(57)【要約】【課題】組織工学や細胞工学などの分野において、特に細胞と基板材料との相互作用の精密な解析を可能とする基板材料の表面近傍の簡便な観察を実現する。【構成】底部の開口２の内周縁にフランジ２’を有し、フランジ２’に試料基板３を載置してボルト６をねじ込んでパッキン及び筒状パーツ１６を介してクランプして固定することで、試料基板３を底壁とした容器部７を形成可能とし、上記試料基板３の表面に付与された試料の観察が可能とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
底部開口内周縁にフランジを有し、該フランジに試料基板を載置して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とし、上記基板の表面に付与された試料の観察が可能な構成であることを特徴とする試料基板ホルダ。
【請求項２】
下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、
上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置して上部パーツを下部パーツに対して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とする試料基板ホルダ。
【請求項３】
下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、
上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置し、パッキン及び筒部材を介して上記上部パーツを下部パーツに固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能としたことを特徴とする試料基板ホルダ。
【請求項４】
試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を培養し、観察し、又は培養及び観察をすることを特徴とする試料基板ホルダの利用方法。
【請求項５】
試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を下方から観察することを特徴とする試料基板ホルダの利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料基板ホルダに関し、特に試料を付与する試料基板の表面近傍を観察に適した試料基板ホルダ及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、固−液界面近傍の観察は、液量が少ない場合には、試料基板材料の表面に液滴を落とし、それを背面から観察することで行われている。また、細胞と基板材料との接着状態を観察するような場合は、十分な液量を長期にわたって保持する必要があり、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられている（特許文献１、２、３参照）。
【０００３】
従来、次のような構成のものが利用されている。
１）細胞と基板材料との相互作用を制御する場合、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられている。例えば、温度応答性高分子で全面被覆した基材表面で細胞を培養し、温度変化によって培養細胞を剥離回収する構成は知られている（特許文献１参照）。又、温度応答性分子でパターン状に被覆した基材表面で細胞を培養し、温度制御によって複数種の細胞パターンに沿って共培養する構成が知られている（特許文献２参照）。
【０００４】
２）平板状の基板にスピンコートや均一なプラズマ照射を含む様々な表面処理を施した構成が用いられている。例えば、温度応答性ポリマーの支持体への被覆方法として、電子線照射、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応、混練する構成が知られている（特許文献３参照）。
【０００５】
３）スライドガラスなどの表面に接着あるいは粘着によって仕切りを張り合わせ、平板状の基板表面を容器部（容器）の底壁（底面）とするキュベットが利用化されている（特許文献４、５参照）。
【特許文献１】特公平０６−１０４０６１号公報
【特許文献２】特開平４−９４６７９号公報
【特許文献３】特開２００３−３８１７０号公報
【特許文献４】特開平６−１１３８１５号公報
【特許文献５】特開２００２−１２５６５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞と基板材料との相互作用などを観察する場合、底面に表面処理を施した培養ディッシュなどが用いられているが、底面はディッシュと一体になっており、表面処理の手法は限られてしまう。
【０００７】
一方、平板状の基板は、スピンコートや均一なプラズマ照射を含む様々な表面処理法に適応可能であるが、そのままの状態で固−液界面を観察するには、必要量の試料液体をその上に安定に保持することは困難である。
【０００８】
スライドガラスなどの表面に接着あるいは粘着によって仕切りを張り合わせ、平板状の基板表面を容器底面とするキュベットが既に実用化されているが、あくまでアッセイを簡便に行うことを目的としたもので、材料表面に対する接着あるいは粘着による張り合わせでは、様々な表面処理に適用することは難しい。
【０００９】
