(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型Ａβペプチドと比較して２２位においてグルタミン酸の代わりにグリシンを含むアミノ酸配列を有するＡβ−Ａｒｃペプチドを含むプロトフィブリルであって、
前記Ａβ−Ａｒｃペプチドが、Ａβ ４０−Ａｒｃ（配列番号１のアミノ酸の１〜４０）である、プロトフィブリル。
【請求項２】
前記プロトフィブリルが、オランダ型突然変異、フラマン型突然変異、イタリア型突然変異、およびアイオワ型突然変異、ならびにこれらの組合わせからなる群より選択される突然変異を有するＡβペプチドをさらに含む、請求項１に記載のプロトフィブリル。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプロトフィブリルと、ヒトおよび獣医学的用途に生理学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のプロトフィブリルを含む、アルツハイマー病の予防または治療のためのワクチン。
【請求項５】
アルツハイマー病の予防または治療のための薬剤の製造における、請求項１または２に記載のプロトフィブリルの使用。
【請求項６】
請求項１または２に記載のプロトフィブリルに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（発明の分野）
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防及び治療に関する。より具体的には、本発明は、ＡＤを治療または予防する目的の能動的免疫化における、非野生型プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）の使用に関する。本発明はさらに、高いプロトフィブリル形成活性を有するペプチドであるＡβ−Ａｒｃ、並びに、いくつかのその応用、例えば、ＡＤに対する受動的免疫化のための該ペプチドに対する抗体に関する。
【０００２】（発明の背景）
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年痴呆として一般に知られている進行性疾患である。該疾患は、後期発症型及び初期発症型という２つのカテゴリーに分類される。一方の形であるこの後者のＡＤ型は遺伝性であり、家系性ＡＤとして知られている。どちらの型のＡＤも、老人斑及び神経原線維濃縮体という、２つの型の脳の病変を特徴とする。老人斑は、中心にある細胞外アミロイド沈着物を有する直径１５０ｍｍ以下の崩壊した神経網領域である。神経原線維濃縮体は、対で互いに捻れた２本の線維からなる、細胞内沈着物である。
【０００３】  アミロイドβペプチド（ＡβＰ）とも称されるＡβは、約４，５００の分子量を有する高度に凝集した小ポリペプチドである。このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称されるはるかに大きな前駆体タンパク質の切断産物である。Ａβタンパク質は、３９から４２アミノ酸を含む。ＡＰＰには、それぞれ５６３、６９５、７１４、７５１、及び７７０アミノ酸という、少なくとも５つの別個のアイソフォームが存在する（Ｗｉｒａｋ等（１９９１））。Ａβタンパク質セグメントは、ＡＰＰアイソフォームの膜貫通ドメインの約半分、及び、細胞外ドメインの最初の約２８アミノ酸を含む。
【０００４】  ＡＰＰは、生体の全ての部分に高度に発現され、いくつかの重要な生物学的機能を有する、膜貫通タンパク質である。インビボにおけるＡＰＰのタンパク質分解プロセシングは、正常な生理的過程である。ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０のカルボキシ末端切断短縮形は、脳及び脳脊髄液に存在する（Ｐａｌｍｅｒｔ等（１９８９））（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ等（１９８９））。１つは非アミロイド形成経路、１つはアミロイド形成経路という、おそらく２つの主な代謝経路が存在するだろう。アミロイドを形成する非正常経路は、Ａβタンパク質ポリペプチドを産生し、これは、濃いアミロイド生成性凝集物を形成する傾向があり、これはタンパク質分解的崩壊及び除去に抵抗性である。得られたＡβタンパク質凝集物はおそらく、ＡＤの神経病理学的特徴である、豊富なアミロイド斑及び脳血管アミロイドの形成に関与している。
【０００５】  ＡＤの脳では、Ａβペプチドは、実質的に不溶性のアミロイド線維を形成し、これが蓄積すると老人斑となる。Ａβ線維化過程は、複雑な多段階反応である。線維化反応の別個の一群の中間Ａβ種であるプロトフィブリルが近年同定された（Ｗａｌｓｈ等（１９９７））、（Ｗａｌｓｈ等（１９９９）、（Ｈａｒｐｅｒ等（１９９９））。
【０００６】  脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血漿中で最も一般的なＡβ形は４０アミノ酸（Ａβ４０）を含むが、斑の中では４２アミノ酸（Ａβ４２）を含むＡβが最も一般的な形である（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ等（１９９６））。このより長い方の形はより急速に凝集する傾向があり、Ａβ４０よりも病原性が高いと考えられている。
【０００７】  多くの患者は、病因の不明なアルツハイマー病に自然発生的にかかるが、いくつかの遺伝的成分も関与している。それぞれ第１、１４及び２１番染色体上に、疾患を引き起こす遺伝子変異が発見されており、これらの変異は、非常に早期（＜５０年）に発症する疾患形の５０％も説明し得る（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ等（１９８７）、（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ等（１９９５））。
