(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含み、
前記糖鎖捕捉段階で用いられる前記糖鎖捕捉物質は、下記式（１）で示される、ジスルフィド結合を介して担体に固定化された構造を有し、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含む分析試料調製方法。
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である。）
【請求項２】
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含み、
前記糖鎖捕捉段階で用いられる前記糖鎖捕捉物質は、下記式（１）で示される、ジスルフィド結合を介して担体に固定化された構造を有し、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含む分析試料調製方法。
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である。）
【請求項３】
請求項１または２に記載の分析試料調製方法において、
前記リンカー部位Ｌが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項４】
請求項３に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質は、下記式（２）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
【化１】
0005115988.tif 000031
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項５】
請求項１または２に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項６】
請求項５に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質が、下記式（３）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
【化２】
0005115988.tif 000032
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項８】
請求項６に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質が、下記式（４）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
【化３】
0005115988.tif 000033
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項９】
請求項８に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉物質が、下記式（５）または（６）の構造を有することを特徴とする分析試料調製方法：
【化４】
0005115988.tif 000034
【請求項１０】
請求項１または２に記載の分析試料調製方法において、
前記リンカー部位Ｌが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の分析試料調製方法において、
前記リンカー部位Ｌが、下記式に示す構造から選ばれる１以上の構造を含むことを特徴とする分析試料調製方法。
【化５】
0005115988.tif 000035
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
前記切出段階では、還元剤の作用により、ジスルフィド結合が切断されることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
前記糖鎖捕捉段階で行われる糖鎖捕捉物質と生体試料との反応は、ｐＨ４〜８の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
前記切出段階で行われる糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出す反応は、ｐＨが中性付近の条件で行われることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
式（１）中の担体が粒子であることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分析試料調製方法において、
式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする分析試料調製方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られる分析試料。
【請求項１８】
下記式（１）で示される構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であってアミノオキシ基またはヒドラジド基からなり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
【請求項１９】
請求項１８に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Ｌが、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【請求項２０】
請求項１９に記載の糖鎖捕捉物質において、
下記式（２）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
【化６】
0005115988.tif 000036
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項２１】
請求項１８に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【請求項２２】
請求項２１に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の糖鎖捕捉物質において、
下記式（３）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
【化７】
0005115988.tif 000037
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項２４】
請求項２２に記載の糖鎖捕捉物質において、
下記式（４）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
【化８】
0005115988.tif 000038
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
【請求項２５】
請求項２４に記載の糖鎖捕捉物質において、
下記式（５）または（６）の構造を有することを特徴とする糖鎖捕捉物質：
【化９】
0005115988.tif 000039
【請求項２６】
請求項１８に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Ｌが、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【請求項２７】
請求項２６に記載の糖鎖捕捉物質において、
