(57)【要約】  【課題】  電気力学的手法を用いた条件下でのハイブリダイゼーションの高効率化（高速化）とハイブリダイゼーション検出の高精度化の達成。  【解決手段】  検出用核酸Ｄと、該検出用核酸Ｄと相補的塩基配列を有する標的核酸Ｔと、前記相補的塩基配列に不適正塩基を有するミスマッチ核酸Ｍと、が混在する反応場２に電界を印加して、検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔとの間の正規ハイブリダイゼーションＨ１を優勢に進行させるバイオアッセイ方法を提供する。  【選択図】  図２
2005345365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用核酸と、該検出用核酸と相補的塩基配列を有する標的核酸と、前記相補的塩基配列部分に不適正塩基を有するミスマッチ核酸と、が混在する反応場に電界を印加して、前記検出用核酸と前記標的核酸との間の正規ハイブリダイゼーションを進行させるバイオアッセイ方法。
【請求項２】
前記検出用核酸は、前記反応場に存在する固相表面に固定されていることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項３】
前記電界は、高周波交流電界であることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項４】
前記電界は、前記反応場に存在する核酸分子を誘電泳動することを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項５】
前記反応場は、ＤＮＡチップに設けられた反応領域であることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法を少なくとも用いて、前記正規ハイブリダイゼーションを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションに係わる方法に関する。より詳しくは、反応場に標的核酸とミスマッチ核酸を混在させて、検出用核酸と前記標的核酸との間の正規ハイブリダイゼーションを進行させるバイオアッセイ方法、並びにハイブリダイゼーション検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイブリダイゼーション検出技術として、近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板を用いた技術が普及し始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能である点が特徴とされ、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００４】
ハイブリダイゼーション検出技術は、前記ＤＮＡチップ以外にも固相ビーズを用いた方法（例えば、特許文献１）を含め、多様な方法が提案されているが、いずれの技術においても、ハイブリダイゼーションの高精度化、高速化が、重要な開発テーマとなっている。
【０００５】
電気的効果を利用するＤＮＡ検出装置も開発されている。例えば、ＤＮＡプローブに直流電圧を印加することで、相補鎖を形成したＤＮＡと相補鎖を形成しなかったＤＮＡを分離したり、引き伸ばしたりする生体高分子検出装置が提案されている（特許文献２参照）。
【０００６】
次に、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術が知られている。具体的には、（核酸分子）は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、核酸分子の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合は、電気力線が集中する部位に向かって移動する（非特許文献１参照）。
【０００７】
また、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、この「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定される（非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００３−３０２３７３号公報。
【特許文献２】特開２００２−１６８８６４号公報（特に、段落００１５、図７参照）。
【非特許文献１】Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。
【非特許文献２】鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、従来のハイブリダイゼーション検出技術においては、その程度の差はあれ、ハイブリダイゼーションの効率や精度が、いまだ不満足なレベルである。これは、（１）核酸の高次構造が丸まったり、絡まったりした状態（ランダムコイル状態）になり易いため、ハイブリダイゼーションの際に、いわゆる立体障害が発生して塩基部分が相補結合し難い、（２）標的核酸分子は反応場に拡散しているので、ハイブリダイゼーションの効率が悪い、（３）蛍光検出においてはバックグラウンドノイズが発生する、などが主な原因である。
