(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）からなる群から選択されるアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ７０タンパク質をコードする単離された核酸分子と、異種抗原をコードする核酸分子とを含む魚類用ワクチンであって、該異種抗原に関連する感染性疾患を予防するための魚類用ワクチン。
（ａ）  配列番号１で表される核酸配列からなる核酸分子、
（ｂ）（ａ）の断片であって、該断片は配列番号２の１６２位〜３６５位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは単離されたアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ７０タンパク質に対する抗体に免疫反応性である断片。
【請求項２】
ｈｓｐ７０タンパク質をコードする核酸分子が、ＡＴＣＣ  ５５９２１の受託番号で寄託されているアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株から得られる、請求項１に記載の魚類用ワクチン。
【請求項３】
異種抗原が細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫類及び腫瘍の抗原から選択され、前記異種抗原をコードする核酸分子がｈｓｐ７０タンパク質をコードする単離された核酸分子にイン・フレームになるように融合された請求項１又は２の魚類用ワクチン。
【請求項４】
前記異種抗原をコードする核酸分子が動物病原体由来の抗原をコードする、請求項１〜３の何れか１項に記載の魚類用ワクチン。
【請求項５】
前記異種抗原が感染性膵臓壊死ウイルス  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  （ＶＰ２）又はｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  （ＶＰ３）である、請求項１〜４の何れか１項に記載の魚類用ワクチン。
【請求項６】
ｈｓｐ７０タンパク質をコードする単離された核酸分子が転写調節配列に作動可能に結合している、請求項１〜５の何れか１項の魚類用ワクチン。
【請求項７】
下記（ａ）または（ｂ）からなる群から選択される単離されたアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ｈｓｐ７０タンパク質と、異種抗原とを含む魚類用ワクチンであって、該異種抗原に関連する感染性疾患を予防するための魚類用ワクチン。
（ａ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）  配列番号２で表されるアミノ酸配列の１６２位〜３６５位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
ｈｓｐ７０タンパク質がＡＴＣＣ  ５５９２１の受託番号で寄託されている、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）株から得られる、請求項７に記載の魚類用ワクチン。
【請求項９】
異種抗原が細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫類及び腫瘍の抗原から選択され、ｈｓｐ７０タンパク質と前記異種抗原とが共有結合により連結されて融合タンパク質を形成する、請求項７又は８に記載の魚類用ワクチン。
【請求項１０】
前記異種抗原が、感染性サケ貧血ウイルス由来の、ヌクレオキャプシドタンパク質、ヘマグルチニン、ポリメラーゼ、及びセグメント７  Ｐ４及びＰ５タンパク質のうちいずれかのタンパク質である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の魚類用ワクチン。
【請求項１１】
ｈｓｐ７０タンパク質がアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）細胞の細胞壁に局在し、Ｎ末端のアミノ酸配列が（Ｍ）ＳＲＡＶＧ  ＩＤＬＧＴ  ＴＮＳＶＶ  ＳＶＬＥであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した分子量が６７ｋＤａである請求項７に記載の魚類用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）由来のヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）遺伝子及びコードされるタンパク質に関する。特に、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属由来のｈｓｐ７０の単離されたＤＮＡ配列及びアミノ酸配列、並びに該配列と相同な配列に関する。さらに、本発明は、ワクチンの調製、特に魚類に対するワクチンの調製におけるアルスロバクターｈｓｐ７０の様々な使用、並びにアジュバントとしての及び抗原のキャリヤーとしてのアルスロバクターｈｓｐ７０の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内病原体に対する有効なワクチンは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ経路を介した液性免疫反応を刺激するだけでなく、ＭＨＣクラスＩ経路の活性化を介した感染細胞の破壊も誘導する（こちらの効果の方がより重要である）。感染細胞中で外来タンパク質の細胞質内分解が起こり、この外来物質の断片が細胞表面に運ばれて、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対して提示されることにより、後者の反応が起こる。ＭＨＣクラスＩ経路が活性化できないことは、精製組み換え抗原を利用したワクチンに共通する欠陥である。
【０００３】
ヒートショックタンパク質（「Ｈｓｐｓ」）は、原核細胞及び真核細胞で産生される分子シャペロンタンパク質ファミリーであり、特に抗原プロセシングや細胞表面におけるＭＨＣ  Ｉ系に対する抗原断片の提示等、多くの細胞内及び細胞間プロセスにおいて必要不可欠な役割を果たす。あるｈｓｐタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質をうまく利用して、インビボにおいて、これらのペプチドに特異的なＣＴＬ反応を誘導することに成功している。
【０００４】
さらに、ｈｓｐｓは、現在、様々な細菌、真菌、蠕虫、及び原虫疾患に対する抗病原体免疫反応の標的として知られている。様々な病原ｈｓｐｓ（基本的にミコバクテリア由来）で哺乳類を免疫することにより、強い免疫反応が誘導され、これらの病原体が原因となる疾患に対する防御能が得られる。病原性ｈｓｐｓに対する哺乳類免疫反応が強いのは、これらのタンパク質上に複数のＢ細胞及びＴ細胞エピトープが存在することがその一因であると推測されている。
【０００５】
生きている、無毒性のアルスロバクター株（コリネバクテリア科に属する）は、「Ｒｅｎｏｇｅｎ」という商品名で、サケ科及びその他養殖魚の細菌性腎臓疾患（ＢＫＤ）を防御するワクチンとして市販されている。この株の特徴については、ＷＯ９８／３３８８４で開示されている。このワクチンは、水産養殖で使用するものとしてライセンスを取得した最初の生の培養菌であるという点で類のないものである。
【発明の開示】
【０００６】
驚くべきことに、アルスロバクターｈｓｐ７０が、様々な魚類病原体に対するワクチンにおいて効果的に用いることができるということが今回示された。
【０００７】
（発明の要約）
第１の側面において、本発明は、アルスロバクターｈｓｐ７０遺伝子の配列、その断片の配列、又は関連配列を含む単離された核酸配列を提供する。この遺伝子は、ＯＲＦ、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、さらに、何らかの成分プロモーター、エンハンサー、調節因子、ターミネーター、及び局在化因子を含む。
【０００８】
第２の側面において、本発明は、アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質の配列、その免疫原性断片、又は関連タンパク質を含む単離されたアミノ酸配列を提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質をコードする核酸配列、又は、アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質、又は、ｈｓｐ７０を濃縮したアルスロバクター細胞抽出液を含むワクチン組成物を提供する。本ワクチン組成物は、水産養殖における使用など、ヒト又は獣医用の医薬の調製において使用することができる。
【００１０】
本発明のさらなる別の側面において、アルスロバクターのｈｓｐ７０タンパク質全体又はその一部分と異種ポリペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。また、融合タンパク質そのものも提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の側面において、異種分子と共有結合又は非共有結合により結合しているアルスロバクターのｈｓｐ７０タンパク質全体又はその一部分を含むポリペプチドを含有する物質を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる側面において、動物の疾患を治療又は予防することを目的とした、アルスロバクターのｈｓｐ７０タンパク質又は核酸配列の、ワクチン抗原、アジュバント、又は異種分子のキャリヤーとしての使用を提供する。
【００１３】
さらなる側面において、動物で免疫原又はハプテンに対する免疫反応を誘導又は強化する方法を提供するが、この方法には、前記免疫原又はハプテンを含有する異種分子と共有結合または非共有結合で結合された本発明に係るｈｓｐ７０アミノ酸配列を含有する医薬組成物を該動物に対する投与こと、が含まれる。
【００１４】
