(57)【要約】  【課題】  前立腺癌に対する新しい治療方法を提供する。  【解決手段】  zesteホモログ２のエンハンサー由来の部分ペプチドであり、HLA-A24抗原に結合でき、細胞傷害性Tリンパ球に認識されうる癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体は前立腺癌を処置および予防するのに有用でありうる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
zesteホモログ２のエンハンサー由来の部分ペプチドであり、HLA-A24抗原に結合でき、細胞傷害性Tリンパ球に認識されうる癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項２】
液性免疫系に認識される、請求項１記載の癌抗原ペプチド。
【請求項３】
配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含む請求項１または２記載の癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか記載の癌抗原ペプチドおよび機能的に同等の性質を有するその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項５】
前立腺癌が骨転移を伴う、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から３までのいずれか記載の癌抗原ペプチドおよび機能的に同等の性質を有するその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項７】
転移性骨病変が前立腺癌に付随する、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
HLA-A24抗原と請求項１から３までのいずれか記載の癌抗原ペプチドまたは機能的に同等の性質を有するその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球。
【請求項９】
請求項８記載の細胞傷害性Tリンパ球を活性成分として含む、前立腺癌を処置するための医薬組成物。
【請求項１０】
前立腺癌が骨転移を伴う、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
癌抗原ペプチドの候補物質を調製し、液性免疫系によって認識されうるその被認識能力を測定し、次いでHLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球を誘導するその誘導能を測定する、癌抗原ペプチドを同定するための方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法により得られる癌抗原ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト主要組織適合抗原HLA-A24陽性前立腺癌患者において免疫原性を有するzesteホモログ２のエンハンサー由来抗原ペプチドの同定に関し、詳細には、前立腺癌を処置または予防するための特異的癌抗原、それを含む癌ワクチン、およびそのための治療学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、老齢男性において最も普通の癌の１つである[1]。前立腺癌は骨に転移することが多く、骨転移を有する患者にはアンドロゲン遮断療法が適用されている。しかし、ホルモン不応性の前立腺癌に対する効果的な治療法は存在していない。従って、新たな治療方法の開発は緊急課題であり、その１つの選択肢は特異的免疫療法である。実際、正常前立腺に発現している前立腺組織特異的な抗原は特異的免疫療法の標的分子であり、前立腺組織特異抗原を標的とする特異的免疫療法が実施されている (2)。また、本発明らのグループも、前立腺癌患者から前立腺癌反応性CTLを誘導できる前立腺関連抗原由来エピトープペプチドを複数個同定した(23-26)。しかしながら、前立腺癌患者を治療する際には、骨転移した前立腺癌が主な障害となり(1)、治療効果は依然不十分である(3-7)。
【０００３】
zesteホモログ２のエンハンサー（Enhancer of zeste homolog 2；EZH2）はzesteのショウジョウバエエンハンサーに相同性があるポリコームグループタンパク質であり、遺伝子サイレンシングに関与している(8)。この遺伝子サイレンシング機構が調節不全に陥ると癌になることがある(9-11)。さらに、EZH2は転移性前立腺癌において過剰発現され、転写抑制物質として機能し、そしてEZH2の阻害は前立腺癌細胞の成長をブロックすることが報告されている(12)。
【０００４】
我々は、いろいろなタイプの癌種に対して臨床試験を行い、クラスI分子に結合し、腫瘍反応性細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を誘導することができる抗原ペプチドが免疫グロブリンG（IgG）によっても認識されていることを観察した(13, 14)。さらに臨床試験を行うことで、投与したペプチドに反応するIgGの誘導が、癌患者の生存率と正に相関していることが判明した(15-17)。これら知見は、液性および細胞性免疫系の両方に認識されうる抗原ペプチドが、いずれか一方に認識される抗原ペプチドよりも免疫療法において有用であることが示している。さらに、ペプチド特異的IgGの検定は、ペプチド特異的CTLを誘導するインビトロ感作実験(18)よりもはるかに単純かつ容易である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
転移性前立腺癌に過剰発現する抗原は前立腺癌患者、特に転移を伴う患者に対する抗癌免疫療法における格好の標的である。本発明では、zesteホモログ２のポリコームグループタンパク質エンハンサー（EZH2）由来ペプチド候補物質に焦点を当てている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のように、液性および細胞性免疫系の両方に認識されうる抗原ペプチドは、いずれか一方に認識されるペプチドよりも免疫療法において有用であると考えられる。従って、本発明ではまず、EZH2由来抗原ペプチド候補を、液性免疫系によって認識されるその被認識能によってスクリーニングし、次いでペプチド特異的かつ前立腺癌反応性CTLを誘導するその誘導能を測定した。その結果、本発明では、HLA-A24陽性前立腺癌患者において液性および細胞性免疫系の両方によって効果的に認識される２つのEZH2由来抗原ペプチドを同定した。
【０００７】
11個のEZH2由来ペプチドをHLA-A24結合モチーフに基づいて準備した。これらのペプチド候補物質をまず、免疫グロブリンG（IgG）によって認識されるその被認識能によって、次いでペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を誘導するその誘導能によってスクリーニングした。3つのEZH2ペプチド (EZH2 243-252、EZH2 291-299およびEZH2 735-742)に反応するIgGが、前立腺癌患者のおよそ半数の血漿中に検出された。これらの中で、EZH2 291-299およびEZH2 735-742ペプチドが前立腺癌患者からHLA-A24拘束性かつ前立腺癌反応性CTLを効率的に誘導した。細胞傷害活性は主として、EZH2ペプチド特異的なCD8陽性T細胞に依存していた。これらEZH2 291-299およびEZH2 735-742ペプチドは、転移を伴うHLA-A24陽性前立腺癌患者に対するペプチドに基づく免疫療法における有用なペプチド候補物質となりうる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、EZH2-291 および EZH2-735の両者がHLA-A24陽性前立腺癌患者において前立腺癌反応性のCTLを誘導できることが明らかにされた。より重要なことは、これら２つのEZH2ペプチドにより刺激したPBMCはHLA-A24拘束性に前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示したことである。この細胞傷害活性はペプチド特異的かつCD8陽性T細胞に依存していることが示された。これらの結果は、上記２つのEZH2ペプチドがHLA-A24陽性前立腺癌患者に対する特異的免疫療法に有用である可能性を示している。
本発明では、EZH2-291、EZH2-735またはEZH2-243ペプチドのいずれかに反応するIgGが前立腺癌患者のおよそ半分に検出された。HLA-A24陽性前立腺癌患者からペプチド特異的CTLを誘導するEZH2-243ペプチドの誘導能は上記２つのEZH2ペプチドのそれよりも低い。このことは、EZH2-291 および EZH2-735ペプチドの両者が細胞性および液性免疫系の両者に効率的に認識されていることを意味する。従って、EZH2-291 および EZH2-735ペプチドをHLA-A24陽性前立腺癌患者にワクチン投与すると、前立腺癌反応性のCTLとペプチド特異的なIgGの両者が効率的に誘導され、その結果、臨床応答を導くと考えられる。
【好ましい態様の説明】
【０００９】
即ち、本発明は、  
