(57)【要約】【課題】  地元特産の果実と有色米を発酵させることにより香りの豊かな地元産の酒類の製造が望まれている。【解決手段】  サクランボに付着している天然酵母を分離して酵母サッカロミセスセレビッシェに属する酵母株を電気泳動によって分離選択し、これと有色米を原料として清酒などの酒類を製造する。サクランボの香りが残り、地元特有の酒が得られる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
果実表面に生息する天然酵母を取得して清酒などの酒類を製造する方法。
【請求項２】
請求項１に関して紫黒米などの有色米を原料として清酒などの酒類を製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の天然酵母に関して、電気泳動によりサッカロミセスセレピッシェを選択的に取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、果実表面に付着生息している天然酵母と有色米を原料とした清酒などの酒類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  天然酵母の分離に関しては、直接平板分離法や集積培養法などが知られているが、いずれの方法も希少な酵母であるサッカロミセスセレビッシェの存在を確認した上で分離することは不可能であった。また有色米を原料とした酒類の製造については、無精米の有色米を使用することや、有色米から色素を抽出することは知られているが、清酒を代表する酒類の製造方法には関係がない。
【特許文献１】  特開２００２−１１９２７４号公報
【特許文献２】  特開２００３−１１６５２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  上記のような従来の分離法ではサッカロミセスセレビッシェ酵母を効果的に分離することは容易ではない。また日本醸造協会で頒布する酵母およびその酵母の変位株を用いて清酒などの酒類を製造しても、有色米の特徴を十分に出した製品にはならない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  発明者は、この点に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものであって、果実の表面に生息する天然酵母を特殊な電気泳動によって効果的に又選択的に分離取得し、これと有色米によって清酒などの酒類を製造するものである。実施例においては山形県特産のサクランボから分離した酵母で酒類を製造するため、有色米にあってもサクランボの色がイメージできるような赤紫色の酒となる紫黒米を使用しているが、最初に培地に浸漬する果実が、山形県特産のラフランスであったらラフランスの色がイメージできるような緑色の酒となる緑米を使用することによって、山形県特有の酒を製造することが可能となる。
【発明の効果】
【０００５】  地域特産の果実表面に生息する天然酵母を取得することで、特産果実のイメージを醸出し、有色米の色合いの特長に、天然酵母に由来する香味の特長を合わせることで、従来にない酒類を製造する。
【実施例１】
【０００６】（１）酵母菌の培養について
酵母菌の生育に必要な栄養分を含む、無菌状態の培地に酵母菌の付着していると思われる果実を浸漬する。浸漬した果実を取り除き、培地を３０℃で静置する。思わくどおり酵母菌が存在した場合には培地が酵母菌体で濁り炭酸ガスが発生する。この培養液を顕微鏡で観察すれば菌の存在は確認できるが、酒類の製造に適した酵母菌であるサッカロミセスセレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）とは明確に判別できない。また今回の実施例では果実としてサクランボを採用したが、野外に実っている果実であれば酵母菌が付着していると思われるので、果実の種類は本発明の本質ではなく、ラフランスでもリンゴでもスモモでも全く同じである。【０００７】（２）ＤＮＡの分離について
（１）で得られた培養液に酒類の製造に適した酵母菌サッカロミセスセレビッシェが存在するか判別するために電気泳動によるＤＮＡの分離を行う。培養液の一部からＤＮＡを抽出し電気泳動に供する。通常の電気泳動ではＤＮＡを分子量により分離するが、今回対象としたｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下ＳＳＵｒＤＮＡ）は分子量がほぼ同じなので、サッカロミセスセレビッシェのＤＮＡを明確に判別できない。そこでＳＳＵｒＤＮＡに書き込まれた遺伝子情報のわずかな差異でも判別できる温度勾配電気泳動（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔＧｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によりＤＮＡを分離した。このとき同時に既知サッカロミセスセレビッシェのＤＮＡを電気泳動に供して、同じ位置にＤＮＡが分離すれば、その培養液にはサッカロミセスセレビッシェが存在すると判別できる。電気泳動によりサッカロミセスセレビッシェの存在を確認する点が本発明の本質の一つであり、この工程がないと次の工程の（３）の酵母の分離が効率よく達成できない。【０００８】（３）酵母菌の分離について
