(57)【要約】    【課題】  Ｌ−システイン生産細菌の菌株の生産能を増強させること、および同菌株を用いてＬ−システインを製造する方法を提供する。    【解決手段】  ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強されるように改変されたエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌を、チオ硫酸塩含有培地で培養し、同培地からＬ−システインを回収することにより、Ｌ−システインを製造する。    【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強されるように改変された、エシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項２】
前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子のコピー数が増加し、または遺伝子の発現が増強するように発現制御配列を改変することにより、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強された、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子を保持するマルチコピーベクターで前記細菌を形質転換することにより前記コピー数が増加した、請求項２に記載のエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項４】
前記クラスターの固有のプロモーターがより強力なプロモーターに置換された、請求項２に記載のエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項５】
前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の付加的コピーが前記細菌の染色体に組み込まれたことにより前記コピー数が増加した、請求項２に記載のエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項６】
前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項７】
前記生産菌が、さらにｙｄｅＤオープンリーディングフレームの発現が増強するように改変された、請求項６に記載のエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細菌をチオ硫酸塩含有培地で培養し、同培地からＬ−システインを回収する、Ｌ−システインの製造法。
【請求項９】
前記細菌は、Ｌ−システイン生合成系遺伝子の発現が増強されていることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、詳しくは発酵によるＬ−システインの製造法に関する。より詳しくは、本発明はエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子に関する。同遺伝子は、エシェリヒア・コリのＬ−システイン産生の向上に有用であることが見出された。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−アミノ酸は、天然から得られた微生物菌株、または特にＬ−アミノ酸生産能が向上するように改変されたそれらの変異株を利用する発酵法により、工業的に製造されてきた。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸生産能を増強させる多くの技術（例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換による）が報告されている（例えば、特許文献１参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、および/または、産生されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害から標的酵素を脱感作させることによる（例えば、特許文献２及び特許文献３参照）。
【０００４】
無機硫黄からのＬ−システインの合成は、微生物（サルモネラおよびエシェリヒア・コリを含む）において還元型硫黄が有機化合物中に取り込まれるメカニズムとして優勢なものである。この過程においては、好気的生物圏において豊富かつ利用可能な硫黄である無機硫酸塩が取り込まれ、硫化物に還元される。次いで、この還元された硫黄は、グルタミンまたはグルタミン酸へのアンモニアの固定と同等の過程でＬ−システイン中に取り込まれる。硫酸塩の取り込みは、ｃｙｓＴＷＡおよびｓｂｐ（硫酸塩結合タンパク質）遺伝子によりコードされるサルフェートパーミアーゼにより行われる。硫黄固定の２つのさらなるメカニズムが、サルモネラ・ティフィムリウムおよびエシェリヒア・コリにおいて開示されている。第一のメカニズムは、ｃｙｓＭ遺伝子によりコードされるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−Ｂにより触媒される、チオ硫酸塩とＯ−アセチル−Ｌ−セリンとの反応を通して起こり、同反応により、チオスルホン酸塩であるＳ−スルホシステインが形成し、これは次にＬ−システインへと還元される。このメカニズムにおいて、細胞へのチオ硫酸塩の輸送は、ｃｙｓＰＴＷＡ遺伝子によりコードされるチオサルフェートパーミアーゼにより行われる。代替的には、硫化物は、ｃｙｓＫおよびｃｙｓＭ遺伝子それぞれによりコードされるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−ＡまたはＢにより触媒される反応を介してＯ−アセチル−Ｌ−セリンに取り込まれ、Ｌ−システインが産生する。第二のメカニズムには、シスタチオニンγ−シンターゼにより触媒される反応においてホモシステインを生成する、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンと硫化物との反応が含まれる（非特許文献１）。
【０００５】
