(57)【要約】【課題】本発明は、酵素センサを組み込んだ検体測定装置および方法に関し、測定精度においてノイズ電流の影響を受けにくく、基質の濃度変化に対応した検出能力を有する検体測定装置及び測定方法を提供する。【解決手段】電極部、２つの電極端子を有する酵素センサ部、電位走査部、電流検出部、マイクロコンピュータとを備え、酵素センサ部に印加する電圧を予め設定した範囲内で走査することにより、基質濃度に対し、精度良好な成分量を検出できる、検体測定装置および方法である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板に少なくとも測定極及び対極を含む電極部を形成し、少なくとも酵素と電子受容体とを含む反応層にて前記測定極および対極を電気的に橋絡した酵素センサ部と、
前記測定部と対極との間に時間とともに変化する電圧を印加して電位差を発生させる電圧走査部と、
前記電極部に流れる電流を検出する電流検出部と、
前記電圧走査部を制御して所定の電圧を発生させ、前記電流検出部の出力に基づいて検体の基質成分量を判別する、マイクロコンピュータとを備え、
前記電圧走査部は前記酵素センサ部の測定極に印加する電圧を、対極を基準として０Ｖから電子受容体のピーク電流を計測可能な電圧を経て予め設定した電圧（Ｅ１）まで一定の速度で増加または減少させ、前記速度と絶対値同一で符号を逆転させた速度で、前記電圧を電圧Ｅ１から減少または増加させ、ピーク電流を計測可能な電圧を経て予め設定した電圧（Ｅ２）まで走査させる、検体測定装置。
【請求項２】
プログラムされたコンピュータによって、検体の基質量を測定して前記基質量値を表示する装置であって、
絶縁性基板に少なくとも測定極及び対極を含む電極部を形成し、少なくとも酵素と電子受容体とを含む反応層にて前記測定極および対極を電気的に橋絡した酵素センサ部と、
前記測定部と対極との間に時間とともに変化する電圧を印加して電位差を発生させる電圧走査部と、
前記電極部に流れる電流を検出する電流検出部と、
前記電圧走査部を制御して所定の電圧を発生させ、前記電流検出部の出力に基づいて検体の基質成分量を判別する、マイクロコンピュータとを備えた検体測定装置であり、
前記マイクロコンピュータが、
（１）予め設定された一定電圧範囲（Ｅ１からＥ２）で電圧走査部と電流検出部の両電極間に電位差を生じさせる手段であって、前記酵素センサ部における前記対極の電圧を基準として前記測定極に電圧０Ｖから、電圧（Ｅ１）まで一定の電圧走査速度（ｖ１）で走査し、その後連続して、前記電圧（Ｅ１）から、前記電圧走査速度（ｖ１）と絶対値が同一で符号を逆転させた電圧走査速度（ｖ２＝−ｖ１）で、電圧（Ｅ２）まで連続的に走査する電圧信号とする手段と、
（２）前記電圧信号をアナログ変換する手段と、
（３）前記電流検出部で検出した電流値をデジタル変換する手段と、
（４）前記デジタル変換された電流値と走査した電極電圧との電圧−電流曲線から検出されたピーク電流値または電流面積値を算出する手段と、
（５）ピーク電流値または電流面積値を予め作成した基準検量線と対比して、検体の基質濃度の成分量を決定する手段、および
（６）前記検体の基質濃度を表示する手段
からなる制御手段を有する、検体測定装置。
【請求項３】
前記請求項１記載の装置を用いて検体の基質量を測定し前記基質量測定値を表示する方法であって、
測定用検体を前記酵素センサ部の反応層上に供給する工程と、
前記電極間の電圧を走査する工程と、
前記酵素センサ部に流れる電流を検出する工程と、
コンピュータが以下の制御工程を行う、検体測定方法。
（１）予め設定された一定電圧範囲（Ｅ１からＥ２）で電圧走査部と電流検出部の両電極間に電位差を生じさせる工程であって、前記酵素センサ部における前記対極の電圧を基準として前記測定極に電圧０Ｖから、電圧（Ｅ１）まで一定の電圧走査速度（ｖ１）で走査し、その後連続して、前記電圧（Ｅ１）から、前記電圧走査速度（ｖ１）と絶対値が同一で符号を逆転させた電圧走査速度（ｖ２＝−ｖ１）で、電圧（Ｅ２）まで連続的に走査する電圧信号とする工程と、
（２）前記電圧信号をアナログ変換する工程と、
（３）前記電流検出部で検出した電流値をデジタル変換する工程と、
（４）前記デジタル変換された電流値と走査した電極電圧との電圧−電流曲線から検出されたピーク電流値または電流面積値を算出する工程と、
（５）前記ピーク電流値または電流面積値を予め作成した基準検量線と対比して、検体の基質濃度の成分量を決定する工程、および
（６）前記検体の基質濃度を表示する工程
【請求項４】
前記コンピュータを用いた制御工程の（１）の工程が、前記測定極の電圧走査において、電圧０Ｖから電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経由してＥ１に至り、さらに前記電圧Ｅ１から電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経由して、Ｅ２に至るように走査する工程である、請求項３記載の検体測定方法。
