(57)【要約】【課題】グリーンな香りをもつ生成物を取得するための新規な方法、それにより得られた生成物およびそれを用いたアルコール飲料の提供。【解決手段】培地中において不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物の取得方法、その生成物およびそれを含有するアルコール飲料。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中において不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法。
【請求項２】
培地中において不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させた後、アルコールによる抽出および蒸留を行うことを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸が多不飽和脂肪酸である請求項１または２記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法。
【請求項４】
前記リポキシゲナーゼがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（麹かび）由来のものである請求項１〜３いずれか記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法。
【請求項５】
前記培地が、アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属の水溶性塩を含有するものである請求項１〜４いずれか記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法。
【請求項６】
ヘキサナール、ヘキセナール、２，４−ヘプタジエナールおよび２，６−ノナジエナールを含有している請求項１〜５いずれか記載の方法により得られたグリーンな香りをもつ生成物。
【請求項７】
ヘキサナール５７〜６７重量％、ヘキセナール２１〜３１重量％、２，４−ヘプタジエナール２〜６重量％、２，６−ノナジエナール５〜１１重量％の割合でヘキサナール、ヘキセナール、２，４−ヘプタジエナールおよび２，６−ノナジエナールを含有していることを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物。
【請求項８】
さらに、３，５−オクタジェン−２−オンを含有するものである請求項６または７記載のグリーンな香りをもつ生成物。
【請求項９】
請求項１〜８記載のグリーンな香りをもつ生成物をアルコール飲料に添加して得られたアルコール飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリーンな香りをもつ生成物、その取得方法およびそれを含有するアルコール飲料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蒸留酒製造において、ウイスキーに含まれるグリーンな香りが非常に重視されてきている。その理由は、個性のあるモルトウイスキーを組み合せて商品ができているからである（既存の商品にもグリーンな香りは含まれている）。またグリーンな香りは複数の成分が組み合わさってかもし出されている。
【０００３】
非特許文献１によれば、ウイスキーにはグリーンな香りが含まれていることはわかっていたが、その含有量が微量であるため、その分析方法を研究してモルトウイスキーＡ、ＢおよびＣ中に含まれるグリーンな香りの成分としてＥ，Ｚ−２，６−ノナジエナール、ノナン−２−オール、４−ヘプテン−１−オール、Ｅ−２−ノナネール、１−オクテン−３−オールが０．０１〜０．１８ｍｇ／リットルの範囲で含まれていたことを報じており、非特許文献２には、かき（ｏｙｓｔｅｒ）中に含まれている（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナールは、グリーンでマッシュルーム的香りをもち、閾値は非常に低い旨報じでおり、非特許文献３ではサワークリーム、バターミルクの製造工程中における前記Ｅ，Ｚ−２，６−ノナジエナールの生成について検討しており、非特許文献４では、Ｅ，Ｚ−２，６−ノナジエナール（不飽和Ｃ９−アルデヒド）の起源、化学的および生物学的特性、合成法などについて報じでいる。
【０００４】
特許文献１では、生大豆を６０℃以下で磨砕し、これにリパーゼを添加し、空気または酸素の供給下に６０℃以下で撹拌することにより青臭香味物質を製造する方法を開示しており、そのなかで、従来青臭の主要成分は中級の脂肪族アルデヒド、アルコールであり、その具体例としてｎ−ヘキサナール、ｎ−ヘキサノール、ヘキセン−３−オールを例示したうえで、この発明方法の実施例により特許文献１の発明の青臭香味物質の主体はｎ−ヘキサナールであると解析している。
【０００５】
特許文献２では、リポキシゲナーゼおよびヒドロぺルオキシド−リアーゼの供給源と、不飽和脂肪酸の天然供給源にリパーゼを作用させて脂肪酸を生じさせ、この酵素の働きによって、グリーンな香りを効率的に生成する方法を開示している。
【０００６】
