(57)【要約】【課題】  非ヒト哺乳類細胞にヒトNK細胞による細胞傷害活性を抑制するHLA-Eキメラ分子、当該キメラ分子をコードする塩基配列、同塩基配列で形質転換された非ヒト哺乳類細胞及び当該哺乳動物を提供する。【解決手段】  本発明のHLA-Eキメラ分子は、HLA-Eのシグナルペプチド領域、α１ドメイン及び／又はα２ドメインの全部又は一部を改変したペプチドであり、また本発明の塩基配列は当該キメラ分子をコードする塩基配列である。本発明の塩基配列を導入した形質転換体はHLA-Eを効率的に発現するという効果を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列を有するHLA-Eキメラ分子。
(1)HLA-E分子のα２ドメインの全部又は一部を、HLA-G1分子のα２ドメインの全部又は一部に置換したHLA-Eキメラ分子、
(2)前記(1)と共に、HLA-E分子のシグナルペプチド（SP）を、HLA-G1分子のSPの一部を改変した改変型SPに置換したHLA-Eキメラ分子、又は
(3)前記(2)と共に、HLA-E分子のα１ドメイン及びα２ドメインのアミノ酸配列の一部を、それぞれHLA-G1分子のα１ドメイン及びα２ドメインのアミノ酸配列の一部に置換したHLA-Eキメラ分子。
【請求項２】
請求項１に記載される各HLA-Eキメラ分子をコードする塩基配列。
【請求項３】
請求項２に記載される塩基配列で形質転換された非ヒト哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はHLA-Eキメラ分子に関する。より詳細には、非ヒト哺乳類細胞にヒトNK細胞の細胞傷害障害活性に対する抵抗性を賦与するHLA-Eキメラ分子及び当該キメラ分子をコードする塩基配列、並びに当該塩基配列で形質転換された非ヒト哺乳類細胞及び非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植は極めて有用な治療法である。臓器移植には同種移植と異種移植があり、各々に長所と短所がある。ヒトからヒトへの同種移植には医療として確立されているという長所があるが、ドナーの数に限りがあるという短所がある。一方、非ヒト哺乳類（例えば、ブタ）からヒトへの異種移植には、多数の移植片の供給が可能である等の長所はあるが、超急性拒絶（HAR）や急性血管拒絶（AVR）と称される異種移植に特有な拒絶反応を生じるという短所がある。
そこで、異種移植に特有な拒絶反応の克服を目的として、非ヒト哺乳類にヒト補体制御因子を発現させる方法（例えば、特許文献１）、霊長類やヒトには存在しないが非ヒト哺乳類に存在する糖鎖非還元末端のGalα1,3Gal配列（以下、α-Gal抗原）を減少させる方法（例えば、特許文献２）、α-Gal抗原の生成に係わっているα-1,3ガラクトシル転移酵素の遺伝子をノックアウトする方法（例えば、非特許文献１〜２）などが開発されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平11-239430号公報
【特許文献２】特開平2002-291372号公報
【非特許文献１】Science 2002, 295, 1089
【非特許文献２】Nat. Biotechnol. 2002, 20, 251
【０００４】
非ヒト哺乳類の移植片がヒトに移植されると、HARを克服できた場合でも、後者の抗体（抗α-Gal抗体など）、補体、血小板、ナチュラルキラー（以下、NK）細胞が前者の細胞に付着して同細胞を活性化する。活性化された細胞は、各種サイトカインを放出し、ヘパリンを離脱し、隣接する細胞との間に隙間を生じ、基底膜のコラーゲンを露出させ、血液凝固反応を惹起し、血管を閉塞させ、非ヒト哺乳類の移植片を壊死させる（非特許文献３）。このような拒絶反応は急性血管拒絶AVRと称されるが、AVRの原因の一つであるNK細胞の細胞傷害活性を効率よく抑制する方法は開発されていなかった。
【０００５】
【非特許文献３】Xenotransplantation 1998, 5, 169
【０００６】
NK細胞は標的細胞と２種類の受容体を介して接着する。即ち、細胞傷害活性を誘導するキラー細胞活性化受容体、及び自己のMHCクラスＩ分子を認識して細胞傷害活性を抑制するキラー細胞抑制性受容体である。そして、前者からのシグナルが後者からのシグナルを上回る場合には、標的細胞を壊死させるが、後者からのシグナルが前者からのシグナルを上回る場合には、標的細胞を壊死させない。
