(57)【要約】【課題】  本発明により、細胞の呼吸複合体の正常な形成に関与し分子が提供され、新規方法によるアルツハイマー病の検出およびその危険率の検出方法が提供される。【解決手段】  本発明は、DLST遺伝子のイントロン７内のいずれかの塩基から転写開始された転写産物である、ミトコンドリア呼吸産生性トランケイティドDLSTタンパク質(Mitochondrial Respiration Generator of Truncated DLST; MIRTD)、およびそれをコードする核酸を提供する。さらに本発明により、MIRTDの発現量を指標として、アルツハイマー病の発症リスクを判定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または（ｂ）のいずれかのタンパク質。
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ(a)のタンパク質と同じ活性を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
以下の(a)または(b)の核酸。
(a)  配列番号２に示す塩基配列を有する核酸
(b)  配列番号２に示す塩基配列を有する核酸に相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸
【請求項４】
被験者から採取した細胞の、ジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子のイントロン７内の塩基から転写開始された転写産物である、ミトコンドリア呼吸産生性トランケイティドDLSTタンパク質(MIRTD)mRNAを定量することを含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定する方法。
【請求項５】
被験者から採取した細胞のMIRTDタンパク質を定量することを含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定する方法。
【請求項６】
細胞が、神経組織、心臓、肝臓および腎臓からなる群より選択されるいずれかに由来するものであることを特徴とする、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
被験者のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子の第１０５７９番目の塩基がTであるか否かを調べることから成る、アルツハイマー病の発症リスクを判定する方法。
【請求項８】
前記遺伝子を末梢血から抽出することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子中のイントロン７内のいずれかの塩基から転写開始された転写産物であるMIRTD mRNA検出用のプライマー対を含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定するための診断キット。
【請求項１０】
MIRTD mRNA検出用のプライマー対が、5'-ctcatttcagacagtgccagtg-3'（配列番号５）および5'-tggctcagctagtggtggg-3'（配列番号６）からなる、請求項９記載の診断キット。
【請求項１１】
MIRTD mRNA定量用のTaqManプローブであって、5'-cctccttctggcaaacctgtgtct-3'（配列番号７）の5’末端にレポーターとして発光色素が、3'末端に該発光色素に対する消光剤が付加されたプローブをさらに含む、請求項９または１０記載の診断キット。
【請求項１２】
標準化用全長DLST mRNA量を測定するためのプライマー対として5'-acctacagcagcggcagt-3'（配列番号３）および5'-ctcctggctcagctagtggt-3'（配列番号４）をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか1項に記載の診断キット。
【請求項１３】
MIRTDタンパク質を検出するためのMIRTDを特異的に認識する抗体を含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定するための診断キット。
【請求項１４】
配列番号１に示す配列からなる、DLSTのエキソン8のメチオニンから下流の領域を含むDLSTのC末端フラグメントを免疫原として作製された、MIRTDを特異的に認識する抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１４または１５記載の抗体を含む、請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病、およびその危険性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（AD）は、認識機能の喪失及び痴呆により特徴付けられる進行性の神経疾患である。この疾患の生物学的メカニズムはよくわかっていないが、家族性の早期発症ADについては、３つの遺伝子、すなわち第２１染色体上のアミロイド前駆体タンパク質遺伝子、第１４染色体上のプレセニリン‐１遺伝子、及び第１染色体上のプレセニリン‐２遺伝子中の突然変異がリンケージ解析及びポジショナルクローニングにより同定されている。孤発性ADの４０〜５０％については、第１９染色体上のアポリポプロテインＥ遺伝子の特定の対立遺伝子がAD発症の加速と関連している。
【０００３】
一方、哺乳類動物のα‐ケトグルタル酸脱水素酵素複合体（KGDHC）はミトコンドリア中に存在し、クレブス回路において、α‐ケトグルタル酸の酸化的脱カルボキシル化の律速段階を触媒してサクシニル‐CoAを合成するものである。この複合体は、３つの異なる酵素、すなわち、α‐ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロリポアミド脱水素酵素、及び中核酵素であるジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素（DLST）から成る。この複合体の酵素活性がAD患者の脳及び培養フィブロブラスト中でしばしば減少していることが報告されている（Mastrogiacomo Fら、J Neurochem 1993;61:2007-2014など参照のこと）。また、本発明者らの研究により、孤発性AD患者において、DLST遺伝子の第19117番目及び第19183番目の塩基が置換している遺伝子がホモ接合になっている頻度が健常人に比較して有意に高いことが見出されている(特許文献１参照のこと)。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１‐３０８９９６号公報
【非特許文献１】THE LANCET 第350巻  第9088頁
【非特許文献２】Eur. J. Biochem., 第224巻  第179-189頁 (1994年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞の呼吸機能に関与する分子である、DLST遺伝子のイントロン７内のいずれかの塩基から転写開始された転写産物である、ミトコンドリア呼吸産生性トランケイティドDLSTタンパク質(Mitochondrial Respiration Generator of Truncated DLST;MIRTD)、およびそれをコードする核酸を提供する。さらなる本発明の目的は、アルツハイマー病およびその危険性の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、神経細胞において、DLSTの末端切断型のタンパク質が発現しており、該タンパク質はDLST遺伝子のイントロン７内のいずれかの塩基から転写開始された転写産物に由来するDLSTのエキソン８および９からなるものであることを見出し、ミトコンドリア呼吸産生性トランケイティドDLSTタンパク質(Mitochondrial Respiration Generator of Truncated DLST;以下MIRTD)と命名した。さらに、MIRTD mRNAおよびMIRTDタンパク質が、AD患者の脳において、健常者に比べて減少していることを見出した。
【０００７】
さらに、DLST遺伝子における第10579位の遺伝子がTであるハプロタイプにおいてMIRTD mRNAの量の低減が認められるという知見を得た。
【０００８】
以上より、本発明は、以下の
１．  以下の(a)または（ｂ）のいずれかのタンパク質：
(a)  配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)  配列番号１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ(a)のタンパク質と同じ活性、すなわち、過酸化水素等による細胞外刺激による酸化ストレス耐性を維持し、および/またはミトコンドリア呼吸鎖酵素複合体（特にコンプレックスIおよび/またはIV）の形成を促進する活性、を有するタンパク質；
２．  上記１記載のタンパク質をコードする核酸；
３．  以下の(a)または(b)の核酸：
(a)  配列番号２に示す塩基配列を有する核酸
