(57)【要約】【課題】製造された薬物代謝体を効率よく回収でき、これにより当該薬物代謝体を効率的に取得するための方法等が求められていた。【解決手段】薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法であって、液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出により回収する工程を有することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法であって、
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出により回収する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出において使用される溶媒が、酢酸エチル又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソプロパノール混合溶媒であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体培地が唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物が哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
液体培地が唯一の炭素源としてグルコースを含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体反応、化学反応等を問わず製造された化合物を取得するための方法において、当該化合物を効率よく回収することは重要である。しかしながら、製造された化合物がどのような方法により製造されたか、また製造された化合物がどのような系内に存在しているか等の種々の要因に応じて適宜適正な方法を選択しなければならない（例えば、非特許文献１、第３３頁〜第５５頁、「３  溶媒抽出」等参照。）。
また、反応液中からの化合物を回収するには、例えば、液相間の分配を利用する液−液抽出方法、吸着性を利用する液−固抽出方法等の各種の抽出方法が知られているが、特に後者の液−液抽出方法の場合には、通常元の反応液に対して数倍量の溶媒を抽出に使用するため、例えば、大量の液体培地中に存在している化合物を抽出する際には、単に当該化合物の抽出効率（即ち、抽出収率）の良さだけではなく、その溶媒の性質（抽出後の溶媒の処理容易性や危険性等）も考慮して選択しなければならない（例えば、非特許文献１、第４０頁、「３．４．２  溶媒の蒸気圧、密度、反応性」及び第４８頁、「３．６．５  可燃性と毒性」等参照。）。
【０００３】
【非特許文献１】
基礎生化学実験法２  抽出・分離・精製、阿南功一、紺野邦夫、田村善蔵、松橋通生、松本重一郎編、丸善株式会社発行、第３３頁〜第５５頁、「３  溶媒抽出」、第４０頁、「３．４．２  溶媒の蒸気圧、密度、反応性」及び第４８頁、「３．６．５  可燃性と毒性」。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法においても、上記のように、製造された薬物代謝体がどのような方法により製造されたか、また製造された薬物代謝体がどのような系内に存在しているか等の種々の要因に応じて製造された薬物代謝体をどのようにして回収するか等を適正に選択しなければならず、製造された薬物代謝体を効率的に取得するには、その都度、熟練者、経験者等の特定な能力を有する専門家による高度な判断が必要であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、前記のような専門家による高度な判断が必要なく標準的な薬物代謝体の取得方法として、薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法において、下記の２つの工程（後述の本培養工程、及び、後述の本回収工程）を有することにより、当該薬物代謝体を効率よく回収できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．薬物代謝能力を有する微生物により薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を取得するための方法であって、
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程（以下、本培養工程と記すこともある。）、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出により回収する工程（以下、本回収工程と記すこともある。）を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出において使用される溶媒が、酢酸エチル又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソプロパノール混合溶媒であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．液体培地が唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物が哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．液体培地が唯一の炭素源としてグルコースを含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、大量の液体培地中に存在している薬物代謝体を抽出する際に特に適する方法であって、当該薬物代謝体の抽出効率（即ち、抽出収率）が良く、さらに前記抽出に用いられる溶媒の性質（抽出後の溶媒の処理容易性や危険性等）もハンドリングし易い優れた方法である。
【０００８】
本発明方法は、本培養工程と本回収工程とを有する。
まず本培養工程について以下に説明する。
本培養工程では、液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養すればよい。
【０００９】
ここで、「薬物代謝能力を有する微生物」（以下、本微生物と記すこともある。）とは、例えば、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物等を意味し、具体的には、例えば、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母等をあげることができる。尚、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母において、２種以上のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を組み合せて使用するには、たとえば、ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種への存在量に相当する割合で、本発明システムで用いられるヒト由来のチトｐクロムＰ４５０分子種をおのおの単独または混合した状態で組み合せて使用すればよい。なお、この組み合せ割合を適宜変えることにより、ヒトにおける人種差、個人差に対応することもできる。ここで、「おのおの単独または混合した状態」とは、上記の２種以上の分子種をおのおの別々の反応系で並列的に存在させる状態または上記の２種以上の分子種を混合し、１つの反応系で同時に存在させる状態を意味する。
【００１０】
