(57)【要約】【課題】  ステロイド剤に代わる新たなネフローゼ症候群の治療剤を提供する。【解決手段】  ヒューマニン又はこれと同等の機能を有するペプチドを有効成分として含有するネフローゼ症候群の治療剤。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒューマニン又はこれと同等の機能を有するペプチドを有効成分として含有するネフローゼ症候群の治療剤。
【請求項２】
ヒューマニンが、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項１記載のネフローゼ症候群の治療剤。
【請求項３】
ネフローゼ症候群が、微小変化型ネフローゼ症候群である請求項１又は２記載のネフローゼ治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネフローゼ症候群を治療するための新規な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネフローゼ症候群とは、多量の蛋白質が尿中に排出され、血液中の蛋白質が減少し、むくみなどの症状のでる病態をいう。ネフローゼ症候群の治療には、主にステロイド剤が使用されている。
【０００３】
しかし、ステロイド剤には、成長障害や免疫力の低下、骨粗鬆症など多くの副作用がある。また、ネフローゼ症候群の中には、微小変化型ネフローゼ症候群のようにステロイド剤が非常によく効くものがある一方、ステロイド剤がほとんど効かないものもある（例えば、巣状硬化型ネフローゼ症候群など）。このため、ステロイド剤に代わる新たなネフローゼ症候群の治療剤の開発が求められていた。
【特許文献１】特開平6-24982号公報
【特許文献２】特開2003-286190号公報
【特許文献３】国際公開第01/021787号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、ステロイド剤に代わる新たなネフローゼ症候群の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、抗アポトーシスペプチドとして知られているヒューマニンが、ネフローゼ症候群に対する治療効果を持つことを見出し、この知見から本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（３）を提供するものである。
（１）ヒューマニン又はこれと同等の機能を有するペプチドを有効成分として含有するネフローゼ症候群の治療剤。
（２）ヒューマニンが、配列番号１記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである（１）記載のネフローゼ症候群の治療剤。
（３）ネフローゼ症候群が、微小変化型ネフローゼ症候群である（１）又は（２）記載のネフローゼ症候群の治療剤。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
ヒューマニンは、抗アポトーシス作用を有する既知のペプチドであるが（Niikura T, Hashimoto Y, Tajima H, Nishimoto I. Death and survival of neuronal cells exposed to Alzheimer's insults, J Neurosci Res 2002;70:380-391.、Guo B, Zhai D, Cabezas E, Welsh K, Nouraini S, Satterthwait AC, Reed JC: Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation. Nature 2003;423:456-461.）、このペプチドがネフローゼ症候群に対する治療効果を持つことは、本発明者によって初めて見出されたものである。
【０００９】
使用するヒューマニンは特に限定されず、ヒト由来のヒューマニンでもよく、ヒト以外の動物、例えば、マウス、ラットなど由来のヒューマニンでもよい。なお、ヒト由来のヒューマニンのアミノ酸配列は、配列番号１に示すとおりである。
【００１０】
ヒューマニンの代わりに、ヒューマニンと同等の機能を有するペプチドを使用することもできる。ここで「ヒューマニンと同等の機能を有するペプチド」とは、ヒューマニンのもつネフローゼ症候群に対する治療機能（より具体的には、尿蛋白量の増加抑制機能）を持つペプチドを意味する。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表されるペプチドが含まれる。ここで、欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は10個以内であり、好ましくは5個以内であり、更に好ましくは3個以内であり、最も好ましくは1個である。
【００１１】
本発明のネフローゼ症候群の治療剤は、ヒューマニンに、適当な添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）や製薬上必要な成分を加えて混合し、腸溶性錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤等の経口剤、あるいは静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与のための注射剤などとして調製される。
【００１２】
投与量は、投与経路、症状、患者の体重や年齢等によって異なるが、例えば、成人患者に皮下注投与する場合は、１日あたりのヒューマニンの投与量は1〜10mg程度が適当である。
【００１３】
治療の対象とするネフローゼ症候群は、主として微小変化型ネフローゼ症候群であるが、これ以外のネフローゼ症候群、例えば、巣状硬化型、膜性、膜性増殖性、メサンギウム増殖性のネフローゼ症候群なども治療対象としてもよい。なお、ここでいう「治療」には、ネフローゼ症候群を完治させる場合のみならず、病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
