(57)【要約】  【課題】  光透過性と絶縁性を備え、かつ検出表面への物質の非特異的吸着を有効に防止すること。  【解決手段】  光透過性の基板（基材層１１）と、該基板に積層された光透過性及び絶縁性の炭素化合物層１２と、該炭素化合物層１２の上面側に形成されて、物質間の相互作用の場を提供する反応領域２と、該反応領域２内に貯留又は保持される媒質Ｍに対して電界印加可能な対向電極Ｅ１−Ｅ２と、を備え、前記炭素化合物層１２が、陰電荷を帯びる官能基で修飾されたダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンから形成されている物質間の相互作用検出部などを提供する。  【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性の基板と、該基板に積層された光透過性及び絶縁性の炭素化合物層と、該炭素化合物層の上面側に形成されて、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域内に貯留又は保持される媒質に対して電界印加可能な対向電極と、を備え、前記炭素化合物層が陰電荷を帯びる官能基で修飾されたダイヤモンド又は／及び同修飾されたダイヤモンドライクカーボンから形成されている物質間の相互作用検出部。
【請求項２】
前記官能基はカルボキシル基であることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項３】
前記相互作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項４】
前記媒質には、前記ハイブリダイゼーションを検出するための蛍光インターカレータが存在することを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項５】
前記基板の裏面側から前記反応領域に向けて、所定波長の励起光を照射して得られる蛍光強度を測定することにより、前記相互作用を検出することが可能に構成されたことを特徴とする請求項１記載の相互作用検出部。
【請求項６】
請求項１記載の相互作用検出部が配設されたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
【請求項７】
ＤＮＡチップである請求項６記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項８】
光透過性の基板と、該基板の積層された光透過性及び絶縁性のダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンから形成された炭素化合物層と、該炭素化合物層の上面側に形成され、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域内に貯留又は保持される媒質に対して電界印加可能な対向電極と、を備える物質間の相互作用検出部を用いて、
前記基板の裏面側から前記反応領域に向けて、所定波長の励起光を照射して得られる蛍光強度を測定することにより、前記相互作用を検出することを特徴とする物質間の相互作用の検出方法。
【請求項９】
前記相互作用であるハイブリダイゼーションを、相補鎖に挿入結合する蛍光インターカレータの蛍光強度を測定することを特徴とする請求項８記載の相互作用の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質間の相互作用を検出するための技術に関する。より詳しくは、陰電荷を帯びる官能基で修飾された、光透過性及び絶縁性のダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンの物性を有効に用いる物質間の相互作用検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板表面に対してダイヤモンド薄膜やダイヤモンドライクカーボン薄膜（以下「ＤＬＣ薄膜」と略称。）を形成する技術が知られている。
【０００３】
「ダイヤモンド薄膜」は、プラズマＣＶＤ法などの気相合成法を用いて形成でき、高熱伝導率、高絶縁耐性、耐熱性、耐腐食性、放射線耐性、Ｘ線吸収特性、化学物質に対する不活性、負の電子親和力などの特性を備えている。
【０００４】
「ＤＬＣ薄膜」は、文字通り、ダイヤモンドの持つ前記特性を備える炭素系物質からなる薄膜であり、例えば、高真空中のアーク放電プラズマで炭化水素ガスを分解し、プラズマ中のイオンや励起分子を基板に衝突させる方法やイオン化蒸着法などの方法によって形成できる。このＤＬＣ薄膜は、緻密なアモルファス（非晶質）構造のために表面平滑性が高く、優れたトラボロジー（摩擦磨耗）を発揮するので、切削工具や磨耗部品などに主に採用されてきた。
【０００５】
現在では、これらの薄膜の特有の機能を活用して、半導体、平面パネルディスプレイ、放射線やＸ線などのモニター装置、歪み・圧力・温度・磁場などを検出するセンサ装置、電極材料などに利用され始めている。
【０００６】
また、近年、分子生物学、ナノテクノロジーに代表される微細加工技術、バイオインフォマティクスなどの進展を主な背景として、種々の測定原理を活用して、微細狭小な表面上で生体物質間の相互作用を進行させ、これを検出する技術（以下、「センサ技術」と称する。）が開発され、実用化されている。
【０００７】
このセンサ技術の分野において、上記したダイヤモンド薄膜やＤＬＣ薄膜を利用する技術が提案されている。例えば、特許文献１には、粗面化処理を施した表面粗さＲａ：１〜５００ｎｍである基板表面上にダイヤモンド、ＤＬＣ、グラファイト、あるいはこれらを混合した炭素系物質層を形成し、この炭素系物質の被膜上に、オリゴヌクレオチド断片、遺伝子、タンパク質、ペプチドなどの生体物質を担持させた粗面化スライドガラスが開示されている。また、この特許文献１には、ＤＬＣ膜は、蛍光強度測定に照らし、透明膜であることが望ましいと記載されている。
