(57)【要約】      （修正有）【課題】稲の雄蕊に特異に発現する新規のシステインプロテアーゼ（cysteine  protease）遺伝子、該遺伝子の雄蕊特異的発現プロモーター、および該遺伝子の発現を抑制して雄性不妊形質が導入された稲を生産する方法の提供。【解決手段】新規システインプロテアーゼ遺伝子、該遺伝子の雄蕊特異的発現プロモーターの利用が可能となった。該遺伝子の機能が花粉生成に関与して発現を制限する場合、雄性不妊植物を生産することができる。【選択図】図１
2005198644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
稲（Oryza  sativa  L.）の雄蕊に特異的に発現して花粉発達に関与する序・目・序列１の塩基序列およびアミノ酸序列を有するシステインプロテアーゼ遺伝子。
【請求項２】
序・目・序列４の塩基序列を有する稲（Oriza  sativa  L.）の雄蕊の特異的発現プロモーター。
【請求項３】
請求項１の遺伝子の発現をT-DNA挿入により抑制させ、それからT2子孫を得た後、前記T2子孫のうち長さ成長が減少する矮小性、遅い開花および遅い種子発芽と共に花粉成長抑制を見せた突然変異植物を分裂により無性繁殖することを特徴とする雄性不妊導入稲の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は稲の雄蕊に特異的に発現する新規のシステインプロテアーゼ（cysteine  protease）遺伝子、該遺伝子の雄蕊の特異的発現プロモーター、該遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産方法に関し、より詳細には稲（Oryza  sativa  L.）のT-DNA挿入変異株から稲の雄蕊に特異に発現するシステインプロテアーゼ遺伝子をT-DNA遺伝子−トラップシステムにより分離し、前記遺伝子の機能が花粉発達に関与することを明らかにすることにより前記遺伝子の発現抑制を利用して植物に雄性不妊を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在まで報告されたシステインプロテアーゼは雄蕊に特異的に発現したりその機能が雄性不妊に利用し得る形質が無かったりであり、また、現在までの雄性不妊導入技術は外部毒性遺伝子の導入による雄蕊組織の選択的死滅に因り誘導されたものであったため、雄蕊に特異的に発現して花粉発達に関与する稲自体遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入技術に関する本発明は新規のものであって、その価値が非常に高いと言える。
稲は、国内は勿論全世界の３分の１以上の国で主食になっている米の生産植物であって、経済的に重要な農作物のうちの一つである。この作物の生産量増大のために雄性不妊導入によるF1ハイブリッド生産は、全世界の研究者が注目している技術開発である。稲においても細胞質雄性不妊（ＣＭＳ）方式が可能であるが、生産費用や実際利用面においては現実的でなく遺伝子操作による雄性不妊形質転換体開発方式にはタペチュム（tapetum）特異的プロモーターを利用して外部毒性遺伝子（バクテリアまたは植物体遺伝子）を利用して選択的な雄蕊組織の死滅を誘導することにより雄性不妊を作る方法が利用されている。
【０００３】
雄蕊は、花植物の雄性生殖器官としてタぺチュム、エンドセシウム（endothecium）、結合組織、管束組織などの多数組織で構成され、花粉の生産を担当する。雄蕊の発達過程は雄蕊の形態が確立されマイクロスポア（microspore）母細胞が減数分裂してテドラドのマイクロスポアを形成する第１期と、花粉と雄蕊が分化して組織退化、裂開（dehiscence）および花粉放出が起こる第２期に区分されるが、このような発達過程に関与する多様な遺伝子のうち一部だけが雄蕊に特異的に発現される。また一方、システインプロテアーゼは広範に広がっているシステム、即ち、動物・植物、そして微生物において、細胞間蛋白質分解の重要な役割をする酵素に属する。このように蛋白質分解から得られたアミノ酸は、新たな蛋白質合成のために更に使用されうる。高等植物におけるシステインプロテアーゼ（CysP）は、種子において広く研究されているが、これは前記の如き蛋白質加水分解酵素が発芽過程のための主要酵素と認識されるためである（非特許文献１）。
種子発芽のための栄養供給は胚乳に保存された澱粉と貯蔵蛋白質を加水分解することにより得られ、従って、CysPは夫々麦と稲における主要貯蔵蛋白質であるホルデイン（hordein）、グルテンの加水分解の責任を負う主要酵素として報告されている（非特許文献２）。
また、CysPは細胞が細胞予定死（programmed  cell  death；PCD）を経験するに寄与する役割を有するが（Solomon  et  al．，1999）、これと関連して豆細胞において前記酵素の生産がPCDの間に増加し調節されるのが発見された。
【０００４】
茲に、本発明者達は前記の如き点を勘案して従来技術の問題点が無く雄性不妊形質を有する稲を得るために多くの研究を重ね、2002年からは稲T−DNA挿入変異株を利用した雄性不妊関連遺伝子探索を課題とする研究を進めて来た。その結果、種子特異的に発現したり種子発芽に関与する一般システインプロテアーゼとは異に雄蕊に特異的に発現して花粉発達に関与する新規のシステインプロテアーゼ遺伝子を明らかにした。
【非特許文献１】Shutov  and  Vaintraub．1987；Ryan  and  Walker-Simmons，1991；Ho  et  al．，2000
【非特許文献２】Rostogi  and  Oaks，1986；Kato  Minamikawa，1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、稲の雄蕊に特異に発現して花粉発達に関与する新規のシステインプロテアーゼ遺伝子を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記遺伝子の稲雄蕊の特異的発現プロモーターを提供することにある。
本発明のまた別の目的は、前記遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的により本発明では稲の雄蕊に特異に発現して花粉発達に関与する下記序列１の塩基序列およびアミノ酸序列を有する新規のシステインプロテアーゼ遺伝子を提供する。
＜序列１＞
catacctgttcaactgcagcgatattagaacatccagttccagccatcaccaatttaacc -2274 
gatatatgatcatactttgatctgtctgaagatttcttcaggtcctttgcttttgtttga -2214 
gcattattgcttgtgctagctacattggcatctgcctgtaatttcataacggataaaatt -2154 
aagattagtaacagagcaagttgagctacaacaggatctcactgtccttccagggacaca -2094 
aaacaaccaacagtttacaatttggacagtgagaaaccttgataataactggcattgcag -2034 
gaccttgacatggatcttccctcagtctgacactattgtagtgctcaccctgatgatacg -1974 
atctatattggaatcaaaacaaaggaacatgagaatgtatgtccttttactgccagtatt -1914 
agcatattagtttaaaacagcagaacacacattaacttacaaatgaatcatactggtagc -1854 
ttcacgatcagaaaagtttcttatgtaccatcgtggtgagttaagctgcaaatcattcag -1794 
taatggtacaggcatcaatcaaatgttacagtacgttctcttctatagaagaaaggctat -1734 
aatatgaaaatgagtacgaaaaataacagagaaccatcaggggatatataagcagcacat -1674 
tgatctatatcacccatgtgtttcaaaatacagactaggcaaggctcaactgcctagcgt -1614 
gttattcataggttgaagaaatcatactgcaaagcttgtattgaaaattaccatgtggat -1554 
