(57)【要約】  【課題】  ハイブリダイゼーションを短時間で効率よく進行させること、即ちハイブリダイゼーションの高速化を達成すること。  【解決手段】  検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域２と、該反応領域２に貯留又保持される媒質Ｍに電界印加可能に配置される対向電極Ｅ１ーＥ２と、を備え、前記対向電極Ｅ１ーＥ２の少なくとも一方の電極面には、凹状部位３が設けられているハイブリダイゼーション検出部１ａ、並びに該検出部１ａを備えるＤＮＡチップを提供する。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、を備え、前記対向電極の少なくとも一方の電極面には、凹状部位が設けられているハイブリダイゼーション検出部。
【請求項２】
前記凹状部位は、前記検出用核酸の固定部位であることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項３】
前記対向電極は、絶縁層で被覆されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項４】
前記凹状部位は、前記絶縁層に形成されていることを特徴とする請求項３記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項５】
前記凹状部位は、規則的に配列されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項６】
前記対向電極は、前記反応領域を挟んで上下に配置されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項７】
前記対向電極のうち少なくとも一方の電極に前記凹状部位が形成されたことを特徴とする請求項６記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項８】
少なくとも前記下方側電極は、所定波長の励起光を透過する電極であることを特徴とする請求項６記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項９】
前記対向電極は、前記反応領域を挟んで左右に配置されていることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項１０】
前記対向電極は、前記媒質に高周波交流電界を印加可能に構成されたことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部。
【請求項１１】
請求項１記載のハイブリダイゼーション検出部を少なくとも備えるＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出技術に関する。より詳しくは、ハイブリダイゼーションの場となる反応領域において電気力学的効果を用いるハイブリダイゼーション検出部と該検出部を備えるＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
このＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に保持されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行った後に、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。
【０００５】
次に、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術が知られている。具体的には、核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られている。その原理は、核酸分子の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果として伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合は、電気力線が集中する部位に向かって移動する（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、この「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定される（非特許文献２参照）。
【０００７】
ここで、反応領域に電極を設けて、該電極によって電場を形成し、核酸分子に対して電気力学的な作用を加える装置や方法が提案されている。例えば、特許文献１には、電場によって核酸内部に生成した双極子と電場形成電極との間に発生する静電吸引力などを利用して、一部が基板に固定された状態の核酸複合体（二本鎖）を平面状に展開する技術が開示されている。