【０００８】
特許文献２には、ダイヤモンドから形成された基板上に、有機単分子膜を直接的な検出部として形成したＤＮＡセンサなどの半導体センシングデバイスが開示されている。なお、この場合、ダイヤモンドは、基板自体の材料である。
【特許文献１】特開２００２−２１１９５４号公報（請求項１、請求項８、請求項９、段落００１１、段落００１５などを参照）。
【特許文献２】特開２００４−４００７号公報（請求項６、請求項１１などを参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在提案されている様々なＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板では、物質間の相互作用の場を提供する反応領域を基板上に予め設定しておき、この反応領域中に滴下等したプローブＤＮＡ等の検出用物質とサンプル溶液中の標的物質との間の特異的な相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）を進行させ、これを光ピックアップ手段（蛍光読み取り手段）により検出する。
【００１０】
しかし、反応領域内の検出表面に対する物質の非特異的吸着が発生し、相互作用の進行の障害となるという問題を抱えている。また、前記非特異的吸着によって、蛍光強度読み取りの際のバックグランドノイズ値を高めてしまうという問題も発生する。具体的には、蛍光標識されたインターカレータを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合を想定すると、当該インターカレータが反応領域表面に非特異的に吸着すると蛍光を発するため、ハイブリダイゼーションに基づく正規の蛍光強度測定の障害となり、ひいては検出精度低下の原因となる。
【００１１】
また、反応領域に貯留又は保持される媒質中に存在する物質に対して電気的作用や効果を与えて、相互作用検出に利用する場合では、反応領域内に貯留又は保持され得るイオン性の媒質による電気化学的な反応を防止するために、反応領域を形成する表面は絶縁性が求められると考えられる。
【００１２】
そこで、本発明は、光透過性と絶縁性を備え、かつ検出表面への物質の非特異的吸着を有効に防止できる物質間の相互作用検出部と該検出部を備えるバイオアッセイ用基板、並びに物質間の相互作用の検出方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、まず、光透過性の基板（基材層）と、該基板に積層された光透過性及び絶縁性の炭素化合物層と、該炭素化合物層の上面側に形成され、物質間のハイブリダイゼーションなどの相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域内に貯留又は保持される媒質に対して電界印加可能な対向電極と、を備えており、前記炭素化合物層を、陰電荷を帯びる官能基で修飾したダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンで形成した物質間の相互作用検出部、該相互作用検出部が配設されたＤＮＡチップなどを含むバイオアッセイ用基板を提供する。
【００１４】
ダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボン、あるいはこれらを混合した構成の炭素化合物層は、光透過性、絶縁性を備えているので、相互作用検出のための光ピックアップや反応領域内での電界印加を用いたアッセイに好適である。
【００１５】
この炭素化合物層を、陰電荷を帯びるカルボキシル基などの官能基で修飾しておくことによって、反応領域内に存在する陰電荷を帯びる物質の反応領域内表面への非特異的吸着を電気的反発により有効に防止することができる。
【００１６】
例えば、ハイブリダイゼーションを検出するために、相補鎖（二本鎖）に挿入結合する蛍光インターカレータを用いる構成では、該蛍光インターカレータの反応領域表面に対する非特異的吸着を防止できる。この結果、蛍光強度測定のバックグランドノイズ値を大幅に低減できるので、検出精度向上に大きく寄与する。
【００１７】
基板と該基板に積層される炭素化合物層の両方を光透過性とすることで、基板の裏面側から反応領域に向けて所定波長の励起光を照射して得られる蛍光強度を測定することにより、物質間の相互作用を検出することが可能となる。なお、反応領域へ向かう光や該反応領域から発せられる蛍光の進行経路中に、電極が介在する基板構成の場合では、この電極もＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）等の光透過性の導体で形成する。
【００１８】
上記説明から理解できるように、本発明では、光透過性の基板と、該基板の積層された光透過性及び絶縁性のダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンから形成された炭素化合物層と、該炭素化合物層の上面側に形成され、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域内に貯留又は保持される媒質に対して電界印加可能な対向電極と、を備える物質間の相互作用検出部を用いて、前記基板の裏面側から前記反応領域に向けて、所定波長の励起光を照射して得られる蛍光強度を測定することにより、前記相互作用を検出する物質間の相互作用の検出方法を提供することができる。
