(57)【要約】【課題】  本発明は、アフリカツメガエルの内因性LPA受容体を介したLPA刺激シグナルを指標に計測装置をメンテナンスする方法に関する。【解決手段】  本発明は、アフリカツメガエル卵母細胞のLPAに対する電流応答性を利用して、細胞の電流応答を計測するための計測装置を検査する方法であって、(1) 細胞の電流応答を計測するための計測装置をセットアップし、(2) 卵母細胞を該装置にセットし、(3) 該卵母細胞にLPAを接触させて、LPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、そして、(4) 電流応答の差が検出された場合には、該計測装置は正常であると判断することを含む方法に関する。卵母細胞のLPAとの接触の前後における電流応答の差の有無を、計測装置が正常か否かの判断の指標とすることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフリカツメガエル卵母細胞のリゾホスファチジン酸（LPA）刺激に対する電流応答性を利用して、細胞の電流応答を計測するための計測装置を検査する方法。
【請求項２】
(1) 細胞の電流応答を計測するための計測装置をセットアップし、
(2) アフリカツメガエル卵母細胞を該装置にセットし、
(3) 該卵母細胞にLPAを接触させて、LPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、そして、
(4) 電流応答の差が検出された場合には、該計測装置は正常であると判断すること、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
(1) 細胞の電流応答を計測するための計測装置をセットアップし、
(2) アフリカツメガエル卵母細胞を該装置にセットし、
(3) 該卵母細胞にLPAを接触させて、LPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、そして、
(4) 電流応答の差が検出されなかった場合には、該計測装置は異常であると判断し、
(5) 装置の各部を調べ、異常がある部分を調整し、
(6) 上記ステップ(2)および(3)を繰り返し、そして、
(7) 電流応答の差が検出された場合には、該計測装置は正常であると判断すること、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
被検サンプルの細胞の電流応答を測定する前に、その測定に利用する計測装置を用いて、アフリカツメガエル卵母細胞のリゾホスファチジン酸（LPA）に対する電流応答を測定し、該電流応答が検出されることを確認した後に、被検サンプルの細胞について電流応答を測定することを特徴とする、細胞の電流応答を測定する方法。
【請求項５】
被検サンプルの細胞の電流応答を測定する前に、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法により、その測定に利用する計測装置を検査し、計測装置が正常であると判断された後に、被検サンプルの細胞について電流応答を測定することを特徴とする、細胞の電流応答を測定する方法。
【請求項６】
複数の計測装置を用いて細胞の電流応答を測定する場合において、アフリカツメガエル卵母細胞のLPA刺激に対する電流応答性を利用して、当該複数の計測装置間の感度のばらつきを低減させる方法。
【請求項７】
複数の計測装置を用いて細胞の電流応答を測定する場合において、それぞれの計測装置について卵母細胞を用いて、
(1) 細胞の電流応答を計測するための各計測装置をセットアップし、
(2) アフリカツメガエル卵母細胞を各計測装置にセットし、
(3)上記卵母細胞それぞれにLPAを同じ条件下で接触させて、LPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、そして、
(4) 各装置における電流応答の差が均一になるように、計測装置を調整すること、
を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
上記ステップ(3)において、各計測装置あたり2〜10個の卵母細胞について、そのLPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、その平均値を求めることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