また、特許文献３では、オイゲノールやサフロールなどの前駆物質に、植物または動物由来のリポキシゲナーゼを作用させて、バニリン、ベンズアルデヒド、アニスアルデヒド、パラ−ヒドロキシベンズアルデヒド、ヘリオトロピン、プロトカテクニックアルデヒドなどの芳香族物質を製造する方法を開示している。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭６２−１３０６６１号公報
【特許文献２】
特表平８−５０４０８４号公報
【特許文献３】
特許第３２４２１１１号公報
【非特許文献１】
Ｆｌａｖｏｕｒ  Ｆｒａｇｒ．Ｊ．  ２００２年  第１７巻  ２０７〜２１１頁
【非特許文献２】
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．  ２０００年  第４８巻  Ｎｏ．１０  ４８５１〜４８５７頁
【非特許文献３】
Ｉｎｔ．Ｄａｉｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９７年  第７巻  ６６７〜６７４頁
【非特許文献４】
Ｐｅｒｆｕｍｅｒ＆Ｆｌａｖｏｒｉｓｔ  １９９３年  第１８巻、９月／１０月号  ２３〜２５頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、グリーンな香りをもつ生成物を取得するための新規な方法、それにより得られた生成物およびそれを用いたアルコール飲料例えば蒸留酒に関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、培地中において不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させることを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法に関する。
本発明の第２は、培地中において不飽和脂肪酸にリポキシゲナーゼを作用させた後、アルコール（好ましくはエチルアルコール）による抽出および蒸留を行うことを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法に関する。
本発明の第３は、前記不飽和脂肪酸が多不飽和脂肪酸である請求項１または２記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法に関する。
本発明の第４は、前記リポキシゲナーゼがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（麹かび）由来のものである請求項１〜３いずれか記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法に関する。
本発明の第５は、前記培地が、アルカリ金属および／またはアルカリ土類金属の水溶性塩を含有するものである請求項１〜４いずれか記載のグリーンな香りをもつ生成物を取得する方法に関する。
本発明の第６は、ヘキサナール、ヘキセナール、２，４−ヘプタジエナールおよび２，６−ノナジエナールを含有している請求項１〜５いずれか記載の方法により得られたグリーンな香りをもつ生成物に関する。
本発明の第７は、ヘキサナール５７〜６７重量％、ヘキセナール２１〜３１重量％、２，４−ヘプタジエナール２〜６重量％、２，６−ノナジエナール５〜１１重量％の割合でヘキサナール、ヘキセナール、２，４−ヘプタジエナールおよび２，６−ノナジエナールを含有していることを特徴とするグリーンな香りをもつ生成物に関する。
本発明の第８は、さらに、３，５−オクタジェン−２−オンを含有するものである請求項６または７記載のグリーンな香りをもつ生成物に関する。
本発明の第９は、請求項１〜８記載のグリーンな香りをもつ生成物をアルコール飲料に添加して得られたアルコール飲料に関する。
【００１０】
本発明で用いる不飽和脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸でもよいが、多不飽和脂肪酸の方が好ましい。３つの不飽和基をもつ脂肪酸としてはシス−９，トランス−１１，トランス−１３−オクタデカトリエン酸（α−エレオステアリン酸）、トランス−９，トランス−１１，トランス−１３−オクタデカトリエン酸（β−エレオステアリン酸）、シス−９，シス−１１，トランス−１３−オクタデカトリエン酸、シス−９，シス−１２，シス−１５−オクタデカトリエン酸（リノレン酸）、トランス−９，トランス−１２，トランス−１５−オクタデカトリエン酸（リノレンエライジン酸）、トランス−１０，トランス−１２，トランス−１４−オクタデカトリエン酸（プソイドエレオステアリン酸）などがあり、４つ以上の不飽和基をもつ脂肪酸としては、９，１１，１３，１５−オクタデカテトラエン酸（α−パリナリン酸）、９，１１，１３，１５−オクタデカテトラエン酸（β−パリナリン酸）、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラギドン酸）、４，８，１２，１５，１９−ドコサペンタエン酸（グルバノドン酸）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、５，８，１１，１４，１７−ドコサへキサンエン酸（ＤＨＡ）などがあり、２つの不飽和基をもつ脂肪酸としては２，４−ヘキサジエン酸（ソルビン酸）、トランス−８，トランス−１０−オクタデカジエン酸、シス−９，シス−１２−オクタデカジエン酸（リノール酸）、トランス−９，トランス−１２−オクタデカジエン酸（リノライジン酸）、シス−９，トランス−１１−オクタデカジエン酸、トランス−１０，シス−１２−オクタデカジエン酸、シス−９，シス−１１−オクタデカジエン酸、シス−１０，シス−１２−オクタデカジエン酸、トランス−１０，トランス−１２−オクタデカジエン酸、トランス−９，トランス−１１−オクタデカジエン酸、トランス−８，トランス−１０−オクタデカジエン酸、２，２−ジメチル−シス−９，シス−１２−オクタデカジエン酸、１２，２０−ヘンエイコサジエン酸、９，１３−ドコサジエン酸、２，２−ジメチル−シス−１１，シス−１４−エイコサジエン酸、９，１５−テトラコサジエン酸などを挙げることができる。
【００１１】
本発明では、前記多不飽和脂肪酸そのものを原料とすることもできるが、前記多不飽和脂肪酸を多く含有する酵母を原料とすることもできる。例えばリノレン酸を多く含有する酵母としては、キャンディダ属酵母、ピキア属酵母、クリべロミセス属酵母などを挙げることができる。
また、不飽和脂肪酸を多く含むアマニ油、シソ油、ローズヒップ油などの植物油、ピーナッツ、ヒマワリなどの種子も原料として使用することができる。
【００１２】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（麹かび）の分生子の色により、黒麹菌、黄麹菌などと呼ぶことがあるが、いずれも使用可能である。
【００１３】
水溶性塩を形成するアルカリ金属やアルカリ土類金属としては、Ｎａがもっとも汎用的であるが、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎなどを使用できる。それぞれ単独で使用してもよいし、併用してもよい。例えばＮａに少量のＫ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎなどを１種または複数種併用してもよい。
これら金属の塩としては、塩酸塩がもっとも一般的であるが、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩などを用いてもよいし、勿論多種併用であってもよい。
【００１４】
培地の添加する前記水溶性塩は、その濃度を調節することにより、グリーンの香りの発生する成分の量を非常に高めることができる。たとえば、水溶性塩としてＮａＣｌを用いた場合には、下記表に示すような結果が得られた。
【００１５】
【表１】
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なお、このときの培地は、Ｄｉｆｃｏ社製  Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地であり、その組成はＮａＮＯ３：０．３ｗｔ％、Ｋ２ＨＰＯ４：０．１ｗｔ％、ＫＣｌ：０．０５ｗｔ％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５ｗｔ％、ＦｅＳＯ４：０．００１ｗｔ％、サッカロース（ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）：３ｗｔ％、水：残、よりなるものである。
【００１６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
使用する菌株は、出願人の酒類総合研究所に保存してあるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（麹かび）約２５０株の中から、ＮＲＩＢ４０、ＮＲＩＢ１２８（以上Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、ＮＲＩＢ９１０、ＮＲＩＢ９１９（以上Ａ．ｓｏｊａｅ）、ＮＲＩＢ２８０４（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、ＩＦＯ４３０８（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、ＮＲＩＢ２００４（Ａ．ｕｓａｍｉｉ）、ＮＲＩＢ２５０１（Ａ．ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉｉ）の計８株を選択した。
【００１７】
使用する培地は
（イ）Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）
ＮａＮＯ３：０．３ｗｔ％、Ｋ２ＨＰＯ４：０．１ｗｔ％、ＫＣｌ：０．０５ｗｔ％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０５ｗｔ％、ＦｅＳＯ４：０．００１ｗｔ％、サッカロース：３ｗｔ％、水：残
（ロ）ＤＰＹ培地
デキストリン：２ｗｔ％、ポリペプトン：１ｗｔ％、酵母エキス：０．５ｗｔ％、ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｗｔ％、ＭｇＳＯ４：０．０５ｗｔ％、水：残
【００１８】
（脂肪酸減少率の測定）
