(57)【要約】      （修正有）【課題】  神経細胞シナプスの脱構築を特異的に行う酵素である、ユビキチンリガーゼSCF複合体を構成するタンパク質、及びそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】  特定のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び上記のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチド、並びにこれらのタンパク質などをコードするポリヌクレオチド。【効果】これにより、ヒト神経系の形成や発達、又は記憶、学習等のメカニズムの解明、並びに神経系の機能的、及びヒト神経系の構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防、又は治療技術の効率的な開発が可能になる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項６】
請求項１又は５のいずれか１項記載のポリペプチドの部分配列を有し、かつ請求項５記載のポリペプチドに特異的な抗体の産生を誘導する、ポリペプチド断片。
【請求項７】
請求項４又は５記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項８】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項７記載の抗体。
【請求項９】
請求項１又は５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項６記載のポリペプチド断片を、哺乳類に投与することを含む、請求項４又は５記載のポリペプチドに対する特異的抗体の製造方法。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
該相同性が少なくとも９０％である、請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該相同性が少なくとも９５％である、請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドの部分配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ポリヌクレオチド配列番号２のアミノ酸配列の部分配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号１のポリヌクレオチド配列の第３８５位〜第１６９８位のポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１０、１４、１５、又は１６のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１、又は５のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項６記載のポリペプチド断片を製造する方法であって、請求項１９記載の宿主細胞を該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片が産生され得る条件で培養し、次いで該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片を回収することを含む、該製造方法。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに対応する、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２２】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、相補的なポリヌクレオチドに対応する、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドの検出方法であって、請求項２２及び２３のＰＣＲ用プライマーを用い、ＰＣＲを行うことを含む、該検出方法。
【請求項２４】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを検出するキットであって、請求項２１及び２２記載のＰＣＲ用プライマーを含む該キット。
【請求項２５】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、又はその部分配列を含むプローブ。
【請求項２６】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス配列、又はその部分配列を含むプローブ。
【請求項２７】
請求項１記載のポリペプチド、又は請求項６記載のペプチド断片を用いることを特徴とする、配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項１記載のポリペプチド、又は請求項６記載のペプチド断片を含むことを特徴とする、配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のF-boxタンパク質、及び該タンパク質をコードする核酸分子に関するものである。さらに詳細に述べると、本発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等において生じる神経細胞シナプスの脱構築において、神経細胞構成タンパク質を特異的に分解する酵素であるユビキチンリガーゼSCF複合体（E3因子）を構成するF-boxタンパク質（FB1タンパク質）、該タンパク質をコードする核酸分子、及びこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序あるタンパク質合成と分解、それによる各種タンパク質の寿命の調節、さらに該タンパク質による細胞機能の発現によって受け渡しされる情報に基づいて起こる細胞の応答といった一連の生命現象の時系列制御が重要である。
多細胞生物に認められる該タンパク質分解制御には、各組織細胞間に多くの共通性が存在するが、一方で、細胞の種類による特異性も存在し、特に神経細胞は他の細胞と大きく異なる特徴を有している。その異なる特徴は、第一に、神経細胞は極性を有し、他の神経細胞とシナプス結合を形成し、自身の興奮によって信号を伝達すること、及び第二に、神経シナプス結合は、一度成立した後にも神経刺激伝達に伴い結合の性状の変化（可塑性）を示すということである。
【０００３】
該可塑性は、長期記憶・学習のメカニズムの基本を成す現象であると考えられており、まさに神経細胞を他の細胞から際立たせる特徴である。該可塑性のメカニズムの詳細はまだ明らかではないが、神経細胞シナプスの構成タンパク質の変化が深く関与することが示されており、その変化の解明が可塑性のメカニズム、さらには記憶・学習、各種神経疾患、痴呆のメカニズムの解明に必須であると考えられている。
該神経細胞シナプスの可塑性の基礎となる構成タンパク質の変化は、適切な刺激に応じた、神経細胞内におけるタンパク質の合成と分解により達成される。この点に関し、本願発明者らの最近の研究から、神経細胞内でのタンパク質の合成とその輸送経路が明らかにされつつある。例えば、脳の主要な興奮性アミノ酸受容体・NMDA受容体はKIF17タンパク質が輸送すること（非特許文献１)、AMPA受容体はKIF5が輸送すること（非特許文献２）、該KIF17タンパク質はCREBという神経活動依存的に活性化される転写因子によって誘導されること（非特許文献３及び４）、及びKIF17タンパク質を増加させたマウスは記憶力の増強が認められること（非特許文献３）などである。
【０００４】
一方、神経伝達物質受容体をはじめとする神経細胞構造タンパク質の分解は、適切な記憶の消去のために必須と考えられるが、その分子的実態は明らかでなかった。一般にタンパク質の特異的分解は、ユビキチンプロテアソームシステムが寄与し（非特許文献５）、特にＦボックスをもつタンパク質が該特異的分解に関与するという知見が得られている（特許文献１及び２、非特許文献６）。しかしながら、神経細胞構造タンパク質を特異的に分解するユビキチンプロテアソームシステムの解明はほとんどなされておらず、特に該特異的分解に関与するＦボックスをもつタンパク質は知られていなかった。
本願発明者らなどがこれまで報告したように、神経細胞内のタンパク質の合成のみならず、その分解の適切な制御が正常な神経活動に重要であり、高次神経活動の全貌を解明するためには、神経細胞内のタンパク質分解の制御因子を特定することが不可欠である。また、該制御因子の同定とその機能の解明は、該制御因子となる分子と関連する中枢神経系の機能的、又は構造的障害に起因する様々な神経疾患の原因解明を可能にする。さらに、該制御因子となる分子を特定することにより、該分子の活性、作用に影響するタンパク質、核酸、低分子化合物などのスクリーニングを可能にし、該精神疾患の診断、予防、及び治療法などの開発に大きく寄与するものと期待される。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１６６５４２号公報
【特許文献２】特開２００１−２２４３８０号公報
【非特許文献１】瀬藤らの論文, Science, Vol.288, pp.1796-1802, 2000
【非特許文献２】瀬藤らの論文, Nature, Vol.417, pp.83-87, 2002
【非特許文献３】王、瀬藤らの論文, PNAS, Vol.99, pp.14500-14505,2002
【非特許文献４】ギヨー、瀬藤らの論文, J. Neurosci, Vol.23, pp.131-140, 2003
【非特許文献５】Alexander Varshavskyの論文, Trends Biochem Sci., Vol.22(10), pp.383-387,Oct.1997
【非特許文献６】Jacksonらの論文, Mol. Cell. Vol.9(5), pp.923-5. May, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等に伴う神経細胞シナプスの脱構築を特異的に行う酵素である、ユビキチンリガーゼSCF複合体を構成するタンパク質を提供することを目的とする。すなわち、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、及び神経系の機能的、又は構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防、又は治療技術の開発に有用な新規のタンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、神経細胞シナプスの脱構築を特異的に行う酵素を見出すため、所定の条件を設定してデータベース検索を行うことにより候補遺伝子を選び、その結果に基づきcDNAライブラリーから全長構造遺伝子を得て、該遺伝子から目的とするタンパク質を調製することができた。本発明は該研究に基づき達成されたものである。
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドを提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドの部分配列、又は配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの部分配列を有し、かつ特異的な抗体の産生を誘導するペプチド断片を提供する。
また、本発明は、配列番号２又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を提供する。
【０００８】
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はこれらの部分配列を有するペプチド断片を、哺乳類に投与することを含む、配列番号２のポリペプチドに特異的な抗体を製造する方法を提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドの部分配列をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが機能的にリンクしている、ベクターを提供する。さらに、本発明は、該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００９】
また、本発明は、前記ポリペプチド、又はポリペプチド断片を製造する方法であって、前記宿主細胞を該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片が産生され得る条件で培養し、次いで該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片を回収することを含む、該製造方法を提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドの検出方法であって、該ポリヌクレオチドの部分配列、または該ポリヌクレオチドのアンチセンス部分配列を含むＰＣＲ用プライマーを用い、ＰＣＲを行うことを含む、検出方法を提供する。
