(57)【要約】【課題】日常的に大量にある天然物原料から容易に製造ができ、安全性が高く、高血圧症の予防・治療薬、及び機能性食品に利用できるＡＣＥ阻害剤を提供する。【解決手段】「Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ」の構成でなるペプチド、その薬理上許容される塩、あるいはそれらの混合物から選ばれる一種以上を有効成分として含んでおり、このペプチドは、動物、特に鶏の骨抽出物より単離されるものが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチド、その薬理上許容される塩、あるいはそれらの混合物から選ばれる一種以上を有効成分として含むことを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項２】
前記ペプチドは、動物骨抽出物より単離されることを特徴とする請求項１記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【請求項３】
前記動物は、鶏であることを特徴とする請求項２記載のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧上昇に関与しているアンジオテンシンＩ変換酵素（以降、「ＡＣＥ」と略す。）の阻害剤、特に特定のペプチドからなるＡＣＥ阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現代の日本においては、高齢社会となって糖尿病や高血圧症等に代表される生活習慣病にかかる人の数が急激に増加している。生活習慣病に対する特効薬はいまだ開発途上であり、症状を進行させない或いは現状を維持するために莫大な費用が費やされている。その中にあって、食品中の栄養成分の中にはこれら生活習慣病を予防することができるような生理活性機能があることが明らかになりつつあり活発に研究がなされている。タンパク質はその良い例であり、栄養源としての第１次機能、味覚に訴える第２次機能に加え、近年ではタンパク質のもつ様々な生体調節機能を健康維持に役立てようとする第３次機能として注目されている。
【０００３】
タンパク質がもつ生理活性機能のひとつに血圧調節系に関与するＡＣＥ阻害ペプチドがある。ＡＣＥは２価の亜鉛イオンをもつ金属プロテアーゼであり、レニンにより生じたアンギオテンシンＩのＣ末端側２残基のＨｉｓ‐Ｌｅｕを遊離し、動脈収縮・昇圧物質であるアンギオテンシンＩＩを生成する〔例えば、非特許文献１参照〕。また、ＡＣＥは動脈弛緩・降圧物質であるブラジキニンの分解を触媒し、よってＡＣＥ阻害物質の作用は降圧効果を示す。このため、各種食品タンパク質の酵素による加水分解物、あるいは食品成分のＡＣＥ阻害活性について多くの研究が行われ、近年、各種の食品からＡＣＥ阻害ペプチドが単離された。例えば、豚骨格筋（大腿二頭筋）より抽出したミオシン由来のペプチド〔非特許文献２参照〕、トウモロコシタンパク質の一種であるα−カゼインに由来するペプチド〔特許文献１参照〕、緑色植物の葉緑素に含有されるルビスコを加水分解して得られるペプチド〔特許文献２参照〕魚肉からのペプチド〔特許文献３参照〕マガキ生殖巣に由来するペプチド〔特許文献４参照〕など天然物由来の各種ペプチドがあり、その他ＡＣＥ阻害活性がある特定のアミノ酸配列のペプチドについての報告〔例えば、特許文献５〜７など参照〕もある。
【０００４】
【非特許文献１】大石幸子他４名著、「キニンとアンギオテンシン生体調節の分子機構」（講談社サイエンティフィク）、２１頁、講談社、１９９４年
【非特許文献２】ナカヤマ（Ｙ．Ｎａｋａｙａｍａ）他５名著、ジャーナル・オブ・フード・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、６７巻、１号、４３４‐４３７頁、２００２年
【特許文献１】特開平６−８７８８６号公報
【特許文献２】特開２００３−３００９９６号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３１９９号公報
【特許文献４】特開２００３−８１９９７号公報
【特許文献５】特開２００２−１３８０９７号公報
【特許文献６】特開２００２−１４５８９９号公報
【特許文献７】特開平７−２１５８８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、日常的に大量にある天然物原料から容易に製造ができ、安全性が高く、高血圧症の予防・治療薬、及び機能性食品に利用できるＡＣＥ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成すべく、本発明請求項１はＡＣＥ阻害剤に係り、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａの構成でなるペプチド、その薬理上許容される塩、あるいはそれらの混合物から選ばれる一種以上を有効成分として含むものである。