(b)  配列番号２に示す塩基配列を有する核酸に相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸；
４．  被験者から採取した細胞の、ジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子のイントロン７内の塩基から転写開始された転写産物である、ミトコンドリア呼吸産生性トランケイティドDLSTタンパク質(MIRTD)mRNAを定量することを含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定する方法；
５．  被験者から採取した細胞のMIRTDタンパク質を定量することを含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定する方法；
６．  細胞が、神経組織、心臓、肝臓および腎臓からなる群またはその他の任意の組織より選択されるいずれかに由来するものであることを特徴とする、上記４または５記載の方法；
７．  被験者のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子の第１０５７９番目の塩基がTであるか否かを調べることから成る、アルツハイマー病の発症リスクを判定する方法；
８．  前記遺伝子を末梢血から抽出することを特徴とする、上記７記載の方法；
９．  ジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素(DLST)遺伝子中のイントロン７内のいずれかの塩基から転写開始された転写産物であるMIRTD mRNA検出用のプライマー対を含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定するための診断キット；
１０．  MIRTD mRNA検出用のプライマー対が、5'-ctcatttcagacagtgccagtg-3'（配列番号５）および5'-tggctcagctagtggtggg-3'（配列番号６）からなる、上記９記載の診断キット；
１１．  MIRTD mRNA定量用のTaqManプローブであって、5'-cctccttctggcaaacctgtgtct-3'（配列番号７）の5’末端にレポーターとして発光色素が、3'末端に該発光色素に対する消光剤が付加されたプローブをさらに含む、上記９または１０記載の診断キット；
１２．  標準化用全長DLST mRNA量を測定するためのプライマー対として5'-acctacagcagcggcagt-3'（配列番号３）および5'-ctcctggctcagctagtggt-3'（配列番号４）をさらに含む、上記９〜１１のいずれかに記載の診断キット；
１３．  MIRTDタンパク質を検出するためのMIRTDを特異的に認識する抗体を含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定するための診断キット；
１４．  配列番号１に示す配列からなる、DLSTのエキソン8のメチオニンから下流の領域を含むDLSTのC末端フラグメントを免疫原として作製された、MIRTDを特異的に認識する抗体；
１５．  モノクローナル抗体である、上記１４記載の抗体；
１６．  上記１４または１５記載の抗体を含む、上記１３記載のキット；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、細胞（特に神経細胞）における呼吸鎖複合体（特に、コンプレックスIおよびコンプレックスIV）の形成を促進するMIRTDタンパク質が提供される。また、本発明により、MIRTDの発現量またはmRNA量を定量することによるADの発症リスクの判定、ならびに、DLST遺伝子のハプロタイプの特定に基づく方法によるADの発症リスクの判定が可能となった。該ハプロタイプの特定に基づく方法によると、染色体中の１塩基を同定するだけで、ADの発症リスクの指標とすることができ、被験者にとって有益な情報を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下本発明を詳述する。
DLSTは、クレブス回路においてα‐ケトグルタル酸の酸化的脱カルボキシル化の律速段階を触媒してサクシニル‐CoAを合成するα-KGDHCの中核酵素であり、そのヒト遺伝子は、第14染色体上のq24.2-q24.3に位置しているが(Nakanoら、1993, Biochim. Biophys. Acta, 1216, 360-368)、総数15個のエキソンからなり、すなわち該遺伝子中には14個のイントロンが存在する(Nakanoら、1994、Eur. J.Biochem. 224 179-189)。
【００１１】
本発明に至る研究において、本発明者らは、ヒト神経モデル細胞株において該遺伝子の第７イントロン内のいずれかの塩基（例えば、第10556位の塩基およびこの付近）を転写開始点とする末端切断型DLST(本明細書中においては、MIRTDと称する) mRNAが存在することを見出した。なお、本発明者らは、該MIRTDが脳、心臓、腎臓、肝臓をはじめとするあらゆる組識に存在しているであろうという知見を得ている。
【００１２】
ヒトMIRTDのアミノ酸配列を配列番号１に示す。該タンパク質は、本明細書の実施例に記載のように、ミトコンドリア外膜と内膜の間に存在し、ミトコンドリアの呼吸鎖酵素複合体（特に、コンプレックスIおよびコンプレックスIV）の形成に関与しており、該タンパク質が欠損することにより、これら複合体の形成は著しく抑制される。したがって、細胞内の該タンパク質量を増大させることにより、呼吸不全が改善され、細胞の障害または細胞死を抑制することができるものと考えられる。特に、ADを含む神経変性疾患においては、変性を伴う細胞内のMIRTDの量を増大させることにより、細胞障害または細胞死を抑制することができ、これによりその発症またはその進行を回避または抑制することができると考えられる。事実、MIRTDについてAD脳におけるその存在量を確認したところ、該MIRTDのmRNA量は、AD脳では健常者(ADでないヒト)の該mRNA量に比べて、有意に低減していることを、本発明者らは見出している。
【００１３】
したがって、本発明は、配列番号１に示すヒトMIRTDタンパク質に関する。また配列番号１に示すアミノ酸配列において、1〜50個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、MIRTDタンパク質と同じ活性、すなわちミトコンドリア呼吸鎖酵素複合体形成活性を有するタンパク質、またはMIRTDタンパク質と機能的に同等のタンパク質もまた本発明に包含され得る。さらには、配列番号１に示すアミノ酸配列との相同性が、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合）、75％以上、80％以上、85％以上または90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、MIRTDタンパク質と同じ活性、すなわちミトコンドリア呼吸鎖酵素複合体形成活性を有するタンパク質、またはMIRTDタンパク質と機能的に同等のタンパク質もまた本発明に包含され得る。
【００１４】
対象とするタンパク質がMIRTDタンパク質と同じ活性を有するか否かについては、対象とするタンパク質を、MIRTDを発現していない細胞に強制発現させ、この細胞を後述の実施例に記載の呼吸鎖複合体活性のアッセイ等に供することによって判定することができる。その他には、上記強制発現させた細胞を過酸化水素に曝露し、過酸化水素に対する耐性の増大を調べることにより達成することができる。MIRTDタンパク質は呼吸鎖複合体形成に必須であり、その発現により細胞外過酸化水素刺激による酸化ストレスに対する耐性が向上することが本発明者らにより明らかにされている。詳細には本明細書の実施例を参照されたい。
【００１５】
そして、本発明はまた、上記のタンパク質をコードする核酸（DNAおよびRNAを含む）も包含する。当業者であれば、上記タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、それをコードする核酸を設計および合成または作製することができる。配列番号２に配列番号１に示すアミノ酸配列からなるMIRTDをコードするDNA配列の一例を示している。しかしながら、配列番号２に示す配列に限らず、これと縮重の関係にあるDNAも本発明に含まれる。さらに、配列番号２に示す配列またはこれに縮重の関係にある配列を有するDNAまたは該DNAの配列に対応するRNAに相補的な核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸もまた、本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が、10mM〜300mM、好ましくは42〜55℃、より好ましくは42℃での条件をいう。さらに、配列番号２に示す塩基配列を含むヌクレオチドにおいて１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸も本発明に含まれる。ここで、欠失、置換若しくは付加される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１〜50個、より好ましくは１〜数個、最も好ましくは１〜３個である。このようなヌクレオチドの塩基配列としては、配列番号２に示す塩基配列との相同性が、BLAST等を用いて計算したときに（例えば、BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメーターを用いた場合）、70％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上若しくは99％以上である。このようなヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列を有するヌクレオチドと実質的に同一である。また、本明細書に言う「核酸」とはDNAおよびRNAに種々の修飾を施した物ならびにこれらのアナログ等も含む。