用いる卵母細胞が全て、同腹由来の卵母細胞である、請求項７または８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電流応答の計測装置の検査、調整、整備および装置間の標準化を行うための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の電流応答を利用して種々の細胞内シグナル伝達の動向を検出する手法は、従来から大変有用な手法として注目されてきたが、近年、薬物のスクリーニング等にも用いられるようになった。したがって、簡易かつ確実な電流応答の検出方法が要求される。しかしながら、細胞の電流応答は非常に微弱なシグナルを増幅して検出するものであり、計測装置も非常に繊細な調整を要するのが現状であり、適正な調整を実験の度に行うには、技術者は相当の経験を要し、経験を積んだ技術者であっても、多くの要因を考え合わせた上で調整することが必要であり、やはり困難な作業である。特に、測定機器が複雑であることが大きな要因ではあるが、応答が検出できない場合、細胞に異常があるのか、測定機器に異常があるのか、または機器の設定が不適切であるのかなど、種々の要因を考慮して適切に判断する必要がある。このような場合、アンプまたはピぺット等に異常があるのか、または機器の製造業者等の専門家による修理または調整を要するものであるのかなどを判断しなければならない。かかる調整において、一般的にはダミーとして電磁ビーズ等をポジティブコントロールとして用いるが、かかるビーズ等の品質も不均質な場合があり、必ずしも適切なコントロールとなり得るとは限らない。
【特許文献１】特開２００２−６５２４０（Ｐ２００２−６５２４０Ａ）(43)平成１４年３月５日（２００２．３．５）公開
【非特許文献１】Kimura, Y 他、「The Journal of Biological Chemistry」 第276巻(2001)、15208-15215頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明により、電流応答を検出する実験系において、試料の測定に先立って計測装置を適切に調整するための方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
アフリカツメガエル卵母細胞には、リゾホスファチジン酸（LPA）の受容体であるEDG受容体が恒常的に発現していることがわかっている（非特許文献１参照）。EDG受容体はGタンパク質共役型リセプター（GPCR）の一種であり、LPAがEDG受容体に結合すると、Gタンパク質を活性化することによりイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を誘導するため、このリガンド-受容体間の結合は、イノシトールリン脂質代謝回転系の活性化による電流応答を測定することができる。該電流応答の測定を利用して、アフリカツメガエル卵母細胞にLPA刺激したときのシグナルの有無や大きさで計測装置が正常に動作するか否かを見極めることができる。
【０００５】
すなわち、本発明は、アフリカツメガエル卵母細胞のLPAに対する電流応答性を利用して、細胞の電流応答を計測するための計測装置を検査する方法に関する。卵母細胞のLPAとの接触の前後における電流応答の差の有無を、計測装置が正常か否かの判断の指標とすることができる。当該方法の1つの実施形態としては、(1) 細胞の電流応答を計測するための計測装置をセットアップし、(2) 卵母細胞を該装置にセットし、(3) 該卵母細胞にLPAを接触させて、LPA接触前と接触後の電流応答の差を測定し、そして、(4) 電流応答の差が検出された場合には、該計測装置は正常であると判断することを含む。
【０００６】
まず、アフリカツメガエル卵母細胞を準備する。そして、該卵母細胞を、予めセットアップしておいた計測装置にセットして、該細胞に天然に存在するLPA受容体の刺激に十分な濃度、好ましくはバッファー中のLPA濃度が約1pM以上、より好ましくは100pM以上、最も好ましくは10nM以上となるようにするとよい。そして、LPAの添加前と添加後の電流応答の差を測定する。電流応答の差が検出された場合、使用した計測装置は正常であると判断することができる。ここで「電流応答の差が検出される」とは、その差が通常の値、すなわち0.1μA以上、好ましくは0.2μA以上、さらに好ましくは0.5μA以上であることを言う。電流応答の差が0.1μA未満である等、通常の値未満の電流応答の差しか得られなかった場合は電流応答の差が検出されなかったと判断してよい。かかる場合には、別の卵母細胞または別の母体由来の卵母細胞で再度検定してみてもよい。
【０００７】
