(57)【要約】【課題】  キャピラリービーズアレイに代表されるキャピラリーとビーズを利用した生体高分子検出技術において、ビーズの配列方法の簡便化とビーズの種類識別能、感度の向上を図る。【解決手段】  キャピラリー３１中に、キャピラリー中の拡幅された空洞部分であって、複数のビーズ３３を貯留させることができるビーズ拘束場３２を設ける。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子の検出及び測定に用いるキャピラリービーズアレイであって、キャピラリーの途中に、キャピラリー中の拡幅された空洞部分であって、複数のビーズを貯留させることができるビーズ拘束場を設けたことを特徴とするキャピラリービーズアレイ。
【請求項２】
キャピラリー中のビーズ拘束場を、サンプル溶液のＩＮ側をＯＵＴ側より下方に傾斜して配置したことを特徴とする請求項１に記載のキャピラリービーズアレイ。
【請求項３】
ビーズ拘束場中にビーズを互いに重ならないように単粒子層に貯留したことを特徴とする請求項１又は２に記載のキャピラリービーズアレイ。
【請求項４】
キャピラリー本数が二本以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のキャピラリービーズアレイ。
【請求項５】
複数のキャピラリーが同心円状に配置されたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキャピラリービーズアレイ。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のキャピラリービーズアレイを用い、サンプル溶液はビーズ拘束場のＩＮ側から入れ、ビーズ拘束場のＯＵＴ側から出すことを特徴とする生体高分子の検出及び測定方法。
【請求項７】
ビーズに励起光を照射し、ビーズが発する蛍光を測定することを特徴とする請求項６に記載の生体高分子の検出及び測定方法。
【請求項８】
ビーズに照射する励起光の光軸と測定する蛍光の光軸が一致していないことを特徴とする請求項７に記載の生体高分子の検出及び測定方法。
【請求項９】
測定する蛍光の光軸がキャピラリービーズアレイのビーズ拘束場の面に対して傾斜していることを特徴とする請求項７又は８に記載の生体高分子の検出及び測定方法。
【請求項１０】
請求項１乃至５のいずれかに記載のキャピラリービーズアレイを載置する手段と、サンプル溶液を導入・排出する注排手段と、ビーズ拘束場のビーズに励起光を照射する照射手段と、ビーズが発光する蛍光を計測する手段とを有する生体高分子の検出及び測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子の検出及び測定に関わるプローブアレイ技術等において、ビーズの配列方法の簡便化を実現し、併せてビーズの種類を識別しやすくする技術に関する。また、反応後の読み取り作業の効率化についても含まれる。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子の検出、測定及び分析技術（これらについて、以下すべて「検出」という。）においては、様々な方法が提案されており、既に製品化され実用されているものも少なくない。そのような中で、既知のプローブ生体高分子を基板及び基質上に固定し、蛍光物質で標識したサンプル生体高分子を、前記基板又は基質上に固定化されたプローブ生体高分子と反応させ、基板又は基質上の標識した蛍光物質由来の蛍光強度によりプローブ生体高分子とサンプル生体高分子の結合量を測定し、生体高分子の検出を行う手法があげられる。前記基質又は基板として選択されるものとして、平板及びビーズに大略構成され、それぞれマイクロアレイ技術及びビーズ利用技術として注目を集めている。
【０００３】
まず、平板を基質又は基板として用いたものとしてＤＮＡマイクロアレイがあげられる。ＤＮＡマイクロアレイとは、主に表面修飾ガラス基板上にプローブＤＮＡをスポットとして配列させ固定化したものである。ＤＮＡマイクロアレイは主に二種類あり、半導体技術を応用し基板上でプローブＤＮＡを合成していく方法と、既に合成されたオリゴＤＮＡあるいはｃＤＮＡを、液滴として基板上に配列させ固定化させる方法がある。
