(57)【要約】【課題】  骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害により大理石骨病を発症する非ヒト動物、及び、該大理石骨病発症モデル非ヒト動物を用いた骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質等のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  免疫活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させて、その遺伝子機能を欠損させたダブルノックアウト（二重欠損）非ヒト動物（ＤＫＯ）を作製する。本発明の大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物を用いて、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質をスクリーニングする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、大理石骨病を発症することを特徴とするＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
大理石骨病が、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害によって引き起こされることを特徴とする請求項１記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項３】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、重度な骨量増加及び破骨細胞への分化障害を生ずるが、正常に生育する症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項４】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬとマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦの存在下において、骨髄細胞が耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣに分化しないという症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項５】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、ビタミンＤ3とデキサメタゾンの存在下、骨芽細胞との共培養において骨髄細胞の耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣへの分化が著しく阻害される症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項６】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、ＰＬＣγのリン酸化およびＣａ2+シグナルを誘導しない症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項７】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、破骨細胞形成転写因子である活性化Ｔ細胞ｃ１核因子ＮＦＡＴｃ１の発現を誘導しない症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項８】
ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害を有するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与すること又は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を被検物質と接触させることを特徴とする骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制、又は、骨代謝促進或いは抑制の測定又は評価を、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害を有するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の場合と野生型非ヒト動物の場合を比較・評価することにより行うことを特徴とする請求項９記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物における骨量の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨代謝促進または抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の破骨細胞前駆細胞におけるＰＬＣ・のリン酸化およびＣａ2+シグナルの増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法
【請求項１３】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の破骨細胞前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、骨髄細胞のＲＡＮＫＬ刺激において、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＰＬＣγのリン酸化の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法を用いることを特徴とする大理石骨病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
予防及び／又は治療薬のスクリーニングが、骨芽細胞や破骨細胞に発現するＩｇＬＲのリガンド或いはレセプター、ＩＴＡＭ分子、ＰＬＣγ、Ｃａ２＋シグナル、及び、ＮＦＡＴｃ１のいずれか１又は２以上に対する被検物質の作用をターゲットとした創薬のためのスクリーニングであることを特徴とする請求項１５記載の大理石骨病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させる特徴を有する抗マウスＴＲＥＭ−２抗体からなる破骨細胞への分化誘導因子。
【請求項１８】
ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させる特徴を有する抗マウスＯＳＣＡＲ抗体からなる破骨細胞への分化誘導因子。
【請求項１９】
ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、抗マウスＴＲＥＭ−２抗体又は抗マウスＯＳＣＡＲ抗体を用いて、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させることを特徴とする骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大理石骨病発症モデル非ヒト動物及び該大理石骨病発症モデル非ヒト動物を用いた骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法等にに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は一度作られると変化しない石のような組織ではない。正常な強度を持った健康な骨組織は、骨形成と骨吸収とがバランス良く行われてはじめて維持される。この形成と吸収を司るのは、骨芽細胞と破骨細胞である。破骨細胞による吸収が行われないと、骨は硬化して骨髄空がなくなる大理石骨病となるが、形成より吸収が上回ると骨密度が低下して骨粗鬆症になる。また関節の破壊においても破骨細胞が重要である。そして、骨芽細胞と破骨細胞の制御のしくみにおいては、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導が深く関わってくる。
【０００３】
ところで、効率的な免疫細胞活性化には共刺激シグナルが必要である（Annu. Rev. Immunol. 14, 233-258, 1996）が、それらが他の生物系に寄与しているかどうかは、未だにわかっていない。骨格系の発達及びホメオスタシスは、骨形成及び骨吸収のバランスに依存している（Dev. Cell. 2, 389-406, 2002; Science 289, 1508-1514, 2000）。ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在下において、骨吸収細胞、すなわち破骨細胞の分化の制御に深く関与している（Nat. Rev. Genet. 4, 638-649, 2003; Nature 423, 337-342, 2003）。しかし、ＲＡＮＫＬが、破骨細胞形成の重要な転写因子である活性化Ｔ細胞ｃ１の核因子（ＮＦＡＴｃ１）の誘導につながるＣａ2+シグナルを活性化する機序は、今も不明である（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）。
【０００４】
ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦにより誘導される破骨細胞分化は、免疫細胞中でＣａ2+シグナル伝達を活性化するＩＴＡＭを含む膜アダプター分子であるＫＡＲＡＰ又はＴＹＰＯＢＰ（J. Immunol. 158, 5083-5086, 1997; Nature 391, 703-707, 1998）としても知られる、ＤＡＰ１２欠損マウス由来の骨髄単球／マクロファージ系統細胞（ＢＭＭ）（１６参照）中ではかなり阻害されている。このインビトロでの観察結果にもかかわらず、ＤＡＰ１２欠損（ＤＡＰ１２-/-）マウスは、軽度の大理石骨病を示すのみで、通常数の破骨細胞を有している。このことは、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦにより誘導された破骨細胞形成系においてＤＡＰ１２を介したシグナルは重要な役割を果たしているが、他の分子はそうしたＤＡＰ１２の欠損をインビボで回避できることを示唆している（J. Clin. Invest. 111, 323-332, 2003）。この矛盾についてその分子的機序を調べるため、間質細胞／骨芽細胞を厳密に欠乏させた後で、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦでＢＭＭを刺激した（Nature 408, 600-605, 2000）。
【０００５】
