(57)【要約】【課題】  細胞に対する標的指向性があり、トランスフェクション能に優れ、かつ安全な遺伝子キャリアーを提供する。【解決手段】  細胞を認識する糖（例えば、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、フコース、シアル酸より選択された単糖および該単糖を含むオリゴ糖）残基で側鎖が修飾された多糖（例えば、β−1,3−グルカン）から成る多糖系遺伝子キャリアー。該多糖系遺伝子キャリアー２本鎖および目的の遺伝子（例えばアンチセンスDNA）を含む核酸１本鎖から成る３重螺旋構造の複合体として投与することにより、細胞特異的に当該遺伝子を細胞内に効率的に導入することができる。【選択図】  図７
2005151891.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を認識する糖残基を含む原子団で側鎖が修飾された多糖から成ることを特徴とする多糖系遺伝子キャリアー。
【請求項２】
細胞を認識する糖残基が、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノ-ス、グルコース、フコースおよびシアル酸より選ばれる単糖または該単糖を含むオリゴ糖の残基であることを特徴とする請求項１に記載の多糖系遺伝子キャリアー。
【請求項３】
多糖がβ−1,3−グルカンであることを特徴とする請求項１または２に記載の多糖系遺伝子キャリアー。
【請求項４】
β−1,3−グルカンがシゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンから選ばれることを特徴とする請求項３に記載の多糖系遺伝子キャリアー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の多糖系遺伝子キャリアーを用いて細胞に遺伝子を導入する方法であって、夫々１本鎖の状態にある前記多糖系キャリアーと目的の遺伝子を含む核酸とを水の存在下で混合し、多糖系キャリアー２本鎖および核酸１本鎖から成る３重螺旋状の複合体を形成させて投与することを特徴とする方法。
【請求項６】
修飾基がβ−ガラクトースの残基を含み、特異的に認識する細胞が肝臓実細胞であることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェクション能が高く、かつ生体に安全な、多糖系の新規な遺伝子キャリアーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、アンチセンス療法が盛んに研究されており、アンチセンス医薬に関する文献・特許が多数報告されつつある。既に開発段階に入っている医薬品の候補として、各種の癌や白血病、エイズや肝炎などのウイルス性疾患、乾癬、クローン病、喘息、リウマチなど多岐に及んでいる。
【０００３】
アンチセンス療法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA、mRNAまたはmRNA前駆体等の標的核酸に見いだされる特異的な配列に対し相補的な配列を有するように設計されている。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬として使用する場合、配列特異性の他にヌクレアーゼに耐性があること；無毒性で、製造コストが安価であること、標的組織や細胞へ送達できるような適当な薬物動態を有すること；細胞膜、小胞オルガネラ膜、核膜を通過できること；高い特異性と親和性をもって高次構造を有するRNA分子の標的領域へ侵入すること；そして、標的蛋白質の翻訳過程を最大限、阻止できるようにすることなど多くの課題がある。
【０００４】
それらの課題の中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内への導入効率を上げることは重要な問題であり、一般に、その解決のために遺伝子キャリアーが併用されている。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてin vitroでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性が原因として、これらのin vivoにおける使用は制限されている。
【非特許文献１】Mulligan, Science, 260, 926-932（1993）
【非特許文献２】Miller, Nature, 357, 455-460（1992）
【非特許文献３】Crystal, Science, 270, 404-410（1995）
【０００５】
近年、非ウイルス性の人工キャリアーとしてポリエチレンイミン（PEI）、PEIと同様に窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマー、カチオン性脂質などが遺伝子キャリー、トランスフェクション剤、薬物担体などという名称で、多数の特許が出願されている。
【０００６】
しかしながら、PEIのようにアミノ基を多数有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性も考えられる。事実、今まで検討されたカチオン性ポリマーは未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献４】医薬品添加物辞典
【非特許文献５】日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社
【０００７】
