(57)【要約】      （修正有）【課題】カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチドを調製する技術を提供する。【解決手段】カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインのＮ末端側に、宿主で大量発現可能なアミノ酸領域を有する、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチド。該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、プラスミドないし形質転換体ならびにその調整方法。該ポリペプチドは、リン酸化された基質タンパク質の調製やカルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの生理機能の解明に利用される。【選択図】図４
2005151836.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインのＮ末端側に、宿主で大量発現可能なアミノ酸領域を有する、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸領域が、宿主で発現可能なタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド
【請求項３】
前記アミノ酸領域が、アフリカツメガエルCaMKIxのＮ末端側１０個以上のアミノ酸配列を含む請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインをコードするＤＮＡの5'末端側に宿主で大量発現可能なコドンユーセージの領域を有する、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有する断片をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記領域が、アフリカツメガエルCaMKIxのＮ末端の少なくとも１０個のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインをコードするＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培地中で培養する工程、
培養液の宿主を破砕処理し、不溶性画分を回収する工程；
得られた不溶性画分の蛋白質を可溶化する工程、
可溶化された蛋白質を再生溶液中で処理して変性されたカルモジュリン非依存性キナーゼの不活性型を活性型に変換する工程、
を有するカルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有する断片の製造方法。
【請求項９】
可溶化を6Mグアニジン塩酸塩又は8M尿素、50mMトリス塩酸（pH7.5）、10 mM β-メルカプトエタノールを含む可溶化溶液中で行う、請求項８に記載の方法：
【請求項１０】
再生を50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM NaCl、10% ethylene glycol、1 mM DTTを含む再生溶液中で行う、請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの活性断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリン・トレオニンリン酸化酵素の一つであるカルモジュリン依存性リン酸化酵素II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII）は、記憶などの高次神経機能
制御や種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしていることが明らかにされている（非特許文献１〜３）。CaMKIIの大きな特徴として、1)脳に多量に存在する。2)可溶型と顆粒結合型がある。3)基質特異性が広い。4)臓器特異性アイソフォームが存在する。5)自己リン酸化によって活性を制御する、などの際だった特徴を備えている。特にCaMKIIは脳神経系では、神経伝達物質の生合成、神経伝達物質の放出、記憶の素過程と考えられている長期増強作用、記憶特に空間記憶、などに関与していることが示唆されている。
【０００３】
遺伝子解析の結果、CaMKIIはα,β,γ,δの4つの異なる遺伝子とさらにそれらのスプライシング産物からなることが知られている。CaMKIIの一次構造は、N末端側から、触媒ド
メイン (catalytic domain)、自己阻害ドメイン (autoinhibitory domain, AID)、Ca2+/calmodulin結合ドメイン (Ca2+/calmodulin-binding domain, CaM)、variable region (V)、subunit association region (Association)からなっていることが判明している（図1
）。CaMKIIの各サブユニットの分子量は約50-60kDaであり、subunit association region
が互いに相互作用し、8-12の複数のサブユニットからなるオリゴマー構造をとっている
