(57)【要約】【課題】サンプルが、微小な凹部同士の間で混合することなく、また、気泡が、同凹部内に形成され難く、効率的に、マイクロアレイ等の、生物学的な反応を行うための検出器具における液相反応を行う手段を提供すること。【解決手段】表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を、好適には、特定の保持物質と共存させて付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行う、検出用器具を用いた検出方法を提供することにより、上記の課題を解決することができることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行う、検出用器具を用いた検出方法。
【請求項２】
表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、（１）検出対象物と共に、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質、および／または、（２）室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質、を共存させて付着させ、検出時に前記の物質（１）および／または（２）を、反応溶液内で溶解させる、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
（１）検出対象物と共に、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質が、ゼラチン、寒天、ＤＰＰＣ（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、および、ポリ（ε−カプロラクトン）、からなる群から選ばれる１種または２種以上である、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
（１）検出対象物と共に、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質が、ゼラチンである、請求項２記載の検出方法。
【請求項５】
（２）室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質が、デキストラン、キシリトール、ポリエチレングリコール、マルトース、および、トレハロースからなる群から選ばれる１種以上である、請求項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
（２）室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質が、トレハロースである、請求項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
検出用器具表面の凹部の内壁と反応溶液との接触が、反応溶液を、検出器具の凹部の開口側面上に上層することによって行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
検出対象物が核酸である、請求項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
反応溶液が、核酸に対するインベーダー反応を行うことができる反応溶液である、請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
検出用器具における凹部が、１〜４００００個／ｃｍ２の密度で設けられている、請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
検出用器具の形状が、基板状である、請求項１〜１０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
下記のＡ，ＢおよびＣを構成要素として含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法を行うための検出用キット。
Ａ．（１）検出対象物と共に、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質、および／または、（２）室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質。
Ｂ．反応溶液、または、反応溶液の溶質。
Ｃ．複数の凹部を有する検出用器具。
【請求項１３】
検出対象物が核酸であり、かつ、反応溶液が核酸に対するインベーダー反応を行うことができる反応溶液である、請求項１２記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に、微細構造を有する検出用器具を用いて行う、生物学的な検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
２０世紀における、医学・生物学分野における、最も輝かしい成果の一つとして、ヒト・ゲノム一次構造の解読が挙げられる。
【０００３】
このゲノム解析の成果は、多くの産業分野において活用され、飛躍的な発展がなされることが期待されている。
