(57)【要約】【課題】急性皮膚炎および粘膜炎を改善し、線維症の発症を防止し、後期腫瘍形成を減少させることができるものは存在しない。【解決手段】本発明は、治療上有効量のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与することにより、治療の後遺症が低頻度であり、腫瘍制御を高い可能性で生じる増殖中の悪性または非悪性疾患についての放射線療法および化学療法における治療効果を増大させる組成物および方法を提供する。化合物は、同時に、上皮再生を刺激し、線維芽細胞増殖を阻害し、コラーゲン沈着を減少させ、線維形成性成長因子を抑制し、炎症誘発性サイトカインを鎮静し、ならびに細胞周期遺伝子、腫瘍抑制因子および癌遺伝子の発現を調節する能力があり、そしてこれは放射線療法および化学療法での治療効果を増大させるのに有用であり、皮膚腫張および炎症の減少、粘膜および真皮における上皮治癒の促進、口内乾燥の減少、足底-手掌症候群の重篤度の防止/減少、組織線維症、潰瘍形成、壊死および腫瘍形成の防止、ならびに腫瘍成長阻害および腫瘍治療効率の増大を生じる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療の後遺症が低頻度であり、腫瘍制御を高い可能性で生じる、増殖性悪性または非悪性疾患についての化学療法および/または放射線療法における治療効果を増大させた薬学的組成物であって、ヒストン過剰アセチル化剤および薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組成物。
【請求項２】
増大した治療効果が、同時に、腫瘍放射線感作を増強するか、または化学療法に対して腫瘍を感作し、腫瘍成長阻害を増大させ、粘膜炎および皮膚炎における創傷治癒を促進し、足底-手掌症候群の重篤度を防止/減少させ、組織線維症を減少させ、細胞死から正常な組織を保護し、口内乾燥を防止し、および腫瘍形成を抑制する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
過剰アセチル化剤が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
放射線療法が、遠隔放射線療法、近接照射療法、または電離放射線である請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項５】
増殖性悪性疾患が、黒色腫、カポジ肉腫、骨肉種、神経芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、皮膚癌、リンパ腫、白血病、乳癌、生殖細胞腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、脳神経膠腫、脳髄膜腫、頭部および頸部癌、甲状腺癌、胸腺癌、頸部癌、肛門癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、肝細胞癌、胆管癌、胃癌、膵癌、食道癌、ウイルス関連腫瘍、および骨髄移植を受けたことに由来する疾患からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
非悪性疾患が、翼状片、グレーブス眼症、眼窩偽腫瘍、黄斑変性、ケロイド、疣贅、角化棘細胞腫、血管腫、動静脈の奇形、滑液包炎、腱炎、類腱腫、ペーロニー病、脈管の狭窄、エナメル上皮腫、動脈瘤性骨嚢胞、異所骨形成、女性化乳房、卵巣去勢、耳下腺炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、上腕肩甲の関節周囲炎、外上顆炎、膝関節症、汗腺炎、ひょう疽、自己免疫炎症性関節炎、原因不明性組織球増殖、および臓器移植を受けたことに由来する疾患からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ヒストン過剰アセチル化剤が、トリコスタチンAまたはトリコスタチンCである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ヒストン過剰アセチル化剤が、オクサムフラチン、トラポキシンA、FR901228、アピシジン、HC-トキシン、WF27082、およびクラミドシンからなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ヒストン過剰アセチル化剤が、サリチリヒドロキサム酸、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびアゼライン酸ビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
ヒストン過剰アセチル化剤が、アゼライン酸-1-ヒドロキサメート-9-アニリド、M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド、6-（3-クロロフェニルウレイド）カルポイック（carpoic）ヒドロキサム酸、MW2796、およびMW2996からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ヒストン過剰アセチル化剤が、酪酸ナトリウム、イソバレレート、バレレート、4-フェニルブチレート、フェニル酪酸ナトリウム、プロピオネート、ブトリミド、イソブチルアミド、フェニルアセテート、3-ブロモプロピオネート、バルプロ酸、およびトリブチリンからなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
ヒストン過剰アセチル化剤が、MS-27-275またはその3'-アミノ誘導体である請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ヒストン過剰アセチル化剤が、デプデシンまたはスクリプタイドである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
非経口で投与される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、粉剤、ローション、パッチ、坐剤、リポソーム組成物、懸濁液、口腔洗浄剤、浣腸、注射溶液、または点滴である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的組成物が、組成物の0.001重量％から100重量％までの過剰アセチル化剤の量で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
サイトカイン、インターロイキン、抗癌剤、または抗新生物剤からなる群より選択される第二の物質、抗血管新生剤、化学療法剤、抗体、接合抗体、免疫刺激剤、抗生物質、レチノール酸、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモンアンタゴニスト、および成長刺激薬をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
接合抗体が、トラスツズマブ、c225、リツキシマブ、およびセツキシマブからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
化学療法剤が、アルキル化剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、ビンカアルカロイド、ビンカ様アルカロイド、エトポシド、エトポシド様薬剤、コルチコステロイド、ニトロソウレア、抗代謝産物、プラチナベースの細胞毒性剤、抗アンドロゲン、および抗エストロゲンからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
抗血管新生剤が、サリドマイド、SU5416、SU6668、トロンボスポンジン-1、エンドスタチン、およびアンギオスタチンからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
抗生物質が、ガンシクロビル、アシクロビル、およびファムシクロビルからなる群より選択される、請求項17記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線および/または化学療法で誘導される損傷の治療に関する。さらに詳細には、本発明は、放射線および化学療法における治療効果を増大するための方法および薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
併用または連続化学療法を伴う放射線療法、またはこれらを伴わない放射線療法は、頭部および頸部癌、乳癌、皮膚癌、肛門性器の癌、ならびにケロイド、類皮腫、血管腫、動静脈奇形、および原因不明性組織球増殖などのある種の非悪性疾患にとって有効な方法である。しかし、治療上の恩典は、組織腫張、粘膜炎、皮膚炎、剥離、および潰瘍形成の急性反応を含めて、放射線および化学療法で誘導される粘膜上皮損傷および皮膚照射症候群（CRS）、ならびに組織/皮膚線維症、壊死、および肉腫、扁平上皮および基底細胞癌（非特許文献1）の生命を脅かす後遺症の発生の長期効果により制限される。実際に、皮膚は、内部臓器の外部放射線療法のあらゆる形態において影響され、粘膜炎は、化学療法および放射線療法の副作用として、経口空洞、食道、胃腸管、膀胱、膣、直腸、肺、鼻腔、耳、および眼で起こりうる。ステロイドまたは非ステロイド性抗炎症剤の使用は、放射線および化学療法で誘導された組織損傷についての最も共通の治療法であるが、その結果は依然として満足できるものではない。放射線療法と化学療法の腫瘍死滅効果を犠牲にすることなく、皮膚病的状態を選択的に減少させる方法は、放射線および医療腫瘍学において長年求められている目標である。
【０００３】
【非特許文献１】Peter, R. U.、「The cutaneous、radiation syndrome.」、Advances in the treatment of radiation injuries、237-240頁、Oxford：Elsevier、1996年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
