(57)【要約】【課題】  軟骨の修復を早期かつ安全に行うことのできる材料を提供すること、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  移植を受ける患者から調製された軟骨細胞と、多血小板血漿と、約４ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと、抗プラスミン剤（メシル酸ナファモスタット）とを含有させた軟骨修復用材料によって解決される。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多血小板血漿と、フィブリノーゲンとを含有したことを特徴とする軟骨修復用材料。
【請求項２】
更に、抗プラスミン剤を含有したことを特徴とする請求項１に記載の軟骨修復用材料。
【請求項３】
移植を受ける患者から調製された軟骨細胞を含有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の軟骨修復用材料。
【請求項４】
患者から軟骨を含む組織片を摘出し、その組織片から軟骨細胞を調製した後に、その軟骨細胞と多血小板血漿とフィブリノーゲンとを含有したものをゲル化させて、その患者の軟骨修復に用いる材料とすることを特徴とする軟骨修復用材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨修復用材料、およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会を迎え、変形性関節症を始めとする関節軟骨の磨耗、欠損に起因する疾患の患者数が増加している。また、若年者においてもスポーツや外傷による関節軟骨の欠損が大きな問題となっている。しかしながら、関節軟骨は再生能力に乏しく、一度欠損した関節軟骨は、自然には元通りに再生しない。このような軟骨疾患に関する治療法の開発も行われているが、従来の治療法では、質的に劣る線維軟骨の再生しか期待できず、未だに満足な治療法がない状態である。
【０００３】
それゆえ関節軟骨再生治療に対する社会的要求度は高い。こうしたなか、１９９４年以降になって、自家軟骨細胞移植が臨床応用されるに至り、軟骨細胞・組織を移植して治療する試みは現実のものとなった。しかし、関節軟骨再生の可能性を持つ自家軟骨細胞移植の具体的方法においては、未だに決め手がない状態であり、例えば様々な形の軟骨欠損部へいかに均一に軟骨細胞をとどめ置くか、また如何にして移植した軟骨細胞の脱分化を押さえ生存を保持するかという問題は十分に解決されていない。この問題は自家軟骨細胞移植の成否を握り、より質の高い関節軟骨を再生するために不可避の問題である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−５５２３７号公報  骨再生を促進する技術開発については、例えば特許文献１に記載されている。この文献によれば、多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いることにより、骨再生の促進効果が得られたことが示されている。しかしながら、上記文献は、骨再生のみに関する技術であり、軟骨再生については効果を確認していない。更に、ＰＲＰのみを用いた場合には、充分な硬化が認められず、かつ早期にフィブリン分解が起こってしまう可能性がある等の問題点がある。このように軟骨再生技術については、未だに良好なものが開発されていない状態である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、軟骨の修復を早期かつ安全に行うことのできる材料を提供すること、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
【０００６】
本発明者らは、自家軟骨細胞移植において、質の高い関節軟骨を再生するために重要である軟骨細胞の軟骨欠損部へのデリバリーシステム（delivery system）とリザーバーシステム（reservoir system）とを自己血由来の成分を用い構築する事を目的として研究を行った結果、多血小板血漿とフィブリノーゲンとを含有したものを応用することを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記課題を解決するために第１の発明に係る軟骨修復用材料は、多血小板血漿と、フィブリノーゲンとを含有したことを特徴とする。
【０００７】
