(57)【要約】【課題】  本発明は、耐熱性アスパルターゼの結晶構造を解明する。【解決手段】ホモ四量体であって、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されている耐熱性アスパルターゼの結晶。この結晶は、好ましくは、１分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されている。この結晶は、さらに好ましくは、ホモ四量体は結晶学的に独立な2個のサブユニット（Ａ鎖とD鎖）とこれらと対称に位置する２個のサブユニット（C鎖とB鎖）とからなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモ四量体であって、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されている耐熱性アスパルターゼの結晶。
【請求項２】
１分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されている請求項１に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)の性質を有する請求項１または２に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(a)  空間群P21212に属し、a=76.2Å、b=140.5Å、c=101.9Åの単位格子定数を有する。
(b)   空間群P21212に属し、a=74.9Å、b=139.4Å、c=100.2Åの単位格子定数を有する。
【請求項４】
ホモ四量体は結晶学的に独立な2個のサブユニット（Ａ鎖とD鎖）とこれらと対称に位置する２個のサブユニット（C鎖とB鎖）とからなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である請求項１、２又は３に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
【請求項５】
各サブユニット（A鎖、B鎖、C鎖及びＤ鎖）がそれぞれ、N末端側の大きなドメイン、中央のヘリクスドメイン及びC末端の小さなドメインからなっており、各ドメインは以下の(c)〜(e)の構造を有する請求項４に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(c)  N末端側の大きなドメインは、逆平行な二本鎖β−ヘアピンとそれに続く５個のαヘリクスからなり、そのうち4個は２対のαヘリクス対をなし、対間は互いにほぼ垂直に配置し、残りの１個のヘリクスは、A鎖においてはπヘリクス性を有し、D鎖においては水素結合したターン性を有する。
(d)  中央のヘリクスドメインは6個のαヘリクスを有し、各サブユニット（A〜D鎖）の中央ヘリクスドメインは、5個のαヘリクスの束を通して他のサブユニットと相互作用することにより四量体分子中に20個のαヘリクス束の中心体を形成している。
(e)  C末端側の小さいドメインは、２個のヘリクス−ターン−ヘリクスモチーフからなり、２個のモチーフにはそれぞれヘリクス対が形成されており、これらのヘリクス対は互いにほぼ垂直に配置している。
【請求項６】
各サブユニットの中央ヘリクスドメインが以下の(f)及び(g)の構造を有する請求項５に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(f)  各サブユニットの束形成された5個のαヘリクスの中の２個のヘリクスは逆平行なβヘアピン構造により連結されており、このβヘアピンは中央ヘリクスドメインからの2個の突起の1個を作り、束形成された5個のαヘリクスの中の他の2個のαヘリクスはループにより連結されており、中央ヘリクスドメインからの２個の突起の他の１個を作っている。
(g)  各サブユニットの中央ドメインで束形成された２個のαヘリクス間に存在するαヘリクスは、N末端側の大きなドメインの互いに垂直に配置したαヘリクス対の一方と相互作用している。
【請求項７】
耐熱性アスパルターゼの結晶の以下の(1)〜（6）の特徴の少なくとも1つを利用する耐熱性アスパルターゼの作用を調節する分子の設計方法。
(1)  ホモ四量体であって、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されている。
(2)  １分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されている。
(3)  以下の(a)又は(b)の性質を有する。
(a)  空間群P21212に属し、a=76.2Å、b=140.5Å、c=101.9Åの単位格子定数を有する。
(b)   空間群P21212に属し、a=74.9Å、b=139.4Å、c=100.2Åの単位格子定数を有する。
(4)  ホモ四量体は結晶学的に独立な2個のサブユニット（Ａ鎖とD鎖）とこれらと対称に位置する２個のサブユニット（C鎖とB鎖）とからなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である。
