(57)【要約】【課題】  アブラナ科植物病害である根こぶ病害に対して防除効果が高く、環境汚染のないアブラナ科病害の防除剤および防除方法を提供する。【解決手段】  アブラナ科植物根こぶ病害に対して拮抗能を有するバリオボラックス属細菌CGF4526を有効成分として含む防除剤をアブラナ科植物と接触させることで解決される。本発明の防除剤は、播種時の育苗培土に混合したり、播種前後の種子にかん注することができる。さらに定植前の苗の根をその希釈液に浸漬したり、育苗中または定植直前の苗にかん注する方法も可能である。本発明により、ハクサイ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリーなどのアブラナ科植物の根こぶ病害を、環境汚染の問題もなく、強く防除できる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アブラナ科植物の根こぶ病害に対して拮抗能を有するバリオボラックス属細菌CGF4526株(Variovorax sp. CGF4526)。
【請求項２】
アブラナ科植物の根こぶ病害に対して拮抗能を有するバリオボラックス属細菌CGF4526株(Variovorax sp. CGF4526)を有効成分として含む防除剤。
【請求項３】
バリオボラックス属細菌CGF4526株(Variovorax sp. CGF4526)をアブラナ科植物に接触させることを特徴とする、アブラナ科植物の根こぶ病害の防除方法。
【請求項４】
アブラナ科植物がハクサイ、キャベツ、カリフラワーまたはブロッコリーである、請求項３に記載の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、学名バリオボラックス属(Variovorax)に属する細菌を用いたアブラナ科植物病害の防除剤および防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ科植物病害の主要な土壌病害である根こぶ病は、ハクサイ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリーなどアブラナ科植物３００種以上の植物に発生する土壌糸状菌病害である。根こぶ病は、これらアブラナ科作物の安定した生産に支障をきたしている。病徴としては、植付け後２０日位から根にこぶが生成し、初期から感染した場合にはハクサイやキャベツでは結球せず、後半以降に感染した場合でも収穫物が大きくならず、全く収穫が得られないことも見られる。
【０００３】
現在、アブラナ科植物の根こぶ病害の防除には、土壌消毒剤としていくつかの化学薬剤が使用されている。しかし、これらの化学薬剤には、環境上の問題や使用者及び近隣住民への安全性の問題、さらに近年の消費者の減農薬・無農薬指向に合致しないというような問題がある。更には、病原菌の菌密度が高い場合には、効果が劣ることも稀ではない。
【０００４】
そこで、この病害の防除には、防除効果が高く、水質汚染などの環境汚染及び安全性を満足する防除剤の開発が望まれている。
【０００５】
これまでにアブラナ科植物根こぶ病に対しての生物防除法は、糸状菌(非特許文献１)やバチルス属細菌（特許文献１）がある。また本願に関連する技術として、特許文献２において、シュードモナス属ベトナミエンシス（Pseudomonas  vietnamiensis）に属する微生物が、ハクサイ等のアブラナ科植物の黄化病（バーティシリウム病害）に防除効果を有することが開示されている。
【非特許文献１】日植病報第６２巻、１９９６年、ｐ．２８１
【特許文献１】特開平１１−３３５２１７
【特許文献２】特開２００３−２３１６０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、アブラナ科植物病害であるハクサイ根こぶ病、キャベツ根こぶ病等のアブラナ科根こぶ病に対して防除効果が高く、環境汚染のない防除剤および防除方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ハクサイ等アブラナ科植物の根こぶ病に対して高い防除効果を有するバリオボラックス属細菌CGF4526株(Variovorax sp. CGF4526)を見出し、本細菌を有効成分とする防除剤を、アブラナ科植物に接触させることで、根こぶ病害の防除を特に効果的に行えることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
なお、本出願人は、アブラナ科植物の根こぶ病に対して高い防除効果を有するアシドボラックス属デラフィールデイ(Acidovorax delafieldii)に属する微生物を見いだし、既に特許出願をしている（特願２００２−１５８５６５）。また、同じくアブラナ科植物の根こぶ病に対して高い防除効果を有するシュードモナス属ベトナミエンシス（Pseudomonas  vietnamiensis）に属する細菌を見出し、特許出願している（特願２００３−１７１２５１）。
【０００９】
本発明に係るバリオボラックス属細菌CGF4526株(Variovorax sp. CGF4526)は、アブラナ科植物の根こぶ病害を効果的に防除するのみならず、保存安定性にも優れ、植物の生長を促進する作用も併せ持ち、農薬としての高い実用性を有している。
【００１０】
すなわち本発明は、バリオボラックス属(Variovorax)菌株並びにその生菌を有効成分として含有することを特徴とするアブラナ科植物根こぶ病の防除剤並びにそれを用いたアブラナ科植物根こぶ病害の防除方法である。
【００１１】
本発明の微生物は、アブラナ科植物根こぶ病害に対して高い防除効果を有するバリオボラックス属細菌CGF4526(Variovorax sp. CGF4526)菌株である。
【００１２】
