(57)【要約】【課題】  癌細胞の遠隔転移を抑制する癌細胞遠隔転移抑制剤を提供する。【解決手段】  ナットウキナーゼを有効成分として含有する癌細胞遠隔転移抑制剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナットウキナーゼを有効成分として含有することを特徴とする、癌細胞遠隔転移抑制剤。
【請求項２】
納豆菌を培養して得られる納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物、又は、納豆菌を培養して得られる納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物をイオン交換樹脂に吸着させて分離精製した精製ナットウキナーゼである、請求項１に記載の癌細胞遠隔転移抑制剤。
【請求項３】
納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物の摂取量が成人１日当たり成人１日当たり２，５００ｍｇ〜２５，０００ｍｇである、請求項２に記載の癌細胞遠隔転移抑制剤。
【請求項４】
精製ナットウキナーゼの摂取量が成人１日当たり成人１日当たり１２．５ｍｇ〜１２５ｍｇである、請求項２に記載の癌細胞遠隔転移抑制剤。
【請求項５】
精製ナットウキナーゼが、納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶解させて、イオン交換樹脂に吸着させて、不純物を分離した後、再度Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶出させることにより精製したものである、請求項４に記載の癌細胞遠隔転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナットウキナーゼを有効成分として含有する癌細胞遠隔転移抑制剤に関するものである。更に詳細には、微少血栓の形成による血液中の酸素分圧の低下により起こる癌細胞の遠隔転移を阻止するナットウキナーゼを有効成分として含有する癌細胞遠隔転移抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
納豆は日本の伝統的な食品の一つで、古来より心臓及び血管の疾病に関する民間薬として、或いは、疲労回復や脚気の治療薬として利用されてきた。
また、近年になって、納豆が見直され、納豆の研究が盛んになり、納豆菌の生産する線維溶解酵素が強力な血栓溶解作用を有していることが発表されるようになった（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
更に、納豆菌によって生産され単離されたナットウキナーゼ含有加工食品（粗精製品）が血栓溶解作用や血栓形成阻害作用を発揮することも明らかにされるようになった（例えば、特許文献３参照）。
それ故、ナットウキナーゼに血栓溶解作用や血栓形成阻害作用があることが知られるようになったことから、虚血性心疾患（心筋梗塞）や脳梗塞の血栓症の予防食品としてナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）が市販（例えば、非特許文献１参照）されるようになり、このナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）による虚血性心疾患（心筋梗塞）や脳梗塞の血栓症の予防には、その摂取量として成人１人当たり２５０〜５００ｍｇであることが推奨されている。
【０００３】
一方、納豆菌等の枯草菌体の培養物が水溶性ビタミンＫ誘導体を含有し、この培養物が骨粗鬆症の予防及び治療剤として有用であることも提案されている（例えば、特許文献４参照）。
しかしながら、ナットウキナーゼが癌細胞自体を抑制する作用があるとの文献については報告がなされていないし、本発明者等も実際にナットウキナーゼ含有食品（粗精製品）を成人１人当たり２５０〜５００ｍｇ程度摂取させただけでは癌細胞自体を抑制する作用効果を確認することはできなかった。
【０００４】
けれども、近年、癌によって死亡する確率が高くなっており、この様な癌による死亡確率が高くなる主たる原因は、癌細胞が増殖する過程で人体内の他の部位の多数の箇所に遠隔転移してしまうからであり、この様な癌細胞の遠隔転移を阻止する方法としては、現時点では特別に有効な手段が有るわけではない。
しかしながら、放射線治療における局所制御効果が、酸素分圧の違い、いわゆる酸素効果により、大きく変化することから、１９５０年代より高圧酸素療法の応用や低酸素細胞増感剤（例えば、非特許文献２参照）を用いる等の酸素療法の研究が為されてきた。
だが、これら酸素療法は臨床的な治療になると酸素効果と放射線感受性との関連について良好な結果が得られなかった。
【０００５】
