(57)【要約】【課題】  本発明は、脂肪細胞内における脂質分解機構に関与する分子の動態を生化学的に解析する方法に関する。【解決手段】  脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞を用いて、タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質を該細胞に導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞。
【請求項２】
脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞を用いて、細胞内諸過程を解析する方法。
【請求項３】
タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質を該細胞に導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該タンパク質が細胞中で合成され、必要に応じて精製されたタンパク質である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該タンパク質が無細胞タンパク質合成法を用いて合成され、必要に応じて精製されたタンパク質である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該タンパク質が検出及び／又は精製のためのタグ配列が付加されたタンパク質である請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
該タンパク質が蛍光タンパク質との融合タンパク質である請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該抗体が脂質分解に正又は負の作用をする分子に結合する請求項３に記載の方法。
【請求項９】
該抗体が脂質分解時のタンパク質の修飾を認識し、結合する請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質が蛍光色素で修飾された物質である請求項３〜９に記載の方法。
【請求項１１】
物理的な破壊により形質膜を物質透過性にする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
化学的処理により形質膜を物質透過性にする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
細菌毒素を用いて形質膜を物質透過性にする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質又は抗体を、所望の条件下であらかじめ調製された細胞質と混合し、該細胞に導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態解析方法に関する。さらに詳しくは、脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性された細胞を用いて、脂質分解過程に関与する分子の動態を詳細に解析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、現在、医療の重要課題のひとつとなっている。肥満は、高血圧、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患などに代表される生活習慣病の危険因子であり、脂肪組織が過剰に蓄積した状態である。例えば、最近、糖尿病又は糖尿病予備軍は日本人成人の６人に１人にのぼるといわれ、特に２型糖尿病が増加している。１型糖尿病はインスリンの絶対量が不足するのに対し、２型糖尿病はインスリンの作用が低下するといわれる。脂肪細胞は、エネルギーを脂肪として蓄積する他に、内分泌器官として機能し、正常な細胞からはインスリン感受性ホルモンであるアディポネクチンなどを、脂肪を過剰に蓄積し、肥大化した細胞はインスリン抵抗性惹起分子であるＴＮＦ−α、レジスチンなどを分泌する。このように、脂肪細胞は生活習慣病と密接な関連があり、脂肪細胞の脂質分解機構あるいはそれに寄与するタンパク質の動態を分子レベルで解析することは肥満、ひいては生活習慣病を改善する上で非常に有効であるといえる。
【０００３】
これまで、脂肪細胞における脂質分解を解析する手法としては、正常マウスと糖尿病などの病態モデルマウスに食物摂取、薬物投与などを施し、脂肪組織量、あるいは糖などの血中濃度を測定したり、脂肪組織の酵素活性を測定するなどの手法がとられてきた。このような解析では、複合的な要因がデータに反映されるため、脂質分解過程そのものを詳細に解析することが難しい。
【０００４】
最近では、脂肪細胞や脂肪細胞における脂質分解制御に関わる因子が発現していない細胞へ遺伝子を導入して解析されている（例えば、非特許文献１）。しかし、この手法では脂質分解刺激に対して貯蔵トリグリセロール量の変化をみたり、放出される脂肪酸量を測定するなど、脂質分解の結果を評価することが主眼となり、脂質分解刺激に対する分子機構自体の解析は困難である。
【非特許文献１】Ｓａｕｚａ，  Ｓ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ８２６７−８２７２
【０００５】
Ｂｒａｓａｅｍｌｅ，Ｄ．Ｌ．らは、脂質分解過程の解析に、脂質分解刺激した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をＤｉｇｉｔｏｎｉｎで処理して物質透過性にした細胞を用いているが、彼らはＨＳＬ（ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ）が細胞質に遊離しているが（例えば、非特許文献２）、細胞内構造体（脂肪滴）に結合しているのかを検証しているにすぎない。そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされていた。
【非特許文献２】Ｂｒａｓａｅｍｌｅ，Ｄ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４８３，２５１−２６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、脂肪細胞内における脂質分解機構に関与する分子の動態を生化学的に解析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性された細胞を用いて、脂質分解過程に関与する分子の動態を詳細に解析することが可能であることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞。
項２．脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞を用いて、細胞内諸過程を解析する方法。
