(57)【要約】【課題】  硬組織・軟骨形成調節剤並びに動脈硬化症等における異所性石灰化の抑制剤およびそれらに対する機能性食品およびそのスクリーニング法を提供する。さらに、硬組織・軟骨形成調節剤並びに動脈硬化症等における異所性石灰化の測定法を提供する。【解決手段】  NaPiトランスポーターの一つであるPit1およびそれを調節するSTC1が関与するPit1-Pi経路を制御することにより、硬組織・軟骨形成調節剤並びに動脈硬化症等における異所性石灰化の抑制剤およびそれらに対する機能性食品およびそのスクリーニング法を提供する。さらに、Pit1およびSTC1の遺伝子あるいは蛋白を測定することにより石灰化の測定法を提供する。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬組織・軟骨形成あるいは動脈硬化症における血管壁の石灰化や異所性石灰化（以下病理的石灰化）のための無機リン酸（Pi）輸送機構としてのナトリウム依存性Pi（NaPi）トランスポーターを調節する作用を有する物質を有効成分として含有することを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤，病理的石灰化抑制剤。
【請求項２】
NaPiトランスポーターがPit1であることを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤または病理的石灰化の抑制剤およびそれらに関する機能性食品。
【請求項３】
Pit1-Pi経路の調節因子の一つがスタニオカルシン（STC）1であることを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤または病理的石灰化抑制剤およびそれらに関する機能性食品。
【請求項４】
Pit1またはその上流あるいは下流の調節因子の内，その調節因子の1つであるSTC1の遺伝子を導入した細胞，ベクターあるいはSTC1アンチセンスDNA，RNAiなどの遺伝子配列，アミノ酸配列に基づく硬組織・軟骨形成および病理的石灰化の遺伝子治療薬。
【請求項５】
Pit1-Pi経路を調節することによる硬組織である象牙質，セメント質，骨や軟骨を標的とした再生医療のための補助薬および骨粗鬆症，骨軟化症，関節リュウマチ，関節炎，関節の硬組織・軟骨形成調節剤および病理的石灰化の抑制剤あるいはそれらに関する機能性食品。
【請求項６】
病理的石灰化が動脈硬化症における血管壁の石灰化や透析や二次性甲状腺機能亢進症による諸臓器(軟組織)の異所性石灰化であるPit1-Pi経路の抑制剤およびそれらに関する機能性食品。
【請求項７】
Pit1-Pi経路の亢進や抑制を指標とする工程を含むことを特徴とする，Pit1-Pi経路を介し，硬組織・軟骨形成を選択的に調節する物質や病理的石灰化を抑制する物質を識別するためのスクリーニング法。
【請求項８】
Pit1およびSTC1の遺伝子あるいは蛋白を測定することによる硬組織・軟骨形成および病理的石灰化を測定する石灰化測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，新規な硬組織・軟骨形成調節剤あるいは病理的石灰化を抑制する治療薬および機能性食品のスクリーニング法，詳細には，Pit1-Pi経路を調節する遺伝子，物質のスクリーニング法に関する。本発明は，Pit-1-Pi経路を調節する有効成分を含有することを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤，あるいは病理的石灰化抑制剤ならびにそれらの機能性食品のスクリーニング法に関する。
【０００２】
また，本発明は，Pit1-Pi経路ならびにその調節因子の1つであるSTC1あるいはSTC1を調節する有効成分を含有することを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤，あるいは病理的石灰化抑制剤および機能性食品のスクリーニング法に関する。
【０００３】
さらに、Pit1ないしはSTC1遺伝子あるいは蛋白を測定することによる硬組織・軟骨形成および病理的石灰化を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨粗鬆症を代表とする骨量減少を示す疾患は，破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスが崩れることにより骨吸収が骨形成を上回ることが原因である。従来，骨量減少を示す疾患においては、骨量の減少を抑制する薬剤による対処療法が主流であり，また骨形成促進剤としては副甲状腺ホルモンや骨形成タンパクなどがあるが，安全性や使用法の制限などの問題などによりその能力を十分に発揮できないか，発揮させることが難しいと予想される。
【０００５】
このような背景から，副作用などの制限が少なく，より有効な骨形成促進剤が望まれる。また，近年，外傷，外科処置あるいは炎症などによる病理的骨吸収または機能的あるいは物理的に欠損した硬組織，軟骨の再生医療も確立されつつあるが，現状の多くは高度先進医療施設などでの試行段階であり，その普及にあたってはより安価で簡便な方法による組織再生技術が必要となる。
【０００６】
