(57)【要約】【課題】  卵またはマヨネーズ等の高濃度油脂含有検体材料から、ＰＣＲ、コロイド金抗体法、生存確認用等の細菌検査に好適な検体試料を調製する方法を提供する。【解決手段】  例えば、検体材料が卵の場合、狭雑細菌の存在確率が高い卵黄の胚の部分から検体試料を採取し、採取した検体試料をＰＢＳＴに溶かし、ＰＢＳＴに溶出させた検体試料を低速遠心することによって、狭雑細菌を沈殿させることなく粗大粒子のみを沈殿させて上清を採取し、採取した上清を高速遠心して狭雑細菌を沈殿させて沈殿を採取する１次沈殿採取工程（４）とを含むことを特徴とし、この１次沈殿に検査種類ごとに固有の処理を加えてＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査の検体試料とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全卵を卵白と卵黄とに取り分け卵黄の胚の部分から微量の検体試料を採取する検体試料採取工程と、採取した検体試料をＰＢＳＴに溶かし出す検体試料溶出工程と、ＰＢＳＴに溶出させた検体試料を低温低速遠心して上清を採取する上清採取工程と、採取した上清を遠心し沈殿を残して上清を除去する１次沈殿採取工程とを含んでなる狭雑細菌検出を目的とする卵からのＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法。
【請求項２】
全卵をＰＢＳＴと混和させる検体試料混合工程と、ＰＢＳＴと混合した検体試料を低温高速遠心して沈殿を採取する１次沈殿採取工程と、採取した１次沈殿とＰＢＳＴとを混和させる１次沈殿混合工程と、ＰＢＳＴと混和した１次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する２次沈殿採取工程と、２次沈殿にＰＢＳＴを加えて混和したものを低温低速遠心して上清を採取する上清採取工程と、採取した上清を低温高速遠心して沈殿を採取する３次沈殿採取工程とを含んでなる狭雑細菌検出を目的とするＰＣＲ陽性卵からの経口感染生存確認検査対応の検体試料調製方法。
【請求項３】
マヨネーズに３〜７重量倍量のＰＢＳＴを加えて混和させる検体試料混合工程と、ＰＢＳＴと混合した検体試料を静置して下ずみと浮上物とに自然分離させて下ずみを採取する１次沈殿採取工程と、採取した１次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する２次沈殿採取工程と、採取した２次沈殿とＰＢＳＴとを混和させる２次沈殿混合工程と、ＰＢＳＴと混和した２次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する３次沈殿採取工程とを含んでなる狭雑細菌検出を目的とするマヨネーズからのＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、食品衛生上の観点または感染症の予防の観点から、卵または卵の加工食品であるマヨネーズ等に含まれることが許容できない狭雑細菌を検出するために実施するＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法に関する。なお、本明細書において「狭雑細菌」と表記する場合には、リケッチャのような微生物を含むものとする。
【背景技術】
【０００２】  卵は、栄養バランスもよく生食されることも多い馴染み深い食品であるが、野菜等と同様に、自然食品としてその内容に及ぶ細菌検査が実施されていない現状にある。しかし、卵を生産する鶏が特定の感染症に罹患している場合、卵の内容には、感染症の原因菌が狭雑している可能性がある。また、その原因菌は、卵の加工食品であるマヨネーズに引き継がれている可能性があるとともに、マヨネーズに関しては、加工過程で雑菌が混入する可能性があることから、加工食品として必要な細菌の検査対象とされる。【０００３】  狭雑細菌の存否に関する検査としては、ＤＮＡを抽出して実施するＰＣＲ検査、細菌に対する抗体の存在から細菌の存在を推定するコロイド金抗体法検査、マウス等の実験動物に細菌による被害が現実に発症するか否かによる生存確認検査等がある。