(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(d)のいずれかのブレビバクテリウム（Brevibacterium）属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌にシャペロンベクターを導入し、前記DNA及びシャペロンを共発現させることにより可溶性NADHオキシダーゼを産生し、該NADHオキシダーゼを回収することを含むNADHオキシダーゼの製造方法：
(a) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ；
(b) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ；
(c) 配列番号１７で表わされる塩基配列を含むDNA；及び
(d) 配列番号１７で表される塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)オキシダーゼ及びその製造法に関する。より詳しくは本発明は、酸素分子(Ｏ2)存在下にNADHを基質特異的に酸化して過酸化水素(H2O2)を生成し、Brevibacterium属微生物から得られるNADHの測定等に有用なNADHオキシダーゼ、及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元型補酵素（NADH）を酸化型補酵素（NAD+）へと再生する酵素は、酸化還元酵素と組み合わせることにより各種アルコールを酸化することができることから非常に有用である。NADHオキシダーゼについて種々報告がある（特許文献１〜１１を参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平7-163378号公報
【特許文献２】特開2003―116585号公報
【特許文献３】国際公開第１WO2004/011670号パンフレット
【特許文献４】欧州特許公開第1285962号公報
【特許文献５】特開平8-196281号公報
【特許文献６】欧州特許公開第623677号公報
【特許文献７】特開平5-344890号公報
【特許文献８】特開平5-84072号公報
【特許文献９】特外平4-365478号公報
【特許文献１０】欧州特許公開第385415号公報
【特許文献１１】特開平2-107186号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、Brevibacterium属微生物由来のpH安定性及び熱安定性に優れた新規NADHオキシダーゼをコードするDNAの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
種々の微生物から単離されたオキシダーゼは多数知られている。しかしながら、Brevibacterium属微生物から単離された例はなかった。
【０００６】
一般的にアルコールの酸化反応を行う酸化還元酵素の最適pHは弱アルカリ性の９〜１０程度である。従って、NAD＋の再生を行うNADHオキシダーゼの最適pHもこれと同じ範囲であることが望ましい。しかし、ラクトバチルス由来のNADHオキシダーゼ（デグサ特許）の最適pHは６付近であり、再生系酵素として適当ではない。また、再生系酵素としては高い熱安定性が求められる。
【０００７】
本発明者らは、これらの優れた特性の酵素を得ようと鋭意検討を行なった。その結果、本発明者等が新たに分離したBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼが、アルカリ側に至適pHを有し、また熱安定性も高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  下記の酵素学的性質を有するBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ：
（１）酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する；
（２）至適pHは８〜10付近である；
（３）70℃、１時間の熱処理でも失活せず、80％以上の残存活性を有する；
（４）至適温度は50〜70℃である；
（５）アンモニウム塩により活性化される；及び
（６）分子量はSDS-PAGEで測定した場合50〜60kDaである。
[２]  さらに、以下の酵素学的性質を有する[１]の酵素：
（７）NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない；及び
（８）Kmは約0.022mMである。
[３]  Brevibacterium sp.KU1309（受託番号：FERM P-21008）由来である[１]又は[２]のNADHオキシダーゼ。
[４]  Brevibacterium属微生物を培養し、培養物からNADHオキシダーゼを回収することを含む、[１]〜[３]のいずれかのNADHオキシダーゼの製造法。
[５]  Brevibacterium属微生物が、Brevibacterium sp.KU1309（受託番号：FERM P-21008）である[４]のNADHオキシダーゼの製造法。
[６]  以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼ。
(a) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ
(b) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ
[７]  以下の(a)又は(b)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(a) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を含むNADHオキシダーゼ
(b) 配列番号１８で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつNADHオキシダーゼ活性を有するNADHオキシダーゼ
