(57)【要約】【課題】花粉管の生長制御機能など植物の生長、生殖制御など多様な生理機能を有するＡＧＰの機能解明に有用であり、雄性不稔などの形質転換植物への応用や食品加工、医薬品、プロトプラスト作製用酵素への応用が期待できる新規なエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼやその遺伝子等を提供すること。【解決手段】市販のセルラーゼ調製物であるＯｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０からβ−（１→６）−ガラクタナーゼを５７倍に精製してＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ由来のガラクタンを用いて分析したところ、ｐＨ４．３で最大の活性を示し、重合度３以上のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖類、及び４−Ｏ−メチル−グルコシルロン基又はグルコシルロン基を非還元末端に有する誘導体を特異的に加水分解した。次いで、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ胞子体由来のＲＮＡを鋳型として、３’及び５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより本酵素の完全長のｃＤＮＡを作製した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列の配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項７】
請求項５又は６記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含有する形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、土壌菌の一種であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来の新規エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼや該エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼをコードする遺伝子、及び、該遺伝子を含有する組換えベクターや形質転換植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の細胞膜や細胞壁はアラビノガラクタン構造を持つ糖タンパク質から構成されている。このアラビノガラクタンプロテイン（ＡＧＰ）は、高Ｍｒプロテオグリカンの一種で、通常は、１０％未満のタンパク質と９０％を越える炭水化物で構成されている。それらは、細胞外マトリックス及び細胞壁の水溶性成分として（例えば、非特許文献１〜３参照。）、又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して原形質膜上で不動化され（例えば、非特許文献４、５参照。）、高等植物のあらゆる組織で見受けられる。ＡＧＰのタンパク質成分は、一般に、Ｈｙｐ／Ｐｒｏ、Ａｌａ及びＳｅｒを豊富に含んでいる。炭水化物成分は、主として、Ｌ−アラビノース（Ａｒａ）及びガラクトース（Ｇａｌ）で構成されており、Ｏ−６でβ−（１→６）結合のガラクトシル側鎖による置換が生じているβ−（１→３）−ガラクタン骨格からなる高度に分岐した構造を有している。Ｌ−アラビノシル残基の多くは、かかる側鎖中のいくつかのガラクトシル残基のＯ−３に付加している。それより少量のグルコシルロン酸（ＧｌｃＡ）、４−Ｏ−メチル−グルコシルロン酸（４−Ｍｅ−ＧｌｃＡ）、Ｌ−ラムノース及びＬ−フコースなど他の糖類は、普通は非還元末端残基として、ときおり側鎖に付加することが知られている（例えば、非特許文献６〜８参照。）。
【０００３】
植物においては、胚から成熟植物へと発生する際に生じる、根、茎、葉、花及び果実の出現とともに、器官が継続的に発生する。細胞の分裂及び増殖は、この継続的な器官発生の基本である。これら２つの過程の制御には、時間的要素（分裂及び増殖は、いつ生じるのか）及び空間的要素（分裂面の配向はどれになるのか、又は、増殖はどの方向に向かうか）がある。これら２つの過程は、分裂組織又はその近くで生じるが、基本的な３つ目の過程である細胞分化が加わることにより、発生の最中に器官を形成する。ＡＧＰは、その複雑な構造の変化により、細胞の同一性を標識し、隣接細胞にシグナル伝達する役目を果たし、細胞増殖、細胞肥大、体細胞胚発生、花粉管の成長、細胞死、植物の生長、ストレス応答、生殖制御など多様な生理機能を果たし、成長と発生のいくつかの側面におけるＡＧＰの役割がこれまでに示されている（例えば、非特許文献９参照。）。
【０００４】
ＡＧＰの炭水化物部分の詳しい構造をよりよく理解するためには、特異的な酵素の使用が必要とされる。例えば、真菌及び植物由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）（例えば、非特許文献１０〜１２参照。）は、ＡＧＰのＬ−アラビノシル残基の除去に効果的であり、そのためβ−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクタナーゼによってβ−（３→６）−ガラクタンコアがさらに分解されることが判明している。本発明者らの以前の研究により、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ由来のエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼ（ＥＣ番号なし）が、ダイコンＡＧＰのβ−（３→６）−ガラクタンコアにおけるβ−（１→３）−ガラクトシド結合を特異的に開裂することが報告されている（例えば、非特許文献１３参照。）。分岐点を回避できるこの酵素のエキソ作用の後で、ＡＧＰの直鎖状骨格から生じた、還元末端位置にＧａｌを有する多様なオリゴマーとして、かかる側鎖を遊離することができる。
【０００５】
また、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼも、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ培養物から精製され（例えば、非特許文献１４参照。）、そのＮ末端側１５個のアミノ酸配列（ＩＳＳＳＰＬＳＴＳＧＧＮＩＶＤ；配列番号３）が同定されている（例えば、非特許文献１５参照。）。Ａ．  ｎｉｇｅｒ培養物から単離したエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ（ＥＣ番号なし）は、ブドウＡＧＰのβ−（１→６）結合ガラクトシル側鎖を特異的に加水分解する。その結果、Ｇａｌ及びβ−（１→６）−ガラクトビオースが遊離されるが、その一方で、β−（１→３）−ガラクタン骨格は依然として耐性を有している（例えば、非特許文献１６参照。）。
これら真菌酵素は、植物起源のいくつかの酵素と同様に、ＡＧＰの構造研究において分解を制御するための便利なツールとなることが知られている（例えば、非特許文献１７、１８参照。）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，  ５２１−５４０，  １９７９
【非特許文献２】
Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３４，  ４７−７０，  １９８３
【非特許文献３】
Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  １７４，  １９５−２９１，  １９９７
【非特許文献４】
Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ３，  ４２６−４３１，  １９９８
【非特許文献５】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  １４７２４−１４７３３，  １９９９
【非特許文献６】
Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，  ５２１−５４０，  １９７９
【非特許文献７】
Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３４，  ４７−７０，  １９８３
【非特許文献８】
Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  １７４，  １９５−２９１，  １９９７
【非特許文献９】
Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃｙｔｏｌ．  １７４，  １９５−２９１，  １９９７
【非特許文献１０】
Ａｄｖ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４２，  ３８３−３９４，  １９８４
【非特許文献１１】
Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００，  ３８８−３９６，  １９９２
【非特許文献１２】
Ｐｌｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  ９２，  ２８６−２９６，  １９９４
【非特許文献１３】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０
【非特許文献１４】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２６４，  ２８１−２９１，  １９９４
【非特許文献１５】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５３，  １５５−１６８，  ２００３
【非特許文献１６】
Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  １５６５−１５７１，  １９９１
【非特許文献１７】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０
【非特許文献１８】
