(57)【要約】  【課題】特に悪性脳腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する人工タンパク質、それを含む抗腫瘍用組成物およびその使用方法を提供すること。  【解決手段】この発明に係る人工タンパク質は、特にグリオーマに対して抗腫瘍作用を有する人工タンパク質であって、下記一般式［Ｉ］：  ＡｃーＲ１−Ｑ１−Ｒ2−Ｑ2−Ｒ３−Ｑ３−Ｒ4−（Ｑ４−Ｒ5）ｎ−ＯＨ      [I]    （式中、Ｒ１、Ｑ１、Ｒ2、Ｑ2、Ｒ３、Ｑ３、Ｒ4、Ｑ４ならびにＲ5はいずれも複数個のアミノ酸配列からなっていて、またｎは０または整数１を意味する）で表されるポリペプチドから構成されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膠芽腫に対して抗腫瘍作用を有する人工タンパク質であって、
下記一般式［Ｉ］：
ＡｃーＲ１−Ｑ１−Ｒ2−Ｑ2−Ｒ３−Ｑ３−Ｒ4−（Ｑ４−Ｒ5）ｎ−ＯＨ      [I]
（式中、Ｒ１は、脂溶性α−へリックスを形成する５〜１３個のアラニンから構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ１は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ２は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ２は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ３は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ３は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ４は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ４は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ５は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
ｎは０または整数１を意味する。
ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、いずれも主にアミノ酸ロイシンおよびリジンからなるアミノ酸配列であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、いずれもＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の構成アミノ酸とは異なるアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のアミノ酸配列位置は、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよい）で表される人工タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の人工タンパク質において、前記Ｒ１が６〜１２個のアラニンから構成されるアミノ酸配列を意味し、前記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも９〜１６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することを特徴とする人工タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の人工タンパク質において、
前記Ｒ１で表されるアミノ酸配列が、マーカーとしてトリプトファンを含んでいてもよいオリゴアラニンであり、
前記Ｑ１で表されるアミノ酸配列が、Ｎ末端からＧ−Ｐ−Ｎ−ＧまたはＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇであり、
前記Ｒ２、Ｒ３およびＲ４で表されるアミノ酸配列が、それぞれチロシンまたはグルタミン酸を含んでいてもよく、ロイシンおよびリジンからなるアミノ酸配列であり、
前記Ｑ２、Ｑ３およびＱ４で表されるアミノ酸配列が、それぞれＮ末端からＧ−Ｎ−Ｐ−ＧまたはＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇであることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項４】
請求項１、２および３のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記Ｑ１は、前記Ｑ２、Ｑ３およびＱ４のアミノ酸配列の配列位置が異なるアミノ酸配列を有していることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項５】
