(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本人被験者のヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、３９７０Ｔ、１３９２８Ｃ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、１２４０６Ａを有するサブハプログループＦ１と、１４９４４Ｔを有するサブハプログループＡ１ａ１ａと、１５０６７Ｃを有するサブハプログループＮ９ａ２ａ１と、５１４７Ａを有するサブハプログループＦ１ｂ１ａと、５１４７Ａを有するサブハプログループＮ９ｂ１と、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１４４７６Ａを有するサブハプログループＦ１ｂ１ａと、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、４６５５Ａを有するサブハプログループＡ１ａと、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１３９１Ｃを有するサブハプログループＢ４ｂ１ｂと、８７６２Ｃを有するサブハプログループＤ４ｍと、８３８３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｄ２と、７８６１Ｃを有するサブハプログループＦ４ａまたは１５０４７Ａを有するサブハプログループＭ８ａ１であるかを調べ、前記ハプログループＮ９ａを持つ日本人女性は２型糖尿病の抵抗性を有すること、ハプログループＦを持つ日本人は２型糖尿病の危険性が高いこと、及びハプログループＡを持つ日本人女性は２型糖尿病の危険性が高いことを評価するための判断材料の一つとする２型糖尿病に関する遺伝子検出法であって、
前記ハプログループの検出方法が、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法であり、この方法の実施に用いるためのオリゴヌクレオチドのうち、
（１）ハプログループＮ９ａを検出するために、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ及び１２３７２Ａを限定して指標とし、
５２３１Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１７：cagctacgca aaatcttagc atacと配列番号１８：ttgggcaaaa agccggttag cgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号９０：tccctaggag gcctacccccであり、
１２３５８Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３９：aggataacag ctatccattg gtctと、配列番号４０：gtggctcagt gtcagttcga gatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号２２１：gcacactact atagccaccc tであり、
１２３７２Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３９：aggataacag ctatccattg gtctと、配列番号４０：gtggctcagt gtcagttcga gatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号２２２：agccacccta accctaactt ccであり、
（２）ハプログループＦを検出するために、３９７０Ｔ、１３９２８Ｃ及び１０３１０Ａを限定して指標とし、
３９７０Ｔの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１１：gagtccgaac tagtctcagg ctと、配列番号１２：gagggggaat gctggagatt gtaであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１７４：ggctatgaag aataaggcgaであり、
１３９２８Ｃの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号４５：gccggaagcc tattcgcagg atと、配列番号４６：caggttttgg ctcgtaagaa ggcであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１３４：ggattctacc ctaccatcaと配列番号１３５：gattctaccc tagcatcaであり、
１０３１０Ａの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号３３：acccctacca tgagccctac aaと、配列番号３４：gtgagatggt aaatgctagt ataatatであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１１５：actattagtg gtaggttagt tと配列番号２０８：tattagtggc aggttagttg ttであり、
（３）ハプログループＡを検出するために、６６３Ｇ及び８７９４Ｔを限定して指標とし、
６６３Ｇの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号１：acatcacccc ataaacaaat aggttと、配列番号２：gcttctattg acttgggtta atcgであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１５７：gctaatagaa aggccaggaであり、
８７９４Ｔの検出については、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列が、配列番号２７：と、caaatatctc atcaacaacc gacta配列番号２８：cagggctatt ggttgaatga gtagであり、多型チェック用のプローブの塩基配列が、配列番号１０７：tggtgtaaat gagtaaggca ggであることを特徴とする遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病に関する遺伝子検出方法に関し、特にヒトミトコンドリアＤＮＡのハプログループを分類することにより２型糖尿病に関する遺伝子検出を行うものに関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン非依存性の２型糖尿病は、先進国において高い発症率を示し、世界的規模で公衆衛生上の主要な問題の一つになっている。２型糖尿病は、複合的な要因に由来する疾患であり、そこでは様々な遺伝的または環境的な影響が相互に重要な役割を果たしている。若年発症性の成人型糖尿病（maturity-onset diabetes of the young ：MODY）を引き起こす病原性突然変異ついては、既にいくつかの報告がある。
【０００３】
一方、ミトコンドリアゲノムにおいて、ｔＲＮＡ−Ｌｅｕ（UUR）遺伝子中の３２４３Ａ＞Ｇ突然変異が、母系遺伝性糖尿病ならびに難聴の患者（非特許文献１。本明細書においては、関連文献については末尾にまとめて示す。）で検出された。更に、ミトコンドリアゲノム多型の幾つかは、日本人集団においてはインスリン抵抗性および／または高血糖と関連を持つことが報告されている（非特許文献２−４）。このように、ミトコンドリアの機能障害は、骨格筋のインシュリン抵抗性、および膵臓のベータ細胞からのインスリン分泌障害の両者に関連していると考えられている（非特許文献５）。
【０００４】
ミトコンドリアゲノム中の母系遺伝性の変異は、過去二十万年以上に渡り、ホモサピエンスがアフリカからアジアおよびヨーロッパに拡張した時代に、新たな突然変異が連続的に追加された事に起因している（非特許文献６）。ミトコンドリアゲノムの突然変異率は核ゲノムの突然変異率に比べると少なくとも１０倍以上高いので、ホモサピエンスに蓄積されて来た古代のミトコンドリア多型は、比較的短い歴史を持つものではあっても、現代人類の代謝特性に影響している可能性がある（非特許文献７）。世界の様々な地域で発見されたミトコンドリアハプログループが、寒冷気候と栄養条件への適応を通じて選択されて来たものであると推測することができる（非特許文献７−９）。ミトコンドリアハプログループ間で機能的差異が存在することを支持する数々の証拠が、精子運動性（非特許文献１０）、敗血症後の生存率（非特許文献１１）、およびパーキンソン病に対する感受性（非特許文献１２）の研究により与えられている。
