(57)【要約】【課題】  組換えタンパク質を含むカイコ体液から少ない工程数で組換えタンパク質を精製し、純度の高い組換えタンパク質を高収率で得る方法の提供。【解決手段】  カイコを用いて作製した組換えタンパク質をカイコ体液から精製する方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法。（１）  ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程、および（２）  （１）に次いで、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫虫体を用いて作製した組換えヘパリン結合性タンパク質を昆虫体液から精製する方法であって、少なくとも
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程、および
ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む方法。
【請求項２】
昆虫がカイコである請求項１記載の方法。
【請求項３】
昆虫体液を昆虫虫体から磨砕により抽出する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組換えヘパリン結合性タンパク質がHGFである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程に次いで、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程が行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
昆虫虫体を用いて作製した組換えヘパリン結合性タンパク質を昆虫体液から精製する請求項１から５のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法。
（１）  リン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトにカイコ体液を接触させる工程、
（２）  （１）に次いで、平衡化に用いた緩衝液でヒドロキシアパタイトを洗浄する工程、
（３）  （２）に次いで、（１）で用いたよりも高濃度のリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で、組換えタンパク質を溶出させる工程、
（４）  （３）の溶出液をリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したヘパリンカラムに添加し、該溶出液をヘパリンカラムと接触させる工程、ならびに
（５）  塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを添加したリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で、ヘパリンカラムから組換えタンパク質を溶出させる工程
【請求項７】
ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が10mM以上、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われ、さらに組換えヘパリン結合性タンパク質が吸着したヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出が、100mM以上、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸水素２カリウム溶液またはリン酸水素２ナトリウムである請求項６記載の方法。
【請求項９】
ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が200mM〜500mMの緩衝液を用いて行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヘパリンカラムからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
組換えヘパリン結合性タンパク質を精製する、少なくともヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程、およびヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む方法であって、ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が10mM以上であり、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われ、さらに組換えヘパリン結合性タンパク質が吸着したヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出が、100mM以上であり、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われる方法。
【請求項１２】
ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸水素２カリウム溶液またはリン酸水素２ナトリウムである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が200mM〜500mMの緩衝液を用いて行われる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヘパリンカラムからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程に次いで、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程が行われる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
