(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、イソフラボンを含有する胚軸ホエーから、イソフラボンの分離回収方法において、一般的な非極性樹脂と一般的な陰イオン交換樹脂の組み合わせを用いた分離回収方法を提供することである。【解決手段】  胚軸ホエーを加熱処理後、特定の固形分濃度領域及び特定のpH領域において、その中に含まれるイソフラボン、ソヤサポニンA群及びソヤサポニンB群が沈澱、不溶解化し、なおかつ、その時の溶液の流動性が良くなることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆胚軸ホエーから、イソフラボンを分離回収する方法において、胚軸ホエーの固形分濃度を20〜45％(w/v)にして固液分離することを特徴とするイソフラボン分離回収方法。
【請求項２】
胚軸ホエーを6〜20時間、90〜100℃で加熱することを特徴とする請求項１記載のイソフラボン分離回収方法。
【請求項３】
鉱酸を加えてpHを0〜2.5にすることを特徴とする請求項１又は２記載のイソフラボン分離回収方法。
【請求項４】
大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の沈澱に濃度20〜50％（v/v）のエタノールを加えて固形分濃度を1〜20％（w/v）とし加熱後放冷し、生じた沈澱を除去することにより、母液側にイソフラボンを選択的に分離することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載イソフラボン分離回収方法。
【請求項５】
大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、非極性樹脂に負荷した後水洗して、非吸着画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール濃度10〜100％(w/v)）で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、引き続きこのエタノール水画分は1〜35％(w/v)エタノール水に調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷した後1〜35％(w/v)エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％(w/v)エタノール水で脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はソヤサポニンA群、ソヤサポニンB群、イソフラボン及びオリゴ糖類を含有する胚軸ホエーよりイソフラボンを分離回収する方法に関連し、より詳しくは、本発明は胚軸ホエーを加熱、酸沈澱、含水アルコール処理、非極性樹脂処理及びイオン交換樹脂処理により、胚軸ホエーよりイソフラボンを分離回収する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚軸ホエーは脱脂、脱タンパクされた大豆胚軸の水、エタノールあるいは含水エタノール抽出物であるが、そこに含有されるイソフラボンを抽出、濃縮するということは、以前から行われている。
【０００３】
胚軸ホエーに含まれるイソフラボンは、弱い女性ホルモン様作用を持ち、閉経後のホルモンバランスの変化が関与しているとされる骨粗鬆症の予防（Nutr．Res．，17，1617（1997）(非特許文献１)）、閉経後の不定愁訴などの緩和（Am．Chem．Soc Symp Ser．，No．662，273（1997）(非特許文献２)）、ホルモンバランスが関与しているとされる疾病のうち、乳がん、前立腺ガンについては、大豆イソフラボンの摂取量との間に、負の相関があることがわかっている（Science．，120 575（1954）(非特許文献３)）。この他、イソフラボンには、動脈硬化に関与する脈管形成の阻害作用があると言う報告もなされている（J．Nutr．，125，2307（1995）(非特許文献４)）。
【０００４】
こうしたことからイソフラボンの需要は近年非常に高まってきており、従来の精製法として、まず、非極性樹脂（三菱化学株式会社製HP及びSPシリーズやオルガノ株式会社製のアンバーライトXAD樹脂等）単独による精製方法がある。この方法はまず非極性樹脂に固形分濃度を調整した胚軸ホエーを負荷した後、水で非極性樹脂を洗浄し、エタノールでイソフラボンを溶離させるという方法である。しかしながらこの方法では、胚軸ホエーに同時に含まれるソヤサポニンA群及びソヤサポニンB群も同時に吸着、溶離してしまう為、イソフラボンの純度は20〜40％前後までにしか上がらない。
【０００５】
この他、特開2002−80474号公報(特許文献１)において陰イオン交換樹脂を用いた高純度イソフラボンの調製方法が示されるが、この場合ここで用いる陰イオン交換樹脂のタイプは、「スチレン・ジビニルベンゼン重合体を基本骨格として持ち、平均粒径±10％の粒径範囲内に90％以上の粒度分布を持つ均一粒径の陰イオン交換樹脂」を用いて精製を行うとあるため、精製に用いる陰イオン交換樹脂の種類がかなり限定されてしまう。
【０００６】
【特許文献１】特開2002−80474号公報
【非特許文献１】Nutr．Res．，17，1617（1997）
【非特許文献２】Am．Chem．Soc Symp Ser．，No．662，273（1997）
【非特許文献３】Science．，120 575（1954）
【非特許文献４】J．Nutr．，125，2307（1995）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、イソフラボンを含有する胚軸ホエーから、イソフラボンの分離回収方法において、一般的な非極性樹脂と一般的な陰イオン交換樹脂の組み合わせを用いた分離回収方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以上の状況について、鋭意検討した結果、胚軸ホエーを加熱処理後、特定の固形分濃度領域及び特定のpH領域において、その中に含まれるイソフラボン、ソヤサポニンA群及びソヤサポニンB群が沈澱、不溶解化し、なおかつ、その時の溶液の流動性が良くなることを見出し、この条件を利用し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は
（１）大豆胚軸ホエーから、イソフラボンを分離回収する方法において、胚軸ホエーの固形分濃度を20〜45％(w/v)にして固液分離することを特徴とするイソフラボン分離回収方法、
（２）胚軸ホエーを6〜20時間、90〜100℃で加熱することを特徴とする（１）記載のイソフラボン分離回収方法、
（３）鉱酸を加えてpHを0〜2.5にすることを特徴とする（１)又は（２)記載のイソフラボン分離回収方法、
(４)大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の沈澱に濃度20〜50％（v/v）のエタノールを加えて固形分濃度を1〜20％（w/v）とし加熱後放冷し、生じた沈澱を除去することにより、母液側にイソフラボンを選択的に分離することを特徴とする(１)〜(３)のいずれかに記載イソフラボン分離回収方法、
(５)大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、非極性樹脂に負荷した後水洗して、非吸着画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール濃度10〜100％(w/v)）で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、引き続きこのエタノール水画分は1〜35％(w/v)エタノール水に調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷した後1〜35％(w/v)エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％(w/v)エタノール水で脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することを特徴とする(１)〜(４)のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法
に関する。
【００１０】
