(57)【要約】【課題】  検体のＤＮＡがターゲットのＤＮＡであるかどうかを、簡単に検出する方法を提供すること。【解決手段】  (a)乖離されたそれぞれの１本鎖ＤＮＡの３’部分に増幅する配列領域の末端を認識しハイブリダイズする２種類のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程（アニール工程）、(b)ＤＮＡポリマラーゼによるプライマーの伸長反応工程、(c)変性工程の３工程を繰り返してサーマルサイクル反応を行いＤＮＡを増幅するに当り、上記（ａ）の工程において使用する２種類のオリゴヌクレオチドが、５’末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴヌクレオチドであるＤＮＡの増幅方法及び該増幅方法を行った後、塩を加え、さらにオリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたポリマーの下限臨界共溶温度以上、増幅されたＤＮＡのＴｍ以下の温度に加熱し、その溶液の濁りの変化を測定するＤＮＡの検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）乖離されたそれぞれの１本鎖ＤＮＡに、増幅する配列の領域のそれぞれの３’側の末端を認識しハイブリダイズするように設計された配列の２種類のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程（アニール工程）、
（ｂ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下にＤＮＡポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドを伸長反応させる工程（ポリメラーゼ工程）、
（ｃ）変性を行う工程（変性工程）
の３工程を繰り返すサーマルサイクル反応を行ことによりＤＮＡを増幅するに当り、上記（ａ）の工程において使用する２種類のオリゴヌクレオチドとして、５’末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
【請求項２】
請求項１に記載の工程でＤＮＡの増幅方法を行った後、塩を加え、さらにオリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたポリマーの下限臨界共溶温度以上、増幅されたＤＮＡのＴｍ以下の温度に加熱し、その溶液の濁りの変化を測定することを特徴とするＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的のＤＮＡ配列が存在するかどうかを、高価な蛍光色素検出装置を用いることなく、簡易に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を増幅する技術としてポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲ法と略す。）が一般的に行われている。ＰＣＲ法は、Ｓａｉｋｉらが開発した方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４（１９８５））で、ある特定のヌクレオチド配列領域（試料中のＤＮＡなどの）を検出する場合、２本鎖のＤＮＡ（一方を＋鎖、他方を−鎖）の特定の領域の両端の一方は＋鎖の３’末端を、他方は−鎖の３’末端をそれぞれ認識してハイブリダイゼーションするような２つのオリゴヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした試料ＤＮＡに対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖ＤＮＡを再び１本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟まれた前述の特定領域を検出可能な量にまで増幅させる方法である。
プライマーを適切に設計した反応系では、ＤＮＡが増幅できたかできなかったかを評価することにより、検体中にごく少量の、例えば、１個のウイルス、細菌、細胞が存在するかどうかを検出することができる。
増幅産物を確認する方法としては、増幅産物をそのまま、直接、ポリアクリルアミドを用いて電気泳動し、その泳動度の差から変異を検出するＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法がある。
この方法では変異による増幅産物の立体構造の変化を電気泳動度の差として検出するものである。又、ショットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング法などシークエンス技術や、ＤＮＡを制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に意図的にＰＣＲプライマーの３’末端を配置し、ＰＣＲが行われるか否かで判別するＰＣＲ−ＡＳＰ（ＰＣＲ−Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ）法や、変異部分をＰＣＲで増幅し、これが制限酵素で切断可能か否かで判別するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、変異部分をさらに蛍光標識プローブで検出するタックマンプローブ法などがある。しかしながらいずれの方法も、高度な技術を習熟した者が高価な機器を用い、相当の時間的、金銭的な負担をかけてなし得る方法であり、このような方法しか開発されていないのが現状である。
【０００３】
ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と水素結合することを利用しているが、Ａ−Ｔ間の水素結合は２本、Ｇ−Ｃ間の水素結合は３本であり、Ｇ−Ｃ配列が多い部分では、ＡもしくはＴの配列がわずかにずれていても、従来法では、間違ってハイブリダイゼーションしてしまうことがあり、確定診断に使用するには、まだ精度も不十分であった。
一方、前田等の特許出願（特開２００１−２５２０９８号公報）には、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と金属陽イオンを含有する水溶液に、遺伝子ＤＮＡを添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定する遺伝子診断方法が提案されている。これは、ＤＮＡの水溶性が高くコロイドを形成するが、２本鎖となるとアデニンがチミンと、シトシンとグアニンが水素結合をして親水性が落ちる性質があり、ＤＮＡと同じ長さで完全に相補鎖を形成するＤＮＡが存在しハイブリダイゼーションを起こしたときだけコロイドの安定性が崩れ、凝集が生じるのを利用した方法で、一塩基多型（ＳＮＰＳ）のようなたった１つのＤＮＡの変異を高精度に検出することができる優れた方法である。
