(57)【要約】【課題】セファロスポリンＣアシラーゼ活性を有する酵素、それを調製するための組換えＤＮＡ方法、前記酵素をコードしているヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換させた細胞、および前記酵素によって７−アミノ−セファロスポラニン酸を調製する方法を提供すること。【解決手段】大腸菌内での発現に最適化されたネイティブ配列部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または「部位飽和」突然変異誘発によって得られた、セファロスポリンＣアシラーゼ活性を有する酵素。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有する、以下の突然変異のうち１つまたは複数が導入されたセファロスポリンＣアシラーゼ活性を有する酵素
アラニン２１５がＴｙｒ、Ｐｈｅ、ＧｌｕまたはＶａｌで置換されている；
ヒスチジン２９６がＡｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＰｈｅで置換されている；
アスパラギン酸４１６およびヒスチジン４１７が任意の他のアミノ酸で置換されている；
アミノ酸２６１、２７１、２９４、２９７、３０７、３０８および３０９が任意の他のアミノ酸で置換されている。
【請求項２】
アラニン２１５がＴｙｒで置換されている、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
アラニン２１５がＰｈｅで置換されている、請求項１に記載の酵素。
【請求項４】
アラニン２１５がＧｌｕで置換されている、請求項１に記載の酵素。
【請求項５】
アラニン２１５がＶａｌで置換されている、請求項１に記載の酵素。
【請求項６】
ヒスチジン２９６がＡｓｎで置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項７】
ヒスチジン２９６がＳｅｒで置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
ヒスチジン２９６がＴｈｒで置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
ヒスチジン２９６がＰｈｅで置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１０】
アラニン２１５がＴｙｒで置換されており、ヒスチジン２９６がＳｅｒで置換されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１１】
配列番号２のヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または完全突然変異誘発によって得ることができるＤＮＡ配列を細菌または真核細胞用の発現ベクター内に挿入すること；
前記ベクターを用いて細菌細胞または真核細胞を形質転換させること；
形質転換させた細胞を培養し、発現産物を抽出および回収すること
を含む、請求項１から１０のいずれかに記載の酵素を調製する方法。
【請求項１２】
適切なアシル化剤の存在下で、請求項１から１０のいずれかに記載の酵素を用いてセファロスポリンＣを加水分解およびアシル化することを含む、セファロスポリンを調製する方法。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載の酵素をコードしているヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１３に記載の配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターで形質転換させた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セファロスポリンＣアシラーゼ活性を有する酵素、それを調製するための組換えＤＮＡ方法、前記酵素をコードしているヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換させた細胞、および前記酵素によって７−アミノ−セファロスポラン酸を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セファロスポリンＣアシラーゼとは、セファロスポリンＣを、多くの半合成セファロスポリンを調製するための中間体である７−アミノ−セファロスポラン酸(７−ＡＣＡ)へと変換する酵素である。
【０００３】
化学合成によって７−ＡＣＡをセファロスポリンＣから得ることができたとしても、酵素的方法の方がより環境にやさしくコストが低いので、これが好ましい。
