(57)【要約】    【課題】  強度を低下させることなく、親水性を高めることができ、測定時の検体中の蛋白質や夾雑物質による非特異吸着を抑制することができ、測定精度に優れ、かつ性能の劣化が生じ難い、液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。    【解決手段】  イオン交換基を有する充填剤粒子表面に、２種類以上の親水基含有化合物を吸着させてなるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤、好ましくは、２種類以上の親水基含有化合物の内、少なくとも１種類の親水基含有化合物の等電点が４．６以下であり、かつ他の少なくとも１種類の親水基含有化合物の等電点が４．７以上とされている、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン交換基を有する充填剤表面に親水基を有する複数種の化合物を吸着させたことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
親水基を有する複数種の化合物の内、少なくとも１種類の化合物の等電点が４．６以下であり、かつ少なくとも１種類の他の化合物の等電点が４．７以上であることを特徴とする、請求項１に記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
等電点が４．６以下の親水基を有する少なくとも１種類の前記化合物が親水基を有する複数種の化合物の総重量中１０重量％以上の割合で、かつ等電点が４．７以上の少なくとも１種類の前記他の化合物が親水基を有する複数種の化合物の総重量中１０重量％以上の割合で用いられていることを特徴とする、請求項２に記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
前記充填剤のイオン交換基がスルホン酸基であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用の充填剤に関し、特に、強度の低下を招くことなく親水性が高められたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換液体クロマトグラフィー法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分離分析に極めて有効な方法である。これまで、イオン交換液体クロマトグラフィー法に用いられる充填剤としては、シリカ系化合物からなる基剤にイオン交換基を導入したもの、有機合成高分子からなる架橋性粒子にイオン交換基含有化合物を反応して得られたもの（特許文献１）、あるいは架橋性単量体とイオン交換基含有化合物とを反応させて得られたもの（特許文献２、特許文献３など）などが知られている。
【０００３】
上記充填剤において、イオン交換基以外の基剤部分は、膨潤や収縮を避けるために、より強く、架橋された粒子であることが望ましい。しかしながら、強度を高めようとすると、親水性が低下し、疎水性物質の非特異吸着を引き起し、測定精度が低下するという問題があった。
【０００４】
他方、疎水性物質の非特異吸着を抑制するために、親水性の単量体を多く含有させることなどにより、親水性を高めると、上述したように膨潤や収縮が生じがちとなり、強度が低下する。従って、高流速下における分析ができなくなったり、複数の溶離液を用いた場合の平衡化が遅れたりし、測定の遅延を招くという問題があった。
【０００５】
他方、上記のような問題を解決する方法として、下記の特許文献４には、イオン交換基を有する充填剤表面に親水基を有する化合物を吸着させる方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献４に記載の方法においては、吸着された化合物の充填剤表面への吸着力が弱い場合、初期状態では十分な性能を維持できたとしても、長期間使用するうちに、充填剤表面から化合物が脱離し、保持時間や測定値が変動するという問題があった。
【特許文献１】特開平１−２６２４６８号公報
【特許文献２】特公昭６３−５９４６３号公報
【特許文献３】特公平８−７１９７号公報
【特許文献４】特開２００１−９１５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、上述した従来技術の問題点に鑑み、強度を低下させることなく、親水性を高めることができ、かつ蛋白質などが非特異的に吸着するのを抑制することができ、測定精度を高めることができ、さらに長期間にわたり性能を維持することを可能とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、イオン交換基を有する充填剤表面に親水基を有する複数種の化合物を吸着させたことを特徴とするイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤である。
【０００９】
本発明に係るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、好ましくは、親水基を有する複数種の化合物の内、少なくとも１種類の化合物の等電点が４．６以下であり、か
つ少なくとも１種類の他の化合物の等電点が４．７以上である。
【００１０】
本発明に係るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、より好ましくは、等電点が４．６以下の親水基を有する少なくとも１種類の前記化合物が親水基を有する複数種の化合物の総重量中１０重量％以上の割合で、かつ等電点が４．７以上の少なくとも１種類の他の化合物が親水基を有する複数種の化合物の総重量中１０重量％以上の割合で用いられている。
【００１１】
本発明に係るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、好ましくは、上記充填剤のイオン交換基がスルホン酸基である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤では、充填剤表面に、親水基を有する２種類以上の化合物が吸着されているので、充填剤強度を低下させることなく、親水性を高めることができる。また、測定対象物、特に蛋白質または試料中の夾雑物質などの非特異吸着を抑制することができ、かつ性能を長期間にわたり維持することができる。
【００１３】
親水基を有する２種類以上の化合物の内、少なくとも１種類の化合物の等電点が４．６以下であり、かつ少なくとも１種類の他の化合物の等電点が４．７以上である場合には、性能をより長期間にわたり維持することができる。
【００１４】
さらに、親水基を有する複数種の化合物の総重量のうち、少なくとも１種類の等電点が４．６以下の親水基を有する化合物の使用割合が１０重量％以上であり、かつ等電点が４．７以上の他の少なくとも１種類の親水基を有する化合物の使用割合が１０重量％以上である場合には、性能をさらに長期間にわたり維持することができる。
【００１５】
また、充填剤のイオン交換基がスルホン酸基である場合にも、性能をより長期間にわたり維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において、充填剤はイオン交換液体クロマトグラフィー用として用いられる充填剤であれば特に限定されず、陽イオン交換基を有するものであってもよく、陰イオン交換基を有するものであってもよい。
【００１７】
