(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、複合体混合物中のタンパク質の同定および定量的分析のための選択的ペプチド単離法を記載する。【解決手段】この方法は、アルギニンもヒスチジンも含まないペプチド（ＮＨＮＲペプチド）のすべてのタンパク質からの選択的単離と、各試料中の異なるアイソトープで標識されたＮＨＮＲペプチドの推定理論的スペクトルの面積の比から、異なる試料中の１つまたは数個のタンパク質の相対的濃度の測定とを含む。タンパク質の相対的濃度の測定は、ＮＨＮＲペプチドの任意の型のアイソトープ標識物について有効である。この方法は、複合体混合物中に存在するタンパク質の分離と精製を避け、試料の酵素的消化物から生成するすべてのペプチドの分析を避ける。この方法は、治療および診断目的で、タンパク質の同定に適用される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジンもアルギニンも含有しないペプチド（本明細書においてＮＨＮＲペプチドと呼ぶ）が各タンパク質から選択的に単離され、１つ以上のタンパク質の相対的濃度が、各試料中の異なるアイソトープで標識された各ＮＨＮＲペプチドの推定理論的スペクトルの面先の比から決定される、複合体混合物中の１つ以上のタンパク質の同定および定量法。この方法は、以下の工程を含む：
ａ）タンパク質試料の酵素的または化学的加水分解、
ｂ）工程（ａ）で得られたすべてのペプチドのアルファおよびイプシロンアミノ基（αおよびε−アミノ基）の化学修飾、
ｃ）工程（ｂ）で得られたペプチド混合物からの陽イオン交換クロマトグラフィーによるＮＨＮＲペプチドの単離、
ｄ）工程（ｃ）で得られたＮＨＮＲペプチドの質量スペクトル分析によるタンパク質同定、
ｅ）工程（ａ）の前、または工程（ａ）または（ｂ）の最中のタンパク質試料の示差的アイソトープ標識、および直後に少なくとも一部の試料を混合、
ｆ）工程（ｄ）で同定されたＮＨＮＲペプチド対の推定理論的スペクトルの面積の比から、ならびに工程（ｄ）で生成したＮＨＮＲペプチドの断片の推定理論的スペクトルの面積の比から、工程（ｅ）の混合物中の１つ以上のタンパク質の相対的定量。
【請求項２】
工程（ａ）で使用される生体分子混合物は、細胞抽出物または生物学的液体からのペプチドまたはタンパク質の混合物である、請求項１の方法。
【請求項３】
ペプチドは、酵素的、化学的、もしくは他の切断物質により、または請求項１の工程（ａ）に従ってペプチド結合を加水分解できる操作の組合せにより、生成される、請求項１の方法。
【請求項４】
得られたペプチドは、アナライトの液体クロマトグラフィーまたは分離および濃縮の操作により分画される、請求項１、２および３の方法。
【請求項５】
請求項１の工程（ｂ）に従ってアミノ基修飾物質は、陽性荷電基も塩基性基もプロトン化の可能な部位も、含有も生成もしない、請求項１の方法。
【請求項６】
アミノ基修飾物質は、無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、９−フルオレニルメチルクロロギ酸である、請求項５の方法。他のいくつかの適当なＮ末端アミノ保護基は以下の通りである：（ａ）芳香族ウレタン型保護基であって、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンゾジオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニルおよび４−メトキシベンジルオキシカルボニルがある：（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基であって、ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルおよびメチルスルホニルエトキシカルボニルがある；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基であって、アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニルおよびイソボルニルオキシカルボニルがある；（ｄ）アシル保護基またはスルホニル保護基。好適な保護基には、ベンゾジオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル、および１−カンファースルホニルがある；（ｅ）光感受性保護基であって、ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチルー１（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、α−メチルニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトフェナシルおよび３’，５’−ジメトキシベンゾインからのカルバメート誘導体を含む。アミノ基の一時的保護のためにペプチド合成で使用されるいくつかの他の試薬が使用できる。
【請求項７】
ＮＨＮＲペプチドはイオン交換クロマトグラフィーのフロースルーに得られる、請求項１、工程（ｃ）の方法。
【請求項８】
ＮＨＮＲペプチドは、物理的、化学的または酵素的に処理されて、遊離のα−およびε−アミノ基を再生する、請求項７の方法。
【請求項９】
ＮＨＮＲペプチドおよびそれが由来するタンパク質を検出し同定するために、質量スペクトル法またはその液体クロマトグラフィとの組合せが使用される、請求項７と８の方法。
【請求項１０】
混合物中に存在する化合物の同定は、あらかじめ生成したタンパク質分解消化物のゲノムデータベース中の、配列決定および／または同定のためのＮＨＮＲペプチドのアミノ酸組成情報を使用して行われる、請求項９の方法。
【請求項１１】
試料中に存在する１つ以上のタンパク質の相対的濃度は、アイソトープ標識されたＮＨＮＲペプチド対の推定理論的スペクトルの面積の比、または工程（ｄ）で生成したＮＨＮＲペプチドからの断片の推定理論的スペクトルの面積の比から決定される、請求項１の方法。
【請求項１２】
