(57)【要約】      （修正有）【課題】コクシジウム感染症を予防するための鶏用ワクチンを提供する。【解決手段】鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである特定の塩基配列をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を含む組み換えヘルペスウイルスを有効成分とする鶏コクシジウム−ヘルペスウイルス感染症用多価ワクチン。当該多価ワクチンを、卵内、皮下又は筋肉内に接種することを特徴とする鶏コクシジウム−ヘルペスウイルス多価ワクチンの接種することによりコクシジウム感染症とヘルペスウイルス感染症とを予防できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を含む組み換えヘルペスウイルス。
【請求項２】
前記配列番号５記載の塩基配列を有する遺伝子が、鳥類ヘルペスウイルス内でプロモータ活性を示すことのできる改変β−アクチンプロモータ支配下に配置されてなる請求項１記載の組み換えヘルペスウイルス。
【請求項３】
請求項２記載の組み換えヘルペスウイルスを有効成分とする鶏コクシジウム感染症及びヘルペスウイルス感染症を予防するための多価ワクチン。
【請求項４】
請求項３記載の多価ワクチンを、卵内、皮下又は筋肉内に接種することを特徴とする鶏コクシジウム感染症及びヘルペスウイルス感染症を予防するための多価ワクチンの接種方法。
【請求項５】
鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を含む組み換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類コクシジウムの感染を予防する鶏用組み換えヘルペスウイルスワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
鶏コクシジウム症は養鶏界で恐れられている寄生虫感染症のひとつで、感染後数日のうちに５０％程度が死亡することもあり、また、慢性感染では下痢・削痩・起立嫌悪などが認められ、養鶏業界の中でも肉用鶏飼育において甚大な被害をもたらす。特に肉用鶏で重要な時期である幼雛や中雛にかけての鶏が本疾病に感受性で、いったん感染が発生した場合、コクシジウム虫体を飼育場から駆逐することは大変難しい。現在、本疾病に対する予防措置として主に抗生物質や化学合成剤が中心的な役割を担っているが、発症前から投与し、これを連用しなければならないことは、生産上コスト高につながり、しかも連用による副作用も懸念される。
また、こうした問題を解決するために、様々な生ワクチンが開発されている。そのうちいくつかは、中等毒コクシジウムであり、それ自体でかなりの病変を形成する。最近になって早熟株を用いたある程度効果的なワクチンが開発された。しかし、このワクチンにも毒性は残っているため、雛へのワクチン株の再感染、ワクチン株感染による病変などの問題がある上、ワクチン株の野生株への突然変異の不安も残る。ワクチン株の接種は、他のワクチンとの接種スケジュールを考慮しなければならないし、抗菌剤の使用が制限されるため別の感染症を引き起こす恐れもある。
近年、これらの薬剤や生ワクチンの副作用などを懸念して、更に安全なコンポ−ネントワクチンや組み換えワクチンを開発するべく、コクシジウム感染防御抗原の探索が懸命に行われているが、まだ十分な効果を発揮したといえる報告はない。
【０００３】
現在、コクシジウムの抗原は数多く配列分析まで行われ、その抗原の局在までよく知られている。テネラのオーシスト抗原であるＴａ４（特許文献１参照）やGX３２６２（ＵＳ５１２２４７１）、Ｍｚｐ５−７（特許文献２参照）、ＥｔＭＩＣ５（非特許文献１参照）、ＥｔＭＩＣ２（非特許文献２参照）、アッセルブリナのｃＭＺ８（非特許文献３参照）、ＥＡＭＺ２５０（非特許文献４参照）など数多くの抗原タンパク遺伝子が見つけられている。そして、これらの抗原遺伝子のうちいくつかは、鶏痘ウイルスやワクシニアウイルスに組み込まれている（特許文献３、特許文献４参照）が、これらを用いた有効なワクチンが得られることまでは確認されていない。
これは、ウイルスと原虫とのゲノムサイズの違い、感染した生体中での形態の違いなどに加え、原虫の感染を抗体だけで防御することができないことにも起因している。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５０２８６９４号明細書
【特許文献２】米国特許第５４０３５８１号明細書
【特許文献３】米国特許第５８１４３２０号明細書
【特許文献４】米国特許第５４０３５８１号明細書
【非特許文献１】Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、  １５．  ９１−１０２  ２０００
【非特許文献２】Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．、  ７９．  １９５−２０６  １９９６
【非特許文献３】Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、  ５７．  ２４３４−２４４０  １９８９
【非特許文献４】Ｉｍｍｕｎｏｌoｇｙ、  ７１．  １２７−１３２  １９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
かかる従来技術の下、本発明者らは、鶏コクシジウム原虫感染症を防御する組み換えワクチンを得るべく鋭意検討した結果、ヘルペスウイルスに、アイメリア・テネラのミクロネームタンパクをコードする遺伝子を組み込むと、抗体形成と同時に細胞免疫が有効に付与され、コクシジウム感染に対して高い防御効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かくして本発明によれば、鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を含む組み換えヘルペスウイルスが提供される。前記遺伝子は、鳥類ヘルペスウイルス内でプロモータ活性を示すことのできる改変β−アクチンプロモータ支配下に配置されているのが好ましい。
