(57)【要約】【課題】カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）の強いバンドル構造を解き溶媒に可溶化することが重要な課題になっている。基礎及び応用にわたり化学・物理・バイオ・エレクトロニクスなどの領域でＣＮＴの可溶化は機能化に結びつくことが理由として挙げることができる。  ＣＮＴの酸処理により生成するカルボン酸部位にＤＮＡを化学結合させたハイブリッド化による可溶化がなされているが、コストが高い、未反応物の分離が困難、大量合成に不向き等の問題がある。【解決手段】本発明によると、ＣＮＴとＤＮＡを水中で混合してバス型の超音波装置を用いて超音波照射するだけの簡便な方法でＣＮＴとＤＮＡのハイブリッド化が可能で、コスト、分離、大量合成における問題点を解決することができた。【選択図】  図１
2005028560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重ラセンＤＮＡ、一本鎖のＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドのいずれか又はこれらの組み合わせとカーボンナノチューブを、純水中又は０．０９Ｍ以下の塩を含む水溶液中で、バス型超音波洗浄器またはカップホーン型の超音波発生装置を用いて超音波処理した後、遠心分離により得られる水溶性カーボンナノチューブの製造方法
【請求項２】
カーボンナノチューブが単層又は多層である請求項１記載の水溶性カーボンナノチューブの製造方法
【請求項３】
ＤＮＡの核酸塩基対が１００以上の二重ラセン構造を示す請求項１、又は２に記載の水溶性カーボンナノチューブの製造方法
【請求項４】
前記請求項１記載のＤＮＡ可溶化カーボンナノチューブ水溶液と陽イオン性ポリマー水溶液にガラス、セラミック、シリコンウエハー、金属及び樹脂の何れかからなる基板を交互に浸漬して得られるＤＮＡ−カーボンナノチューブ交互積層多層超薄膜の製造方法
【発明の詳細な説明】
【本発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  カーボンナノチューブは、１９９１年ＮＥＣ（株）の飯島澄男博士によって発見されたナノサイズの筒状の分子ワイヤーである。銅より高い電導度、高力鋼合金より高い引っ張り強度、超弾性、２８００℃の耐熱性など極限の物性を備えたカーボンナノチューブは、すでに分子エレクトロニクスの分野で応用に向けて大きく展開している。【０００２】  一方、生命体の遺伝情報を司るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝子導入、ＤＮＡチップ、ＤＮＡセンサー、ＤＮＡコンピュータなどバイオテクノロジー、ナノテクノロジー領域の鍵を握るバイオ物質である。
ＤＮＡとＣＮＴとのコンポジット材料は、特に化学・材料やバイオテクノロジー分野での広範な利用が見込まれる、遺伝子導入、ＤＮＡチップ、ＤＮＡセンサー、ＤＮＡコンピュータなどの開発の基盤技術になる可能性をもつ。このためには、ＤＮＡとＣＮＴを均質に複合化する技術の開発が求められる。
【背景技術】
【０００３】  “カーボンナノチューブ（以下ＣＮＴと記載）の強いバンドル構造をほどき、いかに溶媒に可溶化するか”は、ＣＮＴ研究のホットなテーマの一つになっている。なぜなら、基礎および応用にわたり化学・物理・バイオ・エレクトロニクスなど多彩な分野・領域で、ＣＮＴの可溶化は機能化と結びつくからである。可溶化はポリマー鎖がほどけて一本一本が独立して溶解している状態であるが、ＣＮＴの場合この条件が完全に満足されている溶解状態を作り出すことは困難であり、実際はバンドル（集合）ＣＮＴが透明なコロイド分散状態で混在している場合が多い。【０００４】  一方、ＤＮＡをナノ材料として扱う研究が展開しており、これまでさまざまなＤＮＡを含む複合体が報告されている。ＤＮＡ・ＣＮＴ複合系は、ナノバイオテクノロジーとバイオテクノロジーを結ぶナノバイオテクノロジーとして興味ある素材である。ＤＮＡとＣＮＴとを単純に混合しただけのコンポジット材料はすでに報告されているが、そこでは両者は相分離した構造であり、また用いられているＤＮＡは二重らせんＤＮＡでなく一本鎖ＤＮＡである。