(57)【要約】 【課題】  移植における免疫拒絶反応を抑制し、かつ、保管性、入手性および有効期限の問題を解消し、緊急の移植手術をも可能にする。【解決手段】  温度感受性物質を内面に塗布した培養容器内において、幹細胞を分化させることにより細胞外基質を生成させる培養ステップＳ１と、所定温度以下に冷却して温度感受性物質を液化させる冷却ステップＳ２と、液化した温度感受性物質内に細胞外基質を含有する懸濁液を回収する回収ステップＳ３と、細胞を死滅させる処理ステップＳ４とを備える生体組織形成促進材の製造方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の温度以上でゲル化し、それより低い温度で液化する温度感受性物質と、細胞外基質とを混合してなる生体組織形成促進材。
【請求項２】
温度感受性物質を内面に塗布した培養容器内において、幹細胞を分化させることにより細胞外基質を生成させる培養ステップと、
所定温度以下に冷却して温度感受性物質を液化させる冷却ステップと、
液化した温度感受性物質内に細胞外基質を含有する懸濁液を回収する回収ステップと、
細胞を死滅させる処理ステップとを備える生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項３】
処理ステップが、細胞を凍結させるステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項４】
処理ステップが、細胞に超音波を照射するステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項５】
処理ステップが、細胞に放射線を照射するステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項６】
処理ステップが、細胞に界面活性剤を作用させるステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項７】
処理ステップが、細胞を減圧状態に配するステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項８】
処理ステップが、細胞を酸性液に浸漬するステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項９】
処理ステップが、細胞を加熱するステップである請求項２に記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【請求項１０】
冷却ステップの前に、培養容器内部を洗浄する洗浄ステップを備える請求項２から請求項９のいずれかに記載の生体組織形成促進材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織形成促進材とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、培養骨を移植する患者以外の第三者から採取した幹細胞を使用して培養骨を製造する場合、免疫拒絶反応を引き起こす不都合がある。免疫拒絶反応は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）が一致する場合には抑制することができるが、その確率は非常に小さいため、ＨＬＡが一致する幹細胞のドナーを捜すことは困難である。
【０００５】
一方、ＨＬＡが一致しないドナーから提供された幹細胞を用いて製造された培養骨を移植する場合には、免疫拒絶反応を抑制するために免疫抑制剤を投与し続ける必要があり、継続的な投与は患者に、身体的、経済的に大きな負担を強いることになるので好ましくない。
また、培養骨は、生きた状態の細胞を含んでいるため、保管性、入手性、有効期間などの問題があり、また、所定の培養期間を経なければ製造できないので緊急の移植手術には対応できないというデメリットがある。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、移植における免疫拒絶反応を抑制し、かつ、保管性、入手性および有効期限の問題を解消し、緊急の移植手術をも可能にする生体組織形成促進材とその製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、所定の温度以下で液化する温度感受性物質と細胞外基質とを混合してなる生体組織形成促進材を提供する。
この発明によれば、所定の温度以下に設定することにより、温度感受性物質が液化する結果、生体組織形成促進材が流動可能になる。この状態で生体組織形成促進材を患部に充填することにより、患部の形態に合わせて容易に充填することができる。生体組織形成促進材は、温度感受性物質を含んでいるので、患部に充填されるとゲル化させられて患部に固定される。内部に細胞外基質が混合されているので、生体組織形成促進材の周囲の細胞の成長が促進され、患部を迅速に修復することが可能となる。