項３．タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質を該細胞に導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する項２に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、該タンパク質が脂質分解に直接または間接的に作用をする方法。
項４．該タンパク質が細胞中で合成され、必要に応じて精製されたタンパク質である項３に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、該細胞が、動物細胞、昆虫、大腸菌である方法。
項５．該タンパク質が無細胞タンパク質合成法を用いて合成され、必要に応じて精製されたタンパク質である項３に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子、哺乳類網状赤血球、大腸菌、酵母の群より選択される方法。
さらに好ましくは、上記方法において、無細胞タンパク質合成用抽出液が、植物種子の抽出液である方法。
さらになお好ましくは、上記方法において、無細胞タンパク質合成用抽出液が、コムギ胚芽抽出液である方法。
項６．該タンパク質が検出及び／又は精製のためのタグ配列が付加されたタンパク質である項４または５に記載の方法。
項７．該タンパク質が蛍光タンパク質との融合タンパク質である項４〜６のいずれかに記載の方法。
項８．該抗体が脂質分解に正又は負の作用をする分子に結合する項３に記載の方法。
項９．該抗体が脂質分解時のタンパク質の修飾を認識し、結合する項３に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、該抗体が脂質分解時のタンパク質のリン酸化を認識し、結合する方法。
項１０．タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質が蛍光色素で修飾された物質である項３〜９のいずれかに記載の方法。
項１１．物理的な破壊により形質膜を物質透過性にする項１または２に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、物理的な破壊がニトロセルロース膜を用いる方法。
項１２．化学的処理により形質膜を物質透過性にする項１または２に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、界面活性剤を用いて形質膜を物質透過性にする方法。
さらに好ましくは、上記方法において、界面活性剤が非イオン性である方法。
項１３．細菌毒素を用いて形質膜を物質透過性にする項１または２に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、細菌毒素がコレステロール結合性細胞溶解毒素である方法。
さらに好ましくは、上記方法において、細菌毒素がストレプトリシンＯ、ニューモリシン、セレオリシンＯ、アルベオリシン、パーフリンゴリシンＯ、テタノリシンの群より選択される方法。
項１４．タンパク質又は抗体を、所望の条件下であらかじめ調製された細胞質と混合し、該細胞に導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する項３に記載の方法。
好ましくは、上記方法において、該細胞質が一つ又は二つ以上の種類または状態の組織、細胞より抽出された細胞質である方法。
あるいは、好ましくは、上記方法において、該細胞質が一つ又は二つ以上の分化、成長、発生段階の組織、細胞より抽出された細胞質である方法。
あるいは、好ましくは、上記方法において、該細胞質が一つ又は二つ以上の正常及び疾患状態の組織、細胞より抽出された細胞質である方法。
あるいは、好ましくは、上記方法において、該細胞質が一つ又は二つ以上の薬剤により処理された生物組織、細胞より抽出された細胞質である方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法により、タンパク質や抗体をパーミアビライズド脂肪細胞内へ導入し、生細胞内における分子の動態を可視化或いは再構成することが可能になった。本系においては、パーミアビライズド脂肪細胞へ添加する細胞質の種類を変えたり、該細胞質への添加剤・タンパク質の添加、或いはタンパク質の除去することによって、脂質分解過程、或いはそれに寄与するタンパク質の動態を生化学的に詳細に解析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「細胞を処理して細胞形質膜を物質透過性にし」た細胞とは、パーミアビライズドセル（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）あるいはセミインタクト細胞とも呼ばれる細胞で、小型（アミノ酸、ヌクレオチド、イオン等）、或いは大型（タンパク質等）の種々の分子が細胞形質膜を拡散により通過して自由に出入り出来る一方、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置、つまり細胞内のトポロジーが保持された細胞である。当該細胞を用いることにより、タンパク質の機能や動態を、タンパク質が本来機能する場所や空間において調べられる一方、「細胞を一個の試験管」に見立て、細胞質成分に種々のタンパク質や抗体など高分子成分を加えたり、抗体や反応阻害剤、あるいは反応を促進するように薬剤を添加したりして、生化学的な解析を効率よく行うことが可能となる。
【００１１】
上記透過性の高い膜は、種々の動物細胞の細胞形質膜を物理的に破壊したり、化学的な処理、すなわち細胞形質膜に大きな穴をあける細菌毒素や界面活性剤様物質などで細胞形質膜を処理したりして作る。前者の物理的な方法の代表例としては、ニトロセルロース膜を利用するものである（Ｓｉｍｏｎｓ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，２２４１−２２４７）。当該方法ではニトロセルロース膜を細胞表面にはりつけてはがすことにより、膜が部分的に一緒にはがれとれることを利用したもので、特別な試薬を必要とせず、簡便である。より具体的には、ニトロセルロース膜を反応バッファー（例えば、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ‐ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１１５ｍＭ酢酸カリウム。２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジスレイトール）で湿らせ、余分なバッファーを除いた後、培地を除去した細胞表面上に静かに置く。短時間（細胞、バッファーの条件によるが、通常は数十秒から数分間）静置した後、上記ニトロセルロース膜をはがす。上記ニトロセルロース膜をはりつけたり、はがしたりする操作中にずれないように慎重に作業する必要があるため、多検体処理は難しい。
