(57)【要約】【課題】  Ｎｏｃ２の生理学的役割を直接決定するための手段として役立つＮｏｃ２ノックアウト動物（Ｎｏｃ２-/-）を作成すること、及び内分泌系の疾病、特にインスリン分泌不全の原因究明と治療手段の開発のために役立つモデル動物を提供することを目的とする。【解決手段】  Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体又はヘテロ接合体であるマウス、当該マウスの組織及び当該マウスの細胞。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウス。
【請求項２】
Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してヘテロ接合体であるマウス。
【請求項３】
請求項１又は２のマウスの組織。
【請求項４】
請求項１又は２のマウスの細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｏｃ２ノックアウトマウスに関し、より詳しくは、Ｎｏｃ２遺伝子を破壊してなる、ストレス性インスリン分泌不全発現マウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
調節されたエキソサイトーシスは、分泌性細胞における主要な生物学的プロセスの１つであり、シナプス小胞から神経伝達物質を放出するものである（1, 2）神経細胞において幅広く研究されてきた。内分泌細胞及び外分泌細胞等のような多くの非神経細胞は、種々の生物学的作用を発揮する内容物を含んだ、デンスコアベシクル（濃染されるコア小胞）として確認される分泌小胞を含んでいる（3）。分泌小胞のエキソサイトーシスは、アミン／ペプチド含有の内分泌細胞におけるホルモンの分泌（4, 5）、及び、外分泌細胞における消化酵素の分泌（6）において起こる。
【０００３】
Ｒａｂ３は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｂファミリーのサブファミリーであり（7）、エキソサイトーシスにおけるターゲティング、ドッキング、プライミング及び融合の過程において重要な役割を演じている（8）。Ｒａｂ３ファミリーには４つのアイソフォーム（Ａ〜Ｄ）があり、それらの全てが、調節されたエキソサイトーシスと関係付けられてきた（9〜12）。ラブフィリン３（rabphilin 3）（13）やＲｉｍ（Ｒｉｍ１及びＲｉｍ２）（14, 15）及びＮｏｃ２（16）を含む、Ｒａｂ３のエフェクターと考えられる分子が数種確認されている。Ｒｉｍ１及びラブフィリン３は、主として脳において発現されており（13, 14）、このことはシナプス小胞エキソサイトーシスへの関与を示唆するものである。Ｒｉｍ１欠損（Ｒｉｍ１-/-）のマウス及びCaenorhabditis elegansについての研究が、Ｒｉｍ１がシナプス小胞のプライミングに関与していることを示唆しているが（17〜19）、シナプス小胞エキソサイトーシスにおけるラブフィリン３の役割については明らかでない（20, 21）。
【０００４】
神経内分泌細胞及び内分泌細胞においては、Ｒｉｍ２（15）及びＮｏｃ２（16）（非特許文献１参照）の両方が主として発現されているが、このことは、分泌顆粒エキソサイトーシスへの関与を示唆するものである（3）。我々は、ｃＡＭＰ−ＧＥＦＩＩ（Ｅｐａｃ２）及びＰｉｃｃｏｌｏと相互作用するＲｉｍ２が、インスリン顆粒の、ｃＡＭＰ依存性、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）非依存性のエキソサイトーシスを担っていることを、先に示している（15, 22, 23）。
【０００５】
しかしながら、エキソサイトーシスにおけるＮｏｃ２の生理学的機能は、依然として不明なままである。ＰＣ１２細胞中にＮｏｃ２を過剰発現させることにより、我々及び別の一グループは、Ｎｏｃ２がＣａ2+誘発エキソサイトーシスに対する正の（16）及び負の（24）作用を有することを、それぞれ見出している。
【０００６】
【非特許文献１】Kotake, K., Ozaki, N., Mizuta, M., Sekiya, S., Inagaki, N., & Seino, S. (1997) J Biol Chem. 272, 29407-29410.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の背景において、本発明は、Ｎｏｃ２の生理学的役割を直接決定するための手段として役立つＮｏｃ２ノックアウト動物（Ｎｏｃ２-/-）を作成すること、及び当該マウスにおいて発見された知見に基づき、内分泌系の疾病、特にインスリン分泌不全の原因究明と治療手段の開発のために役立つモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明は、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体であり、そのため機能するＮｏｃ２が産生されないマウスを提供するものである。そのようなマウスの生理機能の解析の過程で、それらのマウスが、通常の条件ではグルコース負荷で正常なインスリン応答と正常な血中グルコースレベルを示す一方、ストレス下ではグルコース負荷でインスリン応答が低下し血中グルコースレベルの上昇を起こすことが見出された。従って、ストレス性のインスリン分泌不全のメカニズムの解明のための、また、その治療薬の開発のための、インビボ（in vivo）の試験系として使用することができる。また、当該マウスは、外分泌系不全をも伴うことから、外分泌不全のメカニズムの解明と治療薬の開発のための試験系をも提供する。
