(57)【要約】【課題】  電着により導入物質を針先に固定して保持する場合、鋭利な針先の先端を鈍化させることなく確実に付着させることができる導入物質の保持方法を提供すること。【解決手段】  目的の生体試料に対し導入物質を選択的に導入することが可能な、少なくとも表面に導体を含む導入手段の針４１に対して、導入物質を電気的に吸着させることで針４１に導入物質を保持させる導入物質の保持方法であって、導入物質を含む導入物質溶液７２内に針４１及び溶液内電極７４を互いに接触しないよう浸漬し、かつ少なくとも針４１の先端４１ａを導入物質溶液７２から突出させた状態にして、針４１と導入物質とが逆の電気的極性になるように、針４１と溶液内電極７４との間に電圧を付与する。【選択図】  図１
2005151807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生体試料に対して導入物質を選択的に導入することが可能な、少なくとも表面に導体を含む導入手段に対して、前記導入物質を電気的に吸着させることで前記導入手段に前記導入物質を保持させる導入物質の保持方法であって、
前記導入物質を含む溶液内に前記導入手段及び電極を互いに接触しないよう浸漬し、かつ少なくとも前記導入手段の先端を前記溶液から突出させた状態にして、前記導入手段と前記導入物質とが逆の電気的極性になるように、前記導入手段と前記電極との間に電圧を付与することを特徴とする導入物質の保持方法。
【請求項２】
前記電極は、円筒形状をなすか、または円筒内周面への円周方向等ピッチ配置とし、
少なくとも前記導入手段の先端を前記電極から所定量突出させた状態で、前記導入手段を前記軸方向に挿入することを特徴とする請求項１に記載の導入物質の保持方法。
【請求項３】
前記導入手段は断面が略円形の部分を含む針であり、
前記針と前記電極との相対位置を変化させ、前記針の外周面と前記電極の内周面との距離を前記針の円周方向において連続もしくは複数箇所で一定になるよう制御しながら、前記針と前記電極との間に電圧を付与することを特徴とする請求項２に記載の導入物質の保持方法。
【請求項４】
前記導入物質には遺伝子を構成することが可能な物質が含まれていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の導入物質の保持方法。
【請求項５】
目的の生体試料に対して導入物質を選択的に導入することが可能な、少なくとも表面に導体を含む導入手段と、
前記導入手段と互いに接触しないように、前記導入物質を含む溶液内に浸漬することが可能な電極と、
前記導入手段の少なくとも先端を前記溶液から突出させた状態に保持する位置決め手段と、
前記導入手段と前記電極との間に、前記導入手段と前記導入物質とが逆の電気的極性になるように、前記導入物質を前記導入手段に電気的に吸着しうる電圧を付与することが可能な電圧印加手段と、
を具備したことを特徴とする導入物質の保持装置。
【請求項６】
前記位置決め手段は、前記導入手段の前記突出した部分を回避可能な部分を備えた支持手段を含むことを特徴とする請求項５に記載の導入物質の保持装置。
【請求項７】
前記位置決め手段は、前記導入手段の前記先端を含む部分を所定量通過させることが可能な開口部を含むことを特徴とする請求項５に記載の導入物質の保持装置。
【請求項８】
前記電極は、円筒形状をなすか、または円筒形状を含む部材の円筒内周面に円周方向等ピッチで配置され、
前記位置決め手段は、少なくとも前記導入手段の先端が前記電極から突出した状態で、前記導入手段が前記電極の軸方向に挿入した状態になるように前記導入手段を保持することが可能であることを特徴とする請求項５に記載の導入物質の保持装置。
【請求項９】
前記導入手段は断面が略円形の部分を含む針であり、
前記針と前記電極との相対位置を変化させ、前記針の外周面と前記電極の内周面との距離を前記針の円周方向において連続もしくは複数箇所で一定になるよう制御することが可能な手段をさらに含み、
前記電圧印加手段は、前記制御に基づいて前記針と前記電極との相対位置が変化しているとき、前記針と前記電極との間に電圧を生じさせることを特徴とする請求項８に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１０】
前記導入物質は遺伝子を構成することが可能な物質を含むことを特徴とする請求項５ないし請求項９のいずれかに記載の導入物質の保持装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子等の導入物質を所望の生体試料に選択的に導入するのに用いて好適な導入物質の保持方法及び保持装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞や卵等のような生体試料に対し遺伝子等の導入物質を選択的に導入する場合には、顕微鏡観察下で標的とする生体試料を選択した後、ピペット等の処置具を保持したマニピュレータを３次元的に位置決めして目標部位に挿入し、予め処置具に保持している導入物質を放出するという手法が採用されている。このとき、処置具の挿入及び導入物質の放出圧力等で生体試料がダメージを受け易いため、ダメージをできるだけ小さくして導入後の生存率を向上させる導入方法が研究されている。