ヒト・ゲノムの中には、様々な多型マーカーとなるものが認められ、その中でも、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ：ＳＮＰｓ）が、最も多く存在し、多型マーカーの８０％以上であるともいわれている。現在、このＳＮＰｓを活用した、疾患関連遺伝子の探索や、これに続く新薬の開発、すなわち、ゲノム創薬に期待が高まっている。
【０００４】
また、個人のレベルで見れば、体質の把握等に、ＳＮＰｓの検出を応用することも期待され、いわゆる、オーダーメード医療への途が開かれようとしている。現在、種々の遺伝子解析の効率化を目的とした、いわゆるマイクロアレイ様基板が提供されており、微小なチップ上で、非常に数多くのヌクレオチド鎖に対するハイブリダイズ反応等を行うことにより、特定の遺伝子の機能等が明らかにされつつある。このように、マイクロアレイ様基板を用いることにより、数多くの組み合わせが必要なハイブリダイズ反応を、効率良く行うことが可能となり、さらに、従来の方法に比べて、用いる試料の量を、格段に少量にすることができる。
【０００５】
現在用いられているマイクロアレイ様基板は、基板上に、多種のプローブやターゲットを固相配置したチップ上で、サンプル由来の均一な溶液を一度にかけて、ハイブリダイゼーションを行うもので、その均一な溶液中の異なる配列を一度で解析可能な、効率的な解析手段である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
個々の凹部において液相反応を行うことが可能な、高密度の極めて小さい凹部が基板表面に集約したマイクロアレイ様基板を使用するにあたっては、マイクロメートル（μｍ）単位の精度で、ナノリットル（ｎｌ）単位の分注が可能な微量分注機が必須のものとなる（少数の凹部へ反応試薬を分注するだけなら用手法で行うことも可能であるが、多数の凹部を用手法で処理することは非常に困難である）。微量分注機には、インクジェット型の微量分注機（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社のｓｙｎＱＵＡＤＴＭ等）が使用可能である。特に、個々の反応容器に別々の種類の試薬を分注する際には、インクジェット型の微量分注機は必須となる。また、同一種類の試薬を全面もしくは広範囲に分注する場合にも、これまでは微量分注機が必須であった。
【０００７】
このような微量分注機を用いることが必要なマイクロアレイ様基板を用いる検出作業にあたっては、非常に些細な要因でも、測定誤差の原因となってしまうことが知られている。例えば、マイクロアレイ様基板上に、種類の異なる検体等を分注するにあたっては、分注機のノズルや配管内において、異なる溶液の混入を防ぐために、各々の異なる溶液を吸引する前に、洗浄操作が入り時間がかかる。
この時間の間に最初の分注サンプルと最後の分注サンプルでは蒸発による容量差が大きくなってしまうことが問題となる。
【０００８】
この問題を解決する方法としては、最初に凹部内に分注（第１の分注）した検体等を乾燥させ、その上から、同一の反応溶液をまとめて迅速に分注（第２の分注）するようにすれば、凹部間の容量変化の可能性を大きく減らすことができる。この第２の分注により、第１の分注後に乾燥した検体等が溶け出して反応液と接触して、所望する検出反応が開始することとなる。
【０００９】
この場合、第２の分注後の乾燥を防ぐために、例えば、蒸発防止のシールを、微小凹部群上において行うこととなるが、この場合、微小凹部間の溶液の接触による混合がなくなるよう、シールを基板面に密着させる必要がある。
【００１０】
問題は、このシールの際に、シールと各々の微小凹部内の液相反応系の間に気泡が入り、これが検出誤差となってしまう場合があることである。例えば、気泡が全く入らないように、微小な凹部の容量一杯に分注すれば、隣接している微小凹部の反応液同士が凹部から溢れて接触して混合する可能性が強くなる。さらに、この場合においても、なお、気泡が微小凹部内に残ってしまう可能性も強い。
【００１１】
そこで、本発明が解決すべき課題は、第１の分注後に、サンプルが、微小な凹部同士の間で混合することなく、また、気泡が、同凹部内に形成され難く、効率的に、マイクロアレイ等の、生物学的な反応を行うための検出器具における液相反応を行う手段を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、検体等の検出対象物を、第１の分注により、微小な凹部を複数箇所に設けたマイクロアレイ様基板等の検出器具の凹部の内壁に付着させ、短時間のうちに、検出対象物と反応溶液を接触させることで、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行う、検出用器具を用いた検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１４】
本検出方法の好適な態様として、検出対象物と、特定の物質を、微小凹部の内壁において共存させる態様を挙げることができる。この態様においては、内壁と反応溶液の接触から、内壁に付着した検出対象物と反応溶液が直接的に接触するまでの時間を稼ぐことにより、第２の分注から検出までの操作の許容時間を延長させ、所望する生物学的反応の検出作業を容易化することが可能である。
【００１５】
すなわち、本発明は、表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、（１）検出対象物と共に、１０〜９０℃程度で固体から液体への相変化が、その物質自体若しくはその物質と溶媒の混合物において認められる物質（以下、温度応答性物質ともいう）、および／または、（２）室温で緩徐に溶媒中に溶解する物質（以下、徐溶解性物質ともいう）、を共存させて付着させ、検出時に前記の物質（１）および／または（２）を、反応溶液内で溶解させる態様の、本検出方法を提供する発明である。