（１）で得られた培養液の中で、（２）でサッカロミセスセレビッシェの存在が確認された培養液から酵母菌の分離を行う。培養液を適宜１０００〜１００００倍に希釈して固形化した培地に塗布する。希釈が適宜だと固形培地上に１個の菌に由来するコロニーが形成される。そのコロニーを１個づつ新しい培地に植え付けて分離とする。（２）の工程を経ているので分離した酵母菌はほぼ間違いなくサッカロミセスセレビッシェとなる。分離した酵母について再度（２）の工程を実施するか、またはＤＮＡシークエンスという手法により直接ＳＳＵｒＤＮＡに書き込まれた遺伝子情報を読み取り、サッカロミセスセレビッシェであることを確認することができる。【０００９】（４）有色米について
今回の実施例ではサクランボから分離した酵母で酒類を製造するため、サクランボの色がイメージできるよう赤紫色の酒となる紫黒米を使用したが、有色米の酒類もなんら限定されるものではない。例えば、最初に培地に浸漬する果実がラフランスだったら、ラフランスの色がイメージできるよう緑色の酒となる緑米を使用すれば良いのである。
【実施例２】
【００１０】実験方法
（１）使用菌株
実施例１においてサクランボから分離したサッカロミセスセレビッシェと推定される酵母Ｓ１株およびＳ４株を使用した。対照として日本醸造協会清酒酵母７号（Ｋ７）を使用した。
（２）ＳＳＵｒＤＮＡ情報解析
単離した酵母Ｓ１株およびＳ４株のトータルＤＮＡからＰＣＲにより約５００ｂｐのＳＳＵｒＤＮＡ断片を増幅し、サイクルシークエンシング法により塩基配列を読みとった。使用したプライマーを表１に、ＰＣＲ条件は、表２に示す。
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ＤＮＡシークエンサーはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。得られた塩基配列情報をインターネット上にある遺伝子情報データベース  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＩに送信してホモロジー検索を行った。【００１１】（３）小仕込み試験
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総米１５００ｇで１５℃１２日間の発酵とした。仕込配合は表３のとおりとした
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白米による仕込みは、麹米と掛米ともに出羽燦々（精米歩合５０％）を使用した。有色米には紫黒米品種である朝紫を使用した。有色米による仕込みは、麹米に出羽燦々（精米歩合５０％）を使用し、掛米に朝紫（精米歩合９９％）を使用した。発酵期間中は経時的に炭酸ガス減量を測定して発酵経過の指標とした。【００１２】（４）一般成分分析
アルコール度はアルコメイトＡＬ−２（理研計器）により測定し、他の一般成分分析は国税庁所定分析法注解に従った。【００１３】（５）吸光度測定
分光光度計は使用した。清酒に特有の黄色の度合いを示す着色度は、国税庁所定分析法注解に従い、光路長１０ｍｍセルで４３０ｎｍの吸光度を測定した。同様にして紫黒米品種に特有の色素成分であるアントシアニンの指標として５２０ｎｍの吸光度を測定した。【００１４】実験結果
（１）ＳＳＵｒＤＮＡ情報解析
ＳＳＵｒＤＮＡ情報を解析した結果、サクランボ果実から分離した酵母Ｓ１株とＳ４株は、標準サッカロミセスセレビッシェとほぼ一致したため、同一種と断定した。この結果は、実施例１の３．３分離と分類および３．４ＳＳＵｒＤＮＡ情報解析の結果を追認するものであった。【００１５】（２）発酵経過と一般成分
発酵期間中の炭酸ガス減量を図１に、一般成分の分析結果を表４に示す。
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白米の場合、Ｓ１株とＳ４株ともにＫ７に比べて発酵経過が遅れたが（図１▲１▼）、生成酒のアルコール度はＳ１株がＫ７と同じ１２％台となった。有色米の場合、Ｋ７に比べてＳ１株は発酵経過が進み、Ｓ４株は同等であった（図１▲２▼）。有色米の生成酒のアルコール度は、Ｋ７とＳ１株が１５％台で、Ｓ４株は１３％台であった。この結果から、サクランボから分離した酵母Ｓ１株とＳ４株は白米でも十分な発酵力があるが、特に有色米を使用した場合にＫ７と同等以上の発酵力を示すことがわかった。またＳ４株は、白米でも有色米でも、酸度が高い一方でアミノ酸度が低い特徴を示した。このことからＳ４株は酸味があり淡麗な酒質を醸し出すと予想される。【００１６】（３）吸光度
白米の場合には吸光度に大きな差は見られない。しかし有色米の場合、特にＳ４株はＫ７に比較して５２０ｎｍ／４３０ｎｍ比が大きい値を示す。このことは、生成酒が黄色みが薄く赤紫色が際だつことになり、紫黒米の色の特長を強く出すものであった。
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【００１７】（４）香気成分組成と有機酸組成
香気成分分析の結果を図２に示す。白米の場合、Ｓ１株はＫ７と比較して酢酸イソブチル／イソブチルアルコール比が極めて高く特徴的な香気成分組成を示した。一方Ｓ４株は酢酸イソブチル／イソブチルアルコール比は高いが、酢酸イソアミルアルコール比も高いという特徴を示した。実施例１とやや異なる香気成分組成となったのは、原料米の性状と精米歩合によると考えられる。有色米の場合、Ｓ１株は白米使用時の特徴的な香気成分組成を示せなかった。一方Ｓ４株は、有色米使用時も白米使用時と同様に、酢酸イソブチル／イソブチルアルコール比と酢酸イソアミル／イソアミルアルコール比が高いという特徴を示した。
