(57)【要約】【課題】カンジダ・アルビカンスを始めとする真菌による疾患の治療及び診断に有用な新規な抗原タンパク質、及び該抗原タンパク質をコードする核酸を提供すること。【解決手段】カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されることを特徴とする、抗原タンパク質、及びカンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ−１）  配列番号：２〜配列番号：８に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチド、
（Ａ−２）  配列番号：２〜配列番号：８に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
（Ａ−３）  配列番号：１１〜配列番号：１７に示される塩基配列のいずれかを有する核酸にコードされるポリぺプチド、及び
（Ａ−４）  配列番号：１１〜配列番号：１７に示される塩基配列の核酸のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチド、
からなる群より選択された、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性マウス由来の抗血清により認識される抗原タンパク質。
【請求項２】
（Ｂ−１）  配列番号：２〜配列番号：８に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−２）  配列番号：２〜配列番号：８に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−３）  配列番号：１１〜配列番号：１７に示される塩基配列のいずれかを有する核酸、及び
（Ｂ−４）  配列番号：１１〜配列番号：１７に示される塩基配列のいずれかを有する核酸アンチセンス鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
からなる群より選択された、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性マウス由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
請求項２記載の核酸を含有してなるベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターによって形質転換されてなる形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を、請求項２記載の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性マウス由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法。
【請求項６】
請求項１記載の抗原タンパク質、又は請求項５記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする診断用組成物。
【請求項７】
請求項２記載の核酸を含有することを特徴とする診断用組成物。
【請求項８】
請求項１記載の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片。
【請求項９】
請求項２記載の核酸に特異的に結合する核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌による感染症やアレルギー疾患の予防、治療、診断に有用なカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）抗原タンパク質及びそれをコードする核酸に関する。さらに本発明は、該核酸を含有してなるベクター、及び該ベクターによって形質転換されてなる形質転換体に関する。さらに本発明は、かかる形質転換体を培養する本発明の抗原タンパク質の生産方法に関する。さらに本発明は、本発明の抗原タンパク質及び核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンジダ・アルビカンスはヒトの常在菌であるが、健常人は通常本菌の感染に対して抵抗性を示し、全身的感染症を起こすことはほとんどない。しかし、本菌は、健常人でも部分的な感染症を起こす場合があり、女性、特に妊婦においては膣カンジダ症を起こすことがある。一方、白血病等の癌のため制癌剤の投与を受けた場合、臓器移植に伴う免疫抑制剤の投与を受けた場合、ＡＩＤＳ感染を起こした場合等により免疫的易感染状態になったヒトでは、内臓を始めとする全身的な感染症を起こすことがある。更に本菌は、真菌の中では最も頻度の高いアレルゲンであり、アレルギー疾患の原因でもある。また殆どのヒトは常在菌であるカンジダ・アルビカンスの免疫感作状態にあり、カンジダ・アルビカンスの構成成分に対する抗体を有しており、また細胞性免疫を獲得している。
【０００３】
抗原となっているものの多くは、細胞表面のマンナン（mannan）、グルカン（glucan）等の多糖を中心とする細胞壁構成成分であり、特にマンナン及びそのタンパク質との結合物が多い。またカンジダ・アルビカンス感染患者又はアレルギー疾患患者の血清中には上記細胞壁構成成分に対する抗体の他、細胞内成分であるエノラーゼ（enolase ）、HSP90 （heat shock protein90）、ホスホグリセレートキナーゼ（phosphoglyceratekinase）、アルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase ）に対する抗体等が検出されている。
【０００４】
カンジダ・アルビカンス以外のカンジダ属真菌、例えばカンジダ・トロピカリス（C ．tropicalis）、カンジダ・グラブラータ（C ．glabrata）等も主として免疫的易感染宿主に感染症を起こす。カンジダ属真菌以外の真菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、アルタナリア（Alternaria）属真菌も環境中に広く存在しヒトを始めとする哺乳類にとって非常に身近な存在である。これらの真菌の細胞増殖形態は酵母状もしくは菌糸状であるが、その細胞構造は基本的には類似しており、表層は全て厚い細胞壁に囲まれている。細胞壁構成成分の化学構造は真菌の種類によりある程度異なるが、マンナン、グルカン、キチン（chitin）等の多糖を主成分としている。また細胞壁に取り囲まれた細胞膜、細胞質内のタンパク質を始めとする構成成分も基本的には類似している。これらの真菌も多くのものが免疫的易感染宿主に感染症を起こしたり、アレルギーの原因となっている。
【０００５】
真菌が関与する疾患の病原因子やアレルゲンとして、いくつかの真菌由来の抗原分子が単離同定されている。これら抗原分子の単離同定には一般に真菌に対し感作状態にある哺乳類の血清を利用しており、同定されたこれらの抗原分子としては真菌の表層を取り巻く細胞壁構成成分が最も一般的である。該成分以外にも単離同定されている抗原分子は数多くあり、診断や治療を目的として研究されている。しかし、真菌感作状態において保有されている抗体に反応する抗原が全て感染症やアレルギー疾患において有効に働く抗原とは限らない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的はカンジダ・アルビカンスを始めとする真菌による疾患の治療及び診断に有用な新規な抗原タンパク質を提供することにある。さらに本発明の目的は該抗原タンパク質をコードする核酸を提供することにある。さらに本発明の目的は、該核酸を含有してなるベクター、及び該ベクターによって形質転換されてなる形質転換体を提供することにある。さらに本発明の目的は、かかる形質転換体を培養する本発明の抗原タンパク質の生産方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、本発明の抗原タンパク質及び核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マウス、ラット等のカンジダ・アルビカンス感染に感受性の哺乳類に対してカンジダ・アルビカンス感染抵抗性を付与する方法について検討してきた。その結果、これらの哺乳類に対して、抗原としてカンジダ・アルビカンス細胞を用い、不完全フロイントアジュバントのアジュバントと混ぜて免疫することにより強い感染抵抗性を獲得させることができることを明らかにした。そして、この感染抵抗性にＣＤ４陽性Ｔ細胞が重要な働きを果たしていることを明らかにした。更に上記感染抵抗性を獲得した免疫感作状態にある哺乳類より得られた抗血清は、例えば市販の抗カンジダ血清である因子血清Ｎｏ．１（ヤトロン製）に比べ、意外にも真菌細胞表層に存在する細胞壁由来成分には低い抗体価を示し、細胞壁を除去した真菌のプロトプラスト細胞由来の成分により高い抗体価を示した。
【０００８】
本発明者らは上記感染抵抗性を示す免疫感作状態にある哺乳類の血清中には真菌感染症に有効に働く抗体をより多く含有すると考え該血清に含有される抗体に着目し、該抗血清により認識される抗原タンパク質を探索した。即ち、カンジダ・アルビカンスのｃＤＮＡを基に、発現ライブラリーを作製し、イムノスクリーニングにより探索した。その結果、大腸菌の組み換えタンパク質として９種類の抗原タンパク質を見い出し、そのＤＮＡを単離し、塩基配列を決定すると共に、塩基配列よりアミノ酸配列を決定し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されることを特徴とする、抗原タンパク質、
