(57)【要約】【課題】  プロモーター部位を有するプライマーの精製における有意義な目標純度の設定の提供。【解決手段】  本発明は、ＲＮＡを転写させる鋳型である２本鎖ＤＮＡを合成するために用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む試薬であって、当該プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である、試薬を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡを転写させる鋳型である２本鎖ＤＮＡを合成するために用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む試薬であって、当該プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である、試薬。
【請求項２】
標的ＲＮＡに対する第一のＤＮＡプライマーの付着と伸長、
該伸長によって生じるＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、
該分解後に残るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの付着と伸長、ここで前記第一又は第二のＤＮＡプライマーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモーター部位を有する、
該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づく標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、
の各反応からなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの増幅反応に用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む核酸増幅試薬であって、
当該核酸増幅試薬は前記プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である、核酸増幅試薬。
【請求項３】
前記所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの長さが４０〜６０塩基長である、請求項１又は２記載の試薬。
【請求項４】
前記不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡが前記所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの５’側の１１個以上の連続塩基が欠失している配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを高純度で含む試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロモーター部位を有するプライマーは、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などにおいてＲＮＡを転写させるための鋳型である２本鎖ＤＮＡを合成するためによく用いられる。プロモーター部位を有する２本鎖ＤＮＡから、プロモーター蛋白質および基質であるヌクレオチド燐酸存在下でＲＮＡを転写することができる。
【０００３】
プライマーは一般に塩基長が１０〜３０塩基程度の１本鎖ＤＮＡである。ここで、プロモーター部位を有するプライマーでは、プロモーター部位だけで一般に２０〜３０塩基長程度であるため、これに標的との相補配列を加えると、塩基長は４０〜６０程度に達する。
【０００４】
１００塩基長以下のＤＮＡは、通常、ＤＮＡ自動合成機上で、付加反応、脱保護反応、保護反応を繰り返しながら、固相上で３’末端から順に１塩基ずつ合成していく。合成が終了すると固相からＤＮＡを切り出し、精製する。精製されたＤＮＡの純度は、電気泳動、またはＨＰＬＣにより調べることができる。
【０００５】
固相から切り出された段階のＤＮＡは多くの不純物を含む。この不純物を除去するために、通常、ＨＰＬＣや電気泳動による精製を行う。ＤＮＡが長くなるほど、合成段階での収率が低くなるとともに、不純物が増加し、精製が困難になる。精製において、純度を上げようと、クロマトグラフィーの回数を増やしたり、活性画分を限定すると、往々にして目的物の収率は低くなる。これらは、通常、４０塩基長以上といった比較的長い配列を有するプロモーター部位含有プライマーにおいて特に問題となる。
【０００６】
ところが従来技術において、プロモーター部位を有するプライマーの純度と転写活性の関係については特に重要視されておらず、着目も検討もされていなかった。例えば、純度が１００％のときの活性を１とすると、純度がそれより低い場合、例えば８０％程度の場合における活性がどの程度であるかを示す報告はなく、検討もされていなかった。その結果、プロモーター部位を有するプライマーの精製において有意義な目標純度の設定もされていなかったのが現状である。
【０００７】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【０００８】
【特許文献２】特表平４−５００７５９号公報
【０００９】
【特許文献３】特開２０００−１４４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、プロモーター部位を有するプライマーの精製における有意義な目標純度の設定の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる状況に鑑みて本願発明者らは、十分な転写活性を示すためには、プロモーター部位を有するプライマーの純度と活性について鋭意検討を行ったところ、設計どおりの配列を有するプロモーター部位含有プライマーの純度が８０モル％以上であり、かつこの設計されたプロモーター部位含有プライマーの不完全版であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下であればよいことを明らかにした。
【００１２】
そこで本願発明の第１の目的は、ＲＮＡを転写させる鋳型である２本鎖ＤＮＡを合成するために用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む試薬であって、当該プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である試薬を提供することにある。また本願発明の第２の目的は、標的ＲＮＡに対する第一のＤＮＡプライマーの付着と伸長、該伸長によって生じるＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖核酸中の標的ＲＮＡの分解、該分解後に残るＤＮＡに対する第二のＤＮＡプライマーの付着と伸長、該伸長によって生じる二重鎖ＤＮＡに基づく標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの転写、の各反応からなる、前記標的ＲＮＡ又は標的ＲＮＡと相補的ＲＮＡの増幅反応（ここで前記第一又は第二のＤＮＡプライマーのいずれかは、ＲＮＡ転写のためのプロモーター部位を有する）に用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む核酸増幅試薬であって、当該プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である、核酸増幅試薬を提供することにある。
