(57)【要約】【課題】  多種類の抗原を含み、低い免疫原性の抗原に対しても高い免疫効果を有する、免疫効果の優れた温熱細胞ワクチンとサイトカインのキットを提供することである。【解決手段】  生物個体から細胞を採取すること、該細胞を温熱処理すること、ヒートショックプロテインを発現すること、処理された該細胞を溶解すること、を含む温熱細胞ワクチンの調製方法に関する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物個体から細胞を採取すること、該細胞を温熱処理すること、ヒートショックプロテインを発現すること、処理された該細胞を溶解すること、を含む温熱細胞ワクチンの調製方法。
【請求項２】
細胞の温熱処理が４２〜６０℃、１５〜６０分間の温度処理である、請求項１に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法。
【請求項３】
ヒートショックプロテインを発現することが、上記記載の温熱処理後の細胞を、３７〜４５℃において、０．５〜７２時間の培養である、請求項１または２に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法。
【請求項４】
ヒートショックプロテインがＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、またはｇｐ９６である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法により調製された温熱細胞ワクチン。
【請求項６】
サイトカインを有効成分として含む、請求項５に記載の温熱細胞ワクチンの投与後の生物個体のための温熱細胞ワクチンの免疫増強剤。
【請求項７】
請求項６に記載のサイトカインがＩＬ−１２である温熱細胞ワクチンの免疫増強剤。
【請求項８】
請求項５に記載の温熱細胞ワクチンと請求項６に記載の温熱細胞ワクチンの免疫増強剤を含むキット。
【請求項９】
請求項５に記載の温熱細胞ワクチンと請求項７に記載の温熱細胞ワクチンの免疫増強剤を含むキット。
【請求項１０】
ガンの予防または治療のための請求項５に記載の温熱細胞ワクチン。
【請求項１１】
ガンの予防または治療のための請求項８または９に記載のキット。
【請求項１２】
請求項５もしくは１０に記載の温熱細胞ワクチンまたは請求項８、９もしくは１１のいずれか１項に記載のキットを含む医薬用組成物。
【請求項１３】
請求項５もしくは１０に記載の温熱細胞ワクチンまたは請求項８、９もしくは１１のいずれか１項に記載のキットを接触させることを含む養子免疫療法剤のための免疫細胞の調製方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載に方法により調製された免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン療法、特にガン治療に利用できるガン細胞の温熱細胞ワクチンとサイトカインを含む医薬用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
外科手術、化学療法、放射線療法に続く第四のガン治療法として、免疫療法が盛んに研究されている。免疫療法には、非特異的免疫賦活剤を用いた治療、サイトカイン療法、養子免疫療法、モノクローナル抗体療法、遺伝子治療などがあり、その１つにガン特異抗原の投与によるガン特異的免疫の誘導を目的としたワクチン療法も含まれる。そして、これまでにヒトのガン抗原となりうるタンパク質のエピトープ（ガン抗原ペプチド）が数多く同定され、それらのガン抗原ペプチドを利用したワクチン療法が行われてきた。しかし、ガン抗原の種類は患者によって個体差があることから、同定したガン抗原ペプチドを一種類だけ投与してもほとんど抗腫瘍効果はなく、多種類の抗原ペプチドを含む混合物が望まれている。また、患者のガン細胞は、その患者固有のガン抗原ペプチドを含んでいることからガン細胞自体をワクチンとして使用する方法もある。この場合、ガン細胞を凍結融解等の処理を施して、細胞溶解液の状態でワクチンとして用いる。この方法では多種類かつ患者固有のガン抗原を含む可能性はあるが、細胞溶解液中に占めるガン特異的抗原タンパク質の量は低く、一方、投与できるタンパク質の量には限界があるため、ガンに対する高い特異性免疫が得られず抗腫瘍効果が得られないといった問題が生じている。こういったワクチン療法の問題点を解決するために多様なガン抗原ペプチドを多量に含むワクチンの開発が望まれている。
