(57)【要約】【課題】  光刺激による試料の変化を感知し、光刺激を自動で変更または終了させ、次の動作へ移行する機能を有した走査型光学装置を提供する。【解決手段】  光刺激用レーザ光源と観察用レーザ光源を備え、観察用レーザは励起光を走査することで、観察用レーザ光を試料に照射し、試料から発する光を検出でき、光刺激用レーザは光刺激走査し、光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を走査し、同時に観察用レーザ光で、光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を走査し、光刺激が終了したことを自動的に感知でき、また、輝度がある値に達したとき、試料に照射する光刺激用レーザの強度条件を変化することができ、さらに、前記試料内で複数箇所を連続して光刺激を行い、また、複数箇所の連続光刺激を自動で行う。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察用レーザ光源と、
光刺激用レーザ光源と、
前記観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査する走査手段と、
前記光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査する走査手段と、
前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出する検出手段とを有し、
前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を前記観察用レーザ光で走査し、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する、
ことを特徴とする走査型光学装置。
【請求項２】
前記光刺激用レーザ光で前記光刺激を加える前記走査領域を含む範囲を前記観察用レーザ光で走査し、
前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の輝度が所定値に達したとき、試料に照射する前記光刺激用レーザ光の強度条件を変化させることを特徴とする請求項１記載の走査型光学装置。
【請求項３】
前記光刺激を加える走査領域を含む範囲が複数設定された場合、
一回の開始指示に応じて前記複数の前記光刺激を加える走査領域を含む範囲のうち一つが処理され、別の開始指示が行われることによって当該別の範囲が処理される、
ことを特徴とする請求項１または２記載の走査型光学装置。
【請求項４】
前記光刺激を加える走査領域を含む範囲が複数設定された場合、
一回の指示により予め用意した前記複数の開始指示を前記複数の前記光刺激を加える走査領域を含む範囲のそれぞれを連続して処理することを特徴とする請求項１または２記載の走査型光学装置。
【請求項５】
観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査し、
光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査し、
前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出し、
前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を観察用レーザ光で走査し、
前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する、
ことを特徴とする光刺激停止の検知方法。
【請求項６】
コンピュータに、
観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査する走査機能と、
光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査する走査機能と、
前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出する検出機能と、
前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を観察用レーザ光で走査し、  前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する機能と、
を実現させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学系を介して試料を光で走査することにより、試料に発生する蛍光を検出する技術に係り、特に共焦点走査型レーザ顕微鏡や共焦点の走査型光学装置などに用いられる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を走査光学系及び対物レンズを介して試料のＸ軸及びＹ軸方向に走査しながら照射し、試料からの蛍光または反射光を再び対物レンズ及び走査光学系を介して検出器で検出して蛍光または反射光の二次元の輝度情報を得る顕微鏡である。
【０００３】