〔２〕  抗原タンパク質が、
（Ａ−１）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチド、
（Ａ−２）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
（Ａ−３）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかを有する核酸にコードされるポリぺプチド、又は
（Ａ−４）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリぺプチドである、前記〔１〕記載の抗原タンパク質、
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕記載の抗原タンパク質と免疫学的に同等な抗原タンパク質、
〔４〕  カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸、
【００１０】
〔５〕  核酸が、
（Ｂ−１）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−２）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−３）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかを有する核酸、
（Ｂ−４）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸、又は
（Ｂ−５）  （Ｂ−１）〜（Ｂ−４）いずれか記載の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸である、前記〔４〕記載の核酸、
〔６〕  前記〔４〕又は〔５〕記載の核酸を含有してなるベクター、
〔７〕  前記〔６〕記載のベクターによって形質転換されてなる形質転換体、
〔８〕  前記〔７〕記載の形質転換体を、前記〔４〕又は〔５〕記載の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法、
【００１１】
〔９〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の抗原タンパク質、又は前記〔８〕記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする医薬組成物、
〔１０〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の抗原タンパク質、又は前記〔８〕記載の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有することを特徴とする診断用組成物、
〔１１〕  前記〔４〕又は〔５〕記載の核酸を含有することを特徴とする医薬組成物、
〔１２〕  前記〔４〕又は〔５〕記載の核酸を含有することを特徴とする診断用組成物、
〔１３〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片、
〔１４〕  前記〔４〕又は〔５〕記載の核酸に特異的に結合する核酸、に関するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗原タンパク質はカンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清に認識される抗原であり、カンジダ・アルビカンス感染の治療及び診断に有用である。また、本発明の核酸は本発明の抗原タンパク質をコードするものであり、カンジダ・アルビカンス感染の治療及び診断に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
１．本発明の抗原タンパク質
本発明の抗原タンパク質は、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質である。
本明細書において「カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類」とは、カンジダ・アルビカンス由来の抗原を免疫して感染抵抗性を獲得させた哺乳類であり、免疫前の致死量のカンジダ・アルビカンス細胞（静脈内感染後１０日以内に死ぬ細胞数）を投与されても死ななくなった状態の哺乳類である。
【００１４】
かかる哺乳類は、例えば次のようにして得ることができる。
カンジダ・アルビカンス感染感受性の動物、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ等のマウス、及びＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ等のラット等に対して、抗原としてカンジダ・アルビカンス生細胞、アジュバントとして細胞性免疫を強く誘導するために不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いた混合物を、皮下又は腹腔内に１〜２週間隔で少なくとも２回投与し免疫する。このようにして免疫されて感染抵抗性を獲得した動物をカンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類とする。
【００１５】
本明細書において「カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清」とは、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類から得られる抗血清である。
【００１６】
かかる抗血清としては、例えば、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類において、最終免疫後１〜２週後に採血したものを用いることができる。このような抗血清は、好ましくは哺乳類としてマウス、更に好ましくは５週令以上のＣ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ又はＤＢＡ／２を用い、これに例えば１×１０5〜１×１０8個の生きた細胞をＩＦＡと混ぜ、約１週間隔で２回以上免疫し、その後１週〜１ヶ月経過以降に得られる抗血清である。本発明において使用される抗血清は、真菌細胞の細胞膜成分及び細胞内分子に対して高い抗体価を含有するものである。これに対し、一般的に使用される抗カンジダ抗血清は、感染抵抗性哺乳類由来のものではなく、表層の細胞壁の構成成分、例えばマンナンやマンナンタンパクに対して高い抗体価を有しており、本発明における抗血清とは異なる。
【００１７】
なお本発明において使用できるカンジダ・アルビカンス細胞としては特に限定されるものではなく、カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ１７６８株、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１株等が挙げられる。
【００１８】
本明細書において、「抗血清により認識される」とは、抗血清中に含まれる抗体成分と結合することを意味し、通常、この結合を測定するために使用されるイムノブロッティングやＥＬＩＳＡ、免疫沈降法等の免疫学的手法によりその抗原を検出及び／又は定量できる。抗原と抗体の結合は、通常、４℃〜室温で適当な溶液中やゲル内又は抗原固定化プレート上で実施する。
【００１９】
これらの抗原タンパク質は、哺乳類において、カンジダ・アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン用の抗原として、また感染の有無や進行状態を診断するための抗原として有用である。また、カンジダ・アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断のための抗原として有用である。また、カンジダ・アルビカンスはヒトの常在菌であるため、殆どのヒトの免疫細胞（リンパ球、マクロファージ等）がカンジダ・アルビカンス由来の抗原タンパク質に対して各種サイトカイン遊離、免疫細胞の活性化等の免疫反応を起こす。
【００２０】
即ち、本発明の抗原タンパク質はインターフェロンγ、インターロイキン４等の有効な免疫調節物質を遊離させたり、活性化させるための抗原として有用である。また本発明の抗原タンパク質は生体内診断の目的で、個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、鼻や眼の粘膜試験における抗原性成分として使用することが出来る。更に実験室診断、例えば、抗原抗体反応である凝集反応、沈降反応、中和反応、標識抗体法を用いた診断法、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化試験、白血球遊走阻止試験等における抗原性成分にも使用することができる。
【００２１】
本発明の抗原タンパク質としては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質又はポリペプチドであれば特に限定されない。かかるタンパク質又はポリペプチドは、例えば、カンジダ・アルビカンスｃＤＮＡのライブラリー発現物に対する、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清を用いてのイムノスクリーニングにより得ることができる。