【０００４】
セファロスポリンＣを７−ＡＣＡへと変換するための従来の酵素的手順では２種の異なる酵素、すなわちＤ−アミノ酸オキシダーゼ(ＤＡＡＯ)およびグルタリルアシラーゼが必要である。ＤＡＡＯは、セファロスポリンＣをα−ケト−アジポイル−７ＡＣＡへと変換すると同時に過酸化水素を生成する。その後、α−ケトアジポイル−７ＡＣＡを過酸化水素(酸化的脱アミノ化によって生成されるかつ／または反応媒体に加える)で酸化しグルタリル−７−ＡＣＡへとし、その後、グルタリルアシラーゼによってグルタリル−７−ＡＣＡを７−ＡＣＡへと加水分解する。従来方法では２つの個別の酵素反応器が必要であり、過酸化水素が存在することまたはそれを加えることによって固定化した酵素が失活する可能性があり、これはプラントに障害を与えてコストを増大させる。
【０００５】
セファロスポリンＣを７−ＡＣＡへと直接加水分解する能力を有する酵素を開発する試みがなされてきた。シュードモナス(Pseudomonas)株から単離したＳＥ８３、Ｎ１７６およびＶ２２と呼ばれる３種の既知の酵素がこの能力を有しているが(Journal of Fermentation and Bioengineering、第72巻(4)、232〜243、1991)、それらはセファロスポリンＣに対するよりもグルタリル−７−ＡＣＡに対してアシラーゼ活性が高い。
【０００６】
これら酵素の特徴、特に特異性、安定性および活性を向上させるために、突然変異体やそれらを調製するための組換えＤＮＡ方法が開示されている(例えば特許文献１〜４参照。)。
【特許文献１】米国特許第５３２０９４８号
【特許文献２】欧州特許第４７５６５２号
【特許文献３】欧州特許第５５８２４１号
【特許文献４】米国特許第５８０４４２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、動力学、安定性、活性および特異性に関してセファロスポリンＣアシラーゼ活性が向上しており、大量に発現させることができる酵素が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
シュードモナスＮ１７６由来の既知のアシラーゼの配列に基づいて、セファロスポリンアシラーゼ活性を有する酵素をコードしている遺伝子が設計されている(Aramori I他、(1991)、Cloning and Nucleotide Sequencing of New Glutaryl 7-ACA and Cephalosporin C Acylase Genes from Pseudomonas Strains、Journal of Fermentation and Bioengineering、第72巻(4)、232〜243)。このアシラーゼは、グルタリル−７ＡＣＡに対しても、より低い程度にではあるがセファロスポリンＣに対しても活性があることが報告されている。
【０００９】
開始遺伝子(野生型ＨｉｓＶＡＣと命名)を設計する際に、様々な変異体を挿入した：
−位置２７０におけるフェニルアラニンの導入；この突然変異(文献から知られている)によりセファロスポリンＣに対する活性が上昇する(Ishii Y.他、(1995)、high-level production,chemical modification and site-directed mutagenesis of a cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain N176、Eur.J.Biochem、230、773〜778)。
【００１０】
−活性部位領域(βサブユニットの最初のアミノ酸が触媒作用に関与している)が妨害されないようにした、Ｃ末端における追加の配列(アミノ酸ＬＥＨＨＨＨＨＨからなる)の導入。前記配列は、ｐＥＴ２４プラスミドをクローニングおよび発現のベクターとして使用して、続くクロマトグラフィーによる精製を容易にするために導入した。このプラスミドはカナマイシンに耐性があり、タンパク質のＣ末端に「Ｈｉｓ−タグ配列」を、Ｎ末端に「Ｔ７−タグ配列」を挿入することができる。プラスミド内へのクローニングを容易にするために、ｐＥＴ２４のポリリンカーによってＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩおよびＮｄｅＩの制限部位を含む領域を遺伝子の末端に加えた。
【００１１】
−対応するアミノ酸配列内に望ましくない変更が導入されないように、すなわち大腸菌(E.coli)のコドン使用頻度を用いた、一部の塩基の置換による遺伝子内の一部の制限部位(ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ)の除去。
