(57)【要約】【課題】昆虫細胞あるいは動物細胞などの宿主において外来遺伝子の発現を向上させる方法を提供すること。【解決手段】発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した宿主中で蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することを含む、該外来遺伝子の発現を向上させる方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した宿主中で蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することを含む、該外来遺伝子の発現を向上させる方法。
【請求項２】
発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した昆虫細胞中で宿主のＴＲＮ−１遺伝子の発現を抑制することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した動物細胞中でＴＩＡ−１／Ｒ遺伝子の発現を抑制することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子の発現を抑制する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを用いて遺伝子の発現を抑制する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項６】
合成した小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子の発現を抑制する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項７】
小ヘアピンＲＮＡ発現ベクターを用いて遺伝子の発現を抑制する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項８】
酵素的ＲＮＡ分子発現ベクターを用いて遺伝子の発現を抑制する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項９】
強発現誘導性プロモーターと安定なポリアデニレーションシグナルの間にマルチクローニングサイトを有する発現ベクターの該マルチクローニングサイトに発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を挿入した組み換え発現ベクターを用いて外来遺伝子を導入する、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
薬剤耐性マーカーを用いて樹立した安定な形質導入細胞に対して実施する、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、昆虫細胞あるいは動物細胞を宿主として高水準に組み換えタンパク質を生産することを可能とする遺伝子の発現を向上させる方法に関する。より詳細には、本発明は、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を特異的に抑制することによって外来遺伝子を効率的に発現させる方法に関する。本発明の遺伝子の発現を向上させる方法は、特に、ｍＲＮＡの不安定性等により従来は十分な発現レベルが得られ難かったタンパク質の生産に適している。
【０００２】
【従来の技術】
昆虫細胞あるいは動物細胞を宿主とした組換タンパク質生産の事例は、数多く見られる。また、モノクローナル抗体の遺伝子組換生産に関しても数多くの報告がある。しかしながら導入した遺伝子の蛋白質としての発現量は様々であり、ほとんど生産されない蛋白質も存在する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
昆虫細胞あるいは動物細胞を用いた組換タンパク質の生産性を向上させることはタンパク質性医薬品や診断薬などの製造において非常に重要である。さらに、それらの開発研究にも有効な手段を与える。一方導入した遺伝子の蛋白質としての発現量は様々であり、ほとんど生産されない蛋白質も存在する。そのため、昆虫細胞あるいは動物細胞を宿主として、外来遺伝子を効率的に発現させて発現量を向上させる方法の開発が求められている。即ち、本発明は、昆虫細胞あるいは動物細胞などの宿主において外来遺伝子の発現を向上させる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
効率的な外来遺伝子の発現を可能にするための一つの方法としては、ｍＲＮＡを安定化させる方法が考えられる。ＲＲＭと称されるＲＮＡ認識配列を持つ一連のＲＮＡ結合タンパク質はさまざまな生体内過程、特に細胞活動や発生過程における転写後諸過程の制御機構に関わると考えられる。
【０００５】
この中で哺乳類で報告されたＴＩＡ−１、およびＴＩＡ−Ｒ（以後双方を指してＴＩＡ−１／Ｒとする）はＴ細胞内の細胞核崩壊機能を持つ顆粒内成分として同定された。すなわちＴＩＡ−１／Ｒはこの物質を含む顆粒を受容した細胞に核ＤＮＡの断片化を伴う細胞死（アポトーシス）を誘導する機能を持つと報告されている。この他、ＴＩＡ−１／Ｒにはストレスを与えた細胞の翻訳機能性オルガネラからのメッセンジャーＲＮＡを隔離する働きがあることや、Ｋ−ＳＡＭエキソンを介したｍＲＮＡのスプライシングに重要な働きを持つことも報告されている。さらにＴＩＡ−１／Ｒの一部を細胞内で発現させることによるｔｒａｎｓ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（不完全なタンパク質を細胞内であえて発現させることによる細胞内完全体タンパク質の阻害。まだ機構は明らかになっていないと思われる）による外来タンパク質の高効率発現も報告されている。こうしたことからＴＩＡ−１／Ｒタンパク質は細胞内で転写後の諸過程、特にスプライシング促進や転写産物の配列依存的な排除に関わるとされている。
