(57)【要約】【課題】  無細胞蛋白質合成系における蛋白質の大量製造法の提供。【解決手段】  無細胞系蛋白質合成系によりポリリン酸を添加することを特徴とする蛋白質の製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞蛋白質合成系にポリリン酸を添加することを特徴とする蛋白質の製造法。
【請求項２】
ポリリン酸の添加量が、無機リン酸換算で１〜２００mMとなる量である請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項３】
さらにマグネシウムイオンを添加するものである請求項１又は２記載の蛋白質の製造法。
【請求項４】
さらにマグネシウムイオンとポリリン酸代謝酵素を添加するものである請求項１又は２記載の蛋白質の製造法。
【請求項５】
無細胞蛋白質合成系が、大腸菌由来の系である請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項６】
無細胞蛋白質合成系が、翻訳因子、アミノアシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNAホルミル転移酵素、転写酵素、リボソーム、アミノ酸、tRNA、エネルギー源及びエネルギー再生系が含まれているものである、請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項７】
エネルギー再生系として、ホスホエノールピルビン酸・ピルビン酸キナーゼ系もしくはクレアチンリン酸・クレアチンキナーゼ系が使用されている請求項１記載の蛋白質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞蛋白質合成系における蛋白質の大量調製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム研究として最近は、蛋白質の基本構造と分子機能の網羅的な解明、いわゆるプロテオミクス研究がさかんとなっている。そのためには、目的とする蛋白質の試料が必要であり、組換えDNA技術による蛋白質の大量調製法は欠く事のできない技術である。一般には、大腸菌、酵母、培養細胞などの生細胞を用いる発現系が利用されているが、生細胞は自己の細胞機能を維持するために外来蛋白質を排除する傾向が強いため、発現が困難な蛋白質も多い。
【０００３】
無細胞蛋白質合成系は、生体の遺伝情報翻訳系を人工容器内に取り揃え、設計したmRNAもしくはDNAを添加し、目的の蛋白質を効率良く合成しようとするもので、生細胞における生体維持機構の制約を受けにくく、生細胞の発現系が抱える問題を解決できる有望な手法と期待されている。また、無細胞蛋白質合成系は、mRNAあるいはテンプレートDNAを添加するだけで直ちに目的蛋白質が合成されるため、生細胞を用いる発現系に必要な形質転換、培養、回収、抽出というような工程が不要となり、迅速に目的蛋白質の発現、精製が可能となる利点も有している（特許文献１〜３）。
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【特許文献２】特開２０００−１７５６９５号公報
【特許文献３】特開２００３−１０２４９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、無細胞蛋白質合成系には、蛋白質合成量が少ないという致命的な欠点があった。そのため、反応系自体の改良とともに、反応方法の改良も検討され、蛋白質合成量も向上しているが、未だ十分の合成量とは言えない。
【０００５】
また、蛋白質の合成には、アデノシン５’−トリリン酸（ATP）やグアノシン５’−トリリン酸（GTP）などのエネルギーが不可欠であり、そのエネルギー再生のためにはホスホエノールピルビン酸・ピルビン酸キナーゼ系やクレアチンリン酸・クレアチンキナーゼ系が使用されているが、いずれのリン酸供与体も化学的に不安定で、また高価な化合物であり、コストの安い効率的なエネルギー再生系の適用が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、従来の無細胞蛋白質合成系に、化学的に安定で、かつ安価なポリリン酸を添加することで、蛋白質合成量が増大し、さらにこれにマグネシウムイオン及び／又はポリリン酸代謝酵素を添加することでその合成量はさらに増大することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、無細胞蛋白質合成系にポリリン酸を添加することを特徴とする蛋白質の製造法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、無細胞蛋白質合成系において、単純にポリリン酸を添加するだけで蛋白質の合成量は増大し、安価で実用的な無細胞蛋白質合成系を可能ならしめることができる。