この無骨芽細胞系では、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭ（図１ａ）における破骨細胞の分化は完全に消滅している。破骨細胞のマーカー酵素である耐酒石酸ホスファターゼに陽性の多核細胞（ＴＲＡＰ+  ＭＮＣ）の形成はまったく観察されなかったのである。こうした分化の阻害は、ＤＡＰ１２のレトロウィルス発現により、効率的に回復されるが、ＩＴＡＭシグナルの伝達が欠損しているＤＡＰ１２変異体であるＤＡＰ１２Ｙ６５Ｆによっては回復されず（J. Biol. Chem. 273, 34115-34119, 1998）（図１ｂ）、この系における破骨細胞の形成にはＤＡＰ１２を介したＩＴＡＭシグナルが必要であることを示している。興味深いことに、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭは、骨芽細胞との共培養で破骨細胞の分化が生じる（Endocrinology 123, 2600-2602, 1988）（図１ｃ）。このことは、骨芽細胞が、ＤＡＰ１２を介したＩＴＡＭシグナルを補うシグナルを刺激できることを示している。この代償機構は、ＤＡＰ１２-/-マウスにおけるインビボでの正常な破骨細胞分化を説明するものかもしれない（図５ａ及び５ｂ参照）。
【０００６】
破骨細胞会合受容体（ＯＳＣＡＲ）は、ＲＡＮＫＬで刺激したＢＭＭ中で誘導される活性型免疫グロブリン様受容体である（J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002）。骨芽細胞中での推定ＯＳＣＡＲリガンドの発現（J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002）により、本発明者らは、ＤＡＰ１２を介したシグナル伝達を補う候補受容体としてのＯＳＣＡＲの研究に取り組んだ。ＯＳＣＡＲが会合するアダプター分子を探求するため、本発明者らは、ＩｇＧ用IIＢ型ＦｃＲγ（ＦｃＲγIIＢ）の細胞外部分及びＯＳＣＡＲの膜貫通部分及び細胞質部分から構成されるキメラ受容体（ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲ）を作製した。フローサイトメトリー分析により、ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲの発現は、ＦｃＲγと共トランスフェクトした場合のみ有意に増大することが明らかになった（図１ｄ）。このように、ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲは、ＤＡＰ１２と同じ起源をもつ他のＩＴＡＭ含有膜アダプターであるＦｃＲγと優先的に会合するが、ＤＡＰ１２又はＤＡＰ１０とは会合しない。ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲとＦｃＲγとの排他的な会合は、免疫沈降分析でも確認された（図５ｃ）。
【０００７】
かかる結果を受けて、本発明者らは取り急ぎ、ＦｃＲγ欠損マウス（ＦｃＲγ-/-マウス）の骨表現型の調査を行った（Cell 76, 519-529, 1994）。しかし、野生型マウスとＦｃＲγ-/-マウスとの間に、破骨細胞数及び骨梁量の有意な差は見られなかった（図１ｅ及び図５ｄ）。また、野生型マウスとＦｃＲγ-/-マウスとの間で、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ系（図５ｅ）及び共培養系のどちらにおいても、破骨細胞分化における相違は、あったとしてもごくわずかなものであった。ＯＳＣＡＲ−Ｆｃはインビトロでの破骨細胞形成を抑制すると報告されているが（J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002）、今回の結果は、ＦｃＲγを介したシグナルが、インビボにおいて他のシグナルで補えることを示唆している。
【非特許文献１】Annu. Rev. Immunol. 14, 233-258, 1996。
【非特許文献２】Dev. Cell. 2, 389-406, 2002。
【非特許文献３】Science 289, 1508-1514, 2000。
【非特許文献４】Nat. Rev. Genet. 4, 638-649, 2003。
【非特許文献５】Nature 423, 337-342, 2003。
【非特許文献６】Dev. Cell. 3, 889-901, 2002。
【非特許文献７】J. Immunol. 158, 5083-5086, 1997。
【非特許文献８】Nature 391, 703-707, 1998。
【非特許文献９】J. Clin. Invest. 111, 323-332, 2003。
【非特許文献１０】Nature 408, 600-605, 2000。
【非特許文献１１】J. Biol. Chem. 273, 34115-34119, 1998。
【非特許文献１２】Endocrinology 123, 2600-2602, 1988。
【非特許文献１３】J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002。
【非特許文献１４】J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002。
【非特許文献１５】Cell 76, 519-529, 1994。
【非特許文献１６】J. Exp. Med. 195, 201-209, 2002。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、大理石骨病発症モデル非ヒト動物、特に、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害により大理石骨病を発症する非ヒト動物、及び、該大理石骨病発症モデル非ヒト動物を用いた骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法、更には骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導因子等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、破骨細胞ができるときに必要となる経路について研究を行う中で、新しい経路を発見した。つまりこれまでＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦという２つのシグナルだけで十分であると考えられてきた破骨細胞の分化に、第３のシグナル経路を司る免疫グロブリン様レセプター群が不可欠である経路を発見した。具体的には、免疫活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させて、その遺伝子機能を欠損させたダブルノックアウト（二重欠損）マウス（ＤＫＯ）を作製し、ＤＫＯが重度な大理石骨病を呈し、破骨細胞分化障害を示すことを見い出した。これらＩｇＬＲ群から入力されるシグナルがアダプター分子ＤＡＰ１２とＦｃＲγの免疫受容体チロシン活性化モチーフＩＴＡＭを介して伝達され、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞分化に必須であることを明らかにした。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基くもので、本発明の大理石骨病を発症するモデル非ヒト動物は、免疫系活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物からなるものである。本発明の大理石骨病を発症するモデル非ヒト動物においては、大理石骨病が、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害によって引き起こされる。本発明におけるダブルノックアウト非ヒト動物の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害は、重度な骨量増加及び破骨細胞への分化障害を生ずるが、正常に生育する症状として発生し；ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬとマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦの存在下において、骨髄細胞が耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣに分化しないという症状として発生する。
【００１１】
また、本発明におけるダブルノックアウト非ヒト動物の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害は、ビタミンＤ3とデキサメタゾンの存在下、骨芽細胞との共培養において骨髄細胞の耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣへの分化が著しく阻害される症状として発生し；骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、ＰＬＣγのリン酸化およびＣａ2+シグナルを誘導しない症状として発生し；骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、破骨細胞形成転写因子である活性化Ｔ細胞ｃ１核因子ＮＦＡＴｃ１の発現を誘導しない症状として発生する。
【００１２】
本発明の開発の概略について説明すると、ＦｃＲγ／ＤＡＰ１２が介するＩＴＡＭシグナルとＲＡＮＫＬは強調的に働き、骨ホメオスタシスの維持に必須である。骨代謝は骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスにより維持されている。過剰な骨吸収は骨粗鬆症などの骨減少を、骨吸収の低下は大理石骨病などの骨硬化を生じる。このように骨疾患の発症機構の解明には破骨細胞分化の制御機構の理解が必要である。破骨細胞分化の誘導はＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦにより制御されているが、この過程において協調的に働くシグナルについては良く知られていない。本発明者は、以前、活性化モチーフであるＩＴＡＭを有するアダプター分子ＤＡＰ１２欠損マウスの解析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦにより誘導される破骨細胞分化が著しく阻害されることを報告した。しかし、これらのマウスはｉｎ  ｖｉｖｏでは軽度な大理石骨病と正常な破骨細胞分化を観察し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの代償機構の存在が示唆された。
【００１３】
