(57)【要約】【課題】  抗癌剤と葉酸とのコンジュゲートを生成するのに適する葉酸誘導体の効率的な製造方法の提供。【解決手段】  ２−アミノ保護プテロイルイミダゾールとグルタミン酸γ−低級アルキルとの反応工程、次いで生成物とドラッグの官能基と容易に反応しうる反応性基を有するアミノ化合物との反応工程を含んでなる方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含んでなる葉酸誘導体の製造方法：
ａ）  式（Ａ）
【化１】
2005281138.tif 000007
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す。）
で表されるイミダゾリドを有機溶媒中塩基の存在下でＬ−グルタミン酸γ−低級アルキルと反応させ、式（Ｂ）
【化２】
2005281138.tif 000008
（式中、Ｒは式（Ａ）について定義したのと同義であり、そしてＲ′は低級アルキル基を表す。）
で表される２−アミノ保護葉酸γ−低級アルキルを生成する工程、
ｂ）  式（Ｂ）で表される２−アミノ保護葉酸γ−低級アルキルを有機溶媒の存在下または不存在下で、式（Ｃ）
Ｒ″−Ｌ−ＮＨ２          （Ｃ）
（式中、Ｒ″は有機化合物の官能基と容易に反応することができる反応性基を表し、Ｌは結合、Ｃ１−Ｃ５アルキレンまたは式
−（ＣＨ2ＣＨ(Ｒc )−Ｏ−) nＣＨ2ＣＨ(Ｒc )−
（ここで、Ｒcは水素原子またはメチル基を表し、ｎは１〜１０,０００の整数である。）
のオリゴ−もしくはポリ（オキシアルキレン）を表す。）
のアミン化合物と反応させて、式（Ｄ）
【化３】
2005281138.tif 000009
（式中、Ｒは式（Ａ）について定義したのと同義であり、ＬおよびＲ″は式（Ｃ）について定義したのと同義である。）
の葉酸誘導体を生成する工程。
【請求項２】
式（Ａ）中のＲが式
【化４】
2005281138.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は相互に独立して低級アルキル基を表し、ｍは１〜４の整数を表す。）
で表される基であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（Ｂ−１）
【化５】
2005281138.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は相互に独立して低級アルキル基を表し、ｍは１〜４の整数を表し、そしてＲ′は低級アルキル基を表す。）
で表される２−アミノ保護葉酸γ−低級アルキル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸誘導体、特に抗癌剤とのコンジュゲートを形成するのに適する葉酸誘導体の製造方法および合成中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の著しい進歩に伴い、種々の疾病メカニズムが分子レベルで明らかにされてきており、癌化学療法は新たな時代を迎えている。すなわち、テーラーメード治療と言われる個々の患者に特化した治療法が求められているが、その達成には分子論的なメカニズムの解明をもとに副作用の軽減を狙ったドラッグデザインや薬物投与に関する方法論の確立が必要となる。一般に抗癌剤を用いる化学療法は放射線療法の治療が不十分な場合や白血病のように手術が適用できない場合に必要不可欠な治療法として知られている。しかしながら、癌化学療法ではペニシリン、ストレプトマイシンに代表される抗微生物治療の成功に比べて多くの問題点を抱えているのが現状である。その最大の理由として、抗癌剤のほとんどが人体に対して強い毒性を有するため、投与量の増大による治療効果向上の試みは副作用の併発を伴い薬物治療への限界が指摘されている。このような状況の中で、いかにして抗癌剤自身の毒性を軽減させ治療効果を上げていくかが重要なポイントになっている。最近の癌化学療法における傾向として、これら背景をもとに癌細胞への選択性向上を狙ったドラッグターゲティングが注目されている。
【０００３】
