(57)【要約】【課題】  本発明は、腫瘍にに発現するｏａｔｐ／ＬＳＴ群に属する新規な有機アニオントランスポーターを提供することを目的としている。【解決手段】  本発明は、新規なヒト肝特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ）、及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明は、これらの遺伝子をキャリアーに組み込んでなる、遺伝子運搬用のキャリアーに関する。さらに、本発明は、本発明のＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂを検出することができる配列を用いて、癌細胞、特に消化器癌細胞の存在を検出、同定する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２、４、又は６に示されるアミノ酸配列を有するヒト肝特異的有機アニオントランスポーター。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子。
【請求項３】
ヒト肝特異的有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子が、配列表の配列番号１，３、又は５に示される塩基配列を有するものである請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３のいずれかに記載の遺伝子を、遺伝子の運搬用の遺伝子キャリアーに組み込んでなる遺伝子キャリアー。
【請求項５】
遺伝子の運搬用の遺伝子キャリアーが、プラスミドである請求項４に記載の遺伝子キャリアー。
【請求項６】
遺伝子の運搬用の遺伝子キャリアーが、ウイルスである請求項５に記載の遺伝子キャリアー。
【請求項７】
配列表の配列番号１に示される塩基配列の部分配列を使用して、細胞におけるヒト肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂの発現を検出、同定する方法。
【請求項８】
細胞が、癌細胞である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒト肝特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−３）、及びそれをコードする遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、配列表の配列番号２，４及び６に示されるアミノ酸配列を有するヒト肝特異的有機アニオントランスポーター、及びそれをコードする遺伝子に関する。また、本発明は、これらの遺伝子をキャリアーに組み込んでなる、遺伝子運搬用のキャリアーに関する。さらに、本発明は、本発明のＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂを検出することができる配列を用いて、癌細胞、特に消化器癌細胞の存在を検出、同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機アニオントランスポーターファミリーは、陰性荷電を有する様々な内因性および外因性化合物の細胞膜輸送に関与している。これまでヒトとラットにおいて多くの有機アニオントランスポーターが単離されてきたが、それらは図４の樹形図に示すように、全身の様々な臓器に発現し甲状腺ホルモンや抱合型ステロイドを輸送するｏａｔｐ（organic anion transporting polypeptide）群と、肝臓特異的に発現し抱合型ステロイドや各種胆汁酸を血中から肝細胞内へ輸送するＬＳＴ（liver-specific organic anion transporter）ファミリーに大別される。また、エイコサノイドを輸送するプロスタグランジントランスポーター（ＰＧＴ）も広義の有機アニオントランスポーターに含まれる。
【０００３】
肝臓は様々な内因性・外因性化合物を胆汁へ排除する機構を司り、生体の恒常性維持に欠かせない役割を果たしている。このようなことから、有機アニオントランスポーターの研究の中でも肝臓の胆汁酸輸送の研究が最も精力的に行われている。
胆汁酸は肝細胞でステロイドから生合成され胆汁に排泄された後、消化管から吸収され再び肝細胞へ吸収されるという腸管循環を行っている。従来血中からタウロコール酸をナトリウム依存的に輸送する蛋白としてＮＴＣＰ（Na＋/taurocholate co-transporting polypeptide）が単離されてきたが、１９９０年後半にタウロコール酸のナトリウム非依存性画分の輸送を担う膜蛋白としてＬＳＴ−１およびＬＳＴ−２が、本発明者らにより単離され、ＬＳＴ−２は本発明者らによりクローニングされた（非特許文献１参照）。また、ＬＳＴ−１、ＬＳＴ−２は胆汁酸のみならず抱合型ステロイドやメバロチンなどの外因性化合物の輸送に関与することも明らかにされてきた。ＬＳＴ−１，ＬＳＴ−２のいずれも、肝特異的に発現し、正常肝においてはＬＳＴ−２の発現量はＬＳＴ−１のおよそ数十分の１であると報告されてきている。
しかしながら、胃癌、大腸癌、膵癌など各種の消化器癌症例の癌組織を用いた検討で、ＬＳＴ−２がこれら消化器癌において著明に発現することが、ｍＲＮＡレベル、蛋白レベルで明らかとされてきた。さらに、各種ヒト消化器癌由来の細胞株を用いた検討で、大腸癌、肝癌、胆管および胆のう癌、膵癌、胃癌など様々な消化器癌細胞株にもＬＳＴ−２が著明に発現することが明らかにされてきた。
【０００４】
ＬＳＴ−２をＭＤＣＫ細胞に遺伝子導入し、抗ガン剤の１種であるメトトレキサート（methotrexate（ＭＴＸ））の輸送能および感受性を検討した結果、ＬＳＴ−２発現細胞ではＭＯＣＫ細胞に比べて有意にＭＴＸを輸送しＭＴＸに対する感受性も有意に増加することが示された。ＭＴＸを用いた癌の化学療法の際、肝細胞障害と骨髄抑制がしばしば問題となっている。これは、肝細胞においては主にＬＳＴ−１が、造血細胞においてはＲＦＣ−１（reduced folate carrier -１）がそれぞれ細胞内へＭＴＸを輸送することに起因すると推測されている。ＬＳＴ−１は肝臓のＨＴ−７細胞のみに発現し、ＲＦＣ−１は造血細胞に発現し肺癌由来の細胞株でのみ発現することが知られている。
さらに近年、ＬＳＴ−２が各種消化器癌細胞において著明に発現し、癌細胞のmethotrexate（ＭＴＸ）に対する感受性を規定する可能性が示されてきている。したがって、ｏａｔｐ／ＬＳＴ群は、抗癌剤デリバリーの新たな標的分子として有用である可能性が示されてきた。
【０００５】
【非特許文献１】Takaaki, Abe, et al., Gastroenterology, (2001), 120, 1689-1699
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述してきたように、ｏａｔｐ／ＬＳＴ群は、抗癌剤デリバリーの新たな標的分子として有用である可能性が示されてきたことから、腫瘍特異的に発現する新規有機アニオントランスポーターを単離しその機能を明らかにすることにより、抗癌剤デリバリーに使用することができる新たな有機アニオントランスポーターを提供することができる。
