(57)【要約】  【課題】  HCVコア蛋白質を標的とする薬剤の簡便な評価系を開発し、提供する。  【解決手段】  本発明者らによる酵母を用いた研究において、HCVコア蛋白質による細胞質―核間の輸送阻害作用がCoreによる酵母の増殖抑制活性と強くリンクしていることを見出した。この知見に基づく本発明は、C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、（１）C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現し得る真核細胞に被検試料を作用させる工程、（２）被検試料作用後に前記真核細胞の増殖を測定する工程が含まれる。本発明によればコア蛋白質を発現する真核細胞に、被検試料を作用させ、コア蛋白質発現酵母細胞である真核細胞の増殖を測定するだけで、簡易にCoreが有する細胞質―核内輸送阻害能を阻害し得る物質を選抜することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現している真核細胞に被検試料を作用させる工程、
被検試料作用後に前記真核細胞の増殖を測定する工程を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能が、核内輸送阻害である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記真核細胞が被核内輸送分子を保持し、被検試料存在下において、C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させた際の被核内輸送分子の核内局在を解析する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
真核細胞が酵母である、請求項１から３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質がC型肝炎ウイルスによる疾患の予防薬または治療薬の候補物質である、請求項１から４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能、とりわけ、細胞質―核間の輸送阻害機能を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス(HCV)は、非A非B型肝炎の感染の主な原因として発見され（非特許文献1, 2)、その感染により、慢性肝炎、肝硬変、肝がんへと移行することが知られている。HCVのゲノムは、約3000アミノ酸のポリプロテインをコードし(非特許文献3-5)、細胞およびウイルスのプロテアーゼによって、Core蛋白質（以下、Coreと略す）をはじめとする、少なくとも10個の異なる構造蛋白質や非構造蛋白質に分解される(非特許文献6-8)。
【０００３】
Coreは、HCVのウイルス粒子の主要な構成成分であり、ウイルスのポリプロテインがシグナルペプチダーゼによるプロセシングによってつくられる191アミノ酸の蛋白質である(非特許文献9, 10)。CoreのN末端は親水性で、塩基性アミノ酸残基に富む３つのNLS（核移行シグナル）様配列が存在する。一方、C末端は疎水性であり、CoreのC末端は異なる3種類の分解産物にプロセスされる(非特許文献10-12)。全長のp23と分解産物p21は、細胞質と核の両方に局在し(非特許文献11, 13, 14)、マイナーな分解産物p19は、核に局在している(非特許文献11, 12)。
【０００４】
Coreは、ウイルスRNAの包膜(encapsidation)に関わる(非特許文献15)だけでなく、転写(非特許文献16-19)、アポトーシス(非特許文献20-24)、形質転換(非特許文献25-28)を調節するなど、多くの細胞代謝に影響する。このことがHCVの病原性に寄与していると考えられるが、そのメカニズムは明らかになっていない。
【０００５】
本願発明者らは、酵母を用いた実験からCoreが蛋白質の細胞質―核間の輸送を阻害することを明らかにした(非特許文献29)。また、ヒト培養細胞を用いた実験では、Coreが核内輸送受容体と結合することによりDNA修復系蛋白質の核内輸送を阻害することをも見出した。すなわち、これら知見より、Coreの活性がHCVによるゲノム修復阻害、延いては肝発がんを引き起こす原因となることを強く示唆している。
【０００６】
【非特許文献１】Choo, Q. L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W., and Houghton, M. (1989) Science 244, 359-362
【非特許文献２】Kuo, G., Choo, Q. L., Alter, H. J., Gitnick, G. L., Redeker, A. G., Purcell, R. H., Miyamura, T., Dienstag, J. L., Alter, M. J., Stevens, C. E., Tegtmeier, G. E., Bonino, F., Colombo, M., Lee, W. S., Kou, C., Berger, K., Shuster, J. R., Overby, L. R., Bradley, D. W., and Houghton, M. (1989) Science 244, 362-364
【非特許文献３】Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Ohkoshi, S., Sugimura, T., and Shimotohno, K. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 9524-9528
【非特許文献４】Choo, Q. L., Richman, K. H., Han, J. H., Berger, K., Lee, C., Dong, C., Gallegos, C., Coit, D., Medina-Selby, A., Barr, P. J., Weiner, A. J., Bradley, D. W., Kuo, G., and Houghton, M. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2451-2455
【非特許文献５】Takamizawa, A., Mori, C., Fuke, I., Manabe, S., Murakami, S., Fujita, J., Onishi, E., Andoh, T., Yoshida, I., and Okayama, H. (1991) J. Virol. 65, 1105-1113