陽イオン交換基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられ、陰イオン交換基としては、例えば、３級もしくは４級アミノ基などが挙げられる。
【００１８】
上記充填剤は、少なくとも１種類のイオン交換基を有するものであればよく、本発明においては、公知のイオン交換基を有する充填剤を用いることができる。但し、特に好ましくは、スルホン酸基を有する充填剤が用いられ、それによって性能をより長期間にわたり維持することができる。
【００１９】
上記イオン交換基を有する充填剤の調製方法は特に限定されず、例えば、充填剤となる粒子にイオン交換基を導入する方法、あるいはイオン交換基を有する単量体を重合して充填剤となる粒子にする方法などを用いることができる。
【００２０】
上記粒子としては、例えば、シリカ、ジルコニアなどの無機系粒子や高分子粒子などの有機系粒子が挙げられ、高分子粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサンなど
の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステルなどの合成高分子粒子などを挙げることができる。中でも、合成高分子粒子を用いる場合には、耐圧性及び耐膨潤性を高めるために、架橋度の高い合成高分子粒子を用いることが望ましい。
【００２１】
粒子にイオン交換基を導入する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。高分子粒子の場合では、例えば、官能基を有する高分子粒子を調製した後、その後官能基にイオン交換基を有する化合物を化学反応によって導入する方法、または、イオン交換基を有する単量体と、架橋性単量体とを混合し、重合開始剤の存在下で重合し、粒子とする方法などが用いることがきる。また、特公平８−７１９７号公報に記載のように、架橋性重合体粒子を調製した後、イオン交換基を有する単量体を添加し、重合体粒子の表面付近にイオン交換基を有する単量体を重合させる方法を用いてもよい。また、（メタ）アクリル酸メチルや（メタ）アクリル酸エチルなどの重合性エステル化合物を架橋性単量体などと混合し、重合開始剤の存在下で重合した後、得られた粒子を加水分解処理し、エステル化合物を陽イオン交換基に変換させてもよい。
【００２２】
本発明で用いられる充填剤は粒子状であり、その平均粒径（直径）は、０．１〜２０μｍであることが好ましい。また、粒度分布は、ＣＶ値（標準偏差÷平均粒径×１００）で４０％以下が好ましく、１５％以下がより好ましい。平均粒径が０．１μｍ未満では、カラム内が高圧になり過ぎ、分離不良を起こすことがあり、２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎ、分離不良を起こすことがあり、また、ＣＶ値が４０％を超えても、カラム内のデッドボリュームが大きくなり過ぎ、分離不良を起こすことがある。
【００２３】
本発明において、「充填剤表面に親水基を有する化合物を吸着させる」とは、上記イオン交換基を有する充填剤について、下記の（１）〜（４）の方法の内、少なくとも１つの方法を施すことを意味する。すなわち、（１）〜（４）の処理は、適宜、２つ以上組み合わされてもよい。
【００２４】
（１）スラリー調製時における親水化処理
イオン交換基を有する充填剤に、０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％の親水基を有する化合物を分散媒に溶解させたものを添加し、０．５時間以上、好ましくは１時間以上攪拌する。
【００２５】
（２）充填時における親水化処理
充填液中に０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％の親水基を有する化合物を溶解させてカラム本体に充填を行う。充填後、０．５時間以上、好ましくは１時間以上放置する。
【００２６】
（３）充填後のカラムに親水基を含有する化合物の溶液を通液させることによる親水化処理
イオン交換基を有する充填剤を充填したカラムに０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％の親水基を有する化合物を溶解させた溶液を流速０．０１〜１０ｍＬ／分、好ましく０．１〜５ｍＬ／分で１分以上通液させ、通液後、０．５時間以上、好ましくは１時間以上放置する。
【００２７】
（４）充填後のカラムに親水基を有する化合物の溶液を注入させることによる親水化処理
イオン交換基を有する充填剤を充填したカラムに０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％の親水基を有する化合物を溶解させた溶液を、注入量１〜１０００μＬ、好ましくは１０〜５００μＬ、流速０．０１〜１０ｍＬ／分、好ましくは０．１〜５ｍＬ
／分で注入させる。注入後、０．５時間以上、好ましくは１時間以上放置する。
【００２８】
上記（１）〜（４）の処理に際しては、処理温度は１５〜９０℃が好ましく、より好ましくは４０〜９０℃で攪拌し、或いは放置することが望ましい。
【００２９】
本発明により得られたイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤には、使用前に、測定に使用する最も溶出力の強い溶離液を、流速０．０１〜１０ｍＬ／分で１〜３００分間通液することが望ましい。
【００３０】
また、上記（１）の処理の場合には、上記（１）の処理後であって、カラムに充填する前に、測定に使用するもっとも溶出力の強い溶離液を、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤重量の０．５〜１００倍量添加し、１〜３００分間攪拌することが望ましい。
【００３１】
本発明において、上記充填剤表面に吸着される親水基を有する複数種の化合物とは、吸着により充填剤表面を親水化する化合物であれば特に限定されるものではないが、特に、アルブミン、グロブリン、カゼイン、フィチュイン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンなどの蛋白質、糖類またはノニオン系界面活性剤を用いることが好ましく、この内２種類以上が用いられることになる。
【００３２】
また、本発明においては、好ましくは、上記親水基を有する複数種の化合物の内、少なくとも１種類の化合物は等電点が４．６以下のものが用いられ、かつ少なくとも他の１種類の化合物は等電点が４．７以上のものが用いられる。ここで等電点とは、蛋白質のような両性電解質において分子全体の電荷が±０になるｐＨである。等電点が４．６以下の親水基を有する化合物としては、カゼインやフィツインなどが挙げられる。等電点が４．７以上の親水基を有する化合物としては、アルブミン、ヘモグロビン、グリブリン、フィブリノーゲンなどが挙げられる。
【００３３】
本発明においては、上記親水基を有する化合物を充填剤表面に吸着させることにより、充填剤表面が親水化される。すなわち、イオン交換基を有する充填剤表面の疎水性部分に、親水基を有する化合物が物理的あるいは化学的に吸着することにより、親水性が高められ、充填剤表面の疎水性部分と測定対象物（特に蛋白質）もしくは測定試料中の夾雑物質などとの非特異的吸着が抑制されると考えられる。