。またCa2+/calmodulinが存在しない場合、自己阻害ドメインと触媒ドメインが相互作用
し、不活性な状態をとっている（非特許文献4）。一方、Ca2+/calmodulin存在下では、Ca2+/calmodulinがCa2+/calmodulin結合ドメインに結合して、CaMKIIのコンフォメーション変化を誘導し、自己阻害ドメインと触媒ドメインの相互作用を分断する結果、CaMKIIのリン酸化酵素の活性（Ca2+/calmodulin依存性活性）を誘導する。CaMKIIの活性化が起こる
と自己阻害ドメイン内にあるThr286 /Thr287(αサブユニットの場合Thr286、 β・γサブユニットの場合Thr287)の自己リン酸化が速やかに起こり、Ca2+/calmodulin非依存性の持続的な活性（Ca2+/calmodulin非依存性活性）が出現する。
【０００４】
1991年山肩らは、自己リン酸化したCaMKIIをタンパク質分解酵素の一種であるキモトリプシンで限定分解して生成した分子量30kDaのCaMKIIフラグメントがCa2+/calmodulin非依存性活性を恒常的に示し、この30kDaのフラグメントは1番目〜271番目のアミノ酸(Met1〜Ile271)( β, γの場合Met1〜Val272)をコードしているCaMKIIのフラグメントタンパク質(30k-CaMKII)であることを示した（図1）（非特許文献5）。
【０００５】
30k-CaMKII は自己阻害ドメイン以降のC末端側を欠いたタンパク質であるので、モノマー構造でCa2+/calmodulin非依存性活性を恒常的に示す。つまり、30k-CaMKIIは基質タン
パク質をCa2+/calmodulin非依存的にリン酸化できるので、CaMKIIの基質特異性、ターゲ
ットとなる基質タンパク質の解析、CaMKIIの生理機能の解明、リン酸化したタンパク質の調製などを行うために、活性化などの面倒な操作の要らない、非常に有用なリン酸化試薬として利用されている(非特許文献6) 。しかしながらこれまで30k-CaMKIIを調製する方法として、ラットなどの脳から精製したCaMKIIをタンパク質分解酵素で消化して得る方法や、CaMKIIの豊富に含まれるシナプス後肥厚（PSD）画分をタンパク質分解酵素で消化して
得る方法が使われてきたが、操作が煩雑で大量に得ることは難しかった（非特許文献5, 7）。そこで大腸菌の発現系を用いた30k-CaMKIIの調製法を検討することにした。
【非特許文献１】Soderling, T.R., and Stull, J.T. (2001) Structure and regulation of calcium/calmodulin-dependent protein kinases. Chem. Rev., 101, 2341-2351
【非特許文献２】Soderling, T.R., Chang, B., and Brickey, D. (2001) Cellular signaling through multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem., 276, 3719-3722
【非特許文献３】Hudmon, A., and Schulman, H. (2002) Neuronal Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II: the role of structure and autoregulation in cellular function. Ann. Rev. Biochem., 71, 473-510
【非特許文献４】Ishida, A., and Fujisawa, H. (1995) Stabilization of calmodulin-dependent protein kinase II through the autoinhibitory domain. J. Biol. Chem., 270, 2163-2170
【非特許文献５】Yamagata, Y., Czernik, A.J., and Greengard, P. (1991) Active catalytic fragment of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem., 266, 15391-15397
【非特許文献６】Takasawa, S., Ishida, A., Nata, K., Nakagawa, K., Noguchi, N., Tohgo, A., Kato, I., Yonekura, H., Fujisawa, H., and Okamoto, H. (1995) Requirement of calmodulin-dependent protein kinase II in cyclic ADP-ribose-mediated intracellular Ca2+ mobilization. J. Biol. Chem., 270, 30257-30259