これらの検査における細菌の検出確度は、２種以上の検査を併用することによって格段に高めることができる。【０００４】  これらの検査を実施する場合には、検体材料としての卵またはマヨネーズが、細菌検査に適する形態の検体試料として加工される必要がある。ここで、検体試料には、卵またはマヨネーズに狭雑細菌が存在するとしたならば、その卵またはマヨネーズを検体材料として得られた検体試料には、必ず狭雑細菌が存在することが求められる。卵またはマヨネーズに何らかの菌が存在するにも拘らず検体試料に菌が存在しなければ、必然的に誤った検査結果が報告されることとなるからである。つまり、卵またはマヨネーズの検体材料と、これを加工してなる検体試料との間には、狭雑細菌の存在の一致性、または、狭雑細菌の不存在の一致性が求められるのである。【０００５】  しかし、卵およびマヨネーズのように多量の油脂成分、すなわち、狭雑細菌に対して極めて粗大な粒子を多量に含む検体材料に関しては、菌の存在または不存在の一致性の高い検体試料を作製することが難しいという問題がある。検体試料の調製は、細菌が含まれる確度の高い部分を検査に適する形態で取り出すための一連の分画作業を内容とするものである。分画作業において、最も重要なことは、分画工程の進行に伴って順次に除去される画分内に検出目的とする狭雑細菌が含まれないようにすることである。【０００６】  検体試料を調製する際の分画作業には、一般に、遠心機を用いた遠心分画手段が採用される。多量の油脂成分または粗大粒子を含む検体材料において、菌の存在または不存在の一致性の高い検体試料を作製することが困難であるのは、検体材料を遠心分離して各種検査の阻害画分である油脂成分または粗大粒子を除去する場合において、遠心によって高速で移動する粗大な脂肪粒子の粒子間に細菌が挟まれて拘束された状態で分画が完了してしまい、検出対象となる細菌が分画された油脂成分等と共に除去されてしまうことが原因として挙げられる。また、分画の方法によっては、粗大粒子に拘束された狭雑細菌を含む画分が除去されないで残される画分であることもあるが、この場合には、狭雑細菌は、存在しても検出され難いものとなる。【０００７】  上記したように、食用の卵については、その用途に関連しての細菌検査は、実施されていないが、マヨネーズについては、検査が実施されることもあり、従来技術の代表例として出願人が知得している範囲で説明する（図４）。同図は、マヨネーズに含まれる狭雑細菌をＰＣＲ検査の対象とするための検体試料を調製する方法を示すフロー図であり、同図の括弧内の数字は、時系列上の工程順序を示している。【０００８】  検体試料を作製するための分画に採用されている手段は、遠心によるものである。遠心は、いずれも高速での遠心が全体で４回実施され、いずれの遠心工程においても、その沈殿を採取する方法である（２），（４），（６），（８）。高速遠心においては、質量の大きい成分と、質量の小さな成分との分離速度が高速で完了するため、マヨネーズに狭雑する細菌は、卵黄に由来する脂肪粒に拘束された状態で、除去される脂肪側の画分に閉じ込められるとともに、残存する狭雑細菌は、沈殿側の画分に閉じ込められた状態となる。したがって、最初に存在していた狭雑細菌の大半は、この段階で失われると考えられる。脂肪粒の量が減少する２回目以降の高速遠心では、このように検出対象となる狭雑細菌が大量に失われる事態は改善されるものの、失われた細菌は漸減する。そして、最終的に採取される沈殿は、狭雑細菌の存在数が少ないものとならざるを得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明が解決しようとする問題は、細菌検査を目的とする従来の検体試料の調製方法においては、検体試料を分画する前提となる検体材料が多量の油脂成分または粗大粒子を含むものである場合、検体材料と検体試料との間の狭雑細菌の存在の一致性または不存在の一致性の高い検体試料を調製することが難しいという問題である。