ヒト細胞はHLAクラスＩ分子（HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G）を発現しているから、ヒト細胞はヒトNK細胞による細胞傷害を受けない。一方、非ヒト哺乳類細胞はヒトHLAクラスＩ分子を発現していないから、ヒトNK細胞による細胞傷害を受ける。そこで、非ヒト哺乳類細胞をヒトHLA-A、HLA-B、HLA-C又はHLA-Gの遺伝子で形質転換し、ヒトNK細胞による細胞傷害を回避する方法が開発された（特許文献３）。しかしHLA-A、HLA-B とHLA-Cは多型であり、それぞれ175種類、344種類と90種類の対立遺伝子が存在するから、それぞれのHLAに対応可能な非ヒト哺乳類細胞を調製することは実際的でなかった。
そこで、HLA-EとHLA-Gが多型でないことに着目して、HLA-EとHLA-Gの利用が試みられた。その結果、非ヒト哺乳類細胞の表面にHLA-Gを発現させることは比較的容易であるが、ヒトNK細胞による細胞傷害抑制活性は低いこと、逆に非ヒト哺乳類細胞の表面にHLA-Eを発現させることは容易でないがヒトNK細胞による細胞抑制活性は高いこと、が分かった（非特許文献４）。
また非ヒト哺乳類細胞表面のHLA-E発現量を向上させる目的で、HLA-E、β２ミクログロブリン及びHLA-A2のリーダーペプチド（Val-Met-Ala-Pro-Arg-Thr-Leu-Val-Leu）をコードする塩基配列、又はHLA-Gのリーダーペプチド（Val-Met-Ala-Pro-Arg-Thr-Leu-Phe-Leu）をコードする塩基配列を用いる試みもなされた。しかし、これら形質転換体のHLA-Eの発現量やNK細胞の細胞傷害抑制活性は十分でなかった（非特許文献５）。
【０００７】
【特許文献３】特表平11-510698号公報
【非特許文献４】Transplantation Proceedings 2000, 32, 939
【非特許文献５】Transplantation 2002, 73, 1582
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は従来技術に存在する上記課題を解決するためになされたものであり、本発明者らは非ヒト哺乳類細胞にヒトNK細胞による細胞傷害活性への抵抗性を賦与するHLA-Eキメラ分子について鋭意検討し、
(1)HLA-E分子のα２ドメインの全部又は一部を、HLA-G1分子のα２ドメインの全部又は一部に置換したHLA-Eキメラ分子、
(2)前記(1)と共に、HLA-E分子のシグナルペプチド（SP）を、HLA-G1分子のSPの一部を改変した改変型SPに置換したHLA-Eキメラ分子、又は
(3)前記(2)と共に、HLA-E分子のα１ドメイン及びα２ドメインのアミノ酸配列の一部を、それぞれHLA-G1分子のα１ドメイン及びα２ドメインのアミノ酸配列の一部に置換したHLA-Eキメラ分子、
のそれぞれをコードする塩基配列を作成し、それらを用いて非ヒト哺乳類細胞を形質転換したところ、HLA-Eキメラ分子の発現量が増加すると共に、ヒトNK細胞による細胞傷害活性に対する抵抗性を増加することを見出して本発明を完成させた。
即ち、本発明は、非ヒト哺乳類細胞にヒトNK細胞による細胞傷害活性に対する抵抗性を賦与するHLA-Eキメラ分子、及びそれらをコードする塩基配列、並びに当該塩基配列で形質転換された非ヒト哺乳類細胞及び非ヒト哺乳動物を提供する。
なお、改変型ＳＰとは、ＳＰのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸が置換若しくは欠失され、又は１又は２以上のアミノ酸が付加された配列をいい、例えば、HLA-G1分子のSP(配列番号１１）を改変したSP（Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala：配列番号２１、以下、改変型ＳＰという）が例示される。
また、HLA-E分子のシグナルペプチド（SP）、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及び膜貫通（TM）ドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜５に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号６〜１０に示す。
またHLA-G1分子のSP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１〜１５に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号１６〜２０に示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するための本発明の要旨は、非ヒト哺乳類細胞にヒトNK細胞による細胞傷害活性に対する抵抗性を賦与するHLA-Eキメラ分子及びそれらをコードする塩基配列であり、より具体的な例としては下記の性状を有するキメラ分子及びそれをコードする塩基配列が示される。