【００２２】
なお本明細書におけるタンパク質とは生物体の主要構成成分を意味し、ポリペプチド鎖から成るものを示す。また本明細書におけるポリペプチドとは複数のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、構成アミノ酸の数は特に限定されない。また本明細書におけるポリペプチドは、アミノ酸のみから構成される単純ポリペプチド又はアミノ酸以外の構成成分を含む複合ポリペプチドのいずれであってもよい。更に本明細書で融合タンパク質なる語を使用するが、これは２つ以上のタンパク質の一部又は全部が結合したタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００２３】
本発明の抗原タンパク質の具体例としては、例えば、以下のポリぺプチドが挙げられる。
（Ａ−１）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチド、
（Ａ−２）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
（Ａ−３）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかを有する核酸にコードされるポリぺプチド、
（Ａ−４）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリぺプチド。
【００２４】
ここで、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなるポリぺプチドはそれぞれ、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清を用いてのイムノスクリーニングにより得られる、カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ１７６８株のｃＤＮＡライブラリー由来のものである。また、イムノスクリーニングにおいては大腸菌を宿主とする発現ライブラリーを用いたため、ポリペプチドは単純ポリペプチドとして発現されている。従って、抗カンジダ血清中に多く含まれる糖鎖に対する抗体の影響を除き、ポリペプチド部分に対する抗体により抗原タンパク質をスクリーニングしたことになる。
【００２５】
配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは２４８アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのトリオースホスフェートイソメラーゼ（triosephosphate isomerase ）とホモロジーを有する。カンジダ・アルビカンス培養菌体から単離されたタンパク質のＮ末端アミノ酸配列解析結果によると、Ｎ末のメチオニンは脱離していることから、抗原タンパク質として利用しやすい部分は少なくとも２〜２４８番目の中に存在すると思われる。更に、ホモロジー解析の結果も合わせ考えると、配列表の配列番号：１に示されるポリペプチドはカンジダ・アルビカンスのトリオースホスフェートイソメラーゼの全長構造であると判断される。
【００２６】
配列表の配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは１３２アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのリシルｔＲＮＡシンターゼ（５９０アミノ酸よりなる。）のＮ末付近の１０〜１３７番目とホモロジーを有する。
【００２７】
配列表の配列番号：３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは５４８アミノ酸よりなり、このポリペプチドの２６０〜５４６番目がサッカロミセス・セレビシエの第３染色体のＤＮＡ９８（８７０アミノ酸よりなるタンパク質をコードする。）の５２３〜８６８番目とホモロジーを有する。
【００２８】
配列表の配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは１７５アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのＥＧＤ２（１７４アミノ酸よりなる。）とホモロジーを有する。
【００２９】
配列表の配列番号：５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは８８アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのATP シンターゼ  デルタ鎖（２４４アミノ酸よりなる。）のＣ末付近の１５８〜２４２番目とホモロジーを有する。
【００３０】
配列表の配列番号：６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは２６４アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのＢＭＨ２（２７３アミノ酸よりなる。）とホモロジーを有する。
【００３１】
配列表の配列番号：７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは２２４アミノ酸よりなり、サッカロミセス・セレビシエのリボソームＬ７タンパク（２４４アミノ酸よりなる）とホモロジーを有する。
【００３２】
配列表の配列番号：８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは１１５アミノ酸よりなり、このタンパク質の３９番目〜Ｃ末部分がサッカロミセス・セレビシエのＹＮＬ０８３ｗ（４９４アミノ酸よりなる）の２８４〜３６０番目とホモロジーを有する。
【００３３】
配列表の配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは公知のＨＳＰ７０ＳＳＢタイプであり、ウサギ抗カンジダ血清により認識される抗原タンパク質として発見されたものである。全長は６１３アミノ酸であり、２８０番目〜Ｃ末（３３３アミノ酸）よりなるポリペプチドが抗原タンパク質として得られている［V. Maneu et al., Yeast, Vol ．13, 677-681,（1997）］。
【００３４】
一方、本発明においては、配列表の配列番号：９に示されるアミノ酸配列に係るｃＤＮＡにおいて、発現物のイムノスクリーニングの結果が陽性のｃＤＮＡは４種類得られており、これらは配列表の配列番号：９に示されるアミノ酸配列中、３２０番目〜Ｃ末（２９４アミノ酸）、４５２番目〜Ｃ末（１６２アミノ酸）、４９６番目〜Ｃ末（１１８アミノ酸）、５１３番目〜Ｃ末（１０１アミノ酸）をコードするものである。従って、Ｃ末側の少なくとも１００アミノ酸の長さのタンパク質が抗原性の発現に重要であると考えられる。このことから、前記４種のタンパク質を含めＣ末側の少なくとも１００アミノ酸を含む約１００〜２９４アミノ酸を有するタンパク質は本発明の抗原タンパク質に包含される。即ち本発明の配列表の配列番号：９に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から３１９〜５１２アミノ酸の長さのアミノ酸が除かれたポリペプチドも本発明における抗原タンパク質に包含される。
【００３５】
本発明においては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをも本発明の抗原タンパク質に包含される。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数を言う。例えば、配列番号：１及び配列番号：２に示される抗原タンパク質はＮ末端にはＴ７タグを含むペプチドが付加された融合タンパク質として得られており、このような抗原性に無関係のペプチドが付加されたタンパク質又はポリペプチドも本発明の抗原タンパク質に包含されるが、Ｔ７タグ部分が欠失したものも本発明の抗原タンパク質に包含される。また、前記のように配列番号：９に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末から約３１９〜５１２アミノ酸を欠失させたポリペプチドも欠失させた例として挙げられるが、これも本発明における抗原タンパク質に包含される。
【００３６】
また、本発明においては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。さらに、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、その一部からなるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをも本発明の抗原タンパク質に包含される。また、さらに前述のようなこれらの本発明の抗原タンパク質に抗原性に無関係のペプチドが付加されたタンパク質又はポリペプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。
【００３７】