前記リンカー部位Ｌが、下記式に示す構造から選ばれる１以上の構造を含むことを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【化１０】
0005115988.tif 000040
【請求項２８】
請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の糖鎖捕捉物質において、
式（１）中の担体が粒子であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【請求項２９】
請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の糖鎖捕捉物質において、
式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であることを特徴とする糖鎖捕捉物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析試料調製方法に関し、特に生体試料から糖鎖を分析するための分析試料として遊離させるための分析試料調製方法に関し、およびこの分析試料調製方法を用いて得られる分析試料に関し、さらにこの分析試料調製方法に使用される糖鎖捕捉物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。【０００３】
生体高分子の中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達，タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。【０００４】
なお、糖鎖とは、グルコース，ガラクトース，マンノース，フコース，キシロース，Ｎ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。【０００５】
例えば、糖鎖を有する生体高分子としては、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のペプチドグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、他の生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。【０００６】
特許文献１には、このような糖鎖と特異的に反応しうる物質が記載されており、これらの物質を用いて糖鎖を分離などする方法が併せて記載されている。
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８６８７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、特許文献１には、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖をこの糖鎖捕捉物質より遊離する（切り出す）ために、トリフルオロ酢酸や酸性樹脂などを用いた酸処理を用いる例が記載されている。このような過酷な条件に糖鎖をさらすことは、生体試料から取り出された糖鎖の末端に結合し、かつ、酸性条件で脱離しやすい性質を持つシアル酸残基の脱離など糖鎖の変性を引き起こすおそれがあり、より穏やかな条件での糖鎖切り出しを行うことが望まれていた。なお、糖鎖に結合するシアル酸の有無および結合場所は、疾患と関連することが多く、シアル酸が完全な状態で糖鎖を分析することが望まれ、分析前の前処理段階でシアル酸の一部でも脱離してしまうと正確な糖鎖情報を得ることができなくなるものである。【０００８】
そこで、本発明は、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、糖鎖捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖の切り出しを穏やかな条件で行うことを可能にする分析試料調製方法、およびこの方法を適用して得られる分析試料、ならびにこの分析試料調製に用いられる糖鎖捕捉物質を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る分析試料調製方法は、
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。【００１０】
また、本発明に係る分析試料調製方法は、
生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階と、
糖鎖捕捉反応後の前記糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階と、
洗浄後に前記糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階と
を含む。【００１１】
前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質はジスルフィド結合を介して担体に固定化されており、前記切出段階はこのジスルフィド結合が切断される反応を含む。
【００１２】
前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉段階で用いられる糖鎖捕捉物質は、下記式（１）で示される構造を有する：
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。
【００１３】
さらに、この分析試料調製方法において、捕捉部位Ａを、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかとする。また、リンカー部位Ｌを、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むようにしてもよい。
【００１４】
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質は、下記式（２）の構造を有してもよい：【００１５】
【化１】
0005115988.tif 000002
【００１６】
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００１７】
前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むようにしてもよい。さらに、この糖鎖捕捉物質のリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含んでいてもよい。【００１８】
さらに、この分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（３）の構造を有してもよい：【００１９】
【化２】
0005115988.tif 000003
【００２０】
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００２１】
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（４）の構造を有してもよい：【００２２】
【化３】
0005115988.tif 000004
【００２３】
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００２４】
さらに、この分析試料調製方法において、糖鎖捕捉物質が、下記式（５）または（６）の構造を有してもよい：【００２５】
【化４】