硬組織における石灰化基質の主要構成要素であるPiは細胞外基質としての役割のみならず，骨のリモデリングにおける細胞機能の調節，石灰化促進など，重要な骨代謝調節因子の1つであることが推定されている。X連鎖低リン血症（XLH）におけるくる病／骨軟化症は，腎臓によるPi再吸収の抑制とそれに伴う低リン血症に加え，骨芽細胞のPi取込機能の内因性の障害が原因と考えられている。例えば，XLHの原因遺伝子であるPHEX（Nat. Genet. 11, 130-136, 1995; Hum. Mol. Genet. 6, 165-171, 1997）に変異を持つHypとGyマウスは骨，象牙質形成に障害を持ち，腎臓のPi再吸収の主役であるNaPiトランスポーター（Npt2）欠損マウスには同様の所見は見られない（Proc.  Natl. Acad. Sci. USA 95, 5327-5337, 1998）。
【０００７】
さらに，いくつかのHypマウスモデル由来の骨芽細胞の移植実験などにより，Hyp由来骨芽細胞は骨基質形成と石灰化において内因性障害を持っていることが示されている（J. Bone Miner. Res. 15, 1451-1458, 2000; Endcrinology 142, 926-939, 2001など）。
【０００８】
フォスファトニンと呼ばれる推定上の低リン血症因子はPHEXの基質と考えられている。生理的状態では，フォスファトニンは血液循環中にPHEXで分解され，消失する。一方，病的状態では，フォスファトニンは分解されることなく（後述），腎臓のPi再吸収を抑制する（J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 494-496, 2001; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5945-5946, 2001など）。線維芽細胞増殖因子23（FGF23）はフォスファトニンの１つと考えられており（J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 494-496, 2001; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 98, 5945-5946, 2001など），常染色体優性遺伝性低リン血性くる病/骨軟化症（ADHR）におけるFGF23の変異（Nat. Genet. 26, 345-348-2000）や腫瘍性骨軟化症における腫瘍細胞からの過剰発現（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6500-6505, 2001）あるいはXLHに見られるPHEXプロテアーゼの変異（J. Clin. Endocrinol. Metab. 86, 494-496, 2001; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5945-5946, 2001）はいずれも血中のFGF23レベルを増加させ，低リン血症，くる病／骨軟化症を引き起こすと考えられる。血中FGF23は腫瘍性骨軟化症と密接に関わっており（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6500-6505, 2001など），最近その生理的意義も明らかになってきた（J. Clin. Invest 113, 561-568, 2004）。
【０００９】
しかし，FGF23が直接または間接的にくる病／骨軟化症に関与するとしても，上述の骨芽細胞の内因性の障害をFGF23のみで説明することは難しい。このような背景から，骨芽細胞の内在性因子（フォスファトニンか否かは限定しない）は，直接または間接的に骨芽細胞に作用し，NaPi輸送を活性化し，その結果，細胞内Piレベルを上昇させ，骨基質形成／石灰化に寄与すると予想される。
【００１０】
骨形成の過程で，骨芽細胞は細胞外基質（コラーゲン，非コラーゲン蛋白；類骨）を産生するのみならず，その分子機構が解明されていない石灰化にも関与していると予想される。すなわち，骨形成は類骨の形成と石灰化という二つの別々の過程が連続的に進行する。Piはハイドロキシアパタイト結晶形成のために石灰化前線に輸送されると考えられる。石灰化前線には骨芽細胞の膜成分で構成された基質小胞が存在し，基質小胞のNaPi輸送活性により小胞内にPiが取込まれ，カルシウムとともにコアを形成し，石灰化が進行すると考えられる（Kidney Int. 49, 975-980, 1996）。
【００１１】
これとは別に，骨芽細胞自身にもPiセンシング機構が存在するが，その制御と役割についてはほとんど知られていない。最近，二つのタイプIII NaPiトランスポーター[Pit1/Glvr1（テナガザル白血病ウイルスレセプター）とPit2/Ram1（アンフォトロピックレトロウイルスレセプター）]のmRNAの発現が骨芽細胞細胞株で見出されている（Endocrinology 
138, 5202-5209, 1997; Bone 28, 160-166, 2001など）。
【００１２】
