(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な細胞接着因子をコードする遺伝子を単離し、同遺伝子の利用に関する技術を提供する。【解決手段】新規細胞接着因子（BT-IgSF）をコードするＤＮＡ、又はその部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブ、例えば下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなるハイブリダイゼーション用プローブを用いて、BT-IgSF遺伝子の存在又は発現を調べることにより、脳梁又は精子の形成不全の診断を行う。（ａ）特定の塩基配列で表される塩基配列を含むＤＮＡ。（ｂ）特定の塩基配列で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子として機能する蛋白質をコードするＤＮＡ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなるハイブリダイゼーション用プローブを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
（ａ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子として機能する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡからなるＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
【請求項３】
配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセットからなるＰＣＲ用プライマーを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
【請求項４】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなるハイブリダイゼーション用プローブを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
（ａ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子として機能する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡからなるＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
【請求項６】
配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセットからなるＰＣＲ用プライマーを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梁及び精子の形成に関与する細胞接着因子と推定される新規蛋白質及びそれをコードする遺伝子、並びにそれらの蛋白質及び遺伝子の利用に関する。本発明の蛋白質及び遺伝子は、医薬・診断分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
生体の種々の器官を形成する上で、器官を構成する細胞の表面上の蛋白質分子（細胞接着分子）が重要な働きをすることが良く知られている。細胞接着因子は、例えば、免疫細胞の認識、炎症、ガンの転移等、生体内の重要な反応に深く関与していることが判明している。
【０００３】
細胞接着分子はその構造から、主に、integrin（インテグリン）、cadherin（カドヘリン）、selectin（セレクチン）、immunoglobulin superfamily（イムノグロブリンスーパーファミリー）、CD44ファミリーに分類される。それらのうち、イムノグロブリン・スーパーファミリーは、イムノグロブリンと類似の構造を持つ分子群であって、このファミリーに属する蛋白質は膨大な数にのぼり、その機能も多岐に及んでいる。例えば、細胞接着に伴うシグナル伝達を行う分子が知られている。また、サイトカインの受容体として知られる蛋白質分子やウイルスの受容体として知られる蛋白質分子がある。さらに、免疫機能調節に代表される、細胞機能を調節する細胞表面上の蛋白質分子として知られるものもある。また、多くのイムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質は細胞接着分子として、生体内で形態形成や器官の形成に重要な働きをすることが予想される。しかしながら、蛋白質が、組織や組織を構成するどの細胞で発現するかは、個々の蛋白質により大きく異なっており、蛋白質の一次配列（アミノ酸配列）のみの解析では容易に類推し得ないものである。
【０００４】
ところで、脳梁形成不全による顔面奇形、精神発達遅滞、言語障害等を主症状とする症例が知られており（非特許文献１、２参照）、第３染色体の欠失がその原因と考えられている。しかし、その原因遺伝子は未だ特定されておらず、従って、その治療方法も確立されていない。
【非特許文献１】「クリニカル・ディスモルフォロジー」、１９９４年、第３巻、ｐ．２９２−２９６（Genuardi M, Calvieri F, Tozzi C, Coslovi R, Neri G. A new case of interstitial deletion of chromosome 3q, del(3q)(q13.12q21.3), with agenesis of
【０００５】
the corpus callosum. Clinical Dysmorphology. 3, 292-296, 1994.）
【非特許文献２】「クリニカル・ジェネティクス」、１９９８年、第５３巻、ｐ．２２０−２２２（Ogilvie CM, Rooney SC, Hodgson SV, Berry AC. Deletion of chromosome 3q proximal region gives to a variable phenotype. Clinical Genetics. 53, 220-222, 1998）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な細胞接着因子をコードする遺伝子を単離し、同遺伝子の利用に関する技術、具体的には脳梁又は精子の形成不全の診断用の診断薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）受容体の細胞外領域のアミ
ノ酸配列に相同性を有する遺伝子を既知のデータベースから検索し、見出された配列を有する遺伝子cDNAを単離した。そして、同遺伝子の発現を解析した結果、精巣と脳で発現し、特に脳梁での発現が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなるハイブリダイゼーション用プローブを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
