(57)【要約】【課題】本発明は、大きさ、性質等の酵素の特性に制限されず、すべての酵素に対して汎用的に使用することが可能であり、酵素-基質反応による生成物を、容易にファージ表面に提示でき、高精度でスクリーニングし得るスクリーニング方法を提供することにある。【解決手段】本発明の形質転換体は、タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを、宿主へ感染させたことを特徴とする。また、本発明のファージ又はファージミドファージは、本発明の形質転換体から生産されたことを特徴とする。さらに、本発明のスクリーニング方法は、ファージ又はファージミドファージを利用したことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを宿主へ感染させた形質転換体であって、前記タンパク質コード化ファージミドが有する遺伝情報に基づく発現物と、ヘルパーファージが有する遺伝情報に基づく発現物と、前記発現物と反応可能な物質と、を含む形質転換体。
【請求項２】
タンパク質コード化ファージミドが、タンパク質で構成される基質及び/又は酵素コード化ファージミドであることを特徴とする請求項1記載の形質転換体。
【請求項３】
ヘルパーファージが、基質及び/又は酵素コード化ファージであることを特徴とする請求項1又は2項に記載の形質転換体。
【請求項４】
ヘルパーファージが、前記酵素によって触媒反応することが可能な基質を表示する基質表示型ファージである請求項１〜３項のいずれか1項に記載の形質転換体。
【請求項５】
前記酵素が、アセチル化酵素、リン酸化酵素、ユビキチン化酵素、制限プロテアーゼからなる群から選択される少なくとも1種である請求項1〜４項のいずれか1項に記載の形質転換体。
【請求項６】
基質が、アセチルCoA、ATP、ユビキチン、ビオチン、ビオチンタグペプチドからなる群から選択される少なくとも1種である請求項１〜5項のいずれか1項に記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主が、大腸菌である請求項1〜５項のいずれか1項に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜７項のいずれか1項に記載の形質転換体から生産されたファージ。
【請求項９】
請求項１〜7項のいずれか１項に記載の形質転換体から生産されたファージミドファージ。
【請求項１０】
請求項１〜7項のいずれか1項に記載の形質転換体から生産されたファージ又はファージミドファージと、前記ヘルパーファージとを、宿主へ感染させた形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体から生産されたファージ。
【請求項１２】
請求項１０記載の形質転換体から生産されたファージミドファージ。
【請求項１３】
請求項１〜７、及び10項のいずれか1項に記載の形質転換体をプレート上で培養して得られたファージディスプレイライブラリー。
【請求項１４】
前記ファージディスプレイライブラリーから標的物質をスクリーニングするスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか1項に記載されたファージ又はファージミドファージを利用したスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記ファージミドファージ上に提示されたタンパク質を、親和性を利用して標的タンパク質と結合させることにより、標的タンパク質をスクリーニングする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記標的タンパク質との結合を、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行なう請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体及び当該形質転換体を用いたスクリーニング方法であって、特に、ファージディスプレイを利用した形質転換体及び当該形質転換体を用いたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、医薬、化学、生化学及び産業用途用に高まる酵素需要は、新規特性を有する酵素の設計にかなりの関心を引き起こしている。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の説明及びまだ知られていない酵素の細胞内ネットワークの特徴に対して、それらの細胞内作用に基づく生体内での酵素の選別を可能とする方法に対する要求がある。人工酵素の開発、新規酵素の同定、未知酵素の分析及び生体内の酵素の細胞内ネットワークの特性は、分子進化の展望から魅力的な目標でもある。
【０００３】
酵素を含めたタンパク質のエンジニアリングには2種類の基本的な手法が開発されている。１つは、構造予測にしたがって、タンパク質の特定の残基を置換若しくは修飾することによって変異体を構築する手法(Fersht, A(1997)Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Co.,NY(非特許文献１)) で、もう1つはランダム変異を導入しin vivo及びin vitro選択を行なう手法である(Zhao,H.and Arnold, F. H.(1997)Curr.Opin. Struct. Biol. 7,480-485(非特許文献) 。後者の手法は前者と比較して、多くの変異体を一気にアッセイできるという利点がある。後者の手法のうち、in vitro法による選択では、タンパク質のライブラリーの多様性がin vivo法と比較して高い(典型的には108−1012程度) という利点がある。
【０００４】
また、ファージディスプレイ法は10８の多様性を持つランダムライブラリー若しくはコンビナトリアルライブラリーより酵素を含めた機能性タンパク質をin vitro において選択する強力な手法の一つである。
【０００５】
結合活性に基づくファージ表面の他の表示によるタンパク質の選別は、十分立証されているが、触媒活性に基づく酵素の選別は、かなりもっと複雑である。なぜなら、例えば、反応生成物は、完成後反応部位から拡散し、それゆえ、表示された酵素の特性は、触媒現象の前後で同じだからである。この問題を解決する1つの方法は、ファージ上に表示された酵素を、自殺阻害剤への化学結合又は固体支持体に共有結合した活性中間体アナログによって選別することである。
【０００６】
また、生成物が生じる反応を直接的又は間接的に触媒する酵素へ生産物が結合することによって固体支持体への触媒作用の生成物の特異的結合と、表示酵素の活性とは相関関係があるかもしれない。酵素は、戦略によってその生成物へ結合し、それによって、基質又は生成物のいくつかの部分は、表示された酵素のいくらかの部分に対する強い親和性を有する(酵素の部分とその基質との間の非共有結合。)。このような親和性を利用したファージディスプレイ法では、まず、ファージ表面上に酵素を提示する。そして、試験管内で基質をファージに付加させ、酵素と基質を両方提示したファージを構築する。ファージ表面上で酵素反応によって基質が生成物に変化し、生成物をリガンドに結合させることで,酵素活性を選択する。(図２B参照)
