(57)【要約】      （修正有）【課題】生体分子の複合混合物中のある生体分子の定量方法を提供する。【解決手段】少なくとも１つの識別できる成分を含む、少なくとも２つの画分を与える、生体分子の混合物の分画を含むの画分は、次に組合せ連続希釈に付される。続いて生体分子は、感度閾値及び同一性情報を与える方法により、画分中で検出及び同定される。生体分子の量は、それぞれの希釈係数を考慮して各希釈レベルで各画分中の生体分子の同定の数を集約することにより測定する。正規化を目的として、この合計は、全ての希釈レベルでの全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数で割ることができる。【選択図】    図１
2005189241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の複合混合物中のある生体分子の定量方法であって、
ａ．それぞれ少なくとも１つの識別できる成分を含む、生体分子の混合物の分画の少なくとも２つの画分を用意すること、
ｂ．画分を組合せ連続希釈に付すこと、
ｃ．各原画分及び各希釈画分中の生体分子を、感度閾値及び同一性情報を提供する方法により、検出及び同定すること、並びに
ｄ．それぞれの希釈係数を考慮して各希釈レベルで各画分中の生体分子の同定の数を集約することにより、複合混合物中の生体分子を定量すること
を含む方法。
【請求項２】
ｄ）の合計を、全ての希釈レベルでの全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数で割る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）の画分の数が、生体分子の混合物の複雑さに依存する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ａ）の画分の数が、生体分子の複合混合物中の異なる生体分子の濃度に依存する、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ａ）の画分の数が、ｃ）の検出及び同定方法に依存する、請求項１〜２のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ｂ）の希釈レベルの数が、画分中の生体分子の出発濃度に依存する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ｂ）の希釈レベルの数が、分画後の画分の数に依存する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ｂ）の希釈レベルの数が、検出及び同定方法の検出限界に依存する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
生体分子が、（ｎ−１）個以下の画分に存在する（ここで、ｎは、画分の総数であり、かつｎは、２以上である）、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
生体分子が、２つの画分に存在する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
生体分子が、１つの画分に存在する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ｃ）の検出及び同定方法が、二次元ゲル電気泳動を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ｃ）の検出及び同定方法が、更に質量分析を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ｃ）の検出及び同定方法が、免疫検定法を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ｃ）の検出及び同定方法が、質量分析と組合せたガスクロマトグラフィーを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ｃ）の検出及び同定方法が、特異的に標識した分子的実体による電気泳動を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ａ）の画分が、クロマトグラフィー分画法、超遠心分離法、タンパク質沈降法、又は免疫沈降法により分離される、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
生体分子が、ポリペプチドである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
生体分子が、ポリヌクレオチドである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
生体分子が、炭水化物である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
生体分子が、脂質である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
生体分子が、糖タンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
生体分子が、リポタンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の複合混合物中のある生体分子の定量方法であって、画分への複合混合物の分画と、これに続く画分の組合せ連続希釈、並びに明確な感度閾値及び同定能力を持つ方法による各原画分及び各希釈画分中の生体分子の検出を含む方法に関する。
【０００２】
生体分子（例えば、タンパク質）の現行の検出方法は、二次元ゲル電気泳動と、これに続く染色ゲルの容量分析である。しかし、分析される生体分子の量を測定することは、特に異なる試料中のその量を比較しようとすると困難である。生体分子濃度における試料間変動を明らかにするには、ゲルを並行して処理し、かつゲル間のマッチングを行わなければならない。
【０００３】
生体分子の複合混合物中の生体分子の定量のための簡易な方法が求められている。
【０００４】
本発明は、生体分子の複合混合物中のある生体分子の定量方法であって、
ａ．それぞれ少なくとも１つの識別できる生体分子成分を含む、生体分子の複合混合物の分画から生じる少なくとも２つの画分を用意すること、
