(57)【要約】【課題】  糞便潜在血液のような被検体の検出のための、簡単で、正確で、再現性のある、制御された、かつ所定の検定感度を与える検定法を提供する。【解決手段】  被検体の存在を検定する第１の工程として、所定量の被検体を抗体に結合させることを含み、検定感度の制御が可能な、改良された１段階免疫クロマトグラフィー検定法及びそのための装置である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の被検体の存在の検出のための制御された感度を有する分析装置であって、
互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を含んでなる１つまたはそれ以上の芯の材料を含んでなり、該帯域は、
該被検体に結合する第１の抗体をその上に所定量有するサンプル適用帯域；
視覚的に検出できる粒子に結合した該被検体に結合する第２の抗体を含んでなる移動化可能な複合体を含んでなる複合体帯域；および
該芯の材料上に不動化された該被検体に結合する第３の抗体を含んでなる検出帯域とを含んでなり、
その中に該被検体を含む液体サンプルが、該サンプル帯域に適用された時、閾値量の被検体が該第１の抗体に結合され、該液体サンプル中の未結合のままの被検体が、サンプル帯域から、移動化可能な複合体の該第２の抗体にそれが結合される該複合体帯域を通り、そして移動化可能な複合体に結合した被検体は、被検体が該第３の抗体に結合され、移動化可能な複合体に結合している被検体が不動化される検出体帯域を通るようにしてなる
ことを特徴とする分析装置。
【請求項２】
該視覚的に検出できる粒子が、着色ラテックス粒子および金属ゾルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
該視覚的に検出できる粒子が、直径約０．１μｍ未満〜約１００μｍの着色ラテックス粒子であることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項４】
該芯の材料の１つが、ニトロセルロースであることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項５】
該第１の抗体が、モノクロナールであることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項６】
該第２の抗体が、モノクロナールであることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項７】
該第２の抗体が、該第１の抗体と同じ抗体であることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項８】
該第１の抗体が、ポリクロナールであることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項９】
該第３の抗体が、該第１の抗体と同じ抗体であることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１０】
該複合体帯域が、視覚的に検出できる粒子に複合化した抗原を含んでいる移動化可能な複合体をさらに含み、１つの該芯の材料上にテスト完全帯域をさらに含んでなり、該テスト完全帯域は、該抗原に結合する第４の抗体を含んでなることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１１】
該抗原が、ヤギ血清アルブミンであることを特徴とする請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
負の信号をさらに含み、該負の信号は、該検出帯域の芯の材料上に不動化された視覚的に検出できる粒子を含んでいることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１３】
該粒子が、水平線の芯の材料上で不動化されていて、該第３の抗体が、該水平線と交差する垂直線の芯の材料上で不動化されていることを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を含んでなる１つまたはそれ以上の芯の材料を含んでなる装置を用いて液体サンプル中の被検体を検出する方法であって、該帯域は、
該被検体に結合する第１の抗体をその上に所定量有するサンプル適用帯域；
視覚的に検出できる粒子に結合した該被検体に結合する第２の抗体を含んでなる移動化可能な複合体を含んでなる複合体帯域；および
該芯の材料上に不動化された該被検体に結合する第３の抗体を含んでなる検出帯域とを含んでなり、その中に該被検体を含む液体サンプルが、該サンプル帯域に適用された時、閾値量の被検体が該第１の抗体に結合され、該液体サンプル中の未結合のままの被検体が、サンプル帯域から、移動化可能な複合体の該第２の抗体にそれが結合される該複合体帯域を通り、そして移動化可能な複合体に結合した被検体は、被検体が該第３の抗体に結合され、移動化可能な複合体に結合している被検体が不動化される検出体帯域を通るようにしてなり、該方法は：
