(57)【要約】【課題】  本発明は有用なリゾチームの製造方法を提供する。【解決手段】  珪藻土、白陶土、沸石又はそれらの混合物を吸着剤として、卵白液またはその希釈液と混合して、リゾチームを吸着させる工程、及び吸着剤からリゾチームを塩類溶液で溶出する工程を含むことを特徴とするリゾチームの製造方法を提供する。前記の珪藻土、白陶土及び沸石がリゾチームを効果よく選択性的に吸着され、かつ塩類溶液で容易に溶出される。本発明の方法によれば、簡易な工程で安価にリゾチームを高回収率で製造することが可能となる。また、吸着されていない卵白液は外来物の汚染なく、そのまま食品加工素材として、安全に利用することが可能となる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
珪藻土、白陶土、沸石又はそれらの混合物を吸着剤として、卵白液又はその希釈液と混合してリゾチームを吸着させる工程、及び該吸着剤に吸着されたリゾチームを塩類溶液で溶出する工程を含むことを特徴とするリゾチームの製造方法。
【請求項２】
前記塩類溶液がNaCl溶液であることを特徴とする請求項１に記載のリゾチームの製造方法。
【請求項３】
前記吸着剤から溶出したリゾチームにさらに結晶精製を行うことを特徴とする請求項１または２に記載のリゾチームの製造方法。
【請求項４】
前記吸着剤から溶出したリゾチームにさらに陰イオン交換樹脂での精製を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載のリゾチームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便で有効なリゾチームの製造方法を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾチームは、食品業界及び医薬業界で広く繁用されている。通常食品の保蔵及び加工によく用いられ、例えば、カキ・エビ等の海産物；豆腐、野菜、魚肉、果物等の生鮮品；寿司、麺類、すり身団子、肉団子、かまぼこなどの加工食品等の食品に用いられている。又、リゾチームはチーズの製造にもよく利用され、プロテアーゼに相当する役割を果たし、牛乳に作用して乳蛋白質（カゼイン）を分解し、凝固させる。
【０００３】
何度も結晶精製、脱塩、乾燥を繰り返し経ることにより、純粋なリゾチームが得られれば、錠剤、顆粒剤、バッカル剤の形に用いられる。例えば：リゾチームは蓄膿症（慢性副鼻腔炎）の傷口などの治療剤として用いられ、又目薬等の医療用品の保存剤として用いられる。
【０００４】
卵白に含まれるリゾチームは約3.5％（乾燥重量比）であり、これがリゾチームを精製
する主な原料である。近年、産業上のリゾチームの精製方法として主に直接結晶法が用いられ（非特許文献1参照）、その方法では、卵白に塩化ナトリウムが約5％になるように添加し、pHを9.5に調整し、少量の晶種を加えてから、4℃下に置いて結晶化させる。そのリゾチームの回収率は約60〜80％である。しかしながら、その方法には回収率が原料の量に著しく影響されるおそれがある。張らの研究（非特許文献２参照）では、700mlの卵白液
を使用し同じ方法で試験を行った結果：1回目の結晶の回収率は43.0％、純化倍数が4.9倍；2回目の結晶回収率は12.4％に低減し、純化倍数が7.9倍；3回目の結晶回収率は11.8％
、純化倍数は9.1倍を示した。又、この文献によると、量が多いほど回収率はかなり低く
、純化倍数も好ましくない。この点を除き、最大の欠点はリゾチームを分離した後、大量の卵白液には高濃度の塩化ナトリウムが含有されるため、再利用することはできないことである。高い含塩量という上記の問題点を解決するため、多くの研究で、超ろ過法でリゾチームの製造を行なう試みがあった。張らの研究（非特許文献２参照）により、1回で超
ろ過と結晶の組み合わせで、回収率は47％、純化倍数が3.0を示した。張らの研究（非特
許文献３参照）では、分子量30,000 Cut-offの膜を用い、超ろ過膜処理した後のリゾチーム回収率が96％であり、純化倍数が6倍しかないため、純化効果は好ましくないと指摘さ
れた。その上、超ろ過法の最大の欠点はろ過膜が塞がれやすく、大量生産を阻むことであった。
【０００５】
なお、吸着剤を用いリゾチームを純化する研究にも、Aldertonら（非特許文献４参照）は、ベントナイト（bentonite）がリゾチームを吸着する特性を有することを発見したが
、その溶出は困難であり、5％酢酸ピリジン溶液にしか溶出できないため、産業上の利用
に適さない。
【０００６】
本発明者は上記の問題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、珪藻土、白陶土と沸石がリゾチームに対し、優れた選択的吸着性を有し、又吸着されたリゾチームが容易に塩類溶液で溶出されることを発見した。その上、吸着されない卵白液は元の卵白原液と同じ加工特性を保ち、外来物の汚染がなく、完全に利用性を保持することができることを発見し、遂に本発明を完成した。
