(57)【要約】【課題】  細胞内で局在する部位の違いによって細胞殺傷性あるいは細胞死防御性と異なる機能発現をもたらすペプチド、該ペプチドを有効成分とする細胞殺傷作用や細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬等を提供すること。【解決手段】  神経細胞型グルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＣ１）のＮ末端の１７アミノ酸からなるペプチドとホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）が結合することや、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドをミトコンドリア中に導入すると、ＨＣＣＳと特異的に結合してＨＣＣＳ活性を阻害するため、呼吸鎖が切断されて細胞殺傷性がもたらされることや、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを細胞質内に局在させると、細胞質中のＨＣＣＳと結合してフリーのＨＣＣＳが減少し、その結果ＨＣＣＳにより消費されたＸＩＡＰが消費され難くなるため、カスパーゼを介するアポトーシス防御性がもたらされることを見い出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；
【請求項２】
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されることを特徴とする請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
【請求項５】
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に、前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド。
【請求項８】
ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項７記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項９記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド。
【請求項１２】
請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項１３】
請求項９又は１０記載のＤＮＡを含み、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる形質転換体。
【請求項１５】
請求項１３記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる形質転換体。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを特異的に認識することができる抗体。
【請求項１７】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡ又は請求項９若しくは１０記載のＤＮＡが導入され、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを過剰に発現するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１９】
トランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１６記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターと被検物質とを被験非ヒト動物に投与し、細胞死防御活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞死防御活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド又は請求項１３記載の組換えベクターと被検物質とを被検物質を被験非ヒト動物に投与し、細胞殺傷活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞殺傷活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドからなるホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）不活化剤。
【請求項２３】
請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターからなる細胞死防御剤。
【請求項２４】
請求項２３記載の細胞死防御剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬。
【請求項２５】
細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２４記載の疾病の予防・治療薬。
【請求項２６】
請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド、又は請求項１３記載の組換えベクターからなる細胞殺傷剤。
【請求項２７】
請求項２６記載の細胞殺傷剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬。
【請求項２８】
細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項２７記載の疾病の予防・治療薬。
【請求項２９】
請求項２４記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法。
【請求項３０】
細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２９記載の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法。。
【請求項３１】
請求項２７記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法。
【請求項３２】
細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項３１記載の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞殺傷性と細胞死防御性とを併せもつ新規なペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドを有効成分とする細胞殺傷作用や細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは高等生物の細胞内に存在する細胞小器官であり、その内部にある酸化的リン酸化系を使って細胞の活動に必要なエネルギーの大部分を供給している。このミトコンドリア内には、核ＤＮＡとは独立したミトコンドリアＤＮＡが存在し、酸化的リン酸化系の酵素を構成する１３種のポリペプチドをコードしている。電子伝達系の酸化還元反応によって遊離されるエネルギーを用いて、ＡＤＰと無機リン酸からＡＴＰを合成する反応として知られる酸化的リン酸化の阻害剤には、電子伝達阻害剤（呼吸阻害剤）、エネルギー転移阻害剤（Ｈ+−ＡＴＰアーゼの阻害剤）、膜の透過性を高める脱共役剤の３種があり、呼吸阻害剤としては、ＫＣＮ，ＮＯ，ＮａＮ3，ＣＯなどのチトクロームオキシダーゼ阻害剤、アンチマイシンＡなどのチトクロームｂ−ｃ1間阻害剤、ＳＨ試薬などのコハク酸−ユビキノン間阻害剤、ロテノン，アミタールなどのＮＡＤ−ユビキノン間阻害剤が知られている。
【０００３】
