(57)【要約】【課題】  発酵アルコール製造工業から副生するアルコール発酵残渣の有効利用。【解決手段】  アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。温度耐性およびエタノール耐性を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。動物体内の病原菌に対し免疫増強作用を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。アルコール発酵にて副生の残渣と当該残渣に生育する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物、および乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物を原料若しくは少なくとも原料の一つとする飼料。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。
【請求項２】
アルコール発酵物を蒸留し、得られる残渣に増殖するラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。
【請求項３】
温度耐性およびエタノール耐性を有する請求項１および請求項２の何れかに記載の乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。
【請求項４】
動物体内の病原菌に対し免疫増強作用を有する請求項１乃至請求項３の何れかに記載の乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９。
【請求項５】
アルコール発酵にて副生の残渣と当該残渣に生育する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物。
【請求項６】
アルコール発酵後に蒸留し得られる残渣と当該残渣を乳酸発酵して得られる乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物。
【請求項７】
乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物を原料若しくは少なくとも原料の一つとする飼料。
【請求項８】
動物体内の病原菌に対し免疫増強作用を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物を原料若しくは少なくとも原料の一つとする飼料。
【請求項９】
乳酸発酵生成物は、発酵原料がサトウキビから砂糖を分離した糖蜜および/または柑橘果汁窄汁残渣より回収する果汁蜜である、請求項５および請求項６の乳酸発酵生成物。
【請求項１０】
乳酸発酵生成物は、発酵原料がサトウキビから砂糖を分離した糖蜜および/または柑橘果汁窄汁残渣より回収する果汁蜜である、請求項７および請求項８の飼料。
【請求項１１】
乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９の生菌濃度が１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項５および請求項６の乳酸発酵生成物。
【請求項１２】
アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発酵アルコール製造工業から副生する、アルコール発酵残渣の有効利用に関し、アルコール発酵残渣に極めて良く増殖する乳酸菌の提供、前記乳酸菌の乳酸発酵によるアルコール発酵残渣の乳酸発酵生成物の付加価値の高い飼料原料および飼料としての提供を目的とするものである。
【背景技術】
【０００２】
発酵アルコールは、サトウキビから得られる糖蜜、砂糖大根（シュガービート）から得られる廃液濃縮物、あるいはトウモロコシや甘蔗の加水分解にて得られる糖類を発酵し、発酵もろみを蒸留して製造される。アルコール発酵にて排出される蒸留残渣は所謂廃液であり、環境問題から海洋投棄が禁止されることとなり、有効利用が望まれている。
アルコール発酵後の蒸留残渣は、一部肥料として利用されているが、付加価値が低く、有効な廃棄物処理法とはなっていない。海外では海洋投棄により環境問題を引き起こしており、その有効利用法の開発は世界的に望まれている。飼料としての利用は、アルコール発酵原料となる糖蜜については、飼料の賦形剤（バインダー）としての利用や糖蜜飼料として、飼料に配合するなどの応用が知られているが、アルコール発酵廃液を飼料化することは知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
我々は、アルコール発酵後に排出される残渣（もろみ濃縮液と称す）の有効利用について、鋭意研究を重ねた結果、もろみ濃縮液に極めて良好な増殖を示す乳酸菌を見出した。
乳酸菌は生菌体および死菌体共に、生体の免疫力を高めたり、腸内細菌叢を調節し、便秘を軽減し、整腸作用を示すなど、種々の有用性が示されている（細野朗、上野川修一：腸管免疫とプロバイオティクス、Ｆｏｏｄ
