(57)【要約】【課題】  ネイティブ状態のタンパク質の取得が困難なタンパク質や、カチオン化タンパク質を調製する過程で変性・沈殿を生じてしまうタンパク質等の変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、かつ細胞内での活性化を同時に可能とし、タンパク質及び／又はペプチドの機能解析の迅速化や、タンパク質及び／又はペプチドを用いた医薬品・研究用試薬の調製等に好適に利用・応用される細胞内導入方法、並びに、それに用いられる細胞内導入用試験キットを提供する。【解決手段】  タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入する方法であって、上記細胞内導入方法は、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内に存在するようにタンパク質及び／又はペプチドを導入する過程と、該還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内で活性化される過程とを含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入する方法であって、
該細胞内導入方法は、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内に存在するようにタンパク質及び／又はペプチドを導入する過程と、該還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内で活性化される過程とを含んでなる
ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法。
【請求項２】
前記細胞内導入過程は、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、細胞内で還元させてなる
ことを特徴とする請求項１記載のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法。
【請求項３】
請求項１又は２のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法に用いられるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットであって、
該試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬が封入された容器を含んでなる
ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法、並びに、それに用いられる細胞内導入用試験キットに関する。より詳しくは、可逆的カチオン化による変性タンパク質の細胞内導入と活性化の方法であり、例えば、細胞内で機能させたいタンパク質及び／又はペプチドを任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させ、その機能を細胞内で発現させることを可能とする細胞内導入方法及び試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を細胞内に導入する技術は、タンパク質の性質を知るうえで有用であり、細胞内で機能させたいタンパク質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させることを可能とする技術である。現在、様々な細胞の増殖・分化・発生に関わるタンパク質の発現・修飾のタイムシグナルが明らかにされつつあり、これらの知見に基づいて、例えば、再生医学や組織工学といった工学面へと応用する際に、タンパク質の細胞内導入技術により、様々な可能性が広がることが期待されている。
【０００３】
従来のタンパク質の細胞内導入技術としては、カチオン性の高いタンパク質や化学修飾によりカチオン化されたタンパク質による手法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。この手法においては、負に帯電している細胞表面に、カチオン化された導入目的物であるタンパク質が静電的に吸着することにより、高効率で細胞内に取り込まれることになる。しかしながら、この手法においては、導入目的物であるタンパク質分子における多部位のアミノ酸側鎖の修飾が必要であったため、タンパク質の機能を充分に維持することが望まれていた。
【０００４】
タンパク質の細胞内での機能を維持するために、修飾するカルボキシル基の最適な程度について報告がなされている（例えば、非特許文献２参照。）。この報告では、修飾されるカルボキシル基の数が多いと、細胞内に取り込まれやすいが、タンパク質の細胞内での機能が低下すること、また、修飾されるカルボキシル基の数が少ないと、タンパク質の細胞内での機能を維持し得るが、細胞内に取り込まれにくくなることから、細胞への取り込み性と細胞内でのタンパク質の機能維持とのバランスを考慮して、修飾するカルボキシル基の最適な程度を求めている。しかしながら、このような手法においても、タンパク質を更に高効率で細胞内に取り込むとともに、タンパク質の機能を更に充分に維持するための工夫の余地があった。また、これらの手法においては、再生医学や組織工学等の分野でタンパク質の性質等を充分に研究するために、変性状態のタンパク質であっても、任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させるための工夫の余地があった。
【０００５】
また１１個のアルギニンによるＰＴＤ（タンパク質導入ドメイン）をタンパク質やペプチドに結合させることにより、細胞内へタンパク質を導入する手法が開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。この手法においては、タンパク質を細胞内へ導入する場合には、目的のタンパク質とＰＴＤとの融合タンパク質を組み換えタンパク質として、大腸菌等により精製することを必須とすることが記載されている。しかしながら、この手法においては、酵素タンパク質をＰＴＤとの融合タンパク質として細胞内へ導入した場合には酵素活性が得られないことがあること、また、不溶性タンパク質は精製が困難であるため使用できないことから、任意のタンパク質を充分に細胞内へ導入することができ、そのタンパク質の機能を細胞内で充分に発現するための工夫の余地があった。
【０００６】
ところで、タンパク質を生細胞内に導入する方法に関し、ポリエチレンイミンを用いたタンパク質の細胞内導入の方法（特願２００１−３６３９６７）、及び、抗体−ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇやビオチン−アビジンといった特異的な結合を活用した方法（特願２００２−３４２４８６）が見いだされている。これらの技術は、タンパク質をカチオン化することにより、負電荷を帯びている生細胞表面に静電的な吸着を介して導入するものであり、構造と機能とを保持したままのネイティブ状態のタンパク質の細胞内導入に好適な技術である。一方、これらの技術においては、変性状態のタンパク質は容易に取得できるものの、ネイティブ状態のタンパク質の取得が困難なタンパク質や、カチオン化タンパク質を調製する過程で変性・沈殿を生じてしまうタンパク質等への適用において、タンパク質を充分に細胞内へ導入することができ、これらのタンパク質の機能を細胞内で効果的に発現させるための工夫の余地があった。
【０００７】
またジスルフィド結合（ＳＳ結合）を有する外来性タンパク質を大腸菌内で発現させると、不活性のインクルージョンボディ（封入体）として得られることが多々あり、効率的に巻き戻すことができないことから、これを改善するために、新規カチオン化ＳＨ保護試薬としてＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（トリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホナート・ブロミド）を用いる技術が開示されている（例えば、非特許文献４参照。）。この技術において、ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅは、還元タンパク質のＳＨ基のアルキルスルフィド化と、正電荷の導入とを同時に行うことができるものであり、これを用いることにより、簡単な操作だけで精製を行うことができ、これに起因してタンパク質を巻き戻すことが可能となる。しかしながら、変性タンパク質の細胞内導入や、細胞内でのタンパク質の巻き戻しについては記載されていない。したがって、変性タンパク質等の機能を細胞内で効果的に発現させることにより、細胞内でのタンパク質及び／又はペプチドの機能解析の迅速化や、タンパク質及び／又はペプチドを用いた医薬品・研究用試薬の調製等の技術に好適に用いることができるようにする工夫の余地があった。
【非特許文献１】二見淳一郎、外７名、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、アメリカンケミカルソサイアティ（Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ）、２００１年、第４０巻、第２５号、ｐ．７５１８−７５２４
【非特許文献２】二見淳一郎、外６名、「ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、社団法人日本生化学会、２００２年、第１３２巻、第２号、ｐ．２２３−２２８
