(57)【要約】【課題】  ＴＢＫ１ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウス由来の組織若しくは細胞を用いて、ＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する、ＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  染色体上のＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＢＫ１を発現する機能が失われているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対するＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価し、ＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する応答の促進物質をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＢＫ１を発現する機能が失われているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定・評価するに際し、対照としての同腹の野生型マウスとの比較・評価を行うことを特徴とする請求項１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
マウス由来の細胞が、ＴＢＫ１ノックアウトマウス由来の胚線維芽細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物が、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＬＰＳ刺激に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項４記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
抗ウイルスタンパク質が、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗ウイルスタンパク質が、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０又はＩＲＧ１であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
抗ウイルスタンパク質が、Ｍｘ２、ＩＲＦ−７、インターフェロン誘導性ＧＴＰａｓｅ、ＩＳＧ１５であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＬＰＳ刺激に対するＩＳＲＥ結合活性の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項４記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物が、ウイルスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項１０記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
抗ウイルスタンパク質が、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）であることを特徴とする請求項１１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質が、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０、ＩＲＧ１又はＲＡＮＴＥＳであることを特徴とする請求項１１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウス由来の組織若しくは細胞を用いた、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激及び／又はウイルス感染に対する、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）等の抗ウイルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptors：ＴＬＲ）は、病原体の侵入を認識するために必須であり、自然免疫と適応免疫との重要な連結の役割を果たすことが知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。ＴＬＲは、ＴＬＲ１／ＴＬＲ２ヘテロ二量体が認識するトリアシル化リポペプチド、ＴＬＲ２／ＴＬＲ６ヘテロ二量体が認識するジアシル化リポペプチド、ＴＬＲ４が認識するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＴＬＲ３が認識する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＴＬＲ５が認識する細菌の鞭毛から得たフラジェリン、ＴＬＲ９が認識する非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡ等の様々な細菌成分を認識することができる。現在、ＴＬＲの細胞内シグナル伝達経路について幅広い研究が行なわれている（例えば、非特許文献１、２参照）。各ＴＬＲの細胞質領域には、ＴＬＲ受容体ファミリー及びＩＬ−１受容体ファミリーの両方に共通する、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインが含まれる。ＴＬＲのシグナル伝達の現象は、シグナル伝達分子のリクルーティングにより、ＴＩＲドメインから開始する。ＭｙＤ８８は、ＴＩＲドメイン及びデスドメインの両方を含む細胞質分子であり、ＴＬＲ受容体ファミリー及びＩＬ−１受容体ファミリーのアダプタータンパク質として機能する。ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインは、ＴＩＲドメインを含む受容体とアダプター分子との複合体形成において必要とされている。デスドメインは、ＩＲＡＫ１やＩＲＡＫ４等のその他のデスドメインを含む分子との相互作用を仲介する。ＭｙＤ８８の欠損により、ほとんど全てのＴＬＲリガンドに応答して、結果的に炎症誘発性サイトカインの産生が障害されるが、ｄｓＲＮＡ（ＴＬＲ３リガンド）及びＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）は、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）−３の活性化を誘導し、ＭｙＤ８８非依存的なＩＦＮ−βの産生を引き起こす（例えば、非特許文献３〜６参照）。近年の研究により、ｄｓＲＮＡ及びＬＰＳによるＩＲＦ−３の活性化やＩＦＮ−βの誘導が、ＴＩＲを含む別のアダプター分子である、ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１により仲介されることが明らかになった（例えば、非特許文献６〜９参照）。
【０００３】
ウイルス感染における、タイプＩ ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）誘導の分子機構は、詳細にに研究されている（例えば、非特許文献１０〜１２参照）。ＩＦＮ−βの誘導は、主に転写レベルで制御される。これまでの研究により、ＩＦＮ−βの発現が、ＮＦ−κＢ、ＡＴＦ−２／ｃ−Ｊｕｎ並びにＩＲＦ−３及びＩＲＦ−７により制御されることが知られている（例えば、非特許文献１０〜１２参照）。遺伝子破壊の研究により、タイプＩ ＩＦＮ遺伝子の転写におけるＩＲＦ−３及びＩＲＦ−７の重要な役割が明らかにされている（例えば、非特許文献１３、１４参照）。ウイルス感染の間、ＩＲＦ−３は、主にＩＦＮ−β遺伝子の初期活性化において応答し（例えば、非特許文献１５参照）、ＩＲＦ−７の発現は、ＩＦＮ−βに依存する。その結果、タイプＩ ＩＦＮは、自己分泌の陽性フィードバック様式で強く誘導する（例えば、非特許文献１２、１６参照）。ＩＲＦ−３は、未感染細胞の細胞質中に局在する。ウイルス感染後、ＩＲＦ−３は、Ｃ末端の部分に位置する多重セリン／スレオニン残基でリン酸化する。リン酸化したＩＲＦ−３は、核の中に移行するホモ二量体を形成し、ＩＲＦ結合要素／ＩＦＮ刺激応答要素（IRF-binding element/IFN-stimulated response element）（ＩＲＦ−Ｅ／ＩＳＲＥ）と呼ばれるＩＲＦ−結合部位を含むプロモーターを活性化する。
【０００４】
ＩＲＦ−３の活性化を誘導する分子機構についてはほとんど分かっていないが、近年の研究により、ＩＲＦ−３は、２つのＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）関連キナーゼ（IκB kinase (IKK)-related kinases）、すなわち、誘導性ＩＫＫ（ＩＫＫ−ｉ）及びＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）によりリン酸化されると考えられている（例えば、非特許文献１７、１８参照）。ＩＫＫ−ｉは、ＩＫＫ−εとも呼ばれ、最初にＬＰＳ誘導キナーゼ（LPS-induced kinase）として同定されている（例えば、非特許文献１９、２０参照）。ＴＢＫ１は、ＮＦ−κＢ活性キナーゼ（NF-κB activating kinase）（ＮＡＫ）又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子（ＴＲＡＦ）−２関連キナーゼ（tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)-2 associated kinase）（Ｔ２Ｋ）とも呼ばれている（例えば、非特許文献２１〜２３参照）。これら２種のキナーゼは、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βと相同性を共有する。これらキナーゼは、ＴＲＡＦ２やＴＲＡＦ結合タンパク質であるＴＡＮＫ／Ｉ−ＴＲＡＦと相互作用し、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βの上流で機能すると報告されている（例えば、非特許文献２１、２４参照）。ＴＢＫ１の欠損は、広範囲の肝臓変性による胚死亡の原因となり、ＴＢＫ１欠損（ＴＢＫ１-/-）胚繊維芽細胞（ＥＦ）は、ＮＦ−κＢにより制御される特定遺伝子の発現の減少を示した（例えば、非特許文献２３参照）。したがって、これら２種のＩＫＫ関連キナーゼは、ＮＦ−κＢの活性化に関係していると考えられている。近年、２つの研究グループにより、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１がＩＲＦ−３及びＩＲＦ−７をリン酸化して活性化し、ＴＲＩＦ依存的シグナル伝達経路と同様にウイルス感染におけるＩＦＮ−β、ＲＡＮＴＥＳ（Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted）及びＩＳＧ５４の転写を引き起こすことが示唆されている（例えば、非特許文献１７、１８参照）。