【０００９】
また、ミスハイブリダイゼーションの発生によって、擬陽性や偽陰性の発生が無視できない程度に頻出してしまうという基本的な問題もある。
【００１０】
これらの問題を解決できれば、ハイブリダイゼーション検出の高精度化、高速化を達成できる。そのための有力な手法の一つは、ハイブリダイゼーションに係わるアッセイ過程で、電気力学的手法を用いることであると考えられる。
【００１１】
そこで、本発明は、電気力学的手法を用いた条件下でのハイブリダイゼーションの高効率化（高速化）とハイブリダイゼーション検出の高精度化を、より確実に達成できるバイオアッセイ方法等を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、まず、検出用核酸と、該検出用核酸と相補的塩基配列を有する標的核酸と、前記相補的塩基配列に不適正塩基を有するミスマッチ核酸と、が混在する反応場を設定し、この反応場に電界を印加して、前記検出用核酸と前記標的核酸との間の正規ハイブリダイゼーションを進行させるバイオアッセイ方法を提供する。反応場は、ハイブリダイゼーションを進行させることが可能な場や領域であれば特に限定されない。本発明を実施できる反応場の好適な一例を挙げれば、ＤＮＡチップに形成された反応領域（スポット領域）である。
【００１３】
この方法では、反応場に相補的な標的核酸とミスマッチ核酸とが混在し、相補鎖形成においてこれらの核酸分子が競合した状態であるときに、該反応場に電場を形成することによって、前記検出用核酸と前記標的核酸との間の「正規ハイブリダイゼーション」が、検出用核酸とミスマッチ核酸との間の「ミスハイブリダイゼーション」よりも優位に進行するという現象が起こることが、本願発明者らの研究により明らかになった。即ち、電場のない反応場と比べて、電場を形成した反応場においては、正規ハイブリダイゼーションの量的比率を高めることができる。
【００１４】
その主たる理由は、電場が形成された液相などの反応場において、標的核酸の運動性は静電泳動の電気力学的効果によって高まるため、検出用核酸とミスマッチ核酸との間で発生した結合力の弱いミスハイブリダイゼーションは、前記運動性により解離が促進されて、正規ハイブリダイゼーションへの置換が進行する一方で、プローブ（検出子）である検出用核酸と相補的塩基配列を有する標的核酸との間の結合力の強い正規ハイブリダイゼーションは、電場が存在する条件下でも容易に解離しないので、これらの結果、ミスハイブリダイゼーション量に比較して正規ハイブリダイゼーションの量の割合が次第に高まるからと推測できる。
【００１５】
本発明には、プローブＤＮＡなどの検出用核酸が反応場において遊離状態で存在する場合と反応場に臨むように存在する固相表面に固定されている場合の両方が含まれるが、特に後者の場合では、検出用核酸の一端が固定された状態であるので、該核酸分子を誘電泳動などの電気力学的効果によって、直鎖状に伸長（伸張）し易くなる。
【００１６】
検出用核酸分子や標的核酸の高次構造が、電界によってランダムコイル状から直鎖状へ調整されると、ハイブリダイゼーションの際の立体障害が軽減され、また、塩基が露出するため、正規ハイブリダイゼーションが、益々優勢に進行するようになると考えられる。即ち、この電界による立体障害の軽減電界作用と上記した電界による核酸分子の運動性促進作用が協働して、ミスハイブリダイゼーションに対して正規ハイブリダイゼーションが優勢になると考えられる。
【００１７】
反応場に印加する電界は、目的に応じて、直流又は交流、高周波又は低周波のいずれを採用してもよく、波形も三角波、矩形波、サイン波などを適宜選択可能であるが、直流電界の場合では、反応場の媒質を電気分解して気泡を発生するという問題が発生し得るので、交流電界を採用するのが望ましい。また、反応場に存在する核酸分子に対して誘電泳動の効果を付与するためには、高周波交流電界を採用することが望ましい。電界強度については、正規ハイブリダイゼーションを解離させず、かつミスハイブリダイゼーションの解離が促進される範囲の条件を策定する。
【００１８】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
【００１９】
まず、「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸分子を検出するための検出子として機能する核酸分子である。代表例は、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。
【００２０】
「標的核酸」とは、前記検出用核酸と相補的な塩基配列を有する核酸分子である。
【００２１】
「ミスマッチ核酸」とは、検出用核酸の所定の塩基配列に対して、核酸分子の塩基が部分的に相補的でないため、完全相補的な塩基対を形成できない一本鎖核酸を意味する。
【００２２】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２３】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸分子間の塩基対形成反応を意味する上位概念であり、本発明において、特に「正規ハイブリダイゼーション」は、塩基対部分が完全相補的である状態（フルマッチ状態）のハイブリダイゼーションを意味し、「ミスハイブリダイゼーション」は、形成された塩基対部分が完全相補的でない（即ち、部分相補的である）ハイブリダイゼーションを意味する。