換言すれば、本発明は、検体材料が高濃度の油脂成分または粗大粒子成分を含むものであっても、その検体材料に何らかの狭雑細菌が存在する場合においては、その狭雑細菌を正確に検出することができる検体試料の調製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明の請求項１に記載の卵からのＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法は、全卵を卵白と卵黄とに取り分け卵黄の胚の部分から微量の検体試料を採取する検体試料採取工程と、採取した検体試料をＰＢＳＴに溶かし出す検体試料溶出工程と、ＰＢＳＴに溶出させた検体試料を低温低速遠心して上清を採取する上清採取工程と、採取した上清を遠心し沈殿を残して上清を除去する１次沈殿採取工程とを含む。【００１１】  この構成における検体試料採取工程では、卵黄の胚の部分から、微量の検体試料を採取する。卵黄の胚の部分は、狭雑細菌の最もよく集合する箇所として知られており、採取された検体試料における狭雑細菌の存在確率は、卵の他の部分から採取する場合より大きい。検体試料溶出工程では、ＰＢＳＴが用いられる。ＰＢＳＴは、界面活性物質を含み、検体試料はＰＢＳＴとよく混和する。上清採取工程では、ＰＢＳＴと混和した検体試料が、低温低速遠心される。低温とするのは、蛋白の変質、変性等を防止する趣旨である。低速で遠心するのは、狭雑細菌が遠心による重力方向に移動する粗大粒子から逃れ、上清に残る時間余裕を付与する趣旨であり、本発明のポイントの一つである。したがって、採取された上清に狭雑細菌が存在する確率が高められる。続く１次沈殿採取工程では、採取された上清が低温高速遠心される。これによって上清中に分散していた狭雑細菌は、遠心管の底部に沈殿し、この遠心によって生じた上清は、除去される。残された沈殿には、狭雑細菌が存在する確率が大きく、検査の種類に応じた処理を経ることを前提に、狭雑細菌の検出確度の高い検体試料としてＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査用途に供給することができる。【００１２】  本発明の請求項２に記載のＰＣＲ陽性卵からの経口感染生存確認検査対応の検体試料調製方法は、全卵をＰＢＳＴと混和させる検体試料混合工程と、ＰＢＳＴと混合した検体試料を低温高速遠心して沈殿を採取する１次沈殿採取工程と、採取した１次沈殿とＰＢＳＴとを混和させる１次沈殿混合工程と、ＰＢＳＴと混和した１次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する２次沈殿採取工程と、２次沈殿にＰＢＳＴを加えて混和したものを低温低速遠心して上清を採取する上清採取工程と、採取した上清を低温高速遠心して沈殿を採取する３次沈殿採取工程とを含む。【００１３】  この構成における検体試料混合工程では、ＰＣＲ陽性卵の全卵が用いられる。経口感染生存確認検査は、卵における狭雑細菌の所在の確率の問題ではないからである。１次沈殿採取工程では、低温高速遠心が採用される。全卵に含まれる全ての狭雑細菌を粗大粒子とともに１箇所に集める趣旨である。この工程で採取される１次沈殿は、存在する狭雑細菌略全数を含む。１次沈殿混合工程は、ＰＢＳＴとの混和を内容とする２次沈殿を得るための準備工程である。２次沈殿採取工程では、再度、低温高速遠心が採用される。沈殿する狭雑細菌を含む画分を洗浄する趣旨である。続く上清採取工程では、低温低速遠心が採用され、本発明の特徴をなす。低速遠心では、粗大粒子の移動速度が緩慢であるとともに、狭雑細菌に作用する重力は、相対的に弱いので、狭雑細菌を上清側に残すことがで���るのである。この上清に含まれる狭雑細菌は、３次沈殿採取工程における低温高速遠心によって集合させられ３次沈殿として採取される。採取された３次沈殿には、ＰＣＲ検査を陽性反応とした原因狭雑細菌が存在する可能性が極めて高く、マウス等の実験動物に経口感染させることによって、症状等を確認することができる。