（１）zesteホモログ２のエンハンサー由来の部分ペプチドであり、HLA-A24抗原に結合でき、細胞傷害性Tリンパ球に認識されうる癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体；好ましくは液性免疫系にさらに認識される癌抗原ペプチド；具体的には、配列番号１または２に示すアミノ酸配列を含む癌抗原ペプチド、または機能的に同等の性質を有するその誘導体；
（２）上記（１）記載の癌抗原ペプチドおよびその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物、好ましくは前立腺癌が骨転移を伴う医薬組成物；
（３）上記（１）記載の癌抗原ペプチドおよびその誘導体を少なくとも１つ活性成分として含む、転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物；好ましくは転移性骨病変が前立腺癌に付随する医薬組成物；
（４）HLA-A24抗原と上記（１）記載の癌抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球；  
（５）上記（４）記載の細胞傷害性Tリンパ球を活性成分として含む、前立腺癌を処置するための医薬組成物；好ましくは前立腺癌が骨転移を伴う医薬組成物；および
（６）  癌抗原ペプチドの候補物質を調製し、液性免疫系によって認識されうるその被認識能力を測定し、次いでHLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球を誘導するその誘導能を測定する、癌抗原ペプチドを同定するための方法、およびその方法により得られる癌抗原ペプチド：に関する。
【００１０】
本発明において、「癌抗原ペプチド」なる用語は、zesteホモログ２のエンハンサーの一部を含む部分ペプチドであって、HLA-A24抗原に結合でき、CTLに認識されうる部分ペプチドを意味する。「zesteホモログ２のエンハンサー（EZH2）」はzesteのショウジョウバエエンハンサーに相同性があるポリコームグループタンパク質であり、ショウジョウバエE(z)タンパク質と60.5％の同一性を有しtrithorax様ドメインとDNA結合モチーフを含有している746アミノ酸のポリペプチドである。このアミノ酸配列はChen,H., Rossier,C., Antonarakis,S.E., Cloning of a human homolog of the Drosophila enhancer of zeste gene (EZH2) that maps to chromosome 21q22.2. (1996) Genomics 38:30-37に記載されている。本発明の癌抗原ペプチドは、EZH2の一部を含むペプチド候補物質を合成し、そのペプチド候補物質とHLA-A24抗原との複合体がCTLによって認識されるか否かを決定する検定を行うことで、同定できる。
【００１１】
ペプチドの合成は、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。既知の方法としては、“Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1966; “The Proteins”, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; “Pepuchido-Gosei”, Maruzen Co. Ltd., 1975などの文献に記載されている方法が挙げられる。
本発明の癌抗原ペプチドは、以下の実施例に示す手法により同定できる。
本発明において、「機能的に同等の性質を有する癌抗原ペプチドの誘導体」とは、本発明の癌抗原ペプチドのアミノ酸配列において１つまたは数個の置換、欠失および／または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ癌抗原ペプチドとして性質、すなわちHLA-A24抗原に結合できCTLに認識されうる性質を備えた改変ペプチドを意味する。
【００１２】
本発明においては、HLA-A24陽性前立腺癌患者において液性および細胞性免疫系の両者によって効率的に認識されるEZH2-誘導体ペプチドが好ましい。クラスI結合腫瘍ペプチドに対する抗体が特定の癌患者および健常ドナーにおいて既に観察されているので(18, 20)、本発明者らはまず、11個のEZH2ペプチド候補物質に対するIgGが前立腺癌患者の血漿中に検出されるか否かを調べた。本発明者らは、前立腺関連抗原由来抗原ペプチドに反応するIgGが健常ドナーおよび前立腺癌患者に頻繁に検出されることを既に報告している(23-25)。本発明者らの臨床試験により興味深いことに、ペプチドワクチン投与により、投与した抗原ペプチドに反応するIgGが頻繁に誘導されることが判明した(13, 14)。投与した抗原ペプチドに反応するIgGの誘導は、進行性肺癌または胃癌の患者の生存率の増大と正に相関していた(15, 16]。さらに、投与した抗原ペプチドに反応するIgGの誘導はまた、再発性婦人科癌の患者における臨床応答と相関していた[17]。従って、本発明の癌ペプチドは、細胞性免疫系のみならず液性免疫系によって認識されるものが好ましい。
【００１３】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体は、前立腺癌、好ましくは骨転移を伴う前立腺癌を処置または予防するための医薬組成物に使用でき、さらに転移性骨病変、好ましくは前立腺癌に付随する転移性骨病変を処置または予防するための医薬組成物に使用できる。
【００１４】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体は少なくとも１つ、またはその２つもしくはそれ以上を患者に投与し、要すれば免疫調整物質や化学療法物質などの他の抗癌剤とともに投与する。癌抗原ペプチドまたはその誘導体を投与すれば、それらは抗原提示細胞のHLA-A24とともに効率的に提示され、それにより提示されたHLA抗原複合体に特異的なCTLが増殖し、腫瘍細胞を破壊する。その結果、患者の癌が処置され、あるいは腫瘍の増殖または転移が予防される。
【００１５】
本発明の癌抗原ペプチドまたはその誘導体を活性成分として含む組成物は、細胞性および／または液性免疫を効率的に誘導するためにアジュバントとともに投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与または静脈注射が挙げられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体の投与量は、例えば処置目的の疾患状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.1 mg〜10.0 mg、好ましくは0.5 mg〜5.0 mg、より好ましくは1.0 mg〜3.0 mgであり、これを数日ごとに投与する。
【００１６】
本発明はさらに、HLA-A24抗原と癌抗原ペプチドまたはその誘導体との複合体を特異的に認識するCTLを提供し、またそのCTLを活性成分として含む前立腺癌を処置するための医薬組成物をも提供する。本発明の組成物は好ましくは生理食塩水またはリン酸緩衝化食塩水（PBS）を含む。これらは例えば静脈内、皮下または皮内に投与することができる。
【００１７】
別の態様として、本発明は、癌抗原ペプチドを同定するための方法であって癌抗原ペプチドの候補物質を調製し、液性免疫系によって認識されうるその被認識能力を測定し、次いでHLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する細胞傷害性Tリンパ球を誘導するその誘導能を測定する方法、およびその方法により得られる癌抗原ペプチドを提供する。本発明において、細胞傷害性Tリンパ球は、HLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識し、この複合体は抗原提示細胞に提示される。換言すれば、細胞傷害性Tリンパ球はHLA拘束性に癌抗原ペプチドを特異的に認識する。
【００１８】
投与したペプチドに反応するIgGの誘導が進行性肺癌または胃癌の患者の生存率の増大と正に相関しており、また投与したペプチドに反応するIgGの誘導が再発性婦人科癌の患者における臨床応答とも相関していたことを考慮すれば、本発明の方法は、癌ワクチン療法に有効な癌抗原ペプチド、さらには癌抗原ペプチドを含みうる癌抗原タンパク質を入手するための有益な手段となるに違いない。
【実施例】
【００１９】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。以下の実施例においてEZH2ペプチドの開始アミノ酸の位置番号を表示しているが、それはペプチドそれぞれを表している。データの統計学的有意差は両側スチューデントｔ検定により求めた。０．０５以下のｐ値を統計学的に有意であると判断した。
【００２０】
実施例１
EZH2誘導ペプチドに反応するIgGの検定
1.1  患者
すべての前立腺癌患者はインフォームドコンセントを得た後に本試験に供した。すべての被験者にはヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染は無かった。末梢血20mlを採取し、フィコール・コンレイ密度勾配遠心により末梢血単核球（PBMC）を調製した。癌患者および健常ドナーのPBMCにおけるHLA-A24分子の発現はフローサイトメトリーにより測定した。
