(57)【要約】【課題】  ユビキチン化経路を調節可能な物質を、効率よく探索できるプロテインチップ、及び、このプロテインチップを用いたユビキチン化経路を調節可能な物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  ユビキチン化経路を調節可能な調節物質をスクリーニングすべく、異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）を、基板上の複数の異なる位置に配置させたユビキチン結合酵素固定化プロテインチップ、および、その利用方法。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチン化経路を調節可能な調節物質をスクリーニングすべく、異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）を、基板上の複数の異なる位置に各別に配置させたユビキチン結合酵素(Ｅ２)固定化プロテインチップ。
【請求項２】
前記基板が、ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化されてある、請求項１に記載のユビキチン結合酵素（Ｅ２）固定化プロテインチップ。
【請求項３】
前記酵素を固定化した基板が、更に、ブロッキング剤の添加によりブロッキング処理が施されてあり、前記ブロッキング剤が１０〜５０ｍＭのＤＴＴを含有する、請求項１又は２に記載のユビキチン結合酵素（Ｅ２）固定化プロテインチップ。
【請求項４】
異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）を基板上の複数の異なる位置に配置させてＥ２固定化プロテインチップを作製するタンパク質プリント工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップに、標識化ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を含むユビキチン化試薬（ＵＢＭ）の存在下で、前記試験物質を接触させる接触工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップを洗浄して前記Ｅ２固定化プロテインチップ上の反応後のユビキチン化試薬（ＵＢＭ）及び、試験物質を除去する洗浄工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップ上のユビキチン結合酵素（Ｅ２）と結合した標識化ユビキチンのシグナルを検出する検出工程とを有し、
試験物質を接触させないユビキチン結合酵素（Ｅ２）におけるシグナルと比較して、前記異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）夫々に対する前記試験物質によるシグナル強度の変化を見て、ユビキチンがユビキチン活性化酵素（Ｅ１）からユビキチン結合酵素（Ｅ２）にトランスファーするのを制御することによりユビキチン化経路を調節する調節物質としての特性を調べ、所定の調節物質のスクリーニングに使用する、
ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記基板が、ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化されてある、請求項４に記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記標識化ユビキチンが、ビオチン化標識ユビキチンである、請求項４又は５に記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記ビオチン化標識ユビキチンを、１〜２０μＭ添加する、請求項６に記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を、２．５〜２５０ｎＭ添加する、請求項４〜７のいずれかに記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記洗浄工程を、ＳＤＳの存在下で行う、請求項４〜８のいずれかに記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記タンパク質のプリント工程の後、前記接触工程を施す前の基板に、ブロッキング剤を添加するブロッキング工程を施し、前記ブロッキング剤が１０〜５０ｍＭのＤＴＴを含有する、請求項４〜９のいずれかに記載のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質をスクリーニングするためのユビキチン結合酵素固定化プロテインチップ、及び、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは、７６アミノ酸残基からなる真核生物に普遍的に存在するタンパク質であり、タンパク質のユビキチン化はタンパク質の翻訳後修飾であり、タンパク質分解の標識反応であることが知られている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００３】
図１は、ユビキチン化経路を模式的に図示した図である。ユビキチン化反応には３種類の酵素、つまり、ユビキチン活性化酵素（以下、Ｅ１と略することがある。）、ユビキチン結合酵素（以下、Ｅ２と略することがある）、及び、ユビキチンリガーゼ（以下、Ｅ３と略することがある。）が関与している（例えば、非特許文献２を参照。）。Ｅ１は、単一の分子であるが、Ｅ２及びＥ３は、分子多様性があることが知られている。例えば、酵母では、１０種類以上のＥ２が同定されている。
Ｅ２は、通常、複数のＥ３と相互作用すると考えられ、Ｅ３は類似の認識部位を有する複数の異なった基質タンパク質と相互作用する。
【０００４】
タンパク質のユビキチン化は、まず、ユビキチンはＡＴＰの加水分解を伴ってＥ１によって活性化され、Ｅ１の活性ＳＨ基にチオエステル結合する。次に、ユビキチンはＥ２の活性ＳＨ基にトランスファーされ、Ｅ３によって認識される標的タンパク質のリジン側鎖のε−アミノ基とユビキチンのカルボキシル基とがイソペプチド結合する。そして、タンパク質にイソペプチド結合した第一ユビキチンに第二ユビキチンが結合するサイクルが繰り返されるポリユビキチン化によりマルチユビキチン鎖が結合したタンパク質は、ＡＴＰ依存性プロテアーゼである２６Ｓプロテアソームの標的タンパク質となり、特異的に認識され、分解される。
【０００５】
このようなタンパク質のユビキチン化からプロテアソームによるタンパク質分解に至るユビキチン化経路による標的タンパク質分解が、代謝のホメオスタシス、タンパク質合成における転写および翻訳、情報伝達、細胞周期、腫瘍形成等の種々の生物、生命活動の場で広範な役割を担っている（例えば、非特許文献３を参照のこと。）
このユビキチン化経路によって分解され得る細胞内の標的タンパク質の一例としては、細胞をガン化するタンパク質であるオンコプロテイン（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）等がある。
そのため、このユビキチン化経路が崩壊する（標的タンパク質の急速な分解、標的タンパク質分解量の減少）と、癌、筋萎縮、アルツハイマー病およびパーキンソン病等の神経変性疾患、免疫性および炎症性の応答疾患等の種々の疾患を引き起こす原因になると考えられている（例えば、非特許文献４を参照のこと。）。
つまり、このユビキチン化経路を調節できる物質（例えば、人体にとって有害なタンパク質を正常な崩壊に導けるようにユビキチン化経路を調節する物質）であれば、上述した癌、神経変性疾患等の種々の疾患を治療、予防する薬物となり得る。そのため、近年、このような調節物質（新薬候補物質）を探索することが行われている。
ユビキチン化経路を調節できるポイントとして、例えば、以下の３つが挙げられる（図１参照）。
（１）Ｅ１からＥ２への転移
（２）Ｅ３による標的タンパク質の認識
（３）プロテアソームの標的タンパク質認識
【０００６】
そして、上述した調節物質（新薬候補物質）を探索するために、従来においては電気泳動の手法が採用されていた。
例えば、従来法に基づいて、上記（１）の調節ポイントにおける調節物質（新薬候補物質）を探索する場合を以下に述べる。
（Ａ）Ｅ１、Ｅ２、及び、ユビキチン（以下、Ｕｂと略する場合がある）を反応させると、Ｅ１−Ｕｂ複合体、Ｅ２−Ｕｂ複合体が形成され、Ｅ１、Ｅ２，Ｕｂを含む５種類のタンパク質（複合体）が存在することになる。そしてこれらタンパク質（複合体）を定法に従い電気泳動すると、５種類のタンパク質（複合体）は移動度が異なるため、ゲル中にて分離することができ、バンドを可視化して確認することができる。
（Ｂ）次に、Ｅ１、Ｅ２、Ｕｂに加えて新薬候補物質（有機化合物、タンパク質等）、を反応させ、これを（Ａ）の時と同様に電気泳動にて確認する。
このとき、（Ａ）で得られた電気泳動のバンドパターンと比較して、（Ａ）の新薬候補物質がない条件で反応させた場合に比べて、Ｅ１−Ｕｂ複合体、或いは、Ｅ２−Ｕｂ複合体の生成量が異なっていると判断されれば、この新薬候補物質は、Ｅ１とＵｂ、及び、Ｅ２とＵｂの結合を調節できる物質、つまり、ユビキチン化経路を調節できる物質であると認められる。
【０００７】
上記（２）及び（３）の調節ポイントにおいても、上述した電気泳動の手法を用いてユビキチン−プロテアソーム経路の調節物質（新薬候補物質）の探索を実行していた。
【０００８】
【非特許文献１】Wilkinson, K.D.,他「ユビキチンは、ウサギ網状赤血球のＡＴＰ依存タンパク質分解因子である。（Ubiquitin is the ATP-dependent proteolysis factor of rabbit reticulocytes.）」  １９８０年  J. Biol. Chem. 255, 7529-7532）
【非特許文献２】Scheffner, M.,他「Ｅ１−Ｅ２−Ｅ３酵素ユビキチンチオエステルカスケードを含むタンパク質のユビキチン化。（Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade.）」  １９９５年  Nature 373, 81-83）