【０００５】  ＣＮＴは適当な方法（酸処理など）で切断できる。切断部にはカルボン酸が生成する。同時に、ＣＮＴサイドウオールの欠陥部にもカルボン酸が生成する。このカルボン酸部位を用いてＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを化学結合させたＣＮＴ・ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）ハイブリッドが合成できることがすでに報告されている。（ａ）Ｈ．Ｃａｉ，Ｘ．Ｃａｏ，Ｙ．Ｊｉａｎｇ，Ｐ．Ｈｅ，Ｙ．Ｆａｎｇ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５，２８７（２００３）．（文献１）ｂ）Ｃ．Ｄｗｙｅｒ，Ｍ．Ｇｕｔｈｏｌｄ，Ｍ．Ｆａｌｖｏ，Ｓ．Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｒ．Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ，Ｄ．Ｅｒｉｅ，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，６０１（２００２）．（文献２）ｃ）Ｓ．Ｅ．Ｂａｋｅｒ，Ｗ．Ｃａｉ，Ｔ．Ｌ．Ｌａｓｓｅｔｅｒ，Ｋ．Ｐ．Ｗｅｉｄｋａｍｐ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｈａｍｅｒｓ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２，１４１３（２００２））（文献３）。
更に、Ｚｈｅｎｇらは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．５，ｐｐ．３３８−３４２，２００３：本年５月号）（文献４）に短い二重らせんＤＮＡおよびＰｏｌｙ  Ｔ／Ｃ（チミンとシトシンから成る一本鎖のＤＮＡ）を用いてプローブ型の超音波照射により単層ＣＮＴが０．１Ｍ塩化カリウム水溶液に可溶化できることを報告した。【０００６】  （文献１）
Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３７５，２８７（２００３）
（文献２）
Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，６０１（２００２）
（文献３）
Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２，１４１３（２００２）
（文献４）
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２，Ｎｏ．５，ｐｐ．３３８−３４２（２００３）
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  上記従来方法で得られるものは、新しいナノカーボンバイオ材料として展開が期待できるが、化学結合によるハイブリッド化は、コストが高い、未反応不純物の分離が困難、大量合成に不向きなどの重大な問題を抱えている。
又、Ｚｈｅｎｇらの方法では論文にデータが開示してあるのは一本鎖のＰｏｌｙ  Ｔ／Ｃ  ＤＮＡのみであり、短い二重らせんＤＮＡに関する記述のみでデータの開示はない。また、彼らは０．１Ｍ塩化カリウム水溶液という高いイオン濃度でのみ実験を行っている。さらに彼らが用いたプローブ型の超音波照射では、プローブ先端からのチタンの微粉末が剥離しこれが水溶液に混入するという良く知られた欠点があるとともに、プローブ型の超音波照射では、照射による水溶液の温度上昇が大きく慎重な冷却操作が要求されるのも欠点として挙げられる。
【問題を解決するための手段】
【０００８】  本発明では、本発明によるＣＮＴ・ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）ハイブリッドは、両者を純水中で混合し、バス型の超音波装置を用いて超音波照射するだけの簡便な方法で作成できる。バス型超音波照射はプローブ型超音波照射におけるＴｉ微粉末の混入を防止すると共に冷却操作が困難な欠点を解決できる利点がある。ＤＮＡは切断していない市販の長い二重らせんＤＮＡ、切断した短い二重らせんＤＮＡ、二重らせんを合成オリゴヌクレオチド、二重らせんを形成しない一本鎖のＤＮＡが含まれる。
