(57)【要約】【課題】複雑な合成工程を経る必要なく極めて簡単な操作で得ることができるカテキン‐β‐グルコシドの製造方法を提供すること。【解決手段】本発明のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法は、植物の細胞培養技術を利用したものであり、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物の組織片から誘導した培養細胞を、鉄分を含まない培地で培養し、これにカテキンを添加してさらに培養を続けることにより配糖化を行わせ、培養した細胞を収穫し、溶媒抽出してカテキン‐β‐グルコシドを得ることによりおこなわれる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物の組織片から誘導した培養細胞を、鉄分を含まない培地で培養し、これにカテキンを添加してさらに培養を続けることにより配糖化を行わせ、培養した細胞を収穫し、溶媒抽出して配糖体を得ることからなるカテキン‐β‐グルコシドの製造方法。
【請求項２】
カテキン‐β‐グルコシドが一般式（１）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法。
【化１】
2005021103.tif 000014
［式中Ｘは水素あるいはＯＲ３を示し、Ｙは水素あるいは没食子残基を示し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【請求項３】
カテキン‐β‐グルコシドが一般式（２）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法。
【化２】
2005021103.tif 000015
［式中Ｘは水素あるいはＯＲ３を示し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【請求項４】
カテキン‐β‐グルコシドが一般式（３）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法。
【化３】
2005021103.tif 000016
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【請求項５】
ユーカリ属植物として、Ｅ．Ｐｅｒｒｉｎｉａｎａ（ツキヌキユーカリ）、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ（ユーカリノキ）、Ｅ．ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅ．ｒａｄｉａｔａ、Ｅ．ｄｅｖｅｓ、Ｅ．ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ（レモンユーカリ）およびＥ．ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａから選んだものを使用する請求項１〜４記載のカテキン−β‐グルコシドの製造方法。
【請求項６】
カテキンを添加する培地として、ムラシゲ／スクーグ（ＭＳ）培地から鉄分を除いたもの、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地から鉄分を除いたもの、ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ）培地から鉄分を除いたもの、またはホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地から鉄分を除いたものを使用して実施する請求項１〜４記載のカテキン−β‐グルコシドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、植物の細胞培養技術によるカテキン‐β‐グルコシドの製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物の組織片から誘導した培養細胞を、鉄分を含まない培地で培養し、これにカテキンを添加してさらに培養を続けることにより配糖化を行わせ、培養した細胞を収穫し、溶媒抽出することにより、複雑な合成工程を経る必要なく極めて簡単な操作で得ることができる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、カテキンはコレステロール上昇抑制作用（下記の特許文献１を参照），抗菌作用（下記の特許文献２を参照），抗酸化作用（下記の特許文献３を参照），抗腫瘍作用（下記の特許文献４を参照），血圧上昇抑制作用および酵素活性阻害作用（下記の特許文献５を参照）などの優れた生理活性作用を有することから、現在は食品から医薬産業に至るまで幅広い分野で利用されている。
【０００３】
しかしながら、カテキンは水に対する溶解度が低く、また光酸化に対する色沢安定性も非常に悪いことから、上記食品や医療産業において利用範囲に制約を受けている。このような問題を解消するために、従来から、カテキンにグルコシドを付与させ、易溶性や色沢安定性を付与させることがおこなわれている。
【０００４】
従来より様々なカテキン‐β‐グルコシドの製造法が開発されている。
【０００５】
例えば、植物体を有機溶媒や混合溶媒などを用いて抽出し、カラムクロマトグラフィーにより分離精製することによりによりカテキン‐β‐グリコシドを製造する方法（下記の非特許文献１、非特許文献２を参照）、セルラーゼの存在下において、セルロースなどの糖基質およびカテキンなどのポリフェノール受容体を反応させることにより、カテキン‐β‐グリコシドを酵素により製造する方法（下記の特許文献６を参照）、（＋）‐カテキンの５、７、３’、４’位をそれぞれアセチル化したものと、水酸基をアセチル基で保護し、１位を臭素化した糖とを過塩素酸銀またはシルバートリフレートを用いて反応させ、脱アセチル化することによりチロシナーゼ阻害活性の高いカテキン‐β‐グリコシドを化学合成により製造し、美白化粧品に利用する方法（下記の非特許文献３、特許文献７を参照）などが開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特公平２−４４４４９号公報