【００２１】
1.2  ペプチド
11個のEZH2由来ペプチド（以下の表１に列記）をHLA-A24結合モチーフに基づいて準備した[19]。すべてのペプチドは>90%純度であり、Biologica Co.（名古屋、日本）から入手した。HLA-A24結合モチーフを有する、インフルエンザ（Flu）ウイルス由来ペプチド（RFYIQMCYEL）、EBV由来ペプチド（TYGPVFMCL）およびHIV由来ペプチド（RYLRQQLLGI）を対照として用いた。すべてのペプチドをDMSOに溶解し、用量10 mg/mlとした。
【００２２】
【表１】
2005170799.tif 000002
【００２３】
1.3  ペプチド特異的IgGの検出
既報[20]のようにして、血漿中のペプチド特異的IgGレベルをELISAにより測定した。簡単に説明すると、ペプチド（20 μｇ/ウエル）固定化プレートをBlock Ace (雪印, 東京, 日本)によりブロックし、0.05% Tween20-PBSで洗浄し、次いで0.05% Tween20-Block Aceで希釈した血漿試料を100μｌ/ウエルでプレートに加えた。３７℃で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、1:1000に希釈したウサギ抗-ヒトIgG (γ-鎖特異的) (DAKO, Glostrup, デンマーク)とともにさらに2時間インキュベートした。得られたプレートを洗浄した後、1:100に希釈したヤギ抗-ウサギIgG-結合ペルオキシダーゼ(EnVision, DAKO)100μｌを各ウエルに加え、次いで室温にて40分間インキュベートした。プレートを1回洗浄し、100μｌ/ウエルでテトラメチルベンジジン基質溶液(KPL, Guildford, UK)を加えた後、1Mリン酸を加えて反応を停止させた。値は吸光度(OD)単位/mlで示した。示したEZH2ペプチドに対するIgGの特異性を確認するため、対応するEZH2ペプチドまたは無関係なEZH2ペプチドのいずれかでコートしたプレートを用いて、試料血漿を培養した。次いで得られた上清におけるEZH2ペプチド特異的IgGレベルをELISAにより測定した。
【００２４】
上記したように、本発明者らは11個のEZH2由来ペプチドのそれぞれに反応するIgGが10人の前立腺癌患者の血漿中において検出できるか否かを調べた。既報のように（22）、ペプチド特異的IgGはMHCクラスI分子に限定されないので、これらの癌患者はHLA-A24陽性患者に限定しなかった。ELISAにおいては、HIV陰性の健常ドナーから採取した、1：100に希釈した血漿におけるHIVペプチドに反応するIgGレベルをカットオフ値として使用し、平均＋２SD値（OD: 0.04）を求めた。得られた結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
2005170799.tif 000003
【００２６】
結果、EZH2-291、EZH2-735およびEZH2 243ペプチドに反応するIgGが10人の患者のうちそれぞれ、4、5および6人の血漿中に検出された。これら3つのEZH2ペプチドは、他の8つのEZH2ペプチドよりも効率的にIgGに認識された。患者4および6以外の8人の患者は骨転移があると診断されていた（データ掲載せず）。患者2、7および8において得られた結果を図１Aに示す。次いで、患者2および8から採取した血漿試料を、示したペプチドで前もってコートしておいたプレート中で培養し、得られた上清中のそのEZH2ペプチドに反応するIgGレベルをELISAにより測定した。上記EZH2ペプチドそれぞれに反応するIgGレベルは、対応するペプチドをコートしたプレート中で培養することにより減少したが、無関係のペプチドをコートしたプレート中での培養では減少しなかった（図１B）。
【００２７】
これらの結果は、上記ELISA系がペプチド特異的なIgGを抗原特異的に検出していることを示している。総合すれば、これらの結果は、３つのEZH2ペプチド (EZH2-291、EZH2-735およびEZH2-243)が、前立腺癌患者の血漿においてIgGにより効率的に認識されうることを示している。
【００２８】
実施例２
癌患者由来のPBMCにおけるEZH2ペプチド特異的CTLの検定
次いで、上記3つのEZH2ペプチドがHLA-A24陽性癌患者のPBMCからペプチド特異的CTLを産生させことができるか否かを調べた。
PBMCにおけるペプチド特異的CTLを検出するための検定は、既報の方法に従って行った(21)。簡単に説明すると、U底型96ウエルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において、培養培地200μｌの容量にてPBMC (1 X 105 細胞/ウエル)を10 μg/mlの各ペプチドとインキュベートした。この培養培地には45% RPMI-1640、45% AIM-V 培地 (Gibco BRL)、10% FCS、100 U/ml IL-2および0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液 (Gibco, BRL)が含まれている。3日毎に、培養培地の半分を取り出し、対応するペプチドを含む新たな培地(20 μg／ml)と置き換えた。培養の15日目に、培養細胞を４つのウエルに分け、２つのウエルにはEZH2ペプチド-パルスC1R-A24細胞を、他の２つのウエルにはHIV-パルスC1R-A24細胞を用いた。C1R-A24は、C1Rリンパ腫にHLA-A*2402分子を恒常的に発現させた亜細胞株である(Oiso M, Eura M, Katsura F, Takiguchi M, Sobao Y, Masuyama K, Nakashima M, Itoh K, Ishikawa T. A newly identified MAGE-3-derived epitope recognized by HLA-A24-restricted cytotoxici T lymphocytes. Int. J. Cancer 81: 387-394, 1999)。18時間インキュベートした後、上清を採取し、ELISAによりIFN-γレベルを測定した。この実験では、液性免疫系に少ない頻度でしか認識されないEZH2ペプチドとして、EZH2-170ペプチドを用いた。
【００２９】
得られた結果を表３に示す。表３では、100 pg/ml以上のIFN-γ産生とP<0.05を示す値には下線を付した。
【表３】
2005170799.tif 000004
【００３０】
結果は、EZH2-291およびEZH2-735ペプチドはそれぞれ、10人の癌患者のうち6人、および9人の癌患者のうち4人においてペプチド特異的CTLを誘導した。EZH2-243ペプチドは10人の癌患者のうち2人においてペプチド特異的CTLを誘導し、EZH2-170ペプチドは10人の癌患者のうち1人においてペプチド特異的CTLを誘導した。患者11、14および20は骨転移が存在すると診断されていた（データ掲載せず）。これらの結果は、EZH2-291 および EZH2-735ペプチドの両者が、HLA-A24陽性前立腺癌患者（患者が骨転移を伴っていても）からペプチド特異的CTLを効率的に誘導できることを示している。
【００３１】
実施例３
HLA-A24陽性癌患者からの前立腺癌反応性CTLの誘導
3.1  腫瘍細胞株におけるEZH2遺伝子発現の検出
EZH2ペプチド刺激PBMCがEZH2発現腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示すか否かを決定した。細胞傷害性の検定の前に、RT-PCR法により、腫瘍細胞系株LNCaP細胞およびPC93細胞、およびPBMCs (ネガティブ対照)におけるEZH2遺伝子の発現を調べた。LNCaPはHLA-A24陰性の前立腺癌細胞系統(ATCC番号 CRL-1740)であり、PC93は別の前立腺癌細胞株である（23）。RT-PCR法は次のようにして行った。RNAzolTM B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX) を用いて細胞から総RNAを単離した。第1鎖cDNA合成のためのSuperScriptTM 前増幅システム (Invitrogen)により、cDNAを調製し、それを以下のプライマーを用いて増幅した：
EZH2について
5'-AATGTGGAATGGAGTGGTGC-3'(センス) [SEQ ID NO: 3] および
5'-ACGAACTGTCACAAGGCTGC-3'(アンチセンス) [SEQ ID NO: 4]、ならびに
グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)について
5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(センス) [SEQ ID NO: 5]
5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(アンチセンス) [SEQ ID NO: 6]。PCRはDNA熱サイクラー (iCycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)において、94℃1分、60℃1分および72℃1分を28サイクル行い実施した。