【非特許文献３】松井秀樹、外２名、「日本薬理学雑誌（Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ.）」、社団法人日本薬理学会、２００３年、第１２１巻、第６号、ｐ．４３５−４３９
【非特許文献４】山田秀徳、「新規カチオン性ＳＨ保護試薬ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅの蛋白質工学への応用−大腸菌に生産させたＳＳ結合を持つ外来性タンパク質の精製と巻き戻し−」、和光純薬時報、和光純薬工業株式会社、２０００年、第６８巻、第１号、ｐ．２８−３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、ネイティブ状態のタンパク質の取得が困難なタンパク質や、カチオン化タンパク質を調製する過程で変性・沈殿を生じてしまうタンパク質等の変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、かつ細胞内での活性化を同時に可能とし、タンパク質及び／又はペプチドの機能解析の迅速化や、タンパク質及び／又はペプチドを用いた医薬品・研究用試薬の調製等に好適に利用・応用される細胞内導入方法、並びに、それに用いられる細胞内導入用試験キットを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法について種々検討したところ、細胞外から導入された外来のタンパク質及び／又はペプチドが細胞内で還元された状態にある場合、細胞内で活性構造に巻き戻るという現象が起こり、外来の還元タンパク質及び／又はペプチドによりタンパク質及び／又はペプチドとしての本来の機能を細胞内で発現して活性化することができることに着目し、還元タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入過程と、該還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内で活性化される過程とを含んでなることにより、上記課題をみごとに解決することができることに想到し、本発明に到達したものである。このように本発明は、タンパク質及び／又はペプチドの機能を一過的に生細胞内で発揮させることが可能な画期的な新技術である。また、従来のタンパク質及び／又はペプチドを扱う研究で常に問題となっているタンパク質及び／又はペプチドの変性による不溶化、活性構造への巻き戻しの煩雑さをも同時に解決する可能性があり、新規なタンパク質治療薬の開発、ポストゲノム研究におけるタンパク質機能解析・創薬支援、細胞の増殖・分化の新しい制御法等、多大な可能性・発展性を持つ基盤技術といえる。
【００１０】
更にこのようなタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法に、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬が封入された容器を含んでなる細胞内導入用試験キットを用いると、簡便に可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを形成することができ本発明の細胞内導入方法を更に効率的なものとなることを見いだし、本発明に到達したものである。
【００１１】
すなわち本発明は、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入する方法であって、上記細胞内導入方法は、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内に存在するようにタンパク質及び／又はペプチドを導入する過程と、上記還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内で活性化される過程とを含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法である。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態としては、例えば、タンパク質分子内のＣｙｓ（システイン）残基を活用し、１個以上の全てのＣｙｓ残基を還元ジスルフィド化により正電荷を帯びた化合物・カチオン性ポリマー等を結合させることで、通常は不溶性である変性状態のタンパク質が、尿素等の変性剤が存在しない条件下で高い水溶性を獲得し、かつ生細胞表面の負電荷との静電相互作用を介して細胞内へ取り込まれる機能が付与される形態である。本発明においては、下記式（１）によるスキームで、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを調製し、これを培養細胞の培養上清や生体内に直接投与することで、例えば、図１に示す推定機構により細胞内へ取り込まれ、細胞内で活性構造に巻き戻り、導入されたタンパク質の機能を細胞内で発現することが可能となる。
【００１３】
【化１】
2005120017.tif 000002
【００１４】
上記式（１）中、Ｒは、正電荷を帯びた官能基、カチオン性の基を有する重合体（カチオン性ポリマー）等を表す。Ｒ’は、任意の原子、原子団を表す。
【００１５】
このように本発明は、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、かつ細胞内での活性化を同時に可能とする方法であり、個々のタンパク質及び／又はペプチドは固有の物性・構造を保有することから、各々のタンパク質及び／又はペプチドに適した細胞内導入方法を提供する際に有効な解決手段となる。また、例えば、図２に示すとおり、大腸菌等を用いて発現したタンパク質が不溶性のインクルージョンボディとして得られた場合にも、タンパク質を活性構造へ巻き戻す操作を省略でき、タンパク質機能解析の迅速化や、タンパク質医薬品・研究用試薬の調整に利用・応用することが可能となる。
以下に本発明を詳述する。
【００１６】
本発明の細胞内導入方法において、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内に存在するようにタンパク質及び／又はペプチドを導入する過程（以下、「細胞内導入過程」ともいう。）としては、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内に存在する状態になればよく、例えば、細胞外で可逆的にカチオン化し、得られた可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、細胞内で還元させる過程であることが好ましい。また、細胞外で可逆的にカチオン化した後に還元させて得られた還元タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入してもよい。
【００１７】
上記還元タンパク質及び／又はペプチドとしては、上述した細胞内導入過程により細胞内に存在することとなった還元された状態のタンパク質及び／又はペプチドであればよく、中でも、細胞外で可逆的にカチオン化し、得られた可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、細胞内で還元させた形態のものが好適である。
このような形態において、可逆的にカチオン化されるタンパク質及び／又はペプチドとしては、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを変性剤存在下で還元可溶化したものであることが好ましい。
【００１８】
上記変性状態としては、タンパク質及び／又はペプチド分子がほぼ生理的条件下で示す、天然状態（ネイティブ状態）に相当する固有の立体構造が、共有結合の切断を伴わずに失われた状態が挙げられる。このような状態のタンパク質及び／又はペプチドとしては、例えば、ネイティブ状態のものの取得が困難なタンパク質及び／又はペプチド；細胞内に導入するためにタンパク質及び／又はペプチドをカチオン化する過程で変性・沈殿を生じてしまうタンパク質及び／又はペプチド；大腸菌等によりインクルージョンボディとして発現されたタンパク質及び／又はペプチド等が挙げられる。中でも、メルカプト基を有するものであることが好ましく、システイン残基を有するものが好適である。
なお、本発明において、タンパク質及び／又はペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を意味し、例えば、糖鎖、脂質、リン酸基等が結合した複合タンパク質及び／又はペプチドであってもよい。このようなタンパク質及び／又はペプチドとしては、例えば、ペプチド、酵素、抗体、その他機能性（薬理作用等の生理活性）を有し、医薬・薬物として有用なタンパク質及び／又はペプチド等を用いることができ、その分子量としては、１００〜１００００００であることが好ましい。
【００１９】
上記形態においては、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを変性剤存在下で還元可溶化させることが好適であり、変性剤としては、例えば、尿素、グアニジン塩酸塩を用いることが好ましい。また、還元剤としては、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドとして、メルカプト基を有するものを用いる場合には、例えば、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、β−メルカプトエタノールを用いることが好適である。
