(57)【要約】      （修正有）【課題】  大腸菌由来の７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を担うタンパク質およびこれをコードする遺伝子を同定し、その利用方法を提供する。【解決手段】  下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入し、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法：（ａ）特定の塩基配列、（ｂ）特定の塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内での塩基置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入し、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法。
（ａ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内での塩基置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生合成する宿主生物に導入し、プリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制する方法。
【請求項３】
下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＲＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入し、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法。
（ａ）配列表の配列番号：１１に示す塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号：１１に示す塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内での塩基置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列
【請求項４】
請求項３に記載のＲＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生合成する宿主生物に導入し、プリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制する方法。
【請求項５】
下記のアミノ酸配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するタンパク質の存在下に７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法。
（ａ）配列表の配列番号：１２に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号：１２に示すアミノ酸配列に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、キサントシンから７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される一連の反応系における、プリン環の９位での７−メチルキサントシンの脱リボース化を触媒して７−メチルキサンチンを生成する活性を有するタンパク質およびこれをコードする遺伝子のカフェイン生産への利用に関する。
【発明の背景】
【０００２】  カフェインはコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、コラ（Ｃｏｌａａｃｕｍｉｎａｔｅ）及びマテ（Ｉｌｅｘ  ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）などの植物種において生合成されるプリンアルカロイドである。カフェインは中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するため医薬品として広く利用されている。また、この化合物は昆虫などに対する摂食忌避効果や殺虫効果を有するため、農薬として利用され得る可能性が示唆されている。
【０００３】  現在、カフェインは上記の植物から抽出するか化学合成することによって製造されている。そこで、より安価で大規模にカフェインを供給するために、遺伝子組換え技術を利用して、本来カフェインを生合成しない微生物又は植物にカフェインを生産させる技術を開発することが望まれている。また、植物においてカフェインを生産させる技術は、植物を直接的に草食動物の食害から防御するための方法としても期待される。
【背景技術】
【０００４】  コーヒーノキやチャノキでは、プリン代謝中間産物であるキサントシンを出発材料として、７−メチルキサントシン、７−メチルキサンチン、テオブロミンを経てカフェインが生合成される（図１）。この一連の反応はキサントシンメチル化酵素、７−メチルキサントシン脱リボース化酵素、テオブロミン合成酵素およびカフェイン合成酵素によって触媒される。キサントシンメチル化酵素をコードするＣａＸＭＴ１  ｃＤＮＡ、テオブロミン合成酵素をコードするＣａＭＸＭＴ１  ｃＤＮＡおよびＣａＭＸＭＴ２  ｃＤＮＡ、テオブロミン／カフェイン合成酵素をコードするＣａＤＸＭＴ１  ｃＤＮＡは既にコーヒーノキから単離されている（非特許文献１および２を参照）。また、テオブロミン／カフェイン合成酵素をコードするｃＤＮＡはチャノキからも単離されている（特許文献１を参照）。しかしながら、７−メチルキサントシン脱リボース化酵素をコードするｃＤＮＡはコーヒーノキやチャノキから単離されていない。非特許文献２では、大腸菌は７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性を有することが示されており、ＣａＸＭＴ１、ＣａＭＸＭＴ２、ＣａＤＸＭＴ１の組換えタンパク質と大腸菌抽出物を用いて、キサントシンからカフェインを生成する方法が記載されている。
【非特許文献１】Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２７６，８２１３−８２１８（２００１）
【非特許文献２】Ｕｅｆｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３２，３７２−３８０（２００３）
