(57)【要約】【課題】工業的規模での簡便かつ安価なソルビンアルコールの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ベアウヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属に属する微生物が、優れたソルビンアルコール生成能を有することを見出した。本発明の微生物の菌体あるいはその処理物を用いることにより、簡便かつ効率的にソルビンアルコールを製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ベアウヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属またはヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属に属し、ソルビン酸またはその塩を還元してソルビンアルコールを生成する能力を有する微生物の菌体またはその処理物をソルビン酸またはその塩に作用させ、生成するソルビンアルコールを採取することを特徴とするソルビンアルコールの製造方法。
【請求項２】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項１に記載のソルビンアルコールの製造方法。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）
【請求項３】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項２に記載のソルビンアルコールの製造方法。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）ＩＦＯ  ３０６１８
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）ＩＦＯ    ３２３１１
ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ  ６０８７
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）ＩＦＯ  ５４３８
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ９１６５
【請求項４】
酵素活性を上昇させるインデューサー存在下で培養した微生物を用いる請求項１記載のソルビンアルコールの製造方法。
【請求項５】
インデューサーが６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸である請求項４記載のソルビンアルコールの製造方法。
【請求項６】
受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０として寄託されたベルチシリウム・エスピーＮＹ−１。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いたソルビンアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般にカルボキシル基の還元反応は強い吸エルゴン反応であり、水溶液中でのカルボン酸の還元は有機化学的手法では容易ではない。強力な還元剤である水素化リチウムアルミニウムは高価であり、工業的規模でのカルボキシル基の還元には不適当である。
一方、微生物を用いたカルボキシル基の還元は温和な方法であり、高価な還元剤を必要としない。ソルビン酸に関しては、媒体中、一酸化炭素および／または蟻酸塩の存在下において、微生物を用いてカルボキシル基を還元してソルビンアルコールを得る方法が知られている（特許文献１）。しかし、一酸化炭素および／または蟻酸塩が必要であること、煩雑なプロセスが必要であることから、更に十分な安全性・生産性を示すとは言えない。
以上に述べたように、工業的に実施可能なレベルでソルビンアルコールを製造する方法は未だ確立されていない。
【０００３】
【特許文献１】日本国特許第２６７２３１９号
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物の作用を利用した、ソルビン酸からソルビンアルコールを生成する方法の提供である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこれらの点に鑑み、ソルビン酸からソルビンアルコールを得るための生化学的方法を鋭意検討した。その結果、これまでカルボン酸からのアルコール生成活性が知られていなかったベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ベアウヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属微生物が、ソルビン酸を還元しソルビンアルコールを生成する能力に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のソルビンアルコールの製造方法に関する。
〔１〕ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ベアウヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属またはヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属に属し、ソルビン酸またはその塩を還元してソルビンアルコールを生成する能力を有する微生物の菌体またはその処理物をソルビン酸またはその塩に作用させ、生成するソルビンアルコールを採取することを特徴とするソルビンアルコールの製造方法。
〔２〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔１〕に記載のソルビンアルコールの製造方法。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）
〔３〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔２〕に記載のソルビンアルコールの製造方法。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）ＩＦＯ  ３０６１８
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）ＩＦＯ    ３２３１１
ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ  ６０８７
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）ＩＦＯ  ５４３８