放射線および化学療法で誘導される損傷の管理について以前に試験された薬剤には、抗酸化剤（ビタミンEおよびスーパーオキシドジスムターゼ）、抗炎症剤（コルチコステロイド、コルチシン、D-ペニシラミン、およびTNF-αアンタゴニスト抗体）、および抗線維形成剤（インターフェロン、TGF-βアンタゴニスト、およびアンギオテンシン変換酵素阻害剤）が挙げられる。これらのうちで、同時に、急性皮膚炎および粘膜炎を改善し、線維症の発症を防止し、かつ後期腫瘍形成を減少させることができるものはない。さらに、毒性、副作用、腫瘍保護可能性、および抗腫瘍効果の欠如は面倒である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、必要とする対象において、療法の合併症または後遺症が低頻度であり、腫瘍制御を高い可能性で生じることにより、放射線療法および/または化学療法における治療効果を増大するための方法および薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、治療有効量のヒストン過剰アセチル化剤および薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるその塩を含む。本方法は、必要とする対象に薬学的組成物を投与する工程を含む。
【０００６】
本発明の方法および薬学的組成物の目的は、同時に、（1）放射線療法および/または化学療法の必要な宿主における腫瘍または増殖中の細胞成長の抑制を増大し、および（2）放射線および/または化学療法で誘導される粘膜炎、皮膚炎、潰瘍形成、線維症、口内乾燥、足底-手掌症候群（plantar-palmar syndrome）、および腫瘍形成の合併症または後遺症の発生を防止することを含む。
【０００７】
本発明によって、驚くべきことに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む薬学的組成物は、放射線で誘導される正常な組織の線維症を減少させ、粘膜炎および皮膚炎において放射線で誘導される創傷治癒を促進し、化学療法で誘導される組織壊死を促進し、放射線に関連する腫瘍形成を防止し、直接的な抗腫瘍効果を示し、腫瘍放射線感作を増強し、ならびに放射線療法および他の抗癌剤で、腫瘍細胞成長を相乗的に阻害することが明らかとなった。
【０００８】
本発明の化合物を、静脈、腸内、非経口、筋肉内、鼻内、皮下、局所、または経口に投与することができる。投与量は、インビトロおよびインビボ研究で観察される有効な濃度に基づいている。本発明の化合物の多様な有効な利用性は、それを、サイトカイン、インターロイキン、抗癌剤、または抗新生物剤、抗血管新生剤、化学療法剤、抗体、接合抗体、免疫刺激剤、抗生物質、レチノール酸、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモンアンタゴニスト、または成長刺激薬と併用して、または組合わせて投与することができるという知見によりさらに示される。
【０００９】
本発明に係る薬学的組成物においては、（１）治療の後遺症が低頻度であり、腫瘍制御を高い可能性で生じる、増殖性悪性または非悪性疾患についての化学療法および/または放射線療法における治療効果を増大させた薬学的組成物であって、ヒストン過剰アセチル化剤および薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるその塩を含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（２）増大した治療効果が、同時に、腫瘍放射線感作を増強するか、または化学療法に対して腫瘍を感作し、腫瘍成長阻害を増大させ、粘膜炎および皮膚炎における創傷治癒を促進し、足底-手掌症候群の重篤度を防止/減少させ、組織線維症を減少させ、細胞死から正常な組織を保護し、口内乾燥を防止し、および腫瘍形成を抑制する、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（３）過剰アセチル化剤が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（４）放射線療法が、遠隔放射線療法、近接照射療法、または電離放射線である上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（５）増殖性悪性疾患が、黒色腫、カポジ肉腫、骨肉種、神経芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、皮膚癌、リンパ腫、白血病、乳癌、生殖細胞腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、脳神経膠腫、脳髄膜腫、頭部および頸部癌、甲状腺癌、胸腺癌、頸部癌、肛門癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、肝細胞癌、胆管癌、胃癌、膵癌、食道癌、ウイルス関連腫瘍、および骨髄移植を受けたことに由来する疾患からなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（６）非悪性疾患が、翼状片、グレーブス眼症、眼窩偽腫瘍、黄斑変性、ケロイド、疣贅、角化棘細胞腫、血管腫、動静脈の奇形、滑液包炎、腱炎、類腱腫、ペーロニー病、脈管の狭窄、エナメル上皮腫、動脈瘤性骨嚢胞、異所骨形成、女性化乳房、卵巣去勢、耳下腺炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、上腕肩甲の関節周囲炎、外上顆炎、膝関節症、汗腺炎、ひょう疽、自己免疫炎症性関節炎、原因不明性組織球増殖、および臓器移植を受けたことに由来する疾患からなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（７）ヒストン過剰アセチル化剤が、トリコスタチンAまたはトリコスタチンCである、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（８）ヒストン過剰アセチル化剤が、オクサムフラチン、トラポキシンA、FR901228、アピシジン、HC-トキシン、WF27082、およびクラミドシンからなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（９）ヒストン過剰アセチル化剤が、サリチリヒドロキサム酸、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、およびアゼライン酸ビスヒドロキサム酸からなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１０）ヒストン過剰アセチル化剤が、アゼライン酸-1-ヒドロキサメート-9-アニリド、M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド、6-（3-クロロフェニルウレイド）カルポイック（carpoic）ヒドロキサム酸、MW2796、およびMW2996からなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１１）ヒストン過剰アセチル化剤が、酪酸ナトリウム、イソバレレート、バレレート、4-フェニルブチレート、フェニル酪酸ナトリウム、プロピオネート、ブトリミド、イソブチルアミド、フェニルアセテート、3-ブロモプロピオネート、バルプロ酸、およびトリブチリンからなる群より選択される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１２）ヒストン過剰アセチル化剤が、MS-27-275またはその3'-アミノ誘導体である上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１３）ヒストン過剰アセチル化剤が、デプデシンまたはスクリプタイドである、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１４）非経口で投与される、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１５）クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、粉剤、ローション、パッチ、坐剤、リポソーム組成物、懸濁液、口腔洗浄剤、浣腸、注射溶液、または点滴である、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１６）薬学的組成物が、組成物の0.001重量％から100重量％までの過剰アセチル化剤の量で存在する、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１７）サイトカイン、インターロイキン、抗癌剤、または抗新生物剤からなる群より選択される第二の物質、抗血管新生剤、化学療法剤、抗体、接合抗体、免疫刺激剤、抗生物質、レチノール酸、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモンアンタゴニスト、および成長刺激薬をさらに含む、上記(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１８）接合抗体が、トラスツズマブ、c225、リツキシマブ、およびセツキシマブからなる群より選択される、上記(17)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（１９）化学療法剤が、アルキル化剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、ビンカアルカロイド、ビンカ様アルカロイド、エトポシド、エトポシド様薬剤、コルチコステロイド、ニトロソウレア、抗代謝産物、プラチナベースの細胞毒性剤、抗アンドロゲン、および抗エストロゲンからなる群より選択される、上記(17)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（２０）抗血管新生剤が、サリドマイド、SU5416、SU6668、トロンボスポンジン-1、エンドスタチン、およびアンギオスタチンからなる群より選択される、上記(17)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（２１）抗生物質が、ガンシクロビル、アシクロビル、およびファムシクロビルからなる群より選択される、上記(17)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、治療上有効量のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与することにより、治療の後遺症が低頻度であり、腫瘍制御を高い可能性で生じる増殖中の悪性または非悪性疾患についての放射線療法および化学療法における治療効果を増大させる組成物および方法が提供される。
