(57)【要約】【課題】新規で有用な創傷治癒剤、腱または靭帯の損傷等に対する改善、治癒促進または予防剤、腱または靭帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱または靭帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱または靭帯の改善または強化剤、その創傷治癒剤を含む機能性食品ならびに医薬品を提供する。【解決手段】コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを含むものを有効成分とする。【選択図】図１
2005281186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを含むものを有効成分とすることを特徴とする創傷治癒剤。
【請求項２】
コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを有効成分とすることを特徴とする創傷治癒剤。
【請求項３】
前記分解物はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙで表されるトリペプチドを５質量％以上含むことを特徴とする請求項１または２記載の創傷治癒剤。
【請求項４】
コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す）で表されるトリペプチドを有効成分とすることを特徴とする創傷治癒剤。
【請求項５】
アスコルビン酸またはその誘導体が配合されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の創傷治癒剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする腱の改善または強化剤。
【請求項８】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤。
【請求項９】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする靱帯の改善または強化剤。
【請求項１０】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤。
【請求項１１】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする競走馬の屈腱の改善または強化剤。
【請求項１２】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤。
【請求項１３】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤から成ることを特徴とする競走馬の靱帯の改善または強化剤。
【請求項１４】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする機能性食品。
【請求項１５】
請求項１乃至５のいずれかに記載の創傷治癒剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒剤、腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、腱の改善または強化剤、靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、靱帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱の改善または強化剤、競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の靱帯の改善または強化剤、機能性食品ならびに医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは体を構成するタンパク質の約３０％を占めており、皮膚、血管、内臓および骨組織などいたるところに存在している。皮膚では真皮の７０％がコラーゲンからできており、個々の筋肉を包む筋膜もコラーゲンで構成されている。さらに細胞本体の外側を取り囲み、細胞集団を支える足場となっている細胞マトリックスの主要成分がやはりコラーゲンであることが知られており、旧来から、コラーゲンやコラーゲンを加熱変性させたゼラチン、およびそれらの加水分解物は化粧品及び食品向けの原材料、更に医薬品向けの生体機能性材料として幅広く利用されてきた。
【０００３】
そして、近年、コラーゲンタンパクおよびその分解物の経口摂取の薬理効果について多くの研究がなされるようになった。これまでに、主な効果として、骨粗鬆症の予防・改善に結びつく骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用（例えば、特許文献１，２参照。）、加齢に伴う生体組織の機能の低下を改善させる、生体組織の新陳代謝促進作用（例えば、特許文献３，４参照。）、皮膚代謝促進作用、皮膚賦活作用（例えば、特許文献４，５参照。）など、数多くの効果が明らかとなっている。
【０００４】
さらに、本発明者らの研究により、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られる、アミノ酸配列が Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙのコラーゲントリペプチドが、従来のコラーゲン、ゼラチン、あるいはその加水分解物よりも速やかに効率よく消化吸収され、前記の機能をはじめとした種々の機能を発揮することが明らかとなり（特許文献６参照。）、少量の摂取でも効率よく速やかに消化吸収される、コラーゲン産生促進剤、機能性食品、医薬品、骨芽細胞または線維芽細胞の増殖促進剤、骨の強化または密度向上剤、生体組織の新陳代謝促進剤、皮膚賦活剤、皮膚または骨の加齢による機能低下の予防または改善剤、慢性リウマチ、変形関節症の改善剤および骨折治癒などの創傷治癒促進剤の提供が可能となった。
