(57)【要約】【課題】 ＰＣＲ増幅が困難となり増幅の際のエラー率が高くなるサイズの大きな遺伝子のＧａｔｅｗａｙクローニングと遺伝子内に高精度高効率で点変異、欠失、挿入、置換という変異を導入しクローニングを行う技術を提供する。【解決手段】  ＰＣＲ法またはアダプターＰＣＲ法により５’末端にＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ１を付加できるプライマーＡと遺伝子内にデザインされたプライマーＤを用いてＮ末断片を増幅し、また、プライマーＤに接してデザインされたプライマーＣとＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ２を付加できるプライマーＢを用いてＣ末断片を増幅して、Ｃ末・Ｎ末両断片をａｔｔＰプラスミドベクターに組み込み、セルフライゲーションによりこれを環状化し、コンピテントセルに導入することを特徴とするＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法またはアダプターＰＣＲ法により５’末端にＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ１を付加できるプライマーＡと遺伝子内にデザインされたプライマーＤを用いてＮ末断片を増幅し、また、プライマーＤに接してデザインされたプライマーＣとＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ２を付加できるプライマーＢを用いてＣ末断片を増幅して、Ｃ末・Ｎ末両断片をａｔｔＰプラスミドベクターに組み込み、セルフライゲーションによりこれを環状化し、コンピテントセルに導入することを特徴とするＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
【請求項２】
遺伝子内プライマーＣもしくはＤまたはその両方に遺伝子配列と異なる塩基置換を持つプライマーＥおよびＦをデザインし、遺伝子内に任意の配列に変異を導入することを特徴とする請求項１に記載のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
【請求項３】
遺伝子内プライマーＣとＤとの間に距離を開けてデザインしたプライマーＦおよびＧを用いて、遺伝子内に任意の配列の欠失を導入することを特徴とする請求項１に記載のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
【請求項４】
遺伝子内プライマーＣもしくはＤまたはその両方の５’末端に任意の配列を付加したプライマーＨおよびＩをデザインし、遺伝子内に任意の配列を挿入することを特徴とする請求項１に記載のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
【請求項５】
プライマーＦおよびＧにおいて両者の距離と等しい塩基数となるよう、５’末端に任意の配列を付加したプライマーＪおよびＫをデザインし、遺伝子内に任意の配列を置換することを特徴とする請求項３に記載のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの方法により作製された野生型または変異型遺伝子を持つＧａｔｅｗａｙエントリークローン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の組換え技術に関し、詳しくはＧａｔｅｗａｙクローンの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇａｔｅｗａｙクローニングテクノロジーは、ｃＤＮＡやＰＣＲ  ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現やクローニング／サブクローニングのための迅速で高効率な汎用クローニングシステムである（ＵＳＰ５，８８８，７３２）。このＧａｔｅｗａｙシステムは、部位特異的ＤＮＡ組換え反応を利用して、異なるベクター間でのインサートＤＮＡの載せ換えを、制限酵素やリガーゼなしで、短時間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う技術であり、基本となるエントリークローンの構築においても制限酵素やリガーゼなしで、短時間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えを行う技術であり、組換え効率が非常に高いクローニング法である。該Ｇａｔｅｗａｙクローニングテクノロジーでは両端にａｔｔＢ１とａｔｔＢ２をもつＰＣＲ断片をＢＰ組換え反応を用いａｔｔＰプラスミドベクターに組み込むものである。このため、遺伝子サイズが大きい場合ＰＣＲ反応における酵素のエラーが問題となり、その対策が必要である。
【０００３】
遺伝子に任意の変異を導入する従来法としては変異を導入した断片を制限酵素とリガーゼを用い基となる遺伝子の対応する部分と置き換える方法がある。該方法には適当な制限酵素部位が必要であり、リガーゼによる導入効率が低く、十分量のＤＮＡ断片を得るためにＰＣＲのサイクル数を多くする必要があるという問題がある。
【０００４】
