(57)【要約】【課題】  腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等を発症する新規メカニズムによる自己免疫疾患病態モデル動物と、それを用いた糸球体腎炎や脾腫等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  アポトーシス細胞の食作用を促進する因子として同定した脂肪球皮膜糖タンパク質（Milk Fat Globule EGF factor-8、；ＭＦＧ−Ｅ８）発現遺伝子を欠損させたマウス（ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス）を作製し、被検物質投与後のかかる自己免疫疾患病態モデル動物における糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の症状の改善程度や、モデル動物の脾臓及びリンパ節の胚中心の可染体マクロファージの被検物質存在下でのアポトーシス細胞の貪食作用を評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生することを特徴とする自己免疫疾患モデル非ヒト動物。
【請求項２】
糸球体腎炎を発症することを特徴とする請求項１記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。
【請求項３】
脾腫を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。
【請求項５】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来することを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。
【請求項７】
可染体マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。
【請求項８】
腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ。
【請求項９】
染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と、野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
野生型非ヒト動物が、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項１４記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患が糸球体腎炎であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患が脾腫であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１９】
齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項９〜１９のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤。
【請求項２１】
検体から脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等を発症する自己免疫疾患病態モデル動物と、それを用いた糸球体腎炎や脾腫等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹起するようにプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスは、老化した細胞や病態細胞などの生体にとって好ましくない細胞を排除するために生体に備わった機構である。アポトーシスでは細胞のサイズは急速に縮小し、また細胞核も凝縮、断片化する。ついで、このアポトーシス細胞はアポトーシス小体となり、最終的にはマクロファージ等の食細胞により貪食される。すなわち、まず細胞が縮小して隣接細胞から離れ、核のＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチンが核膜周辺に凝縮し、核の濃縮が生じると共に細胞表面の微絨毛が消失して平滑化し、大小の突起が出現し、やがてそれらがくびれてちぎれ、膜に包まれた大小の球状のアポトーシス小体に断片化し、これらの小体がマクロファージや隣接する食細胞により貪食除去される。
【０００３】
このように、アポトーシスは有害又は無用な細胞を除去するプロセスであり、哺乳類のホメオスタシスを維持するのに欠かせない（例えば、非特許文献１参照）。アポトーシス細胞は食細胞によって速やかに取り込まれ、それが炎症や、瀕死の細胞から放出される細胞内の抗原に対する自己免疫反応を防ぐと考えられている（例えば、非特許文献２，３参照）。アポトーシス細胞の表面に露出しているホスファチジルセリン（ＰＳ；phosphatidylserine）は、マクロファージの有用な認識シグナルとして同定されている（例えば、非特許文献４参照）。アポトーシスは、その初期過程において、細胞を構成する細胞膜リン脂質の配列変化を伴い、結果として負電荷のリン脂質であるホスファチジルセリンが細胞表面へ露出されることが報告されている（例えば、非特許文献５，６参照）。この細胞表面の変化がマクロファージや隣接する細胞に認識され、貪食過程が進行すると考えられている。ホスファチジルセリンと選択的に結合するアネキシンＶにより前記貪食過程が阻害されることから、アポトーシス細胞の細胞表面にホスファチジルセリンが露出することが貪食機構に重要な役割を果たしているものと考えられていた（例えば、非特許文献７，８参照）。
【０００４】
また、二次リンパ組織の胚中心（リンパ濾胞の中心）は、Ｂ細胞の増殖、選択、成熟及び死に対する固有の微小環境を提供する(例えば、非特許文献９，１０参照)。高親和性の表面免疫グロブリンを発現するB細胞は、成熟のために選択されるが、低親和性の免疫グロブリンをもつB細胞はアポトーシスによって死滅させられ、胚中心の可染体（tingible body）マクロファージと呼ばれる固有のマクロファージによって速やかに除去されることも知られている。
【０００５】
他方、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８；milk fat globule-EGF factor8）は、母乳中に多く含まれる乳腺上皮由来の分泌蛋白質としてクローニングされ（例えば、非特許文献１１参照）、その後、他の多くの正常組織やいくつかの腫瘍細胞で強く発現する分泌型糖タンパク質として知られている。ＭＦＧ−Ｅ８は、N末端側から２つのＥＧＦ（上皮増殖因子）ドメインと血液凝固因子Ｖ，VIIIのＣ１，Ｃ２ドメインとホモロジーのあるドメインで構成されている。ＭＦＧ−Ｅ８はヒト（ＢＡ４６，lactadherin）、マウス（ＭＦＧ−Ｅ８）、ラット（ｒＡＧＳ）、ブタ（Ｐ４７）、ウシ（ＰＡＳ−６，ＰＡＳ−７）を含め幾つかの哺乳類でそのホモログが報告されており、さらに、ＭＦＧ−Ｅ８とドメイン構造の類似性がある内皮細胞特異的細胞接着分子ＤＥＬ１がクローニングされており、ＭＦＧ−Ｅ８及びＤＥＬ１は２番目のＥＧＦドメイン内にはインテグリンと結合するＲＧＤ配列を含んでいる。一方、Ｃ末側のＣ１，Ｃ２ドメインは細胞膜のリン脂質に結合することが知られている。しかし、このＭＦＧ−Ｅ８は、酵素活性との関連やその生理機能について不明な点が多く、この点を明らかにするために、マウス脂肪球被膜糖蛋白質ＭＦＧ−Ｅ８のゲノム遺伝子と染色体マッピング、発生過程における遺伝子発現の動態、細胞内局在などについて検討されており、生殖原基がＭＦＧ−Ｅ８の発生初期の主要発現部位であり、発生の後期になると神経細胞や軟骨原基に特徴的な非常に強い発現があるとされている。
【０００６】
