(57)【要約】【課題】  より単純でより安価な形態の抗酸化剤の提供（抗酸化剤は代表的には、食料品などの物質に酸素がいかなる有害な影響を及ぼすことも防止するために使用され、一般的に使用される２つの抗酸化剤は、GRINDOX 142およびGRINDOX 1029であり、これらの抗酸化剤は多くの成分を含み、そして製造するには非常に高価である）。【解決手段】  糖、特に1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)を、抗酸化剤として、特に食料品および飲料の抗酸化剤として使用であって、1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)の甘味料として、特に食料品および飲料の甘味料として、好ましくはヒトの食料品および飲料としての使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化剤としての１，５−アンヒドロフルクトースの使用。
【請求項２】
前記１，５−アンヒドロフルクトースが食料または飲料に添加される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記１，５−アンヒドロフルクトースがポリマーに添加される、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素、特にα-1,4-グルカンリアーゼ(「GL」)の使用に関し、α-1,4-グルカンを基礎とした基質から1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)を 調製する。
【０００２】
本発明は糖、特に1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)を、抗酸化剤として、特に食料品および飲料の抗酸化剤として使用することにも関する。
【０００３】
本発明は1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)の甘味料として、特に食料品および飲料の甘味料として、好ましくはヒトの食料品および飲料としての使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
FR-A-2617502およびBauteら、(Phytochemistry (1988) vol.27 No.11 pp3401-3403)はMorchella vulgarisにおける1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)の見かけの酵素反応による産生について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。可能な酵素反応に言及しているのにもかかわらず、これらの２つの文献は、塩基配列の情報はもちろんのこと、いかなる酵素についてのアミノ酸配列も示していない。これらの文献は、AFが抗生物質ピロンミクロテシン(pyrone microthecin)の調製のための前駆体になり得ることを報告する。
【０００５】
Yuら、(Biochimica et Biophysica Acta (1993) vol 1156 pp313-320)は紅海藻からのGLの調製およびAFを生産するためにα-1,4-グルカンを分解するGLの使用について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。GL酵素に言及するのにも関わらず、この文献は同酵素をコードする塩基配列の情報はもちろんのことその酵素についてのいかなるアミノ酸配列データも示していない。この文献はGLの供給源は藻類であることも示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
代表的なα-1,4-グルカンを基礎とした基質はデンプンである。今日、デンプンは工業における広い使用を見出している。これは主にこれらが安価な原材料であるからである。
【０００７】
デンプン分解酵素は種々のカテゴリーに分類し得る。デンプンヒドロラーゼは、グルコースまたはグルコースオリゴマーを生成する。デンプン分解酵素の第二の群は、無機リン酸の存在下でデンプンからグルコース-１-リン酸を生成するホスホリラーゼである。
【０００８】
AFはまた、化学的に合成されてきた（Tetrahedron Letters Vol 21 pp 1429-1432のLichtenthalerの研究を参照のこと）。しかし、この化学的合成には多くの数の工程が含まれ、そして多量のAFを生成させない。
【０００９】
AFを生成させるこの化学的合成経路は、それゆえ大変高価である。
【００１０】
それゆえ、安価でかつ容易な方法、ならびに多量のAFを生成し得る方法でAFを調製し得るプロセスが必要である。
【００１１】
さらに、抗酸化剤は代表的には、食料品などの物質に酸素がいかなる有害な影響を及ぼすことも防止するために使用される。一般的に使用される２つの抗酸化剤は、GRINDOX 142およびGRINDOX 1029である。これらの抗酸化剤は多くの成分を含み、そして製造するには非常に高価である。
【００１２】
それゆえ、より単純でより安価な形態の抗酸化剤を有する必要がある。
【００１３】
さらに、甘味料はしばしば食料品および飲料の調製に使用される。しかし、多くの甘味料は高価であり、調製が複雑である。
【００１４】
それゆえ、より単純でより安価な形態の甘味料を有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明では、α-1,4-グルカンを酵素α-1,4-グルカンリアーゼで処理する工程を包含する、糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法を提供する。ここでこの方法は、酵素が実質的に純粋な形態で使用されることにより特徴付けられる。
【００１６】
好ましくは、グルカンがα-1,4-結合以外の結合、およびα-1,4-結合に加えて結合を含有する場合、α-1,4-グルカンリアーゼを、他の結合を破壊し得る適切な試薬（ヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼなど）と協同して使用する。
【００１７】
好ましくは、グルカンは、デンプンあるいは化学的または酵素的に調製されるデンプン画分である。酵素的に調製される場合は、反応はα-1,4-グルカンリアーゼを添加する前に行われ得るか、または反応は同時に行われ得る。適切な試薬は、補助酵素(auxiliary enzyme)であり得る。好ましい補助酵素はα-またはβ-アミラーゼである。好ましくは、脱分枝酵素が使用される。より好ましくは補助酵素はプルラナーゼ（pullanase）またはイソアミラーゼの少なくとも１つである。
【００１８】
好ましくは、α-1,4-グルカンリアーゼは支持体に結合しているか、より好ましくは、不溶性の形態である。
【００１９】
好ましくは、酵素は菌類（好ましくは、Morchella costataまたはMorchella vulgaris）から、または菌類感染藻類（好ましくは、Gracilariopsis lemaneiformis）から、あるいは藻類単独（好ましくはGracilariopsis lemaneiformis）からのいずれかで単離される。
【００２０】
好ましくは、酵素は菌類から、または菌類感染藻類から、あるいは藻類単独から、この酵素によって分解されないゲルを使用して、単離および／または精製される。
【００２１】
好ましくは、ゲルはデキストリンまたはその誘導体に基づく。
【００２２】
好ましくは、ゲルはシクロデキストリン、より好ましくは、β-シクロデキストリンである。
【００２３】
好ましくは、酵素は配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列あるいはそれらの任意の変異体を含む。
【００２４】
別の好ましい実施態様では、酵素は配列番号９〜11のいずれかに示したアミノ酸配列またはその任意の変異体を含む。
【００２５】
用語「その任意の変異体」は、その結果として生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、配列からの、あるいは配列に対しての、任意の少なくとも１アミノ酸の置換、多様性、修飾、置き換え、欠失、または付加を意味する。
【００２６】
好ましくは、酵素はアミロペクチンまたはデキストリンと組み合わせて使用される。
【００２７】
好ましくは、酵素はこの酵素をコードするヌクレオチド配列の発現から得られる。
【００２８】
好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列である。
【００２９】
好ましくはDNA配列は、配列番号３、または配列番号４、または配列番号７、または配列番号８のいずれかのDNA配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を含む。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、 DNA配列は、配列番号12〜14に示す配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む、任意の配列を含む。
【００３１】
表現「実質的相同性」は、構造および／またはヌクレオチド成分および／または生物学的活性に関しての相同性を含有する。
【００３２】
表現「任意の適正なコドン置換を含む」は、生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、同じアミノ酸をコードする他のコドンとの任意のコドンの置き換えまたは置換、あるいはコドンの任意の付加または削除を包含する。
【００３３】
他の言葉で言えば、本発明はまた、その中で少なくとも１ヌクレオチドが欠失、置換または修飾される、あるいはその中で付加的な少なくとも１ヌクレオチドが挿入され、グルカンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、修飾されたDNA配列を含有する。好ましくは酵素は、増加したリアーゼ活性を有する。
【００３４】
好ましくは、デンプンは（例えば、約25％溶液までの）高濃度で使用する。
【００３５】
好ましくは、基質を緩衝液の存在下で酵素を用いて処理する。
【００３６】
より好ましくは、基質を実質的に純粋な水の存在下で酵素用いて処理する。
【００３７】
好ましくは、基質を補因子の非存在で酵素を用いて処理する。
【００３８】
本発明では、α-1,4-グルカンを酵素α-1,4-グルカンリアーゼで処理する工程を含有する、糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法も提供する。ここでこの方法は、酵素が配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号９〜11のアミノ酸配列のいずれか、あるいはその任意の変異体を含むことを特徴とする。
【００３９】
本発明では、本発明の方法によって調製される場合の糖1,5-D-アンヒドロフルクトースも提供される。
【００４０】
本発明の方法によって調製されたAFは、13C NMRにより確認され、特徴付けられた。
【００４１】
本発明の方法の一つの鍵となる有利性は、糖1,5-D-アンヒドロフルクトースを、従来よりずっと大量に、および既知のプロセスよりも比較的容易かつ安価な方法で調製し得るということである。例えば、糖は今やほんのごくわずかな量（例えば、マイクログラム量）しか生成され得なかった先行技術の方法に比べて、例えば、100g以上（例えば、500g）の収量で調製され得る。
【００４２】
GLにより触媒され得る代表的な反応は以下のよう要約される：
1).アミロペクチン--------------→AF + 限界デキストリン
2).アミロース------------------→AF + 限界デキストリン
3).デキストリン----------------→AF + グルコース
反応 1)では、２つの生成物の比率はアミロペクチンの構造あるいはα-1,6-グルコシド結合のアミロペクチン分子中の分布に依存する。
【００４３】
反応 2)および 3)では、生成物の比率は基質の重合度(DP)数に依存する。反応３では、AFとグルコースとの間の比率はDPに依存する。例えば、デキストリンが10グルコース単位を含有する場合、AF：グルコース比は９：１である。
【００４４】
本発明の別の有利性は、α-1,4-結合以外の結合を含むグルカンが、実質的に分解され得ることである（従来は、一部のみの分解が達成された）。1,5-D-アンヒドロフルクトース前駆体の実質的な分解は1,5-D-アンヒドロフルクトースの収量を増加に導く１つの要因である。
【００４５】
他の有利性は、AFは天然の基質であり、それゆえヒトへの用途のための潜在力を有する。例えば、AFをAFデヒドラーゼによって抗生物質ミクロテシンに変換し得る。抗生物質は食物生物保存(bio-preservation)におけるそれらの使用が知られており、これは食物工学では重要な領域である。しかし今日まで、AFならびにミクロテシンの調製には数多くの不利性がある。例えば、ほんの少量しか生成され得なかった。また、このプロセスには経費がかかった。
【００４６】
本発明は、AF、およびミクロテシンなどの他の生成物の、より多くの生産、およびずっとより安価な生産を提供することにより、これらの問題を克服する。この点では、グラムからキログラム量のAFを調製可能である。
【００４７】
さらなる有利性は、リアーゼは４℃で少なくとも１年間は安定であり、また活性を損なうことなく凍結乾燥し得る。
【００４８】
別の有利性は、リアーゼがデンプンから直接AFを生成し、そしていかなる補助酵素の存在も必要としないということである。
【００４９】
別の有利性は、酵素を純水中で使用し得るということである。この結果は大変驚くべきことである。
【００５０】
本発明のリアーゼの単純な特性に基づいて、AFの生産経費がグルコースの生産経費に匹敵することが期待され得る。本発明のリアーゼが、一般に非常に高価である補助酵素の存在を、なんら必ずしも要求しないということが、特に有利である。
【００５１】
一般に、α-1,4-グルカンをこの酵素の基質として利用し得る。
【００５２】
好ましい基質として、デンプンが使用される。
【００５３】
好ましいプロセスでは、可溶性またはゼラチン化したデンプンまたはデンプン加水分解物を使用する。デンプン加水分解物は化学的にも酵素的にも調製し得る。
【００５４】
酵素を部分的にデンプンを分解するために使用する場合は、この酵素をリアーゼまたは同時に添加され得る他の追加のデンプン分解試薬（例えば、酵素のグルカノヒドロラーゼ）を添加する前に添加し得る。
【００５５】
リアーゼはグルカンをAFに変換する。この酵素は非還元末端から基質に結合し、還元糖だけを変換しないでおく。残ったグルコースは公知の方法により除去し得、その方法のいくつかは本明細書に記載されている。
【００５６】
ここで記載した反応を使用して、純粋なAFを生成し得、また大量に生成し得る。
【００５７】
一つの実施態様では、α-1,4-グルカンリアーゼを菌類感染藻類（例えばGracilariopsis lemaneiformis）からβ-シクロデキストリンSepharoseでのアフィニティークロマトグラフィー、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィー、およびSuperose 12カラムでのゲル濾過によって精製する。精製した酵素はα-1,4-グルカンから1,5-D-アンヒドロフルクトースを生成する。
【００５８】
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformisから単離した菌類のリアーゼは、アミロペクチンを使用した場合、3.5〜7.5の至適pH、50℃の至適温度、および3.9のpIを有することで特徴付けられる。
【００５９】
別の実施態様では、α-1,4-グルカンリアーゼを菌類Morchella costataからβ-シクロデキストリンSepharoseでのアフィニティークロマトグラフィー、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィー、およびSuperose 12カラムでのゲル濾過によって精製する。精製した酵素は、α-1,4-グルカンから1,5-D-アンヒドロフルクトースを生成する。
【００６０】
この菌類のリアーゼは、３〜９のpH勾配を有するゲルでの等電点電気泳動で測定したところ、5.4付近のpIを示す。８〜25%の勾配を有するゲルでのSDS-PAGEにより測定したところ、分子量は110kDaであった。この酵素はpH５〜７の範囲で至適なpHを示した。至適温度は30〜45℃の間であることが見出された。
【００６１】
別の実施態様では、α-1,4-グルカンリアーゼは菌類Morchella vulgarisからβ-シクロデキストリンSepharoseでのアフィニティークロマトグラフィー、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィー、およびSuperose 12カラムでのゲル濾過によって精製する。精製された酵素は、α-1,4-グルカンから1,5-D-アンヒドロフルクトースを生成する。
【００６２】
別の実施態様では、α-1,4-グルカンリアーゼは藻類（例えばGracilariopsis lemaneiformis）からβ-シクロデキストリンSepharoseでのアフィニティークロマトグラフィー、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィーおよびSuperose 12カラムでのゲル濾過によって精製する。精製された酵素はα-1,4-グルカンから1,5-D-アンヒドロフルクトースを生成する。
【００６３】
本発明によるいくつかのGL酵素についての、リアーゼ触媒反応の代表的な至適pHおよび温度は以下の通りである：
------------------------------------------------------------------------
GL供給源                    至適pH      至適pH範囲       至適温度
------------------------------------------------------------------------
M.costata                    6.5         5.5-7.5         37℃;40℃a
------------------------------------------------------------------------
M.vulgaris                   6.4         5.9-7.6         43℃;48℃ a
