(57)【要約】【課題】リン酸化された被捕捉物の検出が、安全かつ高感度で、迅速高効率に検出結果を得る事ができる方法を提供すること。【解決手段】基板の表面に生体由来物を捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである被捕捉物を特異的に捕捉し、該被捕捉物のリン酸化の有無を識別するリン酸化蛋白質の検出方法であり、好ましくは捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含み、捕捉物である蛋白質が抗体であるリン酸化蛋白質の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の表面に生体由来物を捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである被捕捉物を特異的に捕捉し、該被捕捉物のリン酸化の有無を識別するリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項２】
捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む請求項１記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項３】
捕捉物である蛋白質が抗体である請求項２記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項４】
被捕捉物と抗リン酸化蛋白質抗体を相互作用させる請求項１、２又は３いずれか記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項５】
抗リン酸化蛋白質抗体が抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、又は抗リン酸化チロシン抗体の何れかである請求項４記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項６】
抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されている請求項４又は５記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【請求項７】
ビオチン標識された抗リン酸化蛋白質抗体と蛍光標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる請求項６記載のリン酸化蛋白質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的に蛋白質或いはペプチドを捕捉する物質を用いて、リン酸化された蛋白質或いはペプチドを捕捉する検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質のリン酸化は細胞の分化、増殖、細胞死に至るまでさまざまな細胞活動に関与している。これまで、リン酸化に対する研究は、ある特定の蛋白質に焦点を当てたピンポイント型の研究であった。しかし、蛋白質のリン酸化によって調節されている生命現象の全体像を知るためには、もっと多くのリン酸化情報が必要である。網羅的解析手段の一つであるＤＮＡマイクロアレイでは一度に大量の情報を得ることができるが、蛋白質のリン酸化のような、翻訳後修飾された蛋白質については調べられない。
【０００３】
細胞内の蛋白質のリン酸化を検出する方法としてよく用いられているのが、[32Ｐ]正リン酸による細胞の標識である。該方法は非常に重要な知見が比較的簡単に得られるが、被爆、汚染の恐れがあり、ラジオアイソトープの基本的な性質を理解した上で実験に臨む必要があり注意が必要である。
【０００４】
その他、アイソトープを用いた手法としては標識したサンプルを電気泳動法で直接分離して[32Ｐ]リン酸を取り込んだ蛋白質をオートグラフィーなどで検出する方法があるが、測定に１〜２日を要する。
【０００５】
アイソトープを用いない手法としては抗体、或いは酵素を用いて、上述同様に電気泳動法でサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に転写するウエスタンブロッティング法があるが、測定に２〜３日を要する。
【非特許文献１】「プロテオミクス」、現代化学増刊42、24−30(2002)
【非特許文献２】「タンパク質実験ノート下巻」、105−117(1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、基板の表面に生体由来物を捕捉する物質（以下、捕捉物）が固定されており、該捕捉物との相互作用により蛋白質或いはペプチド（以下、被捕捉物と略す）を特異的に捕捉する検出方法であり、リン酸化された被捕捉物の検出が可能で安全かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）基板の表面に生体由来物を捕捉する物質である捕捉物を固定し、該捕捉物との相互作用により蛋白質又はペプチドである被捕捉物を特異的に捕捉し、該被捕捉物のリン酸化の有無を識別するリン酸化蛋白質の検出方法、
（２）  捕捉物が蛋白質、ペプチド、又は核酸の何れか一つを含む（１）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（３）  捕捉物である蛋白質が抗体である（２）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（４）  被捕捉物と抗リン酸化蛋白質抗体を相互作用させる（１）、（２）又は（３）いずれか記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（５）  抗リン酸化蛋白質抗体が抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、又は抗リン酸化チロシン抗体の何れかである（４）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（６）  抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されている（４）又は（５）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
（７）  ビオチン標識された抗リン酸化蛋白質抗体と蛍光標識されたアビジン又はストレプトアビジンと結合させる（６）記載のリン酸化蛋白質の検出方法、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法に従うと、リン酸化された被捕捉物の検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）に検出結果を得る事ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に使用する検出方法は、固相基板表面の一部に捕捉物が固定化され、リン酸化された被捕捉物の検出ができることを特徴とする。
