(57)【要約】【課題】  糖タンパク質の糖鎖付加機構において副産物であるヌクレオチド二リン酸を代謝する、Ynd1タンパク質の結晶の提供、および該結晶の製造方法の提供を課題とする。【解決手段】Ynd1タンパク質の生産における適切な宿主ベクター系の選択および生産されたタンパク質についての膨大な数の結晶化条件の試行錯誤により、遂に、Ynd1タンパク質の結晶化に成功した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ynd1タンパク質の結晶であって、斜方晶に属し、空間群212121である結晶。
【請求項２】
Ynd1タンパク質の結晶であって、格子定数がa=93.0,b=103.6,c=145.6(Å)である結晶。
【請求項３】
Ynd1タンパク質の結晶であって、0.1mm角以上の大きさを有する結晶。
【請求項４】
基質との複合体である、請求項１から３に記載の結晶。
【請求項５】
基質がヌクレオチド-1リン酸である、請求項４に記載の結晶。
【請求項６】
Ynd1タンパク質の結晶の製造方法であって、ハンギングドロップ法において、7-12% PEG、10-20%エチレングリコールを用いる方法。
【請求項７】
結晶がYnd1タンパク質とその基質との複合体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基質がヌクレオチド-1リン酸である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の糖鎖付加機構において副産物であるヌクレオチド二リン酸を代謝する、ヌクレオチド二リン酸フォスファターゼの結晶、および該結晶の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物由来のタンパク質では、アミノ酸のみから成る単純タンパク質ではなく、糖鎖によって修飾された糖タンパク質が頻繁に見い出される。これら糖鎖は、タンパク質の安定性や立体構造の維持に関与したり、細胞間接着などにおける分子間の認識で重要な役割を果たすことが知られている。糖タンパク質の主要な糖鎖としては、アスパラギンに結合するN-linked型とセリン（Ser）あるいはスレオニン（Thr）に結合するO-linked型が挙げられる（非特許文献１）。N-linked型では全てN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）がアスパラギンのアミド基に結合している。
【０００３】
Asn結合型糖鎖の生合成は、N-アセチルグルコサミン、マンノース、およびグルコースからなる前駆体が脂質キャリアー中間体の上に合成され、まず小胞体（ER）で糖タンパク質の特定の配列（Asn-X-SerまたはThr）に転移される。次にプロセシング（グルコース残基と特定のマンノース残基の切断）を受け、マンノース８残基とN-アセチルグルコサミン２残基からなるM8ハイマンノース型糖鎖（Man8GlcNAc2）が合成される。このハイマンノース型糖鎖を含有するタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受けるが、このゴルジ体での修飾は酵母と哺乳類で大きく異なっている（非特許文献２）。
【０００４】
哺乳類細胞では、糖鎖修飾を受ける蛋白質の種類によって異なる以下の３種の経路をたどる。1)上記のコア糖鎖が何等変化を受けない場合、2)UDP-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）のN-アセチルグルコサミン-１-リン酸部分（GlcNAc-1-P）がコア糖鎖のManの６位に付加してMan-6-P-1-GlcNAcとなったのち、このGlcNAc部分だけが除去されて、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に変換される場合、3)コア糖鎖から５分子のManが順次除去されてMan3GlcNAc2となり、これと相前後してGlcNAc、ガラクトース（Gal）、N-アセチルノイラミン酸、別名シアル酸（NeuNAc）などが順次付加して、多様な混成型および複合型糖鎖が混合物として生成する場合の３通りである（非特許文献３）。哺乳類型糖鎖と一口に言っても構造は多岐にわたりそれらの構造が糖タンパク質の機能に大きく関わっていることがわかっている。
【０００５】
一方、酵母では、上記のコア糖鎖(Man8GlcNAc2)にマンノースが数残基から100残基以上付加した、マンナン型糖鎖、いわゆる糖外鎖(outer chain)を生成する。多くの場合に、糖外鎖は不均質なタンパク質産物を生成し、タンパク質の精製を困難にしたり、比活性を低下させたりする（非特許文献４）。さらに糖鎖の構造が大きく異なるため、酵母で生産された糖タンパク質は、哺乳類由来のものと同一の生物活性が検出されなかったり、哺乳類動物などに対して強い免疫原性を有することが示されている。
【０００６】
O-linked型ではSerあるいはThrの水酸基に結合する糖が異なる数種類が存在する。その中で、マンノース（Man）が結合した一連の糖鎖はO-linked Man 型として分類される。この他、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）が結合するムチン型、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）が結合するO-linked GlcNAc 型も広く知られている。これらのO-linked型糖鎖はアミノ酸に結合している糖が異なるだけでなく、糖鎖構造全体も大きく違っている（非特許文献５）。O-linked Man 型糖鎖は酵母やカビなどの糖タンパク質でしばしば認められる。酵母の場合、構成糖のほとんどはマンノースであるが、リン酸やガラクトース（Gal）が少数結合している場合が知られている。糖鎖構造は不均一で、酵母の種類によっても異なるが、タンパク質にマンノースが直鎖状に１〜３残基結合し、さらにマンノース、ガラクトース、あるいはマンノースリン酸が転移した７糖以下の構造が知られている（非特許文献６）。
