(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
減圧状態にある鏡体内で用いられる走査型電子顕微鏡像観察用の試料支持部材であって、
絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体を備え、前記絶縁性薄膜側が電子線入射面であり、前記導電性薄膜側が試料付着面で且つ前記走査型電子顕微鏡像の形成に寄与する透過２次電子の出射面である、走査型電子顕微鏡像観察用の試料支持部材。
【請求項２】
前記絶縁性薄膜の厚みが１０ｎｍ〜２００ｎｍである、請求項１に記載の試料支持部材。
【請求項３】
前記絶縁性薄膜の電気抵抗率が１０００Ωｍ以上である、請求項１又は２に記載の試料支持部材。
【請求項４】
前記絶縁性薄膜は、窒化シリコン、酸化シリコン、ポリイミドの何れかを主成分とする材料からなる、請求項２又は３に記載の試料支持部材。
【請求項５】
前記導電性薄膜の厚みが２００ｎｍ以下である、請求項１乃至４の何れか１項に記載の試料支持部材。
【請求項６】
前記導電性薄膜は、ニッケル、チタン、アルミ、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とする材料からなる、請求項５に記載の試料支持部材。
【請求項７】
前記導電性薄膜の試料付着面は親水性化処理が施されている、請求項１乃至６の何れか１項に記載の試料支持部材。
【請求項８】
前記導電性薄膜の試料付着面に試料吸着層が設けられている、請求項１乃至６の何れか１項に記載の試料支持部材。
【請求項９】
前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体の試料付着面に対向して設けられた耐圧性薄膜が該耐圧性薄膜と前記積層体との間に間隔を有するように配置されており、前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体および前記耐圧性薄膜は何れも１気圧以上の耐圧性を有し、前記積層体と前記耐圧性薄膜の間の空間を大気圧封止可能とされている、請求項１乃至８の何れか１項に記載の試料支持部材。
【請求項１０】
前記導電性薄膜には該導電性薄膜の電位制御のための電極が設けられている、請求項１乃至９の何れか１項に記載の試料支持部材。
【請求項１１】
請求項９に記載の試料支持部材を備えた試料ホルダであって、外部入力を受けて前記電極に電圧を印加する端子を備えている、走査型電子顕微鏡像観察用の試料ホルダ。
【請求項１２】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の試料支持部材を備えた試料ホルダであって、電子線入射面側および電子線出射面側の少なくとも一方に視野絞りが設けられている、走査型電子顕微鏡像観察用の試料ホルダ。
【請求項１３】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の試料支持部材を用いた走査型電子顕微鏡像の観察方法であって、
入射電子線の加速電圧を入射電子の６０％以上が前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体により散乱、吸収、若しくは遮蔽される値に設定する、走査型電子顕微鏡像の観察方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の試料ホルダを用いた走査型電子顕微鏡像の観察方法であって、
前記端子の電位を走査型電子顕微鏡のグランド電位若しくは該グランド電位よりも高い電位として像観察を行う、走査型電子顕微鏡像の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査電子顕微鏡像の観察技術に関し、特に、照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料の電子顕微鏡像を高分解能で観察するに好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、無機材料系試料や有機材料系試料の形態観察はもとより生物試料の観察にも広く用いられ、バクテリアやウィルスといった肉眼では観察不能な微生物の観察に好適な機器である。
【０００３】
しかし、このような生物試料は電子線の照射により損傷を受けやすいことに加え、高いコントラストの画像を得にくいという問題がある。このため、生物試料をＳＥＭ観察する場合、一般には、観察対象である試料をホルムアルデヒド等で固定化して金やプラチナあるいはカーボン等を表面にコーティングしたり重金属等で染色するなどの手法により前処理を行い、これにより、試料への電子線ダメージを軽減するとともにコントラストを高めるという工夫がなされる。
