(57)【要約】【課題】フィターゼ遺伝子のコドンを改変しかつフィターゼを細胞外へ分泌させることにより、これまで不可能又は低効率であった植物における外来フィターゼの高生産を可能とすること、及び形質転換された植物を動物飼料調製に利用する。【解決手段】本発明のコドン改変と細胞外分泌により外来フィターゼを植物で生産させる方法は、フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンを改変することにより当該使用頻度を低下しかつ細胞外分泌シグナルを利用することによりフィターゼを細胞外に分泌させることにより、植物における外来フィターゼ遺伝子の高発現又は当該フィターゼ酵素の高生産を可能とする。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィターゼ遺伝子の塩基配列を変えることで使用コドンを改変し、かつ、当該フィターゼを細胞外に局在させることを特徴とする、形質転換植物で外来フィターゼ遺伝子を発現し、フィターゼを生産する方法。
【請求項２】
フィターゼ遺伝子が植物以外の生物種に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物以外の生物種が微生物であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物が酵母であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酵母がシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フィターゼを細胞外に局在させるために細胞外分泌シグナルを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
細胞外分泌シグナルに対応するＤＮＡ領域がイネのキチナーゼ遺伝子由来であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンの集団のうち、一個以上のコドンについて当該使用頻度を低下させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フィターゼ遺伝子のコドンを改変により、アミノ酸配列の改変を伴わないことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結することを特徴とするフィターゼ遺伝子発現用構成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載のフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する形質転換された植物。
【請求項１２】
形質転換された植物がルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ルーピン、ダイズ、綿花、セイヨウアブラナ、カリフラワー、ナタネ、ダイコン、ヒマワリ、ニンジン、アカクローバ、シロクローバ、タバコ、ゴマ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバもしくはビートから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、エンバク、アワ、ヒエ、ソルガム、サトウキビ、トウモロコシ、イタリアンライグラス、オーチャードグラス、チモシー、寒地型牧草もしくは暖地型牧草から選ばれる単子葉植物種である、請求項１１に記載の植物。
【請求項１３】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする飼料構成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の飼料構成物を動物に与えることを特徴とする動物の飼育方法。
【請求項１６】
請求項１〜９の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物細胞からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物におけるフィターゼの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、穀物、種子等リン酸塩を多く含む飼料を用いて飼育される家畜（単胃動物）の排せつ物中のリン酸が河川等を汚染し、環境の富栄養化を引き起こすことが問題化している。フィターゼは、飼料添加剤として家畜飼料中に混入されることにより、飼料中のフィチン酸塩が脱リン酸化され、それにより生じたリン酸が動物に吸収されるようになるため、排せつ物中のリン酸源濃度を低減させる効果がある。また、フィターゼの添加により動物におけるリン酸の吸収効率が改善されるため、通常ではリン酸の補給の目的で飼料に加えられるリン鉱石を添加する必要がなくなるため、リン資源としてのリン鉱石の節減につながる。さらにフィターゼは、フィチン酸によりキレートされているミネラルを遊離するので、動物におけるミネラル吸収を促進する効果がある。同様に、フィターゼは、タンパク質、デンプン、脂質等と複合体を形成するフィチン酸を分解するので、タンパク質、デンプン、脂質の消化性向上に役立つ効果がある。一方、フィターゼは、飼料添加剤としての利用の他に、フィチン酸塩の加水分解の生成物であるミオイノシトールの生産にも利用される。なお、ミオイノシトールは鳥類や哺乳類にとっての必須栄養源である。
【０００３】