(5)  各サブユニット（A鎖、B鎖、C鎖及びＤ鎖）がそれぞれ、N末端側の大きなドメイン、中央のヘリクスドメイン及びC末端の小さなドメインからなっており、各ドメインは以下の(c)〜(e)の構造を有する。
(c)  N末端側の大きなドメインは、逆平行な二本鎖β−ヘアピンとそれに続く５個のαヘリクスからなり、そのうち4個は２対のαヘリクス対をなし、対間は互いにほぼ垂直に配置し、残りの１個のヘリクスは、A鎖においてはπヘリクス性を有し、D鎖においては水素結合したターン性を有する。
(d)  中央のヘリクスドメインは6個のαヘリクスを有し、各サブユニット（A〜D鎖）の中央ヘリクスドメインは、5個のαヘリクスの束を通して他のサブユニットと相互作用することにより四量体分子中に20個のαヘリクス束の中心体を形成している。
(e)  C末端側の小さいドメインは、２個のヘリクス−ターン−ヘリクスモチーフからなり、２個のモチーフにはそれぞれヘリクス対が形成されており、これらのヘリクス対は互いにほぼ垂直に配置している。
(6)  各サブユニットの中央ヘリクスドメインが以下の(f)及び(g)の構造を有する。
(f)  各サブユニットの束形成された5個のαヘリクスの中の２個のヘリクスは逆平行なβヘアピン構造により連結されており、このβヘアピンは中央ヘリクスドメインからの2個の突起の1個を作り、束形成された5個のαヘリクスの中の他の2個のαヘリクスはループにより連結されており、中央ヘリクスドメインからの２個の突起の他の１個を作っている。
(g)  各サブユニットの中央ドメインで束形成された２個のαヘリクス間に存在するαヘリクスは、N末端側の大きなドメインの互いに垂直に配置したαヘリクス対の一方と相互作用している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、L-アスパラギン酸からアンモニアを脱離させてフマル酸を生成する可逆的反応を触媒する耐熱性のアスパルターゼの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスパルターゼは、細菌や植物に広く分布する酵素であり、L-アスパラギン酸をフマル酸とアンモニウムイオンとに変換する反応及びその逆反応を触媒する。
【０００３】
アスパルターゼによるL-アスパラギン酸の脱アミノ化反応は、図１に示す酸-塩基触媒反応と考えられている。図１によれば、アスパルターゼの塩基がL-アスパラギン酸のC3位からpro-Rプロトンを引き抜き、得られるカルバニオンは共鳴構造で安定化する。aci-カルボキシル酸中間体は、β-カルボキシル基上に二つの負電荷を有する。引き続きCα-N結合が開裂してフマル酸が生成する。最後に、酵素の酸からプロトンがNH3に与えられて、アンモニウムイオンが生成する。この酵素反応の律速段階は、C2位置でのCα-N結合の開裂反応である。
【０００４】
上記の活性を有するアスパルターゼは、工業的には、医薬や補助栄養食品に使用されるアスパラギン酸の生産、アスパラギン酸を含む人工甘味料の生産等に利用されている。
【０００５】
アスパルターゼは、Esherichia coliや好熱性菌であるBacillus sp.から単離されたものが精製されている。好熱性菌から単離されたアスパルターゼは耐熱性酵素であるために、酵素反応を高温下で効率的に行うことができる、精製において熱処理を行うことにより夾雑タンパク質を効率的に除去することができるといった利点がある。
【０００６】
近年、Bacillus sp.の中でも比較的高温環境で生育できる好熱性のBacillus sp. YM55-1株から新規な耐熱性アスパルターゼ（以下、「BsAsp」と称する。）が単離され、クローニング、大量発現、部位特異的突然変異による機能解析も行われた。BsAspは、E.coliなどの他のアスパルターゼと同様にホモ四量体である。またBsAsは、各468アミノ酸残基(分子量51,627)からなるサブユニットが4個会合したホモ四量体である。
【０００７】
この酵素は基質特異性が高く、また、他の常温性のアスパルターゼに比べて熱及び化学的変性に対して耐性が高いために、有用なアスパルターゼである。従って、BsAspの結晶構造が解明されて、その耐熱性や酵素反応メカニズムに寄与する構造的知見が得られれば、より生産性の高いアスパルターゼの作製や、耐熱性アスパルターゼの耐熱性などの作用を調節する分子の設計に役立てることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、耐熱性アスパルターゼの結晶構造を解明することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、好熱性細菌Bacillus sp. YM55-1株から単離された耐熱性アスパルターゼの結晶化に成功し、その結晶構造について以下の知見を得た。
(i) 耐熱性アスパルターゼはホモ四量体であるが、その結晶状態において、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されていること、及び、１分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されていることが、その耐熱性に寄与している。
