(57)【要約】【課題】ＤＮＡ試料を安定かつ強力に吸着固定し、種々の反応、洗浄、振蕩等の繰返し操作に対しても、ＤＮＡ試料を保持しつづけることができるアビジン修飾ガラス基板を提供する。【解決手段】ガラス表面にアビジンを好ましくはリンカーを介して結合させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス表面にアビジンが結合していることを特徴とするアビジン修飾ガラス基板。
【請求項２】
前記アビジンはリンカーを介して前記ガラス表面に結合している請求項１記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項３】
前記リンカーが二官能性架橋剤残基を含む請求項２記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項４】
前記リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる請求項３記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項５】
前記二官能性架橋剤が、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド（ＫＭＵＳ）及びＮ−（（４−（２−マレイミドエトキシ）スクシニル）オキシ）スクシンイミド（ＭＥＳＳ）からなる群から選ばれるへテロ官能性架橋剤である請求項４記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項６】
前記二官能性架橋剤が、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＨＭＣＳ）からなる群から選ばれる水溶性二官能性架橋剤である請求項４記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項７】
前記リンカーがビオチンラベル化剤残基を含む請求項２記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項８】
前記リンカーがアミノ基とアミノ基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる請求項７記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項９】
前記アミノ基標識用ビオチンラベル化剤が、Ｎ−スクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル  Ｄ−ビオチナミド、５−（５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルアミド））ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド、スルホスクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、スルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノアート、及びスルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｎ’−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノイル）−６’−アミノヘキサノアートからなる群から選ばれるものである請求項８記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項１０】
前記リンカーがチオ基とチオール基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる請求項７記載のアビジン修飾ガラス基板。
【請求項１１】
前記チオール基標識用ビオチンラベル化剤が、Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩又は６−（Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニルアミド）ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩である請求項１０記載のアビジン修飾ガラス基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ検査やＤＮＡ損傷の検出に際してＤＮＡ試料を安定にかつ強力に吸着固定するための、表面にアビジンが結合しているアビジン修飾ガラス基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡは生物の遺伝情報を担う重要な生体物質であり、採取細胞や組織切片とともに、研究、臨床、法医学等を含む現場では絶えず検査の対象となる被験物質である。かかる化学物質であるＤＮＡ試料を検査するに際して、スライドガラス基板に試料を載せて各種試験法に付すことが通常行われている。それぞれの試験手法に応じて、種々の反応、洗浄、振蕩等の操作が複数回繰り返されることが多く、その場合採取したＤＮＡ試料が操作の過程で脱離除去されてしまうことが多い。
【０００３】
例えば、ＤＮＡは、紫外線、外界からの化学物質、体内の代謝産物、活性酸素等の様々な外的・内的要因により損傷を受けることがある。このようなＤＮＡ損傷、特にヌクレオチドのＮ−グリコシド結合の加水分解による塩基欠損部位（脱プリン／脱ピリミジン部位、ＡＰサイト）の形成などは、細胞によるその修復機能の如何により、細胞死や突然変異、ひいては発ガンの遠因ともなる。かかる塩基欠損部位を高感度に検出するためにも、ＤＮＡ試料を安定かつ強力に吸着固定するためのガラス基板が望まれている。
