(57)【要約】    【課  題】  本発明の目的は、パラオ共和国のウルクターブル島のミルキー方面にある白色の海泥の抽出物を精製し、精製された高活性のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有する美白化粧料を提供することである。    【解決手段】    パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物を精製して得られ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有することを特徴とする美白化粧料。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物を精製して得られ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有することを特徴とする美白化粧料。
【請求項２】
海泥エキスを０．００１〜５．０質量％含有することを特徴とする、請求項１記載の美白化粧料。
【請求項３】
パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物を精製して得られ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの肌を美白化し、肌を滑らかにする効果があり、且つ安全性の高い化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌は、日光や様々な化学物質、あるいは掻破などの物理的刺激によって、メラニンの生成が進み、メラニンが皮膚に沈着し黒くなる。メラニン沈着によるしみやそばかす、アトピー性皮膚炎患者などに多く見られる強い色素沈着や黒皮病などは、美容上の問題だけでなく、精神的な苦痛を与え、日常の生活に影響を及ぼすこともある。メラニン色素は、表皮と真皮の間にあるメラニン細胞（メラノサイト）で生成され、生成したメラニンは、浸透作用により隣接細胞へと拡散する。このメラノサイト内における生化学的メラニン生成反応は、必須アミノ酸の一つであるチロシンが酵素チロシナーゼの作用によりドーパキノンとなり、ドーパキノンから継続的な酸化反応の後、ドーパクロム（Ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ）の生成を経て、メラニンの単量体である５，６−ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ）と５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）が生成され、これらが互いに重合して最終的に共重合体の黒色色素のメラニンが生成される。したがって、反応の第一段階であるチロシナーゼの作用を抑制することができれば、メラニン生成を有効に抑制できることになる。
【０００３】
現在、チロシナーゼ阻害活性を有する美白化合物としては、コウジ酸、アルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）、ヒドロキノン、ビタミンＣ、牛胎盤エキス、桑白皮抽出物及び甘草抽出物などが知られている（例えば、特許文献１参照）。これら美白化合物を配合した多くの化粧品や医薬品が販売されている。しかし、長年美白化粧品に利用されてきた牛プラセンタエキスが狂牛病の問題で配合禁止となり、さらに、コウジ酸が発ガン性を指摘されたことで使用禁止になった。また、ビタミンＣ及びその誘導体のチロシナーゼ活性阻害効果は比較的低い。ヒドロキノンは美白作用が非可逆的で皮膚に対する刺激性が強く、安全性の問題でその使用が制限されており、最近では発癌性が判明し、化粧品原料には使用が禁止されている。また大部分の植物抽出物は、高農度の場合にのみ、比較的高いチロシナーゼ活性阻害効果を示し、低濃度においては阻害効果をほとんど示さない。このような状況下、安全で有用な美白剤の開発が待たれている。
【０００４】
近年、パラオ共和国のウルクターブル島のミルキー方面にある白色の海泥の熱水、熱アルコールあるいは熱水と熱アルコールの混液抽出物には、チロシナーゼ阻害活性の認められることが報告され、皮膚外用剤への応用が試みられている（特許文献２参照）。しかし、この抽出物の美白効果はいずれも未だ満足すべきものではない。
【特許文献１】特開平０６−０１６５３２号公報
【特許文献２】特開２００２−３３８４５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、パラオ共和国のウルクターブル島のミルキー方面にある白色の海泥の抽出物を精製して得られる高活性のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有する美白化粧料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明らは、海泥熱水抽出物の美白活性成分の分離精製を目的に、精製を試みたところ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上の高いチロシナーゼ阻害活性を有する海泥エキス画分を得て、この画分が美白効果に従来品に比較して顕著に優れていることを知見した。本発明者らは、さらに研究を進め、本発明を完成した。
すなわち、本発明は