ｂ．画分を組合せ連続希釈工程に付すこと、
ｃ．各原画分及び各希釈画分中の生体分子を、安定かつ充分に明確な感度閾値及び同一性情報を持つ方法により、検出及び同定すること、並びに
ｄ．それぞれの希釈係数を考慮して各希釈レベルで各画分中の生体分子の同定の数を集約することにより、生体分子の複合混合物中の生体分子を定量すること
を含む方法を提供する。
【０００５】
正規化を目的として、ｄ）の合計は、全ての希釈レベル（原画分及び希釈画分の希釈レベル）での全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数で割ることができる。
【０００６】
生体分子の定量のための本発明の方法は、１つのソースからの生体分子の複合混合物中の１つ以上の生体分子の、他のソースからの複合混合物中のそれぞれの生体分子に比較した相対的定量法を提供する。
【０００７】
生体分子の複合混合物は、細胞、細胞培養上清、生物学的流体（血清、血漿、尿、気管支洗浄液、喀痰、生検材料（脳脊髄液など））を含む生物学的ソースを含む、任意のソースに由来してよい。生体分子の複合混合物は、少なくとも２つの異なる生体分子を含む。本発明における生体分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質あるいは他の修飾型又はこれらの代謝物を含む、任意の生体分子であってよい。検出及び同定方法は、単一型の生体分子に限定されていてもよいし、あるいは一度に幾つかの分類の生体分子を検出及び分析することもできる。
【０００８】
本発明の方法において使用される分画方法は、生体分子の複合混合物を識別できる画分に効率的に分離するものである。好ましくは、生体分子の複合混合物は、各異なる生体分子が（ｎ−１）個以下だけの画分に存在する（ここで、ｎは、画分の総数であり、かつｎは、２以上である）、識別できる画分に分画される。好ましくは、異なる生体分子は、２つの異なる画分に、更に好ましくは１つの画分に存在する。本発明の方法において使用することができる分画方法は、標的とする型の生体分子の複合混合物の分離に適した任意の方法から選択することができる。本発明の方法において使用することができる分画方法は、吸着、重力若しくは沈降速度に基づく分画、電気泳動分画又はこれらの方法論の組合せを含む群から選択することができる。例えば、標的分子としてタンパク質の場合には、この群は、クロマトグラフィー分画法、超遠心分離法、タンパク質沈降法、親和性精製法、又は免疫沈降法を非限定的に含む。標的分子としてペプチド（例えば、タンパク質消化物から得られる）の場合には、この群は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を非限定的に含む。
【０００９】
画分は次に、組合せ連続希釈に付される。組合せ連続希釈には、そこから始めるための少なくとも２つの画分が必要である。好ましくは、生体分子の複合混合物は、続いての検出工程において充分な数の異なる標的生体分子の検出及び同定が可能となるのに必要な数の画分に分画される。好ましくは、原画分の数は素数ではなく、更に好ましくは、原画分の数は偶数であり、そして好ましくは、各最初の画分は、少なくとも１つの識別できる成分を含む。
【００１０】
組合せ連続希釈を始めるための画分の数は、生体分子の混合物の複雑さ、生体分子の複合混合物中の個々の生体分子の濃度、分離方法の効率、並びに分画及び組合せ連続希釈後に使用される検出及び同定方法に依存する。
【００１１】
組合せ連続希釈には、少なくとも１つの異なる生体分子を含む、少なくとも２つの異なる画分が組合せられる。好ましくは、２つの画分が組合せられる。これは、各画分中の生体分子の濃度と各画分の容量とのドット積を全てを組合せた画分の総容量で割った商によって、プールした画分中の生体分子の濃度を変化させる。一般に、これは、希釈画分中のどの生体分子成分でも、原画分中のそれぞれの生体分子の最大濃度に比較して、その濃度を低下させる。以下の希釈工程において、個々のタンパク質の濃度は、次の検出及び同定方法の感度閾値を下まわるまで低下する。
【００１２】
希釈工程の数は、原画分中の生体分子の出発濃度、分画後の原画分の数、並びに検出及び同定方法の検出限界に依存する。
【００１３】
本発明の方法は更に、検出及び同定方法を含む。この検出方法は、明確な感度閾値を特徴とし、また検出生体分子に関する同一性情報を提供する必要がある。それによって、特異的な生体分子の存在又は非存在を、原画分又は希釈画分において決定することができる。本発明の検出及び同定方法は、生体分子の化学組成、構造、又は配列、並びにそれから生じる物理化学的又は酵素的性質に依存することがある。これらは、特異的プローブとのハイブリダイゼーション、特異的抗体又はレクチンとの反応、特異的分子プローブとの酵素又は化学反応、等電点、分子量、生体分子の酵素消化により生じる断片の分子質量、ＮＭＲスペクトルあるいはこれらの組合せを含む。タンパク質定量の例では、本発明の検出及び同定方法は、一次元若しくは二次元ゲル電気泳動と質量分析との組合せ、免疫検定法（例えば、ウェスタンブロット）、質量分析と組合せたガスクロマトグラフィー（ＧＳ／ＭＳ）又は特異標識した分子的実体（例えば、蛍光、化合物（例えば、ビオチン）、又は放射活性タグ）による電気泳動よりなる群から選択することができる。
【００１４】
生体分子の定量法を導くために、各希釈工程のそれぞれの希釈係数が考慮される、各希釈工程の画分の同定又は特定の指紋（ペプチド質量指紋）が計算される。得られる生体分子の同定の数は、全ての希釈レベルについて集約される。正規化を目的として、この合計は、全ての画分（原画分及び希釈画分）中の全ての生体分子の同定の総数で割ることができる。
【００１５】
【数１】
2005189241.tif 000003
【００１６】
［式中、Ｎiは、希釈レベルｉでの個々の生体分子の同定の数Ｎであり、ｄiは、それぞれの希釈レベルｉの希釈係数ｄであり、そしてＮtotalは、全ての希釈レベルの全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数Ｎである］。
【００１７】
本方法は、種々の生体分子の性質とは独立である。ポリヌクレオチドは、ポリペプチド又は炭水化物と同様に処理することができる。本方法の更に別の利点は、生体分子定量を目的とする更なる努力を必要とすることなく、定量法を簡単に生体分子の同定と組合せることである。更に、１つのソース由来の生体分子の量を、別のソースのものと比較しようとするならば、生体分子の混合物を相互に別々に処理することができる。