そこで、本発明者等は研究を進めて、血管内皮細胞の塞栓と低酸素状態における癌細胞の遠隔転移が起こる原因が、先ず、癌細胞の増殖と血流を介した酸素と増殖支持液性因子との供給のアンバランスという慢性的な低酸素状態の発生によって、腫瘍内の癌細胞の壊死により乳酸が産生されて、低ｐＨになり、これによって、血管内皮細胞等が傷害を受けて、この傷害部分に血小板が接着され易くなって、フィブリンとなり、血栓が形成され始める。
次いで、このフィブリンにより血管が塞栓されると、血管壁細胞に障害、拡張、収縮等の刺激が与えられて、血管壁細胞から組織プラスミノーゲン賦活剤（ｔＰＡ）が放出される。すると血栓を形成しているフィブリンが溶解する線溶現象が発生し、血管内皮細胞の塞栓が消失すると血管内皮細胞の傷害部分が露出することになる。
それ故、この様な血管内皮細胞の塞栓と消失とが数十分毎に繰り返して起こることによる度重なる血管内皮細胞の再灌流傷害を受け続ける過程で、再灌流後にＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子）やＩＬ−６（インターロイキン−６）やＩＬ−１（インターロイキン−１）等の炎症性サイトカインが流れてきて、ＩＬ−６やＩＬ−１がＩＣＡＭ−１を介して捕捉されて、血管内皮細胞の再灌流傷害部位から侵入するとの仮説を発表し、それにより癌細胞の転移が起こるのではないかと推定した（例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平１−１８０８３４号公報（第１−５頁）
【特許文献２】特開平８−２０８５１２号公報（第１−５頁）
【特許文献３】特開２００１−３５２９２９号公報（第２頁）
【特許文献４】特開２００１−１３６９５９号公報（第１−１９頁）
【非特許文献１】「ナットウ菌培養ろ液乾燥物  ＮＫＣＰ  ナットウキナーゼコンパウンド  日本の伝統食”納豆”から生まれた新しい食品素材」大和薬品株式会社製カタログ
【非特許文献２】雑誌「癌・放射線療法  ２００２」、−III. 放射線生物学の基礎−、中津川重一、中村英亮、小山一之著「放射線増感剤の基礎とその応用−歴史と展望−」、第１６６〜１８６頁、２００２年、篠原出版新社発行、
【非特許文献３】雑誌「放射線生物研究」第４巻、第３７冊、第３９３〜４０５頁、２００２年、中津川重一、他４名著「低酸素状態での仮説、古典的放射線生物学の蹉跌を踏まえて」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それ故、放射線治療における癌によって死亡する確率を低下させる為には、微少血栓の形成による血液中の酸素分圧の低下が生じても血管内皮細胞が破壊されないようにして、癌細胞が血流を通じて遠隔転移することを抑制しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、血管内皮細胞の塞栓と低酸素状態における癌細胞の遠隔転移との関係について更に鋭意研究を重ねた結果、上記癌細胞が遠隔転移する過程において、癌細胞内皮血管の塞栓を促進させる細胞間結合分子（ＩＣＡＭ−１）をナットウキナーゼによって削減乃至無能化させることができれば、癌細胞の遠隔転移や悪性進展を阻止することができるとの知見を得て、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤は、ナットウキナーゼを有効成分として含有すること、を特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
このような本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤は、経口投与することにより血中のグルコース濃度を減少させたり、血中の総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）やトリグリセリド（ＴＧ）を低下させることができるので、癌細胞の遠隔転移抑制用薬剤として使用することができる。
また、納豆から抽出した食品であることから、副作用が無く、極めて安全性の高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
[I]  癌細胞遠隔転移抑制剤
(1)  有効成分
(A)  ナットウキナーゼ
本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤として用いられるナットウキナーゼは、各種方法によって製造したナットウキナーゼを使用することができるが、特に、大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる納豆菌培養物を限外濾過膜等を用いて固形分を分離した後、濃縮し、乾燥することにより得られる固形成分よりなる納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）や、それをイオン交換樹脂に吸着させて分離精製した精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）を用いることが好ましい。