【０００４】
従来、ガラスの表面をポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン又はキトサン若しくはポリアリルアミンで被覆したコーティングスライドガラス（特許文献１）は知られていたが、これらは専ら細胞や組織切片を吸着させるためのものであり、ＤＮＡの安定な吸着には適していなかった。また、紫外線照射したポリスチレン、硫酸プロタミン被覆したマイクロプレート、ニトロセルロースメンブランも知られているが、ＤＮＡの安定な吸着という観点からは満足のいくものではなかった。
【０００５】
また、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラスでは、付着させたＤＮＡ試料の一部が洗浄中に剥離したり、特に蛍光色素含有リポソームを用いるアッセイ法においては、基板にリポソームが非特異的に吸着するなどして、正確なアッセイ評価が困難になることがあった。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−０１４９０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＤＮＡ試料を安定かつ強力に吸着固定し、種々の反応、洗浄、振蕩等の繰返し操作に対しても、ＤＮＡ試料を保持しつづけることができるガラス基板を提供することを目的とする。本発明の他の目的は以下の記載及び図面の内容から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ガラス表面にアビジンを結合させると、驚くべきことにＤＮＡ試料を安定かつ強力に吸着固定することができることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の通りである。
１．  ガラス表面にアビジンが結合していることを特徴とするアビジン修飾ガラス基板。
２．  前記アビジンはリンカーを介して前記ガラス表面に結合している上記１記載のアビジン修飾ガラス基板。
３．  前記リンカーが二官能性架橋剤残基を含む上記２記載のアビジン修飾ガラス基板。
４．  前記リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる上記３記載のアビジン修飾ガラス基板。
５．  前記二官能性架橋剤が、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド（ＫＭＵＳ）及びＮ−（（４−（２−マレイミドエトキシ）スクシニル）オキシ）スクシンイミド（ＭＥＳＳ）からなる群から選ばれるへテロ官能性架橋剤である上記４記載のアビジン修飾ガラス基板。
６．  前記二官能性架橋剤が、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＨＭＣＳ）からなる群から選ばれる水溶性二官能性架橋剤である上記４記載のアビジン修飾ガラス基板。
７．  前記リンカーがビオチンラベル化剤残基を含む上記２記載のアビジン修飾ガラス基板。
８．  前記リンカーがアミノ基とアミノ基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる上記７記載のアビジン修飾ガラス基板。
９．  前記アミノ基標識用ビオチンラベル化剤が、Ｎ−スクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル  Ｄ−ビオチナミド、５−（５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルアミド））ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド、スルホスクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、スルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノアート、及びスルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｎ’−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノイル）−６’−アミノヘキサノアートからなる群から選ばれるものである上記８記載のアビジン修飾ガラス基板。
１０．  前記リンカーがチオ基とチオール基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる上記７記載のアビジン修飾ガラス基板。
１１．  前記チオール基標識用ビオチンラベル化剤が、Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩又は６−（Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニルアミド）ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩である上記１０記載のアビジン修飾ガラス基板。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のアビジン修飾ガラス基板は、ＤＮＡ試料を安定かつ強力に吸着固定し、蛍光色素含有リポソームを用いても基板にリポソームを吸着することがないという予期せぬ優れた効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
