(57)【要約】【課題】  ヒトのES細胞を効率良く増殖させるに際して、危険因子や免疫拒絶反応のない支持細胞を提供する。【解決手段】  ヒトを含む霊長類胚性幹細胞（ES細胞）の増殖用支持細胞として、ヒト胎盤由来の羊膜細胞、絨毛細胞を用いる。現在まで支持細胞としてマウスの胎児細胞が用いられ、異種タンパク質や未知の危険因子（ウィルス等）の混入が危惧されていたが、このヒト由来羊膜細胞、絨毛細胞を支持細胞として用いることで、異種タンパク質や危険因子等の混入の回避が可能となった。また、ヒト胎盤は胎児出産後、廃棄されるものであり、倫理的問題も少なく、細胞が入手しやすく安全である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記支持細胞に、羊膜細胞を使用することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養方法において、
前記羊膜細胞は、霊長類の胎盤由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項３】
請求項２記載の細胞培養方法において、
前記霊長類の胎盤由来とは、ヒトの胎盤由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記羊膜細胞は、胎盤より採取する羊膜組織から細胞毎に羊膜細胞を個別化し、個別化された個々の羊膜細胞を培養させて得られる培養後の羊膜細胞であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記羊膜細胞は、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記羊膜細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項７】
支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記支持細胞に、絨毛細胞を使用することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項８】
請求項７記載の細胞培養方法において、
前記絨毛細胞に、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された絨毛細胞を使用することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
請求項７記載の細胞培養方法において、
前記絨毛細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項５、６、８または９のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記前処理とは、アンモニア溶液処理であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の細胞培養方法において、
前記霊長類由来とは、ヒト由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１３】
請求項１記載の細胞培養方法において、
前記羊膜細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１４】
請求項７記載の細胞培養方法において、
前記絨毛細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１５】
支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記支持細胞に、胎盤由来細胞を使用することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の細胞培養方法において、
前記胎盤由来細胞は、霊長類の胎盤由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の細胞培養方法において、
前記霊長類の胎盤由来とは、ヒトの胎盤由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１８】
請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記胎盤由来細胞は、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の細胞培養方法において、
前記前処理とは、アンモニア溶液処理であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２０】
請求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記胎盤由来細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２１】
請求項１５ないし２０のいずれか１項に記載の細胞培養方法において、
前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の細胞培養方法において、
前記霊長類由来とは、ヒト由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２３】
請求項１５記載の細胞培養方法において、
前記胎盤由来細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２４】
支持細胞を用いて培養される培養細胞であって、
前記培養細胞は、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の細胞培養方法により培養
されるES細胞であることを特徴とする培養細胞。
【請求項２５】
胎盤由来細胞の細胞成分を用いてES細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の細胞培養方法において、
前記胎盤由来細胞とは、霊長類由来の羊膜細胞、絨毛細胞のいずれかであることを特徴
とする細胞培養方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６記載の細胞培養方法において、
前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２８】
細胞成分を用いて培養される培養細胞であって、
前記培養細胞は、請求項２５ないし２７のいずれか１項に記載の細胞培養方法により培
