(57)【要約】【課題】EGFファミリーの増殖因子において、残存フラグメントの生理的意義を明らかにし、その作用を制御する方法を探索し、新たな医薬品を提供すること。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）を介する細胞内情報伝達を阻害する効果を測定することを特徴とする、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法，及び、当該残存フラグメントを介する細胞内情報伝達を阻害する物質を有効成分とする、細胞増殖抑制剤。（Ａ）細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント。（Ｂ）細胞膜結合型増殖因子の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該細胞膜結合型増殖因子と同じ活性を有するタンパク質の、残存フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）を介する細胞内情報伝達を阻害する効果を測定することを特徴とする、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（Ａ）細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント。
（Ｂ）細胞膜結合型増殖因子の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該細胞膜結合型増殖因子と同じ活性を有するタンパク質の、残存フラグメント。
【請求項２】
細胞内情報伝達を阻害する効果を測定する方法が、標識した転写調節因子のトランスフェクタントにおいて、被験物質の存在下または非存在下の各々の場合について、下記（１）及び（２）の工程を実施するものであることを特徴とする、請求項1に記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（１）細胞膜結合型増殖因子のプロセシングにより、当該増殖因子の残存フラグメントを生成させる工程。
（２）標識転写調節因子の核外輸送の程度を測定する工程。
【請求項３】
細胞内情報伝達を阻害する効果を測定する方法が、細胞内ドメインを標識した細胞膜結合型増殖因子を発現させた細胞において、被験物質の存在下または非存在下の各々の場合について、下記（１）及び（２）の工程を実施するものであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（１）細胞膜結合型増殖因子のプロセシングにより、当該増殖因子の標識残存フラグメントを生成させる工程。
（２）当該標識残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達を阻害する効果を測定する工程。
【請求項４】
（２）における標識残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達が、核内転写調節因子のＺｎフィンガー領域を介する情報伝達であることを特徴とする請求項３記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｚｎフィンガー領域が、下記１），２）を有する領域であることを特徴とする請求項４記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
１）２つのＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフ
２）１）の２つのフィンガーモチーフを連結するＴＧＥＫＰＹ配列を有する領域
【請求項６】
Ｚｎフィンガー領域が、下記（ｉ）〜（iii）のいずれかの領域であることを特徴とする請求項５記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（ｉ）ＰＬＺＦタンパク質のＺｎ５〜Ｚｎ８領域
（ii）Bcl-6タンパク質のＺｎ４〜Ｚｎ５領域
（iii）マイオニューリンタンパク質のＺｎ５〜Ｚｎ６領域
【請求項７】
細胞膜結合型増殖因子が、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子であり、（２）における標識残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達が、当該標識残存フラグメント中の、下記（iv）を介する情報伝達であることを特徴とする請求項３乃至６いずれかに記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（iv）プロセシング前のヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子におけるアミノ末端から数えて１８５〜１９８番目に相当するアミノ酸配列部分
【請求項８】
（１）の工程における残存フラグメント又は標識残存フラグメントの生成を、可溶化増殖因子の検出により確認することを特徴とする、請求項２又は３に記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞膜結合型増殖因子が上皮増殖因子ファミリーである請求項１から８のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
標識として、蛍光標識及び／又は抗原性を有するペプチドを用いる請求項２〜９のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
蛍光標識として、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ），黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ），緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のいずれかの蛍光タンパク質を用いることを特徴とする、請求項１０に記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメントを介する細胞内情報伝達を阻害する物質を有効成分とする、細胞増殖抑制剤。
【請求項１３】
細胞内情報伝達を阻害する物質が、（ａ）から（ｃ）のうちの少なくとも２つの間の情報伝達を阻害する物質であることを特徴とする、請求項１２記載の細胞増殖抑制剤。
（ａ）核内転写調節因子
（ｂ）細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント
（ｃ）ＤＮＡ
【請求項１４】
（ａ）がＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１３記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１５】
細胞内情報伝達を阻害する物質が、（ａ）中の（ｂ）と相互作用する領域に作用する物質であることを特徴とする、請求項１４記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１６】
（ａ）中の（ｂ）と相互作用する領域が、Ｚｎフィンガー領域であることを特徴とする、請求項１５記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
細胞内情報伝達を阻害する物質が、（ｂ）中の（ａ）と相互作用する領域に作用する物質であることを特徴とする、請求項１４記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１８】
（ｂ）中の（ａ）と相互作用する領域が、（ａ）のＺｎフィンガー領域と相互作用する領域であることを特徴とする、請求項１５記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１９】