【０００８】  アルツハイマー病に関連している最初の遺伝子は、第２１番染色体上のアミロイド前駆体タンパク質ＡＰＰをコードする遺伝子であった。この遺伝子の違う変異により、異常な遺伝型の疾患が生じる。いくつかの病原性変異が（ＡＰＰ）遺伝子で同定され、全てが、主なＡＰＰプロセシング部位の近くに位置していた。これらのプロセシング部位は、ＡＰＰのＡβドメインの境界の隣（β−及びγ−セクレターゼ部位）またはＡβ配列自体内（α−セクレターゼ部位）に位置している。
【０００９】  β−セクレターゼ部位に近い唯一の既知のＡＤ変異であるスウェーデン型変異（Ｍｕｌｌａｎ等（１９９２））は、スウェーデン大家系のＡＰＰ遺伝子の二重変異（Ｌｙｓ６７０Ａｓｎ／Ｍｅｔ６７１Ｌｅｕ）を開示し、この家系では疾患は早期に発症し、高い浸透力を示す。変異により、Ａβ産生は大きく増加し、変異保因者由来の血漿及び馴化細胞培地中のＡβ４２及びＡβ４０の両方が上昇した。
【００１０】  他のＡＰＰ変異も記載されている。全て、常染色体優性遺伝パターンを有する若年齢で発症するアルツハイマー病をもたらす。α−セレクターゼ部位の近くに位置する、Ａβ配列内部の病原性変異により、ＡＤとは異なる表現型が生じ、脳血管壁に大量のアミロイドが蓄積する。コドン６９２及び６９３における２つの変異、すなわちオランダ型（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）及びフラマン型（Ａｌａ６９２Ｇｌｙ）変異が報告されている（Ｌｅｖｙ等（１９９０））（ｖａｎＢｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ等（１９９０））（Ｈｅｎｄｒｉｋｓ等（１９９２））。これらの変異を有する患者は、脳出血及び血管症状を患う。血管症状は、血管壁中でのＡβの凝集により引き起こされる（アミロイド血管障害）。近年、オランダ人患者に類似した臨床知見を有する、第三の病原性Ａβ内変異（Ｅ６９３Ｋ）がイタリア人家系で発見された（Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ等（１９９９））。
【００１１】  オランダ型及びフラマン型変異に対して、異なる病原性機序が提唱されている。フラマン型変異によりＡβレベルは増加することが観察されたが、オランダ型変異を形質移入した細胞の培地中ではＡβ４２／４０比の低下が見られた（ＤｅＪｏｎｇｈｅ等（１９９８））。合成Ａβペプチドの研究により、オランダ型変異は、野生型（ｗｔ）ペプチドと比べて原線維の形成を加速するが、フラマン型変異は加速しないことが示された（Ｗａｌｓｈ等（１９９７））。
【００１２】  Ｋａｍｉｎｏ等、１９９２により報告されたような、別のＡＰＰ  Ｅ６９３変異体（ＡＰＰ  Ｅ６９３でＧｌｕがＧｌｙに置換されている）が、これまでに１個体で見られている。しかしそれが明白にＡＤに関与しているとは決定できなかった。ＡＤ及び確定的ＡＤに関する類似した臨床特徴を有する家系を起源とするこの症例は検死解剖で確認された。しかし、この家系では変異は２人の痴呆の兄弟姉妹のうち１人にしか検出できなかった。
【００１３】  ＡＰＰ変異に関して遺伝子導入されているマウスは、細胞外アミロイド斑沈着、星状細胞増加症及び神経ジストロフィーを含む、アルツハイマー病の多くの病理的特徴を示す。（Ｓｃｈｅｎｋ等（１９９９））による近年の研究で、Ａβ４２野生型ペプチドによる免疫化は、遺伝子導入マウスにおいて予防になるだけでなく、該ペプチドで免疫化した遺伝子導入マウスの脳のＡβ含有斑を大きく減少できると報告された。
【００１４】  しかし、アルツハイマー病に伴う多くの費用及び苦難により、改良されたその治療法及び予防法が依然として必要である。同様に、アルツハイマー病を治療し、おそらく治癒するための、未来の医薬調製物の一部を構成し得る化合物をスクリーニングする方法が必要である。
【００１５】（発明の要約）
本発明は、アルツハイマー病の治療において、野生型ペプチドを使用するよりも、はるかにより顕著な効果を有する、ＡＤに対する能動的免疫化に関する。免疫原が、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成特性の大きく向上した化合物（群）であるので、本発明に記載の免疫化は、プロトフィブリルに指向された抗体を生じる。末梢で産生されるこれらの抗体は血液脳関門を通過し、脳内のプロトフィブリル状態にあるＡβの排除を仲介する。
【００１６】  本発明では、ＡＰＰ遺伝子のＡβペプチドドメイン内、より詳しくはＡβ−Ａｒｃペプチドの２２位に位置する、「北極型変異」と命名された、コドン６９３における病原性ＡＤ変異（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｙ）を使用する。この変異の保因者は、脳血管疾患の症状を伴うことなく、ＡＤに典型的な臨床特徴を有する進行性痴呆を発達する。該ＡＤは、野生型Ａβペプチドのプロトフィブリル形成に比べて、変異Ａβペプチド（４０Ａｒｃ及び／または４２Ａｒｃ）を含むプロトフィブリルの形成が加速されていることにより明確に特徴づけられる。
【００１７】  従って、第一の態様において、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防または治療用の免疫化のための、非野生型プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）の使用に関する。好ましくは、これらのプロトフィブリルまたは化合物（群）は、野生型対応物と比較して増強したプロトフィブリル形成能及び／または増強した免疫原性を有する。プロトフィブリルの化学は、とりわけ、Ｓｅｒｐｅｌｌ（２０００）により記載されている。