【非特許文献７】Yoshimura, Y., Nomura, T., and Yamauchi, T. (1996) Purification and characterization of active fragment of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II from the post-synaptic density in the rat forebrain. J. Biochemistry, 119, 268-273
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチドを調製する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、プラスミドないし形質転換体並びにその調製法に関する。
項１． カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインのＮ末端側に、宿主で大量
発現可能なアミノ酸領域を有する、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有するポリペプチド。
項２．  前記アミノ酸領域が、宿主で発現可能なタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列を含む項１に記載のポリペプチド
項３．  前記アミノ酸領域が、アフリカツメガエルCaMKIxのＮ末端側から１０個以上のアミノ酸配列を含む項１又は２に記載のポリペプチド。
項４．  カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインをコードするＤＮＡの5’
末端側に宿主で大量発現可能なコドンユーセージの領域を有する、カルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有する断片をコードするＤＮＡ。
項５．  前記領域が、アフリカツメガエルCaMKIxのＮ末端の少なくとも１０個のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む、項４に記載のＤＮＡ。
項６．  カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインをコードするＤＮＡを発現可能に含む、発現ベクター。
項７．  項６に記載の発現ベクターを細菌に導入してなる形質転換体。
項８．  項７に記載の形質転換体を培地中で培養する工程、
培養液の菌体を破砕処理し、不溶性画分を回収する工程；
得られた不溶性画分の蛋白質を可溶化する工程、
可溶化された蛋白質を再生溶液中で処理して変性されたカルモジュリン非依存性キナーゼの不活性型を活性型に変換する工程、
を有するカルモジュリン非依存性キナーゼ活性を有する断片の製造方法。
項９．  可溶化を6Mグアニジン塩酸塩又は8M尿素、50mMトリス塩酸（pH7.5）、10 mM β-メルカプトエタノールを含む可溶化溶液中で行う、項８に記載の方法：
項１０．  再生を50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM NaCl、10% ethylene glycol、1 mM DTTを含む再生溶液中で行う、項８又は９に記載の方法。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００８】
本発明の特徴は、大きく分けて以下の２点に存在する：
（１）大腸菌等の宿主で発現させた場合に、活性を有するカルモジュリン非依存性キナーゼ断片が発現されること
これは、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの触媒ドメインのＮ末端側に、宿主で大量発現可能なアミノ酸領域を導入することで達成することができる。
（２）不溶性画分に発現された不活性なカルモジュリン非依存性キナーゼ断片を可溶化および再生溶液を使用して活性型に導くこと
これは、例えば可溶化溶液および再生溶液として以下の溶液を使用することにより達成できる。
・可溶化溶液（6Mグアニジン塩酸塩又は8M尿素、50mMトリス塩酸（pH7.5）、10 mM β-メルカプトエタノール）
・再生溶液（50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM NaCl、10% ethyle
ne glycol、1 mM DTT）
本明細書において、「Ｎ末端側から」とは、「開始メチオニンから」と同義である。
【０００９】
本発明の宿主としては、大腸菌、枯草菌などの微生物、酵母、ラン藻、放線菌、ヒトを含む動物細胞などの従来公知の種々の宿主を使用することができるが、以下においては好ましい宿主として大腸菌を例に取り説明する。しかしながら、本発明が大腸菌以外の宿主にも使用できることは言うまでもない。
【００１０】
一般にCaMKIIを大腸菌で発現させた場合、多くは不溶性画分に発現してしまう。そのため可溶化を行う必要があるが、ひとたび可溶化を行うと十分な活性の回復は困難であった。まず試みにCaMKIIの調節ドメインよりC末端側を欠失した30k-CaMKIIgのcDNAを大腸菌の発現ベクターpETに入れ、さまざまな条件下にタンパク質の発現を検討したが、発現量が
少なくしかもすべて不溶性画分に検出された（図2、3）。
【００１１】