理論的スペクトルは、観察されたスペクトルによりよく一致する検出された分子種のアイソトープ分布の組合せから推定される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
理論的スペクトルの推定は、候補ＮＨＮＲペプチドのアミノ酸配列情報を取り入れて、他の分子種の存在を考慮する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
考慮すべき可能な分子種は、複数の標識基のＮＨＮＲペプチド構造への取り込み、ならびにペプチドの可能な化学的もしくは翻訳後修飾に由来する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法を含む、複合体混合物中のタンパク質の同定と定量のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野、特にプロテオミクス（proteomics）に関する。プロテオミクスは、プロテオーム（proteomes）研究に密接に関連した手段、技術および方法の群として定義される。用語プロテオームは、ゲノムのタンパク質相補体を定義するのに使用される。
【０００２】
今日、質量スペクトル法や自動データベース検索と組合せた分離法が、複合体混合物中のタンパク質の高い処理能力同定を可能にしている。出現している技術のほとんどは、タンパク質の加水分解により産生されたペプチドを、液体クロマトグラフィーと質量スペクトルとの組合せにより分析する。
【０００３】
１９９９年にリンク（Link）ら（リンク（Link A.J.）ら、質量スペクトルを使用するタンパク質複合体の直接分析、Nat. Biotechnol. 17:676-682, 1999）は、２次元液体クロマトグラフィーと質量スペクトルに基づく方法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を開発した。このために彼らは、マイクロ毛細管カラムにイオン交換体と逆相媒体を充填した。こうしてすべてのタンパク質分解ペプチドは、まずイオン交換体により吸収される。次にペプチドの単一の画分を、不連続塩勾配を使用して逆相に移す。最後にアセトニトリルの上昇勾配を使用して、ペプチドを逆相から質量スペクトル計に直接溶出する。記載の方法は、イオン交換体からペプチドの追加の画分を放出するために、上昇塩濃度を使用して数回繰り返す。この方法はＭｕｄＰｉＴ（多次元タンパク質同定技術（Multidimensional Protein Identification Technology））としてよく知られている。ＭｕｄＰｉＴを使用してウォッシュバーン（Washburn M.P.）らは、酵母サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）から１４８４個のタンパク質を同定した（ウォッシュバーン（Washburn M.P.）ら、多次元タンパク質同定技術による酵母プロテオームの大規模分析、Nature Biotechnology 19:242-247, 2001）。
【０００４】
ＭｕｄＰｉＴは、タンパク質同定法を劇的に進歩させたが、タンパク質の相対的定量は容易にできなかった。この意味でウォッシュバーン（Washburn M.P.）ら（多次元タンパク質同定技術により得られる定量的プロテオームデータの解析、Analytical Chemistry、74:1650-1656, 2002）は、サッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）の２つの培養物の代謝標識により、タンパク質を定量した。オダ（Oda）ら（タンパク質発現と部位特異的リン酸化の正確な定量、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6591-6596, 1999）の以前の試験に似た方法で、濃縮窒素-14/15（14Ｎ／15Ｎ）培地中で細胞を増殖させた。これらの研究者は、２次元電気泳動を使用してタンパク質を同定し、一方ウォッシュバーン（Washburn M.P.）らはＭｕｄＰｉＴを使用した。両方の場合でタンパク質の相対的定量は、元々の試料の培養条件に従って、ある標識ペプチドの質量スペクトルシグナルの相対的強度を考慮して行われた。
【０００５】
必要な試薬と培地が高価なため、代謝標識は主に細菌や酵母のような生物に適用される。さらにこの種の標識では、タンパク質のすべての窒素原子が標識される：ペプチド結合の窒素原子ならびにアミノ酸側鎖の窒素原子が標識され、このため、アミノ酸配列の知識無しで相同体の標識ペプチドの質量の差を予測することが不可能となる。
【０００６】
あるグループの研究者が、異なる種類の代謝標識を使用して重要な進展をした。この場合、標識された必須アミノ酸が細胞培養物中に導入され、従ってこれらはすべての発現されるタンパク質中に取り込まれる。この方策はＳＩＬＡＣ（細胞培養物のアミノ酸による安定アイソトープ標識）と名付けられ、ロイシン（１Ｈ／２Ｄ）やリジン（12Ｃ／13Ｃ）のような標識アミノ酸を使用して、その可能性が証明されている（オング（S.E. Ong）、ブラゴエフ（B. Blagoev）、クラチマロバ（I. Kratchmarova）、クリステンセン（D.B. Kristensen）、スティーン（H. Steen）、パンデイ（A. Pandey）、マン（M. Mann）、Mol. Cell Proteomics 1, 2002, 376-386）；（バーガー（Berger SJ）、リー（Lee SW）、アンダーソン（Anderson GA）、リジアナ（Lijiana PT）、トリック（Tolic N）、シェン（Shen Y）、ザオ（Zhao R）、スミス（Smith RD）、2002, 安定アイソトープアミノ酸標識とデータ依存性多重ＭＳ／ＭＳを組合せた高処理能力グローバルペプチドプロテオーム分析、Analytical Chemistry 74:4994-5000）；および（インビボのリジン特異的質量標識によるヒトプロテオームの正確なペプチド配列決定とタンパク質定量、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003, 14, 1-17）。