【０００９】
更に本発明は、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してヘテロ接合体であるマウスをも提供する。そのようなマウスは、雌雄の交配とＮｏｃ２遺伝子産物の有無確認の試験を通じて、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウスの産生のための手段として使用することができるほか、それ自体、ストレス下でのインスリン分泌に、また外分泌にも、少なくとも潜在的な欠陥を有するマウスとして、ヘテロ接合体マウスと同様の用途に用いることができる。
【００１０】
また本発明は、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体又はヘテロ接合体であるマウスの組織をも提供する。そのような組織、例えばホモ接合体の膵島は、ストレス下でインスリンの分泌が阻害されることから、ストレスによって誘発されるタイプのインスリン分泌不全に対する治療薬の開発のためのインビトロ（in vitro）の試験系として用いることができる。
【００１１】
また本発明は、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体又はヘテロ接合体であるマウスの細胞をも提供する。そのような細胞、例えば膵β細胞は、膵島と同様に、ストレスによって誘発されるタイプのインスリン分泌不全に対する治療薬の開発のためのインビトロ（in vitro）の試験系として用いることができる。また、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウスの生殖細胞又は受精卵は、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損に関してホモ接合体であるマウスの産生に用いることができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、内分泌系及び外分泌系の異常のメカニズムの究明のための、及びそれらの異常に対する治療薬の開発のための、インビボ及びインビトロの試験系を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、Ｎｏｃ２遺伝子の欠損とは、Ｎｏｃ２遺伝子が破壊されており、そのため、機能し得るＮｏｃ２タンパク質が産生されないことをいう。
【００１４】
本発明のマウスについて、「組織」の語は、如何なる組織をも含み、例えば膵島、下垂体、外分泌膵臓、胃腺、小腸腺、ブルンナー腺、唾液腺、乳腺その他の外分泌組織又はその腺房が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明のマウスについて、「細胞」の語は、如何なる体細胞、生殖細胞をも含み、例えば膵β細胞、膵臓腺房その他の腺房細胞等のような内分泌系、外分泌系の組織を構成する細胞のほか、精子、卵子等の生殖細胞及び受精卵が挙げられるが、それらに限定されない。
【実施例１】
【００１６】
本発明者等は、以下に記載するように、Ｎｏｃ２ノックアウトマウスを作成しその生理学的特徴につき調べた。
【００１７】
１．Ｎｏｃ２ノックアウトマウス（Ｎｏｃ２-/-）の作成
Ｎｏｃ２-/-マウスの遺伝子ターゲティング：
本発明者等は、Ｎｏｃ２遺伝子のエキソンを３挟んだイントロン２の途中からイントロン３の途中までを置換することによって、Ｎｏｃ２欠損マウスを作り出した（図１）。すなわち、１２９Ｓｖマウスゲノムライブラリー（λＤＡＳＨファージライブラリー中）をラットのＮｏｃ２コード領域の全長ｃＤＮＡ（配列番号１）（ヌクレオチド１〜１９３４）を用いてスクリーニングした。９個の陽性クローンを単離し、制限酵素による消化と、ラットＮｏｃ２全長ｃＤＮＡをプローブとしたサザンブロット解析を組み合わせることにより、制限酵素マップを作成した。具体的には、ラットＮｏｃ２全長ｃＤＮＡをプローブに、ＧｅｎＢａｎｋデータベースをサーチしたところ、マウスＮｏｃ２遺伝子をコードするゲノム配列が得られた（配列番号２）（ヌクレオチド１〜２０４９２）。この配列データと、９個のゲノムクローンの制限酵素地図を比較することにより、エキソン１からエキソン３を含む、約１５ｋｂの制限酵素地図を作成した（図１）。
【００１８】
得られた制限酵素地図をもとに、ターゲティングベクターを、マウスＮｏｃ２遺伝子のエキソン３より約０．５ｋｂ上流の位置から、エキソン３より約０．５ｋｂ下流の位置までの領域（イントロン２及び３の一部とエキソン３を含む。）を、ネオマイシン耐性遺伝子カセットで置き換え、マウスＮｏｃ２遺伝子のエキソン３より約６ｋｂ上流にあるプロモーター内のＡｐａＩ部位からエキソン３より約０．５ｋｂ上流にあるイントロン２内のＡｐａＩ部位までの断片を、５’側アームとし、マウスＮｏｃ２遺伝子のエキソン３より約０．５ｋｂ下流のＮｈｅＩ部位からエキソン３より約３．８ｋｂ下流にあるＮｈｅＩ部位までの断片を３’側アームとする形で作成した。負の選択のため、チミジンキナーゼカセットをターゲティングベクターの３’末端に付加した。