【０００５】
【特許文献１】特開平9−255588号公報
【特許文献２】特開平11-12192号公報
【特許文献３】特開平7-278012号公報
【特許文献４】特開平9-67262号公報
【特許文献５】特開2000-201649号公報
【特許文献６】特開2002-255847号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
主にスポーツ時に発症するアキレス腱断裂や靭帯損傷などの治癒には長期間要することが多く、復帰の遅れにより結果的に選手生命を絶たれてしまうアスリートも少なくない。また、人間だけでなく競走馬においてもヒトのアキレス腱に相当する屈腱部で発症する屈腱炎の問題が深刻化している。年間1,200頭の競走馬が屈腱炎を発症し、症状の重い馬は引退を余儀なくされ、また、回復の見込みがあっても競走復帰が大幅に遅れる一方、再発率も高く、競走馬にとって屈腱炎は不治の病と考えられている。このような背景から、腱断裂、靭帯損傷、屈腱炎などの治癒を促進する効果を有する創傷治癒剤、機能性食品、医薬品が切望されている。
【０００７】
本発明は、このような課題を解決するためになされたもので、新規で有用な創傷治癒剤、腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、腱の改善または強化剤、靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、靱帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱の改善または強化剤、競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の靱帯の改善または強化剤、その創傷治癒剤を含む機能性食品ならびに医薬品を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られる、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙのコラーゲントリペプチドが、少量の摂取でも効率よく速やかに消化吸収され、コラーゲン産生促進、骨芽細胞または線維芽細胞の増殖促進、骨の強化または密度向上、生体組織の新陳代謝促進、皮膚賦活、皮膚または骨の加齢による機能低下の予防または改善、慢性リウマチ、変形関節症の改善および骨折治癒促進などの機能を有することを明らかにした（特許文献６参照。）。さらに、本発明者らは、そのコラーゲントリペプチドが腱断裂、靭帯損傷、屈腱炎などの治癒促進効果も有することを見出した。
【０００９】
即ち、本発明に係る創傷治癒剤は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを含むものを有効成分とすることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る創傷治癒剤は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを有効成分とすることが好ましい。
本発明に係る創傷治癒剤で、前記分解物はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙで表されるトリペプチドを５質量％以上含むことが好ましい。
【００１１】
さらに、本発明に係る創傷治癒剤は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す）で表されるトリペプチドを有効成分とすることが好ましい。
本発明に係る創傷治癒剤は、創傷の治癒を促進し、早期回復に寄与する。
【００１２】
本発明に係る創傷治癒剤は、アスコルビン酸またはその誘導体が配合されていることが好ましい。この場合、創傷の治癒を促進する効果を高めることができる。
【００１３】
本発明に係る腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、腱の損傷または断裂を改善、治癒促進または予防する効果を有する。
本発明に係る腱の改善または強化剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る腱の改善または強化剤は、腱を改善または強化する効果を有する。
【００１４】
本発明に係る靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、靱帯の損傷または断裂を改善、治癒促進または予防する効果を有する。
本発明に係る靱帯の改善または強化剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る靱帯の改善または強化剤は、靱帯を改善または強化する効果を有する。
【００１５】
本発明に係る競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂を改善、治癒促進または予防する効果を有する。
本発明に係る競走馬の屈腱の改善または強化剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る競走馬の屈腱の改善または強化剤は、競走馬の屈腱を改善または強化する効果を有する。
【００１６】
本発明に係る競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤は、競走馬の靱帯の損傷または断裂を改善、治癒促進または予防する効果を有する。
