(57)【要約】    【課題】  糖類を含まない高純度の有機酸塩を製造する。    【解決手段】  有機酸塩及び糖類の混合物を加熱し、該加熱された混合物にアルコールを接触させ、次いで加熱された糖類と該有機酸塩を分離して、該有機酸塩を取得することにより、糖類を含まない高純度の有機酸塩を製造する。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸塩及び糖類の混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の製造方法。
【請求項２】
有機酸塩及び糖類の混合物が、有機酸生産能を有する微生物を用いて糖類を微生物変換することにより得られる混合物である、請求項１に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項３】
有機酸塩及び糖類の混合物を加熱する温度が、６０℃以上である、請求項１又は２に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項４】
有機酸がジカルボン酸、トリカルボン酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上の有機酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項５】
有機酸が琥珀酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項６】
糖類が、グルコース、マルトース及びシュークロースからなる群より選ばれる１種又は２種以上の糖類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項７】
前記アルコールがメタノールであり、該メタノールを最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加することにより混合物に接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項８】
前記アルコールがエタノール又はプロパノールであり、該エタノール又はプロパノールを最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加し、最終濃度が５ｗｔ％以上かつ５０ｗｔ%以下となる量の水の共存下で混合物に接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有機酸塩の製造方法。
【請求項９】
有機酸塩及び糖類の混合物から有機酸塩を精製する方法であって、前記混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離することを特徴とする方法。
【請求項１０】
有機酸塩及び糖類の混合物に対して糖類の可溶化処理を行い、次いで有機酸塩に対して貧溶媒であって可溶化処理した糖類を可溶な溶媒と接触させた後、有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の製造方法。
【請求項１１】
有機酸塩及び糖類の混合物に対して糖類の可溶化処理を行い、次いで有機酸塩に対して貧溶媒であって可溶化処理した糖類を可溶な溶媒と接触させた後、有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカルボン酸、トリカルボン酸、又はアミノ酸などの高融点を有する有機酸の塩の製造方法に関する。特に、生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖、セルロースなどから微生物変換によって得られる有機酸塩及び糖類を含む混合物から有機酸塩を製造する方法に関する。本発明はまた、有機酸塩、及び糖類の混合物から有機酸塩を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカルボン酸、トリカルボン酸、又はアミノ酸などの高融点を有する有機酸は、ポリマー、食品、医薬品などの原料として広く用いられている。例えば、ジカルボン酸である琥珀酸又はその誘導体は、ポリエステル、ポリアミドなどのポリマー、特に、生分解性ポリエステルの原料として、また、食品、医薬品、及び化粧品などの原料として広く用いられている。また、トリカルボン酸であるクエン酸は食品添加物などとして広く用いられている。
【０００３】
これらの有機酸は、従来、工業的に製造されてきた。例えば、琥珀酸の場合、マレイン酸の水添により工業的に得られており、そのマレイン酸は石油由来の原料であった。しかし、近年では、植物由来の原料から、微生物を用いた発酵操作により、琥珀酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸などの有機酸を製造する技術が検討されている。
【０００４】
発酵による有機酸の製造において、原料となるのは一般に糖類であり、グルコースやブドウ糖又はセルロースなどである。しかし、これらの糖類にはマルトースを代表成分とする多糖類が不純物として含まれる場合があり、これらは微生物によって消費できない事が多く、生成された有機酸に混入することがあった。また、原料の糖類が微生物に完全に資化されずに残り、有機酸に混入することがあった。したがって、製造された有機酸と糖類を分離する必要があった。しかし、こうした糖類は沸点が高く、気液平衡を用いた分離では有機酸から取り除くことは困難であった。
【０００５】
