(57)【要約】【課題】  ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドを製造するための酵素法の利点を改善する。【解決手段】  合成に先立ってプレ加水分解を行う方法であって、以下の工程：  (ａ)ポリ不飽和脂肪酸のＣ１-４アルキルエステルを、真空中での水の連続添加により完全または部分的に加水分解するか、または、真空にせずに数段階で部分的に加水分解する工程；  (ｂ)加水分解後に、水を分離または蒸留によって除去する工程；ならびに、  (ｃ)トリグリセリドを生成させるための、真空中および酵素の存在下での、ポリ不飽和脂肪酸とグリセリンとの反応を、低含水条件下で行う工程；  (ｄ)酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および  (ｅ)残存する脂肪酸および／またはＣ１-４アルキルエステルのありうる残基を、蒸留または精製によってトリグリセリドから除去する工程；を含んでなる方法によって上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成に先立ってプレ加水分解を行う、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素触媒製造のための方法であって、以下の工程：
(ａ)ポリ不飽和脂肪酸のＣ１-４アルキルエステルを、真空中での水の連続添加により完全または部分的に加水分解するか、または、真空にせずに数段階で部分的に加水分解する工程；
(ｂ)加水分解後に、水を分離または蒸留によって除去する工程；ならびに、
(ｃ)トリグリセリドを生成させるための、真空中および酵素の存在下での、ポリ不飽和脂肪酸とグリセリンとの反応を、低含水条件下で行う工程；
(ｄ)酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および
(ｅ)残存する脂肪酸および／またはＣ１-４アルキルエステルのありうる残基を、蒸留または精製によってトリグリセリドから除去する工程；
を含んでなる方法。
【請求項２】
プレ加水分解(工程ａおよびｂ)ならびにその後の合成(工程ｃ〜ｅ)を、同一反応器中で単一容器法として行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プレ加水分解(工程ａおよびｂ)ならびにその後の合成(工程ｃ〜ｅ)を、同一酵素の存在下に行うことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ポリ不飽和脂肪酸および／またはそのアルキルエステルを、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、リノール酸および共役リノール酸からなる群から選択することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
担体物質上に固定化したリパーゼ、ホスホリパーゼまたはエステラーゼを、酵素として使用することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プレ加水分解を、少なくとも２００ｍバールの真空下での水の連続添加により行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プレ加水分解を、真空を適用せずに数段階で水の連続添加により行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ａを、反応混合物全体を基準に、反応混合物において少なくとも１％の水、好ましくは多くとも５０％の水を用いて行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程ｃを、水を添加することなく、少なくとも２００ｍバールの真空下に行うことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程ｃを、
(ｉ)弱塩基性塩、錯生成剤および塩基性イオン交換体からなる群からの添加剤の添加、および／または、
(ii)溶媒またはガスの形態の共留剤の添加、および／または、
(iii)グリセリン結合性吸着剤の添加、および／または
(iv)部分グリセリド中間生成物の熱処理、
によって促進することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは脂肪酸エステルに、より具体的には、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素合成のための新規方法であって、水性環境中でのポリ不飽和脂肪酸のアルキルエステルのプレ加水分解ならびに解放された脂肪酸の低含水条件下でのトリグリセリド生成のための反応からなる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸のエステルは、化学法および酵素法の両方によって製造することができる。化学合成は、通常は非常に高い温度を使用しなければならず、また大量の塩基性触媒が必要になるため、二次生成物および望ましくない異性化がかなり多く生じるという欠点を有する。通常、リパーゼを用いる酵素触媒反応は、比較的穏やかな条件下で起こり、高純度の最終生成物を与える。
【０００３】