【０００５】
また、ＴＢＫ１（Ｔ２Ｋ）ノックアウトマウスが胎生１４．５日目（Ｅ１４．５）頃に死亡することや、ＴＢＫ１（Ｔ２Ｋ）及びＴＮＦのダブルノックアウトマウスが野生型マウスと同様に生育することも知られている（前記非特許文献２３参照）。そしてまた、ＴＬＲ４が認識するリガンドとして、主としてグラム陰性菌の外膜成分として存在するエンドトキシンとも呼ばれるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）、グラム陽性細菌の細胞壁成分であるリポテイコ酸（ＬＴＡ）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）溶解物、グラム陽性菌細胞壁画分等が知られている（非特許文献２５、２６参照）。
【非特許文献１】Janeway, C. A. Jr, and R, Medzhitov. 2002. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20:197-216. First published on October 4, 2001; 10.1146/ annurev. immunol. 20.083001.084359
【非特許文献２】Takeda, K., T. Kaisho, and S. Akira. 2003. Toll-like receptors. Annu. Rev. Immunol. 21:335-376. First published on December 19, 2002; 10.1146/annurev.immunol. 21.120601.141126
【非特許文献３】Kawai, T., O, Takeuch.i, T. Fujita, J. Inoue, P. F. Muhlradt, S. Sato, K. Hoshino, and S. Akira. 2001. Lipopolysaccharide stimulates the MyD88-independent pathway and results in activation of IFN-regulatory factor 3 and the expression of a subset of lipopolysaccharide-inducible genes. J. Immunol. 167:5887-5894
【非特許文献４】Hoshino, K., T. Kaisho, T. Iwabe, O. Takeuchi, and S. Akira. 2002. Differential involvement of IFN-b in Toll-like receptor-stimulated dendritic cell activation. Int. Immunol. 14:1225-1231.
【非特許文献５】Toshchakov, V., B. W. Jones, P. Y. Perera, K. Thomas, M. J. Cody, S. Zhang, B. R. Williams, J. Major, T. A. Hamilton, M. J. Fenton, and S. N. Vogel. 2002. TLR4, but not TLR2, mediates IFN-b-induced STAT1a/b-dependent gene expression in macrophages. Nature Immunol. 3:392-8. First published on March 18, 2002; 10.1038/ni774
【非特許文献６】Yamamoto, M., S. Sato, K. Mori, K. Hoshino, O. Takeuchi, K. Takeda, and S. Akira. 2002. A novel Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter that preferentially activates the IFN-b promoter in the Toll-like receptor signaling. J. Immunol. 169:6668-6672.
【非特許文献７】Oshiumi, H, M. Matsumoto, K. Funami, T. Akazawa, and T. Seya. 2003. TICAM-1, an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferon-b induction. Nature Immunol. 4:161-167. First published on January 21, 2003; doi:10.1038/ni886
【非特許文献８】Yamamoto, M., S. Sato, H. Hemmi, K. Hoshino, T. Kaisho, H. Sanjo, O. Takeuchi, M. Sugiyama, M. Okabe, K. Takeda, and S. Akira. 2003. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent Toll-like receptor signaling pathway. Science. 301:640-643. Published on July 10, 2003; 10.1126/science.1087262
【非特許文献９】Hoebe, K, X. Du, P. Georgel, E. Janssen, K. Tabeta, S. O. Kim, J. Goode, P. Lin, N. Mann, S. Mudd, K. Crozat, S. Sovath, J. Han, and B. Beutler. 2003. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. (July 20, 2003) Nature. 10.1038/nature01889
【非特許文献１０】Sen, G. C. 2001. Viruses and interferons. Annu. Rev. Microbiol. 55:255-81.
【非特許文献１１】Grandvaux, N., B. R. tenOever, M. J. Servant, and J. Hiscott. 2002. The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion. Curr. Opin. Infect. Dis. 15:259-267.
【非特許文献１２】Taniguchi, T., and A. Takaoka. 2002. The interferon-a/b system in antiviral responses: a multimodal machinery of gene regulation by the IRF family of transcription factors. Curr. Opin. Immunol. 14:111-116.
【非特許文献１３】Sato, M., H. Suemori, N. Hata, M. Asagiri, K. Ogasawara, K. Nakao, T. Nakaya, M. Katsuki, S. Noguchi, N. Tanaka, and T. Taniguchi. 2000. Distinct and essential roles of transcription factors IRF-3 and IRF-7 in response to viruses for IFN-a/b gene induction. Immunity. 13:539-548.
【非特許文献１４】Sakaguchi, S., H. Negishi, M. Asagiri, C.Nakajima, T. Mizutani, A. Takaoka, K. Honda, and T. Taniguchi. 2003. Essential role of IRF-3 in lipopolysaccharide-induced interferon-b gene expression and endotoxin shock. Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:860-866.
【非特許文献１５】Yoneyama, M., W. Suhara, Y. Fukuhara, M. Fukuda, E. Nishida, and T. Fujita. 1998. Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300. EMBO J. 17:1087-1095.
【非特許文献１６】Levy, D.E, I. Marie, and A. Prakash. 2003. Ringing the interferon alarm: differential regulation of gene expression at the interface between innate and adaptive immunity. Curr Opin Immunol. 15:52-58.
【非特許文献１７】Sharma, S, B. R. tenOever, N. Grandvaux, G. P. Zhou, R, Lin, and J. Hiscott. 2003. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. Science. 300:1148-1151. First published on April 17, 2003; 10.1126/science.1081315
【非特許文献１８】Fitzgerald, K. A., S. M. McWhirter, K. L. Faia, D. C. Rowe, E. Latz, D. T. Golenbock, A. J. Coyle, S. M. Liao, and T. Maniatis. 2003. IKKe and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway. Nature Immunol. 4:491-496. First published on April 14, 2003; 10.1038/ni921
【非特許文献１９】Shimada, T, T. Kawai, K. Takeda, M. Matsumoto, J. Inoue, Y. Tatsumi, A. Kanamaru, and S. Akira. 1999. IKK-i, a novel lipopolysaccharide-inducible kinase that is related to IkB kinases. Int. Immunol. 11:1357-1362.
【非特許文献２０】Peters, R. T., S. M. Liao, and T. Maniatis. 2000. IKKe is part of a novel PMA-inducible IkB kinase complex. Mol. Cell. 5:513-522.