（ａ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子として機能する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（２）配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡからなるＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
（３）配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセットからなるＰＣＲ用プライマーを含む、脳梁の形成不全の診断用の診断薬。
（４）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなるハイブリダイゼーション用プローブを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
（ａ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子として機能する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（５）配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡからなるＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
（６）配列番号８に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、及び配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡのセットからなるＰＣＲ用プライマーを含む、精子の形成不全の診断用の診断薬。
【０００９】
上記の本発明の蛋白質は、その構造からイムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質分子であると同定され、「BT-IgSF（brain and testis-specific immunoglobulin superfamily）」と名付けられた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、脳梁又は精子の形成不全の診断に有用な、ＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを含む診断薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の脳梁又は精子の形成不全の診断用の診断薬、及び、BT-IgSF蛋白質及びそれをコードするＤＮＡ並びにそれらの用途について詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜４０９で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１〜４０９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、細胞接着因子としての機能を有する蛋白質。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、後述するように、ヒト腎臓由来のmRNAからポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ、White,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)）により増幅することによって得られる。また、本発明により、BT-IgSFのｃＤＮＡの塩基配列が明
らかになったので、化学合成することによっても本発明のＤＮＡ断片は得られる。さらに、ヒト染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより、BT-IgSFをコードする染色体遺伝子が得られる。染色体由来のBT-IgSF遺伝子は、コード領域にイントロンを含むことが予想されるが、そのようなイントロンで分断されているＤＮＡであっても、BT-IgSFをコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１３】
BT-IgSFをコードするｃＤＮＡを取得するための材料としては、BT-IgSFを産生するヒトの臓器、又は株化した細胞であればすべて利用できるが、具体的には腎臓が挙げられる。また、マウス等の動物の精巣由来のcDNAも、BT-IgSFのホモログを取得する材料として用いることができる。これらの組織の細胞から常法［J. Sambrookら著、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、１９８９年］によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製する。また、ヒト腎臓由来mRNAは市販されており（Clontech社、#6538-1）、本発明に好適に使用することができる。得られたｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを調製する。
【００１４】
BT-IgSFの５’側プライマーと３’側プライマーとして種々のオリゴヌクレオチドを化学合成して、これらと一本鎖ｃＤＮＡを用いて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによりこのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動により目的の大きさのＤＮＡ断片を調製する。調製したＤＮＡ断片は、直接塩基配列を決定することができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、配列番号８及び９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのプライマーを用いてヒト組織由来のmRNAまたはcDNAライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うと、配列番号１に示す配列に加え、5' 末端にGを一塩基、3' 末端側にGACATGAGGの配列を持つＤＮＡが得られる。
【００１５】
また、増幅断片を適当な市販のプラスミドベクター、例えばpCR2.1、pCRII（いずれもInvitrogen社）、pUC118（宝酒造社製）等に挿入し、大腸菌、例えばINValphaF'（Invitrogen社）、HB101（宝酒造社製）を形質転換し、プラスミドを精製し、のち塩基配列を決定することもできる。
【００１６】
本発明のＤＮＡの塩基配列を、常法により決定した結果を、配列番号１に示し、これがコードしているアミノ酸配列を配列番号２に示した。
配列番号２のアミノ酸配列を、Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）（Schulta J, Copley RR, Doerks T, Ponting CP, Bork P. SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Research. 28(1)231-234,