【非特許文献６】Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., and Shimotohno, K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5547-5551
【非特許文献７】Grakoui, A., Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S. M., and Rice, C. M. (1993) J. Virol. 67, 1385-1395
【非特許文献８】Hijikata, M., Mizushima, H., Tanji, Y., Komoda, Y., Hirowatari, Y., Akagi, T., Kato, N., Kimura, K., and Shimotohno, K. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 10773-10777
【非特許文献９】Santolini, E., Migliaccio, G., and La Monica, N. (1994) J. Virol. 68, 3631-3641
【非特許文献１０】Hussy, P., Langen, H., Mous, J., and Jacobsen, H. (1996) Virology 224, 93-104
【非特許文献１１】Lo, S. Y., Masiarz, F., Hwang, S. B., Lai, M. M., and Ou, J. H. (1995) Virology 213, 455-461
【非特許文献１２】Suzuki, R., Matsuura, Y., Suzuki, T., Ando, A., Chiba, J., Harada, S., Saito, I., and Miyamura, T. (1995) J. Gen. Virol. 76, 53-61
【非特許文献１３】Liu, Q., Tackney, C., Bhat, R. A., Prince, A. M., and Zhang, P. (1997) J. Virol. 71, 657-662
【非特許文献１４】Yasui, K., Wakita, T., Tsukiyama-Kohara, K., Funahashi, S. I., Ichikawa, M., Kajita, T., Moradpour, D., Wands, J. R., and Kohara, M. (1998) J. Virol. 72, 6048-6055
【非特許文献１５】Shimoike, T., Mimori, S., Tani, H., Matsuura, Y., and Miyamura, T. (1999) J. Virol. 73, 9718-9725
【非特許文献１６】Shih, C. M., Lo, S.J., Miyamura, T., Chen, S. Y., and Lee, Y. H. (1993) J. Virol. 67, 5823-5832
【非特許文献１７】Ray, R. B., Lagging, L. M., Meyer, K., Steele, R., and Ray, R. (1995) Virus Res. 37, 209-220
【非特許文献１８】Ray, R. B., Steele, R., Meyer, K., and Ray, R. (1997) J. Biol. Chem. 272, 10983-10986
【非特許文献１９】Naganuma, A., Nozaki, A., Tanaka, T., Sugiyama, K., Takagi, H., Mori, M., Shimotohno, K., and Kato, N. (2000) J. Virol. 74, 8744-8750
【非特許文献２０】Ray, R. B., Meyer, K., and Ray, R. (1996) Virology 226, 176-182
【非特許文献２１】Ruggieri, A., Harada, T., Matsuura, Y., and Miyamura, T. (1997) Virology 229, 68-76
【非特許文献２２】Ray, R. B., Meyer, K., Steele, R., Shrivastava, A., Aggarwal, B. B., and Ray, R. (1998) J. Biol. Chem. 273, 2256-2259
【非特許文献２３】Zhu, N., Khoshnan, A., Schneider, R., Matsumoto, M., Dennert, G., Ware, C., and Lai, M. M. (1998) J. Virol. 72, 3691-3697
【非特許文献２４】Marusawa, H., Hijikata, M., Chiba, T., and Shimotohno, K. (1999) J. Virol. 73, 4713-4720
【非特許文献２５】Ray, R. B., Lagging, L. M., Meyer, K., and Ray, R. (1996) J. Virol. 70, 4438-4443
【非特許文献２６】Chang, J., Yang, S. H., Cho, Y. G., Hwang, S. B., Hahn, Y. S., and Sung, Y. C. (1998) J. Virol. 72, 3060-3065
【非特許文献２７】Tsuchihara, K., Hijikata, M., Fukuda, K., Kuroki, T., Yamamoto, N., and Shimotohno, K. (1999) Virology 258, 100-107
【非特許文献２８】Ray, R. B., Meyer, K., and Ray, R. (2000) Virology 271, 197-204
【非特許文献２９】Isoyama, T., Kuge, S., and Nomoto, A. (2002) J. Biol. Chem. 277, 39634-39641