また、本発明は配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分配列、または該ポリヌクレオチドのアンチセンス部分配列を含むＰＣＲ用プライマーを含む、前記ポリヌクレオチドを検出するキットを提供する。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、又はその部分配列を含むプローブ、及び配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス配列、又はその部分配列を含むプローブを提供する。
【００１０】
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのペプチド断片を用いることを特徴とする、配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング法。
また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのペプチド断片を含むことを特徴とする、配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング用キット。
【００１１】
（定義）
本明細書で用いられる用語「機能的にリンクした」とは、特定のポリヌクレオチドが、そのコードするポリペプチド、又はタンパク質を発現できるようにベクターに組み込まれていることをいう。
本明細書で用いられる用語「タンパク質」とは、特に断らない限り、立体構造を形成していない又はランダムな立体構造を持つポリペプチド、固有の立体構造を有するタンパク質、及び他のタンパク質と複合体を形成しているタンパク質すべてを含む概念である。
また、本発明の用語「ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質」を、必要に応じて「FB1タンパク質」と略し、かつ該FB1タンパク質をコードする核酸分子をFB1遺伝子と略す。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質、及びそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどが提供された。すなわち、本発明により、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等に伴う神経細胞シナプスの脱構築を特異的に行う酵素である、ユビキチンリガーゼSCF複合体を構成するF-boxタンパク質が提供される。その結果、ヒトの神経系の形成や発達、あるいは記憶、学習等のメカニズムの解明、及び神経系の機能的、又は構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、予防、又は治療技術の開発に有用な新規な標的タンパク質を得ることができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（FB1タンパク質の意義）
本発明のFB1タンパク質とは、神経細胞シナプスの特定タンパク質を特異的に分解し、該シナプスの脱構築に関与するユビキチンリガーゼ（付加酵素）(E3)SCF複合体を構成するタンパク質をいう。
該シナプスにおけるタンパク質の特異的分解は、ユビキチン−プロテアソーム系で、ユビキチンに結合した標的タンパク質が分解されることで起きる。該ユビキチンは、そのC末端のグリシン残基が、標的タンパク質のリジン残基のε-アミノ基とイソペプチド結合することで、該標的タンパク質に結合する。該イソペプチド結合は、ユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、及びユビキチンリガーゼ（E3）といった一連のユビキチン結合酵素が連鎖的に作用することで起きる。該標的タンパク質はE1からE2に転移され、E3によって認識されてユビキチンが結合して、ポリユビキチン化標的タンパク質が形成される。該タンパク質は、調節サブユニットに対する認識シグナルとして機能し、速やかに分解される。
該ユビキチンリガーゼ(E3)は、Skp1タンパク質、Cμl1タンパク質、及びF-boxモチーフとLRRモチーフとを含むF-boxタンパク質の複合体（SCF複合体）であり、本発明のFB1タンパク質は、該SCF複合体を構成するF-boxタンパク質である。
【００１４】
（FB1遺伝子のスクリーニング）
本発明のFB1タンパク質である、神経細胞シナプスの特定タンパク質を特異的に分解し、該シナプスの脱構築に関与するユビキチンリガーゼSCF複合体(E3)を構成するタンパク質、及びその遺伝子を得るため、本発明者らは、次のような手順を用いた。
まず、バイオインフォマティックスの手法を用いてヒト、マウスの全ゲノムから下記条件を満たす核酸分子を網羅的に探索し、FB1タンパク質をコードする遺伝子の分離を行った。データベースとしてCelera社のゲノムデータベースを用いた。
1.  神経系の細胞に発現しているおり、かつ神経細胞特異的プロモーターの下流の遺伝子に位置すること（NRSE応答配列）（参考文献：Schoenherr  CJ,  Anderson  DJ.  Science.  1995  Mar  3;267(5202):1360-3）。
2.  神経活動依存的に発現、又は活性が制御されており、かつCREB等のプロモーターの下流にある遺伝子、すなわちプロモーター領域に刺激応答性転写因子の認識配列を持つ遺伝子であること（CREB応答配列）（参考文献：Conkright  MD,  Guzman  E,  Flechner  L,  Su  AI,  Hogenesch  JB,  Montminy  M.  Mol  Cell.  2003  Apr；11(4)：1101-8.  Erratum  in：Mol  Cell.  2003  May；11(5)：1417.）。
【００１５】
3.  E3の性質を持っている、すなわち現在知られているE3の特徴的な配列であるF-box、Ring finger、及びU-box領域を持つ遺伝子であること。
4.  細胞膜に移行するアミノ酸配列をコードする有するヌクレオチド配列を有する遺伝子であること。
5.  前記１〜４の特性がマウス、ヒト、線虫、ショウジョウバエ、に共通して保存されていること。
該１〜５の条件を満たす遺伝子の検索を行ったところ、唯一これらの条件を満たしたのが本発明のFB1遺伝子であった。本発明者らは、該遺伝子のプローブを使用して、マウス及びヒトcDNAライブラリーからFB1遺伝子の全長cDNAを得ることを試みた。また、該全長cDNAを用いて、FB1遺伝子産物、すなわち配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトFB1タンパク質、及び配列番号４のアミノ酸配列を有するマウスFB1タンパク質を得ることができた。本明細書の実施例に、該FB1遺伝子全長cDNAのスクリーニング、及びFB1タンパク質調製の具体手順を記載した。
【００１６】
なお、本発明のFB1タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２又は４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むもので限定する必要はなく、DNA、及びmRNAなどのRNAのいずれでもよく、かつ１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよく、また、１本鎖の場合、センス鎖（コード鎖）又はアンチセンス鎖（非コード鎖）のいずれであってもよい。また、発現ベクターに組み込むことができればその塩基長も特に制限する必要はない。
また、本発明の核酸分子は、前記FB1タンパク質の活性を有し、かつ該FB1タンパク質と一定の相同性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。該相同性は、先に記載したように、８０％以上、好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。なお、本発明の核酸分子は、前記FB1タンパク質の活性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号２又は４のポリヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイストリンジェントな条件でハイブリダイズするものを含む。該ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular  Cloning）第２版（J.  Sambrook  et  al.,Cold  Spring  Harbor  Lab.  Press,  1989）などに記載された常法で行うことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件をいう。
【００１７】
また、FB1タンパク質の部分ポリペプチド鎖の製造に用いるポリヌクレオチド断片、PCR用プライマー、又はプローブとして用いるポリヌクレオチド断片は、前記FB1タンパク質をコードする核酸分子、又はその相同的な核酸分子を適宜、各種制限酵素で切断して、又はcDNAライブラリーなどから選択し、又は合成により製造することができる。なお、ここで用いるプライマーは、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに対応する、又はそれに相補的なポリヌクレオチドに対応する、少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片がある。
また、これらのプライマーを用いて、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、タンパク質を検出するキットを作製することができる。
また、本発明の核酸分子は、本発明のFB1タンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部、又は全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。該ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular  Cloning）第２版（J.  Sambrook  et  al.,Cold  Spring  Harbor  Lab.  Press,  1989）に記載の方法などで行うことができる。得られた核酸分子は、目的に応じて、そのまま、又は制限酵素で消化したり、リンカーを付加して使用することができる。該DNA分子はその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを付加し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを付加してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００１８】
（FB1タンパク質）
本発明のFB1タンパク質は、配列番号２、又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質、又は配列番号２のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成するF-boxタンパク質の活性を有するポリペプチドを含むタンパク質である。
配列番号２のアミノ酸配列に対する該相同性は、少なくとも８０％、さらに少なくとも９０％、特に９５％であることが好ましい。また、配列番号２のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列には、配列番号２のアミノ酸配列において、少なくとも１アミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列が含まれる。
なお、ここで「F-boxタンパク質の活性」とは、構成タンパク質の一つとして、ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体を構成し、神経細胞内で特異的分解の対象となるタンパク質にユビキチンを結合させる活性、又は該F-boxタンパク質の有する他の活性の少なくとも１つを意味する。
【００１９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチドの標準的表記法に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のFB1タンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルの残基Rとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、又はｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基、又はα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基などがある。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有する場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のFB1タンパク質に含まれる。該エステルには、例えば上記したＣ末端のエステルなどがある。さらに、本発明のタンパク質には、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質などが含まれる。