【００１４】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を表す。
【００１５】
配列番号１：ヒト由来のヒューマニンのアミノ酸配列。
【００１６】
配列番号２：アクチニン-4のR1-R4領域をコードするcDNAに特異的なフォワードプライマーの塩基配列。
【００１７】
配列番号３：アクチニン-4のR1-R4領域をコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【００１８】
配列番号４：アクチニン-4のR1領域をコードするcDNAに特異的なフォーワードプライマーの塩基配列。
【００１９】
配列番号５：アクチニン-4のR1領域をコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【００２０】
配列番号６：アクチニン-4のR2領域をコードするcDNAに特異的なフォーワードプライマーの塩基配列。
【００２１】
配列番号７：アクチニン-4のR2領域をコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【００２２】
配列番号８：アクチニン-4のR3領域をコードするcDNAに特異的なフォーワードプライマーの塩基配列。
【００２３】
配列番号９：アクチニン-4のR3領域をコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【００２４】
配列番号１０：アクチニン-4のR4領域をコードするcDNAに特異的なフォーワードプライマーの塩基配列。
【００２５】
配列番号１１：アクチニン-4のR4領域をコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【００２６】
配列番号１２：ヒューマニンをコードするcDNAに特異的なフォーワードプライマーの塩基配列。
【００２７】
配列番号１３：ヒューマニンをコードするcDNAに特異的なリバースプライマーの塩基配列。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、新規なネフローゼ症候群の治療剤を提供する。本発明の治療剤を用いれば、副作用の多いステロイド剤を使わずに、ネフローゼ症候群を治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００３０】
〔実施例１〕
ピューロマイシンアミノヌクレオシド（PAN）（Sigmaより購入）21mgを21mlの生理食塩水に加え、これを凍結保存用チューブに1.5mlずつ分注した（14回分）。また、ヒューマニン（Tana Laboratoriesより購入）10.5mgを10.5mlの生理食塩水に加え、これを前記と同様に凍結保存用チューブに1.5mlずつ分注した（7回分）。更に、ヒューマニンを加えない生理食塩水を前記と同様に凍結保存用チューブに1.5mlずつ分注した（7回分）。以上のように調製したPAN溶液、ヒューマニン溶液、及び生理食塩水を-20℃で凍結保存した。
【００３１】
２匹のマウス（6週齢、Spraugue-Dawley系、Sizuoka Agricultural Cooperative Association for Laboratory Animalsより購入）の一方にPAN溶液及びヒューマニン溶液を、他方にPAN溶液及び生理食塩水を、連続7日間腹腔内投与し、1日当りの尿蛋白量の経時的変化を調べた。PAN溶液の投与は午後5時ごろ行い、ヒューマニン溶液又は生理食塩水の投与は正午に行った。尿蛋白量の測定は、Biuret法により行った。結果を図１に示す。
【００３２】
図１に示すように、ヒューマニンを投与しなかったマウスでは、尿蛋白量が増大し、ネフローゼ症候群（PAN腎症）を発症したが、ヒューマニンを投与したマウスでは尿蛋白量の増大が抑制された。このことから、ヒューマニンは、ネフローゼ症候群の治療剤として利用できると考えられる。
【００３３】
〔実施例２〕
ヒューマニン投与及び非投与マウス（初回投与日から15日目）の尿中に含まれる蛋白質をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により分析した。電気泳動はLaemmliの方法（Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.）に従って行った。結果を図２に示す。
【００３４】
図２に示すように、ヒューマニンを投与しなかったマウスの尿中には、多量のアルブミンが検出された。ヒューマニンを投与したマウスの尿中にもアルブミンは検出されたが、その量は少なかった。このことから、ヒューマニンは、PANによって引き起こされる尿中へのアルブミンの流出を抑制する効果あると考えられる。
【００３５】
〔参考例１〕
腎臓内で発現している蛋白質の中からアクチニン-4のR1-R4領域と相互作用をする蛋白質を特定するため、大腸菌ツー・ハイブリッド法によるスクリーニングを行った。
【００３６】
大腸菌ツー・ハイブリッド法は、Bacterio Match Two-Hybrid System（Stratagene）を用いて行った。Bacterio Match Two-Hybrid Systemは、ベイト蛋白質を産生するベクター（pBT）、ターゲット蛋白質を産生するベクター（pTRG）、レポーター株（大腸菌）からなる。ベイト蛋白質はλレプレッサー蛋白質との融合蛋白質として、ターゲット蛋白質はRNAポリメラーゼのαサブユニットとの融合蛋白質としてレポーター株内で産生される。ベイト蛋白質とターゲット蛋白質が相互作用をする場合、レポーター株のゲノムに組み込まれたλ−オペレーター領域にλレプレッサー蛋白質が結合し、またRNAポリメラーゼのαサブユニットが他のサブユニットと複合体を形成し、レポーター遺伝子（カルベニシリン耐性遺伝子及びLacZ遺伝子）が発現する。このレポーター遺伝子の発現を指標として、ベイト蛋白質がターゲット蛋白質と相互作用するかどうかを知ることができる。