【０００７】
また近年では哺乳類の脳や神経特異的にO-linked Man 型を持つタンパク質の存在が示されており（非特許文献７、８）、O-linked Man 型糖鎖の合成に関わる糖転移酵素の変異が先天性の筋ジストロフィーに眼奇形、神経細胞移動障害を伴う常染色体劣勢遺伝病の一種であるmuscle-eye-brain病の原因であることが明らかとなった（非特許文献９）。
【０００８】
糖鎖の伸長はアクセプターとなる糖鎖の非還元末端に単糖が付加されて起こる。この時、付加反応に利用されるのは、単糖そのものではなく、ヌクレオチドの結合により活性化された糖ヌクレオチドと呼ばれるドナーである。糖の付加反応の多くは細胞内の小胞体内腔やゴルジ体で行なわれるのに対し、多くの糖ヌクレオチドは細胞質で（CMP-シアル酸のみ核で）合成される。しかし合成された糖ヌクレオチドは膜を透過できないため、この糖供与体を糖鎖合成の場である細胞内小器官の内腔に運ぶ必要がある。この輸送に関与するのが糖ヌクレオチド輸送体である。糖ヌクレオチドには種々の分子種が存在するが、それぞれの糖ヌクレオチドに対し特異的な糖ヌクレオチド輸送体が存在すると考えられている（非特許文献１０、１１）。
【０００９】
糖ヌクレオチド輸送体は、細胞質内にプールされた糖ヌクレオチドを、ヌクレオチド一リン酸（UDP糖はUMP、GDP糖はGMPなど）との対向輸送によって小胞体やゴルジ体内腔に取り入れていると考えられている（非特許文献１２）。対向輸送で細胞質側へ輸送されるモノヌクレオチドは、図1のように生成されると考えられている。まず小胞体やゴルジ体内腔に輸送された糖ヌクレオチドは糖転移反応の糖供与体基質として利用され、ヌクレオチド二リン酸が生成する。このヌクレオチド二リン酸は内腔側に存在するヌクレオチド二リン酸ホスファターゼによって脱リン酸化がおき、ヌクレオチド一リン酸が生成される。このヌクレオチド一リン酸は対向輸送により細胞質側に吐き出され、同時に新たな糖供与体が供給される。このように糖鎖の安定な合成には、糖転移酵素だけでなく、糖受容体、糖供与体となる糖ヌクレオチドの供給に関わる糖ヌクレオチド輸送体、さらに副産物のヌクレオチド二リン酸を代謝するためのヌクレオチド二リン酸ホスファターゼが不可欠であり、これらが一体となって糖鎖合成と糖ヌクレオチド代謝回路を形成している。これらのいずれかの欠損は生体内での糖鎖合成に影響を与え、さらには様々な病態を示すことが示されている。例えば、GDP-フコース輸送体をコードする遺伝子の変異によりおこる、先天性グリコシル化異常症・II型白血球接着不全症（LADII/GDCIIc）が知られており、その解析の結果GDP-フコース輸送体の細胞性免疫に対する関与が示唆されている（非特許文献１３）。
【００１０】
ヌクレオチド二リン酸ホスファターゼはゴルジ体内腔に触媒部位が配向する膜タンパク質であり、不要となったヌクレオチド二リン酸を脱リン酸化し、ヌクレオチド一リン酸に変換する酵素である。出芽酵母ではこの酵素をコードする遺伝子が２つ見つかっている。１つはGDA1であり、もう一つはYND1である。Gda1タンパク質は518アミノ酸からなり、グアノシン二リン酸（GDP）に比較的高い基質特異性を示すことが示されている（非特許文献１４）。またこの遺伝子の欠損株では、ゴルジ体内腔にGDPが蓄積し、また細胞質側からのGDP-マンノースの取り込みが下がることでマンナン合成量が下がることが分かっている（非特許文献１５）。一方Ynd1タンパク質は630アミノ酸から成るタンパク質で、アミノ末端側500アミノ酸がゴルジ体内腔側、カルボキシル末端側113アミノ酸が細胞質側に配向する膜タンパク質である。Gda1タンパク質と異なり、GDPのみならず他のヌクレオチド二リン酸も分解できる。さらにアデノシン三リン酸などのヌクレオチド三リン酸も分解することができるATPase活性を持つため、別名アピラーゼとも呼ばれる。この遺伝子の欠損株もgda1欠損株と同様、糖鎖合成に影響を与えるが、その作用は若干異なっていると考えられている。例えばポリアクリルアミノゲル電気泳動におけるキチナーゼの移動度を比較すると、ynd1破壊株のキチナーゼの移動度は野生型酵母由来キチナーゼより早く、gda1破壊株由来のキチナーゼより遅いことから、Ynd1タンパク質は糖鎖の延長に重要な機能を果たしているかもしれない。さらに、これらの遺伝子の二重破壊株は、酵母の出芽や細胞壁の強さに大きく影響することが示されている。（非特許文献１４）
【００１１】
これらの相同遺伝子は他の酵母のみならず、カビから哺乳類まで幅広く保存されている。ヒトではＣＤ39（ENTPD1）として知られるectoapyrase familyやlysosomal apyrase-like 1 (LYSAL1) familyなどが知られており、少なくとも８つの相同遺伝子が見つかっている。
【００１２】
YND1とGDA1とはアミノ酸レベルで27％の相同性があるが、その基質特異性は大きく異なっており、触媒領域の高次構造が異なっていることが予想される。また、ヌクレオチド二リン酸のみならずヌクレオチド三リン酸をも分解するメカニズムの解明には高次構造の情報が重要である。したがってYnd1タンパク質の高次構造を解明することで、これらの酵素の基質特異性を説明できるようになると考えられる。