【００３１】
本発明は、本発明の以下の説明および付随の図面を参照することにより、さらに十分に理解され、さらなる利点が明らかになると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
放射線および/または化学療法剤が損傷を誘導した後、影響を受けた組織におけるサイトカイン（腫瘍壊死因子（TNF-α）など）および成長因子（トランスフォーミング成長因子（TGF-β）など）の放出は、線維芽細胞の動員および増殖を促進するが、上皮細胞成長を阻害し、炎症反応を永続および増大させる（Hillら、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、49巻：353-365頁、2001年；Seongら、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、46巻：639-643頁、2000年；Wangら、Am. J. Pathol.、153巻：1531-1540頁、1998年；Fedorockoら、Int. J. Radiat. Biol.、78巻：305-313頁、2002年；Martinら、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、47巻：277-290頁、2000年；Randallら、Int. J. Radiat. Biol.、70巻：351-360頁、1996年；Borderら、N. Engl. J. Med.、331巻：1286-1292頁、1994年；Singerら、N. Engl. J. Med.、341巻：738-746頁、1999年）。特に、増幅された損傷は、上皮、内皮、および結合組織細胞からのTNF-αおよびTGF-βの持続性分泌により放射線に反応し、そしてそれはおそらく、細胞分化および増殖の遺伝的プログラム化での修飾により引き起こされ、CRSを特徴とする組織学的修飾に至る（Zhouら、Int. J. Radiat. Biol.、77巻：763-772頁、2001年；Skwarchukら、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、42巻：169-178頁、1998年；Sivanら、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.、53巻：385-393頁、2002年；Delanianら、Radiother. Oncol.、47巻：255-261頁、1998年）。TGF-β経路の慢性活性化も、後期腫瘍形成を刺激する（Wieserら、Curr. Opin. Oncol.、13巻：70-77頁、2001年；Massagueら、Cell、103巻：295-309頁、2000年）。したがって、CRSおよび放射線で誘導された発癌は、放射線照射後の創傷治癒プロセスの遺伝的障害と考えられうる。
【００３３】
遺伝子モジュレーター、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤のクラスの化合物は、ヒストンアセチル化における改変状態を介してクロマチン構造をリモデリングすることにより、遺伝子のサブセットを活性化および抑制する（Marksら、J. Natl. Cancer Inst.、92巻：1210-1216頁、2000年；Kramerら、Trends Endocrinol. Metab.、12巻：294-300頁、2001年）。ヒストン過剰アセチル化は、細胞周期阻害剤（p21Cip1、p27Kip1およびp16INK4）の上方調節、癌遺伝子（MycおよびBcl-2）の下方調節、炎症性サイトカイン（インターロイキン（IL）-1、IL-8、TNF-α、およびTGF-β）の抑制、または変化なし（GAPDHおよびγ-アクチン）を生じる（Laggerら、EMBO J.、21巻：2672-2681頁、2002年；Richonら、Clin. Cancer Res.、8巻：662-667頁、2002年；Richonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、97巻：10014-10019頁、2000年；Van Lintら、Gene Expr.、5巻：245-243頁、1996年；Huangら、Cytokine、9巻：27-36頁、1997年；Mishraら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、98巻：2628-2633頁、2001年；Stockhammerら、J.Neurosurg.、83巻：672-681頁、1995年；Segainら、Gut、47巻：397-403頁、2000年；Leoniら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、99巻：2995-3000頁、2002年）。ヒストン過剰アセチル化を誘導することに加えて、HDAC阻害剤は、NF-κBのリポソームS3、p53またはRel-Aサブユニットのような非ヒストンタンパク質の過剰アセチル化をも誘導し、タンパク質キナーゼC（PKC）活性を調節し、タンパク質イソプレニル化を阻害し、DNAメチル化を減少させ、核受容体に結合する（Webbら、J. Biol. Chem.、274巻：14280-14287頁、1999年；Chenら、Science、293巻：1653-1657頁、2001年）。HDAC阻害剤は、腫瘍細胞での細胞周期停止状態、細胞分化、およびアポトーシス細胞死を誘導する上で、および炎症疾患における炎症および線維症を減少させる上で特性を示した（Warrellら、Natl. Cancer Inst.、90巻：1621-1625頁、1998年；Vigushinら、Clin. Cancer Res.、7巻：971-976頁、2001年；Saundersら、Cancer Res.、59巻：399-404頁、1999年；Gottlicherら、EMBO J.、20巻：6969-6978頁、2001年；Romboutsら、Acta Gastroenterol.Belg.、64巻：239-246頁、2001年）。HDAC阻害剤の効果は、大量のヒストンアセチル化を誘導するが、それらは、腫瘍細胞中のアポトーシス細胞死、終末分化、および成長停止状態を生じ、しかし正常細胞では毒性は生じない（Garberら、J. Natl. Cancer Inst.、94巻：793-795頁、2002年）。さらに、HDAC阻害剤によるクロマチン構造の調節は、細胞が固有に放射線耐性である腫瘍をさらに放射線感作でき、および化学療法に対しても腫瘍細胞を感作できる（Ferrandinaら、Oncol. Res.、12巻：429-440頁、2001年；Millerら、Int. J. Radiat. Biol.、72巻：211-218頁、1997年；Biadeら、Int. J. Radiat. Biol.、77巻：1033-1042頁、2001年）。
【００３４】
したがって、正常および腫瘍細胞でのクロマチンを差異を持ってリモデリングすることにより、腫瘍サプレッサー、癌遺伝子、炎症誘発性サイトカイン（TNF-α）、および線維形成成長因子（TGF-β）の発現を同時に、協力して、選択的に、および後成的に操作する能力に基づいて、HDAC阻害剤を含む薬学的組成物は、放射線および/または化学療法で誘導された粘膜/皮膚損傷を減少させるのみならず、放射線療法および/または化学療法の治療効率を最大限にする抗腫瘍効果を増強する、有効な治療を提供しうる。
【００３５】
本発明を行うために使用された活性化合物は、一般に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のようなヒストン過剰アセチル化剤である。多くのそのような化合物が知られている。例えば、P. Dulski、「Histone Deacetylase as Target for Antiprotozoal Agents」、国際公開公報第97/11366号（1997年3月27日）を参照のこと。このような化合物の例としては以下のものが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００３６】
A．トリコスタチンAおよびその類似体：例えば、トリコスタチンA（Trichostatin A：TSA）；およびトリコスタチンC（Kogheら、1998年、Biochem. Pharmacol. 56巻：1359-1364頁）（トリコスタチンBは単離されたが、HDAC阻害剤であることを示されてはいない）。
【００３７】
B．ペプチド類：例えば、オクサムフラチン（oxamflatin）[(2E-5-[3-[(フェニルスルホニル)アミノールフェニル1]-ペンタ-2-エン-4-イノヒドロキサム酸（Kimら、Oncogene、18巻：2461-2470頁（1999年））；トラポキシンA（Trapoxin A：TPX）−サイクリックテトラペプチド(シクロ-(L-フェニルアラニル-L-フェニルアラニル-D-ピペコリニル-L-2-アミノ-8-オキソ-9,10-エポキシ-デカノイル))（Kijimaら、J. Biol. Chem. 268巻、22429-22435頁（1993年））；FR901228、デプシペプチド（Nakajimaら、Ex. Cell Res. 241巻、126-133頁（1998年）；FR225497、サイクリックテトラペプチド（H. Moriら、国際公開公報第00/08048号（2000年2月17日）；アピシジン（apicidin）、サイクリックテトラペプチド[シクロ(N-O-メチル-L-トリプトファニル-L-イソロイシニル-D-ピペコリニル-L-2-アミノ-8-オキソデカノイル)]（Darkin-Rattrayら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.  93巻、13143-13147頁（1996年）；アピシジン1a、アピシジンIb、アピシジンIc、アピシジンIIa、およびアピシジンIIb（P. Dulskiら、国際公開公報第97/11366号）；HC-トキシン、サイクリックテトラペプチド（Boschら、Plant Cell 7巻、1941-1950頁（1995年））；WF27082、サイクリックテトラペプチド（国際公開公報第98/48825号）；およびクラミドシン(chlamydocin)（Boschら、前記）。