発酵生産によって製造される有機酸の精製方法としては、イオン交換樹脂を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、電気透析を行う方法（例えば、特許文献２参照）などが知られていた。しかし、これらの方法においては、糖類の分離に関しては検討がなされてこなかった。例えば、カチオン交換樹脂を用いた場合は、有機酸と糖類は分離される事はなく、また、電気透析を行う場合にも、有機酸を透過させるのではなく、通常、カチオンとしては水素イオンを、アニオンとしてはアルカリ金属とアンモニアを透過させるため、糖と有機酸は分離されない。さらに、カチオン交換樹脂による処理後又は電気透析後に、水晶析や直接強酸を用いて晶析する場合には、結晶に付着・同伴される母液に糖が含まれるため、糖類を分離するためにはいくらかの洗浄が必要となるが、さらに高純度の有機酸を得るために、再晶析を行ったり、洗浄を行ったりすると、回収率が下がる事になる。一方、回収率の向上のためにリサイクルを行えば、微量の糖類が次第に蓄積する事になるという問題点があった。
【０００６】
アニオン交換樹脂を用いる方法（例えば、特許文献１参照）では、有機酸を特異的に吸着させるので、糖類との分離が可能であるが、樹脂への吸着操作、再生操作などが煩雑であり、再生操作を繰り返すと樹脂が劣化するという問題点があった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
さらに、特殊な装置を用いる分離方法も知られていた。例えば、分子分画の観点から逆
浸透膜モジュールを用いたものがある（例えば、特許文献３参照）。また、クエン酸の場合、ナノ濾過を用いる方法（例えば、特許文献４参照）がある。しかし、これらは特殊な設計をした膜を必要とし、特に、前者（特許文献３）の場合、粗分離が目的であり、不純物としての糖を分離し、有機酸を精製するという目的には合致しないものであった。その他、擬似移動床などクロマト分離を応用した方法が考えられるが（例えば、特許文献５参照）、この方法では更なる溶媒が必要であり、数倍に希釈されてしまうため、溶媒除去に多大なるエネルギーを消費する事になり、少量の不純物としての糖類を分離するには、コストが大き過ぎることになる。
【０００８】
一方で、結晶グルコースや精製グルコースを用い、菌体やカビにより消費できない物質を最初から入れない事、及び発酵時間を長く取って糖類を「食い切り」させる事も試みられてきた。また、アミノ酸の精製工程や従来の無機酸を用いた精製方法などでは、１パスでできる限り回収し、リサイクルしない方法も採用されている。しかし、純度の高い原料は高価であり、完全に微生物変換するには長い滞留時間、即ち大きな装置が必要になり、コストや生産効率の点で問題があった。
【０００９】
上述したような問題点は、有機酸塩を製品とする場合であっても、製品品質に糖類が影響を与える場合においては、全く同様である。例えば、製品としての有機酸塩を晶析によって得る場合、結晶は必ず母液をいくらか含み、糖類の混入は避けられない。常法では、水洗するなど、いわゆるリンスを行うが、一般にこれら有機酸の塩は水溶性が極めて高いため、回収率が著しく悪くなる。回収率を維持するためにリンス液の一部をリサイクルして用いると、微量の糖が循環蓄積し、更にリンス液を増やさなければならなくなり、悪循環に陥ってしまうという問題点があった。
【特許文献１】米国特許第６，２８４，９０４号明細書
【特許文献２】特開平２−２８３２８９号公報
【特許文献３】特開平６−３４３５００号公報
【特許文献４】特表平１０−５０５８４０号公報
【特許文献５】特表２００１−５１８００３号公報
【非特許文献１】三菱化学テクニカルサービスシリーズ  ダイヤイオン  イオン交換樹脂・合成吸着剤マニュアルII
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、微生物を用いた発酵方法により、効率的、かつ、安価に、糖類の混合物を含まない高純度の有機酸塩を製造する方法を提供することを課題とする。本発明はまた、有機酸塩、及び糖類の混合物から有機酸塩を精製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、通常アルコールに対して不溶な糖が加熱後、熱変性を起こし、熱変性前では溶解度が極めて小さいメタノールに溶解する物質に変化する事を見出した。この発見と、有機酸のアンモニウム塩はアルコール類には溶解度が極めて小さく、水の存在下では加熱しても安定な物質であるという知見に基いて、糖類と有機酸アンモニウム塩の混合物について、加熱後にアルコールと接触させることにより、糖類と有機酸アンモニウム塩を分離できる事を見出した。さらに、他の有機酸塩についても同様にして糖類と分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）有機酸塩及び糖類の混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、
次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の製造方法。
（２）有機酸塩及び糖類の混合物が、有機酸生産能を有する微生物を用いて糖類を微生物変換することにより得られる混合物である、（１）の有機酸塩の製造方法。
（３）有機酸塩及び糖類の混合物を加熱する温度が、６０℃以上である、（１）又は（２）の有機酸塩の製造方法。
（４）有機酸がジカルボン酸、トリカルボン酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上の有機酸である、（１）〜（３）のいずれかの有機酸塩の製造方法。
（５）有機酸が琥珀酸である、（１）〜（３）のいずれかの有機酸塩の製造方法。
（６）糖類が、グルコース、マルトース及びシュークロースからなる群より選ばれる１種又は２種以上の糖類である、（１）〜（５）のいずれかの有機酸塩の製造方法。
