(57)【要約】  【課題】  基板自体から発生したノイズ蛍光の発生を防止できるバイオアッセイ用基板を提供すること。  【解決手段】  ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用の場となる反応領域Ａが形成された反応領域形成層１１と、前記反応領域Ａへ所定波長の蛍光励起光Ｐａを通過させる光通過口１３１又は前記蛍光励起光Ｐａを透過する光透過域１３２が一部に形成され、かつ前記反応領域形成層１１への蛍光励起光Ｐの入射を防止する遮光層１３ａと、を少なくとも備えるバイオアッセイ用基板１を提供する。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）、（２）を少なくとも備えるバイオアッセイ用基板。
（１）物質間の相互作用の場となる反応領域が形成された反応領域形成層。
（２）該反応領域へ所定波長の蛍光励起光を通過させる光通過口又は前記励起光を透過する光透過域が一部に形成され、かつ前記反応領域形成層への前記蛍光励起光の入射を防止可能な遮光層。
【請求項２】
前記反応領域形成層は、感光性樹脂層であることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項３】
前記感光性樹脂層は、感光性ポリイミド樹脂から形成されたことを特徴とする請求項２記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項４】
前記遮光層は、金属層、黒色炭素化合物層、遮光性顔料含有層、吸光体含有層のいずれかから選択される層であることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項５】
前記遮光層は、前記反応領域の水平断面積と同等若しくはよりも狭小な面積の前記光透過域又は前記光通過口を有することを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板
【請求項６】
前記遮光層の光透過域は、前記励起光を光透過可能な程度に部分的に薄層化した領域であること特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項７】
前記反応領域は、前記反応領域形成層に形成されたウエルであることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項８】
基板の裏面側から前記反応領域へ、前記蛍光励起光を入射可能にしたことを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項９】
前記反応領域で発生した蛍光を、基板裏面側の領域で受光可能にしたことを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１０】
双方の電極面が前記反応領域に臨む対向電極を、前記反応領域を挟む位置関係で設けたことを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１１】
前記対向電極が、複数対設けられたことを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１２】
前記遮光層を導体で形成して、前記対向電極を構成する電極として用いることを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１３】
前記導体は、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）から形成されたことを特徴とする請求項１２記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１４】
前記対向電極の表面が、絶縁膜で被覆されたことを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１５】
前記絶縁膜は、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２の中から選択される一つの材料によって形成されたことを特徴とする請求項１４記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１６】
前記遮光層の光透過域は、光透過性の導体で形成され、該導体を前記対向電極の一方の電極として用いることを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１７】
前記導体は、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）から形成されたことを特徴とする請求項１６記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１８】