葉酸は、様々な生理活性を有することが知られているビタミンＢ郡の一種であり、細胞表面に存在する葉酸レセプターを介したエンドサイトーシスあるいはポトサイトーシスと呼ばれる機構を経て細胞内へ輸送される。したがって、ドラッグに葉酸を結合（葉酸−ドラッグコンジュゲート）させることができれば、これらメカニズムによって細胞内へ能動的な輸送が可能となる。さらに、癌細胞においては、この葉酸を認識するレセプターが過剰に発現していることが知られており葉酸−ドラッグコンジュゲートは癌細胞へのターゲティングを行える点で期待される。例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ、慣用名：アドリアマイシン）あるいはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオタイド（ＯＤＮ）と葉酸を結合させた系が既に検討されておりドラッグターゲティングとしての効果が示されている（例えば、非特許文献１および２参照。）。
【０００４】
このように、葉酸を用いた生物学的なアプローチには非常に興味深い点が多く、その葉酸誘導体の重要性は広く認識されている。しかし、非特許文献１及び２に記載のコンジュゲートとは異なり、これまでの葉酸−ドラッグを直接共有結合して得られるコンジュゲートは合成面において多くの問題点が指摘されている。すなわち、葉酸とドラッグを共有結合させる場合、ＤＣＣなどの縮合剤を用いて結合させる場合がほとんどであるが、このときの生成物はα体とγ体の両方の混在物として得られてしまうことがよくある。しかし、これら混在物の精製は非常に困難であるだけでなく、α体の葉酸誘導体はレセプターの認識能がないため生化学領域でのアプリケーションにとって全く意味をもたないと考えられる。また、γ体のみを得る葉酸誘導体の合成方法もいくつか報告されてはいるが総じて反応工程が長く汎用性に欠けている。
【０００５】
これらの中で、ある程度有望な製造方法も提案されている。例えば、葉酸の構造の一部であるプテロイル部に対応するプテロイン酸からプテロイルアジドを形成し、次いでグルタミン酸γ−メチルを反応させ、キー中間体としての葉酸γ−メチルエステルを提供し、さらにかような中間体をエチレンジアミンと反応させた後、エチレンジアミンに由来する遊離のアミノ基を介して腫瘍特異性金属バインディングリガンド（ＤＴＰＡ）を結合させた方法およびこうしてえられる化合物が提供されている（例えば、非特許文献３参照）。しかし、かかる製造方法は上記のキー中間体に至るまでに多くの反応段階を経る必要があり、また、キー中間体それ自体は有機合成反応に常用される有機溶媒に殆ど不溶性である。他方、Nomura M. et al., は上記のキー中間体は有機溶媒に対する溶解性が低いことのみならず、γ−メチルエステル部の求核剤との反応性が相対的に低いことを指摘した上で、まず、プテロイン酸におけるプテリジン環の２位のアミノ基を親油基で保護し、次いで、カルボキシル基をイミダゾリドへ転化した後、該イミダゾリドをグルタミン酸のγ−カルボキシル基を遊離のまま保持し、α−カルボキシル基を親油性基で保護したグルタミン酸誘導体と反応させて、上記キー中間体に対応する中間体を得る方法を提案している（例えば、非特許文献４参照。）。Nomura et al., は縮合剤を用い、かような中間体の遊離のγ−カルボキシル基とドラッグのアミノ基との間で共有結合を形成したコンジュゲートを得ている。しかし、γ−カルボキシル基を遊離のまま保持し、α−カルボキシル基を親油性基で保護したグルタミン酸誘導体を取得するためには多段階の工程を必要とする。
【０００６】
【非特許文献１】Lee, R. J. et al., J. Biol. Chem. 1994，269，3198−3204
【非特許文献２】Wang, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 3318−3322
【非特許文献３】Luo, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 1997，119，10004−10013
【非特許文献４】Nomura M. et. al., J. Org. Chem. 2000，65，5016−5021
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上に述べた従来法に比べ、より短い反応工程で葉酸のγ−位カルボキシル基部のみに選択的に目的とする反応性基を導入できる方法を入手することが望まれる。
【０００８】
本発明は、このような従来法が有していた問題を解決しようとするものであり、より短い反応工程にて達成できる新規なγ−位選択的な葉酸誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述したとおり、非特許文献３に記載されたキー中間体である葉酸γ−メチルエステルは有機溶媒に対する溶解性が低く、また、求核剤との反応性も低いことが非特許文献４（特に、５０１６頁右欄下から２行〜５０１７頁左欄本文４行参照。）において指摘されている。しかし、非特許文献４に記載された該キー中間体に対応する化合物の前駆体である２−アミノ保護プテロイン酸のイミダゾリドから得られる２−アミノ保護葉酸のγ−低級アルキルエステルは、Nomura  M. et. al., が示唆するのとは異なり、α−カルボキシル基が遊離であっても、有機合成反応に常用される有機溶媒に溶解し、しかも該エステル基とアミノ化合物との反応により容易にアミノ化合物残基を葉酸に共有結合できることを本発明者らは見出した。
