(57)【要約】      （修正有）【課題】プラスミドＤＮＡのための遠心分離不要清浄化システム及び使用法の提供。【解決手段】システムは孔径約５０から約２００ミクロンの粗フィルタ、次いで孔径約１から２ミクロンのプレフィルタ、次いで約０．２２ミクロンの最終フィルタから成る。システムホールドアップ体積を減少させプラスミドＤＮＡ回収を高めるため、プレフィルタ及び最終フィルタは、１つのフィルタハウスに結合するのが好ましい。本発明の方法によりバッチ運転のみならず連続運転も可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔径約５０から約２００ミクロンを有するフィルタで構成された粗濾過ステップ、孔径約１から約２ミクロンを有するフィルタを含むプレフィルタステップおよび孔径約０．２２ミクロンを有するフィルタで形成された最終濾過ステップを含む、プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを清浄化するシステム。
【請求項２】
プレフィルタおよび最終フィルタステップが、最初のプレフィルタ層に続けて最終フィルタ層を有する複合フィルタ中で組み合わせられている請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
粗濾過層が約８０ミクロンの孔径を有するステンレス鋼篩である請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
プレフィルタが約１．２ミクロンの孔径を有する請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
プレフィルタが約１．２ミクロンの孔径を有し、ポリエチレン、ポリプロピレン、混合セルロースエステル類、ホウケイ酸ガラスおよびそれらの組合せからなる群から選択される材料で形成されている請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
最終濾過フィルタがＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン類、ポリフェニルスルホン類およびポリアミド類からなる群から選択される材料で形成されている請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
最終濾過フィルタがＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン類、ポリフェニルスルホン類およびポリアミド類からなる群から選択される材料で形成され、フィルタは親水性のコーティングを有する請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを用意するステップ、前記ストリームを孔径約５０から約２００ミクロンを有する粗フィルタで構成された第１の濾過ステップにかけて第１の透過液を得るステップ、第１の透過液ストリームを孔径約１から約２ミクロンを有するプレフィルタ層で構成された第２の濾過ステップにかけて第２の透過液を得るステップ、および第２の透過液を約０．２２ミクロンのフィルタで構成された最終濾過ステップにかけることを含むプラスミドＤＮＡの清浄化方法。
【請求項９】
細胞溶解物ストリームが遠心分離ステップに服されていない請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
孔径が約５０から約２００ミクロンのフィルタを有する第１の濾過ステップ、第１の濾過ステップの下流にあって第１の濾過ステップと流体的に連絡している、約１から約２ミクロンの孔径を有するプレフィルタを備えたフィルタを有する第２のステップ、およびプレフィルタ層の下流にあって約０．２２ミクロンの孔径を有する最終フィルタを含む、プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを清浄化するシステム。
【請求項１１】
約５０から約２００ミクロンの孔径を有するフィルタで構成された粗濾過ステップ、約１から約２ミクロンの孔径を有するフィルタを含むプレフィルタステップ、および約０．２２ミクロンの孔径を有するフィルタで形成された最終濾過ステップを含む、プラスミドＤＮＡを含む遠心分離されていない細胞溶解物ストリームを清浄化するシステム。
【請求項１２】
第１の濾過ステップのフィルタが８０ミクロンの孔径のステンレス鋼篩であり、第２の濾過ステップのフィルタが１．２ミクロンの混合セルロースエステルプレフィルタ層およびＰＶＤＦ、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン類、ポリフェニルスルホン類およびポリアミド類からなる群から選択される材料で作られたフィルタである請求項１０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミドＤＮＡを清浄化するためのシステムおよびそのシステムを使用する方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを清浄化するための通常型フロー濾過システムおよびそのシステムを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドＤＮＡは遺伝子治療適用のための重要な製品である。宿主細胞中で増殖させ、次いで、これらの細胞を溶解させ、プラスミドＤＮＡを放出させる。次いで、溶解物を清浄化し、プラスミドＤＮＡをクロマトグラフィーなど様々な方法を使用して回収する。