この研究において本発明者は、まず、骨芽細胞との共培養系においてＤＡＰ１２−／−骨髄細胞は破骨細胞に誘導できること、骨芽細胞上の分子を認識し破骨細胞分化を誘導する活性化受容体ＯＳＣＡＲがＩＴＡＭを有するアダプター分子Ｆｃレセプターγ鎖（ＦｃＲγ）と会合することを見出した。ＦｃＲγ欠損マウスの破骨細胞分化・機能に異常は認められなかったが、ＤＡＰ１２とＦｃＲγ二重欠損マウス（ＤＫＯ）を作製したところ、ＤＫＯが重度な大理石骨病を呈し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても破骨細胞分化障害が観察された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの破骨細胞分化障害はＤＡＰ１２およびＦｃＲγ遺伝子導入によりＩＴＡＭ依存的に回復すること、また破骨細胞前駆細胞でＤＡＰ１２とＦｃＲγはそれぞれimmunoglolin-like receptor(ＩｇＬＲ)に属するＴＲＥＭ−２やＳＩＲＰ−βおよびＯＳＣＡＲやＰＩＲ−Ａと会合することを見出し、これらＩｇＬＲの抗体による架橋刺激はＲＡＮＫＬによる破骨細胞分化誘導を増強させた。
【００１４】
更に、ＲＡＮＫＬ刺激がＤＡＰ１２とＦｃＲγのチロシンリン酸化を誘導後、ＰＬＣγを介してカルシウムシグナルを活性化し、破骨細胞分化に必須な転写因子ＮＦＡＴｃ１を誘導することが明らかとなった。このようにアダプター分子ＤＡＰ１２とＦｃＲγが介するＩＴＡＭシグナルがＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞分化に必須であることを明らかにした。従って、これらの知見が、骨粗鬆症や大理石骨病などの骨疾患の発症機序の解明、更には骨芽細胞や破骨細胞に発現するＩｇＬＲのリガンド、レセプター、ＩＴＡＭ、そのシグナル伝達分子などをターゲットとした骨疾患の新たな治療法の開発につなげることを可能とする。
【００１５】
以上が本発明の開発の概略であるが、本発明は、また、本発明の大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物を用いて、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質をスクリーニングする方法、及び該スクリーニング方法を用いて、大理石骨病の予防及び／又は治療薬をスクリーニング方法を包含する。更に、本発明は、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、抗マウスＴＲＥＭ−２抗体又は抗マウスＯＳＣＡＲ抗体を用いて、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させる骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導方法及び該方法に用いられる抗マウスＴＲＥＭ−２抗体又は抗マウスＯＳＣＡＲ抗体からなる分化誘導因子を包含する。
【００１６】
すなわち具体的には本発明は、免疫系活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、大理石骨病を発症することを特徴とするＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項１）や、大理石骨病が、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害によって引き起こされることを特徴とする請求項１記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項２）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、重度な骨量増加及び破骨細胞への分化障害を生ずるが、正常に生育する症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項３）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬとマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦの存在下において、骨髄細胞が耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣに分化しないという症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項４）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、ビタミンＤ3とデキサメタゾンの存在下、骨芽細胞との共培養において骨髄細胞の耐酒石酸ホスファターゼ陽性破骨細胞ＴＲＡＰ+ＭＮＣへの分化が著しく阻害される症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項５）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、ＰＬＣγのリン酸化およびＣａ2+シグナルを誘導しない症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項６）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害が、骨髄細胞よりマクロファージコロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦで誘導した破骨細胞前駆細胞がＮＦ−κＢ活性化受容体リガンドＲＡＮＫＬ刺激に対し、破骨細胞形成転写因子である活性化Ｔ細胞ｃ１核因子ＮＦＡＴｃ１の発現を誘導しない症状として発生することを特徴を有する請求項２記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項７）や、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物（請求項８）からなる。
【００１７】
また本発明は、請求項１〜８のいずれか記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害を有するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与すること又は該動物由来の組織、器官若しくは細胞を被検物質と接触させることを特徴とする骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法（請求項９）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制、又は、骨代謝促進或いは抑制の測定又は評価を、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害を有するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の場合と野生型非ヒト動物の場合を比較・評価することにより行うことを特徴とする請求項９記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１０）や、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物における骨量の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨代謝促進または抑制物質のスクリーニング方法（請求項１１）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の破骨細胞前駆細胞におけるＰＬＣ・のリン酸化およびＣａ2+シグナルの増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１２）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の破骨細胞前駆細胞におけるＮＦＡＴｃ１の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニングにおける測定又は評価を、骨髄細胞のＲＡＮＫＬ刺激において、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγおよびＰＬＣγのリン酸化の増減を指標として行うことを特徴とする請求項9又は１０記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、請求項９〜１４のいずれか記載の骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質のスクリーニング方法を用いることを特徴とする大理石骨病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１５）や、予防及び／又は治療薬のスクリーニングが、骨芽細胞や破骨細胞に発現するＩｇＬＲのリガンド或いはレセプター、ＩＴＡＭ分子、ＰＬＣγ、Ｃａ２＋シグナル、及び、ＮＦＡＴｃ１のいずれか１又は２以上に対する被検物質の作用をターゲットとした創薬のためのスクリーニングであることを特徴とする請求項１５記載の大理石骨病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法（請求項１６）や、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させる特徴を有する抗マウスＴＲＥＭ−２抗体からなる破骨細胞への分化��導因子（請求項１７）や、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させる特徴を有する抗マウスＯＳＣＡＲ抗体からなる破骨細胞への分化誘導因子（請求項１８）や、ＲＡＮＫＬとＭ−ＣＳＦの存在下において、抗マウスＴＲＥＭ−２抗体又は抗マウスＯＳＣＡＲ抗体を用いて、架橋刺激により骨髄細胞の破骨細胞分化誘導を増強させることを特徴とする骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導方法（請求項１９）からなる。
【発明の効果】
【００１８】
骨は一度作られると変化しない石のような組織ではなく、正常な強度を持った健康な骨組織は、骨形成と骨吸収とがバランス良く行われてはじめて維持される。この形成と吸収を司るのは、骨芽細胞と破骨細胞である。破骨細胞による吸収が行われないと、骨は硬化して骨髄空がなくなる大理石骨病となるが、形成より吸収が上回ると骨密度が低下して骨粗鬆症になる。また関節の破壊においても破骨細胞が重要である。したがって、骨芽細胞と破骨細胞の制御のしくみを理解し、薬剤などで人為的にコントロールすることは、骨ホメオスタシスのために、或い骨形成と骨吸収とがバランスの不均衡から発症する疾病の予防或いは治療のために重要な課題である。