gcatatgttttttctcttgagaatagaagctgcttgcaactccatatgaccagcccaagt -1494 
cccatcctcaagcatagagtcacaatatttctcaaacggttcctcgtcctcaatgaatgg -1434 
ctcaaaatccacacggtgctcctgtaagatgcatacaagaaagattatgaagtgtaaata -1374 
ggccaatgcttgcttgcagcatgtcttttagataaaagaacaacccagcctggcagcctg -1314 
tactctacgcccagatcagatgtacacagccaaagtttgcagcatgtgcaataccttatt -1254 
gattcaatggcaccctaattacagttcttaagtcacagtgttacaagatgtttcttggtc -1194 
atagccaaagcttgcagtatttctaataccttattgattcaatggcaccctaactacagt -1134 
tattaagtcacagtgttacaagatgtttgttttggtcatctcatctgatgcataccttaa -1074 
tgtattgcacaatcattgcacggtacttcatgtgctcttcctcgttgccttcgagctggt -1014 
cgcccattgccctgcagactacgatgagtaaccatataacacaagactgcataatgcata  -954 
tactattcctcctttcataaactaacagtactctaacatatcgtacaacatcgattagcc  -894 
tcttcttgtaaaaagtggcaagaatttgagtaatggaatcgaaaagaagacctaaagaag  -834 
cagttgccatccgcactaacttcgataatcttcaaccccagcgagtccagctgcgcccgg  -774 
aactccgtcatgtcggccttcttcgcgaacttcttctcctcctaacaaatcaatcaccaa  -714 
aaggaaaaaaaaacgagaaaatatattagctaaagctcaattccccttccaccaaaaacg  -654 
atccaatctccagctgactgaggcgcggggtattactgcatcacgcttcggcttccgggc  -594 
tttgggcgccgccacggctaccttcttcttgttccgagccattacgacacgtgcggtagt  -534 
agtggagtctcgcctagatttccccgcggcggcggcggcggcgagggggaggggaggcgg  -474 
aatcgcagatagtatcaaatcgtactctaccagaagcccggagaagaaatcggatgggaa  -414 
aaggaagaggagaagagaagagaagtcgtcaggtgatatttcgtgggccaaatgggccgg  -354 
gccgtaacacctcaatccccaatctgctacggcccgtgtgtgaacgtgacacgtcatcct  -294 
atttagaatcgaataccgaacctgaacgtgacacgtcagatttaggagtagaaacgagta  -234 
cactctacacgatacagatccaatacgagaccgacacgtcgtcagcgaccaagtaaaatt  -174 
cggtcacgaa↓ccgtacgccaccaacctgtataaattcatcgaccgccaagcctctccaga-114 
acatagcacaagccaaccaaacaccgcacgatttcgtatccacacatacttctacgtga    -55 
tttcgtttcgacgatctcgaggcgccgcggcgtgacgtgacgtcgacgacaaccatggca    6 
M  A      2
Ggcggtggcggcaagtccgtagcggcggcgctggccatggcctgcttcctcctcatcctc    66 
G  G  G  G  K  S  V  A  A  A  L  A  M  A  C  F  L  L  I  L      22 
gccgccttcgctcccccggcggcggcggcgccgccggacatcatgtcgatcatcaggtac   126 
A  A  F  A  P  P  A  A  A  A  P  P  D  I  M  S  I  I  R  Y      42 
Aacgcggagcacggggtgcgggggctggagcggacggaggccgaggcgcgcgccgcgtac   186 
N  A  E  H  G  V  R  G  L  E  R  T  E  A  E  A  R  A  A  Y      62 
Gacctgtggttggcgcggcaccggcgcggcggcggcggcggctcgcgcaacgggttcatc   246 
D  L  W  L  A  R  H  R  R  G  G  G  G  G  S  R  N  G  F  I      82 
Ggcgagcacgagcgccggttccgcgtgttctgggacaacctcaagttcgtcgacgcccac   306 
G  E  H  E  R  R  F  R  V  F  W  D  N  L  K  F  V  D  A  H     102 
Aacgcccgcgccgacgagcgcggcgggttccgcctcgggatgaaccgcttcgccgacctc   366 
N  A  R  A  D  E  R  G  G  F  R  L  G  M  N  R  F  A  D  L     122 
Accaacggcgagttccgcgccacctacctcggcaccacgcccgccggcagggggcgccgc   426 
T  N  G  E  F  R  A  T  Y  L  G  T  T  P  A  G  R  G  R  R     142 
Gtcggggaggcgtaccgccacgacggcgtcgaggcgctgccggactccgtggactggagg   486 
V  G  E  A  Y  R  H  D  G  V  E  A  L  P  D  S  V  D  W  R     162 
Gacaagggcgccgtcgtcgcccccgtcaagaaccagggccagtgcggtagctgctgggcg   546 
D  K  G  A  V  V  A  P  V  K  N  Q  G  Q  C  G  S  C  W  A     182 
Ttctcggcggtcgccgccgtggagggcatcaacaagatcgtcaccggcgagctggtgtcg   606 
F  S  A  V  A  A  V  E  G  I  N  K  I  V  T  G  E  L  V  S     202 
Ctgtcggagcaggagctggtggagtgcgcgaggaacgggcagaacagcggctgcaacggt   666 
L  S  E  Q  E  L  V  E  C  A  R  N  G  Q  N  S  G  C  N  G     222 
Gggatcatggacgacgcgttcgccttcatcgcccggaacggcggcctcgacacggaggag   726 
G  I  M  D  D  A  F  A  F  I  A  R  N  G  G  L  D  T  E  E     242
Gactacccgtacacggccatggacggcaagtgcaacctcgccaagaggagccgcaaggtg   786
D  Y  P  Y  T  A  M  D  G  K  C  N  L  A  K  R  S  R  K  V     262
Gtgtccatcgacggcttcgaggacgtgcccgagaacgacgagctgtcgctccagaaggcc   846 
V  S  I  D  G  F  E  D  V  P  E  N  D  E  L  S  L  Q  K  A     282 