【０００８】
そして、本発明に係る生体組織形成促進材は、リン酸カルシウム多孔体のような生体組織補填材と混合して生体に移植することにより、含有されている細胞外基質の作用によって、周囲の生体組織における生体組織形成作用を促進し、生体組織補填材を足場として迅速に患部を修復させることが可能となる。
さらに、製造された生体組織形成促進材を他の細胞の培養容器内面に塗布し、その上で細胞を培養することにより、細胞外基質等の産生物質の作用によって細胞の増殖や分化を促進することが可能となる。
【０００９】
また、本発明は、温度感受性物質を内面に塗布した培養容器内において、幹細胞を分化させることにより細胞外基質を生成させる培養ステップと、所定温度以下に冷却して温度感受性物質を液化させる冷却ステップと、液化した温度感受性物質内に細胞外基質を含有する懸濁液を回収する回収ステップと、細胞を死滅させる処理ステップとを備える生体組織形成促進材の製造方法を提供する。
【００１０】
この発明によれば、温度感受性物質を内面に塗布した培養容器内において幹細胞を培養することにより、幹細胞が分化させられ、培養容器内面の温度感受性物質上に細胞外基質が接着状態に生成される。この細胞外基質をはじめとして、幹細胞が分化するときに産生される物質は、免疫拒絶反応を生ずるものではなく、生体組織の形成作用を促進する性質を有している。一方、幹細胞をはじめとする各種細胞は、免疫拒絶反応を生じさせる原因となる。そこで、細胞を死滅させ、細胞外基質をはじめ各種産生物質を回収することにより、生体組織形成促進材が製造される。
【００１１】
この場合において、本発明によれば、培養容器を所定温度以下に冷却することにより、温度感受性物質が液化させられるので、その表面に付着していた細胞外基質等の産生物質が、液化した温度感受性物質とともに培養容器の内面から剥離される。したがって、細胞外基質等の産生物質を物理的に損傷させることなく容易に回収することができる。
【００１２】
上記発明においては、処理ステップが、細胞を凍結させるステップであることとしてもよい。本発明によれば、細胞を凍結させることにより、細胞膜内の水分が凍結して膨張し、または、氷塊が生成されることにより細胞膜が破壊され、細胞を簡易に死滅させることができる。
【００１３】
また、上記発明においては、処理ステップが、細胞に超音波を照射するステップであることとしてもよい。この発明によれば、超音波により細胞内の水分を振動させて細胞膜を破壊し、細胞を簡易に死滅させることが可能となる。
さらに、上記発明においては、処理テップが、細胞に放射線を照射するステップであることとしてもよい。この発明によれば、放射線のエネルギによって細胞内の核等の細胞内組織が破壊され、細胞を容易に死滅させることができる。
【００１４】
また、処理ステップが、細胞に界面活性剤を作用させるステップであることとしてもよい。この発明によれば、界面活性剤の作用により細胞膜が破壊され、細胞を容易に死滅させることができる。
また、処理ステップが、細胞を減圧状態に配するステップであることとしてもよい。
この発明によれば、細胞内部への浸透圧が高まり、細胞膜を破壊して細胞を容易に死滅させることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、処理ステップが、細胞を酸性液に浸漬するステップであることとしてもよい。この発明によれば、酸性液内に含有される非解離型分子が細胞内に取り込まれるため、細胞内の代謝によって水素イオンが増加して細胞自体が変性する。その結果、細胞を容易に死滅させることができる。
また、上記発明において、処理ステップが細胞を加熱するステップであることとしてもよい。細胞を加熱することにより、細胞自体を熱により変性させて死滅させることができる。
【００１６】
さらに、本発明は、上記発明において、冷却ステップの前に、培養容器内部を洗浄する洗浄ステップを備える生体組織形成促進材の製造方法を提供する。