【００１１】
(a)  納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）
上記大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる納豆菌培養物より固形分を分離した納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）中には、主たる成分としてナットウキナーゼが１００ｇ当たり約１２ｍｇ含まれており、該ナットウキナーゼ以外にも、アミラーゼ、プロテアーゼ、リバーゼ等の酵素や、グルタミン酸のポリペプチド、フラクトースの重合体のフラクタン等が含有されているものである。
具体的には、上記納豆菌の培養物中に蓄積されているナットウキナーゼの量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件等によって変化するが、通常、培養物中にナットウキナーゼが１０〜２０ｍｇ／１００ｇの割合で含有されている真空乾燥粉末である。
【００１２】
(b)  精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）
上記納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）中にはナットウキナーゼが１００ｇ当たり約１２ｍｇしか含まれていないことから、高純度の、例えば１００倍以上に精製した、好ましくは２００〜１，０００倍に精製した、具体的には２０〜１００重量％の濃度に精製した精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）とすることもできる。
精製方法
上記高純度の精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）に精製する方法としては、通常行われている酵素の精製方法と同様に行うことができるが、特に、納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶解させ、イオン交換樹脂に吸着させて、不純物を分離した後、再度Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で溶出させることにより精製したものであることが好ましい。
【００１３】
(c)  性  状
上記ナットウキナーゼの物理化学的特性としては、分子量が２４，０００〜４０，０００、好ましくは３０，０００〜３６，０００（２５７アミノ酸残基）、等電点が好ましくは８．６±０．３（ｓｖｅｎｓｓｏｎカラム法）、ｐＨ６〜１２の塩基性水溶液中で６０℃までの加熱に対して安定なものである。
【００１４】
(2)  摂取量
本発明における癌細胞遠隔転移抑制剤としての投与量は、症状の程度、患者の年齢、体重及び処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、本薬剤を癌細胞遠隔転移抑制剤として投与する場合、通常、前記純粋なナットウキナーゼの投与量換算で、成人１日当たり０．３〜３．０ｍｇ、好ましくは０．４〜２．０ｍｇ、特に好ましくは０．５〜１．０ｍｇを１回または数回に分けて投与する。
上記納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）を用いる場合には、培養物の投与量換算で、成人に対し１日当り成人１日当たり２．５〜２５ｇ、好ましくは２．８〜２０ｇ、特に好ましくは３．０〜１８ｇを１回または数回に分けて投与する。
また、上記精製ナットウキナーゼ（培養精製品：ナットウキナーゼフラクション）を用いる場合には、培養精製品の投与量換算で、成人に対し１日当り成人１日当たり１２．５〜１２５ｍｇ、好ましくは１４〜１００ｍｇ、特に好ましくは１５〜８０ｍｇを１回または数回に分けて投与する。
上記摂取量において、その量が少なすぎると本発明の癌細胞遠隔転移抑制効果を発現することが低下する。また、その量が多すぎると血液凝固能が低下し過ぎる等の副作用が発現し易くなる傾向がある。
【００１５】
(3)  薬剤の形態
本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤は経口投与され、本剤を血液中に投与しても効果を見出すことはできない。
従って、本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤の形態としては、前記培養物を単体で、又は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等として患者に経口投与するのが一般的である。