【０００４】
また、ビーズを基質又は基板として用いたものとして、フローサイトメトリー技術を利用した方法があげられる。本方法は、ＤＮＡマイクロアレイが位置情報を用いて固定されているプローブの種類を識別するのに対し、ビーズ毎に二色以上の蛍光物質色素を用いることによるＩＤを付与することにより、プローブの種類の識別を行っている。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイに代表されるマイクロアレイ技術は、集積度が高く、一回の操作で膨大な情報量が得られることから、研究用途を中心に幅広く利用されているものである。しかし、プローブを固定化させる工程において高度な技術を要することや、一枚あたりの生産コストが高く、プローブの固定化において基質又は基板との結合力が比較的弱いことが問題となってきた。一方、ビーズ技術においては、ビーズのＩＤ化について高度な技術を要するものの、プローブと基質又は基板との結合が比較的強く、ビーズの合成が比較的安価に行うことが可能である点で優れており、それぞれ一長一短がある。尚、上記例ではＤＮＡを用いた方法について紹介したが、これらをペプチドやたんぱく質あるいは細胞に置き換える技術についても進展している。
【０００６】
そこで、下記特許文献２等に開示されるように、マイクロアレイ技術とビーズ利用技術を融合させた形態としてキャピラリービーズアレイ技術が考案された。本技術は、プローブを基質又は基板に固定化する工程と、プローブを基板上に配列させる工程を別とすることに大きな特徴を持つ。すなわち、予めビーズにプローブを固定化させ、該ビーズを基板上の溝やキャピラリー中などに配列させるものである。プローブの種類はビーズの位置情報において判断することができ、反応は溝やキャピラリー中にサンプル溶液を通過させることにより行う。これにより、マイクロアレイ技術の問題点とビーズ利用技術の問題点の多くを解決するだけでなく、プローブとサンプルとの反応性が向上することも期待でき、装置の自動化についても比較的容易に構築できることが考えられる。
【０００７】
特許文献２では、軟質樹脂などに形成したキャピラリーに、生体分子検出用のプローブを結合させたプローブビーズを配列したキャピラリービーズアレイにおいて、ビーズの位置確認するために、プローブビーズの一定個数毎に、プローブビーズと色又はサイズの異なるマーカービーズを配置する方法が開示されている。このときマーカービーズにはプローブが結合していてもしていなくてもよい。マーカービーズの位置を目印としてプローブビーズの順番、すなわちビーズに結合しているプローブの種類を知ることができる。本方法は、主に光学顕微鏡などを用いてビーズの位置を目視にて確認する際に有効な方法である。
【０００８】
一方、キャピラリービーズアレイ技術では、生体分子の高感度検出方法として蛍光検出法を適用することが可能である。蛍光検出法を適用する場合、蛍光標識された標的となる生体分子を含むサンプル溶液をキャピラリーに導入する。該生体分子は、該生体分子と相補性を有するプローブを結合したプローブビーズに捕捉される。蛍光標識された標的となる生体分子を捕捉したプローブビーズだけが蛍光を発する。従って、蛍光読取装置にてキャピラリーのプローブビーズの蛍光検出を行うと、蛍光標識された生体分子を捕捉したビーズのみが検出される。蛍光を発しないプローブビーズは検出されないため、これらのプローブビーズの位置並びに個数を正確に知ることは非常に困難である。これは、蛍光を発するプローブビーズの順番、すなわちプローブビーズに結合しているプローブの種類も正確に知ることができないということを意味する。
【０００９】
このように、キャピラリービーズアレイに蛍光検出法を適用する場合、特許文献２に開示されたビーズの位置確認方法だけでは、プローブビーズの順番、すなわちプローブの種類を確認するのが非常に困難であった。そこで、プローブビーズアレイにおいて蛍光読取装置によりプローブの種類を正確に同定することができる方法が必要であった。
【００１０】
又、キャピラリービーズアレイにサンプル溶液を導入すると、ビーズとの反応が進行するにつれて、サンプル溶液の濃度が急速に減少し、数十から数百個にも及ぶビーズの全てと充分な反応ができないという問題があった。この問題は大量のサンプル溶液を使用すれば解決することではあるが、試料を少なくすることは、経済的に求められる課題である。