【００１６】
本検出方法においては、好適には、第２の分注後に、微小凹部の上からシールを行い、（１）温度応答性物質を検出対象物と共存させる場合には、微小凹部内の温度を、当該溶融性物質の溶融温度以上に上昇、または、溶融温度以下に下降させ［後述するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、温度上昇により固化し、温度下降により液化する性質がある。よって、これを温度応答物質として用いる場合には、第１の分注時には液化温度まで分注溶液の温度を下げて、当該分注後に固化温度まで凹部の温度を上昇させつつ、第２の分注により反応溶液を接触させ、検出時に液化温度まで凹部の温度を下降させることが好適である］、（２）徐溶解性物質を共存させる場合には、室温で放置をするが、器具の微小凹部面上には、反応溶液が上層された状態になるので、上記シールを行っても、シール内に気泡が入りにくく、かつ、反応溶液を媒介して、他の検出対象物同士が接触して、謝った結果をもたらしたり、検出感度が低下するリスクを回避することが可能となり、簡単な操作で、精度良く、マイクロアレイ様基板上等における液相反応を行うことができる。
【００１７】
また、本発明は、本検出方法を行うための検出用キット（以下、本検出用キットともいう）を提供する発明でもある。
【００１８】
【発明の実施の形態】
Ａ．本検出方法
本検出方法は、上述したように、表面に複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行う、検出用器具を用いた検出方法である。
【００１９】
（１）検出用器具
ここで、「表面に複数の凹部を有する検出用器具」とは、液相反応を行うことが可能な凹部を表面に有する検出用器具を意味するものである。この検出用器具は、主としてマイクロアレイ様基板を意味するものであり、形状は主に基板状であるが、必ずしもこの形状に限定されるものではない。
【００２０】
第１図は、本検出方法において用いることが好適な検出用基板の一実施態様を表した図面である。検出用基板１０は、原基板１１の表面（片面のみ）１１０上に、凹部１２を、多数（少なくとも２個以上）設けることにより製造され得る。
【００２１】
凹部１２の容積は、これらの凹部において行う、液相反応の検出に必要な液相のボリュームに応じて自由に選択されるべきものであり、特に限定されるべきものではない。すなわち、凹部１２は、液相反応の検出に必要な液相のボリュームよりも、適度に大きな容積であることが必要である。具体的には、この必要な液相のボリュームに対して、１００〜６８００％程度の容積であることが好適である。
【００２２】
検出用基板１０は、本来、必要な液相のボリュームが、μｌ  単位より小さいことが好適な、液相反応の検出を、各々の凹部１２において行うための基板であるから、凹部１２の、各々の容積は、好適には１μｌ  以下、さらに好適には、０．０１μｌ  以下程度である。この凹部１２の容積の好適な最低値は、液相反応の測定感度と、凹部１２を設ける技術に応じて規定されるべきものである。
【００２３】
また、検出用基板１０における、凹部１２の、基板単位面積当りの存在密度は、各々の凹部１２の大きさ、凹部１２を設ける技術、液相反応の検出技術に応じて規定されるべきものであり、特に限定されるべきものではないが、概ね、好適には、１〜４００００個／ｃｍ２程度である。検出用基板において行われる反応が、後述するインベーダー・アッセイ法である場合、特に好適には、１〜１００００個／ｃｍ２程度である。また、インベーダー・アッセイ法を、「低処理向け」〔検出対象となるＤＮＡの量が少ない場合や、検出目的となる一塩基多型（ＳＮＰ）の数が少ない場合、例えば、検出対象となる個人数が数百人で、検出目的となるＳＮＰが、数個程度である場合等〕として分類される態様で行う場合、極めて好適には、１〜４００個／ｃｍ２未満であり、「高処理向け」〔検出目的となる一塩基多型（ＳＮＰ）の数が多い（例えば、数万個以上）場合〕として分類される態様で行う場合、極めて好適には、４００〜１００００個／ｃｍ２  程度である。また、検出用基板において行われる反応が、低密度のマイクロアレイ法（例えば、発現量を調べるべき遺伝子が数百個程度）、または、低密度のインベーダー・アッセイ法以外の液相反応（免疫反応、ラジオイムノアッセイ法、ホモジーニアスアッセイ法等）（各々の液相反応において、検出対象の種類が数個の場合等）である場合、特に好適には、１〜４００個／ｃｍ２  未満である。さらに、検出用基板において行われる反応が、高密度のマイクロアレイ法（例えば、発現量を調べる遺伝子が数千〜数万個程度）、または、高密度の上記のインベーダー・アッセイ法以外の液相反応（各々の液相反応において、検出対象の種類が数千〜数万個の場合等）である場合、特に好適には、４００〜４００００個／ｃｍ２  、極めて好適には、４００〜１００００個／ｃｍ２  である。
【００２４】
また、凹部１２の形状は、特に限定されず、例えば、半球面状、底が半球面状の円筒状、円筒状、すり鉢状、円錐状、角錐状、角柱状等が挙げられる。また、凹部１２の開口部の大きさは、液相を容易に注入可能な大きさが保たれていることが好適である。具体的には、０．０１〜０．５ｍｍ程度（直径）が好適である。