(ii)  耐熱性アスパルターゼは、ホモ四量体が結晶学的に独立な2個のサブユニットとこれらと対称に位置する２個のサブユニットセット（Ａ鎖とD鎖とのセット及びB鎖とC鎖とのセット）からなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）が、常温性のアスパルターゼに較べて、結晶構造が近似しており、サブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である
(iii)  耐熱性アスパルターゼの結晶は、以下の(a)又は(b)の性質を有する。
(a)  空間群P21212に属し、a=76.2Å、b=140.5Å、c=101.9Åの単位格子定数を有する。
(b)   空間群P21212に属し、a=74.9Å、b=139.4Å、c=100.2Åの単位格子定数を有する。
【００１０】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の耐熱性アスパルターゼの結晶及び耐熱性アスパルターゼの作用を調節する分子の設計方法を提供する。
【００１１】
項１．  ホモ四量体であって、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されている耐熱性アスパルターゼの結晶。
【００１２】
項２．  １分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されている項１に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
【００１３】
項３．  以下の(a)又は(b)の性質を有する項１または２に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(a)  空間群P21212に属し、a=76.2Å、b=140.5Å、c=101.9Åの単位格子定数を有する。
(b)   空間群P21212に属し、a=74.9Å、b=139.4Å、c=100.2Åの単位格子定数を有する。
【００１４】
項４．  ホモ四量体は結晶学的に独立な2個のサブユニット（Ａ鎖とD鎖）とこれらと対称に位置する２個のサブユニット（C鎖とB鎖）とからなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である項１、２又は３に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
【００１５】
項５．  各サブユニット（A鎖、B鎖、C鎖及びＤ鎖）がそれぞれ、N末端側の大きなドメイン、中央のヘリクスドメイン及びC末端の小さなドメインからなっており、各ドメインは以下の(c)〜(e)の構造を有する項４に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(c)  N末端側の大きなドメインは、逆平行な二本鎖β−ヘアピンとそれに続く５個のαヘリクスからなり、そのうち4個は２対のαヘリクス対をなし、対間は互いにほぼ垂直に配置し、残りの１個のヘリクスは、A鎖においてはπヘリクス性を有し、D鎖においては水素結合したターン性を有する。
(d)  中央のヘリクスドメインは6個のαヘリクスを有し、各サブユニット（A〜D鎖）の中央ヘリクスドメインは、5個のαヘリクスの束を通して他のサブユニットと相互作用することにより四量体分子中に20個のαヘリクス束の中心体を形成している。
(e)  C末端側の小さいドメインは、２個のヘリクス−ターン−ヘリクスモチーフからなり、２個のモチーフにはそれぞれヘリクス対が形成されており、これらのヘリクス対は互いにほぼ垂直に配置している。
【００１６】
項６．  各サブユニットの中央ヘリクスドメインが以下の(f)及び(g)の構造を有する項５に記載の耐熱性アスパルターゼの結晶。
(f)  各サブユニットの束形成された5個のαヘリクスの中の２個のヘリクスは逆平行なβヘアピン構造により連結されており、このβヘアピンは中央ヘリクスドメインからの2個の突起の1個を作り、束形成された5個のαヘリクスの中の他の2個のαヘリクスはループにより連結されており、中央ヘリクスドメインからの２個の突起の他の１個を作っている。
(g)  各サブユニットの中央ドメインで束形成された２個のαヘリクス間に存在するαヘリクスは、N末端側の大きなドメインの互いに垂直に配置したαヘリクス対の一方と相互作用している。
【００１７】
項７．  耐熱性アスパルターゼの結晶の以下の(1)〜（6）の特徴の少なくとも1つを利用する耐熱性アスパルターゼの作用を調節する分子の設計方法。
(1)  ホモ四量体であって、１分子当たり20以上のイオン結合がサブユニット間に形成されている。
(2)  １分子当たり100以上の水素結合がサブユニット間に形成されている。
(3)  以下の(a)又は(b)の性質を有する。
