(57)【要約】【課題】被検物質を特異的にかつ簡便に分析する方法として免疫クロマトグラフィーが用いられている。これまでに開示された方法では、それぞれの抗体の特性によって条件が異なり手間がかかるという欠点があった。また、膜を用いているためその強度を上げるのに支持体に保持させ、或いは膜単独では取り扱いが困難なためケーシングが必要であった。【解決手段】本発明は、標識抗体、被検物質捕捉抗体、余剰標識抗体捕捉抗体から選ばれる一つの試薬を結合させた担体を組み合わせて用いることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識抗体、被検物質捕捉抗体、余剰標識抗体捕捉抗体から選ばれる一つの試薬を結合させた担体を組み合わせて用いることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
キャピラリーを用い、その一方の端を液体吸収部材で密封し、他方の端から標識抗体、被検物質捕捉抗体、余剰標識抗体捕捉抗体から選ばれる一つの試薬を結合させた複数種の担体と不活性物質を交互に充填したことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
担体が球体または破砕体である粒子状物質である請求項１または２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項４】
担体の材質がポリエチレン、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスから選ばれる請求項３記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項５】
不活性物質が結晶性セルロースである請求項２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【請求項６】
前記他方の端に、着脱自在の被検物質捕集部を設けたロート状形状のキャピラリー開口部を有する請求項２記載の免疫クロマトグラフィー装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫学的分析装置に関する。具体的には、免疫クロマトグラフィーを用い被検物質を特異的に検出・定量する装置に関する。
【０００２】
【従来技術と発明が解決しようとする課題】
被検物質を特異的にかつ簡便に分析する方法として免疫クロマトグラフィーが用いられている。これまでに開示された方法（特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）では、１枚のニトロセルロースなどの膜上に被検物質を捕捉する抗体と余剰標識抗体を捕捉する抗体がある距離をおいて存在すること、ならびに標識抗体がその膜に移行できる位置に設置することが特徴であり、３種類以上の抗体をそれぞれ膜上に塗布乾燥させなければならず、それぞれの抗体の特性によって条件が異なり手間がかかるという欠点があった。また、膜を用いているためその強度を上げるために膜を適当な支持体に保持させる必要があった。加えて、抗体を塗布した膜単独では取り扱いが困難でありケーシングが必要であった。
【０００３】
【特許文献１】
特公平７−４６１０７号公報
【特許文献２】
特開２００１−３３４５４号公報
【特許文献３】
特開２００１−１３１４３号公報
【０００４】
【課題を解決するための手段】
従来法の欠点を改良するために、使用する抗体をタンパク結合性の素材でできた適当な担体にそれぞれ結合させ、使用目的に応じて適宜組み合わせて使用できる形態とし、本発明を完成させるにいたった。
【０００５】
本発明は、標識抗体、被検物質捕捉抗体、余剰標識抗体捕捉抗体から選ばれる一つの試薬を結合させた担体を組み合わせて用いることを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置である。また、本発明は、キャピラリーを用い、その一方の端を液体吸収部材で密封し、他方の端から標識抗体、被検物質捕捉抗体、余剰標識抗体捕捉抗体から選ばれる一つの試薬を結合させた複数種の担体と不活性物質を交互に充填したことを特徴とする免疫クロマトグラフィー装置である。
【０００６】
抗体を結合させる担体は、いかなる材質のものも使用できるが、ポリスチレン、ニトロセルロース、ナイロン、ガラスなどが便利である。また、表面を必要に応じて界面活性剤などで処理することもできる。いかなる形状でも可能であるが、球体や破砕体などの粒子状が種々の形態に対応でき有利である。
これにより分析に必要な担体に結合した抗体を適宜製造でき、またその保存も容易となる。
以下に実施例を示し、より具体的に本発明の内容を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０００７】
【実施例１】