フィターゼの生産は、フィターゼを生産する微生物自身の培養系、あるいは異種タンパク質生産がすでに開発されている大腸菌、枯早菌、酵母、糸状菌を宿主とする宿主ベクター系を用いた培養系により一般的に行われている。一方、形質転換植物を用いたフィターゼの生産は、上記の微生物培養法に比べ、特殊な装置や大量のエネルギーを必要としないため、生産コストの点で利点がある。また、フィターゼを生産する植物は、直接飼料として動物に与えることができる他、労力やエネルギーをほとんど使わずにフィターゼを生産する植物からフィターゼを粗抽出又は粗精製して飼料添加剤として用いることができるという利点がある。
【０００４】
植物における外来フィターゼの生産については、アスペルギルス・ニガー(Aspeugillus niger)由来のフィターゼを、タバコの種子（非特許文献１）、タバコの葉（非特許文献２）、コムギの種子（非特許文献３）で生産させた例やダイズの懸濁培養から分泌させた例（非特許文献４）やシロイヌナズナの根から分泌させた例（非特許文献５）、アスペルギルス・フミガトゥス(Aspeugillus fumigatus)由来のフィターゼをイネの種子で生産させた例（非特許文献６）、アスペルギルス・フィクウム(Aspeugillus ficuum) 由来のフィターゼをタバコの葉（非特許文献７）やアルファルファの葉（非特許文献８）やジャガイモの塊茎（非特許文献９）で生産させた例が知られているが、アスペルギルス属以外の生物種由来のフィターゼを植物で生産させた例はほとんどない。その原因の一つとして、植物において外来フィターゼ遺伝子の発現効率が低い、あるいは発現したとしても産業上価値のあるレベルでフィターゼを生産することができないことが挙げられる。
【０００５】
フィターゼは、高等植物、動物および微生物に存在するが、由来となる生物種ごとに至適温度、至適ｐＨ、温度安定性、反応可能なｐＨのレンジなどの生化学的な性質はそれぞれ異なっている（非特許文献１０、１１）。一般的に産業上は、温度安定性が高く、反応可能なｐＨレンジが広いフィターゼが望まれるが、家畜、魚を含めた動物種およびそれらの生育ステージ毎に理想的なフィターゼの性質が異なる（１０）。以上のことから、固有の性質を有する様々なフィターゼを植物で生産する系を確立することは産業上重要である。
【０００６】
【非特許文献１】J. Penら、Bio/Technology, vol.11, pp.811-814, 1993
【非特許文献２】T.C. Verwoerdら、Plant Physiology, vol.109, pp.1199-1205, 1995
【非特許文献３】H. Brinch-Pedersenら、Molecular Breeding, vol.6, pp.195-206, 2000
【非特許文献４】J.Liら、Plant Physiology, vol.114, pp.1103-1111, 1997
【非特許文献５】A. E.Richardsonら、The Plant Journal, vol.25, pp.641-649, 2001
【非特許文献６】P. Luccaら、Theor. Appl. Genet., vol.102, pp.392-397, 2001
【非特許文献７】A.H.J.Ullahら、Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.264, pp.201-206, 1999
【非特許文献８】A.H.J.Ullahら、Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.290, pp.1343-1348, 2002
【非特許文献９】A.H.J.Ullahら、Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.306, pp.603-609, 2003
【非特許文献１０】X.G. Leiら、Appl. Microbiol. Biotechnol, vol.57, pp.474-481, 2001
【非特許文献１１】A.Vohraら、Critical Reviews in Biotechnology, vol.23, pp.29-60, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
解決しようとする問題点は、ある生物種由来のフィターゼ遺伝子は宿主とする植物において高い効率で遺伝子発現しない、又は高い効率でその遺伝子発現産物であるフィターゼを生産しない点である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、宿主とする植物種のコドンの使用頻度に近づくよう塩基配列を改変したフィターゼ遺伝子に細胞外への分泌シグナルに対応する塩基配列を連結して宿主植物へ導入することを最も主要な特徴とする。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  フィターゼ遺伝子の塩基配列を変えることで使用コドンを改変し、かつ、当該フィターゼを細胞外に局在させることを特徴とする、形質転換植物で外来フィターゼ遺伝子を発現し、フィターゼを生産する方法。
[２]   フィターゼ遺伝子が植物以外の生物種由来であることを特徴とする[１]に記載の方法。
[３]  植物以外の生物種が微生物であることを特徴とする[２]に記載の方法。
[４]  微生物が酵母であることを特徴とする[３]に記載の方法。
[５]  酵母がシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)であることを特徴とする[４]に記載の方法。
[６]  フィターゼを細胞外に局在させるために細胞外分泌シグナルを用いることを特徴とする[１]に記載の方法。
[７]  細胞外分泌シグナルに対応するＤＮＡ領域がイネのキチナーゼ遺伝子由来であることを特徴とする[６]に記載の方法。
