(57)【要約】【課題】タンデム型質量分析計を用いて同位体化された試料を測定する方法における測定スループットの向上。【解決手段】本発明ではタンデム型質量分析計を用いた同位体ラベリング試料の分析技術において、１段階目の測定（ＭＳ１）スペクトルを測定セッション内でリアルタイムに解析して２段階目以降の解離・スペクトル測定（ＭＳ２）に用いるイオンを決定する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量の異なる同位体試薬によってラベリングされた複数の検体を含む試料を準備するステップ、該試料をクロマトグラフィーにより分離するステップ、分離された該試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計により質量分析するステップ、質量分析結果を実時間で解析するステップ、及び少なくとも１つの検体の解析結果を他の検体の質量分析に実時間で利用するステップを含むことを特徴とする質量分析方法。
【請求項２】
上記タンデム型質量分析計で測定した１段階目のスペクトル測定結果を情報処理装置によって実時間で解析し、その解析結果に基づいて実時間で２段階目又はそれ以降の測定で解離させるイオンを選定することを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項３】
ラベリングする上記同位体試薬は、分子量が異なり化学構造が同一の２つの同位体試薬であり、上記試料は上記同位体試薬によってラベリングされた２つの検体を混合したものであることを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項４】
上記２つの同位体試薬の分子量の差をΔｍとした時、１段階目の計測で得られたスペクトル中においてｎ×Δｍ／ｚ（ｚ：イオンの電荷、ｎ：正の整数）だけ離れたピークのペアを抽出し、抽出したピークのペアのスペクトル強度の相互関係に基づいて、２段階目以降に測定するピークを選択することを特徴とする請求項３に記載の質量分析方法。
【請求項５】
上記ピークのペアの抽出に際し、質量分析計の質量数測定誤差をδとしたとき、注目したピークのｍ／ｚの値から±δの範囲にある全てのピークと注目したピークの質量数から−ｎ×Δｍ／ｚ＋δ〜−ｎ×Δｍ／ｚ−δの範囲に存在するピークとをピークのペアとして扱うことを特徴とする請求項４に記載の質量分析方法。
【請求項６】
上記ピークのペア抽出において測定したスペクトルのうちｍ／ｚが最大のピークからペアの抽出を開始し、順次ｍ／ｚの低いピークのペアを抽出することを特徴とする請求項５に記載の質量分析方法。
【請求項７】
上記ピークのペアにおいて、質量数の高い同位体でラベリングされたピークの強度をＰ１、質量数の低い同位体でラベリングされたピークの強度をＰ２とし、ｒを測定者が設定した値としたとき、判定式Ｐ１／Ｐ２＞ｒもしくはＰ１／Ｐ２＜ｒを満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を２段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項４に記載の質量分析方法。
【請求項８】
注目した質量数の高い同位体でラベリングされたピークのｍ／ｚの値から±δの範囲にあるピークの強度全てを積算したものをＰ１とし、ピークとペアとなる質量数の低い同位体でラベリングされたピークのｍ／ｚの値から±δの範囲に存在するピークの強度全てを積算したものをＰ２とすることを特徴とする請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項９】
上記判定式がＰ１−Ｐ２＞ｒ２もしくはＰ１−Ｐ２＜ｒ２であり、ｒ２を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を２段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項１０】
上記判定式がＰ１×Ｐ２＞ｒ３もしくはＰ１×Ｐ２＜ｒ３であり、ｒ３を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を２段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項１１】
上記判定式がｒ４＞Ｐ１／Ｐ２＞ｒ５であり、ｒ４およびｒ５を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方もしくは両方を２段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項１２】
上記判定式を測定者が任意に設定し、この判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させることを特徴とする請求項７に記載の質量分析方法。