0005115988.tif 000005
【００２６】
また、前述した分析試料調製方法において、リンカー部位Ｌを、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基とすることができる。さらに、リンカー部位Ｌを、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むようにしてもよい。【００２７】
【化５】
0005115988.tif 000006
【００２８】
また、前述した分析試料調製方法において、切出段階では、還元剤の作用により、ジスルフィド結合を切断してもよい。【００２９】
また、前述した分析試料調製方法において、糖鎖捕捉段階で行われる糖鎖捕捉物質と生体試料との反応を、ｐＨ４〜８の条件で行ってもよい。【００３０】
また、前述のいずれかの分析試料調製方法において、切出段階で行われる糖鎖捕捉物質から糖鎖および／または糖の誘導体を捕捉する部分を含む化合物を切り出す反応を、ｐＨが中性付近の条件で行ってもよい。【００３１】
また、前述した分析試料調製方法において、式（１）中の担体が粒子であってもよい。
また、前述した分析試料調製方法において、式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。【００３２】
本発明に係る分析試料は、前述のいずれかの分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られるものである。【００３３】
本発明に係る糖鎖捕捉物質は、
下記式（１）で示される構造を有することを特徴としている：
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌはリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である）。【００３４】
この糖鎖捕捉物質において、捕捉部位Ａを、アミノオキシ基、ヒドラジド基のいずれかとする。また、リンカー部位Ｌを、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含むようにしてもよい。
【００３５】
あるいは、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（２）の構造を有してもよい：【００３６】
【化６】
0005115988.tif 000007
【００３７】
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００３８】
また、前述の糖鎖捕捉物質において、リンカー部位Ｌが、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を含むようにしてもよい。さらに、このリンカー部位Ｌが、システイン残基および２−アミノベンゾイル基を含むようにしてもよい。
また、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（３）の構造を有してもよい：【００３９】
【化７】
0005115988.tif 000008
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００４０】
また、前述の糖鎖捕捉物質において、下記式（４）の構造を有してもよい：【００４１】
【化８】
0005115988.tif 000009
【００４２】
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。【００４３】
また、この糖鎖捕捉物質において、下記式（５）または（６）の構造を有してもよい：【００４４】
【化９】
0005115988.tif 000010
【００４５】
また、前述した糖鎖捕捉物質において、リンカー部位Ｌを、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基とすることができる。さらに、リンカー部位Ｌを、下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むようにしてもよい。【００４６】
【化１０】
0005115988.tif 000011
【００４７】
また、前述した糖鎖捕捉物質において、式（１）中の担体が粒子であってもよい。
また、前述した糖鎖捕捉物質において、式（１）中の担体が固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質であってもよい。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖の切り出しを穏やかな条件で行うことを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
【図１】本発明に係る分析試料調製方法の実施形態の手順を示すフローチャートである。
【図２】本実施形態に係る分析試料調製方法を適用した装置を示すブロック図である。
【図３】実験例で得られた糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを示す図である。
【図４】実験例で得られた糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのチャートを示す図である。
【図５】図４で得られた目的物のＨＰＬＣによる分離パターンを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下に、本発明の分析試料調製方法およびこの方法を適用して得られる分析試料、ならびにこの方法に用いられる糖鎖捕捉物質について詳細に説明する。【００５１】
図１は、本発明の分析試料調製方法にかかる実施形態として、糖鎖の捕捉、回収・精製の手順を示すフローチャートである。
本実施形態は、生体試料から糖鎖捕捉物質により糖鎖および／または糖の誘導体（以下、単に「糖鎖」ということもある）を捕捉する反応を含む糖鎖捕捉段階としてのステップＳ２０と、糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質を洗浄する洗浄段階としてのステップＳ３０と、洗浄後に糖鎖捕捉物質から糖鎖を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる切出段階としてのステップＳ４０とを含む。【００５２】
以下、図１に示した各ステップについて説明する。
ステップＳ１０では、糖鎖および／または糖の誘導体、例えば糖鎖を含む複合分子、例えば糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質などを含む所定の生体試料から糖鎖を回収・精製するための予備処理が行われる。【００５３】
ここで、生体試料とは、生物由来の糖鎖が結合または付属する材料であれば特にその由来に限定はなく、動物、植物、細菌、ウイルス、培養細胞を問わないが、好ましくは動物由来の体液、例えば全血、血漿、血清、汗、唾液、尿、膵液、羊水、髄液、および動物由来の組織、例えば生検組織診断や手術により採取した試料などがあげられる。また、生体試料には、個体から予め分離されていないものも含まれ、例えば外部から試液が接触可能な粘膜組織、あるいは腺組織、好ましくは乳腺、前立腺、膵臓に付属する管組織の上皮が含まれる。【００５４】