Ｓｔｙｌｅ ２１、ｖｏｌ．６、ｐｐ．４５−４９、２００２年；ＭＲ．Ｈｅｒｉｃｈ
ａｎｄ Ｍ．Ｌｅｖｋｕｔ：Ｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ、ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ
ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ
ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．−Czech、ｖｏｌ．４７、ｐｐ．１６９−１８０、２００２年）。
また、もろみ濃縮液を発見した乳酸菌にて乳酸発酵し、乳酸菌の菌体濃度が高く、タンパクやビタミンを含み、最近注目されているプロバイオティックスとなる飼料原料を開発することに成功し、本発明を完成した。
【０００４】
発酵アルコールは甲類焼酎原料、食酢の発酵原料、味噌や醤油の保存性を高める為の添加剤、あるいは食品の保存性を高める為のアルコール製剤の原料として、消費量が増加傾向にある。アルコール発酵原料として最も多いのが、砂糖を採取した残液である糖蜜である。
従来、アルコール発酵・蒸留廃液は、色は黒く問題はあるが、毒性を示すものは含まないので、多くは海洋投棄されていた。
しかし、環境汚染問題から、多くの自治体で海洋投棄を禁止する方向にあり、また、海外でも生産量が多く、大量の蒸留廃液の不法投棄が環境問題を引き起こしており、コストの低い処分法あるいは付加価値の高い有効利用法が求められている。
【０００５】
アルコール発酵・蒸留廃液の一部は肥料原料として利用されている。また、焼酎業界では共同で燃焼処理設備を導入し、廃液を燃焼して処理している。
然るに、肥料原料としての利用は付加価値が低く、運送費用も出ない現状がある。燃焼処理については、必ずしも十分な処理量でなく、また、燃焼する為には費用がかかり、コスト的に負担が大きい。本発明の課題は、アルコール発酵残液に付加価値をつけ、有効利用を図ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
我々は、アルコール発酵にて副生の残渣、例えばアルコール発酵残液即ちもろみ濃縮液の有効利用につき鋭意研究を重ねた結果、意外にも、このもろみ濃縮液に良好に生育する乳酸菌を見出した。また、発見した乳酸菌を用い、乳酸発酵飼料および乳酸菌高濃度液の開発に成功し発明を完成した。
即ち、本発明は、アルコール発酵・蒸留残渣に良好に生育する乳酸菌株、およびアルコール発酵蒸留残渣濃縮物（もろみ濃縮液）の乳酸菌発酵により、乳酸菌体、ビタミン類、タンパクなどを多く含み、飼料としても好適な乳酸発酵生成物としての乳酸発酵もろみ濃縮物の提供に関する。
【０００７】
本発明は、アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌である。
【０００８】
また本発明は、アルコール発酵物を蒸留し、得られる残渣に増殖するラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９である。
【０００９】
また本発明は、温度耐性およびエタノール耐性を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９である。
【００１０】
また本発明は、動物体内の病原菌に対し免疫増強作用を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９である。
【００１１】
また本発明の乳酸発酵生成物は、アルコール発酵にて副生の残渣と当該残渣に生育する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含むことを特徴とする。
【００１２】
また本発明の乳酸発酵生成物は、アルコール発酵後に蒸留し得られる残渣と当該残渣を乳酸発酵して得られる乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含むことを特徴とする。
【００１３】
また本発明の飼料は、乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物を原料若しくは少なくとも原料の一つとすることを特徴とする。
【００１４】
また本発明の飼料は、動物体内の病原菌に対し免疫増強作用を有する乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９を含む乳酸発酵生成物を原料若しくは少なくとも原料の一つとすることを特徴とする。
【００１５】
また本発明の乳酸発酵生成物は、発酵原料がサトウキビから砂糖を分離した糖蜜および/または柑橘果汁窄汁残渣より回収する果汁蜜であることを特徴とする。
【００１６】
また本発明の飼料は、乳酸発酵生成物は、発酵原料がサトウキビから砂糖を分離した糖蜜および/または柑橘果汁窄汁残渣より回収する果汁蜜であることを特徴とする。
【００１７】