他の変異を導入する従来法としては、プラスミドに導入された遺伝子内にプライマーを設計し、インバースＰＣＲ法によって変異を導入する方法がある。該方法ではプラスミド全体に及ぶＰＣＲ反応が必要となり、ＰＣＲ増幅率の低下及びエラー率の上昇が問題となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＰＣＲ増幅が困難となり増幅の際のエラー率が高くなるサイズの大きな遺伝子のＧａｔｅｗａｙクローニングと遺伝子内に高精度高効率で点変異、欠失、挿入、置換という変異を導入しクローニングを行う技術を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意検討をした結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、前記課題を解決するため、以下に示す技術が提供される。
（１）ＰＣＲ法またはアダプターＰＣＲ法により５’末端にＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ１を付加できるプライマーＡと遺伝子内にデザインされたプライマーＤを用いてＮ末断片を増幅し、また、プライマーＤに接してデザインされたプライマーＣとＧａｔｅｗａｙ組換え配列ａｔｔＢ２を付加できるプライマーＢを用いてＣ末断片を増幅して、Ｃ末・Ｎ末両断片をａｔｔＰプラスミドベクターに組み込み、セルフライゲーションによりこれを環状化し、コンピテントセルに導入することを特徴とするＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
（２）遺伝子内プライマーＣもしくはＤまたはその両方に遺伝子配列と異なる塩基置換を持つプライマーＥおよびＦをデザインし、遺伝子内に任意の配列に変異を導入することを特徴とする前記（１）のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
（３）遺伝子内プライマーＣとＤとの間に距離を開けてデザインしたプライマーＦおよびＧを用いて、遺伝子内に任意の配列の欠失を導入することを特徴とする前記（１）のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
（４）遺伝子内プライマーＣもしくはＤまたはその両方の５’末端に任意の配列を付加したプライマーＨおよびＩをデザインし、遺伝子内に任意の配列を挿入することを特徴とする前記（１）のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
（５）プライマーＦおよびＧにおいて両者の距離と等しい塩基数となるよう、５’末端に任意の配列を付加したプライマーＪおよびＫをデザインし、遺伝子内に任意の配列を置換することを特徴とする前記（３）に記載のＧａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかの方法により作製された野生型または変異型遺伝子を持つＧａｔｅｗａｙエントリークローン。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるＮ末、Ｃ末断片化クローニング法は、多種類の発現クローンを迅速かつ容易に作製可能なＧａｔｅｗａｙエントリークローンの有効な作製法である。本発明による点変異、欠失、挿入、置換変異導入法は高効率、高精度で遺伝子内に変異を導入できると共に、エントリークローン化できる技術である。これにより、変異たんぱく質を発現するクローンを容易に構築でき、ｃＤＮＡやＰＣＲ  ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現、変異たんぱく質発現等が容易となり、遺伝子研究、ヒトゲノムｃＤＮＡ等による医薬品開発などの進展に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、サイズの大きい遺伝子に対しＰＣＲエラーを抑えＧａｔｅｗａｙエントリークローンを効率良く作製する方法及び遺伝子内任意の部位に点変異、欠失、挿入、置換を導入した変異遺伝子を持つＧａｔｅｗａｙエントリークローンを高精度高効率で作製する独創的な方法に係るものである。
【０００９】
好ましい態様において、本発明では、目的とする遺伝子ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片からＧａｔｅｗａｙエントリークローン作製の前駆体である５’末端に該ａｔｔＢ１の組換え配列を持つＮ末断片、３’末端に該ａｔｔＢ２の組換え配列を持つＣ末断片を持つ２断片を産生するＰＣＲを用いる。ａｔｔＢ配列の付加するためのＰＣＲ法としてはａｔｔ配列と遺伝子配列を含むプライマーと遺伝子内プライマーを用いる方法及び遺伝子のＮ末端、またはＣ末端とアダプター配列を持つプライマーとａｔｔ配列とアダプター配列を持つプライマーを用いたアダプターＰＣＲ法による。また、本発明による該遺伝子内プライマーは遺伝子内の任意の部位に設定できる。ＰＣＲにより得られた該Ｎ末、Ｃ末断片とａｔｔＰを持つＧａｔｅｗａｙベクタープラスミドを混合し、ＢＰ組換え反応によりＧａｔｅｗａｙベクタープラスミドに該Ｎ末、Ｃ末両断片を組み込む。該ＤＮＡの両末端をライゲーション反応により環状化さ、大腸菌に導入することにより、クローンを得る。その概略図を図１に示す。
【００１０】