また、生体試料に行う予備処理としては、グリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解および必要に応じてプロテアーゼ処理、細胞破砕、脱脂処理、加熱変性処理が挙げられ、生体試料を予備処理して得られた試料は、溶液、分散液、懸濁液、乾燥体の状態で得られる。なお、予備処理済の生体試料は、そのまま次のステップで用いてもよいし、一度乾燥させて所望の溶液に溶解させてから次のステップで用いてもよい。【００５５】
ステップＳ２０では、ステップＳ１０で得られた予備処理済の生体試料を用いて、特定の糖鎖捕捉物質に糖鎖を捕捉させる糖鎖捕捉反応が行われる。【００５６】
ここで、糖鎖捕捉反応、すなわち糖鎖捕捉物質と予備処理済の生体試料との反応は、予備処理済の試料に糖鎖捕捉物質を導入して、ｐＨが４〜８の条件にて、また反応温度が４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃の条件における反応系で、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間行われる。【００５７】
この反応で用いられる糖鎖捕捉物質は、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する物質であり、このアミノオキシ基またはヒドラジド基が、水溶液などの溶液中で糖鎖より形成される環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して特異的、かつ、安定な結合を形成して、糖鎖を捕捉することができるようになる。例えば、アミノオキシ基を例にとり、糖鎖捕捉反応とは、以下に示すような反応をいう。【００５８】
【化１１】
0005115988.tif 000012
【００５９】
糖鎖捕捉物質は、ジスルフィド結合を介して担体に固定化されてものであり、後述するように、切出段階（ステップＳ４０）では、このジスルフィド結合が切断されることが好ましい。
このような糖鎖捕捉物質としては、具体的には、下記式（１）で示される構造を有するものが挙げられる。
（担体）−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ    （１）
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質であり、Ｌがリンカー部位であり、Ａは糖鎖を捕捉する捕捉部位であり、−Ｓ−Ｓ−はジスルフィド結合である。）【００６０】
Ａは、前述のように、アミノオキシ基またはヒドラジド基であり、前述のように、糖鎖の環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して糖鎖を捕捉する捕捉部位として機能する。【００６１】
リンカー部位Ｌは、捕捉部位Ａとジスルフィド結合の部位とをつなぐリンカー部位を表す。
まず、リンカー部位Ｌの例として、ペプチド、オリゴペプチドおよびそれら誘導体から選ばれる部分を含む基が挙げられ、例えばアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびこれらの誘導体の少なくとも一つからなる部分を含んでいてもよい。【００６２】
オリゴペプチドとしては、特にアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインの少なくとも一つを含んだジペプチド（２量体）が好ましく、トリペプチド（３量体）以上のものであってもよい。【００６３】
また、ペプチドまたはオリゴペプチドの誘導体としては、アルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、システインおよびその他のアミノ酸の誘導体の少なくとも一つを含んだもの、およびこれらの化合物を構成する元素の一部が重元素化されたもの等が挙げられる。【００６４】
式（１）中で、Ｌは、例えばジペプチドからなるリンカー部位とすることができ、例えば−アルギニン（Ｒ）−トリプトファン（Ｗ）−，−Ｒ−フェニルアラニン（Ｆ）−，−Ｒ−チロシン（Ｙ）−，−Ｒ−システイン（Ｃ）−などを挙げることができる。これらを代表して、以下の式（２）に、Ｌが−Ｒ−Ｗ−で示した構造を有する化合物を示す。【００６５】
【化１２】
0005115988.tif 000013
【００６６】
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
このように、リンカー部位Ｌにアルギニン（Ｒ）残基を挿入すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定時にイオン化が促進され，検出感度が向上することが知られている。また、トリプトファン（Ｗ）は蛍光性のアミノ酸であり、かつ疎水性であることから、逆相ＨＰＬＣでの分離性向上と、蛍光検出感度向上を図ることができる。なお、フェニルアラニンおよびチロシンを用いた場合には、ＵＶ吸収による検出に適している。【００６７】
また、システインを用いた場合には、後述するようにシステイン残基を担体との結合部位として作用させることができるようになるため、下記スキーム１にて行う２−メルカプトエチルアミン（化合物（ｆ））を用いる反応などのチオール基を導入する反応を行う必要がなくなる。【００６８】
式（２）に示した化合物は、下記のスキーム１に示したように、まず捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｈ）を製造し、続くスキーム２にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。【００６９】
【化１３】
0005115988.tif 000014
【００７０】
【化１４】
0005115988.tif 000015
【００７１】
スキーム１において、化合物（ｂ）は、トリプトファン部分のアミノ基がフェニル基などにより保護された化合物（ａ）の脱保護により得られる。ここで、トリプトファン部分は、フェニルアラニン、チロシン、システインなどにより置換することもできる。【００７２】
続いて、化合物（ｂ）とヒドロキシアミン（BocNHOCH2COOH）（ｃ）との混合酸無水物法などの縮合反応により、化合物（ｄ）が合成される。このヒドロキシアミンの保護基は、Bocに限られることはなく、Fmoc，Trocなどであってもよい。続いて、化合物（ｄ）の末端のメトキシ基の加水分解（ケン化）により、化合物（ｅ）が得られる。【００７３】
化合物（ｅ）に２−メルカプトエチルアミン（化合物（ｆ））を作用させて縮合物（ｇ）を合成し、この縮合物（ｇ）を脱保護処理することにより、化合物（ｈ）が得られる。この脱保護処理としては、例えば保護基がＢｏｃである場合には、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による処理が挙げられる。【００７４】
また、上記式（１）のリンカーＬにおいて、標識化官能基を導入して、クロモフォアまたはフルオロフォアを含む部位を設けてもよい。標識化官能基としては、２−アミノベンゾイル基、ベンジル基、ナフチル基、アントラセニル基、ピリジル基などに代表される芳香族残基、Dansyl基、Fmoc基を含む置換基などが挙げられる。また、後述のように重水素化された（あるいはされていない）アセチル基などを含んでも良い。【００７５】
２−アミノベンゾイル基を含む糖鎖捕捉物質としては、例えば上記式（１）において、リンカーＬに２−アミノベンゾイル基が含まれ、ジスルフィド結合の一方のイオウがシステイン由来の構造、例えば下記式（３）の構造を有するものが挙げられる。【００７６】