【０００５】
これまで本発明者らは、寿命（非特許文献１３）、パーキンソン病（非特許文献１４、１５）およびアルツハイマー病と言った加齢関連の疾病、並びに肥満（非特許文献２）、るい痩（非特許文献１６）、２型糖尿病（非特許文献２）および動脈硬化症と言ったエネルギー代謝に関連する疾病に関与するミトコンドリアＤＮＡ多型（mtSNP）を同定することを目的として研究を重ねてきた。この目的のため、我々は７つの異なる群に属する６７２名について、１６５６９塩基対のミトコンドリアゲノムを完全にシーケンスした。７群は、それぞれ９６名から構成されており、それらは、百寿者群、パーキンソン病罹患者群、アルツハイマー病患者群、肥満の若い男性群、肥満でない若い男性群、重度の血管性病変を持つ２型糖尿病患者群、および重度の血管性病変を持たない２型糖尿病患者群であった（非特許文献１７）。この調査結果から、ヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）を構築した。これらのｍｔＳＮＰデータに基づいて、本発明者らは、蛍光ビーズ法を用いた包括的なｍｔＳＮＰ分析システムを開発した。
【０００６】
Ｐｏｕｌｔｏｎらは、ｍｔＤＮＡの１６１８９Ｔ＞Ｃ変異が２型糖尿病と関連を持つことを既に報告している（非特許文献１８）。Ｗｅｎｇらは、この多型が中国人成人においては、メタボリックシンドロームとも関連していると報告している（非特許文献１９）。しかしながら、ヨーロッパ人に関する研究では、１６１８４−１６１９３のｐｏｌｙ（Ｃ）ｔｒａｃｔの遺伝変異が、２型糖尿病発症においては主要な役割を担っていないことが示されている（非特許文献２０）。従って、非コード領域のみに於ける多型分析は、個々人の代謝特性とミトコンドリアゲノムに於ける機能的多型との間の相互関係については、直接的な証拠を提供し難いと思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の諸点に留意しつつ、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域に於ける包括的な多型分析を基づいて、日本人に於ける２型糖尿病と主要な１０個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）との関係を調べる大規模な関連解析を行った。
本発明者らの研究目的は、ｍｔＤＮＡのハプログループ分けに基づき、２型糖尿病の遺伝的リスクを予測し、それによって２型糖尿病の一次予防に役立てることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、長年に亘ってヒトミトコンドリアゲノムに関する研究を行っている者である。ヒトミトコンドリアＤＮＡは、強固に連鎖した複数のｍｔＳＮＰを有するハプログループに分類することができる。図３〜図５には、ｍｔＳＮＰとハプログループ（及びサブハプログループ）との関係を示した。このハプログループの分布は、人種間において、かなり大きな隔たりがある。個々の日本人は、主要な１０個のハプログループによって、そのほとんど（約９０パーセント以上）を分類することができる。各ハプログループは、数個〜２０個程度のｍｔＳＮＰによって特徴付けられる。例えば、ハプログループＦは、８７０１、９５４０、１０３９８、１０８７３、１５３０１、１６５１９、１２７０５、１６２２３、１６１８３、１６５１９、３９７０、１３９２８、１６３０４、２４８、６３９２、１０３１０等の位置にｍｔＳＮＰを有している（その他のハプログループについても、同様の状況が存在する）。ハプログループ分類をするために、これら全てのｍｔＳＮＰを調べようとするのは、大変な労力が掛かるため大規模な研究には向きにくい。しかしながら、これらのうちのいずれのｍｔＳＮＰを選択・検出すれば、適切にハプログループを分類することが可能であるかについては明確には知られていなかったことに加え、選択したｍｔＳＮＰを迅速かつ的確に検出する方法については開発が十分に進んでいなかった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、鋭意検討の結果、新たなｍｔＳＮＰの検出法を開発し、日本人における主要な１０個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４及びＤ５）を迅速かつ的確に分類する検出法を開発した。
つまり、各ハプログループが持っている数個〜二十個程度のｍｔＳＮＰのうち、適当に１個〜５個のｍｔＳＮＰを選択することにより、表１に記載のｍｔＳＮＰｓを検出すれば、１０個のハプログループへの分類が可能であることを見出した。更に、この方法を用いて、本発明者らは、ミトコンドリアゲノムのコード領域における包括的な多型分析を基にして、日本人における２型糖尿病と主要な１０個のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）との関係を調べるために、２９０６名を対象とした大規模な関連解析を行った。その結果、ハプログループＦを持つ者は２型糖尿病の危険性が高いこと、ハプログループＮ９ａを持つ者は２型糖尿病に対する抵抗性を有すること（特に、女性の場合）、および女性の場合にはハプログループＡを持つ者は２型糖尿病の危険性が高いことを明らかとし、基本的には本発明を完成するに至った。
【００１０】
こうして、上記課題を解決するために、本発明に係る２型糖尿病に関する遺伝子検出法は、ヒトミトコンドリアＤＮＡにおいて、５２３１Ａ、１２３５８Ｇ、１２３７２Ａを有するハプログループＮ９ａと、３９７０Ｔ、１３９２８Ｃ、１０３１０Ａを有するハプログループＦと、６６３Ｇ、８７９４Ｔを有するハプログループＡと、１２４０６Ａを有するサブハプログループＦ１と、１４９４４Ｔを有するサブハプログループＡ１ａ１ａと、１５０６７Ｃを有するサブハプログループＮ９ａ２ａ１と、５１４７Ａを有するＦ１ｂ１ａと、５１４７Ａを有するサブハプログループＮ９ｂ１と、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１４４７６Ａを有するサブハプログループＦ１ｂ１ａと、１５３１４Ａを有するサブハプログループＤ４ａと、４６５５Ａを有するサブハプログループＡ１ａと、８８５６Ａを有するサブハプログループＢ５ｂ３と、１３９１Ｃを有するサブハプログループＢ４ｂ１ｂと、８７６２Ｃを有するサブハプログループＤ４ｍと、８３８３Ｃを有するサブハプログループＤ４ｄ２と、７８６１Ｃを有するサブハプログループＦ４ａと、１５０４７Ａを有するサブハプログループＭ８ａ１とを検出することを特徴とする。
【００１１】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）＞多型塩基」の順で記載する。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ」は、５２３１位のＧがＡとなっている多型を意味している。また、その多型が生じている遺伝子（ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の位置について、カッコ書きで情報を示すことがある。例えば、「５２３１Ｇ＞Ａ（ＮＤ２：ｓｙｎ）」とは、上記多型について、ＮＤ２遺伝子において、アミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを意味している。但し、挿入あるいは欠失多型については、「多型が生じている位置（欠失または挿入に関する塩基情報）」の順で記載する。例えば、「８２７２（9-bp deletion in non-coding region）」とは、８２７２位の非コード領域における９個の塩基の欠失多型であることを意味している。また、順方向（forward strand）に読んでＡ／Ｇ多型としてデータベースに記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。多くの文献について、「Ｔ／Ｃ」多型として記載されている場合には、データベース中の記録であるＡ／Ｇ多型と異なることがある。
【００１２】
一般にミトコンドリアＤＮＡ多型（ｍｔＳＮＰｓ）或いはミトコンドリアＤＮＡハプログループは、対象となる集団（例えば、日本人・中国人・韓国人を含む東アジア人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なる。このため、日本人以外の集団において、２型糖尿病との関係が指摘されているハプログループであっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、集団または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人におけるハプログループおよび２型糖尿病との関連が裏付けられるわけではない。