この発明によれば、冷却ステップにより温度感受性物質が液化される前に培養容器内部を洗浄することによって、赤血球等、幹細胞の成長促進に不要な物質を簡易に除去することができる。また、冷却ステップに先立って処理ステップを行った場合には、処理ステップにおいて使用された界面活性剤や酸性液等の細胞に有害な物質を簡易に除去することができる。その結果、細胞の形成促進に不要な不純物を低減した生体組織形成促進材を製造することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る生体組織形成促進材によれば、患部への適用時には、その流動性により、患部の形状に合わせた任意の形態で容易に充填することを可能とし、充填後には、温度感受性物質をゲル化させることにより、患部に定着させることが可能となる。そして、内部に含有されている細胞外基質を周囲の細胞に作用させることにより、細胞による生体組織形成作用を促進して、迅速に患部を修復することができるという効果を奏する。また、自家細胞を使用する必要がないので、免疫拒絶反応を引き起こす不都合がない。さらに、生きた細胞を保有していないので、保管性、入手性にも優れ、予め大量に製造しておくことができる。そして、移植手術に際して、培養期間を考慮する必要がないので、緊急時にも適用することができるという効果がある。
【００１８】
また、本発明に係る生体組織形成促進材の製造方法によれば、上記生体組織形成促進材を、内部に含有される細胞外基質その他の産生物質を物理的に損なうことなく容易に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の一実施形態に係る生体組織形成促進材とその製造方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織形成促進材は、例えば、骨組織を形成する骨形成促進材であって、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化するときに産生する細胞外基質その他の産生物質を、温度感受性物質に混合したものである。
温度感受性物質は、例えば、温度感受性高分子（ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド誘導体）と、親水性高分子（ポリエチレングリコール誘導体）の共重合体、あるいは温度応答性キトサンであり、３０℃以下で急速に親水性を呈して液化する一方、３４℃を超えるとゲル化し、急速に疎水性を呈する性質のものである。なお、１５℃以下で液化し、２５℃以上でゲル化するメビオールジェル（メビオール株式会社製）を用いてもよい。（ご確認ください）
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る生体組織形成促進材によれば、低温状態に保持することにより、温度感受性物質をゾル状に液化させておくことができるので、流動性を有し、任意の形態の患部、例えば、腫瘍等を摘出した後の骨欠損部に容易に注入して充填することができる。患部に充填された後の生体組織形成促進材は、患者の体温によって３７±０．５℃程度に維持されるので、温度感受性物質がゲル化して、患部に充填された状態に定着する。
【００２１】
そして、生体組織形成促進材には、細胞外基質その他の産生物質、例えば、ＭＢＰ（Maltose Binding
Protein）等が含有されているので、これらの産生物質が骨欠損部周囲の細胞に作用して、骨形成作用を促し、早期に患部を修復することが可能となる。したがって、緊急を要する治療の場合においても、患部に補填して、患部に配されている周囲の細胞を活性化させることで、患部の迅速な修復を行わせることができる。
【００２２】
本実施形態に係る生体組織形成促進材によれば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化するときに産生した細胞外基質を含み、生きた細胞を含まないので、免疫拒絶反応を考慮する必要がなく、また、保管性、入手性に優れている。特に、患者から採取した間葉系幹細胞を使用する必要がないので、予め大量に製造しておくことができる。したがって、移植手術に際して、培養時間を考慮する必要がなく、緊急の場合にも迅速に対応することができるという効果がある。
なお、生体組織形成促進材には、顆粒状のβーリン酸三カルシウム多孔体のような骨補填材をいっしょに混合しておいてもよい。これにより、骨補填材を足場として、骨芽細胞を成長させることができ、骨欠損部の修復をさらに迅速に行うことができる。
【００２３】
次に、この発明の一実施形態に係る生体組織形成促進材の製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織形成促進材の製造方法は、骨形成促進材の製造方法であって、温度感受性物質を内面に塗布した培養容器内において、幹細胞を分化させることにより細胞外基質を生成させる培養ステップＳ１と、所定温度以下に冷却して温度感受性物質を液化させる冷却ステップＳ２と、液化した温度感受性物質内に細胞外基質を含有する懸濁液を回収する回収ステップＳ３と、細胞を死滅させる処理ステップＳ４とを備えている。
【００２４】