[８]  フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンの集団のうち、一個以上のコドンについて当該使用頻度を低下させることを特徴とする[１]に記載の方法。
[９]  フィターゼ遺伝子のコドンを改変により、アミノ酸配列の改変を伴わないことを特徴とする[８]に記載の方法。
[１０]  使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結することを特徴とするフィターゼ遺伝子発現用構成物。
[１１]  [１０]に記載のフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する形質転換された植物。
[１２]  形質転換された植物がルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ルーピン、ダイズ、綿花、セイヨウアブラナ、カリフラワー、ナタネ、ダイコン、ヒマワリ、ニンジン、アカクローバ、シロクローバ、タバコ、ゴマ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバもしくはビートから選ばれる双子葉植物種、又はコムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、エンバク、アワ、ヒエ、ソルガム、サトウキビ、トウモロコシ、イタリアンライグラス、オーチャードグラス、チモシー、寒地型牧草もしくは暖地型牧草から選ばれる単子葉植物種である、[１１]に記載の植物。
[１３]   [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞。
[１４]   [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする飼料構成物。
[１５]   [１４]に記載の飼料構成物を動物に与えることを特徴とする動物の飼育方法。
[１６]   [１]〜[９]の何れか一項に記載の方法により外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物細胞からの分泌物又は抽出物を含むことを特徴とする食品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のコドン改変と細胞外分泌により外来フィターゼを植物で生産させる方法は、コドン改変により翻訳レベルの遺伝子発現効率を向上させる効果、および分泌シグナルの利用により細胞内で合成されたフィターゼを細胞外に効率良く分泌させる効果を組み合わせることにより、これまで不可能、又は低効率であった外来フィターゼ遺伝子の植物における発現又は当該フィターゼ酵素の生産を飛躍的に向上できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
外来フィターゼ遺伝子の導入対象とする宿主植物において塩基配列が解析されている2つ以上の遺伝子群又は特定の遺伝子から求められるコドンの使用頻度に近づくように、外来フィターゼ遺伝子の塩基配列を改変し、それに細胞外分泌シグナルに対応する塩基配列を連結したフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築する。当該フィターゼ遺伝子発現用構成物は、宿主植物での転写レベルでの遺伝子発現誘導に関与するプロモーター領域と遺伝子発現終結に関与するターミネーター領域を含む形で構成される。当該フィターゼ遺伝子発現用構成物を、一般的な広く知られている方法により植物細胞に導入することにより、外来フィターゼを高生産する形質転換植物の取得を実現した。
【００１２】
本発明においてフィターゼとは、フィチン酸を脱リン酸させるホスファターゼである。フィターゼは、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistryにより、フィチン酸の６位を最初に加水分解する６−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．２６．）とフィチン酸の３位を最初に加水分解する３−フィターゼ（ＥＣ．３．１．３．８．）の２つに分類されている。これらはいずれも本発明におけるフィターゼの定義に含まれる。本発明においてフィターゼ遺伝子とは、フィターゼおよびフィターゼを構成するサブユニットをコードするDNA領域全体およびその一部を含むDNA構成物を指し、生物由来のフィターゼ遺伝子のみではなく、人為的に塩基配列を改変した遺伝子も含まれる。
【００１３】
本発明において使用コドンを改変するとは、アミノ酸配列を規定する情報を有する核酸塩基の配列上において、各アミノ酸に対応する３塩基連鎖であるコドン（codon、又は遺伝暗号、又はgenetic code、又は単にcodeとも言う）を改変することを意味する。基本的には、元来のアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを改変することを意味するが、本発明においては、目的とするタンパク質の基本的な特性が変わらない限り、アミノ酸配列の改変を伴う場合も含まれる。
【００１４】
本発明において細胞とは具体的には、膜構造により外界と隔離され、内部に遺伝情報とその発現機構を有する生命の最小単位であり、単細胞では個体と同じだが、多細胞生物では組織の構成単位を意味する。細胞膜に包まれた細胞質には、遺伝情報を含む核（原核生物の場合には明瞭な構造はない）の他に、ATPを供給するミトコンドリア、分泌顆粒を形成するゴルジ体、分泌タンパク質の輸送を担う小胞体、光合成を担う葉緑体（植物細胞のみ）、液胞などの細胞内小器官の他、タンパク質合成を担うリボソーム、分泌顆粒、色素顆粒などが混在する。原核細胞および植物細胞では細胞膜の外側に細胞壁や細胞間隙があるが、本発明においては、細胞壁や細胞間隙を細胞の一部と定義する。
