(57)【要約】      （修正有） 【課題】細胞付着能が高くかつ人工的な合成が容易な100個以下のアミノ酸から成る、細胞付着因子を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むポリペププチド：（ａ）特定のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は(ｂ)特定のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、及びそれをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドから成る細胞付着因子、及び、該細胞付着因子で被覆された基質等。【選択図】 図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチドをコードするＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列から成るＤＮＡ；（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）の塩基配列がコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むポリペププチド：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は(ｂ)配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項４記載のポリペプチドから成る細胞付着因子。
【請求項６】
請求項４記載のポリペプチドで修飾された基質。
【請求項７】
請求項４記載のポリペプチドを含む融合蛋白質。
【請求項８】
請求項５記載の細胞付着因子を介して細胞を基質に付着させることを含む、細胞の処理方法。
【請求項９】
細胞が動物細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が哺乳類細胞である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド細胞付着因子、該細胞付着因子で修飾された基質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞付着因子あるいは細胞接着因子としてフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等が知られていて細胞付着部材として産業に利用されているが、それら因子は動物細胞の細胞外マトリックスを形成している高分子ポリペプチドであり、その複雑さから遺伝子組換え法を用いた人工的かつ効率的な製造方法に向いていないだけでなく、接着力が強力とはいえなかった。
【０００３】
細胞付着あるいは細胞接着に関する従来技術の代表例として以下の特許公報があり、これらには、蛋白質としてラミニン２（特許文献１）、又はラミニン５（特許文献２）を用いて細胞付着や移行(Migration)を促進するという発明が記載されており、又、LFA-3誘導体蛋白質が細胞に接着するという発明が記載されている（特許文献３）。本発明のPIP-1ポリペプチド配列のように強い細胞付着能を示す蛋白質の例は認められなかった。
【特許文献１】特表２００２−５４２８２３号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２８２４号公報
【特許文献３】特開平０９−７５０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで発明者は、細胞付着能が高くかつ人工的な合成が容易な100個以下のアミノ酸から成る分子を同定すべく、ヒト正常cDNAから作製されたファージライブラリーを応用して鋭意スクリーニングを実施した結果、細胞付着や移行(Migration)を促進する極めて強力な細胞付着因子（以下、「PIP-1」と略す）を見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
即ち、本発明は第一の態様として、（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに係る。
【０００６】
本発明は第二の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列から成るＤＮＡ；（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）の塩基配列がコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに係る。
【０００７】
更に本発明は、第三の態様として、上記ＤＮＡを含む発現ベクターに係る。
【０００８】
本発明は第四の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを含むポリペププチド：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は(ｂ)配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドに係る。
【０００９】
更に本発明は、第五の態様として、上記ポリペプチドから成る細胞付着因子、該ポリペプチドで修飾された基質、及び該ポリペプチドを含む融合蛋白質に係る。
【００１０】
