(57)【要約】  【課題】  培養液中のスレオニン、イソロイシンによるスレオニンオペロンのアテニュエーションによる転写制御を解除することによって、エシェリヒア属細菌のＬ−アミノ酸、特にスレオニン、イソロイシンを生産する能力を向上させる。  【解決手段】  Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有し、かつスレオニンオペロン固有のプロモーターにより発現が制御され、かつアテニュエーションによる制御が解除されるようにリーダー配列とアテニュエーター配列が除去されたスレオニンオペロンを含むエシェリヒア属細菌を作製し、得られたエシェリヒア属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシを生成蓄積させ、同培地からＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを採取することにより、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを製造する。  【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、スレオニンオペロン固有のプロモーターにより発現が制御され、かつアテニュエーションによる制御が解除されるようにリーダー配列とアテニュエーターが除去されたスレオニンオペロンを保持することを特徴とする、エシェリヒア属細菌。
【請求項２】
前記スレオニンオペロンをプラスミド上に保持する請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】
前記スレオニンオペロンを染色体上に保持する請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項４】
Ｌ−イソロイシン生合成系酵素の活性が増強され、Ｌ−イソロイシン生産能を有する、請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項５】
リーダー配列及びアテニュエーターを含むアテニュエーションに関与する領域、スレオニンオペロン固有のプロモーター、並びにthrABC構造遺伝子を含むスレオニンオペロンにおいて、少なくともリーダー配列とアテニュエーター配列が除去されたことを特徴とするスレオニンオペロン。
【請求項６】
配列番号１に示す配列の塩基番号１８８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、請求項５に記載のスレオニンオペロン。
【請求項７】
配列番号１に示す配列の塩基番号１６８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、請求項５に記載のスレオニンオペロン。
【請求項８】
配列番号１に示す配列の塩基番号１４８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、請求項５に記載のスレオニンオペロン。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生成・蓄積せしめ、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを培地から採取することを特徴とする、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エシェリヒア属細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンの製造法に関する。Ｌ―スレオニン、Ｌ−イソロイシンはともに必須アミノ酸であり、Ｌ−スレオニンは医療や、動物用飼料添加物として様々な栄養混合物のコンポーネントとして利用される。Ｌ−イソロイシンは、主に栄養剤をはじめとする医薬用として有用であるだけでなく、飼料添加物としても利用出来るアミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのアミノ酸生産菌としては、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株、あるいは遺伝子組換えによりＬ−アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体等が用いられている。
【０００３】
具体的にはＬ−スレオニンの製造法としては、エシェリヒア属細菌の変異株を用いるものには、６−ジメチルアミノプリン耐性の変異株（特許文献1参照）や、ボレリジン耐性の変異株（特許文献２参照）を用いる方法があり、組換え体エシェリヒア属細菌を用いる方法には、例えばスレオニンオペロンをプラスミドで増幅させた菌株（特許文献３参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子やアスパルターゼ遺伝子をプラスミドで増幅させた菌株（特許文献４参照）をＬ−スレオニン生産株として用いる方法がある。
【０００４】
Ｌ−イソロイシンの製造法としては、エシェリヒア属細菌の変異株を用いるものには、６−ジメチルアミノプリンに耐性の変異株（特許文献５参照）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメートに耐性の変異株（特許文献６参照）、チアイソロイシンに耐性の変異株（特許文献６参照）を用いる方法等があり、組換え体エシェリヒア属細菌を用いるものとしては、スレオニンデアミナーゼあるいはスレオニンアセトヒドロキシ酸シンターゼをプラスミドで増幅した菌株をＬ−イソロイシン生産株として用いる方法（特許文献７、特許文献８参照）等がある。
【０００５】
エシェリヒア属細菌を用いたＬ−スレオニン、又はＬ−スレオニンを前駆体とするＬ−イソロイシンの生産において、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を増加させる方法が知られている。
【０００６】
エシェリヒア・コリのＬ−スレオニンの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、アスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）等の遺伝子が知られている。
【０００７】
その中で、エシェリヒア・コリのスレオニン生合成系遺伝子であるthrABC遺伝子は、スレオニンオペロンと呼ばれるオペロンを形成している。
【０００８】
スレオニンオペロンの発現は、細胞内のスレオニン、イソロイシン濃度に依存してアテニュエーションと呼ばれる転写減衰による制御を受け、その中でも、エシェリヒア・コリにおけるスレオニンオペロンの発現は、スレオニンプロモーターと構造遺伝子であるthrAの間に存在する制御領域によって制御されることが知られている（非特許文献１参照）。
また、この制御領域は、プロモーター領域と開始コドンの間に存在する数十塩基からなるリーダー配列とアテニュエーターからなることが知られている。
【０００９】
リーダー配列にはスレオニンとイソロイシンをコードするコドンが多く含まれており、培地中にスレオニンやイソロイシンが存在するとリーダー配列の翻訳がスムーズに行われる。これによりアテニュエーターが立体構造を形成して転写が減衰し、スレオニン生合成系遺伝子の発現が低下する。反対に培地にスレオニンやイソロイシンが存在しないときには、リーダー配列上でリボゾームの進行が遅れ、それに起因するmRNAの立体構造の変化によりスレオニン生合成系遺伝子の発現が上昇する機構の存在が示唆されている。
【００１０】
アテニュエーションによる制御を解除することにより、スレオニンオペロンを高発現させて、高濃度のイソロイシン、スレオニン下で効率よく発酵生産を行うことが試みられている。
【００１１】
アテニュエーションによる制御を解除する方法としては、アテニュエーターを除去したスレオニンオペロンを、高発現化する強力な異種プロモーターと連結させることにより、アテニュエーションによる制御を受けにくくなり、スレオニンオペロンの発現が上昇することが報告されており、このようなスレオニンオペロンを含む細菌はL-スレオニンの生産能力が向上することが開示されている（特許文献3参照）。また、ポレリジン耐性が付与されることにより、スレオニニル-tRNAシンターゼ活性が変化し、アテニュエーション制御を受けにくくなり、L-スレオニンの生産能力が向上することが開示されている（特許文献２参照）。
【００１２】
しかし、アテニュエーターの除去のみでは、アテニュエーション制御を受けにくくなるが、培地中にL-イソロイシン、L-スレオニンを添加することにより転写減衰が生じるという欠点があり、スレオニンオペロンの発現量としては未だ充分ではない。従って、培養液中のL-スレオニン、L-イソロイシンが高濃度となるＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン発酵においては、さらなるスレオニンオペロンの発現量の向上が望まれる。また、他遺伝子のプロモーターを利用する場合、プロモーターと転写開始点との距離、ＳＤ配列と開始コドンの距離、開始コドンの配列などにより発現が大きく影響され、最大でかつ安定した発現量を得ることが難しく、安定したＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン生産能を有する菌株の創出が望まれていた（非特許文献２参照）。
