胞を１０％  ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中、１０ｃｍプレートに播き直し、Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を終濃度６００μｇ／ｍｌとなるよう添加した。６００μｇ／ｍｌ濃度のＧ４１８を含んだ培地を３ないし４日ごとに交換することにより薬剤選択を行い、１０−１４日間培養することによりコロニーを形成させた。形成したコロニーは４％  フォルマリンで固定後、０．２％  クリスタルバイオレットで染色した。コロニーの数と面積の解析を、ＮＩＨアナライザーを使用して行った。本遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクターおよび空ベクターをそれぞれトランスフェクションした細胞について、コロニーの数と面積を比較することにより、本遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞増殖促進活性の判定を行った。１２穴プレート中でベクターをトランスフェクションした細胞を使用して検討した結果を図４−Ａ左パネルに、２４穴プレート中でベクターをトランスフェクションした細胞を使用して検討した結果を図４−Ａ右パネルに示す。また、代表的なコロニー像を図４−Ｂに示す。【０１８４】
本遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４ＡベクターをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のコロニーは、空ベクターをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のコロニーと比較して、その数が多く、また面積も大きかった（図４−Ａ左パネルおよび右パネル）。【０１８５】
本遺伝子を強制発現させた細胞のコロニーが、空ベクターをトランスフェクションした細胞のコロニーと比較して多いことから、本遺伝子によりコードされる蛋白質は細胞増殖促進活性を有することが判明した。
【実施例５】
【０１８６】
（本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性）
本遺伝子によりコードされる蛋白質にはＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅに共通のモチーフが保存されている（図２）。ＲＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅはＲＮＡに結合することによりその酵素活性を発現する。そこで、本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性を検討した。【０１８７】
本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したＲＮＡを使用したゲルシフトアッセイで検討した。【０１８８】
具体的にはまず、本遺伝子によりコードされる蛋白質をバキュロウイルス系で発現させた。そのために、本遺伝子組換えｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター１（実施例２参照）をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで処理し、同様に処理したｐＴｒｃＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込んだ。得られたベクターをさらにＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同様に処理したｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込んだ。使用説明書に従って組換え型バキュロウイルスを調製し、ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で培養したＳｆ９細胞に感染させた。この細胞約２００μｌにトリス緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾールおよびインヒビタータブレット（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を５００μｌ添加し、超音波処理（１５秒５回）を行った。その後、遠心分離処理を４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間行い、上清を回収して可溶性画分として使用した。可溶性画分は、０．７ｍｌのトリス緩衝液で平衡化した０．２ｍｌのプロボンドレジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に添加した。４℃で一晩転倒混和し、未吸収画分を除去した後、１ｍｌのトリス緩衝液による洗浄および４℃にて１分間の遠心分離処理を３回行った。その後、溶出緩衝液（５０、１００、１５０、２００または５００ｍＭイミダゾールを含むトリス緩衝液）で４℃にて５分間転倒混和することにより蛋白質を５回溶出した。溶出画分を併せた後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌａｚｅｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製）で１Ｌ  トリス緩衝液に対し一晩透析し、精製蛋白質を得た。【０１８９】
精製蛋白質２μｇを、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＩＧ標識ＲＮＡプローブ（４２−ｍｅｒ、日本バイオサービスにて合成）９３０ｆｍｏｌに添加し、反応溶液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭ  ヌクレオチド、４０Ｕ  リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤（和光純薬工業株式会社製））中で室温にて１５分間反応させた。ヌクレオチドとしてＡＴＰ、ＡＤＰ、またはＡＭＰ−ＰＮＰを使用した。反応終了後、５％  非変性ポリアクリルアミドゲル（ディー・アール・シー社製）で電気泳動を行い、ＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）へ転写した。ＵＶクロスリンク後、メンブレンをＤＩＧゲルシフトアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）中の抗ＤＩＧ抗体と反応させた。洗浄後、化学発光基質ＣＳＰＤによる蛋白質の検出を行った。得られた結果を、図５に示す。【０１９０】