また、本発明によれば、前記組み換えベクターを有効成分とする鶏コクシジウム−ヘルペスウイルス感染症用多価ワクチンが提供される。
更に、本発明によれば前記多価ワクチンを、卵内、皮下又は筋肉内に接種することを特徴とする鶏コクシジウム感染症及びヘルペスウイルス感染症を予防するための多価ワクチン（以下、鶏コクシジウム−ヘルペスウイルス感染症用多価ワクチン又は単に多価ワクチンという）の接種方法が提供される。
本発明によれば、鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を含む組み換えベクターが提供される。この組み換えベクターは、本発明の組み換えヘルペスウイルスを構築するのに用いるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳述する。
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を有している。
鶏コクシジウム原虫のミクロネームタンパクである配列番号５をコードする遺伝子は、ＥｔＭＩＣ２遺伝子であり、配列番号５記載の塩基配列を有するものである。また、本発明においては、このＥｔＭＩＣ２遺伝子は、変異を受けて、配列番号５記載の塩基配列の一部（１個又は複数個の塩基）が置換、欠失或いは付加されたものであってもよい。
以下、本発明においては、特に断りのない限り、「ＥｔＭＩＣ２遺伝子」とは、配列番号５をコードする遺伝子、又は、その一部が置換、欠失或いは付加されてなる遺伝子を意味する。
【０００８】
ヘルペスウイルスとしては、鳥類に感染するものが好ましく、マレックウイルス（以下、ＭＤＶと言うことがある）や伝染性喉頭気管炎ウイルス（以下、ＩＬＴＶということがある）を選択するのが望ましい。
マレックウイルスは、１、２及び３型の３種類があるが、本発明においてはどの型のものを選択しても良い。これらのマレックウイルスは、天然に得ることができるほか、ＡＴＣＣなどから有償又は無償で入手できるものが挙げられ、特に非病原性のものが好ましい。このようなウイルスとしては、例えば、マレックウイルス１型であれば、ＣＶＩ９８８（Ｒｉｓｐｅｎｓ）株など、マレックウイルス２型であればＳＢ−１株など、マレックウイルス３型（七面鳥ヘルペスウイルス；以下、ＨＶＴということがある。）であれば、ＦＣ１２６（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＹＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが例示できる。特にマレックウイルス３型が好ましい。
ＩＬＴＶとしては、ＮＳ−１７５株（家畜衛生菌株目録の菌株番号ＶＡ０２０４、社団法人動物用生物学的製剤協会）、ＣＥ株（幸田、麻布獣医科大学研究報告、３１、１３３−２０２、１９７６）、ＳＡ−２株（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．、１１９、１８１−１９８、１９９１）、強毒野外分離株６３２株（Ｋｅｅｌｅｒら、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３５、９２０−９２９、１９９１）、ＵＳＤＡチャレンジ株（Ｐｏｕｌｓｅｎら、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ．  Ｖｉｒｏｌ．、７８、２９４５−２９５１、  １９９７）が挙げられる。
【０００９】
ＥｔＭＩＣ２遺伝子を、ヘルペスウイルスに組み込む方法に格別な制限はなく、ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域を持った組み換えベクターの、前記ゲノム領域中にＥｔＭＩＣ２遺伝子を挿入し、この組み換えベクターとヘルペスウイルスとの間で相同組み換えを起こさせる一般的な遺伝子組み換え手法を採用すればよい。
またＥｔＭＩＣ２遺伝子は、プロモータ支配下に配置されるのが好ましい。さらに、ＷｔＭＩＣ２遺伝子の下流にポリＡ付加シグナルなどのシグナル配列を配置するのが好ましい。
【００１０】
ベクターとしては、遺伝子組み換え技術で一般的に用いられるプラスミド、コスミド、ファージなどが挙げられる。
プラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等の市販されたプラスミドが挙げられ、コスミドとしては、ｐＪＢ８やｐＨＣ７９等の市販コスミドベクターが挙げられ、ファージとしては、λファージやＭ１３ｍｐ１８等の市販ファージが挙げられる。
【００１１】
ヘルペスウイルスの増殖に非必須なゲノム領域は、公知の組み換えＨＶＴで使用された領域（公知の非必須領域）や、他のヘルペスウイルスの、これと相同するゲノム領域が挙げられる。
公知の非必須領域の具体例としては、WＯ８９／０１０４０号公報記載のＵＬ４３遺伝子、WＯ９３／２５６６５号公報記載のＵＳ２遺伝子、WＯ９９／１８２１５号公報記載のＵＬ４４からＵＬ４６のＯＲＦ間領域などが例示され、特に好ましい領域は、ＵＬ４５とＵＬ４６のＯＲＦ間領域である。
もちろんこれらの公知の非必須領域に限らず、新たな非必須領域を見出だしても良い。新たな非必須領域をつける方法は特に制限されず、たとえば次のような一般的方法が挙げられる。すなわち、ＨＶＴのゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、その制限酵素地図を作成し、その適当な制限酵素サイトにプロモータとともにマーカー遺伝子を組み込んだ組み換えプラスミドを構築して、後述する一般的な組み換え鳥類ヘルペスウイルスの作製方法でもって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも安定な組み換えヘルペスウイルスが得られるかどうかを調べれば良い。