【請求項１３】
上記検体がタンパク質、タンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類及び核酸からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１４】
上記タンパク質、タンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類及び核酸からなる群から選ばれた１種以上を同位体ラベリングする際、該タンパク質及び／又はタンパク質を分解したペプチド及び／又は化学修飾されたペプチドに含まれるシステイン又はトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いることを特徴とする請求項１記載の質量分析方法。
【請求項１５】
上記同位体試薬が水素の同位体、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体からなる群から選ばれた少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の質量分析方法。
【請求項１６】
複数のラベリング試薬によってラベルされた複数の検体を含む試料を展開するクロマトグラフィー装置と、該クロマトグラフィー装置に接続され、試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、該試料を上記タンデム型質量分析計の分析領域に位置させる手段と、上記タンデム型質量分析計の分析結果を実時間で解析する情報処理装置と、上記クロマトグラフィー装置及びタンデム型質量分析計を制御する制御装置と、該制御装置に必要な情報を入力し及び／又は出力する入出力装置とを備えた質量分析システム。
【請求項１７】
更に、データベース検索のための情報処理装置およびネットワーク接続装置およびデータストレージのうちいずれかもしくは両者を備えたことを特徴とする請求項１６に記載の質量分析システム。
【請求項１８】
上記入出力装置は、データベースに記憶されている情報を引き出すことが可能に接続されていることを特徴とする請求項１６に記載の質量分析システム。
【請求項１９】
上記入出力装置は、少なくともクロマトグラフィー装置の展開時間と選択すべき質量分析データを表示するインターフェースを含むことを特徴とする請求項１６に記載の質量分析システム。
【請求項２０】
上記情報処理装置はネットワークサーバに接続されていることを特徴とする請求項１６記載の質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析方法及び質量分析システムに関し、特に質量分析計および質量分析スペクトルの解析システムに係わり、タンパク質、ポリペプチド、糖、核酸などの生体高分子を精度よくかつ高いスループットで同定・定量する質量分析方法及び質量分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析計（以下ＭＳと略記する）を用いたタンパク質の同定・定量法として近年注目されている技術に同位体ラベリングを用いる方法がある。この技術では二つの検体から試料をサンプリングし、一方には”重い”試薬を、もう一方には軽い”試薬”を結合させる。”重い”試薬と”軽い”試薬の化学構造は同一であるが、含まれる元素の質量数が異なるために分子量が相違している。
【０００３】
このようにして作成した分子量が異なる二つの試料を混合しＭＳで測定すると、二つの試薬の分子量の差（Δｍ）だけ離れたピークのペアが現れる。元の二つのタンパク試料が同じ検体に由来し、使用した試料の濃度と量が同一であればそれぞれの検体に由来する二つのピークはほぼ同じ強度となるはずである。しかし、もし二つの検体のうち一つが特定の病気の個体に由来する検体であり、もう一方が健康な個体に由来する検体である場合、ピーク強度の異なるピークのペアが現れることがある。
【０００４】
このようなピークを詳細に分析することにより、病気のマーカーとなっているタンパク質を特定することができる。また、病気に限らず様々なタンパク機能の解明に役立つと期待されている。
【０００５】
上記のような同位体ラベリングを用いる技術に関連して多くの公知例が存在する。代表的なものとして、特許文献１及び特許文献２が挙げられる。本公知例では同位体で標識された試薬を測定サンプルに添加し、多段解離・計測が可能なタンデム型ＭＳを使って分析する方法について述べられている。また、１段階目の測定（以下ＭＳ１と略記する）で検出したピーク対の強度比を用いて２段階目の測定（以下ＭＳ２と略記する）を実施してタンパク配列を決定する方法についても述べられている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１０７０６６号公報
【０００７】