組換えヘパリン結合性タンパク質が、細菌を用いて製造される、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えヘパリン結合性タンパク質が、動物細胞を用いて製造される、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヘパリン結合性タンパク質を精製する方法、例えばカイコを用いて産生させた組換えヘパリン結合性タンパク質をカイコ体液から精製する方法に関し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー精製およびヘパリンカラムクロマトグラフィー精製により精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在バキュロウイルスベクターによる組換えタンパク質の発現系が広く医薬品等の有用タンパク質の生産方法として利用されている。バキュロウイルス系は、培養昆虫細胞のみならず、昆虫の個体そのものを用いても有用な組換えタンパク質を発現させることが可能である。昆虫個体を用いた場合、培養細胞を用いた場合に比べ、より低コストでかつ効率的に組換えタンパク質を生産することができる。特に、カイコは大量飼育の技術が確立しているので、有用な組換えタンパク質を生産する昆虫工場として用いられている（特許文献１参照）。
【０００３】
カイコ個体を用いて生産した組換えタンパク質は、カイコの体液から精製する必要がある。しかし、カイコの体液は粘性が高くまた不純物も多く含まれているので、精製に多数の工程を要し、最終的な収率を高くすることも容易ではなかった。特に、HGF等のヘパリン結合性の塩基性タンパク質については、カイコ由来の夾雑タンパク質の影響により医薬品として使用するために十分な高度な精製方法は確立されていなかった。
【特許文献１】特開平6-209785号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、少ない工程数で組換えヘパリン結合性タンパク質を精製し、例えば組換えタンパク質を含むカイコ体液から少ない工程数で組換えヘパリン結合性タンパク質を精製し、医薬品として使用するために充分な純度の高い組換えタンパク質を高収率で得る方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、組換えヘパリン結合性タンパク質を精製する方法について鋭意検討を行い、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた精製、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いた精製を組合せることにより、高純度の組換えタンパク質を高収率で得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  昆虫虫体を用いて作製した組換えヘパリン結合性タンパク質を昆虫体液から精製する方法であって、少なくとも
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程、および
ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む方法、
[２]  昆虫がカイコである[１]の方法、
[３]  昆虫体液を昆虫虫体から磨砕により抽出する、[１]または[２]の方法、
[４]  組換えヘパリン結合性タンパク質がHGFである、[１]から[３]のいずれかの方法、
[５]  ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程に次いで、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程が行われる、[１]から[４]のいずれかの方法、
【０００７】
[６]  昆虫虫体を用いて作製した組換えヘパリン結合性タンパク質を昆虫体液から精製する[１]から[５]のいずれかの方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法、
（１）  リン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトにカイコ体液を接触させる工程、
（２）  （１）に次いで、平衡化に用いた緩衝液でヒドロキシアパタイトを洗浄する工程、
（３）  （２）に次いで、（１）で用いたよりも高濃度のリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で、組換えタンパク質を溶出させる工程、
（４）  （３）の溶出液をリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したヘパリンカラムに添加し、該溶出液をヘパリンカラムと接触させる工程、ならびに
（５）  塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを添加したリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液で、ヘパリンカラムから組換えタンパク質を溶出させる工程
[７]  ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が10mM以上、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われ、さらに組換えヘパリン結合性タンパク質が吸着したヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出が、100mM以上、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われる、[１]から[６]のいずれかの方法、
[８]  ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸水素２カリウム溶液またはリン酸水素２ナトリウムである[６]の方法、
