(57)【要約】【課題】免疫原性の低い細胞接着性ポリペプチドを提供することである。【解決手段】細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）を有するポリペプチド（Ｐ）であって、（Ｐ）の数平均分子量が１，５００〜１５，０００であることを特徴とする細胞接着性ポリペプチドを用いる。（Ｘ）はArg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、配列番号（１）〜（１０）で表されるアミノ酸配列、Leu Arg Glu配列、His Ala Val配列及びTyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種であること、（Ｙ）は（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有することが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）を有するポリペプチド（Ｐ）であって、ポリペプチドの数平均分子量が１，５００〜１５，０００であることを特徴とする細胞接着性ポリペプチド。
【請求項２】
細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、His Ala Val配列及びTyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項３】
補助アミノ酸配列（Ｙ）が、（Gly Ala）ａ配列 、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）ｂ配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）ｃ配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）ｄ配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）ｅ配列、｛Asp Gly Gly (Ala)ｆ Gly Gly Ala｝ｇ配列、（Gly Val Pro Gly Val）ｈ配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び（Gly Pro Pro）ｎ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を有する請求項１又は２に記載の細胞接着性ポリペプチド。
なお、ａは１〜２５の整数、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは１〜８の整数、ｆは１〜４４の整数、ｆが１の場合ｇは１〜７の整数、ｆが２の場合ｇは１〜６の整数、ｆが３又は４の場合ｇは１〜５の整数、ｆが５又は６の場合ｇは１〜４の整数、ｆが７〜１０の整数の場合ｇは１〜３、ｆが１１〜１９の整数の場合ｇは１又は２、ｆが２０〜４４の整数の場合ｇは１、ｈは１〜１０の整数、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１６の整数である。
【請求項４】
最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項５】
細胞接着性ポリペプチドが、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾されてなる請求項１〜４のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞接着性ポリペプチド及び基材（Ｂ）からなる細胞接着性ポリペプチド含有基材。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着性ポリペプチドに関する。さらに詳しくは、基材等に対する細胞の接着性を向上させる細胞接着性ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然の細胞接着性ポリペプチド｛コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン及びカドヘリン等のヒト由来の蛋白質（非特許文献１）やフィブロイン等の昆虫由来の蛋白質（非特許文献２）等｝の細胞接着性及び熱安定性の改善された人工の細胞接着性ポリペプチド｛ＳＥＬＰＦ（Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）12配列（１２）とを各々約１２個有し遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約８万のポリペプチド）や、ＣＬＰ−ＣＢ（Arg Gly Asp配列と（Gly Ala Pro （Gly Pro Pro）4）2配列（１３）とを各々約６個有し遺伝子組み換え大腸菌により製造される数平均分子量約４万のポリペプチド）等｝が知られている（非特許文献３）。
【０００３】
【非特許文献１】病態生理（第９巻、第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年）
【非特許文献２】バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーション（Biochemical and Biophysical Research Communications、Vol.208, No.2, 511-516頁, 1995年）
【非特許文献３】ハンドブック  オブ  バイオデグラダブル  ポリマーズ（アブラハム著，ハーウッド  アカデミック  パブリッシャーズ発行，アムステルダム１９９７（Abraham J. Dombら著, Handbook of Biodegradable Polymers, Harwood Academic Publishers発行, Amsterdam 1997年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の人工の細胞接着性ポリペプチドは、生体組織と接触すると免疫原として働き生体内に多量の抗体を産生させる場合がある。即ち、人工の細胞接着性ポリペプチドの免疫原性が高い場合があるという問題がある。
本発明の目的は、免疫原性の低い細胞接着性ポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねてきた結果、特定のポリペプチドを使用することにより上記目的を達成することを見いだし本発明に到達した。
すなわち、本発明の細胞接着性ポリペプチドの特徴は、細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）を有するポリペプチド（Ｐ）であって、ポリペプチドの数平均分子量が１，５００〜１５，０００である点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、免疫原性が極めて低い。また、細胞接着性や熱安定性も著しく優れている。
よって、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、安全性が高いため、細胞が関係する研究開発、有用物質生産及び治療等に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質をを意味する（大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年）。
細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）としては、例えば、「病態生理、第９巻 第７号、５２７〜５３５頁、１９９０年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻 第１号、５８〜６６頁、１９９２年」に記載されているもの等が用いられる。
【０００８】
これらの最小アミノ酸配列（Ｘ）の中で、Arg Gly Asp配列、Leu Asp Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala 配列（８）、Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）、Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）、His Ala Val配列及びTyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）が好ましく、細胞接着性の観点等から、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、Tyr Ile Gly Ser Arg配列（２）及びIle Lys Val Ala Val配列（７）、特に好ましくはArg Gly Asp配列である。
【０００９】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、免疫原性及び細胞接着性の観点等から、１分子中に１〜１５個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは３〜７個、最も好ましくは３〜６個有するものである。
なお、２種以上の最小アミノ酸配列（Ｘ）が一分子中に含まれてもよい。
【００１０】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）以外のアミノ酸配列であれば制限なく使用できるが、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ）の耐熱性及び細胞接着性の観点等から、Gly 及び／又はAlaを有するものが好ましく、例えば（Gly Ala）a 配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly）i、（Ala）j、（Gly Gly Ala）k配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列、（Gly Pro Pro）ｎ配列、（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列及び／又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有するもの等が挙げられる。これらのうち好ましくは（Gly Ala）a配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列、（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列、（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e、｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するもの、さらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列、（Gly Val Pro Gly Val）h配列、（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列及び／又は（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものである。
なお、aは１〜２５の整数、b、ｃ、ｄ及びｅは１〜８の整数、fは１〜４４の整数、ｆが１の場合gは１〜７の整数、ｆが２の場合ｇは１〜６の整数、ｆが３又は４の場合ｇは１〜５の整数、ｆが５又は６の場合ｇは１〜４の整数、ｆが７〜１０の整数の場合ｇは１〜３、ｆが１１〜１９の整数の場合ｇは１又は２、ｆが２０〜４４の整数の場合ｇは１、hは１〜１０の整数、i及びjは１〜５０の整数、kは１〜１６の整数、ｍは１〜１０の整数、ｎは１〜１６の整数、ｏは１〜５の整数、ｐは１〜３の整数、ｑは１〜３の整数である。
【００１１】
