(57)【要約】【課題】分裂酵母細胞中のクロマチン再編成因子であるSpSnf22に機能欠損を加えることにより、染色体組換え頻度を制御する新規方法を提供する。【解決手段】遺伝子操作が比較的容易な細胞を選択し、その細胞において組換えに関与すると思われるクロマチン再編成因子を同定し、該クロマチン再編成因子の機能を改変することによって、該細胞内での染色体の組換え頻度を制御する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の細胞中に存在するクロマチン再編成因子の活性を調節することにより、前記細胞の相同組換え頻度を制御する方法。
【請求項２】
前記真核生物が酵母であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が分裂酵母であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記相同組換えの生じる時期が細胞の減数分裂期であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記相同組換えが、染色体上の特定部位において、クロマチン再編成因子によるクロマチン再編成によって引き起こされるものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記染色体上の特定部位がｃＡＭＰ感応配列を含む組換えホットスポットを有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記クロマチン再編成因子の機能改変を行うことにより該クロマチン再編成因子の活性を促進又は抑制することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記クロマチン再編成因子の機能改変が、細胞内に内在するクロマチン再編成因子遺伝子中に突然変異、又は欠失を導入することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記欠失が、遺伝子の全体を破壊することである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマチン再編成因子がＳｐＳｎｆ２２であることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳｐＳｎｆ２２が、配列番号２で表されるタンパク質であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１に記載の方法により調製された真核生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には真核生物細胞における染色体組換え頻度を制御する技術に係り、より詳細には真核生物細胞中の染色体組換え頻度を制御する方法及び係る方法によって染色体組換え頻度が変化した真核生物細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物にとって染色体の組換えは、遺伝子の多様性を獲得し、その結果としてタンパク質の多様な活性を創出する上で最も重要なＤＮＡ代謝反応の一つである。従って、染色体の組換え頻度を制御することは、遺伝子の多様性又は安定性を獲得する上で、非常に重要な課題の一つである。
従来技術は、細胞内での組換えを活性化する系として、部位特異的組換え酵素Ｃｒｅ−ｌｏｘを用いた系（例えば、非特許文献１参照）、配列特異的エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩを用いた系（例えば、非特許文献２参照）などが存在する。Ｃｒｅ−ｌｏｘの系はバクテリオファージP1から得られた38kDaの部位特異的リコンビナーゼであるＣｒｅを用いて、ｌｏｘＰサイトと呼ばれる特定部位間で組換えを行わせるものである。また、I-SceIの系は、出芽酵母由来のエンドヌクレアーゼであるＩ−ＳｃｅＩが、その認識サイトにおいてＤＮＡ二重鎖を切断し、ＤＮＡ相同組換えを誘起する活性を利用したものである。しかしながら、これらの系では、組換えの調節に関わる配列をあらかじめ染色体に導入し、またＣｒｅあるいはＩ−ＳｃｅＩなどの組換え酵素を細胞内で発現する必要があり、染色体の組換えを誘導するのは容易ではなかった。
一方、組換え活性を抑制する方法等については、組換え酵素の機能を生体内で欠損させることにより理論上は達成されるが、組換え酵素はＤＮＡ複製又は修復など他の重要な生命現象においても必須な因子である場合が多く、該酵素の欠損は細胞死を誘導する可能性があり、組換えのみを抑制することは非常に困難であった。  
【０００３】
【非特許文献１】ＤｉＳａｎｔｏ等，  １９９５．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：３７７−３８１
【非特許文献２】Ｒｏｕｅｔ  等，  １９９４．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：６０６４−６０６８
【０００４】
以上に加えて、ヒトなどの真核生物の組換えの制御を困難にしている要因として、クロマチン構造の存在が挙げられる。真核生物の細胞内ＤＮＡはクロマチン構造と呼ばれる高度に凝縮した構造体として存在している。クロマチン構造は、ＤＮＡ代謝に関わる酵素群のＤＮＡへの接近を立体的に阻害することから、ＤＮＡ代謝に抑制的に作用する。従って、ＤＮＡ代謝の際にはその反応を効率良く行うため、クロマチン構造が再編成を受け、ＤＮＡが露出した環境が現出される必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑みて、所望の染色体の組換え頻度を制御する方法がないかについて鋭意研究した結果、意外にも、細胞内のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性を調節することで、相同組換え頻度を制御することが可能になることを見出した。
