(57)【要約】【課題】本発明は、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤、アポトーシス誘導剤およびそれらを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明は、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清から選ばれる１つ以上を有効成分とするＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤、ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤成分を有効成分とし、ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導することを介して臓器細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするアポトーシス誘導剤ならびに臓器細胞にＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導させる物質を有効成分として含有する医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清から選ばれる１つ以上を有効成分とする臓器細胞に対するＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤。
【請求項２】
有効成分が単純ヘルペスウイルス変異体である請求項１記載のＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤。
【請求項３】
単純ヘルペスウイルス変異体が、潜伏関連転写領域に変異を有する単純ヘルペスウイルス変異体である請求項２記載のＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤。
【請求項４】
ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導させる成分を有効成分とし、細胞にＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を介して臓器細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
有効成分がＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０をコードする遺伝子が導入されたウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清であることを特徴とする請求項４記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
有効成分が単純ヘルペスウイルス変異体である請求項５記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
単純ヘルペスウイルス変異体が、潜伏関連転写領域に変異を有する単純ヘルペスウイルス変異体である請求項６記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
臓器細胞が固形腫瘍細胞である請求項４〜７に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項９】
臓器細胞にＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導させる物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を介して臓器細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とする物質を有効成分として含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清から選ばれる１つ以上を有効成分とするＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤、ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤成分を有効成分とし、ＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導することを介して臓器細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とするアポトーシス誘導剤ならびに臓器細胞にＣＤ３０リガンドおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導させる物質を有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは積極的な細胞死であり、細胞の活性化に伴い、複雑な生化学反応が起こり、種々のタンパクやＤＮＡの分解酵素が産生され、細胞自身に作用して細胞死をもたらす。アポトーシスは、正常な発生・分化に不可欠な現象であり、正常な生体組織において個々の細胞に起こっている。そのため、アポトーシスが過剰に抑制されると多くの機能障害の原因となってくる。
【０００３】
具体的にこれらアポトーシス抑制に起因する障害としては、固形腫瘍、増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、異常な骨発達、肝炎、腎疾患などの疾患が挙げることができるが、いずれもまだ有効な治療剤がないのが現状であり、臨床上有用性の高い治療・改善薬が求められていた。
【０００４】
アポトーシスが関与する疾患において、特に癌は日本人の死亡原因の１位であり、その約３０％を占める（１９９９年）。近年の化学療法、外科的治療法、放射線療法、温熱療法や免疫療法などの進歩により原発癌の除去による治癒率は大幅に向上しているが、原発癌を完全に除去した場合においても、癌転移により再発する例が少なくない。また、癌転移が認められる場合、外科的治療が困難であることが多く、治療の第一選択は化学療法となる。しかし、抗癌剤を用いる化学療法は、その効果の点で十分ではなく、さらに、正常細胞に対しても有害な副作用を及ぼすものが多く、必ずしも有効とはいえない状況にある。このように、原発癌の除去による治癒率は向上しているものの、外科的治療法によらない治療法が確立されておらず、癌治療における重要な課題となっている。
