(57)【要約】【課題】  種々の試料に対して焦点移動を行っても精度の高い画像を獲得することができる走査型光学顕微鏡装置と走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。【解決手段】  光源と、その光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、その波面変換素子を制御する制御装置と、その波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、その光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、物体での集光光束を走査させた場合に検出器で検出された信号を元に画像を復元する走査型光学顕微鏡装置において、制御装置によって集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、物体の三次元ボリュームデータを生成する。【選択図】        図２
2005345761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に画像を復元する走査型光学顕微鏡装置において、
前記制御装置によって前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、物体の三次元ボリュームデータを生成することを特徴とする走査型光学顕微鏡装置。
【請求項２】
生成された物体の前記三次元ボリュームデータを観察対象となるサンプルの三次元ボリュームデータとの相関値に基づいて修正することを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項３】
光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に画像を復元する走査型光学顕微鏡装置において、
前記制御装置によって前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする走査型光学顕微鏡装置。
【請求項４】
同一焦点面に対して前記波面変換素子から発する波面が異なる形状になるように、前記制御装置によって前記波面変換素子を複数回変調することで、同一焦点面に対して複数の画像を生成し、各焦点面に対して生成された複数の画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする請求項３記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項５】
前記制御装置によって前記波面変換素子を変調することにより前記集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得し、かつ、前記制御装置によって前記対物レンズ又は光源から発する照明光を前記対物レンズへ導くレンズを光軸方向に移動することにより前記集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得することで、同一焦点面に対して少なくとも２つの画像を生成し、各焦点面に対して生成された少なくとも２つの画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする請求項３記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項６】
光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備えた走査型光学顕微鏡装置を用いて、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に得られる走査型光学顕微鏡像から物体像を復元する方法において、
前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、物体の三次元ボリュームデータを生成することを特徴とする走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。
【請求項７】
生成された物体の前記三次元ボリュームデータを観察対象となるサンプルの三次元ボリュームデータとの相関値に基づいて修正することを特徴とする請求項６記載の走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。
【請求項８】
光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備えた走査型光学顕微鏡装置を用いて、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に得られる走査型光学顕微鏡像から物体像を復元する方法において、
前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。
【請求項９】
