(57)【要約】  【課題】  実験動物卵を大量に調製して遺伝子導入を行い、トランスジェニック動物の作出や毒性試験などに利用する場合に、容易に投与することができ単回投与で高い効果が得られ動物に対する投与ストレスを軽減した徐放性卵胞刺激剤及び過剰排卵誘起法を提供することを課題とする。    【解決手段】吸着性に優れた水酸化アルミニウムゲルを卵胞刺激ホルモンと混合することで得られる徐放性卵胞刺激剤を、実験動物の皮下、皮内または筋肉内に投与することで、投与する卵胞刺激ホルモンに徐放性を付与して、単回投与でも有効な過剰排卵を誘起させる方法を提供する。   【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸化アルミニウムゲルと卵胞刺激ホルモンからなる実験動物の徐放性卵胞刺激剤。
【請求項２】
水酸化アルミニウムゲルがアルミニウムを1mlあたり1〜10mg含有する水酸化アルミニウムゲルである請求項1記載の徐放性卵胞刺激剤。
【請求項３】
卵胞刺激ホルモン0.1-10 AUと水酸化アルミニウムゲル0.1〜5mlとを混合することで調製される請求項1及び２に記載の徐放性卵胞刺激剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の徐放性卵胞刺激剤を用いる実験動物の過剰排卵誘起法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の徐放性卵胞刺激剤を実験動物の皮下、皮内または筋肉内に投与して過剰排卵を誘起する過剰排卵誘起法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の徐放性卵胞刺激剤を単回投与することを特徴とする過剰排卵誘起法。
【請求項７】
過剰排卵された卵をトランスジェニック動物の作成および毒性試験に用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載される実験動物の徐放性卵胞刺激剤の使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの実験動物の徐放性卵胞刺激剤に関する。さらに詳しくは水酸化アルミニウムゲルと卵胞刺激ホルモンからなる徐放性卵胞刺激剤に関する。また、実験動物、特にウサギに単回投与することで過剰排卵を誘起する徐放性卵胞刺激剤およびこれを用いた実験動物の過剰排卵誘起法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、実験動物における過剰排卵誘起法では、生理食塩水に溶解した卵胞刺激ホルモン（Follicle Stimulating Hormone；以下FSHと略す）を皮下に多回投与して、過剰排卵を誘起する方法が一般的に採用されている。しかし、多回投与による過剰排卵誘起は、煩雑な操作に加え、投与を受ける動物に対しても多大なストレスを与えることから動物福祉の観点から望ましくない処置方法であり、また、投与によるストレス自体が過剰排卵成績を低下或いは不安定にする原因となることが知られている。
【０００３】
実験動物の中でも特に、ウサギは、マウスやラットなどと比較してストレスに対して過敏な動物であることから、ホルモンの多回投与処置が与える過剰なストレスを避けるために、卵胞刺激ホルモン（FSH）に徐放性を付与した剤として投与することで投与回数を減らす試みがなされている。
【０００４】
例えば、徐放性を付与する方法として、卵胞刺激ホルモン（FSH）を徐放性のポリビニールピロリドン（以下、ＰＶＰと略す）と混合し、ウサギに単回投与する方法が挙げられる。この方法と同様の方法はウシにおいても試みられている。また本発明者らは徐放性を付与する物質としてＰＶＰ以外に、ワクチン製造において抗原に徐放効果を付与し良好な感作を得るために用いられる水酸化アルミニウムゲルをウシに用いる発明を特許出願している（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、マウスやラットにおいて、半減期が長く生理活性が持続する妊馬血清性腺刺激ホルモンを単回投与することによる過剰排卵誘起法が挙げられる。
しかし、これらの方法では安定した過剰排卵誘起を起こすことが難しく、例えば、妊馬血清性腺刺激ホルモンを単回投与した場合は、卵胞刺激ホルモンを多回投与する場合に比べて回収できる卵の数および得られた卵の質が低下する。また、ＰＶＰを用いた徐放性剤を調製する場合には、高い粘性のためにホルモンとの懸濁が難しいことに加え、調製した徐放性剤自体の粘性が高いため、投与が難しく、動物に対する投与の苦痛が大きい。
