(57)【要約】【課題】  リポ蛋白の分析を行う際に、いわゆる基準試料又はコントロール試料（以下単に「コントロール試料」ということがある）として用いるためのリポ蛋白を含んだ凍結乾燥試料であって、特に、液体クロマトグラフィーを用いてリポ蛋白分析を行う際に用いるためのリポ蛋白を含んだ凍結乾燥試料を提供する。【解決手段】  リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血清または血漿成分を含まない、リポ蛋白分析用の凍結乾燥試料、又は、リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血清または血漿成分を含まない、液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析用の凍結乾燥試料。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血液成分を含まない、リポ蛋白分析用の凍結乾燥試料。
【請求項２】
リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血液成分を含まない、液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析用の凍結乾燥試料。
【請求項３】
前記リポ蛋白は、高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、中間型リポ蛋白又は超低密度リポ蛋白の１種類以上であることを特徴とする、請求項１又は２の凍結乾燥試料。
【請求項４】
前記リポ蛋白は、カイロミクロンを含まないことを特徴とする、請求項１又は２の凍結乾燥試料。
【請求項５】
そのｐＨが無機塩ではない緩衝剤によってｐＨ６．５からｐＨ８．５に調整されていることを特徴とする、請求項１又は２の凍結乾燥試料。
【請求項６】
更に、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び／又はアルブミンを含むことを特徴とする、請求項１又は２の凍結乾燥試料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、リポ蛋白の分析を行う際に、いわゆる基準試料又はコントロール試料（以下単に「コントロール試料」ということがある）として用いるためのリポ蛋白を含んだ凍結乾燥試料に関するものであり、特に好ましくは、液体クロマトグラフィーを用いてリポ蛋白分析を行う際に用いるためのリポ蛋白を含んだ凍結乾燥試料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）や高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロール値は、臨床的に脂質代謝異常を診断する目的等のために広く利用されている。それらリポ蛋白の分析方法としては、選択的にＬＤＬやＨＤＬ中のコレステロールを分析することの出来るホモジニアス法（いわゆる直接法）が一般的である。
【０００３】
このようなホモジニアス法では、コントロール試料として通常の血清成分を含んだ凍結乾燥試料が使用されている（例えば、第一化学薬品株式会社製、商品名コレステストＮキャリブレータ−（ヒト血清凍結乾燥品）、クオントマトリックス社製、商品名リポフォーリポ蛋白コントロール（ヒト血清凍結乾燥品）、株式会社セロテック製、商品名リピットＬ−３Ｎ（ヒト血清凍結品）等）。従来は、試料中に含まれるリポ蛋白以外の組成成分の差異が分析系（分析結果）に影響を及ぼすと考えられ、このような影響を回避するために、コントロール試料には実際の分析に供される血清試料に類似した組成のもの、即ち上記のような通常の血清成分が含有されるコントロール試料が必要と認識されていたからである。
【０００４】
また、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）やカイロミクロンは凍結溶解によって凝集し易いことが知られている。そこで、このような凝集を防止するためにシュクロースやトレハロース等の非還元糖を添加した凍結乾燥コントロール試料や、凍結乾燥の操作を避けた液体状のコントロール試料や凍結したコントロール試料もまた、知られるようになっている。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−３００７５８号公報
【０００６】
【特許文献２】特開平１１−１２４３９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
液体状の又は凍結したリポ蛋白分析用試料は、保存安定性が凍結乾燥試料と比較して低く、また常に冷暗所への保管が必要になるため、凍結乾燥試料と比較して取扱いが面倒であり、リポ蛋白分析用のコントロール試料としては、凍結乾燥試料が多数を占めている。
【０００８】
しかしながら、リポ蛋白分析用の凍結乾燥コントロール試料においても、その組成成分として蛋白質と脂質を主体とした不安定な複合物質であるリポ蛋白を含むために、通常の蛋白を含む凍結乾燥試料と比較した場合には安定性が極めて悪い、という課題が存在していた。
【０００９】