【００１２】
−最も翻訳されているコドンを使用した(具体的にはタンパク質のＮ末端の位置をコードしている配列を著しく改変した)、ヌクレオチド配列の大腸菌コドン使用頻度への最適化。主な突然変異は以下のとおりである：
１．大腸菌でほとんど使用されないグリシンのＧＧＡコドンで置換；
２．大腸菌でほとんど使用されないアルギニンのＡＧＧおよびＣＧＡコドンで置換；
３．大腸菌でほとんど使用されないイソロイシンのＡＴＡコドンで置換；
４．大腸菌でほとんど使用されないプロリンのＣＣＣコドンで置換；
５．大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミン酸のＧＡＧおよびＧＡＡコドンの使用のバランス；
６．大腸菌内でのその頻度に応じた、フェニルアラニンのＴＴＴおよびＴＴＣコドンの使用のバランス；
７．大腸菌内でのその頻度に応じた、グルタミンのＣＡＧおよびＣＡＡコドンの使用のバランス；
８．大腸菌内でのその頻度に応じた、ヒスチジンのＣＡＴおよびＣＡＣコドンの使用のバランス。
【００１３】
この結果生じたｃＤＮＡは、ネイティブＮ１７６遺伝子に63.7％の配列同一性を有する。
【００１４】
その後、ＨｉｓＶＡＣをコードしているｃＤＮＡが化学合成によって得られた(Itakura K、Rossi JJ、Wallace RB、Synthesis and use of synthetic oligonucleotides、Annu Rev Biochem.、1984、53：323〜56)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
今回、一部の特異的突然変異によって「野生型」酵素(本明細書中では以降ＨｉｓＶＡＣと呼ぶ)の特性が著しく向上されることが判明した。
【００１６】
具体的には、本発明は、図１(配列番号１)に報告したアミノ酸配列を有する、以下の突然変異のうち１つまたは複数を挿入したセファロスポリンＣアシラーゼ活性を有する酵素を提供する：
−アラニン２１５をＴｙｒ、Ｐｈｅ、ＧｌｕまたはＶａｌで置換；
−ヒスチジン２９６をＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅで置換；
−アスパラギン酸４１６およびヒスチジン４１７を任意の他のアミノ酸で置換；
−位置２６１、２７１、２９４、２９７、３０７、３０８および３０９のアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換。
【００１７】
特に好ましいのは以下の酵素である：
−アラニン２１５がＴｙｒで置換されている；
−アラニン２１５がＰｈｅで置換されている；
−アラニン２１５がＧｌｕで置換されている；
−アラニン２１５がＶａｌで置換されている；
−ヒスチジン２９６がＡｓｎで置換されている；
−ヒスチジン２９６がＳｅｒで置換されている；
−ヒスチジン２９６がＴｈｒで置換されている；
−ヒスチジン２９６がＰｈｅで置換されている；
−アラニン２１５がＴｙｒで置換されており、ヒスチジン２９６がＳｅｒで置換されている。
【００１８】
「野生型」酵素のアルギニン２６３は置換されていてはならない。
【００１９】
本発明の酵素は、以下を含む方法を用いて調製することができる：
−配列番号２(図２)のヌクレオチド配列の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発または完全突然変異誘発によって得ることができるＤＮＡ配列を細菌または真核細胞用の発現ベクター内に挿入すること；
−前記ベクターを用いて細菌細胞または真核細胞を形質転換させること；
−形質転換させた細胞を培養し、発現産物を抽出および回収すること。
【００２０】
その後、本発明の突然変異させた配列を従来方法を用いてプラスミド発現ベクター内に挿入することができ、これを用いて、酵素を産生する能力を有する大腸菌コンピテント細胞を形質転換させることができる。
【００２１】
想定される工業的使用では、酵素を、セファロスポリンＣを７−アミノ−セファロスポラニン酸へと酵素的に変換させる際に使用する水性媒体に不溶性の合成ポリマーなどの固体担体に結合させることができる。アシラーゼの固定化に適した樹脂は、アクリル型の構造を有する樹脂、セパビーズ(Sepabeads)ＥＣ−ＥＰ(Resindion srl−Mitsubishi Chemical Corporation)やオイパーギット(Eupergit)Ｃ(Rohm-Degussa)などエポキシ官能基を有する樹脂、またはセパビーズＥＣ−ｈａｓやＥＣ−ＥＡ(Resindion srl−Mitsubishi Chemical Corporation)など第一級アミノ基を有する樹脂である。いずれにせよ、酵素をマトリックスに結合させるために、酵素を樹脂と接触させ、官能基(エポキシド)の高い反応性によって、またはグルタールアルデヒドなどの二官能性試薬を用いて樹脂を活性化させることによって固定化させる。アシラーゼの固定化に適した他の樹脂は、ポリスチレン樹脂、高度架橋樹脂およびセパビーズＥＣ−Ｑ１Ａなど塩基性官能基を有する樹脂である。酵素は樹脂上に吸着され、その後二官能性試薬(グルタールアルデヒド)と架橋結合することによって安定化される。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