【００１３】
X線解析によりタンパク質の高次構造を解明するためには、Ynd1タンパク質を結晶化する必要がある。しかしながら、これまでYnd1タンパク質が結晶化されたという報告例はない。
【非特許文献１】竹内誠, グリコバイオロジーシリーズ 5, グリコテクノロジー, 木幡陽・箱守仙一郎 ・永井克孝編,講談社サイエンティフィック,(1994),191-208
【非特許文献２】Kukuruzinska et al., Annu. Rev. Biochem., 56, 915-944 (1987)
【非特許文献３】R. Kornfeld and S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., Vol. 54, p.631-664(1985)
【非特許文献４】Bekkers et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089, 345-351 (1991)
【非特許文献５】Van den Steen,P., Rudd, P.M., Dwek, R.A., and Opdenakker, G., Crit.Rev. Biochem. Mol. Biol., (1998), 33, 151-208
【非特許文献６】Gemmill, T. R. and Trimble, R.B., Biochim. Biophys. Acta, (1999),1426, 227-237
【非特許文献７】Chiba, A., Matsumura, K., Yamada, H., Inazu, T., Shimizu, T.,Kusunoki, S., Kanazawa, I., Kobata, A., and Endo, T. (1997) J. Biol. Chem. 272,2156-2162
【非特許文献８】Endo, T. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473, 237-246
【非特許文献９】Yoshida, A., Kobayashi, K., Manya, H., Taniguchi, K., Kano, H.,Mizuno, M., Inazu, T., Mitsuhashi, H., Takahashi, S., Takeuchi, M., Herrmann,R., Straub, V., Talim, B., Voit, T., Topaloglu, H., Toda, T., and Endo, T.(2001) Dev. Cell 1, 717-724
【非特許文献１０】Hirschberg, C. B., Robbins, P. W. and Abeijon, C. (1998) Annu. Rev.Biochem. 67, 49-69
【非特許文献１１】Kawakita, M., Ishida, N., Miura, N., Sun-Wada, G.-H. and Yoshioka, S.(1998) J. Biochem. 123, 777-785
【非特許文献１２】石田信宏・川喜田正夫 (2003) 糖ヌクレオチド輸送体、糖鎖機能-第３の生命鎖、蛋白質核酸酵素増刊、48, 1041-1048
【非特許文献１３】Hirschberg, C. B. (2001) J. Clin. Invest. 108, 3-6
【非特許文献１４】Gao, X.-D., Kaigorodov, V. and Jigami, Y. (1999) J. Biol. Chem. 274,21450-21456
【非特許文献１５】Berninsone, P., Miret, J. J. and Hirschberg, C. B. (1994) J. Biol. Chem.269, 207-211
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は糖タンパク質の糖鎖付加機構において副産物であるヌクレオチド二リン酸を代謝する、Ynd1タンパク質の結晶の提供にある。また、本発明は、該結晶の製造方法の提供をも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記の課題を解決すべく、Ynd1タンパク質の生産および結晶化を試みた。その結果、タンパク質生産における適切な宿主ベクター系の選択および膨大な数の結晶化条件の試行錯誤により、遂に、Ynd1タンパク質の結晶化に成功するに至った。
【００１６】
即ち、本発明は、Ynd1タンパク質の結晶およびその製造方法に関し、より具体的には、
〔１〕  Ynd1タンパク質の結晶であって、斜方晶に属し、空間群212121である結晶
〔２〕  Ynd1タンパク質の結晶であって、格子定数がa=93.0,b=103.6,c=145.6(Å)である結晶
〔３〕  Ynd1タンパク質の結晶であって、0.1mm角以上の大きさを有する結晶
〔４〕  基質との複合体である、〔１〕から〔３〕に記載の結晶
〔５〕  基質がヌクレオチド-1リン酸である、〔４〕に記載の結晶
〔６〕  Ynd1タンパク質の結晶の製造方法であって、ハンギングドロップ法において、7-12% PEG、10-20 %エチレングリコールを用いる方法
〔７〕  結晶がYnd1タンパク質とその基質との複合体である、〔６〕に記載の方法