【０００７】
ペプチドの酵素標識も提案されており、水と酸素-18濃縮水（Ｈ218Ｏ）の存在下でのタンパク質混合物のタンパク質分解消化で使用されている。最近の例では、酸素-18の１つまたは２つの原子が、作成されたペプチドのＣ末端に取り込まれる。標識および非標識ペプチドの試料を混合し、質量スペクトル法により相同体ペプチド対を分析することにより、比較プロテオーム試験が行われる。あるペプチドのシグナルの面積の比は、分析試料中の対応するタンパク質の濃度比に比例する。
【０００８】
この標識技術では、アイソトープエンベロープの重複を避けるのに質量シグナルの分離が充分ではない。さらに１つまたは２つの18Ｏ原子の取り込みは複雑なパターンを形成し、これは分析を困難にする。この意味でヤオ（Yao）ら（ヤオ（Yao X）、アフォンソ（Afonso C）、フェンセラウ（Fenselau C）、タンパク質分解18Ｏ標識の分析：エンドプロテアーゼに触媒された末端切断型ペプチド基質の16Ｏと18Ｏの交換。J Proteome Res. 2003, 2:147-52）は、ペプチドのＣ末端への２つの18Ｏの完全な取り込みを触媒する方法を提唱した。
【０００９】
追加の工程と実験的方法以外に、これらの方法は、アイソトープエンベロープによりカバーされる質量範囲の一部を共有する他のペプチドの出現の可能性を避けられない。
【００１０】
逆標識法は、それぞれが互いに逆標識を使用する２つの平行に行った実験により、タンパク質の示差的発現を反映するイオンシグナルを強調するスキームを提唱する。２つの質量スペクトルを引くことは、互いに１つの実験で質量変化シグナルに注目することを可能にする。逆標識法は、極端な発現変化をするタンパク質の同定および翻訳後修飾の検出のようないくつかの利点を与える。さらにこの方法は、ペプチドＭＳ／ＭＳの分析ならびにタンパク質同定と定量に必要な時間と努力を大きく低下させる。しかしタンパク質発現の小さな変化は、特にこの差が質量スペクトルのノイズ以下の時は、視覚的試験では検出できないかも知れない。さらにスペクトルのフィルタリングと平滑化は、低シグナル対ノイズ比の領域で分解能と関連情報を失わせる。逆標識法の他の欠点は、実際に感度を低下させる２つの実験が必要なことである。
【００１１】
液体クロマトグラフィーと質量スペクトルシステムの現在の分解能を考慮すると、タンパク質の複合体混合物の加水分解中に生成されるすべてのペプチドの分析は非現実的なものとなる。このため、プロテオームの定量的分析の他の代替法が出現している。この新しい方法では、タンパク質の同定と定量は、混合物中に存在するタンパク質当たりの減少したペプチド群の選択的単離と分析により行われる。
【００１２】
新しい代替法の例はＩＣＡＴ（アイソトープコード親和性タグ）法である（アイソトープコードした親和性タグを使用する複合体タンパク質混合物の定量的分析、ジジ（Gygi, S.P.）、リスト（Rist, B.）、ガーバー（Gerber, S.A.）、ツレセック（Turecek, F.）、ゲルブ（Gelb, M.H.）、およびイーバーソールド（Aebersold, R.），Nat. Biotechnol. 17:994-999, 1999）。ＩＣＡＴでは、システイン含有ペプチドのみが単離され、３つの機能性成分の試薬を使用して分析される（特異的化学反応性；アイソトープでコードされたリンカー、および親和性タグ）。この方法では、ある細胞段階を示すタンパク質試料のシステインの遊離のチオールが軽いアイソトープのＩＣＡＴ試薬で修飾され、第２の細胞段階を示す試料は重いＩＣＡＴ試薬で修飾される。２つの試料が混合され、酵素的に消化され、システイン含有ペプチドは親和性クロマトグラフィーで単離され、μＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析される。
【００１３】
示差的タンパク質発現は、同じ配列を有するがＩＣＡＴ試薬の軽いものと重いもので標識されたペプチド対の、質量シグナルの相対的強度を測定することにより定量される。
【００１４】
強度の比率を求めるために、平滑化フィルターを使用してスペクトルを再構成するアルゴリズムが使用される。こうして局所的極大（ピーク）の位置と強度が同定される。最後に各タンパク質に対して、同定されるペプチドの強度の平均が決定される。
【００１５】
ＩＣＡＴ法には以下の制限があるとされている：
−  システイン残基を含まないタンパク質は分析から除外される。
−  ＩＣＡＴ試薬のサイズが、イオン化と質量スペクトル解釈を妨害する。
−  ＩＣＡＴ試薬の軽いものと重いもの（Ｈ８／Ｄ８）で標識されたペプチドはＲＰ−ＨＰＬＣ系で大きく分離され、これは定量プロセスを誤らせる事実である。
−  定量プロセスは、アイソトープ分布の重複を避けるのに充分な質量分離を与えない標識法に、適用することができないであろう。
−  あるペプチドのアイソトープ分布と、相同体標識ペプチドの対（軽い／重い）のいずれかのアイソトープ分布との重複があるなら、定量プロセスは信頼できる結果を与えることができないであろう。
【００１６】
この方法について記載された制限にもかかわらず、これはいまだに、タンパク質当たりのペプチドの小さい群の選択的および特異的単離（すなわち、質量スペクトル分析前のタンパク質分解ペプチドの混合物の従来の単純化）により、複合体混合物中のタンパク質発現の相対的レベルを同定し測定するのに必要である。試料の複雑さの減少は、混合物中に少量しか存在しないタンパク質の同定を可能にし、同じタンパク質からの多くのペプチドの配列決定を避けるであろう。さらに実験操作を複雑にすることなく、重複した質量シグナルのスペクトルを分析し処理する方法の開発も必要である。
【００１７】
発明の詳細な説明
タンパク質の複合体混合物を酵素的に消化すると、多くのペプチドが生成し、これは、液体クロマトグラフィーや質量スペクトル系の解像力を超えており、すべてのタンパク質分解ペプチドの分析は非現実的となる。しかし、特異性の高いプロテアーゼによりタンパク質を切断して得られる少なくとも７つの残基のペプチドの配列は、タンパク質の同定に充分である。