本発明による該遺伝子内プライマー配列には任意の変異を導入できる。該変異導入遺伝子内プライマーを用いたＰＣＲによりＧａｔｅｗａｙ変異エントリークローン作製の前駆体である５’末端に該ａｔｔＢ１の組換え配列を持つ変異導入用Ｎ末断片、３’末端に該ａｔｔＢ２の組換え配列を持つ変異導入用Ｃ末断片を持つ２断片を産生し、前記の方法によりＧａｔｅｗａｙ変異エントリークローンを得る。その概略図を図２に示す。
【００１１】
欠失させる配列に隣接した部位に該遺伝子内プライマーを設計し、ＰＣＲによりＧａｔｅｗａｙ欠失エントリークローン作製の前駆体である５’末端に該ａｔｔＢ１の組換え配列を持つ欠失用Ｎ末断片、３’末端に該ａｔｔＢ２の組換え配列を持つ欠失用Ｃ末断片を持つ２断片を産生し、前記の方法によりＧａｔｅｗａｙ変異エントリークローンを得る。その概略図を図３に示す。
【００１２】
本発明による該遺伝子内プライマーの５’には任意の変異を付加し配列挿入用プライマーがデザインできる。該配列挿入用遺伝子内プライマーを用いたＰＣＲによりＧａｔｅｗａｙ挿入エントリークローン作製の前駆体である５’末端に該ａｔｔＢ１の組換え配列を持つ配列挿入用Ｎ末断片、３’末端に該ａｔｔＢ２の組換え配列を持つ配列挿入用Ｃ末断片を持つ２断片を産生し、前記の方法によりＧａｔｅｗａｙ挿入エントリークローンを得る。その概略図を図４に示す。
【００１３】
本発明によるＮ断片、Ｃ断片を産出する両配列挿入用遺伝子内プライマーの遺伝子配列を挿入配列と同配列数離れた部位にデザインし配列置換用遺伝子内プライマーを用いたＰＣＲによりＧａｔｅｗａｙ置換エントリークローン作製の前駆体である５’末端に該ａｔｔＢ１の組換え配列を持つ配列置換用Ｎ末断片、３’末端に該ａｔｔＢ２の組換え配列を持つ配列置換用Ｃ末断片を持つ２断片を産生し、前記の方法によりＧａｔｅｗａｙ置換エントリークローンを得る。その概略図を図５に示す。
【００１４】
本発明では、ＲＮＡを逆転写して得られる全長ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を用いる。該ＤＮＡ断片は、ウイルス、細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫、及びヒトを含む動物など自然の材料から由来することができる。また、あらゆるＲＮＡ材料から調製することもできる。
【００１５】
本発明によるＰＣＲ過程においては、末端にアデニンを付加する活性を持たないＤＮＡポリメラーゼであれば全て用いることができる。好ましくは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  （Ｐｆｕ）の様な細菌から得られるような熱安定的な該ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】
本発明によるＰＣＲ過程においては、エンハンサー溶液（インビトロジェン社製）を用いることにより反応効率を上げることができる。該エンハンサー溶液を加える場合には、ＰＣＲ反応溶液組成中に、５〜１５％であり、好ましくは８〜１２％である。
【００１７】
本発明による該ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は１０〜２０が好ましく、さらに好ましくは８〜１５である。
【００１８】
本発明におけるＮ末、Ｃ末断片産生ＰＣＲの反応条件の一例として、ＰＣＲ反応溶液組成を表１に、アダプターＰＣＲ反応溶液組成を表２に、反応プログラムを表３にそれぞれ示す。
【００１９】
【表１】
2005151846.tif 000002
【００２０】
【表２】
2005151846.tif 000003
【００２１】
【表３】
2005151846.tif 000004
【００２２】
表１〜表３のＰＣＲの反応条件は一例であって、エントリークローン作製のためのｃＤＮＡの長さ等に対応して、例えば鋳型ＤＮＡの量等その条件は適宜選択することができる。
【００２３】
Ｎ末、Ｃ末ＰＣＲ産物のａｔｔＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により両断片同時に容易に行うことができる。表４にＢＰ反応における、反応溶液組成の一例を示す。
【００２４】
【表４】
2005151846.tif 000005
【００２５】
該ＢＰ反応は、２５℃で１時間以上インキュベートした後、１μｌの１０ｘプロテナーゼＫ（２μｇ／μｌ）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートして反応を停止する。この反応に引き続く酵素反応のためにサンプルを７０℃で２０ｍｉｎインキュベートしてプロテナーゼＫを失活させる。
【００２６】
ｃＤＮＡ鋳型として既に作製されたＧａｔｅｗａｙエントリークローンを用いる際には、ＰＣＲ反応液を制限酵素ＤｐｎＩ処理により鋳型クローンを消化しておく。表５にＤｐｎＩ処理反応溶液組成、反応条件の一例を示す。
【００２７】
【表５】
2005151846.tif 000006
【００２８】
Ｎ末、Ｃ末断片、ｐＤＯＮＲ２０１組換えＤＮＡはライゲースにより容易に環状化できる。表６にライゲーション反応における、反応溶液組成、反応条件の一例を示す。
【００２９】
【表６】
2005151846.tif 000007
【００３０】