------------------------------------------------------------------------
菌類感染
Gracilariopsis lemaneiformis     3.8         3.7-4.1         40℃;45℃ a
------------------------------------------------------------------------
aグリコーゲンを基質として用いて測定したパラメーター；他のパラメーターはアミロペクチンを基質として用いて測定した。
【００６４】
本発明の酵素はアミロースおよびアミロペクチンを1,5−アンヒドロフルクトースに変換する。
【００６５】
試験したマルトサッカリドの中で、本発明者らはこのリアーゼがマルトースに対して低い活性を示し、マルトトリオースおよびマルトヘプタオースに対してより低い活性を示し、マルトテトラオースおよびマルトペンタオースに最高の活性を示すことを見出した。この酵素は、これらのマルトサッカリドについては10 mg/mlの濃度までは基質阻害を示さなかった。
【００６６】
それぞれの好ましい供給源由来の酵素は、配列決定し、アミノ酸の配列を後に示した。この酵素をコードするDNA配列も後に示した。
【００６７】
それゆえ本発明は、新規なデンプン分解酵素（すなわち新規なα-1,4-グルカンリアーゼ）について記載する。これは初めて精製され、特徴付けられた酵素である。
【００６８】
上述したように、本発明はAFのいくつかの特定の使用にも関する。
【００６９】
特に、本発明は1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)を、抗酸化剤として、特に食料品および飲料の抗酸化剤として使用することにも関する。
【００７０】
それゆえ、本発明では、1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)の抗酸化剤としての使用が提供される。
【００７１】
好ましくは、AFは食用物質であるか、または食用物質中で使用される。
【００７２】
好ましくは、AFは食料品または飲料中で、あるいは食料品または飲料として使用される。
【００７３】
好ましくは、AFは他の抗酸化剤と組み合わせて使用する。
【００７４】
好ましくは、AFは本発明の方法に従って調製される。
【００７５】
抗酸化剤としてAFを使用することの主な有利性は、これが天然の産物であること、代謝されないこと、製造が容易であること、可溶性であること、そして一般に無毒であることである。
【００７６】
好ましい実施態様では、それゆえ本発明は、食物および非食物目的のために魅力的な水溶性の抗酸化剤として使用し得る、純粋なAFを酵素的に調製することに関する。適用例において、食物調製における抗酸化剤としてのAFの使用を示す。
【００７７】
付随の実施例において、AFが既知の高品質な市販の食物抗酸化剤に匹敵することが理解される。
【００７８】
非食物の例は、重合化学でのポリマー合成時の酸素除去剤としての使用を包含する。また、AFは生分解性プラスチックの合成に使用し得る。
【００７９】
実験は、AFが有効な還元剤（抗酸化剤）であり得ることを示した。なぜならAFは3,5-ジニトロサリチル酸を3-アミノ-5-ニトロサリチル酸に容易に還元し得るからである。
【００８０】
AFは天然の基質であり、それゆえ受容可能な抗酸化剤として使用される莫大な潜在性を有する。AFは、AFデヒドラーゼによって抗生物質ミクロテシンに変換され得る。抗生物質は、食物生物工学の重要な分野である食物生物保存におけるその使用が知られている。
【００８１】
別の局面では、本発明はまた、1,5-D-アンヒドロフルクトースの甘味料としての、特に食料品および飲料、好ましくはヒトの食料品および飲料の甘味料としての使用に関する。
【００８２】
それゆえ、本発明のこの局面では、1,5-D-アンヒドロフルクトースの甘味料としての使用が提供される。
【００８３】
好ましくは、AFはヒトの食料品および飲料として、あるいはヒトの食料品および飲料中で使用される。
【００８４】
AFは、５%溶液または100 mg/kgから500 mg/kgなどの所望の量で使用され得る。
【００８５】
AFを甘味料として用いる有利性は、これが天然の産物であるということ、一般に無毒であること、水溶性であること、代謝されないこと、および生成が容易であることである。
【００８６】
それゆえ本発明はまた、甘味料としてのAFの新規な適用に関する。
【００８７】
好ましくは、AFは本発明の方法によって調製される。
【００８８】
本発明のさらなる局面は以下を包含する：
菌類感染藻類、菌類、または藻類単独から酵素を単離することを含有する酵素α-1,4-グルカンリアーゼ (GL)の調製方法；
配列番号１、または配列番号２、または配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の変異体を含む酵素。
【００８９】
配列番号９、または配列番号10、または配列番号11のアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の変異体を含む酵素；
酵素α-1,4-グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、ここでその配列が自然環境に存在しない（すなわち、この酵素を発現し得る細胞生物のゲノムの一部を形成しない）、好ましくは、ここでヌクレオチド配列はDNA配列である；
DNA配列が配列番号３、または配列番号４、または配列番号７、または配列番号８のいずれかに同一である、または相補的である、または実質的相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を少なくとも含むヌクレオチド配列、好ましくはここでこの配列が単離された形態である；
DNA配列が配列番号12、または配列番号13、または配列番号14のいずれかに同一である、または相補的である、または実質的相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を少なくとも含むヌクレオチド配列、好ましくはここでこの配列が単離された形態である；および、
酵素（好ましくはGL）を精製するためのβーシクロデキストリンの使用。
【００９０】
本発明の他の好ましい実施態様は、以下のいずれかを含む：本明細書に記載のDNA配列を導入する結果としてAFを生産する能力を有する形質転換された宿主生物；微生物である形質転換された宿主生物、好ましくは宿主生物は、細菌、糸状菌、菌類および酵母からなる群から選択され；好ましくは宿主生物は、Saccharomyces,Kluyveromyces,Aspergillus,Trichoderma Hansenula,Pichia,Bacillus Streptomyces,Eschericia（例えば、Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, bacillus sublilis, Bacillus amyloliquefascien, Eschericia coli）からなる群から選択され；糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法、この方法は酵素α-1,4-グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列を発現する形質転換された宿主生物の使用を含み、好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列であり、好ましくはDNA配列は本明細書に記載の配列の１つである；本明細書に記載のヌクレオチド配列を取り込んだベクター、好ましくはベクターは複製ベクターであり、好ましくはベクターはプロモーター配列から下流のヌクレオチド配列を含有している発現ベクターであり、好ましくはこのベクターは（耐性マーカーなどの）マーカーを含有している；そのようなベクターで形質転換された細胞生物または細胞株；産物α-1,4-グルカンリアーゼあるいは同酵素をコードする任意のヌクレオチド配列または一部分を生産する方法であり、この方法はそのようなベクターで形質転換されたそのような生物（または細胞株由来の細胞）を培養する工程、および産物を回収する工程を含有する。
【００９１】
特にこの発現系では、酵素は、好ましくは精製を容易にするように分泌されるべきである。そのために成熟酵素をコードするDNAを、選択した宿主由来のシグナル配列、プロモーターおよびターミネーターに融合させる。
【００９２】
Aspergillus nigerにおける発現のため、gpdA(Aspergills nidulansのグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来) プロモーターおよびシグナル配列を成熟リアーゼをコードするDNA(例えば配列番号３または配列番号４)の5'末端に融合する。A. nigerのtrpC遺伝子のターミネーター配列をその遺伝子の3'末端におく (Punt, P.J.ら、(1991):J.Biotech. 17,19-34)。この構築物をE.coliのための複製オリジンおよび選択オリジンならびにA.nigerのための選択マーカーを含むベクターに挿入する。 A.nigerのための選択マーカーの例としては、amdS遺伝子、argB遺伝子、pyrG遺伝子、hygB遺伝子、BmlR遺伝子などがあり、すべて形質転換体の選択に用いられてきた。このプラスミドをA.nigerに形質転換し得、そして成熟リアーゼを形質転換体の培養液中から回収し得る。最後に、この構築物を、培養液中でのリアーゼのタンパク質分解を減少されるめにプロテアーゼ欠損株に形質転換し得る (Archer D.B.ら、(1992):Biotechnol.Lett.14,357-362) 。
【００９３】
宿主としてAspergillus  nigerのかわりに、それらについて良好な発現系が公知である、以下のような他の工業的に重要な微生物を使用し得る； Aspergillus oryzae, Aspergillus sp.,Trichoderma sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp., Bacillus subtilis, B.amyloliquefaciens, Bacillus sp., Streptomyces sp.,またはE. coli。
【００９４】
以下の試料をブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RYに1994年6月20日に寄託した：
プラスミドpGL1保有E.coli（NCIMB 40652)-[参考DH5α-pGL1]；および
プラスミドpGL2保有E.coli（NCIMB 40653)-[参考DH5α-pGL2]。
【００９５】
以下の試料はブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP)、Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3, Oban, Argyll, Scotland, United Kingdom, PA34 4AD に1994年10月11日に寄託の承認がされた。
【００９６】
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis（CCAP 1373/1）−[参考GLQ-1 (Qingdao）]。
【００９７】
このように、本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物NCIMB 40652または寄託物NCIMB 40653の対象であるプラスミドに存在するGLコード配列の発現により取得し得るGL酵素；および寄託物CCAP 1371/1の対象である菌類感染藻類から取得し得るGL酵素を包含する。
【００９８】
以下の試料をブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, United Kingdom, AB2 1RYに1994年10月３日に寄託した：
プラスミドpMC保有E.coli（NCIMB 40687)-[参考DH5α-pMC]；
プラスミドpMV1保有E.coli（NCIMB 40688)-[参考DH5α-pMV1]；および
プラスミドpMV2保有E.coli（NCIMB 40689)-[参考DH5α-pMV2]。
【００９９】
プラスミドpMCは、Morchella costataから作製されたゲノムライブラリーから単離された4.1 kbのフラグメントを含有するpBluescript II KSである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
【０１００】
プラスミドpMV1は、Morchella vulgarisから作製されたゲノムライブラリーから単離された2.45 kbのフラグメントを含有するpBluescript II KSである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子の5'末端を含有する。
【０１０１】
プラスミドMV2は、Morchella vulgarisから作製されたゲノムライブラリーから単離された3.1 kbのフラグメントを含有するpPUC19である。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子の3'末端を含有する。
【０１０２】
以下の考察において、MCはMorchella costataを表し、MVはMorchella vulgarisを表す。
【０１０３】
言及したように、 Morchella vulgaris由来のGLコード配列は,２つのプラスミドに含有された。図15を参考にすると、pMV1は454位から2902位までのヌクレオチドを含有する；そして、pMV2は2897位から（これを含む）下流のヌクレオチドを含有する。図12および13を参考にすると、コード配列を結合するために、pMV2を制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化し、次に目的のフラグメントを制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化したpMV1に挿入し得る。
【０１０４】
このように、本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物NCIMB 40687または寄託物NCIMB 40688および寄託物NCIMB 40689の対象であるプラスミドに存在するGLコード配列の発現により取得し得るGL酵素を包含する。
【０１０５】
以下の試料はまたブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP)、Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3, Oban, Argyll, Scotland, United Kingdom, PA34 4AD に1994年10月11日に寄託の承認がされた。
【０１０６】
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis（CCAP 1373/2）−[GLSC-1(California）]。
【０１０７】
このように、本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物CCAP 1373/2の対象である藻類から取得し得るGL酵素を包含する。
【０１０８】
本発明はここで実施例によってのみ記載される。
【０１０９】
以下の実施例において、添付する以下の図に言及する：
図１は、染色した菌類感染藻類を示す；
図２は、染色した菌類感染藻類を示す；
図３は、菌類菌糸の切片を示す；
図４は、菌類感染藻類の切片を示す；
図５は、菌類感染藻類の切片を示す；
図６は、pGL1のプラスミド地図を示す；
図７は、pGL2のプラスミド地図を示す；
図８は、配列番号３として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す；
図９は、配列番号１と配列番号２とのアライメント（alignment）を示す；
図10は、顕微鏡写真である。
【０１１０】
図11は、pMCのプラスミド地図を示す；
図12は、pMV1のプラスミド地図を示す；
図13は、pMV2のプラスミド地図を示す；
図14は、Morchella costataから得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'の非翻訳領域を示す；
図15は、Morchella vulgarisから得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'非翻訳領域を示す；
図16は、Morchella costataおよびMorchella vulgaris由来のGLコード配列ならびに非翻訳領域の比較を示す；
図17は、配列番号５として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す；
図18は、配列番号６として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す；
図19は、AFの存在または非存在での酸素消費のグラフを示す；そして、
図20はTLCプレートを示す。
【０１１１】
より詳細には、図１は、Gracilariopsis lemaneiformisの上部および下部での菌類を表すCalcoflour White染色を示す（108×および294×）。
【０１１２】
図２は、菌類を有するGracilariopsis lemaneiformisのPAS/Anilinblue Black染色を示す。菌類は顕著により高い炭水化物を含有する。
【０１１３】
図３は、藻類細胞の厚い壁（w）間で成長する二つの薄い壁の菌類菌糸（f）の縦方向で表面付近の切片を示す顕微鏡写真である。藻類のクロロプラスト中のチラコイド膜に留意（矢印）。
【０１１４】
図４は、クローン２プローブを用いたアンチセンス検出（上列）が、次の切片のCalcoflour White染色（下列）により示される菌類に、限定されるようであることを示す（46×および108×）。
【０１１５】
図５は、クローン２プローブを用いた強いアンチセンス検出がGracilariopsis lemaneiformis内の菌類上に見出されたことを示す（294×）。
【０１１６】
図６は、プラスミドpGL1の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.8kbのフラグメントを含有するpBluescript II KSである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