【０００８】
特許文献２には、対向電極の一方にＤＮＡプローブを固定し、電極間に直流電圧を印加したり、ゲルによる電気泳動を併用したりすることにより、相補鎖サンプルＤＮＡと非相補鎖サンプルＤＮＡを分離する技術が開示されている。
【０００９】
特許文献３では、電極ピンにオリゴヌクレオチドが固定された構成を備えるＤＮＡチップが提案されている。
【非特許文献１】Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。
【非特許文献２】鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）。
【特許文献１】特開平７−２２４０８６号公報。
【特許文献２】特開２００２−１６８８６４号公報。
【特許文献３】特開２００１−２４１３１５号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現在提案されている様々なＤＮＡチップ技術は、端的に言えば、物質間の相互作用の場、即ちハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域を基板上に予め設定しておき、この反応領域中にプローブＤＮＡ等の検出用核酸を固定しておくことによって、この検出用核酸と相補的な標的核酸との間の相互作用であるハイブリダイゼーションを解析する技術であると言える。
【００１１】
しかし、従来のＤＮＡチップ技術においては、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸の固定化作業やハイブリダイゼーションに時間が長くかかるという基本的な技術的課題がある。また、検出表面においては、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸の集積密度（固定密度）に偏りがあったり、ハイブリダイゼーション検出量が不均一であったりするという技術的課題を抱えている。
【００１２】
そこで、本発明は、前記技術的課題を解決することができる、ハイブリダイゼーション検出部と該検出部を備えるＤＮＡチップを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、検出用核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーションの場を提供する反応領域と、該反応領域に貯留又保持される媒質に電界印加可能に配置される対向電極と、を備え、前記対向電極の少なくとも一方の電極面には、凹状部位が設けられているハイブリダイゼーション検出部（以下「検出部」と略称。）、並びに該検出部を少なくとも備えるＤＮＡチップを提供する。
【００１４】
この検出部における前記凹状部位は、前記検出用核酸の固定部位、あるいはハイブリダイゼーションを進行させる領域として用いることができる。また、前記凹状部位を規則的に、例えばナノオーダーで配列させておくことで、検出表面として機能する電極表面に対して、均等に検出用核酸を固定したり、電極表面でのハイブリダイゼーション検出量を均一にしたりすることができる。
【００１５】
また、本発明では、前記対向電極を絶縁層（例えば、酸化膜層）で被覆しておくことによって、反応領域中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止することができる。前記絶縁層を設ける場合では、この絶縁層に前記凹状部位を形成する加工を施してもよい。
【００１６】
次に、前記対向電極は、前記反応領域を挟んで上下に配置したり、前記反応領域を挟んで左右に配置したりする。場合によっては、上下と左右の両方に配置してもよい。また、対向電極は、配置される位置に係わらず、必要に応じて複数対設けてもよい。いずれにしても、一組の前記対向電極のうち少なくとも一方の電極側に凹状部位を形成するようにする。なお、対向電極を構成する両方の電極に凹状部位を形成することも、目的に応じて自由である。
【００１７】
前記対向電極を、反応領域を挟んで上下に配置する場合は、少なくとも下方側電極は、所定波長の励起光を透過する電極とすることによって、反応領域の下方側からの光ピックアップを行うことができる。即ち、反応領域の下方側の領域に光ピックアップに関連する装置群を集約し、反応領域の上方側の領域に、媒質を滴下等する装置群を集約できる。これにより、装置群のコンパクト化を達成できる。
【００１８】
前記対向電極は、前記媒質に電界を形成する手段として機能する。この電界は、直流電界、交流電界、低周波電界、高周波電界を目的に応じて、選択できるようにしてもよい。特に、高周波交流電界を印加すると、電気分解による気泡の発生がない条件で、誘電泳動の電気力学的効果が得られ、これにより、反応領域内に存在する核酸分子を伸長（伸張）させたり、移動させたりすることが可能となる。