【特許文献２】特許第３３４５４０１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来法における課題について以下に述べる。タンデム型ＭＳは１回の測定セッションで多段階の解離と計測を実施できる。通常、ＭＳ１で測定したピークの中から特にアミノ酸配列同定に必要なピークを選び出してＭＳ２を実施し、データベース検索によって測定したＭＳ２スペクトルに対応するアミノ酸配列を決定する。現在の測定装置では、前記“必要なピーク”の質量数が判明している場合、あらかじめ測定装置にＭＳ１で選定するピークを登録することができ、ＭＳ２までの解離と計測を自動的に１セッションで実施することができる。
【０００９】
しかし、前記“必要なピーク”の質量数が判明していない場合には一旦ＭＳ１を実施してＭＳ２測定するピークを選定した後、２セッション目の測定でＭＳ２スペクトルを取得する。通常、ＭＳの前段には液体クロマトグラフィー（以下ＬＣと略記）が設置され、ＬＣから流出した成分をＭＳの試料としている。ＬＣによる分離では測定したい成分が流出するまで場合によっては数時間オーダーの時間がかかり、また前記成分がＬＣカラムから流出している時間は１０秒〜２０秒程度でしかない。従って１０秒〜２０秒以内の時間でＭＳ１測定結果を解析し、ＭＳ２測定ピークを判定しない限り、再度時間のかかるＬＣによる分離を実施しなくてはならない。また測定したい成分が流出し始めた時刻と流出が終わりに近づいた時刻では流出成分の組成が異なる可能性があるため、できれば０．１〜１秒以内で測定ピークの選定をすることが望ましい。
【００１０】
しかし、従来法では上記のような短時間（１０秒〜２０秒）でＭＳ１スペクトルの解析とＭＳ２で測定すべきピークの選定をするシステムについては言及されていない。従って、従来法ではどの質量数で強度比の異なるピーク対が出現するか既知の試料に対しては最低１回の測定セッションでタンパクのアミノ酸配列を同定可能だが、未知の試料に対しては最低２回の測定セッションが必要となる。上記に述べたようにＬＣのスループットは一般的に遅い（数時間程度）ため、測定セッションの回数が増えると同定までのスループットが著しく低下する。今後、診断医療への応用等、迅速な同定・定量のニーズは増大すると考えられ、スループットの低下要因を排除する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以上の課題を解決するため、本発明は以下の解決手段を提供する。
【００１２】
まず、分子量の異なる試薬によってラベリングされた複数の検体を含む試料を準備するステップ、該試料をクロマトグラフィーにより分離するステップ、分離された該試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計により質量分析するステップ、質量分析結果を実時間で解析するステップ、及び少なくとも１つの検体の解析結果を他の検体の質量分析に実時間で利用するステップを含む質量分析方法が提供される。
【００１３】
さらに、複数のラベリング試薬によってラベルされた複数の検体を含む試料を展開するクロマトグラフィー装置と、該クロマトグラフィー装置に接続され、試料を多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、該試料を上記タンデム型質量分析計の分析領域に位置させ又は移動させる手段と、上記タンデム型質量分析計の分析結果を実時間で解析する情報処理装置と、上記クロマトグラフィー装置及びタンデム型質量分析計を制御する制御装置と、該制御装置に必要な情報を入力し及び／又は出力する入出力装置とを備えた質量分析システムが提供される。
【００１４】
上記において、クロマトグラフィー装置は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）のいずれでも良い。また、上記において、実時間でのデータ解析及びそれを反映した質量分析条件の変更、修正などは、データ処理との時間差が最長でも1秒以内、特に０．１秒以内に実行するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、タンデム型質量分析計を利用してスループットの高い生体高分子の同定・定量が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
まず、本発明を実施するための形態の概略について説明する。本発明により、分子量の異なる試薬によってそれぞれラベリングされた複数の検体を混合した試料をタンデム型質量分析計で測定するシステムであって、少なくとも多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計と、情報処理装置と、入出力装置を含む質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、同位体化した試料を迅速に同定・定量することが可能となる。