【００１２】
上記細胞形質膜を物質透過性にする方法として、化学的な処理による方法もある。当該処理は適当な濃度の薬剤を添加して細胞とインキュベートする様式のものであるため、多検体処理化も可能である。
【００１３】
上記細胞形質膜を物質透過性にする化学的処理としては界面活性剤を用いる方法がある。上記界面活性剤は、（イオン性界面活性剤と比較して）タンパク質などに対する作用がより温和であることから非イオン性界面活性剤が好ましい。当該界面活性剤としては、例えば、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ［ＢＩＧＣＨＡＰ］、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ［Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ］、Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ［ＭＥＧＡ−８］等が挙げられる。より好ましくは、ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ，ｓａｐｏｎｉｎが用いられる。上記物質における処理の濃度、温度、時間などの条件は細胞の種類により異なり、所望の解析を行うのに適当な条件を設定しなければならないが、一般的な処理濃度としては、１０〜１０００μｇ／ｍｌ、より一般的には２０〜２００μｇ／ｍｌであり、温度としては２〜３７℃、時間としては１〜３０分間である。当該物質は入手も比較的容易であり、多検体処理化も可能である。しかしながら、形質膜以外の細胞内膜系、すなわち小胞体膜、ゴルジ体膜などのオルガネラ膜も破壊される傾向にあり、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置（細胞内トポロジー）を必要とする解析に利用することは難しく、当該物質処理に対して比較的耐性のある核へのタンパク質の移行などの解析等に限られる。
【００１４】
上記細胞形質膜を物質透過性にする化学的処理として、より好ましくは細菌毒素を用いる方法である。細菌毒素が細胞形質膜を傷害する様式には、（１）膜に“イオンのみが通過する小さな孔、径１〜２ｎｍ”を形成する、（２）“タンパク質分子が通過する程度の大きな孔、直径１０〜３０ｎｍ”を形成する、（３）膜の構成脂質やタンパク質を酵素的に分解する、（４）細胞形質膜の情報伝達物質を標的とし細胞内情報伝達を撹乱する、という大きく分けて４つの機構がある（清水徹、林英生：蛋白質核酸酵素４６、５３２−５３９（２００１））。このうち、当該方法に用いられる細菌毒素は主として（２）の性質を有する毒素、すなわちチオール活性化溶血毒（ｔｈｉｏｌ  ｏｒ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｏｘｉｎｓ）、酸素感受性溶血毒（ｏｘｙｇｅｎ  ｌａｂｉｌｅ，ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）などと総称される一群であれば特に限定されない。上記毒素の生物学的ないし生化学的な性状は、精製が困難であったことから培養液や粗精製品を用いて調べられたものであるが、遺伝子工学の進歩による大量産生系からの精製標品ではこのような性状は認められず、毒素以外の混入物に起因するものであることがあきらかになった。現在、上記毒素の一群のコレステロールに結合するという共通の特徴的な性状から、コレステロール結合性細胞溶解毒素と総称することが提唱されている（Ａｌｏｕｆ，Ｊ．Ｅ．（１９９９）ｉｎ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ，４４３−４５６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００１５】
上記細胞形質膜を物質透過性にするのに用いられ得るグラム陽性細菌が産生するコレステロール結合性細胞溶解毒素を表１に例示する。
【００１６】
【表１】
2005137227.tif 000002
【００１７】
上記細胞形質膜を物質透過性にするために用いられる細菌毒素のうち、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のストレプトリシンＯを用いることがより好ましい。ストレプトリシンＯは、例えばＰｉｍｐｌｉｎｋａｒ  Ｓ．Ｗ．らが極性細胞内の機能を生化学的に解析するため、極性小胞輸送アッセイ系を構築する際に細胞形質膜を物質透過性にするために用いている（Ｐｉｍｐｌｉｎｋａｒ  Ｓ．Ｗ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２５，１０２５−１０３５）。ストレプトリシンＯの処理条件としては、細胞形質膜のコレステロール含有量などの相違により細胞種毎に至適条件が異なる。一般的には、処理濃度としては０．１〜１０ｕｎｉｔ／ｍｌ、処理温度としては４〜３７℃、処理時間としては３〜３０分である。より好ましくは、４〜１０℃で１〜１５分インキュベートして細胞毒素を細胞膜に結合させ、遊離の細胞毒素を洗浄した後、３０〜３７℃で定着・会合させる方法である。当該処理による形質膜の処理は、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎなどの界面活性剤による処理に比べ、形質膜以外の細胞内膜系、すなわち小胞体膜、ゴルジ体膜などのオルガネラ膜は無傷の状態で保持されるため、細胞膜、細胞骨格、細胞内オルガネラ間の相対的位置（細胞内トポロジー）を必要とする解析に適した系である。
【００１８】
当該処理に用いられる細胞としては、株化された前駆脂肪細胞や初代前駆脂肪細胞を分化誘導した脂肪細胞、脂肪組織より単離した脂肪細胞、脂肪細胞ではないが脂質分解機構に関与するタンパク質遺伝子を導入し、脂質分解機構が再構成された細胞が挙げられる。株化された前駆脂肪細胞の例として、３Ｔ３−Ｌ１細胞、３Ｔ３−Ｆ４４２細胞など、或いは分化誘導の手法によっては脂肪細胞に分化誘導可能な細胞、ＥＳ細胞も含む。脂肪細胞ではないが脂質分解機構に関与するタンパク質遺伝子を導入し、脂質分解機構が再構成された細胞の例としては、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ及びＨＳＬ  （ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ）遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞（Ｓａｕｚａ，  Ｓ．Ｃ．，  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ８２６７−８２７２）などが挙げられる。
【００１９】
本発明は、上記細胞形質膜を物質透過性にした細胞に、タンパク質、抗体、脂質、または脂質親和性化合物の群より選択される少なくとも１つ以上の物質を導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する。