【００１８】
タンパク質当たり少ない数のペプチドの分析は、しばしば少量のアミノ酸を含有するペプチドの特異的単離により行われる。しかし、ペプチドの物理的性質を考慮し、タンパク質配列内によく分布したアミノ酸ならびに少量のアミノ酸を含有するペプチド（ヒスチジンやアルギニンを含有するペプチド）を、分析から除外することにより、そのような目標を達成することもできる。
【００１９】
この意味で本発明は、リジン残基のα−アミノ末端基とε−アミノ基の共有誘導体化によりあらかじめ修飾したタンパク質分解性ペプチドのイオン交換クロマトグラフィーに基づく、ヒスチジン残基もアルギニン残基も含有しないペプチド（ＮＨＮＲペプチド）の選択的単離法を提供する。本発明の方法は、すべてのタンパク質はＮＨＮＲペプチドを含有するため、複合体混合物中のタンパク質の同定、および２つの異なる試料中の１つ以上のタンパク質の発現レベルの比率の測定に、効率的に使用することができる。
【００２０】
本明細書に記載の方法の具体例において、種々の天然または合成起源から生成するポリペプチド混合物は、図１に示す工程に付され、これは以下のように説明される：
【００２１】
（１）公知のアルキル化試薬（すなわち、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸またはアクリルアミド）によるシステインのアルキル化。これは、ジスルフィドブリッジ形成のためにきつく折り畳まれたタンパク質または遊離のシステイン残基を含有するタンパク質に、特に有用である。第１の場合に、システインのアルキル化は酵素的消化プロセスを助け、第２の場合には、ジスルフィド／ジチオール交換反応によりダイマーおよび他の付加物の形成を避けるであろう。
【００２２】
（２）タンパク質の加水分解。この目標は、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシン、テルモリシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ、または他の任意のプロテイナーゼによる酵素的消化により達成される。臭化シアンまたは有機もしくは非有機酸によるタンパク質の化学的加水分解を使用することもできる。さらに本発明の方法に付されるペプチド混合物は、酵素的および／または化学操作（例えば上記したもの）の組合せの結果でもよい。こうして生成したペプチドは、好ましくは約１０〜５０アミノ酸の長さであり、さらに好ましくはタンデム質量スペクトル法を使用するペプチド配列決定を促進する。当業者は、目的のタンパク質試料での使用に適したタンパク質消化プロトコールを選択することができる。
【００２３】
（３）リジン側鎖のα−アミノ末端基とε−アミノ基の共有修飾。種々の有用なアミン保護基が当該分野で公知であり、本方法で容易に応用できる。選択される保護基は、塩基性基もプロトン化可能な部位も含有も生成もしてはならない。使用可能な試薬のリストは以下の通りである：無水酢酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−アセトキシスクシンイミド、無水シトラコン酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水テトラヒドロフタル酸、９−フルオレニルメチルクロロギ酸。他のいくつかの適当なＮ末端アミノ保護基は以下の通りである：（ａ）芳香族ウレタン型保護基であって、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、イソニコチニルオキシカルボニルおよび４−メトキシベンジルオキシカルボニルがある：（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基であって、ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルおよびメチルスルホニルエトキシカルボニルがある；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基であって、アダマンチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニルおよびイソボルニルオキシカルボニルがある；（ｄ）アシル保護基またはスルホニル保護基。好適な保護基には、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、アセチル、２−プロピルペンタノイル、４−メチルペンタノイル、ｔ−ブチルアセチル、３−シクロヘキシルプロピオニル、ｎ−ブタンスルホニル、ベンジルスルホニル、４−メチルベンゼンスルホニル、２−ナフタレンスルホニル、３−ナフタレンスルホニル、および１−カンファースルホニルがある；（ｅ）光感受性保護基であって、ｍ−ニトロフェニル、３，５−ジメトキシベンジル、１−メチルー１（３，５−ジメトキシフェニル）エチル、α−メチルニトロピペロニル、ｏ−ニトロベンジル、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジル、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチル、２−（２−ニトロフェニル）エチル、６−ニトロベラトリル、４−メトフェナシルおよび３’，５’−ジメトキシベンゾインからのカルバメート誘導体を含む。
【００２４】
アミノ基の選択的誘導体化の機能を達成する任意の方法および／または試薬は、本発明に包含されると考えられる。そのような修飾を行うための試薬とプロトコールの例は、文献中に容易に見つかる（有機合成における保護基、テオドラ（Theodora W. Greene）とピーター（Peter G.M. Wuts）、494-654頁、ジョンワイリーアンドサンズ社（John Wiley and Sons Inc.）編、(1990)、およびペプチド化学、ボダンスキー（Bodanszky, N.）、74-103頁、スプリンガー−フェアラーク（Springer-Verlag）、ニューヨーク（1988））。
