(57)【要約】【課題】  例えば遺伝子中の１塩基変異等を迅速、且つ簡易に検出し、さらにはその種類まで同定することが可能な特定遺伝子検出方法を提供する。【解決手段】  塩基が結合し電気化学活性を有するナノ粒子と電極とを用いて特定遺伝子を検出する。具体的には、識別対象となる遺伝子が固定された電極に対して１塩基修飾されたナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出し、遺伝子における変異の有無を識別する。１塩基修飾されたナノ粒子としてシトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類のナノ粒子を用い、これらを順次作用させて前記電気化学的信号を検出すれば、遺伝子における変異の種類も判別される。ナノ粒子は、電気化学的活性を有するナノ粒子であり、例えば金ナノ粒子である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基が結合し電気化学活性を有するナノ粒子と電極とを用いて特定遺伝子を検出することを特徴とする特定遺伝子検出方法。
【請求項２】
検出対象となる遺伝子が固定された電極に対して前記ナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出することを特徴とする請求項１記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項３】
前記特定遺伝子が１塩基変異型遺伝子であり、遺伝子における変異の有無を検出することを特徴とする請求項１又は２記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項４】
前記塩基が結合したナノ粒子として、シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾されたナノ粒子を用い、これらを順次作用させて前記電気化学的信号を検出し、前記遺伝子における変異の種類を判別することを特徴とする請求項３記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項５】
前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子またはポリマー粒子であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項６】
前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金ナノ粒子であることを特徴とする請求項５記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項７】
前記電気化学的信号は、ボルタメトリーにより測定することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の特定遺伝子検出方法。
【請求項８】
特定遺伝子を検出するための塩基修飾ナノ粒子であって、電気化学的活性を有するナノ粒子表面がシトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる少なくとも１種により修飾されていることを特徴とする塩基修飾ナノ粒子。
【請求項９】
前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子またはポリマー粒子であることを特徴とする請求項８記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１０】
前記電気化学活性を有するナノ粒子が、金ナノ粒子であることを特徴とする請求項９記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１１】
塩基は、キトサンを介してナノ粒子表面に結合していることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１２】
塩基は、ホスホルアミデート結合により前記キトサンと結合していることを特徴とする請求項１１記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１３】
前記キトサンは、アルカンチオールを介してナノ粒子表面に結合していることを特徴とする請求項１１又は１２記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１４】
前記アルカンチオールは、ナノ粒子の表面に自己組織化単分子膜として形成されていることを特徴とする請求項１３記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１５】
前記アルカンチオールは、前記キトサンと結合するカルボキシル基を有することを特徴とする請求項１３記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１６】
前記アルカンチオールとして、メルカプトプロピオン酸及びメルカプトプロパノールを用いたことを特徴とする請求項１４記載の塩基修飾ナノ粒子。
【請求項１７】
対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬であって、
シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えることを特徴とする１塩基変異型遺伝子識別用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば１塩基変異を有する遺伝子等、特定遺伝子を迅速、且つ簡易に把握し得る特定遺伝子検出方法に関するものであり、さらには、係る検出方法に使用される塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡを基礎とする研究における現在の努力は、ヒトゲノムプロジェクトの膨大なライブラリーを利用することにフォーカスされている。そして、それは種々の生体現象の解明につながっている。これらの努力の最も大きな挑戦は、１塩基変異型遺伝子（ＳＮＰ）の検出に関するものである。体細胞における一塩基変異は、遺伝的あるいは、遺伝的でない病気にも関わると考えられている。遺伝情報の伝達は、全て特異的な塩基のペア、すなわちアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアに依存しており、これは５０年程前にワトソンとクリックによって初めて述べられたことである。ここで、塩基対のミスマッチのタイプは次のように分類される。
【０００３】
一つは、トランジションＳＮＰ、すなわちプリンと誤ったピリミジンとのペアであり、もう一つは、トランスバージョンＳＮＰ、すなわち２つのプリミジンのペア、ピリミジンのペアである。ＳＮＰの同定のプロトコールにおいては多くの組み合わせが考えられる。それは一塩基の変化によってなされる訳である。実際、８種類の可能なＳＮＰが予想されている。例えば、Ａ−Ｃ，Ａ−Ａ，Ａ−Ｇ，Ｃ−Ｃ，Ｃ−Ｔ，Ｔ−Ｔ，Ｔ−Ｇ，Ｇ−Ｇの組み合わせである。
【０００４】
従来、ＳＮＰを計測するいくつかの重要な方法が知られている。しかしながら、従来の方法は、先に例示した全ての種類のＳＮＰを同時に計ることはできない。ＳＮＰを含むＤＮＡ部位を、例えばＳ−１ヌクレアーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIのような一本鎖の特異的なデオキシリボヌクレアーゼによって分裂させることは、直接的なアプローチであった。しかしながら、酵素や反応の条件の数多くの異なる組み合わせがそれらの方法を困難なものにしている。さらに、Ａ−Ａ、あるいはＴ−ＴトランスバージョンＳＮＰは、それらミスマッチ鎖には分裂されない。
【０００５】
ＳＮＰのタンパク質による認識は非常に魅力的な分野である。何故なら、酵素による切断は必要ないためである。ＳＮＰを認識し結合できるタンパク質は大腸菌から分離され、ｍｕｔＳと呼ばれている。ｍｕｔＳはＳＮＰに結合し、この複合体の検出は種々の分析法によって行われる。しかしながら、主な欠点は、あらゆるミスマッチに適応できないことである。例えば、Ｃ−ＣのミスマッチはｍｕｔＳによって認識されない。Ｂｉらは、最近遺伝子修飾ｍｕｔＳを基礎とするプロティンチップを報告した。一般的に修飾したｍｕｔＳは、ＳＮＰのＰＣＲで増幅されたカップルにおいてｍｕｔＳ検出を可能としている。
【０００６】
ミスマッチＤＮＡの完全な相補ＤＮＡとは異なる電気泳動挙動は、特別なゲルシステムによってモニタされる。例えば、グラジエントゲル電気泳動はＳＮＰ同定に用いられている。しかしながら、この方法は、完全なシーケンサとのミスマッチ配列との移動との変化が未だ完全に理解されていない。
【０００７】
Ｇａｎｇｕｌｙらは、ラジオアイソトープラベルされた水溶性カルボジイミドをミスマッチのＴとＧに付加することによって、ＳＮＰがポリアクリルアミドゲル電気泳動でラジオアイソトープラベルをモニタすることにより検出できることを示した。このアプローチ方法の限界はＴやＧの塩基のみ依存することであり、また放射性物質を標識に用いることであり、それはルーチンな分析には望ましいことではない。
【０００８】
これまで、いくつかの電気化学的な方法や光学的なＤＮＡのバイオセンサーがＳＮＰを測定するために用いられてきた。測定のスキームはいつもターゲットＤＮＡシーケンスにおけるＳＮＰの存在を測定するものであった。これに対し、このレポートにおいては、一塩基修飾ナノ粒子によってＳＮＰ中の塩基の同定が可能であった。金のナノ粒子は、そのユニークな光学的、電気化学的な性質により、広くＤＮＡバイオセンサーに用いられている。
【０００９】
Ｔａｔｏｎらは、金のナノ粒子でオリゴヌクレオチドのターゲットをラベル化し、それをハイブリットの融解プロフィルでモニタをした。銀の還元を触媒できる金のナノ粒子とと関連してＳＮＰが選択的に光のスキャノメトリックアレイによって検出された。
【００１０】
Ｐａｒｋらは、金がタグされたプローブとそのターゲットのオリゴヌクレオチド、それは２つのエレクトロードの間のナノギャップに固定化されているが、それをハイブリッドさせた。金のナノ粒子をベースとするプロテインアッセイもまた最近ミルキンによって報告された。ターゲットとなるプロティンは、磁気のマイクロ粒子とＤＮＡが付加された金のナノ粒子の間で捕らえられている。磁場によって分離されたあと、ＤＮＡは金のナノ粒子から放出され測定されている。金のナノ粒子のサイズに依存して非常に多くのＤＮＡの鎖が溶液中に放出され、タンパク質分子に補足される。
【００１１】
Ｗａｎｇらは、磁気的に誘導された電気化学的検出法を開発している。すなわち、ストレプトアビジンでコートされたナノ粒子を、磁気ビーズ上に固定化されたビオチン化ハイブリットに結合させることで、ＤＮＡハイブリダイゼーションする方法である。Ｗａｎｇらは、ＰｂＳ、ＺｎＳ、ＣｄＳ等のクォンタムドットを用いて、同時に複数のＤＮＡターゲットの測定を水銀フィルム電極上において可能にしている。
【００１２】
Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙらは、最近ＳＮＰを測定する技術を開発した。それは蛍光ラベルされたもので、一塩基を用いるものである。それは、我々の仮説も支持している。すなわち、一塩基修飾ラベルがシングルモレキュレベルでのインフォメーションを与えることを可能にしている。ＤＮＡポリメラーゼ酵素がＣｙ−３，Ｃｙ−５と一塩基結合したＤＮＡポリメラーゼ酵素とＤＮＡテンプレート、それはＳＮＰの光学的な測定を可能にしている。ＤＮＡポリメラーゼとミスマッチされたラベル化一塩基は７５ベースのターゲットＤＮＡとに分解された。表面のイメージングのあとで蛍光分子の場所はＤＮＡ分子の位置と比較された。２番目の反応でその時には、蛍光されたベースと反応が行われ、イメージングが数倍にされた時、総合Ｃｙ−３のモデファイされたウラシル（Ｕ）が相補的に結合する。しかしながら、Ｃｙ−３がモデファイされたＡとは結合しない。
【００１３】
Ｗｉｌｌｎｅｒらの研究者は、チオール化されたオリゴヌクレオチドを、金電極または金クォーツのピエゾクリスタルの上にアセンブルした。前記オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰサイトの一塩基に限りターゲットＤＮＡと相補的である。通常、あるいは異常なターゲットＤＮＡを検出のためのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、ハイブリダイズしていないＳＮＰサイトのフリーな塩基を、ＤＮＡポリマラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）の存在下、ビオチン化されたヌクレオチドと反応させる。標識化されたヌクレオチドは、ＳＮＰサイトに含まれる２本鎖ハイブリッドとのみカップリングする。その後のＳＮＰサイト上のビオチン化されたヌクレオチドへのアビジン−アルカリホスファターゼの結合、及び変換器上での不溶性物質の生体触媒された沈殿により、ＳＮＰが増幅されて検出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、Ｗｉｌｌｎｅｒらの研究者は、変異サイトにおける未知のハイブリダイズしていないフリーな塩基の同定には、その検出システムを適用していない。
【００１５】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、１塩基変異型遺伝子等の特定遺伝子を迅速、且つ簡易に検出し、例えば変異の種類まで同定することが可能な特定遺伝子検出方法を提供することを目的とし、さらには、係る検出方法に用いる塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
このような目的を達成するために、本発明の特定遺伝子検出方法は、塩基が結合し電気化学活性を有するナノ粒子と電極とを用いて特定遺伝子を検出することを特徴とする。例えば、特定遺伝子が１塩基変異型遺伝子の場合、識別対象となる遺伝子が固定された電極に対して１塩基修飾されたナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出し、前記遺伝子における変異の有無を識別する。
【００１７】
また、本発明の塩基修飾ナノ粒子は、対象となる遺伝子における変異の有無を識別するための塩基修飾ナノ粒子であって、電気化学的活性を有するナノ粒子表面がシトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる１種により修飾されていることを特徴とする。さらに、本発明の１塩基変異型遺伝子識別用試薬は、対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬であって、シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明の特定遺伝子検出方法は、例えば全ての可能な１塩基変異型遺伝子（ＳＮＰ）を区別できる方法である。すなわち、本発明では、ＳＮＰは特定の塩基が結合したナノ粒子（１塩基修飾ナノ粒子）の電気化学的信号の変化として区別される。１塩基修飾ナノ粒子は、はじめにキトサンポリマーがアルカンチオール自己組織化修飾されたナノ粒子の上に形成される。特定の一塩基は、その後でキトサンで被覆されたナノ粒子の上に形成される。それは、キトサンのアミノ基に結合したホスホルアミデート結合の形成を介してなされる。もし、ＤＮＡにＳＮＰがありそのミスマッチの塩基が相補的に結合するのなら、ナノ粒子は電極表面に蓄積し、その結果、電気化学的信号の大きな変化が起こる。
【００１９】
本発明の検出方法においては、塩基で修飾されたナノ粒子がＳＮＰの存在を示すだけでなく、どの塩基がその塩基対の中に存在しているかを明らかにできる。特にトラスバージョンＳＮＰの同定、それはすなわち同じピリミジンあるいはプリンのカップルを有する場合であるが、その場合は特に単純な応答として区別される。ここではモデルとして構成された２１塩基のＤＮＡプローブを用いて行われた。そのプローブはすべての可能な変異の組み合わせを有するＴＮＦ−αに関するものである。このナノ粒子を基礎とする電気化学的な方法は、あらゆる変異のＤＮＡを測定する有効な方法である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、例えば１塩基変異を有する特定遺伝子の存在を、電気化学的信号の変化として、迅速、且つ簡易に検出することができる。また、本発明によれば、１塩基変異の種類まで同定することが可能であり、あらゆる変異のＤＮＡを測定する全く新規で有効な方法を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を適用した特定遺伝子検出方法、塩基修飾ナノ粒子及び１塩基変異型遺伝子識別用試薬について、詳細に説明する。なお、以下においては、特定遺伝子として、１塩基変異型遺伝子を例にして、その識別方法について説明する。
【００２２】