【化１５】
0005115988.tif 000016
【００７７】
（式中、担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
このような２−アミノベンゾイル基は、蛍光性を付与するための標識化合物であり、糖鎖のＨＰＬＣ分析に一般的に使用されている。したがって、この糖鎖捕捉物質により捕捉した糖鎖またはその誘導体にこの基を導入した標識化サンプルの調製を容易に行うことが可能になる。この標識化サンプルを用いることにより、糖鎖捕捉物質により捕捉された糖鎖またはその誘導体を、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにて高分解能、高感度で分析することが可能になる。【００７８】
式（３）に示した糖鎖捕捉物質は、下記のスキーム３に示したように、まず捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｎ）を製造し、続くスキーム４にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。【００７９】
【化１６】
0005115988.tif 000017
【００８０】
【化１７】
0005115988.tif 000018
【００８１】
スキーム３において、シスチンのメチルエステル（化合物（ｉ））に、２−アミノ安息香酸（化合物（ｊ））を反応させて、化合物（ｉ）の窒素原子と化合物（ｊ）のカルボニル基との間でアミド結合を形成し、化合物（ｋ）が得られる。化合物（ｋ）と、ヒドラジン（化合物（ｌ））とを反応させて、アミノオキシ基を有する化合物（ｍ）が得られる。さらに、化合物（ｍ）をＤＴＴなどの還元剤を用いて還元し、ジスルフィド結合を切断して、２−アミノベンゾイル基と、システインとを有するアミノオキシ基含有化合物（ｎ）が得られる。【００８２】
また、アセチル基を含む糖鎖捕捉物質としては、例えば上記式（３）において、２−アミノベンゾイル基が別の官能基で修飾された構造を有するもの、例えば上記式（１）において下記式（４）の構造を有するものが挙げられる。【００８３】
【化１８】
0005115988.tif 000019
【００８４】
（式中、Ｒはアミノ基を介して導入し得る官能基である。担体は糖鎖捕捉反応に寄与しない無機物質あるいは有機高分子物質である。）。
Ｒとしては、例えば軽水素化または重水素化アセチル基、軽水素化または重水素化スクシニル基、レブリノイル基などが挙げられ、これらを下記に示す。【００８５】
【化１９】
0005115988.tif 000020
【００８６】
これらのうち、Ｒがアセチル基（-COCH3）、または重水素化アセチル基（-COCD3）であるものを好適に用いることができる。すなわち、上記式（４）において、下記（５）または（６）の構造を有するものを用いることができる。【００８７】
【化２０】
0005115988.tif 000021
【００８８】
このようなアセチル基を導入することにより、捕捉した糖鎖またはその誘導体に重水素または軽水素を導入した標識化サンプル、すなわち重水素化または軽水素化サンプルの調製を容易に行うことが可能になる。【００８９】
式（５）または（６）に示した糖鎖捕捉物質は、まず下記に示したようなスキーム５で調製された捕捉部位とリンカー部位とを備えた化合物（ｓ）を製造し、前述のスキーム４にて、例えば活性化チオールセファロースを結合させた担体と反応させて得ることができる。【００９０】
【化２１】
0005115988.tif 000022
【００９１】
スキーム５において、前記スキーム３で得られた化合物（ｋ）に無水酢酸を作用させて、２−アミノベンゾイル基のアミノ基をアセチル化させて、化合物（ｑ）が得られる。このとき、無水酢酸である化合物（ｏ）を用いることにより軽水素化化合物（ｑ−１）が得られ、一方重水素化無水酢酸である化合物（ｐ）を用いることにより重水素化化合物（ｑ−２）が得られる。【００９２】
続いて、化合物（ｑ−１）または（ｑ−２）と、ヒドラジンとを反応させて、アミノオキシ基を有する化合物（ｒ）が得られる。なお、化合物（ｒ）においてＲがアセチル基（-COCH3）であるときは軽水素化物（ｒ−１）が得られ、Ｒが重水素化アセチル基（-COCD3）であるときは重水素化物（ｒ−２）が得られる。【００９３】
さらに、化合物（ｒ）にＤＴＴなどの還元剤を用いて還元し、ジスルフィド結合を切断して、アミノ基がアセチル化された２−アミノベンゾイル基と、システインとを有するアミノオキシ基含有化合物（ｓ）が得られる。なお、化合物（ｒ）においてＲがアセチル基（-COCH3）であるときは軽水素化物（ｓ−１）が得られ、Ｒが重水素化アセチル基（-COCD3）であるときは重水素化物（ｓ−２）が得られる。【００９４】
以上のように、これらのような基をリンカー部位Ｌに導入する場合、捕捉された糖鎖を高精度かつ高感度に検出することができるようになる。【００９５】
また、リンカー部位Ｌの例として、上述した標識化された基の他に、アルキル鎖、またはエステル結合またはアミド結合を含む基で構成される標識化されていない基が挙げられ、例えば下記式に示す構造、または下記式に示す構造から任意に選ばれる複数の構造を組み合わせた構造を含むものであってもよい（式中、ｎは任意の整数を表す）。【００９６】
【化２２】
0005115988.tif 000023
【００９７】
このように、標識化されていない基をリンカー部位Ｌに導入することにより、糖鎖捕捉物質を後述する固相基板からなる担体に適用することができる。【００９８】
また、担体は無機物質または有機高分子物質であり、粒子、固相基板または固相基板の表面に直接結合する物質の形態として用いられる。【００９９】
ここで、担体として用いることができる無機物質としては、粒子状のものを用いることができ、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。【０１００】
また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたもの、固相基板の表面に固定化したものが挙げられる。また、これら物質を用いて固相基板の表面を構成してもよい。【０１０１】
また、粒子としたときの形状は球であることが好ましく、その粒径は、上限が２００μｍ、好ましくは１５０μｍであり、下限が２０μｍ、好ましくは５０μｍである。また、粒子の平均径は８０〜１００μｍである。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離，フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。【０１０２】
また、固相基板としては、マイクロプレート、平板状の基板が挙げられる。このようにすることで、糖鎖捕捉物質を糖鎖マイクロアレイ用基板に適用して、分析試料を調製することが可能になる。【０１０３】
ここで、糖鎖捕捉反応は、上述のような粒子状の糖鎖捕捉物質をカラムなどに充填して予備処理済の生体試料を通してもよい（連続式）し、この粒子を予備処理済の生体試料中に投入して攪拌して行ってもよい（回分式）。また、粒子が予め充填された反応容器内に予備処理済みの生体試料を連続的に投入して攪拌して行ってもよい（半回分式）。【０１０４】
続いて、ステップＳ３０では、ステップＳ２０での糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質を洗浄して、糖鎖捕捉物質に捕捉されなかった糖鎖、他の生体試料などを除去する。【０１０５】