【００１９】
本発明により、大理石骨病を発症するモデル非ヒト動物の提供が可能となったことにより、骨粗鬆症や大理石骨病など骨疾患の発症機序の解明が可能になった。これらの骨疾患の発症機序の解明は、骨芽細胞に発現するＩｇＬＲのリガンド、レセプター、ＩＴＡＭ、そのシグナル伝達分子などをターゲットとした骨疾患の新たな治療法の開発につながることが期待される。更に、本発明においては、本発明のモデル非ヒト動物を用いて、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質をスクリーニングする方法、更には該スクリーニング方法を用いて、大理石骨病の予防及び／又は治療薬をスクリーニングすることができ、骨疾患の新たな治療法の開発に大きな貢献が期待される。かかるように、本発明は、破骨細胞の分化を制御する薬剤の開発、骨粗鬆症や関節リウマチを含めた骨疾患の治療につながるなど、広範囲に応用が期待される。近年、骨の細胞が免疫系と同じメカニズムによって制御されていることが注目を集めているが、本研究によってこの「骨免疫学」の分野に新たな展開が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、免疫系活性化シグナル伝達を担う膜アダプター分子ＤＮＡＸ活性化タンパク質ＤＡＰ１２をコードする遺伝子とＦｃ受容体共通γサブユニットＦｃＲγをコードする遺伝子を欠損或いは変異させることにより、大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物を作製することよりなる。本発明のＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物における大理石骨病は、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の障害によって引き起こされる。
【００２１】
ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物を作製するためには、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子の遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちこれらのシグナル分子及び膜アダプター分子のタンパク質のノックアウト動物を作製する。これらのノックアウト動物は、文献（Cell 76, 519-529, 1994）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、例えば、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、シグナル分子及び膜アダプター分子のタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされた遺伝子を組換えＤＮＡ技術により、シグナル分子の遺伝子の全部又は一部を、例えばネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲティングベクターを作製し、この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
【００２２】
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスと交配させると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交配させることによって、シグナル分子及び膜アダプター分子のノックアウトマウスを得ることができる。そして、かかるシグナル分子及び膜アダプター分子のノックアウトマウスにおけるシグナル分子の遺伝子が染色体上で欠損していることを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスの尾からＤＮＡを単離してサザンブロット法等により調べる方法や、このマウスの骨髄マスト細胞等から抽出したタンパク質をイムノブロット分析等により調べる方法等を挙げることができる。
【００２３】
本発明における、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導促進或いは抑制物質、又は、骨代謝促進或いは抑制物質をスクリーニングする方法、更には該スクリーニング方法を用いて、大理石骨病の予防及び／又は治療薬のスクリーニング方法としては、本発明の大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与する方法や、本発明の大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる方法を挙げることができる。大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物由来の組織、器官、若しくは細胞を被検物質と接触させる方法としては、大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物、例えば、前記大理石骨病を発症する非ヒト動物シグナル分子及び膜アダプター分子のノックアウトマウス由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触させ、該細胞における大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子がコードするタンパク質の発現を測定・評価する方法を具体的に例示することができる。
【００２４】
また、大理石骨病を発症するＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物に被検物質を投与する方法としては、例えば、大理石骨病を発症に関与するシグナル分子及び膜アダプター分子のノックアウトマウスに被検物質を投与し、該マウス由来の組織、器官、又は細胞における大理石骨病の発症に関与するシグナル分子及び膜アダプター分子のタンパク質の発現等、大理石骨病を発症に関与するシグナル分子及び膜アダプター分子を測定・評価する方法や、前記大理石骨病を発症に関与するシグナル分子及び膜アダプター分子をノックアウトしたマウスに被検物質を投与し、該非ヒト動物における大理石骨病の発症を測定・評価する方法挙げることができる。本発明において、大理石骨病の発症を、測定・評価するには、骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導を測定・評価することによって行うことができる。
【００２５】
本発明におけるＤＡＰ１２及びＦｃＲγ遺伝子ダブルノックアウト非ヒト動物の作製及び骨髄細胞の破骨細胞への分化誘導の確認について、以下に詳述する。
ＤＡＰ１２とＦｃＲγの代償的機能（Nat. Rev. Immunol. 2, 580-592, 2002）を考慮して、両方の分子を欠損したマウスを作製した（ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス）。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスは、吸収されなかった骨で骨髄が満たされた、重篤な大理石骨病を示した（図２ａ）。ＤＡＰ１２-/-マウスは、破骨細胞作用の障害による軽度の大理石骨病を示した（J. Clin. Invest. 111, 323-332, 2003）が、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの大理石骨病は、マイクロＸ線写真（図２ａ）及び骨梁量（図２ｂ）に見られるように、更に重篤なものであった。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスにおいて、破骨細胞がほとんど観察されなかったのは、重要なことである。これは、破骨細胞の作用が不完全だったためでなく、破骨細胞の分化が不完全だったために大理石骨病が生じたことを示している（図２ｃ及び２ｅ）。骨の形態計測解析により、骨芽細胞の骨形成も減少したことがわかった（図２ｄ及び図６ａ）。
【００２６】
このように、ＩＴＡＭ含有アダプターであるＦｃＲγとＤＡＰ１２は、インビボでの破骨細胞分化に必須だといえる。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスにおける重篤な大理石骨病にもかかわらず、それらのマウスの歯牙萌出には欠陥がなかった。加えて、骨端板直下の限定的な領域に、非常に少数のＴＲＡＰ+  ＭＮＣを認めた（図２ｅ及び図６ｂ）。これは、他のアダプター分子が特定の条件下で機能を補うことを示唆している。培養系においては、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-破骨細胞の前駆細胞は、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦに応答した破骨細胞の分化を起こせない（図３ａ）。ＤＡＰ１２のレトロウィルスをＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞へ移入すると、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦが誘導する破骨細胞の分化は効率的に回復するが、ＤＡＰ１２Ｙ６５Ｆ又はＦｃＲγの場合は回復しない。また、骨芽細胞と共培養した場合でさえ、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-前駆細胞が破骨細胞に分化することはほとんどない（図３ｂ）。共培養系においては、ＦｃＲγのレトロウィルス移入によっても、部分的ではあるが、破骨細胞の分化が回復するが、ＩＴＡＭ欠損ＦｃＲγＹ６５Ｆの場合は回復しない。こうした結果は、ＦｃＲγ及びＤＡＰ１２を介したＩＴＡＭシグナルがＲＡＮＫＬ誘導型破骨細胞形成に必須であること、及びアダプターを介したシグナルのそれぞれが、個別に制御されていることを示唆している。
【００２７】
ＦｃＲγ又はＤＡＰ１２は、ミエロイド系統細胞における細胞活性化のため、いくつかの特異的な免疫受容体と会合する（Nat. Rev. Immunol. 3, 445-453, 2003; Nat. Rev. Immunol. 2, 580-592, 2002; Nat. Rev. Immunol. 1, 41-49, 2001）。破骨細胞系統細胞においてＦｃＲγ及びＤＡＰ１２に会合する受容体を同定するため、GeneChip分析により既知の候補受容体のｍＲＮＡの発現プロフィールをスクリーニングしたところ、一連の受容体及びＩＴＡＭ会合分子がＦｃＲγ及びＤＡＰ１２と同様に破骨細胞系統細胞で発現していることがわかった（図７ａ）。これらの推定ＦｃＲγ及びＤＡＰ１２会合受容体は、ビオチンでの細胞表面の標識を利用して、破骨細胞系統の表面で検出された（図７ｂ及び７ｃ）。それらのなかでも、免疫沈降実験により、破骨細胞系統におけるＰＩＲ−Ａ、ＦｃγＲIII、及びＯＳＣＡＲとＦｃＲγとの、並びに、ＴＲＥＭ−２及びＳＩＲＰβ１とＤＡＰ１２とのペアリングを確認したが、ＮＫＧ２ＤとＤＡＰ１２とのペアリングは確認されなかった（図３ｃ）。