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ９１６５
〔４〕酵素活性を上昇させるインデューサー存在下で培養した微生物を用いる〔１〕に記載のソルビンアルコールの製造方法。
〔５〕インデューサーが６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸である〔４〕に記載のソルビンアルコールの製造方法。
〔６〕受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０として寄託されたベルチシリウム・エスピーＮＹ−１。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ソルビンアルコール（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）は、下記式（１）で示される反応にしたがい、ソルビン酸（Ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）の還元によって得ることができるアルコールである。ソルビンアルコールは、下記式（１）で示される構造を有する、農薬あるいは医薬品等の原料として産業上有用な化合物である。
【式１】
2005021099.tif 000002
【０００８】
本発明で使用するソルビン酸を還元しソルビンアルコールを生成する能力を有する微生物は、以下に示す属に分類される微生物群から選択することができる。
ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属
ベアヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属
リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属
ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属
【０００９】
生化学的性状等に基づいて、微生物を分類する方法は公知である。更に上記属に属する微生物が目的とする活性を有していることは、たとえば実施例に示すような方法に基づいて確認することができる。すなわち、被験微生物をソルビン酸を含む培地で培養し、培養物に蓄積するソルビンアルコールを検出することによって、目的とする活性を有していることが確認される。ソルビンアルコールは高速液体クロマトグラフィーやＮＭＲなどの手法によって同定することができる。
【００１０】
本発明において、ソルビン酸に作用してソルビンアルコールを生成することができる微生物として、たとえば以下のような種を示すことができる。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）
【００１１】
土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からこれらの種を単離し同定する方法は公知である。たとえば細菌、真菌、およびカビの単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
細菌：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｈｏｌｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
酵母：Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ：Ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．  Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９８）．
カビ：”Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ”，  Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９６８）．  ”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  Ｆｕｎｇｉ”，  Ｋ．Ｈ．  Ｄｏｍｓｈ，  Ｗ．  Ｇａｍｓ，  Ｔ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）．
【００１２】
より具体的には、ソルビン酸を還元してソルビンアルコールを生成する微生物として以下の微生物菌株を示すことができる。これらの菌株は、それぞれのアクセション番号をもとに各セルバンクから入手することができる。
ベルチシリウム・プサリオタ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｓａｌｌｉｏｔａｅ）ＩＦＯ  ３０６１８
ベルチシリウム・レカニイ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｒｅｃａｎｉｉ）ＩＦＯ    ３２３１１
ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０
ベアヴェル・バサイアナ（Ｂｅａｕｖｅｒ  ｂａｓａｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８
ムコール・ヤバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ  ６０８７
リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｉｚａｅ）ＩＦＯ  ５４３８
ヒポクレア・ゲラチノサ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ９１６５
これらの微生物は、野生株、変異株、または、細胞融合、もしくは遺伝子操作などの遺伝子手法より誘導される組み換え株など、いずれの株も好適に用いることができる。
【００１３】
なお、ここに示した菌株のうち、ＩＦＯ番号の付された微生物は、財団法人・発酵研究所発行の微生物カタログ第１１版（２０００年）に記載されており、現在生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ）より入手することができる。
【００１４】
本発明に用いる微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限はない。例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能な任意の炭素原を使用することができる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、ソルビトール、グリセロールなどのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、トルエン、クレゾール、安息香酸などあるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００１５】