Pit1は多様な細胞で発現が確認されており，細胞の基本的な生命活動に関与すると考えられている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7071-7075, 1994）。しかし、少なくとも骨，軟骨でのPit1 mRNAの発現プロファイル，すなわちその発現が軟骨細胞の一定のサブセットに限定されこと（Bone 24, 1-7, 1999）や培養骨形成モデルによる骨芽細胞株の分化過程に特徴的であること（Bone 28, 160-166, 2001）は，Pit1と骨，軟骨形成との密接な関係を示唆する。
【００１３】
長い間，骨芽細胞における細胞内Piの増加が骨基質石灰化に寄与するかどうか不明であった。フォスカネットはNaPiトランスポーターの選択的阻害剤であり，骨芽細胞様細胞株に加えると，細胞内Piレベルの減少に相関してオステオポンチン（OPN，骨基質タンパク）mRNAレベルが減少する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8352-8357, 2000など）。骨代謝におけるOPNの生理的役割はなお不明瞭であるが，アルカリフォスファターゼ（ALP）欠損マウスにおいても，同様にOPNの発現抑制が見られ，石灰化不全を引き起こすことから（J. Bone Miner. Res. 15, 1879-1888, 2000），細胞内Piは骨芽細胞の機能を特異的に制御している可能性がある。実際に，Piは骨芽細胞様細胞株のRUNX2/Cbfa1（骨形成/骨芽細胞分化に必須の転写因子）の核外輸送に関与することが報告されており（Biochem. Biophys. Res Commun. 280, 284-352, 2001），また，骨形成促進因子の多くは骨芽細胞様細胞のPi取り込みを増加させる（とりわけインシュリン様増殖因子は骨芽細胞株のPit1 mRNAの発現を促進させる）（Endocrinology 138, 5202-5209, 1997）。
【００１４】
硬骨魚類のカルシウム/Pi代謝調節因子STCと相同の哺乳類STC1はPit1と同様には多くの組織で発現するが，骨芽細胞を含む様々な細胞で特徴的に発現する（Mol. Cell. Endocrinol. 112, 241-247, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1792-1796, 1996; J. Histochemi. Cytochem. 50, 483-492, 2002など）。筋特異的 [ミオシン軽鎖；MLT（Endocrinology 143, 3681-3690, 2002）]あるいはメタロチオネインIプロモーター（Endocrinology 143, 868-876, 2002）によるSTC1のトランスジェニックマウスはいずれも生育不良を特徴とする表現型を示す。MLT-STC1マウスの筋骨格系を解析した結果，骨代謝パラメーター（例えば、骨吸収を担う破骨細胞や骨芽細胞の活動部位，骨基質形成と石灰化の程度）が正常と異なることが示された。しかし，これらのモデル動物ではSTC1の骨代謝に対する影響がどのような生物活性を反映したものか，特定することはできなかった。
【００１５】
一方，動脈硬化症による血管壁の石灰化や種々の異所性石灰化の少なくとも一部は，骨形成と同じ分子機構によって生ずることがわかってきた（Circ. Res. 89, 1147-1154 2001; Semin. Nephrol. 24, 61-68, 2004など）。
【非特許文献１】Nat. Genet. 11, 130-136, 1995
【非特許文献２】Hum. Mol. Genet. 6, 165-171, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
骨芽細胞が細胞外Piを細胞内に輸送する能力は骨形成に本質的に必須であると考えられているが，その意義，分子メカニズムは不明であり，骨芽細胞のPiセンシング機構やその制御についてはほとんど知られていない。これらの分子メカニズムは特殊なケースを除き硬組織全般，軟骨形成にとって重要な過程であり，また病理的石灰化の仕組みの少なくとも一部に共通すると予想され，現在もその証拠が蓄積されつつある。
【００１７】
従って，本発明の目的は，骨形成における骨芽細胞のPi輸送の分子メカニズムとその役割を明らかにし，これを調節することにより，硬組織，軟骨形成の調節，あるいは種々の骨，軟骨疾患のための治療薬，または病理的石灰化を抑制する薬剤ならびにこれらに関連する機能性食品をスクリーニングする方法を提供することにある。さらには、硬組織・軟骨形成および動脈硬化症による血管壁の石灰化や種々の異所性石灰化による病理的石灰化を測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは，硬組織形成機構を鋭意研究した結果，例えば，骨芽細胞自身が細胞外Piを細胞内へ輸送する能力が骨形成（とくに石灰化）に本質的に重用である事実を見出した。また，本発明者らは，このPi輸送がPit1によって行われ，それが STC1によって制御される新規なPit1-Pi調節系を見出した。さらに，本発明者らは，STC1がPit1の発現レベルを直接制御する一方，STC1の発現レベルが細胞内Piレベルに左右されるフィードバックループの存在を見出した。加えて，本発明者らは，この調節系に重要なSTC1，Pit1が骨，軟骨の他，象牙質や様々な軟組織で共発現していることを確認した。