アビジンは卵白中に見出される分子量約６８０００、等電点１０〜１０．５の糖タンパク質で、４個のサブユニットからなり、１分子当たり４分子のビオチンと特異的に結合することが知られている。
【００１２】
ガラス基板の素材としては特に制限はなく、従来、細胞や組織切片等を吸着させるために用いられているコートスライドグラス用のガラス素材であればいずれも使用することができる。アビジンをガラス表面に結合させるためにリンカーを介する必要性から、ガラス表面に水酸基が存在することが好ましい。
【００１３】
リンカーはガラス基板表面のケイ素（Ｓｉ）原子とアビジンとを仲介する結合基である。かかる結合は共有結合、イオン結合等、ガラス基板とアビジンとを強固に結合させる結合様式であれば特に制限はない。
【００１４】
ガラス基板表面の処理の容易さの観点から、リンカーは二官能性架橋剤残基を含むか、又はビオチンラベル化剤残基を含むことが好ましい。より好ましくは、リンカーは
１）チオ基（−Ｓ−）と二官能性架橋剤残基からなる、
２）アミノ基とビオチンラベル化剤残基からなる、又は
３）チオ基とビオチンラベル化剤残基からなる
ことが好ましい。
【００１５】
二官能性架橋剤は、ガラス基板にアビジンを結合させるリンカーを形成するための試薬である。ガラス基板にチオ基（チオール基）が結合している場合は、二官能性架橋剤は、その分子両端にマレイミド基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルとを有することが好ましい。この場合、ガラス基板表面のチオ基とは一方の分子末端のマレイミド基が選択的に反応してリンカーを形成する。このリンカーの他方の分子末端におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが、タンパク質であるアビジンのＮ−末端のアミノ基と反応する。
【００１６】
二官能性架橋剤としては、へテロ官能性架橋剤であるか又は水溶性二官能性架橋剤が挙げられる。
【００１７】
リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる場合、へテロ官能性架橋剤としては、例えば、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド（ＫＭＵＳ）及びＮ−（（４−（２−マレイミドエトキシ）スクシニル）オキシ）スクシンイミド（ＭＥＳＳ）が挙げられる。
【００１８】
リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる場合、水溶性二官能性架橋剤としては、例えば、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミド  ナトリウム塩（スルホ−ＨＭＣＳ）が挙げられる。
【００１９】
リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる場合、ガラス基板表面を、例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＴＳ）で処理することにより、ポリシロキサン構造中のケイ素に結合していた水酸基をメルカプト基（チオール基）で置き換え、次いでこれに上記二官能性架橋剤を反応させて、結合したオキシカルボニルスクシンイミジル残基の反応性を利用して、アビジンを共有結合させる。その結果、チオ基と二官能性架橋剤残基からなるリンカーを介してアビジンがガラス基板表面に結合したアビジン修飾ガラス基板が作成される。
【００２０】
以上、例示の目的で、リンカーがチオ基と二官能性架橋剤残基からなる場合に限って本発明を説明してきたが、アビジンをガラス表面に結合させることができるのであれば、二官能性架橋剤残基を含むリンカーは上記のものに限られない。
【００２１】
ビオチンラベル化剤はアミノ基やチオ基のようなリンカーの一部を介してガラス基板にビオチン標識を行うための試薬である。ビオチンラベル化剤は、アビジン−ビオチン間の特異的且つ強力な複合体形成反応を利用して、ガラス表面にアビジンを結合させるために用いられる。
【００２２】
ビオチンラベル化剤を用いる場合、リンカーがアミノ基を含む時は、アミノ基と結合する活性エステル型のアミノ基標識用ビオチンラベル化剤を用いることが好ましい。また、リンカーがチオ基を含む時は、チオール基と結合するマレイミド型のチオール基標識用ビオチンラベル化剤を用いることが好ましい。どのビオチンラベル化剤を用いるかは目的に合わせて適宜選択することができる。
【００２３】
リンカーがアミノ基とアミノ基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる場合、アミノ基標識用ビオチンラベル化剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル  Ｄ−ビオチナミド、５−（５−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルアミド））ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド、スルホスクシンイミジル  Ｄ−ビオチン、スルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノアート、及びスルホスクシンイミジル  Ｎ−（Ｎ’−（Ｄ−ビオチニル）−６−アミノヘキサノイル）−６’−アミノヘキサノアートが挙げられる。