更に本発明は、第六の態様として、上記細胞付着因子を介して、哺乳類細胞等の動物細胞に代表される細胞を基質に接着させることを含む、細胞の処理方法に係る。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリペプチド（PIP-1）を含む融合蛋白質GST-PIP-1を組換え法で作製し、それをコートしたビーズを付着性動物細胞の培養液中に加えると、３０分後にはビーズ上に細胞が移動し接着していこと、２４時間後には細胞がビーズ全体にわたって接着していること、また接着した細胞は緩衝溶液で洗浄操作してもはがれ落ちないことにより細胞付着や移行(Migration)を促進することを確認し、これらにより本発明のポリペプチドが強力な細胞付着能を有していることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のＤＮＡは、（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、より具体的には、例えば、配列番号：２で示される塩基配列から成るＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡである。
【００１３】
かかるストリンジェントな条件下で配列番号：２で示される塩基配列から成るＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、オリゴアレイにおいて42℃のHybridization Buffer (50% ホルムアミド , 5×SSC ,
0.5% SDS)を用いて一晩ハイブリダーゼーションを行った60℃の5×SSC , 0.5%SDS溶液中でメンブレンを洗浄する条件（1xSSCは0.15ＭNaCl，0.015Mクエン酸ナトリウムである）でのオリゴアレイ解析で本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１４】
尚、ハイブリダイゼーション自体は、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd edition（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは以下の実施例に従い調製することができる。又、本明細書に記載された配列番号２の具体的な塩基配列に基づいて、当業者であれば、当該技術分野において周知の化学合成法によっても、本発明の核酸分子を容易に合成することが出来る。
【００１６】
一方、配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、具体的には、実施例で示されるような細胞付着能を有していることを意味する。
【００１７】
又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを用いて当業者に公知の任意の手段によって容易に調製することが出来る。このような発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含むＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはSV４０、CMVウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、あるいはそれらプロモーターを組み合わせまたは複合させたプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００１９】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたポリペプチドを他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれに分離することができる。
【００２０】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２由来のＤＨ１（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６０巻，１６０(１９６８)），ＪＭ１０３（Nucleic Acids Research，９巻，３０９(１９８１)），ＪＡ２２１（Journal of Molecular Biology，１２０巻，５１７(１９７８)），及びＨＢ１０１（Journal of Molecular Biology，４１巻，４５９(１９６９)）、あるいはエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）B株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４（Gene，２４巻，２５５(１９８３)），２０７−２１〔Journal of Biochemistry，９５巻，８７(１９８４)〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス
ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia
pastoris）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖero細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２１】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献を参照することができる。Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６９巻，２１１０(１９７２)； Gene，１７巻，１０７(１９８２)；Molecular
＆ General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)；Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Proc.
Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びVirology，５２巻，４５６(１９７３)。
