(57)【要約】【課題】  インターロイキン６とその拮抗的阻害剤との共結晶化を可能とする。更には、インターロイキン６の拮抗的阻害剤の探索、評価および設計を可能とする。【解決手段】  本発明は、新規な結晶構造を有するインターロイキン６の結晶、およびその結晶化方法に関する。本発明は更に、該インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン６の直方晶系結晶であって、単位格子定数がａ＝４９．２８±０．２Å、ｂ＝１１２．７０±０．３Å、ｃ＝３２．５４±０．２Åであり、且つ空間群がＰ２１２１２である、結晶。
【請求項２】
蒸気拡散法によるインターロイキン６の結晶化において、沈殿剤としてポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物を用いることを特徴とする、インターロイキン６の結晶化方法。
【請求項３】
インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、候補化合物を溶解させ、次いで該溶液に請求項１に記載のインターロイキン６の結晶を浸漬させる工程；および、
ｂ）該結晶が該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程；
を含む、該スクリーニング方法。
【請求項４】
インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、インターロイキン６および候補化合物を溶解させる工程；
ｂ）蒸気拡散法により、該インターロイキン６と該候補化合物との結晶を得る工程；および、
ｃ）得られた結晶が該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程； 
を含む、該スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な結晶構造を有するインターロイキン６の結晶、およびその結晶化方法に関する。本発明は更に、該インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、動物細胞の増殖および分化において様々な細胞間シグナル伝達として働くタンパク質性シグナル伝達分子である。サイトカインの特徴としては、例えば細胞表面にある特異的な受容体と結合することによってはじめて生理活性が発揮されること、サイトカインネットワークが存在すること、および本来は生体内の恒常性の維持に寄与しているが、病態の作用機序にも深く関連していることなどが挙げられる。すなわち、サイトカインが産生されると、それに対応する特異的な受容体に結合することにより細胞が活性化され、それぞれのサイトカインに特有の生理活性が発現する。また、ある１つのサイトカインが産生されると次に別のサイトカインが産生されるといった、サイトカインネットワークと呼ばれる連鎖性が存在する。更に、生体内ではサイトカイン産生において正の調節機構と負の調節機構とが併存し、正常な状態ではバランスよく作動しているが、このバランスが崩れると異常なサイトカイン産生の状態が出現し、様々な病態を誘導する。従って、サイトカイン機能亢進による多くの疾患に対して安価で生活の質（ＱＯＬ）を高める治療が望まれており、これにより患者個人だけではなく医療財政の軽減による国内経済への貢献および世界の保険政策への多大な貢献を与えると期待される。
【非特許文献１】宮坂信之編，「最新医学からのアプローチ（第１巻）サイトカイン」，メジカルビュー社，1991年5月，p.1-4。
【０００３】
インターロイキン６（以下、ＩＬ−６と略す）は、活性化Ｂ細胞に作用して抗体産生細胞への分化を誘導するＢ細胞刺激因子として単離された糖タンパク質であるサイトカインの一種である。ＩＬ−６の異常産生は、生体内の異常な免疫反応に限られず、造血の異常、過度の炎症反応および腫瘍の増殖など様々な疾患に関与することが知られている。該疾患としては、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患に大別される。前者としては多発性骨髄腫（例えば、非特許文献２を参照）、クローン病、悪性リンパ腫、腎癌、前立腺癌、カポジ腫および心房粘液腫などが挙げられ、後者としては例えばメサンギウム増殖腎炎、尋常性乾癬および慢性関節リウマチ（例えば、非特許文献３を参照）を挙げることができる。
【非特許文献２】Hirano，T.およびKishimoto，T.ら著，Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor-2 in rheumatoid arthritis. Eur. J. Immunol. Vol.18, p.1797-1801, 1988。