【００１３】
本発明において、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出する方法としては、従来公知の方法、例えばＤＮＡシークエンス、ＤＮＡチップ（或いはＤＮＡマイクロアレイ）、ＲＦＬＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法などの方法を用いることができる。これらの中でも、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いることにより、数百個程度の多型であれば迅速に測定することができる。なお、同方法の詳細については後に詳述する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、２型糖尿病の遺伝的危険度を予測することができる。この発明を用いることにより、２型糖尿病に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１６】
＜研究対象＞
研究対象は、互いに血縁関係の無い４０歳以上の日本人２９０６名（男性１９３８名、女性９６８名）であった。対象者は、２００２年１０月から２００５年３月の間に、３つの研究参加病院（岐阜県立岐阜病院、多治見病院および下呂温泉病院）の１つを外来した受診者、或いは入院患者であった。２型糖尿病患者は、絶食時血漿グルコースレベルが６.９９ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）濃度が６.５％以上を示す者、或いは糖尿病に対する薬物治療下にあった。２型糖尿病は、世界保健機構により承認された基準に従って定義した。これらの基準に基づいて、研究対象集団中の１２８９名の被験者（男性８９０名、女性３９９名）が、２型糖尿病患者であると診断された。残りの１６１７名（男性１０４８名、女性５６９名）は対照群とした。対照群は、研究参加病院に例年の健康チェックのために外来受診した者である。対照群は、絶食時血漿グルコースレベルが６.１１ｍｍｏｌ／Ｌ（１１０ｍｇ／ｄＬ）未満であり、ヘモグロビンＡｌｃが５.６％未満を示し、かつ２型糖尿病の既往歴ならびに２型糖尿病に対する薬物治療を受けた経験が無い者であった。
研究プロトコルは、岐阜県国際バイオ研究所のヒト研究に関する倫理委員会により承認され、また各参加者からは個別に書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１７】
＜ハプログループ分類のためのミトコンドリア多型の選択＞
本発明者らが作製したヒトミトコンドリアゲノム多型データベース（http://www.giib.or.jp/mtsnp/index_e.shtml）および日本人の系統樹（非特許文献１７）を使用して、ミトコンドリアハプログループの分類に有用である１４９個の多型部位を選択した。更に、本発明者らの鋭意検討に基づき、日本人集団において発見された１０個の主要なハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ｂ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４，およびＤ５）を定義するｍｔＳＮＰｓを選択した。これらのｍｔＳＮＰｓを表１に示した。
【００１８】
【表１】
0005360854.tif 000002
【００１９】
表中、左欄より順に、ハプログループ（Haplogroup）、および各ハプログループを代表する多型（Polymorphism）を示している。また表中、「Syn」はアミノ酸の変異を伴わない多型（synonymous mutation）であることを示している。
本発明者らは、上記２９０６名の被験者について、これらハプログループと２型糖尿病との間の関係について研究を行った。
【００２０】
＜多型の遺伝子タイピング＞
各参加者から５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ジナトリウム塩）を含む試験管に、７ｍＬの静脈血を採取し、市販のキット(Genomix, Talent, Trieste, Italy)を用いてＤＮＡを分離した。
ＤＮＡをＰＣＲにかけ、特定のＤＮＡを増幅した。その際に使用したプライマーを表２および表３に示した。ミトコンドリアの多型は懸濁液アレイ技術(Luminex 100; Luminex, Austin, TX)を用い、シーケンス特異性オリゴヌクレオチド試験法（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社、日本）で決定した。詳細な方法については、既報のもの（非特許文献２１）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、条件については、後に詳述する。
【００２１】
また、ハプロタイピングのために使用したプライマーは、表４〜表９に示した。今回のタイピングには、最大で１００種類の多型の判定が行えるものを用いた。１８６種類のプローブを用いるために、全体を１００種類のセット（プローブセットＡ）と８６種類のセット（プローブセットＢ）とに分けて、タイピングを行った。表４〜表６にはプローブセットＡの詳細を、表７〜表９にはプローブセットＢの詳細を示した。
【００２２】
【表２】
0005360854.tif 000003
【００２３】
【表３】
0005360854.tif 000004
【００２４】
【表４】
0005360854.tif 000005
【００２５】
【表５】
0005360854.tif 000006
【００２６】
【表６】
0005360854.tif 000007
【００２７】
【表７】
0005360854.tif 000008
【００２８】
【表８】
0005360854.tif 000009
【００２９】
【表９】
0005360854.tif 000010
【００３０】
表２および表３については、左欄よりＰＣＲ法によって合成されるフラグメント番号（Fragment）、フォワードプライマー（Forward primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列（Sequence）、リバースプライマー（Reverse primer）のｍｔＤＮＡにおける位置（Position）と塩基配列、および合成されるＤＮＡフラグメント長（Product）を示している。
表４〜表６については、第１のセット（プローブセットＡ）について、ｍｔＤＮＡにおける位置（Position）、目的（Purpose）、プローブの塩基配列（Sequence）を示している。また、目的の欄については、「ａ」が多型チェック用、「ｂ」が野生型チェック用、「ｐ」がＰＣＲ産物チェック用、「ｍ」および「ｎ」がマクロハプログループチェック用のものであることを示している。表７〜表９については、第２のセット（プローブセットＢ）について、上記と同じ意味である。
表４〜表９に示したプローブセットは、前述の１０個のハプログループを分類するｍｔＳＮＰに加えて、更に細かいサブハプログループを検出するためのプローブを含んでいる。
【００３１】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献２１に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズ（本発明における固相に該当する）の微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面にはカルボキシル基が存在している。このカルボキシル基と、アミノ修飾された核酸プローブとを結合することにより、ビーズ表面に核酸プローブが結合されている（本発明における核酸プローブの固相化に該当する）。各ビーズには、一種類の核酸プローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との二種類の色素が割合を変化させつつ配されている（Multi-Analyte Microsphere Carboxylated: Luminex, オースチン社（Austin）、米国テキサス州）。こうして、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。
【００３２】
複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