しかしながら、この検出法を各種の遺伝子検査に用いるためには、検体のＤＮＡを多く集めたり、あるいは、検体のＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡをＤＮＡコンジュゲート物質に合わせた長さに高価な制限酵素を用いて切断し、ＤＮＡコンジュゲート物質とＤＮＡのハイブリダイゼーションを妨害するもう一方のＤＮＡを除去するという非常に手間と時間をかけた処理を行い、試料を調整しなければならず、実際の診断に使用するためにはさらなる改良の必要があった。
【特許文献１】特開２００１−２５２０９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は以上の事情を鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ＤＮＡの簡単な検査方法を提供することにあり、さらに詳しくは、検体のＤＮＡがターゲットのＤＮＡであるかどうかを、簡単に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の上記目的は、
（１）（ａ）乖離されたそれぞれの１本鎖ＤＮＡに、増幅する配列の領域のそれぞれの３’側の末端を認識しハイブリダイズするように設計された配列の２種類のオリゴヌクレオチド（以下、プライマーということがある。）をハイブリダイズさせる工程（アニール工程）、
（ｂ）デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下にＤＮＡポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドを伸長反応させる工程（ポリメラーゼ工程）、
（ｃ）変性を行う工程（変性工程）
の３工程を繰り返すサーマルサイクル反応を行ことによりＤＮＡを増幅するに当り、上記（ａ）の工程において使用する２種類のオリゴヌクレオチドとして、５’末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されているオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
（２）上記（１）に記載の工程でＤＮＡの増幅方法を行った後、塩を加え、さらにオリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたポリマーの下限臨界共溶温度以上、増幅されたＤＮＡのＴｍ以下の温度に加熱し、その溶液の濁りの変化を測定することを特徴とするＤＮＡの検出方法。
により達成された。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、高価な蛍光試薬や蛍光検出装置などを用いなくても、目視により目的の遺伝子があるか否かを簡単に検出できる。
【０００７】
以下、本発明について具体的に説明する。
まず、本発明の原理について説明する。
本発明で用いられる５'末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されたオリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチド共重合体ということがある。）は、オリゴヌクレオチドに連結しているポリマーの転移温度以下では、すべての成分が鎖状に伸びた状態となり、増幅の鋳型となるＤＮＡ（鋳型のＤＮＡ、あるいは、単に鋳型ということがある。）にハイブリダイゼーションしやすい構造となる。オリゴヌクレオチドに連結する下限臨界共溶温度を有するポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を選んだ場合、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の下限臨界共溶温度は３２℃であるので、鋳型のＤＮＡにハイブリダイゼーションしやすい温度、例えば、２５℃あたりで、鋳型にアニールさせる。アニールが終わったときには、ポリメラーゼ酵素を用いて、オリゴヌクレオチドを鋳型のＤＮＡに沿って伸長する。一般的に用いられるポリメラーゼ酵素は、５５℃以上の温度でＤＮＡを伸長するため、５'末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーの転移温度以上となり、この部分は疎水化し、オリゴヌクレオチドを親水性部位としたミセル構造となる。ミセル構造をとるかどうかは、合成したＤＮＡの構造で決まる。つまり、重要なのは、合成したＤＮＡにおけるＤＮＡの長さと、ＤＮＡの含有量である。
本発明の増幅方法では、低温でアニールした場合にミスマッチが起きるためか異常な増幅が起きる場合があるが、このようなミセル構造をとるとミスマッチ部分は外れ、正常な増幅のみが進行しもう一方のプライマーがアニールした部分まで伸長する。これにより、鋳型のＤＮＡと完全に相補鎖を有する５'末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されたＤＮＡが合成される。
このＤＮＡの増幅が成功しているかどうかは、下限臨界共溶温度以上の温度とし、塩濃度を高めることにより５'末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーが連結されたＤＮＡが凝集するかどうかで判定することができる。
【０００８】
次に、本発明の構成要素について順次説明する。
本発明のアニール工程で用いられるオリゴヌクレオチド共重合体は、オリゴヌクレオチドの５'末端に下限臨界共溶温度を有するポリマーを有する。
ここで下限臨界共溶温度とは、重合体が水に溶解する状態から不溶の状態へ転位する臨界温度をいう。この温度より低温では、ポリマーは水和状態にあり、分子鎖は広がっているが、この温度より高温では、脱水和を起こし、分子鎖は凝集する。この温度による変化は可逆である。
下限臨界共溶温度は、下限臨界共溶温度を呈さないポリマーを形成する単量体１種以上を、下限臨界共溶温度を呈するポリマーを得ることができる単量体１種以上と共に用いることにより変化させることができる。
下限臨界共溶温度を呈さないポリマーを形成する単量体として、例えば、疎水性単量体を用いた場合、下限臨界共溶温度を低温側へ移動でき、また、親水性単量体を用いた場合、下限臨界共溶温度を高温側へ移動できる。
下限臨界共溶温度を呈するポリマーを形成する単量体としては、Ｎ置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルメチルエーテル等が挙げられ、この中でも、Ｎ置換（メタ）アクリルアミド誘導体が好ましい。
これらのモノマーを重合して得られるポリマーの下限臨界共溶温度は、例えば、
ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）：７２℃