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のとおり、HCVにより肝硬変、肝癌などの肝疾患を引き起こす原因となる有力な機構が示されたが、この機構の中心となるCoreを標的とする薬剤の評価系は確立されていない。そこで、本発明者らは、Coreを標的とする薬剤の簡便な評価系を開発し、提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく、本発明者らは鋭意研究を行った結果、Coreを標的とする薬剤の評価系を開発した。すなわち、本発明者らによる酵母を用いた研究において、Core蛋白質の発現誘導に伴い酵母増殖が抑制されることを見出した。また、Coreの特定の核移行シグナルを欠失させ核内輸送阻害活性が欠損した株では、Coreによる酵母の増殖抑制能が強く抑制されることを見出した。つまり、Coreによる核内輸送阻害活性は、Coreによる酵母の増殖抑制活性と強くリンクしていた。これら知見より、本発明者らは、以下に説明する本発明のCoreを標的とする薬剤の評価系を確立した。
【０００９】
本発明は、C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法であって、（１）C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現し得る真核細胞に被検試料を作用させる工程、（２）被検試料作用後に前記真核細胞の増殖を測定する工程が含まれる。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法はC型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能、特に核内輸送阻害に影響を及ぼす物質をスクリーニングするために好適に利用することができる。
【００１１】
また、本発明のスクリーニング方法では、真核細胞の増殖に基づいて選択された被検試料の活性を確認するための工程として、前記真核細胞が被核内輸送分子を保持し被検試料存在下においてC型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させた際の被核内輸送分子の核内局在を解析する工程を含めることができる。
【００１２】
上記本発明のスクリーニング方法において、真核細胞として酵母を好適に利用することができる。また、上記スクリーニング方法において選択されたC型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質は、C型肝炎ウイルスによる疾患が起因すると強く示唆されたコア蛋白質の核内輸送阻害機能を抑制し得ることから、C型肝炎ウイルスによる疾患の予防薬または治療薬の候補物質として用いることができる。
【発明の効果】
【００１３】
上記発明に基づけば、Coreを発現する真核細胞に、被検試料を作用させ、Core発現真核生物の増殖を測定するだけで、簡易にCoreの機能、とりわけ、細胞質―核内輸送阻害機能を阻害し得る物質を選抜することが可能となる。真核細胞として、酵母を用いる利点として、ヒトと同じ真核生物でありながら、細胞の増殖速度が速いことが挙げられ、それにより迅速なスクリーニングを行うことができる。
【００１４】
上述のとおり、Coreの機能が起因して肝障害を引き起こすことが示唆されていることから、本発明のスクリーニング方法で選抜された物質は、HCVによる肝疾患の予防、治療薬そのもの、あるいはそのリード物質などの有力な候補となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Coreの発現によって生じる酵母内での核内輸送阻害作用と強い相関をもって当該酵母の増殖抑制作用が誘導されるという現象に基づき開発された。そのため、本発明のスクリーニング方法は（１）C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現し得る真核細胞に被検試料を作用させる工程と、（２）被検試料作用後に前記真核細胞の増殖を測定する工程とから構成される。
【００１６】
ここで「C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能」は、主に、細胞内での核内輸送受容体を介する蛋白質等の細胞質と核間の輸送（本明細書では「核内輸送」と表現する）を阻害する機能を意味するが、これに限定されず、Coreが有する細胞の増殖抑制と相関性がある機能であれば本発明における「C型肝炎ウイルスコア蛋白質の機能」に含めることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、Coreの核内輸送阻害能に影響（とりわけ増殖阻害作用）を与える物質のスクリーニングに好適に使用できる他、Coreの細胞増殖抑制能とリンクするCoreの他の機能に影響を与える物質のスクリーニングにも使用することができる。
【００１７】
（１）C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現し得る真核細胞に被検試料を作用させる工程
本工程で使用し得る「真核細胞」としては、Coreによる核内輸送阻害を受ける真核細胞であれば酵母などの真菌または、植物、昆虫、哺乳動物等に由来する培養細胞などを含めることができるが、好ましくは、細胞の増殖が比較的速く取扱いが容易な酵母を挙げることができる。酵母を用いた場合、多数の試料を同時に処理する大規模なアッセイ系やスクリーニング系を構築することが容易である。本スクリーニングに使用する酵母の種類は、特に問わないが、出芽酵母において本スクリーニング系が最初に確立されたことから、出芽酵母を好適に用いることができる。また、分裂酵母または他の酵母類を用いて構築してもよい。特に、全ゲノム情報が明らかになりつつある分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe） を用いた遺伝学的解析は有用である。また、上述の通り、酵母以外の真核細胞を用いてもよい。このような細胞としては、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等が含まれる。例えば酵母を用いたスクリーニングにより選択された物質について、さらに二次スクリーニングを行う際に、これらアフリカツメガエル卵母細胞やヒト細胞などの高等動物細胞を用いることも考えられる。
【００１８】