補助アミノ酸配列（Ｙ）は、以上の例示の他に、他のアミノ酸（セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、システイン（Cys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、プロリン（Pro）、トリプトファン（Trp）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）及びヒスチジン（His）等）を含んでいてもよい。
【００１２】
（Gly Ala）a配列を有するものとしては、配列番号（１４）〜（１９）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）b配列を有するものとしては、配列番号（２０）〜（２５）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）c配列を有するものとしては、配列番号（２６）〜（３１）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）d配列を有するものとしては、配列番号（３２）〜（３７）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）e配列を有するものとしては、配列番号（３８）〜（４３）のアミノ酸配列等が挙げられる。
｛Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala｝g配列を有するものとしては、配列番号（４４）〜（４９）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Pro Gly Val）h配列を有するものとしては、配列番号（５０）〜（５５）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly）i配列を有するものとしては、配列番号（５６）〜（６１）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Ala）j配列を有するものとしては、配列番号（６２）〜（６７）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Gly Ala）k配列を有するものとしては、配列番号（６８）〜（７３）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Val Gly Val Pro）ｍ配列を有するものとしては、配列番号（７４）〜（７９）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Pro Pro）ｎ配列を有するものとしては、配列番号（８０）〜（８５）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）ｏ配列を有するものとしては、配列番号（８６）〜（９１）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）ｐ配列を有するものとしては、配列番号（９２）〜（９７）のアミノ酸配列等が挙げられる。
（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）ｑ配列を有するものとしては、配列番号（９８）〜（１０３）のアミノ酸配列等が挙げられる。
【００１３】
ポリペプチド（Ｐ）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）を１分子中に少なくとも１個有すればよいが、免疫原性、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、１分子中に１〜１５個有するものが好ましく、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは３〜７個、最も好ましくは３〜６個有するものである。また、２種以上の補助アミノ酸配列（Ｙ）が１分子中に含まれてもよい。
【００１４】
補助アミノ酸配列（Ｙ）に含まれるグリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の合計含有割合（％）は、補助アミノ酸配列（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９５、特に好ましくは３０〜９０、最も好ましくは４０〜８５である。すなわち、（Gly）及び（Ala）の合計含有割合（％）の下限は、（Ｙ）の全アミノ酸個数に基づいて、１０が好ましく、さらに好ましくは２０、特に好ましくは３０、最も好ましくは４０であり、また同様に上限は１００が好ましく、さらに好ましくは９５、特に好ましくは９０、最も好ましくは８５である。この範囲であると、細胞接着性及び熱安定性等がさらに良好となる。
グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の両方を含む場合、これらの含有個数割合（Gly／Ala）は、０．０３〜４０が好ましく、さらに好ましくは０．０８〜１３、特に好ましくは０．２〜５である。すなわち、この場合、グリシン（Gly）及びアラニン（Ala）の含有個数割合（Gly／Ala）の下限は、０．０３が好ましく、さらに好ましくは０．０８、特に好ましくは０．２であり、また同様に上限は４０が好ましく、さらに好ましくは１３、特に好ましくは５である。この範囲であると、免疫原性等が低く、さらに良好となる。
【００１５】
ポリペプチド（Ｐ）は、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが化学結合してなる。また、ポリペプチド（Ｐ）は、一部に分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよいが、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００１６】
ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることが好ましい。この場合、ポリペプチド（Ｐ）中の最小アミノ酸配列（Ｘ）と補助アミノ酸配列（Ｙ）との繰り返し単位（Ｘ−Ｙ）数（個）は、細胞接着性及び免疫原性の観点等から、１〜１５個が好ましく、さらに好ましくは２〜１０個、特に好ましくは３〜７個、最も好ましくは３〜６個である。
【００１７】
ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（Ｍｎ）は、１，５００〜１５，０００が好ましく、さらに好ましくは２，０００〜１４，０００、特に好ましくは３，０００〜１２，０００、最も好ましくは４，０００〜１０，０００である。すなわち、（Ｐ）の（Ｍｎ）の下限は、１，５００が好ましく、さらに好ましくは２，０００、特に好ましくは３，０００、最も好ましくは４，０００であり、また同様に上限は１５，０００が好ましく、さらに好ましくは１４，０００、特に好ましくは１２，０００、最も好ましくは１０，０００である。
なお、数平均分子量（Ｍｎ）は、公知の方法により測定でき、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル｛ポリペプチド等｝を分離し、泳動距離を標準物質と比較することによって求められる（以下、同じ）。
【００１８】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、最小アミノ酸配列（Ｘ）及び補助アミノ酸配列（Ｙ）を有するポリペプチドであって、ポリペプチドの数平均分子量が１，５００〜１５，０００であれば制限なく使用でき、ポリペプチド（Ｐ１〜Ｐ３４５）等が好ましく例示できる。
（１）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Gly Asp配列（ｘ１）を含むもの
（ｘ１）の２個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約４，０００のポリペプチド（Ｐ１）；（ｘ１）の３個と（ｙ１）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約６，０００のポリペプチド（Ｐ２）；（ｘ１）の４個と（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ３）；（ｘ１）の２個と（Gly Val Pro Gly Val）2（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１０４）（ｙ２）の２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約６，０００のポリペプチド（Ｐ４）；（ｘ１）の３個と（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチド（Ｐ５）；（ｘ１）の４個と（ｙ２）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１２，０００のポリペプチド（Ｐ６）；（ｘ１）の２個と［Gly Ala Pro（Gly Pro Pro）4］2配列（１３）（ｙ３）の２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約７，０００のポリペプチド（Ｐ７）；（ｘ１）の３個と（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１，０００のポリペプチド（Ｐ８）；（ｘ１）の４個と（ｙ３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１４，０００のポリペプチド（Ｐ９）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala）10配列（１５）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１０）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala Gly Ala Gly Tyr）3配列（２７）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチド（Ｐ１１）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala Gly Val Gly Tyr）3配列（３３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチド（Ｐ１２）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala Gly Tyr Gly Val）3配列（３９）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチド（Ｐ１３）；（ｘ１）の４個と｛Asp Gly Gly (Ala)12 Gly Gly Ala｝配列（４５）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１４）；（ｘ１）の４個と（Gly Val Pro Gly Val）3 配列（５１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１５）；（ｘ１）の４個と（Gly ）21 配列（５７）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１６）；（ｘ１）の４個と（Ala）19 配列（６３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１７）；（ｘ１）の４個と（Gly Gly Ala）7 配列（６９）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１８）；（ｘ１）の４個と（Gly Val Gly Val Pro）3 配列（７５）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ１９）；（ｘ１）の４個と（Gly Pro Pro）5 配列（８１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ２０）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly）2 配列（８７）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチド（Ｐ２１）；（ｘ１）の４個と（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln）配列（９３）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ２２）；（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro）配列（９９）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチド（Ｐ２３）等。