【００１９】
本方法では、基板の裏面側からの光ピックアップ手段を採用できることにより、所定の媒質を反応領域に滴下又は注入等して供給するための装置群を基板上方領域に集約でき、基板裏面側領域に光ピックアップに用いる光学系の装置群を集約させることができる。
【００２０】
本方法では、検出対象の相互作用がハイブリダイゼーションである場合では、該ハイブリダイゼーションにより得られる相補鎖に対して挿入結合する蛍光インターカレータの蛍光強度を測定する方法を採用できる。陰電荷を帯びる官能基で修飾されたダイヤモンド又は／及びダイヤモンドライクカーボンから形成された炭素化合物層を採用することによって、該炭素化合層に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着を確実に防止できるからである。なお、本方法では、蛍光インターカレータを用いるハイブリダイゼーションの検出以外にも、蛍光標識された標的核酸を用いてハイブリダイゼーションを検出することも可能である。
【００２１】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付け等を行う。
【００２２】
「光透過性」とは、相互作用検出に使用される所定波長の励起光並びに所定波長の蛍光を少なくとも透過する性質を有するという意味であり、光透過率は蛍光強度測定が可能な程度あればよい。
【００２３】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域又は空間であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場などを挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。また、この反応領域の形状やサイズは特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍ程度のものであり、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用物質含有媒質、標的物質含有媒質）の最小滴下可能量に基づいて決定することができる。
【００２４】
「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーション、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の特異的な結合又は会合を広く含む。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味し、本発明では、しばしば「ミスハイブリ」と略称する。
【００２６】
「蛍光インターカレータ」は、二本鎖核酸に挿入結合可能な蛍光標識された物質であり、ハイブリダイゼーション検出に用いられる物質である。例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどを用いることができる。
【００２７】
「検出用物質」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に存在し、当該物質と特異的に相互作用する物質を検出するための検出子として機能する物質であり、反応領域中の表面に固定又は遊離して存在する。代表例は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸であるが、タンパク質などの他の生体関連物質も広く含む。
【００２８】
「標的物質」とは、前記検出用物質と特異的な相互作用を示す物質である。
【００２９】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００３０】
「バイオアッセイ用基板」は、基板上の所定の反応領域において、物質間の相互作用を進行させ、該相互作用を検出するための基板を意味し、前記物質の種類に関係なく広く包含し、前記相互作用の検出原理は問わない。
【００３１】
「ＤＮＡチップ」は、前記バイオアッセイ用基板の一つであり、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸が遊離状態又は、固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、検出表面への物質の非特異的吸着を有効に防止できる。また、基板裏面からの光ピックアップ手段を採用でき、さらには、反応領域内での電界アッセイを行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３４】
まず、図１は、本発明に係る物質間の相互作用検出部に用いることができる基板の基本的な層構造を簡略に示す図である。
【００３５】
図１中の基板１ａは、光透過性の基材層１１と、該基材層１１に積層された光透過性の炭素化合物層１２と、該炭素化合物層１２に積層されたポリイミドなどから形成された合成樹脂層１３と、からなり、該合成樹脂層１３にはウェル状の微小な反応領域２が形成されている。この反応領域２の底面は、前記炭素化合物層１２によって構成されている。なお、図１では、反応領域２内に貯留又は保持された媒質が符号Ｍで示されている。
【００３６】
反応領域２は、媒質Ｍを貯留又は保持可能であって、物質間の相互作用の場となり得る微細な領域又は空間であればよい。このような微細な構造の反応領域２の形成には、通常の半導体や機械の微細加工技術の分野で公知の光リソグラフィー法やエッチング法などを用いることができる。
【００３７】
