(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞のアポトーシスメカニズムを解明し、新規かつ有効な抗アポトーシス手段を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、細胞中の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ−１）のキナーゼ活性を抑制する方法及び組成物を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ−１）のキナーゼ活性を抑制する方法。
【請求項２】
細胞中のＳＣＣＡの発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制し、これによりＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患を治療又は予防するための方法。
【請求項３】
ＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患が肌の紫外線照射による皮膚障害である、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を亢進させることにより、ＪＮＫ−１の活性を抑制する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは発生過程における不要細胞の排除、恒常性維持のための細胞の除去、感染や癌に対する生体防御などの目的のために引き起こされる細胞死である。アポトーシスは様々なシグナル伝達系を介して実行されることで知られる。アポトーシス誘導シグナルは細胞内においてアポトーシスの誘導又は阻害に関与する制御因子に伝えられ、これらの因子により細胞死が決定されると、最終的にアポトーシス実行因子が活性化され、細胞死が誘導される。アポトーシス誘導シグナルとしては、紫外線（ＵＶ）照射、酸化剤暴露、乾燥などの様々なストレス性刺激があり、これによりアポトーシス制御因子、例えばＢｃｌ−２ファミリー因子、各種カスパーゼ、ＪＮＫ、ｐ５３などにシグナルが伝達され、細胞死が決定される。
【０００３】
アポトーシス制御因子の一つであり、細胞増殖・分化、ガン化などにおける情報伝達で中心的な役割を果たしているＭＡＰキナーゼファミリーに属するＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ）も、様々なストレス刺激に応答して、活性化される。ＪＮＫについてはＪＮＫ−１，２，３の三つの遺伝子が存在し、ＪＮＫ−１及び２は主に表皮細胞に存在するのに対し、ＪＮＫ−３は脳に存在することが知られる。ＪＮＫ−１は紫外線照射により活性化され、アポトーシスを誘導するのに対し、ＪＮＫ−２は紫外線照射では活性化されず、両者の機能に差異があることも知られる。ＪＮＫの内在性阻害因子については、ＪＮＫ相互作用因子（JNK Interacting Protein; JIP）が知られているのみである（M. Dickens et al. Science Vol. 277, pp.693 (1997); A. J. Whitmarsh et al. Science Vol. 281, pp.1671 (1998)）。しかしながら、ＪＩＰは特異性が低く、これらのＪＮＫや上流の活性化に関する他のＭＡＰキナーゼとも結合することが知られている。ＪＮＫの活性化を特異的に阻害できれば、ＪＮＫにより誘導されるアポトーシスを抑制することができ、これにより紫外線照射などのストレス性刺激を原因とする様々な障害、特に皮膚障害のための新たな治療・予防方法、化粧品、医薬組成物の開発が期待される。
【０００４】
【非特許文献１】Science Vol.277, pp.693 (1997)
【非特許文献２】Science Vol.281, pp.1671 (1998)
【非特許文献３】British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85
【非特許文献４】J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)
【非特許文献５】J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞、特に表皮細胞のアポトーシスメカニズムを解明し、新規かつ有効な抗アポトーシス手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
皮膚病の一つに、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症である乾癬がある（Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85）。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる。乾癬の発症した表皮と正常表皮とを比較すると、乾癬表皮の上層において扁平上皮癌関連抗原（Squamous Cell Carcinoma Antigen、以下「ＳＣＣＡ」と称す)の発現の亢進が認められることが知られる（Takeda A.ら、 J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154）。ＳＣＣＡは子宮頚部扁平上皮癌細胞から見出された抗原であり、子宮頚部、肺、食道、皮膚の扁平上皮癌で高い血中濃度を示し、扁平上皮癌の診断や治療効果の判定によく利用されている。ＳＣＣＡは皮膚扁平上皮癌の診断にも利用されるが、本発明者の研究においては、皮膚における扁平上皮癌においてＳＣＣＡ発現は高くないことが認められた。ＳＣＣＡは染色体18ｑ21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝子ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２によりコードされる。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に分子量約45,000のタンパク質であり、非常に相同性が高いが、反応部位のアミノ酸配列が異なり、異なる機能を有していると考えられている（Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55）。
【０００７】
本発明者はＳＣＣＡが関与する表皮の生理学的メカニズムの解明を目的とする研究を行っていたところ、ＳＣＣＡが細胞のアポトーシスを抑制する作用を有する抗アポトーシス因子であることを驚くべきことに見出した。