【００１３】
【特許文献１】特開平５−３０４９６９号公報
【特許文献２】国際公開第９８/０４７１５号パンフレット
【特許文献３】特開平０５−２２７９７７号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／０１１０８７６号明細書
【特許文献５】特開平５−３０４９６９号公報
【特許文献６】特開平５−１３０８８２号公報
【特許文献７】特開平２−４５８号公報
【特許文献８】欧州特許第０５９３７２９号明細書
【非特許文献１】リーンら(S.P.Lynn)ら、「ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー（Mol.Biol）」アカデミックプレス  1985年、183巻(1985)、ｐ529-541
【非特許文献２】ダルボーグ（ Dalboge H）ら, 「ディーエヌエー」DNA.ニューヨーク・ナイ・メリー・アン・リベルト（ New York Ny Mary Ann Liebert） 1988 年7-8月号、第7巻6号、p399-405
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、エシェリヒア属細菌のスレオニン生合成系を強化することにより、Ｌ−アミ
ノ酸、特にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アテニュエーション領域のリーダー配列とアテニュエーターを除去することにより、培養液中のイソロイシン、スレオニンによるアテニュエーションによる制御を受けないスレオニンオペロンを構築することに成功した。このスレオニンオペロンを有する菌株がＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの発酵生産に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、スレオニンオペロン固有のプロモーターにより発現が制御され、かつアテニュエーションによる制御が解除されるようにリーダー配列とアテニュエーターが除去されたスレオニンオペロンを保持することを特徴とする、エシェリヒア属細菌。
（２）  前記スレオニンオペロンをプラスミド上に保持する（１）のエシェリヒア属細菌。
（３）  前記スレオニンオペロンを染色体上に保持する（１）のエシェリヒア属細菌。
（４）  Ｌ−イソロイシン生合成系酵素の活性が増強され、Ｌ−イソロイシン生産能を有する、（１）のエシェリヒア属細菌。
（５）  リーダー配列及びアテニュエーターを含むアテニュエーションに関与する領域、スレオニンオペロン固有のプロモーター、並びにthrABC構造遺伝子を含むスレオニンオペロンにおいて、少なくともリーダー配列とアテニュエーター配列が除去されたことを特徴とするスレオニンオペロン。
（６）  配列番号１に示す配列の塩基番号１８８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、（５）のスレオニンオペロン。
（７）  配列番号１に示す配列の塩基番号１６８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、（５）のスレオニンオペロン。
（８）  配列番号１に示す配列の塩基番号１４８〜３１０に相当する配列が除去された配列を有する、（５）のスレオニンオペロン。
（９）  （１）〜（４）のいずれかのエシェリヒア属細菌を培地中で培養し、該培地中にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生成・蓄積せしめ、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを培地から採取することを特徴とする、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの製造法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、エシェリヒア属を用いた発酵法によるＬ−スレオニン、及び／又はＬ−イソロイシンの製造において、Ｌ−スレオニン、及び／又はＬ−イソロイシンの発酵収率を向上させることが出来る。また、本発明は、エシェリヒア属のＬ−スレオニン、及び／又はＬ−イソロイシン生産菌の育種に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のエシェリヒア属細菌
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、スレオニンオペロン固有のプロモーターにより発現が制御され、かつアテニュエーションによる制御が解除されるようにリーダー配列とアテニュエーターが除去されたスレオニンオペロン（以下、本発明のスレオニンオペロンということがある）を保持することを特徴とする、エシェリヒア属細菌である。本発明のエシェリヒ
ア属細菌は、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシン生産能を両方有するものであってもよい。
【００１９】
本発明のエシェリヒア属細菌は、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌に本発明のスレオニンオペロンを保持させるか、本発明のスレオニンオペロンを保持する細菌にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を付与することによって得ることができる。なお、本発明のエシェリヒア属細菌は、本発明のスレオニンオペロンを保持させることによってＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有するようになったものでもよい。
【００２０】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いる、エシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt ,F.C. et al.,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium ,American Society for Microbiology,Washington D.C.,1029 table 1） に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００２１】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株毎に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２２】
＜１＞−１．Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能の付与
以下、エシェリヒア属細菌にＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を付与する方法について述べる。なお、本発明において、「Ｌ−スレオニン生産能」とは、培地中で培養したときに、培地中にＬ−スレオニンを生成し、蓄積する能力をいう。また、本発明において、「Ｌ−イソロイシン生産能」とは、培地中で培養したときに、培地中にＬ−イソロイシンを生成し、蓄積する能力をいう。
【００２３】
Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を付与するには、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、L-スレオニン生合成系酵素あるいはL-イソロイシン生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌や、コリネ型細菌の育種に採用されてきた方法を適用することが出来る。これらの方法によるＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産菌の育種において、付与する栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。
【００２４】
また、L-スレオニンまたはL-イソロイシン生合成系酵素活性を増強する場合、増強されるＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン生合成酵素は単独であっても２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−スレオニン及び／又はＬ−イソロイシン生合成系酵素活性の増強を組み合わせてもよい。
【００２５】
以下に、Ｌ−スレオニン、又はＬ−イソロイシン生合成系酵素活性の増強によって、エシェリヒア属細菌にこれらのＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を例示する。酵素活性の増強は、例えば、細胞内の該酵素活性が上昇するように同酵素をコードする遺伝子に変異を導入するか、又同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって行うことが出来る。