【００１８】  好ましくは、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）は、以下のアミノ酸配列ＫＬＶＦＦＡＥＤＶを含む。Ａβ１から４２線維化過程は、ランダムコイルを介したα−ヘリックスからβ−シートへの遷移的コンフォメーション変化を含む。残基１６から２４（ＫＬＶＦＦＡＥＤＶ）の安定なα−ヘリックス配列は、この過程に重要な役割を果たしているようである。
【００１９】  プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）を、対応する野生型対応物に対して、変異または修飾し得る。ＫＬＶＦＦＡＥＤＶ配列の変化は、線維化過程に影響を及ぼす。例えば、荷電アミノ酸Ｇｌｕ２２及びＡｓｐ２３から中性アミノ酸への変化は、Ａβペプチドのランダムコイル構造を誘導する。さらに、Ｎ末端のＡｓｐ７、Ｇｌｕ１１並びにＨｉｓ６、１３及び１４などの他のアミノ酸の脱プロトン化は、α−ヘリックスを不安定化し、線維化過程が開始されると示唆されている。別の例は、例えばＧｌｙ５、Ｐｈｅ１０、Ａｒｇ１３などの特定の位置で、マウスＡβ由来のアミノ酸を使用することにより、ヒトの免疫原性を向上する変異である。さらに、Ａβ中のアミノ酸１３は、ヒトにおいて、ＡＤ疾患機序（炎症）に関与すると推測されている（Ｇｉｕｌｉａｎ等（１９９８））、ヘパラン硫酸結合モチーフ（１３から１６；Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）の一部であることが知られている。マウスでは、Ｈｉｓ１６がＡｒｇ１３と交換されていて、ヘパラン硫酸結合部位が破壊されている。興味深いことに、マウスのＡＤの発達は観察されたことがなかった。従って、Ａβ−Ａｒｃ／Ａｒｇ１３を免疫原として使用することは、無傷ヘパラン硫酸結合モチーフを有するＡβペプチドで誘発される、起こり得る炎症副作用を減少する１つの方法となるだろう。
【００２０】  好ましくは、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）は、Ａβペプチド（β−アミロイドタンパク質）及びその反復配列、例えば二量体、オリゴマーまたは多量体形を含む。好ましい実施形態において、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）は、ＡＤに関連したＡβペプチドを含む。別の実施形態において、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）は、α−シヌクレインを含む。
【００２１】  レビー小体と呼ばれる構造のクラスターを脳に有する患者により特徴づけられる形態の痴呆が存在する。この形態の痴呆は、全痴呆の約２０％を含む。レビー小体を有する患者は、とりわけ、進行性認知機能障害を伴うパーキンソン症状を示す。しかし、アルツハイマー症状を示す患者もおり、これは「アルツハイマーのレビー変異体」と呼ばれる。レビー小体の主成分は、タンパク質のα−シヌクレインである。α−シヌクレイン中の２つの変異は、Ａｌａ５３Ｔｈｒ及びＡｌａ３０Ｐｒｏと同定された。これらの変異により、パーキンソン病が優先遺伝される。これらの変異は、α−シヌクレインの構造／溶解度に影響を及ぼし、プロトフィブリルの形成をもたらす（Ｃｏｎｗａｙ等（２０００））。
【００２２】  Ａβペプチドは、好ましくは、配列番号１に開示したＡβ−Ａｒｃである。Ａβ−Ａｒｃは、３９、４０または４２アミノ酸を含むが、プロトフィブリル形成能が維持される限り、より短くてもよい。
【００２３】  プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）は、上記したオランダ型、フラマン型、イタリア型変異などの既知の変異、並びに、ｌｏｗａ変異（Ｄ６９４Ｎ）（Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ等、２００１）を有するＡβペプチドと組合せて使用し得る。Ａβペプチドは、これら及び／または他の変異の１つ以上を含み得る。また代替法として、異なる変異を有する、異なるＡβペプチドの混液を使用する。
【００２４】  第二の態様において、本発明は、野生型Ａβペプチドと比較し、２２位にグルタミン酸の代わりにグリシンを含む、配列番号１に開示したアミノ酸配列を有するペプチドであるＡβ−Ａｒｃに関する。該ペプチドは、天然でも合成されても、組換え産生されてもよい。本発明の目的では、該ペプチドは、単量体、二量体、オリゴマー、プロトフィブリル、または多量体の形で使用してもよい。
【００２５】  本発明はまた、上記のペプチドをコードする核酸、並びに、核酸を含むベクターに関する。本発明のポリペプチドの発現ベクターは、核酸が「作動可能に連結」していることが必要である。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されている場合に作動可能に連結されている。
【００２６】  このベクターを、宿主細胞に挿入し得る。該宿主細胞を使用して、医薬的または診断的用途のために、並びに、研究目的のために、本発明のペプチドを組換え産生できる。該ペプチドはまた、合成的に製造し、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより精製してもよい。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、上記ベクターを含む遺伝子導入非ヒト動物に関する。さらに、本発明は、ＮＣＢＩデータベース、受入番号ＸＭ＿００９７１０（配列番号２）、ホモサピエンスアミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質（プロテアーゼネキシン−ＩＩ、アルツハイマー病）（ＡＰＰ）のｍＲＮＡに対応する全ＡＰＰ遺伝子を含むベクターを含む、遺伝子導入非ヒト動物に関する。しかし、本発明に使用するＡＰＰ遺伝子は、北極型変異を含み、すなわちヌクレオチド２２２５番がＡからＧへと変異しており、これによりグルタミン酸からグリシンへとアミノ酸置換が生じている。該遺伝子導入動物は、アルツハイマー病のモデリング及び治療処置効力の試験に使用し得る。この遺伝子導入動物は、北極型変異を含む全ＡＰＰ遺伝子を有する。この遺伝子は、好ましくは、プリオン−プロモーターといった強力なプロモーターの制御下にある。ＡＰＰ遺伝子は、北極型変異以外のさらなる変異を含んでもよい。