【００３２】
得られた結果を図２に示す。図２に示されるように、LNCaP細胞はEZH2ｍRNA発現について明らかに陽性であった。しかし、PC-93細胞におけるEZH2ｍRNAの発現は非常に弱く、そのレベルはネガティブ対照として実験に含めた正常PBMCとほとんど同じレベルであった。
【００３３】
3.2  ３つの標的に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性
HLA-A24拘束性細胞傷害活性を調べるため、LNCaPに対する細胞傷害のレベルを、HLA-A*2402 遺伝子がトランスフェクトされそれ遺伝子を安定に発現する亜細胞株であるそのトランスフェクタント、LNCaP-A24（Yao A, Harada M, Matsueda S, Ishihara Y, Shomura H, Noguchi M, Matsuoka K, Hara I, Kamidono S, Itoh K. Idnetification of parathyroid hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24+ prostate cancer patients. Submitted for publication.）に対する細胞傷害レベルと比較した。すべての細胞株は、10% FCSを添加したRPMI-1640培地 (Gibco BRL, Grand Island, NY)にて維持させた。
【００３４】
次いで、3人のHLA-A24陽性前立腺癌患者から得たPBMCを指示したEZH2ペプチドでインビトロ刺激し、HLA-A24陰性LNCaP細胞、HLA-A24陽性LNCaP-A24細胞およびHLA-A24陽性PHA-刺激T芽球様細胞に対する細胞傷害活性について試験した。詳細には、EZH2ペプチドによりインビトロ刺激した後、96丸底ウエルプレートにおいてペプチド刺激PBMCを100 U/ml IL-2とともにさらに約10日間培養し、細胞傷害活性検定を行うために充分な数の細胞を得た。次いで、得られた細胞を、6時間51Cr放出検定によりLNCaP細胞、LNCaP-A24細胞およびPHA-刺激T芽球様細胞に対する細胞傷害活性について試験した。指示したエフェクター/標的比率にて、96丸底ウエルプレートにおいて１ウエル当たり2000個の51Cr標識細胞をエフェクター細胞とともに培養した。この結果を図３に示す。EZH2ペプチド刺激PBMCは、HLA-A24陰性LNCaP細胞およびHLA-A24陽性PHA-刺激T芽球様細胞に対するよりも、HLA-A24陽性LNCaP-A24細胞に対してより高いレベルの細胞傷害活性を示した。この結果は、EZH2-291 および EZH2-735ペプチドが、HLA-A24拘束性かつ前立腺癌反応性のCTLをHLA-A24陽性前立腺癌患者から効率的に誘導できることを示している。  
【００３５】
実施例４
癌患者由来のEZH2ペプチド刺激PBMCのペプチド特異的かつCD8陽性T細胞依存的な細胞傷害活性
4.1  EZH2ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に対する抗体による阻害
さらに、どのようなエフェクター細胞が細胞傷害活性を担っているかを検討した。患者17、18および21から入手したEZH2ペプチド刺激PBMCを、LNCaP-A24に対する細胞傷害活性について試験した。示したモノクローナル抗体の存在下に6時間での細胞傷害活性の検定を行った。検定は、エフェクター/標的の比率10/1にて行った。検定の開始時に、抗-HLAクラスI (W6/32: マウスIgG2a)、抗-HLA-DR (L243: マウスIgG2a)、抗-CD4 (NU-TH/I: マウスIgG1)、抗-CD8 (NU-TS/C: マウスIgG2a)、または抗-CD14 (H14: マウスIgG2a)抗体のいずれかを20 μg/mlでウエルに加えた。その結果、EZH2-291 および EZH2-735ペプチドのいずれかでインビトロ刺激した、3人の前立腺癌患者由来のPBMCのLNCaP-A24に対する細胞傷害活性が抗-HLAクラスIまたは抗-CD8モノクローナル抗体の添加により有意に阻害されたが、他の抗-HLAクラスIIである抗-CD4または抗-CD14モノクローナル抗体の添加では阻害されなかった（図４A）。
【００３６】
4.2  コールド阻害検定によるEZH2ペプチド刺激CTLの特異性の確認
対応するEZH2ペプチドまたはHIVペプチドのいずれかで前もって準備しておいた非標識C1R-A24の存在下に、患者17、18および21から入手したEZH2ペプチド刺激PBMCを、LNCaP-A24に対する細胞傷害活性について試験した。
簡単に説明すると、2 X 104 コールド標的細胞を含有する96丸底ウエルプレートにおいて、51Cr-標識標的細胞 (2 X 103 細胞/ウエル)をCTL (4 X 104 細胞/ウエル)とともに培養した。HIVペプチドまたは対応するEZH2ペプチドのいずれかで前もってパルスしておいたC1R-A24細胞をコールド標的として使用した。検定は、エフェクター/標的の比率10/1にて行った。LNCaP-A24細胞に対するEZH2ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、関連するペプチド-パルスした非標識C1R-A24細胞の添加により有意に抑制されたが、この抑制は、HIVペプチド-パルスした非標識C1R-A24細胞を添加しても認められなかった。これらの結果は、EZH2ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性を主としてペプチド特異的かつCD8陽性T細胞が担っていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明者らは、HLA-A24陽性前立腺癌患者において液性および細胞性免疫系の両者に効率的に認識される２つのEZH2由来ペプチドを同定した。HLA-A24アレルの頻度は全世界を通じて比較的高い[27]。本発明の情報は、転移を伴うHLA-A24陽性前立腺癌患者に対するペプチドに基づく免疫療法の可能性を開くものである。
【００３８】
文献
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【００３９】
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【００４０】
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【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】EZH2ペプチドに反応するIgGを示す。図１Aは、患者2、7および8から得た血漿中における、ELIZAにより調べたEZH2ペプチドに反応するIgGレベルを示すグラフである。値はODである。カットオフレベル（OD: 0.04）はHIV陰性健常ドナーにおける抗-HIVペプチドIgGレベルに基づき算定した。図１Bは、EZH2ペプチドそれｚそれに反応するIgGレベルが対応するペプチドをコートしたプレートで培養することにより減少することを示すグラフである。
【図２】LNCaP細胞、PC93細胞およびPBMCにおけるEZH2のｍRNA発現をRT-PCR法により調べた結果を示す写真である。
【図３】3人のHLA-A24陽性前立腺癌患者から入手したEZH2ペプチド刺激PBMCにおける、3つの異なる標的：LNCaP細胞 (HLA-A24陰性)、LNCaP-A24細胞 (HLA-A24陽性)およびPHA-芽球様T細胞 (HLA-A24陽性)に対する細胞障害性を6時間51Cr放出検定により調べた結果を示すグラフである。*P<0.05は統計学的に有意と考えた。
【図４Ａ】EZH2ペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性に対する抗体の阻害を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。*P<0.05は統計学的に有意と考えた。
【図４Ｂ】EZH2ペプチド刺激CTLの細胞傷害活性の阻害を示すグラフである。値は3回の検定の平均である。*P<0.05は統計学的に有意と考えた。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
TITLE OF THE INVENTION
HLA-A24 binding peptides of Enhancer of zeste homolog 2
TECHNICAL FIELD
The invention relates to identification of enhancer of zeste homolog 2 immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24+ prostate cancer patients, and particularly relates to specific cancer antigens for treatment or prevention of prostate cancers, cancer vaccines comprising the same, and the therapeutical methods therefor.  