別の側面において、本発明は、本発明のｈｓｐ７０核酸配列又はアミノ酸配列を含有する治療組成物を魚類に投与することを含む、魚類の感染性疾患に対する治療的処置又は予防的処置方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の側面において、異種遺伝子の発現を促進する、アルスロバクターｈｓｐ７０プロモーターの使用を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる別の側面において、病原性疾患に対して魚類を免疫化するためのワクチン組成物の製造における、単離されたヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質をコードする核酸分子の使用、あるいは、単離されたヒートショックタンパク質またはヒートショックタンパク質をコードする核酸分子を含有する組成物を魚類に投与することを含む、前記魚類の病原性疾患を予防又は治療する方法を提供する。前記単離されたヒートショックタンパク質は、アルスロバクターのような細菌由来のｈｓｐ７０であることが好ましい。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の単離されたｈｓｐ７０遺伝子の新規配列及びそれにコードされる単離又は精製されたタンパク質を図１及び２にそれぞれ示す。本発明は、図１及び２に示された配列と実質的に相同な核酸配列及びアミノ酸配列を包含する。「実質的に相同」とは、ある配列を参照配列と比較した際に、その配列が参照配列に対して最低でも６０％の相同性を有し、好ましくは最低でも７０％の相同性を有し、さらに好ましくは最低でも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれを超える相同性を有することを意味する。
【００１８】
２個のアミノ酸配列又は２個の核酸配列の相同性％を決定するために、最適な比較条件になるようにしてその２個の配列をアラインすることができる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列と最適な条件でアラインするために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入し、ギャップ中の非相同配列の介在を無視して比較を行う）。この２個の配列が同じ長さである必要はない。特に指定しない限り、配列比較を行う配列の長さが、アラインメントの全体の範囲である。場合によっては、アラインさせて比較を行う配列の長さは、参照配列の長さの最低でも３０％、好ましくは最低でも４０％、さらに好ましくは、最低でも５０％であるが、最低でも６０％であればより好ましく、最低でも７０％、８０％、又は９０％であればさらにより好ましい。例えば、ｈｓｐ７０の場合、参照配列を遺伝子又は蛋白質のアミノ末端側の半分、又は、より具体的にはｌｏｂｅＩＩ構造（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６： ６２３−６２８、及び、Ｚｈｕら、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１６０６−１６１４）に限定するというように、参照配列の任意の特定部分に限定してホモロジー解析を行うことができる。
【００１９】
第１の（参照）配列における位置が、その配列中で相当する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置で相同である（つまり、その位置において同一性がある）。核酸配列比較の場合、遺伝コードの縮重により、そのヌクレオチドを含有するコドントリプレットが比較される両分子間で同じアミノ酸をコードする場合も、その特定位置においてホモロジーがある。
【００２０】
２個の配列間の％ホモロジーは、配列間で共通の相同位置数の関数である（つまり、％ホモロジー＝相同位置数／全位置数）。必要に応じて、数学アルゴリズムを用いて配列比較及び％ホモロジーの決定を行うことができる。適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４３０−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに導入されている。
【００２１】
ストリンジェントな条件下で参照配列番号１とハイブリダイズする配列も、本発明の核酸配列に含まれる。本発明において「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），１．１０１−１．１０４に説明されているとおりであり、すなわち、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが、１ｘＳＳＣバッファー及び０．１％  ＳＤＳにより５５℃にて１時間洗浄した後でも観察されるというように定義されるが、６２℃であることが好ましく、６８℃であれば尚好ましく、特に０．２ｘＳＳＣバッファー及び０．１％  ＳＤＳにより５５℃にて１時間であるが、６２℃であることが好ましく、６８℃が最も好ましい。
【００２２】
本発明の配列には、参照核酸配列又はアミノ酸配列の断片が含まれる。ｈｓｐ７０核酸参照配列の「断片」とは、最低でも５０個、場合によっては最低でも７５個、又は最低でも１００個の連続したヌクレオチドを備えた前記配列の任意の一部分である。
【００２３】
ｈｓｐ７０蛋白質の断片とは、参照ｈｓｐ７０アミノ酸配列の連続したアミノ酸であって最低でも２５個、場合によっては最低でも３５個、又は最低でも４５個のアミノ酸を有する任意のペプチド分子を意味すると理解される。「免疫原性」タンパク質断片とは、病原体の感染性を中和、及び／又は、抗体−補体または抗体依存的細胞毒性を仲介して、免疫された宿主を保護する抗体を誘導することができる断片である。アルスロバクターｈｓｐ７０の免疫原性断片の一例は、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ドメインＩＩ断片（Ｈｕａｎｇ  Ｑら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１（２）：４０３−８）と類似のドメインＩＩ断片である。アルスロバクターｈｓｐ７０のドメインＩＩ断片は、配列番号２のアミノ酸１６２から３６５の配列、又は最低でも１００個の連続したアミノ酸、より好ましくは最低でも１５０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２００個の連続したアミノ酸からなる前記配列の部分である。
【００２４】
本発明のアミノ酸配列には、図２の配列の誘導体、又はその配列の相同体の誘導体も含まれる。アミノ酸配列の「誘導体」とは、アミノ酸配列レベルで（例えば、ある特定の天然アミノ酸が合成アミノ酸置換物で置換されている相同配列）又は３次元レベルで（すなわち参照アミノ酸配列とほぼ同じ形状及び構造を分子が有する）、参照配列に関連する配列である。従って、誘導体には、突然変異体、模倣体、ミモトープ、類似体、単量体及び機能的均等物が含まれる。アミノ酸配列誘導体は、Ｒ．サルモニナルム（Ｒ．ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ）及びピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｓ）等の魚類病原体由来の抗原を認識し（交差）反応する抗体の産生を誘導する能力、及び／又は、魚類においてこれらの病原体の感染を防ぐ免疫反応を誘導する能力を保持する。
【００２５】
本発明のｈｓｐ７０核酸配列には、ｈｓｐ７０遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけでなく、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が組み込まれている。本発明には、いずれかの成分プロモーター、エンハンサー、調節因子、ターミネーター及び局在因子、並びに異種遺伝子と結合させたこれらの因子の使用が含まれる。特に、本発明は、異種遺伝子の発現を促進するために異種遺伝子に連結されたアルスロバクターｈｓｐ７０（配列番号１に示されている。）のプロモーター配列、又は、実質的に相同な配列を含有するＤＮＡ発現ベクターに及ぶ。
【００２６】
本明細書に添付されているアルスロバクターｈｓｐ７０の配列表（配列番号１）は、アルスロバクター中に存在することがゲノムクローニングにより同定された遺伝子の配列であり、配列番号２は、その遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列である。元のアルスロバクター株の培養物は、受託番号  ＡＴＣＣ  ５５９２１として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）に、１９９６年１２月２０日に寄託されたものである。
【００２７】
同属の種のｈｓｐタンパク質は通常、非常によく保存されているので、他のアルスロバクター種に固有のｈｓｐ７０遺伝子とタンパク質の配列は、それぞれ配列番号１及び配列ＩＤ番号２とあまり大きな差がないと考えられる。従って、本発明は、これらの近縁ｈｓｐ７０分子にも及ぶ。あるコリネバクテリア種由来のｈｓｐ７０遺伝子の配列が明らかになれば、近縁生物由来の同一遺伝子を単離するのが容易になる。これらの遺伝子の単離方法は当業者にとって周知である。
【００２８】
「単離された」ｈｓｐ７０遺伝子又は核酸配列とは、アルスロバクターゲノム内に存在するという本来の状態にない遺伝子又は配列を意味すると理解される。ｈｓｐ７０を発現する細胞物質から調製したｃＤＮＡライブラリからｈｓｐ７０をコードするＤＮＡを得ることができる（ｈｓｐはユビキタスであり、大量に発現される）。ｈｓｐ７０をコードする遺伝子は、実施例１で説明する以下の工程などによってゲノムライブラリから取得することもできるし、オリゴヌクレオチド合成によって取得することもできる。
【００２９】
標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、細菌細胞ソースから、天然ｈｓｐ７０タンパク質を単離することができる。例えば、アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１  ｈｓｐ７０抗原に対する抗体を用いてウェスタンブロッティング又は免疫沈降を行うことにより、蛋白質の同一性を確認することができる。精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列決定を用いて、部分的なアミノ酸配列又は完全なアミノ酸配列を決定することができる。これにより、プローブをデザインしてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリから天然ｈｓｐ７０が簡単に単離できるようになる。