【０００３】
プラスミドＤＮＡを含む溶解物ストリームを清浄化する方法は、ＷＯ００／０５３５８およびＷＯ９７／２３６０１に記載されている。この両者では、溶解物は、細胞壁砕片などのより大きな固体から、プラスミドＤＮＡおよびより小さな固体や微粒子を分ける遠心分離ステップにかける。次いで、プラスミドＤＮＡを含む上清を、遠心分離機から注意深く取り出し、一連の濾布（２０ミクロンの平均孔径）で形成された粗フィルタ、後続するプレフィルタステップ（１〜２ミクロン）および最終の濾過ステップ（約０．２ミクロン）から構成された一連の濾過ステップにかける。
【０００４】
他には、遠心分離後の溶解物ストリームを清浄化するために、珪藻土、粘土などの様々な充填材を含むセルロース繊維などのパッドフィルターを用いること、あるいは接線フロー濾過システム（ＴＦＦ）を使用することが示唆されている。
【０００５】
これらのシステムはすべて、プラスミドＤＮＡの回収に最適であるとは言い難い。プラスミドＤＮＡは、典型的には溶解物ストリームの１重量％未満、より典型的には０．５重量％未満を占めるものであり、プラスミドＤＮＡ高回収の必要性を重要なものにしている。
【０００６】
遠心分離は、溶解物ストリームの構成成分に剪断力を及ぼし、プラスミドＤＮＡを損傷するおそれがある。さらに、ストリームのプラスミドＤＮＡを含む部分の回収は主観的であり、得られる全量より少ないか、あるいは下流の濾過ステップに悪影響（典型的には早い段階でフィルタを詰まらせることによる）を及ぼす追加的な固体および粒子を含んでいる。さらに、遠心分離は、高価な資本設備に投資が必要で、ＦＤＡ基準まで消毒することが困難であり、システムがバッチ形式で実行されることを必要とする。
【０００７】
従来技術で提案された濾過列は多段式であり、プラスミドＤＮＡの収率は比較的低く、典型的には約８０％未満である。最適の実験室条件下で、これらのシステムは、入手可能なプラスミドＤＮＡの９０％未満をもたらした。これはいくつかの要因による。選択された濾過要素は、プラスミドＤＮＡと相互作用する傾向があり、そのうちの幾分かをそれらのシステムに結合する。さらに、各システムは、非常に小さいホールドアップ体積を有し、これはプラスミドＤＮＡのうちの幾分かを保持してしまい、濾過の次段階へそれを通さない。
【０００８】
フィルタパッドは比較的高いレベルのプラスミドＤＮＡを不可逆的に吸収し、低収率につながるため、受け入れられる選択肢とはなっていなかった。
【０００９】
薄膜表面上にわたってプラスミドＤＮＡを絶えず洗い流し、また、１つまたは複数のポンプによりその再循環を伴うＴＦＦの使用は、プラスミドＤＮＡに大きな剪断力を及ぼし、収率減少を招くとともに回収されるプラスミドＤＮＡの効力を低減させるため、ＴＦＦシステムの使用は最小にとどまっていた。さらに、ＴＦＦ装置の高いホールドアップ体積は、ＴＦＦ装置の収率に悪影響を及ぼす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
必要とされているのは、収率の損失を低減し、回収したプラスミドＤＮＡの効力を維持する清浄化システムおよび方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細胞溶解物ストリームからプラスミドＤＮＡの少なくとも９０％を回収するシステムに関する。このシステムは、約５０から約２００ミクロンの孔径を有するステンレス鋼篩で形成された粗フィルタ層、約１から約２ミクロンの孔径を有するフィルタで形成されたプレフィルタステップおよび約０．１から約０．２ミクロンの孔径を有するフィルタの最終フィルタステップで構成された一連の３つの濾過層を使用する。遠心分離を使用することなく、プラスミドＤＮＡ回収が良好な清浄化をもたらし、連続的なプロセスの使用を可能にする。
【００１２】
好ましくは、プレフィルタ層および最終フィルタ層は、ストリームが最初にプレフィルタ層を、次いで、最終フィルタ層を、１ステップで通り抜けるような複合体フィルタの一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、遠心分離を必要とせず、かつ、高いプラスミドＤＮＡ回収レベルを有する、プラスミドＤＮＡ含有細胞溶解物ストリームの清浄化方法に関する。
【００１４】
図１は、本発明の清浄化システムを示す。細胞溶解物ストリームは入り口パイプ４を通って第１フィルタステージ２に入る。第１フィルタステージは、約５０から約２００ミクロンの孔径を有するフィルタ材料で構成された粗フィルタ６である。粗フィルタ６からの出口８は、約１から約２ミクロンの孔径を有する通常型フローフィルタで形成されたプレフィルタ１２の入り口１０と流体的に連絡している。プレフィルタ１２の出口１４は、約０．２２ミクロンの孔径を有する最終フィルタ１８の入り口１６と流体的に連絡している。最終フィルタ１８の出口１９はクロマトグラフィー、ウイルスの除去などによってプラスミドＤＮＡを精製するために使用される処理設備４０の残りの部分と流体的に連絡している。