【非特許文献３】hershko, A.,他「ユビキチンシステム。（The ubiquitin system.）」  ２０００年  Nature medicine Volume 6, Number 10, 1073-1081）
【非特許文献４】Ciechanover, A.,「ユビキチン−タンパク質分解システムとヒト疾患の要因：メカニズム−ベースの薬物標的化のための新規なプラットフォーム。（The ubiquitin-proteolytic system and pathogenesis of human diseases: a novel platform for mechanism-based drug targeting.）」  ２００３年  Biochem Soc Trans, 31(2):474-481
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、Ｅ２及びＥ３は、分子多様性があるため、電気泳動の手法を利用して新薬候補物質を探索するには、例えば、Ｅ２の種類と、新薬候補物質の数との組み合わせに応じた電気泳動の実験を行う必要があった。
また、Ｅ１、Ｅ２、及び、Ｕｂを反応させる工程や、電気泳動工程など、煩雑な工程を要するため、手間と時間がかかり、迅速に実験結果を得るのは困難であった。
【００１０】
また、薬の服用者の遺伝子レベルの違いによる体質などの要因により薬の効果が各服用者によって異なる場合があるため、近年、服用者に合った薬剤（テーラーメイド医薬）を調合することが望まれている。この場合、各服用者に適合した薬剤を迅速に調合できれば、疾患が進行する前に投薬可能となるため好ましい。
そのため、各服用者に適合した新薬候補物質の探索を効率よく行うことが望まれている。
【００１１】
従って、本発明の目的は、ユビキチン化経路を調節可能な物質を、効率よく探索できる手段、及び、その手段を用いたユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究したした結果、Ｅ２の生物活性を損なうことなくＥ２を基板上に固定化したＥ２固定化プロテインチップを構築することに成功した。そして、更に鋭意研究を重ねた結果、Ｅ２の生物活性を感度良く、かつ、網羅的に検出できるストラテジーを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
つまり、上記目的を達成するための本発明の第１特徴構成は、
ユビキチン化経路を調節可能な調節物質をスクリーニングすべく、異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）を、基板上の複数の異なる位置に各別に配置させたユビキチン結合酵素（Ｅ２）固定化プロテインチップとした点にある。
【００１４】
上記目的を達成するための本発明の第２特徴構成は、
異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）を基板上の複数の異なる位置に配置させてＥ２固定化プロテインチップを作製するタンパク質プリント工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップに、標識化ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を含むユビキチン化試薬（ＵＢＭ）の存在下で、試験物質を接触させる接触工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップを洗浄して前記Ｅ２固定化プロテインチップ上の反応後のユビキチン化試薬（ＵＢＭ）、及び、前記試験物質を除去する洗浄工程、
前記Ｅ２固定化プロテインチップ上のユビキチン結合酵素（Ｅ２）と結合した標識化ユビキチンのシグナルを検出する検出工程とを有し、
試験物質を接触させないユビキチン結合酵素（Ｅ２）におけるシグナルと比較して、前記異なる複数のユビキチン結合酵素（Ｅ２）夫々に対する前記試験物質によるシグナル強度の変化を見て、ユビキチンがユビキチン活性化酵素（Ｅ１）からユビキチン結合酵素（Ｅ２）にトランスファーするのを制御することによりユビキチン化経路を調節する調節物質としての特性を調べ、所定の調節物質のスクリーニングに使用する、
ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法とした点にある。
【００１５】
例えば、試験物質を、異なる複数のＥ２を配置させたＥ２固定化プロテインチップに１度接触（反応）させるだけで、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質としての、異なる複数のＥ２との反応特性を調べることができる。つまり、従来行われていた電気泳動を用いた手法のように、Ｅ２の種類と調節物質の数との組み合わせに応じた多くの回数の実験を行う必要はない。
そのため、迅速に実験結果を得ることができる。
【００１６】
さらに、後述の実施例に記載したように、本発明のＥ２固定化プロテインチップおよび、該プロテインチップを利用するユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法は、タンパク質の基板への固定化、低コスト化、及び、バックグランドノイズの低減等を実現するために最適な諸条件を検討し、良好な結果を得ることできるものと認められている。
【００１７】
具体的には、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）固定化プロテインチップにおいて、前記基板が、ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化されてあることが好ましい。
ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化した基板上にＥ２を固定化することにより、Ｅ２の酵素活性を有効に保持しつつ、その酵素活性を検出可能な状態に保持したＥ２固定化プロテインチップを提供できる。
【００１８】
また、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）固定化プロテインチップにおいて、前記酵素を固定化した基板が、更に、ブロッキング剤の添加によりブロッキング処理が施されてあり、前記ブロッキング剤が１０〜５０ｍＭのＤＴＴを含有することが好ましい。
１０〜５０ｍＭのＤＴＴを含有するブロッキング剤によりブロッキング処理を行うことにより、Ｅ２の酵素活性を有効に保持しつつ、非プリント領域への非特異結合を抑制しバックグラウンドノイズを有効に低減可能な、Ｅ２固定化プロテインチップを提供できる。
【００１９】
そして、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法において、前記基板が、ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化されてあることが好ましい。
ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、若しくは、アルデヒドで機能化した基板上にＥ２を固定化することにより、Ｅ２の酵素活性を有効に保持しつつ、その酵素活性を検出可能な状態に保持したＥ２固定化プロテインチップが提供可能となることから、高感度、かつ、信頼性の高い、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【００２０】
更に、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法において、前記標識化ユビキチンが、ビオチン化標識ユビキチンであることが好ましい。
ビオチン化標識ユビキチンの使用により、高感度、かつ、正確にシグナルを検出することが可能となり、高感度、かつ、信頼性の高い、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【００２１】
そして、ビオチン化標識ユビキチンを１〜２０μＭ添加することが特に好ましく、また、前記Ｅ１を２．５〜２５０ｎＭ添加することが好ましい。
Ｅ１、ユビキチンを上記濃度範囲で添加することにより、バックグラウンドノイズを低減し、かつ、十分に観察可能なシグナルの検出を達成でき、更なる高感度、かつ、信頼性の高い、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【００２２】
また、本発明のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法において、前記洗浄工程を、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で行うことが好ましい。
ＳＤＳ存在下で洗浄を行うことにより、基板上に固定化されたＥ２とチオールエステル結合によって結合していない標識化ユビキチンを確実に除去することが可能となり、バックグラウンドノイズを低減させることで、高感度、かつ、信頼性の高い、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【００２３】
更に、本発明のユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法において、前記タンパク質のプリント工程の後、前記接触工程を施す前の基板に、ブロッキング剤を添加するブロッキング工程を施し、前記ブロッキング剤が１０〜５０ｍＭのＤＴＴを含有することが好ましい。
１０〜５０ｍＭのＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有するブロッキング剤の使用により、Ｅ２の酵素活性を有効に保持し、その活性を検出することが可能となるとともに、非プリント領域への非特異的結合を抑制してバックグラウンドノイズの低減が達成可能となり、高感度、かつ、信頼性の高い、ユビキチン化経路調節物質のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【００２４】
本発明のＥ２固定化プロテインチップは、ユビキチン化経路を調節可能な物質を、迅速かつ網羅的に直接評価できるため、所定のユビキチン化経路を調節可能な調節物質をスクリーニングするのに有効である。
【００２５】