【００３０】
目的の遺伝子又はこの遺伝子がコードするタンパク質を同定するように設計されたプローブ（ｈｓｐ７０に対する抗体、又は、最低でも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）でライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、本明細書に開示されているアルスロバクター遺伝子配列の一部と相同性を有するようにプローブを設計することができる。あるいは、プローブが、例えばビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）ｈｓｐ７０遺伝子配列等、他の細菌由来のｈｓｐ遺伝子と高い相同性を持っている可能性がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）で説明されているような標準的な手法を使用して、選択したプローブによりｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングしてもよい。ｈｓｐ７０をコードする遺伝子の他の単離方法としては、ＰＣＲ法を用いるものがある［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  すｐら；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）］。
【００３１】
このようなライブラリスクリーニング法で同定された配列を、配列番号１に開示されたｈｓｐ７０、又は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースに寄託されており、データベースから利用可能な他の既知のｈｓｐ配列と比較しアラインすることができる。ホモロジーを測定するために様々なアルゴリズムを利用するＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントにより、その分子の所定の領域内又は全長配列にわたる配列の同一性を（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかで）調べることができる。
【００３２】
アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質が、他種、特に細菌種の相同体と類似性を有すると思われる。近縁種間でｈｓｐ遺伝子が良く保存されていることが知られている。しかし、アルスロバクターｈｓｐ７０が、ミコバクテリウム・ツバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びミコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）由来のｈｓｐ７０と、Ｎ末端領域がほぼ同じ（最初の２０アミノ酸は実際に同じである）であることを発見したことは驚くべきことである。
【００３３】
実施例２で説明する実験において、細胞壁ペプチドグリカンに結合すると思われる、分子量がおよそ６７ｋＤａの、豊富に存在するアルスロバクター表面タンパク質に対して、Ｎ末端アミノ酸の配列決定による分析を行った。２０残基のＮ末端アミノ酸配列がミコバクテリウムｈｓｐ７０の当該部分の配列と同一であることが分かったが、この６７ｋＤａタンパク質は本発明のｈｓｐ７０タンパク質に相当するものであると考えられる。ある側面において、本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定でおよそ６７ｋＤａを示す単離されたヒートショックタンパク質であって、アルスロバクター細胞の細胞壁に局在し且つＮ末端アミノ酸配列が（Ｍ）ＳＲＡＶＧＩＤＬＧＴＴＮＳＶＶＳＶＬＥである単離されたヒートショックタンパク質を提供する。
【００３４】
本発明者らの実験の結果、魚類におけるアルスロバクターｈｓｐ７０の免疫原性が、哺乳類におけるミコバクテリウムｈｓｐ７０と同程度であることが示される。あとになって考えると、魚類のワクチン接種に使用した場合にＲｅｎｏｇｅｎ（ＴＭ）のアルスロバクター生ワクチンによって付与される疾患予防能の一部は、アルスロバクターｈｓｐ７０によるものであると考える。
【００３５】
実際に、本願は、あらゆる起源の単離又は精製されたヒートショックタンパク質が魚類に対するワクチンとして有効であることを示す最初の証拠を提供する。魚類の免疫系は他種、特に哺乳類の免疫系と同じようなものではなく、また、あまり知られていない。従って、ヒートショックタンパク質が、魚類において強力な免疫反応を誘導しうるということは驚くべきことである。ある側面において、本発明は、魚類への投与を目的としたワクチン組成物の調製における単離又は精製されたヒートショック蛋白質の使用に関する。ワクチン組成物に対するアジュバントとして、又は、ワクチン組成物中の異種分子のためのキャリヤーとして本ヒートショックタンパク質を使用するのが好ましい。本ヒートショックタンパク質は、ｈｓｐ７０ファミリーに属することが好ましいが、これに代えて、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１００又はいずれかの小分子ヒートショックタンパク質（ｓＨＳＰ）等の、他のあらゆるクラスの既知のヒートショックタンパク質であってもよい。本ヒートショックタンパク質は、原核生物又は真核生物のあらゆる種に由来するものであってよいが、アルスロバクター等の細菌種由来であることが好ましい。
【００３６】
アルスロバクター及びミコバクテリウムのｈｓｐ７０遺伝子が高い相同性を有することが明らかになったことから、予想しなかった多くのアルスロバクター相同体の適用の可能性が出てきた。単離されたミコバクテリウムｈｓｐ７０タンパク質は、効果的なワクチンアジュバントとして働くことが明らかになった。アルスロバクターｈｓｐ７０も、精製又は単離された状態で、抗原と併用して、アジュバントとして使用することができる。本明細書中で定義される「アジュバント」とは、抗原とともに投与した際に又は同じ部位に別個に投与した際に、抗原に対する特異的免疫反応を非特異的に増強する物質である。本発明のある側面において、動物ワクチン、特に魚類用ワクチンに対するアジュバントとして、単離又は精製されたアルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質を使用する。関連する用途では、前記ｈｓｐ７０遺伝子又はその一部をＤＮＡベクター上に与えて、核酸ワクチンを賦活する。少なくとも１個の他の抗原又は抗原をコードする核酸配列及び１個又は複個の医薬的に許容される賦形剤とともに、本発明のｈｓｐ７０アミノ酸又は核酸配列を含むワクチン組成物も提供されるが、かかるワクチン組成物も本発明の範囲に属する。前記他の抗原は、組み換え又は単離された単一の抗原であってもよく、病原体由来の抗原分子の混合物であってもよい。
【００３７】
従来、医師及び獣医が使用してきた弱毒化ミコバクテリウムの生アジュバントには、細菌株の毒性復帰が起こる危険性があるという点で動物の健康に対するリスクが存在しているが、アジュバントとしてアルスロバクターｈｓｐ７０を使用することにより、このようなアジュバントを使用する必要がなくなる。アルスロバクターｈｓｐ７０核酸又は単離されたタンパク質の魚類への注射を水産養殖で用いることにより、従来型のアジュバントで共通して見られるような注射部位の腫れ又は小結節が生じないので外観を損なわず、魚の商品価値を下げないというさらなる利点が得られる。
【００３８】
アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質は、他の抗原を含有するワクチンを補強する効果を有するというだけでなく、それ自体で免疫原性活性も有する。アルスロバクターｈｓｐ７０は、魚類病原体により起こる疾患、特にＢＫＤ及びＳＲＳ（ｓａｌｍｏｎｉｄ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ、サケ科のリケッチア敗血症）などの（これらに限定されない）様々なヒト及び動物の疾患を予防又は治療する、ワクチンに対する活性成分を提供しうる。本発明のさらなる側面では、ワクチン組成物には、１個又は複数の医薬的に許容される賦形剤とともに、単離又は精製されたｈｓｐ７０タンパク質が唯一の抗原性又は免疫原性成分として含有される。
【００３９】
１個又は複数の医薬的に許容される賦形剤とともに、ワクチン組成物の唯一の抗原性又は免疫原性成分となる抗原をコードする本発明のｈｓｐ７０核酸配列を含有する発現ベクターを含んだ核酸ワクチン組成物も提供される。
【００４０】
ミコバクテリウム及び他のｈｓｐ７０との相同性からアルスロバクターｈｓｐ７０の免疫原性が高いと推定されるので、ｈｓｐ７０タンパク質と異種（ｈｓｐ７０）分子（通常は、非ｈｓｐ７０タンパク質（例えば、ハプテン）であるが、これに限定されるものではない）との遺伝子又はペプチド共有結合コンジュゲート（例えば、キメラ又は融合物）を調製できる可能性も示唆される。このように、アルスロバクターｈｓｐ７０タンパク質は、アジュバントが必要ないキャリヤーとして作用し、付随する異種分子に対する液性及び細胞性免疫反応を刺激する。本明細書中で使用されているように、「キャリヤー」なる語は、第２の分子と共有結合している場合に、該第２の分子（タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖であり得る）に対する免疫反応の誘導を補助し促進するＴ細胞エピトープを含有する分子を意味する。
【００４１】
ワクチン開発に対するこの手法は、対象となる抗原性ペプチドがあまり大きくなく、免疫原性が乏しいが、ワクチン用の標的として適切であると思われる場合に特に有利である。アルスロバクターｈｓｐ７０により運ばれる異種分子は、タンパク質ハプテン又は、炭水化物部分等の非タンパク質分子とするのが有利である。
【００４２】