これら癌細胞遠隔転移抑制剤の形態は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択されるが、後記食品中に配合したものであっても良い。
【００１６】
(4)  添加剤
本発明における癌細胞遠隔転移抑制剤を錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等の固形製剤とする場合には、前記培養物を、常法に従って適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成若しくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤又は希釈剤等と適宜混合して製造することができる。
また、錠剤等は、必要に応じて適当な被覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フイルムコーティング等を施しても良い。
【００１７】
(5)  食品中への配合
上述した様に、前記ナットウキナーゼ含有物をそのまま混合したり、水に溶かしたりして、通常食することのできる食品や飲料中に含有させたものであっても良い。
【００１８】
[II]  ナットウキナーゼの製造
(1)  納豆菌の培養
本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤は、大豆を培地にして納豆菌を培養して得た培養物から固形成分を分離し、濃縮乾燥することにより得られるナットウキナーゼを有効成分として含有するものである。
【００１９】
(A)  菌  体
本発明のナットウキナーゼを有効成分として含有する癌細胞遠隔転移抑制剤を得るのに使用される納豆菌としては、安全性やナットウキナーゼの産生量等を考慮すると、枯草菌類（Bacillus subtilis）に属する公知の納豆菌（Bacillus subtilis natto）が使用される。
納豆菌としては、特に制限されないが、高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（株式会社成瀬醗酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（有限会社宮城野納豆製造所製、仙台）、朝日菌（株式会社朝日工業製、東京）、日東菌（株式会社日東薬品工業製、京都）、目黒菌（株式会社目黒研究所製、大阪）等の市販の納豆菌；及び雲南ＳＬ−００１菌等を挙げることができる。
なお、雲南ＳＬ−００１菌は、平成１１年５月７日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７１３号で国際寄託された。
【００２０】
(B)  培地の調製
納豆菌の培養にて使用される培地としては、納豆菌を一般的に培養するのに用いられる公知の培地と同様の培地が使用される。
具体的には、例えば、オカラ、大豆、味噌や納豆製造時に副生する大豆煮汁、豆腐や油揚げ製造時に副生する豆腐粕、大豆を原料とした製油時に副生する大豆粕、味噌製造時の副産物である大豆の種皮等、納豆菌によって発酵できる材料を使用しても良い。
従って、各種培養成分を適宜混合することにより調製しても、或いは、市販の培地をそのまま使用しても、或いは、市販の培地に下記の炭素源、窒素源及び無機塩及びその他の栄養素等を補助成分として適宜添加した培地を使用しても良い。
この際、培地は、固体又は液体培地のいずれを使用しても良いが、生産性の観点から液体培地が好ましく、使用目的によって適宜選択され、また、使用する微生物が資化し得る栄養素を含有する培地であれば、合成培地又は天然培地のいずれであっても良い。
【００２１】
(a)  炭素源
本発明における納豆菌の培養に使用できる炭素源としては、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを効率良く産生できるものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉、α−澱粉、可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉及びデキストリン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース等の炭水化物を挙げることができる。
これらの炭素源の中でも、ナットウキナーゼの産生の観点から、グルコース及び澱粉が好ましく使用される。これらの炭素源は、単独或いは２種以上の混合物の形態で使用することもできる。
【００２２】
(b)  窒素源