養されるES細胞であることを特徴とする培養細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持細胞を使用するES細胞等の多能性を有する未分化細胞の細胞培養技術に関し、特に、支持細胞として羊膜細胞等の胎盤由来細胞を用い、ヒトを含む霊長類胚から作成したES細胞（embryonic stem cell、胚性幹細胞）等を増殖させるに有効なものである。また、上記胎盤由来細胞からの細胞成分を用いて、ヒトを含む霊長類胚から作成したES細胞（embryonic stem cell、胚性幹細胞）等の未分化細胞の細胞培養技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に説明する技術は、本発明を研究、完成するに際し、本発明者によって検討されたものであり、その概要は次のとおりである。
【０００３】
従来法による種々のES細胞の樹立や増殖において、支持細胞としてマウスの胎児繊維芽細胞やマウス由来の繊維芽細胞株STOが使用されてきた。例えば129系統やC57BL/6系統のマウスから（非特許文献１、２参照）、ラット（非特許文献３参照）、ハムスター（非特許文献４参照）、牛（非特許文献５参照）、豚（非特許文献６参照）、サル（非特許文献７、８参照）、およびヒト（非特許文献９、１０参照）等に到る多くのES細胞株およびEG（embryonic germ(EG)）細胞株に関与している。
【０００４】
その後、ES細胞の分化を抑制する因子としてLIF（leukemia inhibitory factor）が報告されて以来、支持細胞なしでも一部のES細胞の増殖が可能とされているが、高度な分化能力を長期間維持するためには、支持細胞は不可欠である。今まで使用されてきた支持細胞は、マウス胎仔（約14日齢）の繊維芽細胞（MEF）の初代培養とSTOマウス繊維芽細胞株である。
【０００５】
STO細胞は株化されているため、定期的に妊娠マウスを準備する煩雑さはないが、培養条件の変化や、過剰に増殖させた場合には期待するESまたはEG細胞に対する支持細胞の能力が失われる。特にヒトのES細胞、又はEG細胞の樹立および増殖を行う場合、マウスの胎仔由来の初代細胞やSTO細胞株を用いると、マウス由来の異種タンパク質や未知の危険因子（例えばウィルス等）がヒトのESあるいはEG細胞に混入する恐れがある。
【０００６】
このESまたはEG細胞の分化能力を利用して、パーキンソン病やＩ型糖尿病等の多くの病気の治療が可能といわれている。その際、支持細胞としてマウス由来細胞を使用すると危険因子の混入や免疫拒絶反応が排除できない為、臨床的に重大な問題を患者に引き起こす可能性がある。
【０００７】
そのため、最近、危険因子等を排除できるように、支持細胞を使わない方法等が開発された。ラミニンおよびマトリゲル等をコートしたプラスチックシャーレの開発である（非特許文献１１参照）。また、胎児の大腿の皮膚や筋肉細胞および成人の卵管細胞が支持細胞としてヒトES細胞の樹立や増殖に使用された報告もある（非特許文献１２参照）。
【０００８】
また、細胞外マトリックスを用いた細胞培養技術において、細胞外マトリックスをコートしたシャーレをアンモニア蒸気に曝したという報告がある（非特許文献１３参照）。
【非特許文献１】Evance M.J. and Kaufman M.H., Nature, 292:154-156, 1981
【非特許文献２】Doetschman, T.C. et al. J. Embryol. Exp. Morph., 87:27-45, 1985
【非特許文献３】S. Vassilieva. et al. Experimental Cell Research, 258,361-373, 2000
【非特許文献４】Doetschman, T. et al. Dev. Biol, 127:224-227, 1988
【非特許文献５】S. Saito, N. Strelchenko, and H. Niemann, 201:134-141, 1992
【非特許文献６】Strojek, R.M. et al. Theriogenology, 33:901-914, 1990
【非特許文献７】Thomson, J.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848, 1995
【非特許文献８】Suemori, H. et al. Developmental Dynamics, 222:273-279, 2001
【非特許文献９】Thomson, J.A. et al. Science, 282:1145-1147, 1998
【非特許文献１０】Shamblott, M.J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726-13731, 1998
【非特許文献１１】Xu. U. et al. Nat.Biotechnol.19:971-974, 2001
【非特許文献１２】Richards, M. et al. Nat. Biotechnol. 20:933-936,2002
【非特許文献１３】Gospodarowicz, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4094-4098, 1980
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記非特許文献９、１０に示すように、マウスの胎仔由来の初代細胞やSTO細胞株を用いると、マウス由来の異種タンパク質や未知の危険因子（例えばウィルス等）がヒトのESあるいはEG細胞に混入する恐れがある。
【００１０】
しかし、非特許文献１１に記載の如くヒトの支持細胞を用いない方法では、ヒトES細胞を長期間増殖させるとES細胞が分化する等の問題が生じる欠点がある。
【００１１】
一方、非特許文献１２に記載の如く胎児や成人の組織から支持細胞を得るには、倫理的問題や、患者に痛みを伴い、必ずしも最良の方法とは言えない。さらに安全でしかも最適な支持細胞の取得方法が望まれる。
【００１２】
さらには、支持細胞を直接用いることなく、支持細胞としの機能を発揮するに必要な細胞成分を用いて、ヒトのES細胞等の細胞培養が行えればより好ましい。
【００１３】
本発明の目的は、ヒトのES細胞等を効率良く増殖させるに際して、倫理的問題も少なく細胞提供者に安全でしかも痛みを伴わずに、危険因子や免疫拒絶反応のない支持細胞を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、ヒトのES細胞等を効率良く増殖させるに際して、倫理的問題も少なく細胞提供者に安全でしかも痛みを伴わずに、危険因子や免疫拒絶反応のない支持細胞の支持機能の発揮に必要な細胞成分を用いたヒトのES細胞等の細胞培養技術を提供することにある。