装置のサンプル帯域に液体サンプルを適用し、；
サンプル帯域、複合体帯域および検出帯域を液体サンプルが横断するのに十分な時間待機し、；そして
検出帯域の外観に基づいて液体サンプル中の該被検体の存在または不在を決定する
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
支持体層上の抗原と抗体との相互作用を含む液体サンプル中の被検体の存在の検出のための１段階免疫クロマトグラフィー検定であって、検定に用いられる試薬の１種が、視覚的に検出できる粒子に結合している該被検体に結合する第１の抗体を含む移動化可能な複合体を含み、かつもう１種の試薬が、該支持体層上の所定の帯域で不動化されている該被検体に結合する第２の抗体を含んでなり、改良が、該液体サンプルを該第１のおよび第２の抗体に接触させる前に、該液体サンプルを、該被検体に結合する所定量の抗体と接触させる工程を含み、該抗体が、液体サンプルの適用前に該支持体層の所定の帯域に存在することを特徴とする１段階免疫クロマトグラフィー検定。
【請求項１６】
ヒトの糞便の液体サンプル中の血液の存在の検出のための制御された感度を有する分析装置であって、
互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を含んでなる１つまたはそれ以上の芯の材料を含んでなり、該帯域は、
ヒトヘモグロビンに結合する第１の抗体をその上に所定量有するサンプル適用帯域；
視覚的に検出できる粒子に結合したヒトヘモグロビンに結合する第２の抗体を含んでなる移動化可能な複合体を含んでなる複合体帯域；および
該芯の材料上に不動化されたヒトヘモグロビンに結合する第３の抗体を含んでなる検出帯域とを含んでなり、
その中にヘモグロビンを含む糞便のサンプルが、糞便の液体サンプルをつくる緩衝液に懸濁させられ、該液体サンプルが、該サンプル帯域に適用された時、閾値量のヘモグロビンが該第１の抗体に結合され、該液体サンプル中の未結合のままのヘモグロビンが、サンプル帯域から、移動化可能な複合体の該第２の抗体にそれが結合される該複合体帯域を通り、そして移動化可能な複合体に結合した被検体は、被検体が該第３の抗体に結合され、移動化可能な複合体に結合している被検体が不動化される検出体帯域を通るようにしてなり、検出可能な信号を発生する
ことを特徴とする分析装置。
【請求項１７】
該視覚的に検出できる粒子が、着色ラテックス粒子および金属ゾルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
該視覚的に検出できる粒子が、直径約０．１μｍ未満〜約１００μｍの着色ラテックス粒子であることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項１９】
該芯の材料の１つが、ニトロセルロースであることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２０】
該第１の抗体が、モノクロナールであることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２１】
該第２の抗体が、モノクロナールであることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２２】
該第２の抗体が、該第１の抗体と同じ抗体であることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２３】
該第１の抗体が、ポリクロナールであることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２４】
該第３の抗体が、該第１の抗体と同じ抗体であることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２５】
該複合体帯域が、視覚的に検出できる粒子と複合化した抗原を含んでいる移動化可能な複合体をさらに含み、該芯の材料上にテスト完全帯域をさらに含んでなり、該テスト完全帯域は、該抗原に結合する第４の抗体を含んでなることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２６】
該抗原が、ヤギ血清アルブミンであることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【請求項２７】
負の信号をさらに含み、該負の信号は、該検出帯域の芯の材料上に不動化された視覚的に検出できる粒子を含んでいることを特徴とする請求項１６記載の装置。
【請求項２８】