【０１１７】
図７は、プラスミドpGL2の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.6kbのフラグメントを含有するpBluescript II SKである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
【０１１８】
図９は、配列番号１（GL1）と配列番号２（GL2）とのアライメントを示す。GL1の総残基数は1088であり；GL2の総残基数は1091である。比較をするにあたって構造-遺伝子的マトリックス（structure-genetic matrix）を用いた（Open gap cost:10; Unit gap cost:2）図９中で、並べた二つの残基が同一であることを示す記号は「:」であり；並べた二つの残基が類似であることを示す記号は「.」である。「類似である」といわれるアミノ酸はA,S,T; D,E; N,Q; R,K; I,L,M,V; F,Y,Wである。全体で、同一が845アミノ酸（すなわち77.67%）存在し；類似が60アミノ酸（5.51%）存在する。GL1に挿入したギャップの数は３であり、GL2に挿入したギャップの数は２である。
【０１１９】
図10は、藻類の壁（W）間で成長した菌糸（f）の顕微鏡写真である。藻類細胞中の紅藻デンプン（s）およびチラコイド（矢印）の粒子に留意のこと。
【０１２０】
図14において、総塩基数は4726であり、DNA配列組成は：1336Ａ；1070Ｃ；1051Ｇ ；1269Ｔである。ATG開始コドンを太字で示す。イントロンには下線を付す。終止コドンを斜体で示す。
【０１２１】
図15において、総塩基数は4670であり、DNA配列組成物は：1253Ａ；1072Ｃ；1080Ｇ ；1265Ｔである。ATG開始コドンを太字で示す。イントロンには下線を付す。終止コドンを斜体で示す。
【０１２２】
図16において、二つの並べられた配列は、MC(総残基数1066)およびMV(総残基数1070)から得られた配列である。使用した比較マトリックス(comparison matrix)は、構造−遺伝的マトリックス(structure-genetic matrix)である(Open gap cost：10；Unit gap cost：２)。図中、二つの並んだ残基が同一であることを示す記号は「：」である。二つの並んだ残基が類似であることを示す記号は「.」である。「類似」であるといわれるアミノ酸は：A,S,T;D,E;N,Q;R,K;I,L,M,V;F,Y,Wである。全体では、：同一：920(86.30%);類似：51(4.78%)である。MCに挿入されたギャップの数は１であり、MVに挿入されたギャップの数は１である。
【０１２３】
付属の配列リストにおいて：配列番号５は、Morchella costataから得られたGLのアミノ酸配列である；配列番号６は、Morchella vulgarisから得られたGLのアミノ酸配列である；配列番号７は、Morchella costataから得られたGLのヌクレオチド配列である；配列番号８は、Morchella vulgarisから得られたGLのヌクレオチド配列である。
【０１２４】
配列番号５においては総残基数は1066である。GL酵素は以下のアミノ酸組成を有する：
【０１２５】
【化１】
2005133102.tif 000002
【０１２６】
配列番号６においては総残基数は1070である。GL酵素は以下のアミノ酸組成を有する：
【０１２７】
【化２】
2005133102.tif 000003
【０１２８】
１．α-1,4-グルカンを酵素α-1,4-グルカンリアーゼで処理する工程を包含する、糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法であって、該酵素が実質的に純粋な形態で使用されることを特徴とする方法。
２．前記グルカンが前記α-1,4-結合以外の結合およびα-1,4-結合に加えて結合を含有する場合、前記α-1,4-グルカンリアーゼが他の結合を破壊し得る適切な試薬と協同して使用される、項目１に記載の方法。
３．前記グルカンがデンプンであり、かつヒドロラーゼ、好ましくはグルカノヒドロラーゼが前記α-1,4-グルカンリアーゼと協同して使用される、項目２に記載の方法。
４．前記ヒドロラーゼが、プルラナーゼまたはイソアミラーゼの少なくとも１つである、項目２または項目３に記載の方法。
前記α-1,4-グルカンリアーゼが、支持体に結合しているか、より好ましくは溶解された形態である、項目１から４のいずれかに記載の方法。
６．前記酵素が、菌類、好ましくはMorchella costataまたはMorchella vulgarisから、または菌類感染藻類、好ましくはGracilariopsis lemaneiformisから、または藻類単独、好ましくはGracilariopsis lemaneiformisからのいずれかで単離される、項目１から５のいずれかに記載の方法。
７．前記酵素が、菌類から、または菌類感染藻類から、または藻類単独から、該酵素によって分解されないゲルを使用して単離および／またはさらに精製される、項目６に記載の方法。
８．前記ゲルが、デキストリンまたはその誘導体に基づく、好ましくは該ゲルがシクロデキストリンである、より好ましくはβ-シクロデキストリンである、項目７に記載の方法。
９．前記酵素が、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列あるいはそれらの任意の変異体を含む、項目１から８のいずれかに記載の方法。
１０．前記酵素が、該酵素をコードするヌクレオチド配列を発現させることにより得られる、項目１から９のいずれかに記載の方法。
１１．前記ヌクレオチド配列が、DNA配列である、項目１０に記載の方法。
１２．前記DNA配列が、配列番号３、または配列番号４、または配列番号７、または配列番号８の任意のDNA配列に同一な、または相補的な、または実質的に相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を含む、項目１１に記載の方法。
１３．前記デンプンが、高濃度で使用される、例えば約25%までの溶液で使用される、項目３から１２のいずれかに記載の方法。
１４．前記基質が、緩衝液の存在下で前記酵素を用いて処理される、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記基質が、少なくとも実質的に純粋な水の存在下で前記酵素を用いて処理される、項目１から１３のいずれかに記載の方法。
１６．前記基質が、補因子の非存在下で前記酵素を用いて処理される、項目１から１５のいずれかに記載の方法。
１７．前記酵素が、アミロペクチンまたはデキストリンと組み合わせて使用される、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
１８． α-1,4-グルカンを酵素α-1,4-グルカンリアーゼで処理する工程を包含する、糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法であって、該酵素が、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列、あるいはその任意の変異体を含むことを特徴とする方法。
１９．本発明の方法で調製される、糖1,5-D-アンヒドロフルクトース。
２０．反応媒体の疎水性を増加させて、GL酵素の安定性および活性を増加させ得る、試薬の使用。
２１．抗酸化剤としてのAFの使用。
２２．甘味料としてのAFの使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２９】
実験
１可溶性酵素系：
1.1.菌類感染Gracilariopsis lemaneiformisから単離したリアーゼの安定性および活性に及ぼすpHの影響
二つの緩衝系、すなわちHOAcおよびNaOAc、ならびにクエン酸ナトリウム（クエン酸を5mMの濃度で）、37℃で試験した。試験したpHの範囲は、pH３からpH5.2であった。このリアーゼは、3.6と4.2との間のpH範囲で最大の活性を示した。pH３では、この酵素の安定性および活性は約90%減少した。pH5.2では活性は約64%減少した。しかしこの酵素は、このpHではpH３に比較してかなり安定であり、 pH5.2で得られたAFの収量はpH3.8で得られたAFの収量の75%であった。 HOAcおよびNaOAc緩衝液においての方がクエン酸緩衝液よりもいくぶんAFの収量が高かった。これは、AFのアッセイ法における二つの緩衝液（ AFアッセイ混合液中、最終濃度は125 μM)のいかなる異なった影響によるものではない。
【０１３０】
1.2.リアーゼの活性および安定性に及ぼす温度の影響。
【０１３１】
この実験は最適pH範囲で行った。25℃ではAFの生産は少なくとも９日間まで直線的であった。このことは、９日以内ではリアーゼの活性および安定性の損失がなっかたことを示す。温度が上昇するにつれて、酵素の安定性は減少した。
【０１３２】
この酵素の活性の、以下の温度での半減期は以下の通りであった。
【０１３３】
30℃  5日
37℃  2.5日
40℃  １日以下
50℃  １日以下
1.3.このリアーゼの安定性およびAFの収量に及ぼす基質濃度の影響
アミロペクチンおよびデキストリンはリアーゼに対して安定化する効果を有することが観察されたが、最も小さな基質であるマルトースではこのような効果を有さなかった。このことは可溶性酵素系および固定化酵素系の両方について証明された。
【０１３４】
AFの収量は、アミロペクチンの濃度が25%まで増加するにつれて増加した。デキストリンの場合は、濃度が30%を越えると、AFの収量は減少した(30%,40%および50%を試験した)。
【０１３５】
1.4.リアーゼの活性化および不活性化
活性化のために金属イオンは必要でないことが見出され、この酵素に触媒される反応は驚くほど純水中で進行し得た。反応混合液にEDTAを20 mMまで添加しても活性にはほとんど影響がないという事実は、明らかに本発明によるこのリアーゼ酵素の活性には、金属イオンが必要でないということを示す。
【０１３６】
このことは、AFの精製工程で、水を反応媒体とする場合は、反応系から塩を除去するイオン交換クロマトグラフィーの工程を省き得ることを意味する。しかし、反応混合液にNaClを0.85%(0.145 M)の濃度で含有すると、AFの収量を１倍まで増加し得る。
【０１３７】
1.5.基質特異性
可溶化デンプンは、デンプンの濃度が高くなる場合、冷却するにつれて固いゲルを形成する傾向がある。それゆえ、このαー1,4-グルカンリアーゼの基質として部分分解したデンプンを利用することは有利である。
【０１３８】
M.costataから単離した1,4-グルカンリアーゼの、異なるオリゴサッカリドに対する特異性を試験した。オリゴサッカリドは、マルトース(G2)、マルトトリオース(G3)、マルトテトラオース(G4)、マルトペンタオース(G5)、マルトヘキサオース(G6)、およびマルトヘプタオース(G7)であった。これらのオリゴサッカリドは水に８mg/mlの濃度で溶解した。この酵素アッセイは、150 μlのG2/G3/G4/G5/G6/G7の基質、120 μlの0.1 M MES pH 6.3および30 μｌの精製した酵素を含有した。反応混合液は30℃で60分間インキュベートした。後に、反応を３分間煮沸して停止させ、900 μlの無水エタノールを加えて沈殿させた。4℃で20,000×gで５分間遠心分離した後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥した。
【０１３９】
凍結乾燥させた試料を1000 μlのH2Oに溶解し、25 μlの試料をDionex HPLCにロードする前に0.22 μm Milliporeフィルターで濾過した。
【０１４０】
1.7.HPLC 
分析手順
分析は、GPM-2ポンプおよびPED検出器（パルス電流検出モード(pulse-amperometric detection mode)で使用した）からなるDionex 4500iクロマトグラフィーシステムで行った。
【０１４１】
陰イオン交換カラムはDionexのCarboPac PA-100(4×250mm)およびCarboPac PA-100ガードカラム(3×25mm)であった。
【０１４２】
溶離剤は200 mM 水酸化ナトリウム(A)、500 mM 酢酸ナトリウム(B)および18 Mオームの脱イオン水(C)であった。ポンプは方法番号１および方法番号２である２つの異なった方式でプログラムした。
【０１４３】
（方法番号１）
【０１４４】
【化３】
2005133102.tif 000004
【０１４５】
（方法番号２）
【０１４６】
【化４】
2005133102.tif 000005
【０１４７】
標準品：
グルコース、マルトース 、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、およびマルトヘプタオース（すべてSigma）、ならびに1,5-アンヒドロフルクトースを標準品として用いた。すべての化合物を18 Mオームの脱イオン水に溶解し、使用前に0.22 μm Milliporeフィルターで濾過した。
【０１４８】
1.7.結果：
分析により、M.costataから単離した精製酵素は、実際に1,5-アンヒドロフルクトース形成のためにマルトオリゴサッカリドを基質１として利用し得るということが示される。
【０１４９】
マルトースを基質として使用した場合、1,5-アンヒドロフルクトースはほとんど全く形成されなかったが、他のマルトオリゴサッカリド(G3-G7)を使用した場合、多量のこの化合物が生成された。
【０１５０】
より長いマルトオリゴサッカリドを使用した場合、より多量の1,5-アンヒドロフルクトースが得られたということが明らかである。
【０１５１】
この観察は、リアーゼが基質の非還元末端側から1,5-アンヒドロフルクトースを生成し、末端のグルコース分子のみを変化させないという理論と、良好に完全に対応している。
【０１５２】
1.8.AFの形成
M.costata由来のα-1,4-グルカンリアーゼは、デンプンを最終生成物の1,5-アンヒドロフルクトースに加水分解する。最終生成物は方法２のHPLCで示された。酵素アッセイは500 μlのアミロペクチン(20 mg/ml、水に溶解)、400 μlの 0.1 M MES pH 6.3および100 μlの精製した酵素を含有した。反応混合液を30℃でインキュベートし、インキュベーションの30分または120分後に煮沸して反応を停止させた。高分子量のオリゴサッカリドを３倍量の無水エタノールを加えて沈殿させ、試料を前述のように遠心分離して凍結乾燥した。試料を125 μl H2Oに溶解し、そのうち25 μlをHPLCカラムにのせた。
【０１５３】
HPLCの溶出プロフィールは、M.costata由来のα-1,4-グルカンリアーゼが、デンプンの加水分解により1,5-アンヒドロフルクトースを生成することを明らかに示す。インキュベーション30分後および120分後に等しい量の1,5-アンヒドロフルクトースが見出され、このことはこの酵素の活性が、最終生成物である1,5-アンヒドロフルクトースにより阻害されないことを示す。
【０１５４】
この方法で調製されたAFの13Ｃ NMRスペクトル（水）は、以下の信号を生じさせる１つの主要な形態をとることを示す：δ 93.5(カルテット(quart),C-2),81.5(CH,C-5),77.7(CH,C-3),72.6(CH2,C-1),69.8(CH,C-4),62.0(CH2,C-6)。帰属はH-H、C-HおよびC-H 2D相関スペクトルに基づいた。
【０１５５】
1.6.リアーゼのプルラナーゼおよびイソアミラーゼとの協同作用の影響
表１に見られるように、反応混合液にプルラナーゼを含有すると、基質として可溶性デンプンを使用するかアミロペクチンを使用するかに依存して、AFの収量が約15〜23%明らかに増加した。
【０１５６】
【化５】
2005133102.tif 000006
【０１５７】
反応混合液は、示したように0.3 mlの水中の2%バレイショアミロペクチン(Sigma)または0.3mlの２%可溶性デンプン(Merck)、2 μlのリアーゼならびに0.36単位プルラナーゼ(BM)を含有していた。
【０１５８】
反応は30℃で１日行った。反応終了時に、試料をAFおよびGlcの分析に用いた。
【０１５９】
イソアミラーゼの場合は、このリアーゼの至適pHがPseudomonasのイソアミラーゼの至適pH(pH3.0〜4.5)と重なるので有利である。しかし、問題はイソアミラーゼが過剰量の長鎖アミロースを生成することである。過剰量の長鎖アミロースは溶液中で沈殿し、それゆえもはやリアーゼの基質としては適切ではない。リアーゼのイソアミラーゼとの協同作用は、アミロースの鎖が長すぎない場合、効率的であると期待され得る。
【０１６０】
２．固定化酵素系
スクシンイミド活性化Sepharose(Affigel 15ゲル,Bio-Rad)およびグルタルアルデヒド活性化シリカゲル(BM)を使用して、リアーゼの固定化を達成した。 Affigel 15ゲルに固定化した後のリアーゼ活性の回収は40%〜50%の間であった。固定化後にまだ活性であるが、立体障害のため（特にデンプンのような巨大分子の場合に）、基質に接近し得ないリアーゼもいくらか存在し得る。工業で使用される固定化酵素は、通常50%付近の活性回収を有する。
【０１６１】
Affigel 15ゲル固定化リアーゼについての最も興味深いことは、pH5.5で安定性が大きく向上することである。カラムをこのpHで操作する場合、安定性は少なくとも16日間の長さであった。プルラナーゼの至適pHがpH5.5付近であることを考慮すると、安定性におけるpHの変動は大変重要である。このことは、リアーゼおよびプルラナーゼが同じ物理化学的環境で同じ反応器で、効率的に協同作用するための必要条件である。可溶性のリアーゼは、3.6と4.2との間の至適pHを有し、、このpH範囲ではプルラナーゼはほとんどあるいは全く活性を示さない。
【０１６２】
シリカゲル固定化リアーゼでは、活性回収は非常に高く、80〜100%付近であった。しかし、シリカゲル固定化酵素は、カラムをpH3.8あるいはpH5.5のいずれで操作しても安定でなかった。いくらかのリアーゼがシリカゲルビーズの表面に吸着していて、カラムを洗浄するたびにシリカゲルから徐々に放出された可能性がある。それゆえ、高い回収率とカラム活性の減少に寄与しているのは吸着したリアーゼであり得る。
【０１６３】
３．AFの精製
3.1.リアーゼ−アミロペクチン/可溶性デンプン系
この系では、反応系は反応終了時に、AF、限界デキストリン、リアーゼ、および緩衝塩を含有した。AFは巨大分子（限界デキストリンおよびリアーゼ）からエタノール沈殿（最終濃度50%）により分離した。沈殿されない低分子量のアミロペクチンは、Amicon YM3膜（カットオフ3,000)をウルトラフィルトレーションして分離した。エタノールは、ロータリーエバポレーター内で40℃で蒸発させた。緩衝塩を、混合イオン交換剤によりAFから除去した。精製した固体のAFは、凍結乾燥によって得られた。
