(57)【要約】      （修正有）【課題】  人体への安全が保障され、しかも、目的のプラスミドを選択的にキュアリングすることで、任意のプラスミド変異株を簡便に取得する方法を提供すること。【解決手段】  被検菌のプラスミド変異株の取得法；特定の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド；他の特定の塩基配列およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、さらに、特定のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を特定の部分に有することを特徴とするプラスミドｐＤＢ１；前記オリゴヌクレオチドおよび前記プラスミドｐＤＢ１を用いることを特徴とするラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株の取得法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１および２記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号３記載の塩基配列部分、配列表の配列番号４記載の塩基配列部分およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、さらに、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分と配列表の配列番号４記載の塩基配列部分との間に有することを特徴とするプラスミドｐＤＢ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９）。
【請求項３】
（Ａ）被検菌から任意のθ型プラスミドを精製する工程、
（Ｂ）該プラスミドを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する工程、
（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、選択可能な遺伝子を含むプラスミドベクターに組込み、不和合性誘導プラスミドを得る工程、
（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドを被検菌に導入する工程、
（Ｅ）前記不和合性誘導プラスミド保有株を選択物質添加培地で継代培養し、目的のプラスミドをキュアリングする工程、および
（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、選択物質無添加培地で継代培養し、被検菌に内在する前記不和合性誘導プラスミドを自然に消失させる工程からなることを特徴とする被検菌のプラスミド変異株の作出法。
【請求項４】
（Ａ）被検菌であるラクトコッカス属乳酸菌から任意のθ型プラスミドを精製する工程、
（Ｂ）該プラスミドを鋳型として、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する工程、
（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、請求項２記載のプラスミドベクターｐＤＢ１のＤＮＡ増幅配列挿入部に組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得る工程、
（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を被検菌に導入する工程、
（Ｅ）ｐＣＶ（Ｘ）保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養し、目的のプラスミドをキュアリングする工程、および
（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、エリスロマイシン無添加培地で継代培養し、被検菌に内在するｐＣＶ（Ｘ）を自然に消失させる工程からなることを特徴とするラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株の作出法。
【請求項５】
ラクトコッカス属乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチスまたはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  である請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミド変異株の作出法、並びに該作出法に用いるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドベクターに関する。詳しくは、ラクトコッカス属乳酸菌等の被検菌からプラスミド変異株を作出する方法、並びに該作出法に用いるオリゴヌクレオチドおよびプラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、染色体遺伝子の他に、１個から数個のプラスミド（plasmid＝核外遺伝子）を保有しているものがいる。これらのプラスミドには、θ型で複製するものとローリングサークル型で複製するものがあり、θ型で複製するプラスミドは比較的大型である。特に、発酵乳製品のスターターとして汎用されているラクトコッカス属乳酸菌の場合、通常複数のプラスミドを保有しており、発酵特性を支配している遺伝子群をコードしている場合が多い。したがって、特定のプラスミドをキュアリング（curing＝除去）すると、親株とは発酵特性の異なる菌株を得ることができ、そのようなプラスミド変異株を発酵製品の製造に使うことによって、発酵産物の味や風味を変えることができる。
【０００３】
θ型プラスミドのレプリコン（replicon＝複製領域、約２ｋｂ）には、複製開始タンパク質をコードしている構造遺伝子と、複製開始タンパク質が結合する特殊な遺伝子配列からなる複製起点が含まれる。レプリコンの遺伝子配列には、微生物のθ型プラスミドに共通な配列と、個々のプラスミドに特異的な固有配列とがある。
【０００４】
同一の細菌細胞に、近縁の２種類以上のプラスミドが安定に共存できない性質を、プラスミドの不和合性と言う。プラスミドの不和合性は、プラスミドコピー数などレプリコンの特異性を支配する特定の遺伝子配列部分（不和合性決定配列）により決定される。
プラスミド不和合性は、従来プラスミドの分類の研究に応用されてきた。しかし、本性質を微生物のプラスミドのキュアリングに利用し、プラスミド変異株を作出する試みはされていない。
【０００５】
プラスミド変異株の作成には、その作成過程でアクリジン色素等の変異原物質を使用するプラスミドキュアリング法が一般的であった（非特許文献１および２参照）。
変異原物質を用いる方法は、遺伝子解析をはじめとした研究目的の場合には不都合はない。しかし、用いられる変異原は、菌の遺伝子にランダムに作用するため、菌の生育や、発酵性能に関与する他の有用な遺伝子群の変異も同時に誘起するほか、有害な遺伝変異が被検菌に導入される可能性も否定できない。そのため、乳酸菌のように食品の発酵に利用される菌株の改良には、安全面の問題で不向きであった。
さらに従来法では、微生物の菌体内に複数種類内在しているプラスミドのうち、任意のプラスミドだけを選択的にキュアリングすることはできなかったので、発酵産業をはじめとする産業に利用可能な実用菌株の改良方法としての適用は難しかった。
【０００６】
【非特許文献１】Loss of Lactose Metabolism in Lactic Streptococci L．L．McKAY，K．A．BALDWIN，AND E．A．ZOTTOLA（1972）Applied Microbiology 23（6）1090-1096
【非特許文献２】Plasmid Linkage of a Bacteriocin-Like Substance in Streptococcus lactis subsp．diacetylactis Strainn WM4：Transferability to Streptococcus lactis KAREN M．SCHERWITZ，KATHLEEN A．BALDWIN，and LARRY L．McKAY（1983）Applied and Environmental Microbiology 45（5）1506-1512
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記したように、従来のプラスミドキュアリング法は、非常に効率が悪く、目的プラスミド変異株の作出に多大な時間と労力を要した。また、プラスミド変異株の効率的な作出の目的で汎用されてきた変異原物質は、被検菌のみならず、人体にも有害である。
【０００８】
本発明の目的は、人体への安全が保障され、しかも、目的のプラスミドを選択的にキュアリングすることで、任意のプラスミド変異株を簡便に作出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、微生物のうち、発酵乳製品のスターターとして汎用されているラクトコッカス属乳酸菌の不和合性決定配列を増幅することができる１組のポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略記することがある。）プライマーセットを提供する。
また、本発明は、プライマーセットによって増幅したＤＮＡ配列を組込むことができるプラスミドを提供する。
更に、本発明は、微生物に内在するθ型プラスミドのレプリコン内部にコードされている、プラスミドの不和合性を決定する不和合性決定配列（以下ＶＦと略記することがある。）を増幅したＤＮＡ配列をプラスミドベクターに組込んで構築した、不和合性誘導プラスミドを利用して、選択的に被検菌のθ型プラスミドをキュアリングし、任意のプラスミド変異株を作出する方法を提供する。特に、前記のプライマーセットおよびプラスミドを利用して、被検菌であるラクトコッカス属乳酸菌のθ型プラスミドを選択的にキュアリングし、任意のラクトコッカス属乳酸菌プラスミド変異株を作出する方法を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明者らは、ラクトコッカス属乳酸菌に内在するθ型プラスミドの複製領域の遺伝子配列を研究した結果、プラスミドの不和合性を決定している不和合性決定配列を増幅することができるプライマーセットを設計した。
また、本発明者らは、不和合性決定配列の上流および下流に、θ型プラスミドレプリコンに共通なＤＮＡ配列を結合させると、ラクトコッカス属乳酸菌で複製可能な合成レプリコンを構築できることを見い出し、係る知見を基に、特定の共通配列およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、不和合性決定配列が効率よく挿入され得るプラスミドｐＤＢ１を構築した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、任意のθ型プラスミドの不和合性決定配列を、選択可能な遺伝子を含むプラスミドベクターに組込んで構築した不和合性誘導プラスミドを被検菌に導入すると、前記プラスミドの安定した複製を妨害する（不和合性を示す）ので、目的のプラスミドを簡便かつ的確に選択除去（キュアリング）でき、しかも、該プラスミドのキュアリング後に、選択物質エリスロマイシンを培地から除くと、選択可能な遺伝子をコードしているｐＣＶ（Ｘ）も自然に細胞内から消失し、外来遺伝子が一切残存せず、キュアリングしたプラスミド以外のプラスミドの保有状況は野生株と同じ安全な実用菌株が得られることを見出した。
