(57)【要約】【課題】本発明は、新規な細胞賦活剤、育毛剤、及び発毛促進剤を提供することを目的とする。【解決手段】アミノ酸配列ＭＴＣＣＧＣＳＧＧＣを有するペプチドを有効成分として含む細胞賦活剤、育毛剤、及び発毛促進剤とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、細胞賦活活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項３】
配列番号２〜８、１０〜１２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＫＡＰ（ケラチン付随タンパク質）であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号２〜８、１０〜１２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、細胞賦活活性を有することを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドをコードする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
ストリンジェントな条件下で、請求項４に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズし、
細胞賦活活性を有するペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項７】
グリシン／システイン／セリンの含有量が８０％以上のペプチドを有効成分として含有する細胞賦活剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有する細胞賦活剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする育毛剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする発毛促進剤。
【請求項１１】
式１または式２の配列を含む塩基配列を有するＤＮＡ。
（式１）
2005151849.tif 000007
（式２）
2005151849.tif 000008
【請求項１２】
式１または式２の配列を含む塩基配列を有する発現ベクター。
（式１）
2005151849.tif 000009
（式２）
2005151849.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞賦活剤、育毛剤、及び発毛促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容上、しばしば毛髪の抜け毛・薄毛が問題になる。その原因は様々であるが、男性ホルモンの影響、ストレスや自律神経障害による場合、加齢、血行障害、栄養障害などによるとされている。
【０００３】
髪の毛は、毛根部の根本にある毛球に存在する毛母細胞がケラチンタンパク質を合成しながら、さかんに分裂増殖し、毛幹を上方に押し出していくことにより成長する。毛球の底部には、毛細血管が張り巡らされており、この血管からの酸素や栄養の補給が毛母細胞の増殖を支持している。従って、血行不良や栄養不良などにより、毛細血管によって十分な酸素や栄養が毛母細胞に供給されないと、毛髪の成長が健全でなくなり、抜け毛・薄毛に繋がる。
【０００４】
このような抜け毛・薄毛に対処する薬剤として、脱毛を防止し、毛髪を保護する養毛剤、毛髪の成長を促す育毛剤、毛髪が抜落後に新しい毛髪の発毛を促進する発毛促進剤等が開発されてきた。しかし、広くその効果が認められている薬剤は、毛母細胞を賦活化するミノキシジル（例えば、特許文献１参照）、及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を阻害するフィナステリド（例えば、特許文献２参照）等、非常に数少ない。
【特許文献１】特開２００２−３０８７４０号明細書
【特許文献２】特開平８−１５７３７０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記薬剤も、必ずしも全員に効果がある訳ではなく、かゆみ（ミノキシジル）や性的障害（フィナステリド）などの副作用も生じることがある。  
そこで、本発明は、新規な細胞賦活剤、育毛剤、及び発毛促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
申請者らは、ＫＡＰファミリーに属するKerB/KRTAP5.8をqueryにして、ヒトゲノムＤＮＡをブラスト検索し、染色体Chr11q13.5およびChr11p15.5領域上の２個のＤＮＡ配列を得た。これらＤＮＡ配列を用い、１１番染色体のＤＮＡ配列に対し、ドット・マトリックス解析することによって、最終的に11q13.5領域の約56kbに7個、11p15.5領域の約111kb中に6個のＫＡＰ遺伝子様配列を見出し、このうち11q13.5領域の2個は偽遺伝子と推定した。偽遺伝子以外の１１個の遺伝子（KRTAP5.1〜5.11遺伝子：それぞれ配列番号１３〜２３に対応）については、RT-PCRにより毛根細胞での特異的な発現を確認し（図１）、これらが新規ＫＡＰ遺伝子クラスターを構成することを確認した。これら１１個の新規ＫＡＰ遺伝子がコードするアミノ酸配列を整列させた（align）ところ、高度に保存されたドメインが明らかとなった（図２）。これら１１個のＫＡＰ（KRTAP5.1〜5.11：それぞれ配列番号２〜１２に対応）は、何れもＵＨＳ（ultra high sulfur）型に分類されるが、グリシン／セリンの含有率の高い特徴的なドメインも有していた。これらのドメインのうちＮ末端に近いドメイン中の保存配列を基に、グリシン／システイン／セリンの含有率の高い１０アミノ酸からなるペプチドをデザインし、毛母細胞に投与したところ、このペプチドに細胞の賦活化活性が観察された。この機能は、毛根細胞で観察された特異的な発現から予測される機能に適合する。
