(57)【要約】【課題】  液相で短時間にかつその機能を温存して、効率よく目的の蛋白を人工体外循環回路等の血液接触医療用器具の表面に被覆し、生体の血管内腔に近い環境を人工心肺回路等の血液接触医療用器具の表面に形成する方法を提供すること。【解決手段】  赤血球膜蛋白溶解物を調製して、赤血球膜蛋白溶解物に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であるＤＡＦ（ＣＤ５５）やＣＤ５９が人工肺用中空糸上によく吸着し、また、組み立てた人工心肺回路を赤血球膜蛋白溶解液で被覆した。また、組換えＤＮＡ技術により作製した、ＣＲ１（１型補体受容体；ＣＤ３５）の細胞外部分やトロンボモジュリンの細胞外部分とＤＡＦ（ＣＤ５５）のＧＰＩアンカー付着領域であるＣ末端３８アミノ酸部分とのキメラＧＰＩアンカー型蛋白質を作製した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液接触医療用器具の基材表面を、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）と結合しているグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー型蛋白質（ＧＰＩアンカー型蛋白質）で被覆することを特徴とする抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項２】
血液接触医療用器具が、人工の体外循環回路であることを特徴とする請求項１記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項３】
基材が、高分子基材であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項４】
ＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項５】
ＧＰＩアンカー型蛋白質が、組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項６】
キメラＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とする請求項５記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項７】
血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項８】
凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、トロンボモジュリンであることを特徴とする請求項７記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項９】
血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項１０】
補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＤＡＦ及び／又はＣＤ５９であることを特徴とする請求項９記載の被覆方法。
【請求項１１】
補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＣＲ１であることを特徴とする請求項９記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法。
【請求項１２】
血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）と結合しているグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー型蛋白質（ＧＰＩアンカー型蛋白質）で、血液接触医療用器具の基材表面が被覆されていることを特徴とする抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１３】
血液接触医療用器具が、人工の体外循環回路であることを特徴とする請求項１２記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１４】
基材が、高分子基材であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１５】
ＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１６】
ＧＰＩアンカー型蛋白質が、組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１７】
キメラＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とする請求項１６記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１８】
血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項１９】
凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、トロンボモジュリンであることを特徴とする請求項１８記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項２０】
血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項２１】
補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＤＡＦ及び／又はＣＤ５９であることを特徴とする請求項２０記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項２２】
補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＣＲ１であることを特徴とする請求項２０記載の抗血栓性血液接触医療用器具。
【請求項２３】
組換えＤＮＡ技術により作製された、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とするキメラＧＰＩアンカー型蛋白質。
【請求項２４】
