(57)【要約】【課題】昆虫の自然免疫経路を阻害し、農作物の病気を媒介する昆虫を駆除して昆虫による農作物の病気の拡散を防止する抗昆虫剤を提供する。【解決手段】式［Ｉ］【化１】2005281161.tif 000007で表される化合物、その塩又はその水和物を有効成分として含有する自然免疫阻害剤又は抗昆虫剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［Ｉ］
【化１】
2005281161.tif 000006
で表される化合物、その塩又はその水和物を有効成分として含有する自然免疫阻害剤。
【請求項２】
前記式［Ｉ］化合物、その塩又その水和物を有効成分として含有する抗昆虫剤。
【請求項３】
前記式［Ｉ］化合物、その塩又その水和物を有効成分として含有するショウジョウバエの駆除剤。
【請求項４】
前記式［Ｉ］化合物、その塩又はその水和物を用いた病害昆虫又は媒介昆虫の駆除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロペンタンジオール誘導体を有効成分とする抗昆虫剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物の病気が拡散する理由の一つとして、媒介昆虫の存在が挙げられる。農作物の病気に対して免疫を持つ昆虫を媒介とし、病因であるウィルス等が周囲の農作物に急速に伝播し、病気による農作物の被害が拡大するのである。
【０００３】
これまで農薬としては、害虫を防除する殺虫剤をはじめ殺菌剤、除草剤、殺鼠剤、植物成長調整剤、誘引剤、展着剤、天敵、微生物剤などが用いられてきた（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、農作物の病気が一度発生した後にその拡散を有効に防止しうる薬剤、方法は知られていなかった。
【０００５】
また、免疫系は病原体（細菌やウィルスなど）の侵入を察知し、排除する生体防御システムである。その中で自然免疫系は、基本的に生物がもつ異物や病原体に対する非特異的な防御システムであり、獲得免疫系を持たない昆虫にとっては唯一の防御機構である。
【０００６】
しかしながら、昆虫の自然免疫系の阻害作用に起因する抗昆虫剤については報告されていない。
【０００７】
【非特許文献１】“農薬の基礎知識について”http://www.maff.go.jp/nouyaku/nouyakukiso.htm
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、昆虫の自然免疫経路を阻害し、農作物の病気を媒介する昆虫を駆除して昆虫による農作物の病気の拡散を防止する抗昆虫剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、農作物の病気を媒介する昆虫としてショウジョウバエに着目し、遺伝子組み換えにより創出したショウジョウバエを使って自然免疫経路を阻害する物質の探索を行った。その結果、ある特定のシクロペンタンジオール誘導体が、ショウジョウバエの自然免疫経路による内因性抗菌物質の発現を顕著に抑制することを見出した。
【００１０】
かかる知見に基づいて完成した本発明の態様は、式［Ｉ］
【００１１】
【化１】
2005281161.tif 000002
で表される化合物、その塩又はその水和物を有効成分として含有する自然免疫阻害剤である。
【００１２】
本発明の他の態様は、前記式［Ｉ］化合物を有効成分として含有する抗昆虫剤である。
【００１３】
本発明の他の態様は、前記式［Ｉ］化合物、その塩又その水和物を有効成分として含有するショウジョウバエの駆除剤である。
【００１４】
本発明の他の態様は、前記式［Ｉ］化合物、その塩又はその水和物を用いた病害昆虫又は媒介昆虫の駆除方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、昆虫の自然免疫経路を阻害し、農作物の病気を媒介する昆虫を駆除して昆虫による農作物の病気の拡散を防止するために有効な抗昆虫剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
抗昆虫剤の有効成分である前記式［I］で表される化合物は、シクロペンタンジオール誘導体物質である。このシクロペンタンジオール誘導体物質は、例えば、アスペルギルス属に属し、ショウジョウバエの自然免疫経路阻害活性を有するシクロペンタンジオール誘導体物質を産生する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物から該シクロペンタンジオール誘導体物質を採取することにより製造することができる。
【００１７】
本発明のシクロペンタンジオール誘導体物質を生産する菌株は、本発明者らが土壌から新たに分離した菌株であり、微生物の名称「アスペルギルス  スピーシーズ  TF-0770 （Aspergillus sp.TF-0770）」及び微生物寄託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５６０ 」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１８】
この菌株の菌学的性状を以下に示す。
