(57)【要約】                                                                【構成】(1).24週令では明らかな心機能異常はみられない，(2).48週令では収縮期血圧の低下、心重量、心・体重比の増加、左心室収縮末期容積の増大、左心室拡張末期容積の増大、左心室駆出分画の低下、dp/dt の低下がみられ心肥大・心不全を発症するＨＣＶ遺伝子導入による心肥大・心不全マウスである。【効果】ＨＣＶによる心不全・心肥大の発症機序、予防、診断、治療などを究明するためのヒト疾患モデルとしてマウスを円滑に供給することができる。よって、当該マウスをＨＣＶによる心不全、心肥大の実験的研究素材として広く、かつ反復的に利用することができるとともに、また、そのために当該マウスを円滑供給することができる結果、ＨＣＶによる心不全、心肥大の発症機序、予防、診断、治療などの究明に関する研究や細胞レベルでの研究が促進される。【選択図】  図１  
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(1). 24 週令では明らかな心機能異常はみられない。
(2). 48 週令では収縮期血圧の低下、心重量、心・体重比の増加、左心室収縮末期容積の増大、左心室拡張末期容積の増大、左心室駆出分画の低下、dp/dt の低下がみられ心肥大心不全を発症するＣ型肝炎ウイルス遺伝子導入による心肥大心不全マウス
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ) 遺伝子導入による心肥大・心不全マウスに関するもので、心肥大・心不全の実験的研究素材として使用されるものである。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは霊長類以外の動物に感染せず、従ってマウスにも感染せず、心不全などの心異常はきたさないため、マウスは実験には使用できなかった。なお、ＨＣＶ遺伝子導入によるマウスの肝癌のモデルは報告されているが(Nat Med 1998;9:1065-1067), 心肥大・心不全をきたすモデルの報告はない。
【０００３】
【非特許文献１】Nat Med 1998;9:1065-1067
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明の課題はＨＣＶ遺伝子導入による新規な心肥大・心不全マウスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この課題を達成するために、このＨＣＶ遺伝子導入による心肥大・心不全マウスにおいては、
(1).24週令では明らかな心機能異常はみられない。
(2).48週令では収縮期血圧の低下、心重量、心・体重比の増加、左心室収縮末期容積の増大、左心室拡張末期容積の増大、左心室駆出分画の低下、dp/dt の低下がみられ心肥大・心不全を発症するマウスである。
【発明の効果】
【０００６】
ＨＣＶ遺伝子導入による心肥大・心不全マウスは上記のように構成されているため、ＨＣＶによる心肥大・心不全の発症機序、予防、診断、治療などを究明するためのヒト疾患モデルとしてマウスを円滑に供給することができるものである。
【０００７】
よって、この発明に係るＨＣＶ遺伝子導入マウスを使用すれば、当該マウスをＨＣＶによる心不全・心肥大の実験的研究素材として広く、かつ反復的に利用することができるとともに、また、そのために当該マウスを円滑供給することができる結果、ＨＣＶによる心不全・心肥大の発症機序、予防、診断、治療などの究明に関する研究や細胞レベルでの研究が促進されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明者は、ＨＣＶ遺伝子のうち、コア蛋白、E1, E2, P7の構造蛋白をコードする遺伝子(pCMV-980)およびNS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5Bの非構造蛋白をコードする遺伝子(pCMV-NS) を導入したマウスを作製することによって、これらのマウスが、心不全・心肥大を発症することを明らかにした。
【０００９】
以下、発明者は、本マウスをＣ型肝炎ウイルス遺伝子導入心肥大・心不全マウス（以下、ＨＣＶ心肥大・心不全マウス）と名付け説明する。
【００１０】
ＨＣＶ心肥大・心不全マウスは、ＨＣＶによるヒト疾患モデルとして、その発症機序、予防、診断、治療などの究明、さらに、ＨＣＶによる心筋細胞傷害に関する細胞レベルでの究明に極めて有用な研究素材となり得るものであり、ヒトを研究対象とするだけでは到底得られないような基礎的かつ系統的な知見をきたらすであろうことが期待できる。
【００１１】
なお、この発明にあっては「48週令頃から心肥大、心拡大、心機能低下がみられる」ため心肥大・心不全による肺、腎、血管病変の解析にも有用である。
【００１２】
・ＨＣＶ心肥大・心不全マウスの作製  
「宿主」として「マウス受精卵」を使用する。「ベクター」は使用しない。「ＤＮＡ供与体」として「ＨＣＶウイルス」を使用する。また、「遺伝子導入法」として「顕微注入法」を使用する。
【００１３】
具体的には、ＨＣＶウイルスゲノムＤＮＡ由来のｐＣＭＶ／980 遺伝子（あるい  ｐＣＭＶ／ＮＳ遺伝子）を含む組換えＤＮＡ分子をＣ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃマウス受精卵に顕微注入法により導入し、それをマウス仮腹（偽妊娠Ｓｌｃ：ＩＣＲマウス）に移植し、トランスジェニックマウスを作成した。
【００１４】
実際には、清水実験材料（株）に依頼し日本エスエルシー株式会社において作成された。
【００１５】
pCMV-980はＨＣＶ遺伝子のうちコア蛋白、E1, E2, P7のＮ末端側３分の１の構造蛋白であり、pCMV-NS はNS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B蛋白のＣ末端側３分の２の蛋白遺伝子を含む非構造蛋白の遺伝子である。