ここで、糖鎖捕捉物質の洗浄に用いられる溶液としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に代表される界面活性剤の水溶液、メタノール、エタノールなどのアルコール類；水および水性緩衝液などが使用される。ここで、洗浄に水溶液が用いられる場合、この水溶液のｐＨは中性付近であることが好ましく、そのｐＨは４〜１０、より好ましくは６〜８である。【０１０６】
この洗浄処理は、前述したように連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、回分式および半回分式の場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖捕捉物質以外の物質を除去してもよい。【０１０７】
なお、ステップＳ３０の洗浄工程は、当初の生体試料の状態、例えば糖鎖以外の物質の混在の程度によっては行わなくても構わない。【０１０８】
ステップＳ４０では、必要に応じてステップＳ３０にて洗浄処理した後に、糖鎖捕捉物質から糖鎖を捕捉する部分を含む化合物を切り出して遊離させる、すなわち前述した糖鎖捕捉物質を用いた場合、リンカー部位および捕捉部位からなる化合物を糖鎖捕捉物質から切り出す反応を行う。この際、捕捉部位は、糖鎖を捕捉したものと捕捉しなかったものの両方を含む。【０１０９】
この反応は、糖鎖捕捉物質に含まれるジスルフィド結合を切断する反応であって、これにより、担体とリンカー部位とが、短時間で高い反応率で切り離される。また、このジスルフィド結合の切断反応には、還元剤を作用させてもよく、使用可能な還元剤としてはジチオスレイトール、ジチオエリスリトール，２−メルカプトエタノール，２−メルカプトエチルアミンなどが挙げられる。これらの還元剤は固相化されているものを用いることもできる。【０１１０】
この反応は、ｐＨが中性付近、好ましくはｐＨ６〜９で行うことができ、このときの反応温度は４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃で行うことができる。最も好ましい形態は、１〜１００ｍＭの重炭酸アンモニウム水溶液中での反応である。また、反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間である。【０１１１】
中性付近で、糖鎖切り出し反応を行うことができるため、従来のトリフルオロ酢酸による切出しのような強酸の存在下での切出し反応に比べて、シアル酸残基の脱離など捕捉された糖鎖の加水分解などを引き起こすことを抑制することができるようになる。【０１１２】
また、式（１）の構造中、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の部分は還元剤の作用により、効率よく切断することが可能なため、捕捉された糖鎖の遊離効率が高く、糖鎖分析の感度を高くすることができる。【０１１３】
ステップＳ５０では、切り出し反応により得られた捕捉部位を含む化合物と担体とを分離して、捕捉部位を含む化合物の部分を回収し、分析試料の調製処理は終了する。この回収方法としては、遠心分離、ろ過などの分離操作方法が挙げられる。【０１１４】
このようにして、糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物が取り出される。なお、捕捉しなかった捕捉部位を含む化合物も一緒に取り出されるが、糖鎖の同定には差し支えなく、また両者を分離することも容易であるため、特段の問題にはならない。【０１１５】
図２は、本実施形態の分析試料調製方法を適用した装置を示すブロック図である。なお、各構成の説明で、図１のフローチャートの各手順に関連する場合には、そのステップ番号を併せて示す。【０１１６】
生体試料導入部１０には、生体試料を所定の手法で予備処理して（ステップＳ１０）得られた予備処理済の生体試料を装入し、この生体試料が後述する反応部１２に導入されるようになっている。【０１１７】
洗浄液導入部１４には、前述の糖鎖捕捉反応後の反応混合物の洗浄（ステップＳ３０）を行う際の洗浄液を装入し、この洗浄液が後述する反応部１２に導入されるようになっている。【０１１８】
還元剤導入部１６には、前述の糖鎖の切出段階（ステップＳ４０）で用いられる還元剤を含有する溶液を装入し、この還元剤の溶液が後述する反応部１２に導入されるようになっている。【０１１９】
反応部１２は、生体試料導入部１０、洗浄液導入部１４および還元剤導入部１６に接続されている。また、反応部１２には、例えば前述した粒子状の糖鎖捕捉物質が充填されており、この粒子が充填された部分において、糖鎖捕捉段階（ステップＳ２０）、洗浄段階（ステップＳ３０）、糖鎖切出段階（ステップＳ４０）を実行する場を提供するようになっている。【０１２０】
溶出物取出部１８は、反応部１２の溶出側に設けられており、切出段階（ステップＳ４０）の後に、反応部１２より糖鎖捕捉物質の担体から切り離された捕捉部位を含む化合物が溶出され、こうして得られる溶出物を取り出すことができるようになっている。【０１２１】
分離部２０では、溶出物取出部１８で得られる溶出物を装入して、捕捉部位を含む化合物と、担体とが、前述したような方法により分離されるようになっている。なお、分離部２０は、溶出物取出部１８と直接接続し、反応部１２からの溶出物が直接装入されるようになっていてもよいし、あるいは溶出物取出部１８にて得られる溶出物を人による操作により、装入されるようになっていてもよい。【０１２２】
この処理装置によれば、予備処理が済んだ生体試料を生体試料導入部１０より反応部１２に導入し、反応部１２では導入された生体試料を、前述したような条件で保持し、この生体試料から糖鎖が糖鎖捕捉物質により捕捉される糖鎖捕捉反応が起こる（ステップＳ２０）。【０１２３】
続いて、洗浄液導入部１４より洗浄液を反応部１２に導入し、糖鎖捕捉反応後の糖鎖捕捉物質の表面を前述した条件で洗浄して、生体試料の捕捉されなかった糖鎖以外の物質および未反応の糖鎖が洗い流される（ステップＳ３０）。【０１２４】
さらに、還元剤導入部１６より還元剤を含む溶液を反応部１２に導入して、前述した条件にて糖鎖捕捉物質の表面において、捕捉部位を含む化合物の切り出し反応が行われ、糖鎖捕捉物質の捕捉部位を含む化合物が切り出されて溶出され、溶出物取出部１８にて取り出される（ステップＳ４０）。【０１２５】
続いて、分離部２０では、この溶出物から、捕捉部位を含む化合物と担体とを分離し、捕捉部位を含む化合物を含む分析試料が得られる。【０１２６】
このようにして、糖鎖を含む生体試料より分析試料のための糖鎖を回収・精製するに際して、糖鎖捕捉物質を用いて糖鎖を捕捉し、この糖鎖を捕捉する化合物の切り出しを穏やかな条件で、例えば捕捉された糖鎖を分解することなく回収することが可能になる。また、生体試料より糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む化合物を含む分析試料が直接得られるため、この糖鎖の同定、定量が容易になる。【０１２７】
なお、捕捉しなかった捕捉部位を含む化合物も一緒に取り出されるが、糖鎖の同定には差し支えなく、また両者を分離することも容易であるため、特段の問題にはならない。【０１２８】
