(57)【要約】  【課題】冷却後、特に凍結・融解後の動物細胞等の生存率の高い、動物細胞及び臓器の新規な保存液及び新規な保存方法の提供。  【解決手段】高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤、特に１−デオキシマンノジリマイシンを含有する、動物細胞または臓器の保存液。動物細胞または臓器に、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤、特に１−デオキシマンノジリマイシンを接触させ、その後凍結または冷却する、動物細胞または臓器の保存方法。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を含有する、動物細胞または臓器の保存液。
【請求項２】
高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、１−デオキシマンノジリマイシンである、請求項１記載の保存液。
【請求項３】
動物細胞または臓器に、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させ、その後凍結または冷却する、動物細胞または臓器の保存方法。
【請求項４】
高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、１−デオキシマンノジリマイシンである、請求項３記載の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞及び臓器の新規な保存液及び新規な保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臓器移植に対する認識と要望の高まり、及び移植技術の向上に伴い、実施件数が着実に増加傾向にある。しかし、移植臓器が、死後あるいは脳死者によって提供されるものである場合、提供者の所在地と提供臓器に適合する患者の所在地が、必ずしも近隣であるとは限らないため、臓器摘出と移植実施の間に輸送のための相当の時間を要する場合がある。また、その間移植臓器を傷めずに安全に保存することにも大きな課題があった。
生物材料の保存には、冷却保存あるいは凍結保存が最も一般的であるが、動物細胞の場合、冷却後、特に凍結・融解後の生存率が低く、これまで臓器移植のための臓器の冷却あるいは凍結による保存には限界があった。
冷却・凍結法の改良のため、生細胞をジメチルスルホキシドを用いて約−８０℃で保存する方法（非特許文献１参照）が提案されたが、この方法によっても、融解後の生存率は満足のいくものではない。
そこで、動物細胞や臓器を傷めずに長時間保存する技術、すなわち動物細胞や臓器を構成する細胞の生存率を長時間高く維持する技術の開発が求められている。
【非特許文献１】Ｂｏｕｒｏｎｃｌｅ  ＢＡ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１９（４），９５８−９６１，１９６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、冷却後、特に凍結・融解後の動物細胞あるいは臓器を構成する細胞の生存率の高い、動物細胞及び臓器の新規な保存方法並びに当該方法に使用しうる動物細胞及び臓器の新規な保存液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究したところ、動物細胞あるいは臓器を構成する細胞内の高マンノースオリゴサッカライド濃度を高くすることで、冷却後、特に凍結・融解後の動物細胞あるいは臓器を構成する細胞の生存率を高めることができることを見出した。本発明者は、さらに研究を進め、動物細胞、臓器に１−デオキシマンノジリマイシン（１−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）等の高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させることで、冷却後、特に凍結・融解後の動物細胞あるいは臓器を構成する細胞の生存率を高めることができることを見出して、本発明を完成させた。
【０００５】
即ち、本発明は以下の（１）〜（４）に関する。
（１）高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を含有する、動物細胞または臓器の保存液。
（２）高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、１−デオキシマンノジリマイシンである、上記（１）記載の保存液。
（３）動物細胞または臓器に、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させ、その後凍結または冷却する、動物細胞または臓器の保存方法。
（４）高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤が、１−デオキシマンノジリマイシンである、上記（３）記載の保存方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の保存液及び保存方法によれば、動物細胞、臓器の冷却後、特に凍結・融解後の生存率を高めることができるので、動物細胞や臓器を傷めずに長時間保存することが可能となる。従って、本発明の保存液及び保存方法は、特に、動物細胞や臓器を構成する細胞を生存あるいは休存させた状態で長時間保存することが望まれる分野、例えば、臓器移植における臓器の保存、再生医療におけるＥＳ細胞の保存、妊娠医療における卵子、精子の保存等に利用できる。本発明の保存液を移植臓器の保存に利用すれば、臓器を傷めずに長時間保存することが可能となるため、被移植者の決定における輸送時間の制約が緩和され、また、施術態勢の準備に要する時間の制約が緩和されるなど、移植医療の向上に大いに寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の保存液は、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を含有することを特徴とする。高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤は、動物細胞あるいは臓器を構成する細胞内の高マンノースオリゴサッカライドの代謝を阻害するものであれば特に限定されないが、例えば、１−デオキシマンノジリマイシン等が挙げられる。