（ｂ）がヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の残存フラグメントであり、（ｂ）中の（ａ）と相互作用する領域が、プロセシング前のヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の、アミノ末端から数えて１８５〜１９８番までの１４個のアミノ酸配列部分であることを特徴とする請求項１７記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２０】
下記（Ａ）又は（Ｂ）からなる、細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質。
（Ａ）細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント。
（Ｂ）細胞膜結合型増殖因子の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ当該細胞膜結合型増殖因子と同じ活性を有するタンパク質の、残存フラグメント。
【請求項２１】
請求項２０に記載の細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質の、アミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項２２】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質のＺｎフィンガー領域に結合する物質をスクリーニングすることを特徴とする、細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２３】
請求項１から１１に記載の何れかの方法を用いてスクリーニングすることを特徴とする、請求項２２に記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２４】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質がＰＬＺＦタンパク質，Bcl-6タンパク質，マイオニューリンタンパク質の何れかである請求項２２又は２３に記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２５】
細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント中の、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質結合領域に結合する物質をスクリーニングすることを特徴とする、細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２６】
請求項１から１１に記載の何れかの方法を用いてスクリーニングすることを特徴とする、請求項２５に記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２７】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質がＰＬＺＦタンパク質，Bcl-6タンパク質，マイオニューリンタンパク質の何れかである請求項２５又は２６に記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２８】
当該結合領域が、Ｚｎフィンガー領域の結合領域である請求項２５から２７の何れかに記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項２９】
ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の、アミノ末端から数えて１８５〜１９８番までの１４個のアミノ酸配列部分に結合する物質をスクリーニングすることを特徴とする、細胞増殖抑制剤の製造方法。
【請求項３０】
請求項１から１１に記載の何れかの方法を用いてスクリーニングすることを特徴とする、請求項２９に記載の細胞増殖抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、従来知られていなかった、細胞内情報伝達過程を阻害することのできる細胞増殖抑制剤の、スクリーニング方法等に関する。本願発明の方法は、細胞増殖抑制剤、特に新規な作用メカニズムに基づく制癌剤、抗リウマチ剤、心機能不全治療薬等のスクリーニング方法として極めて有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜結合型前駆体として生体内で合成され、プロセシング酵素による切断（シェディング、shedding）を受けて可溶型となり作用を発現する、細胞膜結合型増殖因子が、多数知られている。
【０００３】
例えば、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（HB-EGF）、アンフィレグリン（amphiregulin）、エピレグリン（epiregulin）、トランスフォーミング増殖因子−α（TGF−α）等はいずれも上皮増殖因子（EGF）ファミリーのメンバーであるが、これらEGFファミリーに属する増殖因子は、すべて細胞膜結合型の前駆体として生合成され、プロセシングを受けて可溶型となることが明らかにされている。そして、通常、可溶化された増殖因子が活性型としてErbB受容体ファミリーに結合し増殖因子としての作用を発現することが知られている。
【０００４】
腫瘍壊死因子（TNF-α）もこれらEGFファミリーの増殖因子と同様に、膜結合型前駆体が可溶化酵素によってプロセシングを受けた後、活性型として多くの生理作用を発現することが知られている。
【０００５】
しかしながら、いずれの場合においても、プロセシングにより活性型を放出した後に細胞表層部に残されたフラグメント（以下、残存フラグメント）の役割については従来知られていなかった。
【０００６】
一方、膜結合型の受容体が、細胞外刺激に応答して情報伝達物質（セカンドメッセンジャー）を放出し外部情報を細胞内に伝える機構はよく知られている。最近、膜結合型タンパク質の細胞外ドメインがプロセシングされると、これを契機として残存フラグメントが、場合により更なるプロセシングを受けてから核の中へ移行し遺伝子の転写過程を制御する情報伝達機構（Regulated intramembrane proteolysis; RIP）が提唱され、注目を集めている（M.S.Brown et al., Cell, 100,391-396(2000)）。
【０００７】
しかしながら、これらにおいても、その核への情報伝達事実が突き止められたに過ぎず、それがどういった情報であり、伝えられた情報によって次にどのような現象が起こるかといった、生理的意義は依然明らかにされていなかった。
【０００８】
また、少なくともHB-EGFについては、プロセシング後の残存フラグメントの動向自体、全く知られていなかった。
【非特許文献１】Cell, 100,391-396(2000)（M.S.Brown et al.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
HB-EGFをはじめとするEGFファミリーの増殖因子において、残存フラグメントの生理的意義は全く知られていない。本発明の目的はその生理的意義を明らかにすると共に、その作用を制御する方法及び新たな医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、種々の膜結合型増殖因子の中でも特にHB-EGFに着目し、その残存フラグメントを追跡する目的で、細胞内ドメインのカルボキシ末端（Ｃ端）を蛍光修飾したHB-EGFを、細胞に導入した。そして当該HB-EGFの細胞外ドメインが可溶化酵素によりプロセシングを受けた後、標識された細胞内ドメインが細胞内の核周辺に集積する様子を、顕微鏡下において観察した。
【００１１】