Gtggcgcaccagcccgtcagcgtcgccatcgacgccggcggccgcgagttccagctctac   906 
V  A  H  Q  P  V  S  V  A  I  D  A  G  G  R  E  F  Q  L  Y     302 
Gactccggcgtgttcaccggccggtgcggcaccaacctggaccacggcgtggtggcggtg   966 
D  S  G  V  F  T  G  R  C  G  T  N  L  D  H  G  V  V  A  V     322 
Gggtacggcacggacgccgccaccggcgccgcctactggacggtgcgcaactcgtggggg  1026 
G  Y  G  T  D  A  A  T  G  A  A  Y  W  T  V  R  N  S  W  G     342 
Cccgactggggcgagaacggctacatccgcatggagcgcaacgtcaccgcgcgcaccggc  1086 
P  D  W  G  E  N  G  Y  I  R  M  E  R  N  V  T  A  R  T  G     362 
Aagtgcggcatcgccatgatggcgtcctacccgatcaagaaggggcccaacccgaagccg  1146 
K  C  G  I  A  M  M  A  S  Y  P  I  K  K  G  P  N  P  K  P     382 
Tcgccgccgtctccggcgccatcgccgccgcagcaatgcgaccggtacagcaagtgcccg  1206 
S  P  P  S  P  A  P  S  P  P  Q  Q  C  D  R  Y  S  K  C  P     402 
Gcggggaccacctgctgctgcaactacgggatcaggaaccactgcatcgtgtggggatgc  1266 
A  G  T  T  C  C  C  N  Y  G  I  R  N  H  C  I  V  W  G  C     422 
Tgccccgtcgagggcgccacctgctgcaaggatcactccacctgctgccccaaggagtat  1326 
C  P  V  E  G  A  T  C  C  K  D  H  S  T  C  C  P  K  E  Y     442 
cccgtctgcaacgccaaggctcgcacttgctccaag*gttttaaatttaaattttatgtt  1385 
P  V  C  N  A  K  A  R  T  C  S  K                             454 
Tacttttaatttttagagttgattttagcgtttttataagtaatttctttttcatcattg  1445 
Acttttttttaagttgttaagaacatatgtaaaagttacattggccgctaatacgtgtta  1505 
tgtctgtgtgtgttatgtgctcacacgttgccatgttttttccttgacag*agcaagaac  1564
S  K  N    457 
Agcccgtacaatatcaggactccggcggcgatggcacgaagtgttccggaacaacctgat  1624 
S  P  Y  N  I  R  T  P  A  A  M  A  R  S  V  P  E  Q  P  D     477 
Tcaatctcttttgtagttttgaatagggaagatctagtatagaagccttatctttgttac  1684 
S  I  S  F  V  V  L  N  R  E  D  L  V  -                       490 
Tgttaccgagtcctttattattatcgctctttttttttcgcaagatgtataaagtcctaa  1744 
Acagttactgttactattactgaagttattatctatctttggatatgagttctcccaagt  1804 
Acagcatcacgtgttgttacagctctatcgtttgttttttagggtgtgtttagtttacga  1864 
Aaaaaaaattggtatcacatcgaacgtttgatcgacgttgaaaggggttttcggatacga  1924 
Atgaaaaaactaatttcataactcgcttggaaaccgcgagacgaatttattaagtctaat  1984 
Taatccgtcattagcacatgttggttactgtagcatttatgactaatcatggactaatta  2044 
Ggctcaaaagattcgtctcacgatttccatgtaaactgtgcaattagttttttaatctat  2104 
Atttaacgcccgatgcatgtgtccaaagattcgatgtaatatttttagagaaaaaaattg  2164 
Ggaactaaattattaataaacgttacagctgacaaatgggattgtagcttttgactgagt  2224 
【０００７】
別の目的により前記遺伝子のうち-2333番目乃至-119番目の塩基序列に該当する下記序列２を有する雄蕊特異的発現プロモーターを提供する。
＜序列２＞
catacctgttcaactgcagcgatattagaacatccagttccagccatcaccaatttaacc -2274 
gatatatgatcatactttgatctgtctgaagatttcttcaggtcctttgcttttgtttga -2214 
gcattattgcttgtgctagctacattggcatctgcctgtaatttcataacggataaaatt -2154 
aagattagtaacagagcaagttgagctacaacaggatctcactgtccttccagggacaca -2094 
aaacaaccaacagtttacaatttggacagtgagaaaccttgataataactggcattgcag -2034 
gaccttgacatggatcttccctcagtctgacactattgtagtgctcaccctgatgatacg -1974 
atctatattggaatcaaaacaaaggaacatgagaatgtatgtccttttactgccagtatt -1914 
agcatattagtttaaaacagcagaacacacattaacttacaaatgaatcatactggtagc -1854 
ttcacgatcagaaaagtttcttatgtaccatcgtggtgagttaagctgcaaatcattcag -1794 
taatggtacaggcatcaatcaaatgttacagtacgttctcttctatagaagaaaggctat -1734 
aatatgaaaatgagtacgaaaaataacagagaaccatcaggggatatataagcagcacat -1674 
tgatctatatcacccatgtgtttcaaaatacagactaggcaaggctcaactgcctagcgt -1614 
gttattcataggttgaagaaatcatactgcaaagcttgtattgaaaattaccatgtggat -1554 
gcatatgttttttctcttgagaatagaagctgcttgcaactccatatgaccagcccaagt -1494 
cccatcctcaagcatagagtcacaatatttctcaaacggttcctcgtcctcaatgaatgg -1434 
ctcaaaatccacacggtgctcctgtaagatgcatacaagaaagattatgaagtgtaaata -1374 
ggccaatgcttgcttgcagcatgtcttttagataaaagaacaacccagcctggcagcctg -1314 
tactctacgcccagatcagatgtacacagccaaagtttgcagcatgtgcaataccttatt -1254 
gattcaatggcaccctaattacagttcttaagtcacagtgttacaagatgtttcttggtc -1194 
atagccaaagcttgcagtatttctaataccttattgattcaatggcaccctaactacagt -1134 