人為的に作製される、本微生物は、突然変異処理により作製される微生物であってもよいし、遺伝子工学的な手法を用いて作製させる微生物（以下、本形質転換体と記すこともある。）であってもよい。尚、本形質転換体を作製する際に用いられる薬物代謝酵素（以下、本酵素と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【００１１】
本遺伝子は、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
例えば、薬物代謝能力を有する（例えば、哺乳動物由来の）細胞等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１２】
本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（以下、本補酵素再生酵素遺伝子と記すこともある。）は、例えば、本補酵素再生酵素遺伝子が本酵素とは異なる酵素である場合には、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する（例えば、哺乳動物由来の）細胞又は微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本補酵素再生酵素遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本補酵素再生酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。具体的には、たとえば、特開昭６２−１９０８５号公報に記載される方法等により単離することができる。
【００１３】
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、（１）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子が宿主微生物中で発現できるような単一な組換プラスミドを作製し、これを宿主微生物に導入することにより作製する方法、（２）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子のうちの一方の遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子のうちの一方の遺伝子が宿主微生物中で発現できるような組換プラスミドを上記遺伝子毎に別々に作製し、これらを宿主微生物に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主微生物の染色体中に導入する方法も利用することができる。
尚、上記単一な組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより作製する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミドを構築する方法等をあげることができる。
ここで上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主微生物中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物からの単離・精製が容易であり、宿主微生物中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより宿主微生物を形質転換させた際に、本還元遺伝子等が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素及び／又は本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，  ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ｐ２０２，  講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主微生物としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌、酵母等を好ましく挙げることができる。
本酵素及び／又は本補酵素再生酵素が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドを宿主微生物に導入する方法としては、用いられる宿主微生物に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ／Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法、プロトプラスミド法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等をあげることができる。
宿主微生物において本遺伝子及び／又は本補酵素再生酵素遺伝子が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主微生物（即ち、形質転換体）が本遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００１４】
このような形質転換体がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、用いられるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としては、例えば、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０２Ｄ６、Ｐ４５０２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４等をあげることができる。ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種の存在量は人種差、個人差があるが、しかしながらいずれのヒトの場合においても、上記の１０種類のチトクロムＰ４５０分子種を用いることにより、ほとんどすべての場合を網羅することがてきる。さらに上記の１１種類のチトクロムＰ４５０分子種のうち、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が重要であり、その中でもＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が特に重要である。
【００１５】
上記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列は、例えば、特開平０８−５６６９５号公報等に開示されている。なお、これらのヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡは、たとえば、（１）（ａ）該遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製後、該ｃＤＮＡをファージベクター及びプラスミドベクターに挿入して得たｃＤＮＡライブラリー、または（ｂ）  市販のヒト肝由来のｃＤＮＡライブラリー、から目的とする遺伝子を、（ｉ）  その遺伝子と相同性を有するＤＮＡ断片や、（ｉｉ）その遺伝子により産生されるタンパク質を認識する抗体、を用いるような通常の方法に従いクローニングする方法、あるいは（２）  上記（１）  記載のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ  法を用いてクローニングする方法、等の通常の方法により調製することができる。
【００１６】