バリオボラックス属細菌CGF4526(Variovorax sp. CGF4526)は、イネや野菜から分離収集した約７０００菌株の細菌から、糸状菌に対する抗菌活性、さらにポット栽培ハクサイによる病害防除検定試験による選抜の結果得られた菌株である。
【００１３】
バリオボラックス属細菌CGF4526(Variovorax sp. CGF4526)は、光学顕微鏡および電子顕微鏡での形態観察の結果、細胞の大きさは、１〜３μｍの桿菌であり、細胞の多形性はなく、いずれも運動性を有していた。グラム反応は、陰性で、内胞子は形成しなかった。
【００１４】
その他の細菌学的性質について、以下に示す。
１．培養的性質
CGF4526の栄養寒天培地における生育状態を以下に示す。観察は、３０℃、３日間培養後に行った。
【００１５】
CGF4526のコロニー形態は、クリーム色、円形、全縁滑らか、低凸状、光沢ありである。
２．一般的性質
【００１６】
【表１】
2005137330.tif 000002
【００１７】
３．１６ｓ−ｒＲＮＡ分析
１６ｓ−ｒＲＮＡの塩基配列１５３０ｂｐを決定した。解析は得られた１６ｓ−ｒＲＮＡの塩基配列を用いて相同性検索を行った結果、相同率の上位はバリオボラックス・パラドキサス（Variovorax  paradoxus）であった。
【００１８】
以上の細菌学的性質により、CGF4526は、運動性を有するグラム陰性の桿菌で、カタラーゼ活性陽性、オキシダーゼ活性陽性、内胞子を形成しないことにより、シュードモナスグループに属する細菌であり、資化性からシュードモナスグループＩＩに属する細菌に分類された。また、１６ｓ−ｒＲＮＡ解析から、バリオボラックス属細菌に属することがわかった。なお、バリオボラックス属の中では、バリオボラックス・パラドキサス（Variovorax  paradoxus）と考えられるものの、断定するには至っていないために、バリオボラックス・エスピー（Variovorax  sp.）とした。
【００１９】
本発明の該当菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、以下の寄託番号を得ている。
【００２０】
バリオボラックス属細菌CGF4526(Variovorax sp. CGF4526)：FERM P-19563
【発明の効果】
【００２１】
本発明におけるアブラナ科植物根こぶ病害の防除剤または防除方法を用いれば、アブラナ科植物根こぶ病の病害に対して発病を強く抑制することができ、現在使用されている化学薬剤と同等以上の効果を奏する。また、本発明の防除剤の使用は既存の化学薬剤のように農薬による環境汚染を引き起こすことはない。さらに、本発明の防除剤は市場において安定な状態で流通させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に、これらの菌の培養および防除剤としての製剤は、慣用の手法で行うことができるが、以下に例をもって説明する。ここで使用する培地は菌が増殖するものであれば特に限定するものではない。生育に可能な炭素源、窒素源、無機物を適当に含有している培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。培地としてはブイヨン培地、キングＢ培地、ＰＳ培地、ＰＤＢ培地などが例示できる。以上のような培地で１５〜４２℃好ましくは２８℃〜３５℃で１２〜４８時間培養し増殖させたのちに遠心分離機もしくは膜濃縮機により濃縮して集菌を行い培地成分を取り除く。この操作により菌体の濃度は通常１〜50×1010cfu/ml程度に濃縮される。本発明の防除剤は、培養後の生菌をそのまま使用しても良いが、一般には農薬として使用可能な固体または液体の製剤として使用される。したがって、培養した湿菌体に糖類とグルタミン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム緩衝液からなる保護剤を加え、真空乾燥するものである。
【００２３】
真空乾燥する前に保護剤と混合した菌体を予備凍結し、凍結したまま真空乾燥することが菌の生存率を維持するためには好ましい。なお、保護剤は水溶液の状態で菌体と混合してもよく、固体のまま混合してもよい。
【００２４】
本発明の菌体の固定化は、保護剤としてサッカロース、フルクトース、グルコースおよびソルビトールの一種または二種以上からなる糖類を用いることで行い、菌体と混合し、真空乾燥もしくは凍結真空などの方法で乾燥することによって行うことができる。
【００２５】
ここで培養したバリオボラックス属細菌CGF4526株は、しかるべき担体と混合し、粉剤もしくは粒剤とすることができる。この場合の担体には、タルク、炭酸カルシウム、ケイソウ土等の鉱物性粉末や、ピートモス、さらには、ポリビニルアルコールなどの高分子化合物、ザンサンゴムやアルギン酸などの天然高分子化合物などがある。菌体の濃度は、105cfu/g以上、好ましくは107cfu/g以上とする。水和剤の場合には、109cfu/g以上、好ましくは1010cfu/g以上とする。
【００２６】
一般にハクサイ、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリーなどアブラナ科植物の生産は育苗トレイに播種し、３〜５週間育苗した後に、畑に定植を行う。本発明の防除剤は、薬害の問題もなく使用できる。本発明の防除剤は、播種時の育苗培土に混合したり、播種前後の種子にかん注することができる。さらに定植前の苗の根をその希釈液に浸漬したり、育苗中または定植直前の苗にかん注する方法も可能である。播種時及び定植時の両方の処理を組み合わせると根への本菌の定着がより効率的になるため好ましい。
【００２７】
本発明の防除剤を上記方法で使用する場合、育苗培土への混合処理の場合は、土壌１L当りに１ｇ以上混合し、均一になるように撹拌する。培土中の菌濃度は106cfu/g以上、好ましくは107cfu/g以上になるように調整する。
