(57)【要約】【課題】  くも膜下出血病変の検出及び診断に用いる、くも膜下出血病変を特異的に検出可能なくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー及びくも膜下出血診断用遺伝子マーカー、該くも膜下出血診断用ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該くも膜下出血診断用遺伝子の発現を検出するプローブ、更には該マーカーを用いたくも膜下出血病変の検出及び診断方法を提供すること。【解決手段】  配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、又は２３に示されるアミノ酸配列のポリペプチド、及び、その遺伝子を、くも膜下出血病変を特異的に検出することが可能なくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー及びくも膜下出血診断用遺伝子マーカーとして用いる。本発明は、該くも膜下出血診断用ポリペプチドマーカーを検出するための抗体、及び、該くも膜下出血診断用遺伝子マーカーを検出するためのＤＮＡプローブ等を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、又は２３に示されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列を有するヒトくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるヒトくも膜下出血診断用遺伝子マーカー。
【請求項３】
塩基配列が、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４に示されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項２記載のヒトくも膜下出血診断用遺伝子マーカー。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項５】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体。
【請求項７】
請求項２又は３記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項８】
請求項３記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項７記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ。
【請求項９】
請求項７又は８記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とするヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれか記載の抗体を用いて、被検試料におけるヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１１】
ヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現の検出を、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法、又はＳＥＲＥＸ法を用いて行うことを特徴とする請求項１０記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項１２】
被験体からの血清を、請求項１記載のヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドと反応させ、被験体における血清抗体の発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１３】
請求項７又は８記載の診断用プローブを用いて、被検細胞におけるヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１４】
ヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１５】
ヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項９記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１４のいずれか記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１７】
定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項１６記載の動脈硬化の検出及び診断方法。
【請求項１８】
被検細胞における遺伝子を、所定のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を請求項７又は８記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法。
【請求項１９】
請求項７又は８記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した請求項９記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び請求項４〜６のいずれか記載の抗体の少なくても一つ以上を装備してなるヒトくも膜下出血病変の検出及び診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトくも膜下出血病変の検出及び診断に関し、特に、ヒトくも膜下出血病変を特異的に検出及び診断するのに用いるヒトくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー及びヒトくも膜下出血診断用遺伝子マーカー、更には該マーカーを用いたヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
くも膜下出血の病変は、クモ膜下腔に出血する病徴であり、その原因は脳動脈瘤破裂によるものが最大の原因となっている。動脈瘤は動脈が内圧に対する抵抗性を減じて瘤状に拡張した状態であり、その原因は、動脈瘤一般には、（１）動脈硬化、（２）外傷、（３）非特異性動脈炎、（４）特発性嚢状中膜壊死、（５）梅毒、（６）細菌感染、（７）狭窄後拡張などが挙げられる。近年は、動脈硬化に起因するものが多いと報告されている。くも膜下出血の病変の症状は、クモ膜下腔に広がった血液による髄膜刺激症状及び脳圧亢進症状が前景となり、前者では頂部硬直、Ｋｅｒｎｉｇ徴候、Ｂｒｕｄｚｉｎｓｋｉ徴候などの髄膜刺激症状が出、後者では、頭痛、吐気、咽吐、更には眼底出血などが出現する。破裂脳動脈瘤による出血では、意識障害が出現する。脳動脈瘤の発生には、疫学的調査により、比較的強い遺伝的背景があることが知られている（Neurosurgery, 46(6)1301-1306,2000）。