【００１０】
したがって、上記課題を解決するべき手段として、
ａ）  式（Ａ）
【００１１】
【化１】
2005281138.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒはアミノ基の保護基を表す。）
で表されるイミダゾリドを有機溶媒中、塩基の存在下でＬ−グルタミン酸γ−低級アルキルと反応させ、式（Ｂ）
【００１３】
【化２】
2005281138.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒは式（Ａ）について定義したのと同義であり、そしてＲ′は低級アルキル基を表す。）
で表される２−アミノ保護葉酸γ−低級アルキルを生成する工程、
ｂ）  式（Ｂ）で表される２−アミノ保護葉酸γ−低級アルキルを有機溶媒の存在下または不存在下で、式（Ｃ）
Ｒ″−Ｌ−ＮＨ２          （Ｃ）
（式中、Ｒ″は有機化合物の官能基と容易に反応することができる反応性基を表し、Ｌは結合、Ｃ１−Ｃ５アルキレンまたは式
−（ＣＨ2ＣＨ(Ｒc)−Ｏ−)nＣＨ2ＣＨ(Ｒc)−
（ここで、Ｒcは水素原子またはメチル基を表し、ｎは１〜１０,０００の整数である。）
のオリゴ−もしくはポリ（オキシアルキレン）を表す。）
のアミン化合物と反応させて、式（Ｄ）
【００１５】
【化３】
2005281138.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒは式（Ａ）について定義したのと同義であり、ＬおよびＲ″は式（Ｃ）について定義したのと同義である。）
の葉酸誘導体を生成する工程
を含んでなる葉酸誘導体の製造方法を提供する。
【００１７】
また、本発明者らが知る限り、上記の式（Ｂ）で表される、プテリジン環の２位アミノ基が保護されており、そしてγ位カルボキシル基が低級アルキルエステル基の化合物は従来技術文献未載の化合物である。したがって、このような化合物も本発明の一態様として提供される。
【００１８】
以下、本発明の具体的な態様について説明する。
【００１９】
本発明に関して使用する「低級アルキル」基の語は、炭素原子数１〜６（Ｃ１−Ｃ６）、好ましくはＣ１−Ｃ６のアルキル基を意味し、具体的な基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル、等が挙げられる。
【００２０】
式（Ａ）におけるアミノ基の保護基（Ｒ）は、目的に応じて容易に脱離できる基であって、例えば、ペプチド合成に際してアミノ酸のアミノ基の保護に用いられる保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、アセチル基、等）またはトリフルオロトリフルオロメタンスルホニル基、p−トルエンスルホニル基、有機シリル残基、等を包含する多種多様な基であることができるが、好ましくは、式
【００２１】
【化４】
2005281138.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、相互に独立して低級アルキル基を表し、ｍは１〜４の整数を表す。）
で表される基である。これらの基としては、トリメチルシリルメトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル、３−トリメチルシリルプロポキシカルボニル、２−エチルジメチルシリルエトキシカルボニル、２−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエトキシカルボニル、トリエチルシリルメトキシカルボニル、２−トリエチルシリルエトキシカルボニル、等を挙げることができる。