細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列が、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２３記載のキメラＧＰＩアンカー型蛋白質。
【請求項２５】
ＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列が、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２３又は２４記載のキメラＧＰＩアンカー型蛋白質。
【請求項２６】
細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターをＧＰＩアンカー発現宿主細胞で発現させることを特徴とするキメラＧＰＩアンカー型蛋白質の作製方法。
【請求項２７】
組換えＤＮＡ技術により作製された、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とが連結されていることを特徴とする血液成分活性化制御組換え蛋白質。
【請求項２８】
細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列が、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７記載の血液成分活性化制御組換え蛋白質。
【請求項２９】
ＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列が、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７又は２８記載の血液成分活性化制御組換え蛋白質。
【請求項３０】
細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを宿主細胞で発現させることを特徴とする血液成分活性化制御組換え蛋白質の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において、人工の体外循環回路等の血液接触医療用器具の基材表面に、血液成分活性化を制御する機能をもつグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー型蛋白質（Protein with ＧＰＩアンカー、以下ＧＰＩアンカー型蛋白質という。図１参照）を被覆する抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法や、この調製方法によって得られる抗血栓性血液接触医療用器具や、組換えＤＮＡ技術により作製された新規なキメラＧＰＩアンカー型蛋白質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、血液用回路チューブ、サンプリングモニター用チューブ、大動脈内バルーンポンプ、人工心臓用血液ポンプ、血管造影用カテーテル、人口肺、静脈リザーバー、人工腎臓、動脈フィルターなどの人工の体外循環回路面に血液が正常の状態で通過するように抗血栓など血液成分活性化を制御する技術が開発、実用化されてきた。その中心となって検討されてきたのが抗凝結作用を有するヘパリン又はその誘導体を血液接触医療用器具の表面上に被覆し、血液成分活性化を制御する手法である。
【０００３】
このようなヘパリンコーティング技術に関し、血液用回路の生体適合性を上げるべく種々の方法が検討され一定の成果を上げてきた（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。しかし、ヘパリンコーティングでは体外循環回路内でのトロンビンの生成は抑制できないことが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
最近のこの種の技術として、有機カチオン化合物とヘパリン若しくはヘパリン誘導体とからなるイオン性複合体を含有してなる血液適合性組成物であって、該有機カチオン化合物が４つの脂肪族アルキル基が結合したアンモニウム塩のうち、４つの脂肪族アルキル鎖の炭素原子総数が２２以上２６以下であるアンモニウム塩を全アンモニウム塩の５％以上８０％以下の範囲で含有する血液適合性組成物（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【０００５】
また、生理活性物質を利用した抗血栓材料として、トロンボモデュリン固定化材料（例えば、特許文献３参照）、カテーテルの接触部位にウロキナーゼ固定材料（例えば、非特許文献３参照）血小板付着を抑制するプロスタサイクリング固定化材料（例えば、非特許文献４参照）が知られている。しかしながら、このような生理活性物質等の利用は、ある程度は活性化を抑制できるもののやはり限定的であることが報告されている（例えば、非特許文献５参照）。
【０００６】
更に、合成したＣＲ１（１型補体受容体）を投与したり、抗補体モノクローナル抗体を投与することにより、補体活性化を抑制する報告もある（例えば、非特許文献参照６、非特許文献７参照）。
【０００７】
一方、特定のアミノ酸配列を有するペプチドを血液接触部に固定化した医療材料（例えば、特許文献４〜６参照）が知られている。また、（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−１−［Ｎ2 −（（ＲＳ）−３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−アルギニル］−２−ピペリジンカルボン酸水和物、１種又は２種以上の高分子材料、及び少なくとも２種の有機溶媒を含む均一溶液を高分子基材表面に塗布し、溶媒を除去する工程を含む、高分子基材からなる医療用具の基材表面に抗血栓性皮膜を形成する方法（例えば、特許文献７参照）や、医療用具の基体をなす高分子材料の表面に、アニオン性グラフト分子を重合し、このグラフト層上にカオチン性高分子よりなるリンカー分子を介して血液接触表面をなす坑血栓性多糖類をコーティングすることにより坑血栓被膜を形成してた医療用具（例えば、特許文献８参照）や、少なくとも１種の抗凝血性を有するムコ多糖類と第４級オニウムのイオン性複合体から成る脂溶化ムコ多糖と、有機高分子材料とから成る組成物である抗菌性抗血栓性材料を基材表面にコーティングする際に、該脂溶化ムコ多糖及び該有機高分子材料の良溶媒と、該有機高分子材料の非溶媒もしくは貧溶媒との混合溶媒をコーティング溶媒として用いる抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法（例えば、特許文献９参照）などが知られている  しかしながら、いずれも体外循環回路に利用する血液成分活性化を制御する機能を有する材料として効果的なものではなかった。