温度感受性物質は、上述した生体組織形成促進材に用いたものと同じである。温度感受性物質は、３４℃以下ではゾル状であるので、それ以下の温度に冷却して培養容器に流し込んだ後に、３７℃まで昇温することによりゲル化させて、容易に培養容器の内面にコーティングすることができる。
【００２５】
培養ステップＳ１においては、上記により準備した培養容器内に、間葉系幹細胞を投入して、所定の培地とともに培養条件下に配することにより、間葉系幹細胞を成長させる。培地は、ＭＥＭ（Minimal Essential
Medium：最小必須培地）やＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）であり、骨芽細胞へ分化させるための分化誘導因子、例えば、デキサメタゾンやβグリセロフォスフェートやアスコルビン酸等、およびビタミンＣのような栄養剤を投入しておくことにより、間葉系幹細胞は骨芽細胞に分化させられる。この状態で、例えば、２週間培養し続ける。
間葉系幹細胞は、骨芽細胞に分化するときに、細胞外基質、カルシウム、ＢＭＰ等を産生しながら成長する。培養容器の底面には温度感受性物質がコーティングされているので、細胞外基質その他の産生物質は、温度感受性物質に付着することになる。
【００２６】
次いで、冷却ステップＳ２においては、培養ステップＳ１において培養された細胞を、培養容器ごと、例えば、３０℃に冷却する。これにより、温度感受性物質が親水化してゾル化し、骨芽細胞および細胞外基質等の産生物質は、ゾル化した温度感受性物質内に懸濁状態に混合される。
【００２７】
回収ステップＳ３においては、上記の冷却ステップＳ２において生成された骨芽細胞と、細胞外基質その他の産生物質と、温度感受性物質との懸濁液を、回収容器に回収する。骨芽細胞は、培養容器の底面に接着することなく、底面に塗布された温度感受性物質からなるコーティングに接着して成長し、産生する細胞外基質等の産生物質もコーティングに付着していたため、温度感受性物質が親水化してゾル化することにより、骨芽細胞およびその産生物質も温度感受性物質とともに培養容器から剥がれている。したがって、回収時には、特に、剥離させる力を物理的にかけることもなく、また、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を供給することもなく、培養容器から容易に剥離させて回収容器に回収することができる。
【００２８】
前記処理ステップＳ４は、例えば、回収容器内に収容されている骨芽細胞、細胞外基質および温度感受性物質の懸濁液に対して、例えば、１５〜５０Ｇｙのγ線を照射するステップである。γ線を照射することにより、懸濁液の内部に含有されている骨芽細胞が、γ線のエネルギによって死滅する。したがって、懸濁液中には、免疫拒絶反応を生じさせる生きた細胞が存在しなくなり、そのまま、骨芽細胞を採取した患者とは異なる患者に供給することが可能となる。
【００２９】
なお、図２に示されるように、培養ステップＳ１後、冷却ステップＳ２前に洗浄ステップＳ５を挿入してもよい。洗浄ステップＳ５は、培養により栄養分の失われた培地等の不要な成分をＰＢＳ（リン酸緩衝化水溶液）等によって洗浄するステップであり、これにより、回収される懸濁液内から不要成分を除去することができる。
【００３０】
このように、本実施形態に係る生体組織形成促進材の製造方法によれば、免疫拒絶反応を生じさせることなく、患部の修復を迅速に行うことができる生体組織形成促進材を簡易に、かつ、迅速に製造することができるという効果がある。
また、このようにして製造された生体組織形成促進材は、内部に生きた細胞を含んでいないので、長期にわたり保管することが可能となり、それによって、高い入手性を達成することができる。
【００３１】
なお、上記実施形態においては、処理ステップＳ４として、γ線を照射する方法を採用したが、これに代えて、γ線以外の他の電子線等の放射線を照射することにしてもよい。
また、放射線を照射する方法に代えて、懸濁液をー２０℃程度に冷却して凍結させる方法を採用してもよい。これによれば、凍結により骨芽細胞の細胞膜内部の組織液を膨張させて細胞膜を破壊し、同様に骨芽細胞を死滅させることができる。また、氷塊が生成されることによって細胞膜が損傷しても、骨芽細胞によって産生された骨基質などの産生物質は変質することなく、懸濁液内に維持される。そして、凍結後、室温にて徐々に解凍し、あるいは電子レンジにより解凍することにより、上記生体組織形成促進材が製造されることになる。
【００３２】
また、上記方法に代えて、懸濁液に超音波（例えば、４７ｋＨｚ）を間欠的に照射することにしてもよい。このとき、超音波照射による発熱で、懸濁液内のタンパク質等が変質することを防止するために、懸濁液を冷却してもよい。これにより、上記と同様に、骨芽細胞に振動を与えて死滅させることができる。