本発明においては、該ライゲーション反応により得られた産物を、例えば以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションすることで、Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンを作製することができる。即ち、氷上で５０μｌのコンピテントセル溶液に５μｌのライゲーション反応産物を加え、そのまま３０ｍｉｎインキュベートする。その後、４２℃でセルに３０ｓｅｃ熱ショック処理を行い、直ちに２ｍｉｎ氷上に置く。続いて、２５０μｌのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養する。選択培地プレート（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上にセル１００〜１５０μｌを蒔き、３７℃でインキュベートする。生えてきたそれぞれのクローンから４個のコロニーをとり、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む０．２ｍｌのＴＢ培地中で振とう培養する。その後、８０％グリセロール溶液に５０μｌの培養液を加えて、良く攪拌し、シールした後−８０℃で保存する。
得られたクローンについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行う。
【００３１】
本発明における、目的エントリークローンの生成の確認は、前記クローンから得られ保存したコロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うこと、また、変異部位に関してシークエンス反応による塩基配列決定により可能となる。
【実施例】
【００３２】
本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特記しない限りインビトロジェン社又は和光純薬社製の分析レベル及び生化学レベルのものを使用した。
【００３３】
実施例１
ＯＲＦ長１，６２９ｂｐのｃＤＮＡを用い、Ｎ末、Ｃ末断片化によるエントリークローン作製、および、点変異、欠失、挿入、置換エントリークローン作製の実施例。
【００３４】
ＯＲＦ  １，６２９ｂｐのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片をアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡのＮ末、Ｃ末断片増幅を行い、野生型、点変異、欠失、挿入、置換型Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製を行った。実施例に用いたプライマーの遺伝子内ポジションと配列は表７に記載した。
【００３５】
【表７】
2005151846.tif 000008
【００３６】
野生型ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１，３，５をＣ末断片産生にはプライマー２，４，６を用いた。点変異ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１，３，７をＣ末断片産生にはプライマー２、４，６を用いた。欠失ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１，３，８をＣ末断片産生にはプライマー２，４，９を用いた。挿入ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１，３，１０をＣ末断片産生にはプライマー２，４，１１を用いた。置換型ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１，３，１０をＣ末断片産生にはプライマー２，４，１２を用いた。ＰＣＲ反応は基本的には表２の反応組成溶液と表３の反応プログラムに記載されている条件に従い、２０サイクル行なった。
【００３７】
得られたＮ末、Ｃ末断片とｐＤＯＮＲ２０１のＢＰ反応は表４に記載されている反応組成に従い、２５℃で１６時間インキュベートした後、１μｌの１０ｘプロテナーゼＫ（２μｇ／μｌ）を加え、３７℃で１０ｍｉｎインキュベートして反応を停止した。その後、表６の組成に従い、１６℃で４時間反応させることにより、ＤＮＡの環状化を行なった。環状化された産物を用い、以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションし、Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンを作製した。即ち、氷上で５０μｌのコンピテントセル（ＤＨ５α）溶液に５μｌの環状ＤＮＡ標品を加え、そのまま３０ｍｉｎインキュベートした。その後、４２℃でセルを４５ｓｅｃ熱ショックし、直ちに２ｍｉｎ氷上に置いた。続いて、２５０μｌのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養した。選択培地プレート（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上に培養液全量を蒔き、３７℃でインキュベートした。
【００３８】
以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表８に示した。
【００３９】
【表８】
2005151846.tif 000009
【００４０】