【００２４】
「反応場」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の場や領域を意味する。例えば、ＤＮＡチップに形成された反応領域（または「スポット領域」）が含まれる。
【００２５】
「固相表面」は、基板や樹脂ビーズなどの粒子を含む固体材料物の表面を広く包含する。
【００２６】
「誘電泳動」は、電界が一様でない電場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００２７】
「ＤＮＡチップ」は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸が遊離状態又は固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションに係わるバイオアッセイにおいて、ミスハイブリダイゼーションに比して正規ハイブリダイゼーションを優勢に進行させることができる。これにより、正規ハイブリダイゼーションの量的比率を高めることができるとともに、ハイブリダイゼーションの高速化を達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、ＤＮＡチップ（基板）に形成された反応場におけるハイブリダイゼーションを代表例として採用して、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３０】
まず、図１は、本発明に係わる方法を実施できる反応場が形成されたＤＮＡチップの好適な実施形態の要部構成を表す一部断面図である。なお、該反応場は、電場を形成できるように工夫されていることが前提である。
【００３１】
図１中の符号１で示されたＤＮＡチップには、矩形状、円盤状などの様々な形態に形成され、物質間の相互作用の場となる反応場２が、ウエル形状などの形態で、必要数（図面では１つ）設けられている。この反応場２は、例えば、感応性ポリイミド樹脂からなる樹脂層１１に、フォトレジストを用いた表面処理などによって形成することができる。
【００３２】
この反応場２の形状、サイズ、数は、特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍであって、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液）などの媒質の最小滴下可能量に基づいて決定することができる。
【００３３】
この樹脂層１１の上下には、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などからなる薄膜の絶縁膜１２ａ，１２ｂがそれぞれ介装された状態で、導体層１３ａ，１３ｂが形成されている（図１参照）。導体層１３ａの下側と導体層１３ｂの上側には、それぞれ合成樹脂層１４，１５が設けられている。特に、合成樹脂層１５は、光透過性の合成樹脂で形成するのが望ましい。
【００３４】
導体層１３ａ，１３ｂは、電源Ｇに接続され得る対向電極Ｅ１−Ｅ２として機能する。この対向電極Ｅ１−Ｅ２は、スイッチＳをオンにすることにより、反応場２（に貯留又は保持された媒質）に対して、所定の電界を印加することができる。なお、対向電極は、一対に限定されず、目的に応じて、二対以上設けてもよい。
【００３５】
下側の導体層１３ａ（電極Ｅ１）は、例えば、ＩＴＯ（インジウム-スズ−オキサイド）などの光透過性の導電性材料で形成するのが望ましい。基板１下方側からの励起光照射が可能となるからである。一方の導体層１３ｂ（電極Ｅ２）は、基板１下方側からの励起光照射を前提にすれば、アルミニウムなどの高反射率の導電性材料で形成するのが望ましい。反応場２で発生した蛍光を反射して、基板１の下方側に出射可能となるため、蛍光量を増幅できるからである。
【００３６】
次に、図２は、図１中に符号Ｘで示された領域の拡大図であり、符号Ｄで示された検出用核酸に対する標的核酸Ｔとミスマッチ核酸Ｍとの間の反応系を、経時的に、模式的に示している。
【００３７】
まず、図２のＸ１図では、固相表面Ｂに対して検出用核酸Ｄが固定されている状態が模式的に示されている。固相表面Ｂは、プローブＤＮＡ等の所望の検出用核酸Ｄを固定するために表面処理が施されている。
【００３８】
例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法などを採用できる。合成樹脂製基板に対して表面処理加工を施す場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。
【００３９】
また、銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、アビジン等をコートしてもよい。
【００４０】
例えば、ストレプトアビジンなどのアビジンによって表面処理された検出表面の場合では、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００４１】