また、前記調節物質が薬剤であれば、服用者に合った薬品を調合するテーラーメイド医薬の製造において、各服用者に適合した薬を迅速に調合することが可能となり、疾患が進行する前に投薬可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、Ｅ２の生物化学的活性を保持した状態で基板上にＥ２を担持でき、かつ、その生物活性を感度良く検出することができる、Ｅ２固定化プロテインチップを提供できる。Ｅ２は、分子的多様性に富む性質を有するが、本発明のプロテインチップを利用することにより、複数のＥ２のアイソフォームの各生物活性に関して、高スループットに、また、網羅的かつ直接的に評価することができる。Ｅ２はユビキチン経路に関与する酵素であることから、本発明のプロテインチップは、ユビキチン化経路を調節できる調節物質を知る手段として、直接的、かつ、網羅的な情報を高スループットに与えることができる。したがって、本発明は、また、ユビキチン化経路を調節できる調節物質の高スループットなスクリーニング方法を提供する。本発明によって、スクリーニングされたＥ２の生物活性に影響を与える物質は、ユビキチン化経路を調節できる調節物質として、癌、神経変性疾患等の治療および予防に有用である。
【００２７】
また、本発明によれば、Ｅ３についても、Ｅ２と同様にＥ３固定化プロテインチップを構築でき、該プロテインチップは広範な利用価値を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
タンパク質のユビキチン化からプロテアソームによる標的タンパク質に対するユビキチン化経路が知られているが、このユビキチン化経路が崩壊して標的タンパク質の特異分解が正常に行われない場合、癌、神経変性疾患等の種々の疾病が引き起こされると考えられている。
つまり、このユビキチン化経路を調節できる物質（例えば、人体にとって有害なタンパク質を正常な崩壊に導けるようにユビキチン化経路を調節する物質）があれば、癌、神経変性疾患等の種々の疾病を治療する薬となり得る。そのため、近年、このような調節物質（以下、新薬候補物質と称する場合がある。）を探索することが行われている。
【００２９】
一方、近年、プロテインチップの実現に現在多大な努力がなされている。このプロテインチップは、ＤＮＡマイクロアレイと同様に、高価で貴重なサンプルや試薬の消費量が少ないため低コストで、かつ迅速、簡便なスクリーニング技術として有用性が高いと考えられている。そのため、上記調節物質（新薬候補物質）の探索において、プロテインチップを適用すれば、効率的なスクリーニングシステムが確立できると考えられる。
そして、タンパク質の基板への固定化、低コスト化、及び、バックグランドノイズの低減等の課題を解決することがプロテインチップ実用化の鍵を握っている。
【００３０】
そのため、プロテインチップを利用してユビキチン化経路を調節できる調節物質を効率よく探索できるスクリーニングシステムを確立するという目的を達成するために、最適な実験条件を検討することは重要な課題となっている。このようなスクリーニングシステムが確立すれば、服用者に合った薬品（テーラーメイド医薬）を効率よく製造でき、種々の疾病を迅速に治療できるものと期待される。
【００３１】
本発明は、ユビキチン化経路を調節可能な物質を、効率よく探索できるプロテインチップ、及び、このプロテインチップを用いたユビキチン化経路を調節可能な物質のスクリーニング方法を提供する。以下に詳細に説明する。
【００３２】
本発明の一の態様において、Ｅ２固定化プロテインチップを提供する。本発明におけるプロテインチップとは、基板の表面に複数のタンパク質またはペプチド断片を固着させたもので、タンパク質−タンパク質、タンパク質−薬物等の相互作用を効率よく解析できるものを意味するものであり、本発明におけるＥ２固定化プロテインチップは、基板の表面に、Ｅ２が固定されてある。
【００３３】
ここで、基板上に固定化されるユビキチン化結合酵素（Ｅ２）は、ユビキチン化結合酵素（Ｅ２）のファミリーに属する酵素を指す。Ｅ２は分子的多様性を有する酵素であり、具体的には、ヒト由来ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｃ、ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７等が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、オリゴヒスチジンタグのような、タグが付加されたＥ２をも好適に利用でき、タンパク質を発現させる際に、所望のタグを付加することにより調製することができる。タグを介して基板にタンパク質を固定化することで、基板上にタンパク質がその配向を揃えることが可能となり、また、基板への固定化反応がタンパク質の本体とは別個の箇所で起こることから酵素活性に与える影響も最小限に抑えることが可能となる。
【００３４】
本発明のＥ２固定化プロテインチップの作製は、適当な基板にＥ２をプリンティング、固定化することにより行われる。基板上へのＥ２の固定は、タンパク質の有する立体構造（つまり、２次構造、３次構造）、さらに、Ｅ２の有する生物活性を維持しつつ行われる。また、理想的には、固定化されたタンパク質の反応性の同一性を担保するため、基板上にタンパク質がその配向を揃えて固定化される。機能性タンパク質を固定化しうることは、上記で説明したが、プロテインチップ開発のための重要なポイントである。
【００３５】
ここで、固定化に用いられる基板は、好ましくは平板ガラスであり、下記で説明する実施例において使用されたテフロンマスクにより分割された１２×４サブアレイを有するスライドガラスも好ましく利用可能である。
【００３６】
タンパク質のプリンティングは適当な基板に、好ましくは、インクジェット方式のマイクロアレイヤーを使用して行われる。高密度にプリンティングするためのマイクロアレイヤーロボット等は市販されており、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｎｋ−ｊｅｔ  ｍｉｃｒｏａｒｒｙｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等の市販品を使用することができる。しかし、タンパク質を基板表面に吸着させるだけでは機械強度の面から問題があるため、化学的に共有結合等を介して基板上にＥ２を固定化すべく、予め基板表面を化学的に表面処理することが必要であり、具体的には、ハイドロゲルＮ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅによる（以下、ＮＨＳと略する場合がある。）機能化、アルデヒドによる機能化が本発明のプロテインチップにおける基板の処理方法として、特に好適に利用可能である。
【００３７】
次に、Ｅ２固定化プロテインチップの利用方法について説明するが、本発明の範囲はこれらの利用の形態により限定的に解釈されるものではない。
【００３８】
Ｅ２固定化プロテインチップを使用して、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質のスクリーニングを行うことができる。したがって、本発明の別の態様において、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質のスクリーニング方法も本発明に包含される。ユビキチンは生体内で、発癌、および、細胞周期、ウィルス感染、神経性変性疾患等の多くの生体反応に関与していることから、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質は、例えば、癌や神経変性疾患等の治療用薬物、又は、予防用薬物となり得る。
【００３９】
本発明においては、基板上にＥ２を固定し、固定化されたＥ２を、Ｅ１および標識化ユビキチンの存在下で反応させることによりスクリーニングを行うものであるから、スクリーニングされる調節物質は、ユビキチンがＥ１からＥ２にトランスファーするのを制御することが可能な物質である。したがって、調節物質とは、ユビキチンがＥ１からＥ２へのトランスファーするのを抑止または遅延する物質（インヒビター）と、ユビキチンがＥ１からＥ２に転移するのを促進する物質（アクチベーター）、２つの概念を意味するものとする。そして、前記インヒビターとしては、ユビキチン様分子（以下、Ｕｂｌｓと略する場合がある。）等が挙げられ、この場合、ユビキチンとＥ２との結合反応と、ユビキチン様分子とＥ２との結合反応が競合するため、結果として、ユビキチンがＥ１からＥ２に転移するのを阻害する。本発明のスクリーニング方法は、新規の、このような物質を探索、同定するものである。
【００４０】
本発明に係るユビキチン化経路を調節可能な調節物質のスクリーニング方法の一の態様を以下に詳細に示す（図２を参照のこと。）。本スクリーニング方法は、
１．異なるユビキチン結合酵素（Ｅ２）を基板上の複数の異なる位置に配置させてユビキチン結合酵素固定プロテインチップを作製するタンパク質プリント工程、
２．基板上への非特異反応を回避するブロッキング処理を行うブロッキング工程、
３．前記プロテインチップに、標識化ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、を含むユビキチン化試薬（以下、ＵＢＭと略する場合がある。）の存在下で、試験物質を接触させる接触工程、
４．前記Ｅ２固定化プロテインチップを洗浄して前記Ｅ２固定化プロテインチップ上の反応後のユビキチン化試薬（ＵＢＭ）、及び、試験物質を除去する洗浄工程、
５．前記プロテインチップ上のユビキチン結合酵素（Ｅ２）と結合した標識化ユビキチンのシグナルを検出する検出工程、
６．検出されたシグナルを定量化して解析する解析工程を、含んでいる。
以下に、各工程について詳細に説明する。
【００４１】
１．タンパク質プリント工程
タンパク質プリント工程は、基板にＥ２をプリンティング、固定化する工程である。Ｅ２のプリンティング、固定に関しては、上記で既に説明した。
【００４２】
２．ブロッキング工程