【００１８】
これまで本発明を一般的に記述してきたが、同発明は、以下の図面と一緒に、説明だけを目的として本明細書に含まれるものであり、かつ特に断りない限り限定するという意図のない、特定の実施例を参照することにより更によく理解されよう。
【００１９】
図１は、本発明の方法を図解する：第１の工程において、複合混合物を異なる画分に分画する。これらの画分は、次に組合せ連続希釈に付す。第２の工程において、生体分子は、例えば、試料プールでの二次元ゲル電気泳動と、これに続く質量分析での同定により検出する。（ＡＵ：吸収単位；８〜２３：画分）
【００２０】
図２は、生体分子の相対量の計算を示す。ｑ：生体分子の相対量；Ｎi：希釈レベルｉの個々の生体分子の同定の数Ｎ；ｄi：それぞれの希釈レベルｉの希釈係数ｄ；Ｎtotal：全ての希釈レベルの全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数Ｎ。（スキーム：Ｎ１：非希釈、Ｎ２：２倍希釈、Ｎ３：４倍希釈、Ｎ４：８倍希釈）
【００２１】
図３は、レベル１（希釈なし）、レベル２（２倍希釈）、レベル３（４倍希釈）、及びレベル４（８倍希釈）からの二次元電気泳動ゲルにおけるタンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼ（ａ）、ビメンチン（ｂ）及び熱ショックタンパク１０５（ｃ）に関する同定の数を示す。値は、三重測定で行われた実験から合計した。（対照：５mMグルコース；高グルコース：１０mM）
【００２２】
実施例
実施例において参照される市販の試薬は、特に断りない限り製造業者の指示書にしたがい使用した。
【００２３】
実施例１：
細胞培養
ＩＮＳ−１細胞（Asfari, Janjicら 1992）は、１０％  ＦＣＳ（インビトロジェン（Invitrogen）、熱不活化）、１０mMヘペス溶液（インビトロジェン）、１mMピルビン酸Ｎａ（シグマ（Sigma））；５０μMベータ−メルカプトエタノール（シグマ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（シグマ）、及び低濃度（５mM）又は高濃度（１０mM）のグルコース（シグマ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン）で培養した。細胞は大体、低グルコース濃度で培養した。予備培養のために、細胞を分割し、次に低グルコース培地で細胞がコンフルエントになるまでインキュベートした。次いで培地を低グルコース又は高グルコース培地に替えて、インキュベーションを４日間続けた。回収のために、細胞を最初にハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン）で１回洗浄し、次に細胞が丸みを帯び、瓶表面から離れるまでトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で１〜２分間覆った。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を廃棄して、細胞をトリプシンインヒビター溶液（シグマ）に懸濁し、遠心分離管に移して、１２００×ｇで５分間遠心分離した。この後、再度同じ遠心分離機パラメーターを用いて、細胞をＨＢＳＳ中で３回洗浄した。上清を吸引して、廃棄し、そしてサイトゾルの調製に使用するまでペレットを−８０℃で凍結貯蔵した。
【００２４】
サイトゾルの調製
全ての溶液（ＨＢＳＳを除く）を４℃に冷却し、全ての工程は、冷却環境（氷浴）中で行った。約１０8個の細胞を細胞均質化培地（ＣＨＭ；１５０mM  ＭｇＣｌ2、１０mM  ＫＣｌ、１０mMトリス、０．２５Ｍグルコース、１mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁して、氷上に２分間放置した。この細胞懸濁液をポッター・エルヴェージェム(Potter-Elvehjem)ホモジェナイザーに移した。ポッター・エルヴェージェムホモジェナイザーの冷ペッスルをオーバーヘッド高トルク電動機に取り付け、細胞を１０００rpmで１０ストロークを用いてホモジェナイズした。均質化の効率（＞９０％の破壊細胞）は、位相差顕微鏡により確認した。細胞破砕物及び核は、１０００×ｇで５分間遠心分離することにより除去した。ミトコンドリアは、５０００×ｇでの遠心分離により分離した。濃縮サイトゾル画分は、最後に２０００００×ｇで遠心分離し、上清を清浄な管に移すことにより回収した。調製物中の最終タンパク質濃度は、２．５〜５．０mg/mlであった。
【００２５】
クロマトグラフィー分画
全ての分画工程は、ＡＫＴＡエクスプローラー１０（AKTAexplorer 10）クロマトグラフィーシステム（アマシャム（Amersham））を用いて室温で行った。サイトゾル調製物（１０mgの総タンパク質）を０．４５μmミレックス−ＨＶ（Milex-HV）シリンジ駆動フィルターユニットに通して、脱塩カラム（直列に連結された３個の５mlハイトラップ（HiTrap）脱塩カラム、アマシャム）に載せた。タンパク質は、緩衝液Ａ（２５mM  ＮａＨＰＯ4-  ｐＨ７．５；１mM  ＥＤＴＡ；０．５mMジチオエリトリトール；１×コンプリートＥＤＴＡ−フリー（Complete EDTA-free）（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）製のプロテアーゼインヒビターカクテル錠；ｐＨは７．５に調整）を用いて、１．５ml/分の流量を用いて溶出した。タンパク質は、ＵＶ吸収（２８０nm）の上昇と導電率の最低値をタンパク質画分の境界として利用して、２０ml注入ループに回収した。次にタンパク質は、ＴＳＫ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ  ７．５cm×７．５mmカラム（トーソー・バイオセップ（TOSOH BIOSEP））を１ml/分の流量で用いるアニオン交換クロマトグラフィーにより分離した。緩衝液Ａは、結合緩衝液として使用し、緩衝液Ｂ（２５mM  ＮａＨＰＯ4、ｐＨ７．５；１mM  ＥＤＴＡ；０．５mMジチオエリトリトール；１×コンプリートＥＤＴＡ−フリー（ロシュ・ダイアグノスティクス製のプロテアーゼインヒビターカクテル錠；１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨは７．