【特許文献１】特開２００１−３７４９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  上述のように、大腸菌から７−メチルキサントシン脱リボース化酵素活性が見出されているが、この活性を担うタンパク質およびこれをコードする遺伝子はまだ同定されていない。【０００６】  本発明は、このようなタンパク質および遺伝子を同定し、その利用方法を提供するものである。【０００７】  本発明により、例えば以下の目的を達成することが可能になる。（１）当該タンパク質あるいはこれの組換えタンパク質を用いて７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する。（２）７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に、当該遺伝子を導入して７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する。（３）７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生成する宿主生物に、当該遺伝子を導入してプリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、上記の課題を解決すべく研究を重ねた結果、次の知見を得た。まず、大腸菌ゲノムデータベースを検索したところ、配列表の配列番号：１０に示す塩基配列を有するキサントシン加リン酸分解酵素遺伝子を見出した。そこで、当該ＤＮＡ分子断片を挿入した発現ベクターを大腸菌に導入し、当該ＤＮＡ分子に由来する組換えタンパク質を大量に発現させた。この組換えタンパク質を精製して、その酵素学的性質を調べたところ、リン酸の存在下で７−メチルキサントシンの脱リボース化による７−メチルキサンチンの生成反応を触媒することを認めた。すなわち、当該ＤＮＡ分子に由来する組換えタンパク質は７−メチルキサントシン脱リボース化酵素（７−メチルキサントシン加リン酸分解酵素）活性を有することが認められた。【０００９】  本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。【００１０】  以下、本発明を詳しく説明する。【００１１】  請求項１の発明は、下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入し、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法である。【００１２】（ａ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内での塩基置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列。【００１３】  請求項２の発明は、請求項１に記載のＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生合成する宿主生物に導入し、プリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制する方法である。【００１４】  請求項３の発明は、下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＲＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入し、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法である。【００１５】（ａ）配列表の配列番号：１１に示す塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号：１１に示す塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内での塩基置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列。【００１６】  請求項４の発明は、請求項３に記載のＲＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生合成する宿主生物に導入し、プリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制する方法である。【００１７】  請求項１および請求項３の発明には、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物を用いる。プリンアルカロイドを生合成する生物を除き、多くの生物は７−メチルキサントシンを生成し得ないが、キサントシンメチル化酵素をコードするＤＮＡ分子あるいはＲＮＡ分子を導入することによって、７−メチルキサントシンを生成し得る。【００１８】  プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードするＤＮＡ分子の具体例およびＲＮＡ分子の具体例は、それぞれ配列表の配列番号：２および配列表の配列番号：３に示す塩基配列からなる。なお、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する活性を有する酵素の具体例は、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列からなる。【００１９】  請求項２および請求項４の発明では、７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生合成する宿主生物を用いる。この様な生物として、コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、コラ（Ｃｏｌａ  ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、マテ（Ｉｌｅｘ  ｐａｒａｇｕａｒｉｅｎｓｉｓ）、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）などの植物が挙げられる。【００２０】  また、本来はプリンアルカロイドを生合成しない生物でも、キサントシンメチル化酵素、テオブロミン合成酵素およびカフェイン合成酵素をコードするＤＮＡ分子あるいはＲＮＡ分子を導入して、プリンアルカロイドを生合成するようになった形質転換生物も宿主生物となり得る。【００２１】  プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する酵素をコードするＤＮＡ分子の具体例およびＲＮＡ分子の具体例は、それぞれ配列表の配列番号：２および配列表の配列番号：３に示す塩基配列からなる。