(57)【要約】【課題】ポリペプチドを架橋する方法の提供。【解決手段】分子量の小さい側鎖を持つ非電荷アミノ酸に囲まれたチロシンを含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを作用させることにより、このポリペプチドを架橋させることに成功した。架橋反応はチロシナーゼ等のフェノールオキシダーゼにより触媒され、その反応は分子量の小さい側鎖を持つ非電荷アミノ酸に囲まれたチロシンに特異性を有していた。本発明の方法は、所望のポリペプチドを架橋するために有用である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを接触させる工程を含む、該ポリペプチドを架橋する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、アミノ末端-YXX、アミノ末端-XYXX、XXYXX、XXYX-カルボキシル末端、および XXY-カルボキシル末端 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の方法であって、“Y”はチロシンであり、“X”はグリシン、アラニン、およびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である方法。
【請求項３】
ポリペプチドが、アミノ末端-Y[G/S]G、アミノ末端-GY[G/S]G、[G/S]GY[G/S]G、[G/S]GY[G/S]-カルボキシル末端、および [G/S]GY-カルボキシル末端 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項２に記載の方法であって、“G”、“S”、および“Y”はそれぞれグリシン、セリン、およびチロシンであり、[G/S]はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかである方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、[G/S]GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2 のアミノ酸配列を含む請求項３に記載の方法であって、“G”、“S”、および“Y”はそれぞれグリシン、セリン、およびチロシンであり、[G/S]1-2はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかが1または2残基である方法。
【請求項５】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含むクロスリンカー試薬。
【請求項６】
ポリペプチドの架橋のためのリンカーを有する支持体の製造方法であって、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを支持体に固定化するまたは支持体上で合成する工程を含む方法。
【請求項７】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドに他のポリペプチドが結合した融合蛋白質。
【請求項８】
請求項７に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該ポリペプチドに他のポリペプチドが結合した融合蛋白質を発現できるように、該他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することができるクローニング部位を備えたベクター。
【請求項１０】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドに、他のポリペプチドが結合した融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターが導入された細胞。
【請求項１１】
フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる工程を含む、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法。
【請求項１２】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する試薬。
【請求項１４】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、請求項１３に記載の試薬。
【請求項１５】
ポリペプチドにおける、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基の含量を上昇または低下させる工程を含む、フェノールオキシダーゼによる該ポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法。
【請求項１６】
該ポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基の含量を上昇または低下させた、フェノールオキシダーゼによる該ポリペプチドの架橋が上昇または低下する改変ポリペプチド。
【請求項１８】
フェノールオキシダーゼのアッセイ方法であって、
（ａ）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドと被検試料とを接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドの架橋を検出する工程、
（ｃ）該架橋のレベルをフェノールオキシダーゼのレベルと関連付ける工程、を含む方法。
【請求項１９】
フェノールオキシダーゼのアッセイキットであって、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はポリペプチドを架橋（クロスリンク）する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分泌蛋白質または細胞表面蛋白質は、しばしば付加的な共有結合を形成する。隣接するシステイン残基の2つの-SH基の間のジスルフィド（S-S）結合の形成は、ポリペプチドが共有結合する唯一の方法と考えられてきた。しかし2、3のケースにおいては、蛋白質のチロシン残基がヒドロキシル化されペプチジルDOPA（3, 4-dihydroxyphenylalanine）となり、ペプチドの架橋に関与していると考えられている（Burzio, L. A. & Waite, J. H., Biochemistry 39, 11147-11153 (2000)）。軟体動物の接着性ポリフェノール蛋白質では、多くのチロシン残基がDOPAとして存在しており、足の特異的細胞での繊維化過程における架橋にこれらが関与していることが示唆されている（Burzio, L. A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000); Burzio, L. A. & Waite, J. H., Protein Sci. 10, 735-740 (2001)）。ペプチジルDOPAは、多毛類 Phragmatopoma californicaのセメント前駆蛋白質（Waite, J. H. et al., Biochemistry 31, 5733-5738 (1992)）、および吸虫 Fasciola hepatica の卵殻蛋白質（Waite, J. H. & Rice-ficht, A. C., Biochemistry, 26, 7819-7825 (1987)）において報告されているが、これらのDOPA分子の架橋への関与は示されていない。
【０００３】
昆虫の外骨格であるキューティクルは、表皮細胞から分泌されるキチンフィラメントと多くの蛋白質を主な成分とする複雑な細胞外構造体である。脱皮において形成される昆虫のキューティクルは、通常とは違ったタイプの蛋白質架橋を示すことはよく知られている。キューティクルを固化させる複雑な過程はスクレロチゼーション（sclerotization; 硬化）として知られる（Hopkins, T. L. & Kramer, K. J., Ann. Rev. Entomol. 37, 273-302 (1992); Andersen, S. O. et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 25, 153-176(1995)）。既知の昆虫のキューティクル蛋白質は全て、システイン残基を持たないことは注目に値する。スクレロチゼーションにおける蛋白質の架橋の主要な過程は、フェノールオキシダーゼによりある種のカテコールアミンから産生されるキノンによる蛋白質分子の直接的な結合によると考えられている。ペプチジルDOPAは Manduca sexta の蛹のキューティクル蛋白質でも報告（Okot-Kotber, B. M. et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 24, 787-802(1994)）されているが、蛋白質を直接架橋させるdi-DOPA結合に関する情報はほとんど存在しない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はポリペプチドを架橋する方法を提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
昆虫のキューティクルは一般に3つの高度に組織化された層、すなわちエピキューティクル、エクソキューティクル、およびエンドキューティクルからなり、それらは蛋白質成分、構造的特徴、および生理学的機能が異なっている（Hillerton, J.E., 1984, Cuticle: mechanical properties. In: Bereiter-Hahn, J., Matoltsy, A.G., Richards, K.S. (Eds.), Biology of Integument, vol. 1. Invertebrates. Springer, Berlin, pp. 627-637；Willis, J.H., 1987, Archives of Insect Biochemistry and Physiology 6, 203-215）。昆虫が脱皮すると、昆虫ホルモンの制御下、キューティクル蛋白質の生合成と分解を通して外骨格が更新される。合成と分泌の発生的なタイミングを基に、キューティクル蛋白質は２つのグループに分類される（Andersen, S.O. et al., 1995, Insect Biochemistry and Molecular Biology 25, 153-176）。1つのグループは脱皮前（pre-ecdysial）蛋白質と呼ばれる蛋白質であり、脱皮前の潜期（pharate period）の間に蓄積する。もう1つのグループは脱皮後（post-ecdysial）蛋白質で、脱皮後の間に蓄積する。脱皮前キューティクルの幾つかは架橋により安定化および固化する（Hopkins, T.L. et al., 2000, Insect Biochemistry and Molecular Biology 27, 701-709）が、この過程の機構はまだよく知られていない。最近の研究により、遠く離れた種の昆虫のキューティクル蛋白質の幾つかのクラスの中に、配列の類似性があることが判明した（Nakato, H. et al., 1997, Insect Biochemistry and Molecular Biology 27, 701-709; Rondot, I. et al., 1998, European Journal of Biochemistry 254, 304-312; Andersen, S.O., 2000, Insect Biochemistry and Molecular Biology 30, 569-577）。他の、非保存的なキューティクル蛋白質は、硬質キューティクルに由来すると思われる、主に疎水性のアミノ酸残基からなる繰り返し構造により特徴付けられる。しかしながら、エピキューティクル蛋白質の情報は未だ非常に限られている。
【０００６】
上記した高度に組織化された層構造を形成するには、キューティクル蛋白質の合成は高度にステージ特異的な様式で制御されなければならない。ほとんどのキューティクル蛋白質は、原理的に2つの昆虫ホルモンであるエクジステロイド（20-hydroxyecdysone, 20E）および幼若ホルモン（juvenile hormone, JH）の制御下で合成される（Riddiford, L.M., 1985. Hormone action at the cellular level. In:. Kerkut, G.A., Gilbert, L.I. (Eds.), Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology, 8. Pergamon Press, New York, pp. 37-84）。幼虫の脱皮においては、JHの存在下でのエクジステロイドのパルスが蛋白質合成のタイミングを協調させる。エクジステロイドは受容体蛋白質（EcR/USP）と相互作用し、2〜3の初期遺伝子の転写を差次的に誘導し、結果的に多くの後期遺伝子を活性化する（Ashburner, M. et al., 1974, Cold Spring Harbor Symposium Quantitative Biology 38, 655-662; Talbot, W.S. et al., 1993, Cell 73, 1323-1337; Fujiwara, H. et al., 1995, Insect Biochemistry and Molecular Biology 25, 845-856; Matsuoka, T., Fujiwara, H., 2000, Development Genes and Evolution 210, 120-128）。多くのキューティクル蛋白質遺伝子は、表皮細胞で特異的に発現する後期遺伝子に分類され得る。昆虫におけるキューティクル蛋白質の合成は、昆虫ホルモンにより誘導される組織特異的およびステージ特異的な遺伝子発現を例証するために多大な関心を集めている。
【０００７】
幼虫脱皮におけるキューティクル形成のホルモン作用を解析する過程で、本発明者はディファレンシャルmRNAディスプレイ法を用いてエクジステロイド依存的なキューティクル遺伝子を検索し、Bombyx mori Cuticle Protein GlyGlyTyr-repeat 1（BMCPG1）と名付けた新規なキューティクル蛋白質遺伝子を同定した。この遺伝子は、コード配列中に多数のGly-Gly-Tyr（GGY）リピートを有しており、表皮においてのみ、エクジステロイドのパルス後の非常に限られた期間において発現することが判明した。BMCPG1の発現と、他の2つの蛋白質の遺伝子、すなわち核受容体スーパーファミリーのメンバーであるFTZF1とdopaデカルボキシラーゼ（DDC）の発現が一致することから、これらの遺伝子はエクジステロイドにより活性化するカスケードにより制御されていることが示唆された（Hiruma, K., Riddiford, L.M., 1990, Developmental Biology 138, 214-224; Sun, G. et al., 1994, Developmental Biology 162, 426-437; Hiruma, K. et al., 1995, Developmental Biology 169, 195-209）。表皮特異的な発現、後期脱皮におけるステージ特異的な発現、およびGGYリピートを含む珍しいアミノ酸配列という、BMCPG1の3つの独特の特徴から、BMCPG1は脱皮において合成されるキューティクル蛋白質をコードしていることが示唆された。また本発明者は、Bombyx BMCPG1と類似するエクジステロイド依存的な発現パターンとGGY含有構造を、Drosophilaのキューティクル蛋白質である EDG91（Apple, R.T., Fristrom, J.W., 1991, Developmental Biology 146, 569-582）にも見出した。BMCPG1およびEDG91 は同じエピキューティクル蛋白質のグループに属し、それらのGGY構造を介した架橋により昆虫のキューティクルの固化に関与している可能性がある。BMCPG1とは対照的に、ほとんどの幼虫キューティクル蛋白質（LCP）遺伝子は主に脱皮後（post-ecdysial）ステージにおいて発現し（Nakato, H. et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1218, 64-74; Hiruma, K. et al., 1997, General and Comparative Endocrinology 107, 84-97）、エンドキューティクル蛋白質と考えられている。