【００１６】
さらに、上記核酸を外来遺伝子として含む細胞も本発明に含まれる。上記核酸を、遺伝子銃または公知の種々の方法で細胞に導入することができる。導入に当たって、種々のプラスミドまたはウイルスベクター等に該核酸を挿入し、そのベクターを宿主細胞に組込むこともできる。よって、該核酸を含有するベクター（発現ベクターを含む）もまた、本発明の範囲に含まれる。外来遺伝子として上記核酸を細胞内に導入して相同組換え等によりゲノムに該核酸が組込まれた細胞や、該核酸を包含するベクターを包含する細胞も本発明に含まれる。これらの手法は当技術分野の慣用技術により実施でき、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989等を参照するとよい。
【００１７】
また、AD脳におけるMIRTDのmRNA量は、AD脳では健常者(ADでないヒト)の該mRNA量に比べて、有意に低減していることから、被験者の組織由来の細胞中のMIRTDのmRNA量を測定することにより、該組織の由来する患者がAD病であるか否か、またはADの発症リスクの高低を知ることができる。MIRTDは、心臓、神経組織（特に脳）で発現量が高く、肝臓、腎臓にも存在することが確認されているが、DLSTと同様普遍的に発現しているものと考えられるため、あらゆる組織（血液を含む）のいずれかに由来する細胞を用いればよく、神経組織、心臓、肝臓および腎臓からなる群より選択される組織に由来する細胞を用いることが好ましい。特に好ましくは、中枢神経組織に由来する細胞を用いる。
【００１８】
すなわち、被験者から特定の組織を採取して、該組織サンプルを常法に従って処理して、該組織中に含まれるMIRTD mRNAを定量するとよい。この定量方法としては種々の方法が公知であるが、例えば、mRNAを精製して定量的RT‐PCR法により定量することができる。さらに好ましくは、TaqMan法等のリアルタイムRT-PCR法により定量する。
【００１９】
MIRTD mRNAの定量用には、DLST遺伝子のイントロン７より3’末端側にハイブリダイズする配列からなるプライマー対を用いるとよいが、全長DLST mRNAと区別するために、イントロン７内にハイブリダイズする配列からなるフォワードプライマーを用いることがさらに好ましい。例えば、イントロン７内の配列にハイブリダイズするフォワードプライマー5'-ctcatttcagacagtgccagtg-3'（配列番号５）とエキソン９内の配列にハイブリダイズするリバースプライマー5'-tggctcagctagtggtggg-3'（配列番号６）からなるプライマー対を用いて定量的RT-PCRを行うことができる。
【００２０】
さらに、TaqMan法によるリアルタイプ定量的PCR法により定量する場合は、5'-cctccttctggcaaacctgtgtct-3'（配列番号７）の5’末端にレポーターとして発光色素が、3'末端に該発光色素に対する消光剤が付加されたプローブと、例えば上記のプライマー対などの適切なMIRTDプライマー対を用いて、常法にしたがってTaqMan法を行うことにより、MIRTD mRNAが定量できる。発光色素とこれに対する消光剤との組み合わせは、例えばFAMとTAMRA等があげられるがこれらに限定されることなく、公知のものを組合わせて利用すればよい。
【００２１】
定量に際しては、組織から精製したmRNA含有サンプルを、GAPDH mRNAまたはβアクチンmRNA等の内因性コントロールとなるmRNAの量を同じ方法で定量し、これに対して標準化してMIRTD mRNA量の相対的な定量値を求めるとよい。例えば、GAPDH mRNAを定量する場合、5'-gggaaggtgaaggtcgga-3'（配列番号８）および5'-gcagccctggtgaccag-3'（配列番号９）からなる配列を有するプライマー対を用いることができる。TaqMan法によりGAPDH mRNAを定量する場合は、5'-caacggatttggtcgtattgggcg-3'（配列番号１０）の5’末端にレポーターとして発光色素を、3'末端に該発光色素に対する消光剤が付加されたプローブを適切なプライマー対と共に共に用いることにより、GAPDH mRNAの定量が可能となる。
【００２２】
または、全長DLST mRNAの量を定量して、この量に対する相対的な定量値としてMIRTDのmRNA量を定量することもできる。標準化用全長DLST mRNA量を測定するためのプライマー対として5'-acctacagcagcggcagt-3'（配列番号３）および5'-ctcctggctcagctagtggt-3'（配列番号４）からなるプライマー対を挙げることができる。さらに、全長DLST mRNAを定量するためのTaqManプローブとしては、上記のMIRTDに対するTaqManプローブを用いることができる。
【００２３】
さらに、当業者であれば、各mRNA定量用のプライマーおよびTaqManプローブは容易に設計することができ、上記に例示した配列を有するものに限定されない。
【００２４】
いずれの定量方法を用いた場合でも、AD病の疑いのなく、かつ／またはacタイプ以外のDLST遺伝子を有するヒトから採取した同じ組織をコントロールとして同様の処理にて測定したコントロールMIRTD mRNA量の比べて、約60％以下、好ましくは50％以下である場合、被験者はADに罹っているか、またはAD発症リスクが高いと判断することができる。かかるコントロール用の組織は、発症リスクのあるヒトを排除するために臨床所見としてAD病の疑いが全くなく、かつacタイプ以外のDLST遺伝子を有するヒトから採取したものが好ましい。後述するようにacタイプのDLST遺伝子を有するヒトは、臨床所見にAD病の疑いがなくても、MIRTDの発現量が相対的に高いことが考えられるからである。
【００２５】
したがって、MIRTD定量用のプライマー対を、ADまたはその発症リスクを判定するための診断キットとして提供することができ、かかる診断キットもまた、本発明の範囲に包含される。さらに、該キットは、上記のような、標準化のためのmRNA定量用プライマー、場合によってはさらにTaqManプローブを含んでもよく、さらには、上記コントロール用の組織または該組織から得た全RNAまたはポリA+RNAを含有してもよい。
【００２６】
また、mRNA量に呼応して、AD患者の脳におけるMIRTDタンパク質量も低減しているので、被検体の組織中のMIRTDタンパク質量を定量することによっても、AD病またはその危険性の検出は可能である。
【００２７】
MIRTDタンパク質量を定量する場合は、各種免疫学化学的方法を用いることができるが、全長DLSTタンパク質を検出しないで末端切断型であるMIRTDタンパク質を特異的に検出する方法を用いるとよい。したがって、全長DLSTについてはそのN末端側を認識する抗体等でプルダウン後のサンプル中のMIRTDタンパク質を該MIRTDを認識する抗体等で検出するか、または全長DLSTとMIRTDとの分子量の差を利用してウェスタンブロット法により免疫化学的方法により定量することができる。例えば、配列番号１に示すエキソン8のメチオニンから下流の領域を含むDLSTのC末端領域を免疫原として作製された、DLSTとMIRTDの両方を特異的に認識する抗体を用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を用いる。DLSTの分子量は約55kDaでありMIRTDの分子量は約30kDaであることから、SDS-PAGEにより分離した上記組織細胞由来のタンパク質を半定量的ウェスタンブロットに供することにより、DLSTとMIRTDの分子量の差を見分けることができ、MIRTDを半定量的に定量することができる。
【００２８】
したがって、上記のようなMIRTDを特異的に認識する抗体を含む、アルツハイマー病またはその発症リスクを判定するための診断キットもまた、本発明の範囲に包含される。本明細書中「MIRTDを特異的に認識し得る抗体」とは、MIRTDのみを特異的に認識する抗体に限定する意味ではなく、DLSTをも認識するが、MIRTDとDLST以外のヒト細胞由来タンパク質は認識しないか、またはわずかしか認識しないために、MIRTDおよびDLST以外のタンパク質とMIRTDとDLSTとを明確に識別できるようにMIRTD（およびDLST）を検出できる抗体をいう。