【非特許文献２１】Pomerantz, J. L., D. Baltimore. 1999. NF-kB activation by a signaling complex containing TRAF2, TANK and TBK1, a novel IKK-related kinase. EMBO J. 18:6694-6704.
【非特許文献２２】Tojima, Y., A. Fujimoto, M. Delhase, Y. Chen, S. Hatakeyama, K. Nakayama, Y. Kaneko, Y. Nimura, N. Motoyama, K. Ikeda, M. Karin, and M. Nakanishi. 2000. NAK is an IkB kinase-activating kinase. Nature. 404:778-782.
【非特許文献２３】Bonnard, M., C. Mirtsos, S. Suzuki, K. Graham, J. Huang, M. Ng, A. Itie, A. Wakeham, A. Shahinian, W. J. Henzel, A. J. Elia, W. Shillinglaw, T. W. Mak, Z. Cao, and W. C. Yeh. 2000. Deficiency of T2K leads to apoptotic liver degeneration and impaired NF-kB-dependent gene transcription. EMBO J. 19:4976-4985.
【非特許文献２４】Nomura F, Kawai T, Nakanishi K, Akira S. 2000. NF-kB activation through IKK-i-dependent I-TRAF/TANK phosphorylation. Genes Cells. 5:191-202.
【非特許文献２５】Takeuchi, O., K. Hoshino, T. Kawai, H. Sanjo, H. Takada, T. Ogawa, K. Takeda, and S. Akira. 1999. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity. 11: 443-451.
【非特許文献２６】Takeuchi, O., K. Takeda, K. Hoshino, O. Adachi, T. Ogawa, and S. Akira. 2000. Cellular responses to bacterial cell wall components are mediated through MyD88-dependent signaling cascades. Int. Immunol. 12: 113-117.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＴＢＫ１ノックアウトマウス又は該ノックアウトマウス由来の組織若しくは細胞を用いて、ＬＰＳ刺激及び／又はウイルス感染に対する、ＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ジーンターゲティングによりＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１の生理学的役割について研究を行った。ＩＫＫ−ｉ-/-細胞は、ＬＰＳに応答して、正常な遺伝子誘導を示した。一方、ＴＢＫ１-/-細胞は、ＩＦＮ−βの発現が損なわれることを示したが、炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡの誘導は正常であった。ＬＰＳに応答して、ＮＦ−κＢの活性化は両方の変異体ＥＦで誘導されたが、ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＳＲＥ結合活性は誘導されなかった。また、ウイルス感染したＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の発現が激しく損なわれた。これらの結果は、ＬＰＳ刺激及びウイルス感染によるＩＦＮ−β遺伝子の誘導にＴＢＫ１は必須であるが、ＩＫＫ−ｉは必須でないことを示している。本発明者らは、以上の知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、染色体上のＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＢＫ１を発現する機能が失われているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物とを用いて、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項１）に関する。
【０００９】
また本発明は、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定・評価するに際し、対照としての同腹の野生型マウスとの比較・評価を行うことを特徴とする請求項１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項２）や、マウス由来の細胞が、ＴＢＫ１ノックアウトマウス由来の胚線維芽細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項３）や、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物が、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項４）や、ＬＰＳ刺激に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項４記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項５）に関する。
【００１０】
さらに本発明は、抗ウイルスタンパク質が、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項６）や、抗ウイルスタンパク質が、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０又はＩＲＧ１であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項７）や、抗ウイルスタンパク質が、Ｍｘ２、ＩＲＦ−７、インターフェロン誘導性ＧＴＰａｓｅ、ＩＳＧ１５であることを特徴とする請求項５記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項８）や、ＬＰＳ刺激に対するＩＳＲＥ結合活性の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項４記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項９）や、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物が、ウイルスであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、ウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価することを特徴とする請求項１０記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、抗ウイルスタンパク質が、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）であることを特徴とする請求項１１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、ウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質が、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０、ＩＲＧ１又はＲＡＮＴＥＳであることを特徴とする請求項１１記載のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法（請求項１３）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ＬＰＳ及びウイルス感染に応答して、ＴＢＫ１はＩＦＮ−β遺伝子の誘導に必須の構成成分であるが、ＩＫＫ−ｉは必須でないことが明らかになったことから、ＴＢＫ１活性をコントロールすることにより、炎症誘発性サイトカインの誘導に影響を与えることなくＩＦＮ−βの発現を変更することができる。本発明により、敗血性ショック及びウイルス感染のための新たな治療的処置を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＬＰＳ刺激及び／又はウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質の誘導促進物質のスクリーニング方法としては、染色体上のＴＢＫ１遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＢＫ１を発現する機能が失われているマウス、又は該マウス由来の組織若しくは細胞と、被検物質と、ＬＰＳ及び／又はウイルスとを用い、前記マウス又は該マウス由来の組織若しくは細胞における、ＬＰＳ刺激及び／又はウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記マウスとしては、ＴＢＫ１ノックアウトマウスや、ＴＢＫ１・ＴＮＦダブルノックアウトマウスを例示することができるが、野生型マウスと同様に生育するＴＢＫ１・ＴＮＦのダブルノックアウトマウスが好ましい。また、上記マウス由来の組織としては、脾臓、リンパ節、骨髄、肺等を挙げることができ、上記マウス由来の細胞としては、胚線維芽細胞（ＥＦ）、マクロファージ、脾細胞、樹状細胞、肺繊維芽細胞等を挙げることができる。ＴＢＫ１ノックアウトマウスは胎生１４．５日目（Ｅ１４．５）頃に死亡することから、ＴＢＫ１ノックアウトマウス由来の細胞としては胚線維芽細胞等の培養可能な不死化細胞が好ましい。