【０００６】
水酸化アルミニウムゲルを用いる方法は、ラットにおいて報告されており、卵胞刺激ホルモン（FSH）を水酸化アルミニウムゲルと混合し、単回投与した場合に、卵巣重量の増大が生理食塩水に溶解した卵胞刺激ホルモン（FSH）を6回投与した場合やPVPと混合した卵胞刺激ホルモン（FSH）を単回投与した場合と同等であったという結果があるが（例えば、非特許文献１参照）、この報告において、卵巣重量の増大が確認されただけであって、過剰排卵が確実に誘起され、卵を得ることができたという報告は得られていない。
【０００７】
このため、実験動物においては、実験者の負担が大きいにもかかわらず多回投与による過剰排卵誘起法が実施されている。特に、ウサギはストレスに対して過敏であるにもかかわらず、12時間間隔で卵胞刺激ホルモン（FSH）を6回投与する過剰排卵誘起法が採用されているのが現状である。
【０００８】
生命科学研究における発生工学技術の進歩にともない、実験動物卵を大量に調製して遺伝子導入を行い、トランスジェニック動物を作出することや毒性試験などに利用することが拡大していることから、単回投与でも安定して高い過剰排卵誘起効果が得られ、容易に投与が行える徐放性卵胞刺激剤や、過剰排卵誘起法の開発が望まれている。
【０００９】
前述のように、ウシにおいて水酸化アルミニウムゲルの単回投与が試みられている。しかし、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物は多排卵動物であり、単排卵動物であるウシと卵巣のホルモン感受性が異なる。また、卵胞発育、排卵、黄体形成および黄体期が繰り返される完全発情周期であるウシなどの生殖活動に対し、これらの実験動物は黄体期あるいは排卵以後の相を欠く不完全発情周期であるという特徴を持つ。これらの特徴を考慮したうえで、実験動物に対してストレスを与えず、単回投与で安定して過剰排卵を良好に誘起できる徐放性卵胞刺激剤や、実験動物の過剰排卵誘起法は未だ発明されていない。
【特許文献１】特願2002-371462
【非特許文献１】Theriogenology, 59, 528, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、実験動物に対してストレスを与えず、単回投与で過剰排卵を良好に誘起できる徐放性卵胞刺激剤及び実験動物の過剰排卵誘起法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、この様な状況に鑑み、実験動物に与えるホルモン投与のストレスが少なく、過剰排卵誘起効果が安定して得られる過剰排卵誘起法、特に、ウサギにおける単回投与による過剰排卵誘起法について鋭意研究を重ねた結果、卵胞刺激ホルモンを水酸化アルミニウムゲルに混合した徐放性剤を調製し、この徐放性剤を用いることで、単回投与によっても過剰排卵を安定して誘起することができる方法を見出して本発明に至った。
【００１２】
すなわち、本発明者らは、低粘度で容易に注射が行えて高い徐放効果が期待できる水酸化アルミニウムに着目した。また、実験動物、特にストレスに敏感なウサギに対して本発明の徐放性剤を調製し、単回投与でも良好な過剰排卵を誘起させることに鋭意努力した。卵胞刺激ホルモンなどの投与による過剰排卵誘起のタイミングを精査した結果、単回投与でも良好な過剰排卵を誘起できることを見出し、投与のストレスを大幅に軽減した過剰排卵誘起法の構築に成功して本発明に至った。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、実験動物に与える投与ストレスを軽減し、安定して実験動物の過剰排卵誘起法を実施できる徐放性卵胞刺激剤および煩雑な投与操作を繰り返すことなく、良好な回収卵数と受精卵数を得ることができる実験動物の過剰排卵誘起法を提供できる。本発明の実験動物の徐放性卵胞刺激剤および実験動物の過剰排卵誘起法は、投与回数の減少により作業効率が改善されることから、実験動物の過剰排卵誘起法として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明により提供される徐放性卵胞刺激剤は、水酸化アルミニウムゲルと卵胞刺激ホルモン（FSH）と混合することで得られる。また、本発明により提供される実験動物の過剰排卵誘起法は、本発明の徐放性卵胞刺激剤を用い、実験動物の皮内、皮下または筋肉内に単回投与することで過剰排卵を良好に誘起することができる。このため、従来の卵胞刺激ホルモン（FSH）を多回投与する方法に比べて操作性に優れ、実験動物、特に、ウサギに与える投与ストレスを大幅に軽減した過剰排卵誘起法であり、実験動物に過剰排卵を誘起させる極めて有用な方法である。