該粒子が、水平線の芯の材料上で不動化されていて、該第３の抗体が、該水平線と交差する垂直線の芯の材料上で不動化されていることを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を含んでなる１つまたはそれ以上の芯の材料を含んでなる装置を用いる、糞便の液体サンプル中の血液の検出のための方法であって、該帯域は、ヒトヘモグロビンに結合する第１の抗体をその上に所定量有するサンプル適用帯域；視覚的に検出できる粒子に結合したヒトヘモグロビンに結合する第２の抗体を含んでなる移動化可能な複合体を含んでなる複合体帯域；および、該芯の材料上に不動化されたヒトヘモグロビンに結合する第３の抗体を含んでなる検出帯域を含んでなり、その中にヘモグロビンを含む糞便のサンプルが、糞便の液体サンプルをつくるように緩衝液に懸濁され、該液体サンプルが、該サンプル帯域に適用された時、閾値量のヘモグロビンが該第１の抗体に結合され、該液体サンプル中の未結合のままのヘモグロビンが、サンプル帯域から、移動化可能な複合体の該第２の抗体にそれが結合される該複合体帯域を通り、そして移動化可能な複合体に結合した被検体は、被検体が該第３の抗体に結合され、移動化可能な複合体に結合している被検体が不動化される検出体帯域を通るようにしてなり、検出可能な信号を発生させ、該方法が：
糞便の液体サンプルをつくるように糞便のサンプルを緩衝液に懸濁し、；
装置のサンプル帯域に糞便の液体サンプルを適用し、；
サンプル帯域、複合体帯域および検出帯域を液体サンプルが横断するのに十分な時間待機し、；そして
検出帯域の外観に基づいて液体サンプル中のヘモグロビンの存在または不在を決定する
各工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体の存在を検定する第１の工程として被検体の所定量の結合を含み、よって検定感度の制御を考慮する、改良された１段階免疫クロマトグラフィー検定に関する。このシステムは、例えば、制御された感度を有する糞便潜在血液検定に有用である。
【背景技術】
【０００２】
最近の技術的進歩は、広範囲のさまざまな被検体について、特に、抗原特性を発揮する分子についての検定を望み通りに行うことを可能とした。通常、現在使用されているほとんどの検定は、液体相または固体相のフォーマットで抗原物質を結合する抗体を使用する傾向がある。最近、『１段階』免疫検定が開発され、各種の被検体の検出に使用されている。
【０００３】
１段階免疫クロマトグラフィー検定は、着色粒子または他の視認できる粒子の使用を含んでいる。例えば、サンプルが吸収性物質の基質に適用され、被検体が、可動着色ラテックス粒子を有する抗体に結合する。吸収性材料の長さを横断してサンプルがクロマトグラフィーのように横断するので、被検体が結合する粒子は、次に、それら自体、不動化された免疫試薬により結合される。
【０００４】
検定感度は、受け入れ可能な精度で測定され得る被検体の最少量と定義される。検定感度が特に問題となる１つの領域は、潜在血液の存在を検出するための糞便物質の検定にある。少量の血液は、通常、ヒトの糞サンプル中に存在する。糞中の血液の増加した量は、病理学的出血を示す。現在利用できる検定は、糞便潜在血液の異常な量を検出するのに十分な感度ではないので糞便潜在血液のレベルが約１ｍｇのヘモグロビン／１ｇの糞便に達してしまう。しかしながら、糞中の血液のもっと少ない量でも、異常出血を示している。よって、糞便潜在血液について現在利用できる検定は、糞中の血液の異常に高いレベルの存在を検出するのに十分な感度ではない。しかしながら、糞便潜在血液についての検定の感度は、糞中の血液の正常なレベルが正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のテスト結果を与える点までに増加されるべきではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、糞便潜在血液のような被検体の検出のための簡単で、正確で、再現性のある、制御された、あらかじめ定められた検定感度を与える検定が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の改良された免疫クロマトグラフィー検定は、抗体に所定量の被検体を結合させることを含んでいて、検定感度の制御を可能としている。本発明は、信号発生が、膜を通る粒子の移動の利用により得られる検定で有用であり、特に、制御された感度の糞便潜在血液検定として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の１態様に従えば、サンプル中の被検体の存在の検出のための制御された感度を有する分析装置が提供される。該装置は、互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を有する芯の材料と、サンプルの適用に先立ちサンプルパッドに適用された被検体に対する第１の抗体を所定量含むサンプル適用パッドと、移動性粒子に結合した被検体の第２の抗体を含む複合体帯域と、該芯の材料上に不動化された被検体の第３の抗体を含んでなる検出帯域とを含んでいる。被検体を含む液体サンプルが、該サンプルパッドに適用された時、閾値量の被検体が該第１の抗体に結合され、サンプル中の未結合のままの被検体が、サンプルパッドから、第２の抗体にそれが結合される複合体帯域を通り、そしてそれが第３の抗体に結合され、不動化される検出体帯域を通るようにしてなる。