電流応答の差が検出されなかった場合、該計測装置は異常であると判断することができる。計測装置に何らかの不具合があると考えて、ピペット、針および/またはプレアンプ等をチェックし、該当部分を交換または調整するとよい。不具合が解消したか否かについて、再度上記と同様、LPA刺激による電流応答の差を測定するとよい。LPA刺激による電流応答の差が検出されるまで、不具合があると考えられる部分を交換または調整して、LPA刺激による電流応答の差を測定する。通常の電流応答の差が検出されれば、該計測装置の不具合は解消し、正常に動作し得る状態に回復したと判断することができる。
【０００８】
ここで、個々の卵母細胞のLPA刺激に対する応答能力の個体差による影響を低減させるために、2個以上、好ましくは2〜10個、より好ましくは5〜8個の卵母細胞について、LPA接触前と接触後の電流応答の差を同一の条件下で測定し、その平均値を求め、該平均値に基づいて計測装置が正常であるか否か判断することもできる。かかる場合に、卵母細胞の遺伝形質による個体差を低減するために、全て同腹由来の卵母細胞を用いて実施することが望ましい場合もある。
【０００９】
上記平均値が通常の電流応答の差に到達しない場合は、用いた卵母細胞の遺伝形質による影響である可能性を排除するために、他の母体由来の卵母細胞を用いて再度、測定を繰り返してもよい。
【００１０】
上記方法により正常であると判断された計測装置を用いて、被検サンプルの細胞について電流応答を測定することを特徴とする、細胞の電流応答を測定する方法も、本発明の範囲に包含され得る。上記方法を、被検サンプルの細胞を測定する前に実施することにより、被検サンプルの測定における装置の不具合による、データの誤差、再実験の実施を回避することができ、実験効率の向上および実験コストの低減がもたらされ、また実験精度も向上し得る。
【００１１】
本発明はさらに、複数の計測装置を用いて細胞の電流応答を測定する場合において、アフリカツメガエル卵母細胞のLPA刺激に対する電流応答性を利用して、当該複数の計測装置間のばらつきを低減させる方法にも関する。細胞の電流応答を測定する装置は、微弱な電流をアンプで増幅させて検出するため、各計測装置によってばらつきが生じ易い。したがって、異なる計測装置で測定した細胞の電流応答測定データを比較するためには、各計測装置間で感度のばらつきを低減するための調整が必要となる場合がある。このような場合に、各計測装置により、上記と同様の手法で、卵母細胞のLPA接触前と接触後の電流応答の差を測定することにより、そのLPA接触前と接触後の電流応答の差が均一になるように、アンプの増幅強度等を調整することができる。ここでLPA接触前と接触後の電流応答の差が均一とは、かかる差が一定の範囲内(すなわち、卵母細胞自体の個体差と認識できる範囲内)、好ましくは1.5μA以内、より好ましくは1.0μA以内、または各計測装置により検出された電流応答の差の値のうち、最小のものに対して、他の計測装置により検出された電流応答の差の値が3倍以内、好ましくは2倍以内あることを言う。また、個々の卵母細胞のLPA刺激に対する応答能力の個体差による影響を低減させるために、2個以上、好ましくは2〜10個、より好ましくは5〜8個の卵母細胞について、LPA接触前と接触後の電流応答の差を同一の条件下で測定し、その平均値を求め、該平均値に基づいて計測装置を調整することもできる。かかる場合に、卵母細胞の遺伝形質による個体差を低減するために、全て同腹由来の卵母細胞を用いて実施することが望ましい。各計測装置について複数の卵母細胞を用いる場合、その電流応答の差の平均値が均一となるよう装置を調整するとよい。
【００１２】
また、用いた卵母細胞の電流応答が通常の電流応答を示さない場合、遺伝形質による影響である可能性を排除するために、他の母体由来の卵母細胞を用いて再度、測定を繰り返し、その電流応答に基づいて、装置を調整することもできる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、電流応答を検出する実験の前に、天然に存在する系をシグナル陽性の標準試料として実験に用いる計測装置を調整することが可能となり、実験効率および実験精度が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明を実施するために、まず、常法に従って、メスアフリカツメガエルから、卵塊を摘出し、個々の卵母細胞を取り出し、顕鏡下で、細胞の大きさ、形状、色調および模様等を基準とする判断視覚的判断により、実験に適切な卵母細胞を選抜する。これを、適切なバッファー、例えば96ｍM NaCl、2ｍM KCl、1ｍM MgCl2、1ｍM  CaCl2、5ｍM  HEPES  pH7.5中に分散させる。上記卵母細胞を、予めセットアップしておいた計測装置にセットして、該卵母細胞を二電極膜電位固定法等により、膜電位を一定に、例えば-60ｍVに固定し、バッファー中にLPAを添加する。この際のLPAの濃度は、卵母細胞に天然に存在するLPA受容体の刺激に十分な濃度、好ましくはバッファー中のLPA濃度が約1pM以上、より好ましくは100pM以上、最も好ましくは10nM以上となるようにするとよい。そして、LPAの添加前と添加後の電流応答の差を測定する。かかる測定は、公知の方法に従って行うことができる。