本明細書中で使用されるｈｓｐ７０「融合タンパク質」という用語には、異なるポリペプチド（「異種ポリペプチド」）に作動可能に連結させたｈｓｐ７０ポリペプチドが含まれる。「異種ポリペプチド」又は「非ｈｓｐ７０ポリペプチド」とは、実質的にｈｓｐ７０タンパク質と相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ｈｓｐ７０融合タンパク質中で、ｈｓｐ７０ポリペプチドは、ｈｓｐ７０タンパク質全体又はその一部（ドメインＩＩ部分等）に相当するものでよい。融合タンパク質中で、「作動可能に結合させる」とは、ｈｓｐ７０ポリペプチド及び非ｈｓｐ７０ポリペプチドが互いにイン・フレームで融合していることを示す。ｈｓｐ７０ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に、非ｈｓｐ７０ポリペプチドを融合させるか、又はｈｓｐ７０ポリペプチド中に埋め込むことができる。
【００４３】
融合タンパク質を作製すること以外に、共有結合または非共有結合によって、ｈｓｐ７０ポリペプチドと異種分子とを連結させることが可能である。「異種分子」とは、ｈｓｐ７０タンパク質以外のあらゆるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴ糖類分子である。例としては、例えば一般式、ｈｓｐ７０−Ｘ−異種ポリペプチド（ここで、Ｘは、１個又は複数個のアミノ酸の短い配列等のスペーサー基である）の分子を作製するために、ポリペプチド間に、化学的スペーサー基を挿入してもよい。あるいは、アミノ酸の直鎖におけるアミド結合以外に、例えば、化学的連結（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）又は化学的、光学的（例えばＵＶ）、又は放射線誘導性の架橋（重合）により、非ｈｓｐ分子にｈｓｐ７０ポリペプチドを共有結合で結合させてもよい。グルタールアルデヒド及びメルカプト結合リンカーは、適切な化学架橋剤の例である。具体的に可能であるのは、キットとして市販されている、ＥＤＣ＋ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＢＥＤ、及びＳＡＥＤである。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、ｈｓｐ７０ポリペプチドを、ハプテンと共役させる。ハプテンとは、抗体を結合しうるが、大きなキャリヤー分子に共有結合している場合のみ免疫反応を誘導する低分子（例えば、ペプチド又はオリゴ糖）の物質である。
【００４５】
インビトロにおいて細胞溶解液、画分、抽出液、ウイルス粒子等と複合体を形成させることにより、ｈｓｐ７０を、抗原性細胞又は粒子に由来する全タンパク質集団と結合させることが可能である。
【００４６】
異種分子又はポリペプチドをあらゆるソースから得ることができるが、病原性生物の成分である可能性が最も高い。特に、それらは動物、特に水生動物のウイルス、細菌、原生動物、蠕虫、又は真菌性病原体由来のポリペプチドでありうる。
【００４７】
大量の精製又は単離された組み換えｈｓｐ７０タンパク質（又はｈｓｐ７０融合タンパク質）を得るための発現ベクターにｈｓｐ７０遺伝子をクローニングすることにより、単離されたｈｓｐ７０遺伝子を通常の方法で有効に使用できる。組み換え操作を用いない手法でも、精製されたｈｓｐ７０抗原を得ることができる。本タンパク質は豊富に存在するので、従来の精製法によりアルスロバクター細胞から抽出することが可能である。あるいは、標準的なペプチド合成技術を用いてｈｓｐ７０タンパク質又はポリペプチドを化学的に合成することができる。この精製又は単離された組み換え又は非組み換えタンパク質を含むワクチンは、抗原を基にしたワクチン（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）と称することがある。
【００４８】
「単離された」又は「精製された」タンパク質とは、ｈｓｐ７０タンパク質を取得した細胞又は組織由来の細胞性物質または他の不純なタンパク質が実質的に含有されない状態、又は、化学的に合成を行った場合は、化学的前駆体あるいは他の化学物質が実質的に含有されない状態と定義される。「細胞性物質を実質的に含有しない」という語には、単離又は組み換えによってｈｓｐ７０タンパク質を与えた細胞の細胞性成分からｈｓｐ７０蛋白質を分離してｈｓｐ７０タンパク質を調製することが含まれる。ある実施形態において、「細胞性物質を実質的に含有しない」という語には、非ｈｓｐ７０タンパク質（本明細書中では、「不純なタンパク質」とも言う）の含有率が約３０％未満（乾燥重量）、さらに好ましくは非ｈｓｐ７０タンパク質約２０％未満、さらに好ましくは非ｈｓｐ７０タンパク質の約１０％未満、最も好ましくは非ｈｓｐ７０タンパク質の約５％未満であるｈｓｐ７０タンパク質の調製物が含まれる。ｈｓｐ７０タンパク質又は生物学的に活性を有するその一部を組み換えにより作製する場合、培地が実質的に含有されていないことも好ましい。すなわち、タンパク質調製物の体積に対する培地含有率が約２０％未満であること、さらに好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満ということである。
【００４９】
単離又は精製されたｈｓｐ７０の代わりにｈｓｐ７０を「濃縮された」アルスロバクター細胞抽出液を使用しても、本発明を実施できる。アルスロバクター細胞全体を不活性化又は死滅させ、その細胞を溶解して得られた細胞溶解液を慣用法で分画して、他の画分よりもｈｓｐ７０タンパク質を多く含有する画分を見つける（例えばウェスタンブロッティングなど）ことにより、「濃縮された」細胞抽出液を得ることができる。ヒートショックタンパク質の発現を増大させる条件下（つまり、熱又は他のストレスが細胞にかかっている状態）でアルスロバクター細胞を培養し、不活性化又は殺菌させ、細胞を溶解することによっても、ｈｓｐ７０が濃縮された細胞抽出液を調製することができる。場合によっては、得られた細胞抽出液（溶解液）を分画化し、ｈｓｐ７０含有量が多い画分を見つける。
【００５０】
本発明のｈｓｐ７０キメラ又は融合タンパク質は標準的な組み換えＤＮＡ技術によって産生することが好ましい。例を挙げると、従来の方法、例えば、連結を行うために末端を平滑末端又は粘着末端にし、末端が適切な形になるように制限酵素消化を行い、適宜粘着末端を埋め、望ましくない結合が起こらないようにアルカリホスファターゼで処理し、酵素を用いて連結を行うことにより、様々なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片をイン・フレームになるようにして連結を行う。別の実施形態において、ＤＮＡ自動合成装置を含む従来の技術により融合遺伝子を合成することができる。あるいは、続いてアニーリングさせて再増幅を行い、キメラ遺伝子配列を生成することができる２個の連続した遺伝子断片の間に相補的な突出部を生じさせるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２）。
【００５１】
本発明の別の側面は、ｈｓｐ７０（又はその一部）をコードする核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用する「ベクター」なる語は、連結されている他の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。あるベクターは、「プラスミド」タイプであるが、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状二重鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターとしては、ウイルスベクターがあるが、これは、他のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結できるものである。ある種のベクターは、作動可能なように結合させた遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。一般的に、組み換えＤＮＡ技術において発現ベクターを利用する場合、プラスミドの形で利用することが多い。しかし、本発明では、ウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）など、均等な機能を有する他の形態の発現ベクターも含まれるものとする。
【００５２】
本発明の組み換え発現ベクターには、宿主細胞における核酸発現に適した形態の本発明核酸が含まれるが、これは、発現させるべき核酸配列と作動可能に連結された１個又は複数の調節配列が本組み換え発現ベクターに含有されるということを意味する。ここで上記調節配列は、発現に使用する宿主細胞に依存して選択される。ｈｓｐ７０抗原の対象レシピエント中での発現用（ＤＮＡワクチンとして）、又は、最終的なレシピエント以外の宿主生物中での発現用（組み換え抗原ワクチン産生用）に本発明の発現ベクターを使用し得る。
【００５３】
発現ベクター中で、「作動可能に結合された」とは、目的のヌクレオチド配列と調節配列とが、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又は宿主細胞にベクターが導入された場合にはその宿主細胞において）前記ヌクレオチド配列が発現できるように連結されていることを意味する。「調節配列」なる語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列については、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列及びある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計が、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望される蛋白質の発現レベル等のような要因に依存しうるということは、当業者に自明であろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書中に記載されているような核酸にコードされる、融合タンパク質又はペプチドを含むタンパク質又はペプチド（例えば、ｈｓｐ７０タンパク質、ｈｓｐ７０の突然変異型、ｈｓｐ７０と異種ペプチドとの融合タンパク質など）を産生させることができる。