請求項１、２および４のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記Ｑ１がβ−ターンを形成し易いアミノ酸配列であり、前記Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、いずれもβ−ターンを形成し難いアミノ酸配列であることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項６】
請求項４または５に記載の人工タンパク質において、前記Ｑ１がＮ末端からＧ−Ｐ−Ｎ−Ｇからなるアミノ酸配列であり、前記Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、いずれもＮ末端からＧ−Ｎ−Ｐ−Ｇからなるアミノ酸配列であることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、
前記Ｒ１で表されるアミノ酸配列が、マーカーとしてトリプトファンを含んでいてもよいオリゴアラニンであり、
前記Ｒ２で表されるアミノ酸配列が、Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌであり、
前記Ｒ３で表されるアミノ酸配列が、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌであり、
前記Ｒ４で表されるアミノ酸配列が、Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌであり、
前記Ｒ５で表されるアミノ酸配列が、Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌであることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記一般式［Ｉ］で表されるアミノ酸配列が、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌで表されることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記一般式［Ｉ］で表されるアミノ酸配列が、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌで表されることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項１０】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記一般式［Ｉ］で表されるアミノ酸配列が、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌで表されることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項１１】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の人工タンパク質において、前記一般式［Ｉ］で表されるアミノ酸配列が、Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌで表されることを特徴とする人工タンパク質。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の人工タンパク質を含む抗膠芽腫用組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の人工タンパク質または請求項１２に記載の抗膠芽腫用組成物を膠芽腫細胞に対して使用して該膠芽腫の生育を抑制することを特徴とする人工タンパク質の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特に悪性脳腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する人工タンパク質およびその応用に関するものである。更に詳細には、この発明は、難治性脳腫瘍としての神経上皮性腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する人工タンパク質およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の発生頻度は日本では人口10万人に対し8-10人である。原発性全脳腫瘍の1年生存率は82.4％、5年生存率は66.9％である。そのなかでも、難治性脳腫瘍として神経上皮性腫瘍（広義の神経膠腫：グリオーマ(glioma)）があり、全脳腫瘍の28%を占め、全グリオーマの1年生存率は73.1％、5年生存率は37.3％であり生存率の比較だけでもその悪性度がうかがえる。グリオーマの生存率（1991-1993統計：表1）を比較すると神経膠芽腫（グリオブラストーマ(glioblastoma)）の悪性度が非常に高いことが分かる。
【０００３】
【表１】
2005281250.tif 000002
【０００４】
悪性グリオーマの治療成績について述べると、以前はWHO分類で神経膠腫（グリオーマ）に分類されていた小児脳腫瘍の髄芽腫は、1969-1975の統計で5年生存率が22.2％と大変悲惨であったが、今日では57.8％と治療成績が大変向上している。一方、グリオーマの中でも最も悪性の神経膠芽腫（グリオブラストーマ）に至っては、5年生存率は今日でも10％未満であり、放射線療法、化学療法、免疫療法など各治療が進歩してきているなかでも、あまり治療成績は上がっていない（非特許文献１）。
