(57)【要約】【課題】フローセル内に泡が混入したとしても、容易に泡が除去可能な表面プラズモン共鳴の測定方法を提供する。【解決手段】フローセルの出口に接続された流路の断面積が０．０４ｍｍ2以下であり、圧力損失によってフローセル内の圧力を高め、混入した泡を溶解・消失させる表面プラズモン共鳴の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップ表面に液を流すことのできるフローセルを有する表面プラズモン共鳴装置を用いる表面プラズモン共鳴の測定方法であり、フローセルの出口側の流路もしくは出口に接続された流路の断面積が０．０４０ｍｍ2以下である表面プラズモン共鳴の測定方法
【請求項２】
前記フローセルに流速５０μｌ／ｍｉｎ以上で液を送液する請求項１記載の表面プラズモン共鳴の測定方法
【請求項３】
フローセルの出口側の流路および出口に接続された流路の長さが３０ｃｍ以上である請求項１または２記載の表面プラズモン共鳴の測定方法
【請求項４】
チップ表面に液を流すことのできるフローセルを有する表面プラズモン共鳴装置を用いる表面プラズモン共鳴の測定方法であり、接液部の圧力が１．０×１０4Ｐａ以上となる条件で液を流すことを特徴とする表面プラズモン共鳴の測定方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、泡が混入しても、容易に泡が溶解除去される表面プラズモン共鳴の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学的なセンサー技術として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が知られている。ＳＰＲは金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、金属薄膜上の屈折率の変化を検出する方法である。ＳＰＲはバイオ分野、環境分野、工業分野へ応用されており、表面に固定化した生体分子の相互作用解析、抗原抗体反応モニター、糖度モニターなどに用いられている。
【０００３】
最近はバイオ分野の生体分子相互作用解析に注目が集まっており、ＳＰＲによるラベルフリーかつリアルタイム解析からＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得る試みがなされている。平衡状態を評価するだけでなく、結合、解離、反応などの速度を解析したＫｉｎｅｔｉｃｓデータは生体分子の機能を明らかにする上で非常に有用な情報となる。
【０００４】
通常のＳＰＲは基本的に一点のみの測定であるため、スループット性に欠ける。そこで同時に複数点の解析が可能なＳＰＲイメージング技術が注目されている。ＳＰＲイメージングにおいては、複数の生体分子を金蒸着表面に固定化したアレイを作製し、生体分子が固定化された部位の反射光強度をリアルタイムでモニターすることで、リアルタイムにＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得ることができる（非特許文献１）。
【０００５】
従来のＳＰＲでは測定点は狭い流路内で行う方式であり、泡が混入しても狭い流路内を泡が通過するために、泡が滞留する恐れが少なかった。最近ではランニングバッファと測定対象物質（アナライト）を含む溶液の間に恣意的に泡を混入させて、アナライトを含む溶液が希釈されず、完全に分け隔てられる技術が開発されている。
【０００６】
しかし、ＳＰＲイメージング法においてはチップ上の広い面積に対して液を流すため、泡が一旦混入すると、泡の部分は流れにくく、周囲の領域に流れる傾向となる。その結果、泡は全く除去されず、残ったままとなる問題点があった。特にチップをセットし、液を流し始めたときに泡がチップ上に残る場合が多く、容易には泡は除去されなかった。泡が存在すると、泡の存在する場所は全く測定できなく状態となるため、好ましくない。従って、測定前に泡を完全に除去する必要がある。
【０００７】
泡の混入を予防する手段として、ランニングバッファやアナライトを含む溶液を事前に脱気しておく手段が公知である。しかし、この手段は予防する手段としては効果があるかもしれないが、泡が混入してしまった場合、除去する手段としてはそれほど効果的ではない。
【０００８】
センサー面への試料液供給通路を設け、前記試料液供給通路内に、供給されてきた試料液中の気泡をトラップする凹所を設けたＳＰＲ装置が開発・開示されている（特許文献１）。試料中に泡が混入していた場合、センサー面に泡が入るのを防ぐ優れた技術である。しかし、一旦入った泡を取り除く方法は示されていない。
【０００９】
また、従来のＳＰＲ装置においてはフローセルの入口側の内部容量を微小化し、アナライトのインジェクションからセンサー表面までの到達までのレスポンスが短くなるようには工夫されたものがあるものの、フローセルの出口部分はそのまま開放されて廃液とする場合が多く、出口側に工夫を加えたものはほとんどみられなかった。
【特許文献１】特開２００３−２９４６１３号公報