【０１６４】
3.2. リアーゼ−プルラナーゼ/アミロペクチン/可溶性デンプン系。
【０１６５】
この系では、最終産物は、AFおよびグルコースである。少なくとも実質的に純粋なAFの試料を調製する場合は、副生成物であるグルコースを除去しなければならない。これは酵素法で達成し得る。最初にグルコースは、グルコースオキシダーゼによってグルコン酸および過酸化水素に変換される。
【０１６６】
形成されたH2O2を除去するためにカタラーゼが必要である。H2O2はAFを酸化して現時点では構造が未知の２つの化合物にする。AF調製の際の他の夾雑物は、AFの酸化生成物である。 AFは空気中の程度の酸素によって、特に高温、高濃度のAF、および長時間の曝露において、徐々に酸化され得ることが観察された。
【０１６７】
グルコン酸はイオン交換クロマトグラフィーによって緩衝塩とともに除去された。
【０１６８】
この系では、低分子量のアミロペクチン分子は、あるいはウルトラフィルトレーションを使用する代わりに、アミログルコシダーゼによって加水分解され得る。
【０１６９】
3.3.AFの純度の確認
AF調製物の純度を、TLC、Dionex、およびNMRによって確認した。
【０１７０】
3.4.アンヒドロフルクトースの酸化防止活性の分析
電気化学的酸素消費：
方法
AFの活性を、メチルリノレートエマルジョンにおいて、JorgensenおよびSkibsted(Z. Lebensm. Unters. Forsch.(1993)196:423-429)記載を以下のように若干変更して検討した： pH=5.8 の5.0 mM リン酸緩衝水溶中の液および乳化剤としての0.2 w/w % Tween 20中の、1.33 mM メチルリノレートエマルジョン5.00 mlに、AFを以下の濃度で加えた：０、15、146、および680 μM。この系の酸化は、最終濃度0.26 mMの50 μl 0.26 Mメトミオグロビン(MMb)を添加することにより開始した。反応開始直後、試料を恒温化した(25.0±0.1℃)70 μlの閉鎖セルに注入し、系に酸素が拡散することを効果的に防いだ。酸素消費は、PCデータ収集プログラムに連結したClark電極で測定した。相対的な酸素濃度(%)を、30秒ごとに記録した。
結果
異なった試料についての酸素消費量に対応する曲線を、図19に例示する。AFを添加しなかった試料については、酸素消費量における相対的減少が、試料を注入した直後に見られる。AFを含有する試料については、曲線が急に出現して酸素濃度が減少する前に、遅延相(lag-phase)が観察される。遅延相の後、AFを添加しない試料に比較してわずかな酸素消費速度の減少が観察される。最も多量のAFを含む試料が、最も長い遅延相を有するという傾向が観察される。なお、酸素消費速度はこれらの試料ではより低いので、これは対照(0 μM)の傾斜角と比較して、より小さな傾斜角の曲線により見られる。
【０１７１】
ESR 分析
方法
ヒドロキシラジカルを、H2O2(0.17 mM)およびFeSO4(4.8 μM)を用いてフェントン反応によって生成した。生成したラジカルを5,5-ジメチル-1-ピロリン N-オキシド(DMPO,9.7 mM)によって捕集した。AFを1.3 mMおよび6.3mMの濃度で添加した。ローズマリー(Rosmarinus officinalis L.)の水溶性抽出物を0.25 mg/mlの濃度（グラムで、1.26 mMのAFに相当する）で分析した。測定は、以下のような分光光度計の設定で、120秒に室温(20 ± 1℃)で行い、300秒後に同一の反応混合液について繰り返した：中心磁場(center field) 3475.60 G;掃引幅 55 G;マイクロ波出力 20 mW;変調周波数 100 kHz;変調幅 1.01 G;受信増幅比 1.00・105;変換時間 81.92 ms 時間定数 163.84 ms および掃引時間 83.89s。
結果
生成されたヒドロキシラジカルをDMPOによって捕集した。スピンアダクト(spin adduct)は特徴的な１:２:２:１ ESRスペクトルを生じさせる。スペクトルのピーク高さは、生じたスピンダクトの量に比例する。DMPOおよびAF両方の添加は、スピントラップとAFとの間での競合を生じさせる。ピーク高さの減少は、AFの良好な捕捉活性(scavenging activity)を示す。
【０１７２】
【化６】
2005133102.tif 000007
【０１７３】
1.3 mM AFの濃度では、ヒドロキシラジカルの捕捉活性は見られなかったが、6.3 mM AFでは、ピーク高さが減少し、これは生成されたヒドロキシラジカルの一部がAFにより捕捉されることを示す。
【０１７４】
４．抗酸化剤としてのAFの使用
実施例  4.1
50%マヨネーズにおける抗酸化剤としてのAFの使用
50%マヨネーズは、料理店および小売商の両方で、サラダ、オープンサンドなどに使用される。50%マヨネーズは低油含有であるので、低カロリー使用に適切である。
【０１７５】
代表的なマヨネーズの組成は以下の通り：
大豆油                      50.0%
タラゴン酢                   4.0%
卵黄                         3.5%
砂糖                         3.0%
塩                           1.0%
ソルビン酸カリウム           0.1%
水                          35.2%
MAYODAN 602                  3.0%
レモン香料 10251             0.2%
MAYODAN 602は、良質で安定な油の分散および要求される粘性を確保し、それゆえ50%マヨネーズに長い貯蔵期間を提供する。。
【０１７６】
香料 10251は、マヨネーズに新鮮なレモンの風味を与える天然のレモン香料である。
【０１７７】
代表的なマヨネーズは以下の方法で調製される：
1)MAYODAN 602、砂糖、および塩を乾燥混合する。粉末１対油２の割合で油中に分散させる。
【０１７８】
2)香料およびソルビン酸カリウムを水に加え、Korumaミキサーに注ぐ。1)を加える。
【０１７９】
3)卵黄を加える。
【０１８０】
4)減圧下で連続的に油を加える。
【０１８１】
5) 油の2/3を（ゆっくり）加えた後、タラゴン酢を残りの1/3の油と混ぜ合わせ、加える。
【０１８２】
以下のデータは、AFを抗酸化剤として加えた場合、公知の食物抗酸化剤であるGRINDOX 142 およびGRINDOX 1029に匹敵することを示す。
【０１８３】
GRINDOX 142：
アスコルビルパルミテート        10%
プロピルガレート                20%
クエン酸                        10%
食物用乳化剤                    60%
25℃での形状                    ペースト
色                              灰色から薄茶色(pale brown)
密度                            1.1 g/ml
（全百分率は重量による）
GRINDOX 1029：
アスコルビルパルミテート        20%
天然トコフェロール              20%
食物用乳化剤                    60%
25℃での形状                    ペースト
色                              淡褐(light brown)
密度                            1.0 g/ml
（全百分率は重量による）
試験手順において、抗酸化剤を、抗酸化剤濃度が約500 ppmの桁となるようにマヨネーズに添加した。次に、マヨネーズを純02を含有する80℃のボンベ熱量計においた。そして、生成物が実質的に酸化し始めるまでの誘導期間を測定した。
【０１８４】
結果は以下のとおりである。
【０１８５】
試料：                                         IP(時間) 
１．ブランク                                     28,0
２．+500 ppm GRINDOX 142                         35,0
３．+500 ppm GRINDOX 1029                        33,3
４．+550 ppm GRINDOX 1029                        34,3
５．+500 ppm 1,5-D-アンヒドロフルクトース        32,0
(IP時間-＝誘導期間)
これらの結果は、AFが優れた食物抗酸化剤であり、そして公知の食物抗酸化剤であるGRINDOX 142 および GRINDOX 1029に匹敵するということを示す。
【０１８６】
実施例4.2
サラダドレッシングにおける抗酸化剤としてのAFの使用
50%油を含むヨーグルトサラダドレッシング
50%油を含むヨーグルトサラダドレッシングは、サラダ、ジャガイモ、生野菜サラダ、肉、魚および温野菜に使用される。
組成
大豆油                         50.0%
ヨーグルト（プレーン）         39.0%
酢(10%)                         3.5%
砂糖                            3.0%
卵黄                            2.0%
塩                              1.0%
ソルビン酸カリウム              0.1%
MAYODAN 525                     1.4%
酸マスキング香料2072            0.02%
MAYODAN 525は、独特の乳化安定性を与え、離液を防ぎ、均一な油分散と粘性を確保し、生産プロセスへの寛容を向上させ、長い保存期間を確保する。
【０１８７】
香料2072は天然物と同一の、酸マスキング香料であり、pH値に影響を与えることなく、酸味を減少させる。
プロセス
1.MAYODAN 525、砂糖、および塩を乾燥混合する。粉末１対油２の割合で油に分散させる。
【０１８８】
2.香料,ソルビン酸カリウム、およびヨーグルトを水に加え、Korumaミキサーに注ぐ。1)を加える。
【０１８９】
3.卵黄を加える。
【０１９０】
4.減圧下で連続的に油を加える。
【０１９１】
5.油の2/3を（ゆっくり）加えた後、酢を残りの1/3の油と混ぜ合わせ、加える。
【０１９２】
6.必要に応じて香辛料を加える。
試験結果：
試料：                                  IP(時間) PF
１．ブランク                              37.2              1.00
２．500 ppm 無水フルクトース              39.5              1.06
３．800 ppm GRINDOX 1032                  43.3              1.07
(IP-誘導期間);(PF-保護期間）
保護要素(PF):
温度ごとに以下のように定義される
PF＝抗酸化剤を加えた油のIP/抗酸化剤を加えない油のIP
寿命延長(life extension)(LE)(%):
LE＝(PF-1.0)×100
６．α-1,4-グルカンリアーゼの調製
緒言
本発明のさらなる実施態様に関して、AFの調製に使用する酵素α-1,4-グルカンリアーゼは、菌類感染藻類、好ましくは菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis、より好ましくは菌類感染Qingdao（中国）由来のGracilariopsis lemaneiformisから単離し得る。
【０１９３】
あるいは、この酵素は菌類から得取され得る。例えば、菌類はDiscina perlata, Discina parma, Gyromitra gigas, Gyromitra infula, Mitrophora hybrida, Morchella conica, Morchella costata, Morchella elata, Morchella hortensis, Morchella rotunda, Morchella vulgaris, Peziza badia, Sarcosphaera eximia, Disciotis venosa, Gyromitra esculenta, Helvella crispa, Helvella lacunosa,Leptopodia elastica, Verpa digitaliformis,およびMorchellaの他種のいずれかであり得る。好ましくは菌類はMorchella costataまたはMorchella vulgarisである。
【０１９４】
本発明のさらなる実施態様に関して、AFの調製に使用する酵素α-1,4-グルカンリアーゼは、藻類単独、好ましくはGracilariopsis lemaneiformis、より好ましくはSanta Cruz（カリフォルニア）由来のGracilariopsis lemaneiformisから単離し得る。
【０１９５】
最初の酵素精製は、Yuら（前出）に記載の方法により実施し得る。しかし、好ましくは、最初の酵素精製は、精製工程下で分解しない固体支持体を使用する、至適化された手順を含む。このゲル支持体は、標準的な実験室タンパク質精製設備に適合するという有利性を有する。この至適化した精製ストラテジーの詳細を、後に示す。精製はタンパク質精製のための公知の標準的な技術により終結される。
【０１９６】
酵素の純度は、補足の電気泳動技術を使用して容易に確認し得る。
【０１９７】
Ａ．供給源＝菌類感染藻類
以下の配列情報を、下記のPCR反応のためのプライマーを作成するため、およびそれぞれのヌクレオチド配列から生成するアミノ酸配列を確認するために使用した。
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis由来のペプチドから組み合わせたアミノ酸配列
【０１９８】
【化７】
2005133102.tif 000008
【０１９９】
プライマーＡおよびＢを作成するために使用したアミノ酸配列(27-34)(Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val)
プライマーＡ
【０２００】
【化８】
2005133102.tif 000009
【０２０１】
プライマーＢ
【０２０２】
【化９】
2005133102.tif 000010
【０２０３】
プライマーＣを作成するために使用したアミノ酸配列(45-50)(Gly Gly His Asp Gly Tyr)
プライマーＣ
【０２０４】
【化１０】
2005133102.tif 000011
[配列は相補鎖に対応する。]
プライマーＥを作成するために使用したアミノ酸配列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys Phe Gly)
プライマーＥ
【０２０５】
【化１１】
2005133102.tif 000012
【０２０６】
[配列は相補鎖に対応する。]
プライマーF1およびF2を作成するために使用したアミノ酸配列(1-6)(Tyr Arg Trp Gln Glu Val)
プライマーF1
【０２０７】
【化１２】
2005133102.tif 000013
【０２０８】
プライマーF2
【０２０９】
【化１３】
2005133102.tif 000014
【０２１０】
第１回目のPCR増幅から得られた配列（クローン１）
【０２１１】
【化１４】
2005133102.tif 000015
【０２１２】
第２回目のPCR増幅から得られた配列（クローン１）
【０２１３】
【化１５】
2005133102.tif 000016
【０２１４】
第３回目のPCR増幅から得られた配列（クローン２）
【０２１５】
【化１６】
2005133102.tif 000017
【０２１６】
A.1. Gracilariopsis lemaneiformisの細胞学的検討
A.1.1.1 Gracilariopsis lemaneiformisにおける菌類感染の検出
中国で収集したGracilariopsis lemaneiformisの切片は手で切断するかまたはパラフィン包埋した試料から切断した。切片化した試料を光学顕微鏡で注意深く検討した。菌類菌糸はGracilariopsis lemaneiformis内に明確に検出された。
【０２１７】
Gracilariopsis lemaneiformisの葉状体は、高度に整然として、ほぼ対象の特徴を示す細胞から成る。lemaneiformisの管状葉状体は大きい、無色の中心細胞、ならびにその周囲に伸長された、細長い楕円形の細胞、および小さい、丸い、赤く着色された周辺細胞から成る。全ての藻類細胞タイプは厚い細胞壁により特性づけられる。ほとんどの菌類菌糸は、大きな細胞の中心層および周辺層の中間相に見出される。これらの細胞は長く円筒形であるため藻類細胞と明確に区別し得る。菌糸の成長は、高度に整然とした藻類細胞の間の不規則性として観察された。最も頻繁な菌糸の方向は、藻類の葉状体の主軸に沿った向きである。中心および周辺に向かう側枝がいくつかの場合で検出される。菌糸は藻類の内性／着生第二世代と混同され得ない。
【０２１８】
Calcofluor Whiteはキチンおよびセルロースを含有する組織を染色することが知られている。キチンとの反応は、４個の共有結合した末端のn-アセチルグルコサミン残基を要求する。セルロースは、いくつかの藻類では微量に存在し得るが、ほとんど高等植物に限定されていることが一般に受け入れられている。さらにキチンはGracilaria内には存在しないことが公知である。
【０２１９】
Calcofluor Whiteは切片化したGracilariopsis lemaneiformisの試料中の菌類菌糸の細胞壁に相当する領域を染色することが見出された。
【０２２０】
紫外線下で観察すると、菌糸はGracilaria組織の淡青色の背景に対して明確な白色を示す（図１を参照のこと）。キチンはGracilariaには存在しないが、ほとんどの菌類においては細胞壁の主成分である。これらの観察に基づき、本発明者らは検査した藻類は菌類に感染していると結論する。検討したGracilariopsis lemaneiformis切片の下部の40％は、菌類菌糸に感染していることが見出された。藻類の先端では検査したGracilariopsis lemaneiformisの切片の25％が感染していることが見出された。
【０２２１】