本発明による納豆菌の培養において使用できる窒素源もまた、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを効率よく産生できるものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコーンスティープリカー等の有機窒素化合物、及び、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物等が挙げられる。
これらの窒素源の中でも、ナットウキナーゼの産生の観点から、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）及び大豆粉末が好ましく使用することができる。これらの窒素源も、単独或いは２種以上の混合物の形態で使用することもできる。
【００２３】
(c)  無機塩
本発明による納豆菌の培養に使用できる無機塩もまた、使用する種によって異なり、使用する菌株が良好に生育し、ナットウキナーゼを良好に産生でき得るものであれば特に制限されない。
具体的には、例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することもできる。
【００２４】
(C)  培養条件
本発明において、納豆菌の培養は、従来公知の方法と同様にして行われ、その際の培養条件としては、使用する菌株、培地の組成及び培養法によって適宜選択され、使用する菌株が増殖しナットウキナーゼを効率よく産生できる条件であれば特に制限されない。
培養温度は、通常、２０〜４５℃、好ましくは３７〜４２℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、通常、６．０〜９．５、好ましくは７．０〜８．５である。
【００２５】
(2)  納豆菌の分離
本発明の方法によって培養された納豆菌の培養物の固形成分を、濾過や限外濾過や遠心分離等の既知の方法により集菌し、濾液を濃縮する。
【００２６】
(3)  乾  燥
そして、これを凍結乾燥、風乾、真空熱乾燥等の公知の方法により乾燥することにより、粉体として得ることができる。
得られた粉体は納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）として、そのまま糖尿病治療薬として摂取することもできる。
【００２７】
(4)  精  製
上記粉体状の納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）を、更に精製することにより高純度の精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）とすることもできる。
具体的には、粉体状の納豆菌培養ナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解させて、２５重量％硫安を用いて分画し、遠心分離して、沈殿物を除去した後、その液状物をイオン交換樹脂に吸着させ、その上澄み液を除去した後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液により溶出させることにより約２００〜１，０００倍程度の高純度の精製ナットウキナーゼ（ナットウキナーゼフラクション）に精製することができる。
また、更に精製して、更なる超高純度の超精製ナットウキナーゼとすることもできる。
【００２８】
(5)  納豆菌培養物の濾液乾燥物の構成成分
(A)  ナットウキナーゼ
上記大豆を培地にして納豆菌を培養することにより得られる納豆菌培養物の濾液乾燥物は、主たる有効成分としてナットウキナーゼが含有されている。
具体的には、上記納豆菌の培養物の濾液乾燥物中に蓄積されているナットウキナーゼの量は、使用する菌体や培地の種類や培養条件等によって変化するが、通常、１０〜２００ｍｇ／１００ｇの真空熱乾燥菌体である。
【００２９】
(B)  その他の成分
上記ナットウキナーゼ以外にも、アミラーゼ、プロテアーゼ、リバーゼ等の酵素が０．００２〜０．００５重量％含まれていたり、グルタミン酸のポリペプチドが０．５〜１．５重量％含まれていたり、フラクトースの重合体のフラクタンが０．５〜１．５重量％含まれていたりするものである。
【００３０】
[III]  薬  効
上記の如くして製造されるナットウキナーゼを有効成分として含有する本発明の癌細胞遠隔転移抑制剤は、薬効として、癌が発生した患者、或いは、癌が発生したけれども癌の発生に未だ気付いていない人においても摂取し続ければ、癌細胞が発生した部位から他の部位である別の臓器、特に異種の臓器に遠隔転移することを抑制する効果を発揮することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に示す実施例及び比較例によって、本発明を更に具体的に説明する。
【００３２】
実施例１
[I]  ナットーキナーゼの調製
(1)  納豆菌コロニーの培養