tattaagtcacagtgttacaagatgtttgttttggtcatctcatctgatgcataccttaa -1074 
tgtattgcacaatcattgcacggtacttcatgtgctcttcctcgttgccttcgagctggt -1014 
cgcccattgccctgcagactacgatgagtaaccatataacacaagactgcataatgcata  -954 
tactattcctcctttcataaactaacagtactctaacatatcgtacaacatcgattagcc  -894 
tcttcttgtaaaaagtggcaagaatttgagtaatggaatcgaaaagaagacctaaagaag  -834 
cagttgccatccgcactaacttcgataatcttcaaccccagcgagtccagctgcgcccgg  -774 
aactccgtcatgtcggccttcttcgcgaacttcttctcctcctaacaaatcaatcaccaa  -714 
aaggaaaaaaaaacgagaaaatatattagctaaagctcaattccccttccaccaaaaacg  -654 
atccaatctccagctgactgaggcgcggggtattactgcatcacgcttcggcttccgggc  -594 
tttgggcgccgccacggctaccttcttcttgttccgagccattacgacacgtgcggtagt  -534 
agtggagtctcgcctagatttccccgcggcggcggcggcggcgagggggaggggaggcgg  -474 
aatcgcagatagtatcaaatcgtactctaccagaagcccggagaagaaatcggatgggaa  -414 
aaggaagaggagaagagaagagaagtcgtcaggtgatatttcgtgggccaaatgggccgg  -354 
gccgtaacacctcaatccccaatctgctacggcccgtgtgtgaacgtgacacgtcatcct  -294 
atttagaatcgaataccgaacctgaacgtgacacgtcagatttaggagtagaaacgagta  -234 
cactctacacgatacagatccaatacgagaccgacacgtcgtcagcgaccaagtaaaatt  -174 
cggtcacgaaccgtacgccaccaacctgtataaattcatcgaccgccaagcctct       -119 
また別の目的により前記遺伝子の発現を抑制して雄性不妊導入稲を生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が提供する遺伝子は稲の雄蕊に特異的に発現して花粉発達に関与する新規のシステインプロテアーゼであって、その発現を抑制した場合、稲における花粉生成が制限されるため、種子生産調節を可能にする雄性不妊導入稲の生産を可能ならしめる。また、前記遺伝子は他の花粉と植物にも利用可能であるのみならず、過多発現する場合には反対の形質が現れる可能性があるので、多様に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は稲（Oryza  sativa  L.）のT-DNA挿入変異株から分離され雄蕊に特異に発現して花粉発達に関与し、ゲノム上の塩基序列としては前記序列１で表示される新規のシステインプロテアーゼである。前記rCysP1遺伝子の概略を図示すると図１aの通りであり、その序列を示すと前記序列１の通りである。
図１ａにおいて、右側の黒色矩形はエキソン（exon）を示し、左側の灰色箱はIPCR（inverse  PCR）の結果物であったrCysP1遺伝子のプロモーター部位を指す。逆３角形はT-DNA挿入位置を表示するが、T-DNAはバイナリベクター（binary  vector）の右側境界（BR）の左側境界（BL）との間にリポーター遺伝子であるGUS遺伝子と選別遺伝子であるhph（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）を含んでいる。また、矢印はＴ２子孫（T2  progeny）の遺伝子型分析に用いられた三つのプライマー（ａ，bおよびc）を示す。
【００１０】
一方、rCysP1遺伝子の序列を表示する前記序列１において、右側数字は塩基序列（上）およびアミノ酸序列（下）の位置を示し、このうち１番はrCysP1遺伝子の開始位置を示す。この塩基序列から類推されるアミノ酸コーディング領域のうち454番目コードン間に５’と３’末端に夫々GTおよびAG序列を含んでいるイントロン（別表間部分）が存在する。このコーディング領域の５’非コーディング序列には‐139番目との間の塩基位置にTATAボックス序列であるTATAAATが位置し、３’非コーディング領域には2179番目で2184番目までの塩基位置にポリアデニール化シグナル序列であるAATAAAが位置する。前記序列１でTATAボックス序列を含む５’非コーディング序列（‐119番目）から‐2333番目までの塩基位置がrCysP1遺伝子の雄蕊特異的プロモーター部位である（大文字で表記）。前記アミノ酸コーディング領域のうち180番位置のシステイン、297番位置のヒスチジンおよび339番位置のアスパラギンはパパイン科（papain  family）に属するシステインプロテアーゼで保存される触媒３対（catalytic  triad）と一致する。また、rCysP1のアミノ酸コーデイング領域のうち84番目コードン（グルタミン）と103番目コードン（アスパラギン）との間にはカテプシンB（cathepsin  B）を除く全てのパパイン酵素とシステインプロテアーゼに存在するものと同一のERPNINモチフの保存序列（consensus  sequence）が存在し（Karrer  et  al．，1993）、但し、イソルシンの代わりにバリンを使用する（Akasofu  et  al．，1989）。T−DNAはアミノ酸コーディング領域の５’非コーディング序列のうち‐86番目と‐87番目の塩基位置との間に挿入された（図１ｂ垂直矢印部分）。
【００１１】
前記コーディング領域のオープンリーディングフレーム（ORF）は490個のアミノ酸で構成され、下記序列３のアミノ酸序列を有する。
＜序列３＞
M A G G G G K S V A A A L A
M A C F L L I L A A F A P P A A A A P P D I M S I I R Y N A E H G V R G L E R T
E A E A R A A Y D L W L A R H R R G G G G G S R N G F I G E H E R R F R V F W D
N L K F V D A H N A R A D E R G G F R L G M N R F A D L T N G E F R A T Y L G T
T P A G R G R R V G E A Y R H D G V E A L P D S V D W R D K G A V V A P V K N Q
G Q C G S C W A F S A V A A V E G I N K I V T G E L V S L S E Q E L V E C A R N
G Q N S G C N G G I M D D A F A F I A R N G G L D T E E D Y P Y T A M D G K C N
L A K R S R K V V S I D G F E D V P E N D E L S L Q K A V A H Q P V S V A I D A
G G R E F Q L Y D S G V F T G R C G T N L D H G V V A V G Y G T D A A T G A A Y
W T V R N S W G P D W G E N G Y I R M E R N V T A R T G K C G I A M M A S Y P I
K K G P N P K P S P P S P A P S P P Q Q C D R Y S K C P A G T T C C C N Y G I R
N H C I V W G C C P V E G A T C C K D H S T C C P K E Y P V C N A K A R T C S K