Periodic acid Schiff（PAS）およびAniline blue blackでのGracilariopsis lemaneiformis切片の染色は、藻類細胞と比較して菌類細胞内の顕著に高い炭水化物含有を示した（図２を参照のこと）。Safranin OおよびMalachit Greenは、菌類に感染した高等植物に見出されるのと同じ菌類細胞の呈色反応を示した。
【０２２２】
Acridin OrangeとGracilariopsis lemaneiformis切片との反応は、明確に菌類の不規則な成長を示した。
【０２２３】
A.1.1.2 電子顕微鏡検査
Calcofluor Whiteを用いて菌類を検出した、15μmの厚さの切片を有するスライドを２% OsO4で固定し、水で洗浄し、そしてジメトキシプロパンと無水アルコールで脱水した。アセトンとSpurr樹脂の1:1混合液の一滴をガラススライド上の各々の切片に滴下し、そして１時間後純粋な樹脂の一滴で置き換えた。樹脂を充填したゼラチン包埋カプセルを切片の表面に静置し４℃で一晩放置した。55℃で８時間重合した後、樹脂ブロックに付着した厚い切片は、液体窒素に浸すことによりスライドから分離され得た。
【０２２４】
ブロックの形を整え、ミクロトーム上でダイヤモンドナイフを用いて、100nmの厚さの切片を切断した。切片を酢酸ウラニル水溶液およびクエン酸鉛で染色した。切片を電子顕微鏡内で、80kVで検討した。
【０２２５】
この検査は光学顕微鏡での観察を確認し、リアーゼを生産する中国の株のG. lamneiformisが菌類の寄生体あるいは共生体に感染しているというさらなる証拠を提供した。
【０２２６】
菌類菌糸は、長さ50-100mlおよび直径僅か数ミクロンの管状細胞から作られている。この細胞は隣接した細胞の間の隔壁で連続的に整列されている。時折分枝も見られる。菌糸は、壁を貫通したり細胞を損傷したりすることなく藻類葉状体の厚い細胞壁の間に成長する。このような共生関係（mycophycobiosisと呼ばれる）はいくつかの糸状海洋菌類および大きな海藻間で起こることが知られている（DonkおよびBruning, 1992- 藻類中、および藻類上での水生菌類の生態学。Reisser, W.(編):Algae and Symbioses: Plants, Animals, Fungi, Viruses, Interactions Explored. Biopress Ltd., Bristol.）
図10の顕微鏡写真を検討すると、藻類細胞および菌類細胞の間のいくつかの違いに気付き得る。藻類の数μmの厚さの壁と対照的に、菌類の細胞壁は僅か100〜200nmの厚さである。チラコイド膜を有するクロロプラストおよび紅藻デンプン粒子のような植物に典型的なオルガネラが、藻類細胞内には見られ得るが、菌類内には見られない。
【０２２７】
紅藻類の細胞間の連結は壁孔プラグ（pit plug）あるいは壁孔連絡と呼ばれる特異的な構造により特徴付けられる。この構造は突起した、電子密核（electron dense core）であり、それらは藻類分類学において重要な特徴である（Pueschel, C.M.: 紅藻類の壁孔プラグの超構造の拡張した概観。J. Phycol. 25, 625 (1989)）。本発明者らの試料では、このような連絡は頻繁に藻類葉状体内で観察された。しかし、菌類の細胞の間には全く見られなかった。
【０２２８】
A.1.2 インサイチュハイブリダイゼーション実験
インサイチュハイブリダイゼーション技術はアンチセンスリボヌクレトチド配列のmRNAへのハイブリダイゼーションの原理に基づく。この技術はmRNAが存在する顕微鏡切片中の領域を視覚化するために用いられる。この特定の場合、この技術をGracilariopsis lemaneiformis切片中の酵素α-1,4-グルカンリアーゼを局在化するために用いた。
【０２２９】
A.1.2.1 インサイチュハイブリダイゼーションのための35Ｓ標識したプローブの調製
第３のPCR増幅からの238 bp（クローン２と呼ばれる（前記参照））をpGEM-3Zf(+)ベクター（Promega）にクローン化した。アンチセンスRNAの転写はSP6プロモーターで駆動し、センスRNAの転写はT7プロモーターで駆動した。Ribonuclease protection assay kit (Ambion)を以下のとおり改変して使用した。転写産物を６％シーケンシングゲルで泳動して、取り込まれていないヌクレオチドを除去し、T7RNA polymerase in vitro Transcription Kit (Ambion)で提供される溶出緩衝液で溶出した。アンチセンス転写産物は23の非コードヌクレオチドを含み、一方センス転写産物は39の非コードヌクレトチドを含んでいた。ハイブリダイゼーションのために107cpm/mlの35Ｓ標識したプローブを用いた。
【０２３０】
インサイチュハイブリダイゼーションは本質的にLangedaleら（1988）に記載のように実施した。ハイブリダイゼーションの温度は45℃が至適であることが見出された。45℃で洗浄した後、切片をKodaK K-5 photographic emulsionで覆い、３日間５℃で暗所に放置した（Langedale, J.A., Rothermel, B.A.およびNelson, T.(1988). Genes and development 2: 106-115. Cold Spring Harbour Laboratory を参照）。
【０２３１】
α-1,4-グルカンリアーゼのmRNAに対するリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション実験は、Gracilariopsis lemaneiformis内に検出された菌類の菌糸の上面および周辺に強いハイブリダイゼーションを示した（図４および５参照）。これはα-1,4-グルカンリアーゼが生産されていることを示す強い証拠であると考えられる。弱いランダムなバックグラウンド反応を両方のGracilariopsis lemaneiformisの藻類組織で検出した。この反応は、センスおよびアンチセンス両方のプローブについて観察された。菌類菌糸の上面の強い染色はアンチセンスプローブを用いたときにのみ得られた。
【０２３２】
これらの結果はハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程における45℃での標準的なハイブリダイゼーションの条件を用いて得られた。50℃では菌類の上面の染色は観察されなかったが、バックグラウンドの染色は同様であった。55℃に温度を上げることにより、センスおよびアンチセンスプローブの両方で、有意にかつ等しくバックグラウンドの染色が減衰した。
【０２３３】
相補的染色手順を用いた細胞学的検査に基づき、Gracilariopsis lemaneiformisは菌類に感染していることが結論される。感染は、藻類組織の下部において最も顕著である。
【０２３４】
切片化したGracilariopsis lemaneiformis試料において、インサイチュハイブリダイゼーションの結果は、ハイブリダイゼーションが菌類の感染が見い出される領域に限定されていることを明確に示す（図４参照）。この結果はα-1,4-グルカンリアーゼのmRNAがGracilariopsis lemaneiformisの菌類に感染した領域に限定されているように見えることを示す。これらの観察に基づき、本発明者らは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis内にα-1,4-グルカンリアーゼ活性が検出されると結論する。
【０２３５】

A.2. 酵素の精製と特徴付け
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα-1,4-グルカンリアーゼの精製は以下のように実施した。
【０２３６】
A.2.1   材料と方法
藻類は濾過により回収し、0.9% NaClで洗浄した。細胞をホモゲナイゼーションによって破壊し、次いで氷上で6×3分間、50mMクエン酸-NaOH pH6.2(緩衝液A)中で超音波破砕した。細胞破片(debris)は25,000×g、40分間遠心して取り除いた。この手順で得られた上清を無細胞抽出物とみなし、８〜25%の勾配ゲルで分離した後、活性染色およびウエスタンブロッティングに用いた。
【０２３７】
A.2.2 β-シクロデキストリンSepharoseゲルによる分離
無細胞抽出物をあらかじめ緩衝液Aで平衡化したβ-シクロデキストリンSepharoseゲル4Bカラム( 2.6×18cm )に直接かけた。このカラムを３倍量の緩衝液Aおよび1M NaClを含む２倍量の緩衝液Aで洗浄した。 α-1,4-グルカンリアーゼを緩衝液A中の2% デキストリンを用いて溶出した。活性のある画分をプールし緩衝液を20mM ビス-トリスプロパン-HCl (pH 7.0, 緩衝液B )に変えた。
【０２３８】
活性のある画分をあらかじめ緩衝液Bで平衡化したMono Q HR 5/5カラムにかけた。菌類のリアーゼを0.3Ｍ NaClの直線勾配で緩衝液Bを用いて溶出した。
【０２３９】
β-シクロデキストリンSepharoseクロマトグラフィーの後に得られたリアーゼ調製物は、あるいは150μlに濃縮し、FPLC条件下で操作されたSuperose12カラムにかけた。
【０２４０】
A.2.3   α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイならびに基質特異性、至適pH、および至適温度決定のための条件
α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイのための反応混合液は10mg/mlアミロペクチンおよび25mM Mes-NaOH (pH6.0)を含んだ。反応は30℃で30分間行い、3,5-デニトロサリチル酸試薬を加えて停止した。光学密度は、室温で10分間おいた後に550nmで測定した。
【０２４１】
A.3.  菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis由来のα-1,4-グルカンリアーゼのアミノ酸配列決定
A.3.1リアーゼのアミノ酸配列決定
リアーゼをClostridium histolyticum由来のエンドプロティナーゼArg-CまたはLysobacter enzymogenes由来のエンドプロティナーゼLys-Cのいずれかでで消化した。いずれも配列決定用グレードであり、Boehringer Mannheim,Germanyから購入した。エンドプロティナーゼArg-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの10M尿素、50mM メチルアミン、0.1M Tris-HCl、pH7.6に溶解した。N2で覆い、10μlの50mM DTTおよび5mM EDTAを添加し、N2下50℃で10分間、タンパク質を変性および還元させた。続いて、10μlの50mM Tris-HCl、pH8.0中の1μgのエンドプロティナーゼArg-Cを添加し、N2で覆い、消化を37℃で6時間行った。次のシステインの誘導体化のために、12.5μlの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下、暗所で室温、15分間インキュベートした。
【０２４２】
エンドプロティナーゼLys-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの8M尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.4に溶解した。 N2で覆い、5μlの45mM DTTを添加した後、N2下50℃で15分間、タンパク質を変性および還元させた。室温まで冷却した後、5μlの100mM ヨードアセトアミドを添加して、N2下、暗所で室温、15分間システインを誘導体化した。
【０２４３】
次に、90μlの水および50μlの50mM tricineおよび10mM EDTA、pH8.0中の5μgのエンドプロティナーゼLys-Cを添加し、消化をN2下37℃24時間行った。
【０２４４】
この結果生じたペプチドを溶媒A(水中の0.1% TFA)および溶媒B(アセトニトリル中の0.1% TFA)を用いて、VYDAC C18カラム(0.46×15cm; 10μm; The Separations Group ; California)上の逆相HPLCに分離した。選択したペプチドをパルス化高速液体サイクル(pulsed-liquid fast cycles)を用いてApplied Biosystems 476A シーケンサーによって配列決定する前に、Develosil C18 カラム(0.46×10cm; 3μm; Dr.Ole Schou, Novo Nordisk, Denmark)で再クロマトグラフした。
【０２４５】
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の酵素からのアミノ酸配列情報を以下、特に配列番号１、および配列番号２に示す。
【０２４６】
配列番号１は以下を有する：
アミノ酸残基数：1088
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
【０２４７】
【化１７】
2005133102.tif 000018
【０２４８】
配列番号２は以下を有する：
アミノ酸残基数：1091
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
【０２４９】
【化１８】
2005133102.tif 000019
【０２５０】
A.3.2   N-末端の分析
研究により天然のグルカンリアーゼ１のN-末端配列がブロックされていることが示された。脱ブロック化を本質的にLeGendreら（1993）[タンパク質およびペプチドのSDS-PAGEによる精製; Matsudaira, P. (編) A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing, 第２版; Academic Press Inc., San Diego; pp. 74-101]に記載の方法に従い、PVDF膜にブロットされたグルカンリアーゼ１を無水TFAで40℃で30分間処理することにより達成した。得られた配列はTALSDKQTAであった。これはグルカンリアーゼ１のクローン由来の配列（配列番号１の51位〜59位の配列）と一致し、グルカンリアーゼ１のN-末端残基がN-アセチルスレオニンであることを示す。配列番号１の1位〜50位の配列はシグナル配列を表す。
【０２５１】
A.4. 菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子のDNA配列決定
A.4.1   分子生物学のための方法
以下の改変を加えてSaunders（1993）に記載の方法のようにDNAを単離した：ポリサッカライドを、DNAからゲル精製のかわりにELUTIP-d（Schleicher & Schuell）精製により除去した（Saunders, G.W. (1993). 紅藻類ゲノムDNAのゲル精製：PCRに有用なDNAを単離するための、安価で迅速な方法。Journal of phycology 29(2): 251-254およびSchleicher & Schuell: ELUTIP-d. DNAの精製および濃縮のための迅速な方法。を参照のこと）。
A.4.2   PCR
目的のDNAの調製は、Gene Amp DNA Amplification Kit(Perkin Elmer Cetus, USA)を使用し、Taq ポリメラーゼを後に加え(PCRサイクルを参照のこと)、温度サイクルを以下のように変更した以外は製造業者の使用説明書に従い行った：
【０２５２】
【化１９】
2005133102.tif 000020
【０２５３】
A.4.3  PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントは製造業者の使用説明書に従いpT7Blue(Novagen)にクローニングした。
【０２５４】
A.4.4  DNA配列決定
二本鎖DNAはSangerら(1979)のジデオキシ法に本質的に従い、Auto Read Sequencing Kit (pharmacia)およびPharmacia LKB A.L.F.DNA シーケンサー(参考： Sanger,F., Nicklen,S. およびCoulson,A.R.( 1979 ). 鎖終結インヒビターを用いたDNA配列の決定 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467.)を用いて配列決定を行った。
【０２５５】
配列を配列番号１および２として示す。簡潔に記載すると：
配列番号３は以下を有する：
総塩基数：3267。
DNA配列組成：850 A; 761 C; 871 G; 785 T
配列番号４は以下を有する：
総塩基数：3276。
DNA配列組成：889 A; 702 C; 856 G; 829 T
A.4.5  ライブラリーのスクリーニング
Stratageneより得た、lZapライブラリーのスクリーニングを、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを2×SSC、0.1% SDS、10×Denhardt'sおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中で行った以外は製造者の使用説明に従って行った。ハイブリダイゼーション溶液に32Pで標識した変性プローブを添加した。ハイブリダイゼーションは55℃で１晩行った。フィルターを２×SSC、0.1% SDS中で２回、および１×SSC、0.1% SDS中で２回洗浄した。
【０２５６】
A.4.6  プローブ
クローン化したPCRフラグメントを、適切な制限酵素を用いた消化により、pT7blueベクターから単離した。フラグメントをアガロース電気泳動によってベクターから分離し、フラグメントをAgarase (Boehringer Mannheim)によってアガロースから精製した。フラグメントはわずか90〜240 bpの長さであったのでPrime-It random primer Kit (Stratagene)またはReady to Go DNA labelling kit (pharmacia)を用いて32P-dCTPで標識する前にライゲーション反応に暴した。
【０２５７】
A.4.7  結果
A.4.7.1  α-1,4-グルカンリアーゼをコードするPCR DNAフラグメントの生成
α-1,4-グルカンリアーゼ由来の、３つの重複するトリプシンペプチドのアミノ酸配列(下に示す)を、混合オリゴヌクレオチドを生成するために用いた。このオリゴヌクレオチドはMCおよびMVの両方から単離したDNAを増幅するためのPCRプライマーとして用いられ得た（前記の配列を参照）.