本発明の１塩基変異型遺伝子の識別方法（特定遺伝子検出方法）は、基本的には、識別対象となる遺伝子が固定された電極に対して塩基修飾された電気化学的活性ナノ粒子を作用させ、当該ナノ粒子の前記電極への結合の有無を電気化学的信号として検出し、前記遺伝子における変異の有無を識別するというものである。
【００２３】
先にも述べたように、遺伝子配列中において、各塩基は、特異的に特定の塩基とのみ結合する。具体的には、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアのみである。これらが正常に結合していれば、他の塩基を作用させても結合しない。ところが、１塩基変異が存在する場合、この変異部位には前記組み合わせではない組み合わせが存在し、互いに結合しない塩基が存在する。
【００２４】
したがって、前記変異部位に何らかの塩基を作用させれば、アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）のペアを構成する場合、前記結合していない塩基と作用させた塩基が結合する。塩基として１塩基修飾されたナノ粒子を作用させれば、前記塩基の結合によりナノ粒子が結合し、電気化学的信号の変化として確認できる。これを検出すれば、遺伝子に１塩基変異が存在するか否かを識別することができる。さらに、前記１塩基修飾されたナノ粒子としてシトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類のナノ粒子を用い、これらを順次作用させて前記電気化学的信号を検出することで、遺伝子における変異の種類を判別することも可能である。
【００２５】
図１は、本発明による１塩基変異の識別の原理を模式的に示すものである。例えば、１塩基変異として、Ａ−Ｇの組み合わせが遺伝子中に存在するとする。この場合、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）は、互いに結合することなく遺伝子中に存在する。
【００２６】
ここで、図１（ａ）に示すように、シトシン（Ｃ）修飾ナノ粒子を作用させると、前述の特異的組み合わせによりグアニン（Ｇ）と結合する。この状態で電気化学的信号を測定すると、電極上にナノ粒子が存在するため、電気化学的酸化信号としてピークが発現する。次に、図１（ｂ）に示すように、チミン（Ｔ）修飾ナノ粒子を作用させると、アデニン（Ａ）と結合する。したがって、この場合にも電気化学的酸化信号としてピークが発現する。
【００２７】
一方、図１（ｃ）に示すように、グアニン（Ｇ）修飾ナノ粒子を作用させた場合には、ペアとなる相手の塩基（シトシン）が存在しないため結合せず、電気化学的信号を測定してもピークは発現しない。同様に、図１（ｄ）に示すように、アデニン（Ａ）修飾ナノ粒子を作用させた場合にも、ペアとなる相手の塩基（チミン）が存在しないため結合せず、電気化学的信号を測定しても、やはりピークは発現しない
【００２８】
したがって、いすれの１塩基修飾金ナノ粒子を作用させたときにピークが発現するかを調べれば、その１塩基変異がどのような塩基の組み合わせか判別することができる。例えば、前記のようにシトシン修飾ナノ粒子とチミン修飾ナノ粒子を作用させたときにピークが発現すれば、１塩基変異がＡ−Ｇであることがわかる。他の組み合わせにおいても同様であり、例えば１塩基変異がＡ−Ｃであれば、グアニン修飾ナノ粒子とチミン修飾ナノ粒子を作用させた時に電気化学的信号のピークが発現する。例えば１塩基変異がＡ−Ａである場合には、チミン修飾ナノ粒子を作用させた時にのみ電気化学的信号のピークが発現する。
【００２９】
本発明の１塩基変異型遺伝子の識別方法では、前記ナノ粒子として、電気化学的に活性を持つ粒子であれば任意であるが、例えば金、銀、銅、白金等の金属のナノ粒子や、ＣｄＳ、ＣｕＳ、ＣｄＳｅ等の半導体のナノ粒子や、ポリマー粒子が好ましい。これらの中で、粒子サイズや特異的電気化学的性質等の点から、金ナノ粒子、特に金コロイドナノ粒子が好適である。
【００３０】
遺伝子を固定する電極は、任意であるが、例えばビオチンを含むカーボンペースト電極が好ましく、これに対象となる遺伝子を結合したプローブ標識ビーズを固定化して用いればよい。また、前記電気化学的信号は、例えば矩形波ボルタメトリーにより測定すればよい。
【００３１】
対象となる遺伝子における変異の有無を識別するための塩基修飾ナノ粒子としては、シトシン、チミン、グアニン、アデニンから選ばれる１種により修飾されたナノ粒子を用いる。これを模式的に示したものが図２である。金ナノ粒子（Ａｕ）の表面が塩基（Ｂ）で修飾されている。
【００３２】
ただし、金ナノ粒子の表面を直接塩基で修飾することは難しく、例えば図３に示すように、キトサンを介してナノ粒子表面に塩基Ｂを結合させる。前記塩基は、ホスホルアミデート結合により前記キトサンと結合する。また、キトサンは、アルカンチオールを介してナノ粒子表面に結合する。アルカンチオールは、例えばナノ粒子の表面に自己組織化単分子膜として形成されるが、表面には前記キトサンと結合する官能基、例えばカルボキシル基を有することが好ましい。
【００３３】
対象となる遺伝子における変異の種類を識別するための１塩基変異型遺伝子識別用試薬としては、前記シトシン修飾ナノ粒子、チミン修飾ナノ粒子、グアニン修飾ナノ粒子、及びアデニン修飾ナノ粒子の４種類の１塩基修飾ナノ粒子を備えていればよい。
【実施例】
【００３４】
＜測定装置＞
矩形波ボルタメトリー（ＳＷＶ）には、６６０Ａ電気化学測定ワークステーション（CH instruments Inc., Austin, TX）を用いた。UV測定にはSolutionsソフトウエア付きの日立U-3010分光光度計を用い、１ｍＬ用、光路長１０ｍｍの水晶キュベットを用いた。検出は２．０ｍＬセルを用い、カーボンペースト電極（ＣＰＥ，  直径３ｍｍ）、参照極（ＢＡＳ）、対極にＰｔワイヤーを用いて行った。