【０００３】
上述した遺伝子導入を行う導入方法の従来技術としては、処置具として極細径の針を用意し、導入物質を針先に塗布して乾燥・凍結・電着等により固定して保持した後、生体試料に突き刺して導入するものがある。すなわち、導入物質を保持した極細径の針は、標的とする細胞等に突き刺して目標部位（たとえば細胞核）まで針先を侵入させ、拡散もしくは電圧付与により能動的に導入物質を放出する。このような導入方法により、細胞への針侵入及び内圧によるダメージを抑えることができるとしている。（たとえば特許文献１参照）
【特許文献１】特開平６−３４３４７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上述した導入方法で使用する針先に導入物質を保持するための方法としては、（１）塗布後に乾燥及び凍結させる保持方法と、（２）電着による保持方法とが知られている。
このような従来の保持方法には、次のような問題が指摘されている。
（１）針先に導入物質を塗布後に乾燥及び凍結させて固定する保持方法では、針表面の濡れ性や環境条件により、固定量を安定させることは困難である。
（２）電着により導入物質を針先に固定する保持方法では、針が導入物質と逆の極性になるよう電圧を付与し、電界を形成させることが必要である。しかし、針を一方の電極として使用すると、形成される電界は針の先端に極端に集中した分布となる。この結果、導入物質は針の先端のみに凝集するので、せっかく極細径とした針の鋭利な先端が鈍化して、生体試料へのダメージを低減することは困難になる。
【０００５】
ここで、電着による従来の保持方法（装置）について、その問題点を図１０ないし図１３に基づいて具体的に説明する。
図１０（ａ）において、図中の符号１は遺伝子等の導入物質を含む溶液（以下、導入物質溶液と呼ぶ）を入れておく溶液保管容器、２は導入物質溶液、３は針、４は針３と共に導入物質溶液２内に浸漬される溶液内電極、５は電線、６は電源である。この場合、一方の電極として機能する針３と他方の溶液内電極４とを互いに接触しないよう適当に離間させて導入物質溶液２内に浸漬し、電源６から通電して針３と溶液内電極４との間に電圧を付与する。このとき、導入物質の極性と針３の極性とが異なっていれば、導入物質溶液２内の導入物質が針３の表面に電気的に吸着されて付着する。従って、たとえばＤＮＡといった導入物質は一般的にマイナスの極性を有していることが多いので、この場合は針３がプラス（正極）となるように電線５を電源６に接続して通電する。
なお、図１０（ｂ）に示すように、溶液保管容器１′自体に上述した溶液内電極４の機能を持たせて電源と接続したものもある。
【０００６】
上述した従来技術を用いて針３に導入物質を保持する場合、針３を一方の電極として形成される電界は先端部に集中する分布となるため、導入物質溶液２内の導入物質は、図１１（ａ）に示すように、針先のみに凝集して付着した導入物質２ａとなり、結果的に鋭利な先端を鈍化させてしまう。なお、たとえば生体試料としての卵７に針３を突き刺して導入を行うときには、たとえば図１２に示すように、金網８等に載置された状態とすることが一つの方法として考えられる。
従って、図１１（ｂ）に示すように、先端が鈍化した針３を卵７に突き刺すと、導入物質２ａで鈍化した針先が卵７を押しつぶすように損傷を与えながら内部に侵入するので、卵７は大きなダメージを受けることとなる。
なお、図１３に示すように、生体試料が細胞９である場合も同様に、鈍化した針３の針先が押しつぶすようにして核９ａに向けて侵入するので、やはり大きなダメージを受けることとなる。
【０００７】
このように、針先に導入物質を固定して保持するための従来方法はいずれも問題を有しているにもかかわらず、上記の特許文献１にはこのような問題を回避するための手段が具体的に開示されていない。
そこで、本発明では、電着により導入物質を針先に固定して保持する場合、鋭利な針先の先端を鈍化させることなく確実に付着させることができる導入物質の保持方法及び保持装置の提供を第１の目的としている。また、本発明では、導入物質の保持方法及び保持装置において、鋭利な針先の先端を鈍化させないことに加えて、針先への導入物質の固定量を安定させることを第２の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を採用した。
本発明の導入物質の保持方法は、目的の生体試料に対して導入物質を選択的に導入することが可能な、少なくとも表面に導体を含む導入手段に対して、前記導入物質を電気的に吸着させることで前記導入手段に前記導入物質を保持させる導入物質の保持方法であって、前記導入物質を含む溶液内に前記導入手段及び電極を互いに接触しないよう浸漬し、かつ少なくとも前記導入手段の先端を前記溶液から突出させた状態にして、前記導入手段と前記導入物質とが逆の電気的極性になるように、前記導入手段と前記電極との間に電圧を付与することを特徴とするものである。