【００１３】
上記ＴＢＫ１ノックアウトマウスは、例えば以下のように作製することができる。ＴＢＫ１遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＴＢＫ１遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＴＢＫ１遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＴＢＫ１をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３'末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１４】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明に用いられるＴＢＫ１ノックアウト（ＴＢＫ１-/-）マウスを作製することができる。また、ＴＢＫ１ノックアウトマウスにおいて、ＴＢＫ１が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＢＫ１の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１５】
また、作出されたＴＢＫ１ノックアウトマウスがＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対して不応答性であることは、例えば、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分であるＬＰＳやウイルス等をＴＢＫ１ノックアウトマウスに静脈注射等により投与し、発熱、ショック、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、ＩＦＮ誘発、Ｂリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等のエンドトキシンの生物活性を測定することや、ＴＢＫ１ノックアウトマウスの胚線維芽細胞に、細菌由来のＬＰＳ、又はグラム陽性菌菌体成分である、リポテイコ酸、結核菌溶解物、ウイルス等の存在下において、例えばＩＦＮ−β等の抗ウイルスタンパク質の発現を測定することにより確認することができる。上記ウイルスとしては、ウイルス構成成分にＴＬＲ４が認識するリガンドを含むものであれば特に制限されず、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）等を挙げることができる。
【００１６】
本発明のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法として、具体的には、前記ＴＢＫ１ノックアウトマウスやＴＢＫ１・ＴＮＦダブルノックアウトマウスにＬＰＳを投与したり、ウイルスを感染させ、ＬＰＳ投与（刺激）やウイルス感染の前後又は同時に、ペプチド、核酸、低分子化合物、天然由来の抽出物等の被検物質を投与し、これらノックアウトマウス由来の細胞におけるＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する応答の程度を測定・評価する方法や、前記ＴＢＫ１ノックアウトマウスやＴＢＫ１・ＴＮＦダブルノックアウトマウスに由来する細胞にＬＰＳで刺激したり、ウイルスを感染させ、ＬＰＳ刺激やウイルス感染の前後又は同時に、ペプチド、核酸、低分子化合物、天然由来の抽出物等の被検物質を共存させ、これらノックアウトマウス由来の細胞におけるＬＰＳ刺激やウイルス感染に対する応答の程度を測定・評価する方法を例示することができる。そして、ＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の程度を測定・評価するに際し、対照としての同腹の野生型マウスとの比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
【００１７】
ＴＬＲ４が認識するリガンドがＬＰＳである場合、ＬＰＳ刺激に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度や、ＩＳＲＥ結合活性の誘導の程度を測定・評価することが好ましく、上記抗ウイルスタンパク質としては、ＩＦＮ−βや、ＩＦＮ−βに誘導されるＩＳＧ５４、ＩＰ−１０（IFN-γ-Inducible Protein10）、ＩＲＧ１や、Ｍｘ２、ＩＲＦ−７、インターフェロン誘導性ＧＴＰａｓｅ、ＩＳＧ１５などを具体的に例示することができる。また、ＴＬＲ４が認識するリガンドの含有物がウイルスである場合、ウイルス感染に対する抗ウイルスタンパク質の誘導の程度を測定・評価することが好ましく、上記抗ウイルスタンパク質としては、ＩＦＮ−βや、ＩＦＮ−βに誘導されるＩＳＧ５４、ＩＰ−１０、ＩＲＧ１、ＲＡＮＴＥＳなどを具体的に例示することができる。
【００１８】
本発明のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこれらの含有物に対する応答の促進物質のスクリーニング方法により得られる促進物質は、インビボにおけるＬＰＳ刺激やウイルス感染によるシグナル伝達におけるメカニズムの解明に有用であり、促進物質は細菌感染症やウイルス感染症の予防・治療剤として使用しうる可能性がある。細菌感染症やウイルス感染症の予防・治療効果が期待できる上記促進物質を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品を用いる予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００１９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
［材料と方法］
（細胞、ウイルス及び試薬）
４％のチオグリコール酸２ｍｌをマウス腹腔内に投与し、３日後にチオグリコール酸を誘発した腹膜細胞を回収した。胚繊維芽細胞（ＥＦ）は、胎生１２．５日目の胚より前記非特許文献３記載の通りに調製した。組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、Dr. Yoshiharu Matsuura及びDr. Takayuki Abe（大阪大学）より提供された。センダイウイルス（ＳｅＶ）は、Dr. Tatsuo Shiota（大阪大学）より提供された。ＥＦを、１×１０9のＶＳＶのＲＮＡコピー／ｍｌ又は感染効率（ＭＯＩ）１０のＳｅＶウイルスで感染させた。サルモネラ・ミネソタ（S. minnesota）Ｒｅ−５９５のＬＰＳは、Sigma-Aldrich社より購入した。合成Ｐａｍ３ＣＳＫ４（細菌リポペプチド、ＢＬＰ）は、Boehringer Mannheim社より入手した。ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βは、Genzyme社より購入した。
【００２１】
（プラスミド）
野生型ＩＫＫ−ｉ及びＩＫＫ−ｉ変異アレル由来の変異ＩＫＫ−ｉの発現ベクターを構築するため、野生型ＥＦ及びＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦから得たＩＫＫ−ｉ ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、pFLAG-CMV2ベクター（Sigma-Aldrich社製）にクローニングした。ヒトＩＲＦ−３の発現ベクターは、ヒトＩＲＦ−３ ｃＤＮＡをpFLAG-CMV2ベクターに連結させることにより構築した。ヒトＴＢＫ１（ｈＴＢＫ１）の発現ベクターは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーより得たＴＢＫ１ ｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、pEF-BOSベクターに連結させることにより構築した。
【００２２】
（ＩＫＫ−ｉ-/-マウス及びＴＢＫ１-/-マウスの作製）
ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１をコードするゲノムＤＮＡ断片を１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリーからスクリーニングし、制限酵素マッピング及びシーケンシング分析で特徴づけを行った。ＩＫＫ−ｉ遺伝子の１．０ｋｂｐ断片とＴＢＫ１遺伝子の１．５ｋｂｐ断片の両方をネオマイシン耐性遺伝子カセットで置換し、ターゲティングベクターを設計した。ＭＣ１プロモーターにより作動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をネガティブ選択のために用いた。これらのターゲティングベクターを、胎生１４．１日目のＥＳ細胞にトランスフェクションした。Ｇ４１８及びガンシクロビア二重耐性クローンから、ＰＣＲ及びサザンブロットによりターゲティングしたＥＳ細胞を同定し、その後、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞中に注入した。得られた雄キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配した。その後、Ｆ１子孫同士をインタークロスさせ、各変異アレルのホモ接合体を作製した。