図１に示すように、各培地に菌体を植菌し、３０℃で６日間振とう培養し、培養液を図２に示すようにＧ３のガラスフィルターで濾過し、残渣を滅菌水で洗浄した後、滅菌した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に加えて懸濁させたものを菌体サンプルとした。
前記濾過により得られた濾液を、さらに０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過し、これを培養上清サンプルとした。
図３に示すように菌体サンプルや、培養上清サンプルのいずれでもよいが、いずれかの３ｍｌをスクリューキャップ付試験管にとり、エタノールにリノレン酸を加えて１００００ｐｐｍの濃度とした溶液を前記試験管に加え、試験管中のリノレン酸の最終濃度が１００ｐｐｍとなるように調製した。この試験管を３０℃で１〜１９時間振とうした。振とう操作中にリノレン酸が他の化学物質に変換され、その一部が更に変換されることによりグリーンな香りが生成する。
振とう操作中のリノレン酸減少率の測定は以下のように行った。図４に示すように、まず反応液中のリノレン酸を測定する。すなわち、所定時間振とうした反応液３ｍｌを含むスクリューキャップ付試験管に、内部標準としてエタノールに溶解した１００００ｐｐｍのエラルゴン酸溶液０．０３ｍｌを添加した後、濃塩酸を添加しｐＨを３．０以下にし、酢酸エチル：メタノール（９：１）３ｍｌを添加し、１０分間振とう抽出した。抽出後の溶媒層を他の試験管に取り出し、残った水層に再度酢酸エチル：メタノール（９：１）３ｍｌを添加して１０分間振とうした。溶媒層を前記試験管中の溶媒層に加えて混合し、無水硫酸ナトリウムにより脱水し、得られた抽出成分含有溶媒層をＧＣ分析によりそのリノレン酸を定量した。これにより得られたリノレン酸の値をＡとした。
一方、図５に示すように、リノレン酸定量のために標準品（菌体を添加しないのでグリーンな香りを生成しない場合）を作製するために、前記菌体サンプルまたは培養上清サンプルの代わりに蒸留水３ｍｌをスクリューキャップ付試験管に加えて、上記サンプルの場合と同様の操作を行い、これを標準品とし、これをＧＣ分析によりリノレン酸の定量値Ｂとした。
上記のようにして得られたデータより、リノレン酸減少率は（１−Ａ／Ｂ）×１００（％）として算出した。
【００１９】
リノレン酸定量のためのＧＣ分析条件は以下の通りである。ヒューレット・パッカード社製（現在はアジレント社）ＧＣ５８９０を使用した。使用カラムはアジレント社製、ＩＮＮＯＷＡＸを用いた。カラム内径は０．２５ｍｍ。カラム長は２５ｍ。膜厚は０．２５μｍ。昇温条件について述べると、カラムの温度は５０℃からスタートし、１０℃／ｍｉｎの割合で昇温し、２３０℃に適したとき、その温度で、３２分間保った。ついでカラム内に前記抽出成分含有溶媒２μｌを注入した。インジェクション、ディテクター（ＦＩＤ）温度は共に２５０℃とした。
グリーン香定量のためのＧＣ／ＭＳ及びＧＣ−Ｏｌｆａｃｔｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ／Ｏ）分析は以下のように行った。すなわち、図３に示す操作をスケールアップし、前記培養上清サンプル１００ｍｌに前記濃度のリノレン酸１ｍｌを添加し、グリーンな香りを生成させた。反応終了後、９９．５％エタノールを１０ｍｌ添加し（最終濃度約１０％となるように）、ガラス製蒸留機を用い、常圧蒸留を行い７０ｍｌ回収した。ＯＡＳＩＳカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出し、２ｍｌのジクロロメタンにて溶出させた。無水硫酸ナトリウムにより脱水し、窒素ガスで約３００μｌに濃縮した。ＧＣ／ＭＳ分析条件は以下の通りである。アジレント社製ＧＣ６８９０Ｎにアジレント社製質量検出器５９７３を連結したものを使用した。使用カラムはＤＢ−Ｗａｘ（アジレント社製）、カラム内径は０．２５ｍｍ、カラム長は３０ｍ、膜厚は０．２５μｍを使用した。カラム内流速は１ｍｌ／ｍｉｎ．とした。昇温条件は４０℃、１分間、３℃／ｍｉｎ、２３０℃、１０分間で行った。フロントインレットは２３０℃とした。１μｌをスプリットレス注入した。ＧＣ／Ｏ分析条件は以下の通り。アジレント社製ＧＣ６８９０Ｎを使用し、検出器側にて分岐を行い片方にスニッフィングポートを、片方に質量検出器５９７３（アジレント社製）を連結させた。使用カラムはＤＢ−Ｗａｘ（アジレント社製）、カラム内径は０．３２ｍｍ、カラム長は１５ｍ、膜厚は０．２５μｍを使用した。加温条件は３０℃で２分間保った後、１分間に５℃づつ昇温し、２２０℃になったとき、この温度で２２分間保った。フロントインレットは２３０℃とした。１μｌをスプリットレス注入した。
【００２０】
培地の違いによる添加リノレン酸減少率比較