配列表の配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドは、例えば、配列表の配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなる抗原タンパク質を原料として、リシルエンドペプチドダーゼ、トリプシン等のプロテアーゼによる酵素消化による切断後、又は臭化シアン等による化学的処理による切断後、目的の抗原性を有するぺプチド断片をタンパク質の精製における既知の方法により単離精製すること等により得ることができる。更に、上記の方法等により得られたポリペプチドの化学構造に関する情報を基に、ペプチド合成技術を利用しての化学合成による製造も可能である。また該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である。
【００３８】
アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を行う手法としては、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（１９８９年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティスら編集）等に記載されている、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
【００３９】
配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列はそれぞれ、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸の配列の例である。従って、本発明においては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識されるタンパク質又はポリペプチドであって、配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のそれぞれからなる核酸にコードされるポリぺプチドを本発明の抗原タンパク質に包含する。
【００４０】
該核酸は発現ライブラリーのイムノスクリーニングにより得られる抗原タンパクを発現するｃＤＮＡであるが、該ｃＤＮＡは遺伝子全長若くは部分塩基配列よりなる。例えば、配列番号：１０、配列番号：１５に示される塩基配列は抗原タンパク質遺伝子の全長であり、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８に示される塩基配列は抗原タンパク質遺伝子の部分配列である。例えば、配列番号：１８記載の核酸にコードされるＨＳＰ７０ＳＳＢタイプ由来の抗原タンパク質は、上記の最も小さい抗原タンパク質、即ち配列表の配列番号：９に示されるアミノ酸配列の５１３番目〜Ｃ末１０１アミノ酸からなるポリペプチドの場合、５８０〜８８２番目の塩基配列にコードされている。従って、抗原性の高い部分をコードする組み換えＤＮＡは５８０〜８８２番目のヌクレオチド配列を含有するように設計することが好ましい。
【００４１】
また本発明においては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のそれぞれにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸にコードされるポリぺプチドも本発明の抗原タンパク質に包含する。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数を言う。
【００４２】
このように、塩基配列において１若しくは複数個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を行うためには、公知の種々の遺伝子工学的手法、例えば、ギャップド・デュプレックス法［Wilfried,K. et al., Nucleic Acids Research, Vol.12, 9441-9456(1984) ］、デレーション法［Celeste,Y.P. et al., Methods in Enzymology, Vol.154, 367-382(1987)］、ウラシルＤＮＡ法［Thomas, A.K. et al., Gene, Vol.34, 315-323 (1987) ］やカセット変異法［James,A.W., et al., Gene, Vol.34, 315-323(1985) ］等を利用すれば良い。
【００４３】
また、カンジダ・アルビカンスの変異株、近縁菌（例えばカンジダ・トロピカリス等のカンジダ属真菌）、サッカロミセス・セレビシエ以外の他の真菌由来のタンパク質であって、本発明の抗原タンパク質と免疫学的に同等の性質を有するタンパク質又はポリペプチドも本発明の抗原タンパク質に包含される。本明細書における「免疫学的に同等の性質を有するタンパク質」とはアミノ酸配列或いは糖鎖などの修飾は異なるが、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有する本発明の抗原タンパク質により免疫された哺乳類由来の抗血清に含有される抗体で認識されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００４４】
なお、抗原としての安定性の強化及び／又は所望の反応性の強化、即ち治療目的からすれば、個体防御免疫能の誘導強化や、アレルギー反応の減弱化又は酵素活性の消失を目的に、また診断目的からすれば、抗原と抗体との特異的結合の強化を目的に、本発明の抗原タンパク質を改変して誘導体としてもよい。改変法としては、例えば、ピリジルエチル化、還元、アルキル化、アシル化、適当な単体への化学的カップリング、温和なホルマリン処理、又は塩酸グアニジン処理が挙げられる。誘導体の作製法としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法［Wie et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., Vol.64, 84 −99，(1981)］を用いてＰＥＧと結合させてもよい。
【００４５】
２．本発明の核酸
本発明の核酸は、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸である。
【００４６】
かかる核酸は、例えば本発明の抗原タンパク質と同様に、カンジダ・アルビカンスのｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製し、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清によるイムノスクリーニングを行うことにより得ることができる。また、カンジダ・アルビカンスのゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明の抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部をコードすると推定されるオリゴヌクレオチドをプローブとする該ライブラリーのスクリーニングによって得ることもできる。
【００４７】
本発明の核酸は、哺乳類において、カンジダ・アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン用の抗原遺伝子として、また、カンジダ・アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断のための抗原遺伝子として有用である。
【００４８】
本発明の核酸の具体例としては、例えば、以下のような核酸が挙げられる。
（Ｂ−１）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−２）  配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸、
（Ｂ−３）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかを有する核酸、
（Ｂ−４）  配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸、
（Ｂ−５）  （Ｂ−１）〜（Ｂ−４）いずれか記載の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
ここで、核酸としてはＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでも良い。
【００４９】
配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列はそれぞれ、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸の配列の例である。
【００５０】
なお遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする核酸には、そのアミノ酸配列にもよるが、多数の種類が存在し得る。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる。）もあり、かかる変異を有する核酸は、変異前の核酸と同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸といえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
【００５１】
