(57)【要約】【課題】  ヒアルロン酸などのムコ多糖の不必要な低分子化を防ぐことができるとともに、脂肪及び脂肪酸の混入が極めて少なく、呈味性や保存安定性に優れるヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法を提供すること。【解決手段】  以下（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とするヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法とする。（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程（ｇ）乾燥処理する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とするヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法。
（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程
（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程
（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程
（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程
（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程
（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程
（ｇ）乾燥処理する工程
【請求項２】
以下（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とするヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法。
（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程
（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程
（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程
（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程
（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程
（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程
（ｇ）吸着処理した水可溶性画分にアルコールを加え、沈殿物を回収して乾燥する工程
【請求項３】
前記吸着剤が活性炭及び／又は珪藻土であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法。
【請求項４】
前記（ｂ）工程が、豚の軟骨組織粉砕物を加熱することによって、豚の軟骨組織粉砕物中の蛋白質を変性させることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法に関する。本発明の目的は、ヒアルロン酸などのムコ多糖の不必要な低分子化を防ぐことができるとともに、脂肪及び脂肪酸の混入が極めて少なく、呈味性や保存安定性に優れるヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法を提供することにある。
尚、ムコ多糖とは、グルコサミノグリカンとも呼ばれるプロテオグリカン（ムコ蛋白質）の主構成分である多糖類部分の総称である。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖はヘキソサミンを主成分とする多糖類の総称である。ムコ多糖はプロテオグリカンの側鎖成分である。
ヒアルロン酸はムコ多糖の一種であり、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを反復構成単位とする平均分子量約５０万から３００万の酸性ムコ多糖類である。
ヒアルロン酸を構成するＤ−グルクロン酸のカルボキシル基によって、ヒアルロン酸は特異的な作用を有する。即ち、折り畳み可能な鎖とカルボキシル基の負電荷の相互作用によって、ヒアルロン酸分子は空間に展開しやすくなる。また低濃度であっても、強力な分子間力を有しているので、比較的高い粘性を有する。さらに、ヒアルロン酸の分子形状は溶液中で広範囲の空間を占有することができ、これによって大量の水と結合してゲルを形成することができる。
ヒアルロン酸は大量の水と結合してゲルを形成したり、比較的高い粘性を有したりするので、例えば、関節の湿潤作用、皮膚の柔軟作用などを有する。
【０００３】
プロテオグリカンは体内で生合成・分解される。若い時期はプロテオグリカンの生合成と分解のバランスが保たれているが、加齢と共にこのバランスが崩れ、プロテオグリカンの生合成量に比べて分解量が相対的に増加する。これによって、体内のプロテオグリカンの量が減って、軟骨の消耗、皮膚の弾力の低下などが起ると考えられている。
プロテオグリカンを構成するヒアルロン酸などのムコ多糖を摂取又は皮膚に塗布することにより、プロテオグリカンの生合成量を高めて、軟骨の消耗や皮膚の弾力低下を防止することが試みられている。
【０００４】
ヒアルロン酸を工業的に製造する方法としては、生体組織を原料とする抽出法が知られている。