【００２８】
受容体を介したこれらのシグナルが、ＦｃＲγ又はＤＡＰ１２との会合によって破骨細胞の分化を促進するかどうかをテストするため、ＯＳＣＡＲ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭ−２及びＳＩＲＰβ１に対するプレート結合モノクローナル抗体でＢＭＭを刺激した。抗体で架橋することにより各受容体を刺激したところ、ＲＡＮＫＬの誘導による破骨細胞分化が加速し、ＲＡＮＫＬが低濃度の場合に刺激作用がより顕著ではあるものの、これらの受容体が活性化という役割を果たしていることが示された（図３ｄ及び図７ｄ）。ＲＡＮＫＬの非存在下では、これらの受容体を刺激しただけでは、破骨細胞の分化を誘導できなかった。このことは、受容体を介したこれらのシグナルはＲＡＮＫＬと協調して作用するが、シグナルの代替物とはならないことを示唆している。抗ＯＳＣＡＲ抗体及び抗ＰＩＲ抗体による刺激作用は、ＦｃＲγ-/-ＢＭＭでは認められなかった。
【００２９】
その一方で、抗ＴＲＥＭ−２抗体及び抗ＳＩＲＰβ１抗体は、ＦｃＲγ-/-ＢＭＭにおいて、野生型ＢＭＭにおける場合と同様の刺激作用を有しており（図３ｅ）、これは、ＦｃＲγがＯＳＣＡＲ及びＰＩＲ−Ａの刺激機能に必要であることを示すものである。ＦｃＲγ会合受容体を通じて骨芽細胞がＤＡＰ１２の欠損を回復するという観察結果と一致して、抗ＯＳＣＡＲ抗体及び抗ＰＩＲ抗体は、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭからは破骨細胞形成を回復できたが、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞からは回復できなかった（図３ｆ）。ＴＲＥＭ−２及びＳＩＲＰβ１などのＤＡＰ１２会合受容体の刺激は、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭに対して回復作用を示さなかった。これは、ＴＲＥＭ−２及びＳＩＲＰβ１を介した刺激作用にＤＡＰ１２が必要であることを示している（図３ｆ）。
【００３０】
ＩＴＡＭシグナルはどのようにしてＲＡＮＫＬにより誘導されるシグナル伝達に寄与しているのだろうか。この問題に取り組むため、野生型マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス由来のＲＡＮＫＬで刺激した破骨細胞前駆細胞におけるｍＲＮＡ発現についてゲノム全体のスクリーニングを行った。ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する転写因子及びエフェクター分子（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）のなかでも、ＮＦＡＴｃ１の誘導が、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞において最も強く抑制されていた（図４ａ）。
【００３１】
ＮＦＡＴｃ１、ｃ−Ｆｏｓ及びＴＲＡＦ６を含む、破骨細胞形成の必須分子（Dev. Cell. 2, 389-406, 2002; Nat. Rev. Genet. 4, 638-649, 2003; Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）のタンパク質発現を分析したところ、ＲＡＮＫＬに刺激されたＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞におけるＮＦＡＴｃ１の発現はほとんど検出されないが、ｃ−Ｆｏｓ又はＴＲＡＦ６の発現は同条件下で依然として認められることが判明した（図８ａ）。下流の標的としてのＮＦＡＴｃ１の重要な役割を確認するため、ＮＦＡＴｃ１、ｃ−Ｆｏｓ又はＴＲＡＦ６の異所性発現が、レトロウィルスを介した遺伝子移入によるＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞における破骨細胞の分化阻害を回復するかどうかを調べた。ＮＦＡＴｃ１の異所性発現は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞における場合でさえ、効率的な破骨細胞の形成をもたらしたが、ｃ−Ｆｏｓ又はＴＲＡＦ６の場合は、そうならなかった（図４ｂ）。
【００３２】
ＲＡＮＫＬにより誘導されるＣａ2+シグナル伝達は、破骨細胞形成期のＮＦＡＴｃ１遺伝子の自動増幅に必須である（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）が、その一方で、免疫グロブリン様受容体は、免疫細胞中でＩＴＡＭを介してＰＬＣγとＣａ2+シグナル伝達を活性化する（Nat. Rev. Immunol. 3, 445-453, 2003; Nat. Rev. Immunol. 2, 580-592, 2002）。そのため、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス由来のＲＡＮＫＬで刺激した破骨細胞前駆細胞におけるＣａ2+シグナル伝達を調べてみた。図４ｃに示すように、ＲＡＮＫＬにより誘導されたＣａ2+の振動は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞では有意に認められなかった。
【００３３】
このことは、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＣａ2+シグナル伝達の阻害は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞におけるＮＦＡＴｃ１の誘導障害を説明するかもしれないことを示唆している。さらに、抗ＰＩＲ抗体による刺激は、ＤＡＰ１２-/-細胞におけるＣａ2+シグナル伝達の欠陥及びＮＦＡＴｃ１の発現を回復することができた。このことは、ＮＦＡＴｃ１の誘導及び破骨細胞の形成へとつながるＲＡＮＫＬにより誘導されるＣａ2+シグナルの活性化には、免疫受容体の刺激が必要であることを示唆している（図４ｃ及び図８ｂ）。こうした知見は総合的に、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞分化プログラムにおける重要な工程である、Ｃａ2+シグナル伝達を通じてのＮＦＡＴｃ１の誘導には、ＦｃＲγ及びＤＡＰ１２が必要であることを示唆している。
【００３４】
ＲＡＮＫＬとＩＴＡＭを介したＣａ2+シグナル伝達とをつなげる機構に対するさらなる洞察を得るため、本発明者らは、ＲＡＮＫＬが誘導するリン酸化の分析を行った。その後、ＲＡＷ２６４．７細胞における場合と同様に、ＢＭＭにおいても、ＲＡＮＫＬがＦｃＲγ及びＤＡＰ１２の両方のリン酸化を誘導することが判明した（図４ｄ）。さらに、本発明者らは、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞において、ＲＡＮＫＬにより誘導されるＰＬＣγのリン酸化の障害が認められる（図４ｅ）が、ＲＡＮＫＬにより誘導されるｐ３８、ＪＮＫ及びＩκＢのリン酸化は、これらの細胞において影響を受けていないことを実証した（図８ｃ）。このことは、ＦｃＲγ及びＤＡＰ１２が、ＰＬＣγ−Ｃａ2+経路に特異的に関与していることを示唆している。また、免疫細胞中でＩＴＡＭに補充されることが知られている、Ｓｙｋキナーゼの阻害剤であるピセアタンノールは、破骨細胞形成に対する阻害作用を有している（図８ｄ）。
【００３５】
本発明者らは、ＩＴＡＭ含有アダプターであるＦｃＲγとＤＡＰ１２が、ＲＡＮＫＬにより誘導されるシグナル伝達カスケードと協調して、破骨細胞の末期分化に必須のシグナルを伝達することを示した。免疫系と同様に（Nat. Rev. Immunol. 3, 445-453, 2003; Nat. Rev. Immunol. 2, 580-592, 2002）、本研究は、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞分化におけるＩＴＡＭを介した共刺激シグナルの重要性を確立するものである（図４ｆ）。免疫受容体のリガンドの大半は未だに同定されていないが、区別可能な細胞型により推定リガンドがわかる。破骨細胞前駆細胞それ自体が排他的にＤＡＰ１２会合受容体を刺激するが、骨芽細胞もＦｃＲγ会合受容体を刺激する。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスにおける骨芽細胞機能の欠陥は、これらの受容体を通じた破骨細胞−骨芽細胞間の情報伝達が、骨の吸収と形成を結びつけていることを示唆するものである。
【００３６】
ＦｃγＲIIＢ及びＰＩＲ−Ｂなどの阻害型受容体（図７ａ）が破骨細胞の分化におけるＩＴＡＭシグナルの相殺に寄与しているのかどうかは、まだ不明である。免疫系中でＩＴＡＭシグナルを相殺するＳＨＰ−１又はＳＨＩＰ−１などのホスファターゼを欠損したマウスにおいて、破骨細胞形成が増大するとの報告は有名である（Bone 25, 261-267, 1999; Nat. Med. 8, 943-949, 2002）。ＩＴＡＭ含有アダプター及びその会合受容体の変異は、骨格系の病態に関連しており（Am. J. Hum. Genet. 71, 656-662, 2002; J. Exp. Med. 198, 669-675, 2003; J. Exp. Med. 198, 645-651, 2003）、このことは、共刺激シグナルの制御により骨格系障害の治療に対する新規戦略が提供されることを示唆している。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
［方法］
（マウス及び骨表現型の分析）
１２９／ＳｖＪとＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）との雑種の背景をもつＤＡＰ１２-/-マウス（J. Clin. Invest. 111, 323-332, 2003）と、Ｂ６の背景をもつＦｃＲγ-/-マウス（Cell 76, 519-529, 1994）を交配させて得たＤＡＰ１２+/-ＦｃＲγ+/-マウスの雄と雌を交配させて、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスを作製した。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスは、大きな異常もなく正常に成長し、繁殖能力を有していた。文献（J. Exp. Med. 189, 1573-1579, 1999）にＦｃγＲIII-/-マウスが記載されている。実験はすべて適切な同腹子のコントロールを用いて行った。組織学的検査、組織形態学的検査及びマイクロＸ線検査は、基本的に文献（Nature 416, 744-749, 2002）記載のものと同じ方法を用いて行った。Student's t-test（＃Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１）を用いて統計学的分析を行った。マウスはすべて無菌状態で出生し、飼育された。