S K N S P Y N I R T P A A M A R S V P E Q P D S I S F V V L N R E D L V 
【００１２】
データベース検索結果によれば、前記ORFはcontig8664（http：//btn．Genomics．org．cn：8080/rice/）、OSJNBa0043A12（http：//www．Ncbi．nim．nih．gov/）およびAK107506（http：//cdna01．Dna．affrrc．go．jp/cDNA/）に位置しており、相同性調査によれば植物から発見されるシステインプロテアーゼらのうち稲のorizainβとヌクレオチド序列およびアミノ酸序列において夫々89％、69％の同一性を見せる。従って、本発明の遺伝子はパパイン科のシステインプロテアーゼに属するのである。
【００１３】
本発明の遺伝子の発現は時・空間的に調節される特徴があるが、空間的には稲花の雄蕊器官で著しく発現され、根部分や雄蕊以外の他の花器官そして葉器官では殆んどまたは全く発現されない。特に、前記雄蕊器官のうちでもタペチュム（tapetum）および花粉にのみ限定して発現され、管束組織や結合組織には全く発現されない。また、本発明の遺伝子は相同性を見せたoryzain  βとは異に種子発芽過程中には極めて制限された量で発現され、前記遺伝子rCysP1が標識されたT-DNA挿入稲がその弱器官で著しい花粉退化を見せることにより、花粉発達に重要な役割をする遺伝子であることが分かる。一方、時間的には花が成熟するに従ってその発現量が増加するが、成熟した花で最も著しく発現される。従って、本発明の遺伝子は花の成長時期において遅い時期に発現される遺伝子（late‐expressed  gene）に属する。
本発明遺伝子の雄蕊特異的発現プロモーターは、前記序列１の塩基序列のうち‐2333番目乃至‐119番目の塩基序列に該当する序列２で表示される。前記プロモーターは稲ゲノムDNAから通常的なクローニング方法で得られるが、例えば、序列２の塩基序列を利用して適切にプライマーを合成した後、通常的なPCR方法を行うのである。
【００１４】
本発明におけるT−DNAは、rCysP1−標識されたT−DNA挿入稲のT２子孫に対する遺伝子型分析結果によれば、次世代に同一−分離（co-segregation）され、rCysP1突然変異のうち同型接合植物は、生長および発達において全体的に深刻な遅延を見せてくれる。即ち、前記突然変異植物は、野生型に比べて種子発芽が約７日乃至９日程遅く、根と茎の成長においては正常的な姿を見せるが、植物の長さの成長が減少する矮小性を見せる。特に、円錐花序（panicle）の場合、修正されないまま継続緑色に残っている花を多数個含み、開花も約１５日程遅い。結果的に、rCysP1同型接合突然変異植物は種子形成数が減少する特徴を見せる。また、前記突然変異植物は非正常的な花粉発達を示す。小胞子期（microspore  stage）から単核花粉期（uni-nucleated  pollen  stage）にちょうど放出される段階で一番目異常症候を観察することができるが、雄蕊が非常に少数の花粉を含んでおり、そのうち残っている花粉らは細胞死滅（cell  death）になる。液胞化された花粉期（vacuolated  pollen  stage）に至ると、その程度がもっと深刻になって最後の成熟した花粉期（matured  pollen  stage）では完全に空組織（locule）を含む。
【００１５】
前記から分かる通り、本発明遺伝子は稲雄蕊特異的に発現して花粉発達に関与する新規のシステインプロテアーゼであって、その発現を抑制させる場合、稲における花粉生成が制限されるため、前記遺伝子の発現抑制を利用した雄性不妊導入稲の生産が可能である。また、前記遺伝子は小麦・玉蜀黍・黍または茅草種など他の花粉と植物にも利用可能であるのみならず、前記遺伝子の発現抑制を利用した稲の種子生産および成長調節も可能である。
一方、稲は１株に多数の分げつ枝（tiller）を有しているため、前記分げつ枝を人為的に分離して更に移植する方法により無性繁殖することができる。
【００１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明がこれに限定されるのではない。
＜実施例１：rCysP1遺伝子のクローニングおよび序列分析＞
（１）先ず、2000年前などにより公知された方法（Jeon  et  al．，2000．T‐DNA
insertional  mutagenesis  for  functional  genomics  in  rice．Plant  J．22，561-570参照）によりGUS遺伝子転写体（GUS  gene  transcript）が無作為でゲノム内に挿入された稲（Oryza  sativa  L．）のT−DNA挿入変異株を製作し、2003年ゴタンダム等により公知された方法（Gothandam  et  al．，2003．Identification  of  anther-specific  gene  expression  from  T−DNA  tagging  rice．Mol．Cells  15，102‐109参照）により前記変異株らのＴ２世代で見せたGUS発現を探索し、その結果、前記変異株のうち特に雄蕊でGUS発現を見せたT‐DNA標識変異株を選択してその特性を調査した（図4参照）。
【００１７】
（２）本発明のT−DNAに隣接した序列（flanking  sequence）を決定するために前記T−DNA部位に位置したGUSの転写体序列からデザインしたプライマーセットを利用してIPCR（inverse  PCR）を行った（図１ａ参照）。
IPCRは1988年トリグリア等により公知された方法（Triglia  et  al．，1988．A  procedure  for  In  vitro  amplification  of  DNA  segment  that  lie  outside  the  boundaries  of  known  sequences．Nucl．Acids  Res．16，8186）により行われた。Genomic  DNA  １μｇをPstI制限酵素で12時間切断した。前記反応はエタノール沈澱により止まり、前記DNAは40Ulの水で再懸濁された。その後、前記再懸濁されたgenomic  DNAはT4  DNA  ligaseにより分子内連結（self-ligation）された。PCR反応はDNA  20ng，１Ex  Taqバッファー、0.2mM  ｄNTP，0.5  unit  Ex  Taqポリマーレーズ（Takara，Japan）およびプライマー１UMを含む50ULの混合物で行われた。前記IPCRで用いられたプライマーは下記の通りである。
5’‐TTGGGGTTTCTACAGGTAAC‐3’（reverse）
5’‐GAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATC‐3’（forward）
前記IPCR結果、前記T‐DNAが前記稲ゲノムで1,666bp長さORFの上流部位に融合されたのが明かされ、前記隣接序列に対するデータベース検索結果は前記ORFがcontig8664（http：//btn．genomics．org．cn：8080/rice/）、OSJNBa0043A12（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/）およびAK107506（http：//cdna01．dna．affrc．go．jp/cDNA/）に位置しているのを見せてくれた。
【００１８】
（３）前記genomic DNAを分離して序列分析し、その結果得られたアミノ酸序列に対し植物から発見されるシステインプロテアーゼオリザインβ（Oryzainβ：Oriza sativa，P25777）、玉蜀黍（Zea mays：Zea mays，AAB70820．2）、樅（Douqlas fir：Pseudotsuga menziesii，JC4848）、煙草（Tabacco；Nicotiana tabacum，T03941）および白菜科（Rape；Brassica napus，JQ1121）のアミノ酸序列との相同性調査を行った。
前記序列分析結果は図１の通りであり、ORFが全体490個のアミノ酸を暗号化する。