また、この輝度情報をＸ−Ｙ走査位置に対応させてＣＲＴディスプレイなどに輝点の２次元分布として表示することによって、試料の蛍光像あるいは反射像を観察することも可能であり、また、共焦点走査型レーザ顕微鏡は、検出光学系の試料と共役な位置に、被測定光の回折限界程度の径を有した絞りを設けることにより、焦点の合っている面の情報のみを検出するものである。
【０００４】
この共焦点走査型レーザ顕微鏡では、合焦面の情報だけを検出できるため、試料を傷付けることなく、光学的な断層像、すなわち３次元情報を得ることができ、しかも、非合焦面の情報をカットすることによって、非常にシャープな画像が得られる特徴を有している。
特許文献１では、観察試料の光刺激を行う機能が提案されており、特許文献１のように観察のための走査と、光刺激のための走査を独立かつ同期させるようにした走査型レーザ顕微鏡が提案されている。
【特許文献１】特開2000-275529
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら従来技術において、光刺激のレーザの強度調整や照射の終了に対して何ら制御を行っていない。
本発明は上記従来技術の課題に鑑み、光刺激による試料の変化を感知し、光刺激を自動で変更または終了させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１記載の発明によれば、観察用レーザ光源と、光刺激用レーザ光源と、前記観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査する走査手段と、前記光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査する走査手段と、前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出する検出手段とを有し、前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を前記観察用レーザ光で走査し、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する、ことを特徴とする。
【０００７】
本発明によれば、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像から光刺激を行う場所を指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に、観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料を光刺激させる。
この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が前記指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。これにより光刺激による経時変化を検知し、光刺激を終了させることが出来る。
【０００８】
請求項２記載の発明によれば、前記光刺激用レーザ光で前記光刺激を加える前記走査領域を含む範囲を前記観察用レーザ光で走査し、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の輝度が所定値に達したとき、試料に照射する前記光刺激用レーザ光の強度条件を変化させることを特徴とする。
【０００９】
本発明によれば、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像を確認して光刺激を行う場所を指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料の一部を光刺激する。この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が指定した値に達したとき、光刺激用のレーザ光の強度が変化する。更に時間が経過し、光刺激を行っている範囲の輝度が指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。
これにより光刺激による経時変化を検知し、自動で光刺激用のレーザ光の強度を制御し、また、光刺激が必要でないときに終了させることが出来る。
【００１０】
請求項３記載の発明によれば、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲が複数設定された場合、一回の開始指示に応じて前記複数の前記光刺激を加える走査領域を含む範囲のうち一つが処理され、別の開始指示が行われることによって当該別の範囲が処理される、ことを特徴とする。
【００１１】
本発明によれば、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像を確認して光刺激を行う場所を複数指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料の一部を光刺激する。