【００３８】
C．ヒドロキサミム酸ベースのハイブリッド極性化合物（Hydroxamic Acid-Based Hybrid Polar Compound：HPC）：例えば、サリチリヒドロキサム酸（salicylihydroxamic acid：SBHA）（Andrewsら、International J. Parasitology 30巻、761-768頁（2000年））；スベロイルアニリドヒドロキサム酸（suberoylanilide hydroxamic acid：SAHA）（Richonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95巻、3003-3007頁（1998年））；アゼライン酸ビスヒドロキサム酸（azelaic bishydroxamic acid：ABHA）（Andrewsら、前記）；アゼライン酸-1-ヒドロキサメート-9-アニリド（azelaic-1-hydroxamate-9-anilide：AAHA）（Qiuら、Mol. Biol. Cell 11巻、2069-2083頁（2000年））；M-カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサミド（M-carboxycinnamic acid bishydroxamide：CBHA）（Riconら、前記）；6-（3-クロロフェニルウレイド）カルポイックヒドロキサム酸（6-(3-chlorophenylureido)carpoic hydroxamic acid：3-Cl-UCHA）（Richonら、前記）；MW2796（Andrewsら、前記）；およびMW2996（Andrewsら、前記）。HDAC阻害剤として有効でない類似体は、ヘキサメチレンビスアセトアミド（HBMA）（Richonら、1998年、PNAS、95巻：3003-3007頁）；およびジエチルビス(ペンタメチレン-N,N-ジメチルカルボキサミド)マロネート（EMBA）（Richonら、1998年、PNAS、95巻：3003-3007頁）であることに注目すること。
【００３９】
D．単鎖脂肪酸（Short Chain Fatty Acid ：SCFA）化合物：例えば、酪酸ナトリウム（Cousensら、J. Biol. Chem. 254巻、1716-1723頁（1979年））；イソバレレート（McBainら、Biochem. Pharm. 53巻：1357-1368頁（1997年））；バルプロ酸；バレレート（McBainら、前記）；4-フェニルブチレート（4-PBA）（LeaおよびTulsyan、Anticancer Research、15巻、879-873頁（1995年））；フェニルブチレート（PB）（Wangら、Cancer Research、59巻、2766-2799頁（1999年））；プロピオネート（McBainら、前記）；ブトリミド（butrymide）（LeaおよびTulsyan、前記）；イソブチルアミド（LeaおよびTulsyan、前記）；フェニルアセテート（LeaおよびTulsyan、前記）；3-ブロモプロピオネート（LeaおよびTulsyan、前記）；およびトリブチリン（Guanら、Cancer Research、60巻、749-755頁（2000年）。
【００４０】
E．ベンズアミド誘導体：例えば、MS-27-275[N-(2-アミノフェニル)-4-[N-(ピリジン-3-イル-メトキシカルボニル)アミノメチル]ベンズアミド]（Saitoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96巻、4592-4597頁（1999年））；およびMS-27-275の3'-アミノ誘導体（Saitoら、前記）。
【００４１】
F．他の阻害剤：例えば、デプデシン(depudecin)[その類似体（モノ-MTM-デプデシンおよびデプデシン-ビスエーテル）は、HDACを阻害しない]（Kwonら、1998年、PNAS  95巻：3356-3361頁）；およびスクリプタイド(scriptaid)（Suら、2000年、Cancer Research、60巻：3137-3142頁）。
【００４２】
本出願における説明は、治療の後遺症が低頻度でありながら腫瘍制御を高い可能性で生じるために、増殖性悪性または非悪性疾患のための放射線療法および化学療法における治療上の効果を増大させるために、バルプロ酸、トリコスタチンA、およびフェニルブチレートに向けられるが、これらの例に制限されることはなく、本発明の範囲を限定することを意図していない。バルプロ酸、トリコスタチンAおよびフェニルブチレートの化合物の薬学的組成物および使用も開示される。
【００４３】
実験の過程で、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてのバルプロ酸、トリコスタチンA、およびフェニルブチレートは、皮膚腫張の減少、粘膜炎および皮膚炎における剥離治癒の促進、線維症の減少、および照射組織/皮膚における腫瘍形成の防止のみならず、腫瘍細胞成長の阻害、および腫瘍放射線感作の増強において強力な効果をも示すことが見出された。
【００４４】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、薬学的に許容される塩の形態でもたらされうる。このような薬学的に許容される塩としては、それらが、その化合物の所望の薬理学上の効果に有害に影響しない限り使用されうる。選択および産生は、当業者によって行うことができる。薬学的に許容される塩の例としては、ナトリウム塩またはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩またはマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩のような有機塩基を有する塩、またはトリエチルアミン塩またはエタノールアミン塩のような有機塩基を有する塩が挙げられる。
【００４５】
本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を、経口または非経口に投与することができる。経口投与の場合には、それらは、軟質および硬質カプセル、錠剤、顆粒、粉剤、溶液、懸濁液、口腔洗浄剤などの形態で投与されうる。非経口投与の場合には、それらは、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、パッチ、坐剤、リポソーム組成物、注射溶液、点滴製剤、浣腸などの形態で投与され得て、そしてそれにより、継続した膜吸収が、固形、粘性液体、または懸濁液の形態で維持されうる。これらの処方および賦形剤、崩壊剤または懸濁剤の製造のための方法の選択は、当業者によって容易に行うことができる。本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸、トリコスタチンA、またはフェニルブチレートに加えて、さらに、抗炎症または抗腫瘍活性を有する組成物を含んでもよく、または他の過剰アセチル化剤および薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるそれらの塩を含んでもよい。
【００４６】
当業者に認識されるとおり、有効な用量は、投与の経路、賦形剤使用量、およびサイトカイン、インターロイキン、抗癌剤、または抗新生物剤の使用のような他の治療処置、抗血管新生剤、化学療法剤、抗体、接合抗体、免疫刺激薬、抗生物質、レチノール酸、チロシンキナーゼ阻害剤、ホルモンアンタゴニスト、または成長刺激薬との同時使用の可能性によって変化する。任意の特定の対象（例えば、ヒト、イヌ、またはネコ）についての有効量および治療計画は、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食生活、投与の時間、排泄の速度、疾患の重度および経過、ならびにその疾患に対する患者の素質を含めた多様な他の因子にもよるが、通常は、投与の手段に関係なく組成物の0.001重量％から100重量％までである。増殖性悪性または非悪性疾患についての放射線療法および/または化学療法における治療効果を増大させる上で有用な他の化合物と共に、本発明の活性化合物を任意で投与することができる。他の化合物は任意で同時に投与されうる。本明細書に使用される場合、「同時に」という用語は、組み合せた影響を生じる時間に十分に近いことを意味する（すなわち、「同時に」は、同時に、または互いの前後の短い期間内で生じる2つまたはそれ以上の事象であってよい）。本明細書に使用される場合、「同時に」または「組合わせた」2つまたはそれ以上の化合物の投与は、一方の存在が、他方の生物学上の効果を改変する時間で、2つの化合物が十分に近くに投与されることを意味する。2つの化合物は、同時または連続して投与されうる。同時投与は、投与の前に化合物を混合することにより行うことができ、または化合物を時間的には同じ時点であるが、異なる解剖学上の部位もしくは異なる投与経路を使用して投与することにより行うことができる。
【００４７】
本明細書に使用される場合、増殖中の悪性疾患は、黒色腫、カポジ肉腫、骨肉種、神経芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、皮膚癌、リンパ腫、白血病、乳癌、生殖細胞腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍、脳神経膠腫、脳髄膜腫、頭部および頸部癌、甲状腺癌、胸腺癌、頸部癌、肛門癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌、肝細胞癌、胆管癌、胃癌、膵癌、食道癌、ウイルス関連腫瘍、および骨髄移植を受けたことに由来する疾患を包含する。
【００４８】
本明細書に使用される場合、非悪性疾患は、翼状片、グレーブス眼症、眼窩偽腫瘍、黄斑変性、ケロイド、疣贅、角化棘細胞腫、血管腫、動静脈の奇形、滑液包炎、腱炎、類腱腫、ペーロニー病、脈管の狭窄、エナメル上皮腫、動脈瘤性骨嚢胞、異所骨形成、女性化乳房、卵巣去勢、耳下腺炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、乾癬、上腕肩甲の関節周囲炎、外上顆炎、膝関節症、汗腺炎、ひょう疽、自己免疫炎症性関節炎、原因不明性組織球増殖、および臓器移植を受けたことに由来する疾患を包含する。
【００４９】