ポリスチレン粒子（ＪＳＲ社製；ＩＭＭＵＴＥＸ−ＰＳ、  ２μｍφ）１ｍｌ（固形分１０ｗｔ％）をガラスフィルター上でろ過し蒸留水で３回洗浄した。次に１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）にけん濁した。０．２ｍｌを１ｍｌ用エッペンドルフチューブに入れそこへ５０μｇ／ｍｌに同じ緩衝液で調製した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４（アサヒフードアンドヘルスケア社製；生化学工業カタログ番号２９０４６５）を等量入れた。十分に混和した後室温で５時間放置した。その後に遠心分離して上清を捨て同じ緩衝液で洗浄した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む同じ緩衝液で洗浄した後に１％ＢＳＡ溶液を加え室温で１時間放置した。しかる後に遠心分離を行い上清を捨てた。チューブに残ったポリスチレンビーズを回収し室温で減圧下３時間乾燥した。同様に、抗Ｄｅｒｆ１モノクローナル抗体６Ｇ１（アサヒフードアンドヘルスケア社製；生化学工業カタログ番号２９０４６３）をポリスチレンビーズにコートし洗浄ならびにＢＳＡによるブロッキング処理を行った。さらに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製；カタログ番号１７０−６５１６）をポリスチレンビーズにコートしたものも調製した。調製したビーズは、それぞれ密栓して使用するまで室温で保存した。
【０００８】
【実施例２】
ガラスキャピラリー（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製；カタログ番号２−０００−２００、２００μＬ用）の一端に結晶性セルロース（旭化成（株）製；商品名アビセル１０１）を高さ１．０ｃｍまで充填した。そこへ実施例１で調製した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４をコートしたポリスチレンビーズを約１ｍｍの高さに重層した。続いて結晶性セルロースを高さ１．５ｃｍの高さになるまで重層した。さらに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製；カタログ番号１７０−６５１６）をコートしてあるポリスチレンビーズを約１ｍｍの高さに重層した。さらに結晶性セルロースを１．０ｃｍ重層し両端を脱脂綿にて栓をした。抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４をコートしたビーズを充填している側の脱脂綿へ金コロイド標識した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１５Ｅ１１を添加した。そこへリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，  ５０ｍＭ）で５００ｎｇ／ｍｌ濃度に調製したＤｅｒｆ２溶液を２０μＬ加えた。次に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む同じリン酸緩衝液１００μＬをキャピラリーの同じ側から加え約１０分間放置した。しかる後に、２種のビーズ層の色を比較した。抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４をコートしたビーズ層の色の濃さは抗マウスＩｇＧ抗体をコートしたビーズ層とほぼ同等であった。その結果、本検出器具では１０ｎｇのＤｅｒｆ２を測定できることが判った。
【０００９】
【実施例３】
実施例２と同様にして、ガラスキャピラリーに金コロイド標識した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１５Ｅ１１および金コロイド標識した抗Ｄｅｒｆ１モノクローナル抗体２Ｅ１を含ませ乾燥させた脱脂綿を詰め次に結晶性セルロースを１ｃｍの高さまで充填した。次に実施例１で作製し保存しておいた抗Ｄｅｒｆ１モノクローナル抗体６Ｇ１をコートしてあるポリスチレンビーズを１ｍｍの高さに重層した。次に結晶性セルロースを１ｃｍの高さまで重層し、実施例１で作製し保存しておいた抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４をコートしてあるポリスチレンビーズを１ｍｍ重層した。続いて、結晶性セルロースを１ｃｍの高さまで重層した。さらに、実施例１で作製し保存しておいた抗マウスＩｇＧ抗体をコートしてあるポリスチレンビーズを１ｍｍ重層した。最後に結晶性セルロースを１ｃｍ重層し脱脂綿をキャピラリーに挿入して重層された全体を固定した。リン酸緩衝液（ｐＨ７．４，  ５０ｍＭ）で５００ｎｇ／ｍｌ濃度に調製したＤｅｒｆ１およびＤｅｒｆ２を含む溶液を標識抗体を含む脱脂綿が挿入されているキャピラリー側に添加した。続いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む同じリン酸緩衝液１００μＬをキャピラリーの同じ側から加え約１０分間放置した。しかる後に、ポリスチレンビーズ層の色の濃さを比較した。抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体を含むビーズ層の色の濃さは抗マウスＩｇＧ抗体を含むビーズ層の色の濃さよりやや薄い程度であったが、抗Ｄｅｒｆ１モノクローナル抗体を含むビーズ層の色の濃さは他の２層に比べ半分程度であった。その結果、本検出器具ではＤｅｒｆ１およびＤｅｒｆ２をそれぞれ同時に測定できることが判った。