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２２４，  ２１９−２３５，  １９９２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来、植物多糖類を分解する酵素は、セルラーゼ、キシラーゼ、ぺクチナーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼなどが知られ、食品加工、消化剤として医薬品或いはプロトプラスト作製用酵素として用いられている。本発明の課題は、花粉管の生長制御機能など植物の生長、ストレス応答、生殖制御など多様な生理機能を有するＡＧＰの機能解明に有用であり、自殖性植物の雑種強勢による育種の際に有効な手段となりうる雄性不稔などの形質転換植物への応用や食品加工、医薬品、プロトプラスト作製用酵素への応用が期待できる新規なエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼやその遺伝子等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＡＧＰの機能解明について鋭意研究しているが、ＡＧＰの糖鎖部分の外部遺伝子による機能改変を目指した研究の途上で、β−（１→６）−ガラクタナーゼ遺伝子は植物体に活性を有する酵素遺伝子として導入することが可能であり、農作物、園芸植物の形質改善に利用することができるとの知見を得た。そこで、多くの市販の酵素についてβ−（１→６）−ガラクタナーゼ活性について調べ、市販のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来セルラーゼ調製物であるＯｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０にβ−（１→６）−ガラクタナーゼ活性があることを見い出し、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼを５７倍に精製して、β−（１→６）−結合のガラクトシル残基を高比率で有するＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ由来のガラクタンを用いて、本酵素を分析したところ、ｐＨ４．３下において、ガラクタンに対して最大の活性を示し、本酵素は、重合度３以上のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖類、及び４−Ｏ−メチル−グルコシルロン基又はグルコシルロン基を非還元末端に有する前記糖類の誘導体を特異的に加水分解した。β−（１→６）−ガラクトヘキサオースのメチルβ−グリコシドは、加水分解の初期段階では産物としての重合度２−５の還元ガラクトオリゴマーに、最終段階ではガラクトース及びガラクトビオースに分解された。これにより、本酵素がエンド−ガラクタナーゼに分類可能であることがわかった。次いで、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ胞子体由来のＲＮＡを鋳型として、３´及び５´ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより本酵素の完全長のｃＤＮＡを作製し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。すなわち、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項２）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列の配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項４）に関する。
【００１０】
また本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項５）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質（請求項６）や、請求項５又は６記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド（請求項７）に関する。
【００１１】
さらに本発明は、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含有する組換えベクター（請求項８）や、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡを含有する形質転換植物（請求項９）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡとしては、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列の配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡは、例えば、後述する実施例２記載の方法により調製することができる。
【００１３】
また、上記配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、候補微生物等のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼと同効な目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１４】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼや、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたタンパク質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼと同様にエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有する同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変タンパク質を包含する。
【００１５】
本発明の融合タンパク質としては、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの精製や、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの検出や、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１６】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを含有するベクターであれば特に制限されず、Ｔｉプラスミド（Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクターなどのプラスミド、或いはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスなどのベクターに、本発明の遺伝子ＤＮＡを組み込んだものを具体的に例示することができる。本発明の組換えベクターを作製する方法は、遺伝子工学の分野で周知の手法を適用することができ、例えば、構造が既に解析されている上記ベクターの所定の位置の塩基配列を制限酵素で切断し、次いで切断ベクターの末端に本発明遺伝子を酵素的に導入することにより本発明の組換えベクターを得ることができる。また、適切なプロモーターとターミネーター等の制御配列をあらかじめ本発明のＤＮＡに連結させておくこともできる。かかるプロモーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
【００１７】
本発明の組換えベクターは、形質転換をしようとする植物細胞（受容体細胞）に容易にかつ高い確率で導入され、本発明の遺伝子ＤＮＡを植物細胞のゲノムＤＮＡ内に組み入れることによって、植物細胞がエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼを産生するように形質転換を生じさせることができる。すなわち、本発明の組換えベクターを各種植物の培養細胞に導入することにより、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ産生能を有する植物培養細胞を得ることができる。
また、本発明の組換えベクターを用いて種々の農作物や園芸植物の形質転換を行うことによって、本来の植物における花粉管の生長制御機能など植物の生長、ストレス応答、生殖制御など多様な生理機能を有するＡＧＰの構造に変化を与え、雄性不稔などの形質転換植物を得ることが可能となる。
【００１８】
本発明の形質転換植物としては、前記本発明の遺伝子ＤＮＡを含有するものであれば特に制限されないが、本発明の遺伝子ＤＮＡを含有することによって、本来の植物における花粉管の生長制御機能など植物の生長、ストレス応答、生殖制御など多様な生理機能を有するＡＧＰの構造が変化した、雄性不稔などの形質転換植物とすることが可能となる。かかる本発明の形質転換植物として利用される植物の種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、それら植物の培養細胞のうちから適宜選択することができる。
【００１９】
この形質転換植物を作製するには、本発明の遺伝子ＤＮＡを含有した上記本発明の組換えベクターを用い、この組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子ＤＮＡを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的または化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の遺伝子ＤＮＡを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［酵素の単離と特性］
（材料と方法）
［材料］
Ｙａｋｕｌｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄ．  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．社より、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来の市販のセルラーゼ調製物（ロットＮｏ．２０１０５７）、Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０を購入した。エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼをＤｒｉｓｅｌａｓｅから精製した（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）。β−ガラクトシダーゼ（グレードＩＩＩ、大腸菌由来）及びエンド−グリコシダーゼＨは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社より入手した。
【００２１】
ダイコンＡＧＰ（参考文献中では、ＡＧＰ−ＩＶと称されている）、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｌａｖａ由来のα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼでの分解により得られるかかるダイコンＡＧＰの酵素的修飾産物を、以前の報告のとおりに調製した（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８６，  １５５−１６０，  １９８８）。アカシアガムのスミス分解とダイズアラビノガラクタンの部分酸加水分解により、β−（１→３）−ガラクタン及びβ−（１→４）−ガラクタナンをそれぞれ調製した（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９０，  ５６７−５７４，  １９８９）。Ｔａｇａｗａ  ａｎｄ  Ｋａｊｉの方法により、テンサイアラビナンを調製した（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  １１，  ２９３−３０１，  １９６９）。β−（１→３）結合ガラクトビオース、β−（１→６）結合ガラクトビオース、β−（１→３）結合ガラクトトリオース、β−（１→６）結合ガラクトトリオースを、カラマツ材のアラビノガラクタンから調製した（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ５９３−６０１，  １９５８）。β−（１→６）−ガラクトテトラオースをガティガムから調製した（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ４４０８−４４１４，  １９５８）。重合度（ＤＰ）２−５のβ−（１→４）−ガラクトオリゴ糖類をダイズアラビノガラクタンから調製した（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９０，  ５６７−５７４，  １９８９）。