【００１９】
（２）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてLeu Asp Val配列（ｘ２）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をLeu Asp Val配列（ｘ２）に変更したポリペプチド（Ｐ２４）〜（Ｐ４６）等。
【００２０】
（３）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Glu Asp Val配列（１）（ｘ３）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をArg Glu Asp Val配列（１）（ｘ３）に変更したポリペプチド（Ｐ４７）〜（Ｐ６９）等。
【００２１】
（４）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）（ｘ４）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）（ｘ４）に変更したポリペプチド（Ｐ７０）〜（Ｐ９２）等。
【００２２】
（５）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてPro Asp Ser Gly Arg配列（３）（ｘ５）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をPro Asp Ser Gly Arg配列（３）（ｘ５）に変更したポリペプチド（Ｐ９３）〜（Ｐ１１５）等。
【００２３】
（６）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）（ｘ６）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をArg Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）（ｘ６）に変更したポリペプチド（Ｐ１１６）〜（Ｐ１３８）等。
【００２４】
（７）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてLeu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）（ｘ７）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をLeu Gly Thr Ile Pro Gly配列（５）（ｘ７）に変更したポリペプチド（Ｐ１３９）〜（Ｐ１６１）等。
【００２５】
（８）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてArg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）（ｘ８）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をArg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile配列（６）（ｘ８）に変更したポリペプチド（Ｐ１６２）〜（Ｐ１８４）等。
【００２６】
（９）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をIle Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）に変更したポリペプチド（Ｐ１８５）〜（Ｐ２０７）等。
【００２７】
（１０）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてLeu Arg Glu配列（ｘ１０）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をLeu Arg Glu配列（ｘ１０）に変更したポリペプチド（Ｐ２０８）〜（Ｐ２３０）等。
【００２８】
（１１）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてAsp Gly Glu Ala 配列（８）（ｘ１１）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をAsp Gly Glu Ala 配列（８）（ｘ１１）に変更したポリペプチド（Ｐ２３１）〜（Ｐ２５３）等。
【００２９】
（１２）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてGly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）（ｘ１２）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をGly Val Lys Gly Asp Lys Gly Asn Pro Gly Trp Pro Gly Ala Pro配列（９）（ｘ１２）に変更したポリペプチド（Ｐ２５４）〜（Ｐ２７６）等。
【００３０】
（１３）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてGly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）（ｘ１３）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をGly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys配列（１０）（ｘ１３）に変更したポリペプチド（Ｐ２７７）〜（Ｐ２９９）等。
【００３１】
（１４）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてHis Ala Val配列（ｘ１４）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をHis Ala Val配列（ｘ１４）に変更したポリペプチド（Ｐ３００）〜（Ｐ３２２）等。
【００３２】
（１５）最小アミノ酸配列（Ｘ）としてTyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）（ｘ１５）を含むもの
ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）のArg Gly Asp配列（ｘ１）をTyr Lys Leu Asn Val Asn Asp Ser配列（１１）（ｘ１５）に変更したポリペプチド（Ｐ３２３）〜（Ｐ３４５）等。
【００３３】
これらの例示のうち、ポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）、ポリペプチド（Ｐ７０）〜（Ｐ９２）及びポリペプチド（Ｐ１８５）〜（Ｐ２０７）がさらに好ましく、次に好ましくはポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）およびポリペプチド（Ｐ１８５）〜（Ｐ２０７）、特に好ましくはポリペプチド（Ｐ１）〜（Ｐ２３）、最も好ましくは（Ｐ１）〜（Ｐ９）である。
【００３４】
ポリペプチド（Ｐ）は、人工的に製造でき、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）、及び遺伝子組み換え法等によって容易に製造できる。有機合成法に関しては、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）又は続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法とも、ポリペプチド（Ｐ）を作製できるが、ポリペプチド（Ｐ）を安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００３５】
ポリペプチド（Ｐ）は、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾されていることが好ましい。（ＡＭ）で修飾されていると、（Ｐ）の細胞接着性がさらに良好となる。
【００３６】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーの重合体並びにこれらの４級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも１個の１級アミノ基又は２級アミノ基を有するポリアミン（炭素数２〜５６）等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。
【００３７】
脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン（エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等）、アルキレン基の炭素数が２〜６であるポリアルキレンポリアミン（ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等）、及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体（ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等）等が挙げられる。
【００３８】
脂環式ポリアミンとしては、１，３−ジアミノシクロヘキサン、１，３−ビス（メチルアミノ）シクロヘキサン、１，３−ビス（ジヒドロキシアミノ）シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び４，４’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。
複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、Ｎ−メチルピペラジン、Ｎ−アミノエチルピペラジン及び１，４−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。
芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジメチルフェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び２，６−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、４，４’−ビス（メチルアミノ）ジフェニルメタン及び１−メチル−２−メチルアミノ−４−アミノベンゼン等が挙げられる。
【００３９】
アミノアルコールとしては、炭素数２〜５８のアミノアルコール等が用いられ、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］、これらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００４０】
アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のアルキルアミンのハロゲン（塩素及び臭素等）化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００４１】
アミノ基含有モノマーとしては、炭素数５〜２１のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数２〜２０のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有（メタ）アクリレート、アミノ基含有（メタ）アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。なお、（メタ）アクリ・・・は、アクリ・・・及び／又はメタクリ・・・を意味する。
【００４２】
アミノ基含有（メタ）アクリレートとしては、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジベンジルアミノプロピル（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アクリレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４３】
アミノ基含有（メタ）アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、Ｎ−メチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）アクリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４４】
アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、Ｎ−メチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノスチレン等が挙げられる。
アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、Ｎ−メチルアミノエチルアリルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。
【００４５】
アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノアクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸等が挙げられる。
【００４６】
アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド（ポリペプチド（Ｐ）は含まない。）等が挙げられる。アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量５００以上が好ましく、さらに好ましくは１，０００以上、特に好ましくは２，０００以上であり、また１，０００，０００以下が好ましく、さらに好ましくは８００，０００以下、特に好ましくは５００，０００以下である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定することができる。なお、基準物質としては、例えば、分子量４２０〜２０,６００,０００のポリスチレンスタンダード（東ソー製）等が利用できる。
【００４７】
これらの４級化物としては、これらのアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
【００４８】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）で修飾する方法としては、例えば、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）と修飾前のポリペプチドとを反応させる方法、並びに、アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）を修飾前のポリペプチドに物理吸着させる方法等が適用でき、その方法は、後述するポリペプチド（Ｐ）と基材（Ｂ）との結合方法のうち（１）〜（３）と同様の化学的結合及び／又は物理吸着が使用でき、好ましい化学的結合及び／又は物理吸着も同様である。
【００４９】
アミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）により修飾されたポリペプチド（Ｐ）のアミノ基の平均個数（個）は、ポリペプチド（Ｐ）１分子あたり、０．００１〜１００，０００が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０，０００、特に好ましくは０．１〜１，０００である。すなわち、（Ｐ）のアミノ基の平均個数（個）の下限は、（Ｐ）１分子あたり、０．００１が好ましく、さらに好ましくは０．０１、特に好ましくは０．１であり、また同様に上限は１００，０００が好ましく、さらに好ましくは１０，０００、特に好ましくは１，０００である。
アミノ基の平均個数は、公知の方法等により定量でき、例えば、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法［タンパク質の化学ＩＶ（東京化学同人発行、１９８１年）等］や塩酸・指示薬（ブロムフェノールブルー等）滴定法による全アミン価測定法［ＪＩＳ  Ｋ７２３７−１９８６や、ＡＳＴＭ  Ｄ２０７４−６６等］等が挙げられる。
具体的には、例えば、アミノ基の個数が既知のアミノ基及び／又はアンモニオ基を含有する化合物（ＡＭ）を、単位容積当たりの濃度を変化させてＴＮＢＳ法によって測定し、検量線（アミノ基の個数と吸光度のグラフ）を作製する。また修飾前のポリペプチド（Ｐ）をＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。同時に修飾後のポリペプチドをＴＮＢＳ法で測定し、得られた吸光度を、検量線を用いてアミノ基の個数に換算する。これら修飾前後のアミノ基の個数の差を算出して、その値を測定に用いたポリペプチド（Ｐ）の分子数で除することで、ポリペプチド（Ｐ）に修飾されるアミノ基の平均個数とする。
【００５０】
本発明の細胞接着性ポリペプチドは、基材（Ｂ）とともに細胞接着性ポリペプチド含有基材とすることができる。
基材（Ｂ）の材質としては、細胞や生体に悪影響を及ぼさないものであれば制限無く使用でき、例えば、細胞培養での使用時や細胞の生体への適用時に、培養液や体液に分散、溶解又は吸収され易い材料｛以下、易生分解性材料（Ｎ１）｝、及び細胞培養での使用時や生体への適用時に、培養液や体液に分散、溶解又は吸収され難い材料｛以下、難生分解性材料（Ｎ２）｝が使用できる。また易生分解性材料（Ｎ１）及び難生分解性材料（Ｎ２）を組み合わせて使用することもできる。
【００５１】
易生分解性材料（Ｎ１）としては、天然高分子（Ｎ１Ａ）、合成高分子（Ｎ１Ｂ）及び無機物（Ｎ１Ｃ）等が使用できる。
天然高分子（Ｎ１Ａ）としては、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、エラスチン、キチン、キトサン、フィブリン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、アルブミン、ポリヒドロキシ酪酸、ペクチン、ペクチン酸、ガラクタン、プルラン、アガロース、セルロース、グルテン及びフィブロイン等が挙げられる。
合成高分子（Ｎ１Ｂ）としては、乳酸、ロイシン、グリコール酸、ε−カプロラクトン、ジオキサノン、リンゴ酸、ラクチド及びグリコリドからなる群より選ばれた単量体を必須単量体としてなる（共）重合体（ポリグリコール酸）並びに本発明の細胞接着性ポリペプチドを含まない合成ポリペプチド等が挙げられる。
無機物（Ｎ１Ｃ）としては、炭酸カルシウム及びリン酸カルシウム等が用いられる。
炭酸カルシウムとしては、軽質炭酸カルシウム及び重質炭酸カルシウム等が挙げられる。リン酸カルシウムとしては、ヒドロキシアパタイト、トリカルシウムフォスフェート及びこれらと他のリン酸カルシウム（モノカルシウムハイドロジェンフォスフェート等）との混合物等が挙げられる。
これらのうち、天然高分子（Ｎ１Ａ）及び合成高分子（Ｎ１Ｂ）が好ましく、さらに好ましくは天然高分子（Ｎ１Ａ）、特に好ましくはコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、フィブリン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、アガロース、セルロース及びフィブロインである。
【００５２】
難生分解性材料（Ｎ２）としては、天然高分子（Ｎ２Ａ）、合成高分子（Ｎ２Ｂ）及び無機物（Ｎ２Ｃ）等が使用できる。
天然高分子（Ｎ２Ａ）としては、天然繊維（綿、毛、麻及び絹等）等が挙げられる。
合成高分子（Ｎ２Ｂ）としては、ポリオレフィン（ポリエチレン、ポリプロピレン及びこれらの変性物等）、オレフィン共重合体｛エチレン−ビニルアセテート共重合体、エチレン−エチル（メタ）アクリレート共重合体、エチレン−メチル（メタ）アクリレート共重合体及びエチレン−（メタ）アクリル酸共重合体等｝、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアミド（ナイロン）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、セルロース及び化学繊維（ビスコースレイヨン、キュプラレーヨン、ポリノジック、アセテート、トリアセテート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ビニロン、ポリ塩化ビニル、ビニリデン及びポリウレタン等）等が用いられる。
無機物（Ｎ２Ｃ）としては、金属（金、銀、プラチナ、チタン及びニッケル等）及びセラミックス（アルミナ、ジルコニア及び窒化アルミニウム等）等が用いられる。
これらのうち、合成高分子（Ｎ２Ｂ）と無機物（Ｎ２Ｃ）が好ましく、さらに好ましくは合成高分子（Ｎ２Ｂ）、特に好ましくは、ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアミド（ナイロン）、ポリスチレン及びシリコーン樹脂である。
【００５３】
基材（Ｂ）の形状としては、細胞が接着可能な形状であれば特に制限がなく、一般に用いられるものが使用でき、プレート、シャーレ、Ｔ−フラスコ、ローラーボトル、ビーズ、ホローファイバー、シート（フィルム、フォーム（スポンジ）及び布等）及びゲル等のいずれでもよい。
【００５４】
細胞接着性ポリペプチドと基材（Ｂ）とは、化学結合（イオン結合、水素結合及び／又は共有結合等）及び／又は物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）によって複合化される。細胞接着性ポリペプチドと基材（Ｂ）とが強固に結合される点で、化学結合が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
【００５５】