「C型肝炎ウイルスコア蛋白質」は、HCVがコードしている約3000アミノ酸のポリプロテインのうちプロテアーゼに分解されて得られる構造蛋白質の一つであり、一般的には配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができるが、本発明ではこれに限定されず、核内輸送阻害機能／真核細胞の増殖抑制機能を備えたCoreであれば、上記配列番号２にアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の欠失、付加、置換、挿入を有するアミノ酸配列からなるCoreを用いることもできる。一例を挙げれば、欠失の例として、実施例に示すΔBR２（配列番号：６）、ΔBR３（配列番号：８）などが挙げられ、これらはCoreの一部配列を欠くが、核内輸送阻害機能および真核細胞の増殖抑制機能を備えたコアと類似の蛋白質である。また、核内輸送阻害作用を有することが確認されているCore p21（アミノ酸 1-173）（図９）を用いてもよい。こうしたCoreの改変は、当業者であれば本実施例に基づいて容易に行うことができる。
【００１９】
上記Coreを真核細胞内で発現させる必要がある。Coreの発現は、CoreをコードしたDNAを発現ベクター等に担持させて真核細胞内に導入することにより実施することができる。CoreをコードするDNAとして、例えば、配列番号１に記載の配列を備えたDNAを挙げることができるが、上述した通り、Coreの核内輸送阻害機能／細胞増殖抑制機能を備えたCoreをコードする限り、本発明に用いることができる。こうした配列番号１と類似のCoreコードDNAは、具体的には配列番号５、６などに記載のDNAを挙げることができ、これ以外にも配列番号１に記載の配列を基に公知の方法で人工的に変異導入することにより得ることもできる。さらにはＨＣＶキャリアの血清からＰＣＲ法により自然発生変異CoreコードＤＮＡをクローニングしてもよい。
【００２０】
コアを発現させるための発現ベクターは、例えば、酵母を宿主として用いる場合、Yep13、Ycp50、pRS400シリーズ、pRS310シリーズ等が挙げられる。プロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、MET3プロモーター、GAPDHプロモーター、ADHプロモーター等が挙げられ、好ましくは発現を調節し得る誘導型のプロモーター、例えばgalプロモーターやMet3プロモーターなどを用いる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法 [Methods Enzymol. 194, pp182-187 (1990)]、スフェロプラスト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp1929-1933 (1978)]、 酢酸リチウム法 [J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)]等が挙げられる。
【００２１】
動物由来の培養細胞の場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（Invitrogen社）等が用いられ得る。哺乳動物細胞のプロモーターとしては、ＣＡＧ、ＣＭＶ、Ｅ１Ｆα、Ｔｅｔ制御プロモーターなどが挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポーレーション法、リポフェクション法、あるいはリン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpVL1392、pVL1393（いずれもInvitrogen社）、 pMBac（Stratagene社）、 pBacPAK8／9（Clontech社）、pAcHLT-B（PharMingen社）等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポーレーション法等が挙げられる。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法に適用し得る被検試料は、特に制限はなく、例えば、天然または合成化合物、各種有機化合物、コンビナトリアルライブラリー、天然または合成された糖類、核酸、蛋白質、ペプチド、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、あるいは菌体成分などを挙げることができる。一例としては、被検試料としての蛋白質、ペプチドには、核内輸送受容体蛋白質そのもの、その断片も望ましい被検試料の一つであり、また、HCVCoreの断片などであってもよい。核酸には、Coreに作用し得るアプタマーＲＮＡやCore mRNAに作用するリボザイムおよびsiRNA などを挙げることができる。また、核内輸送受容体遺伝子の転写を促進し得る物質を用いることも考えられる。核内輸送受容体やその遺伝子の転写を促進する物質には、HCVCoreによる抑制作用により低下した核内輸送受容体本来の機能を補う作用が期待できる。あるいは核内輸送受容体やCoreの断片は、HCVCoreによる機能阻害に対して競合的に作用することによって、核内輸送受容体本来の機能の阻害を低減させる可能性を持つ。
【００２３】
真核細胞に被検試料を作用させる方法は、被検試料の種類による。例えば、発現ライブラリープラスミドＤＮＡなどの場合には、真核細胞内に導入する。化合物、蛋白質、ペプチドなどは、真核細胞を培養している培養液などに添加する。あるいは、酵母細胞などでは寒天培地上で培養することもあるが、その場合には、寒天培地上に被検試料を塗布し、その上に酵母を接種して作用させてもよい。蛋白質、ペプチドは、培養液に添加する以外にも、これら蛋白質、ペプチドをコードするDNAを真核細胞内に導入し、真核細胞に被検試料を作用させてもよい。
【００２４】
（２）被検試料作用後に前記真核細胞の増殖を測定する工程
コアが有する核内輸送阻害機能は、コアが発現している真核細胞の増殖抑制機能を介して観察することができる。具体的には、コアが発現している真核細胞は、対照のコアが発現していない（あるいは核内輸送阻害機能を欠損したコアが発現している）真核細胞に比して、その細胞増殖速度が緩やかあるいは停止する。したがって、コアが発現している真核細胞に被検試料を作用させた後、真核細胞の増殖を測定する。なお、核内輸送阻害機能を欠損したコアの例として、ΔBR1（ΔBR1DNA配列を配列番号：３に示し、ΔBR1アミノ酸配列を配列番号：４に示す）を挙げることができる。
【００２５】