【００２０】
本発明のFB1タンパク質のペプチド断片は、該タンパク質の部分配列を含むペプチドであれば特に制限されない。なお、FB1タンパク質特異的抗体の製造に用いる場合、所望の動物で抗原性を発揮するものであれば特にその大きさは制限されない。なお、FB1タンパク質のペプチド断片は、通常、該タンパク質の５個以上の構成アミノ酸配列、特に２０以上の構成アミノ酸配列、さらに１００個以上の構成アミノ酸配列を有するのが好ましい。
また、本発明のFB1タンパク質、又はそのペプチド断片には、その医薬として許容し得る塩が含まれる。特に該塩は無機、又は有機酸付加塩であるのが好ましい。該無機酸付加塩の例を挙げると、塩酸、リン酸、臭化水素酸、及び硫酸の塩があり、また有機酸付加塩の例を挙げると、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、及びベンゼンスルホン酸などの塩がある。
【００２１】
（FB1タンパク質の製造）
本発明のFB1タンパク質は、例えば、FB1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に入れて形質転換し、該形質転換体を培養することにより製造することができる。
本発明の発現ベクターは、本発明のFB1タンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。
ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどがある。
【００２２】
本発明で用いるプロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどである。
本発明の発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いることができる。
【００２３】
該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適したシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡシグナル配列、OmpＡシグナル配列などが、該宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築した本発明のFB1タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
本発明で用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、及び動物細胞などがある。
該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法がある。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods  in  Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７５巻，１９２９(１９７８）などの方法がある。
【００２４】
昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988）などに記載の方法がある。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法がある。このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。
該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２５】
エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal  of  Experiments  in  Molecular  Genetics），４３１−４３３，Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  New  York１９７２〕が好ましい。
また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian,  K.L.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter,  G.A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２６】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する場合、グレイスインセクト培地(Grace's  Insect  Medium：Grace,  T.C.C.,Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The  Journal  of  the  American  Medical  Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding  of  the  Society  for  the  Biological  Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などを用いる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のFB1タンパク質を産生させることができる。
【００２７】
上記培養物から本発明のFB1タンパク質を分離精製するには、常法に従う。例えば、本発明のタンパク質を培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体、又は細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行う。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがある。
【００２８】
該ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法により、遊離体、又は他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどがある。このようにして生成した本発明のポリペプチドは、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
本発明のFB1タンパク質のペプチド断片、又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、又は該FB1タンパク質を適当なペプチダーゼで切断して製造することができる。該ペプチドの合成法は、固相合成法、又は液相合成法のいずれでもよい。すなわち、本発明のタンパク質の構成部分ペプチド、又はアミノ酸残基を縮合させ、該生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチド断片を製造することができる。このペプチド断片の製造では、公知の縮合方法や保護基の脱離工程を用いることができる（M.  Bodanszky及びM.A.  Ondetti；Peptide  Synthesis,  Interscience  Publishers,  New  York  (1966年)；Schroeder及びLuebke、The  Peptide,  Academic  Press,  New  York  (1965年)；泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)（1975年）；矢島治明及び榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、205、(1977年)；矢島治明監修、続医薬品の開発  第14巻  ペプチド合成  広川書店)。なお、これらの反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて、本発明のペプチド断片を精製単離することができる。上記方法で得られるペプチド断片が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、また逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２９】
このように本発明のFB1タンパク質、及びそのポリペプチド断片は、いわゆる常法により製造することができる。これら常法うち、好ましい例として、色々なタンパク質発現系のベクターに１個又は複数個の遺伝子をクローニングする、Gateway（登録商標）テクノロジーに基づくクローニング法がある。該Gateway（登録商標）テクノロジーでは、目的タンパク質、又はポリペプチドをコードするDNA断片を、制限酵素とリガーゼを使用しないで一つのベクターから他のベクター（例えば、発現ベクター）に移し換えることを特徴とするクローニング法である。
該クローニング法は、attB配列とattP配列、又はattL配列とattR配列を用いるλファージの部位特異的組み換え系を基礎として、BL反応とLP反応により構成される。
本方法では、まず、BL反応に基づくPCR Directional TOPOクローニング、PCR組換えクローニング、又は制限酵素とリガーゼを用いたクローニング法などにより、エントリークローンを作製する。該BL反応では、attB配列を5'-及び3'-末端に有するPCR産物又は発現クローンと、attP配列を5'-及び3'-末端に有し、かつ目的遺伝子と置換されるcccB配列を有するドナーベクターとをBPクロナーゼにより処理して、エントリークローンを作成する。該エントリークローンは、attP配列を5'-及び3'-末端に有するPCR産物又は発現クローン（目的遺伝子）を有するベクターである。
【００３０】
次いで、該エントリークローンと、attR配列を5'-及び3'-末端に有し、かつ目的遺伝子と置換されるcccB配列を有するデスティネーションベクターとを、LRクロナーゼで処理して、目的遺伝子の発現クローン（発現ベクター）を得ることができる。該発現クローンは、目的遺伝子の発現に必要なプローブモータ、ターミネータ、及び必要に応じた付加タグなどをコードする配列を含む。
得られた発現クローンで、細菌、昆虫細胞、又は動物細胞などの宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養した後、目的とする遺伝子産物を回収することができる。本発明者らは、このGatewayテクノロジーによりFB1タンパク質を製造した。製造の詳細を実施例に記載した。
（抗体の製造）
本発明の抗体は、FB1タンパク質、又はそのペプチド断片に特異的な抗体であり、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明の抗体の製造に用いる組成物は、前記FB1タンパク質、そのポリペプチド断片、又はこれらの酸付加塩を含むものである。また、必要に応じて、該組成物はベヒクル、希釈剤、アジュバンドなどの成分を含んでいてもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、次の方法で製造することができる。まず、前記抗体製造用組成物を非ヒト哺乳動物に投与する。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行う。該非ヒト哺乳動物の例を挙げると、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリがあり、一般に好ましいのはマウス、又はラットである。
【００３１】
前記抗原で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生が認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓、又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞採取し、同種、又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する。抗血清中の抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させ、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行う。また細胞融合は、ケーラーとミルスタインの方法(Nature,  256、495,  1975)などの常法で行うことができる。融合促進剤として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどを用いることができる。