また本発明の乳酸発酵生成物は、乳酸菌ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６９の生菌濃度が１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることを特徴とする。
【００１８】
また本発明は、アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌（Ｉ−５株、Ｉ−８株、Ｉ−９株、Ｉ−１３株、
Ｉ−１９株、Ｉ−２８株）であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、従来低付加価値の利用しかされていなかった、アルコール発酵にて副生する残渣例えば蜜原料アルコール発酵後の蒸留残渣を有効利用することが出来、この残渣に良好に増殖する乳酸菌を発見したことで、発見した乳酸菌をプロバイオティクスとして利用できると共に、発酵生成物は付加価値のある乳酸発酵生成物および飼料或いは飼料原料として利用可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施例１乃至６に基づいて説明する。
【実施例１】
【００２１】
乳酸菌分離
食品用に使用される工業用アルコールは、主として基質としてサトウキビ窄汁液の蔗糖採取後の廃液である、糖蜜を発酵して行う。通常、アルコール発酵の糖蜜培地は加熱殺菌を施さないので、微量であるが種々の雑菌が含まれる。アルコール発酵時には、多量の酵母菌を種母として接種するので、短時間でアルコール濃度が上昇し、雑菌汚染の頻度は低い。
我々は、微量含まれる雑菌の中から乳酸菌に着目し、アルコール発酵もろみからの乳酸菌分離を試みた。
【００２２】
アルコール発酵は、凝集性アルコール酵母 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ｆ−５をグルコース１.０％、酵母エキス０.３％、麦芽エキス０.３％、ペプトン０.３％を含む培地（以下ＹＭ培地と略記する）に接種し、３２℃で一晩培養したものを一次種母とし、これを糖蜜を希釈し、全糖１６％（ｗ／ｖ）とし、Ｎ源として硫酸アンモニウムを０.０３％添加した培地に５％添加し、３２℃で一晩培養し、２次種母とした。
アルコール発酵は糖蜜を希釈し、全糖１８％（ｗ／ｖ）とし、N源として硫酸アンモニウムを０.０３％添加した液に、２次種母を１０％添加し、３０℃にて４８時間発酵した（発酵１回目）。
以後、全糖濃度１８％とした糖蜜培地に発酵１回目の発酵もろみを２０％接種し、３０℃で２４時間発酵した（発酵２回目）。
発酵３回目は全糖濃度２０％、発酵４回目は全糖濃度２２％とし、種母量は２０％とした。
発酵５回目以降は、発酵４回目と同様の条件とし、８回から１０回繰り返し発酵を行った。
【００２３】
繰り返し回分発酵の最終回のもろみから、乳酸菌および酢酸菌分離用培地を用い、乳酸菌を分離した。
分離培地としては乳酸菌用にＧＹＰ−ＣａＣＯ３培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ
２０ｇ／Ｌ、酵母エキス １０ｇ／Ｌ、ペプトン １０ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ−８０
５ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３ １０ｇ／Ｌ、シクロヘキシミド ２μｇ／ｍＬ）、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ
ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ）、酢酸菌用培地として、シクロヘキシミド
２μｇ／ｍＬ、ＣａＣＯ３ １０ｇ／Ｌ、エタノール ５ｇ／Ｌを添加したポテト−デキストロース寒天培地を使用した。
分離された菌は、桿菌、連鎖桿菌、球菌、連鎖球菌などであり、形態および乳酸の生成などから、多くはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓであり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃと思われる乳酸菌も分離された。結果的に３６株の乳酸菌と考えられる菌株が単離・取得できた。
【００２４】
得られた３６株の乳酸菌より、アルコール耐性（８％エタノール以上に耐性）の観点から、６株（Ｉ−５、Ｉ−８、Ｉ−９、Ｉ−１３、
Ｉ−１９、Ｉ−２８）を選択した。
更に、選ばれた６株について、もろみ濃縮液での増殖を調べ、最終的に良好な増殖を示す株として、Ｉ−５株が選択された。
本株はアルコール発酵蒸留残液の２.５〜３倍濃縮液（もろみ濃縮液）の２倍希釈液にも、極めて良好な増殖を示した。
従来、アルコール発酵蒸留廃液で良好な増殖を示す乳酸菌は知られていなかった。
【実施例２】
【００２５】
菌学的性質
本発明の前記６株のうちＩ−５株の菌学性質を調べた結果を以下に示す。