細胞増殖を測定するタイミングは、用いる真核細胞の種類により異なる。例えば、酵母細胞に比べて、哺乳動物由来の培養細胞は本来細胞分裂速度が遅いため、酵母細胞よりも測定タイミングは被検試料作用後長時間を要する。具体的には、酵母細胞の場合には、実施例に示すように、液体培養を開始し、１０時間経過以降、好ましくは24時間経過以降にコア発現株と、非発現株とで増殖に明らかな差が見られる。そのため、酵母を用いた場合には、液体培養開始少なくとも１０時間経過（好ましくは２４時間経過）以降に増殖の程度を測定する。
【００２６】
細胞増殖の測定は、酵母の場合であれば吸光度計等を用いて実施することができる。哺乳動物等の培養細胞の場合には、直接細胞数をカウントする他、トリチウチミジンなどの取り込みを指標に測定してもよい。
【００２７】
上記測定結果は対照と比較することにより判定することができる。具体的には、被検試料を作用させていないコア発現真核細胞の増殖速度のままであるか、あるいは増殖速度が対象のコアが発現していない（あるいは核内輸送阻害機能を欠損したコアが発現している）真核細胞の増殖速度に同等あるいはそれに近い程度まで回復しているかを判定する。前者の場合には、被検試料はコアの核内輸送阻害機能に抑制する活性はないと評価される。一方、後者の場合には、被検試料はコアの核内輸送阻害機能を抑制し得ると評価される。
【００２８】
（３）被核内輸送分子を保持する真核細胞において、被検試料存在下でC型肝炎ウイルスCoreを発現させた際の被核内輸送分子の核内局在を解析する工程
本発明のスクリーニング方法において、上記真核細胞の細胞増殖速度に基づいてコアの機能を抑制し得ると評価された被検試料をさらにその活性を検証する工程を加えることもできる。この検証は、核内輸送を受ける物質（本明細書では「被核内輸送分子」と表現する）を用いて、実際に被検試料がコアの核内輸送阻害機能を抑制し得るかを解析することにより実施することができる。より具体的には、被核内輸送分子を保持する真核細胞において、被検試料存在下で、C型肝炎ウイルスコア蛋白質を発現させ、当該被核内輸送分子の核内局在を直接的にあるいは間接的に解析することにより実施することができる。
【００２９】
被核内輸送分子の核内局在を直接的に解析する方法としては、例えば、被核内輸送分子に対する抗体を用いて細胞を染色し、顕微鏡下で被核内輸送分子の細胞内局在を検出することにより実施することができる。ここで用いる被核内輸送分子としては、例えば核を構成する構造蛋白質、DNA/RNAポリメラーゼサブユニット、転写因子、RNAプロセッシング因子、snRNP（small nuclear ribonucleoprotein）などが挙げられる。例えば、酵母核内輸送受容体 Pse1pを介する被核内輸送分子Yap1p (Isoyama, T. et al., 2001，J. Biol. Chem. 276: 21863-21869)、Pho4p（Kaffman, A. et al., Genes Dev. 12: 2673-2683, 1998）またはそれらの断片などを使用することができる。YAP1遺伝子の塩基配列は Ac. No. x58693に、Yap1pのアミノ酸配列は Ac. No. P19880 に示されている。また、核内輸送受容体 Kap123p に対しては、Kap123p により核内輸送されることが知られているリボソーム蛋白質 L25（Schlenstedt, G. et al., EMBO J. 16: 6237-6249, 1997）などを用いることができる。核内輸送受容体Kap104に対しては、Kap104で輸送されることが知られているNab2（Lee DC, Aitchison JD., 1999 , J Biol Chem. 274: 29031-29037.）または、その断片を用いることができる。さらに、ランダムにクローニングしたＮＬＳ配列も用いることができる。被核内輸送分子は内因的に発現される分子であってもよいが、当該被核内輸送分子またはその部分ペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入した形質転換体を用いることができる。このとき、検出が容易となるようにタグ（例えば、FlagまたはHAタグなど）を付加したり、GFPなど他の蛋白質との融合蛋白質としてもよい。使用される発現ベクターおよびベクターの導入方法は公知のものを利用することができる。
【００３０】
輸送は細胞質から核への輸送と、核から細胞質への輸送が含まれるが、本発明のスクリーニングにおいてはそのどちらか、あるいは両方を検出することができる。輸送方向は、用いる輸送分子や細胞環境を適宜調節することにより制御することができる。例えば、酵母においては、細胞を過酸化水素などにより酸化ストレス条件に置くことにより、Pse1pによる被核内輸送分子Yap1pの核局在を誘導することができる。また、Yap1pのC末欠損部分ペプチド Yap1p(1-571) などは恒常的に核局在性を示す。このような分子を用いることも可能である。なお、標的とする被核内輸送分子が由来する生物は、スクリーニングに用いる宿主真核細胞と一致していなくてもよい。すなわち、輸送機能が損なわれない限り、核内輸送受容体および／または被核内輸送分子を異種細胞で発現させることも考えられる。
【００３１】
被核内輸送分子の局在を間接的に解析する方法としては、被核内輸送分子の輸送により生じる形質の変化などを利用して輸送活性を検出する方法がある。例えば、輸送分子が転写因子である場合、その蛋白質の転写活性化能を指標に検出することができる。Yap1pは酵母のAP-1様転写因子であり、標的遺伝子のプロモーター領域のYap1p結合配列に結合して転写を活性化する。従って、Yap1pによる標的遺伝子の発現を検出することによって核内輸送受容体によるYap1pの輸送機能を評価することが可能である。転写因子でなくとも、輸送分子の細胞内局在の変化によりある種の遺伝子の発現に変化が生じたり、細胞の生存や増殖、またはその他の表現型が影響を受ける場合には、それらの表現型を指標にして、同様のアッセイまたはスクリーニングを行うことができる。例えば、標的とする核内輸送受容体により輸送される分子により、それに応答性の遺伝子の発現が誘導される場合、これらの応答性遺伝子の発現を解析することによって、核内輸送受容体の輸送機能を検出することができる。
【００３２】