【００１９】
以上のように，本発明は，Pit1が骨形成のための骨芽細胞の機能的Pi輸送分子であり，その調節因子がSTC1であること，そしてこれらが適切な細胞内Pi濃度を保つためにフィードバックループを形成することにより石灰化を調節するというこれまでに全く知られていない知見を得，本発明に到達した。
【発明の効果】
【００２０】
骨芽細胞のPit1を介したPi輸送は骨基質石灰化に必須であること，STC1はPit1発現を直接刺激し，NaPi輸送を調整，骨基質石灰化を調節すること，成熟骨芽細胞が骨基質石灰化を調節するためにSTC1-Pit1-Pi経路が存在することから，STC1-Pit-Pi経路を亢進する物質は骨形成促進のための治療剤や予防食品となることが判明した。また，STC1，Pit1は軟骨，動脈，腎臓，肺など，病理的石灰化を引き起こす組織で共発現することを確認した。これらのことより，病理的石灰化機構の少なくとも一部は骨基質石灰化と共通すると考えられる。
【００２１】
本発明の（STC1）-Pit1-Pi経路を標的とする物質を有効成分として含有することを特徴とする治療剤，補助剤，機能性食品，硬組織，軟骨などの再生医療，骨粗鬆症など代謝性骨疾患，石灰化不全等を起こすくる病/骨軟化症，関節疾患，歯周病に伴う歯牙欠損，軟組織における病理的石灰化を伴う疾患に関する予防・治療・研究等への応用が可能である。
【００２２】
また，本発明の（STC1）-Pit1-Pi経路を促進する物質のスクリーニング方法は、上記の疾患の治療剤の候補や予防食品となる成分を識別する方法として有用である。さらに、STC1およびPit1発現を測定することにより、硬組織・軟骨形成や病理的石灰化を測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の第一の態様は，硬組織，軟骨形成においてPit1-Pi経路を調節する物質を有効成分として含有することを特徴とする硬組織，軟骨形成調節剤，硬組織，軟骨代謝異常に関わる疾患の治療薬または病理的石灰化の抑制剤またはそれらに関する機能性食品である。硬組織に関しては医科，歯科のいずれの用途においても，再生医療も含めすべてが対象であり，特に骨形成促進効果を期待して骨粗鬆症，石灰化促進効果を期待して腫瘍性骨軟化症が例示される。また，これとは逆にPit1-Pi経路を抑制することにより病理的石灰化のすべて，とりわけ動脈硬化症や透析による異所性石灰化の改善が例示される。
【００２５】
本発明の第二の様態は、Pit1-Pi経路を調節する物質であるSTC1またはSTC1を調節する物質を有効成分として含有することを特徴とする第一の態様のごとくに有効な治療薬または機能性食品である。
【００２６】
本発明の第三の様態は、STC1あるいはPit1の遺伝子発現，蛋白発現またはPit1を介したNaPi輸送活性を測定する工程を含むことを特徴とする，Pit1-Piの調節作用を有する物質を識別するためのスクリーニング方法である。
【００２７】
本発明の第四の様態はSTC1あるいはPit1遺伝子あるいは蛋白発現を測定することを特徴とする硬組織・軟骨形成の程度あるいは病理的石灰化の程度を測定する測定試薬である。
【００２８】
本発明において，「硬組織形成調節」の語は，硬組織の類骨形成と石灰化の双方の調節を含み，また，「軟骨形成調節」の語は正常な軟骨形成を促すことを示す。再生医療における硬組織，軟骨形成のための補助剤，骨粗鬆症や遺伝性のくる病，腫瘍性骨軟化症等の治療，歯周病等によって喪失した象牙質，歯周組織治療を目的として行われる。また「病理的石灰化」の語は動脈硬化症における血管壁の石灰化，異所性石灰化を例示し，その抑制剤はこれらの病理的石灰化を抑制し，症状を改善するものである。
【００２９】
本発明の硬組織，軟骨形成調節剤は、硬組織，軟骨形成に関する再生医療の補助剤，または硬組織，軟骨形成異常を伴う疾患に関する治療・研究等への応用が可能であり，病理的石灰化抑制剤はそれらとは逆に軟組織等の非生理的石灰化を抑制して，症状の改善に寄与する治療・研究等への応用が可能である。
【００３０】
また，これらに有効な物質を含む食品は，骨粗鬆症，くる病/骨軟化症，動脈硬化症，歯周病による歯牙欠損，異所性石灰化に代表される疾患を予防するための食品として有用である。
【００３１】
さらに，本発明の， Pit1-Pi経路の調節作用を有する物質を識別するためのスクリーニング方法は，再生医療，上記のような疾患等の治療剤，とりわけ骨粗鬆症，腫瘍性骨軟化症，歯周病による歯牙欠損，動脈硬化症，異所性石灰化の治療剤やそれらに関する機能性食品の開発に有用である。
【００３２】
本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質としては，STC1やPit1などが具体的に挙げられるが，これらに限定されるものではない。本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質を有効成分とする硬組織，軟骨形成調節剤あるいは病理的石灰化抑制剤は単独で投与するか，あるいは一般的に用いられる適当な担体または媒体，例えば結合剤，潤沢剤，香味剤などや乳化剤や安定化剤などと組み合わせて医薬用製剤に調整することができる。製剤の剤形としては，錠剤，カプセル，顆粒剤，散剤，シロップ剤等の形で，経口および静脈内あるいは動脈内の外，吸入，直腸，あるいは外用を問わず，患者に投与することができる。