【００２６】
Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）等の遺伝子が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。これらのＬ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH６株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【００２７】
また、用いるＬ−イソロイシン生合成系遺伝子としては、スレオニンデアミナーゼ遺伝子(ilvA)、ケトール酸レダクトイソメラーゼ遺伝子（ilvC）、アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ilvI）、デヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子(dad)  アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ilvE）等が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。なお、上記ilvA, ilvE遺伝子は、ilvGMEDAオペロン（特開２００２−０５１７８７号公報）に含まれているため、ilvGMEDAオペロンの形で用いてもよい。
【００２８】
また、Ｌ−イソロイシンは、Ｌ−スレオニンを前駆体として生成される。従って、Ｌ−イソロイシンの生産能を高めるには、Ｌ−スレオニンの供給を増加すること、すなわちＬ−スレオニンの生合成系を強化することが好ましい。従って、Ｌ−イソロイシン生成能を高めるには、Ｌ−イソロイシン固有の生合成系を強化すること、またはＬ−スレオニン生合成系とＬ−イソロイシンの生合成系をともに強化することによって達成出来る。このようにしてスレオニン生産能が付与された細菌としては、例えば特開２００２−５１７８７号公報、又は特開平９−１２１８７２号公報等に記載されたものが挙げられる。
【００２９】
前記遺伝子によってコードされる酵素の活性を上昇させることは、例えば、エシェリヒア属細菌内で増幅可能な自律プラスミドで、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン生合成系遺伝子を増幅することによって達成できる。また、これらの生合成系遺伝子を染色体上に組み込んでもよい。さらに、前記遺伝子によってコードされる酵素の細胞内の活性が上昇するような変異を含む遺伝子を導入することによっても達成することができる。このような変異としては、例えば、同遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異及び前記酵素タンパク質の比活性が高くなるような前記遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。
【００３０】
遺伝子の発現の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上の該遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（国際公開パンフレット  WO00/18935）。このようなプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーターやラムダファージ由来のPrプロモーターが強力なプロモーターとして知られている。また、これらのプロモーターを、染色体、あるいはプラスミド上の固有のプロモーターと置換または改変することによっても遺伝子の発現が強化される。これらプロモーターの改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００３１】
以下に、本発明で使用することのできるＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能が付与されたエシェリヒア属細菌を例示する。ただし、Ｌ−スレオニン又はＬ−イソロイシン生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００３２】
Ｌ−スレオニン生産能が付与されたエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−スレオニン生産能を有する６−ジメチルアミノプリン耐性の変異株（特開平５−３０４９６９号公報）があり、組換え体エシェリヒア属細菌としては、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を過剰に生成する変異が導入されたスレオニン生合成遺伝子をプラスミド上で増幅した菌株（特公平１
-２９５５９号公報、特開平０５−２２７９７７号公報、特開平５−２２７９７７号公報）や、スレオニンオペロンをプラスミドで増幅した菌株（特開平２−１０９９８５号公報）、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子及びニコチンアミド・ヌクレオチド・トランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅した菌株（特開２００２−５１７８７号公報）等が挙げられる。
【００３３】
また、エシェリヒア・コリ  VKPM B-3996（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することも出来る。この VKPM B-3996は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National
Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-3996 のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D.Plasmid, 1986, 16, 161-167を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（WO90/04636国際公開パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００３４】
Ｌ−イソロイシン生産能が付与されたエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−イソロイシン生産能を有する６−ジメチルアミノプリン耐性の変異株（特開平５−３０４９６９号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、チアイソロイシン耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、アルギニンハイドロキサメートに耐性の変異株（特開平５−１３０８８２号公報）があり、組換え体エシェリヒア属細菌としては、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強した菌株（特開平２−４５８号公報、特開平２−４２９８８号公報、特開平８−４７３９７号公報）等が挙げられる。
【００３５】
＜１＞−２．本発明のスレオニンオペロン
スレオニンオペロンの転写はイソロイシン、又はスレオニンが存在することで、アテニュエーションと呼ばれる転写制御を受け、転写が減衰されることが知られている（J.Mol.Biol(1985) 183,529-541）。このアテニュエーションによる制御を解除することは、これらのアミノ酸を高生産する上で重要である。
【００３６】
エシェリヒア・コリのスレオニンオペロンは、固有のスレオニンプロモーターによって制御される。スレオニンオペロンは、thrABCの構造遺伝子と、該構造遺伝子上流のプロモーターと、リーダー配列及びアテニュエーターと呼ばれる特異的な配列を含み、thrABCの構造遺伝子上流の領域で発現制御が行われる。
【００３７】
リーダー配列としては、例えば配列番号６で示されるリーダー配列を挙げることができる。この配列は、配列番号２で示される２１個のアミノ酸からなるリーダーペプチドをコードしており、８個のスレオニンコドン、４個のイソロイシンコドンをコードする領域と終始コドンを含む領域から構成されている。アテニュエーターとしては、例えば配列番号７で示される配列を挙げることができる。この配列は、ＤＮＡ分子内で対を形成できる２つの回文配列からなる相補的な配列を含む（J.Mol.Biol(1985) 183,529-541）。アテニュエーターとは、転写を終結させるターミネーターと類似した構造を持ち、アテニュエーター配列の回文配列から構成される相補的な配列同士が結合して対を形成し、ステムループ構造と呼ばれる立体構造を形成し、この領域で転写が終結する。
【００３８】
スレオニン、イソロイシン存在下でのアテニュエーションによる転写減衰は以下のよう