遺伝子の発現の検出は、転写レベル、翻訳レベルの検出の他、発現によって生じる生化学的・生物学的変化により検出することが可能である。例えば、転写産物の検出はノーザンブロット法（T. Maniatis et al., 1987, In "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, pp.201-206）、またはRT-PCR法（A.L. Shaffer et al., 1990, Anal. Biochem., 190: 292-296）などの方法により行うことができる。翻訳産物の検出は、抗体を用いたウェスタンブロット法、免疫沈降、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA; I. Roitt et al., 1989, In "Immunology", The C.V. Mosby Co., pp25.5-25.6）、EIA、RIA、免疫組織化学的染色法などを用いて行うことができる。抗体は公知の方法に従って作製することが可能である。
【００３３】
また、例えば、実施例に記載したように、被核内輸送分子により発現が調節される遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したベクターを細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現を指標にすれば、より簡便に被核内輸送分子の局在変化を検出することができる。レポーター遺伝子としては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、CAT、アミノ酸代謝酵素、細胞毒素などの遺伝子が挙げられる。また、輸送分子に他の機能蛋白質を付加した融合蛋白質を細胞で発現させ、付加した蛋白質の機能を指標に細胞内局在の変化を検出することも考えられる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法により、Coreの核内輸送阻害機能を抑制することが確認された被検試料は、抗コア薬候補、すなわちHCVが起因する肝疾患を予防、治療するための薬剤そのもの、あるいはその有力な候補物質となる。
【００３５】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
GalactoseによるCore発現酵母の増殖阻害
出芽酵母TW株(△Yap1)（以下、「TW株」という）を宿主として、このTW株をGFP HA Yap1 発現ベクター（pRS314cupGFP-HA-Yap1）及び HCV core 発現ベクター（pRS425Gal1-Core）で形質転換し、合成培地SRM(-Trp, Leu, Ura)寒天培地で培養し、それぞれ「Yap1発現株」、「Yap1&Core発現株」を作製した。得られたYap1発現株、Yap1&Core発現株および宿主TW株をSRM(-Trp, Leu, Ura)液体培地を用い30℃にて対数増殖期(OD595≒0.6)となるまで振とう培養した。
【００３７】
各培養液をOD595 = 0.005となるようにSRMあるいはSRM+3% galactose液体培地に希釈後、96 well plateに 100μlずつ分注し、30℃で24時間、振とう培養した。この培養液を経時的にOD595で測定し、galactose存在下での各株の増殖を解析した。
【００３８】
その結果、Coreを発現するYap1&Core発現株では、galactose存在下（すなわち、Coreの発現誘導を行った条件下）の培養では、galactose非存在（Coreが発現していない条件）下の場合と比べ、酵母の増殖が著しく阻害された（図１左に示すグラフ）。培養24時間経過後にOD値の比率が最大となり、その時点でのGal+/Gal-の割合が約6%であった（図１右に示すグラフ）。一方、TW株、Yap1発現株では、galactose存在下、非存在下での増殖に大きな違いはみられなかったことから、galactoseの存在あるいは非存在による非特異的な影響ではなく、Core発現による特異的な増殖阻害であることが示されている（図１左に示すグラフ）。
【実施例２】
【００３９】
GalactoseによるCore及びNLS様領域欠損Core発現誘導の確認
Coreにおける核内輸送受容体と相互作用する部位の同定を試みた。ここでは塩基性アミノ酸領域(NLS様領域)欠損Core発現ベクター、Δ-BR1, Δ-BR2, Δ-BR3を構築した。これらベクター（Δ-BR1, Δ-BR2,およびΔ-BR3）、Coreの全長をコードしたベクター（Core191）、コントロールの空の発現ベクター（pRS425）並びにYap1発現ベクターを準備した。Core蛋白質等はいずれもgalactose存在下で発現が誘導されるように設計した。
【００４０】
上記各ベクターでTW株を形質転換した。各形質転換体をSRM(-Trp, Leu, Ura)液体培地3mlに対して、OD595=0.05となるように接種し、培養した。培養液がOD595=0.5となったら、培養液を半分に分け、一方に3% galactoseを加えた。2時間培養後、sonicationにより細胞を破砕し、その遠心上清をSDS-PAGEし、anti-Core-515 antibody（東京都臨床医学研究所、小原道法博士より分与していただいた。Kashiwakuma, T., Hasegawa, A., Kajita, A., Takata, A., Mori, H., Ohta, Y., Tanaka, E., Kiyosawa, K., Tanaka, T., Tanaka, S., Hattori, N., and Kohara, M., 1996, J. Immunol. Methods 190, 79-89.）でWestern blottingした。
【００４１】
ウェスタンブロッティングの結果、galactose存在下の培養においてCore191, Δ-BR1, Δ-BR2, Δ-BR3の各蛋白質の発現が確認された（図２）。なお、各蛋白質のサイズは次の通りである。Core191: 20.8kDa, DBR1: 19.6kDa, DBR2: 19.9kDa, DBR3: 19.1kDa。
【実施例３】
【００４２】
GalactoseによるCore及びNLS様領域欠損Core発現酵母の増殖阻害
a）液体培養でのOD595比較
上記実施例２の方法でYap1発現株、Yap1&Core発現株、Yap1&Core Δ-BR1発現株、Yap1&Core Δ-BR2発現株、Yap1&Core Δ-BR3発現株を作製した。これらを実施例１の方法で培養し、経時的にOD595を測定した。
【００４３】
液体培養条件において、Galactoseによって、各Core蛋白質発現株の増殖が阻害され、阻害された程度は、以下の順で大きかった（図３）。ΔBR1 < Core191 = ΔBR3 < ΔBR2。
