(57)【要約】【課題】濃縮分離すべきタンパク質又はペプチドに対して優れた選択的保持能力を持つ担体を見出し、それを用いてタンパク質又はペプチドをより選択的に濃縮分離する方法を提供する。【解決手段】π電子含有官能基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを、π電子含有官能基を有する担体を用いて分離する、タンパク質又はペプチドの濃縮分離法。好ましくは、前記アミノ酸残基はトリプトファン残基又はスルフェニル化合物によって修飾されたトリプトファン残基であり、前記担体はフェニル基を有する担体である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを、π電子含有基を有する担体を用いて分離する、タンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項２】
前記π電子含有基を有するアミノ酸残基がトリプトファン残基である、請求項１に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項３】
π電子含有化合物により修飾された、π電子含有修飾基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを、π電子含有基を有する担体を用いて分離する、タンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項４】
前記アミノ酸残基がトリプトファン残基である、請求項３に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項５】
前記π電子含有化合物が、π電子を有するスルフェニル化合物である、請求項３又は４に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項６】
前記スルフェニル化合物が、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドである、請求項３〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項７】
前記π電子含有基を有する担体のπ電子含有基がフェニル基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【請求項８】
π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを断片化し、π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と、π電子含有基を有しないペプチド断片とを含む断片化試料液を得て、
前記断片化試料液を、π電子含有基を有する担体と接触させて、前記π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と前記π電子含有基を有しないペプチド断片とを分離する、ペプチドの濃縮分離法。
【請求項９】
タンパク質又はペプチドをπ電子含有化合物によって修飾し、π電子含有修飾基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチド試料液を得て、
前記π電子含有修飾基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを断片化し、π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と、π電子含有基を有しないペプチド断片とを含む断片化試料液を得て、
前記断片化試料液を、π電子含有基を有する担体と接触させて、前記π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と前記π電子含有基を有しないペプチド断片とを分離する、ペプチドの濃縮分離法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオミクス分野すなわちタンパク質の網羅的解析分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでプロテオミクス分野すなわちタンパク質網羅的解析分野において、二次元電気泳動法と質量分析計とを併用したＰＭＦ（Peptide Mass Fingerprinting；ペプチドマスフィンガープリンティング）法による解析が主流とされてきた。そして、タンパク質の相対定量解析の手法としては、二次元電気泳動を用いたディファレンシャルディスプレイ法が用いられてきた。しかし、タンパク質分離やゲル染色の再現性、タンパク質の溶解性などの点において問題がある。この問題を解決するべく、次世代のタンパク質解析法として、安定同位体を用いたタンパク質の網羅的解析法が考案されている。
【０００３】
一方、スルフェニル化合物は、トリプトファン残基の選択的ラベル化試薬として知られている。その中でも、酸性溶液中でトリプトファン残基を選択的に化学修飾する試薬としてＮＢＳＣｌ（２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド）試薬が、Scoffone E, Fontana A, Rocchi R., Biochem, Biophys. Res. Commu., 1966, 25, 170及びScoffone E, Fontana A, Rocchi R., Biochemistry, 1968, 7, 971によって報告されている。