【請求項５】
前記酵素センサ部において、前記酵素がグルコースオキシターゼ、前記電子受容体がフェリシアン化カリウムである、請求項３または請求項４に記載の検体測定方法。
【請求項６】
前記マイクロコンピュータの電圧走査において、前記電圧Ｅ１が−０．２Ｖ、前記電圧Ｅ２が０．２Ｖ、電圧走査速度が１０ｍＶ／ｓ〜２００ｍＶ／ｓであることを特徴とする請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の検体測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素センサを組み込んだ検体測定装置および方法に関し、特に医療分野における生体成分の測定に有用な酵素センサを組みこんだ検体測定装置および測定方法である。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】
酵素センサは、主に生体関連物質、例えばグルコース、アルコール、乳酸、尿酸、尿素、蔗糖等をセンサー材料として利用した化学センサーである。多くの場合、分子認識機能が優れた生体物質を利用するため、卓抜した選択性を発揮し得る。酵素センサは、酵素反応による酸素の消費あるいは過酸化水素の生成を電気化学的に検出するもので、酵素と電極の間の電子移動を電子メディエータを介在させて電極との電子移動を行う方式がある。これにより、検体中のグルコース、アルコール等の特性、あるいは物質量を簡易に定性または定量することができる。検体としては、例えば血液、唾液、尿等が挙げられ、これらの生体試料中の特定成分を検出する。
【０００３】
基本的な酵素センサ１００を、図８に示す。例えば、プラスチック等の絶縁材料からなる電気絶縁性基板１０２の表面に、電極系が配設されている。図８においては、電極系は２極であり、一方が測定極１０４であり他方が測定極に対する対極１０６でありこれらは近接配置されている。電極系１０４、１０６の両端部は、測定本体部と連結する電極端子部と、反応層１０８が密着固定されている端部となっている。反応層１０８は少なくとも酵素と電子受容体とを含む。固定化膜に酵素および電子受容体を担持させて、基質検知部とする。測定極１０４と対極１０６はリード部を介して外部接続端子に電気接続されている。１１０は電気絶縁スペーサであり、１１２は外面カバーである。体液等の検体の液が検体吸入口１１４から取り込まれ、反応層１０８に固定された酵素と体液中の基質と反応して酸化還元反応が生じ、これに伴って電子受容体が電子移動媒体として機能する。酸化還元反応も生じる。検体に含まれる基質の量は、反応後の電子受容体の量と相関があるため、電子の授受反応が生じ、電流が基質濃度に比例して、流れることとなる。これを検知し、基質濃度を知ることができる。
【０００４】
このような酵素反応を利用し、電極系と酵素反応層を設け、酵素と電子受容体と試料液の反応に際し、物資の濃度変化を電気化学的に電極系で検知させる機能を具備させたバイオセンサが開示されている（例えば、特許文献１）。特許文献１においては、酵素反応層を親水性高分子溶液と電子受容体の混合物からなる反応層を電極系の表面に形成し、電極系を含めた反応層を有するディスポーサブルタイプのバイオセンサを構成し、極めて容易に基質濃度を測定することができる。
【０００５】
従来、酵素センサの反応層での反応量を検出する方式として、酵素電極法が提案されている。この酵素電極法においては、測定極と対極の間に定電圧を印加するポテンシャルステップ法（クロノアンペロメトリー、定電圧法）にて酸化還元電流を検出し、特定成分の濃度測定を行っている（例えば、特許文献２）。
【０００６】
また、グラウンド電圧を一定にし、徐々に電圧を上げて電圧を走査させ、電流を検知して、特定成分量の同定を行う方法も、開示されている（例えば、特許文献３）。
【０００７】
【特許文献１】特許第２５１７１５３号公報
【特許文献２】特開平３−８５４３５号公報
【特許文献３】特開２００１−３１１７１２号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ポテンシャルステップ法は、取り出せる電流が微弱であり、検出電流を電圧に変換する増幅器の増幅率を大きく取る必要がある。従って、ノイズ電流もあわせて増幅してしまう恐れがあり、その結果、センサにとって重要である測定精度に悪影響を与えるおそれがあった。
【０００９】
また、上記特許文献３にかかる電圧走査法では、基質の濃度の広い領域で、直線性が劣るという問題があった。
【００１０】
