(57)【要約】【課題】  抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているβ−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンをきのこから選択的に抽出分画することのできる新しい取得方法と、この方法により得られる新しいβ−グルカン多糖類を提供する。【解決手段】  担子菌類ヒダナシタケ目きのこの細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊した後に、強アルカリ抽出してβ−グルカンのうちの１種以上の多糖類を分画取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌類ヒダナシタケ目きのこの細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊した後に、強アルカリ抽出してβ−グルカンのうちの１種以上の多糖類を分画取得することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項２】
多段階で強アルカリ抽出することを特徴とする請求項１のきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項３】
強アルカリ抽出に際してＮａＢＨ4を添加することを特徴とする請求項１または２のきのこ由来のβ−グルカン各糖類の取得方法。
【請求項４】
次亜鉛素酸ナトリウムおよびＤＭＳＯのうちの１種以上によりきのこ細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかのきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項５】
β−グルカン多糖類が、β−（１→３）グルカン、β−（１→６）グルカン並びにβ−（１→６）グルシル分岐β−（１→３）グルカンの構造を有する１種以上であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかのきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項６】
分子量が2,000,000以上であることを特徴とする請求項５のきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項７】
分子量が400,000前後であることを特徴とする請求項５のきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法。
【請求項８】
担子菌類ヒダナシタケ目きのこから強アルカリにより抽出分画されたβ−グルカン多糖類であって、β−（１→３）グルカン、β−（１→６）グルカン、並びにβ−（１→６）グルシル分岐β−（１→３）グルカンの構造のうちのいずれかを有することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類。
【請求項９】
分子量が2,000,000以上であることを特徴とする請求項８のきのこ由来のβ−グルカン多糖類。
【請求項１０】
分子量が400,000前後であることを特徴とする請求項８のきのこ由来のβ−グルカン多糖類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているβ−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンをきのこから選択的に抽出分画することのできる新しい取得方法と、この方法により得られる新しいβ−グルカン多糖類に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
きのこ細胞壁は多糖類・たんぱく質・脂質などから構成される天然高分子の集合体である。この中で多糖類は最も主要な成分で細胞壁の約４０〜７０％を占めている。この多糖類は細胞壁に独特の形を与え、子実体を形成する骨格材料として大きな役割を果たしていると考えられているが、その組成、階層構造や化学的・物理的性質の詳細はわかっていない。特に堅い子実体のマイタケやハナビラタケ等の担子菌類ヒダナシタケ目のきのこについては、特に主要な部分の構造、組成が全く分かっていない。一方きのこは古くから和漢薬、民間薬として強壮・鎮静・血圧降下など数々の薬効の他に癌などの難病にも効果があることが語り継がれてきた。近年その抗腫瘍活性や生理活性の根拠がβ−（１→３）グルカン、β−グルカンからなる多糖構造体にあることが実証された。これまで幾つかのきのこから熱水抽出法、酸、アルカリを繰り返し用いた抽出法、酵素分解法など様々な抽出法が示された。しかしながら、複雑な多組成を持つきのこの細胞壁中から上記グルカンを単離する一般的方法は示されていない。特に、堅い外観のヒダナシタケ目細胞壁から効率的に抽出、分画する方法は示されていない。
【０００３】
このような状況において、この出願の発明者らは、種々検討した結果、あらかじめアセトン、エタノール脂質を十分に除き、続いてＮａＣｌＯ4で水素結合を予備的に破壊する
と、α−グルカンが除去されて、いわゆる粘着性のある物質が除かれることと、その後ＤＭＳＯで水素結合力を弱くすると、タンパク質やキチン質をほとんど含まない、α型とβ型の複合糖質がほぼ選択的に得られることを見出した（非特許文献１）。
【非特許文献１】高分子学会第５０回北陸支部研究発表会予稿第６１頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、発明者らによるこれまでの検討においては、担子菌類ヒダナシタケ目きのこからβ−グルカン構造を有する多糖類を選択的に取得することは可能とされていなかった。
【０００５】
そこで、この出願の発明はこのような背景から、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているβ−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンをきのこから選択的に抽出分画することのできる新しい取得方法と、この方法により得られる新しいβ−グルカン多糖類を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、担子菌類ヒダナシタケ目きのこの細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊した後に、強アルカリ抽出してβ−グルカンのうちの１種以上の多糖類を分画取得することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を提供する。
【０００７】
また、上記の方法について、第２には、多段階で強アルカリ抽出することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を、第３には、強アルカリ抽出に際してＮａＢＨ4を添加することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン各糖類の取得方法を提供する。
【０００８】
そして、この出願の発明は、第４には、次亜鉛素酸ナトリウムおよびＤＭＳＯのうちの１種以上によりきのこ細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊することを特徴とする上記いずれかのきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を提供する。第５には、β−グルカン多糖類が、β−（１→３）グルカン、β−（１→６）グルカン並びにβ−（１→６）グルシル分岐β−（１→３）グルカンの構造を有する１種以上であることを特徴とする上記いずれかのきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を、第６には、分子量が2,000,000以上であることを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を、第７には、分子量が400,000前後であることを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類の取得方法を提供する。
【０００９】
さらに、この出願の発明は、第８には、担子菌類ヒダナシタケ目きのこから強アルカリにより抽出分画されたβ−グルカン多糖類であって、β−（１→３）グルカン、β−（１→６）グルカン、並びにβ−（１→６）グルシル分岐β−（１→３）グルカンの構造のうちのいずれかを有することを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類を提供し、第９には、分子量が2,000,000以上であることを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類を、第１０には、分子量が400,000前後であることを特徴とするきのこ由来のβ−グルカン多糖類を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
以上のとおりのこの出願の発明によって、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているβ−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンをきのこから選択的に抽出分画することのできる新しい取得方法と、この方法により得られる新しいβ−グルカン多糖類が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の最良の形態について説明する。
【００１２】
この出願の発明においては、まず、きのこの細胞壁の水素結合を弱め、もしくは破壊し、その後に強アルカリ抽出する。この際の水素結合を弱め、もしくは破壊するための手段としては、たとえば、次亜塩素酸塩や過塩素酸塩、スルホン酸塩、パーフルオロスルホン酸塩、あるいは各種の酸化剤、もしくはＤＭＳＯ，ＤＭＦ等の有機溶媒がそれらの例として挙げられ、なかでも、次亜塩素酸ナトリウムやＤＭＳＯがその好適な例として示される。
【００１３】
そして、この出願の発明における強アルカリによる抽出は、通常は、１Ｍ以上のＮａＯＨ，ＫＯＨ等のアルカリ水溶液を用いることによって実施される。特に、この出願の発明においては、β−グルカンの選択的取得のためには、後述の例にも示したように、濃度が順次増大された強アルカリ水溶液を用いて多段階で抽出することが有効である。
【００１４】
また、この強アルカリ水溶液には、抽出時に還元末端からのピーリング反応による多糖類の分解、低分子化を防ぐために、ＮａＢＨ4を添加することが有効でもある。
【００１５】
そして、この出願の発明の抽出分画法を実施するに際しては、あらかじめ、きのこ原料のケトンあるいはアルコールによる洗浄を行うこと、また、低濃度アルカリ水溶液による
α−グルカンの選択的分離を行うことも考慮される。
【００１６】
対象とするきのこについては、従来、その抽出分画が容易ではなかった担子菌類ヒダナシタケ目きのこのうちの各種のものであってよい。たとえば、マイタケ、ハナビラタケ、ヒイロタケ等である。いずれの場合にも、β−グルカンの選択的取得が可能になる。
【００１７】
そこで、さらに詳しく、＜Ａ＞マイタケからの多糖類の抽出、＜Ｂ＞ハナビラタケ並びに＜Ｃ＞ヒイロタケからの多糖類の抽出を例として説明する。
【００１８】
なお、以下の例においては、抽出多糖と比較するために標準多糖を使用しており、この標準多糖の俗称、単離起源、化学構造を表１に示した。デンプン、カードランは和光純薬工業（株）、デキストランはナカライテスク（株）、パスツランはCalbiochem Co.からそれぞれ入手したものであり、シゾフィランは台糖（株）から入手したものである。シゾフィランの構造は〔化１〕に示したようにβ−（１→３）グルカンを主鎖に持ち、そのグルコース残基３つ毎に、１つのβ−（１→６）のグルコピラノシル残基を持つβ−（１→６）の分岐したβ−（１→３）グルカンである。
【００１９】
【表１】
2005133069.tif 000002
【００２０】
【化１】
2005133069.tif 000003
＜Ａ＞マイタケからの多糖類の抽出分画
抽出処理に際し、マイタケ試料としては、その子実体の白い柄の部分を凍結乾燥後、乳鉢で粉砕、粉末化して試料とした。凍結乾燥は東京理化器械Freeze Dryer FD-1, Dry Chamber DRC-1Nを用い、１０日間行なった。白い柄の部分を使用したのは次の理由からである。（１）多糖はマイタケ細胞壁の主成分であり、その硬い骨格形成に寄与している。したがって、多糖は子実体の中でも硬い部位である柄に多く存在すると推測した。（２）子実体全部を使用した場合、傘の黒い色素成分の除去が必要になる、多糖の抽出工程を簡略化するため、また、多糖の純度を向上させるためにも柄の部分のみ用いた。
【００２１】
例  １
分画工程を表２に示した。まず遠心管にマイタケ粉末８．４ｇを入れ、洗浄溶媒アセトン２００ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌した。その後、９，５００ｒｐｍで４０分間、遠心分離し、沈殿物として脱脂マイタケ粉末を得た。洗浄溶媒としてはエタノール等のアルコールでもよい。次いで脱脂マイタケ粉末に、０．１Ｍ水酸化ナトリウム２００ｍｌ、次亜塩素酸ナトリウム２５ｍｌを加え、冷蔵庫（３℃）で１２時間静置した。その後、９，５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上澄み液と次亜塩素酸ナトリウム不溶沈殿物(Residue-1)とに分けた。上澄み液には溶媒の４倍容量（薬８００ｍｌ）のエタノールを加え、冷蔵庫で１２時間静置後、生じた沈殿物を遠心分離で回収した（以後、エタノール沈殿と称す）。こうして得られた沈殿物をエタノールで洗浄後、減圧乾燥して次亜塩素酸ナトリウム抽出物（茶白色）を得た。Residue-1はエタノール、アセトンの順で洗浄、乾燥後、ジメチルスルホキシド１００ｍｌに懸濁させ、９０℃で２０分間、攪拌処理、次いで、５５℃で１０分間、超音波処理を行った。これを３回反復後、９，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液とジメチルスルホキシド不溶沈殿物(Residue-2)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で生じた沈殿物を遠心分離で回収し、エタノール、アセトンで洗浄、減圧乾燥してジメチルスルホキシド抽出物（黄白色）を得た。さらに、Residue-2はエタノール、アセトンの順で洗浄、乾燥後、１．２５Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍｌに懸濁させ、３０℃で１時間、攪拌処理を行った。処理後、遠心分離で上澄み液と１．２５Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-3)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）を回収し、エタノールアセトンで洗浄後、減圧乾燥した。続いて、Residue-3はエタノール、アセトンの順で洗浄、乾燥後、５Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍｌに懸濁させ、３０℃で１時間、攪拌処理を行った。処理後、遠心分離で上澄み液と最終残渣(Residue-4)に分けた。上澄み液からは、エタノール沈殿で５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）を回収し、エタノール、アセトンで洗浄後、減圧乾燥した。