【特許文献１】特開昭４８−１３３４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２０４８０９号公報
【特許文献３】特開昭６１−８２７６０号公報
【特許文献４】特開平７−２２４０９５号公報
【特許文献５】特開平８−３１９１号公報
【特許文献６】特開平８−５９６９４号公報
【特許文献７】特開２０００−６０９６０号公報
【特許文献８】特開２０００−２７９５１１号公報
【特許文献９】特開２００１−５３５号公報
【非特許文献１】Ovrum E et al. Ann Thorac Surg;60:365-371,1995
【非特許文献２】Wager RW et al. Ann Thorac Surg;58:734-741 1994
【非特許文献３】「人工臓器」、第１０巻、ｐ９８９−９９２、１９８１
【非特許文献４】Thromb.Res.,46,p685-695,1987
【非特許文献５】Y JG et al. Ann Thorac Surg 1993;55:917-922
【非特許文献６】Gillinov AM et al. Ann Thorac Surg 1993;55:67-70
【非特許文献７】Rinder CS et al. J Thorac Cardiovasc Surg 1999;118:460-466
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
血液内皮細胞は強い抗血栓作用をもっているが、この抗血栓活性は主に４つの分子が担っている。すなわち、トロンボモデュリン、ヘパリン様糖鎖分子、ＰＧＩ2、プラスミノゲンアクチベーターである。また、血球には補体の活性化から自らを守るためにその細胞膜にＤＡＦ（Decay accelerating factor；ＣＤ５５）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＭＣＰ（Membrane cofactor protein；ＣＤ４６）などの補体制御蛋白をもっている。このように血管内には凝固系や補体系の活性化を制御し、恒常性を維持する機構が存在する。
【０００９】
一方、人工心肺回路などの血液接触医療用器具はそれ自体が凝固系、補体系を活性化するだけでなく、このような制御系を持たないため、初期のわずかな活性化が莫大な量の凝固系・補体系の活性化を引き起こしてしまう。これに続いて血小板や白血球の活性化を引き起こし、全身性炎症応答（ＳＩＲＳ）を誘発し、様々な臓器に障害を与える。そこで、従来からヘパリン等の抗血栓性を有する被覆剤を用いて血液接触医療用器具表面をコーティングする技術が提案されている。    
【００１０】
ヘパリンのような糖鎖は化学的に強固であり、コンフォメーション（分子の折り畳まれ方）がその機能に大きく影響しないため、化学的装飾が可能であり、人工物への被覆が可能であるが、体外循環回路になじみやすく、かつ生理活性物質である凝固系の制御因子や補体系の制御因子を利用しようとする場合、生理活性物質は蛋白質であり、従来の体外循環回路の被覆法ではその機能が失われてしまうという欠点があった。また、体外循環回路に制御機能を付与する方法として血管内皮細胞自体を被覆する方法も考えられるが、体外循環回路の保管の問題や内皮細胞の採取源、感染の問題などがあり、現実的な方法ではな
かった。
【００１１】
本発明の課題は、液相で短時間にかつその機能を温存して、効率よく目的の蛋白を人工物である体外循環回路等の血液接触医療用器具の表面に被覆し、生体の血管内腔に近い環境を人工心肺回路等の血液接触医療用器具の表面に形成する新しい方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、赤血球膜蛋白溶解物を調製して、赤血球膜蛋白溶解物に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であるＤＡＦ（ＣＤ５５）やＣＤ５９が人工肺用中空糸上によく吸着し、また、組み立てた人工心肺回路を赤血球膜蛋白溶解液で被覆したところ、抗血栓性にすぐれ、血小板保護作用や補体活性化抑制作用を有することを見い出した。また、組換えＤＮＡ技術により作製した、ＣＲ１（１型補体受容体；ＣＤ３５）の細胞外部分やトロンボモジュリンの細胞外部分とＤＡＦ（ＣＤ５５）のＧＰＩアンカー付着領域であるＣ末端３８アミノ酸部分とのキメラＧＰＩアンカー型蛋白質も人工肺用中空糸上によく吸着することを見い出した。本発明は、以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１３】
すなわち本発明は、血液接触医療用器具の基材表面を、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）と結合しているグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー型蛋白質（ＧＰＩアンカー型蛋白質）で被覆することを特徴とする抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項１）や、血液接触医療用器具が、人工の体外循環回路であることを特徴とする請求項１記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項２）や、基材が、高分子基材であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項３）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項４）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質が、組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項５）や、キメラＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