な機構で行われる。すなわち、細胞内のイソロイシン、スレオニンの濃度が高いとき、培養液中のスレオニニル-tRNA及びイソロイシル-tRNAの濃度が上昇する。従って、スレオニン、イソロイシンコドンを多くコードするリーダーペプチドを翻訳するのに充分なtRNA−アミノ酸複合体が細胞内に存在することになる。従ってリーダー配列がスムーズに転写、翻訳され、リーダーペプチド自身の終始コドンで翻訳が終結する。さらに、アテニュエーターの回文配列が相補的に結合することによって、ステムループ構造を形成し、ステムループ構造がターミネーターとして機能することにより転写が終結する。従って、スレオニンオペロンまで転写が進行しにくくなり、スレオニン生合成系遺伝子の発現量が減少することとなる。
【００３９】
一方、細胞内のスレオニン、イソロイシンの濃度が少ないとき、細胞内のスレオニニル-tRNA及びイソロイシル-tRNAの濃度が減少する。リーダー配列領域を転写翻訳するのに十分なtRNA−アミノ酸複合体が存在しないことになり、リボゾームはスレオニン、イソロイシンコドンが並んだところで停止する。従って、リーダー配列はスムーズに翻訳されず、リーダーペプチドをコードする領域の終始コドンの直上流領域である領域と、アテニュエーター領域上流の領域が対を形成し、アテニュエーター内での相補鎖の結合が妨げられ、ターミネーターが形成できず、転写は終結しない。従って転写はオペロンのthrABC構造遺伝子の中まで進行し、スレオニンオペロンが最大に転写され、スレオニン生合成酵素が最大に生成される。
【００４０】
Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンを高生産するときには、細胞内のＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンの濃度は高く、アテニュエーションによる制御が機能し、スレオニンオペロンの発現量が低下する。その結果、スレオニン生合成系酵素の活性が低下することにより、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンを生産する能力を最大限に発揮できないこととなる。
【００４１】
このようなアテニュエーションによる制御を解除することが出来れば、スレオニンオペロンを高発現でき、後述するＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン生合成の強化と組合わせることによって、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンの生産能を一層向上することができると考えられる。
【００４２】
本発明のスレオニンオペロンは、「リーダー配列及びアテニュエーターを含むアテニュエーションに関与する領域、スレオニンオペロン固有のプロモーター、並びにthrABC構造遺伝子を含むスレオニンオペロンにおいて、少なくともリーダー配列とアテニュエーター配列が除去されたことを特徴とするスレオニンオペロン」である。
【００４３】
本発明において「アテニュエーション」とは、細胞内のスレオニン、イソロイシン濃度が高まることにより、スレオニンオペロンの転写が減衰することをいう。「アテニュエーター」とは、分子内の相補配列によりステムループ構造を形成してスレオニンオペロンの転写を終結させる配列をいい、エシェリヒア属細菌由来の配列としては、例えば配列番号７に示す配列が挙げられる。また、「リーダー配列」とはイソロイシンコドン、及びスレオニンコドンを多く含む配列をいい、エシェリヒア属細菌由来の配列としては、例えば配列番号２に示す４個のイソロイシンコドン及び８個のスレオニンコドンを含むリーダーペプチドをコードする配列番号６に示す配列を(J,Mol.Biol. (1985)183,529-541)を挙げることができる。「固有のプロモーター」とは、スレオニンオペロン自身のプロモーターをいい、エシェリヒア属細菌由来の配列としては、例えば配列番号１のプロモーターを例示することができる。また、「thrABC構造遺伝子」とは、アスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）を含む遺伝子をいい、エシェリヒア属細菌由来の配列としては、例えば配列番号１の３３７〜５０２０番目の配列を例示することができる。「thrABC構造
遺伝子」は、アスパルトキナーゼI−ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、及びスレオニンシンターゼの活性を有するタンパク質をそれぞれコードする限り、改変されたものであってもよい。例えば、既述したpVIC40に搭載されたthrABC遺伝子のように、L-スレオニンによるフィードバック阻害が解除されるように改変されたものであってもよい。
【００４４】
また本発明において、「アテニュエーションに関与する領域」とは、スレオニンオペロンのリーダー配列とアテニュエーターを含むthrA開始コドン上流領域の配列をいうが、エシェリヒア属細菌由来の配列としては、例えば、配列番号１に示す塩基配列番号148から310で表される領域が挙げられる(J,Mol.Biol. (1985)183,529-541)。
【００４５】
本発明において「アテニュエーションによる制御が解除された」とは、スレオニンオペロンのうちの、少なくともリーダー配列及びアテニュエーターが除去されたことにより、アテニュエーターがステムループ構造を形成できなくなり、イソロイシン又はスレオニン存在下でのスレオニンオペロンの発現量が野生型の発現量より増加することをいう。
【００４６】
また、「少なくともリーダー配列及びアテニュエーターが除去されたスレオニンオペロン」とは、スレオニンオペロンが、少なくともリーダー配列及びアテニュエーターが除去された配列を有することをいう。アテニュエーションが解除される限りにおいて、さらに、リーダー配列及びアテニュエーターの前後の配列が除去された配列であってもよい。例えば、リーダー配列とアテニュエーターの間の配列、及びリーダー配列の５'側の配列が除去されたものであってもよい。ここで、除去されるリーダー配列とアテニュエーターの間の配列としては配列番号１の２５６〜２７２番目に相当する配列などが挙げられる。また、除去されるリーダー配列の５'側の配列としては、配列番号１の１６８〜１８９番目に相当する配列、１４８〜１８９番目に相当する配列などが挙げられる。ただし、アテニュエーションが解除される限り、さらに、これらの配列の５’側の配列を除去したものであってもよい。
【００４７】
本発明のスレオニンオペロンとしては、エシェリヒア属細菌由来のスレオニンオペロンを改変したものが好ましい。例えば、配列番号１において少なくとも配列番号６及び配列番号７に示される配列が除去された配列、又はこれに相当する配列を有するスレオニンオペロンを挙げることができる。具体的には、配列番号１の塩基配列において塩基番号188〜310で示される領域が除去された配列が好ましく、配列番号１の塩基配列において塩基番号168〜310で示される領域が除去された配列がより好ましく、配列番号１の塩基配列において塩基番号148〜310で示される領域が除去された配列が特に好ましい。また、アテニュエーションが解除された状態で、活性を有するthrA,B,Cタンパク質をコードするスレオニンオペロン遺伝子を発現する限り、上記配列において、１又は数個の塩基に置換・欠失等を有する配列であってもよい。ここで数個としては、２〜５０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個をいう。また、上記で除去された領域にリーダー配列及びアテニュエーターとして機能し得ない配列が挿入されたような配列であってもよい。ここで、リーダー配列及びアテニュエーターとして機能し得ない配列は、リーダー配列のスレオニンコドンやイソロイシンコドンの全部又は一部が他のアミノ酸のコドンや終始コドンに置換されたような配列や、アテニュエーターがステムループ構造を形成できないように改変された配列なども含む。
【００４８】
本発明において「スレオニンオペロンの発現量が上昇する」とは、アテニュエーションによる制御が解除されたことにより、mRNAの転写量が増大し、翻訳されるthrABCタンパク質の量が増大することをいう。本発明において「スレオニンオペロンにコードされるスレオニン生合成系酵素の比活性が増大する」とは、スレオニンオペロンの発現量が増大したことにより、スレオニンオペロンの構造遺伝子thrABC遺伝子がコードするアスパルトキナ
ーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）の比活性が野生株又は親株に比べて増大することを意味する。ここで、比較対象となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えばエシェリヒア・コリ  W3110（ATCC27325）が挙げられる。
【００４９】
上述したような、本発明のスレオニンオペロンを含むエシェリヒア属細菌は、「アテニュエーションに関与する領域」を含む配列において、少なくともリーダー配列及びアテニュエーターを欠失させた配列を有するDNAを部位特異的変異法等により作製し、後述するような方法で、染色体上のスレオニンオペロンのアテニュエーションに関与する領域に導入することにより得ることができる。また、本発明のスレオニンオペロンを搭載したベクターDNAを、エシェリヒア属細菌において増幅することによっても作製出来る。ここで用いるベクターDNAとしては、後述するようなエシェリヒア属細菌内で自律複製可能なプラスミド等が挙げられる。欠失等の変異導入は、例えば市販の遺伝子変異導入用キットや制限酵素、PCR法などを組み合わせて行うことができる。