【００２８】  遺伝子導入動物は、コドン６９３において、グルタミン酸の代わりにグリシンをコードする、ヒトＡＰＰまたはその断片を発現する。好ましくは、動物は、ＡＤの神経病理学的特徴を現わす。好ましくは、変異ＡＰＰは、天然の内因性ＡＰＰ遺伝子（存在する場合）を正常に発現する細胞で発現する。典型的には、非ヒト動物はマウスである。該導入遺伝子は、典型的には、北極型変異ＡＰＰ発現カセットを含み、ここでの連結したプロモーター、好ましくはエンハンサーは、北極型変異を含む異種ＡＰＰポリペプチドをコードする構造配列の発現を駆動する。
【００２９】  該遺伝子導入動物は通常、導入遺伝子または標的化作成物を、受精卵または胚幹（ＥＳ）細胞に、典型的にはマイクロインジェクション法、電気穿孔法、リポフェクション法、または微粒子銃により導入して作製する。遺伝子導入動物は、典型的には脳組織で、導入遺伝子（または相同的に組換えた標的作成物）の北極型変異ＡＰＰ遺伝子を発現する。アルツハイマー表現型及び神経病理は、プロトフィブリル形成により引き起こされる。該動物は、様々な疾患モデル及び薬物スクリーニング用途、並びに、他の応用への使用に適している。
【００３０】  またさらなる態様において、本発明は、配列番号１のＡβペプチドに対する抗体に関する。該抗体は、モノクローナル抗体断片でもポリクローナル抗体断片でもよい。好ましくは、該抗体は、ＡＤを予防または治療するための受動的免疫化に使用するためにヒト化されている。従って、コドン６９３のグリシンにより創造される独特なエピトープと反応する抗体を提供する。
【００３１】  本発明の別の態様は、上記ペプチド、並びに、ヒト及び獣医学的用途の生理的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物に関する。調製物は、ワクチン接種目的のアジュバントも含み得る。投与経路は、皮下、筋肉内、経口または鼻腔であり得る。
【００３２】  さらなる態様において、本発明は、抗プロトフィブリル活性を有する物質を発見するための、ハイスループットスクリーニングにおける上記Ａβペプチドの使用に関する。
【００３３】  さらなる態様において、本発明は、ＡＤに罹患または罹患していることが疑われる対象において、Ａβプロトフィブリル及び／またはその低量体形の形成を低減する段階を含む、ＡＤの予防法または治療法に関する。
【００３４】  上記の低減段階は、アルツハイマー病（ＡＤ）の予防または治療用の、プロトフィブリルまたはプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）を用いた能動的免疫化により得、該プロトフィブリルまたは化合物（群）は、野生型対応物と比較して増強したプロトフィブリル形成能及び／または増強した免疫原性を示す。
【００３５】  また代替法としては、上記の低減段階は、プロトフィブリルまたはＡβ−Ａｒｃなどのプロトフィブリル形成能を有する化合物（群）に対する抗体を用いた受動的免疫化による。受動的免疫化は、プロトフィブリル形成及び／または免疫原性を増加する変異／修飾、好ましくはＡＤ関連変異を有する他のＡβペプチドに対する抗体と組合せ得る。北極型変異を含むヒトＡβ配列に対して産生される抗体は、Ａβプロトフィブリルに対して指向し、それ故、アルツハイマー病の治療に治療的価値がある。Ａβペプチドは、免疫原として使用した場合にはプロトフィブリルコンフォメーションであるので、Ａβプロトフィブリルに対する抗体が産生される。該抗体を入手できることにより、アルツハイマー病の予防及び治療のための、効率的かつ持続的なワクチン接種開発の可能性が開かれる。
【００３６】  別の選択肢としては、本発明に記載の方法の低減段階は、抗プロトフィブリル活性を有する薬剤の投与による。
【００３７】  本発明のまたさらなる態様において、ワクチン、或いは、モノクローナル抗体または抗−原線維活性を有する化合物による受動的免疫化と、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、向知性薬、抗炎症薬、エストロゲン、神経栄養因子アゴニスト、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤及びα−セクレターゼアゴニストといった、１または数個の他のＡＤ治療の組合せによりＡＤ治療効力を向上できる。理論上はこれらの物質／治療が完全に異なる作用機序により作用し、従って配合することによりＡＤ患者にとって有益となり得るというものである。
【００３８】（発明の詳細な説明）
本発明の基礎は、北スウェーデンの家系にＡＤを引き起こす、Ａβ配列内のコドン６９３に位置する病原性アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）変異（Ｅ６９３Ｇ）である。驚くべきことに、「北極型」変異の保困者は、血漿中Ａβ４２及びＡβ４０レベルの低下を示す。この知見は、インビトロでは裏付けられており、Ａβ４２濃度は、ＡＰＰＥ６９３Ｇを形質移入した細胞の馴化培地においては低かった。原線維化の研究により、北極型変異（Ａβ４０Ａｒｃ）を有するＡβペプチドは、野生型（ｗｔ）Ａβ（Ａβ４０ｗｔ）よりも、はるかに高い速度でより大量に、プロトフィブリルを形成することが実証される。北極型ＡＤ家系の血漿中Ａβレベルの減少という珍しい知見は、疾患の複雑さを強調し、新しい病理的機序を反映しているようである。本発明に開示した機序は、急速なＡβプロトフィブリル形成を含み、これにより、細胞内及び／または細胞外で不溶性Ａβの構築が加速される。