そして、被検菌としてラクトコッカス属乳酸菌を対象とした場合に、上記プライマーセットで増幅したラクトコッカス属乳酸菌に内在する任意のθ型プラスミドの不和合性決定配列を、上記プラスミドｐＤＢ１に組込んで構築した不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を被検菌に導入すると、前記プラスミドの安定した複製を妨害する（不和合性を示す）ので、目的のプラスミドを簡便かつ的確に選択除去（キュアリング）でき、しかも、該プラスミドのキュアリング後に、エリスロマイシンを培地から除くと、エリスロマイシン耐性遺伝子をコードしているｐＣＶ（Ｘ）も自然に細胞内から消失し、外来遺伝子が一切残存せず、キュアリングしたプラスミド以外のプラスミドの保有状況は野生株と同じ安全な実用菌株として発酵産業に利用することができることを確認し、本発明に到達した。
なお、この手法はラクトコッカス属乳酸菌に限定されず、他の属に属する乳酸菌は勿論のこと、他の細菌、酵母など（例えば、枯草菌、大腸菌、サルモネラ菌等）に対しても適用可能である。
【００１２】
請求項１記載の本発明は、配列表の配列番号１および２記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドである。
請求項２記載の本発明は、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分、配列表の配列番号４記載の塩基配列部分およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、さらに、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分と配列表の配列番号４記載の塩基配列部分との間に有することを特徴とするプラスミドｐＤＢ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９）である。
【００１３】
請求項３記載の本発明は、
（Ａ）被検菌から任意のθ型プラスミドを精製する工程、
（Ｂ）該プラスミドを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する工程、
（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、選択可能な遺伝子を含むプラスミドベクターに組込み、不和合性誘導プラスミドを得る工程、
（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドを被検菌に導入する工程、
（Ｅ）前記不和合性誘導プラスミド保有株を選択物質添加培地で継代培養し、目的のプラスミドをキュアリングする工程、および
（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、選択物質無添加培地で継代培養し、被検菌に内在する前記不和合性誘導プラスミドを自然に消失させる工程からなることを特徴とする被検菌のプラスミド変異株の作出法である。
【００１４】
請求項４記載の本発明は、
（Ａ）被検菌であるラクトコッカス属乳酸菌から任意のθ型プラスミドを精製する工程、
（Ｂ）該プラスミドを鋳型として、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する工程、
（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、請求項２記載のプラスミドベクターｐＤＢ１のＤＮＡ増幅配列挿入部に組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得る工程、
（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を被検菌に導入する工程、
（Ｅ）ｐＣＶ（Ｘ）保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養し、目的のプラスミドをキュアリングする工程、および
（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、エリスロマイシン無添加培地で継代培養し、被検菌に内在するｐＣＶ（Ｘ）を自然に消失させる工程からなることを特徴とするラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株の作出法である。
請求項５記載の本発明は、ラクトコッカス属乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチスまたはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  である請求項４記載の方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、目的のプラスミドを選択的にキュアリングすることで、プラスミド変異株を効率良く作出することができる。特に、ラクトコッカス属乳酸菌に内在しているプラスミドの不和合性決定配列を簡便に増幅することができるできるオリゴヌクレオチドと、増幅配列を組込むことができ、且つＰＣＲの鋳型としたプラスミドと不和合性を示す不和合性誘導プラスミドを構築することができるプラスミドｐＤＢ１とを用いることにより、プラスミド変異株を効率良く作出することができる。
即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーセットとして用いられることによって、個々のプラスミドの塩基配列決定や、プラスミドの部分分解による複製領域の特定作業を行わなくても、ラクトコッカス属乳酸菌に内在しているθ型プラスミドのレプリコン内部にコードされている、プラスミドの不和合性決定配列を簡便に増幅することができる。
また、本発明のプラスミドｐＤＢ１は、上記オリゴヌクレオチドにより得られる増幅配列を組込むことができるので、ＰＣＲの鋳型にしたプラスミドと不和合性を示す、不和合性誘導プラスミドを構築することができ、これにより前記鋳型にしたプラスミドを選択的に短時間でのキュアリングが可能となる。
そして、上記オリゴヌクレオチドおよびプラスミドｐＤＢ１を用いることにより得られるプラスミド変異株は、外来遺伝子が一切残存せず、キュアリングしたプラスミド以外の遺伝子構成は全く野生株と同様で野生株の特性を受け継いでいるため、安全な実用菌株として実用発酵食品の製造に利用することができ、味や風味の改善に役立てることができる。
従って、本発明は、菌株の改良方法として発酵産業上も極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明によるプラスミド変異株の作出法の対象となる微生物は、θ型プラスミドを有する微生物全般であり、例えば、ストレプトコッカス属菌、ラクトコッカス属菌を含む種々の乳酸菌群、枯草菌、大腸菌などのエシェリヒア属菌、サルモネラ菌、バチルス属菌などの細菌の他、酵母を挙げることができる。このうち、特に発酵乳製品のスターターとして汎用されており、そのθ型プラスミドは発酵特性を支配している遺伝子群をコードする場合が多い点で、ラクトコッカス属乳酸菌が好ましい。
ラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチスおよびラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリスを挙げることができる。本発明において、これらのラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株を作出するにあたっては、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドおよび請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９）を用いることができる。
【００１７】
請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１および２記載の塩基配列の組み合わせからなることを特徴とする。
請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドのうち、配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、データーベースであるＤＤＢＪにAccession No．AB079380として登録されている、機能未知なθ型プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの全塩基配列のうち、レプリコン内部の９７２〜１００８番目の塩基部分を基に、５´末端に制限酵素ＥｃｏＴ  ２２Ｉ切断サイトを導入して設計したものである。本発明者らは、この配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＦと名付けた。
一方、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドのうち、配列番号２記載のオリゴヌクレオチドは、同じくｐＤＲ１−１Ｂのレプリコン内部の２０２９〜２０６１番目の塩基部分を基に、５´末端に制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトを導入して設計したものである。本発明者らは、この配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＲと名付けた。
【００１８】
上記のように設計された請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、その配列表の配列番号１および２に記載の塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機等を用いた常法によって、人工的に合成することができる。
【００１９】
請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドは、ラクトコッカス属乳酸菌、例えば、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス、またはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリスに内在するθ型プラスミドを鋳型としたＰＣＲにおいて、プライマーセットとして用いられることにより、該プラスミドのレプリコン内部にコードされている、プラスミドの不和合性を決定しているプラスミド不和合性決定配列を増幅することができる。
【００２０】
また、ラクトコッカス属乳酸菌に内在するプラスミドには、２〜１００ｋｂの様々な大きさのものがあり、各プラスミドにコードされている遺伝子群が関与する形質も多岐に渡る。プラスミドは、その複製様式によってθ型プラスミドと、ローリングサークル型プラスミドに分類され、この内、θ型プラスミドは比較的大型のものが多く、発酵形質に関与する遺伝子群の多くはθ型プラスミドにコードされている。請求項１に記載の本発明のオリゴヌクレオチドは、θ型プラスミドのレプリコンの不和合性決定配列のみを認識し、ローリングサークル型プラスミドの配列は認識しない。
【００２１】