簡単に説明すると、本発明者はＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２に注目して皮膚ＵＶ防御メカニズムの検討を行い、免疫組織的方法や、in situ ハイブリダイゼーションを行った結果、露光部位皮膚のＳＣＣＡの発現は非露光部位と比較して顕著に亢進していることが明らかとなった。さらに、ヒト皮膚へのＵＶ照射により有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡの発現が強力に亢進することが明らかになった。基底層におけるタンパク質発現は認められなかった。また、三次元皮膚モデル、培養ヒト角化細胞でも同様にＵＶ照射によるＳＣＣＡ発現の亢進は確認された。
【０００８】
本発明者は次にＳＣＣＡ発現の認められない３Ｔ３細胞にヒトＳＣＣＡ−１及びＳＣＡＡ−２遺伝子を導入し、安定発現系を確立した。アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）をアポトーシス指標にＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）で解析した結果、いずれのＳＣＣＡ安定発現系においてもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが明らかになった。
さらに、ＳＣＣＡを高発現するＨａＣａｔ細胞にｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターで恒常的にｓｉＲＮＡを発現させるＲＮＡ干渉法によりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のノックダウン（ｓｉＳＣＣＡ）細胞株を樹立した。定量的ＰＣＲによりｓｉＳＣＣＡ細胞株におけるＳＣＣＡ発現が９０％以上抑制されていることが確認された。５０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射をした結果、コントロール株では３８％の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ｓｉＳＣＣＡ細胞株では約８０％の細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかとなった。
【０００９】
次に、本発明者は皮膚細胞においてＳＣＣＡと相互作用する因子を抗体アレー法でスクリーニングしたところ、ＳＣＣＡが紫外線、放射線、酸化傷害などのストレスに関与するストレスキナーゼ、ＪＮＫと相互作用することを見出した。さらにＳＣＣＡとＪＮＫとの関係を検討したところ、ＳＣＣＡはＪＮＫ−１のキナーゼ活性を特異的に抑制することを見出した。ＪＮＫ−１は転写因子ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を通じてアポトーシスを誘導することで知られており、従ってＳＣＣＡはＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制することで、細胞の紫外線照射などのストレス性刺激により誘導されるアポトーシスを抑制することが明らかとなった。
【００１０】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたものであり、その第一の観点において、細胞中の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ−１）のキナーゼ活性を抑制する方法を提供する。細胞は、好ましくは表皮細胞、例えば角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等である。
【００１１】
別の観点において、本発明は細胞中のＳＣＣＡの発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制し、これによりＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患を治療又は予防するための方法を提供する。好ましくは、ＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患が肌の紫外線照射による皮膚障害である。この場合、細胞は、好ましくは表皮細胞、例えば角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等である。
【００１２】
更なる別の観点において、本発明は細胞のＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制し、これによりＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患を治療又は予防するための医薬組成物又は皮膚外用剤であって、治療的又は予防的に有効な量のＳＣＣＡを含有する医薬組成物などを提供する。好ましくは、ＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患が肌の紫外線照射による皮膚障害である。細胞は、好ましくは表皮細胞、例えば角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ストレス性刺激、特に紫外線照射による障害、特に皮膚障害を治療、予防するために有効な手段の提供が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
前述のとおり、ＪＮＫのみを特異的に抑制できる内在性阻害因子に関する報告はない。そして、ＳＣＣＡがＪＮＫ−１のストレス刺激による活性化を抑制できることは、本発明者がはじめて見出した驚くべき事実である。
【００１５】
本発明は、細胞中の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を亢進させることで、細胞中のＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制する方法を提供する。ＪＮＫは、細胞増殖・分化、ガン化などにおける情報伝達で中心的な役割を果たしているＭＡＰキナーゼファミリーに属し、紫外線照射を含む様々なストレス刺激に応答して活性化される。ＪＮＫについてはＪＮＫ−１，２，３の三つの遺伝子が存在し、ＪＮＫ−１は紫外線照射により活性化され、アポトーシスを誘導するのに対し、ＪＮＫ−２は紫外線照射では活性化されず、両者の機能に差異があることが知られている。生体内でのＪＮＫ−１の基質はｃ−Ｊｕｎであることが知られる。ｃ−ＪｕｎはＪＮＫ−１によりリン酸化されることでアポトーシスを誘導する転写因子である。本発明者は、ＳＣＣＡがＪＮＫ−１のキナーゼ活性を特異的な阻害することでｃ−Ｊｕｎのリン酸化を抑制し、その結果ｃ−Ｊｕｎによるアポトーシス誘導を抑制することを見出した。
【００１６】
従って、ＳＣＣＡの発現を亢進させることで、ストレス性刺激により誘導される細胞のアポトーシスを原因とする障害の治療、予防が可能となる。かかるストレス性刺激には紫外線、各種化学系酸化剤、大気汚染物質に対する皮膚の暴露、乾燥刺激、熱刺激などが挙げられる。ストレス性刺激による障害には、例えばストレス性刺激が原因とする皮膚細胞死による皮膚老化、例えばしわ、しみの形成、乾燥肌、かぶれ、湿疹、火傷などが挙げられる。本発明は、特にＳＣＣＡの発現不全を示す被験体の上記障害の治療・予防に有効であり得る。