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎら、  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１巻、３９２８頁−３９３４頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、フローセル内に泡が混入したとしても、容易に泡が除去可能な表面プラズモン共鳴の測定方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．チップ表面に液を流すことのできるフローセルを有する表面プラズモン共鳴装置を用いる表面プラズモン共鳴の測定方法であり、フローセルの出口側の流路もしくは出口に接続された流路の断面積が０．０４０ｍｍ2以下である表面プラズモン共鳴の測定方法
２．前記フローセルに流速５０μｌ／ｍｉｎ以上で液を送液する１記載の表面プラズモン共鳴の測定方法
３．フローセル出口に接続された流路の開放された出口までの長さが３０ｃｍ以上である１または２記載の表面プラズモン共鳴の測定方法
４．  チップ表面に液を流すことのできるフローセルを有する表面プラズモン共鳴装置を用いる表面プラズモン共鳴の測定方法であり、接液部の圧力が１．０×１０4Ｐａ以上となる条件で液を流すことを特徴とする表面プラズモン共鳴の測定方法
【発明の効果】
【００１２】
本発明の表面プラズモン共鳴測定方法は泡が混入しても容易に溶解除去することができる測定方法であり、操作性が大幅に改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明で使用されるＳＰＲ装置はフローセルを有している。フローセルの材質、形状は特に限定されるものではなく、材質としてはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコン系ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）などの抗薬品性を有するポリマー、チタンなどの抗腐食性の金属などの材質が挙げられ、形状としては一体型のマイクロ流路セル、固体の板とチップの間にガスケットを挟み込んで流路部分を確保したセル、Ｏリングで液漏れを防いだセルなどが挙げられる。加工方法としては、削り出し、焼成、エッチング、射出など、それぞれの素材に適合したものであれば、特に限定されるものではない。
【００１４】
また、チップは基板の表面に測定対象物質と何らか結合や相互作用を示す物質が設置されたセンサー部を有し、センサー部はアレイ状に配置されていることができる。
【００１５】
本発明に使用されるフローセルはチップ表面のセンサー部に液を供給して流すことができ、液の入口と出口を有する。ここで、フローセルの流路でチップ表面のセンサー部と液が接触するための領域を接液部と呼ぶ。また、単にフローセル内部という場合はこの接液部を意味する。フローセルの入口側は特に限定されるものではないが、少なくとも５０μｌ／ｍｉｎ以上の流速で水を供給できる能力を有するポンプが接続されていることが好ましい。ポンプの種類も特に限定されるものではなく、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、ギアポンプなどが挙げられる。また、加圧タンクを用いることもできる。
【００１６】
本発明において使用されるフローセルの出口側の流路もしくは出口に接続された流路は細くなるように設計されており、流路中の液の進行方向に対して垂直方向の切断面における断面積は０．０４ｍｍ2以下が好ましく、さらに好ましくは０．０３ｍｍ2以下である。
【００１７】
ここで、フローセルの出口側の流路もしくは出口に接続された流路とは、接液部以降を示し、フローセルの出口側の流路とは、接液部出口からフローセルの液出口を表し、出口に接続された流路とは、フローセルの出口側のチューブ、フローセルとチューブまたはチューブ同士や他の部品とのコネクターを表し、これら各部に設けられた弁などの部分を含む。以下、出口側の流路もしくは出口に接続された流路を総称して出口側流路と記することがある。
【００１８】
Ｈａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式（式１）より、流路の相当半径の４乗に、圧力損失は反比例する。
【００１９】
【数１】
2005227059.tif 000002
【００２０】
式１において、符号は以下の通りである。
ｐ0−ｐL：静圧差  [Ｐａ]
μ：流体の粘度  [Ｐａ・ｓ]
Ｌ：流路の長さ  [ｍ]
＜ｕ＞：平均断面速度  [ｍ／ｓ]
Ｒ：流路の相当半径  [ｍ]
Ｖ：流速  [ｍ3／ｓ]
【００２１】
流路を細くすることで、フローセル内部に圧力を与えることが可能である。圧力を加わると、混入した泡が液中に溶解しやすくなり、容易に泡が除去されるため好ましい。流路の断面形状は耐圧上、円形であることが好ましい。また素材としてはＳＵＳなどの金属、ＰＥＥＫ、テフゼルなどの耐圧性、耐薬品性に優れたポリマーが好ましい。ＰＥＥＫ製のチューブが耐圧性、耐薬品性の面で特に好ましい。
【００２２】
フローセルに送液する液の流速は５０μｌ／ｍｉｎ以上であることが好ましい。当然、液漏れはないため、フローセル出口の流速も、入口と同じ流速である。これも前記理由と同様にフローセル内部に圧力を与え、泡を溶解除去しやすくするためである。流速を上げることで断面平均速度＜ｕ＞が増大し、その結果圧力損失が増加する。さらに好ましい流速は１００μｌ／ｍｉｎ以上であり、場合によっては、流速を上げたり下げたりする方法、瞬間的に圧力波を与え、一気に泡を押し流す方法なども含む。