【０００８】
移動性粒子は、好ましくは、着色ラテックス粒子または金属ゾルであり、さらに好ましくは、着色ラテックス粒子である。芯の材料は、好ましくは、ニトロセルロースであり、第１と第２の抗体は、好ましくは、モノクロナールである。好ましい実施態様では、第２の抗体は、第１の抗体と同じである。もう１つの好ましい実施態様では、第１の抗体は、ポリクロナールである。さらにもう１つの好ましい実施態様では、第３の抗体は、第１の抗体と同じ抗体である。
【０００９】
さらにもう１つの好ましい実施態様では、複合体帯域が、さらに、移動性粒子と複合化した抗原を含み、そして、装置が、さらに、抗原に対する第４の抗体を含んでいるテスト完全帯域を含んでなる。好ましくは、抗原はヤギ血清アルブミンである。もう１つの好ましい実施態様では、本発明の装置は、検出帯域の膜上に不動化された視覚的に検出できる粒子を含んでいる負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の信号を含んでいる。粒子が、好ましくは、水平線の膜上で不動化されていて、第３の抗体が、水平線と交差する垂直線の膜上で不動化されている。
【００１０】
本発明のもう１つの態様に従えば、互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を有している芯の材料と、サンプルの適用に先立ちサンプルパッドに適用された被検体に対する第１の抗体の所定量を含むサンプル適用パッドと、移動性粒子に結合した被検体の第２の抗体を含んでいる複合体帯域と、芯の材料に不動化した第３の抗体を含んでいる検出帯域とを含んでなる装置を用いてサンプル中の被検体を検出する方法が提供される。被検体を含む液体サンプルが、サンプルパッドに適用された時、閾値量の被検体が第１の抗体に結合され、サンプル中の未結合のままの被検体が、サンプルパッドから、第２の抗体にそれが結合される複合体帯域を通り、そして第３の抗体にそれが結合され不動化される検出体帯域を通る。本発明の方法は、装置のサンプルパッドに液体サンプルを適用する段階、サンプルパッド、複合体帯域および検出帯域をサンプルが横断するのに十分な時間待機する段階、並びに検出帯域の外観に基づいてサンプル中の被検体の存在または不在を決定する段階を含んでなる。
【００１１】
本発明のもう１つの態様に従えば、支持体層上の抗原と抗体との相互作用を含むサンプル中の被検体の存在の検出のための１段階免疫クロマトグラフィー検定において、検定に用いられる試薬の１種が、被検体に対する第１の抗体が結合される第１の移動性の粒子を含み、もう１種の試薬が、支持体層上の第１の所定の帯域で不動化されている被検体に対する第２の抗体を含んでなり、サンプルを第１と第２の抗体に接触させる前に、サンプルを、被検体に対する所定量の抗体と接触させる段階を含んでなる改良が提供され、抗体が、サンプルの適用前に支持体層上の第２の所定の帯域に適用される。
【００１２】
本発明のさらにもう１つの態様に従えば、ヒトの糞便のサンプル中の血液の存在の検出のための制御された感度を有する分析装置において、互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を有する芯の材料と、サンプルの適用に先立ちサンプルパッドに適用されたヒトヘモグロビンに対する第１の抗体を所定量含むサンプル適用パッドと、移動性の粒子に結合したヒトヘモグロビンに対する第２の抗体を含んでなる複合体帯域と、芯の材料上に不動化されヒトヘモグロビンに対する第３の抗体を含んでなる検出帯域とを含んでいる分析装置が提供される。ヘモグロビンを含む糞便のサンプルが、緩衝液に懸濁させられ、サンプルパッドに適用された時、閾値量のヘモグロビンが第１の抗体に結合され、サンプル中の未結合のままのヘモグロビンが、サンプルパッドから、第２の抗体にそれが結合される複合体帯域を通り、かつ第３の抗体に結合され、不動化される検出体帯域を通るようにしてなり、検出可能な信号を発生する。
【００１３】
移動性粒子は、好ましくは、着色ラテックス粒子または金属ゾルであり、さらに好ましくは、着色ラテックス粒子である。芯の材料は、好ましくは、ニトロセルロースである。第１と第２の抗体は、好ましくは、モノクロナールである。好ましい実施態様では、第２の抗体は、第１の抗体と同じである。もう１つの好ましい実施態様では、第１の抗体は、ポリクロナールである。さらにもう１つの好ましい実施態様では、第３の抗体は、第１の抗体と同じである。