[９]  ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が200mM〜500mMの緩衝液を用いて行われる、[１]から[８]のいずれかの方法、
[１０]  ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヘパリンカラムからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液である[９]の方法、
【０００８】
[１１]  組換えヘパリン結合性タンパク質を精製する、少なくともヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程、およびヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程を含む方法であって、ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が10mM以上であり、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われ、さらに組換えヘパリン結合性タンパク質が吸着したヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出が、100mM以上であり、pHが6.8以上の緩衝液を用いて行われる方法、
[１２]  ヒドロキシアパタイトへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヒドロキシアパタイトからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸水素２カリウム溶液またはリン酸水素２ナトリウムである[１１]の方法、
[１３]  ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着が200mM〜500mMの緩衝液を用いて行われる、[１１]または[１２]の方法、
[１４]  ヘパリンカラムへの組換えヘパリン結合性タンパク質の吸着に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であり、ヘパリンカラムからの組換えヘパリン結合性タンパク質の溶出に用いる緩衝液がリン酸カリウム緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液である[１３]の方法、
[１５]  ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製する工程に次いで、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて精製する工程が行われる、[１１]から[１４]のいずれかの方法、
[１６]  組換えヘパリン結合性タンパク質が、細菌を用いて製造される、[１１]から[１５]のいずれかの方法、ならびに
[１７]  組換えヘパリン結合性タンパク質が、動物細胞を用いて製造される、[１１]から[１５]のいずれかの方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとヘパリンカラムクロマトグラフィーを含む２工程の精製方法により、カイコ体内で産生させた組換えヘパリン結合性タンパク質等のヘパリン結合性タンパク質を低コストで高収率で回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、組換えヘパリン結合性タンパク質を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとヘパリンクロマトグラフィーの２工程を含む精製方法であり、例えばカイコを用いて作製した組換えヘパリン結合性タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとヘパリンクロマトグラフィーの２工程を含む精製方法である。
【００１１】
本発明の精製方法が対象とするタンパク質としてHGF、EGF、bFGF等のヘパリン結合性の塩基性タンパク質が挙げられる。該ヘパリン結合性タンパク質は、例えばカイコを用いて産生され、カイコから抽出した体液中に含まれている組換えヘパリン結合性タンパク質であるが、ヘパリン結合性タンパク質の製造法や由来は限定されない。例えば、ここでHGFは、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ネコ等HGFを発現しているいずれの動物由来であってもよく、その一部のアミノ酸が欠失、置換または付加されている場合でもHGF活性を有していればよい。また、血清中の活性化酵素等の作用により活性化されるHGF前駆体（pro型HGF）であってもよい。また、組換えヘパリン結合性タンパク質の製造法も限定されず、公知の遺伝子工学的手法を用いて、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、昆虫虫体、動物体、植物体を利用して作製した組換えヘパリン結合性タンパク質が含まれる。
【００１２】
本発明の一つの方法で精製しようとする組換えタンパク質のカイコを用いた製造は公知の方法で行うことができる。すなわち、バキュロウイルス等を用いた昆虫ウイルス遺伝子発現ベクターに産生させようとする目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、該ベクターウイルスを昆虫個体に感染させることにより昆虫体内で、組換えタンパク質を産生させることができる。
【００１３】