【００１７】
好ましくは上記解決手段において、多段解離計測が可能なタンデム型質量分析計で測定した１段階目のスペクトル測定結果を情報処理装置によって解析し、この解析結果に基づいてリアルタイムに２段階目以降の測定で解離させるイオンを選定する質量分析方法及びシステムが提供される。
【００１８】
通常のタンデム型ＭＳでは、試料を同定する上で必要なピークはＭＳ１測定で決定し、ＭＳ２もしくはそれ以降の解離・計測（ＭＳｎ，ｎ＞２）で得たスペクトルをもとに測定対象の構造を明らかにする。測定に必要なピークがあらかじめ判明している場合にはタンデム型ＭＳの機能により１セッションでＭＳ２（もしくはＭＳｎ、ｎ＞２）の計測が可能だが、判明していない場合にはＭＳ１スペクトルを解析した後、更にもう１回追加の測定セッションを実施する必要がある。一方、本発明では測定セッション中に実時間でＭＳ１スペクトル中の測定すべきピークを抽出してＭＳ２を実施する。これにより未知の試料であっても最低１回の測定セッションで試料の分析・同定・定量が可能となり測定スループットが大幅に向上する。
【００１９】
また、好ましくは上記解決手段において、分子量が異なり化学構造が同一の二つの同位体試薬を用い、その分子量が異なる同位体試薬によってそれぞれラベリングされた二つの検体を混合したものを試料とする質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、二つの同位体によりラベリングされた試料の比較・定量を迅速に実行できる。
【００２０】
また、好ましくは上記解決手段において、二つの同位体試薬の分子量の差をΔｍとした時、１段階目の計測で得られたスペクトル中においてｎ×Δｍ／ｚ（ｚ：イオンの電荷、ｎ：正の整数）だけ離れたピークのペアを抽出し、抽出したピークのペアのスペクトル強度の相互関係に基づいて、２段階目以降に測定するピークを選択する質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、ピークのペア選定を迅速に実施できる。
【００２１】
また、好ましくは上記解決手段において、ピークのペア抽出において、質量分析計の質量数測定誤差をδとしたとき、注目したピークのｍ／ｚの値から±δの範囲にある全てのピークと注目したピークのｍ／ｚの値から−ｎ×Δｍ／ｚ＋δ〜−ｎ×Δｍ／ｚ−δの範囲に存在するピークとをピークのペアとして扱う質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、質量分析計の質量分析誤差を考慮した分析が可能となる。
【００２２】
更に好ましくは上記におけるピークのペア抽出において、測定したスペクトルのうちｍ／ｚが最大のピークからペア抽出を開始し、順次ｍ／ｚの低いピークのペア抽出する質量分析システムが提供される。
【００２３】
また、好ましくは上記におけるピークのペアにおいて、質量数の高い同位体でラベリングされたピークの強度をＰ１、質量数の低い同位体でラベリングされたピークの強度をＰ２とし、ｒを測定者が設定した値としたとき、判定式Ｐ１／Ｐ２＞ｒもしくはＰ１／Ｐ２＜ｒを満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させる質量分析システムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて２段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
【００２４】
また、好ましくは、注目した質量数の高い同位体でラベリングされたピークのｍ／ｚの値から±δの範囲にあるピークの強度全てを積算したものをＰ１とし、ピークとペアとなる質量数の低い同位体でラベリングされたピークのｍ／ｚの値から±δの範囲に存在するピークの強度全てを積算したものをＰ２とする質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、ＭＳの質量分析誤差を考慮した分析が可能となる。
【００２５】
また、好ましくは上記における判定式がＰ１−Ｐ２＞ｒ２もしくはＰ１−Ｐ２＜ｒ２であり、ｒ２を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて２段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
【００２６】
また、好ましくは上記における判定式がＰ１×Ｐ２＞ｒ３もしくはＰ１×Ｐ２＜ｒ３であり、ｒ３を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて２段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
【００２７】
