(57)【要約】      （修正有）【課題】β−アミロイドを感度よく特異的に定量することができる測定法を提供する。【解決手段】β-アミロイドを免疫原として、β-アミロイドまたはその誘導体に結合特異性を有する点で有用かつ新規な抗体、即ちβ-アミロイドのＮ端部、Ｃ端部または中心部をそれぞれ認識するモノクローナル抗体を得た。これら抗体を組み合わせることによりβ−アミロイドを感度よく特異的に定量することができる測定法を提供する。この定量法はβ-アミロイドまたはその誘導体が関与する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の診断に有用であり、本発明の抗体はアルツハイマー病の予防・治療剤の開発に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-アミロイドまたはその誘導体を認識し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）および配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）を認識する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２）を認識し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）および配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）を認識しない請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項５】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ４１３９である請求項４記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項６】
請求項５記載のハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ４４５７である請求項４記載のハイブリドーマ細胞。
【請求項８】
請求項７記載のハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１記載の抗体を用いることを特徴とする被験液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-アミロイドまたはその誘導体に結合特異性を有する点で有用かつ新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づくβ-アミロイドまたはその誘導体の測定法の開発、あるいはβ-アミロイドまたはその誘導体が関与する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の診断あるいはアルツハイマー病の予防・治療剤の開発に有用な抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病による老人性痴呆は大きな社会的問題となっており、アルツハイマー病の診断および治療方法の早期確立が望まれてきた。アルツハイマー病患者の脳に特徴的な病変として、老人斑の過剰な形成および神経原繊維変化が知られており、これらのうち老人斑の主要な構成成分の一つがβ-アミロイドまたはその誘導体である。
β-アミロイドは、約４０個のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイド前駆体蛋白質（Amyloid Precursor Protein：以下、ＡＰＰと称する)の細胞膜貫通領域の近傍にコードされている。β-アミロイドのアミノ酸配列を以下に示す。
〔β-アミロイド（１−３８）〕配列番号：１
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly
〔β-アミロイド（１−３９）〕配列番号：２
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val
〔β-アミロイド（１−４０）〕配列番号：３
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val
〔β-アミロイド（１−４１）〕配列番号：４
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
Ile
〔β-アミロイド（１−４２）〕配列番号：５
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
Ile-Ala
〔β-アミロイド（１−４３）〕配列番号：６
Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-
Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-
Ile-Ala-Thr
【０００３】
最近、家族性アルツハイマー病患者のなかに、ＡＰＰの点突然変異を有する家系が報告されており、β-アミロイドがアルツハイマー病の原因物質の一つである可能性が指摘された。このような背景から、β-アミロイドはアルツハイマー病研究の中心的な課題として極めて精力的に研究され、種々の研究成果が発表されてきた。
しかし、このようにβ-アミロイドに深い関心が寄せられているにもかかわらず、これまでβ-アミロイドを簡便に高感度に検出する測定系に関する報告はほとんど発表されておらず、僅かに、P. Seubertらにより、β-アミロイドのサンドイッチ酵素免疫測定法の報告がなされたに過ぎない（Nature, 359, 325-327, 1992)。このP. Seubertらの測定法の検出感度は100 pg/mlと報告されており、満足できる感度とはいえない。また、該測定法はβ-アミロイドのＮ端２８残基からなる部分ペプチド〔β-アミロイド（１−２８）と略す〕とも反応すると報告されている。しかしながら、β-アミロイドのＣ端部、β-アミロイド（２９−３９）、β-アミロイド（２９−４０）、β-アミロイド（２９−４１）、β-アミロイド（２９−４２）あるいはβ-アミロイド（２９−４３）には疎水的アミノ酸が数多く存在することから、細胞膜に埋め込まれている領域と考えられており、この部分がペプチドの凝集や沈着に重要な役割を果たしていると想定される。このため、Ｃ端部疎水的領域を有するβ-アミロイドを測定することが重要であると言えるが、上記のP. Seubertらの方法は、該特異性および感度の点で、社会的要求を満足していないものである。
【０００４】
通常、ペプチドに対する抗体は、該ペプチドと天然あるいは合成高分子担体との複合体を免疫することにより作製されており、β-アミロイドの場合にも、親水性領域であるβ-アミロイドN端部、例えばβ-アミロイド(1-16)を免疫原としてβ-アミロイド(1-40)と反応する抗体を作製し得ることは、前述したP. Seubertらの報告からも示される。しかしながら、細胞膜に埋め込まれるような疎水的領域であるβ-アミロイドのＣ端部に対する抗体を通常の方法で作製し得るかどうかは明らかではない。さらに、仮にそのような領域に対する抗体が得られたとしても、その抗体がβ-アミロイドと反応するという保証は全くない。さらに、仮にその抗体がβ-アミロイドに対して極めて低い親和性しか示さなかった場合、その抗体を用いて、例えば前述したP. Seubertらの報告したようなサンドイッチ酵素免疫測定法を構築し得ること期待することは一般的には困難である。即ち、これまでにも、β-アミロイドの検出を目的としてさまざまな抗体が作製されてきたにもかかわらず、β-アミロイドＣ端部に対する抗体を作製し、該抗体をサンドイッチ-免疫測定法に適用することにより、β-アミロイド（１−２８）と交差反応することなしにβ-アミロイドを高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発したという報告はない。また、β-アミロイド（２５−３５）は、タヒキニンとアミノ酸配列上の類似性が存在し、細胞毒性を有することが報告されている(B. A. Yankner et. al. Science, 250, 279-282, 1990)。しかしながら、β-アミロイド（２５−３５）に対する抗体を作製し、該抗体をサンドイッチ-免疫測定法に適用することにより、β-アミロイド（１−２８）と交差反応することなしにβ-アミロイドを高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発したという報告は全くない。  さらに最近では、β-アミロイドのなかでも、大脳実質中（老人斑）にはβ-アミロイド（１−４２）が主に沈着し、一方脳血管にはβ-アミロイド（１−４０）が主に沈着する（アミロイドアンギオパチー）ことが報告されている（アーチブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys.）, 301, 41-53, 1993）。また、β-アミロイド（１−４２）、β-アミロイド（２６−４２）、β-アミロイド（２６−４３）、β-アミロイド（３４−４２）などのＣ端部分を含むペプチドが種となって、水溶性のβ-アミロイド（１−４０）などの沈着を招くことなどが示唆されている（バイオケミストリー（Biochemistry）, 32, 4693-4697, 1993）。このような報告から、β-アミロイド（１−４０）とβ-アミロイド（１−４２）との沈着様式の相違がアルツハイマー病に大きく関与していると考えられる。したがって、アルツハイマー病の診断を行うには、β-アミロイド（１−４０）とβ-アミロイド（１−４２）とを感度良く分別定量することが重要な課題となってくる。しかしながら、このような課題を解決できる抗体は未だ報告されていない。
【非特許文献１】P. Seubertら「Nature」, 359, 325-327, 1992年
【非特許文献２】B. A. Yankner ら「Science」, 250, 279-282, 1990年
【非特許文献３】「アーチブス  オブ  バイオケミストリー  アンド  バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophys.）」, 301, 41-53, 1993年
【非特許文献４】「バイオケミストリー（Biochemistry）, 32, 4693-4697, 1993」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｃ端部疎水的領域を有するβ−アミロイドまたはその誘導体を感度よく特異的に定量することができる新規抗体、好ましくはモノクローナル抗体、および該抗体を用いるβ−アミロイドまたはその誘導体の測定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、β-アミロイドまたはその誘導体の異なる部分を認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用いるβ-アミロイドの優れた測定法を開発した。そして、さらに研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、β-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、β-アミロイドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体、β-アミロイドまたはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドーマ細胞の製造法、該抗体を用いた競合法あるいはサンドイッチ法によるβ-アミロイドおよびその誘導体の免疫測定法（アルツハイマー病などの診断方法）に関する。
【０００７】
さらに詳しくは、本発明者らはβ-アミロイド（２５−３５）、β-アミロイド（３５−４３）、β-アミロイド（１−４０）およびβ-アミロイド（１−１６）を免疫原として、モノクローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせることにより、β-アミロイド（１−２８）と交差反応することなしにβ-アミロイドまたはその誘導体を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。すなわち、β-アミロイド（２５−３５）、β-アミロイド（３５−４３）およびβ-アミロイド（１−４０）を免疫原としてβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端部を認識するモノクローナル抗体、例えばＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａおよびＢＣ−０５ａを確立した。それらのうち、ＢＳ−８５ａおよびＢＡ−２７ａは、標識化したβ-アミロイドを用いる競合法免疫測定法ではいずれもβ-アミロイドに対して極めて低い親和性しか示さないにもかかわらず、β-アミロイドのＮ端部（β-アミロイド（１−１６））に対するモノクローナル抗体のなかから特に選択された２種類の抗体、すなわちＢＡＮ−０５２ａおよびＢＡＮ−５０ａと組み合わせることにより、β-アミロイドに対して極めて高感度なサンドイッチ-免疫測定法を提供できることが明かとなった。また、ＢＣ−０５ａとＢＡＮ−５０ａとを組み合わせたサンドイッチ−免疫測定法は、β-アミロイド（１−４０）と交差反応することなく、アルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中のβ-アミロイドを高感度に検出することが明かとなった。さらに、本発明者らは、β-アミロイドまたはその誘導体の中心部分の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体、例えばＢＰ−９０ａを確立した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の大きな特徴の１つは、β-アミロイド（１−４０）とβ-アミロイド（１−４２）とを高感度に分別定量することができるサンドイッチ定量法を提供できることである。すなわち、ＢＡ−２７ａとＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａとを組み合わせたサンドイッチ定量法ではβ-アミロイド（１−４０）を検出できるがβ-アミロイド（１−４２）は検出しない、またＢＣ−０５ａとＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａとを組み合わせたサンドイッチ定量法ではβ-アミロイド（１−４２）を検出できるがβ-アミロイド（１−４０）は検出しない、さらにＢＳ−８５ａとＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａとを組み合わせたサンドイッチ定量法ではβ-アミロイド（１−４０）およびβ-アミロイド（１−４２）を検出することができる。したがって、本発明のモノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチ定量法によって、β-アミロイド（１−４０）とβ-アミロイド（１−４２）とを高感度に分別定量することができる。このような技術は、公知技術からは全く類推できない驚くべき知見である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
より具体的には、本発明は、
（１）β-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体、
（２）抗体が配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないことを特徴とする第（１）項記載の抗体、
（３）抗体が配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識するが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないことを特徴とする第（１）項記載の抗体、
（４）抗体が配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とする第（１）項記載の抗体、
（５）抗体がモノクローナル抗体である第（１）ないし（４）項記載の抗体、
（６）第（５）項記載モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（７）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび（または）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とするβ-アミロイドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するＢＡＮ−０５２ａで標示されるモノクローナル抗体、
（８）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび（または）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とするβ-アミロイドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とするＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体、
（９）第（７）項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（１０）第（８）項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（１１）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識せず、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とするβ-アミロイドまたはその誘導体に特異的に反応する抗体、
（１２）抗体がモノクローナル抗体である第（１１）項記載の抗体、
