(57)【要約】 【課題】  試料中の種々のチオール基あるいはスルフィド基を含有する化合物を、簡便、迅速かつ高精度で検出し、その濃度を測定する。【課題解決手段】  試料内のチオール基あるいはスルフィド基含有化合物を電極表面上に吸着・固定・濃縮し、これを還元的に脱離させ、その電流値、あるいはその時間積分値すなわち脱離電気量、及び脱離時の電位を計測することにより、上記化合物の化学種を識別、検出し、かつその濃度を求める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中でマイナス電位を印加させて還元的に脱離させ、脱離に伴う電気量を計測し、この計測値から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物濃度を求めることを特徴とする、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の濃度測定方法。
【請求項２】
チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中で電極にマイナス電位を印加させて還元的に脱離させ、脱離時の電位から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の化学種を識別し、検出する方法。
【請求項３】
チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中で電極にマイナス電位を印加させて還元的に脱離させるとともに、脱離電気量を計測し、該計測された電気量、及び脱離時の電位から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の化学種毎にその濃度を求めることを特徴とする、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の濃度測定方法。
【請求項４】
試料が、チオール基あるいはスルフィド基を有するプロドラッグを含有するものである請求項1〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料が、チオール基あるいはスルフィド基を有する、薬物代謝物、体内物質あるいは生理活性物質を含むものである請求項1〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極、該電極にマイナス電位を電位可変に印加する手段、及び電極電流値を計測する手段を有することを特徴とする、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の識別、検出及び／又はその濃度を測定する装置。
【請求項７】
電極にマイナス電位を電位可変に印加する手段が、一定の割合でマイナス電位を増大させる手段を伴うものである、請求項６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料溶液中に含まれるチオール基又はスルフィド基含有化合物を識別して検出し、かつその濃度を測定するための方法及び装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、６-メルカプトプリンや６-チオグアニンは、腫瘍細胞の発育に必須な代謝物質と拮抗し、細胞の発育・増殖を押さえることで主に小児癌、急性・慢性白血病の治療薬として代表的に使われてきた。これら薬物は重篤な副作用として肝障害、腎障害、消化器障害、貧血などを起こすので、投与する量を予め慎重に検討する必要がある。副作用をできるだけ抑え全投与量の適切化を図るために、頻繁に血液・肝機能・腎機能検査などの臨床検査を行い患者の状態を細かく把握する必要がある。血清中の６-メルカプトプリン等の薬物検出にはこれまで主に高速液体クロマトグラフィー（high-performancd liquid chromatography (HPLC)）による分析が行われてきた。HPLCによる分析は比較的大がかりな装置が必要であり、頻繁に測定する場合には煩雑で、寛解を目指す治療および、寛解後の健康状態を維持するために必要とされる当該薬物の投薬量・投薬計画は、古い臨床結果を元にしたプロトコールをそのまま利用するしかないのが現状である。また、チオール基、スルフィド基等を含有する含硫黄化合物は、例えば生理活性ペプチド等にみられるように、生理学的に重要な働きを有するものが多く、試料中のこのような含硫黄化合物の検出あるいはその濃度測定を簡便かつ迅速に行いうる手段は極めて重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、このような事情のもとで、上記６-メルカプトプリン、６-チオグアニン等をはじめとする、種々のチオール基あるいはスルフィド基を含有する化合物を、簡便、迅速かつ高精度で検出し、あるいはその濃度を測定することで薬物及び代謝物を区別しながら高感度に検出するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、高速液体クロマトグラフィー等の従来の測定と比較してはるかに簡便で検出感度のよい、電気化学的測定法に着目し、鋭意研究を行った。その結果、試料内のチオール基あるいはスルフィド基含有化合物を電極表面上に結合・濃縮し、これを還元的に脱離させ、その電流値、あるいはその時間積分値すなわち脱離電気量を計測することにより、上記化合物の濃度が精度良く測定できるとともに、この還元脱離電位は上記吸着化合物の化学種毎に異なり、還元脱離電位により化学種を識別、検出可能であり、さらに、これにより、試料中のチオール基あるいはスルフィド基含有化合物の各化学種毎にその濃度を測定できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００５】