【００１５】
本発明のその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、支持細胞の供給源として、母体から切り離される胎盤に着目した。胎盤は産後母体から切り離されて別体となる為、胎盤を支持細胞の供給源としても、細胞提供者である母体に細胞採取時の痛みを与えることもなく、安全な採取が可能である。
【００１７】
併せて、母体から切り離された胎盤は、通常、医療廃棄対象となり焼却処理される。そこで、胎盤から支持細胞を採取することは、廃棄対象とされる胎盤を役立てることに繋がり、比較的に、胎盤提供者からの理解が得られ易く、倫理的問題も少ないと思われる。
【００１８】
胎盤は、組織的に見れば、脱落膜、絨毛膜(絨毛膜板とも言う)、羊膜の３層構造をしており、絨毛膜、羊膜の両組織は比較的に胎盤から採取し易い。そこで、本発明者は、採取し易い絨毛膜、羊膜のそれぞれの細胞を使用して、支持細胞としての使用可能性を検討した。
【００１９】
その結果、本発明者は、羊膜細胞に支持細胞としての有効な機能があることを初めて見出した。さらに、羊膜細胞を支持細胞とする細胞培養技術において、その培養性の改善を検討した。羊膜細胞を支持細胞として使用する前に、羊膜細胞を薬液処理することにより、かかる薬液処理を行わない場合に比べて、培養性が改善されることを初めて見出した。かかる薬液処理により、細胞培養に際して支持細胞と培養細胞との間に夾雑する何らかの細胞成分物質の除去が行え、培養細胞の支持細胞への付着性が改善されるものと考えられる。
【００２０】
また、本発明者は、絨毛細胞についても支持細胞としての機能があることを見出した。絨毛細胞についても、上記薬液処理により絨毛細胞を支持細胞とする細胞培養の培養性が改善された。
【００２１】
すなわち、本願発明は、支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、前記支持細胞に、羊膜細胞を使用することを特徴とする。かかる構成において、前記羊膜細胞は、霊長類の胎盤由来であることを特徴とする。かかる細胞培養方法において、前記霊長類の胎盤由来とは、ヒトの胎盤由来であることを特徴とする。
【００２２】
以上いずれかの細胞培養方法において、前記羊膜細胞は、胎盤より採取する羊膜組織から細胞毎に羊膜細胞を個別化し、個別化された個々の羊膜細胞を培養させて得られる培養後の羊膜細胞であることを特徴とする。
【００２３】
以上いずれかの細胞培養方法において、前記羊膜細胞は、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする。あるいは、前記羊膜細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする。
【００２４】
本願発明は、支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、前記支持細胞に、絨毛細胞を使用することを特徴とする。かかる構成において、前記絨毛細胞に、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された絨毛細胞を使用することを特徴とする。あるいは、前記絨毛細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする。
【００２５】
前記構成の細胞培養方法において、前記前処理とは、アンモニア溶液処理であることを特徴とする。
【００２６】
以上いずれかの構成において、前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする。かかる構成において、前記霊長類由来とは、ヒト由来であることを特徴とする。
【００２７】
また、支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法で、前記支持細胞に羊膜細胞を使用することを特徴とする構成において、前記羊膜細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする。
【００２８】
支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法で、前記支持細胞に絨毛細胞を使用することを特徴とする構成において、前記絨毛細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする。
【００２９】
本発明は、支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、前記支持細胞に、胎盤由来細胞を使用することを特徴とする。かかる細胞培養方法において、前記胎盤由来細胞は、霊長類の胎盤由来であることを特徴とする。かかる細胞培養方法において、前記霊長類の胎盤由来とは、ヒトの胎盤由来であることを特徴とする。これらいずれかの細胞培養方法において、前記胎盤由来細胞は、前記ES細胞との付着性改善の前処理が施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする。前記前処理とは、アンモニア溶液処理であることを特徴とする。前記胎盤由来細胞は、アルカリ処理が前処理として施された後で、支持細胞として使用されることを特徴とする。これらいずれかの細胞培養方法において、前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする。前記霊長類由来とは、ヒト由来であることを特徴とする。また、支持細胞を用いてES細胞を培養する細胞培養方法であって、前記支持細胞に胎盤由来細胞を使用するに際して、前記胎盤由来細胞を提供する動物の種と、前記ES細胞を提供する動物の種とが、同一種であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明は支持細胞を用いて培養される培養細胞であって、前記培養細胞は、上記いずれかの構成の細胞培養方法により培養されるES細胞であることを特徴とする。
【００３１】