細胞接着性ポリペプチドと基材（Ｂ）とを共有結合させる方法としては、例えば、（１）細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するもの（例えば、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、オルニチン、ヒスチジン、３−アミノプロピオン酸、８−アミノオクタン酸及び２０−アミノエイコサン酸などを構成単位として含む細胞接着性ポリペプチド）と、（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するもの（例えば、ポリグリコール酸、細胞接着性を発現させる最小アミノ酸配列（Ｘ）を含まない合成ポリペプチド、ポリエチレン又はポリプロピレンの変性物、エチレン−（メタ）アクリル酸共重合体、ポリアクリル酸、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、エラスチン、フィブリン、アルギン酸、アルブミン、ペクチン、ペクチン酸、グルテン及びフィブロイン等の被覆材料）とを反応させる方法；（２）細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと、（Ｂ）のうちヒドロキシル基を有するもの（例えば、ポリグリコール酸、エチレン−ビニルアセテート共重合体、ポリウレタン、ポリエステル、セルロース、化学繊維、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、エラスチン、キチン、キトサン、フィブリン、アルギン酸、デンプン、デキストラン、アルブミン、ポリヒドロキシ酪酸、ペクチン、ペクチン酸、ガラクタン、プルラン、アガロース、グルテン及びフィブロイン等の被覆材料）とを反応させる方法；（３）細胞接着性ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するもの（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、チロニン及びヒドロキシプリン等を構成単位として含む細胞接着性ポリペプチド）と、（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる方法；（４）細胞接着性ポリペプチドのうちハロゲン原子を有するもの（例えば、アミノ基を有するハロゲン化物で修飾されたポリペプチド）と、（Ｂ）のうちヒドロキシル基又はメルカプト基を有するもの（例えば、上記のヒドロキシル基を有するもの以外に、ヒドロキシル基の一部又は全部をメルカプト基に置き換えた構造を有する被覆材料）とを反応させる方法；及び、（５）細胞接着性ポリペプチドのうちビニル基を有するもの（例えば、アミノ基含有モノマーで修飾された細胞接着性ポリペプチド）と、（Ｂ）のうちアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有するものとを反応させる方法等が挙げられる。
【００５６】
これらの反応は公知の方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成９年１０月５日、丸善株式会社発行」に記載の方法等）で行うことができる。具体的には、以下の（１）〜（５）の通りである。
（１）細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素｛Ｒ’−Ｎ＝Ｃ（ＯＣＯＲ）−ＮＨ−Ｒ’（−ＯＣＯＲが（Ｂ）に由来する部分）｝とした後、細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものを加えることによって、（Ｂ）に細胞接着性ポリペプチドを、アミド結合を形成させて導入させることができる。カルボジイミド化合物としては、例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
【００５７】
（２）細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のヒドロキシル基を予めカルボニルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体｛Ｒ−Ｉｍ、Ｉｍはイミダゾリン環、Ｒが（Ｂ）に由来｝とした後、細胞接着性ポリペプチドのうち１級アミノ基又は２級アミノ基を有するものを加えることによって、（Ｂ）に細胞接着性ポリペプチドを、Ｎ−Ｃ結合を形成させて導入させることができる。カルボニルジイミダゾール化合物としては、例えばＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
【００５８】
（３）細胞接着性ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものと（Ｂ）のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、（Ｂ）のカルボキシル基を予めカルボジイミド化合物と反応させ、アシルイソ尿素とした後、細胞接着性ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものを加えることによって、（Ｂ）に細胞接着性ポリペプチドをエステル結合を形成させて導入させることができる。
【００５９】
（４）細胞接着性ポリペプチドのうちハロゲン原子を有するものと（Ｂ）のうちヒドロキシル基又はメルカプト基を有するものとを反応させる場合、両者をアルカリ化合物の存在下又は非存在下に混合することによって、（Ｂ）に細胞接着性ポリペプチドを、エーテル結合又はチオエーテル結合を形成させて導入させることができる。アルカリ化合物としては、例えば無機アルカリ化合物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化リチウム等）及び有機アルカリ化合物（ジメチルアミノピリジン、アンモニア、トリエチルアミン、ナトリウムメトキシド及びＤＢＵ（サンアプロ社登録商標）等）等が挙げられる。
【００６０】
（５）細胞接着性ポリペプチドのうちビニル基を有するものと、（Ｂ）のうちアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、両者をアルカリ化合物の存在下あるいは非存在下に混合し、マイケル付加させることによって、（Ｂ）に細胞接着性ポリペプチドを導入させることができる。
【００６１】
細胞接着性ポリペプチドを基材（Ｂ）に、物理吸着、イオン結合及び／又は水素結合させる方法としては、例えば、溶媒等に細胞接着性ポリペプチドと（Ｂ）とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコール、脂質・糖、酸及び／又は塩基を０．００１〜５０重量％（好ましくは０．０１〜１０重量％）含有する水溶液、水及び体液等が使用できる。
【００６２】
無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過ハロゲン酸金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硝酸鉄、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、硫酸銅、硫酸鉄、塩化リチウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム、過塩素酸ナトリウム及び過塩素酸リチウム等が挙げられる。
有機酸塩としては、例えば、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石酸ナトリウム等が挙げられる。
【００６３】
アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、セリン及びグリシン等が挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、コリン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２及びビタミンＣ等が挙げられる。
アルコールとしては、炭素数１〜４のアルコール等が使用でき、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びブタノール等が挙げられる。
脂質・糖としては、例えば、脂質、単糖、２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸性糖等が挙げられる。
【００６４】
酸としては、無機酸及び炭素数１〜６の有機酸等が使用でき、例えば、塩酸、燐酸、酢酸、蟻酸、フェノール及び硫酸等が挙げられる。
塩基としては、無機塩基及び炭素数２〜６の有機塩基等が使用でき、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びトリエチルアミン等が挙げられる。
水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。
体液としては、血液、血漿、血清及び尿等が挙げられる。
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液、並びに、水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液である。
【００６５】
本発明の基材中の細胞接着性ポリペプチドの含有量は、細胞接着性の観点等から、基材の単位面積あたり、０．１ｎｇ／ｃｍ2以上が好ましく、さらに好ましくは１ｎｇ／ｃｍ2以上、特に好ましくは１０ｎｇ／ｃｍ2以上、最も好ましくは１００ｎｇ／ｃｍ2以上であり、また、１００ｍｇ／ｃｍ2以下が好ましく、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ2以下、特に好ましくは１ｍｇ／ｃｍ2以下、最も好ましくは１００μｇ／ｃｍ2以下である。なお、本発明において、単位面積は、基材（Ｂ）の表面のうち、培養される細胞が接着し得る表面の表面積を意味し、細胞が入り込まないような微小な凹凸（例えば、１μｍ以下）は平坦な表面として取扱うが、単位面積を高める目的でリブ（畝）等が設けてあるものについてはそのリブの表面積を単位面積に含まれる。
単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量の測定方法は特に限定されないが、例えば、免疫学的測定法が利用できる。具体的には、基材の表面の一部（例えば、１ｃｍ×１ｃｍの正方形状）を切り取り、細胞接着性ポリペプチドと結合する抗体に酵素を標識したもの（以下、酵素標識抗体１）を反応させ、この反応した酵素標識抗体１の酵素量を測定することにより、単位面積あたりの細胞接着性ポリペプチドの含有量を測定することができる。
酵素標識抗体１は通常、酵素と特異抗体とを化学結合させたものであり、公知の方法で化学結合できる。例えば、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素等）と特異抗体とをグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法及びピリジルジスルフィド法等によって化学結合させる方法等（超高感度酵素免疫測定法、石川榮治著、株式会社学会出版センター、１９９３年；エンザイムイムノアッセイ、石川榮治訳、株式会社東京化学同人、１９８９年；及び酵素抗体法、渡辺慶一ら編、学際企画株式会社、１９９２年）が適用できる。また、特異抗体は細胞接着性ポリペプチドに特異的に結合する抗体であり、公知の方法で作製できる。例えば、ポリクローナル抗体作製法及びモノクローナル抗体作製法（エンザイムイムノアッセイ、石川榮治訳、株式会社東京化学同人、１９８９年；及び酵素抗体法、渡辺慶一ら編、学際企画株式会社、１９９２年）等が適用できる。尚、特異抗体の交差反応性抗原に対する親和定数は小さいほど好ましく、例えば、特異抗体の細胞接着性ポリペプチドへの親和定数を１とした場合、交差反応性抗原に対する親和定数は、１以下が好ましく、さらに好ましくは０．１以下、特に好ましくは０．０１以下である。これらの親和定数はエンザイムイムノアッセイ（石川榮治訳、株式会社東京化学同人、１９８９年）に記載の方法で得ることが出来る。
【００６６】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。
【００６７】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む細胞の生産方法としては、公知の培養基材の代わりに本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を使用する以外、公知の方法が適用できる。