窒素源としては例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿素、などの無機有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、あるいは培地のｐＨ保持に有効な炭酸カルシウムなどの物質も添加できる。
【００１６】
更に微生物を培養する培地にインデューサーを添加することによって、酵素活性を上昇させることができる。インデューサーとして安息香酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、２−ナフトエ酸、２−メチルナフタレン、２−メチルキノリン、２−メチルキノザリン、３−メチルキノリン等の芳香族化合物が使用できる。なお、インデューサーは目的物の単離・生成の妨げにならない範囲で、還元反応中に存在しても差し支えない。
【００１７】
培養方法としては、培地ｐＨは３〜１１、好ましくは４〜８、培養温度は１５〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適した条件下５〜２４０時間、好ましくは１２〜１２０時間程度培養する。
【００１８】
基質であるソルビン酸またはその塩は酵素の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括あるいは間欠的に、あるいは連続して培養物に添加することができる。本発明において、基質は通常０．００１から１０％（ｗｔ／ｗｔ）程度添加する。基質は、そのまま水に溶解あるいは分散して添加することができる。あるいは基質を反応に影響を与えない有機溶媒に溶解したり、界面活性剤などに分散させて添加することもできる。微生物と基質とは、たとえば次のような方法で接触させることができる。
１）培地に最初から基質を添加しておき、培養する方法、
２）培養液をそのまま用い、該培養液にソルビン酸を添加する方法、
３）遠心分離などにより菌体を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、緩衝液、水などに再懸濁したものに、ソルビン酸を添加し、反応させる方法
【００１９】
本発明において、菌体は生菌体のままでもよいし、菌体の処理物を用いることもできる。本発明における菌体の処理物とは、凍結乾燥処理、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理的処理、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理、もしくは界面活性剤、トルエン、キシレン、又はアセトンなどの有機溶媒との接触処理などの化学的処理等を行った菌体を言う。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液や、それを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに公知の方法で固定化することもできる。更に微生物菌体と基質とが限外ろ過膜などを介して接触する構造を持つ反応容器中で両者を反応させることもできる。
【００２０】
菌体と基質は、５〜７０℃、望ましくは１５〜６０℃の温度で反応させる。反応ｐＨは酵素が反応する範囲で適宜選択することができる。反応時のｐＨを適切な範囲に維持するために、通常ｐＨ５〜１０、望ましくはｐＨ６〜９を与える緩衝液、あるいはｐＨスタットを用いることができる。反応は、静置、振とう、あるいは攪拌することができる。反応に用いる溶媒は通常水、あるいは水性溶媒である。反応液には、反応に影響を与えない範囲でアルコールなどの有機溶媒を加えることができる。
【００２１】
本発明によるソルビンアルコールの製法は、上記微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物をソルビン酸に作用させ、生成するソルビンアルコールを採取する工程を含むソルビンアルコールの製法である。上記微生物によって生成されたソルビンアルコールは限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽出、活性炭処理、晶析など通常の方法を組み合せることで回収し、更に精製することができる。
【００２２】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。以下の実施例に用いた微生物は、土壌から分離されたベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１である。ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１は、以下のとおり特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２３】
ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１の寄託：
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日    平成１５年７月２日
（ｃ）受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２０
【００２４】
ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１は、形態学的には三浦培地で生育したコロニーの直径が７ｃｍになる。コロニーは白色の綿毛状であり、分生子柄が、基底菌糸及び気生菌糸より直立に生成する。フィアライドは分生子柄から２−４本生じる。分生子形成はフィアロ型分生子である。分生子は両端が丸い円筒型であった。これらからＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属に属する糸状菌であると同定した。
【００２５】
〔実施例１〕  ベルチシリウム属微生物によるソルビンアルコールの製造
（ベルチシリウム・エスピー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＮＹ−１株の培養）
次の組成を有する前培養培地  ５ｍｌを試験管（２５×２００ｍｍ）に分注した。１２０℃、２０分のオートクレーブ滅菌後、放冷した前培養培地に、分離した菌株を植菌し、２８℃で３日間振とう培養を行った。前培養後、以下に示す組成を有する本培養培地を５００ｍｌ坂口フラスコに３０ｍｌ分注し、オートクレーブ滅菌したものに移し、２日間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を分離した。