よって、本発明は、一般には、真核生物細胞中の染色体の相同組換え頻度を制御する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は上記方法によって染色体の相同組換え頻度が制御された真核生物細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
しかして、本発明においては、真核生物細胞中での染色体の相同組換え頻度を細胞内のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性を調節（促進又は抑制）することで、相同換え頻度を制御する方法が提供される。また、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性に加えて、ヒストンアセチル化酵素の活性も併せて調節（促進又は抑制）することで、相同組換え頻度を制御する方法が提供される。さらに、かかる方法によって相同組換え頻度が変化した真核生物細胞も提供される。
真核生物細胞のクロマチン構造の再編成を担う因子の代表として、本発明に係るＳｐＳｎｆ２２に代表されるＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子を挙げることができる。ＳｐＳｎｆ２２と非常に高い相同性のあるＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子Ｓｗｉ２／Ｓｎｆ２は、公知の機能としてクロマチン構造をとったＤＮＡからの転写を活性化又は抑制させることが知られている（Hirschhorn等, 1992；Holstegte等, 1998.）。しかしながら、これまでのところＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性に変更を加えることで、細胞内における染色体組換え頻度を制御することに関し、示唆的な報告も存在していない。上述したように、染色体の相同組換え頻度を上昇又は低下させることは、生物の保有する遺伝情報の多様性を高めたり又は遺伝情報の安定的な維持を行う上で非常に有力な手段となり得る。従って、本明細書中に開示される発明を利用することで、産業上利用可能な、例えば、発酵、醸造等に使用し得る酵母菌等に代表される細胞株の遺伝的多様性の獲得、又は動物の胚性幹細胞株などを含む広範な細胞株の遺伝的相同組換えの調節・制御において多大なる成果が得られるものと考えられる。
【０００７】
本発明において使用できる真核生物細胞としては、遺伝子操作を行うことができるものであれば如何なるものでも使用可能であると思われるが、好適には遺伝子操作が比較的容易な酵母、さらに好適には分裂酵母が使用される。
本発明において使用できるＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子は実質的に活性を有し、その活性領域が明らかになるものであれば如何なるものも用いることが可能であると思われるが、好適にはＳｗｉ２／Ｓｎｆ２であり、さらに好適には分裂酵母のＳｗｉ２／Ｓｎｆ２ホモログであるＳｐＳｎｆ２２が用いられる。
本発明に係るＳｐＳｎｆ２２は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は、該アミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸に欠失、付加若しくは置換を含むアミノ酸配列からなり、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子としての活性を有するタンパク質のことである。
ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性を調節（促進又は抑制）する方法としては、当業者において周知である如何なる手段でも可能であると思われるが、好ましくは対象のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性部位をコードする遺伝子領域に変異を加えて、該因子の活性を促進又は抑制する方法、対象となるクロマチン再編成因子をコードする遺伝子の全体を欠損させる方法、対象となるクロマチン再編成因子の組換体を対象細胞内でさらに発現させて該細胞内におけるクロマチン再編成因子の活性を全体的に増強させる方法などが挙げられる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る真核生物細胞中における相同組換えを調節する方法によれば、所望の相同組換え頻度を実現することが可能である。また、本発明は、上記項目〔０００２〕〜〔０００３〕に記載の既存手法とは異なり、染色体およびクロマチン構造の局所的な変化を誘導して組換えを制御しようとするものであり、事前の染色体ＤＮＡの加工や細胞生育への致死効果を考慮せずに実施することが可能になる。
従って、本明細書中に開示される発明を利用することで、産業上利用可能な、例えば、発酵、醸造等に使用し得る酵母菌等に代表される細胞株の遺伝的多様性の獲得、又は動物の胚性幹細胞株などを含む広範な細胞株の遺伝的相同組換えの調節・制御において多大なる成果が得られるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＳｐＳｎｆ２２の機能欠損による相同組換え頻度を低下させる方法は、本発明に係る相同組換えの調節方法を一部に使用するものであるので、以下に詳細に説明する。
本発明に係る相同組換え頻度を低下させる方法においては、遺伝子操作が比較的容易な細胞を選択し、その細胞において組換えに関与すると思われるＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子を同定し、該ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の機能を改変することによって、該細胞内での染色体の相同組換え頻度を制御する。