【０００９】
このような導入物質の保持方法によれば、前記導入物質を含む溶液内に前記導入手段及び電極を互いに接触しないよう浸漬し、かつ少なくとも前記導入手段の先端を前記溶液から突出させた状態にして、前記導入手段と前記導入物質とが逆の電気的極性になるように、前記導入手段と前記電極との間に電圧を付与するので、電界の分布が集中しやすい導入手段の先端部分は溶液外に存在することとなる。このため、溶液中で電荷を持つ導入物質は、異なる極性を有するものの溶液外となる導入手段の先端部分に対し、電気的に吸着されて付着するようなことはない。
【００１０】
上述した導入物質の保持方法において、前記電極は、円筒形状をなすか、または円筒内周面への円周方向等ピッチ配置とし、少なくとも前記導入手段の先端を前記電極から所定量突出させた状態で、前記導入手段を前記軸方向に挿入することが好ましく、これにより、導入手段の全周にわたって導入物質を電気的に吸着させることができる。この場合、導入手段が電極の円形断面中心軸に沿って導入されれば、導入手段の周方向において導入物質を吸着する機会が略均等に得られるため、全周にわたって電気的に吸着されて付着する導入物質の分布も略均一になる。
【００１１】
上述した導入物質の保持方法において、前記導入手段は断面が略円形の部分を含む針であり、前記針と前記電極との相対位置を変化させ、前記針の外周面と前記電極の内周面との距離を前記針の円周方向において連続もしくは複数箇所で一定になるよう制御しながら、前記針と前記電極との間に電圧を付与することが好ましく、これにより、針の円周方向において導入物質を吸着する機会が均等に得られるため、導入物質は円形断面とした針表面の全周にわたって電気的に吸着され、かつ、付着する導入物質の分布も均一になる。
【００１２】
上述した導入物質の保持方法において、前記導入物質には遺伝子を構成することが可能な物質が含まれていることが好ましい。
【００１３】
本発明の導入物質の保持装置は、目的の生体試料に対して導入物質を選択的に導入することが可能な、少なくとも表面に導体を含む導入手段と、前記導入手段と互いに接触しないように、前記導入物質を含む溶液内に浸漬することが可能な電極と、前記導入手段の少なくとも先端を前記溶液から突出させた状態に保持する位置決め手段と、前記導入手段と前記電極との間に、前記導入手段と前記導入物質とが逆の電気的極性になるように、前記導入物質を前記導入手段に電気的に吸着しうる電圧を付与することが可能な電圧印加手段と、を具備したことを特徴とするものである。
【００１４】
このような導入物質の保持装置によれば、導入手段の少なくとも先端を溶液から突出させた状態に保持し、電圧印加手段が電圧を付与して導入手段の表面に吸着した導入物質を電気的に固定するように構成したので、電界の分布が集中しやすい導入手段の先端部分は電圧を印加する際には常に溶液外とすることができる。このため、導入手段と導入物質とが異なる極性となるように電圧印加手段が電圧を付与しても、溶液中で電荷を持つ導入物質は、溶液外にあって異なる極性を有する導入手段の先端部分に電気的に吸着されて付着するようなことはない。
【００１５】
上述した導入物質の保持装置において、前記位置決め手段は、前記導入手段の前記突出した部分を回避可能な部分を備えた支持手段を含むことが好ましく、これにより、極細の導入手段が位置決め手段との干渉により破損するのを防止することができる。
また、上述した導入物質の保持装置において、前記位置決め手段は、前記導入手段の前記先端を含む部分を所定量通過させることが可能な開口部を含むことが好ましく、これにより、極細の導入手段は、開口部を通過することで位置決め手段との干渉により破損することなく位置決めされる。
【００１６】
上述した導入物質の保持装置において、前記電極は、円筒形状をなすか、または円筒形状を含む部材の円筒内周面に円周方向等ピッチで配置され、前記位置決め手段は、少なくとも前記導入手段の先端が前記電極から突出した状態で、前記導入手段が前記電極の軸方向に挿入した状態となるように前記導入手段を保持することが可能であることが好ましく、これにより、導入手段の全周にわたって導入物質を電気的に吸着させることができる。この場合、導入手段が電極の円形断面中心軸に沿って導入されれば、導入手段の周方向において導入物質を吸着する機会が略均等に得られるため、全周にわたって電気的に吸着されて付着する導入物質の分布も略均一になる。
【００１７】
上述した導入物質の保持装置において、前記導入手段は断面が略円形の部分を含む針であり、前記針と前記電極との相対位置を変化させ、前記針の外周面と前記電極の内周面との距離を前記針の円周方向において連続もしくは複数箇所で一定になるよう制御することが可能な手段をさらに含み、前記電圧印加手段は、前記制御に基づいて前記針と前記電極との相対位置が変化しているとき、前記針と前記電極との間に電圧を生じさせることが好ましく、これにより、針の円周方向において導入物質が吸着する機会が均等に得られるため、導入物質は円形断面とした針表面の全周にわたって電気的に吸着され、かつ、付着する導入物質の分布も均一になる。