【０００３】
ヒートショックプロテイン（Heat shook protein、HSP）は温熱等のストレスで発現するタンパク質ファミリーである。ＨＳＰの中でもＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６等は、ガン細胞内で抗原ペプチドと結合しており、ガン細胞から放出されると抗原提示細胞に取り込まれ、抗原ペプチドの提示を促進する事が知られている。そして、我々は今までに、温熱処理を施したガン細胞でＨＳＰ７０の発現が上昇し、これをラットに移植した場合には、その生着が抑制されること（非特許文献１）、さらには、ラットに移植したガン細胞を温熱処理すると宿主の抗腫瘍免疫が強く誘導され、その後に移植したガン細胞の生着が強く抑制されることを報告した（非特許文献２）。しかしながら、ＨＳＰ７０を多量に発現させたガン細胞を直接接種して、強い抗腫瘍効果を得られるか否かは不明であった。そこで、本願発明者等は、本願発明において、感染症に対するワクチン接種のように、温熱処理したガン細胞溶解液（以後、感染症に対するワクチン接種のように生物個体へ接種するガン細胞を含む温熱処理した細胞の溶解液を温熱細胞ワクチンと呼ぶ。）をラットおよびマウスへ接種することにより、移植ガン細胞に対する抗腫瘍効果が誘導できることを明らかとした。しかしながら、この温熱細胞ワクチンの抗腫瘍効果は一定のガン細胞には有効であっても、必ずしもすべてのガン細胞に適用できるとは限らないことも明らかとなった。そして、その原因が抗原の免疫原性の低さにあることを見出した。そこで、さらに温熱細胞ワクチンの免疫効果を増強できる物質の探索を行い、サイトカインの一つであるインターロイキン１２に、温熱処理しない細胞のワクチンには効果はないが、温熱処理した細胞の温熱細胞ワクチンには免疫増強効果のあることを見出した。
【非特許文献１】Ito A, Shinkai M, Honda H, Wakabayashi T, Yoshida J, Kobayashi T. Augmentation of MHC class I antigen presentation via heat shock protein expression by hyperthermia. Cancer Immunol Immunother. 2001 Dec; 50(10): 515-22.
【非特許文献２】Ito A, Shinkai M, Honda H, Yoshikawa K, Saga S, Wakabayashi T, Yoshida J, Kobayashi T.  Heat shock protein 70 expression induces antitumor immunity during intracellular hyperthermia Using magnetite nanoparticles. Cancer Immunol Immunother. 2003 Feb; 52(2): 80-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、多種類の抗原を含み、低い免疫原性の抗原に対しても高い免疫効果を有する、免疫効果の優れた温熱細胞ワクチンとサイトカインのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者等は、ＨＳＰタンパク質を誘導させた細胞の溶解物が高い免疫効果を有すること、そして抗原の免疫原性が低い場合にも、サイトカインを併用することで、未処理の細胞ワクチンには見られない、免疫増強効果を見出し、多種類の抗原を含み、高い免疫効果の得られる、抗腫瘍効果に優れた温熱細胞ワクチンとサイトカインを含むキットの開発に成功した。すなわち、
（１）本発明は、生物個体から細胞を採取すること、該細胞を温熱処理すること、ヒートショックプロテインを発現すること、処理された該細胞を溶解すること、を含む温熱細胞ワクチンの調製方法に関する。