なお、図２では、生体試料導入、糖鎖捕捉工程（ステップＳ２０）、洗浄工程（ステップＳ３０）、糖鎖切出工程（ステップＳ４０）を連続的に処理するように構成された装置を説明したが、これに限定されることはなく、例えば生体試料に糖鎖捕捉物質からなる粒子を導入して、震とうまたは攪拌して、糖鎖を糖鎖捕捉物質に捕捉（ステップＳ２０）させて得られる反応物をフィルタにかけてろ過して、このフィルタ上で洗浄液を導入して洗浄（ステップＳ３０）した後に、ろ取した反応物に還元剤を作用させて、切り出し反応（ステップＳ４０）を行ってもよい。なお、各段階の処理を行う条件は上述したものが適用できる。【０１２９】
また、本実施形態に係る分析試料は、前述した分析試料調製方法にて生体試料より調製されて得られ、具体的には前記の糖鎖捕捉物質のジスルフィド結合由来のチオール基と、リンカー部位とを含む、例えば下記式（ｔ−１）および（ｔ−２）で示される物質として得られる。【０１３０】
【化２３】
0005115988.tif 000024
【０１３１】
【化２４】
0005115988.tif 000025
【０１３２】
したがって、このような分析試料は、リンカー部位にペプチド、２−アミノベンゾイル基、重水素化された官能基などを含んでいる。特に、ペプチドを含むものは、前述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定による検出感度を向上させることができ、２−アミノベンゾイル基を含むものは前述したように蛍光を検出することでＨＰＬＣ分析が可能になる。【０１３３】
また、重水素化された官能基を含むものは、質量分析による検出感度を向上させ、定性および定量が可能になる。【０１３４】
例えば、化合物（６）の糖鎖捕捉物質を用いて重水素化されたサンプルおよび化合物（５）を用いて軽水素化されたサンプルを組み合わせて用いることにより、例えば未知の糖鎖含有サンプル（例えば、血清を処理したもの）に含まれる糖鎖の質量分析による定性および定量分析が可能になる。【０１３５】
これにより、例えば組成も濃度も既知のサンプルを重水素標識化し、未知のサンプルを軽水素標識化して、両サンプルを混合してから質量分析を行った場合、重水素化サンプルの各ピークは軽水素化サンプルの対応する各ピークよりも導入した重水素の数だけ高分子量の方にシフトして観測される。そこで、各ピークの位置（ｍ／ｚ値）および強度を解析して、未知のサンプルの各ピークが示す糖鎖の種類と、そのサンプル中の濃度とがわかる。このような解析は、既知サンプルを軽水素化し、未知サンプルを重水素化することによっても可能である。【０１３６】
また、この解析において、健常人から採取したサンプルを重水素化し、疾病患者から採取したサンプルを軽水素化することにより、あるいは健常者サンプルを軽水素化し、疾病患者サンプルを重水素化することにより、両者のサンプル中に含まれる糖鎖の種類、量における相違を解析することが可能になる。したがって、このような分析試料は、糖の代謝が関与する生体反応に基づく疾病の診断、このような生体反応を制御することによる治療などの用途に好適に使用される。【０１３７】
また、本実施形態の分析試料は、分子中にジスルフィド結合由来のチオール基（−ＳＨ）が存在する。このチオール基と特異的に反応する化合物を、この分析試料に導入することができる。例えば、この化合物としてＩＣＡＴ（Isotope Coded Affinity Tag）試薬を用いることにより、本実施形態の分析試料をＩＣＡＴ法による定量分析に適用させることができる。
【実施例】
【０１３８】
以下、本発明を以下の実験例からなる実施例により説明する。しかし、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。【０１３９】
（実験例１）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
前記スキーム１にしたがって、化合物（ｈ）を合成した。
（ａ）WR-OMe（化合物（ｂ））の合成
Z-WR-OMe（10 mg, 20 mmol）および10% Pd/C（10mg）にメタノール（5ml）を加え、水素ガス雰囲気下、室温で２時間攪拌した。反応溶液を水系メンブレンフィルタでろ過することによりPd/Cを除去し、ろ液を減圧濃縮することで目的物である化合物（ｂ）（WR-OMe）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：376に観測した。【０１４０】
（ｂ）Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe（化合物（ｄ））の合成
Bocアミノオキシ酢酸（2.5mmol）のＴＨＦ（6ml）溶液を-20℃に冷却した。ついでN-メチルモルホリン（3.0mmol）とギ酸イソブチル（3.0mmol）を添加し、１５分攪拌することで混合酸無水物を調製した。反応溶液を０℃とし、別の反応溶液にて化合物（ｂ）（WR-OMe（3.0mmol））を水（３ｍｌ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（3.0mmol）を添加することにより調製したWR-OMe溶液を混合し、１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製することで目的物である化合物（ｄ）（Boc-NHOCH2CO-W-R-OMe）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］イオンをm/z：547に観測した。【０１４１】
（ｃ）Boc-NHOCH2CO-W-R-OH（化合物（ｅ））の合成
化合物（ｄ）を水酸化ナトリウム／メタノール溶液で処理することでケン化し，化合物（ｅ）を得た。【０１４２】
（ｄ）Boc-NHOCH2CO-W-R-NHCH2CH2SH（化合物（ｇ））の合成
化合物（ｅ）をメタノールに溶解し，ＷＳＣ（水溶性カルボジイミド）を３等量加えた。１等量のアミノエタンチオール（ｆ）を加え，２時間攪拌することで縮合物を調製した。反応溶液をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することで目的化合物（ｇ）を得た。【０１４３】
（ｅ）NH2OCH2CO-W-R-NHCH2CH2SH（化合物（ｈ））の合成
化合物（ｇ）にＴＦＡ（2ml）を加え、−２０℃で２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンを加え共沸を繰り返してＴＦＡを除去して、目的物である化合物（ｈ）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］イオンをm/z：493に観測した。【０１４４】
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム２にしたがって、化合物（ｈ）の溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式（２）の糖鎖捕捉物質を得た。【０１４５】
【化２５】
0005115988.tif 000026
【０１４６】
（実験例２）
（生体試料の予備処理）
ヒト血清（５μｌ）をトリプシン消化することにより、含まれるタンパクをペプチド断片化した。トリプシンを熱変性で不活化したのち、ペプチド：ＮグリカナーゼＦ（Roche社製）処理によりペプチドから糖鎖を遊離させた。さらに、塩酸でｐＨ２に調整し、９０℃で１時間処理することにより、シアル酸含有糖鎖を脱シアリル化した。【０１４７】
（糖鎖捕捉反応）
実験例１で調製した糖鎖捕捉物質（10mg）に処理済み血清を添加した。酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液により反応液のｐＨを４に調整したのち、８０℃で１時間静置することで糖鎖を糖鎖捕捉物質に結合させた。【０１４８】