【００２３】
（ノーザンブロット分析）
Sepazol-RNA I（Nacalai Tesque社製）を用いて全ＲＮＡを単離し、電気泳動にかけ、ナイロン膜に移した。前記非特許文献３記載のｃＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。ｃＤＮＡプローブは全て、前記非特許文献３記載のサブトラクティブスクリーニングより得られた。
【００２４】
（電気泳動移動度シフトアッセイ；ＥＭＳＡ）
野生型胚、ＩＫＫ−ｉ-/-胚及びＴＢＫ１-/-胚から得たＥＦ（１×１０6細胞）を、１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、所定の時間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ結合部位又はＩＦＮ刺激制御要素（ＩＳＲＥ）を含む放射能標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いてインキュベーションを行い、前記非特許文献３記載の通りオートラジオグラフィーで視覚化した。
【００２５】
（ウエスタンブロット分析）
核抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。抗ＩＲＦ−３抗体（前記非特許文献８参照）及び抗ＮＦ−κＢp65抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を用いて、かかる膜にブロットした。かかる膜結合抗体は、ＥＣＬシステム（PerkinElmer Life Sciences社製）を用いて、ウサギＩｇＧ（Amersham Bioscience社製）に対する西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗体により視覚化した。
【００２６】
（レポーターアッセイ）
ヒト胎児腎臓２９３細胞を２４ウエルプレートに播種し、Lipofectoamin 2000試薬（Invitrogen社製）を用いて、レポータープラスミドと共に、所定の発現ベクターでトランジェントにトランスフェクションした。６ウエルプレートに播種したＥＦを、Ｆｕ ＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Roche Diagnostics社製）を用いて、ＩＦＮ−βプロモーターレポータープラスミドと共に、空のpEF-BOSベクター（ＭＯＣＫ）又はpEF-BOSヒトＴＢＫ１でトランジェントにトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、かかる細胞を１０μｇ／ｍｌのＬＰＳでさらに１２時間刺激した。全細胞溶解液のルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Dual-luciferase reporter assay system）（Promega社製）を用いて測定した。内部標準として、レニラルシフェラーゼレポーター遺伝子（Renilla-luciferase reporter gene）（Promega社製）を使用した。
【００２７】
（マイクロアレイ分析）
ＬＰＳで２時間若しくは４時間刺激したＥＦ又は刺激していないＥＦから全ＲＮＡを抽出し、ｃＲＮＡプローブの合成を行った。製造者の指示に従い、ｃＲＮＡの調製、ハイブリダイゼーション及びマイクロアレイのスキャニング（scanning）を行った。アフィメトリックスマイクロアレイＭＧ Ｕ７４Ａバージョン２（Affymetrix社製）を用いて分析を行った。Microarray Suite version 5.0 software（Affymetrix社製）及びGeneSpring software（Silicon Genetics社製）を用いてデータ分析を行った。
【実施例２】
【００２８】
［結果］
（ＩＫＫ−ｉ-/-マウス及びＴＢＫ１-/-マウスの作製）
ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１の生理学的役割を検討するため、ジーンターゲティングによりＩＫＫ−ｉ-/-マウス及びＴＢＫ１-/-マウスを作製した。ＩＫＫ−ｉ-/-マウスを作製するためのターゲティングベクターは、第２のキナーゼドメインの一部をコードするＩＫＫ−ｉ遺伝子のエキソン７及びエキソン８を置換するために、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを用いて構築した（図１Ａ）。ＩＫＫ−ｉ-/-マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、繁殖性であり、健康そうであった（図１Ｂ）。ＩＫＫ−ｉ遺伝子のＮ末端断片をプローブとして使用し、ホモ接合体変異マウスのチオグリコール酸誘発腹膜細胞中のＩＫＫ−ｉ転写物を検出した（図１Ｃ）。しかしながら、シーケンシング分析を行ったところ、変異アレルから得たＩＫＫ−ｉ ｍＲＮＡはターゲティングしたエキソンを欠き、早発性（premature）のストップコドンを含み、２つのキナーゼドメインのうち１つのみを含む切断タンパク質を生成することが明らかになった（データは図示せず）。トランジェントなトランスフェクションアッセイを用いて、野生型ＩＫＫ−ｉタンパク質及び変異ＩＫＫ−ｉタンパク質の生物活性を評価した（図１Ｄ）。野生型ＩＫＫ−ｉタンパク質は、ＩＦＮ−βプロモーターの活性を投与量依存的に誘導したが、変異ＩＫＫ−ｉタンパク質は誘導しなかった。したがって、変異ＩＫＫ−ｉタンパク質が、少なくともＩＦＮ−βの誘導に関しては、生物活性を有さないと結論づけた。
【００２９】
ＴＢＫ１-/-マウスを作製するためのターゲティングベクターは、ＴＢＫ１遺伝子のエキソン９を置換するために、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを用いて構築した（図１Ｅ）。ＴＢＫ１のヘテロ接合体マウスが誕生し、かかるマウスは健康そうであった。しかしながら、ＴＢＫ１-/-マウスは、以前に報告（前記非特許文献２３）されていた通り、胎生１４．５日目（Ｅ１４．５）頃に死亡した。胎生１２．５日目の胚から繊維芽細胞（ＥＦ）を得て（図１Ｆ）、ＴＢＫ１ ｍＲＮＡの発現を調べた。野生型ＥＦでは、ＴＢＫ１ ｍＲＮＡが検出され、ＬＰＳ刺激した後に増加した。しかしながら、ＴＢＫ１-/-ＥＦでは、ＴＢＫ１ ｍＲＮＡが全く検出されなかったのに対し、ＩＫＫ−ｉ遺伝子は正常に誘導されていた（図１Ｇ）。
【００３０】
（ＩＫＫ−ｉ-/-細胞及びＴＢＫ１-/-細胞におけるＩＬ−６産生の誘導）
ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は、ＮＦ−κＢの活性化に関係している。ＩＬ−６産生はＮＦ−κＢに依存するため、本発明者らは、ＮＦ−κＢを活性化することで知られている様々な刺激に応答して、ＥＦにおけるＩＬ−６の産生を測定した。ＥＦを、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＴＬＲ２リガンドであるＰａｍ3ＣＳＫ4（細菌性リポペプチド、ＢＬＰ）及びＴＬＲ４リガンドであるＬＰＳで刺激した。図２Ａに示されるように、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦは、調べた全ての刺激剤に応答して、野生型細胞と比較して同様のＩＬ−６量を産生した。
【００３１】
（ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＬＰＳ応答ＩＦＮ誘導性遺伝子セットの誘導）
ＬＰＳ刺激は、ＩＲＦ−３の活性化を誘導し、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子セット（a set of IFN-inducible genes）の誘導を引き起こす（前記非特許文献３、Nakaya, T, M. Sato, N. Hata, M. Asagiri, H. Suemori, S. Noguchi, N. Tanaka, and T. Taniguchi. Gene induction pathways mediated by distinct IRFs during viral infection. 2001. Biochem. Biophys. Res. Commun. 283:1150-1156.）。そこで、ノーザンブロット分析によりこれらＩＲＦ−３制御遺伝子の発現を調べた（図２Ｂ）。ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦにおいては、ＬＰＳに応答して、ＩＦＮ−β及びＩＬ−６遺伝子の発現の増大を示した。さらに、ＬＰＳで刺激したＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦにおいては、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０、ＩＲＧ１、ＲＡＮＴＥＳ等のＩＦＮ誘導性遺伝子の発現もアップレギュレートした。これらの応答は、ＩＫＫ−ｉ-/-マウスから得た骨髄由来樹状細胞及びチオグリコール酸誘発腹膜細胞においても、インタクトであった（データは図示せず）。一方、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおいては、ＩＦＮ−β、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０及びＩＲＧ１のｍＲＮＡ誘導が著しく損なわれたのに対し、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＬ−６のｍＲＮＡ誘導は野生型細胞と類似していた（図２Ｂ）。