ホロチトクロームC合成酵素（holocytochrome c synthetase；ＨＣＣＳ）は、ミトコンドリアでのＡＴＰ産生を担う呼吸鎖に必須の酵素であり、ミトコンドリア膜間に存在してホロチトクロームＣを合成する。上記のように、現在までに種々の酸化的リン酸化の阻害剤は知られているが、ＨＣＣＳに作用してその活性を抑制する分子は全く知られておらず、ＨＣＣＳをターゲットとしたＡＴＰ合成阻害およびそれに引き続く殺細胞効果を目的としたペプチドや阻害剤は全く知られていない。また、ＨＣＣＳはミトコンドリアに移行せず細胞質中に存在すると細胞毒性を持つが、このメカニズムについても全く不明であった。
【０００４】
その他、ミトコンドリアに所定のタンパク質を移行するためのシグナルペプチドとして、例えば、ヒトチトクロームＣ酸化酵素のサブユニットVIIIの移行シグナルペプチド（例えば、非特許文献１参照）、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチド（例えば、非特許文献２参照）等が知られており、これら移行シグナルペプチドをコードする塩基配列の３'側に所定のタンパク質をコードする塩基配列を結合し、この結合体を発現ベクターに組み込んで融合タンパク質発現用組換えベクターを構築して、細胞内に遺伝子導入することにより、ターゲットであるミトコンドリアに、かかる融合タンパク質を移行させることが可能となることも知られている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００２−１７６９８８号公報
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 264:10595-10600，1989
【非特許文献２】Science 224:1068-1074，1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、細胞内で局在する部位の違いによって細胞殺傷性あるいは細胞死防御性と異なる機能発現をもたらすペプチド、該ペプチドをコードするＤＮＡ、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物、該ペプチドを有効成分とする細胞殺傷作用や細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ヒトを含む脊髄動物の神経細胞型グルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＣ１／ＥＡＡＴ３：Excitatory Amino Acid Carrier 1、別称Excitatory Amino Acid Transporter 3）のＮ末端と結合するタンパク質を探索する目的で、ＥＡＡＣ１のＮ末端をベイトとしてマウスブレインライブラリー酵母ツーハイブリッドを行ったところ、ミトコンドリア膜間腔に存在する呼吸鎖関連蛋白ＨＣＣＳがＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸からなるペプチドフラグメントと特異的に結合することを見い出した。かかるＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドフラグメントをミトコンドリア中に導入すると、ＨＣＣＳと特異的に結合してＨＣＣＳ活性を阻害するため、呼吸鎖が切断されて細胞殺傷性がもたらされることを見い出した。すなわち、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドのＮ末に癌細胞特異的な取込みチャネルを認識するペプチドを付加することによって、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを複数の癌細胞に特異的に取込ませるデリバリーシステムを考案し、該システムを用いて癌細胞の生残率を有意に抑えられることを確認した。
【０００７】
また、細胞障害が生じたときには、ＨＣＣＳがミトコンドリアへ移行しなくなり、その際に見られる細胞毒性のメカニズムを明らかにした。すなわち、細胞質中に存在しカスパーゼを介したアポトーシスを抑制しているＸＩＡＰ（カスパーゼの阻害因子であるアポトーシス阻害タンパクファミリー）の機能をＨＣＣＳはＸＩＡＰに結合により阻害する。上記ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドフラグメントを細胞質内に局在させると、細胞質中のＨＣＣＳと結合してフリーのＨＣＣＳが減少し、その結果ＨＣＣＳにより消費されたＸＩＡＰが消費され難くなるため、カスパーゼを介する細胞死（アポトーシス）防御性がもたらされることを見い出した。すなわち、ＸＩＡＰ活性の保護作用を有するＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを細胞質に局在化させると、活性化型カスパーゼ３を示すバンドが薄くなることから、カスパーゼ３の活性が低下していることが示され、その結果ＥＡＡＣ１Ｎ末ペプチドは細胞質内に局在して細胞死防御分子として機能することを明らかにした。
【０００８】
以上のように、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドは、ミトコンドリア中に局在させると細胞殺傷性を、また細胞質中に局在させるとＸＩＡＰ活性の保護作用を有するため細胞死防御分子として機能することを見い出した。また、ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドのＮ末から９番目のＣｙｓのみをＡｌａに置換しただけで殺傷活性が大幅に低下することから、９番目付近のコンフォーメーションが殺傷活性に関わる創薬上重要な部位であることがわかった。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；（請求項１）や、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ該アミノ酸配列からなるペプチドがホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するアミノ酸配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１記載のペプチド（請求項２）や、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されることを特徴とする請求項２記載のペプチド（請求項３）や、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；（請求項４）や、（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；、又は、（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；が、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ（請求項５）や、Ｎ末から９番目にＣｙｓを有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列が、一般式：Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。）