【００１９】
特に、凹状部位の最深部及びその周辺の領域には、電界が集中して不均一な電場が形成される。これによって、前記領域に向けて検出用核酸を誘電泳動により伸長させながら移動させることができるので、短時間で固定作業を完了させることができる。
【００２０】
また、凹状部位の最深部及びその周辺の領域に対して、標的核酸を誘電泳動により移動させてその濃度を高めたり、さらには標的核酸を伸長（伸張）させて高次構造を調整してハイブリダイゼーションの際の立体障害を軽減したりすることにより、ハイブリダイゼーション効率を高めることができる。即ち、ハイブリダイゼーションを短時間で進行させることができる。
【００２１】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
【００２２】
「検出用核酸」とは、反応領域に貯留又は保持された媒質中に固定又は遊離の状態で存在し、当該核酸分子と特異的に相互作用する相補的塩基配列を有する核酸分子を検出するための探り針（検出子）として機能する核酸分子である。代表例は、ＤＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。
【００２３】
「標的核酸」とは、前記検出用核酸と相補的な塩基配列を有する核酸分子である。
【００２４】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味する。
【００２６】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。例えば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。
【００２７】
「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を意味する。なお、「対向軸」とは、対向する二つの電極面の中心同士を結ぶ直線によって形成される軸を意味する。
【００２８】
「凹状部位」は、電極又は該電極を被覆する絶縁膜の表面に微細加工により形成される凹部、あるいは前記表面に形成された凸部間に形成される谷部であって、電界が集中する部位を意味する。
【００２９】
「誘電泳動」は、電界が一様でない電場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００３０】
「ＤＮＡチップ」は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸が遊離状態又は固定化されて微細配列された状態とされたハイブリダイゼーション検出用基板を意味し、ＤＮＡマイクロアレイの概念も含む。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、遺伝子情報を効率よく集積（固定化）することができ、ハイブリダイゼーションを短時間で効率よく進行させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００３３】
まず、図１は、本発明に係るハイブリダイゼーション検出部（以下「検出部」と略称。）の第１実施形態の要部構成を表す断面図、図２は、同検出部１に対する媒質供給手段及び光ピックアップ手段の概略構成を示す図である。
【００３４】
図１中の符号１ａは、検出部の要部形態を示している。この検出部１ａを基板上に形成又は配列することによって、本発明に係るＤＮＡチップを得ることができる。
【００３５】
検出部１ａは、下側基板Ａと、この下側基板Ａに重ね合わされる上側基板Ｂと、から構成されている。下側基板Ａは、基材層１１と、該基材層１１に積層された導体層１２と、この導体層１２に積層された絶縁層１３と、該絶縁層１３に積層され、ウエル状の反応領域２が所定の表面加工により形成された表層１４と、を備える。上側基板Ｂは、下側の絶縁層１５と、該絶縁層１５に積層された導体層１６と、該導体層１６に積層された上層１７と、を備える。
【００３６】
下側基板Ａの基材層１１は、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Degital Versatile Disc）、ＭＤ(Mini Disc)等の光情報記録媒体と同様の基材から形成することができる。また、本発明に係る基板の形状は、特に限定されない。例えば、矩形状、あるいは円盤状をなすように、自由に形成することができる。
【００３７】