ここで、本明細書における高マンノースオリゴサッカライドの語は動物細胞内に存在する高マンノースオリゴサッカライドを示す一般的な意味に用いる。高マンノースオリゴサッカライドは、一般に、マンノースが主に重合した糖鎖であって末端部分に２分子のＮ−アセチルグルコサミンを有する。高マンノースオリゴサッカライドを構成するマンノースは通常３〜９個程度である。高マンノースオリゴサッカライドは、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン以外の単糖（例えばグルコース等）をさらに重合していてもよく、高マンノースオリゴサッカライドを構成する単糖の総数としては、例えば５〜１２個程度が挙げられる。動物細胞内の高マンノースオリゴサッカライドは、一般に末端のＮ−アセチルグルコサミンを介して、ドリコールリン酸等の糖担体脂質、または蛋白質と結合している。
【０００８】
本発明の保存液中の、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤の含有量は、通常１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭである。
【０００９】
本発明の保存液は、本発明の効果を阻害しない限り添加剤を含んでいてもよい。本発明の保存液の添加剤としては、例えば、溶剤（例えば、生理食塩水、バッファー、クレブス液等）等が挙げられる。
【００１０】
本発明の保存液は、例えば、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を溶剤に溶解し、所望により他の添加剤を添加して調製することができる。本発明の保存液は、予め調製されてもよく、用時調製するものであってもよい。本発明の保存液は、以下に説明する本発明の保存方法に好適に用いることができる。
【００１１】
次に、本発明の保存方法について詳述する。本発明の保存方法及び前記本発明の保存液は、動物細胞及び臓器（以下「動物細胞等」という。）を対象とする。本発明の動物細胞等の動物としては、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の家畜、ウサギ、マウス、ラット等の実験動物等））、鳥類（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ等の家禽等）等が挙げられ、哺乳類が好ましい。本発明の動物細胞等には、例えば、ＳＥ細胞、神経幹細胞、精子、卵等の細胞、心臓、肝臓、腎臓等の臓器が含まれる。
【００１２】
本発明の保存方法は、動物細胞等に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させ、その後凍結または冷却することを特徴とする。本発明の保存方法に用いる高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤は、動物細胞あるいは臓器を構成する細胞内の高マンノースオリゴサッカライドの代謝を阻害するものであれば特に限定されないが、例えば、１−デオキシマンノジリマイシン等が挙げられる。
【００１３】
本発明の保存方法において、動物細胞等に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させる方法は、特に限定されないが、例えば、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を溶剤に溶解して保存液を得て、得られた保存液に動物細胞等を浸漬する方法、あるいは、臓器用の灌流液として使用する方法等が挙げられる。この場合、保存液中の高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤の濃度は、通常１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭである。上記溶剤としては、例えば、生理食塩水、バッファー、クレブス液等が挙げられる。
【００１４】
本発明の保存方法において、動物細胞等に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させる時間は、高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤の濃度、動物細胞等の種類、保存方法等によっても異なるが、通常１分〜９６時間程度である。例えば、動物細胞の凍結保存方法の場合、動物細胞に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させる時間は、好ましくは１時間〜９６時間、特に好ましくは２４時間〜９６時間、さらに好ましくは７２時間〜９６時間である。臓器の冷却保存方法の場合、臓器に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させる時間は、好ましくは１分〜１時間、特に好ましくは３分〜３０分である。
【００１５】
本発明の保存方法において、動物細胞等に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させた後凍結する場合の凍結温度は、通常−１００〜０℃、好ましくは−８０〜−１５℃である。凍結は、例えば超低温冷凍庫等を用いて行えばよい。このようにして凍結した動物細胞等は、長時間保存することができる。動物細胞等の使用時に、融解するには、１０〜２０℃程度の温度で自然融解するのが好ましいが、２０〜３７℃程度の低温で加温してもよい。
【００１６】
本発明の保存方法において、動物細胞等に高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害剤を接触させた後冷却する場合の冷却温度は、通常０〜１０℃、好ましくは１〜５℃である。冷却は、例えば氷、冷蔵庫等を用いて行えばよい。このようにして冷却した動物細胞等は、長時間保存することができる。動物細胞等の使用時に、動物細胞等を上記冷却装置等より取り出して室温（１０〜２０℃程度）まで戻せばよいが、２０〜３７℃程度の低温で加温してもよい。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって限定されるものではない。