【０００５】
癌の治療方法の一つとして、増殖性ウイルスを腫瘍細胞に感染させ、ウイルス増殖に伴うウイルスそのもの直接的な殺細胞効果により腫瘍の治療を図るウイルス療法が知られている（実験医学、第２０巻、第８６８−８７５頁、２００２年）。ウイルス療法の概念は古くより存在し、４０年以上も前から臨床に応用されていた。しかし、初期のウイルス療法は、その強い毒性のため、広く適用されるには至らなかった。近年、遺伝子工学の進展により、ウイルスの遺伝子操作を行い、病原性を減弱し、抗腫瘍効果を保持するウイルスも見出されてきた。このようなウイルスの一つに単純ヘルペスウイルス−１型（ＨＳＶ−１）が知られており、例えば、以下のものが挙げられる。
チミジンキナーゼを欠損するウイルス（ｄｌｓｐｔ；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５２巻、第８５４−８５６頁、１９９１年）、リボヌクレオチド還元酵素を不活化したウイルス（ｈｒＲ３；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｅｒ  Ｒｅｓ．）、第５４巻、第３９６３−３９６６頁、１９９４年）、γ３４．５遺伝子を欠失させたウイルス（Ｒ３６１６：ニューロサージャリー（Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ）、第３２巻、第５９７−６０３頁、１９９３年；１７１６：ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、第３５７巻、第５２５−５２６頁、２００１年）、γ３４．５遺伝子の欠失とｌａｃＺ遺伝子挿入によるＩＣＰ６遺伝子の不活化の二重変異ウイルス（Ｇ２０７：ネーチャーメディシン（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．）、第１巻、第９３８−９４３頁、１９９５年）。
Ｇ２０７は、病原性に関与するγ３４．５遺伝子の変異とＤＮＡ合成酵素遺伝子の変異をもつ第二世代の腫瘍治療用の増殖遺伝子組換えＨＳＶ−１であり、病原性が弱められ、しかもチミジンキナーゼ遺伝子は温存されているため、抗ウイルス剤により制御できることから安全性の点も改善されている。近年、γ３４．５遺伝子の欠失とＩＣＰ６遺伝子の不活化に加え、α４７遺伝子の欠失した第三世代の腫瘍治療用の増殖遺伝子組換えＨＳＶ−１（Ｇ４７Δ：プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミーオブ  サイエンス  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９８巻、第６３９６−６４０１頁、２００１年）が開発されている。
【０００６】
ＨＳＶ−１の抗腫瘍作用に関しては、腫瘍特異的なウイルス複製に伴う殺細胞効果と特異的抗腫瘍免疫の惹起であるとされ、腫瘍内でのウイルス増殖が、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ＣＴＬ）の活性上昇を伴う抗腫瘍免疫を誘導すると考えられている（Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、第１０巻、第２７４１−２７５５頁、１９９９年）。また、ＨＳＶチミジンキナーゼを持つレトロウイルスベクターとガンシクロビルにより腫瘍細胞がアポトーシスを起こすことが知られており（キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第５３巻、第５２７４−５２８３頁、１９９３年）、この作用機序として、ＨＳＶチミジンキナーゼとガンシクロビルにより細胞内にｐ５３が蓄積し、細胞表面にＦＡＳ（ＣＤ９５と称される）とＴＮＦレセプターの発現が増加し、次いでｐ５３により細胞表面のＣＤ９５が集合してＦａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＤＤ）とカスパーゼ８を含む複合体が形成され細胞死をもたらすシグナルを発するとされている（プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９６巻、第８６９９−８７０４頁、１９９９年）。
一方、ＨＳＶ−１遺伝子の解析が進み、ＨＳＶ−１遺伝子の中のＲＳ１（ＩＥ１７５）、ＲＬ１（γ１３４．５）、ＵＳ３、ＬＡＴなどにアポトーシスの抑制機能があることが明らかとなっている（蛋白質・核酸・酵素、第４３巻、第８４７−８５６頁、１９９８年；プロシーディングズオブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第８９巻、第３２６６−３２７０頁、１９９２年；プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９４巻、第７８９１−７８９６頁、１９９７年；サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２８７巻、第１５００−１５０３頁、２０００年）。そして、ＨＳＶ−１のγ１３４．５遺伝子を除去し、ＨＳＶ−１自体を神経系腫瘍細胞のアポトーシス剤とする試みがなされている（特開平１０−８７５０３号）。
【０００７】
ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０ＬまたはＣＤ１５３と称される）は、１９９３年にＣＤ３０に対する特異的なリガンドとしてヒトおよびマウスのｃＤＮＡがクローニングされた（セル（Ｃｅｌｌ）、第７３巻、第１３４９−１３６０頁、１９９３年）。そして、ＣＤ３０Ｌは、分子量約４０ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質で、その細胞外ドメインが、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４と称される）などと相同性が高いことからＴＮＦファミリーに分類されている。