（１）  パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物を精製して得られ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有することを特徴とする美白化粧料、
（２）  海泥エキスを０．００１〜５．０質量％含有することを特徴とする、前記（１）記載の美白化粧料、及び
（３）  パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物を精製して得られ、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示す海泥エキスを含有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の美白化粧料に配合される海泥エキスは海泥の熱水抽出物に比較してチロシナーゼ阻害活性が著しく向上しているため、メラニン産生も著しく抑制できる。
本発明の美白化粧料は、高活性のチロシナーゼ阻害活性成分を含有するので、メラニン産生による色素沈着、例えば日焼け後の色素沈着、ホルモンバランスの変化によりおこる色素沈着、扁平母斑、そばかす、あるいは化粧品かぶれ、ニキビ、ヤケド、アトピー性皮膚炎又は体を洗う際に使うナイロンタオルやブラシ等の外的刺激による炎症後に生じる色素沈着、老人性色素斑、又はレーザー治療等の後に起こる色素沈着等を予防、抑制できる。また、本発明の美白化粧料は、従来品に比べてメラニン産生阻害効果において著しく優れているのみならず、海泥が有する美白、肌荒れ防止、クスミの予防等、肌の美白効果を保持している。
本発明の美白化粧料に配合される海泥エキスは、パラオ共和国のウルクターブル島の海泥熱水抽出物とは異なり、例えば塩化ナトリウム等の塩を含有していないため、エマルジョンやクリーム等の製剤が塩により分離等しないので、製剤化が容易となり、かつ経時的に安定な美白化粧料を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
パラオ共和国のウルクターブル島の海泥（本明細書において、単に「海泥」と略称することもある。）とは、パラオ共和国のウルクターブル島のミルキー方面にある白色の海泥を採取し、必要により水で洗浄し、不要物を除き、また、必要により加熱滅菌等を行ったものをいう。なお、該海泥は、サンゴ等が化石化して堆積されたものと考えられている。
本発明の美白化粧料に使用される海泥エキスは、海泥から抽出、精製又は分離等の手段により採取されたエキスであり、水溶液濃度１００μｇ／ｍＬで８０％以上のチロシナーゼ阻害活性を示すものであれば、その精製又は分離、あるいは抽出方法の如何に関わらず、いずれも本発明の海泥エキスとして使用できる。なお、上記水溶液濃度とは、チロシナーゼ阻害活性を測定する反応液中における海泥エキスの濃度をいうが、該反応液には、測定に影響を与えない範囲であれば、必要に応じてジメチルスルホキシドやエタノール等の溶解補助剤等が含有してもよい。本発明において、「精製」というときは、海泥熱水抽出物にさらに手段を加えてチロシナーゼ阻害活性を高めたものにすることをいう。精製の程度は、精製前の海泥熱水抽出物と同等のチロシナーゼ阻害率を示す被検物の水溶液濃度が通常約１／１０以下、好ましくは約１／１０〜１／１００００程度に減少されていることが好ましい。また、本明細書において「画分」とは、熱水抽出物の成分を種々の分離手段で溶出し、溶媒を除去して得られる乾固物（例えば減圧乾固物又は凍結乾燥物等）をいう。
【０００９】
海泥エキスの精製は、海泥の熱水抽出物を、チロシナーゼ阻害活性を指標に、公知の精製手段、例えば、種々のクロマトグラフィー（分子篩クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー等）、限外ろ過又は電気泳動、又はそれらの組み合わせで行うことができる。例えば図１に示されるように、シリカゲル（吸着）カラムクロマトグラフィー及び分子篩カラムクラマトグラフィーを組み合わせ精製することができる。クロマトグラフィーにおける溶出液から溶出溶媒を減圧濃縮又は／及び凍結乾燥、又は／及びスプレードライ等して一部又は全部を除去して得られ、上記チロシナーゼ阻害活性を有するものを本発明に使用する海泥エキスとすることができる。原料物として使用する熱水抽出物は、海泥に水、例えば精製水、蒸留水又は水道水を加え、約７０〜１００℃程度、好ましくは約１００℃に加熱し、約１時間以上、好ましくは約１時間加熱抽出することによって得られる。海泥と水の割合は、海泥１重量部に対し約２〜１０重量部程度、好ましくは約３〜５重量部程度である。このようにして得られる熱水抽出液をろ過し、ろ液の溶媒を減圧濃縮又は／及び凍結乾燥、又は／及びスプレードライ法等により除去し海泥熱水抽出物とする。該海泥熱水抽出物のチロシナーゼ阻害活性は２ｍｇ／ｍＬの濃度で、阻害率は約７０〜８０％程度である。
【００１０】
上記海泥熱水抽出物を水で溶解したものを、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて、クロロホルム／メタノール／水〔６：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いてまず溶出し、次いでメタノールで溶出する。該メタノールで溶出される画分ｄを回収する。前記シリカゲルとしては、例えばシリカゲル６０Ｎ（６３−２１０μｍ；関東化学株式会社製）等を用いることができる。該画分ｄのチロシナーゼ阻害活性は海泥熱水抽出物の１／２の濃度（１ｍｇ／ｍＬ）で、阻害率約９０％程度である。