θ型プラスミドのレプリコンは、この不和合性決定配列（固有配列）と共通配列とからなり、不和合性決定配列を挟んで、共通配列が上流および下流に配置される形で構成されている。
共通配列は、厳密には各プラスミドで塩基配列および大きさに違いがあるものの、不和合性等には関与せず、共通配列部分を他のθ型プラスミドのものと交換しても、ラクトコッカス属乳酸菌で正常に複製することが確認されている。
一方、レプリコンの不和合性決定配列は、複製起点に特徴的なダイレクトリピート配列、複製開始遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、および複製開始タンパク質遺伝子翻訳領域の一部を含むＤＮＡ配列である。その大きさは、各プラスミドごとに異なってるが、約１.１ｋｂの大きさである。この不和合性決定配列は、プラスミドの不和合性を決定すると同時に、プラスミドコピー数などレプリコンの特異性を支配している。
【００２２】
請求項１に係るプライマーセットによって、プラスミド不和合性決定配列を効率良く増幅することができる。このプラスミド不和合性決定配列の上流および下流に、θ型プラスミドのレプリコンに共通な、約５００ｂｐの共通配列がその上流および下流に結合されると、ラクトコッカス属乳酸菌で複製可能なレプリコンとしての機能が発揮されるので、不和合性を利用したプラスミドキュアリングに使用することができる。このように、プラスミド不和合性決定配列を挿入可能な構造を有し、機能的な合成レプリコンを再構築しうるプラスミドベクターｐＤＢ１を提供するのが、請求項２に係る本発明である。
【００２３】
請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１は、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分、配列表の配列番号４記載の塩基配列部分およびエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、さらに、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いた、ポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分と配列表の配列番号４記載の塩基配列部分との間に有することを特徴とする。
このような請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９である。
【００２４】
配列表の配列番号３記載の塩基配列は、データーベースであるＤＤＢＪにAccession No．AB079380として登録されている、機能未知なθ型プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの全塩基配列のうち、レプリコン内部上流側の５２５〜９９１番目の塩基部分に相当し、本領域を増幅するフォワードプライマーによって５´末端に制限酵素Ｂａｎ  III切断サイトが、リバースプライマーによって３´末端に制限酵素Ｎｒｕ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩ切断サイトが導入されたＤＮＡ配列である。該配列は、クローニングベクターのＢａｎ  IIIおよびＥｃｏ  ＲＩ切断サイトに対応する付着末端を露出させた４４５ｂｐのＤＮＡ配列である。本配列をクローニングベクターのＢａｎ  IIIおよびＥｃｏ  ＲＩ切断サイトに結合すると、不和合性決定配列挿入部位（Ｎｒｕ  Ｉサイト）が機能するように設計した。本配列中には、レプリコンの複製起点上流の共通配列が含まれている。
【００２５】
一方、配列表の配列番号４に記載の塩基配列は、同じくｐＤＲ１−１Ｂの全塩基配列のうち、レプリコン内部下流側の２０４０〜２５２０番目の塩基部分に相当し、本領域を増幅するフォワードプライマーによって末端に制限酵素Ｐｓｔ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトが導入されたＤＮＡ配列である。本配列中には、複製開始タンパク質構造遺伝子の下流部分の共通配列と、終止コドンが含まれている。終止コドンの直下には、制限酵素Ｘｂａ  Ｉ切断サイトがあり、ｐＤＢ１の構築には本制限酵素切断サイトを利用することができる。したがって配列表の配列番号４に記載の塩基配列は、フォワードプライマーによって導入したＰｓｔ  Ｉ切断配列から終止コドン直下のＸｂａ  Ｉ切断配列迄の４６６ｂｐに相当する。
Ｘｈｏ  Ｉ切断サイト導入位置は、複製開始タンパク質遺伝子内部であるが、Ｘｈｏ  Ｉ切断サイト導入のための塩基置換が、翻訳タンパク質である複製開始タンパク質のアミノ酸配列に影響しないように設計した。本配列を後述のクローニングベクターのＰｓｔ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ切断サイトに結合すると、不和合性決定配列挿入部位（Ｘｈｏ  Ｉサイト）が機能するように設計した。
【００２６】
エリスロマイシン耐性遺伝子は、抗生物質エリスロマイシンに対する耐性遺伝子であり、ラクトコッカス属乳酸菌で特に選択性が良いことから選択されたものである。本遺伝子をコードしている組み換えプラスミド保有菌株は、５μｇ／ｍｌエリスロマイシン添加培地で生育することができるが、非保有菌は全く生育できないので、保有菌株を、非保有菌株から効率的に分離することができる。
なお、ラクトコッカス属乳酸菌で選択性の良い遺伝子であれば、エリスロマイシン耐性遺伝子に換えて、例えば他の薬剤耐性遺伝子、具体的には例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などを用いることもできる。配列表の配列番号３に記載の塩基配列部分、配列表の配列番号４に記載の塩基配列部分およびエリスロマイシン耐性遺伝子は、上流からこの順に並んでいることが好ましい。
【００２７】
請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１は、さらに、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分と配列表の配列番号４記載の塩基配列部分との間に有する。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られるＤＮＡ増幅配列挿入部に挿入され得るＤＮＡ増幅配列とは、プラスミド不和合性決定配列であり、不和合性決定配列であれば、微生物の種類やプラスミドの種類に関わらず、特に制限なく挿入することができる。
【００２８】
請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１に上記ＤＮＡ増幅配列を組み込む際には、配列表の配列番号３記載の塩基配列部分および配列表の配列番号４記載の塩基配列部分に制限酵素Ｎｒｕ  Ｉ切断サイトおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトを露出させるような前処理が行われ、一方、ＤＮＡ増幅配列の複製起点側末端は、Ｎｒｕ  Ｉ切断サイトに結合させるため、ブラントエンドとし、複製開始タンパク質遺伝子側末端は、Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトに結合させるため、適切な付着末端を生じさせるような前処理が行われる。
実際には例えば、プラスミドｐＤＢ１については、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉを含む反応溶液を調製して制限分解を行った後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行ない、次いで制限酵素Ｎｒｕ  Ｉについて同様に制限分解、抽出および沈殿を行う前処理を、一方、組込みＤＮＡ断片については、制限酵素ＥｃｏＴ２２１を含む反応溶液を調製して制限分解を行った後、ブランチングを行ない、次いで制限酵素Ｎｒｕ  Ｉについて同様に制限分解をした後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行う前処理を行って準備する。
【００２９】
請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１の製造法は、特に限定されず、例えば、上記した配列表の配列番号３に記載の塩基配列部分、配列表の配列番号４に記載の塩基配列部分およびエリスロマイシン耐性遺伝子を、クローニングベクターに配置して製造することができる。クローニングベクターとしては、ラクトコッカス属乳酸菌のレプリコンを持たないものであれば、特に限定されないが、市販のプラスミド抽出キットを使用して、簡便に大量に精製できるように、大腸菌で多コピーに複製できるプラスミドベクターが好ましい。例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９等の市販のクローニングベクターを用いることができる。
【００３０】
請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１は、ラクトコッカス属乳酸菌に内在するθ型プラスミドのプラスミド不和合性決定配列を効率よく挿入することができ、ラクトコッカス属乳酸菌で複製可能な合成レプリコンを有する不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を構築することができる。
従って、任意のθ型プラスミドの不和合性決定配列をｐＤＢ１に組込んで構築した不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を被検菌に導入すると、前記プラスミドの安定した複製を妨害する（不和合性を示す）ので、目的のプラスミドを簡便かつ的確に選択除去（キュアリング）でき、しかも、該プラスミドのキュアリング後に、エリスロマイシンを培地から除くと、エリスロマイシン耐性遺伝子をコードしているｐＣＶ（Ｘ）も自然に細胞内から消失し、外来遺伝子が一切残存せず、キュアリングしたプラスミド以外のプラスミドの保有状況は野生株と同じ安全な実用菌株として発酵産業に利用することができる。
【００３１】
次に、請求項３に係る本発明のプラスミド変異株の作出法について説明する。請求項３に係る本発明の方法は、以下の（Ａ）〜（Ｆ）工程からなることを特徴とする。
【００３２】
請求項３に係る本発明の方法においては、まず、（Ａ）被検菌から任意のθ型プラスミドを精製する。すなわち、全プラスミドを抽出し、そのうちキュアリングの対象となる１種類の任意のθ型プラスミドを精製する。
被検菌は、キュアリングしたい形質に関与する遺伝子をコードするものであれば、先述したようにθ型プラスミドを有する微生物のいずれであっても良い。このうち、特にラクトコッカス属乳酸菌、即ちラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス、またはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリスが好ましい。なお、被検菌については野生株であっても良いし、野生株に何らかの突然変異処理がなされた突然変異株や、既に本発明の方法を含む何らかのプラスミド変異処理が加えられたプラスミド変異株であっても良い。
【００３３】
（Ａ）工程によるθ型プラスミドの精製は、以下のような手順により進めることができる。