【００３３】
また，再生医療の補助剤としては，幹細胞あるいは歯根膜細胞などの分化能を有する細胞の増殖・分化とそれに伴う硬組織，軟骨形成までの過程の少なくとも一部を培養系，生体内のいずれにおいても補助するものであって，そのために必要な製剤化，安定化のために上述あるいはそれ以外のあらゆる調整が可能である。
【００３４】
本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質を有効成分とする硬組織，軟骨形成調節あるいは病理的石灰化抑制食品は単独で用いる他，牛乳や豆乳などの飲料やヨーグルトやゼリーなど既存の食品に添加するか，あるいは加工食品の添加物などと組み合わせて予防食品に調整することができる。
【００３５】
本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質を有効成分とする硬組織，軟骨形成調節剤あるいは病理的石灰化抑制剤およびそれらの機能性食品がタンパクあるいは遺伝子の場合は，本来の機能的性質を保持していれば，活性の維持，向上などのための構造修飾が可能である。例えば，STC1のアンチセンスDNAあるいはRNAiまたはその塩基配列の置換体，あるいは組換えSTC1またはそのアミノ酸置換体を指す。それらが遺伝子の場合は宿主細胞に組み込むための方法，例えばウイルスベクターを用いるなどに制限されず，また組み換えが生体，培養等のいずれによって行われることに制限されない。
【００３６】
本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質を有効成分とする硬組織，軟骨形成調節剤あるいは病理的石灰化抑制剤およびそれらの機能性食品がタンパク質の場合は，例えば家畜などから得られた適切な出発材料を用いた精製品のみならず，大腸菌，バキュロウイルス，CHO細胞など，適切な方法で作製した組み換え体の利用が可能である。
【００３７】
本発明のPit1-Pi経路の調節作用を有する物質を有効成分とする硬組織，軟骨形成調節剤あるいは病理的石灰化抑制剤およびそれらの機能性食品を識別するためのスクリーニング方法は，培養細胞や実験動物におけるSTC1あるいはPit1の遺伝子発現や蛋白発現あるいはそれらの物理化学的，生化学的性質を測定する工程，ある種の細胞，組織における石灰化促進/抑制を測定する工程，ないしはNaPi輸送を測定する工程を含むことを特徴とする。スクリーニングに際し，用いる細胞の種類はSTC1あるいはPit1を発現する細胞であれば特に規定はなく，それらの遺伝子を組み込んだ細胞でもよい。また，人工膜などの無細胞系の実験を用いることも可能であるが，とりわけマウスあるいはラット胎仔または新生仔の骨芽細胞の初代培養のスクリーニングが好ましい。
【００３８】
本発明にあるSTC1あるいはPit1の遺伝子発現ないしは蛋白発現を測定する方法についても特に規定しないが，例えば免疫染色やラジオイムノアッセイ，RT-PCR，ウェスタンブロットなどが挙げられる。結合能を測定する方法としては，それらの遺伝子組換体を作製し，アフリカツメガエル卵細胞に導入して結合能を測定したり，それらの蛋白を固層表面に結合させ，それら蛋白に結合する物質を表面プラズモン法等により測定することもできる。また，Piはモリブデン酸直接法等により測定することができる。さらに，NaPi輸送活性はアイソトープで標識したPiを使用し，Na依存性の細胞内輸送をトレーサー実験により測定することができる。
「実施例」
以下に，本発明を詳細に説明するために実施例により効果を具体的に説明するが，本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。
（実施例１）
骨芽細胞におけるNaPiトランスポーターは骨基質石灰化に必須である
血中カルシウムレベルおよびALP活性はそれぞれシグマおよび三光純薬の比色キットを，Piはシグマの紫外線定量キットを用いた。1,25(OH)2D3はRIAキット（TFB）により，一群（7匹）の血清をプールして測定した。
【００３９】
全身骨格標本を作製するために，ラットを95％エタノールで固定し，皮膚，筋組織をできるだけ除去した。標本はさらにアセトンで固定し，アルシアンブルーとアリザリンレッドで染色した。組織標本作製のために，頭蓋冠を10%ホルマリンで固定し，一部は10％EDTAで脱灰後，4μm厚の樹脂（脱灰標本はパラフィン）切片を作製し，ヘマトキシリン-エオシンあるいはフォン・コッサ/トルイジンブルー，あるいはトルイジンブルー単独ないしはトリクローム染色を行った。
【００４０】
骨形成における骨芽細胞のNaPiトランスポーターの役割を明らかにする目的で，NaPi輸送の選択的阻害剤，フォスカネット（10，30，300 mg/kg/日，シグマ）を新生仔ラットの頭蓋冠部皮下に5日間注射した。フォスカネット30 mg/kg/日以下の投与量では，体重，血清中のCa，Pi，ALP，1,25(OH)2D3レベルに異常値は観察されなかった（表１）。30 mg/kg/日以下投与群の骨格標本ではフォスカネット投与部に一致してアリザリンレッドのみ陰性の部位が見られた（図1a-f）。頭頂骨組織標本によると，フォスカネット投与によって縫合部の新生骨および外側部，内側部の新生骨表層のトルイジンブルー陽性の類骨層がコントロールに比較して著しく増加した（図1g，h，m）。このトルイジンブルー陽性の類骨層は他の組織化学染色（フォン・コッサやトリクローム染色）でも未石灰化部位として確認された。一方，骨芽細胞数，骨基質の厚さに変化は見られなかった（図1i-m）。
