(57)【要約】【課題】  一定のプロモータの制御下に種々の発現量に制御されたタンパク発現形質転換体を得ることが可能なタンパク発現プラスミドまたはＤＮＡ断片を提供する。【解決手段】  対象となる細胞の形質転換を目的として作製されるタンパク発現プラスミドＤＮＡ断片であって、対象となる細胞中で機能するプロモータとターミネータとの間に任意のタンパク発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、前記プロモータと前記遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって遺伝子の発現量が制御される制御配列が挿入されたタンパク発現プラスミドまたはＤＮＡ断片とする。この制御配列は、グアニンまたはシトシンの含有量を調節した非翻訳領域配列または塩基配列の長さを調節した非翻訳領域配列で構成されている。【選択図】  図１
2005151941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる細胞の形質転換を目的として作製されるタンパク発現プラスミドであって、対象となる細胞中で機能するプロモータとターミネータとの間に任意のタンパク発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、前記プロモータと前記遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって遺伝子の発現量が制御される制御配列が挿入されてなることを特徴とするタンパク発現プラスミド。
【請求項２】
前記制御配列が、グアニンまたはシトシンの含有量を調節した非翻訳領域配列で構成されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項３】
前記制御配列が、塩基配列の長さを調節した非翻訳領域配列で構成されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項４】
前記制御配列が、複数の、クローニングを行うサイトによる発現量の段階的な制御が可能で、かつクローニングを行うに適した制限酵素サイトを有する配列を用いて形成されたものであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項５】
酵母の形質転換を行うタンパク発現プラスミドであって、酵母細胞中で稼動する任意のプロモータ、ターミネータ、および形質転換時のセレクションを行う栄養要求性マーカーならびに薬剤耐性マーカーの任意の配列が挿入されてなることを特徴とする請求項１に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項６】
自己複製起点およびセントロメアを有することを特徴とする請求項５に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項７】
前記プロモータがＡＤＨ１、ＧＡＬ１またはＧＡＰＤＨであることを特徴とする請求項５に記載のタンパク発現プラスミド。
【請求項８】
対象となる細胞の形質転換を目的として作製されるタンパク発現ＤＮＡ断片であって、対象となる細胞中で機能するプロモータとターミネータとの間に任意のタンパク発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、前記プロモータと前記遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって遺伝子の発現量が制御される制御配列が挿入されてなることを特徴とするタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項９】
前記制御配列が、グアニンまたはシトシンの含有量を調節した非翻訳領域配列で構成されていることを特徴とする請求項８に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項１０】
前記制御配列が、塩基配列の長さを調節した非翻訳領域配列で構成されていることを特徴とする請求項８に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項１１】
前記制御配列が、複数の、クローニングを行うサイトによる発現量の段階的な制御が可能で、かつクローニングを行うに適した制限酵素サイトを有する配列を用いて形成されたものであることを特徴とする請求項８に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項１２】
酵母の形質転換を行うタンパク発現ＤＮＡ断片であって、酵母細胞中で稼動する任意のプロモータ、ターミネータ、および形質転換時のセレクションを行う栄養要求性マーカーならびに薬剤耐性マーカーの任意の配列が挿入されてなることを特徴とする請求項８に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項１３】