【００３９】
（フローサイトメトリー及び免疫沈降）
ＦｃＲγ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０及びＦｃＲγＲIIＢの細胞外領域をコードするＲIIＢ−ＯＳＣＡＲのｃＤＮＡ、並びにＯＳＣＡＲの膜貫通領域及び細胞質領域を、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏベクター（BD Biosciences社製）に挿入した。２９３Ｔ細胞を一時的にこれらのベクターでトランスフェクトし、４８時間後に回収し、ＰＥ抱合型抗ＦｃγＲIIＢ／III抗体（２．４Ｇ２）で染色し、フローサイトメトリーでモニターした。免疫沈降のために、細胞をジギトニン緩衝液（１％のジギトニン、１３．６ｍＭのトリエタノールアミン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのヨードアセトアミド、プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．８）に溶解した。
【００４０】
２．４Ｇ２（ＡＴＣＣ）、抗ＯＳＣＡＲ抗体、抗ＴＲＥＭ−２抗体（６Ｅ９）（T. Takai氏が調製）、抗ＰＩＲ抗体（６Ｃｌ、H. Kubagawa博士より供与）、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（Santa Cruz社製）及び抗ＳＩＲＰβ１抗体（T. M.氏が調製）並びにプロテインＡセファロースで、細胞溶解液をインキュベーションした。新しく調製した抗体の特異性を、フローサイトメトリー及びＩＴＡＭを介したシグナル伝達に対する反対作用によって測定した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＦｃＲγ抗体又は抗ＤＡＰ１２抗体（T. Takai氏が調製）でイムノブロットした。
【００４１】
（インビトロでの破骨細胞形成）
本発明者らは、以前の文献（Nature 408, 600-605, 2000; Nature 416, 744-749, 2002）で、インビトロでの破骨細胞形成方法について記載している。すなわち、付着細胞を除去した後、１０％のＦＢＳ（Sigma社製）を添加した、１０ｎｇｍｌ-1のＭ−ＣＳＦ（Genzyme社製）を含有するα−ＭＥＭ（Gibco BRL社製）で、非付着骨髄細胞を培養した。２日後、付着細胞をＢＭＭとして使用した。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの単球／マクロファージ前駆細胞は、脾臓に由来するものであり、同様にＭ−ＣＳＦで２日間培養した。これらの破骨細胞前駆細胞を、１００ｎｇｍｌ-1の可溶性ＲＡＮＫＬ（Peprotech社製）及び１０ｎｇｍｌ-1のＭ−ＣＳＦの存在下でさらに培養し、破骨細胞を作製した（ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦ系）。特に他の記載がない限り、文中のＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦは、この濃度で一貫して用いた。ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭからのインビトロでの破骨細胞形成を調べるためには、間質／骨芽細胞の汚染を厳重に回避しなくてはならない（Nature 408, 600-605, 2000）。
【００４２】
これらの培養条件は、破骨細胞の形成が完全に阻害されているわけではない文献（J. Clin. Invest. 111, 323-332, 2003）記載のものとは異なっている。文献（Endocrinology 123, 2600-2602, 1988）記載のとおり、頭蓋冠に由来する破骨細胞前駆細胞及び骨芽細胞の共培養系は、１０-8Ｍの１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3及び１０-6Ｍのデキサメタゾンの存在下、かつ、組換え型ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦの非存在下で行われた。３〜５日後、ＴＲＡＰ+多核（＞３核）細胞を計測した。データはすべて平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表している（ｎ＝６）。文献（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）記載のとおり、象牙質切片に対する骨吸収作用を調べて、ＴＲＡＰ+ＭＮＣの特徴付けを行った。架橋実験のため、前駆細胞を播種する前に、５μｇｍｌ-1の抗体を含むＰＢＳで、培養プレートを２４時間４℃でプレインキュベーションした。
【００４３】
（レトロウィルス遺伝子トランスダクション）
ＤＡＰ又はＦｃＲγのｃＤＮＡ、及びＰＣＲ依存性突然変異誘発により作製されたその変異ｃＤＮＡをｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターに挿入することにより、レトロウィルスベクターのｐＭＸ−ＤＡＰ１２、ｐＭＸ−ＤＡＰ１２Ｙ６５Ｆ、ｐＭＸ−ＦｃＲγ及びｐＭＸ−ＦｃＲγＹ６５Ｆを構築した（Nature 408, 600-605, 2000）。ｐＭＸ−ＮＦＡＴｃ１、ｐＭＸ−ｃ−ｆｏｓ及びｐＭＸ−ＴＲＡＦ６などの他のベクターは文献に記載されており、文献記載のとおりに包装を行った（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002; Nature 416, 744-749, 2002）。接種２日後、ＢＭＭをＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦと共に培養した。４日後、ＴＲＡＰ染色により破骨細胞形成を評価した。文献（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002; Nature 416, 744-749, 2002）記載のとおり、ＧＦＰ発現により査定された感染効率を測定することにより、回復効果を正常化した。
【００４４】
（GeneChip分析）
ＲＮＡの抽出は文献（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）に記載されている。逆転写によるｃＤＮＡの合成に全ＲＮＡ（１５μｇ）を利用し、その後、インビトロでの転写によりビオチン化ｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡの断片化の後、マウスＵ７４Ａｖ２又はＡ４３０GeneChip（Affymetrix社製）とのハイブリダイゼーションを行い、製造者のプロトコルにしたがって分析した。GeneChip分析を数回繰返し、同様の結果を得た。代表的なデータを示す。
【００４５】
（Ｃａ2+測定）
破骨細胞前駆細胞を、Ｍ−ＣＳＦの存在下でＲＡＮＫＬと共に２４時間インキュベーションし、文献（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002）記載のとおり、Ｃａ2+測定を行った。成熟した破骨細胞では、ＲＡＮＫＬによってすぐにＣａ2+の急上昇が誘導されたが、破骨細胞前駆細胞では誘導されなかった（Dev. Cell. 3, 889-901, 2002; J. Biol. Chem. 278, 8286-8293, 2003）。
【００４６】
（ＦｃＲγ／ＤＡＰ１２及びＰＬＣγのリン酸化）
６時間の血清飢餓の後、破骨細胞前駆細胞又はＲＡＷ２６４．７細胞を１００ｎｇｍｌ-1の可溶性ＲＡＮＫＬで刺激した。所定時間後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０，２ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１０ｍＭのＮａＦ、及び１０μｇｍｌ-1のアプロチニンを含むＴＮＥ緩衝液を用いて、細胞から細胞抽出物を回収した。１μｇの抗ＤＡＰ１２抗体又は抗ＦｃＲγ抗体を用いて、細胞抽出物を４℃で１時間インキュベーションした。プロテインＡセファロースで免疫複合体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０、Upstate社製）又は表示の抗体でブロットした。抗ＰＬＣγ１抗体及び抗ホスホＰＬＣγ１抗体（Santa Cruz社製）を用いて、ＰＬＣγの活性化を検出した。
【００４７】
［図の説明］
図１  ＤＡＰ１２の非存在下での破骨細胞形成障害及び骨芽細胞によるその代償機構。ａ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＤＡＰ１２-/-ＢＭＭにおける破骨細胞形成の完全な欠如。ｂ、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭにおける、ＤＡＰ１２のレトロウィルスを介した発現による破骨細胞形成の回復。だが、ＤＡＰ１２Ｙ６５Ｆの場合には回復されない。これらのＭＮＣには骨吸収作用があった。ｃ、骨芽細胞と共培養したＤＡＰ１２-/-ＢＭＭからの破骨細胞の形成。象牙質切片について骨吸収作用を調べてみた。ｄ、ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲ又はＦｃγＲIIＢのキメラ受容体の過剰発現後における、ＦｃγＲIIＢの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析（左）。ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲ単独でのトランスフェクションにより、ＦｃγＲIIＢの弱い発現が検出された（ピンクの線、左及び右のパネル）が、ＦｃＲγとの共トランスフェクションでは、この発現が排他的に増大した（紫の線、右）。ｅ、ＦｃＲγ-/-マウスの頚骨の組織構造（上、トルイジンブルーによる染色）及び大腿骨のマイクロＸ線分析（下、マイクロコンピュータ処理された断層撮影、左；マイクロＸ線写真、右）。顕著な異常は認められなかった。
【００４８】