【００１５】
適当な粗フィルタは、約５０から約１００ミクロン、好ましくは約５０ミクロンから約２００ミクロン、より好ましくは約８０ミクロンの孔径を有するステンレス鋼篩である。そのようなフィルタの１つは、イリノイ州Ｖｅｒｎｏｎ  ＨｉｌｌｓのＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒによって作られている（部品番号Ａ０２９５９５−１６）。同じ孔径範囲を有する他の粗フィルタは、ニッケル、チタン、パラジウム、銅、アルミニウムなどの他の金属、あるいはガラス、セラミックまたは焼結プラスチックで作ることもできる。フィルタ中でのプラスミドＤＮＡの損失を最小限にし、システムのホールドアップ体積を低減するため、フィルタはできるだけ少ない層、好ましくは２以下の材料の層、より好ましくは単一層であることが望ましい。
【００１６】
適当なプレフィルタ層は、デプスフィルタ、またはマサチューセッツ州ＢｉｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｆｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＰＯＬＹＳＥＰ（商標）ＩＩフィルタのような組合せデプスフィルタ／シートフィルタで作ることができる。ＰＯＬＹＳＥＰ（商標）ＩＩフィルタは、ホウケイ酸ガラスデプスフィルタで形成され、このガラス層の下流に混合セルロースエステルシート薄膜を続けたものである。好ましい装置は、１．０ミクロン名目孔径ガラスフィルタに１．２ミクロンの名目孔径の混合エステル薄膜を続けて用いたものである。他のプレフィルタも使用でき、ポリエチレン、ポリプロピレン、ホウケイ酸ガラス、混合セルロースエステルおよびそれらの組合せからなる群から選択される材料で作ることができる。フィルタ媒体は、繊維マット、スパンバウンド繊維、不織布または織布などのデプスフィルタの形でもよいし、薄膜シートの形でもよく、あるいは上に論じたような２層の組合せでもよい。好ましいプレフィルタは、約１ミクロンと約３ミクロンの間、好ましくは約１ミクロンと約２ミクロンの間、より好ましくは約１．２ミクロンの孔径を有する。
【００１７】
適当な最終フィルタは、マサチューセッツ州ＢｉｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）薄膜などのＰＶＤＦ、マサチューセッツ州ＢｉｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）またはＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ＰＬＵＳ薄膜などのポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリアリールスルホン類、ポリフェニルスルホン類、ポリアミド類などからなる群から選択される材料から作られる。好ましくは、選択されたフィルタは、選択されたポリマーにより本来的に、またはポリビニルピリリドン（ＰＶＰ）などの親水性ポリマーを含むコーティング、グラフトの適用もしくは薄膜製造の分野における当業者によく知られた他の方法によって親水性としたものである。
【００１８】
図２は、本発明の清浄化システムの別の実施形態を示す。細胞溶解物ストリームは入り口パイプ２２を通って第１フィルタステージ２０に入る。第１フィルタステージは、約５０から約２００ミクロンの孔径を有するステンレス鋼フィルタ材料などの粗フィルタ２４である。粗フィルタ２４からの出口２６は、約１から約２ミクロンの孔径を有するプレフィルタ材料の１つまたは複数の層を有する通常なフローフィルタおよび第１のセットの層の下流にあって約０．２２ミクロンの孔径を有する最終フィルタである１つまたは複数の層で形成された、組合せプレフィルタ／最終フィルタ装置３０の入り口２８と流体的に連絡している。組合せプレフィルタ／最終フィルタ３０の出口３２は、クロマトグラフィー、ウイルスの除去などによってプラスミドＤＮＡを精製するために使用される処理設備４０の残りの部分と流体的に連絡している。
【００１９】
図２のこの実施形態は、２つの濾過ステップを１つに組み合わせ、それにより、２濾過ステップにおけるよりも１のホールドアップ体積となるため、ホールドアップ体積による流体損失を解消するという点で好ましい実施形態である。これは、プラスミドＤＮＡの収率増加を助ける。
【００２０】
適当な組合せプレフィルタ／最終フィルタは、マサチューセッツ州ＢｉｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＯＰＴＩＣＡＰ（商標）マルチメディアフィルタとして知られている。これは使い捨てのカートリッジ中に設けられた２重層フィルタである。第１の層は１．２ミクロンの混合セルロースエステル層であり、最終層は０．２の親水性ＰＶＤＦ薄膜である。プラスミドＤＮＡを含む流体は、プレフィルタ層、次いで、最終フィルタ層を通ってカートリッジ内に入り、固体を含まずプラスミドＤＮＡを含むストリームを生じる。所望であれば、それらが良好な清浄化および高いプラスミドＤＮＡ収率を提供する限り、本発明では、他のマルチメディア層フィルタを形成するためにフィルタ層の他の組合せを使用してもよい。