[８]  以下の(c)又は(d)のBrevibacterium属微生物由来のNADHオキシダーゼをコードするDNA。
(c) 配列番号１７で表わされる塩基配列を含むDNA
(d) 配列番号１７で表わされる塩基配列を含むDNAと相補的な配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、NADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
[９]  [８]のDNAを含有する発現ベクター。
[１０]  [９]の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
[１１]  [１０]の宿主細胞をDNAの発現可能な条件下で培養して、NADHオキシダーゼを産生させ、該NADHオキシダーゼを回収することを含むNADHオキシダーゼの製造方法。
[１２]  宿主細胞が大腸菌であって、[９]記載の発現ベクターをシャペロンプラスミドを共発現させることにより可溶性NADHオキシダーゼを製造する、[１１]の製造方法。
[１３]  [１]〜[３]及び[６]のいずれかのNADHオキシダーゼを用いて、光学活性マンデル酸又はD-フェニルアラニンを製造する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のNADHオキシダーゼは、pH安定性及び熱安定性に優れており、必要不可欠な補酵素再生系酵素として非常に有用であり高効率な反応プロセスを実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の酵素は、土壌中に生息するBrevibacterium属微生物より単離することができる。Brevibacterium属微生物の単離は公知の方法で行なうことができる。Brevibacterium属微生物として、Brevibacterium sp.KU1309が挙げられ、Brevibacterium sp.KU1309は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に2006年８月29日付けで寄託されている（受託番号：FERM P-21008）。
【００１１】
Brevibacterium sp.KU1309の菌学的性質は以下の通りである。
(a)形態
（１）細胞の大きさ：0.8×1.0〜1.5μm(24h)、0.8×0.8〜1.0μm(72h)の桿菌。Rod-coccus cycleあり。
（２）グラム染色性：陽性。
（３）胞子の有無：なし。
（４）運動性：なし。
（５）コロニー形態（培地；Nutrient Agar、培養時間24時間）：
円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、黄色。
（６）生育温度：37℃で＋、45℃で−。
（７）カタラーゼ：陽性。
（８）オキシダーゼ：陰性。
（９）酸/ガス産生（グルコース）：-/-。
（１０）O/Fテスト（グルコース）：-/-。
【００１２】
また、16S rDNA塩基配列を配列番号１に示す。
【００１３】
上記の菌学的性質により、本発明のBrevibacterium sp.KU1309は新種微生物であると同定された。
【００１４】
本発明の酵素は、上記微生物培養物より高いアルコール酸化活性を有するNADHオキシダーゼとして精製することができる。微生物の培養は公知の方法で行なうことができる。例えば、普通ブイヨン20ｇ（極東製薬工業）、酵母エキス５g（極東製薬工業）を含む培地を用いて培養すればよい。上記微生物を１〜２日培養し、菌体を破砕し菌体抽出液から本発明の酵素を精製することができる。本発明の酵素の精製も、公知の方法で行なうことができる。例えば、超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的破砕、フレンチプレス、界面活性剤、溶菌酵素などを用い菌体を破砕し抽出液を得て、さらに抽出液については硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイミンポリマーなどの凝集法、熱処理、さらにはイオン交換クロマトグラフィーなどにより精製することができる。例えば、Butyl toyopearlカラム（東ソー）を用いて行なえばよい。
【００１５】
本発明の酵素の酵素活性はNADHがNAD＋へ酸化されると減少する340nmの吸光度を吸光光度計で測定することにより測定することができる。NADH１μモルを１分間あたりに酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１６】
本発明の酵素をNOXと呼ぶことがある。
【００１７】
本発明のNADHオキシダーゼは以下の性質を有する。
（１）本発明の酵素は以下の反応式で酸素を受容体としてNADHの酸化反応を触媒し、NAD+と過酸化水素を生成する
ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+ ＋ Ｏ2 → ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ2；
（２）本発明の酵素の至適pHは８〜１０付近であり、酸化還元酵素と共にアルコールの酸化反応を行う際に、好適である；
（３）本発明の酵素は温度安定性に優れており、70℃、１時間の熱処理でも失活せず、80％以上、好ましくは90％以上、さらにほぼ100％の残存活性を有する。この性質は、物質生産プロセスに於いて好適である；
（４）本発明の酵素の至適温度は50〜70℃、好ましくは約60℃である；
（５）本発明の酵素はアンモニウム塩により活性化される。反応系を弱アルカリ性に保つ際にアンモニア水を用いると、酵素も活性化されるので好適である；
（６）本発明の酵素はZn2+(39％)、Cu2+（42％）、Ag+(37％)などの柔らかい酸に阻害される；
（７）本発明の酵素は、NADPHに対する酸化活性は小さく、さらに、FADやFMNによる活性化は認められない。NADPHを酸化できないという本酵素の特性は、NADHとNADPHが混在する生体試料中のNADH量を選択的に測定できるという利点がある。；