【０００５】
悪性グリオーマの従来の治療方法には大きく分けて、手術療法、放射線療法、化学療法、免疫細胞療法などがある。手術療法では、腫瘍摘出率と予後が相関する報告が多く、例えば星状細胞腫の5年蓄積生存率は50％摘出で58％、全摘出では84.2％である。一方、神経膠芽腫では、50％摘出で4.0％、全摘出では17.5％である。放射線治療については、神経膠芽腫において、術後放射線治療を施行した場合としなかった場合はそれぞれ、1年生存率が59.3％および31.8％であったのに対して、5年生存率は8.3％および5.5％と充分な生存期間の延長には至っていない。化学療法については、髄芽腫においてACNU＋vincristine群が無治療群に比べて2年生存率は77.8%：63.5%（p＜0.5）と約10%の延長。神経膠芽腫では放射線治療併用およびACNU単独全てを含む群がACNU非併用群に比べて2年生存率は24.1%：16.1%（p＜0.001）の延長が見られる（非特許文献２、３、４）。
【０００６】
ここで、各治療法について検討すると、以下の通りになる。  このように悪性グリオーマは化学療法において若干の治療効果が見られるが、いかなる治療法によっても根治が困難であり、再発、腫瘍死は避けられない。その理由は、腫瘍の悪性度が増すほど脳組織内への浸潤性発育（infiltrating growth）が強いことにある。たとえ手術療法により肉眼的に腫瘍を全摘出できたとしても、発育先端域に存在する異型度の高い細胞群が残存し、それが再発の中心となる。また、腫瘍が存在する主座によっては、神経学的な機能予後が不良と予測される場合、手術治療自体が困難な場合があり、そのときは脳の機能的重要部位（eloquent area）を避けて腫瘍を摘出するため、やむなく摘出率を抑えてしまうことになる。
【０００７】
一方、化学療法においても、脳血管系に特有の血液脳関門（blood brain barrier）の存在などにより、充分な量の薬剤を腫瘍組織へ到達させることができない点、腫瘍細胞の多様性のために全ての細胞が一様の感受性を示さない点、腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得してゆく点、臨床応用の段階で骨髄抑制を主とする副作用が見られる点などがあり、これらはその他全ての固形癌にとっても共通のマイナス因子であり、化学療法の限界を示すと言われている。
【０００８】
近年、臨床治療例が上がってきている細胞免疫治療には、LAK（lymphokine-activated killer）療法、TNF（tumor necrosis factor）療法、TIL（tumor infiltrating lymphocyte）療法、モノクロナール抗体を用いた治療などがあり、実験系では著効を示すが、臨床効果はいまだ確立されていない（非特許文献５）。
【０００９】
現在、神経膠腫群の腫瘍に対する治療は、基本的には手術および放射線療法や化学療法の組み合わせが行なわれている。現時点では、諸治療法の効果以上に腫瘍の悪性度が勝っており、個体の腫瘍死はほとんど避けられず、充分な生存率の向上には到っていない。手術および放射線療法は、前述の如く自ずと制限があり、従って低毒性で効果の高い化学療法剤の開発が、特にヒト神経膠芽腫において要求される。
【００１０】
本発明者らが開発した人工タンパク質ＳＧＰ（非特許文献６、７）を応用した抗腫瘍効果については、すでに乳癌細胞およびカポジ肉腫などで証明されている（非特許文献８）。人工タンパク質ＳＧＰによる殺細胞効果について、腫瘍細胞に対してネクローシスおよびアポトーシスが引き起こされるが、このネクローシスおよびアポトーシス誘導作用により悪性脳腫瘍に障害を与えると考えられる。しかしながら、悪性脳腫瘍グリオーマに対して応用された例はない。
【非特許文献１】Ohgaki H, Reifenberger G, Nomura K, Kleihues P: Gliomas. Prognostic factors in Cancer, 2nd Edition, p725-743, Edited by Mary Gospodarowicz, Wiley-Liss, Inc, 2001
【非特許文献２】脳腫瘍全国統計調査報告書（第10巻）：The committee of brain tumor registry of Japan: Report of brain tumor registry of Japan（1969-1993）, Neurologia medico-chirurgica, Supplement Vol 40: 34-92, 2000
【非特許文献３】脳腫瘍全国統計委員会・日本病理学会編：臨床・病理  脳腫瘍取扱い規約2002年7月（第2版）、p9-12、金原出版
【非特許文献４】脳神経外科Advanced Practice 5 神経膠腫p176-183
【非特許文献５】脳神経外科学  改定8版  金芳堂p472-524