【００１９】
すなわち、エキソン３より約６ｋｂ上流にあるプロモーター内のＡｐａＩ部位から、エキソン３より約０．５ｋｂ上流にあるイントロン２内のＡｐａＩ部位までを切り出して断端を平滑化し、これをｐＳＰ７２のＰｖｕＩＩ部位にサブクローニングし、プラスミドに対しインサートが逆向きにクローニングされているものを選択した。このクローンＤＮＡをＸｈｏＩで開環し、ネオマイシン耐性遺伝子カセットをコードするＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入した。更に、できたクローンをＳａｌＩとＸｈｏＩで消化しインサート（「５’側アーム＋Ｎｅｏ」という。）を切り出した。同時にｐＧＥＭ３ｚのＸｂａＩ部位に、マウスＮｏｃ２遺伝子のエキソン３より約０．５ｋｂ下流のＮｈｅＩ部位から、エキソン３より約３．８ｋｂ下流にあるＮｈｅＩ部位までの断片（「３’側アーム」という。）をサブクローニングし、プラスミドに対しインサートが逆向きにクローニングされているものを選択した。このクローンのＳａｌＩ部位に、上記の「５’側アーム＋Ｎｅｏ」のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入し、更にＳａｌＩ部位を用いてチミジンキナーゼ遺伝子カセットをコードするＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を挿入した。これをＳａｌＩ消化することにより直鎖状とし、ターゲティングベクターを得た。
【００２０】
ターゲティングベクターを、ＥＳ細胞株（Ｒ１）にエレクトロポレーションで導入し、トランスフェクション後８日目に４１４個の生存クローンを採取した。相同組換えクローンは、サザンブロットで同定した（データ示さず）。すなわち、プローブとしてターゲティングベクターの３’側アームよりも下流の１．０ｋｂのゲノム断片（ＮｃｏＩ〜ＳａｌＩ断片）を用い、ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化した。１個のＥＳ細胞クローンにおいて相同組換えが起きているのが判明した。このクローンを用いて、細胞集合によりキメラマウスを作り出し、マウス株を樹立した。Ｎｏｃ２遺伝子が破壊されていることは、ゲノムサザンブロット及びノーザンブロットにより確認した。これらのマウスをＣ５７／ＢＬ６マウスと戻し交配した。
【００２１】
ヘテロ接合型（Ｎｏｃ２+/-）マウスを交配することによって、ホモ接合型（Ｎｏｃ２-/-）のノックアウトマウスを作成した。相同組換えは、マウスの尾から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロットによって、下記のようにして確認した。
その結果、図２に示すように、Ｎｏｃ２-/-マウスでは、５．７ｋｂに相当するバンドが消失し、代わりに５．１ｋｂに相当するバンドが出現していた。野生型マウス（Ｎｏｃ２+/+）では５．７ｋｂに相当するバンドのみが、またＮｏｃ２+/-マウスでは５．７ｋｂ及び５．１ｋｂにそれぞれ相当するバンドが確認された。また、Ｎｏｃ２ｍＲＮＡの発現欠如も下記のようにして確認した。図３に示すように、野生型マウスの下垂体及び副腎に検出されるＮｏｃ２  ｍＲＮＡは、Ｎｏｃ２-/-マウスでは検出されなかった。更に、Ｎｏｃ２-/-マウスと野生型マウスの膵島からの総ＲＮＡを用い、Ｎｏｃ２遺伝子転写産物について下記のようにしてＲＴ−ＰＣＲを行った。図４に示すように、Ｎｏｃ２遺伝子転写産物は、Ｎｏｃ２-/-マウスには全く検出されなかった。
【００２２】
サザンブロット、ノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲの方法：
標準的方法により、マウスの尾及び各種組織から、ゲノムＤＮＡ（サザンブロット用）及び総ＲＮＡ（ノーザンブロット用）を調製した。
ゲノムＤＮＡはＳｓｐＩ及びＳｐｈＩで消化した。ＤＮＡ（１０μｇ）又はＲＮＡ（２０μｇ）を１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜に移しとった。高ストリンジェント条件で、32Ｐ標識プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。サザンブロットに用いたプローブは示したＮｏｃ２のゲノムＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ〜ＳａｌＩ断片）（配列番号３）であった。ノーザンブロットに用いたプローブは、マウスＮｏｃ２のｃＤＮＡ断片（配列番号４）（５’側非翻訳領域のヌクレオチド１〜４１及び３’側非翻訳領域のヌクレオチド９４８〜９９４を含む）のヌクレオチド１〜９９４に対応する断片であった。