【０００７】
このような方法、すなわち、ファージ表面に基質と酵素を両方提示して、酵素反応によって生成した反応産物を結合させることによって、触媒活性を持つ酵素を選択するという手法が知られている。この方法は、触媒に対する直接選別を可能とするが、転移状態の構造又は触媒の機構に関するいかなる知識も要求しない。
【０００８】
【非特許文献１】Fersht, A(1997)Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Co.,NY
【０００９】
【非特許文献２】Zhao,H.and Arnold, F. H.(1997)Curr.Opin. Struct. Biol. 7,480-485
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上述のランダム変異を導入しin vitro選択を行なう方法においては、選択されたタンパク質の機能が必ずしも細胞内環境を反映しないという欠点を持つ。
【００１１】
また、上述のファージディスプレイ法は、ファージ表面に提示された酵素を触媒活性にしたがって選択することは、反応産物が反応終了後に、拡散してしまうため、非常に困難である(図４)。この問題を解決するために、ファージ表面に提示された酵素を自殺阻害剤などに結合させる方法では、結合活性は必ずしも酵素の触媒活性と一致しないという欠点がある。すなわち、上述の活性中間体アナログに対する結合は、酵素の触媒的活性との完全な相関関係を必ずしも保証しない。
【００１２】
また、上述のファージ表面に基質と酵素を両方表示させる方法では、酵素及び基質の両方をファージ表面に提示するという構築が難しいという欠点(例えば、問題の酵素のファージ表示部と相互作用するいくつかの成分へ結合しなければならない基質の化学合成など)を要求する。
【００１３】
したがって、酵素及び基質の両方をファージ表面に提示することなく、生成物を容易に直接的にファージ表面に表示できれば、ファージディスプレイ法の上述の利点を有しながら、さらに有益な方法を提供することが可能である。しかしながら、このように、酵素-基質反応による生成物を、容易にファージ表面に提示でき、高精度でスクリーニングし得るスクリーニング方法が望まれていた。
【００１４】
また、タンパク質を精製しても微量しか得られないタンパク質などは、それ自体貴重であるが、スクリーニング等によってタンパク質濃度が低下し、貴重なサンプルを失いかねない。これを解決するには、タンパク質ではなく、当該タンパク質をコードする遺伝情報を確保することができれば、微量であっても最も効率的に無駄なく操作すること可能である。
【００１５】
そこで、本発明は、大きさ、性質等の酵素の特性に制限されず、すべての酵素に対して汎用的に使用することが可能であり、酵素-基質反応による生成物を、容易にファージ表面に提示でき、高精度でスクリーニングし得るスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するために、発明者らは、ファージミドによる宿主への転写、及びファージディスプレイ法について鋭意研究した結果、本発明の形質転換体及び当該形質転換体を利用したスクリーニング方法を見出すに至った。
【００１７】
本発明の形質転換体は、タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを宿主へ感染させた形質転換体であって、前記タンパク質コード化ファージミドが有する遺伝情報に基づく発現物と、ヘルパーファージが有する遺伝情報に基づく発現物と、前記発現物と反応可能な物質とを含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、タンパク質コード化ファージミドが、タンパク質で構成される基質及び/又は酵素コード化ファージミドであることを特徴とする。
【００１９】
本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、ヘルパーファージが、基質及び/又は酵素コード化ファージであることを特徴とする。
【００２０】
本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、ヘルパーファージが、前記酵素によって触媒反応することが可能な基質を表示する基質表示型ファージであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、前記酵素が、アセチル化酵素、リン酸化酵素、ユビキチン化酵素、制限プロテアーゼからなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、基質が、アセチルCoA、ATP、ユビキチン、ビオチン、ビオチンタグペプチドからなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、宿主が、大腸菌であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のファージ又はファージミドファージは、上述の形質転換体から生産されることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明の形質転換体は、上述の形質転換体から生産されたファージ又はファージミドファージと、前記ヘルパーファージとを、宿主へ感染させて得られることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明のファージ又はファージミドファージは、さらに、前記ヘルパーファージを宿主へ感染させて得られた形質転換体から生産されたことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のスクリーニング方法は、前記ファージミドファージを利用したこと特徴とする。
【００２８】
また、本発明のファージディスプレイライブラリーは、前記形質転換体をプレート上で培養して得られることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明のスクリーニング方法は、前記ファージディスプレイライブラリーから標的物質をスクリーニングすることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明のスクリーニング方法は、前記ファージ又はファージミドファージを利用したことを特徴とする。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記ファージミドファージ上に提示されたタンパク質を、親和性を利用して標的タンパク質と結合させることにより、標的タンパク質をスクリーニングすることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記標的タンパク質との結合を、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行なうことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、新規機能酵素の開発、発見、酵素機能の分析、細胞内の酵素間ネットワークの解析を迅速に行なうことが可能であるという有利な効果を奏する。例えば、細胞内で重要な機能を持つ酵素群(アセチル化酵素、リン酸化酵素ユビキチン化酵素、カスパーゼ等)の探索や機能解析、シグナル伝達のメカニズムの解析を容易に行なうことができる。
