(57)【要約】      （修正有）【課題】エンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクローン化することを提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号２に示す塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は工業用酵素として有用なエンド−１，４−βグルカナーゼ、それらをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンド−１，４−βグルカナーゼは、グルコースがβ−１，４結合した多糖類を加水分解する酵素の総称であり、植物由来のセルロース、リケナンなどを分解できる。セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。また、リケナンは、地衣類の葉状体に存在するグルコースがβ−１，３、β−１，４結合した多糖類で地衣澱粉とも呼ばれる貯蔵多糖である。セルロースやリケナンの分解によって生ずるオリゴ糖からグルコースを経て燃料物質やより高付加価値の代謝物質へと変換が可能である。また、植物細胞をプロトプラスト化する際には必須の酵素である。従って、エンド−１，４−βグルカナーゼは、世界各国で以前から精力的に研究されている酵素の一つである（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
更に近年、遺伝子工学の発展に伴い産業用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになってきている。エンド−１，４−βグルカナーゼについても例外ではなく既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある（例えば、特許文献３及び４参照）。
【０００４】
従って、本発明の目的は産業用酵素として有用なエンド−１，４−βグルカナーゼを見出し、それをコードする遺伝子の取得並びにその遺伝子を用いた大量かつ単一のエンド−１，４−βグルカナーゼを製造する方法を確立することにある。
【特許文献１】村尾沢夫ら、セルラーゼ、講談社サイエンティフィック、1987
【特許文献２】Tommeら、Advances in Microbial Physiology、37巻、pp 1-75、1995
【特許文献３】国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献４】特開平１０−３１３８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、自然界からエンド−１，４−βグルカナーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、上記目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、更に当該微生物からエンド−１，４−βグルカナーゼをコードする遺伝子をクローン化することにより本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼを用いればセルロースやリケナンのような多糖を分解し、燃料物質やより高付加価値の代謝物質へと変換するシステムの構築が可能となる。また、本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子を用いれば有用な酵素を単一且つ大量に生産することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のタンパク質（以下、「エンド−１，４−βグルカナーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】
ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてエンド−１，４−βグルカナーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、自然界から取得すること以外にも部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００１０】
本発明の配列番号１に示すエンド−１，４−βグルカナーゼ（以下、Ｅｇｌ−５４６Ｈと表記する）のアミノ酸配列と従来公知のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列とその同一性を比較するとBacillus lautasPL236株の生産するエンドグルカナーゼＢ（Jorgensen & Hansen, Gene, 93，55-60,1990）との同一性が最も高く、６４．４％であった。次いでBacillus sp. CBS669.39株由来のエンドグルカナーゼ（欧州特許１２７５７１２Ａ２号公報）との同一性は５９％、Bacillus haloduransが生産するエンド−１，４−βグルカナーゼ（Takamiら、Nucleic Acids Res.，28，4317-433，2000）との同一性は５７．７％であり、いずれも本発明の遺伝子からコードされるエンドグルカナーゼと中程度の同一性を示した。このことは、Ｅｇｌ−５４６Ｈが新規なエンド−１，４−βグルカナーゼであることを示唆するものであり、従って配列番号１に示したアミノ酸配列と最大６５％以上の同一性を有するエンド−１，４−βグルカナーゼは本発明に含まれる。
【００１１】
即ち、本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、６５％以上の同一性を有するエンド−１，４−βグルカナーゼを包含するものである。本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列における同一性が、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは８５％以上、最も好ましくは９５％以上であることが望ましい。