前記反応領域を挟むように上下に配置された対向電極の一方の電極を、該反応領域で発生した蛍光の反射層として兼用することを特徴とする請求項１０記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項１９】
前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項２０】
ＤＮＡチップである請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互作用を高精度に蛍光検出するバイオアッセイ用基板に関する。より詳しくは、蛍光発光性の基板構成層への蛍光励起光の入射を防止する遮光層を備えるバイオアッセイ用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において提案されている様々なセンサーチップ技術の典型的なものは、端的に言えば、物質間の相互作用を提供する反応領域を基板上に予め設定しておき、この反応領域中に、予めプローブとなる検出用物質を遊離状態、あるいは固定状態としておくことによって、この検出用物質と標的物質との間の特異的な相互作用を、蛍光強度検出などの方法に基づいて解析する技術であると言えるだろう。
【０００３】
一例を挙げると、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、物質間の相互作用の検出を、蛍光標識された標的物質やインターカレーターなどの蛍光物質から発せられる蛍光強度測定に基づいて行う場合では、該相互作用の検出に係わる正規の蛍光中に、種々の原因で発生するバックグランドノイズとなる蛍光（以下「ノイズ蛍光」と称する。）が混ざって検出されるため、検出精度の低下を招いている。
【０００５】
例えば、特許文献１では、検体に付けた蛍光標識から発生する蛍光と、基板自体から発生するノイズ蛍光を分離することによって、蛍光読み取りを高精度に行うことができるマイクロアレイチップの読取技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−１８１７０８号公報（特に、請求項１参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記したように、センサーチップ技術では、前記相互作用の検出に役立つ正規蛍光の他に、ノイズ蛍光が測定され、信号のＳ／Ｎを悪化させるので、検出精度を低下させるという技術的課題がある。例えば、基板を構成する層の中に、芳香族化合物などの蛍光発光性の材料で形成された層が存在すると、該層から発生した蛍光も前記正規蛍光とともに検出されてしまうので、正規蛍光量の検出の障害となるという問題がある。
【０００７】
前掲した先行技術は、この問題を解決すべく提案されたものであるが、ノイズ蛍光の発生を前提とした技術であり、ノイズ蛍光の発生自体を防止する技術ではない。
【０００８】
そこで、本発明は、基板自体から発生したノイズ蛍光の発生を防止できるバイオアッセイ用基板を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、まず、（１）ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用の場となる反応領域（例えば、ウエル形状）が形成された反応領域形成層、（２）該反応領域へ所定波長の蛍光励起光を通過させる光通過口又は前記励起光を透過する光透過域が一部に形成され、かつ前記反応領域形成層への前記蛍光励起光の入射を防止可能な遮光層、が少なくとも設けられたＤＮＡチップその他のバイオアッセイ用基板を提供する。
【００１０】
このバイオアッセイ用基板は、前記反応領域形成層が蛍光発光性を有する材料で形成されている場合、例えば、感光性ポリイミド樹脂などの感光性樹脂層などのような材料で形成されている場合において、基板の上方側又は下方側などから入射してくる蛍光励起光のうちの反応領域形成層への入射を遮断し、ノイズ蛍光の発生を防止する。
【００１１】
遮光層は、採用される蛍光励起光を遮光可能な材料で形成された層であればよいが、例えば、金属層、黒色炭素化合物層、遮光性顔料含有層、吸光体含有層のいずれかから選択することが可能である。
【００１２】
また、この遮光層を、前記反応領域の水平断面積と同等若しくはよりも狭小な面積の前記光透過域又は前記光通過口を有するように工夫する。即ち、遮光層を蛍光励起光の入射側から見たときに、蛍光発光性を有する反応領域形成層を覆うような形態に工夫することによって、反応領域形成層への蛍光励起光の入射を確実に防止し、あるいは、反応領域形成層で発生してしまったノイズ蛍光の漏れを確実に防止する。
【００１３】