したがって、本発明は、腫瘍に、好ましくは腫瘍特異的に発現するｏａｔｐ／ＬＳＴ群に属する新規な有機アニオントランスポーターを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、このような観点から、ｏａｔｐ／ＬＳＴ群に属する新規な有機アニオントランスポーターを探索した。その結果、新規なヒト肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３ａとそのアイソフォームであるＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃを単離することに成功した。本発明のＬＳＴ−３ａは消化器癌細胞株に著明に発現しＭＴＸを輸送することから、抗癌剤デリバリーの新たな標的分子として有用である可能性が示され、ＬＳＴ−３ｂはＤＨＥＡＳ、ＴＣＡを基質とし、肝細胞内へのこれらの基質の輸送に関与する可能性が示された。これらの本発明のトランスポーターは、従来のＬＳＴ−１やＬＳＴ−２に比べると発現量が低いが、肝臓に特異的に発現し、かつ消化器癌細胞株での発現も見られることから、癌細胞など検出や治療に有用である。
【０００８】
本発明は、配列表の配列番号２，４及び６に示されるアミノ酸配列を有するヒト肝特異的有機アニオントランスポーター、及びそれをコードする遺伝子に関する。
また、本発明は、これらの遺伝子をキャリアーに組み込んでなる、遺伝子運搬用のキャリアーに関する。
さらに、本発明は、本発明のＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂを検出することができる配列を用いて、癌細胞、好ましくは消化器癌細胞の存在を検出、同定する方法に関する。
【０００９】
本発明の新規な遺伝子の単離について説明する。
本発明者らは、まず、ＬＳＴ−２のアミノ酸配列を用いてＥＳＴデータベース検索を行った結果、ＬＳＴ−２と高い相同性を有する２つのＥＳＴクローンＢＧ６１７８１９、Ｎ５０００５を見出した。
次に、このＢＧ６１７８１９の塩基配列をもとに遺伝子特異的プライマー（gene-specific primer）を作成し、あらかじめ５’および３’末端にアダプターがライゲーションされたヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）をテンプレートとし、プライマーとしてそれぞれの遺伝子特異的プライマー、及びアダプタープライマー（adaptor primer）を用いてＰＣＲを行った。
その結果、５’末端配列の異なる２つの５’ＲＡＣＥ産物と、１つの３’ＲＡＣＥ産物が増幅された。また、３’ＲＡＣＥ産物はもう１つのＥＳＴクローンであるＮ５０００５の配列を含んでいた。
このＲＡＣＥの概略を図１に示す。図１中の「ＢＧ６１７８１９」、及び「Ｎ５０００５」は、ＥＳＴデータベース検索の結果見出されたＥＳＴを示している。５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥにおける「ＡＰ１」及び「ＡＰ２」は２種のアダプタプライマーを示し、ＥＳＴ「ＢＧ６１７８１９」の下に示される「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｆ１」、及び「Ｆ２」は、５’−ＲＡＣＥ及び３’−ＲＡＣＥにおけるそれぞれの遺伝子特異的プライマーを示している。数字の入った四角枠は、２種類の５’−ＲＡＣＥ産物、及び１種類の３’−ＲＡＣＥ産物をそれぞれ示している。枠中の数字はＲＡＣＥ産物の塩基配列を各パートに分割したときの順番を示している。
２つの５’ＲＡＣＥ産物のうちの１つの５’末端配列はＬＳＴ−２のエキソンに由来するものと推定された。図１の１−４の網掛け部分はこの推定されたエキソン領域を示している。また、この時点で２つの５’ＲＡＣＥ産物と３’ＲＡＣＥ産物の末端は約４００塩基の共通する塩基配列を有していたため５’末端配列の異なる少なくとも２つの転写産物の存在が示唆された。
【００１０】
次に、２つの５’−ＲＡＣＥ産物の５’非翻訳領域、および３’−ＲＡＣＥ産物の３’非翻訳領域にそれぞれプライマーを作成し、同じライブラリーを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡ全長の増幅を試みた。その結果、３つの新たなｃＤＮＡが単離された。これらは３’末端に共通の塩基配列を有していたが、５’末端の塩基配列が異なっていた。後述するように、これら３つの新規ｃＤＮＡは肝臓特異的に発現が認められたので、これらのｃＤＮＡがコードしているタンパク質をそれぞれ「ＬＳＴ−３ａ」、「ＬＳＴ−３ｂ」、及び「ＬＳＴ−３ｃ」と命名した。
このＰＣＲの概要及び３種類のＰＣＲ産物とＬＳＴ−２をコードする遺伝子の配列の概要、並びに染色体１２番の概要を図２に示す。図２中のＦ及びＲは、それぞれＰＣＲに使用したプライマーを示し、各遺伝子のボックス中の数字はエキソン領域の番号を示し、ボックスの網掛けはＬＳＴ−２のエキソン領域であることを示す。図２の下段は、染色体１２番の「ＳＬＣ２１Ａ８」遺伝子、及び「ＬＯＣ３３８８２１」遺伝子を示し、遺伝子中の縦線はエキソン領域を示している。
これらのｃＤＮＡ及びＬＳＴ−２の塩基配列を比較検討したところ、２番目の新規ｃＤＮＡである「ＬＳＴ−３ｂ」をコードしている遺伝子は、ＬＳＴ−２のエキソンの１−４、３番目のｃＤＮＡである「ＬＳＴ−３ｃ」をコードしている遺伝子は、ＬＳＴ−２のエキソンの１−１４に由来すると考えられた。また、ＬＳＴ−２をコードしている遺伝子および新規クローンの遺伝子座はともに染色体１２番に存在し、ＬＳＴ−１とともにクラスターを形成しており、ＬＳＴ−３ａ及びＬＳＴ−２をコードしている遺伝子がそれぞれ単一の遺伝子ＳＬＣ２１Ａ８、及びＬＯＣ３３８８２１に由来することがわかった。また、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃをコードしている遺伝子は両方の遺伝子に由来するため、これらの２つはトランススプライシング（trans-splicing）による転写産物であると推測される。
【００１１】
得られた３種の「ＬＳＴ−３ａ」、「ＬＳＴ−３ｂ」、及び「ＬＳＴ−３ｃ」をコードしている遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１、３、及び５に示す。これらの３種の「ＬＳＴ−３ａ」、「ＬＳＴ−３ｂ」、及び「ＬＳＴ−３ｃ」をコードしている遺伝子の核酸レベルでの、ＬＳＴ−２をコードする遺伝子との相同性は、それぞれ８７．６％、８９．１％、及び９４．１％であり、きわめて高い相同性を有している。これらの、今回単離したＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃの遺伝子は、ジーンバンク（genbank）にそれぞれＡＦ４０１６４２、ＡＹ４４２３２５、ＡＹ４４２３２６として登録された。
また、これらのタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号２、４、及び６に示す。これらのタンパク質は、それぞれ６４０、６８７、及び７４８個のアミノ酸をコードしている。
これらの３種のタンパク質ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのアミノ酸配列の比較を図３にアミノ酸の１文字表記で示す。図３中のアミノ酸配列の下に付されている下線は、疎水解析で細胞膜貫通領域と予測された箇所を示し、それぞれ１１ヶ所、１２箇所、１３ヶ所の細胞膜貫通領域を有すると予測された。
また、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びに他のｏａｔｐ／ｌｓｔファミリーの樹形図解析の結果を図４に示す。本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃは、ＬＳＴ−２の枝上にそれぞれ独立して位置することから、ｏａｔｐ／ｌｓｔファミリーに属するとされた。