【００２２】
【表２】
2005133069.tif 000004
１）マイタケ粉末の洗浄
マイタケから多糖部分を純粋に得ようとすれば、共存する脂質やタンパク質を予め除去しなければならない。ここではアセトンまたはエタノールを用いて、脂質除去のための洗浄溶媒をそれぞれの抽出液の1Ｈ ＮＭＲ解析から決定した。アセトンとエタノール抽出液の1Ｈ ＮＭＲスペクトルの０．２ｐｐｍのシグナルは炭化水素に因るものであり、オレイン酸、リノール酸などの不飽和脂肪酸のスペクトルによく一致している。このことからアセトン、エタノールどちらでも脂質除去できることがわかった。しかし、エタノール抽出液のスペクトルでは３〜５．５ｐｐｍに糖質のシグナルが観測され、脂質と共に糖質も溶解していることがわかった。したがって、多糖をnativeに近い状態で得るためには、脂質のみを除去するアセトンが洗浄溶媒により適していると判断される。
２）化学分析による抽出物の評価
上記の分画工程の操作で得られた各抽出物を評価するために、それらの糖含有率および窒素値を調べた。また、収率も求め、あわせて表３に示した。窒素値は各抽出物がタンパク質、キチン質から分離された糖質であるかを判断するために用いた。
【００２３】
【表３】
2005133069.tif 000005
次亜塩素酸ナトリウム抽出物は収率１６％と高かったが、他の抽出物と比較して窒素値が高く、糖含有率は低かった。したがって、タンパク質を多く含むことが推測された。ジメチルスルホキシド抽出物、１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物は、低い窒素値、高い糖含有率からタンパク質、キチン質をほとんど含まない多糖であることが推測された。さらに、１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物の収率は２４％と非常に高かった。５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物の糖含有率が６４％と低かったのは、抽出に用いた水酸化ナトリウム濃度が高いため、抽出物を回収するエタノール沈殿で水酸化ナトリウムの析出が起こり、抽出物中に混入したためではないかと考えられる。これを支持する結果として、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物とナトリウムの炎色反応（橙色）が一致した。
【００２４】
最終残渣の窒素値はキチン質に由来すると考えられる。
３）ＨＰＬＣによる抽出多糖の構成単糖の同定
抽出多糖の構成単糖を調べるため、多糖を塩酸で加水分解して、得られた単糖をＨＰＬＣで分析した。図１に各抽出多糖の加水分解生成単糖のクロマトグラムを示した。全ての抽出多糖から得られた単糖はグルコースに同定できた。したがって、抽出多糖はグルコースから構成されるグルカンであることがわかった。
４）ＦＴ−ＩＲスペクトルによる抽出多糖のα、β結合様式の判定
多糖の一次構造を推定するためには、糖残基配列のグリコシド結合型を決定しなければならない。そこで、迅速に結合様式を調べるため、抽出多糖のＦＴ−ＩＲスペクトルを測定した。多糖のＦＴ−ＩＲスペクトルでは糖残基のアノマー位のＣＨ変角振動（以後、δＣＨ）に由来するピークからその結合様式を推定できる。図２は、標準多糖にデキストラン（α−グルコシド結合型）とカードラン（β−グルコシド結合型）を用い、抽出多糖と比較したＦＴ−ＩＲスペクトルである。デキストランのδＣＨは８４６ｃｍ-1、カードランのδＣＨは８９０ｃｍ-1にそれぞれ観測され、そのδＣＨ由来のピークから抽出多糖のグルコシド結合型を次のように推測した。次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖とジメチルスルホキシド抽出多糖はα型δＣII（８４６ｃｍ-1）、β型δＣＨ（８９０〜８８０ｃｍ-1）由来のピークが観測され、α型、β型が共存する多糖であることが推定された。１．２５Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ型δＣＨ（８９０〜８８０ｃｍ-1）が観測され、β型多糖に帰属できた。
５）1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルによる抽出多糖の構造解析
糖残基のグルコシド結合位置を調べ、一次構造を決定するために1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトル解析を行った。1Ｈ ＮＭＲ測定に供した抽出多糖は、溶媒（ＤＭＳＯｄ6／Ｄ2Ｏ＝６／１）に可溶な次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖およびジメチルスルホキシド抽出多糖である。13Ｃ ＮＭＲ測定は次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖を除く全抽出多糖に対して行った。
【００２５】
1Ｈ ＮＭＲスペクトルによる構造解析は、標準多糖（デンプン、カードラン、パスツラン、シゾフィラン）と比較し、構成糖残基のアノメリックプロトンの帰属から行った。一般にα−グルコシド結合型のアノメリックプロトンは５．００〜５．４５ｐｐｍの領域にスピン結合定数Ｊ1,2  ３．５Ｈｚを、β−グルコシド結合型は４．５０〜４．８０ｐｐｍの領域にＪ1,2  ７．８Ｈｚを示すので、結合配向の区別ができる。
【００２６】
図３に次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖、ジメチルスルホキシド抽出多糖および標準多糖の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した。（ａ）はα−グリコシド結合型多糖であるデンプンのスペクトルである。アノメリックプロトンのピークが５．１３ｐｐｍ（Ｊ1,2 ３．５Ｈｚ）に観測された。（ｂ）、（ｃ）はβ−グルコシド結合型多糖のカードラン（β−（１→３）グルカン）とパスツラン（β−（１→６）グルカン）のスペクトルである。アノメリックプロトンのピークはカードラン、パスツランそれぞれ４．５６ｐｐｍ（Ｊ1,2 ７．８Ｈｚ）、４．３０ｐｐｍ（Ｊ1,2 ７．８Ｈｚ）にダブレットとして観測された。パスツランの４．０２ｐｐｍのダブレットピークは６位の炭素に結合しているプロトンに帰属した。このように、カードランとパスツラのアノメリックプロトンが正確に帰属できたことは、その積分値からβ−（１→３，１→６）グルカンの分岐様式を決定できることを示唆している。そこで、分岐様式が既知であるシゾフィランのスペクトル（ｄ）が実際の構造を定量的に反映しているかを検討した。（ｄ）のスペクトルの帰属はカードランとパスツランを参考に行い、４．５３〜４．５８ｐｐｍのシグナルはβ−（１→３）グルカンに、４．２６ｐｐｍのシグナルはβ−（１→６）グルカンにそれぞれ帰属した。そして、これらのピーク面積比を求めたところβ−（１→３）グルカン／β−（１→６）グルカン＝３／１であり、実際のシゾフィランの構造とよく一致した。また、この結果より、４．５３〜４．５８ｐｐｍのシグナルは３つのダブレットが重なったピークであることもわかった。このように、アノメリックプロトンの積分値からシゾフィランの分岐様式を決定することができたので、次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖、ジメチルスルホキシド抽出多糖についても同様に解析した。
【００２７】
（ｅ）、（ｆ）には次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖、ジメチルスルホキシド抽出多糖のスペクトルをそれぞれ示したが、次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖のアノメリックプロトンは５．１２，４．９５ｐｐｍ（Ｊ1,2  ３．５Ｈｚ）、４．３０ｐｐｍ（Ｊ1,2ｚ）のシグナルは、α−（１→３）グルカンに由来することが後に観測された。
【００２８】
したがって、次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖はα−（１→３），α−（１→４），β−（１→６）グルカンを持つことが推測された。同様に、ジメチルスルホキシド抽出多糖のスペクトルも次のように帰属した。５．１０，４．９５ｐｐｍのシグナルはそれぞれα−（１→４），α−（１→３）グルカンに、４．５５〜４．５８ｐｍｍ、４．２５〜４．３１ｐｐｍのシグナルはそれぞれβ−（１→３），β−（１→６）グルカンに帰属した。これよりジメチルスルホキシド抽出多糖はα−（１→３），α−（１→４），β−（１→３），β−（１→６）グルカンを持ったことが推測された。
【００２９】
ただ、多糖同士が枝分かれ構造を有しているかどうかは、1Ｈ ＮＭＲスペクトルは存在する分子構造の平均的観測から得られる情報であり、またアノメリックプロトンだけで構造を推測しているため、この分岐点を確認することは困難である。しかし、多糖分析において、メチル化法や酵素分解など他の分析法にはないＮＭＲ法の利点（少量の試料で、迅
速に、短時間で、構造を壊すことなく解析できる）を活かすために、そして、これまでの報告や先に述べたシゾフィランの構造決定をふまえて、ここでは、β−グルカンに関しては分岐型を有していると推測した。なお、α−グルカンについては直鎖、分岐鎖を推測することはできなかった。
【００３０】
13Ｃ ＮＭＲによる構造解析はジメチルスルホキシド、１．２５Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖に対して行った。はじめに、α−，β−グルコシド結合様式による13Ｃ ＮＭＲスペクトルの違いをメチルα−Ｄ−グルコピラノシド、メチルβ−Ｄ−グルコピラノシドで確認した。そのスペクトルのメチル基が結合している１位の炭素（Ｃ−１）のピークに着目すると、β型Ｃ−１はα型Ｃ−１よりも低磁場側に現れ、このことから、グルコシド結合型をＣ−１のピークから推定できることがわかった。次に、β−グルカンの標準多糖としてカードランとパスツランを用い、その13Ｃ ＮＭＲスペクトルを比較した。糖の水酸基がグルコシル化を受けると、直接結合している炭素のピークが大きく低磁場シフトする特徴が知られている（グルコシル化シフト）が、カードランとパスツランの13Ｃ ＮＭＲスペクトルでは、カードランのＣ−６のシグナルは６０．８ｐｐｍに表われているが、パスツランのＣ−６のシギナルは６９．８ｐｐｍに移動している。また、パスツランのＣ−３シグナルは７５．４ｐｐｍに現れているが、カードランのＣ−３のシグナルは８６．１ｐｐｍに移動している。このように移動したのはグルコシル化を受けた炭素のみであるため、β−（１→３）グルカンではＣ−３，β−（１→６）グルカンでは、Ｃ−６がそれぞれに特有のシグナルであると決定した。
【００３１】
ジメチルスルホキシド抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを図４に示した。Ｃ−１のピークに関して、α−グルカン由来のピークが９９．４〜１０１．３ｐｐｍに、β−グルカン由来のピークが１０２．７〜１０３．６ｐｐｍに観測された。このα，β型の共存はＦＩ−ＩＲスペクトル、1Ｈ ＮＭＲスペクトル結果と一致した。β−グルカンは1Ｈ ＮＭＲスペクトルからの構造決定によるとβ−（１→３，１→６）グルカンであったが、その構造に特徴的なシグナルが13Ｃ ＮＭＲスペクトルでも観測された。それは８６．１ｐｐｍに現れたダブレットのシグナルであり、β−（１→３）グルカンのＣ−３に帰属した。β−（１→６）グルカンに由来するＣ−６のシグナルは６８〜７６ｐｐｍの複雑なピーク群中にあり正確な帰属は困難であった。そして、この13Ｃ ＮＭＲスペクトルと先に示した1Ｈ ＮＭＲスペクトルから、ジメチルスルホキシド抽出多糖はα−（１→３），α−（１→４），β−（１→３），β−（１→６）グルカンを持つことが13Ｃ ＮＭＲスペクトルからも推定された。
【００３２】
次に、１．２５Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は1Ｈ ＮＭＲ解析できなかったため13Ｃ ＮＭＲスペクトルから一次構造を決定した。しかし、一般に1Ｈ ＮＭＲとは異なり、13Ｃ ＮＭＲスペクトルにはピーク面積の定量性がないと言われる。一つには完全デカップリングに付随して直接結合しているプロトンが多いほど強度が向上すること、もう一つは1Ｈ ＮＭＲと比較して感度が悪いため積分の精度が悪くなる点である。そこで、その問題点を回避するためにプロトン数が同じ炭素核同士を比較し、ピーク面積を秤量する方法を採った。はじめに、この方法で正確に構造決定できるかを調べるため、標準多糖にシゾフィランを用いて13Ｃ ＮＭＲスペクトルを測定した。
【００３３】
しかし、図５（ａ）に示したスペクトルはこれまでに報告のあるシゾフィランのスペクトルと一致しなかった。それは、（１）８８ｐｐｍ付近にはっきりと現われるはずの主鎖β−（１→３）グルカンのＣ−３のシグナルがほとんど観測できない、（２）６２ｐｐｍ付近に一本のシャープなシグナとして現れるはずの主鎖β−（１→３）グルカンのＣ−６のシグナルが４本に分裂している、という２つの大きな違いであった。
【００３４】
この異なったスペクトルの原因は次のように考えることができる。すなわち、13Ｃ ＮＭＲスペクトル測定温度が４０℃と比較的高温であり、またＳ／Ｎ比を向上させるため約２０，０００回の積算が必要で、測定に１７時間を要す。そのため、この測定条件が水酸化ナトリウムによる主鎖β−（１→３）グルカンの分解を生じさせ、Ｃ−３のシグナルの消失や分解生成物による出るはずのないピークの出現につながったと考えられる。また、過酷なアルカリ条件下ではβ−（１→３）グルカンの還元末端から分解が生じるとも報告されている。そこで、β−（１→３）グルカンの分解を防ぐため還元末端を保護して再度同条件下で13Ｃ ＮＭＲスペクトルを測定した。還元末端の保護は測定溶媒である重水素
化された０．２５Ｍ水酸化ナトリウムに水酸化ホウ素ナトリウムを添加し（５ｍｇ／ｍｌ）、還元末端のアルデヒドをアルコールに還元することで行った。そのときのスペクトルを図５（ｂ）に示した。８７．４ｐｐｍにＣ−３のシグナルがはっきり現れ、６２．１ｐｐｍのＣ−６のシグナルも一本となったスペクトルが得られ、報告されたシゾフィランのスペクトルとよく一致した。そこで、次にピーク面積比から構造決定した。
【００３５】