また、骨髄腫細胞の例を挙げると、NS-1,  P3U1,  SP2/O,及びAP-１などの非ヒト哺乳動物の骨髄腫細胞があり、特にP3U1が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０程度であり、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００を１０〜８０％度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の方法で行うことができる。例えば、抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）と、ハイブリドーマ培養上清を接触させ、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を含む溶液を接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体などを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を接触させ、次いで放射性物質や酵素などで標識したタンパク質の溶液と接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがある。
【００３２】
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別は常法で行うことができる。例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地に、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））、又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は２０〜４０℃、培養時間は、通常５日〜３週間で、培養は、通常５％炭酸ガス存在下で行う。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
また、得られたモノクローナル抗体の分離精製は、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、及び電気泳動法などの免疫グロブリンの分離精製法、イオン交換体（ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、又はプロテインＡ活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などの常法で行うことができる。
【００３３】
また、本発明のポリクローナル抗体は、免疫抗原であるFB1タンパク質、そのポリペプチド断片、又はこれらの酸付加塩を含む前記組成物を用いて製造する。また、必要に応じて、該組成物はベヒクル、希釈剤、アジュバンドなどの成分を含んでいてもよい。ポリペプチド等、又は該そのペプチド断片とキャリアータンパク質との複合体で、非ヒト哺乳動物を免疫し、その後、血清などの抗体含有成分を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
該免疫抗原とキャリアータンパク質との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よく産生されるように決定する。例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で用いることができる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等を用いることができる。
【００３４】
該複合体抗原は、単独で、又は担体、希釈剤、さらに抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントとともに投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回行う。該ポリクローナル抗体は、免疫された哺乳動物の血液、腹水、卵黄などから採取する。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。また、ポリクローナル抗体の分離精製は、前記モノクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
（本発明の抗体の使用）
本発明の抗体を使用して、FB1タンパク質の検出、定量、及びブロック・機能阻止などを行うことができる。本発明のFB1タンパク質は、主に神経細胞構造タンパク質の分解・脱構築に寄与するものであるから、該抗体は、ヒトの神経系の形成や発達、記憶、学習等のメカニズムの解明、及び各種神経疾患の診断、予防、又は治療技術の開発に寄与する。また、該抗体の検出、及び定量は、神経系の機能的、又は構造的障害を原因とする各種神経疾患の診断、及び予防に有用である。
【００３５】
これらの目的には、該抗体分子そのものだけでなく、抗体分子のＦ(ａｂ’)2、Ｆａｂ’、又はＦａｂ画分を用いてもよい。該抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト-マウスキメラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に作製されたヒト抗体でもよい。
（FB1タンパク質、又はFB1遺伝子を用いたスクリーニング法）
本発明のFB1タンパク質は、主に神経細胞構造タンパク質の分解・脱構築に寄与するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のF-boxタンパク質であるから、該ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体の活性を指標として、本発明のFB1タンパク質の酵素活性、又は発現を促進、又は阻害する化合物をスクリーニングすることができる。
また、本発明のFB1タンパク質と、組織、細胞、又はそれらの膜画分との反応を促進又は阻害する化合物のスクリーニングを行うことができる。すなわち、（ｉ）本発明のFB1タンパク質が作用する組織、細胞又はそれらの膜画分に、本発明のFB1タンパク質を接触させた場合と、（ii）本発明のFB1タンパク質が作用する組織、細胞又はそれらの膜画分に、該FB1タンパク質、及び試験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする、該FB1タンパク質と、組織などとの反応を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング法である。上記の細胞には株化細胞、又は初代培養系のいずれを用いていよい。該細胞、又は組織としては、ヒトやその他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の神経細胞を挙げることができる。
【００３６】
当該スクリーニング法における反応性としては、結合量、細胞刺激活性、組織刺激活性などがあり、これらを測定して比較する。結合量を測定する場合、ビアコアなどの測定機器や標識リガンドを用いてもよい。後者の場合、例えば、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕、蛍光色素、蛍光タンパク質、ビオチン、β−ガラクトシダーゼやパーオキシダーゼなどの酵素、フラッグなどのタグと呼ばれるペプチドなどで標識したFB1タンパク質を利用することができる。
また、本発明のFB1タンパク質、又はそのペプチド断片をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターによる形質転換体を用いて、導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変化を指標として、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物（促進剤）、又は阻害する化合物（阻害剤）をスクリーニングできる。該形質転換体としては、酵母や細胞が好ましい。また細胞を用いる場合、親株として、株化細胞を用いても、初代培養系を用いてもよい。上記該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変化の指標としては、検出可能であればどのようなものも指標でもよい。例えば、導入された該ＤＮＡと共に組み込まれた、ピューロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞株を親株として用い、該薬剤耐性を指標として、化合物のスクリーニングを実施することができる。
【００３７】
また、本発明のFB1タンパク質の発現を促進、又は阻害する化合物のスクリーニングを行うことができる。例えば、本発明のFB1タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクターによる形質変換体、又は本発明の抗体を、該FB1タンパク質の発現を促進、又は阻害する化合物のスクリーニング法に用いることができる。
該スクリーニングには、該FB1タンパク質を発現している細胞、組織、又は動物自体を用いてもよい。その際、株化細胞、初代培養系細胞、さらに先に記載した種々の細胞や組織を用いてもよい。上記動物には、レポータージーンを導入したノックアウト動物も含まれる。該FB1タンパク質の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、該FB1タンパク質のｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域（促進プロモーター、抑制プロモーターなど）とレポーター遺伝子を組み合わせ、プロモーター活性を促進または阻害する化合物をレポータージーンアッセイによりスクリーニングすることができる。その際、親株としては、株化細胞、又は初代培養系のいずれを用いても、さらに、先に記載した種々の細胞を用いてもよい。
このレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green  fluorescent  protein（ＧＦＰ）、又はβ−ラクタマーゼなどを用いることができる。これらレポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従って行うことができる（例えばMolecular  Biotechnology  13,  29-43,  1999）。
【実施例】
【００３８】
ヒト、及びマウスFB1タンパク質は、その構造配列が99.8％相同であり、機能もほぼ同一である。このため試料の入手が容易なマウスを使用して、該タンパク質の単離、及びその機能の解析を行った。
なお、ここで本実施例で用いたマウスFB1タンパク質（アミノ酸配列：４）の特徴的な領域を説明する。配列番号４のアミノ酸配列における第25位から第72位は、F-box領域であって、E3であるSCF複合体の構成タンパク質に特有の領域である（参考文献：Skowyraらの論文、Cell,  Vol.91,  pp.209-19,  1997、Craig,  K.L.の論文、Prog  Biophys  Mol  Biol,  Vol.72,  pp.299-328,  1999）。また、配列番号４のアミノ酸配列における第328位〜第349位、及び第357位〜第378位は、富ロイシン領域であって、ロイシンに富み、タンパク質相互作用に関わる領域である（参考文献：Battye,  R.らの論文J  neurosci,  Vo21,  pp.4290-4298,  1997）。また、配列番号４のアミノ酸配列における第435位〜第438位は、CAAX領域であって、脂質修飾（プレニル化）される配列で、それにより、FB1遺伝子産物が細胞膜へ移行する（参考文献：Thissen,  J.A.らの論文、J  Biol  Chem,  Vo268,  pp.13780-13783,  1993）。
(実施例１)  マウスFB1の全長cDNAクローンの作成
（全長cDNAクローンの単離）
新生０日のマウス脳から、スーパースクリプトファーストストランドシステム（11904-018,  Invitrogen社）を使用してcDNAを調製し、PCRテンプレートとし、配列番号５、及び配列番号６のプライマーを用いた。
フォワードプライマー：
ATGGCTCCGAGCAGGGACCGC                  (配列番号：５)
リバースプライマー：
TAGGATGATGCAGCACCTGC                   (配列番号：６)
【００３９】
該PCRテンプレート１μl、各プライマー(１０pmol/μl)をそれぞれ１．２５μl、２５mM MgCl2溶液３μl、２mM dNTPを４μl、１０xPCRバッファー２．５μl、DMSOを０．２５μl、耐熱性ポリメラーゼAmpliTaq  Gold(PerkinElmer社)０．２５μlに、滅菌脱イオン水１１．５μlを加えて２５μlとし、GeneAmp  PCR  System  9700装置（Applied  Biosystems社）を用いてPCR反応を行った。該PCR反応の条件は、９６℃、１０分間の変性反応の後、９６℃で１５秒間変性反応し、５５℃で４５秒間再会合反応し、７２℃で２．５分伸長反応するサイクルを４０回行い、さらに７２℃で５分間伸長反応した後、４℃に冷却して反応を終了した。これらの操作によりマウスFB1の全長cDNAクローンを得ることができた。
（全長マウスFB1cDNAを含むベクターの作成）
得られたマウスFB1cDNAクローンを、TOPO  TA  Cloning  Kit(K4500-01,  Invitrogen社)を用いてベクター(pCR2.1-TOPO  vector)にサブクローニングし（組込み）、全長マウスFB1cDNAを含むベクターであるTA  FB1ベクターを得た。