【００３９】  本発明では、Ａβ４０４０Ａｒｃ分子の２２位におけるＧｌｕからＧｌｙへの１アミノ酸置換により、Ａβ４０ｗｔペプチドと比較して、プロトフィブリル形成速度及び形成量の劇的な増加が引き起こされることが判明した。従って、Ａβ４２Ａｒｃ及びＡβ４０Ａｒｃが脳で形成されると、プロトフィブリルを形成する駆動力の加速により、Ａβの体積及び不溶性の両方が増強されるために、細胞系により、より保持される傾向があるようである。従って、散発性ＡＤの発病では、プロトフィブリル形成促進因子を考慮すべきである。プロトフィブリル形成増加は、おそらく、これらのより一般的な疾患形態でも作動しているだろう。実際、本発明の知見は、プロトフィブリル形成の予防に標的化した薬物を使用する、治療的介入の可能性に新しい道を開く。
【００４０】  本発明の北極型変異に関する研究により、以前に記載されていないＡβプロトフィブリル形成増加を通したアルツハイマー病の発病機序が実証された。北極型変異を有するＡβは、等モル量の野生型Ａβの存在下でさえ、野生型Ａβよりもより安定なプロトフィブリルをはるかに高い速度でより大量に形成した。この形成は、野生型Ａβペプチドのプロトフィブリル形成に比べて、少なくとも２から１０倍加速される。この知見の示唆は、アルツハイマー病を最終的にもたらすアミロイド形成経路における危険な種はＡβ原線維ではなくて、原線維成熟過程のより初期に出現する形態のペプチドであるプロトフィブリルであるということである。本発明に関連した知見の１つの意味は、アルツハイマー病の予防及び治療を可能とするには、プロトフィブリルの形成を防ぐことが重要であるということである。
【００４１】  北極型変異ＡＰＰをコードする導入遺伝子を含む非ヒト動物を商業的に使用し、Ａβプロトフィブリルの形成を低減する効果を有する薬剤をスクリーニングできる。該薬剤は、ヒト及びイヌなどの動物における他の神経変性容態の中でも、とりわけ異常なＡＰＰプロセシング及び／またはアルツハイマー病を治療するための医薬として開発できる。本発明の遺伝子導入動物は、異常なＡＰＰプロセシング及び発現を示し、医薬スクリーニング用に、並びに、神経変性疾患及びＡＰＰ生化学の疾患モデルとして使用できる。
【００４２】（実施例）
以下の実施例は説明のために提供し、提供した具体的な実施例に本発明を限定するものではない。
【００４３】  実施例１：北極型変異の同定
「北極型家系」と命名された、４世代以上におよぶ北スウェーデンの家系における、ＡＰＰ変異（Ｅ６９３Ｇ）を同定する。該家系を、一本鎖コンフォメーション多形解析（ＳＳＣＰ）により、ＡＰＰ遺伝子のエキソン１６及び１７の変異についてスクリーニングした（Ｌ．Ｆｏｒｓｅｌｌ、Ｌ．Ｌａｎｎｆｅｌｔ（１９９５））。異常な移動性パターンがエキソン１７で観察された。配列決定により、Ａβ配列の２２位に対応する、ＡＰＰコドン６９３におけるグルタミン酸からグリシンへの置換（Ｅ６９３Ｇ）を表すＡ→Ｇヌクレオチド置換が判明した。静脈血を、ＥＤＴＡを含むチューブに引き入れ、ＤＮＡを標準的な手順に従って調製した。ＳＳＣＰを実施した。ＡＰＰ遺伝子のエキソン１７を配列決定するために、３１９ｂｐの断片を、以下のプライマー５’−ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＡＴＴ−３’及び５’−ＧＣＣ  ＴＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＡＣ−３’を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、配列決定前に、ＱＩＡクイック精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。直接的配列決定は、同じプライマー及びＢＩＧ  Ｄｙｅサイクル配列決定プロトコル（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して３’及び５’方向の両方に行ない、その後、ＡＢＩ３７７自動シークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。北極型変異が１家系で見られ、５６人の対照または痴呆を有する２５４人の症例には見られなかった。北極型変異の保困者は、血管症状を全く示さなかった。該変異はさらに、Ｍｂｏｌｌ制限部位を破壊したため、制限酵素による解析により確認した。該変異は、逸脱者が見出されなかったので、変異は完全に浸透していた。年齢依存的浸透度を有する家系において、変異と罹患状態の間の２点連鎖解析を実施し、組換え比０．００でロッドスコア３．６６が得られた。２点ロッドスコアを、以下の組換え比０．００、０．１０、０．２０、０．３０及び０．４０（男性ｑ人＝女性ｑ人）の各々で、連鎖パッケージのＭｌｉｎｋ（バージョン５．１）を使用して計算した。常染色体優性遺伝を有する単一遺伝子座モデルを仮定し、これは系統に出現したように遺伝と矛盾しなかった。累積年齢依存的浸透度は、家系の既知の発症年齢から指定した。個体を発症時の年齢（罹患）及び最後の検査時の年齢（罹患していない）に応じて、異なる易罹病分類に割り当てた。疾患遺伝子頻度及びマーカー対立遺伝子頻度は０．００１であると推定され、表現型模写速度は０．０００１に設定された。
【００４４】  実施例２：北極型変異の保因者の臨床的症状
「北極型」変異を有する家系を、臨床的かつ系統的に調べた。この家系では、平均発症年齢は５６．６歳であり、平均疾患持続期間は７年であった（ｎ＝５）。この家系の大半の症例の最初の症状は、最近獲得した情報の潜行的な記憶喪失であった。アルツハイマー病が臨床的に顕現する前の症状は、集中力の低下、並びに、ストレス状況対処の困難さであった。第四世代の全罹患個体が、この疾患のために、早期の退職年金をうけた。第四世代の患者を、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）及び脳波検査（ＥＥＧ）により調べ、これにより、アルツハイマー病の診断が確認された。ＣＴ及びＭＲＩにより、４人の個体には卒中または脳出血の兆候は実証されなかった。