【００２５】
（４）修飾ペプチドの混合物のイオン交換クロマトグラフィー。ペプチドの選択は、ｐＨ２〜４の強陽イオン交換クロマトグラフィーにより行われる。酸性条件には、ギ酸、トリフルオロ酢酸、または所望の使用ｐＨを与える任意の他の緩衝液系の使用がある。このクロマトグラフィー工程は、１価および２価荷電ペプチドから非荷電ペプチドを容易に分離する。荷電ペプチドは交換体中に保持され、ＮＨＮＲペプチドはフロースルー中に集められる。
【００２６】
（５）リジンのα−アミノ末端基とε−アミノ基の再生。これは随時工程であり、最初に使用されるアミノ基修飾物質に大きく依存する。無水マレイン酸またはもしくはシトラコン酸が修飾物質として使用されるなら、遊離のアミノ基は、陽イオン交換クロマトグラフィーで使用されるものと同じ酸性条件下で一定時間インキュベートすることにより再生することができる。アミノ基の一時的保護のためにペプチド合成で使用される試薬の場合は、保護基は一般に塩基性条件を使用して除去される。修飾物質が光感受性を有するなら、これは修飾ペプチドの光照射により除去することができるであろう。
【００２７】
具体的に例示される本発明の方法は、逆相カラムでペプチドを洗浄する工程を使用して、ペプチド試料から不要な物質を除去する。
【００２８】
異なる試料中の１つ以上のタンパク質の濃度差の測定は、３つの方法でアイソトープ標識された単離したＮＨＮＲペプチドの質量スペクトル分析により行われる：
【００２９】
ａ）２つのアイソトープを使用したある栄養物質を有する培地中で増殖させた組織または細胞培養物から、タンパク質が抽出される。使用されるアイソトープ標識した栄養物質には、14Ｎ／15Ｎで標識した基本的窒素源、および水素（1Ｈ／2Ｈ）、窒素（14Ｎ／15Ｎ）、炭素（12Ｃ／13Ｃ）、酸素（16Ｏ／18Ｏ）などのアイソトープで標識した必須アミノ酸がある。タンパク質抽出後、試料の少なくとも一部を混合して混合試料を得て、これは、上記したＮＨＮＲペプチドの選択的単離のための方法の工程１〜５に従って処理される。
【００３０】
ｂ）タンパク質試料は、方法の工程２のように緩衝液（その１つは通常の水で調製し、他の１つはＨ218Ｏを含有する）中で別々に加水分解される。その後、試料の少なくとも一部を混合して混合試料を得て、これは、上記したＮＨＮＲペプチドの選択的単離のための方法の工程３〜５に従って処理される。
【００３１】
ｃ）タンパク質試料は、方法の工程２のように別々に加水分解され、生成したペプチドは、方法の工程３に従って、異なるアイソトープを含む同じアミノ修飾試薬で修飾される。両方の試料の混合物は、同じ化学的性質であるがアイソトープ（使用されるアミノ修飾試薬のために、例えばＨ／Ｄ、12Ｃ／13Ｃ、14Ｎ／15Ｃ16Ｏ／18Ｏなど）が異なるペプチドからなる。次にＮＨＮＲペプチドは、上記したように陽イオン交換クロマトグラフィーにより単離される。
【００３２】
３つの上記標識法のいずれにおいても、単離されたＮＨＮＲペプチドは質量スペクトル法により分析される。分析されるタンパク質の濃度比は、示差的に標識されたＮＨＮＲペプチドの推定される理論スペクトルの面積比から決定される。理論的スペクトルは、観察されたスペクトルによく適合するＮＨＮＲペプチドのアイソトープ分布の線形組合せから推定される。この組合せは、観察されたスペクトルのエンベロープへのペプチドの寄与を示す。アイソトープ分布面積が標準化されるなら、面積の比は寄与の比に等しい。
【００３３】
分析されたｍ／ｚの範囲内に存在する化合物は３群に分類することができる：１）ＮＨＮＲペプチド種、第１の試料由来、２）ＮＨＮＲペプチド種、第２の試料由来、３）本分析に無関係の化合物。
【００３４】
各試料由来の目的のＮＨＮＲペプチド種の総寄与の比は、各試料中のタンパク質の濃度比を示す。他の無関係のシグナルの重複により引き起こされる妨害は、理論的スペクトル推定により等しく考慮され、この定量方法に対して堅牢性と一般性を与える。
【００３５】
アイソトープ分布の計算は、ＮＨＮＲペプチドの元素組成と任意の具体的なアイソトープ濃縮を考慮する。これは、シグナル重複の分析とともに、特定のアイソトープ標識からこの方法を区別する。
【００３６】
Ｈ218Ｏの存在下での標識中、脱アミノ化されるアスパラギン、グルタミン、またはカルバミドメチルシステイン残基を含有するようなペプチドは、追加の18Ｏを取り込み得る。これは、18Ｏ標識試料由来のＮＨＮＲペプチドのより広いアイソトープ分布を与え、アイソトープ分布からの最初の２つのピークにのみ基づく軽／重比を推定する任意の方法に取って代わる。理論的スペクトルの推定は、観察されたスペクトルにより一致するＮＨＮＲペプチドのアイソトープ分布組成物により提供される情報を得ることを可能にする。アイソトープ分布に含まれる情報は非常に限定的であり、高精度でノイズを推定することを可能にする。
【００３７】
イオン化源として電子噴射（ＥＳＩ−ＭＳ）またはマトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に基づく質量スペクトル計を、分析に使用することができるであろう。こうして得られる情報は、ペプチドのアミノ酸配列とその対応するタンパク質をデータベース検索により決定するのに有用である。
【００３８】