近年、組織工学や細胞工学などの分野において、特に細胞と基板材料との相互作用の精密な解析は重要な課題であり、基板材料の表面近傍の簡便な観察を実現する装置が、こうした分野の研究現場から強く求められている。本発明は、上記従来の問題を解決する新規な試料基板ホルダを実現することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、平板状基板をそれが容器部の底壁となるようクランプ固定し、必要量の試料液体を内部に安定に保持できる試料基板ホルダを設計製作、これを用いて基板材料−試料液体界面近傍を簡便に観察しうることを見いだし、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１１】
具体的には、本発明は上記課題を解決するために、底部開口内周縁にフランジを有し、該フランジに試料基板を載置して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とし、上記基板の表面に付与された試料の観察が可能な構成であることを特徴とする試料基板ホルダを提供する。
【００１２】
さらに、本発明は上記課題を解決するために、下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置して上部パーツを下部パーツに対して固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能とする試料基板ホルダを提供する。
【００１３】
さらに、本発明は上記課題を解決するために、下部パーツと上部パーツを備え、試料基板を取り付け取り外し自在に装着することが可能な試料基板ホルダであって、上記下部パーツの底部開口内周縁に試料基板を載置することが可能なフランジが形成されており、該フランジに上記試料基板を載置し、パッキン及び筒部材を介して上記上部パーツを下部パーツに固定することで、該試料基板を底壁とした１又は２以上の容器部を形成可能としたことを特徴とする請求項１記載の試料基板ホルダ。
【００１４】
さらに、本発明は上記課題を解決するために、試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を培養し、観察し、又は培養及び観察をすることを特徴とする試料基板ホルダの利用方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は上記課題を解決するために、試料である細胞を付与した基板を試料基板ホルダの下部に底壁として固定し、該細胞を下方から観察することを特徴とする試料基板ホルダの利用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る試料基板ホルダよると、あらゆる表面処理を施した試料基板表面と試料液体の界面近傍を簡便に観察することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明に係る基板ホルダを実施するための最良の形態を実施例に基づいて図面を参照して、以下説明する。
【実施例１】
【００１８】
本発明に係る試料基板ホルダ１は、図１（ｂ）に示すような容器部７を有する。試料基板３を、それが容器部７の底壁となるようにクランプで固定する構造を有し、容器部７の内部で試料基板３上に必要量の試料液体を安定に保持しつつ、試料基板３と試料液体の界面近傍を簡便に観察することを可能にするものである。
【００１９】
試料基板ホルダ１は、図１（ａ）に示すように、その下部パーツ１’に開口２を有する。この開口２の内周縁に沿ってフランジ２’が形成されている。試料基板３を、フランジ２’上に載置して試料基板ホルダ１の底部にはめ込み、開口２を封止する底壁とすることができる。
【００２０】
さらに、試料基板３の上からパッキン４を介して筒状パーツ５、上部パーツ６の順に載せ、下部パーツ１’と上部パーツ６をボルト６’をねじ込んでクランプ（締め込み）し、筒状パーツ５をパッキン４を介して試料基板３に押しつけて固定できる。これにより、試料基板３を底壁とし、筒状パーツ５およびパッキン４を内壁とする容器部７が構成される。
【００２１】
試料基板ホルダ１の全体形状および開口２の形状は、一般的な培養ディッシュと同様に円状であってもよく、また顕微鏡の観察ステージへの固定が便利なように矩形状であってもよい。
【００２２】
さらに、パッキン４、筒状パーツ５、上部パーツ６の一部または全部は一体化されていてもよく、下部パーツ１’と上部パーツ６のクランプ（締め込み）による固定は、ねじ、バネ、挟み込み、接着、引圧、磁力など何によってもよい。
【００２３】
また、本発明に係る試料基板ホルダ１は、試料基板３を取り付けることにより、図２ａに示すように、一般的な培養ディッシュと同様１つの容器部８を形成する構成であってもよく、また、図２ｂに示すように、プレートリーダなどによる解析に便利なように多数の容器部９を形成する構成であってもよい。
【００２４】
本発明の試料基板ホルダ１に固定される試料基板３は、ガラス、プラスチック、無機結晶など様々な材質のものが使用可能であり、培養前に容器部８を形成する際に、クランプ固定されるため、キャスト法、スピンコート法、化学修飾、表面グラフト重合、ＣＶＤ、プラズマ照射、ラビングなど、材料表面に施される処理を選ばない。
【００２５】