【００４５】  実施例３：北極型変異の保因者における、血漿Ａβレベルの低減
病原性ＡＰＰ変異は、罹患した家系メンバーの血漿中の総ＡβまたはＡβ４２の増加に反映されるように、ＡＰＰプロセシングに影響を及ぼすことが示されている。北極型変異は、他のＡＤを引き起こす変異とは異なる領域に位置している。変異が、血漿中Ａβレベルに影響を及ぼすことにより現れるかどうかに関して調べた。家系の中の変異保因者９人（その中の４人は症候性である）、及び非保因者１１人の血漿を、十分に特徴づけられたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により解析し、特異的にＡβ４２（ＢＡＮ５０／ＢＣ０５）及びＡβ４０（ＢＡＮ５０／ＢＡ２７）を検出した（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９９４）。北極型変異により、どの抗体認識部位も変化しなかったことを再確認するために、Ａβ４０ｗｔ及びＡβ４０Ａｒｃペプチドを試験し、等しく十分に認識されることが判明した。さらに、血漿に合成ペプチドを添加すると、ＡβＡｒｃ及びＡβｗｔペプチドの両方が、ＥＬＩＳＡにより同程度回収されることが判明した。得られたデータを、非パラメトリックなマン−ホットニー解析により解析した。血漿中Ａβ４２濃度は、変異保因者及び非保因者で、それぞれ、１１．７±３．９ｆｍｏｌ/ｍｌ及び１６．０±５．６ｆｍｏｌ/ｍｌであり、変異保因者ではＡβ４２の２７％の減少を示す（ｐ＝０．０４）。血漿中Ａβ濃度は、変異保因者及び非保因者で、それぞれ、１０５±２２ｆｍｏｌ/ｍｌ及び１４１±３４ｆｍｏｌ/ｍｌであり、変異保因者ではＡβ４０の２６％の減少を示す（ｐ＝０．０１）。各個体のＡβ４２／４０の比を計算したが、有意差は見出されなかった（ｐ＝０．１３）。結論すると、北極型変異を有する個体では、Ａβ４２及びＡβ４０の両方の濃度が、意外なことに有意に減少していた。
【００４６】  実施例４：細胞培養中のＡβレベル
Ａβ形成に対する北極型変異の作用を、インビトロで、一過性に形質移入したＨＥＫ２９３細胞でさらに調べた。ＡＰＰｗｔを、以下の変異：北極型（ＡＰＰＥ６９３Ｇ）、オランダ型（ＡＰＰＥ６９３Ｑ）、イタリア型（ＡＰＰＥ６９３Ｋ）及びフラマン型（ＡＰＰＡ６９２Ｇ）と比較した。スウェーデン二重変異（ＡＰＰＳｗｅ）及びコドン７１７における１つのＡＰＰ変異（ＡＰＰＶ７１７Ｆ）（両方共、十分に研究されたＡＰＰプロセシング特徴を有する（Ｈａｒｄｙ（１９９７））を含む作成物を、陽性対照として使用した。製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キットを使用して、変異をｐｃＤＮＡ３のＡＰＰ６９５ｃＤＮＡに導入した。変異作成物を、配列決定により確認した。ＥＬＩＳＡ測定のために、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェル皿に蒔き、製造者の指示に従ってＦｕＧＥＮＥ（商標）６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、異なる作成物を形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞を５％新生児仔ウシ血清を含むＯｐｔｉＭＥＭ中で４８時間馴化させた。ＥＬＩＳＡ測定するために培地を吸引した後、細胞中のＡＰＰ発現を、モノクローナル抗体２２Ｃ１１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してウェスタンブロットにより調べた。培地を馴化調製し、ヒト血漿に使用したのと同じＡβ４２及びＡβ４０特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ系により、Ａβレベルについて分析した（Ｃｉｔｒｏｎ等（１９９７））。Ａβ４２及びＡβ４０濃度並びにＡβ４２／４０の比を表１に示す。
【００４７】
【表１】
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Ａβ４２／Ａβ４０比の低下は、ＡＰＰ６９３における全変異（北極型、オランダ型、イタリア型）に見ることができた。これは、細胞内プロトフィブリル形成速度の増加によるものだろう。
【００４８】  実施例５：プロトフィブリル形成に対する北極型変異の効果
アミロイド原線維動態に対する１アミノ酸置換（Ｇｌｕ２２Ｇｌｙ）の効果を調べた。合成Ａβ１−４０を生理的緩衝液に溶かし、様々な期間の間インキュベートした。遠心分離後、両方共低分子量（単量体／二量体）Ａβである上清中の可溶性Ａβとプロトフィブリルを分離し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して２１４ｎｍでＵＶ検出して解析した。沈降した不溶性Ａβの形態を、陰性染色及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して可視化した。Ａβ１−４０ｗｔは、Ｂａｃｈｅｍ、スイスＢｕｅｂｅｎｄｏｒｆまたはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＱＣＢ（米国カリフォルニア州カマリロ）から購入し、Ａβ１−４０ＡｒｃはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ／ＱＣＢから購入した。ペプチドはトリフルオロ酢酸塩であった。それらは−２０℃で保存した。他の全化学物質は、入手可能な最も高い純度であった。各ペプチドの試料を、攪拌せずに、様々な時点で、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）中で３０℃でインキュベートした。初期ペプチド濃度は８８から１４３μＭの範囲内であり、各実験において両ペプチドは類似していた。