特許文献１は、不飽和脂肪酸のアルキルエステルおよびグリセリンからポリ不飽和共役脂肪酸のトリグリセリドを製造するためのリパーゼ触媒法であって、生成したアルコールを減圧下に反応から除去する方法を記載している。さらに、特許文献２は、生成した反応水またはアルコールを減圧下に除去することによって、グリセリンおよび遊離のポリ不飽和脂肪酸またはそのアルキルエステルをエステル化して、対応するトリグリセリドを生成させることを記載している。
【０００４】
しかし、酵素による合成は、反応が比較的遅いという欠点を有していることが多い。極めて低い含水条件下で多くの酵素の安定性は、例えばアルキルエステルからグリセリドへの直接エステル交換におけるように、劣っている。遊離酸を使用するときには、実際のトリグリセリド合成が促進されるが、不飽和脂肪酸のエステルを予め加水分解しなければならない。
【０００５】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１３２２７７６号明細書
【特許文献２】国際公開第９１／１６４４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明が解決しようとする課題は、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドを製造するための酵素法の利点を改善することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、合成に先立ってプレ加水分解を行う、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素触媒製造のための方法であって、以下の工程：
(ａ)ポリ不飽和脂肪酸のＣ１-４アルキルエステルを、真空中での水の連続添加により完全または部分的に加水分解するか、または、真空にせずに数段階で部分的に加水分解する工程；
(ｂ)加水分解後に、水を分離または蒸留によって除去する工程；ならびに、
(ｃ)トリグリセリドを生成させるための、真空中および酵素の存在下での、ポリ不飽和脂肪酸とグリセリンとの反応を、低含水条件下で行う工程；
(ｄ)酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および
(ｅ)残存する脂肪酸および／またはＣ１-４アルキルエステルのありうる残基を、蒸留または精製によってトリグリセリドから除去する工程；
を含んでなる方法に関する。
【０００８】
プレ加水分解(工程ａおよびｂ)ならびにその後の合成(工程ｃ〜ｅ)を、同一反応器中、特に同一酵素の存在下に、単一容器(ワンポット)法として行うのが好ましい。本方法の利点は、トリグリセリド合成のための酵素のより良好な安定化である。
【発明の効果】
【０００９】
酵素の安定性、従ってその再使用可能性が有意に改善され、こうして方法のコストを低下させうることがわかった。これは、一般に酵素がこのような合成法の最もコストのかかる要因であるためである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
図１は、固定化リパーゼ Novozym 435 [Novozymes(デンマーク)からのリパーゼ]の存在下での、ＣＬＡトリグリセリドを得るためのＣＬＡメチルエステル(黒菱形の点)または遊離酸ＣＬＡ(黒四角の点)とグリセリンとの反応を説明するものである。遊離酸を使用したときには、酵素活性の低下が比較的少ないことがわかった。即ち、５週間後には、ＣＬＡメチルエステルを含有するバッチ中のNovozym 435は、もはや濾過することができなかった。しかし、遊離酸の使用は、多くがエステル形態で存在するＣＬＡのエステル切断を予想する。従来技術において既知のように、エステル交換においてエステルを酵素と直接反応させると、酵素は、安定性の重大な損失を受けるであろう(図１を参照)。
【００１１】
従って、本発明の方法は２つの工程からなり、プレ加水分解を実際の合成の前に行う。エステル化の前に、ＣＬＡアルキルエステルを、水に富む媒体中、好ましくは同じ反応容器において、アルコールと遊離酸に分離させる。「水に富む」なる用語は、反応混合物全体を基準に、多くとも５０％(好ましくは多くとも２５％)および少なくとも１％(好ましくは少なくとも５％)の水の量を意味する。真空中であっても、反応混合物全体を基準に少なくとも１％(好ましくは少なくとも５％)の含水量を、水の連続添加によって反応混合物において調節する。加水分解は、既知の化学的方法によって行うことができる。しかし好ましくは、プレ加水分解も、酵素の存在下に、より具体的には、その後の合成において使用する同一酵素の存在下に行う。
【００１２】
トリグリセリドの合成は、低含水条件下で行う。これは、水または蒸気を添加することなく、合成を真空中で行うことを意味する。少量の水が、グリセリンと脂肪酸からのエステルの生成により、合成中に連続的に生成する。この反応水は、リパーゼを完全な脱水から保護する。対照的に、エステルを基質として使用したときには、反応水が生成しないので、リパーゼの脱水、従って失活が、真空中でより迅速に起こる。ポリ不飽和脂肪酸のトリグリセリドの化学合成と比較して、酵素合成は、はるかに低い温度で行うことができ、これが、望ましくない二次生成物(例えば、望ましくない異性体など)の減少を導く。通常、この酵素法の反応速度は極めて遅い。しかし、本発明の方法は、使用する酵素の安定化を導き、こうして酵素の再使用を可能にするので、酵素法を有利なものにする。