【００２０】
上記解析に導入されるタンパク質とは、脂質分解反応を触媒する酵素、脂質分解を活性化あるいは抑制のような制御機能を有するタンパク質などの直接脂質分解に寄与するタンパク質や、さらにこれらの機能を制御し、間接的に脂質分解に寄与するタンパク質を含み、機能の既知、未知を問わない。機能の既知のタンパク質であれば、脂質分解が活性化あるいは抑制されたことをチェースするためのマーカータンパク質としての利用が可能である。また、機能が十分解明されていないタンパク質であれば本解析系により、脂質分解にどのように寄与するのか、その機能の検証が可能である。機能既知の脂質分解過程に関与するタンパク質としては、ＨＳＬ、ＨＳＬの活性を促進するＦＡＢＰ（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、脂質滴に結合して脂質分解の抑制あるいは制御に寄与するといわれるＰｅｒｉｌｉｐｉｎなどが挙げられる。
【００２１】
上記タンパク質は、脂肪細胞、脂肪組織からの抽出液、精製品（あるいは粗精製品）が用いられる他、ｃＤＮＡを種々の細胞、すなわち、動物細胞、昆虫、大腸菌などで大量発現して調製された組換えタンパク質であってもよい。
【００２２】
さらに上記タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて合成されてもよい。無細胞タンパク質合成系とは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、所望のタンパク質をコードする核酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ等）及び当該タンパク質の構成材料となるアミノ酸を含有する反応液を用いて、無細胞条件下でタンパク質合成を行う方法である。当該方法によれば、従来技術では細胞毒性等により製造することが困難であるか、または製造することができなかったタンパク質を容易に製造することが可能になる。さらに、タンパク質において、細胞から抽出する際に必要な細胞破砕のための操作が不要となり、ハイスループット化が容易となる。
【００２３】
上記無細胞タンパク質合成系に使用される無細胞タンパク質合成用細胞抽出液とは、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞等の種々の細胞や組織から抽出される生体のタンパク質合成に関与する成分であって、無細胞タンパク質合成に適用可能な状態、すなわち無細胞条件下でタンパク質合成能力を有する状態で存在する成分を含有する溶液を意味する。当該細胞抽出液は、通常、上記のような細胞を破砕した後、タンパク質成分及びリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈澱させ、ゲル濾過等により細胞由来の低分子成分を除去するという方法によって得られるものである。
【００２４】
上記無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の由来としては特に限定されないが、入手が容易であること、簡便な調製方法が確立されていること、タンパク質の合成能力が高いこと、等の点より、好ましくは植物種子、大腸菌、哺乳動物網状赤血球、酵母由来のものが挙げられる。当該植物種子における植物としては、好ましくはコムギ、オオムギ、イネ、コーン、ホウレンソウ等が挙げられ、特に好ましくはコムギが挙げられる。当該大腸菌としては、好ましくはプラスミドを持たない方が好ましく、一般にＫ−１株由来の大腸菌が用いられることが多い。また、当該哺乳動物網状赤血球における哺乳動物としては、好ましくはウサギ、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。なかでも植物種子、特に好ましくはコムギ種子由来のものが挙げられ、なかでも胚乳を含まない胚芽、特にコムギ胚芽由来のものが好ましい。
【００２５】
当該胚乳を含まない胚芽由来の細胞抽出液（胚芽抽出液）、特にコムギ胚芽抽出液は、胚乳に局在するリボソーム特異的グリコシダーゼ（トリチン）等のタンパク質合成阻害剤成分をほとんど含有しておらず、これを無細胞タンパク質合成系に適用した場合、高効率でタンパク質を合成することが可能である。当該胚芽抽出液、好ましくはＫ．Ｍａｄｉｎらの方法（Ｋ．Ｍａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４）に従って胚芽を水溶液中で超音波洗浄して胚乳成分を洗浄することにより胚芽を純化し、次いで純化した胚芽を常法（例えば、Ａ．Ｈ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に従って処理することにより得られる。
【００２６】
上記タンパク質には、検出及び／又は精製のための一般にタグと呼ばれるアミノ酸配列や何らかの融合タンパク質が付加されていることは好ましい。本発明におけるタグには、後者融合タンパク質をも含む。本発明で合成されたタンパク質はそのまま、細胞形質膜を処理された細胞に導入することもできるが、無細胞タンパク質合成用細胞抽出液中の何らかの因子が上記タンパク質の細胞内動態に対して影響を与える可能性を排除すべく、精製されていることが好ましい。精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイト、または等電点クロマトグラフィーが挙げられる。中でもタグ配列によるアフィニティー精製がより効率的である。さらに、該タンパク質の細胞内存在部位を調べるには該タンパク質に対する抗体を利用した細胞染色を行うこともできるが、もともと細胞や細胞質に存在するタンパク質と区別することができない。そのため、細胞や細胞質のタンパク質と該導入タンパク質を区別、比較するのに、当該タグ配列は、当該タグ配列に対する抗体や特異的結合物質を利用した細胞染色にも使用できる。本発明において使用可能なタグは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳＴＲＥＰタグ、Ｓタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｉｏｎ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＢＰ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＲＥＸ（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）などが挙げられる。
【００２７】