ＣＤ３０Ｌは、活性化したＴ細胞・単球・マクロファージ、顆粒球、一部の腫瘍細胞に発現していることが知られている（臨床免疫、第３４巻、第６４２−６４８頁、２０００年）。また、ＨＳＶで形質転換されたヒトＴ細胞でＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌが発現することが知られている（ジャーナル  オブ  バイロロジー（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．）、第７２巻、第３１３８−３１４５頁、１９９８年）。しかし、ＣＤ３０Ｌの生理機能は、不明な点が多い。
一方、ＣＤ３０は、１９８２年にホジキン病由来の株化細胞の細胞表面分子として見出された。ＣＤ３０は、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属しており、１９９２年にｃＤＮＡがクローニングされている（セル（Ｃｅｌｌ）、第６８巻、第４２１−４２７頁、１９９２年）。通常のＴＮＦＲスーパーファミリーは、アポトーシスに関連が深い分子であり、その数種にはｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  （ＤＤ）と呼ばれる共通の細胞内ドメインが認められている。しかし、ＣＤ３０にはＤＤが存在せず、ＤＤを介したカスパーゼの会合によりアポトーシスが誘導される経路（セル（Ｃｅｌｌ）、第８８巻、第３５５−３６５頁、１９９７年）の関与は、知られていない。また、ＣＤ３０のシグナル伝達について、ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  （ＴＲＡＦ）タンパクを介する経路が確認されているが、他にもＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子の存在が推測されている（臨床免疫、第３４巻、第６４２−６４８頁、２０００年）。さらに、ＣＤ３０を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とし、好酸球増多性疾患治療剤に有効であることが記載されている（国際公開番号ＷＯ０３／０００２８６）。
しかし、臓器細胞やそれらの固形腫瘍細胞にＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現を介してアポトーシスを誘導させることができることは知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤を見出し、さらにアポトーシス関連疾患の治療剤の提供することである。すなわち、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現させることを特徴とする、アポトーシス誘導剤に関する。たとえば、固形腫瘍を有する患者に特別の外科的な処置を行うことなく、固形腫瘍を縮小・消失させ、または腫瘍の再発を防止する新たな方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これまでに、炎症や病原性を誘導することなく、潜伏関連転写領域（ｌａｔｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ：ＬＡＴ）プロモーター制御下においてβ−ガラクドシターゼを発現する神経毒性のないＨＳＶベクターを構築した（ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．）、第２４５巻、第６９−７２頁、１９９８年）。この遺伝子改変ウイルスβＨ１（以下、βＨ１と称する）の病原性は、マウスにおいて、皮膚接種、静注、脳内接種のいずれにおいても認められず、また、βＨ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの継代において安定であり、潜伏感染時に神経システムで長期間安定したβ−ガラクドシターゼを発現した。
本発明者は、βＨ１について研究を進めた結果、βＨ１をヒト神経膠芽腫細胞（Ｕ８７）が移植されたヌードマウスに感染させると極めて顕著な腫瘍の縮小・消失が認められること、この現象は局所性であること、βＨ１が感染していない腫瘍も細胞死を起こす現象を見出し、この現象の作用機序を解明するため、遺伝子の解析を行った。また、種々の固形腫瘍細胞について、同様な研究を進めた。その結果、特定の単純ヘルペスウイルスを投与することで、固形腫瘍細胞において、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現誘導作用を確認した。さらに、これらの作用を特徴とするアポトーシス誘導が見出され、腫瘍が縮小・消失することを見出し、本発明を成すに至った。
以下、本発明について詳述する。
【００１０】
本発明のＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０発現誘導剤は、細胞の表面にＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現を誘導できるものを有効成分とするものであり、これらの作用を有するものであれば、特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、細胞、ウイルス自身、ベクター、ＤＮＡ、ＲＮＡ、培養物、培養上清などのいずれであっても構わないが、好ましくは、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物、その培養上清、ＣＤ３０Ｌが誘導された免疫細胞、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０をコードする遺伝子が導入されたベクター、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の活性ドメインを発現する遺伝子断片が導入されたベクターなどが挙げられ、より好ましくは、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物、その培養上清およびＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０をコードする遺伝子が導入されたベクターが挙げられ、よりさらに好ましくは、単純ヘルペスウイルス変異体、単純ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清が挙げられ、最も好ましくは、単純ヘルペスウイルス変異体が挙げられる。これらは、それ単独または組み合わせ、さらに適当な賦形剤を加えて利用することができる。