微生物の培養および発酵
寒天プレートから単離した単一のコロニーを培養し、ＨｉｓＶＡＣの発現プラスミドを含む大腸菌株を維持する。すべての株が様々な寒天培地、特にｐＨ7.0であり以下の組成を有するＬＢ培地およびＬＢミラー培地(１％のグルコース含むものおよび含まないもの)中で十分な増殖率を示す：
ＬＢ＝10ｇ/ｌのトリプトン(カゼインの膵液消化物)；５ｇ/ｌの酵母抽出液；５ｇ/ｌのＮａＣｌ；
ＬＢミラー＝10ｇ/ｌのトリプトン(カゼインの膵液消化物)；５ｇ/ｌの酵母抽出液；10ｇ/ｌのＮａＣｌ。
【００２３】
寒天プレートを37℃で１日間インキュベートし、その後細胞を剥す。プレートを４℃で数週間維持することでコロニーは生存し続ける。
【００２４】
細胞を滅菌溶液中に懸濁させ、懸濁液(ＯＤ600＝４まで増殖させた)を34μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールおよび30μｇ/ｍｌのカナマイシンを含むＬＢミラー培地を入れたフラスコ(または発酵槽、フラスコ内で増殖期(vegetative phase)を完了させた後)に移す。培養物を37℃、200rpmで３時間、ＯＤ600＝0.8(指数増殖期)まで増殖させる。増殖期(productive phase)後、0.6ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって誘導を行い、その後、細胞を21℃または25℃で３〜５時間増殖させる。
【００２５】
野生型ＨｉｓＶＡＣアシラーゼの抽出および精製
ＨｉｓＶＡＣとは細胞内アシラーゼである。発酵後、培養物のブロスを遠心分離し、化学的(洗剤または水酸化ナトリウムを数秒間加える)または物理的(プレスまたはガラスビーズによる粉砕)処理によって細胞膜の溶解を行う。好ましい方法はリン酸またはピロリン酸緩衝液(ｐＨ7.5〜８)などの緩衝溶液中への細胞ペーストの再懸濁、次いでフレンチプレスまたはラニー(Rannie)ホモジナイザーによる600〜800バールでの溶解である。細胞溶解液を、任意選択で高分子電解質の存在下で遠心分離または精密濾過(カットオフ0.45μｍ)によって清澄にした。粗酵素を含む清澄にした溶液をクロマトグラフィーによって精製した。好ましい手順は、ヒスチジンでタグしたタンパク質を選択的に吸着する能力を有する、金属イオン(たとえば亜鉛やニッケル)に結合するイミン二酢酸基を有するキレート化樹脂を含むカラムによる精製である。適切なクロマトグラフィー用樹脂はHiTrap Chelating(Amersham Biosciences)およびセパビーズＦＰ−ＩＤＡ(Resindion srl-Mitsubishi Chemical Corporation)である。高純度のＨｉｓＶＡＣアシラーゼは、イミダゾール濃度を増加させながらまたはｐＨを変化させながら溶出させることによって得ることができる。
【００２６】
精製したＨｉｓＶＡＣは、ｐＨ５〜９の範囲で120分間インキュベートした後に安定である。酵素活性は５〜10の範囲の反応溶液のｐＨの関数として増大し、30分間の反応後に40℃で最高値に達する。
【００２７】
ｐＥＴ２４Δ−ＨｉｓＶＡＣプラスミドで形質転換させた大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳの培養によるＨｉｓＶＡＣアシラーゼの産生
１）微生物の調製