【００１３】
好適な態様において、前記所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの長さは４０〜６０塩基長である。更に好適な態様において、前記不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡは前記所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの５’側の１１個以上の連続塩基が欠失している配列を有する。
【発明の効果】
【００１４】
本願で提供される、ＲＮＡを転写させる鋳型である２本鎖ＤＮＡを合成するために用いるための所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーを含む試薬であって、当該プロモーター部位含有プライマーを８０モル％以上含んで成り、かつ当該プロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって当該プロモーター部位含有プライマーの配列に比べ塩基配列が１１塩基以上短い不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡの存在率が１モル％以下である試薬を用いることにより、完全なプロモーター部位を有する２本鎖ＤＮＡが高純度に得られ、その結果として、転写反応や転写反応を含む核酸増幅を効率よく行うことができる。さらに、配列が異なるプロモーター含有プライマーの核酸増幅効果の相互比較を行う上で、プロモーター含有プライマーの純度を把握することで、性能差が配列の差によるものか、純度の差によるものかを決定することができる。一方で、プロモーター含有プライマーの製造において、その純度が８０モル％以上であり、かつそのプロモーター含有プライマーに対し１１塩基以上短いＤＮＡの存在率が１モル％以下であるという仕様を設定することにより、過剰の精製のための工程を省くことができる。このことは、収率を上げることができ、コスト低下につながることが容易に予想される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本願発明を詳細に説明する。
プロモーター部位を有するプライマー（以下、「プロモーター含有プライマー」と略す場合がある）の純度はＨＰＬＣや電気泳動で求めることができるが、１塩基単位で不純ＤＮＡの存在比がわかるキャピラリー電気泳動が望ましい。キャピラリー電気泳動によるＤＮＡの純度の測定は、好ましくはキャピラリー電気泳動装置、例えばＰ／ＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ  ＭＤＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）及びキャピラリーとしてＤＮＡ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を使用し、適温、例えば温度３０℃にて、適当な泳動電圧、例えば９ｋＶで泳動し、溶出するＤＮＡの紫外光、例えば２５４ｎｍの波長の紫外光吸収の追跡により実施することができる。
【００１６】
プロモーター含有プライマーの精製は一般的な核酸の精製手順、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、スラブ又はキャピラリーゲル電気泳動などにより行われる。
【００１７】
本願に係るプロモーター含有プライマーに使用するプロモーターは、RNAポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列領域を意味し、バクテリオファージRNAポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のプロモーターが挙げられ、特に転写活性が強いＳＰ６およびＴ７由来のプロモーターが好ましい。
【００１８】
本願に係るプロモーター含有プライマー全体の長さは特に限定されるものではないが、好ましくは２０〜１００塩基長、より好ましくは３０〜８０塩基長、最も好ましくは４０〜６０塩基長である。
【００１９】
本願でいう不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡとは、設計どおりの所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの不完全形態であって、当該プロモーター部位含有プライマーに比べ塩基配列が１１塩基以上短いものをいう。従って、不完全プロモーター部位含有プライマーＤＮＡは、所定の配列を有するプロモーター部位含有プライマーの少なくとも部分連続塩基配列を有する又はそれと実質的に同一の配列（即ち、１又は数個の塩基が置換、付加又は欠失した配列）を有するが、その末端側、即ち５’及び／又は３’末端側、好ましくは５’末端側の塩基が全部で少なくとも１１個欠失した配列を有する。
【００２０】
本願に係るプロモーター含有プライマーで合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型とする核酸転写法は、それ自体だけの反応でも、他の反応と組み合わせた核酸増幅法のどちらでもよい。後者の例として、例えば、特許第２６５０１５９号公報に記載されたいわゆるＮＡＳＢＡ法や特表平４−５００７５９号公報に記載されたいわゆるＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、更には特開２０００−１４４００号公報記載のＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。
【００２１】
以下本願発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
プロモーター含有プライマーの純度と核酸増幅試薬の性能（１）
以下の方法により、結核菌１６ＳリボソームＲＮＡ（以下「ｒＲＮＡ」と略す）の増幅反応を行った。ここで用いた試薬に含まれるプロモーター含有プライマーは、配列番号１で示す完全長なプロモーターを有する５１塩基のプロモーター含有プライマー（純度９９％以上）と、配列番号２で示す５’側が不完全な４０塩基のプロモーター含有プライマー（純度９９％以上）を各種の比率で混合したものを用いた。 
【００２３】
（１）以下の組成の反応液２０μｌを０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チューブ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００２４】
反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後の反応系の最終濃度）
６０．０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH８．６）
１３．０ｍＭ  塩化マグネシウム
９０．０ｍＭ  塩化カリウム