【００３７】
RNA単離キット（RNeasy Mini Kit、Qiagen GmbH）を用いて、健康な被検者の末梢リンパ球から全RNAを単離した。これを鋳型とし、市販のキット（First-Strand cDNA Synthesis Kit、Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.）を用いて逆転写を行い、次いで、アクチニン-4のR1-R4領域（アミノ酸残基239-741）に特異的なプライマー（表１）を用いてPCRを行った。PCR産物をpBTのEcoRI/XhoIサイトに挿入し、アクチニン-4のR1-R4領域をベイト蛋白質として発現するベクター（pBT/actinin-4 R1-R4）を作製した。また、ヒト胎児腎臓cDNAライブラリー（Stratagene）をpTRGにクローニングした。
【００３８】
ベイト蛋白質及びターゲット蛋白質をコードするcDNAをそれぞれ挿入したpBT及びpTRGで、レポーター株を形質転換し、形質転換体をクロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシンを含む培地上で選抜した。更に、前記抗生物質の他に、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを含む培地でLacZ活性を調べ、再度選抜を行い、カルベニシリン耐性及びLacZ活性を持つコロニーからプラスミドを回収した。pTRG特異的なプライマーを用いて、挿入されているcDNAの配列を決定した。cDNAの配列を解析した結果、アクチニン-4のR1-R4領域と相互作用をしたペプチドは、ヒューマニンであることが判明した。
【００３９】
〔参考例２〕
アクチニン-4のR1-R4領域とヒューマニンとの相互作用が、大腸菌細胞内だけでなく、in vitroでも起きるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
【００４０】
参考例１で作製したpBT/actinin-4 R1-R4のEcoRI/XhoI断片を、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）融合ベクターであるpGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech）にサブクローニングした。この改変pGEX-5X-3で大腸菌BL21(DE3)pLysSを形質転換した。比較のため、改変していない元のpGEX-5X-3でも形質転換を行った。培地にイソプロピル-β-d-ガラクトピラノシドを、最終濃度が0.1mMになるように加え、GST及びGSTとアクチニン-4のR1-R4領域との融合蛋白質の発現を誘導した。次に、市販の蛋白質抽出試薬（BugBuster Protein Extraction Reagent及びBenzonase Nuclease、Novagen）を用いて大腸菌から可溶性蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質から市販のキット（GST Bind purification kits、Novagen）を用いて、誘導された蛋白質を精製した。精製された蛋白質の溶液を、緩衝液A（10mM Tris-HCl pH 7.4、0.15M NaCl）で透析した。透析後の蛋白質溶液に、Nonidet P-40を最終濃度が0.1％になるように加えた。
【００４１】
一方、10mgの合成ヒューマニン（Tana Laboratoriesより購入）を、活性化されたCH-セファロース4B（Amersham Pharmacia Biotech）と結合させた。このヒューマニン−セファロース及びヒューマニンを結合させていないセファロースビーズ（コントロールセファロース）を、0.1％Nonidet P-40を含む緩衝液Aで平衡化した。このヒューマニン−セファロース及びコントロールセファロース25μlを、上記で調製した蛋白質溶液200μlと混合し、4℃で一晩静置し、その後、遠心処理によりセファロースビーズを回収した。0.1％Nonidet P-40を含む緩衝液Aでビーズで洗浄した後、結合していた組換蛋白質を、Laemmliのサンプル緩衝液（Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.）で溶出させ、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分析した。以上の結果を図３に示す。
【００４２】
図３に示すように、GSTとアクチン-4のR1-R4領域との融合蛋白質は、ヒューマニン−セファロースと結合したが（レーン６）、コントロールセファロースとは結合しなかった（レーン４）。また、GST単独では、ヒューマニン−セファロースと結合しなかった（レーン５）。
【００４３】
以上の結果から、アクチニン-4のR1-R4領域は、in vitroでもヒューマニンと相互作用すると考えられる。
【００４４】
〔参考例３〕
アクチニン-4のR1、R2、R3、及びR4のそれぞれのドメインが、ヒューマニン及びPANと相互作用するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。
【００４５】
R1（アミノ酸残基259-379）、R2（アミノ酸残基380-491）、R3（アミノ酸残基492-605）、及びR4（アミノ酸残基606-741）のそれぞれをコードするcDNAを、リンパ球のcDNAから特異的PCRプライマー（表１）を用いて作製した。Hisで標識されたアクチニン-4断片を作製するため、前記cDNAを、pCRT7/NT-TOPO（Invitrogen）にクローニングした。融合蛋白質の発現及び抽出は、参考例２と同様に行った。融合蛋白質の精製は、市販のキット（His Bind purification kits、Novagen）を用いて行った。このようにして得られたHisで標識されたアクチニン-4断片を含む溶液（50μg/ml）を、緩衝液Aで透析した。透析後の蛋白質溶液に、Nonidet P-40を最終濃度が1％になるように加えた。