【００３４】
また、本発明によれば、これまで開発されてきたin vivoとin vitroのタンパク質の選択性の両方の利点を併せ持つ。すなわち、本発明の方法によって選択されたタンパク質は、酵素の反応が細胞内でおこっているため、ファージディスプレイ法であるにもかかわらず、細胞内の環境を反映する。また、従来の酵素のファージディスプレイ法では、酵素をファージ表面に提示させるため、酵素を大腸菌から分泌させる必要があり、提示できる酵素の大きさや性質に制限があったが、本発明によれば、酵素は細胞内でのみ機能するので、大きさや性質に制限がない。
【００３５】
また、本発明によれば、ファージディスプレイ法を用いているため、in vivoの手法に比べてタンパク質ライブラリーの多様性が大きいという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
まず、本発明の形質転換体の概要を示せば以下のようになる。
【００３７】
本発明の形質転換体は、タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを含む。さらに、本発明の形質転換体は、前記タンパク質コード化ファージミドが有する遺伝情報に基づく発現物と、前記発現物と反応可能な物質とを含む。これらのファージミド及びヘルパファージを、適当な宿主に感染させることにより、本発明の形質転換体を得ることができる。
【００３８】
タンパク質コード化ファージミドが有する遺伝情報に基づく発現物としては、例えば、酵素、基質、モノ及びポリクローナル抗体などの抗体、タンパク質受容体等を挙げることができる。
【００３９】
発現物と反応可能な物質としては、例えば、発現物が酵素であれば、その酵素の基質、又は発現物が基質であれば、基質又は酵素を挙げることができる。このように、発現物及び当該発現物と反応可能な物質を細胞内に備えることによって、ファージミドが保有する遺伝情報に基づく発現物とは異種の物質、例えば、反応生成物を、子ファージ上にディスプレイすることができる。
【００４０】
これにより、まず第一に、一連の反応、例えば酵素反応が、細胞内でおこっているので、ファージディスプレイ法であるにもかかわらず、細胞内の環境を反映することができるという利点を有する。第二に、従来の方法では、ファージが有する遺伝情報に基づく発現物だけしか子ファージ上にディスプレイできなかったので、発現物が酵素である場合、酵素を大腸菌から分泌させる必要があり、ディスプレイできる物質の大きさや性質に制限があったが、本発明によれば、酵素は細胞内でのみ機能するので、大きさや性質に制限がないという利点を有する。
【００４１】
タンパク質コード化ファージミドは、好ましい態様において、基質及び/又は酵素コード化ファージミドである。特に本発明では、大腸菌などの細胞内での反応、とりわけ触媒反応などによって得られる生成物をもファージ上に表示(ディスプレイ)できる点有利である。
【００４２】
このような表示可能な物質しては、この他、従来からあるファージディスプレイ法でディスプレイできるもの、例えば、モノ及びポリクローナル抗体、タンパク質受容体、核酸、複合糖質、低分子化合物等を挙げることができる。
【００４３】
また、ヘルパーファージを、基質及び酵素コード化ファージとすることができる。これは、要するに、宿主内で発現させたい物質、例えば、基質、酵素などの遺伝情報をファージミド、又はファージの少なくともいずれかに組み込むことにより、宿主内で目的物質(例えば、酵素と基質との反応生成物であれば、その反応生成物)を生産することが可能だからである。したがって、必ずしもファージミドと、ファージとの両方に遺伝情報を与える必要なない。
【００４４】
ヘルパーファージは、好ましくは、前記酵素によって触媒反応することが可能な基質を表示する基質表示型ファージとを含む。ファージミドとは、プラスミドではあるが、M13、fd、あるいはｆ1などの繊維状のファージゲノムの一部を含むように人工的に作られたものである。ファージミドは、プラスミドクローニングベクターで、プラスミドの複数起点だけでなく、Ｍ１３などの一本鎖ＤＮＡゲノムをもったファージ由来の複製起点も持っている。このファージ由来の複製起点によって、首尾よくファージミドの遺伝情報が、応答するファージの中に取り込まれることとなる。
【００４５】
一方、ヘルパーファージの遺伝情報において、ヘルパーファージからは、遺伝情報が発現し、構造タンパク質(キャプシドなど)の部分を供給する。通常、
ファージ遺伝子がキャプシドに取り込まれ,子ファージが形成されるが、遺伝子がキャプシドに取り込まれないように細工されている。その結果、当該ヘルパーファージと、ファージミドにより出現する子ファージは、ファージミド由来の遺伝情報と、ヘルパーファージの骨格とを有することになる。
【００４６】
ファージゲノムの配列として、DNAの複製並びに粒子形成に必要なシス作用エレメントをすべて含むようにする。その結果,複製並びに粒子形成に必要なタンパク質を供給するためにファージミド上にこれらのタンパク質の遺伝子をコードさせる必要がない。これにより、数kbの長さの外来DNAを問題なく挿入することができるようになる。外来DNAを含んだファージミドベクターを適当な大腸菌に形質転換した後、さらにｆ1ファージなどの繊維状ファージ(ヘルパーファージとして)を感染させる。これにより、粒子形成のためのコートタンパク質が供給されるからである。その結果、ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子の混ざったファージ粒子が分泌されてくる。
【００４７】
本発明においては、このような原理を利用したものである。ヘルパーファージ粒子とファージミド粒子との混合状態から一本鎖ＤＮＡを調整してそれをそのままＤＮＡの塩基配列決定用に用いることができる。これは、塩基配列の決定に用いられるプライマーは、ファージミドベクターのクローニング部位の近傍に特異的に結合するような配列を持っているからである。
【００４８】
基質をファージ表面にディスプレイするという観点から、基質はタンパク質成分であることが望ましい。そして、提示された基質タンパク質が酵素反応によって変化する必要がある。よって、リガーゼ又はプロテアーゼが最も選択に適した酵素である。
適応可能な酵素を例示すると、アセチル化酵素、リン酸化酵素、ユビキチン化酵素、カスパーゼなどの制限プロテアーゼからなる群から選択される少なくとも1種を挙げることができる。このような種々の酵素を用いることにより、切断、結合など種々の酵素の特性に応じた生成物をディスプレイすることが可能となる。
【００４９】
例えば、酵素として、ビオチン化酵素を用いた場合には、ビオチンタンパク質リガーゼ（BPL）の天然の基質であるビオチンカルボキシキャリアータンパク質（BCCP）、BPLの人工基質として、ビオチンタグペプチドを挙げることができる。
【００５０】
本発明において選択できる最も簡単な酵素として、次の２種類を挙げることができる。すなわち、
基質A+基質B→生成物C
基質A→生成物C１+生成物C２
つまり、２種類の基質を結合させて、生成物を創るタイプの酵素(リガーゼ)と基質を２種類の生成物に分解する酵素(プロテアーゼ)である。
