(57)【要約】      （修正有）【課題】  従来のペプチドライブラリー中のペプチドよりも長いペプチドのライブラリーを簡単に作製すること。また、ペプチドライブラリーの作製に利用することができる核酸ライブラリーの作製方法を提供すること。【解決手段】  アミノ酸数が２０〜１００個の２種類以上のペプチドからなるペプチドライブラリーであって、２種類以上のペプチドがそれぞれ単離された状態で存在することを特徴とする前記ペプチドライブラリー。２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖及びその相補鎖からなる二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成することを含むが、ここで、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを増幅させないことを特徴とする、核酸ライブラリーの作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸数が１５〜１００個の２種類以上のペプチドからなるペプチドライブラリーであって、２種類以上のペプチドがそれぞれ単離された状態で存在することを特徴とする前記ペプチドライブラリー。
【請求項２】
センス鎖がペプチドをコードしている二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだときに前記ペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させることができるベクターに、センス鎖がペプチドをコードしている２種類以上の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込み、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換し、前記形質転換細胞のコロニーを形成させ、前記コロニーの１つから採取した形質転換細胞を培養してペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させ、前記融合タンパク質からペプチドを切断することを含む、２種類以上のペプチドがぞれぞれ単離された状態で存在するペプチドライブラリーの作製方法。
【請求項３】
ペプチドと融合するタンパク質が、キチン結合ドメインタンパクとインテインである請求項２記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が大腸菌である請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
融合タンパク質から切断されたペプチドが直鎖状である請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
融合タンパク質から切断されたペプチドが環状である請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドのセンス鎖が２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるアミノ酸数が１５〜１００個のペプチドをコードしている請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸が天然に存在する２０種類のアミノ酸のいずれかである請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項２記載の方法で作製したペプチドライブラリー。
【請求項１０】
請求項１又は９に記載のペプチドライブラリーに含まれるペプチドの生物学的活性を測定し、所望の活性を示すペプチドを選択することを含む、ペプチドライブラリーのスクリーニング方法。
【請求項１１】
２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖又はその相補鎖である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用意し、前記一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに１種類のプライマーを添加し、30〜80℃の温度にてＤＮＡポリメラーゼで前記プライマーを伸長させることにより、２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖及びその相補鎖からなる二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成することを含むが、ここで、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを増幅させないことを特徴とする、核酸ライブラリーの作製方法。
【請求項１２】
２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチド鎖が１５〜１００個のコドンを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖の相補鎖が5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(XYZ)nACGGCAGTTAGAAGAG-3'（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、X、Y及びZはそれぞれデオキシチミジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのいずれかであるが、XYZはコドンのアンチセンス部分であり、ｎは１５〜１００のいずれかの整数である。）で表される配列を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
プライマーが5'-TAGGTTAAGTTGCTCTTCTAACTGCC-3'（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシンである）で表される配列を有する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１記載の方法で核酸ライブラリーを作製するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸を含む前記のキット。
【請求項１６】
バッファーがマグネシウム塩を含む請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドライブラリー、その作製方法、そのスクリーニング方法、核酸ライブラリーの作製方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは通常ペプチド合成機で合成する。しかしながら、１）合成できるペプチドの長さに制限がある、２）コストがかかる、３）アミノ酸配列によっては合成収率が低いものがある、などの問題点がある。
【０００３】
一方、遺伝子組換え技術により大腸菌などでタンパク質を合成する場合はこれらの問題点は解決されるが、構造をとっていない短いペプチドなどは大腸菌の中で分解されてしまうため合成が難しい。さらに、通常、大腸菌でタンパク質を合成した場合、精製を簡便にするためにtag(his-tag, GST-tagなど)をタンパク質の末端に付けなければならない。