【０００８】
本発明者は、BMCPG1およびEDG91以外に、特徴的なGGYリピートを含む類似したキューティクル蛋白質を検索した。その結果、Manducaの推定キューティクル蛋白質およびC. elegansの仮想蛋白質（図２(A)）は、GGYまたはGGY関連（LGY, SGY, AGY, および VGY）リピートの長いストレッチを持っていることを見出した。それに加え、Locust成虫のキューティクル蛋白質であるLM-ACP 63、64、および65もまた短いGGYリピートを含んでいた。また本発明者は、キューティクル蛋白質のみならずコリオン蛋白質にもGGYモチーフを見出した。本発明者は、これらの蛋白質においてチロシンを取り囲むアミノ酸は、共通して非電荷で比較的分子量の小さいアミノ酸であることを見出した。本発明者は、グリシンなどに代表される非電荷小分子アミノ酸に囲まれたチロシンのモチーフを便宜的に“GGYモチーフ”と名付けた。キューティクル蛋白質において、ほとんどのGGYモチーフは、シグナルペプチドの後ろの、各成熟キューティクル蛋白質におけるアミノ（N）末端およびカルボキシル（C）末端領域の付近に位置していることは興味深い。NおよびC末端領域の両方にGGYモチーフがあるという類似の構造は、幾つかのカイココリオン蛋白質でも保存されている（図２(B)）。コリオンは卵の周囲に硬いコートを形成し、昆虫のキューティクルのエピキューティクルを連想させる。従って、昆虫の卵殻およびキューティクルにおいて、これらの蛋白質は保存されたGGYモチーフを介して硬い構造を作るのに重要な役割を果たしている可能性がある。
【０００９】
GGYモチーフが、蛋白質の架橋に関与しているのかを調べるため、このモチーフを含むペプチドを合成し、チロシナーゼまたはカイコヘモリンフ（hemolymph;体液）中のフェノールオキシダーゼにより酸化させた。その結果、GGYモチーフを含むペプチドにおいてのみ、ペプチドの架橋を示すUV吸収の有意な変化が観察され、このモチーフを持たない他のペプチドでは観察されなかった。より直接的な証拠として、FITCラベルしたGGYモチーフ含有ペプチドは、チロシナーゼまたはヘモリンフにより多量体化することがSDS-PAGEにより示された。これらの結果は、酸化によりGGYモチーフにおいて特異的な架橋が形成されることを示している。上記の結果は、脱皮において合成された新しいキューティクルが、共在するフェノールオキシダーゼによる架橋により最初に固化する過程をin vitroで再構成するものである。GGYGGなどのGGYモチーフは、卵殻蛋白質、セメント蛋白質、シルク蛋白質、細胞壁蛋白質、およびサイトケラチンなどの硬い蛋白質に広く見られる。本発明は、GGYモチーフがフェノールオキシダーゼによる蛋白質の架橋の潜在的な標的として保存された保存モチーフであることを示すものである。
【００１０】
キューティクル形成および卵殻形成の間の類似は興味深い。カイコのキューティクル形成においては、各脱皮において、GGYモチーフの反復構造を有するキューティクル蛋白質 BMCPG1 が表皮で新規に合成され、古いキューティクル下に分泌される。古いキューティクル中に予め存在するフェノールオキシダーゼ、またはBMCPG1と共在するフェノールオキシダーゼが蛋白質を架橋させ、新しいキューティクルの外部領域（エピキューティクル）を形成すると考えられる。カイコのコリオン形成においては、濾胞細胞（follicle cells）からAL11などのGGYモチーフを含むコリオン蛋白質（表１）が分泌される。最近、Ashidaのグループは、ヘモリンフPOが蛹の卵巣中および産卵後の卵細胞表面に存在することを見出した（Horii, A. et al., Zool. Sci. 15, 43 (1998)）。すなわち、卵殻に共在するフェノールオキシダーゼによるGGY含有蛋白質の架橋を通して、硬い卵殻が形成される可能性がある。
【００１１】
GGYモチーフを含むポリペプチド間のペプチジルクロスリンクの形成においては、まずチロシナーゼまたはフェノールオキシダーゼによりチロシンのヒドロキシル化が起こると考えられる。そしてフェノール環のさらなる酸化が活性ラジカルを産生し、5-5' DOPA残基間の共有結合を形成する。また、このようなペプチジル di-DOPAをベースとした架橋以外にも、別のタイプのdi-またはtri-チロシンリンケージも形成され得る（Edens, W. A. et al., J. Cell. Biol. 154, 879-891 (2001)）。これらの反応において、本発明に示すような非電荷の小さなアミノ酸に囲まれたチロシンを含む特定の配列が、このチロシン残基が標的基質として酵素に露出する開いた構造を形成するのに本質的であると考えられる。
【００１２】
類似したGGYモチーフは昆虫のみならず、脊椎動物および植物の様々な蛋白質にも存在していることが判明した。キューティクル蛋白質以外にも、GGYモチーフは幾つかの昆虫のコリオン蛋白質、JH依存的蛋白質であるoothecin（Pau, R., 1984, Biochimica et Biophysica Acta 782, 422-428）、脊椎動物の表皮ケラチン（Steinert, P.M. et al., 1983, Nature 302, 794-800）、オオムギグリシンリッチRNA結合蛋白質（Molina, A. et al., 1997, Plant Molecular Biology 33, 803-810）などにおいても見出される。GGYモチーフを含む蛋白質の1つに、幾つかの二枚貝（mussels）の足糸（byssus）に見出される接着蛋白質が挙げられる（McDowell, L.M. et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry 274, 20293-20295; Burzio, L.A., Waite, J.H., 2000, Biochemistry 39, 11147- 11153; Burzio, L.A. et al., 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1479, 315-320; Waite, J.H., Ann. New York Sc., 1999, 875, 301）。これらの蛋白質のほとんどはProリッチまたはGlyリッチなポリフェノール蛋白質である。例えば、二枚貝 Aulacomya ater の主要ペプチドはAGY*GGXKのタンデムアレイを含む。ここでY*は常に3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) として見出される（Burzio, L.A. et al., 2000, Biochimica et Biophysica Acta 1479, 315-320）。最近の研究により、これらのペプチドは酸化により、dopa-dopa (di-dopa) の架橋を介してマルチマーを形成できることが明らかとなった（McDowell, L.M. et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry 274, 20293-20295; Burzio, L.A., Waite, J.H., 2000, Biochemistry 39, 11147- 11153; Yu, M. and Deming, T.J., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 5825）。このように多様な生物の蛋白質においてGGYモチーフが保存されている事実は、本発明が広範な生物種に対してin vivoでも適用できることを示している。例えばGGYモチーフを持つ蛋白質を生体内に局所投与したり、あるいは遺伝子発現ベクターを用いて体内で発現させることにより、生体内の内因性フェノールオキシダーゼを利用してポリペプチドを架橋することも可能と考えられる。
【００１３】
また本発明は、in vitroのポリペプチド架橋において特に好適に用いられる。S-S結合とは異なり、GGYモチーフを基にした蛋白質架橋は容易に操作することができる。任意の蛋白質のN末端またはC末端領域にGGYモチーフを付加すれば、フェノールオキシダーゼによりこの蛋白質を架橋することができる。例えばこのようなGGYタグを用いて、任意のポリペプチドを支持体に固定化することが可能である。またGGYモチーフは、蛋白質工学において、新規な機能を持つ蛋白質または極端に硬い構造をもつ蛋白質を作り出すための新たな戦略を提供する。
【００１４】
すなわち本発明はポリペプチドを架橋する方法等に関し、より具体的には
（１）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを接触させる工程を含む、該ポリペプチドを架橋する方法、
（２）ポリペプチドが、アミノ末端-YXX、アミノ末端-XYXX、XXYXX、XXYX-カルボキシル末端、および XXY-カルボキシル末端 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（１）に記載の方法であって、“Y”はチロシンであり、“X”はグリシン、アラニン、およびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である方法、
（３）ポリペプチドが、アミノ末端-Y[G/S]G、アミノ末端-GY[G/S]G、[G/S]GY[G/S]G、[G/S]GY[G/S]-カルボキシル末端、および [G/S]GY-カルボキシル末端 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む（２）に記載の方法であって、“G”、“S”、および“Y”はそれぞれグリシン、セリン、およびチロシンであり、[G/S]はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかである方法、
（４）ポリペプチドが、[G/S]GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2 のアミノ酸配列を含む（３）に記載の方法であって、“G”、“S”、および“Y”はそれぞれグリシン、セリン、およびチロシンであり、[G/S]1-2はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかが1または2残基である方法、
（５）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含むクロスリンカー試薬、
（６）ポリペプチドの架橋のためのリンカーを有する支持体の製造方法であって、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを支持体に固定化するまたは支持体上で合成する工程を含む方法、
（７）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドに他のポリペプチドが結合した融合蛋白質、
（８）（７）に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（９）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該ポリペプチドに他のポリペプチドが結合した融合蛋白質を発現できるように、該他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することができるクローニング部位を備えたベクター、
（１０）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドに、他のポリペプチドが結合した融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターが導入された細胞、
（１１）フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる工程を含む、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法、
（１２）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、（１１）に記載の方法、
（１３）フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する試薬、
（１４）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、（１３）に記載の試薬、
（１５）ポリペプチドにおける、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基の含量を上昇または低下させる工程を含む、フェノールオキシダーゼによる該ポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法、
（１６）該ポリペプチドを含む複合体の硬度を上昇または低下させる、（１５）に記載の方法、
（１７）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基の含量を上昇または低下させた、フェノールオキシダーゼによる該ポリペプチドの架橋が上昇または低下する改変ポリペプチド、
（１８）フェノールオキシダーゼのアッセイ方法であって、
（ａ）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドと被検試料とを接触させる工程、
（ｂ）該ポリペプチドの架橋を検出する工程、
（ｃ）該架橋のレベルをフェノールオキシダーゼのレベルと関連付ける工程、を含む方法、
（１９）フェノールオキシダーゼのアッセイキットであって、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドを含むキット、に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを接触させる工程を含む、該ポリペプチドを架橋する方法に関する。本発明において上記チロシンを“標的チロシン”と称す。“アミノ末端側の2残基以上、およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たない”とは、該アミノ末端側およびカルボキシル末端側の両方に2残基以上に分子量132未満の非電荷アミノ酸を有する場合、並びにその範囲にアミノ酸がない場合を含む。すなわち、チロシンを末端に有するポリペプチドにおいては、該チロシンの内側の2残基以上が分子量132未満の非電荷アミノ酸である場合はこのチロシンは本発明における標的チロシンである。またポリペプチドの末端から1アミノ酸内側にチロシンがある場合には、該末端のアミノ酸、およびチロシンの内側の2残基以上のアミノ酸が分子量132未満の非電荷アミノ酸である場合はこのチロシンは本発明における標的チロシンである。ポリペプチドの末端から2アミノ酸以上内側にチロシンが位置する場合においては、このチロシンの両側の2残基以上のアミノ酸が分子量132未満の非電荷アミノ酸である場合はこのチロシンは本発明における標的チロシンである。
【００１６】
具体的には、本発明における標的チロシンを含むポリペプチドとしては、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。ここで“Y”はチロシン、“X”は分子量132未満の非電荷アミノ酸を表す。なお“アミノ末端”および“カルボキシル末端”はポリペプチドの方向性を示すために記載したもので、これらの末端はアミノ基およびカルボキシル基そのものでなくとも、例えばアセチル化等により修飾されていてもよく、あるいは保護基等で置換されていてもよい。
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【００１７】