本実施例においては、表４〜表６に記載の１００種類のプローブを第１セット（セットＡ）とし、表７〜表９に記載の８６種類のプローブを第２セット（セットＢ）として、２セットを用いることで、合計１８６種類の多型を検出可能な検出系とした。これら１８６種類のプローブを用いることにより、ヒトミトコンドリアＤＮＡを少なくとも１０種類のハプログループ（Ｆ，Ｂ，Ａ，Ｎ９ａ，Ｍ７ａ，Ｍ７ｂ，Ｇ１，Ｇ２，Ｄ４およびＤ５）に分類することができる。
【００３３】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡフラグメントを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチン化したプライマーを用いた。ｍｔＤＮＡフラグメントを増幅するために２８−ｐｌｅｘ  ＰＣＲを行った。２ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（３０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２.５％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０.１μＭずつのプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０.６２５Ｕ）と１ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。最後に、７２℃で７分間の伸長反応を行った。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００３４】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（１.５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００３５】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリッド工程の後、各ウエルに７５μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去った後、再度１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００３６】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００３７】
この方法に拠る遺伝子タイピングの精度を確かめるために、９１個のＤＮＡサンプルを材料に使用した。これらのＤＮＡサンプルは、ミトコンドリアゲノムの全塩基配列が直接シーケンスによって既に決定されているものである。各例において、ルミネックスシーケンス特異性オリゴヌクレオチドハイブリッドアッセイシステム（ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によって決定された遺伝子型は、直接シーケンスによって決定されたものと一致した。
【００３８】
＜統計的分析＞
数量的な臨床データは、２型糖尿病患者群と対照群との間で、対応のないスチューデントｔ検定を用いて比較した。質的なデータは、カイ二乗検定によって比較した。
２型糖尿病と関連する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性別（gender：０＝女性、１＝男性）、喫煙状態（smoker：０＝非喫煙、１＝喫煙）、および各ｍｔＳＮＰの遺伝子型を独立変数とし、２型糖尿病を従属変数とした。Ｐ値、オッズ比（OR）、および９５％信頼区間（CI）を計算した。特に説明しない限り、０.０５未満のＰ値は統計上有意であると考えた。
【００３９】
ハプログループを多重比較するために、ボンフェローニ（Bonferroni）の補正を適用した。我々は、１０個のハプログループを調べたので、０.０５を１０で除して、０.００５とした。こうして、０.００５未満のＰ値を統計上有意であると見なした。
＜結果＞
２９０６名の被験者に関する基礎的データを表１０に示した。
【００４０】
【表１０】
0005360854.tif 000011
【００４１】
表中において、最左欄は上段から順に、年齢（Age）、性別（女性／男性）（Gender）、ＢＭＩ（Body mass index）、喫煙率（Smoker）、高血圧（Hypertension）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、拡張期血圧（Diastolic blood pressure）、高脂血症（Hypercholesterolemia）、全コレステロール（Total cholesterol）、中性脂肪（Triglycerides）、ＨＤＬ−コレステロール（HDL-cholesterol）、空腹時血糖値（Fasting blood glucose）、ヘモグロビンＡｌｃ（Glycosylated hemoglobin）を意味している。また、最上段は左から順に、被験者全員（All subjects）における２型糖尿病患者群（Type 2 diabetes）の値と対照群（Controls）の値とＰ値（P value）、女性（Women）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値、男性（Men）における２型糖尿病患者群の値と対照群の値とＰ値とをそれぞれ示している。また、各値において、「±」が付してあるものは、平均値±ＳＤで示した。喫煙率については、１日あたり１０本以上の喫煙数がある者を喫煙者とした。高血圧については、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、或いは両基準を満たす者、または高血圧薬を服用している者とした。高脂血症については、全コレステロール値が２２０ｍｇ／ｄＬ（５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、または高脂血症剤を服用している者とした。
【００４２】
年齢は２型糖尿病患者群において対照群よりも低かったが、ＢＭＩ、収縮期および弛緩期血圧、トリグリセリド、絶食時血漿グルコース濃度、およびヘモグロビンＡｌｃ（HbA1c）比率は、対照群に比べると２型糖尿病患者群においては有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢とＨＤＬコレステロールは、対照群に比して２型糖尿病患者者の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。喫煙率、高血圧症、高コレステロール血症は、対照群に比較して２型糖尿病患者群では有意に高かった（Ｐ＜０.０５）。女性／男性の比率は、対照群に比して２型糖尿病患者群の方が有意に低かった（Ｐ＜０.０５）。
年齢、性別、喫煙状態を補正して多項ロジスティック回帰分析を行った結果を表１１に示した。
【００４３】
【表１１】
0005360854.tif 000012
【００４４】
表中において、左欄より順に、変数（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（OR）、９５％信頼区間（95%CI）を示している。また、上段より被験者全員（All subjects）における従来の危険因子（Conventional risk factors）である年齢（Age）・性別（Gender）・喫煙率（Smoking）と遺伝的危険因子（Genetic risk factors）であるハプログループＦ、Ｎ９ａを、女性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＮ９ａ、Ｆ、Ａを、男性における従来の危険因子である年齢・喫煙率と遺伝的危険因子であるハプログループＦをそれぞれ意味している。
【００４５】
表に示す通り、Ｐ値が０.０５未満で、ハプログループＦを持つ被験者が、２型糖尿病罹患のリスクが有意に高いことが明らかとなった。これとは対照的に、ハプログループＮ９ａを持つ被験者は、２型糖尿病に罹患するリスクが低い傾向を示した（P = 0.023, オッズ率 0.64（95% CI 0.43-0.94））。ハプログループＮ９ａを持つ女性は、２型糖尿病罹患のリスクが有意に低かった（P = 0.0042, オッズ率 0.27（95% CI 0.10-0.62））。一方、ハプログループＦおよびＡを持つ女性は２型糖尿病罹患のリスクが高い傾向を示した（Ｆについては、P = 0.0165, オッズ率 1.78（95% CI 1.11-2.89）；Ａについては、P = 0.0405, オッズ率 1.67（95% CI 1.02-2.73））。ハプログループＦを持つ男性は、２型糖尿病に罹患するリスクが高かった（P = 0.0482, オッズ率1.43（95% CI 1.00-2.05））。