【００１１】
また、本発明のアポトーシス誘導剤は、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現誘導を介することを特徴とするものであり、ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０の発現誘導剤として上記したものは、臓器細胞のアポトーシス誘導剤としても有用であり、それ単独または組み合わせ、さらに適当な賦形剤を加えて医薬組成物として利用することができる。
【００１２】
本発明に使用される単純ヘルペスウイルス変異体としては、たとえば、ウイルスのもつ毒性が軽減された単純ヘルペスウイルス変異体が挙げられるが、より好ましくは、ＬＡＴ領域が変異したウイルスが挙げられ、さらに好ましくは、β−ｇａｌを挿入した変異体が挙げられる。さらに一層好ましいものは、βＨ１（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  、第２４５巻、第６９−７２頁、１９９８年）である。
【００１３】
変異ウイルスは、周知の相同組換え法により親株のウイルスに変異を形成することで得ることができる。例えば、相同ヘルペス配列に隣接した変異を生じた配列を含むプラスミドベクターとともにヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡをトランスフェクトすればよい。たとえば、βＨ１であれば、ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第２４５巻、第６９−７２頁、１９９８年およびニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第３１巻、第２３５−２４０頁、１９９８年に記載の方法に準じて作成すればよい。
組換えウイルスの作成についても常法に準じて作成すればよく、例えば、以下に示す文献に記載の方法により行うことができる。
・Ｗｏｌｆｆ編、Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ．  （Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４年）
・Ｋａｐｌｉｔｔ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｙ編、Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｐｌｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、１９９５年）
・Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．編、  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｅｒａｉｎ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第７７２巻（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）
・Ｇｌｕｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  編、  Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年）
・  Ｒｏｔｈ編、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第４３巻（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４年）
【００１４】
本発明に使用されるＣＤ３０Ｌをコードする遺伝子およびＣＤ３０Ｌの活性ドメインを発現する遺伝子断片は、例えば、ＷＯ９３／２４１３５に記載のｃＤＮＡである。また、ＣＤ３０をコードする遺伝子は、ＣＤ３０の活性ドメインを発現する遺伝子断片、例えば、ＷＯ９３／１０２３２に記載のｃＤＮＡである。
【００１５】
ＣＤ３０ＬもしくはＣＤ３０をコードする遺伝子またはＣＤ３０ＬもしくはＣＤ３０の活性ドメインを発現する遺伝子断片が導入されるベクターとしては、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスベクターが挙げられるが、好ましくは、単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【００１６】
ベクターの作製は、ウイルスを構成するタンパク質をコードする遺伝子に対し、一般的な組み換えＤＮＡ作成技術を用いて該タンパク質とＣＤ３０またはＣＤ３０Ｌとの融合タンパク質をコードするように該当するウイルスタンパク質のコード領域を入れかえることによって行なえばよい。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年）などに記載の方法に準じて実施すればよい。
【００１７】
上記のウイルスを構成するタンパク質としては、例えば、ウイルスの外表面を構成するタンパク質として、ＶＳＶ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のＧタンパク質、レトロウイルスのエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）、アデノウイルスのキャプシドタンパク質（ヘキソン、ペントンベース、ファイバー）、インフルエンザウイルスのヘマグルチン、パラミクソウイルスの表面糖タンパク質などが挙げられるが、腫瘍細胞などの宿主細胞の表面への吸着や特異的受容体との相互作用を担うようなウイルスタンパク質であれば、いずれも本発明に用いられる。
【００１８】