多血小板血漿とは、濃縮しない血漿中の血小板の平均値（約２００ x １０３／μＬ）に比べて、少なくとも約４倍以上（好ましくは、約５倍以上）の血小板を含有する血漿のことを意味している。このような多血小板血漿は、例えば弱遠心沈殿操作と強遠心沈殿操作とを組み合わせることにより、調製することができる。多血小板血漿は、治療を受ける軟骨疾患患者の血液（自己血）から調製したものを用いることが好ましいが、他者の血液から調製されたものを用いることもできる。
【０００８】
フィブリノーゲンは、多血小板血漿を適当な状態までゲル化させるために用いられる。フィブリノーゲンの濃度としては、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは約４ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは約４ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは約４ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬである。
第１の発明において、更に、抗プラスミン剤を含有させることが好ましい。
抗プラスミン剤とは、生体内においてフィブリンを分解するプラスミンの作用を阻害する剤を意味している。そのような抗プラスミン剤としては、例えば、α2-マクログロブリン、α1-アンチトリプシン、α2-プラスミンインヒビター、アンチトロンビンIII、Ｃ1インヒビター、アプロチニン、アルギン酸ナトリウム、イプシロン-アミノカプロン酸、ウリナスタチン、ゼラチン、トラネキサム酸、トロンビン、ヘモコアグラーゼ、メシル酸アドレノクロムグアニルヒドラゾン、メシル酸ガベキサート、メシル酸カモスタット、メシル酸ナファモスタットなどの中から適当な一種または二種以上のものを選択して用いることができる。
【０００９】
また、第１の発明においては、移植を受ける患者から調製された軟骨細胞を含有させることが好ましい。軟骨細胞を調製する方法としては、例えば後述の実施例に記載の方法に依ることができる。
第２の発明に係る軟骨修復用材料の製造方法は、患者から軟骨を含む組織片を摘出し、その組織片から軟骨細胞を調製した後に、その軟骨細胞と多血小板血漿とフィブリノーゲンとを含有したものをゲル化させて、その患者の軟骨修復に用いる材料とすることを特徴とする。
本発明によれば、軟骨欠損を伴う患者に対して、自己の軟骨細胞を移植することにより、早期かつ安全に欠損した軟骨の修復を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１１】
＜実施例１＞  ＰＲＰの調製方法
多血小板血漿（ＰＲＰ、Platelet rich plasma）は、血液（自己血）を遠心分離することにより得られる血小板を多く含む血漿分画である。定型的な分離方法は決まっていないが、一般的には、弱遠心沈殿操作と強遠心沈殿操作とを組み合わせて分離する。従来には、新鮮凍結血漿や濃厚赤血球液作成時に捨てられていた遠心分画である。
本発明者らは、自己血約２００ｇをバッグで採取後、約１５００ｒｐｍ、約７分間の弱遠心沈殿操作で血漿を分離し、さらに約３５００ｒｐｍ、約１０分間の強遠心操作によってＰＲＰを分離した。この方法では、血小板の弱い凝集塊が得られるため視覚的に血小板量が把握でき易く、かつ懸濁する血漿の量を加減することにより、従来のＰＲＰ製造方法より確実な濃縮が得られるという特徴がある。また、濃縮率を下げれば、得られるＰＲＰの総量を増やすことも可能である。実際に、下表１に示すように、ＰＲＰ中の血小板濃度は血漿の約５〜約１０倍に濃縮することが可能であった。
【００１２】
【表１】
2005170816.tif 000002
【００１３】
ＰＲＰ群の平均血小板数は、１６５４ ｘ １０３／μＬであり、血漿の平均血小板数（２２３ｘ １０３／μＬ）に比べて、約７.４倍であった。血小板を視覚化する我々のＰＲＰ調製方法は、従来の方法に比べると、より確実な血小板の濃縮効果が得られ、かつ最終的なＰＲＰの質的なばらつきを減少させるのに貢献し得る。
ＰＲＰに対して、血液凝固因子であるトロンビンとカルシウムを添加することによりゲル化させることが可能である。これはＰＲＰ中のフィブリノゲンが、カルシウムの存在下でトロンビンにより加水分解されてフィブリンモノマーとなり、架橋を形成してフィブリンとなるためである。このＰＲＰゲルの中で軟骨細胞を培養した報告は知られておらず、ゲルの硬さと軟骨細胞の生存能力の関係や、ゲル中での軟骨細胞の増殖、分化についてのデータは皆無である。そこで、我々は以下の条件で実験を行った。
