(57)【要約】【課題】  抗ニューカッスル病ウイルス活性のある鶏用ワクチンを提供する。【解決手段】  特定の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質をコードするｃＤＮＡが接続されていることを特徴とする環状ＤＮＡを有効成分とする鶏用ＤＮＡワクチン【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質をコードするｃＤＮＡが接続されていることを特徴とする環状ＤＮＡを有効成分とする鶏用ＤＮＡワクチン。
【請求項２】
さらに免疫効果付与物質を含有してなる請求項１の鶏用ＤＮＡワクチン。
【請求項３】
免疫付与物質が核酸である請求項２記載の鶏用ＤＮＡワクチン。
【請求項４】
免疫効果付与物質が、配列の一部にメチル化されていない連続するシトシン、グアニン塩基をもつ合成ＤＮＡ及び／又は二重鎖ＲＮＡである請求項２記載の鶏用ＤＮＡワクチン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載された鶏用ＤＮＡワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法。
【請求項６】
１個体に接種する環状ＤＮＡの量が５〜５０μｇである請求項２〜４のいずれかに記載の鶏用ＤＮＡワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューカッスル病ウイルスの感染を予防する鶏用ＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病は養鶏界で最も恐れられている病気のひとつで、感染後数日の内に沈うつや嗜眠といった症状を示して数１０％から５０％以上の鶏が致死する。経過が長引くと斜頚・頭部捻転の神経症状を示すこともある。この病気が恐れられている原因の一つに、全ての日齢の鶏が本疾病に感受性で、強毒株に感染した場合は日齢を問わず劇症となる点である。また、いったん感染した場合、水平感染性が高く、鶏舎全ての鶏を処分して消毒する措置を講じない限り、感染を抑えることができないといわれている。
現在、本疾病に対する予防措置として生ワクチン及び不活化ワクチンが使われているが、副作用や接種時の鶏の体調への留意が必要であったり、ワクチン効果の持続期間が短く、接種回数が多いという問題があり、より簡便に確実なワクチン効果を得ることが求められている。
このような状況のもと、ニューカッスル病予防のためのＤＮＡワクチンが検討されている（特開平８−１１６９７６号公報）。この公報によれば、ニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶという）のＦタンパク質をコードするｃＤＮＡ（以下、Ｆ遺伝子という）を用いたＤＮＡワクチンの効果は、環状ＤＮＡでは認められず、環状ＤＮＡを線状化する必要があると記載されている。しかしながら、こうした方法は、大量の環状ＤＮＡを制限酵素処理、精製操作を実施する必要があり実用性に乏しい。
【０００３】
【特許文献１】特開平８−１１６９７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
我々は抗ＮＤＶワクチンを得るべく検討した結果、鶏β−アクチンプロモータの改変体である特定のプロモータとして用いた場合、環状ＤＮＡを線状化することなくワクチン効果を発揮することを見出した。
しかもこのＤＮＡワクチンは、移行抗体を保有している市販鶏にも、ＳＰＦ鶏にもＮＤＶに対して高い防御効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かくして本発明によれば、配列番号１記載の塩基配列を有するプロモータ、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなるプロモータの支配下にニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質をコードするｃＤＮＡが接続されていることを特徴とする環状ＤＮＡを有効成分とする鶏用ＤＮＡワクチンが提供される。当該ワクチンには、さらに免疫効果付与物質を含有させることができる。免疫効果付与物質としては、核酸が好ましく、特に配列の一部にメチル化されていない連続するシトシン、グアニン塩基をもつ合成ＤＮＡ及び／又は二重鎖ＲＮＡが好ましい。
また、本発明によれば、前記本発明の鶏用ＤＮＡワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法、及び環状ＤＮＡ量が５〜２０μｇである、免疫効果付与物質を含有する本発明の鶏用ＤＮＡワクチンを家禽に接種することを特徴とする免疫付与方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明を詳述する。
本発明のＤＮＡワクチンは、特定プロモータとＮＤＶのＦ遺伝子とを有する環状ＤＮＡを有効成分とするものである。この環状ＤＮＡは、通常、特定プロモータとＦ遺伝子とをベクターに組み込んで得られる。