基材層１１は、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の合成樹脂、好ましくは射出成形可能な合成樹脂によって、所望の形状に成形する。基板１を安価な合成樹脂を用いて基板を成形することで、従来使用されていたガラスチップに比して、低ランニングコストを実現できる。
【００３８】
導体層１２は、ハイブリダイゼーション検出用に用いられる所定波長の励起光Ｐ（図２参照）を透過可能な光透過性の合成樹脂で形成するのが望ましい。例えば、光透過能を有する導体であるＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）やアルミニウムなどで形成するのが望ましい。絶縁層１３は、ＳｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ２などの無機物で形成する。なお、絶縁層１３（及び絶縁層１５）は、反応領域２中に貯留される場合があるイオン性の媒質による電気化学的な反応を防止するなどの役割を果たす。
【００３９】
このような下側基板Ａの構成によれば、図２に示すように、基板Ａ（基材層１１）の下方側（裏面側）からの励起光Ｐの照射によって、反応領域２内でのハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００４０】
具体的には、基板裏面側からの励起光Ｐによって、反応領域２内にハイブリダイゼーションした状態での蛍光標識された標的核酸から発せられた蛍光Ｆ、あるいは相補鎖を形成する塩基対に挿入結合された蛍光インターカレーターから発せられた蛍光Ｆを、基板の下方側（裏面側）に配置した光学系装置群により検出することができる（図２参照）。
【００４１】
なお、情報読み取り光である励起光Ｐは、例えば、図示しないレーザーダイオードから出射され、図示しないコリメータレンズにて平行光とされて進行し、基板下方に配置された集光レンズＬ１に入射し、絞り込まれる。図２中の符号Ｌ２は、蛍光Ｆを絞り込むための集光レンズ、符号Ｕは、該蛍光Ｆを検出するためのディテクタを簡略に示している。
【００４２】
検出部１ａ、あるいは該検出部１ａが設けられたＤＮＡチップの周辺に、アッセイや検出に必要な装置群の配置設計を行う場合を想定すると、検出部１ａの上方側の領域には、試料溶液などの滴下又は注入に係わるノズルＮを含む装置群をまとめて配置しておき、検出部１ａの下方側には、検出（読み取り）用の光学的装置群をまとめて配置することができる。この結果、装置群全体のコンパクト化を達成できる。
【００４３】
次に、下側基板Ａを構成する上記表層１４について、その一例を挙げると、感光性のポリイミド樹脂によって形成することができる。この感光性のポリイミド樹脂を、フォトレジストを用いた表面処理することにより、微細な反応領域２を形成することができる。
【００４４】
この反応領域２の形状やサイズは、特に限定されないが、その長さ、幅、深さは、それぞれ数μｍから数百μｍであって、このサイズ値は、励起光のスポット径やサンプル溶液（検出用核酸含有溶液、標的核酸含有溶液）などの媒質Ｍの最小滴下可能量に基づいて決定することができる。
【００４５】
なお、媒質Ｍは、上側基板Ｂに形成され孔であり、反応領域２に連通する孔２１（又は２２）の上方からノズルＮ（例えば、インクジェットノズル）を介して所定量滴下等して供給するようにし、さらに、毛細管現象や媒質Ｍに対する親媒性を利用した原理によって、反応領域２内に導かれる構成を採用できる。
【００４６】
ここで、検出部１ａにおける（下側基板Ａの）導体層１２と（上側基板Ｂの）導体層１６は、反応領域２を挟むように上下に配置されており（図１、図２参照）、スイッチＳのオン／オフ操作によって、電源Ｇを介し、反応領域２内に貯留又は保持される媒質Ｍに所望の電界を印加するための対向電極Ｅ１−Ｅ２として機能する。なお、対向電極Ｅ１−Ｅ２は、電界強度の選択、交流と直流の選択、あるいは高周波電界や低周波電界の選択を自在に行うことができるようにするのが望ましい（以下に説明する他の対向電極でも同様）。
【００４７】
この対向電極Ｅ１−Ｅ２は、例えば、高周波交流電界の電界印加によって、より具体例としては、電界条件が、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚ、サイン波によって得られる誘電泳動の電気力学的効果によって、前記媒質Ｍ中に存在する核酸分子（検出用核酸、標的核酸）を直鎖状に伸長（伸張）させたり、電気力線が集中する電極表面の部位に向けて移動させたり、伸長（伸張）させながら移動又は引き寄せたりするための手段として機能する。なお、交流電界の場合は、電気分解による気泡の発生がなく、反応系に影響が少ないことから、直流電界より望ましい。
【００４８】
ここで、ハイブリダイゼーションは、通常、ランダムコイル状に丸まったり、絡まったりしている状態の一本鎖核酸分子同士間で進行するので、立体障害の影響などを受けると、相補結合の効率が低下し、ミスハイブリダイゼーションも起き易くなる。