【００１５】
本発明において局在させるとは、目的とするタンパク質を細胞膜、細胞質、特定の細胞内小器官あるいは細胞膜外に特異的に輸送して蓄積させることを意味する。
【００１６】
本発明において外来フィターゼ遺伝子とは、宿主細胞が本来有していないフィターゼ遺伝子を指しており、そのような遺伝子は蛋白質をコードする領域とその上流に当該領域の発現を制御するプロモーター領域（遺伝子プロモーター）を少なくとも有し、更に所望によりその上流にトランジットペプチド配列や下流にターミネーター領域を有していてもよい。この場合、これらタンパク質をコードする領域以外のプロモーター領域およびターミネーター領域等は必ずしもその由来が蛋白質をコードする領域と同一である必要はなく、必要に応じて適宜選択可能である。このような外来性フィターゼ遺伝子の例としては実施例１に記載のイネのキチナーゼの細胞外分泌シグナルにシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼのｃＤＮＡを含むものがあげられる。
【００１７】
本発明において植物以外の生物とは、クロロフィルによる同化作用、いわゆる光合成を行わない生物を意味し、具体的には、動物および菌類の一群を意味する。
【００１８】
本発明において微生物とは、微小で肉眼では観察できないような生物のことであり、具体的には、細菌、糸状菌、酵母、変形菌、単細胞の藻類、原生動物を意味する。
【００１９】
本発明において酵母とは具体的に、、大部分の生活環を単細胞で経過する菌類を意味し、コウボ菌類の他に大部分の原生子嚢菌類と、不完全世代（無胞子型、偽酵母）を有するPhodosporidium、LeucosporidiumおよびSporobolomycesなどの原生担子菌類を含む。
【００２０】
本発明においてシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼ遺伝子はどのように入手するのかといえば、該遺伝子が真核生物由来のため、イントロンが存在する可能性があることを考慮すれば、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリスIFO 1840のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを大腸菌の発現ベクターに組み込み作製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから該サブユニットと特異的に反応する抗体をプローブとしてクローンを得ることができる。シュワニオミセスオキシデンタリス由来のフィターゼのサブユニットをコードする遺伝子は、具体的には例えば特開平８−２８９７８２の配列表の配列番号：５に記載の塩基配列であり、少なくとも特開平８−２８９７８２の配列表の配列番号：３、配列番号：４のＤＮＡ塩基配列を含んでいる。
【００２１】
シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)由来のフィターゼはどのように入手するのかといえば、シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子を、宿主細胞中で複製可能なベクターに連結することにより組換えプラスミドを作製し、これを適当な微生物に形質転換することにより異種生物中で発現させることで入手できる。例えば、特開平１１−２０６３６８に記載の通り、キャンディダ・ボディニイ（Candida boidinii）のAOD1遺伝子のプロモーターの下流にフィターゼ遺伝子が結合したＤＮＡを有する組換えプラスミドをキャンディダ・ボディニイに形質転換し、０．３〜３．０ｇ／Ｌのリン酸またはリン酸化合物を含む液体培地中で、１０日以上培養することで当該キャンディダ・ボディニイの菌体外に当該フィターゼを分泌生産することができる。
【００２２】
本発明において細胞外分泌シグナルとは、タンパク質が細胞外に分泌される際に機能するペプチド鎖である。具体的には、リボソームにより細胞質で合成されたばかりの分泌タンパク質の前駆体に含まれるペプチド鎖であり、当該ペプチド鎖により当該前駆体タンパク質は小胞体内に導入され、グリコシル化などの修飾を受け、最終的には分泌小胞により成熟タンパク質となって細胞外に分泌される。本発明において細胞外分泌シグナルは、タンパク質を細胞外に分泌する際に機能するペプチド鎖ばかりではなく、当該ペプチド鎖に対応するアミノ酸配列およびＤＮＡの塩基配列をも意味する。
【００２３】
本発明においてイネのキチナーゼは公知であり、その遺伝子配列も既に知られている（Y. NishizawaらMol.Gen.Genet, vol.241, pp.1-10, 1993）。Y. Nishizawaらが単離・解析した３種のイネキチナーゼ遺伝子のうち、Cht-3が細胞外分泌シグナルを含むことが知られている（A.Sharmaら、FEBS Letters, vol.484, pp.7-11, 2000）。
【００２４】