さらに、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びにＬＳＴ−２の細胞膜貫通の状況を模式的にして、図５に示す。ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃは、それぞれ１１ヶ所、１２箇所、１３ヶ所の細胞膜貫通領域を有しており、ＬＳＴ−２は１２ヶ所の細胞膜貫通領域を有している。図５では、白丸印で示されるアミノ酸はＬＳＴ−２に由来するアミノ酸に相当するものであり、ローマ数字はＬＳＴ−２に由来する細胞膜貫通領域に相当するものであることを示し、黒丸印で示されるアミノ酸はＬＳＴ−３ａに由来するアミノ酸に相当するものであり、白抜き数字はＬＳＴ−３ａに由来する細胞膜貫通領域に相当するものであることを示している。図５では、それぞれの上側が細胞外領域で、下側が細胞内領域を示している。ＬＳＴ−２及びＬＳＴ−３ｂではカルボキシル末端が細胞内に位置するのに対し、ＬＳＴ−３ａ及びＬＳＴ−３ｃでは細胞外に位置している。
【００１２】
次に、これらのＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃの発現の臓器特異性と、各種消化器癌細胞での発現について検討した。なお、ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、３ｃ、及びＬＳＴ−２は、相互に核酸レベルでの相同性がきわめて高いために、様々なＰＣＲ条件の検討にも拘わらずＬＳＴ−３ａ、３ｂ、３ｃをそれぞれ単独に、なおかつＬＳＴ−２とは区別して増幅させるプライマーの作成は困難であったので、以下の試験ではこれらの２者、又は３者の共通領域を増幅するプライマーを用いた。
ＬＳＴ−３ａとＬＳＴ−３ｂの共通する塩基配列の領域を増幅するプライマーを作成し、複数器官ｃＤＮＡパネル（multiple tissue cDNA panel（BDbiosciences社製））をテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＳＴ−３ａとＬＳＴ−３ｂの各器官における発現を検討した。この結果を図６に図面に変わる写真で示す。図の上段に試験した各器官を示し、中段にＬＳＴ−２ａ、２ｂの試験結果のブロットを示す。図６の下段はＧ３ＰＤＨの場合であり陽性コントロールして示した。この結果、ＬＳＴ−３ａ、３ｂは、肝臓（Liver）及び胎児肝臓（Fetal liver）でのみブロットが認められ、肝臓特異的に発現することが明らかとなった。
また、ここではデータは示さないが、ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃに共通する３’非翻訳領域をプローブとしたノーザンブロット（Northern blot）では、明らかなブロットが認められなかったことから、肝臓におけるＬＳＴ−３ａ、３ｂの発現量はＬＳＴ−１やＬＳＴ−２より少ないものと考えられる。
【００１３】
次に、これらの発現量を定量化するために、タックマンプローブ（Taqman probe）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により、ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃをそれぞれ個別に検出することを検討した。ここで用いたプライマーはＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃが、それぞれが区別できるように作成し、さらにタックマンプローブ（Taqman probe）をＬＳＴ−２並びにＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃが区別されるよう作成した。Ｇ３ＰＤＨを内因性のコントロールとして用い、比較値法（COMPARATIVE THRESHOLD METHOD）により各臓器におけるｍＲＮＡ発現レベルを胎児肝臓（FETAL LIVER）に対する割合で比較検討した。この結果を図７にグラフで示す。図７は、左からＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのそれぞれの結果を示している。各グラフの縦軸は胎児肝臓のｍＲＮＡの発現量を１とした場合の相対的な比の値を示し、横軸は左側が胎児肝臓で右側が成人の肝臓を示す。グラフ中のアスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。この結果、ＬＳＴ−３、３ｂ、及び３ｃはいずれも肝特異的に発現し、またいずれも成人の肝臓において胎児肝臓のおよそ３倍の発現が認められた。
【００１４】
同様に定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＳＴ−３ａの各種の消化器癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＴ−１７、ＭＫＮ７、ＮＵＧＣ−４、ＫａｔｏIII、及びＨＣＴ１１６）でのｍＲＮＡ発現を検討した。
比較対象として成人の肝臓における発現量と比較した。結果を図８に示す。図８の縦軸は成人肝臓のｍＲＮＡの発現量を１とした場合の相対的な比の値を示し、横軸は左側から成人肝臓、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＴ−１７、ＭＫＮ７、ＮＵＧＣ−４、ＫａｔｏIII、及びＨＣＴ１１６をそれぞれ示す。グラフ中のアスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。この結果、ＬＳＴ−３ａは、ＮＵＧＣ−４，ＫａｔｏIII細胞株においてそれぞれ約１６０倍、５０倍の発現が認められた。統計学的有意差は認められなかったが、ＨＴ−１７，ＭＫＮ７，ＨＣＴ１１６細胞株においても成人肝臓とほぼ同等かやや多い発現が認められた。
【００１５】
次に、ＮＵＧＣ−４細胞及びＫａｔｏIII細胞を用いて、低酸素下におけるＬＳＴ−３ｂの発現を同様な方法で検討した。結果を図９のＡ（ＮＵＧＣ−４細胞）、及びＢ（ＫａｔｏIII細胞）にそれぞれグラフ化して示す。図９の上段のＡはＮＵＧＣ−４細胞を用いた場合を示し、下段のＢはＫａｔｏIII細胞を用いた場合をそれぞれ示す。各グラフの縦軸は、ＬＳＴ−３ｂのｍＲＮＡのコントロール（正常酸素の場合）に対する相対発現量の比の値を示し、横軸は時間（時）を示す。各グラフの白抜きはコントロールを示し、黒塗りはＬＳＴ−３ｂの発現を示す。各グラフのアスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５で有意差があることを示し、二重アスタリスク（＊＊）はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
この結果、ＬＳＴ−３ｂは低酸素状態において発現が増加することがわかった。
【００１６】
また、ＬＳＴ−２の遺伝子配列に低酸素状態反応エレメント（Hypoxia responsive element（ＨＲＥ））が存在し、低酸素状態においてある種の遺伝子発現が誘導されることが報告されている。本発明のＬＳＴ−３ｂはその塩基配列の一部がＬＳＴ−２のエキソンに由来する塩基配列を有しているので、ＬＳＴ−３ｂの発現が低酸素状態で誘導されるかどうか検討してみた。ＮＵＧＣ−４細胞株を低酸素条件下で培養し、３、８，２４時間後にＴＯＴＡＬ ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣによりｍＲＮＡ発現レベルを０時間での発現レベルに対する割合で比較検討した。具体的なデータはここでは省略するが、ＬＳＴ−３ａの発現レベルはほぼ変化しなかったのに対して、一部がＬＳＴ−２の遺伝子に由来するＬＳＴ−３ｂは培養２４時間後に発現レベルの有意な増加が認められた。
【００１７】
これらの結果から、次の（１）〜（３）のことが明らかにされた。
