(57)【要約】【課題】  特定の機能を高めたキチン及びキトサンを提供する。【解決手段】  皮膚糸状菌から得られるキチン又はキトサン、及びこれを含有する生体材料、並びに皮膚糸状菌の培養方法。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚糸状菌から得られるキチン又はキトサン。
【請求項２】
皮膚糸状菌が、トリコフィトン属、エピデルモフィトン属、又はミクロスポルム属に属する微生物である、請求項１記載のキチン又はキトサン。
【請求項３】
請求項１又は２記載のキチン又はキトサンを含有する生体材料。
【請求項４】
ケラチン及びペプトンを含む培地中で、窒素と二酸化炭素を含有する混合ガスを培地中に供給しながら、皮膚糸状菌を培養することを特徴とする皮膚糸状菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚糸状菌から得られるキチン又はキトサン、及びこれを含有する生体材料、並びに皮膚糸状菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、キチン及びキトサンの有効利用は生体材料としての人工皮膚に始まり各種食品の防腐剤、成形剤、土壌改良剤、廃水処理剤等多方面にわたってその応用利用がなされている。特に、人工生体材料分野では本物質の生体内消化性、免疫アジュバント活性、リンパ細胞分離活性、薬物除放機能性、抗凝固活性、並びに抗菌活性等の機能的役割が認められ、今後多くの医療分野での応用利用が考えられる。しかしながら、個々の機能性を追及した素材としてのキチン・キトサンの安定供給は考えられていない。
【０００３】
キチン及びキトサンの供給源は甲殻類、昆虫類、貝類及び菌類等の下等動物、並びに糸状菌の外皮骨格組織及び支持組織の成分として知られている。現在までは、これら天然資源としてのキチン・キトサンは余り需要性が無く、未利用資源としての有効利用は考えられていなかった。しかしながら、本物質の生物学的・化学的性状が明らかになるにつれ、その機能性高分子素材としての需要性が高まってきた。それらに応える素材源としてはカニ類及びこがね虫等の昆虫類並びに一部糸状菌類、特に操状菌類、例えばムコール属等が発酵法によって製造が始められ、将来の本物質の安定供給が検討され始めた。しかしながら先にも触れたように機能性を高めた本物質の素材源を考えた報告は見当たらない。
【非特許文献１】本山高幸, 堀内裕之, 高木正道：化学と生物, Vol.31,No.12, 807-816(1993)
【非特許文献２】大島良夫, 西野健一, 米倉良雄, 前田基彰, 堀江順子, 野々村京子, 岸本三郎, 若林俊治, 外松茂太郎：熱傷, 12, 31(1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、キチン及びキトサンの持つ種々の機能のうち、特定の機能を高めたキチン及びキトサンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、皮膚糸状菌から得られたキチン及びキトサンが、他の生物由来のキチン及びキトサンよりも、抗菌性、生体内分解性、皮膚密着性等に優れていることを見出した。また、皮膚糸状菌を特定条件下で培養することにより、細胞壁中のキチン含量が増大することを見出し、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、皮膚糸状菌から得られるキチン又はキトサンである。
【０００７】
また、本発明は、上記のキチン又はキトサンを含有する生体材料である。
【０００８】
更に、本発明は、ケラチン及びペプトンを含む培地中で、窒素と二酸化炭素を含有する混合ガスを培地中に供給しながら、皮膚糸状菌を培養することを特徴とする皮膚糸状菌の培養方法である。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明のキチン及びキトサンは、皮膚糸状菌から得られるものである。
【００１１】
皮膚糸状菌とは、各種動物の皮膚に親和性を持ち、頭部、体部、足部等に種々の皮膚疾病を引き起こす糸状菌であり、例えば、トリコフィトン（Trichophyton）属、エピデルモフィトン（Epidermophyton）属、ミクロスポルム（Microsporum）属に属する糸状菌である。