(57)【要約】【課題】  C型肝炎ウイルスのNS3プロテアーゼを標的とする、ヘテロ二量体RNAアプタマーを提供する。【解決手段】  ヘテロ二量体を形成する一組のRNA分子から構成され、C型肝炎ウイルス（HCV）のNS3プロテアーゼに対して結合活性、阻害活性を有するRNAアプタマー。本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、C型肝炎の診断、予防又は治療に使用することができる。【選択図】  図４
2005151890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体を形成する一組のRNA分子からなり、C型肝炎ウイルス由来のNS3タンパク
質に対する結合活性及び阻害活性を有するRNAアプタマー。
【請求項２】
上記一組のRNA分子のうち一方のRNA分子は単独で上記結合活性及び阻害活性を有し、他方のRNA分子との間でヘテロ二量体を形成した状態で上記結合活性及び阻害活性が上昇す
ることを特徴とする請求項１記載のRNAアプタマー。
【請求項３】
上記一組のRNA分子のうち一方のRNA分子が、ループ構造を形成する下記の塩基配列5’-GAWUGGGAC-3’（WはA又はU）
を有することを特徴とする請求項１記載のRNAアプタマー。
【請求項４】
上記ループ構造を形成する塩基配列の両末端側にステム構造を形成する塩基配列を有し、ループ-ステム構造を形成していることを特徴とする請求項３記載のRNAアプタマー。
【請求項５】
上記一方のRNA分子は、下記の塩基配列
5'-RGGAGA-3'（RはA又はG）
に対して相補鎖を形成しうる塩基配列を有することを特徴とする請求項３記載のRNAアプ
タマー。
【請求項６】
上記相補鎖を形成しうる塩基配列は下記の塩基配列
5’-UCUCCU-3’
であることを特徴とする請求項５記載のRNAアプタマー。
【請求項７】
上記ループ-ステム構造が
5’-GAGGGUAGAAUGGGACUACCUUU-3’（配列番号1）
からなる塩基配列であることを特徴とする請求項４記載のRNAアプタマー。
【請求項８】
上記ループ-ステム構造と上記相補鎖を形成しうる塩基配列との間にリンカー配列を有
することを特徴とする請求項５記載のRNAアプタマー。
【請求項９】
上記リンカー配列は下記の塩基配列
5’-CCUC-3’
であることを特徴とする請求項８記載のRNAアプタマー。
【請求項１０】
上記一方のRNA分子は、上記ループ構造の5'末端側に、上記他方のRNA分子との間でステム構造を形成しうる塩基配列を有することを特徴とする請求項３記載のRNAアプタマー。
【請求項１１】
上記ステム構造を形成しうる塩基配列は、
(i) 5’-GCUUCGGGAUUU-3’（配列番号2）
(ii) 5’-GGGAUUU-3’
(iii) 5’-GGGAGAUUU-3’
からなる群から選択される塩基配列であることを特徴とする請求項１０記載のRNAアプタ
マー。
【請求項１２】
上記一方のRNA配列は、下記の塩基配列
(i) 5’-GGGAGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号3）
(ii) 5’-GCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号4）
(iii)5’-GGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号5）
からなる群から選択される何れかの塩基配列からなることを特徴とする請求項２記載のRNAアプタマー。
【請求項１３】
上記一組のRNA分子のうち他方のRNA分子が、下記の塩基配列
5’-RGGAGA-3’（RはA又はGである）
を有することを特徴とする請求項２記載のRNAアプタマー。
【請求項１４】
上記他方のRNA分子は、上記塩基配列の3’末端側に、上記一方のRNA分子との間で相補
鎖を形成する塩基配列を有することを特徴とする請求項１３記載のRNAアプタマー。
【請求項１５】
上記他方のRNA分子は、下記の塩基配列
(i) 5’-AUCUCCC-3’
(ii) 5’-AUUCCGA-3’
(iii) 5’-AUCCCGA-3’
(iv) 5’-AUUCC-3’
(v) 5’-AUCCC-3’
からなる群から選択される何れかの塩基配列を有することを特徴とする請求項１３記載のRNAアプタマー。
【請求項１６】
上記他方のRNA分子は下記の塩基配列
(i) 5’-AAGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号6）
(ii) 5’-GGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号7）
(iii) 5’-GGGAGAAUUCCGA-3’（配列番号8）
(iv) 5’-GGGAGAAUCCCGA-3’（配列番号9）
(v) 5’-GGGAGAAUUCC-3’（配列番号10）
(vi) 5’-GGGAGAAUCCC-3’（配列番号11）
からなる群から選択される配列からなることを特徴とする請求項１３記載のRNAアプタマ
ー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎診断医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎予防医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎治療医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウィルスのNS3プロテアーゼを標的とするRNA分子であって、特にヘ