（１）チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中でマイナス電位を印加させて還元的に脱離させ、脱離に伴う電気量を計測し、この計測値から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物濃度を求めることを特徴とする、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の濃度測定方法。
（２）  チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中で電極にマイナス電位を印加させて還元的に脱離させ、脱離時の電位から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の化学種を識別し、検出する方法。
（３）  チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極と試料とを接触させ、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極表面に結合させた後、該化合物をアルカリ溶液中で電極にマイナス電位を印加させて還元的に脱離させるとともに、脱離電気量を計測し、該計測された電気量、及び脱離時の電位から試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の化学種毎にその濃度を求めることを特徴とする、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の濃度測定方法。
（４）  試料が、チオール基あるいはスルフィド基を有するプロドラッグを含有するものである上記（1）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  試料が、チオール基あるいはスルフィド基を有する、薬物代謝物、体内物質あるいは生理活性物質を含むものである上記（1）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）  チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極、該電極にマイナス電位を電位可変に印加する手段、及び電極電流値を計測する手段を有することを特徴とする、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の識別、検出及び／又はその濃度を測定する装置。
（７）  電極にマイナス電位を電位可変に印加する手段が、一定の割合でマイナス電位を増大させる手段を伴うものである、上記（６）に記載の装置。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、試料中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を電極に結合させた後に、還元的に該化合物を脱離させ、この脱離時の電気量を測定することにより、簡便かつ迅速に、高感度でこれら化合物を検出し、その濃度を高精度で測定できる。また、濃度測定においては、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の各化学種を識別可能であり、分子種毎にその試料中の濃度を同時に測定可能である。
【０００７】
したがって、例えば、上記した６-メルカプトプリンのような抗ガン剤を投与した場合、生体内では順次該薬剤は代謝分解されていくが、該生体試料を定期的に採取し本発明の分析法を適用すれば、薬剤とその分解代謝物の濃度を同時に測定可能であることから、経時的な薬物の代謝過程を把握することが可能であり、重篤な副作用の問題のある抗ガン剤の投与計画、病状管理にも極めて有用である。また、本発明によれば、プロドラッグがチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物である場合において、その代謝過程を追跡可能であり、該プロドラッグの有効性の評価についても、簡便かつ迅速に行いうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において利用される電極は、当該薬物・生理活性物質中に有する含硫黄の有機物（チオール基、スルフィド基等）が結合（吸着、化学結合等を含む）により薄膜を形成し得るものであれば特に制限はなく、例えば、S-金属の結合を形成しやすい金、白金、銀、銅電極などが好都合に利用される。これら金属は、その表面にチオール基あるいはスルフィド基を含有する化合物が自己組織化膜を形成することで知られているものである。また、これら金属電極と同様に酸化スズ等の透明電極も好都合に利用される。