ポリ（Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド）：５６℃
ポリ（Ｎ−ピロリジニルアクリルアミド）：５６℃
ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）：４６℃
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）：３２℃
ポリ（Ｎ−ジエチルアクリルアミド）：２９℃
ポリ（Ｎ−プロピルアクリルアミド）：２１℃
ポリ（Ｎ−ピペリジニルアクリルアミド）：５℃
ポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）：５９℃
ポリ（Ｎ−エチルメタリルアミド）：５０℃
ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）：４４℃
ポリ（Ｎ−プロピルアクリルアミド）：１３℃
であるが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、ＰＮＩＰＡＡｍと称することがある。）が、その温度応答挙動もよく知られており（Ｓｃｈｉｌｄ，Ｈ．Ｇ．，Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１７，１６３−２４９，（１９９２））、１本鎖ＤＮＡと複合体を形成した際には、応答温度範囲が比較的低く、扱いやすい上、入手しやすい（（株）興人より入手）ため、本発明においては、ＰＮＩＰＡＡｍを下限臨界共溶温度を有するポリマーとして用いるのが好ましい。
【０００９】
上記のポリマーにおいて、下限臨界共溶温度が失われない限りにおいて、他のモノマーを共重合してもかまわない。
オリゴヌクレオチド共重合体のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結する下限臨界共溶温度を有するポリマーとしてＰＮＩＰＡＡｍを用いた場合には、オリゴヌクレオチドが１本鎖ＤＮＡである場合、オリゴヌクレオチド共重合体は、１本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍとなる。このような１本鎖ＤＮＡ−ＰＮＩＰＡＡｍの製造方法としては、種々の方法が適用されるが、好ましくは、末端アミノ化１本鎖ＤＮＡとアクリロイルオキシスクシンイミド（アクロス社より入手）をカップリング反応させ、末端アミノ基をアクリロイル化した１本鎖ＤＮＡとした後、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下、ＮＩＰＡＡｍという。）モノマーをラジカル共重合させることにより得る方法が挙げられる。このとき、カップリング反応や共重合反応に用いられる触媒はどのようなものであってもよく、反応条件も特に限定されない。例えば、末端アミノ化１本鎖ＤＮＡとアクリロイルオキシスクシンイミドをＮａ2ＣＯ3−ＮａＨＣＯ3下でｐＨを調整した反応系でカップリングし、生成物とＮＩＰＡＡｍを緩衝剤であるＴｒｉｓ−ＨＣｌ下でｐＨを調整し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを活性剤とし、過硫酸アンモニウムなどを開始剤としてラジカル重合させてもよい。もちろん、これら以外の触媒や、助触媒、添加剤を用いてもよい。
なお、末端アミノ化１本鎖ＤＮＡは、特開昭５９−２７９００号公報、特開昭５９−９３０９８号公報、特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−９３１００号公報にその具体的な合成方法が記載されている。また、末端ビニル化する方法及びそれとＮＩＰＡＡｍとの共重合方法は、前田等の論文（ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．２，２６１−２６８及びｐｏｌｙｍｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１０，８３０−８３３）に詳しく記載されている。
本発明のアニール工程で用いられる２種類のオリゴヌクレオチドは、いずれもオリゴヌクレオチド共重合体であることが好ましいが、いずれか一方がオリゴヌクレオチド共重合体であることもできる。
【００１０】
本発明のアニール工程で用いられるオリゴヌクレオチド共重合体のオリゴヌクレオチド部分は、鋳型のＤＮＡの塩基配列の一部と実質的に相補的な塩基配列を有し、変性後の（＋）側のＤＮＡと（−）側のＤＮＡの増幅する配列の領域のそれぞれの３’側の末端にハイブリダイズする。また、ハイブリダイズした後、ＤＮＡ鎖を伸長する。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型のＤＮＡにミスマッチなくアニーリングすることができる塩基配列を意味する。
上記オリゴヌクレオチド共重合体のオリゴヌクレオチド部分は、例えば、デオキシリボヌクレオチド及びそのアナログ（併せてデオキシリボヌクレオチドということがある。）から選択されるもので構成される。該デオキシリボヌクレオチドには未修飾のものばかりでなく修飾されたものも含まれる。ここで修飾デオキシリボヌクレオチドは、特に限定されるものではなく、例えば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基に置換されたデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）を有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
【００１１】
オリゴヌクレオチド共重合体のオリゴヌクレオチド部分をヌクレオチドアナログとすることは、高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。これらのオリゴヌクレオチド部分は、例えば、アプライド  バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等が用いられるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００１２】
次に、本発明のポリメラーゼ工程について説明する。この工程により検出の標的となるＤＮＡが伸長される。
ポリメラーゼ工程はデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下にＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡにハイブリダイズしたプライマー（オリゴヌクレオチド）を伸長させることにより行われる。