まず、被検菌から全プラスミドを抽出する。例えば、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌の場合、該乳酸菌をＧＭ１７培地（Ｍ１７培地に、０．５または１．０％  グルコースを添加したもの），ＭＲＳ培地，プラスミド抽出用培地（１％トリプシン、０．５％イーストエクストラクト、０．５％  塩化ナトリウム、１％  コハク酸ナトリウム、０．５％  グルコースおよび２０ｍＭ  ＤＬトレオニン）などの液体培地、好ましくはプラスミド抽出用培地で培養し、遠心分離して集菌した菌体から、Anderson ＆ Mckayの定法（Anderson，D．G．and McKay，L．L．（1983）Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci．Applied and Environmental Microbiology 46，549-552）で全プラスミドを抽出する。
次に、全プラスミドをアガロースゲル電気泳動やセシウムクロライド遠心分離法など、分子量の相違による分離手段などによって分画した後、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドなどで染色し可視化して、任意のプラスミドのバンドをゲルから滅菌カッターナイフなどで切出す。
【００３４】
次に、（Ｂ）（Ａ）工程で精製された任意のθ型プラスミドを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する。
（Ｂ）工程は、例えば以下のようにして進めることができる。
すなわち、前記（Ａ）工程で精製された任意のθ型プラスミドのバンドを含むゲルと、１００〜２００μＬの滅菌蒸留水をエッペンチューブに入れ、９６〜９８℃で１０〜２０分間加熱し、アガロースを融解する。さらにその融解物を滅菌蒸留水で１０００倍に希釈したものを鋳型プラスミド溶液とする。
続いて、これを鋳型にＰＣＲを行う。ＰＣＲは、被検菌のプラスミドレプリコン内部のプラスミド不和合性決定配列を特異的に増幅させることができる条件であれば、定法に従って行えばよく、市販されているＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）やAmpliTac Gold（パーキンエルマー）等のＰＣＲ反応試薬キットを使用することによって、より簡便に行うことができる。
【００３５】
ＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、例えば、被検菌に内在するθ型プラスミドの全配列のうち、レプリコン内部の塩基配列、特に不和合性決定配列部の塩基配列を基に、好ましくは両端に制限酵素サイトが設けられるようにしてデザインされたオリゴヌクレオチドを用いることができる。
ここで、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌の場合は、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いることが好ましい。
【００３６】
続いて、（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、選択可能な遺伝子を含むプラスミドベクターに組込み、不和合性誘導プラスミドを得る。
ここで用いるプラスミドベクターとは、ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列、すなわちプラスミド不和合性決定配列を組み込み可能であると共に、該ベクター保有株を後述の（Ｄ）工程において特異的に選択可能とするための選択性遺伝子を含むプラスミドベクターである。
選択性遺伝子としては、各種の薬剤体制遺伝子が挙げられ、具体的には例えば、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３７】
このようなプラスミドベクターとしては、被検菌に内在するθ型プラスミドの全配列のうち、レプリコン内部の塩基配列を含むもの、例えば、レプリコンの複製基点上流の共通配列が含まれる塩基配列部分、複製開始タンパク質構造遺伝子の下流部分の共通配列が含まれる塩基配列部分および上述の選択性遺伝子を有し、ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られるＤＮＡ増幅配列挿入部を、前記２塩基部分の間に有するものが好適である。具体的には例えば、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌の場合には、請求項２に係る本発明のプラスミドベクターｐＤＢ１を好ましく用いることができる。
このようなプラスミドベクターの製造法は、特に限定されず、レプリコンの複製基点上流の共通配列が含まれる塩基配列部分、複製開始タンパク質構造遺伝子の下流部分の共通配列が含まれる塩基配列部分および上述の選択性遺伝子を、被検菌のレプリコンを持たないクローニングベクターに配置して作製することができる。クローニングベクターとしては、請求項２に係る本発明の説明において例示したような市販のベクターを適宜用いることができる。
【００３８】
本（Ｃ）工程において請求項２に係る本発明のプラスミドベクターｐＤＢ１を用いる場合について説明すると、前記（Ｂ）工程におけるポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、請求項２に係る本発明のプラスミドベクターｐＤＢ１のＤＮＡ増幅配列挿入部に組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得る。
即ち、前記（Ｂ）工程において、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いたＰＣＲの結果得られる不和合性決定配列を、請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１のＤＮＡ増幅配列挿入部のＮｒｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトに組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得る。
図１は、（Ｃ）工程の一例を示す説明図である。図１中、Ｅｍｒは、エリスロマイシン体制遺伝子を示し、ここで、請求項２に係る本発明の説明において述べたように、ｐＤＢ１と不和合性決定配列の結合に際して、ｐＤＢ１のＮｒｕ  ＩおよびＸｈｏＩ切断サイトを露出させる必要があるため、事前にＮｒｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで切断し、直鎖化する前処理が必要である。
具体的には例えば、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉを含む反応溶液を調製して制限分解を行った後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行ない、次いで制限酵素Ｎｒｕ  Ｉについて同様に制限分解、抽出および沈殿を行う。
【００３９】
一方、不和合性決定配列の複製起点側末端は、Ｎｒｕ  Ｉ切断サイトに結合させるため、ブラントエンドとし、複製開始タンパク質遺伝子側末端は、Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトに結合させるため、適切な付着末端を生じさせるような前処理が行われる。
具体的には例えば、制限酵素ＥｃｏＴ２２１を含む反応溶液を調製して制限分解を行った後、ブランチングを行ない、次いで制限酵素Ｎｒｕ  Ｉについて同様に制限分解をした後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行う。
【００４０】
増幅配列のプラスミドベクターｐＤＢ１への組込みは、市販のライゲーションキットを使用することによってより簡便に行うことができる。
こうして、約６．１ｋｂの不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得ることができる。ここで、ｐＣＶ（Ｘ）の（Ｘ）部分には、鋳型として抽出した任意のθ型プラスミド毎に異なる数値またはアルファベットが入る。例えば、ｐＣＶ１、ｐＣＶ５、ｐＣＶ２８、ｐＣＶｃ８、ｐＣＶｍ６などである。
【００４１】
ここで図１は、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌の場合の（Ｃ）工程の一例を示す説明図である。図１に示すように、ＰＦおよびＰＲの組み合わせからなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅された不和合性決定配列（ＶＦ）は、増幅同時に導入された制限酵素（Ｘｈｏ  ＩおよびＮｒｕ  Ｉ）切断サイトにより、ｐＤＢ１（Ｅｍｒは、エリスロマイシン耐性遺伝子を示す。）のＤＮＡ増幅配列挿入部位に組み込まれ、ｐＣＶ（Ｘ）が得られる。
【００４２】
そして、（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドを被検菌に導入する。
被検菌への導入は、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）によることが好ましい。エレクトロポレーション法は、Holo ＆ Nesの定法（Holo，H．and Nes，I．F．（1989）High-frequency transformation by electroporation of Lactococcus lactis subsp．cremoris growing with glycine in osmotically stabilized media．Applied and Environmental Microbiolorogy 55，3119-3123）に従って行うことができる。
不和合性誘導プラスミドを保有する被検菌の選択は、不和合性誘導プラスミド中の選択性遺伝子を利用して行うことができる。例えば、不和合性誘導プラスミドがｐＣＶ（Ｘ）の場合は、エリスロマイシンを利用して行うことができる。具体的には例えば、被検菌とｐＣＶ（Ｘ）の混合懸濁液４０μｌをエレクトロポレーション処理した後、被検菌をＳＧＭ１７液体培地（ＧＭ１７培地に、シュークロースを０．５Ｍになるように添加する）で２５倍に希釈し、３０℃、２時間復帰培養した後、エリスロマイシンを添加した固形培地に、培養液１００〜２００μｌを塗布し、３０℃で１〜３日間培養してエリスロマイシン耐性菌のコロニーを釣菌する。エリスロマイシン耐性菌株は、エリスロマイシン耐性遺伝子をコードしているｐＣＶ（Ｘ）を保有している。
【００４３】
次に、（Ｅ）前記不和合性誘導プラスミド保有株を選択物質添加培地で継代培養し、目的のプラスミド、すなわち各保有株に内在している不和合性誘導プラスミドと不和合性を示すプラスミドをキュアリングする。
選択物質添加培地としては、被検菌が生育可能な液体培地に、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等の抗生物質など、（Ｃ）で用いたプラスミドベクターの選択性遺伝子に対応した選択物質を、適切な濃度で添加したものを用いることができる。例えば、不和合性誘導プラスミドがｐＣＶ（Ｘ）の場合は、ｐＣＶ（Ｘ）保有株を２〜５μｇ／ｍｌ濃度のエリスロマイシン添加培地で継代培養することになる。このエリスロマイシン添加培地としては、ＧＭ１７、ＭＲＳ、ＴＹＧ（１％  トリプシン、０．５％  イーストエクストラクト、０．５％  塩化ナトリウム、１％  コハク酸ナトリウム、０．５％  グルコース）などのラクトコッカス属乳酸菌が生育可能な液体培地（乳酸菌生育用培地）に、エリスロマイシンを２〜５μｇ／ｍｌの濃度で添加したものを用いることができる。なお、プラスミドｐＤＢ１として請求項２に係る本発明の説明で述べたように、エリスロマイシン耐性遺伝子の代わりに、他の薬剤耐性遺伝子を組込んだものを用いるには、エリスロマイシンの代わりに、それらの薬剤を添加した培地を用いることが必要である。