本発明においては、上記電極を生体等から採取した試料の溶液中（緩衝液、エタノール溶液等）に一定時間（5〜60分程度）浸せきし、試料溶液中のチオール基あるいはスルフィド基を有する化合物（以下、含硫黄化合物という。）を電極表面に結合・濃縮させた後、この電極を含硫黄化合物の含まれない溶液で洗浄し、純水で洗浄し、当該含硫黄化合物の電極表面（試験電極）への結合・濃縮を完了させる。この後、含硫黄化合物が吸着した本発明の電極を、参照電極、対極とともに透明な容器に挿入する。これに水酸化カリウム、または水酸化ナトリウム等のアルカリ水溶液（0.5-１M程度）を加え、本発明の電極に、充分な負の電位を印加し、吸着していた化合物を電極表面で還元して脱離させる。還元的脱離に伴う電流値またはその時間積分値（電気量）を測定することで、試料溶液内に含まれていた含硫黄化合物の濃度を決定することが可能となる。また、脱離の際の電位は、薬物およびその代謝物の性質（官能基、親水性・疎水性など）によって大きく異なるので、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物の化学種を識別、検出できる。
【０００９】
図1は、含硫黄化合物としてアミノエタンチオールが結合した電極において、結合した含硫黄化合物の還元的脱離工程により得られる電位-電流曲線の例である。還元的脱離工程においては、電極に印加する電位を可変にするのが好ましく、例えば一定の走査速度で電位を負方向に走査する。還元的脱離工程においては、電極に結合している含硫黄化合物分子が電極表面において、一電子の還元を受け脱離するが、それに伴い還元電流が流れ、結合含硫黄化合物の分子数に対応する電気量（電流値×時間）分の還元波（図１中、斜線部分）が得られる。  
したがって、この還元波、すなわち上記斜線部分に対応する電気量（電流の時間積分値）は、含硫黄化合物の電極への吸着量を反映し、該吸着量は、試料中の含硫黄化合物の濃度に依存する。
一方、脱離時の電位は、吸着した含硫黄化合物の構造・性質（親水性・疎水性等）に強く依存し、含硫黄化合物の化学種により脱離電位は特有の値をとり、吸着した含硫黄化合物の化学種によりそれぞれ異なる。
【００１０】
この様子は図２に示される。例えば、試料中に化学種が異なる２種の含硫黄化合物が存在する場合、試料の電位−電流曲線には、図２に示されるように、脱離電位の異なる、２種の含硫黄化合物に由来する２つの還元波（斜線部分）が観測される。
本発明においては、上記電位-電流曲線により、含硫黄化合物の試料中の濃度を測定でき、また、その化学種を識別、検出し得るので、上記したように試料中に複数含硫黄化合物が含まれている場合にも、その化学種毎に濃度を一度の試験で測定できる。さらに、例えば、試料中に含まれる特定の含硫黄化合物の化学種のみを検出したい場合には、予め分かっている、その含硫黄化合物の脱離電位において電流値の挙動をみるだけで検出でき、また、上記還元波の大きさは、大凡含硫黄化合物の電極への吸着量に依存するので、この電流の大きさを求めても大凡の含硫黄化合物濃度を測定可能である。
【００１１】
図３は、６-メルカプトプリンを濃度1.0μＭ（ａ）と、1x10-2μＭ（ｂ）で含む被験試料を、本発明の測定法で測定して得られた電位-電流曲線である。図３によれば、両濃度とも同じ電位に還元脱離波が現れており、両被験試料は同じ化学種を含むと判定でき、ある一定時間の修飾ではこの還元波の大きさは、より高濃度の（ａ）の方が（ｂ）よりシャープで大きい。正確に濃度を調べるには、電流値の時間積分値を使用するが、上記したように、電流値によっても大凡の濃度は推測できる。
本発明は、実施例２に示すように、還元波部分の電気量と含硫黄化合物の濃度とは、特に含硫黄化合物が低濃度の場合、直線関係にあることを見いだしたことに基づき、本発明の測定法は、特に低濃度の含硫黄化合物の測定に適しており、極端に高濃度のものには適さない。高濃度の場合は希釈して測定する。有効に測定できる濃度は、10μＭ〜0.005μＭ程度であり、好ましくは1.0μＭ〜0.01μＭである。
【００１２】
本発明の計測装置は、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極、該電極にマイナス電位を印加する手段、及び電極電流値を計測する手段を有する。このうち、マイナス電位を印加する手段は、電位を可変に制御する手段を伴うことが好ましく、例えば一定の割合でマイナス電位を増大させるように設定する。これには、例えば、一定の走査速度で電位を負方向に走査する手段が挙げられる。
本発明の場合、特定の含硫黄化合物の濃度を測定する場合には、電位を、その含硫黄化合物の脱離電位範囲のみに設定しておいても測定できる。
また、本発明における上記電位印可手段、及び電流計測手段を有する装置としては、すでにポテンショスタットが知られており、これを用いるのが好適である。ポテンショスタットを用いることにより、試料中の特定化合物の濃度測定、試料中の含硫黄化合物の検出、識別・同定、あるいは試料中の複数の含硫黄化合物を識別して各化合物毎の濃度を測定することができる。
次に本発明の装置について、図面を参照しながら説明する。
【００１３】
図４は本発明の計測装置を使用して構築した含硫黄化合物の計測系の一例を示す概略図である。
本発明の計測系は、試料濃縮部と計測部からなる。
試料濃縮部は、測定試料溶液（4）を収納した容器（8）、および試料を注入する試料注入部（2）および試料注入量を制御する試料注入制御部（6）、溶液を撹拌する撹拌子（3）並びに攪拌器（スターラー）（5）を備えている。ここに清浄化した、チオール基あるいはスルフィド基を有する化合物を結合しうる金属あるいは金属酸化物からなる電極（以下、作用電極（1）という。）を一定時間導入し表面への含硫黄化合物の結合・濃縮を行う。続いて作用電極を洗浄した後、作用電極（１）を計測部に移動させる。測定部は、試料濃縮部で目的化合物を表面に結合させた作用電極（1）、参照電極（8）、白金線または白金箔からなる対極（9）を備え、これらは測定溶液（10）を入れた容器（11）に収納されている。溶液はアルゴンあるいは窒素ガス等で脱気する必要があるので脱気用ガス注入部（14）も備えている。ポテンショスタット（12）から作用電極（１）にマイナス電位を印加しながら、作用電極（１）に吸着した含硫黄化合物の還元脱離電位及び／又は還元脱離に伴い生ずる還元電流値を計測する。測定データはデータ記録部（13）にて記録される。