【００２０】
上記還元可溶化反応により得られるタンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化する方法としては、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬を用いることが好ましい。
なお、本発明において、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するとは、可逆的な結合を介して正電荷を導入することを意味し、例えば、タンパク質及び／又はペプチドが有するメルカプト基をジスルフィド化して正電荷を導入する形態が挙げられる。この場合の好ましい反応形態としては、上述した式（１）で示すことができ、本発明においては、この反応により得られる正電荷を有するジスルフィド結合が、その後の還元反応により解離してメルカプト基を生じさせ、細胞内活性化過程等により、再びジスルフィド結合を形成することとなる。
【００２１】
上記可逆的カチオン化反応において、ジスルフィド化されるメルカプト基としては、タンパク質及び／又はペプチドが有する全てのメルカプト基のうち、５０％以上のものであることが好ましい。５０％未満であると、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドが充分な水溶性を獲得することができないおそれがあり、精製効率を充分に向上させることができず、細胞内で充分に活性化しないおそれがある。より好ましくは、８０％以上であり、更に好ましくは９０％であり、最も好ましくは１００％、すなわち全てのメルカプト基である。
なお、本発明において、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドとは、このように可逆的にカチオン化されたタンパク質及び／又はペプチドを意味する。
【００２２】
上記タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬としては、タンパク質及び／又はペプチドに可逆的な結合を介して正電荷を導入することができるものであればよく、例えば、２−アミノエチル−２−アミノエタンチオスルフォネート・ジハイドロクロライド（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；２−アミノエチルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；６−アミノヘキシルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（６−Ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；アミノメチルメタンチオスルフォネート（Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；５−アミノペンチルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（５−Ａｍｉｍｏｐｅｎｔｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；３−アミノプロピルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；１０−アミノデシルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（１０−Ａｍｉｎｏｄｅｃｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；１２−アミノデシルメタンチオスルフォネート・ハイドロブロミド（１２−Ａｍｉｎｏｄｅｃｙｌｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ）；アミノプロピルメタンチオスルホナート・ブロミド（ＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；トリメチルアンモニオプロピルメタンチオスルホナート・ブロミド（ＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；カチオン性の基を有する重合体と、Ｃｙｓ残基のチオール基とチオール−ジスルフィド交換反応が可能な基を有する試薬等とを反応させた試薬等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なお、上記試薬の形態としては、粉末状であっても、媒体に溶解した状態であってもよい。
【００２３】
上記Ｃｙｓ残基のチオール基とチオール−ジスルフィド交換反応をする基としては、特に限定されないが、例えば、チオール基、ジスルフィド基、ピリジンジスルフィド（Ｐｙｒｉｄｙｌ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）基、ＴＮＢ−チオール（５−ｔｈｉｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）基を挙げることができる。
上記Ｃｙｓ残基のチオール基とチオール−ジスルフィド交換反応が可能な基を、カチオン性の基を有する重合体に導入する方法は特に限定されないが、カチオン性の基を有する重合体とＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及び／又はその誘導体とを反応させたり、カチオン性の基を有する重合体と４−スクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）及び／又はその誘導体とを反応させたりすることを挙げることができる。
【００２４】
上記カチオン性の基を有する重合体とＳＰＤＰとの混合反応試薬としては、例えば、カチオン性の基を有する重合体の水溶液に対し、ＳＰＤＰのエタノール溶液を、（カチオン性の基を有する重合体／ＳＰＤＰ）のモル比が１／１〜１／２０となるように混合して反応させたものであることが好ましい。モル比としては、より好ましくは、１／１〜１／１０である。尚、この反応は、反応温度を５〜３０℃で行うことが好適であり、また反応時間としては、１〜１０時間とすることが好ましい。この反応条件は、ＳＭＰＴなどの他の反応試薬を用いる場合にも好適に使用できる。
【００２５】
上記カチオン性の基を有する重合体としては、水溶液中でカチオンとなり得る原子を有する重合体であればよく、例えば、２を超えて３００００以下のカチオン価を有する重合体であることが好ましい。２以下であると、タンパク質及び／又はペプチドに充分な正電荷を導入することができないおそれがあり、変性状態のそれを充分に可溶化させることができないおそれがある。３００００を超えると、本発明の作用効果を充分に発揮することができないおそれがある。より好ましくは、２００００以下であり、更に好ましくは、２５００以下であり、特に好ましくは、２５０以下であり、最も好ましくは、４以上、７０以下である。
【００２６】
上記カチオン価とは、重合体のアミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）と該重合体の数平均分子量との積を１０００で割った値であり、また、アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）は、試料化合物中に含まれるアミンの総量の指標を意味し、試料化合物１ｇに含まれるアミンのｍｍｏｌ数で表される。試料化合物のアミン価は、一般的なアミノ基の定量方法に従って測定することができる。一般的なアミノ基の定量方法としては、例えば、「新実験化学講座  第１３巻  有機化学構造Ｉ」（日本化学会編、丸善株式会社、昭和５３年１１月２０日、ｐ．８８−９９）に記載の方法やコロイド滴定法（例えば、千手諒一著、「コロイド滴定法」、第１版、株式会社南江堂、１９６９年１１月２０日参照。）が挙げられる。上記アミン価の分析は、試料化合物の形態、溶解性、含有不純物等を考慮して、精度よく分析できる方法を適宜選択する必要がある。上記重合体のアミン価としては、１〜３０であることが好ましく、５〜２５であることがより好ましい。
【００２７】
上記カチオン性の基を有する重合体の数平均分子量としては、細胞導入効率、取り扱い性等の点から、１００〜１０００００であることが好ましい。より好ましくは、１００〜１００００であり、更に好ましくは、２００〜３０００である。なお、数平均分子量の測定方法については、分子量を精度よく測定するために、数平均分子量が１００００以下の場合は沸点上昇法により測定することが好適であり、１００００を超える場合はゲルパーミーエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することが好適である。
【００２８】
上記カチオン性の基を有する重合体としては、例えば、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、ポリビニルイミダゾール骨格の１種又は２種以上の骨格を有する重合体（共重合体）；これらの重合体の塩、例えば、第一級、第二級、第三級及び第四級アンモニウム塩等が好適である。なお、これらの重合体を化学的に修飾、変成したものも用いることができる。
【００２９】