【００２５】
検出用基板１０の素材は、実用に耐えられる程度の剛性を有していれば特に限定されないが、特に、液相反応の検出手段が、蛍光を用いる検出手段である場合には、基板自体が自家蛍光を有さない素材であることが、計測時のバックグラウンドの発生を防御する上で好適である。よって、このような場合の検出用基板１０の素材は、ガラス、セラミックス、金属、プラスチック等が挙げられる。
【００２６】
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂の例を挙げると、まず、主鎖が殆ど炭素からなるポリマーとして、プロピレン系ポリマー（ポリプロピレン等）、４−メチルペンテン１系ポリマー等のオレフィン系ポリマー；ノルボルネン系ポリマー（エチレンノルボルネンコポリマー等）のシクロオレフィン系ポリマー；メチルメタクリレート系ポリマー、イソボルニルメタクリレートのコポリマー、ジシクロペンタニルメタクリル系コポリマー等のアクリル系ポリマー；非結晶のスチレン系ポリマー、シンジオタクチックスチレン系ポリマー、パラｔ−ブチルスチレン系ポリマー、アルファメチルスチレン−メチルメタクリレートコポリマー、ＡＢＳ樹脂等のスチレン系ポリマー；シクロヘキシルマレート系ポリマー、ジメチルイタコネート系ポリマー、硬化塩化ビニル樹脂、フッ素系ポリマー（ビニリデンフルオライド系ポリマー、テトラフルオロエチレン系ポリマー等）のその他のビニル系ポリマー等を挙げることができる。
【００２７】
また、熱可塑性樹脂のうち、主鎖の骨格にヘテロ原子を含むポリマーとして、ポリアセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリスルフォン、芳香族ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンスルフィド、ポリイミド樹脂、トリアセリルセルロース等が挙げられる。
【００２８】
さらに、熱硬化性樹脂の例としては、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂（特に、脂環族エポキシ樹脂）、三次元硬化型ポリウレタン、不飽和アクリル樹脂（エポキシアクリレート樹脂を含む）、メラミン樹脂、三次元化スチレン樹脂、三次元化シリコーン樹脂、アリル樹脂（ジアリルフタレート樹脂、ジエチレングリコールジアリルカーボネート樹脂等）等が挙げられる。
また、必要に応じて、ガラスやプラスチック製の検出用基板１０において、シリコーン処理、脂肪酸処理等の表面処理を、常法に従い行うことができる。特に、シリコーン処理は、検出用基板１０における、検出に用いる材料、試薬等の基板表面への吸着を防御するために好適である場合が多い。
【００２９】
シリコーン処理は、常法に従い行うことができる。例えば、ゾル・ゲル法等を応用することにより、コロイダルシリカ、その他のシリコーン原料を加水分解し、硬化触媒、溶剤、レベリング剤、必要に応じて紫外線吸収剤等を添加して調製されるシリコーンコート材を、常法、例えば、好適には、ディップ法や蒸着法、その他、スプレー法、ロールコート法、フローコート法、スピンコート法等により行うことができる。
【００３０】
また、検出用基板１０に、着色を施して、例えば、検出に蛍光を用いる場合の自家蛍光を防御したり、隣接した凹部同士の蛍光発光による悪影響を防御することが可能である。かかる着色は、必要に応じて、彩度、色相、明度等を選択可能であるが、概ね、黒色であることが好ましく、この場合、炭素等の黒色顔料を基板材料に混合して着色を行うことができる。
【００３１】
検出用基板１０の具体的な大きさと形状は、自由に規格可能であり、特に限定されないが、マイクロアレイとして汎用されている規格に基づいた設計であることが、現実の使用態様として好適である。すなわち、各種のマイクロアレイ解析機器、解析ソフトや関連する分注機等が、かかる規格に合わせて設計されており、検出用基板１０も、このような規格に合致させた大きさと形状に設計することが好適である。具体的には、日本国で、通常用いられているスライドガラスのサイズである、「縦２６ｍｍ×横７６ｍｍ×厚さ１ｍｍ」近傍の板状形状とすることが好適である。これと同様に、検出用基板１０を用いる地域〔例えば、米国（縦１インチ×横３インチ程度）やヨーロッパ等〕のマイクロアレイの形状と大きさの規格に対応させて、検出用基板１０の形状と大きさの設計を行うことが好適である。もしくは分注、検出用機器に適合した大きさであることが望ましい。マイクロタイタープレートサイズでも解析可能なマイクロアレイスキャナーが販売されてきており、そのサイズでもかまわない。
【００３２】
検出用基板１０の製造方法は、特に限定されないが、通常、単一の基板上に、直接、凹部を設ける方法により製造される。
この製造方法では、例えば、凹部１２に対応する多数の貫通口を設けた、塩化ビニル等の素材の薄膜をマスクとして、加工前の基板の表面上に貼り、その上から、サンドブラスト法（微細粒子を高速で基板表面に衝突させることによって、基板表面に凹部を形成する方法）、微細な凹凸を設けた型を用いる型押し法や型抜き法、微細なドリルによる加工等の、微細凹部形成法により、表面上に、多数の凹部１２が設けられた、検出用基板１０を製造することができる。
【００３３】
また、型押し法や型抜き法は、検出用基板１０の素材がプラスチックである場合に好適である。
このようにして、検出用基板１０を製造することができる。