とする請求項５記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項６）や、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項７）や、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、トロンボモジュリンであることを特徴とする請求項７記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項８）や、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項９）や、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＤＡＦ及び／又はＣＤ５９であることを特徴とする請求項９記載の被覆方法（請求項１０）や、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＣＲ１であることを特徴とする請求項９記載の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法（請求項１１）に関する。
【００１４】
また本発明は、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー（ＧＰＩアンカー）と結合しているグルコシルフォスファチディルイノシトールアンカー型蛋白質（ＧＰＩアンカー型蛋白質）で、血液接触医療用器具の基材表面が被覆されていることを特徴とする抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１２）や、血液接触医療用器具が、人工の体外循環回路であることを特徴とする請求項１２記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１３）や、基材が、高分子基材であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の抗血栓性血液接
触医療用器具（請求項１４）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１５）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質が、組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１６）や、キメラＧＰＩアンカー型蛋白質が、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とする請求項１６記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１７）や、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１８）や、凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、トロンボモジュリンであることを特徴とする請求項１８記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項１９）や、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれか記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項２０）や、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＤＡＦ及び／又はＣＤ５９であることを特徴とする請求項２０記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項２１）や、補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質が、ＣＲ１であることを特徴とする請求項２０記載の抗血栓性血液接触医療用器具（請求項２２）に関する。
【００１５】
さらに本発明は、組換えＤＮＡ技術により作製された、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたことを特徴とするキメラＧＰＩアンカー型蛋白質（請求項２３）や、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列が、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２３記載のキメラＧＰＩアンカー型蛋白質（請求項２４）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列が、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２３又は２４記載のキメラＧＰＩアンカー型蛋白質（請求項２５）や、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターをＧＰＩアンカー発現宿主細胞で発現させることを特徴とするキメラＧＰＩアンカー型蛋白質の作製方法（請求項２６）や、組換えＤＮＡ技術により作製された、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とが連結されていることを特徴とする血液成分活性化制御組換え蛋白質（請求項２７）や、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列が、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７記載の血液成分活性化制御組換え蛋白質（請求項２８）や、ＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列が、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項２７又は２８記載の血液成分活性化制御組換え蛋白質（請求項２９）や、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを宿主細胞で発現させることを特徴とする血液成分活性化制御組換え蛋白質の作製方法（請求項３０）に関する。