上記タンパク質は、所望のタンパク質と蛍光タンパク質の融合タンパク質であることが好ましい。蛍光タンパク質が融合されることによって、所望のタンパク質の動態を観察する際に、細胞の固定や抗体染色などの煩雑な操作が不要となる。前記蛍光タンパク質としては、ＧＦＰ  （Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び種々のアミノ酸置換を導入した改変型などが挙げられる。
【００２８】
上記解析系に導入される抗体とは、脂質分解反応を触媒する酵素、脂質分解を活性化あるいは抑制のような制御機能を有するタンパク質などの直接脂質分解に寄与するタンパク質や、さらにこれらの機能を制御し、間接的に脂質分解に寄与するタンパク質に認識し、結合する抗体である。タンパク質の機能部位を認識する抗体であれば、当該タンパク質機能の脂質分解過程に対する寄与機構を検証することが可能である。また、タンパク質機能に影響を与えない部位を認識し、結合する抗体であれば、タンパク質を標識するマーカー分子として利用される。
【００２９】
上記抗体としては、さらに脂質分解時のタンパク質の修飾を認識する抗体を用いてもよい。例えば、脂肪細胞における脂質分解は細胞内でｃＡＭＰが産生され、ＰＫＡ（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）が活性化され、脂肪滴結合タンパク質であるＰｅｒｉｌｉｐｉｎがリン酸化され、またＨＳＬもＰＫＡによりリン酸化され、活性化されて、脂肪滴付近に集合する。このことから、脂質分解過程の活性化をＰＫＡによりリン酸化される部位を認識する抗体をマーカーとして、検出することが可能となる。上記抗体として、市販のＰｈｏｓｐｈｏ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）  ＰＫＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、Ａｎｔｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｈｏｐｈｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  （ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、などが挙げられる。
【００３０】
上記タンパク質、抗体、或いは脂質、脂質親和性化合物より選択される少なくとも１つ以上の物質が蛍光標識されていてもよい。蛍光標識された分子を用いることによって諸過程を蛍光顕微鏡下で追跡できる。蛍光標識脂質親和性化合物の例としては、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）が挙げられる。
【００３１】
本発明においてはまた、上記タンパク質又は抗体を所望の条件下であらかじめ調製された細胞質と混合し、前記細胞形質膜を少なくとも部分的に物質透過性にされた細胞を導入し、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する。
【００３２】
上記細胞質として、一つまたは二つ以上の種類または状態の組織や細胞から抽出された細胞質を用いることによって、異なる細胞質環境下での所望のタンパク質の動態、機能を比較することが可能である。一つまたは二つ以上の種類または状態の組織や細胞としては、分化、成長、発生段階の相違、正常あるいは疾患状態、あるいは薬剤処理などが挙げられる。
【００３３】
動態の解析の例としては、例えば細胞内局在や相互作用を調べることができる。実施例に示すように目的のタンパク質を蛍光標識して、細胞内での局在部位を顕微鏡で観察する。この際、細胞質の種類を変えることで（例えば病気と正常）、存在部位に変化がないか調べる。あるいは細胞質に薬剤を添加したり、抗体処理によりタンパク質因子を除去したりして、あるいは影響を与える可能性のあるタンパク質因子を添加したりして、局在が変化しないかを調べることができる。
【００３４】
動態の解析の例としては、例えば細胞内局在を調べることができる。実施例に示すように目的のタンパク質を蛍光標識して、細胞内での局在部位を顕微鏡で観察する。この際、細胞質の種類を変えることで（例えば病気と正常）、存在部位に変化がないか調べる。あるいは細胞質に薬剤を添加したり、抗体処理によりタンパク質因子を除去したりして、あるいは影響を与える可能性のあるタンパク質因子を添加したりして、局在が変化しないかを調べることができる。
【００３５】
解析した結果は、薬剤のスクリーニングなどに利用されうる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００３７】
実施例１  ３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞の脂肪細胞分化誘導
３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を、１０％  ＣＳ（ＧＩＢＣＯ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬）を用いて２日に１回培地を交換しながら１００％飽和になるまで培養した。飽和後、１０μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．５  ｍＭ  ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、１０％  ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）を添加したＤＭＥＭに交換し  、２日間培養した。その後、５μｇ／ｍｌ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０％  ＦＣＳを加え、３日間培養した。さらに、１０％  ＦＣＳを添加したＤＭＥＭに交換し、半日培養し、脂肪細胞として次の工程に用いた。
【００３８】
実施例２  脂肪細胞からの細胞質の抽出
１５  ｃｍディッシュ３０枚に３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を培養し、前期条件で分化誘導した。培養された脂肪細胞をＰＢＳ（−）で軽く洗浄した後、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．０２％  ＥＤＴＡで処理して細胞をはがし、８００×ｇ、２分間（４℃）で遠心し、回収した。上清を除去後、ＰＢＳ（−）に懸濁し、８００×ｇ、２分間（４℃）で遠心した。この洗浄操作を再度行ない、上清を除去後、細胞容量の１．５倍量のＴＢバッファー（２５  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、１１５  ｍＭ酢酸カリウム、２．５  ｍＭ  塩化マグネシウム、１  ｍＭジスレイトール）、２５μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を加え、テフロン（Ｒ）ホモジナイザーでよくホモジナイズした。ホモジナイズ液を８９，０００×ｇ、１６分間インキュベートした。上清を回収し、２３，０００×ｇ、９０分間遠心した。上清を回収し、細胞質として、分注後、液体窒素中で保存した。細胞質はＢｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡスタンダード）によりタンパク質濃度を見積もった（１４．９  ｍｇ／ｍｌ）。