このようにして組換えタンパク質をカイコ生体内で産生させ、組換えタンパク質を含むカイコ体液を抽出する。カイコからのカイコ体液の抽出は、カイコを切開し、回収またはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の適当な緩衝液に浸漬する。この際、カイコ体内のタンパク質分解酵素と目的の組換えタンパク質が接触することにより、目的タンパク質が分解されてしまうおそれがあるので、浸漬の際には、PMSF（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、DFP（ジイソプロピルフルオロリン酸）等のタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。さらに、カイコ個体の磨砕により得られた体液中には、バキュロウイルスが生存しているので、バキュロウイルスを不活性化する必要がある。バキュロウイルスの不活性化は、例えば、塩化ベンゾルコニウム等の逆性石鹸等の界面活性剤を用いることによって処理すればよい。
【００１４】
本発明の精製工程により、カイコ体液から組換えタンパク質を精製する前にカイコ体液から固形分等を除去する必要がある。固形分の除去は、遠心分離により行うことができるし、またフィルターを用いて濾過してもよい。固形分の除去のための遠心分離の条件として、例えば10,000〜20,000Gで10〜30分という条件が挙げられる。また、濾過のためのフィルターとしては、適当なポアサイズのグラスフィルター、メンブランフィルター等を用いればよい。
【００１５】
このようにしてカイコ個体から抽出し、固形分を除去したヘパリン結合性タンパク質を含むカイコ体液または種々の方法で得たヘパリン結合性タンパク質をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は、ヘパリンカラムにより精製する。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、溶媒中のリン酸イオンと試料タンパク質とがヒドロキシアパタイト上に分布配置する吸着部位（陽イオンまたは陰イオン交換基）への吸着をめぐって競合することを利用した分離精製法である。ヒドロキシアパタイトと試料タンパク質の吸着および両者の分離には、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液、またはTris緩衝液を用いるのが好ましい。また、精製しようとするタンパク質の種類によっては、KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2等を用いることもできる。用いる緩衝液の濃度、pH等は、精製しようとする組換えタンパク質の電荷により適宜決定することができる。例えば、低濃度のリン酸緩衝液を用いて吸着させ、リン酸濃度を増加することにより溶出させることができる。
【００１６】
以下、組換えヘパリン結合性タンパク質として、肝細胞増殖因子（HGF）を用いた場合のクロマトグラフィー条件について記載する。但し、本発明はこの例に限定されることはなく、当業者ならば精製しようとする目的のタンパク質に応じて、用いる緩衝液等の種類、吸着・溶出条件等を適宜決定することができる。特に以下の例ではカイコ体液からヘパリン結合性タンパク質を精製する条件を記載しているが、精製しようとするヘパリン結合性タンパク質を含む試料の性状に応じて適宜変更を加えることができる。この際、例えば、新生化学実験講座１  タンパク質I  分離・精製・性質  日本生化学会編、東京化学同人  第１版1990年２月26日発行  等の記載を参考に条件を決定することが可能である。
【００１７】
まず、組換えHGFを含むカイコ体液を適当な緩衝液でpH6.0〜9.0、好ましくは7.0〜8.5に調整する。緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液等のリン酸緩衝液を用いればよく、緩衝液の濃度は10〜100mMが好ましい。また、用いる緩衝液にはTween20、Tween80、TritonX100等の界面活性剤を0.001〜0.1％添加するのが好ましい。カイコ体液に対する緩衝液の容積比は、カイコ体液のpHが6.0〜9.0、好ましくは7.0〜8.5に調整され、かつカイコ体液の粘度が低くなりヒドロキシアパタイトと充分な接触が可能になるような比であり、例えば50mM リン酸緩衝液pH7.5を用いる場合、カイコ体液１に対して、緩衝液を5〜20添加すればよい。
【００１８】
このようにして緩衝液を添加してpHを調整したカイコ体液をヒドロキシアパタイトと接触させ、カイコ体液中の組換えタンパク質をヒドロキシアパタイトに吸着させる。この際、カイコ体液とヒドロキシアパタイトは、ビーカ等の容器を用いてバッチ法で接触させても良いし、ヒドロキシアパタイトを充填したカラムに緩衝液を添加したカイコ体液を添加してもよい。ヒドロキシアパタイトは市販のヒドロキシアパタイト粒子を用いればよく、またカラムを用いる場合は、ヒドロキシアパタイトが充填された市販のカラムを用いればよい。市販のヒドロキシアパタイト粒子としては、Bio-Rad社、BDHケミカル社等のものを用いることができる。また、ヒドロキシアパタイトを充填したカラムとしてはBio-Rad社、東燃社、旭光学工業、東ソー、関東化学社等のものを用いることができる。ヒドロキシアパタイトは、カイコ体液と接触させる前にあらかじめ適当な緩衝液で平衡化しておく。平衡化には、カイコ体液に添加した緩衝液を用いればよく、バッチ法で精製する場合は、ヒドロキシアパタイトの10〜100倍量の緩衝液で１分〜24時間平衡化を行えばよい。また、カラム法で精製する場合は、ヒドロキシアパタイトを充填したカラムにヒドロキシアパタイトの2〜100倍量の緩衝液を流せばよい。
【００１９】
ヒドロキシアパタイトとカイコ体液の接触は、バッチ法の場合は、緩衝液を添加したカイコ体液にヒドロキシアパタイト粒子を添加することにより行う。添加するヒドロキシアパタイトの量は、容積比でカイコ体液１に対して、0.1〜10である。接触は、静置することにより行っても良いが、好ましくは、ヒドロキシアパタイト粒子が沈殿しない程度の速度で攪拌する。攪拌はスターラーを用いても、振とう装置を用いてもよい。接触時間は、１時間以上が好ましい。カラム法の場合は、ヒドロキシアパタイトカラムに緩衝液を添加したカイコ体液を添加することにより行う。この際、カイコ体液の流速は、カラムサイズにもよるが、例えば内径3.2cm長さ3cmのカラムを用いる場合、緩衝液を添加したカイコ体液200mlを1.0ml/min.の速度で流せばよい。