【００１５】
本発明で提供される徐放性卵胞刺激剤に使用する水酸化アルミニウムゲルは如何なる製法によるものであってもよい。これらの水酸化アルミニウムゲルは懸濁液として滅菌して使用できる。例えば、市販されている水酸化アルミニウムゲル（シグマ社製  Aluminium Hydroxide Gel, A8222）が使用できる。水酸化アルミニウムゲル懸濁液は、アルミニウムゲル含量が懸濁液1ｍｌあたり1〜10mgを含むように調製し、pH6〜７に調整して滅菌する。滅菌にはオートクレーブによる方法が操作も容易で簡便である。
【００１６】
また、本発明により提供される実験動物の過剰排卵誘起法は、実験動物の皮内、皮下または筋肉内に本発明により提供される徐放性卵胞刺激剤を単回投与することで実施することができる。実験動物への投与量は投与する動物の大きさに依存するが、手技的に容易な0.１〜5ｍｌを選択することが好ましい。すなわち、水酸化アルミニウムゲル懸濁液量として、体重1kgあたり0.3〜5ｍｌを投与することが手技的に好ましく、混合する卵胞刺激ホルモン（FSH）はAU（アーマー単位）で表示されるが実験動物への投与量は 0.1 〜 10AU、好ましくは 0.5 〜 5AUを含むものが良い。卵胞刺激ホルモンは、市販のブタ卵胞刺激ホルモン（例えば、川崎製薬社製  Antrin R）を使用することができる。
【００１７】
以下の実施例、試験例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
徐放性卵胞刺激剤の調製
水酸化アルミニウムゲル（シグマ社製  Aluminium Hydroxide Gel, A8222）とブタの卵胞刺激ホルモン（FSH）（川崎製薬社製  Antrin R）を用いて徐放性卵胞刺激剤を次のように調製した。
3.0 mg/ｍｌのアルミニウムを含む水酸化アルミニウムゲルをオートクレーブ（105℃、30分間）で滅菌し、放置冷却した。これを1.5mlはかりとり、3AUのFSHと混合し、単回投与用の徐放性卵胞刺激剤とした。
【実施例２】
【００１９】
徐放性卵胞刺激剤を用いた実験動物の過剰排卵誘起法
実験動物として、体重3〜4kgのSPF日本白色種ウサギ（北山ラべス株式会社）を用いた。ウサギは室温23 ± 3℃、湿度60 ± 15%、明暗期それぞれ12時間で飼育管理し、飲用にはフィルター滅菌水を用い、ペレット状のウサギ飼料（CRL4,オリエンタル酵母工業社製）を自由飽食させたものを用いた。徐放性卵胞刺激剤の単回投与はウサギ頸部皮下に投与することによって行ない、過剰排卵を誘起した。徐放性卵胞刺激剤投与開始後72時間にヒト絨毛性腺刺激ホルモン（Human chroionic gonnadotropin;以下、hCGと略す）を投与し、人工授精を施した。人工授精は、雄ウサギから採取した精子原液を生理食塩水で約340万個/mlの濃度に希釈し、ガラス管を用いて1.5ml（約500万個精子）を膣内に注入した。hCG投与16〜18時間後に10%牛胎児血清（以下、 FBSと略す）を添加した組織培養液199（以下、TCM 199と略す）（GIBCO社製）で卵管を環流し、卵を回収した。回収された卵は、38.5℃、5% 二酸化炭素下で10% FBSを添加したTCM 199中に保持し、回収卵数は実体顕微鏡下で計測し、受精卵数は倒立顕微鏡下で数えた。
【試験例１】
【００２０】
（１）材料及び方法
実施例１で調製した徐放性卵胞刺激剤および、水酸化アルミニウムゲルの代わりにＰＶＰ（10％,W/V）を含む徐放性卵胞刺激剤を用い、日本白色種ウサギに対し、過剰排卵誘起の試験を行った。また、これら各種の徐放性卵胞刺激剤の徐放性を、徐放性卵胞刺激剤を投与した後の血清中のFSH量を測定することで調べた。