【００２３】
出口側流路の長さは３０ｃｍ以上、さらには４０ｃｍ以上であることが好ましい。これも長ければ長いほど圧力損失が生じるためである。出口側流路の液出口末端は基本的に開放系であり、排出され液は廃液として廃棄される。
【００２４】
出口側流路の断面積が、液出口末端までの間で変化している場合、断面積が０．０４ｍｍ2以下である部分が少しでも含まれている場合は本発明に含まれる。この場合、断面積０．０４０ｍｍ2以下の流路部分が３０ｃｍ以上存在していることが好ましい。
【００２５】
また、フローセル入口側の流路もしくは入口に接続された流路（以下入口側流路と総称することがあり、ポンプやタンク等の送液部から接液部までを表す）は、ポンプに負担をかけず、フローセルに効率よく圧をかけるために、同一の液を同一の流速で流した際に、入口側流路で生じる圧力損失が出口側流路で生じる圧力損失より小さいことが好ましい。
上記の具体的な方法としては、入口側流路の断面積の最少部分を出口側流路の断面積の最少部分より大くする、入口側流路の長さを出口側流路の長さより短くする、等の方法が挙げられる。
【００２６】
本発明のＳＰＲ測定方法においては、接液部の圧力は１．０×１０4Ｐａ以上であることが好ましい。圧力が高いことで混入した泡が溶解して除去されるためである。前述の方法を適宜採用することにより、接液部の圧力を１．０×１０4Ｐａ以上とすることがる。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例］
【００２９】
図１に示すフローセル（材質：ＰＥＥＫ）を備えたＳＰＲイメージング装置（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（Ｒ）：東洋紡績製）にＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（Ｒ）  ＣＯＯＨチップ（東洋紡績製）をセットした。このフローセルに、断面直径０．１７ｍｍで長さ６０ｃｍのＰＥＥＫ製チューブを接続し、２５０μｌ／ｍｉｎの流速で脱気処理を施した水を流した。脱気処理は超音波を当て、アスピレータで１０分間減圧させた。チューブの断面積は０．０２３ｍｍ2と計算され、０．０４０ｍｍ2以下である。ＳＰＲ装置の温度は３０℃に保って実験を行った。
水を通液直後は図２のように泡が混入したものの、その泡は１０分以内に消失した。空気が液中に溶解したためである。このフローセル内の圧力を以下のパラメータをＨａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式に代入し算出した。
流体の粘度：μ＝０．７９７×１０-3  [Ｐａ・ｓ]
流路の長さ：Ｌ＝０．６  [ｍ]
流路の相当半径：Ｒ＝８．５×１０-5  [ｍ]
流速：Ｖ＝４．２×１０-9   [ｍ3／ｓ]
計算の結果、静圧差は９．７×１０4Ｐａであり、１．０×１０4Ｐａ以上であった。泡の除去が完了したのちは、流速を１００μｌ／ｍｉｎに落として、実験を行った。流速１００μｌ／ｍｉｎにおけるフローセル内圧力は３．９×１０4Ｐａと計算され、測定中においても１．０×１０4Ｐａ以上の高い圧力を保っている。この場合、測定中に泡が混入しても、泡が消失する可能性が高く、泡によって測定が中断される危険性が少ない。
【００３０】
［比較例］
図１に示すフローセル（材質：ＰＥＥＫ）を備えたＳＰＲイメージング装置（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（Ｒ）：東洋紡績製）にＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（Ｒ）  ＣＯＯＨチップ（東洋紡績製）をセットした。このフローセルに、断面直径０．２５ｍｍで長さ２０ｃｍのＰＥＥＫ製チューブを接続し、２５０μｌ／ｍｉｎの流速で水を流した。チューブの断面積は０．０４９ｍｍ2と計算され、０．０４ｍｍ2以上であり本発明を満たさない。
実施例と同様に水を通液直後に泡が混入し、水を流したが、泡は３０分経過した段階で、やや小さくなったものの消失しなかった。このフローセル内の圧力をＨａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式から計算したところ、６．９×１０3Ｐａであり、１．０×１０4Ｐａ以下であった。圧力が不十分であり、混入した泡は容易には溶解消失しない。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の表面プラズモン共鳴測定方法は泡が混入しても容易に溶解除去することができる測定方法であり、操作性が大幅に改善され、産業界に貢献すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例、比較例で用いたフローセルの設計図  単位（ｍｍ）
【図２】チップ上に泡の混入したＳＰＲイメージング像
【図１】
2005227059.tif 000003
【図２】
2005227059.tif 000004