本明細書に記述される本発明をさらに十分に理解するために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、目的を例示するためだめけのものであって、なんらかの方法で本発明を制限すると意図されないことを理解すべきである。本明細書に引用される全ての参考文献は、特に参照として全体に組み入れられる。
【実施例１】
【００５０】
種々の局所組成物-油性軟膏、クリームおよびゲル
A.フェニルブチレートの油性軟膏の調製
470gの白色ペトロラタム（Riedel-de Haen）、25gのパラフィンワックス50/52（地域供給業者）、および5gの4-フェニルブチレート（Merck）をビーカー内で混合し、70℃に加熱してペーストを形成した。ペーストを400rpmで1時間攪拌し、その後室温で冷却した。
【００５１】
B.フェニルブチレートの油性軟膏の調製
65gの白色ペトロラタム（Riedel-de Haen）、15gのセチルアルコール（Riedel-de Haen）、260gの軟質パラフィン（Merck）、155gの液体パラフィン（Merck）、および5gの4-フェニルブチレート（Merck）をビーカー内で混合し、70℃に加熱してペーストを形成した。ペーストを400rpmで1時間攪拌し、その後室温で冷却した。
【００５２】
C.フェニルブチレートのクリームの調製
成分I：
70gのTefose 63（登録商標）、20gのSuperpolystate（登録商標）、10gのCoster 5000（登録商標）、15gのMyriyol 318（登録商標）、15gのCoster 5088（登録商標）、および15gのGMS SE（登録商標）（全て地域供給業者から市販されている）をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００５３】
成分II：
5.739gの4-フェニル酪酸ナトリウム（Triple Crown America、Inc.）、0.125gのメチルパラベン（Merck）、0.075gのプロピルパラベン（Merck）、および149.061gの脱イオン水をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００５４】
成分IIを、成分Iにゆっくりと添加し、続いて400rpmで5分間攪拌して混合液を形成した。2％のStabilezeQM（登録商標）（98gの脱イオン水に2gのStabilezeQM（登録商標）を溶解させて加熱し、70℃で攪拌してペーストを形成し、その後室温で冷却することにより調製された）を混合液に添加して、5分間攪拌した。0.85％リン酸（Merck）を用いて、混合液のpHを5.34に調整し、600rpmで20分間攪拌した。混合液を室温で冷却した。
【００５５】
D.フェニルブチレートのゲルの調製
成分I：
10gのStabilezeQM（登録商標）および232.035gの脱イオン水をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００５６】
成分II：
5.739gの4-フェニル酪酸ナトリウム（Triple Crown America、Inc.）、0.125gのメチルパラベン（Merck）、0.075gのプロピルパラベン（Merck）、232.035gの脱イオン水、および20gの10％NaOHをビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００５７】
成分IIを、成分Iにゆっくりと添加し、続いて400rpmで20分間攪拌して混合液を形成した。混合液を室温で冷却した。
【００５８】
E.フェニルブチレートのゲルの調製
成分I：
10gのStabilezeQM（登録商標）および380.561gの脱イオン水をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００５９】
成分II：
5.739gの4-フェニル酪酸ナトリウム（Triple Crown America、Inc.）、0.125gのメチルパラベン（Merck）、0.075gのプロピルパラベン（Merck）、83.5gの1,2-プロパンジオール、および20gの10％NaOHをビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００６０】
成分IIを、成分Iにゆっくりと添加し、続いて400rpmで20分間攪拌して混合液を形成した。混合液を室温で冷却した。
【００６１】
F.フェニルブチレートの徐放性製剤の調製
2つの製剤を、表1に列挙される組成物によって調製した。
【００６２】
（表１）2つの徐放性製剤の組成物
2005281150.tif 000002
＊PF-127（登録商標）は、組成物の基剤であり、カルボキシメチルセルロースナトリウムは濃化剤である。
【００６３】
G.フェニルブチレートのリポソーム製剤の調製
本リポソーム製剤において、卵ホスファチジルコリン（EPC）およびコレステロールを、一次脂質構成要素として、等モル濃度または異なるモル濃度で使用した。4-フェニルブチレートと共に配置される種々のリポソームを、脂質：フェニルブチレート比を変化させることにより得た。薄層フィルム水和によりリポソームを調製し、膜突出により大きさを揃えた後、物理的に評価した。
【００６４】
H.トリコスタチンAの軟膏の調製
472.5gの白色ペトロラタム（Riedel-de Haen）、27gのパラフィンワックス50/52（地域供給業者）、および0.5gのトリコスタチンA（Sigma）をビーカー内で混合して、70℃で加熱してペーストを形成した。ペーストを400rpmで1時間攪拌し、その後室温で冷却した。
【００６５】
I.トリコスタチンAの油性軟膏の調製
67.5gの白色ペトロラタム（Riedel-de Haen）、16gのセチルアルコール（Riedel-de Haen）、260.5gの軟質パラフィン（Merck）、155.5gの液体パラフィン（Merck）、および0.5gのトリコスタチンA（Sigma）をビーカー内で混合して、70℃で加熱してペーストを形成した。ペーストを400rpmで1時間攪拌し、その後室温で冷却した。
【００６６】
J.バルプロ酸のクリームの調製
成分I：
70gのTefose 63（登録商標）、20gのSuperpolystate（登録商標）、10gのCoster 5000（登録商標）、15gのMyriyol 318（登録商標）、15gのCoster 5088（登録商標）、および15gのGMS SE（登録商標）（全て地域供給業者から市販されている）をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００６７】
成分II：
5.739gのパルプロ酸（Sigma）、0.125gのメチルパラベン（Merck）、0.075gのプロピルパラベン（Merck）、および149.061gの脱イオン水をビーカー内で混合して、70℃で加熱した。
【００６８】
成分IIを、成分Iにゆっくりと添加し、続いて400rpmで5分間攪拌して混合液を形成した。2％のStabilezeQM（登録商標）（98gの脱イオン水に2gのStabilezeQM（登録商標）を溶解させて加熱し、70℃で攪拌してペーストを形成し、その後室温で冷却することにより調製された）を混合液に添加して、5分間攪拌した。0.85％リン酸（Merck）を用いて、混合液のpHを5.34に調整し、600rpmで20分間攪拌した。混合液を室温で冷却した。
【実施例２】
【００６９】
局所フェニルブチレート（PB）処置により、インビボでヒストン過剰アセチル化が誘導される
表2に示すとおり、数種のフェニルブチレート（PB）製剤の特徴付けを行った。
【００７０】
（表２）製剤の特徴および薬物動態パラメーター
2005281150.tif 000003
＊cはクリーム、gはゲル、oは軟膏を示す；
1傾きは皮膚を介した各薬剤の一時間当たりの浸透量を示す（μg/cm2/時間）；
2Y切片（Intercept）（μg/cm2）は、負の数ならば、皮膚を介した各薬剤の潜在的な浸透量を示し、正の数ならば、試料採取時間が長すぎて正確な値を得ることができないことを示す；
3滞留時間は、薬剤が皮膚に浸透するためにかかる平均時間数（時間）を示す；
4定数（×10-5cm2/秒）は、薬剤拡散定数を示す；
5Cs（×105mg/cm3）は、皮膚表面における薬剤濃度を示す；
6μg/cm2は、皮膚1cm2当たりを介した各薬剤の平均浸透量を示す；
7mg/cm3は、皮膚における平均濃度を示す。
【００７１】
様々な製剤の中で、安定性が良好で、皮膚刺激速度が小さく、有効期間が長く、かつ皮膚浸透速度が大きかったPBクリーム（Tri-c-02-3）を、試験のために選択した（図1A）。放射線照射された皮膚を処置するのに適した局所PB投与量はどのくらいであるかを決定するために、核におけるヒストン過剰アセチル化の量をマーカーとして用いて薬剤浸透の程度を示し、かつ局所薬剤濃度が十分に生物学的効果を発揮するかどうかを示した。照射（40 Gy単一フラクション）から6時間後の照射皮膚におけるアセチル化ヒストンについてのウエスタンブロット分析により、アセチル化形態のヒストンH3は対照群および賦形剤処置群において穏やかに増大されたが、照射直後の、照射皮膚表面あたり1％PBクリーム200mgの局所処置により著しく増大されたことが示された（図1B）。クーマシーブルー染色ゲル切片により、タンパク質負荷は同等であることが示される。免疫蛍光染色により、照射皮膚でのヒストン過剰アセチル化は、薬剤処置から6時間後にはずっと深い皮下層でも視覚的に明らかであることが、さらに示された（すなわち、皮膚試験での薬物濃度のピークと一致する）（図1Aおよび図1C〜図1F）。核におけるアセチル化H3を、薬物浸透の程度を示すマーカーとして使用した。
【実施例３】
【００７２】
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、急照射で誘導された正常組織の損傷を減少させるのに有効である