我々は、ハプログループの多重比較について、０.００５未満のＰ値が得られた場合に、その関連が有意であると考えた。この基準に基づくと、ハプログループＦは、全ての被験者について２型糖尿病に対する感受性に有意に関与していた（ P = 0.0028）。一方、女性について、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関与していた（ P = 0.0042）。
表１２には、ステップワイズ前向き選択法による解析結果を示した。
【００４６】
【表１２】
0005360854.tif 000013
【００４７】
表より、ハプログループＦは全ての被験者について、２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかとなった（P = 0.0035）。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する防御因子であり（P = 0.0013）、ハプログループＦとＡは２型糖尿病に対して独立な危険因子である可能性が示された（Ｆについて、P = 0.0227；Ａについて、P = 0.0374）。しかし男性の場合には、これらのハプログループのいずれも、２型糖尿病との関連性を示さなかった。
女性の場合、ハプログループＮ９ａ、Ｆ、およびＡの２型糖尿病への抵抗性に対する総合的な寄与は０.０１５２（３つのハプログループの寄与率(R2)の和）であった。これはミトコンドリアゲノム多型が、特に女性においては、２型糖尿病への感受性に影響する重要な遺伝要因であることを示唆している。
表１３には、ｍｔＳＮＰｓのうち、２型糖尿病に対する保護因子或いは危険因子として関連するものを示した。
【００４８】
【表１３】
0005360854.tif 000014
【００４９】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである３９７０Ｃ＞Ｔ、１０３１０Ｇ＞Ａおよび１３９２８Ｇ＞Ｃ、ハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ、ハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃが、全ての被験者に関して、糖尿病と関連性を持つことが明らかになった（P = 0.0014 [10310G>A] , P = 0.0025 [12406G>A], P = 0.0028 [3970C>T], P=0.0028 [13928G>C]。これらは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値（ボンフェローニの補正を行っていない値）である）。個々のｍｔＳＮＰについては、各ハプロタイプに対応していることから、ハプロタイプに適用した有意水準（Ｐ＜０.００５）で判断を行った。
【００５０】
サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔ、サブハプログループＦ１ｂ１ａまたはＮ９ｂ１を代表するｍｔＳＮＰである５１４７Ｇ＞Ａ、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ、およびサブハプログループＦ１ｂ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４４７６Ｇ＞Ａを保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対する危険性が高かった（１０個のハプログループにおけるサブハプログループを代表するｍｔＳＮＰの有無については、表４〜表９に記載のプローブのいずれかによって測定されている。以下の記述中のサブハプログループを代表するサブハプログループについても同様である。）。
対照的に、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃ、サブハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａ、並びにサブハプログループＤ４ａを代表するｍｔＳＮＰである１５３１４Ｇ＞Ａを保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に抵抗性を示した。
【００５１】
女性については、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＮ９ａを代表する２個のｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａが、糖尿病に対する抵抗性に関係することが明らかになった（ P = 0.0025 , P = 0.0035。これは149 個のmtSNP の比較に対しての無修正値である）。これに対し、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、糖尿病に対する危険性が高かった（P=0.0035）。更に、サブハプログループＦ１を代表するｍｔＳＮＰである１２４０６Ｇ＞Ａ、ハプログループＦを代表する３個のｍｔＳＮＰである１３９２８Ｇ＞Ｃ、１０３１０Ｇ＞Ａ、および３９７０Ｃ＞Ｔ、サブハプログループＡ１ａを代表するｍｔＳＮＰである４６５５Ｇ＞Ａ、サブハプログループＢ５ｂ３を代表するｍｔＳＮＰである８８５６Ｇ＞Ａ、ハプログループＡを代表する２個のｍｔＳＮＰである６６３Ａ＞Ｇおよび８７９４Ｃ＞Ｔを保持する被験者は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
【００５２】
これに対し、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである１２３５８Ａ＞Ｇ、サブハプログループＮ９ａ２ａ１を代表するｍｔＳＮＰである１５０６７Ｔ＞Ｃを持つ女性は、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが低いことがわかった。
男性の場合には、年齢および喫煙状態を補正した多項ロジスティック回帰分析の結果、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａを持つと、０.０５未満のＰ値で２型糖尿病に対するリスクが高いことがわかった。
表１４に示すように、ステップワイズ前向き選択法によれば、ハプログループＦを代表するｍｔＳＮＰである１０３１０Ｇ＞Ａが全被験者で２型糖尿病に対する危険因子であることが明らかになった（P = 0.0018）。
【００５３】
【表１４】
0005360854.tif 000015
【００５４】
表中、「＊」は表１において示すように、１０個のハプログループを代表させるために用いた多型マーカであることを示している。また、表中の太字で示したＰ値は、０.００５未満であることを示している。
女性の場合には、ハプログループＮ９ａを代表するｍｔＳＮＰである５２３１Ｇ＞Ａが、２型糖尿病に対する防御因子であることが明らかになった（P = 0.0006）。他方、サブハプログループＡ１ａ１ａを代表するｍｔＳＮＰである１４９４４Ｃ＞Ｔは、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0036）。７個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち５２３１Ｇ＞Ａ、１４９４４Ｃ＞Ｔ、１２４０６Ｇ＞Ａ、８７６２Ｔ＞Ｃ、８８５６Ｇ＞Ａ、１２３５８Ａ＞Ｇ、および８３８３Ｔ＞Ｃの糖尿病に対する感受性ならびに／若しくは防御性への総合的な寄与は０.０３６４（７個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
【００５５】
男性の場合には、サブハプログループＦ４ａを代表するｍｔＳＮＰである７８６１Ｔ＞Ｃは、２型糖尿病に対する危険因子であった（P = 0.0005）。４個のｍｔＳＮＰｓ、すなわち７８６１Ｔ＞Ｃ、１３９１Ｔ＞Ｃ、１０３１０Ｇ＞Ａ、および１５０４７Ｇ＞Ａの２型糖尿病に対する感受性への総合的な寄与は０.０１０１（４個のｍｔＳＮＰｓの寄与率（R2）の和）であった。
これらの結果は、上記のｍｔＳＮＰｓが、特に女性の場合には２型糖尿病に対する感受性に影響する重要な遺伝因子であることを示している。
【００５６】
＜考察＞
我々は、２９０６名の被験者に基づく大規模な関連解析を行い、２型糖尿病と１０個の主要なミトコンドリアハプログループとの間の関係を調査した。これらのハプログループのうち、ハプログループＦは全ての被験者で２型糖尿病のリスクに有意に関係していた。女性の場合には、ハプログループＮ９ａは、２型糖尿病に対する抵抗性に有意に関係していた。一方、ハプログループＦおよびハプログループＡは、２型糖尿病に対するリスクに関係していた。男性の場合には、ハプログループＦは、２型糖尿病のリスクと関係していた。