【０００４】
そして、Hiroki Kuyama, Makoto Watanabe, Chikako Toda, Eiji Ando, Koichi Tanaka, Osamu Nishimura, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 17, 1642-1650によると、正常ラットと高血糖ラットとの二系統の生体試料サンプルをそれぞれ用意し、そのうち一方のサンプル中のタンパク質に含有されるトリプトファンをＮＢＳＣｌ試薬で、他方のサンプル中のタンパク質に含有されるトリプトファンをＮＢＳＣｌ試薬の13Ｃ同位体標識体でそれぞれ化学修飾し、その後、化学修飾されたそれぞれのサンプルを混合してトリプシンで酵素消化し、トリプトファン含有ペプチドを分離し、質量分析計を用いて６Ｄａの質量差を持つペアピークとして検出されたペプチドの相対定量解析及びシークエンス解析を行ったことが報告されている。なお、トリプトファン含有ペプチドの分離は、ＯＤＳカラムもしくはSephadexLH-20を用いた逆相分離により行っている。
【０００５】
また一方、2001/2002 YMC GENERAL CATALOG HPLC COLUMN & GEL（株式会社ワイエムシィ）に記載されている、π電子含有基としてフェニル基を有する担体が知られている。
【０００６】
【非特許文献１】スコフォン・Ｅ（Scoffone E）、フォンタナ・Ａ（Fontana A）及びロッチ・Ｒ（Rocchi R）著、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）」、１９６６年、第２５巻、ｐ．１７０
【非特許文献２】スコフォン・Ｅ（Scoffone E）、フォンタナ・Ａ（Fontana A）及びロッチ・Ｒ（Rocchi R）著、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、１９６８年、第７巻、ｐ．９７１
【非特許文献３】九山浩樹（Hiroki Kuyama）、渡辺真（Makoto Watanabe）、戸田千香子（Chikako Toda）、安藤英治（Eiji Ando）、田中耕一（Koichi Tanaka）及び西村紀（Osamu Nishimura）著、「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、２００３年、第１７巻、ｐ．１６４２−１６５０
【非特許文献４】分析用カラムＰｈ  ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｐｈ、「２００１／２００２  ワイエムシィ  総合カタログ  ＨＰＬＣカラム＆ゲル（2001/2002 YMC GENERAL CATALOG HPLC COLUMN & GEL）」ｐ．５２；株式会社ワイエムシィ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、濃縮分離すべきタンパク質又はペプチドに対して優れた選択的保持能力を持つ担体を見出し、それを用いてタンパク質又はペプチドをより選択的に濃縮分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、π電子性化合物間に働くπ−π電子相互作用に起因する固有の選択性をタンパク質又はペプチドの濃縮分離に利用することによって上記本発明の目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、π電子性基含有アミノ酸残基を有するタンパク質又はペプチドのπ電子と、担体が有するπ電子との相互作用によって、π電子性基含有アミノ酸残基を有するタンパク質又はペプチドを選択的に分離することができるという原理に基づいている。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを、π電子含有基を有する担体を用いて分離する、タンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
（２）前記π電子含有基を有するアミノ酸残基がトリプトファン残基である、前記（１）に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【０００９】
（３）π電子含有化合物により修飾されたアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを、π電子含有基を有する担体を用いて分離する、タンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
（４）前記アミノ酸残基がトリプトファン残基である、前記（３）に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
（５）前記π電子含有化合物が、π電子を有するスルフェニル化合物である、前記（３）又は（４）に記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
（６）前記スルフェニル化合物が、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドである、前記（３）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【００１０】