（７）前記アルコールがメタノールであり、該メタノールを最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加することにより混合物に接触させる、（１）〜（６）のいずれかの有機酸塩の製造方法。
（８）前記アルコールがエタノール又はプロパノールであり、該エタノール又はプロパノールを最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加し、最終濃度が５ｗｔ％以上かつ５０ｗｔ%以下となる量の水の共存下で混合物に接触させる、（１）〜（６）のいずれかの有機酸塩の製造方法。
（９）有機酸塩及び糖類の混合物から有機酸塩を精製する方法であって、前記混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離することを特徴とする方法。
（１０）有機酸塩及び糖類の混合物に対して糖類の可溶化処理を行い、次いで有機酸塩に対して貧溶媒であって可溶化処理した糖類を可溶な溶媒と接触させた後、有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の製造方法。
（１１）有機酸塩及び糖類の混合物に対して糖類の可溶化処理を行い、次いで有機酸塩に対して貧溶媒であって可溶化処理した糖類を可溶な溶媒と接触させた後、有機酸塩を分離することを特徴とする有機酸塩の精製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法を用いることにより、微生物を用いた発酵方法によって、効率的、かつ、安価に、糖類の混合物を含まない高純度の有機酸塩を製造することができる。さらに、本発明の方法を用いることにより、有機酸塩及び糖類の混合物から有機酸塩を効率よく精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造方法においては、有機酸塩及び糖類の混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離する。
【００１５】
本発明において製造される有機酸塩を構成する有機酸の種類は、微生物によって発酵生産される有機酸が好ましく、ジカルボン酸、トリカルボン酸及びアミノ酸が好ましい。ジカルボン酸としては、琥珀酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタル酸、グルタミン酸、アジピン酸、スベリン酸、イタコン酸、テレフタル酸などを、トリカルボン酸としてはクエン酸などを、アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、チロシンなどが挙げられ、この中では、琥珀酸、リンゴ酸、酒石酸、アジピン酸、スベリン酸、イタコン酸、グルタミン酸、クエン酸が好ましく、琥珀酸が特に好ましい。
また、塩の種類は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられ、好ましくはアンモニウム塩である。
混合物に含まれる糖類の種類は、特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、マルトース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質を挙げることができる。
【００１６】
本発明に用いる「有機酸塩及び糖類の混合物」は特に制限されないが、有機酸生産能を有する微生物を用いて糖類を微生物変換することにより得られる、有機酸塩及び糖類の混合物であることが好ましい。なお、有機酸塩及び糖類の混合物には培地成分など他の物質がさらに含まれていてもよい。
以下、糖類を含む培地中で有機酸生産能を有する微生物を培養することにより有機酸塩及び糖類の混合物を得る方法について説明する。
【００１７】
用いる微生物は、「有機酸生産能を有する微生物」である。「有機酸生産能を有する微生物」とは、微生物を後述するような糖を含む培地で培養したときに、培地中に有機酸を生成蓄積する能力を有する微生物である。このような微生物としては、例えば、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌（米国特許第5143833号明細書）、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌（米国特許第5504004号明細書）、エシェリヒア（Escherichia）属細菌（米国特許第5770435号明細書）等の通性嫌気性細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属等のコリネ型細菌（特開平１１−１１３５８８号公報）などの好気性細菌が挙げられる。更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium  flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium  ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium  lactofermentum）に属する微生物が挙げられる。
【００１８】
用いる微生物は、有機酸生産能が増強するように改変された微生物であってもよい。このような微生物としては、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現が増強された微生物（特開平１１−１９６８８８号公報）、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された微生物（特開平１１−２０６３８５号公報）等が挙げられる。