酵母のゲノム組換えによる形質転換を行うタンパク発現ＤＮＡ断片であって、酵母中での自己複製起点を含まず、酵母中での組換えを促進するための酵母ゲノム中に含まれる任意の配列を有し、かつ該組換え個所に導入された時にセレクションマーカーとして機能する配列を有することを特徴とする請求項１２に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【請求項１４】
前記プロモータがＡＤＨ１、ＧＡＬ１またはＧＡＰＤＨであることを特徴とする請求項１２に記載のタンパク発現ＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク発現プラスミドおよびＤＮＡ断片に関し、さらに詳しくはプロモータ領域に同一の配列を用いながら発現量が系統的に制御可能なタンパクの発現ベクタに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵母ｃＤＮＡ、ヒトｃＤＮＡ等を用いて、酵母細胞中に酵母、ヒト等の所望のタンパクの発現を比較的容易に行うことの出来るプロトコルが確立されている。すなわち、細胞内で単独に複製されるための自己複製領域等を有するなどの設計が行われた公知のプラスミドに、酵母中で稼動するプロモータ領域とターミネータ領域を挿入し、この間にタンパクをコーディングする配列を挿入し、酵母核中に導入することで形質転換を行う等の手法である。これにより１ないし数種類の所望のタンパクを酵母細胞中に発現させることが可能であり、その表現型を観察することによる遺伝子の機能解析、酵母への新規機能の付与などを行うことを目的としている。
【０００３】
一方、酵母中でタンパクを発現させる場合、その存在量により表現型が異なることが一般に知られている。このことから、上述のような形質転換によるタンパクの発現において、その発現量をある程度任意にコントロールできることが望まれている。しかし、公知の方法においてはタンパクの発現量は用いるプロモータの種類によりほぼ決定され、したがって、発現量を調整するにあたっては、所望の遺伝子を転写活性の異なる各種のプロモータ下流に接続することにより行う必要がある。
【０００４】
しかしながらこの方法は、その作製において手間を要するばかりでなく、プロモータの種類による細胞周期や成長フェーズに応じた転写タイミングの相違や、各プロモータを稼動させるに必要な溶液条件を用いることによる環境の相違により酵母細胞が示す代謝経路等の変化、薬剤添加等の操作を行う場合においてその薬剤もしくは溶媒等がプロモータ活性に与える影響等により、異なる発現量における測定、観察、分析等を正確に比較するには問題があるものであった。したがって発現量の相違による純粋な表現型の変化を解析するには不十分なシステムである。
【０００５】
また、同一のプロモータで発現量を系統的にコントロールする手法も提案されているが（例えば非特許文献１)、やはり制御には栄養条件によるコントロールが必要であり、またプロモータも限定されるものであった。
【非特許文献１】Finley RL Jr. ら、Gene，285 (2002)49
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで発明者等は鋭意検討の結果、同一の、かつ任意のプロモータを用いて、同一の溶液条件において系統的かつ容易に遺伝子の発現量が調節可能となる、より一般的な目的に適用可能なタンパク発現プラスミドあるいはＤＮＡ断片を見出し、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、対象となる細胞の形質転換を目的として作製されるタンパク発現プラスミドであって、対象となる細胞中で機能するプロモータとターミネータとの間に任意のタンパク発現遺伝子のコーディング領域が組み込まれ、前記プロモータと前記遺伝子との間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御によって遺伝子の発現量が制御される制御配列が挿入されてなることを特徴とするタンパク発現プラスミドまたはＤＮＡ断片である。
【０００８】
ここで、前記制御配列は、グアニンまたはシトシンの含有量を調節した非翻訳領域配列で構成されているか、あるいは塩基配列の長さを調節した非翻訳領域配列で構成されていることが好ましい。さらに好ましくは、前記制御配列は、複数の、クローニングを行うサイトによる発現量の段階的な制御が可能で、かつクローニングを行うに適した制限酵素サイトを有する配列を用いて形成されたものである。
【０００９】
すなわち本発明は、プロモータ下流の転写開始点と導入されるタンパクコーディング領域の間の非翻訳領域の配列を調整することにより翻訳因子群の機能を制御し、これにより翻訳量の調節を行うものである。
【００１０】
また本発明のタンパク発現プラスミドの一つは、酵母の形質転換を行うタンパク発現プラスミドであって、酵母細胞中で稼動する任意のプロモータ、ターミネータ、および形質転換時のセレクションを行う栄養要求性マーカーならびに薬剤耐性マーカーの任意の配列が挿入されてなるものである。
【００１１】