【００２２】
また、β−ＧｌｃＡ−（１→６）−Ｇａｌ及びβ−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌをアカシアガムから調製し、４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−Ｇａｌ、４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌ、及び４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→３）−Ｇａｌを、漆の木、すなわちＲｈｕｓ  ｖｅｒｎｉｃｉｆｅｒａ（ウルシ）の樹液から調製した（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ３３３，  ２７−３９，  ２００１）。エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼでインキュベーションを行うことにより、ダイコンＡＧＰの酵素加水分解物及びアカシアガムのスミス分解物から４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌ及びα−Ｌ−Ａｒａｆ−（１→３）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌをそれぞれ調製した（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）。β−（１→３）結合ガラクトテトラオース及びβ−（１→３）結合ガラクトペンタオース、並びにβ−（１→６）結合ガラクトペンタオース及びβ−（１→６）結合ガラクトヘキサオースのメチルβ−グリコシドは、アメリカ合衆国メリーランド州バテシバ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＰ．  Ｋｏｖａｃ博士より入手した。
【００２３】
その他の化学品の入手先は下記のとおりである：セファデックスＧ−５０及びＧ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）；バイオ−ゲルＰ−２（極細）、Ｐ−１０、及びＰ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）；ＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２）及びＣＭセルロース（ＣＭ３２）（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｐｅｒ  Ｌｔｄ．社製）；ＢａｋｅｒｂｏｎｄＣＢＸ及びＱＵＡＴ（Ｙａｍａｚｅｎ  Ｃｏｒｐ．社製）、多様なｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ）グリコシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製及びＮａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）；アゾカゼイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。
【００２４】
［藻類ガラクタンの調製］
Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅに属する単細胞生物であるＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ  ＡＴＣＣ１６５３３を、３％（ｗ／ｖ）のサブローデキストロース培養液（ｐＨ６．８；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を含む寒天（２％、ｗ／ｖ）プレート上で、５日間、２５℃蛍光灯下でＭａｎｎｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２９，  ６３−７７，  １９７３）の記述のとおりに増殖させた。細胞（乾燥重量で１５ｇ）をカーボランダムですりつぶして破壊した。Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８，  ７９−８４，  １９８１）の方法にしたがって、多糖類の画分を混合物から熱湯で抽出し、ＥｔＯＨで沈降させ、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタンで震盪させて除タンパク処理を行った後、水による透析を行い、凍結乾燥させた（収量２．９ｇ）。６ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１００ｍＬ中において、アルファ−アミラーゼ（１．３ｍｇ；Ｉ−Ａ型、ブタ膵臓由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用して、粗多糖類を３７℃で１．５時間分解した（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８，  ７９−８４，  １９８１）。かかる混合物を熱により不活化し、水による透析を行い、凍結乾燥した（１６ｇ）。かかる多糖類に対して、ＤＥＡＥセルロース（ＨＣＯ３−；Ｓｅｒｖａ  Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．社製）のカラム（３．６×２８ｃｍ）でクロマトグラフィーを行い、全糖（下記参照）及び２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。カラムを水で洗浄した後、ＮａＨＣＯ３の線状勾配（０〜０．５Ｍ、２．２Ｌ）期中、５０〜２５０ｍＭの範囲内での広いピークとして、ガラクタン画分を溶出した。かかるガラクタン画分（７００ｍｇ）をセファデックスＧ−５０のカラム（２．６×１２０ｃｍ）に積載し、１％（ｖ／ｖ）のＨＯＡｃで溶出した。カラムの空隙容量付近に出現した画分を回収し（５９０ｍｇ）、酵素分析に使用した。
【００２５】
［炭水化物分析］
次の比色分析法を使用した：標準物質としてＧａｌを用いたフェノール−Ｈ２ＳＯ４法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８，  ３５０−３５６，  １９５６）により、全糖を測定した；Ｇａｌを標準物質として使用したＮｅｌｓｏｎ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １５３，  ３７５−３８０，  １９４４）及びＳｏｍｏｇｙｉ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９５，  １９−２３，  １９５２）の方法により糖を還元した；ＧｌｃＡを標準物質として使用した修飾カルバゾール−Ｈ２ＳＯ４法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９，  １１９−１３２，  １９６７）によりウロン酸を還元した。１ＭのＨ２ＳＯ４中で４時間１００℃に加熱することにより、及び２Ｍのトリフルオロ酢酸中で１時間１２１℃に加熱することにより、多糖類及びオリゴ糖類をそれぞれ加水分解した。溶媒Ａ、６：４：３（ｖ／ｖ／ｖ）１−ブタノール−ピリジン−水、又は溶媒Ｂ、５：２：３（ｖ／ｖ／ｖ）１−ブタノール−ＨＯＡｃ−水に浸した、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．  １又は３ＭＭペーパーでのペーパークロマトグラフィーで糖類を分析した。クロマトグラム上の糖スポットをアルカリ硝酸銀で検出した。シリカゲル６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）上で、７：１：２（ｖ／ｖ／ｖ）１−プロパノール−ＥｔＯＨ−水を用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、Ｈ２ＳＯ４で炭化することにより糖類を検出した。
【００２６】
ＳｈｉｍａｄｚｕガスクロマトグラフＧＣ−６Ａを使用し、Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ５，  ３４０−３４５，  １９６７）にしたがって、酢酸アルジトール誘導体としての糖類のガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を行った。多糖類中のカルボキシル基をＴａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｒａｄの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１，  １３８３−１３８８，  １９７２）により還元した。未変性サンプル及びカルボキシルを還元したサンプルをＨａｋｏｍｏｒｉ法（Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  ２０５−２０８，  １９６４）によってメチル化し、ＧＬＣ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  １３４，  ２１５−２２８，  １９８４）及びガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）で産物を分析した。ＧＣ／ＭＳには、Ｖａｒｉａｎ４３００ガスクロマトグラフを備えたＴＳＱ７０トリプル四極子質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ社製）を用いた。５％のフェニルメチルポリシロキサン融合キャピラリー（ＤＢ−５；Ｊ  ＆  Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．社製）のカラム（０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．×３０ｍ）を使用し、１８０℃から２７０℃に温度を上昇させて（４℃／分）、ＧＣ／ＭＳを行った。
【００２７】
Ｐ．  ｚｏｐｆｉｉが生産したガラクタン中のウロン酸成分を同定するため、多糖類（１ｍｇ）を加水分解し、Ｍａｔｓｕｕｒａ  ａｎｄ  Ｉｍａｏｋａの方法（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．  ５，  １３−２６，  １９８８）にしたがって、その加水分解物をｐ−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）で標識した。ＲＦ−１０ＡＸＬ型の蛍光検出装置を備えたＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ−１０ＡＳシステム及びＤｅｖｅｌｏｓｉｌ    ＯＤＳ−ＵＧ５（Ｍｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）のカラム（４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でＡＢＥＥ誘導体化単糖類を分析した。６％のＭｅＣＮを含む０．２Ｍのホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を流速１．０ｍＬ／分で用いて、４５℃でかかるカラムの溶出を行った。３０５ｎｍ（励起）及び３６０ｎｍ（発光）で、溶出物中の蛍光をモニターした（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１，  １９４４−１９４６，  １９９７）。