該TA  FB1ベクターの作成は次の手順で行った。まず、Fresh  PCR産物１μl、滅菌脱イオン水２μl、及びpCR2.1-TOPO  vector１μl(最終容量５μl)をチューブに入れて混合し、25℃で5分間インキュベートし、軽く遠心した後、該チューブを氷上に置いた。続いて、氷上で融解したコンピテントセル(TOP10)２５μlにTOPO-Cloning反応液２μlを加え、穏やかに混合した後、氷上で、30分間インキュベートした。その後、該セルに42℃で30秒間、Heat  shockを与え、直ぐにチューブを氷上に移し、2分間インキュベートし、室温のSOC倍地を２５０μl加えた。該チューブを37℃で30分間静置した。
【００４０】
プレート上に、X-Gal(9031,  Takara社)を４０mg/mlの濃度で含むストック溶液(in  DMSO)４０μlをのせ、スプレッダーで、該シャーレを回転させながら塗り広げた。その後、使用するまで該シャーレをインキュベーター（37℃）に保存した。２５mg/mlの濃度でアンピシリン（A-9393,  Sigma社）を含むLB寒天培地を暖めておき、該倍地１００μlをプレート上に撒き、その上に前記セルの懸濁液を塗り広げた。該プレートを逆さまにして、37℃で約16時間インキュベートし、生じたコロニーから白色のコロニーを拾い、37℃で30分間インキュベートした。生じたコロニーを濃度２５mg/mlのアンピシリン（A-9393,  Sigma社）を含むLB液体培地で37℃、12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（11453-024,MARLIGEN社）を用いて目的のプラスミドDNAを抽出、精製し、マウスFB1cDNA全長を含むベクター、TA  FB1ベクターを得た。
(TA FB1の塩基配列の確認)
前記pCR2.1-TOPOベクターは、PCR産物が組み込まれる配列の上流にM13リバースプライマー配列、下流にM13リバースプライマー配列を有するので、これらの配列を用いてPCR産物の配列を解析することができる。これにより得られたTA  FB1の塩基配列を、M13フォワードプライマー（配列番号：７）とM13リバースプライマー（配列番号：８）をシーケンスプライマーとして用い、ABI  PRISM  3100  Genetic  Analyzerキャピラリーシーケンサー（Applied  Biosystems社）で解析し、該クローンが全長マウスFB1cDNAであることを確認した。
【００４１】
M13フォワードプライマー：GTAAAACGACGGCCAG     (配列番号：７)
M13リバースプライマー：  CAGGAAACAGCTATGAC    (配列番号：８)
FB1ベクター1mlをテンプレートとして、M13フォワードプライマー、及びM13リバースプライマー各０．８pmol、反応プレミックス１ml、dH2O  ２．８mlを加えて５mlとし、GeneAmp  PCR  System  9700（Applied  Biosystems社）装置を用いてシーケンス反応を行った。反応の条件は、96℃10分の変性反応の後、96℃20秒変性反応、55℃10秒再会合反応、60℃4分伸長反応、を25サイクル行い、4℃にて反応を終了した。
該反応物にdH2O  ９０μl、３M酢酸ナトリウム１０μl、エタノール２５０μlを加えて混合し、室温で15分間置いた後15000回転で30分間遠心し、エタノール沈澱を行った。上清を除いて沈澱に70％エタノールを加えて洗浄し、15000回転で5分間遠心した後上清を捨て、沈澱を乾燥させた。High  dye１５μlを加えてDNAを溶解し、96℃で2分間過熱してDNAを変性させ、氷上に5分間置いて1本鎖DNAの状態としたものをABI  PRISM  3100  Genetic  Analyzerキャピラリーシーケンサー（Applied  Biosystems社）に供し、解析を行った。
【００４２】
(実施例２)    FB1遺伝子発現ベクターの作成
遺伝子発現ベクター作成には、Gatewayクローニングシステム、又は発現用ベクターのマルチクローニングサイトに制限酵素処理を施してDNA断片を組み込む方法を用いた。
（マウスFB1全長のエントリークローンの作製）
実施例１で得られたTA FB1ベクター1μlをテンプレートとして、配列番号９、及び配列番号１０又は配列番号１１のプライマーを用いて作製を行った。
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTCCGAGCAGGGACCGC
（配列番号：９）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAGGATGATGCAGCACCTGC
（配列番号：１０）
リバースプライマー：  
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATAGGATGATGCAGCATCTGC
（配列番号：１１）
【００４３】
濃度１０pmol/μlの各プライマー０．２５μl、２５mM MgCl2溶液３μl、２mM dNTPを４μl、１０xPCRバッファーを２．５μl、DMSOを０．２５μl、耐熱性ポリメラーゼAmpliTaq  Gold(PerkinElmer社)０．２５μlに滅菌脱イオン水１１．５μlを加えて２５μlとし、GeneAmp  PCR  System  9700（Applied  Biosystems社）装置を用いてPCR反応を行った。該PCR反応の条件は、96℃で10分間変性反応をした後、96℃で15秒変性反応し、55℃で45秒再会合反応し、72℃で2.5分間伸長反応するサイクルを31回行い、さらに72℃で5分間伸長反応した後、4℃に冷却して反応を終了した。これらの操作によりマウスFB1の全長cDNAクローンに、BP反応に必要なアダプター配列(att配列)を付加したPCR産物を得た。
該PCR産物を、１％アガロース（Takara社）、及び１xTAEバッファーのゲル担体を用いる電気泳動により分離し、QIAquick  Gel  Extraction  kit（28704,Qiagen社）を用いて抽出し、組み換え反応に用いた。該抽出DNA２μlを、pDONR201（11798014,Invitrogen社）０．５μl、５xBP  Clonaseバッファー１μl、TE０．５μlと混合し、そこにGateway  BP  Clonase酵素ミックス（11789-013,Invitrogen社）１μlを加えて混合した。該混合物を25℃で1時間インキュベートし、組み換え反応を行った。次いで、該反応物に２μｇ/μlのProteinase  K（52895,Invitrogen社）を０．５μl加えて、37℃で10分間インキュベートした。
【００４４】
該反応液２μlを大腸菌DH5αのカルシウムコンピテントセル（コンピテンシー：１０８／μ）と混合し、氷上で30分間冷却した。引き続き42℃で1分間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間でインキュベートし、濃度２５μｇ/μlのKanamycine（K-4000,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて37℃で12時間培養した。生じたコロニーを濃度２５μｇ/μlのKanamycine（K-4000,Sigma社）を含むLB液体培地で37℃で12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（11453-024,MARLIGEN社）を用いてプラスミドDNAを抽出、精製し、エントリークローンpDONR201-FB1-NT（終止コドンを含まない）とpDONR201-FB1を得た。
（マウスFB1全長の発現ベクター作製）
N末端にGSTタグを付加した目的タンパク質を大腸菌で発現させるために、pDONR201-FB1とpDEST15（11802014,Invitrogen社）でGateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）を用いてLR反応を行い、発現ベクターを得た。
同様にC末端にV5タグとHisタグを付加した目的タンパク質を大腸菌で発現させるために、pDONR201-FB1-NTとpET-DEST42（12276010,Invitrogen社）でGateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）を用いてLR反応を行い、大腸菌での発現ベクターを得た。
【００４５】
また、N末端にGSTタグを付加した目的タンパク質を哺乳類細胞で発現させるために、pDONR201-FB1とpcDNA-DEST53（12288015,Invitrogen社）でGateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）を用いてLR反応を行い、哺乳類細胞に用いる発現ベクターを得た。これらの発現ベクターを作製するために、次の具体的操作を行った。
pDONR201-FB1とpDEST15（11802014,Invitrogen社）、又はpDONR201-FB1-NTとpET-DEST42（12276010,Invitrogen社）、pDONR201-FB1とpcDNA-DEST53（12288015,Invitrogen社）の組み合わせで、それぞれ１μlと０．５μlを混合した。該混合物に５xLR  clonaseバッファー１μl、及びTE１．５μlを加えて混合し、さらにGateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）１μlを加えて撹拌した。該混合物を25℃で1時間インキュベートし、組み換え反応を行った。該反応物に２μｇ/μl  Proteinase  K（52895,Invitrogen社）０．５μlを加え、37℃で10分間インキュベートし、大腸菌DH5のカルシウムコンピテントセル（コンピテンシー；１０８／μ）５０μlと混合し、氷上で30分間冷却した。引き続き、42℃で1分間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間インキュベートし、濃度２５μｇ/μlのアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて、37℃で12時間培養した。生じたコロニーを２５μｇ/μlのアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB液体培地において37℃で12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（11453-024,MARLIGEN社）を用いてプラスミドDNAを抽出、精製し、大腸菌に用いる発現ベクターpDEST15-GST-FB1、及びびpET-DEST42-FB1-V5・His6、及び哺乳類細胞に用いる発現ベクターpcDNA-DEST53-FB1を得た。
【００４６】
(実施例３)    改質FB1遺伝子発現ベクターの作製
（cDNAエントリークローンの作製）
実施例３では、マウスFB1の変異体、部分配列、及び欠損型のエントリークローンを調製し、改質FB1遺伝子発現ベクター作製した。該作製には、Gatewayクローニングシステム、又は発現用ベクターのマルチクローニングサイトに制限酵素処理を施してDNA断片を組み込む方法を用いた。
まず、図１に示す下記マウスFB1の変異体、部分配列、及び欠損型のエントリークローンを、所定のプライマーを用い、FB1全長cDNAをテンプレートとしてPCR反応を行うことにより作製した。なお、図１において、配列番号をSEQと略した。したがって、配列番号７のフォワードプライマーをSEQ7のように略して記載した。
(1)FB1のC末端変異型エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTCCGAGCAGGGACCGC
（配列番号：９）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATAGGATGATGGCGCATCTGC    
（配列番号：１２）
【００４７】
(2)F-box領域のみの部分配列エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTCCGAGCAGGGACCGC
（配列番号：９）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACACTACCCGGCCCTCAATGT
（配列番号：１６）
(3)中央部分のみの部分配列エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGCCGGGTAGTGGAAAATAT
（配列番号：１３）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCACTTCTCAAGCTCATGGCAA
（配列番号：１４）
【００４８】
(4)富ロイシン反復配列(LRR領域)のみの部分配列エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGATTCACTGTCCTCGGCTTCA
（配列番号：１７）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAACAGCTCTTCAAGTGCTCCA
（配列番号：１８）
(5)CAAX領域を含むC末端のみの部分配列エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGAGCTGTCACAGCCTTGAGCG
（配列番号：２０）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATAGGATGATGCAGCATCTGC
（配列番号：１１）
【００４９】
(6)CAAX領域欠損型エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTCCGAGCAGGGACCGC  
（配列番号：９）
リバースプライマー：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGAAGCGCTGTCTGCTGCC
（配列番号：１９）
(7)短い中央の部分配列エントリークローン
フォワードプライマー：  
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGGGGTCTCAAGGCCTTATT  
（配列番号：１５）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCACTTCTCAAGCTCATGGCAA
（配列番号：１４）
(8)C末端領域欠損型エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGCTCCGAGCAGGGACCGC  
（配列番号：９）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCACTTCTCAAGCTCATGGCAA
（配列番号：１４）
【００５０】
(9)F-box欠損型のエントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGCCGGGTAGTGGAAAATAT  
（配列番号：１３）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATAGGATGATGCAGCATCTGC
（配列番号：１１）
(10)N末端欠損型エントリークローン
フォワードプライマー：  
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGGGGTCTCAAGGCCTTATT  
（配列番号：１５）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATCATAGGATGATGCAGCATCTGC
（配列番号：１１）
(11)F-box欠損型（終止コドンなし）エントリークローン
フォワードプライマー：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGCCGGGTAGTGGAAAATAT  
（配列番号：１３）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAGGATGATGCAGCACCTGC
（配列番号：１０）
【００５１】
(12)N末端欠損型（終止コドンなし）エントリークローン
フォワードプライマー：  
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTGCCACCATGGGGGGTCTCAAGGCCTTATT  
（配列番号：１５）
リバースプライマー：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAGGATGATGCAGCACCTGC
（配列番号：１０）
前記エントリークローンの作製を下記の手順で行った。まず、実施例１で得られたTA  FB1ベクター１μlをテンプレートとして、濃度１０pmol/μlの所望のプライマー各０．５μl、２５mM  MgCl2を０．４μl、２mM  dNTPを１μl、１０xPCRバッファーを１μl、DMSOを０．１μl、耐熱性ポリメラーゼAmpliTaq  Gold(PerkinElmer社)０．１μlに、滅菌脱イオン水５．９μlを加えて１０μlとし、GeneAmp  PCR  System  9700装置（Applied  Biosystems社）を用いてPCR反応を行った。該PCR反応の条件は、96℃で10分間変性反応した後、96℃で15秒変性反応し、55℃で45秒再会合反応し、かつ72℃で1.5分間伸長反応するサイクルを30回行い、さらに72℃で2分間伸長反応した後、4℃に冷却して反応を終了した。
【００５２】
これらの操作により、先に記載したマウスFB1cDNAの変異体、部分配列、又は欠損型エントリークローンに、BP反応に必要なアダプター配列(att配列)をつないだPCR産物を得た。
得られたPCR産物を組み換え反応に用いた。すなわち、該PCR産物０．５μlを、pDONR201（11798014,Invitrogen社）０．５μl、５xBP  Clonaseバッファー１μl、及びTE１μlと混合し、そこにGateway  BP  Clonase酵素ミックス（11789-013,Invitrogen社）を１μl加えて撹拌した。該混合物を25℃で1時間インキュベートし、組み換え反応を行った。該反応物に２μｇ/μl  Proteinase  K（52895,Invitrogen社）を０．５μl加え、37℃で10分間インキュベートし、そのうちの２μlを大腸菌DH5のカルシウムコンピテントセル（コンピテンシー；１０８／μ）４μｌと混合し、氷上で30分冷却した。引き続き42℃で30秒間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間インキュベートし、２５μｇ/μlのKanamycine（K-4000,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて37℃で12時間培養した。生じたコロニーを２５μｇ/μlのKanamycine（K-4000,Sigma社）を含むLB液体培地で37℃で12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（11453-024,MARLIGEN社）を用いてプラスミドDNAを抽出、精製することにより、使用したプライマーに対応したマウスFB1各種変異体、部分配列、又は欠損型のエントリークローンを得た。
【００５３】
(発現ベクターの作製)
続いて、マウスFB1の変異体、部分配列、又は欠損型の発現ベクターを作製した。N末端にGSTタグを付加した目的ポリペプチドを大腸菌で発現させるために、エントリークローンとpDEST15（11802014,Invitrogen社）を用い、またN末端にGSTタグを付加した目的ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させるために、pDONR201-FB1とpcDNA-DEST53（12288015,Invitrogen社）を用いた。これらと、Gateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）とを用いてLR反応を行い、大腸菌での発現ベクター、又は哺乳類細胞での発現ベクターを得た。具体的には、下記操作を行った。
所望のエントリークローン１．５μlとpDEST15（11802014,Invitrogen社）、又はpcDNA-DEST53（12288015,Invitrogen社）０．５μlに、５xLR  clonaseバッファー１μl、及びTE１μlを加えて混合し、さらにGateway  LR  Clonase酵素ミックス（11791-019,Invitrogen社）を１μl加えて撹拌した。該混合物を25℃で1時間インキュベートし、組み換え反応を行った。該反応物に濃度２μｇ/μlのProteinase  K（52895,Invitrogen社）０．５μlを加え、37℃で10分間インキュベートし、大腸菌DH5のカルシウムコンピテントセル（コンピテンシー：１０８／μ）４０μlと混合し、氷上で30分冷却した。引き続き42℃で30秒間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間インキュベートし、濃度２５μｇ/μlのアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて37℃で12時間培養した。生じたコロニーを濃度２５μｇ/μlのアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB液体培地において、37℃で12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（11453-024,MARLIGEN社）を用いてプラスミドDNAを抽出、精製し、マウスFB1各種変異体、部分配列、又は欠損型の大腸菌での発現ベクター、又は哺乳類細胞での発現ベクターを得た。
【００５４】
さらに、エントリークローンを組み換える発現用のベクターについては、Vector  Conversion  System（11828-019,Invitrogen社）を用いてpEGFP-C2（632316,BD  Biosciences  clontech社）をGatewayクローニングシステムで使用できるベクターに改変した後、使用した。
（発現用ベクターのマルチクローニングサイトへのFB1cDNA断片の組込み）
発現用ベクターのマルチクローニングサイトに制限酵素処理を施してFB1cDNA断片を組込んだ。
まず前述の操作により得られたTA  FB1ベクターをテンプレートとし、配列番号２１のフォワードプライマー及び配列番号２２のリバースプライマー、又は配列番号２３のフォワードプライマー及び配列番号２４のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
フォワードプライマー：
CGGGATCCATGATTCACTGTCCTCGGCTTC        （配列番号：２１）
リバースプライマー：
AATGCGGCCGCTCAACAGCTCTTCAAGTGCTCCA    （配列番号：２２）
フォワードプライマー：
CGGGATCCATGAGCTGTCACAGCCTTGAGC        （配列番号：２３）
リバースプライマー：
AATGCGGCCGCTCATAGGATGATGCAGCACCTGC    （配列番号：２４）
【００５５】
濃度１０pmol/μlのプライマー各０．５μl、２５mM MgCl2を０．４μl、２mM dNTPを１μl、１０xPCRバッファーを１μl、耐熱性ポリメラーゼAmpliTaq  Gold(PerkinElmer社)０．１μlに滅菌脱イオン水６μlを加えて１０μlとし、GeneAmp  PCR  System  9700装置（Applied  Biosystems社）を用いてPCR反応を行った。該PCR反応の条件は、96℃で10分の変性反応の後、96℃で15秒変性反応し、55℃で30秒再会合反応を行い、72℃で2分伸長反応を行うサイクルを30回実施し、さらに72℃で2分伸長反応した後、4℃に冷却して反応を終了した。該操作によりマウスFB1cDNAの部分配列に制限酵素認識配列を連結した配列を得た。
該PCR産物と大腸菌での発現ベクターpET41a(+)（Nargen社）を制限酵素BamHI（Takara社）とNotI（Takara社）で消化し、1％アガロース（Takara）、1xTAEバッファーでの電気泳動に供し、目的とする大きさのDNAを切り出し、QIAquick  Gel  Extraction  kit（28704,Qiagen社）を用いてDNAを抽出し、核酸連結反応に用いた。
【００５６】
該PCR産物を４μl、大腸菌での発現ベクターpET41a(+)（Nargen社）を４μl、Ligation  high（Takara社）３μlを混合し、16℃で30分間核酸連結反応を行った。該反応物を大腸菌DH5αのカルシウムコンピテントセル１００μlと混合し、氷上で30分間冷却した。引き続き42℃で30秒間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間インキュベートし、濃度２５μｇ/μlのKanamycine（K-4000,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて37℃で12時間培養した。生じたコロニーを濃度２５μｇ/μlのKanamycine（Sigma,K-4000社）を含むLB液体培地で37℃で12時間培養し、培養した大腸菌からMini  prep  kit（MARLIGEN,11453-024社）を用いてプラスミドDNAを抽出、精製し、マウスFB1の部分配列を含む、大腸菌の発現ベクターを得た。
同様に、配列番号２１のフォワードプライマー及び配列番号２５のリバースプライマー、又は配列番号２３のフォワードプライマー及び配列番号２６のリバースプライマーの組み合わせでPCR反応を行い、制限酵素BamHI（Takara社）とEcoRI（Takara社）で制限酵素消化を行った後、核酸連結反応をし、大腸菌での発現ベクターを得た。
リバースプライマー：
GGAATTCTCAACAGCTCTTCAAGTGCTCCA  （配列番号：２５）
リバースプライマー：
GGAATTCTCATAGGATGATGCAGCACCTGC  （配列番号：２６）