すなわち本発明は、胚軸ホエーを原料とし、この固形分濃度を調整して、これを6〜20時間（好ましくは11〜15時間）、90〜100℃で加熱し、胚軸ホエーに含まれる２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４H−ピラン−４−オン（以下DDMPと略す）が結合しているソヤサポニンB群のDDMP部を脱離させ、かつマロニルグルコシドが結合しているイソフラボンのマロニル基をも脱離させることにより、この後これに塩酸または硫酸等の鉱酸を加えてpH調整した際、胚軸ホエー中のソヤサポニンA群、ソヤサポニンB群及びイソフラボンを含む酸沈澱の形成が増大し、なおかつ、その時の溶液の流動性が良くなることを利用して、酸沈澱よりイソフラボンを抽出することを特徴とするイソフラボンの分離回収方法である。
【００１１】
本発明製造法の概略について記す。
まず胚軸ホエーの固形分濃度を20〜45％(w/v)（好ましくは34〜41％(w/v)）に調整した後、胚軸ホエーを6〜20時間（好ましくは11〜15時間）90〜100℃で加熱する。なおこの時固形分濃度が20％未満の場合、これ以降に行う固液分離の際、オイル分が酸沈殿物中に移行する可能性があるため好ましくない。また、45％以上の場合もこれ以降の固液分離が不完全となるため好ましくない。
【００１２】
次に酸沈澱を行うため常温攪拌下、およそ4規定（規定数は特に指定しない）の硫酸、塩酸等の鉱酸を加えpHを0〜2.5（好ましくは、1.8〜2.2）にして、酸沈殿物を生じさせる。この際pHが2.5以上の場合、その後の固液分離状況が悪くなる為、好ましくない。
【００１３】
次に固液分離装置により、固液分離を行う。なお固液分離後、水相よりラフィノース、スタキオース等のガラクトオリゴ糖を含む糖類を製造する場合、このときの温度が高い場合（40℃以上）、ラフィノース、スタキオース等のガラクトオリゴ糖が加水分解されるおそれがあるため、固液分離時の温度は15〜35℃付近の常温が好ましい。
【００１４】
次に固液分離で得た酸沈澱に20〜50％(v/v)（好ましくは30〜40％(v/v)）のエタノール水を加えて、固形分濃度を1〜20％（w/v）（好ましくは5〜10％（w/v））として加熱後放冷し、生じた沈澱を固液分離装置により固液分離を行い、母液側にイソフラボンとソヤサポニンA群を選択的に移行させる。  
【００１５】
次にエタノール水処理母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とし、非極性樹脂（例えば三菱化学株式会社製HP及びSPシリーズやオルガノ株式会社製のアンバーライトXADシリーズ等）に負荷した後、非極性樹脂の3倍量（v/v）の水で水洗して（非吸着画分）この画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール濃度10〜100％（v/v）、好ましくは、60〜80％（v/v））で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、さらに、このエタノール水画分は濃縮して固形分濃度が5％（w/v）以下になるように調整し、エタノール濃度を5〜35％（v/v）（好ましくは20〜30％（v/v））となるようにエタノール水を調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば三菱化学のWA-10等）に負荷した後5〜35％（v/v）（好ましくは20〜30％（v/v））エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％（v/v）（好ましくは60〜80％（v/v））エタノールで脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、胚軸ホエーより高純度のイソフラボンを簡便かつ安価な方法で製造することが可能となる。そしてこの胚軸ホエーにはイソフラボン以外にも、ソヤサポニンＡ群、ソヤサポニンＢ群及びラフィノース及びスタキオース等のオリゴ糖を含む糖質等の有用成分も含まれている為、本発明はそれらの精製においても効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に本発明の実施例を示すが、この実施例は、本発明の一例を示しているに過ぎず、この例示によって本発明の請求範囲が限定されるわけではない。
【実施例１】
【００１８】
（酸沈澱固形分濃度の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー500g（固形分濃度68％、固形物量340g（固形物中のイソフラボン含量：4.83％（NET量：16.42g）））を95℃で13時間攪拌下加熱する。この時容器上部を食品包装用ラップフィルムや、アルミ箔で簡単に被うか、コンデンサー等の装置を付加した加熱攪拌装置を用い、水分がなるべく蒸発しないようにする。この結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となり、イソフラボン含量は4.68％となった。
【００１９】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで濃硫酸を少しずつ加え、沈殿物の生成を促す。続いてそれぞれ固形物量15gとして、沈殿物を含む溶液の固形分濃度を45〜22％(w/v)の間で適宜調整後、3000G、30分間遠心処理を行った。以下の表1に結果を示し、図1にロス率の変化を示した。
【００２０】
【表１】
2005281251.tif 000002
【００２１】
表1及び図1に各固形分濃度における、母液中のイソフラボンの収支、ロス率を示した。固形分濃度が22％から45％と濃度が上昇するに従い、母液へのロスが少なくなることがわかった。なお、固形分濃度が20%以下の場合、オイル分は沈澱に移行し、50％以上の場合では固液分離が不完全であった。
【実施例２】
【００２２】
（酸沈澱pHの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー400g（固形分濃度33％、固形物量132g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：8.95g）））を4サンプル用意し、それぞれを95℃で13時間攪拌下加熱する。この時容器上部を食品包装用ラップフィルムや、アルミ箔で簡単に被うか、コンデンサー等の装置を付加した加熱攪拌装置を用い、水分がなるべく蒸発しないようにする。この結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となり、イソフラボン含量は5.48%となった。
【００２３】
次に常温、攪拌下これらの溶液に4N-硫酸を加え、それぞれpH1.5、2.0、2.5、3.0として沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、液相と沈殿相に分離し、それぞれの成分分析を行う。酸沈澱物中のイソフラボン収支を表2に、また、酸沈澱母液中の糖類の収支を表3に示した。
【００２４】
【表２】
2005281251.tif 000003
【００２５】
【表３】
2005281251.tif 000004
【００２６】
表2の結果より酸沈殿物中のイソフラボンは、どのpH領域においてもおよそ80％前後回収できるが、この沈殿物の容量を確認すると、pH3は、pH1.5の1.8倍以上となり、工業的操作性では不利である。表3では各pHにおける酸沈澱母液の糖の回収率を示したが、pH1.5及び2が最も高い回収率であった.
【実施例３】
【００２７】
（酸沈殿物のエタノール水処理における、エタノール濃度及び固形分濃度の確認）
酸沈殿物（イソフラボン含量9.1％）約10gに、固形分濃度が5％、10％、15％及び20％（w/v）となるように、水、20％、30％、40％及び50％（v/v）エタノール水を加え90℃で15分間加熱後、溶液の温度が室温と同温となるまで放置する。
【００２８】
次にここで生じた沈澱を濾過で分離した後、沈澱及び母液をそれぞれ濃縮乾固して収量を求める。またサポニンA群サポニンB群及びイソフラボン含量を測定して各成分挙動の比較を行う。結果を表4に示す。
【００２９】
【表４】
2005281251.tif 000005
【００３０】
表4に示したように、酸沈殿物を含水エタノールで処理する場合、30％エタノールを用いる時は固形分濃度5％、また40％エタノールを用いる時は固形分濃度10％で行えば、イソフラボン及びソヤサポニンA群は母液側へ90％以上、ソヤサポニンB群は沈澱側へ約65〜76％移行することが確認された（太数字）。