【０００７】
さらに、請求項２は動物骨抽出物より単離されるペプチドを有効成分として含むＡＣＥ阻害剤であり、請求項３は鶏の骨抽出物より単離されるペプチドを有効成分として含むＡＣＥ阻害剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、血圧の上昇を抑え、高血圧の予防・治療薬、及び機能性食品に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＡＣＥ阻害剤は、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａの構成でなるペプチド、その薬理上許容される塩、あるいはそれらの混合物を有効成分としている。ここで、Ｔｙｒはチロシン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｌａはアラニンである。
【００１０】
本発明における特定のペプチドは、アミノ酸からの合成によって得ることができる。すなわち、有機化学的に液相法あるいは固相法によりアミノ酸を段階的に導入して目的のペプチドとする方法、加水分解酵素の逆反応を利用してペプチドを合成していく方法など既によく知られており、本発明はいずれの方法に依って製造されたものも包含している〔例えば、非特許文献３（泉谷信夫他著、「ペプチド合成の基礎と実験」、丸善（株）、１９８５年）参照〕。
【００１１】
また、本発明のペプチドは、動物の骨から抽出し、分離しても得ることができる。ここで、動物は、好ましくは鶏、アヒル、鴨、ウズラ、ガチョウ、七面鳥、ホロホロ鳥などの鳥類である。以下、鶏の骨よりの抽出を例にして本発明の実施の形態を説明する。鶏以外の動物の骨からの抽出も同様にして実施できる。
【００１２】
先ず、鶏骨の抽出工程であり、鶏ガラよりエキスを熱水抽出する。抽出条件は特に限定するものではないが、代表的には、オートクレーブなど加圧の出来る容器中で、鶏骨に対し３〜５倍（重量）の水（蒸留水あるいはイオン交換水が好ましい）を加え、１００〜１５０℃で３０〜９０分間加熱し、次いで水（蒸留水あるいはイオン交換水が好ましい）中で煮沸させエキスを熱水抽出する。冷却後にろ過して油脂分、不溶解分を除き、さらに遠心分離して微細に分散している油脂分をろ過で除去する。その液体部分が抽出液となる。
【００１３】
次いで、この抽出液にプロテアーゼを加えて酵素分解を行う。プロテアーゼは、パパイン、フィチン、ペプシン、トリプシン、α−キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、ブロメライン、パンクレアチンなどであり、任意に一種以上が選ばれる。これらプロテアーゼは、市販されている製品を用いることができる。
【００１４】
プロテアーゼを用いての酵素分解を行う条件は、プロテアーゼの種類やその力価に依り異なるが、代表的には、プロテアーゼを３〜１０ｍｇ／ｍＬ（抽出液）加え、ｐＨを調整して２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、２０〜３０時間である。至適ｐＨ範囲は、用いるプロテアーゼにより異なり、例えばパパインではｐＨ３〜１２、フィチン、トリプシン、α−キモトリプシン、サーモリシン、プロナーゼ、ブロメライン、パンクレアチンなどでは、ｐＨ４〜１０であり、ペプシンではｐＨ２〜４である。ｐＨを調整するときのアルカリまたは酸は、好適には食品に許容されるものが選ばれ、具体的には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸などである。
【００１５】
酵素分解が終わった後、分解混合液の温度を８０〜１００℃に上げてプロテアーゼを失活させ、必要により遠心分離してから不溶解物をろ過して除く。本発明のＡＣＥ阻害活性作用を示す成分は、この分解混合物に含まれており、このまま経口で服用すればその効果は期待できる。しかし、薬、機能性食品、健康食品として使用するには、活性成分であるＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａのペプチドを濃縮するのが好ましい。分解混合物には、本発明の目的物であるＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａのペプチド成分以外の多くの化合物が含まれているが、いずれもヒトには無毒であり、また本発明の意図する血圧降下作用には支障がないのでそのまま用いることができる。本発明のペプチドを濃縮して分離するには、例えば、液体クロマトグラフィーなどにより分取し、さらに一定分子量範囲を分画して、濃縮、凍結乾燥することである。