本発明で得られた水中のＣＮＴ・ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）ハイブリッドは、化学結合によるものではなく、ＣＮＴ表面（サイドウオール）へのＤＮＡの物理吸着によるものと推定される。ＣＮＴ・ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）ハイブリッドは構造的にはＤＮＡと類似しており、荷電水溶性高分子のごとく振る舞う。また、荷電水溶性高分子で広く利用されている交互積層法により、さまざまな基板上にＣＮＴ・ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）ハイブリッドの超薄膜を簡便に作成できた。
【発明の実施の態様】
【０００９】  本発明では、多種のＣＮＴを材料として用いることが出来る。単層ＣＮＴは、主に、レーザー蒸発法、アーク放電法、並びに化学気相成長法（ＣＶＤ法）で合成できるが、いずれで合成されたＣＮＴも、また合成後精製処理したＣＮＴにも適用できる。さらに多層ＣＮＴも同様に適用できる。精製ＣＮＴを用いる場合の精製法は以下の通りである。単層ＣＮＴは、合成空気中、炉温度２２５℃で１８時間加熱処理後、濃塩酸中１５分間超音波処理した。次に、１００ｎｍの細孔フィルターでロ別したＣＮＴを炭酸水素ナトリウム水で洗浄後、５０℃で減圧乾燥した。
ＤＮＡは二重ラセン又は一本鎖の何れでも使用可能である。特に、二重ラセンＤＮＡのデータは低分子量のものに関しての記述があるものの実施例は無く、高分子量のものについての前例は皆無であった。本方法では高分子量ＤＮＡに対しても使用可能であることが判明した。ＤＮＡは切断しないでそのままか、もしくは純水中で約１５分間、プローブ型の超音波照射装置（ＳＭＴ社製、ＵＨ−３００）を用いて超音波照射して切断し、鎖長を電気泳動法により確認した。更に、ＤＮＡの替わりにオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
超音波処理温度は１〜１００℃、好ましくは１〜２０℃、更に好ましくは５〜１５℃がＤＮＡ分解酵素の活性を抑制するため、また実験を容易に行うために適切な温度である。更に、
【０００６】で記載した文献４では０．１モルの塩の水溶液で可溶化が行われるているが、本系では純水中でも可溶化が可能で、より適用範囲が広いこと、作成が簡便であることが特徴である。
【発明の効果】
【００１０】  本発明は、カーボンナノチューブのナノサイエンス、ナノバイオテクノロジー研究分野の新しい素材として、産業上有用なナノカーボン材料となりうる。具体的な応用として、遺伝子導入、ガン治療などへのドラッグデリバリー、高感度ＤＮＡ検出試薬などが挙げられる。
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１１】  ＣＮＴとして単層ＣＮＴ（Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製品名ＨｉＰｃｏ）。この単層ＣＮＴは以下の方法で精製後実験に用いた。これを合成空気中、炉温度２２５℃で１８時間加熱処理し、濃塩酸中、１５分間超音波処理した。細孔フィルター（孔径１００ｎｍ）を用いて炉別したＣＮＴを０炭酸水素ナトリウム水で洗浄後、５０℃で加熱減圧乾燥した。
二重らせんを形成するＤＮＡ（Ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ，６．８ｍｇ）を純水１０ｍＬに入れ、プローブ型超音波照射装置（ＳＭＴ株式会社製、周波数２０ｋＨｚ）を用いて５−８℃で１５分間超音波照射（出力２００−３００Ｗ程度）した。得られたＤＮＡの鎖長は、電気泳動実験により、３００−６００ベースペアであることがわかった。
上記精製した単層ＣＮＴとＤＮＡを純水中、バス型超音波照射装置（超音波洗浄器）を用いて５−１０℃で１時間超音波処理を行い、８００ｇの遠心分離により上澄みの黒色透明の水溶液を集めた。