また、好ましくは上記における判定式がｒ４＜Ｐ１／Ｐ２＜ｒ５であり、ｒ４、ｒ５を測定者が設定した値としたとき、判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させる質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて２段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
【００２８】
また好ましくは判定式として測定者が任意の判定式を設定し、この判定式を満たすピークのペアのうち片方一つもしくは両方を２段階目以降の測定で解離させる質量分析システムが提供される。これにより、判定式による機械的なピーク判定が可能となり、情報処理機器を用いて２段階目以降で測定すべきピークを迅速に判定できる。
【００２９】
また、好ましくは測定対照とする検体がタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類または核酸である質量分析システムが提供される。これにより、一般的な生体高分子の同定・定量を高いスループットで実行できる。
【００３０】
また、好ましくは上記におけるタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドを同位体ラベリングする際、前記タンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドに含まれるシステインもしくはトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いる質量分析方法及びシステムが提供される。
【００３１】
これにより、存在量の低いアミノ酸残基に特異的に結合する試薬を用いることにより、スペクトル解析を容易化できスループットと同定精度を向上させることができる。また、好ましくは上記における同位体試薬が水素の同位体、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体あるいはこれらの組み合わせを含む質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、測定対象に応じて最適な同位体化試薬を選択することができる。
【００３２】
また好ましくは上記における質量分析システムの構成に、データベース検索のための情報処理装置およびネットワーク接続装置およびデータストレージのうちいずれかもしくは両者を加える質量分析方法及びシステムが提供される。これにより、データベース検索の高速化が実現し測定中にリアルタイムに測定対象の同定・定量化が可能となる。
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１
本発明にかかる質量分析システムの実施例について図１〜図５を用いて以下に説明する。図１に示す質量分析システムは試料導入系１０１、液体クロマトグラフィー装置（ＬＣ）１０２、タンデム型ＭＳ１０３、制御装置１０４、コンピュータ２０１、出力装置としてのディスプレイ装置２０２、入力装置としてのキーボード２０３、およびこれらを接続する信号線で構成される。本実施例で用いるタンデム型ＭＳ１０３はイオントラップ型の装置であり、イオン化方法はエレクトロスプレーイオン化を用いる。また、本実施例における使用条件では、タンデム型ＭＳ１０３の質量測定誤差δは約０．５Ｄａである。ここでＤａは原子量単位で、１Ｄａ＝１原子質量である。
【００３４】
本実施例の図１に示したシステムは図２のフローに従って動作する。以下、システムの動作について説明する。ここでは２つの検体Ａ，Ｂについてタンパク同定および定量を実施する。Ａ，Ｂそれぞれの検体は同じ種類の動物の同じ組織から抽出したものであり、濃度および量も同一とする。ただし、抽出した個体はＡ，Ｂ別のものであり、分析の目的は個体によるタンパクの発現量の違いと、そのタンパクの同定であるとする。
【００３５】
まず検体Ａ，Ｂを、それぞれ２つの同位体試薬ａおよびｂでラベリングする。ａ，ｂの化学構造は同一であるが、含まれる炭素の同位体（Ｃ１２およびＣ１３）の数が異なる。ａはＣ１３を８つ構造中に持ち、一方でｂはＣ１２しか持たないのでａはｂに比較して分子量が８だけ大きい。ａ，ｂの試薬はタンパク質中のシステイン残基にのみ結合する性質を持っている。
【００３６】
次に消化酵素によってＡ，Ｂの検体をそれぞれ分解する。分解して得られたＡ，Ｂの検体に由来する試料を等量混合し試料導入系１０１にセットする。試料導入系１０１の試料はＬＣ１０２によって分離されタンデム型ＭＳ１０３に導入される。ＬＣ１０２およびタンデム型ＭＳ１０３の動作は制御装置１０４によりコントロールされる。また制御装置１０４はコンピュータ２０１によりコントロールされる。コンピュータ２０１はあらかじめ測定者がキーボード２０３で入力した測定条件に従って制御装置１０４に指示を与える。また、コンピュータ２０１はＬＣ１０２およびタンデム型ＭＳ１０３で得られたＭＳ１スペクトルデータを記録する。