【００４９】
しかし、対向電極Ｅ１−Ｅ２を介して電界印加を行うことよって、核酸分子の高次構造を伸長（伸張）状態に調整したり、あるいは、核酸分子の会合の確率（即ち、濃度）が高まるように、所定領域へ移動させておいたりすることができる。
【００５０】
電界印加がなされた状態でハイブリダイゼーションを行うと、立体障害の影響を受けないので、該ハイブリダイゼーションの効率と精度を飛躍的に高めることができる。この結果、高速のハイブリダイゼーションを実現できるともに、ミスハイブリダイゼーションを低減することが可能となる。
【００５１】
なお、「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（ここでは、ハイブリダイゼーション）が起こり難くなる現象を意味する。
【００５２】
ここで、本発明では、前記誘電泳動の電気力学的効果を、本発明の目的に沿うように、より効果的に得るために、電極表面の形態構成を工夫する。より具体的には、電極Ｅ１とＥ２の両方、あるいはいずれか一方の電極表面を、凹状部位３がナノオーダーの間隔で規則的に配列されている構成を採用する。なお、この凹状部位３を両方の電極Ｅ１とＥ２に形成した場合では、両電極Ｅ１、Ｅ２に対してＤＮＡプローブなどの検出用核酸Ｄを固定しておくことによって、両電極Ｅ１、Ｅ２上でハイブリダイゼーションを進行させ、これによって、蛍光検出量を増加させることができる。
【００５３】
以下、図３〜図９に基づいて、電極表面の好適な実施形態について説明する。なお、図３は、同検出部の電極の表面形態構成の一例を示す拡大図、図４は、同電極の表面に形成された凹状部位の一例の拡大図、図５は、同検出部の電極表面部分の他の形態構成の例を示す拡大図、図６〜９は、同形態構成の変形例を示す図群である。
【００５４】
まず、図３に示すように、反応領域２に臨むように形成される電極（Ｅ１又はＥ２）の表面の全体に渡って、該表面に対応する絶縁層１３（又は１５）部分に、例えば、図４に示すような円錐状（断面Ｖ字状）をなす凹状部位３を連続的に設けた形態、あるいは、例えば、図５のように、絶縁層１３（又は１５）の一部分にのみ限定して、前記凹状部位３を連続的に設けた形態を採用できる。
【００５５】
若しくは、図６に示す実施形態のように、電極として機能する層、即ち導体層１２（又は１６）それ自体に対して、前記凹状部位３を予め形成しておき、その凹状部位３によって形成された凹凸形状が表面に現れるように、絶縁層１３（又は１５）を被覆した構成を採用することもできる。なお、この点、以下の図７〜図９に示された実施形態の場合でも同様である。
【００５６】
さらに、図７に示すように、断面Ｖ字状の凹状部位３が所定間隔を置いて形成された構成、図８に示すような、断面矩形状の凹状部位３１が所定間隔を置いて形成された構成、あるいは図９に示すような、断面Ｕ字状の凹状部位３２が所定間隔を置いて形成された構成なども適宜採用できる。
【００５７】
なお、電極表面に対して凹状部位３などを形成するための粗面加工方法は、例えば、公知のスパッタリング蒸着技術、エピキタシー蒸着技術やエッチング技術を用いて実施することができるが、その方法自体は特に限定されない。
【００５８】
上記したような凹状部位３（あるいは３１，３２）では、図１０〜１２を参照すればわかるように、当該凹状部位３，あるいは３１又は３２の底部あるいは屈曲部などの空間狭小な部位に、電界が特に集中して電場勾配が形成される（即ち、不均一電界が形成される）。
【００５９】
なお、図１０は、凹状部位３内の電界形成の様子を模式的に示す図（図４中のＩ−Ｉ線矢視断面図）、図１１は、凹状部位３１内の電界形成の様子を模式的に示す図、図１２は、凹状部位３２内の電界形成の様子を模式的に示す図である。図１０〜１２中に示された符号Ｚは、電界強度分布を模式的に示している。
【００６０】
この電場勾配による駆動力が、核酸分子に発生した双極子に働きかけることによって、核酸分子は、凹状部位３，３１，３２内（の電解集中部位へ）移動する。核酸分子が検出用核酸Ｄの場合、凹状部位３などの表面に引き寄せられて、所定の化学結合を介して、伸長整列された状態で固定される。
【００６１】
図１０は、凹状部位３の底部に固定化され、電界によって伸張されている状態の検出用核酸Ｄに向けて、反応領域２中に遊離した状態にある標的核酸Ｔが、誘電泳動の効果によって移動している状態を示している。
【００６２】