ノーザンブロットに用いたプローブは、上記マウスのＮｏｃ２のｃＤＮＡ断片の両端に5'-CGAAGCAGATGTGACTCCTG-3'（配列番号５）、及び5'-TTCTGGAAGAGTTTGCCTCA-3'（配列番号６）の２種のプライマーを設定し、ＰＣＲで増幅し、アガロースゲルで電気泳動後、該当するバンドを切り出し、精製して用いた。なおマウスのＮｏｃ２ ｃＤＮＡ断片は、上記の２種のプライマーを用いて、マウス膵β細胞株であるＭＩＮ６細胞から抽出したＲＮＡから作成したｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅し、pGEM-T easy ベクターにサブクローニングして作製した。
ＲＴ−ＰＣＲは、膵島の総ＲＮＡ（１０μｇ）を用いて行った。ＰＣＲ産物の推定サイズは３４５ｂｐである。ＰＣＲは３０サイクル行った。ＰＣＲによる増幅に用いたプライマーはＮｏｃ２の順方向配列5'-GCAGTGGAAATGATCAGTGG-3'（配列番号７）及び逆方向配列5'-CATCACGTTCCTCTGCATTG-3'（配列番号８）のものである。
【００２３】
２．Ｎｏｃ２ノックアウトマウスと正常マウスとからのキメラマウスの作成
常法に従い、Ｎｏｃ２-/-親同士からの４分裂期の受精卵と、クラゲAequorea victoriaのグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現している野生型（Ｎｏｃ２+/+）の受精卵を合わせてキメラマウスを作成した。キメラ形成は、ＰＣＲ又はゲノムサザンブロット法により判定した。ＧＦＰを発現している野生型の卵は、ＣＡＧプロモーターの調節下にＧＦＰを発現している雄のトランスジェニックマウス（トランスジーンについてホモ接合）（２６）を用いて準備した。すなわち、多数のＧＦＰ変異型の一つである増強型グリーン蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein：ＥＧＦＰ）をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより常法により増幅した。これらのプライマー中のＥｃｏＲＩ部位を、増幅したＥＧＦＰのｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ発現ベクター（ヒヨコのβ−アクチンプロモーター、サイトメガロウイルスのエンハンサー、β−アクチンのイントロン及びウシのグロビンポリアデニル化部位シグナルを含む）内に組み込むのに用いた。プロモーターからコード配列までを含む全インサートをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切り出し、精製した。精製断片を野生型Ｎｏｃ２マウス受精卵に注射することにより、ＧＦＰトランスジェニックマウス株を作成し、仮親中に移植して発生させた。生後１日のマウスについて蛍光顕微鏡によりＧＦＰ発現の有無を調べ、これを発現しているマウスを選択した。
【００２４】
３．インビボ動物実験方法
経口グルコース耐性試験は、１６時間絶食させた１２〜２０週齢の雄性マウスで行った。浸水ストレス実験は、先に記載した（25）ところに準じて、グルコース負荷後に個々に拘束ホルダー中に固定し２０℃の水（水深５ｃｍ）に垂直に１５分間浸漬したマウスを用いて、実施した。血中グルコースレベルは、Antosense Glucose II (三共)を用いて全血で測定した。血清インスリンレベルは、超高感度ラットインスリンＥＬＩＳＡキット（森永）によって測定した。
【００２５】
４．単離膵島からのインスリン分泌の測定。
常法（27）により、コラゲナーゼ消化法で膵島を単離した。ＰＴＸ（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は不存在下に、ＲＰＭＩ１６４０倍地中で、膵島を４８時間培養した。バッチインキュベーションは、先に記述したところに準じて行った（27）。培地中に放出されたインスリンは、ラジオイムノアッセイ（栄研化学）によって測定した。ＬａｃＺ、Ｎｏｃ２ｗｔ（野生型）、又はＮｏｃ２ＡＡＡ（変異型）のｃＤＮＡを有する組換えアデノウイルスを、メーカー（STRATAGENE）の説明書に従って作成した。Ｎｏｃ２ＡＡＡの作成ためには、先に記載したようにして（24）、Trp-Phe-Tyr（残基１５４〜１５６）を３個のアラニンで置換した。Ｎｏｃ２-/-マウスの膵島に、単離直後、これらのアデノウイルスを４８時間感染させた。Ｆｌａｇ標識したＲａｂ３のアイソフォームでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞の細胞溶解液を、ＧＴＰ−γＳの存在下、ＧＳＴ−Ｎｏｃ２野生型（Ｎｏｃ２ｗｔ）又はＧＳＴ−Ｎｏｃ２変異体（Ｎｏｃ２ＡＡＡ）への結合につき評価した。
インスリン分泌実験も、新たに調製した膵島を培養することなく用いて行った。
【００２６】
５．単離膵臓腺房細胞からのアミラーゼ分泌の測定