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法によりＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃの発現は肝特異的であることが明らかとなった。（２）ＬＳＴ−３ａはＫａｔｏIII細胞株やＮＵＧＣ−４細胞株などの各種消化器癌細胞株に著明な発現が認められた。一方、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃは消化器癌細胞株において発現が認められなかった。（３）低酸素状態における培養でＮＵＧＣ−４細胞株のＬＳＴ−３ｂ ｍＲＮＡ発現量が有意に増加した。
【００１８】
次に、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃについて、各種の基質の輸送能を検討した。
まず、アフリカツメガエル卵母細胞発現を用いてＬＳＴ−３ａの各種基質の輸送能を検討した。
タウロコール酸塩（Taurocholate）、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（Dehydroepiandrosterone sulfate）、エストラジオール（Estradior）、プロスタグランジンＥ２（Prostaglandin E2）、アシクロビア（Acicrovir）、ディゴキシン（Digoxin）、メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を基質として検討した結果、ＭＴＸのみ有意な取り込みが認めらた。メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を基質とした、ＬＳＴ−３ａによる細胞内への取り込み能についての試験結果を図１０及び図１１に示す。図１０はＭＴＸが１μＭの濃度での取り込みをＨ２Ｏと比較した結果を示す。図１０の縦軸は、取り込み量（pmol/oocyte/60min）を示し、横軸は左側がＨ２Ｏの場合を示し、右側がＬＳＴ−３ａの場合を示す。図１１はＭＴＸの取り込みを、ＭＴＸの濃度を変化させて測定した結果を示す。図１１の縦軸は、取り込み量（pmol/oocyte/60min）を示し、横軸はＭＴＸの濃度（μＭ）を示す。この結果、ＬＳＴ−３ａによるＭＴＸの輸送は濃度依存的かつ飽和的であり、そのＫｍ値は１７．３μＭであった。
【００１９】
次に、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのそれぞれの基質輸送能をＬＳＴ−１、ＬＳＴ−２と比較するため、ＨＥＫ２９３細胞を用いて一過性に発現させて、各種基質の取り込みを検討した。結果をグラフ化して図１２に示す。図１２の左上は基質がタウロコール酸（ＴＣＡ）の場合を示し、右上は基質がＭＴＸの場合を示し、左下は基質がエストロン硫酸塩の場合を示し、右下は基質がエストラジオール  １７β−Ｄ−グルクロニドの場合を示す。各グラフの縦軸は、取り込み量（pmol/mg protein/20min）を示し、横軸は左からコントロール、ＬＳＴ−１、ＬＳＴ−２、ＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃをそれぞれ示す。この結果、ＬＳＴ−３ｂはＴＣＡをＬＳＴ−１とほぼ同等に取り込み、エストラジオール  １７β−Ｄ−グルクロニド（estradiol 17bD-glucuronide）をわずかに取り込むことがわかった。ＬＳＴ−３ａはアフリカツメガエル卵母細胞発現系ではＭＴＸを有意に取り込んだが（図１０及び図１１参照）、ＨＥＫ２９３細胞を用いた発現系ではＭＴＸを輸送しなかった。また、ＬＳＴ−３ｃはいずれの基質も輸送しなかった。
ＨＥＫ２９３細胞を用いた発現系において基質の輸送能が認められたＬＳＴ−３ｂに関して、さらに他の基質の輸送を検討した。基質として、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（ＤＨＥＡＳ）、エストラジオール  １７β−Ｄ−グルクロニド（estradiol 17bD-glucuronide）、エストロン硫酸塩、タウロコール酸、トリヨードチロニン、プロスタグランジンＥ２（ＰＧ  Ｅ２）、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ジゴキシン、ｐ−アミノ馬尿酸、及びアシクロビルを用いた。結果を次の表１に示す。
【００２０】
【表１】
2005287353.tif 000002
【００２１】
ＬＳＴ−３ｂの発現細胞はＭＯＣＫ細胞に比べてデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（ＤＨＥＡＳ）を３．１倍取り込むことがさらに明らかになった。ＬＳＴ−３ｂの発現細胞におけるＤＨＥＡＳの輸送を、ＤＨＥＡＳの濃度（μＭ）を変化させて測定した結果を図１３に示す。図１３の縦軸は、取り込み量（pmol/mg protein/20min）を示し、横軸はＤＨＥＡＳの濃度（μＭ）を示す。この結果、ＬＳＴ−３ｂの発現細胞におけるＤＨＥＡＳの輸送は濃度依存的かつ飽和的で、Ｋｍ値は２６．４μＭであった。
【００２２】
次に、図５の予想される膜貫通構造に示されるように、ＬＳＴ−３ｂのカルボキシル末端が細胞内に位置するのに対し、ＬＳＴ−３ａでは細胞外に位置するため、ＬＳＴ−３ａがＬＳＴ−３ｂの基質を細胞外へ排出する可能性があることから、ＬＳＴ−３ａをＨＥＫ２９３細胞へ一過性で発現させ、ＤＨＥＡＳの排出能を検討した。
ＬＳＴ−３ａの発現細胞に[３Ｈ]で標識したＤＨＥＡＳを予め細胞内に取り込ませておき、細胞膜へ結合した基質を除くためバッファーで洗浄した後、新たなバッファーを加え、この時点を０分として各時間ごとにバッファーを回収し、バッファーの放射能を計測して流出量とするとともに、細胞を溶解しその放射能を計測して残存量とした。そして、流出量と残存量を加えて、全体の量（loaded count）とした。結果を図１４のグラフで示す。図１４の縦軸は、残存量（remaining count）／全体の量（loaded count）の比を百分率（％）で示し、横軸は時間（分）を示す。図１４の黒菱形印（◆）はＡＴＰ欠乏時のコントロールの場合を示し、黒四角印（■）はＡＴＰ欠乏時のＬＳＴ−３ａの場合を示し、黒三角印（▲）はコントロールを示し、黒丸印（●）はＬＳＴ−３ａの場合を示す。この結果、ＬＳＴ−３ａの発現細胞ではＭＯＣＫ細胞と比べてＤＨＥＡＳの有意な排出は認められなかった。
【００２３】
以上のことから、本発明のＬＳＴ−３ａは消化器癌細胞株に著明に発現し、ＭＴＸを基質とすることから、抗癌剤デリバリーの新たな標的分子として有用であることが判明した。一方、ＬＳＴ‐３ｂは低酸素状態で培養した胃癌細胞株においてその発現が有意に増加しＤＨＥＡＳを基質とすることが明らかとなった。ＤＨＥＡＳはウサギの腎近位尿細管やラットの神経細胞において細胞保護作用を有することが報告されており、低酸素状態でのＬＳＴ−３ｂの発現増加とＤＨＥＡＳの取り込みは癌細胞の生存にとっては有利に働く可能性が示される。性ホルモン感受性の癌では、これらの有効性が考えられるが、性ホルモン感受性の癌以外では、アンドロゲンなどの前駆体としての機能以外には、全身の様々な臓器においてＤＨＥＡＳがどのような作用を有するかはこれまでのところ充分には解明されていないことから、低酸素状態でのＬＳＴ−３ｂの発現増加のメカニズムやその意義に関して更なる検討が必要であろう。
本発明のＬＳＴ−３ａ及びＬＳＴ−３ｂは、その発現レベルはＬＳＴ−１，ＬＳＴ２と比べて低いものの、肝臓特異的に発現が認められ、これらの基質の肝細胞内への輸送に関与している可能性が示される。
【００２４】