前記形質転換体において利用される酵母内で発現させるためのプロモーターとしては、通常の酵母発現系において用いられるプロモーターであれば特に制限されるものではないが、たとえば酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以下、ＡＤＨプロモーターと記す。）、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨプロモーターと記す。）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫプロモーターと記す。）等をあげることができる。なお、ＡＤＨプロモーターは、たとえば酵母ＡＤＨ１プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）から通常の遺伝子操作方法により調製することができる。
【００１７】
上記の酵母内で発現させるためのプロモーターおよび前記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを特開平２−２１１８８０等に記載されるＡＤＨプロモーターとＡＤＨターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  部位に挿入することにより構築する方法等をあげることができる。また必要に応じてｐＡＡＨ５ＮベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位を別な制限酵素用の部位に交換したベクターを利用して構築する方法もあげられる。
【００１８】
上記の酵母内発現プラスミドが酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む場合も通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、特開平２−２１１８０  等に記載されるＡＤＨプロモーターとターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片を特開平２−２１１８８０等に記載される酵母還元酵素遺伝子を保有するプラスミドｐＡＲＲＮのＮｏｔＩ部位に挿入し、得られたプラスミドｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを挿入することにより構築する方法等をあげることができる。こうして得られた酵母内発現プラスミドが導入された酵母においては大量に発現した酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素によりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種への電子伝達効率が上昇し、より高い代謝活性が検出される。このために大量の代謝産物が短時間で得られ、精密な分析が可能になる。また、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のキメラ人工融合酵素を用いても同様の効果が得られる。
【００１９】
酵母内でヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる酵母菌体は、構築された酵母内発現プラスミドを、たとえば、プロトプラスト法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等の通常の方法によって酵母に導入することで得ることができる。
前記形質転換体において利用される酵母菌株としては、たとえばサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等をあげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられる。
【００２０】
つぎに、このようにして作製された、薬物代謝能力を有する微生物が液体培地中で、前記微生物（即ち、本微生物）と当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するには、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないようにすることが重要である。
【００２１】
ここで、「薬物代謝体」とは、本微生物の生育にリンクしない生産物（ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｌｉｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であって、本微生物が産生する（例えば、哺乳動物由来の）薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物を当該薬物代謝酵素に基づく異化作用により分解して得られる化合物を意味し、具体的には、例えば、本微生物がヒト由来のチトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、ヒト由来のチトクロムＰ４５０の基質である薬物となる各種の脂溶性化合物を当該チトクロムＰ４５０に基づく酸化添加等の異化作用（即ち、モノオキシゲナーゼ反応）により分解して得られる化合物等をあげることができる。
【００２２】
本微生物の培養は、基本的には、微生物の培養において通常使用される方法によって行うことができる。好ましくは、本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地を用いることがよい。例えば大腸菌の場合、前記の炭素源、適当な窒素源、有機塩、無機塩およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００２３】
「本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地」とは、その微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）が非常に高い炭素源を含有する液体培地を意味し、好ましくは、炭素源資化定数が小さくなるような（例えば、約５０ｍｇ／ｍｌ程度以下の値であるような）炭素源を含有する液体培地であることがよい。ここで「炭素源資化定数」とは、通常ミカエリス定数と呼ばれ、比増殖速度μ（ｈｒ）がその最大値（μｍａｘ）の１／２を示す炭素源濃度に等しい値を意味し、この値はその微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）を表す指標となるものである。代表的な炭素源資化定数として、例えば、本微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母のグルコースに対する炭素源資化定数は約２５ｍｇ／ｌであり、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の細菌のグルコースに対する炭素源資化定数は約６．８×１０−２ｍｇ／ｌである。
好ましくは、本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地は、唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、かつ、液体培地中に含有される炭素源の初発濃度が、薬物代謝能力を有する微生物による微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量であること等をあげることができる。