コラゲナーゼ消化法により、膵臓腺房を調製した。アミラーゼ分泌実験は、Ohnishi et al. (28)に従って、僅かな改良を加えて行った。すなわち、単離した腺房を、先に記述したように（28）インキュベーション緩衝液〔10ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ7.4）、127ｍＭ ＮａＣｌ、4.7ｍＭ ＫＣｌ、0.6ｍＭ ＭｇＣｌ2、1.3ｍＭ ＣａＣｌ2、0.6ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、2.0ｍｇ／ｍｌグルコース、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭアミノ酸サプルメント、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ＢＳＡ、0.01％大豆トリプシンインヒビターよりなる〕中に懸濁させ、３７℃にて３０分間プレインキュベートした。プレインキュベーションの後、腺房を遠心し、新たなインキュベーション緩衝液中に再懸濁させ、そして３０ｐＭのコレシストキニン（ＣＣＫ）又は１μＭのカルバコールの存在下若しくは不存在下に、３７℃にてインキュベートした。インキュベーション中に上清に放出されたアミラーゼを、Amylase B-test WAKO (和光純薬工業)を用いて定量した。アミラーゼ分泌は、膵臓腺房細胞中の総細胞含量に対する培地への放出量として標準化した（アミラーゼ放出％として表示）。
【００２７】
６．インビトロ（in vitro）結合アッセイ
何れも全長の、野生型Ｎｏｃ２及び変異型Ｎｏｃ２（Ｎｏｃ２ＡＡＡ）をＧＳＴ−融合タンパク質として発現させ、メーカー（AMERSHAM）の説明書に従って精製した。全長のＲａｂ３Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにＲａｂ５のｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（SIGMA）中にサブクローニングした。共沈アッセイのためには、LipofectAMINE (INVITROGEN)を用いてＣＯＳ−１細胞を各プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、緩衝液中〔20ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.4、200ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＡＴＰ及び0.26％（ｖ／ｖ）のＣＨＡＰＳ〕で超音波処理した。インビトロ結合アッセイは、先に記述した（15）ところに準じて行った。すなわち、ＦＬＡＧ標識したＲａｂ３アイソフォーム及びＲａｂ５でトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの細胞溶解液を、ＧＤＰ−βＳ又はＧＴＰ−γＳの存在下におけるグルタチオンビーズに固定化したＧＳＴ−Ｎｏｃ２への結合について評価した。Ｒａｂ３アイソフォームとＲａｂ５とＧＳＴ−Ｎｏｃ２とは、抗Ｆｌａｇ抗体による、又はラットＮｏｃ２に対するイムノグロブリンＧ精製抗体によるイムノブロットによって検出した。
【００２８】
７．組織学的分析
膵臓と、消化管の種々の部分とを、野生型マウス及びＮｏｃ２-/-マウスから取り出し、0.1Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中、４％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定した。固定された組織を、慣用の手順で乾燥させてパラフィン包埋した。５μｍ厚のパラフィン切片を、分泌顆粒についてはヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）、Ａｚａｎ又は過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色し、膵臓ホルモンについては免疫染色した。膵臓、胃及び唾液腺からの小さい組織切片を、２．５％のグルタルアルデヒド及び１％のＯｓＯ4で後固定し、エポキシ樹脂に包埋した。やや薄い及び超薄の切片を、トルイジンブルー及び酢酸ウラニル／クエン酸鉛で、光学顕微鏡及び電子顕微鏡による観察用に、それぞれ染色した。
【００２９】
〔結果〕
Ｎｏｃ２遺伝子の破壊は、下垂体、副腎及び膵島からの総ＲＮＡのノーザンブロット分析又は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって確認された。Ｎｏｃ２-/-マウスは正常に発生し繁殖力があり、全体的外観や挙動に何ら異常はみられない。Ｎｏｃ２は膵島のような内分泌組織おいて高レベルに発現されることから（16）、我々は先ず、内分泌膵臓機能を調べた。Ｎｏｃ２-/-マウスと野生型マウスとで、経口グルコース負荷後の血中グルコース及び血清中インスリンレベルは、正常な条件の下で少量の血液サンプルを採取したときには、同様であり、統計学的差はなかった（それぞれ、図５及び６）。しかしながら、より大量の血液を採取したときは、我々は偶然にも、野生型マウスはグルコース負荷後に共に正常なグルコースレベルとインスリン応答とを示すのに対し、Ｎｏｃ２-/-マウスは、野生型マウスに比して、低下したインスリン応答を伴った有意に高い血中グルコースレベルを示すことを見出した（データは示さず）。
【００３０】