【００３５】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は大気中で、市販のキット (SPA400-SPI3800, Seiko Instruments Inc., Chiba, Japan)を用いて行い、以下の条件でキャリブレーションした（20 mm xy-scan and 10 mm z-scan range PZT-scanner）。窒化シリコンチップ（SI-DF40, spring constant = 42 N/m, Seiko Instruments Inc.）を用い、画像はダイナミックフォースモード（ＤＦＭ）でとった。ＡＦＭ測定用のマイカ基板はふるうち化学社（東京、日本）より購入した。
【００３６】
＜試薬＞
金コロイドナノ粒子（3.5-6.5 nm, 0.75 A520 units/mL）と、ストレプトアビジンをコートした超常磁性酸化鉄粒子（〜１μｍ）はシグマから購入した。ウシ胸腺由来の２重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と１重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）はシグマから購入した。合成オリゴヌクレオチドはファスマックから購入した。構造はそれぞれ下記のとおり。
プローブ：5'-Biotin- CAA GAC CAC CAC TTC GAA ACC -3'
相補体：5' -GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG -3'
グアニンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GGG GTG GTC TTG -3'
シトシンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GCG GTG GTC TTG -3'
アデニンミスマッチ：5' -GGT TTC GAA GAG GTG GTC TTG -3'
非相補体：5'- GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGC GTGCCCC-3'
【００３７】
オリゴヌクレオチド保存溶液（１００ｍｇ／Ｌ）は１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０，ＴＥ）にて調製し、凍結して保存した。プローブの希釈には２０ｍＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ４．８，ＡＢＳ）を用いた。ターゲットの稀希釈には２０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ  ７．０，ＴＢＳ）を用いた。全ての保存液とバッファーはMillipore Milli-Q system (Bedford, MA)で作成した超純水を用いて調製した。全ての核酸の濃度は分光光度法により決定した。ビオチンとキトサンは和光純薬から購入した。アデノシン５′−モノフォスフェート（Adenosine 5'-monophosphate）, シチジン５′−モノフォスフェート（cytidine 5'-monophosphate）,グアノシン５′−モノフォスフェート（guanosine 5'-monophosphate）, チミジン５′−モノフォスフェート（thymidine 5'-monophosphate）はＩＣＮバイオメディカル社（ICN Biomedicals Inc.）より、また３−メルカプトプロピオン酸（3-mercaptopropionic acid：MPA）,３メルカプトプロパノール（3-mercaptopropanol：MP）, Ｎ−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド  ハイドロクロライド［N-(3-dimethylamino)propyl］-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride：EDC］, 及び Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide：(NHS)はアルドリッチ社（Aldrich）より購入した。他の試薬は分析試薬グレードのものを用いた。全ての実験は室温で行った。
【００３８】
＜手順＞
ストレプトアビジンコートビーズ上へのビオチン化プローブ修飾
プローブ標識ビーズはWang らの報告した方法を改変して調製した。改変部：遠心分離（３分、１２０００ｒｐｍ）後、ビーズの洗浄を０．２％Ｔｗｅｅｎと０．１％ＳＤＳを含むバッファーで行った。
【００３９】
溶液中でのハイブリダイゼーション
プローブ修飾ビーズを１００μＬのハイブリダイゼーション溶液（０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ７．０））に懸濁させた後、ターゲットが含まれるハイブリダイゼーション溶液（１５μｇ／ｍＬ）に添加した。ハイブリダイゼーションは２０分間、室温で静かに撹拌して行った。ハイブリダイゼーション後、ガラス瓶の下に磁石を置くことによって磁場をかけてハイブリ化したビーズを溶液から分離した。分離されたビーズは再びハイブリダイゼーション溶液に懸濁させ、その操作を３回繰り返した。ビーズの磁石による分離及び洗浄のいずれも、非特異的結合の影響を大きく抑制した。
【００４０】
ビオチン修飾ＣＰＥの調製