【００２９】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。さらには、キメラ抗体、抗体フラグメントなど、MIRTDを特異的に認識し得る抗体の可変部領域を含む分子であれば、いかなるものでもよい。
【００３０】
さらに、本発明においては、MIRTD量の低下と関連する遺伝子型が見出されている。本発明者らは既に、ヒトDLST遺伝子について、acタイプ、atタイプ、gcタイプの3種のハプロタイプが存在することを見出しているが(特許文献１参照)、そのacタイプ(第10579位がt、第11044位がa、第11104位がt、第13845位がt、第15456位がt、第17107位がg、第19117位がaおよび第19183位がcであるハプロタイプ)では、MIRTDの転写開始点である第10556位のすぐ近傍である第10579位の塩基が、他のタイプではAであるのに対して、Tとなっている。この第10579位におけるA→Tへの点変異を有するacタイプを有する細胞では、第10579位がAであるgcタイプを有する細胞に比べて、MIRTD mRNAの転写量が減少していることが判明している。
【００３１】
したがって、DLST遺伝子の第10579位の塩基がTであるヒトまたはDLST遺伝子のハプロタイプがacタイプのヒトは、該塩基がAであるヒトまたはacタイプ以外のDLST遺伝子を有しているヒトに比べてADにかかる危険性が高いということができる。
【００３２】
したがって、被験者の染色体上のDLST遺伝子の第10579位の塩基を調べることによりADにかかる危険性を検出することができる。また、acタイプであるかどうかの判定は、上記に記載のacタイプに特異的な変異を検出すればよく、特に第19117位がaで第19183位がcであるか否かを調べればよい。
【００３３】
かかる塩基を調べる方法は、最も直接的な方法である標的領域の塩基配列決定法（シークエンス法）や、特定位置の塩基置換だけを検出する目的の場合に有効な、20塩基程度の合成オリゴヌクレオチドと標的塩基配列とのハイブリッド形成の有無を利用したアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法（MASA法）、標準RNAプローブと標準DNA断片とのハイブリッドをリボヌクレアーゼＡで処理しミスマッチ位置でのプローブRNAの切断で塩基置換の存在とおよその位置を知るリボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法（RNaseプロテクション法）や、DNA配列をPCRで増幅する際に、その一端にGCに富んだ塩基配列（GCクランプ）をつけて変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE）を行い一塩基置換を検出する方法（PCR‐DGGE法）を用いることができる。
【００３４】
また、２本鎖DNA断片を１本鎖に解離し、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、一塩基置換を移動度の差として検出する方法（PCR‐SSCP法）や、塩基配列特異的プローブ（SSOP）を用いたハイブリダイゼーション法（PCR‐SSOP法）や、その変法（PCR‐RD法やPCR‐MPH法）や、ある領域をPCR法などで増幅した後、点突然変異が生じた部位を切断部位と認識する制限酵素で処理して点突然変異を生じなかったDNAとはサイズの違ったアリルとして検出するPCR‐RFLP法（特開平5-308999号公報）や、標的DNAの3'末端のヌクレオチド部位に隣接する核酸配列に対して検出プライマーをアニールすることと、DNAポリメラーゼを用いて、検出するヌクレオチドに対して相補性の、シングルラベルのヌクレオチド三リン酸でかかるプライマーを伸長する方法（ミニシークエンシング法）等も用いることができる。
【００３５】
また、TaqManPCR法、インベーダー法等種々の公知のSNPタイピング法によっても検出することができる。例えば、TaqManPCR法による場合は、上記10579位に該当する位置にTを含み、その周囲の約20塩基程度の配列にハイブリダイズするよう設計したプローブを作製する。該プローブの5’末端には蛍光色素を、3’末端には消光剤を付け、さらに3’末端をリン酸化しておく。そして、該プローブを被検体から採取した組織サンプル(任意の組織であってよい)から抽出した鋳型DNAにハイブリダイズさせて、さらに該プローブ領域を増幅するように設計したPCRプライマーとTaqDNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行う。TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、プライマーからの伸長反応がプローブの5’末端に到達するとプローブの5’末端を切断する。これにより、蛍光色素が消光剤から離れて蛍光を発するようになる。該蛍光を計測することによりプローブが鋳型にハイブリダイズしていたか否かが判り、それにより10579位の塩基がTであるか否か判明する。TaqManPCR法の具体的な方法は、種々の文献に開示されている。
【００３６】
一塩基の変異を検出できる方法であれば、上記の方法に限定されることなく、本発明に用いることができる。
【００３７】
なお、本明細書中のDLST遺伝子の塩基位置のナンバリングについては、Nakano Kら、Eur J Biochem. 1994 Aug 15;224(1):179-189.の記載にしたがった。EMBO J. 22  2913-2923 (2003)の記載とは一塩基のずれが認められるが、この論文中の記載にある塩基番号19183は本来19182とすべき誤記であり、本明細書においてはこれを改めた。
【実施例】
【００３８】
材料および方法
細胞培養
ヒト神経芽細胞腫の細胞株SH-SY5Y は、15% ウシ胎児血清（FBS）、2mMグルタミン、20IU/ml ペニシリンおよび20μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で、5%CO2下37℃で培養された。ラット褐色細胞腫PC12は、5% FBS、5%非働化ウマ血清、100IU/ml ペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシンを添加したDMEMで培養した。
【００３９】
脳サンプル
AD患者の脳サンプルおよび対照サンプルは、死後40から660分（255.0  174.9）のものから皮質を採取した。AD患者の平均年齢は77.7±6.5歳（60〜86歳）であり、一方、対照の平均年齢は65.9±9.0歳（48〜79歳）であった。acタイプのキャリアの頻度は、ADおよび対照群でそれぞれ32%および24%であった。
【００４０】
定量RT-PCR
全RNAは、ヒトの脳および培養細胞のサンプルから、製造業者の推奨するプロトコールに従いRNeasy Mini Kit（Qiagen）またはISOGEN（Wako）を用いて単離した。Poly (A)+ RNAはQuickPrep mRNA Purification Kit（Amersham Bioscience）を用いて全RNAから精製した。第一鎖cDNAはオリゴ（dT）プライマー（Invitrogen）を用いて、SUPERSCRIPT II RT（Invitrogen）によって合成した。
【００４１】
mRNA量はABI PRISM 7700 Sequence Detector System（Applied Biosystems）を用いたリアルタイム定量RT-PCRによって定量した（Hollandら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7276-7280.; Livakら、1995, PCR Methods Appl., 4, 357-362.）。測定は少なくとも3回行い平均値を求めた。Primer Express software program（Applied Biosystems）によって設計したプライマーおよびプローブは次のとおりである：DLSTフォワードプライマー; 5'-acctacagcagcggcagt-3'（エキソン8：配列番号３）、DLSTリバースプライマー; 5'-ctcctggctcagctagtggt-3'（エキソン9：配列番号４）、MIRTDフォワードプライマー; 5'-ctcatttcagacagtgccagtg-3'（イントロン7：配列番号５）、MIRTDリバースプライマー; 5'-tggctcagctagtggtggg-3'（エキソン9：配列番号６）、DLSTおよびMIRTDの両方に対するTaqManプローブ; 5'-cctccttctggcaaacctgtgtct-3'（エキソン8から9にまたがっている：配列番号７）、GAPDHフォワードプライマー; 5'-gggaaggtgaaggtcgga-3'（配列番号８）、GAPDHリバースプライマー; 5'-gcagccctggtgaccag-3'（配列番号９）、GAPDHに対するTaqManプローブ; 5'-caacggatttggtcgtattgggcg-3'（配列番号１０）。シトクロムcオキシダーゼのサブユニットIVのmRNA量の測定のために、フォワードプライマー5'-tgtgtgtgtacgagctcatgaaag-3'（配列番号１１）、リバースプライマー5'-gtggtcacgccgatccat-3'（配列番号１２）、およびTaqManプローブ5'-ttgtgaagagcgaagacttttcgctccc-3'（配列番号１３）。数値はGAPDH cDNAに対して標準化した。TaqManプローブは5'末端にレポーターとして発光色素FAMを、3'末端に消光剤としてTAMRAを含む。
【００４２】
MIRTD mRNAの転写開始部位の決定
MIRTD mRNAの転写開始部位は、製造業者の推奨するプロトコールに従ってヒト脳Cap Site cDNAＴＭ（Nippon Gene, Toyama, Japan）を用いてオリゴヌクレオチドキャッピング法（Yamabeら、1998, Mol. Cell Biol., 18, 6191-6200.）により決定した。１回目のPCRは5'-caaggtacgccacagcgtatg-3'（1RC, Nippon Gene：配列番号１４）および5'-aagtaacgaatgtctactgggtatcagca-3'（配列番号１５）を用いて行った。サンプルは94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で45秒で40サイクルで増幅させた。第１反応生成物の一部を２回目のPCRの鋳型として用いた。２回目のPCR（nested PCR）は5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3'（2RC2; Nippon Gene：配列番号１６）および5'-actgggtatcagcaatatgcaaag-3'（配列番号１７）を用いて行い、DNA配列を決定した。
【００４３】
ウェスタンブロッティング
全細胞溶解液のために、培養細胞はPBSで洗浄後、PBSにて回収した。細胞は遠心分離によって回収し、2% SDS、20mM Tris-HCl pH6.8、および1mM フェニルメチルスルフォニルフルオリド（PMSF）にて溶解させた。タンパク質濃度はBCA assay（Pierce）により測定した。サンプルは2-メルカプトエタノールを添加してSDS-PAGEを行った後、抗体を用いてウェスタンブロッティングに供した。
【００４４】
抗DLSTモノクローナル抗体および他の抗体の調製
エキソン8のメチオニンから下流の領域を含むDLSTのC末端領域を、グルタチオンS-トランスフェラーゼとともに大腸菌で発現させた。融合タンパク質を含む封入体を単離し、連続分取用SDS-PAGEに供し、融合タンパク質を、切り出したゲルから溶出し、濃縮後リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に透析した。これを免疫したBALB/cマウスの脾臓細胞をPAIミエローマ細胞と融合させ（OhtaおよびSchatz、1984 EMBO J., 3, 651-657）、抗体を産生しているハイブリドーマ細胞を、精製された６個のヒスチジンを有するDLSTのC末端領域組換え体を用いて、固相酵素免疫測定法によってスクリーニングした。陽性細胞は限界希釈法によってクローニングした。
【００４５】
ミトコンドリアTom40およびTom20に対する抗体は、九州大学の三原教授（Prof. K. Mihara., Kyushu University, Fukuoka, Japan）より贈与を受けた。呼吸鎖複合体のサブユニットに対するすべての抗体はMolecular Probes社から購入した。
【００４６】
ヒトDLST遺伝子を有するPC12細胞の作製
末梢血からゲノムDNAを単離し、Sau3A Iで部分消化した。消化されたDNAをコスミドベクターSuperCos 1（Stratagene）のBamH I部位に挿入した。連結したDNAは、メーカーの使用説明書に従いGigapack III Gold packaging extract（Stratagene）を用いてパッケージングした。陽性クローンはDLST遺伝子のプロモーター領域に相当するPCR断片を用いたコロニーハイブリダイゼーションによって選抜し（Nakanoら、1994, Eur. J. Biochem., 224, 179-189.）、選抜されたコスミドは、PCRにより上流領域、エキソン１、８、１４、および下流領域を増幅させることにより、全長を包含することを確認した。Lipofectin（Invitrogen）を用いて、PC12細胞にacタイプまたはgcタイプのDLST遺伝子を包含するコスミドおよびジェネティシン耐性遺伝子をコトランスフェクトした。14日間ジェネティシン耐性細胞を選抜することにより、トランスフェクト細胞の比率を多くした。
【００４７】
ラット肝ミトコンドリアのサブオルガネラ分画
完全なミトコンドリアを単離するために、新鮮なラットの肝臓を前もって冷却しておいた破砕バッファー（0.22Mマンニトール、0.07Mショ糖、20mM Hepes-KOH pH 7.4、および1mM EDTA）で洗浄し、重量を測定した。それを鋏で裁断し破砕バッファーに懸濁した。懸濁液をテフロン乳棒を用いてPotter-Elvehjemガラスホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートに0.34 M sucroseを重層し、1,000 x gで10分間遠心分離した。上層（post-nuclear上清）は10,000 x gで15分間遠心分離し、沈殿（P10,000画分）を除去した。得られた上清は100,000 x gで2時間再度遠心分離し、沈殿（P100,000画分）と上清（S100,000）に分離した。ミトプラストを調製するために、ミトコンドリア（10 mg/ml）を20 mM Hepes-KOH pH 7.4および1 mM EDTAで10倍希釈した。その後、ミトコンドリアおよびミトプラストのサンプルを3等分し、氷上で30分間、0、10、または50μg/mlのプロテイナーゼKで処理した。ミトコンドリアまたはミトプラストは遠心分離によって再分離し、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって解析された。
【００４８】
マキシザイムを安定して発現する細胞の確立
MIRTD mRNAに対するマキシザイムおよびpol III終止配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチドは、PCRによって２本鎖配列に変換した。Csp45 IおよびSal Iによる消化後、それぞれの適切な断片は、pUC19のEcoR IとSal I部位の間に化学合成し、ヒトtRNAVal遺伝子用のプロモーターを含むpUC-dtのtRNAValプロモーター（Kuwabaraら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1886-1891.）の下流にクローニングされた。構築物の塩基配列はダイレクトシークエンスによって確認した。製造業者の推奨するプロトコールに従いEffectene reagent（Qiagen）を用いてSH-SY5Y細胞にマキシザイムおよびジェネティシン耐性遺伝子をコトランスフェクトした。ジェネティシン（Invitrogen）を用いた選抜によりマキシザイムまたは単量体の対照を安定して発現しているいくつかの独立のクローンが単離された。
【００４９】
呼吸鎖複合体活性のアッセイ
それぞれのミトコンドリア呼吸鎖複合体の活性は、既報（Trounceら、1996; Birch-MachinおよびTurnbull、2001）に従い、分光光度法によって30℃で測定された。NADH-シトクロムc酸化還元酵素（複合体I+III）活性のアッセイのため、凍結融解したミトコンドリア（15 μgタンパク質/ml）は、30℃で3分間、25 mM KPi pH 7.2、5 mM MgCl2および2mMKCNを含む2.5 mg/mlのウシ血清アルブミン（BSA）中でプレインキュベートした。その後、シトクロムc（III）（50μM）およびNADH（130μM）を添加し、シトクロムcの吸光度550nmと580nmとの変化（減衰係数19 mM-1cm-1）を測定した。2分後、ロテノン（2μg/ml）を添加し、ロテノン非感受性の割合を測定した。コハク酸-シトクロムc酸化還元酵素（複合体II＋III）活性のアッセイのため、凍結融解したミトコンドリア（15μg/ml）は、30℃で10分間、25 mM KPi pH 7.2、5mM MgCl2および20mM コハク酸ナトリウム、2 mM KCN、2 μg/mlのロテノンを含む2.5 mg/mlのBSA中でプレインキュベートした。その後、シトクロムc（III）（30μM）を添加し、吸光度の変化を測定した。ユビキノール-シトクロムc酸化還元酵素（複合体III）活性のアッセイのため、35 μMユビキノールおよびシトクロムc（III）を、25 mM KPi pH7.2、5 mM MgCl2および2mM KCN、2μg/mlのロテノン、0.6mM n-ドデシルβ-D-マルトシドを含む2.5mg/mlのBSAに添加し、非酵素的な割合を測定した。その後、ミトコンドリア（10μgタンパク質/ml）を添加し、シトクロムcの吸光度の変化を測定した。シトクロムcオキシダーゼ（複合体IV）活性は、シトクロムcの550 nm〜580 nmの吸光度の変化（減衰係数19 mM-1cm-1）を測定することにより測定した。すなわち、還元型シトクロムc（15μM）を20mM KPi pH 7.2および0.45 mM n-dodecyl β-D-maltosideに添加し、非酵素的な割合を測定した。その後、ミトコンドリア（10μgタンパク質/ml）を添加し、シトクロムcの吸光度の変化を測定した。