本発明の方法により、標的チロシンを含むポリペプチドはフェノール基に架橋される。例えば本発明により、標的チロシンを含むポリペプチドは、該ポリペプチド同士が分子間架橋されホモポリマーとなる。また、標的チロシンを含む複数種のポリペプチドを用いれば、ヘテロポリメリックな分子間架橋が生じる。分子内に標的チロシンを複数含むポリペプチドであれば、それらのチロシンのフェノール基同士が架橋され分子内架橋が生じ得る。また本発明の方法を用いて、標的チロシンを含むポリペプチドを非ペプチド性化合物のフェノール基と架橋させることができる。すなわち本発明は、フェノールオキシダーゼの存在下、（ａ）アミノ末端側の2残基以上およびカルボキシル末端側の2残基以上の範囲に電荷アミノ酸も分子量132以上のアミン酸も持たないチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチド、および（ｂ）フェノール基を含む化合物を接触させる工程を含む、該ポリペプチドと該フェノール基を含む化合物を架橋する方法を提供する。該フェノール基を含む化合物としては、（ａ）のポリペプチド自身（分子内架橋のため）、（ａ）のポリペプチドと同一の構造または別の構造を持つ標的チロシン含有ポリペプチド（分子間架橋のため）、およびフェノール基を持つ非ペプチド性化合物（例えばフェノール基を介したポリペプチドの修飾または担体への固定などのため）などが挙げられる。なお、本発明において“ポリペプチド”は、2アミノ酸以上のペプチド重合体を言い、オリゴペプチドと呼ばれるような短い鎖長のポリペプチドから、蛋白質と呼ばれるような鎖長の長いものまでを含む。また本発明においてポリペプチドは、直鎖状、分枝状、または環状であってよい。また、本発明においてポリペプチドには、その塩も含まれる。
【００１８】
チロシンに隣接する非電荷アミノ酸としては、分子量の小さいアミノ酸が好ましく、具体的には分子量132未満（すなわちアミノ酸の側鎖の分子量が58未満）の非荷電アミノ酸が特に好適である。好ましい非荷電アミノ酸としては、具体的にはアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、およびスレオニン（Thr）などが挙げられる。より好ましくは、分子量が120未満の非電荷アミノ酸であり、具体的にはアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、およびスレオニン（Thr）が挙げられる。中でも分子量110未満のグリシン、アラニン、およびセリンは特に好ましい。また、極性アミノ酸は水との親和性を高めることから好ましい。最も好ましいアミノ酸は分子量110未満の非電荷・極性アミノ酸であり、具体的にはグリシンおよびセリンが挙げられる。本発明において標的チロシンを含むアミノ酸配列を“GGYモチーフ”と称すが、このモチーフは“GGY”配列自体を持つものに限られず、本発明における標的チロシンを構成するアミノ酸配列のモチーフを総称するものである。
ポリペプチドに含まれるアミノ酸は修飾されていてもよい。修飾は制限されず、例えば糖鎖の付加、メチル化、アセチル化、リン酸化、ヒドロキシル化などが挙げられる。例えば、チロシン残基はドーパ（3,4-dihydroxyphenylalanine）であってもよい。またドーパキノンであってもよい。これらの修飾されたチロシンも本発明においてチロシンと総称する。
【００１９】
より好ましくは、標的チロシンを含むポリペプチドは、[G/S]1-2GY[G/S]1-2Gのアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。ここで[G/S]はそれぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかであることを意味する。[G/S]1-2は、それぞれ独立にグリシンまたはセリンのどちらかの残基が1または2残基あることを意味し、具体的には G、S、GG、GS、SG、または SSのいずれかであることを意味する。上記と同様に、ポリペプチド中のアミノ酸残基は修飾されていてもよい。さらに好ましくは、上記ポリペプチドは、GGYGG（配列番号：５１）または GGYSG（配列番号：５２）のアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。最も好ましくは、上記ポリペプチドは GGYGG のアミノ酸配列をとるチロシン残基を１つまたはそれ以上含むポリペプチドである。
【００２０】
また本発明の標的チロシンを含むポリペプチドは、一分子の中に好ましくは標的チロシンを2つ以上、より好ましくは3つ以上、より好ましくは4つ以上、より好ましくは5つ以上含んでいる。ポリペプチドに含まれる複数のチロシンが架橋の標的となることにより、より確実にあるいは多重的にポリペプチドを架橋させることが可能となる。特に多分子間で架橋が生ずることによるマルチメリックな蛋白質複合体の形成を期待する場合には、ポリペプチド中に標的チロシンを3つ以上、より好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5つ以上、さらに好ましくは6つ以上含むことが好ましい。標的チロシンを含む2つ以上のポリペプチドを架橋させる場合は、これらのポリペプチドの少なくとも1つに3つ以上の標的チロシンが含まれていることが好ましく、架橋させたい全てのポリペプチドに3つ以上の標的チロシンが含まれていることがより好ましい。
【００２１】
標的チロシンを複数含む場合は、それらのチロシンは隣接してクラスターを形成していることが好ましい。例えば、2、3、4、または5アミノ酸を介して、標的チロシンを2、3、4、または5残基以上含むポリペプチドは、本発明の架橋に好適に用いられる。標的チロシン間のアミノ酸としては、好ましくは非電荷アミノ酸、より好ましくは分子量の小さい非電荷アミノ酸であり、上記と同様に、例えばアラニン（Ala）、バリン（Val）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）、プロリン（Pro）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、およびスレオニン（Thr）などが挙げられ、中でも分子量の小さいグリシン、アラニン、およびセリンは好ましい。例えば好ましいポリペプチドとして、[G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2G を含むポリペプチドが挙げられる。より好ましくは GGY[G/S][G]1-2Y[G/S][G]1-2Y[G/S][G]1-2を含むポリペプチドが挙げられる。ここで[G]1-2はグリシンが1または2残基であることを示す。特に好ましいポリペプチドとしては、GGYGGYGGGYGG、GGYGGYSGGYGG、GGYSGGYGGYGG、GGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSG、GGYGGYSGGYSG、GGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：５３〜６０）などを含むポリペプチドが挙げられる。より好ましくは、GGYGGYSGGYGGYGG、GGYSGGYGGYGGGYGG、GGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSGGYSG、GGYGGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：６１〜６６）を含むポリペプチドであり、例えば GGYGGYSGGYGGYGGGYGG、GGYSGGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYSGGYGGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSGGYSGGYGG、GGYGGYSGGYSGGYSGGYGG、または GGYGGYGGYSGGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：６７〜７２）を含むポリペプチドである。このような標的チロシンのクラスターは、１つのポリペプチド内に複数箇所含まれていてよい。例えばN末端およびC末端にこのような標的チロシンのクラスターを持つポリペプチドは、本発明において好適に用いられる。
【００２２】
フェノールオキシダーゼとしては、ポリペプチド中の標的チロシンを基質として該ポリペプチドを架橋する活性を有する限り所望の酵素を用いることができる。また、本発明においてフェノールオキシダーゼはさらに他の活性を有していてもよい。本発明に用いることができる酵素としては、具体的にはカテコール・オキシダーゼ（EC 1.10.3.1）およびモノフェノール・モノオキシゲナーゼ（EC 1.14.18.1）などが含まれる。具体的には、チロシナーゼ、フェノラーゼ、モノフェノール・オキシダーゼ、クレソラーゼ、カテコール・オキシダーゼ、ポリフェノラーゼ、DOPAオキシダーゼ、ポリフェノール・オキシダーゼ、チロシン−DOPAオキシダーゼ、ラッカーゼ（laccase）などが挙げられる（Dawson, C.R. and Tarpley, W.B. The copper oxidases. In: Sumner, J.B. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-598; Lerch, K., Proc. Natl Acad. Sci. USA 75 (1978) 3605-3609; Malmstrom, B.G. et al., Copper-containing oxidases and superoxide dismutase. In: Boyer, P.D. (Ed.), The Enzymes, 3rd ed., vol. 12, Academic Press, New York, 1975, p. 507-579; McIntyre, R.J. and Vaughan, P.F.T., Biochem. J. 149 (1975) 447-461; Patil, S.S. and Zucker, M., J. Biol. Chem. 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, S.H., J. Biol. Chem. 238 (1963) 2351-2357; Robb, D.A. Tyrosinase. In: Lontie, R. (Ed.), Copper Proteins and Copper Enzymes, vol. 2, C.R.C. Press, Boca Raton, FL, 1984, 207-240; Brown, F.C. and Ward, D.N., J. Am. Chem. Soc. 79 (1957) 2647-2648; Dawson, C.R. and Tarpley, W.B. The copper oxidases. In: Sumner, J.B. and Myrback, K. (Eds.), The Enzymes, 1st ed., vol. 2, Academic Press, New York, 1951, p. 454-498; Gregory, R.P.F. and Bendall, D.S., Biochem. J. 101 (1966) 569-581; Mason, H.S., Nature (Lond.) 177 (1956) 79-81; Mayer, A.M. and Harel, E., Phytochemistry 18 (1979) 193-215; Patil, S.S. and Zucker, M., J. Biol. Chem. 240 (1965) 3938-3943; Pomerantz, S.H., J. Biol. Chem. 242 (1967) 5308-5314; Robb, D.A. "Tyrosinase". In: Lontie, R. (Ed.), Copper Proteins and Copper Enzymes, vol. 2, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984, p. 207-240）。また、ペルオキシダーゼ（E.C. 1.11.1.7）も好適に利用することができる（Lee, B.P. et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152）。ポリペプチド中の標的チロシンを基質として該ポリペプチドを架橋させる活性は、例えば実施例に記載したように、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドを基質として反応させ、反応産物の吸光度測定または電気泳動などにより検出することができる。
【００２３】
本発明においては、特にチロシナーゼを好適に用いることができる。例えば、原核生物、真菌類、または高等真核生物由来のチロシナーゼを好適に用いることができる。キノコチロシナーゼは商業的に入手可能である（例えばSigma社）。また、哺乳動物由来のチロシナーゼも好適である。チロシナーゼは組み換え体であってもよい。チロシナーゼ遺伝子は、様々な生物において既にクローニングされている（J. Gen. Microbiol. 129, 2703-2714 (1983); Gene 37, 101-110 (1985); 米国特許第 4,898,814号）。また、昆虫等が持つ種々のフェノールオキシダーゼを好適に用いることができる。特に本発明においては昆虫のヘモリンフ（体液）中に存在するフェノールオキシダーゼを好適に用いることができる。昆虫の体液に含まれるプロ-フェノールオキシダーゼは、生体内では微生物感染または創傷により活性化されると考えられている（Asano, T. & Ashida, M., J. Biol. Chem. 276, 11100-11112 (2001)）が、採取した体液を放置したり、あるいは有機溶媒で処理することによって活性化することができる（大西英爾他編, 昆虫の生化学・分子生物学, 名古屋大学出版, 1995, pp. 447-468）。また、ラッカーゼ（laccase）タイプのフェノールオキシダーゼ（Sugumaran M. et al., Arch. Insect Biochem. Physiol. 19, 271-281 (1992)）も本発明において使用することができる。本発明に用いるフェノールオキシダーゼは精製されていてもされていなくてもよい。例えば生物の体液、体腔液、血液、リンパ液、分泌液、あるいは生物試料の溶解液または抽出物でフェノールオキシダーゼが含まれている所望の試料を用いることができる。
【００２４】
標的チロシンを含むポリペプチドにフェノールオキシダーゼを接触させる工程により、このポリペプチドの架橋が生ずる。架橋は分子間、または一分子内に複数のチロシン残基を有するポリペプチドは分子内で生じ得る。該ポリペプチドとフェノールオキシダーゼとの接触は、フェノールオキシダーゼによる反応が阻害されない条件下、通常は適当な水溶液中で行う。pHは通常5〜10、好ましくは pH6〜9で行う。水溶液は、所望のpH緩衝剤を含んでいてよい。この場合、例えばリン酸バッファーまたはTrisバッファー等を用いることができる。フェノールオキシダーゼは反応溶液中に溶解してもよく、あるいは支持体に固定化されていてもよい。反応温度は特に制限されず、用いるフェノールオキシダーゼの温度特性に従って適宜調整することができる。反応は、例えば2℃〜70℃の間、好ましくは12℃〜60℃の間、より好ましくは15℃〜40℃、例えば室温で行われる。反応時間は通常5分〜50時間である。反応を停止させるには、例えば酵素とポリペプチドを分離したり、あるいはSDSの添加または反応系を過熱するなどして酵素を失活させればよい。本発明の方法により、架橋されたポリペプチドが産生される。本発明の架橋方法は、架橋されたポリペプチドの製造方法でもある。
【００２５】