【０００３】
脳動脈瘤の診断は、従来実用的には、血液・生化学的診断法は採用されておらず、ＭＲＩやＣＴｓｃａｎなどの放射線学的診断方法が行われている。
【０００４】
最近、脳動脈瘤の診断に関連して、いくつかの生化学的診断法が開示されている。例えば、ヒト・エラスチン遺伝子のイントロンの部分の遺伝子多型を同定することにより、脳動脈瘤の発症のリスクの存在を判定するもの（特開２００２−２３８５７７号公報）、Ｎａ+−ＨＣＯ3-共輸送体タンパク質の抗体を用いて脳梗塞やクモ膜下出血等の脳障害の診断を行うもの（特開２０００−２３６８８５号公報、ＷＯ００／３７６３７）、体液試料中のヒト脳型プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）の濃度を指標としてクモ膜下出血等の頭蓋内出血を検出するもの（ＷＯ９８／４９５９９）、クレアチンキナーゼアイソザイムＢＢを測定し、血管障害性疾患の検出を行うもの（ＷＯ９８／４０７４９）、ヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体やその活性フラグメントを用いて、動脈瘤のような血管障害性疾患の診断を行うもの（ＷＯ９７／２９７８４）等が開示されている。
【０００５】
このように、クモ膜下出血の病変の診断に関する生化学的検査については、最近いくつかの方法が開示されているが、それらの検出は必ずしも脳動脈瘤のようなクモ膜下出血の病変に特異的な検出及び診断方法とは言えず、従って、動脈硬化の病変の特異的診断のためには、該病変を特異的に検出できるマーカーの更なる開発が要望されている。
【特許文献１】特開２００２−２３８５７７号公報。
【特許文献２】特開２０００−２３６８８５号公報。
【特許文献３】ＷＯ００／３７６３７。
【特許文献４】ＷＯ９８／４９５９９。
【特許文献５】ＷＯ９８／４０７４９。
【特許文献６】ＷＯ９７／２９７８４。
【非特許文献１】Neurosurgery, 46(6)1301-1306,2000。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、クモ膜下出血病変の検出及び診断に用いる、クモ膜下出血病変を特異的に検出可能なクモ膜下出血診断用ポリペプチドマーカー及びクモ膜下出血診断用遺伝子マーカー、該クモ膜下出血診断用ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該クモ膜下出血診断用遺伝子の発現を検出するプローブ、更には該マーカーを用いたクモ膜下出血病変の検出及び診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、クモ膜下出血病変を特異的に検出することが可能な脳動脈瘤の発症を検出して、クモ膜下出血の診断を可能とする診断用マーカーを見い出すべく、脳動脈瘤患者の血清中に発現するタンパク質について、探索を行った結果、脳動脈瘤患者血清から得られたｃＤＮＡを大腸菌に導入し発現させたタンパク質の中から、多くの患者血清と陽性反応を示す１２クローンを選抜し、該クローンが脳動脈瘤の発症を検出して、クモ膜下出血の診断を可能とする診断用マーカーとなることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明は、本発明のクモ膜下出血診断用ポリペプチドマーカー、該ポリペプチドマーカーを検出するための、該ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を含むものである。本発明のクモ膜下出血診断用ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、３、５、７、９，１１、１３、１５、１７，１９、２１、及び２３に示される。
【０００８】
すなわち、本発明のクモ膜下出血診断用ポリペプチドは、以下の遺伝子がコードするポリペプチドからなる。
（１）脳動脈瘤マーカー−１（配列表の配列番号１）
クローン名：３Ａ１
Accession No.：NM#015874
遺伝子名：H-2K binding factor-2
遺伝子の説明：MHC class I 遺伝子のNFκB siteに結合する転写因子。
文献：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (14), 8490-8495, 2003
（２）脳動脈瘤マーカー−２（配列表の配列番号３）
クローン名：６Ｔ１
Accession No.：XM#039236
遺伝子名：molecule interacting with Rab13
遺伝子の説明：calponin  domainを有しRab13に関係すると思われるタンパク質であるが機能の詳細は不明である。
文献：未刊行
（３）脳動脈瘤マーカー−３（配列表の配列番号５）
クローン名：１１Ｃ１
Accession No.：NM#004446
遺伝子名：Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase
文献：Genomics 19 (2), 280-290, 1994
（４）脳動脈瘤マーカー−４（配列表の配列番号７）
クローン名：１１Ｄ１
Accession No.：NM#002337
遺伝子名：Low density lipoprotein-related protein-associated protein 1
遺伝子の説明：ＬＤＬレセプターの安定化に寄与。細胞内シグナル伝達に関係するとの報告がある。
文献：J. Biol. Chem. 278 (20), 17986-17992, 2003
（５）脳動脈瘤マーカー−５（配列表の配列番号９）
クローン名：１１１２
Accession No.: NM#014497
遺伝子名：NP220 nuclear protein
遺伝子の説明:核内タンパク質のひとつ。2本鎖DNAに結合し転写の制御に関係する。
文献：J. Cell. Biochem. 84 (3), 556-566, 2002
（６）脳動脈瘤マーカー−６（配列表の配列番号１１）
クローン名：１１Ｐ１
Accession No.: BC014861
遺伝子名：Actin, beta
遺伝子の説明:細胞骨格構成タンパク質。
文献：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903, 2002
（７）脳動脈瘤マーカー−７（配列表の配列番号１３）
クローン名：１４Ｃ１
Accession No.: NM#003563
遺伝子名：Speckle-type POZ protein
遺伝子の説明:自己抗原性を有するタンパク質。POZ domainを有しDNAまたはアクチン結合性をもちタンパク質相互作用を調節する。
文献：FEBS Lett. 418 (1-2), 23-25, 1997
（８）脳動脈瘤マーカー−８（配列表の配列番号１５）
クローン名14Ｎ
Accession No.: BC004544.