【００１８】
(a)  空間群P21212に属し、a=76.2Å、b=140.5Å、c=101.9Åの単位格子定数を有する。
【００１９】
(b)   空間群P21212に属し、a=74.9Å、b=139.4Å、c=100.2Åの単位格子定数を有する。
(4)  ホモ四量体は結晶学的に独立な2個のサブユニット（Ａ鎖とD鎖）とこれらと対称に位置する２個のサブユニット（C鎖とB鎖）とからなっており、結晶学的に独立な２個のサブユニット間（Ａ鎖とD鎖間）のr.m.s. Cα偏差が１Å以下である。
(5)  各サブユニット（A鎖、B鎖、C鎖及びＤ鎖）がそれぞれ、N末端側の大きなドメイン、中央のヘリクスドメイン及びC末端の小さなドメインからなっており、各ドメインは以下の(c)〜(e)の構造を有する。
【００２０】
(c)  N末端側の大きなドメインは、逆平行な二本鎖β−ヘアピンとそれに続く５個のαヘリクスからなり、そのうち4個は２対のαヘリクス対をなし、対間は互いにほぼ垂直に配置し、残りの１個のヘリクスは、A鎖においてはπヘリクス性を有し、D鎖においては水素結合したターン性を有する。
【００２１】
(d)  中央のヘリクスドメインは6個のαヘリクスを有し、各サブユニット（A〜D鎖）の中央ヘリクスドメインは、5個のαヘリクスの束を通して他のサブユニットと相互作用することにより四量体分子中に20個のαヘリクス束の中心体を形成している。
【００２２】
(e)  C末端側の小さいドメインは、２個のヘリクス−ターン−ヘリクスモチーフからなり、２個のモチーフにはそれぞれヘリクス対が形成されており、これらのヘリクス対は互いにほぼ垂直に配置している。
(6)  各サブユニットの中央ヘリクスドメインが以下の(f)及び(g)の構造を有する。
【００２３】
(f)  各サブユニットの束形成された5個のαヘリクスの中の２個のヘリクスは逆平行なβヘアピン構造により連結されており、このβヘアピンは中央ヘリクスドメインからの2個の突起の1個を作り、束形成された5個のαヘリクスの中の他の2個のαヘリクスはループにより連結されており、中央ヘリクスドメインからの２個の突起の他の１個を作っている。
【００２４】
(g)  各サブユニットの中央ドメインで束形成された２個のαヘリクス間に存在するαヘリクスは、N末端側の大きなドメインの互いに垂直に配置したαヘリクス対の一方と相互作用している。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、耐熱性アスパルターゼの結晶構造が初めて解明された。これにより、より耐熱性の高いアスパルターゼの設計や、耐熱性アスパルターゼの活性を調節する分子の設計を行うことができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
四量体におけるサブユニットの配置
本発明の耐熱性アスパルターゼの１例であるBacillus sp. YM55-1株から単離された耐熱性アスパルターゼ(BsAsp)の結晶は、非対称単位中に２個のサブユニットを有する。３本の分子間２倍軸のうちの1本は、結晶構造学的な２回軸と一致している。この分子の結晶学的に独立な単位はA鎖及びD鎖と命名されている。BsAspのこの２個の独立サブユニットは、両者合計で924アミノ酸残基及び213個の水分子からなる。このように、四量体は非対称単位中の２個のサブユニット（A鎖及びD鎖）及びそれらの結晶学的対称な相手（それぞれC鎖及びB鎖）からなる。サブユニットに折りたたまれたこのポリペプチド鎖及び四量体分子を図２に示す。
全体的構造
図２(a)はBsAspのD鎖の結晶構造を示す。図２(a)において、α及び310ヘリクスは数字付きの螺旋で表されており、βストランドは文字付きの矢印で表されている。図2(b)は、BsAspの四量体の結晶構造を示す。
図２に示すように、Bacillus sp. YM55-1株のアスパルターゼ（BsAsp）は、222対称に配置された４個のサブユニットからなり、各サブユニットは、３個のドメイン、即ちN末端側の大きなドメイン、中央のヘリックスドメイン及びC末端の小さなドメインからなる。A鎖及びD鎖は、二次構造の幾つかの領域で少し異なるコンフォメーションを採る。
【００２７】
N末端側の大きなドメインは、２個の捩れた逆平行β−ヘアピン（ストランドA及びB）とそれに続く５個のヘリクスからなる。逆平行αヘリクス1,4の対とαヘリクス2,3の対とは、互いにほぼ垂直に配置している。ヘリクス５は、A鎖においてはπヘリクス性を有するが、D鎖においては水素結合したターン性を有する。
【００２８】
中央のヘリクスドメインは、主に6個の長いαヘリクスからなる。1個のサブユニットのドメインは、5個のαヘリクス6,7,11,12及び13のヘリクスの束を通して他のサブユニットと相互作用し、四量体分子において20個のヘリクス束の中心体を作る。ヘリクス6,7は、比較的長い逆平行なβヘアピン構造（ストランドC及びD）により連結されている。このβヘアピンは、中央ヘリクスドメインからの2個の突起の1つを作り、ヘリクス11及び12に連結した長いループは中央ヘリクスドメインからの2個の突起の他の1つを作る。中央ヘリクスの束においてヘリクス７と11との間に存在するαヘリクス９は、N末端側ドメインのαヘリクス２と相互作用する。