（１）培地上での生育状態 
本菌は、各種寒天平板培地上で、生育および胞子形成共に良好である。各種培地上、２５℃、１週間で形成したコロニーの特徴を次の表１に示した。なお色の表示は、A.Kornerupら著『Dizionario dei colori』Musterschmidt(1978年)のカラーコードを引用した。
【００１９】
【表１】
2005281161.tif 000003
【００２０】
培地１：ツアペック麦芽エキス寒天培地(CYA)  
培地２：麦芽エキス寒天培地(MEA)
培地３：*-3：２０％スクロース入りツアペック麦芽エキス寒天培地(CY20S)
培地４：ポテト・デキストロース寒天培地(PDA)（栄研化学（株）製、Ｅ−ＭＦ２１）
培地５：サブロー寒天培地(SA)（栄研化学（株）製、Ｅ−ＭＦ０３）
*培地１、２、３：Maren A. Klich、John I. Pitt著『A Laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs』Commonwealth Scientific and Industrial Rese arch Organization、 Division of Food Processing（1988年）。
【００２１】
（２）形態
本菌がＣＹＡ寒天平板上、２５℃、７日間の培養で形成したコロニーから、光学顕微鏡にて形態的特徴を観察した結果、分生子柄は滑面、150〜360 x 3〜9.0 μm。先端に球形〜半球形の頂のうを形成する。頂のうの直径は、7.0〜18.0 μm、上部2/3から1/2部分でメトレを生じる。メトレは、5.0〜8.0 x 1.2〜2.0 μm、フィアライドは、5.0〜6.4 x 1.2〜2.0 μmである。分生子は滑面、球形〜亜球形で、直径は2.0〜2.8 μm。潜入菌糸の側面から直接または短い柄を介して滑面、球形から亜球形、直径4.0〜8.0 μmの厚膜胞子様細胞が多数単生する。
なお、培養を１カ月以上延長してもテレオモルフの形態は認められなかった。
【００２２】
（３）生理的性質
・生育温度範囲及び最適温度
本菌株はｐＨ６．０のサブロー液体培地において、１５〜４５℃の範囲で生育し、最適温度は３３〜３８℃である。
・生育ｐＨ範囲及び最適ｐＨ
本菌株はＹｐＳｓ液体培地中、２５℃においてｐＨ３〜１０の範囲で生育し、最適ｐＨは５〜６である。
【００２３】
（４）好気性、嫌気性の区別 ； 好気性
上記の形態的特徴および培養上の性状は、宇田川 俊一、椿 啓介 編『菌類図鑑』講談社（1978年）およびK. B. Raper、D. I. Fennell著『The genus Aspergillus』The Williams & Wilkins Company（1965年）等に記載されたアスペルギルス（Aspergillus）属の特徴と良く一致するものであり、本菌株が、不完全菌亜門、アスペルギルス（Aspergillus）属の１菌種であることが明らかとなった。
【００２４】
以上の知見から、本菌株を「アスペルギルス  スピーシーズ  TF-0770 （Aspergillus sp.TF-0770）」と命名した。
【００２５】
シクロペンタンジオール誘導体物質の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でTF-株を好気的条件下で培養することにより行う。
【００２６】
培地は主として液体培地を用い、炭素源、窒素源、無機塩よりなり、必要に応じてビタミン類、先駆物質および消泡剤を加えることができ、pHは7前後に調製する。炭素源としては、例えばグルコース、スクロース、デキストリン、グリセリン、澱粉などを単独かまたは混合して用いる。窒素源としては、例えば肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトン、コーン・スティープ・リカー、尿素、アンモニウム塩などを単独または混合して用いる。無機塩としては、例えばリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを、単独または混合して用いる。消泡剤としてはアデカノール、シリコン化合物などを用いることができる。
【００２７】
培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気的培養が適しており、pH 4〜10、25〜35℃で2〜5日間、望ましくはpH 6〜7、25〜28℃で4日間培養する。
【００２８】
本発明の化合物は、発酵生産物について一般的な方法で精製を行うことにより得られる。すなわち、培養終了後、遠心分離または濾過により培養濾液を得、ダイヤイオンHP-20（商品名、三菱化学社製）などのポリスチレン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で溶出させる。菌体は低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒で抽出する。次いでこの菌体抽出液および吸着樹脂からの溶出液を合わせて減圧濃縮し、有機溶媒を除去した後、酢酸エチル、クロロホルム、ｎ−ブタノールなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーおよび逆層分配用ODSを充填したカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに伏すことにより本発明化合物を精製単離することができる。