Ｃ−１，Ｃ−６ともに主鎖／側鎖＝３／１となりシゾフィランの構造とよく一致した。したがって、13Ｃ ＮＭＲスペクトルによる構造決定も可能なことが確認された。そこで、以下に説明する13Ｃ ＮＭＲスペクトルはＮａＢＨ4存在下で測定したものである。
【００３６】
次に、１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の構造解析を行った。ここで、β−（１→６）グルカンのＣ−６を正確に帰属するため、ＤＥＰＴ法でβ−（１→６）グルコシド結合するＣ−６を帰属した。パルス幅は１３５°に設定し、水素原子が２個結合した炭素核のみ下向きのシグナルとして検出できるようにした。つまり、Ｃ−６のシグナルだけ下向きに出現するようにした。１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲ（ＤＥＰ
Ｔ１３５）スペクトルを図６に示した。水素原子が２個結合した炭素核に由来する下向きのシグナルが４つ観測できた。最も高磁場側に現れた５８．５ｐｐｍのシグナルはエタノールのメチレン基に帰属できた。このエタノールは洗浄に用いたものである。６２．２ｐｐｍの強いシグナルはグルコシル化を受けていないＣ−６であり、また、８７．６ｐｐｍにグルコシル化シフトしたＣ−３も観測されたことより、β−（１→３）グルカンのＣ−６に帰属した。７０．２ｐｐｍのシグナルはグルコシル化シフトしたＣ−６であり、β−（１→３）グルカンのＣ−６に帰属した。この２つのＣ−６（６２．２，７０．２ｐｐｍ）を比較すると明らかに６２．２ｐｐｍのシグナルの方が強いため、このシグナルに由来するβ−（１→３）グルカンを主鎖、７０．２ｐｐｍのシグナルに由来するβ−（１→６）グルカンを側鎖と考えた。６３．８ｐｍのシグナルはこれまでの報告から側鎖として存在するβ−（１→６）グルカンの非還元末端Ｃ−６に帰属した。そこで次に、同じ１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖を通常の13Ｃ ＮＭＲ測定し、そのスペクトルから一次構造を推定した。図７に１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した。Ｃ−６のシグナルは上で述べたＤＥＰＴ法に従って帰属した。Ｃ−１の帰属については、これまでの報告から、１０４．６，１０４．１ｐｐｍのシグナルをそれぞれ主鎖Ｃ−１、側鎖Ｃ−１に、また７４．９，７４．７ｐｐｍのシグナルをそれぞれ側鎖Ｃ−２、主鎖Ｃ−２に帰属した。そして、この各ピーク面積比を表４に示した。
【００３７】
【表４】
2005133069.tif 000006
Ｃ−６のピーク面積比について、主鎖の整数値８には側鎖と結合しているグルコース残基のＣ−６（分岐点Ｃ−６）は含まれていない。この分岐点のＣ−６は側鎖の整数値５に含まれる。したがって、Ｃ−６の面積比から誘導されるグルコース残基の並びが推定される。そして、Ｃ−１、Ｃ−２の主鎖／側鎖は２／１である。
【００３８】
次式
【００３９】
【数１】
2005133069.tif 000007
により算出される。
【００４０】
多糖の分岐度は０．２であり、主鎖のグルコース残基５つ毎に１つの側鎖を持つことが推測された。したがって、１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の化学構造は〔化２〕に示したように主鎖にβ−（１→３）グルカン、側鎖にβ−（１→６）グルカンを有し、主鎖のグルコース残基５つ毎に１つの側鎖を持ち、その側鎖長は２〜３であることが推定された。
【００４１】
【化２】
2005133069.tif 000008
次に、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを図８に示した。ピークの帰属は１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖と同様に行った。そして、構造を推定するためＣ−１とＣ−６のピーク面積比を求めたが、主鎖／側鎖が一致しなかった。そこで、Ｃ−３のシグナルを次のように帰属し面積比を求めたところＣ−１のピーク面積比と一致したのでＣ−１とＣ−３から構造を推定した。すなわち、Ｃ−３の帰属は８８．０ｐｐｍのダブレットピークを主鎖β−（１→３）グルカンに、７６．４ｐｐｍのピークを側鎖β−（１→６）グルカンにそれぞれ帰属した。各ピーク面積比を表５に示した。
【００４２】
【表５】
2005133069.tif 000009
６）抽出多糖のコンホメーション
β−（１→３）グルカンは低アルカリ濃度溶液中ではヘリックス構造、高アルカリ濃度溶液中ではランダムコイル構造を有し、そのヘリックス−コイル転移は０．２２〜０．２５Ｍ水酸化ナトリウム濃度範囲で生じることが知られている。そこで、抽出多糖の溶液中におけるコンホメーションをCongo Red−多糖の錯体形成に伴う可視吸収スペクトルの最
大吸収波長（λmax）から推測した。
【００４３】
抽出多糖−Congo Red 錯体の可視吸収スペクトルから得られた最大吸収波長と水酸化ナトリウム濃度との関係を図９に示した。すべての抽出多糖でCongo Redのλmaxシフトが観測された。まず１．２５Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖において０．１５Ｍ以下の低アルカリ濃度溶液中で大きなλmaxシフト（５１０〜５１５ｎｍ）が観測され、ヘリックス構造を有していることが推測された。そして、ラダムコイル構造への転移も０．１５〜０．２０Ｍ範囲で観測された。このようにヘリックス−コイル転移が現れたことは、１．２５Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖がβ−（１→３）グルカンを持つ多糖分子であることを示し、13Ｃ ＮＭＲスペクトルから推測した一次構造（主鎖β−（１→３）グルカン）と一致した。また、ジメチルスルホキシド抽出多糖にも低アルカリ溶液中でλmaxの長波長側へのシフト（５００〜５０５ｎｍ）が観測された。これも先と同様にβ−（１→３）グルカンの存在を示し、1Ｈ ＮＭＲスペクトルから推定した一次構造と一致した。しかし、このλmaxシフトはカードラン、シゾフィランそして上で述べたアルカリ抽出多糖と比較して小さい。それは、β−（１→３）グルカンの存在率が１３％と低く、錯体を形成していないCongo Redの影響を受けて短波長側に現れたためだと考えられる。一方、β−（１→３）グルカンを持たない次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖にもCongo Redの長波長側へのλmaxシフト（５００〜５１０ｎｍ）が観測され、高アルカリ濃度溶液中でも５００ｎｍ以上のλmaxを示した。これはこの画分中に多くのタンパク質の存在が推測されるため、タンパク質−Congo Red錯体に由来するλmaxシフトと示唆される。
【００４４】
以上のことから、β−（１→６）分岐型のβ−（１→３）グルカンはマイタケ細胞壁中において分子内で水素結合を形成し、ヘリックス構造を有することが推測された。これは、マイタケ子実体の堅い骨格形成に寄与し、構造を支えることを示唆している。
７）抽出多糖の分子量
抽出多糖の分子量をSepharose CL-4Bゲルろ過クロマトグラフィーで測定した。
【００４５】
図１０に抽出多糖のゲルろ過クロマトグラムをまとめた。すべての抽出多糖で幅広い分子量分布が確認された。次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上に由来するフラクションが１５５ｍｌに観測され、加えてオリゴ糖に由来するフラクションも３８０〜５００ｍｌに観測された。次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖と比較してジメチルスルホキシド抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上に由来するフラクションが減少し、Ｍｗ：260,000（２５０ｍｌ）を中心とする分子量分布を示した。
【００４６】
１．２５Ｍおよび５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上（フラクション１）とＭｗ：180,000を中心とする（フラクション２）２つのフラクションが観測された。ここで、フラクション２の多糖はフラクション１の多糖分子の抽出過程で分解を受けたものを含むと考えられる。
【００４７】
抽出多糖中に含まれるタンパク質のゲルろ過クロマトグラムによると、タンパク質は４４０〜４８０ｍｌに溶出し、その吸光度は次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖で最大だった。これは次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖に多くのタンパク質が含まれていることを示している。また、抽出順にタンパク質の吸光度も減少したため、タンパク質も段階的に除去されることがわかった。次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖の１５５ｍｌに溶出したタンパク質はＭｗ：2,000,000以上の糖鎖に結合しているタンパク質だと推測される。
８）まとめ
以上の例からは次のことが理解される。
【００４８】
（１）マイタケ粉末の前処理はアセトンによる脂質除去とした。（２）マイタケ細胞壁中の多糖類を次亜塩素酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、１．２５Ｍおよび５Ｍの水酸化ナトリウムで逐次抽出した。（１）次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖はタンパク質を多く含有するが、α−（１→３），α−（１→４），β−（１→６）グルカンを持つ多糖であることが推測される。そして、その分子量は2,000,000以上からオリゴ糖までの幅広い分布を有していた。（２）ジメチルスルホキシド抽出多糖はα−（１→３），α−（１→４），β−（１→３），β−（１→６）グルカンを持つ多糖であることが推測される。そして、その分子量は260,000を中心に広く分布していた。また、０．１５Ｍ水酸化ナトリウム濃度以下の水溶液でβ−（１→３）グルカン由来のヘリックス構造が観測された。（３）１．２５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は２４％の最高収率で得られ、β−（１→６）グルシル分岐したβ−（１→３）グルカンであることが推定される。また、主鎖β−（１→３）グルカンに由来するヘリックス−コイル転移が０．１５〜０．２０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で観測された。そして、その分子量は2,000,000以上と180,000を中心とする２つの分子量分布を持つことが推測される。（４）５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）グルカン／β−（１→６）グルカン＝５／３で存在する多糖であり、β−（１→３）グルカンに由来するヘリックス−コイル転移が０．１５〜０．２０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で観測された。そして、そのβ−（１→３，１→６））グルカンの分子量は2,000,000以上と180,000を中心とする２つの分子量分布を持つことが推測される。なお、最終残査はキチン質を４．６％含有していたが、残存するβ−グルカンとの混合物であった。
【００４９】
以上の例１の結果を踏まえて、より選択的に多糖類をその構造別に分画することが試みられる。以下の例２はその一つの形態を例示したものである。
【００５０】
例  ２
分画工程を表６に示した。遠心管にマイタケ粉末１０．０ｇを入れ、アセトン２００ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌洗浄した。その後、９，５００ｒｐｍで４０分間、遠心分離し、沈殿物として脱脂マイタケ粉末を得た。これに０．１Ｍ水酸化ナトリウム２００ｍｌを加え、３℃で１２時間静置した。その後、９，５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上澄み液と０．１Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-1)とに分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で生じた沈殿物を遠心分離で回収し、エタノール、アセトンの順で洗浄、減圧乾燥して０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（薄茶色）を得た。次にResidue-1をジメチルスルホキシド１５０ｍｌに懸濁させ、８０℃で２時間攪拌処理後、９，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液とジメチルスルホキシド不溶沈殿物(Residue-2)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で生じた沈殿物を遠心分離で回収し、エタノール、アセトンで洗浄、減圧乾燥してジメチルスルホキシド抽出物（茶色）を得た。さらに、Residue-2は１Ｍ水酸化ナトリウム１５０ｍｌに懸濁させ、４０℃で２４時間、攪拌処理を行った。処理後、遠心分離上で上澄み液と１Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-3)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）を回収し、エタノール、アセトンで洗浄後、減圧乾燥した。続いてResidue-3に対して１Ｍ水酸化ナトリウム抽出と同様の処理を３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウムで逐次行い、３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）をそれぞれ得た。そして、５Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-5)には、再び５Ｍ水酸化ナトリウム１５０ｍｌを加え、５５℃で３時間超音波処理を行った。その後、遠心分離で上澄み液と最終残査(Residue-6)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で抽出物を回収することはできなかった。
【００５１】
【表６】
2005133069.tif 000010
１）化学分析による抽出物の評価