このようなカチオン性の基を有する重合体の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン；ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン；ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン；ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体；ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体；ポリアミジン；ポリビニルピリジン；ポリビニルイミダゾール；ジシアンジアミド系縮合物；エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物；ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物；ポリビニルイミダゾリン；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド；カルボキシメチルセルロース第四級アンモニウム（第四級アンモニウムＣＭＣ）；グリコールキトサン；カチオン化デンプン等が挙げられ、中でも、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いることが好ましい。
【００３０】
上記カチオン性の基を有する重合体のアミン価の理論値について、以下の表に例示する。
【００３１】
【表１】
2005120017.tif 000003
【００３２】
上記表中、アミン価の理論値は、重合体を形成する単量体の分子量の逆数に１０００をかけた値を表す。一般的に、上述の方法により測定されるアミン価の実測値は、その理論値と測定誤差の範囲内でほぼ一致し、上述の方法により測定されるアミン価に基づいて、重合体のカチオン価を算出することができる。アミン価は、重合体の合成方法の変更、他成分との共重合、重合体の化学的修飾により、任意に変化させることが可能である。
【００３３】
上記タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬の使用量としては、上述した還元可溶化反応で用いられる還元剤が有するメルカプト基のモル濃度に対して、該試薬類が、１〜１００倍のモル濃度となるように設定することが好ましい。より好ましくは１〜１０倍である。なお、上記試薬としてカチオン性の基を有する重合体とＳＰＤＰとの混合反応試薬を用いる場合には、ＳＰＤＰのモル濃度が上記範囲となるように設定することが好適である。
【００３４】
上記可逆的カチオン化反応としては、上述した還元可溶化反応後に残存した変性剤及び還元剤の存在下で行うことが好ましい。また、可逆的カチオン化反応を行う際の温度としては、５〜４０℃とすることが好適である。より好ましくは、１０〜２５℃である。
なお、上記可逆的カチオン化反応後、透析やカラムクロマトグラフィーなどの定法により可逆的にカチオン化したタンパク質及び／又はペプチドを精製することができる。精製は、酸性条件下で行うことが好ましい。酸性条件下で透析を行うことにより、ジスルフィド結合を充分に安定させることができ、得られる可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドの溶解性が向上するため、細胞内での活性化を充分なものとすることができる。また、大腸菌により発現させたタンパク質及び／又はペプチドを用いる場合には、大腸菌由来の夾雑物（核酸、糖、脂質）を充分に不溶化させることができ、その後の精製を更に容易に行うことが可能となる。より好ましくはｐＨ６以下とすることである。
【００３５】
上記細胞内導入過程において、可逆的にカチオン化した後の還元反応としては、還元物質を用いて行うことが好ましい。還元物質としては、メルカプト基を有するタンパク質及び／又はペプチドを用いる場合には、ジスルフィド結合を解離してメルカプト基を生じさせるものであればよく、例えば、グルタチオンやチオドレキシン等の細胞内に存在し得る還元物質等を用いることができる。
なお、動物細胞内では、酸化型／還元型グルタチオンのバランスが約１／５０で存在し、細胞質内でタンパク質及び／又はペプチド分子中のシステイン残基の側鎖を適切な還元状態に保つ作用を有することから、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入すると、自発的に還元されることになる。
【００３６】
上記細胞内導入過程において、タンパク質及び／又はペプチドを細胞内へ導入する方法としては、例えば、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを導入する場合には、該可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドが有する正電荷と、細胞表面の負電荷との静電相互作用を介する機構により導入することができる。この静電相互作用を介する機構としては、エンドサイトーシス（飲食作用）や細胞膜透過等によるものと推測される。
このような静電相互作用を介した導入方法としては、例えば、タンパク質及び／又はペプチドを導入しようとする細胞を含む培地中に、可逆的カチオン化タンパク質及び／若しくはペプチド、又は、それを含む溶液を添加した後、該細胞を適切な培養温度、培養時間等の培養条件で培養することが好ましい。なお、細胞を培養後、これらを添加してもよい。  これにより、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドは細胞内に取り込まれ、時間の経過とともに該可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドの細胞への取り込み量は増加することとなる。
【００３７】
上記静電相互作用を介した導入方法においては、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドの添加量、添加濃度、添加時間等を変化させることにより、タンパク質及び／又はペプチドの細胞内への取り込み量を容易に制御することが可能である。なお、培地中で細胞に可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを取り込ませる場合には、ヘパリン、核酸等のアニオン性ポリマーが共存しない条件下で行うことが好ましい。
上記タンパク質及び／又はペプチドを細胞内へ導入する方法としてはまた、先端を細くした微小ガラス管を細胞内に刺入し、細胞内へタンパク質及び／又はペプチドを直接導入する方法（マイクロインジェクション）；経口投与、静脈内投与、患部への注射、皮膚への塗布等により、直接生体に接種して生体内の細胞に導入する方法等を用いることもできる。
【００３８】
本発明の細胞内導入方法においては、上述した細胞内導入過程により、還元タンパク質及び／又はペプチドが細胞内で活性化されることとなるが、このような細胞内活性化過程としては、導入した変性状態のタンパク質及び／又はペプチドよりも本来の機能を発現することとなればよく、例えば、（ｉ）細胞質内での自発的な又はシャペロニンを介した活性構造への巻き戻り（再生）、（ｉｉ）正しい高次構造の形成、（ｉｉｉ）正しい細胞内局在、核内への移行、（ｉｖ）各種の細胞増殖制御遺伝子の発現誘導等が生じる形態が挙げられる。
これらの形態を確認する方法としては、例えば、細胞内に導入したタンパク質及び／又はペプチドとして、癌抑制タンパク質として知られ、癌の遺伝子治療への応用が各方面で検討されている野生型のヒトＰ５３タンパク質（配列表配列番号１参照。）を可逆的にカチオン化したものを用い、これを導入した細胞として、遺伝子変異によりＰ５３が欠損した癌細胞株であるヒト骨肉腫由来のＳａｏｓ−２細胞を用いる場合には、以下のようにして行うことができる。
【００３９】
上記（ｉ）活性構造への巻き戻りとしては、例えば、活性構造のＰ５３タンパク質のみを特異的に認識し、変性したものや変異の入ったＰ５３タンパク質を認識しない抗体（Ａｎｔｉ−Ｐ５３抗体（Ａｂ−５））を用いて、免疫沈降・ウェスタンブロット法により検証することができる。
上記（ｉｉ）正しい高次構造の形成としては、例えば、可逆的カチオン化Ｐ５３の細胞内導入後に、グルタルアルデヒドにより分子間架橋反応を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気移動）／ウェスタンブロット法により検証することができる。
上記（ｉｉｉ）核内への移行としては、例えば、細胞内に導入された可逆的カチオン化Ｐ５３が、活性構造のＰ５３が本来局在することが知られている核に蓄積することを免疫化学染色により確認することができる。
【００４０】
上記（ｉｖ）各種の細胞増殖制御遺伝子の発現誘導としては、例えば、活性化したＰ５３が核へ移行した際に発現を誘導するＰ２１／ｗａｆ１の遺伝子発現及びタンパク質発現を、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、及び、細胞の免疫化学染色により確認することができる。また、活性化したＰ５３が核へ移行した際に発現を誘導するアポトーシス関連遺伝子（ＢＡＸ、ＭＤＭ−２）の遺伝子発現を、ノーザンブロット法により確認することができる。更に、活性化したＰ５３が誘導するアポトーシスの誘導を、ＤＮＡラダー法により検出することができる。