ＨｉｓＶＡＣをコードしているｃＤＮＡ(野生型および突然変異体、2322ｂｐ)を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化する。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ２４Δ(ＢｇｌII−Ｔｔｈ１１１Ｉ)−ＨｉｓＶＡＣ発現プラスミドに相当する3.6ｋｂの断片内に連結させる。このプラスミドは、制限酵素ＢｇｌIIおよびＴｔｈ１１１Ｉによる7.6ｋｂのｐＥＴ２４−ＨｉｓＶＡＣプラスミド(制限酵素ＸｈｏＩ／ＮｄｅＩで処理した全ＶＡＣ ｃＤＮＡ(2.3ｋｂ)をＸｈｏI／ＮｄｅＩで消化したｐＥＴ２４プラスミドの5.3ｋｂ断片内にクローニングすることによって得られた)の切断、4984ｂｐ断片の回収、クレノウ(Klenow)酵素による粘着末端の平滑化およびライゲーションによって得られた。この結果生じたｐＥＴΔ−ＨｉｓＶＡＣを用いてＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞を形質転換させる。形質転換させた細胞を34μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールおよび30μｇ/ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ−寒天プレートに移し、37℃で24時間インキュベートする。個々のコロニーをプレートから選択し、34μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールおよび30μｇ/ｍｌのカナマイシンを含む750ｍｌの液体ＬＢミラー培地中で培養する。細胞内にｐＥＴ２４Δ−ＨｉｓＶＡＣプラスミドが存在するかどうかは、回収したプラスミドＤＮＡの制限分析によって確認する。
【００２８】
２）発酵
ａ）増殖期
ｐＥＴ２４Δ−ＨｉｓＶＡＣプラスミドで形質転換させたＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞を37℃で24時間、34μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールおよび30μｇ/ｍｌのカナマイシンを含む固体ＬＢ−寒天培地中で発酵させる。細胞を100ｍｌの滅菌溶液中に再懸濁させ、懸濁液(ＯＤ600＝４まで増殖させた)15ｍｌを34μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールおよび30μｇ/ｍｌのカナマイシンを含む750ｍｌのＬＢミラー培地を入れた２ｌフラスコ(または発酵槽、増殖期が完了するまでフラスコ内で増殖させた後)に移す。培養物を37℃、200rpmで３時間、ＯＤ600＝0.8(指数増殖期)まで増殖させる。
【００２９】
ｂ）誘導期
増殖期の後、0.6ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって誘導を行う。誘導後、細胞を21℃または25℃で増殖させる。３〜５時間後に最も高い酵素産生が達成される。
【００３０】
（実施例２）
野生型ＨｉｓＶＡＣアシラーゼの抽出および精製
実施例１に記載のように4.5リットルのブロスから得た細胞ペースト(13ｇ、90ＵのＨｉｓＶＡＣアシラーゼに相当する)を、0.7μｇ/ｍｌのペプスタチンを含む39ｍｌの50ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ7.5中に再懸濁させる。懸濁液を４℃に冷却し、フレンチプレスに通す。39000ｇで60分間遠心分離することによって溶解液を清澄にする。総ユニット数90に相当する1.8Ｕ/ｍｌのＨｉｓＶＡＣアシラーゼ活性を有する50ｍｌの清澄にした溶液が得られる。この粗試料を、事前にニッケルイオンを載せて50ｍＭのピロリン酸ナトリウム緩衝液、１ＭのＮａＣｌおよび20ｍＭのイミダゾール緩衝液、ｐＨ7.2で平衡化した５ｍｌのHiTrap Chelatingカラム(Amersham Biosciences)に載せる。ＨｉｓＶＡＣアシラーゼを６ｍｌの50ｍＭのピロリン酸ナトリウム緩衝液、500ｍＭのイミダゾール、10％のグリセロール、ｐＨ7.2で溶出させる。精製した酵素は12Ｕ/ｍｌ(総ユニット数72)の活性を有しており、グルタリル−７ＡＣＡを基質として、タンパク質１ｍｇあたり6.5Ｕの特異的活性を有している。
【００３１】
（実施例３）
ＨｉｓＶＡＣアシラーゼのＥＣ−ＥＰセパビーズへの固定化
１ｇのＥＣ−ＥＰセパビーズを、100ユニットのアシラーゼを含む20℃の10ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ8.0に加える。混合物を12時間、20℃で穏やかに攪拌し続け、その後、さらに12時間、20℃で静置する。濾過により樹脂を回収し、25ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ8.0で洗浄する。この結果生じた生体触媒は、グルタリル−７ＡＣＡを基質として35〜40Ｕ/ｇの固定化した際の活性を有する。
【００３２】
（実施例４）
溶液中における、ＨｉｓＶＡＣアシラーゼによるセファロスポリンＣの変換