【実施例４】
【００３１】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂WA-10の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー3031g（固形分濃度33％、固形物量1000g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：67.8g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００３２】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は310g）。
【００３３】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は230g）と沈澱に分離する。
【００３４】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００３５】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、1.1Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後3.2Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール5.4Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００３６】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となった三菱化学株式会社製ダイヤイオンWA-10樹脂1.9Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール3.9Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール9.7Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を58.3g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、84.9％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は73.0％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は90.3％）であった。 
【実施例５】
【００３７】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂IRA67の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー3031g（固形分濃度33％、固形物量1000g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：67.8g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００３８】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は310g）。
【００３９】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は230g）と沈澱に分離する。
【００４０】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００４１】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、1.1Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後3240mLの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール5.4Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００４２】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトIRA67樹脂1.9Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール3.9Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール9.7Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を53.0g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、81.8％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は63.9％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は78.7％）であった。
【実施例６】
【００４３】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂IRA96SBの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー5047g（固形分濃度33％、固形物量1665.5g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：112.9g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００４４】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は516g）。
【００４５】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は383g）と沈澱に分離する。
【００４６】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００４７】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、1.8Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後5.4Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール9Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００４８】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトIRA96SB樹脂3.2Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール6460mLで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール16Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を88.6g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、83.3％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は65.4％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は80.5％）であった。
【実施例７】
【００４９】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂XE583の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー5300g（固形分濃度33％、固形物量1748.8g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：118.5g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００５０】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００５１】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は402g）と沈澱に分離する。