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来のＤＮＡ上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものである場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主での使用頻度の高いものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（たとえば特公平７−１０２１４６号公報等）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作成可能なことは言うまでもなく、自然界においても作成され得るものである。
【００５２】
このことから、本明細書における（Ｂ−１）に示される、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のそれぞれからなるポリぺプチドをコードする核酸は、（Ｂ−３）に示される配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のそれぞれからなる核酸に限定されるものではない。
【００５３】
従って、本発明においては、その発現物がカンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列のそれぞれにおいて、１若しくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を有する核酸も本発明の核酸に包含される。ここで複数個とは、数個乃至それ以上の個数を言う。
【００５４】
例えば、配列表の配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列を有するそれぞれの抗原タンパク質の抗原性を保持したまま、前記タンパク質の一部を適当に脱離させたタンパク質、及びＮ末端、Ｃ末端に例えばＴ７ファージ由来のタンパク質、ヒスチジンポリマー、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が付加された抗原タンパク質の融合タンパク質をコードする、配列表の配列番号：１０〜配列番号：１８に示される核酸の誘導体である核酸も本発明の核酸に含まれる。
【００５５】
さらに、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）のいずれかに示される核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸（即ち、（Ｂ−５）の核酸）も本発明の核酸に包含される。かかる核酸は次のようにして検出することができる。
【００５６】
即ち、対象となる核酸を固定したメンブレンを０．５重量％ＳＤＳ、０．１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１重量％ポリビニルピロリドン、０．１重量％フィコール４００、０．０１重量％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す。）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。このような条件で対象の核酸が検出された場合、該核酸を「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」とする。ここで用いるプローブとしては、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）に示される核酸の一部である。
【００５７】
このような核酸には、例えば、カンジダ・アルビカンスの変異株や近縁菌（例えばカンジダ・トロピカリス等のカンジダ属真菌）の有する、（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）に示される核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸であって、免疫学的に同等な抗原性を有するタンパク質をコードする核酸等が挙げられる。
【００５８】
また、本発明の核酸は、配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかを有するポリぺプチドをコードする核酸、あるいは配列番号：１〜配列番号：９に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸において、その変異型、対立遺伝子、相同遺伝子、コドンの縮重が伴う核酸も、その発現物がカンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される限り、本発明の核酸に包含される。
【００５９】
また本発明の核酸としては、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質をコードする核酸、例えば、（Ｂ−１）〜（Ｂ−５）に示される核酸に特異的に結合する核酸も挙げられる。ここでの、本発明の核酸は公知の蛍光物質や放射性物質によりラベルされていてもよい。該核酸は、ハイブリダイゼーションによるカンジダ・アルビカンス抗原遺伝子の検出に用いるプローブやＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ増幅方法におけるプライマーとして利用可能である。
【００６０】
３．本発明のベクター、形質転換体
本発明のベクターは、本発明の核酸を含有してなるベクターである。このようなベクターは、本発明の核酸を、大腸菌等の宿主に安定に保持させることができる。かかるベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えばｐＵＣ１１８、ｐＷＨ５、ｐＴＶ１１８、ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂ等が挙げられるが、本発明の核酸が挿入でき、発現可能なベクターであれば特に限定されない。また、適当な発現ベクターにつなぎ、発現用組み換えＤＮＡとすることもできる。配列番号：１０〜配列番号：１８に示される塩基配列を有する核酸は、ｐＳＣＲＥＥＮ−１ｂにつなぎ、発現用組み換えＤＮＡとして大腸菌に導入し、本発明に使用された。核酸をベクターに挿入する方法は特に限定されるものではなく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法等の公知の方法を用いることができる。
【００６１】
本発明の形質転換体は、本発明のベクターによって形質転換されてなるものである。このような形質転換体は、本発明のベクターを宿主に導入することにより得られる。宿主としては、大腸菌、バチルス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス属、ピキア・パストリス等の真菌の他、昆虫細胞、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ細胞等の動物細胞を用いることができる。ベクターを宿主に導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、ＣａＣｌ2法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポーレーション法等の公知の方法が挙げられる。かかる形質転換体は、例えば用いたベクターの選択マーカーを指標とすることにより選択することができ、また、例えば該形質転換体より抽出した核酸と本発明の核酸を特異的に検出可能なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、所望の核酸が導入されていることを確認することができる。
【００６２】
このような形質転換体は本発明の核酸を調製する際に、及び本発明の抗原タンパク質を調製する際に利用することができる。
【００６３】
４．本発明の抗原タンパク質の生産方法
本発明の、カンジダ・アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清により認識される抗原タンパク質の生産方法は、本発明の形質転換体を、本発明の核酸にコードされる抗原タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする。
【００６４】
培養条件としては特に限定されるものではなく、例えばベクターとしてラムダファージベクターλＳＣＲＥＥＮ−１とＰｈａｇｅ  ＭａｋｅｒTM  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｈａｇｅ  Ｐａｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ〔共にノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕を用いて得られる形質転換体の場合、選択圧としてのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、適当な時期にＩＰＴＧ（イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）による発現誘導をかければよい。他のベクター及び宿主を用いて得られた形質転換体においても、適当な選択圧をかけた培地中でタンパク質の発現に適した条件で培養すればよい。このように培養して目的のタンパク質を発現させる。