同一焦点面に対して前記波面変換素子から発する波面が異なる形状になるように、前記波面変換素子を複数回変調することで、同一焦点面に対して複数の画像を生成し、各焦点面に対して生成された複数の画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする請求項８記載の走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。
【請求項１０】
前記波面変換素子を変調することにより前記集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得し、かつ、前記対物レンズ又は光源から発する照明光を前記対物レンズへ導くレンズを光軸方向に移動することにより前記集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得することで、同一焦点面に対して少なくとも２つの画像を生成し、各焦点面に対して生成された少なくとも２つの画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする請求項８記載の走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型光学顕微鏡装置及び走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法に関し、特に、走査型光学顕微鏡で得られた三次元物体の走査型光学顕微鏡像から物体像を復元する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えばＬＳＭ（レーザー走査型顕微鏡）において、観測する物体の三次元像を得るためには、その物体又は対物レンズを機械的に光軸方向に移動させて、物体内部の各面における光学像を順次取り込んでいく必要があった。しかし、この方法は機械的駆動を必要とするために、位置制御を高い精度と再現性で実現することは困難である。また、物体を移動させる方法においては、物体が大きい場合には高速走査ができない等の問題があった。
【０００３】
さらに、生体物体を観察する際に、対物レンズを物体に直接接触させるか、あるいは、物体を培養液に浸した状態で対物レンズを走査すると、その振動による悪影響を観察する物体に与えることになり、好ましくない。
【０００４】
これらの問題点を解決する方法として、特許文献１記載のアダプティブ光学装置がある。特許文献１のアダプティブ光学装置は、パワーを変化させることのできる光学素子（波面変換素子）を備えた顕微鏡であって、図９、図１０にその構成図を示す。この構成において、短パルス・レーザーＫＰＬのビームは、プリチャープ・ユニットＰＣＵに到達し、これからビーム・スプリッターＳＴ１及びビーム・スプリッターＳＴ２、ＳＴ３を経て２つのアダプティブミラーＡＤ１、ＡＤ２へ到来し、ここで作動する。第１のアダプティブミラーＡＤ１（粗）は、波面の粗調整用に挿入されており、これによって焦点をＺ方向へスライドさせる。第２のアダプティブミラーＡＤ２（精）では、波面歪みと伝搬時間差（ＰＴＤ）の影響が補正される。レーザー光は、ビーム・スプリッターＤＢＳ、ｘ／ｙ走査ユニット、光学部品ＳＬ、ＴＬ、ミラーＳＰ、さらに対物レンズＯＬを経由して対象物（物体）Ｏへ到達する。その対象物Ｏから到来する光は、ビーム・スプリッターＤＢＳ、レンズＬ、ピンホールＰＨ、及びフィルターＥＦを経由して検出器ＰＭＴへ戻り、この検出器ＰＭＴはこれ自体としてＰＣＵ、ＡＤ１、ＡＤ２と同様に制御ユニットに接続されている。これにより、例えばアダプティブミラーＡＤ１、ＡＤ２と同様プリチャープ・ユニットも調整して、検出器ＰＭＴに最大信号が加わるようにする。
【０００５】
この先行例では、観察光路及び／又は照明光路内に波面変換素子を有し、その波面変換素子を用いて光学系の焦点距離を変化させると共に、この焦点距離変化に伴って生じる収差も補正するものである。こうすることによって、対物レンズと物体との距離を変えることなく、物体空間での焦点の形成と移動、さらに収差補正を行うことができる。
【０００６】
なお、このようなアダプティブ光学装置に用いる波面変換素子として、液晶レンズ、液体レンズ、マイクロミラーデバイス、多数の微小領域からなり各領域の位相が独立して制御できる液晶素子や回折レンズ等を用いることが特許文献２に示されている。
【特許文献１】特開平１１−１０１９４２号公報
【特許文献２】特開２０００−１２１９４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、試料内部での集光位置の移動を行う場合には、試料の屈折率の影響等によって収差が生じてしまうので、種々の試料に対して各試料に応じた波面変換素子の正確な制御が必要となるが、特許文献１等で提案されている従来のＬＳＭ等の走査型光学顕微鏡においては、このような制御は十分にできないので、種々の試料に対して焦点を移動した場合に良好な画像を獲得することは困難であった。
【０００８】