【００５４】
本発明の別の側面は、形質転換により本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。宿主細胞は、いずれかの原核細胞又は真核細胞（多細胞真核生物の真核細胞を含む）とすることができる。例えば、Ｅ．コリ等の細菌細胞、昆虫細胞（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ（バキュロウイルス）発現ベクターを用いて）、酵母細胞又は哺乳類細胞の中でｈｓｐタンパク質を発現させることができる。他の適切な宿主細胞が当業者にとって公知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、上記）。前記組み換え発現ベクターは、宿主魚類細胞中で発現させるようにデザインしてもよい（ＤＮＡワクチン接種後）。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、前記組み換え発現ベクターを、インビトロで、転写、翻訳させることも可能である。
【００５５】
原核細胞におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を支配する構成的又は誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いてＥ．コリで行われることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。融合発現ベクターにおいては、融合部分と組み換えタンパク質との連結部にタンパク質分解性の切断部位を導入して、融合タンパク質を精製した後にその組み換えタンパク質を融合部分から切り離すことができるようにすることが多い。このような酵素、及びその同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）認識配列には、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａが標的組み換えタンパク質と融合している、それぞれ、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
【００５６】
核酸ワクチン（ＮＡＶ）を生きた動物の宿主細胞に取り込ませ、ｈｓｐ７０遺伝子の発現を細胞質中で行うように、ｈｓｐ７０遺伝子をＮＡＶに組み込むことができる。細胞内ｈｓｐ７０抗原の短いペプチドが細胞表面に運ばれ、ＭＨＣ  Ｉ系と接触できるようになるため、ＮＡＶ由来ｈｓｐ７０抗原が細胞性免疫反応を誘導するのに理想的な位置に存在するようになる。
【００５７】
魚類細胞中で、インビボにおいて発現させるために、ＤＮＡベクターに挿入されたｈｓｐ７０遺伝子を魚類に直接接種（例えば、経口、筋肉内又腹腔内投与）することができる。他種の動物にも、ＤＮＡワクチン接種を行うことができる。つまり、本発明のある側面において、医薬的に許容されるキャリヤー及び、アルスロバクターｈｓｐ７０をコードする核酸配列が転写調節配列に作動可能に結合しているＤＮＡプラスミドを含有する核酸ワクチンを提供する。転写調節配列には、プロモーター、ポリアデニル化配列及び、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを有する免疫刺激性オリゴヌクレオチド、又は他の抗原性タンパク質又は促進作用のあるサイトカインをコードするヌクレオチド配列等の他のヌクレオチド配列が含まれる。真核生物又はウイルスの転写調節配列が存在することにより、魚類細胞中でｈｓｐ７０遺伝子が発現できるようになる。ワクチン組成物を調製するために、細菌細胞中でＤＮＡプラスミド自身を複製させることができるが、この場合、通常、原核細胞中ではｈｓｐ７０遺伝子発現を可能にする転写調節配列が欠如している。インビボ発現を最適化するためには、ワクチン接種を行う魚類に内在する転写調節配列を選択することが好ましいであろう。例えば、内在性サイトカイン又はアクチン遺伝子プロモーターが考えられる。前記ＤＮＡは裸の状態にしておくか、又は、細胞取り込みを促進する因子とともに投与することができる（例えば、リポソーム又はカチオン性脂質）。この魚類へのＤＮＡワクチン接種技術については、本明細書中に参照により組み入れる米国特許第５，７８０，４４８号で詳述されている。
【００５８】
本発明は、ある分子に連結されたｈｓｐ７０タンパク質のコンジュゲートを使用して、該分子に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を作製する方法にも関する。この実施形態では、有効量（つまり、前記動物宿主に免疫反応を引き起こす量）の前記コンジュゲートを動物宿主に導入して、前記物質に対する抗体を前記宿主に産生させる。前記宿主から産生された抗体を取り出し、既知の技術（例えばクロマトグラフィー）を用いて精製し、ポリクローナル抗体を得る。あるいは、本発明の方法を用いて産生された抗体を使用して、既知の技術によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することができる。
【００５９】
本発明のある実施形態では、アルスロバクターｈｓｐ７０遺伝子のプロモーター配列を使用して異種遺伝子（つまり、アルスロバクターｈｓｐ７０をコードする遺伝子以外の遺伝子）の発現を誘導する。このプロモーターは、生物の染色体ＤＮＡ中の異種遺伝子の上流、又は染色体外プラスミド又は他の発現ベクターに挿入することができる。例えば、内在するアルスロバクター遺伝子を過剰発現させるか、又はアルスロバクターの内在プラスミドに外来遺伝子を挿入したい場合、上流ｈｓｐ７０プロモーターにより、ヒートショック等の刺激に反応して異種遺伝子の発現を引き起こすようにすることができる。
【００６０】
本発明の方法により製造したワクチンは、液性及び／又は細胞性免疫系を有するあらゆる種の動物に対する投与に適している。本発明において、「動物」及び「哺乳類」の意味の中には、ヒトが含まれる。
【００６１】
哺乳類、鳥類、爬虫類又は魚類（魚類又は貝・甲殻類）に対する、あらゆるワクチンの補強にもアルスロバクターｈｓｐ７０を利用することができる。同様に、ワクチンにおいて、共有結合している抗原のキャリヤーとして、アルスロバクターｈｓｐ７０を使用することができるが、必要に応じて従来のアジュバントを除外して使用してもよい（いわゆる、「非アジュバント」ワクチン）。アルスロバクターｈｓｐ７０は、特異的な疾患、特にＢＫＤ及びＳａｌｍｏｎｉｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ（ＳＲＳ、サケ科のリケッチア敗血症）等の魚類の感染症に対する免疫反応を誘発するためのワクチンにおいて、免疫原（必要に応じて、唯一の免疫原として）として使用することも可能である。
【００６２】
「ワクチン」なる語は広い範囲で使用されるが、病原体に対する免疫に使用する組成物だけでなく、抗腫瘍ワクチン、自己抗原を基にしたワクチン（例えば化学的去勢用）等も含む。獣医科のワクチン接種の分野では、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、及び家禽類といった主要な種の陸生家畜など、ヒト以外のあらゆる動物にワクチン接種することができる。水産養殖の場合には、貝類・甲殻又は魚類において、特に、サケ、マス、コイ、タイ、スズキ、ハマチ、ナマズ、オヒョウ、コダラ等の硬骨類の治療用、又は、場合によっては、甲殻類（例えば小エビ、クルマエビ、ロブスター、カニ）、及び軟体動物（例えば、カキ、イガイ）等の他の水生生物種の治療用に本発明のワクチンを使用することができる。ワクチン中でアルスロバクターｈｓｐ７０配列と結合させるのに適した候補抗原に制限はない。病原性抗原は、細菌、ウイルス、原生動物、蠕虫類及び真菌由来のものでありうる。ある具体的な標的は、魚類病原性生物の抗原、特に表面抗原である。
【００６３】
ワクチン組成物中において、貝・甲殻類又は魚類が罹患する疾患由来の細菌、原生動物、ウイルス又は真菌由来抗原とともに、又はコンジュゲート形成させて、ｈｓｐ７０アミノ酸又は核酸配列を使用することができる。上記抗原には、感染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｓａｌｍｏｎ  Ａｎａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）、感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、神経壊死症原因ウイルス（ＮＮＶ、Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）、サケ膵臓疾患ウイルス（ＳＰＤＶ、Ｓａｌｍｏｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｉｒｕｓ）、ＳＶＣウイルス（ＳＶＣＶ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｉｒｅｍｉａ  ｏｆ  Ｃａｒｐ  Ｖｉｒｕｓ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）、黄頭ウイルス（ＹＨＶ、Ｙｅｌｌｏｗ−ｈｅａｄ  ｖｉｒｕｓ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ、Ｔａｕｒａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ、Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｏｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）、レニバクテリウム・サルモニアルム（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ（細菌性腎疾患の原因物質））、ピシリケッチア・サルモニス（Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｓ（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａの原因物質））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）ｓｐｐ、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ、エルシニア・ルッケリー（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｒｕｃｋｅｒｉｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ、フォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）等由来の抗原（又はコード配列）が含まれる。