【００５０】
スレオニンオペロンのアテニュエーションに関与する領域を改変することは、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌に紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、Ｎ−メチルＮ’−ニトロソグアニジン(ＮＴＧ)もしくはＥＭＳ（エチルメタンスルフォネート）などの変異誘発剤処理等の変異処理を施し、その中からアテニュエーションが解除された細菌を選択することによっても達成出来る。
【００５１】
本発明のエシェリヒア属細菌において、アテニュエーションによる制御が解除されてスレオニンオペロンの発現量が向上したことは、高濃度のＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを添加して培養した菌体で、スレオニンオペロンがコードするスレオニン生合成系酵素の酵素活性を測定することによって確認出来る。このとき比較は、本発明のエシェリヒア属細菌を、アテニュエーション制御が起こらない環境であるＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンが枯渇した培地で培養した菌体の酵素活性の測定結果を対象とするのが好ましい。
【００５２】
測定する酵素については、スレオニンオペロン上のthrABC構造遺伝子のうち、thrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ、thrBがコードするホモセリンキナーゼ、及びthrCがコードするスレオニンシンターゼのうちの1又は２種類以上の酵素活性を測定することによって確認出来る。
【００５３】
ホモセリンデヒドロゲナーゼの酵素活性は、Truffa-Bachi P, Le Bras G, Cohen GN., Biochem Biophys Acta. 128:450 (1966)記載の方法で、ホモセリンキナーゼ、スレオニンシンターゼの酵素活性は、Parsot C. EMBO J. 1986 Nov;5(11):3013-9記載の方法で測定出来る。また、菌体タンパク質は、例えば牛血清アルブミンを標準試料として、Protein Assay（Bio-Rad）を用いて定量することができる。
【００５４】
本発明のエシェリヒア属細菌としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下ＨＤという）活性で評価する場合、例えば、スレオニン又はイソロイシン添加下で当該細菌を培養したときにＨＤ活性が25nmol/min/mg菌体タンパク質以上であるエシェリヒア属細菌、スレオニン又はイソロイシン添加下で当該細菌を培養したときに、アテニュエーションに関与する領域が野生型の細菌に比べてＨＤ活性が２〜３倍以上に上昇しているエシェリヒア属細菌、あるいはイソロイシン、又はスレオニン添加によりＨＤ活性が非添加時の３分の１以下に低下しないエシェリヒア属細菌が好ましい。但し、本発明のエシェリヒア属細菌はこれらに限定されない。また、上記において、培地中に添加するＬ−イソロイシン、Ｌ−スレオニンの濃度は50mg/L以上が望ましい。
【００５５】
本発明のスレオニンオペロンをエシェリヒア属細菌に導入する場合に用いるベクターＤＮＡとしては、プラスミドDNAが好ましく、エシェリヒア・コリの場合には、例えばpSTV29（宝バイオ社製）,RSF1010 （Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）,pUC19,pBR322,pMW119等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。本発明のスレオニンオペロンを搭載したプラスミドとしては、例えばＬ−スレオニン生産菌VKPM B-3996が有するフィードバック阻害解除型スレオニンオペロンを搭載したプラスミドpVIC40（特表平３−５０１６８２号公報）において、アテニュエーションに関与する領域を除去したプラスミド等が挙げられる。
【００５６】
染色体上のスレオニンオペロンの「アテニュエーションに関与する領域」にアテニュエーションが解除されるような配列を導入することは、例えば遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labboratorpress(1972) Matsuyama,S. and Mizushima,S., J.Bacteriol., 162,1196(1985)により行うことができる。例えば、染色体上の野生型スレオニンオペロンのアテニュエーションに関与する領域を含む領域を、アテニュエーションによる制御が解除されるような配列を含む配列に置換することによって行うことが出来る。ここで、アテニュエーションによる制御が解除されるような配列とは、「アテニュエーションに関与する領域」を含む配列において、少なくともリーダー配列及びアテニュエーターを欠失させた配列をいう。
【００５７】
相同組換えの機構は以下の通りである。染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体に組み込まれる。この後、さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと再びプラスミドが染色体から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、染色体上の野生型のアテニュエーション領域が、アテニュエーションによる制御が解除されたスレオニンオペロンのアテニュエーション領域に置換された菌株を取得することが出来る。
【００５８】
このような相同組換えによる遺伝子組換え技術は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用出来る。
【００５９】
エシェリヒア属で機能する温度感受性プラスミドとしては、pMAN997(国際公開WO99/03998号パンフレット)、pMAN031(Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36,
211 (1991) ), pHSG415、pHSG422(Hashimoto-Gotoh, T. et al, 16,227-235(1981)等が挙げられる。
【００６０】
目的とする遺伝子が置換されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上の遺伝子を解析することによって確認することが出来る。本発明に用いる各種遺伝子の取得、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換の方法は、Sambrook,J.Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1.21 (1989)に記載されている。
【００６１】
アテニュエーション制御機構が改変された配列を導入するには、染色体上に組み込むことにより、改変されたスレオニンオペロンのコピー数を増加してもよい。例えば、アテニュエーションに関与する領域を除去したスレオニンオペロンをMuファージ（特開平２−１０９９８５号公報）や、トランスポゾン（Berg,D.E.amd Berg,C.M.,Bio/Technol.,1-147）等で染色体上に組み込んでもいい。
【００６２】
＜２＞本発明のＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンの製造方法
上記のようにしてスレオニンオペロンのアテニュエーションに関与する領域を欠失させる、あるいは変異を導入することにより、スレオニンオペロンの発現量が増大したＬ−スレオニン又はＬ−イソロイシンを生産する能力を有するエシェリヒア属細菌を培地に培養し、培地中にスレオニン又はイソロイシンを生成蓄積せしめ、スレオニン又はイソロイシンを該培地から採取することにより、Ｌ−スレオニン、又はＬ−イソロイシンを製造することが出来る。なお、Ｌ−スレオニン及びＬ−イソロイシンを同時に製造してもよい。
【００６３】
本発明のエシェリヒア属細菌を用いてＬ−スレオニン、又はＬ−イソロイシンを生産するには、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【００６４】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。
【００６５】
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。
【００６６】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特にイソロイシン要求性を有するスレオニン生産菌においては、生育に必要なイソロイシンを補添して培養することが望ましい。
【００６７】
無機塩類としてはりん酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用できる。培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行う。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ−スレオニン、L−イソロイシンが蓄積される。