本発明に係る競走馬の靱帯の改善または強化剤は、前述の創傷治癒剤から成ることを特徴とする。本発明に係る競走馬の靱帯の改善または強化剤は、競走馬の靱帯を改善または強化する効果を有する。
【００１７】
すなわち、本発明に係る腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤・本発明に係る腱の改善または強化剤・本発明に係る靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤・本発明に係る靱帯の改善または強化剤・本発明に係る競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤・本発明に係る競走馬の屈腱の改善または強化剤は、前述の創傷治癒剤・本発明に係る競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤・本発明に係る競走馬の靱帯の改善または強化剤（以下、腱等改善剤という）は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを含むものを有効成分とする。好ましくは、腱等改善剤は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す）で表されるペプチドを有効成分とする。さらに好ましくは、腱等改善剤は、前記分解物はアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙで表されるトリペプチドを５質量％以上含む。また、腱等改善剤は、コラーゲンまたはゼラチンをコラゲナーゼにより分解して得られる分解物であって、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、ＸおよびＹはグリシン以外の任意のアミノ酸残基を表す）で表されるトリペプチドを有効成分とすることが好ましい。また、腱等改善剤は、アスコルビン酸またはその誘導体が配合されていることが好ましい。
【００１８】
腱等改善剤は、ヒト、競走馬のほかの哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類に用いられてもよい。対象となる腱は、アキレス腱のほか、肩、腕その他、部位を問わない。対象となる靱帯もまた、部位を問わない。対象となる競走馬の屈腱、靭帯は、脚の屈腱、靭帯であることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る機能性食品は、前述の創傷治癒剤または腱等改善剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする。
本発明に係る医薬品は、前述の創傷治癒剤または腱等改善剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明において、コラゲナーゼには、Clostridium histolyticum, Bacillusなどの細菌、Streptomyces parvulus などの放線菌、乳酸菌、酵母または真菌など由来で、コラーゲン特有のアミノ酸配列：（Gly-X-Y ）n のグリシンのアミノ基側を特異的に切断する酵素を用いる。また、コラゲナーゼは、これらの酵素遺伝子を遺伝子工学的に特定のベクターに組み込んで、乳酸菌や酵母などの他の菌体または動物に産生させて得られた遺伝子組み替えによる酵素で、類似の基質特異性を有するコラゲナーゼ様酵素であってもよい。
【００２１】
コラゲナーゼは遊離の形で使用しても良いし、コラゲナーゼを物理吸着法または化学結合法によって各種の担体に結合させた固定化酵素として使用しても良い。また、コラゲナーゼによる酵素分解の方法には、(a) バッチ法、(b) カラム法または(c) これらを組み合わせた方法などがある。これら（ａ）〜（ｃ）の方法による製造ラインと、使用するコラゲナーゼの形態との組み合わせは、いろいろな方式を採用することが可能である。
【００２２】
前記トリペプチドは、アミノ酸配列が、（Gly-Ala-Ｘ１）、Ｘ１はAla 、Arg 、Asp 、Hyp 、Lys 、Ser もしくはVal 、（Gly-Asp-Ｘ２）、Ｘ２はAla もしくはThr 、(Gly-Gln- Ｘ３）、Ｘ３は Glu、 HypもしくはSer 、（Gly-Pro-Ｘ４）、Ｘ４はAla 、Arg 、Hyp 、Hyl 、Gln 、Met 、Ile 、Lys 、Pro 、Ser 、Thr もしくはVal 、(Gly-Ser- Ｘ５）、Ｘ５は Ala、Glu もしくはHyp 、（Gly-Lys-Ｘ６）、Ｘ６はAsp 、Pro もしくはSer 、（Gly-Leu-Hyp ）、または(Gly-Val- Ｘ７）、Ｘ７は HypもしくはArg の一般式で示されるトリペプチドの１種または２種以上の混合物から成ることが好ましい。特に、前記トリペプチドは、アミノ酸配列が、（Gly-Ala-Arg ）、（Gly-Ala-Hyp ）、（Gly-Ala-Lys ）、（Gly-Pro-Ala ）、（Gly-Pro-Arg ）、（Gly-Pro-Hyp ）および(Gly-Pro-Ser)の一般式で示されるトリペプチドの混合物であることが好ましい。前記トリペプチドは、アミノ酸を用いた合成技術または発酵技術によって得られたものであってもよい。
【００２３】