で表されるペプチドをコードする塩基配列であることを特徴とする請求項５記載のＤＮＡ（請求項６）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に、前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（請求項７）や、ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項７記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチドのＮ末端側に前記ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（請求項９）や、ペプチドをミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなるタンパク質導入ドメインであることを特徴とする請求項９記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（請求項１０）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合している融合ペプチド（請求項１１）や、請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡを含み、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる組換えベクター（請求項１２）や、請求項９又は１０記載のＤＮＡを含み、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる組換えベクター（請求項１３）や、請求項���２記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項１〜３のいずれか記載のペプチドを発現することができる形質転換体（請求項１４）、請求項１３記載の組換えベクターが導入され、かつ請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを発現することができる形質転換体（請求項１５）や、  請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを特異的に認識することができる抗体（請求項１６）や、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１６記載の抗体（請求項１７）や、請求項４〜６のいずれか記載のＤＮＡ又は請求項９若しくは１０記載のＤＮＡが導入され、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドを過剰に発現するトランスジェニック非ヒト動物（請求項１８）や、トランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１６記載のトランスジェニック非ヒト動物（請求項１９）に関する。
【００１０】
また本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターと被検物質とを被験非ヒト動物に投与し、細胞死防御活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞死防御活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２０）や、請求項７又は８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド又は請求項１３記載の組換えベクターと被検物質とを被検物質を被験非ヒト動物に投与し、細胞殺傷活性の程度を測定・評価することを特徴とする細胞殺傷活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項２１）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド、又は請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチドからなるホロチトクロームC合成酵素（ＨＣＣＳ）不活化剤（請求項２２）や、請求項１〜３のいずれか記載のペプチド又は請求項１２記載の組換えベクターからなる細胞死防御剤（請求項２３）や、請求項２３記載の細胞死防御剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項２４）や、細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２４記載の疾病の予防・治療薬（請求項２５）や、請求項７若しくは８記載のタンパク質導入ドメイン結合ペプチド、又は請求項１３記載の組換えベクターからなる細胞殺傷剤（請求項２６）や、請求項２６記載の細胞殺傷剤を有効成分として含有することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬（請求項２７）や、細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項２７記載の疾病の予防・治療薬（請求項２８）や、請求項２４記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項２９）や、細胞死防御作用を必要とする疾病が、筋萎縮性側索硬化症であることを特徴とする請求項２９記載の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３０）や、請求項２７記載の疾病の予防・治療薬を投与することを特徴とする細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３１）や、細胞殺傷作用を必要とする疾病が、悪性腫瘍・癌であることを特徴とする請求項３１記載の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法（請求項３２）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のペプチド（本件ペプチド）はＨＣＣＳに結合しその活性阻害作用を有する初めてのペプチドであり、本件ペプチドの殺細胞効果や細胞死防御効果の作用点は従来の薬剤やペプチドにはないことから、本件ペプチドの細胞内局在を制御することにより、殺細胞効果と細胞生存効果の両者を選択することができる。例えば、本件ペプチドにミトコンドリア移行シグナルペプチドを付加することにより選択的に本件ペプチドをミトコンドリアへ移行させ、本件ペプチドをミトコンドリア内に局在させることでチロクロームＣの合成を阻害し呼吸鎖を切断し、癌細胞などで効率的な細胞死を誘導することができる。一方、ミトコンドリアへ移行させることなく細胞質で本件ペプチドを発現させることで、細胞質中に存在するＨＣＣＳによるＸＩＡＰの活性抑制を阻害し、カスパーゼ依存性のアポトーシスを抑制することができる。また、本件ペプチドのＨＣＣＳ活性阻害の作用には、９番目のアミノ酸のシステインが必須であることから、このアミノ酸を中心とした領域の３次元構造に基づいて、本件ペプチドと同等の作用を有する低分子のＨＣＣＳ阻害薬の開発を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のペプチドとしては、（Ａ）ＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸からなる配列番号２に示されるアミノ酸配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列；又は（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列；の何れかのアミノ酸配列からなるペプチド（以下「本件ペプチド[１]」ということがある）、あるいは、本件ペプチド[１]のＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド（以下「本件ペプチド[２]」ということがあり、本件ペプチド[１]と本件ペプチド[２]を総称して「本件ペプチド」ということがある）であれば特に制限されず、ここで「ＨＣＣＳ結合活性を有するペプチド」とは、ＨＣＣＳに結合することによりＨＣＣＳのもつ酵素活性に何らかの形で関与するペプチドを意味し、その具体的な作用機構は特に限定されないが、本件ペプチドの具体的な作用の一例としては、ＨＣＣＳに特異的に結合し、ＨＣＣＳのもつ酵素活性を阻害する作用を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００１３】