（８）本発明の酵素のKmは0.1mM以下、好ましくは約0.02mM例えば0.022mMである；
（９）本発明の酵素を用いてNADHを１mol酸化すると、１molの過酸化水素が生成する；及び
（１０）本発明の酵素はホモダイマーを形成し、サブユニットの分子量はSDS-PAGEで測定した場合、50kDa〜60kDa、好ましくは約57kDaである。ゲルろ過で想定したホモダイマーの分子量は約102kDaである。また、アミノ酸配列から推定したサブユニットの分子量は約49kDaである。
【００１８】
本発明の酵素をコードするDNAの塩基配列を図３及び配列番号１７に示す。また、本発明の酵素のアミノ酸配列を図３及び配列番号１８に示す。
【００１９】
本発明の酵素は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質がNADHオキシダーゼ酵素活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００２０】
例えば、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜10個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜10個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜10個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２１】
このような配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号１８のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
【００２２】
このような配列番号１８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号１８のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
【００２３】
また、配列番号１７に表される塩基配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAと下記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAであってNADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAも本発明のDNAに含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。あるいは、サザンブロッティング法によりニトロセルロース膜上にDNAを転写、固定後、ハイブリダイゼーション緩衝液〔50％ フォルムアミド、４×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×デンハルツ（Denhardt, s）溶液、100μg/mlサケ精子DNA〕中で42℃で一晩反応させることによりハイブリッドを形成することができるDNAである。
【００２４】
さらに、上記DNAに対するRNA、又は該RNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるRNAであってNADHオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするRNAも本発明に含まれる。
【００２５】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のDNAを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターDNAは、広く普及した入手の容易なものが用いられる。例えば、pETベクター、pQEベクター、pColdベクター、pUC19ベクター等が挙げられる。
【００２６】
本発明の発現ベクターの構築方法は、特に限定されるものではなく常法により行うことができる。
【００２７】
本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞は、本発明のDNAを発現し得るものであれば特に制限されないが、例えば、細菌としては大腸菌、枯草菌等が、酵母としてはサッカロマイセス・セレビィシエ等が、動物細胞としては、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（CHO）細胞、サルCOS細胞、マウス線維芽細胞等が挙げられる。
【００２８】
本発明は、上記DNAを含む宿主細胞をDNAの発現可能な条件下で培養して、NADHオキシダーゼを産生させ、該NADHオキシダーゼを回収することを含むNADHオキシダーゼの製造方法を包含する。
【００２９】
本発明の酵素を大腸菌で大量に発現させた場合、タンパク質のフォールディンがうまくいかず、不溶性画分に封入体として生産されやすい。そこで、大腸菌においてシャペロンプラスミドと共発現させ、シャペロンによる可溶化を促進させることが好ましい。シャペロンプラスミドとして、pGro7、pKJE7、pTf16等が挙げられる。
【００３０】
宿主細胞により産生されたNADHオキシダーゼは、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、クロマトフォカシング、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動法等の公知の精製法を単独又は組み合わせて精製することができる。
【００３１】