そこで本願発明の目的は、より安定性の高いリポ蛋白分析用の凍結乾燥試料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、より良い安定性を確保するために、従来、前述した理由により組成成分として必要と認識されていた血液成分、すなわち採取した血液に抗凝固剤を入れ、遠心分離により得られた血漿成分、または、採取した血液を抗凝固剤無添加において凝集させた後、遠心分離により得られた血清成分を除去したリポ蛋白質の基準試料又はコントロールに想到し、本願発明を完成するに至った。即ち本願発明は、リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血液成分（すなわち、血漿成分または血清成分）を含まない、リポ蛋白分析用の凍結乾燥試料である。また本願発明は、リポ蛋白及び５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血液成分（すなわち、血漿成分または血清成分）を含まない、液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析用の凍結乾燥試料である。
【００１１】
また本願発明は、前記リポ蛋白が高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白、中間型リポ蛋白又は超低密度リポ蛋白の１種類以上であることを特徴とする凍結乾燥試料、前記リポ蛋白がカイロミクロンを含まないことを特徴とする凍結乾燥試料、そのｐＨが無機塩ではない緩衝剤によってｐＨ６．５からｐＨ８．５に調整されていることを特徴とする凍結乾燥試料、そして、更にエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び／又はアルブミンを含むことを特徴とする凍結乾燥試料である。
【００１２】
従来のリポ蛋白分析用凍結乾燥コントロール試料には、前述したように、試料中のリポ蛋白以外の組成成分を実際の分析に供される血清または血漿試料と類似した組成とするために、血清または血漿成分が含有されている。しかしながら、本願発明者は、血清または血漿は多種多様な物質を含んでおり、その中にはリポ蛋白にダメージを与える物質も含まれ、そのために従来の凍結乾燥コントロール試料では安定性が悪い可能性があると考え、これを含有しないものを検討する中で、特に液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白の分析においては、リポ蛋白は分離カラムによって血清または血漿成分から分離された状態で分析されるため、コントロール試料に血清または血漿成分を含有させていなくとも特別の不都合はないものと考えるに至った。他方、血清または血漿成分を含まない凍結乾燥コントロール試料を液体クロマトグラフィー以外の一般的なリポ蛋白分析用のコントロール試料とする場合には、血清または血漿成分を含有する溶液にてこれを溶解すれば良いことになる。また、取扱いを容易とするために凍結乾燥することについても検討したところ、リポ蛋白と５重量％以上のシュクロースを含み、かつ、血清または血漿成分を含有しないものの凍結乾燥品は、その後溶解しても性能に変化のないことが確認されたのである。以下、本願発明を詳細に説明する。
【００１３】
本願発明のコントロール試料が含有するリポ蛋白は、従来公知の方法である超遠心分離法等で血清または血漿試料等から精製した、血清または血漿成分を含まない精製リポ蛋白であり、より具体的には血清または血漿成分を含まない高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白（ＩＤＬ）又は超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）の１種類以上である。中でも前記した４種類すべてのリポ蛋白を含むコントロール試料が最も好ましい。全てのリポ蛋白を含むコントロール試料であれば、１回の分析でその分析装置の状態の情報をより多く取得できるからである。また更に、リポ蛋白としては凍結時に最も凝集しやすいカイロミクロンを含まないコントロール試料が本願発明では特に好ましい。
【００１４】
本願発明のコントロール試料においては、そのｐＨをリポ蛋白が安定な６．５から８．５の範囲に調整し、かつ、ｐＨをその範囲に維持できるように適当な緩衝剤を添加することが好ましい。この目的のために好適な緩衝剤としては、リポ蛋白に対してダメージを与えにくい無機塩ではない緩衝剤が好ましく、具体的にはトリス（ヒドロキシル）アミノメタン、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＭＯＰＳＯ）等を例示できる。
【００１５】
本願発明のコントロール試料にはシュクロースが安定化のために含まれるが、同一目的のためにシュクロース以外にもエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ２Ｎａ）やアルブミン（例えば、牛血清から精製された他の血清成分を含まない精製品であるアルブミン、以下ＢＳＡ）が含まれても良い。それぞれの含有量は、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウムでは０．００５から３ｍＭ程度、そしてアルブミンでは０．５から３重量％程度が好ましい。
【００１６】