【００３９】
実施例３  脂肪細胞のパーミアビリゼーション
細胞を３５  ｍｍ  ガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ）で前期条件で培養した細胞を、血清を含まないＤＭＥＭでそのまま数回洗浄し、０．５  ｕｎｉｔ／ｍｌ    Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ（ＳＬＯ）を加え，４℃で５分間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（＋）で数回洗浄し、ＴＢバッファーを加え、３２℃で１０分間インキュベートした。
【００４０】
実施例４  抗ＰＫＡリン酸化基質抗体の蛍光標識
Ｐｈｏｓｐｈｏ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）  ＰＫＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１００μｌを、透析カップＭＷＣＯ  １２，０００（第一化学）を用いてＰＢＳ（−）で２時間透析した。抗体の標識はＣｙ３  Ａｂ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）を用いたが、抗体量が少なかったため、以下のようにプロトコールを変更した。透析された抗体を回収し、抗体液の１／２０量のＣｏｕｐｒｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え，よく混合した。Ｄｒｉｅｄ  ｂｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｙｅをＤＭＳＯ  ２５μｌに溶解し、０．５μｌを抗体液に加え、よく混合し、室温で３０分間インキュベートした。４００μｌ  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．０を加え、よく混合した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス）１００μｌを５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．０で平衡化した。平衡化した担体に抗体液を加え，４℃で３０分間インキュベートし、担体に抗体を結合した。抗体が結合した担体を５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．０  ２００μｌで２回洗浄し、０．１  Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎ；ＨＣｌ  ｐＨ  ３．０を加えて４℃でインキュベートして担体から溶出し、溶出液を回収した。溶出液を０．１  Ｍ酢酸アンモニウムで２時間透析し、凍結乾燥した。ＰＢＳ（−）  ５０μｌに溶解し，凍結保存した。
【００４１】
実施例５  パーミアライズド脂肪細胞へのＣｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体の導入（１）
ＴＢバッファーに、１  ｍＭ  ＡＴＰ、１  ｍＭ  ＧＴＰ、２．５  ｍＭ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０  ｕｎｉｔ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、１０μＭ  Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（アドレナリン受容体アゴニスト）、及び前記Ｃｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体（３μｌ）を混合して１００μｌとし、前記処理条件によりパーミアビライズされた脂肪細胞に添加した。３２℃で３０分間インキュベートし、ＴＢバッファーで軽く洗浄した後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。図２はＩｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ刺激されたパーミアライズド脂肪細胞における、脂肪滴周囲のリン酸化タンパク質へのＣｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体の結合を示唆する写真である。
【００４２】
実施例６  パーミアライズド脂肪細胞へのＣｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体の導入（２）
ＴＢバッファーに、１  ｍＭ  ＡＴＰ、１  ｍＭ  ＧＴＰ、２．５  ｍＭ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０  ｕｎｉｔ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、１  ｍＭ  ｃＡＭＰ、５  ｍｇ／ｍｌ  細胞質、及び前記Ｃｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体（３μｌ）を混合して１００μｌとし、前記処理条件によりパーミアビライズされた脂肪細胞に添加した。３２℃で３０分間インキュベートし、ＴＢバッファーで軽く洗浄した後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。図３はｃＡＭＰ存在下のパーミアライズド脂肪細胞における、脂肪滴周囲のリン酸化タンパク質へのＣｙ３標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体の結合を示唆する写真である。
【００４３】
実施例７  Ｎ末端Ｈｉｓタグ・ＥＧＦＰ融合タンパク質合成用ベクターｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰの構築（図４）