琥珀酸生産能を有するコリネ型細菌の例として、具体的には、以下のようなものが挙げられる。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下したブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh株（特開平１１−２０６３８５号公報）や、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が強化されたブレビバクテリウム・フラバムMJ233/pPCPYC株（国際公開第01/27258号パンフレット）、またブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6872、コリネバクテリウム・グルタミカム  ATCC31831、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。
【００１９】
なお、用いることのできる有機酸生産能を有する微生物は上記のものには限定されず、その他の琥珀酸生産菌、公知の方法によって得られるリンゴ酸生産菌、フマル酸生産菌、クエン酸生産菌、イソクエン酸生産菌、アミノ酸生産菌などを使用することができる。
また、２種類以上の有機酸の生産能を有する微生物を用いてもよい。
【００２０】
培養液に含まれる糖類は、微生物が資化しうる糖類であれば特に限定されないが、ガラクトース、ラクトース、グルコース、マルトース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質を挙げることができる。このうち好ましくは、グルコース、マルトース及びシュークロースを用いることがで
き、特に好ましくはグルコースを用いることができる。また、より広義の植物由来原料としては、紙の主成分であるセルロースを好ましく用いることができる。さらに、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの炭素源は、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いても良い。
【００２１】
上記糖類の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記糖類の減少にあわせ、糖類の追加添加を行っても良い。
【００２２】
培養液は、上記糖類に加えて、窒素源や無機塩などを含むものであることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるために、反応水溶液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００２３】
発酵反応が進行するにしたがって、有機酸が生成するため培養液のpHは低下する。ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、中和剤を使用することが好ましい。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加の都度ｐＨを調節する。本発明において、中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であっても良い。
【００２４】
中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩などが挙げられ、このうち好ましくはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素である。
【００２５】
上記アルカリ（土類）金属の水酸化物としては、ＮａＯＨ，ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）2、Ｍｇ（ＯＨ）2などが挙げられ、アルカリ（土類）金属の炭酸塩としては、Ｎａ2ＣＯ３、Ｋ2ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＮａＫＣＯ３などが挙げられる。これらの中で、Ｍｇを含有する中和剤は、琥珀酸の生産量を増加させるためより好ましい。なお、中和剤は２種類以上を用いてもよい。
【００２６】
これらの中和剤による調整ｐＨ値は、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されるが、一般的には、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９程度の範囲である。
【００２７】
有機酸塩及び糖類の混合物の製造に上記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）して得た菌体を用いるのが好ましい。この場合、反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。
【００２８】
温度、圧力等の培養条件は、用いる微生物によって異なるが、有機酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すれば良い。例えば、培養時の温度は、通常、２５℃〜
４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００２９】
培養後の培養液には、有機酸又はその塩及び糖類を含む混合物が蓄積する。例えば、有機酸を微生物変換によって製造する時に、アンモニアや尿素を用いて中和を行った場合には、有機酸はアンモニウム塩として得られ、培地中には有機酸アンモニウムと糖類を含む混合物が蓄積する。一方、アルカリ金属又はアルカリ土類金属を含む中和剤を用いて中和を行った場合には、有機酸はこれらアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として得られ、培地中には有機酸アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩及び糖類を含む混合物が蓄積する。この場合、さらにこれらの金属塩をアンモニウム塩に置換することにより、有機酸アンモニウム及び糖類を含む混合物にしてもよい。このような混合物を、有機酸塩及び糖類の混合物として用いることができる。