【００２０】
次いで、バッチ法の場合は、遠心分離により組換えタンパク質が吸着したヒドロキシアパタイト粒子を沈降回収する。このときの遠心分離は6,000〜12,000Gで5〜10分行えばよい。
【００２１】
その後、組換えタンパク質を吸着したヒドロキシアパタイトを適当な緩衝液で洗浄する。緩衝液は、カイコ体液に添加した緩衝液と同じものを用いればよい。バッチ法の場合は、ヒドロキシアパタイトに洗浄用緩衝液を添加して、攪拌し再度遠心分離によりヒドロキシアパタイトを沈降回収する。遠心操作は１〜５回繰り返すのが好ましい。カラム法の場合は、カラムに緩衝液を流速1〜5ml/min.でヒドロキシアパタイトの３〜５倍量流すことにより洗浄を行う。
【００２２】
次いで、ヒドロキシアパタイトに吸着した組換えタンパク質を溶出する。溶出は溶出用緩衝液を用いて行う。溶出は、リン酸濃度を上げることにより行うことができ、0.1M〜２M、好ましくは0.3〜1.5Mのリン酸緩衝液、例えば、リン酸水素２カリウム水溶液またはリン酸水素２ナトリウム水溶液を用いればよい。バッチ法の場合は、組換えタンパク質の吸着したヒドロキシアパタイトに３〜10倍量の溶出用緩衝液を添加し、１〜30分間攪拌した後、遠心分離によりヒドロキシアパタイトを沈降させ上清を回収すればよい。カラム法の場合は、ヒドロキシアパタイトの３〜10倍量の溶出用緩衝液をカラムに1〜5ml/min.の流速で流せばよい。回収した上清または溶出液は、適当な緩衝液でpHを6.0〜8.0に調整する。
【００２３】
ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いる精製において、ヘパリンは、非常に高い負荷電を有する硫化多糖であり、血液凝固因子や核酸関連酵素等のある種のタンパク質を強く吸着する。ヘパリンカラムとしては、Sepharose、Sephadex、Cellulofine等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂にヘパリンを結合させたものを用いればよく市販のものを用いればよい。市販のものとして、例えばアマシャムバイオサイエンス社のHi-Trap Heparinを挙げることができる。ヘパリンカラムクロマトグラフィーを行う際に用いる緩衝液の種類、濃度、pHも精製しようとする組換えタンパク質に応じて、適宜決定することができる。以下では、HGFの精製の場合について述べる。
【００２４】
上記のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより得られた上清の緩衝液の濃度を、0.2〜0.5M、好ましくは0.3〜0.4Mになるように蒸留水を用いて調製する。この際、上清中に界面活性剤が含まれる場合は蒸留水に界面活性剤が同濃度で含まれるように界面活性剤を添加しておく。次いで、濃度を調整した溶液をヘパリンカラムに１〜50ml/min.の流速で添加する。次いで、調整後の緩衝液の濃度と同じ濃度の緩衝液をカラムに１〜50ml/min.の流速で流し、洗浄する。この際流す量はカラムサイズの３〜５倍量である。その後、吸着した組換えタンパク質を、溶出緩衝液により溶出回収する。この際、塩濃度の高い緩衝液を用いることにより、吸着した組換えタンパク質を溶出することができる。例えば、吸着の際に用いた緩衝液に0.5〜2.0Mの塩化ナトリウム、塩化カリウム等を添加したものを用いればよい。この際の、流速は１〜50ml/min. であり、流す溶出液の量はカラムサイズの３〜10倍量である。
【００２５】
フラクションを回収し、各クラクション中の組換えタンパク質の量を測定し、高濃度のフラクションを回収・プールすることにより高純度の組換えタンパク質を得ることができる。
【００２６】
各ステップ後の純度や、収率はさらにＨＰＬＣ分析にかけたり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動手法、およびウエスタンブロッティング等の手法により測定することができる。
【００２７】
第１工程後の純度は、1〜2％であり、第２工程後の純度は、70〜90％である。最終的にカイコ体液中の組換えタンパク質の95〜99％を回収することができる。比活性としては、第１工程後の比活性は、カイコ体液中の10倍以上であり、第２工程後の比活性は、カイコ体液中の千〜数万倍である。
【００２８】
なお、本発明の２工程の精製方法も、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の分取機器を用いることにより、自動化することが可能である。
【実施例】
【００２９】
WO 01/092332に記載した方法により、ネコHGF組換えバキュロウイルスを感染させたカイコ体液より、組換えネコHGFを精製した。
<ネコHGFの生物活性測定>
得られたネコHGFの活性は、イヌ腎由来細胞（MDCK細胞）の遊走活性を指標として測定した。MDCK細胞は、10%ウシ胎児血清（Moregate社製）、0.3% Tryptose Phosphate broth（DIFCO社製）を含むE-MEM（日水製薬社製）培地中で、37℃、5%CO2存在下で継代を行った。飽和細胞密度まで増殖させたMDCK細胞を、PBS緩衝液で洗浄後、トリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で約5分間静置した。上記の増殖用培地を加え、細胞を良く懸濁した後、1,200 rpm、4℃、5分間遠心した。上清を除き、再度増殖用培地に懸濁した後、常法に従い細胞数を測定し、3x104個/mLとなるように細胞数を調整した。この細胞懸濁液を96穴プレート（FALCON社製）1ウェルあたり100μLずつ分注した。次いで、増殖用培地を用いて2倍階段希釈された組換えネコHGFを含む被験試料を50μLずつ細胞上清に加えた。24時間後、15μLの25%グルタルアルデヒド溶液（和光純薬社製）を加え細胞を固定し、ギムザ染色を行い顕微鏡下で細胞の運動性、形態について観察した。なお、本明細書中においてHGF活性を単位（U）で示す場合は、被験試料を2倍階段希釈し、MDCK細胞遊走活性が最大となる希釈倍率数を単位として定義する。