細胞培養工程としては、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材又は、本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材が入った適当な容器（シャーレ、プレート、フラスコ、ビーカー及びファーメンター等）に、細胞（ＣＥ）を縣濁させた培地（ＭＥ）を加えて適当な条件で培養する方法等が挙げられる。
【００６８】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、細胞接着性ポリペプチドが生体組織に接触しても細胞接着性ポリペプチドの免疫原性が著しく低いため、主に医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝実質細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（oval cell、small hepatocyte等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。
【００６９】
哺乳動物由来の株化細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５−８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ−６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５−１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ−３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４−II−Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ−３２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ−９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８−１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ−１２細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ−１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ−９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＷＩ−３８細胞、ψ２細胞、及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【００７０】
昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ−５細胞、ＨＩＧＨ  ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、２０００年）。
【００７１】
本発明の細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養方法に用いる培地（ＭＥ）は、特に制限無く一般の細胞培養に用いられるものが利用でき、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＯPTIＰＲＯTMＳＦＭ培地、２９３ＳＦＭII培地、ＣＤ２９３培地、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、及びこれらの混合培地が挙げられる。
また、これらの培地に血清等を添加したものも利用できる。血清としては、ヒト血清、及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等）が含まれ、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられ、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。
血清の使用量（重量％）は、培地の重量に基づいて、０．１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．３〜３０、特に好ましくは１〜２０である。すなわち、血清の使用量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、０．１が好ましく、さらに好ましくは０．３、特に好ましくは１であり、また同様に上限は５０が好ましく、さらに好ましくは３０、特に好ましくは２０である。
【００７２】
培地中には、添加剤として必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０-16〜１０-3が好ましく、さらに好ましくは１０-14〜１０-5、特に好ましくは１０-12〜１０-7である。すなわち、この場合、細胞増殖因子の含有量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、１０-16が好ましく、さらに好ましくは１０-14、特に好ましくは１０-12であり、また同様に上限は１０-3が好ましく、さらに好ましくは１０-5、特に好ましくは１０-7である。
【００７３】
これらの培地には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量（重量％）は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、１０-4〜１０が好ましく、さらに好ましくは１０-5〜１、特に好ましくは１０-6〜０．１である。すなわち、この場合、抗菌剤の含有量（重量％）の下限は、培地の重量に基づいて、１０-4が好ましく、さらに好ましくは１０-5、特に好ましくは１０-6であり、また同様に上限は１０が好ましく、さらに好ましくは１、特に好ましくは０．１である。
【００７４】
細胞の播取量は、使用する細胞や細胞接着性ポリペプチド含有基材の種類等によって異なるが、細胞接着性ポリペプチド含有基材の表面積１ｃｍ2当り、１０個以上が好ましく、さらに好ましくは１００個以上、特に好ましくは１０００個以上であり、また１０００万個以下が好ましく、さらに好ましくは１００万個以下、特に好ましくは１０万個以下である。
また、培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、培地１ｍＬ当たり、１００個以上が好ましく、さらに好ましくは１０００個以上、特に好ましくは１万個以上であり、また１億個以下が好ましく、さらに好ましくは１千万個以下、特に好ましくは１００万個以下である。
【００７５】
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ2）濃度１〜２０体積％、５〜４５℃で１時間〜１００日間、必要に応じて１〜１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ2濃度３〜１０体積％、３０〜４０℃、１〜２０日間、２〜３日毎に培地交換しなら培養する条件である。
【００７６】
培養後に細胞を細胞接着性ポリペプチド含有基材から剥離して回収する場合は、（１）ＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は、トリプシンやコラゲナーゼ等の蛋白質分解酵素で処理して回収する方法、（２）スクレーパー等で掻きとることによって回収する方法、（３）細胞接着性ポリペプチド含有基材（Ｂ）及び／又は培地の温度を培養条件の温度より下げることによって回収する方法等が挙げられる。
【００７７】
細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いる細胞培養で得られる細胞（ＣＥ２）としては、細胞接着性ペプチド含有基材に接着できる細胞（ＣＥ）と同じものが挙げられる。なお、細胞（ＣＥ）が分化して、元の細胞（ＣＥ）とは異なる細胞（ＣＥ２）が得られる場合がある。例えば、元の細胞（ＣＥ）が骨髄未分化間葉系幹細胞であって、細胞（ＣＥ２）が骨芽細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞等の場合である（ティッシュ・エンジニアリング、上田実 編、財団法人名古屋大学出版会、１９９９年１０月１０日）。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７９】
＜実施例１＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の２個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約４，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）を得た。
【００８０】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の１ｍｇを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液の１ｍＬに溶解し、さらに、９９．５重量％塩化ナトリウムを０．８５重量％含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、ＰＢＳ）で２０倍希釈して、Ｐ１溶液（Ｐ１の濃度：５０μｇ／ｍＬ）を作製した。このＰ１溶液を９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に５０μＬ／穴で投入し、２７±３℃で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄して、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）を作製した（Ｐ１付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００８１】
細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）における細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の付着量は、以下の手順で測定した。
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の付着量が既知の標準プレート（Ｈ１）及び付着量が未知の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）に、牛血清アルブミンを１重量％で含有するＰＢＳを５０μＬ／穴で投入し、室温（２５℃）で２時間静置した。その後、アスピレーターを用いて溶液を除去した。
尚、標準プレートの調製は、上記の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製とほぼ同様に行うが、付着量は、細胞接着性ポリペプチドが付着後のＰ１水溶液を透析、凍結乾燥して、未付着の細胞接着性ポリペプチド重量を求め、付着前の細胞接着性ポリペプチド重量から未付着の細胞接着性ポリペプチド重量を差し引くことにより求めた。
【００８２】
（２）ペルオキシダーゼ標識抗Ｐ１抗体を０．００１重量％、牛血清アルブミンを１重量％及びＴｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを、５０μＬ／穴で投入し、３７℃で２時間反応した。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを１００μＬ／穴で投入し、３回洗浄して溶液を除去した。
尚、ペルオキシダーゼ標識抗Ｐ１抗体の調製は、ポリクローナル抗体作製法（エンザイムイムノアッセイ、石川榮治訳、株式会社東京化学同人、１９８９年）にしたがってウサギに細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）を免役して抗Ｐ１抗体を得て、その抗Ｐ１抗体とペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製）とをマレイミド法（エンザイムイムノアッセイ、石川榮治訳、株式会社東京化学同人、１９８９年）によって結合させることにより、ペルオキシダーゼ標識抗Ｐ１抗体を得た。