【００１４】
＜実施例２＞  軟骨細胞分離と一次培養
ヒト膝関節軟骨を無菌的に採取し、メスで細かく刻んだ。これを生理的食塩水で数回洗浄した後、０.２５％トリプシンに３０分間浸漬した後、０.２％コラゲナーゼに２〜３時間漬けて軟骨基質を消化させた。消化後の軟骨を細胞フィルター（CELL FILTER）を通し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して細胞を分離した。この細胞をギブコハムズＦ−１２メディウム（GIBCO Ham's F-12 medium 、以下単に「Ｆ−１２」という）に懸濁し、Ｔ−７５フラスコにて培養した。培養液は、１０ｍＬ  Ｆ−１２に対して、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリンＧ（Penicillin G）、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Streptomycin）、２.５μｇ／ｍＬ  アンフォテリシンＢ（Amphotericin B）、０.２ｍＭ  アスコルビン酸（ascorbic acid）、１０ｍＭ  ヘペス（HEPES）を添加したものを用いた（以下、この組成の溶液を単に、「培養用メディウム」という）。
培養開始から４日後に、細胞をＰＢＳ（Phosophate Buffer Saline）で数回洗浄し、浮遊している細胞を取り除いた。付着した細胞を３７℃、５％  ＣＯ２／９５％  Ａｉｒのインキュベータ内に静置し、３日毎に培養用メディウムを交換し、コンフルエントに達するまで一次培養した。コンフルエントに達した時点で、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をはがし、ＰＲＰゲルを用いた３次元培養実験に供した。
【００１５】
＜実施例３＞  ＰＲＰゲルを用いた３次元培養
ＰＲＰ（血小板数１６５.４±２５ ｘ １０４／μＬ）に一次培養した軟骨細胞を懸濁し、そこへ塩化カルシウム水溶液で溶いたトロンビンを加えゲル化した。最終的な濃度は、細胞数が８ｘ１０５個／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン、１００Ｕ／ｍＬ トロンビン、２％ Ｗ／Ｖ 塩化カルシウムであった。一つのゲルの容量は１ｍＬとし、できたゲルを６穴プレートに入れた後、培養用メディウムを４ｍＬ加えて培養した。対照として、血小板数が、２０±１.２ｘ１０４／μＬのＰＰＰ(platelet poor plasma)を用い、上記と同じ条件でゲルを作成し培養した。
【００１６】
＜実施例４＞  軟骨細胞の生存率（viability）の検討
プロメガＭＴＳアッセイ（Promega MTS assay）試薬を用い、あらかじめ細胞数を計測しておいて検量線を作成した。ゲルを０.１％コラゲナーゼ、０.１％パパインで再融解し、融解後すぐに遠心して集めた細胞を１ｍＬの培養用メディウムに懸濁した。検量線の範囲内におさまるように、懸濁液を１００μＬとり、９６穴プレートにて培養した。ＭＴＳアッセイ試薬を２０μＬ加え、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００１７】
＜実施例５＞  ＰＲＰゲルの至適フィブリノーゲン濃度の検討
１００Ｕ／ｍＬ  トロンビン及び２％ Ｗ／Ｖ  塩化カルシウム濃度を固定し、フィブリノーゲン濃度を変化させることでゲルの硬さを変えて、至適フィブリノーゲン濃度の検討を行った。フィブリノーゲン濃度を２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、 １０ｍｇ／ｍＬ、 ２０ｍｇ／ｍＬ、 及び ５０ｍｇ／ｍＬの５段階に変化させ、それぞれの濃度における初期状態での取扱易さ（Initial handiness）、フィブリン溶解性（Fibrin lysis）、細胞増殖（Cell growth）、及び細胞展開（Cell spreading）について検討した。
【００１８】
＜実施例６＞  ゲルの耐久度（durability）に及ぼす抗プラスミン剤の効果
抗プラスミン剤として、メシル酸ナファモスタットを用いた。フィブリノーゲン濃度４ｍｇ／ｍＬのＰＲＰゲルに対して、最終濃度１０μｇ／ｍＬでメシル酸ナファモスタットを加えた。湿重量（Wet weight）を一週間毎に計測し、対照群と比較検討した。
【００１９】
＜実施例７＞  ＰＲＰゲルの組織学的検討、および免疫組織学的検討