【非特許文献３】Kawano, M.およびT. Kishimotoら著，Autocrine generation and requirement of BSF-2/IL-6 for human maltiple myelomas. Nature Vol.332, p.83-85, 1988。
【０００４】
生体内において、ＩＬ−６はＩＬ−６に特異的な受容体であるインターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合して、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ複合体を形成する。その後に、該複合体はＩＬ−６ファミリーに共通の受容体であるｇｐ１３０のホモダイマーに結合して６量体を形成し、その際に膜内にシグナルを送ることが知られる。
【０００５】
一方、タンパク質を含めた生体高分子の構造を詳細に知ることは今日の生命科学を遂行する上で、もはや必須であり特にＸ線結晶構造解析で得られる原子レベルの構造情報はそれら分子の生体内における機能を理解する上で不可欠である。ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０との関係の構造面からの解析はこれまでに発表され（例えば、非特許文献４を参照、但し、該報告では受容体の構造は細胞外ドメインのみの部分構造であり、完全なものではない）、それぞれの結合様式は詳細に解明されつつあり、今後さらに医科学的な研究も進む事が期待されている。
【非特許文献４】Martin J. Boulanger, Dar-chone Chow, *Elena E. Brevnova, K. Christopher Garciaら著, Hexameric Structure and Assembly of the Interleukin-6/IL-6 _ Receptor/gp130 Complex, Science Vol.300, p.2101-2104, 2003。
【０００６】
タンパク質の結晶化の方法（例えば、非特許文献５を参照）は一般的に、低分子有機化合物において用いられる方法とは異なり、多くの生理学的な因子（例えば、ｐＨ、温度、塩濃度）を一定に保つことが要求される。特に、結晶化は溶解度の低下による過飽和点の状態で実現されるために、沈殿剤などの添加物による塩濃度が特に重要な因子となる。
【非特許文献５】中嶋暉躬ら編，「新基礎生物化学実験法（第５巻）高次構造・状態分析」，丸善株式会社，1989年9月，p.180-217）。
【０００７】
タンパク質の結晶化方法において用いられる該沈殿剤は、無機塩、有機溶媒およびポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）に大別される。まず、無機塩としては硫酸塩（例えば、硫安および硫酸ナトリウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸アンモニウムおよびナトリウム塩）、リン酸塩（例えば、リン酸カリウムおよびナトリウム塩）、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウムおよびアンモニウム塩）および硝酸塩（例えば、硝酸アンモニウム塩）が含まれる。また、有機溶媒としては例えば、２−メチル−２,４−ペンタンジオール（ＭＰＤと略す）、イソプロパノール、ジオキサンおよびアセトンなどを含む。
【０００８】
ＰＥＧは、無機塩の硫安と並んで有用な有機添加剤である。ＰＥＧはその平均分子量分画が広範囲にわたる様々な製品を容易に入手することができる。例えば、油状のＰＥＧ２００（分子量２００）から、ロウ状のＰＥＧ２００００までが知られる。
【０００９】
更に、上記のＩＬ−６と、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０を含めたタンパク質、拮抗的阻害剤であるペプチドおよび有機低分子などとの複合体の結晶、すなわち共結晶の結晶構造解析は、ＩＬ−６の異常産生に関連する疾患に対する治療、医薬品の開発を行なうために重要な基礎的構造情報を与える。特に、ＩＬ−６受容体に対して可逆的に且つ競合的にＩＬ−６と結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合を阻害する、いわゆるＩＬ−６拮抗的阻害剤と、ＩＬ−６との共結晶の構造情報により、新規なＩＬ−６拮抗的阻害剤の探索、評価および設計を行なうための簡便なスクリーニング法を開発することが可能となる。該共結晶は、該タンパク質の結晶を該ペプチドなどの溶液中に浸漬し、該ペプチドなどが該タンパク質結晶中の所定部位に侵入することによって得られる。その際の、共結晶化溶液の条件は通常、それらタンパク質の結晶化に用いた条件と同一条件でなければいけない。その理由はいくつか挙げられるが、１つは結晶化の条件と異なる条件で行なうことにより該ＩＬ−６結晶が溶解してしまったりまたは周囲の塩の影響で該結晶が壊れてしまうことが挙げられる。
【００１０】