ここで「炭素数６個である単糖」としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等があげられる。また「微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量」とは、微生物菌体収率が低下する現象（即ち、クラブとリー効果（Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ））が発生させない量を意味する。例えば、微生物の培養において、炭素源濃度が高くなりすぎると、溶存酸素（ＤＯ）が充分に存在しても、当該炭素源から生育に不必要な生体物質や増殖阻害等を起こすような物質を副生した結果、生育に必要な生体物質を生成する量が減少するために、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。より具体的には、微生物が酵母の場合には、糖濃度が高くなりすぎると、当該糖からエチルアルコールが生成し、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。また大腸菌等の細菌の場合には、糖濃度が高いと、当該糖から酢酸、乳酸、蟻酸等の有機酸を副生し、増殖阻害を起こしたり代謝活性に悪影響を与える現象が発生する。
因みに、本微生物が容易に資化する炭素源の培地への添加量としては、例えば、培養液に対して約０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度、好ましくは約１〜２０％（ｗ／ｖ）程度、より好ましくは約５〜１０％（ｗ／ｖ）程度、をあげることができる。
【００２４】
培養温度は、本微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。液体培地のｐＨは、本微生物に接触させる被験薬物によっても変わるが、例えば、約５〜８の範囲が好ましい。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用されることもあるが、本発明では便宜上炭素源としては取り扱わない。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００２５】
薬物代謝体の製造は、例えば、本微生物を含む液体培地に被験薬物を添加する操作、又は被験薬物を含む液体培地に本微生物を添加する操作等により開始される。なお、本微生物の液体培地中の存在量および被験薬物の添加量は、反応温度、反応時間、被験薬物の種類等の各種条件によって異なるが、たとえば、本微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、溶液１ｍｌあたり約１０１０〜約１０１５程度のチトクロムＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液１ｍｌあたり約１０５  〜約１０１０程度の菌体数）、好ましくは溶液１ｍｌあたり約１０１２〜約１０１３のチトクロムＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液あたり約１０７  〜約１０８  の菌体数）であり、被験薬物の添加量としては、例えば、溶液１ｍｌあたり約０．０１μｍｏｌ  〜約１０μｍｏｌ  程度の範囲を望ましいものとしてあげることができる。なお、上記の範囲にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもない。
【００２６】
尚、培養中、液体培地中に存在する薬物代謝体を分析する方法は、監修  塩川二郎ら機器分析のてびき（２）  （増補改訂版）第１刷，化学同人発行（１９８５年）、Ｒ．  Ｍ．  ＳＩＬＶＥＲＳＴＥＩＮ  ら，有機化合物のスペクトルによる同定法  第４版    第３刷，東京化学同人発行（１９８４年）等に記載される通常の分析方法を用いることができる。
【００２７】
次に本回収工程について以下に説明する。
本回収工程では、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出により回収すればよい。
【００２８】
液体培地中から薬物代謝体を回収するには、上述のような培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出により目的物を採取すればよい。例えば、まず液体培地をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒若しくはそれらの混合物、及び、飽和量となる塩化ナトリウムを添加し、当該溶媒で目的物を抽出する。必要に応じて液体培地を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
塩化ナトリウムの飽和量存在下における溶媒抽出において使用される好ましい溶媒としては、酢酸エチル又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソプロパノール混合溶媒（例えば、混合比３：１）をあげることができる。
【００２９】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
実施例１  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ）
市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用プライマーを用いるＰＣＲ法およびヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用合成リンカー等を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを得た。
【００３１】
実施例２  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｄ６、ｐ２Ｄ６Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約２００ｂｐを除くを１．３ｋｂを約０．４ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．９ｋｂ断片はＫｐｎＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。Ｎ末端２００ｂｐは、３本の合成リンカーを用い、まずＮ末端側の２本のリンカーをＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  （＋）ベクターのＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込み、その後もう一本のリンカーをそのＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んだ。さらにこのプラスミドのＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位にＰＣＲ法で得られた約０．４ｋｂ断片を組み込み、その後ＮｓｐＶ、ＸｂａＩで切断し、０．９ｋｂ断片を含むプラスミドに挿入してコーディング領域を連結させた。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子断片を上記と同様に得て、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ２、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ２を構築した。
【００３２】
実施例３  （形質転換酵母菌体の作製）
ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％グルコース）１．０ｍｌにサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  により集菌した。得られた菌体を１．０ｍｌの０．２Ｍ  ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再度遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  し、得られたペレットに２０μｌの１Ｍ  ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００溶液、約１．０μｇの実施例２によって構築された酵母内発現プラスミドを含む１０μｌの溶液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加えて攪拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２．０％グルコース、０．６７％窒素源アミノ酸不含（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  Ｄｉｆｃｏ製）、２０μｇ／ｍｌヒスチジン２．０％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベートし、上記の酵母内発現プラスミドを保有する形質転換酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内でヒト由来のＰ４５０分子種を発現させる酵母菌体を作製した。
【００３３】
実施例４  （酵母内で発現したヒト由来のチトクロムＰ４５０の定量）
実施例３によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる酵母菌体の培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約１．５×１０７  菌体／ｍｌ）２００ｍｌを集菌し、該菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を懸濁した後、遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）した。得られたペレットを新たに２．０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０  ）に懸濁した後、ジチオナイト５−１０ｍｇを添加し撹拌した。これを２本のキュベットに１．０ｍｌずつ分注し、サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、４００−５００ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母内に存在するチトクロムＰ４５０濃度を算出した。各種の形質転換酵母菌体における各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０の発現量はすべて約１０５  −約１０６  分子／菌体のレベルであった。
【００３４】
実施例５  （ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築および酵母内発現）
ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築法を示す。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した後、ＮｏｔＩリンカーを挿入して得たプラスミドｐＵＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＡＲＲＮ（特開平２−２１１８８０に記載）から得たＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．０Ｋｂ）を挿入し、ｐＵＲを得た。一方、プラスミドｐＡＡＨ５のＸｈｏＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入した後、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩにより切断し、得られた断片（約２．２Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ、ＳａＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより切断して得た断片（約２．２Ｋｂ）、サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株から調製した２μｍＤＮＡから切り出したＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．３Ｋｂ）、およびｐＵＲをＰｓｔＩで切断して得た断片、の３断片を連結することによりｐＵＲＬを得た。さらに、ｐＵＲＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断し平滑化した後連結することによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を消失させた。次に、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターを含むＮｏｔＩ断片（約１．６Ｋｂ）〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，５１，１６４１−１６４７（１９８７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６７，１６４９７−１６５０２（１９９２）  に記載される方法により得る〕をｐＵＲＬのＮｏｔＩ部位に挿入することによりｐＵＲＬＧを得た。ｐＵＲＬＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位に、実施例１に準じて得られた各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ又は実施例２に準じて得られたヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードするＤＮＡを挿入することにより、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドを得た。このプラスミドをサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株に実施例３に準じて導入したところ、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の産生が認められた。
【００３５】
実施例６  （本発明における溶媒抽出工程の検討（その１））
実施例５で作製されたヒト由来チトクロムＰ４５０  ２Ｄ６産生酵母を液体培地で４８時間培養した。詳細を下記に記載する。
液体培地として、下記の調製方法により調製された液体培地（以下、ＳＤＨ液体培地と記すこともある。）を用いた。
（ＳＤＨ液体培地の調製方法）