次いで、画分ｄを、分子篩クロマトグラフィーにて、メタノール／水〔１：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて溶出する。分子篩クロマトグラフィーに用いる樹脂としては、例えばセファデックスＬＨ−２０（東ソー株式会社製）等を用いることができる。溶出液の一部は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略記する。）で、クロロホルム／メタノール／水／酢酸〔３：３：１：０．１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて展開し、ニンヒドリン試薬で呈色及びＵＶ２５４ｍｍでの発光を指標にしながら溶出液を分画する。
チロシナーゼ阻害活性の高い画分ｄ３は、さらにシリカゲルクロマトグラフィーにて、クロロホルム／メタノール／水〔５：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて溶出し、溶出液の一部を、ＴＬＣでクロロホルム／メタノール／水〔２：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて展開し、ニンヒドリン試薬による呈色を指標にして溶出液を分画する。ニンヒドリン試薬で呈色しない画分ｄ３−１、Ｒｆ値０．３に呈色スポットを示す画分ｄ３−２、Ｒｆ値が０．２及び０．４に呈色スポットを示す画分ｄ３−３を分取後、溶出液をクロロホルム／メタノール／水〔４：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒に換えさらに溶出する。クロロホルム／メタノール／水〔４：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒で溶出される画分ｄ３−４を回収する。シリカゲルとしては、例えばシリカゲル６０Ｎ（６３−２１０μｍ；関東化学株式会社製）等を用いることができる。画分ｄ３−３及び画分ｄ３−４のチロシナーゼ阻害活性は、共に１００μｇ／ｍＬの水溶液濃度で、阻害率は８０％以上であり、本発明に使用する海泥エキスとすることができる。
【００１１】
チロシナーゼは、メラニン生成の最初の段階であるチロシンからＤＯＰＡ（Ｌ−ｄｏｐａ）への水酸化反応と、次の段階であるＤＯＰＡからＤＯＰＡキノンへの酸化反応を触媒する。チロシナーゼ阻害活性は、自体公知の方法で測定することができる。すなわち、ＤＯＰＡ溶液にチロシナーゼ溶液を加え反応が進むと、無色透明の溶液がオレンジ色に変化する。チロシナーゼ阻害活性測定においては、被検物質を加えることによるこの色の変化の現象を吸光度で測定することにより、チロシナーゼ阻害活性を定量できる。ＤＯＰＡの濃度は、通常０．０３質量％程度が好ましい。反応は、緩衝液（例えばリン酸緩衝液等、ｐＨ約６程度）の存在下、約２５℃の加温下で行われることが好ましい。チロシナーゼの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ程度（約１００Ｕ／ｍＬ程度）が好ましい。反応時間は５分程度である。吸光度は、４７５ｎｍで測定するのが好ましい。
【００１２】
上記海泥エキスは、チロシナーゼ阻害活性が高いため、チロシナーゼ阻害剤として皮膚外用剤、特に美白化粧料等に適用できる。
上記海泥エキスは、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤等の剤型で提供することができる。また、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、乳液状又はクリーム状或いは軟膏型のファンデーション、アイカラー、チークカラーといったメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料などとしても提供することができる。また、入浴剤等として提供することもできる。
本発明の美白化粧料は、自体公知の化粧料の製造方法に従い、例えば海泥エキスを水又は／及び化粧品基剤に溶解又は攪拌し製造し得る。攪拌は自体公知の方法、例えばキルンやミキサーによる攪拌、パドル攪拌、超音波による攪拌、磁気力を利用する攪拌等いずれの方法も適宜に使用しうる。美白化粧料中における海泥エキスの配合量としては、化粧料の全質量に対し、約０．００１〜５質量％程度が好ましく、特に好ましくは約０．００５〜２質量％程度である。
【００１３】
本発明の美白化粧料の化粧品基剤としては、例えば陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、増粘剤、油剤、粉体（色素、樹脂、顔料）、香料、保湿剤、生理活性成分、紫外線吸収剤、溶媒、酸化防止剤、キレート剤、防腐剤、中和剤・ｐＨ調整剤、昆虫忌避剤、酵素等を配合することができる。
【００１４】