【００２９】
C末端側の小さいドメインは、いくつかの短いヘリクスからなる。この短いヘリクスは、主に２個のヘリクス−ターン−ヘリクスモチーフからなり、これらのモチーフはヘリクス対15,16及びヘリクス対17,18により構成されている。ヘリクス対15,16とヘリクス対17,18とは互いにほぼ垂直に配置している。C末端ドメインは、フレキシブルループに富み、二次構造が比較的少ない。
【００３０】
この酵素のA鎖、D鎖の双方における主鎖平均Bファクターの研究により、A鎖のN末端ドメインのBファクターはD鎖のそれらより低く、A鎖のC末端ドメインのBファクターはD鎖のそれらより高いことが分かった。各ドメインのBファクターのこれらの違いは、各ドメインの柔軟性（mobility)の違いに因り、実際は結晶の分子間相互作用の領域の違いにより説明される。
常温性アスパルターゼとの比較
図３は、BsAspとE.coliアスパルターゼ（EcAsp)及びE.coliフマラーゼ（EcFum)とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸番号はBsAspのアミノ酸番号である。
【００３１】
この酵素のPROCHECKにより定められた二次構造を、E.coliの常温性のアスパルターゼ(EcAsp)及びE.coliのフマラーゼ(EcFum)との配列アラインメントとともに図３に示す。図３において、アミノ酸番号はBsAspのアミノ酸番号に基づく。このアラインメントには、公知の殆ど全てのアスパルターゼ（EcAspについては13菌種から単離されたもの、EcFumについては26菌種から単離されたもの）を使用した。アミノ酸配列の下部に示した数字付きの長方形はαヘリクス及び310ヘリクス（ヘリクス8)及びπヘリクス（ヘリクス5)に寄与しており、アミノ酸配列の下部に示した矢印はβストランドに寄与している。二次構造に関しては、A鎖とD鎖との間で長さが異なるこれらのより長い構造要素のみ図に示した。
【００３２】
図３に示すように、BsAspは、E.coliのアスパルターゼEcAspと49％の相同性を有し、E.coliのフマラーゼEcAspと41%の相同性を有する。BsAspの二次構造の位置やフォールディングパターンは、EcAsp及び EcAspのそれらと極めて類似している。
【００３３】
しかし、BsAspのサブユニットの全体構造は、リガンドフリーのEcAspのそれよりも、クエン酸が複合したEcFumのそれに似ている。サブユニット間のr.m.s Cα偏差(deviation)は、BsAspのA鎖及びD鎖の対 、BsAspのD鎖とEcAspのA鎖との対、BsAspのD鎖とEcFumのＡ鎖との対、EcAspのA鎖とEcFumのＡ鎖との対で、それぞれ0.60Å、1.97Å、1.57Å、2.42Åである。
【００３４】
アスパルターゼでは、結晶学的に独立な２個のサブユニット間で、アミノ酸配列が同じ又はほぼ同じであるにも関わらず、その立体構造は異なっている。この異なる程度は、耐熱性アスパルターゼでは、常温性アスパルターゼに比べて小さく、A鎖とD鎖との間のr.m.s Cα偏差は、通常１Å以下、特に0.6Å以下である。
【００３５】
リガンドフリーのEcFumの構造は解明されていない。しかし、リガンドフリーの酵母由来のフマラーゼは、クエン酸が複合したEcFumと殆ど同じで、r.m.s  Cα偏差は0.98Åである。従って、リガンドフリーEcFumの構造は複合体の構造と本質的に同じであることが期待されるが、幾つかの残基の側鎖に違いがあるかもしれない。基質アナログと複合体を形成したEcAspの構造はまだ知られていないが、BsAspの電子密度図は、この酵素がA,B,C鎖からなる活性部位において何かの分子に結合し、B,C,D鎖からなる活性部位において水分子と結合することを示唆している(図４参照)。
【００３６】
図４は、BsAspの２個の独立な活性部位の立体構造を描いた図である。図(a)は、A鎖、B鎖、C鎖からなる活性部位を示す。未知のリガンドは、3.5σレベルでのσA荷重F0-Fc電子密度輪郭の塊として示す。図(b)は、B鎖、C鎖及びD鎖からなる活性部位を示す。水分子は活性部位で酵素と結合する。
【００３７】
アミノ酸残基317-322の柔軟なループを除き、A,D鎖の構造間には顕著な違いは見出されていない。これらの知見は、BsAsp、EcAsp、EcFumのサブユニット間の主鎖における構造上の違いが、それらの固有の構造上の特徴に対応していること、及び、この違いが基質又は基質アナログの結合性によらないことを示している。
異なるコンフォメーションの領域
BsAsp、EcAsp、EcFumのサブユニット間の構造上の違いはループ及びドメインの相対的な配向にある。さらに、EcAspの中央ヘリクスドメインのαヘリクスの相対的な配向及び軸の湾曲は、BsAsp及びEcFumのそれらと大きく異なる。
【００３８】