【０００７】
（プロモータ）
本発明において、Ｆ遺伝子のプロモータとして用いるのは、配列番号１記載の塩基配列を有するもの、又はその一部が置換、欠失、或いは付加されたもの（以下、改変プロモータという）である。もちろん、改変プロモータは、動物細胞中で遺伝子発現用プロモータとして機能するものである。
配列番号１記載の塩基配列を有するプロモータ又は改変プロモータは、特開２００１−０００１８８号公報に詳述されている。
【０００８】
（Ｆ遺伝子）
本発明に用いるＦ遺伝子はＮＤＶのＦタンパク質をコードするｃＤＮＡであればよく、ＮＤＶのセロタイプが何であっても、また、鶏に対して弱毒でも強毒でもかまわない。具体的にはＳａｔｏ株、Ｍｉｙａｄｅｒａ株、Ｄ２６株、Ａｔａｍｉ株、Ｆｕｊｉ株などのほか、ＴｅｘａｓＧＢ株、Ｂ１株、ＬａＳｏｔａ株が上げられるほか、Ｆ遺伝子の塩基配列が知られている株や野外から分離した株でもよいが、中でもＤ２６株が好ましい。
本発明においては、Ｆ遺伝子以外のＮＤＶの抗原遺伝子を含んでいても構わない。その様な遺伝子としてＮＤＶのＨＮタンパク質をコードするｃＤＮＡ、ＮＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ、Ｌタンパク質をコードするｃＤＮＡなどが挙げられる。
Ｆ遺伝子やその他の抗原遺伝子は、ＮＤＶ感染細胞や精製ウイルス粒子やクローン化されたｃＤＮＡから容易に調製することができる。
【０００９】
（ベクター）
本発明に用いるベクターに格別な制限はなく、遺伝子組み換え技術で一般的に用いられるプラスミド、コスミド、ファージなどを用いれば良い。プラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等の市販されたプラスミドが挙げられる。
さらに、ｐＪＢ８やｐＨＣ７９等の市販コスミドベクターあるいはλファージやＭ１３ｍｐ１８等の市販ファージベクターでも良い。
【００１０】
（環状ＤＮＡ）
本発明のワクチンの有効成分である環状ＤＮＡは、ベクターに上述したプロモータとＦ遺伝子とを挿入したものである。
挿入方法に格別な制限はなく、通常、ベクターの制限酵素サイトを利用して、任意の遺伝子をクローニングする、一般的な遺伝子組み換え技術を利用すれば良い。
【００１１】
（鶏用ＤＮＡワクチン）
本発明のワクチンは、上述した環状ＤＮＡを有効成分とするものであり、通常、薬理学的に許容される媒体（生理食塩水等）と共にワクチン製剤として調製される。
有効成分である環状ＤＮＡの１個体に接種する量に格別な制限はないが、通常５〜２００μｇ、好ましくは５〜１５０μｇである。特に、後述する免疫付与物質を用いる場合、環状ＤＮＡの量が少なくても高い効果を与えられるため、１個体に接種する環状ＤＮＡ量は５〜２０μｇで良い。
【００１２】
（免疫賦与効果物質）
更に、ワクチン効果を高めるため、ワクチンに一般に使用される免疫付与効果物質（アジュバント）をワクチンに添加することもできる。
免疫付与効果物質の添加量に格別な制限は無いが、環状ＤＮＡに対して、通常５〜２００重量％、好ましくは１０〜１００重量％である。
好ましい免疫付与効果物質としては、核酸系の免疫賦与物質が挙げられ、例えば配列の一部にメチル化されていない連続するシトシンとグアニンとが並んでいる部分配列をもつ合成ＤＮＡ；二重鎖ＲＮＡ；が特に好ましい例として挙げられる。これらは、単独で用いても、２種類を組み合わせて用いてもよい。組み合わせて用いる場合、合成ＤＮＡと二重鎖ＲＮＡの割合（重量比）は、通常１０：１〜１：１０、好ましくは３：７〜７：３である。
【実施例】
【００１３】
本発明の環状ＤＮＡ構築は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．  Ｎ．Ｙ．  １９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  ＃  ２８７０４）を使って精製した。
【００１４】
（１）環状ＤＮＡの構築
１．１  プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載されたプラスミドｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（２，７７３ｂｐ）を制限酵素ＢａｍＨＩとＡｐａＩとで切断し、合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｕ（配列番号２）と合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｌ（配列番号３）をアニールさせて調製した合成二本鎖ＤＮＡアダプターを挿入してプラスミドｐＧＩＭＣＳ２（２，７６５ｂｐ）を作製した。
【００１５】
１．２  プロモータのクローニング
鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）のゲノムＤＮＡを調製し、これをテンプレートとして、ＰｒＢａｃ１（配列番号４）およびＰｒＢａｃ２（配列番号５）の合成プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、β−アクチンプロモータを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。
次に、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで二重切断して切り出した鶏β−アクチンプロモータ（１，５２３ｂｐ）とｐＧＩＭＣＳ２を同じく制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断したプラスミド断片とを連結させ、ｐＧＩＢａｃ（４，２７２ｂｐ）を作製した。
更にプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃２１２２０９）をテンプレートにして、プライマーＰｏｌｙＡ−Ｆ（配列番号６）とプライマーＰｏｌｙＡ−Ｒ（配列番号７）でＰＣＲを行い、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡシグナルのＤＮＡ断片（３３４ｂｐ）を増幅し、これを制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩとで切断して切り出したＤＮＡ断片（３２４ｂｐ）を、同じく制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩとで二重切断したｐＧＩＢａｃに挿入し、ｐＧＩＢａｃｐＡ（４，５８４ｂｐ）を作製した。このプラスミドには、配列番号１記載の塩基配列を有するプロモータが挿入されている。
【００１６】
１．３  ＮＤＶ−Ｆベクターの作製
プラスミドｐＮＺ９８（米国特許第６３１２６９６号）をＳａｃＩで完全消化した後、ＢａｍＨＩで部分消化して得られる約１．７Ｋｂの断片を、ｐＧＴＰｓ（米国特許第６３１２６９６号）をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化したプラスミドに接続して得られたｐＧＴＰｓＦをテンプレートとしてＰＣＲを行い目的とするＮＤＶのＦ遺伝子を得た。ＰＣＲはＰｒＦ１（配列番号８）およびＰｒＦ２（配列番号９）の合成プライマーを用いた。ここで、ＰｒＦ１にはＸｂａＩ、ＰｒＦ２にはＫｐｎＩを付加してある。プライマーＰｒＦ１とＰｒＦ２を用いてＰＣＲ増幅した断片は、約１．７Ｋｂｐであり、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７、２４１−２５５（１９８７）記載のＦ遺伝子と同一の５５３アミノ酸をコードしていた。得られた断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで処理し、同酵素でｐＧＩＢａｃｐＡを切断して得られた断片（約６．４Ｋｂｐ）と連結してｐＧＩＢａｃＦｐＡ（６１４５ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、鶏用ＤＮＡワクチンの有効成分である環状ＤＮＡである。
作製したｐＧＩＢａｃＦｐＡを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した後、大腸菌を大量培養して、プラスミドを増殖させプラスミド精製キット（キアゲン社製）を使用して、環状ＤＮＡを大量に得た。
【００１７】
（２）ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ遺伝子発現確認
２×１０６個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に１μｇのｐＧＩＢａｃＦｐＡプラスミドをジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径６ｃｍのシャーレにて３７℃、２４時間培養し、冷アセトンにて細胞を固定した。間接蛍光抗体法により発現した抗原を検出するため、市販ＮＤＶワクチン（財団法人化学及血清療法研究所製）免疫鶏血清及びＦ蛋白免疫ウサギ血清を１次抗体として使用し、それぞれ５００倍にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈して用いた。１次抗体で室温、４５分間反応させ、ＰＢＳで三回洗浄後、蛍光物質（ＦＩＴＣ）を結合した抗鶏イムノグロブリンまたは抗ウサギＩｇＧをＰＢＳで１００倍に希釈した溶液と約一時間室温にて反応させた。その後、ＰＢＳで三回洗浄後、蛍光励起波長光下で顕微鏡観察して反応性を調べた。対照としてｐＧＩＢａｃｐＡプラスミドを移入したＣＥＦ細胞を使用した。その結果、ｐＧＩＢａｃＦｐＡを移入したＣＥＦ細胞でのみ抗体と反応する特異抗原が観察され、ｐＧＩＢａｃＦｐＡによりＦタンパク質が発現しているのを確認した。
【００１８】
（３）ウエスタンブロッティング法による遺伝子発現の確認