【００１８】
上述した導入物質の保持装置において、前記導入物質は遺伝子を構成することが可能な物質を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
上述した本発明の導入物質の保持方法及び保持装置によれば、針の鋭利な先端部を導入物質の付着により鈍化させることがないため、針先の侵入時に生体試料へ及ぼすダメージを最小限に抑えた導入が可能になる。
また、導入物質を保持する表面積が小さくなる極細径の針においても、導入物質を針の表面（外周面）に均一に吸着して付着させることで、導入物質を安定して保持させ、かつ保持量の効率を高めることが可能になる。
従って、導入後における生体試料の生存率を高め、また、導入物質の固定量を安定させてかつ保持効率を向上させるという顕著な効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置の一実施形態を図面に基づいて説明する。
＜第１の実施形態＞
図４は、本発明による導入物質の保持方法及び保持装置を適用した遺伝子導入装置を備えている細胞培養装置１０の構成例を図示したものである。この細胞培養装置１０は、たとえば培地中に存在する対象の細胞（生体試料）の核内に適当な遺伝子（導入物質）をインジェクションなどの導入を行って所望の培養環境に保ち、遺伝子にコードされているタンパク質を発現させるものである。
【００２１】
図４に示す細胞培養装置１０は、細胞等を拡大して観察するための倒立顕微鏡２０と、内部を所望の培養環境に維持できる細胞チャンバ３０と、特定の細胞に後述する保持装置７０を用いて針などの導入手段に保持した遺伝子を導入するための遺伝子導入装置４０と、各種の制御や画像データの保存等を行うパーソナルコンピュータ（以下、「ＰＣ」と呼ぶ）５０とを主な構成要素とする。
倒立顕微鏡２０は、上面に細胞チャンバ３０を設置して水平２軸方向（前後・左右）に移動可能なＸＹステージ２１と、このＸＹステージ２１を支持する主架台２２と、細胞チャンバ３０内の観察対象を下方から観察するための対物レンズ２３と、観察に適した照明光を照射する光源２４と、対物レンズ２３で観察された画像を撮像する撮像部２５とを具備して構成される拡大手段である。また、主架台２２は、上下方向及び左右方向の移動が可能なＸＺステージ２６を支持している。
【００２２】
細胞チャンバ３０は、本体３１に加湿器３２が接続された構造とされる。本体３１は、蓋３３を有する箱状に形成されており、内部に培養ディッシュ１１を収納可能であると共に、温度センサ３４及びヒータ３５が配設されている。また、本実施形態では、ＰＣ５０が、温度センサ３４の検出値に基づいてヒータ３５の出力を調整している。すなわち、温度センサ３４、ヒータ３５及びＰＣ５０は、本体３１内部を最適な培養温度近傍、たとえば３７℃±０．５℃に保つための温度保持機構を構成している。
【００２３】
また、本体３１には、遺伝子導入装置４０を内部に挿入するための開口部３６が形成されている。この開口部３６には、開閉部材のシャッタをスライドさせて開口部３６を開閉するシャッタ機構３７が設けられており、たとえば手動やＰＣ５０の作動制御により適宜開閉可能となっている。
なお、本体３１の蓋３３及びシャッタ機構３７のシャッタは、たとえば透明プラスチック等の透明材料で形成されている。
【００２４】
加湿器３２は、図示しない駆動回路から制御電圧が印加されるようになっている。この駆動回路は、インターフェースを介してＰＣ５０によって制御が可能とされている。この加湿器３２で発生した霧状液滴は、エア導入口を介して気流発生部６０から送られてくる空気と共に、エア排出口を通って本体３１の内部空間Ｓに供給される。
【００２５】
気流発生部６０は、たとえば二酸化炭素濃度が５％に調整された空気を圧縮して貯蔵する気流供給源の圧縮空気ボンベ６１と、圧縮空気ボンベ６１内の空気を所定の圧力に調整する圧力調整レギュレータ６２と、所定圧力に調整された空気の供給量を制御する流量調整バルブ６３と、圧縮空気ボンベ６１と加湿器３２との間を連結して空気流路を形成する配管６４と、加湿器３２に供給する空気温度を所定の値（たとえば培養温度近傍）に調整する配管温調器６５とを具備して構成される。
【００２６】
遺伝子導入装置４０は、上述したＸＺステージ２６に取り付けられて一体に上下方向及び左右方向の移動が可能である。この遺伝子導入装置４０は、培養ディッシュ１１に保持されている細胞に対し、遺伝子等の導入物質を選択的に導入するものであり、選択した特定の細胞に突き刺すことで針先に保持している遺伝子を細胞の内部に導入する極細径の針４１を具備して構成される。
また、遺伝子導入装置４０の針４１は、後述する外部電極、保持台（位置決め手段）及び電源（電圧印加手段）等と共に導入物質の保持装置７０を構成している。なお、針４１は、遺伝子導入装置４０に着脱可能であり、従って、複数の針から適宜選択して交換使用することができる。
【００２７】