【００１４】
もう１つの好ましい実施態様では、複合体帯域が、さらに、移動性粒子と複合化した抗原を含み、そして、装置が、さらに、抗原に対する第４の抗体を含んでいるテスト完全帯域を含んでなる。好ましくは、抗原はヤギ血清アルブミンである。
【００１５】
さらにもう１つの好ましい実施態様では、本発明の装置は、検出帯域の膜上に不動化された視覚的に検出できる粒子を含んでいる負の信号をさらに含んでいる。粒子が、好ましくは、水平線の膜上で不動化されていて、第３の抗体が、好ましくは、水平線と交差する垂直線の膜上で不動化されている。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの態様に従えば、互いに隣接していて、互いに吸収性接触している複数の実質的に平坦な帯域を有している芯の材料と、サンプルの適用に先立ちサンプルパッドに適用されたヒトヘモグロビンに対する第１の抗体の所定量を含むサンプル適用パッドと、移動性粒子に結合したヒトヘモグロビンに対する第２の抗体を含んでいる複合体帯域と、芯の材料に不動化したヒトヘモグロビンに対する第３の抗体を含んでいる検出帯域とを含んでなる装置を用いて糞便のサンプル中の血液を検出する方法が提供される。ヘモグロビンを含む糞便のサンプルが、緩衝液中に懸濁され、サンプルパッドに適用された時、閾値量のヘモグロビンが第１の抗体に結合され、サンプル中の未結合のままのヘモグロビンが、サンプルパッドから、第２の抗体にそれが結合される複合体帯域を通り、そして第３の抗体にそれが結合され不動化される検出体帯域を通り、検出可能な信号を発生する。本発明の方法は、糞便のサンプルを緩衝液に懸濁させる段階、装置のサンプルパッドに糞便のサンプルを含む緩衝液を適用する段階、サンプルパッド、複合体帯域および検出帯域を緩衝液が横断するのに十分な時間待機する段階、並びに検出帯域の外観に基づいてサンプル中のヘモグロビンの存在または不在を決定する段階を含む。
【００１７】
我々は、調節可能な分析感度を有する改良した１段階免疫クロマトグラフィー検定を見いだした。この改良点は、ここに参考のために入れたＦａｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，０９６，８３７号及び同第５，２２３，２２０号に開示の形式の免疫クロマトグラフィー検定に特に適用できる。しかしながら、この改良点は、信号発生が、膜を通る水平方向の粒子の移動の使用により得られるすべての検定に適用可能である。
【００１８】
Ａ．抗体−ラテックス複合体の準備
均一なラテックス粒子（『ＵＬＰ』）は、通常、小径の極めて均一な球体である。典型的な直径は、約０．１μｍ未満〜約１００μｍの範囲である。５μｍよりも小さな粒子は、通常、エマルジョン重合により得られる。
【００１９】
例えば簡単な吸着または共有結合を介するタンパク質−ラテックス複合体の基本的なプロセスは、着色ラテックス粒子の使用のように、本分野で周知であり、検定の分解能と読み取り性（ｒｅａｄａｂｉｌｉｔｙ）を増す。さまざまな複合体化の手順が、Ｂａｎｇｓ，  Ｌ．Ｂ．の１９８９年、Ａｍｅｒ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．第４１回全国会議（ｔｈｅ  ４１ｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）のワークショップで提出され、Ｓｅｒａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮから印刷された形で入手可能な『均一ラテックス粒子（Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）』、またはＧａｌｌｏｗａｙ，  Ｒ．Ｊ．の『マイクロ微粒子テストと免疫検定の発達（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）』、Ｓｅｒａｄｙｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ．に一般的用語で説明されている。
【００２０】
被覆したラテックス粒子の１つの製造方法は、例えば、吸着法である。一般的言い方として、１）純粋な試薬を使用すべきである；２）被覆に先立ち粒子を清浄にすべきである；３）粒子の定量的な表面被覆面積およびリガンド化学を測定すべきである。
【００２１】
例えば、抗体−ラテックス複合体（『Ａｂ−ラテックス』）は、次の方法により製造できる：最も簡単な場合、適当なリガンドを緩衝液に溶解させ、ラテックス懸濁物に添加し、２、３分〜２４時間以上の間攪拌する。平衡化の後、ラテックスを遠心分離し、未吸着のリガンドを含む上澄みを捨てる。ラテックスは、新たな緩衝液中に再び懸濁させてから遠心分離し、上澄みを再び捨てる。これらの段階を繰り返し、ラテックスが、なんらの残留未吸着リガンドがなくなるまで洗浄されることが確認されるべきである。この際、ラテックス被覆プロセスは、完全であろうし、ラテックスは、ラテックス凝集検定に用いるのに準備される。