【発明の効果】
【００１６】
ＧＰＩアンカーを介して、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質で被覆された基材表面を有する本発明の抗血栓性血液接触医療用器具は、きわめて実際の血管内の環境に近い人工体外循環回路を形成することができ、抗血栓性を有し、補体活性化のみならず、血液凝固の活性化や血小板の活性化も抑制することができ、人工の体外循環回路等に有利に用いることができる。また、キメラＧＰＩアンカー型蛋白質として、例えば、通常はＧＰＩアンカー型蛋白として存在しないトロンボモヂュリンやＣＲ１にＧＰＩアンカーを付着させた本発明のキメラＧＰＩアンカー型蛋白質を用いると、これらトロンボモヂュリンやＣＲ１の制御蛋白での被覆が可能になるばかりでなく、患者本人に由来するＧＰＩアンカー型蛋白質を大量に合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の抗血栓性血液接触医療用器具の調製方法としては、血液接触医療用器具の基材表面を、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してＧＰＩアンカーと結合しているＧＰＩアンカー型蛋白質で被覆する方法であれば特に制限されるものではなく、また、本発明の抗血栓性血液接触医療用器具としては、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してＧＰＩアンカーと結合しているＧＰＩアンカー型蛋白質で、血液接触医療用器具の基材表面が被覆されているものであれば特に制限されるものではなく、ここで、ＧＰＩアンカー型蛋白質とは、燐脂質の一種であるホスファチジルイノシトール（ＰＩ）と共有結合することによって細胞膜に結合している蛋白質の総称である。図１には、蛋白質がそのＣ末端側でアミド結合を介してＧＰＩアンカーと結合しているＧＰＩアンカー型蛋白質が示されている。ＧＰＩアンカーは、ＰＩの疎水部をアンカーとして利用し、細胞膜に結合しており、蛋白質のＣ末端のアミノ酸残基とＰＩの間に共通のオリゴ糖のコア構造が存在し、このコア構造は、蛋白質のＣ末端カルボキシル基にエタノールアミンがアミド結合し、その水酸基が燐酸ジエステル結合によりオリゴ糖の非還元末端マンノースの６位に結合しており、以下、マンノースα１→２マンノースα１→６マンノースα１→４グルコサミンα１→６イノシトールとつながっている。
【００１８】
上記血液接触医療用器具の種類としては、血液と接触する医療用器具であれば特に制限されないが、人工心肺用、血液透析用に使用される体外循環回路、カテーテル、カニューレ、シャント、サンプリングモニター用チューブ、大動脈内バルーンポンプ、人工心臓用血液ポンプ、カテーテル、血液リザーバー若しくは血液チャンバー、動脈フィルター、ガイドワイヤー、ステントを具体的に例示することができ、中でも、人工の体外循環回路を好適に例示することができる。
【００１９】
本発明の血液接触医療用器具を構成する基材としては、血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質がＧＰＩアンカーを介して結合・吸着しうるものであれば特に制限されないが、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアセタール、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−プロピレン−ジエン共重合体等のオレフィン系エラストマー、可塑化塩化ビニル、熱可塑性ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、シリコーンゴム、熱可塑性ポリエステル、シリコーン樹脂、フッ素樹脂のほか、各種エラストマー及びポリマーアロイなどの高分子基材を挙げることができ、この場合、チタン製血液接触医療用器具の表層がテフロン（登録商標）等の高分子基材でコーティングされている基材も使用することができる。
【００２０】
また、血液接触医療用器具の基材表面にＧＰＩアンカー型蛋白質を被覆する方法としては、ＧＰＩアンカー型蛋白質を１種又は２種以上含む溶液を血液接触医療用器具の基材表面に接触させ、吸着させる方法を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、また、必要に応じて、血液接触医療用器具の基材表面の一部所定の箇所を被覆することもできる。
【００２１】
上記血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質としては、トロンボモジュリン、トロンボモジュリンの凝固制御の下流にある蛋白質ＡＰＣ（Activated  Protein Ｃ）、プロスタサイクリン（ＰＧ１２）、プラスミノーゲンアクチベーター、ヘパリン様分子、肝臓で作られる抗凝固因子ＴＦＰＩ（Tissue Factor Passway  Inhibitor）等の凝固系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質や、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＭＣＰ、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＣＤ５９、Ｃ３ｂに結合しＢｂを乖離させるＨ因子、ＭＣＰ（Menbrane Cofactor  Protein）、Ｉ因子によるＣ３ｂ、Ｃ４ｂの不活性化を促進する膜蛋白等の補体系の血液成分活性化を制御する機能をもつ蛋白質を挙げることができる。
【００２２】
本発明におけるＧＰＩアンカー型蛋白質としては、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質や、組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質を例示することができる。上記細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質としては、血球細胞、リンパ球、血管内皮細胞等の細胞膜に発現するＧＰＩアンカー型膜蛋白質を例示することができるが、中でも、赤血球細胞膜に存するＧＰＩアンカー型膜蛋白質を利用することが好ましく、この場合、ＧＰＩアンカー型膜蛋白質として、ＧＰＩアンカー型膜蛋白質ＤＡＦ及びＧＰＩアンカー型膜蛋白質ＣＤ５９が混在した赤血球膜蛋白溶解物を有利に用いることができる。しかし、このような既存のＧＰＩアンカー型膜蛋白質を大量に精製することは困難である。ヒトの細胞膜より分離する必要があり、実際の医療においては可及的に本人の細胞であることが望ましいことからして、また、緊急手術時は、精製が間に合わないため、あらかじめ蛋白質工学的に合成・保存できることが臨床応用においては不可欠である。