【０００４】
また、ペプチドライブラリーはペプチド合成機で合成するのが一般的である。しかしながら、操作が非常に煩雑で、できるライブラリー中のペプチドは非常に短い（３〜９アミノ酸程度）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来のペプチドライブラリー中のペプチドよりも長いペプチド（例えば、１５〜１００アミノ酸）のライブラリーを簡単に作製することを目的とする。
【０００６】
また、本発明は、ペプチドライブラリーの作製に利用することができる核酸ライブラリーの作製方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、目的のタンパク質をインテインとキチン結合ドメインタンパクとの融合タンパクとして発現するシステム（ニューイングランドバイオラボ社より発売されているIMPACTTM-TWIN System)を用い、ペプチドの発現・精製を試みた。インテインは天然に存在するタンパク質であり、タンパクのイントロンを除く反応でタンパク質を切断する。IMPACTTM-TWIN Systemの手法は、図１に示すように、目的のペプチド配列をコードするDNAテンプレートをクローニングし、大腸菌を用いてインテインとキチン結合ドメイン(CBD)タンパクとの融合タンパクとして発現させる。その後、キチンビーズにこのタンパク質を吸着させ、バッファー交換することで、インテインの切断反応をおこし、目的タンパクを切断して、溶出させ、精製する。この手法は通常タンパク質を発現・精製するために用いられるが、本発明者らは、望みのアミノ酸配列をコードするDNAテンプレートをクローニングし、タンパク質よりも短いペプチドを発現・精製することに用いた。この手法の利点は以下の点にある。１）望みのペプチドはインテインとキチン結合ドメインタンパクとの融合タンパク質として発現されるためにタンパク質全体として構造を有しており、ペプチド自身では構造を有していなくとも大腸菌内で発現される。２）インテインとキチン結合ドメインタンパクは可溶性のタンパク質であり、望みのペプチドがある程度水に溶けにくくても全体として水に溶けやすく精製が容易である。３）通常、大腸菌で発現させたタンパク質を精製するためにはHis-tagやGST-tagなどの余分なペプチド配列が必要となるが、この系ではキチン結合ドメインタンパクで精製し、それはインテインの反応後に切り出されるため除かれる。したがって余分なタグを含まないペプチドが得られる。さらに、本発明者らは、この手法をペプチドライブラリーの構築に応用した。
【０００８】
遺伝子組換え技術により大腸菌などの宿主細胞で翻訳させてペプチドライブラリーを作る際には、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子をランダマイズする必要がある。その際、J. Mol. Biol. (2000) 297, 309-319に記載のように、合成オリゴデオキシヌクレオチドをランダマイズさせる。この合成オリゴデオキシヌクレオチドは一本鎖であるから、何らかの方法で二本鎖にしなければならず、通常、PCRで二本鎖にする。
【０００９】
ところで、完全にアミノ酸をランダマイズするとなると、ペプチドを構成するアミノ酸の数が多くなればなるほど母集団が大きくなり（例えば、アミノ酸数が２７個のペプチドの場合、天然に存在する２０種類のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドの総数は２０の２７乗となる。）、ペプチドライブラリーの中から望みのペプチドを得る確率が低くなる。そこで、アミノ酸の種類を絞ることが得策と考えられる。アミノ酸の種類を絞るとすると、ランダマイズさせるコドンの種類が絞られることになる。例えば、His, Arg, Gln, Asn, Ser, Lysの六種類に絞られたアミノ酸をランダマイズさせたペプチドのライブラリーを作製するためには、ランダマイズさせるコドンの部分（XYZ）の一文字目（X）をC及びA、二文字目（Y）をA及びG、三文字目（Z）をT、C及びAとすればよい。ところが、ランダマイズさせるコドンの種類をしぼると、PCRで二本鎖にすることが難しくなった。そこで、種々の実験条件を検討したところ、PCRでサイクルを回すことが二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの合成を妨げていることがわかった。これは、ランダマイズさせるコドンの種類をしぼると、似たような配列が存在し（A,G,C,Tの４種類のランダマイズでないため）、プライマー若しくは同一分子鎖内でハイブリダイズしてしまうことが原因で、PCRでサイクルをまわすと何回もアニーリングの操作があるため、その度ごとに望みの所でない箇所にプライマー又はプライマー伸長物がハイブリダイズして、望んでない二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが合成されるということが繰り返されるためと思われる。そこで、PCRを行うことなく、DNAポリメラーゼで二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの合成を試みたところ、所望の長さのランダマイズされた二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを調製することができた。
本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）アミノ酸数が１５〜１００個の２種類以上のペプチドからなるペプチドライブラリーであって、２種類以上のペプチドがそれぞれ単離された状態で存在することを特徴とする前記ペプチドライブラリー。
（２）センス鎖がペプチドをコードしている二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだときに前記ペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させることができるベクターに、センス鎖がペプチドをコードしている２種類以上の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込み、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換し、前記形質転換細胞のコロニーを形成させ、前記コロニーの１つから採取した形質転換細胞を培養してペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させ、前記融合タンパク質からペプチドを切断することを含む、２種類以上のペプチドがぞれぞれ単離された状態で存在するペプチドライブラリーの作製方法。
（３）ペプチドと融合するタンパク質が、キチン結合ドメインタンパクとインテインである（２）記載の方法。
（４）宿主細胞が大腸菌である（２）又は（３）記載の方法。