遮光層の光透過域は、蛍光励起光を前記反応領域に入射させることが可能な非開口領域である。この光透過域は、光透過性の材料で形成することができる。あるいは、光透過可能な程度に部分的に薄層化することによって形成することも可能である。即ち、このような構成の遮光層では、蛍光励起光が反応領域形成層へ入射させないように機能する程度の厚みのある層領域と、反応領域への光透過が可能な程度に部分的に薄層化した層領域を備える。
【００１４】
ここで、本発明では、基板の裏面側から反応領域へ、蛍光励起光を入射可能に構成し、さらには、前記反応領域において発生した蛍光を、基板裏面側の領域で受光可能に構成することによって、基板上方領域に媒質供給に係わる装置群（例えば、ノズルや媒質貯留部など）を集約し、基板下方側に光ピックアップに係わる装置群を集約する。
【００１５】
次に、本発明では、双方の電極面が前記反応領域に臨む対向電極を、前記反応領域を挟む位置関係で設けるように工夫する。この対向電極は、一対でもよいが、複数対設けられた構成であってもよい。
【００１６】
なお、基板を構成する前記遮光層の全体を、あるいは光透過域のみを導体で形成しておいて、前記対向電極を構成する電極として用いることも可能であり、さらには、この導体を、光透過性のＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）で形成してもよい。
【００１７】
前記対向電極の表面を絶縁膜、例えば、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２の中から選択される一つの材料などによって形成された絶縁膜で被覆することによって、反応領域中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止することができる。
【００１８】
また、前記反応領域を挟むように上下に配置された対向電極の一方の電極を、該反応領域で発生した蛍光の反射層として兼用するようにしてもよい。電極を反射層として兼用すれば、別途反射層を設ける必要がなくなるので、基板層構成の簡素化を達成できる。
【００１９】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
【００２０】
まず、「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸分子を検出するための検出子として機能する核酸分子である。代表例は、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。「標的核酸」とは、前記検出用核酸と相補的な塩基配列を有する核酸分子である。
【００２１】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味する。
【００２３】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。例えば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。
【００２４】
「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を意味する。
【００２５】
「反応領域形成層」は、前記反応領域の形成対象とされる層を意味し、「遮光層」は、蛍光励起光の導波路として機能しない層を意味する。
【００２６】
「誘電泳動」は、電界が一様でない電場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００２７】
「バイオアッセイ用基板」は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域が少なくとも形成された基板を意味する。
【００２８】
「ＤＮＡチップ」は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸が遊離状態又は固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、基板自体から発生したノイズ蛍光の発生を防止できる。より詳しくは、反応領域が形成された基板も用いて、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用を蛍光物質により信号検出する場合において、該基板中の所定位置に遮光層を設けることによって、蛍光発光性のある層でのノイズ蛍光の発生を防止できる。この結果、検出信号のＳ／Ｎが向上するため、検出精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３１】
まず、図１、本発明に係るバイオアッセイ用基板（符号１）の基本的な実施形態の要部構成を表す一部断面図（Ｘ図）及び上方視一部平面図（Ｙ図）、図２は、同基板（符号１）の他の基本的な実施形態の要部構成を表す一部断面図である。
【００３２】