遺伝子名：hypothetical protein BC004544
遺伝子の説明:機能不明。
文献：Submitted (14-MAR-2001) National Institutes of Health Mammalian Institute
（９）脳動脈瘤マーカー−９（配列表の配列番号１７）
クローン名：１６Ａ
Accession No.: NM#014832.
遺伝子名：TBC1 domain family, member 4
遺伝子の説明:機能不明。
文献：Genomics 79 (2), 154-161, 2002
（１０）脳動脈瘤マーカー−１０（配列表の配列番号１９）
クローン名：１７Ｌ
Accession No.: BC043617
遺伝子名：ＤＮＡ(cytosine-5-)-methyltransferase 3 alpha
遺伝子の説明:胚発達の過程で必要なＤＮＡメチル化を行う
文献：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26), 16899-16903, 2002
（１１）脳動脈瘤マーカー−１１（配列表の配列番号２１）
クローン名：４１Ｄ３
Accession No.: NM#005531
遺伝子名：interferon, gamma-inducible protein 16
遺伝子の説明:ミエロイドの分化に関与すると推定される他のインターフェロンγ誘導タンパク質と２００残基を共有する。
文献：Oncogene 22 (31), 4831-4840, 2003
（１２）脳動脈瘤マーカー−１２（配列表の配列番号２３）
クローン名：４４Ｑ２
Accession No.: NM#001810
遺伝子名：centromere protein B, 80kDa
遺伝子の説明: 細胞周期の中間期、分裂期の核においてセントロメア構造物を集める機能を持つタンパク質。抗セントロメア抗体患者の自己抗原として知られる。
動脈硬化病変マーカー
文献：Mol. Cell. Biol. 22 (7), 2229-2241, 2002
更に、本発明は、本発明のくも膜下出血診断用ポリペプチドをコードする塩基配列からなるくも膜下出血診断用遺伝子マーカー、該塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用プローブを含むものである。本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４に示される。
【０００９】
また、本発明は、本発明のくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー及びくも膜下出血診断用遺伝子マーカーを利用した脳動脈瘤の発症に起因するくも膜下出血病変の検出及び診断方法、及び該検出及び診断方法に用いるキット等を含むものである。
【００１０】
本発明において、発明を完成するに至った経緯について説明すると、本発明者は、くも膜下出血病変を特異的に検出することが可能なくも膜下出血診断用マーカーを見い出すべく、病院、及び協力施設に入院したくも膜下出血病変罹患患者の血清を本人、または家族の了解を得てスクリーニングを行った。得られたｃＤＮＡクローンはプラスミドpBlueScriptIIに組み込みシークエンス。その後プラ
スミドpGEXに組み替え大腸菌に導入し、ＩＰＴＧを加えてタンパク質を大量発現させタンパク質抽出液を調製した。それを用いて多数の患者血清との反応をウェスタン法により調べた。その結果、本発明のマーカーである１２クローンが複数の脳動脈瘤患者血清と陽性反応を示し脳動脈瘤罹患、若しくは脳動脈瘤破裂予測のマーカーとして有用であることを見い出した。そして、これらのクローンの抗原性や遺伝子のプローブを利用し、くも膜下出血病変の検出及び診断方法を開発し、更には該検出及び診断方法に用いる遺伝子及びプロテインアレイでの診断キットの作製を可能とした。
【００１１】
すなわち具体的には本発明は、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、又は２３に示されるアミノ酸配列、又はその部分アミノ酸配列を有するヒトくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカー（請求項１）や、請求項１記載のポリペプチドをコードする塩基配列からなるヒトくも膜下出血診断用遺伝子マーカー（請求項２）や、塩基配列が、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４に示されるＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項２記載のヒトくも膜下出血診断用遺伝子マーカー（請求項３）や、請求項１記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項４）や、抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体（請求項５）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項４記載の抗体（請求項６）や、請求項２又は３記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項７）や、請求項３記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなる請求項７記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ（請求項８）や、請求項７又は８記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とするヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項９）からなる。