ここで、本発明者らは、サイクリックボルタンメトリ法、いわゆる線形電圧走査法を用いる方法を提案する。従来、サイクリックボルタンメトリ法では、ポテンシャルステップ法より大きな検出電流を取り出すことが可能であるが、低濃度域から高濃度域にわたる直線性を得ることができなかった。
【００１１】
しかし、本発明者らは、上記問題点を解決し、測定精度においてノイズ電流の影響を受けにくく、基質の濃度変化に対応した検出能力を有する検体測定装置及び測定方法を提供することを目指し、鋭意検討した結果、サイクリックボルタンメトリ−法において、特定範囲内で電圧を走査させることにより、低濃度域から高濃度域まで精度良く直線性を得ることを知った。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる検体測定装置の態様としては、
絶縁性基板に少なくとも測定極及び対極を含む電極部を形成し、少なくとも酵素と電子受容体とを含む反応層にて前記測定極および対極を電気的に橋絡した酵素センサ部と、
前記測定部と対極との間に時間とともに変化する電圧を印加して電位差を発生させる電圧走査部と、
前記電極部に流れる電流を検出する電流検出部と、
前記電圧走査部を制御して所定の電圧を発生させ、前記電流検出部の出力に基づいて検体の基質成分量を判別する、マイクロコンピュータとを備え、
前記電圧走査部は前記酵素センサ部の測定極に印加する電圧を、対極を基準として０Ｖから電子受容体のピーク電流を計測可能な電圧を経て予め設定した電圧（Ｅ１）まで一定の速度で増加または減少させ、前記速度と絶対値同一で符号を逆転させた速度で前記電圧を、電圧Ｅ１から減少または増加させ、ピーク電流を計測可能な電圧を経て予め設定した電圧（Ｅ２）まで走査させ得る。
【００１３】
また、本発明にかかる検体測定装置の他の態様としては、
プログラムされたコンピュータによって、検体の基質量を測定して前記基質量値を表示する装置であって、
絶縁性基板に少なくとも測定極及び対極を含む電極部を形成し、少なくとも酵素と電子受容体とを含む反応層にて前記測定極および対極を電気的に橋絡した酵素センサ部と、
前記測定部と対極との間に時間とともに変化する電圧を印加して電位差を発生させる電圧走査部と、
前記電極部に流れる電流を検出する電流検出部と、
前記電圧走査部を制御して所定の電圧を発生させ、前記電流検出部の出力に基づいて検体の基質成分量を判別する、マイクロコンピュータとを備えた検体測定装置であり、
前記マイクロコンピュータが、
（１）予め設定された一定電圧範囲（Ｅ１からＥ２）で電圧走査部と電流検出部の両電極間に電位差を生じさせる手段であって、前記酵素センサ部における前記対極の電圧を基準として前記測定極に電圧０Ｖから、電圧（Ｅ１）まで一定の電圧走査速度（ｖ１）で走査し、その後連続して、前記電圧（Ｅ１）から、前記電圧走査速度（ｖ１）と絶対値が同一で符号を逆転させた電圧走査速度（ｖ２＝−ｖ１）で、電圧（Ｅ２）まで連続的に走査する電圧信号とする手段と、
（２）前記電圧信号をアナログ変換する手段と、
（３）前記電流検出部で検出した電流値をデジタル変換する手段と、
（４）デジタル変換された電流値と走査した電極電圧との電圧−電流曲線から検出されたピーク電流値または電流面積値を算出する手段と、
（５）ピーク電流値または電流面積値を予め作成した基準検量線と対比して、検体の基質濃度の成分量を決定する手段、および
（６）前記検体の基質濃度を表示する手段
からなる制御手段を有しうる。
【００１４】
また、本発明の検体測定方法の態様としては、
前記の装置を用いて検体の基質量を測定し前記基質量測定値を表示する方法であって、
測定用検体を前記酵素センサ部の反応層上に供給する工程と、
前記電極間の電圧を走査する工程と、
前記酵素センサ部に流れる電流を検出する工程と、
コンピュータが以下の制御工程を行いうる。
（１）予め設定された一定電圧範囲（Ｅ１からＥ２）で電圧走査部と電流検出部の両電極間に電位差を生じさせる工程であって、前記酵素センサ部における前記対極の電圧を基準として前記測定極に電圧０Ｖから、電圧（Ｅ１）まで一定の電圧走査速度（ｖ１）で走査し、その後連続して、前記電圧（Ｅ１）から、前記電圧走査速度（ｖ１）と絶対値が同一で符号を逆転させた電圧走査速度（ｖ２＝−ｖ１）で、電圧（Ｅ２）まで連続的に走査する電圧信号とする工程と、
（２）前記電圧信号をアナログ変換する工程と、
（３）前記電流検出部で検出した電流値をデジタル変換する工程と、
（４）前記デジタル変換された電流値と走査した電極電圧との電圧−電流曲線から検出されたピーク電流値または電流面積値を算出する工程と、
（５）前記ピーク電流値または電流面積値を予め作成した基準検量線と対比して、検体の基質濃度の成分量を決定する工程、および
（６）前記検体の基質濃度を表示する工程。
【００１５】