【００２８】
１％のＨＯＡｃで平衡化と溶出を行った２．５×６０ｃｍのセファデックスＧ−１００カラムでのゲル濾過によって、多糖類のＭｒを推定した。プルラン（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐ−８２、Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ社製）、ブルーデキストラン（Ｖ０）及びＧａｌ（Ｖｉ）でカラムシステムのキャリブレーションを行った。
【００２９】
［酵素分析］
エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの活性を、該酵素、０．５％（ｗ／ｖ）の藻類ガラクタン、０．０１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）からなる反応混合液（以下、標準分析混合液とする）（０．１ｍＬ）を用いて測定した。３０℃で５〜２０分間のインキュベーションを行った後、遊離した糖類を還元分析的に測定した。１ユニットの酵素活性は毎分１μｍｏｌの還元糖（Ｇａｌ等量として）を遊離する。各種多糖類に対する他の活性についても、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）中で、３０℃で４時間、同様にテストした。
【００３０】
０．２ｍＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）で、３７℃で４時間のインキュベーションを行って、各ｐ−ニトロフェニルグリコシドの１ｍＭの基質から遊離したｐ−ニトロフェノールの量を測定することにより、グリコシダーゼ活性を分析した。０．２ＭのＮａ２ＣＯ３（０．８ｍＬ）を添加して反応を終了させ、４２０ｎｍでモニターした。文献（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）記載のとおり、アゾカゼインを基質として用いてカゼイン分解活性を分析した。
本酵素分析を少なくとも２回行い、平均値を記録した。
【００３１】
［酵素の精製］
作業はすべて０〜４℃で行った。Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０（１５ｇ）及び粉末セルロース（６ｇ）を含む１８０ｍＬの０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０分間攪拌し、その後３５，０００×ｇで１５分間遠心分離した。その上清液を、（ＮＨ４）２ＳＯ４で飽和率８０％にして、２時間放置し、遠心分離した。沈降物を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、該緩衝液で一晩透析した。該緩衝液で平衡化した２．４×１６ｃｍのＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）カラムに、粗酵素溶液を入れた。カラムを該緩衝液で洗浄した後、該緩衝液（総容量２．５Ｌ）において、線状のＫＣｌ勾配（０〜０．４Ｍ）で、本酵素を溶出した。酵素の不活化を防ぐために、０．５ｍＬの０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を入れた試験管に画分（１７．５ｍＬ）を回収し、酵素活性をモニターした。活性画分を回収し、（ＮＨ４）２ＳＯ４で飽和率８０％にして、一晩放置し、遠心分離した。沈降物を、少量の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、該緩衝液で透析した。該緩衝液で平衡させた２．４×１６ｃｍのＣＭセルロース（ＣＭ３２）カラムに透析物を入れた。カラムを該緩衝液で洗浄した後、該緩衝液（総容量１．４Ｌ、１０ｍＬ／画分）において、線状のＫＣｌ勾配（０〜０．４Ｍ）で、本酵素を溶出した。ＹＭ−３膜を備えたＡｍｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて、プールしておいた画分を８ｍＬに濃縮した。本酵素溶液を、５０Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（３ｍＬ／画分）で平衡化と溶出を行った２．０×１４０ｃｍのセファデックスＧ−１００カラムに入れた。活性画分を結合させ、濃縮し、ＬＫＢ８１０１カラム（１１０ｍＬ）及びｐＨ域が５〜８の担体両性電解質（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ；  ＬＫＢ  Ｊａｐａｎ社製）を用いて、６００Ｖの定電圧で４８時間の等電点電気泳動にかけた。１ｍＬの画分を回収した。ｐＨ範囲５．２〜５．８にわたって出現した活性画分をプールし、濃縮し、２０Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化と溶出を行った２．０×５１ｃｍのバイオ−ゲルＧ−１０カラムに通して脱塩を行った。精製したエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼを含む活性画分をプールし、濃縮し、−２０℃で保管した。ＤＥ５２及びＣＭ３２カラムに対するイオン交換クロマトグラフィーの２つの段階については、それぞれ、Ｙａｍａｚｅｎ  ＨＰＬＣクロマトグラフィー系で用いたＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＱＵＡＴカラム（１．５×２１ｃｍ）及びＣＢＸカラム（１．５×１１ｃｍ）を代替とすることが可能である。この別手順では、酵素タンパク質に対するこれらの樹脂の結合能がより高いためにより多量のＯｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０（３０ｇ）を使用できるという理由により、酵素の精製が促進される。また、クロマトグラフィー分析の作業時間も短縮できる。
【００３２】
［タンパク質分析］
Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２，  ２４８−２５４，  １９７６）で、酵素タンパク質を測定した。ダイコンＡＧＰ及び藻類ガラクタン中のタンパク質を、ＭｃＧｒａｔｈの方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４９，  ９５−１０２，  １９７２）で測定した。どちらの手順にも、ＢＳＡを標準物質として使用した。
【００３３】
Ｄａｖｉｓの方法（Ａｎｎ．  ＮＹ  Ｓｃｉ．  １２１，  ４０４−４２７，  １９６４）で調製した３つの平行な（１０％、ｐＨ９．５）ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で、未変性酵素の部分標本（９μｇ）を分析した。１つのゲル中のタンパク質を、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。ダンシルヒドラジン試薬（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７３，  １９２−１９７，  １９７６）を用いて、別のゲル中の炭水化物を蛍光分析により検出した。第３のゲル中のタンパク質を、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．３、０．５ｍＬ）でインキュベーションすることにより、スライスしたゲルディスク（幅２ｍｍ）から抽出し、その酵素活性を分析した。１２．５％のゲルと、ホスホリラーゼｂ、ＢＳＡ、オボアルブミン、炭酸脱水酵素（ｃａｒｂｏｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ）、ダイズトリプシン阻害剤、及びリゾチームを含むＭｒマーカータンパク質混合物とを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，  ６８０−６８５，  １９７０）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、精製酵素（４μｇ）の見かけ上のＭｒ値を測定した。
【００３４】
０．１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化と溶出を行った２．０×１４０ｃｍのバイオ−ゲルＧ−１００カラムで、未変性酵素のＭｒ値を測定し、トランスフェリン、ＢＳＡ、フェリチン、オボアルブミン、α−ラクトアルブミン及びシトクロムｃを含んだマーカータンパク質でキャリブレーションを行った。６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ（１ｍＬ／分）で平衡化と溶出を行ったＡｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５１０（Ａｓａｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄ．社製）のカラム（７．６×５００ｍｍ）を用いたＨＰＬＣによって、変性酵素のＭｒ値を測定した。
０．１５ＭのＮａＣｌ並びに各１ｍＭのＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、及びＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／分で３０分間溶出を行った、不動化コンカナバリンＡを入れたＨＰＬＣアフィニティーカラム、ＬＡ−ＣｏｎＡ（４．６×１５０ｍｍ；Ｈｏｈｎｅｎ  Ｃｏｒｐ．社製）で、精製酵素の結合特性について調べてみた。カラムを緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍのメチルα−マンノシドを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で、酵素を溶出した。画分を回収し、酵素活性を分析した。
【００３５】
エンド−グリコシダーゼＨ（０．１ミリユニット）を含む５０ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．２、６０μＬ）で、本酵素（７μｇ）を２４時間、３７℃でインキュベーションし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
ダンシル化アミノ酸誘導体に使用されるＪａｓｃｏ８８０ＨＰＬＣシステムを用いて、アミノ酸分析を行った。真空密閉試験管中で、６ＭのＨＣｌで２４時間、１１０℃でサンプルを加水分解し、加水分解物をダンシル化キット（Ａｍｉｎｏ−ｃｈｒｏｍｅ；  Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．社製）で誘導体化した。ペルオキシギ酸酸化の後で、システインの分析を行った（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ５７，  ３３−３７，  １９５４）。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＰＳＱ−２  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで、本酵素のアミノ末端配列分析を行った。