【００５７】
我々は、ミトコンドリアＤＮＡ配列の解析から、日本人集団がマクロハプログループＮとＭとに分割されることを報告した（非特許文献１７）。マクロハプログループＭは、１０個の強固なｍｔＳＮＰｓがリンクしたマクロハプログループＮとは異なっている。マクロハプログループＮには、４個の主要なハプログループ、すなわちＦ、Ｂ、Ａ、およびＮ９ａが含まれる。他方、マクロハプログループＭには、６個の主要なハプログループ、すなわちＭ７ａ、Ｍ７ｂ、Ｇ１、Ｇ２、Ｄ４およびＤ５が含まれる。こうして、日本人集団は、これら１０個の主なハプログループに分類される。
【００５８】
ハプログループＦに特異なｍｔＳＮＰに、１３９２８Ｇ＞Ｃトランスバージョンは、潜在的な機能的多型の１つである。このｍｔＳＮＰは、ＮＡＤＨ脱水素酵素サブユニット５遺伝子産物（ＮＤ５）中で、Ｓ５３１Ｔ置換を起こすことが知られている。ＮＤ５はｍｔＤＮＡにコードされたサブユニットの７個の内の一つであるが、これらのサブユニットは呼吸鎖複合体Ｉ（ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素、ＥＣ１．６．５．３）の約４１個のポリペプチドに含まれている。複合体Ｉは、ＮＡＤＨから電子を受け取り、それをユビキノン（補酵素Ｑ１０）に転送する。その際に得られたエネルギーを用いて、ミトコンドリア内膜を通してプロトンを輸送する。
【００５９】
ＮＤ５は、複合体Ｉの機能には欠かすことができない。その理由は、ＮＤ５遺伝子中の様々なミスセンス変異が、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）（非特許文献２２）、リー症候群（非特許文献２５）、またはミトコンドリア性ミオパチー、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症状から成る症候群（ＭＥＬＡＳ）（非特許文献１２）に罹患する患者において報告されているからである。従って、１３９２８Ｇ＞Ｃによって惹き起こされるＳ５３１Ｔ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を及ぼすと考えることができる。１３９２８Ｇ＞Ｃ（ＮＤ５：Ｓ５３１Ｔ）がミトコンドリア機能に及ぼす具体的な作用については、このハプログループを伴うｍｔＤＮＡを持つ細胞質雑種細胞系統を使う実験によって確認することができ得る。
【００６０】
ハプログループＦを持つ個人の代謝特性は、おそらくインスリン分泌ならびに／あるいはインスリン抵抗性に影響を与えることによって、２型糖尿病に対する抵抗性を得るものと思われる。ハプログループＦに属するサブハプログループ（Ｆ１ａ、Ｆ１ｂ、Ｆ１ｃ、Ｆ２ａ、Ｆ３、Ｆ４ａ、およびＦ４ｂ）の内、サブハプログループＦ１ｂは１６１８９Ｇ＞Ｃ多型によって定義される。この多型はハプログループＢにおいても検出されること、およびハプログループＢは本研究では糖尿病に関係しなかったことから、１６１８９Ｔ＞Ｃ多型は２型糖尿病とは関係しないと判断される。
【００６１】
ハプログループＮ９ａに特有のｍｔＳＮＰｓは、ほとんど同義突然変異である。これらの同義突然変異のうち、５２３１Ｇ＞Ａおよび１２３７２Ｇ＞Ａは、本研究の遺伝子タイピングに使用した。このハプログループに於ける機能的な多型として考えられる候補は、１５０Ｃ＞Ｔおよび３３８Ｃ＞Ｔであるが、これらはミトコンドリアゲノムの非コード領域にある。１５０Ｃ＞Ｔ置換は、イタリアの百寿者で最初に報告された（非特許文献２３）。また我々は、この置換がフィンランドと日本の両国で共に健康的な長寿者と関連していることを報告している（非特許文献２４）。このため、１５０Ｃ＞Ｔは、女性の場合には２型糖尿病に対する抵抗性を授与するものと考えられる。
【００６２】
ハプログループＮ９ａに特異なｍｔＳＮＰｓのうちでは、１２３５８Ａ＞ＧがＮＤ５サブユニットにＴ８Ａ置換（８位のスレオニンをアラニンに置換する）を惹き起こすことから、潜在的な機能的な多型であると考えられる。１２３５８Ａ＞Ｇによって惹き起こされたＴ８Ａ置換が、ＮＤ５サブユニットおよび複合体Ｉの機能に影響を与えるかも知れない。１２３５８Ａ＞Ｇ（ＮＤ５：Ｔ８Ａ）がミトコンドリア機能に与える具体的な作用については、細胞実験によって調査することができ得る。１５０Ｃ＞Ｔと１２３５８Ａ＞Ｇの両者を備えたハプログループＮ９ａを持つ女性の代謝特性は、２型糖尿病に対する抵抗性の機構を理解するために更なる調査が望まれる。
【００６３】
本研究において、女性の場合には、ハプログループＡが２型糖尿病への感受性と関連を持つことを見出した。ハプログループＡは８７９４Ｃ＞Ｔ突然変異を特徴とするが、この変異はＡＴＰａｓｅサブユニット６においてＨ９０Ｙ置換（９０位のヒスチジンをチロシンに置換する）を惹き起こす。ＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅは、核ＤＮＡにコードされた１０−１６個のサブユニットおよびｍｔＤＮＡにコードされた２個のサブユニット（ＡＴＰａｓｅ６およびＡＴＰａｓｅ８）から構成される。ＡＴＰ６遺伝子は、サブユニットaをコードする。サブユニットａは、ＡＴＰａｓｅのＦｏセクタを横断してプロトンを輸送する際に重要な役割を果たす。Ｌ１５６Ｒ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｇトランスバージョン、およびＬ１５６Ｐ置換を惹き起こす８９９３Ｔ＞Ｃトランジションは、ＮＡＲＰ（神経障害、運動失調、および色素視神経網膜炎）症候群（非特許文献２５、２６）の原因となる病原性突然変異である。従って、８７９４Ｃ＞Ｔによって惹き起こされたＨ９０Ｙ置換がＡＴＰ６サブユニットとＦｏＦ１−ＡＴＰａｓｅ（複合体Ｖ）の機能に影響を与える可能性がある。
【００６４】
ミトコンドリア機能および代謝に対する８７９４Ｃ＞Ｔ（ＡＴＰ６：Ｈ９０Ｙ）の実際の効果については、この多型と２型糖尿病に対する感受性との関係を理解するために更なる調査が望まれる。ミトコンドリアには組換え機構が存在しないので、各ハプログループあるいはサブハプログループに於けるｍｔＳＮＰｓの全ては、相互に強く連鎖している。従って、本研究で調べたｍｔＳＮＰｓのいくつかが連鎖不均衡にあって、２型糖尿病に対する感受性若しくは抵抗性を実際に担う他のミトコンドリア遺伝子の機能的な多型にそのｍｔＳＮＰが連鎖している可能性がある。女性の場合、ハプログループＮ９ａは２型糖尿病に対する抵抗性に関係していたが、この関係は男性の場合には検出されなかった。
【００６５】
遺伝的変異と肥満との関係は、男性の場合に比べると女性の方が強いという考えを支持する他の証拠がある（非特許文献２７、２８）。Ｃｏｍｕｚｚｉｅらは、性相互作用により遺伝子型を導入し、脂肪重量をメンデル混合モデルにて分析したところ、男性では脂肪重量の分散値全体の３７％を主な遺伝子が担い、女性では４３％を担っていた（非特許文献２８）。これまでに、核遺伝子多型と糖尿病との間の関係についての関連解析がいくつか認められる。グルコキナーゼをコードする遺伝子の多型（非特許文献２９）、インスリン受容体基質１（非特許文献３０）、ペルオキシソーム増殖因子活性性受容体γ（非特許文献３１）、カルパイン−１０（非特許文献３２）、およびアディポネクチン（非特許文献３３）は、糖尿病に関連するものと報告されている。
しかしながら、ミトコンドリアＤＮＡ多型と２型糖尿病との関係に対する性別の果たす影響に関しては、今までのところほとんど報告が見られない。本明細書が、初めての報告である。
【００６６】
このように、本実施形態によれば、ｍｔＤＮＡのハプログループを検出することにより、２型糖尿病の遺伝的危険度を予測することができる。このことにより、２型糖尿病の予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００６７】
【非特許文献１】van den Ouweland JM, Lemkes HH, Ruitenbeek W, Sandkuijl LA, de Vijlder MF, Struyvenberg PA, van de Kamp JJ, Maassen JA: Mutation in mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) gene in a large pedigree with maternally transmitted type II diabetes mellitus and deafness. Nat Genet 1:368-371, 1992