最近、いくつかのレセプターがホスファチジルセリンと結合することが報告されている（例えば、非特許文献２，１２参照）。本発明者らは、ＭＦＧ−Ｅ８が、活性化されたマクロファージから分泌され、ＰＳを認識してアポトーシス細胞に特異的に結合し、貪食する食細胞に誘導することを、既に報告している（例えば、非特許文献１３参照）。すなわち、脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）が、細胞がアポトーシスへ向かいはじめると細胞表面に露出するホスファチジルセリンなどのアミノリン脂質を認識することで、アポトーシス細胞に特異的に結合し、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を促進することや、ＭＦＧ−Ｅ８の点変異誘導体であるＤ８９Ｅ変異体がマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用を阻害することを報告している（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００３−１５５２５１号公報
【非特許文献１】Cell, 88, 347-354, 1997
【非特許文献２】Nature, 407, 784-788, 2000
【非特許文献３】Nat. Rev. Immunol., 2, 965-975, 2002
【非特許文献４】J. Immunol., 148, 2207-2216, 1992
【非特許文献５】Immunol. Today, 14: 131-136, 1993
【非特許文献６】Cirk. Res., 77: 1136-1142, 1995
【非特許文献７】Biochem. Biophys. Res. Commun., 205, 1488-1493, 1994
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1624-1629, 1996
【非特許文献９】Immunology, 107, 167-175, 2002
【非特許文献１０】Annu. Rev. Immunol. 12, 117-139, 1994
【非特許文献１１】Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 522-528, 1999
【非特許文献１２】Cell, 104, 325-328, 2001
【非特許文献１３】Nature, 417, 182-187, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等を発症する新規メカニズムによる自己免疫疾患病態モデル動物と、それを用いた糸球体腎炎や脾腫等の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アポトーシス細胞の食作用を促進する因子として、脂肪球皮膜糖タンパク質（Milk Fat Globule EGF factor-8、；ＭＦＧ−Ｅ８）を既に同定している。そこで、ＭＦＧ−E８遺伝子を欠損させたマウス（ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス）を作製し、かかるＭＦＧ−E８ノックアウトマウスの脾臓及びリンパ節の胚中心の可染体マクロファージについて調べたところ、多くのアポトーシスリンパ球が、効果的に貧食されていなかった。そして、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、肥大した白色髄に複数のリンパ小節を保有して脾腫を発症し、自己抗体を産生し、糸球体腎炎を発症していることを見い出した。これらの結果は、ＭＦＧ−Ｅ８が胚中心のアポトーシスＢ細胞を除去するのに重要な役割を果たし、その貪食機能の欠失が自己免疫疾患を誘導することを示唆している。本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生することを特徴とする自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項１）や、糸球体腎炎を発症することを特徴とする請求項１記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項２）や、脾腫を発症することを特徴とする請求項１又は２記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項３）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項４）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項４記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物（請求項５）に関する。
【００１０】
また本発明は、請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来することを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項６）や、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項７）や、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項６記載のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージ（請求項８）に関する。
【００１１】
本発明はまた、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項９）や、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１０）や、請求項１〜５のいずれか記載の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価することを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１１）や、ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、可染体マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１２）や、ＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージが、腹腔マクロファージであることを特徴とする請求項１０又は１１記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１３）や、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と、野生型非ヒト動物の場合とを比較・評価することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１４）や、野生型非ヒト動物が、染色体上の脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生する非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物であることを特徴とする請求項１４記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１５）や、自己免疫疾患が糸球体腎炎であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１６）や、自己免疫疾患が脾腫であることを特徴とする請求項９〜１５のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１７）や、非ヒト動物が、齧歯目動物であることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１８）や、齧歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項１８記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法（請求項１９）に関する。