2000参照、http://smart.embl-heidelberg.de）により検索した結果、同配列は、N末端側からシグナルペプチド、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域から構成されることが明らかとなった。これらのうち、シグナル配列は配列番号２においてアミノ酸番号−２２〜−１であると予想された。したがって、BT-IgSFの成熟タンパク質は配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０９に相当すると予想される。
【００１７】
一方、解析用プログラムとしてPSORT（中井謙太、「タンパク質の構造予測と機能予測」、遺伝子医学、第４巻、第３号、第３７７〜３８２頁、２０００年。http://psort.nibb.ac.jp）を用いた解析では、シグナル配列は配列番号２においてアミノ酸番号−２２〜−２であると予想された。
【００１８】
以上のことから、BT-IgSFの成熟タンパク質は、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０９、又はアミノ酸番号−１〜４０９に相当すると予想される。いずれにしても、BT-IgSFの成熟タンパク質はアミノ酸番号１〜４０９を含む。
尚、膜貫通領域は、SMARTによる解析では、アミノ酸番号２２４〜２４６、PSORTによる
解析ではアミノ酸番号２２８〜２４４と予想された。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、配列番号２（アミノ酸番号−２２〜４０９）に示すアミノ酸配列を有するBT-IgSF前駆体、又は配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０９、又はアミノ酸番号−１〜４０９で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片である。本発明において、成熟型BT-IgSFは、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０９、又はアミノ酸番号−１〜４０９のアミノ酸配列のＮ末端に、メチオニン残基が付加されていてもよい。
【００２０】
本発明において、BT-IgSFは、BT-IgSFとしての活性、すなわち細胞接着因子としての機能を実質的に損なわない限り、１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含んでいてもよい。これらのいずれのBT-IgSFをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。このようなＤＮＡ断片として具体的には、配列番号１において塩基番号１〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片、及び配列番号１において塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。さらに、同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、各アミノ酸に対するコドンを同等のコドンに置換した配列も本発明に含まれる。
【００２１】
上記のようなBT-IgSFと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、BT-IgSFをコードするＤＮＡを変異剤等で処理することによって、ランダムに変異を導入することによっても得ることができる。このようにして変異が導入されたＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の細胞接着因子としての活性を調べることにより、BT-IgSFと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するBT-IgSFをコードするＤＮＡを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜１２９６で表される塩基配列、又は塩基番号６７〜１２９６からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞接着因子としての機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、BT-IgSFと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４２℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２２】
次に、BT-IgSFの製造法について説明する。BT-IgSFは、例えば、上記ＤＮＡの全部、又は一部を通常の方法により、プロモーター配列、マーカー遺伝子、複製起点等を有する適当な発現ベクターに挿入して、微生物、培養細胞又は動植物に導入して発現させることにより、大量に調製することが可能である。このような発現ベクターは、種々のものが市販されており、本発明に使用することができる。成熟型BT-IgSFを発現させる場合には、配列番号２においてアミノ酸番号１〜４０９で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を、３’末端に終止コドンを、これらの外側に制限酵素認識配列を付加したものを、ベクターのプロモーター配列の下流に挿入すればよい。これらのコドン及び制限酵素認識配列を本発明のＤＮＡに付加するには、このＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する際に用いるオリゴヌクレオチドプライマーに上記コドン及び制限酵素認識配列を含ませればよい。発現されたBT-IgSFが、顆粒体として菌体内に蓄積される場合は、これを８Ｍ尿素溶液、６Ｍグアニジン塩酸溶液等で可溶化し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、リフォールディングして天然と同一又は近似の構造を有するBT-IgSFを製造することができる。
【００２３】
また、例えば、アデノウイルスプロモーター、ＤＨＦＲ（デヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子、ＳＶ４０ポリＡ配列及び複製起点を有するプラスミドに、BT-IgSFをコードするＤＮＡを結合して挿入し、これをリン酸カルシウム法等によりＤＨＦＲを欠損しているＣＨＯ細胞（チャイニーズ・ハムスター由来細胞）に遺伝子導入し、ＭＴＸ（メトトレキセート）培地中で細胞培養することにより、BT-IgSFが発現する。その際、成熟型BT-IgSFを直接発現させてもよいが、シグナル配列を有するBT-IgSF前駆体をコードするＤＮＡを細胞に導入し、前駆体タンパク質を発現させてもよい。発現されたタンパク質が、細胞培養液中に可溶性タンパク質として蓄積する場合は、これを常法により限外濾過膜により濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製し、BT-IgSFを取得することができる。
【００２４】