本発明の酵素は、酸化反応に必要な還元型補酵素（NADH）を酸化型補酵素（NAD+)へと再生することができる。本発明の酵素を他の酸化還元酵素と組合せることにより各種アルコールを酸化することができる。また、例えば、マンデル酸デヒドロゲナーゼやL-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼと組合せ、カップリング反応を行なわせることにより光学活性（S)-マンデル酸や光学活性D-フェニルアラニンを製造することができる。また、本発明の酵素は、H2O2の定量法と組み合わせてNADHが関与する各種脱水素酵素の活性測定及びNADを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測定に利用できる。また、バイオ燃料電池や酵素診断薬への応用も期待される。
【実施例】
【００３２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１  酵素の精製
（１）細胞の培養
Brevibacterium属微生物Brevibacterium sp.KU1309を土壌から単離し、以下の方法で培養した。単離したBrevibacterium sp.KU1309は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に2006年８月29日付けで寄託した（受託番号：FERM P-21008）。
【００３４】
培地は１リットルあたり、普通ブイヨン20ｇ（極東製薬工業）、酵母エキス５g（極東製薬工業）を溶かしたものを２M  水酸化ナトリウムでpH7.0に調整し120℃、20分加熱滅菌したものを用いた。
【００３５】
培地10mlの入った試験管に、固体培地上のBrevibacteriumを白金耳で植菌し、30℃で24時間、振とう培養した。この細胞懸濁液１mlを培地100mlの入った500ml坂口フラスコに加え、30℃で24時間、振とう培養を行い、遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞はリン酸緩衝溶液で洗浄し、再び遠心分離により細胞を回収した。これは−20℃でかなり長期保存することができる。
【００３６】
（２）酵素精製
無細胞抽出液の調製
湿潤した細胞（20g）を100mMリン酸緩衝溶液（pH7.0）５mM 2-メルカプトエタノールに懸濁し、Dyno-mill(Willy A. Bachofen Co.)で破砕した。この混合物を遠心分離し、上澄みを回収し、これを無細胞抽出液とした。
【００３７】
（３）酵素活性の測定
酵素活性は、NADHがNAD＋へ酸化されると減少する340nmの吸光度を吸光光度計で測定して評価した。反応は0.1mM NADH、100mMトリス塩酸（pH8.8）、500mM硫酸アンモニウムに酵素溶液を加えて行った。１ユニットはNADH１μモルを１分間あたりに酸化する酵素量として定義した。
【００３８】
（４）硫安分画
無細胞抽出液を０℃で攪拌しながら、硫酸アンモニウムを35％飽和の濃度となるまで15分間かけて少しずつ添加した。その後さらに１時間攪拌した。遠心分離により沈殿を除去し、上澄みに65％飽和となるまで硫酸アンモニウムを15分間かけて加えた。加え終わってから１時間攪拌した後、遠心分離により沈殿を回収した。この沈殿を10mMリン酸緩衝溶液、５mM 2-メルカプトエタノール、30%飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解した。
【００３９】
（５）クロマトグラフィー
５mM 2-メルカプトエタノール、飽和30％硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(=緩衝溶液A)で平衡化したPhenyl toyopearlカラム（東ソー、カラム体積150ml）に試料をのせた。Econo Gradient Pump（Bio Rad）を用いてクロマトグラフィーを行った(流速1.5ml/min)。450mlの緩衝溶液Aで洗浄したのち、450mlの緩衝溶液Aと450mlの５mM 2-メルカプトエタノール、20％飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液B(pH7.0)の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出させた。各フラクションの酵素活性を調べ、活性フラクションを集めて、10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)に透析した。このフラクションプールを５mM 2-メルカプトエタノール、200mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)（緩衝溶液C）で平衡化されたDEAE toyopearlカラム(東ソー、カラム体積50ml）にのせた。150mlの緩衝溶液Cで洗浄後、150mlの緩衝溶液Cと150mlの５mM 2-メルカプトエタノール、300mM NaClを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)（＝緩衝溶液D）による、NaCl直線勾配でタンパク質を溶出した（流速１ml/min）。これらの中から活性のあるフラクションを回収し、30％飽和となるまで硫酸アンモニウムを加えた。この溶液を、５mM 2-メルカプトエタノール、30％飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)(=緩衝溶液E)で平衡化したButyl toyopearlカラム（東ソー、カラム体積10ml）にのせた。30mlの緩衝溶液Eで洗浄後、30mlの緩衝溶液Eと30mlの５mM 2-メルカプトエタノール、15％飽和硫酸アンモニウムを含む10mMリン酸緩衝溶液(pH7.0)（＝緩衝溶液F）の硫酸アンモニウム直線勾配でタンパク質を溶出した（流速１ml/min）。活性なフラクションを回収し、10mMリン酸緩衝溶液（pH7.0）に透析した。Butyl toyopearlカラムによる各フラクションの酵素活性を図１Bに示す。図１Aに示すように単一ピークが認められた。さらに、精製後にSDS-PAGEを行った。CBBによる染色では50kDa付近（56.8kDa）に均一なバンドを確認することができた（図１A）。またゲルろ過クロマトグラフィーから非変性状態での分子量は102kDaであったことから２量体として存在する酵素であることがわかった。また精製した酵素の溶液は黄色透明であったことからフラビン酵素であると考えられる。
