(57)【要約】【課題】反応時間を短縮でき、かつ高収率でＬ−チロシンを製造する方法を提供すること。【解決手段】チロシンフェノールリアーゼの存在下、フェノールとセリン、または、フェノールと、ピルビン酸またはその塩と、アンモニアまたはその塩からＬ−チロシンを製造する方法において、水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒の存在下で反応させることを特徴とする、Ｌ−チロシンの製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンフェノールリアーゼの存在下、フェノールとセリン、または、フェノールと、ピルビン酸またはその塩と、アンモニアまたはその塩からＬ−チロシンを製造する方法において、水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒の存在下で反応させることを特徴とする、Ｌ−チロシンの製造法。
【請求項２】
請求項１記載の水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒が、フェノールの水と有機溶媒への分配係数が3以上の有機溶媒である、請求項１記載のＬ−チロシンの製造法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−チロシンの製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−チロシンは医薬品の原料、アミノ酸輸液、経口・経腸栄養剤の成分、健康食品などの栄養強化等に多量に利用されている。
【０００３】
従来、Ｌ−チロシンの製造法としては大豆たんぱく質、動物由来物質の加水分解物から抽出等により安価に製造されてきたが、近年のＢＳＥ問題等で抽出品に替わる安価な合成Ｌ−チロシンが期待されている。
【０００４】
チロシンフェノールリアーゼ（β−チロシナーゼ）存在下、フェノールとＬ−セリンまたはピルビン酸と反応させＬ−チロシンを製造する方法はすでに知られている。該酵素反応は反応基質であるフェノールがチロシンフェノールリアーゼの活性を阻害して反応収率を低下させる事が知られている。フェノールによる酵素阻害を回避するために、連続的に間欠的にフェノールを添加する方法、分割フィードする方法にて酵素反応中のフェノール濃度を低濃度下に管理して反応を行うことが開示されている（特許文献１、非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平３−２６６９９１公報
【非特許文献１】酵素ハンドブック（１９８２年１２月１日  初版、６７８頁、朝倉書店発行）
【非特許文献２】アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，）３７、７２５（１９７３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記の背景技術に記載された方法では酵素反応中のフェノール濃度の管理が難しく煩雑である。また反応収率低下も招き易く酵素反応も長時間となり、必ずしも工業的に満足する製造法とは言い難い。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、反応時間を短縮でき、かつ高収率でＬ−チロシンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決する為、鋭意検討した結果、フェノールが有機溶媒層と水層間で分配することを利用して、反応中の水層中のフェノール濃度を酵素活性の阻害濃度以下に制御することによりＬ−チロシンを効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、チロシンフェノールリアーゼの存在下、フェノールとセリン、または、フェノールと、ピルビン酸またはその塩と、アンモニアまたはその塩からＬ−チロシンを製造する方法において、水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒の存在下で反応させることを特徴とする、Ｌ−チロシンの製造法に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、煩雑な操作により水層中のフェノール濃度を制御する必要がなく、短時間でかつ高収率でＬ−チロシンを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、チロシンフェノールリアーゼの存在下、フェノールとセリン、または、フェノールと、ピルビン酸またはその塩と、アンモニアまたはその塩からＬ−チロシンを製造する方法において、水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒を存在させることにより有機溶媒層と水層の二層系を形成させ、水層中のチロシンフェノールリアーゼの酵素活性を低下させないように水層中のフェノール濃度を制御させながら反応させてＬ−チロシンを製造することを特徴とするものである。
【００１１】