【００６５】
発現されたタンパク質又はポリペプチドは、当該分野で知られる公知のタンパク質の精製方法により回収、精製することができる。また、得られたタンパク質又はポリペプチドの抗原性の有無は、例えば、イムノブロッティング法、ＥＬＩＳＡ又は免疫沈降法などの免疫学的手法により確認することができる。
【００６６】
また本発明の抗原タンパク質は、遺伝子工学的手法を用いて得られる本発明の形質転換体から生産してもよく、カンジダ・アルビカンス培養物から公知のタンパク質精製方法によって得ても良い。
【００６７】
５．本発明の医薬組成物及び診断用組成物
本発明の医薬組成物及び診断用組成物は、１）本発明の抗原タンパク質、又は本発明の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有するもの、及び２）本発明の核酸を含有するものである。
【００６８】
１）本発明の抗原タンパク質、又は本発明の生産方法により得られる抗原タンパク質を含有する医薬組成物及び診断用組成物
本発明の医薬組成物及び診断用組成物には、哺乳類において、カンジダ・アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン、また感染の有無や進行状態を判断するための診断用組成物が包含される。更に、カンジダ・アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断に用いられる組成物が包含される。また、カンジダ・アルビカンスはヒトの常在菌であるため、殆どのヒトの免疫細胞（リンパ球、マクロファージ等）がカンジダ・アルビカンス由来の抗原タンパク質に対して各種サイトカイン遊離、免疫細胞の活性化等の免疫反応を起こす。即ち、本発明の医薬組成物及び診断用組成物にはインターフェロンγ、インターロイキン４等の有効な免疫調節物質を遊離させたり、活性化させるための組成物も包含される。
【００６９】
感染防御免疫を誘導するための組成物は、より強い体液性及び／又は細胞性免疫を得るために、本発明の抗原タンパク質を下記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液とした製剤として用いられることが一般的である。アジュバントは、普通、抗原性成分と共に投与されるが、抗原性成分を投与する前または後に与えてもよい。
【００７０】
哺乳類のワクチン接種に適当なアジュバントとしては、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）の完全または不完全アジュバント；水酸化アルミニウム、みょうばん等の無機物ゲル；リゾレシチン、ジメチルオクタデシルアンモニウムブロミド等の界面活性剤；硫酸デキストラン、ポリＩＣ等のポリアニオン；ムラミルペプチド、タフトシン等のペプチド；Ｒｉｂｉ社製のモノフォスフォリルリピドＡ（ＭＰＬ）；コレラトキシンのＢサブユニットがあるが、これらには限定されない。抗原はリポソームまたは他のマイクロキャリアーに取り込ませて投与することができる。当然、いくつかの異なる抗原タンパク質を混合して用いることも可能である。
【００７１】
アレルギー疾患の予防、治療や診断のための組成物は、本発明の抗原タンパク質を適当な塩溶液や懸濁液の形にして用いれば良い。場合によりポリエチレングリコールやフェノールが添加されていても良い。更に上記のようなアジュバントを含む懸濁液又は溶液としてもよい。アジュバントは、普通、抗原と共に投与されるが、抗原投与の前または後に与えてもよい。抗原はまたリポソームまたは他のマイクロキャリアーに取り込ませて投与することができる。
【００７２】
医薬組成物の投与方法としては、経口、経粘膜（鼻、膣等）、経皮（皮下または皮内）的に、または静脈内に投与すればよい。代表的な投与量は、タンパク質量として０．０１μｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、１μg 〜１００μｇ／ｋｇ体重の範囲がより好ましいが、必要に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。
【００７３】
生体内診断の目的で、個体に対し、例えば、吸入誘発試験、皮膚テスト、鼻や眼の粘膜試験で使用する診断用組成物は、本発明の抗原タンパク質を凍結乾燥粉末、若くは適当な塩溶液や懸濁液の形にしたものが挙げられ、ポリエチレングリコールやフェノールが添加されていてもよい。パッチテストには、白色ワセリンを基剤としてラウリル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を添加したものに本発明の抗原タンパク質を混合すればよい。また、ＩｇＥ抗体価測定用の抗原として使用する際には、ペーパーディスク、セルローススポンジ、マイクロプレート等の固相体に上記抗原タンパク質を固定化して使用することができる。
【００７４】
２）本発明の核酸を含有する医薬組成物及び診断用組成物
本発明の医薬組成物及び診断用組成物は、哺乳類において、カンジダ・アルビカンスを始めとするカンジダ菌による感染や他の真菌感染に対する感染防御免疫を誘導するためのワクチン、また、カンジダ・アルビカンスを始めとする真菌を原因とするアレルギー疾患の予防、治療や診断に用いることができる。感染防御やアレルギー疾患の治療のために用いる場合、本発明の核酸を哺乳類細胞内で発現可能となるように、適当なプロモーターの下流に本発明の核酸を含んでいるプラスミドをそのまま、又はレトロウイルスやアデノウイルスに入れ、適当な塩溶液や懸濁液の形とする。また本発明の核酸をリポソームまたは他のマイクロキャリアーに取り込ませたり、適当なポリカチオン系脂質に混合してもよい。
【００７５】
医薬組成物の投与方法としては、筋肉内、皮下、または静脈内に投与すればよい。代表的な投与量は、核酸量として０．０１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましく、１μg 〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲がより好ましいが、必要に応じて、投与量を増加したり、投与回数を増大させればよい。
【００７６】
６．本発明の抗体又は抗体断片
本発明の抗体は、本発明の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体である。ここで、抗体としては、本発明の抗原タンパク質に特異的に結合する限り、抗体断片をも包含する。
本発明の抗体は常法により得ることができ、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体のいずれでもよい。該抗体又は抗体断片は、カンジダ・アルビカンス或いはその類縁菌による感染症における真菌の検出や、カンジダ・アルビカンス或いはその類縁菌によるアレルギー疾患におけるアレルゲン同定等に利用可能である。また、本発明の抗原タンパク質の精製等に使用することもできる。
【００７７】
７．本発明の抗原タンパク質をコードする核酸に特異的に結合する核酸
本発明の抗原タンパク質をコードする核酸に特異的に結合する核酸は、ハイブリダイゼーションによる本発明の抗原タンパク質をコードする核酸の検出に用いるプローブやＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅方法におけるプライマーとして利用可能である。該核酸は公知の蛍光物質や放射性物質によりラベルされていてもよい。
【００７８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７９】
感染抵抗性の誘導及びＣＤ４陽性Ｔ細胞の感染抵抗性への関与
１）感染抵抗性の誘導：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．アルビカンス）ＴＩＭＭ  １７６８をサブロー・デキストロース培地で一晩振とう培養し、細胞を遠心で回収、生理食塩水で洗浄した。得られた細胞を１×１０6、１×１０7、１×１０8個／mlとなるように生理食塩水に懸濁した。各々の懸濁液に等量のＩＦＡ（フロイントの不完全アジュバント）を加えて混合し、この混合物をC57BL/6 マウスに一匹当たり0.1 mlずつ皮下接種して、カンジダ生細胞でマウスを免疫した。一週間後、上記と同様に調製したカンジダ生細胞を同量ずつ皮下接種し、マウスをさらに免疫した。即ち、一匹のマウスに対して、５×１０4個、５×１０5個、又は５×１０6個のカンジダ生細胞で二回免疫したことになる。対照として、カンジダ生細胞の懸濁液の代わりに生理食塩水を用いて、該生理食塩水と等量のＩＦＡを混合したものを一週間隔で二回皮下接種により投与した。
【００８０】
二回目の免疫の一週間後、全ての免疫マウス及び対照マウスに、サブロー・デキストロース培地で培養して得られたＣ．アルビカンス TIMM 1768細胞を２．５×１０5個ずつ静脈内に投与して感染させた。感染後、３０日間マウスの生死を観察した。結果を表１に示す。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
表１より、上記投与量で対照マウス（非免疫マウス）は全例１０日以内に死亡したが、免疫マウスは明らかに感染抵抗性を獲得していることが分かった。
【００８３】