図１中の符号１ａで示されたバイオアッセイ用基板（以下「基板」と略称。）は、矩形状、円盤状などの様々な形態に形成され、物質間の相互作用の場となる反応領域Ａがウエル形状に必要数（図面では１つ）形成されている反応領域形成層１１と、該反応領域形成層１１の下側に配置されたアルミニウムなどの反射層１２と、反応領域形成層１１の上方に積層され、光通過口１３１を備える遮光層１３ａと、を備える。なお、図１では図示しないが、遮光層１３ａのさらに上層に光透過性の層を形成したり、反射層１２の下層に合成樹脂層などを設けたりしてもよい。
【００３３】
前記反応領域形成層１１は、例えば、ポリイミド樹脂を採用すれば、ＳｉＯ２などの無機酸化膜などで形成するよりも、低コストで形成することが可能となるので原材料コスト面で有利であり、また、厚膜形成も前記無機酸化膜などに比較して容易で生膜コストも易いという利点がある。
【００３４】
さらに、感光性ポリイミド樹脂を採用すれば、これにフォトレジストを用いた表面処理を行うことによって、所定形状の反応領域Ａを簡易に形成することができる。
【００３５】
この反応領域Ａの形状、サイズ、数は、特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍであって、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液）などの媒質の最小滴下可能量に基づいて決定することができる。
【００３６】
遮光層１３ａは、検出工程において採用される蛍光励起光Ｐａを遮光可能な材料で形成された層であればよく、特に限定されないが、例えば、金属層、黒色炭素化合物層、遮光性顔料含有層、吸光体含有層のいずれかから選択することが可能である（以下、後述する他の遮光層１３ｂ、１３ｃについても同様）。
【００３７】
なお、遮光層１３ａを金属（導体）で形成すれば、該遮光層１３ａを後述する電極に対する給電用配線の引き回しにも利用できることや、当該電極を低抵抗化する必要がなくなるという利点がある。このため、例えば、ＩＴＯなどによって電極を形成するような場合では、薄膜化や成膜時の酸素量を増やす等により高光透過性の層（膜）にし、検出信号量を増やすことを優先的に行うことができるようになる（この点、後述する他の遮光層１３ｂ、１３ｃについても同様）。
【００３８】
ここで、図１の遮光層１３ａには、反応領域Ａの上方領域に開口する光通過口１３１が形成されている。蛍光励起光Ｐａは、この光通過口１３１から反応領域Ａへ導かれ、該反応領域Ａ内に存在する蛍光物質ｆに照射される。これによって、反応領域Ａ内で発光した蛍光Ｆは、前記光通過口１３１から基板１ａの外部へ出射し、その強度が検出される。
【００３９】
図１中に示された符号Ｒは、反射層１２によって反射されて戻ってきた反射蛍光を示している（他の図面でも同様）。この反射層１２を、より高反射率とすれば、蛍光Ｆを当該反射層１２によって反射させることによって、検出信号量を増幅することができる。
【００４０】
ここで、遮光層１３ａは、この遮光層１３ａに入射してくる蛍光励起光Ｐｂを遮断して、反応領域形成層１１への入射を防止できるように形成されている。該反応領域形成層１１が、上記したポリイミド樹脂のように蛍光発光性の材料で形成されている場合では、蛍光励起光Ｐｂが該反応領域形成層１１に対して入射されなくなるため、反応領域形成層１１におけるノイズ蛍光の発生を確実に防止できる。
【００４１】
なお、遮光層１３ａの光通過口１３１の面積は、反応領域Ａの水平断面面積と同等か、あるいは、図１中のＹ図に示されているように、反応領域Ａの水平断面面積よりも狭小に形成することで、光の入射側から見たときに、反応領域形成層１１が遮光層１３ａで覆われるようになるので、反応領域形成層１１に対する蛍光励起光Ｐｂの入射を確実に防止できる（図１参照）。
【００４２】
次に、図２に示された基板１ｂは、ＩＴＯなどの材料で形成された光透過域１３２が一部に形成された遮光層１３ｂを備える点に特徴がある。蛍光励起光Ｐａは、この光透過域１３２から入射して、反応領域Ａ内に導かれる。
【００４３】
この基板１ｂにおいては、遮光層１３ｂは、反応領域形成層１１の下側に配置されている。蛍光励起光Ｐａは基板１ｂの裏面側（下側）から進行し、光透過域１３２を透過して反応領域Ａに入射する。反応領域Ａで発生した蛍光Ｆは、光透過域１３２を透過して基板１ｂの裏面側へ戻ってくる。なお、遮光層１３ｂを、図１と同様に、反応領域形成層１１の上層に配置し、基板１ｂの上方側から蛍光励起光Ｐａを入射するようにしてもよい。
【００４４】
図３は、本発明に係る基板の変形形態の要部構成を表す一部断面図である。
【００４５】
この図３に示されている基板１ｃは、反応領域形成層１１の下側に遮光層１３ｃが形成され、該遮光層１３ｃの下側に、光透過性の合成樹脂層１４が設けられている。そして、前記反応領域形成層１１の上層には、アルミニウムなどで形成された反射層１２、さらにその上層には、合成樹脂層１５が設けられている。
【００４６】