【０００６】
昆虫種では、ショウジョウバエからＴＩＡ−１／Ｒの相同性遺伝子（Ｒｏｘ８）が単離され、蛹期の卵形成に関わる可能性が示唆されている。またカイコでもＴＩＡ−１／Ｒ相同性遺伝子の単離が行われ、ホルモン制御による絹糸腺の崩壊機構に関わると考えられている。
【０００７】
本発明者らは今回、カイコの発生過程に制御を受けるＲＮＡ結合タンパク質の機能解析を目的として、Ｒｏｘ８の配列を基にしたクローニング法によりカイコからＴＩＡ−１／Ｒ相同性遺伝子（ＢｍＴＲＮ−１）を単離した。ＢｍＴＲＮ−１はカイコ染色体に単一コピー型遺伝子として存在することが明らかになった。また既報のカイコＴＩＡ−１−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｔｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．，  Ｉｗａｍｉ，  Ｍ．，  Ｓａｋｕｒａｉ，  Ｓ．，  ２００１．    Ｅｃｄｙｓｔｅｒｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｓｅｃｔ  ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ．    Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ３２１−３３１）と一部を除いて同じ配列を持つ遺伝子であったが、Ｃ末端側タンパク質相互作用領域の遺伝子コードに重大な違いがあった。本発明者らは、遺伝子導入により組み込まれる遺伝子のコピー数を大きくすることや転写によりｍＲＮＡ量を増やすことではなく、ＢｍＴＲＮ−１遺伝子を抑制することにより導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性を増すことで結果として高水準で安定的なタンパク質の産生を可能にする方法を開発することに成功し本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した宿主中で蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することを含む、該外来遺伝子の発現を向上させる方法が提供される。
【０００９】
本発明において好ましくは、発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した昆虫細胞中で宿主のＴＲＮ−１遺伝子の発現を抑制することができ、あるいは発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した動物細胞中でＴＩＡ−１／Ｒ遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１０】
本発明において好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ発現ベクター、合成した小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ発現ベクター、あるいは酵素的ＲＮＡ分子発現ベクターを用いて遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１１】
本発明において好ましくは、強発現誘導性プロモーターと安定なポリアデニレーションシグナルの間にマルチクローニングサイトを有する発現ベクターの該マルチクローニングサイトに発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を挿入した組み換え発現ベクターを用いて外来遺伝子を導入することができる。
【００１２】
本発明において好ましくは、薬剤耐性マーカーを用いて樹立した安定な形質導入細胞に対して実施することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明においては、発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を導入した宿主中で蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することによって、該外来遺伝子の発現を向上させる。
【００１４】
発現すべきタンパク質の種類は特に限定されず任意のタンパク質を使用できる。発現すべきタンパク質としては有用タンパク質が好ましく、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミラーゼ、インベルターゼ、イソアミラーゼ、プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、チトクローム、セアプローゼ、セラチオペプチダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウレアーゼ等の酵素；インターフェロン、インターロイキン等のサイトカイン；インスリン、グルカゴン、セクレチン、ガストリン、コレシストキニン、オキシトシン、バソプレッシン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン等のホルモン；エンドルフィン、エンケファリン、ダイノルフィン等のオピオイドペプチド；フィブリノーゲン、プロトロンビン等の血液凝固因子；ＳＳＩ等のプロテアーゼインヒビター；さらに、アルブミン、グロブリン、グロビン、ケラチン、コラーゲン等のタンパク質や各種ペプチドが挙げられる。
【００１５】
発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子は、宿主内で発現できるよう宿主に導入される。例えば、用いる宿主に適した発現ベクター中に外来遺伝子を組み込んだ組み換え発現ベクターを宿主に導入することができる。