【００１２】
また本発明は、請求項４〜６のいずれか記載の抗体を用いて、被検試料におけるヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１０）や、ヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現の検出を、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、プロテインアレイ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法、又はＳＥＲＥＸ法を用いて行うことを特徴とする請求項１０記載の動脈硬化の検出及び診断方法（請求項１１）や、被験体からの血清を、請求項１記載のヒトくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドと反応させ、被験体における血清抗体の発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１２）や、請求項７又は８記載の診断用プローブを用いて、被検細胞におけるヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現を検出することを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１３）や、ヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出を、ノーザンブロッティング法を用いて行うことを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１４）や、ヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出を、請求項９記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１５）や、請求項１３〜１４のいずれか記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子の発現の検出が、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用を含んでいることを特徴とするヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１６）や、定量的又は半定量的ＰＣＲの使用が、ＲＴ−ＰＣＲ法であることを特徴とする請求項１６記載の動脈硬化の検出及び診断方法（請求項１７）や、被検細胞における遺伝子を、所定のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を請求項７又は８記載の動脈硬化マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出することを特徴とする請求項１３記載のヒトくも膜下出血病変の検出及び診断方法（請求項１８）や、請求項７又は８記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定した請求項９記載のヒトくも膜下出血マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び請求項４〜６のいずれか記載の抗体の少なくても一つ以上を装備してなるヒトくも膜下出血病変の検出及び診断用キット（請求項１９）からなる。
【発明の効果】
【００１３】
くも膜下出血病変動脈硬化の病変の診断は、従来から、ＭＲＩやＣＴｓｃａｎなどの放射線学的診断方法が行われているが、くも膜下出血の病変の診断を早期発見に繋げるためには、生化学的検査による方法が重要である。本発明のポリペプチドマーカーや遺伝子マーカーを利用することにより、くも膜下出血の病変の特異的な検出診断が可能となり、くも膜下出血の病変の早期発見に繋げることが可能となる。また、本発明のポリペプチドマーカーや遺伝子マーカーの検出のために、本発明のマーカーポリペプチドに結合する抗体や本発明のマーカー遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブ等をチップやアレイの形で用意することにより、簡便な操作でくも膜下出血の病変の検出及び診断を行うことが可能となり、くも膜下出血の早期発見に大きく貢献することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、くも膜下出血の病変で特異的に発現する、くも膜下出血診断用マーカーポリペプチド又はくも膜下出血診断用マーカー遺伝子の発現を検出して、くも膜下出血の病変の検出及び診断を行うことよりなる。本発明において、くも膜下出血診断用のポリペプチドマーカーとなるポリペプチドは、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。また、本発明においてくも膜下出血診断用遺伝子マーカーとなる遺伝子は、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４に示される塩基配列を有する遺伝子である。
【００１５】