ここで、遮光層１３ｃには、基板下側から進行してきた蛍光励起光Ｐａを反応領域Ａ内へ導くことが可能な光透過域１３３が形成されている。この光透過域１３３は、前記励起光Ｐａを光透過可能な程度に薄層化された領域（厚みＬ１）であり、それ以外の領域１３４は、前記励起光Ｐａを反応領域形成層へ入射させない遮光機能を有する程度に厚く形成されている部分（厚みＬ２）からなる（Ｌ１＜Ｌ２）。このように、遮光層１３ｃ内での層の厚みを変化させることによって、遮光機能を発揮させたり、光透過機能を発揮させたりすることができる。
【００４７】
次に、図４は、図１中の符号Ａ１部分（反応領域Ａの一部分）の拡大図であり、相互作用の一例であるハイブリダイゼーションと蛍光物質の一例を示す図である。図５は、他の蛍光物質の例（蛍光インターカレーター）を示す図である。本発明では、これらの例のいずれを採用してもよく、また、蛍光検出の範疇であれば、これ以外の方法（モレキュラビーコンを用いた方法など）であってもかまわない。
【００４８】
具体的に説明すると、まず、図４では、ハイブリダイゼーションを例として、反射層１２の表面に形成された固定相Ｂに対して検出用核酸（例えば、プローブＤＮＡ）Ｄの一端が固定されており、この固定された検出用核酸Ｄと、該検出用核酸Ｄと相補的塩基配列部分を有し、かつ蛍光物質ｆが標識された標的核酸Ｔがハイブリダイゼーションしている状態が示されている。
【００４９】
他方の図５では、ハイブリダイゼーションにより得られた二本鎖核酸の塩基対部分に蛍光インターカレーターＩが挿入結合されている状態が示されている。この蛍光インターカレーターＩの発光により、二本鎖核酸の存在、即ち、ハイブリダイゼーションを確認できる。
【００５０】
なお、固定相Ｂは、プローブＤＮＡ等の所望の検出用核酸Ｄを固定するために表面処理が施されている。例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法などを採用できる。合成樹脂製基板に対して表面処理加工を施す場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。
【００５１】
また、銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、アビジン等をコートしてもよい。
【００５２】
例えば、ストレプトアビジンなどのアビジンによって表面処理された検出表面の場合では、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００５３】
以下、図６、図７に基づいて、本発明に係る基板１のより具体的な実施形態の一例の構成を説明する。
【００５４】
まず、図６に示されている基板１ｄは、反応領域Ａが形成された反応領域形成層１１と、その下側に形成されている、光通過口１３１を有する遮光層１３ａを備えている。さらに遮光層１３ａの下側には、光透過性の合成樹脂層１４を備える。この合成樹脂層１４の反応領域Ａに臨む面には、上記したような固定相Ｂが設けられている。反応領域形成層１１の上層側には、反射層１２が設けられ、さらにその上層には合成樹脂層１５が設けられている。
【００５５】
反射層１２と合成樹脂層１５には、反応領域Ａに連通する孔２ａ，２ｂが形成されており、この孔２ａ，２ｂのいずれか一方に向けて媒質Ｍが上方から滴下等され、毛細官現象や媒質Ｍとの親媒性原理などを利用して、所定の物質を含む該媒質Ｍが反応領域Ａへスムーズに導入される。なお、反応領域Ａに対する媒質Ｍの導入方法は、この方法に限定されない（この点、すべての実施形態に共通）。なお、媒質Ｍは、水溶液状をなす場合やゲルなどが含まれる場合などがある。
【００５６】
上記構成をなす基板１ｄであれば、該基板１ｄの裏面側（下側）からの蛍光ピックアップが可能となるという利点が生じる。具体的には、基板１ｄの裏面側（下方側）から進行してきた蛍光励起光Ｐａは、光透過性の合成樹脂層１４をまず透過する。続いて、遮光層１３ａの光通過口１３１を通過して反応領域Ａに入射し、標的核酸Ｄなどの標的物質に標識された蛍光物質（図４参照）や蛍光インターカレーター（図５参照）を励起する。これにより発生した蛍光Ｆは、光通過口１３１を通過して、光透過性の合成樹脂層１４を透過して、基板１ｄの下方側へ出射されて、受光される。
【００５７】
図７は、本発明で利用可能な蛍光ピックアップ手段の一例の概念を簡略に説明するための図である。
【００５８】
この図７に示されているように、情報読み取り光である蛍光励起光Ｐは、例えば、図示しないレーザーダイオードから出射され、図示しないコリメータレンズにて平行光とされたり、所定のミラーで角度変更等されたりして、基板１ｄの裏面側へ進行し、最終的には、基板１の下方に配置された集光レンズ３に入射して絞り込まれ、反応領域Ａへ入射する。
【００５９】
一方、反応領域Ａから戻ってきた蛍光Ｆについても、図示しないコリメータレンズにて平行光とされたり、所定のミラーで角度変更等されたりして進行し、最終的には集光レンズ４で絞り込まれ、該集光レンズ４の後方所定位置に配置されたディテクタによって受光、検出される。