二つの構造間の5個の連続した残基領域におけるCα−フィッティングの後のr.m.s Cα偏差を中心残基の値としたプロットは、主鎖の局部的な構造上の違いを、二次構造やドメインのような構造要素間の相対的な配向や位置の違いに依存せずに、明確にするために有効である(図５参照)。
【００３９】
図５は、アミノ酸番号に対して、５個の残基のウィンドウサーチによるBsAsp、EcAsp及びEcFumのサブユニット間のr.m.s.Cα偏差をプロットしたグラフである。
【００４０】
図５の比較により、これら三つの酵素のサブユニット間に1.0Åを超える大きなr.m.s偏差を有する７個の領域が見出された。図５は、サブユニット、四量体分子及びBsAspの活性部位中に示されるこれらの構造上違う領域を示す。
【００４１】
315-323の領域は、アスパルターゼ-フマラーゼスーパーファミリーの特徴であるフレキシブルループである。BsAspとEcAspとの間には40-45、81-84、123-128、228-241、265-272の５個の残基領域に構造上の違いがある。EcFumとEcAspとの間には40-45、81-84、96-100、228-241、265-272残基領域に構造の違いが見出されている。従って、40-45、81-84、228-241、265-272の4個の領域は、EcAspの特徴である。他方、BsAspとEcFumとの間には、96-100、123-128残基領域に構造上の違いが見出された。123-128の領域は、BsAspとEcAspとの間で構造的に異なるため、BsAspに特徴的な領域である。96-100の領域は、BsAspおよびEcAspとEcFumとの間で異なる。アスパルターゼとフマラーゼとの構造上の固有の違いはこの領域にあると考えられる。従って、この領域は、アスパルターゼの基質（アスパラギン酸の-NH+3）及びフマラーゼの基質（L-リンゴ酸の-OH)に特徴的な官能基を認識すると考えられる。
耐熱性メカニズム
BsAspはEcAspより耐熱性に優れる。BsAspでは55℃で60分間熱処理した後に80％活性が残存するが、EcAspでは、同じ処理を行うと変性し、活性が全くなくなってしまう。さらに、BsAspは化学的変性に対しても耐性であり、サンプルの50％をフォールディング中間体にする塩酸グアニジン濃度は、BsAspでは1.3Mであるのに対してEcAspでは0.8Mと低い。
【００４２】
両酵素間の結晶構造の違いが耐熱性及び化学的安定性に及ぼす影響を検討する。
【００４３】
表１は、BsAsp及びEcAspについての、水素結合、イオン対の数及び接近可能な表面積を示す。
【００４４】
【表１】
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表１から明らかなように、BsAspのサブユニット間水素結合の数は１分子当たり100個以上、特に120個以上、さらに特に140個以上である。また、BsAspのサブユニット間イオン対の数は１分子当たり20個以上、特に30個以上である。BsAspはEcAspに比べて、１分子当たりのサブユニット内及びサブユニット間の水素結合及びイオン対の数が多い。特に、サブユニット間の水素結合の数がEcAsp の1.7倍であり、イオン対の数はEcAsp の2.29倍である。また、イオン性残基の合計数は、BsAspとEcAspとで同程度であるにも関わらず、サブユニット間のイオン対に寄与している残基数は、BsAspがEcAspの約2.3倍である。これらのことから、BsAspのイオン性残基は、EcAspのイオン性残基に比べて、特にサブユニット間のイオン結合対を形成し易いように配置していることが分かる。
【００４５】
接近可能な表面積については、4量体及び4個のサブユニットの合計の双方で、BsAspはEcAspより小さい。また4量体形成により埋没した表面積はBsAspではEcAspより若干大きい。このことから、BsAsp分子はEcAsp分子よりややコンパクトであり、サブユニット間の接触界面面積がその分大きくなっていることが分かる。
耐熱性アスパルターゼの作用を調節する分子の設計方法
本発明の耐熱性アスパルターゼの作用を調節する分子の設計方法は、上述した本発明の耐熱性アスパルターゼの結晶構造の特徴を利用して、この酵素の作用に影響を与える分子を設計する方法である。結晶状態の耐熱性アスパルターゼに対して影響を及ぼすと考えられる分子は、工業的に利用される溶液状態の耐熱性アスパルターゼに対して同様の影響を及ぼすことが予測される。
実施例
(1)  アミノ酸アラインメント
13種のアスパルターゼ及び26種のフマラーゼのアミノ酸配列を、PIR、GenBank、SWISS-PROT  にインプットし、プログラムCLUSTALW44を用いて配列のアラインメントを行った。結果を図３に示す。
(2)結晶化