フィターゼ遺伝子におけるコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における当該使用頻度よりも高いコドンの集団のうち、一個以上のコドンについて当該使用頻度を低下させるとは具体的には以下のような方法が例示される。シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子をイネで発現させる場合には、まず、シュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子のコドン使用頻度（codon usageとも言う）とイネの塩基配列が決定された遺伝子群から求められるコドン使用頻度を比較する。なお、イネのコドン使用頻度は、例えば、GeneBankのCodon Usage Database（http://kazusa.or.jp/codon/）から調べることができる。特定のアミノ酸に対する各コドンの使用頻度を上記の２者間で比較し、イネよりも当該フィターゼ遺伝子において使用頻度が高いコドンについては、イネでの使用頻度が高いコドンに改変する。例えば、ロイシン（Leu）に対応する６つのコドンの使用頻度の合計を１００％とした場合、TTAのコドン（TTA-Leu）の使用頻度は当該フィターゼ遺伝子において約５４％であるが、イネでは約６％で約９倍の差がある。そこで、当該フィターゼ遺伝子のTTAのコドンの使用頻度を下げ、イネでの使用頻度が高いCTC-LeuやCTG-Leuなどを使用するようにデザインする。このようにすべてのアミノ酸に対するコドンについて同様にデザインすることにより、イネよりも当該フィターゼ遺伝子において使用頻度が高いコドン全般について、コドン使用頻度を低下させることができる。
特にコドン改変の対象となるのは、目的とするフィターゼにおける使用頻度の方が宿主とする植物種における使用頻度よりも顕著に高い場合であって、宿主とする植物種と同等の場合又は低い場合には改変の対象とする必要はない。また、あるコドンの改変の結果として、別のコドンの使用頻度が、宿主とする植物種における使用頻度よりも高く場合があっても、特定のアミノ酸における各コドンの使用頻度が宿主とする植物種における使用頻度に全般的に近づいていれば問題にはならない。例えば前記のシュワニオミセス・オキシデンタリス由来のフィターゼ遺伝子をイネで発現させる場合において、TTA-Leuの使用頻度を下げることにより、CTC-LeuやCTG-Leuの使用頻度がイネにおける使用頻度よりも高くなる場合でも、その割合が大きくなければ、例えば２倍以下であれば、約９倍のTTA-Leuの使用頻度を同等レベル（約１倍）に改変する効果を打ち消すものではない。
【００２５】
デザインした塩基配列を有するDNAは人為的に合成することができるが、長いＤＮＡの場合には、いくつかの断片に分けてあらかじめ合成し、最終的にそれらを結合して合成することができる。
【００２６】
本発明においてフィターゼのコドンの改変がアミノ酸の改変を伴わないとは、特定のアミノ酸に対応するコドンがいくつかある場合に、あるコドンから同じアミノ酸に対応する別のコドンに変えることを意味する。例えば、ロイシンに対応するコドンTTAを同じロイシンに対応するコドンであるTTG又はCTT又はCTC又はCTA又はCTGに改変することを意味する。こうしてフィターゼのアミノ酸配列に含まれるすべてのアミノ酸について同様のコドンの改変を行うことより、フィターゼのコドンの改変はアミノ酸の改変を伴わないことになる。
【００２７】
本発明において使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結する方法としては以下のような方法が例示できる。使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子のＮ末側のＤＮＡ領域を含み、その上流に特定の制限酵素（仮に制限酵素Ｂとする）の認識部位を付加した正方向のオリゴヌクレオチドを合成する。また、当該フィターゼ遺伝子のＣ末側のＤＮＡ領域を含み、その下流にＢとは異なる制限酵素（仮に制限酵素Ｃとする）の認識部位を付加した逆方向のオリゴヌクレオチドを合成する。上記2種のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとし、使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、当該フィターゼ遺伝子の５´上流および３´下流側にそれぞれＢおよびＣという制限酵素認識部位を有するＤＮＡ断片を合成する。細胞外分泌シグナルについても同様に行い、当該分泌シグナルの５´上流および３´下流側にようにそれぞれＡおよびＢという制限酵素認識部位を有するＤＮＡ断片を合成する。上記の２つのＤＮＡ断片を一般的なクローニング技術により、汎用的なプラスミド上に、（Ａ）-（細胞外分泌シグナル）-（Ｂ）-（使用コドンを改変した遺伝子）-（Ｃ）（括弧内は制限酵素認識部位を示す）の順に連結することができる。
【００２８】
上記に代わる連結方法として、まず、（Ａ）-（細胞外分泌シグナルの全ＤＮＡ領域）-（使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子のＮ末側のＤＮＡ領域）を含むの正方向の長鎖のオリゴヌクレオチドと、（当該フィターゼ遺伝子のＣ末側の塩基配列）-（Ｂ）を含む逆方向のオリゴヌクレオチドを合成する。これらをＰＣＲプライマーとし、使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行い、（Ａ）-（細胞外分泌シグナル）-（使用コドンを改変した遺伝子）-（Ｂ）（括弧内は制限酵素認識部位を示す）の順に連結したＤＮＡ断片が合成できる。このＤＮＡ断片は汎用的なプラスミド上に容易にクローニングすることができる。
【００２９】
さらに本発明は、本発明による使用コドンを改変したフィターゼ遺伝子に細胞外分泌シグナルの塩基配列を連結することを特徴とするフィターゼ遺伝子発現用構成物を形質転換して得られる植物を提供する。加えて本発明は、本明細書の方法の結果としてフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する細胞も提供する。
【００３０】