有機酸組成を図３に示す。白米の場合、実施例１と同様にＫ７と比較してＳ１とＳ４株はコハク酸が少なく乳酸が多い傾向であり、リンゴ酸はやや少なかった。一方、有色米の場合、Ｓ１株はコハク酸がやや多く乳酸が突出して多い結果となった。それに対してＳ４株は、白米の場合と同様にコハク酸が少なく乳酸が適度に多く、クエン酸やリンゴ酸はＫ７とほぼ同じ濃度であった。クエン酸やリンゴ酸は爽やかな酸味を有するため、Ｓ４株は適度な特徴を出しつつ爽やかな酸味を有すると思われた。【００１８】（５）官能評価
官能評価の結果は、白米の場合、Ｓ１株とＳ４株はＫ７に比較して遜色のない評価であった。一方、有色米の場合はＫ７よりもＳ１株とＳ４株の評価が高く、特にＳ４株が最も良い評価を得た。（表６）
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これらのことからサクランボの果実から分離した一連の酵母は、有色米を原料とした酒類の製造に非常に適していると判断できる。
【実施例３】
【００１９】（実験方法）
（１）使用菌株
有色米を原料とした清酒製造には、実施例２において高い評価を得た酵母Ｓ４株を使用した。対照として、白米を原料とした通常の清酒製造には、山形県で吟醸酒製造用に頒布する清酒酵母ＫＡ株を使用した。【００２０】  （２）仕込み
仕込配合は表１のとおりとした。
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有色米による仕込みは、麹米に出羽燦々（精米歩合５０％）を使用し、掛米に朝紫（精米歩合９９％）を使用した。白米による仕込みは、麹米と掛米ともに山形８６号（精米歩合５０％）を使用し、製麹は、麹室で蓋麹法により行った。酒母および醪の仕込みには、サーマルタンク（新洋技研工業製）を使用した。原料用アルコールは添加せず、製法品質上の純米酒とした。【００２１】（３）一般成分分析および吸光度測定
一般成分分析は国税庁所定分析法注解に従った。吸光度測定は実施例２のとおりとした。【００２２】（４）香気成分および有機酸分析
香気成分はヘッドスペースガスクロマトグラフィー（島津製作所製ＧＣ−１５Ａ）により分析し、有機酸は高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−９Ａ）により分析した。【００２３】（実験結果）
（１）発酵経過と一般成分
有色米による醪経過は、添１２．０℃、踊１６．７℃、仲１３．０℃、留８．０℃、最高品温１３．５℃となり、８日目に上槽した。白米による醪経過は、添１３．８℃、踊１５．０℃、仲１３．０℃、留１０．３℃、最高品温１２．０℃となり、２６日目に上槽した。一般成分の分析結果を表２に示す。
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有色米の清酒は、サクランボをイメージするため、アルコール度は低くして日本酒度を甘くした。また、有色米の清酒は酸度が高い特徴があるが、一方で精米歩合が高いためアミノ酸度も高くなった。しかし実施例２と同程度に、酸度が高いわりにアミノ酸度が低い特徴を示した。紫黒米品種に特有のアントシアニン色素の指標である５２０ｎｍの吸光度などを表３に示す。
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実施例２に比べるとやや低い値となったが、目視では十分な赤紫色を呈していた。以上より、白米による通常の清酒と比較して、Ｓ４酵母と有色米を原料とした清酒は概ね目的とした酒質に到達することができた。【００２４】（２）香気成分組成と有機酸組成
香気成分分析の結果を図１に示す。実施例１と同じく、酵母Ｓ４を用いた有色米の清酒は、酢酸イソアミル／イソアミルアルコール比（ｉＡｍｙｌ／Ａｃｅｔ  Ｒａｔｉｏ）は低いが、酢酸イソブチル／イソブチルアルコール比（ｉＢｕｔｙｌ／Ａｃｅｔ  Ｒａｔｉｏ）は高いという特徴を示した。このように小仕込みだけでなくパイロットスケールでも酵母Ｓ４の特徴的な香気成分組成を示すことを確認した。また有機酸組成も、爽やかな酸味を有するクエン酸やリンゴ酸が多いなど好ましい特徴を示した。
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【００２５】（３）官能評価
官能評価の数値は、製法品質上の純米大吟醸酒である通常の白米による清酒に及ばなかったが、今後の商品化を目標として十分な評価が得られた。
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【発明の利用可能性】
【００２６】  本発明は、上述のように、本発明によって得られる清酒は、芳香、飲み口等わずかにサクランボの香が漂い、淡い色までも残り、サクランボ王国山形に合致した特徴のある清酒であるため、県内外を問わず特産展や道の駅等で宣伝販売が可能であり、その利用度は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】  発酵期間中の炭酸ガス減量図
【図２】  香気成分の分析図
【図３】  有機酸の組成図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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