【００１１】
【特許文献１】特開平１１−２４３９９７号公報
【特許文献２】特開２０００−３４６８４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
キャピラリービーズアレイは、サンプル溶液とビーズとの反応性がよく、蛍光測定を行うことで全自動化に適していることが特徴であるが、直線的なキャピラリー上にビーズを配列した場合、ビーズを順序良く配列させることが難しく、ビーズの種類を識別することも難しかった。
【００１３】
本発明は、マイクロアレイ技術とビーズ利用技術を融合させたキャピラリーアレイ技術において、キャピラリー中へのビーズの配列作業を簡便化するとともに、ビーズの識別能を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、キャピラリー中に、ビーズを貯留する拘束場を設けることにより、上記課題が解決されることを見出し本発明に至った。
【００１５】
即ち、第１に、本発明はキャピラリービーズアレイの発明であり、キャピラリー中の拡幅された空洞部分であって、複数のビーズを貯留させることができるビーズ拘束場をキャピラリーの途中に設けたことを特徴とする。これにより、特別の配列作業を有することなく、一定量のビーズを少量のサンプル溶液と均一に反応させることができる。ビーズ拘束場の平面形状は特に限定されず、円盤状、楕円状、ひし形状、長方形状、多角形状などが例示される。又、ビーズ拘束場中に、邪魔板や突起物を意図的に設けることによって、サンプル溶液に渦を起こし、ビーズとの反応を促進することも好ましい。
【００１６】
ここで、ビーズ拘束場は、反応の場と蛍光測定の場を兼ねるものであり、反応後に、所望により洗浄等の操作を行った後に励起光を照射し、ビーズが発光する蛍光を測定することができる。
【００１７】
キャピラリー中のビーズ拘束場は、サンプル溶液のＩＮ側をＯＵＴ側より下方に傾斜して配置することが好ましい。
【００１８】
キャピラリービーズアレイを構成するキャピラリーの本数は１本である必要はなく、大量のサンプル溶液を反応させたり、多種類の反応を見るには、キャピラリーが二本以上であることが好ましい。複数のキャピラリーを同心円状に配置すると、コンパクトなキャピラリービーズアレイを作製することができる。
【００１９】
第２に、本発明は上記キャピラリービーズアレイを用いた生体高分子の検出及び測定方法である。サンプル溶液はビーズ拘束場のＩＮ側から入れ、ビーズ拘束場のＯＵＴ側から出すことにより、少量のサンプル溶液を多数のビーズと均一に反応させることができる。
【００２０】
生体高分子の検出及び測定手段としては、特に限定されないが、蛍光を用いるフローサイトメーターが好ましく用いられる。即ち、ビーズに励起光を照射し、ビーズが発する蛍光を測定することにより、生体高分子の検出及び測定を行う。
【００２１】
ここで、ビーズに照射する励起光の光軸と測定する蛍光の光軸が一致させないことで、蛍光のみを計測することができ、Ｓ／Ｎ比を向上させることができて好ましい。特に、測定する蛍光の光軸がキャピラリービーズアレイの拘束場面に対して傾斜させることによって、単位読取面積あたりの蛍光強度を向上させることができる。
【００２２】
第３に、本発明は、生体高分子の検出及び測定装置の発明であり、上記キャピラリービーズアレイを載置する手段と、サンプル溶液を導入・排出する注排手段と、ビーズ拘束場のビーズに励起光を照射する照射手段と、ビーズが発光する蛍光を計測する手段とを有する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、キャピラリー中へのビーズの配列作業を簡便化又は省略することができる。又、少量のサンプル溶液で一定量のビーズを均一に反応させることができる。更に、大量のビーズの識別範囲を限定させることにより、識別能も向上させた。更に、蛍光読み取り面を傾けることにより、検出及び測定に関する速度と感度の向上を図ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
