(57)【要約】【課題】より強力な高脂血症治療剤を提供すること。【解決手段】ＦＸＲ活性を有する下記の式（１）で示される化合物を用いることにより達成する。  【化１】      2005281155.tif 000010式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。【選択図】  図１
2005281155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とするFXRの活性化法。
【化１】
2005281155.tif 000006
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２
は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、
アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項２】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とするコレステロール低下薬。
【化１】
2005281155.tif 000007
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２
は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、
アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項３】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とする高脂血症予防治療薬。
【化１】
2005281155.tif 000008
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２
は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、
アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項４】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とする肝内胆汁うっ滞症予防治療薬。
【化１】
2005281155.tif 000009
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２
は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、
アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症治療剤及び肝内胆汁うっ滞症治療剤として有用なFXR（farnesoid X receptor）転写活性調節剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症は、遺伝性、もしくは不適切な食事や運動不足が原因で、血中の脂質が過剰となり、動脈硬化を引き起こして虚血性心疾患などの様々な成人病をもたらす。
【０００３】
一方核内レセプターは、リガンドの結合により活性化され、標的遺伝子の発現を制御する転写因子であり、様々な生理現象に重要な役割を果たしている。1999年に、核内レセプターの一員であるFXRのリガンドが、ケノデオキシコール酸（CDCA）をはじめとする胆汁酸分子であり、CDCAによりFXRの転写活性が増強されることが示された（非特許文献１，２，３）。
【０００４】
胆汁酸はコレステロールより合成されるが、この転換は最終産物である胆汁酸により抑制される。胆汁酸により活性化されるFXRは律速酵素であるコレステロール7αヒドロキシラーゼ（CYP7A1）の遺伝子発現を抑制することにより、このフィードバック制御を担っている。FXRを欠損したマウスでは、血中コレステロール、胆汁酸、トリグリセリド等の上昇をきたすことが明らかとなった(非特許文献４)。胆汁酸は腸管からのコレステロール吸収を促進するため、FXR欠損マウスでは、コレステロールの胆汁酸への転換は促進されるものの、胆汁酸生合成量の増加により、腸管からのコレステロール吸収が促進されたためと考えられる。また、FXRの活性化が血清トリグリセリドの低下を引き起こすという報告もされている（非特許文献５）。したがって、FXRの活性化剤には血清トリグリセリド、コレステロール低下作用が期待され、高脂血症の予防治療薬の有力な候補となる。
【０００５】
また、FXR活性化剤は肝内胆汁うっ滞症の治療薬としても有用である(非特許文献６)。肝内胆汁うっ滞症は肝臓内で胆汁の流れが滞り、肝細胞が壊れていく病気である。FXRは、胆汁酸の胆汁中への排泄を担い腸肝循環に重要な遺伝子であるbile salt export pump遺伝子(BSEP)の発現を促進することから、FXRの活性化剤は肝内からの胆汁酸の排出を促し、肝内胆汁うっ滞を改善すると考えられる。
【０００６】
強力なFXRの生理的リガンドとして知られるケノデオキシコール酸(CDCA)は毒性をもつリトコール酸に代謝されるため、医薬品としての活用は困難である。しかし、胆汁酸とは異なる構造を持つ化合物は，毒性物質へ代謝されない高脂血症予防治療薬として期待される。
【非特許文献１】Makishima, M. et al., Science, 284, pp.1362-1365, 1999
【非特許文献２】Parks  D. J. et al., Science, 284, pp.1365-1368, 1999
【非特許文献３】Wang,H. et al., Mol. Cell, 3, pp.543-553, 1999
【非特許文献４】Sinal et al., Cell 102, pp731-744, 2000
【非特許文献５】Maloney et al., J. Med. Chem. 43, pp.2971-2974, 2000
【非特許文献６】Liu et al., J. Clin. Invest, pp.1678-1687, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
コレステロール低下剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤が臨床上高い評価を受けている。しかしながら、高い血清コレステロール値を持つ家族性高コレステロール血症の患者、あるいは冠動脈疾患をもつ患者に対し、目標とする低レベルの血清コレステロール値まで下げるには十分な効果を有しておらず、このような患者にも有効な、より強力な高脂血症治療剤が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
HMG-CoA還元酵素阻害剤の主な作用メカニズムは間接的なLDL受容体の発現増強作用にあると考えられている。しかしながら、その作用には限界があり、血清コレステロールの濃度に下げ止まりがあることも事実である。そこでHMG-CoA還元酵素阻害剤とは異なる作用メカニズムの医薬品を開発する事により、単独またはHMG-CoA還元酵素阻害剤との併用により強力な血清コレステロール低下作用を示すことが期待できる。FXRの活性化剤はHMG-CoAとは異なる作用メカニズムを持つため有用なコレステロール低下薬となりうる。さらにFXRの活性化剤には血清トリグリセリドを低下させる働きがあることからも、高脂血症予防治療薬として期待が持たれる。
【０００９】
本発明はレポータージーンアッセイを用いギンコール酸がFXR活性化作用をもつことを発見する事により完成に至った。すなわち本発明は下記の式(1)に示した化合物（１）がFXR活性化作用をもつことに基づくものである。
【化１】
2005281155.tif 000003