残存フラグメントの核内輸送が示唆されたため、次いでHB-EGFの残存フラグメントと相互作用する核内タンパク質を検索した。ヒト心臓のｃＤＮＡライブラリーを対象に、HB-EGFの細胞内ドメイン（185-208aa）をベイト（bait）として酵母を用いたシステム（two-hybrid system; クロンテック社）により探索した結果、相互作用するタンパク質として前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（以下、ＰＬＺＦ）タンパク質が見出された。
【００１２】
ＰＬＺＦタンパク質は、細胞核内においてサイクリンＡの作用を抑えることにより細胞増殖を抑制していることが知られている（Yeyati et al., Oncogene, 18, 925-934(1999)）。従って、HB-EGFの残存フラグメントはこのＰＬＺＦタンパク質と何らかの相互作用をすることにより細胞増殖のコントロールに関与している可能性が示唆された。
【００１３】
そこで、本発明者は鋭意研究を進めた結果、以下の事実を見出した。
【００１４】
1）標識したＰＬＺＦタンパク質を核に導入した細胞において、HB-EGFの細胞外ドメインが可溶化酵素によりプロセシングを受けると、残存フラグメントが、当該標識ＰＬＺＦタンパク質のＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを含む領域に結合すること。
2）当該標識ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が観測されること。
3）ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送に対応して、核内にサイクリンＡの発現が認められること。
4）上記のサイクリンＡの発現に伴って、ブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込み量減少が観測され、細胞周期の進行が認められること。
【００１５】
そして、上記2）の核外輸送が、抗腫瘍剤レプトマイシンＢの添加によって阻害されること（後記実施例参照）を確認して、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１６】
アミノ末端（Ｎ端）が蛍光標識されたCFP-PLZFをトランスフェクトした細胞において、HB-EGFの細胞外ドメインが可溶化酵素によりプロセシングを受けると、当該標識ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が観測され、その効果はプロセシング阻害剤により抑制された（試験例3）。
【００１７】
次に、免疫蛍光法を用いてＰＬＺＦタンパク質とサイクリンＡがそれぞれ細胞の核内に存在することを確認した後、HB-EGFの細胞外ドメインが可溶化酵素によりプロセシングを受けるとＰＬＺＦタンパク質が核外輸送されるとともにサイクリンＡの蛍光強度が増加することが確認された（試験例4）。
【００１８】
また、細胞内にＰＬＺＦタンパク質を強制的に発現させるとサイクリンＡの作用が抑制され細胞周期のＳ期に細胞が集中するため一時的にブロモデオキシウリジン（BrdU）の取込量が増加する。ここで可溶化酵素により細胞外ドメインのプロセシングを行うとＰＬＺＦタンパクの核外輸送のためサイクリンＡの作用が亢進され細胞増殖がＳ期から先のＧ２期へ進行するためBrdUの取りこみ量は減少する（試験例5）。
【００１９】
そして、実際に、可溶化酵素による細胞外ドメインのプロセシングが起こった後であっても、レプトマイシンＢの添加によってＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が、阻害を受けること（後記実施例参照）を確認した。レプトマイシンＢは核外輸送の阻害剤（Kudo et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96,9112-9117(1999)）であって抗腫瘍性抗生物質として知られていることから、細胞内ドメインによる核内転写調節因子の核外輸送を阻害することが、抗腫瘍性の本質であり、本願発明が細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法として有用であることが確かめられた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明で言うスクリーニングには、複数候補の中から、本発明の阻害剤を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物の抗腫瘍性（細胞増殖抑制能）を確認するための、二次スクリーニング（確認試験）も、含まれる。
【００２１】
本発明において、細胞内情報伝達を阻害する効果を測定する方法の一つは、実質的に、被験物質の存在下または非存在下の各々の場合について、試験細胞に対して（１）細胞膜結合型増殖因子のプロセシングにより当該増殖因子の残存フラグメントを生成させる工程と、（２）標識転写調節因子の核外輸送の程度を測定する工程よりなる。
【００２２】
細胞膜結合型増殖因子とは、その前駆体が細胞膜表面上（エクトドメイン領域）に存在し、プロセシング酵素による切断（シェディング、shedding）を受けて可溶型となって作用を発揮することが知られている成長因子である。ＨＢ−ＥＧＦの他、エピレグリン（epiregulin）、アンフィレグリン（amphiregurin）、トランスフォーミング増殖因子−α（TGF−α）、ニューレグリン（neuregulin）、ＮＴＡＫ等の上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）等を例示することができる。
【００２３】
本願明細書において、残存フラグメントとは、下記の（Ｘ），（Ｙ），（Ｚ）を含むものである。
【００２４】
（Ｘ）プロセシングにより活性型を放出した後に残されたフラグメント。
（Ｙ）再度プロセシングを受けて（Ｘ）の細胞膜内ドメインの少なくとも一部が切り離されたフラグメント。
（Ｚ）その生成過程によらず、（Ｘ），（Ｙ）と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００２５】
尚、（Ｙ）は、再度のプロセシングにより、細胞膜からの遊離がし易い傾向を有する。
【００２６】
また、転写調節因子とはＤＮＡのプロモーター部分と結合することによりＲＮＡポリメラーゼの作用を阻害し遺伝子発現を調節しているタンパク質（リプレッサー）であって、上記細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメントによる情報伝達を受けるものであり、ＨＤＡＣ５，ＨＤＡＣ７，ＨＤＡＣ９等のヒストンデアセチラーゼ（Histone deacetylase，ＨＤＡＣ）やそれらのスプライシングアイソフォーム、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質等が挙げられる。ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質としては、具体的にはＰＬＺＦタンパク質，Bcl-6タンパク質，マイオニューリン（Myoneurin）タンパク質，ＫＩＡＡ０４４１（「かずさDNA研究所」コード番号）タンパク質等を例示することができる。
【００２７】
試験細胞としては、プロセシングの標的とされる増殖因子を発現する細胞であればいずれも利用することができるが、特定の残存フラグメントによる情報伝達に対する効果を解析するためには、スクリーニング系を単純化して特定の増殖因子のみを発現している細胞を用いることが好ましい。例えば、HB-EGFの場合はHB-EGFをトランスフェクトしたヒト線維肉腫細胞HT1080（H1080/HB-EGF）を好適に用いることができる。
【００２８】
本発明において、HB-EGFは、野生型だけではなく、その核内転写調節因子との相互作用活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸を欠失・置換・付加したものも使用することができる。