【００１０】
【実施例４】
４−１．実施例２に記載した通り調製したキャピラリーの一端（金コロイド標識した抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１５Ｅ１１を添加した脱脂綿側）をロート状に広げた。そこに室内塵を捕集するための多孔性ポリエチレン製の着脱自在の捕集部をはめ込んだ（図１参照）。次にこの捕集部によって室内塵があるアクリル製カーペット（大きさ６畳）上のＡ４サイズの面積をジグザグに軽くこすり室内塵を捕集部に採取した。その後、室内塵捕集部を上に向けそこへＴｗｅｅｎ２０を０．０５％含むリン酸緩衝液をゆっくりと滴下した。約１０分間放置した。しかる後に抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４をコートしたビーズ部と抗マウスＩｇＧ抗体をコートしたビーズ部の色の濃さを比較した。両者の色はほぼ同等であった。
【００１１】
４−２．次に、電気掃除機で同じカーペット全面を約１０分間くまなく吸引し室内塵を吸い取った。掃除機で回収された室内塵の総量は、約１５０ｍｇであった。次にこの室内塵を１０ｍｇ秤量し０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）１ｍｌに混和し室温で１０分間良く撹拌した。次にこの混合液をろ過し（東洋ろ紙製；Ｎｏ．５１）清澄なろ液を得た。抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１５Ｅ１１（アサヒフードアンドヘルスケア社製；生化学工業カタログ番号２９０４６７）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）に２μｇ／ｍｌになるよう溶解しその５０μＬをＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト社製；スミロンＭＳ−８５９６Ｆ）の各ウェルに分注した。室温で２時間放置した後にプレートをリン酸緩衝液で３回洗浄した。１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液を２００μＬづつ各ウェルに分注し室温で１時間放置しブロッキングした。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した。標準物質としてＤｅｒｆ２（アサヒフードアンドヘルスケア社製；生化学工業カタログ番号２９０４５２）を用いた。０．３μｇ／ｍｌから順次希釈した溶液を調製し５０μＬづつ各ウェルに分注した。先に調製した室内塵抽出液を５０μＬウェルに入れ室温で２時間静置した。その後にプレートをＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した。１μｇ／ｍｌの濃度に溶解したパーオキシダーゼ標識してある抗Ｄｅｒｆ２モノクローナル抗体１３Ａ４（アサヒフードアンドヘルスケア社製；生化学工業カタログ番号２９０４６６）を５０μＬ各ウェルに分注し室温で２時間静置した。その後、プレートをＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した。住友ベークライト（株）製パーオキシダーゼ発色キット（カタログ番号ＭＬ−１１３００）を用いて発色させた。２Ｎ硫酸で発色反応を停止しプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製；型番Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳＵＶ）を用いて４９２  ｎｍの吸光度を測定した。標準物質から得た検量線からカーペットから調製した溶液中のダニアレルゲン濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであった。これより採取した室内塵中のダニアレルゲン濃度は、５μｇ／ｇ室内塵であった。
【００１２】
その結果、実施例１で作製し保存しておいた捕捉抗体などを組み合わせて、先の実施例４−１に記載するようなキャピラリーを用い、都度作製した簡易な装置によるダニアレルゲン測定では、ダニアレルゲン５μｇ／ｇ室内塵の汚染レベルを検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４−１において用いられるキャピラリーの構造を示す概略図である。
【図１】
2005017205.tif 000002