この不溶性画分を公知の可溶化／再生溶液で処理しても、目的とする30k-CaMKIIは実質的に得られなかった。可溶化溶液（6Mグアニジン塩酸塩又は8M尿素、50mMトリス塩酸（pH
7.5）、10 mM β-メルカプトエタノール）・再生溶液（50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM NaCl、10% ethylene glycol、1 mM DTT）で処理すると比活性の
高い30k-CaMKIIは得られるが、量的にはごくわずかに過ぎなかった。
【００１２】
そこで、30k-CaMKIIγの開始コドンの上流にアフリカツメガエルCaMKIxの5'配列（N末
端40アミノ酸に相当するcDNA部分）をつないで、CX-30k-CaMKIIの発現ベクターを構築し
た（図4）。CaMKIxは、アフリカツメガエルcDNAライブラリー中から見出した新規リン酸
化酵素であり、分子量は約38000、rat CaMKIと75%のホモロジーをもつタンパク質で、大
腸菌での大量発現が確認されている酵素である(CaMKIx, Acc. No. AB098710, Xenopus laevis 由来 Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I-like protein)。
【００１３】
作製した発現ベクターを用いると、CX-30k-CaMKIIを大腸菌で大量に発現することがで
きたが、ほとんど不溶性画分として得られた（図3）。そこでCX-30k-CaMKIIを完全にグアニジン塩酸又は8M尿素で変性した後に、酵素活性を再生する条件を検討した。透析処理では酵素活性の回復が見られなかったのに対し、DTT, Tween40, NaClを含む再生溶液で希釈
し、0℃で静置すると時間依存的に顕著な活性回復が見られた。こうして得られた活性化CX-30k-CaMKIIを用いて、さまざまな基質タンパク質をリン酸化できることが確認された。従って、大腸菌を用いた30k-CaMKIIの大量発現と可溶化／再活性化は、タンパク質リン酸化用の酵素試薬の簡便な調製法として有用である。
【００１４】
上記の例は、大腸菌で大量発現可能なコドンユーセージの領域としてアフリカツメガエルCaMKIxの5'配列（N末端40アミノ酸に相当するcDNA部分）を30k-CaMKIIの開始コドンの
上流に連結した例である。該領域としては、アフリカツメガエルCaMKIxの5'配列（N末端
１個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上のアミノ酸配列に相当するcDNA部分）の他に、大腸菌中で大量発現可能なタンパク質の１個以上好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上のアミノ酸配列、特にＮ末端側のアミノ酸部分配列に相当するcDNA部分が挙げられる。この領域には、大腸菌中で大量発現可能なタンパク質の全配列を用いてもよい。
【００１５】
さらに、該領域としてCaMKIIのコドンユーセージを大腸菌用に変更し、必要に応じてさらに余分な転写因子の結合配列を変更する（アミノ酸配列は変更しない）ことにより前記領域を形成してもよい。コドンユーセージの変更―余分な転写配列の削除は、触媒ドメインのＮ末端側に上記の部分アミノ酸配列の追加と組み合わせて行うこともできる。
【００１６】
本発明で使用する触媒ドメインは、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、イヌ、ウマ、ヒツジ、ラット、マウスなど）、鳥類、両生類、は虫類などのいずれの動物並びに植物由来のCaMKII由来の触媒ドメインでもよく、カビ、酵母由来の触媒ドメインでもよい。好ましくは哺乳動物由来の触媒ドメインである。
【００１７】
触媒ドメインは、天然のアミノ酸配列をそのまま使用してもよいが、触媒活性を有する限り、１又は複数のアミノ酸を置換・欠失・付加・挿入した改変型触媒ドメインを使用してもよい。
【００１８】
触媒ドメインは、CaMKIIのα, β, γ, δのいずれのドメイン由来でもよいが、好ましくはγサブユニット由来の触媒ドメインである。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、大腸菌での発現において不溶性画分発現された場合、可溶化溶液中で可溶化を行う。該可溶化溶液の可溶化成分としては、グアニジン塩酸などのグアニジン塩あるいは尿素などが例示される。可溶化処理されたタンパク質は再生溶液中で再生処理される。再生溶液としては、ＤＴＴなどの還元剤、Ｔｗｅｅｎ４０などの界面活性剤（特にノニオン界面活性剤），ＮａＣｌなどの塩類などの成分を１種以上含む溶液が例示される。
【００２０】
可溶化／再活性化に使用する液として、以下のものが好ましく例示される。
・ホモジナイズ溶液(20 mM トリス塩酸(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 40)
・可溶化溶液（6Mグアニジン塩酸塩、50mMトリス塩酸（pH7.5）、10 mM β-メルカプトエタノール）
・再生溶液（50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM NaCl、10% ethylene glycol、1 mM DTT）