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）はオリゴヌクレオチドを伸長させるが、これらデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）としては、ＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。
これらデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のアナログ、例えば、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ等のヌクレオチド三リン酸も含まれる。また、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のアナログの誘導体も含まれ、これら誘導体としては、官能基を有する誘導体、例えば、アミノ誘導体が挙げられる。
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。
【００１３】
本発明に用いるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）とオリゴヌクレオチド共重合体の使用量は、検出の標的となるＤＮＡの塩基配列、目的の増幅断片長及び使用する反応系組成により調整すればよく、例えば、増幅産物量を目安に調整することができるが、特に限定はされない。
【００１４】
ＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことをいい、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含されるが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定はなく、例えば、バチルス  カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す。）やバチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下、Ｂ．ｓｔと称す。）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ  フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明においては、ＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換えタンパク質の何れであってもよい。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであってもよく、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼであるＢ．ｃａ ＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。
また、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えば、Ｍｎ2+の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明を実施することができる。すなわち、Ｍｎ2+を含有する緩衝液中で上記のＢ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示すことができる。なお、上記の態様はＢ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、サーマス  サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
【００１５】
本発明の方法において、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何ら限定はない。
【００１６】
本発明のＤＮＡの増幅方法によれば、２本鎖ＤＮＡばかりでなく、１本鎖ＤＮＡを増幅することができ、また、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって得たｃＤＮＡを用いることによりＲＮＡのヌクレオチドの配列を増幅することもできる。
本発明の実施に用いるＤＮＡやＲＮＡは、当該ＤＮＡやＲＮＡを含む可能性のあるあらゆる試料から調製し、あるいは単離することができる。
本発明のＤＮＡの増幅反応や検出方法には、上記試料を直接使用してもよい。
ＤＮＡやＲＮＡを含む試料は特に限定されないが、これら試料としては、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のようなＤＮＡ含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られるＤＮＡ、ＲＮＡ含有調製物であってもよい。
該調製物としては、例えば、細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中のＤＮＡ、あるいは特定のＤＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が使用できる。さらに、上記試料中に含まれるＤＮＡやＲＮＡを公知方法で増幅したものも好適に使用できる。
上記の試料からの調製物の調製方法には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等の方法を調製に用いることができる。幾つかの例（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）においては、さらに操作を加えてＤＮＡを精製することが有利である。これらの例において、精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
【００１７】
ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを形成するのに用いるＲＮＡは、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡであることができ、その他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
逆転写反応に使用するプライマーは、使用される反応条件において鋳型のＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマーの他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であってもよい。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行わせる観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