また、ポリリン酸単独以外にも、ポリリン酸とマグネシウムイオンとの併用、あるいはポリリン酸とマグネシウムイオンとポリリン酸代謝酵素との併用により蛋白質の合成量を更に増加させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、従来の無細胞蛋白質合成系において、ポリリン酸を添加することを特徴とする蛋白質の大量調製法に関するものである。
【０００９】
本発明で使用する無細胞蛋白質合成系は、大腸菌由来の系が好適であり、公知の方法（Kurland, C. G., Cell, 28, 201-202 (1982), Roberts, B. E. and Paterson, B. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2330-2334 (1973), Spirin, A., et al., Science, 242, 1162-1164 (1988), 木川ら, 蛋白質・核酸・酵素, 44, 294-301 (1999), 木川ら, 蛋白質・核酸・酵素, 47, 1014-1019 (2002)）で調製することができる。また、すでに市販されている大腸菌由来の無細胞蛋白質合成キットを使用することも可能である。市販の無細胞蛋白質合成キットとしては、例えばPURESYSTEM(ポストゲノム社製)、RTS100システム(ロッシュ・ダイアグノスティック社製)、大腸菌S30抽出画分システム（E. coli S30 Extract System） (プロメガ社製)等が挙げられる。
【００１０】
本発明におけるポリリン酸は、市販されているものを使用することができる。使用濃度は、無機リン酸換算で0.1mM以上、好ましくは１mMから２００mMの濃度になるように合成系に添加すればよい。なお、ポリリン酸の重合度は特に制限されず、４以上のもの、好ましくは１０以上のものを用いればよい。
【００１１】
またポリリン酸に加えてマグネシウムイオンを添加すれば、蛋白質合成量はさらに増大する。マグネシウムイオンとしては、合成系内でマグネシウムイオンを生成するものであれば良く、具体的には塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩が挙げられる。マグネシウム塩の添加量は、添加するポリリン酸濃度に応じて適宜決定されるが、たとえばポリリン酸濃度と等量〜１／１００量程度の範囲内から選定するのが好ましい。ポリリン酸とマグネシウム濃度は、種々の濃度で添加試験を行い、最適化することができる。
【００１２】
また、本発明においては、ポリリン酸とマグネシウムイオンに加えて、ポリリン酸代謝酵素を添加することにより、さらに蛋白質合成量の増大を図ることもできる。本発明で使用するポリリン酸代謝酵素とは、ポリリン酸をリン酸供与体としてヌクレオチドをリン酸化する活性を有する酵素であり、具体的にはポリリン酸キナーゼ（PPK）やポリリン酸：アデノシン５’−モノリン酸（AMP）リン酸転移酵素（PAP）が例示される。PPKは、ポリリン酸をリン酸供与体としてヌクレオシド５’−ジリン酸をリン酸化して生体内エネルギー供与体であるアデノシン５’−トリリン酸（ATP）を初めとするヌクレオシド５’−トリリン酸を合成する活性を有しており公知の方法で調製できる（J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (1992), Biosci. Biotech. Biochem., 62, 1594-1596 (1998)）。また、PAPは、ヌクレオシド５’−モノリン酸（AMP）をリン酸化し、アデノシン５’−ジリン酸（ADP）を初めとするヌクレオシド５’−ジリン酸を生成する活性を有し、公知の方法で調製できる（J.Bacteriol., 173, 6484-6488(1991), Appl. Environ. Microbiol., 66, 2045-2051(2000), J. Biosci. Bioeng. 91, 557-563(2001)）。ポリリン酸代謝酵素は、0.001ユニット/mL以上、好ましくは0.1ユニット/mL以上無細胞蛋白質合成系に添加すればよい。