上記基質Aは、細胞外部から導入するタンパク質類又はタンパク質以外の物質を意味し、たとえば、アセチルCoA、ATP、ユビキチン、ビオチンなどを挙げることができる。一方基質Bは、種々のタンパク質、例えば、アセチル化される例としてｐ５３やＰＣＡＦなど、リン酸化の例としてＰ５３などの種々のタンパク質、ユビキチン化であれば、癌遺伝子産物などのタンパク質、ビオチン化ではＢＣＣＰなどを挙げることができる。
例えば、基質Ａ+基質Ｂ→生成物Ｃの反応を例として、基質Ａとしてビオチン、基質Ｂとしてビオチンタグペプチド又はビオチンカルボキシキャリアータンパク質、をビオチンタンパク質リガーゼ（ＢＰＬ）の存在下で反応させる場合を考えると、ビオチンを常法により細胞（大腸菌）内へ導入し、ビオチンタブペプチド又はビオチンカルボキシキャリアータンパク質、及びビオチンタンパク質リガーゼをコードする遺伝子をファージ又はファージミドに組み込み、前記細胞<大腸菌）内で発現させれば、目的のビオチン化ビオチンタグペプチド(生成物はこれでよろしいでしょうか？)をディスプレイさせることが可能となる。
つまり、遺伝子をファージ又はファージミドに組み込み、宿主内で発現させることができ、ひいては、宿主内でこれらの反応により生じた反応生成物をも子ファージ上にディスプレイすることができる。すなわち、本発明の形質転換体によれば、ファージミドの遺伝情報にない物質をもディスプレイすることができる。ここで、本発明の形質転換体によってディスプレイ可能な物質を例示すると次のようになる。すなわち、ファージミド及び/又はヘルパーファージが有する遺伝情報による発現物と反応可能な物質、前記遺伝情報による発現物と反応により生じた物質、前記遺伝情報による発現物により消失した物質等を挙げることができる。具体的に例を挙げれば、基質と酵素による反応生成物、酵素により切断された反応生成物等をファージミドファージ上にディスプレイすることができる。
【００５１】
ここで、宿主についても特に限定されないが、繊維状ファージが感染できるのは大腸菌であるという観点から、好ましくは、宿主は大腸菌である。
【００５２】
次に、本発明のファージミドファージ、又はファージについて説明する。本発明のファージミドファージ又はファージは、上述の本発明の形質転換体を適当な培地上で培養することによって、前記形質転換体から生産される。かかるファージミドファージ又はファージは、大腸菌内(in vivo)で生じた反応生成物をディスプレイすることができる。これによれば、酵素の反応が細胞内でおこっているため、ファージディスプレイ法であるにもかかわらず、相貌内の環境を反映することが可能となる。
【００５３】
また、上述のように、本発明の形質転換体をプレート上で培養することにより本発明のファージディスプレイライブラリーを得ることができる。例えば、一連の酵素基質群のすべてを含むファージミドファージを構築することにより、蛍光標識等の標識をつけたプローブとの反応により、目的物質をスクリーニングすることが可能である。
【００５４】
次に、本発明のスクリーニング方法について説明する。本発明のスクリーニング方法は、上述のファージミドファージを利用する。好ましい実施態様において、前記ファージミドファージを、親和性を利用して標的タンパク質と結合させることにより、標的タンパク質をスクリーニングすることが可能である。
【００５５】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記標的タンパク質との結合を、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行なう。ディスプレイされる物質が特性されているファージミドファージを、アフィニティーカラムに結合させて、前記ディスプレイされる物質と結合可能な標的物質を得ることができる。
【００５６】
なお、カラムの条件、標的物質の精製等は、常法に従って、適宜変更可能であり、それぞれ標的物質の種類に応じて、最良の条件を適用すれば良い。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００５８】
実施例１
この手法では、まずタンパク質をコードするDNAライブラリー(タンパク質ライブラリー)を持つファージミドを大腸菌に形質転換する。続いて、基質ペプチドがファージの表面タンパク質であるgene3タンパク質(g3p)と融合したファージ(基質提示型ファージsubstrate-peptide displaying phage)を大腸菌に感染させる。この基質提示型ファージは、基質ペプチドをコードする遺伝子がgene3遺伝子の上流に挿入されたゲノムを持つ。よって、大腸菌中でのこの遺伝子基質融合g3pが発現する。もしファージミドのタンパク質ライブラリーから発現したタンパク質に触媒活性があれば、酵素反応により基質融合g3pは生成物融合g3pに変化する。生成物融合g3pはファージのアセンブルの際に取り込まれ、ファージ粒子の表面に提示される。ファージ粒子の中にはファージミドのゲノムが取り込まれる(このようなファージ粒子を今後、ファージミドファージと呼ぶ)。生成物に対する親和性で選択を行なうことで、触媒活性を持つタンパク質をコードしたファージミドのゲノムを持つファージミドファージを回収するころができる.回収されたファージミドファージは再び大腸菌に感染させることで、増幅と選択のサイクルを繰り返すことができる(図１)。
【００５９】
＜実験手順＞
＜ファージミド、ファージ及び大腸菌の宿主株の構築＞
入手可能なファージミドｐTV118Nは、ここでは、LacZα遺伝子(Takara,Kyoto,Japan)の存在を示すpTVlacZαとよぶ。PTV 118 Nは、プラスミドpUCの複製の起源であるアンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、及びラクトースプロモータ（Plac）とラクトースオペレータ(lacO)によって規定されるlacZα遺伝子を有する。ファージミドpTVBirAは、以下のようにpTV118Nから誘導された。ビオチンタンパク質リガーゼ（BPL）をコードするBirA遺伝子は、大腸菌ER2738のゲノム(New England BioLabs, Beverly, MA, USA)から増幅することができ、pTV118 NのLacOの下流へ挿入し、lacZα遺伝子を置換することができる。
【００６０】
M13KE−Btag‐ファージは、M13KE-ファージ(New England BioLabs)から以下のように誘導することができる。（１）大腸菌ER2738をM13KEと感染させた。（２）大腸菌において成長したファージの複製型（RF）をQIAprep(登録商標)Spin Miniprep Kit(QIAGEN,Hilden,Germany)で増幅した。（３）我々がビオチンタグペプチド（Btag）と呼ぶ14残基ペプチド(GLNDIFEAQKIEWH)をコードするオリゴヌクレオチド（DNA）を合成し、M13KEのRFにおいてシグナル配列と遺伝子III(g3)との間にライゲートした。精製したRFは、大腸菌をトランスフェクトするのに使用し、細胞から離れたM13KE−Btagファージを精製した。
【００６１】