【００２２】
共有カップリング（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）は、ラテックス粒子表面へのリガンドまたはほかの物質の永久的結合あるいは共有結合を含む。共有カップリングが、より抜きの方法であるなら、リガンドをまずラテックス粒子にカップルさせ、次に、ラテックス粒子の懸濁物の安定性を保持し、さらに、タンパク質が変質するのを防がねばならない。（共有カップリング技術の一般的な説明およびより詳細な引用については、ここに参考としてあげるＢａｎｇｓ，Ｌ．Ｂ．『均一なラテックス粒子』を参照されたい。）
【００２３】
上記の説明は、ラテックス粒子の状況についてであるが、ほかの合成粒子および金属コロイドまたは粒子（例えば金ゾル粒子）を限定することなく含むほかの粒子が使用できることが認識される。これらの粒子およびその製造方法は、本分野で周知である。
【００２４】
Ｂ．ＢＳＡ−ラテックス複合体の準備
ウシ血清アルブミン−ラテックス複合体（『ＢＳＡ−ラテックス』）の準備は、ＢＳＡが用いられることを別にして、上記のように抗体−ラテックス（Ａｂ−ラテックス）の準備と同様である。別法として、ＢＳＡの代わりにほかのタンパク質を用いてもよく、例えば、ラクトアルブミン、カゼイン、グロブリン、非特異的免疫グロブリン（これは、抗原−抗体反応で沈殿しない）および非特異的結合を阻害できる同様なアルブミンを含むほかのアルブミンを用いてもよい。
【００２５】
Ｃ．ＧＳＡ−ラテックス複合体の準備
ヤギ血清アルブミン−ラテックス複合体（『ＧＳＡ−ラテックス』）の準備は、ＧＳＡがＢＳＡの代わりに用いられることを別として、上記のＢＳＡ−ラテックスの準備と同様である。この場合も、他のタンパク質が、ヤギ血清アルブミンの代わりに用いられてもよく、それは、下記に詳述するように『テスト完全』信号または正の手順コントロール信号を発生する手段として用いられる。
【００２６】
Ｄ．複合体の混合物
Ａｂ−ラテックス、ＢＳＡ−ラテックスおよびＧＳＡ−ラテックスを、行うべきテストに応じて、さまざまな比で一緒に混合する。検定の性質に応じて、比をかなり変えることができ、アルブミンで標識付けしたラテックスの量が大きいほど非特異的結合の大きな減少がある。抗体を付着させないラテックスの量は、非特異的結合または疑似的な正を明白に減少させるのに有効な量であり得る。そのような量は、すぐにわかる実験的方法により容易に決定される。
【００２７】
Ｅ．１段階検定手順
１．１段階反応ユニットの調製
固相検定フォーマットでの本発明の使用の１例は、本質的に次のように進み得る。反応装置は、検定のための固体の支持体を含む固体の、典型的にはプラスチックのハウジングからなる。固体支持体は、好ましくは、液体を吸引する芯の材料からなる。好ましくは、ニトロセルロースのような膜ストリップが用いられる。膜は、好ましくは、孔の大きさ約８μを有するニトロセルロース膜のストリップからなるが、より大きなまたはより小さな孔の大きさも使用可能である。約３μ〜約１２μの範囲の孔の大きさが好ましい。
【００２８】
膜の右端は、サンプルウエルと接触している。サンプルウエルは、膜に沿って右から左にサンプル液体の一様な流れを与える吸収性パッドを含んでいる。別法として、反応ユニットは、サンプルの流れが、左から右に、または膜を横断する他の方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）となるように組み立てられることができる。
【００２９】
検定の感度の制御を考慮に入れるため、テスト被検体に特異的なモノクロナールまたはポリクロナール抗体またはそのフラグメントを緩衝液中でサンプルパッドに沈殿させてから乾燥させる。被検体を含むサンプルをサンプルパッドに加えた時、パッドに沈殿した抗体が被検体のいくらかに結合するであろう。抗体に結合しない過剰の被検体は、サンプルパッドを通って進み、膜へと入り、膜に沈殿している抗体で被覆された移動性の着色ラテックス粒子と反応する。サンプルパッドに適用する抗体の量を変えることにより、被検体のベースラインすなわち閾値が設定される。この閾値レベルを越える量でサンプルに存在する被検体は、結合されずにサンプルパットを通り膜へと進み、正の結果を与える。閾値レベルよりも少ない量でサンプル中に存在する被検体は、抗体に結合され、抗体で被覆された移動性の着色ラテックス粒子とは反応しないであろうし、負の結果が、当然の結果となろう。このことは、検定の感度が、反応装置の製造中にあらかじめ設定されることを可能とする。
【００３０】
移動性粒子、たとえば、着色ラテックス粒子は、膜の第１の帯域、複合体帯域に適用される。これらの粒子は、所望の被検体を固定する適当な抗体と複合体を形成し、そして、サンプルパッドに適用したのと同じ抗体であり得る。この帯域は、非特異性結合を減じるＢＳＡ−ラテックスおよびＧＳＡ−ラテックス（正の手順コントロールとして働く）の複合体をも含み得る。