【００４４】
継代培養の培養条件は、被検菌株およびキュアリングを予定するプラスミドの種類にもよるが、例えば、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌であり、ｐＣＶ（Ｘ）保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養する場合を例に取ると、５０世代以上、好ましくは１００世代以上、２５〜３０℃で継続的に培養することが一般的である。
継代は、途中単一コロニーを分離し、目的プラスミドの消失を確認しながら続けることが好ましい。例えば、ｐＣＶ（Ｘ）保有株の場合、ＧＭ１７、ＭＲＳ、ＴＹＧ等の乳酸菌生育用培地に１．５％アガロースなどを添加して固めて得られるエリスロマイシン添加固形培地で５〜２０世代ごとのペースで単一コロニーを分離し、目的プラスミドの消失を確認しながら続けることができる。
【００４５】
目的プラスミドが完全に被検菌株の細胞内から消失したことは、目的プラスミドに特有の遺伝子配列が解っている場合、該配列をＰＣＲで検出し、確認することができる。また、目的プラスミドの遺伝子配列が未知の場合、釣菌したコロニーから全プラスミドを抽出し、プラスミドパターンを野生株と比較することによって確認することもできる。
【００４６】
次に、（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、選択物質無添加培地で継代培養し、被検菌に内在する前記不和合性誘導プラスミドを自然に消失させる。即ち、前記（Ｅ）工程において目的プラスミドが完全にキュアリングされた前記被検菌を、選択物質無添加培地に植菌し、さらに継代培養することで、不和合性誘導プラスミドを細胞内から自然に消失させることができる。
選択物質無添加培地としては、（Ｅ）工程の説明で挙げたのと同様な被検菌が生育可能な液体培地を用いることができる。ここで、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌であり、ｐＣＶ（Ｘ）を利用した場合は、エリスロマイシン無添加培地、すなわち、ＧＭ１７，ＭＲＳ，ＴＹＧ等の乳酸菌生育用培地を用いることができる。
継代培養の培養条件は、被検菌株の種類にもよるが、例えば、被検菌がラクトコッカス属乳酸菌であり、エリスロマイシン添加培地で継代培養する場合を例に取ると、一般に５０世代以上、好ましくは１００世代以上、より好ましくは２００世代以上、２５〜３０℃で継続的に培養する。
細胞内から不和合性誘導プラスミドを消失した菌株を取得するためには、培養液中の被検菌を固形培地に展開し、コロニーを形成させ、コロニーを選択物質添加培地と無添加培地の両方に植菌することによって、選択物質無添加培地でのみ生育できる菌株のコロニーを増殖させる。
【００４７】
このような請求項３に係る本発明の作出法によれば、選択的にプラスミドをキュアリングすることができ、発酵に必要な遺伝子群のみならず、キュアリングしたプラスミド以外の遺伝子構成は野生株と同一なプラスミド変異株を作出することができる。
特に、請求項４に係る本発明の作出法によれば、ラクトコッカス属乳酸菌から、発酵産業に利用可能な実用的プラスミド変異株を効率良く作出することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１（プラスミドｐＤＢ１の構築）
レプリコン内部にコードされている、不和合性決定配列挿入部位を持つプラスミドベクターの構築を行った。
【００４９】
即ちまず、以下の手順でラクトコッカス属乳酸菌に内在するθ型プラスミドの塩基配列を解明した。ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ１株（独立行政法人農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００２０６である。）から、７．３ｋｂの機能未知なプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを抽出し、Sanger法（Sanger，F．，Nicklen，S．and Coulson，A．R．（1977）DNA sequencing with chain-terminating inhibitors．Proceedings of National Academy of Science USA 74，5463-5467）により全遺伝子配列を決定し、相同性検索を行った。その結果、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの総塩基数は７３４４ｂｐであり、その中に、ラクトコッカス属乳酸菌のθ型プラスミドの複製起点と高いホモロジーを示す遺伝子配列、同じくθ型プラスミドの複製開始タンパク質遺伝子と高いホモロジーを示す１１６１ｂｐの翻訳領域、さらにファージ耐性に関与する制限・修飾サブユニット遺伝子と高いホモロジーを示す１２４５ｂｐの翻訳領域等が含まれることが確認された。
尚、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの塩基配列は、データベースであるＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７９３８０として登録されている。
【００５０】
上記相同性検索で確認された、θ型プラスミドの複製起点と高いホモロジーを示すプラスミドｐＤＲ１−１Ｂの遺伝子配列および複製開始タンパク質遺伝子と高いホモロジーを示すプラスミドｐＤＲ１−１Ｂの翻訳領域は、それぞれ複製起点および複製開始タンパク質遺伝子としてレプリコンを構成すると考えられた。
そこで、このレプリコンの遺伝子配列を、既に報告されている、ラクトコッカス属乳酸菌に内在する以下のθ型プラスミドのレプリコンの配列と比較した。
比較の対象としたプラスミド（括弧内はそれぞれのプラスミドが属するラクトコッカス属乳酸菌株名を示す）は、ｐＡＨ３３（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＰＣ２２０株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ２０７８５５）、ｐＡＨ８２（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＰＣ２２０株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ２４３３８３）、ｐＡＷ１２２（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｗ１２株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ０９７４７２）、ｐＣＩ２００１（ラクトコッカス・ラクチス  ２７５株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ１７９８４７）、ｐＤＲ１−１（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ１株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＢ０７９３８１）、ｐＥＷ１０４（ラクトコッカス・ラクチス  Ｗ１０株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ０９７４７１）、ｐＨＰ００３（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  ＨＰ株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ２４７１５９）、ｐＩＬ１０５（ラクトコッカス・ラクチス  ＩＬ９６４株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．ＡＦ１１６２８６）、ｐＳＬ２（ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｂｕ２株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．Ｘ５６５５０）、ｐＳＲＱ７００（ラクトコッカス・ラクチス  ＤＣＨ−４株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．Ｕ１６０２７）、およびｐＵＣＬ２２（ラクトコッカス・ラクチス  Ｚ２７０株，ＤＤＢＪ  Ｎｏ．Ｘ６０４５４）の各種である。
その結果、プラスミドのコピー数などプラスミドの特異性を決定する不和合性決定配列が、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂを構成する全塩基配列のうち９７２〜２０６１塩基部分の約１．１ｋｂ内にあることを見い出した。
【００５１】
本発明者らはこれに着目し、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂのレプリコンの遺伝子配列約２ｋｂのうち、どの部分が不和合性決定配列か調べた。
その結果、レプリコンを構成する５２５〜２５２０塩基部分のうち、５２５〜９９１塩基部分を複製起点側共通配列部、９２７〜２０６１塩基部分を不和合性決定配列部（固有配列部）、２０４０〜２５２０塩基部分を複製開始タンパク質側共通配列部に区分し、それぞれの断片を増幅しうるプライマーを設計した。
即ち、上記の不和合性決定配列部を増幅するためのＰＣＲのプライマーセットとして、配列表の配列番号１および２に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド（ＰＦおよびＰＲ）を設計した。また、上記の複製起点側共通配列部を増幅するためのＰＣＲのプライマーセットとして、配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを設計した。さらに、上記の複製開始タンパク質側共通配列部を増幅するためのＰＣＲのプライマーセットとして、配列表の配列番号７および８に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを設計した。
尚、各オリゴヌクレオチドは、それぞれ５´端寄りにクローニング用の制限酵素切断サイトが設けられるようにデザインした。
【００５２】
これらのオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲを行った。
即ち、配列番号５および６に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用し、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂを鋳型にＰＣＲを行った結果、増幅断片の一端にＢａｎ  III、もう一端にＮｒｕ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉ切断サイトを付した複製起点側共通配列部の増幅断片を得ることができた。