さらに、本発明は、胎盤由来細胞の細胞成分を用いてES細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法である。かかる細胞培養方法においては、前記胎盤由来細胞とは、霊長類由来の羊膜細胞、絨毛細胞のいずれかであることを特徴とする。かかる細胞培養方法においては、前記ES細胞は、霊長類由来であることを特徴とする。また、本発明の培養細胞は、細胞成分を用いて培養される培養細胞であって、前記培養細胞は、上記胎盤由来の細胞成分を用いてES細胞を培養する細胞培養方法により培養されるES細胞であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３２】
本願によって開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば、以下の通りである。
【００３３】
すなわち、本発明により、霊長類のES細胞の増殖用支持細胞として、ヒトの胎盤由来の羊膜細胞を使用することができる。
【００３４】
霊長類のES細胞の増殖用支持細胞として、ヒトの胎盤由来の絨毛細胞を使用することもできる。
【００３５】
霊長類のES細胞の増殖を、直接細胞を用いることなく行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３７】
（実施の形態１）
本実施の形態１では、特に、実施例に基づき、ヒトES細胞の培養におけるヒト胎盤由来の羊膜細胞の支持細胞としての有効性を検証した。
【００３８】
本発明は、羊膜細胞を支持細胞として用いる細胞の培養技術及びその応用に関するものである。ES細胞を培養対象とする場合には、ES細胞を提供する動物種として、例えば、ヒトを含む霊長類を想定することができる。特に、かかるES細胞をヒトの再生医療に適用する場合には、上記動物種をヒトに限定すればよい。
【００３９】
また、羊膜細胞の提供動物種としては、例えば、ヒトを含む霊長類を想定することができる。特に、かかるES細胞をヒトの再生医療に適用する場合には、異種タンパク質等の培養細胞への混入の虞を排除する為に、上記羊膜細胞提供動物種をヒトに限定すればよい。
【００４０】
かかるES細胞は、皮膚、軟骨、角膜、歯周組織、肝臓、血管、靭帯等の体組織の損傷あるいは欠失等の障害部位に移植することにより、障害部位の組織再生を図る再生医療にとって極めて重要な未分化細胞である。
【００４１】
かかる未分化細胞の増殖に際しては、その未分化能を維持させながら増殖させることが重要である。併せて、多数の移植治療に対応すべく、大量培養が必要である。ヒトを含め霊長類のES細胞の細胞周期は、例えばマウス等の場合に比べて長く増殖速度が遅い。そこで、効率よく大量増殖させることができる培養技術が求められている。
【００４２】
本発明では、羊膜細胞を使用することにより、比較的容易に未分化能を維持しながら増殖させることができる。さらに、胎盤から採取した羊膜組織の多数の羊膜細胞をバラバラに個別化し、個別化した羊膜細胞を一旦培養して大量増殖させた後で、これを支持細胞とすることで、胎盤から採取した羊膜組織の切片を直接使用する場合とは異なり、多能性を有する未分化のES細胞を、大量に効率的に増殖させることができる。
【００４３】
尚、勿論、ES細胞の小規模需要に際しては、上記培養を経ることなく、胎盤から直接採取した羊膜細胞を用いることもできる。
【００４４】
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。以下の実施例では、ヒト胎盤由来のヒトの羊膜細胞について、ヒトES細胞の培養における支持細胞としての機能性について検討した。かかる検討に際しては、カニクイザルのES細胞を用いた。
【００４５】
（実施例１）
本実施例では、ヒト羊膜細胞を用いて支持細胞の調製を行った。
【００４６】
医療廃棄対象となるヒトの胎盤から、胎盤提供者等の同意を得て、羊膜組織を採取し、それから羊膜細胞を得た。すなわち、胎盤を採取してから直ちに羊膜細胞を分離しハサミ等で細切した後、PBS溶液で血液等を洗い落とす。その後、Hanks'solution溶液(GIBCO社製)―5ｍM EDTA溶液（和光純薬工業社製）に浸し、37℃で約20分間から30分間、スターラーで細胞を回転撹拌する。終了後、PBSで洗った後、0.05%コラゲナーゼ溶液typeＩ（Sigma社製）で37℃、30分間回転撹拌する。その後、組織切片を濾過して固まりを取り除き、バラバラになった羊膜細胞を集め、PBSで２〜3回洗う。
【００４７】
次にバラバラになった羊膜細胞を、ゼラチンまたはフィブロネクチン等、細胞外マトリックスでコートしたシャーレ(Bection  Dickinson社製)に別々に播種し、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を基礎培養液として牛胎児血清（FCS）(GIBCO社製)等を入れ、２〜３日間培養した。上皮様の羊膜細胞(図１)が効率よく培養増殖した。
【００４８】
（実施例２）
本実施例では、実施例１で増殖培養させた羊膜細胞について、カニクイザルのES細胞を用いて、ヒトES細胞の培養における支持細胞としての有効性を検討した。
【００４９】
実施例1で培養した上皮様のヒト羊膜細胞を約1×105／6cmシャーレに播種し、２〜３日間、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を加え培養し、羊膜細胞による支持細胞を形成した。培養後、上皮様羊膜細胞がシャーレでほぼコンフルエントになった後、マイトマイシンC（Sigma社製）処理した羊膜細胞上に、カニクイザルES細胞34継代（旭テクノグラス（株）から購入）株をPBSで２〜３回洗い播種した。
【００５０】
培養液はDMEM／F12（GIBCO社製）基本培地に20%KSR（GIBCO社製）＋2ｍM L-Glutamine（日本製薬社製）＋1mM Na-pyruvate（GIBCO社製）＋0.1ｍM 2-mercaptoethanol（Sigma社製）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO社製）＋1×非必須アミノ酸（GIBCO社製）とした。培養液は毎日1回交換し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。培養後約７日間で、羊膜上皮様支持細胞上にサルES細胞のコロニーが出現し、シャーレの面積の約7〜8割を占めた。
【００５１】
羊膜上皮様支持細胞上で増殖が確認されたサルES細胞については、その後、トリプシン／EDTA（GIBCO社製）溶液でハーベストして、新しいヒト羊膜細胞支持細胞上で1／2継代を行った。ヒト羊膜支持細胞上で7代継代後、サルES細胞の生化学的検査として、アルカリ性ホスファターゼ染色（VECTOR社製）、SSEA-１、SSEA-4（CHEMICON社製）抗原染色や染色体分析、免疫不全マウス(SCIDマウス)に移植して分化能力を検討した。それらの結果を表、および図２〜５に示した。