【００４０】
精製過程における酵素活性、収率を次の表１にまとめた。
【００４１】
【表１】
0005115708.tif 000002
【００４２】
実施例２  Brevibacterium sp.から単離したNADHオキシダーゼの酵素学的性質
（１）pH依存性
pH5.5〜11.5の範囲で酸化反応の最適pHを測定した。緩衝溶液は各pH範囲に適した緩衝溶液、すなわちMES(pH5.5〜6.5)、MOPS(pH6.5〜7.4)、HEPES(pH7.0〜8.0)、Tris(pH7.5〜8.8)、グリシン(pH8.8〜10.4)、CAPS(pH9.4〜10.8)、リン酸ナトリウム(pH10.54〜11.52)を用いた。各pHでの相対反応速度を図２にまとめた。
本酵素は、アルカリ側pH8.5〜10）に至適pHを有することが判明した。
【００４３】
（２）pH安定性
酵素をpH4.5〜11.5の各pHで70℃、１時間インキュベートし、その後の残存活性を測定した。緩衝溶液はクエン酸(pH4.7)、MES(pH5.5、6.3)、MOPS(pH6.6、7.4)、Tris(pH7.4、8.5)、TAPS(pH8.4、9.2)、CAPS(pH9.4、10.2)、リン酸ナトリウム(pH10.5、11.5)を用いた。
【００４４】
70℃の加熱を行っていない状態を100％として残存活性をプロットしたのが図３である。
図に示すようにpH６〜10の広いpH範囲で安定であった。
【００４５】
（３）熱安定性
MOPS緩衝溶液(pH6.6)中での熱に対する安定性の検討を行った。各温度で１時間インキュベートし、その後の活性を室温で測定した。これを図４のグラフの(◆)で示した。また各温度（30℃〜70℃）で酵素活性を測定し、これを図４のグラフに（□）で示した。
図に示すように70℃、１時間のインキュベートに対してほぼ100％安定であった。
【００４６】
（４）塩の効果
各種塩を加えて反応を行い、340nmの吸光度を測定し反応速度を決定した。図５Aに各種塩の酵素活性に対する効果を示す。このようにアンモニウム塩を加えることに酵素活性は上昇することがわかった。そこで、アンモニウム塩濃度の酵素活性に対する影響を調べた。方法は、硫酸アンモニウムを０Mから4.35Mの各濃度存在下で反応を行い、反応速度の相対値を算出した。図５Bにアンモニウム塩の酵素活性に対する効果を示す。
図に示すように、活性にはアンモニウム塩が必要であり、活性が最大となるアンモニウム塩濃度（[NH4+]）は、3.0Mであった。
【００４７】
（５）阻害実験
酵素溶液を100mM Tris-HCl(pH8.8)に加え、さらに阻害剤を終濃度１mMとなるように加え、３分間室温でインキュベートした。その後、NADHを10μM、(NH4)2SO4を500mMとなるように加え、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
図６に相対活性値を示す。図６に示すように、Zn2+(39％)、Cu2+（42％）、Ag+(37％)などの柔らかい酸に阻害された。
【００４８】
（６）速度論的解析
速度論的解析はNADH濃度を10μMから100μMの間で反応速度を測定し、この値からLineweaver-Burkプロットを作成した。反応は次のように行った。反応液｛NOX;0.28ug/ml、NADH;10μM-100μM、(NH4)2SO4; 500mM、Tris-HCl；100mM (pH8.8)｝を吸光光度計用セルに入れ、340nmの吸光度を測定することにより、反応速度を決定した。
【００４９】
図７にLineweaber-Burkプロットの結果を示す。
【００５０】
表２にNADHに対するKineticsを示す。
【００５１】
【表２】
0005115708.tif 000003
【００５２】
表３に基質及びCofactorによる活性を示す。
【００５３】
【表３】
0005115708.tif 000004
【００５４】
本発明の酵素のKmは0.022mMとかなり小さかった。また、NADPHに対する酸化活性は小さかった。さらに、FADやFMNによる活性化は認められなかった。
【００５５】
（７）酵素による酸素分子の還元状態
NOXはH2O副生型とH2O2副生型に分類される。図８Aに示すアッセイ法を用いてH2O2の生成確認と定量を行った。
まず、既知濃度の過酸化水素とo-ジアニシジン、ペルオキシダーゼを用いて反応を行い、[H2O2] vs Abs460の検量線を作成した。これによって得られたプロットが、図８Bの（◆）である。つづいて、実際にNOXでのNADH酸化反応を行い、反応後に生成した過酸化水素濃度を測定した。すなわち、NOXによる酸化反応をNADH濃度を75μM、100μM、150μMで行い、十分な反応時間で反応を完了した。反応の完了は吸光光度計により確認した。この反応液50μlを、o-ジアニシジン、ペルオキシダーゼを含む100mMのリン酸緩衝溶液（ｐH7.0）に加え、吸光度を測定した。これにより得られたプロットが図８Bの（□）で示した。一番左から、NADH濃度が75、100及び150μMの時のAbs460である。これは[H2O2]濃度と同じ値をとっていることがわかる。
このことから、H2O2の生成が確認できた。またNADHを１mol酸化すると、１molの過酸化水素が生成することがわかった。
【００５６】
実施例３  NADHオキシダーゼの利用例
(i)マンデル酸デヒドロゲナーゼとの併用による光学活性マンデル酸の調製
Enterococcus faecalis IAM 10071からのマンデル酸デヒドロゲナーゼ（Tamura, Y., et al. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:957-957）とBrevibacterium sp.からのNADHオキシダーゼを組み合わせることで、マンデル酸の酸化を行った。
【００５７】