【００３７】
次に得られたＭＳ１スペクトルデータを解析し、検体ＡおよびＢに由来するピークペアの判定を実施する。システイン残基がＬＣ流出成分中のペプチドに含まれる場合にはｍ／ｚが８だけ離れた位置に二つのピークが出現するのでピークペアの判定が可能となる。また、ここでは測定対象としているペプチド中に１つだけシステイン残基が含まれる場合だけを想定しｎ＝１とする。
【００３８】
図３を用いてこれを説明する。図３は測定したＭＳ１スペクトルにおける検体Ａ由来のピークと検体Ｂ由来のピークを模式的に示した図である。図３のピークはスペクトル解析の結果全て１価のイオンに由来すること（ｚ＝１）が分かっている。また、図３のスペクトルにおける主要なピークは２１〜２５のピークであり、２１と２２および２４と２５のピークの間隔は８．２Ｄａおよび７．８Ｄａである。
【００３９】
ここで、タンデム型ＭＳ１０３の質量測定誤差δと試薬ａ，ｂの質量差Δｍを用いてコンピュータ２０１はスペクトルのペアリングを実行する。ペアリングの手順は一般的には図４に示したフローに従って実行する。以下図４のフローに従い、図３のスペクトルからピークペアを抽出する手順を説明する。ペアリングは測定者が特に指定しない限り、最も高いｍ／ｚのピークから実施する。図３の場合ではピーク２１がこれに相当する。
【００４０】
ピーク２１の質量数は１５１０．１であり、まず、ピーク２１から−δの範囲にあるピーク、すなわち１５０９．６〜１５１０．１までのｍ／ｚを検索し、全てピーク２１に属するピークとして記録する。また、ピーク２１に属するピークの強度を全て積算し、ピーク２１のＰ１の値として記憶する。次にペアとなるピークを見つけるため１５１０．１−ｎ×Δｍ／ｚ―δ〜１５１０．１−ｎ×Δｍ／ｚ＋δの領域を探索する。
【００４１】
ここで、ｎ＝１、Δｍ＝８、δ＝０．５またｚ＝１なので、１５０１．６〜１５０２．６の質量範囲を探索することになる。図３ではピーク２２がこの条件に該当し２１と２２のピークがペアとして登録される。また、ピーク２２に属するピークの強度を全て積算しピーク２２のＰ２として記憶する。さらにｍ／ｚの低い領域に探索を広げていくとピーク２３が検出される。ピーク２３付近にはペアリングできるピークが存在しないので、ピーク２３はペアリングせず、更にｍ／ｚの低い領域に探索を進める。次に検出されるピークはピーク２４である（ｍ／ｚ＝１１４６．６）。
【００４２】
ここで、ピーク２４のｍ／ｚ±δの領域にあるピークをまとめてピーク２４に属するものとする。また、ピーク２１と同様にピーク２４に属するピーク全ての強度を積算しピーク２４のＰ１として記憶する。次に１１４６．６―ｎ×Δｍ／ｚ−δ〜１１４６．６−ｎ×Δｍ／ｚ＋δの領域を探索する。これにより新たに２５のピークが検出され、２４と２５のピークがペアとして登録される。また、ピーク２５に属するピーク全ての強度を積算しピーク２５のＰ２として記録する。ピーク２５より更に低いｍ／ｚの領域にピークが存在する場合には上記の探索を続行する。本実施例ではピーク２５より低いｍ／ｚのピークは存在しないのでここまでで探索を終了する。探索終了までにピークのペアが検出されなかった場合にはＭＳ２スペクトルの測定を実施せず、次のＬＣ流出成分が流出してから再びその流出成分についてＭＳ１スペクトルの取得を実行する。
【００４３】
上記までの操作はバックグランドノイズの影響を回避するため、あらかじめ閾値を設けて閾値以下の強度のピークに関してはピークペアの探索から除外するなどの処置が望ましい。
【００４４】
次に、ペアリングされたピークについて、Ａ由来のピークの強度Ｐ１、Ｂ由来のピークの強度Ｐ２の関係から測定すべきＭＳ１のピークを選択する。ここでは判定式としてＰ１／Ｐ２＜ｒを採用し、判定値ｒ＝０．７とする。この判定式が成り立つかどうか全てのピークペアに対して判定を実施する。本実施例ではピーク２１と２２のペアについてはＰ１／Ｐ２＝１．１となり判定式を満たさないがピーク２４とピーク２５はＰ１／Ｐ２＝０．６となり判定式を満たす。そこでピーク２４とピーク２５をＭＳ２で測定すべきピーク（以下選定ピークと呼ぶ）としてｍ／ｚの値を記憶する。選定ピークが複数存在する場合は選定ピークすべてのｍ／ｚを記憶しておく。ここで、ＭＳ１測定結果が得られてから選定ピークを決定するまでの時間は一般的に用いられているパーソナルコンピュータを使用した場合でも０．１秒以下である。
【００４５】
次に選定ピークについてＭＳ２測定を実施する。選定ピークは一つのペアにつき２つ存在するのでどちらか一方もしくは両方を選んでＭＳ２測定を実施する。本実施例では軽い同位体でラベリングした方、ピーク２５だけを選んでＭＳ２測定を実施する。
【００４６】