(1)改変型SPを有すると共に、HLA−E分子のα２ドメインのアミノ酸番号91−182(α１ドメインのＮ末端からの番号である。以下同様)がHLA-G1分子のα２ドメインのアミノ酸番号91−182に置換された以外はHLA−E分子であるHLA−Eキメラ分子とそれをコードする塩基配列。当該キメラ分子において、SP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号2１〜2５に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号26〜30に示す；
(2) 改変型SPを有すると共に、HLA−E分子のα２ドメインの後半部分のアミノ酸番号137-182がHLA-G1分子のα２ドメインの後半部分のアミノ酸番号137-182に置換された以外はHLA−E分子であるHLA−Eキメラ分子とそれをコードする塩基配列。当該キメラ分子において、SP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号31〜35に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号36〜40に示す；
(3) 改変型SPを有すると共に、HLA-E分子のα２ドメインの後半部分のうちのその前半部分のアミノ酸番号137-150をHLA-G1分子のα２ドメインの後半部分のうちその前半部分のアミノ酸番号137-150に置換された以外はHLA−E分子であるHLA−Eキメラ分子とそれをコードする塩基配列。当該キメラ分子において、SP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号41〜45に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号46〜50に示す；
(4) HLA-E分子のSP又は改変型SPを有し、HLA-E分子のα２ドメインのアミノ酸番号147がシステインに置換された以外はHLA−E分子であるHLA−Eキメラ分子とそれをコードする塩基配列。当該キメラ分子において、HLA-E分子のSP を有するキメラ分子のSP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号5１〜5５に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号56〜60に示し、また改変型SPを有するキメラ分子のSP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号61〜65に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号66〜70に示す；
(5) HLA-E分子のSP又は改変型SPを有し、HLA-E分子のα１ドメインのアミノ酸番号11がアラニンに置換されていると共に、α２ドメインのアミノ酸番号147がシステインに置換されている以外はHLA−E分子であるHLA−Eキメラ分子とそれをコードする塩基配列。当該キメラ分子において、HLA-E分子のSP を有するキメラ分子のSP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号71〜75に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号76〜80に示し、また改変型SPを有するキメラ分子のSP、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及びTMドメインのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号81〜8５に示し、またそれらの塩基配列をそれぞれ配列番号86〜90に示す；及び
(6)前記(1)から(5)の何れかのHLA-Eキメラ分子をコードする塩基配列の一つで形質転換され作製された、ヒトNK細胞による細胞傷害活性に対する抵抗性を賦与された非ヒト哺乳類細胞又は非ヒト哺乳動物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のHLA-Eキメラ分子は非ヒト哺乳類細胞に効率よく発現するので、ヒトNK細胞による細胞傷害活性に対する抵抗性を非ヒト哺乳類細胞に賦与することができる。従って、本発明のHLA-Eキメラ分子は、非ヒト哺乳類の細胞、組織、臓器をヒトに異種移植する際に生じるヒトNK細胞による細胞傷害や急性血管拒絶（AVR）の発生の防止に奏効する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ヒトHLAクラスＩ分子はシグナルペプチド（SP）、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン及び膜貫通（TM）ドメインから成り、これにβ２ミクログロブリン（β２ｍ）が配された構造を採る。