【００２９】
例えば、本発明者は、Ｃ端のアミノ酸を１０個欠失させたHB-EGFであっても、残存フラグメントが核周辺に集まり、プロセシングに伴って、核内のＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が起こることを確認した。更に本発明者は、残存フラグメント中の電荷を有するアミノ酸の置換によって、核外輸送が生じなくなることも確認した。
【００３０】
このことは、HB-EGFのＰＬＺＦタンパク質核外輸送活性本体が、185〜198番までのアミノ酸配列部分内に存すること、および正電荷もしくは負電荷を有するアミノ酸残基の存在が核外輸送活性に必須であることを示唆している。
【００３１】
従って、このＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が起こる欠失・置換型のHB-EGFとしては、例えば下記の（１）又は（２）等が挙げられる。
【００３２】
（１）HB-EGFの、いわゆるCyto領域（細胞質内領域；Cytoplasmic domain），つまり１８５〜２０８番までの２４個のアミノ酸配列部分（具体的には、ＲＹＨＲＲＧＧＹＤＶＥＮＥＥＫＶＫＬＧＭＴＮＳＨ）のうち、１９９〜２０８番までの１０個のアミノ酸配列部分に相当するアミノ酸の少なくとも１個を欠失させた欠失型HB-EGF。
【００３３】
（２）野生型又は（１）に記載されたHB-EGF各々の１８５番目以降のアミノ酸配列において、非電荷アミノ酸残基を他の非電荷アミノ酸残基で置換した置換型HB-EGF。
【００３４】
従って、本発明の細胞増殖抑制剤の製造方法は、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子の、アミノ末端から数えて１８５〜１９８番までの１４個のアミノ酸配列部分に結合する物質をスクリーニングすることによって達成することができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法において、細胞膜結合型増殖因子のプロセシングを行う場合は、通常、ＴＰＡ（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート）のような、プロテインキナーゼＣの活性化剤を添加し、プロセシング酵素（HT1080の場合はADAM12）を作用させて行う。
【００３６】
プロセシングの進行，つまり残存フラグメント又は標識残存フラグメントの生成の確認は、その結果生じる可溶化増殖因子を確認することにより可能である。
【００３７】
可溶化増殖因子の生成を確認する方法としては、例えばHB-EGFの場合、以下の方法を挙げることができる。
【００３８】
（アルカリホスファターゼ（AP）のトランスフェクタントを使用する方法）
ＰＣＴ公開公報（ＷＯ01/70269）に記載された手法に従って、AP活性を測定することにより可溶化HB-EGFの生成を確認できる。
【００３９】
（ヘパリン−ビーズを用いる沈降方法）
培養上清１ｍｌにNaClを0.35モル濃度になるように添加する。これにヘパリン−セファロース（ヘパリン−ビーズ）を２０μｌ添加し、室温で３０分インキュベーションする。次に、ヘパリン−ビーズをPBSで３回洗浄し、0.5ｍｌのPBSに懸濁し、HB-EGF抗体＃H6（soluble HB-EGFに対する抗体）を反応させ、AP−結合２次抗体を反応させて、AP活性を測定する。
【００４０】
（ジフテリア毒素とHB-EGF抗体＃H6を用いたサンドイッチELISA法）
９６イムノプレートにジフテリア毒素（シグマ社製）3μｇ／ml PBS、１００μｌ／ウエルで固相化する。細胞培養上清１００μｌを加え室温で２時間反応したのち、ビオチン標識１次抗体、AP標識ストレプトアビジンで反応させ、AP活性を検出する。各反応後のプレート洗浄はPBS / Tween (0.05%)で行う。
【００４１】
尚、プロセシングに際しては、ＴＰＡに代えてエンドセリン−１等を使用することもできる。
【００４２】
プロセシング工程は試験細胞によっても異なるが、ＴＰＡを用いる場合は通常、３０分から９０分、エンドセリン−１を用いる場合は通常、１時間から２時間程度を要する。
【００４３】
プロセシングの工程が終了後、標識転写調節因子の検出または定量の工程に移る。
【００４４】
以下、ＰＬＺＦタンパク質を例に、標識転写調節因子の検出または定量工程を説明する。
【００４５】
ＰＬＺＦタンパク質の標識化には、蛍光標識として例えば黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（商標：Living Colors、クロンテック社）等の蛍光タンパク質を利用できる。又、例えば抗原性の高い合成ペプチド、例えば、合成オクタペプチド（商標：フラッグ、シグマ・アルドリッチ社）をＰＬＺＦタンパク質の標識として用い、当該標識を、蛍光タンパク質等の蛍光標識や色素を結合させた抗体等を用いて検出する方法も可能である。
【００４６】
ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送の評価は、プロセシング工程が終了し所定の時間の経過後に行う。
【００４７】
具体的には、例えばシアン色蛍光タンパク（cyan fluorescent protein; CFP）をＰＬＺＦタンパク質のＮ端に結合させて得られる標識タンパク（CFP-PLZF）をプラスミドに組み込み、常法により試験細胞にトランスフェクトする。そして、プロセシング処理の後、蛍光顕微鏡（例えば、Nikon ECLIPSE TE300, ZEISS LSM 510等）を用いて核外輸送の程度を評価する。
【００４８】
核外輸送の程度を測定する方法としては、核内に残された標識転写調節因子，又は核外に輸送された標識転写調節因子の、いずれかを検出又は定量する方法が挙げられるが、例えば、核内に残された標識転写調節因子の検出・定量の場合、標識ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が生じない細胞の数を計測し当該トランスフェクタントの細胞数との比率を計算する方法，または、核内の標識ＰＬＺＦタンパク質に由来する蛍光強度を測定し対照のトランスフェクタントのものと比較することにより被験物質が有するＰＬＺＦタンパク質の核外輸送阻害効力を評価する方法等が挙げられる。
【００４９】
尚、本発明で言う核外輸送の程度の測定方法には、核外へ輸送される前段階としての、核膜近傍への標識転写調節因子の移動の程度を測定する方法も含まれる。
【００５０】
また、既に述べたとおり、細胞内ドメインのＣ端を蛍光修飾したHB-EGFをトランスフェクトした細胞において、HB-EGFの細胞外ドメインが可溶化酵素によりプロセシングを受けると、標識体が、一旦ゴルジ体と接近した後に、細胞内の核周辺に集積する様子が観察された。
【００５１】
従って、本発明において、細胞内情報伝達を阻害する効果を測定するもう一つの方法は、標識転写調節因子の核外輸送の程度を測定する工程に替えて、残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達を阻害する効果を測定する工程を用いる方法である。
【００５２】
残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達は、具体的には、残存フラグメントの、ゴルジ体への接近，その後の遊離，核周辺への集積，核内への輸送，あるいは核内転写調節因子への結合又は接近，核内転写調節因子との相互作用，残存フラグメントと核内転写調節因子及びＤＮＡからなる複合体の形成等が挙げられる。
【００５３】
尚、残存フラグメントと核内転写調節因子との接近，又は相互作用は、転写調節因子がＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質である場合には、当該タンパク質のＺｎフィンガー領域との間で起こることが、本願発明者らによって明らかとなった。
