(57)【要約】      （修正有）【課題】T細胞免疫調節効果による免疫力の改善。【解決手段】  メリビオースを有効成分として含有する免疫改善剤、Ｔ細胞免疫調節剤、経口免疫寛容誘発剤を提供する。メリビオースはラフィノースに比較しＴ細胞免疫調節作用に優れ、また、口溶け感や味覚の点で経口服用に適している。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メリビオースを有効成分として含有することを特徴とする免疫改善剤。
【請求項２】
メリビオースを有効成分として含有することを特徴とするT細胞免疫調節剤。
【請求項３】
メリビオースを有効成分として含有することを特徴とする経口免疫寛容誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫力の改善に有効な、T細胞免疫調節剤に関するものであり、詳細には、メリビオースを有効成分とするT細胞免疫調節剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫には大きく自然免疫と獲得免疫がある。自然免疫とは、好中球やマクロファージなどの貪食細胞が、体内に侵入した微生物などの異物を食作用により単純に取り除く仕組みである。一方、獲得免疫とは、T細胞が自己と異物を高度に識別し、T細胞が異物情報を記憶することで、再度の異物の侵入に対して、B細胞による抗体産生などの抗原特異性の高い迅速かつ強力な免疫応答を誘導する機構である。またT細胞は、マクロファージの貪食殺傷能も高めるので、獲得免疫のみならず自然免疫においても重要な働きをしている。T細胞の働きを列記すると、I型ヘルパーT細胞による細胞性免疫（貪食細胞による免疫）の誘導増強、II型ヘルパーT細胞による液性免疫（抗体産生）の誘導増強、キラーT細胞によるウイルス感染細胞への攻撃、自己組織及び経口摂取抗原に対する免疫寛容の誘導（自己免疫寛容、経口免疫寛容）などである。
免疫系の中枢機能を果たすT細胞の機能に異常がおこると、免疫不全症や自己免疫疾患、過敏症（アレルギー）など様々な疾患が発症する。またT細胞の機能異常とまでいかなくても、加齢や低栄養、ストレス、化学物質の暴露等によってT細胞機能が変調することで、感染症、自己免疫疾患や過敏症などを罹患しやすい体質となる。逆に言うと、これらの疾患を予防又は治療する上で、T細胞免疫を調節し正常化することは極めて有効な手段となる。
【０００３】
T細胞免疫調節剤としては、リコンビナントサイトカイン、抗サイトカイン抗体、抗サイトカインレセプター抗体などの薬剤が開発されているが、副作用などの弊害が大きいとされている。一方、植物中に含まれる成分でもインゲンマメレクチンのようにT細胞増殖を誘発する物質が知られているが、副作用が強く実験用試薬としての利用に留まっている。一方、安全性の高い成分として、本発明者らが特許文献１（特開２００１−２８８０９３号公報）に開示した過敏症の予防改善に有効なラフィノースがある。
【特許文献１】特開２００１−２８８０９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我が国をはじめ先進国で進む高齢化や、ストレス社会の拡がり、公害、食生活の変化等により、慢性的なT細胞機能の変調が起こり、感染症や過敏症をはじめ、クローン病や潰瘍性大腸炎などの自己免疫疾患などに苦しむ人が増加している。そのため、T細胞機能の慢性的異常の改善又は予防に有効であり、安全性が高く、患者への負担の観点から経口投与も可能なT細胞免疫調節剤の開発が待ち望まれていた。その一つに本発明者らが開示した過敏症の予防改善に有効なラフィノース（特開２００１−２８８０９３）がある。しかしながら、現在ではさらにT細胞免疫調節効果の高い成分が求められており、また経口投与タイプとしては、ラフィノースは口溶け感や味質などの点で嗜好性が不十分な面があり長期間毎日摂取するには乳幼児や老人患者で服用への抵抗感が生じるなどの問題があった。またラフィノースは1日10g以上の摂取により浸透圧性の腹痛や下痢を伴うということがまれに発生し、摂取量を控える必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するために、あらたな成分の検索に着手し、ラフィノースの構造の一部を分解除去することによって得られるメリビオースが、強いT細胞免疫調節作用があることをあらたに見いだした。そしてラフィノースよりもT細胞免疫調節作用に優れていることを発見した。さらにメリビオースはラフィノースよりも口溶け感や味質が良好で服用しやすく、高用量摂取時でも腹痛や下痢を生じづらい特徴があった。
本発明は上述した有用新知見に基づき、更なる研究の結果、完成されたものであって、メリビオースを有効成分とし、経口摂取しやすく、副作用も極めて低いT細胞免疫調節剤を提供することである。