よって、以下では染色体組換えを調節する細胞の選択、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の遺伝子クローニング、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の発現及び精製、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の機能改変、対象の遺伝子座におけるクロマチンの構造解析及び組換え活性の測定方法等について順に説明する。
【００１０】
１．相同組換えを調節する細胞の選択：
本発明における「真核生物細胞」とは、染色体の相同組換えがある程度の頻度で生じているものを指し、宿主動物として好ましくは、ゲノム構造が既知で遺伝子操作が可能な、酵母、ショウジョウバエ、線虫、ニワトリの細胞、もしくはマウス、ヒトなどの幹細胞などであり、より好ましくは酵母、最も好ましくは分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)である。
【００１１】
２．遺伝子クローニング：
本発明においては、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の遺伝子に機能改変を導入するために、対象とする真核生物細胞由来のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の遺伝子を同定する。ここで、「ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子」とは、ＡＴＰの加水分解によって生じるエネルギーを利用し、クロマチンの構造変化を誘起し、その結果、転写活性化等において機能すると考えられている因子のことであり、例えば、哺乳類のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の主要構成因子であるＢＲＧ１又はＢｒｍ、ショウジョウバエのＩＳＷＩ複合体の主要構成因子であるＡｃｆ１、出芽酵母のＳｗｉ２／Ｓｎｆ２、分裂酵母のＳｐＳｎｆ２２などであり、好適には出芽酵母のＳｗｉ２／Ｓｎｆ２、分裂酵母のＳｐＳｎｆ２２であり、最も好適には分裂酵母のＳｐＳｎｆ２２である。すでに、該ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子をコードする遺伝子が同定され、遺伝子配列が公知の場合はその配列に基づいて適切なプローブ又はＰＣＲ用のプライマーを作製し、対象の細胞由来のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡに対しスクリーニングを行う。
【００１２】
また、対象とする細胞由来のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の遺伝子配列が公知でない場合は、公知の他の種、例えば、出芽酵母、ヒトなどのＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子配列を基にして、対象とする細胞由来のホモログを同定するために、対象細胞のｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行い、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の方法を用いて、低い、中程度又は高い緊縮性のハイブリダイゼーションにより得ることができる。ハイブダイゼーションの「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。当業者であれば、ホモログを同定するためのハイブリダイゼーションスクリーニングを行うにあたり、プローブの長さなどを考慮して、温度、イオン強度等を如何に調節するか容易に理解することができる。
さらに、対象とする細胞由来のＯＲＦのデーターベースが存在する場合には、該データーベースに対してＢＬＡＳＴサーチ等を行い既知のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子に対するホモログを同定することも可能である。この場合、検索された配列に基づいて該当する遺伝子全体を増幅するために適当なＰＣＲ用のプライマーを作製し、得られたＰＣＲ産物を適当なクローニング用のベクターに挿入することによって、目的のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子をクローン化させることも可能である。
同定されたＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子は適当なクローニング用ベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）にサブクローニングして配列確認を行う。
【００１３】
３．クローニングした遺伝子産物の発現及び精製：
（i）形質転換宿主細胞の作出
本発明に係るＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子又はその変異体の活性をインビトロで確認し、作製した変異体核酸を用いて、対象細胞のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子変異体株を作出することもできる。単離したＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子又はその変異体の発現に適した宿主細胞は、限定はしないが、原核生物では、大腸菌（E.coli）、バチラス・ズブチリス（B.subtilis）等、酵母では、サッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（S.pombe）等、動物細胞では胚性幹細胞、COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、等、昆虫細胞ではＳｆ９、Ｓｆ２１細胞などが含まれる。