【００１６】
発現ベクターとしては、宿主に対応した各種製品が市販されている。発現ベクターは通常、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主における発現に必須な各種エレメントの他、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正しい向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー等の配列を有している。
【００１７】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様としては、強発現誘導性プロモーターと安定なポリアデニレーションシグナルの間にマルチクローニングサイトを有する発現ベクターの該マルチクローニングサイトに発現すべきタンパク質をコードする外来遺伝子を挿入した組み換え発現ベクターを用いて外来遺伝子を導入することが挙げられる。
【００１９】
このような発現ベクターを用いて宿主を形質転換することにより、上記したような目的タンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。宿主としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等のいずれを使用してもよいが、好ましくは、昆虫細胞、又は動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）である。動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。昆虫細胞の例としては、カイコ胚由来Ｂｍ−Ｎ４細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を挙げることができる。
【００２０】
宿主の形質転換には、当業者に公知の常法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等を適用することができる。得られた形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００２１】
培養条件は特に限定されないが、好ましくは宿主に適した条件下で行われる。培養後、目的のタンパク質が細胞内に生産される場合には細胞を破砕する。一方、目的のタンパク質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去し、上清を得る。得られた液中に、所望のタンパク質が含まれる。
【００２２】
本発明では、外来遺伝子を導入した宿主中において蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制する。蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質とは、ＲＮＡに結合して該ＲＮＡがコードする蛋白質の発現を阻害する蛋白質の総称である。蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の具体例としては、細胞の種類ごとに幾つか報告されている。本発明においては、使用する宿主に応じて、該宿主に存在する蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制する。例えば、宿主が昆虫細胞の場合には、その種由来のＴＲＮ−１遺伝子の発現を抑制することができ、宿主が動物細胞の場合にはＴＩＡ−１／Ｒ遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２３】
蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制する方法は特に限定されないが、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを用いる方法、合成した小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いる方法、並びに、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターを用いる方法などが挙げられる。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現を抑制すべき蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドである。蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、該ＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、該ＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、タンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好適である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは通常、１０〜５０塩基程度、好ましくは１０〜４０塩基程度、さらに好ましくは１５〜３０塩基程度である。また、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００２５】