遠心分離後（１７９００×ｇ、１６℃で５分間）、上清からサンプリングした単量体／二量体及びプロトフィブリルＡβ１−４０を、ＳＥＣを使用して分離した。スＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＰＣ３．２／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン、ウプサラ）に連結した、ダイオードアレイ検出器モデルＬ−７４５５、Ｌ−７２００モデル自動サンプリング機及びモデルＬ−７１００ポンプを有する、Ｍｅｒｃｋ−日立Ｄ−７０００ＬａＣｈｒｏｍ  ＨＰＬＣ系を、クロマトグラフィーによる分離及び分析に使用した。試料を、流速０．０８ｍｌ／分（周囲温度）で、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４ＮａＨ２ＰＯ４（ＰＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを使用して溶出した。２１４ｎｍでのＵＶ吸光度の測定によりクロマトグラムを得た。単量体／二量体及びプロトフィブリルＡβのピーク面積を、Ｍｅｒｃｋ−日立モデルＤ−７０００クロマトグラフィーデータステーションソフトウェアを使用して積分した。ＳＥＣ測定から得た三重積分ピーク値の平均を使用して、図１及び２に示した各データ点を得た。さらに、定量的アミノ酸解析により決定したように、ペプチド濃度と積分ピーク面積を相関させることにより標準曲線を作成した。遠心分離後に溶液中に残存している総濃度（ｔ＝０時間の時点）及び可溶性ペプチドの濃度を、標準曲線から計算した。
【００４９】  新しく溶かしたＡβ１−４０ｗｔのＳＥＣによる解析により、保持時間約２０分で一本の溶出ピークが得られた（図２ａ）。このピークは、Ａβ１−４０ｗｔの単量体／二量体形を示した（Ｗａｌｓｈ等（１９９７））。インキュベート時間を長くするにつれて、第二の別個のピークが、保持時間約１２分でゲル排除画分に出現した。この早い方のピークはプロトフィブリルを含み（図２ｂ、ｃ）、これは、Ａβ１−４０ｗｔの超遠心分離、陰性染色及びＴＥＭにより確認され（データ開示せず）、これは以前の知見を裏付ける（Ｗａｌｓｈ等（１９９７））。類似の保持時間が、Ａβ１−４０Ａｒｃペプチドで得られた（図２ｄ−ｆ）。しかし、Ａβ４０Ａｒｃは、Ａβ４０ｗｔよりもはるかに早く大量にプロトフィブリルを産生した。インキュベート初期の３時点のクロマトグラムは、この差異を説明する（図１）。単量体／二量体Ａβ４０Ａｒｃピークは、プロトフィブリルピークの成長と平行して下降した（図２ｄ−ｆ）。Ａβ４０Ａｒｃプロトフィブリルの最大濃度（１１１μＭ）が６．５時間後に観察された。
【００５０】  ４８時間までの動態研究により、Ａβ１−４０ｗｔは、２５時間後に最大濃度を有する少量のプロトフィブリルを生じたことが示された（図１ａ）。これに対し、プロトフィブリルの迅速かつ有意な形成が、インキュベートの最初の５時間以内に見られ、同時に、単量体／二量体Ａβ１−４０Ａｒｃペプチド濃度が急速に下降した（図１ｂ）。北極型変異の保因者は異型接合体であるので、それらはＡβｗｔ及びＡβＡｒｃの両方を生じる。等モルのインビボでの産生を仮定して、Ａβ１−４０ｗｔ及びＡβ１−４０Ａｒｃの１：１混合物中のプロトフィブリル形成の動態を研究した。このペプチド混合物により、単一ペプチド曲線の中間である動態が示された（図１ｃ）。
【００５１】  実施例６：Ａβ−Ａｒｃの形態
動態研究から得た沈降試料中のＡβ１−４０Ａｒｃの典型的な原線維形態を、陰性染色及びＴＥＭにより確認した。Ａβペプチド試料を調製し、動態研究で指示されているように、より高濃度のペプチド濃度（６１７μＭ）を使用してインキュベートした。８日後、凝集したＡβ種を、上記と同じ遠心分離パラメータを使用して沈降した。緩衝液を取り除き、ペレット化材料を、穏やかな超音波を使用して（２×６秒間）５０μｌの水に懸濁した。８μｌの試料を、炭素で安定化したＦｏｒｍｖａｒフィルム格子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ社、米国カリフォルニア州レディング）にアプライした。試料を、８μｌの酢酸ウラニル（１％）（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ、ダルムシュタット）で陰性染色した。各試料について４つの格子を調製し、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０ＴＥＭを使用して検査した。動態実験中に沈降したペレット由来の試料も検査した。沈降したＡβ４０ｗｔに類似して、Ａβの大きな網をこれらの調製物に見ることができた。プロトフィブリルも、沈降試料で認めることができた。Ａβ１−４０Ａｒｃプロトフィブリルは、Ａβ１−４０ｗｔプロトフィブリルに比べて長くて曲線がより少なかった。数個の原線維の織り込みは、Ａβ４０Ａｒｃ調製物でより一般的であり、より大きな原線維直径が得られた。
【００５２】  実施例７：動態研究
高濃度及び低濃度のＮａＣｌの存在下におけるＡβ４０ｇｌｙ２２プロトフィブリルの形成を比較した動態研究：
Ａβ４０ｇｌｙ２２プロトフィブリル及び原線維形成の検査実験を、１００ｍＭ  ＮａＣｌを補足した５０ｍＭリン酸緩衝液中で実施した。それらは、Ａβ４０ｇｌｙ２２プロトフィブリル形成の速度及び大きさが、高濃度のＮａＣｌの存在下で有意に増強されるということを示すデータを提示する。神経内及び神経外ＮａＣｌ濃度は有意に異なるので（約１１７ｍＭ対３０ｍＭ）、この知見により、β−アミロイド斑が見られる神経外空間におけるＡβ４０ｇｌｙ２２のプロトフィブリル形成能の向上が支持される。
【００５３】参照文献
Ｃｉｔｒｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ３，６７−７２（１９９７）