【０００４】
また、最近では、生物試料に対して上述のコーティングや染色を施すことなく高コントラストの画像を得る手法も開発されている（特許文献１および非特許文献１を参照）。この方法では、薄い試料支持膜（カーボン膜）の下面（裏面）に観察対象試料を付着させ、試料支持膜の上面（表面）から比較的低い電圧で加速された電子線を照射する。試料支持膜に入射した電子線は支持膜内部で拡散しながら広がり、支持膜の下面付近に到達した電子が２次電子を放出する。この２次電子は支持膜下面に付着している観察対象試料に吸収され、これによりコントラストが形成される。
【０００５】
このような２次電子のエネルギは１０ｅＶ程度と極めて低く、生物試料に吸収されても殆どダメージを与えることがないだけではなく、この電子線の吸収の度合いがそのままコントラストとして得られるために極めてクリアで高コントラストなＳＥＭ画像を得ることができる。このような観察条件は、「間接２次電子コントラスト条件」と呼ばれる。
【０００６】
また、電子線を金属薄膜に入射させ、金属薄膜から放出されるＸ線を観察対象試料に照射してＸ線画像を得る構成のＸ線顕微鏡も提案されている（特許文献２および３）。このようなＸ線顕微鏡では、観察対象試料に照射されるＸ線の透過力が大きいために、試料の内部構造を観察できるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-097844号公報
【特許文献２】特開平8-43600号公報
【特許文献３】特開2010−175389号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】T.Ogura「A high contrast method of unstained biological samples under a thin carbon film by scanning electron microscopy」Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377, p79-84 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来は、電子線照射により損傷を受けやすく且つ高いコントラストの画像を得にくい生物試料をＳＥＭ観察する場合、表面コーティングや染色の処理を行っていた。しかし、このような処理には熟練が必要であるのみならず、染色に用いられる薬剤は主として酢酸ウラン等の有害物質であるため環境面からも好ましくない。
【００１０】
また、間接２次電子コントラスト条件で観察されたＳＥＭ画像は極めてコントラストが高いものの、分解能は比較的低いという問題がある。加えて、さらに、通常条件で加速された低エネルギの２次電子では、観察試料の内部を透過することができず、内部構造観察には適さない。
【００１１】
さらに、金属薄膜に電子線を入射させて発生するＸ線を観察対象試料に照射する構成のＸ線顕微鏡で高いコントラストの画像を得ようとすると、電子線からＸ線への変換効率が低いために入射電子線量を大きくする必要があるが、このような大電流条件では分解能が低下することに加え、金属薄膜が発熱したり試料を損傷させてしまうという問題がある。
【００１２】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料の電子顕微鏡像を、表面コーティングや染色の処理を行うことなく、高分解能で観察することを可能とする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の課題を解決するために、本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察に用いられる試料支持部材は、絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体を備え、前記絶縁性薄膜側を電子線入射面とし、前記導電性薄膜側を試料付着面とする、ことを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、前記絶縁性薄膜の厚みが１０ｎｍ〜２００ｎｍである。
【００１５】
また、好ましくは、前記絶縁性薄膜の電気抵抗率が１０００Ωｍ以上である。
【００１６】
例えば、前記絶縁性薄膜は、窒化シリコン、酸化シリコン、ポリイミドの何れかを主成分とする材料からなる。
【００１７】
好ましくは、前記導電性薄膜の厚みが２００ｎｍ以下である。
【００１８】
また、好ましくは、前記導電性薄膜は、ニッケル、チタン、アルミ、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とする材料からなる。
【００１９】