ｃｙｓＧ、ｃｙｓＢ、ｃｙｓＺ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｃｙｓＡ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＵ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＣ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＥ、およびｓｂｐから選ばれるシステイン生合成系遺伝子の少なくとも１つ又はそれ以上が増強され、特に過剰発現する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の微生物の発酵によるＬ−スレオニンの製造法が開示されている（特許文献４）。
【０００６】
しかし、現時点で、チオ硫酸塩含有培地で生育する細菌、及び及びｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター発現が増強するように改善された細菌のＬ−システイン生産の改善については、報告されていない。
【特許文献１】米国特許第４，２７８，７６５号
【特許文献２】米国特許第５，６６１，０１２号
【特許文献３】米国特許第６，０４０，１６０号
【特許文献４】国際公開第０３／００６６６６号パンフレット
【非特許文献１】エシェリヒア・コリおよびサルモネラ（Escherichia coli and Salmonella）」（第二版）、編集長：F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｌ−システイン生産細菌の菌株の生産能を増強させること、および同菌株を用いてＬ−システインを製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題は、本明細書に記載した新規菌株をチオ硫酸塩含有培地で培養したときに、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系、およびＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−ＢのそれぞれをコードするｃｙｓＰＴＷＡクラスター遺伝子及びｃｙｓＭ遺伝子の発現を増強することにより、Ｌ−システイン生産が増強され得ることを見出し、達成された。
本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
（１）ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強されるように改変された、エシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌。
（２）前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子のコピー数が増加し、または同遺伝子の発現が増強するように発現制御配列を改変することにより、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強された、前記細菌。
（３）前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子を保持するマルチコピーベクターで前記細菌を形質転換することにより前記コピー数が増加した、前記細菌。
（４）前記クラスターの固有のプロモーターがより強力なプロモーターに置換された、前記細菌。
（５）前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の付加的コピーが前記細菌の染色体に組み込まれたことにより前記コピー数が増加した、前記細菌。
（６）前記ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である、前記細菌。
（７）前記生産菌が、さらにｙｄｅＤオープンリーディングフレームの発現が増強するように改変された、前記細菌。
（８）請求項１〜７のいずれか一項に記載の細菌をチオ硫酸塩含有培地で培養し、同培地からＬ−システインを回収する、Ｌ−システインの製造法。
（９）前記細菌は、Ｌ−システイン生合成系遺伝子の発現が増強されていることを特徴とする、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、エシェリヒア属に属する新規なＬ−システイン生産菌、及び同細菌を用いたＬ−システインの製造法が提供される。本発明によれば、チオ硫酸塩を用いて、効率よくＬ−システインを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の細菌は、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子群（本明細書では、「ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子」と記載する。）の発現が増強された、エシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌である。ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子は、Ｌ−システイン生産の収率を増強又は増加させる。より具体的には、本発明の細菌は、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現が増強するように改変された、エシェリヒア属に属するＬ−システ
イン生産菌である。
【００１２】
「Ｌ−システイン生産菌」とは、本発明の細菌を培地で培養したときに、Ｌ−システインを生産し培地中に排出する能力を有する細菌を意味する。本明細書中に用いられる用語「Ｌ−システイン生産菌」は、野生株または親株よりも多い量のＬ−システインを生産し培地に排出することができる細菌を意味し、好ましくは、０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量のＬ−システインを生産し培地に排出することができる微生物を意味する。
【００１３】
用語「エシェリヒア属細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物の例として、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられ得る。エシェリヒア・コリは、最も好ましい本発明の細菌の一つである。
【００１４】