〔８〕  基質がヌクレオチド-1リン酸である、〔７〕に記載の方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のYnd1タンパク質の結晶を用い、高次構造を解明することで、該タンパク質の触媒領域の構造が明らかとなり、該タンパク質基質特異性を説明できるようになる。また、これまで哺乳類から原核生物を含めてATPaseの高次構造は解明されておらず、結晶を利用することで、ヌクレオチド二リン酸のみならずヌクレオチド三リン酸をも分解するメカニズムを明らかにすることができる。
【００１８】
また、酵素の欠損が糖鎖合成や、ひいては細胞の増殖に影響を与えるため、Ynd1タンパク質に特異的な阻害剤が見つかれば、抗真菌剤としての応用も考えられる。酵素を大量に生産し、その阻害剤をスクリーニングすることも可能であるが、高次構造の情報からバーチャルスクリーニングにより化合物を同定することも可能となる。
【００１９】
さらに、Ynd1タンパク質は、ヌクレオチド二リン酸やヌクレオチド三リン酸を分解してリン酸を生成するため、リン酸量を指標とした試料中の核酸の定量においても有用である。また、Ynd1タンパク質の結晶化は、Ynd1タンパク質の安定性や保存性を高める上でも有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、Ynd1タンパク質の結晶を提供する。本発明における「Ynd1タンパク質」は、完全なタンパク質でもよく、また、ヌクレオチド二リン酸ホスファターゼ活性（あるいはATPアーゼ活性）を有する部分ペプチドであってもよい。また、該活性を有する限り、1若しくは複数（例えば、30,20,10,5,または3アミノ酸以内）のアミノ酸が、付加、欠失、置換などされた変異体であってもよい。典型的なYnd1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、該タンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号：１に示す。
【００２１】
本発明の結晶の一つの好ましい態様は、斜方晶に属し、空間群212121の結晶である。「空間群」とは、結晶の対象要素の配置をいう。
【００２２】
他の好ましい態様は、格子定数がa=93.0,b=103.6,c=145.6(Å)の結晶である。「格子定数」とは、単位格子の形と大きさを表現している数字の組み合わせをいい、「単位格子」とは、基本的な平行六面体のブロックをいう。
【００２３】
他の好ましい態様は、0.1mm角以上（好ましくは、0.2,0.3,0.4または0.5mm角以上）の大きさを有する結晶である。結晶は、例えば、四方両錘形でありうる。
【００２４】
本発明の結晶は、基質との複合体として調製することができる。本発明において「基質」とは、タンパク質（酵素）の基質結合部位に結合しうる化合物を指し、天然由来の化合物であっても、人工的な化合物であってもよい。また、種々の薬剤候補化合物であってもよい。好ましい基質は、ヌクレオチド-1リン酸、ヌクレオチド二リン酸、あるいはヌクレオチド三リン酸である。
【００２５】
本発明の結晶を得るためには、まず、精製されたYnd1タンパク質を取得する必要がある。精製されたYnd1タンパク質は、Ynd1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入し、宿主において発現したYnd1タンパク質を回収することにより調製することができる。
【００２６】
標的遺伝子のDNA遺伝子断片の単離は、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムプロジェクトにより、その染色体上の配座が既知である（Goffeau et al., Nature, 387 (suppl.), 1-105 (1997)） ことから、米国ATCC（American Type Culture Collection）など公的な機関から標的遺伝子の近傍を含む遺伝子断片の分与を受けることが可能である（ATCC Recombinant DNA materials, 3rd edition, 1993）。また、一般的手法にしたがってS. cerevisiaeからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子を選別することにより、取得することが可能である。S.cerevisiaeからゲノムDNAの抽出は、例えば、Cryer らの方法（Methods in Cell Biology, 12, 39-44 (1975)）およびP. Philippsenらの方法（Methods Enzymol., 194, 169-182 (1991) ）に従って行なうことができる。
【００２７】
標的遺伝子は、PCR法により増幅することができる。PCR法は、インビトロ（in vitro）でDNAの特定断片をその領域の両端のセンス・アンチセンスプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、DNA増幅システム等の組み合わせを用いて約２-３時間で数十万倍以上に増幅できる技術であるが、標的遺伝子の増幅には、プライマーとして25-30merの合成1本鎖DNAを、鋳型としてゲノムDNAを用いる。
【００２８】
上記操作における、DNAの細胞への導入およびこれによる形質転換の方法としては、一般的な方法、例えば、ベクターとしてファージを用いる場合は、大腸菌宿主にこれを感染させる方法等により、効率よく宿主にDNAを取り込ませることができる。またプラスミドを用いて酵母を形質転換する方法としては、リチウム塩で処理して自然にDNAを取込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませる方法や、あるいは電気的にDNAを細胞内に導入する方法を採用できる（Becker and Guarente, Methods Enzymol., 194, 182-187 (1991)）。