【００２２】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２３】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。特に、本発明ポリペプチドを融合蛋白質として発現させた場合には、当業者に公知のそれに応じた適当なリガンドを利用したアフィニティカラムクロマトグラフィによって容易に精製することが出来る。
【００２４】
こうして得られた本発明のポリペプチドは、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことができる。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することもできる。更に、トリプシン、キモトリプシン、FactorXa、トロンビン、KEX2プロテアーゼ、又は、PreScission proteaseのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ-)であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２６】
本発明のポリペプチドがＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２７】
本発明のポリペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２８】
或いは、本発明のポリペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、配列番号１に示されたアミノ酸配列情報に基づき、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することもできる。ペプチドの合成法としては、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、
丸善(株) （1975年）
（２）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座1、 蛋白質の化学IV、
205、(1977年)（３）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻
ペプチド合成 広川書店。
【００２９】
例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、DCC、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、及びN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３０】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３１】
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３２】
このようにして得られる本発明のポリペプチドは、本明細書の実施例に示されるように、顕著な細胞付着能を有しており、細胞付着因子として機能することが出来る。  従って、各種の基質を本発明のポリペプチドで修飾することにより、該基質の細胞付着性を促進させ、該基質に様々な細胞を付着させることが出来る。
【００３３】
例えば、製剤組成物を本発明のポリペプチドで修飾することによって各製剤組成物の各種細胞に対する親和性を高くしたり、人工血管や人工骨といった医療用移植器具の表面に本発明のポリペプチドを被覆することによって、それらの生体適合性を高めたり、再生治療に於いて特定の細胞を移植する際に本発明のポリペプチドを被覆した生分解性を有するビーズ等といった基質に付着させて行うことによりその細胞の生体内での生着能を高めることも可能となる。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドを被覆した基板といった基質上に披検細胞をトラップしたり、あるいはトラップした細胞を増殖せしめ、これにより細胞診断や細胞プロファイリングを可能とする細胞診断用チップを作製することも可能となる。
【００３５】
「基質」の材質・形状・大きさ等に特に制限はない酵素工学・遺伝子工学あるいは人工臓器工学・生体材料工学への応用分野で使用されている様々な基質を使用することが可能である。基質の材質としては、例えば、生体外で使用する場合はガラス、プラスチック、金属といった細胞親和性の高い材料が使用できる。また、磁力を利用した分離を図る目的で磁性を示す物質を基質中に含ませてもよい。基質を生体内で使用する場合には、細胞成長を維持可能な生体適合性物質が好ましい。このような生体適合性物質の例として、例えば、ポリ乳酸、コラーゲン、再生コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリガラクトース、及びポリエチレングリコール又はそれらの誘導体などの生分解性を有する高分子化合物、ポリスチレン、デキストラン、DEAE、セルロース、コラーゲン等からなる高分子ポリマー、リン脂質等からなるリポゾーム、リン酸カルシウム等からなるハイドロオキシアパタイト粒子、チタン及びステンレス鋼などの生体適合性金属、ヒドロキシアパタイト等の人工材料を含むセラミック物質、並びに、ポリエステルおよびナイロン、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、及びポリテトラフルオロエチレンを含むポリマー及び生体分子から作製されるか、又は、それらの材質でコーティングされた医療用器具を挙げることが出来る。
【００３６】
本発明のポリペプチドによる基質の修飾は当業者に公知の任意の方法で行なうことが出来る。ここで、「ポリペプチドによる基質の修飾」とは、基質がポリペプチドにより何らかの作用を受けている状態を意味し、例えば、結合、被覆、及び複合体形成のような当業者に公知の任意の形態を含むものである。
【００３７】