大量の血液損失は、種々のストレス応答を引き起こすことが知られている（29）。そこで、Ｎｏｃ２-/-マウスにおけるストレスに対する内分泌膵臓の応答を調べるため、浸水ストレス（25）に対する血中グルコース応答及びインスリン応答を測定した。浸水ストレスは、経口グルコース負荷の後、Ｎｏｃ２-/-マウスにおいて血中グルコースレベルの持続的上昇とインスリン分泌の顕著な低下を引き起こしたが、野生型ではそのようなことはなかった（それぞれ、図７及び８）。すなわち、グルコース負荷後９０分、１２０分及び１８０分の時点での血中グルコースレベルは、野生型マウスにおけるよりもＮｏｃ２-/-マウスにおいて有意に高く（各時間点において、ｎ＝１３。９０分では*P < 0.01、１２０及び１８０分では**P < 0.001）、また、グルコース負荷後３０分の血清インスリンレベルは、野生型マウスに比してＮｏｃ２-/-マウスにおいて有意に低かった（野生型マウス、919.5±123.8ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝２２；Ｎｏｃ２-/-マウス、451.7±101.9ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝２２。*P<0.001）。このことは野生型マウスではインスリン分泌を高めることによって浸水ストレスに対して正常な血中グルコースレベルを維持することができるのに対し、Ｎｏｃ２-/-マウスではそれができないということを示している。
【００３１】
浸水ストレスは、アドレナリン様応答を引き起こすことが知られていることから（25）、そして、膵β細胞においてα2−アドレナリン受容体を介した阻害性Ｇタンパク質であるＧｉ／ｏシグナル発生の活性化はインスリン分泌を阻害することから（30〜32）、Ｎｏｃ２-/-マウスにおけるインビボでのインスリン応答の欠陥は、膵β細胞におけるＧｉ／ｏシグナル発生の活性化に関係している可能性がある。Ｎｏｃ２-/-マウスインスリン分泌の欠陥という現象の基にあるメカニズムを調べるため、我々は、単離した膵島におけるインスリン分泌を調べた。図９に示すように、Ｎｏｃ２-/-マウスより単離してから２４時間培養した膵島におけるＣａ2+誘発インスリン分泌（高Ｋ+刺激により評価）は、顕著に低下していた。すなわち、２．８ｍＭグルコースでのインスリン分泌において差はなかったが（基底状態）、Ｎｏｃ２-/-マウスの高Ｋ+（60ｍＭ）誘発インスリン分泌は、野生型マウスに比して有意に低かった（野生型マウス、1.43±0.16ｎｇ／島／30分；Ｎｏｃ２-/-マウス、0.83±0.10ｎｇ／島／30分、ｎ＝１２、*P < 0.0001）。単離後に膵島をＰＴＸ（30ｎｇ／ｍｌ、４８時間）で処理したときは、野生型マウスとＮｏｃ２-/-マウスとの間で、高Ｋ+誘発インスリン分泌において差はなかった（白の丸及びカラムは、野生型マウス；黒の丸及びカラムはＮｏｃ２-/-マウス。数値は、平均±標準誤差。）
【００３２】
Ｎｏｃ２-/-マウスにおけるこの低下したインスリン分泌がＧｉ／ｏシグナル発生の活性化によるものであるか否かを判定するために、我々は、Ｇｉ／ｏシグナル発生を阻害するものであるＰＴＸのＣａ2+誘発インスリン分泌に対する効果を調べた。膵島のＰＴＸ処理（４８時間）は、Ｎｏｃ２-/-マウスにおける低下したＣａ2+誘発インスリン分泌を完全に回復させた。培養膵島における結果とは対照的に、Ｎｏｃ２-/-マウス及び野生型マウスのから調製したばかりの膵島におけるＣａ2+誘発インスリン分泌は、同様であった（データは示さず）。培養膵島と調製したばかりの膵島との間のこの相違は、Ｎｏｃ２-/-膵島においては培養中にＧｉ／ｏシグナル発生が活性化されることを示唆している（メカニズムは不明である）。これらの結果は、膵β細胞において、Ｇｉ／ｏシグナル発生の阻害による正常なインスリン分泌の維持にＮｏｃ２が必要であることを示している。Ｎｏｃ２の破壊は、Ｇｉ／ｏシグナルを顕在化させ、それによってインスリン分泌を阻害する。
【００３３】
Ｎｏｃ２は、ラブフィリン３のＮ末端領域と高い相同性を有しており（16）、Ｒａｂ３Ａに結合することが示されている（24）。Ｒａｂ３には４つのアイソフォームがあるが（Ｒａｂ３Ａ〜Ｄ）、それら全てが、調節されたエキソサイトーシスに関連づけられている（9〜12）。我々は、Ｎｏｃ２が、ＧＴＰ依存性にこれらのＲａｂ３のアイソフォームの全てに結合するがしかしＲａｂ５Ａには結合しないということを見出した（図１０）。このことはＮｏｃ２がＲａｂ３ファミリーのメンバーに特異的に結合することを示すものである。エキソサイトーシスにおけるＮｏｃ２のこの効果がＲａｂ３を必要とするか否かを判定するために、我々は、野生型Ｎｏｃ２及びＲａｂ３の如何なるアイソマーにも結合しない変異型Ｎｏｃ２（Ｎｏｃ２ＡＡＡ）（24）を有するアデノウイルスベクターを作成し（図１１）、膵島をこれらのベクターに感染させた。Ｎｏｃ２-/-マウスの培養膵島においてＣａ2+誘発インスリン分泌応答の欠如は、野生型Ｎｏｃ２遺伝子の導入によって完全に回復するのに対し、変異Ｎｏｃ２の導入は効果を持たないことが確認された（図１２）。すなわち、Ｎｏｃ２-/-マウスにおける障害されたＣａ2+誘発インスリン分泌は、野生型のＮｏｃ２遺伝子導入により完全に回復したが（Ａｄ−ＬａｃＺ、0.69±0.07ｎｇ／島／３０分；Ａｄ−Ｎｏｃ２ｗｔ、1.20±0.11ｎｇ／島／30分、ｎ＝９、*P < 0.01）、変異型Ｎｏｃ２遺伝子導入は全く効果がなかった（Ａｄ−Ｎｏｃ２ＡＡＡ、0.65±0.11ｎｇ／島／30分、ｎ＝９：Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−Ｎｏｃ２ｗｔ、及びＡｄ−Ｎｏｃ２ＡＡＡは、ＬａｃＺ、Ｎｏｃ２ｗｔ、及びＮｏｃ２ＡＡＡを有するアデノウイルスを、それぞれ示す）（白のカラムは野生型マウス、黒のカラムはＮｏｃ２-/-マウス。