【００２６】
前培養培地の組成：
以下の成分を蒸留水に溶解して１０００ｍｌとする
ペプトン  ５．０ｇ、
肉エキス（極東製薬工業製）  ５．０ｇ、
塩化ナトリウム  ２．０ｇ、
酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）  ０．５ｇ
【００２７】
本培養培地の組成：
以下の成分を水道水に溶解して１０００ｍｌとする
６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸  ０．２ｇ、
ポリペプトン  ４０ｇ、
フラクトース  ６０ｇ、
リン酸水素２ナトリウム  ３．３ｇ、
リン酸２水素カリウム  １．７ｇ、
硫酸マグネシウム７水和物  ０．５ｇ、
塩化ナトリウム  ０．５ｇ、
ビタミン水溶液  ５ｍｌ（ビオチン  １００ｍｇ、パントテン酸カルシウム  ２０ｍｇ、イノシトール  １００ｍｇ、ニコチン酸  ２０ｍｇ、ピリドキシン塩酸  ２０ｍｇ、パラアミノ安息香酸  １０ｍｇ、リボフラビン  １０ｍｇ、葉酸  ０．５ｍｇ、１０００ｍｌ  蒸留水）、及び
金属水溶液  ５ｍｌ（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３００ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＫＩ  １００ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＨＣｌ  １０ｍｌ、１０００ｍｌ  蒸留水）
【００２８】
（ソルビン酸還元反応）
ソルビン酸濃度が１０ｍＭになるように１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した溶液３０ｍｌに、上記で調製した培養液３０ｍｌ分の菌体を添加することにより反応を開始した。反応は３０℃で振とうして行った。反応途中で適宜反応液を抜きとり、抜き取ったサンプル反応液に等量のエタノールを添加して反応を停止した。反応停止した溶液を１２０００ｒｐｍで５分遠心分離した後、上清を以下に示すＨＰＬＣ条件で分析し、残存ソルビン酸量及び生成ソルビンアルコール量をモニターした。基質濃度が２〜１０ｍＭの範囲となるように適宜フィーディングして反応を行った。２３時間の反応の結果、２．１ｇ／ｌのソルビンアルコールが蓄積していた。
【００２９】
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  Ｓ５  ＯＤＳ２（φ４．６ｘ１５０ｍｍ）
溶出液：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝２．８）／アセトニトリル＝９／１
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５０ｎｍ
【００３０】
（生成ソルビンアルコールの確認）
蓄積した生成物を同定するため、生成物を以下の手順で精製し、構造解析した。反応液のｐＨを１２に調整し、等量のジエチルエーテルで３回抽出した。生成物は揮発性が高いため、ジエチルエーテル溶液を氷上でエバポレーションし、粗生成物を得た。この粗生成物を１ｍｌジエチルエーテルに溶解し、これをシリカゲルカラム（φ１７×２００ｍｍ）にかけ、ヘキサン／酢酸エチル＝２／１溶液で溶出した。これを氷上でエバポレーションし、得られた生成物について日本電子（株）社製ＪＥＯＬ  ＥＣＡ−５００により１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、生成物のスペクトルが市販標品（東京化成）のスペクトルと一致したことから、反応生成物をソルビンアルコールと確認した。
【００３１】
〔実施例２〕  各種微生物によるソルビンアルコールの製造
菌体を１００ｍｌ容培養フラスコに入った下記組成を有する培地３０ｍｌに植菌し、温度２８℃で振とう培養を２日間行った。培養終了後、培養液を全量、遠心分離して菌体を分離した。その菌体を以下の組成の反応液３０ｍｌに混合して反応させた。
反応液の組成：
以下の成分を各濃度となるように１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０）に溶解する
ソルビン酸  ５ｍＭ、
グルコース  １％
反応は３０℃で１時間、振とうして行った。反応後、実施例１と同じ条件でソルビンアルコールの蓄積量を測定した。結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】
2005021099.tif 000003
【００３３】
培地の組成：
以下の成分を水道水に溶解し総容量１０００ｍｌとし、ｐＨ７．０に調整する
６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸  ０．２ｇ、
フラクトース  ６０ｇ、
ポリペプトン  ４０ｇ、
リン酸水素２ナトリウム  ３．３ｇ、
リン酸２水素カリウム  １．７ｇ、
硫酸マグネシウム７水和物  ０．５ｇ、
塩化ナトリウム  ０．５ｇ、
ビタミン水溶液  ５ｍｌ（ビオチン  １００ｍｇ、パントテン酸カルシウム  ２０ｍｇ、イノシトール  １００ｍｇ、ニコチン酸  ２０ｍｇ、ピリドキシン塩酸  ２０ｍｇ、パラアミノ安息香酸  １０ｍｇ、リボフラビン  １０ｍｇ、葉酸  ０．５ｍｇ、１０００ｍｌ  蒸留水）、及び
金属水溶液  ５ｍｌ（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３００ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＫＩ  １００ｍｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ、ＨＣｌ  １０ｍｌ、１０００ｍｌ  蒸留水）
【００３４】
【発明の効果】
本発明は、ベルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ベアウヴェル（Ｂｅａｕｖｅｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ヒポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属に属する微生物をソルビン酸に作用させることによりソルビンアルコールを容易に得ることができる方法を提供した。
本発明のソルビンアルコールの製造方法は、既知の反応に比べて安全性および生産性の点で優れる。本発明によって製造されたソルビンアルコールは農薬および医薬品等の原料として産業上有用な化合物である。