また、本発明のＬＳＴ−３ｂ、及び３ｃは、その塩基配列からして、トランススプライシング（trans-splicing）により転写されると予測される。トランススプライシング（trans-splicing）とは、スプライス供与部位とスプライス受容部位が異なるＲＮＡ分子上に存在する場合にみられるスプライシング様式と定義されており、主に線虫や原生動物などの下等生物で報告されています。人におけるトランススプライシングの報告は極めて少なく、その中の例として、チトクローム（cytchrome（ＣＹ）） Ｐ４５０ ３Ａ遺伝子群や転写因子（transcription factor） Sp1遺伝子があげられます。ＣＹ  Ｐ ４５０ ３Ａ遺伝子群はＡ４３，Ａ４，Ａ７，Ａ５がクラスターを形成し、Ａ４３遺伝子のエキソン１を共通部分に有し、Ａ４，Ａ５の様々なエキソンに由来する転写産物が報告されている。Ｓｐ１遺伝子においては、エキソン２−３の繰り返しの構造を有する転写産物の報告があるが、いずれの転写産物も発現レベルが非常に低く、その機能も明らかにされてきていない。このように、トランススプライシングによる発現、特にヒトにおけるトランススプライシングは極めて珍しい事例であり、本発明の遺伝子は、ヒトにおけるトランススプライシングの機構や意義を解明する上で重要であろう。
【００２５】
本発明は、新規なヒト肝特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−３）を提供するものであり、より詳細にはそのサブタイプであるＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、及びＬＳＴ−３ｃの３種類の新規なヒト肝特異的有機アニオントランスポーターを提供する。本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２、４、及び６にそれぞれ示されるものであれるが、当該配列に限定されるものではなく本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターの特性を維持するものであれば本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターに包含されるものである。アミノ酸配列の相同性としては、本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターは従来のＬＳＴ−２と相同性が高いために、これと区別できる程度の相同性、具体的には９５％以上の相同性を有するものが好ましい。
【００２６】
本発明は、前記した本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターをコードする遺伝子（非翻訳領域を含む）を提供するものであり、より詳細には、配列表の配列番号１、３、及び５に示される塩基配列（非翻訳領域を含む）があげられるが、これに限定されるものではなく、本発明のヒト肝特異的有機アニオントランスポーターの特性を維持することができるアミノ酸配列をコードしているものであれば本発明の遺伝子に包含されるものである。
本発明の遺伝子は、単離された遺伝子としてそれ自体を使用することもできるが、遺伝子の運搬用のキャリアーに組み込んで使用するのが好ましい。例えば、本発明のＬＳＴ−３ａやＬＳＴ−３ｂは癌細胞に発現することから、本発明のＬＳＴ−３ａやＬＳＴ−３ｂの遺伝子をアデノウイルスなどのキャリヤーを用いて当該遺伝子を腫瘍部に注入して癌細胞にＬＳＴ−３ａやＬＳＴ−３ｂを特異的に発現させたのち、メトトレキサート（ＭＴＸ）などのＬＳＴ−３ａやＬＳＴ−３ｂに特異的に輸送される抗癌剤を投与し、当該トランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させて癌細胞を選択的に死滅させることも可能となる。このような方法により、癌の治療、抑制方法、及びその処置、を行うこともできる。このような方法を用いれば、ＬＳＴ−３ａの発現レベルの高い消化器固形癌などに対しては、低投与量でも抗癌剤が選択的に癌細胞に輸送される。あるいはＬＳＴ−３ａが発現していなくてもアデノウイルスを用いてその増強を図るため、副作用を低く抑えながら癌病巣部の縮減効果を高めることも可能となる。
【００２７】
このような遺伝子のキャリアーとしては、生体内に安全に本発明のＬＳＴ−３遺伝子を導入することができるものであれば、特に制限はないが、例えば、アデニウイルなどのウイルスや、プラスミドベクターなどのベクターが好ましい。本発明のＬＳＴ−３遺伝子をキャリアーに含有させる方法としては、キャリアーに応じた通常の方法で行うことができる。例えば、キャリアーとしてウイルスを使用する場合には、リン酸カルシウム法にてトランスフェクションし、目的の遺伝子を発現する株を同定することにより行うことができる。
このようなキャリアーに組み込ませる本発明のＬＳＴ−３遺伝子としては、ＬＳＴ−３の全長をコードするものであってもよいし、部分長でよく、有機アニオンとなって抗癌剤を癌細胞に取り込める蛋白質を発現できる長さであればよい。蛋白質をコードする翻訳領域の上流側にプロモーター領域などを必要に応じて付加することが望ましい。目的の蛋白質を発現させることができるものであれば、プロモーターの種類に特に制限はないが、ＬＳＴ−３のｃＤＮＡ又はゲノムからのものが好ましい。また、下流側にも必要に応じて適当な長さの非翻訳領域を有するものが好ましい。本発明のＬＳＴ−３遺伝子としては、ｃＤＮＡから誘導される全長の翻訳領域及びその前後の非翻訳領域を含む遺伝子、ゲノム遺伝子などが挙げられる。
また、このような方法により癌の処置、治療において使用される抗癌剤としては、本発明のＬＳＴ−３により細胞内に取り込まれるものであれば、特に制限はない。抗癌剤がＬＳＴ−３により細胞内に取り込まれるか否かは、本発明者らの文献（Takaaki, Abe, et al., Gastroenterology, (2001), 120, 1689-1699）に記載された方法により確認することができる。好ましい抗癌剤の例としては、メトトレキサート（ＭＴＸ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明は、ＬＳＴ−３ａをコードする塩基配列、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列の部分配列を使用して、細胞におけるヒト肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂの発現を検出、同定する方法を提供する。本発明のこの方法における部分配列とは、本発明のＬＳＴ−３ａ又はＬＳＴ−３ｂをＰＣＲ法やプローブによる方法で検出や同定することができる配列であれば特に制限はないが、例えば、ＬＳＴ−３ａをコードする翻訳領域や非翻訳領域における１０〜５０、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１０〜２０程度の長さのオリゴヌクレオチドをプライマーやプローブとして、必要により放射性元素や蛍光物質などにより標識化して使用するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