BACKGROUND OF THE INVENTION
Prostate cancer is one of the most common cancers among elder men (1).  Prostate cancer frequently metastasizes to bone, and androgen withdrawal therapy has been applied for such patients.  However, there is no efficient therapy against hormone-refractory and metastatic prostate cancer.  Therefore, there is an urgent need for the development of new therapeutic modalities, and specific immunotherapy is one candidate.  Indeed, prostate tissue-specific antigens expressed in the normal prostate can be target molecules for specific immunotherapy (2).  Specific immunotherapy targeting prostate tissue-specific antigens has been carried out, and, in recent years, our group has identified several epitope peptides derived from prostate-related antigens that are able to generate prostate cancer-reactive CTLs from prostate cancer patients (23-26).  However, one major obstacle encountered when treating prostate cancer patients is the treatment of bone metastases, as prostate cancer frequently metastasizes to the bone tissue (1).  Thus, the clinical responses remain unsatisfactory (3-7).  
Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is a polycomb group protein homologue to the Drosophila enhancer of zeste, and is involved in gene silencing (8).  Dysregulation of this gene-silencing machinery can lead to cancer (9-11).  In addition, it has been reported that EZH2 is overexpressed in metastatic prostate cancer and functions as a transcriptional repressor, and that inhibition of EZH2 blocks growth of prostate cancer cells (12).  
In our clinical trials against several types of cancer, several class I-binding tumor antigen-derived peptides that had originally been identified by their ability to induce tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes (CTLs) were also recognized by immunoglobulin g (IgG) (13, 14).  Additional clinical trials revealed that the induction of IgG reactive to administered peptides was positively correlated with the overall survival of cancer patients (15-17).  These lines of evidence suggest that peptides that can be recognized by both the humoral and cellular immune systems might be more useful for immunotherapy than peptides that can be recognized by only one of the two systems.  In addition, the assay for peptide-specific IgG is much simpler and easier than the in vitro sensitization experiment to induce peptide-specific CTLs (18).  
SUMMARY OF THE INVENTION
Antigens overexpressed in metastatic prostate cancer are appropriate targets in anti-cancer immunotherapy of prostate cancer patients, and particularly in those with metastases.  In the present invention, we focused on one candidate of the polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2 (EZH2).  
As described above, it would be believed that peptides that can be recognized by both the humoral and cellular immune systems might be more useful for immunotherapy than peptides that can be recognized by only one of the two systems.  Along with this line, we first screened EZH2-derived peptide candidates by their ability to be recognized by the humoral immune system, and then determined their potential to induce peptide-specific and prostate cancer-reactive CTLs.  As a consequence, we identified two EZH2-derived peptides that are effectively recognized by both the humoral and cellular immune systems in HLA-A24+ prostate cancer patients.  
Eleven EZH2-derived peptides were prepared based on the HLA-A24 binding motif.  These peptide candidates were screened first by their ability to be recognized by immunoglobulin G (IgG), and then by their ability to induce peptide-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).  IgGs reactive to three EZH2 peptides (EZH2 243-252, EZH2 291-299, and EZH2 735-742) were detected in the plasma of almost half of prostate cancer patients.  Among them, the EZH2 291-299 and EZH2 735-742 peptides effectively induced HLA-A24-restricted and prostate cancer-reactive CTLs from prostate cancer patients.  The cytotoxicity was mainly dependent on EZH2 peptide-specific and CD8+ T cells.  These EZH2 291-299 and EZH2 735-742 peptides could be promising candidates for peptide-based immunotherapy for HLA-A24+ prostate cancer patients with metastases.  
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Fig. 1 shows IgG reactive to EZH2 peptides.  
Fig. 1A is a graph showing the levels of IgG reactive to EZH2 peptides in the plasma from patients 2, 7, and 8 as examined by ELISA.  The values represent OD.  The cut-off level (OD: 0.04) was determined based on the levels of anti-HIV peptide IgG in HIV-negative healthy donors.  
Fig. 1B is a graph showing that the level of IgG reactive to each of these EZH2 peptides was decreased by culturing in corresponding peptide-coated plates.  
Fig. 2 is a photograph showing the mRNA expression of EZH2 in the LNCaP cells and PC93 cells, and PBMCs as examined by the RT-PCR method.  
Fig. 3 is a graph showing the cytotoxicity of EZH2 peptide-stimulated PBMCs from 3 HLA-A24+ prostate cancer patients toward 3 different targets LNCaP cells (HLA-A24-), LNCaP-A24 cells (HLA-A24+), and PHA-blastoid T cells (HLA-A24+) by a 6-hr 51Cr-release assay.  *P<0.05 was considered statistically significant.  
Fig. 4A is a graph showing Inhibition of antibodies against the cytotoxicity of EZH2 peptide-stimulated PBMCs.  The values represent the mean of triplicate assays.  * P<0.05 was considered statistically significant.  
Fig. 4B is a graph showing inhibition of the cytotoxicity of EZH2 peptide-stimulated CTLs.  The values represent the mean of triplicate assays.  * P<0.05 was considered statistically significant.  
DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
Thus, the present invention provides:
(1)  A cancer antigen peptide that is a partial peptide derived from an enhancer of zeste homolog 2, and that is capable of binding to an HLA-A24 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties; preferably, the cancer antigen peptide that is further recognized by humoral immune system; specifically, the cancer antigen peptide, that comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties; 
(2)  A pharmaceutical composition for treating or preventing a prostate cancer, that comprises as an active ingredient at least one of the cancer antigen peptides and derivatives thereof according to (1) above, preferably the pharmaceutical composition, wherein the prostate cancer is associated with bone metastases;  
(3)  A pharmaceutical composition for treating or preventing a pathological bone metastases, that comprises as an active ingredient at least one of the cancer antigen peptides and derivatives thereof according to (1), preferably the pharmaceutical composition, wherein the pathological bone metastases are accompanied by a prostate cancer;
(4)  A cytotoxic T lymphocyte that specifically recognizes a complex between an HLA-A24 antigen and a cancer antigen peptide or derivative thereof according to above (1); 
(5)  A pharmaceutical composition for treating a prostate cancer, that comprises as an active ingredient the cytotoxic T lymphocyte of above (4), preferably the pharmaceutical composition, wherein the prostate cancer is associated with bone metastases; and 
(6)  A process for identifying a cancer antigen peptide, which comprises preparing candidates of the cancer antigen peptide, determining their ability to be recognized by the humoral immune system, and then determining their potential to induce cytotoxic T lymphocytes that specifically recognizes a complex between an HLA antigen and a cancer antigen peptide, and a cancer antigen peptide obtained by the process.  
As used herein, the term “cancer antigen peptide” refers to a partial peptide that comprises a part of an enhancer of zeste homolog 2 and is capable of binding to an HLA-A24 antigen and being recognized by CTL.  Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) is a polycomb group protein homologue to the Drosophila enhancer of zeste, and encodes a 746-amino-acid polypeptide that shows 60.5% identity to the Drosophila E(z) protein and contains a trithorax-like domain and a DNA-binding motif.  The amino acid sequence is described in Chen,H., Rossier,C., Antonarakis,S.E., Cloning of a human homolog of the Drosophila enhancer of zeste gene (EZH2) that maps to chromosome 21q22.2. (1996) Genomics 38:30-37.  Cancer antigen peptides of the present invention can be identified by synthesizing a candidate peptide which comprises a part of EZH2 and conducting an assay for determining whether or not a complex between the candidate peptide and an HLA-A24 antigen is recognized by CTL.  