５に調整）は、溶離緩衝液として使用した。試料をカラムに載せて、非結合物質を７カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａで洗い流した。次に結合タンパク質を３セグメントの勾配（第１セグメント：３ＣＶ中に０〜１１％緩衝液Ｂ；第２セグメント：１０ＣＶ中に１１〜３０％緩衝液Ｂ；１．５ＣＶ中に３０〜５０％緩衝液Ｂ）により溶出した。最後に、カラムを５ＣＶの５０％緩衝液Ｂで洗浄した。１mlの画分を回収し、合わせて８個のプールと流出液を生成した。導電率境界は以下とした：ＦＴ：導電率の上昇までのＵＶ２８０上昇；１（導電率上昇開始〜１２mS）；２（１２〜１５mS）；３（１５〜１８mS）；４（１８〜２１mS）；５（２１〜２４mS）；６（２４〜２７mS）；７（２７〜３０mS）；８（３０〜４０mS）。
【００２６】
二次元電気泳動
画分を濃縮して、ＰＯＲＯＳ２０  Ｒ１材料（パーセプティブ・バイオシステムズ（PerSeptive Biosystems））１００mgで充填した自動充填シリンジ駆動ミニカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ  Ｍ１００２）を用いる逆相クロマトグラフィーにより脱塩した。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１０ml及び７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで洗浄した。試料を装填後、カラムを０．１％ＴＦＡ  １０mlで洗浄して、７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ  ２mlで溶出した。次に溶出液をスピードヴァク（SpeedVac）エバポレーター中で乾燥して、ＩＥＦ試料緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、５０mMトリス、ｐＨ７．５、２％（w/v）ＣＨＡＰＳ、０．４％（w/v）ジチオエリトリトール、０．５％（w/v）両性電解質）にとった。タンパク質０．５mgを含むアリコートを各画分からとっておき、試料１〜８として標識した。画分の残りから以下の試料を調製した：試料９：０．２５mg画分１＋０．２５mg画分２；試料１０：０．２５mg画分３＋０．２５mg画分４；試料１１：０．２５mg画分５＋０．２５mg画分６；試料１２：０．２５mg画分７＋０．２５mg画分８；試料１３：０．１２５mg画分１＋０．１２５mg画分２＋０．１２５mg画分３＋０．１２５mg画分４；試料１４：０．１２５mg画分５＋０．１２５mg画分６＋０．１２５mg画分７＋０．１２５mg画分８；試料１５：０．０６２５mg画分１＋０．０６２５mg画分２＋０．０６２５mg画分３＋０．０６２５mg画分４＋０．０６２５mg画分５＋０．０６２５mg画分６＋０．０６２５mg画分７＋０．０６２５mg画分８。よって試料１〜８は、タンパク質画分０．５mgを含み、試料９〜１２は、それぞれこれらの試料の２倍希釈に相当し、試料１３及び１４は、４倍希釈に、そして試料１５は、これら原画分の８倍希釈に相当する。等電点電気泳動は、２０℃のプロテアンＩＥＦセル（Protean IEF Cell）（バイオラッド（BioRad））中で３〜１０のｐＨ範囲の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ（ＩＰＧ  ３−１０Ｌ；アマシャム）を用いて実行した。乾燥ストリップは、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（w/v）ＣＨＡＰＳ、０．４％（w/w）ジチオエリトリトール、及び０．５％（w/v）両性電解質を含む溶液に再水和した。このタンパク質画分をストリップの陰極末端にカップ装填した。電圧は、８時間にわたり５０００Ｖまで直線的に上昇し、続いて１０時間５０００Ｖで安定した。このストリップを、平衡化溶液Ｉ（６Ｍ尿素、５０mMトリスｐＨ７．５、３０％グリセロール、２．０％  ＳＤＳ、３０mMジチオエリトリトール）及び平衡化溶液II（６Ｍ尿素、５０mMトリスｐＨ８．８、３０％グリセロール、２．０％  ＳＤＳ、０．２３Ｍヨードアセトアミド）中でそれぞれ１０分間連続洗浄することにより、平衡化及びアルキル化した。このストリップを１１％アクリルアミド／ＰＤＡ（３７：１）勾配ゲル（２４０mm×２００mm×１．５mm）に載せた。タンパク質は、常に冷却（２０℃）しながらのＥＴＴＡＮ  Ｄａｌｔ電気泳動装置（アマシャム）で８０Ｖ  Ｏ／Ｎでの電気泳動により分離した。
【００２７】
ゲル染色及び加工
ゲルは、５０％メタノール／１０％酢酸中で固定して、クーマシーブルー（コロイダル・ブルー（Colloidal Blue）、インビトロジェン、カールズバッド（Carlsbad）、カリフォルニア州）で一晩染色し、続いて超純水で合計７時間何回も洗浄した。ゲルを走査して、１．２mmの直径を持つスポットを自動スポットピッキング装置を用いて切り出した。スポットは、１００mM炭酸水素アンモニウム及び３０％アセトニトリルを含む溶液中で脱染色した。乾燥した脱染色ゲル断片を１０μg/mlトリプシン溶液（ロシュ・ダイアグノスティクス）５μl中で一晩室温で消化した。超純水１０μlの添加後、タンパク質は、７５％アセトニトリル及び０．３％（v/v）ＴＦＡを含む溶液５μlで抽出した。このペプチド溶液を、ＭＡＬＤＩ標的上にマトリックスとしてのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と一緒にスポットした。
【００２８】
質量分析及びタンパク質同定
ペプチド質量は、ブルーカー・ウルトラフレックス測定器（Bruker Ultraflex Instrument）（ブルーカー（Bruker）、ブレーメン、ドイツ）で、ＡＣＴＨ及びブラジキニンを内部質量標準として使用して測定した。以下に説明されるように、モノアイソトピックペプチド質量は、質量スペクトルから自動検出して、タンパク質配列のデータベース（例えば、スイスプロット（SwissProt）、又はＮＣＢＩラットゲノムドラフト）からの全てのタンパク質のコンピュータ内（in-silico）トリプシン消化から誘導されるペプチドの理論質量と比較した。
【００２９】