例えば、前記導電性薄膜の試料付着面は親水性化処理が施されている。
【００２０】
また、例えば、前記導電性薄膜の試料付着面に試料吸着層が設けられている。
【００２１】
一態様として、前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体の試料付着面に対向して設けられた耐圧性薄膜が該耐圧性薄膜と前記積層体との間に間隔を有するように配置されており、前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体および前記耐圧性薄膜は何れも１気圧以上の耐圧性を有し、前記積層体と前記耐圧性薄膜の間の空間を大気圧封止可能とされている構成がある。
【００２２】
また、一態様として、前記導電性薄膜には該導電性薄膜の電位制御のための電極が設けられている構成がある。
【００２３】
本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察に用いられる試料ホルダは、上述の試料支持部材を備えた試料ホルダであって、外部入力を受けて前記電極に電圧を印加する端子を備えている。
【００２４】
また、本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察に用いられる試料ホルダは、上述の試料支持部材を備えた試料ホルダであって、電子線入射面側および電子線出射面側の少なくとも一方に視野絞りが設けられている。
【００２５】
本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察方法は、上述の試料支持部材を用いた走査型電子顕微鏡像の観察方法であって、入射電子線の加速電圧を入射電子の６０％以上が前記絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体により散乱、吸収、若しくは遮蔽される値に設定する。
【００２６】
また、本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察方法は、上述の試料ホルダを用いた走査型電子顕微鏡像の観察方法であって、前記端子の電位を走査型電子顕微鏡のグランド電位若しくは該グランド電位よりも高い電位として像観察を行う。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る走査型電子顕微鏡像の観察に用いられる試料支持部材は、絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体を備え、前記絶縁性薄膜側を電子線入射面とし、前記導電性薄膜側を試料付着面とする構成を備えている。
【００２８】
電子線が入射する絶縁性薄膜内部には自由電子がほとんど存在しないため、注入された電子の量に応じて負電位が生じるため、試料を付着させる側の導電性薄膜との間に電位差が生じる。しかも、これらは何れも薄膜であるため、両者間に形成される電位勾配は顕著に大きなものとなる。絶縁性薄膜内で発生する２次電子はこの大きな電位勾配によるトンネル効果によって導電性薄膜側へと放出され、さらに、観察試料をも透過する。
【００２９】
従って、この透過電子（トンネル電子）の空間的分布を記録することにより観察試料内部の構造観察が可能となり、染色等の処理を施すことなく高いコントラストの画像を得ることができる。
【００３０】
また、絶縁性薄膜内で生じる電位勾配は電子線入射方向に略平行（絶縁性薄膜の電子線入射面に略垂直）であり、トンネル効果により導電性薄膜へと透過してくる２次電子の出射方向は試料付着面に略垂直であるため、透過２次電子は空間的に広がることなく観察試料に入射するため、高い分解能が得られる。
【００３１】
しかも、トンネル効果により観察試料に到達する電子のエネルギは入射電子線のエネルギに比較して顕著に低いため、従来の観察に比較して、試料へのダメージを大幅に低減させることができる。
【００３２】
このように、本発明よれば、簡便な構造の試料支持部材により、高コントラスト、高分解能、観察試料への低ダメージ化を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係る試料支持部材および試料ホルダの構成例の概要を説明するためのブロック図である。
【図２Ａ】本発明の試料支持部材に生物試料を付着させてＳＥＭ観察する際の、電子線照射時に絶縁性薄膜内に生じる電位分布を説明するための概念図である。
【図２Ｂ】絶縁性薄膜と導電性薄膜の境界近傍で生じた２次電子が、図２Ａに示した電位分布の下でトンネル効果により導電性薄膜中を透過する様子を示した概念図である。
【図３】導電性薄膜に電圧印加してプラス電位とすることで絶縁性薄膜内の電位勾配が大きくなる様子を説明するための概念図である。