本発明に係る創傷治癒剤、腱等改善剤、機能性食品および医薬品は、カルシウムおよびビタミンＤのいずれか一方または両方を含んでいてもよい。また、グリチルリチン酸エステルまたはその誘導体を含んでいてもよい。また、ヒアルロン酸を含んでいてもよい。本発明に係る創傷治癒剤、腱等改善剤、機能性食品および医薬品は、液剤、固形剤、カプセル剤、その他、形態を問わない。また、甘味剤、賦形剤、充填剤、増量剤、表面活性剤、着色剤、香料、防腐剤などその他の添加物を添加してあってもよい。本発明に係る創傷治癒剤、腱等改善剤および医薬品は、経口投与のほか、肛門投与、静脈投与、皮下投与、筋肉内投与などの方法で投与されてもよい。投与量は、投与対象の年齢、体重、症状などに応じて、適宜、変更することが好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、新規で有用な創傷治癒剤、腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、腱の改善または強化剤、靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、靱帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱の改善または強化剤、競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の靱帯の改善または強化剤、その創傷治癒剤を含む機能性食品ならびに医薬品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤は、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られるペプチド組成物であって、アミノ酸配列が Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ のトリペプチド（以下コラーゲントリペプチド）を５％以上含有するものから成る。アミノ酸配列の Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ の式で、ＸおよびＹはグリシン（Ｇｌｙ）以外の任意のアミノ酸残基、例えば、プロリン、アラニン、あるいはヒドロキシプロリンなどである。
【００２６】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤は、特開平7-82299号公報に記載のペプチド組成物の調整法、特開平9-176196号公報に記載の非抗原性安定化剤の調整法、または特開平11-12196号公報に記載の低抗原性安定化剤の調整法と同一の方法で調整することができ、概略的には、コラーゲン成分あるいはゼラチン成分をコラゲナーゼ酵素を用いて特異的に分解して得られる。
【００２７】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤は、ゼラチン成分またはコラーゲン成分を出発原料とし、酵素の回収率を良くするために固定化コラゲナーゼ酵素を用いたバッチ法やカラム法によるバイオリアクター方式で製造することができる。すなわち、コラゲナーゼ酵素を物理的吸着法あるいは化学結合法によって各種の担体、例えば、キトパールなどに結合させ、クロマトグラフィー用のカラムに充填し、一定温度下、可溶化させたゼラチン溶液あるいは分解が生じない程度の温度、望ましくは４０〜４５℃で変性させたコラーゲンをカラムに通して酵素分解をさせる。この際のコラーゲン原料の送液速度は、固定化酵素の活性および必要とされる分解度合いに応じて適宜選択される。
【００２８】
この調整法により得られた、アミノ酸配列が（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）nで表されるペプチドを含む分解物、好ましくはコラーゲントリペプチドを５％以上含有するもの、さらに好ましくはコラーゲントリペプチドは、創傷治癒剤、腱の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、腱の改善または強化剤、靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、靱帯の改善または強化剤、競走馬の屈腱の炎症、損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の屈腱の改善または強化剤、競走馬の靱帯の損傷または断裂に対する改善、治癒促進または予防剤、競走馬の靱帯の改善または強化剤として用いることができる。
【００２９】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤は、コラーゲントリペプチドを５％以上含有する前記ペプチド組成物にアスコルビン酸もしくはその誘導体を配合することにより、さらに効果を増す。
【００３０】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤は、もともと消化吸収されやすいタンパク質であることが知られているコラーゲンやゼラチン、およびその加水分解物と同等ないしはそれ以上に速やかに、且つ効率よく消化吸収される。
【００３１】
本発明の実施の形態の機能性食品は、前記創傷治癒剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする。その機能性食品は、健康食品であっても、栄養機能食品や特定保健用食品などの保健機能食品であっても良く、コラーゲン産生促進、骨芽細胞または線維芽細胞の増殖促進、骨の強化または密度向上、生体組織の新陳代謝促進、皮膚賦活、皮膚または骨の加齢による機能低下の予防または改善、慢性リウマチ、変形関節症の改善および骨折治癒促進などの機能性に加え、腱断裂、靭帯損傷、屈腱炎などの治癒を促進する。
【００３２】
本発明の実施の形態の医薬品は、前記創傷治癒剤を０．００５質量％以上含むことを特徴とする。その医薬品の範疇には、医薬部外品、化粧品も含み、コラーゲン産生促進、骨芽細胞または線維芽細胞の増殖促進、骨の強化または密度向上、生体組織の新陳代謝促進、皮膚賦活、皮膚または骨の加齢による機能低下の予防または改善、慢性リウマチ、変形関節症の改善および骨折治癒促進などの機能性に加え、腱断裂、靭帯損傷、屈腱炎などの治癒を促進する機能性を有する。