本株（Ｉ−５株）をＤｉｆｃｏ社製ＭＲＳ培地に寒天を１.５％添加した培地でガスパック嫌気システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）にて、３７℃、１〜２日間培し、形態を観察した。Ｉ−５株は短径０.９〜１.１μｍ、長径１.９〜３.３の桿菌であり、単一の細胞でも存在したが、多くは２ヶの菌が連鎖状となり、それ以上の鎖状を示すものも観察された。本株は胞子を形成しなかった。本株をＭＲＳ培地で液体培養し、有機酸の生成を調べたところ、乳酸のほかに酢酸の生成もあり、ヘテロ型乳酸発酵を行う乳酸菌と考えられた。
【００２６】
Ｉ−５株の同定を行う為、炭水化物代謝試験にて同定を行う、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社（フランス、輸入販売元：日本ビオメリュー（株））のＡＰＩ
５０ＣＨを用い、３０℃、４８時間培養し、同定を行った。その結果、本株はラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）と同定された。そこで、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイのタイプ・カルチャーであるＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ
ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＮＢＲＣ １５８８９を取り寄せ、種々の性質を比較検討した。
【００２７】
ＡＰＩ ５０ＣＨによる各種糖の発酵性について調べた結果、多くの糖質でＩ−５株とＮＢＲＣ １５８８９は類似の資化パターンを示したが、表１に示す種々の糖質について、異なる結果を示した。また、図１に各種培養温度における生育についての結果を、図２に各種エタノール濃度におけるエタノールの生育阻害についての結果を示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
表１よりＩ−５株はソルボース、ソルビトール、イヌリン、グルコン酸の発酵性がタイプカルチャーであるＮＢＲＣ
１５８８９と異なった。温度特性は、図１よりＮＢＲＣ １５８８９が４０℃までの増殖温度であるのに対し、Ｉ−５株は４５℃でも生育し、増殖温度特性が異なった。また、図２に示すように、エタノールに対する耐性もＩ−５はＮＢＲＣ
１５８８９より高く、タイプカルチャーでは８％（ｖ／ｖ）でほぼ完全に増殖が阻害するのに対し、Ｉ−５株はエタノール８％（ｖ／ｖ）で生育し、１６％（ｖ／ｖ）でも若干の増殖が認められた。以上より、Ｉ−５株はＡＰＩ
５０ＣＨを用いる同定キットではＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉと同定されるが、タイプカルチャーであるＮＢＲＣ １５８８９とは、生理的に種々の点で異なり、Ｉ−５株はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉの生理的変種であり、ラクトバチルス・パラカセイ・サブスピシズ・パラカセイＩ−５株（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ sｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ−５）と命名された。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ
Ｉ−５株はＦＥＲＭ Ｐ−１９１６９として、独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに寄託されている。
【実施例３】
【００３０】
本発明のもろみ濃縮液での乳酸菌増殖試験について示す。
まず、もろみ濃縮液の各希釈液で乳酸菌（Ｉ−５株）の増殖を調べた。
純粋分離したＩ−５株を５ｍＬのＭＲＳに接種し、ガスパック中で３７℃一晩培養した。試験管にて調製した、各試験区のもろみ濃縮液１０ｍＬに本種母を５％接種し、スクリューキャップをし、３７℃で増殖試験を行った。
その結果、もろみ濃縮液原液では、乳酸菌の増殖は認められず、
２倍希釈以上の希釈液にて増殖が認められた。
また、各希釈液にブドウ糖２％を添加した培地も検討したが、４培希釈液まではブドウ糖の添加は増殖に影響を与えなかった。
もろみ濃縮液はＮＥＤＯアルコール事業本部出水アルコール工場にて得られた、もろみ２.５倍濃縮のもろみ濃縮液を使用した。
分析データを以下に示す。
アルコール発酵原料としては糖蜜と果汁蜜の混合物を使用した。試験に供したもろみ濃縮液のｐＨは４.６９、全糖（％、ｗｔ／ｖ）は７.００％、直接還元糖（％、ｗｔ／ｖ）は６.０８％、ケットの赤外線水分計による水分（％、ｗｔ／ｖ）は６８.９％であった。表２に液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による糖および有機酸分析値を示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
２倍希釈もろみ濃縮液で乳酸菌が良好な生育を示すことが判明したので、この培地を用い、アルコール耐性を示す６株の乳酸菌の増殖試験を行った。