ここで、一般的にタンパク質とタンパク質（ペプチドなどを含む）との相互作用は、ファンデルワールス相互作用、水素結合および電気的な相互作用（すなわち、クーロン相互作用）などの結合である。そこで、高塩濃度条件下での共結晶化は、例えば沈殿剤として用いる周囲環境の塩が当該タンパク質結晶全体にわたって拡散したりおよびタンパク質に結合し得るためにタンパク質間の相互作用が阻害され、あるいは高塩濃度が原因でペプチドが溶出したりおよび沈殿化してしまうために、非常に制約されていた。よって、タンパク質同士の共結晶化を達成するには、その前提としてそれらタンパク質自体の結晶化を低塩濃度下で達成することが必須である。更に、創薬の観点から見れば生体内と同一の低塩濃度条件下での共結晶化により得られる情報でなければ実用性に乏しいとも言える。
【００１１】
上記の通り、ＩＬ−６関連疾患について生化学的な見地からはその作用機序が報告されているが、その構造学的な見地からは依存として未解明な部分が多い。これまでに、ＩＬ−６（例えば、非特許文献６を参照）のＸ−線結晶構造解析が報告されている。しかしながら、そのＩＬ−６の結晶は、沈殿剤として硫安などの無機塩を高塩濃度で用いて得たものである。したがって、従来の結晶化方法では、続いてＩＬ−６とペプチドとの共結晶化を行ない、ＩＬ−６拮抗的阻害剤の探索、評価および設計を行なうことは困難であった。
【非特許文献６】Somers, W.およびSeehra, J. S.ら著，1.9A crystal structure of interleukin 6: implications for a nevel mode of receptor dimerization and signaling., EMBO J 16， pp. 989 1977。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＩＬ−６阻害剤の探索、評価および設計には、ＩＬ−６とＩＬ−６拮抗的阻害剤との共結晶化が可能な低塩濃度条件下でのＩＬ−６の結晶化条件を確立することが重要である。しかしながら、現時点では低塩濃度条件下でのＩＬ−６の結晶化法は知られていない。
【００１３】
本発明者らは低塩濃度条件下でＩＬ−６の結晶化に成功した。また、本発明者らは得られた結晶についてＸ−線構造解析を行ない、その立体構造を解明して、そのものが新規な結晶構造を有するＩＬ−６の結晶であることをも見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、インターロイキン６の直方晶系結晶であって、単位格子定数がａ＝４９．２８±０．２Å、ｂ＝１１２．７０±０．３Å、ｃ＝３２．５４±０．２Åであり、且つ空間群がＰ２１２１２である結晶を要旨とする。
【００１５】
本発明は、蒸気拡散法によるインターロイキン６の結晶化において、沈殿剤としてポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物を用いることを特徴とする、インターロイキン６の結晶化方法をも要旨とする。
【００１６】
本発明は、インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、候補化合物を溶解させ、次いで該溶液に請求項１に記載のインターロイキン６の結晶を浸漬させる工程；および、
ｂ）該結晶が該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程；
を含む、該スクリーニング方法をも要旨とする。
【００１７】
本発明は更に、インターロイキン６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、インターロイキン６および候補化合物を溶解させる工程；
ｂ）蒸気拡散法により、該インターロイキン６と該候補化合物との結晶を得る工程；および、
ｃ）得られた結晶が該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程； 
を含む、該スクリーニング方法をも要旨とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ＩＬ−６の製造法
例えば、以下に本発明におけるＩＬ−６の製造法を説明するが、該方法は例示するものであって、これらに限定されるものではない。