２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞による感染抵抗性の獲得：５×１０6個のカンジダ・アルビカンス生細胞を用いて、上記１）と同様の方法で一週間の間隔で二回免疫されたBALB/cマウスに対して、最終免疫後２３日目、２６日目、及び２９日目の計３回、抗ＣＤ４抗体（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２０７より調製）又は抗ＣＤ８抗体（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１０５より調製）を一匹当り0.3 mgずつ腹腔内に投与した。最終免疫後２９日目にサブロー・デキストロース培地で培養して得られたＣ．アルビカンス TIMM 0136細胞を１×１０5個ずつ静脈内に投与した。対照として、非免疫マウス、及び免疫をするが抗体を投与しないマウスを用意し、これらにも同様にＣ．アルビカンス TIMM 0136細胞を１×１０5個ずつ静脈内に投与した。その投与後７日目に腎臓内の生残Ｃ．アルビカンス細胞数を測定した。
【００８４】
抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体は常法に従い、ハイブリドーマをｓｃｉｄマウス腹腔に注射しハイブリドーマを増殖させた腹水より精製した。また得られた抗体はＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒにより各細胞が除かれていることを確認した。
【００８５】
その結果、抗ＣＤ４抗体の投与により腎臓内の菌数の抑制が有意に阻害され、感染抵抗性にＣＤ４陽性Ｔ細胞が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【実施例２】
【００８６】
感染抵抗性哺乳類の血清の採取とその性質、及び各種吸収血清の作製
１）感染抵抗性哺乳類の血清の採取：実施例１−２）と同様の方法で、アジュバントにＣＦＡ（フロイントの完全アジュバント）５×１０6個のＣ．アルビカンスTIMM 1768 生細胞で３回免疫されたBALB/cマウスより、最終免疫後７日目に常法により血清を採取した。このものを抗カンジダ血清とした。
【００８７】
２）感染抵抗性哺乳類の血清の性質：実施例２−１）で得られた抗カンジダ血清の性質を検討した。
まず抗原成分としてＣ．アルビカンス細胞壁画分（ＣＷ）、細胞質画分（ＨＳＳ）、細胞膜画分（ＬＳＰ）を調製した。
【００８８】
Ｃ．アルビカンスTIMM 1768 のサブロー寒天斜面培養物の一白金耳分を5 mlのYPD 培地（イーストエキストラクト１重量％、ポリペプトン２重量％、グルコース２重量％）を入れた試験管に植菌した。30℃で24時間振とう培養後、その培養液50μＬを、YPD 培地500 mlを入れた2 L 容三角フラスコに植菌し、35℃で一晩振とう培養した。この２Ｌ容三角フラスコを合計四つ用いて培養した。
【００８９】
得られた約2Lの培養液（約７×１０7細胞／ｍＬ）から、2,000 ×１０g 、10分間の遠心により細胞を集めた。細胞を500 mlの滅菌水で２回洗浄後、500 mlのSSB 溶液（0.8 M ソルビトール入り50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5））で１回洗浄した。細胞を約500 mlのSSB 溶液に懸濁後、100 mM EDTA 入りSSB 溶液を70 ml、そして2-メルカプトエタノールを１ml加え、緩やかに振とうした。続いて、この懸濁液に、１ｍＬあたり３．３ｍｇのザイモリエース２０Ｔ（生化学工業社製）を含有するSSB 溶液を70 ml 加え、35℃で１時間緩やかに振とうした。さらに、１ｍＬあたり１２ｍｇのトリコデルマ・ライジングエンザイム（シグマ社製）を含有するSSB 溶液を70 ml 加え、35℃で１時間緩やかに振とうした。得られた懸濁液を2,000 ×g 、10分間の遠心にかけ、プロトプラスト細胞を集めると共に、上清を細胞壁画分（ＣＷ）とした。
【００９０】
上記の様にして得られたプロトプラスト細胞に滅菌生理食塩水を140 ml加え（この懸濁液１ｍＬあたりプロトプラスト細胞は約１×１０9個）、充分攪拌した後、氷上に10分間静置した。プロトプラスト細胞がバーストしたことを確認後、10,000×g 、30分間遠心し、得られた沈殿を不溶性画分（ＬＳＰという）とした。遠心上清をさらに100,000 ×g 、60分間遠心し、その結果得られた遠心上清を可溶性画分（ＨＳＳという）とした。ＬＳＰを１４０ｍＬの生理食塩水に懸濁後、超音波処理し、さらに沸騰水浴下、５分間加熱処理して殺菌し、膜タンパク質等を含有するＬＳＰ抗原液とした。また、ＣＷについても同様に超音波処理、加熱処理を行ってＣＷ抗原液を得た。なおＨＳＳについては、そのままの液をＨＳＳ抗原液とした。
【００９１】
上記のようにして得られたLSP 抗原液のタンパク質濃度は2.3 mg/ml 、HSS 抗原液のタンパク質濃度は3.5 mg/ml 、ＣＷ抗原液のタンパク質濃度は２．１ｍｇ／ｍＬであった（タンパク質量はBSA を標準としてビシンコニン酸（BCA ）試薬により定量した）。
【００９２】
抗原成分として得られたＣＷ抗原液、ＬＳＰ抗原液、ＨＳＳ抗原液を、各々のタンパク質濃度が10μg/mlとなるようにPBS で希釈後、イムノ・モジュール［ヌンク（Nunc）社製］に50μl ずつ加え、４℃に一晩放置し、各イムノ・モジュールをそれぞれの抗原でコーティングした。１重量％牛血清アルブミンを入れたPBS 溶液で、コーティングされたイムノ・モジュールのブロッキング処理を行った。次いで、60倍に希釈した抗カンジダ血清又はコントロール血清をイムノ・モジュールに50μl 加え、37℃で１時間インキュベートした後、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（2000倍希釈）と37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、PBS で洗浄し、次いで基質溶液を加えた。15分後、405nm での吸光度を測定した。該吸光度が高いほど抗原を認識する抗体量が多い、即ち抗原に対する抗体価が高い事を示す。その結果を表２に示す。なお、上記コントロール血清は生菌の代わりに生理食塩水を用いて該生理食塩水と等量のＣＦＡを混合したものを１週間隔で３回皮下接種により投与したマウスの血清より調製した。
【００９３】
【表２】
2005021166.tif 000003
【００９４】
表２より明らかなように、抗カンジダ血清はＨＳＳに対する抗体価が最も高いが、ＬＳＰに対しても抗体価を有していることが明らかとなった。ＣＷに対する抗体価は低かった。
【実施例３】
【００９５】
Ｃ．アルビカンスcDNA発現ライブラリーによる抗原タンパク質のスクリーニング
１）Ｃ．アルビカンスのcDNA発現ライブラリーの作製：Ｃ．アルビカンスTIMM1768株のcDNA発現ライブラリーを作製するため、菌体より全ＲＮＡを抽出、精製した。すなわち、上記の菌を200 ml YPD培地で３5 ℃で培養後、遠心（２０００rpm 、５分間）により菌体を回収し、一度蒸留水で洗浄した。菌体を液体窒素により急速凍結し、乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した。この菌体粉末より、RNA エクストラクションキット［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）］を用いて全ＲＮＡを回収、精製した。この全ＲＮＡからオリゴテックス−ｄＴ３０＜スーパー＞（宝酒造社製）を用いて、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを調製した。cDNA合成キット（宝酒造社製）を用いて、ポリ（Ａ）+ＲＮＡ５μg からｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをラムダファージベクターλSCREEN-1［ノヴァジェン（Novagen ）社製］と連結した後、Phage Maker TM System PhagePack Extract （ノヴァジェン社製）によりインビトロパッケージングを行いｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００９６】
２）Ｃ．アルビカンス生細胞免疫による抗カンジダ血清と認識する抗原タンパク質のイムノスクリーニング：Ｃ．アルビカンス生細胞免疫による抗血清と反応するタンパク質を発現しているファージクローンをイムノスクリーニングにより検出した。なお、ファージベクターλSCREEN-1を用いて作成されたｃＤＮＡライブラリーにおいて、そのｃＤＮＡはT ７タグ配列等を含むペプチドとの融合ポリペプチドまたはｃＤＮＡ内の翻訳開始コドンから始まるポリペプチドとして発現した。
【００９７】
すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを宿主大腸菌 BL21(DE3)pLysE 株に接種し、トップアガロース（０．７重量％アガロースを含むＬＢ培地）と混合後、２×YT（1.6 重量％バクトトリプトン、１重量％イーストエキストラクト、0.5 重量％ NaCl ）プレート上に重層し、３７℃、６時間培養することにより、ファージプラークを形成させた。生じたプラーク上にナイロンメンブレン［Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製］を重ね、４℃で一夜静置した後、３７℃で４時間保温した。メンブレンをプレートから剥がし、ＰＢＳＴ（組成は１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．５，０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０分間洗浄した後、そのメンブレンを適当量のブロックエース（大日本製薬社製）に浸すことによりブロッキングした。一夜室温で放置後、このメンブレンを実施例２−１）で調製した抗カンジダ血清（５００倍希釈液）と３時間室温でインキュベートした。インキュベート後洗浄し、次いでパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（１０００倍希釈）と１時間室温でインキュベートした。インキュベート後洗浄し、次いでSuperSignal Substrate Western Blotting［ピアス（Pierce）社製］により発光させ、抗カンジダ血清と反応するファージプラークを検出した。
【００９８】
５×１０4個のプラークをスクリーニングした結果、抗血清と反応するファージプラークは１００〜１５０個存在した。これらのうち、特に強く反応したプラークに注目し、さらにクローニングを行った。クローニングされたファージを宿主大腸菌BM25.8株に接種することにより、大腸菌内でオートマチックサブクローニングがおこり、ファージDNA に存在するｃＤＮＡを含む領域がプラスミドＤＮＡへ自動的にサブクローニングされた。このプラスミドを含む大腸菌からプラスミドを精製し、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。塩基配列の解析の結果、２クローンはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．セレビシエ）のトリオースフォスフェートイソメラーゼ（triosephosphate isomerase ）とホモロジーを有する新規遺伝子であり、全長のｃＤＮＡを有していた。さらに、Ｓ．セレビシエのリシルｔＲＮＡシンテターゼ（lysyl-tRNA synthetase ）とＳ．セレビシエの第３染色体のＤＮＡ９８とホモロジーを有する新規遺伝子もそれぞれ１クローン存在した。これらのｃＤＮＡはそれぞれの遺伝子の一部分を含んでおり、この領域内に抗血清と反応する抗原決定基が存在していることが明らかとなった。
【００９９】
上記の新規遺伝子であるＳ．セレビシエのトリオースフォスフェートイソメラーゼホモログ遺伝子、Ｓ．セレビシエリシルｔＲＮＡシンテターゼホモログ遺伝子及びＳ．セレビシエ第３染色体のＤＮＡ９８のホモログ遺伝子の塩基配列は各々配列表の配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２に示す通りであり、この塩基配列よりこれらの核酸は各々配列表の配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
【０１００】
３）吸収抗カンジダ血清によるＣ．アルビカンス抗原タンパク質のスクリーニング：Ｃ．アルビカンス生細胞免疫血清由来の吸収抗血清を用いて、上記１）記載のｃＤＮＡライブラリーよりＣ．アルビカンス抗原タンパク質のイムノスクリーニングを行った。すなわち、抗カンジダ血清とＨＳＳとＣＷを１：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）に混合した溶液を作製し、これを吸収抗血清とした。
【０１０１】
この吸収抗血清を用いて、実施例３−２）と同様の方法により抗原分子のスクリーニングを行った。用いた抗血清は、吸収抗血清の５００倍希釈液である。この抗血清と反応するファージプラークについて、さらにクローニングを行った。クローニングされたｃＤＮＡの塩基配列の解析の結果、１クローンはＳ．セレビシエのＥＧＤ２遺伝子とホモロジーを有する新規遺伝子をほとんど全長含んでおり、１クローンはATP シンターゼ  デルタ鎖（ATP synthase delta chain）とホモロジーを有する新規遺伝子の一部分であることが明らかとなった。得られた塩基配列情報を各々配列表の配列番号：１３、配列番号：１４に示す。また、この塩基配列は各々配列表の配列番号：４、配列番号：５に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
【０１０２】
また、既知のＨＳＰ７０  ＳＳＢタイプのｃＤＮＡの一部分を含むクローンが４クローン得られ、各々Ｃ末側の２９４アミノ酸、１６２アミノ酸、１１８アミノ酸、１０１アミノ酸をコードしているｃＤＮＡであった。この結果、ＨＳＰ７０  ＳＳＢタイプ抗原は、Ｃ末側の１１８アミノ酸の領域内に抗血清と反応する抗原決定基が存在していることが明らかとなった。最も長い２９４アミノ酸をコードするＨＳＰ７０  ＳＳＢタイプ遺伝子の塩基配列、及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は各々配列番号：１８、配列番号：９に示す通りである。
【０１０３】
次に、ＨＳＳを加えて得られた吸収抗血清に対しては陽性であるが、ＨＳＳとＣＷを加えて得られた上記の吸収抗血清に対しては陰性のファージプラークが存在していたので、これらプラークのｃＤＮＡを上記２）と同様の方法により解析した。２クローンがＳ．セレビシエのBMH ２遺伝子とホモロジーを有する新規遺伝子を全長含んでおり、１クローンはＳ．セレビシエのリボソームタンパクのL７遺伝子とホモロジーを有する新規遺伝子をほとんど全長含んでいた。１クローンはＳ．セレビシエのYNL ０８３W とホモロジーを有する新規遺伝子の一部分（１１５アミノ酸）を含んでいた。
【０１０４】
これらの新規遺伝子であるＳ．セレビシエのBMH ２ホモログ遺伝子、Ｓ．セレビシエリのボソームL ７タンパクホモログ遺伝子、Ｓ．セレビシエのYNL ０８３W ホモログ遺伝子の塩基配列は各々配列表の配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７に示す通りであり、この塩基配列よりこれらの遺伝子は各々配列表の配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
【実施例４】
【０１０５】
Ｃ．アルビカンス感染抵抗性哺乳類由来の抗血清に認識される抗原タンパク質の製造
実施例３−２）及び３−３）において得られたｃＤＮＡは、Ｓ．セレビシエのYNL ０８３W とホモロジーを有する遺伝子以外は全て、融合ポリペプチドとして発現していた。YNL ０８３W とホモロジーを有する遺伝子はｃＤＮＡ内の開始コドン（ＡＴＧ）よりポリペプチドを発現していた。融合ポリペプチドの発現を示す一例としてトリオースフォスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）とホモロジーを有する遺伝子と、リシルｔＲＮＡシンテターゼとホモロジーを有する遺伝子より発現されるポリペプチドを明らかにした。
【０１０６】
すなわち、実施例３−２）において得られたTPI とホモロジーを有する遺伝子を含むプラスミド、及びリシルｔＲＮＡシンテターゼとホモロジーを有する遺伝子を含むプラスミドを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳへ形質転換し、形質転換体を得た。これらの形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、３７℃で３．５時間培養した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、さらに２．５時間培養を続けた。培養液を遠心し菌体を回収、洗浄後、菌体を３０μl の１×ＳＤＳサンプルバッファーに懸濁した。100 ℃で、５分間加熱処理した後、遠心し、その上清の一部分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（12.5％ゲル）電気泳動にかけ、ポリペプチドの発現を確認した。
【０１０７】
発現する融合ポリペプチドの予想分子量はTPI ホモログが６３ｋＤａ（TPI ホモログ２７ｋＤａ＋Ｔ７タグ領域３６ｋＤａ）で、リシルｔＲＮＡシンテターゼホモログは５０ｋＤａ（リシルｔＲＮＡシンテターゼホモログ１４ｋＤａ＋Ｔ７タグ領域３６ｋＤａ）である。これらの融合ポリペプチドは予想された分子量のポリペプチドとして発現していることが図１より明らかとなった。
【０１０８】
図１のレーン１におけるサンプルはリシルtRNAシンテターゼホモログ遺伝子を導入した形質転換体の発現誘導前（IPTG添加前）、レーン２におけるサンプルは誘導後（IPTG添加後）より得られたポリペプチドである。レーン３におけるサンプルはTPI ホモログ遺伝子を導入した形質転換体の発現誘導前、レーン４におけるサンプルは誘導後より得られたポリペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、Ｃ．アルビカンスのリシルtRNAシンテターゼホモログ遺伝子とTPI ホモログ遺伝子由来の組み換えタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付して得られた結果を示す図である。
【図１】
2005021166.tif 000004
【配列表】
2005021166000001.app