針４１は、たとえば図１に示すように、少なくとも表面が導体よりなる中実円柱形状とされ、その先端部側には、頂点の先端４１ａに向けて徐々に径が減少している円錐形状部４１ｂを設けてある。この針４１の径は、生体試料側のダメージを最小限に抑えるため、生体試料の細胞に突き刺す場合には、先端４１ａの径を１μｍ以下の極細径とすることが好ましく、生体試料の卵（卵母細胞）に突き刺す場合には、先端４１ａの径を２〜３μｍ以下の極細径とすることが好ましい。なお、ここで使用可能な針４１としては、たとえばガラスを芯材として表面に導体（金や白金等）をコーティングした構成のものがある。
【００２８】
また、針４１は、上述した遺伝子導入装置４０の構成要素であることに加えて、導入物質の保持装置７０の構成要素でもある。この場合の針４１は、目的とする特定の生体試料に遺伝子等の導入物質を選択的に導入するため、その表面に遺伝子等の導入物質を電気的に保持する機能を有するものである。
この針４１に導入物質を電気的に吸着させる導入物質の保持装置７０は、たとえばＸＹステージ２１上の適所に設置されている。この保持装置７０は、上述した針４１に加えて、一方の電極として機能する針４１に電圧を印加するための外部電極７１と、針４１の少なくとも先端４１ａを導入物質溶液７２から突出させた状態に保持する位置決め手段である保持台７３と、針４１と互いに接触しないように離間して導入物質溶液７２内に浸漬される溶液内電極７４と、針４１と溶液内電極７４との間に電圧を付与する電圧印加手段の電源７５とを具備して構成される。なお、図中の符号７６，７７は、外部電極７１及び溶液内電極７４と電源７５との間を電気的に接続する電線である。
【００２９】
外部電極７１は、針４１の導体部分（少なくとも表面の必要部分）と導通可能に設けられ、かつ、電源７５と電線７６を介して接続されている。この外部電極７１には、針４１の表面に遺伝子等の導入物質を吸引して付着させ、電気的に保持する極性を与えるための電圧が印加される。図示の例では、外部電極７１が円錐形状部４１ｂより上方に配設されており、少なくとも先端４１ａから円錐形状部４１ｂの範囲については、表面に導入物質を付着させることが可能な保持領域となる。
そして、外部電極７１側に接続された電線７６の他端は、針４１の極性が導入物質の極性と異なるように、電源７５の端子を選択して接続される。すなわち、一般的には、導入物質がマイナス（負）の極性を有していることが多いので、このような場合は、針４１側がプラス（正）の極性となるように電線７６を電源７５の正極端子に接続する。
【００３０】
導入物質溶液７２は、適当な手段により所定量が保持台７３上に液滴として載置される。この導入物質溶液７２を滴下する保持台７３の所定位置には、予め溶液内電極７４を配設しておくとよい。このような溶液内電極７４としては、たとえば保持台７３の表面に導電体（たとえば金や白金など）をパターン化して印刷したものなどがある。
保持台７３は、少なくとも表面にゴム等の軟質部を設けたものであり、針４１の鋭利な先端４１ａを損傷させることなく、所定の長さｈだけ容易に突き刺すことができるようになっている。このときの突き刺す長さｈは、ＸＺステージ２６の下降時の停止位置を精密に制御して所定量に設定する。なお、保持台７３に突き刺さった針４１の先端部分（先端４１ａ）は、導入物質溶液７２の外へ突出して液とは接触しない部分となる。
【００３１】
なお、上述した液滴の導入物質溶液７２及び溶液内電極７４は、たとえば図２（ａ）に示すように、一つの保持台７３毎に１組が配設されるようにしてもよいし、あるいは、図２（ｂ）に示すように、一つの保持台７３′上に複数を配列してもよい。
【００３２】
このような構成の保持装置７０とすれば、以下に説明する手順（方法）によって針４１の表面に導入物質溶液７２内の導入物質を付着させる。
第１の工程では、導入物質を含む導入物質溶液７２内に針４１及び溶液内電極７４を互いに接触しないよう浸漬する。ここでは、ＸＹステージ２１に載置された保持台７３上に予め溶液内電極７４を設置しておき、同溶液内電極７４上に所定量の導入物質溶液７２を滴下した後、ＸＺステージ２６の作動により遺伝子導入装置４０と共に針４１を溶液内電極７４と接触しない位置に降下させる。この結果、針４１の先端４１ａは液滴状の導入物質溶液７２を貫通し、先端４１ａが所定量ｈだけ保持台７３に突き刺さって液の外へ突出する。また、針４１は、先端部４１ａが保持台７３に突き刺さった部分より上方では、導入物質溶液７２の中に浸漬されて導体部分が液と接触した状態となる。この接液部分の長さは、液滴量に応じて略一定となる。すなわち、一方の電極として機能する針４１と、他方の電極である溶液内電極７４とが、互いに接触しない状態として導入物質溶液７２内に浸漬された状態となり、かつ、少なくとも針４１の先端４１ａを導入物質溶液７２から突出させた状態とすることができる。
【００３３】