マンデル酸デヒドロゲナーゼは簡易精製して用いた。以下に方法を示す。
【００５８】
MRS培地10mlの入った試験管にEnterococcus faecalisIAM 10071を固体培地から白金耳を用いて植菌し、30℃で24時間振とう培養した。この培養液をMRS培地1.2リットルの入った5リットルの三角フラスコ（バッフルつき）に全量移し、30℃で48時間、旋回培養した。培養液から遠心分離によって細胞を回収し、湿潤細胞9.2gを得た。これを100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、５mM 2-メルカプトエタノールに懸濁し、ミルによって細胞を破砕した。遠心分離によって未破砕菌体を除去し、無細胞抽出液を得た。マンデル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性はマンデル酸の酸化に伴い生成するNADHの340nmの吸光度を吸光光度計により測定した。反応は50mMラセミ体マンデル酸、１mM NAD+、100ｍMトリス塩酸（pH8.8）に酵素溶液を加えて行った。25％〜60％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿したタンパクを遠心分離によって回収し、10mMトリス塩酸緩衝溶液（pH7.5）に溶解し、同緩衝液で透析した。この酵素溶液を５mM 2-メルカプトエタノール、100mM NaClを含む10mMトリス塩酸(pH7.5)で平衡化したDEAE toyopearlカラム（カラム体積50ml、流速１ml/min）にのせた。平衡化した緩衝溶液で洗浄後、150mlの平衡化した緩衝溶液と150mlの5mM 2-メルカプトエタノール、200mM NaClを含む10mMトリス塩酸(pH7.5)、を用いて直線勾配によりタンパク質を溶出した。このフラクションから活性画分を集め、Amicon Ultra(MILLI PORE)により濃縮してマンデル酸デヒドロゲナーゼの部分精製酵素を得た。
【００５９】
マンデル酸デヒドロゲナーゼとNADHオキシダーゼの併用反応は次の組成で行った。２mMラセミ体マンデル酸、0.1mM NAD+、250mM硫酸アンモニウム、100mMトリス塩酸(pH 8.8)、NADHオキシダーゼ0.1U/ml、マンデル酸デヒドロゲナーゼ0.1U/mlの混合物を30℃でインキュベートし、HPLCによりマンデル酸の光学純度を決定した。[HPLC条件：CHIRALCEL OD-H (ダイセル化学工業)、展開相  ヘキサン/イソプロピルアルコール＝19/1 0.2％トリフルオロ酢酸、流速0.5ml/min、検出UV 254nm、保持時間(S)−マンデル酸22.14min,（R）−マンデル酸27.23min]
本発明の酵素とマンデル酸デヒドロゲナーゼのカップリング反応の反応機構を図９Aに示す。
【００６０】
この結果、48時間後にはR体のマンデル酸は全て酸化され、光学活性(S)-マンデル酸が得られた。
【００６１】
(ii)L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼとの併用によるD−フェニルアラニンの調製
L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼは和光純薬より購入したものを用いた。
反応は次の組成で行った。2.5mM DLフェニルアラニン、0.1mM NAD+、10mM硫酸アンモニウム、100mM CAPS(pH 10.2)、NADHオキシダーゼ0.2U/ml、L-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ0.2U/mlの混合物を30℃でインキュベートし、HPLCによって系中のフェニルアラニンの光学純度を調べた。[HPLC条件：Crownpak CR(+)展開相5.7％過塩素酸、流速0.5ml/min、検出UV200nm、保持時間D-フェニルアラニン18.5min、L-フェニルアラニン25.1min]
【００６２】
本発明の酵素とL-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼのカップリング反応の反応機構を図９Bに示す。
【００６３】
この結果、48時間後にはL体のフェニルアラニンは全て酸化され、光学活性D-フェニルアラニンが得られた。
【００６４】
このように、Brevibacterium sp.からのNADHオキシダーゼは広いpH適性（特に弱アルカリ側）と高い安定性を有しているので、非常に汎用性が高い。
【００６５】
実施例４  酵素遺伝子のクローニング
単離した酵素遺伝子のクローニングは、N末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列を解析後、縮重プライマーを用いたPCRで断片を獲得しインバースPCRにより全長遺伝子配列のクローニングを行った。以下に詳細を示す。
【００６６】
N末端アミノ酸配列
実施例１に記載の方法で精製した酵素についてSDS-PAGEを行った。アクリルアミドゲルからセミドライブロッティング装置によってPVDF膜に転写した。この膜をCBB染色して、目的のバンドをプロテインシーケンサーを用いて解析したところ、本酵素のN末端はXDELTYDLVVLGGGTGG（配列番号２）であることが分かった。
【００６７】
内部アミノ酸配列
実施例１に記載の方法で精製した酵素についてSDS-PAGEを行った。SDS-PAGEをCBB染色し目的のバンドを切り出し、ゲル内消化を行った。はじめはリジルエンドペプチダーゼによる消化を試みたが、なかなかペプチド断片に分解することができずHPLCではあまり切断されていない大きな断片のものと思われるピークが観察された。そこでトリプシンを用いて消化を行うこととした。トリプシンはリジンとアルギニンのC末端を切断する酵素なので、リジルエンドペプチダーゼを用いた場合より、細かく断片に消化できると期待した。この結果、断片化することに成功しプロテインシーケンサーによって解析したところ、GPVTEGFGFEEQGIPMDR（配列番号３）であることがわかった。