【００５２】
図２はヒト羊膜細胞上で増殖したサルES細胞のコロニーの形態を示している。図３はヒト羊膜細胞上で増殖したサルES細胞コロニーのアルカリ性ホスファターゼ染色陽性の写真。図４はヒト羊膜細胞上で増殖したサルES細胞コロニーのSSEA-４抗原染色陽性の写真。図５はヒト羊膜細胞上で培養増殖したサルES細胞をSCIDマウスに移殖してできた未分化なテラト―マの病理組織標本を示す。これらの結果はヒト羊膜細胞上で培養増殖したサルES細胞は未分化の状態で分化能力があることを示している。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
また、かかる結果を、従来のマウスの胎児由来の繊維芽細胞を支持細胞としてサルES細胞を増殖させて得られた場合（文献データ）と比較すると、表１に示すように、生化学的性質、染色体核型および分化能力など全てにおいて同様な結果が得られることが明らかとなった。
【００５５】
以上の結果から、免疫拒絶反応の少ないヒト羊膜細胞を支持細胞としてサルES細胞を増殖させても、ES細胞の分化能力等を十分に維持しつつ増殖させ得ることが確認された。このことは、ヒト羊膜細胞は霊長類ES細胞の増殖用支持細胞としての能力を有しており、ヒトES細胞の増殖用支持細胞として臨床的応用に有効に使用できることを示している。
【００５６】
また、ヒト羊膜細胞の採取は、前述の如く、医療廃棄対象となる産後のヒト胎盤を役立てるものであり、母体から直接採取するものではなく提供者に何らの痛みを与えることなく安全に処理できるため、妊婦および家族からの同意（医師によるインフォームドコンセント）も得られ易く、技術的にも、倫理的にも問題が少ない。
【００５７】
さらに、採取された羊膜細胞は、細胞をバラバラにして1ヶ月間以上の培養もでき、ES細胞の大量培養に必要な支持細胞として大量増殖が可能である。また、凍結保存も可能である。
【００５８】
羊膜細胞は、それ自体、未分化細胞集団で神経幹細胞や肝幹細胞様の性質を示すなどおおくの利点も有しており、場合によっては、支持細胞以外への転用も可能であり、その凍結保存性を有効に利用することもできる。
【００５９】
（実施の形態２）
本実施の形態では、羊膜細胞を支持細胞として使用する場合に、その培養性を改善するために、羊膜細胞に前処理として薬液処理を施す場合について説明する。
【００６０】
前記実施の形態１では、ES細胞を未分化の状態で培養する技術として、羊膜細胞を支持細胞として用いることの有効性を説明したが、本発明者は、さらに、その培養性の改善が図れないかと考えた。
【００６１】
すなわち、培養したES細胞のコロニー出現において、そのコロニーの周縁が周囲と明確に隔絶されている方が、よりコロニーの未分化状態が周縁部まで確立されていると考えられ好ましい。その周縁部が不明瞭な状態では、場合によっては、周縁部領域では、分化した細胞が混在している可能性も排除できない。
【００６２】
また、培養技術においては、如何に効率的に増殖させるかが重要である。より短い培養期間で、十分な増殖性が確保できることが望ましい。
【００６３】
本発明者は、かかる培養性の改善を検討するに際して、羊膜細胞の取り扱い方を種々検討した。その結果、羊膜細胞を支持細胞として使用する前に、薬液処理を行うことが有効であることを見出した。
【００６４】
本発明者は、トライトン-X-100、グルタルアルデヒド、アセトン等の種々の薬液でその前処理を試みた。しかし、トライトン-X-100、グルタルアルデヒド、アセトンでは、薬液処理を施した場合と、施さない場合とでは、培養性について有意の差は見られなかった。
しかし、以下の実施例３で示すように、例えばアンモニア溶液を用いた薬液処理でその培養性の改善が確認できた。
【００６５】
（実施例３）
本実施例では、ヒト羊膜細胞を支持細胞として使用するに際して、一旦、薬液処理として、希アンモニア溶液でアルカリ処理を行った。
【００６６】
ヒト羊膜細胞は、前記実施例１で述べたと同様の方法で調製した。すなわち、胎盤を採取してから直ちに羊膜細胞を分離しハサミ等で細切後、PBS溶液で血液等を洗い落とす。その後、Hanks'solution溶液(GIBCO社製)―5ｍM EDTA溶液（和光純薬工業社製）に浸し、37℃で約20分間から30分間、スターラーで細胞を回転撹拌し、さらにPBSで洗った後、0.05%コラゲナーゼ溶液typeＩ（Sigma社製）で37℃、30分間回転撹拌する。その後、組織切片を濾過して固まりを取り除き、バラバラになった羊膜細胞を集めPBSで２〜3回洗い、羊膜細胞をバラバラにした。
【００６７】
バラバラになった羊膜細胞を、ゼラチンまたはフィブロネクチン等、細胞外マトリックスでコートしたシャーレ(Bection  Dickinson社製)に別々に播種し、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を基礎培養液として牛胎児血清（FCS）(GIBCO社製)等を入れ、２〜３日間培養し、コンフルエントに培養された状態で、希アンモニア溶液を添加した。希アンモニア溶液の添加は、コンフルエントの状態の羊膜細胞全体が完全に浸るように添加した。
【００６８】
希アンモニア溶液としては、本実施例では、０．０９％濃度のアンモニア水溶液を使用した。アンモニア濃度としては、０．３％以下、０．０３％以上の範囲では、少なくとも有効であることが確認された。尚、上記濃度は、重量％表示である。
【００６９】
かかる濃度の希アンモニア溶液を添加した状態で、室温（約２０℃〜２５℃）で１０〜２０分程度静置すると、羊膜細胞からある種の物質が剥離する。その後、剥離物をPBSで３回洗浄して除去した。かかる剥離物については、現在研究中で、その詳細については不明である。
【００７０】
図６（Ａ）は、上記要領で剥離物を除去した状態の羊膜細胞の様子を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示したものである。一方、図７（Ａ）には、実施例１に示した方法で、薬液処理を施さない場合の羊膜細胞の様子を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示したものである。図６（Ａ）の方が、図７（Ａ）と比べて、細胞が繊維芽様の一様な細胞形態を示していることが分かる。
【００７１】