尚、ここで述べるアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を１として解析を行うことにより算出される。
【００１２】
本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子又は該塩基配列からなるＤＮＡにストリンジエントな条件下でハイブリダイズするアルカリプロテアーゼをコードするＤＮＡを含有する遺伝子であるものが好ましい。
【００１３】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１４】
本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼは、その遺伝子を例えばバチルス属に属する微生物、好ましくはBacillus sp. KSM-N546株(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９)等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１５】
本発明遺伝子を用いてエンド−１，４−βグルカナーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記エンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からエンド−１，４−βグルカナーゼを採取すればよい。
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１６】
かくして得られた培養物中からのエンド−１，４−βグルカナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１７】
本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。即ち、分子量約６０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、最適反応ｐＨを５付近（酢酸緩衝液）、最適温度を５５℃付近に有することが望ましい。
【００１８】
本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子は、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６株等からクローン化することができる。
【００１９】
（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６株の菌学的性質）
Ａ：形態学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．３〜０．６×１．５〜４．３μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．４〜０．６×０．８〜１．４μｍ、中央準端、膨潤無し
（ｅ）グラム染色：陽性
【００２０】
Ｂ：生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元：陽性
（ｃ）ＶＰテスト：陰性
（ｄ）インドールの生成：陰性
（ｅ）硫化水素の生成：陰性
（ｆ）デンプンの加水分解：陽性
（ｇ）カゼインの加水分解：陰性
（ｈ）ゼラチンの液化：陽性
（ｉ）クエン酸の利用：陽性
（ｊ）プロピオン酸の利用：陰性
（ｋ）チロシン分解：陰性
（ｌ）フェニルアラニン分解：陰性
（ｍ）レシチナーゼ反応：陰性
（ｎ）カタラーゼ：陽性
（ｏ）オキシダーゼ：陽性
（ｐ）生育の温度範囲：１５〜５０℃
（ｑ）生育における酸素の影響：嫌気条件下で生育する。
（ｒ）ｐＨ５．７における生育：生育せず
（ｓ）ｐＨ６．８における生育：生育する
（ｔ）ｐＨ９．０における生育：生育する
（ｕ）グルコースからのガス産生：陰性
（ｖ）塩化ナトリウム耐性：２％塩化ナトリウム存在下で生育する。
（ｗ）糖の資化：グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトールを利用し、酸を生成する。
【００２１】
以上、ＫＳＭ−Ｎ５４６株は耐アルカリ性細菌であり、且つグラム陽性、カタラーゼ陽性の有胞子桿菌であることからバチルス属細菌であると判断された。そこで本菌株の形態学、生理学的性質についてBergey'ｓ manual of Systematic Bacteriology （第９版）に準じ比較検討した結果、本菌株はバチルス  コアギュランスに近縁な菌種であると考えられた。しかし、その性質は既知のバチルス  コアギュランスとは完全には一致せず、他のバチルス属菌の諸性質とも一致しないため、新規なバチルス属細菌として本菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）として寄託した。
【００２２】
上記のＫＳＭ−Ｎ５４６株からのエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【００２３】
また、本発明のエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにエンド−１，４−βグルカナーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２４】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがBacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００２５】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【実施例】
【００２６】
実施例１  エンド−１，４−βグルカナーゼ生産菌のスクリーニング
少量の日本各地の土壌サンプルを１０ｍＬの滅菌水に懸濁し、８０℃、１５分間熱処理した。室温で冷却した後、０．１ｍＬの上清を以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した［３．０％（ｗ／ｖ）トリプティケースソイブロス（ＢＢＬ）、２．０％  リン酸膨潤セルロース（セルロースパウダーＫＣフロック  Ｗ−１００Ｇより調製，日本製紙）（別滅菌）、１．５％  寒天、０．００５％  トリパンブルー（メルク社：別滅菌）、０．０１％炭酸ナトリウム（別滅菌）］。３０℃で７〜１０日間培養し、コロニーの周りにハローを形成したものをアルカリセルラーゼ生産菌株として選択した。