【００３０】
また、有機酸アンモニウム及び糖類の混合物については、後述するように、酢酸を加えて有機酸を析出させることができる。この場合に、析出した有機酸を分離して得られる、酢酸アンモニウム、未反応の有機酸アンモニウム、未反応の酢酸及び糖類を含む混合物を「有機酸塩及び糖類の混合物」として用いてもよい。なお、この「有機酸アンモニウム、酢酸、酢酸アンモニウム及び糖類を含む混合物」を得る手順については、後述の参考例において具体的に示す。
【００３１】
なお、発酵によって得られた混合物は、培養終了後の培養液から遠心分離等により微生物菌体等を除去した後に、該培養液から常法により単離して用いてもよいが、微生物菌体等を除去した培養ろ液の状態で用いてもよい。培養ろ液の状態で用いる場合は、菌体除去後に濃縮操作を行うことが好ましい。濃縮は、常法を用いれば良く、例えば、ケトル式リボイラや蒸発缶が用いることができる。大規模生産でエネルギー消費が重要となれば、多重効用缶を用いても良い。
【００３２】
本発明では、上記のような「有機酸塩及び糖の混合物」を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、次いで加熱された糖類と有機酸塩を分離する。
加熱は６０〜１８０℃で行うことが好ましく、６０〜１６０℃で行うことがより好ましい。加熱時間は混合液の容量、熱源などによって異なるが、好ましくは０．１〜５時間、より好ましくは０．５〜３時間である。培養ろ液を用いる場合など、混合物を含む液体の状態で加熱する場合には、液体成分を減圧下で濃縮しながら加熱することが好ましい。
【００３３】
加熱された混合物に接触させるために用いるアルコールは、１〜３価のアルコールが好ましく、具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール及び２−プロパノールを挙げることができる。なお、糖類と有機酸塩を分離するために加熱された混合物に接触させるために用いるものとしてアルコールを例示したが、有機酸塩に対して貧溶媒であり、かつ、可溶化処理した糖を可溶な溶媒であれば使用することができる。加えるアルコールの量は、メタノールの場合、最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加することが好ましい。
【００３４】
エタノール又はプロパノールを用いる場合においても、これらのアルコールの最終濃度が５ｗｔ％以上かつ６０ｗｔ%以下となる量で添加することが好ましいが、この場合は、さらに、反応系に、最終濃度が５ｗｔ％以上かつ５０ｗｔ%以下となる量で水を共存させることがより好ましい。この場合、エタノール又はプロパノールは、含水アルコール、すなわち、好ましくは４〜５０ｗｔ％、より好ましくは４〜２０ｗｔ％の水を含有するアルコールとして添加することもできる。
【００３５】
アルコールを接触させる工程は攪拌しながら行うことが好ましい。この工程の反応温度
は特に制限されないが、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは１０〜４０℃で行う。前記加熱工程を行い、放置するなどしてこのような温度まで冷却した後に、アルコールを接触させることが好ましい。反応時間は混合物の量、組成などによっても異なるが、０．２〜４時間が好ましい。
【００３６】
アルコールを接触させることによって、混合物中の有機酸はアルコールに対する溶解度が低いため、析出するが、糖は加熱されたことにより熱変性してアルコールに対する溶解度が高くなっているため、アルコールに溶解する。したがって、濾過などによって、有機酸塩を分離取得することができる。なお、本発明では、熱変性された糖類を「加熱された糖類」といい、また加熱による熱変性の処理を「可溶化処理」という。
【００３７】
得られた有機酸塩から有機酸を得ることもできる。そのためには、例えば、電気透析を用いる方法（特開平２−２８３２８９号公報）、イオン交換樹脂を用いる方法（米国特許第６，２８４，９０４号明細書又はＷＯ０１／６６５０８号）、水酸化カルシウムで中和しながら発酵生産して得られた有機酸カルシウムを、硫酸で分解する方法（特開平３−０３０６８５号公報）硫酸を用いる塩の交換反応で反応晶析を行う方法（特表２００１−５１４９００号公報又は米国特許第５，９５８，７４４号明細書参照、）、反応抽出法（ＷＯ９８／０１４１３号）、酢酸を用いる方法（ＷＯ０３／９５４０９号）などを採用することができる。
【００３８】
本発明はまた、有機酸塩及び糖類の混合物から有機酸塩を精製する方法であって、前記混合物を加熱し、加熱された混合物をアルコールと接触させ、該混合物から有機酸塩を分離回収することを特徴とする方法を提供する。この精製方法は、既述した有機酸塩の製造方法の対応する工程と同様にして行うことができる。
【００３９】
以下に、本発明の製造方法の一態様として、「有機酸アンモニウム塩と糖類の混合物を用いて有機酸アンモニウム塩を製造する方法」を例示する。ただし、本発明の方法は、この態様に限定されない。なお、本発明において「有機酸アンモニウム」は、特に断らない限り有機酸モノアンモニウム、有機酸ジアンモニウム、及び／又は有機酸トリアンモニウム塩を意味する。
【００４０】
まずは、微生物変換により「有機酸アンモニウム塩と糖類の混合物」を得る方法について説明する。
中和剤にアンモニア、炭酸アンモニウム、及び尿素よりなる群から選ばれる１種又は２種以上を用いて、糖類を含む培地中で微生物を培養し、有機酸アンモニウム及び糖の混合物を含む発酵液を得る。