基材層１１は、例えば、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。例えば、光透過性のある石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって、所望の形態に成形する。なお、安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００３８】
炭素化合物層１２は、ダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボン（以下「ＤＬＣ」と略称）、あるいはこれらを混合した材料から形成された層であって、当該層１２は、光透過性に加え、絶縁性を備えている（以下、同様）。炭素化合物層１２の形成方法は、特に限定されない。炭素化合物層１２の膜厚は、１−１００ｎｍが望ましい。光透過性は１％以上あればよいが、光ピックアップを想定すると、より高い光透過性が望ましい。なお、ダイヤモンドやＤＬＣは、屈折率が高いので、多重反射膜を形成して光透過選択性を与える場合に利用することができる。
【００３９】
図２は、本発明に係る検出部に用いることが可能な基板の他の層構造及び該基板に対する好適な光ピックアップ手段の概念を簡略に示す図である。
【００４０】
図２に示された基板１ｂでは、基材層１１と炭素化合物層１２との間に、光透過性の導体層１４が形成されている。この導体層１４は、光透過性の導体であれば採用することができる。例えば、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）を基材層１１にスパッタリング蒸着することにより形成できる。この導体層１４は、反応領域２内の媒質Ｍに電界を印加する際に使用する対向電極の片方として用いることができる。また、基板１ｂでは、基材層１１と導体層１４の間に酸化チタン膜を設けて、後述するサーボ光用の反射層とすることができる。
【００４１】
図１の基板１ａでは、基材層１１と炭素化合物層１２の両方が光透過性であり、図２の基板１ｂでは、基材層１１、導体層１４、炭素化合物層１２がすべて光透過性であるので、基板１ａ、１ｂの各裏面１００ｂ側から所定波長の励起光（励起用レーザ光）Ｐを、集光レンズ３（図６の符号Ｌ２で示す集光レンズに相当）を介して反応領域２（反応領域２内の蛍光物質）へ向けて照射し、これにより該反応領域２内で発生した蛍光Ｆの強度をディテクタ４（図６の符号１１１で示すディテクタに相当）で検出する。
【００４２】
なお、図２中の符号５は、前記ディテクタ４の前に配置される集光レンズ（図６の符号Ｌ３で示す集光レンズに相当）を示している。なお、光ピックアップ手段の詳細は、後述する。
【００４３】
図３は、図２中に示されたＸ部の拡大図である。この拡大図には、反応領域２の底面を構成する炭素化合物層１２の表面１２ａに、ＤＮＡプローブ等の検出用物質（検出用核酸）Ｄの一端が、アミド結合により固定された状態が示されている。
【００４４】
ダイヤモンドやＤＬＣ、あるいはこれらの混合物で形成された炭素化合物層１２の表面１２ａに対する標的物質Ｄの固定化は、例えば、該表面１２ａを紫外線照射中に気相中で反応性のガスを注入する工程を経て官能基を化学修飾して形成し、この官能基と反応性を持つ官能基で修飾した標的物質Ｄとの間で反応を行わせることにより実施できる。
【００４５】
例えば、前記化学修飾により炭素化合物層１２の表面１２ａにカルボキシル基を形成しておき、このカルボキシル基とアミノ基修飾したＤＮＡプローブと反応させ、アミド結合によって、炭素化合物層１２上に前記ＤＮＡプローブを固定できる。
【００４６】
なお、検出用物質Ｄそれ自体が持っている官能基と表面１２ａの官能基とを反応させることができる場合は、これらの官能基同士を反応させることによって、検出用物質Ｄを固定することもできる。
【００４７】
また、図３には、炭素化合物層１２の表面に固定された検出用物質Ｄに対して、これと相補性のある塩基配列を有する標的物質（ここでは、標的核酸）Ｔがハイブリダイゼーションしている様子、並びに、該ハイブリダイゼーションによって得られた相補鎖の塩基対部分に蛍光インターカレータＩが挿入結合している様子が示されている。なお、図示はしないが、蛍光インターカレータＩを用いずに、蛍光物質がラベルされた標的物質（標的核酸）Ｔを用いてもよい。
【００４８】
図３に示されているように、ダイヤモンド、ＤＬＣ、あるいはこれらの混合物からなる炭素化合物層１２の表面１２ａをカルボキシル基のような陰電荷を帯びる官能基で修飾しておくと、同様に陰電荷を帯びる検出用あるいは標的の生体物質（例えば、核酸）や蛍光インターカレータＩの非特異的吸着を電気的な反発により有効に防止できる。
【００４９】
炭素化合物層１２の表面１２ａに対する非特異的吸着がないと、検出用物質Ｄの固定化、検出用物質Ｄと標的物質Ｔとの間の相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）、蛍光インターカレータＩの挿入結合反応などのアッセイを、非特異的吸着との間の競合がない条件で、効率よく、かつ確実に進行させることができるので、好適である。また、非特異的吸着した蛍光インターカレータＩ由来の蛍光、あるいは、非特異的吸着した蛍光標識された標的物質Ｔ由来の蛍光を極めて少なくできるので、相互作用検出のための蛍光強度測定を高精度に行うことができる。
【００５０】
ここで、図４に、電界印加手段を具体的に備える検出部の好適な実施形態の一例を簡略に示す。
【００５１】