【００１２】
さらに本発明は、請求項９〜１９のいずれか記載の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法により得られることを特徴とする自己免疫疾患の予防・治療剤（請求項２０）や、検体から脂肪球被膜糖蛋白質（ＭＦＧ−Ｅ８）遺伝子を抽出し、その遺伝子異常の有無を調べることを特徴とするＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法（請求項２１）に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、新規作用メカニズムによる新しいタイプの抗自己免疫疾患薬、例えば腎臓の内部構造（糸球体）が徐々に破壊されることによって起こる糸球体腎炎や脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫等の予防・治療剤を開発することができるばかりでなく、可染体マクロファージやチオグリコレート刺激腹腔マクロファージ等のマクロファージによるアポトーシス細胞の貪食作用の機構解明が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物としては、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＭＦＧ−Ｅ８を発現する機能が失われ、自己抗体を産生するモデル動物（以下、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損したモデル動物ということがある）であれば特に制限されるものではないが、糸球体腎炎及び／又は脾腫（巨脾症）の症状を呈するモデル動物を好適に例示することができる。また、上記非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができ、中でもマウスを好適に挙げることができる。
【００１５】
本発明において「自己抗体を産生する」とは、少なくとも、血清内の抗二重鎖ＤＮＡ抗体及び／又は抗核抗体濃度が、野生型の非ヒト動物に比して、２倍以上高いことをいう。また、自己免疫疾患としては、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等を例示することができ、糸球体腎炎の症状を呈するとは、少なくとも、糸球体内に多量のＩｇＧが認められ、糸球体が肥大した症状を呈することをいい、脾腫（巨脾症）の症状を呈するとは、少なくとも、白色髄が非常に肥大し、複数のリンパ小節を有する症状を呈することをいう。本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物は、抗自己免疫疾患薬、例えば糸球体腎炎や脾腫等の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。
【００１６】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。また上記ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるものが、ＭＦＧ−Ｅ８欠損型と同腹の野生型を得ることができ、これらを用いて正確な比較実験をすることができる点で好ましい。そして上記のように、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物の好適例としては、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウスを、野生型マウスとしては該ノックアウトマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１７】
ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウスの作製法としては、ＭＦＧ−Ｅ８タンパク質を発現する機能を失ったマウスを作製することができる方法であればどのような作製法でもよいが、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定し、このクローンのＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の全部又は一部を含むフラグメントをネオマイシン耐性遺伝子カセット等で置換することによって、ターゲットベクターを作製する方法を挙げることができる。
【００１８】
この線状化されたベクターをエレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、Ｇ−４１８などの薬剤に抵抗性の細胞の中から相同的組換えを行ったＥＳ細胞を選択し、その細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウス（ＭＦＧ−Ｅ８+/-）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスの雌雄を交配させることによって、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス（ＭＦＧ−Ｅ８-/-）を得ることができる。
【００１９】
本発明のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとしては、上記本発明の自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ、すなわち、ＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子が染色体上で欠損したモデル動物から得られる、アポトーシス細胞の貪食作用が喪失又は減衰したマクロファージであれば特に制限されず、かかるマクロファージとして、可染体マクロファージ、腹腔マクロファージ、メタロフィリック（metalophilic）マクロファージ、骨髄由来マクロファージ、樹状細胞を挙げることができる。例えば、胚中心（リンパ濾胞の中心）に存在するＣＤ６８を特異的に発現する可染体マクロファージは、、抗ＣＤ６８抗体を用いて常法により同定することができ、また、腹腔マクロファージは、３％（ｗ/ｖ）のチオグリコレートの腹腔内注射を受けたマウスから常法により調製することができる。かかる本発明のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージは、アポトーシス細胞の貪食作用の機構を解明する上で、また、抗自己免疫疾患薬、例えば糸球体腎炎や脾腫等の予防・治療剤のスクリーニングに有利に用いることができる。
【００２０】
本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価する方法や、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法や、本発明のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明のスクリーニング方法によると、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の自己免疫疾患の予防・治療剤を開発することが可能となる。
【００２１】