【図４Ａ】絶縁性薄膜が窒化シリコン膜（５０ｎｍ）で導電性薄膜がＮｉ膜（１５ｎｍ）とＡｕ膜（１０ｎｍ）の積層膜である試料支持部材に４ｋＶの印加電圧で加速された電子線を入射させた場合の電子線の散乱状況を、モンテカルロシミュレーションした結果の図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示した電子線の散乱状況下での膜内エネルギ密度分布を、モンテカルロシミュレーションした結果の図である。
【図５】絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体の試料付着面に対向して耐圧性薄膜を設けた試料支持部材に、生物試料を密閉して観察する際の様子を説明するための概念図である。
【図６Ａ】絶縁性薄膜が窒化シリコン膜（５０ｎｍ）で導電性薄膜がＮｉ膜（１５ｎｍ）とＡｕ膜（１０ｎｍ）の積層膜である試料支持部材に４ｋＶの印加電圧で加速された電子線を入射させ、金属積層膜を透過した電子による電流値を測定する際のブロック図である。
【図６Ｂ】図６Ａに示した測定系で透過電子による電流値のバイアス電圧依存性を求めた実験結果である。
【図７】本発明の試料支持部材にウィルスを付着させ、倍率６万倍で観察したＳＥＭ画像である。
【図８】本発明の試料支持部材に大気圧に密閉した状態でバクテリアを付着させ、倍率３万倍で観察したＳＥＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に、図面を参照して、本発明の試料支持部材および試料ホルダならびに走査型電子顕微鏡像の観察方法について説明する。
【００３５】
図１は、本発明に係る試料支持部材および試料ホルダの構成例の概要を説明するためのブロック図である。試料支持部材は絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２の積層体からなり、電子銃４０から射出された電子線４１は絶縁性薄膜側から入射する。導電性薄膜１２の下面は試料付着面であり、観察対象となる試料３０が吸着等により保持されている。なお、符号１３で示したものは、試料支持部材の機械的な強度を担保等するためのフレームである。電子線４１は絶縁性薄膜１１の電子線入射面上を走査し、試料３０を透過してきた２次電子４２を２次電子検出器５０により検知して得られた強度プロファイルにより２次元的なＳＥＭ画像を得る。
【００３６】
入射電子線４１の加速電圧は、電子線４１による試料３０のダメージを低減する目的で、入射電子の適当量が絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２の積層体内で散乱、吸収、若しくは遮蔽される値とする。例えば、入射電子線４１の加速電圧は、入射電子の６０％以上が絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体により散乱、吸収、若しくは遮蔽される値に設定される。
【００３７】
入射した電子線４１は絶縁性薄膜１１の内部で拡散しながら広がり（拡散領域１４）、２次電子を生成しながら導電性薄膜１２の下面（試料付着面）に到達する。電子線４１が入射すると、絶縁性薄膜１１の絶縁性のために、絶縁性薄膜１１の電位は電子注入量に応じた負の電位となる。一方、導電性を有する導電性薄膜１２に注入された電子は、試料支持部材を収容する試料ホルダ２０の上部本体２１や下部本体２２を介して膜外へと排出されるため、導電性薄膜内には蓄積せず導電性薄膜１２の電位変化はない。従って、試料支持部材への電子注入により、電子線が入射した部位の絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２との間に電位差が生じることとなるが、この電位差は、本発明における一般的な観察条件において、数百Ｖを超える値となる。
【００３８】
なお、導電性薄膜１２の電位は、ＳＥＭ装置内のグランド電位（０Ｖ電位）か、或いはこのグランド電位よりも高い電位とすることが好ましい。そのため、導電性薄膜１２に電位制御のための電極等を設け、試料ホルダ２０に設けられた端子等からの外部からの電圧印加により、導電性薄膜１２の電位を制御するようにしてもよい。
【００３９】
絶縁性薄膜１１は、その厚みを例えば１０ｎｍ〜２００ｎｍとし、電気抵抗率は例えば１０００Ωｍ以上とする。このような絶縁性薄膜１１の材料としては、窒化シリコン、酸化シリコン、カプトン（登録商標）などのポリイミドの何れかを主成分とする材料を例示することができる。
【００４０】
また、導電性薄膜１２は、その厚みを例えば２００ｎｍ以下とする。導電性薄膜１２の材料としては、ニッケル、チタン、アルミ、金、銀、銅、コバルト、モリブデン、タンタル、タングステン、オスミウムの何れかを主成分とする材料を例示することができる。