大腸菌HB101にインターロイキン６のcDNAを組み込んだプラスミドベクターを形質転換により組み込み、３０リットル培養装置で２０リットル培養する。菌体を回収し、高圧破砕機で菌体を破砕し、遠心機によって７６００Ｇの２０分で、封入体として回収する。５００ｍｌの洗浄液（２０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解させ、８０００Ｇで１５分の遠心分離で再度回収する。ペレットを６Ｍグアニジン塩酸ｐＨ５．５中で２時間、室温にて静置することにより可溶化させる。６Ｍから０．６Ｍまで、２２℃、１６時間かけてグアニジン濃度を下げ、終溶解液（０．６Ｍグアニジン塩酸、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）の状態にまで溶液状態を徐々に変化させる。この作業によりインターロイキン６はリフォールディングし、正常な構造を持つ蛋白質となる。得られた蛋白質溶液を、ゲル濾過（Sephadex G-25）のカラムに通し、溶出液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で溶出し、インターロイキン６を回収する。溶出液に酢酸ナトリウムを適量追加し、２５０ｍＭのｐＨ５．０にし、これを陽イオン交換カラム（CM−SepharoseFF）に通し、酢酸ナトリウムの濃度勾配で溶出する。溶出液をギ酸でｐＨ４．０に調節し、逆相ＨＰＬＣカラムに通し、アセトニトリルの濃度勾配による溶出バッファー（０．１Ｍギ酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を用いて溶出させる。その後、さらにゲル濾過（Sephadex G-25M）に２回かける。１回目の溶出バッファーは２０ｍＭ酢酸  １０％アセトニトリルを用い、２回目の溶出バッファーは５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を用いる。その後、陽イオン交換カラムCM-SepharoseFFに通す。平衡化は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で行ない、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出させる。これを３回繰り返し、最後に、ゲル濾過ＨＰＬＣ（Superdex-75HR60/600）に通し、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で溶出し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、８．７ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の緩衝液でバッファー置換及び濃縮を行う（Ejima, D., Watanabe, M. Sato, Y., Date, M., Yamada, N., Takahara, Y: High yield refolding and purification process for recombinant human interleukin-6 expressed in Escherichia coli., Biotechnol Bioeng.; Vol.62 (3): p.301-10, 1999を参照）。
【００１９】
（２）ＩＬ−６結晶の製造法
本発明において実施可能なタンパク質の結晶化方法は、タンパク質の結晶化方法として当該分野においてよく知られる方法を用いることができる。該結晶化の方法としては、（静置）バッチ法、透析法、自由界面拡散法および蒸気拡散法などを含むが、これらに限定されない。特に、本発明の結晶化法としては、沈殿剤の濃度を外液の該濃度によって微妙に調節することができるので、上記の通り続く共結晶化の条件において低塩濃度を実現可能な蒸気拡散法が好ましい。ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法が特に好ましい。
【００２０】
蒸気拡散法の原理は以下の通りである。まず、結晶化容器を用いて閉鎖系空間を作り出す。該容器内閉鎖系は、タンパク質を含む内液（液滴を含む）と、外液（リザーバー液を含む）とから構成する。その際に、予め内液の塩濃度および沈殿剤の濃度は過飽和点よりも低い濃度とし、一方で外液の塩濃度および沈殿剤の濃度は過飽和点よりも高い濃度とする。内液と外液との間には大きな浸透圧の差異が存在するので、水蒸気が徐々に内液から外液に向かって移動し、内液の各成分濃度はこの蒸気平衡を通じて外液との平衡状態に達するまでゆっくりと上昇する。その結果、内液の過飽和状態を作り出すことが可能となり、目的の結晶を得ることができる。
【００２１】
例えば、以下に本発明における蒸気拡散法を用いた結晶化法を説明するが、該方法は例示するものであって、これらに限定されるものではない。
蒸気拡散法を用いた本発明の結晶化法は、
ａ）ＩＬ−６の溶液を提供する工程；
ｂ）沈殿剤としてＰＥＧ８０００および１０００の混合物を含有する沈殿剤溶液を提供する工程；
ｃ）該ＩＬ−６溶液と該沈殿剤溶液と混合させて混合液滴を得る工程；および
ｄ）得られる混合液滴とｂ）で得られるリザーバー液の沈殿剤溶液とを別々に共存させ、蒸気平衡により該液滴中でＩＬ−６結晶が成長するまで、該混合液滴を放置する工程
を包含する。
【００２２】