上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物における自己免疫疾患の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、局所への直接投与などの方法を挙げることができる。また、自己免疫疾患の程度を評価する方法としては、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の症状の改善程度を評価する方法を挙げることができる。自己免疫疾患の程度を評価するに際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。
【００２２】
上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、局所への直接投与などの方法を挙げることができる。また、非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとしては、可染体マクロファージや腹腔マクロファージなどを好適に例示することができる。アポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法としては、例えば、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを用いる場合、デキサメサゾンでアポトーシスを誘導したＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞を貪食する程度を、ＴＵＮＥＬ反応により、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより評価する方法を挙げることができる。かかる評価に際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。
【００２３】
上記本発明のＭＦＧ−Ｅ８ノックアウトマウス等のＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の機能が染色体上で欠損した自己免疫疾患モデル非ヒト動物に由来するＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージを、被検物質の存在下にインビトロでアポトーシス細胞と接触させ、該非ヒト動物のＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージのアポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質の存在下でのＭＦＧ−Ｅ８欠損マクロファージとアポトーシス細胞との接触は、マクロファージの培養に用いられる培地中で、被検物質の存在下に共培養することにより行うことができる。アポトーシス細胞に対する貪食作用の程度を評価する方法としては、例えば、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを用いる場合、デキサメサゾンでアポトーシスを誘導したＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞を貪食する程度を、ＴＵＮＥＬ反応により、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより評価する方法を挙げることができる。かかる評価に際しては、自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、中でも自己免疫疾患モデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物と比較評価することが好ましい。
【００２４】
上記本発明の自己免疫疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法における被検物質としては、天然若しくは人為的に合成された各種ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、低分子有機化合物を例示することができる。かかる被検物質の中から、糸球体腎炎、脾腫、ヒト全身性エリマトーデス等の症状を改善する物質やアポトーシス細胞に対する貪食作用を増強する物質は自己免疫疾患の予防・治療剤の候補物質であり、かかる候補物質としては、ＭＦＧ−Ｅ８の他、ＭＦＧ−Ｅ８中のＲＧＤモチーフを有するＥＧＦ−２ドメイン、高プロリン／スレオニン含有ドメイン、２つの因子VIII相同ドメイン（Ｃ１及びＣ２）を有する組換えＭＦＧ−Ｅ８変異体、かかる変異体に対する抗体、Ｄｅｌ−１等のＭＦＧ−Ｅ８の相同体などを具体的に挙げることができる。これら候補物質の中から薬効が確認できた物質を医薬用の治療剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液、リポソームに封入又は包埋体等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２５】
経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。また、自己免疫疾患の予防・治療剤の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができる。
【００２６】
本発明のＭＦＧ−Ｅ８異常に起因する自己免疫疾患の診断法としては、検体のマクロファージからＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を抽出し、その塩基配列を調べて、正常なＭＦＧ−Ｅ８遺伝子と比較して異常の有無を調べる方法を例示することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
（ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊）
ＭＦＧ−Ｅ８染色体遺伝子を１２９／ｓｖマウスλ遺伝子ライブラリーから単離した。エクソン４〜６をｎｅｏ遺伝子で置換し、ジフテリア毒素Ａ断片をコードするＤＮＡ断片を、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の下流に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した。Ｒ１ ＥＳ細胞を、文献（Science, 292, 1546-1549, 2001）記載の通りターゲッティングベクターでトランスフェクトし、Ｇ−４１８耐性クローンを、ＰＣＲにより、相同的組み換え用にスクリーニングし、ＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスを作製した。ＭＦＧ−Ｅ８欠損対立遺伝子を保有するＥＳクローンを、宿主の胎芽に導入し、キメラマウスを作製した。ＥＳ細胞に起因するキメラマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Nippon SLC社製）と交配し、ＭＦＧ−Ｅ８+/-マウスを作製した。ＭＦＧ−Ｅ８+/-を親として交配して、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスを作製し、ＭＦＧ−Ｅ８+/+及びＭＦＧ−Ｅ８-/-の同腹仔の表現型を分析した。全てのマウスを、特定病原体未感染施設に収容し、全ての動物実験は大阪大学医学部動物実験委員会に承認された細則に従って行われた。
【００２９】
（ＰＣＲ、サザンブロット及びノーザンブロット分析）