【００１３】
本方法は、天然のポリ不飽和およびポリ共役不飽和脂肪酸ならびに共役リノールおよびリノレン酸からなる群から選択される、Ｃ１-４アルキルエステル(好ましくはメチルおよび／またはエチルエステル)に適用することができる。ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、γ-リノレン酸および共役リノール酸のエステルを使用するのが好ましく、共役リノール酸(ＣＬＡ)のｃ９,ｔ１１およびｔ１０,ｃ１２異性体のエステルが特に好ましい。使用する原料に対して選択する濃度範囲は、１モルのグリセリンに対して３〜６モルのエステルであり、好ましくは１モルのグリセリンに対して３.２〜４.０モルのエステルを使用して最適の反応速度を達成する。
【００１４】
適する酵素の代表例(これらは、いかなる意味においても本発明の限定を意図するものではない)は、Alcaligenes、Aspergillus、Candida、Chromobacterium、Rhizomucor、Penicilium、Pseudomonas、Rhizopus、Thermomyces、Geotrichum、Mucor、Burkholderiaおよびこれらの混合物からなる群から選択される微生物のリパーゼおよび／またはエステラーゼである。微生物 Alcaligenes、Candida、Chromobacterium、Penicilium、Pseudomonas、Rhizopus、RhizomucorおよびThermomycesに由来するリパーゼおよびエステラーゼが好ましいが、これはこれらが特に活性であるためである。特にCandidaおよびRhizopus、とりわけCandida antarctica Bが好ましい。担体物質上に固定化したリパーゼが特に適しており、より具体的には、油脂含量(％)を基準に３〜１２重量％の固定化体が適している。
【００１５】
反応に適する温度範囲は、酵素の最適活性によって決定される。４０〜９０℃の範囲の温度が、好ましく選択したリパーゼに特に適することがわかった。５５〜８０℃の範囲の温度が好ましい。少なくとも２００ｍバール、好ましくは１〜１００ｍバール、より好ましくは２０〜６０ｍバールの真空を適用すべきである。好ましい方法パラメーターは、反応速度において達成すべき促進によって決定される。
【００１６】
反応の終了時に、固定化酵素を分離または濾過によって除去し、未反応の脂肪酸またはそのアルキルエステルを精製または蒸留(好ましくは短路蒸留)によって除去する。
【００１７】
プレ加水分解工程の使用に加えて、
(i)弱塩基性塩、錯生成剤および塩基性イオン交換体からなる群からの添加剤の添加、および／または、
(ii)溶媒またはガスの形態の共留剤の添加、および／または、
(iii)グリセリン結合性吸着剤の添加、および／または、
(iv)部分グリセリド中間生成物の熱処理、
によって工程ｃを促進することにより、本方法をさらに最適化することができる。
【実施例】
【００１８】
実施例１：操作条件下でのＣＬＡメチルエステルおよびＣＬＡ遊離酸中のNovozym 435の安定性の比較
グリセリン(４ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(４４ｇ)を、１：３.６のモル比で１個のフラスコに秤量して入れ、一方、グリセリン(５.５ｇ)およびＣＬＡメチルエステル(６６ｇ)を、１：３.７のモル比で第２のフラスコに秤量して入れた。Novozym(登録商標) 435 [Novozymes(デンマーク)からのリパーゼ；バッチ１には４ｇおよびバッチ２には３ｇ]を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。油相の試料を４８時間後に取り、グリセリドの割合(％)をガスクロマトグラフィーによって分析した。Novozym 435を、生成したＣＬＡトリグリセリドから濾過によって取り出し、フラスコに戻し、別の反応を同じ反応条件下で開始させた。このようにして反応を８週間にわたって行った。ＣＬＡメチルエステルを用いて始めた反応は窒素下に行った。
【００１９】
結果(図１を参照)
(黒菱形の点)＝ＣＬＡメチルエステルの使用
(黒四角の点)＝ＣＬＡ遊離酸の使用
ジおよびトリグリセリドの合計を基準に、生成物中のトリグリセリド含量(％)を測定した。ＣＬＡメチルエステルをＣＬＡトリグリセリドの合成に使用したときには、使用した酵素の能力がわずか５週間後になくなるが、純粋なエステル化に使用した酵素は、８週間後にその最初の能力の８０％をなお有していることが明瞭にわかるであろう。ＣＬＡ遊離酸を使用したときには、酵素の失活ならびに担体物質の比較的大きな摩耗の両方に起因する、酵素活性の比較的小さな低下だけが存在した。
【００２０】
実施例２：ＣＬＡエステルのプレ加水分解に適するリパーゼの選択
共役リノール酸エチルエステル(４ｇ)および水(６ｇ)をそれぞれ含む１５のバッチを、密閉可能な反応容器に入れ、複数の撹拌プレート上にて室温で同時に撹拌した。市販のリパーゼまたはエステラーゼ(４０ｍｇ)を各バッチに添加した。２および２２時間(hr)後に試料を取った。脂肪酸エチルエステルおよび酵素加水分解した脂肪酸を含有する有機相を分離し、分析した。変換を酸価によって測定した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