【特許文献２】
特開平２−２７６５６２号公報
【特許文献３】
特公平１−４４２３４号公報
【特許文献４】
特開昭６０−１９０７１９号公報
【特許文献５】
特開平３−１３３９２８号公報
【非特許文献１】
Ｐｈｔｏｃｈｅｍ．，ｖｌ．２８，ｎｏ．４，ｐ．１２３７−１２４０，１９８９
【非特許文献２】
Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，ｖｌ．３４，ｎｏ．８，ｐ．３２０８−３２２２，１９８６
【特許文献６】
特開平６−２８４８９７号公報
【非特許文献３】
茶業研究報告、第７６号、別冊１０２−１０３貢、１９９２
【特許文献７】
特開２００１−２４０５３２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらいずれの方法も操作が複雑である上、カテキン‐β‐グルコシドの収率は必ずしも高いとは言えない。そこで本発明は、カテキンを基質とする植物細胞を使用して配糖化をおこなわせることにより、複雑な合成工程を経る必要なく極めて簡単な操作で得ることができるカテキン‐β‐グルコシドの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち請求項１記載の本発明は、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）植物の組織片から誘導した培養細胞を、鉄分を含まない培地で培養し、これにカテキンを添加してさらに培養を続けることにより配糖化を行わせ、培養した細胞を収穫し、溶媒抽出して配糖体を得ることからなるカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【０００９】
請求項２記載の本発明は、カテキン‐β‐グルコシドが一般式（１）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【００１０】
【化４】
2005021103.tif 000002
［式中Ｘは水素あるいはＯＲ３を示し、Ｙは水素あるいは没食子残基を示し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【００１１】
請求項３記載の本発明は、カテキン‐β‐グルコシドが一般式（２）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【００１２】
【化５】
2005021103.tif 000003
［式中Ｘは水素あるいはＯＲ３を示し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【００１３】
請求項４記載の本発明は、カテキン‐β‐グルコシドが一般式（３）で表される請求項１記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【００１４】
【化６】
2005021103.tif 000004
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の少なくとも一つはグルコース残基、他は水素を示す］
【００１５】
請求項５記載の本発明は、ユーカリ属植物として、Ｅ．ｐｅｒｒｉｎｉａｎａ（ツキヌキユーカリ）、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ（ユーカリノキ）、Ｅ．ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅ．ｒａｄｉａｔａ、Ｅ．ｄｅｖｅｓ、Ｅ．ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ（レモンユーカリ）およびＥ．ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａから選んだものを使用する請求項１〜４記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【００１６】
請求項６記載の本発明は、カテキンを添加する培地として、ムラシゲ／スクーグ（ＭＳ）培地から鉄分を除いたもの、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地から鉄分を除いたもの、ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ）培地から鉄分を除いたもの、またはホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地から鉄分を除いたものを使用して実施する請求項１〜４記載のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるカテキンの基本骨格は下記の一般式（４）で表される。
【００１８】
【化７】
2005021103.tif 000005
【００１９】
これらカテキンの立体配置に関して、ベンゾピラン環の２位と３位はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。また、式中Ｘは水素あるいは水酸基を示し、Ｙは水素あるいは没食子残基を示す。
【００２０】