（洗浄）
糖鎖捕捉反応後の反応物を0.5%のSDS、50%のメタノール、純水で洗浄した。【０１４９】
（糖鎖切出（遊離）反応）
洗浄後の反応物に、５０ｍＭジチオスレイトールを１０μｌ添加し、室温で３０分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物（ｔ−１）を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。【０１５０】
【化２６】
0005115988.tif 000027
【０１５１】
（MALDI-TOF-MS分析）
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ，図３に示したように，チャートにおいて血清から捕捉された糖鎖に化合物（ｈ）が付加した分子量に相当するｍ／ｚ値にシャープなピークを観測した。図３では、各ピークに対応して、ｍ／ｚ値から推定される糖鎖を模式的に示している。なお、図３において、還元末端の標識化合物（ｈ）の構造は省略されている。【０１５２】
（実験例３）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム３にしたがって、化合物（ｎ）を合成した。
（ａ）(2-AB-Cys-OMe)2（化合物（ｋ））の合成
(Cys-OMe)2（3.4g, 12.7mmol）をテトラヒドロフラン（THF）に溶解した。ついで２−アミノ安息香酸（2-aminobenzoic acid：（ｊ））（3.5g, 25.4mmol）およびカルボジイミダゾールを添加し、室温で１６時間攪拌した。生成物を重曹および食塩の飽和水溶液で抽出精製することで目的物である化合物（ｋ）（(2-AB-Cys-OMe)2）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：507に観測した。【０１５３】
（ｂ）(2-AB-Cys-CONHNH2)2（化合物（ｍ））の合成
化合物（ｋ）（5.0mg, 9.9mmol）および過剰量のヒドラジン水和物（ｌ）をメタノールに溶解し、室温で１６時間攪拌することで化合物（ｍ）を得た。【０１５４】
（ｃ）2-AB-Cys-CONHNH2（化合物（ｎ））の合成
化合物（ｍ）を100mM DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し、室温で１時間攪拌した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製することで化合物（ｎ）を得た。MALDI-TOF-MSによる解析により、目的物の［M+H］+イオンをm/z：255に観測した。【０１５５】
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｎ）の水／アセトニトリル溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、室温で一昼夜静置後、純水で余剰試薬を除去して、式（３）の糖鎖捕捉物質を得た。【０１５６】
【化２７】
0005115988.tif 000028
【０１５７】
（実験例４）
（糖鎖捕捉反応）
式（３）の糖鎖捕捉物質を、理論官能基量が300nmolとなるよう容器に測り取り、酢酸２％を含むアセトニトリルで分散させた。これに５０μｌのN-アセチルラクトサミン（LacNAc）を加え、80℃で１時間加熱することでLacNAcを糖鎖捕捉物質に捕捉させた。【０１５８】
（糖鎖切出（遊離）反応）
反応物に100mMジチオスレイトール（DTT, 25mM重炭酸アンモニウム水溶液）を２０μｌ添加し、６０℃で３０分静置した。フィルタろ過により糖鎖を捕捉した捕捉部位を含む下記式の化合物（ｔ−２）を含むろ液と、糖鎖捕捉物質の担体を含む部分とを分離し、ろ液を回収した。【０１５９】
【化２８】
0005115988.tif 000029
【０１６０】
（MALDI-TOF-MS分析）
ろ液をMALDI-TOF-MSで測定したところ、図４に示したように、チャートにおいてLacNAcに化合物（ｎ）が付加した分子量に相当する場所にシャープなピークを観測した。図４において、ピーク（Ａ）は糖鎖捕捉しなかった未反応物である化合物（ｎ）由来であり、ピーク（Ｂ）は捕捉されなかった未反応物の糖鎖（LacNAc）由来であり、ピーク（Ｃ）は糖鎖（LacNAc）を捕捉した目的物由来である。【０１６１】
（HPLC分析）
別途調製した化合物（ｔ−２）をＨＰＬＣで測定したところ、図５に示す分離パターンが得られた。各ピークを分取してMALDI-TOF-MSで分析したところ、図中矢印で示すピーク位置に化合物（ｔ−２）の分子量に相当するピークを観測した。【０１６２】
（実験例５）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム５にしたがって重水素アセチル化リンカー（化合物（ｓ−１））を合成した。
（ａ）化合物（ｑ−１）の合成
実験例３で得られた化合物（ｋ）（5.0g, 9.9mmol）をピリジンに溶解した。これに無水酢酸を過剰量添加し，室温で１６時間攪拌することで化合物（ｑ−１）を得た。【０１６３】
（ｂ）化合物（ｒ−１）の合成
実験例３（１）（ｂ）と同様の方法で化合物（ｑ−１）とヒドラジン水和物（ｌ）を反応させ，化合物（ｒ−１）を得た。【０１６４】
（ｃ）化合物（ｓ−１）の合成
実験例３（１）（ｃ）と同様の方法で化合物（ｒ−１）をＤＴＴで処理し、化合物（ｓ−１）を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ，目的物の［M+H］+イオンをm/z：297に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｓ−１）を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式（５）の糖鎖捕捉物質を得る。【０１６５】
（実験例６）
（糖鎖捕捉物質の調製）
（１）チオール基およびアミノオキシ基含有化合物の合成
スキーム５にしたがって軽水素アセチル化リンカー（化合物（ｓ−２））を合成した。
（ａ）化合物（ｑ−２）の合成
実験例３で得られた化合物（ｋ）（5.0g, 9.9mmol）をピリジンに溶解した。これに無水酢酸-d6を過剰量添加し，室温で１６時間攪拌することで化合物（ｑ−２）を得た。【０１６６】
（ｂ）化合物（ｒ−２）の合成
実験例３（１）（ｂ）と同様の方法で化合物（ｑ−２）とヒドラジン水和物（ｌ）を反応させ，化合物（ｒ−２）を得た。【０１６７】
（ｃ）化合物（ｓ−２）の合成
実験例３（１）（ｃ）と同様の方法で化合物（ｒ−２）をＤＴＴで処理し、化合物（ｓ−２）を得た。得られた生成物をMALDI-TOF-MSで測定したところ，目的物の［M+H］+イオンをm/z：300に観測した。
（２）糖鎖捕捉物質の調製
前記スキーム４にしたがって、化合物（ｓ−２）を含む溶液をActivated Thiol Sepharose (Amersham Biosciences社製)と混合し、式（６）の糖鎖捕捉物質を得る。【０１６８】
【化２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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