実施例１
ＰＣ１２細胞凍結融解後の細胞生存率に対する１−デオキシマンノジリマイシンの効果を次の手順で調べた。
ＰＣ１２細胞を各種濃度の１−デオキシマンノジリマイシンを含むクレブス液（本発明の保存液）で４８時間処理、７２時間処理、９６時間処理後、−１５℃で２時間凍結した。その後、３７℃で細胞を融解し、細胞生存率を３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミド（ＭＴＴ）アッセイ法にて定量化した。コントロール（非凍結融解・非１−デオキシマンノジリマイシン処理の細胞生存率）に対するパーセント細胞生存率と１−デオキシマンノジリマイシンの濃度との関係をプロットしたグラフを図１に示す。
【００１８】
図１から明らかなように、１−デオキシマンノジリマイシンはＰＣ１２細胞において凍結融解後の細胞生存率を有意に上げていた。この結果は、１−デオキシマンノジリマイシンによる細胞内高マンノースオリゴサッカライド代謝阻害、即ち細胞内高マンノースオリゴサッカライド濃度を上昇させることにより動物細胞の凍結保存が可能であることを示している。
【００１９】
実施例２
臓器冷却保存に対する１−デオキシマンノジリマイシンの効果を次の手順により調べた。
（Ａ）コントロール群
氷上で９週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（オス）をペントバルビタール麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）下で開胸し、左心室にカニューレ挿入・右心耳を切開し、左心室よりクレブス液で５分間灌流（６ｍｌ／ｍｉｎ）した。マウスを４℃で２０時間保存後、４％パラホルムアルデヒド／リン酸バッファー（ＰＨＡ／ＰＢ）液で１０分間灌流した。マウス全体をＰＨＡ／ＰＢ液に１晩浸した後、各臓器（心臓、肝臓、腎臓）を摘出しＰＨＡ／ＰＢ液中でさらに３２時間処理した。続いて３０％スクロース／リン酸バッファー液で４８時間処理後、ドライアイスにて急速冷凍し、クリオスタットで１０−２０μｍの薄切切片を作成した。心臓、肝臓、腎臓の組織切片はヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色法にて染色された。
（Ｂ）１−デオキシマンノジリマイシン処理群
氷上で９週齢のＣ５７／ＢＬ６マウス（オス）をペントバルビタール麻酔（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）下で開胸し、左心室にカニューレ挿入・左心耳を切開し、左心室よりクレブス液で２分間、１ｍＭ  １−デオキシマンノジリマイシンを含むクレブス液（本発明の保存液）で３分間灌流（６ｍｌ／ｍｉｎ）した。以下同様の手順で、心臓、肝臓、腎臓の組織切片が作成され、ヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色法にて染色された。
【００２０】
上記のようにして得られたコントロール群及び１−デオキシマンノジリマイシン処理群の各臓器組織切片の顕微鏡写真を図２（図２Ａ−１（コントロール群・心臓）、図２Ａ−２（コントロール群・肝臓）、図２Ａ−３（コントロール群・腎臓）、図２Ｂ−１（１−デオキシマンノジリマイシン処理群・心臓）、図２Ｂ−２（１−デオキシマンノジリマイシン処理群・肝臓）、図２Ｂ−３（１−デオキシマンノジリマイシン処理群・腎臓））に示す。コントロール群において４℃で２０時間保存後の心臓、肝臓、腎臓の各組織は著明な破壊が認められた。特に、肝臓、腎臓においては細胞の空胞化が目立っていた。これに対して１−デオキシマンノジリマイシン処理群では４℃で２０時間保存後の心臓、肝臓、腎臓の各組織が正常に近い形で保たれていた。この結果は、１−デオキシマンノジリマイシンが臓器保存に有効であることを示している。換言すれば、移植に用いられる臓器保存への応用（臓器保存時間を画期的に延長させる）が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、実施例１における、ＰＣ１２細胞凍結融解後の細胞生存率に対する１−デオキシマンノジリマイシンの効果を示すグラフである。図１中、●、○、■の各点は、それぞれ各種濃度の１−デオキシマンノジリマイシンで４８時間処理、７２時間処理、９６時間処理したＰＣ１２細胞の凍結融解後の、コントロールに対するパーセント細胞生存率（±標準偏差）を表している（Ｎ＝４）。図１中、＊＊，§§，＃＃は、有意（Ｐ＜０．００１、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を示す。
【図２Ａ−１】図２Ａ−１は、実施例２のコントロール群・心臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図２Ａ−２】図２Ａ−２は、実施例２のコントロール群・肝臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図２Ａ−３】図２Ａ−３は、実施例２のコントロール群・腎臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図２Ｂ−１】図２Ｂ−１は、実施例２の１−デオキシマンノジリマイシン処理群・心臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図２Ｂ−２】図２Ｂ−２は、実施例２の１−デオキシマンノジリマイシン処理群・肝臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図２Ｂ−３】図２Ｂ−３は、実施例２の１−デオキシマンノジリマイシン処理群・腎臓組織切片の顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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