１．０ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
２．２５ｍＭ  ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各１．０μＭの第一のプライマー（配列番号１と配列番号２の混合物）と第二のプライマー（配列番号３）
０．１６μＭの切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４、標的ＲＮＡを第一のプライマーが結合し得る位置で切断するためのオリゴヌクレオチド、３’末端はアミノ化してある）
２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素オキサゾールイエローで標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号５、なおインターカレーター性蛍光色素は、配列番号５のオリゴヌクレオチドにおける５’端１３番目の「Ｃ」と１４番目の「Ａ」の間に標識されており、またその３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている。特許第３１８９０００号公報参照。）
各１．０μＭの第三のプライマー（配列番号６）と第四のプライマー（配列番号７）
４００ｎＭのインターカレーター性蛍光色素エチジウムブロマイドで標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号８、なおインターカレーター性蛍光色素は、配列番号８のオリゴヌクレオチドにおける５’端６番目の「Ｇ」と７番目の「Ａ」の間に標識されており、またその３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されている）
１０００００コピーの配列番号９のＤＮＡ
６Ｕ  リボヌクレエース  インヒビター（タカラバイオ製）
１５．０％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
【００２５】
第一のプライマー（配列番号１と配列番号２の混合物）、第二のプライマー（配列番号３）、および切断用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４）により増幅されたＲＮＡは、インターカレーター性蛍光色素オキサゾールイエローで標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号５）で検出される。また、第三のプライマー（配列番号６）、第四プライマー（配列番号７）により増幅されたＲＮＡは、インターカレーター性蛍光色素エチジウムブロミドで標識されたオリゴヌクレオチド（配列番号８）で検出される。
【００２６】
（２）上記の反応液を４３℃で５分間保温後、以下の組成の予め４３℃で２分間保温した酵素液５μｌを添加した。
酵素液の組成（反応時の再終濃度）
１．７％  ソルビトール
８ユニット  ＡＭＶ逆転写酵素（タカラバイオ製）
１４２ユニット  Ｔ７  ＲＮＡポリメレース  （ＧＩＢＣＯ社製）
３μｇ  牛血清アルブミン
容量調整用蒸留水
【００２７】
ＰＣＲチューブを、温調を行いつつチューブ内の反応液について蛍光強度を測定可能に構成した装置（特開２０００−２１４０９０号公報参照）を用いて、反応液を４３℃で保温しつつ、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍでの蛍光測定を酵素液添加時の時刻を０分として、反応液からのオキサゾールイエロー由来の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の経時変化を測定した。蛍光強度比が１．２に達した時間を検出時間とした。また、反応開始３０分後に蛍光強度比が１．２に達しなかった場合は未検出とした。 
【００２８】
図１より、配列番号２で示す５’側が不完全な４０塩基のプロモーター含有プライマーの混合比率が高くなるに伴い、検出時間が遅くなるとともに、ばらつきが大きくなることが明らかになった。
【００２９】
以上から、プロモーター含有プライマーの純度が核酸増幅試薬の性能に大きく関与することが示された。
【実施例２】
【００３０】
プロモーター含有プライマーの純度と核酸増幅試薬の性能（２）
実施例１において、図２および図３に示される純度の異なるプロモーター含有プライマー（ロットＡおよびロットＢ）を第一のプライマーとして、実施例１に示す方法で初期コピー数０、１０００、１００００コピー／試験の結核菌標準ｒＲＮＡを測定した。結果を図４に示す。このように、ロットＢでは検出に要する時間が有意に長くなり、性能の著しい低下が見られた。
【００３１】
以上から、 プロモーター含有プライマーの純度は８０モル％以上で、目的のプロモーター含有プライマーより１１塩基以上短い不完全なプロモーター含有プライマーは存在しないか、存在したとしても１モル％以下が好ましいことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、実施例１に示す方法で、完全なプロモーター部位を有するプロモーター含有プライマー（配列番号１）と不完全なプロモーター部位を有するプロモーター含有プライマー（配列番号２）を各種比率で混合したプロモーター含有プライマーを有する試薬で、初期コピー数１０００コピー／試験の結核菌標準ｒＲＮＡを測定したときの検出時間である。
【図２】図２は、配列番号１で示されるプロモーター含有プライマー（ロットＡおよびロットＢ）をキャピラリー電気泳動にかけたときの溶出パターンを示す。キャピラリー電気泳動装置はＰ／ＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ ＭＤＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を、キャピラリーはＤＮＡ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）をそれぞれ使用し、温度３０℃、泳動電圧９ｋＶで泳動し、２５４ｎｍで検出した。
【図３】図３は、配列番号１で示されるプロモーター含有プライマー（ロットＡおよびロットＢ）について、図２で示される画分ａ，ｂ，ｃの存在比（モル比）を示す。キャピラリー電気泳動装置はＰ／ＡＣＥ  ＳＹＳＴＥＭ ＭＤＱ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を、キャピラリーはＤＮＡ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）をそれぞれ使用し、温度３０℃、泳動電圧９ｋＶで泳動し、２５４ｎｍで検出した。
【図４】図４は、実施例１に示す方法で、配列番号１で示されるプロモーター含有プライマー（ロットＡおよびロットＢ）について各種比率で混合したプロモーター含有プライマーを有する試薬で、初期コピー数０コピー、１０００コピー、１００００コピー／試験の結核菌標準ｒＲＮＡを測定したときの検出時間である。
【図１】
2005151841.tif 000002
【図２】
2005151841.tif 000003
【図３】
2005151841.tif 000004
【図４】
2005151841.tif 000005
【配列表】
2005151841000001.app