2005287511.tif 000002
試験した全てのリパーゼおよびエステラーゼが、脂肪酸エステルの加水分解において活性であることがわかった。しかし、Alcaligenes、Candida、Chromobacterium、Penicilium、Pseudomonas、RhizopusおよびThermomyces型の微生物が好ましい。上記の条件下で、エタノールを除去しない反応は、約３０重量％ 遊離脂肪酸の平衡を続けた。
【００２２】
実施例３：水およびメタノールの連続ストリッピングを伴う短鎖の共役リノール酸メチルエステルの加水分解
共役リノール酸メチルエステル(１００ｇ)、水(１０ｇ)および固定化 Candida antarctica B リパーゼ(５ｇ)を、加熱可能なフラスコに入れた。取り付けた蒸留ブリッジを用いて、６０ｍバールの減圧下および６０℃の温度で反応を行った。水を、０.２５ｍｌ／分(実施例３Ａ)および０.５ｍｌ／分(実施例３Ｂ)の流速で、連続的にフラスコ中に導入した。添加した水は迅速に留去されるので、反応器中の含水量は、反応中を通して低かった(＜２０％)。変換を、酸価の測定によってモニターした。反応を２４時間後に終了させ(部分的変換)、固定化酵素を反応混合物から濾去した。次いで、有機相を水性相から分離した。酸価２００が１００％変換に相当する。結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
2005287511.tif 000003
添加した水の量に依存して、７６.５％および８３.５％の加水分解レベルが２４時間で得られた。２４時間後の留出物の量は、３１５ｇ(実施例３Ａ)および５８４ｇ(実施例３Ｂ)であった。
【００２４】
実施例４：多段階加水分解による短鎖の共役リノール酸メチルエステルの加水分解
ヒマワリ油に基づく共役リノール酸メチルエステル(２０ｇ)および水(４０ｇ)をそれぞれ含む３つのバッチを、密閉容器に秤量して入れた。次いで、固定化リパーゼ(１ｇ)を各バッチに添加し、混合物を磁気撹拌プレート上にて室温で５時間撹拌した。次いで、酵素固定化体を濾去し、有機相を水性相から分離した。さらに水(４０ｇ)を有機相に添加し、濾去した酵素固定化体をこの反応溶液に再添加した。室温で一晩の反応の後に、酵素固定化体を再び濾去し、有機相を水性相から分離した。水(４０ｇ)を有機相に添加し、濾去した酵素固定化体をこの反応溶液に再添加した。室温でさらに５時間の反応の後に、反応を終了させた。
【００２５】
下記の酵素固定化体を使用した：
(５Ａ)：Novozym 435；
(５Ｂ)：１ｇの固定化 Candida antarctica B リパーゼ；
(５Ｃ)：１ｇの固定化 Thermomyces lanugenosus リパーゼ。
個々の段階での変換を、酸価の測定によってモニターした。酸価２００が１００％変換に相当する。結果を表３に示す。
【表３】
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【００２６】
実施例５：ＣＬＡメチルおよびエチルエステルの部分的加水分解ならびにＣＬＡトリグリセリドを生成させるための加水分解物とグリセリンとの反応
水(３００ｇ)およびＣＬＡメチルエステル(９００ｇ)(バッチ１)またはＣＬＡエチルエステル(９４０ｇ)を、２個のフラスコに秤量して入れた。０.２２％の炭酸ナトリウムをバッチ１に添加した。固定化 Candida B リパーゼ(１００ｇ)(バッチ１)または固定化 Candida B リパーゼ(８０ｇ)(バッチ２)の添加によって、加水分解を開始させた。部分的加水分解を、４５℃の温度(内部温度)、６０ｍバールの真空下、および３００ｒｐｍの撹拌速度で行った。加水分解中に、水を３ｍｌ／分の流速で連続的に添加した。油相の試料を取り、加水分解の程度を、酸価の測定によって決定した。７時間後に、加水分解を終了させた。グリセリン(８０ｇ)を各バッチに添加し、グリセリド合成を、真空中(バッチ１においては６０ｍバールおよびバッチ２においては２０ｍバール)、５５℃の温度(内部温度)で行った。油相の試料を取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量をガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００２７】
結果
【表４】
2005287511.tif 000005
高いＣＬＡトリグリセリド収率が、ＣＬＡエステルの加水分解ならびにその部分的加水分解物から出発するグリセリド合成の組合せによって得られる。高い加水分解レベルが、わずか数時間後に達成される。この組合せの方法においても、炭酸ナトリウムの添加(バッチ１)は、増大したトリグリセリド生成速度を導く。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＣＬＡトリグリセリドの合成において、出発物質としてＣＬＡメチルエステル(黒菱形の点)およびＣＬＡ遊離酸(黒四角の点)を使用したときの、酵素の反応時間の関数として、ジおよびトリグリセリドの合計を基準に、生成物中のトリグリセリド含量(％)を示すグラフである。
【図１】
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