上記表６に例示した分画法で得られた各抽出物の糖含有率、窒素値、収率を表７にまとめた。０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物は他の抽出物と比較して窒素値６．２％と非常に高く、また糖含有率は３３％と低いことからタンパク質を多く含有することが推定される。ジメチルスルホキシド，１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物は窒素値が低く、糖含有率も７２〜８８％と高いことからマイタケ中のタンパク質やキチン質をほとんど含まない多糖であることが推測される。そして、１Ｍ，３Ｍ水酸化ナトリウム抽出物の収率もそれぞれ１２％と高かった。超音波処理を用いた５Ｍ水酸化ナトリウム抽出ではその抽出物を得ることができなかった。これより、残渣に残存するβ−グルカンは非常に強固な分子鎖を持ち、高アルカリによっても抽出され難いことがわかる。
【００５２】
【表７】
2005133069.tif 000011
２）ＨＰＬＣによる抽出多糖の構成単糖の同定
抽出多糖の加水分解生成単糖のＨＰＬＣクロマトグラムによると、全ての抽出多糖の構成単糖はグルコースに同定できた。これは抽出多糖がグルカンであることを示している。
【００５３】
３）ＦＴ−ＩＲスペクトルによる抽出多糖のα，β結合様式
図１１に示したＦＴ−ＩＲスペクトルの観測によると、ジメチルスルホキシド抽出多糖は８４６ｃｍ-1にα型δＣＨ由来のピークがはっきりと観測され、α−グルカンであることがわかる。そして、１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は８８０ｃｍ-1にβ型δＣＨ由来のピークが観測されβ−グルカンであることが推定される。一方、０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は糖含有率が低いため多糖δＣＨ由来のピークがはっきりと観測されず、結合様式を推測できない。
４）1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルによる抽出多糖の構造解析
一次構造を決定するために1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲ解析を行った。1Ｈ ＮＭＲ解析に供した抽出多糖はＮＭＲ溶媒（ＤＭＳＯ−ｄ6／Ｄ2Ｏ＝６／１）に溶解した０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖とジメチルスルホキシド抽出多糖、13Ｃ ＮＭＲ解析に供した抽出多糖は１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖である。
【００５４】
図１２（ａ）に示すように０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の1Ｈ ＮＭＲスペクトルではα−（１→３）グルカンに由来すると考えられるアノメリックプロトンのシグナルが４．９５ｐｐｍ（Ｊ1,2  ３．５Ｈｚ）に観測され、それ以外の多糖に由来するシグナルは観測されなかった。このため、０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は単一のα−（１→３）グルカンであると推測される。また、図１２（ｂ）のジメチルスルホキシド抽出では、まず５．１０ｐｐｍにα−（１→４）グルカンに由来するアノメリックプロトンのシグナルが強く観測された。そして、４．９４，４．２７ｐｐｍにそれぞれα−（１→３），β−（１→６）グルカンに帰属できるシグナルも観測されたが非常に弱く、さらに、その積分比がα−（１→４）／α−（１→３）／β−（１→６）＝１５／１／１であった。この事実から選択的にα−（１→４）グルカンが抽出されていることがわかった。
【００５５】
例１では、次亜塩素酸ナトリウム抽出多糖とジメチルスルホキシド抽出多糖がα，β型の混合多糖であったのに対し、多糖組成別に分画抽出できたことを示している。
【００５６】
１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲスペクトルは図１３にまとめて示した。ピークの帰属は例１に従い、その一次構造はＣ−１，Ｃ−６のピーク面積比から推測した。各抽出多糖のピーク面積比を表８にまとめ、それから推測した多糖の化学構造を〔化３〕に示した。１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）結合したグルコース残基４つに１つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカン、３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）結合したグルコース残基３つに１つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカンと考えられる。そして、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）結合したグルコース残基３つに１つのβ−（１→６）グルコシ分岐鎖を持ち、その分岐鎖長が２つであるβ−グルカン、またはβ−（１→３）結合したグルコース残基３つに２つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカンであると考えられる。
【００５７】
これらの多糖を比較すると、アルカリ濃度を順次高めることで主鎖β−（１→３）グルカンに対する側鎖β−（１→６）グルカンの割合が増大する傾向を示した。このことは、この段階的アルカリ処理が多糖分子の水素結合の弱い順からの抽出を目的とした処理であったことを考慮すると、（１）分子内、分子間の水素結合による分子鎖の部分的な接触や絡み合いなどの強い相互作用は、分岐度や側鎖長に依存し、高度に分岐した多糖分子ほど抽出され難いこと、（２）このように強い水素結合を有し、抽出され難い分子鎖がマイタケ細胞壁の骨格を形作る主要な構築物質であることが示唆されている。
【００５８】
【表８】
2005133069.tif 000012
【００５９】
【化３】
2005133069.tif 000013
５）抽出多糖のコンホメーション
抽出多糖−Congo Red錯体の可視吸収スペクトルから得られた最大吸収波長と水酸化ナトリウム濃度との関係を図１４に示した。１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は０．１７５Ｍ以下の低アルカリ濃度溶液中において、Congo Redのλmax（４８５〜４９０ｎｍ）が大きく長波長側にシフトし（５１０〜５１５ｎｍ）、多糖分子のヘリックス構造が推測される。そして、１Ｍ，３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖においては０．１７５〜０．２０Ｍのアルカリ濃度範囲でλmaxの急激な短波長側へのシフトが観測され、多糖分子
のランダムコイル構造への転移も観測された。これは、多糖一次構造の主鎖β−（１→３）グルカン部分に由来するヘリックス−コイル転移だと推測される。しかし、同様にβ−（１→３）グルカンを有する５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖−Congo Red溶液では０．２Ｍ以上の高アルカリ濃度溶液においても長波長側にλmaxを与えた。すなわちヘリックス構造をとり続けた。これについては、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は主鎖β−（１→３）／側鎖β−（１→６）＝３／２であり他の抽出多糖と比較して側鎖β−（１→６）グルカンの存在率が高く、高度に分岐した多糖分子であるため、側鎖による分子内あるいは分子鎖間の水素結合点が増え、会合や凝集が促進されて、高アルカリ濃度溶液中でもランダムコイルに転換しない強固ならせん状分子鎖を形成している、と考えられる。そして、このように抽出され難く、かつ、強固ならせん状の多糖分子鎖がマイタケの硬い骨格形成に深く関与していると考えられる。
【００６０】
一方、α−グルカンである０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖、ジメチルスルホキシド抽出多糖は低アルカリ濃度溶液中でもヘリックス構造に由来するCongo Redのλmaxシフトは観測されず、ランダムコイルを有していた。
６）抽出多糖の分子量
図１５に示すように、すべての抽出多糖でＭｗ：2,000,000以上（フラクション１）に由来するフラクションが溶出量１５５ｍｌに観測された。そして、１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖においては高アルカリ抽出多糖になるに従ってフラクション１が減少し、また、セカンドフラクション（フラクション２）の増加と低分子化も観測された。このフラクション２については、高アルカリ抽出多糖になるに従って低分子側にピークがシフトしたこと、およびオリゴ糖画分（４６０ｍｌ）が観測されたことはフラクション１の分解多糖の存在を強く支持している。このときの多糖分子の分解は還元末端からの酸化的分解だと考えられる。
【００６１】
α−（１→３）グルカンである０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上とオリゴ糖画分を与えた。α−（１→４）グルカンであるジメチルスルホキシド抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上とＭｗ：380,000の２つの分子量画分を示した。
【００６２】
また、抽出多糖中に含まれるタンパク質のゲルろ過クロマトグラムによれば、タンパク質は４４０〜４８０ｍｌに溶出し、その吸光度は０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物で最大だった。これは、この画分中のタンパク含有率が高いことを表している。つまり、０．１Ｍ水酸化ナトリウム処理はα−（１→３）グルカンを選択的に抽出する方法でもあるが、マイタケ中のタンパク質を除去し、それ以降の抽出工程で多糖の分離、抽出を容易にするための処理としても位置付けられる。また、ジメチルスルホキシド抽出物の１５５ｍｌに現れたピークはＭｗ：2,000,000の多糖分子に結合しているタンパク質に由来すると推測される。
７）まとめ
マイタケ細胞壁多糖の選択的な分画と処理の簡略化を図り、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド、１Ｍ，３Ｍ，５Ｍ水酸化ナトリウムで逐次抽出する方法によって、（１）０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は単一なα−（１→３）グルカンであったがタンパク質を多く含有していた。多糖の分子量は2,000,000以上とオリゴ糖画分を有し、水溶液中でのコンホメーションはランダムコイルであった。（２）ジメチルスルホキシド抽出ではα−（１→４）グルカンを選択的に得た。そして、その分子量は2,000,000以上と380,000の２つの分布を持ち、水溶液中ではランダムコイル構造を有していた。（３）１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は収率１２％で得られ、β−（１→３）結合したグルコース残基４つに１つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカンであると考えられる。そして、低アルカリ濃度溶液中ではヘリックス構造を有し、０．１７５〜０．２０Ｍのアルカリ溶液中でランダムコイル構造に転移した。また、このβ−グルカンの分子量は2,000,000以上から400,000の広い分布を示した。（４）３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は収率１２％で得られ、β−（１→３）結合したグルコース残基３つに１つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカンであると考えられる。そして、低アルカリ濃度溶液中ではヘリックス構造を有し、０．１７５〜０．２０Ｍのアルカリ溶液中でランダムコイル構造に転移した。また、このβ−グルカンの分子量は2,000,000以上から380,000の広い分布を示した。（５）５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は高度にβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンと考えられる。そして、高アルカリ溶液中でもそのコンホメーションはヘリックスを有し、分子内あるいは分子間の強い相互作用が示唆された。また、このβ−グルカンの分子量は2,000,000以上から160,000の広い分布を示した。（８）最終残渣はキチン質を２８．５％含有していたが、残存するβ−グルカンとの混合物であった。
【００６３】
例１に比べて多糖を選択的に分画抽出することができた。ただ、段階的なアルカリ抽出では多糖分子の分解が還元末端から酸化的に生じることが推測された。
【００６４】
例  ３
強アルカリによる抽出では主鎖β−（１→３）グルカンの分解、低分子化が示唆された。そこで、例３では、分解を誘起すると考えられる多糖還元末端のアルデヒド基を水素化ホウ素ナトリウムでアルコールに還元保護してから抽出を行った。処理は、抽出剤である水酸化ナトリウム溶液に水素化ホウ素ナトリウムを３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、抽出に供した。
【００６５】
また、前記の例１および例２では、最終残渣中にはβ−グルカンの残存が確認された。そして、このβ−グルカンは非常に強固ならせん状分子鎖を有し、キチン質と複合体を形成している可能性もある。そこで、例３では、β−グルカンの完全抽出を次のように試みた。
【００６６】
すなわち、段階的水酸化ナトリウム抽出で生じた残渣をジメチルスルホキシドで超音波抽出し、さらに、その残渣に対しては３Ｍ水酸化ナトリウムで超音波抽出を行うこととした。この処理法は次の２つの考えに基づいている。（１）超音波処理は分子同士の凝集や会合などの相互作用を物理的に弱め、分子鎖を互いに無関係に動けるような状態にすることが期待できる。（２）ジメチルスルホキシドは多糖のヘリックス構造をランダムコイル構造に転換させる高い能力を有するため、多糖の強固ならせん状分子鎖を伸ばすことが期待できる。そして、自由に伸びた状態の多糖分子は３Ｍ水酸化ナトリウムで逐次的に抽出できると考えられる。
【００６７】