（１３）第（１２）項記載モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（１４）第（１）、第（７）、第（８）または第（１１）項記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法、
（１５）第（１）項記載の抗体と、第（７）または第（８）項記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中のβ-アミロイドの定量法、
（１６）第（１１）項記載の抗体と、第（１）、第（７）または第（８）項記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中のβ-アミロイドの定量法および
（１７）アルツハイマー病の診断に用いられる第（１４）〜（１６）項記載の定量法に関する。
上記（１）の好ましい態様は、
（１８）β-アミロイドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（１）項記載の抗体、
（１９）β-アミロイドの誘導体が  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第２番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第３番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドであってＮ端のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換したペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第４番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは  配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである第（１）項記載の抗体、
（２０）β-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドのＣ端側の部分ペプチドが、β-アミロイドのＮ端のアミノ酸から数えて２５番目以降のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである第（１）項記載の抗体、
（２１）抗体が配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないことを特徴とする第（１）、（１８）ないし（２０）項記載の抗体、
（２２）抗体が配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とする第（１）、（１８）ないし（２１）項記載の抗体および
（２３）抗体が配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とする第（１）、（１８）ないし（２１）項記載の抗体である。
【００１０】
上記（２）の好ましい態様は、
（２４）配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないことを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドおよび（または）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および
（２５）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドを認識することを特徴とする第（２４）項記載の抗体である。
上記（３）の好ましい態様は、
（２６）配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識するが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないことを特徴とする配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドおよび（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体である。
上記（４）の好ましい態様は、
（２７）配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識しないが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とするアルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中に含まれるβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（２８）アルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中に含まれるβ-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドである第（２７）項記載の抗体および
（２９）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドおよび配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ-アミロイドを認識しないことを特徴とする第（２８）項記載の抗体である。
【００１１】
上記（５）の好ましい態様は、
（３０）ＢＡ−２７ａで標示される第（２４）または（２５）項記載のモノクローナル抗体、
（３１）ＢＳ−８５ａで標示される第（２６）項記載のモノクローナル抗体および
（３２）ＢＣ−０５ａで標示される第（２７）ないし（２９）項記載のモノクローナル抗体である。
特に、
（３３）β-アミロイドまたはその誘導体のサンドイッチ法酵素免疫測定法による定量に用いられる第（１）ないし（５）および第（１８）ないし（３２）項記載の抗体が好ましい。
上記（６）の好ましい態様は、
（３４）第（３０）項記載モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（３５）第（３１）項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞および
（３６）第（３２）項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
上記（７）および（８）の好ましい態様としては、
（３７）β-アミロイドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（７）または（８）項記載のモノクローナル抗体、
（３８）β-アミロイドの誘導体が  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第２番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第３番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドであってＮ端のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換したペプチドまたは  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第４番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドである第（７）または（８）項記載の抗体および
（３９）β-アミロイドまたはその誘導体のサンドイッチ法酵素免疫測定法による定量に用いられる第（７）、（８）、（３７）または（３８）項記載の抗体である。
【００１２】
上記（１１）の好ましい態様としては、
（４０）β-アミロイドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（１１）項記載の抗体、
（４１）β-アミロイドの誘導体が  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第２番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第３番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドであってＮ端のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換したペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第４番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは  配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである第（１１）項記載の抗体、
（４２）β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである第（１１）項記載の抗体、
（４３）β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：３で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである第（１１）項記載の抗体、
（４４）抗体が配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを認識することを特徴とする第（１１）、（４０）ないし（４３）記載の抗体および
（４５）β-アミロイドまたはその誘導体のサンドイッチ法酵素免疫測定法による定量に用いられる第（１１）、（４０）ないし（４４）項記載の抗体である。
上記（１２）の好ましい態様としては、
（４６）ＢＰ−９０ａで標示される第（１２）項記載のモノクローナル抗体である。
上記（１３）の好ましい態様としては、
（４７）第（４６）項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
【００１３】
上記（１４）の好ましい態様としては、
（４８）第（１）、第（７）、第（８）または第（１１）項記載の抗体と、被検液および標識化β-アミロイドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化β-アミロイドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法である。
上記（１５）の好ましい態様としては、
（４９）担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体、標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とし、担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方が第（１）項記載の抗体であり、他方が配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する抗体であることを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法、
（５０）配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する抗体がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体である第（４９）項記載の定量法、
（５１）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体である第（４９）項記載の定量法、
（５２）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＡ−２７ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（４９）項記載の定量法、
（５３）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＳ−８５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドおよび（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（４９）項記載の定量法および
（５４）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（４９）項記載の定量法である。
【００１４】
上記（１６）の好ましい態様としては、
（５５）担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体、標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とし、担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方が第（１１）項記載の抗体であり、他方が第（１）項記載の抗体または配列番号：７もしくは配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する抗体であることを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法、
（５６）配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する抗体がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体である第（５５）項記載の定量法、
（５７）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａ、ＢＣ−０５ａ、ＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体である第（５５）項記載の定量法、
（５８）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、および（または）配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである第（５５）項記載の定量法および
（５９）担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである第（５５）項記載の定量法である。
【００１５】
なお、本発明で得られた抗β-アミロイド抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、ＢＡＮ−０５２、ＢＡ−２７およびＢＳ−８５は平成４年１２月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、そして平成５年１月７日から通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（ＮＩＢＨ）に以下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞    ＩＦＯ              FERM-BP(NIBH)
ＢＡＮ−０５２  ５０３８６              ４１３８
ＢＡ−２７      ５０３８７              ４１３９
ＢＳ−８５      ５０３８８              ４１４０
また、本発明で得られたハイブリドーマ細胞のうち、ＢＡＮ−５０は平成５年１月８日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に、そして平成５年１月２７日から通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（ＮＩＢＨ）に以下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞    ＩＦＯ              FERM-BP(NIBH)
ＢＡＮ−５０    ５０３９０              ４１６３
さらに、本発明で得られたハイブリドーマ細胞のうち、ＢＣ−０５およびＢＰ−９０は平成５年１１月２日から通商産業省工業技術院生命工学技術研究所（ＮＩＢＨ）に以下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞                        FERM-BP(NIBH)
ＢＣ−０５                              ４４５７
ＢＰ−９０                              ４４５８
なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後にａを付けた形で表している。
【００１６】
本明細書において用いられる配列番号のうち、配列番号：１〜配列番号：１２は、以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。
〔配列番号：１〕β−アミロイド（１−３８）
〔配列番号：２〕β−アミロイド（１−３９）
〔配列番号：３〕β−アミロイド（１−４０）
〔配列番号：４〕β−アミロイド（１−４１）
〔配列番号：５〕β−アミロイド（１−４２）
〔配列番号：６〕β−アミロイド（１−４３）
〔配列番号：７〕β−アミロイド（１−２８）
〔配列番号：８〕β−アミロイド（２５−３５）
〔配列番号：９〕β−アミロイド（３５−４３）
〔配列番号：１０〕β−アミロイド（１−１６）
〔配列番号：１１〕β−アミロイド（１７−２８）
〔配列番号：１２〕β−アミロイド（１８−２８）
【００１７】
本発明におけるβ-アミロイドとしては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４１）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２）または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４３）などが用いられる。