【００６０】
次に、図８〜図１３は、反応領域Ａに貯留又は保持される媒質Ｍに対して電界印加可能な対向電極が設けられている基板の層構成を説明するための図である。
【００６１】
より詳しくは、図８〜図１０は、反応領域Ａを挟んで上下に対向電極が配置された実施形態、図１１、１２は、反応領域Ａを挟んで左右に対向電極が配置された実施形態、図１３は、反応領域Ａを挟んで上下と左右に対向電極が計二対配置された実施形態の構成を示す図である。
【００６２】
まず、図８に示された基板１ｅは、反応領域Ａが形成された反応領域形成層１１の直下層に、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などからなる絶縁層１６１が設けられており、さらにこの絶縁層１６１に被覆された状態で、光通過口１３１を有する遮光層１３ａが形成されている。さらに、この遮光層１３ａの下層に、ＩＴＯなどの光透過性の導体層１７１が設けられ、さらに最下層に光透過性の合成樹脂層１４が形成されている。なお、導体層１７１の反応領域Ａを臨む表面領域は、前記絶縁層１６によって被覆されている（図８参照）。
【００６３】
また、反応領域形成層１１の上層側には、まず、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などからなる薄膜の絶縁層１６２が設けられており、該絶縁層１７２の上層には、反射層としても機能する導体層１７２、さらに最上層には、合成樹脂層１５が形成されている。なお、絶縁層１６２、導体層１７２、合成樹脂層１５には、反応領域Ａに連通する一対の孔２ａ，２ｂが形成されている。
【００６４】
本発明では、導体層１７１，１７２を、反応領域Ａを挟むように上下に配置された対向電極Ｅ１−Ｅ２として機能させる。具体的には、対向電極Ｅ１−Ｅ２を外部電源Ｇに接続し、スイッチＳのオン／オフ操作によって、反応領域Ａに貯留又は保持される媒質Ｍに対して所定の電界を印加する構成とする。なお、媒質Ｍは、孔２ａ又は２ｂに対してインクジェットノズルなどのノズルＮから滴下等され、反応領域Ａ内に導入される（図８参照）。
【００６５】
ここで、前記電界は、直流、交流あるいは高周波、低周波などの電界をアッセイの目的に応じて適宜選択して印加し、波形（矩形波、三角派、サイン波など）も自由に選択できるようにする。なお、交流電界の場合は、直流のような電気分解による気泡発生の心配がないので、物質間の相互作用を検出するアッセイには好適である。
【００６６】
高周波交流電界を核酸分子に作用させて、該核酸分子の誘電泳動を行う場合は、１ＭＶ／ｍ以上及び１ＭＨｚ以上が望ましい。例えば、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚを好適に選択できる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００６７】
なお、図８に示された実施形態の如きに、遮光層１３ａそれ自体を、絶縁体で形成しておくと、光通過口１３１をより狭小な面積とすることによって、上方側の電極Ｅ２に比して、下部電極Ｅ１の反応領域Ａに臨む電極面積をより狭小にすることができる。
【００６８】
この結果、（反応領域Ａに臨む）面積がより狭小の下部電極Ｅ１側に電界がより集中することになるので、電極Ｅ１領域に不均一電界を形成できる。なお、図８において、符号Ｚは、下部電極Ｅ１側に電界がより集中した様子を模式的に示すための電気力線を示している。
【００６９】
核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、核酸分子の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合は、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998))。
【００７０】
このように、反応領域Ａ内に不均一電界を形成することによって、誘電泳動によって、核酸分子を電気力線がより集中する領域に向かって移動させることができる。即ち、前記領域における核酸分子の濃度を高めることができる。これは、例えば、ハイブリダイゼーションの効率を高めることに利用することができる。
【００７１】
また、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、この「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定される（鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）)。
【００７２】