大腸菌内で発現させる場合に利用可能なプロモーターには、限定はしないが、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、及びＴ７プロモーターなどが利用される。
また、酵母内で発現させる場合に利用可能なプロモーターには、限定はしないが、ｇａｌ１プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが含まれる。
動物細胞内で発現させる場合に利用可能なプロモーターには、限定はしないが、ＳＶ４０プロモーター、ヒト・サイトメガロウィルス初期（ＣＭＶＩＥ）プロモーター、ＬＴＲプロモーターなどが含まれる。
各宿主細胞へ発現ベクターの導入法は、当業者にとって周知の方法であれば如何なる方法でも可能である。例えば、大腸菌内で発現させる場合は、カルシウムイオン法（Cohen等, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等、酵母内で発現させる場合は、酢酸リチウム法（Ito等, 1983）、スフェロプラスト法（Hinnen等, 1978）、エレクトロポレーション法（Becker等, 1990）等、動物細胞内又は昆虫細胞内で発現させる場合は、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama, 1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が利用可能である。
【００１４】
（ii）宿主細胞の培養
本発明に係るＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子又はその変異体タンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から単離することができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
大腸菌を宿主にした形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、単離するタンパク質の性質に応じて、１７℃から３７℃の至適な温度を用い、６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは６．５〜７．５に維持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
酵母を宿主にした形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３０℃で、６〜２４時間行う。培養に用いる培地は用いた発現ベクターに応じて適宜選択する。例えば、栄養要求性マーカーにより選択される発現プラスミドを用いる場合は、該当する栄養素を除いた培地を用いる。また、薬剤耐性マーカーにより選択される発現プラスミドを用いる場合は、該当する薬剤を培地に加えてもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００１５】
（iii）発現タンパク質の単離
本発明に係るＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子又はその変異体タンパク質が、宿主細胞の菌体内又は細胞内に生産される場合には、培養後、宿主細胞を遠心分離等により収集し、細胞塊を超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理、特に酵母を用いる場合はグラスビーズ処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、本発明のＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子又はその変異体タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００１６】
４．ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の遺伝子機能の改変：
本発明は、細胞に内在するＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の活性を調節することにより、染色体組換え頻度を制御するものである。そのために、細胞に内在するＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の機能を改変することができる。該機能を改変する方法としては、限定はしないが、例えば、内在するＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子に突然変異を導入する方法、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子を破壊する方法、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の組換体を細胞内に過剰に発現させて該因子の活性を全体的に増強させる方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。
また、遺伝子機能の喪失の目的には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することも可能である。この場合、当該ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子の機能ドメインに関する塩基配列をもとに、短いＲＮＡ二本鎖もしくは同等なＲＮＡを産生するベクターを細胞内に導入することで、当該因子の機能喪失をもたらすことができる。