測定したＭＳ２スペクトル情報はコンピュータ２０１に内蔵したマススペクトルデータベースを検索し適合するアミノ酸配列を抽出する。検索結果およびその他のデータはコンピュータ２０１のハードディスクに蓄積されると同時にコンピュータ２０１のディスプレイ装置２０２上に表示される。ディスプレイ装置２０２に表示される情報の例を図５に示す。図５の例では次の情報が表示されている。
（１）ＭＳで測定したピークのＬＣリテンションタイム。
（２）選定したＭＳ１のｍ／ｚの値。
（３）選定したＭＳ１のＰ１／Ｐ２の値。
（４）データベースサーチの結果：候補アミノ酸配列をランキング順に表示。
（５）上記（４）の候補アミノ酸配列を含むタンパク質の名前。
【００４７】
その他、ディスプレイ装置２０２上には測定条件、データベースの検索条件などを測定者の操作によって随時表示させることができる。
【００４８】
データベース検索には数分〜数時間の時間がかかる場合もあるため、上記のデータベース検索は測定と並行して実行され、検索を待って次の測定を実施することはない。タンデム型ＭＳ１０３では選定ピーク全て（測定者が指定した場合には選定ピークの一部）についてＭＳ２測定を実行した後、次のＬＣ流出成分が流出するのを待って再びＭＳ１スペクトルの測定を実行する。
【００４９】
以上までの本実施例により、検体ＡおよびＢに含まれるタンパク質のうち特に個体間の発現量が異なるものを特定することができる。また、本実施例によれば１セッションの測定でＭＳ１、ＭＳ２測定、データベース検索まで実施できるためスループットの高いタンパク同定・定量が可能となる。
【００５０】
実施例２
本発明にかかる質量分析システムの実施例について図６を用いて説明する。図６のシステムは上記実施例１のシステムにクラスター型計算機２０４、データストレージ２０５およびネットワークサーバ２０６を接続したものである。
【００５１】
図６のシステムの基本的な動作は図１のシステムと同様であるが、以下の点が異なっている。まず、測定されたＭＳ２スペクトルデータをコンピュータ２０１本体ではなくクラスター型計算機２０４によって処理する。また、データベースはコンピュータ２０１の内蔵品ではなくより容量が大きく高速なデータストレージ２０５に蓄積されたデータベースを使用する。また、ネットワークサーバ２０６によって外部ネットワーク上のデータベース利用を可能とする。
【００５２】
本実施例のようなシステムを用いることにより、高速なデータベース検索が可能となり、ＭＳ２測定からアミノ酸配列決定までの時間を大幅に短縮できる。クラスター型計算機２０４の計算能力が十分な場合、ほぼＭＳ２スペクトル測定とほぼ同時（実時間、リアルタイム）に配列の決定が可能となる。
【００５３】
実施例３
実施例１では判定式としてＰ１／Ｐ２＜ｒを用いたが、以下のような判定式を用いてもよい。
（１）Ｐ１／Ｐ２＞ｒ
（２）Ｐ１−Ｐ２＞ｒ２またはＰ１−Ｐ２＜ｒ２
（３）Ｐ１×Ｐ２＞ｒ３またはＰ１×Ｐ２＜ｒ３
（４）ｒ４＞Ｐ１／Ｐ２＞ｒ５
上記（１）はＰ１＞Ｐ２となることが明らかな場合に用いる。また（２）はスペクトル強度の差に意味がある場合、例えばＰ１−Ｐ２の値が投薬量に関係している場合などに用いる。また（３）はスペクトル強度の積に意味がある場合に用いる。また、（４）は二つの検体Ａ、Ｂに含まれるタンパク質が実際に同じタンパク質起源のピークであるかどうか確認する場合に用いる。
【００５４】
以上のような判定式を用いた場合においても実施例１と同様に１回の測定セッションでスループットの高い配列同定・定量が可能である。また、上記判定式の組み合わせを用いても同様の効果を奏する。
実施例４
上記実施例における判定式を複数組み合わせ、あるいは任意の判定式を設定する方法について以下に説明する。本実施例では測定を開始する以前、もしくは測定を開始してＭＳ１が実行される以前に図１におけるコンピュータ２０１、ディスプレイ装置２０２、キーボード２０３を用いて判定式の条件を設定する。判定式の設定を指定すると、ディスプレイ装置２０２には図７に示したような入力画面が表示される。入力画面にはチェックボックス５１、判定式５２、判定値入力フィールド５３、ＡＮＤ／ＯＲ設定フィールド５４、任意判定式入力フィールド５９が用意されている。
【００５５】
以下、本インターフェースを用いて判定式を設定する方法について以下に説明する。測定者は設定したい判定式のチェックボックスにチェックを入れる。また判定値を判定値入力フィールドに入力する。複数の判定式を用いる場合にはＡＮＤ／ＯＲ設定フィールドで判定式が同時に成り立つ条件を設定する場合にはＡＮＤを、どちらかが成り立つ条件を設定する場合にはＯＲを選択する。また任意の判定式を使いたい場合には判定式入力フィールドに式を入力する。入力が終了したら決定ボタンを押すことで判定式の設定ができる。判定式の間に矛盾が生じる場合には警告が表示されるので再度判定式を設定する。
【００５６】
以上のように本実施例により複数の判定式を組み合わせたり、自由に判定式を設定することができる。また、これらの判定式を使って上記実施例と同様にスループットの高い同定・定量を実施することができる。