即ち、誘電泳動の電気力学的効果を核酸分子に与えると、核酸分子を伸長（伸張）させることができ、また、検出用核酸Ｄの電極表面に対する固定化作業などを効率よく実施することができる。なお、核酸分子を伸長（伸張）させて直鎖状にすることによって、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を解消することができる。この結果、ハイブリダイゼーションを短時間で進行させることができ、また、ミスハイブリダイゼーションを低減することができる。
【００７３】
なお、「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（ここでは、ハイブリダイゼーション）が起こり難くなる現象を意味する。
【００７４】
基板１ｅでは、基板裏面側から進行してきた蛍光励起光Ｐａは、光透過性の合成樹脂層１４と導体層１７１（下部電極Ｅ１）を透過し、続いて、遮光層１３ａの光通過口１３１を通過して反応領域Ａに通過する。蛍光Ｆはこの逆の経路を辿って、基板裏面側へ出射する。また、蛍光Ｆの一部は、反射層として機能している導体層１７２（上部電極Ｅ２）によって下方側に反射され、蛍光Ｆの量を増幅する。
【００７５】
続いて、図９に示された基板１ｆでは、反応領域形成層１１の下層に、絶縁層１６１を介装して配置された遮光層１３ｂの光透過域（図２の符号１３２に相当）が、ＩＴＯなどの導体層１７３で形成されており、そして、この導体層１７３からなる光透過域が上部電極Ｅ２に対向する面積狭小の下部電極Ｅ１として機能している点に特徴がある。なお、上部電極Ｅ２は、基板１ｅ同様に、反射層としても機能し、蛍光量増幅に寄与している。
【００７６】
基板１ｆのような構成では、電極Ｅ１部分を蛍光励起光Ｐａや反応領域Ａから戻ってくる蛍光Ｆが透過する構成であり（図９の光矢印参照）、また、電極Ｅ１部分に電気力線が集中するため（図９の符号Ｚ参照）、誘電泳動の電気力学的効果を核酸分子などに作用させることができる構成となる。
【００７７】
図９では、誘電泳動によって、標的核酸Ｔが伸長されながら、電極Ｅ１に既に固定化されている検出用核酸Ｄに向かって移動している状態が模式的に示されている。
【００７８】
次に、図１０に示された基板１ｇは、導体層１７２である上部電極Ｅ２に対向配置された下部電極Ｅ１が、導体で形成された遮光層１３ｃそれ自体から構成されている点、また、蛍光励起光Ｐａが、遮光層１３ｃの薄層化された光透過域１３３を透過して、反応領域Ａに入射し、基板１ｇの裏面側に戻ってくる蛍光Ｆを検出する構成である点などが特徴である。なお、上部電極Ｅ２は、基板１ｅ、１ｆと同様に、反射層としても機能し、蛍光量増幅に寄与している。
【００７９】
図１１に示された基板１ｈは、反応領域Ａを挟むように左右に対向配置された電極Ｅ３，Ｅ４を備えており、これら電極Ｅ３，Ｅ４の直下層に遮光層１３ａが設けられていることが特徴である。
【００８０】
また、反応領域Ａに入射する蛍光励起光Ｐａは、光透過性の合成樹脂層１４を透過したのに続いて、遮光層１３ａの光通過口１３１と対向電極Ｅ３-Ｅ４間の開口部を通過して、反応領域Ａに入射し、該反応領域Ａで発生した蛍光Ｆは、光通過口１３１を通過した後、光透過性の合成樹脂層１４を透過し、基板１ｈの裏面側において受光、検出される。なお、反射層１２は、蛍光量増幅に寄与している。
【００８１】
図１２に示された基板１ｉは、反応領域Ａを挟むように左右に対向配置された電極Ｅ３，Ｅ４が遮光層１３ａを兼ねていることが特徴である。即ち、基板１ｉの遮光層１３ａは、導体で形成されている。
【００８２】
また、蛍光励起光Ｐａは、光透過性の合成樹脂層１４を透過したのに続いて、遮光層１３ａの光通過口１３１を通過し、反応領域Ａに入射する。反応領域Ａで発生した蛍光Ｆは、光通過口１３１を通過した後、光透過性の合成樹脂層１４を透過し、基板１ｉの裏面側において受光、検出される。なお、反射層１２は、蛍光量増幅に寄与している。
【００８３】
図１２では、標的核酸Ｔにラベルされた蛍光物質（色素）ｆに蛍光励起光Ｐａが照射されている様子が、代表例として、模式的に示されている。
【００８４】
図１３に示された基板１ｊは、反応領域Ａを挟むように、上下に対向配置された電極Ｅ１，Ｅ２と、反応領域Ａを挟むように、左右に対向配置されたＥ３，Ｅ４が設けられている点、そして、下部電極Ｅ１が、遮光層１３ｂの光透過域１３２を兼ねるため、ＩＴＯなどの光透過性の導体によって形成されている点が主な特徴である。
【００８５】
また、左右に配置された対向電極Ｅ３-Ｅ４のそれぞれの電極の直下層には、遮光層１３ｂが設けられており、図１３では示さない蛍光励起光（Ｐ）が、蛍光発光性の反応領域形成層１１へ入射することを防止している。
【００８６】
図１３では、ハイブリダイゼーション後に、対向電極Ｅ３-Ｅ４のみに電界が印加され、ハイブリダイゼーションの高精度検出の障害となる余剰物質、例えば、標的核酸ｔ、検出用核酸ｄ、インターカレーターｉを、電極Ｅ１周辺領域から電極Ｅ３，Ｅ４の側へ、誘電泳動の作用によって引き寄せている様子が示されている。
【００８７】