この方法は、例えば、検査対象となる細胞の全ｍＲＮＡのｃＤＮＡを作成して、前記したオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲやプローブによるハイブリダイゼーション法などの方法により、検査対象となっている細胞がＬＳＴ−３ａを発現しているかどうかを検査することができる。前述してきたように、本発明のＬＳＴ−３ａは肝臓に特異的に発現し、また消化器癌細胞にも発現していることから、肝細胞や癌細胞などを検出や同定する方法として使用することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、抗癌剤デリバリーの新たな標的分子として有用である可能性が示されてきたｏａｔｐ／ＬＳＴ群に属する新規な肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３を提供するものである。本発明のＬＳＴ−３は、サブタイプとしてＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、及びＬＳＴ−３ｃの３種類が存在し、それらは公知のＬＳＴ−２と相同性が高いが発現形態や機能において特異的な特性を有するものであり、これらのＬＳＴ−３の特性を活かした抗癌剤のデリバリーシステムを構築することができ、またＬＳＴ−３を特異的に発現する細胞の存在を検出、同定する方法を提供することができる。
とりわけ、ＬＳＴ−３ａは各種消化器癌細胞株に著明に発現し、ＭＴＸを有意に取り込んだことから、ＬＳＴ−３ａは抗癌剤デリバリーの新しい標的分子として有用である。
また、ＬＳＴ−３ｂはＬＳＴ−２およびＬＳＴ−３ａのトランススプライシングによる転写産物と考えられ、低酸素状態における ＮＵＧＣ−４細胞株で著明にｍＲＮＡ発現が増加し、ＤＨＥＡＳはウサギ腎近位尿細管やラット神経系で細胞保護作用を有することが報告されていることから、ＬＳＴ−３ｂはＤＨＥＡＳを輸送することで低酸素状態における癌の細胞生存に有利に働く可能性が示された。また、ｏａｔｐ群においてトランススプライシングによる転写産物の報告はこれが最初であり、哺乳類においてトランススプライシング産物が明らかな機能を有するという数少ない事例を本発明は提供するものであり、ヒトにおけるトランススプライシングの重要性やメカニズムを明らかにする上で重要である。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＬＳＴ−３のクローニング
ＬＳＴ−２のアミノ酸配列を用いてＥＳＴデータベース検索を行った結果、ＬＳＴ−２と高い相同性を有する２つのＥＳＴクローンＢＧ６１７８１９、Ｎ５０００５を同定した。
次にＢＧ６１７８１９の塩基配列をもとに、遺伝子特異的な５’ＲＡＣＥ用プライマーＲ１、Ｒ２（nested）、３’ＲＡＣＥ用プライマーＦ１、Ｆ２（nested）を作成した。これらの配列を以下に示す。
プライマーＦ１：  5'-TTAGGTACTGTGAATGCAATGGGAATGACTG-3'
プライマーＦ２：  5'-GGAATGACTGGTCTAGTTTTTGCCTTTATG-3'
プライマーＲ１：  5'-AGTCTTAGATGCAGACCAACCATACTGTTGC-3'
プライマーＲ２：  5'-CAGACCAACCATACTGTTGCTCCACCATT-3'
次に、BD biosciences社製human liver Marathon‐ready ｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＡＣＥをおこなった。５’ＲＡＣＥは１st ＰＣＲとしてＲ１とＡＰ１のプライマーを用い、２nd ＰＣＲとしてＲ２とＡＰ２のプライマーを用いた。３’ＲＡＣＥは１st ＰＣＲにＦ１とＡＰ１を、２nd ＰＣＲにＦ２とＡＰ２の各プライマーを用いた。
なお、ＡＰ１とＡＰ２はMarathon adaptor（BD biosciences社）の配列である。これらの配列を以下に示す。
アダプターＡＰ１：  5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
アダプターＡＰ２：  5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'
ＰＣＲ反応にはPerkin Elmer DNA thermal cycler ４８０を用い、代表的な温度条件は９４度１分の後、９４度１分、６５度３分を３０サイクルでおこなった。
その結果、２つの５’ＲＡＣＥ産物（５’ＲＡＣＥ産物１、５’ＲＡＣＥ産物２とする）と１つの３’ＲＡＣＥ産物が得られた。５’ＲＡＣＥ産物１と５’ＲＡＣＥ産物２は、５’末端配列が異なり、３’末端配列は共通であった。この共通する３’末端配列と３’ＲＡＣＥ産物の５’末端は約４００bpにわたり同一の塩基配列を有していたため、少なくとも２つの完全長ｃＤＮＡの存在が示唆された。
結果の概要を図１に示す。
【００３２】
そこで、５’ＲＡＣＥ産物１の５’末端配列をもとに遺伝子特異的プライマーＦ３、Ｆ４（nested）を、５’ＲＡＣＥ産物２の５’末端配列をもとにＦ５、Ｆ６（nested）を、３’ＲＡＣＥ産物の３’末端配列をもとにＲ３、Ｒ４（nested）を作成した。以下にこれらの配列を示す。
プライマーＦ３：  5'-TGAGGCTCCTCCTGAGGATCTAAGGGTCC-3'
プライマーＦ４：  5'-AAGATCTTCTTGACACTCCTGTCATTCAGC-3'
プライマーＦ５：  5'-GGTCATCATTTCAAACCAAGCATCAGCAAC-3'
プライマーＦ６：  5'-AACAATTAAAAATATTCACTTGGTATCTGTAG-3'
プライマーＲ３：  5'-GGGAGTTTGGAAGAAAATACATCAAGGTGG-3'
プライマーＲ４：  5'-CGTTGCATCATAAGTGAGGAATGTGGG-3'
次に完全長ｃＤＮＡを増幅するため、これらのプライマーを用い、いわゆるend‐to-end ＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ反応は上記と同様におこなった。
その結果、３つの新たなｃＤＮＡが単離された。これらをＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、及びＬＳＴ−３ｃとそれぞれ命名した。
結果の概要を図２に示す。またこれらの塩基配列を配列表の配列番号１、３、及び５にそれぞれ示す。これらはそれぞれ６４０，６８７，７４８アミノ酸をコードしており、これらの翻訳領域におけるアミノ酸配列を配列番号２、４、及び６にそれぞれ示す。
得られた、ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのアミノ酸配列の比較を図３に示し、ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びに他のｏａｔｐ／lｓｔファミリーの樹形図解析の結果を図４に示す。この結果、これらのＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃは、いずれもｏａｔｐ／ＬＳＴファミリーに属することがわかった。
【実施例２】
【００３３】
ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃの発現の臓器特異性
上記に付き、各種消化器癌細胞での発現について検討した。
まず、ＬＳＴ−３ａとＬＳＴ−３ｂの両方を増幅するよう設計されたプライマーＦ７、Ｒ５を用いて逆転写ＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ条件は９５度１分の後、（９５度３０秒、６８度１分）を４０ cycleおこない、最後にfinal extensionとして６８度３分とした。テンプレートとしてBD biosciences社製human multiple tissue ｃＤＮＡ（ＭＴＣ）panelを用いた。
プライマーＦ７：  5'-GGAATGACTGGTCTAGTTTTTGCCTTTATG-3'
プライマーＲ５：  5'-GCCAATTGCAACAGTAGGTAGGGCGAGG-3'
ＲＴ−ＰＣＲ産物を０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、Bio Rad社製Gel Doc 2000で蛍光を検出した。