【００４４】
b）寒天培地でのコロニー形成能の比較
上記液体培養に用いた株について、対数増殖期に達した培養液をSRM(-Trp, Leu, Ura)寒天培地および、3% galactoseを含むSRM(-Trp, Leu, Ura)寒天培地に塗布、30℃で培養した。これら寒天培地上でのコロニー形成能を比較した。
【００４５】
寒天培地上においても、Galactoseによって、各Core蛋白質発現株の増殖が阻害され、阻害の程度は、液体培養のときと同様に、ΔBR1 < Core191 = ΔBR3 < ΔBR2の順で大きかった。
【実施例４】
【００４６】
スクリーニング系の精度
上記実施例１の方法で、Yap1&Core発現株を培養し、24時間後のOD595を測定し、精度を示すCV (Coefficient of Variation)、およびアッセイ系の質を示すZ’ factorを求めた（図５）。
【００４７】
（ａ）Galactose -/+条件での24時間後のOD595値の96wellの間の精度
下記式（１）に基づきＣＶを求めた。
CV(Coefficient of Variation)=標準偏差／平均x100(%)    （１）
Galactose-: 平均値OD595 = 0.643、標準偏差  0.022、CV = 3.4%
Galactose+:平均値OD595 = 0.079、標準偏差  0.003、CV = 3.8%
以上のような結果となり、Galactose添加により、増殖阻害が起きていることが明瞭である。また、CV < 5%であることが、ばらつきの少なさを示す一定の基準であり、これを満たしている。
【００４８】
（ｂ）アッセイ系の質
次の式（２）で算出されるZ’factorを求めた。
Z’factor=1-3x(標準偏差(Gal-)+標準偏差(Gal+))／|平均(Gal-)-平均(Gal+)|    （２）
その結果、Z’factor = 0.87であった。これは、 Z’> 0.5 であることが、アッセイとして有意なものであることの基準であり、これを満たしている。
【実施例５】
【００４９】
GalactoseによるCore発現酵母の増殖阻害におけるgalactoseの量依存性
上記実施例１に記載された培養条件において、培養液をOD595 = 0.005となるように希釈する際、galactose濃度を、A) 0.15%, 0.3%, 0.75%, 1.5%, 3%, および、B) 3 x 10-4%, 3 x 10-3%, 3 x 10-2%, 3 x 10-1%, 3%に調製し、培養開始24時間後のOD595を測定し、Core発現酵母の増殖阻害におけるgalactoseの量依存性を検証した。
【００５０】
Ａ）のgalactose濃度条件の結果を図６Ａに示し、Ｂ）のgalactose濃度条件における結果を図６Ｂに示す。図６Ｂに示されている通り、galactose濃度、3 x 10-3  %から 3 x 10-1  %の間で、量依存に酵母の増殖が阻害されていることが示された。なお、グラフBの横軸はgalactose濃度の対数をとっている。
【実施例６】
【００５１】
CoreまたはNLS様領域欠損Core発現による転写因子Yap1の酵母核内輸送阻害
本実施例ではYap1の核内移行を利用したβ-galactosidase解析系を用いた。この解析系の原理を図１０に示す。酵母細胞内でYap1は標識分子のGFPとの融合蛋白質として発現させる。Yap１が核移行すると、核内に導入されているβgalactosidase遺伝子の上流のTRX2-Pに作用してβ-galactosidaseの発現を促進させる。一旦、核内に移行したYap１は細胞を過酸化水素などにより酸化ストレス条件では、Crm1を介する核外への輸送が阻害され核内にとどまり、β-galactosidaseの発現が維持される。一方、Coreが発現している酵母では、Yap１の核内輸送が阻害されてYap1は細胞質にとどまり、Yap1によるβ-galactosidaseの発現は阻止される。従って、本解析系ではβgalactosidaseの発現を指標にYap1の核内への輸送を間接的にモニタすることができる。
【００５２】
上記原理に基づく解析系を次の通り実施した。予めβgalactosidaseレポーター遺伝子を保持したTW (ΔYap1)株に、NLS様領域欠損Core発現プラスミド（Δ-BR1, Δ-BR2, Δ-BR3）、Core全長の発現プラスミド（Core191）のいずれかとYap1発現プラスミドとでコトランスフェクションし、Yap1&Core発現株、Yap1&Core ΔBR1発現株、Yap1&Core ΔBR2発現株、Yap1&Core ΔBR3発現株を調製した。これら形質転換体とさらに対照のTW (ΔYap1)株をSRM(-Trp, Leu, Ura)液体培地で対数増殖期となるまで培養した。この培養液に3% galactoseを添加し、30℃、2時間培養を続けた。培養液を100μlずつ、96 well plateに分注し、0.5mM H2O2を添加し、30℃、1時間培養を続けた。このplateを遠心分離にかけ、上清を除き、0.1M Tris-HCl(pH7.5)-0.05% Triton X-100を25μl加え、懸濁した。-80℃、10min.で凍結後、室温に戻し解凍した。β-galactosidaseの基質となる4mg/ml ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside) 25μlとZ-buffer (60mM Na2HPO4, 40mM NaH2PO4, 10mM KCl, 1mM MgSO4)を100μl加えた。生成したo-Nitrophenolの吸収を OD405で、酵母細胞の濁度をOD620で測定し、以下の式（３）により、β-galactosidase活性を算出した。
β-galactosidase活性=(OD405-[blank])/([OD620-blank]*[反応時間])    （３）
【００５３】
上記解析の結果を図７に示す。全長Core発現株、ΔBR2発現株、BR3発現株では、Galactose非存在下（すなわちCore発現が抑えられている）のときに比べ、Galactose存在下(すなわちCore発現が誘導されている)ときでは、β-galactosidase活性が約60%〜70％に低下し、Core、ΔBR2、ΔBR3によりYap1の核内輸送が阻害されていることが示唆された。一方、ΔBR1発現株では、Galactoseの存在、非存在で活性に差が見られず、Yap1の核内輸送の阻害活性が消失していることが示唆された。