以下の文献は、特にプロテオーム分析に関連するタンパク質の同定への質量スペクトル法の応用に関する：イデカー（Ideker T）、トーソン（Thorsson V）、ラニッシュ（Ranish JA）、クリスマス（Christmas R）、ブーラー（Buhler J）、イング（Eng JK）、ブンガーナー（Bungarner R）、グッドレット（Goodlett D R）、イーバーソールド（Aebersold R）、フード（Hood L）、「全身性に撹乱された代謝ネットワークの遺伝子およびプロテオーム統合分析」、Science 2001 May 4:292(5518):929-34； ガイギ（Gygi SP）、イーバーソールド（Aebersold R）、「質量スペクトル法とプロテオミクス」、Curr Opin Chem Biol. 2000 Oct;4(5):489-94；ガイギ（Gygi SP）、リスト（Rist B）、イーバーソールド（Aebersold R）、「定量的プロテオーム分析による遺伝子発現の測定」 Curr Opin Biotechnol. 2000 Aug; 1 1(4):396-401；グッドレット（Goodlett D R）、ブルース（Bruce J E）、アンダーソン（Anderson GA）、リスト（Rist B）、パサ−トリック（Pasa-Tolic L）、フィーン（Fiehn O）、スミス（Smith R D）、イーバーソールド（Aebersold R）、「システイン含有ペプチドの単回の正確な質量と制限データベース検索によるタンパク質同定」、Anal Chem. 2000 Mar 15;72(6):1112-8；およびグッドレット（Goodlett D R）、イーバーソールド（Aebersold R）、ワッツ（Watts JD）、「質量スペクトル法によるホスホタンパク質分析のガイドとしての定量的インビトロキナーゼ反応」、Rapid Commun Mass Spectrom. 2000;14(5):344-8; ゾウ（(Zhou, H.）ら、（April 2001) Nature Biotechnol. 19:375-378。
【００３９】
ペプチドの構造情報を得ることは以下のように説明される。タンデム質量スペクトル計の最初の段階で、あるＮＨＮＲペプチドを選択し、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）実験に付す。生じる断片イオンスペクトルを、いわゆるＣＩＤまたはＭＳ／ＭＳスペクトルとして質量スペクトル計の第２の段階で記録する。ＣＩＤプロセスは通常、ペプチド鎖に沿ってペプチド結合で断片化を引き起こすため、ＣＩＤスペクトル単独で、しばしばペプチド配列を決定するのに充分な情報を与える。
【００４０】
単離されたペプチドの配列とタンパク質の同定は、タンデム質量スペクトル法と、ＭＡＳＣＯＴ（マトリックスサイエンス社（Matrix Science Ltd.）、英国）（パーキンズ（Perkins, DN）ら、(1999) 「質量スペクトルデータを使用する配列データベースの検索による確率ベースのタンパク質同定」、Electrophoresis 20, 3551-3567）やＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州）（マコーマック（MacCormack, A.L.）ら、(1996)、「低ヘムトレベルでのＬＣ／ＭＳ／ＭＳとデータベース検索による混合物中のタンパク質の直接分析と同定」、Anal. Chem. 69, 767-776；イング（Eng, J.K.）ら(1994)、「ペプチドのタンデム質量スペクトルデータをタンパク質データベース中のアミノ酸配列と相関させるアプローチ」、J. Amer. Soc. Mass. Spectrom., 5, 976-989；米国特許第５，５３８，８９７号（Jul. 23, 1996）ヤーテス（Yates）ら））のようなコンピューター支援データベース検索プログラムの組合せにより決定される。ＭＡＳＣＯＴとＳＥＱＵＥＳＴの両方とも、すべての既知のゲノム配列を取り、すべての可能な理論的ＣＩＤスペクトルを計算し、これらを実験的ＣＩＤスペクトルとマッチングと配列同定について比較する。
【００４１】
本発明の方法を使用するタンパク質同定プロセスは、ＮＨＮＲペプチド配列のゲノムデータベースの使用により大幅に促進されるであろう。そのようなデータベースは、ＭＡＳＣＯＴおよび／またはＳＥＱＵＥＳＴプログラムを使用して、迅速でより信頼できる検索を可能にし、擬陽性の同定の可能性を最小にするであろう。
【００４２】
いったんＮＨＮＲペプチドが同定されると、ＭＳ／ＭＳスペクトルからタンパク質の相対的濃度を決定することができる。これは、標識の軽いものと重いものを含有する断片イオンのアイソトープ分布を分析することにより行われるであろう。
【００４３】
実施例
例１
組換えストレプトキナーゼからのＮＨＮＲペプチドの単離
組換えストレプトキナーゼを以下の工程に従って図１に示す方法に付した。１）０．１Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ８．６）、尿素４Ｍ中のトリプシンで３７℃で６時間加水分解。２）アミノ基に対して５０モル過剰でシトラコン酸を加えた。反応は４℃で１５分行う。３）ＲＰ−Ｃ４カラム（２０×２．１mm）と、溶媒Ａ（水中０．０５％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ）からなる溶媒系とを使用するＨＰＬＣによりペプチドを脱塩して、過剰の試薬を除去した。４）修飾ペプチドを強陽イオン交換体にのせ、直ちにフロースルー画分を集めた。５）単離したペプチド画分を３７℃で１２時間インキュベートしてシトラコニル基を除去し、質量スペクトルによりさらに分析した。
【００４４】
タンパク質の全消化物のＥＳＩ−ＭＳを図２Ａに示す。ストレプトキナーゼ消化物をＮＨＮＲペプチド単離法に伏して、試料の複雑性を低下させ、４つのペプチドのみを得た（図２Ｂ）。表１は、単離したペプチドのｍ／ｚ値と、タンパク質配列へのその割り当てを示す（記載の最後の配列＃１）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
例２
ＮＨＮＲペプチドの選択的単離を利用する髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の膜抽出物中に存在するタンパク質の同定
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）を１６時間培養し、次に５０００ｇで１５分遠心分離した。バイオマスを、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．５）、１０mM ＥＤＴＡおよび０．５％デオキシコール酸ナトリウムからなる緩衝液で、室温で３０分攪拌しながら抽出した。次にこれを２００００で３０分４℃で遠心分離し、上清を集めた。上記と同じ緩衝液を使用して、ペレットについて別の抽出工程を行った。この試料とあらかじめ採取した上清を混合し、１２５０００で２時間４℃でさらに超遠心分離した。ペレットを５０mMトリス−塩酸、２mM ＥＤＴＡ、１．２％デオキシコール酸ナトリウムおよび２０％ショ糖に溶解し、別の超遠心分離工程を行った。最後にタンパク質ペレットを、３％ショ糖と０．０１％チメロサールを含有する溶液でホモジナイズした。