結果を図６に示す。この結果、ＬＳＴ−３ａ、及び３ｂは肝臓特異的に発現することが明らかにされた。
【実施例３】
【００３４】
ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃの発現の臓器特異性（ノーザンブロット）
ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃに共通する３’−非翻訳領域をプローブとしたノーザンブロットを行った。この結果、これらの明確なバンドを確認することができなかったことから、肝臓におけるＬＳＴ−３ａ、及び３ｂの発現量は、ＬＳＴ−１やＬＳＴ−２より少ないものと推定された。
【実施例４】
【００３５】
肝臓における発現の定量
ＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３Ｃの各ｍＲＮＡをそれぞれ個別に増幅、検出するため、Taq Man Probe（Applied Biosystems社製）を用いた定量ＰＣＲをおこなった。プライマーおよびプローブは以下の通りである。
ＬＳＴ−３ａ用プライマーＦ：  5'-TTATGGGAACTGGAAGTATTTTGATG-3'
Ｒ：  5'-TTGTAAACTAATTAATTTGTCAAACCATTCA-3'
ＬＳＴ−３ｂ用プライマーＦ：  5'-TTATGGGAACTGGAAGTATTTTGACA-3'
Ｒ：  5'-TTGTAAACTAATTAATTTGTCAAACCATTCA-3'
ＬＳＴ−３ｃ用プライマーＦ：  5'-GGAGCACAAGGAGCTTGTAGGA-3'
Ｒ：  5'-CGATCGCATAATCATTGAATGG-3'
さらに、タックマンプローブをＬＳＴ−２とＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃが区別されるよう作成した。
ＬＳＴ−３ａプローブ：5'-FAM-AGAAACCAATATTGATCCAT-Minor Groove Binder(MGB)-3'
ＬＳＴ−３ｂプローブ：5'-FAM-AGAAACCAATATTGATCCAT-MGB-3'
ＬＳＴ−３ｃプローブ：5'-FAM-ATTCCGTATTTTTTGGGATTGTTCAACCTGA-TAMRA-3'
次に、Ｇ３ＰＤＨを内因性のコントロールとして用い、比較値法（COMPARATIVE THRESHOLD METHOD）により、ＬＳＴ−３ａ、ＬＳＴ−３ｂ、ＬＳＴ−３ｃのｍＲＮＡ発現レベルを算出した。
結果を図７に示す。この結果、ＬＳＴ−３，３ｂ，３ｃはいずれも肝特異的に発現し、またいずれも成人肝臓において胎児肝臓のおよそ３倍の発現が認められた。
【実施例５】
【００３６】
各種の消化器癌細胞株でのＬＳＴ−３ａのｍＲＮＡ発現
前記した実施例４と同様の方法により、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＬＳＴ−３ａの各種消化器癌細胞株でのｍＲＮＡ発現を定量化した。
結果を図８に示す。この結果、成人肝臓における発現量と比較して、ＮＵＧＣ−４、及びＫａｔｏIII細胞株においてそれぞれ約１６０倍、５０倍の発現が認められた。
【実施例６】
【００３７】
消化器癌細胞株ＮＵＧＣ−４及びＫａｔｏIIIでのＬＳＴ−３ｂのｍＲＮＡ発現
実施例５と同様にして、ＬＳＴ−３ａの各種消化器癌細胞株でのｍＲＮＡ発現を定量化した。
培養開始から、３時間後、６時間後、及び９時間後に測定した。
また、コントロールとして低酸素条件にする直前の細胞を用いた。結果を図９に示す。
【実施例７】
【００３８】
ＬＳＴ−３ｂの発現が低酸素状態で誘導
アナエロパック（AnaeroPack）システム（三菱ガス社製）を用いて、ＮＵＧＣ−４細胞株を低酸素条件下で培養し、３、８，２４時間後に全ＲＮＡを抽出し、実施例６と同様にして、定量的ＲＴ−ＰＣによりｍＲＮＡ発現レベルを定量化した。
結果を、０時間での発現レベルに対する割合として評価した。この結果、ＬＳＴ−３ａの発現レベルはほぼ変化しなかったのに対して、１部がＬＳＴ−２の遺伝子に由来するＬＳＴ−３ｂは培養２４時間後に発現レベルの有意な増加が認められた。
【実施例８】
【００３９】
ＬＳＴ−３ａの各種の基質の輸送能
アフリカツメガエル卵母細胞発現
ＬＳＴ−３ａ ｃＤＮＡからＴ７ ＲＮＡ polymeraseを用いてｃＲＮＡを合成し、このｃＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に徴量注入（この時点でｃＲＮＡのかわりにＨ２Ｏ注入した卵母細胞を以下の実験のコントロールとした）し、７２時間インキュベートして蛋白を発現させた。
次に放射性同位元素で標識した各種基質（タウロコール酸塩（Taurocholate）、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（Dehydroepiandrosterone sulfate）、エストラジオール（Estradior）、プロスタグランジンＥ２（Prostaglandin E2）、アシクロビア（Acicrovir）、ディゴキシン（Digoxin）、メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を含む溶液中に卵母細胞を置き、一定時間おいた後、卵母細胞の中に取り込まれた基質の量を、その放射活性を測定することで定量化した。この結果、ＭＴＸのみ有意な取り込みが認められた。
メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を基質とした、ＬＳＴ−３ａによる細胞内への取り込み能についての試験結果を図１０及び図１１に示す。図１０はＭＴＸが１μＭの濃度での取り込みをＨ２Ｏと比較した結果を示す。図１１はＭＴＸの取り込みを、ＭＴＸの濃度を変化させて測定した結果を示す。図１１の縦軸は、取り込み量（pmol/oocyte/60min）を示し、横軸はＭＴＸの濃度（μＭ）を示す。この結果、ＬＳＴ−３ａによるＭＴＸの輸送は濃度依存的かつ飽和的であり、そのＫｍ値は１７．３μＭであった。
【実施例９】
【００４０】
ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃの各種の基質の輸送能
ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのそれぞれの基質輸送能をＬＳＴ−１，ＬＳＴ−２と比較するため、ＨＥＫ２９３細胞を用いて一過性に発現させて、各種基質の取り込みを実施例８と同様な方法で行った。
結果を図１２に示す。その結果、ＬＳＴ−３ｂはＴＣＡをＬＳＴ−１とほぼ同等に取り込み、エストラジオール  １７βＤ−グルクロニドをわずかに取り込むことがわかった。ＬＳＴ−３ａはアフリカツメガエル卵母細胞発現系（実施例８参照）ではＭＴＸを有意に取り込んだが、ＨＥＫ２９３細胞を用いた発現系ではＭＴＸを輸送しなかった。
また、ＨＥＫ２９３細胞を用いた発現系において基質の輸送能が認められたＬＳＴ−３ｂに関して、さらに他の基質について、同様な方法で取り込み実験を行った。
結果を表１に示す。この結果、ＬＳＴ−３ｂ発現細胞はＭＯＣＫ細胞に比べてＤＨＥＡＳを３．１倍取り込むことがさらに明らかになった。
ＨＥＫ２９３細胞を用いたＬＳＴ−３ｂの発現系において、ＤＨＥＡＳの濃度を変化させて、各種の濃度におけるＤＨＥＡＳの取り込み実験を同様な方法で行った。
結果を図１３に示す。その結果、ＬＳＴ−３ｂ発現細胞におけるＤＨＥＡＳの輸送は濃度依存的かつ飽和的でＫｍ値は２６．４μＭであった。
【実施例１０】
【００４１】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＬＳＴ−３ａのＤＨＥＡＳの排出能