組換えＤＮＡ技術により調製し、カラムクロマトグラムグラフィー等により精製したBT-IgSFは、細胞凝集塊形成測定法（Hirata, K. et al., Cloning of an immunolglobulin family adhesion molecule selectively expressed by endothelial cells, Journal of Biological Chemistry, 276, 16223-16231, 2001）等により、細胞接着因子としての機能を確認することができる。
【００２５】
後記実施例に示すように、BT-IgSFは、精巣及び脳で発現し、脳の中では特に脳梁において最も強く発現していることが示された。従って、BT-IgSFは、発現が脳の中でも脳梁に限定されているという極めて特異な特徴から、脳梁の形成に関わる細胞接着分子として機能するのではないかと予想される。また、BT-IgSF遺伝子のヒト染色体上の位置を、公開されているヒトゲノムデータベースから検索した。その結果、BT-IgSFのヒト染色体上の位置は、第３染色体（3q12-23）であった。
尚、データベース上のBT-IgSF遺伝子に相当する配列は、少なくとも５つのイントロンにより分断されており、コード領域及びエクソンの配列は不明であったが、本発明によりBT-IgSF遺伝子のコード配列が明らかとなったので、ゲノム遺伝子の機能的構造も明らかとなった。
【００２６】
以上のことから、脳梁に形成不全を起こし、その原因が第３染色体の、BT-IgSF遺伝子が位置することが明らかとなった領域の欠失によると考えられる症例の報告例を検索した。その結果、そのような症例がこれまでに３例報告されていることが明らかとなった（Genuardi M, Calvieri F, Tozzi C, Coslovi R, Neri G. A new case of interstitial deletion of chromosome 3q, del(3q)(q13.12q21.3), with agenesis of the corpus callosum. Clinical Dysmorphology. 3, 292-296, 1994. Ogilvie CM, Rooney SC, Hodgson SV,
Berry AC. Deletion of chromosome 3q proximal region gives to a variable phenotype. Clinical Genetics. 53, 220-222, 1998）。これらの症例は、脳梁形成不全による顔面奇形、精神発達遅滞、言語障害等を主症状とし、第３染色体の欠失がその原因と考えられるが、未だ原因遺伝子が特定されておらず、従って、その治療方法も確立されていない。本発明によって同定されたBT-IgSF遺伝子はその欠失領域に存在する遺伝子であり、また、発現が脳梁に際立っていること、更には、脳梁の形成に重要と考えられる細胞接着分子であることから、これら症例の原因遺伝子である可能性が極めて高い遺伝子である。
【００２７】
従って、BT-IgSF遺伝子は、脳梁形成不全の症例においてその診断に有用と考えられる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列又はその部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブを用いて、BT-IgSF遺伝子の存在又は発現を調べることによって、脳梁形成不全に関連する疾患を診断することができる。具体的には、被検者の染色体ＤＮＡを鋳型として、前記プライマーを用いたＰＣＲ、又は前記プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、BT-IgSF遺伝子の存在又は構造を確認することができる。また、適当な組織から抽出したmRNAを用いて、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションを行うことにより、BT-IgSF遺伝子の発現を調べることができる。BT-IgSF遺伝子を欠損して
いるか、又は欠損していなくても発現していない場合は、それによって発症している可能性が考えられる。
【００２８】
前記配列番号１の部分配列を含むＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブとしては、好ましくは、配列番号１の塩基番号６７〜１２９６で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、前記ＰＣＲ用プライマー又はハイブリダイゼーション用プローブとして具体的には、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
上記プライマーのセットとしては、例えば配列番号８及び９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これ以外にも、配列番号１に示す配列の任意の部分より、作製することができる。また、BT-IgSF遺伝子は、上記の症例の治療においても、同遺伝子又は同遺伝子を組み込んだベクターを含む遺伝子治療薬として、有用である可能性がある。さらに、BT-IgSF蛋白質自体も、脳梁の形成不全等の治療に用いられ得る。
【００３０】
また、前記ハイブリダイゼーション法として具体的には、例えばin situハイブリダイゼーション法が挙げられる。プローブは、例えば、BT-IgSF遺伝子のcDNAをpCR2.1ベクター（Invitrogen社）等のベクターに常法により挿入し、in vitro RNA転写を行うことによって、調製することができる。その際、ジゴキシゲニン等を用いて標識プローブを作製すると、それを用いて組織切片を染色することができる（Murase S, Hayashi Y. Expression pattern and neurotropic role of the c-fms proto-oncogene M-CSF receptor in rodent purkinje cells. The Journal of Neuroscience. 24. 10484-10492. 1998）。
【００３１】
一方、BT-IgSF遺伝子は、前述したように、脳の一部の組織を除けば精巣に限定して発現するという特徴があることから、精巣中の細胞間の接着に関わる細胞接着分子として機能することが予想される。精巣の細精管は精子形成の場であり、ここで、精原細胞は精母細胞へと分裂し精子形成へ至る。この精子成熟過程にはホルモンが重要であるが、同時にセルトリ細胞も重要な働きをすることが広く知られている。セルトリ細胞は精原細胞、精母細胞と直接に接着することでその働きをすると考えられ、その接着には細胞接着分子が必要であることが予想されている。実際、幾つかの細胞接着分子が精巣に発現していることが報告されている。例えば、N-cadherinは良く知られた細胞接着分子であり、精巣でも発現していることが報告されている。しかしながら、その精子形成における役割はこれまでに明らかにされていない（Cyr DG, Blaschuk OW, Robaire B. Identification and developmental regulation of cadherin messenger ribonucleic acids in the rat testis.