【００５７】
（実施例３）  FB1遺伝子発現産物の調製
（FB1遺伝子の大腸菌による発現）
実施例２で得られた大腸菌での発現ベクターpDEST15-GST-FB1、及びpET-DEST42-FB1-V5・His6、同様に作成したFB1の各種変異体、部分配列、又は欠損型の大腸菌発現ベクターを、大腸菌BL21（DE3）株に導入することにより、FB1遺伝子発現産物を得た。
まず、実施例２で得られたプラスミド１００ngをBL21(DE3)にコンピテントセル(stratagene,#200131社)の懸濁液１０μlを混合し、氷上で30分冷却した。引き続き42℃で30秒間ヒートショックを行い、再び氷上に戻した後、SOC倍地２５０μlを加えて37℃で30分間インキュベートし、濃度２５μｇ/μlのアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB寒天培地にまいて37℃で12時間培養した。生じたコロニーを濃度２５μｇ/μlアンピシリン（A-9393,Sigma社）を含むLB液体培地１００ml中で37℃、12時間培養し、その後、１リットルの拡張培養を行った。30℃で2時間培養後、２００mM  IPTG濃度でタンパク質発現誘導を行った。続いて大腸菌を回収し、その培養液４００mlを８M尿素、１００mM  NaCl溶液、１％  TritonX-100、５０mM  Tris-HCL  PH8.0溶液中で超音波破砕して可溶化し、100,000Xgで30分間遠心分離し、上清を回収した。該上清を５０mM  Tris-HCL  PH8.0、１００mM  NaCl溶液中で透析を行い、さらに透析物を100,000Xgで30分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清をグルタチオン4Bセファロース、又はタロンビーズと混合することにより、FB1遺伝子産物を回収した。
【００５８】
（FB1遺伝子の哺乳類細胞における発現）
実施例２で得られた哺乳類細胞発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、FB1遺伝子の発現を行い、該遺伝子産物を得て、該遺伝子産物の細胞内局在を観察した。
まず、実施例２で得られた哺乳類細胞発現ベクターpcDNA-DEST53-FB1、同様に作成したFB1の各種変異体、部分配列、又は欠損型の哺乳類細胞発現ベクターを培養細胞に導入し、FB1遺伝子産物を得ることができた。該FB1遺伝子等の導入にはCOS細胞とLipofectamine  2000試薬（11668-019,Invitrogen社）を使用した。Opti-MEM(Gibco  BRL社)１００mlに該DNA１mgを混合した溶液に、Opti-MEM(Gibco  BRL社)１００mlにLipofectamine  2000試薬３mlを混合し、5分間室温で静置した溶液を混ぜ、さらに30分間インキュベートした。得られたDNA-lipofectamine混合物を、３５mm  dish(falcon社製)上で50-60％コンフルエントの状態のCOS細胞の培養液に加え、1時間CO2インキュベータに置いた後、新しい培養液と交換した。該培養細胞を集め、該細胞中に発現したFB1遺伝子産物を回収することができた。該発現産物には、GFPタグが付加されているので、蛍光顕微鏡で細胞を観察し、FB1遺伝子産物の細胞内局在を観察することができた。
【００５９】
（実施例４）  L-LTPによるFB1  mRNAの誘導
図３に示すように、ラットの脳でL-LTPを行うことによりFB1  mRNAが誘導されることを確認した。すなわち、インビボのL-LTP標本を用い、FB1  mRNA全長のアンチセンスRNAをプローブとしてin  situハイブリダイゼーションを行い、神経活動性依存的にFB1  mRNAの発現が増えることを確認した。
まず、ラットの脳にL-LTPを誘発するために、15分間隔で4回の高頻度の刺激(HFS)(合計2400パルス)を行った。各回の刺激は、400Hzで30パルスの刺激20回からなっている。刺激したラットの脳を、1時間、2時間、6時間、及び24時間後に凍結固定し、凍結切片を作成した。
TA FB1のプラスミドDNAを鋳型とし、DIG  labeling  system(Roshe社)を使用してFB1  mRNAを認識するRNAプローブ（アンチセンス鎖）を作成した。同様に、FB1センス鎖のRNAプローブを作成した。このプローブはFB1  mRNAには結合しないので、ネガティブコントロールとして使用した。これらの切片とプローブを用いて、FB1のmRNAを検出した。その結果、図３に示すように、LTP誘導を行って６時間経過した海馬の中でFB1  mRNAの量が増加していることが示された。
【００６０】
なお、CaN(calcineurin)は常に発現しているポジティブコントロールとして使用した。また、Vesl-1S/HomerもLTP誘導のポジティブコントロールとして使用した。これらは図３に示されているように、FB1  mRNAを示す明瞭な濃淡が現れている。
また、図４は、図３で示されたLTP誘導６時間後のFB1mRNA増加を示す海馬の歯状回部分を拡大して見たものである。対測部位と比較してLTP部位では明らかにFB1  mRNAを示す明瞭な濃淡がさらにはっきりと見て取ることができる。
（実施例５）  CAAX領域によるFB1遺伝子産物の膜への移行
FB1遺伝子産物はC末端にプレニル化されるCAAX配列を持ち、細胞膜に局在すると予想された。実施例３にならってGatewayシステムを用いて作成したGFPタグ付加のFB1遺伝子の全長、及び各種領域を組み換えた哺乳類発現用ベクターのプラスミドを、プラスミド精製試薬（Qiagen社）を用いて精製し、COS細胞に発現させ、観察を行った。その結果、CAAX領域に依存してFB1に遺伝子産物は細胞膜に移行した。全反射顕微鏡による蛍光観察により、実際に膜に移行していることを確認した（図５及び６）。
図５では、各写真を上段左からa、b、下段左からc、d、e、及びfとし、COS細胞にGFPタグ付加のFB1遺伝子を発現させ、細胞内局在を観察した。各写真の上に、FB1のドメイン構造を表す模式図と、それに対応してこの実験でCOS細胞に導入した領域を表す模式図を示した。
【００６１】
(a)では、FB1のドメイン構造はGFPタグ付加のFB1遺伝子の全長であり、膜様の局在を示している。(b)では、ドメイン構造はGFPタグ付加のFB1遺伝子の全長（ただしC末端のCAAX領域の変異体）であり、(a)と比較すると細胞質全体にび漫性に分布している。(c)では、ドメイン構造は、GFPタグ付加のFB1遺伝子のF-box領域であり、(d)では、GFPタグ付加のFB1遺伝子の中央部分の領域であり、かつ(e)では、GFPタグ付加のFB1遺伝子のLRR領域である。(c)、(d)、及び(e)では、細胞質全体にび漫性に分布している。また、(f)では、ドメイン構造はGFPタグ付加のFB1遺伝子のCAAX領域であり、全長のFB1と同じく膜様の局在を示している。したがって、FB1はCAAX領域に依存して細胞膜に局在することが明らかとなった。
また、図６に示すように、全反射顕微鏡(B)では、蛍光が検出できるのはカバーグラス近傍のごく限られた領域に限定されているため、コントラストの極めて高い画像が得られる。落斜蛍光像(A)で同じサンプルを観察したときより、TIRF像では明らかに蛍光強度が異なるものがある。これは、それらがカバーガラスに密着した細胞膜上にFB1が局在していることを意味している。
【００６２】
（実施例６）  脳組織におけるFB1の結合複合体の検出
FB1タンパク質がLRR領域を介してFB1標的分子と結合し、分解に関与することを確認した。FB1タンパク質は、シナプスの脱構築に関与すると考えられるので、分解の標的分子はシナプスの構成分子と予想された。また、該標的分子とFB1タンパク質とは、LRR領域を介して結合すると予想された。
この予想を確かめるため、マウス脳からシナプスに富む分画（シナプトソーム画分）を分離し、精製した。まず、FB1タンパク質のLRR領域をビーズ上に固定し、インキュベートすることにより標的分子を探索した。また対照実験として、同じシナプトソーム画分と、LRR領域とは関係のないCAAX領域をビーズ上に固定したものをインキュベートする実験を行った。なお、ここで用いたCAAX領域とは、C末端のCAAX領域を含む領域で、用いたLRR領域とほぼ同じ分子量になるように作成し、ネガティブコントロールとして用いている。
まず、以下の操作によりシナプトソーム画分を調製した。マウス１０匹分の脳を、０．３２Mスクロース、４mM Hepes-NaOH(pH 7.4)の溶液３０mlでホモゲナイズした後、800×gで10分間、4℃にて遠心した。上清を9,200×gで15分間4℃にて遠心し、上清と沈澱に分離した（参考文献、Hirao  et  al.,  J  Biol  Chem.  1998  Aug  14；273(33)：21105-10,.  Huttner  et  al.,  J  Cell  Biol.  1983  May；96(5)：1374-88.）。沈澱として得られたシナプトソーム画分を５０mMTris-HCl  pH  8.0、１００mM  NaCl、1％Triton  X-100の溶液18mlで可溶化し、抽出物を得、後の実験に使用した。そのうちの一部はInputサンプルとして取り分け、等量の１００mMTris-HCl  pH  6.8、4％SDS、12％α-Melcaptethanol、2％glycerol、bromo  phenol  blueを加えてSDS化し、後に述べる電気泳動サンプルとした。
【００６３】
続いて、検出に用いるビーズを作成した。すなわち、標的分子との結合に関与するLRR領域、又は結合とは関係のないCAAX領域にGSTタグを結合したポリペプチドを大腸菌で発現させ、かつ抽出し、GSTに結合能の高いグルタチオンビーズ上に固定した。具体的な手順としては、実施例３と同様に、pDEST15-GST-FB1-LRR、又はpDEST15-GST-FB1-CAAXを導入した大腸菌（BL21(DE3)株）を、Ampicillinを含むLB培地１００mlで37℃で12時間震盪培養し、引き続きその培養液をLB培地1Lの入ったフラスコに移して30℃で2時間培養培養した後、２００mM  IPTGで発現誘導を行った。さらに4時間培養し、GSTタグを付加したFB1のLRR領域あるいはCAAX領域を発現させ、培養液から発現させたポリペプチドを大腸菌の沈澱として回収した。該大腸菌サンプルを、５０mMTris-HCl  pH  8.0、８M尿素、１００mM  NaCl、1％Triton  X-100の溶液５０mlで可溶化し、抽出物を得た。該抽出物を５０mMTris-HCl  pH  8.0、１００mM  NaCl溶液4リットルで2回透析した透析物をグルタチオンセファロース（＃17-5132-01、アマシャム社）（ビーズ）２００μlと4℃で3時間インキュベートし、発現させたポリペプチドをビーズに結合させた。遠心して該ペプチドを結合したビーズを回収し、５０mMTris-HCl  pH  8.0、１００mM  NaCl溶液１５mlで４回洗浄を行い、該ビーズを余分な夾雑物を除いて使用した。
【００６４】
以上の操作で得られたシナプトソーム抽出物とビーズを混合し4℃で６時間インキュベートして、ビーズ上のGSTタグを付加したFB1のLRR領域に結合するシナプトソーム中の成分を結合させた。その後該ビーズを５mlの５０mMTris-HCl  pH  8.0で１回、１mlの５０mMTris-HCl  pH  8.0で２回、計3回洗浄し、結合しなかった他のシナプトソーム成分を除いた。ビーズを５０μlの５０mMTris-HCl  pH  8.0、５００mM  NaClと氷上で5分間インキュベートし、遠心して解離したタンパク質の含まれる上清を回収し、等量の１００mMTris-HCl  pH  6.8、4％SDS、12％α-Melcaptethanol、2％glycerol、bromo  phenol  blueを加えてSDS化し、電気泳動サンプルとした。さらに沈澱のビーズを５０μlの５０mMTris-HCl  pH  6.8、2％SDS、6％α-Melcaptethanol、1％glycerol、bromo  phenol  blueを加えてSDS化し、電気泳動サンプルとした。対照の電気泳動サンプルとして、ビーズのみをSDS化したものも作成した。
これらの作成したSDS化サンプルのうち２０μlを12％のSDSポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）に供した。泳動後、ゲルを銀染色キット（第一化学薬品社）により染色し、タンパク質を検出した。
【００６５】
先の電気泳動による検出の結果を図７した。図７では、Inputは、マウス脳を分画して得られたシナプトソーム(synaptosome)のみの結果が示されており、それぞれレーン１は０．５M  NaClの溶出物、レーン２は2％SDSの溶出物、かつレーン3はビーズのみである。
図７のシナプトソームのGST-LRR  レーン２（丸印で囲った部分）、つまりシナプトソームをLRR領域と混合した組み合わせの場合でのみ、銀染色でSDS-PAGE上100kDaのバンドが検出された。すなわち、シナプトソーム画分でLRR領域に結合する分子が得られている。したがって、FB1タンパク質のLRR領域のみでは、この標的分子は分解されず結合した状態で検出されるが、ユビキチン化に関わる他の因子を同時に混合することにより、標的分子は分解されることが明らかである。