ここで、前記コンピュータを用いた制御工程の（１）の工程が、前記測定極の電圧走査において、電圧０Ｖから電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経由してＥ１に至り、さらに前記電圧Ｅ１から電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経由して、Ｅ２に至るように走査する工程であり得る。
【００１６】
また、前記酵素センサ部において、前記酵素がグルコースオキシターゼ、前記電子受容体がフェリシアン化カリウムであり得る。
【００１７】
あるいは、前記マイクロコンピュータの電圧走査において、前記電圧Ｅ１が−０．２Ｖ、前記電圧Ｅ２が０．２Ｖ、電圧走査速度が１０ｍＶ／ｓ〜２００ｍＶ／ｓであり得る。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、絶縁性基板と、電極系を密着固着させた反応層を有する酵素センサと、これを各検体ごとに交換可能なディスポーサブルなチップとして、酵素センサからなるチップを組み込む測定装置において、従来に比較して検体の基質濃度を精度良好に検出する検体測定装置および検体測定方法である。
【００１９】
ここで、本願発明に用いられる検体測定装置について説明する。本発明にかかる検体測定装置の実施態様の１例を、図１に従って示す。１０は本発明の検体測定装置であり、測定極とこれに対する対極との２極型の電極系を有する酵素センサ部１２、およびこの酵素センサ部を検体測定装置本体に組み込んだ検体測定装置の概略を示すブロック図である。酵素センサ部１２は、例えば、チップ状の酵素センサであり、本発明にかかる検体測定装置の接続部１４に接続される。上記酵素センサ１２には、酵素センサ部の対極に電圧を印加し電極間に電位差を生じさせその電圧を走査する電圧走査部１６と、酵素センサ部の測定極から発せられる電流を検出するための電流検出部１８が接続され、電圧走査部１６には、電極間に印加するべき測定電極電圧が供給される。電流検出部１８では、電流を検出する。マイクロコンピュータ（以下、「マイコン」という。）２０は、電圧走査部１６と電流検出部１８に接続される。
【００２０】
酵素センサ部１２は、主として電極系と、反応層とで構成される。電極系は、少なくとも測定極および対極の２極よりなり、絶縁性基板上に設けられている。
【００２１】
反応層は電極系の上に密着固定され、少なくとも上記酵素と電子受容体とを担持して含む。担体は、例えば、微細結晶セルロースが挙げられる。酵素は、検体中の基質と選択的に反応し、電子受容体は、その基質と酵素の反応に伴う電子授受に相関して反応する。酵素としては、測定したい検体中の基質、例えばグルコース成分、アルコール成分、乳酸成分、尿酸成分等、により選択されるが、例えば、グルコースを検出したい基質とすれば、酸化還元酵素であるグルコースオキシターゼが挙げられる。また、電子受容体としては、上記酵素の反応を活性化させる無機または有機化合物であり、例えば、フェリシアン化アルカリ金属塩、フェロセンまたはそのアルキル置換体、ｐ−ベンゾキノン、メチレンブルー、β―ナフトキノン４−スルホン酸カリウム、フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が挙げられる。水等の溶媒への溶解性等の観点より、好ましくは、フェリシアン化アルカリ金属塩、特には、カリウム塩、やフェロセン系が挙げられる。例えば、血中のグルコースを測定する場合、グルコースがグルコースオキシターゼと反応し酸化される際に、フェリシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元される。生成されるフェロシアン化カリウムの量はグルコース濃度にほぼ比例する。
【００２２】
本発明の検体測定装置のマイコンは、電圧の制御、酵素センサ部で測定された電流の検知、電流値の補正、電流値から被検成分量の演算等を制御する。マイコン２０は、酵素センサ部１２に印加する電圧を決定し、酵素センサ部１２に印加する、さらに電流検知部で検知した電流を、演算加工し表示する役割を果たす。マイコン２０は、Ｄ／Ａ（デジタル／アナログ）変換と、Ａ／Ｄ（アナログ／デジタル）変換との両変換機能が内蔵されている。Ｄ／Ａ（デジタル／アナログ）変換機能は、予め決定されている酵素センサに印加する電圧を電圧走査部に印加するための電流をＤ／Ａ変換する役割を果たす。測定中、電圧走査部１６から、酵素センサには一連の電圧が走査されて印加される。Ａ／Ｄ変換機能は、検出される基質成分と酵素との反応により発生した電流をＡ／Ｄ変換する役割をする。電流検出部より検知された一定時間内の電流値は、マイコン中の演算機能により、印加電圧との関係において演算加工され、検体中の基質量として換算され、表示される。
【００２３】