【００６８】
培養終了後の培養液からＬ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンを採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【００６９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００７０】
アテニュエーターを除去したスレオニンオペロン増幅用プラスミドを保持する菌株の作製と評価
＜１＞アテニュエーター除去用プラスミドの作製
エシェリヒア・コリで自律複製可能なスレオニンオペロンを搭載したプラスミドpVIC40（特表平３−５０１６８２）を制限酵素HindIIIとBamHIで制限酵素処理し、スレオニンオペロンを含む約６Kbpの断片を得た。次にpBR322(宝酒造株式会社から購入)を制限酵素HindIII、BamHI処理し、この領域に上述のスレオニンオペロンを含む約6Kbpの断片を挿入し、pBRT3240Aを得た。このpBRT3240AをMluI処理した部位に、配列番号８に示すオリゴヌク
レオチドとその相補鎖を結合させて得られる制限酵素XbaI認識部位を導入したアダプターをプラスミドに挿入して、プラスミドpBR3240Aを得た。
【００７１】
次にpVIC40を鋳型としてＰＣＲ法により、スレオニンプロモーターとホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子thrAを含む断片を増幅した。得られた断片をpHSG399(宝酒造株式会社から購入)のHincII部位に挿入し、pHSGthrAを得た。
【００７２】
pBRT3240Aを制限酵素XbaIとSnaBI処理して得られるベクターを含む断片と、pHSGthrAをXbaIとSnaBI処理して得られるthrA領域をコードする断片を結合し、プラスミドpBRΔT3を得た。次にpBRΔT3をPstI,BamHI処理して得られたthrABCを含む断片を、pVIC40のPstI,BamHI断片に導入して、プラスミドpVICΔT3を得た。プラスミドpVICΔT3は、エシェリヒア・コリ内で自律複製可能であり、アテニュエーションに関与する領域からアテニュエーターだけを除去した構造を保持している（図１）。
【００７３】
このプラスミドpVICΔT3と、対照用として野生型のアテニュエーターを有するプラスミドpVIC40を、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＡＫ−Ｉ)を欠損しているE.coli Gif33株（Theze J, Saint-Girons I., J Bacteriol. 118(3):990 （1974））にC.T.Chungの方法(Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) vol. 86, p2172-2175 , C.T.Chung, S.L.Niemela, R.H.Miller)で形質転換し、ストレプトマイシン耐性を指標として、プラスミドpVICΔT3増幅株である形質転換体（Gif33/pVICΔT3）と、その対照株である野生型のスレオニンオペロンを増幅した形質転換体（Gif33/pVIC40）を得た。pVICΔT3を導入することによって取得された形質転換体をGif33/pVICΔT3と、pVIC40を導入することによって取得された形質転換体をGif33/pVIC40と名付けた。
【００７４】
上記のように選択されたGif33/pVICΔT3株と、Gif33/pVIC40株プラスミドを抽出し、目的のプラスミドが増幅されていることを確認した。
【００７５】
＜２＞アテニュエーターを除去したスレオニンオペロン増幅用プラスミドを保持する菌株の培養とホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の測定
スレオニンオペロンのアテニュエーター領域が除去したプラスミドpVICΔT3を増幅した形質転換体Gif33/pVICΔT3と、アテニュエーターが野生型のプラスミドpVIC40を増幅したプラスミドGif33/pVIC40を用いて以下の培養を行い、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（以下、ＨＤと呼ぶ）活性を測定した。
【００７６】
20μg/mlのストレプトマイシンを含むLB培地にて培養したGif33/pVIC40、Gif33/pVICΔT3の菌体を、グルコース40g、硫酸アンモニウム16g、リン酸一カリウム１g、硫酸第一鉄7水和物0.01g、塩化マンガン4水和物0.01g、Yeast extract 2g、硫酸マグネシウム7水和物1g、イソロイシン50mgあるいは250mg、炭酸カルシウム30gを純水1Lに含む培地（KOHでpH7.0に調整されている）を含む生産培地を用いて、培養温度37℃、培養時間22〜27時間、約115 rpmでしんとう培養を行った。
【００７７】
培養終了後、培養液中の菌体を集菌してHD活性を測定した。HD活性の測定法はTruffa-Bachi P, Le Bras G, Cohen GN., Biochem Biophys Acta. 128:450 (1966)記載の方法を参考にし、終濃度200 mM Tris-HCl（pH9.0）、500mM KCl、25mM L-Homoserine、0.8 mM NADPを含む反応液を用い、粗酵素液を反応液に加えた後、340nmの吸光度の上昇を検出して活性を測定した。ブランクはHomoserineの代わりに水を添加して吸光度を測定したものを用いた。粗酵素液は上記培養液から遠心分離により菌体を分離し、0.1M KP buffer (0.01M DTT, pH7.0)で洗浄後、超音波破砕し、未破砕菌体を遠心分離で除去することにより調製した。粗酵素液のタンパク質定量は、牛血清アルブミンを標準試料としてProtein Assay（Bio-Rad）を用いて定量した。結果を表１に示す。
【００７８】
【表１】
2005151829.tif 000003
【００７９】
その結果、Gif33/pVICΔT3株と、Gif33/pVIC40では、HD酵素活性の差は見られず、アテニュエーター除去のみではスレオニンオペロンの発現量の増大は観察されなかった。
【実施例２】
【００８０】
アテニュエーターを除去し、リーダー配列を段階的に除去したアテニュエーション領域除去株の構築と評価
【００８１】
＜１＞アテニュエーター除去とリーダー配列除去用プラスミドの構築
上述の記載通り、アテニュエーターの除去のみでは、イソロイシン添加下でのアテニュエーション制御を回避することはできなかった。そこで、アテニュエーション領域の除去に加え、リーダー配列を段階的に除去させることとした。まずpVIC40を鋳型としてＰＣＲを行い、リーダー配列領域除去型の配列を作製した。プロモーター上流領域に位置する配列の相補鎖である配列番号９に示すオリゴヌクレオチドと、配列番号１０−１４に示すオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行い、プロモーターと種々のリーダー配列の長さを持つthrAの上流領域を取得した。本ＤＮＡ断片を常法により精製し、pHSG398(宝酒造製)のHincII処理物に連結してそれぞれプロモーターと種々のリーダー配列の長さが、配列番号９と１０で増幅した配列に由来するプラスミドpHPBthr, 配列番号９と１１で増幅した配列に由来するプラスミドpHPCthr, 配列番号９と１２で増幅した配列に由来するプラスミドpHPDthr, 配列番号９と１３で増幅した配列に由来するプラスミドpHPEthr, 配列番号９と１４で増幅した配列に由来するプラスミドpHPFthrを得た。次にこの５種のプラスミドを制限酵素HindIIIとBamHIで処理し、thrA上流領域を含む断片をpBR322(ニッポンジーン社製)のHindIII、BamHI領域に導入し、プラスミドpBRBthr,pBRCthr,pBRDthr,pBREthr,pBRFthrを取得した。
【００８２】
次に、上記のアテニュエーターを除去したスレオニンオペロン増幅用プラスミドpBRΔT3をXbaI,BamHIで処理し、thrABCを含む断片をpBRBthr,pBRCthr,pBRDthr,pBREthr,pBRFthrのXbaI,BamHI断片に導入して、スレオニンオペロン構造遺伝子と、プロモーターと種々の長さのリーダー配列を搭載したプラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3を取得した。プラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3をPstI,BamHIで処理して得られた断片を、pVIC40のPstI,BamHI部位に導入して、プラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3を構築した（図２）。得られたプラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3は、エシェリヒア・コリで自律複製可能なプラスミドであり、アテニュエーション領域のアテニュエーター配列が完全に除去し、さらにリーダー配列が段階的に除去されている。pBAT3は配列番号１で示される塩基配列番号188から310の配列が、pCAT3は、塩基配列番号178から310の配列が、pDAT3は塩基配列番号168から310の配列が、pEAT3は塩基配列番号158から310の配列が、pFAT3は塩基配列番号148-310の配列が段階的に除去されている。