チロシンフェノールリアーゼとしては、市販されているチロシンフェノールリアーゼ以外に、チロシンフェノールリアーゼを含有する微生物またはこの微生物に後記の処理を施した処理物（以下、「チロシンフェノールリアーゼの供給源」と略記する。）を用いることもできる。
【００１２】
チロシンフェノールリアーゼを含有する微生物としては、例えば、エシェリヒア属、シトロバクター属、アエロバクター属、プロテウス属、エルビニア属など（山田ら（1975）Adv.Appl.Microbiol.,Vol.19,pp.249-288）、これらの微生物からチロシンフェノールリアーゼ遺伝子を含むDNA断片を単離し、遺伝子組換え技術を応用することにより、チロシンフェノールリアーゼを高発現させたＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６の微生物（特許2999005、WO 90/04031）を挙げることができる。
【００１３】
このような微生物は、培養液としてそのまま用いてもよいし、凍結保存した培養液を融解して用いてもよい。また、培養液から膜分離、遠心分離等で回収した微生物菌体を用いることもできる。
また、さらに、微生物菌体を超音波処理等で破砕した破砕物、またはその破砕物をさらに水等で抽出した抽出液、または該抽出液からさらに硫安分画、有機溶媒沈殿、カラム精製等の精製操作により粗精製したチロシンフェノールリアーゼを用いることもできる。
【００１４】
セリンを用いる場合、セリンとしては、Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、ＤＬ−セリンが用いられる。
【００１５】
ピルビン酸またはその塩を用いる場合、ピルビン酸、またはピルビン酸のアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩の一水和物、ピルビン酸アンモニウム等の塩類が用いられる。
【００１６】
セリンまたはピルビン酸の使用量は、フェノールに対してそれぞれ０．１〜１．５当量が好ましく、より好ましくは０．７〜１．１当量である。０．１当量以下では生産効率が悪く好ましくない。１．５当量以上ではセリン、ピルビン酸が高価であり経済的見地から好ましくない。
【００１７】
セリン、またはピルビン酸の水層中の濃度は、それぞれ１〜５０ｗｔ％が好ましく、より好ましくは５〜２０ｗｔ％である。１ｗｔ％以下でも特に問題はないが、容積効率の観点から１ｗｔ％以上が好ましい。５０ｗｔ％以下であると反応中に生成したＬ−チロシンが粘ちょうにならず、反応が充分に進行し収率低下を防ぐことができるため好ましい。
【００１８】
アンモニウム塩としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウムなどが挙げられる。
アンモニアもしくはアンモニウム塩の使用量としてはセリン、ピルビン酸に対して０．１〜５．０当量が好ましく、より好ましくは０．２〜３．０当量である。０．１当量以下では酵素反応中のｐＨ維持管理が難しい。また５．０当量以上でも問題はないが生成したＬ−チロシンと塩との分離精製が煩雑になり好ましくない。
【００１９】
チロシンフェノールリアーゼの補酵素として用いられるピリドキサールりん酸の量は特に限定されるものではないが、あまり少ないと酵素反応収率が低下し好ましくない。通常、セリン、ピルビン酸に対して０．０２重量倍以上が好ましい。
【００２０】
水層のｐＨは、通常の酵素反応と同様にｐＨ６〜１０の範囲が好ましい。より好ましくはｐＨ７．５〜９．５の範囲である。ｐＨ６以下、ｐＨ１０以上では酵素が失活し易く、反応が十分に進行せず好ましくない。
【００２１】
水層のｐＨ調製は、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリム、塩酸、硫酸などの水溶液で調整すればよい。
【００２２】
水と混和しないがフェノールと混和する有機溶媒としては、フェノールの水層と有機溶媒層への分配係数が３以上である有機溶媒であれば特に制限されない。分配係数があまり大きな有機溶媒を使用すると、反応初期の水層中のフェノール濃度が低いために反応速度が遅くなる傾向がある。そのため分配係数が３〜２１である有機溶媒を使用するのが好ましい。分配係数が３〜２１である有機溶媒としては、例えば、メチルイソブチルケトン（以下、「ＭＩＢＫ」と略記する。）、アセトフェノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、１−ペンタノール、オクタノール、デカノール、トルエンなどの有機溶媒が挙げられる。
なお、分配係数３以上の有機溶媒を使用すると容積効率が向上する点でも好ましい。
【００２３】
フェノールの水層と有機溶媒層への分配係数は丸善株式会社発行の化学反応工学Ｉ、化学工業計算法  第６版を参考に測定することができる。具体的には、有機溶媒１００ｍｌにフェノール７．０ｇを溶解させ、純水１００ｍｌを加えて、３２℃で３０分間攪拌する。３２℃で１時間静置した後、有機溶媒層と水層中のフェノール濃度（ｗｔ％）を高速液体クロマトグラフィーにて分析し有機層／水層の濃度比から分配係数を算出することができる。
【００２４】