上記の逆転写反応に使用される酵素は、ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２  ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。この他、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、高温で逆転写活性を有する酵素も好適であり、例えば、サーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。これらは特に限定されるものではないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ．ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂ．ｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。
上記の逆転写酵素活性を有する酵素は、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
【００１８】
また、本発明の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複製した後、本発明の方法の鋳型となるＤＮＡとしてあるいは鋳型となるＤＮＡを形成して用いてもよい。
ＤＮＡの複製の方法は、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡ断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。さらに、上記複製の方法の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを多数作製した後、逆転写反応により多数のｃＤＮＡとする方法が挙げられる。
ＲＮＡの複製は、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡ断片を用いて行うことができる。該ＤＮＡ断片はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、また、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、上記のように配置されたＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮＡの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼあるいはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。
【００１９】
上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような２本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような１本鎖ＤＮＡのいずれもが、本発明のＤＮＡの増幅方法の鋳型とするＤＮＡとして好適に使用できる。
ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡの増幅を目的とする場合には、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ２本鎖ＤＮＡのＲＮＡ鎖をＲＮａｓｅＨなどを用いて分解して１本鎖ｃＤＮＡとして増幅反応を行うが、本発明の増幅用反応液にＲＮａｓｅＨなどのＲＮＡ鎖分解酵素を加えることにより、予めＲＮＡ鎖を分解しておかなくても本発明の増幅反応を開始することができる。さらに、本発明のＤＮＡの増幅方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生成したｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類のＤＮＡポリメラーゼで行なうことができる。
上記鋳型とするＤＮＡの長さは、標的配列がその断片中に完全に含まれる長さか、あるいは、標的配列の十分な部分が少なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列の十分な結合を提供するような長さのものがよい。
本発明の方法では、特に限定するものではないが、鋳型のＤＮＡが２本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを変性して１本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのオリゴヌクレオチドの結合を可能にさせることができる。２本鎖ＤＮＡが変性する温度、例えば、約９５℃で保持することは好ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、オリゴヌクレオチドを標的物に結合させるためには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上記のような２本鎖を１本鎖ＤＮＡに変性する工程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後に、温度を変化させてＤＮＡを増幅させる。この温度変化は、例えば、２５℃でアニールを行い、５５℃でＤＮＡを増幅し、９５℃で変性を行うこれを繰り返すことにより、連続的にＤＮＡが増幅される。
【００２０】
本発明のＤＮＡの増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより常温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱性を有する酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して高温、例えば、５０℃以上で、さらに例えば６０℃以上で実施することもできる。
さらに増幅反応は、逆転写反応およびＤＮＡの増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを増幅することができる。
使用するＤＮＡポリメラーゼは、オリゴヌクレオチド部分の３’末端から下流への伸長鎖合成に寄与し、そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、Ｂ．ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ由来の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社製）、Ｂ．ｃａ由来のＢ．ｃａ ＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９７巻、１３〜１９頁（１９９１）記載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９  ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。通常は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用できる。