【００３３】
本発明の実施の形態の創傷治癒剤の出発原料であるコラーゲンまたはゼラチンには、牛、豚、鳥、鯨その他の鳥獣類などの骨、軟骨、皮、腱、または鮭、鮫その他の魚類などの魚皮、ウロコなどを原料として調製されたものを用いることができ、そのタイプは問わない。コラゲナーゼには、コラーゲン特有のアミノ酸配列：（Gly-X-Y）n のグリシンのアミノ基側を特異的に切断する酵素を用いる。
【００３４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、この実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものではない。また、本発明に係る創傷治癒剤において、コラーゲントリペプチドまたはコラーゲントリペプチドを５質量％以上含むコラーゲンペプチドを機能性食品、医薬品に配合する方法は、既に公知となっている方法に準じて実施することができる。
【実施例１】
【００３５】
以下の方法により、創傷治癒剤を製造した。
高純度ゼラチン（ゼライス社製） 50 gを 1,000 mlの 20 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4）／0.1M NaCl に加温しながら溶解後、50℃に冷却した。 酵素分解用の固定化酵素は、100 mg のコラゲナーゼ酵素（ワシントン社製、type IVから精製した）を 50 g の粒子担体に結合させて調製した。担体への結合量は結合前後の 280 nm における吸光度の変化を計測して算出したが、９９％以上の結合率であった。使用時、本固定化酵素をカラム式バイオリアクターに充填し、20 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4）／0.1M NaCl 緩衝液で良く洗浄・平衡化を行った。
【００３６】
原料であるコラーゲンあるいはゼラチンを、上記工程で調製されたコラゲナーゼ酵素固定化カラムにアプライし、カラム法による酵素分解を行った。この間、流速は毎分 20 〜 60 ml に、また、カラムの温度は 39 ± 1 ℃にコントロールした。カラムから出てきた酵素反応終了液を分取し、0.45 μm のフィルターで濾過を行った。この濾液をスプレードライ（噴霧乾燥器）で粉末化した。
【００３７】
得られたコラーゲントリペプチド含量が５質量％以上（本実施例では約１５質量％）のコラーゲンペプチドを凍結乾燥した後、Ｎ末端アミノ酸についてエドマン分解法によって検定した。その結果、Ｎ末端側のアミノ酸は   97.5％がグリシンであることが判明し、本発明によるところのコラーゲンに特徴的なアミノ酸配列である (Gly-X-Y)n 構造を保持していることが証明された。本実施例の創傷治癒剤は、こうして製造されたコラーゲンペプチドから成る。
【実施例２】
【００３８】
＜体内動態試験＞
実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを放射性同位元素：トリチウム（３Ｈ）で標識したもの（以下、３Ｈ-コラーゲントリペプチド）、あるいは比較対照として３Ｈ-プロリンを、ラットに経口投与し、（１）血漿中放射能濃度の測定、（２）全身オートラジオグラフィーにより、被験物質のラット体内における吸収及び分布について検討した。
【００３９】
（１）血漿中放射能濃度の測定
血漿中放射能濃度の測定の結果、３Ｈ-コラーゲントリペプチドを経口投与から 5分後において、既に血漿中放射能濃度は 1.4μg eq./mL を示し、その後、経時的に上昇し、最大濃度：42.7μg eq./mL に達した。次いで、徐々に低下する様子が観察され、対照として用いたアミノ酸：３Ｈ-プロリンよりも、吸収速度が速いことが確認された。
【００４０】
（２）全身オートラジオグラフィー
３Ｈ-コラーゲントリペプチドを投与したラットをエーテル麻酔死させた後、全身オートラジオグラムを作成し、各種組織への放射能分布および経時変化について検討した結果、１回投与２４時間後の全身オートラジオグラムにより、腱、靭帯、骨髄、骨膜、胸腺、消化管、粘膜、皮膚などへの分布が確認された。投与回数５回、１２回の全身オートラジオグラムでは、さらに、分布密度が濃く観察され、各組織への分布が明らかとなった。その全身オートラジオグラフィーを図１に示す。
【実施例３】
【００４１】
＜コラーゲン産生促進作用＞
５％  ＦＢＳ−Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地に、０μＭ  あるいは  １μＭ  のアスコルビン酸（ＡＳＡ）、および  ０μｇ／ｍＬ  あるいは  ３．０μｇ／ｍＬ  濃度の実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを培養液に添加し、その培養液でヒト正常線維芽細胞を３日間培養した。培養終了後それぞれの培養上清を採取し、各培養上清中に分泌された typeＩ コラーゲンをウサギ抗ヒト typeＩ コラーゲン抗血清を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果、図２に示すように、a.実施例１により得られた創傷治癒剤の単独添加により、コラーゲン産生能が上昇する、b.１μＭ  ＡＳＡ単独添加によりコラーゲン産生が誘導される、c.実施例１により得られた創傷治癒剤は、ＡＳＡ添加によって誘導されるコラーゲン産生をさらに増強する、ことが明らかとなった。
【実施例４】
【００４２】
＜骨折治癒促進作用＞