例えば、特許文献１には、ミンチ状にした鶏冠に水を加えた状態で３０〜６０分間、１００℃で加熱処理した後に、複合タンパク質脂肪分解酵素と反応させる低分子ヒアルロン酸の製造方法が記載されている。
特許文献２には、リパーゼとプロテアーゼを用いて鶏冠をそのまま５８〜６８℃で消化して、続いて常法により分離精製するヒアルロン酸の製造方法が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３６０２９２号公報
【特許文献２】特開平７−２４１２００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び２に記載の方法は、鶏冠を原料とするものであり、脂肪や脂肪酸の混入は少ないが、工業的規模でヒアルロン酸を製造することができるほどの鶏冠を収集するには手間がかかり、製造コストの増大につながった。
比較的大量に収集することができる原材料としては、豚の軟骨組織が知られているが、原材料として豚の軟骨組織を使用した場合、抽出したヒアルロン酸に脂肪や脂肪酸が混入してしまい、ヒアルロン酸の呈味性を劣化させるとともに、含まれている脂肪や脂肪酸が経時的に酸化することによって酸敗臭が発生するなど、保存安定性の面で問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであって、請求項１に係る発明は、以下（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とするヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法に関する。
（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程
（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程
（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程
（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程
（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程
（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程
（ｇ）乾燥処理する工程
【０００８】
請求項２に係る発明は、以下（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とするヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法に関する。
（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程
（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程
（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程
（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程
（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程
（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程
（ｇ）吸着処理した水可溶性画分にアルコールを加え、沈殿物を回収して乾燥する工程
【０００９】
請求項３に係る発明は、前記吸着剤が活性炭及び／又は珪藻土であることを特徴とする請求項１又は２に記載のヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記（ｂ）工程が、豚の軟骨組織粉砕物を加熱することによって、豚の軟骨組織粉砕物中の蛋白質を変性させることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のヒアルロン酸を含有するムコ多糖の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ヒアルロン酸などのムコ多糖の不必要な低分子化を防ぐことができるとともに、脂肪及び脂肪酸の混入が極めて少なく、呈味性や保存安定性に優れるヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法及びヒアルロン酸含有ムコ多糖を含む健康食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法について詳細に説明する。
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法は、（ａ）豚の軟骨組織中の蛋白質を変性させて除去する工程、（ｂ）豚の軟骨組織を粉砕する工程、（ｃ）豚の軟骨組織粉砕物を酵素分解処理に適した状態に調整する工程、（ｄ）豚の軟骨組織粉砕物を蛋白質分解酵素及び澱粉分解酵素で酵素分解処理する工程、（ｅ）酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程、（ｆ）水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程、（ｇ）乾燥処理する工程、の（ａ）〜（ｇ）の工程からなることを特徴とする。
【００１２】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第一の工程は、豚の軟骨組織中の蛋白質、或いは軟骨組織に付着した蛋白質を変性させて除去する工程である。