【００３４】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤により測定可能な物質は、特に限定されず、従来からイオン交換液体クロマトグラフィーで分離されている物質を挙げることができる。特に、本発明により提供されるイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、カテコールアミン誘導体、ヌクレオチド、ペプチド、蛋白質などの生体関連物質の分離に好適に用いられる。
【００３５】
本発明に係るイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤は、ステンレスなどからなるカラム本体に充填され、液体クロマトグラフィー用カラムを構成する。充填方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、湿式法（スラリー法）を用いる場合、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を溶離液に用いる溶媒などの分散媒に分散させ、カラム本体にパッカーなどを経由して圧入することにより充填することができる。
【００３６】
本発明のイオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによる分析において、使用する溶離液は特に限定されず、公知の溶離液を用いることができる。例えば、リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩等を含む各種緩衝液を用いること
ができる。また、溶離液には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノールもしくはエタノールなどの有機溶媒を添加してもよい。
【００３７】
次に、具体的な実施例及び比較例を挙げることにより本発明をより具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
〔実施例１〕
（充填剤の調製）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体Ａ：東京化成工業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体Ｂ：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５Ｌの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。これを窒素雰囲気下で攪拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄・分級して平均粒径８μｍの充填剤を得た。
【００３９】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）１０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００４０】
次に、０．１重量％ＢＳＡ（和光純薬社製、等電点４．９）と０．１重量％カゼイン（和光純薬社製、等電点４．６）を含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２０ｍＬ添加し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに攪拌した後、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、３０００ｒｐｍ×１０分の遠心操作を行った後、上清を除去し、次に３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を５ｍＬ添加した。再度３０００ｒｐｍ×１０分の遠心を行った後上清を除去した。次に、１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を３０ｍＬ添加し、ゆるやかに攪拌し、親水化処理された充填剤分散液を得た。この全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続してなるパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で充填剤を定圧充填した。
【００４１】
〔実施例２〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
【００４２】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）１０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００４３】
次に、０．１重量％ラクトフェリン（和光純薬社製、等電点７．２）と０．１重量％カゼイン（和光純薬社製、等電点４．６）とを含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）２０ｍＬ添加し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに攪拌した後、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、３０００ｒｐｍ×１０分の遠心を行った後上清を除去した。次に、そこに３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を５ｍＬ添加し、再度３０００ｒｐｍ×１０分の遠心を行った後、上清を除去した。次に、１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を３０ｍＬ添加し、ゆるやかに攪拌し、親水化された充填剤分散液を得た。この全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続してなるパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で充填剤を定圧充填した
。
【００４４】
〔実施例３〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
【００４５】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００４６】
次に、その全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。次に、上記カラム内に０．０５重量％ＢＳ
Ａ（和光純薬社製、等電点４．９）と０．０５重量％カゼイン（和光純薬社製、等電点４．６）を含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を、室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００４７】
その後、６０℃の恒温水槽中で１６８時間放置し、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、上記カラム内に３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。引き続き、上記カラム内に１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００４８】
〔実施例４〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