【００１２】
ＥｔＭＩＣ２遺伝子を効率よく発現させるために用いるプロモータ遺伝子については、本発明の組み換えヘルペスウイルスが感染した細胞内でプロモータとして機能するものであれば効果が期待できるが、鶏体内において活性の高いプロモータが良く、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータ（ＲｏｓｓらＪ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４：３７１−３７７、１９９３）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）及びマレックウイルス（ＭＤＶ）１型のｇＢタンパク質プロモータ（Ｒｏｓｓら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７４：３７１−３７７、１９９３）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のＩＥプロモータ（Ｓｔｉｎｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５５：４３１−４４１、１９８５）、ＳＶ４０プロモータ（Ｇｕｎｎｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：４８３１−４８３５、１９８７）、ヒトβアクチンプロモータ（ＧｕｎｎｉｎｇらＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：４８３１−４８３５、１９８７）、ニワトリβアクチンプロモータ（Ｋｏｓｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１：８２８７−８３０１、１９８３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモータ（Ｇｒｅｕｅｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７：３３−４３、１９９０）、Ｐｅｃプロモータ（特開２００１−０００１８８号公報）などが例示される。
これらの中でも、ヘルペスウイルス内で非常に活性の高い鶏細胞由来のβ−アクチンプロモータやその改変体を用いるのが好ましい。
プロモータに加えて、転写を活性化する因子であるエンハンサーを加えることにより、さらに効率的な発現が予想される（Ｓｔｉｎｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５５：４３１−４４１、１９８５）。エンハンサーは、サイトメガロウイルス由来プロモータの一部などが例示され、挿入遺伝子との位置的関係は通常限定されない。このタイプのプロモータとして、特開２００１−０００１８８号公報において示されているＰｅｃプロモータなどが例示される。
【００１３】
組み換えヘルペスウイルスの作製方法として、以下の方法を挙げることができる。
（１）まず、上述した非必須領域を含むヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ断片がクローニングされたプラスミドを得、このプラスミド中の当該非必須領域に、ＥｔＭＩＣ２遺伝子を挿入し、組み換えプラスミドを構築する。この際、ＥｔＭＩＣ２遺伝子の５’上流にプロモータを、３’下流にポリＡ付加シグナルを付けてＥｔＭＩＣ２遺伝子とともに連結させたものを挿入するのがより好ましい。（２）構築した組み換えプラスミドをヘルペスウイルス感染ＣＥＦ細胞に導入する、あるいは、ＨＶＴから調製した感染性ゲノムＤＮＡとともに組み換えプラスミドをＣＥＦ細胞に導入する。これらの導入方法はエレクトロポレーションなど一般的に用いられている方法でよい。（３）組み換えプラスミドを導入したＣＥＦ細胞を培養皿にまき、プラークが十分大きくなるまで培養する。（４）このプラークには組み換えウイルスと野生型ウイルスが混合して存在しているので、ここから目的とする組み換えウイルスを純化する。この純化の方法も特に限定されるものではないが、たとえばプラークの出現したＣＥＦ細胞を適当に希釈し、９６−ｗｅｌｌプレートにまき、ＥｔＭＩＣ２遺伝子が発現するタンパク質（即ち、ＥｔＭＩＣ２タンパク；ミクロネームタンパクの１種）に対するポリクロ−ナル抗体もしくはモノクローナル抗体を１次抗体とした抗原抗体反応により、ＥｔＭＩＣ２タンパクを発現する組み換えウイルスのプラークを検出するという方法が例示される。
【００１４】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、鶏コクシジウム症の原因原虫であるアイメリア・テネラのミクロネームタンパクをコードする遺伝子ＥｔＭＩＣ２を有することから、鶏用のコクシジウム症ワクチンとして利用されるが、ヘルペスウイルスをベクターウイルスとして用いているので、鶏コクシジウム症と同時にヘルペスウイルス感染症にも有効な二価ワクチンとなる。
【００１５】
本発明の組み換えヘルペスウイルスを主成分とするワクチンは、細胞や培地成分などを含んでいても構わない。この組み換えウイルス以外の成分は、保存安定剤、緩衝液など薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。更に、組み換えウイルス以外の成分として、他の組み換えあるいは非組み換えウイルスを混合しても良い。具体的には、組み換えヘルペスウイルスがＨＶＴである場合、ＭＤＶ−１又はＭＤＶ−２のワクチン株を本発明の組み換えＨＶＴに混合して使用することがその一例として挙げられる。この組み換えＨＶＴは、コクシジウムワクチンであると同時にマレックワクチンとして機能する。
また、他の病原体由来の抗原遺伝子を挿入した組み換えウイルスと混合することも可能である。
【００１６】