【００５４】
従って、本発明のスクリーニング方法における、残存フラグメントから核内転写調節因子への情報伝達としては、核内転写調節因子のＺｎフィンガー領域を介する情報伝達が挙げられる。
【００５５】
従って、本発明の細胞増殖抑制剤の製造方法は、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質のＺｎフィンガー領域に結合する物質，あるいは細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメント中の、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質結合領域に結合する物質を有効成分として用いることによって達成することができる。例えば、Ｚｎフィンガー領域に対する抗体，又は細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメントに対する抗体を有効成分として製造することができる。
【００５６】
Ｚｎフィンガー領域とは、Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを含む領域のことである。具体的には、下記１），２）を含む領域である。
1) ２つのＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフ
2) １）の２つのフィンガーモチーフを連結するＴＧＥＫＰＹ配列を有する領域
【００５７】
具体的には、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、ＰＬＺＦタンパク質の場合は、残存フラグメントは、９つのＺｎフィンガーモチーフのうち、６番目のＺｎ６と７番目のＺｎ７，及びそれらに挟まれたＴＧＥＫＰＹ配列に、結合する。但し、Ｚｎ６〜Ｚｎ７の領域のみでは結合に不十分であり、後述の試験例1で示すように、Ｚｎ５〜Ｚｎ８の領域が必要である。
【００５８】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、Bcl-6タンパク質の場合は、残存フラグメントは、６つのＺｎフィンガーモチーフのうち、４番目のＺｎ４と５番目のＺｎ５，及びそれらに挟まれたＴＧＥＫＰＹＰ配列（Ｚｎ４〜Ｚｎ５）に、結合する。
【００５９】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、マイオニューリンタンパク質の場合は、残存フラグメントは、８つのＺｎフィンガーモチーフのうち、５番目のＺｎ５と６番目のＺｎ６，及びそれらに挟まれたＴＧＥＫＰＹ配列（Ｚｎ５〜Ｚｎ６）に、結合する。
【００６０】
標識体の核周辺への集積や核内輸送の傾向の評価も、前記と同様、集積が生じないトランスフェクタントの細胞数を計測するか、核周辺または核内の標識体由来蛍光強度を測定して行うことができる。
【００６１】
また、残存フラグメントとして、プロセシング以外の方法で人工的に製造したものを、細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質として用いる場合には、膜結合因子としてＮＬＳ（Nuclear  Localization  Signal）タンパク質を結合させても良い。従って、このスクリーニング用タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、スクリーニング用キット等に利用可能な、当該タンパク質の製造にとっても、有用である。
【００６２】
尚、この場合の標識の対象は、必ずしもＣ端のアミノ酸である必要はなく、情報伝達に影響を及ぼさない箇所であれば良い。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法で選択される細胞増殖抑制剤は、細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメントを介する細胞内情報伝達を阻害する物質であるが、その候補として例えば次の様なものが考えられる。
【００６４】
一つは、（ａ）中の（ｂ）と相互作用する領域に作用する物質である。
【００６５】
具体的には、残存フラグメントと同一又は類似の構造を有するタンパク質であって、本来の残存フラグメントと拮抗して、当該残存フラグメントの情報伝達を阻害する物質等が挙げられる。
【００６６】
この残存フラグメントと類似の構造を有するタンパク質を、細胞増殖抑制剤として用いる場合には、本来の残存フラグメントとの拮抗性を高めるため、内在性の細胞膜結合型増殖因子よりも、高濃度で細胞に導入することが好ましい。
【００６７】
また他には、例えば次のような物質が挙げられ、単一物質であっても、複数の物質の集合体であっても良い。
【００６８】
転写調節因子（ａ）が、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質である場合には、残存フラグメント（ｂ）を介する細胞内情報伝達を阻害する物質は、（ａ）中の（ｂ）と相互作用する領域である、当該タンパク質のＺｎフィンガー領域に結合又は接近し、Ｚｎフィンガー領域と残存フラグメントとの相互作用を阻害する物質である。
【００６９】
具体的には、下記１）の２つのモチーフ又は２）の領域のうち、少なくとも１箇所に結合又は接近する物質であるが、２箇所に結合又は接近するものが好ましい。この結合又は接近は、必ずしも、各領域の全域に亘る必要は無く、残存フラグメントが当該領域に結合又は接近するのを実質的に阻害できる程度の結合又は接近で良い。
１）２つのＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフ
２）１）の２つのフィンガーモチーフを連結するＴＧＥＫＰＹ配列を有する領域
【００７０】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、ＰＬＺＦタンパク質の場合、１）は、９つのＺｎフィンガーモチーフのうち、５番目のＺｎ５〜８番目のＺｎ８の少なくともいずれか２つ，２）は、Ｚｎ６とＺｎ７の間のＴＧＥＫＰＹ配列である（試験例1）。
【００７１】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、Bcl-6タンパク質の場合、１）は、６つのＺｎフィンガーモチーフのうち、４番目のＺｎ４と５番目のＺｎ５，２）は、ＴＧＥＫＰＹＰ配列である（試験例2）。
【００７２】
ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質が、マイオニューリンタンパク質の場合、１）は、８つのＺｎフィンガーモチーフのうち、５番目のＺｎ５と６番目のＺｎ６，２）は、ＴＧＥＫＰＹ配列である。
【００７３】
これらの上記１），２）を含む領域の少なくとも１箇所に結合又は接近する物質としては、ＥＧＦファミリー蛋白の残存フラグメントの疑似ペプチドまたは疑似合成化合物等の他、上記１），２）を含む領域に対する抗体等が挙げられる。
【００７４】
これらの、１），２）を含む領域に対する抗体は、１）の２つのモチーフ又は２）の領域のうち、少なくとも１箇所を抗原とし、マウス等に免疫する常法によって製造することができる。しかし、より確実に情報伝達を阻害するには、２箇所の各々を抗原とする抗体の組み合わせ，あるいは、当該２箇所を一度で認識できる抗体が、好ましい。
【００７５】
残存フラグメントを介する細胞内情報伝達を阻害するもう一つの物質は、（ｂ）中の（ａ）と相互作用する領域に作用する物質である。
【００７６】
具体的には、残存フラグメント（ｂ）に対する抗体や、核内転写調節因子（ａ）と同一又は類似の構造を有するタンパク質であって、本来の核内転写調節因子（ａ）と拮抗して、当該核内転写調節因子（ａ）への情報伝達を阻害する物質等が挙げられる。
【００７７】