図２  破骨細胞形成障害によるＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）マウスにおける重篤な大理石骨病。ａ、ＤＡＰ１２-/-マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス（１２週齢）の頚骨の組織構造及び大腿骨のマイクロＸ線分析。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスには、骨髄腔がない。Ｘ線不透過性がより高いということは、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの大理石骨病の表現型がＤＡＰ１２-/-マウスよりもはるかに重篤であることを示している。ｂ、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスにおいて増大している骨梁量。ｃ、ＤＡＰ１２-/-マウスでは破骨細胞数は変化していないが、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスでは顕著に減少している。
【００４９】
ｄ、野生型マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス（１２週齢）の頚骨に対する骨形態計測解析における骨芽細胞のパラメーター。ｅ、ＤＡＰ１２-/-マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの頚骨の組織構造（ＴＲＡＰ及びトルイジンブルーによる染色）。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの骨幹では、吸収されなかった骨で骨髄腔が埋め尽されている。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの骨幹には、破骨細胞がまったく認められないが、ＤＡＰ１２-/-マウスの破骨細胞数は正常である。軟骨残遺物の典型的な部位をアスタリスクで示す。骨幹端部においては、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの骨端板の下に少数の破骨細胞が認められる（矢頭）。
【００５０】
図３  破骨細胞形成制御におけるＦｃＲγ会合免疫受容体及びＤＡＰ１２会合免疫受容体の区別可能な役割。ａ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）細胞におけるインビトロでの破骨細胞形成の完全な阻害。これはｐＭＸ−ＤＡＰ１２により回復したが、ｐＭＸ−ＤＡＰ１２Ｙ６５Ｆ又はｐＭＸ−ＦｃＲγでは回復しなかった。ｂ、骨芽細胞との共培養でも生じたＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞における重篤な破骨細胞形成障害。破骨細胞形成は、ｐＭＸ−ＤＡＰ１２又はｐＭＸ−ＦｃＲγによりＩＴＡＭ依存的に回復した。ｃ、ＦｃＲγと、ＰＩＲ−Ａ、ＦｃγＲIII及びＯＳＣＡＲとの会合（上）。ｐＯＣ：ＲＡＮＫＬで刺激した破骨細胞前駆細胞。ＦｃＲγとＦｃγＲIIIとの会合についてのコメントは、図７ｂ、７ｃを参照のこと。ｐＯＣ中のＤＡＰ１２と、ＴＲＥＭ−２及びＳＩＲＰβ１との会合であり、ＮＫＧ２Ｄとの会合ではない（中及び下）。陽性コントロールのため、樹状細胞（ＤＣ）及びＮＫ細胞（ＮＫ）中で、ＤＡＰ１２がそれぞれＳＩＲＰβ１及びＮＫＧ２Ｄと会合することが示されている。
【００５１】
ｄ、ＯＳＣＡＲ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭ−２又はＳＩＲＰβ１に対するプレート結合モノクローナル抗体によるＢＭＭの処理が、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激した破骨細胞形成を促進している。抗体を介した架橋による刺激作用は、ＲＡＮＫＬが低濃度の場合（５ｎｇｍｌ-1）のほうが、高濃度の場合（１００ｎｇｍｌ-1）よりも顕著である。ｅ、ＦｃＲγ-/-ＢＭＭの破骨細胞形成に対するプレート結合抗体の作用。抗ＯＳＣＡＲ抗体及び抗ＰＩＲ抗体は、ＦｃＲγ-/-ＢＭＭに作用を及ぼさない。ｆ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞又はＤＡＰ１２-/-ＢＭＭの破骨細胞形成に対するプレート結合抗体の作用。抗ＯＳＣＡＲ抗体及び抗ＰＩＲ抗体はＤＡＰ１２-/-ＢＭＭの破骨細胞形成を回復するが、かかる作用は、抗ＴＲＥＭ−２抗体又は抗ＳＩＲＰβ１抗体には見られなかった。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞の破骨細胞形成に対する刺激作用は観察されなかった。
【００５２】
図４  ＩＴＡＭ含有アダプターは、Ｃａ2+シグナル伝達及びＮＦＡＴｃ１のＲＡＮＫＬによる誘導に必須である。ａ、ＲＡＮＫＬシグナル伝達に関与する転写因子及びエフェクター分子のｍＲＮＡ発現のGeneChip分析。ＮＦＡＴｃ１の誘導障害は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）細胞において最も強く認められる。ｂ、ｐＭＸレトロウィルスベクター（ｐＭＸ−ＮＦＡＴｃ１）によりＮＦＡＴｃ１をＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-前駆細胞に導入すると、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦの存在下で破骨細胞形成（骨吸収作用あり）が効率的に回復した。ｃ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで２４時間刺激した破骨細胞前駆細胞におけるＣａ2+シグナル伝達。Ｃａ2+振動は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞又はＤＡＰ１２-/-細胞では観察されなかった。プレート結合抗ＰＩＲ抗体で刺激すると、ＤＡＰ１２-/-細胞ではＣａ2+シグナル伝達が回復したが、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞では回復しなかった。
【００５３】
ｄ、ＲＡＮＫＬによるＦｃＲγ及びＤＡＰ１２のリン酸化。ＲＡＮＫＬは、ＲＡＷ２６４．７細胞中と同様にＢＭＭ中でもＦｃＲγ及びＤＡＰ１２のリン酸化を誘導した。ＰＹ：ホスホチロシン。ｅ、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞におけるＲＡＮＫＬによるＰＬＣγ１のリン酸化障害。ｆ、ＲＡＮＫＬにより刺激された破骨細胞分化誘導におけるＩＴＡＭを介した共刺激シグナルの概略モデル。免疫受容体及びＲＡＮＫにより刺激されたＩＴＡＭのリン酸化の結果、Ｓｙｋファミリーキナーゼの補充となり、ＮＦＡＴｃ１の誘導に重要なＰＬＣγ及びＣａ2+シグナル伝達の活性化につながる。ＮＦＡＴｃ１の誘導は、ともにＲＡＮＫＬにより活性化されるｃ−Ｆｏｓ及びＴＲＡＦ６にも依存している。ＲＡＮＫＬは、免疫受容体又はそれらの推定リガンドの誘導を通じて、効率的なＩＴＡＭシグナル伝達にも寄与している。
【００５４】
図５  骨芽細胞による回復作用及びＦｃＲγの関与の分析。ａ、野生型マウス、ＤＡＰ１２-/-マウス、ＦｃＲγ-/-マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）マウス由来の破骨細胞前駆細胞と、変異体マウス由来の骨芽細胞との共培養。野生型マウス、ＤＡＰ１２-/-マウス、ＦｃＲγ-/-マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス由来の骨芽細胞は、破骨細胞形成支援能力と同等の能力を有しているが、骨芽細胞によるインビトロでの回復作用は部分的なものでしかない。ＦｃＲγ-/-マウスにおけるインビボでの正常な破骨細胞形成は下記のように説明されるのかもしれない：インビトロでの破骨細胞分化の程度は、ＦｃＲγを介したシグナルとＤＡＰ１２を介したシグナルの両方に依存し、ＦｃＲγを介したシグナル単独では、インビトロでの充分な活性化を誘導できない。一方、ＤＡＰ１２の欠損は、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦの発現上昇及びＦｃＲγを介したシグナルのアップレギュレーションなどの複合的な機序により、インビボで完全に補われる。
【００５５】
Ｍ−ＣＳＦの大量投与によりＤＡＰ１２-/-ＢＭＭの破骨細胞形成が部分的に回復するという最近の報告は、この着想と一致する（J. Cell. Biochem. 90, 871, 2003）。また、本発明者らは、骨吸収作用に欠陥があると、フィードバック機構により破骨細胞形成のアップレギュレーションが生じると推測するものである。ｂ、骨芽細胞の培養培地が、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭにおけるＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦにより誘導される破骨細胞形成に及ぼす作用。１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3及びデキサメタゾンの存在下、共培養実験と同じ条件で、骨芽細胞を培養した。１日間（+）又は２日間（++）のインキュベーション後、骨芽細胞の培養上清液（ＯＢ  ｓｕｐ）を回収した。１０％のＦＢＳ、１００ｎｇｍｌ-1の可溶性ＲＡＮＫＬ及び１０ｎｇｍｌ-1のＭ−ＣＳＦを添加したこれらの培養培地で、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭを培養した。共培養によるプラス作用に対して、骨芽細胞の培養培地による回復作用は観察されなかった。
【００５６】
これらの結果は、細胞−細胞接触の必要性を確認するために追加実験が必要とはなるものの、骨芽細胞の培養培地にはこの回復作用に関与する可溶性因子が含まれていないことを示唆している。ｃ、２９３Ｔ細胞中で過剰発現したキメラ受容体と、ＦｃＲγ又はＤＡＰ１２との会合。ＲIIＢ−ＯＳＣＡＲ及びＲIIＢ−ＦｃγＲIIIと会合したＦｃＲγ（左）。ＤＡＰ１２と、ＲIIＢ−ＴＲＥＭ−１との会合。しかし、２９３Ｔ細胞中のＲIIＢ−ＯＳＣＡＲとは会合していない（右）。ｄ、ＦｃＲγ-/-マウスの骨形態計測解析。骨梁量又は破骨細胞数に有意な差はない。ｎ．ｓ．：有意ではない。ｅ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＦｃＲγ-/-ＢＭＭにおける破骨細胞形成。破骨細胞分化に関して、野生型ＢＭＭとＦｃＲγ-/-ＢＭＭとの間に有意な差はない。
【００５７】