Endocrinology. 131. 139-145. 1992）。
【００３２】
BT-IgSFは、その構造から細胞接着因子であることが明らかであり、精巣に特異的に発現することから、例えばセルトリ細胞と精原細胞あるいはセルトリ細胞と精母細胞との接着に寄与し、精子形成に重要な役割をすることが強く予想される。したがって、BT-IgSF遺伝子は、精子の形成不全の診断及び治療においても、有用であると考えられる。
精巣、特に細精管でのBT-IgSF遺伝子の発現は、前述した脳梁におけるBT-IgSF遺伝子の発現と同様にして確認することができる。
さらに、BT-IgSF遺伝子もしくは同遺伝子を組み込んだベクターを含む遺伝子治療薬、又はBT-IgSF蛋白質自体は、精子の形成不全等の治療に用いられ得る。
【００３３】
また、本発明により、BT-IgSFのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列が明らかになったので、それらの情報に基づいて他の動物のBT-IgSF遺伝子ホモログを容易に取得することができる。本発明のBT-IgSF遺伝子又はそのホモログを用いて、BT-IgSF遺伝子を欠損したモデル動物を作製することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞M-CSF受容体の細胞外領域のアミノ酸配列に相同性を有する遺伝子の検索及び単離
M-CSF受容体の細胞外領域のアミノ酸配列を元に、この配列と相同性を持つアミノ酸配列をコードするexpressed sequence tag（EST）クローンをデータベースから検索した。データベースは、米国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）のマウスESTデータベースであり、相同性検索のプログラムにはtblastnを用いた（Altschul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25(17)3389-3402, 1997参照）。
【００３５】
検索の結果、一つのマウスESTクローン（#BF236252）を得た。ESTデータベースは、無作為に抽出したcDNAの塩基配列を大まかに決定し登録してあるものであり、個々のcDNAの塩基配列は正確さを欠いており、また、登録されている配列はmRNAの完全な配列を反映するものではなく、一部が登録されているのみである。したがって、#BF236252の配列を基に、正確な遺伝子断片の配列決定を行なった。具体的には、以下のようにして行った。
【００３６】
前記ESTクローン（#BF236252）の塩基配列に基づいて、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、マウス精巣由来のcDNA（Clontech社、カタログ#K1429-1）を鋳型とするPCRにより、前記ESTクローンに対応するcDNA断片を増幅した。PCRは、市販のキット（Clontech社、Advantage 2 PCR Kit (#K1910)）及びPCR装置（宝酒造、PCR Thermal Cycler MP）を用いて、添付のプロトコールに従い、常法により行なった。
【００３７】
得られたPCR増幅断片を、Invitrogen社のOriginal TA Cloning Kit（#K2000）を用い、同社添付のプロトコールに従いpCR2.1ベクターに挿入し、大腸菌株INValphaF' を用いクローン化した。プラスミドDNAはQIAGEN社Plasmid Mini Kitを用いて、同社プロトコールに従って調製した。得られたプラスミドDNAの配列は、Applied Biosystems社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitを用いて、添付のプロトコールに従い、M13 Reverse PrimerおよびM13 Forward (-20) Primerを用いて反応を行い、その後、同社373S DNA sequencerにて電気泳動を行って決定した。
【００３８】
次に、上記のようにして得られたクローンおよび先のESTクローンには含まれないcDNA部分（3'末端側）を得るために、3' rapid amplification of cDNA ends（3' RACE）法を行なった。先ず、上記で得られたcDNA断片の配列を元に、配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーを作製した。次に、マウス精巣由来mRNA（Clontech社、#6612-1）を鋳型として、同社SMART RACE cDNA Amplification Kit（#K1811）を用いて、添付のプロトコールに従い、3'-RACE-Ready cDNAを合成した。このcDNAと前記プライマーを用い、キットに添付のプロトコールに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を使用してPCR増幅を行い、目的遺伝子の3'末端側のcDNA断片を得た。先に述べた方法により、増幅断片をクローン化し、プラスミドDNAを得、塩基配列を決定した。以上により、5'末端側の一部を除き、目的遺伝子のほぼ完全長のcDNAの配列を決定した。
【００３９】
次に、上記遺伝子のヒトホモログを同定する為に、上記で得られたマウスcDNAがコードすると推定されるアミノ酸配列を元に、ヒトESTデータベースを上と同様の方法で検索した。その結果、一つのヒトESTクローン（#AA620978）を得た。先に述べたように、このESTクローンの配列も正確なものではなく、また、コード領域全長を含むものではないと考えられた。従って、完全長の目的cDNAを得るために、3' RACEおよび5' RACEを行なった。
【００４０】
