(57)【要約】【課題】微少量の試料を高効率に分画できるフラクションコレクタを提供する。【解決手段】キャピラリ２の出口付近は金属製キャピラリ２２となっていて、２〜５ｋＶの高電圧を供給する電源１０とスイッチ１２を介して接続され、スイッチ１２をオンにすることにより導電する。また、電源１０の金属キャピラリ２２と反対側のコネクタには対極１４が接続されており、対極１４は金属キャピラリ２２の下方に配置されている。金属キャピラリ２２に分取しようとする試料成分がきたとき、金属キャピラリ２２と対極１４の間に高電界を印加することにより、試料成分はエレクトロスプレー現象により液滴イオンとなって対極１４方向に飛び出し、サンプルプレート６上に採取される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフから送られる溶出液のみを他の溶液と混合することなくキャピラリから滴下させて分画し分取するフラクションコレクタにおいて、
前記キャピラリ先端に先端方向に気体を噴出する噴出口をもち、その噴出口から噴出する気体によって、液体クロマトグラフからの溶出液をキャピラリ先端から離脱させるプローブを備えたことを特徴とするフラクションコレクタ。
【請求項２】
高速液体クロマトグラフからの溶出液の流路の出口先端部に設置された導電性キャピラリと、
前記導電性キャピラリの下方に配置された対極と、
前記導電性キャピラリと前記対極との間にエレクトロスプレー現象により前記導電性キャピラリからイオンを含んだ液滴を放出させる電圧を印加する電源と、を備え、
前記導電性キャピラリと前記対極との間に配置されたプレート上に分取を行なうフラクションコレクタ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフから送られる溶出液のみを他の溶液と混合することなくキャピラリから滴下させて分画し分取するフラクションコレクタに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、タンパク質の構造解析のためには、液体クロマトグラフで分離したタンパク質を分画し、各成分を酸素消化反応によりペプチドに分解後、再度別の液体クロマトグラフで分離して、質量分析装置による翻訳後修飾解析や、ペプチドシークエンサーによる配列解析がおこなわれる。また、タンパク質の生理活性解析のためには、液体クロマトグラフで分離したタンパク質を分画し、各成分の活性測定、タンパク質・低分子相互作用実験、タンパク質・タンパク質相互作用実験が行なわれる。
【０００３】
試料が生体高分子（タンパク質，核酸，糖など）である場合、これらの生体高分子の構造解析、生理活性解析を行なうには、試料量が微量であることが多いことから、流量域が数μＬ／分以下であるミクロ流量高速液体クロマトグラフ、好ましくは、数ｎＬ／分の流量域であるナノ流量高速液体クロマトグラフを用いるのが好ましい。
【０００４】
通常の高速液体クロマトグラフにおける流量域の分画の場合、流量が大きいため、通常、電磁弁などを用いたフラクションコレクタが用いられる。しかし、微少流量域のミクロ流量高速液体クロマトグラフやナノ流量高速液体クロマトグラフの場合には電磁弁は使えない。そこで、溶出液を分画して捕集する際は、その最終的な出口となるプローブをサンプルプレートの目的スポットの上部に配置し、サンプルプレートをプローブに接近させて溶出液がサンプルプレートに接触するまで待機し、サンプルプレートの目的スポットに溶出液が付着するのを待つか、又は溶出液が滴下するのを待つといった手法をとっていた（非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】
“Ｉｎｔｅｒｆａｃｉｎｇ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｏｒ  Ｎａｎｏ  ＬＣ  Ｗｉｔｈ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成１４年１１月１５日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｃｐａｃｋｉｎｇｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｐｒｏｂｏｔ０１．ｈｔｍｌ＞
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような手法で分取を行なった場合、マイクロプレートなど受け側の部材が液体のしみ込まない素材であったりすると、移動相（溶出液）の表面張力によっては、試料成分が溶出出口の針などに残り、受け側の部材に移動しない場合がある。例えば、タンパク質など水系の移動相を多用する試料の場合、表面張力で液滴が移りにくく、ｎＬオーダーの微量体積での分取は特に困難である。
【０００６】
そこで本発明は、液体クロマトグラフからの微量な溶出液の液滴を、その成分によらず、マイクロプレートなどのサンプルプレートに分取ができるフラクションコレクタを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の一局面は、液体クロマトグラフから送られる溶出液のみを他の溶液と混合することなくキャピラリから滴下させて分画し分取するフラクションコレクタであって、前記キャピラリ先端に先端方向に気体を噴出する噴出口をもち、その噴出口から噴出する気体によって、液体クロマトグラフからの溶出液をキャピラリ先端から離脱させるプローブを備えたことを特徴とするものである。