【００３４】
（２）検出対象物
検出対象物は、特に限定されず、液相反応で検出可能な対象物であれば、特に限定されない、具体的には、例えば、遺伝子解析を行う対象となる核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、２本鎖であっても１本鎖であっても良い。また、ヘアピン構造等の特定の立体構造を有していてもよい）、ポリペプチド、抗体、細菌、ウイルス、各種の臨床検体（血液検体、尿検体、リンパ液検体、滑液検体、唾液検体等）等、特に限定されない。
【００３５】
検出対象物は、通常、第１の分注を行う、分注溶液（以下、第１の分注溶液ともいう）中に含有させることが好適である
また、第１の分注溶液には、水、２−プロパノール（後述するＤＰＰＣの溶媒として好適である）、イソプロピルアルコール等の溶媒の他に、検出対象物の種類に応じた安定剤、処理剤、固定化剤等を、必要に応じて、当該溶液中に含有させることができる。
【００３６】
また、第１の分注溶液における検出対象物の含有量は、検出対象物の種類、目的等に応じて選択されるべきもので、全く限定されるものではない。少なくとも、反応物質との接触により、検出可能な程度のシグナルを発生可能な程度より多く、かつ、ノイズが認められるほどの量より少ないことが必要である。
【００３７】
（３）反応溶液等
反応溶液は、用いる検出対象物の種類と、選択する液相反応に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
本発明において行われる液相反応は、特に限定されず、例えば、酵素反応のような蛋白質の触媒反応、抗原抗体反応、蛋白質間の相互作用、物質間の特異的なアフィニティー（ヌクレオチド鎖同士のハイブリダイゼーションを含む）等が挙げられる。
【００３９】
液相反応の検出は、現在、マイクロアレイ技術で用いている手段を利用することにより行うことができる。具体的には、例えば、本検出方法により得られた液相反応後の基板を、高感度な蛍光スキャナーを用いることにより、各小孔における蛍光を検出することができる。また、ラジオアイソトープによる検出、ＥＩＡ法による検出、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ〔ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  社（米国）製〕のようなホモジーニアスな検出等も行うことができる。
【００４０】
上述したように、本使用方法において行われる液相反応の最も好適な態様の一つとして、いわゆる、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  社（米国）〕が挙げられる。
【００４１】
第２図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第２図において、鋳型ヌクレオチド鎖（野生型遺伝子）２１に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖２２をハイブリダイズさせる。
【００４２】
第１のヌクレオチド鎖２２は、鋳型ヌクレオチド鎖２１における、変異検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖２１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖２２の３’末端の塩基は、変異検出対象塩基に対して相補的ではないが、その塩基が、変異検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三塩基重複構造が形成され得る）。
【００４３】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖２１と第１のヌクレオチド鎖２２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖２３をハイブリダイズさせる。第２のヌクレオチド鎖２３は、鋳型ヌクレオチド鎖２１に対して相補的な「相補的部分」２３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」２３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」２３１の最も５’側の塩基は、変異検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
【００４４】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖２１の変異検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖２２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」２３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三塩基重複構造が形成されることとなる。
【００４５】
次いで、この部分的三塩基重複構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ２４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖２３の検出用部分２３２’〔３’末端が、変異検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１が、野生型であることを検出することができる。