3' RACE用プライマー（配列番号６）と5' RACE用プライマー（配列番号７）を作製した。次にヒト腎臓由来mRNA（Clontech社、#6538-1）を鋳型として、同社SMART RACE cDNA Amplification Kit（#K1811）を用いて、添付のプロトコールに従い3'-RACE-Ready cDNAおよび5'-RACE-Ready cDNAを合成した。これらのcDNAと上記の各々のプライマーを用い、キットに添付のプロトコールに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を使用してPCR増幅を行い、目的遺伝子の3'末端側および5'末端側のcDNA断片を得た。先に述べた方法により、増幅断片をクローン化し、プラスミドDNAを得、塩基配列を決定した。以上により、目的遺伝子の完全な塩基配列を決定し、それによりコードされるアミノ酸配列を決定した。同塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４１】
上記アミノ酸配列を、Simple Modular Architecture Research Tool（SMART）（Schulta J, Copley RR, Doerks T, Ponting CP, Bork P. SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Research. 28(1)231-234, 2000参照）により検索した結果、上記cDNAがコードする蛋白質は、N末端側からシグナルペプチド、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域から構成されることが明らかとなった。更に、細胞外領域は二つのイムノグロブリン様領域から構成されることも明らかとなった。従って前記蛋白質は、細胞表面上に存在する、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白質分子である。この蛋白質は、BT-IgSFと名付けられた。
【００４２】
BT-IgSFのアミノ酸配列と相同性を示す既知の蛋白質を、上述の方法で検索した結果（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）アミノ酸レベルでの相同性が最も高い蛋白質分子として、endothelial cell-selective adhesion molecule（Hirata K, Ishida T, Penta K, Rezaee M, Yang E, Wohlgemuth J, Quertermous T. Cloning of an immunoglobulin family adhesion molecule selectively expressed by endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 276(19)16223-16231, 2001参照）、および、coxsackie and adenovirus receptor（Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, Horwitz MS, Crowell RL, Finberg RW. Isolation of a common receptor
for coxsackie B viruses and adnoviruses 2 and 5. Science. 275, 1320-1323, 1997参照）が見出された。しかしながら、いずれもBT-IgSFとは約30%程度のアミノ酸レベルでの相同性を示すのみであった。また、塩基配列レベルの検索では、有意な相同性を有するものは見い出されなかった（１０％以下）。
【００４３】
＜２＞BT-IgSF遺伝子の発現解析
BT-IgSF分子の機能を知るために、この分子がどの組織で発現をしているかをClontech社のHuman Multiple Tissue Expression Array（#7775-1）を用いてNorthern Hybridization法により検討した。方法は、同Arrayに添付のプロトコールに従って行なったが、概略は以下の通りである。
【００４４】
先ず、ヒトBT-IgSF遺伝子cDNAのコード領域を全て含むcDNAプローブを作製した。このために、配列番号８及び９に示すプライマーを作製した。これらのプライマーを用い、ヒト腎臓由来のcDNA（Clontech社、カタログ#K1420-1）を鋳型とするPCRにより、ヒトBT-IgSF遺伝子のcDNA断片を増幅した。PCRは、同社Advantage 2 PCR Kit（#K1910）を用い、添付のプロトコールに従い、PCR Thermal Cycler MP（宝酒造）を用いて常法により行なった。得られるcDNAは、配列番号１に示す配列に加え、5' 末端にGを一塩基、3' 末端側にGACATGAGGの配列を持つものである。このcDNAを、32Pで標識されたdCTP（Amersham Pharmacia Biotech社、#PB10205）および同社MegaPrime DNA Labelling System（#RPN1606）を用い、同社プロトコールに従って標識した。この標識プローブと、Human Multiple Tissue Expression Arrayを用い、ノーザンハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、Clontech社ExpressHyb Hybridization Solution（#8015）を用い、65℃で一晩行い、洗浄は1% SDSを含む2×SSC溶液にて65℃、20分間を４回、0.5% SDSを含む0.1
×SSC溶液にて55℃、20分間を２回、各々繰り返すことで行なった。
【００４５】
上記の実験の結果、BT-IgSF遺伝子は、精巣と脳にほぼ限定して発現していることが明らかとなった（図１）。脳の種々の部位での発現を、更に同arrayを用いて解析すると、特に脳梁での発現が高いことが明らかとなった（図１）。従って、BT-IgSFは、発現が脳梁及び精巣に限定されているという極めて特異な特徴から、脳梁及び精子の形成に関わる細胞接着分子として機能するのではないかと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ヒトBT-IgSF遺伝子のcDNA断片をプローブとするノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す図（写真）。
【図１】
2005137203.tif 000003
【配列表】
2005137203000001.app