気体の噴出によって溶出液の液滴を強制的に滴下させるので、溶出液成分の表面張力やサンプルプレートなどの受け側の素材による影響を受けることなく分取を行なうことができる。
さらに、このフラクションコレクタは、その先端から液体クロマトグラフからの溶出液のみを滴下することで、液体クロマトグラフによって分離した試料成分をさらに消化液などを添加して分解し、再度液体クロマトグラフなどによって分離するための、前処理装置とすることができる。
【０００８】
本発明の他の局面は、高速液体クロマトグラフからの溶出液の流路の出口先端部に設置された導電性キャピラリと、前記導電性キャピラリの下方に配置された対極と、前記導電性キャピラリと前記対極との間にエレクトロスプレー現象により前記導電性キャピラリからイオンを含んだ液滴を放出させる電圧を印加する電源と、を備え、前記導電性キャピラリと前記対極との間に配置されたプレート上に分取を行なうものである。
【０００９】
エレクトロスプレー法によって溶出液をマイクロプレートウェルや試験管などに移動させれば、ｎＬ領域の微量の液体であっても高効率に移動させることが可能である。
また、エレクトロスプレーは穏やかなイオン化法であるので、生体高分子の変性が起こりにくい。
【００１０】
エレクトロスプレー法では、図３に示されるように、導電性キャピラリの出口先端部に高い電圧をかけ対向する電極１４に対して高電場を生じさせると、キャピラリ２２の先端に溜まる溶液内の成分がイオン化し、イオンを含む液滴が対向の電極１４に引き寄せられ電極１４側に飛び出す。
【００１１】
【実施例】
（実施例１）
本発明の実施例を図面を参照して説明する。
図１は一局面の一実施例をミクロ流量高速液体クロマトグラフとともに示す概略図である。
高速液体クロマトグラフのカラム４４から検出器４２を介して溶出液を送液するために内径０．１ｍｍのキャピラリ２が接続されており、キャピラリ２の先端部にはプローブ４が取り付けられている。プローブ４には開閉バルブ９を介して空気を供給する管１８が三方ジョイント１６によって接続されている。プローブ４の出口ではキャピラリ２の先端の周囲に空気出口が配置され、空気出口からの空気がキャピラリ２先端方向に噴出される。サンプルプレート６はプローブ４の出口の下方に設置され、水平面内（Ｘ−Ｙ方向）で移動させられる。
【００１２】
また、キャピラリ２はプローブ４の手前で分岐し、ミクロ体積電磁弁５によってプローブ２に流体を送るか、又は、排出するかを選択して操作できるようになっている。
【００１３】
ミクロ体積電磁弁５及び開閉バルブ９の流路切替え、流路開閉動作は制御器２０によって制御される。制御器２０は検出器４２から送信される信号を読み取り、ミクロ体積電磁弁５と開閉バルブ９とを独立して動作させることができる。
【００１４】
検出器４２からミクロ体積電磁弁５、検出器４２からプローブ４の出口先端までの距離は既知であり、高速液体クロマトグラフから送液される溶出液の流速が１〜５μＬ／分で一定であるので、検出器４２によって検出された試料成分が所定の位置につくまでにかかる時間を計算することが可能である。したがって、制御器２０は検出器４２によって試料が検出されると、その検出器４２からの信号に基づいてミクロ体積電磁弁５の位置及びプローブ４の出口先端まで試料成分が到達する時間を算出する。
【００１５】
算出した結果に基づいて、制御器２０はミクロ体積電磁弁５を制御して検出された試料成分を含む液だけをプローブ４側に流す。さらに、試料成分を含む液がプローブ４の出口先端に到達し溜まると、制御器２０が開閉バルブ９を開いてプローブ４内に空気を送り込み、サンプルプレートに滴下させる。
【００１６】
以下に動作を説明する。
試料はインジェクター４６から注入されカラム４４に送られる。カラム４４で分離した試料はポンプ４８によって送られてくる溶離液に溶解し溶出液となって検出器４２で検出されキャピラリ２で送液されるが、試料成分を含まない溶離液も流れているため、制御器２０によって制御されているミクロ体積電磁弁５を切り替えることで、分取しようとする試料成分を含んだ溶出液のみがプローブ４に送られる。プローブ４に送られた溶出液は、表面張力によってプローブ４の出口先端に液滴として溜まり、目的の試料成分が先端に溜まった時にバルブ９が開き、流入する空気の圧力によって先端から液が離脱し、滴下される。
【００１７】
（実施例２）
次に、他の局面の一実施例を以下に示す。
溶媒中で電荷を持つような高極性化合物は、エレクトロスプレー現象により生じた試料由来イオンとして静電的に空間移動させることが可能である。カラム分離後の溶出液の出口に導電性キャピラリを用い、これに２〜５ｋＶの電圧を印加し、エレクトロスプレーさせる。これにより、生体高分子などの目的化合物をスプレーし、対になる電極の手前に置いた受け部（マイクロプレートなど）に分取する。
【００１８】