上記及び他の病原性生物由来の多数のポリペプチドの精製及び／又はクローニングと発現が行われ、さらにその数は増えているが、これらは、ワクチン組成物中でアルスロバクターｈｓｐ７０又はそのコード配列とコンジュゲート形成させて利用できるか、又は、アルスロバクターｈｓｐ７０又はそのコード配列とともに提供される。好ましい例には、ＩＰＮＶタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＮＳ、並びにそのコードヌクレオチド配列；ヘマグルチニン、ヌクレオキャプシド、ポリメラーゼ及びセグメント７  Ｐ４及びＰ５タンパク質を含むＷＯ  ０１／１０４６９で開示されているＩＳＡＶタンパク質及びそのコードヌクレオチド配列；ＯｓｐＡ及びｌｃｍＥなどＷＯ  ０１／６８８６５で開示されているＰ．サルモニスタンパク質とそのコードヌクレオチド配列；ヌクレオキャプシド等のノダウイルス（ｎｏｄａｖｉｒｕｓ）タンパク質；及び、ＳＰＤＶ由来の構造ポリペプチド及びそのコードヌクレオチド配列（ＷＯ  ９９／５８６３９で開示）が含まれる。本発明の好ましいワクチン組成物には、イン・フレームでＩＰＮＶ  ＶＰ２配列又はＩＰＮＶ  ＶＰ３配列と融合しているｈｓｐ７０ヌクレオチド配列を担持するＤＮＡ発現ベクターが含有される。必要に応じて、前記ワクチンは、ｈｓｐ７０−ＶＰ２融合物を担持する第１のプラスミドとｈｓｐ７０−ＶＰ３融合物を担持する第２のプラスミドとを含む。
【００６４】
ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ、Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザ３型ウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ３  ｖｉｒｕｓ（ＰＩ３））、ウシ伝染性鼻気管炎（ＩＢＲ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ、Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、レイシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｍ、ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ、ヒオニューモニア（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ブラキスピラ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ネオスポラ（Ｎｅｏｓｐｏｒａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、マンヘミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ヘモフィラス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、アクチノバシラス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）等を含む他の動物病原体及び寄生生物由来の抗原（又はそのコード配列）と併用して又はコンジュゲート形成させて、ｈｓｐ７０配列を使用することも可能である。
【００６５】
前記抗原を与える病原因子による感染によって引き起こされる疾病を治療又は予防するための医薬組成物の製造において、上記抗原の何れか又はそれらのコード配列とともに、ｈｓｐ７０配列を使用することも、本発明に包含される。
【００６６】
前記ワクチン抗原をｈｓｐ７０遺伝子又はタンパク質とともに与える場合には、化学的にｈｓｐ７０とコンジュゲート形成させてもよいし（キメラ又は融合タンパク質）、又は、単一のワクチン組成物の中に、別々の分子として一緒に提供してもよい。別の方法としては、個別投与、連続投与、又は同時投与キット中に、抗原又は抗原をコードする核酸配列とともにｈｓｐ７０遺伝子又はタンパク質を与えてもよい。ｈｓｐ７０遺伝子又はタンパク質とともに与えられるワクチン抗原は、細菌ワクチン、細胞抽出物、組み換えタンパク質、プラスミドによって運ばれる遺伝子、又は生／弱毒化病原株とすることができる。
【００６７】
中性の又は塩の形態の本融合タンパク質又は単離されたｈｓｐ７０タンパク質を用いて、単独投与により又は医薬的に許容されるビヒクル若しくは賦形剤との混合投与により、対象生物を免疫することが可能である。通常は、溶液又は懸濁液としてワクチンを調製するが、投与前に液体ビヒクルにより溶液又は懸濁液として調製するのに適した固形物としてワクチンを調製してもよい。該調製物を乳化してもよいし、又はリポソームビヒクル中に活性成分をカプセル封入してもよい。本発明の医薬組成物は、即時放出の形態又は徐放型の形態で投与することができる。
【００６８】
医薬的に許容されるビヒクルとは、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールや、湿潤剤又は乳化剤、膨張剤、結合剤、錠剤分解物質、希釈剤、潤滑剤、ｐＨ緩衝剤等の補助剤、又はムラミールジペプチド、アブリジン（ａｖｒｉｄｉｎｅ）、水酸化アルミニウム、油、サポニン類、ブロックコポリマーや当業者にとって公知の他の物質等の従来のアジュバントである。
【００６９】
対象を免疫するために、ｈｓｐ７０抗原又はｈｓｐ７０遺伝子ベクターは、適切なビヒクル中に加えて筋肉内注射により非経口投与するのが通常であるが、必要に応じて、皮下経路、静脈内注射、又は皮内注射、経鼻投与により、非経口的に投与することも可能である。魚類に免疫する場合、通常の投与経路は腹腔内注射、餌に混合して行う経口的投与、又は薬浴による投与である。本発明の好ましい抗原性ワクチン組成物は、注射又は薬浴投与に適した形態である。ＤＮＡワクチン接種は通常、筋肉内注射により行う。
【００７０】
有効量は、対象の大きさおよび種、さらに投与形態により様々であってよい。医師又は獣医師が試行を繰り返して最適用量を決定することができる。通常は、ｈｓｐ７０抗原の１回量は、約０．０１−１０００μｇ／ｋｇ体重の範囲にあるものと思われるが、０．５−５００μｇ／ｋｇ体重であることが好ましく、０．１−１００μｇ／ｋｇ体重であればさらに好ましい。ＤＮＡワクチンの場合、インビボにおいて抗原を適切に発現させるためには、動物１匹あたり最小１０ｐｇの用量から最大１０００μｇの用量までのプラスミドで十分であると考えられる。
【００７１】
本発明の一部として開示されている新規抗原は、病原性タンパク質に対する抗体のスクリーニングにも有用である。本発明には、例えば、病原生物の有無について動物を調べる際に有用な診断キットの調製などにおいて、これらの抗原を診断に使用することがさらに含まれる。
【００７２】
本明細書中で開示されている精製ｈｓｐ７０抗原及び／又はｈｓｐ７０融合タンパク質に対して生じた抗体も、本発明の範囲に属する。このような抗体は、疾病管理及び魚類の健康維持のための診断及び治療の両用途に適用可能であろう。この点に関しては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体がともに有用であろう。例えばマウス等の動物をタンパク質で免疫し、免疫原特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する手法は、本分野において周知である（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照）。診断アッセイの具体的な例としてはサンドイッチアッセイ及びＥＬＩＳＡを挙げることができる。
【００７３】
本発明のｈｓｐ７０核酸配列は、例えばＰＣＲ増幅アッセイ用のプライマーのデザイン等で診断へ適用することができる。
【実施例１】
【００７４】
アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１のゲノム由来ｈｓｐ７０遺伝子の単離及び配列決定
５ｍｌのアルスロバクター培養液を、振盪しながら一晩、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地で３０℃にて培養する。Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ）又はＩｎｓｔａｇｅｎｅＴＭ  Ｒｅｓｉｎを用いて、説明書に従い、ＤＮＡ抽出を行う。
【００７５】
縮重ＰＣＲ
いくつかのミコバクテリアとストレプトマイセスとのｈｓｐ７０（ｄｎａＫ）配列間においてヌクレオチドレベルで最も相同性が高い領域を用いて、ＰＣＲ及び配列決定用の縮重プライマーをデザインする。選択したプライマーは、ｄｎａｋ−１Ｆｄｅｇ（５’−ｇｔｃｇｇｎａｔｃｇａｃｃｔｖｇｇｎａｃ−３’）及びｄｎａｋ−４Ｒｄｅｇ（５’−ｇｃｇｇｔｓｇｇｃｔｃｇｔｔｇａｃ−３’）である。アニーリング温度が５０℃のＰＣＲ反応で、アルスロバクターＤＮＡを増幅させるためにこれらのプライマーを使用する。増幅させたＤＮＡの品質を、ゲル電気泳動で確認する。１０μｌの試料を０．８％アガロースゲルに添加し、１ｘＴｒｉｓ−ホウ酸電気泳動バッファー（ＴＢＥ）を用い、１００Ｖでおよそ１時間、電気泳動を行う。次に６５０ｂｐの産物をゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔを用いて説明書に従いＰＣＲ産物をクリーンアップし、ＢｉｇＤｙｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＰＣＲで用いた各プライマーをプライマーとして用いて説明書に従い配列決定を行う。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（８ｒ）ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘを用いて伸長反応混合液（〜６００ｎｇのＤＮＡテンプレート、３．２ｐｍｏｌの適切なプライマーに、ｄｄＨ２Ｏを全量が２０μｌになるよう添加）を調製する。サイクルシークエンシング条件は以下のとおりである。すなわち、９６℃を１０秒、５０℃を５秒、６０℃を４分からなる反応を２５サイクル繰り返すように、サーマルサイクラーを設定する。この配列決定により、この断片がｄｎａＫ遺伝子の最初のおよそ４００ｂｐを含有することが明らかとなる。