【００４１】
同様にフォスカネットの効果を培養骨形成モデルで検証した。妊娠２１日目のウイスターラット胎仔頭蓋冠をコラゲナーゼ（タイプI）で分画消化し，得られた骨原性細胞(RC)分画を10%牛胎児血清を含むα-MEMで１日前培養した。翌日，トリプシン消化で得られた細胞浮遊液を適切な細胞密度（例えば0.3×104個/cm2）に調整し，35 mmディッシュなどで分化培地（上記の培地に50μg/mlアスコルビン酸を添加したもの）で培養した。細胞は約６日でコンフルエンスに達し，その後速やかに結節(類骨)を形成させた（約10日まで）。類骨結節の組織化学的解析のために，ディッシュを中性緩衝ホルマリンで固定し，ナフトールASMX/ レッドバイオレットLB を含む0.1 Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.3）で染色し，ALP活性を検出した。骨結節（石灰化）の同定のため，引き続きディッシュを2.5%硝酸銀溶液で反応させた（ALP/フォン・コッサ染色）。
【００４２】
類骨結節形成後，10 mM β-グリセロリン酸（bGP）を添加すると，12時間後には石灰化が誘導された。フォスカネット（最大濃度は1 mM）を同時添加すると，石灰化は用量依存的に抑制され，動物実験と同様の結果を得た（図2b）。
【００４３】
【表１】
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従って，この実験モデルは，全身性の影響を受けることなく，骨芽細胞のNaPi輸送を選択的に阻害することにより，骨軟化症様の骨基質石灰化不全が起こること証明している。（実施例２）
Pit1は類骨結節の石灰化に必須である
RT-PCRは以下の手順で実施した。すなわち、全RNAはTRIzol（インビトロジェン）を用いて調整した。cDNA合成とPCR増幅は標準的プロトコール（東洋紡またはキアゲン）を用いて実施した。ラットのSTC1， ALP，オステオポンチン（OPN），オステオカルシン（OCN）， Pit1, Pit2, リボゾームRNA L32（内部標準）のプライマーは表2の通りである。
【００４４】
【表２】
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全長ヒト(h)Pit1 cDNAはプライマーとして5'-GGCAACGCTGATTACCAGTACTACAGCT-3'と5'-GGAACTCGAGTCACATTCTGAGGATGACATを用いて得た。クローニングに用いたXhoIの認識部位は下線で示した。RTとPCRには，ReverTra Ace（東洋紡）とQiagen Taq polymerase/ProofStart DNA polymeraseをそれぞれ用いた。
【００４５】
類骨結節のPit1， Pit2tの発現を抑制するために，Pit1，Pit2，STC1（STC1のみ実施例4参照）のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASオリゴ DNA），インバースオリゴDNA（INV，掲載略），コントロールオリゴDNA（SCR）は次の配列（表３）を用いた。配列の両末端はSオリゴ化し，HPLC精製したものを用いた。
【００４６】
【表３】
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PitオリゴDNA（2μM）は培養５日と１１日目に，STC1オリゴDNA（3μM）は培養5日目から2ないし3日おきに添加した。
【００４７】
EcoRVとXhoIクローニングサイトに結合させた全長ヒト(h)Pit1 cDNAはヒトセメント芽種由来細胞株から調製し，pQE-TrisSystem（キアゲン）にクローニングした。0.5μg pQE-TrisSystem-hPit1（pQE-hPit1）あるいはmocをTransFastトランスフェクション試薬（プロメガ）を用いて５日目の培養細胞にトランスフェクションした。
【００４８】
RC細胞を低密度（500個/cm2）培養し，分化培地（上述の分化培地に100 nMデキサメサゾンを追加）で18日間培養した。得られたコロニー形成ユニット−骨芽細胞(CFU-Os)とCFU-線維芽細胞（CFU-F）から上述のごとく全RNAを精製し，cDNAを合成した。これらのサンプルの半定量的PCRによると， Pit1 mRNAはほとんどのCFU-OsといくつかのCFU-Fに検出された。
【００４９】
一方、Pit2は一部のCFUに検出された（図2a）。通常の密度（実施例１）でRC細胞を培養し，形成された類骨結節のPit1あるいはPit2 の発現をASオリゴDNAにより特異的に抑制したところ，Pit1 ASオリゴDNAを添加した場合のみ石灰化の抑制が認められた（コントロールオリゴDNAまたはPit2 ASオリゴDNAによる顕著な作用は見られなかった，図2c，d）。また，Pit1 ASオリゴDNAの添加は Pit1のみならず，OPN mRNAレベルを低下させた（図2e）。一方，RC細胞の類骨結節モデルでhPit1を過剰発現させると，Pit1 ASオリゴDNAの結果とは反対に石灰化が促進された（図2f，g）。従って，類骨結節の石灰化には骨芽細胞のPit1発現レベルが強く関与すると結論した。