図１は、この黒色透明水溶液ならびに単層ＣＮＴのみのカメラ写真を示した。明らかに、ＣＮＴ単独では水に溶解しないが、ＤＮＡ−ＣＮＴ水溶液は、黒色透明水溶液であり、ＤＮＡによるＣＮＴの可溶化を示している。【０００８】で記載したように文献４（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２，Ｎｏ．５，ｐｐ．３３８−３４２，２００３：本年５月号）では、０．１Ｍ塩化カリウム水溶液という高いイオン濃度で一本鎖ＤＮＡによるＣＮＴ可溶化実験の記載があるが、高いイオン濃度の水溶液でなく純水が適用できることが明らかとなった。本実験は純水並びに０．０９Ｍ程度の塩溶液まで広く用いることが出来る。
得られた黒色透明水溶液に電子顕微鏡用のカーボングリッドを１−２秒浸後、減圧乾燥後に電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）を撮影した。また、同じ得られた黒色透明水溶液に新鮮な面を露出させたマイカを１−２秒浸後、減圧乾燥後した後、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行った。ＴＥＭおよびＡＦＭ観察でＣＮＴが観察されたことから、ＤＮＡがＣＮＴを可溶化していることが裏付けられた。黒色透明水溶液のＴＥＭおよびＡＦＭ写真をそれぞれ図２、図３に示した。
図３は黒色透明水溶液のＡＦＭ像の高さプロファイルから単層ＣＮＴの水中での溶解状態を観察したものである。矢印で示したａ−ｆでの像の高さは、それぞれ２．７５、２．３５、２．７２、２．２４、２．１２および１．９６ｎｍであり、この値は、ＣＮＴのバンドル構造がほどけた状態で水中に可溶化していることを示している。また、バンドル構造で水中に可溶化しているＣＮＴも認められる。このように、ＤＮＡ可溶化ＣＮＴは水中でバンドル構造およびバンドルがほどけた構造の両方が存在した。
可溶化のメカニズムとして、超音波により生成が示唆される数％の一本鎖ＤＮＡがＣＮＴ表面にアンカリングしている、または、ＤＮＡ二重鎖の溝（ｇｒｏｏｖｅ）へのＣＮＴの相互作用が示唆される。
更に、黒色透明水溶液に対して紫外−可視−近赤外吸収スペクトルを行い、近赤外領域に単層ＣＮＴに特徴的な吸収バンドを認めた（図４）。この吸収バンドの吸光度から求めたＤＮＡの可溶化量は、約３０−１００μｇ／ｍｌであった。
【実施例２】
【００１２】バス型超音波照射装置の代わりにカップホーン型の超音波発生装置を用いて実施例と同様の実験を行ったところ、同様にＤＮＡ−ＣＮＴの黒色透明水溶液を得た。得られた黒色透明水溶液に対して電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行ったところ、ＣＮＴが観察されたことから、ＤＮＡがＣＮＴを可溶化していることが裏付けられた。バス型超音波照射装置とカップホーン型の超音波発生装置の併用でも同様の結果が得られた。
【実施例３】
【００１３】  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の単層ＣＮＴの代わりにＭＴＲ社製の単層ＣＮＴ並びに多層ＣＮＴを用いて実施例１と同様の実験操作を行ったところ、同様にＤＮＡ−ＣＮＴの黒色透明水溶液を得た。得られた黒色透明水溶液に対して電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行ったところ、ＣＮＴが観察されたことから、ＤＮＡがＣＮＴを可溶化していることが裏付けられた。
【実施例４】
【００１４】Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の単層ＣＮＴの代わりにＭＴＲ社製多層ＣＮＴを用いて実施例１と同様の実験操作を行ったところ、同様にＤＮＡ−多層ＣＮＴの黒色透明水溶液を得た。得られた黒色透明水溶液に対して電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行ったところ、ＣＮＴが観察されたことから、ＤＮＡが多層ＣＮＴを可溶化していることが裏付けられた。
【実施例５】