本発明に用いることができる皮膚糸状菌は特に限定されず、例えば、ミクロスポルム・オドウィニ（Microsporum audouini）、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton tonsarans）、トリコフィトン・ビオラセウム（Trichophyton violaceum）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes）、トリコフィトン・フェルギネウム（Trichophyton ferrugineum）、トリコフィトン・セレブリホルメ（Trichophyton cerebriforme）、トリコフィトン・コンセントリカム（Trichophyton concentricum）、トリコフィトン・ファビホルメ（Trichophyton faviforme）、トリコフィトン・ノドホルマンス（Trichophyton nodoformans）、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Epdermophyton floccosum）などを使用することができる。これらの皮膚糸状菌の中でも、トリコフィトン・ルブルムを使用するのが好ましい。
【００１２】
本発明のキチン又はキトサンは、糸状菌からキチン又はキトサンを得る際に採用される一般的な方法により得ることができる。即ち、菌体を破砕し、細胞壁画分を集め、これを酸及びアルカリで処理し、その不溶物を採取することにより、キチンを得ることができる。このキチンを強アルカリで処理することによりキトサンが得られる。
【００１３】
本発明のキチン及びキトサンは、抗菌性、生体内分解及び吸収性、皮膚密着性などの性質を有することから、人工皮膚、人工臓器などの生体材料として利用することができる。また、生体材料以外にも、繊維、フィルム、金属精製担体、保湿剤、植物生長制御剤、脱臭剤、固定化剤、紙の抗菌剤、繊維の抗菌剤、医薬・農薬・栄養素のデリバリー担体・除放性担体、抗ウイルス剤、抗コレステロール剤、乳化・吸湿剤、抗血栓・血液凝固阻止剤、細胞免疫増強剤、金属・プラスチック表面強化剤、食品添加剤、化粧品、高機能複合素材原料、染料増強剤などとしても利用することができる。
【００１４】
皮膚糸状菌は、通常の培養方法によって培養してもよいが、本発明の培養方法、即ち、ケラチン及びペプトンを含む培地中で、窒素と二酸化炭素を含有する混合ガスを供給しながら培養する方法によって、培養することが好ましい。このような培養方法により、菌体中のキチン含量が増大する。
【００１５】
培地中に含まれるケラチンの量は特に限定されないが、1〜5mg/lとするのが好ましい。ペプトンの量も特に限定されないが、0.5〜5g/lとするのが好ましい。ケラチン及びペプトン以外の培地成分は、糸状菌の培養に一般的に用いられる培地と同様でよい。
【００１６】
混合ガスにおける窒素と二酸化炭素の比は特に限定されないが、二酸化炭素：窒素＝10-50％：50-90％とするのが好ましい。
【００１７】
培養温度や培養期間などの条件は、糸状菌からキチンを得る際に採用される一般的な条件でよい。通常、培養温度は、25〜35℃、培養期間は15〜30時間とするのが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の培養方法は、皮膚糸状菌中のキチン含量を増大させることができる。皮膚糸状菌から得られるキチン及びキトサンは、抗菌性、生体内分解性、皮膚密着性といった性質を示すことから、人工皮膚などの生体材料として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【実施例】
【００２０】
〔実施例１〕  各種皮膚糸状菌によるキチンの生産
ムコール（Mucor）属、リゾプス（Rhizopus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属など従来から知られているキチン生産糸状菌では、細胞壁中のキチン含量が20〜50％であるのに対し、皮膚糸状菌では、細胞壁中のキチン含量は10〜15％程度と少ない。そこで、皮膚糸状菌のキチン含量を増大させるため、その培養条件について検討した。
【００２１】
まず最初に、Microsporum audouini（MTU 20001）、Microsporum canis（AHU 9577）、Trichophyton tonsarans（IFO 5945）、Trichophyton tonsurans（IFO 5928）、Trichophyton violaceum（OUT 4132）、Trichophyton mentagrophytes（IFO 5466,5809）、Trichophyton ferrugineum（IFO 5832）、Trichophyton cerebriforme（IFO 5930）、Trichophyton concentricum（IFO 5972）、Trichophyton faviforme（IFO 5934）、Trichophyton nodoformans（OUT 4131）、Trichophyton rubrum（IFO 5467,6203）、Epdermophyton floccosum（MTU 21002）の15菌株について、前培養を行った。これらの菌株は、財団法人発酵研究所（IFO）、大阪大学大学院工学研究科応用生物工学専攻（OUT）、東京大学医学部（MTU）、北海道大学大学院農学研究科応用生命工学専攻菌株保存室（AHU）といった公の保存機関より容易に入手することが出来る。前培養は、基本培地Ａ（蒸留水1リットル当たり、ブドウ糖25g、硝酸ナトリウム2g、リン酸1水素カリウム1g、硫酸マグネシュム0.5g、塩化カリウム0.5g、硫酸第1鉄0.02gを含む）で、27℃、20時間振盪培養して行った。