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、及び２３に示されるポリペプチドは、前記脳動脈瘤マーカー１〜１２に示されるようにいずれも公知のポリペプチドである。また、その遺伝子も公知の遺伝子である。該本発明の動脈瘤の検出による、くも膜下出血診断用マーカーポリペプチド及びマーカー遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データーベースにおいて、アクセッションナンバー：ＮＭ＿０１５８７４、XＭ＿０３９２３６、ＮＭ＿００４４４６、ＮＭ＿００２３３７、ＮＭ＿０１４４９７、BC０１４８６１、ＮＭ＿００３５６３、ＢＣ００４５４４、ＮＭ＿０１４８３２、ＢＣ０４３６１７、ＮＭ＿００５５３１、及び、ＮＭ＿００１８１０としてアプローチすることができる。
【００１６】
本発明において、本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子の発現を検出するには公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、本発明の遺伝子マーカーにより、くも膜下出血の病変を検出、識別するために、本発明のくも膜下出血診断用遺伝子マーカーのＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を有するプローブを用いることができる。該プローブを用いてくも膜下出血の病変を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、配列表に示した遺伝子マーカーのＤＮＡ配列から適宜の長さのＤＮＡプローブを作製し、適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを被検体とハイブリダイズすることにより、くも膜下出血のマーカー遺伝子の発現の検出を行う。該ＤＮＡプローブとしては、配列表に示した本発明の遺伝子マーカーの塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用プローブを用いることができる。また、該プローブを、少なくとも１つ以上を固定化させたマーカー遺伝子検出用のマイクロアレイ又はＤＮＡチップの形で用いることもできる。
【００１７】
なお、上記ＤＮＡプローブの作製に際して、本発明の塩基配列において、「くも膜下出血診断用マーカー遺伝子のＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１８】
本発明において、本発明のくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカーの検出を行うには、該ポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて行うことができる。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドマーカーを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体を用いて、被検試料におけるくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。該免疫学的測定法としては、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、放射線免疫検定法、蛍光抗体法を挙げることができる。また、組換え発現クローニングによる血清学的抗原同定法であるＳＥＲＥＸ（Serological iderecombinant expression cloning）法を用いることもできる。
【００１９】
本発明においては、本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用プローブ及び／又は本発明のくも膜下出血診断用マーカーポリペプチド検出用抗体及び／又は本発明のくも膜下出血診断用マーカー抗体検出用抗原ポリペプチドを用いて、被検試料におけるくも膜下出血診断用マーカー遺伝子及び／又はくも膜下出血診断用マーカーポリペプチド及び／又はくも膜下出血診断用マーカー抗体の発現を検出し、くも膜下出血の病変を診断することができる。被検細胞におけるくも膜下出血診断用マーカー遺伝子の検出に際しては、被検試料における遺伝子を増幅するために、定量的又は半定量的ＰＣＲを用いることができる。該ＰＣＲとしてはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。該ＰＣＲを行うに際しては、本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子を増幅するためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーからなるプライマーを用いる。該プライマーの構築は、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４に示される塩基配列に基づいて適宜行うことができる。
【００２０】
本発明において、くも膜下出血の病変の検出及び診断を行うには、被検試料の細胞における遺伝子を、上記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの少なくとも１対以上のプライマーを用いて増幅し、増幅した遺伝子を本発明のくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用プローブを用いて検出する。
【００２１】