ゲノムＤＮＡを文献（Nucleic Acids Res. 19, 4293, 1991）記載の通り調製し、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の遺伝子型をＰＣＲにより定量した。野生型に特異なセンスプライマー（５'‐ＧＴＧＡＡＣＣＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡＧＡＴ；配列番号１）又は突然変異対立遺伝子（５'‐ＣＧＴＧＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴ ；配列番号２）を、共通のアンチセンスプライマー（５'‐ＧＧＧＣＡＴＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣ ；配列番号３）と共に使用した。サザンハイブリダイゼーション用に、ゲノムＤＮＡをEcoRV及びKpnIで処理し、０．８％アガロースゲルで電気泳動して単離し、Hybond Ｎ+膜（Amercham Bioscience 社製）に移した。ハイブリダイゼーションを、ターゲッティングベクターのすぐ外側に局在する５４０ｂｐのＤＮＡ断片を使用して行った。ノーザンハイブリダイゼーション用に、全ＲＮＡを２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルで単離し、Hybond Ｎ+膜に移し、マウスＭＦＧ−Ｅ８ ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。
【００３０】
（免疫沈降及びウェスタンブロッティング）
プロテインＡ−セファロースと抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体２４２２との複合体を、文献（Nature, 417, 182-187, 2002）記載の通り、調製した。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、３％（ｗ/ｖ）のチオグリコレート（Sigma社製）の腹腔内注射を受けた１２週齢のマウスから調製した。細胞（１×１０7）をＡＩＭＶ培地（Invitrogen社製）で４８時間培養した。上澄液を回収し、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭの［ｐ-アミジノフェニル］メタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液［ｐＨ７．６］）に細胞を溶解した。培養上澄液及び細胞可溶化液を、２４２２−プロテインＡ−セファロース複合体とインキュベーションした。０．５ＭのＮａＣｌを含むＲＩＰＡ緩衝液で洗浄した後、ビーズに結合したタンパク質を、０．１％のトリトンＸ−１００を含む１００ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１．５）で溶出した。溶出物の一定分量を、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（１０％ゲル）で分離し、その後、ビオチン標識化ハムスター抗マウスＭＦＧ−Ｅ８モノクローナル抗体（クローン１８Ａ２、Ｋ．Ａ．、Ｒ．Ｈ．、Ｍ．Ｔ．、及びＳ．Ｎ．未発表）とペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Roche社製）でウエスタンブロッティングした。抗体が認識したタンパク質を、化学ルミネッセンス反応（Renaissance社製）により視覚化した。
【００３１】
（インビトロ貪食作用分析）
インビトロ貪食作用分析を、本質的に文献（Nature, 417, 182-187, 2002）記載の通りに行った。６週齢のＣＡＤ-/-マウスの胸腺細胞（Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003）の１×１０6細胞を、１０μＭのデキサメサゾンで、３７℃でインキュベーションし、アポトーシスを誘導し、８ウェルのLab‐Tek IIチャンバースライド（Nalge Nunc 社製）中で培養したチオグリコレート刺激腹腔マクロファージ（１×１０5細胞）に添加した。１．５時間の共培養の後、細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ反応させ、光学顕微鏡で観察した。ＴＵＮＥＬ陽性胸腺細胞の数を数え、マクロファージ当たりのＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシス細胞数を定量することにより、貪食作用の指標とした。少なくとも１５０のマクロファージを検査した。
【００３２】
（組織化学及び電子顕微鏡分析及び自己抗体アッセイ）
ヘマトキシリン及びエオシン染色を行うために、マウス脾臓及びリンパ節を、０．１％のリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の４％パラホルムアルデヒド／４％スクロースに固定し、パラフィンに包埋し、４μｍの切片にした。免疫組織化学分析を行うために、凍結した組織の切片（４μｍ）を冷却アセトンで固定し、非特異的部位を、５％のヤギ血清（Invitrogen社製）及び１％のウシ血清アルブミン（Sigma 社製）でブロックした。使用したモノクローナル抗体は、Alexa‐Fluro 488 スプレプトアビジン（Molecular probes社製）、Ｃｙ−３結合抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体（クローン１８Ａ２）と共にビオチン化した抗ＣＤ６８抗体（Serotec社製）又は抗Ｆ４／８０抗体（クローン６−１６Ａ、Ｍ．Ｔ．）、及びＣｙ３結合抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson社製）と共にラット抗ＭＯＭＡ−１抗体（BMA Biomedical社製）であった。ＴＵＮＥＬ染色をApoptag kit（Intergen社製）を用いて行った。染色した切片を、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Dojindo Laboratories 社製）を含むFluorSave mounting 試薬（Calbiochem社製）でマウントし、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。電子顕微鏡での観察には、１０週齢のマウスにKLHを投与した後、脾臓を２％のグルトアルデヒド及び２％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）内に固定した。７．５％のスクロースを含む同緩衝液で洗浄した後、サンプルを１％のＯｓＯ４で固定(post-fix)し、Epon ８１２に包埋した。切片（８０μm）をウルトラミクロトーム（Nissei社製）で調製し、クエン酸鉛及び酢酸ウラニルで染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ‐７１００電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー 社製）で観察した。
【００３３】
抗二本鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡを、ＭＢＬからのMesacup EIAを用いて、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）抗体（Cappel社製）で定量化した。４５０ｎｍの吸光度を自動Micro-ELISA readerを用いて測定した。
【００３４】
（免疫化）
リンパ節の胚中心を発達させるために、文献14記載の通りに、マウスをヒトアルブミンで免疫化した。要約すると、１０週齢のマウスの腹腔内に０．５ｍｌのウサギ抗ヒトアルブミン抗体（２ｍｇ／ｍｌ）(Sigma社製)を注入し、２４時間後に、フッドパッドに２５μｇのヒト血清アルブミンを注入した。膝窩及び笨窩リンパ節を、抗原注入後６日目に調製した。ＫＬＨで免疫化するためには、マウスの腹腔内に１５μｇのＫＬＨ（Wako社製）及びフロイントの完全アジュバンドを注入した。免疫を２回繰返し、脾臓を２回目の注入の４日後に単離した。