【００７６】
さらにｈｓｐ７０／ｄｎａＫ遺伝子配列を得るために、縮重プライマーを用いてアルスロバクターｈｓｐ７０遺伝子の下流の部分を増幅させる。これらのプライマーは、Ｇａｌｌｅｙら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１３０：２０３−２０８から選択する。［ホワード・プライマー  ｈｓｐ７０  ユニバーサル−Ｆ１（５’ＣＡＲ  ＧＣＮ  ＣＡＮ  ＡＡＲ  ＧＡＹ  ＧＣＮ  ＧＧ  ３’）、リバース・プライマー  ｈｓｐ７０  ユニバーサル−Ｒ１：（５’ＧＣＮ  ＣＡＮ  ＧＣＹ  ＴＣＲ  ＴＣＮ  ＧＧＲ  ＴＴ  ３’）］である。プライマーは、ｈｓｐ７０遺伝子中の保存度の高い２つの領域とアニーリングして６５０ｂｐの産物が生成されるようにデザインする。
【００７７】
ＰＣＲ反応液（全量５０μｌ）は、５μｌの１０ｘＰＣＲバッファー、５μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５μｌの１０ｍＭ  各ｄＮＴＰ、２μｌのＨｓｐ７０  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｆ１（２００μＭ）、２μｌのＨｓｐ７０  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ−Ｒ１（２００μＭ）、０．５μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、１０μｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅで抽出したＤＮＡ、２３μｌのｄｄＨ２Ｏからなる。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で２分間処理を行った後、９４℃で１．０分間、５０℃または５８℃のいずれかで０．５分間、７２℃で１．０分間という反応を１サイクルとして４０サイクル行う。このサイクルの後に最後に７２℃で３．０分間、伸長反応を行い、ＰＣＲを終了する。上記のようにして、ＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、切り出し、精製して配列を調べる。この断片の配列が、最初に行った配列決定で同定された、〜４００ｂｐの配列の３'と重複しておりさらに伸びていることが分かる。
【００７８】
ゲノムウォーキング
ゲノムウォーキング法を用いて、既に同定した配列の５’および３’配列を伸長させる。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒマニュアル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に記載されている配列からプライマーをデザインする。最初に、４種類のゲノムライブラリを作製（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｔｕＩ）し、次にさらに３種類のライブラリを作製する（ＡｌｕＩ、ＳｃａＩ及びＳｎａＦ１）。全てのライブラリ及びそれに続くＰＣＲ反応については、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒマニュアルに記載されている。
【００７９】
５'ゲノムウォーキングにより、前に得た配列と重複する、〜５００ｂｐの断片が得られる。５'の延長部分には、開始コドン及びｈｓｐ７０遺伝子の５'ＵＴＲが含まれている。３'ウォーキングでは、遺伝子が伸長できない。
【００８０】
ＲＡＣＥ
３'ＲＡＣＥを使用して、さらなる３'配列を得る。一晩培養（上記のように培養）したアルスロバクターから、Ｐｕｒｅｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｔｒａ）ＲＮＡ単離キットを用いて、使用説明書に従い、ＲＮＡを単離する。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、５'３'ＲＡＣＥキットを用いて、使用説明書に従い、３'ＲＡＣＥを行う。既知の配列の３'末端からＲＡＣＥ用プライマーをデザインする。１０％  ＤＭＳＯを含有すること及びアニーリング温度が５５℃であること以外は、記述したとおりにＰＣＲ反応を行う。〜１．０ｋｂのバンドが増幅されるので、インビトロｇｅｎのＴＯＰＯ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔを用いて、付属のプロトコールに従い、それをｐＣＲ４ベクターにクローニングする。ベクタープライマーを用いてコロニーをスクリーニングし、選択したクローンを一晩培養して、インビトロｇｅｎのＳＮＡＰ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いてＤＮＡ抽出を行い、上記のようにしてベクタープライマーを用いて配列決定を行う。
【００８１】
ＧｅｎｅｃｏｄｅのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを用いてコンティグをアセンブルする。コンティグ配列を用いてＧｅｎｂａｎｋ検索を行い、それがｈｓｐ７０であることを確認する。
【００８２】
上記のようなゲノムウォーキングにより、ｈｓｐ７０遺伝子の残りの部分及び３'ＵＴＲが得られる。再び、ＧｅｎｅｃｏｄｅのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアを用いてコンティグを同定する。コンティグ配列を用いてＧｅｎｂａｎｋ検索を行い、３'ＵＴＲ及び５'ＵＴＲを含むｈｓｐ７０遺伝子がその配列に入っていることを確認する。
【実施例２】
【００８３】
アルスロバクター細胞壁タンパク質の特性分析
電気泳動およびウェスタンブロッティング
２３℃にて４８時間インキュベーションした後に、ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ａｇａｒ（ＴＳＡ）プレートから直接、サブカルチャーした細菌を回収して、アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１細胞懸濁液を調製する。ｐＨ７．２の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からなる１０ｍｌの「ＴＥＴ」バッファー中に、光学密度がおよそ５０ＯＤ６６０単位（ここで、１  ＯＤ６６０は、１ｘ１０９個の細胞を含むと推定される）になるように細菌を再懸濁し、６５００ｇで遠心する。上清を捨て、細胞をさらに１０ｍｌのＴＥＴで懸濁し、再び遠心を行う。４ｍｌのＴＥＴで細胞ペレットを再懸濁し、１．５ｍｌのマイクロチューブにそれぞれ１ｍｌずつ分注する。そのうち１本を、さらに２００μｌの５ｍｇ／ｍｌ  ニワトリ卵白ライソザイムと混合し、振盪しながら一晩（１８時間）、３７℃にてインキュベーションを行う。卓上微量遠心機にて、最高速度で５分間、細胞懸濁液を遠心する。１５０μｌの無細胞上清を、５０μｌのＮｕＰａｇｅ  ４ｘＬＤＳサンプルバッファー（インビトロｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合し、振盪しながら７０℃で１０分間インキュベーションを行う。得られた上清を１０μｌずつ分注し、８％  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｇｅｌ（ＢｉｏＲａｄ）で電気泳動し、セミドライ転写装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて３０分間、２０Ｖで、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）上にウェスタンブロットする。ブロッティング後すぐに、０．１％  ポンソーＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で、膜を１分間洗浄し、ブロットしたタンパク質が見えるようになるまで、蒸留水で数回洗浄して脱色する。後の染色に備えて蒸留水で繰り返し洗浄を行い、前記膜を風乾させることでピンク色の発色が消える前に、免疫染色した後の基準点となるように、分子量マーカー及び特定のタンパク質に鉛筆で印を付ける。
【００８４】
アミノ酸配列決定を行うタンパク質バンドをクーマシーブルーで染め出すために、５０％  メタノール、７％  酢酸、及び０．１％  Ｒ−２５０を含有する溶液中で、脱色した膜を１０分間インキュベーションした後、クーマシーブルーを含有しない上記溶液を用いてバックグラウンドを脱色する。次に、そのブロットを脱イオン蒸留水で１０分間リンスし、風乾させて、タンパク質自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたエドマン分解法によるＮ−末端アミノ酸配列決定に供する。
【００８５】