以上のことを考慮して、表９に示した分画工程を実施した。まず、遠心管にマイタケ粉末１０．０ｇを入れ、アセトン２００ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌洗浄した。その後、９，５００ｒｐｍで４０分間、遠心分離し、沈殿物として脱脂マイタケ粉末を得た。これに０．１Ｍ水酸化ナトリウム２００ｍｌを加え、室温で２時間攪拌処理した。その後、９，５００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上澄み液と０．１Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-1)とに分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で生じた沈殿物を遠心分離で回収し、エタノール、アセトンの順で洗浄、減圧乾燥して０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（薄茶色）を得た。次にResidue-1をジメチルスルホキシド１５０ｍｌに懸濁させ、８０℃で２時間攪拌処理後、９，５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液とジメチルスルホキシド不溶沈殿物(Residue-2)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で生じた沈殿物を遠心分離で回収し、エタノール、アセトンで洗浄、減圧乾燥してジメチルスルホキシド抽出物（茶色）を得た。さらに、Residue-2は水素化ホウ素ナトリウム４５０ｍｇを含む１Ｍ水酸化ナトリウム１５０ｍｌに懸濁させ、４０℃で２４時間、攪拌処理を行った。処理後、遠心分離で上澄み液と１Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-3)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で沈殿物を回収し、副生成物として含まれるホウ酸はメタノールによる洗浄を５回繰り返すことで除去した。その後、この画分はエタノール、アセトンで洗浄し、減圧乾燥し１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）とした。続いて、Residue-3に対して１Ｍ水酸化ナトリウム抽出と同様の処理を３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウムで順次行い、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）をそれぞれ得た。そして、５Ｍ水酸化ナトリウム不溶沈殿物(Residue-5)には、ジメチルスルホキシド１００ｍｌを加え、９０℃で１時間攪拌処理、続いて５５℃で１時間超音波処理を行った。その後、遠心分離（９，５００ｒｐｍ、３０分間）で上澄み液とジメチルスルホキシド不溶沈殿物(Residue-6)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿により抽出物を回収できなかった。次にResidue-6は水素化ホウ素ナトリウム３００ｍｇを含む３Ｍ水酸化ナトリウム１００ｍｌに懸濁させ、９０℃で１時間攪拌処理、続いて５５℃で１時間超音波処理を行った。その後、遠心分離で上澄み液と最終残渣(Residue-7)に分けた。上澄み液からはエタノール沈殿で抽出物を回収し、メタノール、アセトンで洗浄後、減圧乾燥し、超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出物（白色）を得た。
【００６８】
【表９】
2005133069.tif 000014
１）化学分析による抽出物の評価
以上の分画法で得られた各抽出物の糖含有率、窒素値、収率を表１０にまとめた。０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物は他の抽出物と比較して窒素値５．４％と非常に高く、また糖含有率は３８％と低いことからタンパク質を多く含有することが推定された。そして、ジメチルスルホキシド、１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出物、超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出物は窒素値が０．２〜１．１％と低く、糖含有率は７５〜９２％と高いことからタンパク質やキチン質をほとんど含まない多糖であることが推測された。
【００６９】
【表１０】
2005133069.tif 000015
また、β−グルカンの完全抽出を目的に行った２つの処理のうち、超音波−ジメチルスルホキシド処理からその抽出物を得ることはできなかったが、超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム処理からはその抽出物が収率７％で得られた。これは、期待したとおり、これまで抽出されなかった多糖の強固ならせん状分子鎖が超音波−ジメチルスルホキシド処理によって伸ばされたことや超音波処理によって多糖分子同士の凝集や会合などの相互作用が減少したことが多糖の可溶化につながったと推測される。
２）ＨＰＬＣによる抽出多糖の構成単糖の同定
抽出多糖の加水分解生成単糖のＨＰＬＣクロマトグラムによって、全ての抽出多糖の構成単糖はグルコースに同定できた。これより、抽出多糖はグルコースからなるホモグルカンであることがわかった。
３）ＦＴ−ＩＲスペクトルによる抽出多糖のα、β結合様式
ＦＴ−ＩＲスペクトルの観測によると、図１６に示したように、ジメチルスルホキシド抽出多糖は８４６ｃｍ-1にα型δＣＨ由来のピークがはっきりと観測され、α−グルカンであることが確認された。また、１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖にもα型δＣＨ由来のピークが観測された。しかし、この画分にはβ型δＣＨ由来のピークも観測されることから、α，β型グルカンの混合物であることが推測される。そして、３Ｍ、５Ｍおよび超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は８８０ｃｍ-1にβ型δＣＨ由来のピークが観測されβ−グルカンであることを示した。一方、０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はδＣＨ由来のピークが観測されず、結合様式を推測できなかった。これは、この画分が低い糖含有率のため明確なδＣＨのピークを与えなかったと考えられる。
４）1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルによる抽出多糖の構造解析
その一次構造を決定するために1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲ解析を行った。1Ｈ ＮＭＲ解析に供した抽出多糖はＮＭＲ溶媒（ＤＭＳＯ−ｄ6／Ｄ2Ｏ＝６／１）に溶解した０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖とジメチルスルホキシド抽出多糖、13Ｃ ＮＭＲ解析に供した抽出多糖は１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖および超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖である。
【００７０】
図１７（ａ）に示すように、０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の1Ｈ ＮＭＲスペクトルではα−（１→３）グルカンに由来すると考えられるアノメリックプロトンのシグナルが４．９５ｐｐｍ（Ｊ1,2 ３．５Ｈｚ）に観測され、それ以外の多糖に由来するシグナルは観測されなかった。これは、この画分が単一のα−（１→３）グルカンであることを示す。また、図１７（ｂ）のジメチルスルホキシド抽出では、５．１０ｐｐｍにα−（１→４）グルカンに由来するアノメリックプロトンのシグナルが強く観測され、α−（１→３）、β−（１→６）グルカンに帰属できるシグナルも４．９４、４．２７ｐｐｍにそれぞれ観測された。そして、その積分比がα−（１→４）／α−（１→３）／β−（１→６）＝１７／２／１であったことから選択的にα−（１→４）グルカンが抽出されていることがわかった。このことは、α−グルカンに対する組成別の分画抽出が達成されたことを示している。
【００７１】
１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖および超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを図１８にまとめて示した。ピークの帰属は例１に従い、その一次構造はＣ−１、Ｃ−６のピーク面積比から推測した。各抽出多糖のピーク面積比を表１１にまとめ、それから推測した多糖の化学構造を〔化４〕に示した。まず、スペクトル（ｂ）の３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）結合したグルコース残基３つに１つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカン、そして、スペクトル（ｃ）の５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は、β−（１→３）結合したグルコース残基４つに２つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカン、またはβ−（１→３）結合したグルコース残基４つに１つのβ−（１→６）グリコシル分岐鎖を持ち、その分岐鎖長が２つであるβ−グルカンであると考えられる。さらに、スペクトル（ｄ）の超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→３）結合したグルコース残基４つに３つのβ−（１→６）モノグリコシル分岐鎖を持つβ−グルカン、あるいはβ−（１→３）結合したグルコース残基４つに２つのβ−（１→６）グリコシル分岐鎖を持つβ−グルカン、またはβ−（１→３）結合したグルコース残基４つに１つのβ−（１→６）グリコシル分岐鎖を持ち、その分岐鎖長が３つであるβ−グルカンであると考えられる。
【００７２】
１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は、そのスペクトル（ａ）からβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンとα−（１→３）グルカンの混合多糖であることがわかった。この画分中にα−（１→３）グルカンが現れたことの理由は、α−（１→３）グルカンの選択的抽出工程である０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出を簡略化したため、完全に抽出されず残存していたα−（１→３）グルカンがこの段階で溶出したためであると考えられる。
【００７３】
これらの多糖を比較すると、アルカリ濃度を順次高めることで主鎖β−（１→３）グルカンに対する側鎖β−（１→６）グルカンの割合が増大する傾向を示した。これは、高度に分岐した多糖分子ほどその側鎖による分子鎖の部分的な接触や絡み合いなどの強い相互作用を有し、抽出され難く、そして、このような特異な構造をもった多糖分子鎖がマイタケ細胞壁の骨格を形作る主要な構築物質であるとまず考えられる。一方、１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖がもつ高度な分岐様式については、１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は他のアルカリ抽出条件と比較すると穏和な条件下での抽出多糖にあたるため、マイタケ細胞壁中での水素結合による多糖分子鎖の凝集や会合の頻度が少ない、あるいは、その相互作用が弱く、細胞壁中での多糖分子の存在状態は、ある程度の広がりを持ち、緻密に混み合っていないことが示唆される。そのため、主鎖／側鎖＝３／２の多糖であっても分子鎖の相互作用が少なく１Ｍ水酸化ナトリウムで抽出され易い状態にあったと考えられる。
【００７４】
【表１１】
2005133069.tif 000016
【００７５】
【化４】
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５）抽出多糖のコンホメーション
抽出多糖…Congo Red錯体の可視吸収スペクトルから得られた最大吸収波長と水酸化ナトリウム濃度との関係を図１９に示した。１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖および超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は０．１７５Ｍ以下の低アルカリ濃度溶液中において、Congo Redのλmax（４８５〜４９０ｎｍ）が大きく長波長側にシフトし（５１０〜５１５ｎｍ）、多糖分子のヘリックス構造が示された。そして、１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖においては０．１７５〜０．２０Ｍのアルカリ濃度範囲でλmaxの急激な短波長側へのシフトが観測され、多糖分子のランダムコイル構造への転移も観察された。また、３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖にも同様なヘリックス−コイル転移が観測されたが、λmaxの急激な短波長側へのシフトは観測されず、５００ｎｍへの小さなシフトにとどまった。これは、高アルカリ溶液中でもヘリックス構造を有する多糖分子鎖の存在を示唆している。そして、高度なβ−（１→６）分岐鎖を有する５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖、超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は高アルカリ濃度溶液中でも長波長側にλmaxを与えた。すなわちヘリックス構造をとり続けた。これは、多糖分子鎖が緻密な状態にあり、側鎖による分子内あるいは分子鎖間の水素結合点が増え、高アルカリ濃度溶液中でもランダムコイルに転換しない強固ならせん状分子鎖を形成しているためだと考えられる。そして、１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖が高度な分岐鎖を有していながら、高アルカリ溶液中でランダムコイル構造へ顕著に転換することは、マイタケ細胞壁中における多糖分子鎖の広がり、分子内・間の相互作用の弱さを想起させる。このことからも、ヘリックス構造をとり続けるような分子鎖、つまり強固な水素結合を有するらせん状分子鎖がマイタケの硬い骨格形成に深く関与していると推測される。
【００７６】
一方、α−グルカンである０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖、ジメチルスルホキシド抽出多糖は低アルカリ濃度溶液中でもヘリックス構造に由来するCongo Redのλmaxシフトは観測されず、ランダムコイルを有していた。
６）抽出多糖の分子量
図２０は抽出多糖のSepharose ＣＬ−４Ｂゲルクロマトグラムである。多糖の還元末端を還元保護し、主鎖β−（１→３）グルカンの分解を防いだ効果が顕著に観測できた。それは、段階的アルカリ抽出を行った（ｃ）〜（ｅ）のすべての抽出多糖においてＭｗ：2,000,000以上に由来するフラクション（フラクション１）が溶出量１５５ｍｌに強く観測され、例２で観察できたこのフラクション１の減少やセカンドフラクション（フラクション２）の低分子化が起こらなかったことである。このことは、フラクション２がＭｗ：400,000のnativeな多糖分子であることを示唆する。したがって、マイタケ細胞壁を構成するβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンはＭｗ：2,000,000以上の巨大分子とＭｗ：400,000を中心とした画分という２つの大きな分子量分布を有することがわかった。