納豆菌（高橋菌）を純水に加えて攪拌することにより懸濁状態にした後、これを標準寒天培地（ニッスイ製）を用いてシャーレに作製した平板培地に少量を加え（接種し）、３７℃で２４時間培養して上記平板培地上に納豆菌コロニーを得る。
【００３３】
(2)  培養液の調製
一方、原料であるグルコース１ｇと粉末状大豆蛋白質（日清コスモフーズ（株）製，商品名：ソルピーＮＹ）４ｇからなる液体培地２００ｍｌを内容積５００ｍｌの三角フラスコ内に作製し、オートクレーブを用いて１２０℃の状態に３０分間保持して上記三角フラスコ内を滅菌する。
上記粉末状大豆蛋白質は、大豆より精製したものである。なお、原料として、大豆を粉砕する等して得られる大豆の粉末を用いるようにしても良い。
この後、平板培地上に培養した納豆菌コロニーより、白金線の輪の径が２ｍｍの白金耳で納豆菌を１回採取し、採取した納豆菌を上記三角フラスコ内の液体培地に接種する。
次いで、納豆菌を接種した液体培地が収容されている三角フラスコを、４０℃に保持したまま密閉せずに２日間回転振盪させて、三角フラスコ内の液体培地を培養する。
【００３４】
(3)  培  養
また、内容積が３０リットルのジャーファーメンターに、グルコース１００ｇ、粉末大豆蛋白質４００ｇ、及び、可溶性澱粉（敷島スターチ（株）製ＳＦ−４００）からなる液体培地２０リットルを作製し、これらを滅菌したものを用意する。
加えて、上記三角フラスコ内に培養した納豆菌培養液２００ｍｌを、ジャーファーメンター内の液体培地に加え、４２℃に加温した状態でバブリングしながら攪拌する状態を２日間保持して培養する。
同様のものを３つ作製し、約５０リットルの大豆蛋白質培養液を得る。
【００３５】
(4)  納豆菌の分離
次に、得られた大豆蛋白質培養液より納豆菌および不純物を遠心分離により除去した後、硫酸アンモニウムを１モル添加する。この硫酸アンモニウムの添加により、発酵液中に分散している種々の酵素等の蛋白質性の高分子化合物を含む蛋白質を疎水化して凝集し易い状態とする。
また、硫酸アンモニウムの添加により新たに不溶物が形成されるが、これら不溶物は、ガラス繊維濾紙で濾過する。
【００３６】
(5)  凝  集
次いで、不溶物を濾過した濾液に、１モルの硫酸アンモニウム溶液で平衡化した疎水クロマトグラフィー用樹脂（東ソー（株）製、商品名：ブチルートヨパール６５０Ｍ）を浸漬し、樹脂上に疎水化した高分子化合物を凝集（添着）させる。
【００３７】
(6)  濃  縮
次に、上記樹脂上を０．１モル濃度の炭酸水素アンモニウム水溶液に浸漬し、樹脂に添着した高分子化合物を溶出させることで、大豆蛋白質培養液を濃縮した濃縮培養液４０リットルを得る。
【００３８】
(7)  限外濾過
次に、プレッブスケールＭ．Ｗ．１万の限外濾過膜を用いて限外濾過することで低分子物質を分離し、上記濃縮培養液４０リットルを１０リットルになるまで濃縮する。
限外濾過することで、限外濾過膜により濃縮された濃縮物に純水１０リットルを加えて２０リットルとし、再度、上記限外濾過することにより低分子物質を分離して、再び、１０リットルになるまで濃縮する操作を３回繰り返し、大豆蛋白質培養液を濃縮した濃縮培養液から、ほとんどの低分子物質を除去した大豆蛋白質発酵物溶液を得る。
【００３９】
限外濾過
上記限外濾過は、一般にコロイド粒子の様な微細な粒子を分散媒より分離するために行われることから、それに用いられる限外濾過膜は、布や素焼きの多孔板に付けたコロジオン膜やホルマリンで硬化させたゼラチン膜や珪酸膜やセロハン膜等が用いられ、加圧下でコロイド溶液をこれらの膜を通して濾過する。
膜の目の大きさを加減するにはコロジオンではアルコール、エーテルの混合溶媒に対する濃度、乾燥条件等の調節、セロハンでは塩類水溶液中に浸す際の膨張度の調節、又は、膜を通してコロジオン溶液を濾過し、コロジオンを膜に沈着させることにより行うことができる。
【００４０】
濾過により分離されるもの
限外濾過により濾過されるものとしては、 納豆特有の臭いの主な成分は、ジメチルピラジン（分子量１０８．１４），トリメチルピラジン（分子量１２２．１７），テトラメチルピラジン（分子量１２６．２０），２−メチル酪酸（分子量１０２．１３），イソ吉草酸（分子量１０２．１３），アンモニア（分子量１７．０３）などの低分子化合物である。
また、納豆に含まれているビタミンＫ２は、分子量が６４９の炭化水素化合物である。一方、ナットウキナーゼを始めとする酵素などの蛋白質は、分子量数万以上の高分子化合物である。
したがって、前述した限外濾過による低分子物質の除去により、大豆蛋白質培養液中から、納豆特有の上記臭いの成分やビタミンＫ２等の低分子物質が、ほぼ除去された状態となる。
納豆に含まれているビタミンＫ２は、心筋梗塞等の心臓病に対して用いられる拮抗剤「ワーファリン」（医薬品）の効果を抑制するという問題がある。