【実施例２】
【００３５】
（可染体マクロファージにおけるＭＦＧ−Ｅ８の発現）
ＭＦＧ−Ｅ８のインビボでの生理学的な役割を調べるために、その発現を先ずノーザンブロットハイブリダイゼーションによって調べた（図１ａ）。文献（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87, 8417-8421, 1990、Biochem. Biophys. Res. Commun., 254, 522-528, 1999）記載の通り、ＭＦＧ−Ｅ８は乳腺で強く発現した。脾臓、リンパ節及び脳等の他のいくつかの組織もＭＦＧ−Ｅ８ ｍＲＮＡを発現した。抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体との脾臓切片の免疫組織分析は、ＭＦＧ−Ｅ８が、胚中心に局在する制限された細胞で発現することを示した（図１ｂ）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片は、抗体で染色されず、ＭＦＧ−Ｅ８抗体の特異性を確認した。胚中心（リンパ濾胞の中心）には、特異的にＣＤ６８を発現するがＦ４／８０は発現しない可染体マクロファージと呼ばれるマクロファージが存在している（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。ＭＦＧ−Ｅ８を発現する細胞は、ＣＤ６８を発現するがＦ４／８０を発現せず、ＣＤ６８又はＦ４／８０による二重染色は、可染体マクロファージがＭＦＧ−Ｅ８を発現することを示唆した。ＣＤ６８+可染体マクロファージは、脾臓だけでなく、リンパ節及び胸腺にも存在する（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体での染色は、リンパ節のＣＤ６８+マクロファージがＭＦＧ−Ｅ８を発現することを示唆した（図１ｂ）が、胸腺の切片においては、ＭＦＧ−Ｅ８のシグナルは検出されなかった。
【００３６】
（ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊）
本発明者らは、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスをジーンターゲティング法により作製した。マウスＭＦＧ−Ｅ８遺伝子は、第７染色体に局在し、ゲノムＤＮＡ１５．３ｋｂ内に１０個のエクソンによりコードされている。エクソン４〜６をｎｅｏ耐性遺伝子と置換したターゲッティングベクターを構築し（図２ａ）、マウス胚幹細胞（ＥＳ）に注入した。突然変異を有するＥＳクローンを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により同定した。２つのＥＳクローン由来のマウスは、同一の表現型を有した。ヘテロ接合の動物をインタークロスし、その結果生じた同腹仔の尾部ＤＮＡを、ターゲッティングベクター外の配列を含むプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。図２ｂに示すように、EcoRV及びKpnIで二重処理したＤＮＡは、ＭＦＧ−Ｅ８+/+には、７．２ｋｂのバンドが現れ、ＭＦＧ−Ｅ８-/-には、５．６ｋｂのバンドが現れ、ＭＦＧ−Ｅ８+/-ではその両方が現れた。そのサイズは、ターゲッティングベクターとＭＦＧ−Ｅ８遺伝子の相同的組換で想定された通りであった。neo 遺伝子プローブを用いたKpnIで処理したＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションでは、ＭＦＧ−Ｅ８+/-又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおいては単一のバンドが現れ（データは示されていない）、ターゲットベクターが他の部位に挿入されていないことを確認した。
【００３７】
本発明者らは、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージが、ＭＦＧ−Ｅ８を高分泌していることを先に報告した（Nature, 417, 182-187, 2002）。実際、抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体を用いた免疫沈降及びウェスタンブロットによって、野生型マウスのチオグリコレート刺激腹腔マクロファージの培養上澄液における７４ｋＤａのタンパク質が明らかになった（図２ｃ）。このタンパク質は、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージの上澄液では検出されず、ＭＦＧ−Ｅ８-/-対立遺伝子が、ＭＦＧ−Ｅ８に対するヌル対立遺伝子であることを確認した。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力を、アポトーシスを起こしたＣＡＤ-/-胸腺細胞を用いて調べた。ＣＡＤ-/-胸腺細胞はアポトーシス刺激によるＤＮＡ分解をおこさない（Nat. Immunol., 4, 138-144, 2003）。しかし、ＭＦＧ−Ｅ８+/+マクロファージと共培用すると、細胞はアポトーシスの指標であるＴＵＮＥＬ陽性となり、食細胞指標は１．２０であり（図２ｄ及び２ｅ）、ＭＦＧ−Ｅ８+/+マクロファージが効果的にアポトーシス細胞を貪食し、そのＤＮＡを切断することを示した。他方、ＭＦＧ−Ｅ-/-マウスのマクロファージは、アポトーシス細胞を全く又は少数しか貪食せず、食細胞指標は０．３１であった。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力は、組み替えＭＦＧ−Ｅ８を添加することによって、用量依存的に回復した。すなわち、これらのマクロファージに０．１μｇ／ｍｌの組換ＭＦＧ−Ｅ８を添加すると、食細胞指標は０．９２まで増加した。
【００３８】
（ＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスの脾腫）
３つの遺伝子型（ＭＦＧ−Ｅ８+/+、ＭＦＧ−Ｅ８+/-及びＭＦＧ−Ｅ８-/-）は通常のメンデル遺伝の法則通りに現れた。ＭＦＧ-/-マウスは、通常の繁殖力で繁殖し、その乳腺は少なくとも非妊娠時は普通であるように見えた（データは示されていない）。しかし、図３ａに示されるように、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは年齢依存的に脾臓の大きさが正常な範囲を超えて拡大する脾腫（巨脾症）を発症した。４０週齢では、ＭＦＧ−Ｅ８-/-の脾臓は、野生型より約３倍重かった（図３ｂ）。脾臓の組織化学分析で、白色髄がＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスで非常に肥大し、複数のリンパ小節を保有していることが示された（図３ｃ）。マーカーＭＯＭＡ−１によって定義されるメタロフィリックマクロファージは、白色髄の周辺帯と濾胞帯の境界に局在している（Immunology, 58, 665-669, 1986）。抗ＭＯＭＡ−１抗体による脾臓切片の染色により、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓の濾胞帯の肥大を確認した（図３ｄ）。脾臓内のＢ細胞とＴ細胞の比率は、ＭＦＧ−Ｅ８+/+とＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスとで同じであったが、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓のリンパ球の数は、野生型の脾臓より２〜３倍多かった。
【００３９】