このようにして得られたアンモニア処理後の羊膜細胞を支持細胞として、実施例２に説明したと同様の方法で、カニクイザルのES細胞を培養した。すなわち、上記要領で培養後、薬液処理により剥離物を除去した上皮様のヒト羊膜細胞をそれぞれ約1×105／6cmシャーレに播種し、２〜３日間、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を加え培養し支持細胞を形成した。培養後、上皮様羊膜細胞がシャーレでほぼコンフルエントになった後、マイトマイシンC（Sigma社製）処理し、羊膜細胞上にカニクイザルES細胞34継代（旭テクノグラス（株）から購入）株をPBSで２〜３回洗い播種した。
【００７２】
培養液はDMEM／F12（GIBCO社製）基本培地に20%KSR（GIBCO社製）＋2ｍM L-Glutamine（日本製薬社製）＋1mM Na-pyruvate（GIBCO社製）＋0.1ｍM 2-mercaptoethanol（Sigma社製）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO社製）＋1×非必須アミノ酸（GIBCO社製）とした。培養液は毎日1回交換し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。培養後約７日間で、羊膜上皮様支持細胞上にサルES細胞のコロニーが出現し、シャーレの面積の約７〜８割を占めた。
【００７３】
図６（Ｂ）には、薬液処理を施したヒト羊膜細胞上で、１８継代培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示した。一方、図７（Ｂ）には、実施例２に示した方法で、薬液処理を施さない場合のヒト羊膜細胞上で、１８継代培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示した。
【００７４】
図６（Ｂ）に示すコロニーの方が、図７（Ｂ）に示す場合のコロニーよりも、コロニー周縁部が周囲と明確に輪郭されており、その培養性が改善されていることが明確に分かる。図７（Ｂ）に示す場合には、コロニーの輪郭部分が不明瞭で、かかる不明確な周縁部分には、場合によっては分化した細胞が混じっている可能性も懸念されるが、図６（Ｂ）に示す場合には、コロニーの輪郭が明確で、コロニーの周縁部まで培養細胞の未分化の状態が維持されていることが確認できる。
【００７５】
また、図では示していないが、薬液処理を施した羊膜細胞を支持細胞としたES細胞のコロニーの方が、薬液処理を施さない羊膜細胞を使用した場合よりも、コロニーが密であり、コロニーの大きさも平均して大きく、全体のコロニー数も多いことが確認されている。
【００７６】
希アンモニア溶液を用いた薬液処理後の羊膜細胞上で増殖が確認されたサルES細胞については、トリプシン／EDTA（GIBCO社製）溶液でハーベストし新しいヒト羊膜細胞支持細胞上で1／2継代を行い、さらに、ヒト羊膜支持細胞上で１８代継代後のものについて、サルES細胞の生化学的検査として、アルカリ性ホスファターゼ染色（VECTOR社製）を行った。図８（Ａ）に、アルカリ性ホスファターゼ染色の陽性細胞を顕微鏡写真（倍率８０倍）として示す。また、図８（Ｂ）には、培養したサルES細胞のSSEA-4（CHEMICON社製）陽性細胞の状況を顕微鏡写真（倍率８０倍）で示す。
【００７７】
このように、羊膜細胞を支持細胞として使用するに際して、希アンモニア溶液等のように適切な薬液処理を行うことにより、ES細胞の培養において、その培養性の向上が図られることが確認された。
【００７８】
尚、希アンモニア溶液を用いることなく、アンモニア蒸気に曝してみたが、希アンモニア溶液で見られるような培養性の向上は確認できなかった。
【００７９】
かかる薬液処理の作用については、前記の如く、薬液処理により生ずる剥離物の詳細が不明な状態では、その詳細を正確に論ずることはできないが、本発明者としては、かかる剥離物は細胞成分で、ES細胞の培養に際し、支持細胞としての羊膜細胞とES細胞との間の夾雑物となって、ES細胞の支持細胞への付着性に悪影響を与えるものではないかと推測している。
【００８０】
すなわち、上記薬液処理により、支持細胞としての羊膜細胞とES細胞との付着性を阻害する羊膜細胞側の細胞成分が除去されるため、かかる薬液処理を行わない場合に比べて、ES細胞の培養性の改善が図られるものと現段階では考えている。希アンモニア溶液処理は、支持細胞としての羊膜細胞への培養細胞の付着性を改善する役目を果たしているものと強く推察される。
【００８１】
（実施の形態３）
本実施の形態では、胎盤由来の絨毛細胞における支持細胞としての有効性について検討した。
【００８２】
絨毛細胞についても、前記実施の形態1の実施例１、２の要領で、羊膜細胞と同様の取り扱いをして、カニクイザルのES細胞の培養を行った。培養性は、羊膜細胞を用いた場合に比べて劣るものの、支持細胞としての機能を有していることが今回確認された。
【００８３】
絨毛細胞を支持細胞として用いる場合には、羊膜細胞を支持細胞として用いる場合に比べて、培養細胞の支持細胞への付着性の影響が大きく現れることが分かった。そのため、ES細胞の培養時における播種方法を改良することで、支持細胞への付着性を改善して、絨毛細胞上でも継代培養させ得ることが分かった。さらに、羊膜細胞に施したと同様の薬液処理が、絨毛細胞の培養性の改善にも有効であることが確認された。以下、実施例４に基づき、詳細に説明する。
【００８４】
（実施例４）
本実施例で支持細胞として使用する絨毛細胞は、前記実施例１で述べたと同様の方法で調製した。すなわち、胎盤を採取してから直ちに絨毛細胞を分離しハサミ等で細切後、PBS溶液で血液等を洗い落とす。その後、Hanks'solution溶液(GIBCO社製)―5ｍM EDTA溶液（和光純薬工業社製）に浸し、37℃で約20分間から30分間、スターラーで細胞を回転撹拌し、さらにPBSで洗った後、0.05%コラゲナーゼ溶液typeＩ（Sigma社製）で37℃、30分間回転撹拌する。その後、組織切片を濾過して固まりを取り除き、バラバラになった絨毛細胞を集め、PBSで２〜3回洗って絨毛細胞をバラバラにした。
【００８５】
バラバラになった絨毛細胞を、ゼラチンまたはフィブロネクチン等、細胞外マトリックスでコートしたシャーレ(Bection  Dickinson社製)に別々に播種し、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を基礎培養液として牛胎児血清（FCS）(GIBCO社製)等を入れ、２〜３日間培養し、コンフルエントに培養された状態で、希アンモニア溶液を添加した。希アンモニア溶液の添加は、コンフルエントの状態の絨毛細胞全体が完全に浸るように添加した。希アンモニア溶液としては、実施例３で説明したと同様のものを使用すればよい。本実施例では、０．０９％濃度のアンモニア水溶液を使用した。