また特にタンパク発現プラスミドの場合は、自己複製起点およびセントロメアを有するものであって、前記プロモータがＡＤＨ１、ＧＡＬ１またはＧＡＰＤＨのものであり、ＤＮＡ断片の場合は、酵母中での自己複製起点を含まず、酵母中での組換えを促進するための酵母ゲノム中に含まれる任意の配列を有し、かつ該組換え個所に導入された時にセレクションマーカーとして機能する配列を有するものであって、前記プロモータがＡＤＨ１、ＧＡＬ１またはＧＡＰＤＨのものである。
【００１２】
本発明には、遺伝子発現量の制御を目的とした任意の配列を有するプラスミドであって、該配列の両端にクローニングを行うに適した制限酵素サイトを有し、かつ大腸菌中での複製起点及び大腸菌にトランスフェクトを行った際に大腸菌に特定の薬剤への耐性を付与しマーカーとして機能する部位を有するプラスミドを用いて作製したタンパク発現プラスミドまたはＤＮＡ断片が含まれる。
また、遺伝子発現量の制御を目的とした任意の配列の上流に形質転換を行う細胞中で稼動するプロモータを有し、また該配列の下流にクローニングを行うに適した制限酵素サイトを介して形質転換を行う細胞中で稼動するターミネータを有するプラスミドを用いて作製したタンパク発現プラスミドまたはＤＮＡ断片が含まれる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、タンパク発現に用いられるプラスミドの下流に挿入される非翻訳領域を適切に選択することにより、プロモータ活性の特性あるいは相違に基く発現量の相違に関する問題を解決し、一定のプロモータの制御下に種々の発現量に制御されたタンパク発現形質転換体を得ることが可能となる。
また本発明によれば、酵母中におけるタンパクの発現量を系統的かつ容易にコントロールすることが可能となり、遺伝子の発現量を任意に調整しその表現型を観察することによる遺伝子機能の解析、あるいは単一もしくは複数の遺伝子の発現量を至適に調節することによる酵母への所望の機能の付与等の手法を容易に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、対象となる細胞の形質転換を目的として作製されるプラスミドあるいはＤＮＡ断片であって、対象となる細胞中で機能する任意のプロモータ、ターミネータ間に任意の遺伝子のコーディング領域もしくは必要に応じてエキソンを含むイントロン配列が組み込まれ、かつ該プロモータと遺伝子の間にメッセンジャＲＮＡの転写量の制御による遺伝子の発現量の制御を目的とした配列が挿入された構成のものである。
【００１５】
プラスミドを構成する因子としては上述要件を満たせば任意の公知の技術を適用可能であるが、通常は大腸菌中での大量複製を目的として大腸菌形質転換時の選択マーカーとなるアンピシリン、カナマイシン等の抗生物質耐性因子コーディング部位、酵母形質転換体の選択に用いられるＨＩＳ３、ＬＥＵ２等の、使用する酵母株において欠損される栄養合成経路を補償する栄養要求性マーカー等が通常含まれる。また大腸菌中及び酵母中においてプラスミドの複製を行うための複製開始点が通常含まれる。酵母における複製起点には任意のものが適用可能ではあるが、いわゆるコピーナンバーを出来るだけ一定に保つことで本発明の効果をより精密に達成することが可能であることからセントロメアを有していることがより望ましい。また本発明による配列をゲノム上に組み込むことを目的とした場合、プラスミドとしての複製が行われず、ゲノム上に組み込まれることで複製が行われるように自己複製開始点を含まず、また組換えを促進するための配列を含むプラスミドを使用することも可能である。
【００１６】
タンパク発現に用いられるプロモータとしては酵母中でプロモータ活性を有する任意の配列が適用可能である。酵母ゲノム上に存在する種々の遺伝子のプロモータ部位が用いられるが、一般には常時転写活性を示すＡＤＨ１、ＧＡＰＤＨあるいは容易に転写の開始、停止を溶液組成により制御可能なＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＭＥＴ１等の遺伝子上流に存在するプロモータ部位が好適に用いられる。ターミネータは任意の遺伝子のものが適用可能である。
【００１７】
本発明による、プロモータ、コーディング領域間に転写量の制御を目的として挿入される非翻訳領域の配列には所望の目的を達成することが可能な配列であれば任意の配列を適用可能であるが、本発明は転写において形成される転写複合体における転写の進展に関わるものである。すなわち、通常酵母においては転写に際し転写複合体が形成され、これに引き続きヘリカーゼによるＤＮＡ鎖の解離を伴った転写の伸展が生ずるが、非翻訳領域に配列を加えることによりヘリカーゼによる二本鎖ＤＮＡの解離における反応速度を低下せしめ、転写活性の制御を行うものである。したがって、加えられる配列はその塩基数、およびその水素結合の解離に要するエネルギーが比較的小さいアデニン、チミン（２０kJ/mol程度）と、より高いエネルギーを要するグアニン、シトシン（５０kJ/mol程度）の比率によって選択されるべきものである。
【００１８】
この効果をより系統的に実施することを目的として、転写量の抑制効果が確認されている複数の配列を異なる制限酵素サイトを介してプロモータ下流に接続し、コーディング領域のサブクローニングを行う部位による転写量を制御するような構成も実用的に有用である。すなわちこれによるプラスミドを用いれば、所望のタンパクコーディング領域のサブクローニングを行うサイトを選択することによって、これを用いて形質転換を行った酵母中における該タンパクの発現量を系統的に制御可能となる。