【００１４】  本発明の請求項３に記載のマヨネーズからのＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法は、マヨネーズに３〜７重量倍量のＰＢＳＴを加えて混和させる検体試料混合工程と、ＰＢＳＴと混合した検体試料を静置して下ずみと浮上物とに自然分離させて下ずみを採取する１次沈殿採取工程と、採取した１次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する２次沈殿採取工程と、採取した２次沈殿とＰＢＳＴとを混和させる２次沈殿混合工程と、ＰＢＳＴと混和した２次沈殿を低温高速遠心して沈殿を採取する３次沈殿採取工程とを含む。【００１５】  この構成における検体試料混合工程は、マヨネーズとＰＢＳＴを混和させて１次沈殿採取工程の準備をする工程である。この工程におけるＰＢＳＴの混合量は、好ましい分量を示し臨界的な意義を有する分量ではない。１次沈殿採取工程は、ＰＢＳＴと混和したマヨネーズを下ずみと浮上物とに自然分離するまで静置し、下ずみを採取する工程であり、本発明の特徴をなす。狭雑細菌が上方に上昇する浮遊物から逃れる時間は十分であり、採取される下ずみには、狭雑細菌が存在する確率が高い。２次沈殿採取工程では、採取された下ずみに対する低温高速遠心が実施され、その沈殿が採取される。採取される沈殿中には下ずみ中の狭雑細菌凝縮されて存在する確率が高い。３次沈殿採取工程は、２次沈殿にＰＢＳＴを混和して再度低温高速遠心し、その沈殿を採取することを内容とし、２次沈殿を洗浄する趣旨である。
【発明の効果】
【００１６】  本発明に係る卵、マヨネーズからのＰＣＲ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法は、遠心分画を利用する際には、狭雑細菌を含まないようにして脂肪粒子およびその他の粗大粒子を除去することができる低温低速遠心と、広範囲に分散する狭雑細菌を沈殿に凝縮させることができる低温高速遠心とを組み合わせることによって、または、これらの遠心手段にさらに、狭雑細菌の自由移動が可能なＰＢＳＴ混和条件下での自然分離手段を組み合わせることによって、廃棄する画分に含まれる狭雑細菌を最小限に抑えながら検体試料を得ることができるので、卵またはマヨネーズ等の高濃度油脂または粗大粒子含有検体材料との関係において、狭雑細菌の存在または不存在の確度の高い検体試料を調製することができるという利点を有するとともに、この手法は、卵、マヨネーズに限らず、これらと同じような物性を有する検体材料から検体試料を作製することに広く応用することができるという利点をも有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  以下、本発明の趣旨の沿って実施した実施例を説明する。この際、本発明の趣旨を構成しない実験器材メーカ等に関する事項および実施例ごとに重複説明となる事項については、適宜、説明を省略した。
【実施例１】
【００１８】  本実施例は、鶏卵からＰＣＲ検査、生存確認検査、コロイド金抗体法検査対応の検査試料を作製する例であり、検体試料採取工程（１）と、検体試料溶出工程（２）と、上清採取工程（３）と、１次沈殿採取工程（４）を主要工程とする（図１）。【００１９】  検体試料採取工程（１）は、卵の表面を消毒用のアルコールで拭く。卵をラップで包み、表面に割れ目をいれる。卵をラップから取り出し、市販のフードパック２個を用いて卵白と卵黄とに分けて取り出す。卵黄の胚の部分を裂き、滅菌したろ紙（１０ｍｍ×７０ｍｍ）を滅菌したピンセットで掴み、ろ紙の裏と表で十字を描くようにしてろ紙に卵黄を付着させる操作内容である。【００２０】  検体試料溶出工程（２）は、卵黄を付着させたろ紙をＰＢＳＴ４０ｍｌの入った５０ｍｌ遠心管に入れ、振り混ぜて卵黄を溶かし出す。ろ紙の卵黄が取り除けたら、ろ紙を取り出す操作内容である。【００２１】  上清採取工程（３）は、５０ｍｌ遠心管を４℃、４００ｇ、すなわち、低温低速で１５分間遠心し、別の５０ｍｌ遠心管に上清を採取する操作内容である。【００２２】  １次沈殿採取工程（４）は、採取した上清を４℃、１５０００ｇ、すなわち、低温高速で１５分間遠心し、沈殿２ｍｌを残して上清をピペットで吸引して除去する操作内容である。沈殿２ｍｌは、マイクロピペッタでよく混和し、滅菌した複数のマイクロチューブに分注し、ＰＣＲ検査、生存確認検査、コロイド金抗体法検査の検体試料とする。なお、これらの各検査に供するに際しては、検査ごとに必要とされる各固有の工程を経ることとなる。