必要量のグラファイト粉末とミネラルオイル（Acheson 38, Fisher）（３０／７０％（ｗ／ｗ）graphite/oil)をよく混ぜた。その後、カーボンペーストの一部をビオチンと混ぜ、最終的に５％（Ｗ／Ｗ）となるようにした。その混合物をテフロン（登録商標）の電極ホルダーにきつく詰め、なめらかに磨いた。このビオチン修飾ＣＰＥは、その後ハイブリッドストレプトアビジンコートビーズを含むハイブリダイゼーション溶液に浸した。そのビーズを１時間ゆっくりかき混ぜてＣＰＥ上へ固定化した。
【００４１】
１塩基修飾金ナノ粒子の調製
金ナノ粒子上の１塩基による自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）は、既報とほぼ同じようにして調製し、ＭＰＡでコートされた金ナノ粒子を１時間インキュベーションする部分は改変した。キトサン（分子量は不均一）は５ｍＭ  ＡＢＳ（ｐＨ４．５０）に溶解した。その溶液は最終濃度が０．０５％となるようにＡＢＳで定容した。１００μＬの金ナノ粒子溶液に１００μＬのキトサン溶液を加え、１時間保持した。キトサンの第１アミンを、ＳＡＭのカルボキシル末端へ固定化させるためである（ＳＡＭは、２ｍＭ  ＥＤＣと５ｍＭ  ＮＨＳ  ｉｎ  ５０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢＳ，ｐＨ  ７．４０）で、共有結合を活性化しておく）。１塩基溶液は２００μｇ  monobase／ｍＬを含むＴＢＳ溶液とした。１００μＬを１塩基溶液に１００μＬの金／キトサン溶液に加え、１時間放置した。１塩基はキトサンがコートされた金ナノ粒子に５′リン酸基を通じて付着した（固定されたキトサンのフリーのアミノ基とホスホルアミデート結合を形成することによって）。この金/キトサン/１塩基修飾ナノ粒子溶液をハイブリダイゼーションに用いた。
【００４２】
キトサン修飾金ナノ粒子における１塩基装着量の決定
手順は、Patolsky らが報告したものと同様に行った。一時的に、既知の濃度のキトサン修飾金ナノ粒子の吸収スペクトル(0.30 O.D. 520 nm) を１塩基の固定化の前に記録した。１塩基修飾金ナノ粒子の吸収スペクトルは裸の金ナノ粒子の５２０ｎｍでの同じＯ．Ｄ．値で標準化した。ＤＮＡは５２０ｎｍに吸収を持たないので、裸の金ナノ粒子のスペクトルから１塩基修飾金ナノ粒子のスペクトルの値を引くと、関係するＤＮＡの吸収が計算できる。２６０ｎｍにおける吸光度差はＤＮＡ量を表した。既知の金ナノ粒子濃度により、金ナノ粒子上の１塩基の被覆の程度が計算出来る。
【００４３】
１塩基修飾金ナノ粒子のＡＦＭ画像
キトサンと負に荷電したマイカの表面との間の静電的結合を確認するために、無修飾のマイカ基質を用いた。金ナノ粒子溶液（０．３０  Ｏ．Ｄ．）をマイカの上に滴下した。２分後、マイカ基板を１００μＬの超純水で２回洗浄し、窒素ガスで静かに乾燥した。全てのＡＦＭ操作はＤＦＭモード、室温、湿度３０〜４０％で行った。
【００４４】
変異サイトと１塩基修飾金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション
ハイブリッド化−固定化ＣＰＥを、希望する量の金ナノ粒子標識１塩基溶液２．０ｍＬに３７0Ｃで６０分間浸した。その溶液は６０ｍＭ  ＫＣｌと１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2含む２０ｍＭ  ＴＢＳ（ｐＨ７．８  溶液で、２０Ｕ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼＩ(Klenow fragment) を含んでいる。金ナノ粒子への非特異的結合は、Leeらの報告にあるように０．３０Ｍ  ＮａＮＯ3液で電極を洗浄することにより取り除いた。
【００４５】
ＣＰＥ上でのハイブリッド化固定化ビーズの被覆率の計量
ハイブリッド化固定化ビーズの表面被覆率の計量は、Wangらの報告したＤＮＡ中のグアニンのボルタメトリーでの酸化シグナルを測定することで、次のように行った。２重鎖オリゴヌクレオチドの表面密度はグアニンの酸化シグナルを０．５０Ｍ  ＡＢＳ中で（〜１．０Ｖ）ビオチン修飾ＣＰＥを用いて、矩形波ボルタメトリー（パラメーター：amplitude of 25 mV and a step potential of 4 mV at 15 Hz）によって測定し計算した。 
【００４６】
ボルタメトリーの変換
金の酸化シグナルは、ＴＢＳをブランクとし、＋０．５０〜＋１．４０Ｖまでをスキャンし、上述のパラメーターで、矩形波ボルタメトリー（ＳＷＶ）を用いて測定した。生のボルタモグラムは電気化学測定ワークステーションのソフトウエアを用いて、スムージングとベースライン修正を行った。
【００４７】
＜結果と考察＞
理想的なＳＮＰ分析では、８つの可能なＳＮＰをすべて識別し、コード化する必要がある。本実験結果より、１塩基修飾金ナノ粒子を用いてこのゴールに到達したものと考えられる（すなわち、金ナノ粒子はミスマッチ塩基とハイブリすることができ、どのＳＮＰがサンプルの中にあるか正確に明らかにすることができた）。
【００４８】
本実験結果は、未知のＳＮＰｓが、１塩基修飾金ナノ粒子を用いることによって、電気化学的にコードできることを示している。最初のステップでは、ビオチン化したプローブがストレプトアビジンをコートした磁性ビーズに付着する。その後、そのビーズはターゲットＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液に移される。ハイブリダイゼーション後、磁場によって、そのビーズを混合物から分離する。ビーズを洗浄を繰り返した後、ビオチン修飾ＣＰＥを溶液に浸し、ビーズをＣＰＥ表面に固定化する。強いストレプトアビジン／ビオチン親和性を利用して溶液からビーズを集めることにより、電極表面での不要の非特異性結合をさらに抑制できる。その後、１つのバッチ実験では、４つのハイブリ化修飾ＣＰＥ（それらは同じ方法の中で準備されている）を、４つの異なる金ナノ粒子溶液中に浸す。そして、４つの１塩基のボルタモグラムをそれぞれ測定して、ミスマッチ塩基を検出した。