この図４中に符号１０で示された検出部は、光透過性の基材層１１と、該基材層１１に積層された光透過性の炭素化合物層１２と、該炭素化合物層１２に積層されたポリイミドなどの合成樹脂層１３と、からなり、この合成樹脂層１３にはウェル状の微小な反応領域２が形成されている。さらに、反応領域２下方の炭素化合物層１２の一部には、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）などの透明な導体部１４１が形成されている。この導体部１４１は、電極Ｅ１として機能する。なお、基材層１１と炭素化合物層１２の間に酸化チタン膜を設けて、後述するサーボ光用の反射層とすることができる。
【００５２】
前記電極Ｅ１に対向する位置に電極Ｅ２が形成された、ポリイミドなどによってなる上方基板１５が配置されている（図４参照）。この場合、反応領域２は、一部の開口部２１、２２を除き蓋がされた状態となっている。なお、開口部２１又は２２に対して媒質Ｍをインクジェットノズル等により滴下し、毛細管現象を利用して、反応領域２へ送り込むようにすることも可能である。
【００５３】
ここで、図４に示されているように、電極Ｅ１−Ｅ２は、反応領域２を挟むように相対向しており、電源Ｇにより通電可能な対向電極となっており、スイッチＳのオン／オフ操作によって、反応領域２中の媒質Ｍに対して、電界を印加したり、電界オフにしたり自在にできるようにされている。また、電極Ｅ１を一方の電極Ｅ２よりも面積狭小に形成することにより、電極Ｅ１のエッジ付近に電気力線を集中させることができるように工夫されている。
【００５４】
電界は、直流、交流、低周波、高周波の電界を目的に応じて選択できるようにしてもよい。直流電界では、電気泳動が可能であり、交流電界では、電気分解が起こらない条件下で、例えば、所定条件の高周波交流電界を印加することにより、誘電泳動の作用によって、電界密度の高い方へ、核酸分子を移動させたり、あるいは伸張させたりすることができるので、検出用核酸Ｄの固定化やハイブリダイゼーションのアッセイに有効に利用できる。また、低周波では、ミスハイブリダイゼーションしたＤＮＡに振動を与えて、これを検出用核酸から解離させる場合などに利用できる。
【００５５】
なお、このときの高周波電界の好適な条件としては、１ＭＶ／ｍ以上及び１ＭＨｚ以上が望ましく、例えば、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚを選択できる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００５６】
なお、電極Ｅ１−Ｅ２の配置構成は、図４に示された実施形態に限定されず、反応領域２の少なくともいずれかの領域を挟むように対向する配置構成を目的に応じて適宜選択できる。また、対向電極は必ずしも一対である必要はなく、場合によっては、二対以上形成してよい。例えば、対向軸が直交するように二対の対向電極を設けてもよい。
【００５７】
本発明では、以上説明した検出部１０が複数配設された構成を有するバイオアッセイ用基板を提供することができる。一例を挙げると、図５に示されたような形態の円盤状のバイオアッセイ用基板１００を提供することも可能である。なお、バイオアッセイ用基板１００に配設された検出部１０の対向電極Ｅ１−Ｅ２は、反応領域２を挟むように左右に振り分けて配置されている（図５参照）。
【００５８】
以下、この円盤状のバイオアッセイ用基板１００を用いた場合を代表例として、本発明に好適な光ピックアップ手段を詳しく説明する。
【００５９】
なお、図６は、同光ピックアップ手段の好適な実施形態の一例を示すブロック図である。なお、以下の説明では、バイオアッセイ用基板１００がＤＮＡチップである場合を想定して説明する。
【００６０】
まず、図６に示されたバイオアッセイ用基板（ＤＮＡチップ）１００を、回転手段を備えるディスク支持台１０１の上方に突設されたスピンドル（治具）１０２に固定する。このスピンドル１０２は、基板１００中心の孔（図５参照）に位置決めされた状態で挿着される。
【００６１】
なお、基板１００の各反応領域２には、ＤＮＡチップの製造段階では検出用核酸Ｄを含む媒質Ｍ１が滴下又は注入され、ハイブリダイゼーション検出段階では、標的核酸Ｔを含む媒質Ｍ２が滴下又は注入される。なお、標的核酸Ｔと一緒に蛍光インターカレータＩを滴下又は注入してもよい。
【００６２】
これらの媒質Ｍ１，Ｍ２は、溶液状や粘度調製されたゲル状を成すのが一般的である。特に、溶液状の媒質の場合は、液ダレ等の種々の問題を避けるために、前記媒質Ｍが滴下又は注入される基板１００は、水平に保持するのが望ましい。
【００６３】
図６に示されている構成においては、ノズルヘッドＮが基板１００の上面１００ａ側（上方側）に複数配置されている。このノズルヘッドＮは、所定の媒質Ｍ（例えば、Ｍ１〜Ｍ３、Ｍ３はインターカレータを含む媒質）を、所定位置に配列された検出部１０の各反応領域２に正確に追従しながら、所定のタイミングで滴下、あるいは注入できる構成とされている。
【００６４】
図６中の符号１０３は、「制御部」をブロック図的に簡略に示している。この制御部１０３は、基板１００に対する「フォーカス情報」と該基板１００から得られる「トラッキング情報」に基づいて、ノズルヘッドＮの滴下又は注入の動作全体を制御している。
【００６５】
ここで、図６に符号Ｐで示されている励起光は、ハイブリダイゼーション検出段階で使用する情報読み取り用の光である。この励起光Ｐは、レーザーダイオード１０４から出射され、コリメータレンズＬ１にて平行光とされた後、ダイクロイックミラー１０５で９０°屈折される。
【００６６】
その後、励起光Ｐは、光の進行方向前方に配置されたミラー１０６で９０°屈折された後、アクチュエータ１０７によって支持された集光レンズＬ２へ入射し、基板１００の裏面１００ｂ側から選択された検出部１０（の反応領域２）に照射される。なお、符号１０８は、制御部１０３から送信されるレーザーダイオードドライバ１０９を制御するための信号である。