続く第２の工程では、針４１と導入物質とが互いに逆の極性となるように、外部電極７１を介して接続される針４１と溶液内電極７４との間に電圧（たとえば１〜５Ｖ程度）を付与する。すなわち、導入物質がマイナスであるため、針４１側がプラスで溶液内電極７４側がマイナスとなるように電源７５と接続して電圧を付与する。この結果、電界が形成される針４１においては、保持台７３に突き刺さった先端４１ａ部分を除いて、導入物質溶液７２の中に所望の長さだけ浸漬されている部分の表面に反対の極性を有する導入物質が電気的に吸着されるので、針４１の表面に導入物質を保持することができる。
【００３４】
こうして保持された導入物質は、ＸＺステージ２６及びＸＹステージ２１を動作させることにより、針４１と共に細胞チャンバ３０まで移動した後、対物レンズ２３による観察に基づき設定される細胞の目標位置まで針４１の先端４１ａを降下させて細胞を突き刺すことにより、目的の細胞に選択的に導入される。このとき、針４１の先端４１ａには導入物質が付着していないため鋭利な状態が維持されており、従って、細胞に大きなダメージを与えることなく導入を行うことができる。
【００３５】
また、図３に示す位置決め手段の第１変形例では、上述した保持台７３に代えて、保持板７８に穿設して針４１の先端４１ａを所定量だけ通す穴７８ａが使用されている。すなわち、針４１の円錐形状部４１ｂと所望の挿入量とに応じて定めた穴７８ａを保持板７８に穿設しておけば、針４１の先端部は円錐形状部４１ｂの外径が穴径ｄと一致する位置まで、保持板構成部材と干渉することなく挿入可能となる。この場合の穴７８ａは、針４１の先端４１ａがおおよそ２〜３μｍ以下であることから、最大でも直径が１０〜３０μｍ程度になると考えられ、この程度の穴径であれば、導入物質溶液７２の表面張力により穴７８ａから漏出するようなことはない。
また、このような保持板７８の穴７８ａは、針４１の先端４１ａが突出した部分を回避可能な部分、すなわち、位置決めにより先端４１ａを破損させるような干渉が生じないようにするため設けた逃げの空間部分を備えている位置決め手段である。
【００３６】
このような保持板７８を使用する場合には、たとえば図２（ｃ）に示すように、ガラス板の表面に網目状の導体パターンを形成して溶液内電極７４′としてもよい。
また、図示は省略したものの、導体を上述した穴径ｄと略一致する１０〜３０μｍ程度の細かい線間とした網状部材に形成し、この網状部材に溶液内電極及び保持板の機能を持たせることも可能である。この場合、網状部材の線間に形成される穴が、針４１突出量を規定する位置決め手段としても機能する。
【００３７】
＜第２の実施形態＞
本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置における位置決め手段について、その第２の実施形態を図５に基づいて説明する。なお、上述した実施形態と同様の構成要素には同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
この実施形態の位置決め手段は、針４１及び円柱状の溶液内電極７４Ａを互いに絶縁した微小隙間Ｗを設けて平行に配置し、針４１の先端４１ａ側を溶液内電極７４Ａより下方へ突出させて得られる突出量ｈ′を規定するものである。なお、図中の符号７９は絶縁部材であり、溶液内電極７４Ａは針４１と軸方向へ相対移動可能に支持され、かつ所望の位置で固定可能となっている。
【００３８】
図５（ａ）は、針４１及び溶液内電極７４Ａを平行に配置し、所定の微小隙間Ｗ及び突出量ｈ′を設定した準備状態を示している。この準備状態から、針４１及び溶液内電極７４Ａが導入物質溶液を入れた図示しない容器内に浸漬されることにより、導入物質溶液７２Ａは、図５（ｂ）に示すように、表面張力によって隙間Ｗに所定量が保持される。なお、導入物質溶液７２Ａは、上述したように容器内へ浸漬する他にも、適当な手段により所定量を直接、微小隙間Ｗに供給するようにしてもよい。
このとき、針４１の突出量ｈ′部分においては、対向する位置に溶液内電極７４Ａが存在していないため、導入物質溶液７２Ａを保持することができず、従って、先端４１ａからｈ′の領域は、上述した第１の実施形態と同様に、導入物質溶液７２Ａから突出して接液しない状態となる。このため、針４１及び溶液内電極７４Ａ間に電圧を付与すると、図５（ｃ）に示すように、接液部分の針表面には電気的に吸着されて導入物質７２Ａ′が付着するものの、突出量ｈ′の領域に導入物質が付着するようなことはない。
【００３９】
このようにしても、針４１の先端４１ａに導入物質が付着して鈍化するのを防止し、鋭利に保った針４１の先端４１ａから細胞へ突き刺すことができる。従って、針４１の表面に電気的に保持した導入物質７２Ａ′を細胞に導入する場合には、細胞に与えるダメージを最小限に抑えることができる。すなわち、上述した状態で針４１の先端４１ａを溶液内電極７４Ａから突出させた突出量ｈ′を規定する手段が、少なくとも針４１の先端４１ａを導入物質溶液７２Ａと接触（接液）しないよう突出させた状態に保持する位置決め手段として機能する。
また、このような位置決め手段においても、針４１の先端４１ａが移動する領域に障害物を配置しないことにより、先端４１ａの突出した部分を回避可能な部分、すなわち、位置決めにより先端４１ａを破損させるような干渉が生じないよう設けた逃げの空間部分を備えたものとなる。