上部パーツ６及び下部パーツ１’の試料基板ホルダ１を構成する材料としては、金属、ガラス、セラミクス、樹脂が使用可能であり、その材料によって様々な有機溶剤や酸・アルカリ溶液、細胞培養培地を試料液体に用いること、試料基板ホルダ１全体にオートクレーブ、紫外線照射、オゾン処理といった滅菌処理を施すことも可能である。
【００２６】
図３は、本発明の実施例の変形例であり、表面が平滑な試料基板１０を光導波用プリズム１１と一体に組み合わせることにより、界面のごく近傍のみにおける情報を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を含む全反射減衰（ＡＴＲ）法を用いて検出することも可能とする構成である。
【００２７】
（作用）
以上の構成から成る本発明に係る試料基板ホルダ１の作用を以下に説明する。具体的には、試料基板ホルダ１を利用した細胞の培養法および観察法について説明する。
【００２８】
まず、本発明の試料基板ホルダ１に任意の表面処理を施した試料基板３を、それが容器部７の底壁となるよう固定、これを細胞培養のための容器とする。この容器に上に述べた必要な滅菌処理を施し、培地とともに培養する細胞を容器部７内に播種する。
【００２９】
播種された細胞は試料基板３の表面上で培養され、細胞が基板３の表面と相互作用する様子は、任意のタイミングで倒立型の光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型レーザー顕微鏡などを用いて、上方又は下方から観察することができる。
【００３０】
なお、図３に示す変形例では、表面が平滑な試料基板１０を光導波用プリズム１１と一体に組み合わせることにより、界面のごく近傍のみにおける情報を全反射減衰ATR法を用いて検出することも可能である。
【００３１】
光導波用プリズム１１に導かれたプローブ光１２が、試料基板ホルダ１の容器部に満たされた試料液体１３と試料基板１０の界面で全反射する際に、界面から数１０〜数１００ｎｍの範囲に近接場光が発生する。それが近接場光が発生している領域に存在する物体によって散乱され、上方及び下方のいずれか一方又は両方から検出器１３（例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、走査型レーザー顕微鏡等）によって検出される。
【００３２】
（実験例）
さらに、本発明に係る試料基板ホルダ１８を利用した実験例を図４を参照して説明する。ステンレス製の矩形下部パーツ１４および上部パーツ１５、パイレックス（登録商標）ガラス製の筒状パーツ１６を製作し、テフロン（登録商標）製のＯリングをパッキン１７とし、光応答性材料で表面処理を施したガラス基板を試料基板１８として内部で細胞培養が可能な容器部１９を構成した。このような試料基板ホルダ１８を６セット用意した。
【００３３】
組上がった試料基板ホルダ１をオートクレーブで滅菌したのち、培地・血清とともに足場依存性細胞をそれぞれの容器部１９内部に播種、ポリメチルペンテン製のふた２０でふたをして、容器部１９内で培養した。
【００３４】
それらにおいて、試料基板１８が試料基板ホルダ１に完全に固定されていること、下部パーツ１４が矩形で顕微鏡ステージに一意的に固定されることにより、適時、容器部１９から取り出された各試料基板ホルダ１について、試料基板１８上の特定の視野をその都度、位置再現性が良く顕微鏡で観察することができた。
【００３５】
以上、本発明に係る試料基板ホルダ１を実施例に基づいて説明したが、本発明はこのような実施例に限定されることなく、特許請求の範囲記載の技術的事項の範囲内で、いろいろな実施の形態があることは言うまでもない
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明に係る試料基板ホルダは以上の構成であるから、細胞と基板材料との相互作用の精密な解析のために基板材料の表面近傍の簡便な観察技術が望まれている組織工学や細胞工学などの分野において、特に適している。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る実施例を説明する図であり、（ａ）は分解図であり、（ｂ）は組立てられた試料基板ホルダである。
【図２】本発明に係る実施例を説明する図であり、（ａ）は一つの容器部を有し、（ｂ）は複数の容器部を有する試料基板ホルダである。
【図３】本発明に係る実施例の変形例を説明する図である。
【図４】本発明に係る実験例を説明する図である。
【符号の説明】
【００３８】
１  試料基板ホルダ         
１’  下部パーツ           
３  試料基板               
７、８、９、１９  容器部   
２  下部パーツの開口       
２’  開口のフランジ       
１０  試料基板             
１１  光導波用プリズム       
１２  プローブ光           
１３  試料液体             
１４  矩形下部パーツ       
１５  上部パーツ           
１６  筒状パーツ           
１７  パッキン             
１８  試料基板ホルダ       
２０  ふた                 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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