Synthesis of peptides may be conducted according to a method usually used in peptide chemistry.  Examples of the known methods are those described in the literatures including “Peptide Synthesis”, Interscience, New York, 1966; “The Proteins”, vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; “Pepuchido-Gosei”, Maruzen Co. Ltd., 1975.  
Identification of cancer antigen peptides of the present invention can be conducted according to the illustration of the working examples hereinafter.  
As used herein, the term “derivative of a cancer antigen peptide having the functionally equivalent properties” means an altered peptide of which the amino acid sequence contains a substitution, deletion and/or addition of one to several amino acid residues of an amino acid sequence of a cancer antigen peptide of the present invention, and which has the properties as a cancer antigen peptide, i.e., are to be capable of binding to an HLA-A24 antigen and being recognized by CTL.  
It is preferred in the invention that EZH2-derived peptides that are effectively recognized by both the humoral and cellular immune systems in HLA-A24+ prostate cancer patients.  We first investigated whether or not IgG against 11 EZH2 peptide candidates would be detectable in the plasma of prostate cancer patients, because antibodies against class I-binding tumor peptides had already been observed in certain cancer patients and healthy donors (18, 20).  We previously reported that IgG reactive to peptides derived from prostate-related antigens was frequently detectable in healthy donors and prostate cancer patients (23-25).  Interestingly, our clinical trials revealed that peptide vaccination frequently resulted in the induction of IgG reactive to administered peptides (13, 14).  The induction of IgG reactive to vaccinated peptides was positively correlated with longer survival of patients with advanced lung or gastric cancer (15, 16).  In addition, the induction of IgG reactive to the administered peptides was also correlated with a clinical response among patients with recurrent gynecologic cancer (17).  Accordingly, the cancer peptides of the invention preferably are those that are further recognized by the humoral immune system in addition to the cellular immune system.  
A cancer antigen peptide or its derivative of the present invention can be used for a pharmaceutical composition for treating or preventing a prostate cancer, preferably the prostate cancer is associated with bone metastases, and pathological bone metastases, preferably the pathological bone metastases accompanied by a prostate cancer.  
At least one of, or a combination of two or more of, cancer antigen peptides or their derivatives of the present invention is (are) administered to a patient, if necessary, in combination with other anti-agents such as immunomodulators and chemotherapeutics.  When administered, the cancer antigen peptide or derivative thereof is presented at a high density with an HLA-A24 antigen of antigen-presenting cells, and therefore, CTLs specific for the presented HLA antigen complex proliferates and destroys the tumor cells.  As a result, the cancers of the patient may be treated, or proliferation or metastasis of the tumor may be prevented.  
The composition comprising as an active ingredient a cancer antigen peptide or its derivative of the present invention may be administered along with an adjuvant in order to effectively establish the cellular and/or humoral immunity.  Administration may be conducted intradermally, hypodermically, or by intravenous injection.  Although the amount of a tumor antigen peptide or its derivative of the present invention in the formulation to be administered may be adjusted as appropriate depending on, for example, the condition of the disease to be treated, the age and the body weight of the particular patient, it is usually preferred to administered 0.1 mg to 10.0 mg, preferably 0.5 mg to 5.0 mg, more preferably 1.0 mg to 3.0 mg every several days.  
Additionally, the present invention provides CTLs that specifically recognize a complex between a HLA-24 antigen and the cancer antigen peptide or derivative thereof, and also provides a pharmaceutical composition for treating a prostate cancer which comprises the CTLs as an active ingredient.  The compositions preferably contain a physiological saline or a phosphate buffered saline (PBS).  It may be administered, for example, intravenously, subcutaneously, or intradermally.  
In another embodiment, the present invention provides a process for identifying a cancer antigen peptide, which comprises preparing candidates of the cancer antigen peptide, determining their ability to be recognized by the humoral immune system, and then determining their potential to induce cytotoxic T lymphocytes that specifically recognizes a complex between an HLA antigen and a cancer antigen peptide, as well as a cancer antigen peptide obtained by this process.  As used herein, cytotoxic T lymphocytes specifically recognizes a complex between an HLA antigen and a cancer antigen peptide, which complex is presented on an antigen-presenting cell.  In other words, cytotoxic T lymphocytes specifically recognizes a cancer antigen peptide in an HLA-restricted manner.  
The process of the present invention should be an advantageous tool to obtain cancer antigen peptides and also cancer antigen proteins that could comprise cancer antigen peptides, which are efficient for cancer vaccination, in view of the findings that the induction of IgG reactive to vaccinated peptides was positively correlated with longer survival of patients with advanced lung or gastric cancer, and that the induction of IgG reactive to the administered peptides was also correlated with a clinical response among patients with recurrent gynecologic cancer.  
EXAMPLES
The present invention is further illustrated by the following examples, but is not limited by these examples in any respect.  In the following examples, only the position number of the starting amino acid of EZH2 peptides is shown to show each of the peptides.  The statistical significance of the data was determined using a two-tailed Student's t-test.  A p value of less than 0.05 was considered to be statistically significant.  
Example 1
Assay for IgG reactive to EZH2-derived peptides
1.1  Patients
All prostate cancer patients in this study provided their informed consent before enrollment.  None of these participants was infected with human immunodeficiency virus (HIV).  Twenty milliliters of peripheral blood was obtained, and the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were prepared by Ficoll-Conray density gradient centrifugation.  The expression of HLA-A24 molecules on the PBMCs of cancer patients and healthy donors was determined by flow cytometry.  
1.2  Peptides
Eleven EZH2-derived peptides (listed in Table 1) were prepared based on the HLA-A24 binding motif (19).  All peptides were of >90% purity and were purchased from Biologica Co., Nagoya, Japan.  Influenza (Flu) virus-derived (RFYIQMCYEL), EBVderived (TYGPVFMCL), and HIVderived peptides (RYLRQQLLGI) with the HLA-A24 binding motif were used as controls.  All peptides were dissolved with DMSO at a dose of 10 mg/ml.  
Table 1
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1.3 Detection of peptide specific IgG
Peptide-specific IgG levels in the plasma were measured by ELISA using a previously reported method (20).  In brief, peptide (20 μg/well)-immobilized plates were blocked with Block Ace (Yukijirushi, Tokyo, Japan) and washed with 0.05% Tween20-PBS, after which 100 μl/well of plasma sample diluted with 0.05% Tween20-Block Ace was added to the plates.  After a 2-hr incubation at 37 ℃, the plates were washed and further incubated for 2 hr with a 1:1000-diluted rabbit anti-human IgG (γ-chain-specific) (DAKO, Glostrup, Denmark).  The plates were washed, and then 100 μl of 1:100-diluted goat anti-rabbit IgG-conjugated horseradish peroxidase (EnVision; DAKO) was added to each well, and the plates were incubated at room temperature for 40 min.  After the plates were washed once, 100 μl/well of tetramethyl benzidine substrate solution (KPL, Guildford, UK) was added, and the reaction was stopped by the addition of 1 M phosphoric acid.  The values are shown as optical density (OD) units/ml.  To confirm the specificity of IgG to the indicated EZH2 peptide, sample plasma was cultured with plates coated with either the corresponding EZH2 peptide or an irrelevant EZH2 peptide.  Thereafter, the levels of EZH2 peptide-specific IgG in the resulting supernatant were determined by ELISA.  