また、本発明のＤＮＡとしては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）ＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸をコードする配列番号１に示される塩基配列；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつＨＣＣＳ結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＣＳ結合活性を有するペプチドをコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ（以下「本件ＤＮＡ[１]」ということがある）、あるいは、本件ペプチドＩのＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチドをコードするＤＮＡ（以下「本件ＤＮＡ[２]」ということがあり、本件ＤＮＡ[１]と本件ＤＮＡ[２]を総称して「本件ＤＮＡ」ということがある）であれば特に制限されない。
【００１４】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００１５】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、ＤＮＡ工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、ＤＮＡ工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。ＤＮＡ工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
【００１６】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００１７】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１８】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１９】
本件ＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１等又は配列番号２等に示される塩基配列情報又はアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２０】
具体的には、本件ＤＮＡ[１]が単離された動物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、ＥＡＡＣ１遺伝子の塩基配列情報に基づいて適当なプローブを作製し、かかるプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本件ＤＮＡ[１]を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、イヌ等の動物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本件ＤＮＡ[１]をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。ヒト、ウシ、ウサギ、イヌ、マウス、ラット由来の本件ＤＮＡ[Ｉ]の塩基配列を、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１として例示する（図１参照）。また、ヒトＥＡＡＣ１遺伝子の塩基配列を配列番号１３として例示する。
【００２１】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる変異ＤＮＡ又は相同ＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７又は９に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２２】
本件ペプチドの取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のペプチドでも、化学合成したペプチドでも、ＤＮＡ組換え技術により作製した組み換えペプチドの何れでもよい。天然由来のペプチドを取得する場合には、かかるペプチドを発現している細胞又は組織からペプチドの単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本件ペプチド]１[を取得することができる。化学合成によりペプチドを調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本件ペプチドを合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本件ペプチドを合成することもできる。ＤＮＡ組換え技術によりペプチドを調製する場合には、該ペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本件ペプチドを調製することができる。
【００２３】
例えば、ＤＮＡ組換え技術によって本件ペプチドを調製する場合、かかるペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件ペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本件ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのペプチドの精製物を得ることができる。
【００２４】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＥＷＫＲＦＬＫＮ）を有するヒト由来の本件ペプチド[１]において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるペプチド、例えば、ウシ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＷＫＲＦＬＲＮ；配列番号４）、ウサギ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＳＫＲＦＬＫＮ；配列番号６）、イヌ（ＭＧＫＰＡＲＫＧＣＤＣＲＲＦＬＲＮ；配列番号８）、マウス（ＭＧＫＰＴＳＳＧＣＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１０）、ラット（ＭＧＫＰＴＳＳＧＣＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１２）を製造することもできる（図１参照）。また、ヒトＥＡＡＣ１のアミノ酸配列を配列番号１４として例示する。
【００２５】