【００２４】
リンカーがアミノ基とアミノ基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる場合、ガラス基板表面を、例えば、アミノシランで処理することにより、ポリシロキサン構造中のケイ素に結合していた水酸基をアミノ基に置き換え、次いでこれに上記のようなアミノ基標識用ビオチンラベル化剤を反応させて、結合したビオチン残基との特異性を利用して、アビジンを結合させる。その結果、アミノ基とビオチンラベル化剤残基からなるリンカーを介してアビジンがガラス基板表面に結合したアビジン修飾ガラス基板が作成される。
【００２５】
リンカーがチオ基とチオール基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる場合、チオール基標識用ビオチンラベル化剤としては、例えば、Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩又は６−（Ｎ’−（２−（Ｎ−マレイミド）エチル）−Ｎ−ピペラジニルアミド）ヘキシル  Ｄ−ビオチナミド塩酸塩が挙げられる。
【００２６】
リンカーがチオ基とチオール基標識用ビオチンラベル化剤残基からなる場合、ガラス基板表面を、例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＴＳ）で処理することにより、ポリシロキサン構造中のケイ素に結合していた水酸基をメルカプト基（チオール基）に置き換え、次いでこれに上記のようなチオール基標識用ビオチンラベル化剤を反応させて、結合したビオチン残基との特異性を利用して、アビジンを結合させる。その結果、チオ基とビオチンラベル化剤残基からなるリンカーを介してアビジンがガラス基板表面に結合したアビジン修飾ガラス基板が作成される。
【００２７】
以上、例示の目的で、リンカーが二官能性架橋剤残基を含むか、又はビオンラベル化剤残基を含む場合に限って本発明を説明してきたが、アビジンをガラス表面に結合させることができるのであれば、リンカーは上記のものに限られない。
【００２８】
アビジン修飾ガラス基板の作成、DNAの固定化及びDNA損傷（APサイト）の蛍光測定のための実験操作は以下の通りである。
（１）アビジン修飾ガラス基板の作成法
カバーガラス（18ｘ24 mm）を１M NaOH中に１昼夜（少なくとも３時間以上）浸漬する。Milli-Q水で十分洗浄後、70℃で約2時間乾燥する。ただちに、カバーガラスの片面に50(v/v)％3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（MTS）の無水トルエン溶液を100μl載せて、１時間室温で放置する。無水トルエンで洗浄後、２mＭ N-スクシンイミジル4-マレイミドブチレート（GMBS）のジメチルスルホキシド（DMSO）溶液８０μlを載せ、室温で1時間放置する。Milli-Q水で十分洗浄後、5 mＭ KH2PO4(pＨ7.4)溶液（リン酸緩衝液と略す）に溶解したアビジン（0.1mg/ml）を200μl載せ、室温で１時間反応させる。その後Milli-Q水で洗浄する。作成後はMilli-Q水に保管し、できるだけ速やかに使用する。
【００２９】
（２）DNAの固定化法
１0 mＭクエン酸ナトリウム（pＨ5.0）を含む0.10 Ｍ NaCl溶液（ＡＰ緩衝液と略す）に溶解した牛胸腺ＤＮＡ（クロロフォルム／フェノール洗浄したもの）を必要に応じてリン酸緩衝溶液で希釈する。このＤＮＡ溶液の100μlをアビジン修飾ガラス基板の中央部に載せ、室温で１５分間インキュベートする。5〜500 ngのDNAを定量的に固定することができる（サイバーグリーン蛍光試薬によるDNA量の測定による（励起波長488、蛍光波長530 nm）。
【００３０】
（３）DNA損傷（APサイト）の蛍光測定
DNA（260 ng）を固定化したアビジン基板に1mg/ｍｌのビオチンを含むリン酸緩衝液100μlを室温で15分間反応させて遊離のアビジンサイトをブロックする。次に0.5 mg/mlアルデヒド反応性試薬（ARP）を含むリン酸緩衝液100μlを加え、３７℃で30分間インキュベートする。これによりDNAの脱塩基部位（APサイト）にARPが結合する。過剰のARPをMilli-Q水で洗浄、除去後、ストレプトアビジン（50μg/ml）を含むリン酸緩衝液と室温で１５分間インキュベートする。DNAに結合したARPのビオチン部位にストレプトアビジンが結合する。リン酸緩衝液で洗浄後、ビオチン化ホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルコリン／コレステロールから調製した1.5mMスルホローダミンＢを含むリポソーム5 mlと15分間反応させる。最後に、リン酸緩衝液で３回洗浄後、蛍光イメージアナライザーで測定する（励起波長514 nm、測定波長590 nm）。本法により数百ngのDNAを用いて10４ヌクレオチド当り１個のAPサイトを検出することができる。
【００３１】
以下に実施例を参照しながら本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は何ら本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００３２】
例１  アビジン修飾基板に対するDNAの吸着と洗浄の影響
上記（１）アビジン修飾ガラス基板の作成法に従って、アビジン修飾基板を作成し、この基板に対するDNAの吸着と洗浄の影響を調べるために、以下の実験を行った。