【００３２】
次に、ＬＰＳで刺激したＥＦのＤＮＡマイクロアレイ分析を行った。野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦをＬＰＳで２時間又は４時間刺激した。野生型ＥＦに誘導された遺伝子を図２Ｃ（参考写真１）に示す。ＴＢＫ１-/-ＥＦでは、Ｍｘ２、ＩＲＦ−７、インターフェロン誘導性ＧＴＰａｓｅ、ＩＳＧ１５等のＩＦＮ誘導性遺伝子は誘導されなかった。一方、ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ−１、ＩκＢ−β等のＭｙＤ８８依存的遺伝子の誘導が正常であることを示した（図２Ｃ）。ＥＭＳＡ分析により、野生型細胞と同様に、ＩＫＫ−ｉ-/-細胞及びＴＢＫ１-/-細胞の両方においても、ＮＦ−κＢの正常な活性化が見られることが明らかになった（図３Ａ）。これに対して、ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＳＲＥ結合活性が誘導されなかったが、野生型細胞及びＩＫＫ−ｉ-/-細胞の両方においては確認された（図３Ａ）。
【００３３】
ＩＦＮ−βの誘導にＴＢＫ１が必要であることを確認するため、ＴＢＫ１-/-細胞中のＴＢＫ１を再構成（re-constitution）が、ＬＰＳ刺激によりＩＦＮ−βプロモーターの活性化を回復することが可能であるかどうかを調べた（図３Ｂ）。ＬＰＳは、モックトランスフェクションした野生型ＥＦにおいてはＩＦＮ−βプロモーターを活性化したが、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおいては活性化しなかった。しかしながら、ヒトＴＢＫ１の一時的な発現は、ＬＰＳで刺激したＴＢＫ１-/-ＥＦのＩＦＮ−βプロモーターを活性化能を付与した。したがって、これらの結果は、ＴＬＲ４仲介ＩＦＮ−βの発現にＴＢＫ１が必須であることを示唆している。
【００３４】
（ＴＢＫ１は、ウイルス感染におけるＩＦＮ−β遺伝子の誘導に必須の分子）
ウイルス感染は、ＩＲＦ−３のリン酸化及び二量体化を誘導し、ＩＦＮ−β及びその他の抗ウイルス性分子の誘導を引き起こす（Lin, R, C. Heylbroeck, P. Genin, P. M. Pitha, J. Hiscott. 1999. Essential role of interferon regulatory factor 3 in direct activation of RANTES chemokine transcription. Mol. Cell Biol. 19:959-966.、Genin, P., M. Algarte, P. Roof, R. Lin, and J. Hiscott. 2000. Regulation of RANTES chemokine gene expression requires cooperativity between NF-kB and IFN-regulatory factor transcription factors. J. Immunol. 164:5352-5361.）。そこで、ＩＫＫ−ｉ又はＴＢＫ１のどちらが、ウイルスを誘導した遺伝子の発現を仲介するのかを調べた（図４Ａ）。ＥＦを水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はセンダイウイルス（ＳｅＶ）に感染させ、ノーザンブロット分析によりｍＲＮＡの発現を調べた。ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦでは、ＶＳＶ又はＳｅＶのウイルス感染に応答して、ＩＦＮ−β、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＰ−１０に対するｍＲＮＡが、野生型細胞と同様に誘導された。一方、ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＦＮ−βのｍＲＮＡ発現は観察できず、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＰ−１０のｍＲＮＡ発現は野生型細胞と比較して著しく減少した。ＩＲＦ−３の活性化を調べるため、ＶＳＶに感染した野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦから核タンパク質を調製し、免疫ブロットを行ってＩＲＦ−３を検出した。図４Ｂに示されるように、野生型細胞では、核のＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢp65の蓄積が認められた。ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＲＦ−３の蓄積が損なわれたが、ＮＦ−κＢp65の移行には影響を与えなかった。これらの結果は、ＴＢＫ１がＩＲＦ−３の活性化に必須の分子であり、それがウイルス感染においてＩＦＮ−β及びその他の抗ウイルス性分子のｍＲＮＡ誘導を引き起こすことを示唆する。ウイルス感染したＴＢＫ１-/-ＥＦにおいて、ＲＡＮＴＥＳ転写物の誘導は損なわれたが、これに対して、ＬＰＳで刺激した場合は、ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡは明らかに誘導されたことに注目すべきである。
【００３５】
［まとめ］
上記実施例２により、ＩＦＮ−βを含むＩＦＮ誘導遺伝子セットの誘導にＴＢＫ１が必須であることが証明された。これらの遺伝子は、ＭｙＤ８８非依存的に、しかしＴＲＩＦ依存的に制御されており、転写因子ＩＲＦ−３により活性化される（前記非特許文献３、８、９参照）。さらに、ＴＢＫ１はＴＲＩＦと相互作用し、ＩＲＦ−３をリン酸化すると報告されており（前記非特許文献１７、１８参照）、ＴＢＫ１がＴＬＲ４−ＴＲＩＦ−ＩＲＦ３シグナル伝達経路に必須の分子であることを示唆している。これらのデータと一致して、ＴＢＫ１-/-細胞では、ＩＳＲＥ結合活性の誘導が消滅した。また、ウイルス感染における、ＩＦＮ−β、ＲＡＮＴＥＳ及びＩＰ−１０のｍＲＮＡ誘導は、ＴＢＫ１-/-細胞では消滅した。これに対して、ＩＫＫ−ｉ-/-細胞は、ＬＰＳ及びウイルス感染の両方に応答して、正常なレベルの遺伝子誘導を示した。したがって、インビトロ研究においてＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は同様の機能を示したが（前記非特許文献１７〜２０、２２参照）、上記実施例２におけるデータは、これら２つのキナーゼが、ＬＰＳ刺激及びウイルス感染においては異なる機能を有することを示している。
【００３６】
ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βに関連する分子として最初に同定された。ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、ＩＫＫ−ｉ又はＴＢＫ１の過剰発現は、ＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。しかしながら、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は、そのＮＦ−κＢを活性化させる方法において、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βとは異なる。ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βは、セリン３２及びセリン３６の両方をリン酸化するが、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は、セリン３６のみをリン酸化する（前記非特許文献１９〜２２参照）。さらに、近年の報告により、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１が、ＴＡＮＫ／Ｉ−ＴＲＡＦと相互作用し、リン酸化することや（前記非特許文献２１、２４参照）、ＩＫＫ−ｉ又はＴＢＫ１の存在下では、ＴＡＮＫとＮＥＭＯ／ＩＫＫ−γ及びＩＫＫ−α／β複合体との会合が著しく増加することが分かっており、これらは、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１が、ＩＫＫ−α／βの上流でＮＦ−κＢの活性化に関与することを示唆している（Chariot A, Leonardi A, Muller J, Bonif M, Brown K, Siebenlist U. 2002. Association of the adaptor TANK with the IkB kinase (IKK) regulator NEMO connects IKK complexes with IKKe and TBK1 kinases. J. Biol. Chem. 277:37029-37036. First published on July 19, 2002; 10.1074/jbc.M205069200）。しかしながら、遺伝子ノックアウト研究により、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性が、ＴＢＫ１-/-細胞におけるＴＮＦ−α又はＩＬ−１刺激のいずれかによりアップレギュレートすることが明らかになった（前記非特許文献２２参照）。