本件ペプチド[１]を特異的にミトコンドリア内へ移行させるために、本件ペプチド[１]のＮ末端側に、本件ペプチド[１]をミトコンドリアに移行させることができるタンパク質導入ドメインが連結されているタンパク質導入ドメイン結合ペプチド、すなわち本件ペプチド[２]を調製することができる。タンパク質導入ドメインとしては、ＨＩＶウイルスのＴａｔタンパク質のもつ１１アミノ酸残基からなるタンパク質導入ドメイン（protein transduction domain；ＰＴＤ）のＴａｔ配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１５）の他、多くのミトコンドリア分子が有しているミトコンドリア移行シグナルペプチド、例えばヒトチトクロームｃ酸化酵素のサブユニットVIIIの移行シグナルペプチド（ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫ；配列番号１６）、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼの移行シグナルペプチド（ＭＬＦＮＬＲＩＬＬＮＮＡＡＦＲＮＧＨＮＦＭＶＲＮＦＲＣＧＱＰＬＱ；配列番号１７）等を好適に例示することができる。なお反対に、Ｔａｔ配列の代わりに小胞体（ＥＲ）移行シグナルペプチドなどを用いてミトコンドリアに移行させなくすることも可能である。
【００２６】
また、本件ペプチド[１]を特異的にミトコンドリア内へ移行させるために、細胞内に本件ペプチド[２]を導入する方法として、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることができるが、本件ペプチド[２]をコードする本件ＤＮＡ[２]を含む組換えベクターを構築し、細胞内に遺伝子導入することにより、細胞内で本件ペプチド[２]を発現させ、ミトコンドリア内へ本件ペプチド[１]を移行させることもできる。
【００２７】
また、配列番号１０に示されるマウスの本件ペプチド[１]のＮ末から９番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃｙｓ）をアラニンに置換したＣ９Ａペプチド（ＭＧＫＰＴＳＳＧＡＤＷＲＲＦＬＲＮ；配列番号１８）をＴａｔ配列に結合したＴａｔ結合Ｃ９Ａペプチドでは殺細胞効果は認められなかったことから、本件ペプチドのＨＣＣＳ活性阻害の作用には、９番目のアミノ酸のシステインが必須であることがわかった。したがって、本件ペプチド[１]や本件ＤＮＡ[１]においては、Ｎ末から９番目にシステインを有するアミノ酸配列からなるペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡを好適に例示することができ、中でも、ヒト（配列番号２）、ウシ（配列番号４）、ウサギ（配列番号６）、イヌ（配列番号８）、マウス（配列番号１０）、ラット（配列番号１２）のアミノ酸配列比較から、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｘａａ3−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘａａ4−Ｘａａ5−Ｘａａ6−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｘａａ7−Ａｓｎ（式中、Ｘａａ1はＡｌａ又はＴｈｒを、Ｘａａ2はＡｒｇ又はＳｅｒを、Ｘａａ3はＬｙｓ又はＳｅｒを、Ｘａａ4はＧｌｕ又はＡｓｐを、Ｘａａ5はＴｒｐ，Ｓｅｒ又はＣｙｓを、Ｘａａ6はＬｙｓ又はＡｒｇを、Ｘａａ7はＬｙｓ又はＡｒｇをそれぞれ表す。；配列番号１９）で表されるペプチドや該ペプチドをコードするＤＮＡを好適に例示することができる。同様に、上記本件ペプチド[１]や本件ＤＮＡ[１]に相当する本件ペプチド[２]や本件ＤＮＡ[２]を好適なものとして例示することができる。例えば、上記Ｎ末から９番目のシステインを中心とした領域の３次元構造に基づいて、あるいは動物間で保存されている領域情報に基づいて、本件ペプチドと同等の作用を有する低分子のＨＣＣＳ阻害薬の開発を行うことが容易となる。
【００２８】
本発明の融合ペプチドとしては、上記本件ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよい。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件ペプチドの精製や、本件ペプチドの検出や、本件ペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２９】
本発明の組換えベクターとしては、前記本件ＤＮＡを含み、かつ上記本件ペプチドを発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本件ＤＮＡを、例えば動物細胞発現用の発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本件ＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。また、発現系としては、上記本件ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。
【００３０】
また、異なる細胞種が混在する組織や腫瘍組織では、特定の細胞種あるいは癌細胞など細胞種の選択性・特異性を引き出すため、アデノウイルスなどのウイルスベクターを有利に用いることができる。この場合、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰなどの系を用いることで容易に細胞種特異的に本件ペプチドを発現させることも可能となる。これにより、特定の細胞種特異的に本ペプチドの殺細胞作用と細胞生存作用を発揮することができる。
【００３１】
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ上記本件ペプチドを発現する形質転換体であれば特に制限されず、形質転換酵母、形質転換植物（細胞、組織、個体）、形質転換細菌、形質転換動物（細胞、組織、個体）を挙げることができるが、形質転換動物細胞が好ましい。動物細胞宿主としては、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞等を挙げることができる。動物細胞への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３２】
本件ペプチドを特異的に認識することができる抗体としては、本件ペプチド[１]に特異的に結合する抗体が好ましく、かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは本件ペプチド[１]を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本件ペプチドに特異的に結合する抗体は、例えば、本件ペプチド[１]の変異又は欠失に起因する疾病の診断や本件ペプチド[１]の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３３】
本件ペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該ペプチド又はエピトープを含む断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下に本件ペプチド[１]として、ヒト由来のペプチドを例に挙げてマウス由来の本件ペプチド[１]に対して特異的に結合するモノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００３４】
上記本発明のモノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００３５】
上記本発明のルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒト、ラット、イヌ等から得られた本件ペプチド[１]を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、ペプチドやタンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００３６】