（５）融合タンパク質から切断されたペプチドが直鎖状である（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）融合タンパク質から切断されたペプチドが環状である（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドのセンス鎖が２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるアミノ酸数が１５〜１００個のペプチドをコードしている（２）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）アミノ酸が天然に存在する２０種類のアミノ酸のいずれかである（７）記載の方法。
（９）（２）記載の方法で作製したペプチドライブラリー。
（１０）  （１）又は（９）に記載のペプチドライブラリーに含まれるペプチドの生物学的活性を測定し、所望の活性を示すペプチドを選択することを含む、ペプチドライブラリーのスクリーニング方法。
（１１）２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖又はその相補鎖である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用意し、前記一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに１種類のプライマーを添加し、30〜80℃の温度にてＤＮＡポリメラーゼで前記プライマーを伸長させることにより、２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖及びその相補鎖からなる二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成することを含むが、ここで、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを増幅させないことを特徴とする、核酸ライブラリーの作製方法。
（１２）２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴヌクレオチド鎖が１５〜１００個のコドンを含む（１１）記載の方法。
（１３）アミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖の相補鎖が5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(XYZ)nACGGCAGTTAGAAGAG-3'（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、X、Y及びZはそれぞれデオキシチミジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのいずれかであるが、XYZはコドンのアンチセンス部分であり、ｎは１５〜１００のいずれかの整数である。）で表される配列を有する（１２）記載の方法。
（１４）プライマーが5'-TAGGTTAAGTTGCTCTTCTAACTGCC-3'（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシンである）で表される配列を有する（１３）記載の方法。
（１５）（１１）記載の方法で核酸ライブラリーを作製するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸を含む前記のキット。
（１６）バッファーがマグネシウム塩を含む（１５）記載のキット。
【００１１】
本明細書において、「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものをいう。
【００１２】
「アミノ酸」とは、同一分子内にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物をいうが、プロリンのようなイミノ酸もアミノ酸とみなす。グリシン以外のアミノ酸は、少なくとも一つの不斉炭素原子をもち、光学的に活性であり、L体とD体がある。
【００１３】
「ペプチドライブラリー」とは、２種類以上のペプチドを集めたものをいい、ペプチドそのもの（ペプチドは単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたもの、ペプチドの溶液（ペプチドは単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたもの、ペプチドと１種類または２種類以上のタンパク質又はその断片との融合タンパク質（ペプチドを含む融合タンパク質は単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたもの、前記融合タンパク質の溶液（ペプチドを含む融合タンパク質は単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたもの、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞（宿主細胞は単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたもの、前記宿主細胞の溶液（例えば、宿主細胞を培養した液、緩衝液に宿主細胞を懸濁したものなど）（宿主細胞は単離されていても、単離されていなくともよい。）を集めたものなどを含む概念である。
【００１４】
「核酸ライブラリー」とは、２種類以上の核酸の配列を集めたものをいい、核酸は単離されていてもいなくてもよい。
【００１５】
「核酸」とは、プリン又はピリミジン塩基、糖（ペントース）、リン酸から成るヌクレオチドを基本単位とし、各ヌクレオチド間が糖の3'位と5'位炭素のリン酸ジエステル結合で結ばれて重合したものを意味する。糖部分がリボースであるか、デオキシリボ−スであるかによって、リボ核酸(RNA)とデオキシリボ核酸（DNA)に大別されるが、それらに限定されるわけではない。プリン又はピリミジン塩基、糖（ペントース）、リン酸は種々の置換、修飾などがなされていてもよい。核酸は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。
【００１６】
本明細書において、DNA配列中のＡはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシンを表す。また、特に断りがない限り、DNA配列は、左端から右端に向かって5’末端から3’末端となるように記載される。
【００１７】
また、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すIUPAC-IUB生化学命名委員会(CBN)で採用された略語を用いて表される。また、特に断りがない限り、ペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端に向かってN末端からC末端となるように記載される。
Ala又はA：アラニン
Val又はV：バリン
Leu又はL：ロイシン
Ile又はI：イソロイシン
Pro又はP：プロリン
Phe又はF：フェニルアラニン
Trp又はW：トリプトファン
Met又はM：メチオニン
Gly又はG：グリシン
Ser又はS：セリン
Thr又はT：トレオニン
Cys又はC：システイン
Gln又はQ：グルタミン
Asn又はN：アスパラギン
Tyr又はY：チロシン
Lys又はK：リシン
Arg又はR：アルギニン
His又はH：ヒスチジン
Asp又はD：アスパラギン酸
Glu又はE：グルタミン酸