【００７７】
超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖（ｆ）は超音波処理による多糖分子の分解がフラクション２の大きな低分子側へのシフト（３２０ｍｌ）で観測された。また分解副生成物と考えられるオリゴ糖画分も溶出量４５０ｍｌに観測された。このように、これまで抽出されなかったβ−グルカンがその分子鎖を分解されたことで抽出されるようになったことは、ある程度の多糖分子鎖の分解は多糖の可溶化を促進し、nativeな状態での多糖の抽出は非常に困難であることを示唆している。また、この画分が超音波アルカリにより分解、低分子化されたにもかかわらず図１９で示したように強固ならせん状分子鎖を形成できたのは、アルカリ分解が還元末端からのピーリング反応によるためだと考えられる。つまり、エンド型の酵素のように一回の反応で分子鎖を二分するような分解反応ではなく、エキソ型酵素分解のようなアルカリ分解は一回の反応で分子量１８０のグルコースが分子量何十万の分子鎖から分かれるだけで、分子鎖のらせん形成にはほとんど影響しないためだと推測される。
【００７８】
α−（１→３）グルカンである０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上とオリゴ糖画分を与えた。α−（１→４）グルカンであるジメチルスルホキシド抽出多糖はＭｗ：2,000,000以上とＭｗ：400,000の２つの分子量画分を示した。すなわち、骨格形成に重要な寄与をしないα−グルカンでもＭｗ：2,000,000以上とＭｗ：を400,000中心とした巨大分子を持つことが推測された。
【００７９】
また、抽出多糖中に含まれるタンパク質のゲルろ過クロマトグラムによると、タンパク質は４４０〜４８０ｍｌに溶出し、その吸光度は０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物で最大だった。これは、この画分中のタンパク含有率が高いことを表している。これより、０．１Ｍ水酸化ナトリウム処理はα−（１→３）グルカンを選択的に抽出する方法でもあるが、マイタケ中の大半のタンパク質を除去し、それ以降の抽出工程で多糖の分離、抽出を容易にする有用な処理であると考えられる。また、０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出物、ジメチルスルホキシド抽出物の１５５ｍｌに現れたピークはＭｗ：2,000,000の多糖分子に結合しているタンパク質に由来すると推測できる。
７）まとめ
強アルカリ抽出時の多糖の分解を防ぐため、抽出剤に水素化ホウ素ナトリウムを添加し、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド、１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウム、超音波−３Ｍ水酸化ナトリウムで逐次多糖を抽出する例３の方法において、次のことが理解される。（１）０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は単一なα−（１→３）グルカンであったがタンパク質を多く含有していた。多糖の分子量は2,000,000以上とオリゴ糖画分を有し、水溶液中でのコンホメーションはランダムコイルであった。（２）ジメチルスルホキシド抽出ではα−（１→４）グルカンを選択的に得た。そして、その分子量は2,000,000 以上と400,000の２つの分布を持ち、水溶液中ではランダムコイル構造を有していた。（３）１Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はα−（１→３）グルカンとβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンの混合多糖であった。そして、β−グルカンに由来するヘリックス構造が低アルカリ濃度溶液中で観測され、ランダムコイル構造への転移が０．１７５〜０．２０Ｍのアルカリ溶液中で観測された。また、この混合多糖の分子量は2,000,000以上と400,000を中心とした２つの分子量分布を有していた。（４）３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖はβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンであることが推測された。この多糖は０．２０Ｍ以上のアルカリ溶液中でランダムコイル構造に転移する分子とヘリックス構造をとり続ける分子鎖の存在が示唆された。また、このβ−グルカンの分子量は2,000,000以上と400,000を中心とした画分の２つの分子量分布を有していた。（５）５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は高度にβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンと推測された。そして、高アルカリ溶液中でもそのコンホメーションはヘリックスを有し、分子内あるいは分子間の強い相互作用が示唆された。また、このβ−グルカンの分子量は2,000,000以上と400,000を中心とした画分の２つの分子量分布を有していた。（６）超音波−３Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖は高度にβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンと推測された。そして、高アルカリ溶液中でもそのコンホメーションはヘリックスを有し、５Ｍ水酸化ナトリウム抽出多糖と共にかさ高なマイタケ子実体を支える堅い細胞壁骨格の中心を担っていると推測した。（７）最終残渣はキチン質を３７．５％含有していたが、残存するβ−グルカンとの混合物であった。
【００８０】
そして、以上の例１、例２および例３に示した結果から、強アルカリによる抽出がマイタケ多糖を組成別に分画抽出できる簡便かつ選択的な分画法であることがわかる。また、これに先行する０．１Ｍ水酸化ナトリウム抽出ではα−（１→３）グルカンが単一の多糖として得られ、ジメチルスルホキシド抽出ではα−（１→４）グルカンが選択的に抽出されることから予備処理として有用であることがわかる。そして、１Ｍ、３Ｍ、５Ｍ水酸化ナトリウムでの強アルカリ多段抽出では単一な多糖としてβ−（１→６）分岐したβ−（１→３）グルカンが抽出されたことが強調される。
【００８１】
抽出剤に水素化ホウ素ナトリウムを添加し、多糖還元末端を保護することでnativeな分子量に近い状態で多糖を抽出できることも確認された。
＜Ｂ＞ハナビラタケからの多糖類の抽出分画
抽出分画の手順を表１２に示した。この場合の試料には乾燥したハナビラタケ子実体を用いた。
【００８２】
【表１２】
2005133069.tif 000018
手順の概要は以下のとおりである。
１）試料の調製
１．乾燥した試料を乳鉢を用いて粉砕し、これを乾燥ハナビラタケ粉末とした。
２）アセトン処理
１．乾燥ハナビラタケ粉末１０．０７ｇにアセトン２００ｍｌを加え、５０℃で８時間、室温で２４時間攪拌した。
【００８３】
２．濾過によって沈殿を回収し、これを真空乾燥させ、アセトン残渣（９．２３ｇ）とした。
３）０．１Ｍ  ＮａＯＨ処理
１．アセトン残渣に０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液２００ｍｌを加え、４℃で１２時間静置した。
【００８４】
２．遠心分離によって上澄みと沈殿を得た。
【００８５】
３．２．で得られた上澄みに４倍容量のエタノールを加え、４℃で１２時間静置した。沈殿が確認されたので、これを遠心分離によって回収し、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物（０．９３ｇ）とした。
【００８６】
４．２．で得られた沈殿を遠心分離によって回収し、エタノールで８回洗浄した後、真空乾燥させ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ残渣（７．１１ｇ）とした。
４）ＤＭＳＯ処理
１．０．１Ｍ  ＮａＯＨ残渣にＤＭＳＯ１００ｍｌを加え、９０℃の湯浴中で１５分間の処理と５５℃の湯浴中で超音波を１５分間の処理とを交互に、合わせて１時間３０分行った。
【００８７】
２．遠心分離によって上澄みと沈殿を得た。
【００８８】
３．２．で得られた上澄みに４倍容量のエタノールを加え、４℃で１２時間静置した。沈殿が確認されたので、沈殿を遠心分離によって回収し、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させ、ＤＭＳＯ抽出物（０．５２ｇ）とした。
【００８９】
４．２．で得られた沈殿は上澄みを遠心分離によって除き、エタノールで３回洗浄した後、真空乾燥させ、ＤＭＳＯ残渣（５．９２ｇ）とした。
５）１．２５Ｍ  ＮａＯＨ処理
１．ＤＭＳＯ残渣に１．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｍｌを加え、室温で１８時間攪拌した。
【００９０】
２．遠心分離によって上澄みと沈殿を得た。
【００９１】
３．２．で得られた上澄みに４倍容量のエタノールを加え、４℃で１２時間静置した。沈殿が確認されたので、沈殿を遠心分離によって回収し、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させ、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物（０．８１ｇ）とした。
【００９２】
４．２．で得られた沈殿を遠心分離によって回収し、エタノールで３回洗浄した後、真空乾燥させ、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ残渣（５．４３ｇ）とした。
６）５Ｍ  ＮａＯＨ処理
１．１．２５Ｍ  ＮａＯＨ残渣に５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｍｌを加え、室温で１８時間攪拌した。
【００９３】
２．遠心分離によって上澄みと沈殿を得た。
【００９４】
３．２．で得られた上澄みに４倍容量のエタノールを加え、４℃で１２時間静置した。沈殿が確認されたので、これを上澄みを遠心分離によって除き、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させ、５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物（０．４７ｇ）とした。
【００９５】
４．２．で得られた沈殿を遠心分離によって回収し、エタノールで３回洗浄した後、真空乾燥させ、５Ｍ  ＮａＯＨ残渣（５．４１ｇ）とした。
７）５Ｍ  ＮａＯＨ処理（超音波）
１．５Ｍ  ＮａＯＨ残渣に５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｍｌを加え、５５℃の湯浴中で超音波処理を１時間行った。
【００９６】
２．遠心分離によって上澄みと沈殿を得た。
【００９７】
３．２．で得られた上澄みに４倍容量のエタノールを加え、４℃で１２時間静置した。沈殿が確認されたので、これを遠心分離によって回収し、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させ、５Ｍ  ＮａＯＨ（超音波）抽出物（０．８９ｇ）とした。
【００９８】
４．２．で得られた沈殿は遠心分離によって回収し、エタノールで３回洗浄した後、真空乾燥させ、５Ｍ  ＮａＯＨ（超音波）残渣（４．２１ｇ）とした。
【００９９】
以上の抽出により得られた抽出生成物の収量、収率を、原料（乾燥ハナビラタケ粉末）を１００％として、次の表１３に示した。
【０１００】
【表１３】
2005133069.tif 000019
各抽出物の収率は、５〜９％と低いものとなった。この原因としては、マイタケと比較してその成分の内容や乾燥粉末の密度などに大きな違いが見られることから、その細胞壁の組成・構造にマイタケとは大きな違いがあることが考えられる。
【０１０１】
元素分析の結果を表１４に、全糖量分析の結果を表１５に示した。
【０１０２】
【表１４】
2005133069.tif 000020
【０１０３】
【表１５】
2005133069.tif 000021
０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物で高いＮ値を示した。これは、０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物においてはタンパク質に由来するものとみられる。
【０１０４】
また、０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物のみが３３％と低い糖量を示し、他の抽出物は７０〜９０％と高い糖量を示した。これも、０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物はその高いＮ値からタンパク質の含有量が多いためだと考えられる。
【０１０５】
そして、例１〜例３と同様にして、抽出物の多糖類の同定を試みたところ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出とＤＭＳＯ抽出ではα−グルカンが選択的に抽出されていること、並びに１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出と５Ｍ  ＮａＯＨ抽出ではβ−（１→３）グルカン、β−（１→６）グルカンとして、β−（１→６）グルシル分岐β−（１→３）グルカンのβ−グルカンが抽出されていることが確認された。
＜Ｃ＞ヒイロタケからの多糖類の抽出分画
〔１〕抽出分画
抽出分画の手順を表１６に示した。この場合の試料には乾燥したヒイロタケ子実体を用いた。
【０１０６】
【表１６】
2005133069.tif 000022
手順の概要は以下のとおりである。
１）試料の調製
１．ヒイロタケ子実体を真空乾燥して、5mm程のチップ状に刻み、コーヒーミルを用いて細かく粉砕することで、綿状のヒイロタケ試料とした。
２）アセトン処理
１．ヒイロタケ試料５．０ｇにアセトン２００ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌した後、９,５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄みと沈殿物を得た。
【０１０７】
２．上澄みからロータリーエバポレーターを用いてアセトンを留去し、これを一晩室温で真空乾燥させ、アセトン抽出物とした。また、沈殿物は、一晩室温で真空乾燥し、脱脂ヒイロタケ粉末とした。
３）０．１Ｍ  ＮａＯＨ処理とＮａＣｌＯ処理