【００２９】
本発明における塩としては、硫酸、塩酸、燐酸などの鉱酸との塩、酢酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、フマール酸、マレイン酸、メタンスルホン酸などの有機酸との塩、トリメチルアミン、メチルアミンなどのアミンとの塩、またはナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンとの塩などが挙げられる。
【００３０】
前記式［Ｉ］化合物をショウジョウバエの内因性抗菌物質発現作用に基づく自然免疫阻害剤又は抗昆虫剤として用いる場合の態様としては、例えば、水和剤、顆粒水和剤、水溶剤、乳剤、液剤、水中懸濁剤・水中乳化剤等のフロアブル剤、カプセル剤、粉剤、粒剤、エアゾール剤が挙げられる。
【００３１】
使用方法としては、有害生物の種類や発生量、対象とする農作物・樹木等の種類や栽培形態・生育状態により異なるが、例えば、前記水和剤、顆粒水和剤、水溶剤、乳剤、液剤、水中懸濁剤・水中乳化剤等のフロアブル剤、カプセル剤では、これらを水で希釈し、農作物、樹木等に散布すればよい。また、粉剤、粒剤、エアゾール剤では、製剤の状態で散布等すればよい。
【００３２】
そして、前記式［Ｉ］化合物を含有する抗昆虫剤を予め農作物に散布しておくと、農作物の病気が発生しても免疫機能の低下した昆虫は病気に感染し、健康な農作物に病原菌等を伝播することなく死滅し、被害の発生を最小限に抑えることができる。また、農作物に被害を与える病害昆虫は免疫機能が低下しているため通常よりも少量の殺虫剤によって容易に駆除できる。
【実施例】
【００３３】
以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３４】
実施例１
下記シクロペンタンジオール誘導体物質（以下、適宜「TP-1」と略記する）の製造
【００３５】
【化２】
2005281161.tif 000004
【００３６】
（１）グルコース２%、ポリペプトン0.5ｇ、酵母エキス0.2ｇ、リン酸一カリウム0.1ｇ、硫酸マグネシウム0.05ｇを含む液体培地100 mlを500 mlの三角フラスコに入れ、120℃、2気圧で20分滅菌した。次いで、この無菌培地にAspergillus sp.TF-0770株を接種し、26℃、200 rpmで96時間回転振とう培養し、種培養とした。
【００３７】
次に５０L容培養ジャー1基を用いて、種培養と同じ組成の無菌培地３０Lに前記種培養液３００ｍｌを接種し、２６℃、９６時間通気攪拌培養した。
【００３８】
培養終了後、吸引濾過により上清液と菌体に分けた。得られた上清液を１．５LのHP-20（商品名、三菱化成社製）に吸着させた。アセトンで溶出し、これを菌体のアセトン抽出液と合わせて濃縮後、その濃縮液を５Lのブタノールで抽出した。この抽出液を減圧濃縮乾燥し、褐色のシロップ状物質82.8ｇを得た。    
【００３９】
（２）前項のシロップ状物質82.8 gをメタノール500 mlに溶解し、さらにn-ヘキサン500 mlを加えて抽出した。n-ヘキサン層を除いた後、1000 rpmで10分間遠心分離し、上澄みのメタノール層を減圧濃縮乾固して、褐色油状物質39.2ｇを得た。
【００４０】
（３）前項の褐色油状物質のうち、7ｇを水 450 ml に懸濁させ、酢酸エチル 450 ml で３回抽出した。酢酸エチル層を全て合わせて溶媒を減圧留去し 酢酸エチル可溶画分 5.5 g を得た。
【００４１】
この酢酸エチル可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、n-ヘキサン-酢酸エチル、酢酸エチル-メタノールの混合溶媒系で溶出を行い、計７画分を得た。n-ヘキサン-酢酸エチル (1:2) で溶出した画分 543 mg のうち、244 mg を ODS を担体とするカラムクロマトグラフィに付し、水-アセトニトリルの混合溶媒系で溶出を行い、計５画分を得た。水-アセトニトリル (9:1) で溶出した画分 37.3 mg のうち、22.8 mg をシリカゲルカラムクロマトグラフィに付し、クロロホルム-メタノールの混合溶媒系で溶出を行い、クロロホルム-メタノール (49:1) で溶出した画分より、化合物１を12.8mg得た。化合物１は((c-4((E)-1-propenyl)-r-1,c-2-cyclopentanediol)である。この化合物（TP-1）のＮＭＲスペクトルについて図１及び図２に示した。
【００４２】
1H NMR (400MHz, CDCl3) d 5.33-5.48 (2H, m), 3.98-4.05 (1H, m), 2.53 (1H, br.s), 2.38 (1H,ddd, J = 9.1, 8.9, 6.1 Hz), 2.11 (2H, ddd, J = 13.6, 8.9, 4.6 Hz), 1.64 (3H, d, J = 5.1 Hz), 1.48(2H, ddd, J = 13.6, 9.1, 4.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d 135.5, 123.5, 73.2 (2C), 38.8 (2C), 36.9, 17.8; EIMS ｍ/z 142, 124, 109, 97, 83, 69, 55, 41 (base); HREIMS 142.0983 (142.0994 calcd. for C8H12O2)