【非特許文献６】Lee S: Biochemistry. 1997 Apr 1;36(13):3782-91
【非特許文献７】Matsumoto E: Biopolymers. 2000-2001;56(2):96-108）
【非特許文献８】H. Michael Ellerby: Journal of Biological Chemistry 2003 Sep 12;278(37):35311-6. Epub 2003 May 14.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明者らは、人工タンパク質ＳＧＰおよびその他の関連人工タンパク質が悪性脳腫瘍グリオーマに応用できるかどうか鋭意検討した結果、かかる人工タンパク質が悪性脳腫瘍グリオーマに対して適用できる可能性を見出して、この発明を完成した。
【００１２】
したがって、この発明の目的は、抗腫瘍作用を有する人工タンパク質ＳＧＰなどを含む人工タンパク質を提供することである。
この発明はまた上記人工タンパク質を含む抗腫瘍用組成物を提供することを別の目的としている。さらに、この発明は、上記人工タンパク質または上記抗腫瘍用組成物を、特に悪性脳腫瘍グリオーマに対して適用することからなる人工タンパク質の使用方法を提供することを別の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、この発明は、特にグリオーマに対して抗腫瘍作用を有する人工タンパク質であって、下記一般式［Ｉ］：
ＡｃーＲ１−Ｑ１−Ｒ2−Ｑ2−Ｒ３−Ｑ３−Ｒ4−（Ｑ４−Ｒ5）ｎ−ＯＨ      [I]
（式中、Ｒ１、Ｑ１、Ｒ2、Ｑ2、Ｒ３、Ｑ３、Ｒ4、Ｑ４、Ｒ5およびｎはいずれも下記意味を有する）
で表される人工タンパク質を提供する。この発明に係る人工タンパク質は特にグリオーマに対して抗腫瘍作用を有している。
【００１４】
また、この発明は、上記一般式［Ｉ］で表される人工タンパク質を含む膠芽腫に対する抗腫瘍用組成物を提供する。更に、この発明は、上記一般式[I]で表される人工タンパク質または上記抗腫瘍用組成物を膠芽腫細胞に対して使用して該膠芽腫の生育を抑制することを特徴とする人工タンパク質の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
人工タンパク質ＳＧＰの抗腫瘍効果について、今後は悪性脳腫瘍の浸潤性発育の問題に対する検討が必要であるが、実用化に当たっては、手術療法や放射線療法などとの組み合わせによる相乗効果のみならず、今までの治療薬には見られない作用機序での悪性脳腫瘍に対する新しい殺細胞効果が期待できる。
また、本発明者らの実験では、細胞間基質を障害することなく抗腫瘍活性を示すことを証明している。このことは、エタノールやその他の細胞毒性薬剤に比べ、正常細胞や正常組織への障害が少ないことが期待される。また、人工タンパク質ＳＧＰは、アミノ酸から合成された人工ペプチドであり、投与後の一時的な高濃度を避ければ、代謝されて毒性物質として体内へ蓄積しないことが考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この発明に使用する人工タンパク質は、下記一般式［Ｉ］：
ＡｃーＲ１−Ｑ１−Ｒ2−Ｑ2−Ｒ３−Ｑ３−Ｒ4−（Ｑ４−Ｒ5）ｎ−ＯＨ      [I]
（式中、Ｒ１は、脂溶性α−へリックスを形成する５〜１３個のアラニンから構成されるオリゴアラニンを意味し、
Ｑ１は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ２は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ２は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ３は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ３は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ４は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｑ４は３〜５個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ５は、脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列であって、主にロイシンとリジンとを含む８〜１８個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
ｎは０または整数１を意味する。
ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、いずれも主にアミノ酸ロイシンおよびリジンからなるアミノ酸配列であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、いずれもＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の構成アミノ酸とは異なるアミノ酸からなるアミノ酸配列を意味し、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のアミノ酸配列位置は、いずれも同一であってもまたは異なっていてもよい）