本発明では自動でサーマルサイクラーのような反応装置を使って増幅してもよいし、アニール工程、ポリメラーゼ工程、変性工程のそれぞれの温度に調整したヒートブロック中に順番に入れることで増幅を行ってもかまわない。
本発明のポリメラーゼ工程は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。
本発明においては、鋳型とするＤＮＡのＧＣ含量に応じて反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができる。例えば、鋳型となるＤＮＡがＧＣ含量の低い場合には、伸長する鎖長やオリゴヌクレオチドのＴｍ値にもよるが、ポリメラーゼ工程を５０〜５５℃で行うことができる。
また、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｂ．ｃａ ＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来のＤＮＡの増幅を１種類の酵素のみで簡便に実施することができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型のＤＮＡとして使用することもできる。
【００２１】
本発明のＤＮＡの増幅方法は、ＤＮＡの増幅を利用した種々の実験操作、例えば、ＤＮＡの検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明のＤＮＡの増幅方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕＤＮＡ増幅方法、ＤＮＡチップのような固相担体上でのＤＮＡ増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックスＤＮＡ増幅方法として使用することができる。
本発明でいうＴｍとは、ＤＮＡの２本鎖が熱変性して１本鎖になる温度をいい、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”による以下の式で計算される。
Ｔｍ（℃）＝81.5+16.6*log[S]+0.41*(%GC)-(500/n)
[S]  ：塩のモル濃度
(%GC)：オリゴＤＮＡ中のＧＣ含量（％）
ｎ   ：オリゴＤＮＡの長さ(bp)
但し、[S]は、［（ナトリウムイオン濃度）＋（カリウムイオン濃度）＋（Ｔｒｉｓイオン濃度）×０．６７］をいい、マグネシウムイオン濃度は濃度の計算に入れない。
【００２２】
本発明のＤＮＡの検出方法によれば、標的ＤＮＡ上の塩基配列の違いを判別することができる。
この態様においては、プライマーの中間部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基に位置するように、例えば、該塩基とプライマーの中間部分の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの中間部分の塩基配列と鋳型として用いたＤＡＮの塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。
本発明の方法により、点突然変異、一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ、ＳＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
本発明のＤＮＡの検出方法を用いて行う標的ＤＮＡの検出は、ＤＮＡを含有する試料を用いて直接、あるいは、標的ＤＮＡを増幅して実施することができる。この場合、増幅される標的ＤＮＡの鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的ＤＮＡを検出する観点からは、例えば、２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。
さらに、本発明の検出方法では、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量のＤＮＡ試料からもさらに高感度に標的ＤＮＡを検出することができる。この場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされない。
本発明のＤＮＡの検出方法を用いて遺伝子診断を行う場合、本発明のＤＮＡの増幅方法で得られたＤＮＡの増幅液における１本鎖のＤＮＡの含有率は、安定なミセル構造を形成できれば、限定されない。あまり低い含有率では、相補的遺伝子の添加による光分散強度の変化が確認されにくいばかりでなく、ミセルが形成されないことも考えられるので好ましくない。また、１本鎖ＤＮＡの含有率が高すぎる場合には、ポリマーを有するＤＮＡ（ＤＮＡ共重合体という。）がミセルとなりにくく、ミセルが形成されても不安定となる場合が多いため好ましくない。したがって、０．１ｍｏｌ％以上０．５ｍｏｌ％以下程度が好ましい。しかし、１本鎖ＤＮＡの含有率は、１本鎖ＤＮＡ鎖長や疎水性物質の構造に応じて変更することが望ましいため、上記の範囲に限定されるものではない。
【００２３】
本発明のＤＮＡの検出方法を用いた遺伝子診断では、増幅が終わったＤＮＡの増幅液中に、塩、例えば、マグネシウムやナトリウムなどの金属陽イオンを共存させる。
イオン性界面活性剤のミセルや高分子ミセルでは、溶液中の対イオン濃度の増大に伴って、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の低下と会合数の増大が起こることが知られている。つまり、対イオンが増大すると、少量の界面活性剤でもミセルを形成できるようになったり、ミセルの粒子径が増大したりするのである。
本発明のＤＮＡの検出方法を用いて遺伝子診断を行う場合、形成されたポリマーを有する１本鎖ＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ共重合体物質）の濃度が小さくてもミセルが形成され、ミセルの粒子径が大きくなり、光散乱の測定が容易になる等という理由からも金属陽イオンを共存させることが好ましい。
ここで使用する金属陽イオンはとくに限定されないが、好ましくは、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンである。マグネシウムイオンとしては、ＭｇＣｌ2等を用いることができ、その濃度は、２０〜１００ｍＭが好ましく、より好ましくは、３０〜５０ｍＭである。また、ナトリウムイオンとしては、ＮａＣｌ等を用いることができ、その濃度は０．１〜２Ｍが好ましく、より好ましくは、０．５〜１．５Ｍとする。