本発明は従来技術のこのような問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ）等の走査型光学顕微鏡において、種々の試料に対して焦点移動を行っても精度の高い画像を獲得することができる走査型光学顕微鏡装置と走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成する本発明の走査型光学顕微鏡装置は、光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に画像を復元する走査型光学顕微鏡装置において、
前記制御装置によって前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、物体の三次元ボリュームデータを生成することを特徴とするものである。
【００１０】
この場合に、生成された物体の三次元ボリュームデータを観察対象となるサンプルの三次元ボリュームデータとの相関値に基づいて修正するようにすることができる。
【００１１】
本発明のもう１つの走査型光学顕微鏡装置は、光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備え、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に画像を復元する走査型光学顕微鏡装置において、
前記制御装置によって前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とするするものである。
【００１２】
この場合に、同一焦点面に対して波面変換素子から発する波面が異なる形状になるように、制御装置によって波面変換素子を複数回変調することで、同一焦点面に対して複数の画像を生成し、各焦点面に対して生成された複数の画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うようにすることができる。
【００１３】
また、制御装置によって波面変換素子を変調することにより集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得し、かつ、制御装置によって対物レンズ又は光源から発する照明光を対物レンズへ導くレンズを光軸方向に移動することにより集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得することで、同一焦点面に対して少なくとも２つの画像を生成し、各焦点面に対して生成された少なくとも２つの画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うようにすることもできる。
【００１４】
本発明の走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法は、光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備えた走査型光学顕微鏡装置を用いて、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に得られる走査型光学顕微鏡像から物体像を復元する方法において、
前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、物体の三次元ボリュームデータを生成することを特徴とする方法である。
【００１５】
この場合に、生成された物体の三次元ボリュームデータを観察対象となるサンプルの三次元ボリュームデータとの相関値に基づいて修正することができる。
【００１６】
本発明のもう１つの走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法は、光源と、前記光源から発する照明光に任意の波面変換を与える波面変換素子と、前記波面変換素子を制御する制御装置と、前記波面変換素子から発する波面変換後の照明光を互いに直交する方向に走査する光束走査手段と、前記光束走査手段によって進行方向を変えた照明光を物体に集光する対物レンズと、前記物体から発する信号光を検出する検出器とを備えた走査型光学顕微鏡装置を用いて、物体での集光光束を走査させた場合に前記検出器で検出された信号を元に得られる走査型光学顕微鏡像から物体像を復元する方法において、
前記集光光束の焦点面を移動させた場合に獲得される複数の画像を用いて、各焦点面での画像の修正を行うことを特徴とする方法である。
【００１７】
この場合に、同一焦点面に対して波面変換素子から発する波面が異なる形状になるように、波面変換素子を複数回変調することで、同一焦点面に対して複数の画像を生成し、各焦点面に対して生成された複数の画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うようにすることができる。
【００１８】