本明細書において、「天然に存在する２０種類のアミノ酸」とは、上記の２０種類のアミノ酸のL体を意味する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、従来の化学合成によるペプチドライブラリー中のペプチドよりも長いペプチド（例えば、１５〜１００アミノ酸）のライブラリーを簡単に作製することができるようになった。
【００１９】
また、本発明により、２種類以上のアミノ酸をランダマイズした長いペプチドを遺伝子組換え技術で効率的に作製することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．核酸ライブラリーの作製
本発明は、２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖又はその相補鎖である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用意し、前記一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに１種類のプライマーを添加し、30〜80℃の温度にてＤＮＡポリメラーゼで前記プライマーを伸長させることにより、２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖及びその相補鎖からなる二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成することを含むが、ここで、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを増幅させないことを特徴とする、核酸ライブラリーの作製方法を提供する。
【００２１】
本発明の核酸ライブラリーの作製方法の一例を図２に示す。
【００２２】
まず、アミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードするオリゴデオキシヌクレオチド鎖である一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの相補鎖（図２のODN2、以下、「アンチセンス鎖」と記す。）を用意する。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドがコードするペプチドを構成するアミノ酸の数（図２のODN2では２７個）は特に限定されないが、１５〜１００個が適当であり、１５〜１００個が好ましく、１８〜５０個がより好ましい。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、アミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドをコードする配列の他、他のアミノ酸をコードする配列、制限酵素の認識配列、終止コドンの配列、制限酵素の切断効率を上げるための２で〜１１残基からなる任意の配列（例えば、New England biolabs社のカタログに記載されているが、一般的に制限酵素の認識サイトの５‘末端及び３’末端に２〜１１残基余計に、任意の配列のDNAを付ける。例えばBamHIはGGATCCが認識配列であるが、この配列が３‘末端にあるときは、５’〜GGATCCGGCなどとする。）などを含んでもよい。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの長さは、特に限定されないが、２０〜１５０塩基が適当であり、５０〜１５０塩基が好ましく、９０〜１５０個がより好ましい。
【００２３】
アンチセンス鎖の配列の一例を以下に示す。
5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(XYZ)nACGGCAGTTAGAAGAG-3'（nが１の場合の配列を配列番号１に示す。）
（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、X、Y及びZはそれぞれデオキシチミジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのいずれかであるが、XYZはコドンのアンチセンス部分であり、ｎは１５〜１００のいずれかの整数である。）
【００２４】
上記アンチセンス鎖の配列には、任意のアミノ酸のコドンのアンチセンス部分（XYZ）の他、終止コドンのアンチセンス部分（TTA）、BamHIの認識配列のアンチセンス部分（GGATCC）、BamHIの切断効率を上げるための２残基からなる任意の配列（CG）が含まれている。
【００２５】
例えば、His, Arg, Gln, Asn, Ser, Lysの６種類のアミノ酸でランダマイズしたペプチドのライブラリーを作製するためには、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドのコドンのアンチセンス部分（配列番号１の配列中のXYZ）の一文字目（X）をT,G,A二文字目（Y）をT,C、三文字目（Z）をT,G,とすればよい。
【００２６】
また、別の例として、Leu, His, Arg, Iie, Asn, Ser, Val, Asp, Glyの９種類のアミノ酸でランダマイズしたペプチドのライブラリーを作製するためには、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドのコドンのアンチセンス部分（配列番号１の塩基配列中のXYZ）の一文字目（X）をG二文字目（Y）をA,C及びG、三文字目（Z）をC,G,Tとすればよい。
【００２７】
また、プライマー（図２のODN1）も用意する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、前記のアンチセンス鎖を鋳型として伸長した結果、前記のアンチセンス鎖の相補鎖が合成されるものであればよい。通常、プライマーは、鋳型となるデオキシヌクレオチドの一部に相補的な配列を有する。この他に、制限酵素の認識配列、制限酵素の切断効率を上げるための２〜１１残基からなる任意の配列などの配列を有してもよい。プライマーの長さは、特に限定されないが、１０〜１００塩基が適当であり、１５〜５０塩基が好ましく、２０〜３０個がより好ましい。プライマーは一本鎖であるとよい。
【００２８】
5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(XYZ)nACGGCAGTTAGAAGAG-3'（nが１の場合の配列を配列番号１に示す。）の配列を有するアンチセンス鎖とその相補鎖であるセンス鎖からなる二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを合成するためのプライマーの配列の一例を以下に示す。
5'-TAGGTTAAGTTGCTCTTCTAACTGCC-3'（配列番号２）
（ここで、Ａはデオキシアデノシン、Ｔはデオキシチミジン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシンである。）
【００２９】
配列番号２の配列には、鋳型となる5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(XYZ)nACGGCAGTTAGAAGAG-3'（nが１の場合の配列を配列番号１に示す。）の配列を有するアンチセンス鎖の3’末端に相補的な配列（CTCTTCTAACTGCC）の他、SapIの認識配列（GCTCTT)、SapIの切断効率を上げるための配列(TAGGTTAA)が含まれている。