【００１７】
ＳＣＣＡは上述のとおり扁平上皮癌細胞や乾癬表皮に存在する分子量約45,000のタンパク質である。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列はTakeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)（前掲）に記載されている。表皮細胞のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現の亢進は、例えばその発現を亢進させる薬剤を適用することにより達成できる。
【００１８】
薬剤としては、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２自体を使用してもよい。この場合、ＳＣＣＡは天然ＳＣＣＡでも組換ＳＣＣＡであってもよく、また全長タンパク質でも、ＪＮＫ−１キナーゼ活性を抑制する活性を有する限りにおいて、そのフラグメントなどの誘導体をも意味する。従って、一つの態様において、本発明は細胞のＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制し、これによりＪＮＫ−１の活性化を原因とする疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療的又は予防的に有効な量のＳＣＣＡを含有する医薬組成物又は皮膚外用剤を提供する。ＳＣＣＡの治療的又は予防的に有効な量とは、ＳＣＣＡがＪＮＫ−１のキナーゼ活性を抑制し、その細胞のアポトーシスを抑制するのに十分な量を意味し、医師、獣医などにより適宜決定されるであろう。特に限定するわけではないが、好ましくは、本発明に係る組成物はＳＣＣＡを１μＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは１００μＭ〜１ｍＭの量で含む。
【００１９】
また、本発明に係る医薬組成物又は皮膚外用剤は、上記必須成分たるＳＣＣＡ又はその誘導体以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２０】
その他、組成物の用途に合わせ、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ類なども適宜配合することができる。
【００２１】
本発明に係る医薬又は化粧組成物は、その用途に合わせ、例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等の外用剤、例えば化粧水、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤、軟膏、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス、養毛・育毛剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。 
【００２２】
被験体におけるＳＣＣＡをコードする遺伝子が不活性状態又は沈黙状態にあり、その結果細胞がＳＣＣＡ欠損状態にあるときは、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２遺伝子自体を表皮細胞に導入することで、あるいはＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２遺伝子の発現を亢進させる調節配列、例えばプロモーターやエンハンサーをそれらの遺伝子に対し作用可能な位置に配置することにより達成することもできる。
【００２３】
ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードする遺伝子を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、実験医学増刊、12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療 の基礎技術」、羊土社（1996））のいずれの方法も適用することができる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスに、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。また、上記遺伝子を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法がある（日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁、月刊薬事、36(1), 23-48（1994）、実験医学増刊、12(15)(1994)）。in vivo法がより好ましい。in vivo法により投与される場合は、疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、一般的には注射剤等とされ、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【００２４】
細胞中のＳＣＣＡの亢進は、例えば皮細胞中のＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の量を直接測定することにより決定することができる。好ましくは、この測定はＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。また、皮膚からRNAを抽出し、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２をコードするmRNAの量を測定することにより決定することもできる。mRNAの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばRNAの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）により行われる。以上の他、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の既知の生物活性を測定することによりＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現量を測定することもできる。他に、ＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２の発現はin situハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて決定することができる。
【００２５】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
免疫組織化学的検査