ハンギングドロップ法においては、該ｄ）の放置する工程において、ｃ）の混合工程で得られる該混合液滴を密封容器中で沈殿剤溶液を保持する溶液溜め部の上に懸垂させ、且つ該溶液溜め部中の該沈殿剤の濃度は該混合液滴中の該濃度よりも高い。
【００２３】
また、シッティングドロップ法においては、該ｄ）の放置する工程において、ｃ）の混合工程で得られる該混合液滴を密封容器中で沈殿剤溶液を保持する溶液溜め部の上部の液滴台中に静置させ、且つ該溶液溜め部中の該沈殿剤溶液の濃度は該混合液滴中の該濃度よりも高い。
【００２４】
本発明の結晶化方法において用いる該沈殿剤は、様々な平均分子量分画を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧと略す）を含み、例えばＰＥＧ２００〜２００００を含むが、これらに限定されない。特にＰＥＧ８０００と１０００の混合物が好ましく、それらの重量比は約１：２〜約２：１が許容され、重量比が１：１である混合物が特に好ましい。
【００２５】
更に、本発明の結晶化方法は１種類以上の緩衝剤をさらに含んでいてもよい。該緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（例えば、Ｔｒｉｓ・クエン酸ナトリウム）およびリン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。更に、結晶化溶液のｐＨは該緩衝剤によって調節することができ、他のｐＨ値も本発明によって意図されるものの、好ましくはｐＨ６〜７．５である。
【００２６】
本発明のハンギングドロップ蒸気拡散法による結晶化の条件を例示する。
液滴の組成：
ＩＬ−６                                １０〜２０ｍｇ／ｍＬを２〜１０μＬ
ＰＥＧ８０００と１０００の重量比が
１：１の混合物                          ４〜５％
Ｔｒｉｓ・クエン酸ナトリウム            ０．５〜２０ｍＭ（ｐＨ  ７．０）
リン酸ナトリウム水溶液                  ０．１〜２０ｍＭ
リザーバー液の組成：
容量                                    ０．３〜０．５ｍＬ
ＰＥＧ８０００：１０００の重量比が
１：１の混合物                          ８〜１０％
【００２７】
液滴におけるＩＬ−６溶液の濃度は約１〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲が許容され、１０〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲であることが好ましい。該緩衝剤の濃度はそれぞれ約０．１〜２００ｍＭの範囲で許容され、約５〜１００ｍＭの範囲であることが好ましく、該緩衝剤を加えることにより、液滴のｐＨは約６〜７．５の範囲を許容される。その液滴の容量は約１〜１０μＬが許容される。一方、リザーバー液の容量は約０．１〜０．８ｍＬが許容される。
【００２８】
結晶化は４〜２０℃で行ない、数日後に良好な結晶が得られる。得られる結晶は６角形の板状であり、これまで報告されている空間群ｐ３１２１の結晶とは異なることを見出した。比較として、これまでに報告されている（上記引用文献６を参照）結晶化条件は、液滴中のＩＬ−６の濃度が１５ｍｇ／ｍＬであって、またリザ−バー液には沈殿剤としてＰＥＧは用いられず、高濃度の塩（すなわち、１．８Ｍ  硫安、３００ｍＭ  酒石酸ナトリウムカリウム、１００ｍＭ  クエン酸ナトリウム）が用いられている。ここで、本発明の結晶化条件における液滴中の塩は、タンパク質の結晶化法において通常用いられる緩衝剤に含有される塩であって、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどの塩を含むが、これらに限定されない。これらの塩濃度は、タンパク質の結晶化法において通常沈殿剤として使用される塩の濃度よりも非常に有意に低い。すなわち、沈殿剤として通常用いられる塩濃度は約１００ｍＭ〜２Ｍであるのに対して、本発明において許容される塩濃度は約０．１ｍＭ〜２００ｍＭであって、次数がおよそ１０２倍の低い塩濃度で結晶化が可能であった。よって、有意な低塩濃度でＩＬ−６の結晶化を達成することに成功した。
【００２９】
（３）ＩＬ−６結晶のＸ線構造解析の方法
例えば、以下に本発明におけるＩＬ−６結晶のＸ線構造解析の方法を説明するが、該方法は例示するものであって、これらに限定されるものではない。