本発明におけるβ−アミロイドの誘導体としては、上記β−アミロイドのＮ端部のアミノ酸がそれぞれ１ないし１７残基程度欠落したもの、Ｌ−アスパラギン酸がＬ−イソアスパラギン酸、Ｄ−イソアスパラギン酸またはＤ−アスパラギン酸に異性化したもの、Ｎ端部にピログルタミン酸を有するものなどが用いられる。具体的には、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第２番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第３番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチドであってＮ端のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換したペプチド、  配列番号：５で表されるアミノ酸配列の第４番目〜４２番目のアミノ酸配列を有するペプチド、  配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、β-アミロイド（１７−４０）、β-アミロイド（１８−４０）など）などが用いられる。これらのβ−アミロイドまたはその誘導体は、例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物より自体公知の方法で調製することもできるし、また市販の天然精製標品であってもよい。
【００１８】
本発明におけるβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドとしては、例えばβ-アミロイドのＮ端のアミノ酸から数えて２５番目以降のアミノ酸配列を有する部分ペプチドが挙げられる。
本発明におけるβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）としては、例えばβ-アミロイドまたはその誘導体を認識するが、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（１−２８）で表されるβ-アミロイドのＮ端側の部分ペプチド）を認識しない抗体などが用いられる。より具体的には、これらの抗体の中でも、
（ｉ）配列番号：８および配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（２５−３５）およびβ-アミロイド（３５−４３））を認識しない抗体、
（ii）配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（２５−３５））を認識する抗体、より好ましくは配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（２５−３５））を認識するが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（３５−４３））を認識しない抗体、
（iii）配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（３５−４３））を認識する抗体、より好ましくは配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（２５−３５））を認識しないが、配列番号：９で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β-アミロイド（３５−４３））を認識する抗体などが好ましい。
【００１９】
上記（ｉ）の抗体の中でも、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）および（または）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）を特に認識する抗体が好ましく、さらには配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２）を認識する抗体が好ましい。
また、上記（ii）の抗体の中でも、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）および（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２）を特に認識する抗体が好ましい。
さらに、上記（iii）の抗体の中でも、アルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中に含まれるβ-アミロイド（特に、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２））を特に認識する抗体が好ましく、さらには配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４２）を認識するが、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３８）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−３９）および配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４０）を認識しない抗体が好ましい。
上記（ｉ）の抗体の代表例としては、ＢＡ−２７ａで標示されるモノクローナル抗体があり、上記（ii）の抗体の代表例としては、ＢＳ−８５ａで標示されるモノクローナル抗体があり、上記（iii）の抗体の代表例としては、ＢＣ−０５ａ、ＢＣ−１５ａ、ＢＣ−６５ａ、ＢＣ−７５ａ、ＢＣ−５５ａ（特に、ＢＣ−０５ａが好ましい）で標示されるモノクローナル抗体がある。
【００２０】
次に、本発明におけるβ-アミロイドまたはその誘導体のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、例えば配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（β−アミロイド（１−２８））および（または）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（β−アミロイド（１−１６））を認識するモノクローナル抗体が用いられ、具体的にはＢＡＮ−５０ａ、ＢＡＮ−０５２ａ、ＢＡＮ−１１ａ、ＢＡＮ−３０ａ、ＢＡＮ−２０ａ、ＢＡＮ−４０ａで標示されるモノクローナル抗体などがあるが、特にＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体が特に好ましい。
さらに、本発明におけるβ-アミロイドまたはその誘導体の中心部の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、例えば配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識せず、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴とするβ-アミロイドまたはその誘導体に特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。これら抗体のなかでも、配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドを特に認識する抗体が好ましく、なかでも配列番号：３で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列（配列番号：１１のアミノ酸配列）または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列（配列番号：１２のアミノ酸配列）を有するペプチドを特に認識する抗体が好ましい。具体的には、ＢＰ−０１ａ、ＢＰ−０２ａ、ＢＰ−０３ａまたはＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体などが用いられる。これらモノクローナル抗体のうち、ＢＰ−０３ａおよびＢＰ−９０ａは配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドをも認識することができる。これらモノクローナル抗体のなかでも、特にＢＰ−９０ａが好適である。
【００２１】
以下に、抗原の調製方法およびモノクローナル抗体の作成方法について詳細に説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えばβ−アミロイドまたはその誘導体、β−アミロイドまたはその誘導体を加水分解して得られる部分ペプチド、β−アミロイドと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にβ−アミロイド抗原と称することもある）。
該β−アミロイドまたはその誘導体としては、前述したものが用いられる。これらβ−アミロイドまたはその誘導体は、例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製することもできるし、また市販の天然精製標品であってもよい。
該β−アミロイドを加水分解して得られる部分ペプチドとしては、例えば配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するβ−アミロイド（１−４３）などをアミノペプチダーゼやカルボキシペプチダーゼなどのエキソプロテアーゼによりＮ末端および（または）Ｃ末端から順次加水分解して得られる部分ペプチドまたはそれらの混合物、あるいはβ−アミロイド（１−４３）を種々のエンドペプチダーゼにより加水分解して得られる部分ペプチドまたはそれらの混合物などが用いられる。この方法でβ−アミロイド（１−４２）を作製した場合、標品中にβ−アミロイド（１−４１）および（または）β−アミロイド（１−４３）が混合している場合がある。
該合成ペプチドとしては、例えば上述した天然より精製したβ−アミロイド抗原と同一の構造を有するものや、β−アミロイド（１−４３）などのアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチド（以下β−アミロイド関連合成ペプチドと略す）などが用いられる。
上記合成ペプチドは、公知の常套手段で製造することができ、固相合成法、液相合成法のいずれによっても製造することができる。具体的な、ペプチド合成の方法としては、例えばB. Merrifield〔ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイェティ（J. Am. Chem. Soc.）,85. 2149(1963)〕、M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti〔ペプチド  シンセーシス（Peptide Synthesis）, Intｅrscience Publishers, New York,1966年〕、SchroderおよびLubke〔ザ  ペプチド（The Peptide）, Academic Press，New York, 1965年〕、泉屋信夫他〔ペプチド合成の基礎と実験、丸善、1985年〕、矢島治明および榊原俊平〔生化学実験講座１、タンパク質の化学IV, 205,1977年〕などが用いられる。例えば、固相法によりβ−アミロイドあるいはβ−アミロイド関連合成ペプチドを合成する場合には、不溶性樹脂として当該技術分野で知られたもの（例えば、クロロメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂など）の何れかの樹脂を用い、β−アミロイドあるいはβ−アミロイド関連合成ペプチドのＣ末端側から保護アミノ酸を常法に従って順次縮合する。次いで、フッ化水素処理で全保護基を除去して、高速液体クロマトグラフィーなどのそれ自体公知の方法による精製後、目的とするβ−アミロイドあるいはβ−アミロイド関連合成ペプチドを得ることができる。また、Ｎ−保護アミノ酸としては、α−アミノ基はＢｏｃ基で保護し、さらに例えばセリンおよびスレオニンの水酸基はＢｚｌ基で保護し、グルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボキシル基はＯＢｚｌ基で保護し、リジンのε−アミノ基はＣｌ−Ｚ基で保護し、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基で保護し、アルギニンのグアニド基はＴｏｓ基で保護し、ヒスチジンのイミダゾール基はＢｏｍ基で保護する方法で製造することができる。
【００２２】
本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
ＰＡＭ    ：フェニルアセタミドメチル
Ｂｏｃ    ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ  ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル
Ｂг−Ｚ  ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル
Ｂｚｌ    ：ベンジル
ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル
ＯＢｚｌ  ：ベンジルエステル
Ｔｏｓ    ：ｐ−トルエンスルホニル
ＨＯＢｔ  ：１−ベンゾトリアゾール
ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル
Ｂｏｍ    ：ベンジルオキシメチル
ＤＣＣ    ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｇｌｙ    ：グリシン
Ａｌａ    ：アラニン
Ｖａｌ    ：バリン
Ｌｅｕ    ：ロイシン
Ｉｌｅ    ：イソロイシン
Ｓｅｒ    ：セリン
Ｔｈｒ    ：スレオニン
Ｃｙｓ    ：システイン
Ｍｅｔ    ：メチオニン
Ｇｌｕ    ：グルタミン酸
Ａｓｐ    ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ    ：リジン
Ａｒｇ    ：アルギニン
Ｈｉｓ    ：ヒスチジン
Ｐｈｅ    ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ    ：チロシン
Ｔｒｐ    ：トリプトファン
Ｐｒｏ    ：プロリン
Ａｓｎ    ：アスパラギン
Ｇｌｎ    ：グルタミン。
【００２３】
β−アミロイド抗原は、凝集しやすいため、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、該β−アミロイド抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体および担体（キャリアー）とβ−アミロイド抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させたβ−アミロイド抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ,Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
【００２４】
（２）モノクローナル抗体の作製
β−アミロイド抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラットなどが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、β−アミロイド抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗β−アミロイドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗β−アミロイド抗体価の測定は、例えば後記の標識化β−アミロイドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５  （１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗β−アミロイド抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばβ−アミロイドあるいはβ−アミロイド関連合成ペプタイドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗β−アミロイドモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したβ−アミロイドを加え、固相に結合した抗β−アミロイドモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗β−アミロイドモノクローナル抗体の選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗β−アミロイド抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗β−アミロイドモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
また、β−アミロイドの一部領域と反応する抗β−アミロイド抗体を産生するハイブリドーマおよび、β−アミロイドとは反応するがその一部領域とは反応しない抗β−アミロイドモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別はたとえばその一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
以上のようにして得られる  本発明のβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体、  ＢＡＮ−０５２ａで標示されるモノクローナル抗体、  ＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体および  β-アミロイドまたはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体は、それぞれβ-アミロイドのＮ端側、Ｃ端側および中心部分の部分ペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
【００２５】
すなわち、本発明は、