【００２３】
本発明の組換えＤＮＡ技術により作製されたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質としては、酵素などを用いてインビトロで由来の異なるＤＮＡを融合させてできた組換えＤＮＡ分子を宿主細胞に導入し、増殖させて、所定の物質を大量に合成するという組換えＤＮＡ技術により作られた天然に存在しないキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であれば特に制限されないが、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とを備えたキメラＧＰＩアンカー型蛋白質を好適に挙げることができ、より具体的には、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域であるＣ末端３８アミノ酸部分と、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列を備えた、キメラＧＰＩアンカー型蛋白質を例示することができる。
【００２４】
これらキメラＧＰＩアンカー型蛋白質は、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを、ウイルスベクター等の哺乳動物用発現ベクターに組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを、ＣＨＯ細胞等のＧＰＩアンカー発現宿主細胞に、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションで導入し、発現させることにより作製することができる。ＧＰＩアンカー型タンパク質は、小胞体で別々に合成されたタンパク質部分とＧＰＩアンカー部分が複合体を形成することにより構築される。
【００２５】
本発明の血液成分活性化制御組換え蛋白質としては、組換えＤＮＡ技術により作製された、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とが直接又はリンカーを介して連結されている組換え蛋白質であれば特に制限されないが、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカ−付着領域のアミノ酸配列と、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域のアミノ酸配列とが直接又はリンカーを介して連結されている組換え蛋白質を好適に挙げることができ、より具体的には、ＤＡＦのＧＰＩアンカ−付着領域であるＣ末端３８アミノ酸部分と、ＣＲ１又はトロンボモジュリンの細胞外領域のアミノ酸配列とが直接又はリンカーを介して連結されている組換え蛋白質を例示することができる。
【００２６】
これら血液成分活性化制御組換え蛋白質は、前記キメラＧＰＩアンカー型蛋白質から酵素処理によって作製することもできるが、細胞膜に存するＧＰＩアンカー型蛋白質のＧＰＩアンカー付着領域をコードするＤＮＡと、前記ＧＰＩアンカー型蛋白質以外のＧＰＩアンカー型蛋白質の細胞外領域をコードするＤＮＡとを、ウイルスベクター等の哺乳動物用発現ベクターに組み込んだキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを構築し、このキメラＧＰＩアンカー型蛋白質発現ベクターを、宿主哺乳動物細胞に、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションで導入し、発現させることにより作製することができる。血液成分活性化制御組換え蛋白質は、ＧＰＩアンカー型タンパク質の構造解析や、血液成分活性化制御を必要とする疾病の治療薬として使用することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［赤血球膜蛋白溶解物の調製（既存ＧＰＩアンカー型膜蛋白の採取）］
２０ｍｌのヒト全血を採取し、１００Ｕのへパリンを加えた。５００Ｇ，４℃で１０分間遠心し、血清部分を捨てた。３０ｍｌの蒸留水を加え、よく攪拌後、５００Ｇ，４℃で１０分間遠心した。上澄み液を除去して、再び３０ｍｌの蒸留水を加え、よく攪拌後、５００Ｇ，４℃で１０分間遠心した。沈殿物（赤血球膜）をリン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）（ｐＨ７．４）で充分洗浄した。沈殿物（赤血球膜）を１０ｍｌの１ｗ／ｖ％のオクチルグルコシドで溶解し、室温で３０分放置後、５００Ｇ，４℃で１０分間遠心し、不溶解成分を除いた。遠心後の約１０ｍｌの１ｗ／ｖ％のオクチルグルコシド溶解液を赤血球膜蛋白溶解液として用いた。
【実施例２】
【００２９】
［人工肺用中空糸の赤血球膜蛋白での被覆実験（既存ＧＰＩアンカー型膜蛋白であるＣＤ５５やＣＤ５９が人工肺用中空糸に吸着するかどうかの実験）］  ポリプロピレン製の人工肺用中空糸（泉工医科工業社製）を１０ｃｍ切り取り、９ｍｌのＰＢＳに入れた。これに実施例１で調製した赤血球膜蛋白溶解液１ｍｌを加え、３０分室温で放置した。対照には１ｗ／ｖ％のオクチルグルコシドを１ｍｌ加え、同様に３０分室温で放置した。これらをよく洗浄後、５０％ヒト血清を加えて、３０分室温で放置し、ブロッキングを行った。膜蛋白を反応させた中空糸（ＲＢＣ fiber）と対照中空糸（control）にフィコエリスロシン（phycoerythrosin）で標識した抗ＣＤ５５抗体（antiCD55-PE；Phamingen社製）又はフルオレセイン イソシアネート（fluorescein isocyanate）で標識した抗ＣＤ５９抗体（antiCD59-FITC；Phamingen社製）をそれぞれに反応させ、蛍光実体顕微鏡（ニコン社製）にて観察した。また、比較として、赤血球膜蛋白の代わりにＤＴＡＦ（Dichlorotriazinylamino Fluorescein）標識アルキルヘパリンを用いて、同様な操作をし、共焦点レーザー走査顕微鏡（Bio Rad社製）にて観察した。なお、アルキルヘパリンは本発明者らによる文献（Biomacromolecules, 2, 1169-1177）記載の方法に準じて調製した。