ブロッキング工程は、非プリント領域への非特異結合は、高いバックグラウンドノイズを発生させるため、基板上のＥ２が固定化されていない領域における、非特異的結合を阻害するべく、例えば、ブロッキング剤を使用して、非特異的結合に耐性の基板表面を提供することより行われ、これによりバックグラウンドノイズを低減することが可能となる。ブロッキング工程で用いられる、ブロッキング剤は、低バックグラウンドで、かつ、ユビキチン経路のいずれの成分とも反応性を有しないものであることが必要であり、具体的には、１０〜５０ｍＭのＤＴＴ、特には１０ｍＭのＤＴＴを含有することが好ましく、２％  ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ含有ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．６）が好適に利用できることが、下記で説明する検討例において判明した。しかしながら、これに限定されるものではなく、１０〜５０ｍＭのＤＴＴ、特には１０ｍＭのＤＴＴを含有することより、良好なブロッキング効果が得られるとの知見が得られたことから、かかる知見に基づいてブロッキング剤の組成を適宜改変することが可能である。しかし、５０ｍＭを超える高濃度のＤＴＴの存在は、検出対象であるＥ２由来のシグナルが相当に影響を受けることから、高濃度のＤＴＴの存在は好ましくない。また、ウェスタンブロットで汎用される、ブロッキング剤はミルクであるが、ミルクは少量のビオチンを含有するため、ビオチン化標識ユビキチンを使用する場合には、使用を避けるべきである。
【００４３】
３．接触工程
接触工程は、基板に固定されたＥ２と、ユビキチン化経路を調節可能な調節物質候補化合物である試験物質を、標識化ユビキチン、Ｅ１を含むユビキチン化試薬の存在下で接触させる。具体的方法は特に限定されないが、例えば、Ｅ２を固定化した基板を、試験物質を適当な溶媒に溶解させた試験溶液に浸漬するか、基板上のＥ２を固定化した領域に試験溶液をスポットすることにより行われる。接触時間は、固定化されるＥ２の種類に応じて適宜変更することができる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法に用いる試験物質は、有機合成された有機化合物や、タンパク質のライブラリー、あるいは、動植物や微生物に由来する成分等を用いることができる。
【００４５】
また、ユビキチン化試薬とは、Ｅ１、ユビキチン、ＡＴＰ等のユビキチン化経路中の、ユビキチンをＡＴＰの加水分解に伴ってＥ１によって活性化してＥ１の活性ＳＨ基にチオエステル結合する反応、および、それに続く、Ｅ１に結合したユビキチンがＥ２の活性ＳＨ基にトランスファーされる反応を良好に遂行するために必要な試薬を意味するものとする。
【００４６】
ユビキチンは、Ｅ２のユビキチン化の検出を容易にするため標識を付される。標識としては、Ｅ２のユビキチン化反応を阻害しないものを利用することが必要であり、具体的には、ビオチンによって標識化することが好ましい。また、ビオチン化標識の形態は、Ｎ末端標識が特に好ましいが、ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識も好適に利用可能である。ユビキチン化の検出の対象となるＥ２の種類（例えば、ＵｂｃＨ２ｂ）によっては、ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識であると低いシグナルしか得られない一方で、Ｎ末端標識の場合には強いシグナルの検出が可能となる場合がある。これは、ユビキチンの４８番目のリジンがＵｂｃＨ２ｂとの結合に関与することに起因するものと考えられるものであるが、現在のところ、そのような現象はＵｂｃＨ２ｂしか観察されておらず、また、その場合においても十分に検出は可能であることから、ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識も好適に利用可能である。
そして、Ｃｙ３標識等の蛍光色素での直接的なユビキチンの標識化は、決定的に反応プロセスに影響を与え、蛍光色素は荷電を有するため活性検出に際して妨害物質となることから、本発明の適応には好ましくなく、また、酵素標識等の利用の検出に際して発色剤の添加を要することから、隣接するスポットとのコンタミネーションの要因となり、好ましくない。
【００４７】
Ｅ１および標識化ユビキチンの添加濃度は、Ｅ１の添加量の増加、ユビキチンの添加量の増加が、バックグラウンドノイズの増加を招くことから、検出対象由来のシグナルの強度とバックグラウンドノイズとを比較検討して最適化されるものである。Ｅ１は、好ましくは、２．５〜２５０ｎＭ、特には１００ｎＭで添加される。ユビキチンは、好ましくは、１〜２０μＭ、更に好ましくは、１〜１０μＭ、特には、１〜５μＭで添加される。
【００４８】
また、固定化Ｅ２スポットを、試験物質と接触させることなく、ユビキチン化試薬の存在下で反応させたものをコントロールとして好適に利用できる。コントロールスポットの存在により、コントロールにおいて検出されるシグナル強度と、試験物質との接触スポットにて検出されるシグナル強度とを比較することにより、試験物質のユビキチン化調節能の評価を行うことができる。
【００４９】
また、チップ上での反応の有効性を確認すべく、陰性コントロールとして、ＢＳＡを基板上にプリンティングしたものを用いることができ、このＢＳＡスポットがシグナルを発しなかった場合、後の検出工程で検出されるシグナルが、基板表面上に非特異的に結合したユビキチンに起因するものではないことを示すことができる。
【００５０】
４．洗浄工程
ここでいう洗浄工程は、試験物質とユビキチン化試薬の接触反応直後の洗浄を意味し、基板上に固定化されたＥ２とチオールエステル結合により結合していない標識化ユビキチンの存在は高いバックグラウンドノイズを発生させるため、基板上のＥ２とチオールエステル結合を形成していない標識化ユビキチン、および、Ｅ１および試験物質を除去するべく、例えば、洗浄液中に基板を浸漬することにより行われる。洗浄工程で用いられる、洗浄液は、ブロッキング剤と同様、低バックグラウンドで、かつ、ユビキチン経路のいずれの成分とも反応性を有しないものであることは、もちろんのこと、Ｅ２−ユビキチン間の結合を開裂せず、バックグラウンドノイズの要因となる基板表面上に存在する非共有結合分子を除去できるものであることが必要である。具体的には、０．１％濃度以上のＳＤＳ、特には０．１〜１０％のＳＤＳの存在下で洗浄を行うことが好ましく、０．１％  ＳＤＳ含有２０ｍＭ  トリスバッファー（ｐＨ５．７）が好適に利用できることが、下記で説明する検討例において判明した。しかしながら、これに限定されるものではなく、０．１％のＳＤＳ、特には０．１〜１０％のＳＤＳが存在することにより良好な洗浄効果が発揮されるとの知見、および、基板上ではＥ２とユビキチンの結合は安定性を示すとの知見が得られたことから、かかる知見に基づいて洗浄溶液の組成を適宜改変することが可能である。
【００５１】
５．検出工程
検出工程は、プロテインチップ上に固定化したＥ２と結合した標識化ユビキチンを検出するものである。ユビキチンの標識の種類に応じた検出がなされる。
例えば、ユビキチンをビオチン標識した場合、ストレプトアビジン  フィコエリトリン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：以下、ＳＡＰＥと略する場合がある。）が検出に用いられる。つまり、ＳＡＰＥを含んだ染色液を、前記洗浄工程後のプロテインチップに接触させ、洗浄後、マイクロスキャナー等を用いて、上記標識が発するシグナルを検出する。検出は、例えば、Ｗｈｉｔｅ  ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ−Ａｒｒａｙ  Ｗｏｒｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社製）等の市販のマイクロアレイスキャナーを用いて行うことができる。
【００５２】
６．解析工程
検出されたシグナルを、例えば、ＩＭＡＧＥＮＥTMソフトウェアー等の市販のソフトウェアーを用いて定量化し、データを解析する。ここで、検出されるシグナルは、Ｅ２に共有結合しているユビキチン量に相当し、試験物質を接触させないＥ２におけるシグナル（コントロール）と比較して、シグナル強度を変化させる試験物質を、ユビキチンがＥ１からＥ２にトランスファーするのを制御することによりユビキチン化経路を調節可能な調節物質として選択する。つまり、基板のＥ２が固定された位置において、標識化ユビキチンが検出されない場合、また、コントロールと比較して検出量が減少した場合には、試験物質は、ユビキチンがＥ１からＥ２にトランスファーする反応を阻害することによってユビキチン経路を阻害するインヒビターと判定され、これは、癌、神経変性疾患等の有力な治療用薬物、予防用薬物となり得る。一方、コントロールと比較して検出量が増加した場合には、試験物質は、Ｅ１からＥ２にトランスファーする反応を活性化することによってユビキチン経路を活性化するアクチベーターと判定され、これは、癌、神経変性疾患等の有力な治療用薬物、予防用薬物となり得る。
【００５３】
更に、本発明のＥ２固定化プロテインチップは、種々の利用に供することができる。以下に、上記以外の利用の態様について説明する。これらも利用の形態も本発明に含まれる。
【００５４】
ユビキチンとのチオールエステル結合を形成する能力について、タンパク質をスクリーニングすることに利用することができ、高スループットな処理が可能となることから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやウェスタンブロッティング等の今日の標準技術の代替法として提示することができる。例えば、組み換えタンパク質の生産現場での品質調査において、Ｅ２固定化プロテインチップは、発現精製されたＥ２の機能性のチェックするために利用できる。また、新たなＥ２が連続的に発見されていることから、Ｅ２固定化プロテインチップは、ユビキチンと結合する能力について未知のタンパク質をスクリーニングするための、また、新しいファミリーのメンバーを同定するための、基礎的研究において利用できる。この場合、調査されるタンパク質は、基板上にプリンティングされ、そしてＥ１触媒ユビキチン結合反応が、標識ユビキチンの存在下で行われる。更には、Ｅ２の基質特異性およびユビキチン経路の異なる経路の関与の解明にも利用可能である。
【００５５】
部位特異的突然変異誘発による突然変異体の構築は、しばしば、酵素を初めとするタンパク質の活性のメカニズムを解明するための構造研究に使用されることから、Ｅ２固定化プロテインチップは、構築されたＥ２突然変異体の活性レベルをスクリーニングするための、また、Ｅ２のドミナントネガティブな突然変異体の単離のための有用なツールとして利用することができる。