上記の結晶化の方法で得られたＩＬ−６の結晶について、Ｘ線構造解析を行なった。当該単結晶のＸ線回折データの収集は、回転対陰極を装備したＸ線発生装置または放射光を利用したＸ線を利用することができる。本発明においては、装置としてＳＰring８のタンパク研ビームラインＢＬ４４ＸＵを用いる。次いで、回折斑点の処理はＸ線回折データの処理プログラムとしてＤｅｎｚｏ（マックスサイエンス）を用いて行ない、分解能２．２６Åを得た。初期位相の決定には、重原子多重同型置換法、多波長異常分散法、分子置換法を利用することができる（Jan Drenthによる[Principles of Protein X-ray crystallography], Springer-verlag Inc. (1994)）。ＩＬ−６の構造解析データが知られているために（上記引用文献６参照）、本発明における初期位相の決定は、ＰＤＢに登録されているＳｏｍｅｒｓらによるデータ（ＰＤＢ  Ｎｏ．１ＡＬＵ）を用いた分子置換法を用いた。次いで、初期位相の決定後に、初期的な分子モデルの構築を行なった。該構築はグラフィックスプログラムを用いたワークステーションによってモデルを作成した。モデル構築後に、立体化学的な制約を課した立体構造精密化プログラムであるＣＮＳを用いて構造の精密化を行なった。得られた分子モデルを、プログラムＯ（Jonesら，Acta Crystallogr．A 47；1991，110−119）を用いて修正した。
【００３０】
本発明は、ＩＬ−６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング方法にも関する。該スクリーニング方法は、以下の２通りの方法を用いて行なうことができる。すなわち、第１の方法は、ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、候補化合物を溶解させ、次いで該溶液に本発明で得られるＩＬ−６の結晶を浸漬させる工程；および、ｂ）該結晶が該ＩＬ−６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程、を含む。ここで、ａ）の共結晶を得る工程は上記のＩＬ−６結晶の製造法における記載に従って行なう。すなわち、該沈殿剤としてのＰＥＧ８０００と１０００の重量比が例えば、１：１の混合物の存在下、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）を含む溶液に、候補化合物を溶解させ、次いで該溶液に上記で得たＩＬ−６の結晶を浸漬させる。ここで、溶液中におけるＩＬ−６と候補化合物の濃度は、それぞれＩＬ−６が０．０５−１ミリモル／ｍＬ、候補化合物が０．５〜１０ミリモル／ｍＬが許容される。次いで、該結晶が所望する該ＩＬ−６と該候補化合物との共結晶であるかどうかの分析を行なう。分析方法としては、Ｘ線結晶解析法、ＮＭＲ法、顕微鏡写真法などを含む。例えば、該結晶についてのＸ線構造解析法は、一般的なＸ線構造解析法に従って行なうことができる。すなわち、該単結晶のＸ線回折データを収集し、次いで、上記のＩＬ−６結晶の結晶構造解析において得られるデータを利用する分子置換法によって初期位相を決定する。初期位相の決定後に、初期的な分子モデルを構築し、その後に、精密化プログラムを用いて構造の精密化を行ない、最後に結晶を解析して所望の共結晶であるかどうかを分析する。これらの分析方法を実施することにより、候補化合物の有無および結合様式を知ることが可能となる。
【００３１】
第２のスクリーニング方法は、ａ）沈殿剤としてのポリエチレングリコール８０００および１０００の混合物の溶液に、インターロイキン６および候補化合物を溶解させる工程；ｂ）蒸気拡散法により、該インターロイキン６と該候補化合物との結晶を得る工程；および、ｃ）得られた結晶が該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶であるかどうかを分析する工程、を含む。すなわち、本方法は直接的に該インターロイキン６と該候補化合物との共結晶を得ることを特徴とする。
【００３２】
該ａ）およびｂ）の工程は上記のＩＬ−６結晶の製造法に記載に従って行なう。すなわち、ａ）の工程において、該溶液は、沈殿剤として様々な平均分子量分画を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧと略す）を含み、例えばＰＥＧ２００〜２００００を含むが、これらに限定されない。特にＰＥＧ８０００と１０００の混合物が好ましく、それらの重量比は約１：２〜約２：１が許容され、重量比が１：１である混合物が特に好ましい。また、溶液は１種類以上の緩衝剤をさらに含んでいてもよい。該緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（例えば、Ｔｒｉｓ・クエン酸ナトリウム）およびリン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。更に、結晶化溶液のｐＨは該緩衝剤によって調節することができ、他のｐＨ値も本発明によって意図されるものの、好ましくはｐＨ６〜７．５である。また、ｂ）の蒸気拡散法としては、ハンギングドロップ法およびシッティングドロップ法が好ましい。液滴におけるＩＬ−６および候補化合物の濃度はそれぞれ、ＩＬ−６が０．