また、ヒトHLAクラスＩ分子は、立体構造的に、α１ドメインとα２ドメインで形成される溝に、シグナルペプチド（SP）に由来するオリゴペプチドを挟み込んで抗原提示する。
前述のように、非ヒト哺乳類細胞をHLA-Gの遺伝子を用いて形質転換させることは比較的容易であるが、ヒトNK細胞傷害活性抑制能は低い。逆に、非ヒト哺乳類細胞をHLA-Eの遺伝子を用いて形質転換させれば、より高いヒトNK細胞傷害活性抑制能を得られるが、形質転換させること自体が容易でない。そこで、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性を非ヒト哺乳類細胞に賦与することを目的として、HLA-G1分子とHLA-E分子の分子内ドメインを入れ換えたHLA-Eキメラ分子をコードする塩基配列を作製し、非ヒト哺乳類の細胞株を形質転換し、抗HLA抗体（B9.12.1、コスモバイオ）を使用して発現強度の増減をFACS解析し、鋭意検討した。そして後記の実施例が示すように、次に掲げるHLA-Eキメラ分子をコードする塩基配列で形質転換された非ヒト哺乳類細胞のHLA-E発現量は増加し、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性が増加することを見出した。
【００１２】
(1)HLA−E分子のSP（配列番号１）を、HLA-G1分子のSP(配列番号１１）を改変したSP（配列番号２１；後記実施例で使用した改変型SPである）と置換すると共に、HLA−E分子のα２ドメイン（アミノ酸番号91−182）をHLA-G1分子のα２ドメイン（アミノ酸番号91−182）に置換したHLA−Eキメラ分子（配列番号21〜30参照）、
(2)HLA−E分子のSPを上記改変SPと置換すると共に、HLA−E分子のα２ドメインの後半部分（アミノ酸番号137-182）をHLA-G1分子のα２ドメインの後半部分（アミノ酸番号137-182）に置換したHLA−Eキメラ分子（配列番号31〜40参照）、
(3) HLA−E分子のSPを上記改変SPと置換すると共に、HLA-E分子のα２ドメインの後半部分のうちのその前半部分（アミノ酸番号137-150）をHLA-G1分子のα２ドメインの後半部分のうちその前半部分（アミノ酸番号137-150）に置換したHLA−Eキメラ分子（配列番号41〜50参照）、
(4)HLA-E分子のSPを上記改変SPと置換する又は置換しないで、HLA-E分子のα２ドメインのアミノ酸番号147のセリンをHLA-G1分子のα２ドメインのアミノ酸番号147のシステインに置換したHLA−Eキメラ分子（配列番号51〜60及び配列番号61〜70参照）、及び
(5) HLA-E分子のSPを上記改変SPと置換する又は置換しないで、HLA-E分子のα１ドメインのアミノ酸番号11のセリン及び同α２ドメインのアミノ酸番号147のセリンのそれぞれをHLA-G1分子のα1のアミノ酸番号11のアラニン及び同α２のアミノ酸番号147のシステインに置換したHLA−Eキメラ分子（配列番号71〜80及び配列番号81〜90参照）。
【００１３】
上記(1)から(5)に記載の何れか一つのHLA−Eキメラ分子をコードする塩基配列と遺伝子プロモーター（例えば、βアクチンのプロモーター、pMCPのプロモーターなど）及び／又はその他の発現調節配列からなる導入遺伝子を構築し、非ヒト哺乳類の細胞を形質転換すれば、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性を有する非ヒト哺乳類細胞を調製することができる。
また当該導入遺伝子をマイクロインジェクション法により非ヒト哺乳類の受精卵に注入すれば、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性を有する細胞、組織、臓器から成る非ヒトトランスジェニック哺乳動物を調製することができる。本発明における非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されず、例えば、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ウマ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコなどが例示され、異種移植を考慮すると、ドナーとして好適なブタが好ましい。