また、波面変換素子を変調することにより集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得し、かつ、対物レンズ又は光源から発する照明光を対物レンズへ導くレンズを光軸方向に移動することにより集光光束の焦点面を移動させた場合に複数の画像を獲得することで、同一焦点面に対して少なくとも２つの画像を生成し、各焦点面に対して生成された少なくとも２つの画像に基づいて各焦点面での画像の修正を行うようにすることもできる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の走査型光学顕微鏡装置と走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法によると、種々の試料に対して焦点移動を行っても精度の高い画像を獲得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１は、本発明の第１の実施例のＬＳＭ（レーザー走査型顕微鏡）の全体の構成を示す図であり、この図において、光源としてのレーザー光源１１は照明光を発し、その照明光はコリメータレンズ１２によって平面波に変換される。次に、この照明光はダイクロイックミラー５１で反射した後に、波面変換素子２に入射する。この波面変換素子２は、ミラーの反射面が電気的制御によって制御可能な形状可変ミラー２２で構成され、この形状可変ミラー２２では、後述する所定の波面変換が行われる。波面変換素子２によって波面変換が施された照明光は、その前側焦平面が波面変換素子２と略一致するように配置されている第三のリレー光学系７１に入射する。第三のリレー光学系７１を透過した照明光は、次に第二のリレー光学系７２を透過し、その後側焦平面に配置してある光束走査手段３に入射する。ここで、第三のリレー光学系７１の後側焦平面と第二のリレー光学径７２の前側焦平面が略一致するように配置されているので、光束走査手段３と波面変換素子２とは共役な面となる。
【００２１】
光束走査手段３は互いに直交する２つの軸で回転が可能なジンバルミラーからなり、ジンバルミラーで適切に照明光の向きを変えることで、物体面で互いに直行するＸ方向及びＹ方向に入射する照明光を走査できるようにする。
【００２２】
光束走査手段３で特定の角度に反射された照明光は、第一のリレーレンズ７３に入射し、次に結像レンズ７４に入射し、最後に対物レンズ４を透過することで、物体Ｏに集光する。ここで、第一のリレーレンズ７３、結像レンズ７４、対物レンズ４はテレセントリックな光学系で形成され、それぞれの前側焦平面と後側焦平面が略同一となるようになっている。
【００２３】
照明光が集光した物体Ｏからは測定すべき反射光束が発生し、その光束は照明光が通ってきたのと逆向きの光路を進み、対物レンズ４、結像レンズ７４、第一のリレーレンズ７３、光束走査手段３、第二のリレーレンズ７２、第三のリレーレンズ７１と通過し、波面変換素子２で反射される。波面変換素子２で反射された光束は、次にダイクロイックミラー５１で検出すべき特定の波長のみが透過し、集光レンズ５２に入射する。集光レンズ５２の後側焦平面には、ピンホール付きの検出器５３がそのピンホールの位置が集光位置と一致するように配置され、ピンホールを通過した光量が検出される。
【００２４】
ここで、波面変換素子２は、パソコン６１を介してメモリ６２に記憶されているテーブルに従って波面変換素子２を構成する形状可変ミラー２２の分割電極各々に印加する電圧を制御することにより、物体Ｏ位置で光軸方向（Ｚ方向）に集光する位置を変化させる（Ｚスキャン）と共に、このＺ方向集光位置変化に伴って生じる収差を補正するためのものである。
【００２５】
図２に、図１のような第１の実施例のＬＳＭで得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する方法の概念図を示す。メモリ６２に記憶されているテーブルに従って波面変換素子２を構成する形状可変ミラー２２の分割電極各々に印加する電圧をパソコン６１を介して制御すると共に、光束走査手段３を動作させることにより、物体ＯのＺスキャンを行い、特定のＺ位置でのＺスキャン画像Ｚi を獲得する（図２の最も左に示され、ΔＺ＝−２５μｍ〜２５μｍまで５μｍ間隔だと、１１枚ｉ＝１〜１１）。
【００２６】
パソコン６１でのデータ処理により、これらのＺスキャン画像Ｚi をつなぎ合わせて三次元（３Ｄ）のボリュームデータを生成することにより、３Ｄ物体像の再構成を行う。この際に、物体Ｏ中に観察対象として既知のサンプル（例えば、神経細胞）が存在することが分かっているので、そのサンプルの３Ｄボリュームデータを予め種々用意しておいて、生成された３Ｄのボリュームデータとサンプルの３Ｄボリュームデータとのマッチングを行い、そのサンプルの位置を特定し、その既知のサンプデータを当てはめて、３Ｄ物体像の再構成を行うようにする。
【００２７】
より具体的には、例えば図３にその処理手順の１例を示すようにする。まず、ステップＳＴ１で、図１の光学系及び試料の屈折率分布に基づいた収差による影響を受けている隣接する上下のＺスキャン画像Ｚi のＸＹ位置の対応付けを行う。具体的には、画像Ｚi の対応する点（ｘi ，ｙi ）を中心とするｎ×ｎの画素領域を用いて、その周辺のＭ×Ｍの領域にわたって上下の画像の相関演算を行い、最も相関値の高い位置を対応点とする。全ての上下の画像について同様の相関演算を行い、上下の画像のＸＹ位置の対応付けを行う。