【非特許文献１】Alderton,G.and Fevold, H.L.Direct crystallization of lysozyme from egg white and same crystalline of lysozyme.J.Biol.CHem.104：1（1946）
【非特許文献２】張珍田など。超ろ過法卵白のリゾチームの純化する研究。中国農業化学会談、24（1）：86（1986）、台北
【非特許文献３】Chiang, B.H., et al, Egg White lysozyme purification by ultrafiltration and affinity Chromatography. J. Food Sci. 58（2）：303（1993）
【非特許文献４】Alderton, et al. Isolation of lysozyme from egg white. J. Biol. Chem. 157：43（1945）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、有用なリゾチームの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によるリゾチームの製造方法は、珪藻土、白陶土、沸石又はそれらの混合物を吸着剤として、卵白液又はその希釈液と混合してリゾチームを吸着させる工程、及び該吸着剤に吸着されたリゾチームを塩類溶液で溶出する工程を含むことを特徴としている。
【０００９】
前記塩類溶液はNaCl溶液が好ましい。
【００１０】
前記吸着剤から溶出したリゾチームにさらに結晶精製を行うことが好ましい。
【００１１】
前記吸着剤から溶出したリゾチームにさらに陰イオン交換樹脂での精製を行うことが望ましい。
【００１２】
〔発明の具体的説明〕
リゾチームの製造方法に関する本発明は、珪藻土、白陶土、沸石又はそれらの混合物を吸着剤として、卵白液又はその希釈液と混合してリゾチームを吸着させる工程、及び吸着剤に吸着されたリゾチームを塩類の溶液で溶出する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明で使用する卵白液は、特に限定されず、リゾチームを含有する食用飼鳥類（poultry）の卵であれば、いずれも使用できる。入手する容易さによって、家禽類の卵白が好
ましい。より好ましいのは鶏と鴨の卵白であり、さらに好ましいのは鶏の卵白である。使用する卵白は希釈せずに直接用いてもよく、希釈してから用いてもよい。一般に１〜５倍に希釈して使用する。
【００１４】
本発明で使用する珪藻土、白陶土、沸石等のリゾチーム吸着剤は、単独に使用してもよく、二種類以上を混合して使用してもよく、特に限定されない。
【００１５】
本発明で使用する吸着剤からリゾチームを溶出する塩類溶液は特に限定されない。安全性があれば、いかなる塩類の溶液でも使用できる。好ましくはナトリウムとカリウムの塩類の溶液で、さらに好ましくはナトリウムの塩類溶液である。具体的には、例えば、NaClとＫClの溶液等が挙げられる。
【００１６】
分析方法
1．タンパク質の吸着率（％）の測定：
卵白液を適宜に希釈してU-1100分光光度計（日立株式会社製）で280nmの吸光度（A280
）を測定し、そのA280の相対値でタンパク質の吸着率（％）を計算する。
【００１７】
2．タンパク質濃度の測定：
Lowry法によって測定する。
【００１８】
A液：Na2CO3（10g）とNaHCO3（2g）の500ml水溶液。
【００１９】
Ｂ液：CuSO4・5H2O（16g）とクエン酸ナトリウム（2.3g）の200ml水溶液。
【００２０】
Ｃ液：50mlのA液と1mlのＢ液の混合液。
【００２１】
Folin−Ciocalteusフェノール試薬：使用する前、2倍の容積の蒸留水で希釈する。
【００２２】
適当に希釈したサンプル液0.2mlを取り、1mlのＣ液を加え、均一に混合した後、室温下で30分間反応させ、さらにFolins溶液0.1mlを添加し、室温下で60分間反応させて、650nmの吸光値を測定し、標準曲線に基づいてサンプル液中のタンパク質含量を求める。
【００２３】
標準曲線は50〜400μg／mlの牛血清アルブミンを標準溶液として作成した。
【００２４】
3．リゾチームの活性測定：
Micrococcus lysodeikticus菌体を0.067Ｍリン酸（20mg／100ml,pH6.3）バッファ溶液
中に懸濁させ、該菌液2.97mlを取り石英セルに入れ、3ml試料液を添加して均一に混合さ
せたあと、室温で波長450nmでの吸光度の変化を測定する（30秒ごとに記録し、20分間継
続）。
