(57)【要約】【課題】脱アセチル化された種々の分子量のアミノオリゴ糖混合物またはアミノオリゴ糖混合物を還元したアミノオリゴ糖アルコール体を含む混合物から、アミノオリゴ糖またはアミノオリゴ糖アルコール体を製造する方法において、塩酸を用いずに塩水溶液を用いて精製する方法を提供する。【解決手段】溶離液として塩水溶液を使用し、陽イオン交換樹脂によりアミノオリゴ糖混合物からアミノオリゴ糖を分離精製する。この方法は、陽イオン交換樹脂を用いた１回もしくは複数回の精製工程、またはこれに既知の他の精製法による工程を加えることにより構成できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶離液として塩水溶液を使用し、陽イオン交換樹脂により、アミノオリゴ糖混合物からアミノオリゴ糖を分離精製することを特徴とするアミノオリゴ糖の精製方法。
【請求項２】
アミノオリゴ糖混合物が式１で示されるキトサンオリゴ糖を含むものである、請求項１に記載の精製方法。
【化１】
2005029505.tif 000007
【請求項３】
アミノオリゴ糖混合物が式２で示されるキトサンオリゴ糖の還元末端を還元したキトサンオリゴ糖アルコール体を含むものである請求項１に記載の精製方法。
【化２】
2005029505.tif 000008
【請求項４】
キトサンオリゴ糖がキトサン多糖試料を酸分解、酵素分解または微生物分解して得たものである請求項２に記載の精製方法。
【請求項５】
キトサンオリゴ糖アルコール体が、キトサン多糖試料を酸分解、酵素分解または微生物分解してキトサンオリゴ糖を得た後、さらにその還元末端を還元したものである請求項３に記載の精製方法。
【請求項６】
Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＮＨ４＋からなる群より選ばれる陽イオンと、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、硫酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン及び酢酸イオンからなる群より選ばれる陰イオンとからなる塩を使用する請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
高速液体クロマトグラフィー法の如く加圧下で行う手法、オープンカラムクロマトグラフィー法の如く常圧下で行う手法、またはこれらの併用で行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項８】
請求項２または４に記載の方法により精製されたキトサンオリゴ糖を還元することを特徴とするアミノオリゴ糖アルコール体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脱アセチル化された種々の分子量をもつアミノオリゴ糖またはその還元末端を還元した糖アルコール体の混合物（以下、「アミノオリゴ糖混合物」と総称する）から、アミノオリゴ糖またはその糖アルコール体を効果的に精製する方法に関する。
本発明の精製方法は、従来技術に比べてより安全な作業環境にて実施でき、また、汎用的な精製装置を用いて行うことが可能である。さらに、目的とする化合物をより安定に精製することが可能である。本発明は食品、食品添加物、化粧品成分、医薬品、医薬品原末、医用材料、農業用資材などの原料として用いられるアミノオリゴ糖の製造に広く利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
アミノオリゴ糖は、少なくとも一つの構成単糖がアミノ基を有するオリゴ糖の総称である。その中の１種であるキトサンオリゴ糖はＤ−グルコサミンがβ−１，４結合したものである。キトサンオリゴ糖はカニの甲羅などから得られたキチンの脱アセチル化生成物のキトサン多糖を分解することによって得られる。キトサンオリゴ糖は、その抗菌作用、溶解性、生理作用、構造的な有用性などの特徴から、医用材料、化粧品材料、食品添加剤、分離材料、農業資材、シート材料、水処理材などの広い分野において使用されている（『キチンキトサンハンドブック』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９５年）。
【０００３】
医薬品としてキトサンオリゴ糖またはその糖アルコール体を用いる場合、薬効、薬理作用の同等性が求められるため、高度に精製された単一分子量のオリゴ糖として製造することが求められている。例えば、キトサンオリゴ糖には抗腫瘍活性が認められ、その活性度はグルコサミン残基の数によって異なることが報告されている（『キチン、キトサンの応用』キチンキトサン研究会、技報堂出版、１７５項）。このため、薬効、薬理作用の同等性を確保するため、高度に精製された単一分子量のオリゴ糖を用いることが必要である。また、キトサンオリゴ糖あるいは他のアミノオリゴ糖およびその糖アルコール体を医薬品原料として用いる場合、医薬品は高度の品質の均一性が求められるため、高度に精製された単一分子量のオリゴ糖を用いる必要がある（特開平０８−２０８５２５号公報、特開２００２−１８７９４８号公報、国際公開ＷＯ０２／０５１８５４号公報）。また、一般的な反応用の試薬としてキトサンオリゴ糖あるいは他のアミノオリゴ糖およびその糖アルコール体を使用する場合も、不純物の生成を抑制するために、単一分子量のオリゴ糖を使用することが望ましい。