ＭＡＬＤＩ質量スペクトルに関するピーク注釈
質量分析データは、測定器のベースラインを決定するために、低域中央パラメトリックスプラインフィルターで２回フィルターにかけた。ベースラインからの平滑化残差平均標準偏差を、データにおける測定器ノイズレベルの推定値として使用した。
【００３０】
ベースライン補正、及びノイズを超えるレベル座標におけるデータの修正後、ベースラインから最大偏差のデータ点を使用して、予想ペプチドピークを検出するための非線形（Levenberg-Marquardt）データフィッティング手順の種を蒔いた。具体的には、このフィット手順は、ピーク高、分解能、及びモノアイソトピック質量によりパラメーター化された最良のフィッティングの平均理論ペプチド同位体分布を作り出すことを試みる。有意なフィットへの収斂は、シグマ値を追跡することにより常法で求められる。
【００３１】
収斂の成功後、データ点の１／３をランダム交換しての１６回反復を用いるブートストラップ手順を利用して、求めたパラメーターの誤差を推定する。
【００３２】
得られるフィットは、データから引き算して、フィット付近のノイズレベルを、外挿ノイズレベル及びピークフィットからの偏差の合計に調整し、そしてノイズのレベルを５倍を超えて上まわる候補ピークを見い出すことができるまで、次のピークを見い出すため、このプロセスを繰り返す。このプロセスは、５０を超えるデータピークが見い出されたら終える。
【００３３】
ゼロ次及び一次の質量への飛行時間の変換は、検出内部標準ピークからの直線外挿を用いて補正し、そしてモノアイソトピック質量値の信頼区間は、ピークと標準の質量の正確さから推定する。
【００３４】
コンピュータ内タンパク質消化物へのスペクトルピークの確率的マッチング
質量スペクトルのピーク質量リストは、タンパク質全体の配列データベースについての理論消化物と直接比較する。各理論消化物について、［１−Π（１−ＮＰ（ｐｉ））］cMatches（ここで、Ｎは、消化物中のペプチドの数であり、Ｐ（ｐｉ）は、配列データベース中の全てのペプチドのカウントにより割ったピークのモノアイソトピック質量に関する信頼区間と一致するペプチドの数であり、そしてｃＭａｔｃｈｅｓは、消化物と質量スペクトルの間の一致の数である）を計算する。この値は、消化物とスペクトルの間の擬陽性一致が得られる確率に比例することを証明することができる。確率値は、スペクトルピークから高い有意性で一致が得られるように更にフィルターにかける。同定の第１ラウンド後、同一条件下で獲得される質量スペクトルについての同定の偏差を使用することにより、質量への飛行時間の変換の第２及び第３次条件を補正する。得られる質量値は、ほぼ１０ppm未満の絶対偏差を持つ。次にこれらの質量値は、最終ラウンドのマッチングに使用するが、ここでは、０．０１／ＮＰｒｏｔｅｉｎｓ（ボンフェローニ（Bonferroni）補正による１％有意レベル）未満のＰｍｉｓｍを持つ全ての一致が許容される。
【００３５】
データベース分析
データベース中の各タンパク質について、本試験において分析した２Ｄ−ＰＡＧＥゲル当たりの同定の数をカウントした。本実施例では、希釈レベル１を対照として設定した。次に、以下の値を導いた：
・  希釈レベル１における同定の数（非希釈試料、試料１〜８）＝Ｎ1
・  希釈レベル２における同定の数（２倍希釈、試料９〜１２）＝Ｎ2
・  希釈レベル３における同定の数（４倍希釈、試料１３、１４）＝Ｎ3
・  希釈レベル４における同定の数（８倍希釈、試料１５）＝Ｎ4
【００３６】
予想されるとおり、多くのタンパク質ではＮ値は、層から層へおおよそ２倍低下した。希釈係数を明らかにするために、及び各タンパク質についての大ざっぱな絶対量を導くために、定量値ｑを以下のとおり計算した：
ｑ  ＝  （Ｎ1＋２×Ｎ2＋４×Ｎ3＋８×Ｎ4）／全ての希釈レベルでの同一ソースの全ての試料についての同定タンパク質スポットの総数
【００３７】
同一ソースの全ての試料についての同定の総数で割ることは、タンパク質濃度における試料間変動を明らかにするために導入した。
【００３８】
各タンパク質について、両方の混合試料（高及び低グルコース）のｑ値を計算して比較した。
【００３９】
以下の３種のタンパク質を、本定量方法の実行可能性の説明のための実施例として選択した：グリコーゲンホスホリラーゼ（肝臓型）；ビメンチン、及び熱ショックタンパク１０５（表１、図３）。
【００４０】
【表１】
2005189241.tif 000004
【００４１】
表１：３種の実施例タンパク質の３回の実験で得られたサイトゾル中に存在するタンパク質の相対量（ｑ値）
【００４２】
実施例２：コラーゲンアルファＩ（IV）
インスリン抵抗性患者３名とインスリン感受性患者３名（白人、女性）からの血清試料を後述のとおり分画した。肥満度指数（Body Mass Index）（ＢＭＩ）と、オイグリセミック−高インスリン血症クランプ（Euglycemic-Hyperinsulinemic Clamp）方法（Garveyら, Diabetes 34 (1985) 222-234）により求めたグルコース廃棄速度（Glucose Disposal Rate）（ＧＤＲ）を表２に示す。組合せ連続希釈は、本特許出願に記載されるように実施して、生じた試料を後述のとおり二次元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に付した。検出可能なタンパク質スポット全てを各ゲルから切り出した。タンパク質をトリプシンで消化して、生じたペプチドをマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間質量分析（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry）（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）に付した。タンパク質同定は、後述のようにペプチド質量指紋分析により実現し、そしてタンパク質リストを実施例１に記載されたように比較した。
【００４３】
【表２】
2005189241.tif 000005
【００４４】
表２：被験者６名の肥満度指数（ＢＭＩ）及びオイグリセミック高インスリン血症クランプ方法により求めたグルコース廃棄速度（ＧＤＲ）。１５を超えるＧＤＲが、インスリン抵抗性の決定の区切点と考えられるため、パネルの左側の患者は、インスリン感受性（ＩＳ）として、そして右側はインスリン抵抗性（ＩＲ）として分類される。これらの個人からの血漿は、組合せ連続希釈と、続く２Ｄ−ＰＡＧＥ、スポット切り出し、トリプシン消化、ＭＡＬＤＩ−ＭＳそして最終的にペプチド質量指紋比較法によるタンパク質同定によって分析した。