テロ二量体を形成するRNA分子に関する。本発明はさらに、該RNA分子を含むC型肝炎の診
断、予防または治療用の医薬組生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、非A及び非B型肝炎の病原体で、慢性肝炎の主要原因であるウイルスである（Houghton, M. et al., Hepatology, 14:381-388 1991; Matsuura, Y and Miyamura, T., Sem. Virol. 4:297-304, 1993; Cuthbert, J.A., Clin. Microbiol. Rev., 7:505-532, 1994）。HCV由来の慢性肝炎の約２０％は肝硬変、肝臓癌へと移行するため、重篤な肝疾患の要因となっており、その感染者および患者は世界各国において急増している（本出願現在、約１億７千万人）。現在までのところ、C型肝炎の治療にはインターフェロンが主に用いられている。しかしながら有効な治療薬が存在していないため、その開発が急務とされている。
【０００３】
HCVは約９５００ヌクレオチドからなるプラス鎖RNAを遺伝子として持ち、フラビウイルス科に分類される。HCV遺伝子は前駆体タンパク質への翻訳を経て、HCV増殖に必要な構造タンパク質（コアタンパク質；C、外被タンパク質；E1、E2）ならびに非構造タンパク質
（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）に変換される（図１参照）。
【０００４】
今までの研究から、この前駆体蛋白質のプロセシングには宿主細胞由来のシグナルペプチダーゼならびにウイルス由来のプロテアーゼが関与している。非構造蛋白質の一つであるNS3は、トリプシン様セリンプロテアーゼファミリーに見られる共通した配列を有して
いる。NS3のN末端側の約1/3にはプロテアーゼドメイン、C末端側の約2/3にはヘリカーゼ
ドメインがコードされている。NS3のヒスチジン1083、アスパラギン酸1107及びセリン1165はセリンプロテアーゼファミリーの中でもキモトリプシン系に属しているようなNS3プロテアーゼの触媒作用のトリアッド（三つ組み）を構成している。NS3領域にコードされて
いるセリンプロテアーゼ（以下、「NS3プロテアーゼ」という）の活性は、非構造蛋白質
間の切断（４箇所；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B;図１参照）に関与しており、NS4Aによって促進されることが報告されている（Hijikata, M. et al., J. Virol., 67:4665-4675, 1993b等）。これらの知見から、NS3プロテアーゼ活性は、HCV増殖に必
要な因子の一つと結論づけられる。このためNS3プロテアーゼ活性阻害剤は、HCV疾患の予防薬および治療薬となりうると考えられている。
【０００５】
本発明者らは先に、NS3プロテアーゼに特異的に結合し、そのプロテアーゼ活性を特異
的に阻害可能なRNAアプタマーを創製することに成功した（特許文献１参照）。アプタマ
ー（aptamer）は、アミノ酸のような小分子からタンパク質、さらにはウイルスのような
高分子を認識する核酸分子であり、インビトロ選択法によって得ることができる。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−１３７２５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、先の研究結果から、上記RNAアプタマーが分割できる可能性を考えた。
上記RNAアプタマーを分割することができると、各々の分子のみではプロテアーゼ阻害活
性を持たない（或いは弱い阻害活性を示す）が、各々の分子を混合することによってヘテ
ロ二量体RNA分子を形成した状態ではプロテアーゼ結合活性並びに阻害活性を有する（或
いは結合活性並びに阻害活性が上昇する）といった機能性RNA分子となりうることが予想
される。
【０００８】
また、上記RNAアプタマーを分割することができると、２分子のRNAアプタマーを利用してモレキュラービーコン（Tyagi, S. and Kramer, F. R. Nature Biotechnology 14:303-308,1996）などの核酸診断薬への応用が期待される。
【０００９】
そこで、本発明の第一の目的は、ヘテロ二量体を形成することによってNS3プロテアー
ゼに対して結合活性並びに阻害活性を有する（或いは結合活性並びに阻害活性が上昇する）といった機能性RNA分子を提供することである。
【００１０】
また、本発明の第二の目的は、C型肝炎の診断、予防及び治療のために、上記RNA分子を利用することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、NS3プロテアーゼに対す
るRNAアプタマーのループ構造の一部を除去しても、NS3プロテアーゼに対する結合活性並びに阻害活性を保持すること、及び当該ループ構造の一部を除去することで上記RNAアプ