電圧走査は、具体的には、酵素センサ部における対極の電圧を基準として測定極に電圧０Ｖから、予め設定した電圧（Ｅ１）までの一定の電圧走査速度（ｖ１）にて走査し、その後連続して、電圧（Ｅ１）から、電圧走査速度（ｖ１）と符号逆で絶対値が同一の電圧走査速度（ｖ２＝−ｖ１）で、予め設定した電圧（Ｅ２）まで走査して、測定電極電圧を供給することができる。
【００２４】
測定中、電圧走査部１６から酵素センサ部１２へは、電圧が一定範囲内で一定速度で変化するように常にマイコンで所定電圧がコントロールされ、マイコンからの電圧信号がアナログ変換されて印加されている。
【００２５】
次に、本発明の検体測定装置の操作手順を説明する。検出する体液等を浸潤させる酵素センサ部を準備する。酵素センサ部は、例えば、チップ状の酵素センサを、本発明にかかる検出装置の接続部１４に接続する。酵素センサ部１２が検体の液に浸漬され、検体の液が反応層に導かれると、被検成分と酵素との反応が開始され、被検成分の量に比例した電流ｉが発生する。この電流ｉは電流検出部１８で検出される。この値は、マイコン２０のＡ／Ｄ変換機能によりデジタル変換される。時系列的にデジタル変換して取り込まれた電流値から、ピーク電流または、電流積分値を算出する。この値が、マイコン内で、設定されたテーブルと比較され、検体中の基質量が決定され、測定値として表示されることとなる。
【００２６】
前記ブロック図１を更に詳細にした図２に基づいて、具体的に測定機構と測定手順を説明する。図２においては、図１の各機能部１４、１６、１８、２０に対応する電気回路を点線で囲み、相互の関係を表示してある。
【００２７】
酵素センサ部１２が、酵素センサ部の接続部１４に接続されると、マイコン２０の制御の下でＤ／Ａ変換器２２ａからバッファ２４ａを通過して所定電圧Ｐ１が出力される。
【００２８】
測定極と対極の間が検液で浸漬されると、電流ｉが流れる。この電流ｉを検出する。電流ｉを検出すると、マイコン２０の制御により測定極と対極との間の電圧印加が停止される。引き続き、一定時間、酵素が検液に溶解するまで、測定極と対極との間の電圧印加を停止する。
【００２９】
本発明においては、酵素センサに担持される酵素や電子受容体と基体との反応条件によるが、通常一定時間は、基質と酵素の反応時間に相当し、２秒〜１０秒である。一定時間経過後、マイコン２０の制御の下でＤ／Ａ変換器２２ａからバッファ２４ａを通過して所定電圧Ｐ１が出力される。もう１つのＤ／Ａ変換器２２ｂからバッファ２４ｂを通過して所定電圧Ｐ２が出力される。
【００３０】
酵素センサ部の対極（３ｄ）の電圧は、Ｐ１、測定極（３ｃ）の電圧は、Ｐ２であり、演算増幅回路２６ｃの−、＋端子は仮想短絡なので、酵素センサ部端子（外部端子３ｃ、３ｄ）には電圧（Ｐ２−Ｐ１）が与えられる。
【００３１】
酵素センサ部は導通状態にあるとき、酵素センサ部の基質検知部に電流ｉが流れる。この結果、抵抗ＲｘとコンデンサＣ１及び演算増幅器２６ｃとにより回路形成された電流電圧変換回路２８ｂの出力端子に、
Ｐｘ＝Ｐ２＋ｉ・Ｒｘ
の電圧が観測されることになる。
そして、ここで、Ｐ２が加算されるので、減算回路３０によりＰ２の電圧を除いた新たな電圧Ｐ３が出力される。
このＰ３は、
（Ｐｘ＋Ｐ４）−Ｐ２＝［（Ｐ２＋ｉ・Ｒｘ）＋Ｐ４］−Ｐ２＝ｉ・Ｒｘ＋Ｐ４
によって演算された値をとる。この演算式におけるＰ４は、グランド電圧であり、単電源駆動回路の場合には正電圧に設定される。
【００３２】
電流ｉに対応する電圧Ｐ３は、Ａ／Ｄ変換回路２２ｃにより、Ａ／Ｄ変換され、さらにマイコン２０により数値化される。
【００３３】
ここで、本発明の特徴は、上記装置において、電圧を走査する手段において、サイクリックボルタンメトリ法に従って、電圧をマイナスからプラスに反転またはプラスからマイナスへ反転させることである。上記Ｐ２−Ｐ１の電圧を、図３に示す。電圧に対し、検出電流は、曲線を描いてプロットされる。
【００３４】
本発明においては、電圧走査の手順に特徴を有する。すなわち、電圧（Ｐ２−Ｐ１）は、電圧印加開始時は０Ｖであり、一定の走査速度（単位：ｍＶ／ｓ）にて、対極を基準にして測定値に、０Ｖから電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経て予め設定した電圧（−Ｅ１）まで一定の速度で電圧走査した後、連続して対極を基準にして、大きさが同じで符号逆の電圧走査速度で、電子受容体のピーク電流を観測できる電圧を経て予め設定した電圧（Ｅ２＝Ｅ１）まで電圧走査を行うように設定される。
【００３５】
例えば、基質をグルコース、酵素をグルコースオキシターゼ、電子受容体をフェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−として、説明する。
【００３６】