本発明ではムコ多糖を抽出する原料として豚の軟骨組織が用いられる。豚の軟骨組織は、軟骨細胞と軟骨基質とから構成され、軟骨基質にはコラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などが含まれている。
本発明で用いられる豚の軟骨組織は、関節軟骨、肋軟骨、喉頭甲状軟骨、輪状軟骨、披裂軟骨、気管及び気管支軟骨、鼻軟骨、喉頭蓋軟骨、耳介、外耳道、眼瞼軟骨、関節円板、椎間円板、蹄軟骨、腱鞘などの豚の全身に存在するあらゆる軟骨組織を用いることができる。
また本発明では、豚の軟骨組織として、硝子軟骨、弾性軟骨、線維軟骨、軟骨様組織のいずれも用いることができるが、特に硝子軟骨を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明で用いられる豚は特に限定されないが、デュロック種（Duroc）、バークシャー種（Berkshire）、ハンプシャー種（Hampshire）、ランドレース種（Landrace）、大ヨークシャー種（Large Yorkshire）、中ヨークシャー種（Middle Yorkshire）或いはこれらの雑種等を例示することができる。本発明で用いられる豚は好ましくは、生後１ヶ月〜１２ヶ月、より好ましくは３ヶ月〜６ヶ月程度の子豚を使用することが好ましい。
【００１４】
豚の軟骨組織中の脂肪組織の含有量は少ないが、軟骨周囲に蛋白質などの結合組織が含まれている。軟骨組織に付着した蛋白質などを変性させることによって軟骨組織から取り除く。軟骨組織粉砕物中の蛋白質を変性させて除去することによって、後述する酵素分解処理工程を効率良く行うことができる。軟骨組織から蛋白質を変性させて取り除く方法は特に限定されないが、軟骨組織を加熱する方法を例示することができる。加熱する方法を採用する場合、軟骨組織を長時間加熱処理すると、蛋白質の変性はより進行するが、ヒアルロン酸などのムコ多糖の低分子化を招く。従って、短時間の加熱処理が有効である。具体的には、軟骨組織を水に浸漬して、７０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃の加熱温度で、１０〜５０分、好ましくは１５分〜４０分程度の加熱処理することが望ましい。
【００１５】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第二の工程は、第一の工程で蛋白質などを除去した原料（軟骨組織）を粉砕処理工程である。
軟骨組織を粉砕処理する方法は特に限定されず、例えば、豚の軟骨組織を粉砕器や磨砕器などを用いて粉砕処理すればよい。
【００１６】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第三の工程は、第二の工程で得られた軟骨組織粉砕物を、酵素分解処理に適した状態に調整する工程である。
酵素には、酵素活性を発揮することができる至適条件が存在する。その範囲内にないと、酵素活性を十分発揮することができない。また酵素分解処理に適した状態は、使用する酵素の種類によっても異なるので、使用する酵素に適した状態に調整する。
具体的には、軟骨組織粉砕物の液温やｐＨを、使用する酵素の至適条件内に調整する。
【００１７】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第四の工程は、酵素分解処理に適した状態に調整された軟骨組織粉砕物を酵素分解処理する工程である。
ヒアルロン酸などのムコ多糖は、コアタンパク質に結合してプロテオグリカンを形成している。軟骨組織粉砕物を加水分解することにより、ヒアルロン酸を分解することなく、ヒアルロン酸とコアタンパク質との結合を分解することができる。
【００１８】
本発明で用いられる酵素は、蛋白質分解酵素と澱粉分解酵素が用いられる。蛋白質分解酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＡ、プロナーゼ、アクチナーゼ、サモアーゼ、パパインなどを例示することができる。
澱粉分解酵素としては、澱粉中のα−１，４結合又はα−１，６結合を加水分解することができる酵素であれば特に限定されず、例えば、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどを例示することができる。
市販の蛋白質分解酵素の一例としては、商品名「Alcalase」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。市販の澱粉分解酵素の一例としては、商品名「BAN」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。
【００１９】
酵素分解によって、軟骨組織粉砕物のｐＨが変動する場合があるので、一定時間、例えば１０〜１５分毎にｐＨを調整することが望ましい。
酵素反応時間は特に限定されず、加えられる酵素の酵素活性や酵素の量に応じて適宜任意に設定されるが、概ね２〜１５時間、好ましくは５〜１０時間の処理時間とされる。
【００２０】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第五の工程は、酵素分解処理物中の水可溶性画分を回収する工程である。
酵素分解処理物中の水可溶性画分には、ヒアルロン酸などのムコ多糖やアミノ酸、ペプチドが含まれている。水可溶性画分を回収するには、酵素分解処理物を静置した後に、下層を回収する方法や、酵素分解処理物を濾過する方法、酵素分解処理物を遠心分離する方法などを例示することができる。
【００２１】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第六の工程は、回収した水可溶性画分に吸着剤を加えて吸着処理する工程である。