【実施例７】
【００５４】
Core及びNLS様領域欠損Core発現による転写因子Yap1の酵母核内輸送阻害
実施例６の結果を検証するために、GFP HA Yap1融合蛋白質の細胞内分布をGFPの蛍光発光を基に解析した。実施例６で用いたYap1&Core発現株、Yap1&Core ΔBR1発現株をSRM(-Trp, Leu, Ura)液体培地で対数増殖期となるまで培養した。この培養液に3% galactoseを添加し、30℃、2時間培養を続ける。これを0.5mM H2O2存在下あるいは非存在下で蛍光顕微鏡により観察した。
【００５５】
全長Core発現株では、H2O2存在下かつGalactose非存在下において核で強い蛍光発光が観察され、GFP HA Yap1融合蛋白質が核内に局在することが示され、またH2O2存在下かつGalactose存在（Coreの発現誘導）下では、細胞質で蛍光発光が観察され、GFP HA Yap1融合蛋白質が細胞質に分布することが示された（図８）。ΔBR1発現株では、H2O2存在下かつGalactose非存在下または存在下ともに核で蛍光発光が観察され、GFP HA Yap1融合蛋白質が核内に局在することが示された。すなわち、これら結果より全長Coreの発現によってYap1の核内輸送は阻害されるが、ΔBR1発現によっては、Yap1の核内輸送は阻害されないことが確認された。
【実施例８】
【００５６】
Core及びNLS様領域(basic resion)欠損Core発現酵母における、核内輸送阻害と増殖阻害の関係
上記Core191, p21, p19, ΔBR1,ΔBR2, ΔBR3の各蛋白質の発現株において、核内輸送阻害アッセイ、増殖阻害アッセイを行った結果を以下の表にまとめた。なお、p21とp19の核内輸送阻害の結果は、Isoyama, et al. (2002) JBC 277, 39634-39641（論文では、ここで示すp21をp19と、またp19をp16と表記している）に掲載されているin vivoのアッセイ系の結果について記載している。
【００５７】
図９、表１に示す通り、核内輸送阻害活性の強弱と、増殖阻害活性の強弱との間に相関があった。すなわち、この結果よりCoreの核内輸送阻害活性について、酵母の増殖阻害活性を指標にモニタすることができることがわかる。このことは、上述したような、Yap1などの核内輸送物質の動向を解析するような煩雑な操作を要する解析を行うことなく、酵母の細胞増殖を指標にCore蛋白質の核内輸送阻害活性をモニタすることができることを示している。さらに言えば、Coreの核内輸送活性に対するアンタゴニストのスクリーニングを実施する場合、Coreを発現している酵母株に被検試料を作用させ、Coreによる酵母増殖抑制活性が低減された被検試料を選抜することにより、Coreの核内輸送活性を阻害するアンタゴニストの候補物質を簡易に選抜することが可能となることを意味している。このスクリーニング系により、多数の試料を簡便に処理することが可能となる。
【００５８】
〔表1〕Coreの欠損変異と核内輸送阻害、増殖阻害との相関性
核内輸送阻害    増殖阻害
core(p23)        ○            ○
p21              ○            ○
p19             弱い       かなり弱い
ΔBR 1          弱い          弱い
ΔBR 2           ○            ○
ΔBR 3           ○            ○
【産業上の利用可能性】
【００５９】
HCVCore蛋白質は、核内輸送阻害作用を有する。そのため、HCVが宿った肝臓細胞では、遺伝子修復等に関わる蛋白質の核内輸送が阻害され、遺伝子の忠実な複製、修復に影響がもたらされ、結果として肝硬変、肝癌などの肝機能が障害される可能性が高い。本発明のスクリーニング方法では、こうした疾患の原因となるコアの核内輸送阻害作用を、酵母など真核細胞の増殖抑制作用という簡易な指標に置き換え、酵母の増殖を測定するという簡易な操作でHCVCoreの核内輸送阻害作用を抑制し得る物質を選択することが可能となる。本スクリーニング系は、永年課題とされていたHCVの予防薬、治療薬の開発のブレークスルーとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Galactose添加によるCore発現酵母の増殖阻害を検出した結果を示すグラフである。
【図２】Galactose添加によるCore及びNLS様領域欠損Coreの発現誘導を行った結果を示す写真である。各発現蛋白質はAnti-Core-515 antibody を用いてWestern blottingにより検出した。各蛋白質のサイズは次の通りである。Core191: 20.8kDa, ΔBR1: 19.6kDa, ΔBR2: 19.9kDa, ΔBR3: 19.1kDa。
【図３】液体培養におけるGalactoseによるCore及びNLS様領域欠損Core発現酵母の増殖曲線を示す。
【図４】寒天培地上において、GalactoseによるCore及びNLS様領域欠損Core発現酵母の増殖結果を示す写真である。
【図５】Core発現酵母増殖阻害アッセイ系の精度を示す。
【図６】Core発現酵母の増殖阻害がCoreの発現を誘導するgalactoseの濃度に依存することを示す。
【図７】Core全長とNLS様領域欠損CoreによるYap1に対する核内輸送阻害作用をYap1の転写活性化能を指標に解析した結果を示す。
【図８】core全長あるいはΔBR 1発現下でのGFP HA Yap1融合蛋白質の細胞内分布を示す写真である。
【図９】CoreおよびNLS様領域欠損Core 等を模式的に示し、各株の右には核内輸送阻害作用の程度を示す。
【図１０】実施例６で実施した解析系の原理図を示す。
【図１】
2005151847.tif 000002
【図２】
2005151847.tif 000003
【図３】
2005151847.tif 000004
【図５】
2005151847.tif 000005
【図６】
2005151847.tif 000006
【図７】
2005151847.tif 000007
【図９】
2005151847.tif 000008
【図１０】
2005151847.tif 000009
【図４】
2005151847.tif 000010
【図８】
2005151847.tif 000011
【配列表】
2005151847000001.app