先の論文に記載された方法でE.coli組換え体よりBsAspを生産させ、精製した。酵素の結晶を、Crystal Screen Kit (Hampton Research Inc.)のNo.42と同じ条件で、30℃の下、ハンギングドロップ蒸気拡散（hanging-drop vapor-diffusion）法により成長させた。X線解析のための大きな結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散（sitting-drop vapor- diffusion method）法により得た。タンパク質溶液は、10mg／ml酵素を含む50mMリン酸カリウムバッファー溶液(pH7.5)である。リザーバー溶液は、25％(w/v)ポリエチレングリコール4000、10％(v/v)２-プロパノール、0.1M NaHepesバッファー(pH7.5)である。タンパク質溶液５μlと保存溶液５μlとを混合することにより液滴を調製し、30℃でリザーバー溶液に対して蒸気平衡化した。タンパク質溶液の液滴を調製する前にリザーバー溶液に、Mg+2、Sm+2、Re+2のようなある種の２価金属イオンを添加することにより、結晶はよく成長した。
(3)データ収集・加工
2個の結晶（NAT1及びNAT2）の回折データの２セットを、Fuji imaging plate(400mm×200mm)付きのscreenless Weissenberg カメラを用いて、BL18Bステーション（Photon Factory, Institute of Materials Structure Science, High Energy Accerator Research Organization, Tsukuba, Japan）で、1.00Åの波長で収集した。NAT1のデータ収集は、ガラスキャピラリ中に密閉された１個の結晶を用いて、291Kで行った。室温実験に使用される結晶は、8mM Sm(NO3) 3を添加した結晶化条件下で0.5mm×0.4mm×0.1mmのサイズまで成長させた。NAT2データ収集は、液体窒素ガス流の中で瞬間的冷却結晶（flash-cooled crystal）を用いて100Kで行った。cryo-実験に使用される結晶は、3mM MgCl2を添加した結晶化条件下で、約0.4ｍｍ×0.2mm×0.03ｍｍのサイズまで成長させた。結晶は、抗凍結剤（cryo-protectant）として10％ポリエチレングリコール400を含む結晶母液に、１〜2分間浸漬し、ナイロンループで保持してゴニオメーター（goniometer）に載せた。両データセットをDENZO及びSCALEPACKのプログラムで数値データ化した。
【００４６】
この結晶は、空間群P21212に属し、NAT1はa＝76.2Å、b＝140.5Å、c＝101.9Åの単位格子定数を有し、NAT2はa＝74.9Å、b＝139.4Å、c＝100.2Åの単位格子定数を有する。データ収集及び処理統計値をまとめて表２に示す。
【００４７】
(4)構造決定及び精密化
本アスパルターゼの構造を、出発モデルとしてEcAsp（PDBコード1JSW）の構造を用いた分子置換法（molecular replacement method）により決定した。非対称な2個のサブユニットの存在により、2.67Da/Å3という適当なVM値が得られた。二量体サーチテクニックを分子置換法に適用した。プログラムAMoRe及びX-PLORで計算された回転関数（rotation  function）は、同じ解答を与えた。しかし、この場合の並進関数(translation function)は両プログラムを用いてどのような条件下でも解を与えなかった。従って、X-PLORプログラムを用いて、結晶学的c-軸に沿ってR-因子サーチを行った。
【００４８】
非対称単位における4量体分子の半分の存在及びP21212の空間群を考慮すれば、３個の分子二回軸の中の１本は、結晶学的ｃ-軸に沿った２回軸に一致する。従って、回転関数の解答に基づき回転するサブユニットダイマーモデルは、(x,y)＝(0.0,0.0)に位置する結晶学的c-軸の上に重ねられた分子二回軸とともに結晶学的c-軸に沿って1.0Åの間隔で並進させられた。各並進の後、このモデルは、rigid bodyとして精密化され、R-ファクター及びRfreeファクターは、10〜4Åの分解能範囲で計算された。この並進サーチは分子中心が最初の位置から単位格子のc-軸長の半分まで動くまで続けられた。R-ファクター及びRfreeファクターのプロットは、c-軸に沿った26オングストロームの並進のところで、それぞれ51.8％及び51.8％と減少を示した。この位置は格子単位のc-軸の殆ど4分の１の所であった。計算において、平均値はそれぞれ53.9％（r.m.s偏差0.6%）及び56.5%（r.m.s偏差1.5％）であった。
【００４９】