他方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β−1,3−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献６】TheresaM. McIntire and David A. Brant, J. Am. Chem. Soc., 120, 6909（1998）
【０００８】
さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約20年の使用実績がある。
【非特許文献７】清水、陳、荷見、増淵、Biotherapy, 4, 1390（1990)
【非特許文献８】長谷川、Oncology and Chemotherapy, 8, 225（1992）
【０００９】
このようなβ−1,3−グルカンを化学修飾して、DNA等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−1,3−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−1,3−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−1,3−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が述ベられている。
【特許文献１】PCT／US95／14800
【００１０】
また、最近、本発明者らにより、β−1,3−グルカンまたはβ−1,3−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、各種の核酸と新しいタイブの複合体を形成することが見出された。
【特許文献２】PCT／JP00／07875
【非特許文献９】櫻井、新海、J.Am. Chem. Soc., 122, 4520（2000）
【非特許文献１０】木村、甲元、櫻井、新海、Chem. Lett., 1242（2000）
【００１１】
もともと天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、主に、水素結合を介して形成されると考えられる。
【非特許文献１１】櫻井和朗、井口律子、木村太郎、甲元一也、水雅美、新海征治、Polym. Preprints Jpn., 49, 4054（2000)
【００１２】
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、場合によってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類にアミノ基のようなカチオン性官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も研究されている。そして、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされている。
【特許文献３】PCT／JP02／02228
【００１３】
さらに、細胞内へのトランスフェクション効率を高める手段として、最近は、標的細胞への特異的な親和性を活用する方法の研究が盛んである。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白にインテグリンがしられているが、そのインテグリン結合に有効と認められているペプチドとしてRGD配列が知られている。RGD配列を含むペプチドを、既知のキャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、特許に例示されている。
【特許文献４】特表2002-502243
【特許文献５】特願2003-52508
【００１４】
同様に、標的化の対象として細胞の表面に存在する糖レセプターを活用するトランスフェクションの方法も研究されている。例えば、肝細胞に代表されるガラクトース受容体をもつ細胞に対して、特異的に親和性を有するガラクトースまたはガラクトースを構成成分として含むラクトースで修飾された脂質、ペプチド、ポリエチレングリコール等の高分子が、肝臓癌のアンチセンスDNA治療薬のキャリアーとして特許出願されている。
【特許文献６】特開平9-235292
【特許文献７】特開平11-290073
【特許文献８】特表2002-515418
【特許文献９】特表2002-538174
【００１５】
また、抗原提示細胞の樹状細胞やランゲルハンス細胞等に対しては、マンノース受容体が特異的に作用することから、マンノースで修飾されたポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リシンなどの高分子が免疫応答を発現するのに有効な遺伝子キャリアーとして知られている。
【特許文献１０】特表2001-516729
【特許文献１１】特表2001-517709
【特許文献１２】特表2002-516290
【００１６】
畑中らの著書には、そのような哺乳動物の細胞膜表面で認識に関与する糖として、β−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、α−Ｄ−マンノース、α−Ｄ−グルコース、α−Ｌ−フコース、シアル酸などの単糖が例示されている。
【非特許文献１２】畑中研一、西村紳一郎、大内辰郎、“糖質の科学と工学”、講談社サイエンティフィク、1997,2.20  しかしながら、このような単糖もしくはオリゴ糖を多糖の側鎖に導入した化合物を合成し、遺伝子キャリアーなどに利用する例は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、細胞を認識する糖レセプターを活用し、標的細胞へのトランスフェクション能が高く、かつ生体に安全な、新規の遺伝子キャリアーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、多糖類の側鎖に、細胞を認識する糖の残基を含む修飾基を導入し、これを遺伝子キャリアーとするものである。