また活性化したＰ５３が結合する特異的なＤＮＡ配列に対する結合を、ゲルシフトアッセイにより確認することができる。
【００４１】
このように本発明においては、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、細胞内で本来の機能を効果的に発揮させることができることとなるが、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドとして、大腸菌等により発現させたタンパク質を用いた場合の好ましい形態（図２）について、以下に更に詳しく説明する。
図２は、上述したようにタンパク質の発現・精製過程から細胞内導入に至るまでの好ましい形態を示した概念図である。
【００４２】
図２において、大腸菌等を用いたタンパク質大量生産システムは、取り扱いが容易で短時間に大量のタンパク質が得られることから、外来性タンパク質の生産手段として広く利用されている。このシステムによりタンパク質を発現させると、可溶性のネイティブ状態のものが得られることもあるが、通常は、正常な位置で架橋しないランダム結合体を形成し、不溶性のインクルージョンボディ（封入体）として得られることが多い。ネイティブ状態のタンパク質は、多量の菌体由来の不純物を含むことがあるが、水に可溶であるため精製は比較的容易である。そこで、精製後、ポリエチレンイミン等のカチオン性の基を有する重合体を用いてタンパク質をカチオン化することにより、タンパク質の機能低下を充分に抑制しつつ、効率的に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００４３】
一方、インクルージョンボディは、含有する菌体由来の不純物は少量であるが、疎水性残基が多く露出しており、大腸菌由来の夾雑物（核酸、糖、脂質）等と疎水性相互作用を形成したり、メルカプト基間でジスルフィド結合を形成し、大きな塊となったりすることがある。この場合、活性型のタンパク質を得るために、インクルージョンボディを変性剤中で還元可溶化し、ＳＨ−ＳＳ交換反応を触媒する適当な酸化還元系に希釈して巻き戻す必要がある。８Ｍ尿素や６Ｍグアニジン塩酸塩等の変性剤を用いて還元可溶化することは容易であるが、この還元可溶化されたタンパク質を直接酸化還元系に希釈しても、酸化還元系に希釈したときにインクルージョンボディ中の不純物が発現タンパク質を巻き込んで沈殿するため、ほとんど巻き戻らず、また、精製を行った後に酸化還元系に希釈しようとしても、インクルージョンボディは水に溶けにくいため精製が煩雑となる。
【００４４】
そこで、このような場合に本発明の細胞内導入方法を好適に用いることができる。すなわち、図２に示されるように、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬を用いて、変性剤存在下で、還元可溶化されたタンパク質を可逆的にカチオン化する。これにより、夾雑物等との疎水性相互作用が不利になり、インクルージョンボディが水に対して可溶化するため、簡単な操作だけで充分に精製することができることとなる。その後、これを細胞内へ導入すると、自発的に活性構造に巻き戻るため、タンパク質を活性構造へ巻き戻す操作を省略でき、タンパク質の本来の機能を、細胞内で一過的に発現させることができる。これにより、タンパク質の機能解析の迅速化を図ることができ、また、細胞増殖・分化の制御を効率的に行うことが可能となる。
なお、従来におけるタンパク質の細胞内導入技術としては、遺伝子導入法が用いられており、恒常的に細胞内で任意のタンパク質を機能させたい場合に有利な手法である。一方、任意のタンパク質を一過的に細胞内で機能させたい場合には、タンパク質そのものを細胞内に導入する手法が好適であるが、中でも本発明の細胞内導入方法を用いることにより、細胞内で機能させたいタンパク質及び／又はペプチドを任意の量かつ任意の時間細胞内に存在させて、機能を発揮させることができることとなる。
【００４５】
本発明はまた、上記タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法に用いられるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットであって、上記試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬が封入された容器を含んでなるタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入用試験キットでもある。
上記試験キットは、上述した細胞内導入方法において、効率的かつ簡便に可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを形成するためのものであり、形成された可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドは、上述した細胞内導入過程を経て、細胞内で活性化することとなる。
【００４６】
上記試験キットは、タンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬が封入された容器（以下、「容器１」ともいう。）を含んでなる。この場合、上記試験キットの使用方法としては、可逆的カチオン化タンパク質及び／又はペプチドを形成することになる限り特に限定されるものではなく、例えば、（ｉ）変性状態のメルカプト基を有するタンパク質及び／又はペプチドを変性剤存在下で還元剤を用いて還元可溶化し、得られたタンパク質及び／又はペプチドを、この反応で残存した変性剤及び還元剤とともに、容器１に入れる方法、（ｉｉ）変性状態のメルカプト基を有するタンパク質及び／又はペプチド、変性剤、並びに、還元剤を容器１に入れる方法等が挙げられる。
なお、上記容器１内の温度や反応時間等の反応条件としては、上記可逆的カチオン化反応で述べたように設定することが好ましい。
【００４７】
上記試験キットに用いられる容器としては、０．５〜１０ｍＬのものを用いることが好ましく、該容器を、オートクレープや紫外線、ガンマ線等で滅菌処理してもよい。また、カビの発生や容器内の物質の腐敗を防ぐために、容器の内側をコーティングしてもよい。更に、窒素やアルゴン等の不活性ガス下で、容器に内容物を封入することも好ましい。なお、容器の保存方法としては、容器内に上記物質を封入後、２５℃以下の低温で密封保存することが好ましい。
上記試験キットに用いられるタンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化するための試薬、並びに、その形態としては、上述したものであることが好ましく、その使用量等も上述したように設定することが好ましい。
このように本発明の試験キットを用いることにより、変性状態のメルカプト基を有するタンパク質及び／又はペプチドを可逆的にカチオン化することができ、本発明の細胞内導入方法を効率よく、かつ簡便に行うことができることとなる。
【発明の効果】
【００４８】
本発明の細胞内導入方法は、上述のような構成であるので、変性状態のタンパク質及び／又はペプチドを細胞内に導入し、かつ細胞内での活性化が同時に可能となること、また、大腸菌等を用いて発現したタンパク質及び／又はペプチドが不溶性のインクルージョンボディとして得られた場合にも、活性構造へ巻き戻す操作を省略できることから、固有の物性・構造を保有する各々のタンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入に適しており、タンパク質及び／又はペプチドの機能解析の迅速化、タンパク質及び／又はペプチドを用いた医薬品・研究用試薬の調製に好適に利用・応用される方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味するものとする。
【００５０】
（１）ジスルフィド結合を介した可逆的なタンパク質カチオン化試薬の調製
（ｉ）アミノプロピルメタンチオスルホナート・ブロミド（ＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）の合成
先ず、以下のようにして、ＣＨ３ＳＯ２Ｓ−Ｎａ（Ｍｗ（分子量）＝１３４．１６）を合成した。
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ：１４４．２ｇ（０．６ｍｏｌ）を、蒸留水：１５０ｍＬに溶かし、約８０℃で加熱しながら撹拌した。この液に、ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ：４６．６ｍＬ（０．６ｍｏｌ）を１０分かけて、滴下ロートを用いて加えていった。
滴下を始めると、液が濃い赤色に変化し、黄色の沈殿物が少し生じた。また、滴下終了直前に液が沸騰し、暗緑色、淡黄色へと変化した。このときの液の温度は約１００℃であった。その後、還流を１４．５時間行った。
還流後、漏斗を用いてろ過し、ろ液をエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社製）を用いて濃縮し、水分を除去した。用いたフラスコが冷めてから、エタノールを加え、再び濃縮して水分を除去した。その後、エタノールを加え、吸引ろ過によってろ過した。このろ過による析出物は、ＮａＣｌであった。得られたろ液にエタノールを加え、濃縮し、ろ過を行うという一連の操作を３回繰り返した。その後、得られたろ液を別の１０００ｍＬフラスコ（「フラスコＡ」ともいう。）に移した。また、ろ過による析出物の中にも目的物が含まれ得るため、この析出物を、水２０％及びエタノール８０％の溶液に溶解し、上記と同じ操作を行い、ろ液を回収し、フラスコＡに加えた。