【０００６】
（１）メリビオースを有効成分として含有することを特徴とする免疫改善剤
（２）メリビオースを有効成分として含有することを特徴とするT細胞免疫調節剤
（３）メリビオースを有効成分として含有することを特徴とする経口免疫寛容誘導剤    
【発明の効果】
【０００７】
T細胞免疫調節効果により、免疫力の改善が図られる。
口溶け感や味質が良好で服用しやすく、多量を摂取しても腹痛や下痢を生ぜず、経口摂取に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下本発明を詳述する。本発明に用いるメリビオースは、ガラクトースの1位とグルコースの6位がαグルコシド結合した６−O−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−D−グルコースの構造を持ち、ラフィノースの部分構成糖として知られる。
【０００９】
その製造法の一例を示すと、ラフィノースにインベルターゼあるいは無機酸、有機酸を作用させることによりメリビオースとフルクトースに加水分解されるので、これよりメリビオースを精製回収することができる。またラフィノース溶液にパン酵母などを加えて発酵させることによっても、ラフィノースのフルクトース部分が資化されるので、発酵液よりメリビオースを精製回収することができる。またガラクトースとグルコース混合溶液にαガラクトシダーゼを添加すると縮合反応によってメリビオースが生成するので、この反応液よりメリビオースを精製回収することも可能である。
【００１０】
メリビオースの使用量は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが、通常成人1日当たり0.1 〜20gを経口投与することができる。
【００１１】
以下、本発明の実施例について述べる。
【実施例１】
【００１２】
T細胞は特定の抗原に対する1種類のT細胞抗原受容体(TCR)だけを発現し、1個のT細胞は特定の抗原としか反応しない。従って、無数に近い種類の抗原に対応するために、多様なTCRを発現するT細胞が作られている。通常、ある種の抗原に反応できるT細胞の割合は極めて低いため、実験的にそのT細胞応答を観察することは困難である。しかし、特定のTCR遺伝子を導入した（TCRトランスジェニック）マウスでは、その個体内のT細胞のほとんどが、導入した同一のTCRを発現しているため、抗原特異的なT細胞免疫の観察が可能である。動物試験に供したTCRトランスジェニックマウスOVA23-3（以後、Tgマウス）は、導入遺伝子ホモマウス（雄性）と遺伝的背景がほぼ同一とみなされるBALB/cAマウス（雌性）を交配させて生まれたヘテロマウスであり、卵白アルブミン（OVA）の323から339番目のペプチドとMHC（主要組織適合抗原）クラスII分子であるI-Adが結合した複合体を認識する特異的TCR-αβ鎖の遺伝子が導入されており、大部分のTCRαβ-T細胞がこのTCRを発現している。このTgマウスに特異抗原であるOVAを投与すると、脾臓や腸管膜リンパ節などの免疫器官に存在するOVA特異的T細胞が抗原感作を受けて、未感作型から感作型T細胞（Th1細胞やTh2細胞など）へ分化し、さらに抗原投与が継続すると感作型T細胞は免疫寛容状態に変化し、サイトカイン産生性や増殖応答性が低下することが明らかとなっている（引用文献Journal of Immunology 169, 4723-4731, 2002）。
本実施例では、このTgマウスを使った動物試験において、抗原としてOVAを投与することで誘導されるT細胞免疫応答が、メリビオース食を与えておくことにより、どのように調節されるか調査した。
【００１３】
（１）動物試験デザイン
3週齢の雌性Tgマウス10匹を体重の平均が等しくなるように2群（5匹／群）に分け、コントロール群には基本飼料（カゼイン20%、コーンスターチ48.17%、α−スターチ9%、スクロース5%、セルロース5%、大豆油6%、ミネラルミクスチャー5%、ビタミンミクスチャー1.3%、塩化コリン0.23%、メチオニン0.3%）を、メリビオース群には5%メリビオース添加飼料（基本飼料のコーンスターチを43.17%として、メリビオースを5%添加した飼料）を与えた。2週間後、コントロール群の飼料は8%OVA添加飼料（基本飼料のカゼインを12%として、卵製アルブミンを8%添加した飼料）に、メリビオース群の飼料は8%OVA-5%メリビオース添加飼料（5%メリビオース添加飼料のカゼインを12%として、卵製アルブミンを8%添加した飼料）に変更し、さらに1週間飼育した。飼育終了後、頸椎亜脱臼により屠殺した後、直ちに解剖し、脾臓を採取した。採取した脾臓はRPMI培地中ですりつぶすことで単細胞に分散させ、メッシュを通して組織片を取り除いた。この細胞群にビーズ標識抗CD4抗体(Miltenyi Biotech GmbH社)を反応させ、磁気細胞分離カラム（Miltenyi Biotech GmbH社）によりCD4分子を表出しているT細胞（ヘルパーT細胞）を精製した。