0.053ｇのセファロスポリンＣ、ナトリウム塩二水和物(純度86％)を20ｍｌの100ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８(2.27ｇ/ｌ、純度100％と仮定する)に溶かし、6.4ｍｌの精製したアシラーゼ(総ユニット数167.2)に加える。混合物を攪拌下、20℃でインキュベートし、この間希水酸化ナトリウムを加えることによってｐＨを８に保つ。150分間に７−ＡＣＡへの最大の変換率が得られる(92.8％変換、ＨＰＬＣ)。
【００３３】
（実施例５）
突然変異体の調製
１．部位特異的突然変異誘発
二本鎖ＤＮＡの特異的部位に突然変異を導入することを可能にする「QuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キット」(STRATAGENE)を用いて、ヌクレオチドの突然変異を導入する。目的遺伝子を含む二本鎖ｐＥＴ２４Δ−ＨｉｓＶＡＣおよび所望の突然変異を含む２つのプライマーを使用する。それぞれが対応するベクター鎖に相補的なプライマーは、高い厳密性で両プラスミド鎖を複製するＰｆｕＴｕｒｂｏ(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させる。ＰＣＲ後、混合物をＤｐｎＩ(親ＤＮＡを消化するために用いる、メチル化ＤＮＡに特異的なエンドヌクレアーゼＤＮＡ)で処理し、生成物を用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞を形質転換させ、これからＤＮＡを抽出して大腸菌発現株ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳを形質転換させる。
【００３４】
約50ｎｇの鋳型ＤＮＡ(ｐＥＴ２４Δ−ＨｉｓＶＡＣ)、それぞれ125ｎｇのプライマー、2.5ＵのＰｆｕＴｕｒｂｏ(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼを使用し、以下のＰＣＲプログラムを実行する：
【００３５】
【数１】
2005198655.tif 000003
【００３６】
部位特異的突然変異誘発によって得た突然変異したタンパク質は、実施例２に記載のように精製した。
【００３７】
２．部位飽和突然変異誘発
ランダム組換えＨｉｓＶＡＣ突然変異体のライブラリーを得るために、部位飽和(または完全)突然変異誘発を使用し、これは、20種のアミノ酸の任意の１種をタンパク質の同じ位置に挿入することを可能にするので使用する。この技術は特定の標的コドン中に様々な突然変異を導入するために変性オリゴヌクレオチドを使用することからなる。オリゴヌクレオチドは「飽和」する位置に対応する等モルのヌクレオシド混合物(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ)を用いて合成する。これにより生じる突然変異遺伝子の集合体は、ランダムコドンを有する同一の遺伝子からなる。様々なクローン内で、このコドンは任意のアミノ酸をコードすることができ、したがって、１つの特定標的残基における可能なすべてのアミノ酸置換を有する突然変異体のライブラリーが得られる。ｐＥＴ２４Δ−ＡｃｙＨｉｓ発現プラスミドをＤＮＡ鋳型として使用し、特定の残基(たとえば位置215および296のアミノ酸）をコードしているコドンの３つの塩基すべてが変性したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。
【００３８】
部位特異的突然変異誘発にも使用される「QuikChange部位特異的突然変異誘発キット」(STRATAGENE)を使用して突然変異を導入した。変異したＤＮＡを使用して発現株ＢＬ21(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳを形質転換させる。その後、変異したクローンをスクリーニングに供し、実施例２に記載のように精製した。
【００３９】
３．ランダム突然変異誘発
変異性ＰＣＲで目的遺伝子を増幅することによって組換えＨｉｓＶＡＣ酵素突然変異体のライブラリーを調製した。増幅は、様々な突然変異誘発条件下で実施した：
ａ．10％のＤＭＳＯ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、および多数回のサイクル；
ｂ．[Ｍｎ++]＝0.5ｍＭ、[Ｍｇ++]＝0.25ｍＭ、[ｄＧＴＰ]および[ｄＡＴＰ]＝0.2ｍＭ、[ｄＣＴＰ]および[ｄＴＴＰ]＝１ｍＭ。
【００４０】