このように凹状部位３（又は３１，３２）を電極（Ｅ１又はＥ２）の表面に規則的に配設しておくことによって、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸の集積密度（固定密度）の偏りを無くすことができる。さらには、電極（Ｅ１又はＥ２）の表面に規則的に配列された凹状部位３（又は３１，３２）においてハイブリダイゼーションを進行させることができるので、電極（Ｅ１又はＥ２）の表面におけるハイブリダイゼーション検出量を均一化できる。
【００６３】
なお、ハイブリダイゼーションの検出は、標的核酸イにラベルされた蛍光色素、あるいは、二本鎖核酸の塩基対部分に挿入結合して蛍光を発する特性を有する蛍光インターカレーターを用いて、これらからの蛍光強度を測定することによって実施できる。蛍光インターカレーターは、標的核酸と同時に反応領域２へ添加してもよいし、ハイブリダイゼーション進行後に添加してもよい。蛍光インターカレーターを用いた場合は、余剰の標的核酸イを反応領域２から洗浄除去する作業を省略できるという利点がある。
【００６４】
次に、図１３は、本発明に係る検出部の第２実施形態の要部構成を表す断面図である。
【００６５】
この第２実施形態である検出部１ｂは、対向電極の一方の電極（ここでは、Ｅ１）の表面積を、他方側の電極（ここでは、Ｅ2）の表面積よりも狭小の表面に形成されている点が特徴である。
【００６６】
この構成によって、表面積がより狭小に形成されている電極Ｅ１には、電界（電気力線）がより集中して不均一電界が形成されるため（図１３中の符号Ｚ参照）、誘電泳動によって、核酸分子が該電極Ｅ１に向けて移動する。なお、図１３では、遊離状態の検出用核酸Ｄが電極Ｅ１に向けて移動する様子が、代表例として模式的に示されている。
【００６７】
これによって、反応領域２内に広く拡散し、遊離状態で存在する核酸分子を、電極Ｅ１周辺の領域に集めて、その濃度を高く維持した状態を得ることができる。さらに、それに続いて、電極Ｅ１表面の各凹状部位３（３１，３２）内部において、より電界が局部的に集中する部位（電界強度の傾きがある部位）へ前記核酸分子を移動させることができる。
【００６８】
続いて、図１４は、本発明に係る検出部の第３実施形態の要部構成を表す断面図である。なお、図１４には、同図中のＩＩ-ＩＩ線矢視断面図を付記してある（図１４中の下図参照）。
【００６９】
この第３実施形態である検出部１ｃは、対向電極Ｅ３−Ｅ４が反応領域２の左右に振り分けられたような配置構成を備える点が特徴である。さらに、その変形例を示す図１５では、核酸分子を引き寄せる側の電極として利用する電極（ここでは、Ｅ３）の表面積を、他方の対向電極Ｅ４よりも狭小に形成している点が特徴である。
【００７０】
この図１５に示す変形例では、前述の検出部１ｂと同様に、表面積がより狭小の電極Ｅ３に電界がより集中して不均一電界が形成されるので（図１５の電気力線Ｚ参照）、誘電泳動によって、反応領域２に拡散し、遊離して存在する核酸分子（検出用核酸Ｄ又は標的核酸Ｔ）を該電極Ｅ３に向けて移動させることができる。即ち、電極Ｅ３の周辺領域における核酸分子の濃度を高め、その上で、凹状部位３（３１，３２）内部に該核酸分子を引き寄せることができる。
【００７１】
なお、とくに図示しないが、上下配置の対向電極Ｅ１−Ｅ２と左右配置の対向電極Ｅ３−Ｅ４を両方配置するようにしてもよい。この場合、一方の対向電極Ｅ１−Ｅ２を、検出用核酸Ｄの高次構造調整やハイブリダイゼーション効率向上を目的とする高周波電界印加手段として使用し、他方の対向電極Ｅ３−Ｅ４は、ハイブリダイゼーション検出の際の障害となる余剰物質（例えば、余剰の検出用核酸Ｄ、余剰の標的核酸Ｔ、余剰のインターカレーターなど）やミスハイブリダイゼーションした核酸分子を検出表面部位から他の領域へ強制的に除去するための電界印加手段として使用することができる。このような電界を用いた除去作業は、現在一般に実施されている水溶液を用いた洗浄除去作業に変わり得る技術となる。
【００７２】
以上説明してきた（反応領域２を臨む対向電極を構成する）電極Ｅ１,Ｅ２,Ｅ３,Ｅ４の表面は、ＤＮＡプローブなどの検出用核酸Ｄを固定するための表面として用いることができる。
【００７３】
ＤＮＡプローブ等の所望の検出用核酸Ｄを固定するため、電極表面を、例えば、アミノ基含有のシランカップリング剤溶液やポリリシン溶液で予め表面処理しておく方法を採用できる。また、合成樹脂製基板に対する表面処理加工を行う場合は、その表面をプラズマ処理及びＤＵＶ（ＤｅｅｐＵＶ、遠赤外）照射処理後、アミノ基含有シランカップリング剤溶液で処理することもできる。
【００７４】
また、電極表面に銅、銀、アルミニウム又は金をスパッタして成膜して、その表層にアミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）等をコートしてもよい。
【００７５】
アビジンによって表面処理された検出表面の場合には、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００７６】