（Ｐ２−Ｐ１）は電圧印加開始時０Ｖとし、一定の電圧走査速度にて、負に走査していくと、ある電圧からフェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−が測定極から電子を受け取る還元が起こる。
【００３７】
ピーク電流を観測できる電圧を経て−Ｅ１まで電圧走査される。その結果、測定極近傍においては、フェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−が増加する。
このとき、対極近傍においては、フェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−が対極に電子を渡す酸化が起こり、その結果、対極近傍においてフェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−が増加する。フェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−は、グルコースオキシターゼとの反応によって生成した量のみであり、フェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−になる量は有限であり、対極近傍のすべてのフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−が、フェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−に酸化される。
【００３８】
測定極にて増加するフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−は、対極にて減少したフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−と同量であり、その結果、測定極近傍では、グルコースオキシダーゼとグルコースの酵素反応にて生成したフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−の２倍のフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−が存在する。
【００３９】
Ｐ２−Ｐ１＝−Ｅ１Ｖから、上記と同様の電圧走査速度で、正に走査していくと、ある電圧からフェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−    が測定極に電子を渡す酸化が起こり、ピーク電流を観測できる電圧を経て、Ｅ２Ｖまで電圧走査される。その結果、測定極近傍において、フェリシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−が増加する。
【００４０】
本発明において、−Ｅ１Ｖまで反対方向に走査した理由は、ピーク電流が０Ｖ付近にあるためである。また、反対方向に走査することにより、フェロシアン［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−の量が約２倍に増加し、検出できる電流値が大きくなり、ノイズによる影響を受けても、検体ごとの数値化が精度良好に得られることとなる。なお、電圧の走査は、一旦マイナスに振ってからプラスに反転させても、まずプラスに振ってからマイナスに反転させても、同様の効果を得ることができる。
【００４１】
電圧と検出電流値を関連づけて、上記電圧−電流曲線により、検出される基質成分量を決定する。この決定方法には以下の２つの方法が挙げる。
【００４２】
一つの方法は、図３に示すように、Ｐ２−Ｐ１の電圧を０Ｖから−Ｅ１まで電圧走査するとき、−Ｅ１を経由した後、ピークが、立ち上がるまでは線形に推移する。
【００４３】
上記−Ｅ１からピークが立ち上がるまでの区間の接線と、最大値電流（ｉｍａｘ）が観測された電圧を通り、ｉ軸に平行な直線との交点をｉ０とする。ピーク電流は、
ｉｐ＝ｉｍａｘ−ｉ０
にて算出する。このピーク電流ｉｐと被検成分濃度は高い相関が得られる。
酵素活性は一般に温度依存性があるので、実際の測定温度でのピーク電流値ｉｐを基準温度でのピーク電流値ｉｐ０に補正する。温度補正はマイコン１００によりあらかじめ作成した温度補正テーブルを用いる。その後、マイコン１００により、ピーク電流ｉｐ０を予め作成した基準検量線に対比して、検出される基質の成分量を演算する。
【００４４】
他の方法は、図４に示すように、電圧（Ｐ２−Ｐ１）を０Ｖから−Ｅ１を経て、折り返しＥ１まで電圧走査するとき、−Ｅ１を経由した後、ピークが立ち上がるまでの区間の接線と、−Ｅ１からＥ１までの電圧走査により得られた電圧−電流曲線により囲まれた面積を電流面積値Ｓとする。この電流面積値と検体中の基質成分量は高い相関が得られる。
【００４５】
その後、マイコン２０により、電流積分値Ｓ０を、予め作成した基準検量線に対比して被検成分量を演算する。