【００６６】
（実施例７）
配列番号４のアミノ酸配列を有するFB1タンパク質５０μｇを、抗体産生用免疫原として、生理食塩水０．２５ｍＬに溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部皮下に０．５ｍＬ／１匹ずつ注射する。
当該初回免疫から２週間後に、前記抗体産生用免疫原３０μｇを生理食塩水０．２５ｍＬに溶解し、フロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとして、それを０．５ｍＬにより追加注射を行う。この追加免疫注射は２週間おきに行う。
該マウスの血清中抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて、１週間ごとに測定する。このＥＬＩＳＡ法は、前記FB1タンパク質をマイクロプレートに１ウエル当たり１μｇずつ固相化し、適当な濃度に希釈した免疫動物の血清を加えて反応させ、洗浄後更にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応を行わせ、そして洗浄した後、過酸化水素と２，２’−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含んだ発色液を加えて発色させ、ＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社製）にて４５０ｎｍ（又は４１５ｎｍ）の吸光度を測定して抗体価を求める操作法により行う。
最初の１週間経過後に該マウスの血清中に抗体が見出される。該追加免疫を４回行うことにより、抗体価がプラトーに達する。
【００６７】
（実施例８）  モノクローナル抗体の製造
実施例７の免疫マウスの腹部皮下に、生理食塩水１００μｇ／ｍＬに溶解したFB1タンパク質溶液０．５ｍＬを注射する。その後３日目に、該マウスから脾臓を取る。
骨髄腫細胞の増殖ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク  ９０８５）を、胎児ウシ血清１０％含有し、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地で増殖させる。これは、この骨髄腫細胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増殖させる。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び血球計で計数することができる。
前記マウスから得た脾臓を、ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分にほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄し、その後、２００ｇで遠心分離を行い、脾臓細胞を分離する。更に、再度血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄する。
【００６８】
この脾臓細胞と前記Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した後、遠心分離を行う。混合した細胞を、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマンハイム社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液にゆっくりと懸濁する。そして、最終的にポリエチレングリコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈する。
該細胞を遠心分離で分離し、ハイブリドーマクローニングファクター（オリゲン社製）５％を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社製）に増殖培地に徐々に分散させる。そして、平底の９６穴マイクロタイタープレートのウエルに、１ウエル当たり１０６個／１００μＬの細胞を植え、CO2５％の二酸化炭素雰囲気中３７℃で培養する。
該細胞融合後１日目に、各ウエルに１００μＬのＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテリンとなるように各成分を補充したもの（いずれも東京化成社製））を加える。その後３日間は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後は、２〜３日毎に同様の交換を行う。
【００６９】
該細胞は、顕微鏡で観察を行う。ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以後より出現する。１４日以降に、プラスミノーゲンに結合する抗体の産生を検査するため、ウエルの上澄み液をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングする。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、実施例１の操作に準じて行うが、免疫動物の血清に変えてウエルの上澄み液を用い、また、精製FB1タンパク質を固相化したマイクロプレートで測定を行う。
当該スクリーニングにおいて、FB1タンパク質に結合する抗体を産生していることが判明したウエルのハイブリドーマを、２４穴のウエルがあるプレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養する。次いで、該ハイブリドーマはＨＴ培地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングファクターを含まないＨＡＴ培地）で培養する。該培養後、前記ＥＬＩＳＡ法により調べると、FB1タンパク質に対する特異的モノクローナル抗体が検出される。
該培養上清に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）含まれていることを、２８０ｎｍの吸光度より確認し、これを集めて２ｍＬに濃縮する。次いで、これをプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィーカラムで精製し、FB1タンパク質特異的モノクローナル抗体を得る。
【００７０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号１）  本発明のヒトFB1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子の配列である。
（配列番号２）  本発明のヒトFB1タンパク質のアミノ酸配列である。
（配列番号３）  本発明のマウスFB1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子の配列である。
（配列番号４）  本発明のマウスFB1タンパク質のアミノ酸配列である。
（配列番号５)  実施例１で、マウスFB1タンパク質をコードするcDNAを調製するのに用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
（配列番号６)  実施例１で、マウスFB1タンパク質をコードするcDNAを調製するのに用いたリバースプライマーのDNA配列である。
【００７１】
（配列番号７）  実施例１で、pCR2.1-TOPO ベクターに組み込まれたTA FB1の塩基配列の確認に用いたM13フォワードプライマーのDNA配列である。
（配列番号８）  実施例１で、pCR2.1-TOPO ベクターに組み込まれたTA FB1の塩基配列の確認に用いたM13 リバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号９)  実施例２で、マウスFB1全長のエントリークローンの作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
（配列番号１０)  実施例２で、マウスFB1全長のエントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。また、実施例３のF-box欠損型（終止コドンなし）エントリークローン、及びN末端欠損型（終止コドンなし）エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号１１)  実施例２で、マウスFB1全長のエントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。また、実施例３のF-box欠損型のエントリークローン、N末端欠損型エントリークローン、及びCAAX領域を含むC末端のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
【００７２】
（配列番号１２)  実施例３のFB1のC末端変異型エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号１３)  実施例３のFB1の中央部分のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
（配列番号１４)  実施例３の短い中央の部分配列エントリークローン、及びC末端領域欠損型エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号１５)  実施例３の短い中央の部分配列エントリークローン、N末端欠損型エントリークローン、及びN末端欠損型（終止コドンなし）エントリークローンの作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
【００７３】
（配列番号１６)  実施例３のF-box領域のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号１７)  実施例３の富ロイシン反復配列(LRR領域)のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
（配列番号１８)  実施例３の富ロイシン反復配列(LRR領域)のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号１９)  実施例３のCAAX領域欠損型エントリークローンの作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
（配列番号２０)  実施例３のCAAX領域を含むC末端のみの部分配列エントリークローンの作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
(配列番号２１)  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
【００７４】
(配列番号２２)  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
(配列番号２３)  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたフォワードプライマーのDNA配列である。
(配列番号２４）  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
(配列番号２５)  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
(配列番号２６)  実施例３において、TA FB1ベクターをテンプレートとし、発現用ベクターのマルチクローニングサイトへ組み込むFB1cDNA断片の作製に用いたリバースプライマーのDNA配列である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、マウスFB1遺伝子の概略構造、及びエントリークローンの作成に使用したプライマーと、該プライマーで作成しマウスFB1遺伝子の変異体、部分配列、又は欠損型のPCR産物のマウスFB1遺伝子に対する位置を示す。
【図２】図２は、FB1遺伝子の概略構造、及び該FB1類似タンパク質の相同性と部位の関係を示す。
【図３】図３は、L-LTPによるFB1 mRNA の経時的な誘導を示す。
【図４】図４は、図３で示されたLTP誘導６時間後のFB1mRNA増加を示す海馬の歯状回部分を拡大した図である。したがって、図４は、LTPの間に後期遺伝子として誘導されたFB1mRNA を示す。
【図５】図５は、FB1遺伝子、及びFB1遺伝子関連ポリヌクレオチドの遺伝子産物の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、FB1遺伝子の遺伝子産物の細胞内分布を示す落斜蛍光像(A)と、全反射顕微鏡(B)の蛍光像である。全反射顕微鏡(B)の蛍光像では、コントラストの極めて高い画像が得られた。
【図７】図７は、マウス脳を分画して得られた細胞質（サイトゾル）、及びシナプトソームのみのFB1遺伝子産物の電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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