次に、図１６に基づいて、本発明に係るＤＮＡチップの好適な実施形態の一例について説明する。
【００７７】
図１６に示されたＤＮＡチップ１０は、ＣＤ様の円盤状をなす基板上に、上述した検出部１ａ（あるいは１ｂ又は１ｃ）が、例えば、周方向、螺旋状、放射状に配列されている。各検出部１ａに設けられた対向電極に対しては、中央の穴１０ａに対して、図示しない通電治具を挿着し、基板に配設した給電用配線を介して、電界を印加することができる。
【００７８】
このＤＮＡチップ１０を回転させて、サーボ機構を働かせながら位置を検出し、所定の反応領域２に向けて媒質Ｍを滴下等の手段によって基板上方側から供給することができる。あるいは、所定の反応領域２に対して、励起光Ｐを基板下方（裏面）側から照射して、得られる蛍光を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【実施例】
【００７９】
ハイブリダイゼーションを検出する方法において、誘電泳動現象により核酸分子をより効果的に電極表面に引き付けることが可能な電極表面形状を検証するために、試験を実施し、電極表面近傍の電界強度などを計算した。
【００８０】
計算モデルとする検出部では、ガラス基板に２５０ｎｍ厚の導体層であるＩＴＯ層（下部電極）を形成し、さらに、このＩＴＯ層に絶縁層であるＳｉＯ２層（１５０ｎｍ厚、誘電率ε＝５）を設けた。また、前記下部電極表面に、高さおよび深さが±５〜１５ｎｍである凹凸形状を形成した（凹凸を形成する角度は９０°）。ＳｉＯ２（二酸化ケイ素）層には５μｍ厚のポリイミド樹脂を積層し、ウエル形状の反応領域２（サイズ：φ100μm）を形成し、該反応領域２を覆うように上部電極（材料：ＳｉＯ２(100nm)/Ａｌ(100nm)/Glass）をかぶせた。
【００８１】
計算モデルである上記検出部の上下の対向電極間に、１Ｖの電圧が印加されている場合の電極表面の電界強度分布を計算した。本試験において、電極間に印加したのは交流電界であるが、電界強度分布の傾向を把握する目的に限定し、計算上は静的な電界とみなした。電界計算上必要な材料の誘電率は、ＳｉＯ２が誘電率ε＝５、核酸分子（ＤＮＡ）を含有するバッファー溶液はほぼ水と同じとみなしてε＝７８とした。
【００８２】
電極表面の凹凸近傍の電界強度分布を計算したところ、凹部の場合は、その底部において、図１０に示す如き電場勾配で、上部領域に比べ電界強度が徐々に強くなっていることが検証できた。一方、凸部の場合では、その基部の方が凸部先端よりも電界強度が強くなっていることがわかった。即ち、平坦部から凸部へ立ち上がる部分についても、凹部類似の電場勾配を形成することが検証できた。
【００８３】
これら凹凸表面の電界強度分布およびその電界強度の傾き分布をグラフにすると図１７、図１８のようになる。なお、図１７、図１８の横軸は、凹部の最大深部からの水平方向の距離（単位：μｍ）であり、図１７の縦軸は電界強度（単位：Ｖ／μｍ）、図１８の縦軸は、電界強度の傾きである。なお、図１７、１８において、ｐ＝５、１０、１５ｎｍは、凸部における基準面からの高さ位置をそれぞれ示しており、ｐ＝−５、−１０、−１５ｎｍは、凸部における基準面からの深さ位置をそれぞれ示している。
【００８４】
まず、図１７で示されているように、明らかに凹部の底部で電界強度は最大となり、その値は深さに依存しないことがわかる。また、図１８により、電界強度の傾きも凹部の底で最大となることがわかる。よって、誘電泳動力は電界強度の傾きの２乗に比例して大きくなるため、凹部の底部でＤＮＡを引き付ける力が最も強くなることが明らかになった。
【００８５】
以上より、誘電泳動力によりＤＮＡを引き付けるためには、凸部を形成するよりも凹部を形成した方が効果的であることがわかった。さらに、電界強度およびその傾きは凹部の深さに依存しないため、実際にハイブリダイゼーションが検出される核酸分子長に相当する数〜数十ｎｍの深さで凹部を形成すればよい。
【００８６】
従って、電極表面として、例えば、既述した図３、図５〜図９の如きに、凹部を規則的に整列させた形態を採用することで、核酸分子を電極表面に、均等な間隔で集積（固定）することができる。それにより、立体障害等が緩和されるので、電極表面でのハイブリダイゼーション時間を短縮化でき、検出量も電極表面において均一にすることができる。
【００８７】
電界を印加しない場合は、ハイブリダイゼーションが完了するまでに約４時間以上を要するが、前記電界を印加した場合、約５分でハイブリダイゼーション完了と同等の蛍光信号が得られた。即ち、ハイブリダイゼーションの高速化を達成できた。
【００８８】
従って、電極表面上の凹部により作られた不均一電界により誘電泳動効果が標的核酸に働いて、検出用核酸であるＤＮＡプローブの固定された電極表面領域の前記標的核酸濃度が高まり、この結果、ハイブリダイゼーション反応が促進されたと考えられる。