【００３０】
人工肺用中空糸の横断面の共焦点レーザー走査顕微鏡像（図２Ａ）は蛍光染料結合アルキルヘパリンによる明瞭な蛍光活性化層を示した。また、ＧＰＩアンカー型膜蛋白であるＤＡＦ（ＣＤ５５）やＣＤ５９もまた人工肺用中空糸上によく吸着していた（図２Ｂ，Ｃ）。ＤＡＦ（ＣＤ５５）やＣＤ５９の人工肺用中空糸上への吸着は、ＰＢＳで数回洗浄してもほとんど脱離しなかった。
【実施例３】
【００３１】
［人工心肺回路の組立て］
動物用人工肺（ＥＣ−３０Ａ，泉工医科工業社製）及び小動物用熱交換器（ＨＨＥ７２，泉工医科工業社製）を塩化ビニールチューブで結合し、ローラーポンプ（ＢＰＣ−Ｓ，トノクラ医科工業社製）に連結し、図６に示すように、ウサギ（体重３ｋｇ）に装着して、常温体外循環を実施した。体外循環回路は１００ｍｌの乳酸Ringer溶液で充填した。
【実施例４】
【００３２】
［人工心肺回路の赤血球膜蛋白溶解液での被覆］
初期充填液を１０ｍｌ取り出し、１０ｍｌの赤血球膜蛋白溶解液を加え、室温で３０分、５０ｍｌ／ｍｉｎのフロー（flow）で循環させた。その後、初期充填液をすべて取り出し、１００ｍｌの乳酸Ringer溶液をいれ、２５０ｍｌ／ｍｉｎのフローで循環し、洗浄した。この洗浄操作を計３回行った。洗浄後、再び１００ｍｌの乳酸Ringer溶液で充填し、赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）を形成した。１０ｍｌの赤血球膜蛋白溶解液を加えないものを対照回路（non-coat circuit）とし、また比較として、１０ｍｌの赤血球膜蛋白溶解液に代えて１０ｍｌの５％アルキルヘパリンの乳酸Ringer溶液を用いて、アルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）を形成した。
【実施例５】
【００３３】
［体外循環の方法と検体採取］
２００Ｕのヘパリン入りシリンジで、１００ｍｌの健常人の全血を採取し、実施例４で形成した３種類の体外循環回路（赤血球膜蛋白被覆回路，対照回路，アルキルヘパリン被覆回路）にそれぞれ入れた。約１分間、１００ｍｌ／ｍｉｎのフローで循環し、充填液とよく混合した。最終ヘマトクリット値は平均２２％であった。混合直後に検体採取（Time 0）した。熱交換器で３７℃に加温しつつ、２５０ｍｌ／ｍｉｎのフローで循環し、１０分、３０分、６０分、１２０分後に検体採取を行った（Time 10,Time 30,Time 60,Time 120）。対照回路、赤血球膜蛋白被覆回路、アルキルヘパリン被覆回路それぞれ４回づつ行った。血漿中のＴＡＴ（Thrombin-antithrombin complex）,Ｃ３ａ,Ｃ５ａ,β−トロンボグロブリン（thromboglobulin）のレベルを測定した（測定はＳＲＬ福岡に依頼した。）。血小板数を血球計算機（Sysmex K-4500）で計数した。
【実施例６】
【００３４】
［抗血栓性の評価］
抗血栓性を、トロンビン生成の指標であるＴＡＴの生成で評価した。結果を図３に示す。ＴＡＴレベルは３種の回路において時間の経過と共に上昇したが、赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）とアルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）では、対照回路（non-coat circuit）と比べて、１２０分の循環で有意に低下することがわかった。抗血栓性に関して、赤血球膜蛋白被覆回路とアルキルヘパリン被覆回路間に有意な差は見られなかったが、赤血球膜蛋白被覆回路の方が、アルキルヘパリン被覆回路よりもＴＡＴレベルが低いと思われる。
【実施例７】
【００３５】
［血小板保護作用の評価］
血小板保護作用を、血小板数及び血小板活性化の指標であるβ−トロンボグロブリン（β−ＴＧ）の生成で評価した。結果を図４に示す。対照回路（non-coat circuit）では、１回の循環後に血小板数が急激に減少し、６０分の循環で最少となり、その後徐々に回復した（図４Ａ）。アルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）では、循環時間の経過と共に血小板数は減少したが、赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）では、１２０分の循環でもほとんど減少しなかった（図４Ａ）。他方、β−ＴＧの生成は、対照回路において、循環開始から急激に上昇した（図４Ｂ）。赤血球膜蛋白被覆回路とアルキルヘパリン被覆回路では、循環時間の経過と共にβ−ＴＧは上昇したが、対照回路に比べると有意に低かった。赤血球膜蛋白被覆回路の方が、アルキルヘパリン被覆回路よりもβ−ＴＧレベルは低かったが、統計的に有意な差は認められなかった。
【実施例８】
【００３６】
［補体活性化抑制作用の評価］
補体活性化抑制作用を、補体Ｃ３ａ及びＣ５ａの生成で評価した。結果を図５に示す。Ｃ３ａの生成は、３種の回路において循環時間の経過と共に上昇したが、アルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）及び対照回路（non-coat circuit）に比べて赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）ではＣ３ａの生成量が有意に低く（図５Ａ）、循環１０分後には有意差が認められた。Ｃ５ａの生成も、アルキルヘパリン被覆回路及び対照回路に比べて赤血球膜蛋白被覆回路の方が低かったが、統計的に有意な差は認められなかった（図５Ｂ）。なお、赤血球膜蛋白被覆回路におけるＣ５ａレベルは、検出限界以下であった。
【００３７】
本発明のＧＰＩアンカー型膜蛋白であるＤＡＦ（ＣＤ５５,ＣＤ５９）が吸着された体外循環回路では、アルキルヘパリン被覆及び対照回路（non-coat circuit）の体外循環回路に比べ、Ｃ３ａの生成は抑制された（図５）。