第１のPCR増幅において、プライマーA/B（前記参照）を上流のプライマーとして、プライマーＣ（前記参照）を下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは71 塩基対である。
【０２５８】
第２のPCR増幅において、プライマーA/Bを上流のプライマーとして、プライマーＥを下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは161 塩基対である。
第３のPCR増幅において、プライマーF1（前記参照）およびプライマーF2（前記参照）を上流のプライマーとして、プライマーＥを下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは238塩基対である。
【０２５９】
このPCR産物を２％ LMT アガロースゲルで分析し、予想される長さのフラグメントをゲルから切り出して、Agarase（Boehringer Manheim）で処理し、そしてpT7blueベクター（Novagen）にクローン化して配列決定した。
【０２６０】
第１および第２のPCR増幅由来のクローン化したフラグメントは、配列決定したペプチド（前記参照）に相当するアミノ酸をコードしていた。第３の増幅由来のクローン（前記参照）は配列決定したペプチドに対して約87%のみ相同であった。
【０２６１】
A.4.7.2 クローン化したPCRフラグメントを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング。
【０２６２】
前記したクローンを用いたライブラリーのスクリーニングにより２つのクローンを得た。１つのクローンは配列番号４（遺伝子２）のヌクレオチド配列を含有した。他のクローンは配列番号３の配列の一部を含有した（塩基対1065から下流）（遺伝子１）。
【０２６３】
配列番号３の５’末端（すなわち塩基対1064から上流）はGibco BRLの5' race systemを用いたRACE（rapid amplification of cDNA ends）手順（Michael, A.F., Michael, K.D.およびMartin, G.R.（1988）. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998-99002）により得た。全RNAをCollingeら（Collinge, D.B., Milligan D.E;, Dow, J.M., Scofield, G.およびDaniels, M.J.(1987). Plant Mol Biol 8: 405-414）に従い単離した。5' raceは、１μgの全RNAを用いて、製造業者のプロトコルに従い実施した。第２の増幅由来のPCR産物をNovagenのpT7blue vectorに製造業者のプロトコルに従いクローン化した。 PCRエラーを補償するために３つの独立したPCRクローンを塩基配列決定した。
【０２６４】
上で記載のクローンにATG開始コドンの直前のXbaIおよびNdeI制限部位を補足するために以下のオリゴヌクレトチドを上流のプライマーに用いて：
GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG、そして配列GLI（すなわち配列番号３）の塩基対1573-1593の相補配列を含むプライマーを下流のプライマーとして用いて、追加のPCRを実施した。
【０２６５】
遺伝子１の完全な配列（すなわち配列番号３）はStratageneのpBluescript II KS+ ベクターに遺伝子の３’末端をゲノムクローン由来のBamHI-HindIIIフラグメントとしてクローン化し、そしてさらにPCRにより生成した遺伝子の５’末端をXbaI-BamHIフラグメントとして３’末端の前にクローン化することにより生成した。
【０２６６】
遺伝子２を、HindIII平滑末端化フラグメントとしてStratageneのpBluescript II KS+ ベクターのEcoRV部位にクローン化した。３’非転写配列の一部をSacI消化により除去し、次に再結合した。HindIIIおよびHpaI制限部位を開始ATGの直前に、HindIIIおよびNarI消化、および以下のアニールしたオリゴヌクレオチドの存在下での再結合により導入した。
AGCTTGTTAACATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGG
ACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC
配列決定したクローン内にイントロンを見出さなかった。
【０２６７】
クローン１タイプ（配列番号３）を10のペプチド配列全てと（図８参照）100%の同一性を示して、並べ得る菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから単離された遺伝子によりコードされる二つのタンパク質の配列のアライメントは約78%の同一性を示した。これは両方の遺伝子がα-1,4-グルカンリアーゼをコードすることを示す。
【０２６８】
A. 5   微生物におけるGL遺伝子の発現
（例えば、Pichiaのリアーゼ形質転換体およびAspergillusのリアーゼ形質転換体の分析）
GLをコードするDNA配列を微生物に導入し、高い比活性を有する酵素を大量に生産した。
【０２６９】
これに関して、遺伝子１(すなわち配列番号３)をPichia pastorisで発現させるために (Invitrogenにより供給されるPichia Expression Kit中に記載のプロトコールに従って)Pichia 発現ベクターpHIL-D2(AOX1プロモーターを含有する)をEcoRIで消化し平滑末端化(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)したものに、NotI-HindIII平滑末端化(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)フラグメントとしてクローン化した。
【０２７０】
別の実施態様では、遺伝子１(すなわち配列番号３)は、Aspergillus nigerで発現させるために (Pallら、(1993)Fungal Genet Newslett. vol40 pages 59-62) 、Aspergillus発現ベクターpBARMTE1 (Neuropera crassa由来のメチルトリプトファン耐性プロモーターを含有する)をSmaIで消化したものに、NotI-HindIII平滑末端化フラグメント(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)としてクローン化した。プロトプラストはDaboussiら(Curr Genet(1989) Vol 15 pp453-456)に従って溶解(lysing)酵素Sigma L-2773およびリティカーゼ(lyticase)Sigma L-8012を使用して調製した。プロトプラストの形質転換はBuxtonら(Gene (1985) vol37 pp207-214)に記載のプロトコルに従ったが、形質転換したプロトプラストのプレーティングに関しては、0.6%の浸透圧安定化トップアガロースを使用した以外はPuntら(Methods in Enzymology (1992) vol216 pp447-457)により立案されたプロトコールに従った。
【０２７１】
結果は、形質転換したPichia pastorisおよびAspergillus nigerにおいてリアーゼ活性が観察されたことを示した。
【０２７２】
A.5.1   一般的方法
無細胞抽出物の調製
細胞を9000rpm、5分間遠心することによって回収し、0.9%NaClで洗浄し、破砕(breaking)緩衝液(1mM EDTA 、および5% グリセロール含有50mM K-リン酸、pH7.5)に再懸濁した。細胞はガラスビーズおよびボルテックス処理を用いて破砕した。破砕緩衝液は1mMのPMSF(プロテアーゼインヒビター)を含有した。リアーゼ抽出物(上清)を、9000rpmで５分間遠心し、次いで20,000×gで５分間遠心後得た。
【０２７３】
アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬(DNS)によるリアーゼ活性のアッセイ
リアーゼ抽出物の１倍量を等量の4%アミロペクチン溶液と混合した。反応混合液は制御された温度でインキュベートし、そして試料は特定の間隔で取り出しAFについて分析した。
【０２７４】
リアーゼ活性はまた、放射活性方法を使用して分析した。
【０２７５】
反応混合液は、10μlの14C-デンプン溶液(1μCi; Sigma Chemicals Co.)および10μlのリアーゼ抽出物を含有した。反応混合液は25℃で１晩おき、その後通常のTLC系で分析した。生成された放射活性AF産生量はInstant Imager(Pachard Instrument Co.,Inc.,Meriden,CT)を用いて検出した。
【０２７６】
電気泳動およびウェスタンブロッティング
SDS-PAGEは8〜25%勾配ゲルおよびPhastSystem(Pharmacia)を使用して行った。ウェスタンブロッティングもPhastSystemのSemidry transfer unitで実施した。   Qingdao(中国)で採取された紅海藻から精製されたリアーゼに対してもたらされた１次抗体を1:100に希釈して使用した。アルカリホスファターゼ(Dako A/S, Glostrup, Denmark)に結合したブタ抗ウサギIgGを２次抗体として使用し、1:1000に希釈して使用した。                      
【０２７７】
パート１、前記構築物を含有するPichia形質転換体の分析
結果：
１．リアーゼ活性を誘導後５日目に測定し（手引き書に従い）、Ｂシリーズの全ての試料について活性が細胞内であることが判明した。
【０２７８】
【化２０】
2005133102.tif 000021
【０２７９】
2005133102.tif 000022
【０２８０】
試料B27の経時変化は以下のとおりである。データをまた、図１に示す。
【０２８１】
【化２１】
2005133102.tif 000023
【０２８２】
アッセイの条件は時間の変化を除いて上記と同様である。
２．ウエスタンブロット分析
全ての試料のCFEは天然のリアーゼに相当する分子量を有するバンドを示した。
【０２８３】
【化２２】
2005133102.tif 000024
【０２８４】
パートII、Aspergilus形質転換体
結果
I.  リアーゼ活性は、５日間のインキュベーション(0.2% カゼイン酵素的加水分解産物を含む最少培地)の後、アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬による分析で測定した。
１）培養液のリアーゼ活性の分析
0.2%アミロペクチンとともに増殖させた35の培養物の中で、AFは２つの培養物でのみ検出された。5.4+および5.9+の培養物はそれぞれ0.13g AF/リットルおよび0.44 g/リットルを含有していた。この結果は活性なリアーゼが細胞から分泌されていることを示した。リアーゼ活性はまた、無細胞抽出物中でもまた測定可能であった。
２）無細胞抽出物におけるリアーゼ活性の分析
【０２８５】
【化２３】
2005133102.tif 000025
【０２８６】
結果はGLの遺伝子１がA.nigerにおいて細胞内で発現したことを示す。
【０２８７】
形質転換したE.coliを用いた実験は（QiagenのQia express vector kitのクローニングベクターpQE30を用いた）、酵素の発現を示し、この酵素は菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の精製した酵素に対する抗体により認識された。
【０２８８】
B. 供給源＝菌類
B.1. 菌類Morchella costata由来のα-1,4-グルカンリアーゼの酵素精製および特徴付け
B.1.1   材料と方法
菌類Morchella costataは、アメリカンタイプカルチャーコレクチョン(ATCC)から得た。この菌類はATCCにより推奨される培養培地を使用して25℃で振とう培養した。菌糸体は濾過により回収し、0.9%NaClで洗浄した。
【０２８９】
菌類細胞をホモゲナイゼーションによって破壊し、次いで氷上で6×3分間、50mMクエン酸-NaOH pH6.2(緩衝液A)中で超音波破砕した。細胞破片(debris)は25,000×g、40分間遠心して取り除いた。この手順で得られた上清を無細胞抽出物とみなし、８〜25%の勾配ゲルで分離した後、活性染色およびウエスタンブロッティングに用いた。
【０２９０】
B.1.2  β-シクロデキストリンSepharoseゲルによる分離
無細胞抽出物をあらかじめ緩衝液Aで平衡化したβ-シクロデキストリンSepharoseゲル4Bカラム( 2.6×18cm )に直接かけた。このカラムを３倍量の緩衝液Aおよび1M NaClを含む２倍量の緩衝液Aで洗浄した。 α-1,4-グルカンリアーゼを緩衝液A中の2% デキストリンを用いて溶出した。活性のある画分をプールし緩衝液を20mM ビス-トリスプロパン-HCl (pH 7.0, 緩衝液B )に変えた。
【０２９１】
活性のある画分をあらかじめ緩衝液Bで平衡化したMono Q HR 5/5カラムにかけた。菌類のリアーゼを0.3Ｍ NaClの直線勾配で緩衝液Bを用いて溶出した。β-シクロデキストリンSepharoseクロマトグラフィーの後に得られたリアーゼ調製物は、あるいは150μlに濃縮し、FPLC条件下で操作されたSuperose12カラムにかけた。
【０２９２】
B.1.3  α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイならびに基質特異性、至適pH、および至適温度決定のための条件
α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイのための反応混合液は10mg/mlアミロペクチンおよび25mM Mes-NaOH (pH6.0)を含んだ。
【０２９３】
反応は30℃で30分間行い、3,5-デニトロサリチル酸試薬を加えて停止した。光学密度は、室温で10分間おいた後に550nmで測定した。無細胞抽出物を使用する場合は、10mM EDTAをアッセイ混合液に加えた。
【０２９４】
このアッセイ混合液の基質アミロペクチンは、他の基質で置換し得、反応温度は本文に記載したように変化し得る。
【０２９５】
至適pH検討において、反応混合液は40mM緩衝液中の10 mg/mlのアミロペクチンあるいはマルトテトラオースを含有する。使用した緩衝液は、グリシン-NaOH(pH 2.0〜3.5)、HOAc-NaOAc (pH 3.5〜5.5)、Mes-NaOH(pH 5.5〜6.7)、Mops-NaOH(pH 6.0〜8.0)、およびbicine-NaOH(pH 7.6〜9.0)であった。反応を 、30℃で30分間行った。至適温度検討における反応条件は、すべての実験において緩衝液Mops-NaOH(pH 6.0)を使用したことを除いて、上記と同じである。反応温度は本文に示したように変化した。
【０２９６】
SDS-PAGE、ネイティブ-PAGEおよび等電点電気泳動を、８〜28%の勾配ゲルおよびpH3〜9の勾配ゲルをそれぞれ使用して、PhastSystem(Pharmacia Sweden)で行った。電気泳動に続いて、ゲルを、製造業者(Pharmacia)により推奨される手順に従って銀染色で染色した。糖蛋白は、PhastSystemに適用したPASで染色した。活性染色のためには、電気泳動はネイティブな条件下で６℃で行った。
【０２９７】
電気泳動に続いて、ゲルを１%可溶性デンプンの存在下で30℃で一晩インキュベートした。菌類のリアーゼの活性バンドは、I2/KI溶液を用いた染色により出現させた。
【０２９８】
B.1.4 結果
B.1.4.1 α-1,4-グルカンリアーゼの精製、分子量および等電点
菌類のリアーゼは、β-シクロデキストリンSepharose、デンプンおよびRed Sepharoseを充填したカラムに吸着することが見出された。β-シクロデキストリンSepharose4Bゲルおよびデンプンを充填したカラムを、精製目的のために使用した。
【０２９９】
この工程で得られたリアーゼ調製物は、菌類のリアーゼより高い分子量を有する少量の混入タンパク質を含んでいた。混入物は、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィー、またはより効率的にSuperose 12でのゲル濾過により除去した。
【０３００】
精製した酵素は無色であり、可視光領域に吸光を示さなかった。分子量は、SDS-PAGEで見積もると、110 kDaであると測定された。
【０３０１】
精製した菌類のリアーゼは、３〜９のpH勾配を有するゲルでの等電点電気泳動で測定するとpI 5.4の等電点を示した。ネイティブ電気泳動ゲルでは、この酵素は単一のバンドとして現れた。このバンドは、活性染色で検出したところ、デンプン分解活性を示した。酵素を抽出した培養期間の長さに依存して、ネイティブおよび等電点電気泳動ゲルでのこの酵素は、同一の移動度およびpIで、明瞭なバンドまたはより拡散したバンドを示した。
【０３０２】
B.1.4.2   菌類のリアーゼが触媒する反応の至適pHおよび至適温度
菌類のリアーゼが触媒する反応の至適pHのpH範囲はpH５およびpH７の間であることが見出された。
【０３０３】
B.1.4.3 基質特異性
精製した菌類のリアーゼは、マルトサッカリドをマルトースからマルトヘプタオースへ分解する。しかし、分解速度は変化する。最も高い活性はマルトテトラオース(100%としての活性)、続いてマルトヘサオソース(97%)、マルトヘプタオース(76%)、マルトトリオース(56%)で達成され、そして最も低い活性はマルトース(2%)で観察された。
【０３０４】
アミロペクチン、アミロースおよびグリコーゲンはまた、菌類のリアーゼにより分解された（％は後に測定する）。菌類のリアーゼは、エキソリアーゼであり、エンドリアーゼではなかった。なぜならこの酵素はp-ニトロフェニルα-D-マルトヘプタオースを分解するが、還元末端ブロックされたp-ニトロフェニルα-D-マルトヘプタオースを分解できなかったからである。
【０３０５】
B.1.5 Morchella vulgaris
Morchella vulgarisから得られたα-1,4-グルカンリアーゼの酵素精製および特徴付けのプロトコルは、Morchella costataについての上記と同じであった（結果も同様であった）。
【０３０６】
B.2.  菌類由来のα-1,4-グルカンリアーゼのアミノ酸配列決定
B.2.1   リアーゼのアミノ酸配列決定
リアーゼをClostridium histolyticum由来のエンドプロティナーゼArg-CまたはLysobacter enzymogenes由来のエンドプロティナーゼLys-Cのいずれかでで消化した。いずれも配列決定用グレードであり、Boehriner Mannheim,Germanyから購入した。エンドプロティナーゼArg-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの10M尿素、50mM メチルアミン、0.1M Tris-HCl、pH7.6に溶解した。N2で覆い、10μlの50mM DTTおよび5mM EDTAを添加し、N2下50℃で10分間、タンパク質を変性および還元させた。続いて、10μlの50mM Tris-HCl、pH8.0中の1μgのエンドプロティナーゼArg-Cを添加し、N2で覆い、消化を37℃で6時間行った。
【０３０７】
次のシステインの誘導体化のために、12.5μlの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下、暗所で室温、15分間インキュベートした。
【０３０８】
エンドプロティナーゼLys-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの8M尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.4に溶解した。 N2で覆い、5μlの45mM DTTを添加した後、N2下50℃で15分間、タンパク質を変性および還元させた。室温まで冷却した後、5μlの100mM ヨードアセトアミドを添加して、N2下、暗所で室温、15分間システインを誘導体化した。次に、90μlの水および50μlの50mM tricineおよび10mM EDTA、pH8.0中の5μgのエンドプロティナーゼLys-Cを添加し、消化をN2下37℃24時間行った。
【０３０９】
この結果生じたペプチドを溶媒A(水中の0.1% TFA)および溶媒B(アセトニトリル中の0.1% TFA)を用いて、VYDAC C18カラム(0.46×15cm; 10μm; The Separations Group ; California)上の逆相HPLCに分離した。選択したペプチドをパルス化高速液体サイクル(pulsed-liquid fast cycles)を用いてApplied Biosystems 476A シーケンサーによって配列決定する前に、Develosil C18 カラム(0.46×10cm; 3μm; Dr.Ole Schou, Novo Nordisk, Denmark)で再クロマトグラフした。
【０３１０】
菌類Morchella costata由来の酵素のアミノ酸配列情報を図17に示す。
【０３１１】