また、本発明の上記本件ペプチド[１]に対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件ペプチド[１]を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーで本件ペプチドを精製することもできる。本件ペプチドに対する抗体は、本件ペプチドの分子機構を明らかにする上で有用である。
【００３７】
また上記本件ペプチドに対するモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件ペプチドの機能解析を有利に行うことができる。また、本発明の抗体を用いた免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００３８】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、本件ＤＮＡが導入され、本件ペプチドを過剰発現する非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ここで、本件ペプチドを過剰発現するとは、野生型の非ヒト動物の本件ペプチド発現量に比べて有意に多量の本件ペプチドを発現することをいう。また、上記非ヒト動物としては、ラット，マウス，ウシ，ブタ，ニワトリ，カエル，ヒト，イヌ，ウサギ等を挙げることができるが、中でもマウスやラットが好ましい。また、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の好ましい態様として、ホモ体であるトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができる。かかる変異染色体をホモに有するホモ体は、染色体をヘテロに有するマウス等の非ヒト動物同士を交配することにより得ることができ、本件ペプチド発現量がヘテロ体よりも多いことから、実験モデル動物として特に好ましい。本件ＤＮＡが導入され、本件ペプチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物は、細胞死防除効果、特に神経細胞死防除効果を有する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、細胞死、特に神経細胞死等に関する実験モデル動物として有用である。
【００３９】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製方法（例えば、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を挙げることができる。例えば、本件ペプチドトランスジェニックマウスを創製する方法としては、常法により調製した本件ＤＮＡを発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントをマウス受精卵雄性前核にマイクロインジェクションし、この受精卵あるいは２細胞期胚を仮親マウスの卵管に移植し、仔マウスを発生させ、その産仔の組織から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法等により、本件ＤＮＡが組み込まれていることを確認する方法等を挙げることができる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法としては、本件ペプチド[１]又は本件ペプチド[１]を発現することができる本発明の組換えベクターと被検物質とを、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に投与し、細胞死防御活性の程度を測定・評価する細胞死防御活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法や、本件ペプチド[２]又は本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターと被検物質とを、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に投与し、細胞殺傷活性の程度を測定・評価する細胞殺傷活性の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、具体的には、ラットやマウス等の被験非ヒト動物に本件ペプチドや組換えベクターを経静脈的に投与する前後、あるいは投与と同時に被検物質を経口若しくは非経口的に投与し、細胞死防御活性や細胞殺傷活性の程度を測定し、被検物質を投与しない対照の測定値と比較・評価することにより、細胞死防御活性や細胞殺傷活性の促進物質や抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００４１】
上記被検物質として、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いることもでき、また、上記被検物質としては、動植物・微生物からの抽出物などの天然物、化学合成により得られる化合物、各種生理活性ペプチドやタンパク質・ペプチド、従来公知の各種細胞死促進剤や細胞死抑制剤の他、各種アジュバントを例示することができる。本発明のスクリーニング方法により得られる細胞死防御活性の促進物質や細胞殺傷活性の抑制物質は、単独若しくは本件ペプチド[１]と併用することにより、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患やアポトーシスが関与する細胞死に起因する疾患の予防・治療薬として有用である可能性があり、また、細胞死防御活性の抑制物質や細胞殺傷活性の促進物質は、単独若しくは本件ペプチド[２]と併用することにより、癌・悪性腫瘍等の疾患の予防・治療薬として有用である可能性があり、さらにこれらの促進物質や阻害物質は、インビボにおけるＥＡＡＣ１とＨＣＣＳとの結合の作用機序を研究する上で有用である。
【００４２】
本発明のＨＣＣＳ不活化剤としては、本件ペプチド[１]又は本件ペプチド[２]からなるものであれば特に制限されず、本件ペプチド[１]や本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターも、本件ペプチド[１]や本件ペプチド[２]を発現させる目的で使用する場合は、便宜上本発明のＨＣＣＳ不活化剤に含まれる。
【００４３】
本発明の細胞死防御剤としては、本件ペプチド[１]、又は本件ペプチド[１]を発現することができる本発明の組換えベクターからなり、本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬としては、本発明の細胞死防御剤を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよく、また本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療方法としては、本発明の細胞死防御作用を必要とする疾病の予防・治療薬を投与する方法であれば制限されず、上記細胞死防御作用を必要とする疾病としては、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患や腎不全、虚血性心疾患等のアポトーシスが関与する細胞死に起因する疾患を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明の細胞殺傷剤としては、本件ペプチド[２]、又は本件ペプチド[２]を発現することができる本発明の組換えベクターからなり、本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬としては、本発明の細胞殺傷剤を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよく、また本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療方法としては、本発明の細胞殺傷作用を必要とする疾病の予防・治療薬を投与する方法であれば制限されず、上記細胞殺傷作用を必要とする疾病としては、悪性腫瘍・癌、水虫等の真菌感染症などの疾患を挙げることができる。