【００１５】
データの信頼性を向上させるために、5〜10個の同腹由来の卵母細胞について測定し、その電流応答の差の平均値を求める。
【００１６】
上記実験条件下では通常、電流応答の差の平均値は0.5μA以上であることを本発明者らは経験的に確認しているので、これ未満の値しか得られなかった場合は、別の母体由来の卵母細胞5〜10個について再度、同一の条件下で測定する。
【００１７】
以上の測定により、0.5μA以上の電流応答の差が得られた場合、当該計測装置は正常であると判断する。
【００１８】
上記測定により0.5μA未満の電流応答の差しか得られなかった場合、当該計測装置が異常である、すなわちどこかに不具合があると判断し、その部分を特定し、交換または調整する。例えば、当該装置のピペット、針、プレアンプに不具合がある場合が多い。したがって、ピペットを交換するかまたは精度を調整して、再度上記同様の測定を行う。この場合、上記で用いた卵母細胞と同腹のものを用いるのがよい。ここで、0.5μA以上の電流応答の差が得られた場合、ピペットの交換または調整により、当該計測装置の不具合は是正されて、当該装置は正常であると判断する。
【００１９】
上記測定により0.5μA未満の電流応答の差しか得られなかった場合、当該計測装置はピペット以外の部分に未だ異常があると判断し、例えば、針を交換または調整して、再度上記同様の測定を行う。この場合も、上記で用いた卵母細胞と同腹のものを用いるのがよい。ここで、0.5μA以上の電流応答の差が得られた場合、針の交換または調整により、当該計測装置の不具合は全て是正されて、当該装置は正常であると判断する。
【００２０】
上記測定により未だ0.5μA未満の電流応答の差しか得られなかった場合、当該計測装置はピペットおよび針以外の部分に未だ異常があると判断し、例えば、プレアンプを交換または調整して、再度上記同様の測定を行う。この場合、上記で用いた卵母細胞と同腹のものを用いるのがよい。ここで、0.5μA以上の電流応答の差が得られた場合、プレアンプの交換または調整により、当該計測装置の不具合は全て是正されて、当該装置は正常であると判断する。
【００２１】
上記測定により0.5μA未満の電流応答の差しか得られなかった場合、当該計測装置はピペット、針およびプレアンプ以外の部分に未だ異常があると判断し、その他の部品を交換または調整して、再度上記同様の測定を行う。この場合も、上記で用いた卵母細胞と同腹のものを用いるのがよい。最終的に0.5μA以上の電流応答の差が得られるまで、各部品の交換または調整を行うか、または当該計測装置のメインテナンスの専門家による精査・調整を依頼する。なお、上記の実施形態において、ピペット、針およびプレアンプの交換または調整の順序は、いかなる順序でもよい。
【００２２】
上記により、正常であると判断された計測装置に、被検サンプルである細胞の電流応答を、常法に従って測定する。
【００２３】
本発明の方法を用いて、複数の計測装置間の感度のばらつきを低減させる場合には、上記と同様に準備、選抜した同腹由来の卵母細胞を、予めセットアップしておいた当該複数の計測装置それぞれにセットし、上述と同様にしてLPA接触前と接触後の電流応答の差を測定する。ここでばらつきの低減を精度よく行うためには、各装置につき、5〜10個の卵母細胞について測定し、その電流応答の差の平均値を求める。用いる卵母細胞はすべて同腹由来の細胞とする。各装置における該平均値の差が2倍以内であれば、計測に用いた全ての装置は、その感度のばらつきはほとんどないと考えてよく、被検サンプルの測定に進む。
【００２４】
上記平均値が全て0.5μA未満の場合は、卵母細胞のLPA刺激応答性に遺伝形質による影響がある可能性が考えられるため、これを排除するために別腹由来の卵母細胞を準備、選抜し、再度上記測定を行う。
【００２５】
各装置における該平均値の差が2倍以内となるまで、各装置の調整および測定を繰り返す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、アフリカツメガエル卵母細胞のLPA刺激に対する電流応答性を利用して、細胞の電流応答を計測するための計測装置を検査する方法の概略図である。
【図２】図２は、LPA刺激に対する電流応答測定の概念図である。
【図１】
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【図２】
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