本発明のポリペプチドは、ＧＳＴタグ、カルボキシ末端タグ、Ｈｉｓタグ、多重荷電ペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴタグ）、抗体のＦc部分、免疫グ
ロブリン結合ドメイン、プロテインＡ若しくはプロテインＧ若しくはこれらの一部、レシチン、核酸結合部位、ヘパリン結合部位、特異性リガンド、特異性受容体、インテグリン、サイトカイン又はそれらの受容体結合ドメインなどを触媒ドメインのＣ末端側にさらに結合してもよい。
【発明の効果】
【００２１】
CaMKIIは高次神経機能に深く関わる酵素と言われており、その活性型酵素の安定的供給は、神経科学分野の研究において重要な意味を持つ。また現在のところ、基質特異性の広い多機能性タンパク質リン酸化酵素のうち、“タンパク質リン酸化用の試薬”として取り扱いが容易でしかも安価・大量に入手できるものはProtein kinase Aの触媒サブユニットのみであり、基質特異性の異なる別の多機能性タンパク質リン酸化酵素についても同様の“試薬”としての用途開発が強く望まれているところである。CX-30k-CaMKIIgは活性発現にCa2+/ calmodulinを必要とせず、しかも自己リン酸化反応を示さないことから、このような目的に適している。従って本発明は、リン酸化された基質タンパク質の調製やCaMKIIの生理機能の解明にとって有用な試薬となるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
＜実施例1＞発現ベクター(pET-30k-CaMKIIγ)の構築
まず、EST database中からラットCaMKIIγの全塩基配列(Acc. No. S71571)を見出し、こ
の配列をもとに以下の2本のプライマーを合成した。
UrCaMKIIγ/Nhe    5'-AAAGCTAGCATGGAGACCACCGCCACCTG-3'  （下線部 NheI site）
LrCaMKIIγ30/Xho  5'-TTTCTCGAGGACCCATGGGTGCTTGAGAGC-3' （下線部 XhoI site）
次に、5'-RACE Ready cDNA library (Rat brain)(クロンテック社製)を鋳型にしてPCR (ABI社製 GeneAmp PCR System 2700を使用)を行った。PCRにはタカラバイオ社製のPyrobest
DNA polymeraseを用い、プログラムは96℃ 2 min, (96℃ 10 sec, 68℃ 2 min) x 30, 68℃ 7 minで増幅した。増幅産物を電気泳動後、ゲルから精製し(フナコシ社製  Gene Clean III kitを使用)、NheIおよびXhoIで消化した。引き続き、pET23a（Novagen社製）のNheI/XhoI siteに組み込んで発現ベクターpET-30k-CaMKIIγを構築した（図2）。
＜実施例2＞発現条件の検討1
発現ベクターpET-30k-CaMKIIγを大腸菌BL21(DE3)（Novagen社製）に電気穿孔法にて導入し(Harvard Apparatus社、BTX ECM-600を使用)、100 mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天
培地で37℃、16 h培養した。生えてきたコロニーを3 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピ
シリン）に植菌し、37℃で16 h振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮な5 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピシリン）に植菌し、37℃で16h振とう培養した。培養後の菌体をSDS-PAGEサンプル溶液（63 mM トリス塩酸(pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 1% β-メルカプトエタノール, 0.001% bromophenol blue）中で超音波破砕し(Branson社のBranson sonifier 450を使用)、SDS-PAGEにて発現の有無を確認したところ、わずかに30k-CaMKIIγの発現が認められた（図3）。培養条件及び大腸菌株をいろいろ変えても発現量は改善さ
れなかった。
＜実施例3＞発現ベクター（pET-CX-30k-CaMKIIγ）の構築
上記実施例2で30k-CaMKIIγをそのままの状態で発現させても十分な発現量が得られなか
ったのは、ラットCaMKIIの開始メチオニン付近の配列がコドン使用頻度の問題で大腸菌に認識されにくくなっているためと考えられる。これを解決するため、既に大腸菌にて可溶性画分に大量発現することが確認されているアフリカツメガエルCaMKIxのN末端40アミノ
酸に相当する配列（配列番号７）を30k-CaMKIIγのN末端に挿入し、発現ベクターpET-CX-30k-CaMKIIgを構築した。新たに合成したプライマーUrCaMKIIγ/EcoRIと実施例1で示したプライマーLrCaMKIIγ30/Xhoを用い、5'-RACE Ready cDNA library (Rat brain)（クロンテック社製）を鋳型にしてPCRを行った。