【００１６】
本発明のペプチドは、必要により水中で薬理上許容される酸と反応させ、濃縮、凍結乾燥して塩にして分離することもできる。ここで、薬理上許容される塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、グルタミン酸塩などである。
【００１７】
本発明のペプチドあるいはその酸付加塩は、本ＡＣＥ阻害剤として経口的あるいは非経口的（静脈注射、直腸投与等）投与方法に適した形態に製剤することができる。製剤化する際には、緩衝剤、ｐＨ調節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等）、結合剤（シロップ、ゼラチン、ソルビット、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等の製薬補助剤を加えることがあるが、本発明の効果を損なわない限りにおいてこれら製薬補助剤の使用は制約されるものではない。本発明のＡＣＥ阻害剤をヒトに対して投与する場合、有効成分としてＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａのペプチドを２〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度である。
【００１８】
また、本発明のペプチドは多量に摂取しても生体に悪影響を与えない利点を有することから、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品中に含有せしめて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、健康食品として食してもよい。すなわち、例えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには粉末状としてそのままあるいは各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機能性食品、健康食品としての本ＡＣＥ阻害剤ひいては血圧降下剤中の有効成分の含有量、摂取量はそれぞれ上記製薬における含有量、投与量を基準にして適宜決められる。
【実施例】
【００１９】
次に本発明を実施例により説明する。以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００２０】
（１）骨抽出液の調製
鶏ガラ（４羽分、約１ｋｇ）を水洗し、３〜４ｃｍ角に裁断し、水とともにオートクレーブに入れ、１２１℃で３０分間加熱した。冷却後、オートクレーブから取り出し周囲の水を拭き取り、その骨１，０００ｇを蒸留水４，０００ｇとともに鍋で、始めは中火で、沸騰後はできるだけ弱火で加熱し、蒸発分の水を補給しつつ４時間加熱抽出した。ペーパータオルでろ過して骨および水中の不溶解分を除去した後、液部分を冷却して脂肪層を除き、さらに遠心分離（１０，０００×ｇ、３０℃、６０分間）してからろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＯＹＯ  Ｎｏ．５Ａ）でろ過し、凍結乾燥した。乾燥固形分１０ｍｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ；Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．５）１ｍｌに溶解し試料として用いた。尚、リン酸緩衝液は、超純水にリン酸二水素カリウム（ナカライテスク株式会社製、特級）１．４７ｍＭ、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物（ナカライテスク株式会社製、特級）８．１ｍＭ、塩化ナトリウム（和光純薬株式会社製、特級）１３７ｍＭ、塩化カリウム（ナカライテスク株式会社製、特級）２．６８ｍＭを溶解して調製した。
【００２１】
（２）酵素分解
上記骨抽出物のＰＢＳ溶液に、トリプシン（シグマ社製）を５ｍｇ／ｍｌになるように０．００１Ｎ塩酸に溶解した溶液を加えた。このとき、ＰＢＳ溶液中のタンパク質１００重量部に対し、トリプシンを１重量部の割合となるようにした。
トリプシンを添加した骨抽出物のＰＢＳ溶液は、３７℃で６時間保持して反応させ、その後９５℃に１０分間加熱してトリプシンを失活させた。１０，０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を回収したものをトリプシン分解物とした。
【００２２】
（３）タンパク質の定量
鶏骨抽出物、トリプシン分解物および精製で得られた画分のタンパク質濃度は、紫外線吸収法で、２１５ｎｍにおける吸光度から２２５ｎｍにおける吸光度を差し引き、１４４倍したときの数値をタンパク質濃度とした。