フラスコＡ中のろ液を数回濃縮し、ろ過した後に、そのろ液を回収し、１日静置し、更にこのろ液をろ過した。得られた析出物の上から、エタノール、ジエチルエーテルを順に加えて洗い、エバポレーターを用いて乾燥させた。
なお、ＣＨ３ＳＯ２Ｓ−Ｎａの合成反応は、下記式（２）により表される。
【００５１】
【化２】
2005120017.tif 000004
【００５２】
得られたＣＨ３ＳＯ２Ｓ−Ｎａを用いて、以下のようにして、ＮＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＯ３ＣＨ３Ｂｒ（アミノプロピルメタンチオスルホナート・ブロミド、ＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を合成した。
１０００ｍＬナス型フラスコに、ＢｒＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２・ＨＢｒ：２５ｇ（０．１１４ｍｏｌ）、得られたＣＨ３ＳＯ２Ｓ−Ｎａ：１５. ３ｇ（０．１１４ｍｏｌ）、及び、特級エタノール：２１５ｍＬを仕込み、２３時間還流した。この際、液は白濁していた。還流後、沈殿物を除くためにろ過を行った。得られたろ液を濃縮して、静置した。
なお、ＮＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＳＯ３ＣＨ３Ｂｒの合成反応は、下記式（３）により表される。
【００５３】
【化３】
2005120017.tif 000005
【００５４】
得られたＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅについて、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）にて測定し、目的化合物の合成を確認した。
【００５５】
（ｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−ＳＰＤＰの調製
ポリエチレンイミン（日本触媒社製、平均分子量３００又は６００）の水溶液（塩酸でｐＨ８に調整）に対し、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、和光純薬社製）のエタノール溶液を、ＰＥＩ：ＳＰＤＰのモル比が１０：１になるように混合し、室温で１時間反応させた溶液を、それぞれ「ＰＥＩ３００−ＳＰＤＰ」、「ＰＥＩ６００−ＳＰＤＰ」とし、そのまま反応に用いた。
【００５６】
（２）組換えＰ５３タンパク質の調製
癌抑制蛋白質として知られ、癌の遺伝子治療への応用が各方面で検討されているヒトＰ５３をモデルタンパク質として用いて、以下のようにして可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質を調整した。
（ｉ）組み換えＰ５３タンパク質の大腸菌による発現
野生型ヒトＰ５３タンパク質（配列表配列番号１参照：“ＤＢＧＥＴ検索結果（ＤＢＧＥＴ  Ｒｅｓｕｌｔ）；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ）” ゲノムネット、［ｏｎｌｉｎｅ］、京都大学バイオインフォマティックスセンター、［平成１５年７月２２日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｓｐ：Ｐ５３＿ＨＵＭＡＮ＞）をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、ｐＥＴ１４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）内の制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ認識部位間に挿入し、Ｔ７プロモーター制御下にて野生型のヒトＰ５３タンパク質を発現させることが可能なプラスミドＤＮＡ（ｐＢＯ４２９）を作製した。次に、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＯ４２９）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、野生型ヒトＰ５３タンパク質発現用菌体（ｐＢＯ４３２）を得た。ｐＢＯ４３２は、２００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ）培地（１Ｌあたり、トリプトン１２ｇ、イーストエクストラクト２４ｇ、グリセロール４ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４２.３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４１２.５４ｇ）に植菌し、３７℃にて１６時間、緩やかに培養した。この菌液を、２５０ｍＬの２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴＢ培地に１ｍＬずつ添加し、３７℃でＯＤ６００＝０．８になるまで培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．５ｍＭで添加し、更に３７℃で３時間培養した。これらの菌体は遠心分離機を用いて回収し、−８０℃にて保存した。
【００５７】
（ｉｉ）組換えＰ５３タンパク質の粗精製
−８０℃に保存した菌体は、凍結融解を繰り返した後、１Ｌ培養液由来の菌体あたり２５ｍＬの溶菌バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０％スクロース、０．４Ｍ  ＮａＣｌ）中にて分散し、超音波破砕機を用いて核酸等を分解した。次に１００００ｒｐｍ、１５分の条件で遠心分離を行い、発現された組換えＰ５３タンパク質を不溶性画分に回収した。組換えＰ５３タンパク質は、６ｍＬの変性溶解液（６Ｍの塩酸グアニジン、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６）を加えて溶解し、脱気・窒素置換後、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加し、３７℃で１時間の還元反応を行い、還元変性Ｐ５３タンパク質を得た。
【００５８】
（ｉｉｉ）可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の調製
（２）の（ｉｉ）項で得られた還元変性Ｐ５３タンパク質に対し、共存する還元試薬（ジチオトレイトール）のメルカプト基（２ｍＭ）に対し１．５倍モル量（３ｍＭ）のＰＥＩ３００−ＳＰＤＰ又はＰＥＩ６００−ＳＰＤＰを添加し、３７℃で１時間反応した後に、未反応のメルカプト基（ＳＨ基）を完全に保護するために、１０ｍＭのＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅを添加し、０.５％酢酸に対して透析した後のサンプルをそれぞれ「ＰＥＩ３００−Ｐ５３」及び「ＰＥＩ６００−Ｐ５３」とした。また、（２）の（ｉｉ）項で得られた還元変性Ｐ５３タンパク質に対し、１０ｍＭのＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ又はＴＡＰＳ−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（和光純薬社製）を添加し、同様に０．５％酢酸に対して透析した後のサンプルを、それぞれ「ＡＰＳ−Ｐ５３」又は「ＴＡＰＳ−Ｐ５３」とした。得られた可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質を酸性条件下にて４℃で保存した。
【００５９】
（３）可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の再生能力の検証
（ｉ） 可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の試験管内における細胞質内環境での再生能の検証実験
動物細胞内の酸化還元系は、酸化型／還元型グルタチオンのバランスが約１／５０で存在し、細胞質内では、タンパク質分子中のシステイン残基の側鎖が適切な還元状態に保たれていることが知られている。可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質が細胞質内へ導入された後に可逆的に還元され、活性構造への巻き戻り（再生）が自発的に起こり得ることを検証する実験を以下の条件で行った。
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）中に酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとを１：５０に溶解した溶液中に、ＡＰＳ−Ｐ５３を終濃度２５μｇ／ｍＬで加え、励起波長２８０ｎｍ、蛍光波長３３６ｎｍ（トリプトファンの蛍光）を測定し、蛍光の減少からトリプトファンが内部に埋もれる過程、すなわち、Ｐ５３が構造を形成していく様子を経時的に測定した（図３）。この結果から、可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の１つであるＡＰＳ−Ｐ５３は、細胞質を模倣した酸化還元系において、数分以内に活性構造へ自発的に再生される可能性が示唆された。