菌類Morchella vulgaris由来の酵素のアミノ酸配列情報を図18に示す。
【０３１２】
B.3. 菌類由来のα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子のDNA配列決定
B.3.1 分子生物学のための方法
DNAはDellaporteら(1983-Plant Mol Biol Rep vol 1 pp19-21)に記載のように単離した。
【０３１３】
B.3.2 PCR
目的のDNA分子の調製は、Gene Amp DNA Amplification Kit(Perkin Elmer Cetus, USA)を使用し、Taq ポリメラーゼを後に加え(PCRサイクルを参照のこと)、温度サイクルを以下のように変更した以外は製造業者の使用説明書に従い行った：
【０３１４】
【化２４】
2005133102.tif 000026
【０３１５】
B.3.3  PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントは製造業者の使用説明書に従いpT7Blue(Novagen)にクローニングした。
【０３１６】
B.3.4  DNA配列決定
二本鎖DNAはSangerら(1979)のジデオキシ法に本質的に従い、Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia)およびPharmacia LKB A.L.F.DNA シーケンサー(参考： Sanger,F., Nicklen,S. およびCoulson,A.R.(1979). 鎖終結インヒビターを用いたDNA配列の決定 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5497.)を用いて配列決定を行った。
【０３１７】
B.3.5  ライブラリーのスクリーニング
Stratageneより得た、lZapライブラリーのスクリーニングを、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを2×SSC、0.1% SDS、10×Denhardt'sおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中で行った以外は製造者の使用説明に従って行った。
【０３１８】
ハイブリダイゼーション溶液に32Pで標識した変性プローブを添加した。ハイブリダイゼーションは55℃で１晩行った。フィルターを２×SSC、0.1% SDS中で２回、および１×SSC、0.1% SDS中で２回洗浄した。
【０３１９】
B.3.6  プローブ
クローン化したPCRフラグメントを、適切な制限酵素を用いた消化により、pT7blueベクターから単離した。フラグメントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、フラグメントをAgarase (Boehringer Mannheim)によってアガロースから精製した。フラグメントはわずか90〜240 bpの長さであったのでPrime-It random primer kit (Stratagene)またはReady to Go DNA labelling kit (Pharmacia)を用いて32P-dCTPで標識する前にライゲーション反応に曝した。
【０３２０】
B.3.7   結果
B.3.7.1  α-1,4-グルカンリアーゼをコードするPCR DNAフラグメントの生成
α-1,4-グルカンリアーゼ由来の、３つの重複するトリプシンペプチドのアミノ酸配列（以下に示す）を、混合オリゴヌクレオチドを生成するために用いた。このオリゴヌクレオチドはMCおよびMVの両方から単離したDNAを増幅するためのPCRプライマーとして用いられ得た。
【０３２１】
【化２５】
2005133102.tif 000027
【０３２２】
第１のPCR増幅において、プライマーA1/A2（下記参照）を上流のプライマーとして、プライマーB1/B2（下記参照）を下流のプライマーとして用いた。
【０３２３】
【化２６】
2005133102.tif 000028
【０３２４】
PCR産物を２％ LMT アガロースゲルで分析し、予想される長さのフラグメントをゲルから切り出して、Agarase（Boehringer Manheim）で処理し、そしてpT7blueベクター（Novagen）にクローン化して配列決定した。
【０３２５】
PCR増幅由来のクローン化フラグメントは、配列決定したペプチド（上記参照のこと）に対応するアミノ酸をコードしており、またそれぞれの場合でさらに２つのイントロンをコードしていた。MCについては、PCR増幅したDNA配列は、図14を参考にすると、1202位から1522位で示される配列に対応する。 MVについては、PCR増幅したDNA配列は、図15を参考にすると1218位から1535位で示される配列に対応する。
【０３２６】
B.3.7.2   クローン化したPCRフラグメントを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング。
【０３２７】
上記のクローンを用いたライブラリーのスクリーニングにより、それぞれの供給源で２つのクローンを得た。MCについては、２つのクローンを組み合わせて図14に示す配列を形成した（下記参照のこと）。MVについては、上に記載の方法により、２つのクローンを組み合わせて図15に示す配列を形成した。
【０３２８】
MCクローンにATG開始コドンの直前のPstI、PvuII、AscI、およびNcoI制限部位を補足するために以下のオリゴヌクレトチドを上流のプライマーに用いて：
AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT、そして図４中の塩基対1297-1318の相補配列を含むプライマーを下流のプライマーとして用いて、追加のPCRを実施した。
【０３２９】
MCの完全な配列を、StratageneのpBluescript II KS+ベクターのBamHI-EcoRI部位に、遺伝子の５’末端をゲノムクローンの１つ（クローン１）由来のBglII-EcoRIフラグメントとしてクローン化することにより生成した。遺伝子の3’末端を、次に、修飾したpBluescript II KS+ベクターをEcoRIおよびEcoRVで消化した後、他のゲノムクローン（第２のクローン）からのNspV（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用して平滑末端化した）-EcoRIフラグメントと連結することにより、修飾したpBluescript II KS+ベクターにクローン化した。次に、遺伝子の中間部分を、EcoRIで消化したさらに修飾したpBluescript II KS+ベクターに、第１のクローンからのEcoRIフラグメントを連結することにより、さらに修飾したpBluescript II KS+ベクターにクローン化した。
【０３３０】
B.4   微生物におけるGL遺伝子の発現
GLをコードするDNA配列を微生物に導入し、高い比活性を有する酵素を大量に生産し得る。
【０３３１】
これに関して、 MC遺伝子（図14）をPichia pastorisで発現させるために (Invitrogenにより供給されるPichia Expression Kit中に記載のプロトコールに従って)Pichia 発現ベクターpHIL-D2(AOX1プロモーターを含有する)をEcoRIで消化し平滑末端化(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)したものに、 XbaI-XhoI平滑末端化(Amersham InternationalのDNA bluning kitを使用)フラグメントとしてクローン化した。
【０３３２】
別の実施態様では、 MC遺伝子１（上記のようにPCRにより修飾して、制限部位を導入する以外は図14と同じである）は、Aspergillus nigerで発現させるために (Pallら、(1993)Fungal Genet Newslett. vol40 pages 59-62) 、Aspergillus発現ベクターpBARMTE1 (Neuropera crassa由来のメチルトリプトファン耐性プロモーターを含有する)をSmaIで消化したものに、PvuII-XhoI平滑末端化フラグメント(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)としてクローン化した。プロトプラストはDaboussiら(Curr Genet(1989) Vol 15 pp453-456)に従って溶解(lysing)酵素Sigma L-2773およびリティカーゼ(lyticase)Sigma L-8012を使用して調製した。プロトプラストの形質転換はBuxtonら(Gene (1985) vol37 pp207-214)に記載のプロトコルに従ったが、形質転換したプロトプラストのプレーティングに関しては、0.6%の浸透圧安定化トップアガロースを使用した以外はPuntら(Methods in Enzymology (1992) vol216 pp447-457)により立案されたプロトコルに従った。
【０３３３】
結果は、形質転換したPichia pastorisおよびAspergillus nigerにおいてリアーゼ活性が観察されたことを示した。
【０３３４】
Pichiaリアーゼ形質転換体およびAspergillusリアーゼ形質転換体の解析
一般的方法
無細胞抽出物の調製
細胞は9000rpm、5分間遠心することによって回収し、0.9%NaClで洗浄し、破砕(breaking)緩衝液(1mM EDTA 、および5% グリセロール含有50mM K-リン酸、pH7.5)に再懸濁した。細胞はガラスビーズおよびボルテックス処理を用いて破砕した。破砕緩衝液は1mMのPMSF(プロテアーゼインヒビター)を含有した。リアーゼ抽出物(上清)を、9000rpmで５分間遠心し、次いで20,000×gで５分間遠心後得た。
【０３３５】
アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬(DNS)によるリアーゼ活性のアッセイ
リアーゼ抽出物の１倍量を等量の4%アミロペクチン溶液と混合した。反応混合液は制御された温度でインキュベートし、そして試料は特定の間隔で取り出しAFについて分析した。
【０３３６】
リアーゼ活性はまた、放射活性方法を使用して分析した。
【０３３７】
反応混合液は、10μlの14C-デンプン溶液(1μCi; Sigma Chemicals Co.)および10μlのリアーゼ抽出物を含有した。反応混合液は25℃で１晩おき、その後通常のTLC系で分析した。生成された放射活性AF産生量はInstant Imager(Pachard Instrument Co.,Inc.,Meriden,CT)を用いて検出した。
【０３３８】
電気泳動およびウェスタンブロッティング
SDS-PAGEは8〜25%勾配ゲルおよびPhastSystem(Pharmacia)を使用して行った。ウェスタンブロッティングもPhastSystemのSemidry transfer unitで実施した。Qingdao(China)で採取された紅海藻から精製されたリアーゼに対してもたらされた１次抗体を1:100に希釈して使用した。アルカリホスファターゼ(Dako A/S, Glostrup, Denmark)に結合したブタ抗ウサギIgGを２次抗体として使用し、1:1000に希釈して使用した。
パートI、前記構築物を含有するPichia形質転換体の分析
【０３３９】
【化２７】
2005133102.tif 000029
【０３４０】
パートII、Aspergilus形質転換体
結果
I.リアーゼ活性は、５日間のインキュベーション(0.2% カゼイン酵素的加水分解産物を含む最少培地)の後、アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬による分析で測定した。
無細胞抽出物中のリアーゼ活性の分析
【０３４１】
【化２８】
2005133102.tif 000030
【０３４２】
結果はMCリアーゼがA.nigerにおいて細胞内で発現したことを示す。
【０３４３】
II.放射活性方法によるリアーゼ活性の試験
以下の培養物の無細胞抽出物が、14Ｃ標識したAFを含有した。
【０３４４】
51+、54+、55+、59+、512、513、514、515、516、518、519。
【０３４５】
基質として14Ｃデンプンを使用したα-1,4-グルカンリアーゼ反応の分解産物のTLCを、図20に示す。反応混合物をTLCにのせた。レーン番号は培養物の名称に対応する：1,512; 2,513; 3,514; 4,515; 5,516; 6,517; 7,518; 8,519; 9,520。早く移動した点がAFである。
【０３４６】
C.供給源＝藻類単独
Gracilariposis lemaneifomis（Santa Cruzで得られた）から得られたα-1,4-グルカンリアーゼの酵素精製および特徴付けのプロトコルは、本質的には前記のプロトコル、例えばMorchella Costataと同じである（結果も同様）。
１．カリフォルニアで収集した寄生体のない紅海草であるGracilariopsis lemaneifomis由来のα-1,4-グルカンリアーゼの特徴付け
リアーゼのアミノ酸組成を以下の表に示す。
【０３４７】
【化２９】
2005133102.tif 000031
【０３４８】
２．配列解析
カリフォルニアの藻類のペプチド配列の、中国の菌類感染藻類のアミノ酸配列との比較は、２つのタンパク質配列の間の高い相同性（PCRフラグメントで生成じたフラグメントのアミノ酸配列と、中国の藻類から得られたGLの対応する配列の間で78〜80%同一）を示した。
【０３４９】
３つのオリゴヌクレオチドを、カリフォルニアの藻類由来のこれら２つの配列から作成して、約970 bpのPCRフラグメントを生成した。
【０３５０】
【化３０】
2005133102.tif 000032
【０３５１】
第１のPCR増幅において、プライマー１を上流のプライマーとして使用し、プライマー２を下流のプライマーとして使用した。第２のPCR増幅において、プライマー１を上流のプライマーとして使用し、プライマー３を下流のプライマーとして使用した。期待されたサイズのPCRフラグメントが生成され、NovagenのpT7blueベクターにクローン化された。PCRフラグメントを含む３つの独立したプラスミドを配列決定し、これらの３つのクローン化されたPCRフラグメントが、３つの異なるタンパク質に由来するペプチド配列のコドンを含むことが見出された。このことは、カリフォルニアの藻類には、少なくとも３つの異なるα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子が存在することを示す。
【０３５２】
３．最大速度の半分に達するときの基質濃度は、アミロペクチンで3.76 mg/mlおよびグリコーゲンで3.37 mg/mlである。
４．種々の基質でのリアーゼの分解速度を以下に示す。
【０３５３】
---------------------------------------------
基質                                                   放出AF(nmol)
---------------------------------------------
マルトース                                                   657
---------------------------------------------
マルトトリオース                                       654
---------------------------------------------
マルトテトラオース                                   670
---------------------------------------------
マルトペンタオース                                   674
---------------------------------------------
マルトヘキサオース                                   826
---------------------------------------------
マルトヘプタオース                                   865
---------------------------------------------
デキストリン 20                                         775
---------------------------------------------
デキストリン 15                                         775
---------------------------------------------
デキストリン 10                                         844
---------------------------------------------
アミロペクチン                                           732
---------------------------------------------
グリコーゲン                                               592
---------------------------------------------
反応条件：反応混合液は、10 mMのHOAc−NaOAc(pH3.8)を含有していた。基質濃度は10 mg/mlであった。リアーゼおよび水を加えた後の最終容量は100 μlであった。反応時間は45 ℃で40分であった。
【０３５４】
リアーゼはプルラン、ニゲランテトラサッカリド、トレハロース、イソマルトース、グルコース、α-、β-およびγ-シクロデキストリンを分解し得なかった。リアーゼは、低速度でパノースおよびニゲロースを分解した。
【０３５５】
５．リアーゼの至適温度は、アミロペクチンを基質とした時48℃であり、グリコーゲンを基質とした時50℃であった。50℃では、グリコーゲンの反応はアミロペクチンの反応と似ていた；50℃以下では、アミロペクチンはグリコーゲンよりも優れた基質であった。
【０３５６】
６．リアーゼの至適pH範囲は、pH 3.5およびpH 7.0の間であった；至適pH は3.8であった。 pH試験に用いた緩衝液は、グリシン−HCl(pH 2.2〜3.6)；NaOAc−HOAc(pH 3.5〜5.5)；Mes−NaOH(pH 5.5〜6.7)；Mops−NaOH(pH 6.0〜8.0)、およびbicine−NaOH (pH 7.6〜9.0)であった。すべての緩衝液は40 mMであった。
【０３５７】
７．２mMの最終濃度で、p-クロロ安息香酸第二水銀(PCMB)は、リアーゼ活性を96%阻害し、酵素活性に-SH基が必須であることを示す。
【０３５８】
７．さらなる研究
7.1 菌類感染藻類から精製したリアーゼの活性および
安定性の増加に及ぼすアルコールの影響
1-プロパノール、2-プロパノールおよび１-ブタノールを以下の濃度で試験した(0%、1%、5%、および10%)。1-プロパノールの至適濃度は５%であり、この濃度は６日間インキュベーション後のAF収量を34%増加した；2-プロパノールの至適濃度は１%であり、この濃度は10日間インキュベーション後のAF収量を20%増加した; 1-ブタノールの至適濃度は５%であり、この濃度は３日間インキュベーション後のAF収量はを52%増加した。
【０３５９】
エタノールを以下の濃度で試験した(０、１、３、５、７、９、11、13、15%)。７日間インキュベーションの至適濃度は５%であり、この濃度はAF収量を12%増加した。10日間インキュベーションの至適濃度は３%であり、この濃度はAF収量を16%増加した。
【０３６０】
1-プロパノールの影響：
【０３６１】
【化３１】
2005133102.tif 000033
【０３６２】
7.2菌類感染藻類ならびにM.costataおよびM.vulgarisから精製したリアーゼによるAFの生成への異なった反応媒体の影響
2.1.菌類感染藻類由来のリアーゼ
結果（下の表を参照のこと）は、最も良好な反応媒体はmM濃度のNa2−EDTAを含有する５mMのHOAc−NaOAc(pH 3.9)（短縮してBACE）であることを示す。純水または0.85%NaClのいずれかを反応媒体として使用してのAFの生成は、収量を減少した。 BACE中に0.85%NaClを含有すると、AFの収量はまた減少した。
【０３６３】
【化３２】
2005133102.tif 000034
【０３６４】
2.2.以下の緩衝液：Mes−NaOH、 Mops−NaOH、Hepes−NaOHおよびBicine-NaOHは、M. costataおよびM. vulgaris由来のリアーゼのための至適反応媒体であった。 HOAc−NaOAc緩衝液中では、リアーゼは不安定であり、それゆえこの緩衝系の使用は、AF収量の減少を引き起こした。
7.3. エンドアミラーゼおよび脱分枝酵素がAF生成に及ぼす影響
3.1. エンドアミラーゼの影響
AF生成に使用されるデンプンは、まずエンドアミラーゼまたは酸加水分解のいずれかで液状化され得る。