【００１９】
上述のプラスミドを用いて作製する酵母の形質転換体は公知の任意の手法を用いて作製可能である。すなわち、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等が適用可能であるが、単一の細胞に導入されるプラスミドが重複することで本発明の目的とするところの発現量のコントロールが正確に行われなくなることを回避するために、充分希薄な適切なプラスミドの濃度において処理を行うことが望ましい。
【実施例】
【００２０】
次に、本発明の実施例について説明する。
本実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の理解の一助とするべきものであり、同一の効果を目的とした同様の手法は何れのものも本発明に含まれるものである。
【００２１】
実施例１
酵母用のシャトルベクタであって大腸菌中において機能する複製開始点、アンピシリン耐性部位および酵母中において機能するヒスチジンマーカ（ＨＩＳ３）、セントロメア、自己複製サイトを有するｐＲＳ３１３に、酵母ツーハイブリッドに用いられる発現ベクタｐＢＴＭ１１６よりＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ処理により切り出されるターミネータ領域、およびｐＢＴＭ１１６をテンプレートとしてＰＣＲ法により得られるＡＤＨ１プロモータ領域（ＰＡＤＨ１）を順次適切な方法によりライゲーションを行い、ＡＤＨプロモータ-ターミネータ配列を有するｐＲＳ３１３を得る。この間にヒトｃＤＮＡをテンプレートとして適切なプライマを用いてＰＣＲ法により調製したアリルハイドロカーボンレセプタ（ＡｈＲ）遺伝子の各鎖長の非翻訳領域を含むフラグメントを導入し、各フラグメントの挿入をシークエンス法により確認した。作製されたプラスミドの概要は図１に示す通りである。
【００２２】
図中、Ａｍｐ ｒはアンピシリン耐性マーカー、ＨＩＳ３はヒスチジンマーカー、ＡＲＳ、Ｏｒｉは酵母及び大腸菌における複製開始点、ＣＥＮは酵母におけるセントロメアを示し、ＰＡＤＨＩ、ＴeｒｍがアルコールデヒドロゲナーゼＩのプロモータ部位及びターミネータ部位を、ＡｈＲがヒトＡｈＲのｃＤＮＡ配列を、Ａが次式（１）から式（５）に示す非翻訳領域配列を示す。
【００２３】
なお、公知のＰＡＤＨ１による転写開始点から翻訳開始配列ＡＴＧ直前までの非翻訳領域の配列は、次の式（１）〜（５）とした。
【００２４】
ここで、式（１）は非翻訳領域にヒトｃＤＮＡ由来の非翻訳領域配列を含まず、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）において下線にて示す領域がヒトｃＤＮＡ由来の非翻訳領域配列に相当する。
【００２５】
なお、式（１）に示される、酵母由来配列におけるＧおよびＣの含有率は５４％程度であるのに対し、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）において挿入されたヒトｃＤＮＡ由来配列はＧおよびＣの含有率が高くなるように選択され、含有率は６５ないし８３％である。
これらのプラスミドをプラスミド（１−１）〜（１−５）とする。
【００２６】
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTACC  …（１）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTCGTCGGCTGGGCACC  …（２）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  …（３）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCTGACCCGGCCGCCAGTGCCCGGGGAGTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  …（４）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGTCAAGATCGGCCGCGGGAATTCGATGTCCCAGCCTACACCGGGTTCCGGGGACCCGGCCGCCAGTGCCCGGGGAGTAGCCGCCGCCGTCGGCTGGGCACC  …（５）
【００２７】
また同様な配列を用いて、酵母ゲノム上に組み込むことを目的として、上記のように作製されたプラスミドより、自己複製サイト（ＡＲＳ）およびセントロメア（ＣＥＮ）を適切な手法により除去した一連のプラスミドを作製した。このプラスミドの概略を図２に示す。これらのプラスミドをプラスミド（１−６）〜（１−１０）とする。
【００２８】