【００４０】
＜第３の実施形態＞
続いて、本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置の第３の実施形態を図６に基づいて説明する。なお、上述した各実施形態と同様の構成要素には同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
この実施形態では、円筒状とした溶液内電極７４Ｂを採用し、針４１を溶液内電極７４Ｂの軸方向に挿入して先端４１ａを所定量ｈ′だけ突出させた構成とされる。すなわち、図５に示した実施形態の溶液内電極７４Ａを平行配置の円柱状から円筒形状に変更し、互いに同軸配置とした針４１の外周面と溶液内電極７４Ｂの内周面との間に、微小隙間Ｗが形成されるように構成されている。なお、以下の説明では、円筒状の溶液内電極７４Ｂを電極管７４Ｂと呼ぶことにする。
【００４１】
このような構成とすれば、電極管７４Ｂと針４１との間には表面張力により導入物質溶液７２Ｂが所定量保持されるので、電極として機能する針４１と電極管７４Ｂとの間に電圧を付与することにより、針４１の表面接液部に導入物質を電気的に吸着して付着させることができる。従って、この場合のｈ′を規定する手段は、上述した第２の実施形態と同様に、少なくとも針４１の先端４１ａを導入物質溶液７２Ｂと接触（接液）しないよう突出させた状態に保持する位置決め手段として機能する。
また、このような位置決め手段においても、針４１の先端４１ａが移動する領域に障害物を配置しないことにより、先端４１ａの突出した部分を回避可能な部分、すなわち、位置決めにより先端４１ａを破損させるような干渉が生じないよう設けた逃げの空間部分を備えたものとなる。
【００４２】
また、このような電極管７４Ｂを用いることにより、極細径とした針４１の全周にわたって導入物質を均一分布に付着させることができる。すなわち、溶液内電極７４Ａを円筒状とした第２の実施形態では、表面張力による溶液保持を行うことから、平行配置した針４１の対向面にしか導入物質を付着させることができず、従って、全周の表面積を利用できない分導入物質の保持量には制約があった。しかし、電極管７４Ｂを採用することにより、針４１の円周方向全面が接液部となるので、針４１の接液部表面を有効利用した導入物質の保持が可能になって保持量を増すことができる。
特に、針４１と電極管７４Ｂとが同軸となるように挿入すれば、円形断面とした針４１の外表面と電極管７４Ｂの内周面との面間距離が周方向で一定（針４１が多角形など非円形断面の場合は略一定）になるため、導入物質を吸着する機会が周方向で均等（針４１が非円形断面の場合は略均等）になり、付着する導入物質の分布は全周にわたって均一（針４１が非円形断面の場合は略均一）となる。
【００４３】
ところで、上述した第３の実施形態では、針４１と電極管７４Ｂとが同軸に配設されるものとしたが、以下では、両者が同軸配置されない場合に導入物質を均一分布させる均一化対策について説明する。すなわち、微小隙間Ｗ（電極間距離）が不均一であれば、最もＷが小さくなる接近した面の吸着量が多くなるので、円周方向における導入物質の分布が不均一になるのを防止する対策について述べる。
図７に示す第１の均一化対策では、電極管４１を固定しておき、針４１の自転を規制した状態として、電極管４１の軸Ｃを中心に電極管４１内を公転させる。この結果、針４１が１回公転することにより、相対的に変化する面間距離の微小隙間Ｗは、全周にわたって平均値が均一化するので、電界の影響も平均値が均一化される。従って、針４１の接液部表面に吸着する導入物質の分布も均一になり、針４１の接液部表面を有効利用した導入物質の均一保持が可能になる。
【００４４】
また、図７の例では針４１を軸Ｃを中心に公転させるものとしたが、針４１を軸Ｃ′上に回転可能に支持し、針４１の軸Ｃ′を中心として針自体を自転させてもよい。
このようにしても、１回の自転により相対的に変化する面間距離の微小隙間Ｗは、全周にわたって略均一化するので、電界の影響も略均一化される。従って、針４１の接液部表面に吸着する導入物質の分布も略均一になり、針４１の接液部表面を有効利用した導入物質の均一保持が可能になる。
【００４５】
続いて、図８に基づいて第２の均一化対策を説明する。この対策では、針４１を軸Ｃ′上に固定しておき、同軸Ｃ′を中心として電極管７４Ｂを針４１の外周側で公転させる。このとき、電極管７４Ｂの自転は阻止されている。
このようにしても、電極管７４Ｂが１回公転することにより、相対的に変化する面間距離の微小隙間Ｗは、全周にわたって平均値が均一化するので、電界の影響も平均値が均一化される。従って、針４１の接液部表面に吸着する導入物質の分布も均一になり、針４１の接液部表面を有効利用した導入物質の均一保持が可能になる。
なお、この場合においても、針４１側を固定すると共に、電極管７４Ｂが所定の軸を中心として自転するようにしてもよい。
【００４６】