タマーをヘテロ二量体として構成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1)  ヘテロ二量体を形成する一組のRNA分子からなり、C型肝炎ウイルス由来のNS3タンパク質に対する結合活性及び阻害活性を有するRNAアプタマー。
(2)  上記一組のRNA分子のうち一方のRNA分子は単独で上記結合活性及び阻害活性を有
し、他方のRNA分子との間でヘテロ二量体を形成した状態で上記結合活性及び阻害活性が
上昇することを特徴とする(1)記載のRNAアプタマー。
(3)  上記一組のRNA分子のうち一方のRNA分子が、ループ構造を形成する下記の塩基配
列5’-GAWUGGGAC-3’（WはA又はU）を有することを特徴とする(1)記載のRNAアプタマー。
(4)  上記ループ構造を形成する塩基配列の両末端側にステム構造を形成する塩基配列
を有し、ループ-ステム構造を形成していることを特徴とする(3)記載のRNAアプタマー。
(5)  上記一方のRNA分子は、下記の塩基配列5'-RGGAGA-3'（RはA又はG）に対して相補
鎖を形成しうる塩基配列を有することを特徴とする(3)記載のRNAアプタマー。
(6)  上記相補鎖を形成しうる塩基配列は下記の塩基配列5’-UCUCCU-3’であることを
特徴とする(5)記載のRNAアプタマー。
(7)  上記ループ-ステム構造が5’-GAGGGUAGAAUGGGACUACCUUU-3’（配列番号1）からなる塩基配列であることを特徴とする(4)記載のRNAアプタマー。
(8)  上記ループ-ステム構造と上記相補鎖を形成しうる塩基配列との間にリンカー配列を有することを特徴とする(5)記載のRNAアプタマー。
(9)  上記リンカー配列は下記の塩基配列5’-CCUC-3’であることを特徴とする(8)記載のRNAアプタマー。
(10)  上記一方のRNA分子は、上記ループ構造の5'末端側に、上記他方のRNA分子との間でステム構造を形成しうる塩基配列を有することを特徴とする(3)記載のRNAアプタマー。
(11)  上記ステム構造を形成しうる塩基配列は、
(i) 5’-GCUUCGGGAUUU-3’（配列番号2）
(ii) 5’-GGGAUUU-3’
(iii) 5’-GGGAGAUUU-3’
からなる群から選択される塩基配列であることを特徴とする(10)記載のRNAアプタマー。
(12)  上記一方のRNA配列は、下記の塩基配列
5’-GGGAGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号3）
5’-GCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号4）
(iii)5’-GGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号5）
からなる群から選択される何れかの塩基配列からなることを特徴とする(2)記載のRNAアプタマー。
(13)  上記一組のRNA分子のうち他方のRNA分子が、下記の塩基配列5’-RGGAGA-3’（R
はA又はGである）を有することを特徴とする(2)記載のRNAアプタマー。
(14)  上記他方のRNA分子は、上記塩基配列の3’末端側に、上記一方のRNA分子との間
で相補鎖を形成する塩基配列を有することを特徴とする(13)記載のRNAアプタマー。
(15)  上記他方のRNA分子は、下記の塩基配列
(i) 5’-AUCUCCC-3’
(ii) 5’-AUUCCGA-3’
(iii) 5’-AUCCCGA-3’
(iv) 5’-AUUCC-3’
(v) 5’-AUCCC-3’
からなる群から選択される何れかの塩基配列を有することを特徴とする(13)記載のRNAア
プタマー。
(16)  上記他方のRNA分子は下記の塩基配列
(i) 5’-AAGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号6）
(ii) 5’-GGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号7）
(iii) 5’-GGGAGAAUUCCGA-3’（配列番号8）
(iv) 5’-GGGAGAAUCCCGA-3’（配列番号9）
(v) 5’-GGGAGAAUUCC-3’（配列番号10）
(vi) 5’-GGGAGAAUCCC-3’（配列番号11）
からなる群から選択される配列からなることを特徴とする(13)記載のRNAアプタマー。
(17）  (1)〜(16)のいずれか一に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎診断医薬組成物。
(18)  (1)〜(16)のいずれか一に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎予防医薬組成物。
(19)  (1)〜(16)のいずれか一に記載のRNAアプタマーを含むC型肝炎治療医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、ヘテロ二量体を形成することによって、HCVのNS3プロテアーゼ活性を阻害する新規の機能性核酸分子である。ヘテロ二量体RNAアプタマーを構成する一組のRNA分子は、単独では阻害活性を有しないか、または弱い阻害活
性を有しているが、ヘテロ二量体を形成することによって阻害活性を発現するか、または阻害活性が上昇する。すなわち、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、モレキュ