続いて、これらのプラスミドを用いて酢酸リチウム法により、発芽酵母サッカロミセスセレビジアの野生株であるＢＹ４７４２株をトランスフォームした。具体的には、対数増殖期の酵母を遠心沈降し、上清を廃棄したのち酢酸リチウム-トリス緩衝溶液に懸濁し、変性サケ精子ＤＮＡおよび上述のプラスミド（１−１）〜（１−５）を混合した。また、プラスミド（１−６）〜（１−１０）については、制限酵素ＭｓｃＩを用いて処理し、エタノール沈殿により精製した後に緩衝溶液に溶解したものを混合した。
【００２９】
次いで、ポリエチレングリコールを加えて４２℃で処理した後にＤｉｆｃｏ社製Yeast Nitrogen baseを用い必須アミノ酸類の一部及び炭素源としてグルコースを添加し作製した、ヒスチジンを含まない寒天培地に塗布し、形質転換された酵母株を得た。
【００３０】
プラスミド（１−１）〜（１−５）においては酵母核内へのプラスミド導入により、またプラスミド（１−６）〜（１−１０）より調製されるＤＮＡ断片においては酵母Ｙ７００株ゲノム上に存在する、一部欠損を行ったＨＩＳ３部への組換えにより、ＨＩＳ３の発現と同時にＡＤＨプロモータ下流に接続されたＡｈＲの発現が期待される。
【００３１】
このようにして得られた形質転換酵母を取り出し、グルコース、アデニン及びヒスチジンを除く必須アミノ酸類を添加した Yeast Nitrogen base 培地１０ｍＬにおいて３０℃で振盪培養を行ったのち、酵母が対数増殖期にある状態で終濃度５％のトリクロロ酢酸を添加し、０℃で静置した。遠心により回収した酵母をトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により中和した後グラスビーズを添加し激しく振盪させることで破砕し、タンパク質の回収を行った．更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりタンパクの分離を行い、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写し、抗ＡｈＲヤギ抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｓｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社 ｓｃ−８０８７)およびＨＲＰ（ホースラディッシュペロキシダーゼ）標識抗ヤギＩｇＧマウス抗体（ＳＩＧＭＡ社 Ａ４１８７）、ＥＣＬ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてウェスタンブロッティング法によりＡｈＲの検出を行った。結果はScion Image（Scion Corporation 製バージョンBeta 4。0。2）を用い定量化し、導入プラスミド毎に３コロニーずつ測定した平均値を用いた。
【００３２】
この結果、図３に示すように明らかに導入した配列長に応じたタンパク翻訳量の制御が行われたことが確認された。図中、横軸１−１〜１−１０は、プラスミドの種類を示し、縦軸はプラスミド１−１のタンパク翻訳量を１００とした時の、各プラスミドのタンパク翻訳量を相対値で示す。
【００３３】
実施例２
実施例１と同様にして、次式（６）、（７）、（８）、（９）に示す非翻訳領域の配列を有するプラスミド（２−１）〜（２−４）を作製した。
【００３４】
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGATCTAAGATG  …（６）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGATCTCGTATAATCCTTTTCTTTTCAAGATG  …（７）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGATCTGGGTATCGGAAAGCAAGCCTACGTTGCTCACTATTACGTATAATCCTTTTCTTTTCAAGATG  …（８）
AGCTATACCAAGCATACAATCAACTCCGGATCCGTCGGCCGCGGGAATTCGATCTGGGTATCGGAAAGCAAGCCTACGTTGCTCACTATTACGTATAATCCTTTTCTTTTCAAGATG  …（９）
【００３５】
遺伝子としては実施例１と同様に調製されたヒトＨｓｐ９０βを用いた。作製されたプラスミドの概要を図４に示す。
【００３６】
実施例１と同様にしてウェスタンブロッティング法によりヒトＨｓｐ９０の翻訳量を測定した。なお、ウェスタンブロッティングに用いられた抗体は抗Ｈｓｐ９０マウスモノクローナル抗体（ＳｔｒｅｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社 ＳＰＡ８３０） 抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＤＡＫＯ 社 Ｐ０４４７）である。
この結果、ヒトＨｓｐ９０の転写量は図５に示す通りとなり、導入した非翻訳領域の配列により導入された遺伝子の発現量がコントロールされていることが明らかである。
【００３７】
実施例３
次式（１０）および次式（１１）に示すＤＮＡオリゴマを合成し、以下の方法によりアニーリングを行った。まず酢酸カリウム−ＨＥＰＥＳ緩衝溶液５０μＬ中に該２種オリゴマを２μｇずつ添加し、９５℃で５分加熱した後３０分間かけて除冷し４５℃とした。更にこの溶液からアガロースゲル電気泳動法によりアニールしたオリゴマを分離抽出した。