吸着剤を加えて吸着処理することによって、水可溶性画分に含まれていた脂肪酸、酵素などを吸着除去することができるとともに、水可溶性画分を脱色することができる。
水可溶性画分のｐＨは特に限定されないが、酸性域に調整することが好ましい。水可溶性画分のｐＨを酸性域に調整によって、吸着剤の吸着能力を高めることができる。水可溶性画分のｐＨは酸性域であれば特に限定されないが、ｐＨ２．０〜６．５が好ましく、ｐＨ３．０〜６．０であることがより好ましい。
用いられる吸着剤は特に限定されないが、活性炭、珪藻土、タルク、カオリン、真珠岩等を例示することができる。特に本発明では、吸着剤として活性炭又は珪藻土を使用することが好ましい。
加えられる吸着剤の量は特に限定されないが、加水分解物の０．０５〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１〜３ｗ／ｖ％程度添加すればよい。
吸着処理した後に、濾過又は遠心分離によって吸着剤を除去して濾液（以下、吸着処理物という場合がある。）を回収する。
【００２２】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法の第七の工程は、第六の工程で得られた吸着処理物を乾燥して、本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖を得る工程である。
吸着処理物を乾燥する方法は特に限定されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧濃縮、真空乾燥などを例示することができる。
さらに必要に応じて、得られたヒアルロン酸含有ムコ多糖を所要の粒度、例えば１００メッシュ以下の粒度に粉砕することもできる。
尚、噴霧乾燥法などによって乾燥した場合、原材料の３０〜３５％の固形物が回収される。このうち、ヒアルロン酸は１〜２％程度、コンドロイチン硫酸は３５〜４０％程度、ペプチドは４０〜５０％程度含まれている。
【００２３】
尚、本発明では、得られるヒアルロン酸含有ムコ多糖の純度を高める目的で、第六の工程で得られた吸着処理物をアルコール沈殿処理することもできる。アルコール沈殿処理することにより、吸着処理物中に含まれていた微量の不純物、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等を除去することができる。
吸着処理物をアルコール沈殿処理する方法は特に限定されず、常法に従って沈殿処理すればよい。
アルコール沈殿の際に用いられるアルコールとしては、エタノール、イソプロパノールなどを例示することができる。
常法に従って、第六の工程で得られた吸着処理物をアルコール沈殿処理した後に、沈殿物を回収する。次いで、沈殿物を乾燥処理することによって、本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖を得ることができる。
尚、アルコール沈殿法によって乾燥した場合、原材料の２５〜３０％の固形物が回収される。このうち、ヒアルロン酸は１〜２％程度、コンドロイチン硫酸は６０〜６５％程度、ペプチドは２０〜３０％程度含まれている。
【００２４】
さらに、ヒアルロン酸の精製度を上昇させるために、第四級アンモニウム塩を加えて、第四級アンモニウム塩とヒアルロン酸との複合体を形成させ、次いで、この複合体を回収した後に、塩化ナトリウムと接触させて、ヒアルロン酸と第四級アンモニウム塩とを分離させて、ヒアルロン酸を回収することもできる。
第四級アンモニウム塩としては、ＣＰＣ（セチルピリジニウムクロライド）やＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）などを例示することができる。
【００２５】
本発明に係るヒアルロン酸含有ムコ多糖の製造方法では、原料として用いられる豚の軟骨組織には脂肪や脂肪酸が少ないので、実質的に脂肪や脂肪酸が含まれていないヒアルロン酸含有ムコ多糖を製造することができる。また製造されたヒアルロン酸含有ムコ多糖の平均分子量は、５０万〜１００万程度、好ましい場合で６０万〜８０万程度であり、食品、医薬品、化粧品などの素材として用いることができ、特に健康食品の素材として好適に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
生後６ヶ月の豚（ＰＩＣ五元雑種）の硝子軟骨３８０ｇを洗浄した後、加熱釜に入れて攪拌しながら、蒸留水３８０ｇを加えて１００℃に加熱して２０〜３０分間加熱して、硝子軟骨に付着していた蛋白質を変性させて軟骨組織から除去した。次いで、蒸留水４８０ｇを加えて攪拌するとともに、加熱釜自体を冷却して、４０〜５０℃まで素早く冷却した。またｐＨを８．０〜９．５に調整した。
蛋白質分解酵素（商品名「Alcalase」、NOVOZYMES社製）と澱粉分解酵素（商品名「BAN」、NOVOZYMES社製）を加えて、４０〜５０℃に維持した状態で２〜３時間攪拌した。一定時間毎にｐＨ調整を行なった。４０〜５０℃の液温を維持した状態で、さらに２〜３時間静置した。
水可溶性画分を回収するとともに、濾布を用いて濾過した。
濾液のｐＨを塩酸で５．０に調整した後に、１００〜２００メッシュの粒度の活性炭１ｗ／ｖ％を加えて３０〜６０分攪拌した。圧力濾過によって活性炭を除去した後に、水酸化ナトリウム水溶液で濾液のｐＨを７．０に調整した。これを、噴霧乾燥することによって、実施例１のヒアルロン酸含有ムコ多糖を調製した。
【００２８】
（実施例２）
生後６ヶ月の豚（ＰＩＣ五元雑種）の硝子軟骨３８０ｇを洗浄した後、加熱釜に入れて攪拌しながら、蒸留水３８０ｇを加えて１００℃に加熱して２０〜３０分間加熱して、硝子軟骨に付着していた蛋白質を変性させて軟骨組織から除去した。次いで、蒸留水４８０ｇを加えて攪拌するとともに、加熱釜自体を冷却して、４０〜５０℃まで素早く冷却した。またｐＨを８．０〜９．５に調整した。