（２）本発明は、細胞の温熱処理が４２〜６０℃、１５〜６０分間の温度処理である、（１）に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法に関する。
（３）本発明は、ヒートショックプロテインを発現することが、上記記載の温熱処理後の細胞を、３７〜４５℃において、０．５〜７２時間の培養である、（１）または（２）に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法。
（４）本発明は、ヒートショックプロテインがＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、またはｇｐ９６である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法に関する。
（５）本発明は、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の温熱細胞ワクチンの調製方法により調製された温熱細胞ワクチンに関する。
（６）本発明は、サイトカインを有効成分として含む、（５）に記載の温熱細胞ワクチンの投与後の生物個体のための温熱細胞ワクチンの免疫増強剤に関する。
（７）本発明は、（６）に記載のサイトカインがＩＬ−１２である温熱細胞ワクチンの免疫増強剤に関する。
（８）本発明は、（５）に記載の温熱細胞ワクチンと（６）に記載の温熱細胞ワクチンの免疫増強剤を含むキットに関する。
（９）本発明は、（５）に記載の温熱細胞ワクチンと（７）に記載の温熱細胞ワクチンの免疫増強剤を含むキットに関する。
（１０）本発明は、ガンの予防または治療のための（５）に記載の温熱細胞ワクチンに関する。
（１１）本発明は、ガンの予防または治療のための（８）または（９）に記載のキットに関する。
（１２）本発明は、（５）もしくは（１０）に記載の温熱細胞ワクチンまたは（８）、（９）もしくは（１１）のいずれか１項に記載のキットを含む医薬用組成物に関する。
（１３）本発明は、（５）もしくは（１０）に記載の温熱細胞ワクチンまたは（８）、（９）もしくは（１１）のいずれか１項に記載のキットを接触させることを含む養子免疫療法剤のための免疫細胞の調製方法に関する。
（１４）本発明は、（１３）に記載に方法により調製された免疫細胞に関する。
【発明の効果】
【０００６】
ワクチンの抗原として、細胞を溶解液の状態で用いることにより多種類かつ患者固有の抗原を含むことが可能となり、細胞に温熱処理を施すことにより抗原提示能力を促進するヒートショックプロテインの発現を誘導し、さらにサイトカインを併用することで未処理の細胞ワクチンには見られない、免疫効果のさらなる増強が図られることで、少ない量の抗原や免疫原性の低い抗原に対しても優れた免疫効果を有する温熱細胞ワクチンとサイトカインのキットの作製が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
・本発明で用いられる生物個体は、感染症またはガンを患っているヒトであることが好ましい。
【０００８】
・本発明で用いられる生物個体から採取される細胞は、採取されたそのままの細胞でも、培養された細胞でも、株化されている細胞でも構わないが、感染症またはガンを患っているヒトの病部に由来する細胞であることが好ましく、特にガン細胞であることが好ましい。
【０００９】
・本発明で用いられる細胞の温熱処理の好ましい条件は、４２〜６０℃、１５〜６０分間で、より好ましくは４２〜４５℃、３０〜６０分間で、特に好ましいのは４３℃、３０分間の温度処理である。なお、細胞を温熱処理する以外にも、ヒートショックプロテインの発現を誘導できれば、放射線照射処理；ケラニルゲラニルアセトン処理；レチノイン酸等のイソプレノイド処理；工クノール等の低級脂肪族アルコール処理；亜鉛、カドミウム等の重金属イオン処理；砒素処理；セレン処理；腫瘍壊死因子α、インターフェロンβ等のサイトカイン処理；シスプラチン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、アドリアマイシン、ゲルダナマイシンまたはヘルビマイシナド等の抗ガン剤処理;リドカイン等の局所麻酔剤処理等でも構わず、またＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６等のＨＳＰ自身の細胞へ直接投与してもよい。