アンチセンスＲＮＡ発現ベクターは、発現を抑制すべき蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のＤＮＡに相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＲＮＡを発現できるベクターである。このようなアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを細胞内に導入し、アンチセンスＲＮＡを細胞内で発現させると、標的ｍＲＮＡ（即ち、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のｍＲＮＡ）の機能を効果的に阻害できることが公知である。本発明では、この手法を利用して、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することもできる。即ち、本発明では、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡを安定に発現させうる、蛋白質発現抑制機能を有する遺伝子を組み込んだアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを使用することができる。本発明で使用するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターにおいては、通常、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列が、プロモーターの下流に連結されている。
【００２６】
合成した小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ発現ベクターは何れも、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象を利用して標的遺伝子（本発明においては、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質）の発現を抑制するために使用することができる。ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ法は１９９８年に線虫Ｇａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓを用いて開発された。  その後、無脊椎動物及び脊椎動物において使われるようになった。当初は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるＲＮＡ干渉を利用して遺伝子発現の抑制が試みされていたが、その後、２−ｎｔ（ヌクレオチド）の３’オーバーハングを対称的に持つ２本鎖２１−ｎｔＲＮＡが、ターゲットＲＮＡに対して細胞内におけるＲＮＡ分析機構のガイド役をしていることが示された。Ｔｕｓｃｈｌらのグループは２本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）の抑制効率、ｓｉＲＮＡの長さ、  ３’オーバーハングの長さ、  及びオーバーハング配列を体系的に調べている（Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｐ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅ，  Ｒ．Ｌｅｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ｐ．ａｒｔｅｌ，  Ｐ．Ａ．ｓｈａｒｐ，  ”Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  ”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３．  ｐ３１９１−３１９７  （１９９９））。また、Ｅｌｂａｓｈｉｒらはこの技術を利用して様々な哺乳動物細胞株について調べている（Ｓ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｗ．Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ，  ”ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ２１−ａｎｄ  ２２−  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ．  ”Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，ｐ１８８−２００（２００１））。
【００２７】
酵素的ＲＮＡ分子とは、リボザイム又は触媒的ＲＮＡ分子とも呼ばれる分子であり、特定の標的ｍＲＮＡ（本発明においては、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質）と相補的又は実質的に相補的なヌクレオチド配列を有しており、そしてまた標的ｍＲＮＡを特異的に開裂する酵素活性も有している。酵素的ＲＮＡ分子は、ＤＮＡ／ＲＮＡのキメラ分子でもよいし、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でもよい。このような酵素的ＲＮＡ分子は、分子内開裂を行い、それによって標的ｍＲＮＡ分子を不活性化することができる。上記した相補的配列によって酵素的ＲＮＡ分子と標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションが可能になり、開裂を生起させることができる。相補性はハイブリダイゼーションが可能である限り特に限定されず、例えば、５０〜１００％程度の相補性があればよい。本発明で使用する酵素的ＲＮＡ分子は、通常、（１）ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（即ち、標的ＲＮＡ分子を開裂することができる）酵素的部分；及び（２）標的ｍＲＮＡと特異的に結合することができる、上記酵素的部分の直ぐ近くにある標的結合部分の２つの領域から構成されている。
【００２８】