成体雌性スプラーグ・ドーリー（SD）ラットを、台湾国家科学委員会の動物センターから購入し、照射の時点で体重250g〜300gとした。各ラットを単独でケージに収容し、餌と水を与えた。照射前にペントバルビタール50mg/kgを腹腔内注射して麻酔した。臀部領域全体の皮膚を完全に剃り上げ、照射直前に、直径2cmの照射域の輪郭を、マーキングペンで描いた。線形加速器によって生じる6MeVエネルギーの電子ビームを使用した。0日目に、4Gy/分で最大40Gyの線量が調製領域に送出された。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処置された各群を、さらに3つの亜群（各5匹）に分割した：皮膚照射の後賦形剤で処置された第一の亜群；皮膚照射の後ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処置された第二の亜群；および、皮膚照射のみで処置された第三の亜群。その後、ワセリン（陰性対照）、マデカゾール（madecassol）軟膏（陽性対照）、または賦形剤のいずれか、すなわち1％フェニルブチレートクリーム、1％バルプロ酸クリームもしくは0.1％トリコスタチンA軟膏を、照射後1日目から90日目まで毎日2回、照射皮膚に局所的に塗布した。個々の群における各処置についての平均投与量は、ワセリンが皮膚1cm2当たり16mg、マデカゾールが皮膚1cm2当たり16mg、フェニルブチレートが皮膚1cm2当たり50mg、バルプロ酸が皮膚1cm2当たり50mg、トリコスタチンAが皮膚1cm2当たり5mg、および、対照群については等量の賦形剤基剤であった。皮膚全体の反応を、全てのラットについて評価した。急性皮膚反応を評価し、そして改変皮膚スコアリングシステムを用いて、照射から90日後まで一日おきにスコアリングした（Abe Y.およびUrano M.、Fraction size-dependent acute skin reaction of mice after multiple twice-a-day doses.、International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics.、18（2）：359-64頁、1990年）。ここで、0＝正常、0.5＝僅かに脱毛、1.0＝照射領域の約50％で脱毛、1.5＝50％を上回る領域で脱毛、2.0＝完全に脱毛、2.5＝50％を上回る領域で明確な浮腫または乾式剥離を伴う完全脱毛、3.0＝小領域での湿潤剥離、3.5＝大部分の領域での湿潤剥離。
【００７３】
皮膚スコアは、皮膚反応の重篤化に伴って増大する。各群における平均皮膚反応スコアを、図2に示す。11日目には、マデカゾール（陽性対照）またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で処置した群における皮膚反応のスコアは、陰性対照群または賦形剤対照群における反応を下回っていた。21日目まで、陰性対照群または賦形剤群における大部分の領域で、脱毛が湿式剥離まで進行したのに対して、マデカゾール群またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤群では改善されており、かつ上皮治癒が迅速に始まっていた。
【実施例４】
【００７４】
照射皮膚のH＆E組織学は、HDAC阻害剤による創傷治癒の促進と相互に関連する
バルプロ酸、トリコスタチンA、およびフェニルブチレートは、構造的に関連のないヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるが、これらは全て、急性皮膚炎および剥離を含む放射線誘導された皮膚損傷、ならびに後期線維症、潰瘍形成および壊死の抑制において、類似の効果を示した。図3で示すとおり、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤で180日間処置した群は、180日目の賦形剤群および対照群（7日目には正常皮膚および急性反応）と比較して、より多くの細胞層を伴う厚い表皮を有するが、コラーゲン沈着の少ない薄い真皮（表皮から皮下脂肪層まで測定した）を有する。
【実施例５】
【００７５】
HDAC阻害剤による処置後の、放射線誘導された組織学における変化は、炎症および線維形成性サイトカイン発現における抑制と相互に関連する
放射線誘導性損傷の発生は、放射線誘導された一過性変化、ならびに、TNF-αのような炎症誘発性サイトカイン、およびTGF-β1やTGF-β2のような線維形成性成長因子の持続性上方調節に起因しているので、HDAC阻害剤による放射線誘導性損傷の抑制は、TNF-αおよびTGF-βの発現の抑制と相互に関連することが示された。
【００７６】
照射により誘導されるTGF-β1、TGF-β2、およびTNF-αの発現レベルのピーク出現のタイミングは、放射線誘導性損傷の発生の開始と相互に関連した（図4）。TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TNF-α、および内部対照GAPDHについての標的mRNAとハイブリダイズした32P標識アンチセンスRNAプローブを生じさせる一組の鋳型を含む、複数のサイトカインRNase保護アッセイキット（Riboquant；Pharmingen、カリフォルニア州サインディエゴ）を用いて、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3およびTNF-αのmRNAレベルを評価した。標的RNAに対する標識プローブのハイブリダイゼーションの後、未保護RNAを、リボヌクレアーゼ（RNase）で消化し、保護RNA断片を6％ポリアクリルアミドゲルに溶解させて、燐光イメージング（phosphorimaging）により記録した（Molecular Dynamics Corp.、カリフォルニア州サニーベール）。濃度計を用いて各mRNA種の量を定量し、内部対照GAPDHに対して正規化させた。
【００７７】
各群中のラット5匹からの皮膚反応についての皮膚スコアの平均を計算した。各群における3つの皮膚試料から得られるサイトカイン/成長因子mRNAの平均レベルを、内部対照GAPDHに正規化させ、時間対応対照群における平均レベルに対する比として表した。マン-ホイットニー試験（Stata Statistical Software、テキサス州カレッジ・ステーション）を用いて、処置ラットおよび対照ラットの間のそれぞれ平均皮膚スコアにおける、および平均mRNAレベルにおける差異について、p＜0.05レベルにおける統計学的有意性を判定した。
【００７８】
フェニルブチレート（PB）処置群では、TGF-β1、TGF-β2、およびTNF-αの動揺は照射の6時間後に最大となったが、レベルは14日後には実質的に抑制された。局所PB処置が90日目に中断された場合でさえ、12ヶ月においてもまだ抑制が持続していた。ワセリンおよび賦形剤対照群では、照射皮膚におけるTGF-β1、TGF-β2、およびTNF-αのmRNAレベルは増大し、1年間の間非照射対照レベルを上回って変動した。照射後6時間で、非照射対照レベルより2倍〜3倍大きな最初のピークに達し、照射の14日後〜28日後頃に10.5倍〜16倍大きな第二のピークに達し、照射後9ヶ月目で、13倍〜14倍大きな第三のピークに達した。その後、レベルは、照射後12ヶ月までに、正常レベルの2倍〜3倍へと減少した。PB群において6時間目の第一のピークでのTGF-β1、TGF-β2、およびTNF-αのmRNAレベルはワセリン群および賦形剤対照群におけるものよりも高かったが、それらは14日目でワセリン群および賦形剤群におけるものより低いレベルまで減少し、そして28日目〜35日目で非照射対照レベルまで回復した。
【００７９】
上皮細胞成長の阻害、および皮膚の線維芽細胞増殖の促進において、TGF-β1およびTGF-β2は類似した細胞効果を示すが、TGF-β3は反対の効果を示す。TGF-β3のmRNAレベルの変化は、14日目に全照射群において僅かに一過性の2倍の増加を示し、その後、非照射対照レベルまたはそれ未満までの累進的減少を示したことが分かった。TGF-β3のmRNAレベルにおける有意差は、ワセリン、賦形剤またはPBで処置された照射群の間では観察されなかった。
【実施例６】
【００８０】
照射皮膚における線維形成性成長因子TGF-βの免疫蛍光は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により抑制される
実施例4と同じ病理学的切片を、抗TGF-β1抗生物質、抗TGF-β2抗生物質を用いた免疫蛍光に供した。図5に示すとおり、強力な線維形成性因子であるTGF-βタンパク質は照射により上方調節され、それぞれ、急性反応群および賦形剤処置群における7日目および180日目に、表皮のケラチノサイトおよび真皮の筋線維芽細胞の両方において、線維形成性の皮膚中で高発現されるが、TGF-βの発現は、180日目にPB処置群では有効に抑制された。
【実施例７】
【００８１】
照射皮膚における炎症誘発性サイトカインTNF-αの免疫組織化学は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により抑制される
270日目に、PB処置群ではラット5匹中0匹であったのと比較して、ワセリン処置群におけるラット5匹中3匹、および賦形剤処置群におけるラット5匹中4匹が、慢性潰瘍形成、壊死、水疱形成、および炎症性細胞浸潤を示した。局所PBによる遅発性放射線誘導皮膚損傷における減少は、TNF-α発現の抑制と一致した（図6）。
【実施例８】
【００８２】
局所フェニルブチレート（PB）処置は、遅発性の放射線誘導皮膚の腫瘍形成を防止する
多くの研究が、TGF-βの慢性過剰発現が、新生物成長を刺激することを示した。PB処置により引起されるTGF-β発現の減少は、遅発性放射線誘導腫瘍形成の発生率を減少させうる。新たに発生した皮膚および皮膚腫瘍が、PB処置を受けなかった照射対照群において50週目以降経時的に増加することが見出されたが、PB処置照射群は腫瘍は見られなかった（図7）。90週目に、PB処置された照射群で0％（0/42）であったのと比べ、累積腫瘍形成率の15％（6/39）が、PB処置なしの照射群で観察された。放射線誘導腫瘍の組織構造には、線維腫、紡錘細胞肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌が含まれた。
【実施例９】
【００８３】
局所フェニルブチレート（PB）は、皮膚腫瘍成長に対して直接的抗腫瘍効果を示す
同系の癌細胞1MEA7R.1およびCT-26（American Type Culture Collection、バージニア州マナサスから購入）を、雌性BALB/cマウスの側腹部領域に皮下注射した。腫瘍の最大寸法を、0.5cmと想定した。局所HDAC阻害剤および賦形剤を、一日二回で4週間、全腫瘍表面および周辺皮膚を覆うために200mg/マウスの用量で塗布した。腫瘍サイズを、式ab2/2（式中、aおよびbはそれぞれ、大きい方の直径（cm）と小さい方の直径（cm）である）に従い、カリパスを用いて毎週計算した。