【００６７】
励起光Ｐは、前記集光レンズＬ２によって基板１００の裏面で数μｍ程度の大きさまで絞り込まれる。この微小な励起光スポット径を活かすためには、基板１００上に、検出用核酸Ｄを含む媒質Ｍ１、標的核酸Ｔを含む媒質Ｍ２などを滴下又は注入するノズルヘッドＮとして、ピコリットルオーダーの微少量溶液を滴下可能なインクジェットプリンティングノズルが好適である。
【００６８】
ノズルヘッドＮの一例であるインクジェットプリンティングノズルの数は、使用する媒質の数や種類だけ用意してもよいし、１種類の媒質を滴下後、一旦ノズルを洗浄し、別種類の溶液を滴下することによって、より少ないノズル数で多種の媒質を扱うようにしてもよい。
【００６９】
なお、このインクジェットプリンティングノズルを用いて、インターカレータＩ（図３参照）を含む媒質Ｍ３を、標的核酸を含む媒質Ｍ２と同時に反応領域２へ滴下又は注入できるし、ハイブリダイゼーション後の所定タイミングで、反応領域２に滴下又は注入することもできるし、あるいは、所定の洗浄溶液を固定化工程後の所定タイミングで、反応領域２に滴下又は注入することもできる。
【００７０】
基板１００上に媒質Ｍ１〜Ｍ３を滴下又は注入する際には、サーボ用レーザー光Ｖ（後述）を用いて、基板１００上に予め記録されているアドレスマーク情報を読み取りながら、所望のアドレス（番地）に、媒質を滴下又は注入する。
【００７１】
基板１００の反応領域２（の検出表面部分）に固定された検出用核酸Ｄと後からから滴下又は注入されてくる標的核酸Ｔとがハイブリダイゼーションを示し、相補的な二本鎖核酸を形成した後、あるいは、標的核酸Ｔの滴下又は注入と同時に、所定のノズルヘッドＮを介して、前記二本鎖核酸に対して挿入結合可能な蛍光インターカレータＩを含む媒質Ｍ３を、反応領域２へ滴下又は注入することができる。
【００７２】
励起光Ｐが照射されると、符号Ｆで示される蛍光がインターカレータＩ（図３参照）から発せられ、基板１００の裏面１００ｂ側に該蛍光Ｆが戻ってくる。この蛍光Ｆは、基板１００の下方に配置された前記ミラー１０６で９０°屈折された後、蛍光Ｆの光進行方向に配置された前記ダイクロイックミラー１０５を透過して直進し、更に前方に配置されたダイクロイックミラー１１０で９０°屈折される。
【００７３】
続いて、この蛍光Ｆは、ダイクロイックミラー１１０の上方のレンズＬ３に入射して集光された後に、ディテクタ１１１に導かれる。このように、ダイクロイックミラー１１０は、蛍光Ｆを反射する性質を有するとともに、後述するサーボ用レーザー光Ｖに対しては、透光性を有する性質を備える。
【００７４】
ここで、蛍光強度は、一般の光ディスクＲＦ信号等と比較して、非常に弱いことが予想される。従って、蛍光検出用のディテクタ１１１には、一般のフォトダイオードと比較して非常に感度の高いフォトマルチプライヤー（光電管）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を採用するのが好適である。
【００７５】
前記ディテクタ１１１で検出された蛍光Ｆは、ＡＤ変換機１１２によって所定ビット数のデジタル信号１１３に変換される。このデジタル信号１１３は、例えば、基板１００上のアドレスと発せられた蛍光強度とを対応させたマップの作成等の解析に利用される。
【００７６】
次に、本発明に関連する「サーボ機構」について具体的に説明する。
【００７７】
まず、基板１００の下方に配置される上記集光レンズＬ２は、上記アクチュエータ１０７によって、フォーカス方向（上下方向）及びトラッキング方向（周方向）に駆動される構成となっている。このアクチュエータ１０７としては、光ディスクのピックアップに使用されるものと同じタイプの、２軸ボイスコイル型のものが好適である。
【００７８】
上記したように、基板１００は水平に保持され、かつ前記集光レンズＬ２は、基板１００から見て鉛直方向下方位置に設置されているので、励起光Ｐ並びにフォーカスサーボ及びトラッキングサーボに利用されるサーボ用レーザー光Ｖは、基板１００の裏面側１００ｂから照射可能となる。
【００７９】
基板１００の裏面１００ｂ側からサーボ用レーザー光Ｖを照射する構成を採用したことによって、このサーボ用レーザー光Ｖは、基板１００の検出部１０の媒質中に存在している検出用核酸Ｄや標的核酸Ｔの影響を全く受けることなく、基板１００の裏面１００ｂから、基板１００に設けられた酸化チタン膜などから形成された反射層（図示せず）などによって反射されて戻ってくる。
【００８０】
このため、基板１００が回転しても、基板１００中の媒質により反射光の方向及び強度が乱されることはないので、非常に好適である。即ち、フォーカスエラー及びトラッキングエラーも外乱を受けることなく、サーボが安定して動作できるようになる。
【００８１】
具体的に説明すると、まず、図６中の符号１１４は、サーボ用レーザーダイオードを示しており、その後方には前記ダイオード１１４を制御するためのドライバ１１５が配置されている。サーボ用レーザーダイオード１１４の光出射方向には、コリメータレンズＬ４が配置されている。
【００８２】
このコリメータレンズＬ４によって、サーボ用レーザー光Ｖは、平行光に変換されて直進する。なお、コリメータレンズＬ４の前方に配置されたダイクロイックミラー１１６は、サーボ用レーザー光Ｖに対して透光性を有する性質を備える。
【００８３】
ここで、フォーカスエラーの発生には、非点収差法、ナイフエッジ法、スキュー法等、幾つかの方法が考えられるが、図６の構成の場合、非点収発生レンズＬ５を用いた非点収差法採用している。
【００８４】
また、トラッキングエラーの発生には、ディファレンシャルプシュプル法と３スポット法が好適であると考えられる。両方法ともディスク上で３つの光スポットを得る必要がある。