【００２７】
実施例２  バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６株のゲノムＤＮＡの調製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ５４６株の培養は、２．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（大日本製薬）、０．１％カルボキシセルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１％酵母エキス（ディフコ）、１．０％  魚肉エキス（和光純薬）、０．１５％リン酸１カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水塩、０．３％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得られた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００ｘｇ、１５分、５℃）により菌体を回収した。この菌体から斉藤・三浦の方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）によりゲノムＤＮＡを調製した。
【００２８】
実施例３  Ｅｇｌ−５４６Ｈ遺伝子断片のクローニング
Ｎ５４６株のゲノムＤＮＡ（２μｇ）を制限酵素HindIIIで３７℃、一夜完全分解させた後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を２．５μＬの脱イオン水に溶解した。また、予めHindIIIで処理し、脱リン酸化したｐＵＣ１８（タカラバイオ）５０ｎｇをエタノール沈殿し、沈殿を２．５μＬの脱イオン水に溶解した。各溶液を混合し（５μＬ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ キット Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）の溶液Ｉ ５μＬを加え１６℃、３０分間恒温してＤＮＡ連結反応を行った。反応液を用いて E. coli HB101株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、０．５％（ｗ／ｖ）カルボキシルメチルセルロース（関東化学）、０．００５％トリパンブルー（メルク）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。セルラーゼ生産に伴いハローを形成した形質転換体よりHight Pure Plasmid Purification キット（ベーリンガーマンハイム）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型に、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト近傍に相補的なＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ２及びＲＶ（タカラバイオ）を用い塩基配列を３７７ＤＮＡシークエンサー（Ｐ-Ｅ  アプライド・バイオシステムズ）にて決定した。塩基配列を解析した結果、シグナル配列の途中から上流が欠損していることが判明した為、ゲノムＤＮＡを制限酵素BamH Iで処理し、インバースＰＣＲを行った。即ち、Ｎ５４６株のゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）を制限酵素BamH Iにて完全分解した後、エタノールを添加し、得られた沈殿を脱イオン水１０μＬに溶解した。この溶液にＬｉｇａｔｉｏｎ キット Ｖｅｒ．１（タカラバイオ）の溶液Ａを４０μＬ、溶液Ｂを１０μＬ加えて自己閉環を行った後、エタノールを添加し、得られた沈殿を５μＬの脱イオン水に溶解したものを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーは、すでに決定した塩基配列を用いて構築した上流プライマー１（配列番号３）と下流プライマー２（配列番号４）を用いた。ＰＣＲは自己閉環溶液０．５μL、各プライマーを２ｐｍｏｌ用いＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）の説明書に従いを行った。反応条件は、９４℃ ２分間の熱変性後、９４℃ ２０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ４分を１サイクルとし１６サイクル行った。次いで伸張反応時間を徐々に延長する目的で、９４℃ ２０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ４分のサイクルにおいて伸張反応（７２℃  ４分）を１サイクル毎に２０秒間ずつ増加するようにプログラムし、１２サイクル反応させた後、７２℃１０分間放置した。得られたＰＣＲ産物を用い１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約１．６ｋｂの位置にバンドを確認した。ＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification キット（ベーリンガー・マンハイム）を用いて精製し、一部を用いてダイレクトシークエンスを行った。
【００２９】
実施例５  形質転換枯草菌によるＥｇｌ−５４６Ｈの生産
取得したＥｇｌ−５４６Ｈの成熟領域をコードする遺伝子をBacillus sp. KSM-S237株由来アルカリセルラーゼ(Ｅｇｌ−Ｓ２３７)遺伝子（特願平１１−０１３０４９）の上流発現領域と下流発現領域の間に導入した。即ち、予めSma Iで処理したｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）にＥｇｌ−Ｓ２３７遺伝子の上流発現領域からターミネーターを含む領域を連結したプラスミドｐＨＹＳ２３７から以下のようにＥｇｌ-Ｓ２３７の構造遺伝子を除き、そこへＥｇｌ-５４６Ｈの構造遺伝子を挿入することでプラスミドを作製した。