本発明のウイルスベクターは、適宜、外来の遺伝子を組み込んで作成してもよい。外来の遺伝子の組み込みによって、当該遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。例えば、外来遺伝子としては、直接的または間接的に標的細胞に対して細胞毒性作用を有するような分子をコードする遺伝子が挙げられ、これらの外来遺伝子を組み込むことにより、標的となる細胞を効率的かつ選択的に殺すことができる。
【００１９】
外来遺伝子としては、例えば、サイトカイン、細胞増殖因子および細胞増殖抑制因子などをコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、細胞死調節遺伝子などが挙げられる。
また、外来遺伝子として、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシン・デアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ，  ＣＤ）などの非毒性のプロドラッグを細胞毒性を有する薬剤に変換することができる酵素をコードする遺伝子を組み込むことにより、標的細胞を当該プロドラッグに対して感受性にすることができる。例えば、ＨＳＶ−ｔｋをコードする遺伝子を組み込んだ場合は、標的細胞をガンシクロビルまたはアシクロビルに対して感受性にすることができ、ＣＤをコードする遺伝子を組み込んだ場合は、標的細胞内で非毒性の５−フルオロシトシンを細胞毒性を有する薬剤である５−フルオロウラシルに変換させることができる。
【００２０】
本発明で利用されるヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清とは、ヘルペスウイルス変異体の培養物およびその培養上清を単独または混合した組成物、さらにそれらを、たとえば、破砕、遠心分離、濾過などにより適宜処理して得られる組成物が挙げられる。
【００２１】
本発明における臓器細胞としては、生体内に存在するの臓器または組織を構成する細胞およびそれらに由来する細胞であれば、とくに限定されないが、たとえば、肝、腎、脾、肺、膵、脳、脊髄などの実質臓器の構成細胞；胃、小腸、大腸、食道などの管腔臓器の構成細胞；生体内の各組織の固着細胞ならびに固形腫瘍細胞などが挙げられる。
さらに上記の固形腫瘍細胞としては、異常増殖を行う腫瘍細胞であれば、特に限定されないが、好ましくは、悪性腫瘍細胞が挙げられる。より具体的には、たとえば、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、結腸腺癌、頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膀胱癌、ウィルムス腫瘍、線維肉腫、骨肉種、黒色腫、滑膜肉腫、神経芽腫並びに神経膠芽腫を含む脳腫瘍、神経内分泌腫瘍、腎臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、胃癌、食道癌、肝癌、胆道癌、肉腫、皮膚癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、膵臓癌および中皮腫などの固形腫瘍細胞が挙げられ、より好ましくは、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、神経芽腫並びに神経膠芽腫を含む脳腫瘍などの固形腫瘍細胞が挙げられ、さらに好ましくは、神経膠芽腫細胞が挙げられる。
【００２２】
本発明のアポトーシス誘導剤は、組織の異常増殖に関与する疾患であればその疾患の治療に適用可能であるが、たとえば、固形腫瘍、増殖性皮膚疾患、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、異常な骨発達、ＨＩＶ感染、肝炎、腎疾患などの疾患が挙げられる。適応疾患として、好ましくは、自己免疫疾患および固形腫瘍が挙げられ、より好ましくは、固形腫瘍、とりわけ、固形悪性腫瘍が挙げられる。
【００２３】
本発明のＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０発現誘導剤およびアポトーシス誘導剤は、通常、薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬組成物として、たとえば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、固結・付着防止剤、滑沢剤、吸収・吸着担体、溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、被覆剤、吸収促進剤、ゲル化・凝固促進剤、光安定化剤、保存剤、防湿剤、乳化・懸濁・分散安定化剤、着色防止剤、脱酸素・酸化防止剤、矯味・矯臭剤、着色剤、起泡剤、消泡剤、無痛化剤、帯電防止剤、緩衝・ｐＨ調節剤などの各種医薬品添加物を配合して、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤など）、注射剤、坐剤、外用剤（軟膏剤、貼付剤など）、エアゾール剤などして提供することもできる。
【００２４】
上記各種薬剤は、通常の方法により製剤化される。
錠剤、散剤、顆粒剤などの経口用固形製剤は、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、無水第二リン酸カルシウム、部分アルファ化デンプン、コーンスターチおよびアルギン酸などの賦形剤；単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、水およびエタノールなどの結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸、かんてん末、デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムおよびデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリルアルコール、ステアリン酸、カカオバターおよび水素添加油などの崩壊抑制剤；ケイ酸アルミニウム、リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、無水ケイ酸などの固結防止・付着防止剤；カルナバロウ、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、硬化油、硬化植物油誘導体、胡麻