本遺伝子によりコードされる蛋白質をＤＩＧ標識ＲＮＡプローブに添加して調製した試料では、ＲＮＡを示すバンド（図５においてその位置を矢印で示す）に加えて、別の新たなバンド（図５においてその位置を矢頭で示す）が検出された。一方、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加しなかった試料では、ＲＮＡを示すバンドのみが検出された。矢頭で示すバンドは、ＲＮＡを示すバンドより移動度が減少していることから、ＲＮＡとＤＤＸ３９との複合体を示すものと考えられる。すなわち、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加した試料で観察されたバンドのシフトは、該蛋白質がＲＮＡに結合したことによる。【０１９１】
本遺伝子によりコードされる蛋白質によるＲＮＡを示すバンドのこのようなシフトは、ヌクレオチド非存在下でも認められた。このとき、ＡＴＰまたはＡＭＰ−ＰＮＰの添加によりバンドのシグナルが増強された。すなわち、ＡＴＰおよびその誘導体により、本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡ結合活性は強化される。換言すれば、ＡＴＰポケットにＡＴＰおよびその誘導体等の化合物が結合すると、本遺伝子によりコードされる蛋白質の構造が変化し、そのＲＮＡ結合活性が上昇すると考える。【０１９２】
このように、本遺伝子によりコードされる蛋白質はヌクレオチド非存在下でもＲＮＡに結合して複合体を形成すること、さらに、ＡＴＰあるいはＡＭＰ−ＰＮＰの結合により構造が変化し、該蛋白質とＲＮＡとの複合体が安定化することが判明した。
【実施例６】
【０１９３】
（本遺伝子によりコードされる蛋白質の細胞内局在性）
ＲＮＡヘリカーゼは転写、翻訳、スプライシング、リボソーム生合成等、様々な機能を担うと考えられている。そこで、本遺伝子によりコードされる蛋白質の機能を探るため、この蛋白質の細胞内局在性を調べた。【０１９４】
まず、本遺伝子によりコードされる蛋白質とレポーター蛋白質モンスターＧＦＰとの融合蛋白質発現用ベクターを構築した。ｐｈＭＧＦＰベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を鋳型とし、配列表の配列番号１０および配列番号１１に記載の各塩基配列からなるプライマーおよびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、５％  ＤＭＳＯを添加した反応系でＰＣＲを実施した。反応条件は、９４℃２分処理後、１サイクルを９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分を１サイクルとして３５サイクル行い、最後に６８℃３分処理した。増幅産物はｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターに組込み、ＡＢＩ３１００により塩基配列の確認を行った。このベクターをＸｈｏＩ処理して生じたフラグメントを、ＸｈｏＩ消化後にＢＡＰ処理した本遺伝子組換えｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａベクター（実施例４参照）とライゲーションした。【０１９５】
得られたベクター２μｇを、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して３．５ｃｍ  ディッシュ中でＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、３７℃にて２４時間培養し、その後１０％  ホルマリンで固定（４℃、３０分間）した。これをＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２試薬（ＰＢＳにて１００ｎｇ／ｍｌに希釈、和光純薬工業株式会社製）で室温にて１０分間処理し、カバーガラスで封入してプレパラートを作成し、蛍光顕微鏡下で観察した。【０１９６】
その結果、本遺伝子によりコードされる蛋白質は核内において斑点状のシグナルを示した（図６）。本遺伝子によりコードされる蛋白質はスペックルという構造体に存在すると考える。スペックルという構造体は、一般的にスプライシング因子の貯蔵庫と考えられる。本遺伝子によりコードされる蛋白質は、スペックルに存在すること、およびそのアミノ酸配列中にＲＮＡヘリカーゼモチーフが保存されていることから、スプライシングに関与すると発明者らは考える。
【実施例７】
【０１９７】
（本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性）
本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性の測定のために、巻き戻し反応の基質となる２本鎖ＲＮＡを調製した。２本鎖ＲＮＡの調製には、４０−ｍｅｒ（配列番号１２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび５´末端をＡｌｅｘａ６８０で標識した１０−ｍｅｒ（配列番号１３）のＲＮＡオリゴヌクレオチド（いずれも日本バイオサービス社）の２本の１本鎖ＲＮＡを用いた。２本鎖ＲＮＡの調製は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で、４０−ｍｅｒ（配列番号１２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドと１０−ｍｅｒ（配列番号１３）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをモル比で１．２５：１となるように混合し、９５℃で５分間加熱後、９０分間かけて４℃に冷却することにより行い、その結果、Ａｌｅｘａ６８０標識２本鎖ＲＮＡを取得した。【０１９８】
本遺伝子によりコードされる蛋白質は、本遺伝子を発現させた昆虫細胞から精製した蛋白質を用いた（実施例５を参照）。【０１９９】