【００１４】
（２）T細胞のサイトカイン産生能の評価
上述のとおり調製したCD4分子陽性T細胞（ヘルパーT細胞）をin vitroにて培養する段階でOVA抗原により再刺激し、サイトカイン産生能を調べた。48穴培養プレート(Costar社)に、1穴あたりヘルパーT細胞を5×105/ml、抗原提示細胞を2×106/mlになるように添加し、各穴にはOVAを0〜1 mg/ml濃度で加え、全量を1 mlとして37℃5%CO2下にて60時間培養し、培養上清中のサイトカイン濃度をELISA法により定量した。なお抗原提示細胞は、50 mg/mlマイトマイシンC（Sigma社）と反応（45分37℃）させて増殖性を低下させたBALB/cAマウスの脾臓細胞を用いた。
【００１５】
（３）結果
感作型T細胞の中でTh2細胞が特異的に産生するサイトカインであるIL-４について、培養上清中の濃度を図1に示した。コントロール群と比較してメリビオース群では、IL-4濃度が有意に低下していた。この結果から、メリビオース投与により、Th2サイトカイン産生量の低下が誘導されることが明らかとなった。
メリビオース投与によりIL-4産生量が低下した要因として、Th2細胞のサイトカイン産生能が低下する、すなわちメリビオース投与によって免疫寛容状態のTh2細胞の誘導が促進された可能性が考えられた。そこで実施例2の実験を行い、これを検証した。
【実施例２】
【００１６】
動物試験において、抗原として卵白アルブミン（OVA）を投与することで誘導されるヘルパーT細胞の免疫寛容が、メリビオース食の投与により促進されるか調査した。
【００１７】
（１）動物試験デザイン
3週齢の雌性Tgマウスをまず2群（12匹／群）に分け、コントロール群には基本飼料（実施例1に記述）を、メリビオース群には5%メリビオース添加飼料（実施例1に記述）を与えた。2週間飼育後、上述の各群をさらに4群（3匹／群）に分け、OVA添加飼料を与える日数を変えて（0、4、7、10日間）与えた。すなわちコントロール群には8%OVA添加飼料（実施例１に記述）を、メリビオース群には8%OVA-5%メリビオース添加飼料（実施例１に記述）に変更し、各日数の期間飼育した。飼育終了後、各マウスから腸管膜リンパ節を採取して、実施例1と同様にCD4分子陽性T細胞（ヘルパーT細胞）を精製した。
【００１８】
（２）T細胞の増殖応答能の評価
上述のとおり調製したヘルパーT細胞をin vitroにてOVA抗原により再刺激し、チミジンのアナログである、5-Bromo-2’deoxy-Uridine(BrdU)の取り込み量を指標として、T細胞の増殖応答を調べた。96穴培養プレート(Costau社)に、1穴あたりヘルパーT細胞を5×105/ml、抗原提示細胞（実施例１に記述）を2×106/mlになるように添加し、各穴にはOVAを0〜1 mg/ml濃度で加え、全量を0.2 mlとして37℃、5%CO2下にて培養した。培養開始22時間後に培地中にBrdUを添加し、さらに36時間後まで培養した。細胞内DNAへ取り込まれたBrdU量をELISA法（BrdUラベリングディテクションキットIII、ロシュ・ダイアグノスティックス社）により測定した。すなわち、BrdU標識された細胞をエタノールにより培養プレートに固定し、ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体と反応させた後、基質を添加し、酵素反応を405nm波長により検出した。
【００１９】
（３）結果
図２に示すように、コントロール群では抗原刺激に対するヘルパーT細胞の増殖能がOVAを投与してから7日目まで上昇し、10日目に低下していた。OVA投与10日目で観察されたヘルパーT細胞の増殖能低下は、ヘルパーT細胞が免疫寛容状態になったことを示している。一方、コントロール群と比較してメリビオース群では、ヘルパーT細胞の増殖能がピークとなるOVA添加食給与7日目において、有意に低下していた。
この結果は、メリビオースを投与することによって、抗原感作したヘルパーT細胞の増殖能の上昇が抑制されたこと、すなわちヘルパーT細胞の免疫寛容の誘導が促進されたことを示している。
またIL-4産生量についても、図３に示すようにコントロール群では7日目に最大量に達して10日目には低下していたが、メリビオース群の７日目のIL-4産生量は、コントロール群と比較して有意に低下しており、図２の増殖応答の変化と一致していた。この結果から、メリビオース投与は特にTh2細胞の免疫寛容の誘導を促進することが明らかとなった。