【非特許文献２】Guo LJ, Oshida Y, Fuku N, Takeyasu T, Fujita Y, Kurata M, Sato Y, Ito M, Tanaka M: Mitochondrial genome polymorphisms associated with type-2 diabetes or obesity. Mitochondrion 5:15-33, 2005
【非特許文献３】Kokaze A, Ishikawa M, Matsunaga N, Yoshida M, Makita R, Satoh M, Teruya K, Sekiguchi K, Masuda Y, Harada M, Uchida Y, Takashima Y: Longevity-associated mitochondrial DNA 5178 C/A polymorphism is associated with fasting plasma glucose levels and glucose tolerance in Japanese men.   Mitochondrion 5:418-425, 2005
【非特許文献４】Okura T, Koda M, Ando F, Niino N, Tanaka M, Shimokata H: Association of the mitochondrial DNA 15497G/A polymorphism with obesity in a middle-aged and elderly Japanese population. Hum Genet 113:432-436, 2003
【非特許文献５】Lowell BB, Shulman GI: Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes. Science 307:384-387, 2005
【非特許文献６】Macaulay V, Hill C, Achilli A, Rengo C, Clarke D, Meehan W, Blackburn J, Semino O, Scozzari R, Cruciani F, Taha A, Shaari NK, Raja JM, Ismail P, Zainuddin Z, Goodwin W, Bulbeck D, Bandelt HJ, Oppenheimer S, Torroni A, Richards M: Single, rapid coastal settlement of Asia revealed by analysis of complete mitochondrial genomes. Science 308:1034-1036, 2005
【非特許文献７】Wallace DC: A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 39:359-407, 2005
【非特許文献８】Mishmar D, Ruiz-Pesini E, Golik P, Macaulay V, Clark AG, Hosseini S, Brandon M, Easley K, Chen E, Brown MD, Sukernik RI, Olckers A, Wallace DC: Natural selection shaped regional mtDNA variation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 100:171-176, 2003
【非特許文献９】Ruiz-Pesini E, Mishmar D, Brandon M, Procaccio V, Wallace DC: Effects of purifying and adaptive selection on regional variation in human mtDNA. Science 303:223-226, 2004
【非特許文献１０】Montiel-Sosa F, Ruiz-Pesini E, Enriquez JA, Marcuello A, Diez-Sanchez C, Montoya J, Wallace DC, Lopez-Perez MJ: Differences of sperm motility in mitochondrial DNA haplogroup U sublineages. Gene 368C:21-27, 2006
【非特許文献１１】Baudouin SV, Saunders D, Tiangyou W, Elson JL, Poynter J, Pyle A, Keers S, Turnbull DM, Howell N, Chinnery PF: Mitochondrial DNA and survival after sepsis: a prospective study. Lancet 366:2118-2121, 2005
【非特許文献１２】Pyle A, Foltynie T, Tiangyou W, Lambert C, Keers SM, Allcock LM, Davison J, Lewis SJ, Perry RH, Barker R, Burn DJ, Chinnery PF: Mitochondrial DNA haplogroup cluster UKJT reduces the risk of PD. Ann Neurol 57:564-567, 2005
【非特許文献１３】Tanaka M, Gong JS, Zhang J, Yoneda M, Yagi K: Mitochondrial genotype associated with longevity. Lancet 351:185-186, 1998
【非特許文献１４】Ikebe S, Tanaka M, Ozawa T: Point mutations of mitochondrial genome in Parkinson's disease. Brain Res Mol Brain Res 28:281-295, 1995
【非特許文献１５】Tanaka M: Mitochondrial genotypes and cytochrome b variants associated with longevity or Parkinson's disease. J Neurol 249 Suppl 2:II11-18, 2002
【非特許文献１６】Fuku N, Oshida Y, Takeyasu T, Guo LJ, Kurata M, Yamada Y, Sato Y, Tanaka M: Mitochondrial ATPase subunit 6 and cytochrome b gene polymorphisms in young obese adults. Biochem Biophys Res Commun 290:1199-1205, 2002
【非特許文献１７】Tanaka M, Cabrera VM, Gonzalez AM, Larruga JM, Takeyasu T, Fuku N, Guo LJ, Hirose R, Fujita Y, Kurata M, Shinoda K, Umetsu K, Yamada Y, Oshida Y, Sato Y, Hattori N, Mizuno Y, Arai Y, Hirose N, Ohta S, Ogawa O, Tanaka Y, Kawamori R, Shamoto-Nagai M, Maruyama W, Shimokata H, Suzuki R, Shimodaira H: Mitochondrial genome variation in eastern Asia and the peopling of Japan. Genome Res 14:1832-1850, 2004
【非特許文献１８】Poulton J, Brown MS, Cooper A, Marchington DR, Phillips DI: A common mitochondrial DNA variant is associated with insulin resistance in adult life. Diabetologia 41:54-58, 1998
【非特許文献１９】Weng SW, Liou CW, Lin TK, Wei YH, Lee CF, Eng HL, Chen SD, Liu RT, Chen JF, Chen IY, Chen MH, Wang PW: Association of mitochondrial DNA 16189 variant (T->C transition) with metabolic syndrome in Chinese adults. J Clin Endocrinol Metab 90:5037-5040, 2005