酵素的ＲＮＡ分子としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム、テトラヒメナ（グループＩ型イントロン）リボザイム、ＲＮアーゼＰ  ＲＮＡ（Ｍ１  ＲＮＡ）及びニューロスポラＶＳ  ＲＮＡリボザイムなどが知られており、本発明においてはこれらの何れを使用してもよい。これらの酵素的ＲＮＡ分子は、生理学的条件下でＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒して、標的ＲＮＡ分子を開裂することができる。一般的に、酵素的核酸は先ず標的ＲＮＡと結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを開裂するように作用する分子の酵素部分の直近にある酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。かくして、酵素的核酸は標的ＲＮＡを先ず認識し、そしてその後相補的塩基対形成によってこの標的ＲＮＡと結合し、そして正しい部位に結合すると酵素的に作用してこの標的ｍＲＮＡを切断する。
【００２９】
本発明では、上記した酵素的ＲＮＡ分子を発現できる発現ベクターを用いることができる。酵素的ＲＮＡ分子発現ベクターにおいては、ウイルス又は哺乳動物プロモーターを含む広範囲のプロモーターを使用して、蛋白発現調節関連性ＲＮＡ結合蛋白質のｍＲＮＡに向けられたリボザイムの発現を指令することができる。本発明で使用することができる哺乳動物及びウイルスプロモーターは公知であり、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、β−アクチン、メタロチオネン又は免疫グロブリンプロモーターのようなプロモーターを使用することができる。
【００３０】
本明細書中に以下に記載する実施例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＢｍＴＲＮ−１の発現を抑制した細胞における外来遺伝子に由来するタンパク質の発現を調べた。その結果、ＢｍＴＲＮ−１の発現を抑制することにより、高塩基性プロテアーゼ（ＢｍＨＢＰ）、カエルＬｉ１６、そしてＧＦＰなどの外来遺伝子に由来する蛋白質の発現が向上できることが判明した。
【００３１】
ＢｍＴＲＮ−１のＲＮＡ認識ドメイン配列は、ヒトＴＩＡ−１／ＲやショウジョウバエのＲｏｘ８の一次構造において相当する領域と高い相同性を有するが、Ｃ末端側タンパク質認識領域についてはこれらのタンパク質グループの間で相同性が低く、また配列の長さにも大きな違いが見られた。したがって、カイコにもＢｍＴＲＮ−１の他にＴＩＡ−１ファミリーのＲＮＡ結合タンパク質が存在し、それらの中にはＲｏｘ８タイプのタンパク質認識領域を持つものもあるかも知れない。ＴＩＡ−１／Ｒにはストレスを与えた細胞の翻訳機能性オルガネラからのメッセンジャーＲＮＡを隔離する働きがあることや、Ｋ−ＳＡＭエキソンを介したｍＲＮＡのスプライシングに重要な働きを持つことも報告されている。さらにＴＩＡ−１／Ｒの一部を細胞内で発現させることによるｔｒａｎｓ−ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎによる外来タンパク質の阻害も報告されている。こうしたことからＴＩＡ−１／Ｒタンパク質は細胞内で転写後の諸過程、特にスプライシング促進や翻訳の阻害に関わるとされている。カイコＢｍＴＲＮ−１の生理的な機能はいまだスプライシング制御か翻訳の抑制に絞られたわけではないが、実施例３の図３のノーザンブロッティングにおけるα−チューブリンｍＲＮＡ解析の結果による推察から、もしＢｍＴＲＮ−１が外来の転写産物を特異的なターゲットとし、本来細胞内に存在する転写産物は認識しにくいものであるなら、以下の考察が成り立つ。
【００３２】
すなわち、外来の遺伝子や相補的ＤＮＡから作られる人工的な転写産物には、スプライシングによる成熟ｍＲＮＡ生成の過程、効率的翻訳に必要なＲＮＡ結合タンパク質−ｍＲＮＡ複合体の形成、そして翻訳後の複合体の寿命に関わる調節などにおいて重大な異常が伴っていると考えられ、この異常により転写後プロセスに不適切な過程を経た転写産物を認識して排除する機構にＢｍＴＲＮ−１は関わると考えられる。こうしたＢｍＴＲＮ−１の発現の人為的制御の方法は、昆虫細胞内でのウイルスベクターを用いた外来タンパク質の生産系の改良に役立つものと考えられる。これまでにもバキュロウイルスベクターの強力な転写プロモーターを用いた外来タンパク質発現の場合であっても、配列によっては特定できない理由で期待通りの発現量が得られない実験例があり、タンパク質の発現量が転写後のさまざまな細胞内調節の影響を受けることが想定される。こうした転写産物調節系の一つとしてＢｍＴＲＮ−１が機能すると考えられるため、ＢｍＴＲＮ−１機能の人為的阻害が、特に難発現性外来タンパク質の発現効率向上に貢献する新しいテクノロジーになることが期待される。
【００３３】
ＣＡＴ遺伝子を発現させた場合、他の外来遺伝子を用いた場合に比べ、培養４８時間でアンチセンスＤＮＡの効果が弱いものとなった。ＣＡＴ遺伝子はカイコ細胞において、本来ＢｍＴＲＮ−１処理を行わなくても他の遺伝子に比べ高発現性である。こうした結果から、転写産物は内部の配列に依存してＢｍＴＲＮ−１機能の影響を受けることが考えられ、従ってＢｍＴＲＮ−１が直接作用するための配列的要因を持つ転写産物が、特異的な細胞内機構により排除されると推察される。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１：完全長のＢｍＴＲＮ−１遺伝子の単離