本発明においてフィターゼ遺伝子発現用構成物を有する形質転換された植物としては具体的には双子葉植物種、例えばルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ルーピン、ダイズ、綿花、セイヨウアブラナ、カリフラワー、ナタネ、ダイコン、ヒマワリ、ニンジン、アカクローバ、シロクローバ、タバコ、ゴマ、テンサイ、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバもしくはビート、又は単子葉植物種、例えばコムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、エンバク、アワ、ヒエ、ソルガム、サトウキビ、トウモロコシ、イタリアンライグラス、オーチャードグラス、チモシー、寒地型牧草もしくは暖地型牧草でありうる。特に関心があるのは、潜在的な食物又は飼料成分になりうる植物、又は物質生産性の高い植物である。植物の状態としては、生のもの、サイレージ化したもの、乾燥したもの、粉砕したもの、加工処理したもの、飼料調製したものが本発明の請求の範囲に含まれる。
【００３１】
植物を形質転換する方法としては、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）または、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換法、プロトプラストへの直接導入法（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれるが、熟練した読者には公知であり、ここでは詳細な説明は省略する。一旦、植物組織に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性の発現系で測定され得て、あるいは植物ゲノム内への安定に組み込まれるため、選別ののち、決定されうる。技術としては、植物組織のインビトロ培養、そして多くの場合に、植物体への再分化が知られている。導入された遺伝子を、もともと形質転換された植物から商業的に有用な培養物に転移する技術は、当業者には知られている。
【００３２】
本発明の範囲には外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞が包含される。植物の一部とは、たとえば葉、茎、根、花器、種子、さやの一部であり、これらの未発達又は未熟な組織、器官ばかりでなく、老化又は乾燥又は枯死した組織や器官の一部が含まれる。また、飼料用に調製処理された上記の組織や器官も含まれる。植物細胞とは、植物の個々の細胞であるが、プロトプラストや細胞膜の外側にある細胞壁や細胞間隙も本発明の定義に含まれる。また、各種培養細胞、未分化細胞やその集合体やカルス等も含まれる。
【００３３】
本発明において飼料とは、天然物又は人工物に関わらず、動物が食べ、摂取し、消化することを意図した食料、食事である。飼料構成物とは、例えば飼料に混入された原材料、加工された物質、又は添加物等であって、飼料を構成する成分を意味する。
【００３４】
本発明において飼料構成物を動物に与えるとは、動物の飼育、健康の維持又は増進、又は動物から得られる製品の栄養価の向上や物性の改変、又は動物由来の排泄物の量や質の制御等を意図して動物に飼料構成物を食べさせること、又は摂取させることを意味する。動物とは、すべての動物であり、例えば豚、トリ、ヒト、魚である。特に好ましいのは単胃動物の豚および鶏（ブロイラー）である。飼育方法とは、動物の肉、卵、生乳、それらの乳製品、加工品、発酵品等の食品を得ること、又は動物の骨、肉、脂、臓器、体毛、角質、皮等から得られる製品を得ることを主な目的として、管理された環境条件下および食餌・食事制御下において動物を飼う方法を意味する。
【００３５】
本発明において外来フィターゼ遺伝子が発現する植物、植物の一部、又は植物細胞を含む、又は当該植物細胞からの分泌物又は抽出物を含む食品とは、成分として含まれるフィターゼがフィチン酸をミオイノシトールとリン酸に分解する作用を見込んで作られる食品であり、具体的には、抗栄養剤として働くフィチン酸の量の低下、又は動物におけるリン酸吸収効率の改善、又は動物の排泄物に含まれるリン酸量の低下、又は鳥類や哺乳類にとっての必須栄養源であるミオイノシトール量の増加等の効果を意図して作られる食品であって、外来フィターゼを生産する生食用の植物、又は成分としてフィターゼを含む外来フィターゼ遺伝子が発現する植物からの分泌物又は抽出物が添加された加工食品、医薬品、医薬部外品、健康食品を意味する。
【００３６】
以下本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、ＤＮＡの切断、連結、クローニング、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定等の遺伝子組換えに必要な方法は、特に記載のない限り、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付された説明者や、実験書（例えば、「Molecular Cloning (Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)」に従った。また、イネに関する形質転換法、栽培法、分子生物学的な解析法等については、特に記載のない限り、実験書（例えば、「モデル植物の実験プロトコール、イネ・シロイヌナズナ編」細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４、島本功、岡田清孝監修、秀潤社、1996）に基本的に従った。
【実施例１】
【００３７】