【００２９】
また、上記操作における、DNAの単離・精製等は何れも常法、例えば大腸菌の場合、アルカリ/SDS法とエタノール沈殿によるDNA抽出、さらにRNase処理、PEG沈殿法などによりDNAを精製できる。また、遺伝子のDNA配列の決定等も通常の方法、例えばジデオキシ法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467 (1977)）等により行なうことができる。さらに、上記DNA塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行ない得る。
【００３０】
また、Ynd1タンパク質は本来膜貫通タンパク質であるので、C末端側の膜貫通領域を欠失させ、N末端側に分泌シグナルを付加したタンパク質を発現させることによって、細胞外に可溶化型酵素として製造させることが可能である。組換え体ポリヌクレオチドを導入する宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞（動物細胞、酵母細胞、カビ細胞、昆虫細胞など）のように、遺伝子組換え技術で用いられる細胞を用いることができる。例えば、原核細胞としては大腸菌、真核細胞のうち酵母細胞としては、出芽酵母のほか、異種タンパク質発現に適しているメタノール資化性酵母があげられる。メタノール資化性酵母はPichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolitica, Candida boidinii, Ogatae minuta等が知られており、いずれも利用可能である。Pichia pastorisについては、発現用ベクターが市販品として入手可能であり、公知の方法によって形質転換を行なうことができる。
【００３１】
発現用ベクター中、目的遺伝子の発現に利用するプロモーターとしては、恒常的に発現が誘導される解糖系の遺伝子、例えばグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターが利用できる。さらにはメタノール資化性酵母の場合、メタノールによって誘導されるメタノール代謝系遺伝子、例えばアルコールオキシダーゼ（AOX）などのプロモーターが利用可能である。
【００３２】
効率的にYnd1タンパク質を生産するためには、図２に示すようなプラスミドを構築し、適した制限酵素で直線化した後、ゲノム上に導入することでPichia pastorisを形質転換することが好ましい。
【００３３】
上記の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。例えば、宿主が大腸菌であれば、塩化カルシウム法その他の方法により作製したコンピテント細胞に組換えポリヌクレオチドを含むベクタ−を温度ショック法あるいはエレクトロポレ−ション法により導入することが可能である(Sambrook, J, Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), 1.74-1.85)。宿主が酵母細胞であれば、塩化リチウム法その他の方法により作製したコンピテント細胞に組換えポリヌクレオチドを含むベクタ−を温度ショック法あるいはエレクトロポレ−ション法により導入することが可能である(Becker, D.M. and Guarente, L., Methods Enzymol., (1991), 194, 182-187)。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組換え体ポリヌクレオチドを含むベクタ−をリン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレ−ション法により導入することが可能である(Sambrook, J, Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), 16.30-16.55)。
【００３４】
このようにして得られた形質転換体を培地に培養することにより、Ynd1p タンパク質を産生させることが可能である。形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては、それぞれの宿主が生育可能な培地ならば良い。例えば、宿主が大腸菌であればLB培地などを用い、宿主が酵母であればYPD培地などを用いる。宿主がメタノール資化性酵母であればDifco社から供給される各種の培地成分とグリセロールを炭素源とした培地で菌体を増殖した後、メタノールを培地中に添加することで目的タンパク質を生産できる。動物細胞であれば、Dulbecco's MEM に動物血清を加えたものなどを用いる。培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件で行う。例えば、宿主が大腸菌ならば約30〜37℃で、約3〜24時間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が酵母であれば約25〜37℃で、約12時間〜2週間行い、必要により通気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約32〜37℃で、5%CO2、100% 湿度の条件で約24時間〜2週間行い、必要により気相の条件を変えたり撹拌を加えることができる。