【００８５】
従って、光ディスクのピックアップで一般的であるように、図６中に示された回折格子１１７を、サーボ用レーザー光学系のコリメータレンズＬ４とダイクロイックミラー１１６の間に挿設して、回折された０次及び±１次光を、集光レンズＬ２を介して基板１００に照射する。
【００８６】
図６における符号１１８は、サーボ用レーザー反射光のディテクタを示している。なお、上記したドライバ１１５並びに及び該ディテクタ１１１８は、制御部１０３によって制御されている（図６参照）。
【００８７】
上記した励起光Ｐの波長、蛍光Ｆの波長、サーボ用レーザー光Ｖの波長は、それぞれ異なっていてもよい。これらの光Ｐ、Ｆ、Ｖの波長が異なるようにした構成を採用する場合には、基板１に設けた反射層が、蛍光Ｆの波長に対して所定程度の透光性（透過率）を有し、かつサーボ動作が可能なレーザー光反射率を備える物性が要求される。つまり、反射率・透過率に波長依存性があってもかまわず、好ましくはローパスフィルタ的な周波数特性があればよい。単一の波長の場合では、蛍光Ｆの透過率とレーザー光Ｖの反射率の両方を向上させることは困難であるが、波長依存性を持たせることによって、蛍光Ｆの透過率及びレーザー光Ｖの反射率を向上させることができる。
【実施例１】
【００８８】
まず、シリコン製の基板上に１０ｎｍ厚のＤＬＣ薄膜を形成し、化学修飾によってＤＬＣ薄膜表面にカルボキシル基を形成した。次に、固定用の溶液中でアミノ修飾されている３０塩基の一本鎖ＤＮＡプローブ（オリゴヌクレオチド）と前記カルボキシル基を反応させて、アミド結合によりＤＬＣ薄膜上に、前記ＤＮＡプローブを固定した。なお、ＤＮＡプローブの溶液中の濃度は、１μＭ、５μＭ，１０μＭの三種類を準備して、それぞれの固定化表面を形成した。
【００８９】
前記ＤＮＡプローブと相補的な配列を持つ３０塩基の一本鎖である標的ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド、Comp）、相補的な配列を全く持たない３０塩基の一本鎖である標的ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド、Scramble）の両方で，蛍光色素であるＣｙ３で修飾したものをそれぞれ用意した。それらを用いて、ハイブリダイゼーションを緩衝液（クエン酸緩衝液）中で行い、ハイブリダイゼーション後は、ＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含有したクエン酸緩衝液で、基板表面を洗浄した。なお、本試験で用いたすべてのオリゴヌクレオチドは、エスペックオリゴサービス社の受託合成品を採用した。
【００９０】
蛍光色素Ｃｙ３で修飾された標的ＤＮＡを用いた試験区（試験区１）では、前記洗浄作業後、そのまま蛍光測定（５７０ｎｍ）を行った。即ち、「試験区１」は、インターカレータを用いないで、ハイブリダイゼーションを検出する場合を想定したものである。その結果を図７に示す（縦軸は蛍光量を示す、後述の図８も同様）。前記蛍光測定の分光システムとしては、蛍光顕微鏡（ニコンインスティック社製）と光ファイバー型瞬間マルチ測光検出システムを組み合わせた顕微分光システム（大塚電子社製）を用い、受光の感度は一定にして行った。
【００９１】
前記Ｃｙ３で修飾していない標的ＤＮＡを用いた場合（試験区２）では、二本鎖ＤＮＡに選択的にインターカレーションする蛍光色素であるＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎI（Molecular Probes）を含むトリス・ＥＤＴＡ緩衝液を用いて染色した後に，蛍光測定（５２０ｎｍ）を行った。即ち、「試験区２」は、インターカレータを用いてハイブリダイゼーションを検出する場合である。その結果を図８に示す。
【００９２】
まず、「試験区１」の結果を示す図７を見ると、相補的な配列を持つ相補的な標的ＤＮＡ（図７中に「Comp-Cy3」で示す。）は、５μＭと１０μＭの場合において、ほぼ同等の蛍光量を示していることがわかる。即ち、５μＭ以上の濃度では、プローブ固定量がほぼ飽和すると考えられる。
【００９３】
一方、１−５μＭの濃度では、ＤＬＣ薄膜表面に対するＤＮＡプローブの固定量が増加することから、それに応じて、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション量も増加すると考えられる。
【００９４】
これに対して、「試験区１」において、相補的な配列を全く持たない標的ＤＮＡ（図７中に「Scramble-Cy3」で示す）の場合では、ＤＮＡプローブの溶液中の濃度に関係なく、蛍光が殆ど測定されず、また蛍光量もほとんど変化しなかった。
【００９５】
「試験区１」における以上の結果から、相補的な配列を持つ標的ＤＮＡのみで蛍光が測定されたことより、ＤＬＣ薄膜を設けたシリコン基板上において、ハイブリダイゼーションを正規に進行させることが可能であることが理解できる。
【００９６】
なお、図７中に示された「対照区Ｘ」は、蛍光染色を全く行わない状態で、ＤＬＣ薄膜を設けたシリコン基板の蛍光強度を測定した結果を示しており、相補的な配列を持たないＤＮＡの場合の蛍光量は、これとほとんど差がないことがわかる（図７中の「Scramble-Cy3」参照）。
【００９７】
次に、上記した「試験区２」の結果を示す図８には、相補的である標的ＤＮＡ（図８中「Comp-SBGr」で示す。）と相補的でないＤＮＡ（図８中「Scramble-SBGr」で示す。）のそれぞれの場合のＤＮＡプローブの濃度別の蛍光強度が示されている。
【００９８】