【００３８】
5’GATCCCTTTTCTTTTCGAATTCTCGTATAATCAGATCTGCTCACTATTAGTCGACGCAAGCCTACG
CCGCGGCGTCGGCTGGGCGGCCGC 3’   …（１０）
5’ GATCGCGGCCGCCCAGCCGACGCCGCGGCGTAGGCTTGCGTCGACTAATAGTGAGCAGATCTGATTATA
CGAGAATTCGAAAAGAAAAGGGATC 3’   …（１１）
【００３９】
なお、このオリゴマの作製においては、実施例１および実施例２において翻訳量の抑制が確認された配列について、複数の制限酵素サイト（ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ）で接続することによって、作製された同一のプラスミドを用いて、導入するコーディング領域のクローニングを行う際に用いる制限酵素サイトを選択することで容易に翻訳量の制御を行うことを可能とすることを想定した設計を行っている。
【００４０】
続いて、実施例１で用いたＰＡＤＨＩおよびターミネータを導入したプラスミドのＰＡＤＨＩを、適切な方法により公知のプラスミドｐＫＴ１０ Ｇａｌ１またはｐＫＴ１０ＧＡＰより得たＧＡＬ１（ガラクトキナーゼ）プロモータ領域またはＧＡＰＤＨ (グリセルアルデヒド−3−フォスフェイトデハイドロゲネース)プロモータ領域に置き換えた。続いてプロモータ領域直後にあるＢａｍＨＩ制限酵素サイトに上述のアニールを行ったオリゴマを挿入した。このようにして作製されるプラスミドの概略は図６に示すとおりである。
続いて更に、挿入されたオリゴマ中の各制限酵素サイトに、公知のプラスミドｐＭＥＬβ２に含まれるＬａｃＺ遺伝子のコーディング配列を適切な手法により導入した。
【００４１】
実施例１に示した方法により、これらのプラスミドを用いた酵母の形質転換体をそれぞれ作製した。作製された酵母を各プラスミドについて３クローンずつ採取し、実施例１に示す方法により培養を行った。培地中の酵母濃度をO.D.600nm 0.3に調製し、各株０．２ｍＬずつ１２ウェルずつ９６ウェルプレートに採取した。９６ウェルプレートごと遠心を行い酵母を沈殿させた後上清を吸引除去し、次の表１に示す各種の培地を２００μLずつ添加することで培地の置換を行った。プレートは３０℃で２４時間静置された後遠遠心沈降により酵母を沈殿させた後上清を吸引除去し、５０マイクロリットルのTriton X-トリス緩衝溶液に再懸濁し、凍結融解することにより細胞からのタンパクの溶出を生じさせた。この後ＯＮＰＧ-リン酸緩衝溶液を添加し３０℃で５分インキュベートした後、遠心し上清１００μLを採取し３６０ｎｍにおいてＯＮＰＧの吸光度変化を測定し、更に残渣を含むプレートを再懸濁し６００ｎｍにおいて観察される酵母濃度（濁度）を測定した。これらよりＬａｃＺ遺伝子にコーディングされるβ-ガラクトシダーゼの発現量を次の数式（１）により見積った。
【００４２】
Ｏ.Ｄ.360nm ／ Ｏ.Ｄ.600nm ＝ β−ガラクトシダーゼ発現量（指標値）  …（1）
この結果、表２に示す発現量の指標値を得た。なお表２は、上式（１０）のＤＮＡオリゴマを用いて作製されたものを用いた結果である。
【００４３】
表２より明らかなように、クローニングを行う制限酵素サイトを選択することにより同一のプロモータにより行われるタンパクの翻訳量を制御することを目的として導入されたこれらの配列について、種々の環境下において、プロモータを入替えた場合に比して非常に安定して系統的な発現量制御が機能していることが明らかであり、本発明の効果が明確に理解される。
【００４４】
【表１】
2005151941.tif 000003
【００４５】
【表２】
2005151941.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】実施例１で作製されたプラスミドの概要を示す図である。
【図２】実施例１で酵母ゲノム上に組み込まれたＤＮＡ断片を調製するためのプラスミドの概要を示す図である。
【図３】実施例１における各プラスミドのＡｈＲ翻訳量を示す図である。
【図４】実施例２で作製されたプラスミドの概要を示す図である。
【図５】実施例２における各プラスミドのヒトＨｓｐ９０の翻訳量を示す図である。
【図６】実施例３でオリゴマを挿入して作製されたプラスミドの概要を示す図である。
【図１】
2005151941.tif 000005
【図２】
2005151941.tif 000006
【図３】
2005151941.tif 000007
【図４】
2005151941.tif 000008
【図５】
2005151941.tif 000009
【図６】
2005151941.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月11日(2004.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005151941000001.app