カイコ、青熟種の幼虫消化管組織から抽出したｍＲＮＡに対するｃＤＮＡライブラリーを作成し、ショウジョウバエのＲｏｘ遺伝子の配列を用いたＰＣＲ法により、Ｒｏｘ８相同性遺伝子を単離した。完全長２０１１塩基対からなるこの遺伝子の配列をすべて解析し、ＢｍＴＲＮ−１と名づけた。ＢｍＴＲＮ−１の塩基配列を配列表の配列番号１に記載し、アミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。カイコの変態期中腸の遺伝子ライブラリーから単離したＢｍＴＲＮ−１の完全長ｃＤＮＡの遺伝子配列は２０１１塩基からなり、１−１１６４塩基の部分にタンパク質がコードされていた。
【００３５】
実施例２：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた培養細胞内におけるＢｍＴＲＮ−１の発現抑制
（１）細胞培養
培養細胞にはカイコ胚由来Ｂｍ−Ｎ４細胞（Ｂｒｏｗｎ，  Ｍ．，  Ｆａｕｌｋｎｅｒ，  Ｐ．，  １９９７．    Ａ  ｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｏｖｅｒｌａｙ．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６，  ３６１−３６４）を用いた。細胞は、ＥＳＦ９２１昆虫細胞培養液（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  社製）に最終濃度１４％の子牛血清を添加した混合培地を用いて２５℃下で培養した。
【００３６】
（２）発現ベクターの構築
ＢｍＴＲＮ−１の発現ベクターとしては、ｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴ（インビトロジェン社製）を使用した。この発現ベクターは、バキュロウイルスＩＥプロモーターを使用し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼとパラミクソウイルスＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質をコードしている。
【００３７】
カイコ高塩基性プロテアーゼ（ＢｍＨＢＰ）の発現ベクターは、ｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴをベースにし、ＢｍＨＢＰの翻訳開始メチオニンから１３３残基までの配列と、ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現するように構築した。
【００３８】
カエルＬｉ１６タンパク質の発現ベクターは、Ｌｉ１６のＮ末端から１１５残基までの配列とＢｍＨＢＰの場合と同様ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現するように構築した。
【００３９】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現ベクターは、ＧＦＰのＮ末端から終止コドン部分までをプラスミドｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴのクローニングサイトに挿入した。
【００４０】
（３）オリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＢｍＴＲＮ−１遺伝子の塩基配列の２９９−３２２部分の相補配列である５’−ＣＧＡＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＣＣ−３’（配列番号３）の５’部分をｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎにより修飾したものを使用した。同様に５’を修飾した同部位のセンス鎖ヌクレオチドを対照実験に用いた。
【００４１】
（４）市販試薬を用いた化学的トランスフェクション法（細胞内への遺伝子の移入）
ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）をトランスフェクション試薬として用いた。１．５ｍｌ  混合培地中の０．７ｘ１０６  個の単層細胞を３５ｍｍプラスティックプレートに播いた。１００μｌのＥＳＦ９２１に１μｇの発現プラスミドベクター、０．５μｇのオリゴヌクレオチド、そして６μｌのＦｕＧｅｎｅ６試薬を加えて混合し、室温で１５分インキュベートした。この混合液を細胞プレートに滴下し、室温５時間のインキュベート中に細胞内にＤＮＡを取込ませた。その後培地を１．５ｍｌの新しい混合培地に交換し、室温での培養を続けた。
【００４２】
（５）ウエスタンブロッティング法による発現タンパク質の解析
細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル処理液２００μｌに溶解させたものを電気泳動用サンプルとした。３μｇタンパク質を含む１０μｌサンプル液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンに注入した。電気泳動終了後、分離したタンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦ膜に転写した。このＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含む抗体反応緩衝液（ｐＨ７．４）内でブロッキングした後、５℃一晩抗体と反応させた。
【００４３】
ＧＦＰ発現細胞の場合は、ＧＦＰ抗体（インビトロジェン社製）を用い、ＣＡＴ、Ｌｉ１６およびＢｍＨＢＰの場合は、Ｃ末端に付加したＳＶ５抗原に対する抗体（インビトロジェン社製）を、抗体：緩衝液＝１：５０００の濃度で用いた。同抗体反応液で洗浄後、二次抗体（最初に用いた抗体と反応する抗体）とＰＶＤＦ膜を室温３時間反応させた。特異バンドは、二次抗体に標識した西洋わさびペルオキシダーゼの化学発光反応により検出した。発色にはウエスタンプラスキット（アマシャム・ファルマシア社製）を用いた。
【００４４】
（６）結果