また本発明は、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドを含むクロスリンカー試薬を提供する。すなわち本発明の標的チロシンを有するポリペプチドは、フェノールオキシダーゼによる架橋用基質となる。本発明のクロスリンカー試薬は、該ポリペプチドを様々なポリペプチドに対して架橋させるために、あるいはクロスリンカー試薬に含まれるポリペプチド自身を重合させるために、あるいは該クロスリンカー試薬に含まれるポリペプチドを媒介物として用いて、標的チロシンを含む2つ以上のポリペプチドを間接的に架橋させるために有用である。このようなリンカーポリペプチドとしては、例えば“N末端-Y-[X]n-Y-C末端”の構造を持つポリペプチドが含まれる。ここでXは分子量132未満の非荷電アミノ酸であり、nは2以上である。Xのアミノ酸としては、1つ1つ独立に例えばグリシンまたはセリンが好ましく、例えば全てのXがグリシンであるポリペプチド（ホモグリシンの両端にチロシンを有するポリペプチド）などが好適である。あるいは本明細書に記載した標的チロシンを含む任意のポリペプチドなどが挙げられる。クロスリンカー試薬は、上記ポリペプチド以外に所望の溶媒および/または溶質を含む組成物とすることができる。例えば水、アルコール等の有機溶媒、塩化ナトリウム等の塩、所望の保存剤、懸濁剤、または安定剤などを含むことができる。あるいはクロスリンカー試薬は乾燥した状態であってもよい。クロスリンカー試薬中のポリペプチドは自由な（遊離した）状態であっても、支持体または担体に固定化されていてもよい。本発明のクロスリンカー試薬は、例えば新たなペプチド性重合体の製造のための原料として有用である。重合反応は酵素的に行われるため、毒性のある添加剤や架橋剤を用いる必要がない。またこのような重合体はペプチド性であるため微生物により分解される新たな生分解性プラスチックとしても期待できる。本発明は新たなバイオマテリアルの製造に有用である。
【００２６】
また本発明は、本発明の標的チロシンを有するポリペプチドが固定化された支持体を提供する。固定化されたとは、共有結合または非共有結合により、該ポリペプチドが支持体に結合していることを言う。非共有結合としては、例えば水素結合、配位結合、イオン結合、疎水相互作用（疎水結合）、および分子間力（ファンデルワールス力）などが挙げられる。上記ポリペプチドと支持体は、好ましくは共有結合で結合している。該ポリペプチドは、所望の固定化方法により支持体に固定化することができる。ポリペプチドは、例えば支持体に存在する官能基を用いて共有結合させることができる。官能基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、サクシニルイミド基、フェノール基等が挙げられるが、これらに制限されない。共有結合の例としてエステル結合、エーテル結合、アミノ結合、アミド結合、スルフィド結合、イミノ結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。共有結合法としては、臭化シアン活性化法、酸アジド誘導体法、縮合試薬法、ジアゾ法、およびアルキル化法などが挙げられる。例えば支持体表面はアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で処理することができる。エポキシはアミン及びチオール基と共有結合を形成する。またカルボニルジイミダゾールはアミンと共有結合する。また、例えばポリペプチドのN末端もしくはC末端にシステインを含むようにしておき、その部位とマレイミド基を介して支持体に共有結合させる方法が知られている。また、p-フェニレンジイソチオシアネート（DITC）を含む支持体を用いれば、ポリペプチドのN末端部位のαアミノ基またはリジン残基のεアミノ基がDITCに共有結合で固定化される。N-ヒドロキシルスクシンイニドエステル（N-hydroxyl succinimide ester）により修飾された架橋アガロースなどの担体、およびエポキシコートされた担体などは公知である。また、担体表面のフェノール基を利用してフェノールオキシダーゼにより上記ポリペプチドを固定化させることもできる。このような担体には、フェノール基を導入したアガロースまたはアガロース誘導体、およびチロシンまたはDOPAなどにより修飾したポリエチレングリコールヒドロゲルなどが挙げられる（Lee, B.P. et al., "Enzymatic and non-enztmatic pathways to formation od DOPA-modified PEG hydrogels" Trans. Soc. Biomat., 24, 2001; Lee, B.P. et al., Polymer Preprints, 2001, 42, 151-152; Deming, T. J. Curr. Op. Chem. Biol. 1999, 3, 100）。
【００２７】
また、比較的短いポリペプチドの固定化を目的とする場合は、支持体に結合したアミノ基等から、化学合成により本発明の標的チロシンを含むポリペプチドを合成することもできる。ポリペプチドの合成法は様々な方法が知られている。例えば、α-アミノ基および側鎖の官能基の保護として、α-アミノ基をt-ブトキシカルボニルで、側鎖の官能基をベンジルアルコール系保護基で保護するBoc法、およびα-アミノ基を9-フルオレニルメトキシカルボニルで、側鎖官能基をt-ブチルアルコール系保護基で保護するFmoc法などが挙げられる。酸アミド結合の形成反応は、脱水剤により保護アミノ酸無水物を作り、これを縮合反応に利用する対称型無水物法、保護アミノ基にアルキルクロロホルメートを作用させ、混合酸無水物を作り縮合反応に用いる混合酸無水物法、p-ニトロフェノール（HONp）、ペンタフルオロフェノール（HOPfp）、N-ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）、またはN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）などの活性エステルを用いて縮合させる活性エステル法などの他、アジド法、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）にHOBtのような添加剤を組み合わせるDCC-添加剤法、酸ハロゲン化物法、その他が知られている（E. Gross, J. Meienhofer ed., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Academic Press, New York, 1979; 新生化学実験講座１, 日本生化学会編, 東京化学同人, 東京, 1992, pp.3-44）。ポリペプチドの合成は液相および固相で可能であるが、固相法を用いて支持体上に直接ポリペプチドを合成することができる（S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 57, 957, 1988; E. Atherton, R.C. Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis, a Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1989）。マイクロタイタープレート、小型のポリエチレンのピン、またはガラス上でポリペプチドを合成する技術が既に開発されている（A.M. Bray et al., Tetrahedon Lett., 31, 5811, 1990; G. Schnorrenberg, H. Gerhard, Tetrahedon, 45, 7759, 1989; S.P.A. Fodor et al., Science, 251, 767, 1991）。例えば光感受性保護基と光リソグラフィーを利用してガラスまたはシリコンなどの基板上に所望のポリペプチドを合成することができる。
【００２８】
支持体に固定化されるポリペプチドとしては、本発明の標的チロシンを含む限り制限されず、生理活性を持つポリペプチド、例えば酵素または受容体などであってよく、あるいはスペーサーまたはタグなどの特別な活性を持たないポリペプチドであってもよい。支持体に固定化されたスペーサーポリペプチドは、標的チロシンを含有する他の所望のポリペプチドと架橋することを通して、該所望のポリペプチドを支持体に固定化するための媒介物として有用である。例えば、後述する標的チロシン含有ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質を、このチロシンを介して支持体に固定化することにより、所望の蛋白質を支持体に固定化することが可能である。例えば酵素を支持体に固定化することは生物工学的に重要な意味を持っており、工業、研究、および臨床場面において、支持体に固定化された様々な酵素が用いられている。本発明の方法によれば、フェノールオキシダーゼにより所望の酵素または補酵素を支持体に固定化することが可能である。あるいは、抗菌または抗カビ活性を有する蛋白質を固定化することにより、所望の素材に抗菌・抗カビ機能を付加することができる。またセンサーとして機能する蛋白質を固定化したバイオセンサーを製造することも考えられる。架橋反応は本発明の標的チロシンに特異性を持つことから、固定化したいポリペプチドを含む試料中に他のポリペプチドが混合していても、架橋により標的チロシンを有するポリペプチドが優先的に固定化される。従って、目的のポリペプチドを高度に精製することなく固定化の工程を行うことができる点でも優れている。また後述する標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞を用いれば、支持体に該細胞を固定化することも可能である。細胞としては制限されず、原核細胞および真核細胞が用いられ得る。またオルガネラなども本方法を用いて固定化することができる。例えば固定化微生物を用いて、種々の生体物質を合成させることができる。
【００２９】
本発明において支持体は、水溶液に不溶性の固体または半固体であれば制限はない。支持体は、化学的に安定であり有意な生物毒性を示さないものが好ましい。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガラス、シリカゲル、アルミナ、および活性炭などの無機材料、ならびにセルロースおよびキチン等の多糖類を含む所望の素材を支持体として用いることができる。支持体は所望の形態であってよく、例えば膜状、繊維状、粉末状、ビーズ状、中空糸状、または多孔形状などであってよい。
【００３０】
高分子化合物からなる支持体としては、例えば、ポリメチルメタクリレート系重合体、ポリアクリロニトリル系重合体、ポリスルフォン系重合体、ビニル系重合体、ポリオレフィン系重合体、フッ素系重合体、ポリエステル系重合体、ポリアミド系重合体、ポリイミド系重合体、ポリウレタン系重合体、ポリアクリル系重合体、ポリスチレン系重合体、ポリケトン系重合体、ポリフェノール系重合体、シリコン系重合体、セルロース系重合体、キトサン系重合体などが挙げられる。具体的には、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、セファロース、デキストラン等の多糖類およびそれらの誘導体、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリアリルエーテルスルフォン、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、アセチル化セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、シリコン樹脂、フッ素樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリアクリルアミド、それらの誘導体などが挙げられる。これらの高分子材料は単独、あるいは２種以上を組み合わせて使用され得る。
【００３１】
本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが結合した支持体としては、該ポリペプチドが固定化されたカラム担体が挙げられる。例えば、セファロースビーズに該ポリペプチドを固定化し、各種クロマトグラフィーに用いることができる。このようなカラム担体に抗体、受容体蛋白質、またはリガンドなどを本発明の標的チロシンを介して固定化し、アフィニティークロマトグラフィーを実施することにより、これらの蛋白質に結合する因子をスクリーニングすることが可能である。
【００３２】
また、本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが結合した支持体としては、基板状の支持体の上に該ポリペプチドが高密度で多数結合したポリペプチドアレイ（プロテインチップとも言う）を特に挙げることができる。近年、ゲノムサイエンスの進展により膨大な種類の遺伝子およびそれらがコードする蛋白質が同定され、それらの蛋白質の発現や機能を解析するためにプロテインチップの開発が進められている。高密度ポリペプチドアレイ（プロテインチップ）とは、小面積に多数のポリペプチドが固定化された基板を言う。基板上に固定化したいポリペプチドに標的チロシンを含むタグを付加しておき、これを本発明の方法に従って基板上のフェノール基に固定化することができる。基板は、予め標的チロシンを含むオリゴペプチドでコーティングしてアンカーとして用いることもできる。コーティングに用いるポリペプチドの親水性を高くすることにより、基板を水和性に保ち、後で固定化する蛋白質が変性するのを防止することができる（MacBeath, G. & Schreiber, S.L., Science, 289, 1760-1763, 2000）。プロテインチップを製造するには、例えば上記のようなアンカーペプチドでコーティングしたスライドガラスやシリコンなどの基板上に、標的チロシンを含むポリペプチドをスポット法により固定することができる。この場合、ポリペプチドを含む溶液をスポッターまたはアレイヤーという装置で数nlから数plの微小体積で基板上に並べ、基板上の特定領域に固定する。スポット法としては、例えばピン先端の固相への機械的な接触によるピン（あるいはペン）方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、スポッター内に加熱によって泡（バブル）を生じさせてその圧を利用してサンプルを噴出させるバブル噴出方式、および毛細管によるキャピラリー方式などが知られている。スポット処理した後は、フェノールオキシダーゼによる架橋形成、基板表面のブロッキング、および洗浄等の後処理を行う。
【００３３】
高密度ポリペプチドアレイの基質は通常ガラスが用いられるが、ポリスチレン、シリコン、ナイロン、ニトロセルロース、またはその他の重合体などであってもよい。高密度ポリペプチドアレイは、その密度は1 cm2 当り一般に約60より多い、より好ましくは約100より多い、さらに好ましくは約600より多い、さらに好ましくは約1,000、約5,000、約10,000、または約40,000より多い、最も好ましくは約100,000より多い密度でポリペプチド分子が結合されたアレイを言う（ペプチドが固定されている総面積は1 cm2 より小さくてもよい）。ポリペプチド分子の鎖長は特に限定されず、天然に存在する蛋白質またはその断片などの比較的長いポリペプチドであってもよく、あるいは数アミノ酸から数十アミノ酸の長さのオリゴペプチドなどであってもよい。アレイの表面積は小さいため、各プローブ（アレイ上のポリペプチド）間の環境は極めて均一になり、しかも非常に大量のプローブの反応を同時に行うことができる。このポリペプチドアレイを用いることにより、例えば種々の蛋白質リン酸化アッセイや、蛋白質が標的とする低分子化合物の解析等を行うことができる。本発明の高密度ポリペプチドアレイは、プロテーム解析において好適に用いられる。
【００３４】
また本発明は、上記標的チロシンを含むポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質に関する。このような融合蛋白質は、ペプチド合成または組み換えDNAの発現等により製造することができる。このような融合蛋白質において、上記標的チロシンを含むポリペプチド部分は架橋のためのペプチドタグとして機能する。融合蛋白質は、2つまたは3つ以上のポリペプチドが融合したものであってよい。融合する他のポリペプチドとしては特に制限はない。架橋させたい所望のポリペプチドを用いることができる。具体的には、例えば、所望の酵素、細胞膜蛋白質、抗体またはその断片、受容体、受容体のリガンド結合部位を含む断片、リガンド、ホルモン、その他の生理活性ペプチドなどが挙げられる。例えば抗体断片の定常領域側末端に標的チロシンを含むポリペプチドを融合させ、これを介して抗体同士を架橋させることにより、機能を増強させた抗体分子を構築することができる。また、異なる機能的蛋白質にそれぞれ標的チロシンを導入し、これらを相互に架橋することにより、多機能の蛋白質複合体をデザインすることができる。このような蛋白質複合体はナノマシーンの創成に応用可能である。融合蛋白質中の標的チロシンを含むポリペプチドの位置は、融合ポリペプチドのN末端、C末端、および/または内部であってよいが、好適にはN末端またはC末端に位置する。例えば、細胞表面に発現する蛋白質の細胞外ドメインに標的チロシンを含むポリペプチドを融合させることにより、標的チロシンを細胞表面に発現する細胞を得ることができる（後述）。このような細胞は、本発明の方法を利用して、標的チロシンを含む所望のポリペプチドを細胞表面に付加することが可能であり、これを通して細胞に新規な機能を与えることが可能となる。また、機能蛋白質を支持体等に固定化する場合には、標的チロシンを適当な長さのスペーサーペプチドを介してその蛋白質に融合させることにより、元々の蛋白質の活性に有意な影響を与えずに支持体等に固定化することができる。