図２は同実施例のフラクションコレクタをナノ流量高速液体クロマトグラフとともに示す概略図である。液体クロマトグラフの構成は図１のものと基本的に同じであるが、それよりも流量が小さくなっているためにカラム４４ａの内径は図１のカラム４４よりも小さいものが使用されている。
内径７５μｍのキャピラリ２ａの出口付近は金属製キャピラリ２２となっていて、２〜５ｋＶの高電圧を供給する電源１０とスイッチ１２を介して接続され、スイッチ１２をオンにすることにより高電圧が印加される。また、電源１０の金属キャピラリ２２と反対側のコネクタには対極１４が接続されており、対極１４は金属キャピラリ２２の下方に配置されている。サンプルプレート６は金属キャピラリ２２と対極１４の間に設置され、水平面内（Ｘ−Ｙ方向）に移動させられる。
【００１９】
また、キャピラリ２ａは金属キャピラリ２２の手前で分岐し、ミクロ体積電磁弁５によって、金属キャピラリ２２側に試料溶液を送るか、又は排出するかを選択できるようになっている。
ミクロ体積電磁弁５及びスイッチ１２は制御器２０に接続され動作を制御される。制御器２０は検出器４２から送信される信号を読み取り、ミクロ体積電磁弁５とスイッチ１２とを独立して動作させることができる。
【００２０】
検出器４２からミクロ体積電磁弁５、検出器４２からキャピラリ２ａの出口先端までの距離は既知であり、高速液体クロマトグラフから送液される溶出液の流速が５０〜１００ｎＬ／分で一定であるので、検出器によって検出された試料成分が所定の位置につくまでにかかる時間を計算することが可能である。したがって、制御器２０は検出器４２によって試料が検出されると、その検出器４２からの信号に基づいてミクロ体積電磁弁５の位置及びキャピラリ２ａの出口先端まで試料成分が到達する時間を算出する。
【００２１】
算出した結果に基づいて制御器２０はミクロ体積電磁弁５を制御し、検出された試料成分を含む液だけを滴下出口方向に流す。そして、試料成分を含む液がキャピラリ２ａの出口先端に到達すると、滴下するタイミングでスイッチ１２を閉じて金属キャピラリ２２とその下方に位置する対極１４との間に高電場を生じさせ、溶出液をエレクトロスプレー現象によってサンプルプレート６に移動させる。
【００２２】
以下に動作を説明する。
金属キャピラリ２２の先端と対極１４との間に試料を捕集するサンプルプレート６を設置する。
試料はインジェクター４６から注入されカラム４４ａに送られる。カラム４４ａで分離した試料はポンプ４８によって送られてくる溶離液に溶解し溶出液となって検出器４２で検出されキャピラリ２ａ内を送液されるが、試料成分を含まない溶離液も流れているため、制御器２０がミクロ体積電磁弁５を制御することで、分取しようとする試料成分を含んだ溶出液のみが滴下出口方向に送られる。
【００２３】
滴下出口方向に送られた溶出液は、表面張力によってキャピラリ２ａの出口先端に液滴として溜まる。目的の試料成分が先端に溜まると制御器２０がスイッチ１２を閉じて、金属キャピラリ２２と対極１４との間に高電場を生じさせる。試料成分を含む溶液はエレクトロスプレー現象によって電極１４に向かって飛び出す。このとき、金属キャピラリ２２の先端と対極１４の間にはサンプルプレートが設けられているため、飛び出した試料成分はサンプルプレート６上に捕集されることになる。目的となる試料成分がサンプルプレート６上に移動すると、スイッチ１２を開いて電源１０との接続を遮断する。１つの分画の捕集が終わるとサンプルプレート６を水平面内で移動させてサンプルプレート６上の新しい位置で次の分取に備える。この動作を繰り返し行ない、試料成分を分画捕集していく。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の一局面により、気体の噴出によって強制的に試料成分を含む液を滴下することによって、キャピラリの出口先端部分に試料が残りにくいので、相互汚染を防止することができる。
また、気体の噴出量を調節すれば、溶出分画の乾燥を防ぐ効果が期待でき、タンパク質など乾燥で変性の恐れのある試料であっても失活させずに分画を行なうことができる。
【００２５】
本発明の他の局面により、エレクトロスプレーによって試料を移動させれば、穏やかなイオン化法であることから生体高分子の変性が起こりにくく、高効率に微少量の試料液を分取することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】一局面の実施例を液体クロマトグラフとともに示す概略構成図である。
【図２】他の局面の実施例を液体クロマトグラフとともに示す概略構成図である。
【図３】エレクトロスプレーイオン化の説明図である。
【符号の説明】
２，２ａ    キャピラリ
４      プローブ
５      ミクロ体積電磁弁
６      サンプルプレート
９      開閉バルブ
１０      電源
１２      スイッチ
１４      電極
１６      ３方ジョイント
１８      空気供給管
２０      制御器
２２      金属キャピラリ
４２      検出器
４４      カラム
４６      インジェクター
４８      ポンプ
【図１】
2005017226.tif 000003
【図２】
2005017226.tif 000004
【図３】
2005017226.tif 000005