本発明のＤＮＡの検出方法では、１本鎖ＤＮＡの含有率０．１〜０．５ｍｏｌ％の範囲において、Ｍｇ2+イオンを３０ｍＭ添加した後、下限臨界共溶温度を有するポリマーの相転移温度以上（ＰＮＩＰＡＭでは３２℃以上）とすることが好ましい。ただし、増幅されたＤＮＡのＴｍ以上の温度にすると、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションがほぐれてしまうので、例えば、３２〜４０℃にすることが好ましい。
本発明のＤＮＡの検出方法においては、１本鎖ＤＮＡと相補鎖との間での二重らせんの形成や光散乱強度の測定を妨げない範囲で、増幅が終わったＤＮＡの増幅液中に他の物質を添加してもよい。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１
緑膿菌を寒天培地に塗沫して、３７℃で一晩培養した。
ＩＣＡＮ  ＧＮ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて以下の手順に従い緑膿菌のＤＮＡを抽出した。
（１）１．５ｍＬのマイクロチューブにＬｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ入れる。
（２）培養した緑膿菌のコロニーの一つを爪楊枝で突っつき、（１）のマイクロチュウブ中に入れ、ボルテックスでよく分散させた。
（３）これを３７℃のヒートブロック中に入れ、３０分間保温した。
（４）さらに９５℃のヒートブロックで５分間加熱処理を行い、２本鎖ＤＮＡを２本の１本鎖ＤＮＡに分けた。
（５）これを５℃に冷却した遠心分離機にセットし１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを回収した。
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、セラミダーゼ産出菌であるため、このセラミダーゼ産出遺伝子を検出することで、緑膿菌を検出することとし、ｇｅｎｂａｎｋデータベースを用いてこの部分の配列を調査した。
【００２５】
1 ggatcctctt cggcatctgg atgatggcgg tgcagtacat cgactatccg gcggacaacc
61 acaagctcgg ctggaacgag atgctcgcct ggctgcgcag caagcgctgg gcgtgcatgg
121 gtttcggcgg ggtgacctac ctggcgctgc tgatcccgct ggtcaacctg gtcatgatgc
181 ccgccgccgt cgccggcgcc accctgttct gggtccgcga ggaaggcgag aaggcgctgg
241 tgaaataagc atgcgcccgg tgtccgctgt cggcattgtc aggcgggcgt cagcgccctg
301 acagccggcg tcgggcacac tacgaatgcc ctcgggagcg tcggcgcagg ccgcagccga
361 gacctgcgcc agcccttgca gaccggctcg acgctgccga accgactggc cgccggtgcc
421 tccccacgca ggcggccttt ttttacccgc ctgccttgcc gtccatgcag gatggccggc
481 gctcaccccc ttcctgtccg ctacgccccc ctcgactcca ccaccctggc actacagtgg
541 caaccaggcg aagcaggctc cggcccgctt tcgatgacca ccgtccccag cccgcccagc
601 ggcggaaaac aagaagaggg tcgccatgtc acgttccgca ttcaccgcgc tcttgctgtc
661 ctgcgtcctg ctggcgctct ccatgcctgc cagggccgac gacctgccct accgcttcgg
721 cctgggcaag gcggacatca ccggcgaagc cgccgaagtc ggcatgatgg gttactcctc
781 cctcgaacag aagaccgccg gcatccacat gcgccagtgg gcgcgtgcct tcgtgatcga
841 ggaagcggcc agcggacgtc gcctggtcta cgtcaacacc gacctgggga tgaccttcca
901 ggccgtgcac ctgaaggtcc tggcccggct caaggcgaag taccccggtg tctacgacga
961 gaacaacgtg atgctcgccg ccacccacac ccactccggt ccgggcggct tctcccacta
1021 cgcgatgtac aacctgtcgg tgctcggctt ccaggaaaag accttcaacg ccatcgtcga
1081 cggcatcgtc cgctccatcg agcgggccca ggccaggttg cagcccggcc gcctgttcta
1141 cggcagcggc gagctgcgca acgccagccg caaccgttcg ctgctgtcgc acctgaagaa
1201 tccggacatc gccggctacg aggatggcat cgacccgcag atgagcgtgc tcagcttcgt
1261 cgacgccaac ggcgagctgg ccggcgcgat cagttggttc ccggtgcaca gcacctcgat
1321 gaccaacgcc aatcacctga tctccccgga caacaagggc tacgcctcct atcactggga
1381 gcacgacgtc agccgcaaga gcggtttcgt cgccgccttc gcccagacca atgccggcaa
1441 cctgtcgccc aacctgaacc tgaagcccgg ctccggtccc ttcgacaacg agttcgacaa
1501 cacccgcgag atcggtctgc gccaattcgc caaggcctac gagatcgccg gccaggccca
1561 ggaggaagtg ctcggcgaac tggattcgcg cttccgtttc gtcgacttca cccgcctgcc
1621 gatccgcccg gagttcaccg acggccagcc gcgccagttg tgcaccgcgg ccatcggcac
1681 cagcctggcc gccggtagca ccgaagacgg tccaggcccg ctggggctgg aggaaggcaa