【００２３】
（４）酵素処理による低分子量化の確認
〔方法〕
ゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。装置および条件を表１に示した。
【表１】
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【００２４】
〔結果〕
鶏骨抽出物およびトリプシン分解物のゲルろ過ＨＰＬＣの結果を図１に示した。鶏骨抽出物には、保持時間１０分〜１２分にかけて大きなピークが見られ、高分子量のタンパク質が存在しており、２０分〜３０分にかけて若干のピークが見られることから、ポリペプチドも存在していることが明らかとなった。また、トリプシン分解物は、保持時間１０分〜１２分のピークが消失し、保持時間２０分〜３０分にかけてピークが多数出現している。これから、鶏骨抽出物をトリプシン分解することによってタンパク質が低分子量化していることが確認された。
【００２５】
（５）低分子量ポリペプチドの精製
〔方法〕
トリプシン分解物における低分子量ポリペプチドを、ゲルろ過ＨＰＬＣ法、および逆相ＨＰＬＣ法を組合わせて分離精製した。それぞれの段階で使用した装置および条件を表２に示した。
【表２】
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【００２６】
〔結果〕
結果を図２〜７に示した。図２は、第１回目のゲルろ過ＨＰＬＣの結果であり、分子量約３，５００〜５００Ｄａの範囲にペプチド群が存在した。その画分を分取し、さらに逆相ＨＰＬＣにて順次分画した。
先ず、「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ‐２」カラムにて２回逆相ＨＰＬＣを行った。図３はこの最初の逆相ＨＰＬＣの結果であり、保持時間２９〜３２分にかけてのペプチド群を分画し、さらに図４の逆相ＨＰＬＣにおける２６〜２７分のペプチド群を分画した。この分画部分を、さらに「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５ＰＥ‐ＭＳ」カラムにて２回逆相ＨＰＬＣを行い、図５の保持時間１０〜１１分のペプチド群、図６の保持時間１６〜１７分のペプチド群を順次分画した。この最終分画物を「ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５ＰＥ‐ＭＳ」カラムにて逆相ＨＰＬＣを行うと、図７に示すようにシングルピークとなった。
【００２７】
（６）ＡＣＥ阻害ペプチドのアミノ酸配列の決定
上記で精製分画した成分につき、プロテインシーケンサー〔アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社（米国）製、「プロサイス（Ｐｒｏｃｉｓｅ）４９２」（商品名）〕を用いてそのアミノ酸配列を解析した。その結果、最終分画物のアミノ酸配列は、「Ｔｙｒ‐Ｔｙｒ‐Ａｒｇ‐Ａｌａ（ＹＹＲＡ、分子量＝５７１．６７）」であることが確認された。
【００２８】
（７）ＡＣＥ阻害ペプチドのホモロジー検索
ホモロジー検索の結果、本ペプチドは骨髄中に多く含まれるタンパク質の一種である「免疫グロブリン重鎖（Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｖ  ｒｅｇｉｏｎ）」の２７−３０位由来であると推定された（図８）。
【００２９】
（８）「Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ」のアミノ酸配列ペプチドの合成
上記した「Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ」のアミノ酸配列ペプチドを、構成アミノ酸（Ｌ体）から合成した。合成手順は、Ｆｍｏｃ（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−Ｗａｎｇ樹脂〔アメリカンペプタイド社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）製品〕を基に、ペプチド合成装置〔レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）社製、「Ｓｙｍｐｈｏｎｙ」（商品名）〕にて、Ｆｍｏｃ法による全自動合成を実施した。得られたレンジ付きの完全保護ペプチドにチオアニソールを含む８０％−トリフルオロ酢酸溶液を加え、室温で１時間反応し、粗ペプチドを得た。これを逆相クロマトグラフィー〔カラム；ＯＤＳカラム（シリカゲル担体にオクタデシルシリル基（ＯＤＳ基）を化学結合した充填剤を詰めたカラム）〕にて分取精製し、目的とするペプチドを得た。