【００４６】
以上のような機構により検液中の被検成分量が測定される。いずれによって決定された成分量も、基質濃度に直線的に対応する。図５（ａ）は、ピーク電圧とピーク電流の相関性を示す図、および図５（ｂ）は、ピーク電流と電流積分値との相関性を示す図である。これにより、ピーク電流とピーク電圧は相関し、さらに、ピーク電流と電流積分値も相関することがわかる。
【００４７】
電圧走査速度は、特には制限されないが、測定時間を短縮するためには、５０〜２００ｍＶ／ｓが好ましい。早くしすぎると、必要以上に出力電流が大きくなってしまう。出力電流が大きくなるに従い、ピーク電圧が大きくなる方向にシフトし、０．１５Ｖ以上のところにピーク電圧がくると、グルコース濃度と電流積分値に間の直線性が失われてしまう。この範囲においては、ピーク電流と走査速度は、相関性がある。図６は、ピーク電流と走査速度の関係を示したグラフであり、走査速度を５０、１００、２００ｍＶ／ｓで変化させた場合の走査速度の平方根に対しピーク電流の値をプロットしたものである。本発明においては、電圧走査速度は、一定範囲の電圧走査の過程において常に一定であることが、正確なピーク電流または電流積分値を得るのに必要である。
【００４８】
本発明において走査される電圧は、電圧０Ｖから、マイナスまたはプラスに振って、ピーク電流が観測されるピーク電圧を超えてから逆の電圧に走査することが本発明の特徴である。電子受容体にフェリシアン化カリウムを選択した場合には、走査される電圧は、好ましくは、−０．３Ｖ〜＋０．３Ｖ、特に好ましくは、−０．２Ｖ〜＋０．２Ｖである。この動作方法は、マイコンにおいて設定される。
【００４９】
上記得られたピーク電流値または電流積分値は、マイコンに含まれるＡ／Ｄ変換機能により、デジタル化される。ここで、酵素活性は一般に温度依存があるので、実際の測定温度でのピーク電流値または電流積分値は、基準温度でのピーク電流値または電流積分値に補正される。温度補正はマイコン２０によりあらかじめ作成した温度補正テーブルを用いる。
【００５０】
上記補正されたデジタル化されたピーク電流値または電流積分値は、マイコン内で予め作成されている基準測定値に対比され、検体中の基質の成分量が、決定される。決定された成分量は、表示手段により表示される。
【００５１】
以上、本発明について説明したが、本発明は、これらの実施の態様のみに限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲内で、当業者の知識に基づき、種々なる改良、変更、修正を加えた態様で実施しうるものである。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明の方法及びその装置の実施の形態を以下の実施例により詳しく説明する。
【００５３】
酵素センサおよび検体測定装置として図２に示す検体測定装置を用いた。
酸化還元酵素：グルコースオキシターゼ（東洋紡績株式会社製  活性１６５ユニット（ｕ）／ｍｇ）、電子受容体：純フェリシアン化カリウム（株式会社ナカライテスク製）を、微細結晶セルロース溶液：ゼオラスクリーム（旭化成工業株式会社製  ＦＰ−０３で結晶セルロース１０ｗｔ％）水溶液に溶解したものを、ＰＥＴフィルムに滴下乾燥し、酵素センサの反応層として用いた。
【００５４】
電圧走査は、以下のようにして行った。Ｐ２−Ｐ１は、電圧印加開始時は０Ｖであり、５０ｍＶ／ｓの電圧走査速度にて、負に走査し、ピーク電流を観測できる電圧：Ｐ２−Ｐ１＝−０．２Ｖから、５０ｍＶ／ｓの電圧走査速度にて、正に走査し、ピーク電流を観測できる電圧を経て、０．２Ｖまで、電圧走査した。
【００５５】
【実施例１】
検体として濃度１００ｍｇ／ｄＬグルコース標準液を調製した。サンプルをグルコース標準液とし、酵素センサチップの吸入口からグルコース標準液を５μＬを注入したサンプルを３個作製した（サンプル１−１）（サンプル１−２）（サンプル１−３）。溶解時間４秒とし、この時間経過後直ちに、電圧走査を行った。走査方式１００ｍＶ／ｓで、電圧を０Ｖから−０．２Ｖにした後、同一の走査方式により−０．２Ｖから＋０．２Ｖに変化させた。（サンプル１−１）のピーク電圧およびピーク電圧時の測定電流は、−０．０６Ｖで−２０．２μＡ、０．０７５Ｖで＋３４．８μＡであった。
（サンプル１−２）のピーク電圧およびピーク電圧時の測定電流は、−０．０６Ｖで−２２．２μＡ、０．０７５Ｖで＋３３．９２μＡであった。（サンプル１−３）のピーク電圧およびピーク電圧時の測定電流は、−０．０６Ｖで−２２．２μＡ、０．０７５Ｖで＋３３．４３μＡであった。
【００５６】
【実施例２】