ラービーコンなどを利用した診断方法への応用や、C型肝炎ウイルスに感染したが発症し
ていないキャリアに対する発症予防やC型肝炎発症後の治療に使用可能であり、診断成績
、治療成績の向上が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。先ず、本明細書で使用する用語の定義は以下の通りである。
【００１５】
「アプタマー」とは、アミノ酸のような小分子から、タンパク質及びウイルスのような高分子に対して特異的に認識して結合することができる核酸分子を意味し、本発明ではHCV由来のNS3プロテアーゼタンパク質に直接結合して該プロテアーゼの活性を阻害することが可能な機能性RNA分子をいう。阻害作用を有するアプタマーは、インビトロ選択法によ
って得ることができる。この選択法では、ランダムな配列を持つRNA分子のプールから特
定のタンパク質に結合するRNA分子を選択し、増幅するサイクルをくり返すことによって
、上記プールから非常に特異的に結合するRNA分子をアプタマーとして同定する。すなわ
ち、最初はごく僅かしかないそのような分子もPCR法で増幅され、結合の弱い分子はサイ
クルをくり返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残る。
【００１６】
「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造、すなわち、一本鎖核酸における一組の領域が自己分子内で二本鎖構造を形成したときに、当該一組の領域に挟まれる領域がとる構造をいう。
【００１７】
「ステム構造」とは、一組の一本鎖核酸間或いは一本鎖核酸における一組の領域が塩基対合により二本鎖を形成した構造をいう。
【００１８】
「ループ-ステム構造」とは、一本鎖の核酸において、当該核酸がループとステムを形
成した構造をいう。
【００１９】
「ヘテロ二量体」とは、配列及び塩基長が異なる２つの独立した核酸が、相補的な領域において塩基対合を形成し、二本鎖構造をとった構成をいう。特に、一組のRNA分子がヘ
テロ二量体をとった場合、「ヘテロ二量体RNA」と称する。
【００２０】
本発明では、ヘテロ二量体を形成することにより、C型肝炎ウイルス由来のNS3プロテアーゼに対する結合活性を示すRNA分子を提供する。すなわち、本発明に係るRNA分子は、C
型肝炎ウイルス由来のNS3プロテアーゼに対して結合することによって、そのプロテアー
ゼ活性を阻害することができる。なお、以下の説明において、本発明に係るRNA分子をヘ
テロ二量体RNAアプタマーと称する場合もある。
【００２１】
HCVのNS3プロテアーゼに対する阻害活性をもつRNAアプタマー配列
ヘテロ二量体RNAアプタマーの基礎となる、HCVのNS3プロテアーゼに対して阻害活性を
示す一本鎖RNAアプタマーについて説明する。
【００２２】
先ず、NS3プロテアーゼ阻害活性を示す一本鎖RNAアプタマーを得るために、インビトロ選択法によってランダムなRNAオリゴヌクレオチドのライブラリーから、NS3プロテアーゼ活性ドメインに対するRNAアプタマーを作成した(Fukuda, K. et al., Eur. J. Biochem., 267:3685-3694, 2000)。ここで、ライブラリーは、図２Ａ中「N30」として示す領域にランダムに配列を挿入してなるRNAオリゴヌクレオチドを化学合成によって準備することが
できる。また、NS3プロテアーゼ活性ドメインは、NS3プロテアーゼにおけるアミノ酸番号1027〜1218に相当するドメインであり、以下の説明においてΔNS3と称する。
【００２３】
インビトロ選択法は、標的分子に対して特異的親和性を持った新規の核酸分子を創製する手法としてその有効性が認められている。インビトロ選択法によって、図２Ｂ及び図２Ｃに示すG9-I、G9-II及びG9-IIIの３種類の一本鎖RNAアプタマーを取得することができる（特開平１１−１３７２５２号公報参照）。
【００２４】
これら３種類の一本鎖RNAアプタマーの二次構造をMulfoldプログラム（M. Zuker、On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule. Science, 244, 48-52, (1989)）によって解析した結果、図２Ｃに示すようなループ-ステム構造を持つことが予測される。また、これら３種類の一本鎖RNAアプタマーにおける共通モチーフ配列が、ループ構造
（5’-GA(A /U)UGGAC-3’）を形成していることが推測される（図２Ｂにおける四角で囲
われた領域及び図２Ｃにおける太字の領域）。
【００２５】
なお、これらの予測はRNase限定分解法や、化学修飾法により、この構造の正しいこと
を確認することもできる。一本鎖RNAアプタマーのΔNS3に対する解離定数を算出した結果、３つとも約10 nMであった。また、ΔNS3及びMBP-NS3（NS3プロテアーゼの全アミノ酸配列を含むもの）のプロテアーゼ活性に対する抑制効果を調べた結果、すべての一本鎖RNA
アプタマーが約９０％の阻害活性を示した。さらに、p41（NS4Aの一部の配列を含む合成
ペプチドでNS4Aと機能相補し、NS3プロテアーゼ活性を促進する。）存在下におけるMBP-NS3のプロテアーゼ活性の抑制効果を調べたところ、すべての一本鎖RNAアプタマーが約７
０％の阻害活性を示した。
【００２６】