この核内転写調節因子（ａ）と類似の構造を有するタンパク質を、細胞増殖抑制剤として用いる場合には、本来の核内転写調節因子（ａ）との拮抗性を高めるため、内在性の核内転写調節因子（ａ）よりも、高濃度で細胞に導入することが好ましい。
【００７８】
転写調節因子（ａ）が、ＢＴＢ／Ｃ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフを有するタンパク質である場合には、残存フラグメント（ｂ）を介する細胞内情報伝達を阻害する物質は、（ｂ）中の（ａ）と相互作用する領域である、当該タンパク質のＺｎフィンガー領域と相互作用する領域に作用し、Ｚｎフィンガー領域と残存フラグメントとの相互作用を阻害する物質である。
【００７９】
具体的には、（ｂ）中の、下記（ａ）の１）の２つのモチーフ又は２）の領域のうち、少なくとも１箇所が相互作用する領域に、核内転写調節因子（ａ）と拮抗して作用する物質である。拮抗する物質としては、２箇所以上で核内転写調節因子（ａ）と拮抗するものが好ましい。この相互作用は、必ずしも、（ｂ）中の、下記１），２）の各領域の全域に亘る必要は無く、核内転写調節因子（ａ）が、当該領域に作用するのを実質的に阻害できる程度の相互作用で良い。
１）２つのＣ２Ｈ２Ｚｎフィンガーモチーフ
２）１）の２つのフィンガーモチーフを連結するＴＧＥＫＰＹ配列を有する領域
【００８０】
これらの上記１），２）を含む領域の少なくとも１箇所と相互作用する領域に作用する物質としては、核内調節因子中のＺｎフィンガー領域の少なくとも一部の、疑似ペプチドまたは疑似合成化合物等の他、残存フラグメント中の、核内調節因子のＺｎフィンガー領域と相互作用する領域に対する抗体等が挙げられる。
【００８１】
これらの抗体も、残存フラグメント（ｂ）中の、核内調節因子（ａ）のＺｎフィンガー領域と相互作用する領域の少なくとも一部を抗原とし、マウス等に免疫する常法によって製造することができる。しかし、より確実に情報伝達を阻害するには、Ｚｎフィンガー領域と相互作用する領域のうち、できるだけ多くの領域を認識できる抗体が、好ましい。
【００８２】
本発明者は、「HB-EGFの残存フラグメントを抗原とするウサギポリクローナル抗体」によって、PLZFの核外輸送が阻害することを確認した。
【００８３】
また、残存フラグメント（ｂ）がHB-EGFの残存フラグメントである場合、核内調節因子（ａ）と相互作用する領域である、プロセシング前のHB-EGFのアミノ末端から数えて１８５〜１９８番までの１４個のアミノ酸配列部分の少なくとも一部に対する抗体であっても良い。
【００８４】
これらの抗体も、１８５〜１９８番までの１４個のアミノ酸配列部分の少なくとも一部を抗原とし、マウス等に免疫する常法によって製造することができる。しかし、より確実に情報伝達を阻害するには、１８５〜１９８番までのアミノ酸配列のうち、できるだけ多くのアミノ酸部分に対する抗体であることが、好ましい。
【００８５】
細胞膜結合型増殖因子の残存フラグメントを介する細胞内情報伝達を阻害する、他の物質の例としては、核内転写調節因子の核外汲み出しを阻害する物質が挙げられる。具体的には、ＰＬＺＦタンパク質と、その核外輸送に関与するエクスポーチンであるCRM１等との結合又は接近を阻害するレプトマイシンＢのような、核内転写調節因子とエクスポーチンとの相互作用を阻害する物質等が挙げられる。
【００８６】
これらの本発明の細胞増殖抑制剤は、細胞増殖に起因する疾病の治療に用いることができる。
【００８７】
試験例1  ＰＬＺＦタンパク質に対するＨＢ―ＥＧＦ残存フラグメントの結合領域
【００８８】
１．試験方法
(1)残存フラグメントと相互作用するＰＬＺＦタンパク質の領域を特定するために、ＧＳＴ pull-down assay を行った。
(2)ＧＳＴ pull-down assay スタンダード・プロトコルに従い、大腸菌BL21株によって、発現・単離させた、ＧＳＴ，ＧＳＴ結合ＨＢ−ＥＧＦ残存フラグメントを使用した。グルタチオン・セファロース・ビーズにこれらを結合させた後、FLAGで標識した様々なＰＬＺＦタンパク質誘導体を含む細胞溶解物を、４℃で２時間、２０μｌのビーズと共にインキュベートした。水洗後、結合したタンパク質を、抗FLAG抗体（Sigma Aldrich）を用いたイムノブロッティングによって分析した。
【００８９】
２．試験結果
ＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントは、下記のＰＬＺＦタンパク質誘導体には、野生型ＰＬＺＦと同様に、強く結合した。
１）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ９の領域のみからなる誘導体
２）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ４〜Ｚｎ９の領域のみからなる誘導体
３）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ５〜Ｚｎ８の領域のみからなる誘導体
【００９０】
また、下記のＰＬＺＦタンパク質誘導体には、野生型ＰＬＺＦ程ではないが、ＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントが結合した。
４）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ６の領域のみからなる誘導体
【００９１】
一方、下記のＰＬＺＦタンパク質誘導体にはＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントは結合しなかった。
５）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎフィンガー領域を欠く誘導体
６）ＰＬＺＦタンパク質の、ＢＴＢ領域のみからなる誘導体
７）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ６〜Ｚｎ７の領域のみからなる誘導体
８）ＰＬＺＦタンパク質の、Ｚｎ６〜Ｚｎ７の領域を欠く誘導体
【００９２】
以上の結果から、Ｚｎ６〜Ｚｎ７の領域も網羅したＺｎ５〜Ｚｎ８の領域が必要であることが分かった。
【００９３】
試験例2
Bcl-6タンパク質に対するＨＢ―ＥＧＦ残存フラグメントの結合領域
【００９４】
１．試験方法
試験例1と同様の方法で、Bcl-6タンパク質に対する残存フラグメントの結合領域を調べた。
【００９５】
２．試験結果
ＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントは、下記のBcl-6タンパク質誘導体には、強く結合した。
１）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ６の領域のみからなる誘導体
２）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ５の領域のみからなる誘導体
３）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ２〜Ｚｎ６の領域のみからなる誘導体
４）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ３〜Ｚｎ６の領域のみからなる誘導体
５）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ４〜Ｚｎ６の領域のみからなる誘導体
【００９６】
また、下記のBcl-6タンパク質誘導体にも、上記の誘導体程ではないが、ＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントが結合した。
６）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ４及びＺｎ４のＣ末に結合するＴＧＥＫＰＹ配列からなる誘導体
７）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ５〜Ｚｎ６の領域及びＺｎ５のＮ末に結合するＴＧＥＫＰＹＰ配列からなる誘導体