【００１３】
本発明の無細胞蛋白質合成法は、通常の無細胞蛋白質合成系にポリリン酸及び必要によりマグネシウムイオンおよび／またはポリリン酸代謝酵素を添加すればよい。すなわち、目的とする蛋白質をコードするテンプレートDNAもしくはmRNAを準備する。市販の無細胞蛋白質合成系には、翻訳因子である開始因子、伸長因子、終結因子、アミノアシルtRNA合成酵素、メチオニルtRNAホルミル転移酵素及び転写酵素が含まれている。また、リボソーム、アミノ酸、tRNA、エネルギー源、エネルギー再生システム等も含まれているため、市販の無細胞蛋白質合成系にポリリン酸、及び必要に応じてマグネシウムイオンおよび／またはポリリン酸代謝酵素を添加し、テンプレートDNAを添加するだけで所望の蛋白質が合成できる。反応は、通常２５〜40℃で30分〜２４時間程度で十分である。反応終了後は、限外濾過、クロマトグラフィー処理等により目的蛋白質を精製分取することができる。なお、テンプレートDNAは、プラスミドを用いてもよく、またPCR産物を用いてもよい。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。
【００１５】
材料：
大腸菌粗抽出液を用いた無細胞蛋白質合成系として、大腸菌S30画分及びそれを用いた無細胞蛋白質合成系であるプロメガ社E. coli S30 Extract System for Linear Templateを用いた。このシステムには、大腸菌S30画分以外に、 転写、翻訳反応に必要なコンポーネントを含むS30 Premix（T7 RNA polymerase, 各種リボヌクレオチド、各種tRNA、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、塩類）とアミノ酸混合液が添付されており、それをそのまま使用した。また、この他の大腸菌粗抽出液を用いた無細胞蛋白質合成系として、ロッシュ・ダイアグノスティック社のRTS100システムを用いた。さらに、転写・翻訳に必要な高純度の精製蛋白質から構成されている無細胞蛋白質合成系としては、ポストゲノム社製のPURESYSTEMクラッシックを使用した。ルシフェラーゼ活性はBright Gro（プロメガ社製）を用いて、そのプロトコールに従って測定した。
【００１６】
ルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpIVEX-lucは以下の方法により調製した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpGEM-luc（プロメガ社製）を鋳型として、合成オリゴプライマー（5'-catgccatggaagacgccaaaaacataaag-3', 5'-aactgcagttacattttacaatttgga-3'）を用いてPCRによりルシフェラーゼ遺伝子のコーディング部分を増幅した。この増幅断片の末端をNcoI, PstIで切断し、pIVEX2.4a（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）のNcoI, PstI部位に挿入した。上記プラスミドDNAの調製、制限酵素による切断、T4DNAリガーゼによるDNA連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning II」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、及びＤＮＡポリメラーゼ、T4DNAリガーゼなどのDNA関連酵素はすべて宝酒造（株）より入手した。またルシフェラーゼ mRNAの調製は上記組換えプラスミドpIVEX-lucをHindIIIで切断することによって直線化し、Klenow fragmentを用いて平滑末端化したものを鋳型として、RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System（プロメガ社製）を用いて行った。また合成された該mRNAは、SV Total RNA Isolation System（プロメガ社製）を用いて精製した。反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離にはトーソー（Tosoh）社製のODS-120Tカラム(4.6 mm I.D. × 250 mm)を使用して、溶出液として30 mM ジエチルアミノエタノール、20 mM リン酸、2% w/v メタノールを用い、1 mＬ/minの流速で行った。検出は260 nmの吸光度をモニターリングすることによった。またすべての実施例において用いたポリリン酸（ポリリン酸ナトリウム）のモル濃度はリン酸残基あたりで示した。