７週齢のＳＤ系雄ラットの左大腿骨に人為的に骨折を施して骨折モデルラットを作製し、モデル作製翌日から１２週間、１日１回、実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドをゾンデで、０，８０，５００ｍｇ/ｋｇ経口投与した。投与終了翌日、大腿骨（左右）を摘出し、軟Ｘ線写真撮影（ソフテックス株式会社製ＳＯＦＴＥＸ-Ｍ-６０使用）及び骨強度測定（マルト−株式会社製ＭＺ５００Ｄ使用）を実施し、骨折の治癒状態を判定した。
【００４３】
（１）軟Ｘ線写真
軟Ｘ線写真（図３）から、実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを投与した群（８０,５００ｍｇ/ｋｇ）では、対照群（０ｍｇ/ｋｇ）よりも皮質骨の連続性が増し、骨折線が薄くなる傾向が認められ、骨折治癒の亢進傾向が確認された。
【００４４】
（２）骨強度測定
左右大腿骨の骨幹部で三点曲げ試験（支点間距離：１８ｍｍ、前面を上方、近位側を右側とし２０ｍｍ/６０ｓで破断）を行ったところ、ａ．破断時間、ｂ．破断変位、ｃ．破断荷重、ｄ．最大荷重、e．堅さ、のいずれのパラメータについても、対照群（０ｍｇ/ｋｇ）では、骨折処置を施した左大腿骨と骨折処置を施していない右大腿骨の測定値間で大きな差が認められたのに対し、実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを投与した群（８０,５００ｍｇ/ｋｇ）では、差が小さく、健常な骨（右大腿骨）と同程度まで回復していることが確認された（図４乃至図８参照）。
【実施例５】
【００４５】
＜アキレス腱断裂時における治癒促進作用＞
７週齢のＳＤ系雄ラットの左アキレス腱を人為的に切断してアキレス腱切断モデルラットを作製し、モデル作製直後から、１日１回２、３週間および４週間、実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドをゾンデで、０，８０ｍｇ/ｋｇ経口投与した。投与終了日の翌日、アキレス腱周囲の腱を取り出し、組織観察および引っ張り試験を実施してアキレス腱の修復程度を判定した。 
【００４６】
（１）組織観察
２週間目において、実施例１により得られた創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを投与した群（８０ｍｇ/ｋｇ）では、対照群（０ｍｇ/ｋｇ）よりも切断部位付近の炎症が抑制されており、血管の増生、弾性線維量の増加傾向が認められた。さらに、腫骨の破骨細胞数も少なく、骨の形状および腱と骨との結合部位の状態も正常側（右）に近づいており、修復の亢進傾向が認められた。４週目では、対照群においても大部分が修復している様子ではあったが、コラーゲントリペプチド投与群の方が、より正常状態に近かった。
【００４７】
（２）引っ張り試験
腱の部分と筋肉部分に縫合糸を巻き、巻いた糸の部分を圧縮し保定し、さらに腫骨の部分を押さえて引っ張り試験（５０ｍｍ/ｍｉｎ）を行ったところ、２週目において、破断荷重、最大荷重ともコラーゲントリペプチド投与群（８０ｍｇ/ｋｇ）の値が高く、より正常側（右）に近い値を示し、修復の亢進傾向が認められた（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の実施例２の、創傷治癒剤：コラーゲンペプチドの（Ａ）１回投与、（Ｂ）５回投与、（Ｃ）１２回投与による２４時間後のラット体内における吸収および分布を示す全身オートラジオグラフィーの図である。
【図２】本発明の実施例３の、（Ａ）創傷治癒剤：コラーゲンペプチドを添加した培養液、（Ｂ）創傷治癒剤：コラーゲンペプチドおよびアスコルビン酸を添加した培養液で、それぞれヒト正常線維芽細胞を培養したとき、培養上清中に分泌されたコラーゲンの濃度を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）の軟Ｘ線写真である。
【図４】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）について、骨幹部で三点曲げ試験を行ったときの破断時間を左右大腿骨の比で示すグラフである。
【図５】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）について、骨幹部で三点曲げ試験を行ったときの破断変位を左右大腿骨の比で示すグラフである。
【図６】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）について、骨幹部で三点曲げ試験を行ったときの破断荷重を左右大腿骨の比で示すグラフである。
【図７】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）について、骨幹部で三点曲げ試験を行ったときの最大荷重を左右大腿骨の比で示すグラフである。
【図８】本発明の実施例４の、人為的に骨折を施した骨折モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを（１群）０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、（２群）８０ｍｇ／ｋｇ、（３群）５００ｍｇ／ｋｇ、それぞれ経口投与した後に摘出した大腿骨（左右）について、骨幹部で三点曲げ試験を行ったときの堅さを左右大腿骨の比で示すグラフである。
【図９】本発明の実施例５の、人為的にアキレス腱を切断したアキレス腱切断モデルラットに対し、創傷治癒剤：コラーゲントリペプチドを０ｍｇ/ｋｇ（対照群）または８０ｍｇ/ｋｇ経口投与した後に取り出したアキレス腱周囲の腱について引っ張り試験を実施したときの破断荷重を示すグラフおよび最大荷重を示すグラフである。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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