【０００４】
アミノオリゴ糖を精製する場合、陽イオン交換樹脂が用いられ、溶離液としては、高濃度の塩酸（ＨＣｌ）溶液を用いることが一般的である（『キチンキトサンハンドブック』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９５年、２１６項、２１８項）。
しかし、塩酸を用いることは、以下の理由により、不都合がある。
【０００５】
第一に安全性の問題が挙げられる。塩酸は目、皮膚などに付着すると炎症を起こす。また塩酸は揮発性が大きく、揮発した塩酸は、目、呼吸器系粘膜を強く刺激する。このように、塩酸を用いる場合は作業者への危険性が高く、作業にあたっては細心の注意、また安全確保のための防護具、機器、設備が必要となる。また、塩酸を用いると、精製後に塩酸のアルカリによる中和操作の必要性が生じる。中和反応では熱が生じるため、本操作も危険な作業である。
【０００６】
第二に使用する器具、機器の材質が制限されることが挙げられる。塩酸は水分があると腐食性が強く、金属、コンクリート等を侵す。したがって、基材として汎用的に使用されるステンレス材が使用できない。このため、ステンレスの代わりにガラスまたは表面を耐塩酸性の材質で覆ったものなどの特殊な設備を用いる必要がある。
【０００７】
第三に、溶離液としての塩酸が、目的物安定性に影響することがある。目的物の製造において、多糖からオリゴ糖に分解する際、塩酸による分解が一般に用いられる（『キチンキトサンハンドブック』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９５年、２０９、２１６項）。よって、既に分解したオリゴ糖を高濃度の塩酸を用いて精製する場合、さらにオリゴ糖を分解することがあり、純度を下げる原因となる。
以上のように、作業者の安全性確保、使用機器材質の制約、化合物安定性確保などの理由から、溶離液として塩酸以外の塩水溶液を用いて精製することが求められていた。
【０００８】
一方、光富氏らにより、キトサンオリゴ糖の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶離液を用いた陽イオン交換樹脂による精製が報告されている（キチン・キトサン研究、２２８−２３１、Ｖｏｌ．８、２、２００２）。しかし、この報告で得られたキトサンオリゴ糖は、その残基の一つがＮアセチルグルコサミン残基のものであり、アセチル基を含むキトサンオリゴ糖に関するものである。
【０００９】
しかし、以下の３つの理由から、脱アセチル化度が高いキトサンの精製が求められている。第一に、医薬品の原料として用いる場合、高度の品質の均一性が求められるため（特開平０８−２０８５２５号公報、特開２００２−１８７９４８号公報、国際公開ＷＯ０２／０５１８５４号公報）、アセチル基を含まないグルコサミン残基のみから実質的に構成される化合物の精製方法が求められている。第二に、キトサンオリゴ糖を健康食品として用いる場合、体内のコレステロール値を下げる働きが期待されるが、このとき、脱アセチル化度が高いほどその効果が高いことがわかっている（『キチンキトサンハンドブック』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９５年、３９１項）。第三に、キトサンには抗カビ力があることが分かっているが、この効果も脱アセチル化度が高いほどその効果が高いことがわかっている（『キチンキトサンハンドブック』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９５年、３０６項）。
なお、脱アセチル化度が低いキトサンを精製し、精製後に脱アセチル化を行った場合は、目的物の分解、およびこれに伴う不純物の生成が考えられる。
【００１０】
また、還元末端を還元し、糖アルコール体としたものは、化学的により安定であることがわかっている（特公平４−７４３５８号公報、特開平６−２５６３７４号公報）。このため、キトサンオリゴ糖混合物を還元したキトサンオリゴ糖アルコール体混合物の精製法も求められていた。
【００１１】
【特許文献１】特開平０８−２０８５２５号公報
【特許文献２】特開２００２−１８７９４８号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ０２／０５１８５４号パンフレット
【特許文献４】特公平４−７４３５８号公報
【特許文献５】特開平６−２５６３７４号公報
【非特許文献１】キチンキトサン研究会、「キチンキトサンハンドブック」、技報堂、１９９５年