【００１０】
式中、Ｒ１は水素原子、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能
基、Ｒ２は水素原子、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、
Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
本化合物は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の薬学的
に許容される塩である場合を含む。
【発明の効果】
【００１１】
上記化合物は、FXRの転写活性調節を行うことにより血清トリグリセリド、コレステロール低下作用が期待される。また、これら化合物は胆汁酸とは異なる構造をもつ化合物であり、毒性を持つリトコール酸に代謝されることが無い。従って、効果的な高脂血症予防治療薬として期待できる。また、FXRの活性化はBSEPの転写を促進し肝内胆汁うっ滞症の予防治療薬としても有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
化学式で表される化合物およびその塩は、これを医薬として用いるにあたり経口的または非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の形で経口的に投与することができ、あるいはその溶液、乳剤、懸濁液等の液剤の形にしたものを注射の形で非経口投与することができる。坐剤の形で直腸投与することもできる。また、前記の適当な投与剤形は許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤などに活性化合物を配合することにより製造することができる。また、注射剤として用いる場合には許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。また、本発明の化合物の投与量は、通常1~50mg/体重kgであり、好ましくは5~30mg/体重kgである。投与対象は、哺乳動物であり、通常ヒトである。
【実施例】
【００１３】
(実施例１)レポータージーンアッセイによるFXR活性化化合物の評価
FXRはリガンドと結合しFXR結合配列(FXRE)に結合することにより下流の遺伝子の転写促進を行う。FXR結合配列(FXRE)下にCMV promoterの3'側201 bpと enhanced yellow fluorescent protein (EYFP)遺伝子をつないだプラスミド (レポータープラスミド)とSV40 promoter下にenhanced cyan fluorescent protein (ECFP)遺伝子をつないだプラスミド(内部標準測定用プラスミド)、核内受容体発現用プラスミドとしてRXR遺伝子を有するプラスミド及びFXR遺伝子を有するプラスミドの4種をCOS7細胞に導入した。この細胞の培養液中に被験化合物を添加し、約40時間後に培地を除きPBSでwashした後EYFPとECFPの蛍光を測定した。細胞内へのプラスミドの導入効率等の補正を行うために、内部標準として測定したECFPの蛍光値でEYFPの蛍光値の補正を行った。すなわちFXRの転写活性は(EYFPの蛍光値) / (ECFPの蛍光値)の値により評価を行った。
【００１４】
式(1)中、R1=H、R2=8-pentadecenylであるギンコール酸15:1(式(2)の化合物)、及び、式(1)中、R1=H、R2=10-heptadecenylであるギンコール酸17:1(式(3)の化合物)処理により、FXR転写活性の促進が引き起こされた（図１）。これらの活性化は同濃度のCDCAと同等もしくは高い率であった。なお、これらの化合物はRXRの活性化は引き起こさずFXRを活性化する事により、レポータージーンの発現を上昇させた。
【化２】
2005281155.tif 000004
【化３】
2005281155.tif 000005
【００１５】
(実施例2)定量的RT-PCR
CYP7Ａ1 mRNAの発現量抑制及びsmall heterodimer partner(SHP) mRNAの発現量増加を定量的PCRで測定した。SHP遺伝子はFXRの活性化により転写促進されることが明らかとなっており、CYP7A1と同様にFXR活性化の指標として使用できる。肝癌由来培養細胞であるHepG2を10% FCSを含むDMEM培地で培養した。培地を10%活性炭処理FCSを含むフェノールレッド不含DMEMに交換後、さらに6時間後に被験物質及び10%活性炭処理FCSを含むフェノールレッド不含DMEMに置換し培養を行った。24時間後細胞を回収し、RNeasy kit (QIAGEN)を用いてRNAの抽出を行った。得られたRNAを用い、TaqMan PCR法によりCYP7A1及びSHP mRNAの定量を行った。各試料は18s rRNAを用いてRNA濃度の補正を行った。
【００１６】
コントロールとして使用したDMSO  0.1%処理との比較の結果、ギンコール酸は30 μMでCYP7A1 mRNAの発現を約70%抑制し、SHP mRNAの発現を約2倍に上昇させた。これより、これら化合物がFXRの活性化を引き起こし下流の遺伝子の発現量を調整することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各被験化合物の濃度依存的FXR活性化効果を示したレポータージーンアッセイの結果を示す。
【図２】HepG2細胞を用い、各被験化合物のFXRにより転写制御を受ける遺伝子発現への影響を示した図である。遺伝子としてCYP7A1及びSHPのmRNAの測定を行った。
【図１】
2005281155.tif 000011
【図２】
2005281155.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月2日(2004.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とするＦＸＲの活性化法。
【化１】
2005281155.tif 000013
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項２】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とするコレステロール低下薬。
【化１】
2005281155.tif 000014
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項３】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とする高脂血症予防治療薬。
【化１】
2005281155.tif 000015
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【請求項４】
下記の式（１）で示されるギンコール酸又はその誘導体を用いることを特徴とする肝内胆汁うっ滞症予防治療薬。
【化１】
2005281155.tif 000016
式中Ｒ１は水素、アシル基、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基、Ｒ２は水素、アルキル基、アリール基から選ばれる官能基を示し、Ｒ３はアルキル基、アルキニル基、アルケニル基から選ばれる官能基を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明はレポータージーンアッセイを用いギンコール酸がＦＸＲ活性化作用をもつことを発見する事により完成に至った。すなわち本発明は下記の式(1)に示した化合物（１）がＦＸＲ活性化作用をもつことに基づくものである。
【化１】
2005281155.tif 000017