【００３５】
例えば本発明の融合蛋白質には、所望の蛋白質のN末端、C末端、または蛋白質の鎖中に GGYGG（配列番号：５１）またはGGYSG（配列番号：５２）、あるいはそれらの繰り返し配列が付加された蛋白質が含まれる。また本発明の融合蛋白質には、例えば所望の蛋白質の任意の位置に [G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2GY[G/S]1-2G を含むポリペプチドを付加した蛋白質が挙げられる。より具体的には、該付加させるポリペプチドとしては、GGY[G/S][G]1-2Y[G/S][G]1-2Y[G/S][G]1-2を含むポリペプチドが挙げられ、例えば GGYGGYGGGYGG、GGYGGYSGGYGG、GGYSGGYGGYGG、GGYGGGYGGYGG、GGYGGYGGYSG、GGYGGYSGGYSG、GGYSGGYSGGYSG、または GGYSGGYSGGYGG（順に配列番号：５３〜６０）などを含むポリペプチドが例示できる。融合蛋白質中の標的チロシンを介して、表面にフェノール基を持つ所望の支持体にこの融合蛋白質を酵素的に固定化することが可能である。
【００３６】
また本発明は、上記融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであってもよい。このポリヌクレオチドは、適当な発現ベクターに組み込んで融合蛋白質を発現させるために有用である。発現ベクターとしては、プラスミドベクター、PCR増幅断片、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられるがこれらに制限されない。非ウイルス性のベクターは、naked DNAとしてそのまま細胞または組織等に投与することができるし、あるいはLipofectAMINE（Gibco/Life Technologies）またはFugene、DOTAP、もしくはDOSPER（Roche）等のトランスフェクション試薬と混合して投与してもよい。本発明は、上記ポリヌクレオチドを細胞に導入して発現させる工程、および該細胞またはその培養上清から発現した融合蛋白質を回収する工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。
【００３７】
また、上記融合蛋白質を発現させることができるように、標的チロシンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築することができる。このベクターは、標的チロシンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、該ポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現できるように、該他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することができるクローニング部位を備えたベクターである。このようなベクターは、標的チロシンを含むポリペプチドのコード領域の5'隣接および/または3'隣接に、外来遺伝子を挿入するためのクローニング部位を備えている。ここに所望の蛋白質をコードする外来遺伝子をインフレームで挿入することにより、外来遺伝子がコードする蛋白質と標的チロシンを含むポリペプチドとの融合蛋白質を発現させることができる。クローニング部位は、例えば制限酵素認識配列を含む。複数の制限酵素認識配列を含むいわゆるマルチクローニング部位としてもよい。発現ベクターはプラスミド、ファージ、ウイルスベクターなどいずれの発現ベクターでもよい。本発明の発現ベクターは、具体的にはプロモーター−転写開始点−標的チロシンを含むポリペプチドのコード配列−外来遺伝子クローニング部位−転写終結配列を含むベクターであってよい。あるいは、プロモーター−転写開始点−外来遺伝子クローニング部位−標的チロシンを含むポリペプチドのコード配列−ストップコドン−転写終結配列を含むベクターであってよい。蛋白質コード配列の先頭に翻訳開始コドンがない場合には、適宜翻訳開始コドンを挿入する。翻訳開始コドン周辺の塩基配列は、翻訳開始に適した配列にすることができる（Kozak, M. Cell, 1986, 44:283-92）。プロモーターとしては、宿主細胞で機能する所望のものを用いることができる。例えばバクテリアであれば、lacプロモーター、trpプロモーター、またはtrp-lacハイブリッド（tac）プロモーターなどが例示できる。またT7 RNAポリメラーゼまたはT4 RNAポリメラーゼなどの認識配列をプロモーター配列として用いて、宿主細胞内で各RNAポリメラーゼを誘導的に発現させることにより強力な転写を誘導することができる。高等真核生物を宿主細胞にする場合は、例えばactinプロモーターなどの内在遺伝子由来のプロモーター、または宿主で機能するウイルス由来プロモーター等を用いることができる。哺乳動物細胞には、例えばSV40プロモーター、CMVプロモーター、MLV-LTRプロモーター、EF1（Elongation Factor-1）プロモーター、β-actinプロモーターなどが挙げられる。発現ベクターには、ベクターが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含んでいてもよい。
【００３８】
また本発明は、標的チロシンを含むポリペプチドと他のポリペプチドとの融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターが導入された細胞に関する。このような形質転換細胞は、本発明の融合蛋白質を製造するために有用である。あるいは、該融合蛋白質を発現する細胞そのものを新たな機能が付加された細胞として用いることもできる。本発明の形質転換細胞は、原核細胞および真核細胞が含まれる。具体的には、大腸菌、枯草菌、放線菌、コリネ菌、シアノバクテリア、ラクトバチルス、ラクトコッカス、リステリア、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、ビブリオ、アグロバクテリウム、および酵母などの微生物、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、トマト、ジャガイモ、コムギ、スギ、およびヒノキ等由来の植物細胞、ショウジョウバエ、カイコ、マウス、ラット、サル、およびヒト等由来の動物細胞が含まれる。発現ベクターは、対象とする宿主細胞に合わせて適宜選択することができる。
【００３９】
本発明の形質転換細胞としては、例えば該融合蛋白質を分泌する細胞が挙げられる。本発明は、分泌シグナルの下流に本発明の標的チロシンを含むポリペプチドを結合させた融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターを細胞に導入し発現させる工程、および発現した融合蛋白質をこの細胞の培養上清から回収する工程、を含む、該融合蛋白質の製造方法を提供する。得られた融合蛋白質は、本発明の架橋方法の基質として用いられる。例えば上記融合蛋白質は、本発明のクロスリンカー試薬として有用である。
【００４０】
また本発明の形質転換細胞としては、特に該融合蛋白質を細胞表面に発現する細胞が挙げられる。このような細胞は、例えば標的チロシンを含むポリペプチドを膜貫通蛋白質との融合蛋白質として発現するベクターを細胞に導入することにより製造することができる。例えば、膜に移行した成熟蛋白質のN末端が細胞外に位置する膜貫通蛋白質の場合は、シグナルペプチドと該成熟蛋白質との間に本発明の標的チロシンを含むポリペプチドが挿入された融合蛋白質を細胞で発現させることにより、標的チロシンが細胞外に提示された細胞を作り出すことができる。この細胞に、標的チロシンを含む別のポリペプチドを外から添加し、フェノールオキシダーゼで処理することにより、このポリペプチドをこの細胞の表面に固定化することができる。例えば腫瘍マーカーに対する抗体またはその抗原結合断片に本発明の標的チロシンを付加した融合ポリペプチドを作製し、これを細胞表面に架橋することにより、該腫瘍を特異的に認識する細胞を作り出すことができる。例えば、この細胞に細胞毒性効果を与える別の遺伝子を発現させておくことにより、腫瘍細胞を特異的に攻撃することが可能である。また、標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞は、このチロシンを介して支持体などに固定化することができる。固定化細胞は、生化学物質の工業的生産、あるいは疾患治療または再生医学等における臨床に応用することができる。また標的チロシンを含むポリペプチドを細胞表面に発現する細胞は、これらのポリペプチドを介して細胞同士を接着させることが可能である。
【００４１】
また本発明は、フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる工程を含む、本発明の標的チロシンを含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する方法に関する。この方法により、上記ポリペプチドを含む架橋した複合体の硬度を上昇または低下させることができる。複合体の硬度とは、該複合体に加わる力に対する該複合体の変形または破壊のしにくさを意味し、複合遺体に押し、引っぱり、またはせん断等の力を加えた時の変形の度合い、または一定の変形または破壊に至るまでの力を測定することにより決定することができる。また本発明は、フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、本発明における標的チロシンを含むポリペプチドの架橋を促進または抑制する組成物に関する。フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇させるには、フェノールオキシダーゼを添加したり、フェノールオキシダーゼをコードする遺伝子を発現させることにより実施することができる。また、フェノールオキシダーゼを活性化するトランスアクチベーターを添加することによりフェノールオキシダーゼを活性化することもできる（Lee, et al., Gene 65, 71 (1988); Bernan, et al., Gene 37, 101 (1985); Chen, et al., J. Biol. Chem. 268, 18710 (1993); WO95/13386）。また、ミノキシジル（minoxidil）などのピリミジン-3-オキシド誘導体が、チロシナーゼ活性を促進することが知られている（Rushton, D. H. et al., Clin. Exp. Dermatol., 14, 40-46 (1989); 日本国特許第2999163号）。また、イカ墨汁中の複合糖質ペプチドグリカンに、チロシナーゼ活性を増強する作用が報告されている（Naraoka T. et al., Food Sci. Technol. Res., 6, 171-175 (2000); 内沢ら, 生化学, 67, 734 (1995)）。これらの活性化剤の存在下、本発明に従ってポリペプチドを架橋させることにより、該ポリペプチドを強固に固定または重合させることができる。
【００４２】
フェノールオキシダーゼの量または活性を低下させるには、フェノールオキシダーゼを反応系から取り除いたり、フェノールオキシダーゼの発現を抑制したり、あるいはフェノールオキシダーゼの阻害剤を添加することにより実施することができる。フェノールオキシダーゼの発現の抑制は、例えばフェノールオキシダーゼ遺伝子のアンチセンス核酸の導入、またはフェノールオキシダーゼ遺伝子のジーンターゲッティング等により実施することができる。フェノールオキシダーゼの阻害剤としては、例えばビタミンＣ、プロアントシアニジン、またはそれらの誘導体などの酸化防止剤を用いることができる。また、フェノールオキシダーゼはCOまたはフェニルチオウレア等により阻害される。また、ペルオキシダーゼなどは、パラアミノ安息香酸（p-aminobenzoic acid）、アジド（azide）、シアン化合物（cyanide）、cyclopropanone、L-システイン、ニクロム酸（dichromate）、エチレンチオ尿素（ethylenethiourea）、ヒドロキシルアミン（hydroxylamine）、硫化物（sulfide）、バナジン酸（vanadate）、およびCd, Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb等の2価金属イオンにより阻害される（Handbook of Enzyme Inhibitors, Part A, 2nd Ed, Helmward Zollner, Ed, VCH, Weinheim, Germany (1993)）。また、チロシナーゼ阻害剤としては、種々の化合物および組成物が報告されている。代表的なチロシナーゼ阻害剤としては、コケモモ、梨、および高山植物の葉などに含まれるアルブチン（arbutin）、コウジ菌からつくられるコウジ酸（Kojic acid）の他、エラグ酸（ellagic acid）、およびレゾルシン（resorcin）誘導体（例えば 4-n-ブチルレゾルシノール (4-n-butylresorcinol)）等が挙げられる。また、銅メタロチオネイン（Copper metallothionein）等の銅と複合体を形成する化合物（銅キレート剤等）、安息香酸 (benzoic acid)、およびシアン化合物（cyanide）によっても阻害される（Duckworth, H.W. and Colman, J.E., J. Biol. Chem., 245, 1613-1625 (1970)）。また桂皮酸（cinnamic acid）または微生物のエステラーゼ抽出物にフェノールオキシダーゼの阻害効果が報告されている（Kermasha, S. et al., J. Agric. Food Chem. 41, 526-531, 1993; Walker, J.R.L. 1969, Phytochem. 8, 561-566; 2nd Inertnational Electronic Conference on Synthetic Organic Chemistry (ECSOC-2), 1998, dp138-139）。また、シャクヤク（paeoniae）、ユキノシタ（saxifrage）、カンゾウ（glycyrrhiza）などの植物エキスに、チロシナーゼ活性の阻害効果が報告されている。4位置換レゾルシノール骨格を有する樹木抽出物にも強力なチロシナーゼ阻害効果が報告されている（清水邦良, 木材学会誌付録, 47, 5 (2001)）。これらの阻害剤の存在下、本発明に従ってポリペプチドを架橋させることにより、該ポリペプチドの架橋のレベルを低下させることができる。
【００４３】
フェノールオキシダーゼの量または活性を上昇または低下させる化合物を有効成分として含む、本発明の架橋促進組成物または抑制組成物は、その標的チロシンを含むポリペプチドが架橋した複合体の硬度を上昇または低下させるための組成物（すなわち硬化剤または硬化防止剤）となる。これらの組成物は、ポリペプチド含有重合体製造における工業用試薬として、また組織硬化を促進または抑制する医薬または化粧品等として有用である。
【００４４】