【００４１】
例えば、絶縁性薄膜１１の厚みが５０ｎｍ程度で電位差が５００ｅＶ程度であるとすると、その電位勾配は１００Ｍｅｖ／ｃｍもの大きな値となる。通常、１００Ｍｅｖ／ｃｍの電位勾配の下では、絶縁性薄膜１１の表面のポテンシャル障壁が薄くなり、トンネル効果による電子放出現象（電界放出現象）が生じる。従って、絶縁性薄膜１１の内部で生じた２次電子は、この電位勾配に沿って、導電性薄膜１２側へとトンネル透過する。２次電子のエネルギは概ね１０ｅＶ以下であるためドブロイ波長も長く、トンネル透過率は高いと考えることができる。このようなトンネル透過した２次電子は導電性薄膜１２内を拡散して試料３０に到達するが、試料３０が生物試料などの電子透過率の高いものである場合には、２次電子は試料３０内部もトンネル透過し、この２次電子４２が２次電子検出器５０により検知されて試料３０の内部構造を反映するＳＥＭ画像が得られる。
【００４２】
このようなＳＥＭ画像は試料３０の内部のポテンシャル障壁を反映したものとなるため、染色等の特別な処理を施すことなく、高いコントラストの画像を得ることができる。また、試料３０に入射し透過する電子は主としてエネルギの低いトンネル電子であるため、試料３０に対するダメージは顕著に軽減される。
【００４３】
このように、絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体を備えた本発明に係る試料支持部材では、自由電子がほとんど存在しない絶縁性薄膜内部に入射した電子線により負電位が生じさせて導電性薄膜との間に大きな電位勾配を形成しこの電位勾配を利用して絶縁性薄膜内で発生する２次電子を導電性薄膜側へとトンネル透過させ、さらに試料３０もトンネル透過させることにより、染色等の処理を施すことなく、試料内部の構造を反映する高いコントラストの画像を得ることを可能としている。
【００４４】
なお、絶縁性薄膜１１の内部で生じる電位勾配は電子線４１の入射方向に略平行（絶縁性薄膜１２の電子線入射面に略垂直）であるため、トンネル効果により導電性薄膜１２へと透過してくる２次電子の出射方向は試料付着面に略垂直となる。このため、絶縁性薄膜１１からの透過２次電子は空間的に広がることなく観察試料３０に入射し、高い分解能が得られる。しかも、トンネル効果により観察試料３０に到達する電子のエネルギは入射電子線のエネルギに比較して顕著に低いため、従来の観察に比較して、試料３０へのダメージを大幅に低減させることができる。
【００４５】
このように、本発明よれば、簡便な構造の試料支持部材により、高コントラスト、高分解能、観察試料への低ダメージ化を実現することが可能となる。
【００４６】
導電性薄膜１２の試料付着面は、水溶性試料等の吸着のために親水化処理を施すようにしてもよい。また、導電性薄膜１２の試料付着面に、生物試料等を吸着させるための試料吸着層を設けるようにしてもよい。
【００４７】
また、図１に示したように、試料支持部材の上方（電子線入射面側）に視野絞り２３を設けたり、試料支持部材の下方（電子線出射面側）に視野絞り２４を設けたりしてもよい。視野絞り２３は、電子線入射部位から上方へと放出される２次電子を試料ホルダ２０外へと漏れ出すことを防止することに寄与する。このような２次電子は試料３０の情報を含んでいないため、これが検知されてしまうと画質を落としてしまう。また、視野絞り２４は、試料ホルダ２０の下部から出射され２次電子検出器５０によって検知される２次電子の視野角を限定するためのもので、観察画像の分解能向上に寄与する。
【００４８】
図２Ａおよび図２Ｂはそれぞれ、本発明の試料支持部材に生物試料を付着させてＳＥＭ観察する際の、電子線照射時に絶縁性薄膜内に生じる電位分布を説明するための概念図、および、絶縁性薄膜と導電性薄膜の境界近傍で生じた２次電子が、図２Ａに示した電位分布の下でトンネル効果により導電性薄膜中を透過する様子を示した概念図である。
【００４９】
入射電子線４１は、絶縁性薄膜１１の表面に、直径数ｎｍで細く絞られた状態で照射される。電子線の入射領域には多量の入射電子が極めて狭い領域内に注入されることとなり、その結果として入射電子線４１の電子線入射面側の電位は負電位（Ｖ＝Ｖｓ）となる。導電性薄膜１２が装置のグランド電位（ＶＧ＝０）とされている場合には、絶縁性薄膜１１を透過して導電性薄膜１２に入射してきた電子は速やかに導電性薄膜１２内から排除され、導電性薄膜１２はグランド電位（ＶＧ＝０）を維持し、入射電子線４１の導電性薄膜１２側の面の電位（Ｖ＝０）との間で電位勾配が形成される。
【００５０】