【００２２】
前培養した菌株は、改良培地Ｂで、25℃、30時間振盪培養した。この際、培地中に、二酸化炭素と窒素の混合ガス（CO２ 10-50％及びN2 50-90％）をバブルさせた。改良培地Ｂは、基本培地Ａにケラチン3mg（Sigma社製）とペプトン1g（栄研化学）を添加し、pH6.0に調整し、減菌処理（110℃、1気圧、10分）して調製した。この培養菌を濾過にて集菌し、リン酸緩衝液（pH6.0）にて2回洗浄後、液体窒素にて急冷凍結し、菌体を破砕した。破砕菌体は12,000rpmで遠心処理を行い、細胞壁画分を集めキチン含量を測定した。対照として、前培養した菌株を、再度前培養と同様の条件で30時間振盪培養し、同様に菌体の細胞壁画分のキチン含量を測定した。
【００２３】
菌体からのキチン抽出は、以下のように行った。まず、細胞壁画分1gに対して100mlの10％NaOH溶液を加え25℃、48時間撹拌処理を行った。遠心により沈殿物を集め、これを蒸留水で2回洗浄した後、5％酢酸で処理し、再び蒸留水で2回洗浄した。次に、沈殿物を95％エタノールで脱脂及び脱水乾燥し、これをキチンとした。
【００２４】
キチン含量は、キチンをキトサンに変換した後、グルコサミンに分解し、エルソン・モルガン法によりグルコサミン含量を測定し、その値から算出した。キチンからキトサンへの変換は、以下のように行った。0.5gのキチン試料に4mlの3％ラウリル硫酸ナトリウム溶液（wt/vol）を添加し、100℃、15分処理し、冷却後3,000 rpmで遠心した。沈殿物を蒸留水で洗浄し、再び同一条件で遠心処理し、沈殿物に3mlのKOH溶液（120gに100mlの蒸留水で希釈したもの）で130℃、1時間処理した。冷却後3,000rpmで遠心処理し、沈殿物を蒸留水で2回洗浄し、この沈殿物をキトサン抽出物とした。キトサン抽出物は、窒素ガス封かんのガラス管の中で、6N 塩酸で110℃、14時間処理し、その後6 M NaOH溶液で中和した。
【００２５】
本発明の培養方法（培養方法２）によって培養された菌体の細胞壁中のキチン含量を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2005137225.tif 000002
【００２７】
表１に示すように、本発明の培養方法により皮膚糸状菌の細胞壁中のキチン含量が大幅に増大した。特に、Trichophyton rubrumの増大量が著しかった。
【００２８】
〔実施例２〕  皮膚糸状菌由来のキトサンの各種微生物に対する抗菌性
従来よりキチン及びキトサンが各種微生物に対して抗菌性を示すことは周知の事実である。しかしながら、現在までの報告では、甲殻類のキチン、キトサンによる抗菌性については学会報告、特許等に知られているが微生物由来、特に糸状菌の中でも皮膚糸状菌由来キチン、キトサンに関しては皆無である。そこで、カニのキトサンとTrichophyton rubrum由来キチンの各種細菌、酵母及び真菌についてその抗菌性の比較を試みた。
【００２９】
キトサンの希酢酸(2M)溶液を添加したぺプトン培地又はサブロー培地（いずれも極東製薬社製）を、無菌小試験管に流し込んで試験培地を作製した。この試験培地に、キトサンを含まないペプトン又はサブロー培地で予め前培養した細菌、酵母、又は皮膚糸状菌を3-5×10７/ml接種した。細菌については18時間培養し、真菌については48時間培養した後、吸光度（OD 620nm）を測定した。この吸光度と、キトサンを添加しない場合の吸光度から、増殖阻害率（％）を算出し、キトサンの抗菌性を評価した。
【００３０】
キトサンは、カニ由来キトサン（Sigma社製）とTrichophyton rubrum（IFO 5467）由来のキトサン（実施例1で抽出）とを使用した。また、キトサンの添加量は、培地中のキトサンの最終濃度が、2、4、6、8又は9mg/mlになるようにした。
【００３１】