本発明に用いるカテキンとしては（＋）あるいは（−）‐カテキン、（＋）あるいは（−）‐エピカテキン、（＋）あるいは（−）‐ガロカテキン、（＋）あるいは（−）‐エピガロカテキン、（＋）あるいは（−）‐カテキン‐３‐Ｏ‐ガレート、（＋）あるいは（−）‐エピカテキン‐３‐Ｏ‐ガレート、（＋）あるいは（−）‐ガロカテキン‐３‐Ｏ‐ガレート、（＋）あるいは（−）‐エピガロカテキン‐３‐Ｏ‐ガレートが挙げられる。
【００２１】
本発明のカテキン‐β‐グルコシドは、一般式（１）、一般式（２）あるいは一般式（３）で表される。
【００２２】
【化８】
2005021103.tif 000006
【００２３】
【化９】
2005021103.tif 000007
【００２４】
【化１０】
2005021103.tif 000008
【００２５】
本発明のカテキン‐β‐グルコシドは、一般式（１）の中のＸが水素あるいはＯＲ３であり、Ｙが水素あるいは没食子残基であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つがグルコース残基で他は水素である。好ましくは、一般式（２）の中のＸが水素あるいはＯＲ３であり、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも一つがグルコース残基で他は水素である。さらに好ましくは、一般式（３）の中のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５の少なくとも一つがグルコース残基で他は水素である。最も好ましいのは、一般式（３）の中のＲ１、Ｒ４、Ｒ５の少なくとも一つがグルコース残基で他は水素である。
【００２６】
上記の配糖体を与える本発明のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法は、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｓｕ）属植物の組織片から誘導した培養細胞を培養し、これにカテキンを投与してさらに培養を続けることにより配糖化を行わせ、培養した細胞を収穫し、溶媒抽出して配糖体を得ることからなる。
【００２７】
ユーカリ属植物としては、Ｅ．ｐｅｒｒｉｎｉａｎａ（ツキヌキユーカリ）、Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ（ユーカリノキ）、Ｅ．ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅ．ｒａｄｉａｔａ、Ｅ．ｄｅｖｅｓ、Ｅ．ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ（レモンユーカリ）およびＥ．ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａから選んだものを使用するのが好ましい。
【００２８】
カテキンを添加する培地は任意であるが、ムラシゲ／スクーグ（ＭＳ）培地、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地、ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地またはこれらの改良培地が好適である。
【００２９】
細胞培養の諸条件、および溶剤抽出によるカテキン‐β‐グルコシドの回収操作の条件は、この分野において既知の技術に従って、また後記する実施例を参考にして、当業者は容易に決定しうるであろう。
【００３０】
【実施例】
（実施例１）Ｅ．ｐｅｒｒｉｎｉａｎａ（ツキヌキユーカリ）の無菌芽生えから、常法にしたがって培養細胞を誘導した。それをさらに寒天培地にとり、２５℃で暗所に静置し、３〜４週間ごとに継代培養し、成長のよい細胞株を得た。
【００３１】
寒天培地は、ＭＳ培地に、寒天０．９％、ベンジルアデニン１ｐｐｍ、ショ糖３％を添加して加熱溶解後、容量１００ｍｌの三角フラスコに４０ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、固化することにより用意したものである。
【００３２】
寒天培地は、下記の表１に示す組成をもつＭＳマイナスＦｅ培地にベンジルアデニン１ｐｐｍを添加して加熱溶解後、容量１００ｍｌの三角フラスコに４０ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、固化することにより得られたものである。
【００３３】
【表１】
2005021103.tif 000009
【００３４】
カテキン‐β‐グルコシド製造のための細胞培養は、１ｐｐｍのベンジルアデニンを含むＭＳマイナスＦｅ培地約１００ｍｌを容量３００ｍｌの三角フラスコに注入し、上記のツキヌキユーカリ培養細胞を三角フラスコ１本あたり約３０ｇずつ入れ、２５℃に保った暗所で３日間、回転培養することによりおこなった。
【００３５】
さらに２４時間回転培養を続けた後、細胞を収穫して培地から分けた。培地をまずイオン交換樹脂「ダイヤイオンＨＰ‐２０」のカラムを通して培地成分を吸着させた後、カラムを水洗いし、メタノール溶出をおこない、メタノール溶媒を減圧下に留去してＳａｍｐｌｅ１を得た。
【００３６】
細胞はホモジナイズ後、メタノール冷浸をおこなって抽出エキスを得た。このメタノールエキスを水に溶解し、酢酸エチルで抽出し、水層を「ダイヤイオンＨＰ‐２０」のカラムに通して吸着させた。カラムを水洗後、メタノール溶出し、メタノールを減圧下に留去してＳａｍｐｌｅ２を得た。この作業を数回おこない、合計（＋）‐カテキン３００ｍｇを投与した。
【００３７】
Ｓａｍｐｌｅ２を逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、（＋）‐カテキンの配糖体と思われるピークが確認できたので、分取高速液体クロマトグラフィーを用いて単離精製を行い、カテキン‐β‐グルコシドを得た。ＨＰＬＣの分析条件を下記に示す。