表皮生検をＡＭｅＸ手順（Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986)）に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでＰＢＳで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を１０％正常ウサギ血清(Histofine, Tokyo, Japan)でブロックした。
表皮切片を抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）、抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）（1：500に希釈）又は抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体（Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにして精製）のそれぞれとインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をヘマトキシリンでカウンター染色し、ＤＡＫＯ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(DAKO Corp., CA, USA)で観察を行った。
【００２７】
図１は、表皮検体として、非露光部位である上腕部（ヒト24歳）、臀部（ヒト46歳）、太腿部（ヒト75歳）由来の表皮、及び露光部位である頬部（ヒト20歳、76歳）、目瞼（ヒト82歳）由来の表皮を採取し、抗体としてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の両者に結合する抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体を用い、顕微鏡観察した結果である。図１から、非露光部位と比べ、露光部位の表皮上層でＳＣＣＡが顕著に亢進していることがわかる。しかしながら、露光部位でも、基底層ではＳＣＣＡの発現の亢進は認められなかった。
【００２８】
図２は、表皮検体として、ＵＶ照射（トランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、２ＭＥＤ（Minimum Erythema Dose）の照射量にて照射）を施したヒト表皮及び照射を施していないコントロール表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のそれぞれの発現の顕微鏡観察結果である。抗体として、抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体及び抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体それぞれを使用した。図２から、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ヒト表皮にＵＶを照射することで発現が亢進されることが明らかとなった。また、発現の亢進は皮膚有棘層及び顆粒層において顕著であった。
【００２９】
以上により、表皮にＵＶが照射されると、表皮、特にその有棘層及び顆粒層においてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。
【００３０】
定量ＰＣＲ実験
次に、表皮におけるＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現がＵＶ照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った。
ヒト角化細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。コントロール細胞にはＵＶＢ照射を施さなかった。
【００３１】
上記培養細胞から総ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Nippon Gene)を用い、添付の説明書に従い、単離精製した。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２それぞれの発現レベルを定量リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により決定した。簡単には、総ＲＮＡをSuperscript II（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、ｃＤＮＡへと変換させた。その試料をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、２−ステップＰＣＲを４０サイクル行い、増幅させた。内部標準としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を用いた。
【００３２】
使用したプライマーは下記のとおりである。
ＳＣＣＡ−１：
順方向プライマー
5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'（配列番号１）
逆方向プライマー
5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'（配列番号２）
Taq Man プローブ
5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(配列番号３）
【００３３】
ＳＣＣＡ−２：
順方向プライマー
5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'（配列番号４）
逆方向プライマー
5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'（配列番号５）
Taq Man プローブ
5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(配列番号６）
【００３４】
ＧＡＰＤＨ：
順方向プライマー
5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（配列番号７）
逆方向プライマー
5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（配列番号８）
Taq Man プローブ
5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(配列番号９）
【００３５】
リポーター色素（６−カルボキシ−フルオレセイン）をＴａｑ  Ｍａｎプローブ配列の５’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）をその３’末端に組み込ませた。
【００３６】