前記アミノ酸序列に対する調査結果は図２ａに示した。図２ａにおいて、黒色箱は同一のアミノ酸残基を示し、灰色箱は類似のものを示す。別表はERFNINモチフの保存序列（concensus  sequence）を指し、アンダーライン部分はパパイン酵素とシステインプロテアーゼのペプチダーゼ（peptidase）C1ドメインを表示する。また、垂直矢印は翻訳後切断位置（posttranslational  cleavage  site）と推定される所を表示する。
前記遺伝子は植物から発見されるシステインプロテアーゼらのうち稲のoryzainβとヌクレオチド序列およびアミノ酸序列において、夫々89％，69％の同一性を見せたが、oryzainβはorizainαおよびγと共にシステインプロテアーゼのパパイン酵素科（papain  family）に属する（Watanabe  et  al．，1991）。また、前記rCysP1遺伝子はカテプシンB（cathepsin  B）を除く全てのパパイン酵素とステインプロテアーゼに存在するRFNINモチフの保存序列（consensus  sequence）を含んでおり（Karrer  et  al．，1993）、前記保存序列はrCysP1のアミノ酸序列のうち84番位置のグルタミンと103番位置のアスパラギンとの間で発見された。また、Karrer等（1993）が描写した通り、本発明者達はrCysP1とOrizainβが同一のモチフ序列を共有するが（図２ａ参照）、前記保存序列EX3RX2（V/I）FX2NX3IX3Nは種によって多様であることを発見した。しかし、他のIVステインプロテアーゼとは異なりrCysP1とOryzainβは哺乳動物システムで観察されたようにイソルシンの代わりにバリンを用いるものと明かされた（Akasofu  et  al．，1989）。パパイン酵素科に属するもののうち保存される180番位置のシステイン、297番位置のヒスチジンおよび339番位置のアスパラギンなどの特徴的触媒３対（catalytic  triad）が前記rCysP1のアミノ酸序列においても観察された（図１ｂ参照）。一方、このような結果は植物から発見される代表的なシステインプロテアーゼに対する系統分析結果と一致するのであった。前記系統分析結果は図２ｂに示し、図２ｂで用いられたシステインプロテアーゼは、じゃが芋（potato；Solanum  tuberosum，CAB53515．1）、トマト（tomato；Lycopersicon  esculentum，Y06416）、豌豆（garden  pea；Pisumsativum，S24602）、白菜科（brassica  o．；Brassica oleracea，AAL60579．1）、樅（Douglas  fir；Pseudotsuga  menziesii，JC4848）、クローブピンク（clove  pink；Dianthus  caryophyllus，AAA79915．1）、三度豆（phaseolus  v．；Phaseolus  vulgaris，CAB17076．1）、スプリングベッチ（spring  vetch；Vicia  sativa，S47312）、煙草（tobacco；Nicotiana  tabacum，T03941）、アラビドプシス（arabidopsis；Arabidopsis  thaliana，AAK92229．1）、レープ（rape；Brassica  napus，JQ1121）、玉蜀黍１（maizel；Zea  mays，AAB70820．2）、玉蜀黍２（maize２；Zea  mays，T01206）、玉蜀黍３（maize３；Zea  mays，T01207）、オリザイン  a（oryzain  a；Oryza  sativa  P25777）、麦（barley；Hordeum  vulgare，T06208）、クリスマス（Christmas；Sandersonia  aurantiaca，AAD28477．1）、薩摩芋（sweet  potato；Ipomoea  batatas，AAK27968．1）である。      
従って、前記結果を綜合してみるとき、前記rCysP1遺伝子は稲でシステインプロテアーゼを暗号化したのが分かった。
【００１９】
（４）前記稲ゲノムにおいてrCysP1遺伝子の遺伝体複合性（genomic complexity）を決定するためにDNAブラット分析を行った。
稲の葉を窒素溶液に入れて粉砕した後、抽出溶液（extraction  buffer，100mM  Tris‐HCl，pH8.0，50mM  EDTA，500mM  NaCl，1.25％  SDS）で懸濁した。次いでフェノール/クロロホルム（１：１．ｖ/ｖ）で抽出した後、前記水相（aqueous  phase）はエタノール沈澱により濃縮した。前記沈殿物はTEバッファー（10mM  Tris‐HCl，pH7.4，１mM  EDTA）で再懸濁された。このように分離抽出されたgenomic  DNA  13Ugを前記rCysP1序列には存在しない三つの互いに異なる制限酵素EcoRI，HindIIIおよびPstIにより切断し、0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、変性および中和反応を経てナイロン膜上にブラッチングさせた。前記膜（membrane）を65℃で2時間前処理した後、32Pと標識されたrCysｐ１特異的な二つの探針で一夜混成化させた。前記二つのフローブはrCysP1全体クーロン（full‐length  rCysP1  clone）と前記遺伝子の5’上流部位から製作した。混成化後、前記膜は２SSC，0.5％  SDSで５分ずつ洗浄した。更に２SSC，0.1％  SDSで65℃で５分ずつ２回洗浄した。
その結果を図３ａに示した。図３ａにおいて、EはEcoRIを、HはHindIIIを、PはPstI酵素を表示する。１〜３番レーンは全体クローン（full-clone）探針で混成化した結果を示し、４〜６番レーンは５’UTR部位探針で混成化した結果を示す。サイズ表示は左側にした。
前記全体遺伝子（full-gene）の探針から由来した結果は１個以上のバンドで混成化され、このような事実はrCysP1遺伝子が前記稲ゲノムで小さい遺伝子集団として存在することを暗示した（図３ａ参照）。一方、前記rCysP1遺伝子の５’上流部位から製作された探針の場合には前記ゲノムでrCysP1遺伝子のみを認識した（図３ａ右側参照）。
【００２０】
＜実施例２：稲においてrCysP1遺伝子の発現様相を調査するためのRT‐PCR分析＞
rCysP1遺伝子の発現様相を調査するためにRT‐PCR分析を行った（図３参照）。
（１）先ず、稲の雄蕊器官（anther）、雄蕊を除く他の花器官（anther‐less  flower）、葉、根におけるrCysP1遺伝子の転写体蓄積および互いに異なる三つの発達段階（young，immature，mature）にある花器官における時間的発現を知るために前記器官らからRNA分離キット（TRI  reagent，Molecular  Research  Center，Cincinnati，OH）を利用してtotal  RNAを抽出し、該total  RNAの逆転写酵素を利用してcDNA筋を合成した。RT‐PCRは94℃で30秒、55℃で30秒および72℃で50秒を30回繰り返し、そして72℃で5分間延長過程（extension）の条件で行い、rCysP1転写体を探知するためのプライマーは下記の通りである。
5’‐AAGTGCAACCTCGCCAAGAG‐3’（forward）
5’‐CCGGAGTCCTGATATTGTACG‐3’（reverse）
一方、オーエスアクチン（OsActin）を対照区として用い、そのプライマーは下記の通りである。
5’‐TCCATCTTGGCATCTCTCAG‐3’（forward）
5’‐GTACCCGCATCAGGCATCTG‐3’（reverse）
【００２１】
前記実験結果を図３ｂおよび３ｃに示した。図３ｃにおいて、１は幼花（young  flower）を、２は未成熟花（immature  flower）を、３は成熟花（mature  flower）を示す。図３ｂを見ると、前記遺伝子転写体は雄蕊部分で著しく蓄積されており、根と葉部分では非常に弱く、雄蕊以外の他の花器官では殆んど蓄積されていなかった（図３ｂ参照）。従って、これから前記rCysP1遺伝子が雄蕊‐特異的であるのが分かった。一方、図３ｃを見ると、前記rCysP1遺伝子の場合、３で蓄積量が最も多く現れることにより、稲花の後期発達段階（mature  stage）でもっと多くの発現があるのが分かった。