このように、対向電極Ｅ３-Ｅ４による電界印加手段は、所定の緩衝液などを用いた溶液洗浄工程の代替となる洗浄（除去）工程を担う手段として利用することができる。
【実施例】
【００８８】
本発明の基本的な効果を検証するため、図８に示された基板１ｅを代表例として使用して、次の検証試験を行なった。
【００８９】
本試験で使用した基板（１ｅ）の具体的構成は、次の通りである。反応領域形成層（１１）は、ポリイミド樹脂により厚み５μｍに形成し、該反応領域形成層（１１）に形成したウエル状の反応領域（Ａ）の幅（図８左右方向の間隔）は、１００μｍとした。遮光層（１３ａ）として機能する金属層は、１５０ｎｍのクロム（Ｃｒ）層を採用した。この遮光層（１３ａ）に形成された光通過口（１３１）の幅は、１３０μｍである。絶縁層１６１，１６２は、ＳｉＯ２で膜厚２００ｎｍに形成し、下部電極（Ｅ１）は、ガラス基板の上に、ＩＴＯによって層厚２５０ｎｍに形成した。上部電極（Ｅ２）は、反射層を兼ねてアルミニウムで層厚１００ｎｍに形成した。なお、本試験で用いた基板では、図８に示されたような孔２ａ，２ｂは設けなかった。
【００９０】
遮光層（１３ａ）の光通過口（１３１）における蛍光発光特性の測定（ラマン光によるピーク測定）を行った。蛍光発光特性は、分光蛍光光度計を用い測定した。設定として、例えば、インターカレーターとして５００ｎｍ程度で励起した場合に、５２０〜５５０ｎｍ程度で発光する蛍光物質を用いることを想定して、励起波長を５００ｎｍに固定した場合の発光波長をスキャンすることによりその発光強度を測定した。
【００９１】
測定結果は、図１４の図面代用グラフに示すとおりとなった。この結果を遮光層（１３ａ）を設けていない比較例基板を用いた蛍光発光特性の測定結果を示す図１５と比較すると、実施例である上記構成の基板では、蛍光発光性のあるポリイミドによって形成された反応領域形成層（１１）からの蛍光発光が前記光通過口（１３１）に影響していないことがわかった。従って、上記構成の基板によって、反応領域形成層（１１）からのノイズ蛍光がないため、Ｓ／Ｎの良いハイブリダイゼーション信号検出が可能となることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、蛍光検出に基づく物質間の相互作用検出技術、特に、ＤＮＡチップなどのハイブリダイゼーション検出技術に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明に係るバイオアッセイ用基板（１）の基本的な実施形態の要部構成を表す一部断面図（Ｘ図）及び上方視一部平面図（Ｙ図）である。
【図２】同基板（１）の他の基本的な実施形態の要部構成を表す一部断面図である。
【図３】本発明に係る基板の変形形態の要部構成を表す一部断面図である。
【図４】図１中の符号Ａ１部分（反応領域Ａの一部分）の拡大図であって、相互作用の一例と蛍光物質の一例を示す図である。
【図５】他の蛍光物質（蛍光インターカレーター）の例を示す図である。
【図６】本発明に係る基板のより具体的な実施形態の例の構成を示す図である。
【図７】蛍光ピックアップ手段の一例の概念を簡略に説明するための図である。
【図８】反応領域（Ａ）を挟んで上下に対向電極が配置された実施形態の一例を示す図である。
【図９】反応領域（Ａ）を挟んで上下に対向電極が配置された実施形態の他の例を示す図である。
【図１０】反応領域（Ａ）を挟んで上下に対向電極が配置された実施形態のさらに他の例を示す図である。
【図１１】反応領域（Ａ）を挟んで左右に対向電極が配置された実施形態の一例を示す図である。
【図１２】反応領域（Ａ）を挟んで左右に対向電極が配置された実施形態の他の例を示す図である。
【図１３】反応領域（Ａ）を挟んで上下と左右に対向電極が計二対配置された実施形態の構成を示す図である。
【図１４】実施例の蛍光発光特性結果を示すグラフ（図面代用グラフ）である。
【図１５】比較例の蛍光発光特性結果を示すグラフ（図面代用グラフ）である。
【符号の説明】
【００９４】
１（１ａ〜１ｊ）  バイオアッセイ用基板
１１  反応領域形成層（反応領域が形成された層）
１２  反射層
１３ａ  光通過口を有する遮光層
１３ｂ  光透過域を有する遮光層
１３ｃ  薄層化された光透過域を有する遮光層
１３１  光通過口
１３２  光透過域
Ａ  反応領域
Ｄ  検出用核酸（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１−Ｅ２，Ｅ３−Ｅ４  対向電極
Ｆ  蛍光
Ｍ  （溶液やゲルなどの）媒質
Ｐ  蛍光励起光
Ｐａ  反応領域に入射する蛍光励起光
Ｐｂ  遮光される蛍光励起光
Ｔ  標的核酸
【図１】
2005345353.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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