この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。これにより光刺激による経時変化を検知し、光刺激が必要でなくなったときに自動で終了させ、指定した別の箇所の光刺激を指示により開始することが出来る。
【００１２】
請求項４の発明によれば、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲が複数設定された場合、一回の指示により予め用意した前記複数の開始指示を前記複数の前記光刺激を加える走査領域を含む範囲のそれぞれを連続して処理することを特徴とする。
本発明によれば、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像を確認して光刺激を行う場所を複数指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料の一部を光刺激する。
【００１３】
この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。これにより光刺激による経時変化を検知し、光刺激が必要でなくなったときに終了させる。また、指定した別の箇所の光刺激を予め用意した条件に基づいて連続して光刺激を行うことができる。
【００１４】
請求項５の発明によれば、観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査し、光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査し、前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出し、前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を観察用レーザ光で走査し、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する、ことを特徴とする。
【００１５】
本発明によれば、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像から光刺激を行う場所を指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に、観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料を光刺激させる。この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が前記指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。これにより光刺激による経時変化を検知し、自動で光刺激を終了させることが出来る。
【００１６】
請求項６の発明によれば、コンピュータに、観察用レーザ光源により観察用レーザ光を走査する走査機能と、光刺激用レーザ光源により光刺激用レーザ光を走査する走査機能と、前記観察用レーザ光を試料に照射することにより発する光を検出する検出機能と、前記光刺激用レーザ光で光刺激を加える走査領域を含む範囲を観察用レーザ光で走査し、前記光刺激を加える走査領域を含む範囲の前記検出手段により検出した光の輝度に基づき前記光刺激が完了したことを検知する機能と、を実現させるためのプログラム。
【００１７】
本発明のプログラムをコンピュータに実行させることにより、観察用光学系を用いて試料を観察し、得られた観察画像から光刺激を行う場所を指定する。そして、光刺激による輝度の変化を参照し、光刺激を終了する輝度を指定する。次に、観察用光学系と光刺激用光学系を同時に使用し、試料を光刺激させる。
この光刺激による試料の輝度の変化を観察用光学系にある検出器で検出し、光刺激を行っている範囲の輝度が前記指定した値に達したとき、光刺激の走査を終了する。これにより光刺激による経時変化を検知し、光刺激を終了させることが出来る。
【発明の効果】
【００１８】
以上説明したように、本発明によれば、蛍光観察における光刺激を行うとき、光刺激を行う条件を決めることで、光刺激を自動制御することができる。
さらに、自動制御することで、前記条件での光刺激を繰り返し行うことができ、蛍光観察するときの光刺激の再現性が向上する。また、観察するときの作業者の作業工数を削減することができる。
【００１９】
また、光刺激用のレーザの制御によって、観察試料中の複数箇所を条件を変えながら自動で光刺激を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本実施形態で使用する共焦点走査型顕微鏡について説明する。しかし、本発明は、共焦点走査型顕微鏡に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない範囲内で、その他の走査型光学装置にも適用可能である。
図１に一般的な共焦点走査型レーザ顕微鏡の例を示す。このレーザ走査顕微鏡は、第１のレーザ光源１から出力されたコヒーレント光で試料面上を走査する。観察用走査光学系Ａは、ダイクロイックミラー２、光強度調整ユニット３、第１のレーザ光源１から出力されるコヒーレント光の光路上に、互いに直交方向に走査する各走査ミラー４ａ、４ｂを備えた走査光学ユニット４、リレーレンズ５、ミラー６、が配置されている。