上述のとおり、絶縁性薄膜１１の厚さが５０ｎｍで電子線入射面側の電子線照射領域の電位が−５００Ｖであると仮定すると、絶縁性薄膜１１の内部に形成される電位勾配は１００ＭｅＶ／ｃｍとなり、電界放射現象により絶縁性薄膜１１内の電子を導電性薄膜１２側へと放出するに十分な極めて大きな値となる。この大きな電位勾配のため、電子線の照射領域の垂直下方では、絶縁性薄膜１１内および絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２との界面近傍で発生した２次電子は導電性薄膜１２内へとトンネル透過し、さらに導電性薄膜１２および試料３０をも透過して２次電子４２として試料支持部材外に放出される。なお、既に説明したように、２次電子のエネルギは概ね１０ｅＶ以下であるためそのドブロイ波長は原子の直径に比べて長いために量子効果が生じやすく、トンネル透過率は高い。
【００５１】
このように、本発明では、絶縁性薄膜１１内部に入射した電子線により負電位が生じさせて導電性薄膜１２との間に大きな電位勾配を形成し、この電位勾配を利用して、絶縁性薄膜１１内で発生した２次電子を導電性薄膜１２側へとトンネル透過させている。
【００５２】
このような２次電子のトンネル透過効率は電位勾配が大きいほど高くなるから、導電性薄膜１２側を正電位にすることで２次電子のトンネル透過効率を高めることができる。
【００５３】
図３は、導電性薄膜１２に電圧印加（＋Ｖｂ）してプラス電位とすることで絶縁性薄膜１１内の電位勾配を大きくした様子を説明するための概念図である。この図に示したように、導電性薄膜１２を正電位（＋Ｖｂ）とした分だけ、絶縁性薄膜１１内で生じる電位勾配は大きくなり、その分だけ２次電子のトンネル透過効率が高くなり、得られるＳＥＭ画像の分解能とコントラストの向上に寄与する。
【００５４】
図４Ａは、絶縁性薄膜が窒化シリコン膜（５０ｎｍ）で導電性薄膜がＮｉ膜（１５ｎｍ）とＡｕ膜（１０ｎｍ）の積層膜である試料支持部材に４ｋＶの印加電圧で加速された電子線を入射させた場合の電子線の散乱状況を、モンテカルロシミュレーションした結果の図である。また、図４Ｂは、図４Ａに示した電子線の散乱状況下での膜内エネルギ密度分布を、モンテカルロシミュレーションした結果の図である。
【００５５】
図４Ａに示したように、窒化シリコン薄膜内では、電子は比較的弱く散乱される一方、ＮｉとＡｕの金属膜内においては電子は強く散乱乃至吸収されている。４ｋＶという加速電圧では、窒化シリコン薄膜に入射した電子の９０％以上が、絶縁性薄膜と導電性薄膜の積層体の内部で散乱、吸収、若しくは遮蔽されており、試料側へと透過する入射電子（１次電子）はごく僅かである。従って、試料へのダメージは大幅に軽減される。
【００５６】
図５は、絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２の積層体の試料付着面に対向して、スペーサ１５を介して耐圧性薄膜１６を設け、この耐圧性薄膜１６にもフレーム１７を形成した態様の試料支持部材の構成を説明するための図である。この試料支持部材の、スペーサ１５により間隔が画定される耐圧性薄膜１６と導電性薄膜１２の試料付着面との間の空間内に、試料３０が収容されている。例えば絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２は何れも０．５気圧以上の耐圧性を有しており、この積層体は１気圧以上の耐圧性を有しており、耐圧性薄膜１６は１気圧以上の耐圧性を有している。積層体と耐圧性薄膜１６の間の空間は大気圧封止（密閉）され、真空によるダメージの防止と本来の形態を観察することを可能としている。
【００５７】
図６Ａおよび図６Ｂはそれぞれ、絶縁性薄膜が窒化シリコン膜（５０ｎｍ）で導電性薄膜がＮｉ膜（１５ｎｍ）とＡｕ膜（１０ｎｍ）の積層膜である試料支持部材に４ｋＶの印加電圧で加速された電子線を入射させ、金属積層膜を透過した電子による電流値を測定する際のブロック図、および、図６Ａに示した測定系で透過電子による電流値のバイアス電圧依存性を求めた実験結果である。
【００５８】
積層体を透過してきた２次電子は、試料支持部材の下方に設けられた計測カップ６０により、電流として計測される。ここで、例えば、計測カップ６０に外部電源６２から電流計６１を介して負のバイアス電圧を印加すると、透過電子のうちバイアス電圧より小さなエネルギをもつ電子は試料ホルダ２０側へと押し戻されるため、計測カップ６０によって検出されない。従って、バイアス電圧以上のエネルギを有する透過電子のみが計測カップ６０で計測される。この原理に基づけば、上述のバイアス電圧を徐々に大きくすることにより、透過電子のエネルギ分布を求めることが可能となる。
【００５９】