２００ｍＬ容の三角フラスコに、２倍希釈もろみ濃縮液２００ｍＬを入れ、シリコ栓（株式会社三商販売）を施し、ＭＲＳ培地で前培養した乳酸菌株を接種し、３７℃で時々攪拌し、４日間培養を行った。ただし、初発ｐＨは菌の増殖を考慮し、６.５に調整した。培養試験の結果を表３に示す。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
表３の結果より、乳酸菌Ｉ−５株が優秀菌株として選択できた。
Ｉ−５株のもろみ濃縮液培養物には多量の乳酸菌生菌が含有され、プロバイオティックスとしての有用性が示唆された。
また、有機酸である乳酸が約２％も生成され、腸内細菌叢を整える作用が期待できる。
【実施例４】
【００３５】
ビタミンの生成
更に、本発明の効果を明かにするため、スケールアップし、もろみ濃縮液でＩ−５株を培養し、乳酸菌の生菌数や組成、乳酸菌の特徴であるビタミンの生成を調べた。
３０００ｍＬ容のジャーファーメンターに、２倍希釈もろみ濃縮液２０００ｍＬを入れ、５％アンモニア水で培地ｐＨを６.５に調整した。ＭＲＳ培地で前培養した乳酸菌培養液１００ｍＬを接種し、３７℃無通気で、時々攪拌し、４日間培養を行った。乳酸菌増殖の結果を図３に示す。図３から、乳酸菌のもろみ濃縮液での増殖は３日目で最大に達することが判明した。表４に培養３日目の乳酸菌培養もろみ濃縮液の組成を示す。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
表４より、乳酸菌Ｉ−５株はもろみ濃縮液の２倍希釈液で良好な増殖を示し、培養３日目で生菌数が１０９
ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達し、十分な乳酸生菌を提供できることが判明した。また、有機酸含有量も培養前と比べ、総量で約２倍となり、特に乳酸は約２％となった。十分に乳酸菌Ｉ−５株が増殖したので、ビタミン類も生成しているものと考え、（社）日本分析センターにビタミンの分析を依頼し、乳酸菌発酵によるビタミン生成に対する効果を調べた。結果を表５に示す。
【００３８】
【表５】
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【００３９】
表５より明らかなように、乳酸菌Ｉ−５株にてもろみ濃縮液を発酵すると、多量のビタミンが生成されることが判明した。
中でも、葉酸はＩ−５株で発酵する前が５μｇ／ｍＬであったものが、４６μｇ／ｍＬと約１０倍に増加しており、本発明の効果は明らかである。
【実施例５】
【００４０】
免疫増強効果
乳酸菌Ｉ−５株の免疫増強効果を調べる為、マウスを使用した動物試験を行った。乳酸菌の効果を明瞭にするため、被検液として実施例２で培養した乳酸菌発酵もろみ濃縮液を遠心し、含まれる乳酸菌量を約１０倍多くした発酵もろみ濃縮液を調製した。
即ち、実施例２で培養した乳酸菌発酵液２Ｌを遠心チューブにとり、６０００回転で２０分間遠心し、乳酸菌体を含む沈殿を得た。沈殿を先の遠心上清液で懸濁し、乳酸菌を含む液量を２００ｍＬとした。この液の乳酸菌の生菌数は１.４７×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
【００４１】
実験動物は日本エスエルシー（株）より３．５週齢で購入したＩＣＲ系雄性マウス（ＳＰＦ）を４日間予備飼育して実験に供した。マウスは予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％の感染動物飼育室（照明時間８時〜１８時、換気回数１８回／時）で飼育した。なお、マウスの大腸菌感染時の週齢は５．５週齢とした。
マウスは５匹／ケージとし、滅菌蒸留水を給水瓶にて、またマウス用放射線滅菌固形飼料（ＣＭＦ、オリエンタル酵母工業）を給餌器にて、それぞれ自由に与えた。これらの飼育器具は全て滅菌したものを使用した。なお、マウスの個体識別はピクリン酸を被毛に塗布した。
【００４２】
被験物質として、先に調製した生菌数１.４７×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬである乳酸菌培養もろみ濃縮液を用いた。
この溶液は冷暗所（４℃）に保存し、感染前１１日間（１日１回）および感染後２時間の合計１２回、それぞれマウス用経口ゾンデを用いて強制経口投与した。投与容量はマウスの体重３０ｇ当り０.５ｍＬとした。
【００４３】
感染菌株として病原性大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｊｕｈｌ（メルシャン株式会社生物資源研究所保存菌株）を使用した。
凍結乾燥保存菌にブドウ糖リン酸ペプトン水を加え復元し、ＳＣＤ寒天平板培地（Lｏｔ Ｎｏ． ０５５０１２、日水製薬）に塗抹した。３１℃で２０時間培養し、再度ＳＣＤ寒天平板培地に継代培養した（３１℃、２０時間）。生育した菌体をブドウ糖リン酸ペプトン水に懸濁して６×１０７ＣＦＵ（＝Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｍＬおよび２×１０８ＣＦＵ／ｍＬに調製した（Ｍａｃ
Ｆａｒｌａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ使用）。５．５週齢のマウスに各濃度の大腸菌０．５ｍＬを腹腔内投与した（３×１０７ＣＦＵ／マウスおよび１×１０８ＣＦＵ／マウス）。動物数は一群１０匹とした。群構成は表６に示した。
【００４４】
【表６】
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【００４５】
検査項目は以下の通りである。
体重：大腸菌の接種日をｄａｙ０とし、ｄａｙ−１１，−８，−４，０，１，３，５および７に体重計にて測定した。ｄａｙ０における体重に群間のバラツキが生じた場合には、ｄａｙ０を基準とした体重増減で表した。一般症状：大腸菌接種日のｄａｙ０よりｄａｙ７まで毎日観察した。症状は個体別に記録し、顕著な変化がみられた症状項目を発現個体数で表した。死亡：マウスの死亡をｄａｙ０よりｄａｙ７まで毎日朝夕の２回調べた。マウスの死亡日より平均生存日数および死亡率（％）を計算した。採血および血漿保存：試験最終日に生存マウスをエーテル吸入麻酔下で心臓より採血し、遠心分離後の上清（血漿）部分を−８０℃に凍結保存した。
【００４６】
統計処理は以下の通りに行った。
体重、体重増減および平均生存日数は群毎の平均値±標準誤差を算出した。また、これらのデータの対照群（２群および４群）に対する各群の統計的有意を検定するため、解析ソフト（Ｓｔａｔ
Ｖｉｅｗ， Ａｂａｃｕｓ
Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて有意差の検定を行った（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、２群間の検定）。統計的有意差はＰ＜０．０５の場合を有意であるとした。試験結果を以下に示す。死亡マウスの死亡状況および生存日数を表７および図４に示す。
【００４７】
【表７】
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【００４８】
表７および図４より、３×１０７ＣＦＵ／マウスの大腸菌を接種したグループにおいて、対照群（感染）は１／１０例の死亡を示した。これに対し、乳酸菌培養もろみ濃縮液投与群は０／１０例の死亡を示した。平均生存日数は対照群（感染）が６．５±０．５以上を示したのに対し、乳酸菌培養もろみ濃縮液投与群は７．０±０．０以上を示し、両群間に大差は認められなかった。１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌を接種したグループでは、対照群（感染）が９／１０例（９０％）の死亡を示した。これに対し、乳酸菌培養もろみ濃縮液投与群は３／１０例（３０％）の死亡を示し、乳酸菌培養もろみ濃縮液投与群で顕著な死亡マウス数の減少がみられた。また、平均生存日数は対照群（感染）が２．５±０．５以上を示したのに対し、乳酸菌培養もろみ濃縮液投与群は５．５±０．８以上を示し、乳酸菌培養もろみ濃縮液が有意な生存日数の延長を示した（ｐ＜０．０１）。乳酸菌培養もろみ濃縮液の大腸菌感染防御効果が明らかとなった。
【００４９】
体重測定結果を表８、表９および図５、図６に示す。
【表８】
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【００５０】
【表９】
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【００５１】
表８、表９、図５、図６より、感染前の体重推移でみた場合、３×１０７ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種および１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種のいずれのグループにおいても、乳酸菌培養もろみ濃縮液群は対照群（非感染）および対照群（感染）との間に大きな体重差を示さなかった。感染後の体重推移では、３×１０７ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種グループにおいて、乳酸菌培養もろみ濃縮液群は対照群（感染）との間に大きな体重差を示さなかった。１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種グループでは、ｄａｙ３以降の対照群（感染）の生存動物数が１例のため、乳酸菌培養もろみ濃縮液群との差を判断できなかった。
【００５２】
一般症状の観察結果を表１０に示した。
【表１０】
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【００５３】
表１０より、３×１０７ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種グループにおいて、対照群（感染）に比べて乳酸菌培養もろみ濃縮液群が軽度の軟便および肛門部の便付着を示した動物数の増加と肛門部の充血を示す動物数の増加を示した。また、１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌接種グループにおいて、ｄａｙ１までの変化では対照群（感染）と乳酸菌培養もろみ濃縮液群との間に一般症状の差が認められなかった。ｄａｙ３以降では、対照群（感染）の生存動物数が１例のため、乳酸菌培養もろみ濃縮液群との間の一般症状の差を判断できなかった。