（３）ＯＬＹＤＡＳ専用発色液セット（三洋化成工業株式会社製）の２０重量％及びイオン交換水の８０重量％で含有する混合液を、５０μＬ／穴で投入し、３７℃で１時間反応した。反応後、３８０ｎｍの波長で吸光度測定した。
（４）標準プレート（Ｈ１）で得られた吸光度を用いて検量線を作成し、その検量線から、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の付着量を得た。
以下、同様にして細胞接着性ポリペプチドの付着量を各々測定した。
【００８３】
＜実施例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約６，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２）を得た。
【００８４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ２）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ２）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ２）を作製した（Ｐ２付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００８５】
＜実施例３＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の４個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ３）を得た。
【００８６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ３）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ３）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ３）を作製した（Ｐ３付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００８７】
＜実施例４＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１０４）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ５）を得た。
【００８８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ４）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ５）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ４）を作製した（Ｐ５付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００８９】
＜実施例５＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の３個と［Gly Ala Pro（Gly Pro Pro）4］2配列（１３）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ８）を得た。
【００９０】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ５）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ８）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ５）を作製した（Ｐ８付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００９１】
＜実施例６＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１Ｅ）の調製
ガラス試験管中で、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールの０．２ｇをジメチルスルフォキシドの５ｍＬで溶解したものに、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の１０ｍｇを投入し、振とう恒温槽にて３７℃、９０回／分の振とうで１時間反応した。１時間後、エチレンジアミンの０．１ｇを加え、３７℃、９０回／分の振とうで２４時間反応した。次に反応液を透析チューブ内に移し、２Ｌの蒸留水で２時間の透析を５回行った。透析後、凍結乾燥（１０Ｐａの減圧、−２０℃、４８時間）して、エチレンジアミンで修飾した細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１Ｅ）を得た（Ｍｎ約４，０００）。
【００９２】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ６）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１Ｅ）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ６）を作製した（Ｐ１Ｅ付着量：約０．５μｇ／ｃｍ2）。
【００９３】
＜実施例７＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８５）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の２個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約４，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８５）を得た。
【００９４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ７）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８５）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ７）を作製した（Ｐ１８５付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００９５】
＜実施例８＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８６）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の３個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約６，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８６）を得た。
【００９６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ８）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８６）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ８）を作製した（Ｐ１８６付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００９７】
＜実施例９＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８７）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の４個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（２１）（ｙ１）の４個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８７）を得た。
【００９８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ９）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８７）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ９）を作製した（Ｐ１８７付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【００９９】
＜実施例１０＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８９）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の３個と（Gly Val Pro Gly Val）2（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）3配列（１０４）（ｙ２）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約９，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８９）を得た。
【０１００】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１０）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８９）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１０）を作製した（Ｐ１８９付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【０１０１】
＜実施例１１＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１９２）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の３個と［Gly Ala Pro（Gly Pro Pro）4］2配列（１３）（ｙ３）の３個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１，０００のポリペプチドを遺伝子組み換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性ポリペプチドを得た。さらに、このポリペプチドをオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）することにより、細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１９２）を得た。
【０１０２】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１１）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１９２）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１１）を作製した（Ｐ１９２付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【０１０３】
＜実施例１２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１８５Ｅ）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８５）を使用する以外は、実施例６の細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１Ｅ）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド［Ｐ１８５Ｅ］を作製した（Ｍｎ約４，０００）。