図６Ｂには、バイアス電圧を＋２Ｖから−１０Ｖまで変化させた際の、計測カップ６０により計測された電流（正規化電流）を示している。入射電子線の加速電圧が４ｋＶの場合、バイアス電位を＋２Ｖから下げてゆくと電流値は指数関数的に減少し、バイアス電位が−１０Ｖでは電流値は略ゼロとなる。これは、透過電子のほぼ全てが１０Ｖ以下の低いエネルギのものであることを意味している。また、入射電子（１次電子）の透過がほとんどないことも意味している。一方、入射電子線の加速電圧が１０ｋＶの場合、バイアス電位が−１０Ｖでも６０％の電流が計測されている。これは、検知された電子の多くが−１０Ｖを越えるエネルギを有していることを意味しており、入射電子（１次電子）が無視できないレベルで透過していることを示している。
【００６０】
図７は、本発明の試料支持部材に非染色の状態でウィルス（バキュロウィルス）を付着させ、倍率６万倍で観察したＳＥＭ画像である。なお、用いた試料支持部材は、絶縁性薄膜が窒化シリコン膜（５０ｎｍ）で導電性薄膜がＮｉ膜（１５ｎｍ）とＡｕ膜（１０ｎｍ）の積層膜で、入射電子線の加速電圧は４ｋＶである。
【００６１】
図７中に示した矢印部分に、長さが概ね３００ｎｍの棒状のバキュロウィルスが明確に観察される。また、その下方にはエンベローブと呼ばれるタンパク質を内包する袋状の形状も観察されている。さらに、ウィルス内部やエンベローブ内の濃淡構造が観察されており、これらは内部構造を反映していると考えられる。
【００６２】
図６Ｂに示したように、加速電圧が４ｋＶである場合には、エネルギが１０ｅＶ以下の電子のみが検知されるから、図７のＳＥＭ画像は１０ｅＶ以下のエネルギの透過電子により得られたものである。一般には、１０ｅＶ以下といった低エネルギの電子の透過力は１０ｎｍ程度と考えられるが、本発明による試料支持部材を用いたＳＥＭ観察では、１０ｅＶ以下のエネルギの透過電子でありながら、５０ｎｍ以上の厚さを有する試料を透過しており、内部構造の観察も可能となっている。この理由は、本発明の構成とすることによる量子効果の結果であると考えられる。
【００６３】
図８は、本発明の試料支持部材に大気圧に密閉した状態でバクテリアを付着させ、倍率３万倍で観察したＳＥＭ画像である。なお、このＳＥＭ画像は、耐圧性薄膜を窒化物シリコン薄膜とした図５に示した態様の試料支持部材を用い、試料であるバクテリアを大気圧下で観察して得られたものである。なお、入射電子線の加速電圧は４ｋＶである。
【００６４】
このＳＥＭ画像においても、極めて高い分解能で、バクテリアの内部構造が確認できる。
【００６５】
上述したように、本発明によれば、バクテリアやウィルスあるいはタンパク質複合体等の試料から、特別な染色や固定作業なしに、高いコントラストの画像を得ることができる。また、試料支持部材からの透過２次電子は空間的に広がることなく観察試料に入射するため、高い分解能が得られる。
【００６６】
しかも、トンネル効果により観察試料に到達する電子のエネルギは入射電子線のエネルギに比較して顕著に低いため、従来の観察に比較して、試料へのダメージを大幅に低減させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明により、照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料の電子顕微鏡像を、表面コーティングや染色の処理を行うことなく、高分解能で観察することを可能とする技術が提供される。
【符号の説明】
【００６８】
１１  絶縁性薄膜
１２  導電性薄膜
１３、１７  フレーム
１４  拡散領域
１５  スペーサ
１６  耐圧性薄膜
２０  試料ホルダ
２１  上部本体
２２  下部本体
２３、２４  視野絞り
３０  試料
４０  電子銃
４１  電子線
４２  ２次電子
５０  ２次電子検出器
６０  計測カップ
６１  電流計
６２  外部電源
【要約】
【課題】照射電子線によるダメージを受けやすい有機材料系試料や生物試料の電子顕微鏡像を、表面コーティングや染色の処理を行うことなく、高分解能で観察することを可能とする技術の提供。
【解決手段】試料支持部材への電子注入により、電子線が入射した部位の絶縁性薄膜１１と導電性薄膜１２との間に電位勾配が生じ、絶縁性薄膜１１の表面のポテンシャル障壁が薄くなり、トンネル効果による電子放出現象（電界放出現象）が生じる。絶縁性薄膜１１の内部で生じた２次電子は、この電位勾配に沿って、導電性薄膜１２側へとトンネル透過する。このようなトンネル透過した２次電子は導電性薄膜１２内を拡散して試料３０に到達するが、試料３０が生物試料などの電子透過率の高いものである場合には、２次電子は試料３０内部もトンネル透過し、この２次電子４２が２次電子検出器５０により検知されて試料３０の内部構造を反映するＳＥＭ画像が得られる。
【選択図】図１【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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