【００４５】
本発明の予防・治療薬には、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができ、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、非経口投与的に投与することが好ましい。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。
【００４６】
また、本発明の予防・治療薬の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができるが、例えば成人に投与する場合、有効成分である本件ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩を通常１回量として約０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇであり、この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。本発明の心機能抑制／降圧剤を非経口的に投与するには、たとえば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができるが、静脈内投与や皮下投与が好ましい。
【００４７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４８】
［ペプチド合成］
以下のペプチドの合成は固相法を原理とするペプチド合成機を用いて行った。合成したペプチドは樹脂からの切り出しを行い、ＨＰＬＣを用いた逆相クロマトグラフィーを行い精製した。
Tat-EAAC；N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGCDWRRFLRN-C（配列番号２０）
Tat-EAAC-C9A  ；N-YGRKKRRQRRRMGKPTSSGADWRRFLRN-C（配列番号２１）
EAAC1 peptide ；N-MGKPTSSGCDWRRFLRN-C（配列番号１０）
C9A peptide；N-MGKPTSSGADWRRFLRN-C（配列番号１８）
【実施例２】
【００４９】
［プラスミド］
ラットＥＡＡＣ１（accession ナンバーD63772）の翻訳領域の後ろにＨＡタグを付加したインサートを哺乳類発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ（genebank accession No. AB009864）にサブクローニングした。また、マウスＨＣＣＳ（accessionナンバーMMU36788）の翻訳領域の前にＦｌａｇタグを付加しｐＭＥ１８Ｓにサブクローニングした。
【実施例３】
【００５０】
［細胞培養］
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質クロム親和性細胞腫）はコラーゲンコートした培養皿で１０％馬血清（hoese serum）、５％子牛血清（fetal bovine sreum）含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養し、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ６グリオーマ細胞は子牛血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した。また、一過性遺伝子導入実験では、リポフェクトアミン２０００（Invitrogen社製）を用いてリポフェクション法にて目的プラスミドをＣＯＳ−７細胞に導入し、ＥＡＡＣ１ペプチド、Ｃ９ＡペプチドをBioPORTER（GTS社製）を用いてＰＣ１２細胞へ導入した。なお、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１、Ｔａｔ−Ｃ９Ａペプチドは目的濃度になるよう培養上清に直接添加した。
【実施例４】
【００５１】
［酵母ツーハイブリッドスクリーニング］
ＥＡＡＣ１Ｎ末端１−３４アミノ酸を含む領域を３回繰り返した配列をベイト（bait）としてマウスブレインライブラリー（クロンテック社製）を定法に従いスクリーニングした。
【実施例５】
【００５２】
［免疫沈降法］
遺伝子導入した培養細胞に溶解バッファー（150mM NaCl, 20mM Tris-HCl (pH7.5), 10mM EDTA, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 1.5% aporotinin, 1mM PMSF, Leupeptin .）を加え撹拌後３０分程度。遠心上清にＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を加え１時間程度４℃でインキュベートした。Protein sepharose G（Zymed社製）を加えローテーターで混合、５０００回転１分遠心後上清を除く操作を４回繰り返した。上清をすべて取り除きペレットにＳＤＳサンプルバッファーを加え煮沸後ウエスタンブロットを行った。
【実施例６】
【００５３】
［ウエスタンブロット］
遺伝子導入した培養細胞に溶解バッファー(50 mM Pipes/NaOH [pH 6.5], 2 mM EDTA, 0.1% CHAPS, and 5 mM DTT, 20 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL pepstatin, 10 μg/mL aprotinin, 1 mM PMSF)を加え３回凍結融解を繰り返し遠心後上清を回収した。BCA protein assay reagent kit（Pierce社製）にて蛋白濃度を測定し３０μｇを電気泳動に使用した。ブロッティング後５％のmilk-TBSTにてブロッキングを室温下１時間行い、１０００〜２０００倍の濃度のcleaved caspase3抗体（Cell signaling社製）、HA抗体（Roche社製）を用いて４℃でオーバーナイトで反応させた。２次抗体反応後ECLdetection kit（アマシャム社製）にて目的バンドを検出した。
【実施例７】
【００５４】
［ＥＡＡＣ１過剰発現動物の作製］
ラットＥＡＡＣ１を傷害運動ニューロンに過剰発現させる目的で、ＤＩＮＥプロモーター下流にＥＡＡＣ１翻訳領域配列をつなげ、さらに外来性ＥＡＡＣ１を検出するためｉｒｅｓ−ＧＦＰ配列をつなげた。Ｉｒｅｓ（internal ribosomal entry site）とは、ＤＩＮＥプロモーター制御下に転写されたｍＲＮＡから同時にＥＡＡＣ１蛋白とＧＦＰ蛋白の２種類の蛋白の合成を可能にする配列である。以上の６．４Ｋｂ遺伝子断片はアガロース電気泳動後、ゲルより抽出し精製した。この遺伝子断片をＢＤＦ由来の受精卵にマイクロインジェクションし状態の良好な卵（２００個以上）を仮親（ＩＣＲ）の卵管に移植し自然分娩させる過程はＳＬＣ社に受託した。生まれたマウスの遺伝子導入を確認するため尾よりゲノムを抽出しＰＣＲにて確認した。ＰＣＲ用プライマーとして５'−ｏｌｉｇｏ（５'−ＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＴＡＴＡＡＴＣＧＡＣＣ−３'）、３'−ｏｌｉｇｏ（５'−ＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＴＣＣ−３'）を使用した。ＰＣＲの条件は：９４℃で１分，６４℃で１分，及び７２℃で１分を３０サイクル行い、７２℃で７分伸長した。