【実施例１】
【００１６】
次にこの発明に係るＨＣＶ心肥大・心不全マウスの実施例を示すＨＣＶ遺伝子導入マウスは、生まれた仔がトランスジェニックであることを確認するためマウスの尾部から DNAを抽出し、 PCR法によりスクリーニングを行った。スクリーニングに用いた PCRプライマーは次のものである。
pCMV-980
(F)5'-ACG GCG TGA ACT ATG CAA CAG 
(R)5'-GGA TGG TCA AAC AAG ACA GCA A 
pCMV-NS 
(F)5'-GAT TTC CAA GTC TCC ACC CCA 
(R)5'-CGA GCT CTG CTT ATA TAG ACC TCCC
【００１７】
・コンダクタンス・カテーテルによる圧・容積の測定
ミラー1.4 Frカテーテル(SPR-719, ミラーInstruments,ヒューストン、アメリカ）を使用し、これまで報告した方法 (J. Am. Coll. Cardiol. 2002;40:1506-1514)により測定した。コンダクタンスシステムおよび圧力変換器コントローラー[Integral 3(VPR-1002), Unique Medical 社、東京、日本] を周波数20 kHz、フルスケールカレント20 (A,圧力変換器を5 (V/V/100mmHgにセットし、圧−容積ループおよび心内心電図をオンラインでモニターし、コンダクタンス、圧力および心内心電図シグナルを2 kHzでデジタル化したのちディスク上に保存し、Integaral 3 ソフトウェア(Unique Medical 社) で分析した (J. Am. Coll. Cardiol. 2002;40:1506-1514)。
【００１８】
48週令のトランスジェニックマウス(n = 3) および対照群マウス(n = 3) を対象として、ケタミン100 mg/kg およびキシラジン5 mg/kg のミクスチャーを用いて該動物の腹腔内麻酔を行い、仰臥位で解剖顕微鏡（モデルMZ75: ライカ  マイクロシステムズWetzlar GmbH, Wetzlar,ドイツ）下に供し、気管を露出させ気管内挿管の後、げっ歯類用循環人工呼吸装置(Shinano社、東京、日本) にカニューレを接続し、1.4 Fr. SPR-719 ミラーカテーテルを大動脈圧測定用に右頚動脈より上行大動脈内へと進め、次に左心室に挿入した。胸骨横切開を行い下大静脈を露出し、下大静脈を一時的に圧迫することにより左心室の圧容積関係を測定した後、容積管理のため、ポリエチレンチューブ(PE-10; ベクトン・ディキンソン商会、フランクリンレイクス、ニュージャージー、アメリカ) を用いて外部頚静脈にカニューレを挿入した。外部頚静脈へ10μL の高張生理食塩水を注入することにより、各マウスの並列容積(parallel volume: Vp) をキャリブレートした。
【００１９】
24週令ではＨＣＶ心肥大・心不全マウスは明らかな心機能異常はみられなかった。
【００２０】
48週令では表１に示すように収縮期血圧の低下、心重量、心・体重比の増加、左心室収縮末期容積の増大、左心室拡張末期容積の増大、左心室駆出分画の低下、dp/dt の低下がみられ、マウスは心不全および心肥大、心拡大をきたした。
【００２１】
表１
───────────────────────────────────
対照群               HCV心肥大・心不全マウス
(n = 3)                        (n = 3)
───────────────────────────────────
体重 (g)                 29.2 ± 2.7                     30.8 ± 1.2  
心重量 (mg)             116.7 ± 21.9                   160.0 ± 5.8
心重量/体重比             4.0± 0.5                      5.2 ± 0.3
収縮期血圧 (mmHg)       80.1± 4.2                       64.2 ± 6.9
収縮末期容積 ((l)          7.4± 1.8                     14.1 ± 3.3
拡張末期容積 ((l)         20.3± 2.1                     56.6 ± 6.2
dp / dt max (mmHg/s)      7,180 ± 858                  4,541 ± 1,272
dp / dt min (mmHg/s)      -4,710± 530                 -3,158 ± 249
───────────────────────────────────
実際の圧曲線の例を図１に、圧・容積曲線を図２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
ＨＣＶによる心不全・心肥大の実験的研究素材として広くかつ反復的に利用することができる。また、そのために当該マウスを円滑供給することができる結果、ＨＣＶによる心不全・心肥大の発症機序、予防、診断、治療などの究明に関する研究や細胞レベルでの研究が促進される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は表１に示した収縮期血圧の変化の曲線グラフとこの血圧の変化の割合（dP/dt)を示した曲線グラフである。
【図２】図２は表１に示した圧・容積の曲線グラフである。
【図１】
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【図２】
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