蛋白質分解酵素（商品名「Alcalase」、NOVOZYMES社製）と澱粉分解酵素（商品名「BAN」、NOVOZYMES社製）を加えて、４０〜５０℃に維持した状態で２〜３時間攪拌した。一定時間毎にｐＨ調整を行なった。４０〜５０℃の液温を維持した状態で、さらに２〜３時間静置した。
水可溶性画分を回収するとともに、濾布を用いて濾過した。
濾液のｐＨを塩酸で５．０に調整した後に、１００〜２００メッシュの粒度の活性炭１ｗ／ｖ％を加えて３０〜６０分攪拌した。圧力濾過によって活性炭を除去した後に、水酸化ナトリウム水溶液で濾液のｐＨを７．０に調整した。これに、４ｗ／ｖ％の塩化ナトリウム及び３重量倍の９５％エタノールを加えた。沈殿物を回収した後、真空乾燥して、実施例２のヒアルロン酸含有ムコ多糖を調製した。
【００２９】
（試験例１；ウロン酸含有量の測定）
１．グルクロン酸標準溶液の調製
１０５℃で乾燥したグルクロン酸標準品５０ｍｇを水に溶解して１００ｍＬにメスアップした。十分に攪拌溶解したものを水で１０倍希釈してグルクロン酸標準溶液を調製した。
２．カルバゾール試薬の調製
カルバゾール０．１２５ｇを無水アルコール１００ｍＬに溶解してカルバゾール試薬を調製した。
３．ホウ酸溶液の調製
四ホウ酸ナトリウム４．７７ｇを濃硫酸５００ｍＬに溶解してホウ酸溶液を調製した。
４．標準曲線の作成
グルクロン酸標準溶液を０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ及び１．０ｍＬずつ試験管に秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。これらを攪拌した後、４℃以下になるまで冷却した。
次いで、振動攪拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、煮沸水浴中で１０分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて攪拌した後、煮沸水浴中で１５分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、標準曲線を作成した。
５．ウロン酸含有量の測定
実施例２の調製の際に、アルコール沈殿処理して得られた上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。この濃縮液５ｍＬを水で２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
試料溶液１．０ｍＬを４℃以下になるまで冷却した。次いで、振動攪拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、煮沸水浴中で１０分間加熱した後、水で室温まで冷却した。さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて攪拌した。煮沸水浴中で１５分間加熱した後、水で室温まで冷却した。紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した標準曲線からウロン酸含有量を算出した。
【００３０】
（試験例２；ペプチド含有量の測定）
１．牛血清アルブミン標準溶液の調製
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）標準品を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液に加えて、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン標準溶液を調製した。
２．アルカリ性酒石酸銅試薬の調製
無水炭酸ナトリウム１０ｇ、水酸化ナトリウム２ｇ、酒石酸カリウムナトリウム０．２５ｇに水５００ｍＬを加えて溶解した第一液と、硫酸銅０．５ｇを水１００ｍＬに溶解した第二液とを、５０：１の割合で混合してアルカリ性酒石酸銅試薬を調製した。
３．標準曲線の作成
牛血清アルブミン標準溶液を０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬを秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて攪拌した後１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて攪拌して、３７℃の水浴で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、標準曲線を作成した。
４．ペプチド含有量の測定
アルコール沈殿処理した際の上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。濃縮液を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で１００倍希釈して試料溶液を調製した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて攪拌した後、１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて攪拌して、３７℃の水浴で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて、７５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した標準曲線からウロン酸含有量を算出した。
【００３１】