数値は平均±平均偏差）。このことはＣａ2+誘発インスリン分泌に対するＮｏｃ２の作用がＲａｂ３との相互作用を必要とするものであることを示している。Ｒａｂ３Ａ-/-マウスもまた、インスリン分泌に欠陥を有することが示されており（33）、そのことは、本知見を補完すると共に、正常なインスリン分泌の維持におけるＮｏｃ２とＲａｂ３との間の相互作用の必要性を示唆するものである。Ｒａｂ３媒介性のエキソサイトーシスとカップリングする三量体Ｇシグナルはこれまで同定されていないが、我々のこの結果は、膵β細胞におけるＧｉ／ｏシグナル発生が、Ｎｏｃ２／Ｒａｂ３相互作用と密接に関連していることを示している。
【００３４】
我々は次に、Ｎｏｃ２-/-マウスの膵島の形態学的分析を行った。図１３は、ヘマトキシリン・エオシン染色した外分泌膵臓の腺房細胞の光学顕微鏡（ＬＭ）分析（上側パネル）、及び腺房細胞の電子顕微鏡（ＥＭ）分析（下側パネル）の結果を示す（スケールバーは、上側パネルでは１０μｍを、下側パネルでは３μｍを表す）。
膵臓ホルモンに対する免疫組織染色によってもまた電子顕微鏡分析によっても、Ｎｏｃ２-/-マウスの膵島の形態学にもインスリン分泌顆粒にも、明らかな異常は見られなかった。
【００３５】
しかしながら、興味深いことに、ある著しい異常が外分泌膵臓に現れていた（図１３；下側パネル）。光学及び電子顕微鏡分析は、Ｎｏｃ２-/-マウスの外分泌膵臓における腺房細胞が、分泌顆粒（チモーゲン顆粒）の顕著な蓄積のために、細胞質全体にわたって肥大していることを示している。外分泌膵臓機能を評価するため、チモーゲン顆粒中の主要な分泌性タンパク質であるアミラーゼ（6）のインビトロでの分泌を調べた（図１４：白のカラムは野生型マウス、黒のカラムはＮｏｃ２-/-マウス）。野生型マウスとは対照的に、Ｎｏｃ２-/-マウスの膵臓腺房細胞からは、共にアミラーゼ分泌の強力な刺激因子であることが知られているコレシストキニンやカルバコールの何れに対しても、これに応答したアミラーゼ分泌（アミラーゼ含量のうちのアミラーゼの放出％として表示）はない〔野生型マウス：5.6±0.9％（基底レベル）、13.0±0.7％（ＣＣＫ刺激アミラーゼ分泌）及び15.6±0.8％（カルバコール刺激アミラーゼ分泌）、各々ｎ＝１２、それぞれP < 0.0001；Ｎｏｃ２-/-マウス：4.9±0.5％（基底レベル）、5.8±0.5％（ＣＣＫ刺激アミラーゼ分泌）及び6.2±0.5％（カルバコール刺激アミラーゼ分泌）、ｎ＝１２：数値は平均±標準誤差〕。これらの結果は、Ｎｏｃ２が、外分泌膵臓におけるチモーゲン顆粒の調節されたエキソサイトーシスのための必須の分子であることを実証している。
【００３６】
Ｎｏｃ２-/-マウスの腺房細胞は、転写因子ＮｅｕｒｏＤを欠損したマウス（ＮｅｕｒｏＤ-/-マウス）（34）のそれに似ている。ＮｅｕｒｏＤ-/-マウスにおいては、腺房細胞中のチモーゲン顆粒の過多は、ＣＣＫ分泌小腸細胞における発生上の欠陥による二次的なものであると考えられている。Ｎｏｃ２-/-マウスの膵臓腺房細胞におけるチモーゲン顆粒の過多が腺房細胞における原発的な欠陥によるものか又はＣＣＫ分泌小腸細胞における欠陥による二次的なものかを判定するために、我々は、マウスの４分裂期受精卵をあわせることにより、Ｎｏｃ２-/-マウスと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＧＦＰ−Ｔｇ）を発現する野生型（Ｎｏｃ２+/+）マウスとの間のキメラマウスを作成した。もしも膵臓の腺房細胞のＮｏｃ２の破壊が、形態学的異常の直接の原因であるならば、キメラマウスの外分泌膵臓は、正常な外見を有する（ＧＦＰ−Ｔｇからマウスに由来する）ＧＦＰ陽性腺房細胞と、チモーゲン顆粒の過多を伴った（Ｎｏｃ２-/-マウスに由来する）ＧＦＰ陰性腺房細胞との混合集団よりなるモザイクパターンを示すはずである。キメラマウスの組織学的分析は、モザイクパターンを呈した（図１５）。図１５において、左側パネルは、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した切片を示し、右側パネルは、蛍光顕微鏡で観察された切片を示す（スケールバーは10μｍを表す）。図に見られるとおり、キメラマウスの外分泌膵臓は、正常な外観のＧＦＰ陽性の腺房細胞（ＧＦＰ−Ｔｇマウス由来）とＧＦＰ陰性のチモーゲン顆粒の過剰を有する腺房細胞（Ｎｏｃ２-/-マウス由来：白の線で囲ってある）との混合集団のモザイクパターンを示している。このことはＮｏｃ２-/-マウスの腺房細胞におけるチモーゲン顆粒の過多は、主としてＮｏｃ２の欠如によるものであることを示している。
【００３７】