ここで、図１のＸ１図で示された段階の反応場２には、標的核酸Ｔとミスマッチ核酸Ｍがそれぞれ遊離状態で混在しており、未だ電場が形成されていない状態となっている。この状態では、自然のブラウン運動の支配下でのハイブリダイゼーション進行が、開始可能な状態となっている。
【００４２】
次に、図１中のＸ２図の段階における反応場２は、上記した対向電極Ｅ１−Ｅ２を介して電界が印加された状態となっている。なお、符号Ｚは、その電場形成を模式的に示す電気力線を示している。
【００４３】
前記電界は、直流、交流あるいは高周波、低周波などの電界をアッセイの目的に応じて適宜選択して印加し、波形（矩形波、三角派、サイン波など）も自由に選択できるようにする。なお、交流電界の場合は、直流のような電気分解による気泡発生の心配がないので、物質間の相互作用を検出するアッセイには好適である。
【００４４】
高周波交流電界を核酸分子に作用させて、該核酸分子を誘電泳動によって伸長（伸張）あるいは移動させる場合は、１ＭＶ／ｍ以上及び１ＭＨｚ以上が望ましい。例えば、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚを好適に選択できる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００４５】
ここで、反応場２における電界（電場）の核酸分子に対する作用を説明する。まず、反応場２に不均一電界を形成することにより、誘電泳動に基づいて、核酸分子を電気力線がより集中する領域に向かって移動させることができる。即ち、反応場２の固相表面Ｂの近傍領域に電気力線を集中させれば、該領域における核酸分子の濃度を高めることができる。なお、不均一電界は、対向電極Ｅ１−Ｅ２（図１参照）の一方の電極をより狭小な面積にしたり、電極表面を粗面状に処理したりすることによって、形成することができる。
【００４６】
この誘電泳動の効果は、核酸分子同士（検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔ）の会合確率を高めることになる。即ち、ハイブリダイゼーションの効率を高めることに利用できる。また、誘電泳動の効果は、検出用核酸Ｄの固相表面（電極表面）に対する整列固定の作業を効率よく実施する際にも利用することができる。
【００４７】
また、誘電泳動の電気力学的効果を核酸分子に与えると、核酸分子を伸長（伸張）させることができる。核酸分子を伸長（伸張）させて直鎖状にすることによって、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を軽減し、塩基を露出させることができる。この結果、ハイブリダイゼーションを短時間で進行させることが可能となり、また、ミスハイブリダイゼーションの発生割合を低減することができる。
【００４８】
なお、「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（ここでは、ハイブリダイゼーション）が起こり難くなる現象を意味する。
【００４９】
ここで、図１のＸ２図に戻って説明を再開すると、このＸ２図の段階では、固相表面Ｂの近傍領域に電界が集中し、該近傍領域に標的核酸Ｔやミスマッチ核酸Ｍが移動している。これらの核酸分子の濃度が高まった条件で、ハイブリダイゼーションが進行している。
【００５０】
具体的には、検出用核酸Ｄと標的核酸Ｔとの間の正規ハイブリダイゼーションに加えて、検出用核酸Ｄとミスマッチ核酸Ｍとの間のミスハイブリダイゼーションが同時並行的に進行している。
【００５１】
Ｘ２図に示された段階から電界印加を継続して実施すると、徐々に、正規ハイブリダイゼーションＨ１が、ミスハイブリダイゼーションＨ２よりも優位になる現象が見られる。即ち、全体のハイブリダイゼーション量における正規ハイブリダイゼーションＨ１の比率が次第に高まる。なお、この段階での電界強度については、正規ハイブリダイゼーションＨ１を解離させず、かつミスハイブリダイゼーションＨ２の解離が促進される範囲の条件を策定する。
【００５２】
より詳しく説明すると、電場が形成された反応場２における標的核酸Ｔの運動性は、電気力学的効果によって高まるため、検出用核酸Ｄとミスマッチ核酸Ｍとの間で発生した結合力の弱いミスハイブリダイゼーションＨ２の解離が促進されて、正規ハイブリダイゼーションＨ１への置換が進行する。
【００５３】
一方、検出用核酸Ｄと相補的塩基配列を有する標的核酸Ｔとの間の結合力の強い正規ハイブリダイゼーションＨ１は、電場が存在する条件下でも容易に解離しないので、一旦形成された相補鎖結合は維持される。この結果、全体のハイブリダイゼーションに対する正規ハイブリダイゼーションＨ１の量的比率が高まる。
【００５４】
ここで、二本鎖核酸分子の塩基対部分に挿入結合するインターカレーターという物質が知られている。この中に、前記挿入結合時に蛍光を発する性質を有するものがある。従って、この蛍光インターカレーターを用いて、ハイブリダイゼーション（二本鎖核酸）を検出することが可能となる。
【００５５】
しかし、この蛍光インターカレーターは、ミスハイブリダイゼーションＨ２によって形成された、（不適正塩基対部分を有する）塩基対部分にも挿入結合して蛍光を発する。この蛍光は、正規ハイブリダイゼーションＨ１を検出する際のノイズとなる。
【００５６】