で表される。
【００１７】
この発明の人工タンパク質［Ｉ］は、通常、１個の脂溶性α−へリックスを形成する脂溶性アミノ酸からなるアミノ酸配列部分と、複数個、好ましくは３個または４個の脂溶性アミノ酸と塩基性アミノ酸とからなる両親媒性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列部分とから構成されている。
【００１８】
上記人工タンパク質［Ｉ］において、上記Ｒ１は６〜１２個のアラニンから構成されるオリゴアラニンからなるアミノ酸配列であるのが好ましい。このオリゴアラニンには、検出用のマーカーとしてトリプトファンが含まれているのが好ましい。
また、上記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はいずれも９〜１６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列であるのが好ましい。このアミノ酸配列は、上記したように、主にロイシンとリジンとから構成されているが、グルタミン酸もしくはチロシンを含んでいてもよい。更に、上記Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のアミノ酸配列は互いに同一であっても、異なっていてもよい。
【００１９】
また、上記Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４で表されるアミノ酸配列は、いずれも上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のアミノ酸配列を構成するアミノ酸とは異なるアミノ酸配列である。
また、上記Ｑ１で表されるアミノ酸配列は、たとえば、Ｎ末端からＧ−Ｐ−Ｎ−ＧまたはＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇで表されるアミノ酸配列であり、β−ターンを形成しやすいアミノ酸配列であるＧ−Ｐ−Ｎ−Ｇで表されるアミノ酸配列が好ましい。一方、上記Ｑ２、Ｑ３およびＱ４で表されるアミノ酸配列は、いずれもＮ末端からＧ−Ｎ−Ｐ−ＧまたはＧ−Ｇ−Ｇ−Ｇで表されるアミノ酸配列であり、β−ターンを形成しにくいアミノ酸配列であるＧ−Ｎ−Ｐ−Ｇで表されるアミノ酸配列が好ましい。
【００２０】
上記構成からなる人工タンパク質［Ｉ］において、上記Ｒ２で表されるアミノ酸配列としては、たとえば、Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌなどが挙げられる。
【００２１】
上記Ｒ３で表されるアミノ酸配列としては、たとえば、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ、Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌなどが挙げられる。
【００２２】
上記Ｒ４で表されるアミノ酸配列としては、たとえば、Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ、Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−ＬまたはＫ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌなどが挙げられる。
【００２３】
また、上記Ｒ５で表されるアミノ酸配列として、たとえば、Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌなどが挙げられる。
【００２４】
つまり、上記一般式［Ｉ］で表される人工タンパク質のうち、下記一般式［ＩＩ］で表される人工タンパク質ＳＧＰは、６９残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有していて、N末端部に一つの脂溶性α-ヘリックスを形成するオリゴアラニン（α1）と脂溶性アミノ酸および塩基性アミノ酸（Lys）からなる三つの両親媒性α-ヘリックス部分（α2〜4）を持つ。水溶中では中心の脂溶性α-ヘリックスを三つの両親媒性α-ヘリックスが取り囲むような三次構造を持ち球状タンパク質の性質を示している。各ヘリックスは、β−ターン（β-turn）を形成しやすいGly- Pro-Asn- Gly（α1-α2の間）およびβ−ターンを形成しにくいGly- Asn- Pro-Gly（α2-α3およびα3-α4の間）の関係でタンパク質の折り畳みの際の自由度を持たせるようにデザインされている。ＳＧＰは、脂質膜が存在すると傘が開いた形に変形し、脂溶性α-ヘリックスが膜に挿入され、両親媒性α-ヘリックスはその脂溶性部分が膜の表面に食い込むように横たわるような性質があることが予測されている。
【００２５】
一般式［ＩＩ］で表される人工タンパク質ＳＧＰのアミノ酸配列：
Ａｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｐ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−ＯＨ（配列番号１）
【００２６】
人工タンパク質ＳＧＰ［ＩＩ］の他の人工タンパク質としては、たとえば、次のような人工タンパク質が挙げられる。
一般式［ＩＩＩ］で表される人工タンパク質ＳＧＰ−Ｇ：
Ａｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−ＯＨ（配列番号２）
【００２７】
一般式［ＩＶ］で表される人工タンパク質ＳＧＰ−Ｅ：
Ａｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｙ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−ＯＨ（配列番号３）
【００２８】
一般式［Ｖ］で表される人工タンパク質ＳＧＰ−５：
Ａｃ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−ＯＨ（配列番号４）
【００２９】
なお、本明細書において、アミノ酸の記号は次の意味を有している。Ａはアラニン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシンを意味する。
【００３０】
以下に、この発明の人工タンパク質の合成および腫瘍内ペプチド投与実験方法について説明する。ただし、この発明は、下記実施例に限定されるものではなく、また下記実施例は、この発明を具体的に説明するために記載するものであって、この発明を限定する意図で記載されるものでは一切ないものと理解さるべきである。
【実施例１】
【００３１】
（人工タンパク質ＳＧＰの合成）
ペプチド（人工タンパク質ＳＧＰ）は、以下の手法で化学的に合成した。つまり、Fmoc固相合成法で、出発原料として、Fmoc-L-Leu-PEG-PS（0.190 meq/g）を使用、配列相当のFmoc-アミノ酸を連続的に縮合した。縮合剤としてはHATUを用い、Fmoc基の脱保護にはピペリジンを用いた。最終縮合物をアセチル化後、1,2-エタンジチオール、チオアニソール、メタクレゾール（21：46：7 v/v）を含むトリフルオロ酢酸（TFA）でペプチドを脱樹脂した。得られた粗ペプチドを、30%酢酸を用いて、Sephadex G25クロマトグラフィーでゲル濾過し、ペプチドを含む部分を凍結乾燥後に得られた粗粉末をRP-HPLC（逆相高速液体クロマトグラフィー）で精製し、再び凍結乾燥することによって、白色の泡状粉末を得た。最終物は分析RP-HPLCで単一のピークであること及びTOF-Mass測定で相当物であることを確認した。
その他の人工タンパク質についても同様に化学合成して、相当物であることを確認した。
【００３２】
（脳腫瘍ヌードマウス皮下モデル）
脳腫瘍はヒト神経膠芽腫U87-MGを使用した。培養培地はDulbecco’s Modification of Eagle’s Medium MEDIUM 41（10% fetal bovine serum含有）を使用した。U87-MG細胞を培地に懸濁し培養器に入れ、37 ℃のインキュベーター内で培養した。細胞を数回継代の後、PBS（−）で洗浄しトリプシン処理をして回収した。ヌードマウスBALB/c nu/nu の7週令メスに対し、U87-MGヒト神経膠芽腫の培養細胞を1個体あたり10の7乗個移植し、腫瘍径が1 cmとなった時点（約4週間後、平均腫瘍体積250 mm3前後）の個体を脳腫瘍皮下モデルとした。
【００３３】
（人工タンパク質ＳＧＰの投与実験）
人工タンパク質ＳＧＰは、生理食塩水に溶解し1 mMおよび0.5 mMの2種類の濃度のＳＧＰ溶液を作成した。上記脳腫瘍皮下モデルを使用し、生食対照群、ＳＧＰ 0.5 mM投与群、ＳＧＰ 1.0 mM投与群をそれぞれ経過観察した。生食対照群の生食は100μlを週3回投与した。ＳＧＰ投与群はそれぞれ100μlを週3回投与する群、および50μlを週3回投与する群に分けた。腫瘍内へは注射器を用いて直接投与した。腫瘍径は測径器を使用し腫瘍体積を毎週測定した（腫瘍体積＝長径×短径×高さ×1/2）。ＳＧＰの投与は腫瘍が消失または個体が腫瘍死するまで行なった。
【００３４】
（シスプラチン投与実験）
薬剤の効能の比較として、悪性脳腫瘍に対して従来よりアポトーシスを誘導し、殺細胞効果を示すことが証明され、実際に臨床でも使用されているCDDP（cisplatin文献：Journal of Neuro-Oncology 52: 11-21, 2001、文献：Journal of Neuro-Oncology 52: 23-36, 2001）の投与実験を同様に行った。ＳＧＰ投与群と同様にU87-MGヌードマウス皮下モデルを使用し、CDDPは各個体に対して4 mg/kgを週3回腫瘍内へ直接投与した。腫瘍径は測径器を使用し腫瘍体積を毎週測定した。
【００３５】
以下、実験データについて説明する。