【００５２】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００５３】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、1.9Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後5.7Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール9.5Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００５４】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトXE583樹脂3.4Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール6780mLで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール17Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を105.3g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、84.2％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は74.8％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は92.1％）であった。
【実施例８】
【００５５】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂XT6050RFの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー6000g（固形分濃度33％、固形物量1980g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：134.2g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００５６】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００５７】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は455g）と沈澱に分離する。
【００５８】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００５９】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、2.2Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後6.5Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール11Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００６０】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトXT6050RF樹脂3.8Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール7.7Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール19Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を118.6g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、81.7％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は72.1％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は88.9％）であった。
【実施例９】
【００６１】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂DOWEX-66の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー6000g（固形分濃度33％、固形物量1980g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：134.2g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００６２】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００６３】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は455g）と沈澱に分離する。
【００６４】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００６５】
次に固形分濃度を5％に調整した母液を、2.2Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後6.5Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール11Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％（v/v）の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００６６】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったダウ・ケミカル日本株式会社製のDOWEX-66樹脂3.8Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール7.7Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール19Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を120.1g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、80.3％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は71.9％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は88.6％）であった。
【００６７】
なおイソフラボンの分析は、（財）日本健康・栄養食品協会法に従って、12種類の大豆イソフラボンはHPLCにて確認を行い、ダイジンの標品を用いて純度を測定した後、ダイジン以外のイソフラボンは、各イソフラボンの定量係数を乗じて、純度を算出した。以下にHPLC条件及びイソフラボンの定量係数を記す。
【００６８】
2005281251.tif 000006
【００６９】
【表５】
2005281251.tif 000007
【００７０】
ソヤサポニンの分析については、以下に方法を示す。
およそ20〜50mgの試料を精秤後5％塩化水素-メタノール5mL加え、1時間82℃で加熱してメタノリシスを行う。反応後これをエタノールで100mLにメスアップして試料溶液とする。また、アグリコンであるソヤサポゲノール-A及びソヤサポゲノール-Bの標準品はそれぞれ10mg前後を精秤後エタノールで100mLにメスアップして、試料溶液及び標準溶液は以下に記したHPLC条件下で分析を行う。このとき反応後アグリコンとなったソヤサポゲノール-A及びソヤサポゲノール-Bはそれぞれ11〜12分、24〜25分に溶離するため、ソヤサポニンA群は3.028、またソヤサポニンB群については2.056をそれぞれ乗じて、ソヤサポニンAb、ソヤサポニンBbとして配糖体換算する。
【００７１】
（HPLC条件）
検出器：UV210nm
カラム：YMC-Pack ODS-AQ AQ-302  5μm  150×4.6mm I.D.
恒温槽：40℃
移動相：アセトニトリル／水／メタノール(6：3：1)
流  速：0.7mL／min.