陰イオン性界面活性剤としては、例えばアルキル硫酸塩、ココイルメチルタウリン塩、脂肪酸塩、ヤシ油脂肪酸その塩、アルキルリン酸塩及びポリオキシエチレンアルキルエーテルのリン酸塩や硫酸塩等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、例えばアルキルベタイン、ホスホベタイン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びこれらのリゾ体の他、ホスホファチジン酸とその塩等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えばグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及びポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００１５】
増粘剤としては、例えばアクリル酸アミド及びその誘導体、カルボキシビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、セルロース、ケラチン及びコラーゲン又はその誘導体、アルギン酸カルシウム、プルラン、寒天、ゼラチン、タマリンド種子多糖類、キサンタンガム、カラギーナン、ハイメトキシルペクチン、ポリビニルアルコール、ローメトキシルペクチン、グァーガム、アラビアゴム、結晶セルロース、天然ゴムラテックス、アラビノガラクタン、カラヤガム、トラガカントガム、アルギン酸、アルブミン、カゼイン、カードラン、ジェランガム及びデキストラン等が挙げられる。
【００１６】
油剤としては、例えばセタノール、イソステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ヘキサデシルアルコール、ベヘニルアルコール及びオクチルドデカノール等の高級アルコール、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ウンデシレン酸及びオレイン酸等の脂肪酸、ミリスチン酸ミリスチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、エチルヘキサン酸セチル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸イソプロピル、ジメチルオクタン酸へキシルデシル、モノステアリン酸グリセリン、トリオクタン酸グリセリン、パルミチン酸セチル、フタル酸ジエチル、モノステアリン酸エチレングリコール及びオキシステアリン酸オクチル等のエステル類、ステアリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル及び分岐脂肪酸コレステリル等のコレステロールエステル、流動パラフィン、ワセリン、スクワラン等の炭化水素、ラノリン、還元ラノリン、水素添加大豆リン脂質等のリン脂質、ミツロウ及びカルナバロウ等のロウ、ホホバ油、ミンク油、カカオ脂、ヤシ油、パーム核油、ツバキ油、ゴマ油、ヒマシ油及びオリーブ油等の油脂、ジメチルポリシロキサン、環状ジメチルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサン等のシリコーン油等が挙げられる。
【００１７】
粉体としては、例えば赤色２０１号、黄色４号、青色１号、黒色４０１号等の色素、黄色４号Ａｌレーキ、黄色２０３号Ｂａレーキ等のレーキ色素、ナイロンパウダー、シルクパウダー、シリコーンパウダー、セルロースパウダー、シリコーンエラストマー球状粉体、ポリエチレン末等の樹脂、黄酸化鉄、赤色酸化鉄、酸化クロム、カーボンブラック、群青、紺青等の有色顔料、酸化亜鉛、酸化チタン等の白色顔料、タルク、マイカ、セリサイト、カオリン等の体質顔料、雲母チタン等のパール顔料の顔料、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、珪酸マグネシウム等の金属塩、シリカ、アルミナ等の無機粉体、ベントナイト、スメクタイト及び窒化ホウ素等が挙げられる。これらの粉体の形状（球状、棒状、針状、板状、不定形状、燐片状、紡錘状等）に特に制限はない。
【００１８】
保湿剤としては、例えばグリセリン、キシリトール、ソルビトール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール２００〜６００、ポリオキシエチレンメチルグルコシド、マルチトール及びマンニトール等が挙げられる。
生理活性成分としては、例えばグリチルリチン酸及びその塩、塩酸ジフェンヒドラミン、胎盤抽出物、アルブチン、コラーゲン、アラントイン及びｄｌ−α−トコフェロール等が挙げられる。溶媒としては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、精製水及び低級アルコール等が挙げられる。
紫外線吸収剤としては、例えばオキシベンゾン、サリチル酸フェニル、シノキサート及び２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール等が挙げられる。
【００１９】
酸化防止剤としては、例えばカテコール、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン及びブチルヒドロキシアニソール等が挙げられる。
キレート剤としては、例えばエデト酸及びその塩類、並びにクエン酸及びその塩等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば安息香酸及びその塩類、イソプロピルメチルフェノール、塩酸クロルヘキシジン、オルトフェニルフェノール、グルコン酸クロルヘキシジン、クロルクレゾール、クロルフェネシン、クロロブタノール、ソルビン酸及びその塩類、デヒドロ酢酸及びその塩類、パラオキシエチレン安息香酸エステル及びハロカルバン等が挙げられる。