用語「遺伝子（又は遺伝子群）の発現を増強するよう改変された」とは、例えば、前記遺伝子の発現量が、非改変株、例えば野生株よりも高くなっていることを意味する。例えば、細胞あたりの遺伝子の数が増加するか、遺伝子によりコードされる分子の数が増加するか、または遺伝子発現レベルが増加する場合等が含まれる。発現遺伝子のコピー数は、例えば、染色体ＤＮＡの制限酵素切断、次いで遺伝子配列に基づいて構築されるプローブを用いたサザンブロット法、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）等により測定され得る。遺伝子発現レベルは、ノーザンブロット法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法等のような種々の公知の方法によって測定され得る。さらに、コントロールとして、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２等の野生株を用いることができる。前記遺伝子発現の増強の結果として、培地におけるＬ−システインの排出及び蓄積が増加する。
【００１５】
細菌細胞におけるｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の発現の増強は、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子のコピー数を増加することにより、または遺伝子発現が増強するようにその発現制御配列を修飾することにより達成し得る。
【００１６】
本発明に用いられるｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子としては、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子およびサルモネラのような他の細菌由来の遺伝子が用いられ得る。エシェリヒア属細菌由来の遺伝子が好ましい。
【００１７】
エシェリヒア・コリのｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子の配列は、以下に示すように、報告されている化（Blattner,F.R. et al., Science 277 (5331), 1453-1474 (1997)）。
ｃｙｓＰ遺伝子（配列番号１）：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｇｉ：１６１３０３５０）の配列中、ヌクレオチド番号２５４０５３２〜２５４１５４８、
ｃｙｓＴ（ｃｙｓＵ）遺伝子（配列番号３）：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｇｉ：１６１３０３４９）の配列中、ヌクレオチド番号２５３９６９９〜２５４０５３２、
ｃｙｓＷ遺伝子（配列番号５）：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｇｉ：１６１３２２２４）の配列中、ヌクレオチド番号２５３８８２４〜２５３９６９９、
ｃｙｓＡ遺伝子（配列番号７）：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｇｉ：１６１３０３４８）の配列中、ヌクレオチド番号２５３７７３７〜２５３８８３４、
ｃｙｓＭ遺伝子（配列番号９）：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｇｉ：１６１３０３４７）の配列中、ヌクレオチド番号２５３６６９２〜２５３
７６０３。
【００１８】
ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスターは、エシェリヒア・コリＫ−１２株の染色体上のｙｃｈＭ
ＯＲＦｂ２４２０遺伝子座とｂ２４２６遺伝子座間に位置する。したがって、これらの遺伝子は、同遺伝子の報告されたヌクレオチド配列に基づいて調製されたプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、White, T.J.et.al., Trends Genet., 5, 185(1989)を参照）により得ることができる。他の微生物の硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系のタンパク質をコードする遺伝子は、同様の方法で得ることができる。
【００１９】
エシェリヒア・コリ由来のｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子には、以下に例示されたＤＮＡが含まれる。
【００２０】
以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードするｃｙｓＰ遺伝子：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列のタンパク質バリアントであり、チオ硫酸塩ペリプラズム結合タンパク質の活性を示すタンパク質。
【００２１】
以下のタンパク質（Ｃ）または（Ｄ）をコードするｃｙｓＴ遺伝子：
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列のタンパク質バリアントであり、タンパク質（Ｅ）または（Ｆ）、および（Ｇ）または（Ｈ）と結合したときに、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系パーミアーゼの活性を示すタンパク質。
【００２２】
以下のタンパク質（Ｅ）または（Ｆ）をコードするｃｙｓＷ遺伝子：
（Ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列のタンパク質バリアントであり、タンパク質（Ｃ）または（Ｄ）、および（Ｇ）または（Ｈ）と結合したときに、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系パーミアーゼの活性を示すタンパク質。
【００２３】
以下のタンパク質（Ｇ）または（Ｈ）をコードするｃｙｓＡ遺伝子：
（Ｇ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｈ）配列番号８に示すアミノ酸配列のタンパク質バリアントであり、タンパク質（Ｃ）または（ＤＦ）、および（Ｅ）または（Ｆ）と結合したときに、硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系パーミアーゼの活性を示すタンパク質。
【００２４】
以下のタンパク質（Ｉ）または（Ｊ）をコードするｃｙｓＭ遺伝子：