【００２１】
本例では、第１のレーザ光源１から照射された光は光強度調整ユニット３で調整される。尚、光強度調整ユニット３の調整は、光源が半導体レーザ等の電気的に調整が容易なものであれば、第１の光源に駆動回路を配置し電気的に光強度調整をしてもかまわない。
観察用走査光学系Ａにおけるダイクロイックミラー２の分岐光路上には、検出光学系Ｃが配置されている。この検出光学系Ｃは、観察用走査光学系Ａによりコヒーレント光で試料面上を走査したときの試料に発生する蛍光を検出する機能を有している。この検出光学系Ｃは、ダイクロイックミラー２の分岐光路上に、測光フィルタ７、レンズ８、ピンホール９及び光電変換素子１０を配置した構成となっている。
【００２２】
次に、第２のレーザ光源１１から出力されたコヒーレント光を試料の任意の位置に照射して光刺激を行うための光刺激用走査光学系Ｂとを備えている。光刺激用走査光学系Ｂは、第２のレーザ光源１１から出力されるコヒーレント光の光路上に、走査光学系Ａと同様に光強度調整ユニット１２、走査光学ユニット１３を配し、走査光学ユニット１３は互いに直交方向に走査する各走査ミラー１３ａ、１３ｂを備え、リレーレンズ１４、ダイクロイックミラー１５、結像レンズ１６、対物レンズ１７を配置した構成となっている。光刺激（フォトアクチベーション）として、たとえば蛍光のブリーチングやケージド化合物の解除などがある。本実施例では蛍光のブリーチングを行うものとして説明する。
【００２３】
本例では、第２のレーザ光源１１から照射された光は光強度調整ユニット１２で調整される。
尚、光強度調整ユニット１２の調整は、光源が半導体レーザ等の電気的に調整が容易なものであれば、第２の光源に駆動回路を配置し電気的に光強度調整をしてもかまわない。
また、ダイクロイックミラー１５、結像レンズ１６、対物レンズ１７は、観察用走査光学系Ａと光刺激用走査光学系Ｂが共用する光学系である。
【００２４】
上記ダイクロイックミラー２の特性は、試料を染色する蛍光色素の励起波長（レーザ波長）及び蛍光波長によって決定される。
次に、上記構成されたレーザ走査顕微鏡の作用について説明する。この例で光刺激用走査光学系Ｂは、ステージ１８上の試料１９の任意の位置にコヒーレント光を照射するために用いられる。
【００２５】
すなわち、第２のレーザ光源１１から発せられたコヒーレント光は、走査光学ユニット１３に入射する。この走査光学ユニット１３は、各走査ミラー１３ａ、１３ｂによってコヒーレント光を任意に偏向する。この任意に偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ１４を透過した後、ダイクロイックミラー１５によって光路の向きを変え、結像レンズ１６を透過し、対物レンズ１７に導かれる。
【００２６】
この対物レンズ１７を透過した光は、ステージ１８上に載置された試料１９の断面２０に集光される。なお、用途に応じて、各走査ミラー１３ａ、１３ｂによってある範囲を走査し、又静止させてスポット的に照射することもできる。
さらに、各走査ミラー１３ａ、１３ｂを瞬間的にスキップ作動させることで、瞬時に複数の任意の位置にスポット的に照射することもできる。
【００２７】
一方、第１のレーザ光源１から発せられたコヒーレント光は、ダイクロイックミラー２を透過して走査光学ユニット４に入射する。
この走査光学ユニット４は、各走査ミラー４ａ、４ｂによってコヒーレント光を偏向する。この偏向されたコヒーレント光は、リレーレンズ５を透過した後、ミラー６によって光路の向きを変え、結像レンズ１６により対物レンズ１７の瞳径を満足するものとなる。
【００２８】
そして、結像レンズ１６を透過した光は、対物レンズ１７に至り、さらにこの対物レンズ１７を透過した光は、ステージ１８上に載置された試料１９の断面２０に集光される。
このように試料１９に光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。この試料１９からの蛍光は、先の光路と逆の経路で、対物レンズ１７から結像レンズ１６、ミラー６、リレーレンズ５、各走査ミラー４ａ、４ｂを通ってダイクロイックミラー２に到達し、このダイクロイックミラー２で反射して測光フィルタ７に入射する。
【００２９】
このダイクロイックミラー２は、試料１９を染色する蛍光色素の励起波長及び蛍光波長とレーザ波長に依存している。この測光フィルタ７に入射した光は、試料１９からの蛍光波長のみが選択され、その光がレンズ８によってピンホール９面に結像される。
【００３０】
このピンホール９を貫けた蛍光は、光電変換素子１０によって計測される。試料１９から反射光または蛍光が発生すると、それが信号光として検出光学系Ｃの光電変換素子１０で取出され、信号光の強度を示す電気信号に試料１９からの反射光または蛍光を変換した後にコントロールユニット２１へ送られる。観察用走査光学系Ａの２次元走査に対応するように、この電気信号を入力してデジタルデータに変換し、前記２次元走査に従った前記断面の信号光の強度分布からなる濃淡画像を作成して表示装置２２でモニタ表示させる。また、入力装置２３は、利用者が光刺激を行う領域の指示や、設定条件の入力を行う。入力装置２３はマウスなどによって入力できる。