【００８３】
＜２＞アテニュエーション領域の除去用プラスミド導入株の構築と評価
取得されたプラスミドのいくつかについて、リーダー配列除去の効果があるかどうか確認した。これらのリーダー配列を含む配列を段階的に除去した配列を持つプラスミドpDAT3,pFAT3と対照となるプラスミドpVIC40をHD欠損株であるGif33に導入し、ストレプトマイシン耐性を指標に形質転換体を取得した。プラスミドpDAT3,pFAT3を導入した株をそれぞれGif33/pDAT3, Gif33/pFAT3と名付けた。
【００８４】
上記のように選択されたプラスミド増幅株である形質転換体（Gif33/pDAT3,Gif33/pFAT3と）と、その対照株である野生型のスレオニンオペロンを増幅した形質転換体（Gif33/pVIC40）からプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが増幅されていることを確認した。これらの形質転換体を  実施例１<2>に示す方法で培養を行い、ＨＤ活性を測定した。その結果を表2に示した。
【００８５】
【表２】
2005151829.tif 000004
【００８６】
アテニュエーター領域が野生型であるスレオニンオペロン増幅株であるGif33/pVIC40株は、イソロイシン添加によりＨＤ活性が六分の一に低下するのに対し、アテニュエーターとリーダー配列を欠失したスレオニンオペロン増幅株Gif33/pDAT3株、Gif33/pFAT3株ではＨＤ活性はイソロイシン添加下でも減少しなかった。実施例１と実施例２の結果からアテニュエーターとリーダー配列も除去したスレオニンオペロン増幅用プラスミドを保持する菌株Gif33/pDAT3株、及びGif33/pFAT3株は、イソロイシン添加によりアテニュエーションの影響を受けていないことが分かった。なお、Gif33/pDAT3株のイソロイシン非添加時のHD活性は17.7nmol/min/mgであり、対照株であるGif33/pVIC40株のHD活性20.0nmol/min/mgよりも低値を示したが、これは培養中にプラスミドが脱落したためであると考えられた。
【００８７】
次に得られたこれらのアテニュエーション解除型スレオニンオペロン搭載プラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3と対照プラスミドpVIC40を、スレオニン生産能を有するVKPM  B-3996株からpVIC40を脱落させた株に相当するTDH6株（特許第3239903号  Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism breeding  にVKPM B-3420で登録されている。）に形質転換し、ストレプトマイシン耐性を指標に形質転換体を取得した。なお、TDH6株は、トランスポゾンTn5の挿入によりスレオニンデヒドロゲナーゼが欠損した株である（特開2001-346578号）。プラスミドpBAT3,pCAT3,pDAT3,pEAT3,pFAT3、pVIC40を導入した株をそれぞれTDH6/pBAT3株,G TDH6/pCAT3株, TDH6/pDAT3株, TDH6/pEAT3株, TDH6/pFAT3株、TDH6/pVIC40株と名付けた。
【００８８】
上記のように選択されたプラスミド増幅株である形質転換体（TDH6/pBAT3株, TDH6/pCAT3株, TDH6/pDAT3株, TDH6/pEAT3株, TDH6/pFAT3株と）と、その対照株である野生型のスレオニンオペロンを増幅した形質転換体（TDH6/pVIC40株）からプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが増幅されていることを確認した。これらの形質転換体を  実施例１<2>に示す方法で培養を行い、イソロイシン添加、無添加でのＬ−スレオニン生産能について比較した。
【００８９】
培養終了後、培養液中のＬ−スレオニン蓄積量は、培養液を適当に希釈したあと、液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を表3に示す。スレオニン生産量の相対値は、それぞれの形質転換体ごとにイソロイシン無添加でのＬ−スレオニン生産量を100とした場合の相対値を示した。
【００９０】
【表３】
2005151829.tif 000005
【００９１】
TDH6/ pVIC40株では、スレオニン収率が培地中にイソロイシンが存在するとイソロイシン無添加に対して55%に低下するの対して、TDH6/pDAT3株では76%、TDH6/pEAT3株では320%、TDH6/pFAT3株では79%となり、イソロイシン添加した条件でのスレオニン生産量の減少が少なくなるか、あるいは増加した。アテニュエーション領域のアテニュエーターとリーダー配列を除去した配列では、スレオニンオペロンのアテニュエーションによる制御が解除され、イソロイシン添加下でＬ−スレオニン生産に対して有効に働くことが示された。表３において、TDH6/pCAT3株のイソロイシン添加時のスレオニン生産量は非添加時の３９％となり、対照株であるTDH6/pVIC40株よりも低値を示した。しかし、これは培養中にプラスミドが脱落したためであると考えられ、実際は、アテニュエーションが解除されて対照株よりもスレオニン生産量も増加しているものと思われる。
【実施例３】
【００９２】
染色体上アテニュエーター、リーダー配列を除去した株の構築と効果の検討
＜１＞  TDH6株へのthrC遺伝子導入株の構築
アテニュエーターとリーダー配列の除去により、アテニュエーションによる制御が解除されたプラスミドpDAT3のスレオニンオペロンのアテニュエーション領域の配列を染色体上に導入してその効果を確認した。スレオニン生産能をもつTDH6株はスレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrCが欠損している。従って野性株であるエシェリヒア・コリW3110株（ATCC27325）を供与菌として、P1 transductionを用いた常法によりTDH6株からthrCが野生型になった株を取得した。
【００９３】
具体的には以下の方法で行った。エシェリヒア・コリ  W3110を培養した溶液とP1ファージ溶液を保温した柔寒天培地に加え、 LBプレート上に流し固まってから37℃で6-7時間培養してプラークを形成させ、プラークからファージを回収した。
受容菌であるプラスミドが脱落したTDH6株に供与菌からのファージを加え、2.5mMCaCl2存在下で約20分37℃で静置させ、ファージを吸着させ、10mM Na-citrateを添加、30minほど
37℃で反応させ、吸着反応を停止させた。
【００９４】
thrCを欠損しているTDH6がスレオニン無添加の最小培地で増殖出来ないのに対し、P1 transductionによりMG1655のthrCが形質導入された株は、最小培地で生育出来る。次いで、反応溶液を、グルコース0.5g、硫酸マグネシウム2mM、リン酸一カリウム3g、塩化ナトリウム0.5g 塩化アンモニウム1g リン酸2ナトリウム6g を純水1Lに含む最小培地に播種した。24hr後、最小培地で生育してきたコロニーをthrC導入株とし、W13と名付けた。
【００９５】
＜２＞アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体導入用プラスミドの構築  アテニュエーション領域のアテニュエーターとリーダー配列を除去したプラスミドpDAT3（配列番号１で示される塩基配列番号168-310の領域を欠損している）をHindIII、PvuII処理し、アテニュエーション領域とthrAを含む断片をプラスミドpUC18 (宝酒造株式会社より購入)のHindIII,HincII領域に導入して、プラスミドpUC18Dを構築した。
【００９６】
次に相同組換えを行う為に、染色体上のスレオニンオペロンのプロモーターの5’側上流配列を図3で示すようにPCR法でクローニングした。具体的には、GENBANK登録番号AE000510の塩基番号４４５４〜６１２７の配列を含むDNAをクローニングした。5’側のプライマーには、塩基置換によりHindIIIとEcoRIサイトを導入するために、GENBANK登録番号AE000510の4458番目のAをTに、4469番目のCをTに置き換え、その両塩基を含む領域に相当するオリゴヌクレオチドを用いた。また、3’側のプライマーは、GENBANK登録番号AE000510の配列の塩基番号６１２２〜６１２７に存在するHindIIIサイトの3'側の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーを用いてスレオニンオペロンプロモーター上流領域の増幅断片を得た。この断片をHindIIIで処理し、pUC18DのHindIII領域に挿入したプラスミドpUC18DDを構築した。
【００９７】