【非特許文献２０】Chinnery PF, Elliott HR, Patel S, Lambert C, Keers SM, Durham SE, McCarthy MI, Hitman GA, Hattersley AT, Walker M: Role of the mitochondrial DNA 16184-16193 poly-C tract in type 2 diabetes. Lancet 366:1650-1651, 2005
【非特許文献２１】Itoh Y, Mizuki N, Shimada T, Azuma F, Itakura M, Kashiwase K, Kikkawa E, Kulski JK, Satake M, Inoko H: High-throughput DNA typing of HLA-A, -B, -C, and -DRB1 loci by a PCR-SSOP-Luminex method in the Japanese population. Immunogenetics 57:717-729, 2005
【非特許文献２２】Howell N, Halvorson S, Burns J, McCullough DA, Paulton J: When does bilateral optic atrophy become Leber hereditary optic neuropathy? Am J Hum Genet 53:959-963, 1993
【非特許文献２３】Zhang J, Asin-Cayuela J, Fish J, Michikawa Y, Bonafe M, Olivieri F, Passarino G, De Benedictis G, Franceschi C, Attardi G: Strikingly higher frequency in centenarians and twins of mtDNA mutation causing remodeling of replication origin in leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 100:1116-1121, 2003
【非特許文献２４】Niemi AK, Moilanen JS, Tanaka M, Hervonen A, Hurme M, Lehtimaki T, Arai Y, Hirose N, Majamaa K: A combination of three common inherited mitochondrial DNA polymorphisms promotes longevity in Finnish and Japanese subjects. Eur J Hum Genet 13:166-170, 2005
【非特許文献２５】Holt IJ, Harding AE, Petty RK, Morgan-Hughes JA: A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy. Am J Hum Genet 46:428-433, 1990
【非特許文献２６】Tanaka M, Borgeld HJ, Zhang J, Muramatsu S, Gong JS, Yoneda M, Maruyama W, Naoi M, Ibi T, Sahashi K, Shamoto M, Fuku N, Kurata M, Yamada Y, Nishizawa K, Akao Y, Ohishi N, Miyabayashi S, Umemoto H, Muramatsu T, Furukawa K, Kikuchi A, Nakano I, Ozawa K, Yagi K: Gene therapy for mitochondrial disease by delivering restriction endonuclease SmaI into mitochondria. J Biomed Sci 9:534-541, 2002
【非特許文献２７】Borecki IB, Bonney GE, Rice T, Bouchard C, Rao DC: Influence of genotype-dependent effects of covariates on the outcome of segregation analysis of the body mass index. Am J Hum Genet 53:676-687, 1993
【非特許文献２８】Comuzzie AG, Blangero J, Mahaney MC, Mitchell BD, Hixson JE, Samollow PB, Stern MP, MacCluer JW: Major gene with sex-specific effects influences fat mass in Mexican Americans. Genet Epidemiol 12:475-488, 1995
【非特許文献２９】Vionnet N, Stoffel M, Takeda J, Yasuda K, Bell GI, Zouali H, Lesage S, Velho G, Iris F, Passa P, et al.: Nonsense mutation in the glucokinase gene causes early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 356:721-722, 1992
【非特許文献３０】Almind K, Bjorbaek C, Vestergaard H, Hansen T, Echwald S, Pedersen O: Aminoacid polymorphisms of insulin receptor substrate-1 in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet 342:828-832, 1993
【非特許文献３１】Altshuler D, Hirschhorn JN, Klannemark M, Lindgren CM, Vohl MC, Nemesh J, Lane CR, Schaffner SF, Bolk S, Brewer C, Tuomi T, Gaudet D, Hudson TJ, Daly M, Groop L, Lander ES: The common PPARgamma Pro12Ala polymorphism is associated with decreased risk of type 2 diabetes. Nat Genet 26:76-80, 2000
【非特許文献３２】Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI: Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. Nat Genet 26:163-175, 2000
【非特許文献３３】Hara K, Boutin P, Mori Y, Tobe K, Dina C, Yasuda K, Yamauchi T, Otabe S, Okada T, Eto K, Kadowaki H, Hagura R, Akanuma Y, Yazaki Y, Nagai R, Taniyama M, Matsubara K, Yoda M, Nakano Y, Tomita M, Kimura S, Ito C, Froguel P, Kadowaki T: Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population. Diabetes 51:536-540, 2002
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図３】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（１）である。図の下端には、ハプログループ及びサブハプログループを示している（図４及び図４においても同じである）。
【図４】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（２）である。
【図５】ｍｔＳＮＰに基づくハプログループ分類を示す図（３）である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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