（７）前記π電子含有基を有する担体のπ電子含有基がフェニル基である、前記（１）〜（６）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドの濃縮分離法。
【００１１】
（８）π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを断片化し、π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と、π電子含有基を有しないペプチド断片とを含む断片化試料液を得て、
前記断片化試料液を、π電子含有基を有する担体と接触させて、前記π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と前記π電子含有基を有しないペプチド断片とを分離する、ペプチドの濃縮分離法。
【００１２】
（９）タンパク質又はペプチドをπ電子含有化合物によって修飾し、π電子含有修飾基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチド試料液を得て、
前記π電子含有修飾基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドを断片化し、π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と、π電子含有基を有しないペプチド断片とを含む断片化試料液を得て、
前記断片化試料液を、π電子含有基を有する担体と接触させて、前記π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むペプチド断片と前記π電子含有基を有しないペプチド断片とを分離する、ペプチドの濃縮分離法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、濃縮分離すべきタンパク質又はペプチドに対して優れた選択的保持能力を持つ担体を用いて、タンパク質又はペプチドをより選択的に濃縮分離する方法を提供することが可能となる。また、本発明の方法を用いると、質量分析計を用いたペプチド又はタンパク質の相対定量及びシーケンス解析を含む、多様な生体試料中のタンパク質の網羅的解析をより効率的かつ正確に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、タンパク質又はペプチドのクロマトグラフィーを用いた濃縮分離において、濃縮分離すべきタンパク質又はペプチド中のアミノ酸残基が有するπ電子性基と固定相の担体が有するπ電子性基との間に働くπ−π電子相互作用を利用する方法である。
【００１５】
本発明においては、π電子含有基を有するアミノ酸残基を含むタンパク質又はペプチドが選択的に濃縮分離される。π電子含有基としては特に限定されないが、芳香族炭化水素基であることが好ましい。また本発明においては、前記π電子含有基を有するアミノ酸残基がトリプトファン残基であることが特に好ましい。トリプトファン残基のタンパク質中の含有量は、アミノ酸残基の中でも最も少ない部類に属するため、本発明の方法によって得られるマススペクトルが単純となり、その解析が容易となる。
【００１６】
また本発明における前記π電子含有基を有するアミノ酸残基は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸残基をあらかじめπ電子含有化合物で修飾したものであってもよい。修飾のためのπ電子含有化合物としては、スルフェニル化合物であることが好ましい。スルフェニル化合物は、上述した好ましいアミノ酸残基であるトリプトファン残基を選択的に修飾することができる。スルフェニル化合物としては、一般式R-S-X（Rは有機基、Xは脱離基を表す。）で表されるものであれば特に限定されないが、有機基Rが芳香族炭化水素基であることが好ましい。例えば、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド、４−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド、２，４−ベンゼンスルフェニルクロリド、２−ニトロ−４−カルボキシベンゼンスルフェニルクロリドなどが挙げられる。本発明においては、下記構造式に示す２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いることが特に好ましい。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
一方、上述のようなπ電子性基含有アミノ酸残基を含むンパク質又はペプチドを分離するための担体は、π電子含有基を有する。担体が有するπ電子含有基としては特に限定されないが、芳香族炭化水素基であることが好ましく、例えばフェニル基などのものが用いられる。このような担体を用いることは、疎水的相互作用に加えてπ−π電子相互作用を利用することができる点で好ましい。本発明においては、上記担体に、π電子性基を有するタンパク質又はペプチドを接触させて用いる。具体的には、フェニル基を有する担体を固定相として充填したYMC-PackPh（ワイエムシィ社製）カラムなどを用いることができる。
【００１９】