pTVBirA-Btag−g8及びpTV‐Btag‐g8は、Ampr 、pUC複製起源、Btag遺伝子VIII融合タンパク質(Btag‐g8p)用の遺伝子を含んだ。pTVBirA‐Btag‐g8のみが、BirA遺伝子を含んだ。2つのファージミドをpTVBirA及びpTVlacZ
αからそれぞれ、以下のように構築した。VIIIタンパク質(g8p)融合をコードする遺伝子をM13KEファージからPCRによって増幅し、pTVBirA又はpTV118Nへ挿入した。それぞれの場合に、遺伝子をPlacによって制御した。
【００６２】
大腸菌BM4062から誘導された大腸菌BM4062F’(a gift from the E.coli Genetic Stock Center at Yale University, New Haven, CT, USA)は、テトラサイクリック耐性遺伝子(Tetr)を含むF’プラスミドを含む。Tetrを含んだF’プラスミドを含む大腸菌ER2738をストレプトマイシン耐性遺伝子(Smr)を運搬するBM4062細胞と混合し、混合物をLuria-Bertani(LB)培地で1時間、37℃でインキュベートした。その後、混合物を、ストレプトマイシン及びテトラサイクリンを有するアガロースゲル固化LB培地にプレートした。残存細胞を大腸菌BM4062F’として単離した。
【００６３】
＜ビオチン化ビオチン−タグ−ペプチド(Btag)を表示するファージミド−ファージの親和性選別＞
50μlのTBST[50mM  Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl 及び0.1％Tween 20] 中の10６ファージミド−ファージ(pTVBirA-ファージ、pTVlacZα−ファージ、又は割合で1:1又は1:10のpTVBirA‐ファージ及びpTVlacZα−ファージの混合物)及び106ファージ(M13KE‐Btag‐ファージ)の混合物を,1mM ビオチンを有するか又は有しない７μlのSoftLink登録商標、Soft Release Acidin Resin（Promega, Madison,WI,USA）で、１時間、30℃でインキュベーション後、樹脂を1回、1mlのTBST緩衝液で洗浄した。ファージの溶出のために、100μlの溶出緩衝液[100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)及び5mMビオチン]を樹脂へ加えた。
【００６４】
その後、選別されたファージミド−ファージを含む１μlの溶出緩衝液を、成長の対数期での大腸菌ER2738を含む100μlのLB培地へ加えた(600nm≒0.6でのOD)。室温で10分間インキュベーション後、混合物をアンピシリン及びテトラサイクリンを有するアガロース固化LB培地上にプレートし、選別したプラスミド−ファージのタイターを決定した。
【００６５】
プラスミド、すなわちpTVBirA又はpTVlacZαのどちらが細胞に感染したかを決定するために、BirA又はlacZα遺伝子を含むファージミドを含む(プレート上の)大腸菌の各残存コロニーを鋳型としてPCRに対して反応混合物へ加えた。その後、PCRの生成物をアガロースゲル上で電気泳動によって分析し、細胞中のファージミドを同定した。
【００６６】
＜Btag-g8p融合タンパク質を表示するファージミド-ファージを使用する生体内酵素の選別＞
pTVBirA-Btag-g8又はpTV-Btag-g8を含む大腸菌BM4062F’を、37℃でアンピシリン及びテトラサイクリンを有する5mlのLB培地において培養した。成長の対数期で(600nm≒0.2)、当方は、培地を混合し、pTVBirA-Btag-g8及びpTV-Btag-g8を１：１又は１：１０の割合で含む大腸菌の混合物を生じさせた。これらの細胞をM13K07ヘルパーファージで感染させて(５×10８pfu；New England BioLabs) 
37℃で１時間インキュベーション後、カナマイシンを培地へ加えた。その後、37℃で6時間インキュベーション後、放出したファージとファージミド-ファージを精製した。108〜1010ファージミド-ファージの各サンプルを、上述したようにアビジン樹脂上へ選別にさらした。
【００６７】
＜結果＞
＜ファージディスプレイを使用して生体内で活性ビオチンタンパク質リガーゼ(BPL)の選別用システムの構築＞
当方が開発した方法の妥当性と潜在的有用性を確認するために、当方は、モデル酵素として大腸菌のビオチンタンパク質リガーゼを使用した(図３)。BPLは、ビオチンとATPからビオチニル５‘-アデニレートの形成を触媒し、アセチルCoAカルボキシラーゼのサブユニットであるビオチンをビオチンカルボキシル運搬タンパク質(BCCP)上の特異的リシン残基へ転移する。ビオチニル化反応は、かなり特異的で、ビオチン依存カルボキシラーゼ(アセチルCoAカルボキシラーゼ)のみが生体内で基質として作用する。
【００６８】
まず、ファージの細胞への感染のために、当方は、F’プラスミド(Tetr)を点変異(Arg to Cys at position 235) の結果として温度感受性BirA遺伝子を有するBM4062細胞の中へ導入することによって生産した大腸菌BM4062F’を構築した。構築したBM4062F’は、F’プラスミドと、突然変異体BPLを発現する内因性の突然変異体BirA遺伝子の両方を有する。突然変異体BPLは、37℃で非常に低活性を有し、ビオチニル化反応に対してビオチンの高い濃度を要求する。
【００６９】
酵素コード化ファージミドとして、当方は、BPLをコードするBirA遺伝子を運搬するpTVBirAを調製した。ネガティブコントロールとして、当方は、pTVBirAのBirA遺伝子をLacZα遺伝子 (生産物が、βラクタマーゼから誘導したαペプチドである) によって置換し、pTVlacZαを生じさせた。PpTVBirA及びpTVlacZαの両方とも、アンピシリン耐性遺伝子（Ampr）を運搬し、pUCプラスミドの複製の起源を含んだ。BirA及びlacZα遺伝子の発現のレベルは、ラクトースプロモータ(Plac)及びラクトースオペレータ(lacO) によって調節されているので、両方の遺伝子は、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)によって、誘導可能である。
【００７０】
当方は、M13KE-Btag-ファージを、基質-コード化ファージとして調製した。なぜなら、14残基ペプチド、ビオチン-タグ-ペプチド(Btag)が、BPLによって大腸菌から要求された最小配列として組み合わせ方法として最近同定されたからである。M13KE-Btag-ファージは、Btagをコードする配列がシグナル配列と遺伝子II(g3)の5’末端との間に導入されたM13KEの単純な誘導体であった。当方は、Btagが遺伝子IIIタンパク質のアミノ末端へ融合、すなわち、Btag-g3p融合タンパク質は、ファージのキャプシドの中へ組み込まれるであろうと、と予想した。加えて、ファージは、lacZα遺伝子を含んでいるので、容易に可視できる青いプラークが5-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルβ-D-ガラクトピラノサイド（X-gal）及びIPTGで調製されたプレート上に形成されるであろう。
【００７１】