【実施例１】
【００２１】
プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを、イリノイ州Ｖｅｒｎｏｎ  ＨｉｌｌｓのＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒによって作られ８０ミクロンのステンレス鋼粗フィルタ（部分番号Ａ０２９５９５−１６）、次いでマサチューセッツ州ＢｉｌｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＯＰＴＩＣＡＰ（商標）マルチメディアフィルタ（１．２ミクロンの名目孔径を有する混合セルロースエステル）、次いで０．２２ミクロンのＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）ＰＶＤＦ薄膜を使用する、図２に示され記載されるようなシステムによって処理した。
【００２２】
そのサイズストリームの粒子の粒子サイズおよび量を、処理前、粗濾過後、および組合せプレフィルタ／最終フィルタステップ後に分析した。図３は、分析の間に、ストリーム中で検出された粒径が２ミクロンまでの粒子のグラフを示す。明確に見ることができるように、本発明によるシステムは、ストリームを顕著に清浄化した。
【実施例２】
【００２３】
プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを、イリノイ州Ｖｅｒｎｏｎ  ＨｉｌｌｓのＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒによって作られ８０ミクロンのステンレス鋼粗フィルタ（部分番号Ａ０２９５９５−１６）、次いでマサチューセッツ州ＢｉｌｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＰＯＬＹＳＥＰ（商標）ＩＩフィルタ（１．０ミクロン名目孔径のガラスフィルタに１．２ミクロン名目孔径の混合エステル薄膜が後続したもの）、次いでマサチューセッツ州ＢｉｌｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な最終フィルタ（カートリッジ形式の０．２２ミクロンのＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）親水性ＰＶＤＦ）を使用する、図１に示され記載されるようなシステムによって処理した。
【００２４】
プラスミドＤＮＡを含む細胞溶解物ストリームを、イリノイ州Ｖｅｒｎｏｎ  ＨｉｌｌｓのＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒによって作られ８０ミクロンのステンレス鋼粗フィルタ（部分番号Ａ０２９５９５−１６）、次いでマサチューセッツ州ＢｉｌｌｌｅｒｉｃａのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＯＰＴＩＣＡＰ（商標）マルチメディアフィルタ（１．２ミクロンの名目孔径を有する混合セルロースエステル）、次いで０．２２ミクロンのＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）ＰＶＤＦ薄膜を使用する、図２に示され記載されるようなシステムによって処理した。
【００２５】
プラスミドＤＮＡ収率は、図４に示すようなゲル分析によって決定した。この図に見ることができるように、本発明の濾過システムから回収されたプラスミドは、各場合で比較的高く９０％を超えていた（ゲル分析からの計算によって決定した）。
【００２６】
本発明は、高容量、処理流体における濁度の最大のプラスへの変化（高い固体除去を証拠づける）、小粒子数および最小限のプラスミドＤＮＡ収率損失を有するシステムを、すべて遠心分離ステップを必要とせずに提供する。それは、処理ステップを解消する（潜在的な収率を増加させる）ことにより、システムホールドアップ体積の低減を可能にし、システムおよびプロセスを、バッチ形式のプロセスではなく連続的に実行することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の１つの実施形態による清浄化システムを示す図である。
【図２】本発明の別の実施形態を示す図である。
【図３】本発明の様々なステップの前後における細胞溶解物ストリーム中に見出される粒子の相対的な大きさおよび量を示すグラフである。
【図４】本発明の方法およびシステムによるプラスミド回収のゲル分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
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