【００３７】
［作用の形態］
精製ガラクタナーゼの作用の形態を、本酵素（０．１μｇ）を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．３、５０μＬ）でβ−（１→６）−ガラクトヘキサオースのメチルβ−グリコシド（２５０μｇ）を０〜１２０分間、３０℃でインキュベートすることによって分析した。適切な間隔をおいて、一部分を取り出し、熱による不活化を行った。遊離した還元糖（ただし、メチルグリコシドのものは皆無）を、前記のとおりＡＢＥＥを用いて、還元末端で結合させた。ＴＳＫゲルアミド−８０（Ｔｏｓｏｈ社製）のカラム（４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで、ＡＢＥＥ誘導体化糖を分析した。７４：２６から５８：４２（ｖ／ｖ）まで、ＭｅＣＮ−水の線状勾配で４０分間、流速１．０ｍＬ／分で４０℃にてカラムの溶出を行った。ＵＶ検出装置ＳＰＤ−１０Ａを用いて、３０４ｎｍで、ＡＢＥＥ糖をモニターした。
【００３８】
［ＡＧＰの酵素分解］
α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼで処理したダイコンＡＧＰのサンプル（糖含有量基準で６０ｍｇ）を、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ（５μｇ）を含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３、１０ｍＬ）で、２４時間３０℃にてトルエン下で分解した。還元糖の遊離がプラトーに達したとき、分解産物を熱湯槽で５分間加熱し、１％ＨＯＡｃ（２．２ｍＬ／画分）で溶出した、２．５×６０ｃｍのセファデックスＧ−１００カラムでクロマトグラフィーを行った。画分の全糖、ウロン酸、及びタンパク質の含有量をモニターした。分解産物を２つの画分、すなわち高Ｍｒ成分と低Ｍｒ成分とに分離し、それらを別々に回収し、ＨＯＡｃを除去するために繰り返し水を加えて蒸発させることで濃縮した。高Ｍｒ成分と低Ｍｒ成分の収量は、それぞれ２８ｍｇと３２ｍｇだった。高Ｍｒ成分の糖組成とグリコシド結合の型を分析した。低Ｍｒ成分について、１．５×５ｃｍのＤＥＡＥセルロース（ＨＣＯ３−；Ｓｅｒｖａ社製）カラムでのクロマトグラフィーを行った。中性糖（２３ｍｇ）を水で溶出し、酸性糖（７ｍｇ）を、線状のＮａＨＣＯ３勾配（０−０．５Ｍ、２００ｍＬ）後の単一のピークとして溶出した。Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（Ｈ＋）の小さなカラムを通過させて、酸性画分の脱塩を行った。どちらの画分も、１％のＨＯＡｃで溶出した２．５×９５ｃｍのバイオ−ゲルＰ−２カラムでのクロマトグラフィーにより、さらに分画した。
【００３９】
エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼでの分解により得た高Ｍｒ成分の一部（２５ｍｇ）を、その構造的な特徴を分析するため、エキソ−β−（１→６）−ガラクタナーゼ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）でさらに分解した。本酵素（０．６ユニット）を含む５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．６、３ｍＬ）で、２４時間３７℃で該成分を分解した。セファデックスＧ−１００カラムで上記のとおり分解産物を分画した結果、高Ｍｒ成分と低Ｍｒ成分をそれぞれ６ｍｇと１８ｍｇの収量で得た。ＤＥＡＥセルロースカラムで、低Ｍｒ成分を上記と同様の方法でクロマトグラフィーにかけ、中性糖（１１ｍｇ）と酸性糖（６ｍｇ）を得た。これらの糖をバイオ−ゲルＰ−２カラムで分離した。
【００４０】
エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼのみで分解して得た産物に使用したのと基本的に同様の手順（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）、すなわち、溶媒Ａ及びＢを用いたペーパークロマトグラフィーでの移動度、糖組成、大腸菌β−ガラクトシダーゼに対する感受性、グリコシド結合の形態を測定して標準物質と比較することにより、このように単離したオリゴ糖類を同定した。
【００４１】
（結果）
［藻類ガラクタンの特性］
前記のＰ．  ｚｏｐｆｉｉが生産するガラクタンは、（１→６）結合β−Ｇａｌｐ残基を主鎖とし、単一の非還元末端Ｇａｌｆ残基からなる少量（〜１０％）の側鎖も備える分岐状の構造を有している（Ｃａｒｂｏｈｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２９，  ６３−７７，  １９７３、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８，  ７９−８４，  １９８１）。そのため、このガラクタンは、多様な酵素源の研究において、（１→６）結合β−Ｇａｌｐ配列を加水分解する酵素活性を測定するための優れた基質となるであろうと考えられてきた。しかし、その目的を達成するためには、ガラクタン及びその分解産物のより詳細な性質を知る必要があると思われる。精製ガラクタンには、下記の特性があることがわかっている：［α］Ｄ＋１３．６°（ｃ０．５、水）；Ｍｒ、８５，０００；糖の総含有量、９１％（ｗ／ｗ）；ウロン酸、４％（ｗ／ｗ）；タンパク質、７％（ｗ／ｗ）；主要な（９７ｍｏｌ％）糖組成としてのＧａｌ及び中性糖としての少量のラムノース、リボース、Ｌ−Ａｒａ、又はＤ−Ａｒａ、及びマンノース。ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）は、ガラクタンの加水分解物をそのＡＢＥＥ誘導体としてＨＰＬＣで分析した際に認められた唯一のウロン酸成分だった。カルボキシル還元ガラクタンのＧＬ／ＭＳ分析に続いて行ったメチル化により、分岐点のＯ−６及びＯ−３，６を介して結合したＧａｌｐ残基、並びにＯ−３及び非還元末端で結合した少量の残基の関与を確認した（表１）。表１中、（ａ）はＯ−アセチルアルディトール誘導体として、（ｂ）はカルボキシル還元後の求められ、（ｃ）はセファデックスＧ−１００カラム上のクロマトグラフィーにより単離された反応混合物中の高Ｍｒ産物（収率４９％）である。ガラクタンは、以前に提案されたモデル（Ｃａｒｂｏｈｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２９，  ６３−７７，  １９７３、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８，  ７９−８４，  １９８１）よりも複雑な構造を有しているようであり、Ｏ−３及び非還元末端を介して結合しているＧａｌｆ残基を含んでいた。ガラクタン鎖中のＧａｌＡ残基の局在も、それらがピラノース環又はフラノース環の形態で生じているかどうかも、未変性ガラクタン（データなし）とカルボキシル還元標本（表１）のメチル化データの比較からは、不明瞭で計測できなかった。
【００４２】
【表１】
2005021046.tif 000002
【００４３】
市販のセルロース標本（下記参照）から精製したガラクタナーゼで藻類ガラクタンを徹底的に分解したところ、標準のβ−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌとして移動したＧａｌ及び１つのオリゴマー、並びにいくつかの既知のオリゴマーが、溶媒Ａ及びＢを用いたペーパークロマトグラフィーで低Ｍｒ産物として検出された。ガラクタンの加水分解の限界は、Ｇａｌを標準物質として用いた還元分析的推定に基づくと１３％だった。一方、酵素分解産物の後に残った高Ｍｒ成分は、セファデックスＧ−１００カラムを用いたクロマトグラフィーにより、当初のガラクタンの４９％（重量基準）という収率で回収された。この画分のウロン酸含有量は９％（ｗ／ｗ）に増大していた。高Ｍｒ成分では、Ｏ−６結合Ｇａｌｐ残基の比率が減少している一方で、非還元末端、分岐、及びＯ−３結合のＧａｌｐ残基の比率は、その分増大していた（表１）。これらの結果は、酵素が、ガラクタンの、連続した直鎖状のβ−（１→６）結合ガラクトシル部分からオリゴ糖類を遊離し、それにより、分岐点及び非還元末端のＧａｌ残基が高Ｍｒ画分中で蓄積することを示唆している。それに対し、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによりガラクタンが加水分解されることはほとんどなく（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）、ガラクタンは大腸菌β−ガラクトシダーゼに対して耐性を示していた。これらの結果は、ガラクタンが、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの酵素分析の適切な基質であるという考えを裏付けるものである。
【００４４】
さまざまな量の多糖類を用いた標準分析条件下での反応の結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔによる動態データが以下のように得られた：Ｋｍ＝３．０ｍｇ／ｍＬ、及びＶｍａｘ＝３４０μｍｏｌ  Ｇａｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質。ガラクタンをさらにすぐれたガラクタナーゼ用基質にするために、０．１ＭのＨ２ＳＯ４を用いて加熱して、熱湯中で９０分間の部分加水分解を行った。中和後、修飾された多糖類を回収し、酵素加水分解に対する感受性を調べた。しかし、この試みで加水分解の限界を引き上げることはできなかった。再び、約半量の多糖類が、酵素への接近が不可能な高Ｍｒ画分として残ったからである。だが、修飾された多糖類は、酵素により接近できるようになった。当初の加水分解速度が未変性ガラクタンの場合と比較して約３倍も速かったからである。これはおそらく、未変性ガラクタン中で酵素作用を阻害するＧａｌｆ残基の大部分が除去されたことによるものと思われる。
【００４５】
［酵素の精製］
藻類ガラクタンを加水分解できるガラクタナーゼを求めて、市販により入手可能なさまざまな酵素調製物を解析した。Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０というあるセルラーゼ標本が高い活性を示すことが判明し、そのため、これを精製源として選択した。この酵素標本のガラクタナーゼを（ＮＨ４）２ＳＯ４画分及びその後の数回にわたるカラムクロマトグラフィーによって精製した。本酵素をＤＥＡＥセルロースカラムに吸着させ、０．１ＭのＫＣｌ付近の単一のピークとして溶出させた。ＣＭセルロースとセファデックスＧ−１００カラムを使用したその後の精製段階における本酵素の溶出プロフィールを、図１に示す。等電点電気泳動では、酵素活性の単一のピークが見られた。その溶出は、タンパク質の溶出と一致していた。ガラクタナーゼを収率３％で５７倍に精製した（表２）。代替的精製手順としてＱＵＡＴカラム及びＣＢＸカラムを使用した場合の溶出プロファイルは、それぞれＤＥＡＥセルロースカラム及びＣＭセルロースカラムを使用した場合と類似しており、同程度の収量の酵素が得られた。αとβの両形態のＧａｌ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びＭａｎ、並びにβ−Ｘｙｌ、α−Ｌ−Ｆｕｃ、及びα−Ｌ−Ａｒａｆのｐ−ニトロフェニルグリコシドを分析したところ、精製酵素には、タンパク質分解活性及びグリコシダーゼ活性がないことが確認された。かかる精製酵素は、下記の多糖類も加水分解しなかった：デキストラン、アラビナン、デンプン、ラミナリン、β−（１→４）ガラクタン及びβ−（１→３）ガラクタン、カラマツアラビノガラクタン、酸不溶性ポリガラクツロン酸（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６５，  １５１９−１５２７，  ２００１）。