【００３１】
膜上の第２の帯域、検出帯域では、第２の抗体が不動化される。この抗体も、被検体に対して向けられ、ポリクロナールまたはモノクローナールであり得る。被検体が閾値レベルよりも上でサンプル中に存在すると、第２の帯域の抗体は、被検体に結合し、これが、移動性の着色ラテックス粒子と複合化した抗体に結合する。結果は、膜の上の第２の帯域に不動化された視覚的に検出できる抗体−抗原−抗体複合体『サンドイッチ』である。
【００３２】
また、第２の帯域には、通常は、水平線の形式である、不動化された『負の』信号が好ましくはある。この線は、好ましくは、膜上で不動化された視覚的に検出できる粒子例えば着色ラテックス粒子を含んでなる。好ましくは、上記の第２の抗体は、負の信号と交差する垂直線の膜の上で不動化されている。よって、被検体が、閾値レベルよりも大きな量でサンプル中に存在しないときは、水平な負の信号だけが、視認できる。被検体が、閾値レベルを越える量で存在するときは、被検体−抗体複合体が、第２の抗体に結合され、正または『＋』の信号が膜の上に現れる。
【００３３】
第３の試薬が用いられてもよく、好ましくは、膜状の第３の帯域、テスト完全帯域に付着される。この試薬は、サンプルが加えられた後第１の帯域から移動する粒子を固定し得る。この第３の薬剤は、手順コントロールとして働き得、検定が完全であることを示すように働き得るか、または例えば第３の薬剤が不動化される帯域で検出可能な応答が起こるかどうかを適切に行うことを示すように働き得る。この第３の薬剤は、抗原−ラテックス複合体例えばＧＳＡ−ラテックス複合体を固定する抗体を含んでなる。
【００３４】
本発明のクロマトグラフィー検定テスト手順では、液体試験体が、第１の帯域に近接する固体の支持体に適用される。上記したように、サンプル中に存在する抗原の所定量が、サンプルパッド上に存在する抗体に結合する。流体が、毛管作用により膜の第１の帯域へと移動すると、それは、抗体を有するラテックス粒子または粒子と複合化したタンパク質を移動させる。閾値レベルを越えてサンプル中に存在する抗原は、ラテックス粒子上の抗体に結合する。次に流体は、膜を横断して粒子を次の１つの帯域または複数の帯域に移動させる。被検体が、閾値レベルを越えてサンプル中に存在すると、不動化した抗体／被検体／抗体−複合化粒子の『サンドイッチ』が形成され、検出できる結果が生じる。流体が膜を横断して粒子を移動させ続けると、流体と粒子は、第３の試薬（膜上に不動化される）と接触して結合する。すると、その帯域に検出可能な応答が起こるはずである：これは、テストが有効であることまたはテストが完全であることを示す。
【実施例】
【００３５】
本発明は、好ましい実施態様の典型である以下の実施例によりよりよく理解できるが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきものではない。
【００３６】
例１
糞便潜在血液反応ユニットの準備
本発明の１つの実施態様で用いられる検定反応ユニットは、プラスチックケーシングに収納した孔の大きさ８μを有するニトロセルロースの１ｃｍｘ５ｃｍのストリップを含んでなる。吸収性サンプルパッドに、４０μＬの捕獲溶液（ｃａｐｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えた。捕獲溶液は、１５０〜２００μｇ／ｍＬのモノクローナール抗ヒトヘモグロビン（抗−ｈ  Ｈｂ）、５ｍｇ／ｍＬの親和性−精製済ウサギＩｇＧ、２％のカゼイン、５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、０．２２ＭのＴｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）および０．０１ｍｇ／ｍＬのフルオレセインを含んでなり、ｐＨ８．２であった。捕獲溶液は、反応ユニットのサンプルパッド上に付着させてから乾燥させた。
【００３７】
ラテックス抗ヒトヘモグロビン被覆溶液約３μＬ（２．０〜３．５ｍｇ）を膜の第１の帯域に適用した。被覆溶液は、約０．３０〜０．３４μｍの青色ラテックス粒子に複合化した０．１５〜０．２５％のモノクロナール抗ヒトヘモグロビン、０．５％のヤギ血清アルブミン−青色ラテックス複合体および被覆溶液の全ラテックス濃度を１．７％にするのに十分な量のウシ血清アルブミン−白色ラテックス複合体を含んでなるようにした。
【００３８】
正の線被覆溶液約０．５μＬを、垂直線の膜の第２の帯域に適用した。被覆溶液は、ｐＨ７．７で、４ｍｇ／ｍｌの親和性精製済ウサギ抗ヒトヘモグロビンと０．０１ｍｇ／ｍＬのフルオレセインとをＰＢＳ／ＮａＮ３ に含んでなるようにした。
【００３９】