例えば、本発明のポリペプチドは、直接、又は適当なリンカーを介してかかる基質へ結合させることによって、該基質を被覆することが出来る。化学的な結合の場合、基質の表面に本発明のポリペプチドに含まれるアミノ基あるいはカルボキシル基、特にアミノ基と化学的に結合できる反応性官応基をもつスぺーサーを導入したものを用いるとよい。例えば、トシル基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基あるいはその他に蛋白質架橋剤として用いられる反応性官応基をもつスぺーサーを基質の表面に導入するとよい。  
【００３８】
また、本発明のポリペプチドが融合蛋白質として他の蛋白質と結合している場合には、該他の蛋白質に特異的に結合するリガンド（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼとの融合蛋白質の場合にはグルタチオン）をリンカーとして利用することができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドと基質との結合は、基質の材質・形状・大きさ等に応じて、当業者に公知の任意の方法・手段により容易に実施することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドを含む適当な緩衝液中で基質を適当な時間保持することにより、本発明ポリペプチドを該基質の表面上に簡単に被覆することが出来る。尚、基質はその全体にわたって本発明のポリペプチドで修飾されている必要はなく、目的などに応じて、任意の一部が本発明のポリペプチドで修飾（被覆）されている基質も本発明の範囲である。
【００４０】
更に細胞の増殖・分化を促進するために、本発明のポリペプチドに加えて所望の細胞増殖・分化因子、例えば各種増殖因子、各種サイトカイン、コロニー刺激因子、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、エンタクチン／ニドゲン、α−ジストログリカン、その他の糖タンパク質、プロテオグリカン、硫酸ヘパリン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンあるいはそれら由来の高分子化合物のいずれかあるいは混合組成物で基質を被覆してもよい。こうすることによって、例えば、再生治療に於いてより効果を得ることも期待できる。
【００４１】
本発明ポリペプチドは、他の蛋白質との融合蛋白質とすることもできる。ここで、該他の蛋白質の目的及び用途に制限はない。例えば、既に記載したように、本発明ポリペプチドの分離・精製の便宜のために融合蛋白質を作成することも可能である。更に、治療及び機能解析などの目的で他の蛋白質（ポリペプチド）との融合蛋白質を作成することによって、該他の蛋白質の細胞内への導入を促進させることが出来る。このような融合蛋白質は当業者に公知の任意の方法で調製することが可能である。例えば、これらを夫々コードするＤＮＡを連結して発現ベクターに導入し、上記の方法で容易に調製することができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドと他の蛋白質とは適当なリンカー又はスペーサー（配列）を介して結合させることも出来る。例えば、本発明ポリペプチドと他の蛋白質を細胞内ペプチダーゼ認識配列を介して融合した融合蛋白質とすれば、細胞内で目的の蛋白質のみを遊離させることも可能である。
【００４３】
本発明の融合蛋白質の成分である上記蛋白質は、融合蛋白質の目的等に応じて当業者に公知の任意のものとすることが出来る。例えば、治療目的では、上記の各種の細胞増殖・分化因子を挙げることができる。
【００４４】
本発明は、上記の基質を利用することによって、例えば、診断に使用するために採取した血液から白血球を回収・採取したり、又は除去したりする等、本発明の細胞付着因子を介して細胞を基質に付着させることを含む、細胞の様々な処理方法にも係るものである。本発明のポリペプチドを用いることにより、基質に細胞を付着させた後に、その細胞を基質上で増殖させることも可能である。更に、本発明ポリペプチドを細胞内へ導入したい蛋白質や遺伝子とともに基質上に固層化し、その表面で細胞を培養することによって目的の分子の細胞内への導入を促進させることも可能である。ここで、細胞の処理方法の具体的な態様に特に制限はなく、当業界で実施されている様々な操作を含むものである。
【００４５】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：３７）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列（１１１塩基対）を示す。
【実施例】
【００４６】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Molecular cloning, 3rd edition（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載されている方法に従った。
【００４７】
まず6 cm径のコラーゲンがコートされた培養皿にコンフルエントになるようヒト培養細胞HEK293細胞6 X105 cellsを撒いた。次にファージライブラリーを1.6 X 1011 pfu/mlになるまで増やした後、500 μlを培養皿に加えて37℃で30分間培養した。用いたファージライブラリーは脳由来のcDNAライブラリーが組み込まれ、それにコードされるアミノ酸をウイルス表面に呈示するファージライブラリー（human normal T7Selected cDNA library; Novagen社 # 70637）である。D-MEM培養液（GIBCO BRL社; #11885-084）で細胞がはがれないよう注意しつつ５回洗浄後、RIPA
buffer（50 mM
Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton x-100, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS）で細胞を破壊した。15.000 rpm 5 min遠心後上清を一晩ＬＢ培地中で培養した大腸菌BLT5615
(Novagen社 #
69905-3)に感染させ、更に溶菌が生じるまで約２時間培養した。こうして生細胞の細胞表面に付着するアミノ酸を表出したファージのみが選択的に増殖されたことになる。この操作を複数回繰り返すことで更にその選択性をあげることが可能で、本スクリーニングに於いては、各回の細胞破壊液の力価をチェックして、一旦102 pfu/ml程度まで低下する力価が再び上昇し始めマキシマムに到達するまで上記の操作を繰り返した。最終的には５回の感染・パニングを繰り返す事となった。これにより、強力な細胞接着能を有する組換えファージを複数クローン選択することが出来た。
【００４８】
得られたファージをプレートに撒き14個のプラークを解析したが、11個が同一の組換えファージ由来であることが判明した。それら組換えファージにより呈示されたヒトcDNA由来のポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を配列番号１及び配列番号２としてそれぞれ記載する。
【００４９】
配列番号１：
SSQPGRQERNSVSKKKNKTNKKKTRNIPFWLQYTCLF
【００５０】
配列番号２：
TCAAGCCAGCCTGGGCGACAAGAGCGAAACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAACAAAACAAACAAAAAAAAAACAAGAAACATTCCCTTTTGGTTACAGTATACATGTTTGTTC
【００５１】
次にこのアミノ酸配列を有するポリペプチド（PIP-1）が本当に動物細胞表面にある分子を認識し動物細胞に付着するのか確認するため、この配列をGST融合蛋白質として大腸菌を宿主として発現させて動物細胞への付着を観察した。すなわち、ファージに組み込まれたヒトcDNAライブラリー由来の遺伝子配列をEcoRI/XhoIで制限酵素消化して切り出し、次にpGEX-4T-3 プラスミド (Amersham社; #27-4538-01：所望のペプチド配列ををGlutatione S-transferase配列との融合蛋白として発現させる市販の発現ベクター)のEcoRI/XhoIサイトに組み込んだ。得られた組換えプラスミドを大腸菌K12由来DH5α株に導入して組換え大腸菌を作製し、LB液体培地を用いてその組換え大腸菌を培養し増殖せしめ、1mM
IPTG (isopropyl &acirc;−D-thiogalactoside)で発現誘導し、次にglutathione-sepharose
ビーズ
(Glutathione Sepharose 4B, Amersham社; #17-0756-01)を用いGST融合蛋白質精製の定法に則って、目的とするGST-PIP-1融合蛋白質を精製した（Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., and Wingfield, P.J.,
1997, Current Protocols in Protein, John Wiley & Sons, Inc. New Jersey, pp. 6.6.1-6.6.21.）。次に、精製した100 μgのGST- PIP-1融合蛋白質（以下GST-PIP-1蛋白質という）または100 μgのGST蛋白質（陰性対照として用いる：コントロール）を各々50μlのglutathione-sepharose ビーズに対して結合させた。
【００５２】
具体的には、GST蛋白質あるいはGST-PIP1融合蛋白質を発現せしめた大腸菌培養液それぞれ100 mlを４℃で8,000回転５分間遠心して、各々の大腸菌を沈殿せしめ大腸菌ペレット作製した。作製したべレットを各10 mlのTBSTバッファー（50mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1M NaCl, 1mM EDTA, Tween 20 or 0.1% TX-100）に懸濁し、超音波破砕機（Sonifier250）を用いて超音波により各々破砕した。破砕した菌体を含む懸濁液を、４℃で11,000回転30分間遠心し上清を回収した。回収したそれぞれの上清は、可溶性のGSTあるいはGST-PIP1融合蛋白質を含有する。次に各々の蛋白質を含有する溶液に対し、各々glutathione-sepharose ビーズ
を添加し４℃で1時間緩やかに振とうすることにより、それぞれ目的とする可溶性蛋白質をビーズに結合させた。４℃で1.700回転５分間遠心することにより上清を除去し、更に、沈殿した蛋白質結合ビーズをTBSTバッファーで２回洗浄してビーズに非特異的吸着している余分な蛋白質の除去を行った。ビーズに特異的吸着している各々の蛋白質の吸着量については、glutathioneバッファー（10mM glutathione、0.1M Tris-HCl (pH8.0), 0.2M NaCl ）を用いてGST蛋白質あるいはGST-PIP1融合蛋白質をビーズから遊離せしめ、それら遊離した蛋白質を含む溶液を、PBSで4℃一晩透析を行い、溶液に含まれるglutathioneを除去後、ブラッドフォード法により蛋白濃度を測定したところ、遊離した目的とする蛋白質をそれぞれ検出（約100mlの溶液に対し約1mgの蛋白質程度）することが出来、用いたglutathione-sepharoseビーズに対し、それぞれGST蛋白質あるいはGST-PIP1融合蛋白質が十分に結合していることを確認できた。
【００５３】