【非特許文献２】キチンキトサン研究会、「キチン、キトサンの応用」、技報堂出版、１７５項
【非特許文献３】光富他、キチン・キトサン研究、２００２年、第８巻、第２号、ｐ．２２８−２３１
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
かかる現状を鑑み、本発明は、アセチル基を含まないアミノオリゴ糖を含む混合物またはアミノオリゴ糖混合物を還元したアミノオリゴ糖アルコール体を含む混合物から、アミノオリゴ糖またはアミノオリゴ糖アルコール体を製造する方法において、塩酸を用いずに塩水溶液を用いて陽イオン交換樹脂による精製を効果的に行い、高品質のアミノオリゴ糖あるいはアミノオリゴ糖アルコール体を得ることができるようにすることを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は各種重合度のアミノオリゴ糖を含む混合物からそれぞれのアミノオリゴ糖を分離して精製する際、溶離液として塩水溶液を使用した陽イオン交換樹脂による精製方法を採用することにより、それぞれの重合度のアミノオリゴ糖を効率良く高純度に分離精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の第一の局面によれば、溶離液として塩水溶液を使用し、陽イオン交換樹脂により、アミノオリゴ糖混合物からアミノオリゴ糖を分離精製することを特徴とするアミノオリゴ糖の精製方法が提供される。
【００１４】
本発明の精製方法は、精製の目的化合物にアセチル基を含まない。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、下記式１で示されるキトサンオリゴ糖をアミノオリゴ糖として含む混合物から単一分子量のアミノオリゴ糖を分離精製するのに用いられる。
【００１６】
【化３】
2005029505.tif 000002
【００１７】
また、本発明において「アミノオリゴ糖」の語は、アミノオリゴ糖の還元末端を還元したアミノオリゴ糖アルコール体をも包含する概念である。
【００１８】
したがって、本発明の他の好ましい態様において、本発明の方法は、下記式２で示されるキトサンオリゴ糖の還元末端を還元したキトサンオリゴ糖アルコール体をアミノオリゴ糖として含む混合物から単一分子量のキトサンオリゴ糖アルコール体を分離精製するのに用いられる。
【００１９】
【化４】
2005029505.tif 000003
【００２０】
なお、本明細書においては、式１及び式２の化合物を下記表１のように略す（ｎが４以上の場合も同様）。
【００２１】
【表１】
2005029505.tif 000004
【００２２】
上記の式１で示されるキトサンオリゴ糖または式２で示されるキトサンオリゴ糖アルコール体をアミノオリゴ糖として含有する混合物としては、具体的には、（１）キトサン多糖試料を酸分解、酵素分解または微生物分解して得たキトサンオリゴ糖混合物、（２）キトサン多糖試料を酸分解または酵素分解して得たキトサンオリゴ糖の還元末端を還元したキトサンオリゴ糖アルコール体混合物などが挙げられる。
【００２３】
なお、本発明によれば、式１で示される化合物の混合物を本法によって精製した後、これの還元末端を還元することで、式２で示される化合物を得ることも可能である。
したがって、本発明の他の局面によれば、本発明の精製方法によって式１で示されるキトサンオリゴ糖の混合物から単一分子量のキトサンオリゴ糖を精製した後、これの還元末端を還元することによって、式２で示される単一分子量のアミノオリゴ糖アルコール体を得ることを特徴とするアミノオリゴ糖アルコール体の製造方法が提供される。
【００２４】
本発明の精製方法は、陽イオン交換樹脂を用いた一回もしくは複数回の精製工程、またはこれに既知の他の精製法による工程を加えることにより構成できる。陽イオン交換樹脂は、高速液体クロマトグラフィー法または擬似移動床クロマトグラフィーの如く加圧下に用いてもよいし、オープンカラムクロマトグラフィー法の如く常圧下に用いてもよく、これらの併用でもよい。陽イオン交換樹脂としては、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタクリレート、ポリメタクリレート等のメタクリル系基材、スチレンジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレンなどのスチレン系基材、シリカ系基材、アクリル系基材およびこれらの表面を親水性ポリマーで覆ったゲル基材に、スルホキシル基（−ＳＯ３Ｈ）、スルホプロピル基、スルホエチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基などの陰イオン性の官能基を結合したものなどが用いられる。溶離液としては塩水溶液が用いられ、好ましくは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、ＮＨ４＋から選ばれる陽イオンと、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、硫酸イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、酢酸イオンから選ばれる陰イオンとからなる塩を溶解した水溶液が用いられる。