コード領域としてシュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡ又はコドン改変型ｃＤＮＡに、イネキチナーゼの細胞外分泌シグナルを連結した、又は連結しないフィターゼ遺伝子発現用構成物をイネで発現させた例
（１）フィターゼ遺伝子発現用構成物の構築
シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡは以前に望月らにより単離され、ヌクレオチド配列が決定されたもの（特開平８-２８９７８２、以下、Oriと略す）を用いた。また、アミノ酸配列は変えずに、当該フィターゼにおける使用コドンを宿主とするイネにおけるコドンの使用頻度よりも顕著に高いコドンがないようにデザインしたＤＮＡ（配列番号：１）を全合成した（以下、Modと略す）。図１は、特定のアミノ酸に対応する各コドンの使用頻度の合計を１００％とした場合のコドン毎の使用頻度をOri、Mod及びイネについて算出し、Ori又はModの各コドンの使用頻度を対応するイネの各コドンの使用頻度で除した値を示す。Oriでは、イネではあまり使われないコドンを使用する傾向がみられ、コドン：TTA-Leu（ロイシン）においてはイネの使用頻度の約９倍である。一方、コドン改変後のModにおいては、すべてのコドンにおいてその比率は２倍以下となっており、イネにおけるコドン使用頻度に近づいていることがわかる。
【００３８】
改変型のフィターゼ遺伝子上記のコドン改変前、又は改変後のフィターゼＤＮＡに、イネキチナーゼの細胞外分泌シグナルのDNA領域を連結したＤＮＡ構成物（以下、それぞれTp-Ori、Tp-Modと略す）を構築するためにするために以下のＰＣＲプライマーを設計した。上流側のプライマーとして、すでに報告されているCht-3の分泌シグナルに対応するＤＮＡ配列（Y. Nishizawaら、Mol. Gen. Genet., vol. 241, pp. 1-10, 1993）とその５’側にXbaI認識部位を含むＤＮＡ配列、その３’側にTp-Ori又はTp-Modの開始コドンを含むＮ末側のＤＮＡ配列を付加した正方向のオリゴヌクレオチド（Tp-Ori用の配列番号：２、Tp-Mod用の配列番号：３）を合成した。下流側のプライマーとして、当該フィターゼの終始コドンを含むＣ末側のＤＮＡ配列及びその３’側にSacI認識部位を含むＤＮＡ配列を付加した逆方向のオリゴヌクレオチド（配列番号：４）を合成した。配列番号：２と配列番号：４のＰＣＲプライマーを用い、シュワニオミセス・オキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のフィターゼのｃＤＮＡクローンであるｐＨＹ３６を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ増幅断片をXbaIとSacIで同時に切断してプラスミドベクターであるpBluescript SK-にクローニングした。こうして得られたクローンをさらにSmaIとSacIで同時に切断して得られたＤＮＡ断片、およびイネのクロロフィルa/b結合タンパク質（以下、Cabと略す）のプロモーター領域（Y. Tadaら、EMBO J, vol.10, pp.1803-1808, 1991）を含むHindIII-SmaI断片を、あらかじめHindIIIとSacIで同時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクターpBI-HIにクローニングして、Tp-Oriのフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築した。一方、上記の配列番号：３と配列番号：４のＰＣＲプライマーを用い、配列番号：１のＤＮＡクローンを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ増幅断片をXbaIとSacIで同時に切断してプラスミドベクターであるpBluescript SK-にクローニングした。こうして得られたクローンをさらにSmaIとSacIで同時に切断して得られたＤＮＡ断片、およびイネのCabプロモーターを含むHindIII-SmaI断片を、あらかじめHindIIIとSacIで同時に切断してＧＵＳ遺伝子を除去したバイナリーベクターpBI-HIにクローニングして、Tp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を構築した。図２にTp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
【００３９】
（２）形質転換イネの取得
上記（１）で得られたフィターゼ遺伝子発現用構成物はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介した方法により、ジャポニカ品種であるキヌヒカリの種子由来カルスに用いて形質転換を行った。形質転換イネは閉鎖系のグロースチャンバーを用いて、２４℃、湿度６０％、１４時間日長（７００μｍｏｌ／ｍ2／ｓｅｃ）の条件で育成した。
【００４０】
（３） 形質転換イネの粗酵素液抽出
作出された形質転換イネ当代について、フィターゼ活性を測定するための粗酵素液の抽出を行った。粗酵素液はいずれも緑葉を液体窒素で凍結させ、乳鉢内で破砕、融解した後適量の抽出バッファー（０．１M 酢酸ナトリウム pH５、10mM CaCl2、 1mM DTT）に懸濁し、１２０００rpmで２０分遠心分離した上清を回収することで調製した。
【００４１】
（４） 形質転換イネのフィターゼ活性