（Ｉ）配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｊ）配列番号１０に示すアミノ酸配列のタンパク質バリアントであり、Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−Ｂの活性を示すタンパク質。
【００２５】
用語「硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系パーミアーゼの活性」とは、外部の培地から細胞内へチオ硫酸塩を輸送するタンパク質の活性を意味する。用語「Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−Ｂの活性」とは、Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンおよびチオ硫酸塩の間の反応を触媒し、Ｓ−スルホシステインを生成する活性を意味する。上記活性の存在は、例えば、対応遺伝子中に変異を有する細菌を用いる相補実験により決定され得る。
【００２６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、タンパク質の活性が損なわれない限り、タンパク質（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）又は（Ｉ）中の１又はそれ以上の位置での１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含んでいてもよいタンパク質バリアントをコードするＤＮＡを含む。「数個の」アミノ酸数はタンパク質の三次元構造にお
ける位置およびアミノ酸残基の種類により異なるが、約３００アミノ酸残基からなるタンパク質に対し２〜３０、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１０であり得る。これは、いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そしてそのようなアミノ酸における差異はタンパク質の三次元構造およびその活性に大きくは影響しないからである。したがって、タンパク質（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）、（Ｈ）又は（Ｊ）は、タンパク質（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）又は（Ｉ）の全アミノ酸残基に対して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好ましくは７０〜９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつそれぞれのタンパク質の活性を有するものであり得る。
【００２７】
ＤＮＡの相同性の度合いを評価するには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索、およびＣｒｕｓｔａｌＷ等の公知の計算法が使用され得る。
【００２８】
ＢＬＡＳＴ（基本局所配列比較検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムに用いられている発見的（heuristic）検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、Karlin. Samuel and Stephen F. Altschulの統計的方法を用いて、有意度をそれらの発見によるものとする（「一般的スコアリングスキームを使用することによる分子配列の特徴の統計的有意度を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes）」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-58；「分子配列における複数のハイスコア断片のための応用および統計（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1993, 90:5873-7）。ＦＡＳＴＡ検索法は、W. R. Pearsonにより記載される（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡでの迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」, Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. により記載される（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ、および重さマトリクス選択を通じた進化的多重配列比較の感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」, Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680)。
【００２９】
上記のようなタンパク質（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）又は（Ｉ）の改変は、それぞれのタンパク質の活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。前記タンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。
【００３０】
（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）、または（Ｉ）で定義されたタンパク質と実質的に同一のタンパク質、例えばタンパク質バリアントをコードするＤＮＡは、例えば、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的変異法を用いて、（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）、または（Ｉ）で定義されたタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を改変することにより得ることができる。このような改変されたＤＮＡは、変異を発生させる試薬および条件での処理を用いる従来法により得られ得る。このような処理は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミンで処理すること、またはＤＮＡを保持する細菌をＵＶ照射により、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸のような試薬で処理することが含まれる。