UrCaMKIIγ/EcoRI  5'-AAAGAATTCGATGGAGACCACCGCCACCTG-3'  （下線部EcoRI site）
LrCaMKIIγ30/Xho  5'-TTTCTCGAGGACCCATGGGTGCTTGAGAGC-3'  （下線部XhoI site）
PCRにはタカラバイオ社製のPyrobest DNA polymeraseを用い、プログラムは96℃ 2 min, (96℃ 10 sec, 68℃ 2 min) x 30, 68℃ 7 minで増幅した。増幅産物を電気泳動後、ゲルから精製し、EcoRIおよびXhoIで消化した。一方、pET-CaMKIxも同様にEcoRIおよびXhoIで消化することでCaMKIxのN末端40アミノ酸以外の部分を除去しておき、代わりに前述のPCR増幅産物を組み込むことで、発現ベクターpET-CX-30k-CaMKIIγを構築した（図4）。    
【００２３】
ラットCaMKIIγのかわりにヒトCaMKIIγ (Acc. No. BC034044)を用いる場合は、Ur-human CaMKIIγ/EcoRIとLr-human CaMKIIγ30/Xhoの二つのプライマーを用いることにより実施可能である。
Ur-human CaMKIIγ/EcoRI  5'-AAAGAATTCGATGGCCACCACCGCCACCTG-3'
（下線部EcoRI site）
Lr-human CaMKIIγ30/Xho  5'-TTTCTCGAGGACCCACGGGTGCTTGAGAGC-3'
（下線部XhoI site）
＜実施例4＞発現条件の検討３
発現ベクターpET-CX-30k-CaMKIIγを大腸菌BL21(DE3), BL21(DE3) pLysS, BL21(DE3) pLysE（Novagen社製）に電気穿孔法にて導入し、100 mg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地で37℃、16 h培養した。生えてきたコロニーを3 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピシリ
ン）に植菌し、37℃で16 h振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮な5 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピシリン）に植菌し、0.1 mMのIPTG存在・非存在下で37℃（or 25℃）で16 h振とう培養した。培養後の菌体をSDS-PAGEサンプル溶液中で超音波破砕し、SDS-PAGEにて発現の有無を確認した。BL21(DE3)で発現させた場合、37℃で培養するとIPTGの有
無に関わらず大量に発現したが、25℃では菌の生育が悪く、発現量も非常に少なかった。一方BL21(DE3) pLysS及びBL21(DE3) pLysEで発現させると、いずれの条件においても全く発現が認められなかった。最終的にBL21(DE3)を宿主とし、IPTG非存在下で37℃、24時間
培養するのが最も発現に適していた（図3）。
＜実施例5＞CX-30k-CaMKIIγの大量発現
発現ベクターpET-CX-30k-CaMKIIγを導入した大腸菌BL21(DE3)を3 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピシリン）に植菌し、37℃で16 h振とう培養した。次に、培養液の一部を新鮮
な100 mlのLB液体培地（100 mg/mlアンピシリン）に植菌し、37℃で24 h振とう培養した
。培養液を8,000 rpmで10 min遠心分離することで菌体を回収し、10 mlのホモジナイズ溶液(20 mM トリス塩酸(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 40)に懸濁して超音波破砕し
た。遠心分離にて沈殿を回収し(20,000g, 10分, 2℃)、同様に2回超音波破砕を繰り返す
ことで沈殿を洗浄し、不溶性画分を回収した。
＜実施例6＞CX-30k-CaMKIIγの可溶化
不溶性CX-30k-CaMKIIγを大量に含む画分は、可溶化溶液（6Mグアニジン塩酸塩、50mMト
リス塩酸（pH7.5）、10 mM β-メルカプトエタノール）中で超音波処理をすることにより完全に可溶化された。この時の可溶化サンプルの蛋白量は3 mg/ml以上になるように調整
した。
＜実施例7＞CX-30k-CaMKIIγの再生と精製
可溶化したCX-30k-CaMKIIγは、そのままでは活性が見られないので、酵素の再生法を検
討した。変性剤であるグアニジン塩酸を除くために透析処理を行っても活性の回復は全く見られなかったが、再生溶液（50 mM トリス塩酸（pH 7.5）、0.05% Tween 40、150 mM N
aCl、10% ethylene glycol、1 mM DTT）により急激に希釈すると活性が徐々に回復した。再生溶液により200倍に希釈して、氷上ならびに16℃に静置し、一定時間ごとにSyntide-2(PLARTLSVAGLPGKK)を基質に用いてプロテインキナーゼ活性を測定した（図5）。
【００２４】
プロテインキナーゼ活性は30℃における[γ-32P]ATP存在下での合成ペプチドへの１分