本発明の二価ワクチンの調製方法は特に限定されないが、たとえば次の方法が挙げられる。本発明の組み換えヘルペスウイルスを当該ウイルスが増殖可能なＣＥＦ細胞などに感染させ、増殖させた後、感染細胞をスクレーパー又はトリプシンではがし、遠心分離によって細胞と上清に分離する。得られた細胞を１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁させ液体窒素中に保存する。
本発明の二価ワクチンの鶏への投与方法も特に限定されず、ヘルペスウイルスワクチンに用いられている一般的な方法が使用できる。即ち、１０〜１０５ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、好ましくは１０２〜１０４ＰＦＵ／ｄｏｓｅになるように適量のリン酸緩衝液などに溶かして、初日齢の鶏の頸部皮下や大腿部筋肉内、大胸筋あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与する。
【実施例】
【００１７】
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．  N．Y．  １９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＱＵＩＡＧＥＮ社、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
【００１８】
（実施例−１）ＥｔＭＩＣ２ＤＮＡの単離
Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ米国株のスポロゾイトを、常法に従って界面活性剤で溶解させたのち、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）セルロースカラム（Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｍＲＮＡを精製した。二重鎖ＤＮＡはＺＡＰ−ｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使って合成し、Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターにクローニング後、λファージにパッケージした（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ、  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。これによって作製した一次ライブラリーを増幅後、大腸菌に感染させ、プラークハイブリダイゼーション法によってＥｔＭＩＣ２遺伝子が挿入されているファージを選択した。具体的には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されているＥｔＭＩＣ２遺伝子配列（Ｊｉａｎｌｉｎ、  Ｊ．  ａｎｄ  Ｊｉｎｓｈｕ、  Ｊ．  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１１１８３９）からＥｔＭＩＣ２遺伝子のＮ末端側にあたる部分の配列であるＥｔＭＩＣ２−Ｆ（配列番号１）と、Ｃ末端にあたる部分の配列であるＥｔＭＩＣ２−Ｒ（配列番号２）の二種類の合成ＤＮＡを作製し、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、カタログ番号１６３６  ０９０）を用い、ジゴシニゲニン（ＤＩＧ）標識を施した。
【００１９】
これらの標識プローブを用い、プラークハイブリダイゼーション法を定法に従い実施した。上記標識ＤＮＡがハイブリダイズするλファージプラークの検出には、プローブ検出用に１０００倍にＰＢＳで希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体を用い、発色試薬（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、カタログ番号１６８１４５１）を発色させることにより、プローブがハイブリダイズしたプラークのみ青紫色に発色した。約２００００プラークをスクリ−ニングし、その結果上記両プローブがハイブリダイズした２個のプラークを選択した。更に反応したプラークを形成したファージを標識していないＥｔＭＩＣ２−Ｆ及びＥｔＭＩＣ２−Ｒを合成ＤＮＡプライマーとしてＰＣＲクローニングを実施した。その結果、約１ｋｂｐのＤＮＡがクローニングされたので、更にこのＤＮＡをｐＰＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングするために配列番号３及び配列番号４の合成ＤＮＡを作製し、更にＰＣＲを実施し、制限酵素ＳａｌＩ−ＸｈｏＩで切断後ｐＰＣＲ−ｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングしたプラスミドｐＰＣＲ−ＥｔＭＩＣ２を取得した。
【００２０】
本プラスミド挿入断片の配列分析をＤＮＡアナリシスシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ社、ＣＥＱ２０００ＸＬ）で配列分析したところ、クローニングされた断片（配列番号５）は、新たに付け加えた制限酵素切断点を除きＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されているＥｔＭＩＣ２遺伝子配列（Ｊｉａｎｌｉｎ、  Ｊ．  ａｎｄ  Ｊｉｎｓｈｕ、  Ｊ．  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＦ１１１８３９）と同一であった。
【００２１】
（実施例−２）リコンビナントプラスミド（ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２）の構築
２−１  鶏β−アクチンプロモータ遺伝子の単離
鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰｒＢａｃ１（配列番号６）とプライマーＰｒＢａｃ２（配列番号７）を用いてＰＣＲにより鶏β−アクチンプロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。このＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出さしたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１８にクローニングして、前述のＤＮＡシークエンサーを用いて、このＤＮＡ断片の塩基配列分析をした。鶏β−アクチンプロモーターであることを確認した。
２−２  プラスミドｐＧＩＢａｃｐＡの構築
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載されたプラスミドｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（２，７７３ｂｐ）を制限酵素ＢａｍＨＩとＡｐａＩとで切断し、合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｕ（配列番号８）と合成オリゴヌクレオチドＡｄ−Ｂ−Ａ−Ｌ（配列番号９）をアニールさせて調製した合成二本鎖ＤＮＡアダプターを挿入してプラスミドｐＧＩＭＣＳ２（２，７６５ｂｐ）を作製した。
次に、２−１で、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩで二重切断して切り出した鶏β−アクチンプロモーター（１，５２３ｂｐ）とｐＧＩＭＣＳ２を同じく制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで切断したプラスミド断片とを連結させ、ｐＧＩＢａｃ（４，２７２ｂｐ）を作製した。
更にプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、カタログ番号＃２１２２０９）をテンプレートにして、プライマーＰｏｌｙＡ−Ｆ（配列番号１０）とプライマーＰｏｌｙＡ−Ｒ（配列番号１１）でＰＣＲを行い、ＳＶ４０のｐｏｌｙＡシグナルのＤＮＡ断片（３３４ｂｐ）を増幅し、これを制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩとで切断して切り出したＤＮＡ断片（３２４ｂｐ）を、同じく制限酵素ＡｐａＩとＫｐｎＩとで二重切断したｐＧＩＢａｃに挿入し、ｐＧＩＢａｃｐＡ（４，５８４ｂｐ）を作製した。
２−３  プラスミドｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐｏｌｙＡの構築
上記のようにして作製したｐＧＩＢａｃｐＡを制限酵素ＢｇｌＩで切断して、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分離し、１，９３１ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。この回収ＤＮＡ断片を制限酵素ＳｆｉＩで切断したＷＯ９９／１８２１５号公報記載のプラスミドｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５，４９３ｂｐ）に挿入して、ｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐｏｌｙＡ（７，４２４ｂｐ）を構築した。
２−４  ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２の構築
ＥｔＭＩＣ２遺伝子を含む組み換えＨＶＴ作製用プラスミドを構築するため、ｐＰＣＲ−ＥｔＭＩＣ２をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断した約１１３２ｂｐの断片と、ｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐｏｌｙＡをＢａｍＨＩとＳａｌＩとで切断して得られた断片とをライゲーションによってｐＮＺ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２（８４６１ｂｐ）を構築した。
尚、ここに記したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐｏｌｙＡは、鶏β−アクチンプロモータで挿入抗原遺伝子を発現するように組み立てられたＨＶＴ組み換え用プラスミドである。
【００２２】
（実施例−３）ｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２の構築・純化
Ｍｏｒｇａｎらの方法（Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、３４：３４５−３５１（１９９０）によって、親株ＨＶＴのＤＮＡを調製し、実施例−２で構築したプラスミドｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２とともにエレクトロポレーションを用いてＣＥＦ細胞に導入し、ＥｔＭＩＣ２に対する抗体又はＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対する抗体を用いて組み換えＨＶＴの純化を行った。その具体的方法は以下の通りである。