本発明は、例えば質量分析計を用いたペプチド又はタンパク質の相対定量及びシーケンス解析を含む、多様な生体試料中のタンパク質の網羅的解析に用いることができる。例えば、上記スルフェニル化合物の安定同位体標識体及び非標識体の２種類のラベル化試薬を調製する。別途、２系統（例えば、正常細胞及びガン細胞）の生体試料を用意し、上記２種のスルフェニル化合物のうち安定同位体標識体を用いていずれか一方の系統の試料を、非標識体を用いていずれか他方の系統の試料をそれぞれトリプトファンラベル化処理する。ラベル化処理されたそれぞれの試料を混合し、断片化を行い、ラベル化ペプチド断片と非ラベル化ペプチド断片との混合物を得る。
【００２０】
その後、得られたペプチド断片混合物からラベル化ペプチド断片を分離する。本発明は、この分離の際に有用に用いることができる。すなわち、例えばフェニル基を有する担体を用い、前記ペプチド断片の混合物中のラベル化ペプチド断片を選択的に吸着させ、その他の非ラベル化ペプチド断片を洗浄する。その後、吸着したラベル化ペプチド断片を溶出させることによって選択的に分離を行うことができる。分離されたラベル化ペプチドには、安定同位体標識体によるラベル化体及び非標識体によるラベル化体の２種類のラベル化体が含まれている。従って、それらは質量分析計によって、２種類のラベル化試薬の質量数の差に相当する６Ｄａの幅と２種類のラベル化体の相対量比に相当する面積比とを有するペアピークとして検出することができる。検出されたペアピークからは、相対定量解析及びシークエンス解析を行うことができる。
【００２１】
従来のセファデックス逆相分離による方法は、実際の生体試料に対し分解能及び再現性においてばらつきが生じる場合もあったが、本発明の方法によってこれらの点が改善された。従って本発明の方法は、従来の方法に比べ実用性に優れ、より効率的かつ正確なタンパク質解析を行うことが可能となる。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。また、特に断りのない限り、％で表される量は重量基準である。
【００２３】
サンプルとしてはCrj: Wistarラット及びGK/Crj (Goto-Kakizaki)ラット（ともに日本チャールズリバージャパン社製）の２種類の血清を用いた。
【００２４】
（ａ）サンプルの処理
Crj: Wistarラット血清50μlを、アルブミン・グロブリン除去キット（Aurum Serum Protein Mini Kit、バイオラッド社製）を用いて前処理を行った。その後、ＢＣＡ法に基づきタンパク質定量を行い、総タンパク量が100μgとなるようにサンプル液を調製した。サンプル液15μlを、0.1% SDS、5mM EDTAの水溶液に溶解し、沸騰水中で５分間煮沸し、その後、氷中で冷却する処理を行った。
別途、ＮＢＳＣｌ試薬（２−ニトロ［12Ｃ6］ベンゼンフルフェニルクロリド；以下（12Ｃ）ＮＢＳＣｌと表記する。）を用意した。0.17mgの（12Ｃ）ＮＢＳＣｌ試薬を溶解した酢酸溶液35μlを、上記処理を行ったサンプル液に加え、暗所において室温で終夜静置した。このようにして、Crj: Wistarラット血清の（12Ｃ）ラベル化体を得た。
【００２５】
GK/Crj (Goto-Kakizaki)ラット血清50μlを、アルブミン・グロブリン除去キット（Aurum Serum Protein Mini Kit、バイオラッド社製）を用いて前処理を行った。その後、ＢＣＡ法に基づきタンパク質定量を行い、総タンパク量が100μgとなるようにサンプル液を調製した。サンプル液15μlを、0.1% SDS、5mM EDTAの水溶液に溶解し、沸騰水中で５分間煮沸し、その後、氷中で冷却する処理を行った。
別途、上記（12Ｃ）ＮＢＳＣｌの13Ｃ安定同位体標識体（２−ニトロ［13Ｃ6］ベンゼンフルフェニルクロリド；以下（13Ｃ）ＮＢＳＣｌと表記する。）を用意した。0.17mgの（13Ｃ）ＮＢＳＣｌ試薬を溶解した酢酸溶液35μlを、上記処理を行ったサンプル液に加え、暗所において室温で終夜静置した。このようにして、GK/Crj (Goto-Kakizaki)ラット血清の（13Ｃ）ラベル化体を得た。
【００２６】
上述のようにして得られたそれぞれのラベル化体を混合し、混合サンプルとした。これをSephadexLH-20（ファルマシア社製）を用いて脱塩し、遠心エバポレーターによって乾固させた。
【００２７】
50mM Tris-HCl(pH 8.6), 0.01% SDS水溶液44μlを乾固させた混合サンプルに加えて混合サンプルを溶解し、さらに4μlの4mM TCEP（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）水溶液を加え、３７℃で３０分間放置し、その後、500mMヨードアセトアミド水溶液1μlを加えて暗所において室温で４５分間静置した。
【００２８】
2μgのトリプシンを溶解した50mM Tris-HCl(pH 7.8)の5mM CaCl2水溶液450μlを混合サンプルに加え、３７℃で１６時間静置し、酵素消化を行った。
【００２９】
上記の処理を行った混合サンプルについて脱塩チップ（ZipTipC18；ミリポア社製）を用いて脱塩し、MALDI-TOF MSで測定した。このとき得られたスペクトルチャートを図１（ラベル化トリプトファン残基を有するペプチド断片の濃縮前(Before enrichment of peptide fragments containing labeled Tryptophan residue)）に示す。図１中、横軸は質量／電荷（Mass/Charge）、縦軸はフラグメントイオンの強度を表す。