【００５６】
また、Ｅ２固定化プロテインチップは、標的タンパク質のユビキチン化の調査に利用する事ができる。所与のタンパク質がマイクロアレイ上に固定され、共に固定化された様々のＥ２と並行的にユビキチン化反応を行うことによってユビキチン化の調査が行われる。そして、これは標的タンパク質へのユビキチンの結合を含む特異的経路の決定に貢献することができる。
【００５７】
更に、本発明のＥ２固定化プロテインチップは、生物学的サンプル中における多数のタンパク質のユビキチン化プロファイルを決定するツールとして利用することができ、ユビキチンシステムの機能不全と疾患との間の相関関係を解明することが可能となり、これは、薬物開発における標的を確認するためのスターティングポイントを提供することが可能となる。つまり、固定化Ｅ２と血液、尿等の生物学的サンプルを接触させて、Ｅ２のユビキチン化に与える影響を、標識化ユビキチンの検出により確認するものである。
【実施例】
【００５８】
（準備実験例１）
Ｅ１、Ｅ２の調製
１．酵素の起源
Ｅ１は、ラビット由来のＥ１を使用し、Ｅ２は、ヒト由来のＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ５ｂ、（Ｃ８５Ａ）ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｃを使用し、これらはＨｉｓ−Ｔａｇが付加されてある。ＵｂｃＨ６、ＵｂｃＨ５ｂ、（Ｃ８５Ａ）ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｃはコスモバイオから購入した。また、ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７は発現、精製することにより得た。Ｎ末端に６Ｈｉｓ−Ｔａｇを含む５ｃＤＮＡは、Ｔ７プロモーター下流のｐＴ７−７ベクター（ＭＹＡＭＯＴＯより提供。）にクローニングした。
【００５９】
２．Ｅ．ｃｏｌｉでの発現
上記５つの酵素（Ｅ１、ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７）は、組換えＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉを用いて発現させて精製した。１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを２０μlのＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（ストラタジーン社製）に添加し、この混合物を氷上で３０分間インキュベートした後、４２℃、３０秒間の熱処理を行った。細胞を２分間氷上で保った後、１８０μlのＳＯＣ培地（ストラタジーン社製）を添加して、３７℃にて１時間振とうした。続いて、５０μｇ/ｍＬカルベニシリン（シグマ  アルドリッチ社製）含有ＬＢ寒天培地（ナカライ  テスク社製）上に静置した後、３７℃で一晩にてインキュベートした。プレート上の半分のコロニーは収集され、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン含有２００ｍＬのＬＢ培地（ナカライ  テスク社製）に接種された。バクテリア細胞をＯＤ600nm＝０．６になるまで２００ｒｐｍで約３時間、３７℃にて増殖した後、２６℃、シェーカーにトランスファーし、ＯＤ600nm＝０．８になるまで約３０分間インキュベートした。タンパク質発現は２０μＭ  ＩＰＴＧ（ナカライ  テスク社製）の添加によって誘導し、２６℃で２００ｒｐｍにて約１２−１４時間インキュベートした。トランスフォームされたＥ．ｃｏｌｉ細胞を収集し、４℃で８３００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した後、上澄液を廃棄して得られた細胞ペレットを−８０度にて下記で説明する精製まで保存した。
【００６０】
３．タンパク質の精製
Ｅ１をセファロース−ユビキチン上で分離精製した。具体的には、以下のように行った。細胞ペレットを、２０ｍＬの５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６：和光純薬社製）中で再懸濁した後、氷上での３分間、３回のソニケーションを行った。細胞溶解物を４℃で１０，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し、上澄液を濾過した。セファロース−ユビキチンカラムは樹脂メーカー（ＮＨＳ活性化−ｓｅｐｈａｒｏｓｅTM  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ：アマシャム  バイオサイエンス社製）の指示に従って、１ｍＭユビキチン溶液（シグマ  アルドリッチ社製）を使用して作製し、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2（和光純薬社製）含有５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）で平衡化した。１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｍＭ  ＡＴＰ（シグマ  アルドリッチ社製）を含有する上澄液をカラムにロードした。カラムは、２０ｍＬの０．５Ｍ  ＫＣｌ含有５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）および１０ｍＬの５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄し、Ｅ１タンパク質を１０ｍＭ  ＤＴＴ（和光純薬社製）含有５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）で溶出し、１５のフラクション（各０．５ｍＬ）を収集した。カラムは最終的には、２０ｍＬの１Ｍ  ＫＣｌ含有５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ９）と２０ｍＬの５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した。
【００６１】
Ｅ２をＮＴＡ樹脂上で分離精製した。具体的には、以下のように行った。細胞ペレットを１０ｍＬの冷ＰＢＳ（ｐＨ７．６：ナカライ  テスク社製）中で再懸濁した後、氷上での３分間、３回のソニケーションを行い、細胞溶解物を４℃にて１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄液を、２０ｍＬのＰＢＳで前平衡化された１ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社製）にアプライし、２５ｍＬの２０ｍＭイミダゾール（和光純薬社製）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で洗浄した。そして、Ｅ２タンパク質を０．３Ｍ  イミダゾール含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で溶出し、そして、１０のフラクション（各０．５ｍＬ）を収集した。
【００６２】
各フラクション中における精製されたタンパク質の存在は、ブラッドフォード法（タンパク質アッセイ試薬：バイオラッド社製）を使用して評価された。また、精製酵素の精製度をチェックするため、フロースルー、洗浄、タンパク質含有フラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。タンパク質含有フラクションは、Ｅ１の場合は５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．６）で、また、Ｅ２の場合は、ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に対して、Ｓｐｅｃｔｒａ/Ｐｏｒ再生セルロース透析膜ＭＷＣＯ３５００（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用して３時間、４℃にて３回透析を行った。タンパク質濃度は、上記で説明した通り、ブラッドフォード法によって測定した。
【００６３】
（検討例１）
パラメータの解析実験（溶液中における予備検討）
いくつかの重要なパラメーターの解明について、Ｅ１、ユビキチン、Ｅ２とを液相中で反応させた後、ゲルにロードして、Ｅ２のユビキチン化シグナル強度を検出して検討を行った。
【００６４】
Ｅ２（ＵｂｃＨ２ｂ）のインヴィトロ  ユビキチン化を、５０ｍＭ  トリスバッファー（ｐＨ７．６）中で３μＭ  Ｅ２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＡＴＰを含有する反応混合液中で行った。このとき、Ｅ１のモル濃度は６ｎＭ〜３μＭ、そして、ビオチン化ユビキチンのモル濃度を３μＭ〜１００μＭの、種々のモル濃度に設定した。前記反応混合液を、３０分間もしくは５時間、３７℃にてインキュベートした。各インキュベーション終了後、各反応処理液１６μｌに、４μＬのＳＤＳローディングバッファー５Ｘ（バイオラッド社製）を添加し、得られたサンプルを、９５℃、５分間の熱処理した後、Ｂｉｏｒａｄ  ｒｅａｄｙｇｅｌ  Ｊ上で分離した後、クマシーブルーにて染色し、７％メタノール、酢酸１０％で脱色した。
【００６５】
結果を図３に示す。ＵｂｃＨ２ｂとユビキチンとの間で形成された共有複合体に対応するバンドが箱で囲まれている。全てのテストされた条件において２０ｋＤ付近のＵｂｃＨ２ｂを示すバンドを観察したところ、Ｅ１を等モルのＵｂｃＨ２ｂとインキュベートしたとしても、Ｅ２の大部分はユビキチン化されないことが判明した。Ｅ１濃度におけるレンジ研究により、一定のＵｂｃＨ２ｂ濃度で複合体形成が減少することが確認された。これは、ＵｂｃＨ２のチオールエステル形成において進行的な減少を表すものである。また、ユビキチン濃度を増加させた場合、ユビキチン濃度がＥ２濃度の１０倍となると、平衡状態に達する事も判明した。更に、インキュベーション時間による影響は、インキュベーション時間が３０分と５時間との間で相違がないことが確認されたことから、液相でのＵｂｃＨ２ｂ−ユビキチンのチオールエステル結合反応は３０分で飽和点に達することが判明した。Ｅ１からＥ２へのユビキチンのトランスファーをモニターするための最初のアプローチとして、この実験は、オンチップ実験においてさらに考慮しなくてはならない、重要なパラメーターの影響を指摘するものであることが認識される。