【００４６】
上記で調製した蛋白質溶液200μlを、ヒューマニン−セファロース及びコントロールセファロース25μlと混合し、4℃で一晩静置し、その後、遠心処理によりセファロースビーズを回収した。1％Nonidet P-40を含む緩衝液Aでビーズで洗浄した後、結合していた組換蛋白質を参考例２と同様に分析した。この結果を図４に示す。
【００４７】
図４に示すように、Hisで標識されたアクチニン-4のR1、R2、R3、及びR4は、ヒューマニン−セファロースと結合したが（レーン３、６、９、１２）、コントロールセファロースとは結合しなかった（レーン２、５、８、１１）。これらの結果から、アクチニン-4のR1、R2、R3、及びR4のすべての領域がヒューマニンと高い親和性を持つと考えられる。
【００４８】
PANの添加が、アクチニン-4のR1、R2、R3、及びR4とヒューマニンとの相互作用に影響を与えるかどうかを調べるため、PAN存在下で上記の親和性アッセイを行った。これらの条件でも相互作用に対する影響は観察されなかった（データは示さない）。
【００４９】
また、ヒューマニン−セファロースの代わりに、PAN−セファロースを用いて、同様の実験を行った。PAN−セファロースはKodama T, Wakui H, Komatsuda A, Imai H, Miura AB, Tashima Y: Purification of a 25-kD porcine renal puromycin aminonucleoside-binding protein. Nephrol Dial Transplant 1997;12:1453-1460.に従って調製し、0.1％Nonidet P-40を含む緩衝液Aで平衡化した。この結果を図５に示す。
【００５０】
図５に示すように、R1はPAN−セファロースと結合したが（レーン３）、コントロールセファロースとは結合しなかった（レーン２）。R2、R3、R4もPAN−セファロースと結合したが、その結合量はR1に比べ明らかに少なかった（レーン６、９、１２）。
【００５１】
〔参考例４〕
ヒューマニンをコードするcDNAを、リンパ球のcDNAから特異的PCRプライマー（表１）を用いて作製した。GFPとヒューマニンとの融合蛋白質を作製するため、前記cDNAを、pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO(Invitrogen)にクローニングした。
【００５２】
ヒト胎児腎臓細胞HEK293（Health Science Research Resources Bank）を、10％ウシ胎児血清を添加したイーグル最小必須培地（Sigma Chemical Co.）で維持した。HEK293細胞をプレート内のカバーガラスに播き、48時間インキュベートした後、市販の遺伝子導入試薬（LipofectAMINE PLUS reagent、Invitrogen）を用いて、前記ヒューマニンcDNA挿入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPOで、形質転換した。次の日、PAN（10 nM to 100 μM）添加又は無添加培地を加え、細胞を1〜4日維持した。その後、細胞を3％パラホルムアルデヒド（5％スクロースを含むPBS溶液）で固定し、PBSで洗浄し、0.1%Tween20を含むPBS（PBS-T）で透過処理を行った。細胞を、ニワトリ砂のう由来のαアクチニンに対するウサギ抗血清（アクチニン-4と交差反応する、PBS-Tで1/200に希釈されている）で1時間室温でインキュベートした。洗浄後、細胞を、標識された抗ウサギIgG抗体（Texas Red anti-rabbit IgG、Molecular Probes、PBS-Tで1/400に希釈）で室温で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、50％グリセロール−PBSでスライドガラスに固定した。細胞の状態を共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM510; Carl Zeiss Jena GmbH）によって観察した。結果を図６に示す。
【００５３】
図６に示すように、GFP融合ヒューマニンは、主に核周辺の細胞質に存在し（図６Ａ）、内在性アクチニンもほぼ同位置に存在した（図６Ｂ）。
【００５４】
培地中にPANが存在する条件下におけるHEK239細胞内でのヒューマニンとアクチニンの位置も調べた。PANへの曝露後、付着細胞の密度は量依存的に減少した。ヒューマニンとアクチニンの共存の変化は、損傷したHEK293細胞においても観察されなかった（データは示さない。）。
【００５５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】PAN投与マウスの尿蛋白量の経時的変化を表す図。
【図２】PAN投与マウスの尿をサンプルとした電気泳動の結果を示す写真。
【図３】アクチニン-4のR1-R4領域とヒューマニンとの親和性アッセイの結果を示す写真。
【図４】アクチニン-4のR1、R2、R3又はR4領域とヒューマニンとの親和性アッセイの結果を示す写真。
【図５】アクチニン-4のR1、R2、R3又はR4領域とPANとの親和性アッセイの結果を示す写真。
【図６】蛍光標識したアクチニンとヒューマニンを含むHEK293細胞の顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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