【００３０】
（ｂ）ラベル化トリプトファン含有ペプチドの濃縮
まず、50mM KH2PO4/ CH3CN /MeOH=68/6/26水溶液でYMC-Pack Ph充填剤（ワイエムシィ社製）を終夜膨潤し、膨潤したYMC-Pack Phスラリーゲルを、ゲルの体積が1mlとなるように充填した。
【００３１】
次に、前述の（ａ）の手順で得られた混合サンプルについて遠心エバポレーターを用いて乾固させた後、洗浄バッファ（Wash Buffer；50mM KH2PO4/CH3CN/MeOH=68/6/26水溶液）100μlに再溶解した。得られたサンプル溶液を、前述の（ｂ）の手順で得られたカラム（フェニルカラム(Phenyl column)）にアプライした。移動相としては、Wash Bufferを適用し、シリンジを用いて流速が６滴／分（１滴＝約25μl）となるようにした。この際、１フラクションの体積は500μlになるようにした。この条件で最終的に１２フラクションを分画した。このようにして、移動相にWash Bufferを用いて分画することにより１２のフラクション（Wash fraction (1)-(12)）を得た。
【００３２】
さらに、移動相を溶出バッファ（Elute Buffer；50mM KH2PO4/ CH3CN /MeOH=4/18/78水溶液）に変えてカラムに通し、ラベル化トリプトファン含有ペプチドを溶出した。このとき流速は６滴／分（１滴＝約25μl）となるようにし、１フラクションの体積は500μlになるようにした。このようにして、移動相にElute Bufferを用いて分画することによりラベル化トリプトファン含有ペプチドの５つの溶出フラクション（Elute Fraction(1)-(5)）を得た。
【００３３】
Wash Buffer、Elute Bufferの順で分画した各フラクションのサンプル溶液について遠心エバポレーターを用いて乾固させた後、それぞれを0.1%TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液100μlに再溶解し、脱塩チップ（ZipTipμC18、ミリポア社製）を用いて脱塩した。
【００３４】
このようにして得られた各フラクションのサンプルを、MALDI-TOF MSによって測定した。このとき得られたスペクトルチャートを、図２〜４に示す（フェニルカラムによるラベル化トリプトファン残基含有ペプチド断片の濃縮(Enrichment of peptides fragments containing labeled Tryptophan residue with Phenyl column)）。これらの図においてはいずれも、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）、縦軸にフラグメントイオンの強度を表す。
【００３５】
図２は、前記Wash Bufferによる１２の洗浄フラクションのうち１番目のフラクション(Fr.1)〜６番目のフラクション(Fr.6)（Wash Fraction (1)-(6)）のスペクトルチャートである。図３は、前記Wash Bufferによる１２の洗浄フラクションのうち７番目のフラクション(Fr.7)〜１２番目のフラクション(Fr.12)（Wash Fraction (7)-(12)）のスペクトルチャートである。
【００３６】
図４−ａは、前記Elute Bufferによる１番目のフラクション(Fr.1)〜５番目のフラクション(Fr.5)の５つの溶出フラクション（Elute Fraction(1)-(5)）のスペクトルチャートである。図４−ａにおける矢印は、ＮＢＳＣｌラベル化トリプトファン含有ペプチド断片のペアピークを指す。そのペアピークの一対を図４−ｂに拡大して示す。図４−ｂが示すように、このペアピークは、（12Ｃ）ＮＢＳＣｌラベル化トリプトファン含有ペプチド断片と（13Ｃ）ＮＢＳＣｌラベル化トリプトファン含有ペプチド断片との質量差に相当する６Ｄａの質量差、及び混合比に相当する１：２のピーク面積比を有する。このようなペアピークは、溶出フラクション（１）〜（５）においてのみ検出された。
【００３７】
これらの図が示すように、本発明の方法を用いることによって、目的のラベル化トリプトファン含有ペプチド断片を溶出フラクションに選択的に溶出することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本実施例で得られた、ラベル化トリプトファン残基を有するペプチド断片の濃縮前のMALDI-TOF MSスペクトルチャートである。
【図２】本実施例で得られた、洗浄バッファによる１２の洗浄フラクションのうち、１番目のフラクション〜６番目のフラクションのMALDI-TOF MSスペクトルチャートである。
【図３】本実施例で得られた、洗浄バッファによる１２の洗浄フラクションのうち、７番目のフラクション〜１２番目のフラクションのMALDI-TOF MSスペクトルチャートである。
【図４】本実施例で得られた、溶出バッファによる１番目のフラクション〜５番目のフラクションの５つの溶出フラクションのMALDI-TOF MSスペクトルチャート（ａ）、及び、（ａ）中の矢印が示すペアピークの１つの拡大図（ｂ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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