【発明の効果】
【００１９】
標的細胞を認識する糖の残基含有側鎖で修飾された本発明の多糖系遺伝子キャリアーは、目的の遺伝子をコードするDNAと複合体化して投与されることにより、当該遺伝子を細胞に効率的に導入することができるので、例えば、アンチセンス療法において治療効果を向上させるのに寄与するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明で使用する細胞を認識する糖とは、前述した文献等に記載されているガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコース、フコース、シアル酸等より選択された単糖および該単糖を含むオリゴ糖である。そのうち、ガラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミンは肝実細胞に、マンノースは肝クッパー細胞、肺胞マクロファージ、ウイルス感染ラット繊維芽細胞等に、マンノース−６−リン酸は繊維芽細胞に、グルコースは3LL（ルイス肺がん細胞）に、フコースはL1210（マウス白血病細胞）に認識されることが知られている。
【００２１】
修飾の基体となる多糖は、対象とする疾患のアンチセンス治療薬に用いられる核酸と安定な複合体を形成する多糖が好適に使用される。そのような多糖として、シゾフィランやカードランのようなβ−1,3−グルカン、β−1,3−キシラン、キチンやデキストランなどの主に1,4−結合をもつものなどが考えられる。そして、中でも、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのような約30％以上の側鎖のグルコース残基を有する天然のβ−1,3−グルカンは、後述するように、側鎖に選択的に所望の糖鎖を導入するのに好ましい素材である。
【００２２】
多糖の側鎖に、所望の単糖またはオリゴ糖を導入する方法としては、種々の反応が考えられるが、主鎖のグルコシド結合に影響を与えることなしに、側鎖に選択的に導入する方法として、基体の多糖が本来的に有している側鎖のグルコースを利用し、過ヨウ素酸酸化／還元アミノ化を経由する方法が適当である。例えば、まず、側鎖のグルコースを過ヨウ素酸ナトリウムなどを用いて酸化し、開環してアルデヒドをつくる。それに導入する糖のアミン誘導体（例、アミノエチルグルコシド）を反応させ、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて還元アミノ化することにより、糖（グルコース）含有側鎖を導入できる（実施例２、図１参照）。また、過ヨウ素酸酸化後に、アンモニア水とシアノ水素化ホウ素ナトリウムを先に反応させ、ラクトノラクトンを後で反応させることにより、同様に糖（ガラクトース）を含む修飾基を導入することができる（実施例３、図２参照）。さらに、過ヨウ素酸酸化後、亜塩素酸ナトリウムでアルデヒドをカルボン酸に酸化し、アジ化ジフェニルホスホリルを用いて糖のアミン誘導体とカルボン酸の縮合反応を行う方法でも、同様に目的物を得ることができる。
【００２３】
側鎖に細胞を認識する糖鎖を導入した多糖から成る本発明の遺伝子キャリアーを使用する際は、既述の本発明者らにより見出された方法に従い（特許文献２および３）、該多糖を極性溶媒（例えばジメチルスルホキシド）に溶解して１本鎖にした後、水性溶媒中で１本鎖の核酸を加えることにより核酸１本鎖・多糖２本鎖から成る３重螺旋状の複合体を形成させて投与することにより、優れたトラクション効率で目的の遺伝子の細胞への導入を図ることができる。かくして、本発明は、如上の多糖系遺伝子キャリアーを使用する方法の発明として、該多糖系遺伝子キャリアーを用いて細胞に遺伝子を導入する方法であって、夫々１本鎖の状態にある多糖系キャリアーと目的の遺伝子を含む核酸とを水の存在下で混合し、多糖系キャリアー２本鎖および核酸１本鎖から成る３重螺旋状の複合体を形成させて投与することを特徴とする方法を提供する。（以下の実施例参照）。
【実施例１】
【００２４】
β−1,3−グルカン（シゾフィラン）の調製  ３重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ATCC（American Type Culture Collection）から入手したSchizophyllum commune. Fries（ATCC 44200)を、最小培地を用いて7日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量45万の３重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献１３】GregoryG. Martin, Michael F. Richardson, Gordon C. Cannon and Charles L. McCormick,Am. Chem. Soc. Polymer Prepr. 38（1）, 253-254（1997）
【非特許文献１４】Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, ShozoKawabata and  Akira Misaki,Carbohydrate Research, 89, 121-135（1981）
【実施例２】
【００２５】