【００２５】
本発明の精製方法は、具体的には、アミノオリゴ糖混合物を陽イオン交換樹脂に吸着させた後、溶離液によって溶出させることによって実施できる。この際、吸着の手法は、カラムに樹脂を充填した後にアミノオリゴ糖混合物溶液をカラムに通して、アミノオリゴ糖を樹脂に吸着させても良いし、陽イオン交換樹脂とアミノオリゴ糖混合物溶液を攪拌して樹脂にアミノオリゴ糖混合物を吸着させた後、陽イオン交換樹脂をカラムに充填しても良い。さらに溶出の手法は、溶離液の塩濃度を一定にするアイソクラティック溶出でもよいし、溶離液の塩濃度を徐々に高くするグラジエント溶出でもよいし、溶離液の塩濃度を階段状に高くしていくステップワイズ溶出でもよく、これらの併用でもよい。塩水溶液の塩濃度は、グラジエント溶出およびステップワイズ溶出の場合、好ましくは塩を溶解させない溶液から８ｍｏｌ／Ｌ程度までの濃度範囲で実施できる。さらに好ましくは、塩を溶解させない溶液から、６ｍｏｌ／Ｌ程度までの濃度範囲で実施できる。特に塩としてＮａＣｌを用いる場合、好ましくはＮａＣｌを溶解させない溶液から５ｍｏｌ／Ｌまでの濃度範囲で精製を実施できる。アイソクラティック溶出の場合、塩の濃度範囲は、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌから８ｍｏｌ／Ｌの範囲のいずれかの濃度で実施できる。さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌから６ｍｏｌ／Ｌの範囲のいずれかの濃度で実施できる。溶出液を適切に分画することで、目的の精製化合物が得られる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  キトサン多糖酵素分解試料からのＮａＣｌ溶離液によるオープンカラム精製
脱アセチル化度９９％以上のキトサン多糖混合物を、キトサン分解酵素（キトサナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＢＮ−２６２）によって分解したキトサンオリゴ糖混合物粉末試料（ＣＨ２Ａ：２７．５％、ＣＨ３Ａ：２７．９％、ＣＨ４Ａ：１１．０％含有、分析条件は以下に記載）をアミノオリゴ糖混合物として用いた。このキトサンオリゴ糖混合物１．６ｇをイオン交換水に溶解し、ｐＨをｐＨ５．５に調整し、これを常圧下で陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４により分離精製した。精製条件は以下の通り。
【００２８】
・精製条件
樹脂：Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４  ５０−１００ｍｅｓｈ（ダウケミカル社製、スチレンジビニルベンゼン共重合体にスルホキシル基を結合させた樹脂）、
カラムサイズ：２１φ×１４４ｍｍＬ（５０ｍＬ）、
溶離液条件：イオン交換水、ＮａＣｌ水溶液によるステップワイズ溶出。
・負荷試料の分析条件（ＨＰＬＣ分析）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ  （４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）、
カラム温度：３５℃、
移動相：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ＝７０／３０、
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製液体クロマトグラフィーシステム、
検出：示差屈折検出器（検出部ヒーター３５℃）。
【００２９】
溶出液の各分画を電気透析により脱塩処理したのち濃縮し、上記負荷試料の分析条件と同一の条件下でＨＰＬＣ分析を行った。結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2005029505.tif 000005
【００３１】
（注１）純度：各フラクションのＨＰＬＣクロマトグラムにおける、オリゴ糖ピークの面積百分率（クロマトグラムにおける水およびＮａＣｌに由来するピークは除いて計算）。
（注２）回収率：精製後各フラクションにおける各化合物の、負荷試料に含まれるそれぞれの化合物に対する割合。負荷試料と各フラクションにおけるそれぞれの化合物を定量して得られた含量から算出。
【００３２】
なお、それぞれの糖について回収率合計が１００％に満たない理由は、分析前処理で実施している電気透析処理によって損失していることが考えられる。また、ＣＨ４の回収率が低い原因は、負荷試料の含量が他の糖に比べ低いこと（分析誤差が大きいこと）が考えられる。