本発明の検出方法は、基板作製工程、基板表面修飾工程、捕捉物固定工程、ブロッキング工程、捕捉物／被捕捉物相互作用工程及び検出工程を含む。
基板表面処理工程は省いても使用可能であるが、より強固に捕捉物を固定化する為に用いる事が好ましい。
【００１０】
（基板の素材）
基板の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基板の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。たとえばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリペンテン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、飽和環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等をさす。
【００１１】
（基板の表面修飾）
本発明に使用する基板の表面修飾方法としては、種々の方法が用いられるが、アルデヒド基を導入すると捕捉物が基板上で共有結合し、より強固に固定されるので該基を導入することが好ましい。アルデヒド基の導入方法として好適に用いられるのは、アミノ基導入の後に多官能性アルデヒドを反応させる方法である。アミノ基の導入手段としては、アミノ基含有シランカップリング剤による処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられるが、処理の簡便性、均一性の観点から、アミノ基含有シランカップリング剤による処理が好ましい。多官能性アルデヒドとしてはグルタルアルデヒドが好ましい。
【００１２】
（捕捉物の固定化）
本発明に使用する捕捉物は、アルデヒド基との反応性を高めるため、予めアミノ基を導入しておくことが好ましい。捕捉物が核酸の場合は、アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。蛋白質、ポリペプチドの場合は、アミノ基を具備している為、アミノ基導入の必要性はない。固定化は通常、生理活性物質を溶解した溶液を基板上に点着した後、適宜処理を施すことにより行う。
【００１３】
（ブロッキング工程）
捕捉物を固定化し、該捕捉物と被捕捉物を相互作用させる前に基板表面上で捕捉物が固定化されていない部分と被捕捉物が非特異的に吸着するのを防止する事をブロッキングとよぶ。本発明でブロッキングに使用する物質はスキムミルク、アルブミン、抗体及び抗体のＦｃ部分よりなる群より選択された少なくとも１種であることが好ましい。これらの物質を純水或いはトリス酸緩衝液で０．１〜１０重量％に調製し、その溶液中に生理活性物質が固定化された基板を浸し、基板表面の官能基と１〜３時間反応させることにより行う。
【００１４】
（捕捉物／被捕捉物相互作用工程）
捕捉物が固定化され、ブロッキングが施された基板上に目的のリン酸化の有無を知りたい蛋白質即ち被捕捉物溶液を滴下する。
【００１５】
（検出工程）
上述、被捕捉物に蛍光標識物質を結合させてそれを検出器で検出しても構わないが、被捕捉物と蛍光標識物質が結合する際に被捕捉物が構造変化を起こし捕捉物と特異的に結合しない場合がある。
その為、被捕捉物と特異的に結合する抗リン酸化セリン抗体、抗リン酸化トレオニン抗体、抗リン酸化チロシン抗体などの抗リン酸化蛋白質抗体水溶液を被捕捉物と結合した捕捉物が固相化された基板上に滴下し、被捕捉物と該抗リン酸化蛋白質抗体と結合させる事が好ましい。
更に好ましくは該抗リン酸化蛋白質抗体がビオチン標識、蛍光標識、又は、ペルオキシダーゼ標識されているとよい。
蛍光標識されていればそのまま、蛍光量を測定でき、ペルオキシダーゼ標識されていれば基質を基板上に滴下する事により発色させその発色量を検出すればよい。
更にビオチン標識されていれば蛍光標識されたアビジン、又はストレプトアビジンと該ビオチン基が特異的に結合するので、結合させた後その蛍光量を検出すればよい。
【００１６】
被捕捉物と標識された抗リン酸化蛋白質抗体との反応性が低い場合は非標識の抗リン酸化蛋白質抗体を使用し、次工程でビオチン、蛍光、又は、ペルオキシダーゼなどの標識を施された該抗リン酸化蛋白質抗体と結合させた後、上述同様に検出してもよい。
【実施例】
【００１７】
（実施例１、２）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工した。表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。これを１％グルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより一次抗体、ＣＲＥＢ抗体をスポット後、室温４℃の環境下に２４時間静置した。その後、ブロッキングの為に５％濃度になるようにスキムミルクを溶解させた２５ｍＭのトリス緩衝溶液に該基板を浸し室温で２時間静置した。その後、リン酸化された抗原ＣＲＥＢとリン酸化されていない抗原ＣＲＥＢとをそれぞれ一次抗体と抗原抗体反応を実施した。その後、二次抗体としてビオチン標識された抗リン酸化セリン抗体と抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行い、その際のＳ／Ｎ比（Signal/noise ratio）を計算した。また、ブロッキング工程以降にかかった時間について計測した。結果を表１に示す。
【００１８】
（比較例）
実施例と同じ試料を使用して従来法であるウエスタンブロッティング法を実施した。蛍光強度はスポットの形状が異なる為、比較できなかったが抗原のリン酸化の有無による検出差は確認できた。但し、測定時間は４８時間を要した。
【００１９】
実施例における蛍光量の測定には、Packard BioChip Technologies社製バイオチップスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度７０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
【００２０】
【表１】
2005069788.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明のリン酸化蛋白質の検出方法は、検出が容易で安全、かつ高感度で迅速高効率（ハイスループット）であり、各種のリン酸化蛋白質の解析、分析に適用できる。