（実施例３）
STC1はPit1発現を直接促進してPi輸送を調整する
NaPi輸送活性は，次のようにして実施した。RC細胞培養の類骨結節形成後，洗浄し，37℃，Na+の存在下あるいは非存在下で0.1 mM リン酸第一カリウム（1μCi/ml 32Pi, アマシャム）を含む緩衝液で5分間培養した。細胞を洗浄，乾燥後，0.2 N 水酸化ナトリウムで可溶化した。Pi取り込みは液体シンチレーションカウンターにより測定し、得られたデーター（cpm）はnmol/mg protein に変換して表示した。
【００５０】
骨芽細胞のPiセンシング機構とリンクしている調節因子を同定するため，これまでに報告のある骨芽細胞のPi取込み調節因子，あるいは骨芽細胞の増殖・分化に関与すると思われる液性因子のうち，フォスカネットに比較的速やかに応答する遺伝子を検索したところ，STC1遺伝子が特定された。STC1 mRNAは，類骨結節を形成した骨芽細胞にフォスカネットを添加すると速やかに発現が促進され，同時期にALP mRNA，その後経時的にPit1，OPN， Pit2 mRNAレベルが増加した（図3a）。
【００５１】
STC1とNaPiトランスポーターとの関連性を明らかにするために，類骨結節形成後のRC細胞にrhSTC1（20 ng/ml）を添加し，3日間培養した。Pit1，OPN，ALP mRNAの発現レベルとNaPi輸送活性を測定した。その結果，rhSTC1はNaPi輸送を促進するとともに（図3b），Pit1，OPN mRNAレベルを増加させた（ALP mRNAレベルは影響されなかった，図3c）。
【００５２】
同様に，サイクロヘキシミド存在下，類骨形成後のRC細胞をrhSTC1で3時間処理したところ， Pit1 mRNAのスーパーインダクション現象が確認された（図3d）。これらの結果は，rhSTC1は骨芽細胞のPit1 の発現を直接促進し，NaPi輸送を増加させ，結果としてOPN mRNAレベルを上昇させたことを示している。
（実施例４）
STC1は骨基質石灰化を促進する
STC1がPit1介在性の骨基質石灰化に機能的に関与することを確認するために，Pit1 ASオリゴDNAと組み合わせてrhSTC1の効果を検討した。すなわち，Pit1  ASオリゴDNAで処理した（実施例2）類骨形成後のRC細胞にrhSTC1を添加し，3日後に石灰化を定量した。その結果，rhSTC1はPit1 AS オリゴDNAによって抑制される石灰化を回復させることができた（図3e）。このことは，STC1がPit1を介した石灰化に機能的に関与することを示している。
【００５３】
この実験モデルにおいて，rhSTC1は単独でも類骨結節の石灰化促進することを見出した（図3e）。このrhSTC1の効果を詳細に検討するために，rhSTC1を類骨結節形成後のRC細胞に添加し，βGP非存在下（βGPは生体における骨基質の石灰化に例えられる比較的ゆっくりとした石灰化現象には必要としない），無血清で3日間 培養した。この条件下において，rhSTC1は類骨結節上に多数の石灰化のコアを形成させた（図4a）。骨芽細胞は，骨組織ではSTC1の高発現部位であり，次に，類骨形成後のRC細胞におけるSTC1 ASオリゴDNAの効果を検討した（オリゴDNA詳細は実施例2参照）。
【００５４】
その結果，骨芽細胞におけるSTC1発現の抑制（図4b）は，Pit1，OPN mRNAレベルの減少（図4d）とともに，石灰化を抑制した（図4d）。これらの結果は，STC1が類骨結節の石灰化を促進するオートクライン/パラクライン因子として作用することを示している。
【００５５】
さらに，ラット新生仔のde novo骨形成過程におけるrhSTC1の影響を検討した。フォスカネットの実験（実施例１）に準じ，rhSTC1（5μg/kg/日）を頭蓋冠部皮下に5日間注射した。その結果，rhSTC1投与群の頭頂骨において，骨基質全体の厚さに顕著な変化は見られなかったが，類骨層の厚さが著しく減少した（図4g，h，i）。その他の形態学的特徴（図4e-h，i）や血清パラメーター，体重には検出できる変化は認められなかった。
同条件でrhSTC1を投与したラット新生仔頭頂骨から全RNAを回収し，Pit1，OPN mRNAレベルを個体ごとに測定したところ， rhSTC1投与群ではmRNAレベルの増加が確認された（図4j）。これらの結果は，STC1は生体においてもPit1を介して骨形成に関与することを示唆している。
（実施例5）
STC1とPit1は病理的石灰化を起こす組織で共発現する
正常ウィスターラット（オス）の動脈，腎臓，肺，関節軟骨から全RNAを回収し， STC1とPit1の発現をRT-PCRで確認した（実施例2参照）。病理的石灰化を起こすそのいずれの組織においても、STC1とPit1両方の発現が確認された（図５）。従って、これらの組織においてSTC1およびPit1発現レベルを測定することにより，病理的石灰化を測定することができる。