【００６０】
（４）可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の細胞内での巻き戻りの検証 
遺伝子変異によりＰ５３が欠損した癌細胞株であるヒト骨肉腫由来のＳａｏｓ−２細胞を用いて、細胞内に導入された可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の活性化の検証実験を行った。
（ｉ）Ｐ５３タンパク質の活性構造のみを認識する抗体を用いた検証実験
Ｓａｏｓ−２細胞を１０ｃｍシャーレに８０％の密度になるように培養した。無血清培地に転換し１時間培養後、ＡＰＳ−Ｐ５３を１００ｎＭとなるように添加した。１時間培養後、１０％の血清を添加し、サンプル添加後の時間ごとに細胞を回収した。シャーレを氷冷したＰＢＳで1回洗浄後、セルスクレイパーを用いて細胞を１．５ｍＬ遠心チューブに回収した。２０００ｒｐｍ、１分、４℃で遠心し、回収した細胞を溶菌バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１ｇ／ｍｌ  コール酸ナトリウム：１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に縣濁し、氷上で３０分間インキュベートして溶解後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心させ、これをライセートとした。なお、ＥＤＴＡとは、エチレンジアミン４酢酸であり、ＥＧＴＡとは、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸であり、ＤＴＴとは、ジチオトレイトールである。
【００６１】
活性構造のＰ５３タンパク質のみを特異的に認識し、変性したものや変異の入ったＰ５３タンパク質を認識しない抗体であるａｎｔｉ−Ｐ５３抗体（Ａｂ−５）（宿主：マウス、アイソタイプ：ＩｇＧ２ａ、免疫原：Ｐ５３タンパク質、エピトープ：野生型Ｐ５３の立体配座エピトープ、“アポトーシス研究用の抗体及び阻害ペプチド（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”、［ｏｎｌｉｎｅ］、オンコジーンリサーチプロダクツ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、［平成１５年７月２２日］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＰｒｏｄｕｃｔＤｅｔａｉｌ＿ＯＮＣ．ａｓｐ？ｃａｔＮＯ＝ＯＰ３３＆ＣａｔＩＤ＝２７＞）を用いて、各ライセートの５００μｇのタンパク量分に対して抗体を添加し、２時間４℃で混ぜ合わせた後、プロテインＧセファロース（ｐｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に４℃で１時間吸着させた。免疫沈降物は、洗浄用バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）にて５回洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気移動）にて分離後、ニトロセルロース膜に転写し、１０％スキムミルク・６％グリシン（ｐＨ７．０）の溶液で３０分ブロッキングした。１次抗体（マウスａｎｔｉ−Ｐ５３）を１／１０００で加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ）で洗浄後、１０％スキムミルク・６％グリシン（ｐＨ  ７．０）の溶液で２０分ブロッキングした。２次抗体（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を１／１０００で加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、基質を添加し撮影を行った（図４）。
【００６２】
（ｉｉ）可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の細胞内導入後の免疫化学染色
Ｓａｏｓ−２細胞を、ポリＬ−リジンでコートしてあるガラスプレートに８０％となるように培養した。ＡＰＳ−Ｐ５３を１００ｎＭで添加し、６時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定化した。１次抗体としてマウスａｎｔｉ−Ｐ５３、２次抗体にａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−Ｃｙ３を加えて標識し、蛍光顕微鏡で観察した。
本結果より、活性化したＰ５３タンパク質が核に移行していることが確認され、活性構造のＰ５３が核内に移行し、転写因子として作用しているとの従来の知見と一致することが確認された（図５）。
【００６３】
（ｉｉｉ）細胞内導入後の可逆的カチオン化Ｐ５３のＰ５３ＤＮＡ結合エレメントへの結合
Ｓａｏｓ−２細胞及び正常繊維芽細胞株ＯＵＭＳ−２４（正常型のＰ５３を発現している）を８０％コンフルエントとなるように培養した後、無血清培地に転換し、（１）１００ｎＭ
ＰＥＩ化ウシ血清アルブミン（ＰＥＩ−ＢＳＡ：ネガティブコントロール）、（２）１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３、（３）１μＭ  ４−ニトロキノリン−１−オキシド（４ＮＱＯ：ＤＮＡ傷害因子で正常型のＰ５３をもっている細胞に添加することでＰ５３の活性化を誘導する）、（４）コントロール（細胞のみ）をそれぞれ添加し、６時間培養後に各細胞を回収した。次に、３２Ｐ−γｄＡＴＰで放射ラベルしたＰ５３結合エレメント配列を添加し、４℃で１時間反応させた後、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、Ｘ線フィルムに感光した（図６）。
【００６４】
（ｉｖ）架橋剤を用いたＰ５３高次構造の解析
内在性のＰ５３を発現しているＯＵＭＳ−２４（正常繊維芽細胞）及びＰ５３を欠損しているＳａｏｓ−２細胞に対し、図７の条件通りに添加・処理し、各条件で培養した。
次にグルタルアルデヒドを１ｍＭで添加し、室温で１０分放置し、分子間相互作用のあるタンパク質同士を架橋した。細胞を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ａｎｔｉ−Ｐ５３抗体を用いてウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｇ）を行った（図７）。
【００６５】
（ｖ） 変性カチオン化Ｐ５３タンパク質導入に伴う、内在性Ｐ２１タンパク質の含有変化（ウェスタンブロット法による検証）
細胞内で活性化されたＰ５３は、核に移行し、転写因子として細胞増殖の抑制やアポトーシスに関わる一連の遺伝子群の発現を誘導することが知られている。サイクリン依存性キナーゼの阻害因子であるＰ２１／ｗａｆ１は、Ｐ５３依存的に発現が誘導されることが確認されている顕著な例の一つである。本知見を基に、細胞外から導入した変性カチオン化Ｐ５３が細胞内で活性化され、Ｐ２１／ｗａｆ１の発現を誘導することを、タンパク質レベル（（４）の（ｖ）項）及び遺伝子レベル（（４）の（ｖｉ）項）で確認を行った。（４）の（ｉｖ）項に記載した手順に従い、Ｓａｏｓ−２細胞に１００ｎＭのＡＰＳ−Ｐ５３を図８の条件で添加して３７℃で培養し、各時間経過後に細胞を回収した。正常繊維芽細胞ＯＵＭＳ−２４をポジティブコントロールとして、活性型Ｐ５３が転写を誘導することが知られている内在性Ｐ２１／ｗａｆ１のタンパク質含有量の細胞内での変動を、抗Ｐ２１抗体を用いたウェスタンブロット法にて確認した（図８）。
【００６６】
（ｖｉ）変性カチオン化Ｐ５３タンパク質導入に伴う、内在性遺伝子（Ｐ２１）の発現誘導（ノーザンブロット法：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによる検証）
Ｓａｏｓ−２細胞を１０ｃｍシャーレに８０％になるように培養し、１００ｎＭのＡＰＳ−Ｐ５３又は１００ｎＭのＰＥＩ−ＢＳＡを添加後３７℃でインキュベートし、図９記載の各時間後に細胞を回収し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出・精製した。これらのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを各レーンに１５μｇずつアプライし、変性アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写・固定したブロットを得た。検出用のＤＮＡプローブはヒトＰ２１／ｗａｆ１のｃＤＮＡ全長を用いて、ニックトランスレーション法により３２Ｐ−αｄＣＴＰにより放射ラベルを行い、ノーザンハイブリダイゼーションによりＰ２１／ｗａｆ１のｍＲＮＡ発現を検出した（図９）。
【００６７】
（ｖｉｉ）可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質導入後のＰ２１／ｗａｆ１タンパク質の免疫化学染色
Ｓａｏｓ−２細胞に１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３又は１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡを添加後、３７℃で６時間インキュベートし、抗Ｐ２１／ｗａｆ１抗体を用いた免疫化学染色を行った。詳細な手法は、（４）の（ｉｉ）項記載の手順に従った。（４）の（ｖ）、（ｖｉ）項でそれぞれ確認された可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質導入後のＰ２１／ｗａｆ１遺伝子の誘導発現に加え、Ｐ２１／ｗａｆ１の核への顕著な集積が確認された（図１０）。