1741 caatccgttc ctctcggccc ttggcgggtt gctcaccggc gtgccgccgc aggaactggt
1801 gcaatgccag gcggaaaaga ccatcctcgc cgacaccggc aacaagaaac cctacccctg
1861 gacgccgacg gtgctgccga tccagatgtt ccgcatcggc cagttggaac tgctcggcgc
1921 ccccgccgag ttcaccgtga tggccggggt gcggatccgc cgcgcggtgc aggcggccag
1981 cgaagcggcc ggtatccgcc atgtggtctt caatggctac gcgaatgcct atgccagcta
2041 cgtcaccacc cgcgaggaat acgccgccca ggaatacgaa ggcggctcga ccctctacgg
2101 cccctggacc caggccgcct accagcagtt gttcgtcgac atggcggtgg cgctgcgcga
2161 acgcctgccg gtggaaacct cggcgatagc gccggacctg tcctgctgcc agatgaactt
2221 ccagaccgga gtagtggccg atgatcccta tatcggcaag tccttcggcg acgtgttgca
2281 acaacccagg gaaagttatc gcatcggcga caaggtgacc gtcgctttcg tgaccggaca
2341 tccgaagaat gacttgcgca ccgagaagac tttcctggaa gtggtgaata tcggcaagga
2401 tggcaaacag acgcccgtga ccgttgccac cgataatgac tgggataccc aataccgctg
2461 ggagagagtg ggtatatctg cctcgaaagc gactatcagc tggtccattc caccagggac
2521 cgagcccggc cattactaca tcaggcacta tggcaacgcg aagaacttct ggacccagaa
2581 gatcagcgaa atcggcggct cgacccgctc cttcgaggtg ctcggcacca ctccctagcg
2641 ggctccagcc aaggtttcga gattcgccag ccaactttat gacgcatgaa agtcgtcaaa
2701 taaaatgtga tttaaaacac atgaacaagt gaccttttca ttca
【００２６】
この配列の内、1045〜1500の456bpを増幅することとしプライマーとして、
foward primer   ：5'-CGGCTTCCAGG-3'
reverse primer  ：5'-TTGTCGAACTC-3'
と設定した。
オリゴヌクレオチドの吸光度(260nm）は、以下の計算式より計算できる。
Ｅ260＝A*15300+C*7400+G*11800+T*9300
式中、Ａはオリゴヌクレオチド中のアデノシンの数、Ｃはオリゴヌクレオチド中のシチジンの数、Ｇはオリゴヌクレオチド中のグアノジンの数、Ｔはオリゴヌクレオチド中のチミジンの数を表す。
上記計算式から、foward primerの吸光度（ＥＦ）は
ＥＦ＝1*15300+4*7400+4*11800+2*9300＝110700
reverse primerの吸光度（ＥＲ）は
ＥＲ＝2*15300+3*7400+2*11800+4*9300＝113600
foward primer、reverse primer及びfoward primer、reverse primerそれぞれの5'末端をアミノヘキシル化したものをオリゴＤＮＡ合成業者（シグマゲノミクス社）に発注し入手した。
【００２７】
５’末端をアミノヘキシル化したfoward primer０．６μｍｏｌを、炭酸バッファー（Ｎａ2ＣＯ3（１０ｍＭ）−ＮａＨＣＯ3（９０ｍＭ））１５０μＬに溶解し、プライマー溶液を作製した。
アクリロイルオキシサクシンイミド（アクロス社製）８．５μｍｏｌをジメチルスルホキシド４６０μＬに溶解し、先ほどのプライマー溶液に加え、２４時間室温で反応させた。この液をイソプロパノール１０ｍＬ中に添加し、よく攪拌した後、遠心分離機にかけ、上澄みを除去し５’末端にビニル基を導入した。
同様の方法で、５’末端をアミノヘキシル化したreverse primerの５’末端をビニル化した。
得られた末端ビニル化foward primerと末端ビニル化reverse primerのそれぞれをＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）とテトラメチルエチレンジアミンの存在下、過硫酸アンモニウムを開始剤としてラジカル共重合させ、foward primer−ＰＮＩＰＡＡｍ複合体およびreverse primer−ＰＮＩＰＡＡｍ複合体を合成した。得られた反応物を透析後、ＳＨＥＰＨＡＤＥＸＧ１００を充填したカラムでゲルろ過を行い未反応物を除去した。
得られたポリマーを、凍結乾燥したのち、２５ｍＬの精製水に溶解したところ２６０ｎｍでの吸光度はそれぞれ以下のとおりだった。
foward primerから得られたもの   ２．１６    （以降、プライマーＡ溶液という。）
reverse primerから得られたもの  ２．２９    （以降、プライマーＢ溶液という。）
タカラバイオ社のポリメラーゼとＰＣＲ反応用バッファー、ｄＮＴＰ混合液のキット“Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”を購入した。
【００２８】
１．５ｍｌのＰＣＲチューブ中に
緑膿菌のＤＮＡを抽出した上澄み液    100μＬ
10×ＰｙｒｏｂｅｓｔＢｕｆｆｅｒ    100μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ             80μＬ
プライマーＡ溶液                    253μＬ
プライマーＢ溶液                    245μＬ
滅菌蒸留水                          222μＬ
を混合し、９８℃で１０秒、２５℃で２分、６８℃で１分のサーマルサイクルを４０回繰り返した。
得られた反応液をＰＮＩＰＡＭの下限臨界共溶温度３２℃以上である４０℃に加熱した。反応液は透明であったが、３３０ｍＭの塩化マグネシウム水溶液、１００μＬを加えたところ、反応液は、白濁し、１０分後には透過率が５％以下となった。
同様に、サーマルサイクルを行わない反応液に塩を加え、４０℃に加熱しても白濁しなかったことから、白濁は、ＰＣＲの反応が進行したことを検知しているといえる。