【００３１】
ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスターのＤＮＡは、エシェリヒア属細菌の他の菌株又は変異株に由来する、自然の多様性によるバリアントを含む。
【００３２】
そのような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｃｙｓＰ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ又はｃｙｓＭ遺伝子またはそれらの遺伝子の一部分とハイブリダイズし、かつそれぞれのタンパク質固有の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られ得る。用語「ストリンジェントな条件」には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ、非特異的ハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件には、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が含まれる。あるいは、ストリンジェントな条件には、サザンンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、が含まれる。洗浄の時間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般に製造元により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件におけるＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）の洗浄に推奨される時間は１５分である。変異体をコードするＤＮＡのための、かつｃｙｓＰ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ又はｃｙｓＭ遺伝子とハイブリダイズするプローブとして、配列番号１、３、５、７又は９のヌクレオチド配列の部分配列もまた使用され得る。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１、３、５、７又は９のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１、３、５、７又は９のヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製されてもよい。長さが約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションにおける洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳであり得る。
【００３３】
遺伝子発現を向上させる方法には、遺伝子コピー数の増加が含まれる。エシェリヒア属細菌中で機能し得るベクター中に遺伝子を導入すると、遺伝子のコピー数が増加する。好ましくはマルチコピーベクターが使用され、マルチコピーベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂなどが含まれる。また、遺伝子発現の向上は、例えば、相同組換えなどの方法により、遺伝子の複数コピーを細菌染色体中に導入することにより達成され得る。
【００３４】
タンパク質をコードする遺伝子を保持するＤＮＡによる細菌の形質転換とは、例えば常法によって、細菌にＤＮＡを導入し、同細菌中で遺伝子発現を増加させることを意味する。
【００３５】
さらに、遺伝子発現の増強は、本来の天然プロモーターの代わりに、より強力なプロモーターの制御下に、本発明のＤＮＡを配置することにより達成され得る。用語「本来のプロモーター」は、野生型生物に存在するＤＮＡ領域であって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置し、同遺伝子の発現を促進する領域を意味する。ｃｙｓＰＴＷＡクラスターにおける遺伝子の翻訳カップリングは、これらの遺伝子がｃｙｓＰ遺伝子のプロモーターの直上流から単一転写単位として発現されるということを示している（Hryniewicz MM, et al., J. Bacteriol. 1991 Sep;173(18):5876-86）。エシェリ
ヒア・コリの染色体において、ｃｙｓＭ遺伝子はｃｙｓＡ遺伝子からわずか１７４ｂｐだけ離れており、このオペロンの一部である可能性もあり、染色体上で反時計回りに転写する（エシェリヒア・コリおよびサルモネラ、第二版、編集長：F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）。プロモーターの強度は。ＲＮＡ合成開始の頻度により決定される。プロモーターの強度の評価法は、例えば、Deuschle U., Kammerer W., Gents R., Bujard H. により記載されている（エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ  ｖｉｖｏ強度の階層は代替的構造を示す。  EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）。
【００３６】
翻訳の向上は、本来のシャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列（ＳＤ配列）の代わりに、より効果的なＳＤ配列を本発明のＤＮＡ中に導入することにより達成され得る。ＳＤ配列は、リボソームの１６Ｓ  ＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流領域である（Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1974, 71, 4, 1342-6)。用語「本来のＳＤ配列」とは、野生型生物に存在するＳＤ配列を意味する。効果的なＳＤ配列としては、Ｔ７ファージ由来ψ１０遺伝子のＳＤ配列が挙げられる（Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。
【００３７】