【００３８】
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０  Ｓ‐５（φ４．６×２５０ｍｍ）、移動相：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝５／９５、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃
【００３９】
得られたカテキン‐β‐グルコシドの収量、収率について表２に示す。なお、比較のため、通常のＭＳ培地すなわちＦｅＳＯ４を含有する培地にベンジルアデニン１ｐｐｍを加えたものを用いて、同様に培養および抽出を行ったが、ほとんど変換は認められなかった。
【００４０】
【表２】
2005021103.tif 000010
【００４１】
また、１Ｈ‐ＮＭＲ、１３Ｃ‐ＮＭＲを用いて構造決定をおこなった結果、下記に示す構造をもつことがわかった。また、これらのもつ特性も併せて列記した。１Ｈ‐ＮＭＲ分析結果のチャートを図１〜図３に示す。
【００４２】
【化１１】
2005021103.tif 000011
【００４３】
Ｐｒｏｄｕｃｔ１：
（＋）‐カテキン‐７‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシド
δ４．８０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）
ＥＳＩ＋／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７５［Ｍ＋Ｎａ］＋
１３Ｃ‐ＮＭＲ：８２．８（Ｃ‐２），６８．５（Ｃ‐３），２８．５（Ｃ‐４），１０３．５（Ｃ‐４ａ），１５６．６（Ｃ‐５），９７．３（Ｃ‐６），１５８．５（Ｃ‐７），９６．８（Ｃ‐８），１５７．４（Ｃ‐８ａ），１３１．９（Ｃ‐１’），１１５．９（Ｃ‐２’），１４６．１（Ｃ‐３’），１４６．１（Ｃ‐４’），１１９．８（Ｃ‐５’），１１５．１（Ｃ‐６’），１０２．１（Ｃ‐１”），７４．７（Ｃ‐２”），７７．９（Ｃ‐３”），７１．３（Ｃ‐４”），７８．０（Ｃ‐５”），６２．４（Ｃ‐６”）
【００４４】
【化１２】
2005021103.tif 000012
【００４５】
Ｐｒｏｄｕｃｔ２：
（＋）‐カテキン‐５‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシド
δ４．８１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）
ＥＳＩ＋／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７５［Ｍ＋Ｎａ］＋
１３Ｃ‐ＮＭＲ：８２．３（Ｃ‐２），６８．６（Ｃ‐３），２８．４（Ｃ‐４），１０３．２（Ｃ‐４ａ），１５６．５（Ｃ‐５），９６．７（Ｃ‐６），１５７．８（Ｃ‐７），９８．０（Ｃ‐８），１５７．９（Ｃ‐８ａ），１３１．９（Ｃ‐１’），１１５．９（Ｃ‐２’），１４６．１（Ｃ‐３’），１４６．１（Ｃ‐４’），１１９．８（Ｃ‐５’），１１５．０（Ｃ‐６’），１０２．４（Ｃ‐１”），７４．８（Ｃ‐２”），７８．１（Ｃ‐３”），７１．２（Ｃ‐４”），７８．１（Ｃ‐５”），６２．４（Ｃ‐６”）
【００４６】
【化１３】
2005021103.tif 000013
【００４７】
Ｐｒｏｄｕｃｔ３：
（＋）‐カテキン‐３’‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシド
δ４．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）
ＥＳＩ＋／ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７５［Ｍ＋Ｎａ］＋
１３Ｃ‐ＮＭＲ：８２．７（Ｃ‐２），６８．６（Ｃ‐３），２８．６（Ｃ‐４），１００．７（Ｃ‐４ａ），１５６．７（Ｃ‐５），９５．３（Ｃ‐６），１５７．７（Ｃ‐７），９６．２（Ｃ‐８），１５７．４（Ｃ‐８ａ），１３２．２（Ｃ‐１’），１１７．０（Ｃ‐２’），１４７．９（Ｃ‐３’），１４６．４（Ｃ‐４’），１２３．６（Ｃ‐５’），１１６．７（Ｃ‐６’），１０３．６（Ｃ‐１”），７４．７（Ｃ‐２”），７７．５（Ｃ‐３”），７１．１（Ｃ‐４”），７８．１（Ｃ‐５”），６２．２（Ｃ‐６”）
【００４８】
【発明の効果】
本発明のカテキン‐β‐グルコシドの製造方法は、植物の細胞培養技術を利用したものであり、複雑な合成工程を経る必要なく製造できるものである。この方法により製造されたカテキン‐β‐グルコシドは、易溶性や色沢安定性が高く、カテキンの持つ優れた作用を体内の隅々に長時間持続させることができ、食品や医療産業において幅広く利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】（＋）‐カテキン‐７‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシドの１Ｈ‐ＮＭＲである。
【図２】（＋）‐カテキン‐５‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシドの１Ｈ‐ＮＭＲである。
【図３】（＋）‐カテキン‐３’‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコシドの１Ｈ‐ＮＭＲである。
【図１】
2005021103.tif 000017
【図２】
2005021103.tif 000018
【図３】
2005021103.tif 000019