本研究において、上述したように、当方は、選別用の宿主として大腸菌BM4062F’を使用した。内因性BPLの活性の抑制は、Btagのバックグランドビオチニル化を内因性BPLによって最小限化することが必要である。大腸菌BM4062F’は、pTVBirA又はpTVlacZαで形質転換され、その後、宿主細胞は、ビオチン、アンピシリン、テトラサイクリンを有するLB培地でインキュベートした。その後、ｐTVBirA含有又はpTVlacZα含有宿主細胞をM13KE-Btag-ファージで感染させて、インキュベーションを続けた。
【００７２】
当方のシステムにおいて、当方は、M13KE-Btag-ファージのゲノムから発現されたBtag-g3p融合タンパク質は、活性BPLが宿主細胞においてビオチニル化反応を首尾よく触媒するなら唯一、ビオチンとラベルされると予測した。仮定において、ｐTVBirAゲノム(pTVBirA-ファージ)を梱包した子孫ファージミド-ファージと子孫ファージ(M13KE-Btag-ファージ)の両方は、ビオチニル化したBtag-g３p融合タンパク質を表示する一方、前者は、酵素の合成に対して遺伝子形成を含むであろう。実際問題として、アビジン-結合ビオチニル化pTVBirA-ファージ及びアビジン結合ビオチニル化M13KE-Btag-ファージを収集し、宿主細胞へ再度感染させるのに使用した(図3)。しかしながら、ビオチニル化pTVBirAファージと感染した宿主細胞だけが、アンピシリンで調整されたプレート上に残存することができた。なぜなら、pTVBirAファージ(M13KE-Btag-ファージ)のみがAmpr遺伝子を運搬するからである。この現象は、BPLの触媒活性に基づいた選別を可能とする。
【００７３】
＜ビオチン-タグ-ペプチド(Btag)の生体内でのビオチニル化の確認＞
上述したように、BPLの発現は、IPTGの添加によって制御することができる。しかしながら、ビオチニル化反応の最適化中に、当方は、BPLの高いレベルが、ファージ(基質コード化ファージゲノムの捕獲物を有する)及びファージミド-ファージ(BPLコード化ファージミドゲノムの捕獲物を有する)の両方のレベルを減少させたと理解した。この問題は、ビオチンの添加後にも生じる。すなわち、pTVlacZα含有細胞の培地へのビオチン自身の添加は、ファージ及びファージミド-ファージのレベルに影響を与えなかったが、ビオチンのpTVBirA含有細胞の培地へのビオチンの添加はファージ及びファージミドの両方のレベルを減少させて、ビオチニル化は宿主細胞に毒性効果を有することを示した(JBCwebサイトに補足データとして公開されている補足データ及び図６参照)。条件の最適化は、選別がIPTGの不存在下で、且つビオチンの存在なしに可能であることを明らかにした(LB培地の成分の市販の調製において上述のレベルで)。それゆえ、本研究において、ビオチニル化は、BPLの漏出レベルで、ビオチンの添加なしに市販のLB培地におけるビオチンレベルの存在下で行なわれた(補足図６参照)。
【００７４】
上述の条件の下で、ファージミド-ファージ上に表示されたBtagの生体内でのビオチニル化を確認するために、当方は、pTVBirA又はpTVlacZαを含む大腸菌BM4062F’細胞(又はpTVBirA 及びpTVlacZαを１：１又は1:10で含む大腸菌細胞の混合物)を、M13KE-Btagファージと感染させた(図3)。pTVBirAを含有する大腸菌の場合において、当方は、(BirA遺伝子を含む)ビオチニル化ファージミド-ファージ粒子及び(基質に対する遺伝子を含む)ビオチニルファージ粒子は、宿主細胞から分泌されるであろうと予期した(図3)。同様に、pTVlacZα含有宿主細胞の場合、(lacZα遺伝子を含む)ファージミド-ファージ粒子と(基質に対する遺伝子を含む)ファージ粒子の両方は、ビオチニル化なしに細胞から分泌される。それゆえ、当方はpTVBirA及びpTVlacZαを含む大腸菌の混合物の場合、4種の粒子(ビオチニル化ファージミド-ファージ、ビオチニル化ファージ、ビオチニル化なしのファージミド-ファージ、ビオチニル化なしのファージ)が分泌されるであろう(図3)。ファージ及びファージミド-ファージのタイターは、精製後、それぞれプラーク及びコロニーをカウントすることによって決定することができる。本分析において、当方は、30℃で16時間又は37℃で4.5時間インキュベーションした後、各分泌されたファージミド-ファージ及び分泌されたファージの混合物を精製した。
【００７５】
ビオチン-タグ（Btag）の生体内のビオチニル化の効率を確認するために、当方は、精製した各サンプル(106ファージミド-ファージ)を、10-7のKdでビオチンへ結合する固定化モノマーアビジンを運搬し、例えば、競争相手としてビオチン添加によって、ビオチニル化ファージの溶出を穏やかな条件下で可能とするSoftLink登録商標Soft Release Avidin Resinで、混合した(図４の工程４から５)。コントロールとして、バックグランド測定に対して、当方は、精製したサンプルの添加前に過剰のビオチンで樹脂を処理したので、ビオチニル化したファージですら樹脂に結合しないであろう(図４の黒い部分)。
【００７６】
ファージミド-ファージを含み、樹脂と結合する物質は、ビオチンの溶液によって溶出され(図３工程５)、溶出液は、感染用に大腸菌ER2738とファージミド-ファージによって混合し(図３工程６)、その後、細胞をアンピシリン及びテトラサイクリンを含むアガロース固定化LB培地上にプレートした。Ampr遺伝子を含むファージミドで感染した(Tetr遺伝子を運搬する)細胞は、このような培地で製造することができたので、各ファージミド-ファージの回復効率をコロニーをカウントすることによってモニターすることができる。当方の結果は、30℃又は37℃でpTVBirAファージで感染したER2738細胞のコロニーの形成率が、ｐTvlacZファージで感染させたER2738細胞のものより、６〜9倍高いことを明らかにした(図4)。
【００７７】
37℃で、17％のpTVBirA-ファージは、樹脂から回復する一方、図４において、陰のバーで示したpTVlacZαファージの2％だけが樹脂から回復した。PpTVlacZ
αファージ(2％)の単離効率は、過剰なビオチンを用いた樹脂の以前の処理後(図４の黒い部分)pTVlacZα-ファージの樹脂への非特異的結合効率よりより高かった。それゆえ、たとえ当方が(上述のように)宿主として大腸菌BM4062細胞を使用したとしてもいくつかのpTVlacZα-ファージは内因性BPLによってビオチニル化したようである。当方が、pTVBirAを含む大腸菌細胞と1:10の割合のpTVlacZ
αを含むものとを混合したとき、pTVlacZαのより高いレベルにもかかわらず、当方は、選別の最初の段階後pTVBirAを含む大腸菌細胞を選択的に回復ことができた。
【００７８】
当方の結果は、30℃及び37℃での培養中内因性突然変異体BPLによるビオチニル化の効率が非常に低いので、当方が予期したように、pTVBirA-ファージがpTVBirAから発現したBPLによって選択的にビオチニル化されたことを示した。
【００７９】
＜PpTVBirAゲノムをパッケージするファージミド-ファージ用の選択濃縮＞