Ｒａｂ３Ｄが、膵臓腺房細胞に発現していることが示されている（35）。膵臓腺房細胞における野生型Ｒａｂ３Ｄ及びその優勢ネガティブ型の過剰発現は、Ｒａｂ３Ｄがチモーゲン顆粒のエキソサイトーシスの最終の諸段階を調節していることを示唆している（12, 28）。Ｒａｂ３Ｄノックアウトマウスの一研究が、Ｒａｂ３Ｄはチモーゲン顆粒のエキソサイトーシスには必須でないが顆粒の成熟の維持には必須であることを示している（36）。しかしながら、他のＲａｂ３アイソフォームがＲａｂ３Ｄの欠乏状態を代償している、という可能性は排除できない。我々は先に、オートラジオグラフィーにおける短時間（３６時間）曝露によって評価したとき、Ｎｏｃ２ ｍＲＮＡが内分泌組織中に主として発現されることを報告したが、また、より長時間（１週間）の曝露によって評価したとき、多くの組織において低レベルの発現を見出した。我々は、従って、Ｎｏｃ２-/-マウスの唾液腺（腺房細胞がアミラーゼ及び種々の増殖因子を分泌する）、胃腺（主細胞がペプシノーゲンを分泌する）及び小腸腺（パーネト細胞が抗菌性のリゾチームを分泌する）を含む、Ｒａｂ３Ｄが発現される他の外分泌組織における組織学的変化を調べた。
【００３８】
サイズが増大し形状が不規則な分泌顆粒蓄積が、Ｎｏｃ２-/-マウスについて調べた全ての外分泌細胞において顕著であった（図１６：スケールバーは10μｍを表す）。対照的に、Ｎｏｃ２-/-マウスの胃の表面粘膜細胞及び十二指腸上皮のゴブレット細胞等の、単に構成的なエキソサイトーシスを行うに過ぎない分泌細胞においては、形態学的変化はない（データ示さず）。これらの形態学的データは、Ｎｏｃ２が、Ｒａｂ３Ｄと相互作用する形で、外分泌細胞における調節されたエキソサイトーシスに必要であることを示唆している。
【００３９】
Ｒａｂ３のエフェクターの生理学的役割の決定は、Ｒａｂ３媒介性のエキソサイトーシスのメカニズムの解明へ向けての非常に重要なステップである。ラブフィリン３のＮ末端又はＣ末端の過剰発現又はマイクロインジェクションが、種々の系でＣａ2+誘発エキソサイトーシスを阻害することが示されている（20）。しかしながら、ラブフィリン３ノックアウトマウスについての最近の研究は、Ｒａｂ３Ａ-/-マウスにおいてシナプス伝達の異常が見られないことを報告しており、このことは、神経細胞におけるＲａｂ３Ａ媒介性のエキソサイトーシスにラブフィリン３は必要でないことを示唆するものである（21）。
【００４０】
Ｒｉｍ１-/-マウスの研究は、Ｒｉｍ１が、骨格タンパク質の一つとして、苔状繊維（mossy fibers）においてシナプス小胞をプライミングすることにより神経伝達物質の放出を調節していることを示唆している（17〜19）。Ｎｏｃ２の破壊は、明らかに、内分泌膵臓及び外分泌膵臓の双方における分泌機能に明確な異常を引き起こす。ＲＡｂ３は調節されたエキソサイトーシスの後期の段階に関与することが示されているが、Ｒａｂ３媒介性のエキソサイトーシスにカップリングする細胞内シグナルは、これまで同定されていない。本明細書に記載した我々の研究は、Ｎｏｃ２がＲａｂ３と相互作用し、その結果内分泌膵臓からのＣａ2+誘発インスリン分泌の阻害をもたらすＧｉ／ｏシグナル発生を阻害すること、及び、Ｎｏｃ２が外分泌膵臓からのアミラーゼ分泌に必要であることを実証している。従って、Ｎｏｃ２は、内分泌細胞及び外分泌細胞の双方において、分泌顆粒の調節されたエキソサイトーシスの維持に極めて重要な分子である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、内分泌系の疾患、特にインスリンの分泌不全を伴う疾病の原因究明と治療手段の開発のために役立つモデル動物及びスクリーニング系として利用することができる。
【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ターゲティングベクターの作成方法を示す概要図。
【図２】マウスマウスのサザンブロット分析を示す。
【図３】野生型及びノックアウトマウスの下垂体及び副腎のＮｏｃ２ ｍＲＮＡについてのノーザンブロット分析を示す。
【図４】マウス膵島のＮｏｃ２及びα−チュブリンについてのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図５】経口グルコース負荷後のマウスの血中グルコースレベルの推移を示す。
【図６】経口グルコース負荷後のマウスの血中インスリンレベルの推移を示す。
【図７】浸水ストレス下におけるマウスの経口グルコース負荷後の血中グルコースレベルの推移を示す。
【図８】浸水ストレス下におけるマウスの経口グルコース負荷後の血中インスリンレベルの推移を示す。
【図９】単離後２４時間培養したマウス膵島のインスリン分泌量を示す。
【図１０】マウスＮｏｃ２とＲａｂ３アイソフォームとの結合を示す。
【図１１】ＧＳＴ−Ｎｏｃ２（野生型、変異型マウス）とＲａｂ３アイソフォームとの結合を示す。
【図１２】マウスのＮｏｃ２遺伝子を有するベクターの感染による、ノックアウトマウス膵島からのインスリンの分泌を示す。
【図１３】マウス膵島の光学顕微鏡像及び電顕像を示す。
【図１４】マウスの単離膵臓腺房からのアミラーゼ分泌を示す。
【図１５】キメラマウスの膵臓腺房のヘマトキシリン・エオシン染色像及びＧＦＰ蛍光像。
【図１６】Ｎｏｃ２ノックアウトマウスの外分泌細胞における分泌顆粒の蓄積を示す。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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