有機溶媒の使用量としては、フェノールの水層と有機溶媒への分配係数を利用し、酵素反応開始時の水層中フェノール濃度が１％以下になるように用いれば良い。有機溶媒の使用量は水層に対して０．２〜１０重量倍が好ましく、０．４〜５重量倍がより好ましい。０．２重量倍以下では反応が粘ちょうになり充分に反応が進行せず好ましくない。１０重量倍以上では容積効率が悪く経済的な見地から好ましくない。
【００２５】
反応温度としては１０℃〜５０℃が好ましく、より好ましくは２５〜４５℃である。１０℃以下では反応速度が遅く好ましくない。５０℃以上では酵素が失活して好ましくない。
【００２６】
チロシンフェノールリアーゼおよびチロシンフェノールリアーゼの供給源の使用量は特に限定されるものではないが、あまり少ないと反応時間が長く反応が完結せず好ましくない。あまり多いと経済的見地から好ましくない。
【００２７】
本発明の製造法の実施態様を具体的に例示するとすれば、フェノールを溶解させた有機溶媒を、フェノールを除くチロシンフェノールリアーゼまたはチロシンフェノールリアーゼの供給源等の原材料を含有する水層に一括して添加して撹拌させながら反応させる方法、チロシンフェノールリアーゼまたはチロシンフェノールリアーゼの供給源を除く原材料およびフェノールを溶解させた有機溶媒の混合物を０．５〜１．０時間程度攪拌した後、チロシンフェノールリアーゼまたはチロシンフェノールリアーゼの供給源をこれに添加して反応させる方法が挙げられる。
【００２８】
反応は数時間で完結する。反応終了後は通常の脱溶媒、菌体分離、晶析、ろ過して高品質のＬ−チロシンを得る事ができる。
【００２９】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、フェノールの分配率の算出、生成したＬ−チロシンの定量は高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略記する。）分析によった。分析条件は以下の通りである。
【００３０】
・  カラム  Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＭＧ−５
・  移動相  ０．０５％ＴＦＡ：ＭｅＯＨ＝９０：１０
・  流  速  １．０ｍｌ／ｍｉｎ．
・  カラム温度  ４０℃
・  検出波長  ＵＶ２８０ｎｍ
・  内部標準物質  ３，５−ジヒドロキシ安息香酸    
【００３１】
実施例１
純水８６２．３ｇにＬ−セリン１０５．１ｇ（１．０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム２．５ｇ（０．０４７ｍｏｌ）、ピリドキサル０．０４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．８に調整した。ｐＨ調整液にメチルイソブチルケトン３３５．８ｇと  フェノール９８．８ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温し、チロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６の微生物を培養して得られた菌体５２．０ｇ（固形分５．７ｇ）を装入し酵素反応を開始した。５時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて結晶を溶解しＬ−チロシン水溶液１３９８．４ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１２．８２ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１７９．３ｇ（０．９９０ｍｏｌ）であった。Ｌ−セリンに対する収率は９９．０ｍｏｌ％で有った。
【００３２】
実施例２
純水８６２．３ｇにＬ−セリン１０５．１ｇ（１．０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム２．５ｇ（０．０４７ｍｏｌ）、ピリドキサル０．０４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．８に調整した。ｐＨ調整液に酢酸ブチル３３５．８ｇと  フェノール９８．８ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温してチロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６の微生物を培養して得られた５２．０ｇ（固形分５．７ｇ）を装入し酵素反応開始した。５時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて結晶を溶解しＬ−チロシン水溶液１４０１．３ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１２．６０ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１７６．７ｇ（０．９７５ｍｏｌ）であった。Ｌ−セリンに対する収率は９７．５ｍｏｌ％で有った。
【００３３】
実施例３