クローニングベクターへの結合に際して、増幅断片はＢａｎ  IIIおよびＥｃｏＲ  Ｉで切断し、４４５ｂｐの組込み配列を準備した。本増幅断片４４５ｂｐの全塩基配列は、配列表の配列番号３に記載した通りである。
【００５３】
一方、配列番号７および８に記載の塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして使用し、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂを鋳型にＰＣＲを行ったところ、増幅断片の一端にＰｓｔ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトを付した複製開始タンパク質側共通配列部の増幅断片４６６ｂｐを得ることができた。
クローニングベクターへの結合に際して、増幅断片はＰｓｔ  Ｉおよび複製開始タンパク質遺伝子の終止コドン直後にあるＸｂａ  Ｉで切断し、４６８ｂｐの組込み配列を準備した。本増幅断片４６８ｂｐの全塩基配列は、配列表の配列番号４に記載した通りである。
【００５４】
クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のマルチクローニングサイトに、複製起点側共通配列部（即ち、上記の組み込み配列（配列番号３））、複製開始タンパク質側共通配列部（即ち、上記の組み込み配列（配列番号４））、エリスロマイシン耐性遺伝子を順次クローニングし、プラスミドｐＤＢ１を得ることができた。
こうして得られたプラスミドｐＤＢ１は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９である。
【００５５】
実施例２（プラスミド変異株の作出）
ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ１株（ＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００２０６）に内在する、７．３ｋｂプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを以下の手順で選択的にキュアリングし、プラスミド変異株を作出した。
【００５６】
（Ａ）θ型プラスミドの精製
被検菌であるラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ１株から７．３ｋｂプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを精製した。
即ち、まず、ＤＲＣ１株をプラスミド抽出用培地（１％トリプシン、０．５％イーストエクストラクト、０．５％  塩化ナトリウム、１％  コハク酸ナトリウム、０．５％  グルコース、２０ｍＭ  ＤＬトレオニン）１０ｍｌを用いて３０℃で１晩培養し、遠心分離して集菌した菌体から、Anderson ＆ Mckayの方法（Anderson，D．G．and McKay，L．L．（1983）Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci．Applied and Environmental Microbiology 46，549-552）を一部改変した方法で全プラスミドを抽出した。
【００５７】
全プラスミドの抽出の手順は、以下に示す（１）〜（９）の通りとした。
（１）菌体を１回滅菌蒸留水で洗浄した後、遠心分離で回収し、４００ｍｌのＳＴＥバッファー（６．７％  シュークロース、５０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した。（２）これに１００ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ  リゾチーム／２５ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０）と、ＲＮａｓｅ溶液２０μｌ（１０ｍｇ  ＲＮａｓｅ／ｍｌ、１０ｍＭ  トリス、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて、３７℃で３０分間静置した。
（３）続いて、４８．２μｌの５０ｍＭ  トリス、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、ついで、２７．６μｌの２０％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  トリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えて転倒混和し、３７℃で１０分間静置した。（４）さらに２７．６μｌの３Ｎ  ＮａＯＨを加えて１０分間転倒混和した。（５）そして、５０μｌの２Ｍ  トリス（ｐＨ７．０）を加えて３分間転倒混和した。（６）これに、７１．７μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加えて混和後、７５０μｌのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）を加えて、１０〜１５分間転倒混和した。
（７）遠心分離して上清を回収し、７００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（和光純薬）を加えて１０〜１５分間転倒混和した。（８）さらに遠心分離して上清を回収し、等量のイソプロピルアルコールを加えて−２０℃で３０分以上静置した後、遠心分離で沈澱を回収した。（９）沈澱は、７５％  エタノールで１回洗浄し、再び遠心分離で回収した後、風乾した。
【００５８】
次に、風乾した全プラスミドを、２０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、その全量をアガロースゲル電気泳動で分画した（１．０％ゲル、電気泳動装置（商品名：ミューピッド、アドバンテック社製））。電気泳動後のゲルは、エチジウムブロマイド染色によって可視化し、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂのバンドを、アガロースゲルから滅菌カッターナイフで切出した。
【００５９】
（Ｂ）ＰＣＲ
前記（Ａ）工程で得られるプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを鋳型として、前記実施例１で設計した配列表の１および２からなる塩基配列の組み合わせからなるオリゴヌクレオチド（ＰＦおよびＰＲ）をプライマーセットとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、ｐＤＲ１−１Ｂレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅した。
【００６０】
すなわち、まず、前記（Ａ）工程で得られるｐＤＲ１−１Ｂのバンドを含むゲルと、１００〜２００μｌの滅菌蒸留水をエッペンチューブに入れ、９６℃で１５分間加熱し、アガロースを融解した。さらにその融解物を滅菌蒸留水で１０００倍に希釈したものを鋳型プラスミド溶液として調製した。
続いて、これを鋳型にＰＣＲを行った。
すなわち、キット付属の反応緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ  mixture  ０．２ｍＭ、プライマー（ＰＦおよびＰＲ）各０．４μＭ、鋳型ＤＮＡ溶液５μｌおよびAmpliTac Goldポリメラーゼ  １．０Ｕを含むＰＣＲ反応液（総量５０μｌ）を調製した。GeneAmp PCR System（パーキンエルマー社）を用いて、９５℃で９分間の予備加熱後、変性を９５℃で３０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、伸長を７２℃で８０秒で行ない、このサイクルを４０サイクル行った。
【００６１】
（Ｃ）不和合性誘導プラスミドｐＣＶ５の調製
前記（Ｂ）工程で得られるプラスミドｐＤＲ１−１Ｂの不和合性決定配列を、実施例１で得られるプラスミドｐＤＢ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９）のＤＮＡ増幅配列挿入部のＮｒｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトに組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ５を作成した。
まず、プラスミドｐＤＢ１のＮｒｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断サイトを露出させる必要があるため、Ｎｒｕ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで切断し、直鎖化する前処理を行った。前処理の手順は、以下に説明する（１）〜（６）の通りとした。
【００６２】
（１）Ｘｈｏ  Ｉ分解
Ｘｈｏ  Ｉ  １μｌ、１０×バッファー２μｌ、サンプル（ｐＤＢ１）４μl（２〜１０μｇ  ＤＮＡ）および滅菌蒸留水１３μｌからなる反応溶液（２０μｌ容量）を、３７℃で一晩処理してＸｈｏ  Ｉ分解処理した。
【００６３】
（２）フェノール／クロロホルム抽出
反応が終わった後の前記（１）の反応溶液に、１８０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  トリスおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、２０μｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、および２００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（和光純薬）を加えて約５分間震盪した後、遠心分離して上清を回収した。
【００６４】
（３）エタノール沈澱
前記（２）で回収した上清に、２倍量のエタノールを加えて−３０℃で３０分間静置した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。その後、７５％エタノールで１回洗浄した後、再び遠心分離し、沈澱を風乾して１５μｌの滅菌蒸留水に溶解した。
【００６５】
（４）Ｎｒｕ  Ｉ分解
Ｎｒｕ  Ｉ  １μｌ、１０×バッファー２μｌ、１０×ＢＳＡ  ２μｌ、および前記（３）で得られたサンプル１５μlからなる反応溶液を、３７℃で２時間処理してＮｒｕ  Ｉ分解した。
【００６６】
（５）フェノール／クロロホルム抽出
反応が終わった後の前記（４）の反応溶液を用いた他は、（２）と同様にして行った。
【００６７】
（６）エタノール沈澱
前記（５）で回収した上清を用いた他は、（３）と同様にして行った。
【００６８】
一方、（Ｂ）工程で得られるプラスミドｐＤＲ１−１Ｂの不和合性決定配列の複製起点側末端は、Ｎｒｕ  Ｉ切断サイトに結合させるため、ブラントエンドとし、複製開始タンパク質遺伝子側末端は、Ｘｈｏ  Ｉ切断サイトに結合させるため、適切な付着末端を生じさせるような前処理を行った。前処理の手順は、以下に説明する（１）〜（４）の通りとした。
【００６９】
（１）ＥｃｏＴ２２１分解