上述したように、当方は、pTVBirAゲノムによってコードされたBPLによって基質の完全なビオチニル化を確認した。当方は、次に、酵素コードファージミドファージ用の当方の調製を高めることを試みた。各選別サイクルにおいて、当方は、樹脂に結合したファージミド-ファージを含むサンプルを回復した(図3における工程5)。このサンプルは、ファージミドーファージで細胞を再度感染させるために大腸菌ER2738と混合し、感染細胞は、アンピシリン及びテトラサイクリンを含むアガロース固定化LB倍地上にプレートした。Amrｒをコードするファージミドで感染させた（Tetr遺伝子を運搬する）細胞だけがこのようなプレート上に残存した。残存大腸菌細胞は、その後、次回の選別及びさらなる濃縮のためにファージと感染させた。
【００８０】
この研究において、pTVBirAゲノム及びpTVlacZαゲノムのライブラリーが実際に、本選別システムによってpTVBirAゲノム用に選択的に高めることができことを確認するために、当方は、上述したAmprプレート上に残存した大腸菌において、pTVBirA又はpTVlacZαファージミドが含まれるかどうか調べた(工程6)。この特別な場合において、当方は、コロン-PCRによってファージミド(ｐTVBirA又はpTVlacZα)を同定した(表1)。アビジンでの選別前に(工程4の前)、pTVBirAファージのpTVlacZαファージに対する割合を確認するために、当方は、どちらのファージミド、pTVBirA又はpTVlacZαが、各分泌されたファージミド-ファージのタイターを決定するために調製されたAmpｒプレート上で残存しているのかも調べた。
【００８１】
当方は、30℃及び37℃の両方でpTVBirAファージの濃度が、pTVBirA及びpTVBirAZαを1:1又は1:10含む大腸菌の混合物のプールから首尾よく2.5〜10倍増加したことを見出した(表1)。表1に示す結果の場合に、濃縮(2.5〜10倍)は一度だけ行なわれた。所望の酵素コードファージミドの濃度が低いとき、選別の反復は、所望のファージミドの単離を容易に可能とする。当方の実験では、当方は、内因性BPLの背景活性を完全に取り除くことができなかった。もしシステムが、大腸菌ゲノムによってコードされない酵素、例えばアセチラーゼ、ダイサー(Dicer)又はカスパーゼ等に基づくなら、酵素活性に基づく選別システムを改善することは可能であろう。
【００８２】
Btag-g8p融合タンパク質を表示するファージを使用して、基質のより高い濃度の存在下生体内での触媒活性に基づく酵素の選別用の別のシステム
【００８３】
当方は、十分高い濃度(g8pタンパク質の2700コピーがウイルス粒子のコアでDNAゲノムを含む一方、最初のシステムに使用したg3pの5コピーが粒子に付加された)で存在するBtag-g8p融合タンパク質上にビオチンが表示される別のシステムを構築した。Btag-g8pタンパク質の集合は、Btag-g3pタンパク質の集合より多くのビオチン分子を表示し、この第二モデルは、より弱い活性を有する酵素が選択されることを可能とするかもしれない。(g8pタンパク質の2700コピーあたり1つのビオチニル化は選別のために十分であるかもしれない)
Btag-g8p融合タンパク質(基質コードファージ)を発現するM13KEの誘導を使用したとき、図3に示すように、Btagペプチドはすべてのg8p分子上に表示された、それゆえ、ファージ粒子の組み立ては、ファージの表面に表示された近接Btagペプチド間の立体障害のため、不可能である。それゆえ、当方は、Btag付加g8pタンパク質(ファージミド由来)及びBtag無しのg8pタンパク質の両方を発現させて、それぞれのコードDNAの割合に依存する相対レベルを有するBtag付加及びBtag無しのg8pタンパク質の混合物を生じさせた(図5)。(ヘルパーファージから発現させた)g8pと(ファージミドから発現させた)Btag-g8pの両方は、子孫ファージミド-ファージの粒子に組み込まれるべきであり、Btagはg8pの2700コピーのいくつかの分画上に表示されるべきである。
【００８４】
当方は、酵素コードファージミド-ファージを濃縮することができるかどうか確認するために、当方は、（BPL(酵素)及びBtag(異質)の両方をコードする）pTVBirA-Btag-g8ファージミドを調製した。ネガティブコントロールとして、当方はBirA遺伝子を削除し、pTV-Btag-g8を構築した(図５工程1)。各ファージミドは大腸菌BM4062F’細胞の感染を可能にした。感染した大腸菌細胞は、１：１又は１：１０の割合で混合し、その後、M13K07ヘルパーファージは、大腸菌細胞の各混合物の感染を可能にした(工程2)。適当なインキュベーション後、途方は、4種類の粒子(ビオチニル化ファージミド-ファージ、ビオチニル化ファージ、ビオチニル化されていないファージミド-ファージ及び、ビオチニル化されていないファージ)が分泌されるだろうと予測した。ヘルパーファージゲノムと比較したとき、ファージミドゲノムがキャプシドの中へ優先的にパッケージされるので、非常に少ないビオチニル化ファージミド-ファージとビオチニル化されていないファージは4つの可能な生産物の中で分泌されるべきである。ファージ及びファージミド-ファージ粒子のタイターを、プラーク及びコロニーを、それぞれ以前に述べたように精製後に測定した。本分析において、当方は、37℃で6時間インキュベーション後、分泌されたファージミド-ファージ及び分泌されたファージの混合物を精製した。ｐTVBirA-Btag-g8ゲノムがpTVBirA-Btag-g8ゲノム及びpTV-Btag-g8ゲノムのライブラリーから当方の選別システムによって、選択的に濃縮されたかを確認するために、各精製されたサンプル(108〜1010ファージミド-ファージ)をSoftLink登録商標Soft Release Avidin Resinで混合した。この樹脂を、ビオチンの溶液で溶出し、溶出物をファージミド-ファージによる感染用に大腸菌ER2738と混合した。その後、感染した細胞は、アンピシリン及びテトラサイクリンを含むアガロース固定化LB培地上にプレートした。
【００８５】
当方は、ファージミド、すなわち、pTVBirA-Btag-g8 又はpTV-Btag-g8が、コロニーPCRによるAmprプレート(図5工程6)上に残存した大腸菌細胞においていずれが含まれるか調べた。アビジンによる選別前に(工程4の前)、pTVBirA-Btag-g8ファージのpTV-Btag-g8ファージへの割合を確認するために、当方は、また、ファージミド、すなわち、pTVBirA-Btag-g8又はpTV-Btag-g8のどちらが、アビジンによる選別前に各分泌されたファージミド-ファージのタイターの決定用に調製されたAmprプレートに残存している大腸菌細胞を含むかどうかを決定した。6時間37℃でインキュベーション後、pTVBirA-Btag-g8ファージを1:1〜1;10の割合でｐTVBirA-Btag-g8及びpTV-Btag-g8を含む大腸菌細胞の混合物から4.5〜12倍濃縮され、この方法の実行可能性を証明した。
【００８６】