【００４９】
キトサン及び１塩基層による金ナノ粒子の修飾は図２及び図３に示した。キトサンは、アルカンチオールＳＡＭの上に共有結合する。１塩基もまた、ホスホルアミデート結合によりキトサン表面へ付着する。金ナノ粒子のキトサン修飾に対する特性評価をAFMで行い、図４及び図５に示した。修飾無しの裸の金ナノ粒子の場合は、負に荷電したマイカ表面に結合することは出来ない。したがって、マイカ表面(図４)上で５±２nanoparticles/mm2程度観察出来たのみである。これに対し、正に荷電したキトサン修飾では、７３±３nanoparticles/mm2(図５)が静電気的に付着出来た。キトサン修飾により、金ナノ粒子のマイカへの付着は約１５倍に上昇した。裸の金ナノ粒子は、キトサン修飾により５ｎｍから８．４６±１．５３ｎｍまでその大きさを増加させた。この観察では、ナノ粒子の高さについても考慮した。
【００５０】
仮に、変異サイトが、導入された金ナノ粒子に対し相補的な塩基を持っている場合、これらの塩基はＤＮＡポリメラーゼＩの助けを得てハイブリダイゼーションし、電極表面に金ナノ粒子を蓄積させ、金の酸化シグナルを増強させた。金ナノ粒子の１塩基と非ハイブリ化塩基の結合定数は低くなくてはいけないが、１つの粒子が多くの変異サイトへ結合出来ると仮定される。それゆえ、相互依存的な結合が認められた。これらの１．２５Ｖ前後（Gonzales-Garcia らとOzsozらにより報告）での電気化学的シグナルの変化を計測することで、ミスマッチ塩基をコード化することが出来た。
【００５１】
図６にはＡ−Ｃミスマッチによる塩基対置換のハイブリッドから得られた電気化学シグナルを示した。Ａ−Ｃミスマッチを含んだハイブリッドは、１重鎖プローブとＣ−ミスマッチをもつターゲットＤＮＡから作られた。電極をＴを修飾した金ナノ粒子に浸すことにより高いシグナルを示した。なぜなら、ＴはミスマッチしたＡ塩基とハイブリすることが出来るからである。予想どおり、Ｇ修飾金ナノ粒子もミスマッチＣ塩基とのハイブリ後、高いシグナルを示す。これに対し、ＣとＡを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーションでは、いずれも低いシグナルを示した。これらの低いシグナルは金ナノ粒子との非特異的な結合の結果である。それは洗浄の過程で、完全に除去することはできない。４つの異なる１塩基修飾金ナノ粒子を用いてＡ−Ｃミスマッチがコードしたデータは図７に示した。それぞれのバーは平均と平均値と標準偏差（ｎ＝５）を示している。
【００５２】
他の塩基対置換ミスマッチであるＡ−Ｇ対の測定結果もまた、金ナノ粒子の電気化学的酸化シグナル変化として図８のように示された。高いシグナルはＴとＣを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション後に認められ、一方相補的ではないＡとＧを修飾した金ナノ粒子とのハイブリダイゼーション後には低いシグナルが得られた。
【００５３】
塩基対置換ミスマッチの検出はこのプロトコールを用いれば非常に簡単である。いくつかの塩基により構成されるミスマッチ対は、それと相補的な塩基を修飾した金ナノ粒子が付着することで、そのシグナルを増強させる。例えば、Ａ−Ａ対では、図９に示したように電極をＴ修飾金ナノ粒子に浸した場合に有意にシグナルは増強し、他では低い。これらシグナル間での大きな違いが、塩基対置換のミスマッチの検出を非常に簡単、迅速なものにしている。
【００５４】
対照実験はプローブ修飾ビーズを１５μｇ／ｍＬの非相補的ターゲットＤＮＡ、１０  μｇ／ｍＬの２重鎖ＤＮＡおよび１重鎖ＤＮＡに浸して行った。いずれの場合も、これらのＤＮＡのプローブへの非特異的結合は、実験の項で述べたような磁石による分離で抑制された。磁気分離後、非特異的結合をしたＤＮＡはプローブから離れ、ビーズは溶液から集められた。この結果は、非特異的結合の影響を非常に抑制することが出来ることを示しており、それは未知のＳＮＰの検出には非常に重要なことである。
【００５５】
完全に相補的なハイブリッドについても、同様に４つの１塩基修飾金ナノ粒子溶液を用いて検討した（データは示していない）。完全に相補的にハイブリする１塩基修飾金ナノ粒子溶液に浸した場合に低いシグナルが得られた。これらの所見は、金ナノ粒子が２重らせんの中にそれ自身が非特異的に補足されることを示したが、ＳＮＰのコード化には影響を及ぼさなかった。
【００５６】
キトサン修飾金ナノ粒子の1塩基の表面被覆量は次のような分光光度法により決定した。金ナノ粒子上の1塩基の表面被覆量は、5回の計測の結果、平均33(1.42 pmol/cm2であった。サンプル中のナノ粒子の直径のばらつきは少ないにもかかわらず、表面被覆量は、金ナノ粒子上の４つの１塩基において類似していた。
【００５７】
ハイブリッドＤＮＡ固定化ビーズが、ビオチン修飾ＣＰＥ上へ強く吸着され、蓄積されることは、さらに有用であった。ＣＰＥ上への固定化過程は、ＤＮＡのグアニンの酸化によるマイナスシグナルを用いて調べた。全表面に付着する条件（ＤＮＡ溶液の濃度、吸着時間）はグアニンの電流値を測定することで調べた。ＡＢＳ中で、ビーズ濃度９０μｇ／ｍＬ、プローブ６μｇ／ｍＬとターゲット１５μｇ／ｍＬの条件下で、吸着時間６分以上において表面が飽和した。固定化ＤＮＡ層の安定性は、撹拌中のＡＢＳ溶液に浸し、そのシグナルをモニタリングすることで確認した。グアニンの応答は３０分以上たっても減少せず、ＤＮＡ層は安定であることが示された。いろいろな濃度でのＡ−Ｃ  ＳＮＰの場合の電流値の高さをまとめた結果、全表面を被覆した時の値は２９．７５(２．３４ｐｍｏｌ／ｃｍ2であった。ハイブリッド分子のこのような高い密度は金ナノ粒子により多くの結合部位があることを示しており、その結果、この相互依存的な結合が電気化学応答を強めていた。