実施例における酵素は以下に記載された方法で調製した。
（１）Acinetobacter johnsoniiのＰＡＰの調製
１−１：Acinetobacter  johnsonii  210A株のＰＡＰ遺伝子のクローニング
Ａ.  大腸菌ポリリン酸キナーゼ及び放射性標識ポリリン酸の調製
文献（J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)）に記載された方法で大腸菌ポリリン酸キナーゼを調製した。さらに調製した大腸菌ポリリン酸キナーゼを用いて秋山らの方法（J. Biol. Chem., 268, 633-639 (1993)）に従い放射性標識ポリリン酸を調製した。
【００１７】
Ｂ． Acinetobacter johnsoniiゲノムライブラリーの作製とスクリーニング
Acinetobacter johnsonii 210A株をLB培地に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。遠心分離により菌体を回収し、染色体DNAを精製した。Acinetobacter johnsonii染色体DNAを制限酵素 Sau3AIで部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心により分画し、約7-10Kbの画分を回収した。該DNA断片とBamHIで切断したプラスミドベクターpBlueScript SK(+)（東洋紡より購入）をT4 DNA ligaseにより連結し、該DNA液を用いて大腸菌JM109株（宝酒造より購入）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体 6000株を単離し、８ずつグループ化した。
【００１８】
各グループをLB培地で37℃で一晩培養し、遠心分離により菌体を回収後20mM Tris-HCl(pH8.0)で菌体を洗浄し、同緩衝液で菌体を再懸濁した。菌体懸濁液に等量のBugBuster（宝酒造より購入）を加え、室温で30分放置して溶菌させたのち、3倍容の20mM Tris-HCl(pH8.0)を加えて、菌体抽出液とした。
【００１９】
先に調製した放射性標識ポリリン酸（リン酸として0.24mM）を含有する活性検出液（50mM Tris-HCl(pH8.0), 40mM (NH4)2SO4, 4mM MgCl2,1mM AMP）20μLに菌体抽出液1μLを加え、37℃で1時間反応させた。該反応液を薄層クロマトグラフィー（展開液：0.75M KH2PO4(pH 3.5)）にかけ、ホスホイメージアナライザーBASS2000（Fujix製）でADPの生成を検出することで、得られた形質転換体のスクリーニングを行い、6000株中１クローンにPAP活性が検出された。
【００２０】
得られたクローンより、Acinetobacter johnsonii 210A株のＰＡＰ遺伝子（図１）が挿入されたプラスミドｐＰＡＰ２を得た。なお、プラスミドｐＰＡＰ２は、約10ｋｂのAcinetobacter johnsonii 210A株の染色体DNAが挿入されており、プラスミドDNA(pPAP2)の表記で、平成14年（2002）５月21日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号としてFERM BP-8047を与えられている。
【００２１】
１−２：Acinetobacter johnsonii由来 PAPの調製
プラスミドｐPAP2を保持する大腸菌JM109菌をアンピシリンを100μg/mL含有する2xYT培地で28℃で一晩培養した。遠心分離により菌体を回収し、50mM Tris-HCl（pH 7.8）,1mM EDTAからなる緩衝液に懸濁し、超音波処理後、遠心分離により菌体抽出液を回収した。該抽出液をDEAEトヨパール650M（トーソー）によるイオン交換クロマトグラフィー（溶出液：50mM Tris-HCl(pH 7.8), 0〜0.5M NaClの濃度勾配）で分画することで、PAPを部分精製し、回収された画分を酵素標品とした。なお、該画分におけるPAPの比活性は、80.5ユニット／ｍｇ蛋白質であった。ただし、１単位（ユニット）とは、37℃で１分間に１μmoleのＡＤＰを生成する活性を示し、以下の条件で測定する。