ＰＣＲ後の増幅産物５０μｌを、フェノール／クロロホルム処理およびエタノール沈澱で精製、風乾し、３４μｌの１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．５）に溶解した。
これにＥｃｏＴ２２Ｉ  ２μｌおよび１０×バッファー  ４μｌを加えて３７℃で２時間処理してＥｃｏＴ２２１分解した。
続いてフェノール／クロロホルム処理およびエタノール沈澱で精製、風乾し、ブランチング処理に供した。
【００７０】
（２）ブランチング
風乾した前記（１）のサンプルを、Ｂｕｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ２（タカラバイオ）を使用して平滑末端化した後、フェノール／クロロホルム処理およびエタノール沈澱で精製、風乾し、３４μｌの１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．５）に溶解した。
【００７１】
（３）Ｘｈｏ  Ｉ分解
前記（２）で得られるサンプルに、Ｘｈｏ  Ｉ  ２μｌおよび１０×バッファー  ４μｌを加えて３７℃で２時間処理してＸｈｏ  Ｉ分解した。
【００７２】
（４）フェノール／クロロホルム抽出
反応が終わった後の前記（３）の反応溶液を用いた他は、前記したプラスミドの前処理の（２）と同様にして行った。
【００７３】
（５）エタノール沈澱
前記（４）で回収した上清を用いた他は、前記したプラスミドの前処理の（３）と同様にして行った。
【００７４】
制限酵素分解後、精製して風乾したｐＤＢ１および不和合性決定配列断片は、一緒に１０μｌの１０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．５）に溶解し、ライゲーションキットＶｅｒ  ２（タカラバイオ）を使用してライゲーション反応を行った。
こうして、約６．１ｋｂの不和合性誘導プラスミドｐＣＶ５を得た。ｐＣＶ５は、必要に応じて市販の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅで増幅し、市販のプラスミド抽出用キットで抽出精製して使用した。なお、野生株（ＤＲＣ１）を受容菌として、ｐＣＶ５を導入した場合の形質転換効率は、８．３×１０４（個／１μｇＤＮＡ）であった。
【００７５】
（Ｄ）被検菌への導入
前記（Ｃ）工程で得たプラスミドｐＣＶ５を、被検菌であるＤＲＣ−１株にHolo ＆ Nesの方法（Holo，H．and Nes，I．F．（1989）High-frequency transformation by electroporation of Lactococcus lactis subsp．cremoris growing with glycine in osmotically stabilized media．Applied and Environmental Microbiolorogy 55，3119-3123）を利用して、エレクトロポレーションにより導入した。
すなわち、０．１ｃｍエレクトロポレーション用キュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に、コンピテントセル４０μｌ、ｐＣＶ５  ２μｌ（１〜５μｇプラスミドＤＮＡ）を入れ、電圧１．８ｋＶ、２．５ｍｓｅｃ．の条件で処理した。電気パルスをかけた後、素早くＳＧＭ１７液体培地（ＧＭ１７培地にシュークロースを０．５Ｍになるように添加したもの）を１ｍｌ加えて２５倍に希釈し、３０℃、２時間復帰培養した後、エリスロマイシンを添加した固形培地に、培養液２００μｌを塗布し、３０℃で３日間培養して、出現したｐＣＶ５保有菌のコロニーを釣菌した。
【００７６】
（Ｅ）プラスミドｐＤＲ１−１Ｂのキュアリング
ｐＣＶ５保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養した。
即ち、エリスロマイシンを添加（５μｇ／ｍｌ）したＴＹＧ培地を用いて、３０℃で１２時間おきに継代し、１００世代培養を続けた。１０世代目、５０世代目および１００世代目において、エリスロマイシン添加固形培地（エリスロマイシン添加培地に１．５％アガロースを添加して固めた培地。）で単一コロニーを分離し、目的プラスミドｐＤＲ１−１Ｂが完全に被検菌ＤＲＣ１株の細胞内から消失した変異株の出現を確認すると同時に、本変異株の出現割合を測定した。
即ち、コロニーを構成している菌体を直接ＰＣＲ反応の鋳型にして、ｐＤＲ１−１Ｂにコードされている制限・修飾サブユニット遺伝子を特異的に認識するプライマーを使ってＰＣＲを行い、ｐＤＲ１−１Ｂが菌体内に残存しているか否かを確認した。
継代培養の過程におけるｐＤＲ１−１Ｂの消失割合を図２に示す。
なお、１個の細胞が２個に分裂することを以て１世代とカウントしているので、１回の植え継ぎで、約１０世代継代するものとして計算した。
【００７７】
図２に示すように、１０世代目まではｐＤＲ１−１Ｂがほとんど消失していないが、５０世代目には３０％程度となり、１００世代目には完全に消失した。
このことから、１００世代の継代培養により、被検菌ＤＲＣ１株からプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを完全にキュアリングできることが確認された。
【００７８】
（Ｆ）ｐＣＶ５の消失
前記（Ｅ）工程において得られた、目的プラスミドｐＤＲ１−１Ｂがキュアリングされた被検菌を、エリスロマイシン無添加培地で継代培養した。
即ち、前記（Ｅ）工程で用いた液体培地を用いて、３０℃で１２時間おきに継代し、１００世代培養を続けた。
培養後、培養液中の被検菌をＴＹＧ固形培地に展開し、３０℃で１晩培養した。培地中に形成したコロニーを、前記（Ｅ）工程で用いたエリスロマイシン添加培地と、上述のエリスロマイシン無添加培地の両方に植菌し、３０℃で１晩培養した。その結果、エリスロマイシン無添加培地でのみ生育できるコロニーの存在が確認され、このコロニーはｐＣＶ５が自然消失した被検菌、即ち目的のプラスミド変異株であることが確認できた。そのコロニーをさらに増殖させ、目的のプラスミド変異株を得ることができた。
【００７９】
実施例３（プラスミド変異株の作出）
ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  ７１２株（農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００１０４である。）に内在する、機能未知な多コピープラスミドを選択的にキュアリングし、プラスミド変異株を作出した。
変異株の作出は、実施例２と基本的に同様の手順で行った。
すなわち、実施例２の工程（Ａ）〜（Ｃ）において、被検菌をラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  ７１２株とし、プラスミドを該菌株に内在する機能未知な多コピープラスミドとした他は同様の条件で行い、不和合性誘導プラスミドｐＣＶｍ６を得た。
続いて、実施例２の工程（Ｄ）と同様の条件で、プラスミドｐＣＶｍ６を上記７１２株に導入した。
【００８０】
次に、工程（Ｅ）としてｐＣＶｍ６保有株から機能未知な多コピープラスミドをキュアリングした。即ち実施例２の工程（Ｅ）と同様にしてｐＣＶｍ６保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養した。ここで、この目的プラスミドの機能および遺伝子配列は未知であるため、実施例２の方法では目的プラスミドのキュアリングの確認が困難である。そこで、継代培養の各世代の培養液をエリスロマイシン固形培地に塗布してコロニーを形成させた点は、実施例２の工程（Ｅ）と同様としたが、その後単一コロニー由来の菌株からプラスミドを抽出して電気泳動し、そのプラスミドパターンを、７１２野生株のそれと比較することにより、目的プラスミドが菌体内に残存しているか否かを確認した。
その結果、ｐＣＶｍ６保有株を分離してから２０世代継代培養すると、目的プラスミドキュアリング株を得ることができた。
【００８１】
その後、目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、継代培養を５０世代とした他は実施例２の（Ｅ）工程と同様にしてｐＣＶｍ６を消失させた。その結果、エリスロマイシン無添加培地でのみ生育できるコロニーの存在が確認され、このコロニーはｐＣＶｍ６が自然消失した被検菌、即ち目的のプラスミド変異株であることが確認できた。そのコロニーをさらに増殖させ、目的のプラスミド変異株を得ることができた。
本実施例３の結果から、実施例２で対象としたＤＲＣ１株とは亜種（＝サブスピーシーズ）を異にするラクトコッカス乳酸菌（クレモリス）を被検菌とする場合においても、本発明の方法が有効であることが確認された。
【００８２】
実施例４（プラスミド変異株の作出）
ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株（農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００２０７である。また、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７である。）に内在する、クエン酸資化性プラスミドを、選択的にキュアリングし、プラスミド変異株を作出した。
変異株の作出は、実施例２と基本的に同様の手順で行った。
すなわち、実施例２の工程（Ａ）〜（Ｃ）において、被検菌をラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株とし、プラスミドを、該菌株に内在するクエン酸資化性プラスミドとした他は同様の条件で行い、不和合性誘導プラスミドｐＣＶｃ８を得た。
続いて、実施例２の工程（Ｄ）と同様の条件で、プラスミドｐＣＶｃ８を上記Ｎ７株に導入した。
【００８３】
次に、工程（Ｅ）としてｐＣＶｃ８保有株から機能未知な多コピープラスミドをキュアリングした。即ち実施例２の工程（Ｅ）と同様にしてｐＣＶｃ８保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養した。ここで、目的プラスミドはクエン酸資化を支配する遺伝子（クエン酸透過酵素遺伝子）をコードしており、その配列は既知である。そこで、本遺伝子の塩基配列を認識するプライマーセットを合成し、これをコロニーを構成している菌体を直接鋳型としたＰＣＲに用いた他は実施例２の工程（Ｅ）と同様にして、目的プラスミドが菌体内に残存しているか否かを確認した。
その結果、ｐＣＶｃ８保有株を分離してから２０世代継代培養すると、目的プラスミドキュアリング株を得ることができた。
【００８４】
その後、目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、実施例２の（Ｅ）工程と同様にしてｐＣＶｃ８を消失させた。その結果、エリスロマイシン無添加培地でのみ生育できるコロニーの存在が確認され、このコロニーはｐＣＶｃ８が自然消失した被検菌、即ち目的のプラスミド変異株であることが確認できた。そのコロニーをさらに増殖させ、目的のプラスミド変異株を得ることができた。
【００８５】
クエン酸資化性プラスミドの消失によって、被検菌はクエン酸を資化することができなくなり、フレーバー成分の１つであるジアセチルを生成しなくなることがわかっている。そこで、本実施例４において得られたプラスミド変異株が、実際にジアセチルを生成しない性質を有しているか否かの確認を行った。