【００１０】
・本発明で用いられるヒートショックプロテインを発現することは、細胞に温熱処理等の刺激を与えた後、該細胞を一定条件で培養することにより行われる。従って、本発明で用いられる、温熱処理後に、培養することによるヒートショックプロテインの発現を行うための条件は、５％二酸化炭素付加型インキュベーター内での３７〜４５℃、０．５〜７２時間が好ましいが、より好ましくは３７〜４３℃、６〜４８時間で、特に好ましいのは３７℃、１２時間の培養である。
【００１１】
・本発明で用いられる発現されるヒートショックプロテインは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ１１０、ＨＳＰ２７等が挙げられるが、好ましくは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６である。
【００１２】
・本発明で用いられる細胞の溶解は、好ましくは煮沸処理、凍結融解処理があるが、凍結融解処理がより好ましい。
【００１３】
・本発明に用いる凍結融解処理は、細胞を３７℃に保ったウォーターバスと液体窒素の中に交互に、好ましくは１〜１０回、より好ましくは３〜７回、特に好ましくは５回、繰り返し浸すことで凍結融解し、細胞を破壊することである。
【００１４】
・本発明に用いる温熱細胞ワクチンと併用されるサイトカインには、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２等のインターロイキン類；ＩＦＮβ、ＩＦＮγ等のインターフェロン類；ＴＮＦα等の腫瘍壊死因子類；穎粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子類；ＨＳＰ７０等のＨＳＰ類が挙げられるが、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦであり、より好ましくは、ＩＬ−１２である。そして、由来は、生物の種類は問わないがヒト由来が好ましく、また、天然由来でも、遺伝子組換え体でも構わないが、純度、価格の点から遺伝子組換え体が好ましい。
【００１５】
・本発明に用いるマウスにおけるＩＬ−１２の投与の条件は、好ましくは０．１〜１０μg／回であり、より好ましくは、細胞融解物を投与直後に４μg／回の投与を行うことが好ましい。
【００１６】
・本発明に用いるマウスにおける１回のワクチンに用いる細胞の数は、好ましくは１×１０4個〜１×１０10個、より好ましくは５×１０5個〜１×１０6個である。
・本発明に用いるワクチンは、ウイルス、細菌、真菌等の感染症およびガンの予防又は治療に用いることができるが、より好ましい使用は、外科切除後の転移しているガンや転移しようとしているガンに対する予防および治療への使用である。
【００１７】
・本発明で用いられる養子免疫療法とは、ヒト・リンパ球をＩＬ−２やＩＬ−４などの存在下で培養し腫瘍細胞に対して非特異的な細胞障害活性を示すキラー細胞を誘導し、この細胞を患者に戻してガン治療に応用しようというガン治療法の一つを意味する。
【００１８】
・本発明で用いられる養子免疫療法の免疫細胞には、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞）、マクロファージ（樹状細胞、を含む）、ＮＫ細胞、キラー細胞（ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ細胞を含む）、食細胞、ランゲルハンス細胞等が含まれる。
【実施例】
【００１９】
１．ガン細胞の培養
ガン細胞は悪性黒色腫であるマウスＢ１６メラノーマ細胞および神経膠腫であるラットＴ−９グリオーマ細胞を用いた。継代は１０mlの培地を入れた１００mm組織培養皿（旭テクノグラス）を用い、５％二酸化炭素のインキュベーターにて３７℃で培養した。培地は、Ｂ１６細胞はダルベッコ改変イーグル培地（Gibco BRL）に１０％のウシ胎児血清と抗生物質としてペニシリンＧカリウム（１００U/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（９０mg/ml）を含む培地、Ｔ−９細胞はイーグル最少培地（Gibco BRL）に１０％のウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、抗生物質としてペニシリンＧカリウム（100U/ml）、ストレプトマイシン硫酸塩（９０mg/ml）を含む培地を用いた。