まずＮＲＩＢ４０株を用い、培地の違いによる添加リノレン酸の減少率を調べた。その結果を図６に示す。ＤＰＹ培地は栄養リッチであり増殖も早かったが添加リノレン酸の減少率は３０％と低かった。わずかながら、グリーンな香りは生成していた。Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地は糸状菌の最小培地であるが、栄養分が少なすぎるのか、増殖が極端に悪く、添加リノレン酸の減少率も３０％と低かった。Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地に０．５％ＮａＣｌを含有する培地（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ＋ＮａＣｌ）の場合、ＤＰＹ培地ほどではないが増殖がかなり早くなり、添加リノレン酸の減少率は約９０％と一番高かった。グリーンな香りもより多く生成していた。Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地に２％カザミノ酸を含有する培地（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ＋カザミノ酸）の場合、栄養リッチであり増殖もＤＰＹと同等となったが、添加リノレン酸の減少率は１０％と一番低かった。栄養がリッチとなると添加リノレン酸の減少率が低くなり、最小限の栄養素（糖とミネラル）でよいと推測された。酵素の精製という点を考慮するとＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ＋ＮａＣｌ培地はタンパクを含有しないことから有利であろうと考慮して、この培地を使用して実験を進めた。
【００２１】
各菌株による添加リノレン酸減少率比較
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ＋ＮａＣｌ培地を用いて、選択した菌株ＮＲＩＢ４０、ＮＲＩＢ１２８、ＮＲＩＢ９１０、ＮＲＩＢ９１９、ＮＲＩＢ２８０４、ＩＦＯ４３０８、ＮＲＩＢ２００４、ＮＲＩＢ２５０１の８種の菌株をそれぞれ培養し、培養上清中の添加リノレン酸減少率を比較した。その結果を図７に示す。Ａ．ｏｒｙｚａｅの２株はどちらも添加したリノレン酸を５０％以上減少させた。それ以外の株については、Ａ．ｓｏｊａｅの一株を除いて、リノレン酸をまったく減少させなかった。Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ＋ＮａＣｌ培地での増殖に問題なかったのにリノレン酸を減少させない株も存在した。今後、菌株のスクリーニングを行うのであれば、まずはＡ．ｏｒｙｚａｅを中心に進めたほうがよりよい株を選択できる可能性が高いと予想される。一番リノレン酸を減少させたのはＮＲＩＢ４０株（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）であったため、以降はこの株を用いて実験を進めた。
【００２２】
グリーン香気成分の推定（ＧＣ／ＭＳ分析、ＧＣ／Ｏ分析）
添加リノレン酸の減少とグリーンな香りの生成には時間的に差がある。図８に示すように、添加リノレン酸の減少は４時間程度で終了するのに対して、グリーン香の生成は４時間でも若干生成するが、一晩程度反応を行った方がよりグリーンな感じが強くなった。リポキシゲナーゼ反応以降の段階で時間を要すると推測される。
一晩反応させたグリーンな香りを持つ溶液を、蒸留、固相抽出することによりグリーンな香りを回収した。これをＧＣ／Ｏ解析したところ、グリーンな香りをもつリテンションタイムの異なる５成分のピークを認めることができた。ＧＣ／Ｏ解析により認められた５成分について、各成分のＧＣ／Ｏ解析のリテンションインデックスをＧＣ／ＭＳのリテンションタイムに変換し、それらのリテンションタイムに検出されるピーク成分をＧＣ／ＭＳ解析することにより、グリーン香成分を同定した。すなわち、前記培養上清サンプル１００ｍｌに前記濃度のリノレン酸１ｍｌを添加し、グリーンな香りをもつ溶液、すなわちグリーン溶液を得た。反応終了後、９９．５％純度のエタノールを１０ｍｌ添加し（最終濃度約１０％となるように）、ガラス製蒸留機を用い、常圧蒸留を行い７０ｍｌ回収した。ＯＡＳＩＳカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出し、２ｍｌのジクロロメタンにて溶出させた。無水硫酸ナトリウムにより脱水し、窒素ガスで１０倍濃縮した。これにより当初のグリーン溶液からみると５００倍濃縮されたことになる。これを使用カラムＤＢ−Ｗａｘ、０．２５ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、昇温は４０℃、１分間、３℃／ｍｉｎ、２３０℃、１０分間、フロントインレットは２３０℃で行い、１μｌをスプリットレス注入することにより、ＧＣ／ＭＳ分析を行った。
ライブラリー“ＷＩＬＥＹ”中のデータベースと今回ＧＣ／ＭＳ解析により得られた各ピークのマススペクトルデータを比較し、また標準物質が入手できるもの〔ｎ−ヘキサナール、（Ｅ）−ヘキセナール、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〕はそれらのリテンションタイムとマススペクトルを比較することによりどのピークが何の物質であるか同定した。その結果、図９に示すように、リテンションタイム５．９５のマススペクトルがｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）、リテンションタイム１０．０７のマススペクトルが（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕、リテンションタイム２０．７７のマススペクトルが（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕、リテンションタイム２１．９２のマススペクトルが（Ｅ，Ｅ）−３，５−オクタジエン−２−オン〔（Ｅ，Ｅ）−３，５−ｏｃｔａｄｉｅｎ−２−ｏｎｅ〕、リテンションタイム２４．４２のマススペクトルが（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕であり、各成分の時間的なずれは０．１分以内であった。