すなわち、作出したプラスミド変異株で実際に発酵乳を作成した。すなわち、１０％スキムミルクにプラスミド変異株を添加し、１〜２晩培養して発酵乳を作製した。一方、比較対照として、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株（野生株、すなわち、プラスミド変異していないもの）を用いた他は同様にして発酵乳を作製した。
得られる発酵乳について、クレアチンテストでジアセチルの生成を試験した。すなわち、発酵乳５ｍｌに、０．５％  クレアチン溶液１ｍｌおよび５％  α−ナフトール（２．５Ｎ  ＮａＯＨ）１ｍｌを混合し、室温で１時間処理した。赤色が観察された場合には、ジアセチルが生成されたと判定した。
その結果、野生株で作成した発酵乳にはジアセチルが生成していたが、変異株で作成した発酵乳では生成していないことを確かめた。
本実施例４の結果から、Ｎ７株を被検菌とする場合においても、本発明の方法が有効であることが確認されるとともに、得られたプラスミド変異株は、親株とは発酵特性を異にし、発酵特性（風味成分）の異なる発酵産物を生産する能力を有することが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、目的のプラスミドを選択的にキュアリングすることで、プラスミド変異株を効率良く作出することができる。特に、ラクトコッカス属乳酸菌に内在しているプラスミドの不和合性決定配列を簡便に増幅することができるできるオリゴヌクレオチドと、増幅配列を組込むことができ、且つＰＣＲの鋳型としたプラスミドと不和合性を示す不和合性誘導プラスミドを構築することができるプラスミドｐＤＢ１とを用いることにより、プラスミド変異株を効率良く作出することができる。
即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーセットとして用いられることによって、個々のプラスミドの塩基配列決定や、プラスミドの部分分解による複製領域の特定作業を行わなくても、ラクトコッカス属乳酸菌に内在しているθ型プラスミドのレプリコン内部にコードされている、プラスミドの不和合性決定配列を簡便に増幅することができる。
また、本発明のプラスミドｐＤＢ１は、上記オリゴヌクレオチドにより得られる増幅配列を組込むことができるので、ＰＣＲの鋳型にしたプラスミドと不和合性を示す、不和合性誘導プラスミドを構築することができ、これにより前記鋳型にしたプラスミドを選択的に短時間でのキュアリングが可能となる。
そして、上記オリゴヌクレオチドおよびプラスミドｐＤＢ１を用いることにより得られるプラスミド変異株は、外来遺伝子が一切残存せず、キュアリングしたプラスミド以外の遺伝子構成は全く野生株と同様で野生株の特性を受け継いでいるため、安全な実用菌株として実用発酵食品の製造に利用することができ、味や風味の改善に役立てることができる。
従って、本発明は、菌株の改良方法として発酵産業上も極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】（Ｃ）工程の一例を示す説明図である。
【図２】継代培養の過程におけるｐＤＲ１−１Ｂの消失割合を示す。
【図１】
2005151931.tif 000002
【図２】
2005151931.tif 000003
【配列表】
2005151931000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月3日(2003.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
ラクトコッカス属乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス（Lactococcus lactis subsp．lactis）またはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp．cremoris）である請求項４記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
請求項４記載の本発明は、
（Ａ）被検菌であるラクトコッカス属乳酸菌から任意のθ型プラスミドを精製する工程、
（Ｂ）該プラスミドを鋳型として、請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を行い、該プラスミドレプリコン内部の、プラスミド不和合性決定配列を増幅する工程、
（Ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応の結果得られる増幅配列を、請求項２記載のプラスミドベクターｐＤＢ１のＤＮＡ増幅配列挿入部に組込み、不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を得る工程、
（Ｄ）前記不和合性誘導プラスミドｐＣＶ（Ｘ）を被検菌に導入する工程、
（Ｅ）ｐＣＶ（Ｘ）保有株をエリスロマイシン添加培地で継代培養し、目的のプラスミドをキュアリングする工程、および
（Ｆ）目的プラスミドがキュアリングされた被検菌を、エリスロマイシン無添加培地で継代培養し、被検菌に内在するｐＣＶ（Ｘ）を自然に消失させる工程からなることを特徴とするラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株の作出法である。
請求項５記載の本発明は、ラクトコッカス属乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス（Lactococcus lactis subsp．lactis）またはラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp．cremoris）である請求項４記載の方法である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
以下に、本発明を詳しく説明する。
本発明によるプラスミド変異株の作出法の対象となる微生物は、θ型プラスミドを有する微生物全般であり、例えば、ストレプトコッカス属菌、ラクトコッカス属菌を含む種々の乳酸菌群、枯草菌、大腸菌などのエシェリヒア属菌、サルモネラ菌、バチルス属菌などの細菌の他、酵母を挙げることができる。このうち、特に発酵乳製品のスターターとして汎用されており、そのθ型プラスミドは発酵特性を支配している遺伝子群をコードする場合が多い点で、ラクトコッカス属乳酸菌が好ましい。
ラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス（Lactococcus lactis subsp．lactis）およびラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp．cremoris）を挙げることができる。本発明において、これらのラクトコッカス属乳酸菌のプラスミド変異株を作出するにあたっては、請求項１に係る本発明のオリゴヌクレオチドおよび請求項２に係る本発明のプラスミドｐＤＢ１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５９９）を用いることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
即ちまず、以下の手順でラクトコッカス属乳酸菌に内在するθ型プラスミドの塩基配列を解明した。ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ１株（Lactococcus lactis subsp．lactis biovar．diacetylactis DRC1）（独立行政法人農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００２０６である。）から、７．３ｋｂの機能未知なプラスミドｐＤＲ１−１Ｂを抽出し、Sanger法（Sanger，F．，Nicklen，S．and Coulson，A．R．（1977）DNA sequencing with chain-terminating inhibitors．Proceedings of National Academy of Science USA 74，5463-5467）により全遺伝子配列を決定し、相同性検索を行った。その結果、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの総塩基数は７３４４ｂｐであり、その中に、ラクトコッカス属乳酸菌のθ型プラスミドの複製起点と高いホモロジーを示す遺伝子配列、同じくθ型プラスミドの複製開始タンパク質遺伝子と高いホモロジーを示す１１６１ｂｐの翻訳領域、さらにファージ耐性に関与する制限・修飾サブユニット遺伝子と高いホモロジーを示す１２４５ｂｐの翻訳領域等が含まれることが確認された。
尚、プラスミドｐＤＲ１−１Ｂの塩基配列は、データベースであるＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０７９３８０として登録されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例３（プラスミド変異株の作出）
ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  ７１２株（Lactococcus lactis subsp．cremoris 712）（農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００１０４である。）に内在する、機能未知な多コピープラスミドを選択的にキュアリングし、プラスミド変異株を作出した。
変異株の作出は、実施例２と基本的に同様の手順で行った。
すなわち、実施例２の工程（Ａ）〜（Ｃ）において、被検菌をラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  クレモリス  ７１２株とし、プラスミドを該菌株に内在する機能未知な多コピープラスミドとした他は同様の条件で行い、不和合性誘導プラスミドｐＣＶｍ６を得た。
続いて、実施例２の工程（Ｄ）と同様の条件で、プラスミドｐＣＶｍ６を上記７１２株に導入した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
実施例４（プラスミド変異株の作出）
ラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株（Lactococcus lactis subsp．lactis biovar．diacetylactis N7）（農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その寄託番号はＭＡＦＦ  Ｎｏ．４００２０７である。また、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７である。）に内在する、クエン酸資化性プラスミドを、選択的にキュアリングし、プラスミド変異株を作出した。
変異株の作出は、実施例２と基本的に同様の手順で行った。
すなわち、実施例２の工程（Ａ）〜（Ｃ）において、被検菌をラクトコッカス・ラクチス  サブスピーシーズ  ラクチス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株とし、プラスミドを、該菌株に内在するクエン酸資化性プラスミドとした他は同様の条件で行い、不和合性誘導プラスミドｐＣＶｃ８を得た。
続いて、実施例２の工程（Ｄ）と同様の条件で、プラスミドｐＣＶｃ８を上記Ｎ７株に導入した。