また、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性のアップレギュレーションは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βと同様にＬＰＳに応答して、野生型細胞において認められるアップレギュレーションに匹敵することを確認した（図３Ａ）。また、ＮＦ−κＢの活性化に依存するＩＬ−６の産生は、ＴＢＫ１-/-細胞では正常であった。ＩＫＫ−ｉ-/-細胞はＬＰＳに応答してＩＬ−６の産生の減少を示すことが以前に報告（Kravchenko, V. V., J. C. Mathison, K. Schwamborn, F. Mercurio, and R. J. Ulevitch. 2003. IKKi/IKKe plays a key role in integrating signals induced by pro-inflammatory stimuli. J. Biol. Chem. 278:26612-26619. First published on May 6, 2003; 10.1074/jbc.M303001200）されているが、本発明者らの行った実験では、ＬＰＳで刺激したＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦにおいて同様のＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−６産生が認められた。したがって、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１は、炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こすＮＦ−κＢの活性化に不必要であることを示唆している。それでもなお、ＩＫＫ−ｉ及びＴＢＫ１が互いにＮＦ−κＢの活性化を補完する可能性を除外することができない。
【００３７】
マクロファージへのＴＬＲ３又はＴＬＲ４の刺激は、ＩＦＮ−β、ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ遺伝子のＩＲＦ−３依存的で急速なアップレギュレーションを引き起こすことが知られている（Doyle, S., S. Vaidya, R. O'Connell, H. Dadgostar, P. Dempsey, T. Wu, G. Rao, R. Sun, M. Haberland, R. Modlin, and G. Cheng. 2002. IRF3 mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program. Immunity. 17:251-263.）。上記実施例２に示すように、ＶＳＶ又はＳｅＶで感染したＴＢＫ１-/-ＥＦにおいて、ＩＦＮ−β、ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳ転写物の誘導が消滅することが明らかになった。しかしながら、ＬＰＳに応答して、ＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡは、ＴＢＫ１-/-ＥＦで誘導された。ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡ誘導は、野生型細胞と比較して、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおいてわずかに減少したようであったが、この減少は、ＩＦＮ−βの自己分泌産生による二次的なアップレギュレーションが欠如していることが原因かも知れない。現在、この矛盾の分子機構については分かっていないが、これらの結果は、ＲＡＮＴＥＳ ｍＲＮＡの発現が、細胞の種類又は適用した刺激によって、ＩＦＮ−β及びＩＰ−１０の発現とは異なって制御されることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＩＫＫ−ｉ-/-マウス及びＴＢＫ１-/-マウスの作製に関する図である。（Ａ）ＩＫＫ−ｉ遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。Closed boxes（■）は、コーディングエキソンを示す。Ｓは、制限酵素ＳｐｈＩを示す。（Ｂ）へテロ接合体のインタークロスで生じた子孫のサザンブロット分析の結果を示す図である。マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳｐｈＩで消化し、電気泳動にかけ、（Ａ）に記載した放射能標識プローブでハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（＋／＋）には単一の１９ｋｂｐバンドが、ホモ接合体（−／−）には４ｋｂｐバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（Ｃ）チオグリコール酸で誘発した腹膜細胞のノーザンブロット分析の結果を示す図である。野生型マウス及びＩＫＫ−ｉ-/-マウスから得た、チオグリコール酸で誘発した腹膜細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、プローブとしてＩＫＫ−ｉのＮ末端断片、ターゲティングコンストラクト（targeting construct）におけるＩＫＫ−ｉ遺伝子の除去領域、又はＴＢＫ１ ｃＤＮＡ断片を用いてハイブリダイズした。β−アクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダイズした。（Ｄ）ＩＦＮ−βプロモーターレポーターアッセイの結果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を、記載した発現ベクター及びＩＦＮ−βルシフェラーゼレポーターベクターを用いて、トランジェントにコトランスフェクション（co-transfected）した。トランスフェクションから３６時間後、全細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｅ）ＴＢＫ１遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。Closed boxes（■）は、コーディングエキソンを示す。Ｂは、制限酵素ＢａｍＨＩを示す。（Ｆ）ヘテロ接合体のインタークロスで生じた胚から得たＥＦのサザンブロット分析の結果を示す図である。ＥＦからゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、電気泳動にかけ、（Ｅ）に記載した放射能標識プローブでハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（＋／＋）には単一の３．５ｋｂｐバンドが、ホモ接合体変異体（−／−）には１．２ｋｂｐバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（Ｇ）ＥＦのノーザンブロット分析の結果を示す図である。野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦから全ＲＮＡを抽出し、１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激し、電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、プローブとしてＩＫＫ−ｉ又はＴＢＫ１ ｃＤＮＡ断片を用いてハイブリダイズした。β−アクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダイズした。
【図２】ＬＰＳで刺激したＴＢＫ１-/-ＥＦには見られるが、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦには見られない、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の障害された誘導を示す図である。（Ａ）ＥＦによるＩＬ−６の産生を示す図である。野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ（上）又はＴＢＫ１-/-ＥＦ（下）を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１００ｎｇ／ｍｌのＢＬＰ又は記載のＬＰＳ濃度で、２４時間刺激した。培養上澄清液中のＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±ＳＤとして表示した。（Ｂ）ＬＰＳで刺激したＥＦの遺伝子誘導を示す図である。野生型、ＩＫＫ−ｉ-/-（左）又はＴＢＫ１-/-（右）を、１．０μｇのＬＰＳで記載の時間刺激した。全ＲＮＡを抽出し、記載の遺伝子のノーザンブロット分析を行った。（Ｃ）ＬＰＳで刺激したＥＦのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦをＬＰＳで刺激し、記載の時点でＲＮＡを収集し、マイクロアレイ分析に使用した。Genespring softwareを用いて、絶対発現（absolute expression）を表示した。シグナル強度のカラーコードを、左に表示した。