中和剤・ｐＨ調整剤としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、ジエタノールアミン及びジイソプロパノールアミン等が挙げられる。
昆虫忌避剤としては、例えばジエチルトルアミド等が挙げられる。
酵素としては、例えば、塩化リゾチーム等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明の美白化粧料には、他の美白成分を添加することもできる。美白成分としては、例えばアスコルビン酸及びその塩類、システイン、グルタチオン及びその塩類又はそのエステル類、Ｎ−アシル化グルタチオン、ハイドロキノン及びその塩類、フェルラ酸及びその塩類、イソフェルラ酸及びその塩類、カフェー酸及びその塩類、４−ｎ−ブチルレゾルシノール等のレゾルシノール類、エルゴ酸及びその塩類、プラセンタエキス、カフェイン、タンニン、べラパミル、トラネキサム酸、甘草抽出物、グラブリジン、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カミツレ抽出物、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸等が挙げられる。
以下に実施例、試験例によって、更に具体的に説明するが、本発明は、これら実施例等によって、限定されるものでないことは云うまでもない。
【実施例１】
【００２１】
美白パック  
Ａ：
海泥エキス                                      ３．０重量部
酸化チタン                                      ２．０重量部
ポリオキシエチレン（２０Ｅ．０）セチルエーテル  １．０重量部
１，３ブチレングリコール                      １０．０重量部
グリセリン                                    １０．０重量部
パラオキシ安息香酸メチル                        ０．１重量部
Ｂ：
ポリビニルアルコール                            １．０重量部
精製水                                        ７２．９重量部
調製方法：Ａを５０℃で加温し、均一に混合する。Ｂは常温で均一に溶解する。Ａを撹拌しながらＢを徐々に加え均一に混合する。撹拌しながら冷却し、３５℃で撹拌を止め放置し、パック剤とする。
【実施例２】
【００２２】
美白クリーム
Ａ：
スクワラン                                    ２５．０重量部
ホホバ油                                        ５．０重量部
ミツロウ                                        ５．０重量部
セタノール                                      ３．０重量部
ステアリン酸モノグリセリン                      ２．０重量部
Ｂ：
ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタン
モノステアリン酸エステル                  ３．０重量部
海泥エキス                                      １．０重量部
グリセリン                                      ７．０重量部
１，３ブチレングリコール                        ７．０重量部
パラオキシ安息香酸メチル                        ０．３重量部
精製水                                        ４１．７重量部
製法：Ａ，Ｂそれぞれに加温し、攪拌しつつ、Ａに徐々にＢを加え、冷却する。
【実施例３】
【００２３】
美白乳液
Ａ：
モノミリスチン酸デカグリセリル                  ２．１重量部
水素添加大豆リン脂質                            ０．６重量部
ステアリン酸                                    ０．５重量部
ベヘニルアルコール                              １．６重量部
パルミチン酸セチル                              ０．６重量部
α−オレフィンオリゴマー                        ６．０重量部
２−エチルヘキサン酸セチル                      ６．０重量部
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル              ６．０重量部
海泥エキス                                      ０．２重量部
グリセリン                                      ５．０重量部
パラオキシ安息香酸                              ０．３重量部