【００２２】
＜測定条件＞
１００mM塩化マグネシウム、10mM AMP、及びポリリン酸（無機リン酸として30mM）を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.8)に酵素標品を添加して、37℃で保温することで反応を行い、100℃、１分間の熱処理により反応を停止させ、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて反応液中のADPを定量する。
【００２３】
実施例１：PURESYSTEMを用いた無細胞蛋白質合成におけるポリリン酸とマグネシウムの最適濃度での組み合わせの効果
転写・翻訳に必要な高純度の精製蛋白質から構成されているPURESYSTEMクラシック（ポストゲノム社製）を用いて、翻訳反応に対するポリリン酸とマグネシウムの効果をみた。PURESYSTEMクラシックの反応系には精製したリボソーム、20種類のアミノアシルtRNA合成酵素、IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts、RF1、RF3、RRF、methionyl-tRNA transformylase、T7 RNA polymerase、46種のtRNA、NTP、クレアチンリン酸、10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid、20種のアミノ酸、クレアチンキナーぜ、ミオキナーゼ、ヌクレオチドジリン酸キナーぜ、ピロフォスファターゼが含まれている（Nature Biotech. 19:751-755, 2001）。ポリリン酸とマグネシウムの組み合わせが翻訳に関与するこのシステムに含まれる酵素群に直接作用するものであるかどうかを確認することができる。
【００２４】
無細胞蛋白質合成におけるポリリン酸とマグネシウムの最適濃度での組み合わせの効果を調べる目的で以下の実験を行った。
【００２５】
方法：
PURESYSTEMクラシック（ポストゲノム社製）soln. A, 14.0 μL、soln. B, 2.0 μLに鋳型としてin vitroで合成したルシフェラーゼ遺伝子のmRNAを1.54 μg混合し、これを基本的な反応系とした。この反応液に表１に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、各種濃度の塩化マグネシウムを加え、基本反応系に対するその影響をみた。反応は37℃で３時間反応を行い、反応系全体の体積は20.0 μLであった。
【００２６】
【表１】
2005151802.tif 000002
【００２７】
上表それぞれの反応系中で生成されたルシフェラーゼ量は、反応液の10倍希釈液2 μL中の活性をBright Gro（プロメガ社製）中の測定溶液10 μLと混合することによってその発光量をルミノメーターで測定することにより評価した。
【００２８】
合成量の比較はPURESYSTEMクラシックのみの反応系1Aでの生産量を１として見積もった。反応系1Aにポリリン酸を終濃度15 mMになるように加え、さらに塩化マグネシウムを０〜12.5 mM加えた時に（反応系1B〜1I）、マグネシウム濃度が増加するにつれて合成量も増加し、5 mM加えた時（反応系1F）に1.68倍となって最高値を示した。この結果から、ポリリン酸の添加による合成活性の上昇は反応液中のマグネシウム濃度に大きく依存することがわかった。またこの現象は塩化マグネシウムの代わりに酢酸マグネシウムを用いた時も同等であり、マグネシウム自体の影響であるといえる。このことから、ポリリン酸は適量のマグネシウム存在下でmRNAの翻訳を促進することが明らかになった。
【００２９】
実施例２：大腸菌S30画分を用いた無細胞蛋白質合成系（プロメガ社製）に対するポリリン酸とマグネシウムの最適濃度での組み合わせの効果
プロメガ社製大腸菌S30画分を用いて、ポリリン酸とマグネシウムの組み合わせによる無細胞系での蛋白質合成促進を確認する目的で、種々の濃度の塩化マグネシウムの添加による蛋白質合成量の影響をみた。基本的な反応系は、大腸菌S30画分（プロメガ社製）15 μLにS30 premix（プロメガ社製）20 μL、アミノ酸混合液５ μL、ルシフェラーゼ遺伝子を鋳型としてルシフェラーゼ遺伝子を含む環状プラスミドDNA、pIVEX-luc(0.857 μg)を混合したものを用いた。この反応液に表２に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、塩化マグネシウム及び精製したＰＡＰを加え、ルシフェラーゼ合成に対するマグネシウム濃度の影響をみた。反応は37℃で1.5時間行い、反応系全体の体積は50 μLであった。