【００４７】
タンパク質の抽出物（３００μg）を０．１Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ８．８）、塩化グアニジウム６Ｍに溶解し、ＤＴＴ（１０mM、２時間）を加えて混合物を還元しアルキル化し、次にヨードアセトアミドとともに１時間インキュベートした。次に試料を希釈した後、トリプシンで３７℃で１６時間消化した。生じたペプチド混合物を基本的に例１のように処理した。
【００４８】
この方法で単離したペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、タンパク質のデータベース検索による同定のためにＭＳ／ＭＳスペクトルを記録した。表２は、同定されたペプチドと対応するタンパク質または遺伝子のリストを示す。同定したタンパク質（全部で５８個）のほぼ４０％が、細菌膜に局在化している。これらのタンパク質の半分は、２次元ゲル電気泳動を使用する以前の試験では検出されなかった（結果は示していない）。これは、２次元電気泳動法を使用すると膜タンパク質はあまり出現しないという事実と完全に一致する。
【００４９】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００５０】
表２から、９５個の陽性に同定されたペプチドのうちで１つのみがアルギニン残基を含有することが観察された。これらの結果は、本方法で達成される高度の選択性を証明した。一方２０個の同定されたタンパク質（３４％）はシステインを含有せず、これは、システイン残基の選択的単離に基づく方法を使用して検出できなかったことを意味する。（アイソトープコードした親和性タグを使用する複合体タンパク質混合物の定量的分析、ジジ（Gygi, S.P.）、リスト（Rist, B.）、ガーバー（Gerber, S.A.）、ツレセック（Turecek, F.）、ゲルブ（Gelb, M.H.）、およびイーバーソールド（Aebersold, R.），Nat. Biotechnol. 17:994-999, 1999；プロテオミック分析のための複合体ペプチド混合物の単純化：システイニルペプチドの逆ビオチン化。スパー（Spahr CS）、スシン（Susin SA）、ブレス（Bures EJ），ロビンソン（Robinson JH）、デービス（Davis MT）、マギンレイ（McGinley MD）、クレーマー（Kroemer G）、パターソン（Patterson SD）、Electrophoresis, 21(9), 1635-1650, 2000）。この事実は、本発明のより広い応用を可能にする。
【００５１】
例３
本発明の方法による２つの混合物（ＡとＢ）のタンパク質成分の同定と相対的定量
試料ＡとＢは、タンパク質組換えストレプトキナーゼ、ウマミオグロビン、およびヒトアルファ−２ｂインターフェロンを用いて調製した。３つのタンパク質をＡ対Ｂのモル比をストレプトキナーゼについて１：１、ミオグロビンについて１：２、そしてアルファインターフェロンについて１：４で混合した。ＮＨＮＲペプチドの単離は、基本的に例１に記載のように行ったが、この場合、トリプシンによる酵素消化は、混合物Ａについては通常の水の存在下で行い、混合物ＢはＨ218Ｏの存在下で加水分解した。両方の試料を混合し、ＮＨＮＲペプチドを本発明の方法に従って単離した。
【００５２】
16Ｏ／18Ｏによる酵素的標識法が導入する可能性がある複雑さのレベルの増加のために、この標識法を選択した。例えばこれは、ペプチドアイソトープエンベロープの重複を避けるための質量シグナルの分離が充分ではない。さらに１つまたは２つの18Ｏ原子の取り込みは複雑なパターンを形成し、これは分析をさらに困難にする。
【００５３】
単離したＮＨＮＲペプチドを配列決定し、単一のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で定量した。これは、混合物中に存在する３つのタンパク質の確実な同定、ならびに１４％未満の誤差の正確な定量を可能にする（表３）。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
図３Ａは、両試料の混合物からのＮＨＮＲペプチド単離に対応する質量スペクトルを示す。図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、各ペプチドのＣ末端に16Ｏ／18Ｏの典型的なアイソトープ分布を含有するそれぞれｍ／ｚシグナルが７２５．８３、９０８．４６および１０８１．５５についてのスペクトルの拡大範囲を示す。さらに、総理論的スペクトルへの各ペプチド種とアイソトープ変種の寄与が観察される。ｍ／ｚ１０８１．５５のペプチドの場合、アスパラギン脱アミド化の存在が同定かつ定量され、これはまた、16Ｏ／18Ｏで標識したペプチドの相対的濃度の計算についても考慮された。
【００５６】
この定量法は、ＡｓｎとＧｌｎ残基の組成物に従ってＮＨＮＲペプチドの可能な脱アミド化を考慮する。Ｈ218Ｏ暴露中に起きている脱アミド化プロセスは、ＯＨ基に18Ｏの追加の原子を導入し、これはＡｓｎのＮＨ2 基を代用してＡｓｐを形成する。従って酵素的加水分解中にペプチドのＣ末端に導入される18Ｏ原子以外に、Ｈ218Ｏの存在下で加水分解された試料由来のＮＨＮＲペプチドは、ペプチドのすべてのＡｓｎまたはＧｌｎに追加の18Ｏを導入するかも知れない。
【００５７】
スペクトル分析のために、各ＮＨＮＲペプチドの理論的アイソトープ分布が計算され、アイソトープ変種と可能な脱アミド化を含めて標準化される。観察されたスペクトルによりよく一致するアイソトープ分布の組合せが推定される。
【００５８】