純水８６２．３ｇにＬ−セリン１０５．１ｇ（１．０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム２．５ｇ（０．０４７ｍｏｌ）、ピリドキサル０．０４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．８に調整した。ｐＨ調整液にオクタノール３３５．８ｇと  フェノール９８．８ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温し、チロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６を培養して得られた菌体５２．０ｇ（固形分５．７ｇ）を装入した。５時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて溶解しＬ−チロシン水溶液１４０６．１ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１１．４０ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１６０．３ｇ（０．８８５ｍｏｌ）であった。Ｌ−セリンに対する収率は８８．５ｍｏｌ％で有った。
【００３４】
実施例４
純水８６２．３５ｇにピルビン酸８８．１ｇ（１．０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム６４．２０ｇ（１．２００ｍｏｌ）、ピリドキサル０．０４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．３に調整した。ｐＨ調整液にメチルイソブチルケトン３３５．８ｇと  フェノール９８．８ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温し、チロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６を培養して得られた菌体５２．０ｇ（固形分５．７３ｇ）を装入し酵素反応を開始した。１０時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて結晶を溶解しＬ−チロシン水溶液１４０６．１ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１９．３７ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１５４．９ｇ（０．８５５ｍｏｌ）であった。ピルビン酸に対する収率は８５．５ｍｏｌ％で有った。
【００３５】
実施例５
純水８６２．３ｇにＤ−セリン１０５．１ｇ（１．０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム２．５ｇ（０．０４７ｍｏｌ）、ピリドキサル０．０４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．８に調整した。ｐＨ調整液にメチルイソブチルケトン３３５．８ｇと  フェノール９８．８ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温してチロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６を培養して得られた菌体５２．０ｇ（固形分５．７ｇ）を装入し酵素反応を開始した。５時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて結晶を溶解しＬ−チロシン水溶液１３８６．４ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１２．９３ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１７９．３ｇ（０．９９０ｍｏｌ）であった。D−セリンに対する収率は９９．０ｍｏｌ％で有った。
【００３６】
実施例６
純水８６．２ｇにL−セリン１０．５ｇ（０．１０００ｍｏｌ）、塩化アンモニウム０．２５ｇ（０．００５ｍｏｌ）、ピリドキサル０．００４ｇを溶解させた後、２５％アンモニア水にて該溶解液のｐＨを８．８に調整した。ｐＨ調整液にトルエン４２０．０ｇと  フェノール９．９ｇを加え３０分間室温下で攪拌した。３０分後に４０℃まで昇温してチロシンフェノールリアーゼ含有微生物としてＦＥＲＭ  Ｐ−１１３８６を培養して得られた菌体５．２ｇ（固形分０．５７ｇ）を装入し酵素反応を開始した。５時間後に脱溶媒し、３５％塩酸水にて結晶を溶解しＬ−チロシン水溶液１１６．９ｇを得た。ＨＰＬＣにてＬ−チロシンを分析した結果、１４．７０ｗｔ％、Ｌ−チロシン量は１７．２ｇ（０．０９５ｍｏｌ）であった。Ｌ−セリンに対する収率は９５．２ｍｏｌ％で有った。
【００３７】
【表１】
2005287436.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、医薬品の原料、アミノ酸輸液、経口・経腸栄養剤の成分、健康食品などの栄養強化の分野において大量に利用されているＬ−チロシンの製造方法として有用である。