なお、マススペクトルとは化合物が分解していくときの分子量を示す。つまりとある物質が分解するときには最初Ａという分子量であったが、次に分解されてＡより小さい分子量Ｂとなり、次にＢより小さいＣとなる。このような分解されていくときの分子量の変換パターンには規則性があり、このパターンを比較することにより物質名が推測される。これらのマススペクトルのパターンをまとめたものがライブラリーと呼ばれる。今回用いているのは“ＷＩＬＥＹ”という名のライブラリーである。“ＷＩＬＥＹ”の中のマススペクトルデータと今回ＧＣ／ＭＳ解析により得られた各ピークのマススペクトルデータを比較することにより物質を特定している。比較はもちろんコンピューターのソフトで行い、一般的にはＭａｔｃｈ  ｑｕａｌｉｔｙという数値（％）で表される。７０％以上で同定と言われるが、すべて９０％以上であった。
【００２３】
定量分析の結果、（ａ）ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は９３８ｐｐｂ、（ｂ）（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は３８６ｐｐｂ、（ｃ）（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は６５ｐｐｂ、（ｄ）（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は１２６ｐｐｂ含有されていることが判ったが、３，５−オクタジエン−２−オン（３，５−ｏｃｔａｄｉｅｎ−２−ｏｎｅ）は標準物質が入手できず、定量できなかった。定量できた（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）の４成分の合計量に対する各成分の占める割合は、（ａ）６１．９ｗｔ％、（ｂ）２５．５ｗｔ％、（ｃ）４．３ｗｔ％、（ｄ）８．３ｗｔ％であった。
【００２４】
＜グリーン溶液を添加したウイスキー、焼酎の作成＞
この実験で使用したグリーン溶液中にはｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は５７７ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は３００ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は３４ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は３６ｐｐｂ含有していた。この溶液１００ｍｌに原料用アルコール（アルコール度数９５．６％）を１０ｍｌ添加し、ガラス製の蒸留機により常圧蒸留を行った。蒸留液を１０ｍｌずつ回収したが、最初の１０ｍｌにグリーンな香りが強く感じられたのでこの部分（グリーン香蒸留物）を焼酎またはウイスキーに添加した。単純に成分が１０倍になっていたとすると、ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は５７７０ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は３０００ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は３４０ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は３６０ｐｐｂ含有していることになる。ウイスキーまたは焼酎に１／１００量添加した場合、ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は５７．７ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は３０．０ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は３．４ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は３．６ｐｐｂ含有し、１／２００量添加した場合、ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は２８．９ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は１５ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は１．７ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は１．８ｐｐｂ含有し、１／４００量添加した場合、ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は１４．５ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は７．５ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は０．９ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は０．９ｐｐｂ含有し、１／８００量添加した場合、ｎ−ヘキサナール（ｎ−ｈｅｘａｎａｌ）は７．３ｐｐｂ、（Ｅ）−ヘキセナール〔（Ｅ）−ｈｅｘｅｎａｌ〕は３．８ｐｐｂ、（Ｅ，Ｅ）−２，４−ヘプタジエナール〔（Ｅ，Ｅ）−２，４−ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｌ〕は０．５ｐｐｂ、（Ｅ，Ｚ）−２，６−ノナジエナール〔（Ｅ，Ｚ）−２，６−ｎｏｎａｄｉｅｎａｌ〕は０．５ｐｐｂ含有していることになる。
【００２５】
＜グリーン溶液添加ウイスキーまたは焼酎の官能評価＞
蒸留酒の専門パネラー５名に、上述のグリーン香蒸留物を添加した市販の焼酎〔アサヒ協和（株）製造品、商品名「玄海」〕、ウイスキー〔ニッカウヰスキー（株）製造品、商品名「ブラッククリアブレンド」〕の官能評価を行った。下記表のように悪いを１点、普通を３点、よいを５点として全体評価を行った。またその際の味および香気に関するコメントも載せた。グリーンな香り以外に興味深い意見として、香味が味に変化を及ぼすという点であった。グリーンな香気が感じられると、味が甘く、スーと伸びる感じとなるように感じられ、味が良くなるという点で長所をもつと思われた。また、ウイスキーにおいては味・香りのバランスが非常に重要であるが、明らかにグリーンな香気が感じられなくても、味も含めて効果があると言える。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
＜市販麦焼酎（商品名「玄海」）に前記グリーン香蒸留物を添加した場合の官能検査結果＞
【表３】
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結果が示すように、１／４００量添加時が最も効果があると思われた。１／１００量添加では、香りが強すぎる傾向があり、好ましくなく、１／８００量添加では余り差は認められなかった。
【００２８】
＜市販ウィスキー（商品名「ブラッククリアブレンド」）に前記グリーン香蒸留物を添加した場合の官能検査結果＞
【表４】
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【００２９】
結果に示されるように、グリーンな個性的なタイプのウィスキーという点においては１／２００量添加が一番イメージに合うものであった。また、全体のバランスが保たれており、グリーンな香りと味わいが適度にバランスしているという点では、１／４００量添加および１／８００量添加時が好ましい結果を示した。ウィスキーに添加した結果が焼酎に添加した場合と異なっているのは、ベースとなる蒸留酒に含まれる香気成分が異なっているためであると考えられる。すなわち、ウィスキーには焼酎に含まれるよりも多くの複雑な香気成分が含まれていることを示していると思われる。
【００３０】
以上の結果から、焼酎にグリーン香蒸留物を添加するときの好ましい添加量は、１／１５０乃至１／６００、ウィスキーにグリーン香蒸留物を添加するときの好ましい添加量は、１／１５０乃至１／９００であると考えられる。
【００３１】
【発明の効果】
（１）本発明により、グリーンな香りをもつ生成物を取得するための新しい方法を提供するとともにそれにより得られた新規なグリーンな香りをもつ生成物を提供できた。
（２）この新規なグリーンな香りをもつアルコール性生成物をアルコール飲料に適量添加すると、アルコール飲料の香りのみならず、味も改良することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】菌体の培養を説明するためのモデル図である。
【図２】培養後、濾過により菌体と培養液を分離する工程を示すモデル図である。
【図３】グリーンな香りの生成工程を示すモデル図である。
【図４】ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析による添加したリノレン酸の定量における第１工程であるグリーンな香り生成後に残っているリノレン酸の定量を示すモデル図である。
【図５】ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析による添加したリノレン酸の定量における第２工程であるリノレン酸の定量のための標準品の作製工程を示すモデル図である。
【図６】各培地により、添加したリノレン酸がどれだけ分解したかを示すグラフである。
【図７】特定培地中で、いろいろの菌株により添加したリノレン酸がどれだけ分解したかを示すグラフである。
【図８】リノレン酸の減少速度とグリーンな香りの発生の程度との関係を示すグラフである。
【図９】実施例におけるグリーンな香りをもつ生成物のＧＣ／ＭＳの解析図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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