【００６８】
縮重PCR
得られたN末端及び内部配列をもとに以下のような縮重したセンスプライマー(F01,F02)とアンチセンスプライマー(R01,R02)を設計した。
DELTYDLVVL（配列番号４）に対応したNOX degenerate primer F01 
5’- GAYGARYTIACITAYGAYYTIGTIGTNYT-3’（配列番号５）
VLGGGTGGY（配列番号６）に対応したNOX degenerate primer F02 
5’-AARYTIGGNGGIGGNACIGGIGGNTA-3’（配列番号７）
PVTEGFGFE（配列番号８）に対応したNOX degenerate primer R01
5’-TCRAANCCRAAICCYTCIGTNACNGG-3’（配列番号９）
TEGFGFEEQ（配列番号１０）に対応したNOX degenerate primer R02 
5’-TCCATIGGDATNCCYTGYTCYTCRAA-3’（配列番号１１）
【００６９】
反応は表４に示す組成及び方法でプライマーを(F01×R01)、(F01×R02)、(F02×R01)、(F02×R02)と組み合わせて行った。初めはゲノムDNAをテンプレートとして試みたが増幅が安定せず、回収量が少なかった。そこでEcoRＩ消化物、PstＩ消化物を用いて反応を行ったところ、EcoRＩ消化物で行った場合に図１０のレーン５に示すように800b.p.程度のDNAフラグメントを得ることができた。この際、縮重度が上がり過ぎないようにイノシンを用いた。図１０中レーン１〜４はテンプレートにPstI消化物を用いた場合の結果であり、レーン５からはテンプレートにEcoRI消化物を用いた場合の結果である。プライマーの組合せは、レーン１及び５がF01×R01、レーン２及び６がF01×R02、レーン３及び７がF02×R01、レーン４及び８がF02×R02である。
【００７０】
【表４】
0005115708.tif 000005
【００７１】
得られたDNA断片を精製しpGEM（登録商標） T-easy ベクターへライゲーションした(16℃, 30 min)。XL10-Gold(Zコンピテントセル)を形質転換しアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布した。Colony direct PCRによりインサートの確認を行い、陽性クローンからプラスミド(pGEMNOXin)を抽出した。得られたプラスミドに対しM13プライマーを用いてシークエンス解析を行い、825b.p.の内部遺伝子配列を同定した。
【００７２】
サザンハイブリダイゼーション
得られた遺伝子断片を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。pGEMNOXinからNotＩを用いて酵素の内部配列を切り出し、精製してこれをプローブとしてゲノミックサザンハイブリダーゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは55℃で終夜振とうすることで行った。また一次洗浄も55℃で行った。この結果を図１１に示す。図１１(a)はUVによるゲノム消化物の検出の結果を示し、図１１(b)は酵素発行による検出の結果を示す。用いたサンプルは、レーン１〜６でそれぞれSal I消化物、Sac I消化物、Hinc II消化物、Xho I消化物、Bgl I消化物、Sma I消化物であり、Mはマーカーである。Sal・Ｉ消化物中に約3000b.p.程度のフラグメントが検出された。
【００７３】
インバースPCR
ゲノムDNAのSalＩ消化物をアガロースゲルで分離し2.0kb.p.〜3.4kb.p.の部分を切り出し精製しTEに溶解しDNA断片溶液(20ng/μL)を得た。この溶液20μLに水80μLとTOYOBO社製2×Ligation highを100μL加え16℃で終夜静置した。この溶液を精製して50μLのTE溶液としてインバースPCRに用いた。インバースPCRには以下のプライマーを組み合わせて用いた。
【００７４】
NOX inverse primer F01; 5’-ACGGTGCAGGCAGGTGCCTCCCACCTTGTC-3’（配列番号１２）
NOX inverse primer F02; 5’-GCGTTCGATCAAAGCGACCTTCATGTCGAG-3’（配列番号１３）
NOX inverse primer R01; 5’-GGCGTCATGTTCAAGGGCGTCGAAGAGACG-3’（配列番号１４）
NOX inverse primer R02; 5’-GCCGACGGGGTCAAGGTCACTCTCGAAGAC-3’（配列番号１５）
反応は表５に示す組成及び方法で行った。
【００７５】
【表５】
0005115708.tif 000006
【００７６】
結果を図１２に示す。図１２に示すように、これによりプライマー(F02×R02)の組み合わせで2.6kb.p.程度のDNA断片を得た。この断片をアガロースゲル電気泳動によって切り出し精製した。このPCR産物をNOX inverse primer F02, NOX inverse primer R02を用いてシークエンス解析を行い、N末端の縮重部分と1300b.p.までの遺伝子配列を解析した。C末端まで解析するために以下のプライマーを用いてnoxの全長遺伝子を同定した。
NOX sequence 2; 5’-TCCGTCGGACTCTCCTCTGCACAG-3’（配列番号１６）
【００７７】
このフラグメントに関してシークエンスを解析することで、精製した酵素をコードする全塩基配列を取得した。遺伝子配列解析から該酵素はアミノ酸462残基からなる48909.99Dalton の酵素であることがわかった。配列解析の結果を図１３A〜Cに示す。また、塩基配列を配列番号１７に、アミノ酸配列を配列番号１８に示す。
【００７８】
実施例５  Brevibacterium sp.KU1309由来NADHオキシダーゼの組み換え大腸菌を用いた大量発現系の構築
大腸菌を用いて本酵素の大量発現に関する検討を行った。
【００７９】