従来のキャピラリービーズアレイは、図１のように、直線状のキャピラリー中にサンプル溶液を流し、キャピラリー中に配列されたビーズ表面との反応を行うものであった。この方式においては、キャピラリー中に順序良くビーズを配列させることは困難であった。さらに、ビーズの挿入順序に誤りがあった場合においても、それを判別することは難しく、これらの課題を解決することが産業上の実用化を行っていくにあたって強く望まれていた。このような背景に基づき、以下に本発明を実施する場合の形態を、図面を参照して具体的に説明する。
【００２５】
図２に本発明の実施例１のキャピラリービーズアレイを示す。図２を用いて具体的な実施方法について例示する。サンプル溶液の送液は、ＩＮ側にペリスターポンプを配置することにより行う。このとき、ビーズ拘束場のＯＵＴ側をビーズ拘束場のＩＮ側に対して鉛直方向上側に配置することにより、キャピラリー及び拘束場への気泡の混入を防ぐものとする。サンプル溶液はＩＮ側からＯＵＴ側に向かって送液され、ＩＮ側よりキャピラリー中を流れビーズ拘束場を溶液で満たした後、ＯＵＴ側より排出される。
【００２６】
図３に本発明の実施例２のキャピラリービーズアレイを示す。図３を用いて具体的な実施方法について例示する。図４は、図３におけるＡ‐Ａ’断面図である。サンプル溶液の送液は、ＩＮ側にペリスターポンプを配置することにより行う。図４のとおり、ＩＮ側からビーズ拘束場に至る間については勾配が設けられており、気泡等の混入を防いでいる。サンプル溶液はＩＮ側からＯＵＴ側に向かって送液され、ＩＮ側よりキャピラリー中を流れ拘束場を溶液で満たした後、ＯＵＴ側より排出される。
【００２７】
上記いずれの場合においても、ビーズの識別は、領域ごとに行えばよい。すなわち、染色されたビーズを用いた場合、その領域に存在するビーズの種類数以上の染色色数を用意すればよく、識別作業の簡便化が図られる。また、鉛直上側から励起用光源を照射し、同一方向又は読み取り面と垂直方向から読み取ることにより、バックグラウンドシグナルを減少させＳ/Ｎ比を向上させることができ、検出及び測定感度の向上を図ることができる。さらに、図３においては、同一円心上に拘束場が配列されており、同一円中心を中心とした回転により読み取りを行うことで、読み取り時間の短縮を図ることができる。
【００２８】
図５に、励起光の光軸と蛍光の光軸の関係を示す。ここで、ビーズに照射する励起光の光軸と測定する蛍光の光軸が一致させないことで、蛍光のみを計測することができ、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。特に、測定する蛍光の光軸がキャピラリービーズアレイの拘束場面に対して傾斜させることによって、本来Ｓの面積の蛍光発光をより小さい面積であるＳ’で計測することにより光束密度を向上させることができ、感度の向上が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明により、プローブアレイに代表されるキャピラリーとビーズを利用した生体高分子検出技術において、製造コストを削減し、検出及び測定に関する時間の短縮や感度の向上を図ることができる。これにより、プローブアレイに代表されるキャピラリーを用いたビーズアレイを、コストが安く、検出及び測定速度の速い汎用性のあるデバイスとして市場に提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】従来のビーズアレイの構造を示す概略図である。
【図２】実施例１における構造の概略図である。
【図３】実施例２における構造の概略図である。
【図４】実施例２における構造の断面概略図である。
【図５】拘束場における励起光の光軸と蛍光の光軸の関係を示す。
【符号の説明】
【００３１】
１１・・・キャピラリー、１２・・・ビーズ、２１・・・キャピラリー、２２・・・拘束場、２３・・・ビーズ、３１・・・キャピラリー、３２・・・拘束場、３３・・・ビーズ、５１・・・キャピラリー、５２・・・拘束場、５３・・・ビーズ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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