一本鎖RNAアプタマーのうちG9-IのΔNS3に対する阻害様式をDixonプロットによって解
析した結果、非競合的な阻害様式を示し、阻害物質定数は約100 nMであった。これらの結果から、得られた3種類の一本鎖RNAアプタマーは、NS3プロテアーゼに対して特異的親和
性を示し、抗HCV剤としてのリード化合物の候補になりうることが示唆された。
【００２７】
例えば、一本鎖RNAアプタマーのうちG9-Iについて、ループ-ステム構造の新たな塩基置換もしくは欠失体を作成し、その機能に及ぼす影響を調べた。その結果、共通のモチーフ配列（5’-GA(A/U)UGGG AC）を含む特定のループ-ステム構造（以下「Stem-loop III」と称する場合もある。図３参照）がΔNS3プロテアーゼ阻害活性に重要であることが明らかになった。さらに、G9-Iにおける5’末端領域を含むステム構造（以下「Stem I」と称す
る場合もある。図３参照）も、両活性に関与していることが判明した。
【００２８】
これに対して、G9-Iにおける特定のループ-ステム構造（以下「Stem-loop II」と称す
る場合もある。図３参照）は、ΔNS3プロテアーゼ阻害活性に関して直接関与していなか
った。しかしながら、Stem IとStem-loop IIIとの間には、ΔNS3プロテアーゼ阻害活性を維持するための特定の三次構造を必要とするために、Stem-loop IIにおけるステム構造（以下、「Stem II」と称する場合もある。図３参照）が必要であることが判明した。ただし、このStem IIに関しては配列非依存的であって二本鎖構造を取るような配列であれば
如何なる配列であってもよい。
【００２９】
この結果より、一本鎖RNAアプタマーにおける所定のループ構造（以下、「loop II」と称する場合もある。図３参照）を欠失させることにより、G9-Iは２つの独立したRNA分子
に分割可能で、両RNA分子を混合することによりG9-I様の高次構造を形成し、ΔNS3プロテアーゼ阻害活性を有するヘテロ二量体RNAアプタマーとなる。なお、以下の説明において
、G9-Iからloop IIを欠失させた構成のG9-I様の高次構造において、Stem-Loop IIIを含む塩基配列を「Long RNA」と称し、Stem-Loop IIIを含まない塩基配列を「Short RNA」と称する。
【００３０】
すなわち、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、Long RNAとShort RNAとから構成されるヘテロ二量体である。ここで、Long RNAに含まれるループ構造は、以下の塩基配列である。
5’-GAWUGGGAC-3’（配列中、WはA又はUである。）
【００３１】
また、このループ構造は、ループ-ステム構造をとる。すなわち、このループ構造の両
端側には、ステム構造をとりうる塩基配列がそれぞれ存在する。ステム構造をとりうる塩基配列としては、特に限定されず、如何なる塩基配列であってもよい。ループ-ステム構
造をとる塩基配列としては、特に限定されないが、以下の配列番号１に表す塩基配列を例示することができる。
5’-GAGGGUAGAWUGGGACUACCUUU-3’（配列番号1、（配列中、WはAまたはUである。））
【００３２】
さらに、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーにおいて、Long RNAは、Short RNAとの間で二本鎖構造を形成することでStem Iを形成する。Short RNAに含まれ、Long RNAとの間でStem Iを形成する塩基配列は、5’-GGGAGA-3’である。したがって、Long RNAは、Short RNAに含まれる5’-GGGAGA-3’に対して二本鎖構造を形成するような塩基配列を有
する。すなわち、Long RNAに含まれ、Short RNAとの間でStem Iを形成する塩基配列とし
ては、例えば、5’-UCUCCC-3’を挙げることができるが、この配列に限定されない。例えば、Long RNAは、5’-UCUCCU-3’といった塩基配列のように、１塩基程度であればミスマッチの塩基（下線部）を含んでいてもよい。
【００３３】
さらにまた、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマー配列においては、上記ループ構
造（ループ-ステム構造「Stem-loop III」）と上記ステム構造（「Stem I」）との間に、活性を有する三次構造を維持するためにリンカーが存在する。このリンカーの塩基配列としては、特に限定されないが、例えば5’-CCUC-3’とすることができる。
【００３４】
さらにまた、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマー配列において、Long RNAには、
上記ループ構造（ループ-ステム構造「Stem-loop III」）の5’末端側に、Short RNAとの間でステム構造（「Stem I」）を形成し、活性を有する三次構造を維持するための塩基配列が存在する。Long RNAに含まれ、Stem Iを形成する塩基配列としては、特に限定されないが、例えば、5’-GCUUCGGGAUUU-3’（配列番号2）を挙げることができる。
【００３５】
また、Long RNAに含まれ、Stem Iを形成する塩基配列としては、配列番号２に表す塩基配列に限定されず、例えば、
(i) 5’-GGGAUUU-3’