本発明の抗体を用いて蛍光抗体法を用いて、被検試料細胞におけるくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドの発現を検出し、可視的にくも膜下出血の病変の検出を行うことができる。蛍光抗体法によりくも膜下出血診断用マーカーポリペプチドを発現試料細胞を標識化するには、本発明のくも膜下出血診断用ポリペプチドマーカーに特異的に結合する抗体を蛍光標識し、これを抗原を発現している試料細胞に結合させて、くも膜下出血診断用ポリペプチドマーカーを発現する細胞を標識化する（直接蛍光抗体法）か、或いは、抗原を発現している細胞に、未標識の本発明の特異抗体を結合させた後に、標識化した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）を結合させてくも膜下出血診断用ポリペプチドを標識化し（間接蛍光抗体法）、該標識化したくも膜下出血診断用ポリペプチドを発現する細胞を検出し、診断を行う。
【００２２】
本発明のくも膜下出血病変の検出及び診断に用いるくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用プローブ、該プローブを固定したくも膜下出血診断用マーカー遺伝子検出用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ、及び本発明のくも膜下出血診断用マーカーポリペプチド検出用の抗体は、それらを装備したくも膜下出血病変の検出及び診断用キットとして製品化しておくことができる。
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
［実験手順−ＳＥＲＥＸ法、ウェスタン法、ＥＬＩＳＡ法］
（試料の調製）
（１）病院および研究協力施設を受診した頚動脈狭窄症患者を対象とし、外来受診者の中から性別・年齢（±5歳）を一致させた，正常被験者をコントロールとして選択した。外来受診時又は脳神経外科入院時に，１）研究目的や研究協力の任意性などを家族に説明しインフォームド・コンセントを得た上で，２）家族歴・既往歴・飲酒や喫煙難などのライフスタイル，作業態様に関する問診を行い，３）採血を行って血清と血球成分を分離凍結保存する。さらに，４）医師の診療録を基に，臨床的重症度，治療経過，血液検査所見などを記載する。解析対象の患者血液は血清分離後マイナス８０度にて研究開始まで凍結保存されたものを使用する。
（２）血清によるスクリーニング対象はヒト臍帯静脈内皮(ＨＵＶＥＣ)由来ｃＤＮＡライブラリーを組み込んだ市販λＺＡＰ  IIファージベクター(STRATAGENE)を用いる。
【００２５】
（ＳＥＲＥＸ法実験手順）
（３）ＳＥＲＥＸ法によるスクリーニングはSahinらの方法に準じて実施する。
１）上記（２）のファージベクターを大腸菌（XL1-Blue）に感染させ、φ１５ｃｍＮＺＹ寒天プレート培地上で培養する。
２）プラークが出現したのを確認後、ＩＰＴＧ（isopropyl thiogalactoside）処理したニトロセルロース膜を培地上にのせ膜にファージ由来タンパク質を発現、転写させる。
３）０．５％ＢＳＡで２０００倍希釈した患者血清と膜と一夜インキュベートし発現タンパク質と血清中抗体を反応させる。
４）洗浄後２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を膜と反応させる。
５）発色試薬としてＮＢＴ、ＢＣＩＰを使い血清ＩｇＧ認識クローンを同定する。
６）陽性クローンは２、３次スクリーニング（φ１０ｃｍプレート）を行い、偽陽性クローンを排除する。
７）選択されたファージをExAssist helper phage system(Stratagene, La Jolla, CA)によりpBlueScriptにクローニングする。
８）Rapid plasmid miniprep system(Marigen)を用いプラスミドを精製する。
９）塩基配列決定は外部委託もしくはDNA Sequencing kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems)を使用しＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００   DNA Analyzer (Applied Biosystems)により実施する。得られた塩基配列を公開されているデータベース上の塩基配列と照合し得られえたクローンの相同性検索を行う。この時点で読み枠の違ったクローンを除外し残ったものを抗原タンパク質候補としタンパク質精製の過程へと進める。
【００２６】
（ＥＬＩＳＡ法実験手順）
（４）２次スクリーニングとしてのＥＬＩＳＡ法の準備
１）抗原タンパク候補のインサートを含むpBlueScriptをタンパク質発現、精製用ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham Bioscience）への組み替えを行う。得られた塩基配列情報よりpBlueScriptよりｐＧＥＸへの組み換えに適した制限酵素、ｐＧＥＸプラスミド（4T1-3）を選択し制限酵素処理を行う。
２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動後目的のバンドを精製キットGeneElute Minus EtBr Spin Columns(ＳＩＧＭＡ)を用い切り出し，制限酵素処理されたインサートおよびｐＧＥＸを回収する。
３）Ligation kit ver.2（Takara）を用いインサートとｐＧＥＸをライゲーションしインサートを含むプラスミドを作製する。
４）クローンにより適当な制限酵素が存在しない場合にはＰＣＲ法によりインサートを作製する。あらかじめ制限酵素認識部位を持つプライマーを外注により作製し動脈瘤組織より抽出したＲＮＡを鋳型に逆転写ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを作製、さらにＰＣＲを行い全長のインサートを得る。以下は同様に制限酵素、ライゲーションキットを用いたライゲーションを行う