したがって、この実験の結果から、トランスチオール化効率に影響せずにＥ１濃度を１：５の比率に減少させることができ、また、ユビキチン濃度の上昇は、わずかにチオールエステル形成に効果を表し、一方、反応時間を長時間にしても、効果に何ら影響を与えず、また、反応を平衡点よりさらに押し上げることができないことが判明した。
【００６６】
（検討例２）
洗浄条件の最適化検討実験
Ｅ２のオンチップユビキチン化において、固定化Ｅ２にＵＢＭを接触反応させた後の、基板表面上に存在する非共有結合的分子を除去するための洗浄条件について、様々な洗浄液を比較検討し、最適な洗浄条件の構築を試みた。
スライドガラス上に３種類のＥ２（ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３  ＵｂｃＨ７）を固定し、ＵＢＭ（Ｅ１＋、Ｅ１−）を添加して反応させた後、０．１％ＳＤＳ含有バッファーで洗浄した場合と、ＰＢＳで洗浄した場合を比較した。そして、ビオチン化ユビキチンを基板上にプリンティングした陽性コントロール（コントロール＋  Ｕｂ−ビオチン）および、ＢＳＡを基板にスポットした陰性コントロール（コントロール−  ＢＳＡ）を調製した。
【００６７】
結果を図４Ａおよび図４Ｂに示す。反応をＥ１の不在下で行った場合に、ＳＤＳ含有溶液のみがすべてのシグナルを除去したが、他の溶液は除去することができなかったことが判明した。当初、Ｅ２−ユビキチン結合は弱く、高ストリンジェントな洗浄溶液の使用は適さないであろうと予想されていたが、当初の予想に反し、固定化されたＥ２とユビキチンの間で形成されたチオール結合は、基板表面上で、驚くべき安定性を有することが判明した。これは液相とオンチップの相違を強調するものである。以上の結果より、ＳＤＳの存在下にて洗浄を行うことにより、非共有結合的分子を有効に除去することが可能となることが判明した。また、ＳＤＳ濃度は、ここで検討した０．１％以上とすることが好ましく、上限としては、Ｅ１とユビキチンとの間で形成されたチオール結合の保持の観点から、１０％程度とすることが望ましいとの結論が導かれる。
【００６８】
また、上記結果は、前記陽性コントロールは高いシグナルを示したが、一方、前記陰性コントロールはシグナルを検出しなかったことをも示すものである。このことから、Ｅ２が固定化された領域上で検出されたシグナルは、固定化されたＥ２に結合したビオチン化ユビキチン由来のシグナルであることが確認できる。したがって、Ｅ２のオンチップ上でのユビキチン化が実行可能であることを証明するものである。
【００６９】
次に、上記３種類のＥ２を固定化したガラススライドに、次の３種類の反応溶液（−Ｅ１  −ユビキチン化ビオチン、−Ｅ１  −ＡＴＰ  ＋ユビキチン化ビオチン１μｌ、−Ｅ１  ＋ＡＴＰ  ＋ユビキチン化ビオチン１μｌ、）を添加して固定化Ｅ２と反応させた後、ＰＢＳで洗浄を行った場合における、シグナル強度の比較実験を行った。
【００７０】
結果を図４Ｃに示す。いくつかのシグナルが、ビオチン化ユビキチンのみの存在下（つまり、−Ｅ１）で、Ｅ２固定化基板表面上でインキュベートした場合に検出されたことから、Ｅ２に対して、ユビキチンが非共有結合することが判明した。この結果は、以前のＮＭＲ研究により検出されたユビキチンとの弱い相互反応のための追加部位がＵｂｃＨ２ｂ上に存在するとの見解に合致する。
【００７１】
（検討例３）
ブロッキング剤の最適化検討実験
オンチップユビキチン化において、ブロッキング剤がＥ２の酵素活性を示すシグナルおよびバックグラウンドシグナルに与える影響を、下記で説明する様々なブロッキング剤を比較検討し、最適なブロッキング剤の構築を試みた。
【００７２】
検討のための反応条件は以下の通り。
Ｅ２：ＵｂｃＨ７
基板：ハイドロゲル−ＮＨＳ機能化ガラススライド（Ｊａｐ−ＮＨＳ）
Ｅ１：１００ｎＭ
ユビキチン：ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ビオチン化ユビキチン  １μＭ
反応時間：５時間
【００７３】
今回検討を行った、ブロッキング剤について説明する。検討に用いたブロッキング剤は以下の通り。
ブロックエース、ミルク、２％ＢＳＡ、２％ＢＳＡと５０ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＢＳＡと１０ｍＭ  ＤＴＴ
【００７４】
検討結果を図５に示す。ブロッキング剤中において、１０ｍＭ  ＤＴＴが存在する場合、ブロックエース、ミルク、ＢＳＡのみの場合と比較すると明らかにバックグラウンドシグナルの減少が認められる共に、Ｅ２−ユビキチン由来のシグナルの増加も観察された。図５の結果より、本発明の適応において、ＤＴＴの存在下でブロッキングを行うことが好適であることが判明した。ここで、ＤＴＴの存在下によりバックグランウンドシグナルが低減される要因としては、バックグラウンドシグナルの検出は、ユビキチン種、つまり、ユビキチン単独もしくは、ユビキチン化Ｅ１が基板表面上の非タンパク質プリンティング領域に存在することに起因するものであるが、ＤＴＴは、ＮＨＳ活性化−表面に共有結合できることから、ＤＴＴがＥ１−ユビキチンと反応してチオールエステル結合を開裂することで、Ｅ１からユビキチンを遊離させて、バックグラウンドシグナルを減少させることに寄与していることが一つの可能性として考えられる。一方、ＤＴＴの存在下における、Ｅ２−ユビキチン由来シグナルの増加は、Ｅ２は、酸性状態で生体内から分離、精製された後、基板上に固定化されるが、その活性化にはＤＴＴのような還元剤による還元作用を要するということを説明するものであると考えられる。しかしながら、高濃度ＤＴＴ（５０ｍＭを超える。）の存在により、Ｅ２由来のシグナルが相当に影響を受けることも認められた。おそらく、Ｅ２のプリンティングおよびそれに続くインキュベーションの間、固定化されたＥ２のいくつかはチオール架橋ダイマーに酸化されるが、ブロッキング剤中のＤＴＴは、この反応の逆で、モノマーのＥ２の濃度を上昇させる。したがって、高濃度ＤＴＴにより、基板表面に共有結合したＥ２分子は、反応溶液中に遊離するかもしれず、また、高濃度のＤＴＴの存在はタンパク質を変性させ酵素活性を失活させることから、トランスチオール化反応の効率を減少させると考えられる。以上の検討結果より、１０〜５０ｍＭのＤＴＴの存在下でブロッキングを行うことが本発明の適用において好適であるとの結論が導かれる。
【００７５】
（検討例４）
ＵＢＭとの接触反応時間の最適化検討実験
４種類のＥ２（ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７）のオンチップユビキチン化において、ＵＢＭとの反応時間が、ユビキチントランスチオール化効率に与える影響を、経時的に、シグナル強度、バックグラウンド強度を検出して検討し、最適な接触反応時間を同定した。
【００７６】
検討のための反応条件は以下の通り。
Ｅ１：１００ｎＭ
ユビキチン：ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ビオチン化ユビキチン  １μＭ
【００７７】
結果を図６示す。上記Ｅ２のユビキチン化反応を液相で行った場合（検討例１を参照）においては、３０分の反応により平衡状態に達したが、Ｅ２が化学的に機能化されたガラススライド上に固定化された時、インキュベーションタイムは明らかに、反応効率に影響を及ぼすことが判明した。この結果、ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４は、接触反応時間が５時間で検出されるシグナルは最高となり、ＵｂｃＨ７は、接触反応時間が４時間で検出されるシグナルは最高となるものの、接触反応時間が５時間の場合であっても、高レベルのシグナルが検出されることが認められた。この結果から、今般の実験において使用したＥ２種にすべてを良好に検出するためには、５時間での接触反応が最適であるとの結論が導かれたが、使用されるＥ２種に応じて適宜設定することが好ましい。
【００７８】
（検討例５）
酵素の異種混合オンチップにおける活性の観察実験
４つのＥ２（ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ２ｂ）は６０％のアミノ酸配列同一性を有し、そして溶液中で同じような行動をするのにも係わらず、ガラススライド上に固定された時、これらの反応性は、かなり相違することが確認された（図６、図７参照）
また、これらの結果は、ＵｂｃＨ３、特にＵｂｃＨ２ｂは、他の２つのＥ２と比較して低いトランスチオール化効率を示すと結論できるのに十分であった。チップベーススクリーニングシステムの開発は、頑強なアッセイを必要とすることから、検出されるシグナルは、バックグラウンドノイズより可能な限り高くあるべきである。４つの固定化されたＥ２と同様のユビキチン化プロファイルを達成するために、ＵｂｃＨ３およびＵｂｃＨ２ｂのより高いシグナルを得ることが必要である。そのため、高いシグナルを観察でき、バックグラウンドの低い、検出を可能とする条件を探索する必要があり、Ｅ１、ユビキチン濃度の最適化を達成するための検討を行った。
【００７９】
（検討例６）
Ｅ１、ユビキチン濃度の最適化検討
ＵｂｃＨ２ｂおよびＵｂｃＨ４のオンチップユビキチン化における、Ｅ１およびユビキチン濃度がシグナル、および、バックグランドノイズに与える影響を検討した。
上記Ｅ２をハイドロゲル−ＮＨＳ機能化スライドガラス（松浪硝子工業）上に固定化して、ユビキチン濃度１μＭ、１０μＭで、前記各濃度のユビキチンに対するＥ１濃度を０．０２５、０．１、０．２５として、それぞれ固定化したＥ２と反応させ、シグナルおよびバックグラウンドシグナルを検出した。
【００８０】
結果を図８に示す。一定のビオチン化ユビキチン濃度において、Ｅ１濃度を増加させた場合、濃度依存的に強いシグナルが検出されることを確認した（図８Ａ、図８Ｂ）。これはＥ１濃度の増加が、Ｅ２のトランスチオール化効率を向上させる結果、検出シグナルが増加するであると期待したが、Ｅ１濃度の増加によって、バックグラウンドノイズが増加することも判明した。特に、ＵｂｃＨ２ｂ―ユビキチンチオールエステルに対応するシグナルは、かなり低いことから、ＵｂｃＨ４の場合に比べて、バックグラウンドの増加はより好ましくない結果をもたらすこととなる。