【００８４】
局所PB製剤は抗腫瘍効果を有することが示された。p21Cip1の上方調節によりインビトロにおいてPBによる成長阻害を示した（図8A）BNL 1MEA7R.1およびCT-26癌細胞を、同系マウスの背中に接種した。皮膚腫瘍を、最大寸法0.5cmまで成長させ（図8D）、200mg/マウスのPBを一日二回、、腫瘍表面に局所的に塗布した。4週目までに、プラセボ群における1MEA7R.1およびCT-26癌の腫瘍サイズはそれぞれ、PB処置群よりも約6倍および1.6倍大きくなった（図8B〜図8C）。PB処置群における皮膚腫瘍は、皮膚潰瘍形成することなくゆっくりと成長した（図8F）が、対照群またはプラセボ群における腫瘍は急速に成長し、そして壊死性外観および皮膚潰瘍形成を示した（図8E）。処置から5週間後、局所PBの使用中止により、腫瘍成長阻害が失われ、その後2週間以内に、これらの腫瘍は、対照群またはプラセボ群における腫瘍と同じサイズに達した。
【実施例１０】
【００８５】
放射線誘導された正常組織損傷の治療における、および遅発性放射線誘導性腫瘍形成の阻害における、構造的に関連のない抗腫瘍HDAC阻害剤の類似効果
PBに加えて、トリコスタチンA（抗真菌剤）およびパルプロ酸（抗発作剤）のような構造的に関連のないその他の抗腫瘍HDAC阻害剤はまた、放射線誘導された損傷および腫瘍形成の発生をも改善し、放射線誘導されたTGF-β1、TGF-β2、およびTNF-αの発現を減少させた（図9および表3）。
【００８６】
トリジェント（Trigent）（Molecular Research Center Inc.、オハイオ州シンシナティ）を用いて、全RNAを凍結皮膚試料から単離した。全RNA（30μg）を、変性ホルムアルデヒド-アガロースゲル上で電気泳動させ、ハイボンド（Hybond）N（Amersham、アマシャム、英国）上にブロットし、紫外線（UV）照射により固定した。以下に記述するとおり、32P標識プローブと共に膜をRapid-hyb緩衝液（Amersham）中でインキュベーションした。ラットTGF-β1およびTGF-β2用のプローブを調製するために、それらの全長コーディング配列を、特異的なフォワードプライマー（TGF-β1、5'-CGGGTGGCAGGCGAGAGC-3'（配列番号：1）；およびTGF-β2、5'-CATGCACTACTGTGTGCT-3'（配列番号：2）) およびリバースプライマー（TGF-β1、5'-GGAATTGTTGCTATATTTCTGC-3'（配列番号：3）；およびTGF-β2、5'-CCGAGGACTTTAGCTGCA-3'（配列番号：4）)を用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させた。RNase保護アッセイキット（Riboquant；Pharmingen）由来のTNF-αおよびGAPDHの一組の鋳型を用いて、TNF-αおよびGAPDHに対するmRNAとハイブリダイズした32P標識アンチセンスRNAプローブを作製した。
【００８７】
（表３）様々なHDAC阻害剤で処置した照射皮膚における組織学的知見の概要
2005281150.tif 000004
【００８８】
各群における5匹の照射ラットから得た皮膚標品での組織学的知見を以下のように示す：A、上皮下腫張；B、50％を上回る領域で乾式剥離；C、50％を上回る領域で湿潤剥離；D、大部分の領域で表皮のアトピー；E、大部分の領域で皮膚付属器のアトピー；F、より多い細胞層を伴う、表皮の厚さの増大；G、コラーゲン沈着の増加、脈管密度の増加、および真皮の厚さの増大；H、慢性潰瘍形成、壊死、水疱形成、およびより増加した炎症性細胞浸潤；I、TGF-β1、TGF-β2およびTNF-αの下方調節；J、遅発性放射線誘導の腫瘍形成の防止；K、皮膚腫瘍成長に対する直接抗腫瘍効果の証拠。「＋」〜「＋＋＋＋＋」とは、ラット1匹〜5匹から得た標品が、表記のとおり反応または効果を示したことを意味する。
【実施例１１】
【００８９】
バルプロ酸は腫瘍放射線感作を増強する
照射増強比（RER）を用いて、同じ効果を示す放射線線量の比を計算する。
RER＝（生存率10％における薬物処置なしの放射線線量）/（生存率10％における薬物処置を伴う放射線線量）。
線量2Gy〜16Gyの放射線照射の60分前に、バルプロ酸（0.1mMまたは0.5mM）をCNE2鼻咽頭癌細胞に添加して、その後洗い流した。1週間後、50個を上回る細胞を含むコロニーを計数した。平板培養効率は、対照群およびPB処置群においてと同じであった。0.1mMまたは0.5mMバルプロ酸の放射線増強比（RER）を、生存率10％においてそれぞれ1.2および1.7まで増大させた（図10）。
【実施例１２】
【００９０】
トリコスタチンA（TSA）、ガンシクロビル（GCV）、および放射線（RT）の同時投与は、エプスタイン-バーウイルス（EBV）感染癌細胞を選択的に死滅させる
遺伝子調節因子としてのHDAC阻害剤は、EBVチミジンキナーゼの、ガンシクロビル（GCV）によりEBV関連腫瘍を死滅させる活性を上方調節しうるが、これは、細胞性DNAポリメラーゼを阻害して、細胞周期のS期における細胞死を引き起すためにEBVチミジンキナーゼによりリン酸化されうる。HDAC阻害剤も、抗増殖剤および放射線感作剤として作用するため、TSA、GCVおよび放射線（RT）の併用療法は、免疫抑制された子供における、鼻咽頭癌、ホジキン病リンパ腫、X関連リンパ球増殖性疾患、AIDS関連非ホジキンリンパ腫、および平滑筋腫瘍のようなEBV関連腫瘍に対する治療的恩典を有しうる。
【００９１】
EBVチミジンキナーゼ活性アッセイのために、等量の細胞質ゾル画分を、37℃で30分間、反応緩衝液（50mMTris-HCl（pH7.4）、1mg/ml BSA、3mMクレアチンリン酸、11.2U/mlクレアチンホスホキナーゼ、0.1μM[3H-8]-GCV（特異的活性13.5Ci/mmol）、2.5mM ATP、2.5mM MgCl2、10mM NaF、10mM DTT）と共にインキュベートした。反応混合液を、ワットマンR DE-81イオン交換クロマトグラフィー紙上に添加し、その後これを、1.5mM NH4COOHで3回洗浄して、非リン酸化形態の[3H-8]-GCVを除去した。空気乾燥の後、これらの紙を、液体シンチレーションカクテルと共に一晩インキュベートした。ワットマンR DE-81イオン交換クロマトグラフィー紙に結合したリン酸化形態の[3H-8]-GCVを、LS6500シンチレーション計数計（Beckman）により測定した。
【００９２】
図11Aで示すとおり、EBVチミジンキナーゼ活性を、1nMのTSA処置48時間により上方調節した。TSA、GCV、および放射線の併用により、EBV陽性細胞の選択的死滅が最大となったが、EBV陰性細胞においては全く起こらなかった（図11B）。ダウジ細胞（EBV＋）およびHL-60（EBV-）を、ガンシクロビル（GCV）（10μg/ml）および/またはトリコスタチンA（TSA）（1nM）で48時間処置し、その後、1Gy放射線（RT）を照射したまたはしなかった。生存細胞を1週間後に計数した。
【実施例１３】
【００９３】
局所フェニルブチレートを用いた放射線誘導粘膜炎の治療の動物モデル
化学療法で誘導された粘膜炎および放射線で誘導された粘膜炎のハムスターモデルを作製した。モデルの再現性は、照射後12日目〜15日目の間の潰瘍性粘膜炎外見の一致により確認された。このモデルを用いて、局所フェニルブチレートゲルおよび溶液の効率を、放射線誘導粘膜炎の経過を改変させる能力について試験した。15日目頃に重篤な粘膜炎を生じさせるために、0日目に急照射線量40Gyを適用した。粘膜炎を誘導するための急照射の使用は、これらの当初の研究用に分取された放射線または化学療法のどちらの使用よりも好ましい。急性モデルは全身毒性をほとんど有さないため、動物はほとんど死ぬことがない。この事実により、当初の研究において、より小さな群を使用することが可能になった。急性モデルを用いた、多数の化合物についての有効性の有無の解明が成功している。したがって、急照射モデルは、多様なファミリーの化合物をスクリーニングするための最初のプロトコールとして適切である。
【００９４】
急照射プロトコールを用いて、粘膜炎を誘導した。0日目に、単回線量（40Gy/線量）の放射線を全ての動物に適用した。放射線を、焦点距離50cmで、250キロボルト電位（15mM）源で発生させ、0.35mm Cu濾過システムで硬化させた。照射は、121.5cGy/分の速度で、左頬嚢の粘膜を標的にした。照射の前に、動物を、ペントバリビタールナトリウム（80mg/kg）の腹膜内注射で麻酔した。左頬嚢を、裏返し、固定し、誘導遮蔽板を用いて単離した。
【００９５】
本研究には、一群当たり5匹からなる4つの群に任意に分割した、20匹のハムスターを使用した。各群に、以下のとおり異なる処置を割り当てた：グループ1は、20μl PBS/ハムスター；グループ2は、200μgフェニル酪酸ナトリウム/20μl PBS/ハムスター；グループ3は、20mgプラセボ（ゲル基剤）/ハムスター；グループ4は、20mgフェニルブチレートゲル/ハムスター。15日目以降、被験ハムスターの放射線誘導された粘膜炎領域に、各物質を毎日1回、10日間連続して局所的に塗布した。15日目、17日目、19日目、21日目、23日目、および25日目に清潔なプラスチック製シートに写した粘膜炎創傷領域を、イメージアナライザー（Life Science Resources VISTA、バージョン30）の使用により定量した。粘膜炎創傷領域の半終止時間（CT50）を、グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）（Graph Pad Software、米国）を用いて線形回帰により測定し、不対スチューデントt検定を、各測定時点で処置群とプラセボ群との間の比較のために適用した。p＜0.05において、差は、統計学的に有意であると考えられた。
【００９６】
表4に示すとおり、粘膜炎創傷終止における有意な増加（p＜0.01）は、21日目、23日目、および25日目にグループ2（200μgフェニル酪酸ナトリウム/20μl PBS/ハムスター）で、ならびに17日目、19日目、21日目、23日目および25日目にグループ4（20μgフェニルブチレートゲル/ハムスター）で観察された。CT50も、グループ2では（グループ1での7.7±0.2日間に比べて）6.5±0.2日間まで、およびグループ4では（グループ3での10.5±1.3日間に比べて）8.9±0.2日間まで、有意に減少（p＜0.01）した。