強力なプロモーターを使用することは、遺伝子コピーの増加と組合せてもよい。１個または数個のクラスターの遺伝子組み込みとマルチコピーベクターへの数個の遺伝子のうち１つの導入の組み合わせにより、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター遺伝子のコピー数を増加させることも可能である。
【００３８】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者に既知の通常の方法であってもよい。それらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., 「分子クローニングの実験室の手引き（Molecular Cloning A Laboratory Manual）第三版」、 Cold Spring Habor Laboratory Press（2001）等に記載される。
【００３９】
本発明の細菌は、上記のＤＮＡを本来的にＬ−システイン生産能を有する細菌に導入することにより得られ得る。あるいは、本発明の細菌は、既にＤＮＡを保持する細菌にＬ−システイン生産能を付与することにより得られ得る。
【００４０】
本発明のタンパク質の活性を増強させる親株としては、エシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌、例えば、フィードバック耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるｃｙｓＥ対立遺伝子で形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号、ロシア特許出願第２００３１２１６０１号）、細胞にとって毒性の物質を分泌するのに好適なタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリＷ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ菌株（特開平１１−１５５７１Ａ２）、およびｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンに対するポジティブな転写調節因子の活性が増加したエシェリヒア・コリＷ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７Ａ１）等が用いられ得る。
【００４１】
Ｌ−アミノ酸の生合成経路に関与しない膜タンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子は、Ｌ−システイン生産株の細胞に付加的コピーとして導入された場合に、Ｌ−システインの生産を増加させ得ることが報告されている（米国特許第５,９７２,６６３号）。したがって、本発明の一態様には、ｙｄｅＤオープンリーディングフレーム発現を増強するようにさらに改変されたＬ−システイン生産菌が含まれる。
【００４２】
本発明の細菌は、Ｌ−システイン生合成のための遺伝子発現が増強されていてもよい。
そのような遺伝子には、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするｃｙｓＥ遺伝子（米国特許第6,218,168号）、及びフィードバック耐性ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードするｓｅｒＡ遺伝子（米国特許第6,180,373号）等が含まれる。
【００４３】
ｙｄｅＤ、ｃｙｓＥ又はｓｅｒＡ遺伝子によりコードされるタンパク質は、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ又はｃｙｓＭ遺伝子産物について記載したのと同様のバリアントであってもよい。
【００４４】
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、同細菌にＬ−システインを生成及び排出させ、Ｌ−システインを培地から回収する、Ｌ−システインの製造法を含む。
本発明において、培養、培地等からのＬ−システインの回収および精製は、微生物を使用してアミノ酸を製造及び単離するのに通常用いられる従来の発酵法及び精製法により行うことができる。
【００４５】
培養に使用される培地は、培地が、炭酸源、窒素源、硫黄源およびミネラル類、および必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。
【００４６】
炭酸源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。
【００４７】
窒素源としては、アンモニアおよびアンモニウム塩のような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。
【００４８】
本発明に用いる硫黄源としては、チオ硫酸塩が使用され得る。
【００４９】
ミネラル類としては、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、マグネシウム塩、第一鉄塩、マンガン塩等が使用され得る。
【００５０】
必要に応じて、さらなる栄養が培地に添加され得る。例えば、微生物が生育にメチオニンを必要とする場合（メチオニン栄養要求性）、培養のため十分量のメチオニンが培地に添加され得る。
【００５１】
培養は、好ましくは、振盪培養、通気を伴う攪拌培養のような好気的条件下、２０℃〜４２℃、好ましくは３４℃〜４０℃の温度で行われる。培養のｐＨは、通常５〜９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１日〜５日間の培養で、Ｌ−システインの液体培地への生産、排出及び蓄積が起こる。
【００５２】
培養後、細胞のような固体は、遠心分離または膜濾過により液体培地から除去することができ、次いでＬ−システインがイオン交換、濃縮、および結晶法のような方法により回収および精製され得る。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を、実施例を参照してより具体的に以下に説明する。本実施例においては、特記しない限り、アミノ酸はＬ−体である。全てのＰＣＲにおいて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用した。
【００５４】
〔実施例１〕ｙｄｅＤ遺伝子、変異型ｃｙｓＥ遺伝子および変異型ｓｅｒＡ５遺伝子を保持するプラスミドの構築
【００５５】
トランスメンブレンタンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子が、システイン産生に有用であることが報告されている（米国特許第５、９７２、６６３号）。したがって、ｙｄｅＤ遺伝子を、プライマーydeD299F及びydeD299R （それぞれ配列番号１９及び２０）及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲによりクローニングした。次いで、システインによるフィードバック阻害を受けないセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｃｙｓＥＸ遺伝子（米国特許第６,２１８,１６８号に記載）を、図１に示すようにして、プライマーcysEF及びcysEX-1、cysEX-2及びcysER（それぞれ配列番号２１、２２、２３及び２４）及びエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを用いて２つの連続したＰＣＲによりクローニングした。得られた２回のＰＣＲ産物は、電気泳動により分離し、ゲルから溶出させた。２回目のＰＣＲで、これらの２つのＤＮＡ断片はアニールし、変異型ｃｙｓＥＸ遺伝子が完成された。
【００５６】
セリンによるフィードバック阻害を受けないホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｓｅｒＡ５遺伝子（米国特許第６,１８０,３７３号に記載）も、プライマー serA5F及びserA5R （それぞれ配列番号２５及び２６）及びエシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲによりクローニングした。Ｌ−セリンはＬ−システインの前駆体であるため、Ｌ−セリン量を増加させるため変異型ｓｅｒＡ５遺伝子の増幅が必要である。
【００５７】
最終的に、プロモーターＰompAを、配列番号１１（プライマーＰｒＯＭＰＡＦ）および配列番号１２（プライマーＰｒＯＭＰＡＲ）に示されるプライマーを使用するＰＣＲによりクローニングした。プライマーＰｒＯＭＰＡＦは、その５’末端に導入された制限酵素ＳａｌＩ認識部位を含む。ＳａｌＩ部位は、ｙｄｅＤ（配列番号１９）、ｃｙｓＥＸ（配列番号２１）、およびｓｅｒＡ５遺伝子（配列番号２５）の増幅のためのフォワードプライマーにも導入した。そのため、ＳａｌＩ部位は、プロモーターＰompAおよび各々の遺伝子を組み立てるために用いられた。プライマーＰｒＯＭＰＡＲは、その５’末端に導入された制限酵素ＰａｅＩ認識部位を含む。これらの制限部位は、遺伝子のさらなる組み立て及び形質転換のために使用されるプラスミドの構築のために導入した。
次いで、それぞれプロモーターＰompA下にある全３遺伝子を、ベクターｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。こうして、プラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳを得た（図２）。
【００５８】
〔実施例２〕エシェリヒア・コリ由来ｃｙｓＰＴＷＡ遺伝子のクローニング
硫酸塩／チオ硫酸塩輸送系タンパク質群をコードするｃｙｓＰＴＷＡ遺伝子を、配列番号１３（プライマーＭｚ０２５）および配列番号１４（プライマーＭｚ０２６）に示されたプライマーを使用してクローニングした。プライマーＭｚ０２５は、ｃｙｓＰ遺伝子の開始コドンの３１５ｂｐ上流から始まる配列と同一な配列であり、その５’末端に導入された制限酵素ＰａｅＩ認識部位を有する。プライマーＭｚ０２６は、ｃｙｓＡ遺伝子の終止コドンの１３ｂｐ下流から始まる配列と相補的な配列であり、その５’末端に導入された制限酵素ＳａｌＩ認識部位を有する。自身のプロモーター下にあるｃｙｓＰＴＷＡクラスターを含むＰＣＲフラグメントを、ＰａｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素により処理し、同じ酵素で予め処理したベクターｐＭＷ１１９に挿入した。こうして、プラスミドｐＭＷ−ＰＴＷＡを得た。
【００５９】
〔実施例３〕エシェリヒア・コリ由来ｃｙｓＭ遺伝子のクローニング
Ｏ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼ−ＢをコードするｃｙｓＭ遺伝子を、配列番号１５（プライマーｃｙｓＭＦ）および配列番号１６（プライマーｃｙｓＭＲ）に示されたプライマーを用いたＰＣＲによりクローニングした。プライマーｃｙｓＭＦは、その
５’末端に導入された制限酵素ＳａｌＩ認識部位を含む。プライマーｃｙｓＭＲは、その５’末端に導入された制限酵素ＸｂａＩ認識部位を含む。
【００６０】
プロモーターＰcysKを、配列番号１７（プライマーＰｃｙｓＫＦ）および配列番号１８（プライマーＰｃｙｓＫＲ）に示されたプライマーを用いたＰＣＲにより得た。プライマーＰｃｙｓＫＦは、ｃｙｓＫ遺伝子の開始コドンの６ｂｐ上流から始まる配列と同一な配列であり、その５’末端に導入された制限酵素ＳａｌＩ認識部位を有する。プライマーＰｃｙｓＫＲは、ｃｙｓＫ遺伝子の開始コドンの３０１ｂｐ上流から始まる配列と相補的な配列であり、その５’末端に導入された制限酵素ＰａｅＩ認識部位を有する。次いで、２つの得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩで処理した後ライゲーションすることによって組み立て、組み込みベクターｐＭＷ１１９ｉｎｔ（図３）に導入した。ベクターｐＭＷ１１９ｉｎｔは、後のＭｕ組み込みに必要なａｔｔＲおよびａｔｔＬ部位をベクターｐＭＷ１１９のＳａｌＩ部位に挿入することにより、市販のベクターｐＭＷ１１９から構築した。こうして、プラスミドｐＭＷ−ＰcysK−ｃｙｓＭを得た。
【００６１】
〔実施例４〕改変されたＬ−システイン分解系を持つエシェリヒア・コリ菌株の構築
ｔｎａＡおよびｍｅｔＣ遺伝子は、システイン分解のための主要経路のタンパク質をコードする（特願２００２−２７１４６３号）。したがって、改変されたＬ−システイン分解系を持つエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ｔｎａＡ-、ｍｅｔＣ-）を構築した。
【００６２】
初めに、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、次いで複数回のアンピシリン富化により、ｍｅｔＣ遺伝子中の変異を誘導した。シスタチオニン上で生育可能であり、ホモシステイン上で生育できない変異体を選択した。次いで、得られたｍｅｔＣ-株に、ＣＧＳＣ７１５２（ｔｎａＡ３００：：Ｔｎ１０（ＴｃR）、E. coli Genetic Stock Center, USA）株由来の破壊されたｔｎａＡ遺伝子を、標準的なＰ１形質導入法（Sambrook et al., 「分子クローニングの実験室の手引き  第二版（Molecular