【０１０４】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１２）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｐ１８５Ｅ）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１２）を作製した（Ｐ１８５Ｅ付着量：約０．５μｇ／ｃｍ2）。
【０１０５】
＜比較例１＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｈ１）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列（ｘ１）の約１２個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）12配列（１２）の約１２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８０，０００のポリペプチド（Ｐ３４６）を細胞接着性ポリペプチド（Ｈ１）とした。
【０１０６】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＨＢ１）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｈ１）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＨＢ１）を作製した（Ｈ１付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【０１０７】
＜比較例２＞
（１）細胞接着性ポリペプチド（Ｈ２）の調製
特許第３３３８４４１号公報中の実施例に記載の方法に準じて、Ile Lys Val Ala Val配列（７）（ｘ９）の約１２個と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）12配列（１２）の約１２個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約８０，０００のポリペプチド（Ｐ３４７）を細胞接着性ポリペプチド（Ｈ２）とした。
【０１０８】
（２）細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＨＢ２）の調製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）の代わりに（Ｈ２）を使用する以外は、実施例１の細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）の調製と同様にして、細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＨＢ２）を作製した（Ｈ２付着量：約１μｇ／ｃｍ2）。
【０１０９】
＜比較例３＞
９６穴のポリスチレンプレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）をそのまま使用して、基材（Ｂ１）とした。
【０１１０】
＜評価１：細胞接着性ポリペプチドの免疫原性＞
（１）細胞接着性ポリペプチドの抗血清作製
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ１）を０．５重量％で含有させたコンプリートフロイントアジュバンド（ディフコ社製）の０．２ｇを、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）３匹それぞれの腹腔内に注入した。その後１ヶ月間隔で３回同様に注入した（合計４回注入）。最初の注入から５ヶ月後にマウスの尾静脈から血液をマウス１匹当たり約０．１ｍＬ分採取した。３匹の血液を混合して約０．３ｍＬにした後、冷蔵庫（６±４℃）中で一晩放置して、約０．１ｍＬの抗血清（ＰＡ１）を得た。
細胞接着性ポリペプチド（Ｐ２）、（Ｐ３）、（Ｐ５）、（Ｐ８）、（Ｐ１Ｅ）、（Ｐ１８５）、（Ｐ１８６）、（Ｐ１８７）、（Ｐ１８９）、（Ｐ１９２）、（Ｐ１８５Ｅ）、（Ｈ１）及び（Ｈ２）についても同様に操作し、抗血清（ＰＡ２）〜（ＰＡ１２）、（ＨＡ１）及び（ＨＡ２）を得た。
【０１１１】
（２）抗血清の評価
細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）に、牛血清アルブミンを１重量％で含有するＰＢＳを５０μＬ／穴で投入し、室温（２５℃）で２時間静置した。その後、アスピレーターを用いて溶液を除去した。
抗血清（ＰＡ１）を０．２重量％、牛血清アルブミンを１重量％及びＴｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを、５０μＬ／穴で投入し、３７℃で１時間反応した。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを１００μＬ／穴で投入し、３回洗浄して溶液を除去した。
次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を０．０５重量％、牛血清アルブミンを１重量％及びＴｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを、５０μＬ／穴で投入し、３７℃で１時間反応した。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．２重量％で含有するＰＢＳを１００μＬ／穴で投入し、３回洗浄して溶液を除去した。
最後に、ＯＬＹＤＡＳ専用発色液セット（三洋化成工業株式会社製）の２０重量％及びイオン交換水の８０重量％で含有する混合液を、５０μＬ／穴で投入し、３７℃で１時間反応した。反応後、３８０ｎｍの波長で吸光度測定し、この値を免疫原性とした。免疫原性は、当該吸光度の高さに比例する。
細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ２）〜（ＰＢ１２）、（ＨＢ１）及び（ＨＢ２）を用いて、抗血清（ＰＡ２）〜（ＰＡ１２）、（ＨＡ１）及び（ＨＡ２）についても同様に評価し、免疫原性を各々求めた。これらの結果を表１に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。
【０１１２】
【表１】
2005170810.tif 000002
【０１１３】
表１の結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、比較例の細胞接着性ポリペプチドに比べて、免疫原性が極めて低いことが判る。
【０１１４】
＜評価２：ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル腎由来細胞）の細胞接着性＞
細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ１）〜（ＰＢ６）、（ＨＢ１）及び細胞接着性ポリペプチドが付着されていない基材（Ｂ１）の各々について、以下の手順で測定した。
各基材に、牛血清アルブミンを１重量％で含有するＰＢＳを５０μＬ／穴で投入し、室温（２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、ＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＶＥＲＯ細胞を２万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着性とした。細胞接着性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表２に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。なお、テトラカラーワンのテトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより還元されて、ホルマザンを生成することにより発色する。
【０１１５】
【表２】
2005170810.tif 000003
【０１１６】
＜評価３：ＨＴ１０８０細胞（線維肉腫由来細胞）の細胞接着性＞
細胞接着性ポリペプチド含有基材（ＰＢ７）〜（ＰＢ１２）、（ＨＢ２）及び細胞接着性ポリペプチドが付着されていない基材（Ｂ１）の各々について、以下の手順で測定した。
各基材に、牛血清アルブミンを１重量％で含有するＰＢＳを５０μＬ／穴で投入し、室温（２５℃）で２時間放置した。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、生理食塩水１００μＬ／穴で２回洗浄しさらに脱イオン水１００μＬ／穴で洗浄した。次に、ＤＭＥＭ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を１００μＬ／穴で添加し、３７℃インキュベーター内に１時間保存した。１時間後、ＨＴ１０８０細胞を２万ｃｅｌｌｓ／穴で添加し、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中にて１時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら１００μＬ／穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にＰＢＳを５０μＬ／穴で添加し、さらにテトラカラーワン（生化学工業株式会社）を１０μＬ／穴で添加して、３７℃、ＣＯ2濃度５容量％のインキュベーター中に４時間放置した。
４時間後に、ホルマザン生成量を、４５０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）の吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＰ−３２）を用いて測定し、この値を細胞接着性とした。細胞接着性は、当該吸光度の高さに比例する。これらの結果を表３に示す（これらの結果は各々８穴分の平均データである。）。なお、テトラカラーワンのテトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより還元されて、ホルマザンを生成することにより発色する。
【０１１７】
【表３】
2005170810.tif 000004
【０１１８】
表２及び表３の結果から、本発明の細胞接着性ポリペプチドは、細胞接着性ポリペプチドを使用しない場合（比較例３）に比べて細胞接着性が極めて高く、また従来の人工の細胞接着性ポリペプチド（比較例１及び比較例２）と比べて細胞接着性が同等以上であることが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明の細胞接着性ポリペプチド、細胞接着性ポリペプチド含有基材及び細胞接着性ポリペプチド含有基材を用いて細胞培養する工程を含む製造方法は、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に好適である。
研究開発用としては、動物実験（毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等）の代替、遺伝子導入、目的物質（細胞、生理活性物質、遺伝子、有害化学物質及び薬効成分等）のスクリーニング及び細胞の精製や機能解析等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産に利用できる。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の治療に利用できる。
【配列表】
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