かようなアミノ基の保護基（特に、トリメチルシリルエトキシカルボニル基）を有する式（Ａ）で表される化合物は、非特許文献４に記載されているように、プロテイン酸をＮ,Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）および２−（トリメチルシリル）エタノールと反応させること、またはこれらに類似する方法により得ることができる。本発明に従う工程ａ）は、式（Ａ）の化合物を有機溶媒、好ましくは極性非プロトン性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、等に溶解させ、塩基、好ましくは、有機強塩基、例えば、Ｎ−メチル−１,５,９−トリアザビシクロ［４.４.０］デセン（ＭＴＢＤ）、１，８−ジアザビシクロ[5．4．0]ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）、等の存在下でグルタミン酸のγ−低級アルキルエステルと反応させることによって実施する。反応温度、反応時間は、使用する塩基等によって最適条件は変動するが、グルタミン酸のラセミ化が起こらない温度を選ぶことを優先する。通常、室温で約２０時間前後反応させるのがよい。こうして、式（Ｂ）の化合物が高収率で得られる。
【００２３】
工程ｂ）は、ドラッグ、特に抗癌剤（必要により機能化した）と共有結合を形成しうる反応性基を導入する段階である。この工程は、式（Ｂ）の化合物を有機溶媒（好ましくは、上記の工程ａ）で使用する溶媒または溶媒の不存在下（特に、式（Ｂ）の化合物と反応させる下記のアミノ化合物が室温で液体である場合）で、式（Ｃ）
Ｒ″−Ｌ−ＮＨ２          （Ｃ）
で表されるアミノ化合物と反応させて、γ−低級アルキルエステルのアルコキシ基が式（Ｃ）の化合物に由来する Ｒ″−Ｌ−ＮＨ− 基で置換した上記の式（Ｄ）で表される化合物を提供する。
【００２４】
式（Ｃ）のＲ″についていう、有機化合物、特に、抗癌剤の官能基（本来の抗癌剤の構造中に，必要により、本発明の目的に沿うようにまたは本発明の反応に供することができるように導入された官能基を包含する）と容易に反応することができる反応性基とは、葉酸が、例えば癌細胞において発現されている葉酸を認識するレセプターに結合する能力に悪影響を及ぼすことなく有機化合物の官能基と反応して共有結合を形成しうる基を意味する。
【００２５】
このような反応性基としては、（ｉ）アミノ基（−ＮＨ２）、（ｉｉ）置換ジスルフィド基、例えば、
【００２６】
【化５】
2005281138.tif 000006
【００２７】
（ｉｉｉ）アセチレン基：
−Ｃ≡ＣＨ
および (ｉｖ) アジド基（−Ｎ３）を挙げることができる。これらの反応性基は、式（Ｃ）の化合物のアミノ基に直接結合しているか、または連結基（Ｌ）：Ｃ１−Ｃ５アルキレン、例えば、メチレン、ジー、トリー、テトラ−もしくはペンタ（メチレン）、あるいは式
−(ＣＨ2ＣＨ(ＲC)Ｏ)nＣＨ2ＣＨ(ＲC)−
（式中、Ｒcは水素原子またはメチル基を表し、ｎは１〜１０,０００の整数である。）
で表されるオリゴ−もしくはポリ（オキシアルキレン）鎖を介して該アミノ基に結合している。
【００２８】
かような反応性基を有する式（Ｄ）の化合物は、それ自体公知の温和な反応条件により、該反応性基と反応しうるドラッグ、特に、抗癌剤の官能基と反応して共有結合を形成し、葉酸−ドラッグコンジュゲートを提供できる。
【００２９】
限定されるものでないが、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の反応性基は、それぞれ、以下の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
（ｉ）  アミノ基の場合には、例えば、ドキソルビシンの１３位炭素カルボニル基とシッフ塩基を介して容易に葉酸とドラッグを結合させることができる。注目すべきは、ヒドラジド基にて形成されたシッフ塩基がエンドソーム内の酸性条件下でその結合を再び切断することである（例えば、Angew. Chem. Int. Ed., ４２．４６４０（２００３）参照）。一般に強固な共有結合にて得られた葉酸−ドラッグコンジュゲートが細胞内に取り込まれたときの１つの問題点は、細胞内エンドソームからレセプターの回収機構に伴いドラッグを再び細胞外に排出してしまうことである。このとき、細胞内エンドソーム内で葉酸とドラッグを切断させることができれば、更に薬物効果を上げることが可能となる。したがって、例えば、ヒドラジドのアミノ基とカルボニル基から形成されるシッフ塩基を介して葉酸とドキソルビシンを結合させｐＨに応答できるよう設計すると癌細胞に過剰に発現している葉酸レセプターを介してエネルギー依存的に効率よく細胞内に取り込まれるだけでなく、細胞内のエンドソームからリソソーム移行する過程でシッフ塩基が開裂して葉酸レセプターからドキソルビシンをリリースすることができる。こうして、レセプターが細胞表面へ回収される際にドキソルビシンが細胞外へ排出されることなく効率的な細胞内薬物リリースの達成が期待される。また、適する場合にはドラッグを予めスクシンイミジル化等により機能化した活性エステルとしておき、アミド結合を形成することもできる。