相補的な標的ＤＮＡを用いた場合（図８中「Comp-SBGr」参照）、蛍光強度が、図７の結果と同様に、ＤＮＡプローブ濃度が５μＭで飽和を示していることがわかる。一方、相補的な配列を全く持たないＤＮＡ（図８中「Scramble-SBGr」参照）の場合は、相補的な標的ＤＮＡの場合の５分の１程度の蛍光強度が測定された。
【００９９】
相補的な配列を持たないＤＮＡを用いた場合には、ハイブリダイゼーションが見られず、また、インターカレータ・ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩは、一本鎖ＤＮＡにもある程度吸着し，発光を持つことが知られていることから、相補的な配列を全く持たないＤＮＡの場合において測定された蛍光は、基板表面に固定された一本鎖のＤＮＡプローブに吸着したインターカレータ・ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩ由来の蛍光であると考えられる。
【０１００】
なお、「試験区２」において、相補的でないＤＮＡを用いた場合の蛍光強度が、図７の相補的な配列を持つ標的ＤＮＡ（Comp-Cy3）の結果と同様のプローブ濃度依存性を持つことから（図８参照）、インターカレータ・ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩを用いて、基板上の一本鎖ＤＮＡの量を蛍光強度から測定できることもわかった。
【０１０１】
また、「試験区２」では、カルボキシル基が修飾されたＤＬＣ薄膜が積層されているシリコン製の基板をインターカレータ・ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩで染色する試験も行なった（図８中の対照区Ｂ）。この対照区Ｂでは、該染色を全く施さない対照区Ａと同様に、蛍光が殆ど観察されなかった。このことから，カルボキシル基で修飾されたＤＬＣ薄膜表面に対するインターカレータ・ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎＩの非特異的な吸着は、ほとんどないということが確認できた。
【０１０２】
以上から、カルボキシル基を化学修飾したＤＬＣ薄膜表面を備える基板を用いれば、ＤＬＣ薄膜表面に対する蛍光インターカレータの非特異的吸着が発生しないので、基板表面上では従来困難であったハイブリダイゼーション量の測定を、蛍光インターカレータを用いて容易に実現できることが確認できた。
【実施例２】
【０１０３】
石英基板上に、ＩＴＯをスパッタリング蒸着によって設け、その上にＤＬＣ薄膜を形成した。そしてウォール構造体をポリイミドで形成し、基板上にウェル構造を設けた（図２の基板構成参照）。
【０１０４】
次に、ＤＬＣ薄膜に対して表面処理を施し、カルボキシル基を修飾した。これに、アミノ基で修飾され、かつＣｙ３で標識された核酸分子を固定溶液で処理し，ウェルに滴下した。そして、このウェルを覆うようにアルミ基板を置き，倒立蛍光顕微鏡を用いて、基板の裏面から水銀灯の光を照射し，戻り光の蛍光測定を行った。
【０１０５】
その結果、光透過性は９０％以上あり、ウェル内の蛍光を観察できた。これにより，微細構造を形成した基板上のウェル内に存在する蛍光物質を、基板の裏面側から光照射手段により、光学的に測定できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、物質間の相互作用検出技術として有用である。特に、蛍光標識された標的物質や蛍光インターカレータなどの蛍光強度の測定に基づいて、ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出する技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明に係る物質間の相互作用検出部に用いることが可能な基板の基本的な層構造を簡略に示す図である。
【図２】本発明に係る検出部に用いることが可能な基板の他の層構造及び該基板に対する好適な光ピックアップ手段の概念を簡略に示す図である。
【図３】図２中に示されたＸ部の拡大図である。
【図４】電界印加手段を具体的に備える検出部の好適な実施形態の一例を簡略に示す図である。
【図５】本発明に係るバイオアッセイ用基板の一例である実施形態を示す図である。
【図６】本発明に好適な光ピックアップ手段の好適な実施形態の一例を示すブロック図である。
【図７】実施例の試験区１の結果を示す図（グラフ）である。
【図８】実施例の試験区２の結果を示す図（グラフ）である。
【符号の説明】
【０１０８】
１ａ，１ｂ  基板
２  反応領域
３，５  集光レンズ
４  ディテクタ
１０  物質間の相互作用検出部（略称「検出部」）
１１  基材層
１２  炭素化合物層
１３  合成樹脂層
１４  導体層
１００  （円盤状の）バイオアッセイ用基板
１００ｂ  裏面
１４１  狭小な導体層（電極）
Ｄ  検出用物質（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１，Ｅ２  対向電極
Ｆ  蛍光
Ｇ  電源
Ｍ  媒質
Ｐ  読み取り用の励起光
Ｓ  スイッチ
Ｔ  標的物質
【図１】
2005345181.tif 000003
【図２】
2005345181.tif 000004
【図３】
2005345181.tif 000005
【図４】
2005345181.tif 000006
【図５】
2005345181.tif 000007
【図６】
2005345181.tif 000008
【図７】
2005345181.tif 000009
【図８】
2005345181.tif 000010