そこで、本発明では、反応場２に好適な電界印加を所定時間継続し、全体のハイブリダイゼーションに対する正規ハイブリダイゼーションＨ１の量的比率を充分に高めた後（図１中のＸ３段階後）に、前記蛍光インターカレーターを反応場２に加えるようにする。
【００５７】
このようにすると、図３に示された段階のように、反応場２では、正規ハイブリダイゼーションＨ１が圧倒的に優勢な状態の下で、蛍光インターカレーターＩが塩基対部分に挿入結合する。この結果、反応場２から得られる蛍光の大部分が、正規ハイブリダイゼーションＨ１に由来する蛍光となるので、Ｓ／Ｎがよくなり、正規ハイブリダイゼーションの検出精度を向上させることができる。
【実施例】
【００５８】
電界印加なしの反応場と電界印加有りの反応場におけるハイブリダイゼーションの比較実験を行うことによって、本発明の基本的な効果を検証した。
【００５９】
具体的には、図１に示したＤＮＡチップの反応場に、ミスマッチ核酸（オリゴヌクレオチド、３０ｍｅｒ）と完全相補的な標的核酸（オリゴヌクレオチド、３０ｍｅｒ）とを混在（競合）させた条件を設定し、検出用核酸（オリゴヌクレオチドプローブ、３０ｍｅｒ）と前記ミスマッチ核酸とのミスハイブリダイゼーション、並びに検出用核酸（ＤＮＡプローブ）と前記標的核酸との間の正規ハイブリダイゼーションの進行状況を検証した。
【００６０】
本発明に係る実施例は、反応場に１５分連続で高周波交流電界（電界条件：１Ｖ／μｍ、１ＭＨｚ（サイン波））の印加を行った場合であり、比較例１は、電界印加なし条件下での４時間振とうした場合、比較例２は、電界印加無しの条件下で振とうせずに９時間放置した場合である。
【００６１】
ハイブリダイゼーション状況の確認は、各例において、前記検出用核酸に対するミスマッチ核酸と標的核酸が競合する状況下での、全体のハイブリダイゼーションの中でのミスマッチ核酸が係わったミスハイブリダイゼーションの比率を求めることにより実施した。
【００６２】
各例における試験で採用したミスマッチ核酸は、検出用核酸の塩基配列と完全相補的である標的核酸の塩基配列に対する不適正塩基率が、１６．６％（５不適正塩基／３０塩基），３３．３％（１０不適正塩基／３０塩基），５０．０％（１５不適正塩基／３０塩基）、６６．６％（２０不適正塩基／３０塩基）、１００％の比率で不適正塩基を有するオリゴヌクレオチドをそれぞれ設計して用いた。なお、この設計の際、ＧＣ含有率とＴｍ値が標的核酸と同様になるように、また自己ハイブリのないように考慮した。
【００６３】
図４は、この検証試験の結果を示す図（図面代用グラフ）である。縦軸は、全体のハイブリダイゼーション量に対するミスハイブリダイゼーションの量的比率（mis-hybridization%）、横軸は、使用したミスマッチ核酸の不適正塩基率をそれぞれ示している。
【００６４】
図４に示された結果のように、特に、不適正塩基率６６．６％以下のミスマッチ核酸を用いた場合において、電界印加有りの条件である実施例（黒三角プロットのグラフ線を参照）は、これを比較例１、比較例２の結果と比較すると、圧倒的にミスハイブリダイゼーションの割合が低かった。
【００６５】
この結果から、高周波交流電界印加して、固相表面に固定された検出用核酸を伸長させることにより、ミスマッチ核酸と相補的なターゲットを競合させた条件では、正規ハイブリダイゼーションの量的比率を向上させることができることを確認できた。また、不適正塩基率の程度によっても、正規ハイブリダイゼーションの量的比率向上の効果が異なることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術、例えば、ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーション検出技術に有用である。特に、標的核酸が含まれるサンプル媒質中に、完全相補的でない核酸が混在しているようなアッセイ系において、本発明を用いると、検出用核酸と標的核酸との間の正規ハイブリダイゼーションの比率を高めることができる。従って、例えば、ＤＮＡチップを用いた疾病遺伝子診断などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明に係わる方法を実施できる反応場（２）が形成されたＤＮＡチップ（１）の好適な実施形態の要部構成を表す一部断面図である。
【図２】図１中に符号Ｘで示された領域の拡大図であり、符号Ｄで示された検出用核酸に対する標的核酸Ｔとミスマッチ核酸Ｍの反応系を、模式的に示す図である。
【図３】正規ハイブリダイゼーション（Ｈ１）が優勢な反応場（２）において、蛍光インターカレーター（Ｉ）が正規塩基対に挿入結合されている状態を模式的に示す図である。
【図４】実験結果を示す図（図面代用グラフ）である。
【符号の説明】
【００６８】
１  ＤＮＡチップ（要部）
２  反応場
Ｂ  固相表面
Ｄ  検出用核酸（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１−Ｅ２  対向電極
Ｈ１  正規ハイブリダイゼーション
Ｈ２  ミスハイブリダイゼーション
Ｉ  蛍光インターカレーター
Ｍ  ミスマッチ核酸
Ｔ  標的核酸
Ｚ  電気力線
【図１】
2005345365.tif 000003
【図２】
2005345365.tif 000004
【図３】
2005345365.tif 000005
【図４】
2005345365.tif 000006