【００４６】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素２５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）２５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）２５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
【００４７】
ヘアピン型プローブ２５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖２３の検出用部分２３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、変異検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分２３２’が、ヘアピン型プローブ２５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分２３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ２５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三塩基重複構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ２４が作用して、ヘアピン型プローブ２５における、蛍光色素２５１と蛍光消光物質２５２の間が切断され、蛍光色素２５１が遊離し、蛍光消光物質２５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１が、変異検出対象塩基において変異が認められない野生型遺伝子であることを検出することができる。
【００４８】
これに対して、鋳型ヌクレオチド鎖２１の変異検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖２２と第２のヌクレオチド鎖２３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、検出用部分２３２の配列とそれに対する２５の配列を別配列のセットにし、さらに、ヘアピン型プローブ２５における蛍光色素２５１と蛍光消光物質２５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖２１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
【００４９】
また、鋳型ヌクレオチド２１が、野生型塩基と変異型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
【００５０】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分２３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分を検出することにより、ＳＮＰｓ等を検出することも可能である。さらに、ここでは、ＳＮＰｓを有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
【００５１】
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三塩基重複構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応であり、本発明のような微量液相反応を行う場合においては、最も好適な液相反応である。また、この方法は、オーダーメード医療の鍵となるＳＮＰｓを効率良く検出可能な方法として、非常に有用であり、このアッセイ法に、本発明を適用することにより、平易かつ効率的・網羅的に、ＳＮＰｓを検出することの、産業上における意義は、非常に大きい。
【００５２】
本使用方法において、インベーダー法を検出手段として用いる場合には、上記の鎖型ヌクレオチド鎖２１が、第１の分注溶液に含有させる検出対象物であり、上述したインベーダー法の他の検出要素を含有する溶液が、反応溶液として選択される。
【００５３】
上述したように、第１の分注溶液を、検出器具の微小凹部に分注後、乾燥させて、検出対象物を、複数の凹部を有する検出用器具の凹部の内壁に、検出対象物を付着させ、この検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の検出対象物を付着させた検出用器具の凹部の内壁に接触させ、この接触により発生するシグナルを検出して、検出対象物の評価を行うことができる。しかしながら、この場合、第２の分注からシール、検出作業の行程を急いで、しかも、正確に行わないと、各々の凹部から、内容成分が検出器具の表面上に漏れだして、これらが混ざり合って、検出対象物の評価に悪影響を及ぼすことも考えられる。
【００５４】
そこで、本発明においては、特定の物質、すなわち、温度応答性物質、および／または、徐溶解性物質を、検出対象物と凹部の内壁において共存させることにより、第２の分注後、検出対象物が凹部内に止まる時間を、通常の技術者においても十分に確保することが可能になる。