【０３６５】
エンドアミラーゼで分解されたデンプンは、もとのデンプンに比較してリアーゼのためのより適切な基質である。デンプンは、リアーゼ反応に使用する温度では、制限された溶解性を有する。デンプンをエンドアミラーゼで処理することにより、グルコース収量が増加に導かれた。10〜15%付近（乾燥物質に基づいて）まで変換した物質（reducing matter）が、AFの収量という点からリアーゼのための基質として最も適しており、さらに19%の変換した物質までエンドアミラーゼを用いて処理することは、もはやこのリアーゼには適切ではないことが見出された。
【０３６６】
3.2.プルラナーゼおよびイソアミラーゼの影響
下記の結果に見られるように、イソアミラーゼおよびプルラナーゼの両方は、 AFの収量をpH 4.5および5.0で50%まで増加させた。反応系は、イソアミラーゼまたはプルラナーゼ(MegaZyme Ltd.)を添加してまたは添加しないで、菌類に冒された紅藻類由来のリアーゼからなっていた。アミロペクチンを基質として使用した。リアーゼのみの存在下で生成されたAFを、100%として表した。
【０３６７】
【化３３】
2005133102.tif 000035
【０３６８】
４．種々の基質に対する菌類のリアーゼの相対的分解速度
4.1.M.costata由来のリアーゼ
マルトテトラオースで観察された活性を100%として表した。
【０３６９】
【化３４】
2005133102.tif 000036
【０３７０】
4.2.M.vulgaris由来のリアーゼ
マルトテトラオースで観察された活性を100%として処理した。すべての基質の最終濃度は10 mg/mlであった。
【０３７１】
---------------------------------------------
基質                                                       活性(%)
---------------------------------------------
マルトース                                                     10.1
---------------------------------------------
マルトトリオース                                         49.8
---------------------------------------------
マルトテトラオース                                   100.0 
---------------------------------------------
マルトペンタオース                                     79.3
---------------------------------------------
マルトヘキサオース                                     92.4
---------------------------------------------
マルトヘプタオース                                     73.9
---------------------------------------------
デキストリン 10                                           62
---------------------------------------------
デキストリン 15                                           45
---------------------------------------------
デキストリン 20                                           37
---------------------------------------------
可溶性デンプン                                           100.5
---------------------------------------------
アミロペクチン                                           139.9
---------------------------------------------
グリコーゲン                                               183.3
---------------------------------------------
M.costata およびM.vulgaris由来のリアーゼは以下の糖を分解し得なかった。
【０３７２】
トレハロース、パノース、ニゲロース、ニゲロテトラオース、グルコース、イソマルトース、α-、β-およびγ-シクロデキストリン、プルラナン（pullulalan）ならびに非還元末端のブロックされたｐ-ニトロフェニル α-D-マルトヘプタオシド。なぜならこれらの基質を菌類のリアーゼとともに48時間インキュベートした後、TLCプレート上で検出可能なAFが存在しなかったからである。
【０３７３】
7.5.リアーゼ触媒反応の至適pHおよび至適温度
【０３７４】
【化３５】
2005133102.tif 000037
【０３７５】
aグリコーゲンを基質として使用して測定したパラメーター；他のパラメーターはアミロペクチンを基質として使用して測定した。
【０３７６】
7.6. 菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis由来のリアーゼに及ぼすグリコーゲンの安定化効果
結果は、アミロペクチンの代わりにグリコーゲンを使用した場合、より高い温度において反応速度がより高くなることを示す。
【０３７７】
【化３６】
2005133102.tif 000038
【０３７８】
7.7.リアーゼの分子量およびpI値
菌類感染G. lemaneiformis由来のリアーゼ、見かけ上菌類のないG.lemaneiformis由来、M.costataおよびM.vulgaris由来の両方の形態のリアーゼの分子量を、勾配ゲル(８〜25%)でのSDS−PAGEを使用して、110,000±10,000ダルトンと見積もった。
【０３７９】
菌類感染G. lemaneiformis由来のリアーゼのpIは、3.9付近であった。M.vulgaris由来のリアーゼについては、pIはpH 4.6付近であり、M.costata由来のリアーゼについてのpIは5.0付近であった。これらの値は、３から９のpH勾配を有するゲルでの等電点電気泳動によって得られた。
【０３８０】
アミノ酸組成から推定されるpI値は以下のとおりである：
菌類感染G. lemaneiformis由来のリアーゼ：4.58、およびM.costata由来のリアーゼ：6.30。
【０３８１】
7.8.ウエスタンブロッティングによるリアーゼの免疫学的試験。
【０３８２】
結果は、藻類のリアーゼに対する抗体が、無細胞抽出物中および精製された形状の両方で、菌類のリアーゼを認識し得ることを示した。これはウエスタンブロッティングにより明らかとなった。中国で収集された藻類から精製された藻類のリアーゼに対する抗体は、カリフォルニアのSanta Cruzから収集された藻類のリアーゼも認識した。
【０３８３】
----------------------------------------------------------------------
GL供給源                                                     菌類感染G. lemaneiformis由来の
GLに対する抗体の反応性
菌類感染G.lemaneiformis                                  強い
カリフォルニア由来のG.lemaneiformis                           強い
両方の形態
M.costata                                             中程度
M.vulgaris                                           中程度
----------------------------------------------------------------------
7.9.菌類のリアーゼの可逆的および非可逆的インヒビター
9.1.可逆的インヒビター、グルコースおよびマルトース
10 mg/mlの基質濃度において、 M.costataのリアーゼについての活性は、アミロペクチンを基質として使用した場合、0.1 Mグルコースの存在下で19.3%減少した；基質としてグリコーゲンを用いた場合、活性は影響されなかった。0.1 Mマルトースの存在下では、グリコーゲンおよびアミロペクチンについてそれぞれ48.8%および73.4%活性が減少した。
【０３８４】
----------------------------------------------------
基質濃度                                     インヒビター
グルコース    マルトース
----------------------------------------------------
アミロペクチン１%(２%)       19.3%(7%)         73.4%(67.2%)
グリコーゲン１%(２%)             0.000(-)         48.8%(49.7%)
----------------------------------------------------
0.1 Mグルコースによる阻害は、基質を１%から２%に増加させると阻害が19.3から７％に減少するため、拮抗的であるようだが、一方0.1 Mマルトースによる阻害は、基質の増加が阻害程度に有意には影響しないため、非拮抗的である。
【０３８５】
M.vulgarisのリアーゼについては、0.1 Mグルコースおよびマルトースは、アミロペクチンまたはグリコーゲンを基質として使用した場合、反応を阻害しなかった。
【０３８６】
--------------------------------------------
基質                           グルコース    マルトース
--------------------------------------------
アミロペクチン(１%)       28%                     80%
--------------------------------------------
グリコーゲン(１%)             5%                     57%
--------------------------------------------
9.2.可逆的インヒビター、デオキシジリミシン
最終基質濃度２%において、活性は、アミロペクチンを基質として用いて、25 μMのデオキシジリミシンの存在下で、藻類のリアーゼおよびM.costataのリアーゼについて10.4%に減少した。100 μMでは、どちらのリアーゼの活性も完全に失われた。
【０３８７】
9.3.非可逆的インヒビター：PCMB
同じアッセイ条件下で、２mMのPCMBの存在下で、活性はM.costataのリアーゼについては60%、および菌類感染紅藻類由来のリアーゼについては98%減少した。このことは、菌類のリアーゼは重金属阻害に対する感受性がずっと少ないということを意味する。
【０３８８】
7.10.AFの研究室規模の生成実施例
10.1.デキストリンを基質として使用したAFの生成
反応器は、4.6リットルの最終容量（HOAc-NaOAc,pH 3.9、５mM Na2-EDTAを含有する）中に、1000 gのデキストリン（デンプンをTermamylで10%の最終変換物質まで処理して得た）を含んだ。反応は、菌類感染藻類から精製した３mg のリアーゼを添加することにより開始した。反応を室温で行った。19日目に、リアーゼの別のバッチ(4 mg)を添加した。
【０３８９】
【化３７】
2005133102.tif 000039
【０３９０】
10.2.14Ｃ-AFの生成のための14Ｃ-デンプンの使用
均一に標識した14Ｃ-デンプン（Sigmaから得た340 μCi）を、含有していたエタノールを除くために真空乾燥し、次に２mlの水に溶解した。反応は、菌類感染藻類から精製した20 μlのリアーゼおよび20 μlのプルラナーゼ（MegaZyme Ltd.)を添加することにより開始した。反応は30℃で一晩行った。反応終了時に、反応混合液を10,000の分子量カットオフを有するフィルターを使用して濾過して、酵素および未反応のデンプン分子を除去した。
【０３９１】
濾液をWaters HPLCを使用してCa2カーボハイドレートカラム(Chrompack)にのせた。水を溶離剤として使用した。流速は0.5 ml/分であった。AFは、効率的にグルコースおよびマルトサッカリドから分離された。プールしたAF画分を凍結乾燥して、合計140 μCiの14Ｃ-AFを得た。
【０３９２】
これらの知見は、本発明のさらなる局面に関連する。すなわち、反応媒体（好ましくはアルコール）の疎水性を増加させて、本発明のリアーゼの安定性および活性を増加し得る試薬の使用である。この安定性の増加は、AF収量を増加へ導く。
【０３９３】
本発明の他の修飾は、発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０３９４】
【図１】図１は、染色した菌類感染藻類を示す。
【図２】図２は、染色した菌類感染藻類を示す。
【図３】図３は、菌類菌糸の切片を示す。
【図４】図４は、菌類感染藻類の切片を示す。
【図５】図５は、菌類感染藻類の切片を示す。
【図６】図６は、pGL1のプラスミド地図を示す。
【図７】図７は、pGL2のプラスミド地図を示す。
【図８】図８は、配列番号３として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す。
【図９−１】図９は、配列番号１と配列番号２とのアライメント（alignment）を示す。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】図10は、顕微鏡写真である。
【図１１】図11は、pMCのプラスミド地図を示す。
【図１２】図12は、pMV1のプラスミド地図を示す。
【図１３】図13は、pMV2のプラスミド地図を示す。
【図１４−１】図14は、Morchella costataから得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'の非翻訳領域を示す。
【図１４−２】図１４−２は、図14−１の続き。
【図１４−３】図１４−３は、図14−２の続き。
【図１５−１】図15は、Morchella vulgarisから得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'非翻訳領域を示す。
【図１５−２】図１５−２は、図１５−１の続き。
【図１５−３】図１５−５は、図１５−１の続き。
【図１６−１】図16は、Morchella costataおよびMorchella vulgaris由来のGLコード配列ならびに非翻訳領域の比較を示す。
【図１６−２】図１６−２は、図１６−１の続き。
【図１７】図17は、配列番号５として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す。
【図１８】図18は、配列番号６として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す。
【図１９】図19は、AFの存在または非存在での酸素消費のグラフを示す。
【図２０】図20はTLCプレートを示す。
【０３９５】
（配列表）
【０３９６】
【数１−１】
2005133102.tif 000040
【０３９７】
【数１−２】
2005133102.tif 000041
【０３９８】
【数１−３】
2005133102.tif 000042
【０３９９】
【数１−４】
2005133102.tif 000043
【０４００】
【数１−５】
2005133102.tif 000044
【０４０１】
【数１−６】
2005133102.tif 000045
【０４０２】
【数１−７】
2005133102.tif 000046
【０４０３】
【数１−８】
2005133102.tif 000047
【０４０４】
【数１−９】
2005133102.tif 000048
【０４０５】
【数１−１０】
2005133102.tif 000049
【０４０６】
【数１−１１】
2005133102.tif 000050
【０４０７】
【数１−１２】
2005133102.tif 000051
【０４０８】
【数１−１３】
2005133102.tif 000052
【０４０９】
【数１−１４】
2005133102.tif 000053
【０４１０】
【数１−１５】
2005133102.tif 000054
【０４１１】
【数１−１６】
2005133102.tif 000055
【０４１２】
【数１−１７】
2005133102.tif 000056
【０４１３】
【数１−１８】
2005133102.tif 000057
【０４１４】
【数１−１９】
2005133102.tif 000058
【０４１５】
【数１−２０】
2005133102.tif 000059
【０４１６】
【数１−２１】
2005133102.tif 000060
【０４１７】
【数１−２２】
2005133102.tif 000061
【０４１８】
【数１−２３】
2005133102.tif 000062
【０４１９】
【数１−２４】
2005133102.tif 000063
【０４２０】
【数１−２５】
2005133102.tif 000064
【０４２１】
【数１−２６】
2005133102.tif 000065
【０４２２】
【数１−２７】
2005133102.tif 000066
【０４２３】
【数１−２８】
2005133102.tif 000067
【０４２４】
【数１−２９】
2005133102.tif 000068
【０４２５】
【数１−３０】
2005133102.tif 000069
【０４２６】
【数１−３１】
2005133102.tif 000070
【０４２７】
【数１−３２】
2005133102.tif 000071
【０４２８】
【数１−３３】
2005133102.tif 000072
【０４２９】
【数１−３４】
2005133102.tif 000073
【０４３０】
【数１−３５】
2005133102.tif 000074
【０４３１】
【数１−３６】
2005133102.tif 000075
【０４３２】
【数１−３７】
2005133102.tif 000076
【０４３３】
【数１−３８】
2005133102.tif 000077
【０４３４】
【数１−３９】
2005133102.tif 000078
【０４３５】
【数１−４０】
2005133102.tif 000079
【０４３６】
【数１−４１】
2005133102.tif 000080
【０４３７】
【数１−４２】
2005133102.tif 000081
【０４３８】
【数１−４３】
2005133102.tif 000082
【０４３９】
【数１−４４】
2005133102.tif 000083
【０４４０】
【数１−４５】
2005133102.tif 000084
【０４４１】
【数１−４６】
2005133102.tif 000085
【０４４２】
【数１−４７】
2005133102.tif 000086
【図１】
2005133102.tif 000087
【図２】
2005133102.tif 000088
【図３】
2005133102.tif 000089
【図４】
2005133102.tif 000090
【図５】
2005133102.tif 000091
【図６】
2005133102.tif 000092
【図７】
2005133102.tif 000093
【図８】
2005133102.tif 000094
【図９−１】
2005133102.tif 000095
【図９−２】
2005133102.tif 000096
【図１０】
2005133102.tif 000097
【図１１】
2005133102.tif 000098
【図１２】
2005133102.tif 000099
【図１３】
2005133102.tif 000100
【図１４−１】
2005133102.tif 000101
【図１４−２】
2005133102.tif 000102
【図１４−３】
2005133102.tif 000103
【図１５−１】
2005133102.tif 000104
【図１５−２】
2005133102.tif 000105
【図１５−３】
2005133102.tif 000106
【図１６−１】
2005133102.tif 000107
【図１６−２】
2005133102.tif 000108
【図１７】
2005133102.tif 000109
【図１８】
2005133102.tif 000110
【図１９】
2005133102.tif 000111
【図２０】
2005133102.tif 000112