【実施例２】
【００２３】  本実施例は、ＰＣＲ陽性卵からの経口感染生存確認検査用の検体試料を作製する例であり、検体試料混合工程（１）と、１次沈殿採取工程（２）と、２次沈殿採取工程（３）と、上清採取工程（４）と、３次沈殿採取工程（５）を主要工程とする（図２）。【００２４】  検体試料混合工程（１）は、２リットル容量のＰＰ製容器に、ＰＣＲ陽性卵１個と滅菌済ＰＢＳＴ７００ｍｌを入れ、容器を１００回以上振って混和させる操作内容である。【００２５】  １次沈殿採取工程（２）は、遠心専用袋に混和した卵を移し、これを１リットル遠心管に入れ、４℃、１２０００ｇ、つまり、低温高速で４５分間遠心し、上清を除去する操作内容である。【００２６】  ２次沈殿採取工程（３）は、１次沈殿採取工程（２）で得られた沈殿に、再度、ＰＢＳＴ７００ｍｌを加えてよく混和させ、これを４℃、１２０００ｇで４５分間遠心し、沈殿を採取する操作内容である。【００２７】  上清採取工程（４）は、２次沈殿採取工程（３）で得られた沈殿に１２０ｍｌの滅菌済ＰＢＳＴを加えて混和し、必要量を５０ｍｌ遠心管に取り分け、４℃、４００ｇ、すなわち、低温低速で１５分間遠心し、この上清を別の５０ｍｌ遠心管に採取する操作内容である。【００２８】  ３次沈殿採取工程（５）は、採取した上清を、４℃、１５０００ｇで低温高速遠心し、沈殿を採取する内容である。採取した沈殿は、２ｍｌのＰＢＳを加えて混和し、高圧蒸気滅菌したマイクロチューブの取って経口感染生存確認用の検体試料とした。
【実施例３】
【００２９】  本実施例は、マヨネーズからＰＣＲ検査、生存確認検査、コロイド金抗体法検査対応の検査試料を作製する例であり、検体試料混合工程（１）と、１次沈殿採取工程（２）と、２次沈殿採取工程（３）と、２次沈殿混合工程（４）と、３次沈殿採取工程（５）を主要工程とする（図３）。【００３０】  検体試料混合工程（１）は、２リットルのＰＰ製容器に、マヨネーズとその５重量倍量のＰＢＳＴを入れ、２００回以上振ってよく混和させる。【００３１】  １次沈殿採取工程（２）は、混和したマヨネーズをＰＰ製容器に入れたまま、涼しいところに２昼夜静置し、その下ずみを採取する操作内容である。【００３２】  ２次沈殿採取工程（３）は、採取した下ずみを遠心専用袋に入れ、さらに、これを１リットル遠心管に入れ、４℃、１２０００ｇで低温高速遠心し、沈殿を含む４０ｍｌ程度を採取する操作内容である。【００３３】  ２次沈殿混合工程（４）は、２次沈殿採取工程（３）で得られた沈殿をよく混和させる内容である。【００３４】  ３次沈殿採取工程（５）は、混和させた２次沈殿を５０ｍｌ遠心管に入れ、４℃、１５０００ｇで１５分間低温高速遠心し、沈殿を含む約６ｍｌを採取する操作である。採取した沈殿は、よく混和させた上、マイクロチューブ３本に取り分け、ＰＣＲ検査、生存確認検査、コロイド金抗体法用の検体試料とした。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】  卵から検体試料を調製する実施例を示すフロー図である。
【図２】  卵から経口感染生存確認用の検体試料を調製する実施例を示すフロー図である。
【図３】  マヨネーズから検体試料を調製する実施例を示すフロー図である。
【図４】  マヨネーズから検体試料を調製する従来例を示すフロー図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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