【００６８】
（ｖｉｉｉ） 可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質導入後に発現が制御される遺伝子群の解析
Ｓａｏｓ−２細胞内において、活性型Ｐ５３が発現を誘導することが知られている遺伝子群（Ｐ２１／ｗａｆ１、ＭＤＭ２、ＢＡＸ）、及び、発現が抑制される遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）をノーザンブロット法により確認した。Ｓａｏｓ−２細胞を１０ｃｍシャーレに８０％となるように培養し、図１１に示す通りの各サンプルを添加後、３７℃で６時間培養し、（４）の（ｖｉ）項の手順に従ってそれぞれの遺伝子発現を解析した（図１１）。細胞の状態に依存せずに常に一定の発現を示すことが知られているＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）の遺伝子発現には変動がなかったものの、１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３を添加した場合にのみ、Ｐ２１／ｗａｆ１、ＭＤＭ２、ＢＡＸの遺伝子の顕著な発現の上昇が確認され、一方で、β−Ａｃｔｉｎの遺伝子発現が低下することが確認された。これらの結果は、ＡＰＳ−Ｐ５３がＳａｏｓ−２細胞内で活性構造に再生し、各種の遺伝子発現を制御していることを示唆する。
【００６９】
（ｉｘ）変性カチオン化Ｐ５３タンパク質の細胞内導入に伴う、アポトーシスの誘導
Ｓａｏｓ−２の細胞内において活性型のＰ５３が発現することによって、アポトーシスが誘導されることが知られていることから、アポトーシスの誘導をＤＮＡラダーの形成を確認することで評価した。Ｓａｏｓ−２細胞を１０ｃｍシャーレに８０％となるように培養した。１００ｎＭ
のＰＥＩ６００−Ｐ５３及びＰＥＩ−ＢＳＡを添加し、３７℃でインキュベートした。図１２に示す経過時間後に、それぞれの細胞を１５ｍＬ遠心チューブに培地ごと回収し、１５００ｒｐｍ、３分、４℃で遠心し細胞を集めた。ＰＢＳで１度洗った後、溶菌バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ, 1ｍＭ ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を加え細胞を溶かした。氷上で１０分静置し、１４０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心した。上清を１.５ｍＬチューブに回収しＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ加え、３７℃で1時間インキュベートした。続いてプロテアーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を２μＬ加え、更に３７℃で１時間インキュベートした。この溶液を２％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、撮影した（図１２）。図１２より、細胞内に導入された変性カチオン化Ｐ５３が、細胞内で活性構造を形成し、アポトーシスを誘導したことが示唆された。
【００７０】
以上より、Ｓａｏｓ−２細胞の培養上清に添加した可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質が細胞内に取り込まれた後、細胞内で活性構造に巻き戻り、活性型Ｐ５３タンパク質機能を発現したものと確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の細胞内導入方法は、タンパク質及び／又はペプチドの機能を一過的に生細胞内で発揮させることが可能な画期的な新技術であり、従来のタンパク質を扱う研究で常に問題となっているタンパク質及び／又はペプチドの変性による不溶化、活性構造への巻き戻しの煩雑さをも同時に解決することができることから、新規なタンパク質治療薬の開発、ポストゲノム研究におけるタンパク質機能解析・創薬支援、細胞の増殖・分化の新しい制御法等、多大な可能性・発展性を持つ基盤技術である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の細胞内導入方法における可逆的カチオン化タンパク質の細胞内導入機構、及び、細胞内での活性発現機構の好ましい形態を示した概念図である。
【図２】タンパク質の発現・精製過程から細胞内導入に至るまでの好ましい形態を示した概念図である。
【図３】可逆的カチオン化Ｐ５３タンパク質の試験管内での巻き戻しを、蛍光スペクトルのタイムスキャンを測定することにより検証した図である。
【図４】可逆的カチオン化Ｐ５３の細胞内巻き戻しを、免疫沈降・ウェスタンブロット法により検証した図である。
【図５】細胞内導入後の可逆的カチオン化Ｐ５３を、免疫化学染色により観察した図である。
【図６】Ｐ５３結合エレメントと細胞内導入後の可逆的カチオン化Ｐ５３との結合（Ｓａｏｓ−２細胞にて）、及び、正常細胞内での内在性Ｐ５３との結合（ＯＭＵＳ−２４細胞にて）を、ゲルシフトアッセイにより観察した図である。１：１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡを添加した細胞の観察図である。２：１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３を添加した細胞の観察図である。３：１μM  ４ＮＱＯを添加した細胞の観察図である。４：コントロール（細胞のみ）を用いた細胞の観察図である。
【図７】Ｐ５３の四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）形成、及び、他のタンパク質との複合体形成を、ウェスタンブロット法により観察した図である。１：コントロール（８０％コンフルエントの細胞のみ）を用いたＯＵＭＳ−２４細胞の観察図である。２：コンフルエントまで増殖したＯＵＭＳ−２４細胞の観察図である。３：無血清条件下で２４時間処理後のＯＵＭＳ−２４細胞の観察図である。４：１μM の４ＮＱＯで６時間処理後のＯＵＭＳ−２４細胞の観察図である。５：コントロール（８０％コンフルエントの細胞のみ）を用いたＳａｏｓ−２細胞の観察図である。６：１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３で６時間処理後のＳａｏｓ−２細胞の観察図である。７：１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡで６時間処理後のＳａｏｓ−２細胞の観察図である。
【図８】変性カチオン化Ｐ５３タンパク質導入に伴う内在性Ｐ２１タンパク質含有量の上昇を、１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３を添加したＳａｏｓ−２細胞を用いてウェスタンブロット法により観察した図である。
【図９】変性カチオン化Ｐ５３タンパク質導入に伴うＰ２１／ｗａｆ1遺伝子発現を、１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３又は１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡを添加したＳａｏｓ−２細胞を用いてノーザンブロット法により観察した図である。
【図１０】抗Ｐ２１／ｗａｆ1抗体を用いたＰ２１／ｗａｆ1タンパク質の免疫化学染色による観察図（上段）、及び、細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した観察図（下段）である。（１）は、１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３を添加したＳａｏｓ−２細胞の観察図である。（２）は、１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡを添加したＳａｏｓ−２細胞の観察図である。
【図１１】ＧＡＰＤＨ及びＰ５３依存的に発現が制御される遺伝子群（Ｐ２１／ｗａｆ１、ＭＤＭ２、ＢＡＸ、β−Ａｃｔｉｎ）のＳａｏｓ−２細胞内での発現を解析した図である。１：コントロールを用いた細胞の解析図である。２：１００ｎＭ  ＡＰＳ−Ｐ５３を添加後、３７℃で６時間培養した細胞の解析図である。３：１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡを添加後、３７℃で６時間培養した細胞の解析図である。４：１μM  ４ＮＱＯを添加後、３７℃で６時間培養した細胞の解析図である。
【図１２】変性カチオン化Ｐ５３細胞内導入に伴う細胞のアポトーシス誘導を、１００ｎＭ  ＰＥＩ−ＢＳＡ又は１００ｎＭ  ＰＥＩ６００−Ｐ５３を添加したＳａｏｓ−２細胞を用いて、ＤＮＡラダー検出法により検出した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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