【００３５】
上記の培養物（培養液、培養菌体）から糖タンパク質を単離精製するためには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、菌体内に存在する糖タンパク質については培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得、これを遠心分離することにより上清を得る。一方培養上清に存在する糖タンパク質については培養終了後、細胞を遠心分離により分離し、限外ろ過、塩析法等により濃縮する。以降の操作は通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）セファロース等を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、スルホプロピル（SP）セファロース（ファルマシア社製）等を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、フェニルセファロース等を用いた疎水性クロマトグラフィー法、セファクリル等を用いた分子篩を用いたゲルろ過法、群特異性担体、レクチンリガンド、金属キレートなどを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００３６】
本発明の結晶の調製においては、このようにして得た精製タンパク質標品につき、結晶化条件のスクリーニングを行なう。スクリーニングには、透析法、蒸気拡散法、バッチ法、自由界面拡散法、濃縮法、温度勾配法などが利用できる。蒸気拡散法においてはハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法などが使用可能である。使われる沈殿剤は一般的な試薬を購入し、適当に濃度調節・混合して調製できる。また市販の沈殿剤のセットを購入することも可能である。しかしながら、X線回折実験に適した単結晶を調製するためには、無限に考えられる結晶化条件の中から好適な条件を選択しなければならない。ハンギングドロップ法において、タンパク質濃度7-15 mg/mlの場合には、沈殿剤として7-12% PEGを用い、エチレングリコール濃度を10-20 %とするのが好適な条件である（本発明者は、タンパク質濃度10mg/ml の場合、PEG濃度7-12 %、エチレングリコール濃度10-20 %の条件を、また、PEG 濃度8%の場合、タンパク質濃度7-15 mg/ml、エチレングリコール濃度10-20%の条件を本発明の結晶を製造するために用いることができることを確認している）。基質との共結晶を得る場合には、基質濃度としては、10mMの条件を適用することができる。本発明の結晶を製造するために最も好ましいのは、実施例に記載の条件である。本発明は、このように本発明の結晶の製造方法をも提供するものである。
【００３７】
得られた結晶の構造解析は、例えば、重原子同型置換法や多波長異常散乱（分散）法により行なうことができる。構造解析によりYnd1タンパク質の三次元構造が明らかとなれば、形状相補性や相互作用エネルギーなどの評価により、Ynd1タンパク質に結合する化合物をコンピュータ上でスクリーニングすることも可能となる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
(1) 参考例および実施例に用いた試薬類
特に指定の無い試薬類は、シグマ製、和光純薬製あるいはナカライテスク製の最高グレードのものを使用した。また、制限酵素はTAKARA製のものを用いた。結晶のスクリーニングにはハンプトン製の「クリスタルスクリーニングキット」およびJENA BIOSCIENCE 社製のJBScreenキットを用いた。
【００３９】
(2) 実施例に用いた機器類
目的のDNA断片を増幅する際には、TAKARA製Tharmal Cycler 650を、また、遺伝子配列決定には、ABI PLISM 310 DNA
Sequencer（Perkin-Elmer社製）を使用した。大量培養には、ジャーファーメンターシステム（東京理化器械社製）を用いた。
【００４０】
〔実施例１〕  可溶型Ynd1タンパク質の発現系の構築
出芽酵母YND1 遺伝子配列は、 GenBankデータベースにAF203695で登録されている（Gao, X.-D., Kaigorodov, V. and Jigami, Y. (1999) J. Biol. Chem. 274, 21450-21456）。 酵母W303-1Aより常法に従いゲノムDNAを抽出し、プライマーA(CCCTCGAGAAAAGAATGCTCATAGAAAACACTAATGATC:配列番号：３)とプライマーB（ATTTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGATGATGAGACTCCAGTAACTTGCCAGGTATG：配列番号：４）を用いてPCRで増幅を行なった。増幅した遺伝子はYnd1タンパク質の配列番号：５に示す部分アミノ酸配列（Met1-Ser487；）のC末端側にヒスチジンが6残基付加したような融合タンパク質（以下可溶型Ynd1タンパク質と略する）をコードしている。得られたPCR産物をMicrospin S-400カラム（Amersham Bioscience社製）を用いて塩とプライマーを除いた。精製したPCR産物をXhoIとNotIで切断を行ない、同様にXhoIとNotIで切断したpPIC9(Invitrogen社製)にライゲーション反応を行い、PCR産物を挿入した。PCR産物の塩基配列をシークエンサーで確認後、SalIでプラスミドの切断を行ない、直鎖状にした（図２）。これを用いて、Pichia pastoris SMD1168株（Invitrogen社製）の形質転換を行なった。コンピテントセルの調製、キュベット、電気穿孔の条件はInvitrogenのプロトコールに従った。SD-His（2％グルコース、0.67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製)、核酸塩基、およびヒスチジンを除くアミノ酸混合物（20-400 mg/L））培地のプレートにまいて、30℃で2日間培養し、形質転換体を得た。