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】各固形分濃度における母液へのロス率を示す図。
【図１】
2005281251.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月30日(2004.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の沈澱に濃度20〜50％（v/v）のエタノールを加えて固形分濃度を1〜20％（w/v）とし加熱後放冷し
、生じた沈澱を除去することにより、母液側にイソフラボンを選択的に分離することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、非極性樹脂に負荷した後水洗して、非吸着画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール濃
度10〜100％（v/v））で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、引き続きこのエタノール水画分は1〜35％（v/v）エタノール水に調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷した後1〜35％（v/v）エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％（v/v）エタノール水で脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はソヤサポニンA群、ソヤサポニンB群、イソフラボン及びオリゴ糖類を含有する胚軸ホエーよりイソフラボンを分離回収する方法に関連し、より詳しくは、本発明は胚軸ホエーを加熱、酸沈澱、含水アルコール処理、非極性樹脂処理及びイオン交換樹脂処理により、胚軸ホエーよりイソフラボンを分離回収する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚軸ホエーは脱脂、脱タンパクされた大豆胚軸の水、エタノールあるいは含水エタノール抽出物であるが、そこに含有されるイソフラボンを抽出、濃縮するということは、以前から行われている。
【０００３】
胚軸ホエーに含まれるイソフラボンは、弱い女性ホルモン様作用を持ち、閉経後のホルモンバランスの変化が関与しているとされる骨粗鬆症の予防（Nutr．Res．，17，1617（1997）(非特許文献１)）、閉経後の不定愁訴などの緩和（Am．Chem．Soc Symp Ser．，No
．662，273（1997）(非特許文献２)）、ホルモンバランスが関与しているとされる疾病のうち、乳がん、前立腺ガンについては、大豆イソフラボンの摂取量との間に、負の相関があることがわかっている（Science．，120 575（1954）(非特許文献３)）。この他、イソフラボンには、動脈硬化に関与する脈管形成の阻害作用があると言う報告もなされている（J．Nutr．，125，2307（1995）(非特許文献４)）。
【０００４】
こうしたことからイソフラボンの需要は近年非常に高まってきており、従来の精製法として、まず、非極性樹脂（三菱化学株式会社製HP及びSPシリーズやオルガノ株式会社製のアンバーライトXAD樹脂等）単独による精製方法がある。この方法はまず非極性樹脂に固形分濃度を調整した胚軸ホエーを負荷した後、水で非極性樹脂を洗浄し、エタノールでイソフラボンを溶離させるという方法である。しかしながらこの方法では、胚軸ホエーに同時に含まれるソヤサポニンA群及びソヤサポニンB群も同時に吸着、溶離してしまう為、イソフラボンの純度は20〜40％前後までにしか上がらない。
【０００５】
この他、特開2002−80474号公報(特許文献１)において陰イオン交換樹脂を用いた高純度イソフラボンの調製方法が示されるが、この場合ここで用いる陰イオン交換樹脂のタイプは、「スチレン・ジビニルベンゼン重合体を基本骨格として持ち、平均粒径±10％の粒径範囲内に90％以上の粒度分布を持つ均一粒径の陰イオン交換樹脂」を用いて精製を行うとあるため、精製に用いる陰イオン交換樹脂の種類がかなり限定されてしまう。
【０００６】
【特許文献１】特開2002−80474号公報
【非特許文献１】Nutr．Res．，17，1617（1997）
【非特許文献２】Am．Chem．Soc Symp Ser．，No．662，273（1997）
【非特許文献３】Science．，120 575（1954）
【非特許文献４】J．Nutr．，125，2307（1995）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、イソフラボンを含有する胚軸ホエーから、イソフラボンの分離回収方法において、一般的な非極性樹脂と一般的な陰イオン交換樹脂の組み合わせを用いた分離回収方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以上の状況について、鋭意検討した結果、胚軸ホエーを加熱処理後、特定の固形分濃度領域及び特定のpH領域において、その中に含まれるイソフラボン、ソヤサポニンA群及びソヤサポニンB群が沈澱、不溶解化し、なおかつ、その時の溶液の流動性が良くなることを見出し、この条件を利用し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は
（１）大豆胚軸ホエーから、イソフラボンを分離回収する方法において、胚軸ホエーの固形分濃度を20〜45％(w/v)にして固液分離することを特徴とするイソフラボン分離回収方
法、
（２）胚軸ホエーを6〜20時間、90〜100℃で加熱することを特徴とする（１）記載のイソフラボン分離回収方法、
（３）鉱酸を加えてpHを0〜2.5にすることを特徴とする（１)又は（２)記載のイソフラボン分離回収方法、
（４）大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の沈澱に濃度20〜50％（v/v）のエタノールを加えて固形分濃度を1〜20％（w/v）とし加熱後放冷し、生じた沈澱を除去することにより、母液側にイソフラボンを選択的に分離することを特徴とする(１)〜(３)のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法、
（５）大豆胚軸ホエーからイソフラボンを分離回収する方法において、固液分離後の母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、非極性樹脂に負荷した後水洗して、非吸着画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール
濃度10〜100％(v/v)）で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、引き続きこのエタノール水画分は1〜35％(v/v)エタノール水に調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷した後1〜35％(v/v)エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％(v/v)エタノール水で脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することを特徴とする(１)〜(４)のいずれかに記載のイソフラボン分離回収方法に関する。
【００１０】
すなわち本発明は、胚軸ホエーを原料とし、この固形分濃度を調整して、これを6〜20時間（好ましくは11〜15時間）、90〜100℃で加熱し、胚軸ホエーに含まれる２，３−ジヒドロ−２，５−ジヒドロキシ−６−メチル−４H−ピラン−４−オン（以下DDMPと略す）が結合しているソヤサポニンB群のDDMP部を脱離させ、かつマロニルグルコシドが結合しているイソフラボンのマロニル基をも脱離させることにより、この後これに塩酸または硫酸等の鉱酸を加えてpH調整した際、胚軸ホエー中のソヤサポニンA群、ソヤサポニンB群及びイソフラボンを含む酸沈澱の形成が増大し、なおかつ、その時の溶液の流動性が良くなることを利用して、酸沈澱よりイソフラボンを抽出することを特徴とするイソフラボンの分離回収方法である。
【００１１】
本発明製造法の概略について記す。