好ましくは、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子に突然変異を導入する方法、又はＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子に突然変異を導入する方法であり、最も好ましくは、ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子遺伝子を破壊する方法である。
遺伝子を破壊する方法にはクローン化した標的遺伝子の必須領域にマーカー遺伝子を挿入したＤＮＡを細胞に形質転換する方法がある。細胞内に導入されたＤＮＡは標的遺伝子の両隣接配列を介した相同組換えを誘発し染色体上の標的遺伝子をマーカー遺伝子により破壊することができる(Alfa等, 1993)。
また、インビトロおいて突然変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異導入法、及びＰＣＲ突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異導入法（Carter, 1986；Zoller及びSmith, 1987）、カセット突然変異導入法、限定的選択突然変異導入法（Wells等, 1985）又は他の既知の技術は、IFI206変異DNAを生産するために、クローン化されたＤＮＡ上で実施することができる（Ausbel等, 1987；Sambrook, 1989）。
ＡＴＰ依存型クロマチン再編成因子に突然変異を導入することで機能改変を行う場合、クロマチン再編成因子活性を欠失させるように変異を導入すること、又はクロマチン再編成を行う上で他の因子と相互作用を行うのに必要な部位に変異を導入し該相互作用を消失させるような変異を導入することなどが望ましい。
【００１７】
５．クロマチン構造解析
染色体全域又は特定の領域におけるクロマチン構造を解析するために、当業者にとって既知の方法を用いることができる。例えば、限定はしないが、解析対象である領域におけるＤＮａｓｅ感受性を指標として検出するのが一般的である。目的の領域のクロマチン構造が弛緩すると、その部分におけるＤＮＡ及びクロマチン構成タンパク質（ヒストン等）間の結合に緩みが生じると考えられる。その結果、クロマチン構成タンパク質と結合していたためにＤＮａｓｅにより切断されなかったＤＮＡ部分が、クロマチン構造の弛緩により露出されることで、ＤＮａｓｅに対して感受性を示すようになる。クロマチン構造の変化の前後における、ＤＮａｓｅに対する感受性の変化は、当該領域のＤＮＡ切断パターンを変化させることとなり、新たに生じたＤＮＡ断片をサザンブロット法等で検出することで、クロマチン構造が弛緩又は堅固になった遺伝子座領域を確認することができる。ここで、ＤＮａｓｅとしては、ＤＮａｓｅＩ、ＭＮａｓｅ（球菌ヌクレアーゼ）などが一般的に用いられる。
ここで、「特定の領域」とは、ＳｐＳｎｆ２２によるクロマチン構造の再編成に応答して組換え反応が誘起されやすい領域を意味し、例えば、ｃＡＭＰ感応配列、Ａｔｆ１−Ｐｃｒ１結合領域、等を含む領域であって、組換えスポットを有することを特徴とする染色体領域である。好適には、ｃＡＭＰ感応配列であって組換えホットスポットを有することを特徴とする染色体領域である。ハイブリダイズ化したバンドの定量は当該技術において既知の方法を用いて行うことができる。「組換えホットスポット」とは染色体の組換えが比較的高い確率で生じる部位を意味する。
【００１８】
６．組換え活性の測定
組換え活性の測定は、当業者が通常行う測定方法であれば如何なるものでも利用可能である。限定はしないが、例えば、（１）適当な二倍体細胞をＰＭ培地（０．３％  フタル酸水素カリウム，  ０．１８％  Ｎａ２ＨＰＯ４，  ０．５％  ＮＨ４Ｃｌ，  ２％  グルコース，    ２％  Ｓａｌｔ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （５．２６％  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．１４６％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ５％  ＫＣｌ，  ０．２％  Ｎａ２ＳＯ４）中で５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  以上の濃度になるまで培養し、これをＰＭ−Ｎ培地（０．３％  フタル酸水素カリウム，  ０．１８％  Ｎａ２ＨＰＯ４，  １％  グルコース，  ２％  Ｓａｌｔ  Ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ０．０１％  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，  ０．１％  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に移し、さらに２４時間培養する。その後、培養液の一部をＧｌｕｓｕｌａｓｅ  （商品名、ＮＥＮ）と３０％エタノールで処理し、胞子以外の細胞を完全に殺す。胞子濃度を計測した後、適当に希釈して完全培地、アデニンを欠く選択培地にプレーティングし、両培地上で形成したコロニー数の比から組換え率を算出する。又は、（２）掛け合わせる一倍体細胞どうしをＳＰＡプレート上にて混合し３０℃で３日間保温する。その後細胞塊を滅菌水に懸濁したあと、Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ  で処理する。胞子濃度を計測した後、適当に希釈して完全培地、アデニンを欠く選択培地にプレーティングし、両培地上で形成したコロニー数の比から組換え率を算出する。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２０】
１．分裂酵母ｓｎｆ２２＋遺伝子破壊株の作製