（１）本発明のβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体と、被検液および標識化β-アミロイドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化β-アミロイドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法、
（２）担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体、標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のβ-アミロイドまたはその誘導体の定量法であって、担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方がβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体であり、他方が配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β−アミロイド（１−２８））および（または）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β−アミロイド（１−１６））を認識する抗体である定量法、
（３）担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体、標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とし、担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方がβ-アミロイドまたはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体であり、他方がβ-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体または配列番号：７もしくは配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する抗体である定量法を提供する。
【００２６】
より具体的には、β-アミロイドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体がＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β−アミロイド（１−２８））および（または）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（すなわち、β−アミロイド（１−１６））を認識する抗体がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体である。
上記の定量法（２）の中でも、特に
担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方がＢＡ−２７ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである定量法、
担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方がＢＳ−８５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである定量法、あるいは
担体上に不溶化したβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体および標識化されたβ-アミロイドまたはその誘導体に対する抗体の一方がＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドが配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである定量法が好適である。
上記の定量法（３）の中でも、特に
担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡＮ−０５２ａまたはＢＡＮ−５０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、および（または）配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである定量法、あるいは
担体上に不溶化したβ-アミロイドに対する抗体および標識化されたβ-アミロイドに対する抗体の一方がＢＰ−９０ａで標示されるモノクローナル抗体であり、他方がＢＡ−２７ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＣ−０５ａで標示されるモノクローナル抗体であり、β-アミロイドまたはその誘導体が配列番号：１〜配列番号：６で表されるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配列または第１番目〜１７番目のアミノ酸配列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドである定量法が好適である。
【００２７】
以下に本発明のβ−アミロイドまたはその誘導体（以下、β−アミロイドと略称する）の定量法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。
本発明の抗体はβ−アミロイドを認識することができるので、β−アミロイドの測定あるいは組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａｂ'）2、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画分などを用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、β−アミロイド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法、サンドイッチ法などが好適に用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいはβ−アミロイドと標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化した抗β−アミロイド抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化抗β−アミロイド抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のβ−アミロイド量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法によるβ−アミロイドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる抗β−アミロイド抗体とはβ−アミロイドの該抗体と結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、例えば１次反応で用いられる抗体がβ−アミロイドのＮ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体は、好ましくはＮ端側の部分ペプチド以外（すなわち、Ｃ端側の部分ペプチド）を認識する抗体が用いられる。
【００２８】
具体的に、本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられるβ−アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、β−アミロイド（１−４０）を免疫原として作製したモノクローナル抗体のうち、β−アミロイド（１−２８）と交差反応しない抗体が好適に用いられる。本発明者らは、このような抗体を産生するハイブリドーマを２種類確立した。これらのハイブリドーマが産生する抗体は、後述するβ−ガラクトシダーゼ標識化β−アミロイド（１−４０）を用いる競合法の酵素免疫測定法において、β−アミロイド（１−２８）と交差反応しなかったが、β−アミロイド（１−４０）と反応した（Ｂ／Ｂ。＝０．５を与える抗原濃度：２００〜２５０ｎＭ、４０〜５０ｎｇ/well）。さらに、後述するβ−アミロイド（１−１６）を免疫原として作製したβ−アミロイドのＮ端側の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体のうち、特にＢＡＮ−５０ａまたはＢＡＮ−０５２ａと組み合わせたサンドイッチ法に用いた場合、予想外にもβ−アミロイドをより高感度に測定できることが明らかとなった（検出感度、０．２ｐｇ/well）。すなわち、本発明のサンドイッチ法酵素免疫測定法に適したβ−アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体の１種類として、β−アミロイド（１−４０）に反応し、β−アミロイド（１−２８）と交差反応しないモノクローナル抗体が好適に用いられるが、それらの抗体は必ずしもβ−アミロイド（１−４０）に対して高親和性である必要はない。このような抗体として、例えば、ＢＡ−２７ａなどが好都合に用いられる。
また、本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられるβ−アミロイドのＣ端側の部分ペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体としては、β−アミロイド（２５−３５）を免疫原として作製した抗体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を産生するハイブリドーマを５種類確立した。これらの抗体は、後述するβ−ガラクトシダーゼ標識化β−アミロイド（１−４０）を用いる競合法の酵素免疫測定法において、β−アミロイド（２５−３５）と反応し（Ｂ／Ｂ。＝０．５を与える抗原濃度：２０ｎＭ、１ｎｇ/well）、β−アミロイド（１−４０）とも反応した（Ｂ／Ｂ。＝０．５を与える抗原濃度：８００ｎＭ、１６０ｎｇ/well）。さらに、上述したＢＡＮ−５０ａまたはＢＡＮ−０５２ａと組み合わせたサンドイッチ法に用いた場合、予想外にもβ−アミロイドをより高感度に測定できることが明らかになった（検出感度、３ｐｇ/well）。すなわち、本発明のサンドイッチ法酵素免疫測定法においては、β−アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体として、β−アミロイド（２５−３５）に対するモノクローナル抗体が好適に用いられるが、これらの抗体は必ずしもβ−アミロイド（１−４０）に高親和性である必要はない。このような抗体として、例えば、ＢＳ−８５ａが好都合に用いられる。
なお、ＢＳ−８５ａとＢＡＮ−５０ａあるいはＢＡＮ−０５２ａとを組み合わせたサンドイッチ法、あるいはＢＡ−２７ａとＢＡＮ−５０ａあるいはＢＡＮ−０５２ａとを組み合わせたサンドイッチ法において、β−アミロイド（１−２８）との交差反応性は認められなかった。
【００２９】
さらに、本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられるβ−アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、β−アミロイド（３５−４３）を免疫原として作製した抗体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を産生するハイブリドーマを１８種作製した。なかでも４種類の抗体は、後述するパーオキシダーゼ標識化β−アミロイド（３５−４３）を用いる競合法の酵素免疫測定法において、森らの方法（ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、２６７巻，１７０８２−１７０８６ページ，１９８８年）によりアルツハイマー病患者脳から抽出したβ−アミロイド画分（ギ酸抽出物）に対して高い反応性を示す一方、合成ペプチドであるβ−アミロイド（１−４０）とは反応性を示さなかった。これらの抗体をＢＡＮ−５０ａと組み合わせたサンドイッチ法に用いた場合、上述したアルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中のβ−アミロイドを高感度に検出し、β−アミロイド（１−４０）については全く検出しないことが明かとなった。なお、用いたアルツハイマー病患者の脳ギ酸抽出物中のβ−アミロイドは、質量分析からβ−アミロイド（１−４２）が主要な構成成分であることがわかっており、さらにＮ端部にピログルタミン酸を有するβ−アミロイド（３−４２）や、β−アミロイド（２−４２）、β−アミロイド（４−４２）をはじめとするＮ端部が順次欠落した分子種を含むことが明らかにされた。
一方、本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられるβ−アミロイドのＮ端側の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体としては、β−アミロイド（１−１６）を免疫原として作製した抗体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を産生するハイブリドーマを８種類作製した。これらの抗体のβ−アミロイド（１−４０）に対する反応性を後述するパーオキシダーゼ標識化β−アミロイド（１−１６）を用いる競合法により調べたところ、４種類の抗体がβ−アミロイド（１−４０）に良好な反応性を有していた（Ｂ／Ｂ。＝０．５を与える抗原濃度：２５〜７０ｎＭ、５〜１５ｎｇ/well）。さらに、これらの抗体をサンドイッチ法に適用した場合、これら抗体の間で予想外にも大きな感度の差が認められた。すなわち、モノクローナル抗体ＢＡＮ−０５２ａが他の３種類（ＢＡＮ−１１ａ、ＢＡＮ−２０ａ、ＢＡＮ−３０ａ）の抗体と比較して群を抜いて高感度のサンドイッチ−測定法を与えることが明らかとなった。そこで、サンドイッチ法にさらに適した抗β−アミロイド（１−１６）モノクローナル抗体を選択すべく新たに１６種類の抗体を作製した。パーオキシダーゼ標識化β−アミロイド（１−１６）を用いる競合法により調べたところ、これらの抗体のうち１０種類の抗体がβ−アミロイド（１−４０）に良好な反応性を有していたが、そのなかでも特にＢＡＮ−５０ａが極めて高感度のサンドイッチ−測定法を与えることが明らかとなった。すなわち、本発明において、サンドイッチ法に適したβ−アミロイドのＮ端側の部分ペプチドを認識する抗体として、β−アミロイド（１−１６）に対する抗体を数種類提供するが、特にＢＡＮ−５０ａおよびＢＡＮ−０５２ａが好適に用いられる。
さらに、本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられるβ−アミロイドの中心部分の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体としては、配列番号：１２で表されるβ−アミロイド（１８−２８）を免疫原として作製した抗体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を産生するハイブリドーマを９種類作製した。なかでも、ＢＰ−０１、ＢＰ−０２、ＢＰ−０３、ＢＰ−９０の４つのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体ＢＰ−０１ａ、ＢＰ−０２ａ、ＢＰ−０３ａ、ＢＰ−９０ａが好適であり、ＢＰ−０３ａおよびＢＰ−９０ａは配列番号：１１で表されるβ−アミロイド（１７−２８）をも認識することができる。これらモノクローナル抗体のなかでも、特にＢＰ−９０ａが好適である。
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどにも用いることもができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、ＢおよびＦいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法や、第１抗体として固相化抗体を用いるかあるいは第１抗体は可溶性のものを用い、第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法などが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてβ−アミロイドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ］（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ］（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法によりβ−アミロイドの測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、β-アミロイドまたはその誘導体を感度良く定量することができるので、アルツハイマー病の診断剤等として有用である。
【実施例１】
【００３１】
抗原の作成
（１）β−アミロイド（１−４０）の製造
市販のBoc-Val-OCH2-PAM樹脂(アプライド バイオシステムズ社製) ０．７１ｇ（０．５ミリモル）を用い、ペプチド合成機(アプライド バイオシステムズ社製モデル430A)を使用し合成した。樹脂上のBoc基を５０％トリフルオロ酢酸/塩化メチレンで処理しアミノ基を遊離させた後、このアミノ基に各２ミリモルのBoc-Gly, Boc-Val, Boc-Met, Boc-Leu, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asn, Boc-Asp(OcHex), Boc-Glu(OcHex), Boc-Phe, Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ser(Bzl), Boc-Arg(Tos) をβ−アミロイド（１−４０）のアミノ酸配列通りにHOBt/DCCで活性化して縮合し、保護β−アミロイド（１−４０)-OCH2-PAM樹脂２．７０ｇを得た。この保護β−アミロイド（１−４０)-OCH2-PAM樹脂０．５６ｇをｐ-クレゾール共存下無水弗化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し残渣をエーテル１０ｍｌで２回洗浄した。これを５０％−酢酸水で抽出し、不溶物を濾去し５０％−酢酸水で洗浄した。濾液、洗浄液を合わせ、２〜３ｍｌに減圧濃縮し、５０％−酢酸水で充填したセファデックスＧ−２５のカラム（2.0×85cm）に付し、同溶媒で展開した。主要画分を集め凍結乾燥し黄白色の粉末約１５０ｍｇを得た。これを２０％−アセトニトリル水（０．１％トリフルオロ酢酸含有）５０ｍｌに溶解し、同溶媒で充填したLiChroprep  ＲＰ−１８カラム（4.1×10cm）に付し、２０％〜７０％までのアセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸含有)の直線型濃度勾配溶出した。主要画分を集め再度LiChroprep  ＲＰ−１８カラム（2.6×6cm）に付し、０％〜５０％までのアセトニトリル水溶液（０．１％トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出、主要画分を集め凍結乾燥し白色粉末１０ｍｇを得た。