【実施例８】
【００５５】
［動物の手術および切片作製］
ペントバルビタール麻酔下、右側舌下神経を眼科手術用はさみで切断した。術後５週間経過後、断頭し脳をドライアイスにて凍結した。クリオスタットにて約16μｍの厚さの凍結切片を作製し−３０℃に保存した。切片は風乾後、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、ＰＢＳで洗浄後サイオニン染色を行い、脱水系列後、封入した。２４枚の舌下神経核の連続切片を用いて健常側と損傷側の神経細胞数を光学顕微鏡下でカウントした。
【実施例９】
【００５６】
［ＥＡＡＣ１とＨＣＣＳの結合］
ＥＡＡＣ１のＮ末結合蛋白を探索する目的で、ＥＡＡＣ１のＮ末端をベイトとしてマウスブレインライブラリー酵母ツーハイブリッドを行った。この結果、ミトコンドリアに存在するミトコンドリア膜間腔に存在する呼吸鎖関連蛋白ＨＣＣＳをＥＡＡＣ１のＮ末端結合蛋白として得ることができた。
【００５７】
哺乳類細胞でのＥＡＡＣ１蛋白とＨＣＣＳ蛋白との結合を調べるため免疫沈降を行った。ＨＡタグを付加したＥＡＡＣ１とＦＬＡＧタグ付加したＨＣＣＳの翻訳領域を哺乳類細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓに組み込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし共発現させた。トランスフェクション４８時間後細胞を回収し蛋白を抽出した。ＦＬＡＧタグ特異的抗体（ＦＬＡＧ）を用いた免疫沈降により抽出蛋白中のＦＬＡＧタグを有する蛋白が濃縮された。さらにこのサンプルを用いてウエスタンブロットを行うことにより、ＦＬＡＧ付加蛋白に結合している蛋白（ＨＡタグ付加蛋白）をＨＡタグ特異的抗体（ＨＡ）にて検出した。結果を図２に示す。その結果ＥＡＡＣ１とＨＣＣＳを共発現させたサンプルにおいて強いバンドが認められ、これら２つの蛋白は哺乳類細胞内でも結合することが明らかになった。
【実施例１０】
【００５８】
［ｔａｔ−ＥＡＡＣ１ペプチドによる殺細胞効果］
ミトコンドリア膜間腔のＨＣＣＳを標的として、株化細胞にＴａｔ配列付加ＥＡＡＣ１のＮ末端ペプチドを添加した。Ｔａｔ配列はそれが結合したペプチドを細胞質をはじめ核やミトコンドリアへも局在させることが知られている。２４時間後に細胞生存率を生細胞数測定試薬にて測定した。結果を図３に示す。図３のグラフの縦軸はコントロール（無添加）に対する細胞生存率を示す。ＰＣ１２細胞では最終濃度１０μＭになるようＴａｔ（Ｔａｔ配列のみ；配列番号１５）、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１（Ｔａｔ配列にＥＡＡＣ１のＮ末１７アミノ酸を繋いだもの；配列番号２０）、Ｔａｔ−Ｃ９Ａ（Ｔａｔ配列にＥＡＡＣ１のＮ末１７アミノ酸を繋いだもので、９番目のシステインをアラニンに置換したもの；配列番号２１）の３種類のペプチドを添加した。ＣＯＳ−７細胞では最終濃度５０μＭで同様のペプチドを添加した。Ｃ６グリオーマ細胞では最終濃度０〜５０μＭの範囲でのＴａｔ−ＥＡＡＣ１ペプチドによる殺細胞効果を検討した。２４時間後には各種の株化腫瘍細胞で６０〜８０％の細胞数の現象が見られた。このように、Ｔａｔ−ＥＡＡＣ１は各種株化細胞に対して強い細胞死誘導効果を示した。また、Ｎ末端から９番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに置換したＣ９Ａペプチドではこのような殺細胞効果は認められなかった。このことから本ペプチドの９番目のアミノ酸システインは殺細胞作用を得る上で必須のアミノ酸であることが明らかになった。
【実施例１１】
【００５９】
［ＥＡＡＣ１のＮ末ペプチドによる細胞保護効果］
Ｔａｔ配列を持たないペプチドは主に細胞質へ導入されるがミトコンドリアや核へは移行しない。このような性質を利用しＮＧＦ除去により細胞死を引き起こす分化ＰＣ１２細胞に、ＥＡＡＣ１  Ｎ末端ペプチドを導入した。本実験はミトコンドリアではなく細胞質中に存在することによりカスパーゼ依存型の細胞死（アポトーシス）を加速させる細胞質型ＨＣＣＳを標的としており、ＥＡＡＣ１Ｎ末端ペプチドによる細胞保護効果を検討するものである。ＮＧＦ除去と同時にペプチドを導入し６時間後、細胞死のマーカー蛋白であるカスパーゼ３の活性化を、活性型カスパーゼ３特異的認識抗体を用いて評価した。活性化型カスパーゼ３抗体を用いたウエスタンブロットの結果を図４に示す。ＥＡＡＣ１  Ｎ末ペプチド（ＥＡＡＣ１ペプチド１−１７）導入時には活性化型カスパーゼ３を示すバンドが薄くなっており、カスパーゼ３の活性が低下していることが示された。このことから本ペプチドをミトコンドリアではなく細胞質に導入することにより明らかな細胞保護効果が認められた。
【実施例１２】
【００６０】
［生体内でのＥＡＡＣ１による細胞死防御効果］
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）舌下神経（末梢運動神経）を切断すると、起始核である舌下神経核の運動神経細胞は数週間かけて緩徐な神経細胞死を引き起こす。この現象はヒトの筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の大変良い動物モデルとなる。マウスの場合神経切断により運動神経細胞内でのＥＡＡＣ１の発現は著しく低下した。同様の実験をラットで行なうとＥＡＡＣ１の発現は逆に上昇し、損傷運動神経細胞は生存した。このことから、この神経細胞死はＥＡＡＣ１の発現抑制が原因であると考えられた。そこで軸索切断を受けた舌下神経核運動神経細胞でＥＡＡＣ１の発現が抑制されず逆に発現上昇されるようなトランスジェニックマウスの作製を試みた。具体的には、神経損傷に対して発現応答するDamage Induced Neuroendopeptidase（ＤＩＮＥ）（Kiryu-Seo et al 2000 PNAS）のプロモーター制御下にＥＡＡＣ１が発現するようＥＡＡＣ１トランスジェニックマウスを作製した（ＥＡＡＣ１ Ｔｇマウス）。図５（左）は、野生型（ＷＴ）とＥＡＡＣ１トランスジェニックマウス（ＥＡＡＣ１ Ｔｇ）の舌下神経切断後５週目の舌下神経核のサイオニン染色像を示す。写真の左側部分が健常側、右側部分が損傷側の舌下神経核を示す。野生型の損傷側運動神経細胞は健常側に比べ顕著に減少しているのに対し、ＥＡＡＣ１トランスジェニックマウスでは右側損傷側の運動神経細胞が比較的残っていることが示されている。図５（右）は健常側に対する損傷側の運動神経細胞数をパーセントで示したグラフである。この結果、野生型マウスでは舌下神経切断後５週目には健常側に対して細胞生存率が４２％であるのに比べ、ＥＡＡＣ１ Ｔｇマウスの細胞生存率は８５％であることが明らかになった。これはＥＡＡＣ１による生体内での神経細胞死保護効果を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＥＡＡＣ１のＮ末端の１７アミノ酸からなる本件ペプチド[１]のアミノ酸配列（下線部）を示す図である。
【図２】ＥＡＡＣ１蛋白とＨＣＣＳ蛋白との結合を示す免疫沈降の図である。
【図３】本発明のＴａｔ−ＥＡＡＣ１ペプチドの殺細胞効果を示す図である。
【図４】ＥＡＡＣ１のＮ末ペプチドによる細胞保護効果を示す、活性化型カスパーゼ３抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】生体内でのＥＡＡＣ１による細胞死防御効果を示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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