上記（１）〜（５）に記載した方法により、ＢｍＴＲＮ−１の細胞内機能を明らかにする目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＢｍＴＲＮ−１の発現抑制処理を行った細胞での外来遺伝子由来タンパク質発現を調べた。特異抗体により検出される分子質量４２．５および４４．１ｋＤａのＢｍＴＲＮ−１タンパク質バンドは、センスＤＮＡを取込んだ対照区に比べ、アンチセンス抑制により明らかに細胞内での存在量が減少した。
【００４５】
図１は、アンチセンスＢｍＴＲＮ−１オリゴヌクレオチドによる部分的ＢｍＨＢＰの高効率発現試験の結果を示す。図１−１では、図示した量のオリゴヌクレオチドを細胞（０．７×１０６単層／３５ｍｍプレート）にＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）により取り込ませた。同時にｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴをベースに作製したＢｍＨＢＰの翻訳開始メチオニンから１３３残基までの配列と、ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現するプラスミドを１μｇ分同細胞に取り込ませた。処理後２４時間後の細胞を回収し、３μｇ分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、ＰＶＤＦ膜（アマシャム・ファルマシア社製）上での特異一次抗体（１：５０００＝抗体：反応液）とウエスタンブロッティング反応させた。洗浄後、同膜をＰＯＤ標識された特異二次抗体と反応させ、最終ＢｍＨＢＰバンドはＰＯＤの化学発光反応により検出した（アマシャム・ファルマシア社製、ウエスタンプラスキット）。またバンド検出量を算出し、下表にまとめた。Ｃ：ＢｍＨＢＰ非使用対照、ＮＤ：検出限界未満
【００４６】
図１−２では、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを０．５μｇ取り込ませた同細胞から図示した時間経過後に蛋白質を回収し、５％分を同電気泳動で分離した。これをＰＶＤＦ膜上の抗体とのウエスタン解析により、  ＢｍＨＢＰを検出した。バンド検出量を算出し、下表にまとめた。対照区：ＢｍＨＢＰ非使用対照、ＮＤ：検出限界未満
【００４７】
図１−１に示す通り、ＢｍＴＲＮ−１のアンチセンス抑制を行っている細胞内でカイコの高塩基性プロテアーゼ（ＢｍＨＢＰ）のＣ末端活性基を除く部分配列を発現させたところ、対照区として何も処理をしなかった細胞およびセンス鎖ＤＮＡを取込ませた細胞に比べて、著しく発現タンパク質の増加が認められた。さらに０．７５μｇまでは取り込ませたアンチセンスＤＮＡ量に依存して、ＢｍＨＢＰの発現量は増加した。現在理由はわかっていないが、１．５μｇのアンチセンスＤＮＡではかえってＢｍＨＢＰの発現量は減少する結果をえている。おそらくトランスフェクション試薬の添加ＤＮＡ最適量から大きく逸脱したことが原因ではないかと予想される。また、図１−２に示す通り０．５μｇアンチセンスＤＮＡで細胞内ＢｍＴＲＮ−１抑制を行っている際のＨＢＰの発現量は培養時間に依存して増加した。
【００４８】
図２は、ＢｍＴＲＮ−１アンチセンスによる外来蛋白質の昆虫細胞内発現試験の結果を示す。
（上）ＣＡＴ：インビトロジェン社製、ｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴ、バキュロウイルスＩＥプロモーターを使用しクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼとパラミクソウイルスＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現する。
（中）ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質のＮ末端から終止コドン部分までを同プラス  ミドのクローニングサイトに挿入した。
（下）Ｌｉ１６：カエルＬｉ１６タンパク質のＮ末端から１１５残基までの配列と上記と同様、ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現する。
【００４９】
以上３種類の発現ベクターを取り込ませた細胞（０．７ｘ１０６単層／３５ｍｍプレート）にＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）によりセンスおよびアンチセンスヌクレオチドを各区０．５μｇ取り込ませた。図示した時間経過後の細胞蛋白質の３μｇ分を電気泳動と特異抗体によるウエスタンブロッティング（抗体：反応液＝１：５０００）で発現蛋白質を検出した。写真の下表は検出バンドの測定蛋白濃度。
【００５０】
図２に示す通り、外来遺伝子としてＣＡＴ、カエルＬｉ１６、そしてＧＦＰについての同様の解析から、センスＤＮＡ  の場合に比べ、ＢｍＴＲＮ−１アンチセンスＤＮＡを取込ませた細胞では、培養４８時間目にＧＦＰとＬｉ１６の過剰な発現が確認された。一方ＣＡＴ遺伝子では２４時間まではＢｍＴＲＮ−１アンチセンスＤＮＡの発現量増大効果が見られたが、処理４８時間後では対照区と実験区で有意な差が見られなくなった。
【００５１】
実施例３：アンチセンス抑制中の細胞におけるｍＲＮＡの解析