【００４１】
培養終了後、まず、遠心分離により菌体を分離する。得られる発酵液は一般に希薄な水溶液であり、このままでは晶析が困難であるため、まず、この反応液を濃縮することが好ましい。この濃縮方法には特に制限はないが、例えば蒸発、逆浸透圧を利用する膜分離、イオン交換膜を用いる電気透析等が挙げられる。このうち、電気透析は前述の如く、スケールメリットが得られず、装置コストや運転コストが高いという難点がある。コスト等の観点からは、加熱による蒸発等が好ましく、より好ましくは多重効用缶を用いた濃縮が挙げられる。
【００４２】
次に、得られる濃縮液に酢酸を加えて、下記反応式（I）のように有機酸アンモニウム塩（Ｒ−ＣＯＯＮＨ4）から有機酸（ＲＣＯＯＨ）を析出させ、ろ過によって母液と分離する。この場合、濃縮液に含まれていた少量の糖類は、酢酸に溶解し、母液側に残る（後述の参考例参照）。したがって、この母液には、未反応の有機酸アンモニウム、過剰の酢酸、糖及び生成した酢酸アンモニウムが含まれる。この母液を「有機酸又はその塩及び糖
類を含む混合物」として用いる。
【００４３】
Ｒ−ＣＯＯＮＨ４＋ＣＨ３ＣＯＯＨ→ＲＣＯＯＨ↓＋ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４  （Ｉ）
【００４４】
上記の母液には溶媒が多く含まれるので、濃縮しながら加熱を行う。濃縮は120℃以下、好ましくは100℃以下の温度で加熱しながら、減圧下で操作を行う。
【００４５】
次に、加熱した母液にメタノールを加えて有機酸アンモニウム塩を析出させ、析出した有機酸アンモニウム塩とメタノールに可溶な糖、酢酸及び酢酸アンモニウムとを分離する。この操作は、以下の２通りの操作を挙げることができる。
【００４６】
１つ目は、加熱工程の直後、母液加熱物に既述した割合でメタノールを加えて有機酸アンモニア塩を析出させる。得られる結晶は糖をほとんど含まない有機酸アンモニウム塩である。ただし、この方法の場合、析出し、回収される有機酸アンモニア塩は熱履歴を受ける事は無いが、余剰な溶媒が存在するため回収率は２つ目の方法に比べ低くなる。
【００４７】
２つ目の方法を以下に示す。加熱工程を行った後、更に薄膜蒸発器などを用いた短時間高温処理（120℃以上、好ましくは140℃以上）によって、酢酸アンモニウム塩を、酢酸及びアンモニアの形でできる限り除く。その後、メタノールを加えて糖を分離し、有機酸アンモニウム塩を析出させて得る方法である。この方法の場合、余剰の溶媒が著しく少ないため、回収率は前述の方法に比べ高くなる。しかしながら、母液中に含まれる有機酸アンモニウム塩が全て熱履歴を受けるため、薄膜蒸発器などの滞留時間が長いと、アンモニウム塩に含まれるアンモニウムイオンがアミド化されることによるロスが大きくなる可能性があるので滞留時間の制御等が必要である。
【実施例】
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００４９】
＜実験例１：熱変性糖のメタノールへの溶解実験＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０１ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０２ｇを２００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１００．０４ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、特に変化は見られなかった。これを減圧し、３４０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま３０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は９２．８４ｇ得られた。フラスコ内は水あめ状の部分があった。ナス型フラスコにメタノール（和光純薬社製）８０．０２ｇを加えた。これを攪拌すると完全に溶解した。加熱後のグルコース、マルトースはメタノールに溶解することが確認された。
【００５０】
＜実験例２：熱変性糖のメタノールへの溶解実験（アンモニアの影響）＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０１ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０２ｇを２００ｃｃのナス型フラスコに入れ、２８％アンモニア水（和光純薬社製）３０．３２ｇと水７０．０３ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、着色した。これを減圧し、４６０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま３０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は８３．５２ｇ得られた。フラスコ内は褐色の水あめ状の部分があった。ナス型フラスコにメタノール（和光純薬社製）１００．１６ｇを加えた。これを攪拌すると溶解した。アンモニアの共存下加熱することで糖類が着色物質に変化するが、この場合も同様に加熱後の糖はメタノールに溶解することが確認された。
【００５１】