図３に培養ヒト角化細胞におけるＳＣＣＡの発現についてのＵＶＢ照射の影響の結果を示す。ＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２、共にＵＶ照射により発現が亢進されることが明らかとなった。従って、表皮細胞はＵＶ照射により、遺伝子レベルでＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の発現が亢進されることが明らかとなった。
【００３７】
ＵＶ照射におけるＳＣＣＡの役割の検討
以上により、表皮細胞では、ＵＶ照射を受けることでＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現が亢進することが解明された。次に、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２がＵＶ照射を受けた表皮細胞においてどのような役割を担っているかを検討した。
【００３８】
ＳＣＣＡ−１及び２高発現細胞の樹立
３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣより入手）はＳＣＣＡ−１及び２を発現しないマウス胎児由来の細胞である。この細胞に、下記のとおりにしてＳＣＣＡ−１又は２をコードする遺伝子を導入した。
ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のｃＤＮＡ（Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)）をBam HI及びKpn Iで二重消化した。それらをｐＴａｒｇｅｔ ベクターの中にサブクローニングし、次いでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（GIBCO, Invitrogen Corp.）を用い、３Ｔ３細胞に導入した。簡単に述べると、無血清ＤＭＥＭ培地（Invitrogen Corp.) ６７５μｌ中のｃＤＮＡ  ２０μｇを７５μｌのＰｌｕｓ試薬と混合し、２５℃にて１５分放置した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（１００μｌ）を６５０μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、次いでそれを上記ｃＤＮＡ−Ｐｌｕｓ混合物に加え、そして２５℃にて１５分放置した。このｃＤＮＡ混合物を１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に添加し、そして３Ｔ３細胞をその中で３７℃にて４時間、５％のＣＯ2雰囲気下でインキュベーションした。その培地を１０％のＦＣＳ（Invitrogen Corp.）含有のＤＭＥＭ培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。翌日、Ｇ４１８（Calbiochem）を最終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように添加した。Ｇ４１８は培養期間中この濃度に保っておいた。培地は２〜３日ごとに交換した。培養４週間後、いくつかのＧ４１８耐性コロニーを単離することができ、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２発現細胞系が樹立された。
【００３９】
ＳＣＣＡ−１をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−１導入細胞）はＳＣＣＡ−１を特異的且つ安定的に発現し、そしてＳＣＣＡ−２をコードするｃＤＮＡが導入された細胞（ＳＣＣＡ−２導入細胞）はＳＣＣＡ−２を特異的且つ安定的に発現することが確認された。また、同様の操作で非特異的な配列の導入された３Ｔ３細胞（コントロール細胞）はＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２のいずれも発現しなかった。
【００４０】
上記ＳＣＣＡ−１導入細胞、ＳＣＣＡ−２導入細胞及びコントロール細胞を用い、ＵＶ照射を与えたときのＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２が果たす役割について検討した。詳しくは、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、ＳＣＣＡ−２の役割について検討した。
【００４１】
上記各種細胞を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを０〜４８時間にわたり、照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。
【００４２】
これらの細胞についてのアポトーシス評価はＦＡＣＳ  ＣＯＵＬＴＥＲ（EPIX XL-MCL, Becjman Coulter）を用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法(Annexin V-FITC kit, Immunotech）を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。
【００４３】
その結果を図４に示す。図４から明らかなとおり、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２導入細胞のいずれもＵＶ照射によるアポトーシスが有意に減少することが認められた。従って、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２共に、ＵＶによる誘導されるアポトーシスを抑制できるものと推定された。
このことを確認するため、本発明者は次にＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２ノックダウン細胞株をＲＮＡ干渉法により樹立し、ＵＶ照射における表皮細胞内でのＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の役割についてさらに検討した。
【００４４】
ＳＣＣＡノックダウン細胞の樹立
ＨａＣａｔ細胞（H. Hans. et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998)）はＳＣＣＡを高発現するヒト角化細胞である。この細胞に、ＲＮＡ干渉法に従い、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクター（Ambion）で恒常的にｓｉＲＮＡ（short interference RNA）を発現させることにより、ＳＣＣＡ−１及び２のノックダウン細胞株を樹立した。
ｓｉＲＮＡはｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターを用い、添付の説明書に従い、構築した。詳しくは、ＳＣＣＡをコードする遺伝子のヌクレオチド番号４６〜６６位に相補性な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（ACATGAACTT GGTGTTGGCT T：配列番号１０）を含む６５ｍｅｒのセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）と、ヌクレオチド番号４６〜６６位に相同な２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（AAGCCAACAC CAAGTTCATG T；配列番号１２）を含む６５ｍｅｒのアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）とから成る二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＳｉｌｅｎｃｅｒベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位及びＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。ＨａＣａｔ細胞へのトランスフェクションはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Invitrogen)を用い、添付の説明書に従って行った。コントロール細胞は、哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、相補性をもたない二本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い、作製した。安定な細胞系はトランスフェクション細胞をハイグロマイシン−Ｂ選択培地の中で４〜６週間培養して選択を行うことにより獲得した。ＳＣＣＡの発現が抑制されていることを確認するため、上述のとおりにして、リアルタイムＰＣＲによりＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド（配列番号１１）
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
（下線部が相同領域）
アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１３）
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG
（下線部が相補性領域）
【００４５】
その結果を図５に示す。上記ｓｉＲＮＡの導入された細胞では、コントロールに比べ、ＳＣＣＡ−１及び２ともに発現が９０％以上抑制（ノックダウン）されていることが確認された。
【００４６】
上記ノックダウン細胞及びコントロール細胞を用い、表皮細胞におけるＵＶ誘導アポトーシスに対するＳＣＣＡ−１、２の役割について検討した。
上記各種細胞をケラチノサイト−ＳＦＭ培地（GIBCO, Invitrogen)中、Ｌ−グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、ＣＯ2５％の雰囲気において、３７℃にて培養した。集密度６０〜７０％の細胞にＵＶＢを照射した。ＵＶＢ照射はトランスルミネーターＴＯＲＥＸ  ＦＬ２０５−Ｅ−３０／ＤＭＲ（Toshiba Medical Supply)を用い、５０ｍＪ／ｃｍ2の強度で行った。
【００４７】
これらの細胞についてのアポトーシス評価をＦＡＣＳ  ＣＯＵＬＴＥＲを用い、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びプロピジウムイオダイン（ＰＩ）二重染色法を指標とするＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソータ）解析により行った。
その結果を図６に示す。ノックダウン細胞にＵＶ照射を行った結果、コントロール細胞では３８％の細胞がアポトーシスを生じるのに対し、ノックダウン細胞では約８０％もの細胞がアポトーシスを引き起こすことが明らかになった。従って、ＳＣＣＡはＵＶ照射により誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわかった。よって、ＳＣＣＡは表皮細胞のＵＶ防御機構を担うものと考えられる。
【００４８】
抗体アレー
次に、ＳＣＣＡがどのようにしてＵＶ誘導アポトーシスを抑制するかを調べるため、ＳＣＣＡと表皮細胞中のタンパクとの相互作用を検討した。
タンパク質間相互作用をスクリーニングするため、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ(Hypomatorix, Inc）を利用した。ＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ2で照射したＳＣＣＡを高発現するヒト口腔癌細胞株ＨＳＣ−４（住商ファーマーインターナショナル株式会社）を、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＤＴＴ、８０μＭのベスタイン及び１０ｍＭのペプタチンを含有する１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出バッファーに溶解させた。不溶性画分を１４，０００ｒｐｍにて１５分、４℃での遠心分離操作により除去した。４００種の抗体が事前に固定化されたニトロセルロース膜を０．１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するブロッキング溶液の中で室温で１時間、ゆっくりと揺らしながらインキュベーションし、次いで上記溶解物と反応させた。さらに室温２時間インキュベーション後、その膜をＴＢＳ−Ｔ／Ｔ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．５）で２回、次いでＴＢＳで１回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の接合した抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体又は抗ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, CA, USA）を室温にて２時間かけて膜にブロッティングした。ＴＢＳで３回洗浄後、膜を増強ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）(Amersham Pharmacia Biotech）検出にかけた。その結果、興味深いことに、ＳＣＣＡ−１及び−２に対するモノクローナル抗体はストレスキナーゼＪＮＫの活性型に特異的な抗体がスッポトされている位置において検出され、従ってＳＣＣＡ−１は活性型ＪＮＫと相互作用することが見出された。尚、ＳＣＣＡは非活性型ＪＮＫとは相互作用しなかった。
【００４９】