DNA（非損傷、500ng）を含む5ｍMリン酸緩衝溶液１００μｌを各基板に載せ、室温で１５分間インキュベートした。その後、Milli-Q 水を用い30秒間洗浄した。臭化エチジウム (１μg/ml)と３０分反応させ蛍光測定（励起波長：４８８nm、蛍光波長：610nm）により以下の検討基板に残存しているＤＮＡ量を測定した。結果を図１に示す。
検討基板：
アビジン修飾基板（本実施例で作成したもの）
ポリL-リジン修飾基板（松浪ガラス、市販品）
アミノ基板（松浪ガラス、市販品）
未修飾ガラス基板
アビジン修飾基板にDNAは最も強く吸着した。洗浄によるDNAの脱離は無視できる程度に少なかった。
【００３３】
例２  アビジン修飾基板に対するＤＮＡの吸着量の検討
異なる量（５〜500ng）のＤＮＡ（非損傷及び損傷ＤＮＡ）を含む5ｍMリン酸緩衝溶液（ｐH７．４）の100μｌをアビジン修飾基板に載せた後、室温で15分間インキュベートした。その後、5ｍMリン酸緩衝溶液（ｐH７．４）で洗浄し、Cyber green (０．５μg/ml)と反応させ、蛍光測定（励起波長：514nm、蛍光波長：610nm）により基板に残存しているＤＮＡ量を測定した。結果を図２に示す。
非損傷及び損傷ＤＮＡともに、その量が5ngから５００ngの範囲でアビジン修飾基板に定量的に保持される。
なお、損傷DNAは以下のように調製したものを使用した。０．１０Ｍ  ＮａＣｌを含む１０mＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐH５．０）に溶解した牛胸腺ＤＮＡを70℃の湯浴中で一定時間熱処理して損傷を形成させた。氷中で冷却後、２８０nmの吸光度を測定して濃度を定めた。
【００３４】
例３  アビジン修飾基板に対するビオチン化リポソームの非特異的吸着の抑制
アビジン修飾基板を異なる濃度のビオチン溶液１００μｌと室温で１５分間インキュベートしてアビジンサイトをブロックした後、スルホローダミン（ＳＲＢ）を含むビオチン化リポソーム5mlと反応させた。５mＭリン酸緩衝溶液で3回洗浄した後、蛍光測定（ex:514nm,em:590nm）した。結果を図３に示す。
ビオチン濃度が１０μｇ/ｍｌ以上であれば、スルホローダミン（ＳＲＢ）を含むビオチン化リポソームが下地のアビジンサイトに吸着するのを抑制できる。
【００３５】
例４  ストレプトアビジン濃度の影響
ビオチン化リポソームはストレプトアビジンを介してＡＲＰ（ＤＮＡに結合している）に結合した。必要なストレプトアビジン濃度について検討した。上記（３）DNA損傷（APサイト）の蛍光測定の実験操作において50分損傷ＤＮＡ量を2６0ngとし、ストレプトアビジン濃度を変えて蛍光測定（励起波長:514nm、蛍光波長:590nm）した。結果を図４に示す。
ストレプトアビジン濃度が  ０．１μｇ/ｍｌ以上で一定の蛍光強度を示した。
【００３６】
例５  ＤＮＡ損傷(ＡＰサイト)を検出するのに必要なＡＲＰ濃度の検討
50分間酸/熱処理により損傷をかけたDNA（２６０ng）を含む5ｍMリン酸緩衝溶液（ｐH７．４）  の100μｌをアビジン修飾基板に載せた後、室温で15分間インキュベートした。その後、１００μｌのビオチン溶液(1ｍｇ/ｌ)でアビジンサイトをブロックした。異なる濃度のＡＲＰ溶液100μｌと３７℃で30分間インキュベートした後、MilliーＱ水で1回洗浄し、過剰のＡＲＰを除去した。その後１００μｌのストレプトアビジンを反応させ、さらにビオチン化リポソーム５ｍｌとインキュベートして蛍光測定を行った。ＡＲＰ濃度以外は上記（３）DNA損傷（APサイト）の蛍光測定の実験操作と同じとした。結果を図５に示す。
ＡＲＰ濃度が０．１ｍｇ/ｍｌ以上で一定の蛍光強度を示した。これは、ARP濃度の増加とともにＤＮＡのAPサイトに結合するＡＲＰ量が増加し、１ｍｇ/ｍｌ濃度以上では飽和に達したことを示す。
【００３７】
例６  ＤＮＡ損傷(ＡＰサイト)量と蛍光強度の関係
上記（３）DNA損傷（APサイト）の蛍光測定の損傷測定手順により損傷時間（APサイト量）と蛍光強度の関係を検討した。結果を図６に示す。
牛胸腺DNA量として２６０ngを用いて損傷時間が10分から50分の間で蛍光強度は直線的に増加した。損傷時間1０分で１０４ヌクレオチド当り１個のAPサイトが生成することが知られている。DNA２６０ng中１０４ヌクレオチド当り１〜５個のAPサイトを検出できる。なおアビジンプレートの作成に要する時間は約３時間、APサイトを測定するのに要する時間は約２時間である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のアビジン修飾ガラス基板はＤＮＡ等の核酸分析のためのＤＮＡ結合基板として広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】アビジン修飾基板に対するDNAの吸着と洗浄の影響を示す。
【図２】アビジン修飾基板に対するＤＮＡの吸着量の検討結果を示す。
【図３】アビジン修飾基板に対するビオチン化リポソームの非特異的吸着の抑制を示す。
【図４】ストレプトアビジン濃度の影響を示す。
【図５】ＤＮＡ損傷(ＡＰサイト)を検出するのに必要なＡＲＰ濃度の検討結果を示す。
【図６】ＤＮＡ損傷(ＡＰサイト)量と蛍光強度の関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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