ｐ４５ＢａｃＥｔＭＩＣ２  ５μｇと２５μｇのＨＶＴゲノムＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉｎｅ  Ｇ（０．１４Ｍ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  塩化カリウム、１．１ｍＭ  リン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭ  リン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ  塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％  グルコース）に懸濁した。２×１０６個の鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅ  Ｇに懸濁し、上記ＤＮＡ液を加え、室温でジーンパルサー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて２５μＦ、１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子導入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔ’ｚ  L−１５：ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（１：１）（ともにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬＧＩＢＣＯ社、カタログ番号＃４１３００−０３９、２１５００−０６１）（以下、ＬＭ（＋）培地と略す）を加え、直径６０ｍｍの細胞培養皿で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日間、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６−ｗｅｌｌ培養プレートに分注し、プラークがでるまで培養した。
【００２３】
各ｗｅｌｌの細胞をトリプシン処理して、新鮮なＣＥＦ細胞を追加して９６−ｗｅｌｌ培養プレート２枚の各ウエルに移した。こうして作製したレプリカプレートをプラークが出現するまで培養した。その後、その１枚のプレートの細胞をメタノールで固定し、ＥｔＭＩＣ２タンパクに対するポリクロ−ナル抗体を１次抗体とした抗原抗体反応により、ＥｔＭＩＣ２タンパクを発現する組み換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認されたｗｅｌｌに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）培地に懸濁した新鮮なＣＥＦ細胞とまぜて９６−ｗｅｌｌプレートに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ｗｅｌｌから由来する全てのプラークがほぼ１００％組み換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０５ＰＦＵ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６−ｗｅｌｌプレートのＣＥＦ細胞に感染させた。１週間培養後、再び、この操作を繰り返して組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。こうして純化した組み換えＨＶＴウイルスをｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２と命名した。
【００２４】
（実施例−４）ｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２の安定性確認
３−１．  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ
純化の終了した組み換えＨＶＴウイルスをＣＥＦ細胞とともに２枚の１５０ｍｍ直径の培養皿で全面にプラークが出現するまで培養し、その感染細胞をスクレーパーで培養皿から剥がして遠心分離（２５０Ｇ、５分）して感染細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後ＰＢＳ１．２ｍｌに再懸濁し、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５０ｍＭ２−ＭＥ、５０ｍＭＥＤＴＡ  ｉｎ  ＰＢＳ）０．８ｍｌを加えてＶｏｒｔｅｘ（３０秒）して細胞を可溶化した。１，５００Ｇ、５分で細胞残さを除去し、上澄をエッペンドルフチューブに移して１５，０００Ｇ、２０分間、２２℃で遠心してウイルスをした。１２．５ｍＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）を１ｍｌ加えて、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（０．２５ｍｇ／ｍｌＤＮＡｓｅ  Ｉ、０．２５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ  Ａ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）を４μｌ加えて３７℃で３０分間静置した。その後、５００ｍＭＥＤＴＡ  ２５μｌ、１０％ＳＤＳ１２５μｌ、Ｈ２Ｏ８７μｌ、１０ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  １２．５μｌ、２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ  ０．５μｌ加えて、５５℃で３０分間静置した。その液をフェノ−ル／クロロホルムで２回抽出した。
【００２５】
その水層に５Ｍ塩化ナトリウム１６μｌを加え、水層の２．５倍量の（−２０℃で冷やした）１００％エタノ−ルを加えて沈殿させ、遠心分離で沈殿させた沈殿物（ＤＮＡ）を７０％エタノ−ルで洗浄後、再度遠心分離して沈殿させた後乾燥させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０μｌに溶かした。