＊1 unit（U）のリゾチーム活性は上記の条件下で、1分間で菌体懸濁液の吸光値0.001単
位を低減させる酵素量を1 unitと定義する。
【００２５】
【数１】
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【００２６】
4．SDS-PAGE分析
分離ゲル用のゲル濃度は15％、Stacking gel用のゲル濃度は4％とする。10μl試料液（濃度は約4mg／ml）に10μlバッファ試液〔註（1）〕及び4μlのトラッキング染料溶液〔
註（2）〕を加えて、100℃で5分間加熱した後、室温まで冷却して電気泳動を行う。ゲル
中のタンパク質はCoomassie Brilliant Blue Rで染色し、ゲルは酢酸／メタノール／水（10：20：70）を用いて、バックグランドが透明になるまで脱色させる。
【００２７】
次に乾燥して保存する。
【００２８】
註（1）：SDS-PAGEバッファ試液（2×）
Tris（Trizma Base,125mM×2）            3.0mg
EDTA-2Na（2mM×2）                      14.8mg
SDS（2％×2）                           4.0mg
2−メルカプトエタノール（5％×2）       10.0ml
80ml水を加えて溶かし、pH6.8になるまで調整して、100mlになるまで水を加える。2倍
に希釈してから用いる。
【００２９】
註（2）：トラッキング染料溶液：
ブロモフェノールブルー約1mg（適宜）を5ml水に溶かし、5mlグリセリンを加えて、
均一に混合する。
【００３０】
5．吸着されない卵白の加工機能性の測定：
（A）タンパク質発泡力及びバブル安定性の測定：
吸着されない卵白液50mlを容量100mlメスシリンダーに入れ、パラフィン紙に封じ込ん
で、1分間垂直振動させ（約2回／秒）、そのバブル体積（ml）すなわち発泡力（foam expansion）を測定する。そのまま30分間置き、再びバブル体積を測定し、残留した体積と元の体積との比（パーセンテージ）でそのバブル安定性を示す。
（B）卵白乳化安定性の測定：
吸着されない卵白液25mlを容量50mlメスシリンダーに入れ、大豆油25mlを加え、12,000rpmで１分間ホモジナイスした後、直ちに水層の高さ（Mo）を測定し、次いで30分間放置
した後、再び水層の高さ（Mt）を測定する。下式により、その乳化安定性を計算する。
【００３１】
【数２】
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【発明の効果】
【００３２】
本発明において使用される珪藻土、白陶土と沸石が吸着剤として、リゾチームの吸着に対して優れた選択性を有し、リゾチームの製造を簡便、かつ有効なものにできる。卵白を原料として上記3種類の吸着剤を用いてリゾチームを製造する場合、比活性が17倍以上に
高まり、リゾチームの回収率も高く（珪藻土：約80％以上、白陶土：約90％以上、沸石：50%以上）なることが明らかとなった。さらに結晶化処理又はイオン交換樹脂での精製に
よってSDS-PAGE分析に単一バンドを呈する純化リゾチームを製造することができる。
【００３３】
（実施例及び実験例）
以下に本発明を実施例及び実験例に基づいてさらに詳細に説明する。これらの実施例などは、いかなる意味においても本願発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３４】
卵白液を蒸留水で5倍希釈して、撹拌して混合した後、多層ガーゼを用いてろ過させ、
粘性塊物質を除去した。100ml卵白希釈液（4個）にそれぞれ5gのベントナイト、珪藻土、白陶土または沸石（すべてシグマ社の商品）を添加し、室温で30分間処理させ、間欠的に振とうして混合させた。遠心（1000g×5min）して上清液を分離した。上清液及び卵白原
液のリゾチーム活性と280nmの吸光度を測定した。測定値によって、タンパク質の吸収率
、リゾチーム活性の吸着率及び吸着されたリゾチームの理論的な純化倍数を算出した。その結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
表１の結果により、ベントナイトはリゾチームに対する優れた吸着性を有するが、リゾチーム以外のタンパク質に対する吸着力も強いために、あまり好ましくない。また吸着されたそのタンパク質のリゾチームの比活性は僅か1.89倍までしか上昇しない。対照的に、珪藻土、白陶土及び沸石に吸着したタンパク質はほとんどリゾチームであり、それらの比活性はそれぞれ26.88倍、16.72倍、12.20倍に上がり、それら3種類の吸収剤がリゾチーム吸着に対して優れた選択性を有することが判明した。すなわち、上記3種類の吸着剤が、
リゾチームの製造に有効利用できる。