【００２２】
（２）一方、前記実施例１でrCysP1遺伝子のアミノ酸序列に対する相同性調査結果、前記遺伝子が発芽する種子で活性を帯びるものと知られているOryzainβと相同性を見せたため、前記rCysP1遺伝子とOryzainβの雄蕊器官および発芽過程のうち発現を比較調査した。これのためにOryzainβ塩基序列から下記も如きプライマーを製作し、前記プライマーを前記RT−PCR反応が適切になされたかを知るための陽性対象群（positive  control）として利用した。
5’‐TGACATCAACAGGGAAAATGCT‐3’（forward）
5’‐GTGTTCAGTTTAGCGAGCGTG‐3’（reverse）
その結果を図３ｄに示した、図３ｄにおいて、１ｄは発芽1日目、３ｄは発芽3日目、５ｄは発芽5日目を意味する。図３ｄを見ると、Oryzainβの転写体は既に研究された通り、種子発芽過程のうち著しく蓄積されたことが分かった（Watanabe  et  al．，）。しかし、rCysP1の転写体蓄積は稲花の雄蕊で多少特異的であり、発芽する種子では非常に制限された量で現れた。前記結果はrCysP1遺伝子の１番目の役割は発芽過程でなく花粉発達に関与するものであるのを暗示した。
【００２３】
＜実施例３：稲におけるrCysP1プロモーターの活性調査＞
前記rCysP1遺伝子のプロモーター活性を決定するために前記rCysP1‐標識されたT−DNA挿入稲のT2世代を利用した組織化学的GUS分析を行った（図４参照）。
稲の花器官、根器官、葉器官を収集してGUS分析を行い、稲花は雄蕊器官と雄蕊以外の他の花器官に細分化した。本発明でのGUS活性の組織化学的分析は1987年ジェファーソン等により公知された方法（Jefferson  et  al．，1987．GUS  fusion：β‐glucuronidase  as  a  sensitive  and  versatile  gene  fusion  marker  in  higher  plants．EMBO  J．6，3901‐3907参照）にやや変更を加えて行ったが、観察組織を100mMの燐酸ナトリウム、pH7.0の0.1％  BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-glucuronide）、5mMのフェロシアンカリウム（potassium  ferrocyanide）、5mMのフェリシアンカリウム（potassium  ferricyanide）、10mMのEDTA、0.5％のトリトン（Triton）X‐100および20％のエタノールを含有する溶液に入れて37℃の培養器に１夜間放置した後、70％のエタノールで洗浄して立体顕微鏡で観察した。また、時間による前記薬におけるGUS発現分析を行い、前記プロモーター活性をもっと詳細に分析するためにrCysP1突然変異植物から採取した雄蕊器官を４％（w/v）のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）、0.5％（v/v）のグルタールアルデヒド（glutaraldehyde）および100mMのフォスフェートバッファー（phosphate  buffer，pH  7.0）を含む溶液に4℃で1夜間固定して組織を準備し、前記雄蕊組織をエタノールで完全に脱水した後、アクリル樹脂内で固め、超マイクロトムを利用して１Um大に切開した。その後、サフラニンO（Safranin  O）で染色して光学顕微鏡で観察した。
その結果を図４に示した。図４ａは互いに異なる発達期にある花器官のGUS発現結果を見せてくれ、４ｂはGUS遺伝子が発現された雄蕊器官を切開して光学顕微鏡で観察したものであって、前記rCysP1遺伝子の発現位置を見せてくれる。４ｃは雄蕊部位（anther  locule）に限定されたGUS発現（矢印の頭部分）を見せてくれ、４ｄおよび４ｅは夫々GUS発現が現われない葉部位とを根部位を示す。Aは雄蕊（anther）、S1は不妊性外翳（sterile  lemma）、Pはパレア（palea）、Poは花粉（pollen）、Tはタペチュム（tapetum0、Vは管束（vascular  bundle）を意味する。
【００２４】
図４ａを見ると、GUS発現は未成熟花（immature  flower）からは見られなく、花の後期発達段階（mature  flower）で最も高い水準で観察された。このような事実はrCysP1遺伝子が雄蕊の遅く発現される遺伝子（late-expressed  gene）に属することを提示した。また、図４b〜４ｅを見ると、rCysP1プロモーターの活性は雄蕊で著しく、雄蕊以外の他の花器官ではそうでなく（図４ｂ参照）、管束や結合組織でもGUS発現が現れなかった。局部的に、GUS発現はタペチュム（tapetum）と幾つの発達中の花粉で観察された。しかし、実施例２におけるRT−PCR結果とは異に、稲の他の植物器官、即ち、葉と根ではGUS発現を探知し得なく（図４ｄ、４ｅ参照）、発芽する種子でもGUS発現を見出し得なかった。これは、たとえ葉を除く他の器官らからは少量の転写体蓄積が見られたが（図３参照）、rCysP1プロモーターの活性があまり低いため、Gus発現が視覚的に探知されなかったからであると判断された。また、本発明者達はrCysP1−標識されたT‐DNA挿入稲の雄蕊器官が花粉発達において著しい欠陥、即ち、花粉退化を見せるのを発見した（図４ｄ参照）。綜合して見るとき、前記結果はrCysP1遺伝子が花粉発達に関与することを暗示した。
【００２５】
＜実施例４：T−DNAの同一−分離（co-segregation）か否かおよび同型接合突然変異（homozygous  mutant）の表現型確認＞
（１）T−DNAの遺伝学的分離を研究するために前記rCysP1−標識されたT−DNA挿入稲のT2‐子孫を養成して遺伝子型を分析した。
全19個のT2子孫の幼葉からgenomic  DNAを抽出してこれを前記遺伝子の同型性または異型性を決定するための遺伝子型分析に利用した。PCR反応は94℃で１分、57℃で１分、72℃で２分の条件で35回行い。下記序列のa，b，c三つのプライマーを用いた。
・プライマーa（rCysP1  gene‐specific  forward  primer）
：５’‐ATCGAAAAGAAGACCTAAAGAAGCA‐３’
・プライマーb（rCysP1  gene‐specific  reverse  primer）
：５’‐AACTTGAGGTTGTCCCTACAGGACGTAAC‐３’
・プライマーc（T‐DNA  border‐specific  reverse  primer）
：５’‐TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC‐３’
図５ａのその概略図に表現された通り、前記ａプライマーはrCysP1遺伝子の上流部位から製作されたフォーワードプライマー（forward  primer）であり、ｂプライマーはrCysP1遺伝子のコーディング領域から製作されたリバースプライマー（reverse  primer）である。一方、ｃプライマーはT−DNA部位から製作されたリバースプライマー（reverse  primer）である。ａ＋ｃのプライマー組合は0.9kbのＰＣＲ断片を生産するため単にこのような増幅のみを許容するＴ2植物は同型接合体であろうと期待された。ａ＋ｂプライマー組合によるＤＮＡ断片（16.5kb）は増幅するにはあまり大きためである（図５ａ参照）。しかし、野生型植物はゲノム内にＴ‐ＤＮＡが挿入されなかったためａ＋ｂプライマーであり、組合による唯一つの1.1kbのPCR断片のみを生産する反面、異型接合T2植物はａ＋ｃおよびａ＋ｂプライマー組合による0.9kb、1.1kb  PCR増幅が可能である。
その結果を図５ｂに示した。前記図５ｂを見ると、2,5,9,10,11,14,15,17レーンの８個の形質転換植物は同型接合であり、1,3,4,6,7,8,12,13,16,19レーンの10個の形質転換植物は異型接合であった。残りの18番レーンの植物は野生型であった。このような結果は前記T−DNAが次の世代に同一−分離されることを立証した。
【００２６】
（２）一方、前記同型接合植物は、T−DNA融合によるrCysP1遺伝子の機能的トラッピング（functional  trapping）から由来した突然変異表現型を次の世代に伝達するであろうと期待されたため、前記植物の生長および発達を調査した。