【００３３】
また、上記方法に代えて、懸濁液を減圧処理することにしてもよい。懸濁液を真空乾燥装置に収容して、約１２０Ｐａ程度の圧力に減圧する。これにより骨芽細胞内への浸透圧が高まり、細胞膜が破壊されて骨芽細胞が死滅することになる。
【００３４】
また、上記方法に代えて、懸濁液を高温槽に挿入して１分間に１℃程度の温度上昇で６３℃まで昇温した後に、３０分間の保持を行う低温長時間殺菌法（ＬＴＬＴ）処理を行うことにしてもよい。これにより、骨芽細胞を死滅させることができる。なお、７２℃まで昇温した後に、１５秒間保持する高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ）によってもよい。
【００３５】
また、本実施形態に係る製造方法においては、懸濁液を冷却して回収容器に回収してから細胞を死滅させる処理ステップＳ４を行っているが、これに代えて、図３に示されるように、培養ステップＳ１直後の培養容器底面の温度感受性物質からなるコーティングに骨芽細胞やその産生物質が付着している状態で、骨芽細胞を死滅させる処理ステップＳ４を行ってもよい。
【００３６】
また、このようにすることで、図４に示されるように、処理ステップＳ４後に、死滅した骨芽細胞や、培養により栄養分の失われた培地等の不要な成分をＰＢＳ等によって洗浄する洗浄ステップＳ５を行うことが効果的となる。そして、洗浄ステップＳ５によって洗浄した後に冷却ステップにより温度感受性物質をゾル化させることによって、不要な成分を含まない懸濁液を製造することができる。
【００３７】
そして、このように、洗浄ステップＳ５を行うことを可能にすると、処理ステップＳ４としては、上記方法に代えて、懸濁液に界面活性剤を供給する方法を採用することができる。界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレンアルキルエーテルの内の少なくとも１つあるいはこれらの混合物が適している。具体的には、０．５％濃度のＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業製）を含有するＰＢＳを供給する。これにより骨芽細胞の細胞膜等が、界面活性剤によって破壊されて骨芽細胞が死滅する。界面活性剤を非イオン性とすることにより骨基質等の変質を抑制することができる。
【００３８】
この場合、処理ステップＳ４後に、洗浄ステップＳ５を行って、ＰＢＳによりリンスして界面活性剤を洗い流すことが必要となる。このようにすることで界面活性剤を含まない生体組織形成促進材を製造することができる。
なお、界面活性剤として、トリトンＸ−１００（和光純薬工業製）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業製）を用いてもよい。
【００３９】
また、上記方法に代えて、懸濁液を酸溶液、例えば、ｐＨ４〜６程度の酢酸溶液に浸漬することにしてもよい。これにより、酢酸溶液内の非解離型分子が骨芽細胞の細胞膜を通過して細胞内に侵入するため、細胞の代謝によって水素イオンが増加して細胞が自ら変質して死滅する。その後、炭酸カルシウム水溶液等のアルカリ溶液によって中和し、あるいは洗浄ステップによって洗浄することにより、上記と同様、酸溶液を含まない生体組織形成促進材を製造することができる。
【００４０】
なお、上記実施形態に係る生体組織形成促進材とその製造方法においては、骨組織を修復するために使用する骨形成促進材を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、他の任意の生体組織の修復に使用される生体組織形成促進材に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織形成促進材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の製造方法の変形例を示すフローチャートである。
【図３】図１の製造方法の他の変形例を示すフローチャートである。
【図４】図１の製造方法のさらに他の変形例を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００４２】
Ｓ１  培養ステップ
Ｓ２  冷却ステップ
Ｓ３  回収ステップ
Ｓ４  処理ステップ
Ｓ５  洗浄ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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