ｐＥＵ３−ＮＩＩにＮ末端Ｈｉｓタグ、ＥＧＦＰ遺伝子、及びＧａｔｅｗａｙ配列を挿入したｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰを構築した。具体的にはｐＥＵ３−ＮＩＩを制限酵素Ｓｐｅ  Ｉ、ＮｃｏＩ（東洋紡績）で消化後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）で平滑末端化処理した。さらにＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（東洋紡績）で脱リン酸化処理した。該ベクターをＧａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｅｒｓｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍｒｆＢ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いてライゲーションし、ｐＥＵ−ＤＳを取得した。該ｐＥＵ−ＤＳベクターは制限酵素ＥｃｏＲ  Ｖ（東洋紡績）で消化後、  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで脱リン酸化処理した。
次に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を鋳型として、オリゴヌクレオチド１、２（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ）（配列番号１、２）、ＰＣＲ試薬ＫＯＤ  ＰＬＵＳ（東洋紡績）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＥＧＦＰ遺伝子を増幅した。この際、オリゴヌクレオチド１によりＥＧＦＰ遺伝子配列の５’末端側に翻訳開始メチオニン及びＨｉｓタグ配列を付加した。さらに、オリゴヌクレオチドはあらかじめＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績）で処理して５’末端がリン酸化されたものを使用した。
前期処理ベクターと該ＥＧＦＰ遺伝子断片をライゲーションし、ｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰを取得した。
【００４４】
実施例８  Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ発現プラスミドの構築（図５）
６０  ｍｍディッシュにおいて前記条件で培養した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から、ＴＲＩＺＯＬ  ＲＥＡＧＥＮＴ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  を用いて添付のプロトコールに従って、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲキットＲｅｖｅｒＴｒａ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績）を用いてｃＤＮＡ合成（ＲＴ反応）、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、オリゴヌクレオチド３、４  （ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ）  （配列番号３、４）を用いてＰｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ遺伝子を増幅し、Ｘｈｏ  Ｉで消化した。ｐＥＮＴＲ−１ＲをＸｍｎ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉで消化し、前記Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ遺伝子断片を挿入した（ｐＥＮＴＲ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ）。続いて、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＥＮＴＲ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  ＡとｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰの組換え反応を行ない、Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ発現ベクターｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａを取得した。
【００４５】
実施例９  無細胞タンパク質合成系発現用鋳型ＲＮＡの調製
５μｇ  ｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａを鋳型として、１５０  ｕｎｉｔ  ＴＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績）及び反応バッファー、２．５  ｍＭ  ＮＴＰｓ  （終濃度）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４０  ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡績）を混合して５０μｌとし、３７℃で４時間の転写反応を行なった。反応後、合成したｍＲＮＡを、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ（東洋紡績）  Ｂｕｆｆｅｒ  ｍｉｘで平衡化したＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたゲル濾過法により精製し、吸光度測定（ＯＤ２６０）を行ない、濃度を算出した。
【００４６】
実施例１０  Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの無細胞タンパク質合成
Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａタンパク質の合成は、無細胞タンパク質合成試薬Ｐｒｏｔｅｉｏｓ（東洋紡績）を用いて、Ｋ．  Ｍａｄｉｎらの方法（Ｋ．  Ｍａｄｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７，  ５５９−５６４）を参考に  透析法で行なった。具体的には、５０μｇ  Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ  ＲＮＡ、４μｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃２、３４μｇ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ、４０  ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、２０μｌ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ（コムギ胚芽抽出液）を混合して１００μｌのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを調製し、ＢＳＡ，  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  （ＵＳＢ）で一晩ブロッキングされた透析カップＭＷＣＯ  １２，０００に入れて、Ｐｒｏｔｅｉｏｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｉｘ  ２  ｍｌで透析しながら、２３℃、２４時間反応させた。