【００４９】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００５０】
次に、その全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続してなるパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。次に、上記カラム内に０．０５重量％
ラクトフェリン（和光純薬社製、等電点７．２）と０．０５重量％カゼイン（和光純薬社製、等電点４．６）を含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を、室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００５１】
その後、６０℃の恒温水槽中で１６８時間放置し、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、上記カラム内に３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。引き続き、上記カラム内に１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００５２】
〔比較例１〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤を用い、以下のようにして充填を行ったが、親水化処理は行わなかった。
【００５３】
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００５４】
次に、その全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続してなるパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。
【００５５】
〔比較例２〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
【００５６】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）１０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００５７】
次に、０．２重量％カゼイン（和光純薬社製、等電点４．６）を含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を２０ｍＬ添加し、８０℃の恒温水槽中で２４時間ゆるやかに攪拌した後、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、３０００ｒｐｍ×１０分の遠心により上清を除去し、そこに３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を５ｍＬ添加し、再度３０００ｒｐｍ×１０分の遠心により上清を除去した。そこへ１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を３０ｍＬ添加し、ゆるやかに攪拌した後、全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続してなるパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。
【００５８】
〔比較例３〕
（充填剤の調製）
実施例１と同じ充填剤について以下の親水化処理を施した。
【００５９】
（親水化処理）
上記充填剤０．７ｇを１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）３０ｍＬに分散させ、５分間超音波処理した後、よく攪拌した。
【００６０】
次に、その全量をステンレス製空カラム（直径４．６ｍｍ×長さ３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2で定圧充填した。次に、上記カラム内に０．１重量％フィツ
イン（和光純薬社製、等電点３．５）を含む１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を、室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００６１】
その後、６０℃の恒温水槽中で１６８時間放置し、恒温水槽から取出し、室温になるまで放置した。その後、上記カラム内に３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。引き続き、上記カラム内に１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）を室温において送液ポンプ（ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）により流速２ｍＬ／分で３０分間通液した。
【００６２】
（使用開始直後の同時再現性の評価）
グリコＨｂ（ヘモグロビン）コントロールレベル２（国際試薬社製）を２００μＬの注
射用水で溶解した後、希釈液（０．１重量％トリトンＸ−１００）を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として用い、以下の条件でヘモグロビンＡ１ｃの測定を１０回連続行い、同時再現性の比較を行った。再現性の評価は、Ａ１ｃ値とＡ１ｃ成分の保持時間を測定することにより行った。結果を下記の表１及び表２に示す。
【００６３】
測定条件
システム  ：  送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー：ＡＳＵ−４２０（積水化学工業社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液    ：  第１液：１７０ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
第２液：３００ｍ  ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）
溶出法    ：  ０〜３分は第１液を、３〜３．２分は第２液を、３．２〜４分は第１
液を流した。
流速      ：  １．０ｍＬ／分
検出波長  ：  ４１５ｎｍ
試料注入量：  １０μＬ
【００６４】
【表１】
2005227237.tif 000002
【００６５】
【表２】
2005227237.tif 000003
【００６６】
（実検体の負荷におけるカラム劣化による測定値の変動の評価（耐久性試験））
健常人血をＮａＦ採血し、溶血希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈したものを負荷検体とし、１日に３００検体を測定した。測定の前後でグリコＨｂコントロールレベル２（国際試薬社製）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを測定試料として、上述した測定条件に従ってヘモグロビンＡ１ｃの測定を１０回連続で行い、その平均値を測定値とした。本試験の評価は、Ａ１ｃ値（％）と、Ａ１ｃ成分の保持時間（秒）により行った。結果を下記の表３及び表４に示す。
【００６７】
【表３】
2005227237.tif 000004
【００６８】
【表４】
2005227237.tif 000005