As shown above, we investigated whether IgG reactive to each of the 11 EZH2-derived peptides could be detected in the plasma of 10 prostate cancer patients.  These patients were not limited to the HLA-A24+ subjects, because peptide-specific IgG was not restricted to MHC class I molecules, as reported previously (22).  The mean + 2 SD value (OD: 0.04), which was determined as the level of IgG reactive to the HIV peptide in plasma from HIV-negative healthy donors, was used as a cut-off value at a 1:100 diluted plasma in the ELISA.  The results are shown in Table 2.  
Table 2
2005170799.tif 000012
As a result, IgGs reactive to the EZH2-291, EZH2-735, and EZH2 243 peptides were detected in the plasma of 4, 5, and 6 of 10 patients, respectively.  These 3 EZH2 peptides were recognized by IgG more efficiently than the other 8 EZH2 peptides.  Eight patients other than patients 4 and 6 were diagnosed to suffer from bone metastases (data not shown).  The representative results of patients 2, 7, and 8 are shown in Figure 1A.  Then, the plasma samples from patients 2 and 8 were cultured in plates that were pre-coated with the indicated peptides, and the levels of IgG reactive to the indicated EZH2 peptide in the resultant supernatants were determined by ELISA.  The level of IgG reactive to each of these EZH2 peptides was decreased by culturing in corresponding peptide-coated plates, but not in irrelevant peptide-coated plates (Figure 1B).  
These results indicate that the ELISA system detected peptide-specific IgG in an antigen-specific manner.  Taken together, these results indicated that these 3 EZH2 peptides (EZH2-291, EZH2-735, and EZH2-243) can be effectively recognized by IgG in the plasma of prostate cancer patients.  
Example 2
Assay for EZH2 peptide-specific CTLs in PBMCs from cancer patients
We next determined whether these 3 EZH2 peptides had the potential to generate peptide-specific CTLs from the PBMCs of HLA-A24+ cancer patients.  
The assay for the detection of peptide-specific CTLs in PBMCs was performed according to a previously reported method (21).  In brief, PBMCs (1 X 105 cells/well) were incubated with 10 μg/ml of each peptide in a U-bottom-type 96-well microculture plate (Nunc, Roskilde, Denmark) at a volume of 200 μl of culture medium.  The culture medium consisted of 45% RPMI-1640, 45% AIM-V medium (Gibco BRL), 10% FCS, 100 U/ml of interleukin (IL)-2, and 0.1 mM MEM nonessential amino acid solution (Gibco, BRL).  Half of the culture medium was removed and replaced with new medium containing a corresponding peptide (20 μg/ml) every 3 days.  On the 15th day of culture, the cultured cells were separated into 4 wells, and two of which were used for EZH2 peptide-pulsed C1R-A24 cells, and the other two of which were used for the HIV peptide-pulsed C1R-A24 cells.  C1R-A24 is an HLA-A*2402-expressing subline of C1R lymphoma (Oiso M, Eura M, Katsura F, Takiguchi M, Sobao Y, Masuyama K, Nakashima M, Itoh K, Ishikawa T. A newly identified MAGE-3-derived epitope recognized by HLA-A24-restricted cytotoxici T lymphocytes. Int. J. Cancer 81: 387-394, 1999).  After an 18-hr incubation period, the supernatants were collected and the level of IFN-γ was determined by ELISA.  The EZH2-170 peptide was included in this experiment as an EZH2 peptide that was less frequently recognized by the humoral immune system.  
The results are shown in Table 3.  The values that showed more than 100 pg/ml IFN-γ production and P<0.05 are underlined in this table.  
Table 3
2005170799.tif 000013
The result was that the EZH2-291 and EZH2-735 peptides induced peptide-specific CTLs in 6 of 10 and 4 of 9 cancer patients, respectively.  The EZH2-243 peptide induced peptide-specific CTLs in 2 of 10 cancer patients, and the EZH2-170 peptide induced peptide-specific CTLs in 1of 10 cancer patients.  Patients 11, 14, and 20 were diagnosed to suffer from bone metastases (data not shown).  These results indicate that both the EZH2-291 and EZH2-735 peptides have the potential to effectively induce peptide-specific CTLs from HLA-A24+ prostate cancer patients, even with bone metastases.  
Example 3
Induction of prostate cancer-reactive CTLs from HLA-A24+ cancer patients  
3.1  Detection for the expression of EZH2 gene in tumor cell lines
We further determined whether these EZH2 peptide-stimulated PBMCs showed any cytotoxicity against EZH2-expressing tumor cells.  Before assay of cytotoxicity, the expression of EZH2 gene in tumor cell lines, the LNCaP cells and PC93 cells, and PBMCs (negative control) was examined using the RT-PCR method.  The LNCaP is an HLA-A24-negative prostate cancer cell line (ATCC number CRL-1740), and the PC93 is another prostate cancer cell line (23).  The RT-PCR method was carried out as follows.  Total RNA was isolated from the cells using RNAzolTM B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX).  The cDNA was prepared using the SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Invitrogen), and it was amplified using the primers:
5'-AATGTGGAATGGAGTGGTGC-3'(sense) [SEQ ID NO: 3] and 
5'-ACGAACTGTCACAAGGCTGC-3'(anti-sense) for EZH2 [SEQ ID NO: 4], and 
5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(sense) [SEQ ID NO: 5]
5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(anti-sense) [SEQ ID NO: 6] for glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).  PCR was performed using Taq DNA polymerase in a DNA thermal cycler (iCycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) for 28 cycles of 94 ℃ for 1 min, 60 ℃ for 1 min, and 72 ℃ for 1 min.  
The result is shown in Figure 2.  As shown in Figure 2, the LNCaP cells were clearly positive for the EZH2 mRNA expression.  However, expression of EZH2 mRNA in PC-93 cells was very faint, and was almost the same as that in normal PBMCs included as a negative control.  
3.2  Cytotoxicity of peptide-stimulated PBMCs against three targets
To investigate HLA-A24-restricted cytotoxicity, the level of cytotoxicity against the LNCaP was compared with the level of cytotoxicity against its transfectant, LNCaP-A24, which is a subline that transfected with the HLA-A*2402 gene and express the gene stably (Yao A, Harada M, Matsueda S, Ishihara Y, Shomura H, Noguchi M, Matsuoka K, Hara I, Kamidono S, Itoh K. Idnetification of parathyroid hormone-related protein-derived peptides immunogenic in human histocompatibility leukocyte antigen-A24+ prostate cancer patients. Submitted for publication.).  All cell lines were maintained in RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) supplemented with 10% FCS.  
The PBMCs from 3 HLA-A24+ prostate cancer patients were then stimulated in vitro with the indicated EZH2 peptide, and examined for their cytotoxicity against HLA-A24- LNCaP cells, HLA-A24+ LNCaP-A24, and HLA-A24+ PHA-stimulated T cell blasts.  Specifically, after in vitro stimulation with the EZH2 peptides, the peptide-stimulated PBMCs were additionally cultured with 100 U/ml IL-2 for approximately 10 days in 96 round-well plates in order to obtain a sufficient number of cells to carry out a cytotoxicity assay.  Then, these cells were tested for cytotoxicity against LNCaP, LNCaP-A24, and PHA-stimulated T cell blasts by a 6-hr 51Cr-release assay.  Two thousand 51Cr-labeled cells per well were cultured with effector cells in 96 round-well plates at the indicated effector/target ratios.  The results are shown in Figure 3.  The EZH2 peptide-stimulated PBMCs exhibited higher levels of cytotoxicity against the HLA-A24+ LNCaP-A24 cells than against the HLA-A2- LNCaP and HLA-A2+ PHA-stimulated T cell blasts.  These results indicated that the EZH2-291 and EZH2-735 peptides have the potential to effectively induce HLA-A24-restricted and prostate cancer-reactive CTLs from HLA-A24+ prostate cancer patients.  