翌日、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘに２０μｇ  Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ  ＲＮＡを追添し、透析液を新しいものに交換し、さらに２３℃、２４時間反応した。翌日、反応液（約１００μｌ）を回収し、１０，０００×ｇ、５分間遠心し、可溶性画分、不溶性画分に分画した。図６はＨｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａが無細胞タンパク質合成系で発現され、不溶性であることを示す電気泳動像である。
【００４７】
実施例１１  パーミアビライズド脂肪細胞への５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの導入
不溶化した５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａを８  Ｍ尿素２５μｌに懸濁し、可溶化した。５  ｍｇ／ｍｌ  脂肪細胞細胞質、１  ｍＭ  ＡＴＰ又はＡＭＰ−ＰＮＰ、１  ｍＭ  ＧＴＰ又はＧＴＰγＳ、２．５  ｍＭ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｏｈａｔｅ、１０  ｕｎｉｔ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、及び前記可溶化Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  １．２５μｌ  （約０．５μｇ）、１×ＴＢを混合して１００μｌとし、前記処理条件により調製されたパーミアビライズド脂肪細胞に加えた。３２℃、４０分間インキュベートし、ＴＢバッファーで軽く洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図７はＨｉｓ／ＥＧＦＰ−ＰｅｒｉｌｉｐｉｎがＡＴＰ或いはＧＴＰの加水分解に非依存的に脂肪滴へ局在することを示す観察像である。
【００４８】
実施例１２  パーミアビライズド脂肪細胞への５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの導入（２）
５  ｍｇ／ｍｌ  脂肪細胞細胞質、１  ｍＭ  ＡＴＰ、１  ｍＭ  ＧＴＰ、２．５  ｍＭ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｏｈａｔｅ、１０  ｕｎｉｔ  Ｃｒｅａｔｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、１  ｍＭ  ｃＡＭＰ及び前記可溶化Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  １．２５μｌ  （約０．５μｇ）、１×ＴＢを混合して１００μｌとし、前記処理条件により調製されたパーミアビライズド脂肪細胞に加えた。３２℃、４０分間インキュベートし、ＴＢバッファーで軽く洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。図８はＨｉｓ／ＥＧＦＰ−ＰｅｒｉｌｉｐｉｎがｃＡＭＰ添加により脂肪滴への局在が阻害されたことを示す観察像である。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の脂肪細胞又は脂質分解過程に関与する分子が発現する細胞を処理して、少なくとも部分的に細胞形質膜を物質透過性にされた細胞を用いて、脂質分解過程またはそれに関与する分子の動態を解析する方法は、脂質分解過程へ寄与する分子のスクリーニング系として、さらには脂質分解過程を調整する薬剤のスクリーニング系として利用することができ、創薬などの産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明におけるパーミアビライズド脂肪細胞へのタンパク質、抗体、脂質、脂質親和性化合物の導入解析フローを示す図面である。
【図２】Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ刺激パーミアビライズド脂肪細胞へ導入された蛍光標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体が脂肪滴周囲のリン酸化タンパク質へ結合したことを示唆する共焦点レーザー顕微鏡による観察像である。
【図３】ｃＡＭＰ存在下でパーミアビライズド脂肪細胞へ導入された蛍光標識抗ＰＫＡリン酸化基質抗体が脂肪滴周囲のリン酸化タンパク質へ結合したことを示唆する共焦点レーザー顕微鏡による観察像である。
【図４】Ｇａｔｅｗａｙシステム化された、Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びＥＧＦＰ融合タンパク質用無細胞タンパク質合成系発現ベクターｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰの構築フローを示す図面である。
【図５】Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａ発現プラスミドｐＥＵ−５’Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−ＰｅｒｉｌｉｐｉｎＡの構築フローを示す図面である。
【図６】Ｈｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの無細胞タンパク質合成系における発現及び不溶化を示す図面に代わる写真である。
【図７】パーミアビライズド脂肪細胞に導入されたＨｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの脂肪滴移行とエネルギー非依存性を示す共焦点レーザー顕微鏡による観察像である。
【図８】パーミアビライズド脂肪細胞に導入されたＨｉｓ／ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａの脂肪滴移行がｃＡＭＰにより阻害されたことを示す共焦点レーザー顕微鏡による観察像である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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