Ｃｏｎｗａｙ等、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，５７１−５７６（２０００）
ＤｅＪｏｎｇｈｅ等、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ５，２８１−２８６（１９９８）
Ｆｏｒｓｅｌｌ，Ｌａｎｎｆｅｌｔ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ  １８４，９０−９３（１９９５）
Ｇｉｕｌｉａｎ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３，２９７１９−１９７２６，（１９９８）
Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ等、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４９，６９７−７０５（２００１）
Ｈａｒｄｙ、Ｔｒｅｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，１５４−１５９（１９９７）
Ｈａｒｐｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，９７２−８９８０（１９９９）
Ｈｅｎｄｒｉｋｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  １，２１８−２２１（１９９２）
Ｋａｍｉｎｏ等、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５１，９９８−１０１４（１９９２）
Ｌｅｖｙ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８，１１２４−１１２６（１９９０）
Ｍｕｌｌａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  １，３４５−３４７（１９９２）Ｐａｌｍｅｒｔ等、ＰＮＡＳ  ８６：６３３８（１９８９）
Ｓｃｈｅｎｋ等、Ｎａｔｕｒｅ，４００，１７３−１７７（１９９９）
Ｓｃｈｅｕｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２，８６４−８６９（１９９６）Ｓｅｒｐｅｌｌ  Ｌ．Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５０２，１６−３０（２０００）
Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３７５，７５４（１９９５）
Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：８８５（１９８７）
Ｓｕｚｕｋｉ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４，１３３６−１３４０（１９９４）
Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ等、Ａｌｚ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２，Ｓ２８（１９９９）
Ｗａｌｓｈ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，２２３６４−２２３７２，（１９９７）
Ｗａｌｓｈ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３６，２５９４５−２５９５２，（１９９９）
Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ等、Ｃｅｌｌ  ５７：１１５（１９８９）
Ｗｉｒａｋ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３２３（１９９１）
【配列表】
＜１１０＞  Ｌａｎｎｆｅｌｔ，Ｌａｒｓ
＜１２０＞  アルツハイマー病の予防および治療
＜１３０＞  Ｐ０５３８４ＰＣ
＜２１０＞  １
＜２１１＞  ４２
＜２１２＞  ＰＲＴ
＜２１３＞  ホモサピエンス
＜４００＞  １
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明を、ここで、添付の図面を参照してさらに説明する。図１は、可溶形のＡβ１−４０ｗｔ（ａ）、Ａβ１−４０Ａｒｃ（ｂ）、及び、Ａβ１−４０ｗｔ、Ａβ１−４０Ａｒｃ対Ａβ１−４０ｗｔ＋Ａｒｃ（１：１）の混合物のプロトフィブリル形成（ｃ）の動態を示す。Ａβ１−４０Ａｒｃペプチド（９２μＭ）は、Ａβ１−４０ｗｔペプチド（８８μＭ）に比べて急速にプロトフィブリル（黒点）を形成し、これは主に単量体（二量体（灰色の点））形であり、データは、３回の中の代表的な１回の実験から得る（ａ及びｂ）。プロトフィブリル形成速度は、最初の７時間の間モニタリングし、純粋なペプチド（５０μＭにおけるＡβ１−４０ｗｔ及びＡβ１−４０Ａｒｃ）を、Ａβ１−４０ｗｔ＋Ａｒｃの１：１混合物（５０μＭ）（ｃ）のプロトフィブリル形成速度と比較した。
【図２】  図２は、５（ａ、ｄ）、４５（ｂ、ｅ）、及び１２５（ｃ、ｆ）分間のインキュベート後の、Ａβ４０ｗｔ（ａ−ｃ）対Ａβ４０Ａｒｃ（ｄ−ｆ）を示す溶出プロファイルを示す。Ａβ４０ｗｔ（ａ−ｃ）に比べてＡβ４０Ａｒｃ（ｄ−ｆ）では、単量体／二量体（ｍ／ｄ）Ａβレベルの下降に平行してプロトフィブリル（ｐ）形成の加速を観察できる。データは、４回の中の代表的な１回の実験のものである。初期ペプチド濃度は、それぞれ、Ａβ４０ｗｔ及びＡβ４０Ａｒｃについて１４３μＭ及び１３８μＭであった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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