【００５５】
（４）温度応答性物質と徐溶解性物質
温度応答性物質は、特に限定されないが、塩類等の添加剤なしに、１０〜９０℃程度、好適には、４０〜７０℃程度の温度領域で、固体（ゲル）から液体への相変化をもたらす物質であることが好適である。具体的には、ゼラチン、寒天、ＤＰＰＣ（Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ε−カプロラクトン）等を挙げることができるが、特に、ゼラチンが好適である。
【００５６】
また、徐溶解性物質としては、多価アルコール全般、例えば、デキストランなどの多糖や、マルトース、トレハロースなどの水飴成分、さらには、ポリエチレングリコール、キシリトール等があげられるが、特に、トレハロースが好適である。
【００５７】
温度応答性物質と徐溶解性物質（これらを併せて、保持物質ともいう）は、それぞれ、または、共に、１種または２種以上を選択して、通常は、第１の分注溶液中に含有させて用いることができる。
【００５８】
保持物質の、第１の分注溶液における含有量は、乾燥状態、保湿状態若しくは膨潤状態で、検出対象物を十分保持できる量以上を必要とする。すなわち、乾燥後、反応溶液を分注（第２の分注）を行った後、保持物質は、保湿または膨潤するが、その際に保持物質の量が十分でないと、検出対象物が、保持物質の中に完全に保持されず遊離することになる。遊離した検出対象物は、凹部間が反応液を介して通じている場合には、直ちに隣接凹部に混入し得るため、好ましくない。
凹部内が反応溶液で満たされても、検出対象物が十分保持される量の保持物質が存在すれば、隣接する凹部への混合が防がれ、分注後のシールによって隔離された凹部内では、その後の加温または冷却による温度応答性物質の相変化による検出対象物質の遊離、または、徐溶解性物質の、室温での緩徐な徐溶解性物質の溶解により、他の凹部に影響を受けない、単独凹部特異的な反応が生じる。
【００５９】
例えば、温度応答性物質がゼラチンであれば、第１の分注溶液に対して０．０５〜２質量％の範囲で含有させることが好適である。当該溶液に対して０．０５％未満であると、上述のように検出対象物が温度応答物質としてのゼラチン内に保持されきらず、反応溶液中に溶出して、反応溶液を介して、他の凹部内の検出対象物同士が接触して、検出感度が低下するおそれがあり、２質量％を超えると、第１の分注溶液自体が、過度に粘調となり、分注に支障が生ずる傾向がある。
【００６０】
第１の分注溶液は、通常、液状化（ゾル化）している状態の、保持物質の水溶液に検出対象物を添加して溶解させて調製することが好適であるが、この方式に限定されるわけではなく、他の調製方法でもよい。また、第１の分注溶液は、検出基板の凹部への分注直前に調製することも可能であり、分注の数日〜数時間前に、予め調製することも可能である。この第１の分注溶液としての保存期間は、検出対象物の安定性等に応じて選択することが好適である。また、少なくとも分注時には、第１の分注溶液は液状であることが必要である。さらに、検出対象物を添加後は、検出対象物が変性を起こす温度とすることは好適ではない。
【００６１】
（５）検出方法
本検出方法は、液状の第１の分注溶液を、上述した検出用器具の凹部毎に、用手法も可能であるが、好適には微量分注機（インクジェット型の微量分注機等）を用いて注入し、凹部中の第１の分注溶液を、乾燥処理（保持物質が徐溶解性物質の場合、若しくは、保持物質を用いない場合に好適である）または冷却処理（室温放置を含む：保持物質が温度応答性物質の場合に好適である）等により、検出用器具の凹部に付着させた後、この第１の分注溶液中の検出対象物に対する反応物質を含有する反応溶液を、前記の第１の分注溶液の付着処理を行った凹部の内壁に接触させ、温度上昇または下降［上述したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、温度上昇により固化し、温度下降により液化する性質がある。よって、これを温度応答物質として用いる場合には、第１の分注時には液化温度まで分注溶液の温度を下げて、当該分注後に固化温度まで凹部の温度を上昇させつつ、反応溶液を接触させ、検出時に液化温度まで凹部の温度を下降させることが好適である］、放置等により溶解させることで検出対象物を遊離させ、発生するシグナルを検出することにより、検出対象物の評価を行うことができる。
【００６２】
なお、上記の凹部の壁面に付着させた第１の分注溶液と、反応溶液の接触態様として、反応溶液を、第１の分注溶液を付着させた後、基板面上に向けて、一様に反応溶液を上層することが、効率的であり好適である。
【００６３】
Ｂ．本検出用キット
本検出用キットは、下記のａ，ｂおよびｃを構成要素として含む、本検出方法を行うための検出用キットである。
【００６４】
ａ．温度応答性物質、および／または、徐溶解性物質。
ｂ．反応溶液、または、反応溶液の溶質。
ｃ．複数の凹部を有する検出用器具。
【００６５】
かかる構成の本検出用キットは、例えば、採取した検出対象物を、温度応答性物質、および／または、徐溶解性物質（保持物質）と、水等の溶媒の混合物の中に添加して、第１の分注溶液を調製して、この第１の分注溶液を、キット付属の検出用基板の凹部に分注して固化させ、上述した本検出方法の要領に従って、付属の反応溶液で検出反応を行い、検出対象物の評価を行うことができる。
【００６６】