【００３０】
アンチセンス鎖及びプライマーは、公知の方法で、市販のＤＮＡ合成機により製造することができる。
【００３１】
アンチセンス鎖及びプライマーを用いて二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを生成する手順は以下の通りである。まず、アンチセンス鎖及びプライマーを適量（反応体積250マイクロリットルの場合、１００〜５００pmolが好ましく、１００〜２００pmolがより好ましく、200 pmolが最も好ましい。）ずつ反応バッファー溶液（市販のＤＮＡポリメラーゼに添付されているものでよい。）に加える。そこへdNTP(N=A,G,C,T)を適当な最終濃度（反応体積250マイクロリットルの場合、０．１〜１mMが好ましく、０．１〜０．５mMがより好ましく、0.2 mMが最も好ましい。）となるように加える。この溶液を適当な温度（６０〜１００℃が好ましく、９０〜１００℃がより好ましく、９６℃が最も好ましい。）で適当な時間（１〜２０分が好ましく、５〜１０分がより好ましく、5分が最も好ましい。）加熱する（変性）。その後徐々に室温まで冷やし（アニーリング）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、図２のKlenow Fragment DNA polymerase I（タカラバイオ）、Taq Polymerase (東洋紡、タカラバイオ、アマシャムなど）、Tth  Polymerase（東洋紡など）、 KOD Polymerase（東洋紡など）、Pfu Polymerase （東洋紡など）、Tub Polymerase (アマシャムなど）、T4 DNA Polymerase(タカラバイオ、アマシャムなど）など）を適量（反応体積250マイクロリットルの場合、０．５〜５Uが好ましく、１〜３  Uがより好ましく、1 Uが最も好ましい。）加える。反応はＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、Klenow Fragment DNA polymerase Iの場合は37℃、Taq Polymerase (東洋紡、タカラバイオ、アマシャムなど）、Tth  Polymerase（東洋紡など）、 KOD Polymerase（東洋紡など）、Pfu Polymerase （東洋紡など）、Tub Polymerase (アマシャムなど）の場合は７４℃、T4 DNA Polymerase(タカラバイオ、アマシャムなど）は３７℃）で適当な時間（０．５〜５時間が好ましく、０．５〜３時間がより好ましく、３時間が最も好ましい。）行う。この際、プライマーが伸長するだけでなく、鋳型となるアンチセンス鎖も伸長して、完全に相補的な二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドが生成している。生成した二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを精製キット（例えば、プロメガ社）で精製する。このようにして作製した２種類以上の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは核酸ライブラリーを構成する。
【００３２】
なお、図２では、ランダマイズした一本鎖オリゴヌクレオチド(ODN2)がアンチセンス鎖であり、これをプライマーとアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを生成させたが、ランダマイズさせる一本鎖オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖に限られるわけではなく、センス鎖である一本鎖オリゴヌクレオチドをランダマイズさせ、これをプライマーとアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを生成させてもよい。
【００３３】
２．ペプチドライブラリーの作製
本発明は、センス鎖がペプチドをコードしている二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだときに前記ペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させることができるベクターに、センス鎖がペプチドをコードしている２種類以上の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込み、前記二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換し、前記形質転換細胞のコロニーを形成させ、前記コロニーの１つから採取した形質転換細胞を培養してペプチドをタンパク質と融合した形態で発現させ、前記融合タンパク質からペプチドを切断することを含む、２種類以上のペプチドがぞれぞれ単離された状態で存在するペプチドライブラリーの作製方法を提供する。
【００３４】
ベクターは、タンパク質をコードしている領域の両末端のいずれか一方にクローニングサイトを有するものであるとよい。このようなベクターとしては、pTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社)、pTWIN1(ニューイングランドバイオラボ社)、pTYB1、pTYB2、pTYB11、pTYB12、pKYB1、pTXB1、pTXB3、pMYB5、pTYB3、pTYB4、pTWIN-MBP1（全てニューイングランドバイオラボ社）などが市販されている。
【００３５】
ペプチドと融合するタンパク質は、キチン結合ドメインタンパクとインテインであることが好ましいが、それらに限定されることはない。
【００３６】
本発明のペプチドライブラリーの作製方法の一例を以下に記載する。
【００３７】
１で得られた二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、5マイクログラム）及び適当なベクター（例えば、pTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社)、pTWIN1(ニューイングランドバイオラボ社)、pTYB1、pTYB2、pTYB11、pTYB12、pKYB1、pTXB1、pTXB3、pMYB5、pTYB3、pTYB4、pTWIN-MBP1（全てニューイングランドバイオラボ社）（例えば、3マイクログラム）をそれぞれ別々に反応バッファー（SapIに添付されたものでよい。）に加える。そこへSapI(ニューイングランドバイオラボ社)を適量（例えば、４U）加え適当な時間（例えば、6時間）反応させる。精製キット（プロメガ社）で精製し、次の制限酵素の反応バッファー（BamHIに添付されたものでよい。）に加える。そこへBamHI（東洋紡）を適量（例えば、１０U）加え適当な時間（例えば、6時間）反応させる。制限酵素で処理したベクターと二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドをそれぞれ精製キット（プロメガ社）で精製する。なお、上記の説明では、図２に示した操作で作製した二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドにSapIとBamHIの認識配列が含まれるために、制限酵素としてSapI及びBamHIを用いたとして解説したが、制限酵素の種類は、SapI及びBamHIに限定されるわけではない。いかなる制限酵素の認識配列を二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドに導入してもよい。