【図３】ＬＰＳで誘導したＩＳＲＥ結合及びＩＦＮ−βプロモーター活性におけるＴＢＫ１の必要性を示す図である。（Ａ）ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＩＳＲＥ結合の障害を示す図である。野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ、又はＴＢＫ１-/-ＥＦを、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激し、ＮＦ−κＢ結合（右）及びＩＳＲＥ結合活性（左）をＥＭＳＡにより決定した。（Ｂ）ＴＢＫ１の発現により、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＩＦＮ−βプロモーターの活性が回復した結果を示す図である。ＴＢＫ１+/+（ＷＴ）又はＴＢＫ１-/-ＥＦを、ヒトＴＢＫ１（ｈＴＢＫ１）及びＩＦＮ−βプロモータールシフェラーゼプロモーターでコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定する前に、かかる細胞をさらに１２時間、ＬＰＳで刺激する（ＬＰＳ stim.）か又は刺激しなかった（unstim.）。
【図４】ウイルス感性したＥＦのＩＦＮ−誘導性遺伝子発現におけるＴＢＫ１の必要性を示す図である。（Ａ）野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦを、組換えＶＳＶ又はＳｅＶに記載の時間感染させて全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析を行った結果を示す図である。（Ｂ）ＶＳＶ感染に応答したＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢp65の核への移行を示す図である。ＥＳを組換えＶＳＶに記載の時間感染させ、核タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＩＲＦ−３抗体及びＮＦ−κＢp65抗体でブロットした。
【図１】
2005137333.tif 000002
【図２Ａ−Ｂ】
2005137333.tif 000003
【図２Ｃ】
2005137333.tif 000004
【図３】
2005137333.tif 000005
【図４】
2005137333.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月8日(2003.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【図１】ＩＫＫ−ｉ-/-マウス及びＴＢＫ１-/-マウスの作製に関する図である。（Ａ）ＩＫＫ−ｉ遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。Closed boxes（■）は、コーディングエキソンを示す。Ｓは、制限酵素ＳｐｈＩを示す。（Ｂ）へテロ接合体のインタークロスで生じた子孫のサザンブロット分析の結果を示す図である。マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、ＳｐｈＩで消化し、電気泳動にかけ、（Ａ）に記載した放射能標識プローブでハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（＋／＋）には単一の１９ｋｂｐバンドが、ホモ接合体（−／−）には４ｋｂｐバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（Ｃ）チオグリコール酸で誘発した腹膜細胞のノーザンブロット分析の結果を示す図である。野生型マウス及びＩＫＫ−ｉ-/-マウスから得た、チオグリコール酸で誘発した腹膜細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、プローブとしてＩＫＫ−ｉのＮ末端断片、ターゲティングコンストラクト（targeting construct）におけるＩＫＫ−ｉ遺伝子の除去領域、又はＴＢＫ１ ｃＤＮＡ断片を用いてハイブリダイズした。β−アクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダイズした。（Ｄ）ＩＦＮ−βプロモーターレポーターアッセイの結果を示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を、記載した発現ベクター及びＩＦＮ−βルシフェラーゼレポーターベクターを用いて、トランジェントにコトランスフェクション（co-transfected）した。トランスフェクションから３６時間後、全細胞溶解液におけるルシフェラーゼ活性を測定した。（Ｅ）ＴＢＫ１遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された変異アレルの構造を示す図である。Closed boxes（■）は、コーディングエキソンを示す。Ｂは、制限酵素ＢａｍＨＩを示す。（Ｆ）ヘテロ接合体のインタークロスで生じた胚から得たＥＦのサザンブロット分析の結果を示す図である。ＥＦからゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、電気泳動にかけ、（Ｅ）に記載した放射能標識プローブでハイブリダイズした。サザンブロットにより、野生型（＋／＋）には単一の３．５ｋｂｐバンドが、ホモ接合体変異体（−／−）には１．２ｋｂｐバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（Ｇ）ＥＦのノーザンブロット分析の結果を示す図である。野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦから全ＲＮＡを抽出し、１．０μｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激し、電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、プローブとしてＩＫＫ−ｉ又はＴＢＫ１ ｃＤＮＡ断片を用いてハイブリダイズした。β−アクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダイズした。
【図２Ａ−Ｂ】ＬＰＳで刺激したＴＢＫ１-/-ＥＦには見られるが、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦには見られない、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ誘導性遺伝子の障害された誘導を示す図である。（Ａ）ＥＦによるＩＬ−６の産生を示す図である。野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ（上）又はＴＢＫ１-/-ＥＦ（下）を、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、１００ｎｇ／ｍｌのＢＬＰ又は記載のＬＰＳ濃度で、２４時間刺激した。培養上澄清液中のＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±ＳＤとして表示した。（Ｂ）ＬＰＳで刺激したＥＦの遺伝子誘導を示す図である。野生型、ＩＫＫ−ｉ-/-（左）又はＴＢＫ１-/-（右）を、１．０μｇのＬＰＳで記載の時間刺激した。全ＲＮＡを抽出し、記載の遺伝子のノーザンブロット分析を行なった。
【図２Ｃ】ＬＰＳで刺激したＥＦのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。野生型ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦをＬＰＳで刺激し、記載の時点でＲＮＡを収集し、マイクロアレイ分析に使用した。Genespring softwareを用いて、絶対発現（absolute expression）を表示した。シグナル強度のカラーコードを、左に表示した。
【図３】ＬＰＳで誘導したＩＳＲＥ結合及びＩＦＮ−βプロモーター活性におけるＴＢＫ１の必要性を示す図である。（Ａ）ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＩＳＲＥ結合の障害を示す図である。野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ、又はＴＢＫ１-/-ＥＦを、０．１μｇ／ｍｌのＬＰＳで記載の時間刺激し、ＮＦ−κＢ結合（右）及びＩＳＲＥ結合活性（左）をＥＭＳＡにより決定した。（Ｂ）ＴＢＫ１の発現により、ＴＢＫ１-/-ＥＦにおけるＩＦＮ−βプロモーターの活性が回復した結果を示す図である。ＴＢＫ１+/+（ＷＴ）又はＴＢＫ１-/-ＥＦを、ヒトＴＢＫ１（ｈＴＢＫ１）及びＩＦＮ−βプロモータールシフェラーゼプロモーターでコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定する前に、かかる細胞をさらに１２時間、ＬＰＳで刺激する（ＬＰＳ stim.）か又は刺激しなかった（unstim.）。
【図４】ウイルス感性したＥＦのＩＦＮ−誘導性遺伝子発現におけるＴＢＫ１の必要性を示す図である。（Ａ）野生型ＥＦ、ＩＫＫ−ｉ-/-ＥＦ及びＴＢＫ１-/-ＥＦを、組換えＶＳＶ又はＳｅＶに記載の時間感染させて全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析を行なった結果を示す図である。（Ｂ）ＶＳＶ感染に応答したＩＲＦ−３及びＮＦ−κＢp65の核への移行を示す図である。ＥＳを組換えＶＳＶに記載の時間感染させ、核タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＩＲＦ−３抗体及びＮＦ−κＢp65抗体でブロットした。