出芽酵母のＳｗｉ２／Ｓｎｆ２タンパクのアミノ酸配列を用いて、分裂酵母ゲノムから翻訳したＯＲＦに対してＢＬＡＳＴサーチを行った。最も相同性の高いＯＲＦは、ＳＰＡＣ１２５０．０１とＳＰＣＣ８３０．０１ｃであった。いずれも、Ｓｗｉ２／Ｓｎｆ２タンパクのＡＴＰａｓｅドメインとブロモドメインに対して非常に高い相同性を有しているので（図１）、それぞれ、ｓｎｆ２１＋とｓｎｆ２２＋（配列番号１，配列番号２）と名付けた。ｓｎｆ２１＋遺伝子破壊株は生育不能であったため、ｓｎｆ２２＋遺伝子破壊株について解析を行った。ｓｎｆ２２＋遺伝子破壊株の作製法は以下のとおりである。
分裂酵母ゲノムＤＮＡを鋳型として、８３０−Ｎ１合成ＤＮＡプライマー（５’−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣ−３’）（配列番号３）および８３０−Ｎ２プライマー（５’−ＡＴＣＡＡＣＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＴＣＧ−３’）（配列番号４）とＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用いてＰＣＲ法によりｓｎｆ２２＋遺伝子の５’領域部分を増幅した。これをＸｈｏ  ＩとＴａｑ  Ｉで切断し、その６４２ｂｐ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）のＸｈｏ  Ｉ−Ａｃｃ  Ｉ部位にクローニングした。これをＬ５とする。これを鋳型にＬ５−１Ｆプライマー（５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＧ−３’）（配列番号５）およびＬ５−１Ｒプライマー（５’−  ＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号６）を用いてＰＣＲ法によりｓｎｆ２２＋遺伝子の５’領域部分両端にＸｈｏ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を付加した。これをＬ５Ｂとする。
同様にして８３０−Ｃ１プライマー（５’−ＣＡＴＧＣＴＴＡＧＴＡＣＴＣＧＴＧＣＴＧＧ−３’）（配列番号７）および８３０−Ｃ２プライマー（５’−ＡＡＴＴＡＴＣＧＴＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＣ−３’）（配列番号８）を用いてｓｎｆ２２＋遺伝子の３’領域部分を増幅した。その増幅断片をＭｕｎ  ＩとＢｃｌ  Ｉで切断し、その６９０ｂｐ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）のＥｃｏ  ＲＩ−Ｂａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。これをＬ６とする。
Ｌ５ＢをＸｈｏ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、その６５０ｂｐ断片をＬ６のＸｈｏ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入した。これをＬ１３とする。Ｌ１３のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に分裂酵母のｕｒａ４＋遺伝子を挿入した。これをＭｕｎ  ＩとＥｃｏ  ＲＩで切断したものをターゲッティングコンストラクトとし、これを用いて分裂酵母二倍体細胞を形質転換した。得られた形質転換体を胞子形成させ、そこからウラシル非要求性一倍体のコロニーを選択した。得られたコロニーのゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット解析し正しくｓｎｆ２２＋遺伝子が破壊されている株を選択した。その後、互いに異なる接合型を持つ一倍体ｓｎｆ２２＋遺伝子破壊株を接合させ二倍体細胞を作製し、減数分裂期組換え頻度の測定とクロマチン構造解析に用いた。
【００２１】
２．分裂酵母ｓｎｆ２２＋及びｇｃｎ５＋遺伝子二重破壊株の作製
上述した方法により作成したｓｎｆ２２＋破壊株を用いて、ｇｃｎ５＋も欠損した二重破壊株を作製した。ｇｃｎ５＋遺伝子の核酸配列及び予想されるアミノ酸配列は、各々、配列番号３及び配列番号４として示した。
以下の要領でターゲティングコンストラクトを構築した。分裂酵母染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｇ５ＮＦプライマー（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧ−３’）（配列番号９）および  Ｇ５ＮＲプライマー（５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＣＧＣＧ−３’）（配列番号１０）を用いてＰＣＲによりｇｃｎ５＋遺伝子の５’領域部分を増幅した。同様にしてＧ５ＣＦプライマー（５’−ＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＣＡＧＧＡＴＣＡＣＴＣＧＧＴＣＧＡ−３’）（配列番号１１）およびＧ５ＣＲプライマー（５’−ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＧＣＡＡＣＣＧ−３’）（配列番号１２）を用いてｇｃｎ５＋遺伝子の３’領域部分を増幅した。つづいて、同一のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  （＋）  のＢａｍＨ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉサイト、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイト、Ｃｌａ  Ｉ−ＸｈｏＩサイトにそれぞれｇｃｎ５＋遺伝子５’領域部分、ｕｒａ４  ＋  遺伝子カセット、ｇｃｎ５＋遺伝子３’領域部分をサブクローニングした。このプラスミドをＮｃｏＩおよびＡａｔ  ＩＩで切断したものをターゲティングコンストラクトとし、分裂酵母半数体細胞にトランスフォーメーションした。得られたトランスフォーマントからＰＣＲおよびサザンブロット解析により、正しくｇｃｎ５＋遺伝子が破壊された株を選択した。その後、互いに異なる接合型（ｈ＋とｈ−）  を持つｇｃｎ５＋遺伝子破壊株を接合させ２倍体細胞を作製し、以下の解析を行った。