遺伝子の調製
Brevibacterium sp.KU1309ゲノムをテンプレートとして、プライマーを以下のように設計した。N末端のバリン(GTG)はメチオニン(ATG）に換えて設計した。
NOXForNde01: 5’-GGAATTCCATATGAGTGACGAATTGACCTACGACCTT-3’（配列番号１９）下線はNdeＩサイト）
NOXRevEco01:5’-GGAATTCTTATGAGTGGAAGTGCAGGGGTTTGCC-3’（配列番号２０）
(下線はEcoRＩ, 斜体は終止コドン)
【００８０】
このプライマーとKU1309のゲノムDNA(SalＩ)消化物をテンプレートとして表６に示す組成及び方法でPCRを行った。
【００８１】
【表６】
0005115708.tif 000007
【００８２】
ベクターの構築
得られた遺伝子（nox遺伝子）を用いてpET21-b(+)とpCold ＩＩＩに組み込んだプラスミドpET21BNOX, pCBNOXを作成した。pET21BNOXはT7プロモータ制御下に野生型BNOXを発現するように挿入した。pCBNOXはコールドショックプロモーター制御下にTEE融合型BNOXを発現するように挿入した（図１４）。
【００８３】
発現検討
構築したプラスミドベクターを用いて、様々な宿主に関して発現検討を行った。発現は37℃で培養後、IPTGを添加後、数時間誘導することで行った。得られた菌体を超音波で破砕し、その上清中のNADH酸化活性を測定した。IPTGを添加していない場合でも、大腸菌自体がNOX活性を有しているため、IPTGの非添加時と比べて有意な差のある系を検討することとした。この結果を表７に示す。
【００８４】
【表７】
0005115708.tif 000008
【００８５】
表７に示すように、一部の宿主で大量に発現するものの、ほとんどが封入体を形成してしまった。そこで、この問題を解決するため、シャペロンプラスミドを導入した大腸菌を用いて発現してみることとした。大腸菌は先の検討の結果で、可溶性活性酵素として発現していたBL21(DE3)を用いることとした。この結果を表８に示す。また、SDS-PAGEの結果を図１５に示す。図１５中、レーン１はpGro7との発現（誘導あり）、レーン２はpGro7との発現（誘導なし）、レーン３はpKJE7との発現（誘導あり）、レーン４はpKJE7との発現（誘導なし）を示す。
【００８６】
【表８】
0005115708.tif 000009
【００８７】
表８に示すように、pGro7やpKJE7を用いた場合に活性の向上が見られた。また図１５に示すように、可溶性画分に目視できる程度の発現に成功した。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】Butyl toyopearlカラムを用いた本発明の酵素の精製の結果を示す図である。
【図１Ｂ】本発明の酵素のSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図２】本発明の酵素のpHプロフィールを示す図である。
【図３】本発明の酵素のpH安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の温度安定性を示す図である。
【図５Ａ】各種塩の本発明の酵素に対する効果を示す図である。
【図５Ｂ】アンモニウム塩の本発明の酵素に対する効果を示す図である。
【図６】本発明の酵素の酸による阻害を示す図である。
【図７】本発明の酵素のKineticsを示す図である。
【図８Ａ】本発明の酵素による酸素分子の還元状態を決定する方法を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の酵素による酸素分子の還元状態を示す図である。
【図９Ａ】本発明の酵素とマンデル酸デヒドロゲナーゼのカップリング反応を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の酵素とL-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼのカップリング反応を示す図である。
【図１０】本発明の酵素遺伝子のクローニングにおける縮重PCRの結果を示す図である。
【図１１】本発明の酵素遺伝子の断片を用いたサザンブロッティングの結果を示す図である。
【図１２】本発明の酵素遺伝子を用いた印バースPCRの結果を示す図である。
【図１３Ａ】本発明の酵素遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１３Ｂ】本発明の酵素遺伝子の塩基配列を示す図である（図１３Aの続き）。
【図１３Ｃ】本発明の酵素遺伝子の塩基配列を示す図である（図１３Bの続き）。
【図１４】本発明の酵素の組換え大腸菌を用いた発現のためのプラスミドの構造を示す図である。
【図１５】シャペロンとの共発現による本発明の酵素の発現（可能性画分）を示す図である。
【図１Ａ】
0005115708.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
0005115708.tif 000016
【図６】
0005115708.tif 000017
【図７】
0005115708.tif 000018
【図８Ａ】
0005115708.tif 000019
【図８Ｂ】
0005115708.tif 000020
【図９Ａ】
0005115708.tif 000021
【図９Ｂ】
0005115708.tif 000022
【図１０】
0005115708.tif 000023
【図１１】
0005115708.tif 000024
【図１２】
0005115708.tif 000025
【図１３Ａ】
0005115708.tif 000026
【図１３Ｂ】
0005115708.tif 000027
【図１３Ｃ】
0005115708.tif 000028
【図１４】
0005115708.tif 000029
【図１５】
0005115708.tif 000030
【配列表】
0005115708000001.app