【０００７】
さらに、これら１１個の遺伝子がいずれも毛根細胞で特異的に発現するため、プロモーター領域に共通のエンハンサー配列の存在が予想された。そこで、開始コドン上流のプロモーター領域の塩基配列（KRTAP5.1〜5.11遺伝子プロモーター：それぞれ配列番号２４〜３４に対応）から、全ての遺伝子のプロモーター領域で保存されている塩基配列をGibbs sampler programを用いて検索したところ、６〜１０塩基の類似した配列（図３）から共通配列（式１または式２）が得られ、本発明が完成した。  
（式１）
2005151849.tif 000002
（式２）
2005151849.tif 000003
【０００８】
本発明にかかるペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。このペプチドは、配列番号２〜８、１０〜１２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＫＡＰ（ケラチン付随タンパク質）であってもよい。
【０００９】
また、配列番号１〜８、１０〜１２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、細胞賦活活性を有することを特徴とするペプチドであってもよい。一方、マウスＫＡＰの保存配列とヒトＫＡＰの保存配列はほぼ完全に一致するため、近縁の生物種でも保存されていることが予想される。従って、ヒトとマウスだけではなく、それらに近縁の生物種に由来するＫＡＰも細胞賦活活性を有し、このペプチドに含まれると考えられる。
【００１０】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、前記いずれかのペプチドをコードする塩基配列またはその塩基配列に相補的な塩基配列を有する。なお、ストリンジェントな条件下で、このポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とハイブリダイズし、細胞賦活活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよい。
【００１１】
本発明にかかる細胞賦活剤は、グリシン／システイン／セリンの含有量が８０％以上のペプチドまたは上記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。
【００１２】
本発明にかかる育毛剤は、上記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。また、本発明にかかる育毛剤は、上記いずれかのペプチドを有効成分として含有する。
【００１３】
本発明にかかるＤＮＡは、式１または式２の塩基配列を有する。また、本発明にかかる発現ベクターは、式１または式２の塩基配列を有する。  
（式１）
2005151849.tif 000004
（式２）
2005151849.tif 000005
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、新規な細胞賦活剤、育毛剤、及び発毛促進剤を提供することができる。また、タンパク質を毛根細胞で特異的に発現させることのできるプロモーターおよびベクターを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook & D.W.Russell (Ed.), Molecular Cloning: a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１６】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１７】
本発明にかかる育毛剤及び発毛促進剤は、グリシン／システイン／セリンの含有量が８０％以上のペプチドを有効成分として含有し、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列ＭＴＣＣＧＣＳＧＧＣを有するペプチドを有効成分として含むのが好ましい。本ペプチドの細胞賦活活性、育毛活性、及び発毛促進活性を阻害しない限り、上記ペプチドが余分なアミノ酸を有していても構わない。
【００１８】
以下、このようなペプチドの投与方法について、（１）外用（塗布）による投与（２）遺伝子導入による強制発現、の二通りの方法について詳細に述べる。
【００１９】
＝＝ペプチドの頭皮への投与＝＝
本発明にかかるペプチドは、化学合成によって合成することができる。また、常法により、このペプチドをコードする核酸（ＤＮＡでもＲＮＡでもよい）を作製し、ＤＮＡの場合は、発現ベクターに組み込み培養細胞に導入し、ＲＮＡの場合は、そのまま培養細胞に導入し、それぞれ発現したペプチドを回収してもよい。
【００２０】
これら育毛剤及び発毛促進剤を溶解するための溶媒は、水、低級アルコール、多価アルコール、エーテル類、エステル類、ケトン類、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの極性有機溶媒や、生理食塩水、リン酸緩衝液などの水溶液などを用いることができ、特に５０％プロピレングリコール−２％ＤＭＳＯ溶液を用いることが好ましいが、これらの溶媒には限定されない。この溶媒中の上記ペプチドの濃度は、０．００１〜５％（w/v）が好ましいが、特にこの濃度に限定されることはない。
【００２１】
本発明にかかる育毛剤及び発毛促進剤の形態は、ローション、エアゾール、ゲル、ゼリー、クリーム、などでよいが、特にこれらの形態に限定されることはない。その製造方法は、医薬品や化粧品の製剤化における常法に従う。
【００２２】
本発明にかかる育毛剤及び発毛促進剤には、必要に応じ、溶解補助剤、界面活性剤、乳化安定剤、吸収促進剤などを配合してもよい。