まず胚軸ホエーの固形分濃度を20〜45％(w/v)（好ましくは34〜41％(w/v)）に調整した後、胚軸ホエーを6〜20時間（好ましくは11〜15時間）90〜100℃で加熱する。なおこの時固形分濃度が20％(w/v)未満の場合、これ以降に行う固液分離の際、オイル分が酸沈殿物中に移行する可能性があるため好ましくない。また、45％(w/v)を超える場合もこれ以降の固液分離が不完全となるため好ましくない。
【００１２】
次に酸沈澱を行うため常温攪拌下、およそ4規定（規定数は特に指定しない）の硫酸、塩酸等の鉱酸を加えpHを0〜2.5（好ましくは、1.8〜2.2）にして、酸沈殿物を生じさせる。この際pHが2.5を超える場合、その後の固液分離状況が悪くなる為、好ましくない。
【００１３】
次に固液分離装置により、固液分離を行う。なお固液分離後、水相よりラフィノース、スタキオース等のガラクトオリゴ糖を含む糖類を製造する場合、このときの温度が高い場合（40℃以上）、ラフィノース、スタキオース等のガラクトオリゴ糖が加水分解されるおそれがあるため、固液分離時の温度は15〜35℃付近の常温が好ましい。
【００１４】
次に固液分離で得た酸沈澱に20〜50％(v/v)（好ましくは30〜40％(v/v)）のエタノール水を加えて、固形分濃度を1〜20％（w/v）（好ましくは5〜10％（w/v））として加熱後放冷し、生じた沈澱を固液分離装置により固液分離を行い、母液側にイソフラボンとソヤサポニンA群を選択的に移行させる。
【００１５】
次にエタノール水処理母液をアルカリで中和し、蒸溜によりエタノールを溜去後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とし、非極性樹脂（例えば三菱化学株式会社製HP及びSPシリーズやオルガノ株式会社製のアンバーライトXADシリーズ等）に負荷した後、非極性樹脂の3倍量（v/v）の水で水洗して（非吸着画分）この画分へサポニンA群を排出し、さらにこの非極性樹脂をエタノール水（エタノール濃度10〜100％（v/v）、好ましくは、60〜80％（v/v））で洗浄してこのエタノール水画分よりイソフラボンを回収し、さらに、このエタノール水画分は濃縮して固形分濃度が5％（w/v）以下になるように調整し、エタノール濃度を5〜35％（v/v）（好ましくは20〜30％（v/v））となるようにエタノール水を調整して弱塩基性陰イオン交換樹脂（例えば三菱化学のWA-10等）に負荷した後5〜35％（v/v）（好ましくは20〜30％（v/v））エタノール水で洗浄し、続いて35〜100％（v/v）（好ましくは60〜80％（v/v））エタノールで脱着を行い、さらに溶媒を溜去、乾燥することにより純度80％以上のイソフラボンを分離製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、胚軸ホエーより高純度のイソフラボンを簡便かつ安価な方法で製造することが可能となる。そしてこの胚軸ホエーにはイソフラボン以外にも、ソヤサポニンＡ群、ソヤサポニンＢ群及びラフィノース及びスタキオース等のオリゴ糖を含む糖質等の有用成分も含まれている為、本発明はそれらの精製においても効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に本発明の実施例を示すが、この実施例は、本発明の一例を示しているに過ぎず、この例示によって本発明の請求範囲が限定されるわけではない。
【実施例１】
【００１８】
（酸沈澱固形分濃度の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー500g（固形分濃度68％（w/v）、固形物量340g（固形物中のイソフラボン含量：4.83％（NET量：16.42g）））を95℃で13時間攪拌下加熱する。この時容器上部を食品包装用ラップフィルムや、アルミ箔で簡単に被うか、コンデンサー等の装置を付加した加熱攪拌装置を用い、水分がなるべく蒸発しないようにする。この結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となり、イソフラボン含量は4.68％となった。
【００１９】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで濃硫酸を少しずつ加え、沈殿物の生成を促す。続いてそれぞれ固形物量15gとして、沈殿物を含む溶液の固形分濃度を45〜22％(w/v)の間で適宜調整後、3000G、30分間遠心処理を行った。以下の表1に結果を示し、図1にロス率の変化を示した。
【００２０】
【表１】
2005281251.tif 000009
【００２１】
表1及び図1に各固形分濃度における、母液中のイソフラボンの収支、ロス率を示した。固形分濃度が22％(w/v)から45％(w/v)と濃度が上昇するに従い、母液へのロスが少なくなることがわかった。なお、固形分濃度が20%(w/v)以下の場合、オイル分は沈澱に移行し、50％(w/v)以上の場合では固液分離が不完全であった。
【実施例２】
【００２２】
（酸沈澱pHの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー400g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量132g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：8.95g）））を4サンプル用意し、それぞれを95℃で13時間攪拌下加熱する。この時容器上部を食品包装用ラップフィルムや、アルミ箔で簡単に被うか、コンデンサー等の装置を付加した加熱攪拌装置を用い、水分がなるべく蒸発しないようにする。この結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となり、イソフラボン含量は5.48%となった。
【００２３】
次に常温、攪拌下これらの溶液に4N-硫酸を加え、それぞれpH1.5、2.0、2.5、3.0として沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、液相と沈殿相に分離し、それぞれの成分分析を行う。酸沈澱物中のイソフラボン収支を表2に、また、酸沈澱母液中の糖の収支を表3に示した。
【００２４】
【表２】
2005281251.tif 000010
【００２５】
【表３】
2005281251.tif 000011
【００２６】
表2の結果より酸沈殿物中のイソフラボンは、どのpH領域においてもおよそ80％前後回収できるが、この沈殿物の容量を確認すると、pH3は、pH1.5の1.8倍以上となり、工業的操作性では不利である。表3では各pHにおける酸沈澱母液の糖の回収率を示したが、pH1.5及び2が最も高い回収率であった.
【実施例３】
【００２７】
（酸沈殿物のエタノール水処理における、エタノール濃度及び固形分濃度の確認）
酸沈殿物（イソフラボン含量9.1％）約10gに、固形分濃度が5％、10％、15％及び20％（w/v）となるように、水、20％、30％、40％及び50％（v/v）エタノール水を加え90℃で15分間加熱後、溶液の温度が室温と同温となるまで放置する。
【００２８】
次にここで生じた沈澱を濾過で分離した後、沈澱及び母液をそれぞれ濃縮乾固して収量を求める。またサポニンA群サポニンB群及びイソフラボン含量を測定して各成分挙動の比較を行う。結果を表4に示す。
【００２９】
【表４】
2005281251.tif 000012
【００３０】
表4に示したように、酸沈殿物を含水エタノールで処理する場合、30％(v/v)エタノールを用いる時は固形分濃度5％(w/v)、また40％（v/v）エタノールを用いる時は固形分濃度10％(w/v)で行えば、イソフラボン及びソヤサポニンA群は母液側へ90％以上、ソヤサポニンB群は沈澱側へ約65〜76％移行することが確認された（太数字）。
【実施例４】
【００３１】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂WA-10の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー3031g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1000g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：67.8g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００３２】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は310g）。