その結果を図５および図６に示した。前記rCysP1同型接合突然変異植物は、種子発芽において約７日〜９日ほど遅延される様相を示したが、結局には完全に成熟した植物に成長した。17個のrCysP1突然変異と24個の野生型植物を準備して植物の長さ（plant  height）を分析した結果、rCysP1突然変異植物は野生型に比べて長さの成長が減少する矮小性（dwarfism）を見せ（図５ｄ，５ｆおよび６ａ参照）、根および茎成長においては正常的であったが（図５ｃ参照）、全体的な成長は深刻に阻害された（図５ｆ参照）。また、前記突然変異植物は花を有する正常的な円錐花序（panicle）を形成した。しかし、46個のrCysP1突然変異と75個の野生型植物の円錐花序を分析した結果、前記突然変異植物の円錐花序は修正されないまま継続緑色に残っている花を多数個含んでおり（図５ｅ，矢印参照）、修正された種子の比率も野生型に比べてずっと低く（図６ｂ参照）、開花も約15日程遅れた。これは雄蕊の非正常的な発達のためであると判断された。
一方、前記rCysP1突然変異植物と野生型植物から雄蕊器官をテトラゾリウム染色して光学顕微鏡で観察した。前記染色は50％のスクローズ（sucrose）に１％（w/v）の2，3，5‐トリフェニルテトラゾリウムクロライド（triphenyltetrazolium  chloride）水溶液を含む溶液を利用して28℃の暗条件下で１時間行った。その結果、前記同型接合植物の多くの雄蕊器官が生育可能な花粉を含んでいないことが分かり（図６ｃ参照）、結果的に、前記rCysP1突然変異は種子形成の数が減少する現象を現した（図６ｂ参照）。
【００２７】
＜実施例５：花粉発達中の同型接合rCysP1突然変異の細胞学的特長調査＞
花粉発達において、野生型植物と前記rCysP1突然変異間の差異点を調査するために雄蕊切断組織（anther  sections）を光学顕微鏡で観察したところ、前記雄蕊器官の細胞学的な特徴は花粉母細胞期（pollen  mother  cell  stage）で二つ、4分子期（tetrad  stage0で二つ、小胞子期で一つ、単核花粉期（uni‐nucleated  pollen  stage）で二つ、液胞化花粉期（vacuolated  pollen  stage）で一つ、そして成熟花粉期（mature  pollen  stage）で二つに構成される全10個の発達段階に細分化して調査した。
野生型と前記rCysP1突然変異稲の花器官を分離して４％（w/v）のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）、0.5％（v/v）のグルタールアルデヒド（glutaraldehyde）および100mMフォスフェートバッファー（phosphate  buffer，pH  7.0）を含む溶液に4℃で１夜間固定してサンプルを準備した。次いで、前記サンプルをエタノール連続処理過程（ethanol  series）により脱水し、アクリル樹脂（London  Resin  Company，London，UK）に入れて固めた。前記樹脂に固定されたサンプルを超マイクロトム（LKB，Bromma  2088）を利用して１Um大に切開し、0.1％炭酸ナトリウムを含む0.5％トルイジンブルー（toluidine  blue）で染色した。前記組織部位は光学顕微鏡（Zeiss）で調査した。一方、前記rCysP1標識された雄蕊器官におけるGUS発現を調査するために雄蕊サンプルを実施例３に記載されたものと同一の方法で準備および切開し、サフラニンO（Safranin  O）で染色した後に光学顕微鏡で調査し、実施例４に記載されたものと同一の方法でテトラゾリウム染色した後に観察した。
【００２８】
前記実験結果を図７に示した。図７において、7a，7b，7k，7lは花粉母細胞期、7c，7d，7m，7nは4分子期、7e，7oは小胞子期、7f，7g，7p，7qは単核花粉期、7h，7rは液胞化花粉期および7i，7j，7s，７tは成熟花粉期における様相を示し、7a〜7jは野生型植物の、7k〜7tはrCysP1突然変異植物の細胞学的特長を見せてくれる。また、dpは退化した花粉（degenerated  pollen）、Eはエピダーミス（epidermis）、Enはエンドセシウム（endothecium）、Miは中間層（middle  layer）、MSpは小胞子（microspores）、PCはパリエタルセル（parietal  cell）、PGは花粉粒（pollen  grain）、PMCは花粉母細胞（pollen  mother  cell）、Tはタペチュム（tapetum）、Tdsは４分子（tetrads）およびvMSは液胞化花粉を示し、前記図において矢印部位は前記部位における非正常的な繊維物質を指す。Scale  barsは20Umである。
【００２９】
本発明者達が前記実施例４で観察した通り、前記rCysP1突然変異の雄蕊は非正常的な花粉発達を含むものと明かされた（図７q〜ｔ）。異常（abnormality）を探知し得る１番目標識は小胞子期（microspore  stage）から単核花粉期（uni‐nucleated  pollen  stage）に将に放出される段階で観察された（図７ｑ）。前記段階で雄蕊は非常に制限された数の花粉を含むものと顕れ、前記花粉らのうち幾つは細胞死滅（cell  death）を経ていた。このような花粉の退化は前記花粉の細胞質が無くなる液胞化された花粉期（vacuolated  pollen  stage）ではずっと深刻になり（図７ｒ）、その次の成熟花粉期（mature  pollen  stage）で前記rCysP1突然変異の雄蕊は完全に空いた花粉嚢（locule）を含んでいた（図７ｓ参照）。反面、野生型植物の雄蕊は前記部位に完全に成熟した花粉粒（pollen  grain）を含んでいた（図７ｉ参照）。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プロモーター部分を含むrCysP1遺伝子の概略図および序列を表すもので、図１ａはrCysP1遺伝子の構造およびT‐DNA挿入位置を示し、図１ｂはrCysP1遺伝子の塩基序列およびアミノ酸序列を示す。
【図２】植物から発見されるシステインプロテアーゼのアミノ酸序列を比較したもので、図２ａはシステインプロテアーゼを整列したものであり、図２ｂは植物から観察される代表的なシステインプロテアーゼの系統数（phylogenetic  tree）を示したものである。
【図３】図３ａ，ｂ，ｃおよびｄはrCysP1のgenomic  DNAをブラッチングした結果とRT−PCRした結果を示したもので、３ｂは稲の各種器官（雄蕊、雄蕊が無い花、葉、根）におけるrCysP1遺伝子の転写体蓄積を示し、３ｃは稲花の時間的発現様相を示す。また、３ｄは発芽する種子におけるrCysP1転写体蓄積を示す。
【図４】図４ａ，ｂ，ｃ，ｄおよびｅはrCysP1標識された稲を組織化学的にGUS分析した結果である。雄蕊に特異に発現されるGUSの発現でrCysP1プロモーターの雄蕊特異的発現を見せてくれる。ｃはこの遺伝子の発現が制限される場合、花粉生成が退化しているのを見せているので、雄性不妊形質の可能性を見せてくれている。
【図５】図５ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅおよびｆはｒCysP1  T2子孫の遺伝子型分析結果とrCysP1同型接合突然変異の表現型を示したものである。
【図６】図６ａは充分に成長したrCysP1突然変異植物と野生型植物を形態学的に分析した結果であり、図６ｂは円錐花序（panicle）に対する修正（fertilization；seed  formation）の比率を示す。この際、図６ｃと６ｄはrCysP1突然変異と野生型植物の雄蕊をテトラゾリウム染色して観察した結果である。突然変異植物体の雄蕊では花粉の生成が退化して染色に現れていない。
【図７】図７ａ〜図７ｊは野生型植物の発達過程中の雄蕊器官を細胞学的に分析した結果であり。図７ｋ〜７ｔはrCysP1突然変異の発達過程中の雄蕊器官を細胞学的に分析した結果である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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