ラクトース修飾シゾフィランの合成  ラクトース修飾シゾフィランは図１のスキームに従って合成した。例としてアミノエチルラクトシドを用いた場合の合成法を示しているが、同様の合成法はすべての糖類（単糖、オリゴ糖、多糖）のアミノエチルグリコシドに適用することができる。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン234mgを蒸留水234mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム23.7mg（側鎖グルコースに対して0.3当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液を透析膜（排除限界：8000）で透析後、反応溶液にアミノエチルラクトシド0.64gを加え、2日間室温で攪拌した。反応溶液をそのまま凍結乾燥させ、得られた白色固体をジメチルスルホキシド35mlに溶解させた。反応溶液にさらにアミノエチルラクトシド（合成法についてはSunらの方法参照）0.45g、少量の炭酸カリウムを加え、2日間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウムを加え、2日間攪拌後、反応溶液をエタノール500mlにて再沈殿操作を行った。生成した沈殿を濾別し、メタノールとアセトンで洗浄を繰り返した。沈殿を蒸留水に件濁させた後、不溶物を濾別した。溶液を透析膜（排除限界：8000）で透析した後、凍結乾燥し、ラクトース修飾シゾフィランを得た。
【非特許文献１５】Sun, Xue-Long;Faucher, Keith M.; Houston,Michelle; Grande, Daniel;Chaikof, Elliot L. Journal of the American ChemicalSociety, 124(25), 7258-7259(2002)
【実施例３】
【００２６】
ガラクトース修飾シゾフィランの合成  ガラクトース修飾シゾフィランは図２のスキームに従って合成した。例としてラクトノラクトンを用いた場合の合成法を示しているが、同様の合成法はすべての還元糖類（単糖、オリゴ糖、多糖）の導入に適用することができる。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、ラクトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、ガラクトース修飾シゾフィランを得た。
【実施例４】
【００２７】
グルコース修飾シゾフィランの合成  グルコース修飾シゾフィランの合成法は図２のスキームに従い合成し、ラクトノラクトンの代わりにここではマルトノラクトンを用いている。実施例１にて調製された分子量45万のシゾフィラン100mgを蒸留水100mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム3.3mg（側鎖グルコースに対して0.1当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液はそのまま冷蔵庫内で2日間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、28％アンモニア水溶液40ml、シアノ水素化ホウ素ナトリウム100mgを加え、室温で1週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。得られた白色固体をジメチルスルホキシド20mlに溶解させ、マルトノラクトン1g（大過剰）を加え、室温で１週間攪拌を続けた。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥し、グルコース修飾シゾフィランを得た。
【実施例５】
【００２８】
糖修飾シゾフィランのキャラクタリゼーション  実施例２、３および４にて得られた糖修飾シゾフィランをゲル排除クロマトグラフィー（カラム：TSKgel-α-4000、溶離液：[LiBr]=20mM/DMF）により分子量を測定したところ、すべての糖修飾シゾフィランのサンプルにおいて、化学修飾に伴った分子量の実質的変化がなく、シゾフィラン主鎖の切断が起っていないことが認められた。また、各糖修飾シゾフィランの糖の導入率は元素分析における窒素含有率から算出され、表１に示す通りであった。
【００２９】
【表１】
2005151891.tif 000003
【実施例６】
【００３０】
レクチンに対する親和性の評価  実施例２にて得られたラクトース修飾シゾフィランのβ-ガラクトース認識レクチンであるRCA120に対する親和性を評価した。親和性の評価はフルオレセイン修飾体であるFITC-RCA120（生化学工業より購入）を用いて、文献記載の定法に従って、結合に伴う蛍光スペクトル変化より見積もった。FITC-RCA120（30μg/ml）を含むトリス緩衝液（20mM、pH7.2）300μlに対して、2mg/mlの濃度でトリス緩衝液（20mM、pH7.2）に溶解させたラクトース修飾シゾフィランを、ラクトース修飾シゾフィランの繰り返し単位の最終濃度が0〜0.1Mになるように50μl加えた後、4℃で12時間熟成した。熟成した各サンプルを室温に戻し、520nmにおける蛍光強度を測定し、ラクトース修飾シゾフィラン不在下の値との比をシゾフィラン、もしくは、ラクトース修飾シゾフィランの濃度に対してプロットした（図３）。未修飾のシゾフィラン（○）はRCA120の蛍光強度を全く変化させないのに対して、ラクトース修飾シゾフィラン（●）は濃度が増加すると蛍光強度比が低下することからシゾフィランに修飾されたラクトース末端に存在しているガラクトースはレクチン（RCA120）に認識されることが明らかとされた。このような効果は、ガラクトース修飾シゾフィランにおいても同様に確認される。
【非特許文献１６】Teruaki Hasegawa, Shunsuke Kondoh, Kazunori Matsuura, and KazukiyoKobayashi, Macromolecules, 32, 6595-6603（1999）
【実施例７】