ＢｍＴＲＮ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド（０．５μｇ）を細胞（０．７×１０６単層／３５ｍｍプレート）にＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）により取り込ませた。同時にｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴをベースに作製したＢｍＨＢＰの翻訳開始メチオニンから１３３残基までの配列と、ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現するプラスミドを１μｇ分同細胞に取り込ませた。処理後３６時間後の細胞を回収し、酸性フェノール抽出、エタノール沈澱法で細胞全ＲＮＡを精製した。このうち１０μｇ相当分を変性条件下でアガロースゲル電気泳動で分離し、陽性荷電ナイロン膜（アマシャム・ファルマシア社製）に転写した。この膜上でサンプルＲＮＡと１０ｎｇ／ｍｌのフルオレッセイン標識プローブ（ＢｍＨＢＰ：  ＢｍＨＢＰの翻訳開始メチオニンから１３３残基のｃＤＮＡ、アルファチューブリン：カイコアルファチューブリンｃＤＮＡの７１−５５５塩基部分、２８ｓ  ｒＲＮＡ：カイコ２８ｓ  ｒＲＮＡの１−２８８塩基部分）とハイブリダイゼーション反応させた（アマシャム・ファルマシア社製、ＧｅｎｅＩｍａｇｅ  キット）。ハイブリダイズしないプローブを洗浄により除いた後、膜上のフルオレッセインにアルカリ性フォスファターゼ標識特異抗体（抗体濃度１：５０００）を結合させ、最終アルカリ性フォスファターゼの化学発光反応によりハイブリダイズバンドを検出した。結果を図３に示す。図３において、Ｃ：無処理細胞の対照区、Ｓ：センスオリゴヌクレオチドを取り込ませた細胞、ＡＳ：アンチセンスオリゴヌクレオチドを取り込ませた実験区を示す。
【００５２】
図３から分かるように、２８ｓリボソーマルＲＮＡの解析は試料ＲＮＡ量の均一性を測るインターナルスタンダードであるが、センス・アンチセンスＤＮＡの取込み処理によらず無処理のものと比べ差異が認められなかった。またアルファチューブリンｍＲＮＡもセンス・アンチセンスＤＮＡの取り込み処理に影響されず、無処理区の結果との間で差異が認められなかった。これらに対し、ＢｍＨＢＰの転写産物ＲＮＡは無処理区およびセンスＤＮＡ取り込み区ではほとんど検出されなかったが、アンチセンスＤＮＡ取り込み区では多量のＢｍＨＢＰ転写産物の存在が検出された。上記の結果から、外来遺伝子の転写産物は、ＢｍＴＲＮ−１の本来の働きが関与して引き起こされる細胞内機能により崩壊すること、そしてこのＢｍＴＲＮ−１の働きを阻害したことにより、外来遺伝子の転写産物は崩壊を免れ、多量のタンパク質が産生したことが立証された。
【００５３】
実施例４：アンチセンスヌクレオチド発現によるＧＦＰの発現の向上
ＧＦＰの発現ベクター（ｐＧＦＰ）は実施例２と同様のものを使用し、またｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴのクローニングサイトに図４に示した配列（図４の上部のＢｍＴＲＮ−１の塩基番号を参照）のセンス配列又はアンチセンス配列を挿入した発現ベクターを使用して、実施例２（４）と同様の方法で細胞にｐＧＦＰベクター（１μｇ）と図４に示した量のセンス又はアンチセンスプラスミドを取り込ませて、細胞を４８時間培養した。ＧＦＰの発現をウエスタンブロッティングで調べた結果を図４に示す。
【００５４】
図４の結果から分かるように、アンチセンスプラスミドを取り込ませた細胞でＧＦＰは強く発現した。特に０．２５μｇのアンチセンスプラスミドが有効であった。プラスミドにコードされたアンチセンスＤＮＡは長期的に細胞内で産生するため、長期にわたる目的タンパク質大量生産の可能性をもたらすものである。
【００５５】
実施例５：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＦＲ１０の発現の向上
ｐＩＺ／Ｈｉｓ−Ｖ５／ＣＡＴをベースにカエル由来ＦＲ１０翻訳領域の翻訳開始メチオニンから９０残基までの配列と、ＳＶ５そして６Ｈｉｓの融合タンパク質を発現するようなベクター（ｐＦＲ１０）を構築した。ｐＦＲ１０を細胞内で発現させると、アミノ末端側２３残基は分泌シグナルであるため切り取られ、培地内には１０．８９ｋＤａのタンパク質が検出される。
【００５６】
実施例２（４）と同様の方法で細胞にｐＦＲ１０ベクター（１μｇ）と０．５μｇのセンス又はアンチセンスオリゴＤＮＡ（実施例２（３）で作成したもの）を取り込ませて、２４又は４８時間培養した。ＦＲ１０の発現をＳＶ５特異的抗体を用いてウエスタンブロッティングで調べた結果を図５に示す。
図５の結果から分かるように、アンチセンスプラスミドを取り込ませた細胞でＦＲ１０は強く発現した。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、昆虫細胞あるいは動物細胞などの宿主において外来遺伝子の発現を向上させることが可能になった。
【００５８】
【配列表】
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【００５９】
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2005021089.tif 000004
【００６０】
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【００６１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アンチセンスＢｍＴＲＮ−１オリゴヌクレオチドによる部分的ＢｍＨＢＰの高効率発現試験の結果を示す。
【図２】図２は、ＢｍＴＲＮ−１アンチセンスによる外来蛋白質の昆虫細胞内発現試験の結果を示す。
【図３】図３は、ＢｍＴＲＮ−１アンチセンスによる外来遺伝子転写産物量増大効果を示す。
【図４】図４は、ＢｍＴＲＮ−１のセンスおよびアンチセンスで処理した場合のＧＦＰ発現量を分析した結果を示す。
【図５】図５は、ＢｍＴＲＮ−１のセンスおよびアンチセンスで処理した場合のＦＲ１０発現量を分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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