【００３０】
【表２】
2005151802.tif 000003
【００３１】
上表それぞれの反応系中で生成されたルシフェラーゼ量は、反応液の10倍希釈液2 μL中の活性をBright Gro（プロメガ社製）中の測定溶液10 μLと混合することによってその発光量をルミノメーターで測定することにより評価した。
【００３２】
結果：
それぞれの反応系におけるルシフェラーゼ生産量を図２に示した。S30にプロメガ社で最適化されたエネルギー再生系等(S30 Premix)を含む反応系（反応系２A）でのルシフェラーゼ合成量を１とすると、反応系２Ｂに塩化マグネシウムを0〜1.25 mMとPAPを加えた時（反応系2B〜2D）では合成量は1.45〜1.67倍で増加傾向がみられ、2.5 mM加えた時（反応系2E）に2.15倍となって最高値を示した。しかしながら、この濃度以上の塩化マグネシウム存在下（反応系2F〜2G）では合成量が再び減少し、５mMで1.72倍、10 mMでは0.3倍になった。この結果から、ポリリン酸の添加による合成活性の上昇は反応液中のマグネシウム濃度に大きく依存することがわかった。またこの結果は実施例１のPURESYSTEMを使用した時と同様であり、ポリリン酸とマグネシウムの最適濃度での組み合わせが、無細胞蛋白質合成の促進に効果があることが確認された。またPAP添加時でも最適濃度での組み合わせが合成促進効果に大きく影響することがわかった。
【００３３】
実施例３：大腸菌S30画分を用いた無細胞蛋白質合成系におけるポリリン酸とマグネシウムの最適濃度の組み合わせの効果（鋳型として DNAもしくはmRNAを用いた時の同一性）
（１）プラスミドDNAを鋳型として用いた無細胞蛋白質合成
方法：
大腸菌S30画分（プロメガ社製）15 μLにS30 premix（プロメガ社製）20 μL、アミノ酸混合液５μL、鋳型としてルシフェラーゼ遺伝子を含む環状プラスミドDNA、pIVEX-luc(0.857 μg)を混合し、この反応系を基本とした。この反応液に表３に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、もしくはPAPを加え、基本反応系に対するその影響をみた。反応は37℃で２時間行い、反応系全体の体積は45 μLであった。
【００３４】
【表３】
2005151802.tif 000004
【００３５】
上表それぞれの反応系中で生成されたルシフェラーゼ量は、反応液の１０倍希釈液2 μL中の活性をBright Gro（プロメガ社製）中の測定溶液10 μLと混合することによってその発光量をルミノメーターで測定することにより評価した。
【００３６】
結果：
それぞれの反応系におけるルシフェラーゼ生産量を図３に示した。S30にプロメガ社で最適化されたエネルギー再生系を含む反応系（反応系３A）での生産量を１とすると、ポリリン酸のみを加えた反応系（反応系３B）では1.08倍であったが、ポリリン酸とマグネシウムを同時に加えた反応系（反応系３C）では、1.48倍にまで生産量が増加した。また、反応系３Cの組成にさらにPAPを加えた反応系（反応系３Ｄ）では、生産量は1.65倍に増加した。
【００３７】
（２）mRNAを鋳型として用いた無細胞蛋白質合成
方法：
大腸菌S30画分（プロメガ社製）15 μLにS30 premix（プロメガ社製）20 μL、アミノ酸混合液５μL、ルシフェラーゼ遺伝子を鋳型としてin vitroで合成したルシフェラーゼmRNAを3.84 μg混合し、これを基本的な反応系とした。この反応液に表４に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、もしくはPAPを加え、基本反応系に対するその影響をみた。反応は37℃で30分間反応を行い、反応系全体の体積は45 μLであった。
【００３８】
【表４】
2005151802.tif 000005
【００３９】
上表それぞれの反応系中で生成されたルシフェラーゼ量は、反応液の10倍希釈液２μL中の活性をBright Gro（プロメガ社製）中の測定溶液10 μLと混合することによってその発光量をルミノメーターで測定することにより評価した。
【００４０】
結果：