間あたりの[32P]リン酸の取り込み量をホスホセルロースペーパーを用いるRoskoskiの方
法（Roskoski, R. (1983) Assay of protein kinases. Methods in Enzymology 99, 3-6
）で測定することにより算出した。タンパク質リン酸化酵素の活性測定反応液の組成は以下の通りである。
【００２５】
活性測定反応液:40 mM HEPES-NaOH (pH8.0), 5 mM Mg(CH3COO)2, 0.1 mM EGTA, 2 mM dithiothreitol, 50 mM [γ-32P]ATP(200-500 cpm/pmol), 1 mg CX-30k-CaMKIIγ, 40 mM Syntide-2
16℃では、希釈後数時間で活性の回復がピークに達し、その後時間経過とともに活性の低下がみられた。これに対し、氷上での酵素再生処理では、24時間後までゆっくりと活性の回復が観察された（図5）。再生した酵素は、そのままでも使用可能であるが、酵素のC末端にhistidine-tagがついているので、HiTrap Chelating HPカラム（アマシャムバイオサイエンス社）を通して、容易に精製することが可能である。
＜実施例８〜１０＞発現条件の検討2
実施例３のCaMKIxのN末端40アミノ酸に代えて、CaMKIxのN末端の10アミノ酸（配列番号８）および３０アミノ酸（配列番号９）を30k-CaMKIIγのN末端に挿入した以外は、実施
例３〜７の操作を繰り返した。
【００２６】
その結果、CaMKIxのN末端30アミノ酸を使用した場合には、実施例３のCaMKIxのN末端40アミノ酸を使用した場合とほぼ同様の結果が得られたが、CaMKIxのN末端10アミノ酸を使
用した場合には、比活性が高くなったが、キナーゼタンパク質の発現量は低下した。
【００２７】
＜実施例１１＞活性型CX-30k-CaMKIIγを用いたタンパク質のリン酸化反応
再生した酵素が、native CaMKIIと同様にさまざまな基質タンパク質のリン酸化反応に
使えるかどうかを調べてみた。図6AはCa2+/calmodulin存在下でのCaMKIIによるリン酸化
反応を、図6BにはCX-30k-CaMKIIγによるリン酸化反応を示した。用いるタンパク質基質
は、ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein, MBP)（Sigma-Aldrich社製）、ヒストン(histone)（Sigma-Aldrich社製）、ミオシン軽鎖(myosin light chain, MLC)（ニ
ワトリの砂嚢から精製）、シナプシンI(Synapsin I)（ウシ脳から精製）の4種のタンパク質を用いた。
【００２８】
CaMKII及びCX-30k-CaMKIIγによるタンパク質リン酸化酵素の活性測定反応液の組成は
以下の通りである。またCX-30k-CaMKIIγによるリン酸化反応の場合、0.2 mM CaCl2と1 mM calmodulinは反応液から除いた。
【００２９】
活性測定反応液:40 mM HEPES-NaOH (pH8.0), 5 mM Mg(CH3COO)2, 0.1 mM EGTA, 2 mM dithiothreitol, 50 mM [γ-32P]ATP(200-500 cpm/pmol), 1 mg CX-30k-CaMKIIγまたはCaMKII, 100 mg/ml タンパク質基質, 0.2 mM CaCl2と1 mM calmodulin (CX-30k-CaMKIIγによるリン酸化反応の場合は除く)
CaMKIIを用いた場合、いずれの場合にも50 kDaと60 kDa付近にCaMKIIの自己リン酸化のバンドが認められた（図6A）。一方、CX-30k-CaMKIIγを用いたリン酸化反応では、Ca2+/calmodulinが不要であり、CX-30k-CaMKIIγにはCaMKIIの自己阻害ドメイン及びそれより
Ｃ末端側の領域を欠いているので、50 kDaと60 kDa付近のCaMKIIの自己リン酸化由来のバンドが認められなかった（図6B）。CaMKII及びCX-30k-CaMKIIγを用いた場合いずれも、M
BP、ヒストン、MLC、シナプシンIのリン酸化によるバンド（MBPは分子質量18 kDa 、ヒストンは14-15 kDa 、MLCは15-20 kDa、シナプシンIは80-86 kDa）が認められた。つまり、CX-30k-CaMKIIγを用いたリン酸化反応はnative CaMKIIを用いた場合と同程度に基質のリン酸化が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】カルモジュリン依存性リン酸化酵素II(CaMKII)の構造
【図２】pET-30k-CaMKIIγの構築
【図３】CX-30k-CaMKIIγの発現
【図４】pET-CX-30k-CaMKIIγの構築
【図５】CX-30k-CaMKIIγのキナーゼ活性
【図６】CaMKIIとCX-30k-CaMKIIγによるミエリン塩基性蛋白質、シナプシンI、ヒストン及びミオシン軽鎖のリン酸化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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