【００３８】
制限酵素で処理したベクターと二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドそれぞれ適量（例えば、0.1 pmol）を混ぜ（例えば、合計５マイクロリットル）、ライゲーションさせる。このライゲーションは、制限酵素で処理したベクターと二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの混合物にligation high(東洋紡)を（例えば、５マイクロリットル）加え、16度で8時間反応させることにより行うことができる。ライゲーションしたベクターを精製キット（プロメガ社）で精製し、宿主細胞（例えば、コンピテントセルRossetta(DE3)pLysS）（Novagen）、AD494(DE3),AD494(DE3)pLysS,BL21(DE3)(全てNovagen社)等、lacプロモーターの制御下にT7RNAポリメラーゼの染色体コピーを有しIPTGによりタンパク質の発現が誘導されるもの）にトランスフォーメーションし、プレートにまく。
【００３９】
プレート上のコロニー一つを適当な培地（例えば、LB培地）に適当なスケール（例えば、１L）で培養し、A600（波長600nmでの吸収）が0.5になったところでIPTG(イソプロピル1-チオ-β-D-ガラクトシド）を適当な最終濃度（例えば、0.4mM）で加え適当な温度（例えば、25℃）で適当な時間（例えば、4時間）培養する。その後、集菌して沈殿物をbufferB1(20 mM HEPES(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1 % TWEEN 20, 20 μM PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）, 1 mM DTT（ジチオトレイトール）)中で超音波して溶菌させる。次いで、遠心し上澄み溶液から、適当な方法でペプチドを精製する。例えば、ベクターとしてpTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社)を用いた場合には、上澄み溶液を４℃でキチンビーズカラムに通し、タンパク質を吸着させる。その後、カラムにbufferB2(20 mM HEPES (pH 6.0〜7.5), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)を通しbuffer交換して室温で8時間放置し、インテインの切断反応をおこさせる。その後、溶出することにより目的のペプチドを得ることができる。別のコロニーについて、上記の操作を繰り返すことにより、複数の種類のペプチドを得ることができる。同じコロニーから採取した形質転換細胞からは同じ種類のペプチドが得られるので、ペプチドの単離が容易である。また、どのコロニーからどのような種類のペプチドが得られたかを記録しておけば、所望のペプチド（例えば、アッセイにおいて、所望の生物学的活性を示したペプチドなど）を容易に得ることができる。
【００４０】
ペプチドは、直鎖状または環状のいずれの形態でも得ることができる。例えば、pTWIN1又はpTWIN2ベクターを用いて、直鎖状のペプチドを得るには、以下のようにするとよい。
まず、市販のベクターpTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社) に目的のペプチド配列をコードするDNA配列を以下のようにクローニングする。目的のペプチドをコードするDNA配列をPCRで増幅することにより得る。この際、タンパク合成における大腸菌のコドンの使用頻度に留意してコドンを選択する。このPCR生成物を制限酵素（例えばSapI、BamH1）（ニューイングランドバイオラボ社）で処理し、同様にこれら二種類の制限酵素（例えばSapI、BamH1）で処理したpTWIN2ベクター（ニューイングランドバイオラボ社）にクローニングした（切断する制限酵素はマルチクローニングサイト(MCS)から一つ、MCSの下流のインテイン及びキチンバインディングドメイン（CBD）より下流の制限酵素から一つ選ぶ）。得られたプラスミドでトランスフォーメーションした大腸菌をLB培地１Lで培養し、A600（波長600nmでの吸収）が0.5になったところでIPTGを最終濃度0.4mMで加え25℃で4時間培養する。その後、集菌して沈殿物をbufferB1(20 mM HEPES(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1 % TWEEN 20, 20 μM PMSF, 1 mM DTT)中で超音波して溶菌させる。遠心し上澄み溶液を４℃でキチンビーズカラム（ニューイングランドバイオラボ社）に通し、タンパク質を吸着させる。その後、カラムにbufferB2(20 mM HEPES (pH 6.0〜7.5), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)を通し、buffer交換して室温で8時間放置しインテインの切断反応をおこさせた。その後、溶出することにより目的のペプチドを得る。
また、pTWIN1又はpTWIN2ベクターを用いて、環状のペプチドを得るには、以下のようにするとよい。
まず、市販のベクターpTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社) に目的のペプチド配列をコードするDNA配列を以下のようにクローニングする。目的のペプチドをコードするDNA配列をPCRで増幅することにより得る。この際、タンパク合成における大腸菌のコドンの使用頻度に留意してコドンを選択する。このPCR生成物を制限酵素（例えばSapI、EcoRI）（ニューイングランドバイオラボ社）で処理し、同様にこれら二種類の制限酵素（例えばSapI、EcoRI）で処理したpTWIN2ベクター（ニューイングランドバイオラボ社）にクローニングした（切断する制限酵素はマルチクローニングサイト(MCS)から二つ選ぶ）。得られたプラスミドでトランスフォーメーションした大腸菌をLB培地１Lで培養し、A600（波長600nmでの吸収）が0.5になったところでIPTGを最終濃度0.4mMで加え25℃で4時間培養する。その後、集菌して沈殿物をbufferB1(20 mM HEPES(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1 % TWEEN 20, 20 μM PMSF, 1 mM DTT)中で超音波して溶菌させる。遠心し上澄み溶液を４℃でキチンビーズカラム（ニューイングランドバイオラボ社）に通し、タンパク質を吸着させる。その後、カラムにbufferB2(20 mM HEPES (pH 6.0〜7.5), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)を通し、buffer交換して室温で8時間放置しインテインの切断反応をおこさせた。その後、溶出することにより目的のペプチドを得る。