それぞれの反応系におけるルシフェラーゼ生産量を図４に示した。S30にプロメガ社で最適化されたエネルギー再生系を含む反応系（反応系4A）での生産量を１とすると、ポリリン酸のみを加えた反応系（反応系4B）では1.64倍であったが、ポリリン酸とマグネシウムを同時に加えた反応系（反応系4C）では、1.97倍にまで生産量が増加した。また、反応系4Cの組成にさらにPAPを加えた反応系（反応系４Ｄ）では、生産量は2.19倍に増加した。
【００４１】
上記の結果から、反応系にポリリン酸と適度濃度のマグネシウムを添加することで、S30を用いた無細胞蛋白質合成系の蛋白質生産量を増加させる効果があり、その効果はDNAを鋳型として加えた時も、mRNAを鋳型として加えた時も同様であることがわかった。また、他の実施例同様にPAPを加えることでさらに生産量が増加した。
【００４２】
実施例４：その他の大腸菌抽出液（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）を用いた無細胞蛋白質合成系におけるポリリン酸の効果
プロメガ社製のS30以外の大腸菌抽出液においても、ポリリン酸とマグネシウムの最適濃度による組み合わせとPAPの組み合わせによって、蛋白質合成量の上昇が見られるかどうか、また、ルシフェラーゼ以外の蛋白質においても合成量が増加するかどうか調べる目的で、ロッシュ・ダイアグノスティック社製の無細胞蛋白質合成システム（RTS100）とGreen Fluorescent Protein (GFP)を発現するプラスミド pIVEX2.3-GFP WT（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて蛋白質合成量の測定を行った。
【００４３】
方法：
基本的な反応系は、RTS100システム中のE. coli lysate 12 μL、Reaction mix 10 μL、アミノ酸混合液（L-メチオニン不含） 12 μL、L-メチオニン 1.0 μL、環状プラスミドDNA、pIVEX2.3-GFP WT (1 μg/μL) 0.5 μLを混合したものを用いた。この反応液に表５に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、もしくはPAPを加え反応を行った。反応は30℃で24時間行い反応系全体の体積は50 μLであった。また蛋白質（GFP）合成量は反応液を485nmのレーザー光で励起した時に出る蛍光強度（535nm）を蛍光分光光度系（テカン社製）で測定することによって定量した。
【００４４】
【表５】
2005151802.tif 000006
【００４５】
結果：
表５に示したそれぞれの反応系における24時間後のGFP生産量を図５〜７に示した。ロッシュ・ダイアグノスティック社のRTS100システムで最適化された反応系（反応系5A）での24時間後のGFP合成量を１とすると、ポリリン酸と塩化マグネシウムの最適濃度の組み合わせは、ポリリン酸を30 mM加えた時（反応系5B-5E）では塩化マグネシウムを添加しない条件（反応系５Ｂ、RTS100システム中にもともと含まれているマグネシウム濃度）で約３倍のGFP合成量であった。また、ポリリン酸を50 mM加えた時には５mMの塩化マグネシウムを加えた時（反応系５Ｇ）に最大の合成促進が見られ、反応系5Aの約３倍となった。ポリリン酸を100 mM加えた時には、20 mMの塩化マグネシウム（反応系５Ｋ）で最大の合成促進がみられた。つまりポリリン酸濃度に依存して、最適塩化マグネシウムの濃度は変化し、その最適濃度条件においてのみ蛋白質合成量の増加が見られた。これらの結果から、ロッシュ・ダイアグノスティック社のRTS100システムにおいてもポリリン酸とマグネシウムの最適濃度の組み合わせが蛋白質合成の促進に寄与していることが確認された。また、蛋白質合成の促進はルシフェラーゼのみでなくGFPでも見られたため、ポリリン酸とマグネシウム、PAPによる合成促進が特別に決まった蛋白質にのみ見られる効果ではないことがわかった。
【００４６】
実施例５：PAPの添加によるAMP、ADP、ATP量のバランスの変化