【００９７】
一方、下記のBcl-6タンパク質誘導体にはＨＢ−ＥＧＦの残存フラグメントは結合しなかった。
８）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ４の領域のみからなる誘導体
９）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ３の領域を欠く誘導体
１０）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ１〜Ｚｎ２の領域を欠く誘導体
１１）Bcl-6タンパク質の、Ｚｎ５〜Ｚｎ６の領域を欠く誘導体
【００９８】
以上の結果から、Ｚｎ４，Ｚｎ５の間にあるＴＧＥＫＰＹ（Ｐ）配列，及び少なくともＺｎ４，Ｚｎ５のいずれか（好ましくは両方）の領域が必須であることが分かった。
【００９９】
試験例3 プロセシングによるＰＬＺＦタンパク質の核外輸送
【０１００】
１．試験方法
次の細胞群を使用した；
1）ヒト線維肉腫細胞HT1080 
2）HB-EGFを導入したHT1080（HT1080/HB-EGF）
3）上記細胞でADAM12のメタロプロテアーゼドメインが欠損したミュータント（HT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGF）
4）プロセシング抵抗性のHB-EGFを導入したHT1080（HT1080/HB-EGF-UC）
【０１０１】
1）から3）については既に報告（Asakura et al., Nat. Med.,8,35-40(2002)）がある。
4）はプロセシング抵抗性のHB-EGF（Hirata et al., BBRC, 283,915-922(2001)）発現ベクターを、リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社）を用いてHT1080にトランスフェクトさせて作製した。
【０１０２】
ＰＬＺＦタンパク質の標識化は、シアン色蛍光タンパク（CFP）のcDNAをＰＬＺＦタンパク質cDNAのＮ端側に導入して行い、市販のベクター（pECFP-C1；クロンテック社）を利用して上記の各細胞にトランスフェクトした。
【０１０３】
CFP-PLZFを含む各トランスフェクタントを24時間培養した後、100nM TPAを添加して60分間処理をした。TPA処理の前後各々において、蛍光顕微鏡観察下、核内にCFP-PLZFを発現している細胞の数（Ｎ）と、細胞質中に漏れだしている細胞の数（Ｃ）の各々をカウントし、CFP-PLZFを発現している細胞の総数（Ｎ＋Ｃ）中の、核内にCFP-PLZFを発現している細胞の数（Ｎ）の割合を算出することによって、求めた（Ｎ／（Ｎ＋Ｃ）×１００（％））。野生のHT1080細胞（上記の1））を比較の対照（control）とした。
【０１０４】
２．試験結果
結果を図1に示した。ＴＰＡ処理によってプロセシングが惹起され、HB-EGFの残存フラグメントが細胞の核内に存在するＰＬＺＦタンパク質の核外輸送を引き起こした。その結果、HT1080/HB-EGFではＴＰＡ処理により核内に存在するCFP-PLZFの蛍光強度が減少するが、HB-EGFの存在しない対照細胞（HT1080）ではＴＰＡ処理の前後でCFP-PLZFの蛍光強度は変化しなかった。一方、HT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGFではＴＰＡ処理によってもプロセシングが惹起されず、またHT1080/HB-EGF-UCではHB-EGFがプロセシングに対して抵抗性なので、これら細胞においてもＴＰＡ処理の前後でCFP-PLZFの蛍光強度は変化しなかった。
【０１０５】
試験例4 ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送に伴うサイクリンＡの発現
【０１０６】
１．試験方法
免疫蛍光法によりＰＬＺＦタンパク質の核外輸送に伴うサイクリンＡの発現を追跡した。ＰＬＺＦタンパク質のｃＤＮＡのＮ端に抗原性の高い合成オクタペプチド（商標：フラッグ、シグマ・アルドリッチ社）のｃＤＮＡを結合し、市販のベクター（pcDNA3.1/Hygro(+)；インビトロジェン社）を用いてHT1080/HB-EGFにトランスフェクトした。
【０１０７】
培養した当該トランスフェクタントをＴＰＡ処理（100 nM, 8時間）した後、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）で洗浄し４％パラホルムアルデヒド（PFA）／PBSで固定化した（４℃、１０分間）。続いて、0.5％トリトンＸ-100／PBS及び1％ウシ血清アルブミン（BSA）で処理をした。
【０１０８】
導入したオクタペプチドに対するマウスモノクローナルIgG抗体およびサイクリンＡに対するウサギポリクローナル抗体を加えて１時間インキュベーションし、PBSで洗浄後、蛍光標識であるローダミン融合（rhodamine-conjugated）ヤギ抗マウスIgG抗体，および蛍光標識（商標：Alexa Fluor 488、モレキュラプローブス社）ヤギ抗ウサギIgG抗体を添加して、更に１時間インキュベートした。PBSで洗浄後、50％グリセロールと0.1％フェニレンジアミンを含むPBSで細胞をマウントして蛍光顕微鏡で観察し、画像処理ソフトウェア（商標：Lumina Vision、三谷商事）を用いて蛍光強度を測定した。
【０１０９】
２．試験結果
試験に用いた細胞のそれぞれの核について、ＰＬＺＦタンパク質と結合したオクタペプチドに由来する蛍光強度を縦軸、サイクリンＡに由来する蛍光強度を横軸としてＴＰＡ処理の有無による相違を比較した（図２）。オクタペプチド標識したＰＬＺＦタンパク質の導入によって抑制を受けていた核内サイクリンＡの発現が、ＴＰＡ処理によってＰＬＺＦタンパク質が核外輸送された結果、抑制から開放され、サイクリンＡの蛍光強度が高強度領域（0.8付近）に収束することが観察できた。
【０１１０】
尚、かかる効果は、HT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGF、HT1080/HB-EGF-UCにおいては認められなかった。
【０１１１】
試験例5 プロセシングによるBrdUの取込み量の変化
【０１１２】
１．試験方法
試験例3の細胞群（HT1080、HT1080/HB-EGF、HT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGF及びHT1080/HB-EGF-UC）について、合成オクタペプチドで標識したＰＬＺＦタンパク質（試験例4参照）をそれぞれトランスフェクトした。
【０１１３】
各トランスフェクタントをイーグルMEM培地（3％FCS含有）で３６時間培養し、同培地（10％FCS含有）で１２時間インキュベートした後100nMＴＰＡを加えて２時間処理した。その後、3μg/mlのBrdUを培地に添加して更に２時間インキュベートした。4％PFA/PBSによる固定化と0.5％トリトンX-100/PBSによる透過処理の後、細胞を2Ｎ塩酸で30分、続いて1％BSAで30分処理した。
【０１１４】
オクタペプチド部分に対するマウスモノクローナルIgG抗体（シグマ社）とBrdUに対するラットモノクローナルIgG抗体（Abcam社）を加えて1時間インキュベートし、PBSで洗浄後、蛍光イソチオシアネート融合（isothiocyanate-conjugated）ヤギ抗マウスIgG抗体および蛍光標識であるローダミン融合（rhodamine-conjugated）ヤギ抗ラットIgG抗体（ケミコン社）を添加して更にインキュベートした。PBSで洗浄し50％グリセロールと0.1％フェニレンジアミンを含むPBSで細胞をマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１５】
オクタペプチドで標識したＰＬＺＦタンパク質のトランスフェクタントおよび非トランスフェクタントにおいてBrdUを取り込んだ細胞数の割合をＴＰＡ処理の有無で比較した。