５×１０６個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）に１μｇのｐＧＩＢａｃＦｐＡプラスミドをジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーション法にて遺伝子を導入した後、直径１０ｃｍのシャーレにて３７℃、２４時間培養した。培養細胞を、スクレーパーを用いて回収し遠心して細胞を集めた後、ＳＤＳ−ＧＥＬローディングバッファーを用いて可溶化した。対照としてｐＧＩＢａｃｐＡを移入したＣＥＦ細胞を使用したものも同様に可溶化した。これらのサンプルを通常の変性還元状態のアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、泳動たんぱく質をＳＤＳゲルからポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜は１％スキムミルクを含むリン酸バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ６．５）で１時間室温にてブロッキングした。その後、ＰＢＳで５００倍希釈した抗Ｆウサギ血清と室温にてインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、５００倍希釈したビオチン化抗ウサギ抗体（ヤギ）と１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、アビジンアルカリフォスファターゼ複合体にて１時間インキュベートして、ＰＢＳで３回、ＴＢＳで１回洗浄ののち、アルカリフォスファターゼの基質であるＢＣＩＰ−ＮＢＴにて発色させた。その結果、ｐＧＩＢａｃＦｐＡを移入した細胞でのみ、分子量６５キロダルトンの位置にＦタンパク質の存在が確認できた。
【００１９】
（４）鶏動物実験
４．１
（１）で得られた環状ＤＮＡであるｐＧＩＢａｃＦｐＡのワクチン効果を判定するために、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）鶏（Ｌｉｎｅ  Ｍ、日本生物科学研究所）を用いたワクチン効果試験を実施した。
濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ（ｐＨ６．５）に精製ｐＧＩＢａｃＦｐＡプラスミド（環状ＤＮＡ）を溶解して、評価用ＤＮＡワクチンを得た。
環状ＤＮＡの接種量が１００μｇになるように得られたワクチンを、鶏の後肢筋肉に注射した後、ただちに接種部位に電気パルス発生装置（ＢＴＸ社製、ＥＣＭ８３０）を使用して５０Ｖ、２０μ秒の電気パルスを１秒間隔で３回付与し、電極極性を逆にして同条件のパルスを３回付与した（合計６回パルス）。
【００２０】
攻撃時抗ＮＤＶ抗体価は、ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＥＸＸ社製、ニューカッスル病診断用酵素抗体反応キット）で測定した値である。
コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。最終免疫から４週間後、各群の鶏に、アメリカ標準攻撃株であるＮＤＶ  ＴｅｘａｓＧＢ株の１０３ＥＩＤ５０を大腿部に筋肉注射で攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い１４日間の死亡状況を確認した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2005281239.tif 000002
【００２２】
この結果、環状ＤＮＡを含有する本発明のワクチンは、抗ＮＤＶ活性を有することがわかる。
【００２３】
４．２  核酸免疫効果付与物質の併用効果比較実験
４．１で調製したｐＧＩＢａｃＦｐＡを含有する評価用ワクチンと、核酸免疫効果付与物質とを、表２記載の日齢の市販鶏（イセファーム社）に、表２記載の量（単位＝μｇ）接種した。４週間後、４．１と同様にして攻撃し、攻撃後毎日経過観察を行い１４日間の鶏の死亡状況を確認した。コントロールにはプラスミド非接種鶏を用いた。
評価用ワクチンの接種量は、環状ＤＮＡが１０μｇとなる量にした。
免疫効果付与物質としては、配列番号１０記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡと配列番号１１記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡとを１：１（重量比）で混合した合成ＤＮＡ（ＣｐＧ）、及び、シグマ社製、ポリアデニル酸ポリウリジル酸、および、ポリイノシン酸ポリシチジル酸を、重量比１：１で混合した二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いた。
【００２４】
【表２】
2005281239.tif 000003
【００２５】
この結果、本発明のＤＮＡワクチンであるｐＧＩＢａｃＦｐＡを接種するにあたり、核酸を免疫効果付与物質として併用することで、ワクチン効果が上昇することが確認された。
【配列表】
2005281239000001.app