まず、微量成分ストック溶液を調製するために、１６微量成分［（１）ビオチン：１．５ｍｇ（ナカライテスク製）、（２）Ｄ−パントテン酸カルシウム：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（３）イノシトール：１５００ｍｇ（ナカライテスク製）、（４）ニコチン酸：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（５）ｐ−アミノ安息香酸：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（６）ピリドキシン塩酸塩：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（７）チアミン：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（８）ホウ酸：３７５ｍｇ（和光純薬製）、（９）モリブデン酸ナトリウム：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１０）硫酸銅（ＩＩ）：３０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１１）ヨウ化カリウム：７５ｍｇ（ナカライテスク製）、（１２）塩化鉄：１５０ｍｇ（和光純薬製）、（１３）硫酸マンガン：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（１４）硫酸亜鉛：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（１５）リボフラビン：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１６）葉酸：１．５ｍｇ（ナカライテスク製）］を個別に計り取り、それぞれ１００ｍＬの蒸留水を加えて溶解した。溶解後、微量成分（１）〜（１４）の水溶液を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで滅菌処理し、また（１５）及び（１６）  の水溶液をオートクレーブ（１２１℃，２０ｍｉｎ）で滅菌処理した。このようにして各微量成分ストック溶液を調製した。
また、微量成分混合液を調製するために、上記で作製された各微量成分ストック溶液を等量づつ混合した。
次いで、主成分溶液（１Ｌ）を調製するために、（１）硫酸アンモニウム：４７ｇ（ナカライテスク製）、（２）リン酸一カリウム：９．４ｇ（和光純薬製）、（３）硫酸マグネシウム：４．７ｇ（ナカライテスク製）、（４）塩化ナトリウム：０．９ｇ（和光純薬製）、（５）塩化カルシウム溶液（６０ｇ／１６０ｍＬ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：２．５ｍＬ（和光純薬製）、（６）微量成分混合液：２０ｍＬ／１Ｌを計り取り、１０００ｍＬの蒸留水を加えて溶解した。溶解後、これをオートクレーブ（１２１℃，２０ｍｉｎ）で滅菌処理した。このようにして主成分溶液を調製した。
次に、ＳＤＨ液体培地を調製するために、上記で調製された主成分溶液（１Ｌ）に、２５０ｍＬ  の４０％グルコース溶液（和光純薬製、オートクレーブ滅菌、終濃度８％）及び２．５ｍＬ  の８０ｍｇ／ｍＬヒスチジン溶液（和光純薬製、オートクレーブ滅菌、終濃度１６０μｇ／ｍＬ）を添加することにより、ＳＤＨ液体培地を調製した。
予め凍結保存によりストックされていた形質転換酵母菌体（０．５ｍＬ）を５ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養することにより前々培養液を得た。得られた前々培養液から２×１０８相当分の菌体液（約５ｍＬ）を採取し、これを２５０ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養（培養条件：３０℃，２００ｒｐｍ）することにより前培養液を得た。得られた前培養液から６．６×１０９相当分の菌体液（約１００〜１４０ｍＬ）を採取し、これを１．６ＬのＳＤＨ液体培地に加え、ＭＤＬ３Ｌ型ミニ培養ジャーで培養（培養条件：３０℃、ｐＨ５．５、４８時間）した。
培養後、得られた液体培地を熱処理（オートクレーブ処理）することにより予め酵素を不活性化した。処理後の液体培地５ｍｌに、予め少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された薬物（ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ））及び薬物代謝体（１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ））（以下、試験区１と記すこともある。）、或いは、薬物（テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ））及び薬物代謝体（６β−ヒドロキシテストステロン（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ））（以下、試験区２と記すこともある。）を添加し、３時間混合状態を維持した。このとき添加された溶媒の量は培地に対して１重量％以下とした。また添加された薬物及び薬物代謝体の濃度は薬物の場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、薬物代謝体の場合には０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにした。
このようにして得られた液体培地に下記の抽出条件で記載された抽出用溶媒５ｍＬを混ぜ、この混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した。その後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により溶媒層、水層及び沈渣に分離した。
＜検討された抽出条件＞
Ａ．酢酸エチル＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ａと記すこともある。）
Ｂ．メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソプロパノール（３：１）＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ｂと記すこともある。）
次いで、分離された溶媒層を回収した。一方、分離された水層には再び抽出用溶媒５ｍｌを加えた。
得られた混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。以後、前記の分離操作を２回繰り返した（計３回）。
回収された全ての溶媒層を集めて、一旦濃縮乾固した後、得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを添加し、溶解することにより溶媒抽出物（溶媒抽出画分）を調製した。
次に、調製された溶媒抽出画分中に含まれる薬物及び薬物代謝体の量を下記の分析条件でのＨＰＬＣ定量分析（ＵＶ簡易定量：正確な補正処理等は実施していないために、後述する回収率が１００％を超えることがある。）により測定した。得られた測定値から薬物及び薬物代謝体の回収率を算出した。その結果を表２に示した。
【００３６】
（分析条件）
１．試験区１の場合：
薬物：ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
薬物代謝体：１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：〔Ａ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液と〔Ｂ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸メタノール溶液とのグラジエント法（表１参照）