さらに、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性を有する非ヒト哺乳類細胞をドナー細胞として核移植法を適用すれば、ヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性を有する細胞、組織、臓器から成る非ヒトクローン哺乳動物を調製することができる。これらの非ヒトトランスジェニック哺乳動物又は非ヒトクローン哺乳動物の作製方法としては、公知の方法及び至適条件を適宜選択すればよい。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
各種HLA-Eキメラ分子の非ヒト哺乳類細胞での発現（１）
表１に記載の構成から成るアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現ベクターであるpCXN（チキンのβアクチンプロモーター、CMVのエンハンサーを有する）に導入した。次に各導入遺伝子をCHO細胞に導入し、抗HLA抗体(Pan-Class I抗体、B9.12.1、コスモバイオ）を用いてFACS解析し、発現量の相対値を求めた。その結果を表１に示す。なお、発現ベクターの作製、形質転換などの操作は、遺伝子組換技術の常法に準じて行った（以下同様）。
【００１５】
2005151982.tif 000002
【００１６】
表１に示す結果から、HLA-E分子のSP配列をHLA-G1のSPに類似する改変型SP（配列番号２１）に置換すると共に、HLA-E分子のα２ドメイン（アミノ酸番号91−182）、HLA-E分子のα２ドメインの後半部分（アミノ酸番号137-182）又はHLA-E分子のα２ドメインの後半部分のうちのその前半部分（アミノ酸番号137-150）をそれぞれに対応するHLA-G1分子のアミノ酸配列に置換することによって、HLA−Eキメラ分子は効率よくCHO細胞上に発現することが確認された。
【００１７】
実施例２
各種HLA-Eキメラ分子の非ヒト哺乳類細胞での発現（２）
表２に記載の構成から成るアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現ベクターであるpCXNに導入した。次に各導入遺伝子をCHO細胞に導入し、抗HLA抗体を用いてFACS解析した。その結果を表２に示す。
【００１８】
2005151982.tif 000003
【００１９】
表２に示す結果から、HLA-E分子のα２ドメインのアミノ酸番号147のセリンをHLA-G1分子のα２ドメインのアミノ酸番号147のシステインに置換したHLA-Eキメラ分子は効率よくCHO細胞上に発現することが確認された、またHLA-E分子のSP配列を改変型SP（配列番号２１）に置換すると共にHLA-E分子のα２ドメインのアミノ酸配列番号147をシステインに置換したHLA-Eキメラ分子はさらに効率よくCHO細胞上に発現することが確認された。セリンのβ位の水酸基（-OH）をシステインのチオール基（-SH）に置換することによりHLA-Eキメラ分子はさらに効率よくCHO細胞上に発現することが確認された。
【００２０】
実施例３
HLA-Eキメラ分子を発現する非ヒト哺乳類細胞のヒトNK細胞の細胞傷害活性に対する抵抗性
表３に記載の構成から成るアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現ベクターであるpCXNに導入した。次に各導入遺伝子をブタ血管内皮細胞（SEC）に導入し、各安定細胞株を作製した。各形質転換SEC細胞にヒトNK様細胞（YT）を5：1の割合で作用させ（37℃、４時間）、SECから遊離される乳酸脱水素酵素（LDH）を指標としてヒトNK細胞の細胞傷害活性を測定し、細胞傷害率の相対値を求めた。その結果を表３に示す。
【００２１】
2005151982.tif 000004
【００２２】
表３に示す結果から、HLA-E分子のSPを改変型SPに置換したHLA-Eキメラ分子、HLA-E分子のSPを改変型SPに置換すると共にHLA-E分子のα２ドメインのアミノ酸番号147をシステインに置換したHLA-Eキメラ分子、及び、上記に加えα１ドメインのアミノ酸番号11をアラニンに置換したHLA-Eキメラ分子、の何れかをコードする塩基配列で形質変換されたブタ血管内皮細胞はヒトNK細胞による細胞傷害を抑制することが確認された。
【配列表】
2005151982000001.xml