【００９７】
（表４）フェニルブチレート（PB）で処置した粘膜炎創傷治癒
2005281150.tif 000005
差は、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01で有意と考えられる。
【００９８】
その他の態様
本明細書に開示された特徴は全て、任意の組み合わせで併用されうる。本明細書に開示される各特性は、同一、同等、または類似の目的をはたす代替特性によって置換されうる。したがって、特に明らかに規定されない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特性の例示に過ぎない。
【００９９】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、かつその概念および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の改変および修飾を加えて、種々の使用法および条件に適合させることができる。例えば、上述されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に構造的かつ機能的に類似の化合物は、本発明の実施にも使用されうる。したがって、他の態様はまた、添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】皮膚を介する様々のPB製剤の送達の薬理学上の研究を示す図である。
【図１Ｂ】照射後6時間、フェニルブチレートクリーム（PB）有りまたは無しで処置された照射皮膚（40Gy単一比率）でのアセチル化H3についてのウエスタンブロット分析を示す図である。レーン1、照射なしの正常な皮膚；レーン2、処置なしの照射皮膚；レーン3、賦形剤で処置した照射皮膚；レーン4、1％PBクリームで処置した照射皮膚。
【図１Ｃ−１Ｆ】照射後6時間、フェニルブチレートクリーム（PB）有りまたは無しで処置された照射皮膚におけるアセチル化H3の免疫蛍光染色を示す図である。Ｃは、照射なしの正常な皮膚を示す；Ｄは、処置なしの照射皮膚を示す；Ｅは、賦形剤で処置した照射皮膚を示す；Ｆは、1％PBクリームで処置した照射皮膚を示す。
【図２】40Gy照射後の平均皮膚スコアの時間曲線を示す急性皮膚反応スコアを示す図である。
【図３】局所ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、照射で誘導された皮膚損傷を抑制する上で効果を有することを示すH＆E組織学写真を示す図である。Ａ、Ｄ、Ｇ、およびＪは、40×視野でのH＆E組織学である；Ｂ、Ｅ、Ｈ、およびＫは、100×視野でのH＆E組織学である；Ｃ、Ｆ、Ｉ、およびＬは、200×視野でのH＆E組織学である。Ａ〜Ｃは、正常な皮膚のものである。Ｄ〜Ｆは、照射後の7日目の急性反応のものであり、上皮下組織腫張（白い矢印）を示す。Ｇ〜Ｉは、180日目の賦形剤群のものであり、上皮組織が薄く、上皮下組織腫張、血管および皮膚付属器密度の増大、およびいっそうのコラーゲン沈着を伴う厚い真皮を示す。黒色矢印は、賦形剤群での皮下脂肪層が、線維性組織および付属器により置換されたことを示す。Ｊ〜Ｌは、180日目のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を処置された群のものであり、10〜30細胞層を有するより厚い表皮（黒い矢印）、上皮下組織腫張が少ないこと、コラーゲン沈着が少ない真皮が薄いこと、および皮膚付属器が少ないことを示す。
【図４Ａ】局所HDAC阻害剤（フェニルブチレート（PB））有りまたは無しで処置した照射後のTGF-β1の発現レベルの変化を示す図である。照射後の皮膚におけるTGF-β1のmRNAレベルにおける一過性変動は、内部対照GAPDEに正規化され、非照射対照試料でのレベルに対する比として表される。各点は、ワセリン、賦形剤、またはフェニルブチレート（PB）の同じ群での5つの試料のmRNAレベルの平均を表す。矢印は、薬剤処置が、90日後に中断されたことを示す（PB処置および賦形剤群での比較で＊p＜0.05、＊＊p＜0.001）。
【図４Ｂ】局所HDAC阻害剤（フェニルブチレート（PB））有りまたは無しで処置した照射後のTGF-β2の発現レベルの変化を示す図である。照射後の皮膚におけるTGF-β2のmRNAレベルにおける一過性変動は、内部対照GAPDEに正規化され、非照射対照試料でのレベルに対する比として表される。各点は、ワセリン、賦形剤、またはフェニルブチレート（PB）の同じ群での5つの試料のmRNAレベルの平均を表す。矢印は、薬剤処置が、90日後に中断されたことを示す（PB処置および賦形剤群での比較で＊p＜0.05、＊＊p＜0.001）。
【図４Ｃ】局所HDAC阻害剤（フェニルブチレート（PB））有りまたは無しで処置した照射後のTGF-β3の発現レベルの変化を示す図である。照射後の皮膚におけるTGF-β3のmRNAレベルにおける一過性変動は、内部対照GAPDEに正規化され、非照射対照試料でのレベルに対する比として表される。各点は、ワセリン、賦形剤、またはフェニルブチレート（PB）の同じ群での5つの試料のmRNAレベルの平均を表す。矢印は、薬剤処置が、90日後に中断されたことを示す（PB処置および賦形剤群での比較で＊p＜0.05、＊＊p＜0.001）。
【図４Ｄ】局所HDAC阻害剤（フェニルブチレート（PB））有りまたは無しで処置した照射後のTNF-αの発現レベルの変化を示す図である。照射後の皮膚におけるTGF-αのmRNAレベルにおける一過性変動は、内部対照GAPDEに正規化され、非照射対照試料でのレベルに対する比として表される。各点は、ワセリン、賦形剤、またはフェニルブチレート（PB）の同じ群での5つの試料のmRNAレベルの平均を表す。矢印は、薬剤処置が、90日後に中断されたことを示す（PB処置および賦形剤群での比較で＊p＜0.05、＊＊p＜0.001）。
【図５】抗TGF-β1、2抗体を用いた免疫蛍光の写真であり、線維形成性成長因子であるTGF-βの発現を、実施例4でのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により抑制されたことを示す図である。Ａは、TGF-βで染色された正常皮膚のものである。Ｂは、任意の薬剤処置なしの照射後の7日目の急性皮膚炎の写真であり、TGF-βが、上方調節されたことを示す。Ｃは、照射後180日目の賦形剤群のものであり、TGF-βの発現が、時間とともに増大し、持続し、表皮のケラチン細胞中および真皮の筋腺維芽細胞中の両方の線維形成性皮膚で高レベルで発現されたことを示す。Ｄは、照射後180日目のPB処置群のものであり、局所PBは、TGF-β発現を有効に抑制し、真皮でのコラーゲン線維蓄積が少ないことを示す。これは、TGF-βが腺維芽細胞増殖を促進するが、上皮細胞成長を阻害するので、上皮で細胞層が多いことと十分に相関関連がある。
【図６】炎症誘発性サイトカインであるTNF-αの発現が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤により抑制されたことを示す抗TNF-α抗体を用いた免疫組織化学の写真である。Ａは、TNF-α染色についての正常皮膚のものである。Ｂは、照射後270日目のPB処置群のものであり、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、TNF-α発現を効率的に抑制する。これは、炎症性細胞浸潤が少ないこと、および慢性潰瘍形成がないことと十分に相関関係がある。Ｃは、ワセリンで処置した照射皮膚であり、TNF-αが、270日目に潰瘍形成を示す皮下組織で上方調節されたことを示す（矢印は、壊死創傷を示す）。Ｄは、賦形剤で処置した照射皮膚であり、TNF-αが、270日目に重い炎症性細胞浸潤を示す皮下組織で上方調節されたことを示す。
【図７】HDAC阻害剤による照射後の皮膚腫瘍形成の抑制を示す図である。新たに発生した皮膚または皮膚の腫瘍は、PB処置を受けなかった対照群において50週以降の照射後経時的に増大したが、PB処置群で腫瘍を発生したものはなかった。
【図８Ａ】局所フェニルブチレート（PB）が、腫瘍成長を直接的に阻害することを示す図であり、BNL 1MEA7R.1での細胞周期阻害剤であるp21Ciplタンパク質、および4mM PBでの処置の間のCT-26癌細胞の上方調節レベルの経時的解析を示す。
【図８Ｂ−８Ｃ】局所フェニルブチレート（PB）が、腫瘍成長を直接的に阻害することを示す図であり、成長阻害曲線を示す。
【図８Ｄ−８Ｆ】局所フェニルブチレート（PB）が、腫瘍成長を直接的に阻害することを示す図であり、インビボでの腫瘍成長阻害を示す。Ｄは、処置前の寸法で皮膚約0.5cm下方に1MEA7R.1の当初の腫瘍サイズを示す。Ｅは、4週でのプラセボまたは賦形剤で処置した腫瘍である。Ｆは、4週でのPB処置した腫瘍である。
【図９】照射後の皮膚におけるTGF-β1、2およびTNF-α発現の上方調節が、構造的に関連のないHDAC阻害剤（トリコスタチンAおよびバルプロン酸）によって抑制されることを示すノーザンブロットアッセイ法である。
【図１０】バルプロ酸による腫瘍放射線感作の増強を示す。点は、三重に行われた2つの異なる実験の平均を示す；SDは10％未満である。
【図１１】エプスタイン-バーウイルス（EBV）-陽性ダウジリンパ腫細胞は選択的に破壊されたが、EBV-陰性HL-60白血病細胞は、HDAC阻害剤、抗生物質および放射線の組み合わせの低い用量によっては破壊されないことを示す。Ａは、48時間の1nM TSAが、EBV-陽性ダウジ細胞中でのEBVチミジンキナーゼ活性を上方調節したことを示す。Ｂは、TSA、GCV、および放射線の組み合わせが、EBV陽性細胞の最大限の死を生じることを示す。棒は、三重に行われた3つの異なる実験の平均を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−８Ｃ】
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【図８Ｄ−８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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