【００３１】
ここで、コントロールユニット２１は、各光強度調整ユニット３、１２、第１の走査光学ユニット４、第２の走査光学ユニット１３等の制御を行う。
コントロールユニット２１内の各回路は、ＣＰＵ２４によって各回路を統括制御し、デジタルデータから画像データを作成して表示装置２２に表示させる画像表示回路２５、画像データや波形データなどを保存するシステムメモリ２６、光学ユニットの光電変換回路から出力される電気信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換回路２７、これらの回路を同期して動作させるための同期信号を発生する同期信号発生回路２８、第１の走査光学ユニット４や第２の走査光学ユニット１３等の２次元走査光学系に使用されるスキャナへの駆動波形を発生するスキャナ波形発生回路２９などにより構成される。
【００３２】
スキャナ波形発生回路２９は、同期信号発生回路２８から発生する垂直／水平同期信号及びピクセルクロックに合せて、予め設定されているスキャナ駆動波形を発生し、上記レーザ光を試料１９の焦点面内で２次元に走査するようスキャナを駆動する。そして、走査にあわせて検出した光強度を示す電気信号がＡ／Ｄ変換回路２７に入力され、そのデジタル出力を上記水平／垂直同期信号及びピクセルクロックによりサンプリングしてデジタルデータに変換する。
【００３３】
このデジタルデータは、上記光強度の情報であり、ＣＰＵ２４により、画像として画像表示回路２５を介してＣＲＴなどで構成される表示装置２２へ表示させるか、画像データとしてシステムメモリ２６に格納、保存される。
ここで、ＣＰＵ２４、画像表示回路２５、システムメモリ２６等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。
【００３４】
また、後述する図４、図７の処理はコンピュータプログラムにより処理可能で、その処理プログラムはＣＤ−ＲＯＭ等記録媒体やハードディスク等システムメモリ２６に記録されている。必要に応じて前記パーソナルコンピュータのメモリ上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵ２４により実行しパーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御している。
【００３５】
なお、記録媒体は通信回線を介してコンピュータと接続されている、プログラムサーバとして機能するコンピュータが備えている記憶装置であってもよい。
この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータヘ伝送するようにし、コンピュータでは受信した伝送信号を復調して処理プログラムを再生することでこの処理プログラムをＣＰＵで実行できるようになる。
【００３６】
このように上記構成において、観察用走査光学系Ａとは別に、第２のレーザ光源１０から出力されたコヒーレント光を光刺激用走査光学系Ｂにより試料１９上の任意の位置に照射し、かつ第１のレーザ光源１から出力されたコヒーレント光で観察用走査光学系Ａにより試料１９上を走査し、その蛍光を光電変換素子１０によって計測するようになっており、第１の走査光学系により試料画像を観察、記録している途中に、光刺激用走査光学系Ｂによりコヒーレント光を試料１９に照射すれば、光刺激用走査光学系Ｂによるコヒーレント光照射によって引き起こされる試料１９の動的特性(化学反応)などを調査できる。
【００３７】
（実施形態１）
まず、図２で概略を説明すると、共焦点走査型レーザ顕微鏡により試料を走査し、観察用走査光学系Ａにより蛍光観察画像を取得する。取得した画像は図２のように表示装置２２（ＣＲＴ等）に表示される。表示された画面に入力装置２３により、光刺激箇所（ここではブリーチを行う場所）を指定する。そして、光刺激箇所に光刺激用走査光学系Ｂにより光刺激を行うと、その部分が褪色をはじめ蛍光が徐々に検出できなくなる。この時の輝度値により光刺激を停止する。
【００３８】
次に、図３で複数光刺激箇所がある場合を図４のフローチャートで説明をする。
ステップＳ４０１では、試料全体の蛍光観察画像を、観察用走査光学系Ａにより蛍光観察画像を取得する。
ステップＳ４０２で、取得した蛍光観察画像を図３のような形で表示装置２２に表示し、ステップＳ４０３で光刺激を行いたい箇所を指定する。例えば、図３の（１）、（２）のように一箇所または複数箇所決定する。
【００３９】
そして、Ｓ４０４で、光刺激用のレーザ光の波長と、試料に使用されている蛍光試薬別に、輝度とレーザ照射時間の関係を表した図５のような褪色グラフを表示する。
ステップ４０５では、図５のような褪色グラフを用いて、光刺激を終了させたいタイミングをグラフ等で指示して設定する。例えば、図６のグラフで示すように、輝度値の最大値と最小値から、最大値の２０％を設定し光刺激開始タイミング、最小値の２０％を設定し光刺激終了タイミングとして設定して、光刺激の開始と終了のタイミングを決める。