【００４１】
形質転換体よりゲノムDNAを調製し、PCR法により、増幅した遺伝子がP. pastorisのゲノム上にインテグレーションされていることを確認した。この発現株をAWP-1株と命名した。
【００４２】
次にAWP-1株を小スケールで培養し、可溶型Ynd1タンパク質の発現を確認した。5 mlのBMGY培地（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)、1.34％ Yeast Nitrogen Base、1％グリセロール）で1日培養後、集菌し、上清を除いた。これに5 mlのBMMY培地（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、100mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)、1.34％ Yeast Nitrogen Base、0.5％メタノール）を添加・懸濁し、さらに3日培養を行なった。集菌後、上清15 μlをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供し、親株（SMD1168株）の上清との比較を行なった。その結果、AWP-1株の上清を流したレーンのみ、分子量約50 kDa付近に染色されるバンドを確認することができた。
【００４３】
〔実施例２〕可溶型Ynd1タンパク質の活性測定
可溶型Ynd1タンパク質の活性測定はGaoらの方法（Gao, X.-D., Kaigorodov, V. and Jigami, Y. (1999) J. Biol. Chem. 274, 21450-21456）を一部改変して行なった。Ynd1タンパク質精製標品を終濃度で0.2 M imidazole buffer, 10 mM MnCl2, 0.1% Triton X-100, 2 mM UDP, pH 7.6になるように調製した酵素反応液に加え、100μlになるように調製した。なお他の基質に対する活性を測定する場合は、UDPの代わりに同濃度でヌクレオチド二リン酸またはヌクレオチド三リン酸を加えて、同様の反応を行った。基質30℃、5分間反応させた後、80μlの60%(w/v)過塩素酸を加え、反応を停止した。遊離したリン酸をEnzChekTMPhosphate Assay Kit（Molecular probes社製）を用いて定量した。なお1 unitは1分間に1μmolのリン酸を遊離する酵素量として定義した。その結果、AWP-1株の培養上清中にYnd1タンパク質活性が確認された。
【００４４】
〔実施例３〕  可溶型Ynd1タンパク質の大量調製法の構築
可溶型Ynd1タンパク質を大量調製するために、培養をスケールアップして行なった。まず100 mlのBMGY培地（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、100 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)、1.34％ Yeast Nitrogen Base、1％グリセロール）で前培養を行なった後、６Ｌのrich BMGY培地（1％酵母エキス、6％ポリペプトン、100 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 6.0)、1.34％ Yeast Nitrogen Base、1％グリセロール）、30℃で培養を行なった。Glycerolの消費の終点は酸素溶存濃度（DO）値を指標とし、DO値の上昇とともにメタノールの添加を開始した。同時に酸素発生装置を用いて、酸素ガスを培地にブローし、DO値10％を維持するようにした。また温度を26℃で培養し、メタノールは連続的に添加した（約10 ml/hr）。48時間後、培養上清を回収した。
【００４５】
得られた培養上清はマイクローザUFラボモジュールACP-1010（旭化成社製）を用いて濃縮・脱塩し、NaOHでpHを7.0に調整した。次にTALON Metal Affinity Resin (Clontech社製) 25 mlを空カラムに詰めた。バッファーA（20 mM リン酸ナトリウム、0.3 M NaCl、pH 7.0）でカラムを平衡化し、濃縮した培養上清をカラムに添加した。カラムを10倍容のバッファーAで洗浄した後、バッファーB（20 mM リン酸ナトリウム、0.3 M NaCl、0.15 M イミダゾール、pH 7.0）で溶出を行なった。溶出した画分の一部をSDS-PAGEで泳動し、精製度を確認した。次いで予めバッファーC（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5）で平衡化したHiLoad16/60 Superdex 200pg（Amersham Bioscience社製）でゲル濾過を行なった。一定量ずつ分取を行ない、各画分を電気泳動し、また実施例2に従い活性を測定して、可溶型Ynd1タンパク質の画分を取得した。これらをまとめて可溶型Ynd1タンパク質標品を得た。