【０１１６】
２．試験結果
結果を図３に示した。ＰＬＺＦタンパク質の非トランスフェクタントではBrdUの取込率は通常40から50％前後でありＴＰＡ処理を行っても変化しなかった。しかし、ＰＬＺＦのトランスフェクタントにおいては、発現したＰＬＺＦタンパク質のサプレッサー効果によりサイクリンＡの作用が抑制され、細胞周期がＳ期（ＤＮＡ合成期）より先に進行しなくなるのでBrdUの取込率が上昇した。ここでＴＰＡ処理を行うとＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が働くため同タンパク質のサプレッサー効果が弱くなりサイクリンＡが活性化して細胞周期がＳ期からその先のＧ1期へ進行し、結果的にBrdUの取込率は低下した。しかしながら、HB-EGFが殆ど存在しないHT1080や、プロセシングが作用しないHT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGF及びプロセシングに抵抗するHT1080/HB-EGF-UCではＴＰＡ処理によってはBrdUの取込率は変化しなかった。
【０１１７】
試験例6 プロセシングによるBcl-6タンパク質，マイオニューリンタンパク質の核外輸送
【０１１８】
１．試験方法
次の細胞群を使用し、標識化した転写調節因子として、ＰＬＺＦタンパク質に変えて、Bcl-6タンパク質，マイオニューリンタンパク質を用いる以外は、試験例3と同様の方法を用いて、これらの転写調節因子の核外輸送の有無を調べた。 1）ヒト線維肉腫細胞HT1080 2）HB-EGFを導入したHT1080（HT1080/HB-EGF）
【０１１９】
２．試験結果
結果を図４，図５に示した。ＴＰＡ処理によってプロセシングが惹起され、HB-EGFの残存フラグメントが細胞の核内に存在するBcl-6タンパク質，マイオニューリンタンパク質の核外輸送を引き起こした。その結果、HT1080/HB-EGFではＴＰＡ処理により核内に存在するCFP-Bcl-6，CFP-マイオニューリンの蛍光強度が減少した。
【０１２０】
試験例7 プロセシングによるＫＩＡＡ０４４１タンパク質の核外輸送
【０１２１】
１．試験方法
次の細胞群を使用し、標識化した転写調節因子として、ＰＬＺＦタンパク質に変えてＫＩＡＡ０４４１タンパク質を，HB-EGFに変えてエピレグリン（ER）を用いる以外は、試験例3と同様の方法を用いて、これらの転写調節因子の核外輸送の有無を調べた。
【０１２２】
1）ヒト線維肉腫細胞HT1080 2）エピレグリンを導入したHT1080（HT1080/ER）
【０１２３】
２．試験結果
結果を図６に示した。ＴＰＡ処理によってプロセシングが惹起され、エピレグリンの残存フラグメントが細胞の核内に存在するＫＩＡＡ０４４１タンパク質の核外輸送を引き起こした。その結果、HT1080/ERではＴＰＡ処理により核内に存在するCFP-KIAA0441の蛍光強度が減少した。
【実施例】
【０１２４】
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送に対するレプトマイシンＢの阻害効力
【０１２５】
１．被験化合物  レプトマイシンB（LMB）
【０１２６】
２．試験方法
CFP-PLZFをトランスフェクトしたHT1080/HB-EGF（試験例3参照）を24時間培養した後、LMB（10 ng/ml）の共存下100nM TPAで60分間処理をした。TPA処理の前後において、顕微鏡下で、核内にCFP-PLZFが発現している細胞の数を計測しその比を計算した。
【０１２７】
対照としてLMBを添加せずにTPA処理した場合の当該処理前後のCFP-PLZF発現細胞数の比を求め、LMBを添加した場合と比較して被験化合物LMBを評価した。
【０１２８】
３．試験結果
LMBを添加した場合としなかった場合のTPA処理前後における核内CFP-PLZF発現細胞数を図７に示した。LMBによって、ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が阻害されることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明のスクリーニング方法は、細胞内情報伝達過程を阻害することのできる細胞増殖抑制剤の、一次スクリーニングとして実施することができるほか、被験物質の細胞増殖抑制能（抗腫瘍性）を確認するための、二次スクリーニング（確認試験）として実施することも可能である。また、本発明の製造方法で得られた細胞増殖抑制剤は、特に新規な作用メカニズムに基づく制癌剤、抗リウマチ剤、心機能不全治療薬等として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】プロセシングによる核内ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送効果を示す図である。縦軸はCFP-PLZFトランスフェクタント細胞総数に対して核内にCFP-PLZFが発現している細胞数の割合（％）を示し、着色した棒グラフはTPA処理なし、無色の棒グラフはTPA処理をしたものである。横軸はそれぞれHB1080、HB1080/HB-EGF、HT1080/ΔMP-ADAM12/HB-EGF、HT1080/HB-EGF-UCを示す。
【図２】プロセシングによる核内ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送が核内サイクリンＡの発現に及ぼす効果を示す図である。縦軸は蛍光標識したＰＬＺＦタンパク質の蛍光強度、横軸はサイクリンＡの蛍光強度をそれぞれ表す。
【図３】プロセシングが核内ＰＬＺＦタンパク質の核外輸送および核内サイクリンＡの活性化を通じてBrdUの取込量に及ぼす効果を示す図である。横軸のＴＰＡの（＋／−）はＴＰＡ処理の有無、ＰＬＺＦタンパク質の（＋／−）はそれぞれ標識ＰＬＺＦタンパク質のトランスフェクタント／非トランスフェクタントを表す。縦軸は試験に供したトランスフェクタント又は非トランスフェクタントの細胞数に対するBrdU取込細胞数の比率（％）を示す。
【図４】プロセシングによるBcl-6タンパク質の核外輸送効果を示す図である。縦軸はCFP-Bcl-6トランスフェクタント細胞総数に対して核内にCFP-Bcl-6が発現している細胞数の割合（％）を示し、着色した棒グラフはTPA処理なし、無色の棒グラフはTPA処理をしたものである。横軸はそれぞれHB1080、HB1080/HB-EGFを示す。
【図５】プロセシングによるマイオニューリンタンパク質の核外輸送効果を示す図である。縦軸はCFP- マイオニューリントランスフェクタント細胞総数に対して核内にCFP-マイオニューリンが発現している細胞数の割合（％）を示し、着色した棒グラフはTPA処理なし、無色の棒グラフはTPA処理をしたものである。横軸はそれぞれHB1080、HB1080/HB-EGFを示す。
【図６】ＫＩＡＡ０４４１タンパク質の核外輸送効果を示す図である。縦軸はCFP- KIAA0441トランスフェクタント細胞総数に対して核内にCFP- KIAA0441が発現している細胞数の割合（％）を示し、着色した棒グラフはTPA処理なし、無色の棒グラフはTPA処理をしたものである。横軸はそれぞれHB1080、HB1080/ERを示す。
【図７】プロセシングによるＰＬＺＦタンパク質核外輸送に対するレプトマイシンＢの阻害効果を示す図である。縦軸はCFP-PLZFトランスフェクタント細胞総数に対して核内にCFP-PLZFが発現している細胞数の割合（％）を示す。横軸のＴＰＡの（＋／−）はＴＰＡ処理の有無、ＬＭＢの（＋／−）は被験化合物レプトマイシンＢの有無をそれぞれ示す。
【図１】
2005151949.tif 000002
【図２】
2005151949.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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