【００２８】
また、育苗された苗を播種前後もしくは定植前に本防除剤希釈液に浸漬処理する場合の希釈液の菌濃度は107cfu/ml以上、好ましくは108cfu/ml以上になるように調整する。
【００２９】
次に、バリオボラックス属細菌CGF4526の選抜について詳しく記載する。CGF4526は、イネ、野菜および雑草などから分離・収集した細菌の中から糸状菌であるトマト萎凋病菌（Fusarium oxysporum）およびハクサイ黄化病菌（Verticillium daliae）に対する抗菌活性、さらにハクサイ苗を用いた黄化病および根こぶ病ポット検定試験による選抜の結果、ハクサイ黄化病およびアブラナ科植物根こぶ病に対し、防除効果を有することを見出し、選抜された。具体的には、圃場から採取した植物の根を水道水で洗浄した後、根を細かく裁断し、滅菌水に入れ、ミキサーで潰した。その潰した液を、適当に希釈し、ブイヨン寒天培地に塗布し、培養を行った。そこで出現したコロニーを単離、保存し、供試菌株とした。
【００３０】
トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum)およびハクサイ黄化病菌(Verticillium daliae)に対する抗菌活性の測定は、トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum)およびハクサイ黄化病菌(Verticillium daliae)と供試菌株をＰＤＡ培地（ポテトデキストロース培地）上で対峙培養を行うことにより測定した。培養は、２５℃で１週間または3週間行った。
【００３１】
さらに、対峙培養で得られた抗菌活性を有する菌株について、ハクサイ黄化病及びハクサイ根こぶ病に対して防除試験を行った。方法は、供試菌株の108cfu/ml希釈液にハクサイ苗の根を植付け時に２４時間浸漬処理を行い、汚染土壌に植え付けた後、４〜５週間目に発病調査を行った。その結果、根こぶ病を強く抑制することがわかった。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、実施例に用いた培地の組成を次に示す。
ブイヨン培地：肉エキス 3g、ペプトン 10g、NaCl 15g、水１Ｌ、pH7.0
ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース培地）：ポテト滲出液２００ｇ、ブドウ糖２０ｇ、水１Ｌ、ｐＨ５．６）。
【００３３】
〔実施例１〕  ハクサイ根こぶ病に対する防除試験
バリオボラックス属細菌CGF4526株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。この懸濁液に、ハクサイ苗(品種：新理想めぐみ)を浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、汚染土壌に植え付けた。汚染土壌は、ハクサイ根こぶ菌に罹病したハクサイ根(根こぶ付き)をホモジナイズし混和した畑土壌を使用した。33日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表２に示す。
【００３４】
バリオボラックス属細菌CGF4526株の懸濁液の菌濃度は、1×108cfu/mlで行った。その結果、バリオボラックス属細菌CGF4526に高い防除効果が認められた。ハクサイ根こぶ病の検定は根部の根こぶの生成程度から発病度を算出し、評価した。
根部発病指数０；健全、１；根の10%以下に根こぶの付着を認める、２；根の10%から50%に根こぶの付着を認める、３;根の50%以上に根こぶの付着を認める。
発病度＝１００×｛Σ（指数の値）×（各指数に該当する固体数）｝÷｛３×（供試株数）｝。
【００３５】
【表２】
2005137330.tif 000003
【００３６】
〔実施例２〕  ブロッコリー根こぶ病に対する防除試験
バリオボラックス属細菌CGF4526株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、供試菌の懸濁液を調整した。この懸濁液に、ブロッコリー苗(品種：緑帝)を浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、ハクサイ根こぶ病の罹病根の破砕液を混和した汚染土壌を詰めた１０．５ｃｍのポリポットに移植した。約30日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表３に示す。バリオボラックス属細菌CGF4526株の懸濁液の菌濃度は、108cfu/mlで行った。その結果、バリオボラックス属細菌CGF4526に高い防除効果が認められた。
【００３７】
【表３】
2005137330.tif 000004
【００３８】
〔実施例３〕  ハクサイ根こぶ病に対する防除試験(圃場試験)
バリオボラックス属細菌CGF4526株をブイヨン液体培地で２４時間培養し、得られた菌体を遠心により分離し、播種土壌に108cfu/gの菌濃度に混和した。ハクサイ種子（品種；新理想めぐみ）を播種し、３週間育苗した。同様に培養したバリオボラックス属細菌CGF4526株菌の懸濁液（108cfu/ml）を調整し、ハクサイ苗を浸漬し、懸濁液に浸漬したまま２４時間置いた。その後、ハクサイ根こぶ病の罹病根の破砕液を混和した畑に定植した。約65日間後に発病の有無を調査し、防除効果の判定を行った。その結果を表４に示す。その結果、バリオボラックス属細菌CGF4526に高い防除効果が認められた。
【００３９】
【表４】
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