参考のため、リポ蛋白分析に用いる液体クロマトグラフィーについて記載すると、ゲルろ過クロマトグラフィーによる方法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，  １９９７  ｂｙ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｉｎｃ．  ｐ５３１-５４８）やイオン交換クロマトグラフィーによる方法（特開２００１−３２４４８８号公報または特開２００２−２９６２６１号公報参照）を例示することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本願発明によれば、特に液体クロマトグラフィーによるリポ蛋白分析用に好適な凍結乾燥コントロール試料を提供することができる。このコントロール試料では血液成分を含まないことから、安価な製造することが可能であり、また使用する血液成分が変動することによる製品間格差を生じる恐れが無いという効果が達成される。
【実施例】
【００１８】
以下、本願発明を実施例により説明するが、本願発明は実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
健常人血清より超遠心分離法を用いて、カイロミクロン（比重が１．００６ｇ／ｃｍ２のときに浮上係数４００以上）を除いた後、比重１．００６ｇ／ｃｍ２以上のリポ蛋白分画であるＶＬＤＬを取得した。さらに、ＨＤＬとＬＤＬとＩＤＬを含んだ比重１．００６〜１．２１０ｇ／ｃｍ２のリポ蛋白分画を取得した。得られたＶＬＤＬ分画はコレステロール濃度１１２ｍｇ／ｄｌであり、ＨＤＬ＋ＬＤＬ＋ＩＤＬ分画はコレステロール濃度１１２５ｍｇ／ｄｌであった。凍結乾燥する溶液１００μＬあたりに、ＶＬＤＬ分画５０μＬとＨＤＬ＋ＬＤＬ＋ＩＤＬ分画３３μＬと、および、緩衝液などを加えた。その加えた試薬の最終濃度を表１に示す。ガラスバイアル１本に１００μＬのリポ蛋白を含む溶液を入れ凍結乾燥を行い、純水にて再溶解して分析した。分析条件は、特開２００２−２９６２６１号公報の実施例７と同様とした。
【００２０】
【表１】
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凍結乾燥する前の試料として、糖類を加えず、それ以外のＭＯＰＳＯ  ３．３ｍＭ、ＢＳＡ  ２％、ＥＤＴＡ２Ｎａ  ０．０１ｍＭとリポ蛋白を含んだ状態での試料の分析結果を図１に示す。また、実験番号１から４を図２から５にそれぞれ示す。実験番号３、４については明らかにＶＬＤＬピークの割合が凍結乾燥前に比べ多くなっている。このことから、少なくともマンニトールとソルビトールは好ましくなく、シュクロールが良いことが確認された。
【００２１】
実施例２
それぞれの凍結乾燥品を４０℃で保存し、７日後と１４日後の再溶解して分析した。分析方法は実施例１と同じとした。
【００２２】
【表２】
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分析結果から各リポ蛋白ピークの割合を算出した。実験番号３，４については、徐々にＶＬＤＬピークの割合が増加していることがわかる。この結果からも、凍結乾燥品に加える糖類は、マンニトールとソルビトールは好ましくなく、シュクロールが良いことがわかる。
【００２３】
実施例３
ＶＬＤＬは、ＨＤＬ、ＬＤＬに比べ凍結溶解により凝集しやすいことが知られている。そこで、実施例１と同様にして得られたＶＬＤＬ分画（コレステロール濃度２００ｍｇ／ｄｌ）を３５０μｌに、１００ｍＭ  ＭＯＰＳＯ  ｐＨ６．５を２００μＬ加え、さらに最終濃度が０、２、５、１０、２０％になるようにシュクロース溶液を加えた。なお、最終容量１ｍｌとなるようにした。このことなるシュクロース濃度のＶＬＤＬ溶液について、−２０℃凍結前の試料と、凍結し１６時間後に溶解した試料について、濁度の指標として６００ｎｍの吸光度を分析した。結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
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表１からわかるように、５％以上で凍結前後でほとんど吸光度に差が見られなかった。このことから、凍結乾燥品に入れるシュクロールの量は５％以上が望ましいことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１の凍結前試料の分析結果である。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図２】実施例１の実験番号１の分析結果である。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図３】実施例１の実験番号２の分析結果である。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図４】実施例１の実験番号３の分析結果である。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図５】実施例１の実験番号４の分析結果である。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2005227216.tif 000009
【図５】
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