こうして回収されたウイルスＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＶとで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにブロットし、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブは、“ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ”（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＣＳ社、カタログ番号＃１６３６０９０）の試薬を用いて２種類のＤＩＧ標識されたＤＮＡプローブを調製した。そのＤＮＡプローブは、ＥｔＭＩＣ２  ＤＮＡ領域内のプローブ（以下、ＥｔＭＩＣ２プローブと称する）と外来遺伝子の挿入部位のＨＶＴゲノム領域（以下、４５／４６プローブと称する）である。前者のプローブはＥｔＭＩＣ２−Ｆ２（配列番号１２）とＥｔＭＩＣ２−Ｒ２（配列番号１３）の２本のプライマー及びプラスミドｐ４５／４６ＥｔＭＩＣ２をテンプレートとして、後者は、４５／４６−Ｆ（配列番号１４）と４５／４６−Ｒ（配列番号１５）の２本のプライマー及びプラスミドｐＮＺ４５／４６ＳｆｉをテンプレートとしてＰＣＲ反応によって調製した。
【００２６】
この２種類のプローブを使ったサザンハイブリダイゼーションの結果、ＥｔＭＩＣ２プローブでは２００４ｂｐと６３１ｂｐのバンドがハイブリし、４５／４６プローブでは２００４ｂｐと８４０ｂｐの２本のバンドがハイブリした。この結果は、どちらのプローブも予期した通りのバンドであったので、組み換えウイルスは設計どおり正しい組み換え体であることが確認された。
【００２７】
（実施例−５）組み換えＨＶＴゲノム構造の安定性確認（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
組み換えＨＶＴをＣＥＦ細胞で１０代継代した組み換えウイルスについても実施例３−１と同様にサザンブロッティングを実施し、１０代継代後の組み換えウイルスも正しい遺伝子構造を持っていることが確認されたので、安定な組み換え体であることが確認された。
【００２８】
（実施例−６）組み換えＨＶＴゲノム構造の安定性確認（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２を初日齢の市販鶏及びＳＰＦ鶏の背部皮下に３０００ＰＦＵ接種し、５週間飼育し、３，４，５週齢に翼下静脈より末梢血を採取し、末梢血中のリンパ球から、ウイルスを分離した。末梢血からのリンパ球分離は以下のようにして実施した。
１００Ｕ／ｍｌのヘパリン溶液０．５ｍｌをあらかじめ２．５ｍｌシリンジに入れておき、翼下静脈から２ｍｌの血液を採取し、あらかじめ１５ｍｌのファルコン製遠心チューブに入れておいた５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）上に上層する。５５０Ｇで２０分間遠心すると、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅと血清成分の境界に末梢血リンパ球がバンドとなって現れる。この部分のパスツールピペットで吸引し、９ｃｍシャーレにあらかじめ撒いてあったＣＥＦと混合し、７日間培養した。更に、このＣＥＦを２回継代し、ウイルスプラークの出現を調べた。ＣＥＦにて２回継代する間にプラークが現れた場合、リンパ球からウイルスが分離できたと判断した。結果は表１に示した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
組み換えＨＶＴも親株と同様に３〜５週齢いずれの時期にもウイルスを末梢血リンパ球から分離することができた。これら分離できたウイルスのプラークを、実施例−２と同様の方法で染め分けて、ＥｔＭＩＣ２タンパク発現の有無を調べたところ、全ての分離されたプラークがＥｔＭＩＣ２タンパクを発現していることがわかった。このことから、組み換えＨＶＴはｉｎ  ｖｉｖｏでも安定していることを確認した。
【００３１】
（実施例−７）組み換えＨＶＴの遺伝子発現確認
７−１蛍光抗体法
組織培養用チャンバースライドに培養した上記組み換えＨＶＴ感染細胞をＣＥＦとともに３７℃でプラークが出現するまで培養し、冷アセトンで固定した。発現した抗原を検出するために用いた一次抗体は、ＥｔＭＩＣ２タンパク質の検出には、精製ＥｔＭＩＣ２タンパク免疫ウサギ血清を、非反応対照血清には抗ニューカッスル病ウイルス鶏血清、抗伝染性ファブリキウス嚢病のＶＰ２タンパクに対するモノクローナル抗体Ｒ６３を用いた。各血清、モノクローナル抗体をそれぞれ５００倍にＰＢＳで希釈して用いた。反応時間は室温１００％湿度で約一時間放置し、ＰＢＳで三回洗浄後蛍光物質（ＦＩＴＣ）を結合した抗鶏イムノグロブリン又は抗ウサギＩｇＧをＰＢＳで１００倍に希釈した溶液と約一時間室温にて反応させた。その後、ＰＢＳで三回洗浄後、蛍光励起波長光下で顕微鏡観察して反応性を調べた。対象ウイルスとしてＨＶＴ親株ＦＣ１２６を感染させた細胞を使用した。結果を表２に示した。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
表２から判るとおり、組み換えＨＶＴは挿入されたＥｔＭＩＣ２遺伝子を発現していることがわかった。
【００３４】
７−２ウエスタンブロッティング