【００３０】
（９）ＡＣＥ阻害活性の測定
〔方法〕
山本らの方法〔非特許文献４（山本節子他２名著、「血清アンギオテンシン変換酵素活性測定方法の検討」、日本胸部疾患学会誌、１８巻、２９７〜３０３頁、１９８０年）参照〕に準じて行った。
緩衝液；０．２５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた。
基質溶液；塩化ナトリウム（和光純薬工業製、特級）、０．２５Ｍホウ酸緩衝液を、それぞれ最終濃度０．６０８Ｍ、０．０１Ｍになるように超純水を用いて調製し、この溶液にＨＨＬ（Ｈｉｐｐｕｒｙｌ‐Ｌ‐Ｈｉｓｔｉｄｙｌ‐Ｌ‐Ｌｅｕｃｉｎｅ）〔ナカライテスク社製〕）を溶解して７．６ｍＭ合成基質ＨＨＬを作成した。
ＡＣＥ溶液；ウサギ肺由来ＡＣＥ〔和光純薬工業（株）製〕を活性が６０ｍＵ／ｍｌとなるように上記ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解した。
【００３１】
〔ＡＣＥ阻害率〕
試料０．００６ｍｌに、６０ｍＵ／ｍｌＡＣＥ溶液０．０２ｍｌおよび基質溶液０．０５ｍｌを入れ、３７℃で３０分間反応させた。０．１Ｎ塩酸０．５５４ｍｌを加えて反応を停止し、酢酸エチル１．５ｍｌを加えてＡＣＥの作用により遊離した馬尿酸を抽出し、１，０００×ｇで１５分間遠心分離を行った後、酢酸エチル層１ｍｌを分取して蒸発乾固（１００℃、１０分間）した。乾固した馬尿酸を１Ｍ塩化ナトリウム溶液１ｍｌで溶解し、波長２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３２】
阻害率は、サンプルの吸光度をＳ、サンプルの代わりに超純水を加えて同様に反応させた時の値をＣ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＢとして次式により求めた。
ＡＣＥ阻害率（％）＝｛（Ｃ−Ｓ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
上式により求められる阻害率が５０％を示す時の阻害物質濃度（反応液１ｍｌ当たりのｍｇ数）を、阻害活性（ＩＣ５０）とした。鶏骨抽出物のトリプシン分解物の濃度とＡＣＥ阻害率の関係を図９に示す。
対照実験として、既知のＡＣＥ阻害物質であるカルノシン（β‐ａｌａｎｙｌ‐Ｌ‐ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）〔和光純薬工業（株）社製品〕のＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００３３】
〔結果〕
結果を表３に示した。
【表３】
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【００３４】
以上の結果、鶏骨抽出物のトリプシン分解物にはＡＣＥ阻害活性があり、これから分画した最終分画物のＩＣ５０は３２．７μｇ／ｍｌ（５７．２μＭ）であり、この値は精製前のトリプシン分解物のＩＣ５０７８１μｇ／ｍｌと比べ、約２４倍となっていた。合成した同じアミノ酸配列のペプチドでは、ＩＣ５０が３３．９μｇ／ｍｌ（５９．３μＭ）であり、鶏骨抽出物のトリプシン分解物からの最終分画物と同等の活性を有していることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
日常的に大量にある天然物原料から容易に製造ができ、安全性の高いＡＣＥ阻害剤が提供され、人々の健康維持に寄与することができる高血圧症の予防・治療薬、機能性食品に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】鶏骨抽出物およびそのトリプシン分解物のゲルろ過ＨＰＬＣの結果である。
【図２】鶏骨抽出物およびそのトリプシン分解物のゲルろ過ＨＰＬＣの結果である。
【図３】図２における分子量約３，５００〜５００Ｄａの範囲にあるペプチド群について、さらに分離を行った逆相ＨＰＬＣの図である。
【図４】図３の特定部分についてさらに分離を行った逆相ＨＰＬＣの図である。
【図５】図４の特定部分についてさらに分離を行った逆相ＨＰＬＣの図である。
【図６】図５の特定部分についてさらに分離を行った逆相ＨＰＬＣの図である。
【図７】最終分画物についての逆相ＨＰＬＣの図である。
【図８】鶏骨抽出物トリプシン分解物より単離されたＡＣＥ阻害ペプチドのホモロジー検索の結果である。
【図９】鶏骨抽出物のトリプシン分解物の濃度とＡＣＥ阻害率の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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