【００３１】
Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNA）との複合体の調製  実施例２で合成されたLac-SPGならびに実施例３で合成されたGal-SPG、実施例４で合成されたGlc-SPGをそれぞれ極性溶媒であるジメチルスルホキシド（以下DMSOと表記）に溶解させ、濃度を19.8 mg/mlに調整し、この溶液1μl、純水3μl、10mMのトリス緩衝液（pH7.8）1μlと、１本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチド水溶液（1mg/ml）5μlを混合した。得られた溶液はすべて透明で、均一であった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌原遺伝子として文献に報告されているc-myb遺伝子のセンス配列に相補的なホスホロチオエート結合を持つアンチセンス配列 5’-GTG CCG GGG TCT TCG GGC-3’を適用した。実際に使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（固相合成品）は、3’末端に40のdAをつけたシークエンスのc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１、以下AS-c-mybと表記）とした。
【非特許文献１７】Barbara Majello et al., Proc. Natl.Acad. Sci., 83, 9636（1986）
【実施例８】
【００３２】
Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体形成のゲル電気泳動法による確認  アンチセンスオリゴヌクレオチドは負に帯電したリン酸基が正電荷方向に電気泳動する。さらにゲルマトリックスの網目の隙間を泳動するためアンチセンスオリゴヌクレオチドがペプチド修飾多糖類と複合体を形成することにより分子量が大きくなるほど移動度は減少する。そこで、アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-c-myb）にLac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGを添加して実施例７に記載の方法で複合体を形成させた後、MOPS緩衝液（20mM MOPS(pH7.0)、5mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、3%ジメチルスルホキシド）中で2.5%アガロースゲル用いて2V/cmで2時間電気泳動させ、Gel Star Nucleic Acids Stain（BMA）で染色後、トランスイルミネーター下でその移動度を評価した。図４に例示したアガロースゲル電気泳動の結果によると、Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGの添加に伴って、AS-c-mybの移動度は減少しており、複合体の形成が確認された。
【実施例９】
【００３３】
＜比較例１＞
Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGと複合体を形成させたヒトc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-c-myb）によるヒト由来肝臓癌細胞HepG2の増殖抑制の効果  細胞増殖試験には、ガラクトースを認識するアシアロ糖レセプターを発現することが報告されているヒト由来肝臓癌細胞HepG2（ATCCより入手）を利用して文献記載の方法で試験を行った。96穴プレートに100μlの10%仔牛胎児血清および1mMピルビン酸ナトリウム、1mM非必須アミノ酸を含むMEM培地（シグマ）に懸濁した2×103個のHepG2を播種した。一晩、CO2インキュベーター内で37℃、5％CO２下で培養を行った後に、AS-c-mybおよび実施例７で調製したAS-c-mybとLac-SPG若しくはGal-SPGとの複合体および比較例としてAS-c-mybとGlc-SPGとの複合体を限外ろ過膜（排除限界3000：ミリポア）でろ過してDMSOを除去し濃度を再調整したものを添加し、37℃、5％CO２下で96時間培養後、細胞数をCell Counting Kit-8（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。AS-c-myb無添加の穴の細胞数を生存率100％として細胞増殖を評価した。その結果を図５に示した。
【非特許文献１８】Joyce Bischoff and Harvey F.Lodish, J. Biol. Chem., 262, 11825(1987)
【非特許文献１９】橋田充ら、J. Control. Release, 53,301(1998)
【００３４】
図５に例示したように、AS-c-myb単独投与よりもAS-c-mybとLac-SPGおよびGal-SPGの複合体である本発明の遺伝子治療剤の方が、40から50%細胞の生存率が低下している。一方、同じ条件でAS-c-mybとGlc-SPGの複合体を投与してもHepG2細胞の生存率は、AS-c-myb単独投与よりも8から10%程度しか細胞の生存率が低下していない。その結果、本発明に従う遺伝子治療剤のAS-c-mybとLac-SPG若しくはGal-SPGとの複合体が、肝細胞特異的に細胞生存率を低下させることが確認された。
また、Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGのみをHepG2細胞に投与しても細胞生存率にはほとんど影響を与えていない。
【００３５】