アミノ酸分析値:
Gly 6.85(6), Ala 3.44(3), Val 5.68(6), Leu 2.00(2), Ile 1.39(2), Met 0.89(1), Phe 3.21(3), Ser 1.89(2), Asp 4.35(4), Glu 4.52(4), Lys 2.05(2), His 2.86(3), Arg 1.10(1), Tyr 0.97(1)
質量分析による(M+H)+  ４３２８．０５
ＨＰＬＣ溶出時間  ２２．８分
カラム条件
カラム：Wakosil−５Ｃ１８  ＨＧ  （４．６×１００ｍｍ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水溶液）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶質（５０分）
流  速：１．０  ｍｌ／分。
【００３２】
（２）［Cys17］β−アミロイド（１−１６）の製造
市販のBoc-Cys(MeBzl)−OCH2-PAM樹脂(アプライド バイオシステムズ社製) ０．７５ｇ（０．５ミリモル）を用い、ペプチド合成機(アプライド バイオシステムズ社製モデル430A)を使用し合成した。樹脂上のBoc基を５０％トリフルオロ酢酸/塩化メチレンで処理しアミノ基を遊離させた後、このアミノ基に各２ミリモルのBoc-Lys(Cl-Z), Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Val, Boc-Glu(OcHex), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asp(OcHex), Boc-Arg(Tos), Boc-Phe を［Cys17］β−アミロイド（１−１６）のアミノ酸配列通りにHOBt/DCCで活性化して縮合し、保護 ［Cys17］βーアミロイド（１−１６)（ＭｅＢｚｌ）-OCH2-PAM樹脂１．９０ｇを得た。この保護 ［Cys17］β−アミロイド（１−１６)（ＭｅＢｚｌ）-OCH2-PAM樹脂０．６８ｇをｐ-クレゾール共存下無水弗化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し残渣をエーテル１０ｍｌで２回洗浄した。これを５０％−酢酸水で抽出し、不溶物を濾去し５０％−酢酸水で洗浄した。濾液、洗浄液を合わせ、１〜２ｍｌに減圧濃縮し、５０％−酢酸水で充填したセファデックスＧ−２５（2.0×85cm）のカラムに付し、同溶媒で展開した。主要画分を集め凍結乾燥し、白色の粉末１３６．７ｍｇを得た。
アミノ酸分析値:
Asp 2.17(2), Ser 0.96(1), Glu 3.04(3), Gly 1.00(1), Ala 1.00(1), Cys 0.82(1), Val 0.99(1), Tyr 0.94(1), Phe 1.09(1), Lys 1.05(1), His 2.89(3), Arg 0.97(1)
質量分析による(M+H)+  ２０５６．８３
ＨＰＬＣ溶出時間  １４．８  分
カラム条件
カラム：Wakosil−５Ｃ１８  ＨＧ  （４．６×１００ｍｍ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水溶液）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶質（５０分）
流  速：１．０  ｍｌ／分。
【００３３】
（３）β−アミロイド（２５−３５）の製造
市販のBoc-Met-OCH2-PAM樹脂(アプライド バイオシステムズ社製) ０．６６ｇ（０．５ミリモル）を用い、ペプチド合成機(アプライド バイオシステムズ社製モデル430A)を使用し合成した。樹脂上のBoc基を５０％トリフルオロ酢酸/塩化メチレンで処理しアミノ基を遊離させた後、このアミノ基に各２モリモルのBoc-Leu, Boc-Gly, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asn, Boc-Ser(Bzl)をβ−アミロイド（２５−３５）のアミノ酸配列通りにHOBt/DCCで活性化し縮合し、保護β−アミロイド（２５−３５)-OCH2-PAM樹脂１．１４ｇを得た。この保護β−アミロイド（２５−３５)-OCH2-PAM樹脂０．６１ｇをp-クレゾール共存下無水弗化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理した後、弗化水素を減圧留去し残渣をエーテル１０ｍｌで２回洗浄した。これを５０％−酢酸水で抽出し、不溶物を濾去し５０％−酢酸水で洗浄した。濾液、洗浄液を合わせ、２〜３ｍｌに減圧濃縮し０．１％トリフルオロ酢酸水５０ｍｌで希釈した後、０．１％トリフルオロ酢酸水で充填したLiChroprep  ＲＰ−１８カラム（2.6×10cm）に付し、０％〜５０％までのアセトニトリル水溶液（０.１％トリフルオロ酢酸含有）の直線型濃度勾配溶出した。主要画分を集め凍結乾燥し白色の粉末１００ｍｇを得た。これをＮ−酢酸0.5 mlに溶解し、同溶媒で充填したセファデックスＬＨ−２０（1.0×96cm）に付し同溶媒で展開した。主要画分を集め凍結乾燥し白色粉末９１ｍｇを得た。
アミノ酸分析値:
Asp 0.97(1), Ser 0.95(1), Gly 2.94(3), Ala 1.00(1), Met 0.89(1), Ile 1.59(2), Leu 1.00(1). Lys 0.97(1)
質量分析による(M+H)+  ２０５６．８３
ＨＰＬＣ溶出時間  １８．９  分
カラム条件
カラム：Wakosil−５Ｃ１８  ＨＧ  （４．６×１００ｍｍ）
溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水溶液）
Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル）を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶質（５０分）
流  速：１．０  ｍｌ／分。
【００３４】
（４）［Cys34］β-アミロイド（３５−４３）の製造
Fmoc-Thr(tBu)-ワン樹脂（０．４６ｇ＝０．２５ミリモル、渡辺化学社製）を出発原料として、アプライド・バイオシステムズ社のFmoc-アミノ酸誘導体カートリッジ（１．０ミリモル）を用い、２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液によるFmoc基の脱保護後、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法にて順次Ｃ末端側からペプチド鎖を延長する。このようにして、次式で表される保護ペプチド樹脂０．７３ｇを得る。
Fmoc-Cys(Trt)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr(tBu)-ワン樹脂
このペプチド樹脂のうち０．５８ｇ（０．２０ミリモル）を氷冷下フェノール０．７５ｇ、ブタンジチオール０．２５ｍｌ、チオアニソール０．５ｍｌ、脱イオン水０．５ｍｌ、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを加え、室温で１．５時間撹拌した。樹脂を濾去し、濾液を濃縮し、残渣に氷冷下エーテルを加えて、沈澱として濾取し、十分にエーテルで洗浄した後、乾燥し白色粉末を得た。
収量  １６８ｍｇ（８９％）
質量分析による(M+H)+＝９４９．５  （理論値＝９４９．５）。
【００３５】
（５）β-アミロイド（１−３８）およびβ-アミロイド（１−３９）の作製
β-アミロイド（１−４０）をカルボキシペプチダーゼ Ｙ で限定分解することによりβ-アミロイド（１−３８）およびβ-アミロイド（１−３９）を作製した。すなわち、β-アミロイド（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ社製）５０μｇとカルボキシペプチダーゼ Ｙ（オリエンタル酵母社製）０．５μｇを０．５％酢酸アンモニウム水溶液に溶解して６０μlとし、１０℃で２時間反応させた。反応後、Ｖｙｄａｃ Ｃ４（The Sep/a/ra/tions Group社製）を用いる逆相-ＨＰＬＣにより分画し、ＵＶ（２１０ｎｍ）で検出された３本の主なピークを質量分析により同定した。
カラム条件
カラム：Ｖｙｄａｃ Ｃ４
（The Sep/a/ra/tions Group社製、4.6×250mm）
溶離液：Ａ液（０．１％ トリフルオロ酢酸含有 ５％ アセトニトリル）
Ｂ液（０．１％ トリフルオロ酢酸含有 ８０％ アセトニトリル）
溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間は３０ ％に維持、次に６０分間かけて３０−５０ ％に直線的に上昇させた。
流  速：０．５ ml／分
質量分析による(M+H)+＝４１３２．９：β-アミロイド（１−３８）（理論値 ４１３２．６）
４２３１．６：β-アミロイド（１−３９）（理論値 ４２３１．８）
４３３０．９：β-アミロイド（１−４０）（理論値 ４３３０．９）。
【実施例２】
【００３６】
免疫原の作製
（１）β-アミロイド(１−４０)を含む免疫原の作製
上記実施例１（１）で得られたβ-アミロイド（１−４０）と牛チログロブリン（ＢＴＧ）との複合体を作製し免疫原とした。すなわち、β-アミロイド（１−４０）０．６ｍｇを１５％のＤＭＦを含む３ｍＭリン酸緩衝液、 ｐＨ６．５、１．１ｍｌに溶解させたのち、０．５ｍｌの水に溶解させたＢＴＧ２．５ｍｇを加え、さらに終濃度０．３％のグルタルアルデヒドを加えて室温で３時間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。
（２）β-アミロイド(２５−３５)を含む免疫原の作製
上記実施例１（３）で得られたβ-アミロイド（２５−３５）とＢＴＧとの複合体を作製し免疫原とした。すなわち、β-アミロイド（２５−３５）０．５ｍｇとＢＴＧ２．５ｍｇとを、ｐＨ４．５に調節した水１ｍｌに溶解させ、終濃度０．４％のグルタルアルデヒドを加えて室温で３時間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。
（３）β-アミロイド(１−１６)を含む免疫原の作製
上記実施例１（２）で得られた[Cys17]β-アミロイド（１−１６）とＢＴＧとの複合体を作製し、免疫原とした。すなわち、ＢＴＧ２０ｍｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１．４ｍｌに溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニミド(ＧＭＢＳ)２．２ｍｇ（８μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたＢＴＧ１５ｍｇと［Cys17]β-アミロイド（１−１６）３．６ｍｇとを混合し、４℃で２日間反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。
（４）β-アミロイド（３５−４３）を含む免疫原の作製
上記実施例１（４）で得られた［Cys34］β-アミロイド（３５−４３）と牛血清アルブミン（ＢＳＡ）との複合体を作製し、免疫原とした。すなわち、ＢＳＡ２１ｍｇ（０．３１μｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．４ｍｌに溶解させ、ＧＭＢＳ３．５ｍｇ（１２．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で３５分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたＢＳＡ４．５ｍｇと［Cys34]β-アミロイド（３５−４３）２．１ｍｇとを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析した。
（５）β−アミロイド（１８−２８）を含む免疫原の作製
[Cys29]β−アミロイド（１８−２８）とＢＴＧとの複合体を作製し、免疫原とした。すなわち、ＢＴＧ２１ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１．５ｍｌに溶解させ、ＧＭＢＳ２．４ｍｇ（８．４μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マレイミド基の導入されたＢＴＧ約７ｍｇと[Cys29]β−アミロイド（１８−２８）（アコード社製）２．０ｍｇとを混合し、４℃で一晩反応させた。反応後、生理食塩水に対し４℃で３日間透析した。
【実施例３】
【００３７】
免疫
６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記実施例２記載の免疫原β-アミロイド（１−４０）−ＢＴＧ複合体、β-アミロイド（２５−３５）−ＢＴＧ複合体、β-アミロイド（１−１６）−ＢＴＧ複合体、β-アミロイド（３５−４３）−ＢＳＡ複合体あるいはβ-アミロイド（１８−２８）−ＢＴＧ複合体を、それぞれ約８０μｇ／匹を完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに２〜３回追加免疫した。
【実施例４】
【００３８】
酵素標識化抗原の作製
（１）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）標識化β-アミロイド(１−４０)の作製
β-アミロイド（１−４０）７０μｇ（１６ｎｍｏｌ)を４０μｌのＤＭＳＯに溶解させ、トリエチルアミン１６０ｎｍｏｌ（１０μｌ ＤＭＳＯ溶液）とＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート(ＳＰＤＰ）２３ｎｍｏｌ（７μｌ ＤＭＳＯ溶液）とを加えた後、室温で９０分反応させた。反応液の全量をβ−Ｇａｌ(酵素免疫測定法用、 ベーリンガーマンハイム社製)１．７ｍｇ（３．３ｎｍｏｌ）の溶液（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．４５ｍｌに溶解)に加え、 ４℃で１日反応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ34カラム（ＬＫＢ−ファルマシア社製）で分画し、β−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）を得た。
（２）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化β-アミロイド(１−１６)の作製
上記実施例１（２）で得られた[Cys17]β-アミロイド（１−１６）とＨＲＰ（酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識体とした。すなわち、ＨＲＰ５ｍｇ（１２５ｎｍｏｌ）を０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶解させ、ＧＭＢＳ３．６ｍｇ（１．３μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入されたＨＲＰ３．３ｍｇ（７８ｎｍｏｌ）と実施例１（２）で作製された[Cys17]β-アミロイド（１−１６）０．５６ｍｇ（２７０ｎｍｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ44（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）を得た。
（３）ＨＲＰ標識化β-アミロイド（３５−４３）の作製
上記実施例１（４）で得られた［Cys34］β-アミロイド（３５−４３）とＨＲＰとを架橋し、ＥＩＡの標識体とした。すなわち、ＨＲＰ１２ｍｇ（３１０ｎｍｏｌ）を１．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶解させ、ＧＭＢＳ１．３ｍｇ（４．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マレイミド基の導入されたＨＲＰ３．２ｍｇ（７６ｎｍｏｌ）と実施例１（４）で作製された[Cys34]β-アミロイド（３５−４３）２．１ｍｇ（７．２μｍｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、ＨＲＰ標識化β-アミロイド(３５−４３）を得た。（４）ＨＲＰ標識化β−アミロイド（１８−２８）の作製
[Cys29]β−アミロイド（１８−２８）とＨＲＰとを架橋し、ＥＩＡの標識体とした。すなわち、ＨＲＰ１６ｍｇ（３９０ｎｍｏｌ）を１．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解させ、ＧＭＢＳ１．１ｍｇ（３．９μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し室温で４０分間反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画した。このようにして作製したマレイミド基の導入されたＨＲＰ６．０ｍｇ（１５０ｎｍｏｌ）と[Cys29]β−アミロイド（１８−２８）２．５ｍｇ（１．９μｍｏｌ）とを混合し、４℃で２日間反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４カラムで分画し、ＨＲＰ標識化β−アミロイド（１８−２８）を得た。