フィターゼ活性の測定はフィチン酸ナトリウムを基質としてフィターゼの反応によって生じる遊離リン酸を定量することにより行った。０．１ｍｌの反応バッファー（４０ mM酢酸ナトリウム溶液（pH５．５）、１mMフィチン酸ナトリウム）中で、３７℃で６０分反応させた後、０．２ｍｌの５mM硫酸を添加することにより反応を停止した。０．１６mlの反応停止後の溶液に、１．５８５mMマラカイトグリーン／２０％(v/v)硫酸、７．５％(w/v)モリブデン酸アンモニウム、１１％(v/v)Tween20をそれぞれ１００：２５：２(v/v)の割合で混合することにより調整したリン酸検出液を４０μｌ加え、混合して３０分静置した後、６５５nmの吸光度測定によりリン酸量を定量した。標準曲線としては、０、５、１０、２０、４０μMのリン酸カリウム溶液を使用した。なお、植物抽出した粗酵素液には内生の遊離リン酸が含まれているので、６０分反応後の反応液に含まれるリン酸量から反応０分の反応液に含まれるリン酸量を差し引いた値をフィターゼの反応による遊離リン酸量とした。（１）で述べたフィターゼ遺伝子発現用構成物を導入したイネ以外に非形質転換イネについても酵素活性を測定した。なお、フィターゼ活性の１単位（１ユニット）は、３７℃、ｐＨ５．５において、フィチン酸から一分間あたりに１マイクロモル（μmol）のリン酸を生産する能力と定義した。
【００４２】
フィターゼ遺伝子発現用構成物を含まない非形質転換体の平均のフィターゼ活性を１とした場合の、形質転換イネの各系統の相対活性をそれぞれ図１にまとめた。その結果、コドン改変せずに細胞外分泌シグナルを付加したTp-Oriやコドンを改変して細胞外分泌シグナルを付加しなかったModを導入したイネでは、非形質転換イネと同等の低い活性レベルしか示さなかったが、コドンを改変し、かつ、細胞外分泌シグナルを付加したTp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物を導入した系統においては顕著な活性上昇が認められ、その最大相対活性は１１０倍であった。実施例１の結果から、コドン改変と細胞外分泌シグナルを組合せて利用することにより、植物における外来フィターゼの高生産が可能になることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
任意のフィターゼについて、当該遺伝子のコドン改変と細胞外分泌シグナルの使用を組み合わせて宿主とする植物に導入することにより、当該植物における当該フィターゼの高生産が可能となる。フィターゼを高生産する植物はそれ自身、あるいは当該植物の抽出液又は分泌液を飼料に添加することにより、動物における栄養性向上ばかりではなく、環境富栄養化の原因となる未分解リン酸の動物からの排出軽減等に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】特定のアミノ酸（アミノ酸の表記はアルファベット三文字／アミノ酸）に対応する各コドン毎の使用頻度の合計を１００％とした場合の各コドンの使用頻度をOri、Mod及びイネについて算出した後、Ori又はModのコドン毎の使用頻度を対応するイネの各コドンの使用頻度で除して求めた比率を示す。白抜きの棒グラフはOriにおける当該比率、黒塗りの棒グラフはModの当該比率を示す。
【図２】Tp-Modのフィターゼ遺伝子発現用構成物の基本構造を示す図である。イネのキチナーゼの細胞外分泌シグナル（Cht-Tp)とそれに連結したOri又はMod（アミノ酸配列は同一）のＮ末側のアミノ酸配列を示す（アミノ酸の表記はアルファベット一文字／アミノ酸）。
【図３】Tp-Ori、Tp-Mod、Ori、Modの各フィターゼ遺伝子発現用構成物を導入して得られたイネ各系統におけるフィターゼの相対活性を示す図である。フィターゼ活性は、非形質転換体（non-transformant）の活性値の平均を１とした相対活性で示す。
【符号の説明】
【００４５】
P-Cab：イネのCabプロモーターの領域を示す。
【００４６】
Cht3-Tp：イネのキチナーゼの細胞外分泌シグナルの領域を示す。
【００４７】
Phytase：Ori又はModのフィターゼ遺伝子のコード領域を示す。
【００４８】
T-nos：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノバリンシンターゼのターミネーター領域を示す。
【００４９】
Tp-Ori： Schwanniomyces occidentalis由来フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼ遺伝子の細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加して構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
【００５０】
Tp-Mod： 配列表１に示すコドン改変型フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加して構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
【００５１】
Ori： Schwanniomyces occidentalis由来フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加せずに構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
【００５２】
Mod： 配列表１に示すコドン改変型フィターゼ遺伝子にイネ由来キチナーゼの細胞外分泌シグナルのＤＮＡ領域を付加せずに構築したフィターゼ遺伝子発現用構成物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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