【００３３】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は230g）と沈澱に分離する。
【００３４】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００３５】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、1.1Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後3.2Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール5.4Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００３６】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となった三菱化学株式会社製ダイヤイオンWA-10樹脂1.9Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール3.9Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール9.7Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を58.3g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、84.9％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は73.0％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は90.3％）であった。
【実施例５】
【００３７】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂IRA67の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー3031g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1000g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：67.8g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００３８】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は310g）。
【００３９】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は230g）と沈澱に分離する。
【００４０】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００４１】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、1.1Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後3240mLの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール5.4Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００４２】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトIRA67樹脂1.9Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール3.9Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール9.7Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を53.0g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、81.8％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は63.9％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は78.7％）であった。
【実施例６】
【００４３】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂IRA96SBの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー5047g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1665.5g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：112.9g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００４４】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は516g）。
【００４５】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は383g）と沈澱に分離する。
【００４６】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００４７】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、1.8Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後5.4Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール9Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００４８】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトIRA96SB樹脂3.2Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール6460mLで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール16Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を88.6g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、83.3％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は65.4％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は80.5％）であった。
【実施例７】
【００４９】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂XE583の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー5300g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1748.8g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：118.5g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００５０】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００５１】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は402g）と沈澱に分離する。
【００５２】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００５３】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、1.9Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後5.7Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール9.5Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００５４】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトXE583樹脂3.4Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール6780mLで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール17Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を105.3g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、84.2％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は74.8％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は92.1％）であった。
【実施例８】
【００５５】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂XT6050RFの確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー6000g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1980g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：134.2g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００５６】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００５７】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は455g）と沈澱に分離する。
【００５８】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後、水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００５９】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、2.2Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後6.5Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール11Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００６０】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったオルガノ株式会社製のアンバーライトXT6050RF樹脂3.8Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール7.7Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール19Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を118.6g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、81.7％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は72.1％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は88.9％）であった。
【実施例９】
【００６１】
（非極性樹脂SP-825及びイオン交換樹脂DOWEX-66の確認）
脱脂大豆胚軸を70％(v/v)エタノールで抽出し、濃縮、脱溶媒を行った胚軸ホエー6000g（固形分濃度33％(w/v)、固形物量1980g（固形物中のイソフラボン含量：6.78％（NET量：134.2g）））を実施例1と同様に加熱処理した結果、加熱前胚軸ホエーのpHはおよそ5.7であったが加熱後にはおよそpH5.3となる。
【００６２】
次にこの溶液を常温下、攪拌しながらpH2になるまで4N-硫酸を加え、沈殿物の生成を促す。続いて沈殿物を含む溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、上相のオイル相と水相を分離除去して沈殿物を得る（沈澱物の乾燥収量は542g）。
【００６３】
この沈殿物にエタノール水を加え、エタノール濃度30％（v/v）、固形分濃度5％（w/v）として加熱攪拌して常温となるまで放置後、沈澱を含むこの溶液を3000G、30分間遠心機で処理を行い、母液（濃縮乾燥後の収量は455g）と沈澱に分離する。
【００６４】
次にこの母液に1N-水酸化ナトリウム溶液を加え、pH7に調整し、エタノールを溜去した後水を加えて固形分濃度を5％（w/v）とする。この際固形分濃度をこれより低くすると、これ以降行う樹脂精製においてイソフラボンの樹脂に対する吸着効果はあがるが、排水量の増加にもつながる。また固形分濃度をこれ以上に上げた場合、イソフラボンの樹脂に対する吸着効果が低くなる為、この後原料液を樹脂に負荷する際の通液スピードを遅くするなどコントロールする必要があるが、これらは適宜決定すればよい。
【００６５】
次に固形分濃度を5％(w/v)に調整した母液を、2.2Lの三菱化学株式会社製ダイヤイオンSP-825樹脂に負荷して通液する（SV1）。通液後6.5Lの水で樹脂を洗浄した後、80％（v/v）エタノール11Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮、エタノールを一部溜去、加水調整等行い、固形分濃度5％(w/v)の25％（v/v）エタノール溶液とする。
【００６６】
次にこの溶液をアルカリ水で再生後、水洗を行い洗浄液が中性となったダウ・ケミカル日本株式会社製のDOWEX-66樹脂3.8Lに負荷して通液する（SV1）。この後25％（v/v）エタノール7.7Lで樹脂を洗浄し、80％（v/v）エタノール19Lでイソフラボン画分を溶離後、これを濃縮乾燥する。この結果、濃縮乾燥物を120.1g得て、このとき濃縮乾燥物に含まれるイソフラボンの含有率は、80.3％（原料胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は71.9％、加熱胚軸ホエーからのイソフラボン回収率は88.6％）であった。
【００６７】
なおイソフラボンの分析は、（財）日本健康・栄養食品協会法に従って、12種類の大豆イソフラボンはHPLCにて確認を行い、ダイジンの標品を用いて純度を測定した後、ダイジン以外のイソフラボンは、各イソフラボンの定量係数を乗じて、純度を算出した。以下にHPLC条件及びイソフラボンの定量係数を記す。
【００６８】
2005281251.tif 000013
【００６９】
【表５】
2005281251.tif 000014
【００７０】
ソヤサポニンの分析については、以下に方法を示す。
およそ20〜50mgの試料を精秤後5％塩化水素-メタノール5mL加え、1時間82℃で加熱してメタノリシスを行う。反応後これをエタノールで100mLにメスアップして試料溶液とする
。また、アグリコンであるソヤサポゲノール-A及びソヤサポゲノール-Bの標準品はそれぞれ10mg前後を精秤後エタノールで100mLにメスアップして、試料溶液及び標準溶液は以下に記したHPLC条件下で分析を行う。このとき反応後アグリコンとなったソヤサポゲノール-A及びソヤサポゲノール-Bはそれぞれ11〜12分、24〜25分に溶離するため、ソヤサポニンA群は3.028、またソヤサポニンB群については2.056をそれぞれ乗じて、ソヤサポニンAb、ソヤサポニンBbとして配糖体換算する。
【００７１】
（HPLC条件）
検出器：UV210nm
カラム：YMC-Pack ODS-AQ AQ-302  5μm 150×4.6mm I.D.
恒温槽：40℃
移動相：アセトニトリル／水／メタノール(6：3：1)
流  速：0.7mL／min.
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】各固形分濃度における母液へのロス率を示す図。