組み換えＨＶＴをｍ．ｏ．ｉ＝０．１で感染させたＣＥＦを７２時間培養した後、ＳＤＳ−ＧＥＬローディングバッファーを用いて可溶化した。コントロールとして、ウイルスを感染させないＣＥＦ及び親株であるＦＣ１２６を同じｍ．ｏ．ｉで感染させたＣＥＦを７２時間培養したものも、同様に可溶化した。これらのサンプルを通常の変性還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、泳動タンパク質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。転写後、ＰＶＤＦ膜は１％スキムミルクを含むＰＢＳで１時間室温にてブロッキングした。そののち、ＰＢＳで５００倍希釈した抗Ｆウサギ血清と室温にてインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄後、５００倍希釈したビオチン化抗ウサギ抗体（ヤギ血清由来）と１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、アビジンアルカリフォスファターゼ複合体にて１時間インキュベートして、ＰＢＳで３回、ＴＢＳで１回洗浄ののち、アルカリホスファターゼの基質であるＢＣＩＰ−ＮＢＴにて発色させた。その結果組み換えｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２感染細胞のみ、予想される分子量４７ＫＤａの位置にＭＩＣ２タンパクの存在が確認できた。
【００３５】
（実施例−８）動物コクシジウム感染防御実験
実施例３で得られたＨＶＴ組み換えワクチンのコクシジウムに対する効果を判定するためにコクシジウム感染防御試験を実施した。
各群１２羽の一日齢の試験用ＳＰＦ鶏（ＬｉｎｅＭ、日本生物科学研究所）に組み換えＨＶＴを３０００ＰＦＵ／１００μｌ／鶏になるように背部皮下に２０Ｇの鶏を持つ注射針を使って接種した。コクシジウム症三種混合生ワクチンＴＡＭ（日本生物科学研究所）を四日齢に処方箋どおりに接種し、陰性対照群は未接種とした。組み換えＨＶＴ又は三種混合生ワクチン接種の３４日後（３５日齢）に各群の鶏にＥ．ｔｅｎｅｌｌａの日本野外分離株であるＲｔ７株の胞子形成オーシスト３８０個をヒナのそ嚢内に単回強制経口投与で攻撃した。以下の項目について観察又は測定した。観察期間は攻撃後８日までとした。オーシストの排泄は攻撃後５日以降毎日、各群ごとにオーシスト排泄の有無を飽和食塩液浮遊法により確認した。オーシストが認められた場合は、クロム硫酸法により、糞便１ｇ当たりのオーシスト数（ＯＰＧ）を測定した。腸病変は攻撃後８日に全鶏を殺処分して剖検を行い、盲腸の肉眼病変の程度を観察した。病変の程度はＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｒｅｉｄの方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ、  Ｊ．、  ａｎｄ  Ｒｅｉｄ、  Ｍ．  １９７０．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ２８、  ３０−３６）に従い、０（正常）〜＋４（最重度）の５段階で記録した。腸病変の有意差検定は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｅｎｅｙのＵ検定法により、各ワクチン接種群と非免疫感染対照群間を比較した。結果を表３に示した。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
表３に示したように、組み換えＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２を接種した鶏群は強毒Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ攻撃に対して、非接種攻撃群と比較し、排出オーシスト数が有意に低く、盲腸病変が市販生ワクチンと比較してもほぼ同程度で、非接種攻撃群と比べて有意に低く、顕著なコクシジウム感染防御活性が認められている。
【００３８】
（実施例９）ｒＨＶＴ接種鶏末梢リンパ球からのｒＨＶＴ分離
ｒＨＶＴ／ＥｔＭＩＣ２を初日齢のＳＰＦ鶏の背部皮下に３０００ＰＦＵ接種、もしくは１８日胚に接種し、３０週間飼育し、２週ごとに全て翼下静脈より末梢血を採取し、末梢血中のリンパ球から、ウイルスを分離した。末梢血からのリンパ球分離は実施例６と同じ方法で実施した。
その結果、組み換えＨＶＴを接種した鶏リンパ球からは全てウイルスが分離され、それらを実施例７と同じ方法でＥｔＭＩＣ２タンパクの発現を調べたところ、そのウイルス全てが組み換えＨＶＴ純化時と同じレベルでＥｔＭＩＣ２タンパクを発現していることがわかった。また、３０週間飼育した後に分離されたウイルスを実施例３と同様の方法でサザンブロッティングを行い、ウイルスの安定性を調べたところ、挿入遺伝子・挿入部位いずれも、接種時のウイルスと同じ構造であることを確認した。このことから、本組み換えＨＶＴが、鶏体内においても長期にわたり構造的に安定で、しかも安定して抗原タンパクを発現していることがわかった。
【００３９】
（実施例１０）マレック病感染防御実験
実施例３で得られたＨＶＴ組み換えワクチンのマレック病に対する効果を判定するためにマレック病感染防御試験を実施した。各群１２羽の一日齢の試験用ＳＰＦ鶏（ＬｉｎｅＭ、日本生物科学研究所）に組み換えＨＶＴを３０００ＰＦＵ／１００μｌ／鶏になるように背部皮下に２０Ｇの鶏を持つ注射針を使って接種した。また、３０００ＰＦＵのＨＶＴのワクチンであるＦＣ１２６を同様の方法で接種した。同種の雛の他群はすべてワクチン接種を行わなかった。６日例に非接種非攻撃群を除くすべての雛にきわめて強毒なマレック病攻撃株であるＭｄ５株を５００ＰＦＵ皮下に攻撃した。試験中にマレック病により生じた死亡を記録し、８週の試験終了時にマレック病の典型的な肉眼的病変及び腫瘍を検査した。試験結果は表４に示す。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
非接種攻撃群は有意な下図の雛が試験終了前にマレック病により死亡した。他方組み換えワクチン接種群、ＦＣ１２６接種群はマレック病による死亡から完全に防御されただけでなく、典型的な病変も示さず、良好なワクチン効果があった。
以上のことから、本発明の組み換えヘルペスウイルスは、コクシジウム及びヘルペスウイルスの一種であるマレック病の感染に対して非常に効果の高いワクチンとなることがわかる。
【配列表】
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