【００５０】
結果
DLSTの末端切断型転写産物の特定
本発明者らは、筋細胞中にDLSTの末端切断型が存在していることを見出している（Matsudaら、1997）。この事実より、DLST遺伝子末端切断型タンパク質が細胞死を誘発するのではないかと考え、まず、DLST遺伝子のイントロンから転写開始された末端切断型DLST mRNAを検索することとした。
【００５１】
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞由来のポリA+RNAから逆転写酵素（RT）を用いて逆転写し、これを図2に示すプライマーを用いてPCR増幅に供した。
【００５２】
イントロン7内の配列とエクソン９内の配列からなるプライマー対を用いた場合に、約240bpからなる断片の増幅が検出された（図２Bレーン１）。プライマーの位置から推定される増幅産物の塩基長と一致しており、イントロン７からエキソン８、エキソン９に続く配列を有する転写産物であると考えられた。さらに、イントロン８を含む長さではないことから、該増幅産物がmRNAに由来するものであることは明らかであった。
【００５３】
したがって、この増幅産物が由来するmRNAの転写開始部位を、既報のオリゴヌクレオチドキャッピング法（Yamabeら、1998, Mol. Cell Biol., 18, 6191-6200）により特定したところ、DLST遺伝子の第10556位のa塩基を転写開始部位とするmRNAであることが判明した。この新規mRNAに由来する末端切断型タンパク質をMIRTD（MItochondrial Respiration Generator of Truncated DLST）と命名した。
続いて、該mRNAの翻訳産物であるタンパク質の機能について解析を進めた。
【００５４】
AD患者の脳ではMIRTD mRNAの発現が有意に減少している
AD患者および健常者の大脳皮質に由来するポリA+RNAを用いてMIRTD mRNA量を、リアルタイム定量RT-PCRにより比較した。コントロールである健常者の大脳皮質由来のmRNAでは、MIRTD mRNAのDLST mRNAに対する比率、およびMIRTD mRNAのGAPDH mRNA（GAPDHは標準化用コントロールのために測定した）に対する比率は、それぞれ、（0.0621±0.0505）×104、（1.62±1.47）×104であったのに対し、AD患者の大脳皮質由来のmRNAでは、上記比率がそれぞれ、（0.0248±0.0368）×104、（0.731±1.15）×104であり、いずれの比率においてAD患者健常者の間に有意な差が認められた（MIRTD mRNAのDLST mRNAに対する比率ではp=0.004、MIRTD mRNAのGAPDH mRNAに対する比率では、p=0.018）。したがって、AD患者の大脳皮質ではMITRD mRNAが顕著に低減していることが示された。したがって、このことからMITRDはADと関連があることが示唆される。
【００５５】
DLST遺伝子のハプロタイプによりMIRTDの発現制御
上記で特定したMIRTD mRNA転写開始部位10556位の近傍にDLST遺伝子の多型が存在することが判っていることから、DLST遺伝子のハプロタイプがMIRTD mRNAの発現に影響を与えるか否かを検討した。
【００５６】
まず、図１に示すacタイプとgcタイプのハプロタイプの全長ヒトDLST遺伝子をそれぞれ、コスミドベクターにクローニングし、ラットPC12細胞株にトランスフェクトした。該トランスフェクタントにおけるヒトMIRTD mRNAの量とヒトDLST mRNAの量をリアルタイム定量RT-PCRにより測定し、ヒトDLST mRNAの量に対するヒトMIRTD mRNAの量を求めた（図４）。PC12細胞の内因性のラットのmRNAを増幅せずヒトDLSTおよびMIRTDのみ特異的に増幅させるプライマーを選択して使用した。実際に、外因性のヒトDLSTとMIRTD mRNAのみが検出され、PC12の内因性mRNAは検出されなかった（図４A,B）。10579T（acハプロタイプ）の細胞では、DLST mRNAに対するMIRTD mRNAの比は、3.6±1.9％と4.6±2.3％であったが、10579A（gcハプロタイプ）の細胞では、DLST mRNAに対するMIRTD mRNAの比は、8.7±2.4％と9.7±3.2％であった（それぞれ、2つの独立クローンにて測定：図４C）。両者の間には統計学的に有意差が認められ（図面の簡単な説明の図４の欄参照）、ヒトMIRTD mRNAの発現は、DLST遺伝子のハプロタイプに依存していることが示唆された。
【００５７】
MIRTDタンパク質の細胞内分布
MIRTDのタンパク質レベルでの存在を証明した。ラットの肝臓を用いて実験を行った。肝臓を用いたのは、細胞内オルガネラの分画が容易であるためである。ラット肝臓において、短いmRNA分子、すなわちMIRTD mRNAがノーザンブロッティングにより検出された（図５A）ので、ラット肝臓にMIRTDタンパク質が発現されていると考えられた。
【００５８】
MIRTDタンパク質の細胞内分布を明らかにするために、ラット肝臓を常法に従って細胞分画に供し、各画分についてウェスタンブロットを行った（図５B）。ミトコンドリア画分（P10000画分）に、55kDaと30kDaのタンパク質が検出された。55kDaのタンパク質は全長DLSTに相当し、30kDaのタンパク質は、DLST遺伝子のエクソン８に存在する最初のAUGコドンからの翻訳産物（該産物の推定分子量は29.7kDaであり、リーディングフレームは全長DLSTと同じである）からの翻訳産物であると考えられる。したがって、MIRTDであり、これがミトコンドリア画分に検出されたことは、該タンパク質はミトコンドリアに主に分布していることが示唆される。
【００５９】
MIRTDの分布をさらに詳細に検討するため、ラット肝臓から単離したミトコンドリアをプロテイナーゼKにて処理して、ウェスタンブロットに供した。内在コントロールとして、Tom40、Tom20および全長DLST（マトリックスタンパク質）を用いた。Tom40とTom20は、核DNAにコードされたミトコンドリアプレカーサータンパク質をミトコンドリアに移行させるための移行複合体の成分であり、Tom40は内膜側に露出されており、Tom20はミトコンドリアの外側に露出されているタンパク質である（PfannerおよびGeisller,2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2, 339-349）。Tom20は10μg/mlのプロテイナーゼKで容易に消化されたが、Tom40とDLSTおよびMIRTDタンパク質は消化されなかった（図５C、レーン１〜３）。一方、ミトコンドリアをマイトプラストにすると、MIRTDのバンドは消失したが（図５C、レーン４）、Tom40とTom20のバンドは検出された。このことから、MIRTDタンパク質は、ミトコンドリアの内膜と外膜との間のスペースに局在していると推定される。
【００６０】
MIRTD mRNAを消化するための細胞系の確立
次に、マキシザイム技術を用いて、MIRTD mRNAを特異的に消化して、MIRTDタンパク質の発現量を減少させることにより、該タンパク質の細胞内における役割を特定しようとした。マキシザイムとは標的配列を認識して標的RNAを特異的に切断する新しいリボザイムである。強力なプロモーターの制御下でマキシザイムを発現させるために、ヒトtRNAValプロモーターの配列の下流にマキシザイムの各単量体（MzLとMzR）をコードする遺伝子を挿入した。ヒトtRNAVal構築物の設計は、Kosekiら、1999に記載した方法にしたがって行った。DLST遺伝子のイントロン7‐エキソン8の連結部位に対応するmRNAの存在下でのみ活性な立体構造をとるマキシザイムの配列を設計し（図６A）、特定の場所でのみ切断するようにした。該マキシザイムはMIRTD mRNAを特異的に切断し、DLST mRNAは切断しないことが判っている（Tanabeら、2000, Biomacromolecules, 1, 108-117.）。
【００６１】
MzLおよびMzRをコードするDNA断片をトランスフェクトし、これらを発現するヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞から、ポリA+RNAを単離し、MIRTD mRNAをリアルタイム定量的PCRによりMIRTD mRNAを定量した。マキシザイム発現細胞においては、やはり、MIRTD mRNA量は顕著に減少していた（図6B）。DLSTおよびMIRTDタンパク質の量をウェスタンブロットにより半定量的に検出した（図６C）。DLSTタンパク質の量には、マキシザイムの導入による影響は認められなかったが、MIRTDタンパク質は、顕著に減少していた（図６C、レーンZ5およびZ２１）。したがって、マキシザイムは、特異的にMIRTD mRNAを消化し、上記30kDaタンパク質は、MIRTD mRNAの翻訳産物であることが証明できた。