Ｂ：
精製水                                        ５４．２重量部
Ｃ：
カルボキシビニルポリマー                        ０．１重量部
精製水                                        １０．０重量部
Ｄ：
水酸化ナトリウム                                ０．０４重量部
精製水                                          ６．７６重量部
調製方法：Ａ、Ｂともに８０℃で加温溶解し、ＢをＡにホモミキサー撹拌しながら徐々に加え、５，０００ｒｐｍで５分間乳化する。パドル撹拌しながらＣ、Ｄを加え、冷却し、４０〜３５℃で撹拌を止め、放置する。
【実施例４】
【００２４】
美白化粧水
Ａ：
グリチルリチン酸ジカリウム                      ０．２重量部
クエン酸                                        ０．１重量部
クエン酸ナトリウム                              ０．３重量部
精製水                                        ８２．９９重量部
Ｂ：
テトラオレイン酸Ｐ０Ｅ（６０）ソルビトール      ０．９重量部
モノオレイン酸ソルビタン                        ０．１重量部
オリブ油                                        ０．１重量部
ジプロピレングリコール                          ５．０重量部
海泥エキス                                      ０．０１重量部
エタノール                                    １０．０重量部
パラオキシ安息香酸                              ０．３重量部
調製方法：Ａ、Ｂともに５０℃で加温溶解し、ＢをＡに撹拌しながら徐々に加え可溶化する。撹拌しながら冷却し、３０℃で撹拌を止め、放置する。
【実施例５】
【００２５】
美白洗顔剤
Ａ：
ラウリン酸                                      ２．０重量部
ミリスチン酸                                  １７．０重量部
パルミチン酸                                    ４．０重量部
ステアリン酸                                    ４．０重量部
ヤシ油脂肪酸カリウム                            ８．０重量部
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                  ３．０重量部
Ｎ−ココイルメチルタウリンナトリウム          １０．０重量部
濃グリセリン                                    ５．０重量部
１，３−ブチレングリコール                      ５．０重量部
海泥エキス                                      ０．５重量部
パラオキシ安息香酸                              ０．３重量部
Ｂ：
水酸化カリウム                                  ５．５重量部
エデト酸四ナトリウム                            ０．２重量部
精製水                                        ３５．５重量部
調製方法：Ａを８０℃に加温溶解する。Ｂは常温溶解する。ＢをＡに撹拌しながら徐々に加え均一溶解する。攪拌しながら冷却し、３５℃で撹拌を止め、放置する。
【００２６】
試験例１
チロシナーゼ阻害活性
チロシナーゼはきのこから分離及び精製したものを、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社から購入して使用した。チロシナーゼを０．０５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．８）に溶かし、０．１ｍｇ／ｍＬ（２００Ｕ／ｍＬ）溶液とし、チロシナーゼ溶液として使用した。試験管に被検液０．５ｍＬと、基質Ｌ−ｄｏｐａ溶液（０．０３質量％、１／１５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６に溶解）を０．５ｍＬ加え、２５℃、１０分間加温した。次に、チロシナーゼ溶液０．５ｍＬを加え、２５℃、５分間加温した後、吸光度を４７５ｎｍで測定した（Ｄ１）。基質を加えず同様の操作をした吸光度をＤ２、被検液を添加せず同様の操作をした吸光度をＤ３とし、阻害率を以下の式で求めた。
阻害率（％）＝（（Ｄ３−Ｄ２）−（Ｄ１−Ｄ２））／（Ｄ３−Ｄ２）×１００
【００２７】
試験例２
海泥エキスの分離
（１）  海泥熱水抽出物
海泥１ｋｇに、精製水３Ｌを加え、１００℃で１時間加熱後、ろ過した。ろ液を、減圧濃縮後、凍結乾燥し、水を除去し、海泥熱水抽出物した。このときの海泥に対する収率は４％であった。また、海泥熱水抽出物のチロシナーゼ阻害活性は、２ｍｇ／ｍＬの濃度で７４％であった。