ＬＳＴ−３ａをＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させた。このＬＳＴ−３ａ発現細胞に[３Ｈ]標識ＤＨＥＡＳを予め取り込ませておいた。このとき、細胞膜へ結合した基質を除くためバッファーで充分洗浄した後、あらたなバッファーを加えた。この時点を０分として各時間ごとにバッファーを回収し、バッファー中の［３Ｈ］による放射能を計測して排出量とした。また、その時、細胞を溶解し、同様に放射能を測定して、残存量とした。
測定された排出量と残存量を加えて、その合計を全体の量（loaded count）として、測定結果をグラフ化した。
結果を図１４に示す。この結果、ＬＳＴ−３ａ発現細胞ではＭＯＣＫ細胞と比べてＤＨＥＡＳの有意な排出は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、抗癌剤デリバリーとして有用な新規な肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３を提供するものである。本発明の肝特異的有機アニオントランスポーターＬＳＴ−３は癌細胞に発現することから、癌細胞を検出または同定するための材料として使用できるだけでなく、これと抗癌剤を投与することにより、癌細胞に選択的に抗癌剤を輸送することが可能となり、癌細胞に選択的な癌の治療方法を可能にする医薬品とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＥＳＴデータベース検索の結果見出された「ＢＧ６１７８１９」、及び「Ｎ５０００５」に基づく、ＲＡＣＥの概略を示す。
【図２】図２は、図１に示すＲＡＣＥ産物に基づいて作成されたプライマーを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡ全長の増幅を試みた結果の概要、ＰＣＲの結果得られた３つの新たなｃＤＮＡ「ＬＳＴ−３ａ」、「ＬＳＴ−３ｂ」、「ＬＳＴ−３ｃ」遺伝子、及びＬＳＴ−２をコードする遺伝子の配列の概要、並びに染色体１２番の概要を示す。
【図３】図３は、本発明の３種のタンパク質ＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃのアミノ酸配列の比較をアミノ酸の１文字表記で示したものである。図３中の下線は膜貫通領域を示す。
【図４】図４は、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びに他のｏａｔｐ／ｌｓｔファミリーの樹形図解析の結果を示す。図４の右下のバーは、０．１の単位を示している。
【図５】図５は、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びにＬＳＴ−２の細胞膜貫通の状況を模式的にして示したものである。図５の白丸印で示されるアミノ酸はＬＳＴ−２に由来するアミノ酸に相当するものであり、ローマ数字はＬＳＴ−２に由来する細胞膜貫通領域に相当するものであることを示し、黒丸印で示されるアミノ酸はＬＳＴ−３ａに由来するアミノ酸に相当するものであり、白抜き数字はＬＳＴ−３ａに由来する細胞膜貫通領域に相当するものであることを示す。
【図６】図６は、本発明のＬＳＴ−３ａとＬＳＴ−３ｂの共通する塩基配列の領域を増幅するプライマーを用いて、複数器官ｃＤＮＡパネル（multiple tissue cDNA panel（BDbiosciences社製））をテンプレートとしてＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＳＴ−３ａとＬＳＴ−３ｂの各器官における発現を検討した結果を示す図面に変わる写真である。
【図７】図７は、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃが、それぞれが区別できるように作成されたタックマンプローブ（Taqman probe）を用いて、比較閾法（COMPARATIVE THRESHOLD METHOD）により各臓器におけるｍＲＮＡ発現レベルを胎児肝臓（FETAL LIVER）に対する割合で比較検討した結果を示すグラフである。
【図８】図８は、図７と同様の定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＬＳＴ−３ａの各種の消化器癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＴ−１７、ＭＫＮ７、ＮＵＧＣ−４、ＫａｔｏIII、及びＨＣＴ１１６）でのｍＲＮＡ発現を、成人肝臓に対する割合で比較検討した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＮＵＧＣ−４細胞及びＫａｔｏIII細胞を用いて、ＬＳＴ−３ｂの発現を図８と同様な方法で検討した結果を結果を図９のＡ（ＮＵＧＣ−４細胞）、及びＢ（ＫａｔｏIII細胞）にそれぞれグラフ化して示したものである。
【図１０】図１０は、メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を基質とした、ＬＳＴ−３ａによる細胞内への取り込み能について、ＭＴＸが１μＭの濃度での取り込みをＨ２Ｏと比較した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、メトトレキサート（Methotrexate（ＭＴＸ））を基質とした、ＬＳＴ−３ａによる細胞内への取り込み能について、ＭＴＸの取り込みを、ＭＴＸの濃度を変化させて測定した結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明のＬＳＴ−３ａ、３ｂ、及び３ｃ、並びにＬＳＴ−１、及びＬＳＴ−２のそれぞれの基質輸送能を、ＨＥＫ２９３細胞を用いて一過性に発現させて、各種基質の取り込みを検討した結果を示すグラフである。  図１２の左上は基質がタウロコール酸（ＴＣＡ）の場合を示し、右上は基質がＭＴＸの場合を示し、左下は基質がエストロン硫酸塩の場合を示し、右下は基質がエストラジオール  １７β−Ｄ−グルクロニドの場合を示す。
【図１３】図１３は、ＬＳＴ−３ｂの発現細胞におけるＤＨＥＡＳの輸送を、ＤＨＥＡＳの濃度を変化させて測定した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明のＬＳＴ−３ａのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡＳ）の排出能を検討した結果を示すグラフである。図１４の縦軸は、残存量（remaining count）／全体の量（loaded count）の比を百分率（％）で示し、横軸は時間（分）を示す。図１４の黒菱形印（◆）はＡＴＰ欠乏時のコントロールの場合を示し、黒四角印（■）はＡＴＰ欠乏時のＬＳＴ−３ａの場合を示し、黒三角印（▲）はコントロールを示し、黒丸印（●）はＬＳＴ−３ａの場合を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１：「ＬＳＴ−３ａ」をコードする遺伝子の塩基配列。
配列番号２：「ＬＳＴ−３ａ」のアミノ酸配列。
配列番号３：「ＬＳＴ−３ｂ」をコードする遺伝子の塩基配列。
配列番号４：「ＬＳＴ−３ｂ」のアミノ酸配列。
配列番号５：「ＬＳＴ−３ｃ」をコードする遺伝子の塩基配列。
配列番号６：「ＬＳＴ−３ｃ」のアミノ酸配列。
【図１】
2005287353.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図６】
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【配列表】
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