実験手技上の問題があったと思われる個体（後述の結果に示す）および、薬物投与開始時の腫瘍体積が100 mm3以上、600 mm3以下の範囲から外れる個体は実験データから除外した。個体数はそれぞれ生食投与群n = 6、0.5 mM ＳＧＰ 50μl投与群n = 5、0.5 mM ＳＧＰ 100μl投与群n = 6、1.0 mM ＳＧＰ 50μl投与群n = 4 、1.0 mM ＳＧＰ 100μl投与群n = 5、CDDP 4 mg/kg投与群n = 10である。
【００３６】
具体的には、人工タンパク質ＳＧＰの溶液を、1mMおよび0.5 mMの2種類の濃度で、また100μl および50μlの2種類の投与量で、U87-MGヒト神経膠芽腫ヌードマウス皮下モデルに対し3回／週の頻度で直接腫瘍内投与した。3週間後の腫瘍体積を対照の生食投与群と比較したところ、ＳＧＰ投与群では腫瘍の増大の抑制、腫瘍の縮小および腫瘍消失など著明な腫瘍抑制効果がみられた。また、腫瘍細胞に対するアポトーシス作用が証明されているシスプラチン（CDDP）4mg/kgをＳＧＰ投与群と同様に3回／週の頻度で直接腫瘍内投与したものと比較したところ、濃度1 mM 投与量100μlのＳＧＰ投与群が同等の腫瘍抑制効果を示した。更にはシスプラチン投与群でも腫瘍の増大の抑制および腫瘍の縮小効果が見られたが、ＳＧＰ投与群のように腫瘍を消失させた個体はみられなかった。
【００３７】
（結果）
投与実験開始時の平均腫瘍体積および3週間後の平均腫瘍体積を表2に示す。また、各投与群の投与開始前及び投与開始3週間後の個々のヌードマウスの腫瘍体積をグラフ（図１〜図６）。この結果から、ＳＧＰ投与群およびシスプラチン投与群は、生食対照群に比べて抗腫瘍効果が明らかであった。対照群である生食投与群では83%の個体（n=5）が4週間以内に腫瘍死した。また、抗腫瘍効果について平均腫瘍体積で比較すると、ＳＧＰ 1.0 mM投与群は、CDDP 4 mg/kg投与群と同等であった。しかしながら、CDDP投与群では著明な体重減少がみられた（表３を参照）。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
【表３】
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【００４０】
また、図５からも明らかなように、ＳＧＰ 1 mM 100μl投与群においては著しい腫瘍増大抑制効果のみならず著しい個体差があることが示されている。その後の経過で、場合によっては、腫瘍の完全なる消失がみられた。他のＳＧＰ投与群でも腫瘍消失がみられた。腫瘍が消失した6匹の個体では腫瘍再発は見られず（n=6のうちＳＧＰ 0.5 mM 50μl投与群はn = 1、ＳＧＰ 1.0 mM 50μl投与群はn = 1、ＳＧＰ 0.5 mM 100μl投与群はn = 1、ＳＧＰ 1.0 mM 100μl投与群はn = 3）、いずれも非腫瘍モデルのヌードマウスと同様に長期間生存した。又、ＳＧＰ 0.5 mM 100μl投与群及びＳＧＰ 1 mM 100μl投与群を比較すると後者が著しく効果的であることがわかる。
【００４１】
一方、シスプラチン投与群では、個々のマウスの腫瘍体積の推移に関して個体差はあまり見られないが、腫瘍の消失もみられない。生存曲線の比較ではＳＧＰ投与群およびシスプラチン投与群は生食対照群に比べ有意に生存期間の延長が見られた（図７〜図１１を参照：p値は0.05以下を有意差があると考えた）。
【００４２】
上記のことから、難治療性の原発性上皮性腫瘍、その中でも最悪性であるヒト神経膠芽腫に対してＳＧＰ溶液を直接腫瘍内投与したところ、著明な抗腫瘍効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
この発明は、難治性脳腫瘍である膠芽腫（グリオーマ）及びなかでも最悪性の神経膠芽腫（グリオブラストーマ）に対する治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】生食投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図２】ＳＧＰ投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図３】ＳＧＰ投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図４】ＳＧＰ投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図５】ＳＧＰ投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図６】ＳＧＰ投与群に対する体積増加を示すグラフ。
【図７】生食投与群とＳＧＰ投与群との比較を示すグラフ。
【図８】生食投与群とＳＧＰ投与群との比較を示すグラフ。
【図９】生食投与群とＳＧＰ投与群との比較を示すグラフ。
【図１０】生食投与群とＳＧＰ投与群との比較を示すグラフ。
【図１１】生食投与群とＳＧＰ投与群との比較を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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