なお、プリン環の７位でのキサントシンのメチル化を触媒する活性を有する酵素の具体例は、配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列からなる。【００２２】  プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する酵素をコードするＤＮＡ分子の具体例およびＲＮＡ分子の具体例は、それぞれ配列表の配列番号：５および配列表の配列番号：６に示す塩基配列からなる。なお、プリン環の３位での７−メチルキサンチンのメチル化を触媒する活性を有する酵素の具体例は、配列表の配列番号：４に示すアミノ酸配列からなる。【００２３】  プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する酵素をコードするＤＮＡ分子の具体例およびＲＮＡ分子の具体例は、それぞれ配列表の配列番号：８および配列表の配列番号：９に示す塩基配列からなる。なお、プリン環の１位でのテオブロミンのメチル化を触媒する活性を有する酵素の具体例は、配列表の配列番号：７に示すアミノ酸配列からなる。【００２４】  上記のプリンアルカロイドの例としてカフェイン、テオブロミン、パラキサンチンなどが挙げられる。【００２５】  複数の酵素で構成される生合成経路のうち、その一部を強化すると、生合成が促進あるいは抑制されることが知られている。従って、カフェインを生合成するコーヒーノキに請求項２あるいは請求項４の発明を適用すれば、カフェインの生合成が促進あるいは抑制されることが期待される。【００２６】  請求項５の発明は、下記のアミノ酸配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するタンパク質の存在下に７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成する方法である。【００２７】（ａ）配列表の配列番号：１２に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列表の配列番号：１２に示すアミノ酸配列に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列。【００２８】  上記の当該タンパク質は大腸菌あるいはその近縁種から精製することができる。実際的には、請求項１の塩基配列に由来する組換えタンパク質を調製する方法が簡便である。
【発明の効果】
【００２９】  本発明によれば、下記のような効果が発揮される。【００３０】（１）当該タンパク質あるいはこれの組換えタンパク質を用いて、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成できる。【００３１】（２）７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に当該遺伝子を導入して、７−メチルキサントシンから７−メチルキサンチンを生成できる。【００３２】（３）７−メチルキサントシンを経由してプリンアルカロイドを生成する宿主生物に当該遺伝子を導入して、プリンアルカロイドの生成を促進あるいは抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】  請求項１の発明において用いるＤＮＡ分子は下記の塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するものである。【００３４】（ａ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号：１０に示す塩基配列に、これがコードするタンパク質が上記酵素活性を損なわない範囲内で１若しくは数個の塩基の置換、挿入または欠失を行って得られた変異塩基配列。【００３５】  変異塩基配列（ｂ）は、例えば上記塩基配列（ａ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである。【００３６】  配列表の配列番号：１０に示す塩基配列、又は１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ分子は、例えば、これに特異的にハイブリダイズするオリゴ塩基をプライマーとして用いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、これを含む生物から分離することができる。このＤＮＡ分子は大腸菌由来のものであり、奈良先端科学技術大学院大学・遺伝子教育研究センター・生体情報工学講座から入手可能である。【００３７】  塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に導入するには、まず、塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を、発現ベクターに組み込む。この組み込みには、既知のいずれの方法も適用し得る。例えば適当な制限酵素を選択し、これで該ＤＮＡを処理して切断し、次いで同様に処理した発現ベクターと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。【００３８】  この組換えベクターを形質転換法によって宿主生物に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖すると、目的の遺伝形質とベクターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる。【００３９】  請求項１の発明において、７−メチルキサントシンからの７−メチルキサンチンの生成は、７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物に塩基配列（ａ）（ｂ）のいずれかを有するＤＮＡ分子を導入して宿主生物を形質転換し、この形質転換体の抽出液をＨＰＬＣ分析することによって確認することができる。【００４０】  ７−メチルキサントシンを生成し得る宿主生物としては、配列表の配列番号：２に示す塩基配列を有するＤＮＡ分子で形質転換された微生物や植物を利用することができる。【００４１】  請求項５の発明において用いるタンパク質は大腸菌から精製するか、上記ＤＮＡ分子から組換えタンパク質を発現、精製することによって得られる。この組換えタンパク質を発現、精製するためには、１）大腸菌発現系、２）酵母発現系、３）植物細胞発現系、４）昆虫細胞発現形、５）哺乳類細胞発現系、６）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、などを利用することができる。【００４２】  上記の組換えタンパク質の精製試料を得るためには１）大腸菌発現系が最も有用であり、上記ＤＮＡ分子を挿入したヒスチジン６量体タグ融合発現ベクターを奈良先端科学技術大学院大学・遺伝子教育研究センター・生体情報工学講座から入手することが可能である。この発現ベクターを用いた場合、定法に従って組換えタンパク質を発現、精製することができる。