次に染色体に変異を導入する温度感受性プラスミドを構築した。PBR322(ニッポンジーン社より購入)をHindIIIとPstIで切断し、pMAN031(Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991) )のHindIIIとPstIの間の領域に導入し、温度感受性pTS1を構築した。次に抗生物質耐性遺伝子を置き換えたプラスミドpTS2を構築した。テトラサイクリンの遺伝子ブロック（Tetracycline GenBlock  Amersham社より購入）をpTS1のアンピシリン耐性遺伝子内部に存在するScaI領域に挿入した温度感受性プラスミドpTS2を構築した。
【００９８】
次に下記の手法により、アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体導入用温度感受性プラスミドの構築を行った。pUC18DDをEcoRIで切断して、スレオニンオペロンアテニュエーション近傍の遺伝子をpTS2のEcoRIに導入した相同組換え用プラスミドpTS2DDを構築した。
【００９９】
＜２＞アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体株の構築
温度感受性プラスミドpTS2DDをTDH6株のthrC導入株に導入した。この温度感受性プラスミドpTS2DDを上記のthrC導入株W13に形質転換し、LB+テトラサイクリンプレートで30℃でコロニーを選択した。選択したクローンを30℃で一晩培養した後、培養液を10-3希釈して、ＬＢ＋テトラサイクリンプレートに巻き、４２℃でコロニーを選択した。選択したクローンをＬＢ＋テトラサイクリンプレートに塗り広げて３０℃で培養した後、液体培地にうえつぎ、４２℃で４−５時間振とう培養した。適時希釈した培養液をＬＢプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをＬＢプレートとＬＢテトラサイクリンプレートに植菌し、生育を確認することで、テトラサイクリン感受性株を選択した。テトラサイクリン感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、アテニュエーション解除型スレオニンオペロンが導入されているかを確認した。このようにして、TDH6からthrCを導入してアテ
ニュエーションを解除したW13112株を取得した。また、この時同時に染色体上のアテニュエーションは野生型であるが、TDH6型のスレオニンオペロンに置換された株としてW1325株が取得できた。
【０１００】
＜４＞  アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体導入株のＬ−スレオニン生産の検討
染色体上のスレオニンオペロンのアテニュエーション領域のリーダー配列とアテニュエーターが欠損したW13112株とアテニュエーション領域と、野生型である対象株となるW1325株を、実施例１＜２＞で記載してある方法で培養を行い、実施例２＜２＞で記載してある方法でＬ−スレオニンの濃度を測定した。スレオニン生産量の相対値は、それぞれの形質転換体ごとにイソロイシン無添加でのＬ−スレオニン生産量を100とした場合の相対値を示した。結果を表４に示す。
【０１０１】
【表４】
2005151829.tif 000006
【０１０２】
染色体上のスレオニンオペロンがアテニュエーション解除型のW13112株では、イソロイシン無添加でのＬ−スレオニン蓄積量は高く、培地中にイソロイシンを添加していても影響をうけず、イソロイシン添加下でのＬ−スレオニン生産量の減少が抑えられることが確認された。
【実施例４】
【０１０３】
染色体上アテニュエーション解除型スレオニンオペロン導入株のスレオニンオペロンプラスミド増幅株の構築と評価
実施例3で、染色体上のアテニュエーション解除型スレオニンオペロンに置換した株では、イソロイシン添加下でもＬ−スレオニンの蓄積量は低下せず、次にアテニュエーション領域が野生型のスレオニンオペロンを増幅したプラスミドpVIC40を導入し、染色体上でスレオニンオペロンのアテニュエーション領域を解除した効果を確認した。
【０１０４】
W13112にpVIC40を形質転換し、ストレプトマイシン耐性を指標に形質転換体を得た。上記のように選択されたプラスミドpVIC40増幅株である形質転換体をW13112/pVIC40と名づけ、W13112/pVIC40からプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが増幅されていることを確認した。
【０１０５】
W13112/pVIC40株を、染色体上のスレオニンオペロンが野生型のTDH6/pVIC40株を比較対照として実施例１＜２＞に記載している方法により、Ｌ−スレオニン生成能を確認した。スレオニン生産量の相対値は、それぞれの形質転換体ごとにイソロイシン無添加でのＬ−スレオニン生産量を100とした場合の相対値を示した。結果を表５に示す。
【０１０６】
【表５】
2005151829.tif 000007
【０１０７】
染色体上のスレオニンオペロンのアテニュエーター領域が野生型のTDH6/pVIC40株では、イソロイシン添加下で、スレオニン生産量が大幅に低下した。一方、アテニュエーション解除型のW13112/pVIC40株では、TDH6/pVIC40株と比べ、イソロイシン存在下でのスレオニン生産量の減少が抑えられることが認められた。
【実施例５】
【０１０８】
アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体導入株のＬ−イソロイシン生産能の確認
＜１＞染色体上アテニュエーション解除型スレオニンオペロン導入株からのＬ−イソロイシン生産菌の構築と評価
イソロイシンは、Ｌ−スレオニンを前駆体として生成され、Ｌ−スレオニン菌からイソロイシン生合成系を強化することによっても取得される（特開平09-121872号公報、特開2002-051787号公報）。従って、イソロイシン生合成系を強化するため、実施例5で用いたTDH6/pVIC40株とW13112/pVIC40株に、イソロイシン生合成増幅プラスミドである、pMWD5を導入した。pMWD5は、イソロイシンオペロンのアテニュエーションに必要な領域が欠失されたイソロイシンオペロンを含むプラスミドである（特開平09-121872号公報）。プラスミドpMWD5を形質転換により、実施例5に記載のTDH6/pVIC40, W13112/pVIC40株に導入し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。TDH6/pVIC40にpMWD5を導入した株を、TDH6/pVIC40 pMWD5、W13112/pVIC40にpMWD5を導入した株をW31112/pVIC40 pMWD5と名付けた。
【０１０９】
＜２＞  染色体上アテニュエーション解除型スレオニンオペロン導入株であるＬ−イソロイシン生産菌の評価
TDH6/pVIC40 pMWD5株 W31112/pVIC40 pMWD5株からプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが増幅されていることを確認した。
【０１１０】
20μg/mlのストレプトマイシンを含むLB培地にて培養したTDH6/pVIC40 pMWD5株 W31112/pVIC40 pMWD5の菌体を、グルコース40g、硫酸アンモニウム16g、リン酸一カリウム１g、硫酸第一鉄7水和物0.01g、塩化マンガン4水和物0.01g、Yeast extract 2g、硫酸マグネシウム7水和物1g、炭酸カルシウム30gを純水1Lに含む培地（KOHでpH7.0に調整されている）を含むＬ−イソロイシン生産培地を用いて、培養温度37℃、培養時間22〜27時間、約115 rpmでしんとう培養を行った。
【０１１１】
培養終了後、培養液中のＬ−イソロイシン蓄積量は、培養液を適当に希釈したあと、液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を表５に示す。
【０１１２】
染色体上アテニュエーション解除型スレオニンオペロン導入株であるW13112/pVIC40 pMWD5 株を用いた場合、コントロールであるTDH6/pVIC40 pMWD5株に対しイソロイシン収率は向上し、L-イソロイシン生産においてもスレオニンオペロンのアテニュエーション解除
効果があることが確認出来た。
【０１１３】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明により、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシンを発酵生産する際に生産効率を向上させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】アテニュエーターを欠失したスレオニンオペロン増幅用プラスミドの構築を示す図。
【図２】アテニュエーション領域を欠失したスレオニンオペロン増幅用プラスミドの構築を示す図。
【図３】アテニュエーション解除型スレオニンオペロン染色体導入用温度感受性プラスミドの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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