【００４３】
試験例１  ショウジョウバエの内因性抗菌物質Diptericin発現阻害活性
（試験動物）
ショウジョウバエの内因性抗菌物質 Diptericin の転写制御領域にレポーター遺伝子 lacZ をつないだ遺伝子を導入したショウジョウバエを１８あるいは２５℃で飼育し、実験時に雌の３齢幼虫を選別して用いた。
【００４４】
（試験方法）
ショウジョウバエの幼虫を解剖することで内因性抗菌物質産生器官である脂肪体を露出させ、20%(v/v)牛胎児血清、1%(v/v) antibiotic antimycotic (SIGMA社製) を含んだ Schneider's Drosophila 培地中、２５℃で１２時間培養した。化合物１は実施例１のように製造し、目的濃度になるようジメチルスルホキシドに溶解させ、培養培地に添加した。陽対照として自然免疫活性化能を有するリポポリサッカライド(LPS)を精製水に溶解させ、最終濃度10mg/mL になるように培養培地に添加した。各試料につき６匹の幼虫を用いた。
【００４５】
Diptericin 遺伝子発現量の指標として、レポータータンパク質であるβ-galactosidase をそれぞれの幼虫について定量し、その平均値を求めた。 試料を全く添加していない時の平均値を０、陽対照の平均値を１００とし、各濃度の化合物１を添加したときの自然免疫抑制作用を求めた。
【００４６】
（結果）
表２に示すように、TP-1は濃度依存的に自然免疫抑制作用を示した。
【００４７】
【表２】
2005281161.tif 000005
【００４８】
試験例２
実験には、羽化後１２時間以内の野生型ショウジョウバエ成虫（Oregon R）と、ジャガイモの黒脚病などを引き起こしショウジョウバエによって媒介されることがすでに知られているErwinia carotovora （Basset A, Khush RS, Braun A, Gardan L, Boccard F, Hoffmann JA,Lemaitre B. (2000) The phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora infects Drosophila and activates an immune response. Proc Natl Acad Sci U S A., 97 (7):3376-3381. 参照）を用いた。 
【００４９】
感染実験は、すでに確立され、広く用いられている方法（Tzou P., Meister M., Lemaitre B.(2001) Methods for studying infection and immunity in Drosophila. Methods in Microbiology 31:507-529. 参照）に従った。すなわち、Erwinia carotovoraシングルコロニーを液体培地に入れ、１晩振とう培養した。遠心 (3600_g, 5min, 室温) 後、培養液をほぼ除去した。沈査を昆虫生理食塩水（130mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl2）に懸濁後、新たな遠心管に移した。遠心 (2000_g, 5min, 室温) 後、上清を除き、菌体量と同量の昆虫生理食塩水を加え菌懸濁液とした。感染は、一群３０匹の成虫を用いて、菌懸濁液に浸したタングステンニードルで胸部背中側を傷つけることにより行った。TP-1は5mg/mlの濃度のショ糖溶液として、濾紙にしみこませ、この濾紙と共に成虫を飼育することにより、断続的に経口投与した。飼育は、２５℃で行った。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
抗昆虫剤の分野では、自然免疫経路の阻害は新しい作用機作である。特異性及び有効性に優れた自然免疫経路阻害物質は、昆虫の自然免疫系を阻害し、農作物の病気を媒介する昆虫を駆除して被害の拡散を防ぐという新しいタイプの抗昆虫剤としての開発が期待される。  
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】重クロロホルム中、400 MHzで測定した化合物１の1H-NMRスペクトルを示す。
【図２】重クロロホルム中、100 MHzで測定した化合物１の13C-NMRスペクトルを示す。
【図３】化合物TP-1によるE. carotovora感染ショウジョウバエの駆除の様子を表す。化合物１は5mg/mlの濃度のショ糖溶液として、濾紙にしみこませ、４日間（-1、0、1、2 day）断続的にハエに経口投与した。E. carotovoraはday 0に胸部に感染させた。縦軸は、生存率を示し、横軸は飼育日数を示している。
【図１】
2005281161.tif 000008
【図２】
2005281161.tif 000009
【図３】
2005281161.tif 000010