(ii) 5’-GGGAGAUUU-3’
であってもよい。
【００３６】
一方、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーにおけるShort RNAは、上述したLong RNAにおけるStem-loop IIIを除く領域と二本鎖構造を形成するような塩基配列を有する。
特に、Short RNAは、上述したLong RNAとStem Iを形成する領域（以下「領域１」）とし
て、下記の３種類の塩基配列のうち何れかを有する。
(i) 5’-GGGAGA-3’
(ii) 5’-AGGAGA-3’
(iii) 5’-AAGGAGA-3’
【００３７】
また、Short RNAは、上述したLong RNAとStem IIを形成する領域（以下「領域２」）として、下記の４種類の塩基配列のうち何れかを有する。
(i) 5’-AUCUCCC-3’
(ii) 5’-AUUCCGA-3’
(iii) 5’-AUCCCGA-3’
(iv) 5’-AUUCC-3’
(v) 5’-AUCCC-3’
【００３８】
Short RNAは、5’末端から3’末端に向かって領域１及び領域２の順とるように構成さ
れている。なお、領域１と領域２の間には、リンカー配列が存在していてもしていなくてもよい。
【００３９】
より具体的に、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーを構成するLong RNAとしては
、下記の３種類の塩基配列のうち何れかからなるRNA分子を使用することができる。
(i) 5’-GGGAGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号3）
(ii) 5’-GCUUCGGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号4）
(iii) 5’-GGGAUUUGAGGGUAGAAUGGGACUACCUUUCCUCUCUCCUU-3’（配列番号5）
を挙げることができる。
【００４０】
また、本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーを構成するShort RNAとしては、
(i) 5’-AAGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号6）
(ii) 5’-GGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号7）
(iii) 5’-GGGAGAAUUCCGA-3’（配列番号8）
(iv) 5’-GGGAGAAUCCCGA-3’（配列番号9）
(v) 5’-GGGAGAAUUCC-3’（配列番号10）
(vi) 5’-GGGAGAAUCCC-3’（配列番号11）
を挙げることができる。
【００４１】
特に、好ましいLong RNAとしては、配列番号３又は４に表される塩基配列からなるRNA
が挙げられる。また、好ましいShort RNAとしては、配列番号９又は１１表される塩基配
列からなるRNAが挙げられる。（図４中Type2およびType3）。
【００４２】
本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、上記の塩基配列からなるRNA分子に限定されず、上記塩基配列における１以上の塩基が欠失、置換、挿入或いは付加された塩基配列からなり、且つ、NS3プロテアーゼ阻害活性を有するRNA分子であっても良い。ここで、複数の塩基とは、Long RNAにおいては、２〜７個、好ましくは３〜６個、より好ましく４〜５個を意味する。Short RNAにおいて、２〜７個、好ましくは３〜６個、より好ましく４〜５個を意味する。
【００４３】
所定のRNA分子がNS3プロテアーゼ阻害活性を有するか否かは、後述する方法によって検討することができる。
【００４４】
ヘテロ二量体RNAアプタマーによるNS3プロテアーゼ活性の阻害
以上説明した本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、HCV由来のNS3プロテアーゼ
の活性を阻害する。例えば、評価対象のヘテロ二量体RNA分子がHCV由来のNS3プロテアー
ゼの活性を阻害するか否かは、ΔNS3のプロテアーゼ活性の阻害効率を測定することによ
って検討することができる。
【００４５】
阻害効率を測定する際には、先ず、プロテアーゼとしてのΔNS3と、基質としてのNS5A/NS5Bペプチドと、NS3プロテアーゼのコファクターとしてのp41ペプチドとを含む反応液に、評価対象のヘテロ二量体RNA分子を添加し、NS5A/NS5Bペプチドの切断反応による生成物を検出する。基質としては、NS5A/NS5Bペプチドに限定されず、NS3/NS4A、NS4A/NS4BおよびNS4B/NS5Aペプチド等を使用することができる。生成物を検出には、蛍光標識を有する
基質を使用することで、生成物を蛍光強度として検出することができる。
【００４６】
ヘテロ二量体RNAアプタマーによるNS3プロテアーゼへの結合活性
以上説明した本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、HCV由来のNS3プロテアーゼ
に対して結合活性を示す。例えば、評価対象のヘテロ二量体RNA分子がHCV由来のNS3プロ
テアーゼに対して結合活性を示すか否かは、ΔNS3に対する結合活性を測定することによ