【実施例２】
【００３７】
5倍に希釈した卵白液100ml（4個）を取り、それぞれ5gのベントナイト、珪藻土、白陶
土及び沸石を添加し、実施例1と同様にして吸着処理を行った。その上清液のリゾチーム
活性を測定して、吸着されたリゾチームのパーセンテージを算出した。なお、遠心分離して沈澱した各吸着剤からそれぞれ100mlの1 M NaClでリゾチームを溶出して（室温、75rpm振とう30分間）溶出液のリゾチーム活性を測定した。各吸着剤の吸着したリゾチームの回収率及び吸着剤からのリゾチームの溶出率を算出した。その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
表２の結果により、ベントナイトはリゾチームに対する吸着力が強いが、1 M NaClでリゾチームを溶出できない。本発明で使用した珪藻土、白陶土及び沸石等の吸着剤で吸着されたリゾチームは容易に溶出された。溶出率はそれぞれ82.23％、90.70％、及び96.40％
であった。
【実施例３】
【００４０】
5倍に希釈した卵白液100ml（複数個）に、それぞれ1g、2g、3g、4gまたは5gの珪藻土あるいは白陶土、あるいは2g、4g、6g、8gまたは10gの沸石を添加する以外は、実施例1と同様にして実験を行った。遠心して上清液を分離し、各吸着剤に吸着されたリゾチームを1 M NaCl 100mlで溶出させた（75rpm,30min,25℃）。その溶出液のリゾチームの活性回収率を測定した。結果を図1に示す。図1によると、各々5倍に希釈した100ml卵白液に対して、珪藻土あるいは白陶土の使用量が4gだけでリゾチームの回収率がほぼ100％であり（すな
わち、卵白原液の吸着剤に対する比率が10：1であった）、沸石の使用量が8g以上になる
と、リゾチームの回収率は最大の50%程度になった（すなわち、卵白原液の吸着剤に対す
る好適比率は5：1であった）。
【実施例４】
【００４１】
5倍に希釈した卵白液100ml（複数個）を取り、それぞれ4gの珪藻土、白陶土及び8gの沸石を添加して、実施例3と同様に吸着及び溶出処理を行った。但し、その後、使用した溶
出液はそれぞれ異なる濃度のNaCl溶液に変更した。すなわち、それぞれ蒸留水、0.25M、0.50Ｍ、0.75M及び1.00MのNaCl溶液でリゾチームを溶出した。溶出液中のリゾチームの回
収率を測定した。その結果を表３に示す。表３の結果によると、1MのNaCl溶液で、吸着されたリゾチームの大部分が回収できる。珪藻土、白陶土及び沸石を使用したゾチームの活性回収率はそれぞれ86.01％、90.12％及び51.69％であった。
【００４２】
【表３】
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【実施例５】
【００４３】
5倍に希釈した卵白液にそれぞれ8gの珪藻土、8gの白陶土及び16gの沸石を添加し、Shaker（75rpm）で30分間混合した。遠心（1000g×5min）により分離して、上清液を除去した。沈澱を150mlの水で水洗して、遠心によって水洗液を除去した。沈澱を1M NaCl 150mlを用いて、タンパク質の溶出を3回繰り返し、遠心によって溶出液を回収した。タンパク質
含量及びリゾチーム活性を測定し、同時に電気泳動分析を行った。
【００４４】
純化結果を表4に示す。珪藻土、白陶土及び沸石を吸着剤とするリゾチームの回収率は
それぞれ82％、98％、54％であった；純化倍数はそれぞれ17.05倍、19.91倍及び20.85倍
であった。これらの吸着剤は優れた純化効果を有することを示している。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
上記3種類の吸着剤を用いて、純化されたリゾチームのSDS-PAGE分析の結果を図2に示す。図2の1番サンプルは卵白液を示す分析結果であり、そのSDS-PAGE図には43Kdに近いバンドを主成分としており、14.4Kdに近いところにあるリゾチームはほとんどバンドを現わさず、すなわち、卵白液中のリゾチーム含量は極めて少ないことを表わす。2、3及び4番サ
ンプルはそれぞれ珪藻土、白陶土及び沸石で精製したもののSDS-PAGE分析結果であり、すべて14.4Kd付近にあるリゾチームのバンドを主成分とし、元の43Kd近くに存在した主成分が微量になった。これらの結果により、上記の種類の吸着剤がリゾチームに対して優れた選択性を有することが明らかになった。
【実施例６】
【００４７】
吸着剤として白陶土を用い、実施例5と同様にしてリゾチームを製造した。次に、以下
の方法により、さらにイオン交換樹脂の精製処理またはリゾチームの結晶精製処理を行った。
（1）イオン交換樹脂の精製処理：