ＰＲＰゲルは４％パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィンに包埋した。このゲルについて、ＨＥ染色を行い、ゲル内の細胞形態及び分布を検討した。また、アルシアンブルー染色を行い、プロテオグリカンの有無を検討した。また、II型コラーゲン特異的な抗体を用いて免疫組織染色を行った。
【００２０】
＜実験結果＞
１．軟骨細胞の viabilityの検討
ＰＲＰゲル、またはＰＰＰゲルを用いて、軟骨細胞を培養したときのviabilityの経時的な経過の様子を図１に示した。図より明らかなように、ゲル中の軟骨細胞のviabilityは、ＰＲＰゲル及びＰＰＰゲル共に、全体として経時的に減少傾向を示した。このviabilityの減少は、一見すると細胞の死を反映しているかのように思われるが、ゲル外へ遊走拡散した細胞を考慮しなければならないことから必ずしも全てが細胞死を意味しているわけではないと考えた。
また、ＰＰＰゲルでは、培養開始から４週まで、一貫してviabilityの減少を示すものの、ＰＲＰゲルでは、２週から４週の時点では増加に転じた。更に、培養開始から２週の時点以降では、ＰＲＰゲル群とＰＰＰゲル群とのviabilityの間に有意差が認められた。
【００２１】
２．ＰＲＰゲルの至適フィブリノーゲン濃度の検討
Initial handiness, Fibrin lysis, Cell growth, Cell spreadingをそれぞれ段階的に評価した結果を図２に示した。表より明らかなように、ＰＲＰゲルの至適フィブリノーゲン濃度領域は、約４ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬであることが判明した。軟骨細胞のリザ−バー機能を重視すれば、約４ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン濃度でFibrin lysisを抑えたものが、最適の条件であると考えられた。
【００２２】
３．ゲルの durabilityに及ぼすProteinase inhibitor の効果
フィブリノーゲン濃度４ｍｇ／ｍＬのＰＲＰゲルに対して、最終濃度１０μｇ／ｍＬでメシル酸ナファモスタットを加えたときのFibrin lysis に与える影響を検討するため、ゲルのWet weightを一週間毎に計測し、対照群と比較した結果を図３に示した。
メシル酸ナファモスタットを加えた群（PRP gel + PI）では、加えない群（PRP gel）に対して、Fibrin lysisが遷延する傾向が認められた。メシル酸ナファモスタットは強力な抗プラスミン作用を持つことから、その濃度を上げることにより、更なるFibrin lysisの遷延効果が見込まれた。しかしながら、高濃度のメシル酸ナファモスタットを用いると、同時にセリンプロテイナーゼであるトロンビンを阻害することになるため、ＰＲＰゲルが固まらなくなるという問題点がある。このため、今回の実験では、低濃度での使用を余儀なくされた。
【００２３】
４．ＰＲＰゲルの組織学的検討、および免疫組織学的検討
図４に示すように、軟骨細胞は、ＰＲＰゲルの内部では円形状（round shape）を保つ一方、ＰＲＰゲルの辺縁では扁平化したものが認められた。ゲルの辺縁部には、核が細長い細胞が目立つが、ゲル内部の細胞は、核が丸みを帯び線維芽細胞様ではなく、軟骨細胞様の形態を示した。
また、図５には、軟骨細胞をＰＲＰゲルで培養したときのＰＲＰゲル周辺の細胞の様子を経時的（０ｄａｙ、３ｄａｙｓ、５ｄａｙｓ、４ｗｅｅｋｓ）に顕微鏡観察した写真図を示した。０ｄａｙの写真は、ＰＲＰゲルと培養液の境界を示したものである。軟骨細胞は、ＰＲＰゲルの中だけに入れてあるが、この時点ではゲル周辺には確認できなかった。３ｄａｙｓの写真は、軟骨細胞がＰＲＰゲルの辺縁に移動してきた、もしくは辺縁にいた細胞がゲルの外へ出ようするのを示している。５ｄａｙｓの写真は、軟骨細胞がゲルから培養液中に完全に移動したのを示している。４ｗｅｅｋｓの写真は、次々に移動してゆく軟骨細胞と、ゲル内外の細胞増殖の様子を確認することができた。なお、いずれの写真図も、１００倍の倍率で倒立顕微鏡で撮影した。
図６左には、ＰＲＰゲル内で軟骨細胞を４週間に渡って３次元培養し、アルシアンブルーで染色したときの顕微鏡写真図を示した。細胞質、細胞膜周囲から細胞外マトリックスが青染された。このことから、ゲル内の軟骨細胞が、グリコサミノグリカンを生成していることが示された。