【実施例３】
【００２０】
以上のように、Tgマウスを用いた実施例1、2の動物実験から、メリビオースはT細胞免疫を調節し、経口免疫寛容誘導を促進することが分かった。そこで、メリビオースの経口免疫寛容誘導作用に関して、別の動物実験モデルを用いて、さらに検証を行った。
【００２１】
（１）実験動物/飼育方法及び細胞調製
4週齢の雌性BALB/cAマウス22匹を、対照群（n＝6）、試験(-)群（n＝8）、試験(+)群（n＝8）の3群に分け、対照群と試験(-)群には基本飼料（カゼイン20%、コーンスターチ48.17%、α-スターチ9%、スクロース5%、セルロース5%、大豆油6%、ミネラルミクスチャー5%、ビタミンミクスチャー1.3%、塩化コリン0.23%、メチオニン0.3%）を、試験(+)群には5%メリビオース添加飼料（基本飼料のコーンスターチを43.17%として、メリビオースを5%添加したもの）を与え14日間飼育した。
その後、試験(-)及び(+)群には卵白アルブミン(OVA) 1 mgを含有する生理食塩水を、対照群には生理食塩水のみを単回経口投与した。OVA経口投与7日後にOVA 50μgを含むフロイント完全アジュバント（DIFCO社）を各個体の両足裏と尾根部に単回皮下免疫し、さらに7日間飼育した。
飼育終了後、頚椎亜脱臼により屠殺・解剖を行い、鼠蹊部リンパ節を採取した。採取した細胞は個体毎に単細胞液に調製した。
【００２２】
（２）サイトカイン定量（ELISA法）
（１）で調製したリンパ節細胞を、48穴培養プレート(Costar社)に1穴あたり2.5×106/mlとなるように添加し、OVAを0、0.1、1mg/ml濃度で加えて全量を1 mlとした。これらを37℃、5%CO2下にて培養し、24時間後に培養上清中のIL-2濃度をELISA法により定量した。結果を図４に示す。
【００２３】
（３）リンパ球増殖応答（BrdU法）
（１）で調製したリンパ節細胞をin vitroにてOVA抗原により再刺激し、チミジンのアナログである、5-Bromo-2’deoxy-Uridine(BrdU)の取り込み量を指標として、増殖応答を調べた。96穴培養プレート(Costau社)に、1穴あたりリンパ節細胞を2.5×106/mlになるように添加し、各穴にはOVAを0、0.1、1mg/ml濃度で加え、全量を0.2 mlとして37℃、5%CO2下にて培養した。培養開始24時間後に培地中にBrdUを添加し、さらに38時間後まで培養した。細胞内DNAへ取り込まれたBrdU量を実施例2と同様にELISA法（BrdUラベリングディテクションキットIII、ロシュ・ダイアグノスティックス社）により測定した。結果を図５に示す。
【００２４】
（４）結果
（ａ）サイトカイン産生量
対照群に対し、試験(-)及び試験(+)群では、サイトカイン（IL-2）産生量が低下した。さらに、試験(+)群においては、試験(-)群と比較してIL-2産生が有意に低下した（図４）。
（ｂ）リンパ球増殖応答
対照群に対し、試験(-)及び(+)群では、リンパ球増殖応答が低下した。 さらに、試験(+)群においては、試験(-)群と比較してリンパ球増殖応答が有意に低下した（図５）。
（ｃ）本実験の結果から、対照群に対し、予め抗原を経口投与した試験（-）群及び試験（+）群では、IL-2産生量及びリンパ球増殖応答の低下が観察され、実験的に経口免疫寛容状態が誘導されていることが確認された。
さらに、メリビオース添加試料を与えた試験（+）群では、試験（-）群に比べ、IL-2産生とリンパ球増殖応答の有意な低下が認められたことから、メリビオースの摂取により、経口免疫寛容の誘導が促進され、免疫が改善されることが、実施例3からも明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各群のTgマウスから調製したCD4T細胞をOVAにより抗原再刺激した時のインターロイキン4（IL-4）産生の比較した図
【図２】各群のTgマウスから調製したCD4T細胞をOVAにより抗原再刺激した時の増殖応答性の比較した図
【図３】各群のTgマウスから調製したCD4T細胞をOVAにより抗原再刺激した時のインターロイキン4（IL-4）産生の比較した図
【図４】実施例３における各群のBALB/cAマウスから調製したリンパ球細胞をOVAにより抗原再刺激した時のインターロイキン2（IL-2）産生を比較した図
【図５】実施例３における各群のBALB/cAマウスから調製したリンパ球細胞をOVAにより抗原再刺激した時のリンパ球増殖応答を比較した図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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