図６  ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）マウスの骨形態計測解析及び骨組織学的分析。ａ、野生型マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウス（１２週齢）の頚骨に対する骨形態計測解析における骨芽細胞パラメータ。他のパラメータについては、本文の図２ｄを参照のこと。これらの結果により、骨芽細胞の骨形成も減少したことが明らかになり、骨形成の増加が骨量の増加に寄与している可能性が排除された。ｂ、野生型マウス及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの頚骨の組織構造を低い拡大率で示した図。矢頭は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスの骨端板の下に認められる少数の破骨細胞を示す。骨端板の下に現れた少数の破骨細胞と正常な歯牙萌出は、骨髄における重篤な大理石骨病と対照的である。詳細な機序は未だに不明であるが、ＦｃＲγ及びＤＡＰ１２が骨髄でのみ必要とされ、骨膜／歯周環境では必要とされないということもありうる。骨髄における破骨細胞の分化に関しては、ＩＴＡＭを介する共通下流シグナル伝達経路を活性化することによりＤＡＰ１２とＦｃＲγがお互いに補い合うが、ＤＡＰ１２-/-マウスにおける軽度の大理石骨病は、ＦｃＲγでは補えない、破骨細胞の骨吸収作用の制御に関するＤＡＰ１２の特異的作用に起因するものである。
【００５８】
図７  破骨細胞系統細胞におけるＩＴＡＭ含有アダプター会合免疫受容体。ａ、ＩＴＡＭ含有アダプター、会合分子及び免疫受容体のｍＲＮＡ発現（Affymetrix社製GeneChip）。阻害受容体（アスタリスクで示す）を含む多数の免疫受容体が破骨細胞前駆細胞（ｐＯＣ）及び成熟破骨細胞（ｍＯＣ）によって発現している。ｂ、破骨細胞系統細胞表面上のＦｃＲγ会合タンパク質。ｐＯＣにおいては、予想コアサイズが７４及び３３ｋＤａのグリコシル化タンパク質が多いように思われたのに対し、ｍＯＣでは、３３ｋＤａの種が多くなった。３３ｋＤａの種は、ＦｃγＲIII-/-マウスの両方のＯＣで消失した。このことは、このバンドがＦｃγＲIIIであることを示している（相対分子量（Ｍr）４０〜６０ｋＤａ；コアサイズ３３ｋＤａ［J. Cell. Sci. Suppl. 9, 45, 1988］）。また、３３ｋＤａの種の非存在下では、７４ｋＤａのタンパク質種がタンパク質の大半を占めるようになった。この糖タンパク質は、ＰＩＲ−Ａだと思われる（Ｍr８５ｋＤａ；コアサイズ７３ｋＤａ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5261, 1997］）。
【００５９】
他の少量のタンパク質種には、ＦｃγＲＩ（Ｍr７０ｋＤａ；コアサイズ４９ｋＤａ［Immunology 78, 358, 1993］）、ＯＳＣＡＲ（Ｍrは不明；コアサイズ２７ｋＤａ［J. Exp. Med. 195, 201, 2002］）、ＤＣＡＲ（Ｍrは不明；コアサイズ２４ｋＤａ［J. Biol. Chem. 278, 32645, 2003］）がある。したがって、ＯＣ表面のＦｃＲγ会合受容体には、ＦｃγＲIII、ＰＩＲ−Ａ、ＦｃγＲＩ、ＯＳＣＡＲ及びＤＣＡＲがある。ＦｃＲγとＦｃγＲIIIとの会合にも関わらず、ＦｃγＲIIＢ／III（２．４Ｇ２）に対する抗体が、ＦｃγＲIIＢ-/-ＢＭＭに対してさえ刺激作用を全くもたないことを観察した（データは図示せず）。加えて、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-マウスとは異なり、ＤＡＰ１２-/-ＦｃγＲIII-/-マウスの骨表現型は、ＤＡＰ１２-/-マウスとほぼ同じであり（M. I. and T. Takai未公開観察結果）、ＦｃγＲIIIが破骨細胞形成に深く関与しているわけではないことを示唆している。
【００６０】
ｃ、破骨細胞系統細胞表面上のＤＡＰ１２会合タンパク質。細胞表面上に、コアサイズが１６〜４５ｋＤａのＤＡＰ１２会合タンパク質が有意に存在する。そのなかでも、ｐＯＣでは４５ｋＤａ、３９ｋＤａ、２９ｋＤａ、２５ｋＤａの骨格を有するグリコシル化タンパク質が多いようであり、一方、ｍＯＣでは４５ｋＤａ、３９ｋＤａ、２９ｋＤａの骨格を有するもの、及び１６ｋＤａの非グリコシル化タンパク質が顕著であった。各候補受容体について既知のコアサイズのデータを参照すると（ＴＲＥＭ−２ｂ及びＴＲＥＭ−３は、それぞれ２３ｋＤａ及び１８ｋＤａ［Eur. J. Immunol. 31, 783, 2001］；ＭＤＬ−１は２２ｋＤａ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9792, 1999］；ＳＩＲＰβ１は４２ｋＤａ［H. O. and T. M. 未公開観察結果］）、４５ｋＤａのタンパク質種はＳＩＲＰβ１であり、２５〜２８ｋＤａの種にはＴＲＥＭ−２ｂ及びＭＤＬ−１が含まれると思われる。１８ｋＤａの弱いシグナルは、ＴＲＥＭ−３かもしれない。
【００６１】
これらの結果は、ＤＡＰ１２と会合する受容体の範囲には、ＴＲＥＭ−２、ＴＲＥＭ−３，ＭＤＬ−１及びＳＩＲＰβ１が含まれる場合があることを示唆している。ｄ、ＲＡＮＫＬにより刺激されたＢＭＭにおけるアポトーシス細胞の比率に対する、免疫受容体のプレート結合抗体の作用。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇｍｌ-1）及びＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇｍｌ-1）の存在下、ＢＭＭをプレート結合抗体で３日間刺激し、ＴＵＮＥＬ用に染色した。いかなる抗体刺激についても、コントロールのＩｇＧとの間には有意な差はなかった。
【００６２】
図８  ＩＴＡＭ含有アダプター下流の細胞内シグナル伝達。ａ、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦで刺激したＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）細胞及び野生型細胞におけるＮＦＡＴｃ１、ｃ−Ｆｏｓ及びＴＲＡＦ６の発現。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇｍｌ-1）及びＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇｍｌ-1）の存在下、破骨細胞前駆細胞を７２時間培養し、文献（Dev. Cell 3, 889, 2002）記載のとおり、抗ＮＦＡＴｃ１抗体及び抗ｃ−Ｆｏｓ／抗ＴＲＡＦ６抗体（Santa Cruz社製）で染色した。ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞におけるＮＦＡＴｃ１の発現はほとんど検出できないが、ｃ−Ｆｏｓ又はＴＲＡＦ６の発現は依然として観察された。Ｐｈ：位相差。ｂ、ＤＡＰ１２-/-細胞におけるＰＩＲ刺激によるＮＦＡＴｃ１の誘導。ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇｍｌ-1）及びＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇｍｌ-1）の存在下、ＤＡＰ１２-/-ＢＭＭをプレート結合抗ＰＩＲ抗体で３日間刺激し、上記の通り、抗ＮＦＡＴｃ１抗体で免疫染色した。抗ＰＩＲ抗体での刺激により、ＤＡＰ１２-/-細胞におけるＮＦＡＴｃ１の発現が回復した。
【００６３】
ｃ、野生型細胞及びＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞における、ＲＡＮＫＬによるｐ３８、ＪＮＫ、及びＩκＢのリン酸化。破骨細胞前駆細胞を、所定の時間、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇｍｌ-1）で刺激し、細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、続けてリン酸化特異的抗体（Cell Signaling社製）又は他の抗体（ｐ３８、ＪＮＫ；Cell Signaling社製、βアクチン；Sigma社製）で、イムノブロットした。これに対し、ＩＴＡＭのリン酸化に依存すると思われるＰＬＣγのリン酸化は、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-細胞において障害が認められた（図４ｅ）。ＲＡＮＫはチロシンキナーゼ受容体ではなく、ＴＲＡＦ６と会合するものであって、ＴＲＡＦ６は、ｃ−Ｓｒｃ、ＴＡＫ１及びＭＡＰキナーゼなどの各種キナーゼと結合しており、そのなかでもｃ−Ｓｒｃは、ＲＡＮＫＬによるＩＴＡＭのリン酸化に関与する場合がある。ｄ、Ｓｙｋファミリーキナーゼ阻害剤であるピセアタンノールの、ＲＡＮＫＬ／Ｍ−ＣＳＦにより誘導される破骨細胞形成に対する作用。文献（Nature 416, 744, 2002）記載の通り、ピセアタンノールの作用を調べてみた。これらの濃度では、ＢＭＭの増殖への影響はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の試験例において、ＤＡＰ１２の非存在下での破骨細胞形成障害及び骨芽細胞によるその代償機構についての試験の結果を示す図である。
【図２】本発明の試験例において、破骨細胞形成障害によるＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）マウスにおける重篤な大理石骨病の症状について示す図である。
【図３】本発明の試験例において、破骨細胞形成制御におけるＦｃＲγ会合免疫受容体及びＤＡＰ１２会合免疫受容体の区別可能な役割についての試験結果を示す図である。
【図４】本発明の試験例において、ＩＴＡＭ含有アダプターと、Ｃａ2+シグナル伝達及びＮＦＡＴｃ１のＲＡＮＫＬによる誘導との関係についての試験の結果を示す図である。
【図５】本発明の試験例において、骨芽細胞による回復作用及びＦｃＲγの関与の分析についての試験の結果を示す図である。
【図６】本発明の試験例において、ＤＡＰ１２-/-ＦｃＲγ-/-（ＤＫＯ）マウスの骨形態計測解析及び骨組織学的分析についての試験の結果を示す図である。
【図７】本発明の試験例において、破骨細胞系統細胞におけるＩＴＡＭ含有アダプター会合免疫受容体についての試験の結果を示す図である。
【図８】本発明の試験例において、ＩＴＡＭ含有アダプター下流の細胞内シグナル伝達の状況についての試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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