ロッシュ・ダイアグノスティック社製の無細胞蛋白質合成システム（RTS100）とGreen Fluorescent Protein (GFP)を発現するプラスミド pIVEX2.3-GFP WT（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて、基本的な反応系（RTS100システム中のE. coli lysate 12 μL、Reaction mix 10 μL、アミノ酸混合液（L-メチオニン不含） 12 μL、L-メチオニン 1.0 μL、環状プラスミドDNA、pIVEX2.3-GFP WT (1 μg/μL) 0.5 μLを混合したもの）に表６に示した組み合わせで、ポリリン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、もしくはPAPを加え、AMP、ADP、ATP量の変化を経時的に測定した。反応（50 μL）は30℃で８時間まで行った。また蛋白質（GFP）合成量は反応液を485nmのレーザー光で励起した時に出る蛍光強度（535nm）を蛍光分光光度系（テカン社製）で測定することによって定量した。
【００４７】
【表６】
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【００４８】
結果：
表６に示したそれぞれの反応系におけるAMP、ADP、ATP量の変化を図８〜１０に示した。またGFP合成の経時変化を図１１に示した。まずATP量の変化においては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のRTS100システムで最適化された反応系（反応系6A）での減少に比べて、ポリリン酸とマグネシウムを加えた反応系（反応系6B）ではATPが急速に消費され、減少が早いことがわかった。また、この時のGFP合成量も反応系6Aの1.9倍であった。このことからポリリン酸とマグネシウムの添加によって蛋白質合成反応が促進され、そのスピードが速くなっていることが予想される。また、この反応系にPAPを加えた時（反応系6C）では、PAPとRTS100システムにもともと入っているATP再生系とPAPの協調作用によってATPの再生反応が進み、ATP減少は反応系6Aよりも穏やかであることがわかる。また、PAPの添加によるATP再生効率の上昇により、ポリリン酸とマグネシウムのみの組み合わせによる蛋白質合成反応の促進効果がさらに高まり、GFPの合成量は最も高い値を示していた（図１１、反応系6C）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】取得されたAcinetobacter johnsonii 210A株のPAP遺伝子を含有する約10KbのDNA断片の制限酵素地図を示す。PAP遺伝子は、SacI-HpaI DNA断片中に含まれる。
【図２】大腸菌S30画分を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型とし、種々の塩化マグネシウム濃度下で蛋白質合成を行った時の反応液中のルシフェラーゼ活性を示したものである。
【図３】大腸菌S30画分を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型とし、蛋白質合成を行った時のルシフェラーゼ合成量を示したものである。
【図４】大腸菌S30画分を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を含むmRNAより蛋白質合成を行った時のルシフェラーゼ合成量を示したものである。
【図５】ロッシュ・ダイアグノスティック社製の無細胞蛋白質合成システム（RTS100）を用いてポリリン酸(30mM)と種々の濃度の塩化マグネシウムの組み合わせによる蛋白質合成量の変化を示したものである。-Poly(P)はポリリン酸を添加していないことを示す（以下同じ）。
【図６】ロッシュ・ダイアグノスティック社製の無細胞蛋白質合成システム（RTS100）を用いてポリリン酸(50mM)と種々の濃度の塩化マグネシウムの組み合わせによる蛋白質合成量の変化を示したものである。
【図７】ロッシュ・ダイアグノスティック社製の無細胞蛋白質合成システム（RTS100）を用いてポリリン酸(100mM)と種々の濃度の塩化マグネシウムの組み合わせによる蛋白質合成量の変化を示したものである。
【図８】反応系６ＡにおけるAMP、ADP、ATP量のバランスの変化を示す図である。
【図９】反応系６ＢにおけるAMP、ADP、ATP量のバランスの変化を示す図である。
【図１０】反応系６ＣにおけるAMP、ADP、ATP量のバランスの変化を示す図である。
【図１１】実施例５で実施したサンプルの蛋白質（GFP）合成量の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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