また、高いビオチン化ユビキチン濃度で行われた結果を図８Ｃ、図８Ｄに示すが、ユビキチン濃度の増加も高いバックグラウンドの要因となることが判明した。したがって、Ｅ１およびユビキチン濃度の増加は、オンチップにおいて高いトランスチオール効率を達成するための適当な手段でないことが判明した。次に、最適なＥ１、ユビキチンの添加濃度の設定のための更に詳細な検討を行った。
【００８１】
Ｅ１濃度の好適化検討を、Ｅ１濃度を２．５ｎＭ、２５ｎＭ、２５０ｎＭ、２５００ｎＭに設定して行った。
【００８２】
検討結果を図９に示す。図９より、Ｅ１濃度が２．５〜２５０ｎＭの範囲において、有効にバックグラウンドシグナルを抑制し、Ｅ２に結合したユビキチン由来のシグナルを良好に観察できることが認められた。また、以下で説明する実施例において判明した最適化プロトコールによりＥ１濃度を１００ｎＭと設定した場合に最適の結果が導かれることが判明した。
【００８３】
続いて、ユビキチン濃度の好適化検討を、ユビキチン濃度を１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭに設定して行った。
【００８４】
検討結果を図１０に示す。図１０より、ユビキチン濃度が１〜１０μＭの範囲、特に１〜５μＭの範囲において、有効にバックグラウンドシグナルを抑制し、Ｅ２に結合したユビキチン由来のシグナルを良好に観察できることが認められた。ここでは、具体的には示さないが、ユビキチン濃度を２０μＭとした場合においても、１〜１０μＭとした場合と同様の良好なシグナルを観察できることが理解されることから、１〜２０μＭの範囲にユビキチン濃度を設定することが本発明の適用において好ましい。
【００８５】
（検討例７）
ユビキチンの標識方法の最適化検討実験
４種類のＥ２（ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７）のオンチップユビキチン化において、ユビキチンの標識がＥ２の酵素活性に与える影響を、下記で説明する様々なユビキチンの標識方法を比較検討し、最適な標識方法の構築を試みた。
【００８６】
基板に上記Ｅ２を固定化して、Ｅ２の酵素活性を測定した。検討のための反応条件は以下の通り。
Ｅ１：１００ｎＭ
標識化ユビキチン：１μＭ
反応時間：５時間
【００８７】
今回、検討を行ったユビキチンの標識化方法を以下に示す。
【００８８】
ビオチン化標識−Ｎ末端標識ユビキチン（以下、ＮｔｅｒｍＵｂｂと略する場合がある。）
−ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識ユビキチン（以下、Ｕｂｂと略する場合がある。）
２５ｍｇのユビキチン（シグマ社製）を１ｍＬのカルボネートバッファー（０．１Ｍ  ＫＣＯ3、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に溶解させ、４．１ｍｇのｂｉｏｔｉｎｃａｐｒｏｙｌ−ＮＨＳ（シグマ社製）をこの溶液中に添加し、室温で３時間インキュベートした。ビオチン化ユビキチンはエタノール１００％で３回沈降させ、蒸留水中に溶解させた後、タンパク質濃度を測定した。
【００８９】
シアニン３標識（Ｕｂ−Ｃｙ３）
０．１ｍｇのユビキチン（シグマ社製）を、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋTM ＭＡｂ  Ｃｙ３標識キット（アマシャム  バイオサイエンス社製）を使用してシアニン３により標識化した。精製度および、標識化ユビキチン量は、製造業者のプロトコールに従って、ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒｙを使用して評価した。
【００９０】
結果を図１１に示す。今回検討した４種類のＥ２において、シアニン３標識ユビキチンと反応させた場合に、トランスチオール化効率がもっとも低いことが確認された。蛍光色素での直接的なユビキチンの標識は、決定的に反応プロセスに影響を与えることが判明した。また、Ｎ末端標識ビオチン化ユビキチンは、ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識ビオチン化ユビキチンに比べて、ＵｂｃＨ２ｂにおいて高いシグナルを得ることができた。これは、ユビキチンの４８番目のリジン残基が、ＵｂｃＨ２ｂとの相互作用に関与するとの仮説に干渉するものである。この現象は、他の酵素では観察されなかったことから、ユビキチンの他の残基が、他のＥ２との相互作用に関与していることが想定された。ＵｂｃＨ２ｂにおいてはシグナルレベルは低かったが、ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ標識ビオチン化ユビキチンは、ＵｂｃＨ２ｂ以外の酵素の検出においてはトランスチオール化プロセスに影響を与えず、また、より多くの残基がビオチン化され、検出工程においてストレプトアビジンによって認識されることから、高いシグナルを得ることができることが確認された。
【００９１】
（検討例８）
基板の表面処理の最適化検討実験
７種類のＥ２（ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７、ＵｂｃＨ５ｂ、（Ｃ８５Ａ）ＵｂｃＨ５ｂ、ＵｂｃＨ５ｃ）のオンチップユビキチン化において、固定化表面がＥ２の酵素活性に与える影響を、下記で説明する様々な化学的表面処理方法を比較検討し、最適な基板の表面処理方法の構築を試みた。
【００９２】
基板は、テフロンマスクで分割された１２×４サブアレイを有するガラススライドを用い、松浪硝子工業、ＥＲＩＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）のいずれかによって製造されたものを用いた。
【００９３】
検討のための反応条件は以下の通り。
Ｅ１：１００ｎＭ
ユビキチン：ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ビオチン化ユビキチン  １μＭ
反応時間：５時間
【００９４】
以下に今回検討を行った、表面処理方法について説明する。
【００９５】
アルデヒドによる表面処理（アルデヒドと略する場合がある。）
ＥＲＩＥ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製スライドガラスに、ＮｏＡｂ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによってアルデヒド処理を行った。
典型的なタンパク質はその表面に多数のリジンを表示することから、基板の表面をアルデヒドで機能化することにより、タンパク質のリジン残基と、基板表面のアルデヒド基がアミンカップリングして、基板上にタンパク質が固定化される。
【００９６】
ハイドロゲル−ＮＨＳによる表面処理（ＮＨＳと略する場合がある。）
スライドガラスに、ＮｏＡｂ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによってハイドロゲルコーティングを行った（それぞれ、ＵＳＡ−ＮＨＳ、Ｊａｐ−ＮＨＳ）。ハイドロゲルは、水膨張構造体の親水性ポリマーであり、水溶液媒体中ではハイドロゲルは腫大した３次元構造を形成することから、タンパク質の変性の可能性を軽減して、プリンティングされたタンパク質に対して溶液様環境を提供し、また、ハイドロゲルの３次元構造は、平面よりも高いタンパク質密度を達成することができる。
【００９７】
ＢＳＡ−ＮＨＳによる表面処理（ＢＳＡ−ＮＨＳと略する場合がある。）
１５μＬ  ２％ＢＳＡ（和光純薬社製）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）をハイドロゲル−ＮＨＳ機能化スライドガラス（ＮｏＡｂ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、松浪硝子工業社製）の各サブアレイ上にアプライし、室温で一晩インキュベートした。後日、スライドはＰＢＳ中で２回、蒸留水で２回、すすいだ後、表面を乾燥させるため、５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、完全に表面を乾燥させるため１時間デシケーター内に静置した。Ｎ，Ｎ´−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ中に溶解された１００ｍＭのＮ，Ｎ−Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｒｂｏｎａｔe（シグマ  アルドリッチ社製）および１００ｍＭのＮ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（和光純薬社製）を含有する溶液をスライドガラスの各サブアレイにアプライし、室温で３時間インキュベートした。そして、スライドガラスを１００％エタノール（和光純薬社製）中で３回すすいだ後、５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、使用まで室温でデシケーター内に保存した。ＢＳＡ−ＮＨＳ（ＢＳＡ-Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）で機能化したスライドガラスを基板に用いることで、１万を越えるタンパク質をスポットしたプロテインチップの作製に成功したことが報告されている（Ｍａｃｂｅａｔｈ他  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３，２０００を参照のこと。）。これは、ＢＳＡ上でのＮＨＳ活性化リジン、アスパラギン酸、そしてグルタミン酸残基は共有アミド結合を形成するためプリンティングされたタンパク質上の一次アミンと迅速に反応することができることによるものである。 ＢＳＡ−ＮＨＳ機能化によって基板表面を水和性に保つことが可能となりスポットしたタンパク質が変性するのを防ぐことができると共に、スポットしたタンパク質を化学反応によって固定化させることができる。
【００９８】
ニッケルによる表面処理（ニッケルと略する場合がある。）