油、サラシミツロウ、酸化チタン、乾燥水酸化アルミニウムゲル、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、リン酸水素カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリエチレングリコールなどの滑沢剤；第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、尿素および酵素などの吸収促進剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、無水ケイ酸、含水二酸化ケイ素、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムおよびコロイド状ケイ酸などの吸収・吸着担体などの固形製剤化用医薬用添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００２５】
錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、胃溶性被覆錠、腸溶性被覆錠および水溶性フィルムコーティング錠とすることができる。
カプセル剤は、上記で例示した各種の医薬品と混合し、硬質ゼラチンカプセルおよび軟質カプセルなどに充填して調製される。
【００２６】
溶剤、増量剤、等張化剤、溶解補助剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤などの上記した各種の液体製剤化用添加物を用い、常法に従い調製して、水性または油性の懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤とすることもできる。
【００２７】
坐剤は、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ラノリン、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライドおよびウィテップゾールなどに適当な吸収促進剤を添加し調製すればよい。
【００２８】
注射剤は、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、クエン酸、酢酸、リン酸、乳酸、乳酸ナトリウム、硫酸および水酸化ナトリウムなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤および緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸およびチオ乳酸などの安定化剤；食塩、ブドウ糖、マンニトールまたはグリセリンなどの等張化剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロピレングリコール、安息香酸ナトリウム、安息香酸ベンジル、ウレタン、エタノールアミン、グリセリンなどの溶解補助剤；グルコン酸カルシウム、クロロブタノール、ブドウ糖、ベンジルアルコールなどの無痛化剤；および局所麻酔剤などの液体製剤化用の医薬品添加物を用い、常法に従い調製すればよい。
【００２９】
ペースト、クリームおよびゲル形態の軟膏剤は、例えば、白色ワセリン、ポリエチレン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコンおよびベントナイトなどの基剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどの保存剤；安定剤；湿潤剤などの医薬品添加物を用い、常法により混合、製剤化すればよい。
【００３０】
貼付剤を製造する場合には、通常の支持体に上記軟膏、クリーム、ゲルまたはペーストなどを常法により塗布すればよい。支持体としては、綿、スフおよび化学繊維からなる織布または不織布；軟質塩化ビニル、ポリエチレンおよびポリウレタンなどのフィルムまたは発泡体シートが使用できる。
【００３１】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、たとえば、経口投与または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与を挙げることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などが挙げられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などが挙げられる。一方、非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。例えば、注射剤は、上記方法により調整されるが、注射剤は、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
また、噴霧剤は、該ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０発現誘導剤およびアポトーシス誘導剤そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ、該ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０発現誘導剤およびアポトーシス誘導剤の有効成分をを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。ＣＤ３０Ｌおよび／またはＣＤ３０発現誘導剤およびアポトーシス誘導剤並びに用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００３２】
上記医薬組成物の投与方法は、特に限定されず、投与量または投与回数などは、目的とする治療効果、治療期間、患者の年齢、体重、ウイルスベクターなどの種類、製剤の形態、性別その他の条件、患者の症状の程度に応じて適宜決定される。
例えば、通常成人に対して１日０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１回から数回に分割して投与すればよい。また、たとえばウイルスまたはウイルスベクターを投与する場合は、１回当たり、ウイルスまたはウイルスベクターとして１０３〜１０１５ＰＦＵであればよい。
【００３３】