＜実験例３：熱変性糖のメタノールへの溶解実験（80℃で加熱）＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０３ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０８ｇを２００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１００．０１ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、80℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、これを減圧し、１５０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま１０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は３３．２５ｇ得られた。缶残は２７．１８ｇあり、あめ状となっていた。マテリアルバランスが取れていないが、これは１０ｍｍHgでは水が凝縮せず、排気されてしまったためである。ここにナス型フラスコにメタノール（和光純薬社製）１００．１６ｇを加えた。これを攪拌すると完全に溶解した。
【００５２】
＜実験例４：熱変性糖のメタノールへの溶解実験（60℃で加熱）＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．００ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０４ｇを２００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１００．０９ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、60℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、これを60℃のオイルバスに浸けたまま減圧、そのまま１０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は９．９５ｇ得られた。缶残は５３．８７ｇあり、あめ状となっていた。マテリアルバランスが取れていないが、これは１０ｍｍHgでは水が凝縮せず、排気されてしまったためである。ここにナス型フラスコにメタノール（和光純薬社製）１００．１６ｇを加えた。これを攪拌すると完全に溶解した。
【００５３】
実験例１〜４により加熱後の糖類（グルコース・マルトース）はメタノールに完全に溶解する事が分かった。
【００５４】
＜実験例５：琥珀酸アンモニウム塩と糖の分離＞
琥珀酸ジアンモニウム（和光純薬社製）  ５０．０２ｇ、D−グルコース（キシダ化学社製）１０．５０ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０１ｇを５００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１５０．２１ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、着色が見られた。これを減圧し、４２０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま３０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は１４２．３４ｇ得られた。フラスコ内は乾固した部分と水あめ状の部分があった。ナス型フラスコにメタノール（和光純薬社製）１００．０７ｇを加えた。これを攪拌し、全体をスラリー状にした。これをろ過すると、ろ過液は９４．８ｇ、結晶は４７．９５ｇ得られた。それぞれ分析すると、ろ過液は琥珀酸７．５重量％、アンモニア１．４重量％、結晶は琥珀酸が６３．９重量％、アンモニアが１４．７重量％であった。
５０．０２ｇ×１１８／１５２＝３８．８３ｇ（仕込み琥珀酸）
４７．９５ｇ×６３．９／１００＝３０．６４ｇ（回収琥珀酸）
回収率  ３０．６４／３８．８３＝７８．９％
【００５５】
実験例５では、実験例１〜４と同様の条件でアルコールの添加を行うことにより、有機酸塩（琥珀酸アンモニウム）が７９％回収できた。これらの結果から、加熱後の糖類と有機酸塩類のメタノールに対する溶解度の差は驚く程大きい事が示され、この方法により糖類と有機酸塩の混合物から有機酸塩を得ることができる事が示された。
【００５６】
＜実験例６：熱変性糖のエタノールへの溶解実験＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０１ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０２ｇを３００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１０１．０６ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。
1時間の加熱後、特に変化は見られなかった。これを減圧し、３８０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま２５ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は７８．１２ｇ得られた。フラスコ内は水あめ状の部分があった。ナス型フラスコにエタノール（
和光純薬社製）１００．７９ｇを加えた。これを攪拌したが、分離したままであった。そこで、水を５ｇずつ添加すると、加えた水の量が８０ｇになった所で溶解した。
【００５７】
＜実験例７：熱変性糖の２−プロパノールへの溶解実験＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０１ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０２ｇを３００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１０１．０６ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。