共免疫沈澱及び免疫ブロッティング分析
ＳＣＣＡとＪＮＫとの相互作用を確認するため、以下の分析も行った。
ＵＶＢを５０ｍＪ／ｃｍ2で照射したＳＣＣＡを高発現するヒト口腔癌細胞株ＨＳＣ−４を、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＤＴＴ、８０μＭのベスタイン及び１０ｍＭのペプタチンを含有する１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出バッファーに溶解させた。不溶性画分を１４，０００ｒｐｍにて１５分、４℃での遠心分離操作により除去した。その上清液をプロテインＧ−セファロース４Ｂビーズと４℃で１時間、定常振盪させて予備浄化した。プロテインＧ−セファロース４Ｂビーズを２，０００ｒｐｍにて２分、４℃での遠心分離操作により除去した。その上清液を、抗ＳＣＣＡ抗体（Santa Cruz Biotechnology）の結合したプロテインＧ−セファロース４Ｂビーズ又は抗ｐ−ＪＮＫ抗体（Cell Signaling and BD Pharmingen）の結合したプロテインＧ−セファロース４Ｂビーズと４℃で一晩、定常振盪させながらインキュベーションした。そのビーズをＴＢＳ−Ｔ／Ｔ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．５）で４回洗浄し、４ｘのサンプルバッファー（２０％のグリセリン、２６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％のＳＤＳ）中で煮沸し、そしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ＰＶＤＦ膜に転写させた後、結合したタンパク質について、抗ＳＣＣＡ抗体又は抗Ｐ−ＪＮＫ抗体のそれぞれを用いるウェスタンブロッティングによりアッセイした。検出にはＥＣＬ  ＰＬＵＳケミルミネッセンスシステム(Amersham Pharmacia Biotech）を使用した。抗ＳＣＣＡ抗体結合ビーズとのインキュベーションではＪＮＫが検出され、抗ｐ−ＪＮＫ抗体結合ビーズとのインキュベーションではＳＣＣＡが検出されたことから、ＳＣＣＡがＪＮＫと相互作用することが確認された。
【００５０】
「プルダウウン」ＪＮＫキナーゼアッセイ
（ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質を利用する「プルダウン」ＪＮＫキナーゼアッセイ）
上述のとおり、活性型ＪＮＫ１は紫外線を含む様々なストレス性刺激の伝達をあずかる分子である。活性型ＪＮＫは転写因子ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を通じてアポトーシスを誘導する。従って、ＳＣＣＡの抗アポトーシス活性が、ＪＮＫのｃ−Ｊｕｎリン酸化活性の阻害によるものと予想し、我々は組換ＳＣＣＡ−１の存在下及び不在下で、基質としてｃ−Ｊｕｎを使用し、組換リン酸化ＪＮＫ１及び組換リン酸化ＪＮＫ２について、in vitroキナーゼアッセイを行った。
組換ＳＣＣＡ−１は標準の方法で作成した。簡単に説明すると、ＳＣＣＡ−１のｃＤＮＡをポリヒスチジンタッグ（６ｘのＨｉｓ）とともにｐＱＥ−３０（Qiagen）にサブクローニングした。Ｈｉｓタッグ付タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３１）において合成した。Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen）及びＭｏｎｏ−Ｑ（Amersham)を組換タンパク質の精製のために用いた。
上記組換ＳＣＣＡ−１  ２μｇ、ｃ−Ｊｕｎ融合タンパク質結合ビーズ（Cell Signaling社）及び活性化組換リン酸化ＪＮＫ１（Cell Signaling社）  ２μｇ又は活性型組換リン酸化ＪＮＫ２（Cell Signaling社）  ２μｇを静かに振盪させながら４℃で一晩インキュベーションした。コントロールとして、ＳＣＣＡ−１を含有させていないものをインキュベーションした。２，０００ｒｐｍで４℃にて２分間の遠心分離操作の後、ｃ−Ｊｕｎ融合ビーズを５００μｌの溶解バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ｍＭのＰＭＳＦ）で２回洗浄し、次いで５００μｌのキナーゼバッファー（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのβ−グリセロリン酸塩、２ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で２回洗浄し、そして以下のようにしてキナーゼアッセイを行った。
【００５１】
キナーゼアッセイ
ｃ−Ｊｕｎ融合ビーズのペレットを１００μＭのＡＴＰの添加された５０μｌのキナーゼバッファーに懸濁した。３０℃で３０分インキュベーション後、反応生物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、そして抗リン酸化ｃ−Ｊｕｎ抗体（希釈率１：１０００）で標識した。その結果を図７に示す。図から明らかなとおり、ＳＣＣＡ−１を活性型ＪＮＫ１とともにインキュベーションした場合、ＳＣＣＡ−１を含有しないコントロールと比べ、リン酸化ｃ−Ｊｕｎの量は顕著に減少した。従って、ＳＣＣＡ−１はＪＮＫ１によるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を抑制することが明らかとなった。一方、ＳＣＣＡ−１を活性型ＪＮＫ２とともにインキュベーションした場合、コントロールと比べ、リン酸化ｃ−Ｊｕｎの量の有意な増減は認められなかった。従って、ＳＣＣＡ−１はＪＮＫ１の活性を特異的に抑制することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】露光及び非露光部位の表皮におけるＳＣＣＡの発現。
【図２】ＵＶ照射による表皮におけるＳＣＣＡの発現の変動。
【図３】培養ヒト角化細胞におけるＳＳＣＡ発現に対するＵＶ照射の影響。
【図４】ＳＣＣＡ高発現細胞とＳＣＣＡ非発現細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。
【図５】ＳＳＣＡノックダウン細胞株の樹立を示す。
【図６】ＳＣＣＡノックダウン細胞とコントロール細胞との、ＵＶ照射により誘導されるアポトーシス率の比較。
【図７】「プルダウウン」ＪＮＫキナーゼアッセイの結果。
【図３】
2005281140.tif 000002
【図４】
2005281140.tif 000003
【図５】
2005281140.tif 000004
【図６】
2005281140.tif 000005
【図１】
2005281140.tif 000006
【図２】
2005281140.tif 000007
【図７】
2005281140.tif 000008
【配列表】
2005281140000001.app