１％  カゼインＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水（ｐＨ７．４）（ｃＴＢＳ）（ＢｉｏＲａｄ）で２００分の１に希釈した抗体（ポリクローナルウサギ抗アルスロバクター）とともに６０分間、前記乾燥させたブロットをインキュベーションし、ＴＢＳで１０秒ｘ２回洗浄し、その後１：２０００希釈のヤギ抗ウサギイムノグロブリンアルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）とともにインキュベーションすることにより、免疫反応抗原の検出に必要な反応を行う。１−Ｓｔｅｐ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて約３分間発色反応を行い、蒸留水で洗浄して反応を停止させる。全てのインキュベーションは、ｒｅｄ  ｒｏｃｋｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｈｏｅｆｅｒ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）上で、最終体積１０ｍｌで行う。Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ及び関連ソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて記録を行う。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、抗原の移動度を比較して分子量を推定する。Ｆｉｒｓｔ  Ｏｒｄｅｒ  Ｌａｇｒａｎｇｅ使用して相対的移動度を計算することにより、分子量の概算を行う。
【００８６】
抗血清の産生
滅菌したダルベッコ塩類溶液で前もって洗浄した４ｘ１０８個の細胞を３部とフロイント不完全アジュバントを１部とからなる０．５ｍｌの懸濁液をニュージーランドウサギにｉ．ｍ．注射して、アルスロバクター抗原に対するポリクローナル抗血清を調製する。４週間後に、同量の注射用試料を上記ウサギに注射する。６週間後に耳の末梢静脈から５ｍｌの血液を採取し、血餅を形成させた後に遠心を行って、血清を収集する。
【００８７】
結果
ライソザイム処理したアルスロバクター懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することにより、１５０−１０ｋＤａの範囲にわたりタンパク質バンドが存在することが分かる。これらのバンドのうち、およそ６７、６３及び５９ｋＤａの主要なタンパク質バンドが卓越している。アルスロバクター細胞壁のペプチドグリカンはライソザイム処理を行わないと放出されないので、６７ｋＤａのタンパク質が、アルスロバクター細胞壁のペプチドグリカンと架橋結合していることは明らかである。
【００８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたタンパク質をウェスタンブロットしてアルスロバクターの細胞全体に対する抗血清で染色すると、免疫反応を示す主要なバンドは１２２及び６７ｋＤａと同定される。６７ｋＤａタンパク質のＮ末端の配列決定から、ＳＲＡＶＧ  ＩＤＬＧＴ  ＴＮＳＶＶ  ＳＶＬＥであることが分かる。ＢＬＡＳＴのタンパク質−タンパク質アルゴリズムを用いてホモロジー検索を行うと、その配列がミコバクテリウム・ツバキュロシスのｈｓｐ７０タンパク質 と１００％の相同性を有することが示される。この６７ｋＤａのタンパク質は、ゲノム配列決定によって同定され、本明細書中に開示されているｈｓｐ７０タンパク質と同じであると考えられる。
【実施例３】
【００８９】
ｈｓｐ７０の組み換え発現
アルスロバクターヒートショックタンパク質７０の完全なコード配列を、非融合ペプチド及び融合ペプチドとして、ｐＥＴ３０ＥＫＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。Ｎ融合タグは、その後の標的タンパク質の精製に利用する様々な機能を有する５５個のアミノ酸（Ｈｉｓタグ、Ｓ−タグ、エンテロキナーゼ切断部位を含む）からなる。ドメインＩＩとして知られている、ＨＳＰ７０タンパク質内に存在する２００アミノ酸活性モチーフも、非融合ペプチド及び融合ペプチドとしてクローニングする。
【００９０】
組み換えＨＳＰ７０及び組み換えドメインＩＩの発現をＥ．コリ  ＤＥ３細胞中で行う。適切な細胞密度に達したら、ＤＥ３培養物を２本のフラスコに分ける。そのうち１本に対して、ＩＰＴＧ基質によりタンパク質発現を誘導し、もう１本のフラスコはコントロールとする。ＨＳＰ７０及びドメインＩＩの両方が、融合又は非融合ペプチドとして発現されるが、基本的に、Ｅ．コリの細胞質内における可溶型として、又はペリプラズムに会合して存在する。従って、Ｅ．コリにおいて、アルスロバクターの天然のタンパク質と同じように、組み換えＨＳＰ７０及びそのドメインＩＩは、首尾よく細胞表面に誘導される。上記タンパク質のＮ末端には融合タグが付加されているが、これは蛋白質の転移に影響を与えないと思われる。以上の観察から分かるように、完全長のＨＳＰ７０及びドメインＩＩはともに、他の抗原性配列を細胞表面へと移動させる能力を有する。
【実施例４】
【００９１】
ｈｓｐ７０との遺伝子融合を用いたＩＰＮＶに対する核酸ワクチン
清潔な水槽水で希釈したベンゾカインを用いて、流動する淡水で飼育したｐｒｅ−ｓｍｏｌｔの大西洋サケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）（３５−４０ｇ）を麻酔する。ワクチン接種前に、致死量の麻酔剤で６匹の魚を安楽死させ、免疫前血清として尾静脈から採血する。
【００９２】
５０μｌの核酸ワクチン及びＰＢＳコントロールを、背びれ直下の左背側面に筋肉内注射で接種する。４０匹の魚にワクチン接種し、さらに４０匹の魚に前の４０匹と同じようにワクチン接種する（各群８０匹、２つのタンクに分ける）。ワクチン接種後、魚を淡水で回復させ、それぞれ適切なタンクに移動させる。
【００９３】
試験を行う核酸ワクチンは、ｐＵＫｒｓｘＨＳＰ７０−ｉｐｎＶＰ２及びｐＵＫｒｓｘＨＳＰ７０−ｉｐｎＶＰ３である。これらのプラスミドには、ＣＭＶプロモーター制御下において、アルスロバクターｈｓｐ７０とそれぞれＩＰＮＶ  ＶＰ２又はＩＰＮＶ  ＶＰ３との完全コード配列のイン・フレームの融合物が組み込まれている。ｐＵＫｒｓｘＨＳＰ７０−ｉｐｎＶＰ２単独で、さらに両プラスミドを一緒に試験する。
【００９４】
比較を行うために、先行研究でＶＰ２成分の免疫防御効果をおよそ２０％強化することが知られている配列の３'と融合させたＩＰＮ  ＶＰ２タンパク質を含むプラスミドも調製する（つまり、「ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ」ＶＰ２−ベースのＩＰＮＶ核酸ワクチン）。
【００９５】
ワクチン接種から６週間後、魚を海水に移す。攻撃誘発を行う前日に、各同型群当たり４匹の魚から血清を採取する。注射部位の筋肉試料も採取しホルマリン固定してワクチン反応を観察する。攻撃誘発から２１日後に、各同型群につき最大４匹の生存魚から血清を採取する。攻撃誘発後には、毎日、ざっと観察して死亡した魚を排除し、腎臓試料を採取してＥＬＩＳＡ分析を行うために凍結する。
【００９６】
毒性のあるＩＰＮＶ（１０６ｃｆｕ）を腹腔内注射して攻撃誘発を行い、マークを付した同種の魚と一緒に飼育することによって、海水に移動させてから４−６週間後に攻撃誘発を行う。２０週間後に試験を終了する。
【００９７】
この結果、ｈｓｐ７０−ＶＰ２融合物をはじめ、ＩＰＮＶのＶＰ２配列を利用した核酸ワクチン全てに、ウイルスによる攻撃誘発に対する防御効果があることが示される。
【実施例５】
【００９８】
ＩＳＡＶに対するワクチンにおける組み換えＨｓｐ７０
実験開始１週間前から通気した流水（１０℃）が供給されている０．５ｍの貯蔵タンクに大西洋サケの幼魚を順応させ、実験期間全体を通して、毎日給餌する。各群５５匹の魚を、２５匹ずつ２つのタンクに分け、同型処理群を用意する。大西洋サケ幼魚に対してＩＳＡＶで攻撃誘発を行うと、６０−８０％のへい死率を示す。
【００９９】
魚に麻酔をかけた後、０．２ｍｌの生理食塩水又は、特異的な組み換えタンパク質を含有する０．２ｍｌの生理食塩水を腹腔内に注射してワクチン接種する。ネガティブコントロールはＰＢＳ注射（生理食塩水）である。処理群は、（Ａ）Ｈｉｓタグ付加精製アルスロバクターｈｓｐ７０組み換えタンパク質、１２μｇ（Ｂ）ＩＳＡＶ組み換えＨｉｓタグ付加ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）、１２μｇ（Ｃ）Ｈｉｓタグ付加精製アルスロバクターｈｓｐ７０組み換えタンパク質、１２μｇ、Ｈｉｓタグ付加ＩＳＡＶ  ＮＣ、１２μｇとの混合剤、（Ｄ）Ｈｉｓタグ付加精製アルスロバクターｈｓｐ７０組み換えタンパク質、１２μｇ、Ｈｉｓタグ付加ＩＳＡＶ  ＮＣ、１２μｇと架橋結合、（Ｅ）Ｈｉｓタグ付加精製アルスロバクターｈｓｐ７０ドメイン２組み換えタンパク質、１２μｇ、Ｈｉｓタグ付加ＩＳＡＶ  ＮＣ、１２μｇとの混合剤、（Ｆ）Ｈｉｓタグ付加精製アルスロバクターｈｓｐ７０  ドメインＩＩ組み換えタンパク質、１２μｇ、Ｈｉｓ−タグ付加ＩＳＡＶ  ＮＣ、１２μｇと架橋結合、である。
【０１００】
処理群Ｄ及びＦには、共有結合によって架橋されたタンパク質を与える。架橋剤としてＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳを用い、標準的手法を使用する。
【０１０１】
０．１ｍｌの培養毒性ＩＳＡＶ（〜１０４  ＴＣＩＤ５０／匹（魚））を少数のサケにｉ．ｐ．投与し、処理魚の各タンクに加えて一緒に飼育して攻撃誘発を行う。各タンクのへい死状況を毎日観察する。
【０１０２】
特定の時点における各処理群とコントロール群との間のへい死率を比較して、相対的生存率を調べる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１−１】図1は、配列番号１、つまり、アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１から単離した、５’及び３’ＵＴＲ配列を含むｈｓｐ７０遺伝子のＤＮＡ配列（５’から３’）を表す。
【図１−２】図1は、配列番号１、つまり、アルスロバクターＡＴＣＣ  ５５９２１から単離した、５’及び３’ＵＴＲ配列を含むｈｓｐ７０遺伝子のＤＮＡ配列（５’から３’）を表す。
【図２】図２は、配列番号２、つまり、図１のｈｓｐ７０遺伝子配列によりコードされると予想されるアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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