【００１５】  未切断の長い二重らせんＤＮＡ（２０００ベースペアー程度）や長さが一定のプラスミドＤＮＡならびに一本鎖のＤＮＡであるｐｏｌｙ  Ａを用いて実施例１と同様の実験を行ったところ、同じく黒色透明水溶液が得られた。得られた黒色透明水溶液に対して電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行ったところ、ＣＮＴが観察されたことから、様々なＤＮＡがＣＮＴを可溶化することが裏付けられた。
【実施例６】
【００１６】  二重らせんＤＮＡの代わりに一本鎖のオリゴヌクレオチド（１０量体）を用いて実施例１と同様の実験を行ったところ、同じく黒色透明水溶液が得られた。  得られた黒色透明水溶液に対して電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によりＣＮＴの映像化を行ったところ、ＣＮＴが観察されたことから、ＤＮＡがＣＮＴを可溶化していることが裏付けられた。
【実施例７】
【００１７】  実施例１で得られた黒色透明水溶液を多孔質のメンブレンフィルターで濾過したところ、ＤＮＡとＣＮＴの複合体が得られた（図５）。
得られた複合体は超音波照射により再度水中に可溶化することができた。このＴＥＭ像を図６に示した。
得られた可溶化溶液と陽イオン性ポリマーであるポリアリールアミン塩酸塩水溶液に基板（ガラス、シリコンウエハー、金属など）に交互に浸漬（交互積層法）することにより、ＤＮＡ・ＣＮＴ複合体の超薄膜を基板上に固定できた。
交互積層法の具体的実験操作の方法を以下に示す。
石英基板を濃硝酸溶液に一晩浸し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で十分にリンスし、乾燥させた。この基板をポリアリールアミン塩酸塩水溶液（０．１ユニットｍＭ）に２０分浸漬後、引き上げ、水でリンスし、ドライヤーで十分に乾燥させた。次に、この基板をＤＮＡとＣＮＴの複合体水溶液に２０分浸漬後、引き上げ、水でリンスし、ドライヤーで十分に乾燥させた。この操作を１サイクルとしてこれを３０回繰り返した。この基板は、可視−近赤外吸収スペクトル測定で可視−近赤外領域に図４と同様の吸収バンドを示し、ＣＮＴ超薄膜の形成が裏付けられた。
【実施例８】
【００１８】  上記実施例６でポリアリールアミン塩酸塩水溶液の代わりにポリ（４−ビニルピリジニウム塩）を用いたところ、実施例６と同様にＤＮＡ・ＣＮＴ交互積層超薄膜が石英基板上に固定できた。
【実施例９】
【００１９】上記実施例６で石英基板の代わりに水晶振動子用金電極を用いて交互積層実験を行った。実施例６の可視−近赤外吸収スペクトル測定の代わりに水晶振動子マイクロバランス法での測定で実施例６と同様のＤＮＡ・ＣＮＴ交互積層超薄膜が金電極上に固定できることがわかった。
【比較例１】
【００２０】  ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドが共存しないＣＮＴ単独で、実施例１と同じ方法で超音波処理したが可溶化することはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】  分散水溶液
【図２】  ＤＮＡで可溶化した単層ＣＮＴ水溶液のＴＥＭ像
【図３】  ＤＮＡで可溶化した単層ＣＮＴ水溶液のＡＦＭ像
【図４】  紫外−可視−近赤外吸収スペクトル（スペクトルａ，ｃはＤＮＡ−単層ＣＮＴ水溶液、スペクトルｂはＤＮＡのみの水溶液のデータを示している）
【図５】  ＤＮＡで可溶化した単層ＣＮＴ水溶液を濾過して得られたＤＮＡ−単層ＣＮＴ複合体
【図６】  ＤＮＡ−単層ＣＮＴ複合体の再可溶化水溶液のＴＥＭ像
【符号の説明】
【図１】
（１）ＤＮＡで可溶化した単層ＣＮＴ水溶液、（２）単層ＣＮＴのみの分散水溶液
【図３】
ａ：２．７５，ｂ：２．３５，ｃ：２．７２，ｄ：２２４，ｅ：２．１２，ｆ：１．９６（バンドル構造が解けた状態で水中に可溶化時の像の高さ（ｎｍ））
【その他】
国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「ナノカーボン応用製品創製プロジェクト」に関する委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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