各ペプチドについて、天然のアイソトープ変種（すなわち16Ｏ標識種）のアイソトープエンベロープの面積の合計と、18Ｏ濃縮種のアイソトープエンベロープの面積の合計の比が計算される。Ａｓｎを有するペプチドとＡｓｐを含有する脱アミド化ペプチドのイオン化効率の差の可能性のために、これらのアイソトープ変種の濃度比は別々に計算される。例えばｍ／ｚ１０８１．５５のペプチドは２つのＡｓｎを含有し、その計算は、スペクトルで検出されたペプチドの３つの種のアイソトープエンベロープの面積を考慮して行われた：１）脱アミド化の無いペプチド、２）１つの脱アミド化のあるペプチド、および３）２つの脱アミド化のあるペプチド。
【００５９】
これらの試料への本発明の方法の応用により、混合物のＬＥＰ加水分解中に生成する５９個の可能なペプチドのうち６つのペプチドが単離され同定された。この結果は、こうして得られた混合物組成の大きな単純化を示す。質量スペクトル分析は、タンパク質を同定する能力に影響を与えることなく、ペプチドの約９０％まで縮小される。例えば、タンパク質アルファインターフェロンの同定は、配列ＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫとｍ／ｚ７２５．８３を有する単一のペプチドの単離により可能であった（図４）。
【００６０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとデータベース検索
質量スペクトル測定は、ハイブリッド四極子直交加速タンデム質量スペクトル計ＱＴｏｆ−２（登録商標）（マイクロマス（Micromass）、マンチェスター、英国）で行った。質量スペクトル計を、ＲＰ−Ｃ１８、２００×１mmカラム（バイダック（Vydac）、アメリカ合衆国）を使用して、オンラインで液体クロマトグラフィーＡＫＴＡベーシック（AKTA Basic）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、スエーデン）に連結した。１２０分で５〜４５％の溶媒Ｂ（ＣＨ3ＣＮ、０．２％ギ酸）の線形勾配を使用して、ペプチドを溶出させた。
【００６１】
毛細管とコア電圧は、それぞれ３０００と３５に設定した。断片化される２価および３価荷電前駆体イオンは、強度が規定の閾値（７conts/sec）を超えると自動的に選択された。ＴＩＣが２カウント／秒以下に低下するか、または４秒の間にＭＳ／ＭＳモードが達成すると、ＭＳ／ＭＳをＭＳモードに変換した。データ採取と処理は、マイクロマス（Micromass）からのMassLynxシステム（バージョン３．５）を使用して行った。
【００６２】
ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づくタンパク質同定は、インターネットで入手できる検索エンジンＭａｓｃｏｔを使用して行った。検索パラメータには、固定（カルバミドメチルシステイン）および可変修飾を含み、これは、アスパラギンおよび／またはグルタミン残基の脱アミド化、およびメチオニンの酸化を含んだ。
【００６３】
（配列表）
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の方法によるペプチドの選択的単離を示すスキーム。
【図２】タンパク質組換えストレプトキナーゼからのＮＨＮＲペプチドの選択的単離の結果。タンパク質のＬＥＰ消化物を、本発明の方法の適用前（Ａ）と後（Ｂ）にＥＳＩ−ＭＳにより分析した。
【図３】それぞれＨ216ＯおよびＨ218Ｏの存在下で消化されたタンパク質ＡとＢの混合物への、本発明の方法の適用後に得られた質量スペクトル。混合物は、タンパク質組換えストレプトキナーゼ、ウマミオグロビン、およびヒトアルファ−２ｂインターフェロンからなった。混合物Ａ対混合物Ｂ中のタンパク質組換えストレプトキナーゼ、ウマミオグロビン、およびヒトアルファ−２ｂインターフェロンの濃度比は、それぞれ１：１、１：２および１：４であった。  Ａ）。両方の試料の混合物からのＮＨＮＲペプチドの選択的単離に対応する質量スペクトル。  （Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）。タンパク質ヒトアルファ−２ｂインターフェロン、ウマミオグロビン、および組換えストレプトキナーゼに対応するｍ／ｚシグナル７２５．８３、９０８．４６および１０８１．６０の拡張質量範囲。これらのシグナルは、すべてのペプチドのＣ末端に16Ｏ／18Ｏ含有の典型的なアイソトープ分布を含む。以下のペプチド種の推定される理論的スペクトルの寄与も観察された：  観察されたスペクトル  総推定スペクトルへの各ペプチド種の寄与：−  16Ｏ標識−  １つの18Ｏ原子で標識−  ２つの18Ｏ原子で標識−  16Ｏ標識と１つの脱アミド化−  16Ｏ標識と２つの脱アミド化−  １つの18Ｏ原子による標識と１つの脱アミド化−  １つの18Ｏ原子による標識と２つの脱アミド化−  ２つの18Ｏ原子による標識と１つの脱アミド化−  ３つの18Ｏ原子による標識と１つの脱アミド化−  各ペプチド種を含む理論的総推定スペクトル
【図４】ＭＡＳＣＯＴプログラムにより、タンパク質ヒトアルファ−２ｂインターフェロンに対応する配列ＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫに自動的に割り当てられたｍ／ｚ７２５．８３のＮＨＮＲペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。Ｎ末端イオンとＣ末端イオンは、ロセプストルフ（Roepstorff P.）とフォールマン（Fohlman J.）（ペプチドの質量スペクトル中の配列イオンについての一般的命名法の提案、Biomed Mass Spectrom. 11, 984, p. 601）が提唱した命名法に従ってスペクトル中に記載される。
【図１】
2005189232.tif 000098
【図２】
2005189232.tif 000099
【図４】
2005189232.tif 000100
【図３】
2005189232.tif 000101
【外国語明細書】
2005189232000001.pdf