【実施例５】
【００３９】
抗体価の測定
（１）β-アミロイド(１−４０)を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定  
β-アミロイド（１−４０）を免疫中のマウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、４℃で少なくとも２４時間処理した。
上記、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＡ［０．１％ＢＳＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０５％ＣＨＡＰＳ〔３-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸〕および０．１％ＮａＮ3を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０］ ５０μｌ、バッファーＡで希釈したマウス抗β-アミロイド（２５−３５）抗血清１００μｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例４（１）で作製したβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）（バッファーＡで２００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（４−ＭＵＧ）を用いて測定するため、２０μg/mlの４−ＭＵＧのバッファーＡ(ただしＣＨＡＰＳを含まない）溶液１００μlを加え３７℃で３時間反応させた。反応を０．２Ｍ Ｎａ2ＣＯ3 １００μｌ加えることにより停止させたのち、遊離した４−メチルウンベリフェロンを蛍光プレートリーダー（フルオロスキャンII、 ラボシステム社製)を用い、 励起波長３５５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで測定した。結果を〔第１図〕に示す。免疫した８匹のマウスのうち４匹に比較的高い抗体価が認められた。
（２）β-アミロイド（２５−３５）を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
β-アミロイド（２５−３５）を免疫中のマウス抗血清中の抗体価を同様の方法により測定した。 抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＡ５０μｌ、バッファーＡで希釈したマウス抗β-アミロイド（２５−３５）抗血清５０μｌ、および上記実施例４（１）で作製したβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）（バッファーＡで１００倍希釈）５０μｌを加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性を４−ＭＵＧを用いて同様に測定した。結果を〔第２図〕に示す。免疫した８匹のマウスのうち５匹に比較的高い抗体価が認められた。
（３）β-アミロイド（１−１６）を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
マウス抗血清中の抗体価を以下の方法により測定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファーＣ［１％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０］５０μｌ、バッファーＣで希釈したマウス抗β-アミロイド（１−１６）抗血清５０μｌ、および上記実施例４（２）で作製したＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）（バッファーＣで２０００倍希釈）を加え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、 フナコシ薬品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＭＴＰ−32、コロナ社製）で測定した。結果を〔第３図〕に示す。免疫した７匹のマウス全てにβ-アミロイド（１−１６）に対する抗体価の上昇が認められた。
（４）β-アミロイド（３５−４３）を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
上記実施例５（３）記載の方法に従って、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート、マウス抗β-アミロイド（３５−４３）抗血清、および上記実施例４（３）で作製したＨＲＰ標識化β-アミロイド（３５−４３）を反応させることにより、マウス抗血清中の抗体価を測定した。結果を〔第４図〕に示す。免疫したマウス９匹のうち３匹に比較的高い抗体価が認められた。
（５）β−アミロイド（１８−２８）を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定
上記実施例５（３）記載の方法に従って、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート、マウス抗β−アミロイド（１８−２８）抗血清、および上記実施例４（４）で作製したＨＲＰ標識化β−アミロイド（１８−２８）を反応させることにより、マウス抗血清中の抗体価を測定した。免疫した７匹のマウスのうち４匹に比較的高い抗体価が認められた。
【実施例６】
【００４０】
モノクローナル抗β-アミロイド抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して２００〜３００μｇの免疫原を生理食塩水０．２５〜０．３ｍｌに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫３〜４日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ63.Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジー、81、１（1978)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャー、256、495(1975)〕 に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）(ＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０5個になるように浮遊し、２４穴マルチディッシュ（リンブロ社製）に１ウェル１ｍｌずつ１２０ウェルに播種した。播種後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-3Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨てたあと、１ｍｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄変したとき（約１×１０6セル／ｍｌ)、上清を採取し、実施例５に記載の方法に従って抗体価を測定した。
β-アミロイド（１−４０）を免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニングの典型例として、マウスＮｏ.１（第１図参照）を用いて得られた結果を〔第５図(ａ)〕に示した。これらも含め計２種類のハイブリドーマを選択した〔第１表〕。
【表１】
2005170951.tif 000002
【００４１】
β-アミロイド(２５−３５）を免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニングの典型例として、マウスＮｏ.８（第２図参照）を用いて得られた結果を〔第５図(ｂ)〕に示した。これらも含め計５種類のハイブリドーマを選択した〔表１〕。
β-アミロイド（１−１６）を免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニングの典型例としてマウスＮｏ.５（第３図参照）を用いて得られた結果を〔第５図（ｃ）〕に示した。これらも含め当初ハイブリドーマ８株を選択し、 さらにその後ハイブリドーマ１６株を新たに選択した〔第２表〕。
β-アミロイド（３５−４３）を免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニングの典型例として、マウスＮｏ.４（第４図参照）を用いて得られた結果を〔第５図(ｄ)〕に示した。これらを含め計１８種類のハイブリドーマを選択した〔第３表〕。さらに、β-アミロイド（１８−２８）を免疫したマウス由来のハイブリドーマをスクリーニングし、計９種類のハイブリドーマを選択した〔第４表〕。
【表２】
2005170951.tif 000003
【表３】
2005170951.tif 000004
【表４】
2005170951.tif 000005
【００４２】
次に、これらのハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５×１０5個になるように加えた。クローニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に１〜３×１０6セル／匹を腹腔内投与したのち、６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は得られた腹水よりプロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、 腹水６〜２０ｍｌを等量の結合緩衝液（３．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ3を含む１．５Ｍグリシン、ｐＨ９．０）で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン−Ａ−アガロース（Repligen社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（０．０５％ＮａＮ3を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液はＰＢＳに対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μmのフィルター(ミリポア社製)により除菌濾過し４℃あるいは−８０℃で保存した。モノクローナル抗体のクラス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル抗体結合固相を用いるエンザイム−リンクトイムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を行った。すなわち、抗体２μg/mlを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μlずつ分注し、４℃で２４時間放置した。上記実施例５で述べた方法に従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を用いるＥＬＩＳＡによって固相化抗体のクラス、サブクラスを調べた。
【実施例７】
【００４３】
競合法酵素免疫測定法
（１）競合法−ＥＩＡ（その１）
β−アミロイド（１−４０）あるいはβ−アミロイド（２５−３５）を免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。まず、各モノクローナル抗体溶液の抗体価を実施例５（１）または実施例５（２）記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約４０％となる抗体濃度（約３〜１５ｎｇ／ｍｌ)を決定した。次に、上記実施例５記載の抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、決定された濃度にバッファーＡで希釈された抗体溶液５０μｌ、β−アミロイドあるいはβ−アミロイド部分ペプタイド、すなわちβ−アミロイド（１−４０）（以下、免疫測定法用のβ-アミロイド（１−４０）はBachem社より購入したものを使用）、β−アミロイド（１−２８）（Peninsula社より購入）およびβ−アミロイド(２５−３５）のバッファーＡ溶液５０μｌ、および上記実施例４（１）記載β−Ｇａｌ標識化β−アミロイド（１−４０）（バッファーＡで１００倍希釈）を５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素活性を上記実施例５（２）記載の方法により測定した。結果を〔第１表〕に示す。いずれの抗体もβ−Ｇａｌ標識化β−アミロイド（１−４０）と反応し、またβ−アミロイド（１−４０）に対しても反応性を有していた〔第１表〕。
典型例として、β−アミロイド（１−４０）あるいはβ−アミロイド（２５−３５）に対するモノクローナル抗体として、それぞれＢＡ−２７ａ（ＩｇＧ２ａ，κ）あるいはＢＳ−８５ａ（ＩｇＧ１，κ）を用いた場合の競合法−ＥＩＡの結果を〔第６図〕に示した。ＢＡ−２７ａのβ−アミロイド（１−４０）の標準曲線から、（Ｂ／Ｂ。）＝０．５を与えるβ-アミロイド（１−４０）濃度は、２００ｎＭ、４０ｎｇ／wellであることが分かった。また、この抗体はβ−アミロイド（１−１６）、β−アミロイド（１−２８）およびβ−アミロイド（２５−３５）に対しては交差反応性を示さないことから、 β-アミロイドのＣ端側の部分ペプチドに反応するものの、β−アミロイド（２５−３５）の部分構造を認識するものではないことが分かった〔第６図（ａ）〕。一方、ＢＳ−８５ａのβ−アミロイド（２５−３５）の部分構造に対する反応性（（Ｂ／Ｂ。）＝０．５を与える抗原濃度：２０ｎＭ、１ｎｇ／well）は、β-アミロイド（１−４０）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ。）＝０．５を与える抗原濃度：８００ｎＭ、１６０ｎｇ／well）の４０倍であることが分かった〔第６図（ｂ）〕。
【００４４】
（２）競合法−ＥＩＡ（その２）
抗β-アミロイド（１−１６）モノクローナル抗体の反応特異性を同様の方法により調べた。まず、各モノクローナル抗体溶液の抗体価を実施例５（３）記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約４０％となる抗体濃度（約３０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を決定した。次に、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、決定された濃度にバッファーＣで希釈された抗体溶液５０μｌ、β-アミロイドあるいはβ-アミロイド部分ペプタイド、すなわちβ-アミロイド（１−４０）、 β-アミロイド（１−２８）、[Cys17]β-アミロイド（１−１６）のバッファーＣ溶液５０μｌ、および上記実施例４（２）記載ＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）(バッファーCで２０００倍希釈）を５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素活性を上記実施例５（３）記載の方法により測定した。結果を〔第２表〕に示す。当初選択したモノクローナル抗体８種類のうちのうち４種類がβ-アミロイド（１−４０）とも比較的強く反応し、 さらにその後新たに選択したモノクローナル抗体１６種類のうち１０種類がβ-アミロイド（１−４０）とも比較的強く反応した〔第２表〕）。典型例として、 これらの中でβ-アミロイド（１−４０）に対して最も高い反応性を示したモノクローナル抗体ＢＡＮ−０５２ａ（ＩｇＧ１，κ）およびＢＡＮ−５０ａ（ＩｇＧ１，κ）の競合法-ＥＩＡの結果を〔第７図〕に示す。これらの抗体がβ-アミロイド（１−４０）、β-アミロイド（１−２８）、β-アミロイド（１−１６）に対して同程度の反応性を有することが分かる。また、〔第８図〕に、これら２種類の抗体に加え、当初選択したβ-アミロイド（１−４０）に対して高い反応性を示したモノクローナル抗体３種類、ＢＡＮ−１１ａ（ＩｇＧ１，κ）、ＢＡＮ−２０ａ（ＩｇＧ１，κ）およびＢＡＮ−３０ａ（ＩｇＧ１，κ）を用いた競合法−ＥＩＡにおけるβ−アミロイド（１−４０）の標準曲線を示した。これらの抗体の（Ｂ／Ｂ。）＝０．５を与えるβ-アミロイド（１−４０）濃度は  ２５〜７０ｎＭ（５〜１５ｎｇ／well)の範囲内にあり、 抗体間で３倍未満の差しか認められなかった。そのなかで、 ＢＡＮ−５０ａを用いる競合法−ＥＩＡが最も高感度であり、約０．６ｎｇ／well［（Ｂ／Ｂ。）＝０．９］のβ-アミロイド（１−４０）を検出可能であった。
【００４５】
（３）競合法−ＥＩＡ（その３）
アルツハイマー病患者脳 １０ｇより、森らの方法（本文参照）に従ってβ-アミロイド画分（蟻酸抽出物）０．１ｇを得た。次に、上記実施例７（２）記載の方法に従って、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート、抗体溶液、β-アミロイドまたはその部分ペプチド、すなわちβ-アミロイド（１−４０）、［Cys34］β-アミロイド（３５−４３）、あるいは上記アルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分、および上記実施例４（３）記載ＨＲＰ標識化β-アミロイド（３５−４３）（バッファーＣで５０倍希釈）を反応させた。結果を〔第３表〕に示す。当初選択したモノクローナル抗体のうち、４種類がアルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分と比較的強く反応した。これらの中から、高い抗体価を示したモノクローナル抗体ＢＣ−０５ａ（ＩｇＧ１，κ）を選択し、以下の実験に用いた。
【００４６】
（４）競合法ＥＩＡ（その４）
抗β−アミロイド（１８−２８）モノクローナル抗体の反応特異性を上記実施例７（２）記載の方法により調べた。すなわち、各抗体濃度を決定したのち、β−アミロイドあるいはβ−アミロイド部分ペプタイドとしてβ−アミロイド（１ー４０）、[Cys29]β−アミロイド（１７−２８）（アコード社製）、[Cys29]β−アミロイド（１８−２８）およびβ−アミロイド（１−２８）を用い、標識化抗原として上記実施例４（４）記載ＨＲＰ標識化β−アミロイド（１８−２８）（バッファーＣで１０００倍希釈）を用いて反応させ、反応後の酵素活性を測定した。結果を[第４表]に示す。選択した９種類の抗体はいずれも、抗原であるβ−アミロイド（１８−２８）と高い反応性を有しており、さらにそのうち５種類の抗体はβ−アミロイド（１７−２８）とも比較的強く反応した。いずれの抗体もβ−アミロイド（１−２８）およびβ−アミロイド（１−４０）とは反応しなかった。