【００４０】
尚、輝度とレーザ照射時間の関係は図５のようなグラフだけでなく、他のグラフィカルな図を予め用意してもいいし、直接設定値を入力してもかまわない。
ステップＳ４０６で、試料のリアルタイムな蛍光観察画像を観察用光学系Ａと検出用光学系Ｃで取得し表示装置２２に表示する。
ステップＳ４０７で、表示装置２２のグラフで指定した箇所の光刺激の実行を開始する。
【００４１】
ステップＳ４０８では、走査して光刺激による試料の変化を観察用光学系Ａと検出光学系Ｃでモニタし、ステップＳ４０９ではＣＰＵ２４が光刺激部分の輝度をＡ／Ｄ変換回路２７からのデータを取得し、ステップＳ４１０で上記グラフを用いて設定した輝度になったかを判断する。輝度が設定値になるのは光刺激により褪色が進んだことによるためＹＥＳの方に分岐しステップＳ４１１で、光刺激の走査を自動で停止する。ＮＯであればステップＳ４１１〜Ｓ４１３を再度実行する。
【００４２】
また、光刺激を行う箇所が複数である場合は、次の光刺激箇所に移り光刺激を開始し、指定した全箇所の光刺激が終了したら光刺激の作業を全て完了する。
本実施形態によれば、試料に対する光刺激の変化により試料が任意の輝度に達したとき、自動で光刺激を完了することが出来る。また、違う箇所を光刺激する際に、同じ条件で光刺激を行うことが出来る。
【００４３】
実施形態１では、光刺激による輝度の変化を表したグラフを以て、光刺激の終了条件を決定しているが、光刺激用のレーザの波長と試薬の関係から、ルックアップテーブル等で光刺激が完了する輝度を予め用意しておき、使用者が光刺激用レーザの波長と試薬の種類を入力することで光刺激の終了が決定してもよい。
また、光刺激を行う各箇所の完了条件が、それぞれ設定可能であっても良い。また、光刺激用のレーザを複数設置し、光刺激を行う各箇所によって照射するレーザの波長が異なっていても良い。
【００４４】
（実施形態２）
次に図７を用いて実施形態２の説明を行う。ステップＳ７０１で蛍光観察画像を取得する。ステップＳ７０２で、取得した画像を図３のような形で表示装置２２（ＣＲＴ等）に表示し、ステップＳ７０３で、光刺激を行いたい箇所を図３（１）、（２）のように一箇所または複数箇所決定する。
【００４５】
そして、ステップＳ７０４で、光刺激用のレーザ光の波長と試料に使用されている蛍光試薬別に輝度とレーザ照射時間の関係を表した図８のような褪色グラフを表示させる。
ステップＳ７０５でまず光刺激を行うレーザ光の強度を決定する。そして、ステップＳ７０６で、ステップＳ７０５で決めた強度で光刺激を行う区間を褪色グラフで図８（１）のＳ１のように決定する。その後、Ｓ１で光刺激用のレーザ光強度を変化させ光強度の設定を行う。
【００４６】
これは例えばゆっくりした変化を観察したい場合はレーザ光強度を小さく、また早い変化を観察したい場合はレーザ光強度を大きく設定する。
ステップＳ７０８で、光刺激を終了させたいタイミングＥ１を図８（１）のようにグラフ上で指示して設定する。
尚、このグラフは予め用意されているが、図８（２）レーザ強度を変化させて設定する際にグラフの傾斜が相対的に変化することが望ましい。
【００４７】
その後、ステップＳ７０９で、試料のリアルタイム画像を観察用光学系Ａと検出用光学系Ｃで取得し、表示装置２２のＣＲＴ等に表示する。
ステップＳ７１０では、指定した箇所の光刺激を実行する。ステップＳ７１１では、光刺激による試料の変化を検出光学系でモニタし、ステップＳ７１２では、上記で設定した輝度Ｓ１になったかを、ＣＰＵ２４で光刺激部位の輝度を確認する。
【００４８】
ステップＳ７１３では、設定した輝度であるかを判断し、ＹＥＳであればステップＳ７１４で光刺激用レーザの強度を制御し、設定した終了のタイミングＥ１になったら光刺激の走査を自動で停止する。ＮＯであればＳ７１１〜Ｓ７１３を再度実行する。
本実施形態によれば、違う箇所を光刺激する際には、同じ条件で光刺激を行うことが出来る。また、光刺激を行う箇所が複数である場合は、次の設定した箇所の光刺激を開始し、指定した全箇所の光刺激が終了したら光刺激の作業を全て完了とする。
【００４９】
実施形態２によれば、試料に対する光刺激の変化により試料が任意の輝度に達したとき、自動で光刺激の条件を変更し、その後自動で完了することが出来る。
実施形態２において、光刺激の条件をレーザ強度の変更のみでなく、光刺激用のレーザを複数設置し、このレーザの波長などを変更してもよい。また、光刺激の条件を変える輝度の条件が一箇所でなく複数あってもよい。
【００５０】
さらに、第１、２の実施形態について、複数の光刺激箇所を連続して光刺激する場合、利用者が複数ある光刺激箇所毎に光刺激の開始を指示して、複数の光刺激箇所のそれぞれに一回毎に光刺激することができる。また、予め利用者は光刺激を行うそれぞれの光刺激箇所の光刺激を実行する開始条件を入力しておき、その開始条件により光刺激を複数の光刺激箇所に行う。例えば、光刺激箇所の光刺激をする順番などを入力する。
【００５１】