また、図６右には、軟骨細胞を同様に培養したものを抗type II collagen抗体を用いて免疫染色したときの顕微鏡写真図を示した。細胞質は茶褐色に染まり、type II collagen の発現が認められた。細胞外マトリックスが染まっていないのは、４週ではまだ分泌量が少ないためか、細胞外のＧＡＧなどの物質にマスクされて染まりにくいためと考えられた。なお、いずれの写真図も、２００倍の倍率で倒立顕微鏡で撮影した。
【００２４】
＜考察＞
血小板の分泌顆粒中にはＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＥＧＤ、ＩＧＦ、ＦＧＦなどの増殖因子が存在する。ＰＲＰでは、これらの増殖因子も血小板の濃縮度に応じて数倍に濃縮されると報告されている。血小板は、トロンビンとカルシウムを加えることで活性化し、血小板内の顆粒から増殖因子を含む多くの物質が分泌される。
軟骨細胞は、２次元（monolayer）による培養では、線維芽細胞様に分化することが指摘されていることから、軟骨細胞の形態を保つには３次元培養が優れている。しかし、一旦線維芽細胞様に分化した細胞であっても、ＰＤＧＦの作用により再び軟骨細胞の形態を取り戻すことが報告されている。我々の実験においても、一時的に培養途中の段階で線維芽細胞様形態になった軟骨細胞も、ＰＲＰゲル内では軟骨細胞の形態に戻っているのが確認された。
【００２５】
従来の軟骨細胞の培養方法では、３次元培養のための足場（scaffold）として、アテロコラーゲン、アルジネート、ポリ-Ｌ-乳酸などが使用されているが、トロンビン以外の成分が自己血から製造されるＰＲＰゲルは、移植時の組織適合性や感染の危険性が少ない点において優れているのみならず、材料としては、ほとんどランニングコストがかからないため経済的にも優れている。なお、将来的には、トロンビンも自己血からまかなえる可能性があるので、全ての成分を自己血からまかなえることになる。
更に、上述した増殖因子の中でも、ＦＧＦは軟骨細胞の増殖を強力に促進し、ＩＧＦは軟骨細胞の形質発現維持に深く関わっている。よって、ＰＲＰゲルの中に軟骨細胞を包埋し、軟骨欠損部へ移植する方法は、軟骨再生医療として多大な可能性を秘めている。しかしながら、この点に関する基礎的実験はほとんどなされてこなかった。
【００２６】
今回の本発明者らの実験によって、ＰＲＰゲルには軟骨細胞の増殖を促進し、脱分化を防ぐ効果があることが判明した。さらに軟骨細胞はＰＲＰゲルの中を移動し、ゲル外へ遊走することが認められた。つまりＰＲＰゲルは、軟骨細胞を包含したまま任意の形を形成することでさまざまな形をとる軟骨欠損部に軟骨細胞をデリバリーする機能と、軟骨欠損部に軟骨細胞の形態を保った細胞をある一定期間に渡って持続的に送り続けるリザーバーとしての機能とを併せ持つことが示されたことになる。今回の試験結果と、ＰＲＰゲルが分解性のある（degradatable）自己フィブリンゲルであることとを併せて考えると、自家軟骨細胞移植においてＰＲＰゲルは軟骨再生促進能をもつ細胞保持担体としてきわめて有用であることが示された。
このように本実施形態によれば、軟骨欠損を伴う患者に対して、自己の軟骨細胞を移植することにより、早期かつ安全に欠損した軟骨の修復を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】軟骨細胞に対するＰＲＰゲルの増殖効果を評価した結果を示すグラフである。
【図２】ＰＲＰゲル中のフィブリノーゲン濃度による特性を評価した結果を示す表である。
【図３】抗プラスミン剤（メシル酸ナファモスタット）の効果を評価した結果を示すグラフである。
【図４】ＰＲＰゲル中の軟骨細胞の形態を示す顕微鏡写真図である。左写真は、ＰＲＰゲル内で軟骨細胞を２週間３次元培養し、ヘマトキシリン・エオジン染色したものである（x100）。右写真は、同様に４週間培養し、ヘマトキシリン・エオジン染色したものである（x200）。
【図５】軟骨細胞がＰＲＰゲルの辺縁に移動して、外方で増殖する様子を示す顕微鏡写真図である。図中、０ｄａｙ、３ｄａｙｓ、５ｄａｙｓ、４ｗｅｅｋｓは、培養開始からの日数を示す。
【図６】軟骨細胞をＰＲＰゲル内で４週間に渡って３次元培養し、染色した後のＰＲＰゲルを示す写真図である。左はアルシアンブルー染色、右はタイプIIコラーゲン免疫染色である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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