１５μＬのＰＢＳ  （ｐＨ８）中に溶解させた１６ｍＭ  ＡＢＮＴＡ（Ａｍｉｎｏｂｕｔｈｙｌ  Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ：同仁社製）含有溶液をハイドロゲル−ＮＨＳ機能化スライドガラス（ＮｏＡｂ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、松浪硝子工業社製）の各サブアレイ上にアプライし、室温で一晩インキュベートした。後日、蒸留水で３回すすぎ、そして室温で２４時間  ０．５Ｍ  ＮｉＣｌ（和光純薬社製）中に浸漬した。スライドガラスは蒸留水中で３回すすぎ、そして、１００％エタノール中で浸漬した後、表面を乾燥させるため、５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、使用まで室温でデシケーター内に保存した。ニッケルコーティングは、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾された基板にタンパク質を固定化するものであり、基板上でタンパク質の配向を揃えて固定化することを可能とするものである。
【００９９】
検討結果を図１２Ａ、図１２Ｂに示す。図１２Ａは、松浪硝子工業によって製造されたスライドガラスに、ハイドロゲル−ＮＨＳ、ＢＳＡ−ＮＨＳ、ニッケルにて表面処理を施した場合の酵素活性の比較結果を示し、また、図１２Ｂは、ＥＲＩＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によって製造されたスライドガラスに、ハイドロゲル−ＮＨＳ、および、アルデヒドにて表面処理を施した場合の酵素活性の比較結果を示す。
図１２Ａの結果より、ＢＳＡ−ＮＨＳ、ニッケルにて表面処理を施した場合に比べて、ハイドロゲル−ＮＨＳで機能化した場合に、高い酵素活性を保持する事ができることが判明した。また、図１２Ｂにより、ハイドロゲル−ＮＨＳにて表面処理を施した場合と、アルテヒドにて表面処理を施した場合、双方とも同程度の酵素活性が観察された。
したがって、本発明における適用においては、基板をハイドロゲル−ＮＨＳもしくはアルデヒドにて機能化を行うことが好ましいことが判明した。
【０１００】
（実施例）
上記検討例で検討した結果から、最適化プロトコールが判明した。以下に、最適化プロトコールを以下に示す。
【０１０１】
４種類のＥ２（ＵｂｃＨ２ｂ、ＵｂｃＨ３、ＵｂｃＨ４、ＵｂｃＨ７）、０．５〜２ｍｇ／ｍｌを高精度のインクジェット方式のマイクロアレイヤー（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：ＵＳＡ）を使用してスライドガラス上に、室温にて１００％の湿度雰囲気下でマイクロプリンティングした。スライドガラスは、テフロンマスクで分割された１２×４サブアレイを有する、ハイドロゲル−ＮＨＳ機能化ガラススライド（松浪硝子工業社製）を用い、各サブアレイにＥ２をプリンティイングした。分配容量は１スポット当たり１０ｎＬで、平均スポット直径２５０〜５００μｍ、タンパク質平均重量５ｎｇ／スポット（０．２５ｐｍｏｌ／スポット）、となるようにスポットした。プリンティングの後、スライドガラスを水飽和チャンバー内で室温にて、１時間インキュベートした。次に、ガラス基板表面への非特異的結合を避けるべく、ブロッキング剤（２％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６））を各サブアレイにアプライし、室温で２時間インキュベートした後、スライドガラスをＰＢＳ（ｐＨ７．６）中で、４回洗浄した。洗浄後、スライドガラスに１５μＬのＵＢＭ（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）中に、１００ｎＭウサギＥ１、１μＭ標識化ユビキチン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有）を各サブアレイにアプライし、３７℃にて５時間インキュベートして、スライドガラス上に固定化されたＥ２と反応させ、チオエステル結合を介してユビキチンをＥ２に結合させた。標識化ユビキチンは、ビオチン化標識ユビキチンを使用した。反応後、ガラス表面の非共有結合分子を避けるべく、スライドガラスは５０ｍＬの０．１％ＳＤＳ含有５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ５．７）中での振とうにて洗浄し、蒸留水中で４回すすいだ後、バキューム下で乾燥させた。そして、２０μｇ／ｍＬストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）／５％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）を含有する染色液１５μｌを各サブアレイにアプライした後、室温で３０分間インキュベートした。その後、スライドガラスを、５０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．６）中ですすぎ、そして、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄ，Ｉｎｃ．製）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）中での２分間の振とうによって洗浄した。そして、注意深く蒸留水中ですすだ後、表面の均一な乾燥のために２０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。スライドガラスはＷＨＩＴＥ−ＬＩＧＨＴスキャナー（Ａｐｐｒｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社製）を使用して５５０ｎｍでスキャンされ、ＩＭＡＧＥＮＥTMソフトウェアーによってシグナルを量化し、データを解析した。結果を図１３に示す。
【０１０２】
図１３をみると、検討したすべてのＥ２ファミリーにおいて、バックグラウンドに対する顕著なシグナルが観察された。また、上記実験を、Ｅ１の添加をしないＵＢＭ試薬で行った場合、シグナルは検出されなかった（図１３、左）ことから、Ｅ２上の共有結合しているユビキチンは、Ｅ１依存性であることを示しており、Ｅ２上で検出されているシグナルは、Ｅ１からトランスファーされたユビキチンに起因するものであることが確認される。したがって、このアッセイは、Ｅ２ファミリーのユビキチン化レベルを調査するために好適に利用できることが判明した。
また、ここでは図示しないが、ＡＴＰの添加をしないＵＢＭ試薬で行った場合、シグナルは検出されなかったことから、Ｅ１のユビキチン活性化機構は、ＡＴＰ依存であることが確認された。
そして、Ｅ２固定化プロテインチップとＵＢＭとの接触の際に、ユビキチン化経路を調節できる可能性がある試験物質を添加することにより、該試験物質が、ユビキチンのＥ１からＥ２にトランスファーするのを制御することによりユビキチン化経路を調節できる調節物質として利用可能か否かを調査することができる。そして、ここでユキチン化経路を調節可能な調節物質であると選別、同定された物質は、ユビキチン化経路の異常に関係する疾患の治療用薬物、予防用薬物となり得る。
【０１０３】
（別実施例）
異なる複数のＥ２を、基板上の複数の異なる位置に配置させたが、異なる複数の所望の標的タンパク質を基板上の複数の異なる位置に配置させることが可能である。
【０１０４】
さらに、異なる複数のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）を基板上の複数の異なる位置に配置させることが可能である。（Ｅ３を含める場合、本実施例において、Ｅ２の最適化を検討した結果が開示されているが、このストラテジーをＥ３に適用できるという根拠の開示が必要であると考えます。）このように構成することにより、Ｅ２固定化プロテインチップと同様に、ユビキチン経路を調節可能な調製物質のスクリーニング等、広範な利用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ユビキチン経路を模式的に示す図
【図２】本発明のプロテインチップを用いた解析方法の一般原理を示す図
【図３】液相でのパラメータ解析実験の結果を示す図
【図４】洗浄条件の最適化検討実験の結果を示す図
【図５】ブロッキング剤の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図６】接触反応時間の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図７】４種類の異なるＥ２のオンチップユビキチン化における酵素活性を示す図
【図８】Ｅ１およびユビキチン濃度の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図９】Ｅ１濃度の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図１０】ユビキチン濃度の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図１１】ユビキチンの標識方法の最適化検討実験の結果を示すグラフ
【図１２】基板表面処理方法の最適化検討実験の結果を示すグラフであって、図１２Ａは松浪硝子工業社製ガラスでの検討結果を、図１２ＢはＥＲＩＥ社製ガラスでの検討結果を示すグラフ
【図１３】実施例のＥ２ユビキチン化実験の結果を示す図
【図５】
2005287463.tif 000003
【図６】
2005287463.tif 000004
【図８】
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【図１１】
2005287463.tif 000006
【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2005287463.tif 000011
【図７】
2005287463.tif 000012
【図９】
2005287463.tif 000013
【図１０】
2005287463.tif 000014
【図１３】
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