【００２０】
２．温熱処理の方法
サブコンフルエント状態になった細胞を、ウォーターバス（PROTERMO BATH, 東京理化機械）であらかじめ温めておいた一定温度（４１℃、４３℃、４５℃）の湯の中に、皿ごと一定時間（３０分、６０分、１２０分）浸した後、３７℃の５％二酸化炭素付加インキュベーター内で一定時間（１２時間、１８時間、２４時間）静置した。
【００２１】
３．ガン細胞の集め方
細胞をトリプシン処理により皿からはがし、培地を４〜５ml入れて酵素反応を止めた。細胞懸濁液を遠沈管（IWAKI）に集め、遠心分離（１０００回転、５分）で細胞を沈降させ、培地を除いた。その後、細胞はＰＢＳ １０mlに懸濁し、遠心分離（１０００回転、５分）でＰＢＳを除くことにより洗浄した。これを２回繰り返して、得られた細胞のペレットをＰＢＳに懸濁した。その後セルカウントして、細胞を遠沈管に移した。
【００２２】
４．ワクチンの作製
Ｂ１６細胞を４３℃で３０分間あるいはＴ−９細胞を４３℃で６０分間温熱処理した後、Ｂ１６細胞５×１０5個あるいはＴ−９細胞１×１０6個を３７℃に保ったウォーターバスと液体窒素の中に交互に（５回繰り返し）浸すことで凍結融解し、細胞を破壊した。この融解物を温熱細胞ワクチンとした。
【００２３】
５．マウスヘの投与方法
マウスはＣ５７ＢＬ／６（メス４〜６週齢）、ラットはＦ３４４（メス６週齢）を用い、投与の際にはネンブタールで麻酔した。温熱細胞ワクチンは、１週間ごとに２回、あらかじめ剃毛しておいた右後背部の皮下に注射器（２９Ｇ×１／２″、ベクトンディッキンソン）で投与した。２回目の投与から１週間後、Ｂ１６細胞（５×１０5個）あるいはＴ−９細胞（１×１０6個）を剃毛した左後背部の皮下に注射器で移植した。その後、腫瘍がいつ生着するかを測定した。腫瘍直径が２mm以上となった時点を生着とみなした。
【００２４】
６．サイトカインの調製
サイトカインは、ＩＬ−２（ヒト組換え体，Wako）、ＩＬ−１２（マウス組換え体，Wako）を使用した。それぞれ４０μg/mlの濃度になるようにＰＢＳで溶解した。
【００２５】
７．サイトカインの投与
１回目にワクチンを投与した直後に投与した。サイトカインが４μgとなるように溶液から１００μlをとり、注射器でマウスの腹腔に投与した。
【００２６】
８．ＨＳＰ７０の定量法
Ｂ１６細胞がＨＳＰ７０を高発現する温熱条件を、ＥＬＩＳＡ法によって検討した。ＨＳＰ７０  ＥＬＩＳＡキット（ストレスジェン）を用い、ＨＳＰ７０を定量した。検討した条件は、ウォーターバスで温熱する温度（４１℃、４３℃、４５℃）と時間（３０分、６０分、１２０分）と温熱後インキュベートする時間（１２時間、１８時間、２４時間）である。
【００２７】
結果
温熱条件の検討
Ｂ１６細胞のＨＳＰ７０が高発現する温熱条件をＥＬＩＳＡ法で検討した。温熱する温度、時間、温熱後のインキュベート時間について、ＨＳＰ７０発現量を比較した結果を図１に示す。まず４１℃、４３℃、４５℃でＨＳＰ７０量を比較した。温熱していない（３７℃）ものに比べ、４３℃で温熱したものでは細胞中のＨＳＰ７０発現量が顕著に上昇し、４５℃で温熱したものでは細胞がほほとんど死滅しており、ＨＳＰ７０もほとんど検出されなかった。温熱時間は３０分間、６０分間、１２０分間で検討し  ＨＳＰ７０発現量を比較したところ、３０分間の加温でＨＳＰ７０発現量が顕著に上昇L, ６０分間、９０分間の加温では細胞が死滅していたことからＨＳＰ７０発現量は減少していた。１２時間、１８時間、２４時間のインキュベート時間におけるＨＳＰ７０発現量を比較Lたところ、温熟後１２時間でＨＳＰ７０発現量が最大となり、時間が経過するにつれてＨＳＰ７０量は減少した。したがって、Ｂ１６細胞にＨＳＰ７０を高発現させる条件は、４３℃、３０分間の温熱後、１２時間のインキュベートすることとし、これを凍結融解後に、ＨＳＰ７０の発現を確認し、温熱細胞ワクチンとした。