【００２３】
このようにして製造された、配列番号１に示されるアミノ酸配列ＭＴＣＣＧＣＳＧＧＣを含む配列を有するペプチドを有効成分として含む育毛剤及び発毛促進剤を、頭皮に投与する際、製剤形態によって適当に選択した、塗布、スプレーなど、適当な投与形態により投与する。
【００２４】
＝＝毛母細胞内への遺伝子導入＝＝
有効な活性を有するペプチドをコードする遺伝子を、毛母細胞内に導入し、強制発現することによって、ペプチドを投与することができる。まず、強制発現に用いるための、毛母細胞特異的に機能するプロモーター／エンハンサーを探索した。図１に示すように、新規に同定した１１個のＫＡＰ遺伝子は、すべて毛母細胞特異的に発現する。そこで、これらの遺伝子のプロモーター領域の配列（配列番号２４〜３４）を調べたところ、共通配列（consensus sequence）を見いだすことができ（図３）、これらの配列は、１１個のＫＡＰ遺伝子の毛母細胞特異的発現に関与するエンハンサーのコア配列であると考えられた。
【００２５】
これらの共通配列に属するコア配列を１コピーあるいはタンデムに繋いだ複数コピーを、SV40やtkなどの基本プロモーターの上流につなぎ、ベクターに組み込む。ベクターとしては、プラスミド由来の発現ベクターでも、ウイルス由来の発現ベクターでもよく、種類は限定されないが、特にレトロウイルス又はアデノウイルスが好ましい。
【００２６】
毛母細胞特異的に機能する組換えウイルスベクターにおいて、コア配列を有するプロモーターの下流に、本発明にかかる有効な活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを組み込む。その際、５’端にATGをつけたり３’端にストップコドンやポリアデニレーションシグナルを設けたりすることにより、そのペプチドを細胞内で発現できる形にしておく。このウイルスベクターを有するウイルスをin vitroで増殖させ、頭皮に感染させることにより、有効な活性を有するペプチドを毛母細胞で特異的に発現させることができる。また、そのペプチドのＮ端に、シグナルペプチドのついた組換えタンパク質を発現させることによって、このペプチドを細胞外に放出させることもできる。
【実施例】
【００２７】
単離したマウス毛母細胞において、細胞のミトコンドリアにおけるエネルギー代謝活性を指標として毛母細胞賦活作用を評価した。以下に、その詳細を述べる。
【００２８】
まず、ICRマウス（日本クレア）3日齢新生仔より皮膚を切除し、ディスパーゼで４℃一晩処理した。翌日、真皮側をピンセットで剥離し、０．３５％コラゲナーゼに浸漬し、３０分ごとに２度軽くピペッティングすることにより、細胞塊を得た。予め冷やしたＰＢＳ（−）で、得られた細胞塊を数回洗い、０．２５％トリプシン処理によって細胞を解離した後、メッシュロートで濾過することにより、残存する細胞塊を除いた。このようにして単離した毛母細胞を、KG2培地（クラボウ社）を用いて96穴マイクロプレートに７０％コンフルエントの条件で播種した。播種24時間後に所定の濃度の合成ペプチドを含有したKG2培地と再度交換した。さらに48時間培養したのち、0.4mg/mLのMTT （3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を含有するDMEM培地に交換し、2時間培養した。培地を除去したのち、2-プロパノールを添加して溶解した細胞溶解液の550nmでの吸光度を測定することによりMTT還元量を求めた。
【００２９】
MTT還元量は試料無添加の培養細胞（コントロール）の吸光度を100としたIndex（％）で表した。統計処理には、Student t検定をもちいた有意差検定を行った。表１に示すように、本実験では、配列１のペプチドを０．０１２５〜０．０５mg/mlの濃度で用いた時、毛母細胞の賦活化が有意差をもって認められた。
【表１】
2005151849.tif 000006
【００３０】
このように、配列番号１に示されるアミノ酸配列ＭＴＣＣＧＣＳＧＧＣを有するペプチドには、毛母細胞を賦活化する活性が認められた。毛母細胞の活性化は、そのケラチン合成や細胞分裂・増殖の促進に繋がるため、ミノキシジルのように、毛母細胞を賦活化する活性のある薬剤は、毛髪の成長を促進したり、毛髪が抜落後に新しい毛髪の発毛を促進したりすることができる。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列ＭＴＣＣＧＣＳＧＧＣを有するペプチドは、育毛剤や発毛促進剤をして有効である。
【００３１】
また、マウスＫＡＰの保存配列と本試験で用いたヒトＫＡＰの保存配列はほぼ完全に一致することから、このペプチドはヒトに対しても同様の作用を有すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】新規ＫＡＰ遺伝子KRTAP5.1〜5.11の毛根と皮膚における発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す図である。＋は逆転写酵素を添加したサンプル、−は逆転写酵素を添加していないサンプル（ゲノムＤＮＡ混入のないことを確認するためのネガティブコントロール）、ＧはゲノムＤＮＡ（ポジティブコントロール）であり、それぞれ表示した遺伝子を検出可能なプライマーを添加した。
【図２】新規ＫＡＰ遺伝子KRTAP5.1〜5.11がコードするアミノ酸配列を並べた図。高度に保存されているアミノ酸配列がボックスで囲まれている。
【図３】新規ＫＡＰ遺伝子KRTAP5.1〜5.11において、全ての遺伝子のコーディング領域の上流に見いだされた共通配列を整列させた表である。
【図１】
2005151849.tif 000011
【図２】
2005151849.tif 000012
【図３】
2005151849.tif 000013
【配列表】
2005151849000001.app