【００４６】
次に酵素により可溶型Ynd1タンパク質のN-結合型糖鎖を切断した。可溶型Ynd1タンパク質 1 mgに対し、Endoglycosidase H（endoH；New England Biolab社製）を 1000 unit添加し、37℃、3時間処理した。反応後、HiTrapQ HP（Amersham Bioscience社製）でendoHを除去した。HiTrapQ HPカラムをバッファーD（20 mM リン酸ナトリウム緩衝液, 15 mM NaCl, pH 7.0）で平衡化した後、酵素反応液をカラムに供した。10倍容のバッファーDで洗浄の後、NaClの濃度を500 mMまで直線的に増加させることにより、可溶型Ynd1タンパク質とendoHを分離した。可溶型Ynd1タンパク質の脱糖鎖はSDS-PAGE上での移動度の変化で確認した。
【００４７】
前述の方法で調整したタンパク質溶液(濃度20mg/mL以上)を充分量のミリQ水に対して16時間以上透析した。透析後、溶液を遠心(15krpm、10分)し、不溶性の残渣を取り除いた。
【００４８】
その後BCA法によりタンパク質濃度を決定し、結晶化時の濃度に調製した。この溶液に必要に応じて結晶化添加剤あるいは酵素基質、2価金属イオンなどを加え、結晶化用ストック溶液とした。
【００４９】
〔実施例４〕可溶型Ynd1タンパク質の結晶化条件の検討
結晶化実験は全てハンギングドロップによる蒸気拡散法で行った。タンパク質ドロップはストックのタンパク質溶液とリザーバー溶液とを1対1で混合し調製した。
【００５０】
タンパク質ドロップは表面をシリコンで撥水処理を施した丸形カバーグラス上に調製した。リザーバーの容器は24穴の細胞培養用プレートを用いた。カバーグラスでプレートの穴に蓋をする形で密閉した。機密性を高めるためカバーグラスとプレートの間には真空グリスを塗布した。
【００５１】
1〜3マイクロリットルのタンパク質ドロップを0.5mLのリザーバー溶液に対して平衡化した。このように作製したプレートを4℃あるいは20℃で1〜7日間放置した。
【００５２】
結晶の観察は随時、オリンパス社製の偏光顕微鏡あるいは双眼実体顕微鏡で行った。
【００５３】
最初の結晶化条件のスクリーニングにはJENA BIOSCIENCE 社製JBScreenキットを用いた。このキットには文献でよく報告されている240の結晶化条件で構成されている。
【００５４】
本タンパク質の1次スクリーニングはタンパク質濃度 10mg/mLで行い、キットの全ての条件に対し、基質(UDP)を加えたものと無添加のものの2種類を行った。合計480通りの条件を検討した。
【００５５】
このスクリーニングにより、いくつかの条件で微結晶が得られた。これらの条件をもとにより大きな結晶が得られるよう結晶化条件の最適化するためにタンパク質濃度 12種類と沈殿剤濃度 64種類の全ての組み合わせで結晶化実験を行い、大きな結晶(0.1mm角以上)を得たが、X線回折像から、上述の条件で得られた結晶は全て多結晶であることが判明した。
【００５６】
結晶を単結晶化するため、以下のことを行った。
(1)72の結晶化添加剤の検討
(2)精製用タグの検討
(3)別のスクリーニングキットの検討
(4)精製法の検討
【００５７】
約 35,000回にも及ぶ結晶化実験の結果、遂に高分解能の単結晶が得られる条件を見出した。その条件を表１に、得られた結晶を図３に示す。
【００５８】
【表１】
2005151909.tif 000002
【００５９】
結晶は四方両錘形で大きさは0.2-0.5mm角であった。
【００６０】
〔実施例５〕X線回折実験
X線回折実験は高エネルギー加速器研究機構の放射光施設(PFーBL6A、BL18B)あるいは(AR-NW)あるいは回転対陰極式X線発生器FRーDで行った。結晶は常法に従いクライオループにマウントし、液体窒素中で急速凍結した。測定は全てクライオ条件(100K)で行った。以下、最もよいデータセットの収集条件です。
【００６１】
X線回折データの収集にはR-AXIS III (IP 300mm×300mm)を用いた。線源はFR-D回転対陰極式X線発生器(波長Cuκα線1.5418Å、加速電圧50kV、加速電流60mA)を使用した。カメラ長は180mmで測定した。測定はデータ収集プログラムd*trek (crystal clear)で制御し、プログラムd*trekによりデータ処理を行った。表２にデータ収集の概要を示す。
【００６２】
【表２】
2005151909.tif 000003
【００６３】
結晶は斜方晶に属し、空間群P212121、格子定数はa=93.00 b=103.57 c=145.59 (Å)であった。非対称単位中に3分子のモノマーが存在すると仮定すると、Vm＝1.95 Å3/Daであった。結晶は最大で2.3Å分解能以上まで反射を示した。135枚のX線回折像をd*trekで処理した結果、2.3Å分解能までの回折強度データセットを得た。データの完全性(99.4%)と精度(Rmerge=0.057)が良好であるので、この結晶を用いて、2.3Å分解能での構造解析が可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】真核生物における糖鎖付加機構を示した図である。
【図２】Ynd1タンパク質の生産に利用したプラスミドを示した図である。
【図３】Ynd1タンパク質の結晶の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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