って検討することができる。
【００４７】
結合活性を測定する際には、結合対象となるNS3プロテアーゼ或いはΔNS3を含む反応液に、評価対象のヘテロ二量体RNA分子を添加し、当該ヘテロ二量体RNA分子と結合対象との結合を検出する。ヘテロ二量体RNA分子と結合対象との結合は、RNA分子を標識化する場合には放射線検出器や蛍光検出器などで、RNA分子を標識化しない場合には水晶振動子や表
面プラズモン共鳴検出装置等によって検出することができる。
【００４８】
診断薬および医薬組生物
以上説明した本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーは、C型肝炎を診断、予防または治療するために用いることができる。すなわち、上述したヘテロ二量体RNAアプタマーは
、HCVのNS3プロテアーゼの活性を阻害するため、HCVの増殖を低減することができる。
【００４９】
C型肝炎を診断するには、例えば、被験者の組織または細胞（例えば肝臓など）に、上
述したヘテロ二量体RNAアプタマーを導入する。細胞内にHCVが存在していれば、そのNS3
プロテアーゼをヘテロ二量体RNAアプタマーにより特異的に検出することができる。これ
により、被検者におけるHCV陽性又は陰性を判別することができる。例えば、一方のRNA分子の末端に蛍光プローブ化合物を共有結合でつなげたもの等と他方のRNA分子とを混合後
、細胞抽出液を加え、その後適当な分離系を用いて該ヘテロ二量体とNS3プロテアーゼと
の複合体を分離し、蛍光検出器等で検出する方法等があげられる。
【００５０】
C型肝炎を予防又は治療するには、HCVに感染した被験者の組織または細胞（例えば肝臓など）に、上述したヘテロ二量体RNAアプタマーを導入することによって、細胞内のHCVのNS3プロテアーゼを阻害し、HCVの増殖を阻止することができる。ヘテロ二量体RNAアプタ
マーの導入は、例えば、導入対象のヘテロ二量体RNAアプタマーをリポソームに封入し細
胞内に取り込む方法（“lipidic vector systems for gene transfer”(1997) R.J lee and L. Huang Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 14: 173-206; 中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  vol.44, No. 11, 1590-1596 (1999)）、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。
【００５１】
なお、ヘテロ二量体RNAアプタマーを有効成分として含む医薬組生物は、必要により医
薬上許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。本発明の医薬組生物は、C型肝炎の予防または治療に使用することができる。被験者への投
与量、投与方法、投与頻度は、被験者の年令、体重、性別、疾病の状態、重篤度、生体の応答性によって適宜変化させうるし、また、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり投与が継続される。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５３】
[実施例１]
二量体アプタマー構成RNA分子等の構築
ここで使用したΔNS3タンパク質はすでに本発明者が報告した方法により大腸菌BL21株
により精製した（Vishunuvardhan, D. et al., FEBS Lett., 402: 209-212, 1997）。
【００５４】
また、本例では、ヘテロ二量体RNAアプタマーとして、図４に示したType1〜Type3のLong RNAを構築した。Type1のLong RNAの構築のために、以下の２本のプライマーを用いた。(i) Type1 f-プライマー
5’-AGAAATACGACTCACTATAGGGAGAATTTGAGGGTAGAATGGGAC -3’（配列番号１２）
(ii) Type1 r-プライマー
5’-AAGGAGAGAGGAAAGGTAGTCCCATTCTACCCTC-3’（配列番号１３）
【００５５】
また、Type2のLong RNAの構築のために、以下の２本のプライマーを用いた。
(i) Type2 f-プライマー
5’-AGAAATACGACTCACTATAGCTTCGGGATTTGAGGGTAGAATGGG -3’（配列番号１４）
(ii) Type3 r-プライマー
5’-AAGGAGAGAGGAAAGGTAGTCCCATTCTACCCTCAAATCCC -3’（配列番号１５）
【００５６】
また、Type3のLong RNAの構築のために、以下の２本のプライマーを用いた。
(i) Type3 f-プライマー
5’-AGAAATACGACTCACTATAGGGATTTGAGGGTAGAATGGG -3’（配列番号１６）
(ii) Type3 r-プライマー
5’-AAGGAGAGAGGAAAGGTAGTCCCATTCTACCCTCAAATCCC -3’（配列番号１５）
【００５７】
上記のプライマーを用いてPCRを行った（94℃、75 sec→55℃、75 sec→72℃、75 sec
のサイクルを２５回、次いで72℃、60 sec）。得られたDNA断片を精製し、精製したDNA断片を、T7 RNAポリメラーゼ（EPICENTRE社製）を用いてRNAに転写して以下の実験に用いた。