【００６２】
MIRTD欠損細胞株の形質
MIRTD mRNAを特異的に消化することによって現れる形質を調べることにより、MIRTDの作用を明らかにすることを試みた。まず、マキシザイムまたはその単量体（非活性型）を発現した細胞を0〜0.6mMの過酸化水素含有培地に曝露し、生細胞と死細胞の数をそれぞれヨウ素プロピジウム（PI）とヘキスト33342の色素染色により調べた。マキシザイム発現細胞では、過酸化水素の曝露量および時間に依存的に、コントロール（単量体発現細胞）に対して顕著に過酸化水素に対する細胞活性の減少が認められた（図７AおよびB）。該細胞をレチノイン酸処理により神経細胞へと分化させると、マキシザイム発現細胞の過酸化水素に対する感受性はさらに増大した（図７C）。神経細胞に分化させても、過酸化水素に対する感受性は大きく変化しなかったことから、細胞の状況によらない現象であることが推定された。
【００６３】
上記トランスフェクタント細胞における、MIRTDの発現をリアルタイムRT-PCRおよびウェスタンブロットにて調べたところ、mRNA量およびタンパク質量ともに、コントロールの細胞では、早い段階で若干の増加は認められるが、その後徐々に減少し、マキシザイム発現細胞では低レベルのまま維持されていた（図７D,E）。この結果は、MIRTDの減少が、過酸化水素による外部刺激に対する細胞の感受性に関与していることを示唆するものである。
【００６４】
細胞の内因性酸化ストレスを誘発する薬剤に対する感受性についても試験した。メナディオン（menadione）は、キノン誘導体であり、ミトコンドリア呼吸鎖から、スーパーオキシドアニオンを生成し、これが即座に過酸化水素に変換される。メナディオンにマキシザイム発現細胞を曝露したところ、コントロール細胞に比べて、該薬剤に対する耐性が増加していた(図７G)。メナディオンからの過酸化水素産生は、過酸化水素特異的な蛍光色素[5‐(および-6-)クロロメチル2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセテートアセチルエステル(CM-H2DCFDA)]を用いてフローサイトメトリーにより調べた。
【００６５】
コントロール細胞クローンL1では、メナディオン処理により過酸化水素の産生量が増大したが、マキシザイム発現細胞クローンZ21では、過酸化水素の産生量の増大は認められなかった(図７H)。したがって、MIRTD欠損細胞は、スーパーオキシドアニオンの産生が減少し、メナディオンに対する耐性が増大する結果となったことが判った。
【００６６】
マキシザイム発現細胞における呼吸不全
上記で判明したMIRTD欠損細胞がメナディオンに非感受性であることの理由を探索するために、マキシザイム発現細胞におけるミトコンドリア呼吸鎖について調べた。まず、酸素電極を用いて全細胞の酸素消費速度を調べたところ、マキシザイム発現細胞クローン(Z5,Z21)では、ほとんど呼吸が認められなかったが、一方のコントロール細胞クローン(L１およびR２)では呼吸が認められた(図８A)。そこで、各クローンからミトコンドリアを単離し、呼吸鎖の各コンプレックスの酵素活性を測定したところ(図８B)、コンプレックスIV(シトクロムｃオキシダーゼ)の活性は、MIRTD欠損クローン(Z５、Z２１)では検出されなかった。さらにこれらのクローンでは、NADH-シトクロムｃオキシドレダクターゼ(コンプレックスI＋III)の活性は顕著に減少していたが、コハク酸シトクロムcオキシレダクターゼ(コンプレックスII＋III)の活性は減少していなかった。この結果は、シトクロムｃオキシダーゼの活性は完全に消失され、コンプレックスI(NADH-ユビキノンオキシドレダクターゼ)の活性は有意に影響を受けるものの完全に消失しなかったが、このことが、MIRTD欠損細胞における呼吸の消失をもたらすことが判った。
【００６７】
呼吸欠損の背後にある機序を探るために、呼吸鎖に関与するサブユニットの恒常的レベルをウェスタンブロットにより調べた(図８C)。核染色体上にコードされる、コンプレックスII,III,Vのサブユニットの量は、MIRTD欠損とは無関係であった。対照的に、核染色体上にコードされる、コンプレックスIの15Kサブユニットの量は、MIRTD欠損細胞では若干減少していた。さらに、ミトコンドリア染色体上にコードされる、コンプレックスIVのサブユニット(CO IとCO II)の量は、著しく減少していた。さらに、核染色体上にコードされるコンプレックスIVのサブユニット(CO IV)の量もまた著しい影響を受けていた。これらの傾向は、酵素活性の低下と一致していた。ミトコンドリア染色体上にコードされるサブユニット(CO IおよびCO II)の減少に、ミトコンドリア翻訳機構が関与しているか否かを調べるために、ミトコンドリアにおける翻訳を、細胞質の翻訳機構を阻害する薬剤であるエメチン(emetine)の存在下における[35S]メチオニンを用いて遺伝子産物をパルス標識することにより調べた。標識した翻訳産物を、SDS-PAGEで分離しオートラジオグラフィにより検出した(図８D)。シグナル強度は、各クローンとも、あまり変化しておらず、その変化からCO IおよびCO IIの恒常的レベルの減少を説明することはできなかった。したがって、コンプレックスIVサブユニットの恒常的レベルの減少は、翻訳後の過程で起こっていると考えられる。さらに、コンプレックスIVの核染色体上にコードされるサブユニットCO IVのmRNAの量は、MIRTDとは無関係であった(図８E)。これらのことから、MIRTD欠損は、コンプレックスIVの複合体形成に影響を与えるとともに、コンプレックスIの複合体形成にも何らかの影響を与え、活性を消失させて、複合体形成に参加しなかったサブユニットはミトコンドリアプロテナーゼにより消化されてしまうのではないかという説が有力である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、DLST遺伝子構造の概略図である。ヌクレオチド残基はDLST mRNAの転写開始部位から1で始まる改訂された配列に基づいて数えられる（Nakanoら、1994）。ハプロタイプは19117位（AまたはG）および19183位（CまたはT）での２つのヌクレオチド変異によって規定される。acハプロタイプに特異的なヌクレオチドを列挙している。MIRTD mRNAの転写開始部位は10556位付近である。
【図２】図２は、イントロン7から転写される末端切断型mRNAの存在を示す。（A）用いたプライマー（a-d）およびTaqManプローブ（e）の概略図である。矢印はプライマーの位置を示す。末端切断型mRNA（MIRTD mRNA）を検出するために、95℃で10分間の後95℃15秒と57℃1分間の35サイクルによるPCRを行った。プライマーa、b、cおよびdはそれぞれ、MIRTDフォワードプライマー; 5'-ctcatttcagacagtgccagtg-3'（イントロン7：配列番号５）、MIRTDリバースプライマー; 5'-tggctcagctagtggtggg-3'（エキソン9：配列番号６）、DLSTフォワードプライマー; 5'-acctacagcagcggcagt-3'（エキソン8：配列番号３）およびDLSTリバースプライマー; 5'-ctcctggctcagctagtggt-3'（エキソン9：配列番号４）を表す。（B）SH-SY5Y細胞からPoly (A)+ RNAが単離された。オリゴ（dT）プライマーを用いて相補DNAを合成し、プライマーaおよびb（レーン1）またはプライマーcおよびd（レーン2）を用いてPCRを行った。Poly (A)+ RNA画分は逆転写酵素で処理せず、PCRに供した（レーン3）。レーン4はHinc IIで消化されたφX174 DNAのマーカーを示す。矢印はそれぞれの増幅断片を示す。（C）MIRTD mRNAの開始部位は、材料と方法に記述されたように、Cap Site cDNATM of human brain（Nippon Gene, Toyama, Japan）を用いてオリゴヌクレオチドキャッピング法（Yamabeら、1998, Mol. Cell Biol., 18, 6191-6200.）により決定した。
【図３】図３は、アルツハイマー病患者の脳におけるMIRTD mRNA量の減少を示す図である。AD患者または対照の脳におけるMIRTD mRNA量は、上述のとおり、リアルタイム定量RT-PCRによって測定し、DLST（A）またはGAPDH mRNA（B）に対して標準化した。サンプル数、標準偏差（± S.D.）を伴う平均値、およびStudentのt-検定によって検定されたp値は図中に示された。
【図４】図４は、acタイプのヒトDLST遺伝子を含むラットPC12細胞におけるヒトMIRTD発現の減少を示す。Lipofectin（Invitrogen）を用いて、ac-型またはgc-型DLST遺伝子およびジェネティシン耐性遺伝子を包含するコスミドをPC12細胞にコトランスフェクトした。組換え体は14日間のジェネティシン耐性細胞を選抜することによって富化され、組換え体プールからPoly (A)+ RNAを調製した。ヒトMIRTDおよびDLST mRNA量はリアルタイム定量RT-PCRによって測定した。（A）ヒトDLSTおよびMIRTD mRNAによるPCR産物の増加を示している、リアルタイム定量RT-PCRのプロフィールである。（B）DLSTとMIRTD mRNAとのいずれも検出されない非トランスフェクトPC12細胞からのPoly (A)+ RNAを用いたリアルタイム定量RT-PCRのプロフィールである。（C）DLST mRNAに対するMIRTDの相対値は、４回の独立した実験から得られた平均値± S.D.で示している。その差は1と3（p = 0.039）、1と4（p = 0.049）、2と3（p = 0.016）および2と4（p = 0.016）において有意であった。