表８の結果から、該方法により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。生えてきたそれぞれのクローンのコロニーから任意に８個のコロニーを選びとり、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む０．２ｍｌのＴＢ培地中で振とう培養した。その後、８０％グリセロール溶液に５０μｌの培地を加えて、良く攪拌し、−８０℃で保存した。
【００４１】
各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行った。即ち、各タイプのクローン８個よりプラスミド抽出し、塩基配列を決定することにより、正しくデザインされているクローンの割合を調べた。その結果を表９に示した。
【００４２】
【表９】
2005151846.tif 000010
【００４３】
表９の結果によれば、本発明によるＮ末、Ｃ末断片化によるエントリークローンの作製法及び変異導入エントリークローン作製法において作製されたクローンは非常にエラーが少ないことが分かる。特に、野生型、挿入型、置換型エントリークローンにおいて、エラーが全く無かったことが分かる。
【００４４】
実施例２
Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンを用い、点変異、欠失、挿入、置換を導入する実施例。
【００４５】
実施例１で作製したＧａｔｅｗａｙエントリークローンを用いた。点変異ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１と７をＣ末断片産生にはプライマー２と６を用いた。欠失ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１と８をＣ末断片産生にはプライマー２と９を用いた。挿入ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１と１０をＣ末断片産生にはプライマー２と１１を用いた。置換型ＧａｔｅｗａｙエントリークローンのＮ末断片の産生にはプライマー１と１０をＣ末断片産生にはプライマー２と１２を用いた。ＰＣＲ反応は基本的には表１の反応組成溶液と表３の反応プログラムに記載されている条件に従い、２０サイクル行なった。
【００４６】
ＰＣＲ反応後、表５の記載に従って、鋳型に使用したＧａｔｅｗａｙエントリークローンをＤｐｎＩにより消化した。
【００４７】
ＤｐｎＩでの消化を以下の操作により確認した。即ち、氷上で５０μｌのコンピテントセル（ＤＨ５α）溶液にＮ末断片ＰＣＲ反応液、Ｃ末断片ＰＣＲ反応液にＤｐｎＩを加え鋳型の消化が終了した標品を２．５μｌづつ、合計５μｌ加え、そのまま３０ｍｉｎインキュベートした。その後、４２℃でセルを４５ｓｅｃ熱ショックし、直ちに２ｍｉｎ氷上に置いた。続いて、２５０μｌのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養した。選択培地プレート（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上に培養液全量を蒔き、３７℃でインキュベートした。
【００４８】
上に記載された実験結果を表１０に示した。
【００４９】
【表１０】
2005151846.tif 000011
【００５０】
ＢＰ組換え反応、ライゲーション反応、形質転換は実施例１と同様に行なった。
【００５１】
以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１１に示した。
【００５２】
【表１１】
2005151846.tif 000012
【００５３】
表１１の結果から、該方法により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。生えてきたそれぞれのクローンのコロニーから実施例１同様任意に８個のコロニーを選びとり、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む０．２ｍｌのＴＢ培地中で振とう培養した。その後、８０％グリセロール溶液に５０μｌの培地を加えて、良く攪拌し、−８０℃で保存した。
【００５４】
実施例１同様、各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行った。その結果を表１２に示した。
【００５５】
【表１２】
2005151846.tif 000013
【００５６】
表１２の結果によれば、本発明による変異導入法において作製されたクローンはエラーが少なく効率良く変異が導入できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明によるＮ末、Ｃ末断片化エントリークローン作製法の概略を示した図である。
【図２】点変異エントリークローン作製法の概略を示した図である。
【図３】決失エントリークローン作製法の概略を示した図である。
【図４】挿入エントリークローン作製法の概略を示した図である。
【図５】置換変異エントリークローン作製法の概略を示した図である。
【符号の説明】
【００５８】
ｐ：リン酸
【図１】
2005151846.tif 000014
【図２】
2005151846.tif 000015
【図３】
2005151846.tif 000016
【図４】
2005151846.tif 000017
【図５】
2005151846.tif 000018
【配列表】
2005151846000001.app