【００４６】
【表２】
2005021046.tif 000003
【００４７】
［精製度及びＭｒ］
未変性ＰＡＧＥ上で、精製酵素は、単一のタンパク質バンドとして、酵素活性と同じ位置に移動した（図２Ａ）。炭水化物を蛍光染色した際にかかるバンドは陽性反応を示したが、このことは、酵素の糖タンパク質性を示している。この特徴は、コンカナバリンＡカラムに酵素を結合させて、メチルα−マンノシドで溶出することにより、さらに確認された。しかし、本酵素はエンド−グリコシダーゼＨでの分解に耐性を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、そのＭｒは減少していなかった。
【００４８】
本酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、見かけ上のＭｒ値が４７，０００の単一糖タンパク質としての挙動を示した（図２Ｂ）。キャリブレーションを行ったバイオ−ゲルＰ−１００での見かけ上のＭｒ値を測定したところ、未変性酵素のＭｒ値はかなり低く、１７，０００だった。キャリブレーションを行ったＡｓａｈｉｐａｋカラムを用いた変性条件下でのサイズ排除ＨＰＬＣでも、同様の値（Ｍｒ値１７，５００）が得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの観察結果とサイズ排除ＨＰＬＣでの観察結果との間で、本酵素のＭｒ値が一致しなかったのは、本酵素のグリコシル化特性及び／又はゲルマトリックスとの相互作用によるものと思われる。同様の不一致が、Ａ．  ｎｉｇｅｒから単離したエンド−（１→６）ガラクタナーゼで観察されている。その場合のＭｒ値は６０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と２９，０００（ゲル濾過）であった。
【００４９】
本酵素の等電点（ｐＩ）はｐＨ５．４であり、高比率のＳｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ，Ｔｈｒ、及びＬｅｕが含まれている（表３）。表３中、（ａ）はシステイン酸として求められ、（ｂ）は測定しなかったことを示している。本酵素のアミノ末端配列（１１残基）は、ＤＴＴＬＳＩＤＰＴＳＮ−であった。
【００５０】
【表３】
2005021046.tif 000004
【００５１】
［酵素の特性］
希釈溶液中で保管した場合、精製したガラクタナーゼの活性は減少する傾向があった。例えば、ｐＨ４．５で２５ｎｇ／ｍＬ未満の酵素溶液を、４℃で一晩放置したところ、活性がかなり減少した。しかし、本酵素溶液にＢＳＡを添加すると、この失われた活性が回復した。そのため、０．０１％のＢＳＡの存在下で酵素活性の標準的な分析を行った。希釈した（０．５μｇ／ｍＬ未満）酵素溶液の凍結と解凍を繰返した場合も、酵素が不活化された。
【００５２】
酢酸緩衝液（ｐＨ２．８〜６．０）及びカコジル酸緩衝液（ｐＨ５．５〜７．５）を最終濃度５０ｍＭで使用した場合のｐＨ活性曲線に基づく藻類ガラクタンに対する本酵素の最適ｐＨは、４．３だった。反応混合物にＢＳＡを添加しない場合、同一の値が得られた。ＢＳＡの存在下又は非存在下のそれぞれにおいてｐＨ２．５〜１１．０の緩衝液を使用して２４時間４℃でインキュベーションを行った後で残っていた活性を測定した場合、ｐＨ域が３．０〜１１．０及び４．０〜９．５であれば、本酵素は安定していることが判明した。ＢＳＡの非存在下で、本酵素をｐＨ４．３でさまざまな温度（２５〜７０℃）に１０分間おいた後で、残っていた活性を測定した。この処理の結果、５０℃及び６０℃における活性の喪失はそれぞれ３０％と１００％だった。ＢＳＡの添加によって、本酵素の熱不活化が妨げられることはなかった。
【００５３】
［基質特異性］
表４は、ガラクトオリゴ糖類のガラクタナーゼ及びグリコシド結合のタイプや鎖長が異なるその酸性誘導体の活性をまとめたものである。表４中の（ａ）加水分解は、本酵素（２８ｎｇ）と各種基質（各５ｍｇ／ｍＬ）及び酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）を含む混合液を３０℃で１０時間インキュベートし、次いで３分間沸騰したウォーターバス中で加熱して反応を終了させ、ＴＬＣやペーパークロマトグラフィーで分析したものである。未反応及び分解したオリゴマーはそれぞれ−と＋で示されている。表４中の（ｂ）加水分解の相対速度（％）は、本酵素（５ｗ１２０ｎｇ）と上記の分解した基質（ガラクタン、５ｍｇ／ｍＬ；各オリゴマー、５ｍＬ）を含む標準分析条件下でインキュベートした。適切な時間間隔で、初期加水分解速度が還元分析的に求められた。値は各時間ゼロのブランクにより補正された。相対速度は藻類ガラクタンを１００％として算定されている。表４に示されているように、本酵素がＤＰ３よりも長いβ−（１→６）結合ガラクトオリゴマーを加水分解する一方で、β−（１→３）結合オリゴマー及びβ−（１→４）結合オリゴマーが基質として作用することはなかった。β−（１→６）−ガラクトテトラオースの相対的な加水分解速度がβ−（１→６）−ガラクトトリオースの速度よりも速いことから明らかなように、加水分解速度はＤＰの増加とともにそれぞれ増大した。しかし、β−（１→６）−ガラクトオリゴマーの還元末端基を水素化ホウ素ナトリウムで還元すると、加水分解速度が顕著に低下した。
【００５４】
【表４】
2005021046.tif 000005
【００５５】
本酵素は、非還元末端が単一のＧｌｃＡ残基又は４−Ｍｅ−ＧｌｃＡ残基で置換されているβ−（１→６）結合ガラクトオリゴマーも低速で加水分解した。ウロノシル残基で置換されたβ−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌは、本酵素の基質として作用する構造的な要件を満たしているようであるが、加水分解効率は低い。
酸性β−（１→６）−ガラクトトリオースに加えて、β−（１→６）グリコシド結合及びβ−（１→３）グリコシド結合で構成される酸性ガラクトトリオースも、加水分解される。これら酸性オリゴマーの加水分解物からは、遊離ＧｌｃＡも４−Ｍｅ−ＧｌｃＡも検出されなかった。一方、非還元末端のＯ−３がα−Ｌ−Ａｒａｆ残基で置換されたβ−（１→６）−ガラクトビオースは、基質ではなかった。
【００５６】
［酵素の作用形態］
（ガラクトオリゴ糖類）  酵素の作用形態を測定するため、ガラクタナーゼが生成したβ−（１→６）−ガラクトヘキサオースのメチルβ−グリコシドの加水分解産物をＨＰＬＣでモニターした（ＡＢＥＥ誘導体として；図３）。ガラクトビオースからガラクトペンタオースに対応する還元ガラクトオリゴ糖類及び少量のＧａｌを、反応の最初の段階（３分及び３０分のインキュベーション）で検出した。これらのオリゴマーのうち、例えば、ガラクトペンタオースの出現は、基質分子の非還元末端からの、第５のβ−（１→６）−ガラクトシド結合の開裂を示し、結果としてガラクトペンタオース及びメチルβ−ガラクトシドの遊離につながる。最終段階（１２０分間のインキュベーション）では、Ｇａｌ及びガラクトビオースが唯一の加水分解産物として蓄積した。このことは、本酵素がエンド作用型ガラクタナーゼであることを示している。
【００５７】
酵素作用によりガラクトオリゴマーから形成された産物も、ＴＬＣで分析した（図４）。β−（１→６）−ガラクトトリオース及びβ−（１→６）−ガラクトテトラオースは、β−（１→６）−ガラクトヘキサオースのメチルβ−グリコシドと同様に、最終産物としてのＧａｌ及びガラクトビオースに分解された。本酵素は、β−（１→６）−ガラクトテトラオースを、中央のβ−（１→６）−ガラクトシド結合で優先的に開裂するようだが、その他に、効率は低くなるものの、少量のＧａｌでガラクトビオースを生産する、非還元及び／又は還元末端ガラクトシル残基の結合においても開裂を行うようである。この作用パターンは、他のいくつかのエンド型グリカナーゼのパターンとさほど矛盾するものではない。例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓのエンド−β−（１→４）−キシラナーゼは、その最小の基質であるキシロトリオースをキシロビオースとキシロースに開裂することが知られている。一方、キシロテトラオースの分解により、キシロビオースだけではなくキシロースも生産される。なぜなら、キシロテトラオースのなかには、開裂によってまずキシロトリオースとキシロースになるものがあるからである（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １６０，  ６３８−６４８，  １９８８）。
【００５８】
（ＡＧＰ）  ガラクタナーゼによる未変性ＡＧＰ及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ処理ダイコンＡＧＰの加水分解の相対速度は、単一体としての藻類ガラクタンの相対的加水分解速度（１００％）を基準として、それぞれ４１％と１０１％であった。これら２つの基質の加水分解の限界は、それぞれ８％と２６％（全糖に対するＧａｌ等量として）だった。β−３，６−ガラクタン骨格の側鎖に付着した大量のα−Ｌ−Ａｒａｆ残基（未変性ＡＧＰ中の全糖の１９％に達する（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８６，  １５５−１６０，  １９８８））を除去した後で、酵素加水分解に対する未変性ＡＧＰの感受性がいっそう強くなったように思われる。この挙動は、Ａ．  ｎｉｇｅｒ由来のエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼがブドウＡＧＰに作用する際の挙動に類似している。
【００５９】
ガラクタナーゼによるα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ処理ダイコンＡＧＰの加水分解産物を、溶媒Ａ及びＢを用いたペーパークロマトグラフィーで調べてみた。ガラクトビオース及びガラクトトリオースに対応するオリゴ糖類並びに高級オリゴマー（高重合度オリゴ糖）が反応の初期段階で遊離していた。最終段階では、Ｇａｌ、ガラクトビオース、並びにＤＰ３及び３の酸性オリゴマー（下記参照）が蓄積し、それに伴い、高次のオリゴマーが消失した。このことは、ガラクトオリゴマーに対する本酵素のエンド型作用とも一致している。
【００６０】
［エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ及びエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによるＡＧＰの連続分解］
エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼによるα−Ｌ−アラビノシダーゼ処理ダイコンＡＧＰの分解機構を調べるため、酵素による徹底的な分解の後で得られた産物を、セファデックスＧ−１００上で高Ｍｒ成分と低Ｍｒ成分とに分離した（図５）。こうして得た低Ｍｒ画分をイオン交換クロマトグラフィーで分離し、その後バイオ−ゲルＰ−２カラムでのクロマトグラフィーを行った。表５及び６は、未変性ＡＧＰ、α−Ｌ−アラビノシダーゼ処理ＡＧＰ、及び２種類のガラクタナーゼによる連続分解で得られた高Ｍｒ画分と低Ｍｒ画分についての分析データをまとめたものである。実際に、得られたすべてのオリゴ糖類は、修飾されたＡＧＰが遊離したものをエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼのみで分解することにより、同定したものである（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）。表５中、（ａ）は部分的に採取されたものであり、（ｂ）はカルボキシル還元後に求められたものであり、（ｃ）はカルボキシル還元なしに求められたものであり、カッコ内は比色定量的に求められたウロン酸含量であり、（ｄ）は１％未満であり、（ｅ）は検出できなかったことを示している。また、表６中、（ａ）は糖含量に基づく天然のＡＧＦの％（全７６％）を、（ｂ）は各々のＤＰ数を、（ｃ）は求めなかったことを、それぞれ示している。
【００６１】
【表５】
2005021046.tif 000006
【００６２】
【表６】
2005021046.tif 000007
【００６３】
α−Ｌ−アラビノシダーゼ処理ＡＧＰ中の糖の半量を、エンド−β−（１→６）の作用によってオリゴ糖類に変換した（図５Ｂ、表５）。高Ｍｒ成分の構造分析により、Ｏ−６結合Ｇａｌ残基の比率が減少し、それに伴ってＯ−３及びＯ−３，６結合Ｇａｌ残基が増大しているのがわかった。こうした観察結果は、短い断片がβ−（１→３）結合Ｇａｌ残基の骨格鎖に付着したままになるように、ＡＧＰの側鎖のβ−（１→６）結合Ｇａｌ配列（その非還元末端で、部分的に４−Ｍｅ−ＧｌｃＡ残基に置換されている）が、酵素によって除去されたことを示唆している。酵素による攻撃でも破壊されずに残った短側鎖の存在も、感知可能な量の４−Ｍｅ−ＧｌｃＡ残基が残っているという事実により示唆されている。結果として、中性糖及び酸性糖（比率３：１）のうち、β−（１→６）−ガラクトビオース及び４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−Ｇａｌを、Ｇａｌ以外の主要な産物として同定した（Ａｄｖ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４２，  ３８３−３９４，  １９８４）。このことは、各種オリゴ糖類に対する本酵素の特異性と一致している（表４）。
その後の、高Ｍｒ成分に対するエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼの作用（加水分解の限界、Ｇａｌとして５７％）により、再び大部分の糖がオリゴ糖類へと変換し、おそらくは短いβ−３，６−ガラクタン断片が付着したポリペプチド鎖からなるコアタンパク質（糖含有量基準で５％の未変性ＡＧＰ）がその後に残った（図５Ｃ、表５）。この画分において、糖含有量に対するタンパク質の比率が高い（約０．６：１）ことが、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼのみによる作用に関して以前に提案されていた、この考えの裏付けとなるかもしれない（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）。しかし、本来α−Ｌ−アラビノシダーゼ処理ＡＧＰ中に存在していたタンパク質の約半量は、２つのガラクタナーゼによる連続分解中に低Ｍｒ成分へと分画されており、このこともまたダイコンＡＧＰ中の短いポリペプチドが関連している可能性（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）を裏付けるものである。
【００６４】
高Ｍｒ画分の構造分析は、Ｏ−３及びＯ−３，６結合Ｇａｌ残基の比率の減少と、それに伴う非還元末端のＧａｌ残基及びＬ−Ａｒａｆ残基、並びにＯ−２結合Ｌ−Ａｒａｆ残基の増大を示した。これは、Ｌ−Ａｒａｆ残基は主として未変性ＡＧＰの糖鎖内部に局在し、そのため、α−Ｌ−アラビノシダーゼによる処理の後も耐性を保っていることを示唆している。β−３，６−ガラクタン鎖の分岐を回避することができるエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼの作用パターンに基づくと（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼによる処理の後も残っている側鎖が、β−（１→３）結合Ｇａｌ残基の骨格鎖から生じた、還元末端位置にＧａｌを有するオリゴ糖類として遊離することはありそうに思われる。これと一致して、β−（１→６）−ガラクトビオース及び４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌが主要産物として、大量のＧａｌとともに加水分解物中で見受けられた（表６）。これらの産物は、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼのみによってα−Ｌ−アラビノシダーゼ処理ＡＧＰから遊離されたものとはかなり異なり、ＤＰ２から少なくともＤＰ２０のβ−（１→６）−ガラクトオリゴマー、及びそれに対応する、非還元末端に４−Ｍｅ−ＧｌｃＡを有する酸性オリゴマーが得られた（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）。エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼのみで分解した後の顕著な産物として、酸性三糖類、すなわち、４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−β−Ｇａｌ−（１→６）−Ｇａｌを検出した。このことは、骨格鎖に沿ったＧａｌ残基のＯ−６に付着した４−Ｍｅ−β−ＧｌｃＡ−（１→６）−Ｇａｌの側鎖の一部が、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼによる攻撃でも破壊されずに残ったことを示している。
【００６５】
非還元末端残基の比率は、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの後で得られた高Ｍｒ画分に対する、未変性ダイコンＡＧＰ由来のカルボキシル還元サンプル用のメチル化データ（表５）における分岐Ｇａｌ残基の比率よりも高く、差異の程度は、酵素分解の段階とともに増大する傾向がある。これは、ＡＧＰの微細構造、鎖長、及び単一のポリペプチド骨格に沿ったグリカン鎖の数を反映しているのかもしれない。例えば、ＮｉｃｏｔｉａｎａＡＧＰについては約９５の糖残基をもつ９つの候補鎖（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２７７，  ６７−８５，  １９９５）があり、古典的なＡＧＰについては、３０−１５０の残基をもつ多数の鎖（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２２，  ３−９，  ２０００）が提案されている。ダイコンＡＧＰの構造が類似しているとすれば（本発明者らは決定的なデータをもちあわせていないが）、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによる分解後に到達したような、最大で９５％に達する糖残基の段階的除去によって、数個の残基だけがポリペプチド骨格上の断片として残ることになる。このことは、非還元末端残基の比率がかなり増大することを暗示している。このように、本発明者らのデータは、ダイコンＡＧＰの周辺部から中心部のグリカン構造に関する手がかりを提供するものと思われる。エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによる分解後に回収した高Ｍｒ画分中のグリコシド結合の形態に関するデータは、α−Ｌ−アラビノシダーゼとエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼという２つの酵素でダイコンＡＧＰを連続分解した後で得られた高Ｍｒ画分についての本発明者らの以前の結果（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  ７２０７−７２１５，  １９９０）と異なっていることにも、本発明者らは注目している。以前の結果では、かかる画分が収率７．３％（未変性ＡＧＰを基準とする）で回収されており、その際のＯ−６結合Ｇａｌ残基の比率は高かった（本研究において、５１ｍｏｌ％対２０ｍｏｌ％）。この違いは、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによる分解に先だってエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの作用によりＧａｌ残基が遊離されたことから生じているようである。
【００６６】
［まとめ］
Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０から精製した酵素は、ＤＰ３よりも長い連続β−（１→６）結合Ｇａｌ残基に特異的なエンド型ガラクタナーゼとして分類されると考えられ、非還元末端に４−Ｍｅ−ＧｌｃＡ基を有する又は有しないβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖類及びＧａｌとして、ダイコンＡＧＰの側鎖を遊離することができる。その後、高Ｍｒ産物にエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼを応用することにより、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼのこの作用パターンについての確固たる証拠が得られた。このエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの特異性及び作用形態は、Ａ．  ｎｉｇｅｒから単離した酵素のものと類似しているようである（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  １５６５−１５７１，  １９９１、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  ２２４，  ２１９−２３５，  １９９２）。
【００６７】
実施例２（組換えエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ）
［酵素の遺伝子クローニング］