【００３７】
【表１】
2005021106.tif 000002
【００３８】
２．試験区２の場合：
薬物：テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
薬物代謝体：６β−ヒドロキシテストステロン（６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：４０℃、検出波長：ＵＶ２４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、水／メタノール＝４５／５５
【００３９】
その結果、表２から明らかなように、いずれの条件でも高い回収率で薬物及び薬物代謝体を取得することができた。
【００４０】
【表２】
2005021106.tif 000003
【００４１】
実施例７  （本発明における溶媒抽出工程の検討（その２））
実施例５で作製されたヒト由来チトクロムＰ４５０  ２Ｄ６産生酵母を、実施例６記載の培養条件と同等な条件下で、液体培地で４８時間培養した。
まず、抽出条件として塩析条件を含む場合には、培養後、得られた液体培地を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により上清（培地）及び沈渣（菌体）に予め分離した。分離された上清を熱処理（オートクレーブ処理）することにより予め酵素を不活性化した。処理後の液体培地５ｍｌに、予め少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された薬物（７−エトキシレゾルフィン（７−Ｅｔｈｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ））及び薬物代謝体（塩化レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−Ｎａ））を添加し、３時間混合状態を維持した。このとき添加された溶媒の量は培地に対して１重量％以下とした。また添加された薬物及び薬物代謝体の濃度は薬物の場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、薬物代謝体の場合には０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにした。このようにして得られた上清を、以下の「調製された液体培地」として用いた。
一方、抽出条件として塩析条件を含まない場合には、培養後、得られた液体培地を熱処理（オートクレーブ処理）することにより予め酵素を不活性化した。処理後の液体培地５ｍｌに、予め少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された薬物（７−エトキシレゾルフィン（７−Ｅｔｈｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ））及び薬物代謝体（塩化レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−Ｎａ））を添加し、３時間混合状態を維持した。このとき添加された溶媒の量は培地に対して１重量％以下とした。また添加された薬物及び薬物代謝体の濃度は薬物の場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、薬物代謝体の場合には０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにした。このようにして得られた液体培地を以下の「調製された液体培地」として用いた。
【００４２】
調製された液体培地に下記の抽出条件で記載された抽出用溶媒５ｍＬを混ぜ、この混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した。その後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により溶媒層及び水層、さらに抽出条件として塩析条件を含まない場合には沈渣（菌体）、に分離した。
＜検討された抽出条件＞
Ａ．酢酸エチル＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ａと記すこともある。）
Ｂ．メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／イソプロパノール（ＭＴＢＥ／ＩＰＡ）（３：１）＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ｂと記すこともある。）
Ｃ．酢酸エチル（以下、比較抽出条件Ｃと記すこともある。）
次いで、分離された溶媒層を回収した。一方、分離された水層には再び抽出用溶媒５ｍｌを加えた。
得られた混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。以後、前記の分離操作を２回繰り返した（計３回）。
回収された全ての溶媒層を集めて、一旦濃縮乾固した後、得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを添加し、溶解することにより溶媒抽出物（上清抽出画分）を調製した。
一方、調製された沈渣（菌体）に上記の抽出条件で記載された抽出用溶媒２ｍＬを混ぜ、この混合物を超音波処理（２０分）した後、ボルテックスミキサー（２分）で攪拌した。その後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により溶媒層及び沈渣に分離した。
次いで、分離された溶媒層を回収した。一方、分離された沈渣には再び抽出用溶媒２ｍｌを加えた。
得られた混合物を超音波処理（２０分）し、さらにボルテックスミキサー（２分）で攪拌した後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。以後、前記の分離操作を２回繰り返した（計３回）。
回収された全ての溶媒層を集めて、一旦濃縮乾固した後、得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを添加し、溶解することにより溶媒抽出物（菌体抽出画分）を調製した。
次に、調製された各抽出画分中に含まれる薬物及び薬物代謝体の量を下記の分析条件でのＨＰＬＣ定量分析（ＵＶ簡易定量：正確な補正処理等は実施していないために、後述する回収率が１００％を超えることがある。）により測定した。得られた測定値から薬物及び薬物代謝体の回収率を算出した。
その結果を表４及び表５に示した。
【００４３】
（分析条件）
薬物：７−エトキシレゾルフィン（７−Ｅｔｈｏｘｙｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）
薬物代謝体：塩化レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ−Ｎａ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：〔Ａ液〕２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液と〔Ｂ液〕メタノールとのグラジエント法（表３参照）
【００４４】
【表３】
2005021106.tif 000004
【００４５】
その結果、表４（本発明：抽出条件Ａ及びＢの場合、比較例：比較抽出条件Ｃの場合）から明らかなように、塩析条件下での溶媒抽出における回収率は無塩析条件下での溶媒抽出における回収率に比べて高く、特に薬物代謝体の場合には顕著な差異が認められた。そして塩析効果が溶媒の種類差に基づく効果よりも大きいものであることが判った。