【００３０】
まず、ｐＨＹＳ２３７（約１００ｎｇ）を鋳型とし上流プライマー３（配列番号５）、下流プライマー４（配列番号６）各２０ｐｍｏＬ及びPyrobestポリメラーゼ（タカラバイオ）を用い、ＰＣＲ（反応条件：９４℃  ２０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  ３分を１サイクルとして３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物をHight Pure PCR Purification キット（ベーリンガーマンハイム）にて精製し、ＢＫＬ キット（タカラバイオ）を用いて末端の平滑化並びに５’末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素XbaＩにて処理し、Hight Pure PCR Purification キットで精製を行った。
【００３１】
次に、Ｅｇｌ−５４６Ｈ遺伝子断片の取得は、プライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）を用いＰＣＲ（反応条件：９４℃  ２０秒、６０℃  ３０秒、７２℃  ２分を１サイクルとして３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物をＢＫＬ キットにて末端の平滑化及び５‘末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素XbaＩにて処理し、精製を行った。これら増幅した遺伝子断片をＢＫＬキットに付属のLigation Solutionを用いて連結を行った。このライゲーション溶液を精製、乾燥後３μＬの滅菌脱イオン水に溶かし、全量を用いてプロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行い、ＤＭ３再生培地[０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．３Ｍコハク酸二ナトリウム６水和物、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水和物。０．０１％牛血清アルブミン（シグマ）、０．５％ＣＭＣ（関東化学）０．００５％トリパンブルー（メルク）]上でハローを示すコロニーを目的のＰＣＲ産物を含む形質転換体として選択した。得られた形質転換体を、３．０％（ｗ／ｖ）  ポリペプトンＳ、３．０％  マルトース、０．５％  魚肉エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μｇ／ｍＬ）からなる培地にて３０℃、７２時間振盪培養した。遠心分離により得られた培養上清中のセルラーゼ活性は１．２Ｕ／ｍＬであり、ＳＤＳ電気泳動を行って検出された主要なタンパク質バンドの分子量は、約６０ｋＤaであり、アミノ酸配列から推定される分子量（６１．３ｋＤａ）とほぼ一致した。
【００３２】
実施例６  Ｅｇｌ−５４６Ｈの精製
実施例５により得られた培養液１５０ｍＬを脱イオン水で４倍に希釈した後、予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱトヨパールカラム（２．５×８．５ｃｍ）に添着させた。同緩衝液にて洗浄した後、０．２Ｍ  塩化カリウム濃度まで直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。更に０．５Ｍ塩化カリウムにて吸着タンパク質を溶出させた。Ｅｇｌ活性はこの画分に溶出され、限外濾過膜により濃縮、脱塩を行った。得られた酵素液を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（２．５×４．５ｃｍ）へ添着させた。洗浄溶出後、０．３Ｍ  塩化カリウム濃度まで直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。Ｅｇｌ活性は０．２Ｍ塩化カリウム濃度付近に溶出されこの画分を集めて限外濾過膜にて濃縮し、諸性質を調べるために用いた。
【００３３】
［酵素活性測定法］
０．１ｍＬの０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．４ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃で２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で５分間恒温した。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００３４】
参考例１  Ｅｇｌ−５４６Ｈの最適反応ｐＨ及び温度
クエン緩衝液（ｐＨ４〜７）、リン緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８〜１１）、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１２〜１２．５）の各緩衝液（５０ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、Ｎ５４６ＨセルラーゼはｐＨ５．３のクエン緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中、ＣＭＣ分解に対する最適反応温度は４０℃付近に認められた。
【００３５】
参考例２  Ｅｇｌ−５４６Ｈの基質特異性
Ｅｇｌ−５４６Ｈの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中におけるＣＭＣに対する分解速度を１００％とした場合、リケナン、グルコマンナン並びにペクチンに対し、それぞれ２５１％、１７７％、３８％の相対速度を示した。一方、ラミナリン、カードランには全く作用しなかった。
【配列表】
2005287440000001.app