本検出用キットには、他の必要な要素、例えば、上述した保持物質の溶解に用いる溶媒（精製水、２−プロパノール等）、検出対象物の保存剤、安定化剤等を含有させることが可能である。
【００６７】
本検出用キットを、インベーダー法を用いて使用する場合には、検出対象物を核酸として、かつ、反応溶液を、当該核酸に対するインベーダー反応を行うことができる溶液とすることになる。
【００６８】
【実施例】以下に、本発明をさらに具体的に説明するために、本発明の実施例を記載するが、本発明は、この実施例の内容に限定されるべきものではない。
【００６９】
検出用基板
上述した製造方法に従って、本発明に使用する検出用基板を作成した。その概略を第３図に示す。第３図に示した検出用基板は、ポリカーボネート製、高密度凹部で構成されたスライドである。この検出用基板は、２２ｘ７６ｘ１  （ｍｍ）のサイズのプラスチックスライド上に、開口部  ０．４５ｘ０．４５  （ｍｍ）、  深さ０．４５ｍｍの凹部を５０４０個設けたものである。凹部部は、上部全面の面積が２１  ｘ  ６０  （ｍｍ）であり、１  凹部の容量は４４−ｎｌである。また、凹部間は、上部が０．０５  ｍｍの隔壁で仕切られている。
【００７０】
各凹部への分注対象物の分注は、インクジェット型の微量分注機（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ社のｓｙｎＱＵＡＤＴＭ  ）を用いて行った。
【００７１】
適切なゼラチン濃度の決定
室温下で、第３図の検出用基板の各凹部に、ＧｅｎｏｍｅＤＮＡ，  ０．１％  ゼラチンを分注後、固化させ、基板面上から、１万倍希釈ＯｌｉＧｒｅｅｎ，  １％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を反応溶液として、一度に上層することで、当該反応溶液の分注を各凹部において行い、ＤＮＡ染色反応を実施した。反応時の基板面の状態を、第４図に示す。第４図において、％はゼラチン濃度である。ＤＮＡが分注された凹部（１，３，５列と、Ｈ２Ｏ，ゼラチン濃度が記載された行の交差した凹部）は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ染色されて強い蛍光を発しているのと共に、隣接凹部に蛍光の観察された凹部も認められた。
【００７２】
染色形状はＤＮＡに混在させたゼラチンの濃度によって異なっていた。すなわち、ＤＮＡが凹部内壁表面から溶液に溶け出さなかった凹部では、凹部内壁面に張り付いたＤＮＡが角張ったドーナツ形状で染色されているのに対し（０．０５％以上の濃度のゼラチンの入った凹部）、０．０２５％濃度以下の凹部ではＤＮＡが溶け出して、内壁以外の凹部内部でも蛍光シグナルが観察された他、分注凹部の隣接した凹部でも蛍光シグナルが観察された。なお、蛍光スキャナーはＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００（現在はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用した。焦点深度は、表面から０．１ｍｍであった。また、ヒトゲノムＤＮＡは、全て熱変性させたものであった。
【００７３】
このように０．０５％以上の濃度でゼラチンを混在させたゲノムＤＮＡでは、隣接凹部への影響を及ぼさずに、反応溶液の分注が可能であることがわかった。
【００７４】
本検出方法
第４図に示した結果を参考に、本検出方法を行った。すなわち、０．１％ゼラチンを共存させた、別個の遺伝子型を持つ５０ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡを、３種類、２０ｎｌずつ別々の凹部へ分注後、室温にてゼラチンを固化させ、第３図に示した方法の要領で、インベーダー試薬［酵素、プローブミックス（ＡＢＣＡ１遺伝子の−４４７Ｃ／Ｔ多型を判別するためのもの）、ＦＲＥＴ試薬、マグネシウム溶液が混入したもの］を一括して、基板上に上層して分注した。反応後、前記蛍光スキャナーを用いて解析を行った。
【００７５】
反応時の基板面の状態を、第５図に示す。第５図において、緑がＴのホモ接合体、赤がＣのホモ接合体、黄色がヘテロ接合体のゲノムＤＮＡを分注した凹部である（本図は、モノクロ像のため、カラーの参考図面を提出する用意あり）。お互いの試薬等の混合による判定不良は認められなかった。
【００７６】
このように、本検出方法を用いた、検出用基板での検出は、特別な機器を必要とせず、分注時の吐出口先端を１凹部毎に微妙に位置調整する必要がなく、分注量は凹部容量を全量満たす方式のため誤差が少なく、迅速、簡便、安価な方法であることが判明した。
【００７７】
【発明の効果】
本発明により、気泡が微小凹部内に形成される懸念なく、効率的に、マイクロアレイ等の検出基板における液相反応を行う手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】検出用基板についての概略を示した図面である。
【図２】インベーダー・アッセイ法の概略を示した図面である。
【図３】実施例で用いた検出用基板についての概略を示した図面である。
【図４】本検出方法の予備試験の結果を表す、基板面像を示した図面である。
【図５】本検出方法の有用性を表す、基板面像を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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