尚、ブラッドフォード法は、精製した酵素標品中に含まれるタンパク質量を求めるための定法である。同法では試験管に蛋白質量が 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30μgとなるようにウシ血清アルブミン (BSA) 標準タンパク質溶液 (0.5 mg/ml) を分注した。誤差を避けるため同一濃度の試料を2本用意した。体積を一定にするため、水を加え全量を0.1 mlにあわせた。 次に、 0.5 mlの染色試薬を加えて混合し、5分後にプラスチックキュベットに入れ595 nmの吸光度を測定し、BSA を用いた標準曲線を作成した。GST蛋白質あるいはGST-PIP1融合蛋白質をビーズから遊離せしめた蛋白質を含む溶液を、各々10μl 試験管にとり、水を加え全量を0.1 mlにあわせ、それぞれ蛋白質濃度の決定を行った。これにより、上記で示した条件にて、GST蛋白質が結合したglutathione-sepharose
ビーズあるいはGST-PIP1融合蛋白質が結合したglutathione-sepharose
ビーズを作製することが出来ることが判明したので、これら２種のビーズを上記の方法にて作製し、以下に示す細胞付着実験に供した。
【００５４】
これら２種のビーズを各々培養皿に付着させた各種培養細胞の培地中に加え培養を続けるとGST蛋白質では特に変化が観察されないが、GST-PIP-1蛋白質では数分でビーズが細胞表面に付着し、更に培養を続けると細胞がビーズを取り囲むように盛り上がってくる所見が観察された（図１）。
【００５５】
すなわち図１に示される実験では、GST蛋白質（コントロール）またはGST-PIP-1蛋白質を結合させたビーズをそれぞれHEK293細胞の培養液中に添加し、０．５時間後で比較すると、GST-PIP-1ビーズでは速やかに細胞に付着するが、コントロールのGSTビーズでは全く付着せず、細胞とは離れた部分に単独で存在していた。GST-PIP-1ビーズを添加して２４時間後に、直径が100 μm以下のビーズでは細胞に貪食されているように見え、また、直径が100 μm以上のビーズ に於いては２４時間後あるいは４８時間後にビーズ上に多くの細胞が盛り上がって付着し増殖していた。更に、培養24時間後に、培養液を吸引しPBSで洗浄後70% メタノール固定・ヘマトキシリン染色(和光社、#131-09665)を行った。顕微鏡を用いた細胞とビーズの観察結果から、GST蛋白質を結合させたビーズは完全に洗い流されるが、GST-PIP-1蛋白質を結合させたビーズは洗い流されずに細胞とともに留まっていることが判明した。ヘマトキシリン染色により細胞の核が青紫色に濃染されるので、GST-PIP-1ビーズではビーズ上に複数の細胞由来核の濃染が認められた。
【００５６】
ここで用いた細胞は付着性細胞なので、本発明のPIP-1蛋白質によって付着性細胞の移動あるいは移行(Migration)する活性が惹起されたものと解釈することもできる。また調べた限りの全ての細胞（MDCK； イヌ、 HCT116； ヒト、 HEK293； ヒト、 COS7；サル）で同様の所見が観察されたことから、このような細胞付着能あるいは移行性の惹起は種を越えて生じるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上の実施例から明らかなように、本発明ポリペプチドで修飾した径100 μm程度あるいはそれ以上にも及ぶ様々な基質に対して動物細胞を付着させることができる。従って、基質としてリポゾームや粒子を使用した場合には、それらの内部に含ませた各種の薬剤、高分子化合物、蛋白性因子等を付着した細胞内に導入することも可能である。更に、磁性を帯びた高分子化合物、磁性粒子、各種金属微粒子、各種発光体等をリポゾームや粒子内に含ませることによりナノマシーンとして利用することも可能であり、今後これらの方面への応用が期待される。
【００５８】
又、本発明ポリペプチドで被覆することによって細胞付着能が付与又は促進された新規な医療用器具、製剤組成物、再生治療用細胞担体及び、診断用組成物等を提供することができ、更に、DDS(drug delivery system; 薬剤導入方法)としても利用することができる為に、産業上、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】GST蛋白質（コントロール）またはGST-PIP-1蛋白質を結合させたビーズをそれぞれHEK293細胞の培養液中に添加し時間経過を透過型顕微鏡で観察した。１）GSTビーズあるいはGST-PIP-1ビーズを添加して０．５時間後で比較すると、GST-PIP-1ビーズ（右、上から２番目）では速やかに細胞に付着するが、コントロールのGSTビーズ（右、上から１番目）では全く付着せず、細胞とは離れた部分に単独で存在している。左の上から１，２番目の顕微鏡写真は、対照としてビーズを添加した０時間目の細胞とビーズの様子を示す。左の上から３番目の顕微鏡写真で示すように、GST-PIP-1ビーズを添加して２４時間後に、直径が100 μm以下のビーズ （矢印）では細胞に貪食されているように見える。左の上から４番目の顕微鏡写真は、更に４倍に拡大した写真である（バー５０μmを示す）。右の上から３，４番目の顕微鏡写真は、それぞれ２４時間後、４８時間後に直径が100 μm以上のビーズ に多くの細胞が盛り上がって付着し増殖している像を示す（バー２００μmを示す）。
【図２】GST蛋白質（コントロール）またはGST-PIP-1蛋白質を結合させたビーズをそれぞれHEK293細胞の培養液中に添加し、24時間後培養液を吸引しPBSで洗浄後70% メタノール固定・ヘマトキシリン染色(和光社、#131-09665)を行うと、GST蛋白質を結合させたビーズは完全に洗い流されているが（写真上）、GST-PIP-1蛋白質を結合させたビーズは細胞とともに留まっている（写真下：矢印）。細胞の核がヘマトキシリンで青紫色に染色されるので、GST-PIP-1ビーズの場合（写真下）、ビーズ上に複数の細胞由来核の濃染が認められる。
【図１】
2005287350.tif 000003
【図２】
2005287350.tif 000004
【配列表】
2005287350000001.app