この第２の帯域では、また、負の信号が、水平線の膜上に負のラテックス溶液０．５μＬを適用することによりつくられた。負のラテックス溶液は、ｐＨ８．５で、０．７５％の青色のラテックスと０．２％のＰＥＧとを４０ｍＭのほう酸塩に含んでなるようにした。
【００４０】
『テスト完全』信号は、膜の第３の帯域につくられた。ＰＢＳ／ＮａＮ３ に含むようにした０．５ｍｇ／ｍＬの親和性精製済ウサギ抗ヤギアルブミン抗体を含んでなる溶液０．５μＬを、第３の位置で膜上に付着させた。
【００４１】
反応ユニットを組み立てるため、膜をプラスチックのハウジングに入れた。ハウジングは、サンプル添加ウエルと膜の視認ができる開口部すなわち窓を含んでいた。膜をハウジングの中に入れ、サンプルパッドをサンプル添加ウエルの下方とし、膜の一端をサンプルパッドに接触させ、膜の第２と第３の帯域が、プラスチックケーシングの窓を通して視認できるようにした。
【００４２】
例ＩＩ
１段階糞便潜在血液検定手順
０．０〜２５．０ｍｇ／ｇの範囲の量のヒトヘモグロビンを、ヒトの糞便に加えた。検定の特異性の対照として、１．０ｍｇ／ｇのウシヘモグロビンをヒト糞便に加えた。ヘモグロビンを含む糞便物質の各サンプル約１２ｍｇを、１．２５ｍＬの輸送緩衝液（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｂｕｆｆｅｒ）を含む管に入れた。輸送緩衝液は、ｐＨ８．８で、１．０％のプロテアーゼを含まないＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、０．８８％のＮａＣｌ、０．０３７％のホルムアルデヒド、０．１％のＰｒｏｃｌｉｎ３００（Ｒｏｈｍ−Ｈａｓｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）および０．１％のＮａＮ３ を含んでるようにした。それぞれの管をふたをして１０〜１５回振盪させて糞便物質を緩衝液に懸濁させた。
【００４３】
糞便物質を含む緩衝液約２００〜２５０μＬを、例１に記載の１段階反応ユニットのサンプルパッドに加えた。テスト結果は、反応ユニットへのサンプルの添加後、１０分、３０分および６０分で読み取った。発生した信号は、負または正とした：結果は、プレプリントした青色の水平線だけが膜上の第２の帯域に視認できたとき負と判断し、青色が、膜上の第２の帯域の垂直線に視認できたとき正と判断した。それぞれのサンプルは、本発明の反応ユニットの３つの異なる製造ロットを用いてテストした。
【００４４】
各サンプルは、また、Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ（登録商標）  ＳＥＮＳＡ（登録商標）  （ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）およびＯＣ−Ｈｅｍｏｄｉａ（登録商標）  （Ｅｉｋｅｎ，  Ｊａｐａｎ）を用いて製造者の指示に従ってテストした。検定の結果を表１〜３に示す。
【００４５】
【表１】
2005189246.tif 000002
【００４６】
【表２】
2005189246.tif 000003
【００４７】
【表３】
2005189246.tif 000004
【００４８】
表１〜３に示したように、本発明の検定は、糞便中の０．０５０ｍｇ／ｇのヘモグロビンの存在を検出する。
【００４９】
例ＩＩＩ
１段階糞便潜在血液検定の感度
サンプルは、各種濃度のヒトヘモグロビンを輸送緩衝液に加えて準備した。サンプルは、例ＩＩについて上記に説明したように本発明の１段階糞便潜在血液検定を用いてテストした。サンプル添加３０分後、それぞれの結果を負または正と判断した。サンプルは、本発明の反応ユニットの３つの異なる製造ロットを用いてテストした。
【００５０】
サンプルは、また、前記Ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ  ＳＥＮＳＡおよびＯＣ−Ｈｅｍｏｄｉａを用いて製造者の指示に従ってテストした。検定の結果を表４に示す。本発明の検定は、０．５〜１．０μｇ／ｍＬのヘモグロビンを含むサンプルについて正の結果を与えた。
【００５１】
【表４】
2005189246.tif 000005
【００５２】
検定結果と比較する目的または試薬の実行可能性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をテストする目的で対照溶液も用いられ得る。例えば、ヒトヘモグロビンを含む正の対照を用いることができる。ウシヘモグロビンを含む負の対照を用いることができる。これらの対照は、サンプルとして同じようにして反応ユニットでテストされるべきである。対照は、ここに記載の検定成分および試薬のいずれかまたは全てを有するようにキットの形式にしてよい。
本発明を特定の実施態様により説明したが、特許の保護範囲はこれらの特定の実施態様に限定されるものではなく、特許請求の範囲により決定されるのもであることを意図する。