抗菌性は、Staphylococcus aureus（FDA 209P）、Staphylococcus epidermidis（ATCC 14990）、Streptococcus pyogenes（IID 0688）、Enterococcus facecium（IFO 3128）、Eschericha coli（NIHJ JL-2）、Klebsiella pneumoniae（IID 865）、Serratia marusucens（IFO 12648）、Salonella typhimurium（IID 971）、Pseudomonas aeruginosa（IAM 1095）、Haemophillus influenzae（IID 983）の１０種の細菌と、酵母であるCandida albicans（ATCC 10261）、皮膚糸状菌であるMicrosporum canis（AHV 9577）を測定対象とした、
カニ由来キトサン及びTrichophyton rubrum（IFO 5467）由来のキトサンの各種微生物に対する増殖阻害率を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2005137225.tif 000003
【００３３】
表２に示すように、カニ由来キトサンよりTrichophyton rubrum由来キトサンの方が、各種微生物に対する抗菌性が高かった。特に、グラム陰性菌及び真菌に対する抗菌性は顕著にカニ由来キチンより高かった。
【００３４】
なお、この抗菌性試験は、Muzzarelli et alの方法（Muzzarelli et al：Antimicrobial properties of N-carboxylbutyl chitosan. Antimicrobial Agents and Chemotherapy．Vol 34, No 10, p 2019-2023. 1990.）に従って行ったものである。
【００３５】
〔実施例３〕  皮膚糸状菌由来キチンの生体内での分解性と抗原性
生体内分解性及び低抗原性は生体材料の素材選択要因として重要である。このことは素材の生体に対する安全性はもとより、分解産物が無毒であること、適当な時期に分解・吸収されることなどが医療生体材料の選択条件として求められている。そこで、皮膚糸状菌由来キチンとカニ由来キチンの生体内での分解性及び抗原性について比較を試みた。
【００３６】
解剖バサミを用いて、モルモット背部に皮下に添って1cmの長さで切開し、ここに3mm×3mmのキチン切片を埋め込み、縫合した。キチン切片の埋め込みから2、4、6、8、又は10週間後に、モルモットの背部を再び切開し、キチン切片の分解とモルモット背部の炎症反応を観察した。各操作は全て無菌的に行った。
【００３７】
キチンは、Trichophyton rubrum（IFO 5467）由来のキチンとカニ由来のキチン（sigma社製）とを使用した。
【００３８】
モルモットは、合計8匹のハートレー系の白色雌モルモット（日本クレア社）を用い、これらは本実験1週間前に購入した。5匹の体重平均は269±9.3gで、温度が22.5℃±0.3℃、湿度65±5％の飼育環境下で、固形飼料（日本クレア）を与えて飼育した。
【００３９】
各キチン切片のモルモット皮下部での分解性及び炎症反応について、表３に示す。
【００４０】
【表３】
2005137225.tif 000004
【００４１】
表３に示すように、Trichophyton rubrum由来のキチンの方がカニ由来のキチンよりも早い時期に分解が認められた。また、生体内での炎症反応については両者に差は認められなかった。
【００４２】
〔実施例４〕皮膚糸状菌及びカニ由来キチンのラット及びモルモット皮膚部に対する密着性
市販ズワイガニ由来キチン膜（関東化学社製）及びTrichophyton rubrum（IFO 5467）由来キチン膜（実施例1で抽出したもの）を用いてラット及びモルモットの背部皮膚に対する密着性及び乾燥性について比較検討した。
【００４３】
モルモット及びラットの背部の毛を電機バリカンで刈り、除毛6時間後、解剖バサミで皮膚表面を1.5mm四方に切開し、各キチン膜を貼布し、2×2cm四方のろ紙で閉鎖貼布した。キチン膜の貼布から1、2、及び3週後に開封して、キチン膜の皮膚に対する密着性、及びキチン膜を貼布した皮膚の乾燥状態を観察した。
【００４４】
ラットは４週齢の雌のWister系ラット、モルモットは４週齢の雌のハートレー系白色モルモットを使用した。動物の飼育は、実施例３と同様の条件で行った。本実験を始める際のラットの平均体重は120±9.2gで、モルモットの平均体重は235±14.6gであった。尚、用いた各動物は一群6匹として実験に供試した。
【００４５】
各キチン膜の密着性及び乾燥性の評価結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
表４に示すように、皮膚部に対する密着性及び乾燥性は、Trichophyton rubrum由来キチンはカニ由来キチンに比べて早い時期に著明な効果が得られた。