本遺伝子によりコードされる蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性を測定する際に、ＣＩＰ２９をＲＮＡヘリカーゼ活性の補助因子として用いた。ＣＩＰ２９のクローニング、発現および精製は次のように行った。ヒト肺ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を鋳型とし、５％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）添加の条件で配列表の配列表の配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡオリゴヌクレオチドをプライマーとし、本遺伝子を取得する方法で用いた条件と同様の条件でＰＣＲを行った（実施例５を参照）。増幅された遺伝子産物をｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込み、クローニングを行った。配列確認後、得られた組換えベクターをＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化して作成したフラグメントと、同様に酵素消化したｐＦａｓｔＢａｃＨＴＢベクターを連結し、昆虫細胞発現用組換えベクターを得た。本ベクターにより、Ｈｉｓ−ｔａｇが付加されたＣＩＰ２９が発現される。昆虫細胞発現用組換えベクターを用い、使用説明書に従って組換え型バキュロウイルスを調製し、実施例５に記載した方法と同様の方法で、Ｓｆ９細胞へ感染させた。感染させたＳｆ９細胞におけるＣＩＰ２９の発現、並びにＣＩＰ２９の回収および精製を、実施例５に記載した方法と同様の方法で実施した。【０２００】
本遺伝子によりコードされる蛋白質の２本鎖ＲＮＡ巻き戻し活性は、上記Ａｌｅｘａ６８０標識２本鎖ＲＮＡを用いて次のように実施した。まず、本遺伝子によりコードされる蛋白質およびＣＩＰ２９をそれぞれ２μｇと、５０ｆｍｏｌのＡｌｅｘａ６８０標識２本鎖ＲＮＡを、７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／２００ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／５ｍＭ  ＤＴＴ／２ｍＭ  ＡＴＰ／４０Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤溶液に添加して２０μｌとし、３７℃で３０分間反応させた。コントロールとして、Ａｌｅｘａ６８０標識２本鎖ＲＮＡ、本遺伝子によりコードされる蛋白質、ＣＩＰ２９およびＡＴＰのうち、本遺伝子によりコードされる蛋白質、ＣＩＰ２９およびＡＴＰから選ばれるいずれか１以上を添加しない試料を調製し、同様に反応させた。反応終了後、各試料に５μｌの２％ＳＤＳ／５０％  グリセロール／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え、１×トリスホウ酸バッファーを用いて４℃で１２．５％非変性ポリアクリルアミドゲル（ディー・アール・シー社製）電気泳動を行い、オデッセイ赤外イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ社製）にてシグナルを定量的に検出した。２本鎖ＲＮＡ、すなわち低い移動度を示すバンドのシグナルが減少し、それに代わって１本鎖ＲＮＡ、すなわち高い移動度を示すバンドのシグナルが増加する場合、２本鎖ＲＮＡが巻き戻されたと判定できる。巻き戻し率（％）は、２本鎖のシグナルおよび１本鎖のシグナルをそれぞれａおよびｂとしたときに、ｂ／（ａ＋ｂ）×１００で表した。【０２０１】
５´末端をＡｌｅｘａ６８０で標識した１０−ｍｅｒ（配列番号１３）の１本鎖ＲＮＡを移動位置確認のためそのまま泳動した結果、該１本鎖ＲＮＡを示すバンドがダブレットとして検出された（図７のレーン１）。バンドがダブレットとなるのは、１本鎖ＲＮＡの安定性が低いため、１本鎖ＲＮＡが分解されたことに起因すると考える。【０２０２】
一方、Ａｌｅｘａ６８０標識２本鎖ＲＮＡを用い、本遺伝子によりコードされる蛋白質（図７中、ＤＤＸ３９と表記）およびＣＩＰ２９を添加せずにＡＴＰ存在下で反応を行ってシグナルを検出した結果、２本鎖ＲＮＡのシグナルが検出されたが、１本鎖ＲＮＡのシグナルは検出されなかった（図７のレーン２）。【０２０３】
ＤＤＸ３９の添加により、ＡＴＰの存在下で、２本鎖ＲＮＡのシグナル減少し、代わって１本鎖ＲＮＡのシグナルが増加した（図７のレーン３）。本遺伝子によりコードされる蛋白質に加えてＣＩＰ２９を添加すると、ＡＴＰの存在下で、２本鎖ＲＮＡのシグナルの減少および１本鎖ＲＮＡのシグナルの増加がさらに亢進した（図７のレーン４）。これに対し、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加せず、ＣＩＰ２９のみを添加したときには、ＡＴＰの存在、非存在に拘らず、１本鎖ＲＮＡのシグナルは検出されなかった（図７のレーン５、８）。また、ＡＴＰ非存在下では、本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加しても、ＣＩＰ２９の添加、非添加に拘らず、１本鎖ＲＮＡのシグナルは検出されなかった（図７のレーン６、７）。【０２０４】
これら結果から、本遺伝子によりコードされる蛋白質はＲＮＡヘリカーゼ活性を有すること、該蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性はＡＴＰ依存性であること、該蛋白質のＲＮＡヘリカーゼ活性は該蛋白質と相互作用する蛋白質ＣＩＰ２９により増強されることが明らかになった。
【実施例８】
【０２０５】
（本遺伝子によりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性）
本遺伝子によりコードされる蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性の測定を、種々のＲＮＡ存在下で行った。本遺伝子によりコードされる蛋白質は、本遺伝子を発現させた昆虫細胞から精製した蛋白質を用いた（実施例５を参照）。ＲＮＡは、ＰｏｌｙＡ、ｔＲＮＡおよびＰｏｌｙＩＣを用いた。【０２０６】