【００５４】
一群10匹のマウスに３×１０７ＣＦＵ／マウスまたは１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌を接種し、死亡動物数、生存日数、体重および一般症状の変化から乳酸菌培養もろみ濃縮液の防御効果を検討した。
その結果、３×１０７ＣＦＵ／マウスの大腸菌を接種したグループにおいて、乳酸菌培養もろみ濃縮液群は対照群（感染）と比べてマウスの死亡匹数、平均生存日数および体重に顕著な差を示さなかったが、一般症状観察において軽度の消化器症状発現動物数の増加を示した。一方、１×１０８ＣＦＵ／マウスの大腸菌を接種したグループにおいて、乳酸菌培養もろみ濃縮液群は対照群（感染）と比べて一般症状に差を示さないものの、顕著なマウスの死亡匹数の減少と有意な平均生存日数の延長を示した。以上の結果から、乳酸菌培養もろみ濃縮液はマウスの大腸菌感染に対する強い感染防御作用を有することが判明した。
したがって、本発明の乳酸菌および発酵もろみ濃縮液の動物における免疫増強作用が証明された。
【実施例６】
【００５５】
飼料
本発明の乳酸菌は、上記のとおり、いわゆる熟成もろみ、この例では、繰り返し回分発酵なる発酵法により最終回に取得した熟成もろみであり、その後の蒸留工程で回収するエタノール分も含む中間工程品であって、当該熟成もろみの蒸留によりエタノール分ともろみ濃縮液とに分離された、当該濃縮液から分離されたものである。
飼料は、このもろみ濃縮液（アルコール発酵残渣）を増殖可能な濃度に希釈すると共にｐＨを例えば６〜６．５程度に調整した所要の育成条件の基で、当該もろみ濃縮液に本発明の乳酸菌を添加するという人為的方法によって当該もろみ濃縮液に本発明の乳酸菌を増殖（乳酸発酵）させたものであり、こうしてアルコール発酵によって副生する残渣（廃液）を乳酸発酵生成物化して飼料としたものである。
【００５６】
この乳酸発酵生成物は、直接、主な飼料の配合物として混合することによって飼料原料として利用することもできるし、乳酸発酵生成物を一旦遠心分離後、沈殿、粉末化したものを主な飼料の配合物として混合することによって飼料原料として利用することもできる。また、乳酸発酵生成物を直接或いは遠心分離後、沈殿、粉末化したもののみを飼料とすることもできる。
【００５７】
図７のフローに基づいて、飼料原料の製造方法の一例を説明する。
先ず、もろみ濃縮液（濃縮残渣および残渣濃縮液）の一部をスタータータンク（小規模タンク）に導入する。
次に、予め培養（前々培養→前培養）してあった本発明の乳酸菌を前記スタータータンクに導入して、所定の攪拌、ｐＨおよび温度条件の基で本発明の乳酸菌を培養する。
次に、所定の濃度まで達した本発明の乳酸菌を、もろみ濃縮液を導入（所定の攪拌、ｐＨおよび温度条件の基）した発酵タンク（大規模タンク）に添加し、多量の本発明乳酸菌を培養する。
次に、発酵タンクで所定濃度まで達した本発明の乳酸菌を、遠心分離にかけ、沈殿物（＝乳酸菌を含むもの）とする。
最後に、この沈殿物を粉末化手段例えば流動層造粒、スプレードライ、真空凍結（←粉砕工程要）等により粉末化し、当該粉末物を回収しそのままおよび所定の加工（＝配合）、包装を施し飼料とする。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の乳酸菌を原料若しくは少なくとも原料の一つとした飼料は、当該乳酸菌の免疫増強作用および整腸作用等が発揮される有用な飼料として提供できると共に、当該飼料が、従来では破棄されていたアルコール残渣の乳酸発酵生成物であるため、飼料或いは飼料原料としての生産コストを低廉化することができ、牛・鶏・豚等の家畜やペットの好適な飼料として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ−５株とタイプカルチャーであるＮＢＲＣ １５８８９株の増殖温度範囲を示した図である。
【図２】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ Ｉ−５株とタイプカルチャーであるＮＢＲＣ １５８８９株のアルコール存在下での増殖を示した図である。
【図３】本発明のＩ−５株のもろみ濃縮液２倍希釈液での増殖曲線である。
【図４】乳酸菌発酵もろみ濃縮液の生存日数延長効果を示した図である。
【図５】乳酸菌発酵もろみ濃縮液の感染防御試験（体重変化、感染菌量：３×１０７ ＣＦＵ）結果を示した図である。
【図６】乳酸菌発酵もろみ濃縮液の感染防御試験（体重変化、感染菌量：１×１０８ＣＦＵ）結果を示した図である。
【図７】飼料原料の製造方法を示すフロー図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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