【００８６】
かかる濃度の希アンモニア溶液を添加した状態で、室温（約２０℃〜２５℃）で１０〜２０分程度静置しておき、絨毛細胞から剥離した剥離物を、PBSで３回洗浄して除去した。
【００８７】
図９（Ａ）は、上記要領で剥離物を除去した状態の絨毛細胞の様子を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示したものである。一方、図１０（Ａ）には、上記絨毛細胞の調製で、希アンモニア処理を施さない場合の絨毛細胞の様子を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示したものである。
【００８８】
このようにして得られたアンモニア処理後の絨毛細胞を支持細胞として、実施例２に説明したと同様の方法で、カニクイザルのES細胞を培養した。すなわち、上記要領で培養後、薬液処理により剥離物を除去したヒト絨毛細胞をそれぞれ約1×105／6cmシャーレに播種し、２〜３日間、高グリコール含有DMEM培養液（GIBCO社製）を加え培養し支持細胞を形成した。培養後、絨毛細胞がシャーレでほぼコンフルエントになった後、マイトマイシンC（Sigma社製）処理し、絨毛細胞上にカニクイザルES細胞34継代（旭テクノグラス株から購入）株をPBSで２〜３回洗い播種した。
【００８９】
培養液はDMEM／F12（GIBCO社製）基本培地に20%KSR（GIBCO社製）＋2ｍM L-Glutamine（日本製薬社製）＋1mM Na-pyruvate（GIBCO社製）＋0.1ｍM 2-mercaptoethanol（Sigma社製）＋ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO社製）＋1×非必須アミノ酸（GIBCO社製）とした。培養液は毎日1回交換し、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。培養後約７日間で、絨毛支持細胞上にサルES細胞のコロニーが出現し、シャーレの面積の約７〜８割を占めた。
【００９０】
尚、継代に際しては、増殖したES細胞を、支持細胞を含まないようにして、ES細胞を取り出し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞をバラバラにした後に、支持細胞としての絨毛細胞上に播種して培養するようにした。このように播種技術において工夫することで、支持細胞としての絨毛細胞と培養細胞としてのES細胞との付着性を改善して、絨毛細胞の支持細胞としての使用可能性を見出した。
【００９１】
図９（Ｂ）には、薬液処理を施したヒト絨毛細胞上で培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示した。一方、図１０（Ｂ）には、薬液処理を施さない場合のヒト絨毛細胞上で培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を位相差顕微鏡写真（倍率８０倍）で示した。
【００９２】
図９（Ｂ）に示すコロニーの方が、図１０（Ｂ）に示す場合のコロニーよりも、コロニー周縁部が周囲と明確に輪郭されており、その培養性が改善されていることが確認できる。
【００９３】
また、図では示していないが、薬液処理を施した絨毛細胞を支持細胞としたES細胞のコロニーの方が、薬液処理を施さない絨毛細胞を使用した場合よりも、コロニーが密であり、コロニーの大きさも平均して大きく、全体のコロニー数も多いことが確認されている。
【００９４】
このようにして絨毛細胞を支持細胞として培養したサルES細胞の未分化性については、前記羊膜細胞を支持細胞として得られたサルES細胞の場合と同様に、その未分化性の生化学的結果が得られた。併せて、培養増殖したサルES細胞は未分化の状態で分化能力があることをも示していた。
【００９５】
表１で、絨毛細胞を支持細胞として培養させたサルES細胞について、従来のマウスの胎児由来の繊維芽細胞を支持細胞としてサルES細胞を増殖させて得られた場合（文献データ）と比較した。生化学的性質、染色体核型および分化能力など全てにおいて同様な結果が得られることが明らかとなった。
【００９６】
すなわち、免疫拒絶反応の少ないヒト絨毛細胞を支持細胞としてサルES細胞を増殖させても、ES細胞の分化能力等を十分に維持しつつ増殖させ得ることが確認でき、ヒト絨毛細胞は霊長類ES細胞の増殖用支持細胞としての能力を有しており、ヒトES細胞の増殖用支持細胞として臨床的応用に使用できることを示している。
【００９７】
また、ヒト絨毛細胞の採取については、羊膜細胞について前記した如く、妊婦および家族からの同意も得られ易く、技術的にも、倫理的にも問題が少ない。さらに、採取された絨毛細胞については、羊膜細胞と同様、細胞をバラバラにして1ヶ月間以上の培養もでき、ES細胞の大量培養に必要な支持細胞として大量増殖性、凍結保存も可能である。
【００９８】
しかし、図６（Ｂ）、図７（Ｂ）に示す羊膜細胞を支持細胞として使用した場合に比べて、図９（Ｂ）、図１０（Ｂ）は、いずれの場合も、コロニーは粗で、且つコロニー周縁の輪郭も不明確で、羊膜細胞を支持細胞として使用した培養方法の方が、ES細胞の培養には好ましいことが分かる。このことは、勿論、絨毛細胞の支持細胞としての有用性を否定するものではなく、羊膜組織に比べて絨毛組織は採取しやすく、また絨毛細胞は大量に獲得できる等のメリットもあり、例えば、簡易な実験系等では手軽に有効に使用し得るものと思われる。
【００９９】
（実施の形態４）
前記実施の形態１〜３では、細胞培養に際して支持細胞用いる場合について説明したが、支持細胞として機能する上記胎盤由来細胞である羊膜細胞、絨毛細胞等の細胞の支持細胞としの機能を発揮するに必要な細胞成分を分離し、それをシャーレ等細胞培養器材にコートして、その上に、前記実施の形態1で説明した要領でES細胞株を播種することで、ES細胞の培養を行うことができる。コートに際しては、必要に応じて、アセトン等の有機溶媒を用いて固定を行っても構わない。
【０１００】
また、細胞成分は、タンパク質、糖タンパク質、糖、脂質、核酸、細胞分泌物、及び細胞外マトリックス等である。
【０１０１】
さらには、かかる細胞成分は、実際の細胞由来のものに限定する必要はなく、可能であれば、生化学的に、あるいは化学的に合成されたものであっても構わない。
【０１０２】