Cloning A Laboratory Manual, Second Eddition）」、 Cold Spring Habor Laboratory
Press(1989)）により転移させた。こうして、エシェリヒア・コリＭＴ株を得た。
【００６３】
〔実施例５〕Ｌ−システイン産生におけるｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター発現増強の効果
Ｌ−システイン産生におけるｃｙｓＰＴＷＡＭクラスター発現増強の効果の評価のためにエシェリヒア・コリＭＴ株を親株として使用した。
【００６４】
初めに、Ｍｕ−組み込みの標準法により、プラスミドｐＭＷ−ＰcysK−ｃｙｓＭを用いてｃｙｓＭ遺伝子をＭＴ株の染色体へ組み込んだ。
次いで、得られた形質導入株ＭＴｉｎｔＣＹＳＭに、プラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳおよびｐＭＷ−ＰＴＷＡを続けて導入して、ＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳおよびＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ／ｐＭＷ−ＰＴＷＡ株を得た。
【００６５】
ＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳおよびＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ／ｐＭＷ−ＰＴＷＡの両株を、アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）およびテトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を添加しておいた２ｍｌのニュートリエントブロス中で、振盪しながら３４℃で一晩培養した。次いで、得られた０．２ｍｌの培養物を、２０×２００ｍｍ試験管中の、テトラサイクリン（２０ｍｇ／Ｌ）およびアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を含む２ｍｌの発酵培地に接種し、３４℃で４２時間、ロータリーシェーカーを用いて２５０ｒｐｍで培養した。発酵培地の組成は以下のとおりであった。１５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１．５ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ4、２０．０ｇ／ＬのＣａＣＯ3、０．１ｍｇ／Ｌのチアミン、１％のルリアブロス（ＬＢ培地）、４％のグルコース、３００ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、および種々の濃度のＮａ2Ｓ2Ｏ3。
【００６６】
培養後、培地に蓄積したＬ−システインの量を、Gaitonde, M. K.（Biochem.J., 104:2, 627-33(1967)）に記載の方法で決定した。得られたデータを表１に示す。
【００６７】
【表１】
2005137369.tif 000003
【００６８】
ミニジャー発酵のために、Ｌ−寒天上で生育させたＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳおよびＭＴｉｎｔＣＹＳＭ／ｐＡＣＹＣ−ＤＥＳ／ｐＭＷ−ＰＴＷＡのそれぞれの菌株の１白金耳をＬ−ブロスに移し、５４０ｎｍでの光学密度が約２．０に達するまで、回転（１４０ｒｐｍ）させながら３４℃で培養した。次いで、２５ｍｌの種培養を発酵培地２５０ｍｌに添加し、回転（１５００ｒｐｍ）させながら３４℃で４８時間培養した。
【００６９】
ミニジャー発酵用の発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）：
トリプトン                        ２．０
イーストエキストラクト            １．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4                   ５．０
ＫＨ2ＰＯ4                        １．５
ＮａＣｌ                          ０．５
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                 ０．３
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ                 ０．０１５
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                 ０．０７５
クエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ        １．０
グルコース                    １００．０
メチオニン                        ０．４５
【００７０】
６時間の発酵の後、０．４ｇ／Ｌ・ｈの速度で、発酵培地にチオ硫酸塩を供給した。
培養後、培地に蓄積したＬ−システインの量を上記の方法で決定した。得られたデータを表２に示す。
【００７１】
【表２】
2005137369.tif 000004
【００７２】
表１および表２からわかるように、ｃｙｓＰＴＷＡＭクラスターの遺伝子発現の増強は、ＭＴ株のシステイン生産能を改善した。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】プライマーcysEF、cysEX-1、cysEX-2およびcysERの相対位置を示す図。
【図２】プラスミドｐＡＣＹＣ−ＤＥＳの構造を示す図。
【図３】プラスミドｐＭＷ１１９ｉｎｔの構造を示す図。
【図１】
2005137369.tif 000005
【図２】
2005137369.tif 000006
【図３】
2005137369.tif 000007
【配列表】
2005137369000001.app