【００４５】
試料調製
プロテオミクス技術を適用することにより、ヒト血漿中のインスリン抵抗性（Insulin Resistance）マーカーを探索するための方法を確立した。血漿は、約１０個の高存在量タンパク質を含み、これらが、総タンパク質量の約９８％に相当するため、プロテオミクス技術により分析することが困難である。高存在量タンパク質である、アルブミンと抗体鎖は、クロマトグラフィー法を適用することにより除去して、流出画分をイオン交換体で分画した。説明したスキームは、３つのクロマトグラフィー工程のマトリックスブルー、プロテインＧ及びイオン交換を含み、そして再現性が高い。全てのクロマトグラフィー工程は、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア（Pharmacia））で実行した。
【００４６】
ミメティックブルー（Mimetic blue）での親和性クロマトグラフィーによるアルブミンの除去及びプロテインＧでの親和性クロマトグラフィーによるイムノグロブリンの除去
ヒト血漿を、対照となる個人３名及びII型糖尿病の患者３名から採取した。プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ・ダイアグノスティクス、マンハイム、ドイツ）を血漿に加えた（５０mlに１錠）。血漿は、２５mM  ＭＥＳ、ｐＨ６．０で３倍希釈することにより塩濃度を低下させ、ｐＨを約６．０に調整した。２つのカラム、ミメティックブルーＳＡ  Ｐ６ＸＬ（５０ml、プロメティック・バイオサイエンシーズ社（ProMetic BioSciences Ltd.））及びハイトラップ・プロテインＧ  ＨＰ（HiTrap Protein G HP）（５ml、アマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences））を連続してつなぎ、２５mM  ＭＥＳ、ｐＨ６．０で平衡化した。血漿タンパク質約１ｇに対応する容量（１５ml、６６mg/ml）を０．２２μmフィルターにより濾過して、ミメティックブルーカラムに５ml/分で適用した。このカラムの流出液が直接プロテインＧカラムに載るため、後のカラムからの流出画分を集めた（約１２０mg）。２つのカラムを２５mM  ＭＥＳ、ｐＨ６．０  １００mlで洗浄し、次にこれらを分離した。ミメティックブルーカラムは、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の２Ｍ  ＮａＣｌの段階的勾配で溶出し、プロテインＧは、１００mMグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．８で溶出し、そして溶出液は１Ｍトリス塩基で中和した。流出画分と２つの溶出液は、二次元ゲルにより分析して、タンパク質はＭＡＬＤＩ−ＭＳにより同定した。ミメティックブルーからの溶出液では、主として完全長及び断片化アルブミンを検出した。プロテインＧカラムからの溶出液では、主として重鎖及び軽鎖Ｉｇ鎖を検出した。他の血漿タンパク質の多くは、流出画分中に回収した。
【００４７】
イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質分画
ミメティックブルー及びプロテインＧカラムからの流出及び洗浄画分を合わせて、２Ｍトリス塩基でｐＨ８．０に調整し、ハイトラップＱ  ＨＰカラム（HiTrap Q HP column）（５ml、アマシャム・バイオサイエンシーズ）に適用して、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で５ml/分で平衡化した。このカラムを、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの上昇塩濃度の直線勾配で溶出した。５ml画分を回収して、１−Ｄゲルにより分析した。総タンパク質約５０mgをこのカラムから回収した。ゲル分析に基づいて、画分をプールすることにより、各プールが総タンパク質約５mgを含むように、８個のプールを形成した。このプールをウルトラフリー−１５遠心分離フィルター（Ultrafree-15 Centrifugal Filter）（５ｋＭＷＣＯ、ミリポア（Millipore））で濃縮して、８個のプールのそれぞれを２−Ｄゲルにより分析した。各ゲルから約４００スポットを切り出して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。
【００４８】
２Ｄ−ＰＡＧＥ
固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップは、アマシャム・バイオサイエンシーズ（ウプサラ、スウェーデン）から購入した。アクリルアミドは、バイオソルブ（Biosolve）（ファルケンスワード（Valkenswaard）、オランダ）から入手し、そしてポリアクリルアミドゲル調製のための他の試薬は、バイオラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）（ハーキュリーズ（Hercules）、カリフォルニア州、米国）から入手した。ＣＨＡＰＳはロシュ・ダイアグノスティクス（マンハイム、ドイツ）から、尿素はアプリケム（Applichem）（ダルムシュタット（Darmstadt）、ドイツ）から、チオ尿素はフルカ（Fluka）（ブックス（Buchs）、スイス）から、そしてジチオエリトリトールはメルク（Merck）（ダルムシュタット）から入手した。
【００４９】