従って、サブユニットのダイマーを、最少のRファクターを与える位置に移動し、rigid-body精密化（refinement）を行った。プログラムTurb-FRODOを用いて電子密度図を観察し、モデル構築（building）を行った。オミット図によれば、ヘリクスドメインにおいて、明らかな電子密度の流れが見られた。これに対して、N末端側の大きなドメイン及びC末端側ドメインでは、電子密度図は弱かった。サブユニットダイマーにおける中央ヘリクスドメインのα-ヘリクスを位相(phase)計算のための出発モデルとして用いた。位置の精密化（refinement）の計算、溶媒領域平滑化及び非結晶学的対称(NCS)による電子密度平均化、EcAsp構造を利用したポリペプチド鎖のモデル構築を3.0Å分解能で繰り返した。構造モデルを約80％まで構築後、NAT2データセットをNAT1データセットに代えて用い、プログラムCNSを精密化に用いた。全体的なB因子の修正及び嵩張る溶媒（bulk solvent）の修正を以下の手順で行った。即ち、rigid-body精密化の後、3.0Åから2.5Åへ分解能を徐々に拡張させることにより、動力学的精密化法のプロトコールを用いてモデルを精密化した。NCSにおける制限は初期には2個の結晶学的に独立なサブユニットに適用し、最終的には無制限状態に段階的緩められた。各原子温度因子及び原子位置は、さらなる精密化サイクルで精密化された。精密化の過程において、このモデルの妥当性は、σA荷重された2F0-Fc及びF0-Fcマップに基づき注意深く調べられ、電子密度外に現れたモデル領域においては手動で再構築された。2個の結晶学的に独立な活性部位の1つにおけるLys324の側鎖の先端に余分な電子密度の塊が観察されたが、密度の形の適当な候補が見つからなかったために、このピークの説明はつかなかった(図4(a))。マグネシウムイオンの明らかなピークは認められなかった。Cβを超える側鎖の電子密度が2個のポリペプチド鎖の24残基に観察されなかったため、これらの残基はアラニンとしてモデル化された。最後にこのモデルの精密化により、22.1％のR-ファクター、また2.5Å分解能でのデータの5%をランダムに選択したデータに対して26.6%のRfree-ファクターが得られた。この精密化の結果を表２にまとめて示す。ここで得られたBsAspの構造は、RCSBタンパク質データバンクにIDコード1J3Uとして登録してある。
【００５０】
【表２】
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結晶構造の比較のための計算
比較のための同等物としては、EcAspのためにPDBコード1JSWを、EcFumのためにPDBコード1FUOを用いた。EcAspの四量体構造は結晶学的に独立な四つのサブユニットからなるが、BsAsp及びEcFumの同等物は、非対称単位当たり２個のサブユニットの同等物からなっていた。従って、BsAsp及びEcAspの四量体は結晶学的に対称な操作により構築された。
【００５１】
BsAsp、EcAsp及びEcFum間の局所構造の比較のためのr.m.s.偏差の計算は、プログラムLSQMANを用いて行った。３個の構造中のいずれの２個間の５個の連続する残基のセグメントにおける対応するCα原子も、最小二乗法でのフィッティングによりフィットされ、得られたr.m.s.偏差はセグメントの中央残基のそれとしてプロットされた。r.m.s.偏差はこの５個の残基のウィンドウサーチによりサブユニットの全体（アミノ酸残基5-466）にわたり計算された。EcAspに挿入されたアミノ酸残基（アミノ酸残基43-44及び86）及びEcFumに挿入されたアミノ酸残基（残基158）は、BsAspの配列に基づき欠失させた。EcAsp及びEcFumの他の残基はBsAspの対応する残基番号に基づき番号を付け替えた。サーチウィンドウとして用いた残基数は経験的に選んだ。
【００５２】
水素結合の数は、プログラムHBPLUSを用いて計算した。水素結合の距離の基準はアクセプターとドナーとの間で2.5-3.4Åの範囲であった。イオン対の数はプログラムパッケージCCP4中のCONTACTSを用いて計算した。イオン対間の距離の基準は、負荷電残基（アスパラギン酸及びグルタミン酸）及び正荷電残基（リジン及びアルギニン）における反対荷電した原子間の4.0Å以内の距離とした。分子表面積及び界面面積はプログラムGRASPを用いて計算した。
【００５３】
本明細書での議論及び図面の基礎とした構造物間の最小二乗フィッティングは、プログラムパッケージCCの中のプログラムLSQKABを用いて行った。
【００５４】
図1(a)及び図3(b)及び図５〜９は、プログラムMOLSCRIPTにより描き、プログラムRaster3Dにより表現した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】提案されたアスパルターゼの反応機構を示す図である。
【図２】図(a)は、BsAspの結晶におけるサブユニット(D鎖）を示し、図(b)はBsAspの四量体の結晶を示す。
【図３】BsAspと関連酵素であるEcAsp及びEcFumとのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。
【図４】図(a)は、A鎖、B鎖、C鎖からなる活性部位の立体構造を示す図であり、図(b)は、B鎖、C鎖、D鎖からなる活性部位の立体構造を示す図である。
【図５】BsAsp、EcAsp、EcFumのサブユニット間のr.m.s.Cα偏差をプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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