＜比較例２＞
Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGと複合体を形成させた、ヒトc-mybホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（S-c-myb）によるヒト由来肝臓癌細胞HepG2の増殖抑制  比較例としてAS-c-mybの代わりにヒトc-mybの配列の一部でありアンチセンス効果のない（治療効果を示さない）と文献に記載されているヒトc-mybホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチドのセンス配列CAC GGC CCC AGA AGC CCGの3’末端に40のdAをつけたシークエンス（配列番号２、以下S c-mybと表記）を実施例９および比較例１と同様の方法でヒト由来肝臓癌細胞HepG2の増殖抑制の効果を評価した。この結果を図６に例示した。
【非特許文献２０】Alan M. Gewirtz and Bruno Calabretta Science, 242, 1303（1988）
【００３６】
図６に示すように、S-c-myb単独投与区およびLac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとの複合体投与区では細胞の生存率はほとんど低下せず、アンチセンス効果のないオリゴヌクレオチドとの複合体形成物は、細胞増殖抑制効果が無いことが示された。
【００３７】
＜比較例３＞
Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGと複合体を形成させたヒトc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-c-myb）によるヒト由来黒色腫瘍細胞A375の増殖抑制の効果  比較例として肝臓癌細胞の代わりにガラクトースを認識するアシアロ糖レセプターを発現しないヒト由来黒色腫瘍細胞A375（ATCCより入手）を治療対象としてAS-c-mybおよび複合体による細胞増殖抑制の効果を評価した。96穴プレートに100μlの10%仔牛胎児血清を含むDMEM培地に懸濁した2×103個のヒト由来黒色腫瘍細胞A375を播種しCO2インキュベーター内で37℃、5％CO２下で一晩前培養後に、AS-c-mybおよび実施例７で調製したAS-c-mybとLac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとの複合体を限外ろ過膜（排除限界3000：ミリポア）でろ過してDMSOを除去し濃度を再調整したものを添加し、37℃、5％CO２下で96時間培養後、細胞数をCell Counting Kit-8（同仁化学研究所）を利用し、付属のプロトコールに従って測定した。AS c-myb無添加の穴の細胞数を生存率100％として細胞増殖を評価した。その結果を図７に示した。
図７に例示したように、AS-c-myb単独投与よりも複合体投与の方が、10%程度細胞の生存率が低下している。A375細胞は、ガラクトース認識部位を持たないためLac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGの複合体による差異は無く、細胞特異的な増殖抑制効果を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の細胞認識糖修飾多糖系の遺伝子キャリアーは、細胞に対する標的指向性が高く、病原性細胞の増殖抑制効果に優れた、かつ生体に安全な遺伝子キャリアーとして遺伝子治療の分野で利用され得るものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ラクトース修飾シゾフィランの合成スキーム（実施例２）を示す。
【図２】ガラクトース修飾シゾフィランの合成スキーム（実施例３）を示す。
【図３】ラクトース修飾シゾフィランのレクチン（FITC-RCA120）に対する蛍光応答曲線を示す。（○）未修飾シゾフィラン、（●）ラクトース修飾シゾフィラン（実施例６）。
【図４】本発明に従う遺伝子治療剤のLac-SPGおよびGal-SPGとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体化を示すアガロースゲル電気泳動パターン（実施例８）である。
【図５】Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとヒトc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来肝臓癌細胞HepG2の増殖抑制試験の結果（実施例９および比較例１）を示す。
【図６】Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとヒトc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-c-myb）および、治療効果を示さないヒトc-mybホスホロチオエートのセンス鎖オリゴヌクレオチド（S-c-myb）との複合体使用によるヒト由来肝臓癌細胞HepG2の増殖抑制試験の結果（比較例２）を示す。
【図７】Lac-SPGおよびGal-SPG、Glc-SPGとヒトc-mybホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体使用によるヒト由来黒色腫瘍細胞A375の増殖抑制試験の結果（比較例３）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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