【実施例】
つぎに本発明を参考例、実施例および製剤例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例において、以下の略号は、次の意味を有する。
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ウイルスバッファー：ウシ胎児血清２％含有ＭＥＭ培地
【００３４】
実施例１  βＨ１投与によるヒト悪性神経膠腫の消失
同様な大きさ（＞１００ｍｍ３）のＵ８７ＭＧ腫瘍を皮下に宿した胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスを無作為に分け、５０μｌウイルスバッファー中のβＨ１を１×１０７  ＰＦＵで腹腔内投与した。対照にはＰＢＳのみを投与した。
その結果、腫瘍の増加率は、βＨ１の治療群において対照群に比べ、顕著な抑制が見られた。（Ｐ＝０．０００２、実験終了時のｔ検定、図１）
また、βＨ１によって治療された全ての腫瘍は、治療後、１８日で消失した（図２）。
ＬＡＴ領域におけるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子挿入からのβ−ｇａｌの発現は、組織化学的なＸ−ｇａｌ染色によって、βＨ１処置Ｕ−８７ＭＧ腫瘍群で確認された。しかし、対照群の腫瘍では、確認されなかった。
【００３５】
実施例２  βＨ１によるヒト悪性神経膠腫に対するアポトーシス誘導
βＨ１治療腫瘍の組織像の評価のために、腫瘍を移植したマウスは、治療後３、７、１０日で屠殺した。これらの腫瘍を４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで終夜４℃で固定した後、エタノール濃度を増加させて脱水し、パラフィンで包埋し、４μｍに切断した。断片は、ヘマトキシリン−エオシン染色し、一次抗体ＧＫ１．５（ラット  抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）、５３−６．７（ラット  抗マウスＣＤ８ａモノクローナル抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）、ＭＯＭＡ−２（ラット  抗マウスマクロファージモノクローナル抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）、ＰＫ１３６（マウス  抗マウスＮＫ１．１モノクローナル抗体、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）で免疫染色した。結合した抗体は、ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ２  Ｋｉｔ／ＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）でビオチン化二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン（クロモーゲン）と結合するストレプトアビジンで検出した。Ｎ−１８（ヤギ  抗ヒトＣＤ３０Ｌポリクローナル抗体，  Ｓａｎｔａ  Ｃｕｒｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）による免疫組織化学は、ビオチン化二次抗体、アビジン、ビオチン化西洋わさびペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン（クロモーゲン）を使用するヤギ  ＡＢＣ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ  Ｃｕｒｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で行った。また、Ａｐｏｐ  Ｔａｇ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）を使用し、常法に準じ、ＴＵＮＥＬ法でアポトーシスの解析を行った。アポトーシスは、各切片からランダムに測定した３０００個の細胞によって評価した。
その結果、ヘマトキシリン−エオシン染色されたβＨ１治療群の腫瘍切片は、核の断片化、クロマチン凝縮などのアポトーシスの典型的な形態的な変化を確認された。さらに、これらの細胞は、ＴＵＮＥＬ法で陽染された。（図３）
【００３６】
実施例３  アポトーシスが誘導された細胞におけるＣＤ３０およびＣＤ３０Ｌの発現
皮下接種した腫瘍は、５０μｌウイルスバッファー中の１×１０７ＰＦＵのβＨ１で感染した。異種移植サンプル（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で感染後、２、４、６、８日で、腫瘍塊を取り出し、液体窒素ですぐに凍結した。一方、Ｕ８７ＭＧ細胞のコンフルエントな単相は、ＭＯＩ  １でβＨ１を感染させた。培地中（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でも、感染前および感染後６、１２、２４、４８時間後にサンプルを取得し、上記と同様に液体窒素で凍結した。各々の資料をＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で全ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）で添付の手順に準じ、精製した。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ６０，  ５００７−５０１１，  ２０００年に記載の方法に準じ、サンプルから増幅させたｍＲＮＡの一定量をＣｙ−３−ｄＣＴＰおよびＣｙ−５−ｄＣＴＰでラベルした。
リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を常法により実施した。ｃＤＮＡの定量は、内部基準としてのＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）との比較で行った。
ＣＤ３０ＬｍＲＮＡのプライマーとプローブは、以下の通りである。
ＣＤ３０Ｌ−ｆｏｒｗａｒｄ（５’−ＧＣＣＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＧＴＣＧＴＴ−３’）
ＣＤ３０Ｌ−ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＣ−３’）
ＣＤ３０Ｌ−Ｐｒｏｂｅ（５’−ＦＡＭ−ＣＧＧＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’−）尚、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓを用いて各々の遺伝子の発現割合を決定した。
その結果、異種移植サンプルについて特異的にＣＤ３０Ｌの発現の誘導が確認された。（図４）
【００３７】
さらにＣＤ３０ＬとＣＤ３０の免疫組織的な確認を行った。固定された腫瘍は、ヒトＣＤ３０に特異的なマウスのモノクローナル抗体およびヒトＣＤ３０Ｌ特異的なヤギポリクローナル抗体で免疫染色した。アポトーシスを起こした細胞は、両方で染色され、ＣＤ３０ＬおよびＣＤ３０が発現していることを確認した。（図５）
【００３８】
実施例４  抗ＣＤ３０抗体および抗ＣＤ３０Ｌ抗体によるアポトーシスの抑制
ＣＤ３０−ＣＤ３０Ｌの経路がβＨ１によって活性化され、アポトーシスを引き起こしていることを確認するために抗ＣＤ３０抗体および抗ＣＤ３０Ｌ抗体によるアポトーシスの抑制を確認する試験を行った。
腫瘍を移植されたマウスを抗ＣＤ３０モノクローナル抗体（Ｋｉ−１：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ社製）２００μｇまたは抗ＣＤ３０Ｌポリクローナル抗体（Ｎ−１８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）７０μｇ存在下にβＨ１を１×１０７ＰＦＵ感染させ、全量で１００μｌとした。
対照群には１００μｌのＰＢＳを接種した。マウスは、１日および３日めに屠殺した。腫瘍を固定し、免疫学的な解析とＴＵＮＥＬ法によって確認した。
その結果、対照群と比較して、抗ＣＤ３０Ｌ抗体および抗ＣＤ３０抗体いずれの存在下においてもβＨ１を接種した群においてアポトーシスの誘導が阻害された。（図６）
この結果、ＣＤ３０−ＣＤ３０Ｌの経路がこのアポトーシスの誘導に必須であることが確認できた。
【００３９】
実施例５  βＨ１のヒト腫瘍への有効性
ヒト腫瘍へのβＨ１の抗腫瘍効果を特定するために、Ａ５４９（ヒト肺癌由来細胞株）、ＭＸ−１（ヒト乳癌由来細胞株）、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ヒト胃癌由来細胞株）およびＲＣＡ（ヒト大腸癌由来細胞株）の移植された腫瘍について検討を行った。
腫瘍細胞は、各々３×３×３ｍｍ３を胸腺欠損ＢＡＬＢ／Ｃマウスの右大腿部に皮下接種した。腫瘍細胞が１００ｍｍ３以上に達した後、右大腿の腫瘍細胞に５０μｌのウイルス緩衝液中のβＨ１を１×１０７ＰＦＵを、対照群にはＰＢＳを接種した。
腫瘍の容積は、（腫瘍の最も長い部分の長さ）×（腫瘍の最も長い部分の長さと直交する部分の長さ）２／２で算出した。
対照群に比べ、βＨ１の治療群は、腫瘍の増殖率において明らかに阻害が見られた。（Ａ５４９：Ｐ＝０．０００９、ＭＸ−１：Ｐ＝０．００５４、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ：Ｐ＝０．０４６８、ＲＣＡ：Ｐ＝０．０１５３、試験終了時におけるｔ検定、図７、図８、図９、図１０）
βＨ１治療腫瘍の形態学的な評価のために腫瘍は、ヘマトキシリンとエオシンおよびＴＵＮＥＬ法で染色した。βＨ１処置腫瘍部分のヘマトキシリンとエオシン染色は、アポトーシスの典型的な形態学的な変化、核の断片化、核のクロマチン凝集を確認した（図１１）。これらのアポトーシスを起こした細胞は、ＴＵＮＥＬ法で陽染された。
この結果、βＨ１のヒト腫瘍への有効性は、複数の固形腫瘍細胞において確認でき、さらにこれらは全てアポトーシスによるものであることが判明した。
【００４０】
【発明の効果】
これらの結果、ＣＤ３０および／またはＣＤ３０Ｌの発現誘導によって、アポトーシスが誘導できることが明らかとなった。さらに、ＣＤ３０および／またはＣＤ３０Ｌを発現を誘導することを特徴とするアポトーシスの誘導方法を見出した。上記の通り、本発明のＣＤ３０および／またはＣＤ３０Ｌの発現誘導剤は、アポトーシス誘導能を有し、異常増殖が関与する疾患の治療剤として有用であり、とりわけ、固形腫瘍の治療剤として有用である。
【００４１】
【配列表】
2005021110.tif 000002
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【図面の簡単な説明】
【図１】βＨ１投与によるヒト悪性神経膠腫の体積の経日変化のグラフ
【図２】βＨ１投与後１８日めおよび対照群のマウスの図
【図３】βＨ１治療群のヘマトキシン−エオシン染色およびＴＵＮＥＬ染色結果の図
【図４】アポトーシスが誘導された細胞におけるＣＤ３０ＬおよびＣＤ３０の発現結果のグラフ
【図５】アポトーシスが誘導された細胞の免疫染色像の図
【図６】抗ＣＤ３０Ｌ抗体および抗ＣＤ３０によるアポトーシスの抑制を行った結果のＴＵＮＥＬ染色された細胞数のグラフ
【図７】βＨ１投与によるＡ５４９細胞（ヒト肺癌由来細胞株）の体積の経日変化のグラフ
【図８】βＨ１投与によるＭＸ−１細胞（ヒト乳がん由来細胞株）の体積の経日変化のグラフ
【図９】βＨ１投与によるＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞（ヒト胃癌由来細胞株）の体積の経日変化のグラフ
【図１０】βＨ１投与によるＲＣＡ細胞（ヒト大腸癌由来細胞株）の体積の経日変化のグラフ
【図１１】各種のヒト固形腫瘍に対するβＨ１治療群のヘマトキシン−エオシン染色およびＴＵＮＥＬ染色結果の図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005021110.tif 000009
【図７】
2005021110.tif 000010
【図８】
2005021110.tif 000011
【図９】
2005021110.tif 000012
【図１０】
2005021110.tif 000013
【図１１】
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