1時間の加熱後、特に変化は見られなかった。これを減圧し、３８０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま１０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は７８．１２ｇ得られた。フラスコ内は水あめ状の部分があった。ナス型フラスコに２−プロパノール（和光純薬社製）１００．１２ｇを加えた。これを攪拌したが、分離したままであった。そこで、水を５ｇずつ添加すると、加えた水の量が６０ｇになった所で溶解した。
【００５８】
＜実験例８：２−プロパノールを用いたクエン酸ナトリウムと糖の分離＞
D−グルコース（キシダ化学社製）１０．０４ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）１０．０１ｇ、更に、クエン酸ナトリウム５０．０８ｇを３００ｃｃのナス型フラスコに入れ、水１００．１０ｇに溶解した。これをロータリーエバポレータに設置し、100℃にオイルバスによって1時間加熱した。1時間の加熱後、黄色っぽく色が変色した。これを減圧し、３８０ｍｍHgになったところで最初の留分が得られた。そのまま１０ｍｍHｇまで減圧留去した。留去分は７５．６３ｇ得られた。ナス型フラスコに水６０．０１ｇを加えて攪拌すると、時間をかけてゆっくりと溶解した。更に、２−プロパノール（和光純薬社製）１００．０ｇを加えると白色結晶が析出した。これを濾過すると、５７．３３ｇの白色結晶が得られた。分析すると、クエン酸３８．1ｗｔ％、ナトリウム１７．２ｗｔ％であった。
【００５９】
実験例６，７により加熱後の糖類（グルコース・マルトース）は含水エタノール又は含水２−プロパノールに完全に溶解する事が分かった。また、実験例８では、実験例６，７と同様の条件でアルコールを添加することにより、有機酸塩（クエン酸ナトリウム）が回収できた。これらの結果から、糖類と有機酸塩の混合物から、糖類を分離し、有機酸塩を得られる事が示された。
【００６０】
＜実験例９：熱変性糖のエタノールへの溶解実験＞
D−グルコース（キシダ化学社製）５．０５ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）５．０１ｇ、水１００．０ｇ、酢酸アンモニウム３０．０２ｇを５００ｃｃのフラスコを用いた単蒸留装置に入れ、溶解した。これを常圧にて１００℃のオイルバスによって1時間加熱した。内温は９０℃であった。1時間の加熱後、褐色に変化した。これを１０ｍｍHgまで減圧し、蒸気を留去した。留去分は５２．８４ｇ得られた。風袋引きにより、フラスコ内の残分を計算すると、１９．４３ｇであった。フラスコ内は水あめ状になっていた。真空度が高いため、多くはコンデンサーにて凝縮せず、排気されたものと推察される。
フラスコにエタノール（和光純薬社製）１００．１ｇを加えた。完全に均一にはならなかったので、更に１６ｇの水を加え、これを攪拌すると完全に溶解した。加熱後のグルコース、マルトースは１５％の水を含むエタノールに溶解することが確認された。
【００６１】
＜実験例１０：エタノノールを用いた琥珀酸アンモニウムと糖の分離＞
D−グルコース（キシダ化学社製）５．２２ｇ、D−マルトース（キシダ化学社製）５．１９ｇ、水１００．０３ｇ、琥珀酸アンモニウム３０．０３ｇを５００ｃｃのフラスコを用いた単蒸留装置に入れ、溶解した。これを常圧にて１００℃のオイルバスによって1時間加熱した。内温は９０℃であった。1時間の加熱後、褐色に変化した。これを１６ｍｍHgまで減圧し、蒸気を留去した。留去分は３３ｇ得られた。風袋引きにより、フラスコ内の残分を計算すると、５０．４８ｇであった。フラスコ内は水あめ状になっていた。フラ
スコにエタノール（和光純薬社製）１００．１ｇ、水２０ｇを加えた。完全に均一にはならなかった。これを十分に攪拌した後、ろ過を行った。
固形分が１８．６８ｇ、濾液が１２０．５５ｇ得られた。濾液は静置して1時間以上おくと、薄めの褐色の溶液と濃い褐色の溶液の2液に分離している事が観察された。
固形分の組成は、琥珀酸が６８．６ｗｔ％、アンモニア１７．６％であり、糖類から分離できている事が確認された。
【００６２】
実験例９により加熱後の糖類（グルコース・マルトース）は含水エタノールに完全に溶解する事が分かった。また、実験例１０では、実験例９と同様の条件で含水エタノールを添加することにより、有機酸塩（琥珀酸アンモニウム）が回収できた。これらの結果から、糖類と有機酸塩の混合物から、糖類を分離し、有機酸塩を得られる事が示された。
実験例１〜１０の条件及び結果を表１にまとめた。
【００６３】
【表１】
2005151984.tif 000002
【００６４】
[参考例]
＜琥珀酸アンモニウム塩の酢酸による晶析＞
琥珀酸ジアンモニウム１８０．２８ｇ、酢酸１１９．７５ｇ、イオン交換水１３９．１０ｇ、酢酸アンモニウム２０．１２ｇ、グルコース５．０ｇを晶析装置に入れ、１００℃にて溶解した後、３０℃に冷却して晶析を行った。種晶として琥珀酸１．０２ｇを加えた。種晶を加えて５分後、析出が始まった。４０分攪拌した後、吸引濾過を開始した。１時間１５分濾過をした後、固形分を取り出した。濾液は３０２．４４ｇ、固形分は１４５．５ｇであった。得られた固形分を分析すると琥珀酸５９．０重量％、酢酸１４．６重量％であった。グルコースは検出されなかった。得られた母液を分析すると、琥珀酸１８．１重量％、酢酸３６．３重量％、グルコースが１．３重量％であった。
【００６５】
参考例より、グルコースはモノカルボン酸に溶解し、反応晶析後母液側へ濃縮されるので、この琥珀酸アンモニウムと糖類を含む母液を「有機酸塩及び糖類を含む混合物」として用いて、本発明の製造方法を行うことができる。