（胚中心のＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食障害）
可染体マクロファージが、胚中心で発生したアポトーシスＢ細胞を貪食することは知られている（Anat. Rec., 229, 511-520, 1991）。４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウスの脾臓では、胚中心のＣＤ６８陽性マクロファージと結合しているアポトーシスをおこしたＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は少なかった（図４ａ）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスのＣＤ６８陽性細胞は、明らかに野生型マウスのＣＤ６８陽性細胞より大きく、より多くのＴＵＮＥＬ陽性細胞と結合していた。ＣＤ６８陽性マクロファージの肥大と、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓のＴＵＮＥＬ陽性細胞との強い結合は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）でマウスを免疫し、B細胞を活性化すると明瞭であった（図４ａ）。ＣＤ６８は、主に後期エンドソーム又はリソソーム内に局在している（Adv. Immunol., 68, 271-314, 1998）。したがって、ＫＬＨで処理したＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓内のＴＵＮＥＬ陽性細胞を保有するマクロファージを共焦点顕微鏡で分析したところ（図４ｂ）、ＣＤ６８を細胞内に見い出した。ＴＵＮＥＬ陽性物質であるアポトーシス細胞の核はＣＤ６８と共在していなかったが、マクロファージの表面の細胞外に存在していたようである。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージ内のアポトーシス物質が細胞外に局在していることを確認するために、脾臓切片を電子透過型顕微鏡で分析した。図４ｃに示すように、野生型マウスの可染体マクロファージは、アポトーシス細胞の凝縮核を細胞内に保有しており、いくつかのアポトーシス物質は分解されていた。ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓では、アポトーシス細胞は一見、可染体マクロファージに局在していたが、これはインタクトな原形質膜を保有してた。このことは、これらのアポトーシス細胞がマクロファージの外側に局在することを示唆している。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓から調製したリンパ球は、Ｆａｓリガンド又はＵＶの処理により野生型細胞と同じ効率でアポトーシスを起こし、ＰＳを表面に露出した。これらの結果から、可染体マクロファージのアポトーシス細胞を貪食する能力は、ＭＦＧ−Ｅ８の欠如によって障害されていると結論した。
【００４０】
（ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおける糸球体腎炎の発症）
アポトーシス細胞を全身へ連続的に注入すると、自己抗体が産生されることが知られている（J. Exp. Med., 188, 387-392, 1998）。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、自発的に自己抗体を年齢依存的に産生した。図５ａに示すように、１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-の血清内の抗二重鎖ＤＮＡ抗体又は抗核抗体（ＡＮＡ）の濃度は、野生型マウスと同じであった。しかし、４０週齢では、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス、特にメスのマウスは、血清内に、抗二重鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡを高い濃度で保有していた。すなわち、オスのＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの抗二重鎖ＤＮＡ抗体及びＡＮＡの濃度は、野生型マウスよりそれぞれ２．３倍及び５．４倍高かった。メスのマウスでは、これらの値は野生型マウスより６．３倍及び８．０倍高かった。４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの全ＩｇＧレベルも、同齢の野生型マウスより２倍高かった（データは示されていない）。循環している自己抗体は、腎臓に免疫複合体として堆積し、糸球体腎炎を誘発することが知られている（Semin. Nephrol., 12, 379-394, 1992）。腎臓の凍結切片を、蛍光抗体法により調べたところ、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの糸球体内に多量のＩｇＧの堆積が明らかになった（図５ｂ）。ＩｇＧの堆積と一致して、細胞過多及び糸球体の肥大が、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの糸球体で見られ、これらのマウスが糸球体腎炎を発症したことを示している（図５ｃ）。
【００４１】
（まとめ）
アポトーシス細胞の除去は通常非常に効率的であり、アポトーシスの割合が非常に高い組織でもほとんどアポトーシス細胞を見い出すことができない（Nature, 372, 100-103, 1994）。マクロファージ内のいくつかの分子が、アポトーシス細胞のレセプター又はアポトーシス細胞とマクロファージとの間の架橋分子（bridging molecules）として提案された（Nature, 407, 784-788, 2000）が、各分子の生理学的役割は明確にはなっていなかった。上記実施例は、ＭＦＧ−Ｅ８が、脾臓及びリンパ節の胚中心の可染体マクロファージ並びにチオグリコレート刺激腹腔マクロファージで特異的に発現することを示した。胚中心では、抗原に対して減衰した親和性を有するＢ細胞が、アポトーシスを起こす（Immunity, 4, 107-111, 1996）。可染体マクロファージは、これらのアポトーシス細胞の排除に寄与し、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスで得られた結果は、ＭＦＧ−Ｅ８がこの過程に重要な役割を果たしていることを示している。ＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスは、多量の自己抗体を発生させた。この結果は貪食されなかったアポトーシスＢ細胞は二次的ネクローシスを起し、遊離した物質は濾胞性の樹状細胞と結合し、自己反応性Ｂ細胞に生存シグナルを与える可能性を示唆している（Immunol., 74, 61-88, 2000）。さらにこのシグナルは、リンパ球の成長を刺激するサイトカインを産生するＴ細胞を活性化し、脾腫を誘発してのであろう。
【００４２】
ＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージは、アポトーシス細胞と結合していた。このことは、ＭＦＧ−Ｅ８-/-マクロファージがアポトーシス細胞をまだ認識できることを示している。Hoffmann et al.は以前に、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食に関して２段階モデルを提案した（J. Cell Biol., 155, 649-659, 2001）。このモデルにおいては、アポトーシス細胞は、先ずマクロファージによって繋ぎとめられ、次にＰＳ依存方式で、マクロピノサイトーシスに貪食される。このシナリオでは、ＭＦＧ−Ｅ８は、マクロピノサイトーシス段階で機能しているように思われる。ＣＤ−６８陽性可染体マクロファージは、二次リンパ組織の胚中心だけでなく、胸腺にも存在する（J. Exp. Med., 174, 827-836, 1991）。胸腺マクロファージにＭＦＧ−Ｅ８が発現しないことは、異なる組織のマクロファージが、アポトーシス細胞の貪食に異なる分子を用いることを示している。このことに関して、本発明者らは、近年ＭＦＧ−Ｅ８の相同体（Ｄｅｌ−１）を見い出し、その発現がＭＦＧ−Ｅ８の発現と完全に異なることを確認した。