本遺伝子によりコードされる蛋白質１０μｇを、２０μｌの反応溶液（４ｍＭ  ＡＴＰ／１ｍＭ  ＭｇＣｌ２／２５０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／４Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤／２μｇ  ＲＮＡ／酵素およびＲＮａｓｅ不含の精製水）に加え、３７℃で３０分間反応させた。ここにＰｉＰｅｒＴＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）の反応溶液をさらに３０μｌを加えた後、同キット中のリン酸測定用溶液５０μｌを加えた。３７℃で３０分間反応させた後、５３０／５９０ｎｍでの蛍光を測定した。本遺伝子によりコードされる蛋白質を添加せず、上記同様に反応および測定を行って得られた測定値を、バックグラウンドとして各測定値から差し引いた後、標準曲線より遊離リン酸量を算定した。【０２０７】
図８に示すように、ＲＮＡ非存在下では、遊離リン酸が殆ど検出されなかった。一方、ＲＮＡ存在下では、本遺伝子によりコードされる蛋白質によりＡＴＰから遊離されるリン酸量が顕著に増加した。【０２０８】
この結果から、本遺伝子の遺伝子産物はＲＮＡ依存性のＡＴＰａｓｅ活性を有することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０２０９】
本発明によれば、ＤＤＸ３９の機能を調節し得る次に示す化合物の同定方法を提供できる。本同定方法により、ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９のＲＮＡ結合活性を阻害する化合物、ヌクレオチドまたはあるヌクレオチド類縁体が有する活性であってＤＤＸ３９とＲＮＡとの結合を増強する活性を阻害する化合物、ＤＤＸ３９とある非水解性ヌクレオチド類縁体の結合を阻害する化合物を取得できる。本発明は、ＤＤＸ３９のＮＴＰａｓｅ活性を阻害する化合物を含有してなるＮＴＰａｓｅ活性阻害剤を提供できる。さらに本発明は、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害する化合物を含有してなるＲＮＡへリカーゼ活性阻害剤を提供できる。本同定方法により得られた化合物は、ＤＤＸ３９のＲＮＡヘリカーゼ活性を阻害し、その結果、細胞増殖を阻害する。したがって、本同定方法により得られた化合物は、癌疾患の予防および／または治療のための医薬の有効成分として使用できる。また、本発明は、被験組織におけるＤＤＸ３９遺伝子の発現量を測定することにより被験組織が癌組織由来であるか否かを判定する方法を提供できる。【０２１０】
このように、本発明は、癌疾患の予防および／または治療のための医薬の開発および癌疾患の診断等、並びにＲＮＡヘリカーゼに関する研究等に非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２１１】
配列番号１：ＤＤＸ３９遺伝子。
配列番号２：ＤＤＸ３９遺伝子によりコードされる蛋白質。
配列番号２：（８８）：（９５）ＡＴＰとの結合に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩ。
配列番号２：（１２０）：（１２７）ＲＮＡ結合に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩａ。
配列番号２：（１７１）：（１７４）ＲＮＡ結合に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩｂ。
配列番号２：（１９５）：（１９８）ＡＴＰ加水分解に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩＩ。
配列番号２：（２２７）：（２２９）ＲＮＡの巻き戻しに関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩＩＩ。
配列番号２：（２８９）：（２９１）ＲＮＡとの結合に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＩＶ。
配列番号２：（３４７）：（３５０）ＲＮＡ結合に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＶ。
配列番号２：（３７０）：（３８１）ＲＮＡとの結合およびＡＴＰ加水分解に関与する、ＤＥＡＤ  ｂｏｘモチーフＶＩ。
配列番号３：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号４：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号５：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号６：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号７：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号８：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号９：ＲＮＡプローブとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１０：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１１：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１２：２本鎖ＲＮＡ調製に使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１３：２本鎖ＲＮＡ調製に使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１５：プライマーとして使用する、設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１６：ＣＩＰ２９。
【図１】
0005291342.tif 000002
【図２】
0005291342.tif 000003
【図４−Ａ】
0005291342.tif 000004
【図８】
0005291342.tif 000005
【図３】
0005291342.tif 000006
【図４−Ｂ】
0005291342.tif 000007
【図５】
0005291342.tif 000008
【図６】
0005291342.tif 000009
【図７】
0005291342.tif 000010
【配列表】
0005291342000001.app