徐放性卵胞刺激剤の単回投与はウサギ頸部皮下に投与することによって行なった。対照区として生理的食塩水 1.5ｍｌにFSH 0.5AUを溶解したものを用いた。対照区の投与法としては上述の混合液を12時間間隔でウサギ皮下に6回投与することにより、過剰排卵を誘起した。徐放性卵胞刺激剤投与開始後72時間にhCGを投与し、人工授精を施した。人工授精は、雄ウサギから採取した精子原液を生理食塩水で約340万個/mlの濃度に希釈し、ガラス管を用いて1.5ml（約500万個精子）を膣内に注入した。hCG投与16〜18時間後に10% FBSを添加したTCM 199で卵管を環流し、回収された卵を38.5℃、5% 二酸化炭素下で10% FBSを添加したTCM 199中に保持した。回収卵数は実体顕微鏡下で計測し、受精卵数は倒立顕微鏡下で調べた。
また、徐放性は、各種の徐放性卵胞刺激剤を投与後０、１．５、３、６、１２、２４、３６、４８、６０、７１、８８時間のウサギ（n=4）の血液より血清を採取して調べた。まず、採取した血清100μlに1%BSA−PBS（生理食塩水）100μlを加え、次に−40℃に冷却したエタノール50μl加えて攪拌する操作を5回行い、合計250μlのエタノールを加えてウサギIgGをエタノール沈殿した。沈殿を除去するため、3000rpm、30分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清液をサーバント遠心濃縮器（43℃加温してクライオポンプで吸引）で乾固させた。次に、精製水200μlと1%BSA-PBS 100μlを加えて溶解させてFSH測定用のウサギ血清サンプルを調製した。
【００２１】
このようにしてウサギIgGを除去したウサギ血清サンプルを常法の競合RIA法で測定した。即ち、100μlの抗ブタFSHウサギ血清（一次抗体：Biogenesis社製(4561-7244) を10mM EDTA-PBSで200倍希釈）と適量の125ヨウ素ラベルしたブタFSHを加え、B／F分離のため抗ウサギIgGヤギ血清（二次抗体：カペル社製(55628)）を添加して沈殿を遠心回収し、そのガンマ線量をガンマカウンターで測定した。標準品（Biogenesis社製(4561-7204)）で作成した検量線と対比してウサギ血清中のFSH濃度を定量した。
【００２２】
（２）結果
各種の過剰排卵誘起法により回収できた卵の数を表１に示した。3.0 mg/ｍｌ 水酸化アルミニウムゲルとFSHを混合した懸濁液を投与した場合に回収された卵数は40.4 ± 6.2個であり、FSHを6回投与した場合（47.4 ± 5.5個）と同等であった。これら2つの場合に回収した卵数はPVP にFSH を溶解した場合（17.3 ± 2.7個）に比べて有意に高かった(P<0.01)。一方、3.0 mg/ｍｌ 水酸化アルミニウムゲルとFSHを混合した懸濁液を投与した場合の受精卵数は26.3 ± 6.4個であり、FSHを6回投与した場合（28.6 ± 5.8個）と同等であった。これら2つの場合の受精卵数はPVP にFSH を溶解した場合（11.5 ± 2.9個）に比べ有意に高かった(P<0.05)。従って、水酸化アルミニウムゲルが、ＰＶＰを用いた徐放性卵胞刺激剤と比較して、安定して過剰排卵を誘起できる効率的な徐放性卵胞刺激剤であり、また粘性が低いため調製しやすく、工業的にも利用価値の高い徐放性卵胞刺激剤であることが示された。
【００２３】
【表１】
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各種の徐放性卵胞刺激剤投与後の血清中のFSH濃度は表２に示した。水酸化アルミニウムゲルを用いた徐放性卵胞刺激剤における血清中のFSHは、多回投与した生理食塩水を用いた徐放性卵胞刺激剤よりは少ないものの、単回投与であるにも関らず投与後60時間まで持続し、徐放性を有することが示された。PVPを用いた徐放性卵胞刺激剤においても、徐放性を示したが、水酸化アルミニウムゲルを用いた徐放性卵胞刺激剤と比較してウサギごとにおけるばらつきが大きく、また表１で示されたように卵の回収数は少なかった。これらの結果より、水酸化アルミニウムゲルを用いた徐放性卵胞刺激剤は、生理食塩水を用いた徐放性卵胞刺激剤やPVPを用いた徐放性卵胞刺激剤と比較して、ウサギに与えるストレスが少なく、効率的な徐放性卵胞刺激剤であることが示された。
【００２４】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明により提供する実験動物の徐放性卵胞刺激剤及び過剰排卵誘起法は、これまでは実験者の負担が大きいにもかかわらず採用されていた多回投与による過剰排卵誘起法に代わり、容易かつ安定して過剰排卵を誘起し、卵を得ることができる優れた剤及び方法であるため、生命科学研究において必要とされる大量の実験動物受精卵を効率よく採取することができ、極めて有用である。