５）真核細胞タンパク質発現用に改良された大腸菌コンピテントセルＢＬ２１(DE3) RIL codon plus(STRATAGENE)に得られたｐＧＥＸを形質転換する
６）アンピシリン入りＬＢ培地で培養、ＩＰＴＧでインサートＤＮＡ由来タンパク質の発現を誘導する。
７）大腸菌を遠心分離回収し超音波破砕、可溶画分と不溶画分に分離する
８）目的タンパク質が不溶画分に入る場合は尿素を用い可溶化を行う
９）得られた可溶タンパク質を、GSTrapFF（Amersham Bioscience）を用いＧＳＴ融合タンパク質のみを精製する
１０）カラムよりのタンパク質の抽出はトロンビン切断により行う。
【００２７】
（ウェスタン法実験手順）
（５）ウェスタン法による２次スクリーニング
１）上記で得られた形質転換されたＢＬ２１(DE3) RIL codon plusをＬＢアンピシリン２ｍｌで１夜培養する。
２）ＬＢアンピシリン２０ｍｌに移し変え１時間培養後ＩＰＴＧ終濃度１ｍＭとなるように加えたものとコントロールをさらに３時間培養する。
３）培養液を遠心後、大腸菌を回収しサンプルバッファーにて溶解、ウェスタン法のサンプルとする。
４）１２％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを電気泳動後、平板転写装置でニトロセルロース膜にタンパク質を転写する。
５）１％スキムミルクでブロッキング後、５０００倍患者血清を1次抗体として加え、１夜インキュベートする。
６）ＴＢＳＴで洗浄後、１万倍希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加え２０分間反応させる
７）ＴＢＳＴで洗浄後、発色試薬Immunostar (WAKO)を使い発色させる。
８）フィルムに感光させる。
９）コントロールに無くＩＰＴＧ誘導に存在するバンドを陽性バンドとする。
【００２８】
（ＥＬＩＳＡ法実験手順）
（６）ELISA法による２次スクリーニング
１）ＳＥＲＥＸ法にて得られた精製タンパク質をＥＬＩＳＡ法の固相とする。９６穴ＥＬＩＳＡプレートに５０μｇ/ｍｌの濃度の精製タンパク質を入れ一晩４℃で保存、固相化させる。
２）前述のタンパク質精製によりクローンあたり５ｍｇの精製タンパク質の採取を目標とする。
３）ＰＢＳ洗浄、０．５％スキムミルクでブロッキング後患者血清、および対照血清を５０００倍希釈し固相化したタンパク質と反応させる。
４）ＰＢＳ洗浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加える
５）基質を加え発色させプレートリーダーにてＯＤを測定する
６）各タンパク質、血清とも３回の実験を行い、平均を血清抗体値とする。
【００２９】
［ウェスタンブロット法によるペプチドマーカーの検出］
病院、及び協力施設に入院した脳動脈瘤罹患患者の血清を本人、または家族の了解を得てスクリーニングに用いた。得られたｃＤＮＡクローンはプラスミドpBlueScriptIIに組み込みシークエンス。その後プラスミドpGEXに組み替え大腸菌に導入し、ＩＰＴＧを加えてタンパク質を大量発現させタンパク質抽出液を調製した。それを用いて多数の患者血清との反応をウェスタン法により調べた。
【００３０】
ウェスタン法による解析には、λＺＡＰIIをベクターとするヒト臍帯静脈内皮細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを使用した。組み込まれたｃＤＮＡをＩＰＴＧ処理より発現させ、脳動脈瘤罹患患者に存在する抗体と反応するものを単離した。単離したｃＤＮＡクローンについてさらにpGEXプラスミドに組み替えタンパク質の大量発現を行った後、脳動脈瘤罹患患者の反応をウェスタン法により解析し、陽性反応を示すクローンを選択した。
【００３１】
ウエスタン法により検出したクローンのブロッティングの写真を図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び、図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄに示す。
［ＳＥＲＥＸ法によるペプチドマーカー遺伝子の確認］
検出したクローンの遺伝子の配列決定をＳＥＲＥＸ法を用いて行った。得られたＤＮＡ配列を、公開されている遺伝子データーベース上の塩基配列と照合した結果、得られたクローンの遺伝子は、それぞれ前記脳動脈瘤マーカー１〜１２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と一致した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】１ａ〜１ｄは、本発明の実施例において、検出した動脈硬化診断用のポリペプチドの発現をウェスタン法により検出した、クローンの脳動脈瘤マーカーのブロッティングの写真である。
【図２】２ａ〜２ｄは、本発明の実施例において、検出した動脈硬化診断用のポリペプチドの発現をウェスタン法により検出した、クローンの脳動脈瘤マーカー１〜４のブロッティングの写真である。
【図３】３ａ〜３ｄは、本発明の実施例において、検出した動脈硬化診断用のポリペプチドの発現をウェスタン法により検出した、クローンの脳動脈瘤マーカー５〜８のブロッティングの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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