【００２２】
３．分裂酵母ａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座周辺のクロマチン構造解析
クロマチン構造解析は、以下の方法に従って解析した （Mizuno等, 1997.）。
３−１．菌体の準備
酵母細胞をＰＭ培地で１−２×１０７細胞／ｍｌ  になるまで培養し、その半分を滅菌水で洗浄後、液体窒素で凍結、−８０℃にて保存した。残りの半分の細胞は、滅菌水で洗浄後ＰＭ−Ｎ培地に移し、指定した時間、培養を続けた。その後、菌体を回収、洗浄し、液体窒素で凍結したあと、−８０℃にて保存した。
３−２．菌体からのクロマチン画分の単離と球菌ヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）消化
凍結した菌体に菌体１ｇあたり２ｍｌのプレインキュベーションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），  ０．７Ｍβ−メルカプトエタノール，  ３ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて解凍し、１０分間３０℃で激しく震盪した。続いて、１Ｍ  ソルビトールで洗浄し、菌体１ｇあたり２．５ｍｌのザイモリエースを含まないザイモリエース溶液（３７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５），  ０．７５Ｍ  ソルビトール，  １．２５％  グルコース，  ６．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に完全に懸濁した。その後、０．２５％  ザイモリエースを含むザイモリエース溶液を加え５分間、３０℃に保温し細胞をスフェロプラスト化した。スフェロプラストを１Ｍ  ソルビトールで洗浄したあと、菌体１ｇあたり７ｍｌのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  １０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １８％フィコール４００）に完全に懸濁し２０，０００ｇで３０分間遠心した。沈澱を菌体１ｇあたり８ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ａ  （１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０），  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５ｍＭ  ＫＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、これをクロマチン画分とした。
クロマチンのＭＮａｓｅ消化は１サンプルに対し、４種類の異なった濃度のＭＮａｓｅを反応させて行った。クロマチン画分１ｍｌに１Ｍ  ＣａＣｌ２を５μｌ（最終濃度５ｍＭ）加えてから、それぞれ０，  ２０，  ３０，  ５０Ｕ／ｍｌ  の濃度になるようＭＮａｓｅを添加した。３７℃で５分間保温したあと、最終濃度２０ｍＭになるようにＥＤＴＡを加えて反応を終了させた。その後ＳＤＳ（最終濃度１％）、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  （最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を加えて、５０℃で２時間保温し、蛋白質を分解した。続いて、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱にてＤＮＡを精製した。
【００２３】
３−３．間接末端標識法
上記で調製したＤＮＡを制限酵素で完全に切断したあと、１．２％アガロースゲル電気泳動にて展開した。泳動後のゲルからＤＮＡを、変性バッファー（０．５Ｍ  ＮａＯＨ，  １．５Ｍ  ＮａＣｌ  ）、  トランスファーバッファー  （０．２５Ｍ  ＮａＯＨ，  １．５Ｍ  ＮａＣｌ）  を用いてバキュームブロッターによりナイロンメンブレンにサザントランスファーした。
トランスファー後、メンブレンを２×ＳＳＣで中和し、ＣｈｕｒｃｈとＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｃｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ，  １９８４．）に従い、以下のようにサザンハイブリダイゼーションを行った。まず、メンブレンをハイブリダイゼーションバッファー（１％  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ），  ０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  （ｐＨ７．３），  ７％  ＳＤＳ，  １ｍＭＥＤＴＡ）中で、６２℃で１時間インキュベートしプレハイブリダイゼーションを行った。続いて、ハイブリダイゼーションバッファーを交換し、ランダムプライム法により３２Ｐで標識したプローブを加え、６２℃で１８時間以上インキュベートした。なお、プローブとしてａｄｅ６−Ｍ２６周辺を解析する際はプローブＢ  （ａｄｅ６  ＯＲＦ中２１０２塩基目のグアニンから２３４５塩基目のグアニンまでに相当する配列を持つ配列）を使用した。