しかしながら、本実施の形態によれば、ビタミンＫ２が除去されるので、この問題を解消することが可能になる。
【００４１】
(8)  乾  燥
最後に、上記限外濾過により低分子物質が除去された大豆蛋白質発酵物溶液に、賦形剤として乳糖２キログラムを加えて凍結乾燥すれば、大豆蛋白質発酵物粉末（加工食品）約２．１ｋｇが得られる。
【００４２】
(9)  臭気試験
納豆が苦手で食べられない被検者二人による、本実施の形態による大豆蛋白質発酵物粉末の臭いの有無を確認を行ったところ、被検者二人とも納豆臭を感じることはなかった。
【００４３】
(10)  精  製
上記粉体状のナットウキナーゼ含有物（粗精製品：ナットウキナーゼコンパウンド）１０ｇを３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）５００ｍｌに溶解させて、２５重量％飽和硫安１６６ｍｌを加えて１５分間攪拌し、１５分間放置した後、回転数１１０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行い、分画して、沈殿物を除去した。
その後、その液状物にイオン交換樹脂（東ソー（株）製「Ｂｕｔｙｌ  トヨパール」）５０ｍｌ（３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、２５重量％飽和硫安、ｐＨ９．０）を加えて２時間攪拌してイオン交換樹脂に吸着させ、再び回転数３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、その上澄み液を除去した後、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、２５重量％飽和硫安、ｐＨ９．０で洗浄した。
そして、再び回転数３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行い、その上澄み液を除去した後、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０により溶出させることにより精製したナットウキナーゼフラクション（２００倍精製品）を調製した。
【００４４】
[II]  評  価
上記ナットウキナーゼを用いて、実験動物による癌細胞の遠隔転移抑制効果を測定し評価した。
(1)  実験動物及び飼育条件
７週齢の雄性マウス１０匹を日本ＳＬＣ（株）から購入し、室温２２±２℃、１２時間明暗サイクルのＳＰＦ動物実験施設で飼育した。餌（日本クレア（株）製、商品名：ＣＥ−２）及び水は自由摂取として、１週間の予備飼育を行った後、実験に供した。
【００４５】
(2)  投  与
上記ヌードマウスＢＡＬＢ／ｎｕ１０匹に、それぞれヒト肺癌由来ＡＯ１細胞を腹部に移植した。
移植後１日経過した後の腹部腫瘍の大きさを測定した。
表１に示す通り、実施例１−１〜１−５の５匹のマウスにおいては餌を与えながら２週間後からナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）を水に溶解し、１００ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙを６０日間連続経口投与した。
また、比較例１−１〜１−５の５匹のマウスにおいては餌を与えた以外は水のみを経口投与した。
移植日から６０日間経過した後に、上記１０匹のマウスの肺を解剖し、腹部腫瘍の大きさを測定すると共に、転移した腫瘍のコロニー数を測定した。
その結果を表１に示す。
【００４６】
比較例１
実施例１において納豆キナーゼを投与しなかった以外は実施例１に記載の方法と同様に行った。
その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2005120035.tif 000002
【００４８】
これらの結果から、ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）を投与したマウスは移植した部分の腫瘍が成長しているが、解剖した肺臓のコロニー数は０であり、肺臓に転移していないことが理解できる。
しかし、ナットウキナーゼコンパウンド（粗精製品）を投与していないマウスは移植した部分の腫瘍が成長しているが、解剖した肺臓のコロニー数は平均１０．４であり、腹部の腫瘍が肺臓に転移していることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
このよう本発明のナットウキナーゼを有効成分として含有する癌細胞遠隔転移抑制剤は、癌が発生した患者、或いは、癌が発生したけれども癌の発生に未だ気付いていない人においても摂取し続ければ、癌細胞が発生した部位から他の部位である別の臓器、特に異種の臓器に遠隔転移することを抑制する効果があるので、医薬品或いは健康食品等として極めて有用なものである。