（実施例６）
STC1-Pit1-Piセンシング機構
以上の結果より、骨芽細胞におけるSTC1-Pit1-Piセンシング機構の模式図を図６に示した。骨基質石灰化においては，これら全ての因子が必要である。細胞内Piレベルが低くなるか，またはPiレベルの要求量が高まることにより、STC1とALPの発現が促進される。
【００５６】
STC1はオートクライン−パラクライン因子として未同定のSTC1受容体を介して、直接的にPit1発現を誘導させる。次に、Pit1の発現量の増加は，ALPの発現量の増加によってもたらされた細胞外Piレベルの上昇と協調し，細胞内へのPiの取込みを増加させる。増加した細胞内PiはOPN発現を刺激し、あるいは未知の経路を介して石灰化を開始させる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は硬組織・軟骨形成調節剤ならびに病理的石灰化を伴う疾患の石灰化抑制のための治療薬および機能性食品に関し，特にPit1-Pi経路を調節する物質を有効成分として含有することを特徴とする硬組・軟骨形成調節剤ならびに病理的石灰化の抑制剤および機能性食品であり，Pit1-Pi経路の調節因子の一つがSTC1であることを特徴とする硬組織・軟骨形成調節剤ならびに病理的石灰化抑制剤および機能性食品であり、さらにPit1ないしはSTC1遺伝子あるいは蛋白を測定することによる硬組織・軟骨形成および病理的石灰化を測定する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ラット胎仔頭蓋冠におけるファオスカネット（30 mg/kg/day）の局所での影響を示す図である。(a-f)アルシアンブルーとアルザリンレッド染色による骨格標本。（c-f）頭蓋冠の近影。（e，f）糸状縫合部の強拡大。（g-l）頭頂骨横断切片。（g，h）樹脂切片のトルイジンブルー染色。（i-l）パラフィン切片のヘマトキシリン-エオシン染色。高倍率（I，j）と低倍率（k，l）像。スケールバーは50 mm。(m)骨芽細胞数。（cont）コントロール，（foscarnet）フォスカネット，（ob）。（m）骨芽細胞数（上段），骨の厚さ（中段），類骨層の厚さ（下段）。
【図２】RC細胞培養におけるPit1と類骨結節石灰化との強い関連性を示す図である。（a）CFU-Os/FにおけるタイプIII NaPiトランスポーターのmRNA発現。（o）CFU-Os，（F）CFU-F。（+）石灰化，（++）強い石灰化，（-）非石灰化。（b）類骨結節形成後のRC細胞。（cont）コントロール，（foscarnet）フォスカネット添加。（c-e）Pit ASオリゴDNA（AS）またはコントロール（INVおよびSCR）オリゴDNA添加よる類骨結節の石灰化への影響。（c，d）オリゴDNA添加後の類骨結節の石灰化。（e）Pit1 ASオリゴDNAによるPit1とOPN mRNAレベルの減少。（f，g）hPit1過剰発現の影響。（f）pQEtri-hPit1のトランスフェクションによるhPit1 mRNA（上段）およびタンパク（中段）の発現レベルおよびPit1，Pit2，OPNの mRNA レベル。（g）pQEtri-hPit1トランスフェクションによる類骨結節石灰化への影響。
【図３】類骨結節形成後のRC細胞におけるNaPi輸送のSTC1依存性誘導を示す図である。（a）1mMフォスカネット添加後のOPN，Pit1， Pit2， STC1，ALP mRNAレベルの経時的変化。（b）rhSTC1前処理（3日間）後のNaPi輸送活性。（c）bにおけるPit1, OPN mRNAレベルの増加。（d）サイクロヘキシミド（CHX）存在下，非存在下におけるrhSTC1のPit1 mRNAレベルに対する影響。
【図４】STC1依存性の骨基質石灰化を示す図である。（a）骨結節形成後のRC細胞をβGP非存在下，無血清血清下でrhSTC1を添加した3日後の類骨結節の石灰化。（b-d）STC1 ASオリゴDNAのRC細胞への影響。（b）ASオリゴDNAの特異的発現抑制。（c）類骨の石灰化に対する影響。（d）（c）におけるOPN，Pit1 mRNA レベルに対する影響。（e-j）rhSTC1の新生仔ラット頭蓋冠部皮下5日間投与による頭蓋冠への影響。（e-h）頭頂骨横断切片。薄い類骨層。（e，f）パラフィン切片のヘマトキシリン−エオシン染色。（g，h）樹脂切片のトルイジンブルー染色。（[]類骨，（ob）骨芽細胞。スケールバー，50 mm。（i）個体ごとのPit1，OPN mRNAレベル。（+）rhSTC1投与，（-）コントロール。（Mn）母ラットの個体番号。（j）頭頂骨の骨芽細胞数（左），骨基質の厚さ（中），類骨の厚さ（右）。
【図５】軟組織におけるSTC1とPit1の共発現を示す図である。Articular cartilage （関節軟骨）、Aorta（動脈）、Lung(肺)、Kidney(腎臓)、RC cells（ラット骨原性細胞）。
【図６】骨芽細胞におけるSTC1-Pit1-Piセンシング機構を示す模式図である。  Mineralization（石灰化）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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