ｐＥＴ２４Δ−ＡｃｙＨｉｓ発現プラスミド(以下参照)をＤＮＡ鋳型として使用し、２つの指定したオリゴヌクレオチド、すなわちＲＮＤ−ＡＣＹ−ＥＸＴ(５'−ＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡ−３')およびＲＮＤ−ＡＣＹ−ＵＰ(５'−ＡＡＣＣＡＡＣＣＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＣ−３')をプライマーとして使用した。これらのプライマーは以下のスキームに示すように制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの部位に隣接するベクター領域にアニーリングさせる。
【００４１】
【数２】
2005198655.tif 000004
【００４２】
増幅されたバンド(約1.6ｋｂ)をＤＮＡ鋳型(7.6ｋｂ)から単離するために、ＰＣＲ産物をプールし、アガロースゲルで分離する。その後、増幅したＤＮＡをゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた予備消化に供する。消化混合物をアガロースゲルに載せ、目的断片(約1.4ｋｂ)を回収してゲル精製した。抽出したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いたＯ．Ｎ．消化に供し、3.6ｋｂおよび1.4ｋｂの２つの断片が得られた。目的断片(3.6ｋｂ)を回収し、ゲル精製した。突然変異誘発条件下で増幅し、消化および精製した、ＡｃｙＨｉｓ酵素をコードしているＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ２４Δ(ＢｇｌＩＩ−Ｔｔｈ１１１)−ＡｃｙＨｉｓ内に連結させる。このライゲーション混合物を用いて大腸菌株ＪＭ１０９を形質転換させる。
【００４３】
「突然変異体ライブラリー」を大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ(発現株)内に移すために、細胞を、得られたすべての突然変異体を含むプラスミドＤＮＡのプールで形質転換させる。この目的のために、ライゲーション産物を用いたＪＭ１０９細胞の形質転換によって得られたすべてのコロニーを選択培地中に再懸濁させ、全プラスミドＤＮＡを抽出する。このＤＮＡは、ＢＬ21(ＤＥ３)ｐＬｙｓＳ発現株を形質転換させるために使用する。
【００４４】
（実施例６）
突然変異誘発によって得られた突然変異体の特徴
突然変異体およびＨｉｓＶＡＣアシラーゼの動力学的パラメータは、37℃における0.1Ｍのリン酸緩衝溶液、ｐＨ8.0中でのセファロスポリンＣまたはグルタリル７−ＡＣＡの加水分解率を測定して決定した(その後、25℃におけるユニットに換算変換した)。７−ＡＣＡの量は、標準曲線を使用し、改変したBulasingham法(Biochem.Biophys.Acta、276、250、1972)を用いてｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応によって生じる415ｎｍにおける黄色強度(シッフ塩基)を測定する分光光度法によって決定する。
【００４５】
１ユニットのアシラーゼとは、アッセイ条件下で１分間に１マイクロモルの７−ＡＣＡを生じる(溶液中のまたは固定化した)酵素の量である。
【００４６】
以下の表に報告するデータによると、本発明の突然変異体は野生型ＨｉｓＶＡＣアシラーゼと比較して、グルタリル−７−ＡＣＡに対するよりもセファロスポリンＣに対して良好な動力学特性を有する。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
さらに、突然変異体Ａ２１５Ｙは25℃より高い温度でより安定である。
【００４９】
【表２】
2005198655.tif 000006
【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【００５２】
産物−阻害のデータを以下の表に報告する。このデータは、野生型ＨｉｓＶＡＣに対して、変異アシラーゼの産物の阻害において有意な変化を示している。
【００５３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【図２】配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【図３】配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【図４】配列番号１のアミノ酸配列を示す。
【図５】配列番号２のヌクレオチド配列を示す。
【図６】配列番号２のヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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