この研究において、当方は、ファージディスプレイを使用する触媒活性に基づいた生体内の酵素の選別方法を開発した。当方の方法は、初期のファージディスプレイ法よりいくつかの利点を有する。(1)基質が大腸菌において酵素的な反応によって生産物に変えられるので、選択された酵素の性質が細胞内環境へ影響を与える。それゆえ、当方は細胞環境に安定な酵素を自動的に選択する。（２）酵素は、大腸菌において細胞からの分泌なしに発現され、反応を触媒するので、ファージの分泌に影響を与えるかもしれない酵素の大きさ及び性質は要因を限定しない。(3)リーダー配列(分泌に要求される)及びコートタンパク質のアミノ末端の両方(g3p又はg8p)にフレーム結合する必要性のために、一般に、M13は、ｃDNA発現用の有益な担体ではない。それゆえ、ｃDNAは、両方の末端で正しいリーディングフレームで挿入しなければならない(p=１/9)。この要求は、M13ｃDAライブラリーにおいて殆ど無視できる少量の生産コロニーを生ずる。しかしながら、当方の方法において、ｃDNAは、アミノ末端(p=3)でのみ正しいリーディングフレームに挿入されなければならない。なぜなら、酵素は、大腸菌において反応を唯一触媒しなければならないだけで、ファージの表面上に表示される必要はないからである。それゆえ、生産コロニーの数は、従来のファージディスプレイ法におけるものと比較して3倍より高い。
【００８７】
酵素の選別法を使用して、当方は、ペプチド基質への付加を触媒する酵素(リガーゼ)及びペプチドの切断を触媒する酵素(プロテアーゼ)、たとえば、アセチラーゼ、ホスファターゼ、ユビキチン化酵素、カスパターゼ等を選別することができる。ファージを使用したシャペロン及び基質配列の生体内の選別は、すでに報告されているが、本発明は、ファージディスプレイを使用して生体内で酵素を選別することができる最初の証明を提供する。当方のシステムは、シグナル形質導入のメカニズムを分析し、cDNAライブラリ-によってコードされる未知の酵素、及び人造の酵素を単離するのに有益である。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
医学、医薬、化学、生化学等の分野における人工酵素の開発、新規酵素の同定、未知酵素の分析及び生体内の酵素の細胞内ネットワーク特性の調査、等に本発明を適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを大腸菌に感染させた場合に得られる本発明のファージミドファージの一例を示す。図４中、訳は以下のとおりである。１．Introduction of phagemid into host cell:ファージミドの宿主細胞への導入、Enzyme-encoding phagemid: 酵素コード化ファージミド、biotin:ビオチン、substrate:基質、biotinylation:ビオチン化。２．Host infected with phage:ファージで感染させた宿主、substrate-displaying phage:基質ディスプレイファージ、Biotin tag peptide:ビオチンタクペプチド。３．Production of fusion phage: 融合ファージの生産、Biotihylated M13KE-Btag-phage:ビオチン化M13KE-Btag-ファージ、phagemid phage: ファージミドファージ。４．Binding to and selection on avidin resin:アジビンレジン上への結合、選別。Biotinylated pahgemid-phage:ビオチン化ファージミドファージ。５．Reinfection of host cells: 宿主細胞の再感染。
【図２】図２は、個々のファージミドファージの回復の効率を示す。結果は、2〜３回の個々の実験からの平均を示す。M13KE−Btag-ファージをPTVBirA,pTVlacZαを有する大腸菌BM4062F‘細胞、又HｐTbirAとpTVlacZαとを１：１又は１：１０の割合で有する大腸菌の混合物に感染させることができた。30℃で16時間又は37℃で4.5時間インキュベーション後、放出したファージ粒子を精製し、アビジン樹脂と結合させた。図中の訳は以下のとおりである。Recovery of pagemid-phage:ファージミドファージの回復。Selected phagemid-phage(-biotin):選択されたファージミドファージ（−ビオチン）。Background(+biotin):バックグランド(+ビオチン)。pTVBirA-phage: pTVBirA-ファージ、pTVlacZα-phage: pTVlacZα-ファージ、mizture:混合物。
【図３】図３は、タンパク質コード化ファージミドと、ヘルパーファージとを大腸菌に感染させた場合に得られる本発明のファージミドファージの一例を示す。１．Introduction of phagemid into host cell:ファージミドの宿主細胞への導入、Substrate-and enzyme-encoding gene: 基質-酵素コード化遺伝子。２．Infection of host by phage:ファージによる宿主の感染、Helper phage：ヘルパーファージ、ビオチン化。３．Production of fusion phage: 融合ファージの生産、phagemid phage: ファージミドファージ。４．Binding to and selection on avidin resin :アビジン樹脂への結合、当該樹脂上での選択、５．Recovery of bound phage :結合ファージの回復。６．Reinfection of host cells: 宿主細胞の再感染。ビオチニル化ファージミドファージ。
【図４】図４は、ファージディスプレイ法の一例を示す。図４中、訳は以下のとおりである。１．Introduction of phagemid into host cell:ファージミドの宿主細胞への導入、Enzyme-encoding gene: 酵素コード化遺伝子。２．Host infected with phage:ファージで感染させた宿主、Helper phage：ヘルパーファージ、Enzyme:酵素。３．Production of fusion phage: 融合ファージの生産、phagemid phage: ファージミドファージ、substrate:基質、product:生産。４．Selection of enzyme based on catalytic activity:触媒活性に基づく酵素の選択、Selected phagemid phage：選択されたファージミドファージ。５．Reinfection of host cells: 宿主細胞の再感染。
【図５】図５は、ファージディスプレイ法の一例を示す。図５中、訳は以下のとおりである。Enzyme-encoding gene: 酵素コード化遺伝子、Enzyme:酵素、caotyre;捕獲、resin:樹脂、suicide inhibitor or transition-state analog: 自殺阻害剤又は活性中間体アナログ（図５A）。Gene for binding motif: 結合モチーフ用遺伝子、binding motif:結合モチーフ、Substrate:基質、ligand:リガンド、catalysis:触媒、product:生産、capture:捕獲、Anti-product affinity ligand:抗生産物親和性リガンド（図５B）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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