また、図に示していないがＴ−９細胞のＨＳＰ７０の高発現条件についてもＢ１６細胞の場合と同様に、４３℃、６０分間の温熱後、１２時間インキュベートすることとし、これを凍結融解後に、ＨＳＰ７０の発現を確認し、温熱細胞ワクチンとした。
【００２８】
温熱細胞ワクチンの効果
温熱細胞ワクチンを投与したラットおよびマウスと、コントロールとしてＰＢＳを投与したラットおよびマウス間で、移植したガン細胞の生着までの期間を比較し、ワクチン効果を検討した。ここでは、免疫原性の高いガン細胞であることが知られるラットＴ−９グリオーマ細胞も用いた。図２において、ガン細胞移植後の経過日数に対し、腫瘍が生着しなかったラット（Ｔ−９）あるいはマウス（Ｂ１６）の割合を示した（ｎ＝５）。Ｔ９グリオーマ細胞では、コントロール群では全てのラットが腫瘍を形成したのに対して、ワクチン投与群においては６０％が腫瘍を形成しなかった。これより、Ｔ９グリオーマ細胞においては、ワクチンの効果が認められた。
一方、悪性度の非常に高い（免疫原性の低い）マウスメラノーマ細胞であるＢ１６細胞の場合、ワクチン投与群においても腫瘍形成を認めなかったマウスはなく、腫瘍生着の遅れもコントロール群と比べて２、３日程度でしかなかったので、Ｂ１６細胞におけるワクチンの効果はほとんどみられなかったと判断された。
【００２９】
サイトカイン併用によるワクチン効果の検討
Ｂ１６メラノーマは非常に免疫原性が低いガン細胞であり、ヒトの末期ガンの状態に近いモデルであると考えられている。そこで、Ｂ１６メラノーマに対するワクチンの効果を高める物質の探索を行い、このような悪性度の高いガンに対しても効果があるワクチンの開発を行った。温熱細胞ワクチンを投与したマウスにサイトカインを併用し、ワクチン効果を検討した（図３）。サイトカインとして、免疫系を全般的に活性化する作用のあるＩＬ−２、あるいは特に細胞性免疫等を活性化するＩＬ−１２を用いた。ＩＬ−２との併用においては、無処理マウスに比べて、温熱細胞ワクチンを投与したマウスと温熱なしの細胞ワクチンを投与したマウスの両方で生着の遅れが見られ、共にある程度のワクチン効果が認められた。しかし、ＨＳＰを高発現させた温熱細胞ワクチンとＨＳＰ発現のない温熱なし細胞ワクチン間には効果の差はそれほど見られなかった。一方、驚くべきことに、温熱細胞ワクチンはＩＬ−１２との併用によって特異的にワクチン効果が増強されるといった結果が得られた。すなわち、ＩＬ−１２との併用では、温熱なし細胞ワクチン投与群はほとんど効果が見られなかったのに対し、温熱細胞ワクチン投与群では、無治療群あるいは温熱なし細胞ワクチン投与群と比較して、温熱細胞ワクチン投与群で有意に腫瘍形成が抑制され、５匹中１匹は腫瘍が全く形成されないといった、温熱細胞ワクチンとの併用においてのみ有効な格別の効果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
外科手術、化学療法、放射線療法に続く第四のガン治療法に対するワクチンとして用いることが出来る。特に、外科切除後の転移しているガンや転移しようとしているガンに対する治療での使用が有効である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】温熱条件の検討。Ｂ１６細胞のＨＳＰ７０が高発現する温熱条件をＥＬＩＳＡ法で検討した。温熱する温度、時間、温熱後のインキュベート時間について、ＨＳＰ７０発現量を比較した結果を示す。温熱温度の図では、温熱時間、温熱後のインキュベート時間はそれぞれ３０分、１２時間である。温熱時間の図では、温熱温度、温熱後のインキュベート時間はそれぞれ４３℃、１２時間である。インキュベート時間の図では、温熱時間、温熱温度はそれぞれ３０分、４３℃である。
【図２】温熱細胞ワクチンの効果。ガン細胞をマウスに移植してから生着するまでの期間を、調製した温熱細胞ワクチン投与マウスとコントロールとしてＰＢＳ投与マウス間で比較したワクチン効果を示す。
【図３】サイトカイン併用によるワクチン効果。温熱細胞ワクチンを投与したマウスにサイトカインを併用した時のワクチン効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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