総タンパク質０．５mgの試料を、試料カップ中その塩基性及び酸性末端で３−１０  ＮＬ  ＩＰＧストリップに適用した。等電点電気泳動は２００Ｖで開始し、電圧は、コンピュータ制御電源を用いて３Ｖ/分で５０００Ｖまで徐々に上昇させて、更に６時間一定に保持した。第２の次元の分離は、１２％一定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１８０×２００×１．５mm）上でゲル当たり４０mAで実行した。５％リン酸を含む４０％メタノール中で１２時間のタンパク質固定後、ゲルはコロイド状クーマシーブルー（ノーベックス（Novex）、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国）で２４時間染色した。過剰の染料は、Ｈ2Ｏでゲルから洗浄し、そしてゲルは、アグファ・デュオスキャン（Agfa DUOSCAN）デンシトメータ（分解能４００）で走査した。ゲルの電子画像をフォトショップ（Photoshop）（アドビ（Adobe））ソフトウェアで記録した。画像は、ｔｉｆｆ（約５Ｍバイト／ファイル）及びｊｐｅｇ（約５０Ｋバイト／ファイル）フォーマットで保存した。ゲルは、ＭＳ分析に使用するまで４℃に保持した。
【００５０】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ
選択した１．２mm直径のスポットを、手製のスポットピッカー（ヨーロッパ特許出願EP 1,384,994に記載）で切り出し、９６ウェルマイクロタイタープレートに入れて、各ゲル片を、サイバイ（登録商標）−ウェル（CyBiTM-Well）装置（サイビオ社（Cybio AG）、イェーナ（Jena）、ドイツ）中で５０mM重炭酸アンモニウム中の３０％アセトニトリル１００μlにより脱染色した。脱染色後、ゲル片をＨ2Ｏ  １００μlで５分間洗浄し、スピードヴァク（speedvac）エバポレーター中で加熱することなく４５分間乾燥した。各乾燥ゲル片は、トリプシン（ロシュ・ダイアグノスティクス、マンハイム、ドイツ）５０ngを含む１mM重炭酸アンモニウム５μlで再水和した。室温で１６時間後、０．３％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル２０μlを各ゲル片に加えた。ゲル片は、絶えず振盪しながら１５分間インキュベートした。ペプチド混合物（１．５μl）は、０．０２５％α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シグマ（Sigma））からなり、かつ標準ペプチドの脱Ａｒｇ−ブラジキニン（シグマ、２０nM、９０４．４６８１Da）及び副腎皮質刺激ホルモン断片１８〜３９（シグマ、２０nM、２４６５．１９８９Da）を６５％エタノール、３２％アセトニトリル、及び０．０３％トリフルオロ酢酸中に含むマトリックス溶液１μlと同時に、アンカーチップ（AnchorChip）（登録商標）に適用した。試料の適用は、サイバイ−ウェル装置により実行した。試料は、飛行時間質量分析機（ウルトラフレックス（Ultraflex）ＴＯＦ−ＴＯＦ、ブルーカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics））でリフレクトロンモードで分析した。２０kVの加速電圧を使用した。タンパク質は、ペプチド−質量マッチングに基づいて同定した。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピーク注釈
質量分析データは、測定器のベースラインを決定するために、低域中央パラメトリックスプラインフィルターで２回フィルターにかける。ベースラインからの平滑化残差平均標準偏差を、データにおける測定器ノイズレベルの推定値として使用する。ベースライン補正、及びノイズを超えるレベル座標におけるデータの修正後、ベースラインから最大偏差のデータ点を使用して、予想ペプチドピークを検出するための非線形（Levenberg-Marquardt）データフィッティング手順の種を蒔いた。具体的には、このフィット手順は、ピーク高、分解能、及びモノアイソトピック質量によりパラメーター化された最良のフィッティングの平均理論ペプチド同位体分布を作り出すことを試みる。有意なフィットへの収斂は、シグマ値を追跡することにより常法で求められる。収斂の成功後、データ点の１／３をランダム交換しての１６回反復を用いるブートストラップ手順を利用して、求めたパラメーターの誤差を推定する。得られるフィットは、データから引き算して、フィット付近のノイズレベルを、外挿ノイズレベル及びピークフィットからの偏差の合計に調整し、そしてノイズのレベルを５倍を超えて上まわる候補ピークを見い出すことができるまで、次のピークを見い出すため、このプロセスを繰り返す。このプロセスは、５０を超えるデータピークが見い出されたら終える。ゼロ次及び一次の質量への飛行時間の変換は、検出内部標準ピークからの直線外挿を用いて補正し、そしてモノアイソトピック質量値の信頼区間は、ピークと標準の質量の正確さから推定する。
【００５２】
コンピュータ内タンパク質消化物へのスペクトルピークの確率的マッチング
質量スペクトルのピーク質量リストは、タンパク質全体の配列データベースについての理論消化物と直接比較する。各理論消化物について、［１−Π（１−ＮＰ（ｐｉ））］cMatches（ここで、Ｎは、理論消化物中のペプチドの数であり、Ｐ（ｐｉ）は、配列データベース中の全てのペプチドのカウントにより割ったピークのモノアイソトピック質量に関する信頼区間と一致するペプチドの数であり、そしてｃＭａｔｃｈｅｓは、消化物と質量スペクトルの間の一致の数である）を計算する。この値は、消化物とスペクトルの間の擬陽性一致が得られる確率に比例することを証明することができる。確率値は、スペクトルピークから高い有意性で一致が得られるように更にフィルターにかける。同定の第１ラウンド後、同一条件下で獲得される質量スペクトルについての同定の偏差を使用することにより、質量への飛行時間の変換の第２及び第３次の条件を補正する。得られる質量値は、ほぼ１０ppm未満の絶対偏差を持つ。次にこれらの質量値は、最終ラウンドのマッチングに使用するが、ここでは、０．０１／ＮＰｒｏｔｅｉｎｓ（ボンフェローニ補正による１％有意レベル）未満のＰmismを持つ全ての一致が許容される。
【００５３】
結果
コラーゲンアルファＩ（IV）（コラーゲンIV；スイスプロット（Swissprot）アクセッション番号Ｐ１２１０９；Ｏ００１１７；Ｏ００１１８；Ｑ１４０４０；Ｑ１４０４１；Ｑ１６２５８）は、専らインスリン抵抗性患者２名（ＩＲ２及びＩＲ３、表３を参照のこと）において検出された。１名の患者（ＩＲ２）では、スポットは第２レベル（２倍希釈試料）で検出されたが、一方第２の患者（ＩＲ３）では、タンパク質は、第４レベル（８倍組合せ希釈）で２回検出された。同定の数は、希釈係数と共に増加し（この場合には、それぞれ１と４）、そしてそれぞれ試料で同定されたタンパク質スポットの総数について補正した。
【００５４】