【００４６】
【表４】
2005021106.tif 000005
【００４７】
【表５】
2005021106.tif 000006
【００４８】
実施例８  （本発明における溶媒抽出工程の検討（その３））
実施例５で作製されたヒト由来チトクロムＰ４５０  ２Ｄ６産生酵母を、実施例６記載の培養条件と同等な条件下で、液体培地で４８時間培養した。
培養後、得られた液体培地を熱処理（オートクレーブ処理）することにより予め酵素を不活性化した。処理後の液体培地５ｍｌに、予め少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解された薬物（ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ））及び薬物代謝体（１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ））を添加し、３時間混合状態を維持した。このとき添加された溶媒の量は培地に対して１重量％以下とした。また添加された薬物及び薬物代謝体の濃度は薬物の場合には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、薬物代謝体の場合には０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにした。
次に、得られた液体培地に下記の抽出条件で記載された抽出用溶媒５ｍＬを混ぜ、この混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した。その後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により溶媒層、水層（残渣画分）及び沈渣（菌体）に分離した。
＜検討された抽出条件＞
Ｄ．ジエチルエーテル／エタノール（３：１）＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ｄと記すこともある。）
Ｅ．ジエチルエーテル／エタノール（３：１）（以下、比較抽出条件Ｅと記すこともある。）
得られた混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。以後、前記の分離操作を２回繰り返した（計３回）。
回収された全ての溶媒層を集めて、一旦濃縮乾固した後、得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを添加し、溶解することにより溶媒抽出物（抽出画分）を調製した。
次に、調製された各抽出画分中に含まれる薬物及び薬物代謝体の量を実施例９記載のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合の分析条件でのＨＰＬＣ定量分析（ＵＶ簡易定量：正確な補正処理等は実施していないために、後述する回収率が１００％を超えることがある。）により測定した。得られた測定値から薬物及び薬物代謝体の回収率を算出した。
その結果を表６に示した。
【００４９】
その結果、表６から明らかなように、塩析条件下での溶媒抽出における回収率は無塩析条件下での溶媒抽出における回収率に比べて高く、特に薬物代謝体の場合には顕著な差異が認められた。
【００５０】
【表６】
2005021106.tif 000007
【００５１】
実施例９  （本発明における溶媒抽出工程の検討（その４））
実施例５で作製されたヒト由来チトクロムＰ４５０  ２Ｄ６産生酵母を液体培地で４８時間培養した。詳細を下記に記載する。
液体培地として、実施例６に記載された「（ＳＤＨ液体培地の調製方法）」と同様な方法により調製された液体培地（即ち、ＳＤＨ液体培地）を用いた。
予め凍結保存によりストックされていた上記の形質転換酵母菌体（０．５ｍＬ）を５ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養することにより前々培養液を得た。得られた前々培養液から２×１０８相当分の菌体液（約５ｍＬ）を採取し、これを２５０ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養（培養条件：３０℃，２００ｒｐｍ）することにより前培養液を得た。得られた前培養液から６．６×１０９相当分の菌体液（約１００〜１４０ｍＬ）を採取し、これを１．６ＬのＳＤＨ液体培地に加え、ＭＤＬ３Ｌ型ミニ培養ジャーで培養（培養条件：３０℃、ｐＨ５．５、４８時間）した。同時に、予めガラス製サンプル瓶に取りおいた薬物（ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ））が１７ｍＬのＤＭＳＯに溶解されてなる被験薬物溶解液を、当該薬物終濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ（但し、当該薬物溶解液中に含まれるＤＮＳＯ量が全培養液量の１重量％以下にする。）になるように、上記の培養ジャー内に添加した。
培養後、得られた液体培地５ｍｌに下記の抽出条件で記載された抽出用溶媒５ｍＬを混ぜ、この混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した。その後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）により溶媒層、水層（残渣画分）及び沈渣（菌体）に分離した。
＜検討された抽出条件＞
Ｂ．メチルｔｅｒｔｅｒｔ−ブチルエーテル／２−プロパノール（ＭＴＢＥ／ＩＰＡ）（３：１）＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（即ち、抽出条件Ｂ）
Ｆ．クロロホルム／メタノール（３：１）＋飽和塩化ナトリウム（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ液体培地）（以下、抽出条件Ｆと記すこともある。）
得られた混合物をボルテックスミキサー（２分）で攪拌した後、当該混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。以後、前記の分離操作を２回繰り返した（計３回）。
回収された全ての溶媒層を集めて、一旦濃縮乾固した後、得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを添加し、溶解することにより溶媒抽出物（抽出画分）を調製した。
次に、調製された各抽出画分中に含まれる薬物及び薬物代謝体の量を実施例９記載のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合の分析条件でのＨＰＬＣ定量分析（ＵＶ簡易定量：正確な補正処理等は実施していないために、後述する回収率が１００％を超えることがある。）により測定した。その結果を表７に示した。
【００５２】
【表７】
2005021106.tif 000008
【００５３】
＊表中の数値は、液体培地５ｍＬからの収量を化合物濃度と溶液量とから補正してモル数とした。
その結果、表７から明らかなように、塩析条件下での溶媒抽出における回収量において、薬物での回収量は両抽出条件とも同等であったが、薬物代謝体での回収量は抽出条件Ｄに比べて抽出条件Ｂの方が多いことが判った。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、製造された薬物代謝体を効率よく回収でき、これにより当該薬物代謝体を効率的に取得するための方法等が提供可能となった。