１．脱脂ヒイロタケ粉末に０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液２００ｍｌを加え、さらに所定量の次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）溶液（０〜１００ｍｌ）を加えて懸濁し、３℃で１２時間静置した。
【０１０８】
２．遠心分離（９,５００ｒｐｍ、３０分間）によって上澄み(Supernatant-1)と沈殿物(Residue-1)を得た。
【０１０９】
３．２．で得られた上澄み(Supernatant-1)に４倍容量のエタノールを加え、３℃で１晩静置した。沈殿物が確認されたので、これを遠心分離によって回収し、エタノールで２回洗浄した後、一晩室温で真空乾燥させ、ＮａＣｌＯ抽出物とした。
４）ＤＭＳＯ処理
１．上記３）２．で得られた沈殿物(Residue-1)を、エタノールとアセトンによって洗浄し、一晩室温で真空乾燥した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍｌに懸濁し、９０℃、２０分間の攪拌処理と、５５℃、１０分間の超音波処理を行った。これを３回繰り返した。
【０１１０】
２．次いで、遠心分離して上澄み(Supernatant -2)と沈殿物（Residue-2）を得た。
【０１１１】
３．２．で得られた上澄み(Supernatant -2)に４倍容量のエタノールを加え、３℃で一晩静置し、生じた沈殿物を遠心分離によって回収した。次いで、この沈殿物をエタノールで２回洗浄した後、一晩室温で真空乾燥させて、ＤＭＳＯ抽出物とした。
【０１１２】
４．２．で得られた沈殿物（Residue-2）は、エタノールおよびアセトンによって洗浄し、一晩室温で真空乾燥させて、ＤＭＳＯ残渣とした。
５）１．２５Ｍ  ＮａＯＨ処理
１．ＤＭＳＯ残渣に１．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００ｍｌを加え、３０℃で１時間攪拌した。
【０１１３】
２．遠心分離によって上澄み(Supernatant -3)と沈殿物（Residue-3）を得た。
【０１１４】
３．２．で得られた上澄み(Supernatant -3)に、４倍容量のエタノールを加え、３℃で一晩時間静置した。生じた沈殿物を遠心分離によって回収した。そして、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥させて、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物とした。
６）５Ｍ  ＮａＯＨ処理
１．上記５）２．で得られた沈殿物（Residue-3）を遠心分離によって回収し、エタノールおよびアセトンを加えて洗浄した後、一晩室温で真空乾燥させ、５Ｍ  ＮａＯＨ１００ｍｌを加え懸濁し、３０℃で１時間攪拌した。
【０１１５】
２．遠心分離によって上澄み(Supernatant -4)と沈殿物（Residue-4）を得た。
【０１１６】
３．２．で得られた上澄み(Supernatant -4)に、４倍容量のエタノールを加え、３℃で１時間静置した。沈殿が確認されたので、これを遠心分離して回収した。そして、エタノールで２回洗浄した後、真空乾燥して、５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物を得た。
【０１１７】
４．２．で得られた沈殿物（Residue-4）は、遠心分離によって回収し、エタノールで３回洗浄した後、一晩室温で真空乾燥させ、最終残渣（Residue-4）とした。
【０１１８】
以上の抽出により得られた抽出生成物の収量、収率を、原料（乾燥ヒイロタケ粉末）を１００％として、次の表１７および図２１に示した。
【０１１９】
【表１７】
2005133069.tif 000023
この表１７および図２１に例示したとおり、０〜５０ｍｌのＮａＣｌＯ溶液を添加した量を増やすことで、抽出物全体の収率は大きく増加し、最大で約８０％の収率となった。さらに、ＮａＣｌＯ溶液の添加量を１００ｍｌに増やすと、逆に各抽出物の収率は減少した。これは、ＮａＣｌＯ処理によって分解が進みすぎたことで、収率が減少したと考えられる。また、各残渣（各Residue）の収率もＮａＣｌＯ溶液の添加量が５０および１００ｍｌの場合、０および２５ｍｌと比べ、大きく減少した。さらに、最終残渣（Residue-4）の形状を観察したところ、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が０および２５ｍｌの場合では、抽出前の綿状であった。その一方、ＮａＣｌＯの添加量が５０および１００ｍｌの場合では、この最終残渣（Residue-4）は粉末状であった。
【０１２０】
以上のことから、ヒイロタケ子実体からの多糖の抽出・分画は、収率の点ではＮａＣｌＯ溶液の添加量によって大きく変化することが確認できた。
〔２〕抽出物中の糖の定量
１）標準試料の調製と吸光度の測定
抽出物中の糖の定量は、フェノール-硫酸法で行った。まず、標準試料として、Ｄ-グルコースを０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、０、２０、４０、６０、８０μｇ／ｍｌの溶液をそれぞれ調製した。これら標準試料溶液を０．３ｍｌ試験管にとり、０．３ｍｌの５ｗｔ％フェノール水溶液を加えた。さらに、１．５ｍｌの濃硫酸を加えて直ちに攪拌し。２０分間放冷した後、紫外・可視分光光度計（島津製作所、ＵＶ-３１００ＰＣ）で波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた測定結果を基に、糖の定量のための検量線を作成した（図示せず）。
２）測定試料の調製と吸光度の測定
各抽出物２０ｍｇを、５０ｍｌの１．２５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。これら溶液から、２ｍｌをそれぞれとり、蒸留水で１０倍に希釈して測定試料溶液として用いた（試料濃度４０μ／ｍｌ）。これら測定試料溶液０．３ｍｌを試験管にとり、０．３ｍｌの５％フェノール水溶液を加えた。さらに、１．５ｍｌの濃硫酸を加え、直ちに攪拌し、２０分間放冷した。そして、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、抽出物中の糖の含有率を算出した。この糖分析（糖の定量）の結果を表１８に示した。
【０１２１】
【表１８】
2005133069.tif 000024
ＮａＣｌＯ抽出物での糖の含有率は、４２〜６６％を示した。そして、この糖の含有率は、ＮａＣｌＯの添加量が０および２５ｍｌの場合よりも、５０および１００ｍｌの場合の方が高い含有率を示した。
【０１２２】
ＤＭＳＯ抽出物の糖の含有率は、７３〜８９％と高い含有率であった。これは、他の抽出物と比べ、特に高い含有率であった。１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の糖の含有率は、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が０〜５０ｍｌのときは、ＮａＣｌＯの添加量とともに増加した。しかし、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が１００ｍｌの場合、糖の含有率は減少した。そして、５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物においては、４２〜６３％であった。
【０１２３】
抽出物の収率の結果と併せて考えると、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が５０ｍｌのときに最も高い抽出物全体の収率（約８０％）を示し、最も多くのヒイロタケ多糖を抽出できた。
〔３〕タンパク質の定量
１）試薬の調製
抽出物中のタンパク質の定量は、ビシンコニン酸法（ＢＣＡ法）で行った。以下の試薬を調製し、使用した。
試薬Ａ：１％  ２-２’ビシンコニン酸二ナトリウム（ＢＣＡ-Ｎａ）、２％炭酸ナトリウム水和物、０．１６％酒石酸ナトリウム、０．４％水酸化ナトリウム。０．９５％炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ  １１．２５）
試薬Ｂ：４％硫酸銅五水和物水溶液
この試薬Ａと試薬Ｂとを、１００：２の体積比で混合し、呈色試薬とした。
２）標準試料の調製と吸光度の測定
標準試料として、ウシ血清アルブミンを０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、０、１０、２０、３０、４０、５０μｇ／ｍｌの溶液を調製した。これら標準試料溶液から５０μｌとり、呈色試料１ｍｌを加え、６０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、波長５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質の定量のための検量線を作成した。
３）測定試料の調製と吸光度の測定
各抽出物１０ｍｇを１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。これを蒸留水で１０倍に希釈し、測定試料溶液とした（試料濃度１００μｇ／ｍｌ）。これら測定試料溶液から５０μｌとり、これを標準試料の測定と同様に、呈色試薬１ｍｌを加え、６０℃で３０分間インキュベートした。そして、波長５６２ｎｍにおいての吸光度を測定し、この測定結果を基に抽出物中のタンパク質の含有率（タンパク質の定量）を算出した。結果は、表１９に示した。
【０１２４】
【表１９】
2005133069.tif 000025
この表１９に例示したとおり、ＮａＣｌＯ抽出物は、ＮａＣｌＯ溶液を添加していない場合と比べて、添加した場合はタンパク質の含有率は顕著に減少した。また、ＮａＣｌＯ抽出以降の抽出物（ＤＭＳＯ抽出物、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物および５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物）いずれにおいても、１１％以下の低いタンパク質含有率を示した。このことは、マイタケのＮａＣｌＯ処理と共通した結果であり、タンパク質の除去に効果があることが確認できた。
〔４〕抽出多糖の構成単糖の同定
抽出物を塩酸で加水分解処理をし、高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および13Ｃ  ＮＭＲを用いて、抽出多糖を構成している単糖の同定および分析を行った。
１）ＨＰＬＣによる構成単糖の同定および分析
１．ＨＰＬＣによる構成単糖の同定
各抽出物および残渣２０ｍｇをそれぞれ試験管に入れ、２Ｍ塩酸１ｍｌを加えた。１００℃で８時間の加水分解処理を行い、２ＭＮａＯＨ１ｍｌで中和して試料溶液とした。
【０１２５】
また、標準単糖として、グルコース、マンノース、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ-アセチルグルコサミン、グルコサミンを用いた。標準単糖を２Ｍ塩化ナトリウムに溶かして（５ｍｇ／ｍｌ）、標準試料溶液とした。
【０１２６】
ＨＰＬＣの装置は、示差屈折計（日本分光、８３０-ＲＩ示差屈折計）、高速液体クロマトグラフィーポンプ（８８０-ＰＵ）およびカラム（昭和電工、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ５０-４Ｅ）で構成した。移動層をアセトニトリル-水（８０：２０）として、流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで試料を溶出した。
【０１２７】
２．ＨＰＬＣによる構成単糖の分析
標準単糖のＨＰＬＣクロマトグラムを図２２に、また各抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを図２３〜図２６に示した。
【０１２８】
この図２２に示したとおり、標準単糖のピークは、それぞれＮ-アセチルグルコサミン（保持時間１２．５分）、マンノース（保持時間１３．５分）、ガラクトース（保持時間１５分）、グルコース（保持時間１５．５分）であった。これらを基に、各抽出物の加水分解生成物のクロマトグラムを検討した。なお、グルコサミンは、塩化ナトリウムのピークと重なっている。
【０１２９】
図２３〜図２６に示したとおり、各抽出物のクロマトグラムにおいて、グルコースと同じ保持時間のピークが確認できた。Ｎ-アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトースを示すピークはいずれの抽出物において確認できなかった。一方、ＮａＣｌＯ抽出物、ＤＭＳＯ抽出物、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物のクロマトグラムにおいて、グルコースよりもやや高い長い保持時間のピークが観測された。これらは、Ｎ-アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース、グルコースに該当するものではない。
【０１３０】
また、他の単糖として、たとえば、リボース、キシロース、アラビノーズ等のアルドペントースの存在を考慮しても、この出願の発明における分画工程の実験条件下でのこれら単糖の保持時間は短かった。さらに、加水分解が完全に進行していないと仮定して、二糖以上のオリゴ糖が存在していることを考慮しても、二糖以上のオリゴ糖は標準単糖よりも大幅に長い保持時間を示すことから、これらピークに当てはめることはできないと考えられる。
【０１３１】
これらの結果を総合して、発明者は、各抽出物中に含まれる糖の構成糖はグルコースであると推測した。そこで、この推測を実証するため、抽出物の加水分解生成物を以下の13Ｃ  ＮＭＲによってさらに分析を行った。
２）13Ｃ  ＮＭＲによる構成単糖の同定および分析
１．13Ｃ  ＮＭＲによる構成単糖の同定
各抽出物５０ｍｇをそれぞれ試験管に入れ、濃塩酸を重水で希釈した２Ｍ塩酸を０．５ｍｌ加えた。１００℃で８時間、加水分解処理を行ない、２Ｍ水酸化ナトリウム１ｍｌで中和し、アセトニトリルを１滴加えて、これを試料溶液とした。また、標準単糖として、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミンを用いた。これら標準単糖を２Ｍ塩化ナトリウムに溶解し（２５ｍｇ／ｍｌ）、これを標準試料溶液とした。これら試料溶液および標準試料溶液を、13Ｃ  ＮＭＲを利用して分析を行った。
【０１３２】
２．13Ｃ  ＮＭＲによる構成単糖の分析
ＨＰＬＣの結果から、ＮａＣｌＯ溶液を添加した量に影響されずに、同じ抽出段階での抽出物の加水分解生成物のピークは、同じ保持時間を示した。そこで、一つの抽出条件（今回は、２５ｍｌのＮａＣｌＯ）における各抽出物について、それぞれ分析を行った。
【０１３３】