ハイブリダイゼーション後、洗浄バッファー（４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  （ｐＨ７．３），  １％  ＳＤＳ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄したメンブレンを、イメージングプレートに感光させ、ＢＡＳ２０００あるいはＢＡＳ２５００（ともにＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）イメージアナライザーをもちいて、メンブレン上の放射活性を２次元画像データに変換した。さらに、メンブレンをＸ線フィルムに感光させオートラジオグラフィーを作製した。
【００２４】
上記の方法により、組換えホットスポットを有するａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座を保持する野生株、ｓｎｆ２２遺伝子破壊株＋、ｓｎｆ２２＋及びｇｃｎ５＋二重遺伝子破壊株から、減数分裂誘導０、３、６時間後のクロマチン画分を単離し、各画分をＭＮａｓｅで部分消化した後、ＤＮＡを精製し制限酵素Ｘｈｏ  Ｉで切断した。切断したＤＮＡ断片について、サザンハイブリダイゼーション解析を行い、クロマチン構造の変化について検討を行った。コントロールには減数分裂期にはクロマチン構造が変化しないａｄｅ６−Ｍ３７５遺伝子座のクロマチン画分を用いた。通常、野生型の体細胞分裂期では、ａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座のヌクレオソームの配置が周期的に整列されている。これに対し、ａｄｅ６−Ｍ２６を有する野生型株においては、減数分裂へと進行するに伴い、ａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座のクロマチン構造が不安定化し、ヌクレオソームの配置が変動する。
結果を図２に示す。野生型ではＭ２６部位の周辺にヌクレアーゼ感受性部位に対応するバンドが減数分裂期３時間で出現するが（図２、野生型）、変異体では断片のパターンに変化がないことが明らかとなった（図２、ｓｎｆ２２Δ，  ｓｎｆ２２Δｇｃｎ５Δ）。また、組換えホットスポットを有するａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座以外の領域における相同組換えの抑制は、部分的には認められるが、Ｍ２６部位における効果に比べると小規模に限定された（図４Ａ及びＢ）。
【００２５】
４．ａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座での組換え活性の測定
ランダムスポア処理によりａｄｅ６−Ｍ２６でのホットスポット活性を測定した。
互いに異なる接合型を持つ一倍体細胞を接合培地中で混合し３日間培養した。その後、細胞塊の一部をＧｌｕｓｕｌａｓｅ  （ＮＥＮ）で処理し、胞子以外の細胞を完全に殺した。胞子濃度を計測した後、適当に希釈して完全培地、アデニンを欠く選択培地にプレーティングした。両培地上で形成したコロニー数の比から組換え率を算出した。
組換え頻度はａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座を持つ一倍体細胞（アデニン要求性）とａｄｅ６−４６９遺伝子座（アデニン要求性）を持つ一倍体細胞を掛け合わせ、アデニン非要求性の胞子の出現頻度を数えることで計測した。なお、コントロールとして減数分裂期にも組換え頻度が上昇しないａｄｅ６−Ｍ３７５遺伝子座を用いた。
ｓｎｆ２２＋破壊株のａｄｅ６−Ｍ２６周辺での組換え頻度を計測したところ、体細胞分裂期組換えは野生株と変化なかったものの、減数分裂期におけるａｄｅ６−Ｍ２６周辺での組換え頻度は野生株のそれの１／６程度に低下していた（表１及び図３）。さらに、ｓｎｆ２２＋及びｇｃｎ５＋二重破壊株のａｄｅ６−Ｍ２６周辺での組換え頻度は、やはり野生型株の１／６程度のレベルにまで抑制されたことが分かった（表１及び図３）。
【００２６】
表１．ｓｎｆ２２＋及び／又はｇｃｎ５＋伝子破壊のａｄｅ６−Ｍ２６遺伝子座周辺での組換え頻度への影響
【表１】
2005198548.tif 000002
【００２７】
この結果から、クロマチン再編成因子であるＳｐＳｎｆ２２を単独で破壊した株、及びＳｐＳｎｆ２２とヒストンアセチル化酵素であるｇｃｎ５＋をあわせて破壊した株においては、特定領域の組換え頻度を特異的に抑制させることが可能になることが分かる。一方で、これらの遺伝子（ｓｎｆ２２＋、ｇｃｎ５＋）機能を大量発現などにより強化することで、相同組換え頻度を局所的に増大させることも可能になると考えられる。
【００２８】
参考文献
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Zoller及びSmith 1987. Methods. Enzymol. 154:329-350
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】出芽酵母ＳＷＩ２／ＳＮＦ２とｓｎｆ２２＋遺伝子（Ｓｐｓｎｆ２２＋）の比較を示す。ＳＮＦ２，  ヘリカーゼ，  ブロモドメインのアミノ酸配列の同一性を％で示している。
【図２】ｓｎｆ２２＋とｇｃｎ５＋の二重遺伝子破壊によるａｄｅ−Ｍ２６遺伝子座のクロマチン構造への影響を示す。レーン「ＤＮＡ」は、精製した染色体ＤＮＡをＭＮａｓｅで部分消化したものを示す。
【図３】各遺伝子破壊株のＭ２６部位における減数分裂期相同組換えへの効果を示す（表１に示した値をグラフ化したものである）。
【図４】ｇｃｎ５＋  ｓｎｆ２２＋遺伝子破壊株のａｄｅ６−Ｍ２６領域以外の染色体領域における減数分裂期相同組換えへの影響を示す。Ａは染色体領域がｌｙｓ７−ｌｅｕ２インターバルの場合、Ｂは染色体領域がｌｙｓ４−ａｄｅ１インターバルの場合を示す。縦軸は組換え頻度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005198548.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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