０５−１ｍｍｏｌ／ｍＬ、候補化合物が０．５−１０ｍｍｏｌ／ｍＬが許容される。該緩衝剤の濃度はそれぞれ約０．１〜２００ｍＭの範囲で許容され、約５〜１００ｍＭの範囲であることが好ましく、該緩衝剤を加えることにより、液滴のｐＨは約６〜７．５の範囲を許容される。その液滴の容量は約１〜１０μＬが許容される。一方、リザーバー液の容量は約０．１〜０．８ｍＬが許容される。次いで、得られた結晶が所望する該ＩＬ−６と該候補化合物との共結晶であるかどうかの分析を行なう。分析方法としては、Ｘ線結晶解析法、ＮＭＲ法、顕微鏡写真法などを含む。例えば、該結晶についてのＸ線構造解析法は、一般的なＸ線構造解析法に従って行なうことができる。すなわち、該得られた単結晶のＸ線回折データを収集し、次いで、上記のＩＬ−６結晶の結晶構造解析において得られるデータを利用する分子置換法によって初期位相を決定する。初期位相の決定後に、初期的な分子モデルを構築し、その後に、精密化プログラムを用いて構造の精密化を行ない、最後に結晶を解析して所望の共結晶であるかどうかを分析する。これらの分析方法を実施することにより、候補化合物の有無および結合様式を知ることが可能となる。
【実施例１】
【００３３】
（１）ＩＬ−６結晶の製造法
ハンギングドロップ法を用いた結晶化法について記載する。ＩＬ−６は、味の素株式会社より提供を受けたものを用いた。まず、ＩＬ−６（２１ｍｇ）をＴｒｉｓ・クエン酸ナトリウム１ｍＭ・リン酸ナトリウム１ｍＭの水溶液（ｐＨ６．８）に溶解することにより、ＩＬ−６の水溶液を調製した。ＩＬ−６の最終濃度は、２１ｍｇ／ｍＬとした。次いで、リザーバー液は、ＰＥＧ８０００（１６ｍｇ、ハンプトン製）およびＰＥＧ１０００（１６ｍｇ、ハンプトン製）を水（１ｍＬ）に加えて１０％の水溶液を調製した。このものは、０．２２μのフィルターでろ過してから使用した。結晶化の容器は２４穴プレート（ＴＰＰ製）を用いた。カバーガラスはシリコーン処理した。また、リザーバーの口のところには、シリコーングリースを塗って、該カバーガラスを密着させ、蒸気平衡を保った。次いで、該カバーガラス上で、上記で調製したリザーバー溶液（２μＬ）中に、上記のＩＬ−６水溶液（２μＬ）を加えて撹拌しながら混合することによって、ＰＥＧ混合物の濃度が８％の液滴を調製した。十分に混合した後に、該カバーガラスを静かに反転させ、リザーバー上部に懸垂させた。そして、この結晶化容器をインキュベーター（２０℃）中に静置することによって、結晶を製造した。結晶は約３日後に生成し、ＩＬ−６の結晶を得た。
【００３４】
（２）ＩＬ−６結晶の構造解析の結果、得られた知見
本発明で得られた結晶の構造解析データを、以下の表１にまとめる。なお、比較としてこれまでに報告されている引用文献６に記載の構造解析データをもあわせて示す。
表１．Ｘ線結晶構造解析データ
2005170832.tif 000002
これまで報告されている結晶の空間群はＰ３１２１の斜方晶系であるのに対し、本発明の結晶の空間群はＰ２１２１２の直方晶系を有していた。このことは、ＩＬ−６の新規な結晶系であることを示唆する。また、単位格子定数がａ＝４９．２８±０．２Å、ｂ＝１１２．７０±０．３Å、ｃ＝３２．５４±０．２Åであった。
【００３５】
上記の構造解析の結果得られたＩＬ−６の立体構造を図１に示す。該図に示す通り、これまで確認されていないアミノ酸の５２番目から６０番目までの部分ＡＢ−ループについての主鎖を確認することに成功した。ここで、該ＡＢ−ループはｇｐ１３０との相互作用において重要な部分であることが知られているサイトＩＩＩと呼ばれる部位である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によって、低塩濃度下でのＩＬ−６の結晶化に成功した。このことにより、ＩＬ−６と、ＩＬ−６と相互作用して複合体を形成する化合物との共結晶化が可能となり、ＩＬ−６と相互作用して複合体を形成する化合物のスクリーニング法が可能となった。該ＩＬ−６と相互作用して複合体を形成する化合物は、ＩＬ−６受容体に対して可逆的に且つ競合的にＩＬ−６と結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体との結合を阻害する、いわゆるＩＬ−６拮抗的阻害剤と考えられる。よって、該ＩＬ−６拮抗的阻害剤は、ＩＬ−６の異常産生に関連する疾患に対する治療、医薬品の開発を行なうのに有用である。従って、本発明で得られたＩＬ−６の結晶を用いて、新規なＩＬ−６拮抗的阻害剤の探索、評価および設計を行なうための簡便なスクリーニング法を開発することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明において得られた新規なインターロイキン６結晶の結晶構造を示す図面である。
【図１】
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