これらのうち、β−アミロイド（１７−２８）およびβ−アミロイド（１８−２８）の両者と高い反応性を有するモノクローナル抗体ＢＰ−９０ａ（ＩｇＧ１，κ）を今後の実験で主に用いることとした。
【実施例８】
【００４７】
ＨＲＰ標識化抗β-アミロイドモノクローナル抗体の作製
（１）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ
ＢＳ−８５ａ精製画分４．２ｍｇ（２８ｎｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８溶液にＧＭＢＳ４２０ｎｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で４０分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カラム（溶離液、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．７）で分離し、マレイミド基の導入された抗体画分３ｍｇを得た。 次に、ＨＲＰ１２ｍｇ（３００ｎｍｏｌ）を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌも含む）、ｐＨ６．８、１．４ｍｌにＳＰＤＰ４．５μｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で４０分反応させた。次に、６８μｍｏｌのジチオスレイトールを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．５ｍｌを加え、室温で２０分反応させた後セファデックスＧ−２５カラム（溶離液、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６）で分離し、ＳＨ基の導入されたＨＲＰ８ｍｇを得た。次に、ＳＨ基の導入されたＨＲＰ８ｍｇとマレイミド基の導入された抗体画分３ｍｇとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス社製）で約０．３ｍｌにまで濃縮したのち、４℃で１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５を用いるウルトロゲルＡｃＡ３４カラムに供し、ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ複合体画分を精製した。
（２）ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ
同様の方法により、ＢＡ−２７ａ精製画分４．７ｍｇとＨＲＰ１４ｍｇを用いてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ複合体を作製した。
（３）ＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰ
同様の方法により、ＢＡＮ−０５２ａ精製画分５ｍｇとＨＲＰ１４ｍｇを用いてＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰ複合体を作製した。
（４）ＢＣ−０５ａ−ＨＲＰ
同様の方法により、ＢＣ−０５ａ精製画分５ｍｇとＨＲＰ１４ｍｇとを用いてＢＣ−０５ａ−ＨＲＰ複合体を作製した。
【実施例９】
【００４８】
サンドイッチ法−ＥＩＡ（１）
（１）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ
上記実施例６記載の精製したモノクローナル抗体ＢＡＮ−０５２ａ、ＢＡＮ−１１ａ、ＢＡＮ−２０ａ、ＢＡＮ−３０ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＡ−２７ａを１０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース３００μｌを加え不活化した。
以上のように調製したプレートに、バッファーＥ〔１０％ブロックエース、０．２％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％  ＣＨＡＰＳ、０．０５％ ＮａＮ3を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〕で希釈したβ-アミロイド（１−４０）標準液１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例８（１）で作製したＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ（バッファーＣで１５００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例５（３）記載の方法によりＴＭＢを用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応２０分）。結果を〔第９図〕に示す。実施例７に記したように、ＢＳ−８５ａの競合法ＥＩＡにおけるβ−アミロイド（１−４０）に対する反応性は高いものではなかった。しかし、上記のようにβ−アミロイド（１−１６）を免疫原とするモノクローナル抗体を固相に用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの標識抗体として用いる場合には、極めて高感度にβ−アミロイド（１−４０）を検出することがわかった。特に、ＢＡＮ−０５２ａの固相を用いたとき、他の３種類の抗体固相と比較して１０〜３０倍高感度であり、３ｐｇ／wellのβ-アミロイド（１−４０）を検出することが可能であった。
（２）ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ
同様に、ＢＡＮ−０５２ａ、ＢＡＮ−１１ａ、ＢＡＮ−２０ａ、ＢＡＮ−３０ａ、ＢＳ−８５ａまたはＢＡ−２７ａを固定したマイクロプレートにβ-アミロイド（１−４０）標準液１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例８（２）で作製したＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ（バッファーＣで２５００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢにより測定した（酵素反応２０分）。結果を〔第１０図〕に示す。ＢＳ−８５ａの場合と同様、ＢＡ−２７ａも競合法ＥＩＡにおいてはβ−アミロイド（１−４０）に対し高い反応性を示さなかった。しかし、上記のようなサンドイッチ法−ＥＩＡの標識抗体として用いる場合には、ＢＳ−８５ａよりもさらに高感度にβ−アミロイド（１−４０）を検出することがわかった。特に、ＢＡＮ−０５２ａの固相を用いたとき、他の３種類の抗体固相と比較して約３０倍高感度であり、０．６ｐｇ／wellのβ-アミロイド（１−４０）を検出することが可能であった。
（３）ＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡ  
ＢＳ−８５ａまたはＢＡ−２７ａを固定したマイクロプレートにβ-アミロイド（１−４０）標準液１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例８（３）で作製したＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰ（バッファーＣで２５００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素活性をＴＭＢにより測定した（酵素反応２０分）。結果を〔第１１図〕に示す。  このように、実施例８（２）とは逆の系、すなわち、ＢＳ−８５ａまたはＢＡ−２７ａのＣ端抗体を固相とし、ＢＡＮ−０５２ａのＮ端抗体を標識体とするサンドイッチ-ＥＩＡにおいても、 それぞれ約８０ｐｇ／wellおよび１０ｐｇ／wellのβ-アミロイド（１−４０）を検出することが可能であった。
また、ＢＡＮ−０５２ａを固相とするサンドイッチ-ＥＩＡにおいて、標識体にもＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰを用いた場合（バッファーＣで１０００倍希釈）には、ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いた場合（バッファーＣで１５００倍希釈）と比較して、検出感度が１／１００以下となることから、本発明で用いている実験条件下では多量体のβ-アミロイド（１−４０）はほとんど存在しないことが示唆される〔第１２図〕。
【実施例１０】
【００４９】
サンドイッチ法−ＥＩＡ（２）
抗β-アミロイド（１−１６）モノクローナル抗体のなかで、ＢＡＮ−０５２ａが群を抜いて高感度のサンドイッチ-ＥＩＡを与えたことから、サンドイッチ-ＥＩＡにより適した抗β-アミロイド（１−１６）モノクローナル抗体を選択すべくさらに１６種類の抗体を作製した〔第２表〕。その結果、ＢＡＮ−５０ａを得ることができた。〔第１３図〕および〔第１４図〕にＢＡＮ−５０ａを固相抗体とするサンドイッチ-ＥＩＡの結果を示した。アッセイ方法は上記実施例９（３）に従ったが、標識体濃度としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰは１０００倍希釈〔第１３図〕、ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰは１５００倍希釈〔第１４図〕を用いた。また、これら測定系の特異性を調べるため、β-アミロイド（１−２８）に対する反応性も検討した［図中で●および▲がβ-アミロイド（１−４０）に対する反応性を、また○および△がβ-アミロイド（１−２８）に対する反応性を示す］。その結果、いずれの標識体を用いても、ＢＡＮ−５０ａ固相を用いた場合にはＢＡＮ−０５２ａ固相を用いた場合と比較して２〜３倍高感度であり、ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ標識体と組み合わせたとき０．２ｐｇ／wellのβ-アミロイド（１−４０）を検出可能であった。また、いずれの測定系もβ-アミロイド（１−２８）を検出せず、β-アミロイド（１−４０）に特異的であることが分かった。
【実施例１１】
【００５０】
サンドイッチ法−ＥＩＡ（３）
（１）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰまたはＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの特異性
実施例１０に示したようにＢＡＮ−５０ａを固相抗体として用い、標識体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰまたはＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いる２種類のサンドイッチ法−ＥＩＡの測定系の特異性をさらに詳しく検討した。アッセイ方法は上記実施例１０に従ったが、標識体濃度としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰは６７０倍希釈、ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰは１０００倍希釈を用い、β−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）、β−アミロイド（１−４０）、β−アミロイド（１−４２）およびβ−アミロイド（１−２８）に対する反応性を調べた（〔第１５図〕（ａ）、（ｂ））。ここで、β−アミロイド（１−３８）およびβ−アミロイド（１−３９）は実施例１（５）で作製したものを用いた。実施例１（５）でβ−アミロイド（１−３８）およびβ−アミロイド（１−３９）に対応した逆相ＨＰＬＣの溶出画分中のそれぞれの濃度は、実施例７（２）の方法に従い、ＢＡＮ０５０ａを用いる競合法ＥＩＡにより決定した。その結果、標識体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用いた測定系は（〔第１５図〕（ａ））、β−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）、およびβ−アミロイド（１−４０）をほとんど同一の感度（０.７ｐｇ／well）で検出し、β−アミロイド（１−４２）については上記の３種のβ−アミロイドに対する感度と比較して１／２から１／３の感度で検出することがわかった。また、β−アミロイド（１−２８）は全く検出せず、実施例１０と同様の結果を得た。一方、標識体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いた測定系は（〔第１５図〕（ｂ））、β−アミロイド（１−４０）、β−アミロイド（１−４２）をそれぞれ０．２ｐｇ／well、１８ｐｇ／wellの感度で検出した。また、β−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）についてはそれぞれ８５ｐｇ／well、１７ｐｇ／wellの検出が可能であった。
以上の結果から、標識体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用いた測定系はβ−アミロイドのＣ端部に非特異的であり、標識抗体の免疫原として用いた部分ペプチドであるβ−アミロイド（２５−３５）の配列を含むβ−アミロイドに対しては、ほぼ同等の感度を有することがわかった。一方、標識体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用いた測定系はβ−アミロイド（１−４０）のＣ末端に特異的と考えられ、β−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）およびβ−アミロイド（１−４２）に対しては２％以下の交差反応性で弱く反応することがわかった。
【００５１】
（２）ＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの特異性と感度
固相抗体としてＢＡＮ−５０ａを用い、標識体として上記実施例８（４）で作製したＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの特異性および感度を調べた。上記実施例１１（１）と同様にしてβ−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）、β−アミロイド（１−４０）、β−アミロイド（１−４２）およびβ−アミロイド（１−２８）に対する反応性を調べたが、標識体濃度としては２００倍希釈のものを用いた（〔第１５図〕（ｃ））。その結果、このＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡは、０.７ｐｇ／wellのβ−アミロイド（１−４２）を検出することが可能だったが、β−アミロイド（１−４２）以外の４種のβ−アミロイド、すなわちβ−アミロイド（１−３８）、β−アミロイド（１−３９）、β−アミロイド（１−４０）およびβ−アミロイド（１−２８）は全く検出しなかった。したがって、固相抗体としてＢＡＮ−５０ａを用い、標識体としてＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡは、β−アミロイド（１−４２）を極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可能であるとわかった。
以上の結果から、固相抗体としてＢＡＮ−５０ａを用い、標識体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰまたはＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用いる２種類の測定系を組み合わせることにより、β−アミロイド（１−４０）およびβ−アミロイド（１−４２）の分別定量ができることがわかった。
【実施例１２】
【００５２】
モノクローナル抗体固定化アフィニティ固相の作製
（１）ＢＡＮ−０５２ａ固定化アフィニティ固相の作製
ＢＡＮ−０５２ａを充填剤に固定化することにより、アフィニティ固相を作製した。即ち、ＢＡＮ−０５２ａ ４５ mgとＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−トレシルトヨパール ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）５ｇとを０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム水溶液中、４℃で一晩反応させた。反応後、０．５Ｍの食塩水で洗浄し、余剰の活性基をふさぐため、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）中、室温で１時間反応させた。得られたＢＡＮ−０５２ａ−トレシルトヨパール２５ｍｌはＰＢＳで洗浄後、バッファーＥ 中、４℃で保存した。
（２）ＢＡ−２７ａ固定化アフィニティ固相の作製
上記（１）と同様にして、ＢＡ−２７ａを充填剤に固定化することによりアフィニティ固相を作製した。すなわち、ＢＡ−２７ａ １５ｍｇとＴＳＫgel ＡＦ−トレシルトヨパール６５０Ｍ  ２ｇとを反応させ、１０ｍｌのＢＡ−２７ａ−トレシルトヨパールを得た。
【実施例１３】
【００５３】
アルツハイマー病患者脳脊髄液中のβ-アミロイドの分析
上記実施例１２（１）で作製したＢＡＮ−０５２ａ固定化アフィニティ固相により精製したアルツハイマー病患者の脳脊髄液を逆相−ＨＰＬＣで分画し、サンドイッチ−ＥＩＡによって分析した。