【００５７】
実施例５
上記実施例における検体Ａ、Ｂがタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチド、糖類または核酸いずれかであってもよい。検体Ａ、Ｂが糖類である場合には特定の単糖に特異的に結合する同位体試薬を用いる。また、核酸の場合には特定の塩基もしくは塩基配列に対して特異的に結合する同位体試薬を用いる。
【００５８】
上記実施例と同様に、本実施例により、測定試料が一般的な生体高分子であっても１回の測定セッションでスループットの高い構造同定、定量が可能となる。
【００５９】
実施例６
上記実施例におけるタンパク質、あるいはタンパク質を分解したペプチド、化学修飾されたペプチドに対して、アミノ配列中に含まれるトリプトファンに特異的に結合する同位体試薬を用いてもよい。トリプトファンは生体起源のタンパク質に含まれる頻度が最も低い（存在比１．１８％、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅによる）のでスペクトル解析が単純となる利点がある。
【００６０】
図８，図９を用いてこれを説明する。図８は存在量の高いアミノ酸残基に結合する同位体試薬を用いた場合に得られるＭＳ１スペクトルの例である。図８で測定したペプチド鎖には複数の同位体試薬が結合したアミノ酸残基を持っている。このため、実施例１のようにペアとなるピークが１つではなく複数現れる。図８においてピーク８１、８２、８３および９１、９２、９３は実施例１における検体Ａに由来するもの、ピーク８４およびピーク９４は検体Ｂに由来するものである。
【００６１】
図８のスペクトル解析を実施するには実施例１におけるｎの値を３としてピークペアを抽出する必要がある。更にピーク群８１〜８４とピーク群９１〜９４が重なる場合（図９）にはスペクトル解析が非常に困難になる。十分に反応性の高い試薬を用いれば、ピークは複数ではなく１つになる可能性もあるが、検体Ａに由来するピークと検体Ｂに由来するピークの間のｍ／ｚの値が離れるので複数のピーク群が重なる可能性は高くなる。一方、トリプトファンは生体タンパク中の存在比が最も低いアミノ酸残基であるため、１つのペプチド中に複数の同位体化試薬が結合する可能性が低い。
【００６２】
このため、スペクトル解析が単純となり解析スループットが高く、高精度なタンパク同定・定量化が可能となる。同様にシステインも生体タンパク中の存在比がトリプトファンに次いで低い（システインの存在比１．６％、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｄａｔａｂａｓｅによる）ため上記の効果が期待できる。以上のように本実施例によればスペクトル解析を単純化しスループットおよび精度の高い同定・定量が可能となる。
【００６３】
実施例７
上記実施例で用いた一般的な同位体試薬では炭素もしくは水素の同位体を含む試薬を使うが、酸素の同位体、炭素の同位体、窒素の同位体、リンの同位体あるいはこれらの組み合わせを含む試薬であっても上記実施例と同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の第1実施例に係る質量分析システムの構成を示す概略図。
【図２】本発明の実施例において実施されるに質量分析方法のフロー図。
【図３】本発明の実施例によるＭＳ１の質量分析スペクトル図。
【図４】本発明の実施例に係る質量分析システムのスペクトルのペアリング手順を示すフロー図。
【図５】本発明の実施例に係る質量分析システムにおけるディスプレイ表示の例。
【図６】本発明の他の実施例に係る質量分析システムの構成を示す概略図。
【図７】本発明の実施例に係わる質量分析システムの判定式選定のためのディスプレイ表示例。
【図８】本発明の実施例に係る質量分析スペクトルを示し、スペクトル群が重ならない場合を示す図。
【図９】本発明の実施例に係る質量分析スペクトルを示し、スペクトル群が重なる場合を示す図。
【符号の説明】
【００６５】
１０１…試料導入系、１０２…ＬＣ、１０３…タンデム型ＭＳ、１０４…制御装置、２０１…コンピュータ、２０２…ディスプレイ装置、２０３…キーボード、２０４…クラスター型計算機、２０５…データストレージ、２０６…ネットワークサーバ、２１〜２５…質量分析スペクトル中のピーク、５１…チェックボックス、５２…判定式、５６…判定値入力フィールド、５４…ＡＮＤ／ＯＲ設定フィールド、５９…任意判定式入力フィールド、
８１〜８４…質量分析スペクトルのピーク、９１〜９４…質量分析スペクトルのピーク。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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