本発明の組成物は、有効成分それ自体であってもよいし、必要に応じて水、またはエタノールなどのアルコール系溶媒を加えてもよい。剤形に制限はなく、液状、粉末状、顆粒状、錠剤状、乳液、クリーム、パック、軟膏等の任意の剤形を採用することができる。製剤化に当たっては、有効成分を単独で配合する以外に、必要に応じて任意の助剤を使用することができ、例えば他のフェノールオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼ阻害剤などの生理活性物質、またはその他の有用物質と混合して製剤化してよい。その場合は、併用された他の有効成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。具体的には、例えばクエン酸、酒石酸、乳酸、あるいはそれらの塩などの収斂剤、安息香酸、塩化ジステアリルメチルアンモニウム、またはソルビン酸などの殺菌・抗菌剤、植物または動物抽出物、紫外線吸収剤、コラーゲン、ビトロネクチン、またはフィブロネクチンなどの保湿剤、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、またはパントテン酸などの賦活剤等を適宜組み合わせることができる。本発明の組成物の製造においては、一般的な諸原料を用いて行う組成物の製造工程の任意の段階で有効成分であるフェノールオキシダーゼ、あるいはその量または活性を促進または抑制する化合物を添加すればよい。該有効成分の配合率は適宜変更することができるが、好ましくは約0.01〜30重量％、好ましくは約0.05〜10重量％である。本発明の組成物は、化粧品、あるいは皮膚または毛髪等に適用される医薬部外品もしくは医薬品等に組織硬化の促進作用または予防作用を付与する目的で配合するほか、所望の製品中の蛋白質架橋を促進または防止するための添加物または表面処理剤として使用することができる。
【００４５】
また本発明は、ポリペプチドにおける標的チロシンの含有量を上昇または低下させる工程を含む、フェノールオキシダーゼ処理による該ポリペプチドの架橋量を上昇または低下させる方法を提供する。例えば、天然のポリペプチドに標的チロシンが含まれる場合に、そのアミノ酸配列を除去したり、他のアミノ酸配列に置換するなどして標的チロシンの数を低下または完全に喪失させることにより、フェノールオキシダーゼによるこのポリペプチドの架橋を抑制または阻害することができる。また、天然のポリペプチドに標的チロシンを付加することにより、このポリペプチドのフェノールオキシダーゼによる架橋を上昇させることができる。標的チロシン含量を改変したこのようなポリペプチドは、本発明の架橋反応において架橋の程度を制御するために重要である。また、標的チロシンを含む非天然の構造を持つポリペプチドを化学的または生物的に新規に合成することもできる。このようなポリペプチドを用いて架橋反応を行うことにより、該ポリペプチドを含む架橋した複合体の硬度を制御することが可能である。
【００４６】
例えば天然蛋白質において標的チロシンを挿入したり、あるいはこの位置または数を変更することにより、より強度が高いあるいはより柔らかいバイオポリマーを開発することが可能である。改変対象となる蛋白質に制限はないが、クモまたはカイコの絹糸などの成分となる蛋白質（フィブロイン (fibroin)、セリシン (sericin)、およびスピドロイン (spidroin)、およびその他のシルク蛋白質など）、脊椎動物および無脊椎動物の皮膚、毛、および角質蛋白質、卵殻蛋白質、細胞外マトリクス（ECM）蛋白質、ならびに植物の細胞壁などが挙げられるが、これらに制限されない。例えばシルク蛋白質に標的チロシンを多数導入することにより、これまでにない強度を持つ蛋白質繊維を開発することも可能と考えられる。逆に、ポリペプチド中の標的チロシン含量を減らすことにより架橋度を下げ、より柔らかい素材を新規に開発することもできる。
【００４７】
改変の対象となるポリペプチドは、例えば綿花、麻、羊毛、カシミヤ、ラクダ、兎毛などのその他の獣毛、絹、石綿、紙などの天然繊維に含まれるポリペプチド成分が挙げられる。また、牛乳蛋白質、大豆蛋白質、落花生蛋白質などの蛋白質を原料とする再生蛋白質系ポリマーに含まれる蛋白質、プロミックス（Promix）等の蛋白質と合成化合物との共重合体などにおける蛋白質も改変の対象となる。生物が持つ蛋白質のアミノ酸を改変するには、相同組み換えを利用して内因性の遺伝子を改変遺伝子と入れ替える方法、および新たに改変遺伝子を導入する方法がある。これらは公知のトランスジェニック法およびジーンターゲティング法に従って行うことができる。
【００４８】
また本発明は、本発明における標的チロシンを含むポリペプチドを用いたフェノールオキシダーゼのアッセイ方法を提供する。この方法は、標的チロシンを含むポリペプチドと被検試料を接触させる工程、該ポリペプチドの架橋を検出する工程、および該架橋のレベルをフェノールオキシダーゼのレベルと関連付ける工程、を含む方法である。架橋のレベルはフェノールオキシダーゼ活性のレベルを反映する。従って、架橋反応が高いレベルで検出されるほど、試料中に高いレベルのフェノールオキシダーゼ活性が存在することが分かる。架橋の検出は、例えば実施例に記載したような吸光度測定、または反応生成物の電気泳動により実施することができる。また、標的チロシンを含むポリペプチドを固定化したマイクロプレートと、標的チロシンを含む蛍光標識した遊離ポリペプチドを組み合わせて被検試料と接触させれば、架橋反応により特異的にマイクロプレートに標識ポリペプチドが結合するため、洗浄後に蛍光を検出することにより容易にアッセイを行うこともできる。また、酸素消費をオキシグラフ等により測定したり、あるいはマススペクトロメトリーにより質量を測定することにより架橋を検出することができる（Jee, J.-G. et al., 2000, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 1563-1567）。フェノールオキシダーゼのアッセイは、特にヒトチロシナーゼ阻害剤のスクリーニングにおいてしばしば用いられている。本発明のアッセイ方法を用いれば、チロシナーゼ阻害剤の新たなスクリーニングが方法として有用である。また、本発明の標的チロシンを効率的に架橋する酵素の開発等において有用である。
【００４９】
本発明のフェノールオキシダーゼのアッセイキットは、標的チロシンを含むポリペプチドを含む。キットのポリペプチドは、乾燥していても水溶液に溶解していてもよい。ポリペプチドは、蛍光物質等により標識されていてもよい。また上記に記載したアッセイ方法で用いられるような、（ａ）標的チロシンを含むポリペプチドが固定化された支持体、および（ｂ）標識された標的チロシンを含むポリペプチドを含むキットも本発明に含まれる。キットには上記アッセイ方法の手順を記載した説明書を添付することができる。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は全て本明細書の一部として組み込まれる。
【００５１】
[実施例１]  カイコの新規なキューティクル蛋白質遺伝子の単離
１．カイコ表皮からのRNAの単離
脱皮において、JHの存在下の20Eの鋭いピークが表皮において多くの遺伝子の逐次的な発現を協調させる。脱皮におけるごく限られた期間に発現する、20Eにより制御されるこれらの遺伝子をスクリーニングするため、カイコの４回目の脱皮および５齢の発生ステージにおける遺伝子の発現を比較する実験を行った。
【００５２】
まずカイコBombyx moriのストックであるpSm788（mottled striped strain）（Fujiwara, H. et al., 1991, Genetical Research 57, 11-16）を、16:8 h（明:暗）の光周期条件下、25℃で、人工飼料（Nihon Nosan Kogyo, Yokohama, Japan）で育てた。
4回目の幼虫脱皮における発生時期を正確に定義するため、新しい気門の形成の特長的な序列を表す気門インデックス（spiracle index）を用いてカイコ発生ステージを定義した（Kiguchi, K., Agui, N., 1981, Journal of Insect Physiology 27, 805-812）。可視的な特徴を基に、脱皮期における10の形態学的な幼虫ステージ（A, B, C1, C2, D1, D2, D3, E1, E2 [A〜E, 4齢幼虫] および F [5齢幼虫]）を区別することが可能であった。これらのステージを気門インデックス（spiracle index）と称す。
新たに脱皮した4齢および5齢幼虫を明期の開始直後に分離した（この日を day 0 とした）。pSm788 株のほとんどの幼虫は 5齢幼虫の day 8 の明期初期に遊走（wandering）し始め（この日を W0 とした）、day 12 に蛹化した。
【００５３】
4回目の脱皮の3つの異なるステージ（C1、D1、およびE1）および5齢初期のステージ（F）におけるmRNA集団を、mRNAディファレンシャルディスプレイ技術を用いて比較するため、これらの4ステージにおいて pSm788 株のカイコ幼虫表皮から全RNAを調製した。具体的には、グアニジウムイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Chomczynski, P., Sacchi, N., 1987, Analytical Biochemistry 162, 156-159）を改変した方法により全RNAを単離し、エタノール沈殿によりさらに精製した。RNA濃度を分光光度計測定により決定した。
【００５４】
２．ディファレンシャルcDNAディスプレイ
上記で調製した、カイコpSm788株の4回目の脱皮期の幼虫のステージ C1、D1、およびE1、および5齢幼虫のステージ Fの表皮からの全RNAをDNase Iで処理した（MessageClean Kit, GenHunter Corp.）。これらのサンプルを SuperscriptTM II (GIBCO BRL) および 3'アンカーオリゴdTプライマー（H-T11A: 5'-AAGCTTT TTTTTTTTA-3' (配列番号：１) または H-T11C: 5'-AAGCTTTTTTTTTT TC-3' (配列番号：２)）を用いて逆転写した。逆転写は 0.5μgの熱変性した全RNA, 0.25μgの1つのプライマー, 0.5 mM dNTP, 10 mM dithiothreitol および 1× RTバッファーを含む10μlの反応液中で行った。42℃で2分インキュベートした後、100 Uの逆転写酵素を添加し、すばやく混和し、さらに42℃で50分インキュベートした。その後サンプルを70℃、15分で熱変性させ、40μlの蒸留水で希釈し、PCRに用いるまで-20℃で保存した。
【００５５】
PCRは10μlの反応液中、最終濃度1×のPCRバッファー[10 mM Tris-HCl, pH 8.3/50 mM KCl/0.001% (w/v) gelatin], 2μM dNTP, 2 mM MgCl2, 0.4μM 5'アービトラリープライマー（下記参照）および3'アンカーオリゴdTプライマー, 0.25 U Taq DNA polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer) および 37 kBq の [α-32P] dCTP (3000 Ci/mmol, ICN) の組成にて行った。
各cDNAサンプルについて40のアービトラリープライマー（OPM01〜20およびOPI01〜20, Operon Inc.）を用いてディファレンシャルディスプレイを解析した。サイクル条件は 94℃30秒, 40℃2分, 72℃1分を40サイクル行い、その後72℃で10分インキュベートとした。PCRサンプル（3.5μl）を2μlのDNAローディングダイ [95% formamide, 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.09% xylene cyanole, および 0.09% bromophenol blue] と共に80℃2分で変性させ、7 M尿素を含む6％ポリアクリルアミドシークエンシングゲルで電気泳動的に分離した。ゲルは濾紙上で乾燥させX線フィルムに露光した。
【００５６】
ほとんどのcDNAバンドは上記に記載した4ステージの全てのRNAサンプルで等しく可視であったが、幾つかはステージにより異なるレベルで発現していた。1つのcDNAバンド（4'-1, 149 bp）は、E1ステージ（これは後期脱皮期の間である）でのみ発現し、他のどのステージでも発現していなかった（データ省略）。この高度にステージ特異的な遺伝子の構造的特徴を同定するため、オートラジオグラフィーにより可視化した目的のcDNAバンドをゲルから切り出した。各ゲル切片は100μlのH2Oに浸し、80℃で15分インキュベートした。溶出したcDNAは、ディファレンシャルディスプレイで用いたのと同じプライマーセットでPCRにより再度増幅した。そのcDNAはpGEM-T Easy Vector（Promega）にクローニングした。プラスミドクローン中の挿入配列は、自動DNAシークエンサー（ABI PRISM310, PE Applied Biosystems）を用いて解析した。挿入配列は未同定のmRNAの3'領域に相当しており（図１のボックスで示した領域）、この配列を基に、5'および3'RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術を用いて全長cDNAクローンを単離した。5'および3'RACEは、Marathon cDNA Amplification Kitを用いて行った。
【００５７】
３．新規キューティクル蛋白質遺伝子BMCPG1の構造的特徴
単離したE1ステージ特異的cDNAの完全な配列の長さは595 bp（配列番号：３）であり、165アミノ酸の配列（配列番号：４）をコードする495 bpのオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでいる（図１）。そのORFから導出されるアミノ酸配列には、顕著な数のグリシン残基（55/165, 33.3%）が含まれている。GGYまたはその関連配列（GGGYおよびSGGY）が何回もタンデムにリピートしている。その特徴的な構造から、本発明者はこの遺伝子をB. mori cuticle protein GGY-repeat 1、すなわちBMCPG1と名付けた。SignalP V1.1プログラム（H. Nielsen et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997); H. Nielsen et al., Protein Engineering 12, 3-9 (1999); H. Nielsen et al., Int. J. Neural Sys. 8, 581-599 (1997)）により、BMCPG1の推定シグナルペプチドが予想された。
【００５８】
これまで報告されているカイコのキューティクル蛋白質と比較すると、BMCPG1と他のBombyxのキューティクル蛋白質との間に構造的類似性は見出されなかった。カイコの幼虫キューティクル蛋白質（LCP17, 18, 23, 32）および蛹キューティクル蛋白質（PCP1）（Nakato, H. et al., 1992, Biochimica et Biophysica Acta 1132, 161-167; Nakato, H. et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1218, 64-74; Shofuda, K. et al., 1999, Comparative Biochemistry and Physiology 122, 105-109）は、全てエンドキューティクル領域を形成するようであり、多くのAla、Val、またはPro残基を有している（データ省略）。これに対し、BMCPG1の主要なアミノ酸はGly、Val、およびTyrである。アミノ酸組成および配列の類似性（データ省略）に基づき、本発明者はBMCPG1はカイコの新規なキューティクル蛋白質であると考えた。
【００５９】
BLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656）を用いたホモロジーサーチにより、幾つかの蛋白質がBMCPG1と高い構造的類似性を有することが示された。それらはDrosophilaの推定されるキューティクル蛋白質 EDG91（Apple, R.T., Fristrom, J.W., 1991, Developmental Biology 146, 569-582）、ヒトサイトケラチン、Bombyxコリオン蛋白質、軟体動物ラバー蛋白質、および幾つかの他の蛋白質で、それらのほとんどは構造蛋白質であり、GGYリピートを含んでいる。これらの蛋白質の中で、EDG91はBMCPG1と顕著な構造的類似性を示した（図２）。EDG91およびBMCPG1はGGYリピートの長いストレッチを2つ、そして推定シグナルペプチドを含んでいる。BLASTPによっては、GGY構造を持つ昆虫のキューティクル蛋白質で高いスコアを持つものはEDG91以外に見出すことはできなかった。そこで本発明者は、ENTREZプログラム（National Center for Biotechnology Information (NCBI)）により、キーワード「cuticle」と共にリストされた遺伝子の中から、1つ1つ類似した蛋白質を探すことを試みた。本発明者は、Manduca sextaの推定キューティクル蛋白質 MsmaA16（Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518）、およびC. elegansの仮想蛋白質CeT27E4.4（The C. elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018）もまた、類似したGGYストレッチを持つことを見出した（図２）。しかしながら、今のところ、CeT27E4.4がキューティクル蛋白質であるのかは不明である。さらに、Locustのキューティクル蛋白質 LM-ACP 63、64、および 65（Hojrup, P. et al., 1986, Biochemical Journal 236, 713-720）が、N末およびC末に短いGGYリピートを含んでいることを見出した（データ省略）。これらの推定キューティクル蛋白質は、CeT27E4.4に1つあるのを除きCys残基を含まないことは特筆に値する。これらの蛋白質に含まれる、Gly、Ala、およびLeuなどの小さな非電荷アミノ酸に囲まれたTyr残基が、ジスルフィド結合に代わって蛋白質の架橋に使われる可能性がある。卵殻を構成するコリオンもまた、昆虫における硬い構造蛋白質である。カイコのほとんどのコリオン蛋白質はGGYリピートを持たないようであるが、幾つかのコリオン、すなわちL-11およびL-12のミドルクラスAおよびBは、GGY様モチーフを含んでいる（図２(B)）。GGYリピートを含むコリオン蛋白質は、多くのCys残基も含んでいる。
【００６０】
４．脱皮および変態におけるBMCPG1のステージ特異的および組織特異的発現
4回目の脱皮におけるBMCPG1の発現の正確な発生的プロファイルを調べるため、ステージ C1、D1、D3、E1、E2、および F の表皮cDNAにおいて、LightCycler (Roche) を用いた定量的RT-PCRを行った（図３）。また、いずれも脱皮ステージにおいて特異的に転写される遺伝子であるBMCPG1、DDC、およびFTZF1遺伝子の発現パターンを比較した。
【００６１】
定量的逆転写PCRのために、First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) を用いて全RNAをcDNAに逆転写した。1μgの全RNAおよび0.1μgのランダムヘキサデオキシヌクレオチドを含む7.5μlの反応液を37℃で60分インキュベートし、90℃で5分加熱し、素早く氷上で冷やし、180μlのRNase-freeの水で希釈した。定量的逆転写PCR（quantitative RT-PCR）は SYBR Green Kit（LightCycler-DNA Master SYBR Green I, Roche）を用いて、LightCycler（Roche）により行った。細胞で恒常的に発現するリボソーム蛋白質L3（rpL3）の遺伝子を内部標準として用い、mRNAの相対的発現を評価した。定量的RT-PCRで用いたオリゴヌクレオチドプライマーセットを以下に示す。rpL3（GenBank accession no. AB024901）については 5'-AGCACC CCGTCATGGGTCTA-3'（配列番号：５）および 5'-TGCGTCCAAG CTCATCCTGC-3'（配列番号：６）; FTZF1 (D10953) については 5'-AAACTTGAAGCGGTTCGAGC-3'（配列番号：７）および 5'-GCATAACAGACCATGAGTCC-3'（配列番号：８）; DDCについては 5'-GGCACGGCTAGCGAAGCTAC-3'（配列番号：９）および 5'-GATCCAGCGTAGGCGGCATC-3'（配列番号：１０）; BMCPG1については 5'-GGCATCATGAGAGCATTCGT-3'（配列番号：１１）および 5'-TAGTTCACCACCA TCCGTTG-3'（配列番号：１２）。これらのプライマーを用いることで、RT-PCR反応後のアガロースゲル電気泳動では単一のバンドのみ観察された。rpL3、FTZF1、DDC、およびBMCPG1の各バンドは、それぞれ 409, 679, 395 および 508 bp であった。
【００６２】
BMCPG1、DDC、およびFTZF1の3つの遺伝子は類似した発現パターンを示した。各遺伝子から転写されるmRNAは、エクジステロイドのタイターが上昇しているか、またはピークにあるCおよびDステージでは低く、エクジステロイドレベルが下降するステージEでより高かった。しかしながら、E1およびE2ステージに発現のピークがあるFTZF1と比べ、BMCPG1およびDDCの発現は遅れてE2ステージにピークがある。4回目の幼虫脱皮の後のFステージでは、BMCPG1およびFTZF1 mRNAレベルは完全に抑制されていたが、DDCの発現は脱皮後でさえ持続した（図３および４）。
【００６３】
さらに、4回目の脱皮および前蛹ステージの両者の間のBMCPG1のステージ特異的な発現をノーザンブロット解析により調べた（図４）。ノーザン解析のために、10μgの全RNAをホルムアルデヒド−アガロース（1%）ゲルで分離し、Hybond-Nナイロンメンブレン（Amersham）に転写した。ハイブリダイゼーションを、50% ホルムアミド, 5× SSC, 10× Denhardt's液 (各0.2%のBSA, Ficoll, および polyvinylpyrrolidone), 25μg/ml sonicated salmon sperm DNA, および 50 mM sodium phosphate (pH 7.0) 中、42℃で18時間行った。DNAプローブはBcaBESTTM Labeling Kit (TaKaRa) を用いて[α-32P]dCTPで標識した。メンブレンは、0.1% SDSを含む2× SSC中、室温で20分の洗浄を2回行った。その後、メンブレンは65℃30分の洗浄を段階的に1% SDSを含む2× SSC、1% SDSを含む1× SSC、1% SDSを含む0.1× SSC中で行った。
【００６４】
BMCPG1は、第4脱皮における E1およびE2ステージ、およびエクジステロイドのタイターが低下する時期である、前蛹期における遊走開始後の day 3（W3）および day 3.5（W3.5）で発現していた。FTZF1およびDDCもまた、報告（Sun, G. et al., 1994, Developmental Biology 162, 426-437; Hiruma, K. et al., 1995, Developmental Biology 169, 195-209）されているように、脱皮の直前に発現のピークがある類似したパターンを示した。脱皮および前蛹期におけるステージ特異的発現は、BMCPG1遺伝子がエクジステロイドタイターの低下に応答することを示唆している。
【００６５】
BMCPG1の組織特異的な発現を調べるため、E2およびW3.5ステージの表皮以外の組織におけるBMCPG1 mRNAレベルをノーザン解析により調べた（図５）。BMCPG1は表皮でのみ強く発現しており、他の組織（脂肪体、精巣、絹糸腺、および翅原基）ではいずれのステージでも発現していなかった。しかしながら、X線フィルムの露光と現像を長くすると、精巣および脂肪体の両方でごく少量のBMCPG1 mRNAが検出された（データ省略）。これに対し、FTZF1およびDDCは、様々な組織およびステージにより発現レベルは異なるものの、ほとんどの組織で発現していた。この結果は、BMCPG1遺伝子はキューティクル蛋白質をコードしていることを強く示唆する。
【００６６】
５．培養表皮のBMCPG1 発現に及ぼす20-hydroxyecdysoneの効果
上記の結果は、20-hydroxyecdysone（20E）のパルスは表皮においてBMCPG1の転写を誘導することを示唆する。この仮説を検証するため、培養表皮のBMCPG1発現に及ぼす20Eの効果を調べた。具体的には、day 2の4齢幼虫から表皮を切り出した。表皮は背側からキューティクルと共にハサミで5から8つのセグメントに切り分けた。phosphate-buffered saline (pH 7.0) 中で、付着する脂肪体、筋肉、および気管を注意深く、できるかぎり取り除き、表皮をGrace's medium (GIBCO BRL) 中で1時間25℃で培養した（前培養）。前培養の後、表皮の小片を4枚のマルチウェルディッシュ (Nunc, 直径16 mm) に移し、1% antibiotic reagents (GIBCO BRL, Antibiotic-Antimycotic) を含むGrace's medium 1 ml中でインキュベートした。エクダイソン刺激は、20-hydroxyecdysone (20E, SIGMA) を10% isopropyl alcohol中に溶解し、培地中に2μg/mlで添加して行った。その後表皮を6〜42時間培養した。
【００６７】
LightCyclerを用いた定量的RT-PCRにより、培地中に20Eがない場合でも、培地中に2μg/mlの濃度の20Eが存在する場合でも、42時間までの期間にBMCPG1の転写は誘導できないことが示された（図６）。2μg/mlの20Eで6時間インキュベート後に培地から20Eを取り除くと、BMCPG1 mRNAレベルの増加がはっきりと誘導された。このような20Eのパルス処理は、FTZF1の発現も誘導した。しかしながら、BMCPG1とFTZF1の誘導パターンは異なっていた。FTZF1の誘導は培地から20Eを取り除いた直後に始まったが、BMCPG1の発現は20Eの除去の後、約12時間遅れた。これは、BMCPG1の発現は、エクジステロイド誘導遺伝子活性化経路の転写因子であるFTZF1の機能により制御されている可能性を示唆する。
【００６８】
[実施例２]  GGYモチーフを含むペプチドの架橋
GGYモチーフが実際に蛋白質の架橋に関与する確証を得るため、BMCPG1配列を基にGGYモチーフを含むペプチドを合成した。そして酵素的酸化によるこれらのペプチドの架橋を調べた。ペプチドが架橋すると、UV-可視光のレンジの吸収は有意に変化することから（Burzio, L. A. & Waite, J. H., Protein Sci. 10, 735-740 (2001)）、まず分光光度計によるスキャニングを用いて架橋反応を測定した（図７）。20 mer のGGYpep（GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY; BMCPG1の残基51〜70に相当、表１参照）（配列番号：１３）をキノコチロシナーゼにより酸化すると、波長210〜600 nm における吸収のパターンは、反応時間を0から60分まで増加させるに従い上昇した（図７a）。しかし、GGYpepをチロシナーゼではなくウシ血清アルブミン（BSA）と混合した場合は、そのような変化は起こらなかった（図７b）。チロシン残基がないペプチド（BHRpep）（配列番号：１４）にチロシナーゼを添加した場合は、吸収パターンの変化は観察されなかった（図７c）。これらの結果は、GGYpepのチロシン残基の間で、チロシナーゼ依存的な様式でdi-DOPAクロスリンクが形成することを示唆している。この反応において、キノコチロシナーゼを昆虫のフェノールオキシダーゼ（PO）で代替することができ、キューティクル形成において観察されるBMCPG1のin vivoの架橋を模倣することを調べるため、カイコから得たPO活性化ヘモリンフを用いた（Ashida, M. & Brey, P. T. (1998) Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects (Brey, P. T. and Hultmark, D. eds). pp. 135-172. Chapman & Hall, London）。GGYpepをPO活性化ヘモリンフと混合したところ、吸収パターンはチロシナーゼ反応で観察されたのと同様に上昇した（図７d）。
【００６９】
[実施例３]  架橋反応のアミノ酸配列特異性
それぞれ1つまたは2つのチロシン残基を含む3つの異なるペプチド、アンギオテンシン II（angiotensin II）（配列番号：１５）、副腎皮質刺激ホルモン（adrenocorticotropic hormone; ACTH）（配列番号：１６）、および血管作用性小腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide; VIP）（配列番号：１７）をチロシナーゼと反応させ、2分および10分後にサンプルのUV吸収を波長210〜320 nm でスキャンした。GGYpepの反応で観察された上昇パターン（図８a）に比べ、アンギオテンシン II（図８b）またはACTH（図８c）ではUV吸収の変化は見られなかった。しかしVIPの10分の反応時間の後では、UV吸収の僅かな上昇が観察された（図８d）。これらの結果は、チロシナーゼにより触媒されるdi-DOPAの架橋はGGYモチーフに特異的な様式で起こり、幾つかのチロシン残基（VIPのNYTまたはKYL）で低効率で起こる架橋に比べ有意に高い効率で反応することを示している。なお最近、2つの神経内分泌ペプチド、ニューロテンシン（neurotensin）（ELYENK／配列番号：１８）およびプロクトリン（proctolin）（RYPT／配列番号：１９）が、di-DOPAクロスリンクを受けることが報告された（Burzio, L. A. & Waite, J. H., Protein Sci. 10, 735-740 (2001)）。
【００７０】
[実施例４]  GGYモチーフを含むポリペプチドの架橋反応の解析
GGYモチーフを含むポリペプチドで起こる構造変化をより明確に理解するため、BMCPG1の異なる部分に相当する配列（残基128〜145, FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY／配列番号：２０）を用いてFITCラベルしたオリゴペプチド（FITC-GGYpep）を合成し、このペプチドを酸化反応後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で解析した。FITC-GGYpepをキノコチロシナーゼで5分または30分インキュベートすると（図９A, レーン3, 4, および8）、FITC-GGYpepのもともと（単量体）のバンド（2.7 kDa）の上に、約30 kDaまでスメアなバンドが観察された。このようなスメアなバンドは、チロシナーゼ反応を省略したり（図９A, レーン1および2）、あるいはチロシナーゼをBSAに代えた（レーン9）場合には生じなかった。これらの結果は、GGYペプチドはチロシナーゼ酸化により架橋し、約10 merまでの多量体を形成できることを強く示唆している。スメアなバンドは、おそらくFITC-GGYpepのチロシン残基間のランダムな共有結合の形成に起因している。これらの架橋は反応混合液にSDSを添加すると妨害された（レーン6）が、反応後のローディングバッファーにβ-メルカプトエタノールを添加しても妨害されなかった（レーン5）。S-S結合とは違い、GGYモチーフを含むペプチド間の架橋はβ-メルカプトエタノールにより開裂されなかった。
【００７１】
[実施例５]  フェノールオキシダーゼによるGGYモチーフを含むポリペプチドの架橋
カイコヘモリンフで反応させたFITC-GGYpep間の架橋をさらに調べた（図９B）。架橋産物のスメアなバンドは、FITC-GGYpepをPO活性化ヘモリンフと反応させた場合にも観察された（レーン2および4）が、ポリメライゼーションの程度はチロシナーゼ反応における観察に比べ小さいように見えた（レーン7）。特異的フェノールオキシダーゼ阻害剤であるフェニルチオウレア（phenylthiourea; PTU）をヘモリンフに添加すると、バンドシフトは完全に遮断された（レーン3および5）ことから、カイコヘモリンフ中のフェノールオキシダーゼ活性が、GGYペプチドの架橋に責任を持つことが示唆された。この知見は、キューティクル蛋白質BMCPG1は、カイコにおいて実際に架橋されることを示唆する。