まず、アルツハイマー病患者の脳脊髄液１．５ｍｌをバッファーＥで２倍に希釈後、ＢＡＮ−０５２ａ−トレシルトヨパール充填カラム（0.8×0.3cm）より溶出し部分精製した。溶離液には、０．２％ トリフルオロ酢酸含有６０％ アセトニトリルを用いた。次に、この溶出画分を濃縮後、実施例１（５）記載の方法によりＶｙｄａｃ Ｃ４を用いる逆相−ＨＰＬＣによって分離し、実施例１０記載のＢＡＮ−５０ａ結合固相とＢＳ−８５ａ−ＨＲＰあるいはＢＡ−２７ａ−ＨＲＰとを用いるサンドイッチ−ＥＩＡで溶出画分中のβ-アミロイドを定量した。結果を〔図１６〕に示す。分画Ｎｏ．５９は、合成β−アミロイド（１−４０）の溶出位置にほぼ一致したため、〔第１６図〕（ａ）（ｂ）で共に検出された免疫活性はβ−アミロイド（１−４０）に対するものと考えられた。従って、〔第１６図〕の結果から、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中には高濃度のβ−アミロイド（１−４０）が存在することが明らかとなったが、さらに〔第１６図〕（ａ）からＢＳ−８５ａ−ＨＲＰのみで検出可能な分子種も少量含まれていることがわかった（分画Ｎｏ．４７およびＮｏ．４８）。これらの溶出位置は、β−アミロイド（１−４０）の溶出位置よりもアセトニトリル濃度が低いため、分画Ｎｏ．４７およびＮｏ．４８で溶出されるのはβ−アミロイド（１−４０）よりもより親水性の分子種であると考えられる。実施例１１の結果より、標識体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用いる測定系は、β−アミロイド（１−４０）のＣ末端から１、２残基欠落した分子種に対してもβ−アミロイド（１−４０）と同等の感度を有することが示された。従って、分画Ｎｏ．４７およびＮｏ．４８に見られる免疫活性は、β−アミロイド（１−４０）のＣ端部が欠落した分子種に対するものである可能性が高い。
【実施例１４】
【００５４】
アルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分の分析
上記実施例７（３）記載のアルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分（ギ酸抽出物）１１ｍｇをギ酸に溶解し、ＴＳＫ Ｇ３０００ＰＷを用いるゲルろ過により分離した。
カラム条件
カラム：ＴＳＫ Ｇ3000ＰＷ （東ソー株式会社製）
溶離液：０．１％ トリフルオロ酢酸含有４０％アセトニトリル
流  速：０．５  ｍｌ／分
上記実施例１０記載のＢＡＮ−５０ａ抗体結合固相とＢＳ−８５ａ−ＨＲＰとを用いるサンドイッチ−ＥＩＡで溶出画分中のβ-アミロイドを定量した結果、ＨＰＬＣ溶出時間１４分から１５分の間に強い免疫活性が認められた。次に、この画分に０．０５％ ＣＨＡＰＳを添加後濃縮し、実施例１（５）記載の方法によりＶｙｄａｃ Ｃ４を用いる逆相-ＨＰＬＣにより分離した。溶出結果を〔図１７〕に示す。
得られたＮｏ.３５およびＮｏ.４１−４５の画分それぞれを３００μｌずつ濃縮したのち、質量分析（ＨＸ１１０、日本電子社製）に付した。Ｎｏ.３５、Ｎｏ.４１およびＮｏ.４３の画分の分析結果を〔図１８〕に示す。Ｎｏ.３５はβ-アミロイド（１−４０）が、Ｎｏ.４１はβ-アミロイド（１−４２）が、また、Ｎｏ.４３はβ-アミロイド（３−４２）（分子量１８相当分が不足しているためピログルタミン酸になっていると推測される）が主要な構成成分であり、さらにＮ端部が欠落した他の分子種が混在していた。また、Ｎｏ.３５は合成β-アミロイド（１−４０）の溶出位置に一致した。
次に、上記実施例１１記載の方法により、溶出画分の免疫活性を調べた。各画分３μｌを試料とし、ＢＣ−０５ａ−ＨＲＰは２００倍希釈で用いた。結果を〔第１９図〕に示す。ＢＳ−８５ａを用いる測定系ではＮｏ.３５およびＮｏ.４１−４５の両ピークが、ＢＡ−２７ａを用いる測定系では主としてＮｏ.３５のピークが、またＢＣ−０５ａを用いる測定系ではＮｏ.４１−４５のピークが検出された。
以上の結果は、実施例１１で示した各測定系の特異性に基づくものであり、実施例１３とともに、本発明による測定系がアルツハイマー病の診断、病因の解明、およびアルツハイマー病の予防・治療を目的とする医薬品の開発において重要な手段を提供できることを示す。
【実施例１５】
【００５５】
ヒト型アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）遺伝子のクローニング
β−アミロイドは巨大な前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のごく一部であり、ＡＰＰをコードするｃＤＮＡはこれまでに５種類見いだされている。ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７１４、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０、およびＡＰＰ５６３と呼ばれるこれらのｃＤＮＡは、同一のＡＰＰ遺伝子からオルターナティブスプライシングの結果生じることがわかっている。これらのうちヒト型ＡＰＰ６９５の高発現用プラスミドＤＮＡを構築するため、ヒトＡＰＰ６９５遺伝子のクローニングを行った。  
まず、強力なＳＲαプロモーター（モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第８巻、４６６−４７２ページ、１９８８年）を持つプラスミドｐＭＥ１８ｓをベクターとして、ヒト肺ガン細胞由来の細胞であるＭＡＣ１０のｃＤＮＡライブラリーを作製した。既に報告されているヒトＡＰＰのｃＤＮＡ塩基配列を基に、タンパク質をコードしている領域より上流側の配列（センス）
５'-ＡＴＣＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＴＣ-３'      （配列番号：１３）
および下流側の配列（アンチセンス）
５'-ＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ-３'      （配列番号：１４）
の合成ＤＮＡを作製し、これをプローブに用いて上記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。得られたｃＤＮＡをクローニングし、その塩基配列を合成鎖停止法で決定したところ、すべてがＡＰＰ７５１をコードするｃＤＮＡであった。そこで、λｇｔ１０をベクターとして作製されたヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーン社）を同様の方法でスクリーニングした結果、ＡＰＰ６９５をコードするｃＤＮＡを得た。ＡＰＰ７５１とＡＰＰ６９５のｃＤＮＡの配列はプロテアーゼインヒビター領域を除くと完全に一致しているので、ＡＰＰ７５１のｃＤＮＡを持つプラスミドＤＮＡとＡＰＰ６９５のｃＤＮＡを持つファージＤＮＡを切断し再結合させて、ＡＰＰ６９５のｃＤＮＡをＳＲαプロモーターの下流に結合させたプラスミドＤＮＡを構築した。
【実施例１６】
【００５６】
ヒトＡＰＰ６９５高発現ラットＣ６グリオーマ細胞の育種
ラットＣ６グリオーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０７）は、３７℃、５％ ＣＯ2存在下、直径１０ｃｍの培養用シャーレで、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭを培地として培養した。上記実施例１５で構築したヒトＡＰＰ６９５高発現用プラスミドＤＮＡ ２０μｇをネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドＤＮＡ ｐＴＢ６（セル・ストラクチャー・アンド・ファンクション、１２巻、２０５−２１７ページ、１９８７年）１μｇと混合し、８０％飽和まで培養したＣ６グリオーマ細胞にリン酸カルシウム共沈殿法を用いて導入した。２４時間後に終濃度７５０μｇ／ｍｌのネオマイシン（ＧＩＢＣＯ社）を加えて培養を続け、耐性株を選択した。得られた選択株１８株をそれぞれ１００μｌのＰＢＳに懸濁し、凍結融解と超音波処理ののち８％ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ電気泳動を行った。タンパク質をニトロセルロース膜に転写後、抗ヒトＡＰＰマウスモノクローナル抗体（ベーリンガーマンハイム社）を用いたウェスタンブロットを行い、ＡＰＰ６９５の発現量が最も高いＣ６−６９５−１８を得た。  
【実施例１７】
【００５７】
ヒトＡＰＰ６９５高発現Ｃ６グリオーマ細胞培養上清に含まれる３ｋＤａペプチドの検出
上記実施例１６記載ヒトＡＰＰ６９５高発現Ｃ６グリオーマ細胞の培養上清中に含まれるβ−アミロイド分子種を同定するため、実施例１３と同様の方法で培養上清を精製し、サンドイッチ−ＥＩＡによって分析した。すなわち、まず、培養上清１リットルを上記実施例１２（２）で得られたＢＡ−２７ａ−トレシルトヨパール充填カラムを用いて部分精製し、この溶出画分を濃縮後Ｖｙｄａｃ Ｃ４を用いる逆相ＨＰＬＣによって分画した。
カラム条件
カラム：Ｖｙｄａｃ Ｃ４ (4.6 x 250 mm)
溶離液：Ａ液（０．１％トリフルオロ酢酸含有 ５％アセトニトリル）
Ｂ液（０．１％トリフルオロ酢酸含有 ８０％アセトニトリル）
溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間に１５％から２５％まで上昇させ、次に６０分間かけて２５−５０％に直線的に上昇させた。
流速：０．５ｍｌ／分
実施例９（１）記載の方法に従いＢＰ−９０ａを固定化した９６ウェルマイクロプレート、および標識体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰをもちいて、上記の逆相ＨＰＬＣ画分のサンドイッチＥＩＡを行った。強い免疫活性が認められた分画No.２８およびNo.３８−３９を濃縮し質量分析を行ったところ、それぞれβ−アミロイド（２０−４０）またはβ−アミロイド（１８−４０）が主要な構成成分であることがわかった。以上の結果から、ＢＰ−９０ａおよびＢＡ−２７ａを用いるサンドイッチＥＩＡ法は、β−アミロイドＣ端側の誘導体を選択的に検出することが可能であるとわかった。従って、本測定系はＡＰＰの代謝を研究する際の重要な手段を提供するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
アルツハイマー病患者の脳に特徴的な病変として、老人斑の主要な構成成分の一つであるβ-アミロイドの沈着が知られている。本発明のモノクロナール抗体を用いることによって、Ｃ端部疎水的領域を有するβ-アミロイドを感度よく特異的に定量することができ、この定量方法はアルツハイマー病などの診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】β-アミロイド（１−４０）を免疫したマウスの抗体価をβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）を用いて調べた結果を示す。
【図２】β-アミロイド（２５−３５）を免疫したマウスの抗体価をβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）を用いて調べた結果を示す。
【図３】β-アミロイド（１−１６）を免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）を用いて調べた結果を示す。
【図４】β-アミロイド（３５−４３）を免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識化β-アミロイド（３５−４３）を用いて調べた結果を示す。
【図５】細胞融合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示す。（ａ）はβ-アミロイド（１−４０）を免疫したマウスを用いた場合、（ｂ）はβ-アミロイド（２５−３５）を免疫したマウスを用いた場合、（ｃ）はβ-アミロイド（１−１６）を免疫したマウスを用いた場合、および（ｄ）はβ-アミロイド（３５−４３）を免疫したマウスを用いた場合である。
【図６】β-アミロイド（１−４０）を免疫原として作製したモノクローナル抗体ＢＡ−２７ａのβ-アミロイド（１−４０）（−●−）、β-アミロイド（１−２８）（−△−）、β-アミロイド（１−１６）（−○−）、β-アミロイド（２５−３５）（−□−）、およびβ-アミロイド（３５−４３）（−▲−）に対する反応性をβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。 同様に、図６（ｂ）はβ-アミロイド（２５−３５）を免疫原として作製したモノクローナル抗体ＢＳ−８５ａの反応性をβ−Ｇａｌ標識化β-アミロイド（１−４０）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図７】（ａ）および（ｂ）は、それぞれβ-アミロイド（１−１６）を免疫原として作製したモノクローナル抗体ＢＡＮ−０５２ａおよびＢＡＮ−５０ａのβ-アミロイド（１−４０）（−□−）、β-アミロイド（１−２８）（−△−）、およびβ-アミロイド（１−１６）（−○−）に対する反応性をＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図８】ＢＡＮ−０５２ａ（−●−）、ＢＡＮ−１１ａ（−○−），ＢＡＮ−２０ａ（−△−），ＢＡＮ−３０ａ（−□−）およびＢＡＮ−５０ａ（−■−）のβ-アミロイド（１−４０）に対する反応性をＨＲＰ標識化β-アミロイド（１−１６）を用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図９】酵素標識抗体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−０５２ａ（−●−）、ＢＡＮ−１１ａ（−▼−）、ＢＡＮ−２０ａ（−▲−）またはＢＡＮ−３０ａ（−■−）を用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（１−４０）の標準曲線を示す。
【図１０】酵素標識抗体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−０５２ａ（−●−）、ＢＡＮ−１１ａ（−▼−）、ＢＡＮ−２０ａ（−▲−）またはＢＡＮ−３０ａ（−■−）を用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（１−４０）の標準曲線を示す。
【図１１】酵素標識抗体としてＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡ−２７ａ（−●−）またはＢＳ−８５ａ（−○−）を用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（１−４０）の標準曲線を示す。
【図１２】酵素標識抗体としてＢＡＮ−０５２ａ−ＨＲＰ（−○−）あるいはＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ（−□−）を用い、固相用抗体としてＢＡＮ−０５２ａを用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（１−４０）の標準曲線を示す。
【図１３】酵素標識抗体としてＢＳ−８５ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−０５２ａ（−●，○−）あるいはＢＡＮ−５０ａ（−▲，△−）を用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（1-40)（−●，▲−）あるいはβ-アミロイド（１−２８）（−○、△−）の標準曲線を示す。
【図１４】酵素標識抗体としてＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−０５２ａ（−●，○−）あるいはＢＡＮ−５０ａ（−▲，△−）を用いたサンドイッチ-ＥＩＡのβ-アミロイド（１−４０）（−●，▲−）あるいはβ-アミロイド（１−２８）（−○、△−）の標準曲線を示す。
【図１５】酵素標識抗体として（ａ）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ（ｂ）ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰ、あるいは（ｃ）ＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−５０ａを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、β−アミロイド（１−３８）（−○−）、β−アミロイド（１−３９）（−△−）、β−アミロイド（１−４０）（−■−）、β−アミロイド（１−４２）（−●−）、あるいはβ−アミロイド（１−２８）（−□−）の標準曲線を示す。
【図１６】アルツハイマー病患者脳脊髄液中のβ-アミロイドの逆相−ＨＰＬＣによる溶出画分の免疫活性を、酵素標識抗体として（ａ）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ、（ｂ）ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−５０ａを用いるサンドイッチ-ＥＩＡによって調べた結果を示す。
【図１７】アルツハイマー病患者由来β−アミロイド画分（ギ酸抽出物）をゲル濾過により部分精製したのち、逆相ＨＰＬＣにより分画した結果を示す（検出波長＝２１０ｎｍ）。
【図１８】アルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分（蟻酸抽出物）の図１７の逆相-ＨＰＬＣの溶出画分の（ａ）Ｎｏ.３５、（ｂ）Ｎｏ.４１および（ｃ）Ｎｏ．４３の質量分析スペクトルを示す。
【図１９】アルツハイマー病患者脳由来β-アミロイド画分（蟻酸抽出物）の図１７の逆相-ＨＰＬＣ溶出画分について、酵素標識抗体として、（ａ）ＢＳ−８５ａ−ＨＲＰ、（ｂ）ＢＡ−２７ａ−ＨＲＰおよび（ｃ）ＢＣ−０５ａ−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＢＡＮ−５０ａを用いたサンドイッチ-ＥＩＡによって定量した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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