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【０１０３】
前記実施の形態１における前記実施例１、２では、ヒト胎盤由来の羊膜細胞を支持細胞とした場合のサルES細胞の増殖結果からヒトES細胞培養への支持細胞としての有効性を示したが、ヒトを含めた霊長類EG細胞の増殖、培養にも有効である。
【０１０４】
また、前記実施の形態２の実施例３からは、ヒト胎盤由来の羊膜細胞を支持細胞として使用するに際して、羊膜細胞を支持細胞として使用する前に、例えば希アンモニア溶液等のアルカリ処理に例示されるような薬液処理を施しておくことが、よりその培養性を向上させるのに有効であることが確認されたが、培養細胞の支持細胞への付着性を改善させる役目を有する薬液処理であれば、アンモニア以外の薬液を用いたアルカリ処理、酸処理、あるいは中性薬液を用いた処理でも、培養性の改善に有効に適用することができる。
【０１０５】
前記実施の形態３の実施例４からは、ヒト胎盤由来の絨毛細胞においても、ヒト胎盤由来の羊膜細胞と比べてその培養性は劣るものの、サルES細胞の増殖結果からヒトES細胞培養への支持細胞としての使用性が確認できる。また、かかる絨毛細胞の使用性は、ヒトを含めた霊長類EG細胞の増殖、培養にも有効である。
【０１０６】
前記実施の形態では、胎盤由来細胞として羊膜細胞、絨毛細胞について検討したが、より詳細に述べれば、絨毛細胞とは絨毛膜（絨毛膜板）、付着絨毛等の絨毛組織から採取された細胞である。その他の胎盤由来細胞についても、例えば、臍帯細胞等にも本発明は適用できる。尚、胎盤内の組織的詳細については、例えば、足高善雄共著の「新産科学」（１９７６年刊、南山堂）の１４頁に明確な記載がある。
【０１０７】
さらには、本発明の細胞培養方法は、上記ES細胞、EG細胞等の胚性幹細胞ばかりではなく、ヒトを含めた霊長類の体性幹細胞の培養にも有効に適用できる。
【０１０８】
また、前記説明においては、霊長類、特に再生医療を念頭においた場合にはヒトに限定することを例示したが、本発明はその他の動物種に適用しても有効である。例えば、畜産動物の品種改良等を想定する場合には、ヒトや霊長類以外に、例えば、牛、豚、羊等の哺乳類を想定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ヒト胎盤から羊膜細胞を分離後、コラゲナーゼ処理して細胞をバラバラにした後、培養した形態を示す顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図２】ヒト羊膜細胞上で７継代培養増殖したサルES細胞のコロニーの形態を示す顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図３】ヒト羊膜細胞上で増殖したサルES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色陽性のコロニーを示す顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図４】ヒト羊膜細胞上で増殖したサルES細胞のSSEA-4抗原の陽性コロニーを示す顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図５】ヒト羊膜細胞上で培養増殖したサルES細胞をSCIDマウスに移殖してできた典型的な未分化テラトーマの顕微鏡写真における病理組織像を示す図であり、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はメラニン、軟骨、筋肉、腺などを含む未分化な神経組織を×５０倍の倍率で示し、（Ｄ）はサイトケラチン陽性の腺を×５０倍の倍率で示す免疫組織化学標本を示し、（Ｅ）はGFAP陽性の神経膠組織を×５０倍の倍率で示し、（Ｆ）は×１００倍の倍率でミオグロビン陽性の横紋のある筋肉組織を示している。
【図６】（Ａ）は希アンモニア溶液で処理した培養羊膜細胞の様子を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）で、（Ｂ）は希アンモニア溶液で処理を施した培養羊膜細胞上で１８継代培養増殖させたサルES細胞のコロニーの状況を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図７】（Ａ）は希アンモニア溶液での処理を施さない場合の培養羊膜細胞の様子を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）で、（Ｂ）は希アンモニア溶液での処理を施さない場合の培養羊膜細胞上で１８継代培養増殖させたサルES細胞のコロニーの状況を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図８】（Ａ）は希アルカリ溶液で処理した培養羊膜細胞上で増殖したサルES細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の陽性細胞を示す顕微鏡写真（×８０倍）で、(Ｂ)は希アルカリ溶液で処理した培養羊膜細胞上で増殖したサルES細胞のSSEA-4陽性細胞を示す顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図９】（Ａ）は希アンモニア溶液で処理した培養絨毛細胞の様子を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）で、（Ｂ）は希アンモニア溶液で処理した絨毛細胞上で培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図１０】（Ａ）は希アンモニア溶液での処理を施さない場合の培養絨毛細胞の様子を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）で、（Ｂ）は希アンモニア溶液での処理を施さない場合の絨毛細胞上で培養増殖したサルES細胞のコロニーの状況を示す位相差顕微鏡写真（×８０倍）である。
【図１】
2005137337.tif 000004
【図２】
2005137337.tif 000005
【図３】
2005137337.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
2005137337.tif 000009
【図７】
2005137337.tif 000010
【図８】
2005137337.tif 000011
【図９】
2005137337.tif 000012
【図１０】
2005137337.tif 000013