サンプルを実施例１で調製したグルコース標準液とし、酵素センサチップの吸入口からグルコース標準液５μＬを注入したサンプルを２個作製した（サンプル２−１）（サンプル２−２）。溶解時間８秒とし、この時間経過後直ちに、電圧走査を行った。走査方式５０ｍＶ／ｓで、電圧を０Ｖから−０．２Ｖにした後、同一の走査方式により−０．２Ｖから＋０．２Ｖに変化させた。
（サンプル２−１）のピーク電圧およびピーク電圧時の測定電流は、−０．０８Ｖで−１６．８４μＡ、０．０４５Ｖで＋２４．４μＡであった。（サンプル２−２）のピーク電圧およびピーク電圧時の測定電流は、−０．０５５Ｖで−１６．８４μＡ、０．０７Ｖで＋２５．３８μＡであった。
【００５７】
上記測定電流から電流積分値を求め、以下の式により、ＣＶ値を求めた。
【００５８】
【数１】
2005017183.tif 000003
【００５９】
結果を表１に示す。表１は、実施例１，２の電流積分値、グルコース濃度０ｍｇ／ｄｌの電流積分値の平均値との差、および標準偏差、上記数１により求めたＣＶ値を示す。ＣＶ値は、３％以下であり、精度が良好であることがわかった。なお、表２は、グルコース濃度０ｍｇ／ｄｌの蒸留水での電流積分値を標準１−１，１−２，２−１，２−２として求めた表である。
【００６０】
【表１】
2005017183.tif 000004
【００６１】
【表２】
2005017183.tif 000005
【００６２】
【実施例３】
グルコース濃度をそれぞれ、１ｍｇ／ｄｌ、１９９ｍｇ／ｄｌ、４４５ｍｇ／ｄｌ、６６０ｍｇ／ｄｌ、９０１ｍｇ／ｄｌとしたサンプルを準備し、これらを５μＬを注入したサンプルを５個作製した。溶解時間８秒とし、この時間経過後直ちに、電圧走査を行った。走査方式５０ｍＶ／ｓで、電圧を０Ｖから−０．２Ｖにした後、同一の走査方式により−０．２Ｖから＋０．２Ｖに変化させた。これらのサンプルの検出電流値から、電圧との電流積分値を求めた。電流積分値を表３に記載する。
【００６３】
【比較例１】
グルコース濃度をそれぞれ、１ｍｇ／ｄｌ、１９９ｍｇ／ｄｌ、４４５ｍｇ／ｄｌ、６６０ｍｇ／ｄｌ、９０１ｍｇ／ｄｌとしたサンプルを準備し、これらを５μＬを注入したサンプルを５個作製した。溶解時間８秒とし、この時間経過後直ちに、電圧走査を行った。走査方式５０ｍＶ／ｓとし、電圧を−０．５Ｖから＋０．２Ｖに変化させた。これらのサンプルの検出電流値から、電圧との電流積分値を求めた。電流積分値を表３に記載する。なお、比較例１は、特開平２００１−３１１７１２号公報に開示される方法で測定したものである。
【００６４】
【表３】
2005017183.tif 000006
【００６５】
図７に、実施例３及び比較例１とを、Ｘ軸をグルコース濃度、Ｙ軸を電流積分値とした座標のグラフで示した。比較例１が、グルコース濃度６００ｍｇ／ｄｌから直線性を失い、曲線を描くのに対し、本願発明の方法および装置による実施例３は、グルコース濃度１０００ｍｇ／ｄｌまで、直線性を保持することができることがグラフより解る。
【００６６】
【発明の効果】
従来の定電圧法、電圧走査法に比較して、高感度で検液中の被検成分量が測定でき、濃度の増加に対しても、精度良く直線性を保持することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を実施するための装置のブロック図である。
【図２】本発明を実施するための装置の回路図である。
【図３】電圧電流曲線から、ピーク電流値を求める方法を示す。
【図４】電圧電流曲線から、電流積分値を求める方法を示す。
【図５】図５（ａ）は、ピーク電圧とピーク電流の相関性を示すグラフであり、図５（ｂ）は、ピーク電流と電流積分値との相関性を示すグラフである。
【図６】走査速度の平方根とピーク電流との関係を示すグラフである。
【図７】実施例３と比較例１のグルコース濃度に対する電流積分値を示すグラフである。
【図８】一般に用いられている酵素センサの一例である。
【符号の説明】
１０；本発明の検体測定装置
１２；酵素センサ部
１４；検体測定装置の接続部
１６；電圧走査部
１８；電流検出部
２０；マイクロコンピュータ
２２ａ、２２ｂ；Ｄ／Ａ変換器
２２ｃ；Ａ／Ｄ変換器
２４ａ，２４ｂ；バッファ
２６ｃ；演算増幅回路
２８ｂ；電流電圧変換回路
１００；基本的な酵素センサ
１０２；電気絶縁性基板
１０４；測定極
１０６；対極
１０８；反応層
１１０；電気絶縁スペーサ
１１２；外面カバー
１１４；検体吸入口
【図１】
2005017183.tif 000007
【図２】
2005017183.tif 000008
【図３】
2005017183.tif 000009
【図４】
2005017183.tif 000010
【図５】
2005017183.tif 000011
【図６】
2005017183.tif 000012
【図７】
2005017183.tif 000013
【図８】
2005017183.tif 000014