（ｉｉ）  置換ジスルフィド基の場合には、必要があれば、ドラッグの一部へ既知の方法でチオール基を導入しておき、該チオール基と置換ジスルフィド基の開裂を伴うジスルフィド結合を形成することができる。
（ｉｉｉ）  アセチレン基の場合には、必要があればドラッグの一部へ既知の方法でアジド基を導入しておき、アセチレン基とアジド基との間での、所謂、ヒュースゲンの１,３−双極環化付加反応（Huisegen １,３−dipolar cycloadditions）によるトリアゾール環の形成を介して葉酸−ドラッグコンジュゲートを形成することができる（該双極環化付加反応については，例えば、Angew. Chem. ,2002,114,p.2708-2711参照）。
（ｉｖ）  アジド基の場合には、必要があればドラッグの一部へ既知の方法でアセチレン基を導入しておき、上記（ｉｉｉ）と同様に葉酸−ドラッグコンジュゲートを形成することができる。
【００３０】
こうして、本発明によれば、ドラッグと葉酸とのコンジュゲートを形成するのに適する葉酸誘導体の製造方法が提供できる。なお、上記の工程ａ）および工程ｂ）における生成物は、必要により、それ自体既知のクロマトグラフィー、溶媒抽出、再結晶、等により単離できる。
【００３１】
以下、具体例を挙げて本発明を説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものでない。
【００３２】
製造例１（参考例）
１−［２−Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］プテロイル］イミダゾールの合成
プテロイン酸３.０ｇとトリエチルアミン（ＴＥＡ）５.３５ｍＬを混ぜたところへＤＭＳＯ ５０ｍＬに溶解させたＣＤＩ ６.２４ｇを加え、室温で３.５時間反応させた。そして、２−（トリメチルシリル）エタノール（９.６３ｍＬ）を加え、更に室温中で５時間反応させた。精製としては、水（１０ｍＬ）−酢酸（０.３２ｍＬ）とジエチルエーテル（６.４ｍＬ）に反応溶液を滴下してしばらくの間、強く撹拌した後、吸引ろ過を行い固体として回収した。そして、カラム精製（シリカゲルカラム；溶離液クロロホルム中１０％メタノール）を行い、最後に、減圧乾燥にて２.６７ｇ（収率５４.８％）の目的化合物を回収した。
【００３３】
製造例２（実施例）
２−Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸γ−メチルエステルの合成
ＤＭＳＯ １０ｍＬに１−［２−Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］プテロイル］イミダゾール１.０ｇ（１.９７ｍｍｏｌ）とＭＴＢＤ ０.７ｍｌ（４.８８ｍｍｏｌ）を溶解させたものをグルタミン酸γ−メチルエステル０.４７７ｇ（２.９６ｍｍｏｌ）へ滴下して室温中で２１時間反応させた。精製として、酢酸水（１Ｍ，３０ｍＬ）−メタノール（１５ｍＬ）とＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）に反応溶液を滴下し有機層を酢酸（１Ｍ）メタノール（１：１，２０ｍＬ）と水−メタノール（２：１，３０ｍＬ、２回）で洗浄。そして、Ｎａ２ＳＯ４で脱水、ろ過、エバポレーションを行った。最後にＣＨＣｌ３ジエチルエーテル洗浄にて１.０５ｇ（収率８８.５％）の目的化合物を回収した。この化合物は１Ｈ ＮＭＲの測定から目的化合物が得られたことを同定した［イミダゾール基に由来するピークの１つ（７.１ｐｐｍ）が完全に消失し、新たに、グルタミン酸のメチルエステル基に由来するピーク（３.６ｐｐｍ）が観察された。］
製造例３（実施例）
葉酸γ−ヒドラジト゛の合成
無水ヒドラジン１０ｍＬ中に２−Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル］葉酸γ−メチルエステル０.２１ｇを溶解させて５０℃、３時間反応させた。反応終了後、溶液を減圧下で除去しｐＨ１.０塩酸水溶液１０ｍＬに再溶解させて室温にて１時間撹拌した。次にＮａＯＨ水溶液で中和後に凍結乾燥し、純水に再溶解させて遠心操作を２回行うことによって脱塩した。最後に、凍結乾燥にて黄色い粉体として回収した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
上述したように本発明の方法は、ドラッグ、特に抗癌剤と葉酸−ドラッグコンジュゲートを提供するための葉酸誘導体を提供できる。