【００４３】
他方、チオグリコレート刺激腹腔マクロファージは、ＭＦＧ−Ｅ８を発現し、その貪食作用はＭＦＧ−Ｅ８に強く依存する。チオグリコレート刺激腹腔マクロファージは、炎症部位の好中球及びリンパ球の速やかな排除に関与する専門のマクロファージを代表する（J. Leukoc. Biol., 61, 375-380, 1997）。バクテリア又はウイルス感染に対するＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの反応を観察することは興味深いかもしれない。最後に、全身性エリマトーデスのヒトの患者は、胚中心の可染体マクロファージのアポトーシス細胞の貪食にしばしば欠陥がある（Arthritis Rheum., 46, 191-201, 2002）ことから、本発明の自己免疫マウスは、ヒト全身性エリマトーデスのモデル動物として有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】可染体マクロファージにおけるＭＦＧ−Ｅ８の発現に関する図である。ａ．１０週齢のマウスの示された組織から調製した全ＲＮＡ（１０μｇ）を、32Ｐ標識マウスＭＦＧ−Ｅ８  ｃＤＮＡをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行った（上パネル）。下のパネル；フィルターをメチレンブルーで染色した。ｂ．１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+（ＷＴ）マウス又はＭＦＧ−Ｅ８-/-（ＫＯ）マウスの脾臓切片を抗Ｆ４／８０抗体又は抗ＣＤ６８抗体（緑）及び抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体（赤）で染色した。切片をヘモキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した。マウスをヒトアルブミンで免疫化してリンパ節を発達させ、切片を上記の通り染色した。ＨＥで染色した切片の、付点の四角は、免疫染色パネルで示す区域に対応する。スケールバー、１００μｍ。
【図２】本発明の自己免疫疾患モデルマウスを作製するための、ＭＦＧ−Ｅ８遺伝子を標的とした破壊に関する図である。ａ．内在性のＭＦＧ−Ｅ８部位（ＷＴ）、ターゲットベクター及びターゲット部位（ＫＯ）を示した。エクソンを黒の四角で示し、番号を付した。ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）及びジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）をコードする遺伝子を示した。ｂのサザンハイブリダイゼーションに使用したプローブをバーで示した。プローブにより検出されたEcoRV‐KpnIで処理した断片を示した。ｂ．ＭＦＧ−Ｅ８+/-の親から生じた仔の尾部DＮＡ（５μｇ）を、サザンハイブリダイゼーションにより分析した。ｃ．１２週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスから調製したチオグリコレート刺激腹腔マクロファージを４８時間培養した。細胞抽出液及び培養上澄液を、抗ＭＦＧ−Ｅ８抗体２４２２で免疫沈降し、１８Ａ２モノクローナル抗体でウェスタンブロットした。ｄ．チオグリコレート刺激腹腔マクロファージを、組換えＭＦＧ−Ｅ８（０．１μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下でＣＡＤ欠損マウスから調製したアポトーシス胸腺細胞と共培養し、ＴＵＮＥＬ（茶）で染色した後、光学顕微鏡で観察した。倍率は４００倍。ｅ．マクロファージ当たりの貪食された（ＴＵＮＥＬ陽性）アポトーシス細胞数で示された貪食作用指標。実験は３回行い、平均値が標準偏差と共に示されている。
【図３】本発明のＭＦＧ−Ｅ８ヌルマウスの脾腫発症に関する図である。ａ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓を撮影した。スケールバー、１センチ。ｂ．１０週齢又は４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス（白いバー）及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス（黒いバー）の脾臓を秤量し、１０匹のマウスの平均値を標準偏差と共に示した。ｃ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。スケールバー、０．１ｍｍ。ｄ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片を抗ＭＯＭＡ−１抗体（赤）で染色した。スケールバー、０．１ｍｍ。
【図４】本発明の胚中心のＭＦＧ−Ｅ８欠損可染体マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食障害に関する図である。ａ．脾臓切片は、４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウス、又はＫＬＨで免疫化した１０週齢のマウスから調製し、抗ＣＤ６８抗体（赤）及びＴＵＮＥＬ（緑）で染色した。スケールバー、１００μｍ。付点の区域の拡大図を右のパネルに示す。スケールバー、２５μｍ。ｂ．ＫＬＨで免疫化した１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓に局在するＴＵＮＥＬ陽性細胞（緑）と結合したＣＤ６８陽性（赤）可染体マクロファージを、共焦点顕微鏡（Zeiss社製）で観察し、３Ｄ投影システムを使用して３次元の像を作成した。ｃ．ＫＬＨで免疫化した１０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+又はＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの脾臓切片を、電子顕微鏡により分析した。ＭＦＧ−Ｅ８+/+脾臓の可染体マクロファージ（ＴＢＭ）は、アポトーシス細胞の残遺物しか保有しない（矢印）が、ＭＦＧ−Ｅ８-/-脾臓でＴＢＭと結合したアポトーシス細胞はまだインタクトである。
【図５】本発明のＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスにおいて糸球体腎炎の発症を示す図である。ａ．１０又は４０週齢のオス（Ｍ）及びメス（Ｆ）のマウス（各グループに８匹のマウス）の抗二重鎖ＤＮＡ抗体及び抗核抗体（ＡＮＡ）の血清濃度は、平均でプロットした（バー）。ｂ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの腎臓の凍結切片をＣｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson社製）で染色した。スケールバー、１００μｍ。ｃ．４０週齢のＭＦＧ−Ｅ８+/+マウス及びＭＦＧ−Ｅ８-/-マウスの腎臓切片をパラホルムアルデヒドで固定し、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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