コラーゲンIVレベルはまた、免疫検定法（バイオトリン（Biotrin）コラーゲンIV  ＥＩＡ；カタログ番号ＢＩＯ８２；バイオトリン（Biotrin）、ダブリン、アイルランド）を供給業者のプロトコールにより使用することによって測定した。２つの検定法からの結果は、表３において比較する。
【００５５】
【表３】
2005189241.tif 000006
【００５６】
表３：組合せ連続希釈からの結果と免疫検定法からの結果との比較。
ＩＳ＝インスリン感受性患者、ＩＲ＝インスリン抵抗性患者。
組合せ連続希釈：同定の数は、希釈係数と総スポットカウントについて調整した。
免疫検定法（コラーゲンIV  ＥＩＡ）：コラーゲンIVレベルは、バイオトリン・コラーゲンIV  ＥＩＡにより測定した。与えられた結果は、二重反復測定の平均である。
【００５７】
記載されたプロテオミク方法論の検出の限界は、約１５０ng/mlの免疫検定法の限界を上まわる。このレベルより上で、タンパク質を検出することができ、記載された同定方法と対にした組合せ連続希釈により粗く定量することができる。絶対定量化は観察されていないが、幾つかの順位相関が存在する、即ち、最高レベルと２番目に高いレベルの試料が正しく同定された。
【００５８】
プロテオミクス型大規模タンパク質同定と組合せた、組合せ連続希釈法は、並行して数百のタンパク質を定量するための、及び（例えば、バイオマーカーの同定研究のために）ディファレンシャルタンパク質発現分析において使用することができる、濃度が顕著に異なるタンパク質を同定するための、効率的な手段である。
【００５９】
本発明の実施態様は以下のとおりである。
１．生体分子の複合混合物中のある生体分子の定量方法であって、
ａ．それぞれ少なくとも１つの識別できる成分を含む、生体分子の混合物の分画の少なくとも２つの画分を用意すること、
ｂ．画分を組合せ連続希釈に付すこと、
ｃ．各原画分及び各希釈画分中の生体分子を、感度閾値及び同一性情報を提供する方法により、検出及び同定すること、並びに
ｄ．それぞれの希釈係数を考慮して各希釈レベルで各画分中の生体分子の同定の数を集約することにより、複合混合物中の生体分子を定量すること
を含む方法。
２．ｄ）の合計を、全ての希釈レベルでの全ての画分中の全ての生体分子の同定の総数で割る、上記１の方法。
３．ａ）の画分の数が、生体分子の混合物の複雑さに依存する、上記１又は２の方法。
４．ａ）の画分の数が、生体分子の複合混合物中の異なる生体分子の濃度に依存する、上記１〜２のいずれか１の方法。
５．ａ）の画分の数が、ｃ）の検出及び同定方法に依存する、上記１〜２のいずれか１の方法。
６．ｂ）の希釈レベルの数が、画分中の生体分子の出発濃度に依存する、上記１〜５のいずれか１の方法。
７．ｂ）の希釈レベルの数が、分画後の画分の数に依存する、上記１〜５のいずれか１の方法。
８．ｂ）の希釈レベルの数が、検出及び同定方法の検出限界に依存する、上記１〜５のいずれか１の方法。
９．生体分子が、（ｎ−１）個以下の画分に存在する（ここで、ｎは、画分の総数であり、かつｎは、２以上である）、上記１〜８のいずれか１の方法。
１０．生体分子が、２つの画分に存在する、上記１〜８のいずれか１の方法。
１１．生体分子が、１つの画分に存在する、上記１〜８のいずれか１の方法。
１２．ｃ）の検出及び同定方法が、二次元ゲル電気泳動を含む、上記１〜１１のいずれか１の方法。
１３．ｃ）の検出及び同定方法が、更に質量分析を含む、上記１２の方法。
１４．ｃ）の検出及び同定方法が、免疫検定法を含む、上記１〜１１のいずれか１の方法。
１５．ｃ）の検出及び同定方法が、質量分析と組合せたガスクロマトグラフィーを含む、上記１〜１１のいずれか１の方法。
１６．ｃ）の検出及び同定方法が、特異的に標識した分子的実体による電気泳動を含む、上記１〜１１のいずれか１の方法。
１７．ａ）の画分が、クロマトグラフィー分画法、超遠心分離法、タンパク質沈降法、又は免疫沈降法により分離される、上記１〜１６のいずれか１の方法。
１８．生体分子が、ポリペプチドである、上記１〜１７のいずれか１の方法。
１９．生体分子が、ポリヌクレオチドである、上記１〜１７のいずれか１の方法。
２０．生体分子が、炭水化物である、上記１〜１７のいずれか１の方法。
２１．生体分子が、脂質である、上記１〜１７のいずれか１の方法。
２２．生体分子が、糖タンパク質である、上記１〜１７のいずれか１の方法。
２３．生体分子が、リポタンパク質である、上記１〜１７のいずれか１の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の方法を示す。
【図２】生体分子の相対量の計算を示す。
【図３】タンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼ（ａ）、ビメンチン（ｂ）及び熱ショックタンパク１０５（ｃ）に関する同定の数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
1. Title of Invention
Quantitation by serial combinatorial dilution
2. Detailed Description of Invention
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2005189241.tif 000029
3. Brief Description of Drawings
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1. Claims
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2005189241.tif 000032
2005189241.tif 000033
1. Abstract
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2. Representative Drawing
None
Fig. 1
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Fig. 2
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Fig. 3 
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