アルコール沈殿処理して得られた上清液のウロン酸含有量は３７．７μｇ／ｍＬであり、ポリペプチド含有量は３１．０μｇ／ｍＬであった。
【００３２】
（試験例３；ｐＨ値測定）
実施例１及び２の各試料０．１０ｇに煮沸冷却した蒸留水を加えて溶解、希釈した後、１ｍｇ／ｍＬ溶液とした。中国薬典２０００年版附録ＶＩ Ｈに基づいてｐＨ測定を行なった。結果を表１に記載する。
【００３３】
（試験例４；水分含有量の測定）
実施例１及び２の各試料０．３ｇを用いて、ハロゲン水分測定器（ＨＧ５３、メトラー・トレド社製）により、１１０℃の条件下で水分含有量を測定した。尚、測定時間は１５分間であった。結果を表１に記載する。
【００３４】
（試験例５；アミノ酸組成の分析）
１２０℃の６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いて、実施例１及び２の各試料を１時間加水分解した後、減圧して乾燥した。さらに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを使用して一定濃度に希釈した後、８３５−５０型アミノ酸自動分析器（日立社製）によって、アミノ酸組成を分析した。結果を表２に記載する。
【００３５】
（試験例６；ヒアルロン酸ナトリウム含有量の測定）
一定量秤量した実施例１及び２の各試料溶液を、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で１００ｍＬにメスアップした。１５ｍＬに２％ＣＰＣ（セチルピリジニウムクロライド）溶液（０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解）を加えて、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液でメスアップして攪拌した。その後、４０００ｒｐｍで遠心分離した。
上清液を除去して沈殿を回収した後、塩化ナトリウム溶液を用いてＣＰＣ結合していた物質を回収した。これを、上記ウロン酸含有量の測定方法と同様の方法で、ウロン酸の含有量を測定した。
得られたウロン酸の含有量から、次式１（数１）に基づいてヒアルロン酸ナトリウムの含有量を算出した。結果を表２に記載する。
（数１）
ヒアルロン酸ナトリウムの含有量（％）＝ウロン酸（％）×２．０６７５
【００３６】
（試験例７；コンドロイチン硫酸含有量の測定）
１．トリス塩酸緩衝液
トリス０．２１ｇ及び無水酢酸ナトリウム０．８２ｇに１５ｍＬの水を加えて溶解した後に、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加えてｐＨ８．０に調整した。その後、水を加えて全量を２５ｍＬとすることにより、トリス塩酸緩衝液を調製した。
２．測定用溶液の調製
コンドロイチン硫酸標準品に水を加えて、１ｍＬ中にコンドロイチン硫酸を８０μｇ含有するコンドロイチン硫酸標準液を調製した。
実施例１及び２の各試料２５．０ｍｇに水を加えて２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
３．測定用溶液の前処理
上記調製した試料溶液とコンドロイチン硫酸標準液を、それぞれ０．２０ｍＬずつ２ｍＬの試験管に採取した。コンドロイチナーゼＡＢＣを０．２単位加えて、さらにトリス塩酸緩衝液を０．２０ｍＬ加えて攪拌した後、３７℃の恒温槽で１時間保温した。次いで、沸騰水で３分間加熱した後、冷却して測定用溶液の前処理を行った。
４．コンドロイチン硫酸含有量の測定
前処理を行なった試料溶液及び対照品溶液を、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行なった。各試料のピーク面積から実施例１及び２のコンドロイチン硫酸含有量を算出した。結果を表１に記載する。
ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｗａｔｅｒｓ高性能糖分析カラム（６０Å、４μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
移動相；混合塩溶液（リン酸水素二ナトリウム１．５６ｇ、硫酸アンモニウム３．９６ｇを秤量し、水を加えて１０００ｍＬにメスアップして調製した。）
波長；２３０ｎｍ
理論段数；４０００以上（４ｓピークと６ｓピークの分離度は２以上）
【００３７】
（試験例８；ペプチド含有量の測定）
試験例２と同様の方法で、実施例１及び２のペプチド含有量を測定した。結果を表１に記載する。
【００３８】
【表１】
2005137334.tif 000002
【００３９】
【表２】
2005137334.tif 000003
【００４０】
以下、本発明に係る製造方法で得られたムコ多糖を用いた製剤の処方例を示す。
（処方例１；錠剤）
実施例２で得られたムコ多糖８０ｇ、澱粉１５０ｇ、ラクトース６０ｇ、デキストリン３０ｇ、メチルセルロース１５ｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｇ、澱粉ムチン質１５ｇ、硫酸カルシウム２０ｇを混合した後、造粒して錠剤（１０００錠）を調製した。
【００４１】
（処方例２；錠剤）
実施例２で得られたムコ多糖５０ｇ、澱粉１００ｇ、ショ糖４０ｇ、デキストリン２０ｇ、カルボキシメチルメチルセルロースナトリウム１０ｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｇ、澱粉ムチン質２０ｇを混合した後、造粒して錠剤（１０００錠）を調製した。
【００４２】
（処方例３；カプセル剤）
実施例２で得られたムコ多糖２００ｇ、澱粉２００ｇをよく混合した後、空のカプセルに充填してカプセル剤（１０００個）調製した。