【００３３】
実施例２  キトサン多糖酸分解試料の還元処理試料からのＮａＣｌ溶離液によるオープンカラム精製
脱アセチル化度９９％以上のキトサン多糖混合物２０ｇを、濃塩酸による酸分解によりキトサンオリゴ糖混合物とした。分解条件は成書（『キチン、キトサン実験マニュアル』キチンキトサン研究会、技報堂、１９９１年、８１項）記載の方法に基づいた。分解溶液をｐＨ８に調整し、２ｇのＮａＢＨ４を加え１７時間撹拌することで還元末端を還元し、キトサンオリゴ糖アルコール体混合物とした。分解から還元までを合計３回行い、これを混合することで負荷試料を得た（分析値ＣＨ２：３６．８％、ＣＨ３：４２．３％、ＣＨ４：１０．８％含有、分析条件は実施例１と同様）。このうちの一部をとり、オリゴ糖含量２３ｇ（溶液量４．２Ｌ）を含む溶液を、常圧下で陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４により分離精製した。精製条件は以下の通り。
樹脂：Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ４  ５０−１００ｍｅｓｈ（ダウケミカル社製、スチレンジビニルベンゼン共重合体にスルホキシル基を結合させた樹脂）、
カラムサイズ：６０φ×２８０ｍｍＬ（８００ｍＬ）
溶離液条件：イオン交換水、ＮａＣｌ水溶液によるステップワイズ溶出。
溶出液を電気透析により脱塩処理したのち濃縮し、実施例１と同様にＨＰＬＣ分析を行った。結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
2005029505.tif 000006
【００３５】
実施例２により、各化合物の純度を向上することができた。特にＣＨ３については、Ｆｒ４及びＦｒ５より純度（水、ＮａＣｌに由来するピークを除いた面積百分率）が１００％のものを回収率６８．７％で得た。
実施例１および２の結果から、一回の精製により、高い回収率で各化合物の純度を著しく向上させることができた。より高純度の化合物を得る場合は、本精製を繰り返すことで目的が達成される。また、実施例１の精製試料を還元することによって、還元末端を還元したキトサンオリゴ糖を得ることも可能である。
【００３６】
実施例３  キトサン多糖酵素分解試料の還元処理試料からのＮａＣｌ溶離液及びＮａ２ＳＯ４溶離液によるＨＰＬＣ溶出クロマトグラムの比較
実施例１と同様のキトサン多糖酵素分解試料を用いた。分解試料５０ｇを水溶液とした後ｐＨ８に調整し、２ｇのＮａＢＨ４を加え１７時間撹拌することで還元末端を還元しキトサンオリゴ糖アルコール体混合物とした（分析値ＣＨ２：３６．８％、ＣＨ３：４２．３％、ＣＨ４：１０．８％含有、分析条件は実施例１と同様、溶液量１．６Ｌ）。これを５０ｍＬ量り取り、ｐＨをｐＨ５．５に調整した。この一部を負荷試料として、加圧下において陽イオン交換カラムに負荷し、ＮａＣｌおよび硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）によって溶出した。その溶出クロマトグラムを比較した。条件は以下のとおり。
【００３７】
樹脂：Ｐｏｒｏｓ２０ＨＳ（アプライドバイオシステムズ社製、スチレンジビニルベンゼン共重合体に親水性ポリマーをコートしたものにスルホプロピル基を結合させた樹脂）、
カラムサイズ：４．６φ×１００ｍｍＬ（１．６７ｍＬ）、
流量：１．６７ｍＬ／ｍｉｎ、
溶離液条件：ＮａＣｌ溶離塩０→２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（１２０分）、リニアグラジエント溶出、Ｎａ２ＳＯ４溶離塩０→１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（１２０分）、リニアグラジエント溶出、
負荷量：１００μＬ、
検出：ＵＶ２１０ｎｍ、
装置：Ｗａｔｅｒｓ社製液体クロマトグラフィーシステム。
【００３８】
溶出クロマトグラムを図１及び図２に示す。その結果、ＮａＣｌとＮａ２ＳＯ４ではよく類似したクロマトグラムが得られ、どちらの塩でも同様に分離できることが判明した。
【００３９】
【発明の効果】
塩酸を用いずに溶離液として塩水溶液を使用し、陽イオン交換樹脂により、種々の分子量のアミノオリゴ糖を含む混合物からアミノオリゴ糖を精製できる。このとき、一段階の精製であっても、高い回収率で純度を著しく向上させることができる。また、溶離液に各種の塩を用いて再現性よく精製できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３においてＮａＣｌを溶離液としたときの溶出クロマトグラム
【図２】実施例３においてＮａ２ＳＯ４を溶離液としたときの溶出クロマトグラム
【図１】
2005029505.tif 000009
【図２】
2005029505.tif 000010