標準単糖として、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ-アセチルグルコサミン、グルコサミンの13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図２７に、各抽出物の加水分解生成物の13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図２８に示した。標準単糖のスペクトルは、公知文献（The Journal of Pharmacology and Experomaental Therapeutics, 257, 500, 1991）に従い帰属した。
【０１３４】
ＮａＣｌＯ抽出物は、６２ｐｐｍと７４ｐｐｍにピークを確認することができた。また、特にＤＭＳＯ抽出物、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物および５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の加水分解生成物の13Ｃ  ＮＭＲスペクトルにおいて、一位の炭素（α１、β１）の化学シフトに着目し、グルコースまたはガラクトースであると判断した。また、グルコースの二位〜五位の炭素のピーク（７０〜７８ｐｐｍ）は、ＤＭＳＯ抽出物、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物および５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物中に確認でき、これらに存在する多糖の構成単糖はグルコースであると同定できた。
〔５〕抽出多糖の構造解析
１）1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲスペクトルの測定
抽出物中の多糖の構造を1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲによって分析を、分光計装置（ＪＮＭ  ＧＸ２７０  ＦＴ-ＮＭＲ分光計）を用いて行った。
【０１３５】
1Ｈ  ＮＭＲによる分析の際は、溶媒はジメチルスルホキシド-ｄ6と重水との混合溶媒（６：１）、試料濃度は５ｍｇ／ｍｌ、測定温度は８０℃として、化学シフトはテトラメチルシラン（０ｐｐｍ）を内部標準として表した。また、13Ｃ  ＮＭＲによる分析の際は、溶媒は重水素化した０．２５Ｍ  ＮａＯＨ（５ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムを含む）、試料濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、測定温度は４０℃として、化学シフトはアセトニトリル（１．６ｐｐｍ）を内部標準として表した。
２）1Ｈ  ＮＭＲによる抽出多糖の構造解析
ＮａＣｌＯ抽出物、ＤＭＳＯ抽出物については、重ＤＭＳＯと重水との混合溶媒を用いて、1Ｈ  ＮＭＲスペクトルから多糖を構成するグルコピラノシル単位のアノメリックプロトンを参照し、抽出物中の多糖の結合形式を検討した。
【０１３６】
ＮａＣｌＯ抽出物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図２９に、ＤＭＳＯ抽出物の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図３０に示した。ＮａＣｌＯ抽出物には、α、β多糖のアノメリックプロトンは確認できなかった。その一方で、ＤＭＳＯ抽出物では、いずれの条件においてもα型多糖のアノメリックプロトンに由来するピークを確認することができた。また、ＮａＣｌＯ溶液（２５〜１００ｍｌ）を添加した条件の場合、β型多糖のアノメリックプロトン二由来するピークを確認することができた。このことから、ＮａＣｌＯ溶液を添加しない条件で、α型多糖をＤＭＳＯ抽出物として抽出できることが確認できた。
３）13Ｃ  ＮＭＲによる抽出多糖の構造解析
１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物は、ＮａＯＨを溶解した重水を溶媒として13Ｃ  ＮＭＲによって分析を行った。
【０１３７】
１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを図３１に示した。図３１に示したとおり、ＮａＣｌＯ溶液を添加していない抽出物では、多糖に由来するシグナルをほとんど示さなかった。一方、ＮａＣｌＯ溶液を添加した条件における抽出物は、いずれにおいても多糖に由来するシグナルを示した。特に、ＮａＣｌＯ溶液を５０ｍｌ添加した場合の抽出物では、顕著にシグナルを示した。なお、図３１中のＡ部に示したスペクトルについては、図３２にてさらに詳細に検討して示した。
【０１３８】
そして、抽出物中に含まれる多糖の構造を検討するために、β-（１→６）分岐を持つβ-（１→３）グルカンであるシゾフィランの13Ｃ  ＮＭＲスペクトル、ＮａＣｌＯ溶液を５０ｍｌ添加した場合の抽出物の13Ｃ  ＮＭＲスペクトル、さらにＤＥＰＴ法（パルス幅１３５°）13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを併せて図３２に示した。
【０１３９】
図３２に示したとおり、抽出物のスペクトルは、シゾフィランに帰属できるピークと、その他に７８．５ｐｐｍで示したピークが確認できた。この位置で確認できる多糖のピークは、グリコシル化された四位の炭素、つまり１→４結合からなる糖の存在が考えられる。α-（１→４）結合であれば、そのグリコシル化された一位の炭素のピークは１００ｐｐｍ前後であるが、抽出物のスペクトルからは確認できないことから、β-（１→４）結合であると判断した。したがって、アルカリ抽出物中に存在する多糖の構造は、β-（１→６）分岐β-（１→３）グルカンと、β-（１→４）グルカンが共存していると判断できた。また、ＤＥＰＴ法による13Ｃ  ＮＭＲスペクトルから、シゾフィランのグルコース単位における六位の炭素（Ｃ６）、つまり二級炭素（-ＣＨ2-）に帰属したピークが、抽出物において下向きのシグナルで現れ、その帰属を確認することができた。
【０１４０】
なお、図３１において、シグナルの強度には差がみられるが、ＮａＣｌＯ溶液を添加した抽出物はいずれも同じ位置にピークを示した。５０ｍｌのＮａＣｌＯ溶液を添加した条件における抽出物が、最も明確なシグナルを示したが、これは上記の表１９で示したように、１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の中で最も高い糖の含有率を有することを起因としていると判断した。
【０１４１】
これら1Ｈ  ＮＭＲおよび13Ｃ  ＮＭＲの結果を総合すると、ＮａＣｌＯ溶液を添加しない場合は、抽出の前半段階（ＮａＣｌＯ抽出物、ＤＭＳＯ抽出物）でα型多糖を選択的に分画できるが、後半段階（アルカリ抽出物）においてβ型グルカンを抽出することができないことを確認できた。
【０１４２】
そして、ＮａＣｌＯ溶液を添加した場合は、抽出の前半段階（ＤＭＳＯ抽出物）で、α型およびβ型多糖がともに抽出されるが、後半段階（アルカリ抽出物）において、β-（１→６）分岐β-（１→３）グルカンと、β-（１→４）グルカンとを抽出することができた。
〔６〕まとめ
以上のとおり、ＮａＣｌＯ溶液、ＤＭＳＯ、１．２５Ｍ  ＮａＯＨおよび５Ｍ  ＮａＯＨを用いて、ヒイロタケ子実体からの多糖の分画について検討した。そして、ＮａＣｌＯ溶液の添加量を０〜１００ｍｌの範囲で変化させることで、以下の結果を確認することができた。
（１）抽出物全体の収率は、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が０〜５０ｍｌの場合、ＮａＣｌＯ溶液の添加量とともに顕著に増加し、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が５０ｍｌのとき最大（約８０％）となり、一方、ＮａＣｌＯ溶液の添加量が１００ｍｌのときは５０ｍｌのときよりも収率は減少した。
（２）ＮａＣｌＯ溶液処理によって、抽出されるタンパク質を減らすことができた。
（３）ＮａＣｌＯ抽出物では多糖は確認されなかったが、ＤＭＳＯ抽出物ではα型およびβ型多糖ともに抽出することができた。
（４）１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物に含まれる多糖は、β-（１→６）分岐β-（１→３）グルカンと、β-（１→４）グルカンであることが判断できた。
【０１４３】
このようにヒイロタケ多糖の分画において、高収率で抽出物を得ることができ、多糖の抽出および回収で大変効果があると確認できた。また、ヒイロタケ子実体中には、β-（１→６）分岐β-（１→３）グルカンが存在することから、ヒイロタケ多糖にも抗腫瘍活性等の生理活性を有し、食品や医療等に応用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
この出願の発明によって、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているβ−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンをきのこから選択的に抽出分画することのできる新しい取得方法と、この方法により得られる新しいβ−グルカン多糖類が提供される。
【０１４５】
これらのβ−グルカンを食品や医療に応用すること、また、これらのβ−グルカン多糖類をフィルムや繊維等の形態において利用することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】例１におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２】例１におけるＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図である。
【図３】例１におけるＮａＣｌＯ抽出物とＤＭＳＯ抽出物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図４】例１におけるＤＭＳＯ抽出物の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図５】シゾフィランの13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。（ａ）ＮａＢＨ4非存在下、（ｂ）ＮａＢＨ4存在下。
【図６】例１における１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の13Ｃ ＮＭＲ（ＤＥＰＴ１３５）スペクトルを示した図である。
【図７】例１における１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図８】例１における５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図９】例１におけるコンゴーレッド存在下での抽出多糖類の最大吸収値のＮａＯＨ濃度による変化を示した図である。
【図１０】例１における抽出多糖類のゲル濾過クロマトグラムを示した図である。
【図１１】例２における抽出物のＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図である。
【図１２】例２における０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物およびＤＭＳＯ抽出物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１３】例２におけるＮａＯＨ抽出物の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１４】例２におけるコンゴーレッド存在下での抽出多糖類の最大吸収値のＮａＯＨ濃度による変化を示した図である。
【図１５】例２における抽出多糖類のゲル濾過クロマトグラムを示した図である。
【図１６】例３における抽出物のＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図である。
【図１７】例３における０．１Ｍ  ＮａＯＨ抽出物およびＤＭＳＯ抽出物の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１８】例３におけるＮａＯＨ抽出物の13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１９】例３におけるコンゴーレッド存在下での抽出多糖類の最大吸収値のＮａＯＨ濃度による変化を示した図である。
【図２０】例３における抽出多糖類のゲル濾過クロマトグラムを示した図である。
【図２１】ヒイロタケにおける、ＮａＣｌＯの添加量の変化に伴う各抽出物の収率の変化を示した図である。
【図２２】標準単糖におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２３】ヒイロタケのＮａＣｌＯ抽出物におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２４】ヒイロタケのＤＭＳＯ抽出物におけるにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２５】ヒイロタケの１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物におけるにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２６】ヒイロタケの５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物におけるにおけるＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図２７】標準単糖における13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図２８】加水分解生成物の抽出物における13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図２９】ＮａＣｌＯ抽出物における、溶媒ＤＭＳＯ-ｄ6-Ｄ2Ｏを用いての1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図３０】ＤＭＳＯ抽出物における、溶媒ＤＭＳＯ-ｄ6-Ｄ2Ｏを用いての1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図３１】１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物における、溶媒０．２５Ｍ  ＮａＯＤを用いての13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図３２】シゾフィランと１．２５Ｍ  ＮａＯＨ抽出物における、溶媒０．２５Ｍ  ＮａＯＤを用いての13Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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