【図５】図５は、MIRTDタンパク質の同定と局在を示す図である。（A）ラットの肝臓から単離された全RNA（50 μg）はノーザンブロッティングによって解析した。DLSTおよびMIRTD mRNAは32P-標識したラットDLST cDNAによって検出した。28Sおよび18SリボゾームRNAは右側に示している。矢印はDLSTおよびMIRTDに対応するmRNAを示す。（B）ラット肝臓の分画は上述のとおり実施した。核を除いた上清を10,000 x gで遠心分離した沈殿画分（P10,000）は大部分のミトコンドリアを包含していた。その上清を100,000 x gで遠心分離し、沈殿（P100,000）および上清（S100,000）はそれぞれミクロソームおよび細胞質ゾルを包含していた。サンプルは抗DLSTモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによって解析した。（C）単離したラット肝ミトコンドリアは、ミトプラストを調製するために、等張バッファー（レーン1-3）または低張バッファー（レーン4-6）で希釈した。サンプルを3等分し、0（レーン1、4）、10（レーン2、5）、または50μg/ml（レーン3、6）のプロテイナーゼKで処理した。サンプルは抗DLSTモノクローナル抗体、抗Tom40ポリクローナル抗体、または抗Tom20ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによって解析した。星印はDLSTの分解産物を表す。PK; プロテイナーゼ K、M; ミトコンドリア、 MP; ミトプラスト。
【図６】図６は、マキシザイムの導入によるMIRTD mRNA量の減少を示す図である。（A）MIRTD mRNAおよびマキシザイムヘテロダイマー、MzRおよびMzLの配列を示す。マキシザイムヘテロダイマーは、DLST遺伝子のイントロン7とエキソン8との間の連結部が存在する場合のみ、活性を有する立体構造を形成することができる。三角印はマキシザイムによる切断部位を示す。（B）神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞にマキシザイムおよびジェネティシン耐性遺伝子のDNAをコトランスフェクトし、マキシザイムを恒常発現している独立クローン（Z5、Z7およびZ21）または単量体のコントロール（L1 およびR2）を単離後、材料および方法に記述されたように、DLST mRNAに対するMIRTD mRNAの相対値が得られた。（C）上のパネル; 各サンプルのタンパク質（50 μg）をSDS-PAGEに供し、続いてDLSTタンパク質のC末端領域に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。下のパネル; MIRTDタンパク質量を定量し、DLSTタンパク質量に対して標準化した。結果は３回の実験の平均値±S.D.として示している。
【図７】図７は、MIRTD欠損細胞での酸化ストレスに対する感受性を示す図である。（A）マキシザイム発現細胞（Z5、Z7およびZ21）および対照細胞（L1 およびR2）を、0.2、 0.4 または0.6 mM H2O2を含む培地に曝露した。24時間後、細胞をHoechst 33342 （青色; 死細胞および生細胞）およびpropidium iodide （ピンク; 死細胞）で染色した。細胞生存率は様々な濃度のH2O2に曝露した各クローンについて200個の細胞を数えることによって算出した。（B）Z5、Z21、 L1 およびR2細胞を示された時間0.4 mM H2O2に曝露した。細胞生存率は上記と同様に算出した。（C）組換え体（L1、R2、Z7およびZ21）は、1%ウシ胎児血清存在下で５日間10 μMのレチノイン酸によってニューロン様細胞へと分化誘導した後、1%ウシ胎児血清存在下で12時間様々な濃度のH2O2に曝露した。細胞生存率は上記と同様に算出した。（D）0、6、12および24時間0.2 mM H2O2 に曝されたL1およびZ21細胞から全タンパク質を調製し、各サンプルのタンパク質（50μg）をSDS-PAGE後、DLSTタンパク質のC末端領域に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングに供した。矢印はMIRTDおよび全長DLSTタンパク質を示す。（E）0、3、6、12または24時間0.2 mM H2O2 に曝露されたL1 および Z21細胞からPoly (A)+ RNAを単離した。MIRTD mRNA量は、リアルタイム定量RT-PCRによって測定し、DLST mRNA量に対して標準化した。（F）MIRTDタンパク質量は（D）のウェスタンブロッティングによって定量し、DLSTタンパク質量に対して標準化した。（G）Z5、Z21、L1、およびR2細胞は、表示した濃度のメナジオンを含む培地に曝露した。24時間後、細胞生存率は（A）に記述したとおり算出した。（H）Z21およびL1細胞は10 Mメナジオンの存在下または非存在下で3時間培養した後、5-(-6)-クロロメチル-2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H2DCFDA,  Molecular Probes）（5 μM）で1時間処理した。細胞をトリプシン処理後、DCFの蛍光シグナルを測定するため、EPICS ELITE flow cytometer （Beckman Coulter）によるフローサイトメトリーに供した。各実験において2万個の細胞を測定し、平均値を求めた。(A-C)および（E-H）の結果は３または４回の実験から得られた平均 ± S.Dとして示している。
【図８】図８は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体の活性およびその量の減少を示す図である。（A）セミコンフルエントの細胞を、トリプシン処理により回収した。回収した細胞は培養培地中に0.7-1.5 x 107細胞/ mlに懸濁し、酸素電極のチャンバー（50 l）に入れた。細胞による酸素消費速度はクラーク型電極（Strathkelvin Instruments, Glasgow）を用いて37℃で測定した。左; 1 x 107細胞/mlでの細胞による酸素消費の追跡結果。右;細胞数に対して標準化された３回の独立した実験の平均値と標準偏差。（B）上述のとおりNADH-シトクロムc酸化還元酵素（I + III）、コハク酸-シトクロムc酸化還元酵素（II + III）、ユビキノール-シトクロムc酸化還元酵素（III）およびシトクロムcオキシダーゼ（IV）の活性を測定した。結果は相対的な活性として示している。SH-SY5Y細胞から分離したミトコンドリアにおける活性のレベルを100とした。Z5およびZ21クローンから分離したミトコンドリアにおける複合体IV活性が検出されなかったことに注意されたい。平均値と標準偏差は３回の独立した実験から得られたものである。（C）各クローンから調製されたミトコンドリア画分のタンパク質（10 μg）は、呼吸複合体およびATP合成酵素のサブユニットに対するそれぞれの抗体を用いたウェスタンブロッティングに供した。COIおよびIIはミトコンドリアにコードされるタンパク質であるが、他は核遺伝子によってコードされている。F1β; F1-ATPase：βサブユニット。（D）in vivoにおいて[35S]メチオニンで標識されたミトコンドリア翻訳産物は記述されたように（Hayashiら、1993）解析された。簡潔に述べると、セミコンフルエントの細胞は37℃で60分間エメチン（0.2 mg/ml）存在下で[35S]メチオニンによって標識された。ミトコンドリア画分のタンパク質はSDS-PAGE（15-25%濃度勾配ゲル）によって分離した。翻訳産物はbioimaging analyzer FLA2000（Fuji Film, Tokyo）を用いて解析した。ND 1-5; 複合体I（NADH-ユビキノン酸化還元酵素）のサブユニット、COI-III; シトクロムcオキシダーゼ（複合体IV）のサブユニット、cyt b; ユビキノール-シトクロムc酸化還元酵素（複合体III）のシトクロムbサブユニット、ATP6および8; ATP合成酵素（複合体V）のサブユニット。（E）各クローンからのPoly (A)+ RNAはcDNAに変換され、CO IV mRNAは材料および方法に記述されたようにリアルタイムRT-PCRによって定量した。３回の実験の平均値と標準偏差はGAPDH cDNAに対して標準化された後に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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