【００３０】
<ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの操作>
カイコ体液200mLに0.01% Tween 80を含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)1800mLを加え、よく混和した。そこに0.01% Tween80を含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化したヒドロキシアパタイト100cm3を加え、回転子を用いて混和した。この際、ヒドロキシアパタイトはLevinの方法（メソッズインエンザイモロジー、アカデミックプレス、第5巻27-32頁）に従って作製したものを用いた。1時間後、ヒドロキシアパタイト懸濁液を3,000 rpm、10分間遠心分離し、上清を除いた。ヒドロキシアパタイトの沈殿に、500 mLの上記の体液希釈液を加え、よく懸濁した後、上記と同様に遠心分離を行った。上清を除いた後、0.01 % Tween 80を含む0.6 Mリン酸水素2カリウム500 mLを加えよく懸濁し、室温にて10分間静置して溶出を行った。5,000 rpm、20分間の遠心分離を行い、回収した上清を濾紙（ワットマン社製No. 3）により吸引濾過した。このろ液に0.01 % Tween 80を含む0.6 Mリン酸2水素カリウムを適量加え、pHを7.5に調整した後、等量の0.01% Tween 80水溶液を加え、ヒドロキシアパタイト溶出液とした。
【００３１】
ヘパリンカラムにかける前のサンプルと、溶出後のサンプルのウエスタンブロッティングのシグナル強度の比較から、ほとんどロス無くHGFが回収されているのが確認された。
【００３２】
<ヘパリンカラムクロマトグラフィーの操作>
ヒドロキシアパタイト溶出液を、0.01% Tween 80を含む0.3 Mリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）で平衡化したHeparin sepharose CL-6B（アマシャムバイオサイエンス社製、カラムサイズ内径3.2 cm、高さ3 cm）に流速1 mL/min.で添加した。同緩衝液にて洗浄後、2 M NaCl及び0.01% Tween 80を含む10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）を用いて流速1 mL/ min.で溶出を行い、2 mLずつフラクションを回収した。各フラクションからサンプルの一部を取り、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）およびクマシー染色を行い、HGFのバンドが確認されたフラクションを混合し、ヘパリン溶出液とした。
【００３３】
＜ゲル濾過クロマトグラフィーの操作>
ゲル濾過クロマトグラフィーは、装置はAKTA exploler 100を、カラムは、HiLoad 26/60 Superdex 200 pg（両者ともアマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。展開液には、0.3 M NaCl及び0.01% Tween 80を含む10 mMクエン酸緩衝液（pH 6.0）を用いた。流速は2.5 mL/ min.とし、ピークの検出は280 nmの吸光度を測定することで行った。サンプル添加から約75分前後にネコHGFのメインピークが現れ、これらのフラクションを回収した。
【００３４】
<SDS-PAGEの操作>
上記3段階のクロマトグラフィーで精製された組換えネコHGFを2-メルカプトエタノール還元下でSDS-PAGEを行い、次いで銀染色を行った（銀染色キットIIワコー、和光純薬社製）。結果を図1に示す。精製ネコHGFは、分子量（約85 kDa）相当領域に単一のバンドが認められた。大腸菌組換えネコHGFタンパク質をウサギに免疫した抗血清をを用いたウエスタンブロッティングによりネコHGFであることが確認された。この結果を図2に示す。
【００３５】
以上の結果から、本精製法によりカイコ体液中の夾雑物が効率よく除去され、高純度のネコHGFが製造できることが明らかとなった。各工程による精製過程を表1に示した。
【００３６】
【表１】
2005170835.tif 000002
【００３７】
〔比較例〕
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、通常10m M程度の低濃度のリン酸緩衝液、pH 6.8を用いて吸着を行う。しかしながらこの条件では、カイコ体液由来の夾雑タンパクが大部分カラムに吸着してしまうため、ほとんど精製度が上がらなかった。ヒドロキシアパタイトカラムからの溶出は、通常リン酸緩衝液（pH 6.8）の濃度を段階的に上げることによって行われ、0.5 M程度でほとんどのタンパク質がカラムから溶出される。しかし、通常用いられる条件では、HGFは5〜20％程度しか回収されず、精製効率が非常に悪かった。
【００３８】
通常、ヘパリンクロマトグラフィーは、0.1 M NaClを含む10 mMトリス−塩酸緩衝液を用いて吸着を行い、NaCl濃度を上げることで溶出を行う。しかしながら、その条件では、体液由来の夾雑タンパクを効率良く除くことができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】精製した組換えネコHGFの銀染色の結果を示す図である。
【図２】精製した組換えネコHGFのウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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