【００５８】
金ナノ粒子濃度に関連するシグナル増幅について、図１０に示した。金ナノ粒子濃度はハイブリダイゼーション前後（１塩基修飾ナノ粒子と電極表面の高密度の変異部位との）の５２０ｎｍにおける吸光度変化で測定した。このような効果的なハイブリダイゼーション過程は、微量の金の測定に便利であった。Ｓ／Ｎ＝３の場合、これらの検出限界は０．０２  Ｏ．Ｄ．であった。析出時間を長くすることで、さらにシグナルを増加させ、検出限界を下げることが期待できる。金濃度が０．０５  Ｏ．Ｄ．から０．３０  Ｏ．Ｄ．へ増加した場合、金シグナルは直線的に上昇し、０．３０  Ｏ．Ｄ．以上では飽和に達した。それゆえ、０．３０  Ｏ．Ｄ．のキトサン修飾金ナノ粒子溶液は、表面は飽和状態であると結論づけられた。
【００５９】
Millan と Mikkelsenの報告によると、ハイブリッド固定化および裸のＣＰＥから得られたキャリブレーションデータ（データは提示していない）は、１塩基修飾金ナノ粒子の（電極表面の微小環境での）分配係数を推定するのに用いられ、次のような等式で示される。
【００６０】
【数１】
2005227154.tif 000003
AuboundとAufreeは遊離および結合した金ナノ粒子複合体の濃度
ibound はハイブリッド修飾のピーク電流値、ifree は裸のＣＰＥのピーク電流値
【００６１】
この等式の正当性は、Millan と Mikkelsenによれば、次のような仮説に基づいている。（ａ）遊離および結合型の金ナノ粒子の平衡は、ボルタメトリックな時間のスケールでは瞬時に起こる、（ｂ）金ナノ粒子の拡散係数は、ハイブリッドＤＮＡ中とバルク溶液中で同じである、（ｃ）ハイブリッドＤＮＡ中での電極表面の金ナノ粒子の前濃度は、至適金ナノ粒子複合体濃度と有意差は無い。金ナノ粒子の分配係数は、いろいろな金ナノ粒子濃度での、両電極の電流値を用いて、０．９４と推定された。このように高い分配係数は、１塩基修飾金ナノ粒子が（ＤＮＡポリメラーゼの助けを借りて）効果的に固定化変異部位に結合できることを示している。
【００６２】
以上のように、本発明の電気化学的なＳＮＰｓの検出は、マイクロアレイにも適用できる応用範囲の広い方法である。ここでは、塩基対置換とＳＮＰｓが２１塩基のプローブで簡単に識別できることについて述べたが、さらに、この方法をマイクロアレイに適用することにより、いくつものＰＣＲサンプルのミスマッチ塩基を同時に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の基本原理を説明する模式図である。
【図２】１塩基修飾金ナノ粒子を模式的に示す図である。
【図３】キトサンを介して塩基が金ナノ粒子に結合する様子を示す図である。
【図４】裸の金ナノ粒子を示すものであり、（ａ）は平面像、（ｂ）はＡＦＭによる高さの測定結果である。
【図５】１塩基修飾金ナノ粒子を示すものであり、（ａ）は平面像、（ｂ）はＡＦＭによる高さの測定結果である。
【図６】Ａ−Ｃミスマッチによる塩基対置換のハイブリッドから得られた電気化学シグナルを示す特性図である。
【図７】Ａ−Ｃミスマッチにおける測定データである。
【図８】Ａ−Ｇミスマッチにおける測定データである。
【図９】Ａ−Ａミスマッチにおける測定データである。
【図１０】金ナノ粒子濃度によるシグナル増幅を示す特性図である。
【図１】
2005227154.tif 000004
【図２】
2005227154.tif 000005
【図３】
2005227154.tif 000006
【図４】
2005227154.tif 000007
【図５】
2005227154.tif 000008
【図６】
2005227154.tif 000009
【図７】
2005227154.tif 000010
【図８】
2005227154.tif 000011
【図９】
2005227154.tif 000012
【図１０】
2005227154.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月11日(2004.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
＜試薬＞
金コロイドナノ粒子（3.5-6.5 nm, 0.75 A520 units/mL）と、ストレプトアビジンをコートした超常磁性酸化鉄粒子（〜１μｍ）はシグマから購入した。ウシ胸腺由来の２重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と１重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）はシグマから購入した。合成オリゴヌクレオチドはファスマックから購入した。構造はそれぞれ下記のとおり。
プローブ：5'-Biotin- CAA GAC CAC CAC TTC GAA ACC -3'（配列番号１）
相補体：5’ -GGT TTC GAA GTG GTG GTC TTG -3’（配列番号２）
グアニンミスマッチ：5’ -GGT TTC GAA GGG GTG GTC TTG -3’ （配列番号３）
シトシンミスマッチ：5’ -GGT TTC GAA GCG GTG GTC TTG -3’ （配列番号４）
アデニンミスマッチ：5’ -GGT TTC GAA GAG GTG GTC TTG -3’ （配列番号５）
非相補体：5'- GGGGC ACGTT TATCC GTCCC TCCTA GTGGC GTGCCCC-3'（配列番号６）