最後に、図９に基づいて第３の均一化対策を説明する。この対策では、円筒管８０の内周面に対して、円周方向に等ピッチとなるように溶液内電極８１を配設する。図示の例では、円筒管８０の内周面に９０度ピッチとした４つの溶液内電極８１が円周方向に設けられている。
このような構成とすれば、針４１及び円筒管８０を互いに同軸とすることにより、円周方向に多少の不均一は生じるものの、４カ所（複数箇所）において微小隙間Ｗの面間距離（電極間距離）が一定となるので、電極管７４Ｂを使用しなくても導入物質の付着を円周方向に略均一化することができる。この場合、溶液内電極８１の数を増せば、各電極間のピッチが狭まってより一層電極管７４Ｂに近づいていく。
【００４７】
また、図９に示すような構成においても、円筒管８０を固定して針４１側を自転または公転させたり、あるいは、針４１を固定して円筒管８０側を自転または公転させたりすることにより、互いに同軸上にない場合であっても、針４１の表面に付着する導入物質の均一分布が可能になる。
また、上述した各均一化対策では、自転または公転中は電圧の付与が連続的になされるものとしたが、複数回の自転または公転中において、最も接近する位置関係で均等に電圧が付与されるように通電のタイミングを考慮するなどして、所定の間隔で断続的に電圧を付与してもよい。
【００４８】
このように、円筒状の溶液内電極である電極管７４Ｂまたは円筒管８０の内周面に溶液内電極８１を円周方向へ等ピッチの配置とし、針４１を電極管７４Ｂまたは円筒管８０の軸方向に挿入して先端４１ａを所定量ｈ′だけ突出させると共に、針４１と電極管７４Ｂまたは溶液内電極８１との相対位置を変化させ、針４１の外周面と、電極管７４Ｂまたは円筒管８０内にある溶液内電極８１の内周面との距離を、針４１の円周方向において連続もしくは複数箇所で一定になるよう制御しながら電圧を付与する保持方法及び保持装置とすることにより、針４１の外表面に付着する導入物質の分布が安定して円周方向に均一化される。従って、極細径となる針４１の表面を有効利用して導入物質の保持量を確保できるため、導入物質の保持効率が向上する。
【００４９】
なお、本発明は上述した各実施形態に限定されることはなく、たとえば細胞培養装置の構成が図４に示したものに限定されないなど、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置の第１の実施形態を示す図で、（ａ）は針を導入物質溶液に浸漬する前の状態、（ｂ）は針を導入物質溶液に浸漬した状態、（ｃ）は（ｂ）のＡ−Ａ断面拡大図である。
【図２】溶液内電極と導入物質溶液の液滴との配置例を示す保持台の平面図で、（ａ）は単独配置、（ｂ）は複数配置、（ｃ）はガラス板の表面に網目状の導体パターンを形成した配置である。
【図３】図１に示した第１の実施形態に係る第１変形例の要部拡大断面図である。
【図４】導入物質の保持装置の一適用例として細胞培養装置の構成例を示す図である。
【図５】本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置の第２の実施形態を示す斜視図で、（ａ）準備状態、（ｂ）は導入物質溶液を電極間に保持した状態、（ｃ）は針表面に導入物質を保持した状態である。
【図６】本発明に係る導入物質の保持方法及び保持装置の第３の実施形態を示す図で、（ａ）は導入物質溶液を保持した状態の要部断面斜視図、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ断面図である。
【図７】第３の実施形態における第１の均一化対策を示す断面図である。
【図８】第３の実施形態における第２の均一化対策を示す断面図である。
【図９】第３の実施形態における第３の均一化対策を示す断面図である。
【図１０】従来技術を示す説明図で、（ａ）は容器内の導入物質溶液に溶液内電極を浸漬する方式、（ｂ）は容器自体を溶液内電極とする方式である。
【図１１】従来の問題点を示す説明図で、（ａ）は生体試料の卵に導入する直前の状態、（ｂ）は導入した状態を示している。
【図１２】生体試料の卵を金網に載置した状態を示す平面図である。
【図１３】従来の問題点を示す説明図で、生体試料の細胞に導入する直前の状態を示している。
【符号の説明】
【００５１】
１０    細胞培養装置
１１    培養ディッシュ
２０    倒立顕微鏡
２１    ＸＹステージ
２６    ＸＺステージ
３０    細胞チャンバ
４０    遺伝子導入装置
４１    針（導入手段）
４１ａ    先端
６０    気流発生部
７０    保持装置
７１    外部電極
７２，７２Ａ，７２Ｂ    導入物質溶液
７３，７３′    保持台
７４，７４′，７４Ａ，８１    溶液内電極
７４Ｂ  電極管（溶液内電極）
７５    電源
７８    保持板
７８ａ    穴
７９    絶縁部材
８０    円筒管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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