【００２８】
次いで、ステップＳＴ２で、得られた上下の対応点を結び付けて物体Ｏの三次元（３Ｄ）のボリュームデータを生成する。
【００２９】
一方、ステップＳＴ３で、観察対象となるサンプル（例えば、神経細胞）の３Ｄボリュームデータを構築しておく。この際、サンプルの可能な形態の３Ｄボリュームデータを多数構築しておく。
【００３０】
次いで、ステップＳＴ４で、ステップＳＴ２で生成された物体Ｏの３ＤボリュームデータとステップＳＴ３で構築されたサンプルの３Ｄボリュームデータとの相関演算を行う。その結果が予め設定された閾値以上の場合（ステップＳＴ５）は、ステップＳＴ６で、その相関値が閾値以上のサンプルの３Ｄボリュームデータに近づくように、そのサンプルの３Ｄボリュームデータとの差分に基づいて、ステップＳＴ２で生成された物体Ｏの３Ｄボリュームデータを修正して物体Ｏの３Ｄボリュームデータとする。
【００３１】
ステップＳＴ４での相関演算結果が予め設定された閾値未満の場合（ステップＳＴ７）は、ステップＳＴ８で、ステップＳＴ２で生成された物体Ｏの３Ｄボリュームデータの画素値が小さくなるように修正して物体Ｏの３Ｄボリュームデータとする。
【００３２】
このようにパソコン６１でデータ処理することにより、Ｚスキャン画像Ｚi をつなぎ合わせ、かつ、上記のような修正を施して３Ｄ物体像を再構成することにより、種々の試料に対して精度の高い画像を獲得することができる。
【００３３】
次に、図１のようＬＳＭで得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する第２の実施例の概念図を図４に示す。メモリ６２には、図５（ｂ）に例示するようなテーブルが記憶されている。波面変換素子２の形状可変ミラー（ＤＦＭ）２２の分割電極配置が例えば図５（ａ）に示すように９個の電極１〜９からなるとき、照明光を集光するＺ方向の位置をサンプル（物体Ｏ）の深さΔＺ（μｍ）とするとき、ＤＦＭ２２の電極１〜９各々に印加すべき電圧値（Ｖ）は、図５（ｂ）の表に示すようになっており、この図５（ｂ）のテーブルがメモリ６２に記憶されている。各サンプルの深さΔＺ（μｍ）に対して、電極１〜９各々に印加すべき３組の電圧値が記憶されているが、それぞれ、例えば異なる３つの試料の深さΔＺ（μｍ）に対して最適化された電圧値であったり、あるいは、特定の試料に対して最適化された電圧値とその前後に対応する電圧値である。
【００３４】
このように、メモリ６２に予め記憶されているテーブルに基づいて、特定のＺ位置に対して波面変換素子２の形状を複数回（図では３回）変調して、複数枚（３枚）のＺスキャン画像を獲得する（図４の中央に示され、ΔＺ＝−１５μｍ〜０μｍまで５μｍ間隔だと、３枚×４＝１２枚）。
【００３５】
パソコン６１でのデータ処理により、各Ｚ位置に対して、対応する複数枚（３枚）のＺスキャン画像から修正した１枚のＺスキャン画像を再構成し、その各Ｚ位置に対して修正した各々１枚のＺスキャン画像から３Ｄ物体像を得る。
【００３６】
各Ｚ位置の複数枚（３枚）のＺスキャン画像から修正した１枚のＺスキャン画像を再構成するには、例えば図６に示すような順でデータ処理を行えばよい。すなわち、ステップＳＴ１１で、各Ｚ位置の複数枚（３枚）の画像の同一位置（ｉ，ｊ）の画素値ｘkij （ｋ：画素番号）の比較を行い、ステップＳＴ１２のように、その中に予め設定した閾値（例えば１２８）以上の画素値の画素がある場合には、複数枚（３枚）の画像の同一位置（ｉ，ｊ）の画素値の中の最も値の高い画素値をその位置（ｉ，ｊ）の画素値とする。ステップＳＴ１３のように、その中に予め設定した閾値（例えば１２８）以上の画素値の画素がない場合には、複数枚（３枚）の画像の同一位置（ｉ，ｊ）の画素値の中の最も値の小さい画素値をその位置（ｉ，ｊ）の画素値とする。
【００３７】
このように、各Ｚ位置に対して、対応する複数枚（３枚）のＺスキャン画像から修正した１枚のＺスキャン画像を再構成し、その各Ｚ位置に対して修正した各々１枚のＺスキャン画像から３Ｄ物体像を得ることができる。このようにすると、種々の試料に対して、光学系及び試料の屈折率分布に基づいた収差を最も良好に補正した精度の高い物体像を獲得することができる。
【００３８】
次に、図１のようＬＳＭで得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する第３の実施例の概念図を図７に示す。ただし、この実施例のＬＳＭにおいては、Ｚスキャンは、パソコン６１を介してメモリ６２に記憶されているテーブルに従って波面変換素子２を構成する形状可変ミラー（ＤＦＭ）２２の分割電極各々に印加する電圧を制御することによっても可能であるが、他の方法として選択的に、図１に破線で示すように、パソコン６１を介してメモリ６２に記憶されているデータに従って対物レンズ４を光軸方向に移動させることによってもできるようになっている。もちろん、対物レンズ４の代わりに、結像レンズ７４、リレー光学系７１、７２、７３の何れかを光軸方向に移動させることで行うようにしてもよい。