市販の酵素剤（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来セルラーゼ  オノヅカＲ−１０、ヤクルト社）より、実施例１記載の方法で精製したエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した。得られた配列、Ｎ−ＤＴＴＬＴＩＤＰＴＳＮＷＧＴＷＥＧＷＧＶＳＬＡＷＷＡＫＡＦＧＮＲＤＤＬ−Ｃ（配列番号４）を基に２つのプライマー、Ｆ−１（５´−ＡＡＹＴＧＧＧＧＮＡＣＮＴＧＧＧＡＲＧＧ−３´：配列番号５、配列番号４中のＮＷＧＴＷＤＧに基づく）及びＦ−２（５´−ＡＣＮＴＧＧＧＡＲＧＧＮＴＧＧＧＧ−３´：配列番号６、配列番号４中のＴＷＤＧＷＧ基づく）を作製し、ＲＴ−ＰＣＲにより目的の遺伝子を増幅した。なお、逆転写反応はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ胞子体由来のＲＮＡを鋳型として、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−アダプタープライマー（宝酒造）、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ−α（東洋紡）を用いて行った。まず、作製したｃＤＮＡを鋳型にしてＦ−１プライマー及びアダプタープライマーで増幅し、得られた産物を鋳型とした２回目の増幅反応を、Ｆ−１の内側に位置するＦ−２プライマー及びアダプタープライマーを用いて行った。この操作により、成熟タンパク質Ｎ末からポリＡテイルまでのほぼ全長のｃＤＮＡが得られた。得られた塩基配列をもとにＲ−２（５´−ＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＡＣＴＧＣ−３´：配列番号７）及びＲ−３（５´−ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＧ−３´：配列番号８）プライマーを作製し、市販の５´−ＲＡＣＥキット（クローンテック社）を用いてＰＣＲによる上流領域の増幅を行った。ＰＣＲ反応は上記と同じ条件で行った。これにより、５´側、３´側非翻訳領域を含む完全長のエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼｃＤＮＡが得られた。
【００６８】
［リコンビナントタンパク質の作製］
得られたｃＤＮＡ（以下Ｔｖ６ＧＡＬと略）のうち、成熟タンパク質（シグナルペプチドを除いた領域）に相当するＡｓｐ２１−Ｇｌｎ４３９（図６参照）をＥＸ−Ｆ−２プライマー（５´−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ−３´：配列番号９、ＧＧＡＴＣＣは制限酵素ＢａｍＨ  Ｉサイト）及びＥＸ−Ｒ−１プライマー（５´−ＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＣＧＣ−３´：配列番号１０、ＧＡＧＣＴＣは制限酵素Ｓａｃ  Ｉサイト）により増幅し、プライマーにより導入した制限酵素サイトにより、融合タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ３２ａベクター（ノバジェン社）に挿入した。作製した組換えタンパク質発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に導入し、１０℃で１週間培養した後に、０．５ｍＭのＩＰＴＧで２４時間処理することで、組換えタンパク質を誘導した。組換えタンパク質は、キレーティングセファロースＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）により精製した。組換えタンパク質の抽出、カラムによる精製は製造元のマニュアルに従った。精製組換えタンパク質は、その精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により確認した（図７）。
【００６９】
［組換えタンパク質の評価方法］
組換えタンパク質の基質特異性は次のように調べた。０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．３）の存在下で、５ｍＭのオリゴ糖を組換えタンパク質と反応させ、その反応産物を薄層クロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社）により分離し、硫酸の吹きつけと焼き付けにより検出した。なお、酵素反応は６時間行い、薄層クロマトグラフィーの溶媒には、１−プロパノール：エタノール：水＝７：１：２（ｖ／ｖ／ｖ）を用いた（図８）。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によると、カビ（土壌菌）の一種であるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来のエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼ活性を有する新規なガラクタナーゼをクローニングし、該酵素を同定したので、アラビノガラクタンプロテイン（ＡＧＦ）のβ−（１→６）−ガラクトシル側鎖を特異的分解することが可能となり、この新規な新規なエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼを用いることにより、花粉管の生長制御機能など植物の生長、ストレス応答、生殖制御など多様な生理機能を有するＡＧＰの機能解明に有用であり、自殖性植物の雑種強勢による育種の際に有効な手段となりうる雄性不稔などの形質転換植物への応用や食品加工、医薬品、プロトプラスト作製用酵素への応用が期待できる。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼのカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。
図中のＡ、ＣＭセルロース；Ｂ，セファデックスＧ−１００を示し、ブルーデキストラン（Ｖｏ）及びＧｌｃ（Ｖｉ）を用いてカラムのキャリブレーションを行った。●−●、酵素活性；−−−、２８０ｎｍでの吸光度；…、ＫＣｌの濃縮。バーは、プールした画分を示す。
【図２】精製したエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの未変性ＰＡＧＥ（Ａ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂ）の結果を示す図である。
図中、レーン：（１）タンパク質染色；（２）炭水化物染色；（３）Ｍｒマーカータンパク質；（４）酵素
【図３】エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼによるβ−（１→６）−ガラクトヘキサオース加水分解のメチルβ−グリコシドの経時変化を示す図である。
遊離した還元糖（斜線をつけたピーク）を、ＡＢＥＥで誘導体化し、ＨＰＬＣで分析した。図中の矢印は、標準的なＡＢＥＥ誘導体化Ｇａｌ及びＤＰ２〜４のβ−（１→６）−ガラクトオリゴマーの溶出位置を示す。２３分付近のピークはＡＢＥＥ誘導体化β−（１→６）−ガラクトペンタオースと推定される。２〜４分前後に見られる斜線なしのピークは、誘導体化の後に残った不純物である。反応時間３０分及び１２０分でのＵＶ吸光度の強さを、０分及び３分の場合と比較して、それぞれ１／４と１／５に縮小してある。
【図４】β−（１→６）−ガラクトオリゴマーに対するエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの作用によって生じた加水分解産物の、ＴＬＣによる分析結果を示す図である。
反応条件については、表４の説明を参照のこと。図中、レーン：（１）標準Ｇａｌ及びβ−（１→６）−ガラクトビオース、β−（１→６）−ガラクトトリオース、及びβ−（１→６）−ガラクトテトラオース（上から順に）；（２）β−（１→６）−ガラクトビオース；（３）β−（１→６）−ガラクトビオース＋酵素；（４）及び（５）β−（１→６）−ガラクトトリオース及びその加水分解物；（６）及び（７）β−（１→６）−ガラクトテトラオース及びその加水分解物。
【図５】α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ処理ＡＧＰ（Ａ）、エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼによるその分解産物（Ｂ）、及びエキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼによるその分解産物（Ｃ）に対する、セファデックスＧ−１００でのクロマトグラフィーの結果を示す図である。
図中、●−●、全糖；○−○、ウロン酸；…、タンパク質。Ｂにおいて高Ｍｒ成分（画分番号４３〜５８）及び低Ｍｒ成分（８２〜９８）を含む画分を回収し、その構造を分析した。高Ｍｒ成分の一部を、エキソ−β−（１→３）−ガラクタナーゼでさらに加水分解した。結果として得られた、Ｃにおける高Ｍｒ成分（画分番号４８〜５８）及び低Ｍｒ成分（８５〜９８）を回収して分析した。
【図６】３´及び５´ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより得られた全長エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼｃＤＮＡ、及び該ｃＤＮＡから推定される全長エンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼのアミノ酸配列を示す図である。
図中の下線で示した領域は、市販の酵素剤（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来セルラーゼオノヅカＲ−１０、ヤクルト社）より精製したエンド−（１→６）−ガラクタナーゼのＮ末アミノ酸配列に相当している。二重線で示したのは糖鎖付加（Ｎグリコシレーション）の起こりうる部位である。本遺伝子は、ファミリー５の糖質分解酵素遺伝子と非常に弱いながら相同性があり、それらに共通した酵素の触媒残基（２つのグルタミン酸）を四角で囲ってある。
【図７】精製した組換えエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼの電気泳動の結果を示す図である。
図中のレーン１及び５は分子量マーカー、２は組換え大腸菌の粗抽出液、３はキレートカラムで１回精製した組換えβ−（１→６）−ガラクタナーゼ、４は同じく２回精製した組換えエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼをそれぞれ示す。レーン４で示されたとおり完全に精製された組換え酵素を得ることに成功した。
【図８】本発明の実施例において、組換えエンド−β−（１→６）−ガラクタナーゼのガラクトオリゴ糖への作用を示す図である。
図中のレーン１はガラクトースと重合度２及び３のβ−１，３−ガラクトオリゴ糖マーカー、レーン２はガラクトースと重合度２、３及び４のβ−１，４−ガラクトオリゴ糖マーカー、レーン３はガラクトースと重合度２、３及び４のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖マーカー。レーン４〜１１ではそれぞれ組換え酵素を、重合度２のβ−１，３−ガラクトオリゴ糖、重合度３のβ−１，３−ガラクトオリゴ糖、重合度２のβ−１，４−ガラクトオリゴ糖、重合度３のβ−１，４−ガラクトオリゴ、重合度４のβ−１，４−ガラクトオリゴ糖、重合度２のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖、重合度３のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ、重合度４のβ−（１→６）−ガラクトオリゴ糖に作用させた。レーン１０と１１では、オリゴ糖が分解されて、重合度の小さい分解産物が得られた。オリゴ糖の分離は薄層クロマトグラフィーで行った。その結果、得られた遺伝子がβ−（１→６）−ガラクトシル結合に特異的に作用する酵素をコードしていることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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