【００１４】
また、本発明の計測装置においては、上記試料濃縮部、及び計測部の間に電極洗浄部を設け、作用電極（１）がこれら各部を移動できるようして、自動計測、自動記録ができるようにしてもよい。この場合において電極洗浄部は、作用電極（１）を収容する洗浄容器、該容器に洗浄液を供給する手段及び洗浄後の液体を排出する手段を有するように構成し、試料濃縮部及び計測部の容器（８，１１）には洗浄液供給手段及び洗浄後の液体排出手段を設けてもよい。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例］
【００１５】
〔実施例１〕
（６-メルカプトプリンの高感度測定）
直径１．６mmの金ディスク基板または金単結晶電極（面積0．０５平方センチメートル）を０．１mMから１０nMの各種濃度の６-メルカプトプリンのエタノール溶液に30分浸せきし、金電極表面に当該薬物を吸着・濃縮させた。この電極基板を、エタノール、純水で洗浄の後、０．５MKOH水溶液中に移動し、電位範囲-0．2Ｖ（対Ag/AgCl）から-１．０Ｖ（対Ag/AgCl）まで100ｍＶ／sの走査速度で電位を負に掃引し、-０．６Ｖ付近に観察されるピークより電気量を求めた。このとき求められた電気量と試料溶液中の６-メルカプトプリンの濃度の関係を図５に示す。図５の、低濃度部分を示したのが図６である。図６からわかるように６-メルカプトプリンの濃度が10-8Mでも十分に６-メルカプトプリンは検出可能であり、10-8M〜10-7Mの鞄囲で６-メルカプトプリン濃度と脱離電気量の間に直線関係が観察された。10-8Mという低濃度での検出は、現在、高速液体クロマトグラフィー等で検出できる濃度の限界を容易にカバーするものであり、またその検出限界を超えるものである。
【００１６】
〔実施例２〕
（６-メルカプトプリン、チオグアニン、および代謝物の測定例）
金単結晶電極（面積０．０５平方センチメートル）を10mM程度の各種薬物・代謝物のエタノール溶液に30分浸せきし、電極表面に薬物を吸着させた。この電極基板を、エタノール、純水で洗浄の後、  ０．５MKOH水溶液中に移動し、電位範囲-０．２V（対Aｇ/AgCl）から-１．０V（対Ag/AgCl）まで100ｍV/s）の走査速度で電位を負に掃引し、‐０．３Ｖから-０．６Ｖ付近に観察される還元波のピーク（先端）電位を計測した。代表的な各薬物の脱離の電位を以下の表１に示す
【００１７】
【表１】
2005345156.tif 000002
【００１８】
〔実施例３〕
（薬物・代謝物の高感度同時測定）
金単結晶電極（面積０．０５平方センチメートル）を1．０μMの６-チオキサンチン及び０．１μMの６-メルカプトプリンを含むエタノール溶液に30分間浸せきし、電極表面に薬物を吸着させた。この電極基板を、エタノール、純水で洗浄の後、０．５MKOH水溶液中に移動し、電位範囲-０．２Ｖ（対Ag/AgCl）から-１．０Ｖ（対Ag・AｇCl）まで１００mＶ／sの走査速度で電位を負に掃引し、-０．３Ｖから-０．６Ｖ付近に観察される還元波のピーク電位を計測したところ、６-メルカプトプリンの濃度が６-チオキサンチン濃度の10分の1程度であるにもかかわらず、それぞれ-０．６２Ｖ（６-メルカプトプリン）、-０．４V（6-チオキサンチン）に還元波が分かれて観察された（図２）。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】金電極表面上に吸着させたアミノエタンチオールの還元脱離の際得られた電位-電流曲線である。
【図２】測定試料中に２種の硫黄化合物（６-メルカプトプリン及び6-チオキサンチン）が存在した場合に得られた電位−電流曲線である。
【図３】６-メルカプトプリンを濃度1.0μＭ（ａ）と、１×１０-２μＭ（ｂ）で含む被験試料を、本発明の測定法で測定して得られた電位-電流曲線である。
【図４】本発明の計測装置の一例を示す概略図である。
【図５】試料中の６-メルカプトプリンの濃度と吸着した６-メルカプトプリンの脱離時の電気量との関係を表すグラフである。
【図６】図５で示した関係のうち、低濃度の６-メルカプトプリンに対する還元脱離電気量の関係示すグラフである。横軸はμM単位で表した試料中の６-メルカプトプリン濃度、縦軸は還元脱離電気量である。
【符号の説明】
【００２０】
１    作用電極
２    試料注入部
３    攪拌子
４    試料溶液
５    攪拌機（スターラ）
６    試料注入制御装置
７    容器
８    参照電極
９    対極
１０  測定溶液
１１  容器  
１２  ポテンショスタット
１３  データ記録部
１４   脱気用ガス注入部
【図１】
2005345156.tif 000003
【図２】
2005345156.tif 000004
【図３】
2005345156.tif 000005
【図４】
2005345156.tif 000006
【図５】
2005345156.tif 000007
【図６】
2005345156.tif 000008