【００３９】
この例においては、図７の左側に示すように、対物レンズ４を例えばピエゾ素子により光軸方向に移動させることによってＺスキャンを行うことによりＺスキャン画像Ａを獲得する（図７の場合は、ΔＺ＝−１５μｍ〜０μｍまで５μ間隔で３枚）。また、図７の右側に示すように、波面変換素子２のＤＦＭ２２を変形することによりＺスキャンして、Ｚスキャン画像Ａと対応する焦点面のＺスキャン画像Ｂを獲得する。そして、図７の下側に示すように、各Ｚ位置（焦点面）に対して、対応する２つの画像ＡとＢから修正した１つの画像を得て、それをその焦点面のＺスキャン画像とする。
【００４０】
この実施例のデータ処理過程を図８（ａ）、（ｂ）に示す。すなわち、図８（ａ）に示すように、ステップＳＴ２１で、対物レンズ４を光軸方向に移動させることによってＺスキャンを行うことにより、Ｚスキャン画像Ａを獲得する。次いで、ステップＳＴ２２で、波面変換素子２のＤＦＭ２２を変形することによりＺスキャンして、Ｚスキャン画像Ｂを獲得する。そして、ステップＳＴ２３で、対応する２つの画像ＡとＢから修正した１つの画像を得て、それを修正したＺスキャン画像とする。
【００４１】
このステップＳＴ２３の修正方法の１例を図８（ｂ）に示す。まず、ステップＳＴ３１で、２つの画像ＡとＢそれぞれに対して各点のコントラストを計算する。この場合に、コントラストとして、例えば周辺領域（Ｎ×Ｎ）の領域毎の画素値の最大値と最小値を計算してその差あるいは比をその点のコントラストとする。次に、ステップＳＴ３２で、２つの画像Ａ、Ｂ間の対応点を求める。そのためには、例えば片方の画像Ａから（Ｎ×Ｎ）の領域を切り出して、他方の画像Ｂの領域にわたって相関を計算し、最も相関値の高い位置を対応点とする。次いで、ステップＳＴ３３で、ステップＳＴ３２において対応点が求められたら、対応点間のコントラストを比較する。その結果、ステップＳＴ３４で、コントラストの大きい方の画像の画素値をその点の画素値とすることにより、修正した１つのその焦点面でのＺスキャン画像を得ることができる。
【００４２】
このように、各Ｚ位置に対して、異なるＺスキャン方式によって得た複数のＺスキャン画像から修正した１枚のＺスキャン画像を再構成し、その各Ｚ位置に対して修正した各々１枚のＺスキャン画像から３Ｄ物体像を得ることができ、種々の試料に対して、光学系及び試料の屈折率分布に基づいた収差を最も良好に補正した精度の高い物体像を獲得することができる。
【００４３】
以上、本発明の走査型光学顕微鏡装置及び走査型光学顕微鏡像から物体像の復元法をいくつかの実施例に基づいて説明してきたが、それらの実施例は種々の設計変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の第１〜第３実施例のレーザー走査型顕微鏡の全体の構成を示す図である。
【図２】第１の実施例のレーザー走査型顕微鏡で得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する方法の概念図である。
【図３】第１の実施例の方法の処理手順の１例を示す図である。
【図４】第２の実施例のレーザー走査型顕微鏡で得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する方法の概念図である。
【図５】第２の実施例において形状可変ミラーの形状を制御するためのテーブルの例を示す図である。
【図６】第２の実施例の方法の処理手順の１例を示す図である。
【図７】第３の実施例のレーザー走査型顕微鏡で得られた走査型光学顕微鏡像から三次元物体の物体像を復元する方法の概念図である。
【図８】第３の実施例の方法の処理手順の１例を示す図である。
【図９】ビームスプリッターによって光路分割をする従来の顕微鏡の構成を示す図である。
【図１０】ビームスプリッターによって光路分割をする従来の２光子顕微鏡の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００４５】
２…波面変換素子
３…光束走査手段
４…対物レンズ
１１…レーザー光源
１２…コリメータレンズ
２２…形状可変ミラー（ＤＦＭ）
５１…ダイクロイックミラー
５２…集光レンズ
５３…検出器
６１…パソコン
６２…メモリ
７１…第三のリレー光学系
７２…第二のリレー光学系
７３…第一のリレーレンズ
７４…結像レンズ
Ｏ…物体
ＫＰＬ…短パルス・レーザー
ＰＣＵ…プリチャープ・ユニット
ＳＴ１、ＳＴ２、ＳＴ３…ビーム・スプリッター
ＡＤ１、ＡＤ２…アダプティブミラー
ＤＢＳ…ビーム・スプリッター
ＳＬ、ＴＬ…光学部品
ＳＰ…ミラー
ＯＬ…対物レンズ
Ｌ…レンズ
ＰＨ…ピンホール
ＥＦ…フィルター
ＰＭＴ…検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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