【００４１】
本発明の上記方法により、２種類以上のペプチドがぞれぞれ単離された状態で存在するペプチドライブラリーが提供される。
【００４２】
このペプチドライブラリーは、有用なペプチドの探索に利用することができる。
【００４３】
３．ペプチドライブラリーのスクリーニング
本発明は、上記のペプチドライブラリーに含まれるペプチドの生物学的活性を測定し、所望の活性を示すペプチドを選択することを含む、ペプチドライブラリーのスクリーニング方法を提供する。
【００４４】
生物学的活性の測定において、ペプチドライブラリーに含まれるペプチドは１種類ずつ単独で使用してもよいし、あるいは複数の種類を混合して使用してもよい。例えば、個々のペプチドの生物学的活性を調べたいときには、ペプチドは１種類ずつ単独で使用するとよい。また、特定の物質（例えば、タンパク質、低分子化合物など）に結合するペプチドを網羅的に探索したいときには、複数の種類のペプチドを混合して使用するとよい。
【００４５】
ペプチドの生物学的活性は、確立されたアッセイ系で測定することができる。後述の実施例には、ペプチドの遺伝子キャリヤーとしての生物学的活性を測定する方法が記載されている。この方法でペプチドライブラリーに含まれるペプチドの遺伝子キャリヤーとしての生物学的活性を測定し、所望の遺伝子キャリヤー活性を示すペプチドを選択することにより、遺伝子キャリヤーペプチドとして有用なペプチドを得ることができる。
【００４６】
４．核酸ライブラリーを作製するためのキット
本発明は、上記の方法で核酸ライブラリーを作製するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸を含む前記のキットを提供する。
【００４７】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、Klenow Fragment DNA polymerase I（タカラバイオ）、Taq Polymerase (東洋紡、タカラバイオ、アマシャムなど）、Tth  Polymerase（東洋紡など）、 KOD Polymerase（東洋紡など）、Pfu Polymerase （東洋紡など）、Tub Polymerase (アマシャムなど）、T4 DNA Polymerase(タカラバイオ、アマシャムなど）などを例示することができる。
【００４８】
バッファーとしては、ＤＮＡポリメラーゼに適した組成のものであればよく、例えば、Tris-HCl、Tris-acetateなどの緩衝液、MgCl2、(CH3COO)2Mgなどのマグネシウム塩、KCl、CH3COOKなどのカリウム塩、ジチオトレイトール(DTT)、CoCl2などの成分を含むとよい。バッファーは、マグネシウム塩を含むことが好ましい。
【００４９】
本発明のキットは、さらに、キットの使用説明書を含んでもよい。
【００５０】
本発明のキットにおいて、キットを構成する要素は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまとめにして、バイアル, チューブなどのような容器に包含されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめにして納めるための区画化された担持手段に納められていてもよい。
【００５１】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５２】
大腸菌を用いたＭ９を含むペプチド配列の作製
核移行シグナルであるM9を含むペプチド配列（アミノ酸配列GRAMGNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGYGGSGGSC（配列番号３））を大腸菌で作製した。
【００５３】
まず、市販のベクターpTWIN1(ニューイングランドバイオラボ社) にM9のペプチド配列をコードするDNA配列を以下のようにクローニングした。DNA配列は3本のDNA（配列（５’→３’CCGGGCCCATGGGTAACCAGAGCAGCAACTTCGGCCCGATGAAAGGTGGTAACTTCGG（配列番号４）、GATGAAAGGTGGTAACTTCGGTGGTCGTAGCAGCGGTCCGTACGGTGGTGGTGGTCAGTACTTCGCAAAACCGCGTAACCAGGGTGGTT（配列番号５）、CGCCGCGGATCCTTAGCAGCTACCGCCGCTGCCACCGTAACCACCCTGGTTACGCGG（配列番号６））をPCRで増幅することにより得た。このPCR生成物を制限酵素（NcoI、BamH1）（タカラバイオ）で処理し、同様にこれら二種類の制限酵素（NcoI、BamH1）で処理したpTWIN1ベクター（ニューイングランドバイオラボ社）にクローニングした。得られたプラスミド（pTWM9）でトランスフォーメーションした大腸菌をLB培地１Lで培養し、A600（波長600nmでの吸収）が0.5になったところでIPTGを最終濃度0.4mMで加え25℃で4時間培養した。その後、集菌して沈殿物をbufferB1(20 mM HEPES(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1 % TWEEN 20, 20 μM PMSF, 1 mM DTT)中で超音波して溶菌させた。遠心し上澄み溶液を４℃でキチンビーズカラム（ニューイングランドバイオラボ社）に通し、タンパク質を吸着させた。その後、カラムにbufferB2(20 mM HEPES (pH 6.0〜7.5), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)を通し、buffer交換して室温で8時間放置しインテインの切断反応をおこさせた。その後、溶出することにより目的のペプチドを得た。結果を図３に示す。レーン１はマーカー、レーン2はintein-tagの切断を誘導した後にキチンビーズから溶出された画分である。インテインの反応後タンパクが切断され望みのペプチドが得られていることがわかる。精製後の濃度を測定したところ、1Lの培地から5mgのペプチドが得られていた。
【実施例２】
【００５４】
大腸菌を用いたペプチドライブラリーの作製
本実施例では遺伝子導入能力を持つペプチドを作製することが目的なので、そのために重要と思われるアミノ酸のみをランダマイズさせたペプチドライブラリーを作製した。具体的なアミノ酸としては、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、セリンである。これらのアミノ酸をランダマイズさせようとすると、コドンの一文字目をCおよびA,二文字目をA及びG,三文字目をT,C及びAにすればよい。以下の配列を有するDNA（以下、「ODN2」と記す。）を合成した。（ODN2はアンチセンス鎖のため、DはA,G,T、YはT,C、KはG,Tとなる。）
5'-CGGGATCCTTAGCAGCA(DYK)27ACGGCAGTTAGAAGAG-3'（配列番号７）
プライマーとしては、以下の配列を有するDNA（以下、「ODN1」と記す。）を合成した。
5'-TAGGTTAAGTTGCTCTTCTAACTGCC-3'（配列番号２）