【００８９】
ハイブリダイゼーションの検出は、インターカレーターや標的核酸に標識された蛍光色素を用いたハイブリダイゼーション検出を採用でき、また、モレキュラビーコンを利用して検出してもよい。
【００９０】
また、電極表面の凹状部位の深さや角度は限定されるものではなく、引き付けたい（移動させたい）核酸分子の量、種類、分子長に基づいて、好適な値を選ぶことが望ましい。さらに、電界の強度や周波数についてもとくに限定するものではなく、核酸分子の種類や分子長などに基づいて、適正な値を選ぶことが望ましい。波形についてもサイン波に限定するものでもなく、三角波等でもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、ハイブリダイゼーション検出を短時間で効率よく実施でき、かつ検出精度が高いので、ＤＮＡチップなどのハイブリダイゼーション検出技術に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明に係るハイブリダイゼーション検出部の第１実施形態（１ａ）の要部構成を表す断面図である。
【図２】同検出部（１ａ）に対する媒質供給手段及び光ピックアップ手段の概略構成を示す図である。
【図３】同検出部（１ａ）の電極（Ｅ１又はＥ２）の表面形態構成の一例を示す拡大図である。
【図４】同電極（Ｅ１又はＥ２）の表面に形成された凹状部位の一例の拡大図である。
【図５】検出部（１ａ）の電極表面部分の他の形態構成の例を示す拡大図である。
【図６】同電極表面部分の変形例を示す図である。
【図７】同電極表面部分の他の変形例を示す図である。
【図８】同電極表面部分の他の変形例を示す図である。
【図９】同電極表面部分の他の変形例を示す図である。
【図１０】凹状部位（３）内の電界形成の様子を模式的に示す図（図４中のＩ−Ｉ線矢視断面図）である。
【図１１】凹状部位（３１）内の電界形成の様子を模式的に示す図である。
【図１２】凹状部位（３２）内の電界形成の様子を模式的に示す図である。
【図１３】本発明に係る検出部の第２実施形態（１ｂ）の要部構成を表す断面図である。
【図１４】本発明に係る検出部の第３実施形態（１ｃ）の要部構成を表す断面図である（同図中のＩＩ-ＩＩ線矢視断面図を付記）。
【図１５】検出部（１ｃ）の変形例の電極形態を示す図である。
【図１６】本発明に係るＤＮＡチップ（１０）の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図１７】凹凸表面の電界強度分布を示す図（図面代用グラフ）である。
【図１８】凹凸形状の電極表面の電界強度の傾き分布を示す図（図面代用グラフ）である。
【符号の説明】
【００９３】
１ａ,１ｂ,１ｃ  検出部
２  反応領域
１０  ＤＮＡチップ（特に、検出用核酸が固定化された基板）
Ｄ  検出用核酸（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１−Ｅ２，Ｅ３−Ｅ４  対向電極
Ｆ  蛍光
Ｍ  （溶液やゲルなどの）媒質
Ｐ  励起光
Ｔ  標的核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2005345439.tif 000016
【図１５】
2005345439.tif 000017
【図１６】
2005345439.tif 000018
【図１７】
2005345439.tif 000019
【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月24日(2005.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
特許文献３では、電極ピンにオリゴヌクレオチドが固定された構成を備えるＤＮＡチッ
プが提案されている。
【非特許文献１】Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichiTazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。
【非特許文献２】鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）。
【特許文献１】特開平７−２２４０８６号公報。
【特許文献２】特開２００２−１６８８６４号公報。
【特許文献３】特開２００１−２４２１３５号公報。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
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