【００７２】
[実施例６]  GGYモチーフを有する蛋白質
BMCPG1はGGYモチーフ（主にGGYGG）のリピートからなる2つのドメインを、1つはN末端付近に、他方はC末端付近に含んでおり（表１）、それらは全長165アミノ酸の配列の半分を構成している。GGY様のリピートは軟体動物の接着蛋白質にも存在し、蛋白質の架橋に関与すると考えられている; A. ater 蛋白質中の AGY*GG（Y* はDOPAを表す）（Burzio, L. A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000)）。さらに、多毛類のセメント蛋白質のGGY*GGまたはGGY*GY（Waite, J. H. et al., Biochemistry 31, 5733-5738 (1992)）、および吸虫の卵殻蛋白質のGGY*GGY*G（Waite, J. H. & Rice-ficht, A. C., Biochemistry, 26, 7819-7825 (1987)）という、ペプチジルDOPA（Y*）を含む他のGGY様配列も報告されている。これらの蛋白質に共通するGGYモチーフが、di-DOPAの共有結合を介する蛋白質の架橋に関与していると考えられる。
【００７３】
上記の蛋白質は全て、硬い細胞外蛋白質であることは興味深い。従って、GGYモチーフのリピートは、強力な蛋白質構造の形成を特定する保存された一般的モチーフである可能性がある。この可能性を検証するため、BMCPG1の全体の配列とホモロガスな配列を、再度BLASTP2.0プログラムを用いて検索した。最も高いホモロジーの値はBMCPG1自身でその期待値は6e-97であり、Drosophilaのエクダイソン誘導性のGGYリッチキューティクル蛋白質であるEDG91の3e-21（Apple, R. T. & Fristrom, J. W., Dev. Biol. 146, 569-582 (1991)）がそれに続いた（表１）。残りの配列（2e-17よりもホモロジー値が小さい）の多くはGGYリッチな蛋白質をコードしており、それらの大半は硬い蛋白質である。これらの蛋白質の典型的な例を表１にまとめた。上記した蛋白質に加え、昆虫の幾つかのコリオン蛋白質（Sporel, N. et al., J. Mol. Biol. 190, 23-35 (1986)）、クモのシルク蛋白質（Hayashi, C. Y. & Lewis, R. V., BioEssays 23, 750-756 (2001); Ac no. AAK30596）、植物の細胞壁蛋白質（Rhode, W. et al., Plant Mol. Biol. 14, 1057-1059 (1990)）、および哺乳動物の幾つかのタイプのサイトケラチン（CK9およびCK10）（Langbein, L. et al., Differentiation 55, 57-71(1993）が、GGYモチーフ配列に富んでいる。その役割は明らかではないが、GGYリッチモチーフはRNA結合蛋白質およびRNAヘリカーゼAにも見られる（Lee, C. G. & Horwitz, J., J. Biol. Chem. 268, 16822-16830 (1993)）。
【００７４】
BMCPG1とホモロガスな配列をBLASTP2.0で検索し、さらに目視によりGGYリッチな配列を調べた結果を表１にまとめた。表中、各蛋白質におけるGGYまたはGGY関連配列の総数（#1）および典型的なGGYリッチ領域（#2）が4番目のカラムに示されている。典型的な領域のGGYモチーフ配列は中抜き文字で示されている。チロシン残基の直近を取り囲むGlyリッチ領域の5残基に下線を引いた。Y* はペプチジルDOPAとして同定されたチロシン残基を示す（#3）。各蛋白質中のGGYリッチ領域の位置は5番目のカラムに示されている。
【００７５】
【表１】  広範で様々な蛋白質中に見出されるGGYGGモチーフ
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【００７６】
軟体動物蛋白質のAGY*GGXK配列（配列番号：３４）またはGY*GAK配列（配列番号：３５）が酸化の標的として作用する（Burzio, L. A. et al., Biochim. Biophys. Acta 1479, 315-320 (2000)）ことから、“GGY”それ自体のリピートが唯一の厳格な架橋部位ではありそうにない。表１に示した配列の多くにおいて、“GGY”は常に直接（GGYGGYとして）繰り返している訳ではなく、しばしばグリシンのような非電荷の小さなアミノ酸に富む領域に隣接している（表１の下線部）。従って、効率的な架橋のためには、チロシンは、GGYGGまたはAGYGGのように、グリシンのような非電荷の小さなアミノ酸に富む配列に囲まれている必要があると考えられる。この条件が満足されることにより、“GGY”様配列（SGY、AGY、および表１に示した幾つかの他の配列を含む）も架橋の標的として作用する。チロシン残基を囲むグリシン、セリン、およびアラニン残基は比較的小さなアミノ酸であり、チロシンが酸化酵素に露出されるのを助けると考えられる。
【００７７】
【発明の効果】
本発明により、ポリペプチドを架橋するための新たな方法が提供された。本発明は例えば高強度のペプチド性繊維、または強固な構造を持つ蛋白質の製造に有用である。また、所望の蛋白質を支持体または他の蛋白質と共有結合させるために有用である。本発明は、例えば組織の接着剤として用いることができる。本発明の架橋反応は水溶液中で進行することから、本発明の方法を水中の蛋白質および生体などにおいて組織を接合させるために用いることができる。このように本発明の方法は、工業および医療において様々な応用が可能である。
【００７８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  cDNA配列から導出されるBMCPG1のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸残基を塩基配列を下に示し、第１Met残基（position 1）からの番号を示した。GGY、GGGY、およびSGGY配列に下線を引いた。GGY関連配列は括弧で示した。アスタリスクはストップコドンを表す。推定シグナルペプチドは、World Wide Web prediction server (CBS) の SignalP V1.1プログラムにより予測し、イタリックの文字で示した。ディファレンシャルディスプレイで得られた元々の産物はボックスで示した。5'RACE（5'-1 および 5'-2）および3'RACE（3'-1 および 3'-2）のためのプライマーセットは矢印で示した。5'RACEおよび3'RACEの結果に基づき、BMCPG1の全配列を決定した。
【図２】  GGYリッチキューティクル蛋白質およびカイココリオン蛋白質中のアミノ酸配列の比較を示す図である。(A) BMCPG1の導出アミノ酸配列（配列番号：４）を、他の種の3つのキューティクル蛋白質のそれと整列させた。DmDG91, D. melanogaster ecdysteroid dependent gene 91 (accession no. AAF55440)（配列番号：４６）。MsmaA16, Manduca sexta putative cuticle protein (accession no. AF117571, Robertson, H.M. et al., 1999, Insect Molecular Biology vol. 8, 501-518)（配列番号：４７）。CeT27E4, C. elegans hypothetical protein T27E4.4 (accession no. AAB04835, The C. elegans Sequencing Consortium, 1998, Science 282, 2012-2018)（配列番号：４８）。(B) GGYリピートモチーフを含むカイココリオン蛋白質。コリオン蛋白質 A-L11 (accession no. CAB01210)（配列番号：４９）および B-L12 (accession no. CAA31323)（配列番号：５０）は、それぞれミドルAクラスおよびミドルBクラスのコリオンに分類される（Tsitilou, S.G. et al., 1983, EMBO Journal 2, 1845-1852）。GGYおよびGGY関連配列に下線を引いた。推定シグナルペプチドは、World Wide Web prediction server (CBS) の SignalP V1.1プログラムにより予測し、イタリックの文字で示した。各蛋白質におけるシグナルペプチドを除いた推定分子量を計算し、図中に示した。
【図３】  4回目の幼虫脱皮における、BMCPG1、DDC、およびFTZF1の3遺伝子の発生的プロファイルを示す図である。各遺伝子のmRNAの相対的発現を定量的RT-PCRにより測定し、最大のデータを100として示した。バーは平均±SD（n=4-14）を示す。
【図４】  4回目の脱皮および前蛹ステージにおける、BMCPG1、DDC、およびFTZF1のノーザンブロット解析を示す図である。定量的RT-PCR解析で用いたそれぞれのPCR断片（BMCPG1, 508 bp; DDC, 395 bp; FTZF1, 679 bp）を32Pラベルし、全RNA（5μg）とハイブリダイズさせた（実施例参照）。BmN, エクジステロイドパルスで処理したBmN4培養細胞株（図６参照）。なお、BmN4はカイコ卵巣から樹立された細胞株で、Nihon Nosan Kogyoより入手した。脱皮ステージは気門インデックスに基づいて決定した。W0〜W3.5, 遊走開始の0〜3.5日後。幼虫はW4で蛹化する。等量ロードしたことを示すコントロールとして、rRNAのエチジウムブロマイド染色を示した。
【図５】様々な組織におけるBMCPG1、DDC、およびFTZF1のノーザンブロット解析を示す図である。E2（脱皮）およびW3.5（変態）における様々な組織からの全RNA（10μg）を、32Pラベルしたプローブとハイブリダイズさせた（図４参照）。Ep, 表皮; FB, 脂肪体; T, 精巣; PSG, 後部絹糸腺; WD, 翅原基。等量ロードしたことを示すコントロールとして、rRNAのエチジウムブロマイド染色を示した。
【図６】エクジステロイドパルスによるBMCPG1発現の誘導を示す図である。4齢 day 2 の表皮を図の下のダイアグラムに示したようにインキュベートした。ダイアグラム中の黒いボックスは 2μg/mlの20E処理を示す。白いボックスは20E非添加を示す。サンプルはインキュベーションの 6、18、30、および42時間後に回収した。BMCPG1の相対的発現をLightCyclerを用いたRT-PCRにより測定し、FTZF1の発現パターンと比較した。mRNAの相対的発現は、最大データを100として示した。バーは平均±SD（n=3）を示す。
【図７】チロシナーゼによるGGYモチーフ含有ペプチドの架橋を示す図である。チロシナーゼまたはヘモリンフのフェノールオキシダーゼによりGGYモチーフ含有ペプチドが酸化されると、UV-可視光のレンジの吸収が有意に変化することを示す。
(a) チロシナーゼで酸化したGGYリッチペプチド（GGYpep）；(b) BSAと混合したGGYpep；(c) チロシナーゼにより酸化したチロシンを欠損するBHRpep；(d) カイコ幼虫からのヘモリンフフェノールオキシダーゼにより酸化したGGYpep。
GGYpepの20 merの配列 GGYGGYSGGYGGYGGGYGGY（配列番号：１３）は、BMCPG1 (accession number AB055661) のアミノ酸残基51〜70に相当する。33 merのBHRpep（MPKNLLLFKKIIPEINFAKRNLTSPLGRNIFIS／配列番号：１４）をネガティブコントロールとして用いた。両ペプチドはSAWADAY Tech. Corp.（Tokyo）で合成しHPLCで精製した。ペプチドは50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に 1 mg/ml で懸濁した。キノコチロシナーゼ（6050 unit/mg, Sigma, product No. T7755）およびBSAは、50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に 1 mg/ml で懸濁した。架橋反応は110μlの5 mM Tris-HCl（pH 7.9）中、ペプチド：酵素重量比を1：1で、0.01 mgのキノコチロシナーゼ（またはBSA）を添加することにより開始した。反応液を室温で0〜60分（0, 1, 2, 5, 10, および 60分, または d においては 0, 5, および 15分）インキュベートした。各反応は、20μlの 1 N HCl を添加することにより停止させた。UV-可視光吸収は、Hitachi分光光度計を用いてスキャンした。カイコヘモリンフは5齢初期の幼虫からガラスプレート上に回収し、室温で10分保持してフェノールオキシダーゼを活性化させた。ヘモリンフは50 mM Tris-HCl（pH 7.9）中に1/10に希釈し軽く遠心した。上清（10μl）を架橋反応に用いた。
【図８】チロシナーゼによる架橋の基質特異性を示す図である。
GGYpep、アンギオテンシン II（Bachem, CA）（配列番号：１５）、ACTH（Peninsula Laboratories Europe Ltd, UK）（配列番号：１６）、およびVIP（Peninsula Laboratories Inc, CA）（配列番号：１７）を、図７に記載の条件下でキノコチロシナーゼと 0、2、および10分間架橋させた。
【図９】  FITCラベルしたGGYペプチドの架橋のSDS-PAGE解析を示す図である。
FITCラベルしたGGYペプチドをキノコチロシナーゼ（A）またはフェノールオキシダーゼ（PO）活性化ヘモリンフ（B）で架橋させ、SDS-PAGEで分離した。架橋したペプチドをゲル上で効率的に検出するため、FITCラベルしたGGYペプチドであるFITC-GGYpep（FITC-CKKNGGYGGYSGGYSGGYSGGY, MW: 2737ダルトン）（配列番号：２０）を合成した。配列 GGYGGYSGGYSGGYSGGY はBMCPG1の残基128〜145に相当し、GGYpepとは異なっている（図７参照）。FITC-GGYpep（4μl）を 1μlのキノコチロシナーゼ（A）または 0.25μlのPO活性化ヘモリンフ（B）と混合し、室温で図中ゲルの下に示した時間インキュベートした。反応は、20μlの1％SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% (v/v) glycerol,および 0.01% CBB を添加し、75〜80℃で5分インキュベートして停止させた。その後、サンプルを15％SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、UVイルミネーションにより可視化した。
A. (1) キノコチロシナーゼ未添加；(2-4) 0.2 mg/ml チロシナーゼによる反応；(5) 65 mM βメルカプトエタノールを反応後に加えた；(6) 1.7% SDSを反応の間加えた；(7) 0.05 mg/ml チロシナーゼを反応に加えた；(8) 0.8 mg/ml チロシナーゼを反応に加えた；(9) 0.2 mg/ml BSA をチロシナーゼの代わりに加えた。
B. カイコ幼虫からヘモリンフを回収し、フェノールオキシダーゼ阻害剤であるフェニルチオウレア（phenythiourea; PTU）の存在下または非存在下、室温で30分おいた。(1) ヘモリンフ非添加；(2-3) PTUの非存在下または存在下で 1μlのヘモリンフを加えた；(4-6) PTUの非存在下または存在下で 0.25μlのヘモリンフを加えた；1μlのチロシナーゼを加えた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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