ODN1及びODN2を200 pmolずつ反応バッファー溶液（酵素に添付されているもの）に加えた。そこへdNTP(N=A,G,C,T)を最終濃度0.2 mMとなるように加えた。この溶液を96度で5分加熱した。その後徐々に室温まで冷やし、Klenow Fragment DNA polymerase I（タカラバイオ）を１U加えた。反応体積250マイクロリットルで行った。反応は37度で三時間行った。精製キット（プロメガ社）で精製を行った。
【００５５】
上で得られた二本鎖DNA断片（5マイクログラム）及びベクターpTWIN2(ニューイングランドバイオラボ社)を3マイクログラムそれぞれ別々に反応バッファー（酵素に添付されたもの）に加えた。そこへSapI(ニューイングランドバイオラボ社)を４U加え6時間反応させた。精製キット（プロメガ社）で精製し、次の制限酵素の反応バッファー（酵素に添付されたもの）に加えた。そこへBamHIを１０U（東洋紡）加え6時間反応させた。精製キット（プロメガ社）で精製した。
【００５６】
制限酵素で処理したベクターとDNA断片それぞれ0.1 pmolを混ぜ（合計５マイクロリットル）、ligation high(東洋紡)を５マイクロリットル加え、16度で8時間反応させた。精製キット（プロメガ社）で精製し、コンピテントセルRossetta(DE3)pLysS)(Novagen)にトランスフォーメーションし、プレートにまいた。
【００５７】
プレート上のコロニー一つをLB培地１Lで培養し、A600（波長600nmでの吸収）が０.5になったところでIPTGを最終濃度0.4mMで加え25℃で4時間培養した。その後、集菌して沈殿物をbufferB1(20 mM HEPES(pH 8.5), 500 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.1 % TWEEN 20, 20 μM PMSF, 1 mM DTT)中で超音波して溶菌させた。遠心し上澄み溶液を４℃でキチンビーズカラムに通し、タンパク質を吸着させた。その後、カラムにbufferB2(20 mM HEPES (pH 6.0〜7.5), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA)を通しbuffer交換して室温で8時間放置しインテインの切断反応をおこさせた。その後、溶出することにより目的のペプチドを得た。結果を図４に示す。レーン１がマーカー、レーン２が精製後のペプチドである。インテインの反応後タンパクが切断され望みのペプチドが得られていることがわかる。精製後の濃度を測定したところ、1Lの培地から3  mgのペプチドが得られていた。
【００５８】
本実施例においては、コドンの一文字目をC,A,Gにしているので終止コドンはあらわれないが、終止コドンがあらわれる配列を用いた場合、以下の方法でその様な短いペプチドは除くことができる。本実施例においては、クローニング後に大腸菌で発現されるタンパク質はN末からキチン結合ドメインタンパク-インテイン-ライブラリーであるが、pTWIN1ベクターの制限酵素サイト(Nde1及びSap1)にクローニングするとライブラリ-インテイン-キチン結合ドメインタンパクとなる。この場合、終止コドンが現れて翻訳がライブラリーの途中で止まるとその後のタンパクは翻訳されない。したがってキチン結合ドメインタンパクも翻訳されず精製の際にカラムに吸着されることがないので除かれる。したがって長さが均一のライブラリーが合成できる。
【実施例３】
【００５９】
生成したペプチドを蛍光を発するタンパク質（Green Fluorescent protein（GFP））を発現するプラスミド(pEGFP-Vector (Clontech社))と複合体を組ませる。その複合体を細胞(HeLa S3細胞(理研から入手可能））に加え、48時間後に蛍光顕微鏡で蛍光を発しているか観測する。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によりこれまでのペプチド合成機による合成が困難であった長い（１５アミノ酸以上）ペプチドのライブラリーが簡単に合成できるようになった。
【００６１】
本発明のペプチドライブラリーは有用なペプチドの探索に利用することができる。
【００６２】
また、本発明のペプチドライブラリーの作製方法により、有用なペプチドの探索に利用することができるペプチドライブラリーを作製することができる。
【００６３】
さらに、本発明の核酸ライブライリーの作製方法及びキットにより、２種類以上のアミノ酸のランダムな組合せからなるペプチドライブラリーを作製するための二本鎖オリゴデオキシヌクレオシドを簡単に作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】pTWINベクターを用いて、ペプチドをキチン結合タンパク及びインテインの融合タンパク質として発現させる工程を示す図である。
【図１−２】ペプチドをキチン結合タンパク及びインテインの融合タンパク質として発現させた後、融合タンパク質をキチンビーズに吸着させ、pH及び温度条件を変えることにより、ペプチドを切断し、溶出させる工程を示す図である。
【図２】一本鎖ＤＮＡ（ODN2）から二本鎖ＤＮＡを生成し、二本鎖ＤＮＡを制限酵素処理した後にベクター（pTWIN2）にライゲーションさせるまでの工程を説明する図である。
【図３】インテインの切断反応後、望みのペプチド（M9のペプチド配列）が得られたことを示す電気泳動写真である。
【図４】望みのペプチド（ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、セリンの６種類のアミノ酸をランダマイズさせたペプチド）が得られたことを示す電気泳動写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
＜配列番号１＞
配列番号１は、１個の任意のコドンのアンチセンス部分を有する一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（アンチセンス鎖）の配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、プライマーの配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、M9を含むペプチド配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、実施例１で用いたM9ペプチドをコードするDNAを得るために用いたDNAの配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、実施例１で用いたM9ペプチドをコードするDNAを得るために用いたDNAの配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、実施例１で用いたM9ペプチドをコードするDNAを得るために用いたプライマーの配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、実施例２で用いた一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
2005151923.tif 000003
【図２】
2005151923.tif 000004
【図３】
2005151923.tif 000005
【図４】
2005151923.tif 000006
【配列表】
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