【００３８】
以上の実施例、及びその結果より、既存のＧＰＩアンカー型膜蛋白を用いて体外循環回路の被覆を行い、ＧＰＩアンカー型膜蛋白が効率よく体外循環回路に吸着すること、及びその機能が発揮されることを確認した。
【実施例９】
【００３９】
［トロンボモジュリン、ＣＲ１のｃＤＮＡのクローニングとＧＰＩアンカー付加配列の接続］
ヒトリンパ球よりＤＡＦ（ＣＤ５５）のＧＰＩアンカー付着領域であるＣ末端３８アミノ酸部分（配列番号２）のｃＤＮＡ（配列番号１）のクローニングを行い、哺乳類細胞発現ベクターpｃＤＮＡ３（Invitrogen社製）へ組み込んだ（ＧＰＩアンカー付着ベクターＧ−１）。ヒトリンパ球よりＣＲ１（１型補体受容体；ＣＤ３５）のｃＤＮＡ、及びＨＵＢＥＣ細胞株よりトロンボモジュリンのｃＤＮＡのクローニングを行い、哺乳類細胞発現ベクターpｃＤＮＡ３（Invitrogen社製）へ組み込んだ。ＣＲ１及びトロンボモジュリンの膜貫通部分をコードする部分を除く細胞外部分のｃＤＮＡ（配列番号３及び５）を、それぞれ上記ＤＡＦのＧＰＩアンカー付着ベクターＧ−１へ組み込んで、ＣＲ１を組み込んだベクターｐｃＤＮＡ３−ＧＣＲ、及びトロンボモジュリンを組み込んだベクターｐｃＤＮＡ３−ＧＴＭを構築した。これらベクターをＣＨＯ細胞に導入し、安定発現株を樹立した。１０％ウシ胎児血清（fetal calf serum ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地でこの細胞を大量培養した。これらのＣＨＯ細胞をフローサイトメトリーでそれぞれ検査し、細胞表面上に発現した抗原を、蛍光を有するＦＩＴＣ抗体と結合させて蛍光量を測定し、導入した遺伝子が発現したことを確認した（図７）。
【００４０】
上記の大量培養した細胞より、アフィニティカラムを用いて組換え蛋白の分離・精製を行った。配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する組換え蛋白質をもつキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であるＧＰＩアンカー型トロンボモデュリン（ＧＰＩ−ＣＲ１）約２ｍｇを、また、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する組換え蛋白質をもつキメラＧＰＩアンカー型蛋白質であるＧＰＩアンカー型ＣＲ１（ＧＰＩ−ＴＭ）約４ｍｇを精製した。
【実施例１０】
【００４１】
［合成ＧＰＩアンカー型トロンボモデュリンの抗血栓性］
粗精製したＧＰＩ−ＴＭ（ＧＰＩアンカー型トロンボモデュリン）で人工肺用の中空糸（ポリプロピレン）２０ｃｍを被覆した。５０ｍｌのコニカルに２５ｍｌのヒト新鮮血をいれ、これに未処理の中空糸（コントロール）及び被覆した中空糸をいれ、３７度で緩やかに振盪した。振盪開始前、開始後１５分、３０分に血液２ｍｌを採取し、ＴＡＴレベルを測定した（図８）。その結果、ＧＰＩ−ＴＭがすぐれた抗血栓性を示すことがわかった。
【実施例１１】
【００４２】
［合成ＧＰＩアンカー型ＣＲ１の補体活性化抑制］
粗精製したＧＰＩ−ＣＲ１（ＧＰＩアンカー型ＣＲ１）で人工肺用の中空糸（ポリプロプレン）２０ｃｍを被覆した。５０ｍｌのコニカルに２５ｍｌのヒト新鮮血をいれ、これに未処理の中空糸（コントロール）及び被覆した中空糸をいれ、３７度で緩やかに振盪した。振盪開始前、開始後１５分、３０分に  血液２ｍｌを採取し、Ｃ３ａレベルを測定した（図９）。その結果、ＧＰＩ−ＣＲ１がすぐれた補体活性化抑制作用を示すことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＧＰＩアンカー型膜蛋白の骨格を示す図である。
【図２】比較例の標識アルキルヘパリン及び本発明の赤血球膜蛋白の人工肺用中空糸へのコーティング結果を示す図である。
【図３】本発明の赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）、比較例のアルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）及び対照回路（non-coat circuit）におけるＴＡＴレベルの測定結果を示す図である。＊は、対照回路に対してｐ＜０．０５であることを示す。
【図４】本発明の赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）、比較例のアルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）及び対照回路（non-coat circuit）における血小板数及びβ−トロンボグロブリン（β−ＴＧ）レベルの測定結果を示す図である。＊は、対照回路に対してｐ＜０．０５であることを、＊＊は、対照回路に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【図５】本発明の赤血球膜蛋白被覆回路（CD55,CD59 coat）、比較例のアルキルヘパリン被覆回路（alkylheparin coat）及び対照回路（non-coat circuit）における補体Ｃ３ａ及びＣ５ａレベルの測定結果を示す図である。＊は、対照回路に対してｐ＜０．０５であることを、＊＊は、対照回路に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【図６】人工心肺回路での赤血球膜蛋白溶解液による被覆の概略を示す図である。
【図７】ＣＨＯ細胞におけるキメラＧＰＩアンカー型蛋白質の発現を示すフローサイトメトリーの図である。
【図８】本発明の合成ＧＰＩアンカー型トロンボモデュリン被覆中空糸及び未処理の対照中空糸におけるＴＡＴレベルの測定結果を示す図である。＊＊は、対照中空糸に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【図９】本発明の合成ＧＰＩアンカー型ＣＲ１被覆中空糸及び未処理の対照中空糸における補体Ｃ３ａレベルの測定結果を示す図である。＊＊は、対照中空糸に対してｐ＜０．０１であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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