(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品もしくは医薬品の原料として有用なソヤサポゲノールＢを、ソフォラジオールから新規に製造する方法の提供。【解決手段】カンゾウのカルスをナフタレン酢酸及び６−ベンジルアミノプリンを含む培地で培養したものなど、植物培養物に由来の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールとＮＡＤＰＨを原料とし、ソフォラジオールのオレアナン骨格の24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールＢの新規な製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の水酸化酵素を用いて、ソフォラジオールからソヤサポゲノールＢを生産することを特徴とするソヤサポゲノールＢの製造法
【請求項２】
カンゾウの水酸化酵素を用いて、ソフォラジオールからソヤサポゲノールＢを生産することを特徴とする請求項１記載のソヤサポゲノールＢの製造法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の水酸化酵素を用いた、ソヤサポゲノールＢ（soyasapogenol  B）の新規な製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ソヤサポゲノールＢ（12-oleanane-3,22,24-triol）は大豆種子より単離・構造決定されたオレアナン骨格を有するトリテルペン（Chem. Pharm. Bull.  24,121-129,1976、Chem. Pharm. Bull.   30,2294-2297,1982）であり、その配糖体であるソヤサポニンはマメ科植物に広く分布している。これまでにソヤサポゲノールＢに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用（特開昭61-37749）、抗腫瘍活性（特開平10-234396）および肝保護作用（Bioorg.Med.Chem. Lett.7,85-88,1997）などが報告されており、医薬品もしくは医薬品原料としての有用性が期待されている。
【０００３】
ソヤサポゲノールＢの製造法としては、大豆種子に含有されるサポニンの糖鎖を加水分解したのち、ソヤサポゲノールＢを精製する方法が知られているが、大豆種子に含有されているサポニンの割合は約0.2％（薬学雑誌104,162-168,1984）と少なく、より効率的な製造法が求められていた。
【０００４】
ソヤサポゲノールＢと構造的に類似するソフォラジオール（12-oleanene-3,22-diol）は槐花（エンジュ）の成分として報告されている物質（薬学雑誌78,1090-1094,1958）であるが、このソフォラジオールの２４位を水酸化すると目的であるソヤサポゲノールＢを生産することが可能である。しかしながら、化学合成的な手法で位置選択的に水酸基を導入することは困難である。
従来より、位置選択的に水酸基を導入する方法として微生物による培養変換法が古くから研究されており、ステロイド類では位置選択的に水酸基を導入する微生物が多数発見されている。一方、植物の生合成機能を利用する方法に関する研究も進められており、培養細胞を用いて水酸化や配糖化などが試みられている。
【０００５】
これまでにカンゾウの培養細胞がグリシルレチン酸（3-Hydroxy-11-oxo- 12-oleanene-30-oic acid）の24位を水酸化して、24-ハイドロキシグリシルレチン酸を生成することが報告（Phytochemistry 34,1303-1307,1993）されているが、ソフォラジオールを水酸化してソヤサポゲノールＢを生産したことは報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
植物の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールの24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールＢの製造法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
カンゾウ（Glycyrrhiza glabra）培養細胞から酵素画分を調製して、ソフォラジオールの24位を水酸化するための条件を検討した。その結果、カンゾウ培養細胞のミクロソーム画分にNADPHとソフォラジオールを添加してインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールＢを生産することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨とするところは、植物特に好ましくはカンゾウの水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールからソヤサポゲノールＢを生産することを特徴とする、ソヤサポゲノールＢの製造法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
1. 酵素画分の調製法
本発明に用いることができる植物は、ソヤサポゲノールＢを生合成する植物であれば、オレアナン骨格の24位を水酸化する機能を有すると考えられることから、カンゾウに限定されるものではなく、ソヤサポゲノールＢを含有するマメ科のダイズ、クララ、アルファルファなども利用できる。またその形態としては、種子から発芽して間もない幼植物体、栽培した植物体、あるいはカルスなどの培養細胞のいずれからでも調製することができる。
【０００９】
収穫した植物あるいは細胞を適当な方法で破砕し、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを含む緩衝液中で撹拌する。これをろ過や遠心沈降などの方法で処理して不溶物を除去し、酵素を抽出することができる。酵素の比活性を高めるため、超遠心により粗抽出液からミクロソーム画分を調製しても有効である。またゲルろ過やイオン交換樹脂などの常法によってさらに比活性を高めることも可能である。
【００１０】
2. ソヤサポゲノールＢの生産
適当な緩衝液に懸濁した酵素画分に、NADPHおよびソフォラジオールを加えてインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールＢを生産することができる。得られたソヤサポゲノールＢは、酢酸エチルやクロロホルムなどの有機溶媒で抽出し、シリカゲルやODSを用いて精製することができる。また単にソヤサポゲノールＢの生産を確認するだけであれば、有機溶媒での抽出物をTLCあるいはHPLC、GC、GC-MS、LC-MSなどの分析機器により検出、定量することができる。
【００１１】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではなく、本発明によって明らかにされた事実に基づいて、酵素学的にソヤサポゲノールＢを生産する手法をすべて包括する。
【００１２】
【実施例１】
カンゾウ培養細胞は、カンゾウ（Glycyrrhiza glabra）の幼植物より誘導したカルスを100 μMのナフタレン酢酸と1 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地で継代培養（Phytochemistry  29,3127-3129,1990）したものを用いた。ソヤサポニン生産培地である1 μMのナフタレン酢酸と10 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地に移植後10日目に細胞を収穫し（30g新鮮重）、液体窒素で凍結して乳鉢中で粉砕後、PVPP 3ｇと、0.25 M ショ糖、2 mM EDTA、20 mM 2-メルカプトエタノールを含む0.1 M トリス塩酸緩衝液（pH 7.5）60 mlを加えてホモジナイズした。これをガーゼでろ過し、10,000 x gで10分間遠心した。遠心上清について、さらに100,000 x gで30分間遠心して得られた沈殿部に、20%グリセロール、2 mM EDTA、20 mM 2メルカプトエタノールを含む0.1 M Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）6 mlを加えて懸濁し、ミクロソーム画分とした。
ミクロソーム画分1 mlに、NADPH（終濃度2 mM）およびソフォラジオール（終濃度50μM、Bioorg.Med.Chem.Lett.7,85-88,1997記載の方法により合成）をそれぞれ加え、15℃で30分間インキュベートした。反応終了後、これをエ-テル5 mlで2回抽出して、乾固後、200μlのメタノールに溶解した。
抽出液をLC-MS（Hewlett-Packard製、HP1090）で分析し、保持時間並びにマスフラグメントをソヤサポゲノールＢの標品（和光純薬製）と比較した結果、ソヤサポゲノールＢの生産を確認することができた。LC-MSによる分析条件と検出したマススペクトルを以下に示した。
【００１３】
2005137201.tif 000002
【００１４】
【発明の効果】
本発明は医薬品もしくは医薬品の合成原料であるソヤサポゲノールＢの製造法として有用である。