上記では、複数箇所の光刺激を順番に行っているが、走査ミラーを瞬間的にスキップ作動させて、複数箇所に照射させてもよい。すなわち、複数箇所の光刺激を効率よく時間ずれ少なく行うために、同一の光刺激の走査線上にある光刺激箇所を一度に光刺激を行う。
例えば、２つの光刺激箇所があるとき、第１の光刺激箇所と第２の光刺激箇所が、１以上の同一の走査線上にある場合、第１と第２の光刺激箇所を光刺激する走査が、第１の光刺激箇所を走査したところで次の走査線に移らず、第１の光刺激箇所の刺激を途中で止め、引き続き同じ走査線上にある第２の光刺激箇所を光刺激する。走査線上の第２の光刺激が終わったら、次の走査線に移り、また、第１の光刺激箇所の光刺激を行う。このように動作することでフライバック動作を減らし、領域間の刺激の時間差を小さくできる。
【００５２】
尚、第１、２の実施形態は、それぞれの実施形態を選択可能であることが望ましい。
（変形例）
以上の説明で共焦点走査型顕微鏡の構成は図１に示す構成としたが、これに限らず各種の共焦点走査型顕微鏡に適用することができる。
例えば、観察用光学系Ａと検出用光学系Ｃは、Ｎｉｐｋｏwディスクやスリットディスクを回転させる等のディスクスキャン型共焦点顕微鏡であっても良い。このとき、前記ディスクに設けられた開口部が対物レンズの集光位置と共役な位置に配置される微小開口を兼ね、光検出器としてＣＣＤ等の２次元画像センサが用いられる。
【００５３】
さらには２次元光走査機構に変えて、１次元光スキャナによって対物レンズの集束光を試料の１ライン上で走査し、試料を観察する構成であっても良い。
その他、上記の構成に限らず、各種の共焦点顕微鏡に本発明を適用することができる。更に、以上の説明で全ての処理をプログラム上で行うことが望ましいが、電気回路としてハードウェアでコントロールユニットにルックアップテーブルを構築し、電気回路上だけで処理を行っても良い。
【００５４】
全ての実施形態において光刺激の変更や終了のタイミングをタスクテーブルのように一度手動で行った動作をコントロールユニットに記憶させて、その条件を繰り返させるようにしてもよい。また、電動で動くステージを用意し、複数の試料で自動に観察できるようにしても良い。
また、光刺激を停止する輝度を決定する方法として、一度手動で光刺激を停止したときの輝度を記録して、その後、光刺激を自動停止するときの輝度をその記録した輝度としても良い。
【００５５】
実施例においては共焦点走査型レーザ顕微鏡を用いて説明したが、本発明は共焦点内視鏡などその他の走査型光学装置にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】共焦点走査型光学顕微鏡の概略的な構成を示す図である。
【図２】光刺激による試料の変化を示す図である。
【図３】光刺激による試料の表示例で、（１）は光刺激を行う場所を指定するところを示し(一箇所)、（２）は光刺激を行う場所を指定するところを示す図である。（複数箇所）
【図４】実施形態１の処理を示すフローチャートである。
【図５】光刺激用レーザの波長と試薬の種類による、レーザ照射時間と試料輝度の関係を示す図である。
【図６】光刺激用レーザの走査の開始と終了を、輝度の最大値と最小値から決定する例である。
【図７】実施形態２の処理を示すフローチャートである。
【図８】（１）は光刺激を終了させる輝度を指定する設定画面を示し、（２）は光刺激の条件を変更する輝度と光刺激を終了させる輝度を指定する図である。
【符号の説明】
【００５７】
１  ・・・  第１のレーザ光源
２  ・・・  ダイクロイックミラー
３  ・・・  第１のレーザ光強度変換装置
４  ・・・  第１の走査光学ユニット
４ａ  ・・・  走査ミラー
４ｂ  ・・・  走査ミラー
５  ・・・  リレーレンズ
６  ・・・  ミラー
７  ・・・  測光フィルタ
８  ・・・  レンズ
９  ・・・  ピンホール
１０  ・・・  光電変換素子
１１  ・・・  第２のレーザ光源
１２  ・・・  第２のレーザ光強度変換装置
１３  ・・・  第２の走査光学ユニット
１３ａ  ・・・  走査ミラー
１３ｂ  ・・・  走査ミラー
１４  ・・・  リレーレンズ
１５  ・・・  ダイクロイックミラー
１６  ・・・  結像レンズ
１７  ・・・  対物レンズ
１８  ・・・  ステージ
１９  ・・・  試料
２０  ・・・  試料断面
２１  ・・・  コントロールユニット
２２  ・・・  表示装置
２３  ・・・  入力装置
２４  ・・・  ＣＰＵ
２５  ・・・  画像表示回路
２６  ・・・  システムメモリ
２７  ・・・  Ａ／Ｄ変換器
２８  ・・・  同期信号発生回路
２９  ・・・  スキャナ波形発生回路
３０  ・・・  光路制御回路
Ａ  ・・・  観察用走査光学系
Ｂ  ・・・  光刺激用走査光学系
Ｃ  ・・・  検出用光学系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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