【実施例】
【００４３】  本発明を下記の実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。【００４４】（１）組換えＸａｐＡタンパク質の生産
配列表の配列番号：１０に示す、ｘａｐＡ遺伝子（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ７３８２８）の塩基配列を挿入したｐＣＡ２４Ｎ組換えベクター（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０５２８９１）（図２参照）によって大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。この形質転換体を５０ｍＬの２ｘ  ＹＴ液体培地（１７０μ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む）において、培養の吸光度（Ａ６００）が約０．８になるまで３７℃で振盪培養を行った。この培養に終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に２０℃で６時間、振盪培養を行った。以上の操作によって、大腸菌において組換えＸａｐＡタンパク質を生産した。【００４５】（２）組換えＸａｐＡタンパク質の精製
組換えＸａｐＡタンパク質を生産した大腸菌を遠心分離によって回収し、４ｍＬの破砕液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に懸濁した。以降の操作は氷上あるいは４℃で行った。得られた懸濁液を超音波破砕処理し、終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて、３０分間インキュベーションした。得られた破砕液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、１．２ｍＬの上清をスピンカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ；Ｑｉａｇｅｎ社製）に通した。このスピンカラムを６００μＬの洗浄液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で３回洗浄し、１００μＬの溶出液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）あるいは溶出液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５００ｍＭ  リン酸ナトリウム［ｐＨ８．０］）で溶出を行った。回収した溶出液を組換えＸａｐＡタンパク質の精製試料とした。図３に組換えＸａｐＡタンパク質精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示す。【００４６】（３）組換えＸａｐＡタンパク質の酵素反応と反応生成物の検出
Ｕｅｆｕｊｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３２：３７２−３８０（２００３））の方法に従って（メチル−１４Ｃ）−７−メチルキサントシン溶液（＜１６μＭ）を調製した。２０μＬの（メチル−１４Ｃ）−７−メチルキサントシン溶液に５μＬの組換えＸａｐＡタンパク質精製試料（３０ｎｇ／μＬ）を加え、２７℃で１時間の酵素反応を行った。反応終了後、２μＬの酵素反応液を等量のメタノールと混合して薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４；Ｍｅｒｃｋ社製）に点着し、水／酢酸／ｎ−ブタノール（２：１：４，ｖ／ｖ／ｖ）で１．５時間展開した。その後、Ｘ線フィルム（ＢｉｏＭａＸ  ＭＳ；Ｋｏｄａｋ）を用いて、ＴＬＣプレートのオートラジオグラフィー（マイナス８０℃で３日間の露光）を行った。ＴＬＣによる酵素反応生成物の検出結果を図４に示す。標準品（７−メチルキサントシンおよび７−メチルキサンチン）との移動度の比較により、オートラジオグラフィーの各スポットの化合物を同定した。その結果、組換えＸａｐＡタンパク質は、リン酸（１００ｍＭ）の存在下で、７−メチルキサントシンを７−メチルキサンチンに変換することが観察された（図４レーン４参照）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１はコーヒーノキおよびチャノキにおける主要なカフェイン生合成経路を示すフローシートである。図１の右側に各化合物の名称を併記し、左側に各反応を触媒する酵素の名称を併記する。
【図２】図２はｘａｐＡ遺伝子のコード配列（ｘａｐＡ）を挿入したｐＣＡ２４Ｎ発現ベクターを模式的に示す図である。Ｔ５／ｌａｃプロモーター（ｐＴ５−ｌａｃ）、ヒスチジン６量体タグ（６ｘＨｉｓ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）、ラックリプレサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を図中に示す。
【図３】図３は組換えＸａｐＡタンパク質精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。左のレーンは分子量マーカー、右のレーンは組換えＸａｐＡタンパク質精製試料を示す。矢頭は組換えＸａｐＡタンパク質のバンドを示す。
【図４】図４は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による酵素反応生成物の検出を示す。（メチル−１４Ｃ）７−メチルキサントシン（７ｍＸＲ）とリン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質とし、組換えＸａｐＡタンパク質精製試料（ＸａｐＡ）を用いて酵素反応を行った。酵素反応液をＴＬＣプレートで展開した後、オートラジオグラフィーによって、（メチル−１４Ｃ）７−メチルキサントシン（７ｍＸＲ）と（メチル−１４ｃ）７−メチルキサンチン（７ｍＸ）のスポットを検出した。パネルの上に反応に加えた基質とタンパク質試料を示す。パネルの左に７ｍＸＲと７ｍＸの位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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