【００２８】
（２）（１）で得た海泥熱水抽出物を水で溶解し、シリカゲル〔シリカゲル６０Ｎ（６３−２１０μｍ；関東化学株式会社製）〕カラムクロマトグラフィー（直径６ｃｍ、長さ５０ｃｍ）にて、クロロホルム／メタノール／水〔６：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いてまず溶出し、各画分の溶出液は、これの一部をＴＬＣで、クロロホルム／メタノール／水〔６：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて展開した。ニンヒドリン試薬で呈色したときのＲｆ値が０．６〜１のものを画分ａ〔海泥熱水抽出物に対する収率（以下、単に収率と略称する。）：０．８％〕、Ｒｆ値が０．５〜０．６のものを画分ｂ（収率：６．５６％）及びＲｆ値が０．１〜０．２のものを画分ｃ（収率：４３．９％）として得た。各画分の１ｍｇ／ｍＬの水溶液濃度のチロシナーゼ阻害率は、それぞれ、４０．０％、５８．６％、６３．３％であった。次いで上記シリカゲルクロマトグラフィーをメタノールで溶出する。該メタノールで溶出される溶出液を回収し、画分ｄ（収率：２０．８％）とした。該画分ｄの１ｍｇ／ｍＬの濃度のチロシナーゼ阻害率は８９．％であった。なお、画分ａ及び画分ｂについて、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー、及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔溶出液：ヘキサン／酢酸エチレン＝１：２（Ｖ／Ｖ））で分離精製を試み、３−ヒドロキシブタン酸を分取した。３−ヒドロキシブタン酸１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼ阻害率は約４０％であった。
【００２９】
（３）次いで、画分ｄ１０ｇを、セファデックスＬＨ−２０（東ソー株式会社製）を用い、分子篩クロマトグラフィー（直径３．５ｃｍ、長さ４２ｃｍ）により、メタノール／水〔１：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて溶出した。ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ（約１５０ｍＬ）の溶出液を溶出後、約１５ｍＬずつ試験管に分取し、順次番号を付与し、溶出Ｎｏ．とした。分取した溶出液の一部はＴＬＣで、クロロホルム／メタノール／水／酢酸〔３：３：１：０．１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて展開し、ニンヒドリン試薬で呈色及びＵＶ２５４ｍｍでの発光により表１に示す６つの画分に分画し、画分ｄ１〜ｄ６とした。各画分の収率と１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼ阻害率は表１に示した。
【表１】
2005281228.tif 000002
【００３０】
（４）  チロシナーゼ阻害活性の高い画分ｄ３は、さらにシリカゲルクロマトグラフィー（直径２ｃｍ、長さ１５ｃｍ）にて、クロロホルム／メタノール／水〔５：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて溶出した。溶出液は、ＴＬＣで、クロロホルム／メタノール／水〔２：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒を用いて展開し、ニンヒドリン試薬で呈色により３つの画分を得た。それぞれ画分ｄ３−１（ニンヒドリン試薬で呈色しない画分、収率：０．０４％）、ｄ３−２（Ｒｆ値０．３、収率：０．１１％）、ｄ３−３（Ｒｆ値０．２及び０．４、収率：０．０４６％）とした。各画分の１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼ阻害率はそれぞれ、３３％、４５．２％及び９０．６％であった。
ついで、溶出液をクロロホルム／メタノール／水〔４：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒に換えさらに溶出する。クロロホルム／メタノール／水〔４：４：１（Ｖ／Ｖ）〕混合溶媒で溶出される画分を回収し、画分ｄ３−４とした。画分ｄ３−４の収率は０．７７％で、１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼ阻害率は８４．８％であった。
海泥熱水抽出物を精製し、１００μｇ／ｍＬのチロシナーゼ阻害率が８０％以上である
海泥エキスである画分ｄ３−３及び画分ｄ３−４を得た。これら海泥エキスは、海泥熱水抽出物に比較して約１／２０の量で、海泥熱水抽出物と同等のチロシナーゼ阻害活性を有するまで精製されたことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の美白化粧料は、チロシナーゼ阻害活性の高い海泥エキスを含有するため、メラニン産生による色素沈着を予防、抑制できる化粧料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、海泥熱水抽出物から海泥エキスを精製する方法を示す図である。
【図１】
2005281228.tif 000003