イオン交換樹脂（Amberlyst A-207,OH-型、（株）オルガノ、日本）1gを蒸留水でpHが8〜9になるまで水洗し、実施例5において白陶土で吸着精製した酵素液10mlを添加し、室温下で1時間混合した。上清液を分取し、タンパク質含量及びリゾチームの活性を測定し、
同時に電気泳動分析をした。
（2）リゾチームの結晶精製処理：
実施例5において白陶土で吸着して1M NaClで溶出した溶液を分子量30,000のろ過膜でpHが9.5になるまで調整し、少量の結晶リゾチームを加えて、4℃下で数日（4−5日）置き、結晶を生成した後、遠心処理でリゾチームを集めて、タンパク質含量及びリゾチーム活性を測定した。
【００４８】
それぞれ処理前後のサンプルのタンパク質含量及びリゾチーム活性を測定し、その比活性、純化倍数及びリゾチームの回収率を計算した。それらの結果を表5に示す。その結果
によると、上記2つの処理ともリゾチームをさらに純化することができ、その純化倍数は27〜28倍まで高められることを示している。
【００４９】
上記の純化したリゾチームについてSDS-PAGE分析を行い、結果を図3に示した。その結
果によると、上記イオン交換樹脂処理あるいは結晶化処理を経たリゾチームが、市販品の純化リゾチーム（（株）シグマ）と同様に単一バンドを呈した。これらの結果によると、上記純化した2種類のものとも純化リゾチームであることを示している。
【００５０】
【表５】
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【実施例７】
【００５１】
卵白の希釈倍数のリゾチーム製造への影響
卵白液20g（3個）をそれぞれ蒸留水で1倍（希釈なし）、3倍及び5倍に希釈した。各卵
白液に白陶土5g（（株）シグマ）を添加して30分間混合した。遠心分離（1000rpm×10分
間）によって卵白液を除去した。蒸留水200mlを用いて沈澱物を洗い、遠心で洗液を除去
した。沈澱物に4％塩化ナトリウム溶液60mlを加え、撹拌して、遠心分離で溶出液を集め
た。各溶出液のリゾチームの比活性、純化倍数及び回収率を測定した。結果を表６に示す。純化倍率はいずれも18倍以上、回収率は90％以上であった。そのSDS-PAGE分析結果を図4に示す。
【００５２】
【表６】
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【実施例８】
【００５３】
塩化カリウム溶液でリゾチームを溶出する効果
上記卵白液20gを蒸留水で3倍に希釈した後、4%塩化カリウムを溶出液とした以外は、実施例7と同様にして行った。その結果、リゾチームの純化倍数が19.8倍、回収率が95.4%であった。そのSDS-PAGE分析結果を図4に示す。
【００５４】
（実験例1）
本発明において使用する3種類の吸着剤で処理した3種類の卵白液と卵白原液（比較組と
する）を上記の方法によりそれらの加工機能性（すなわち発泡力、バブル安定性及び乳化安定性）を測定した。その結果を表７に示す。表７の結果によると、上記本発明方法で吸着処理した後の卵白液は、依然として優れた加工機能性を持っている。
【００５５】
なお、本発明が用いる吸着剤は、食品加工上、適法の添加剤であり、そうした等吸着剤に吸着処理した卵白液であっても、依然として安全に利用できる。すなわち、塩類又は他の添加剤を添加しないため、食品原料として幅広く利用できる。
【００５６】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】リゾチーム回収率に対する3種類の吸着剤の使用量の影響を示す。
【図２】卵白原液及び3種類の吸着剤の処理で得られたもののSDS-PAGE分析結果を示す。  Ｍ：標準タンパク質  1：卵白液  2：卵白液が珪藻土の処理で得られたもの  3：卵白液が白陶土の処理で得られたもの  4：卵白液が沸石の処理で得られたもの
【図３】本発明方法によって得られたリゾチームのSDS-PAGE分析結果を示す。  Ｍ：標準タンパク質  1：リゾチーム標準品（Sigma Co．）  2：卵白原液  3：卵白液が白陶土の処理で得られたもの  4：前記3のものがさらに結晶処理で得られたもの  5：前記3のものがさらに陰イオン交換樹脂処理で得られたもの
【図４】卵白原液及び本発明方法で得られたリゾチームのSDS-PAGE分析結果。  Ｍ：標準タンパク質  1：卵白原液  2：卵白液を白陶土に吸着させた後、4％NaClで溶出したもの  3：3倍で希釈した卵白液を白陶土に吸着させた後、4％NaClで溶出したもの  4：5倍で希釈した卵白液を白陶土に吸着させた後、4％NaClで溶出したもの  5：3培で希釈した卵白液を白陶土に吸着させた後、4％KClで溶出したもの
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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