Example 4
Peptide-specific and CD8+ T cell-dependent cytotoxicity of EZH2 peptide-stimulated PBMCs from cancer patients
4.1  Inhibition of the cytotoxicity of EZH2 peptide-stimulated PBMCs by antibodies
We further tried to confirm which effector cells were responsible for the cytotoxicity.  EZH2 peptide-stimulated PBMCs from patients 17, 18, and 21 were tested for their cytotoxicity against the LNCaP-A24.  The 6-hr cytotoxicity assay was performed in the presence of the indicated mAb.  The assay was done at an effector/target ratio of 10/1.  Either anti-HLA class I (W6/32: mouse IgG2a), anti-HLA-DR (L243: mouse IgG2a), anti-CD4 (NU-TH/I: mouse IgG1), anti-CD8 (NU-TS/C: mouse IgG2a), or anti-CD14 (H14: mouse IgG2a) mAb was added to the wells at a dose of 20 μg/ml at the start of the assay.  As a result, the cytotoxicity of the PBMCs from 3 prostate cancer patients, which were stimulated in vitro with each of the EZH2-291 and EZH2-735 peptides, against the LNCaP-A24 cells were significantly inhibited by the addition of anti-class I or anti-CD8 mAb, but not by the addition of anti-class II, anti-CD4, or anti-CD14 mAb (Figure 4A).  
4.2  Confirmation of the specificity of EZH2 peptide-stimulated CTLs by a cold inhibition assay
EZH2 peptide-stimulated PBMCs from patients 17, 18, and 21 were tested for their cytotoxicity against the LNCaP-A24 in the presence of unlabeled C1R-A24 cells, which were pre-loaded with either the corresponding EZH2 peptide or the HIV peptide.  
In brief, 51Cr-labbeled target cells (2 X 103 cells/well) were cultured with the CTLs (4 X 104 cells/well) in 96 round-well plates with 2 X 104 cold target cells.  C1R-A24 cells that were pre-pulsed with either the HIV peptide or a corresponding EZH2 peptide were used as cold targets.  The assay was done at an effector/target ratio of 10/1.  The cytotoxicity of these EZH2 peptide-stimulated PBMCs against the LNCaP-A24 cells was significantly suppressed by the addition of the relevant peptide-pulsed unlabeled C1R-A24 cells, but not by the addition of the HIV peptide-pulsed unlabeled C1R-A24 cells.  Collectively, these results indicate that cytotoxicity of the EZH2 peptide-stimulated PBMCs was mainly ascribed to peptide-specific and CD8+ T cells.  
EFFECTS OF THE INVENTIONS
In the invention, we revealed that both the EZH2-291 and EZH2-735 peptides have the potential to induce prostate cancer-reactive CTLs in HLA-A24+ prostate cancer patients.  More importantly, PBMCs that were stimulated with these 2 EZH2 peptides showed cytotoxicity against prostate cancer cells in an HLA-A24-restricted manner.  The cytotoxicity was revealed to depend on peptide-specific and CD8+ T cells.  These results indicate that these two EZH2 peptides are potentially useful in specific immunotherapy for HLA-A24+ prostate cancer patients.
In the invention, IgG reactive to either the EZH2-291, the EZH2-735, or the EZH2-243 peptide was detected in almost half of prostate cancer patients.  The potential of the EZH2-243 peptide to induce peptide-specific CTLs from HLA-A24+ prostate cancer patients was lower than those of the former 2 EZH2 peptides.  This means that both the EZH2-291 and EZH2-735 peptides were recognized efficiently by both the cellular and the humoral immune system.  Therefore, vaccination with the EZH2-291 and EZH2-735 peptides into HLA-A24+ prostate cancer patients could efficiently elicit the induction of both prostate cancer-reactive CTLs and peptide-specific IgG, and subsequently lead to clinical responses.  
INDUSTRIAL APPLICABILITY
In conclusion, we identified two EZH2-derived peptides that are efficiently recognized by both the humoral and cellular immune systems in HLA-A24+ prostate cancer patients.  The frequencies of the HLA-A24 allele are relatively high throughout the world (27).  The information provided here might increase the possibility of treating HLA-A24+ prostate cancer patients with metastases using peptide-based immunotherapy.  
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SEQUENCE LISTING
<110> Kurume University
<120> HLA-A24 binding peptides of Enhancer of zeste homolog 2
<130> 192367
<160> 6
<210> 1
<211> 9
<212> Amino acid
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe
5
<210> 2
<211> 9
<212> Amino acid
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Lys Tyr Val Gly Ile Glu Arg Glu Met
5  
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aatgtggaat ggagtggtgc                                  20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
acgaactgtc acaaggctgc                                  20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
acaacagcct caagatcatc ag                                  22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggtccaccac tgacacgttg                                  20
WHAT IS CLAIMED IS
1.  A cancer antigen peptide that is a partial peptide derived from an enhancer of zeste homolog 2, and that is capable of binding to an HLA-A24 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
2.  The cancer antigen peptide according to claim 1, that is recognized by humoral immune system.  
3.  The cancer antigen peptide according to claim 1, that comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties.  
4.  A pharmaceutical composition for treating or preventing a prostate cancer, that comprises as an active ingredient at least one of the cancer antigen peptides and derivatives thereof according to any one of claims 1 to 3.  
5.  The pharmaceutical composition according to claim 4, wherein the prostate cancer is associated with bone metastases. 
6.  A pharmaceutical composition for treating or preventing a pathological bone metastases, that comprises as an active ingredient at least one of the cancer antigen peptides and derivatives thereof according to any one of claims 1 to 3.  
7.  The pharmaceutical composition according to claim 6, wherein the pathological bone metastases are accompanied by a prostate cancer.  
8.  A cytotoxic T lymphocyte that specifically recognizes a complex between an HLA-A24 antigen and a cancer antigen peptide or derivative thereof according to any one of claims 1 to 3.  
9.  A pharmaceutical composition for treating a prostate cancer, that comprises as an active ingredient the cytotoxic T lymphocyte of claim 8.  
10.  The pharmaceutical composition according to claim 9, wherein the prostate cancer is associated with a metastasis to bone tissues.  
11.  A process for identifying a cancer antigen peptide, which comprises preparing candidates of the cancer antigen peptide, determining their ability to be recognized by the humoral immune system, and then determining their potential to induce cytotoxic T lymphocytes that specifically recognizes a complex between an HLA antigen and a cancer antigen peptide.  
12.  A cancer antigen peptide obtained by the process according to claim 11.  
Abstract
New therapeutic modalities for prostate cancers are provided.  
A cancer antigen peptide that is a partial peptide derived from an enhancer of zeste homolog 2, and that is capable of binding to an HLA-A24 antigen and being recognized by cytotoxic T lymphocytes, or a derivative thereof having the functionally equivalent properties can be useful for treatment and prevention of prostate cancers.   
【図１−Ａ】
2005170799.tif 000014
【図１−Ｂ】
2005170799.tif 000015
【図２】
2005170799.tif 000016
【図３】
2005170799.tif 000017
【図４−Ａ】
2005170799.tif 000018
【図４−Ｂ】
2005170799.tif 000019