【００５８】
一方、本例では、Type1、Type2、Type3のLong RNAに対する以下の６種類のShort RNAを、核酸合成機（394 DNA/RNA synthesizer, ABI）で合成した。
(i) 5’-AAGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号6）
(ii) 5’-GGGAGAAUCUCCC-3’（配列番号7）
(iii) 5’-GGGAGAAUUCCGA-3’（配列番号8）
(iv) 5’-GGGAGAAUCCCGA-3’（配列番号9）
(v) 5’-GGGAGAAUUCC-3’（配列番号10）
(vi) 5’-GGGAGAAUCCC-3’（配列番号11）
【００５９】
[実施例２]
二量体アプタマーによるΔNS3プロテアーゼ阻害活性の測定
実施例１で作製したLong RNAとShort RNAを用いて、ヘテロ二量体RNAアプタマーによるΔNS3プロテアーゼ阻害活性を測定した。なお、本例では、基本的に垣内らによって報告
された方法（Kakiuchi, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:1059-1065, 1995）に従った。
【００６０】
すなわち、ダンシル標識化したNS5A/NS5B境界領域の２０アミノ酸 Dns-GEAGD DIVPC／SMSYT WTGAL （／がΔNS3による切断部位）（43 μM）にプレインキュベートしたΔNS3（0.8 μM）とLong RNA （0.8 μM）のみ、Short RNA （0.8 μM）のみ、および１当量のLong RNA（0.8 μM）に対して０〜１当量のShort RNA （0〜0.8μM）の混液を加え、２５℃
、４０分反応した。反応混液をHPLCで分離し、蛍光（励起波長：340 nm、発光波長：510 nm）測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。
【００６１】
結果を図５に示した。図５AはLong RNAのみを加えたときの結果を示し、図５BはShort RNAのみを加えたときの結果を示し、図５CはLong RNA及びShort RNAを加えたときの結果を示す。なお、図５A及び図５Bにおけるコントロールは、RNA分子を加えないものを用い
た。
【００６２】
図５A及び図５Bに示すように、各々のLong RNA又はShort RNAのみを加えただけでは阻
害活性を示さないか、或いは弱い阻害活性を示した。また、図５Cに示すように、Type2及びType3のLong RNAは、Short RNAの濃度に依存して阻害活性を示し、両RNA分子の比が１
：１の時、８０％強の阻害活性を示した。一方、Type1のLong RNAは同条件下で、約２０
％程度の阻害活性を示した。さらに、Type2、Type3のLong RNAに関しては、より安定な塩基対を組むShort RNAの方（配列番号9および11）が、若干強い阻害活性を示した（図５C
）。
【００６３】
[実施例３]
二量体アプタマーのΔNS3への結合活性
実施例２で阻害活性の強かったType2及びType3のLong RNAを含むヘテロ二量体RNAアプ
タマーについて、ΔNS3に対する結合活性を検討した。具体的には、ΔNS3（0.8 μM）に
対して１当量のLong RNA（0.8 μM）と０〜１当量のShort RNA （0〜0.8μM）の混液を加
え、室温で３０分反応した。結果を図６に示す。図６に示す結果から、Type2及びType3のLong RNAは、Short RNAの濃度に依存してそれぞれ結合活性の上昇を示し、両RNA分子の比が１：１の時、１０％弱の結合活性を示すことが分かった。また、Type2及びType3のLong
RNAともに、より安定な塩基対を組むShort RNAの方（配列番号9および11）が、若干強い結合活性を示すことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】HCV遺伝子、当該遺伝子にコードされる前駆体タンパク質及び当該前駆体タンパク質がプロセシングされてなる構造タンパク質並びに非構造タンパク質を示す図である。
【図２】インビトロ選択法によって得られたNS3プロテアーゼ阻害活性を有する一本鎖RNAアプタマーを示す図である。
【図３】NS3プロテアーゼ阻害活性を有する一本鎖RNAアプタマー（G9-1）を示す図である。
【図４】本発明に係るヘテロ二量体RNAアプタマーの一例を示す図である。
【図５】ヘテロ二量体RNAアプタマーによるNS3プロテアーゼ阻害活性を示す特性図であり、（A）はLong RNAのみを加えたときの結果を示し、（B）はShortRNAのみを加えたときの結果を示し、（C）はLong RNA及びShort RNAを加えたときの結果を示す。
【図６】ヘテロ二量体RNAアプタマーによるNS3プロテアーゼ結合活性を示す特性図である。
【図１】
2005151890.tif 000003
【図２】
2005151890.tif 000004
【図３】
2005151890.tif 000005
【図４】
2005151890.tif 000006
【図５】
2005151890.tif 000007
【図６】
2005151890.tif 000008
【配列表】
2005151890000001.app