(57)【要約】【課題】  発現微量タンパク質／ペプチドの検出・分離・同定法及びそのシステムを提供する。【解決手段】  微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法であって、蛍光試薬で標識した被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析することを特徴とする上記タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法、及びその同定システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項２】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（２）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（３）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（４）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
【請求項１２】
上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化１の一般式（１）
【化１】
2005017264.tif 000014
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はジアルキル置換Nアルキル又はトリアルキル置換Nアルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は下記の化２の一般式（２）
【化２】
2005017264.tif 000015
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化３の一般式（１）
【化３】
2005017264.tif 000016
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はジアルキル置換Nアルキル又はトリアルキル置換Nアルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は下記の化４の一般式（２）
【化４】
2005017264.tif 000017
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、のいずれか１を有効成分とすることを特徴とする蛍光誘導体化試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法に関するものであり、更に詳しくは、生体において遺伝子の発現により産生される微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法で、高感度に検出し、同定することを可能とする新規な発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法、及びその同定システムに関するものである。
本発明は、ポストゲノム時代において重要な役割を果たすことが期待される、発現タンパク質及び／又はペプチドを網羅的に解析するプロテオーム技術における新しい検出・分離・同定手法を提供するものとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代において重要な課題は、遺伝子を介して発現する発現タンパク質／ペプチドの微量検出とその分離・同定である。従来、この課題達成のために、２次元電氣泳動後のペプチドフィンガープリント法が汎用されてきた（非特許文献１参照）。しかし、この方法は、煩雑な操作のために該方法の再現性に難点があった。この難点を克服する手法として、最近、多次元高速液体クロマトグラフィー（多次元ＨＰＬＣ）による分離・同定法、或いはＩＣＡＴによる手法が提案されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
これらのうち、タンパク質／ペプチドを、直接、多次元ＨＰＬＣで分離・同定する方法は、全てのタンパク質／ペプチドを同時に処理するために、多大な労力と時間を要するという欠点がある。また、ＩＣＡＴによる手法は、チオール含有タンパク質／ペプチドのチオール基をｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ  （ＩＣＡＴ）  ｒｅａｇｅｎｔで標識した後、それをビオチン結合カラムにて捕集し、これら全てを酵素水解し、得られたペプチドフラグメント混合物をＨＰＬＣで分離、質量分析計（ＭＳ）にて質量分析し、タンパク質／ペプチドを網羅的に解析しようとするものである。しかし、この方法は、チオール含有タンパク質／ペプチドの全てを酵素水解するため、大量に存在する目的以外のタンパク質／ペプチドのフラグメントが、目的とする微量タンパク質／ペプチドのフラグメントの検出及びその同定を妨害する、と言う欠点があり、当技術分野においては、更なる方法のブレークスルーが必要とされていた。
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｕｎｎ  ＭＪ．Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  １９８７；４１８：１４５−１８５
【非特許文献２】Ｇｙｇｉ  Ｓ．Ｐ，  Ｒｉｓｔ  Ｂ，  Ｇｅｒｂｅｒ  Ｓ．Ａ，  Ｔｕｒｅｃｅｋ  Ｆ，  Ｇｅｌｂ  Ｍ．Ｈ，  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ、  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙｔａｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９；１７：９９４−９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上記従来技術における諸問題を抜本的に解決することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、従来法と異なり、被験試料中の蛍光標識可能なタンパク質及び／又はペプチドのみを蛍光選択的に分離した後、これを酵素水解に付し、分画した蛍光画分を質量分析、データベース照合、構造解析に供することにより、従来法では検出不可能であった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出し、同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、簡便な測定手法で、高感度に検出・分離・同定することを可能とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記微量検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、高感度で検出・分離・同定するための発現タンパク質及び／又はペプチド同定システムを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、従来法では検出することができなかった、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを超高感度で検出・分離・同定することを可能とする新しい分析方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（２）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、前記（１）に記載の方法。
（３）（ａ）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（ｂ）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（ｃ）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（ｄ）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、前記（１）に記載の方法。
（４）タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（６）蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（７）酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（８）質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
（９）被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１０）タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
（１２）上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、前記（１１）に記載のシステム。
（１３）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化５の一般式（１）
【化５】
2005017264.tif 000002
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但し、Ｒ′はジアルキル置換Nアルキル又はトリアルキル置換Nアルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は下記の化６の一般式（２）
【化６】
2005017264.tif 000003
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、を用いて、蛍光誘導体とする、前記（１）に記載の方法。
（１４）前記（１）に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化７の一般式（１）
【化７】
2005017264.tif 000004
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但し、Ｒ′はジアルキル置換Nアルキル又はトリアルキル置換Nアルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は下記の化８の一般式（２）
【化８】
2005017264.tif 000005
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、のいずれか１種を有効成分とすることを特徴とする蛍光誘導体化試薬。
【０００８】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、上記従来法の難点を克服するためになされたものであり、１）微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、２）それをＨＰＬＣ／蛍光検出にて第一段の分離・蛍光検出を行い、３）その蛍光分画（コントロール試料と比べて、被験試料に特異的に増減する蛍光画分）のみを捕集後、酵素水解し、それを第二段のＨＰＬＣ／蛍光検出にて分離し、蛍光ピークの確認を行った後、ＨＰＬＣ／ＭＳに付し、蛍光標識タンパク質／ペプチドフラグメントの同定を行い、当該微量タンパク質／ペプチドの特定を行う方法に関するものである。尚、タンパク質／ペプチド試料が純度の高い場合には、第一段のＨＰＬＣ／蛍光検出による分離を省くことができる。本発明の方法は、従来法と異なり、蛍光標識可能なタンパク質／ペプチドのみを特異的に抽出し、検出・同定することができるという特徴を有し、微量の発現タンパク質／ペプチドを特定するために尤も相応しい方法である。
【０００９】
本発明では、被験試料として、生体から採取したあらゆる種類のタンパク質及び／又はペプチドを含む試料が対象とされる。本発明の方法では、被験試料中の微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、蛍光誘導体化するが、この場合、タンパク質／ペプチド水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、発現タンパク質／ペプチドを定量的に誘導体化することが重要である。即ち、本発明では、タンパク質／ペプチド試料の水溶液に、界面活性剤と場合によっては還元剤を添加し、これに官能基特異的蛍光試薬を加え、必要により、加温することにより、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する。本発明では、上記界面活性剤として、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両イオン性界面活性剤が用いられる。また、本発明では、上記還元剤として、好適には、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅが用いられるが、これらに制限されるものではなく、同効のものであれば同様に使用することができる。
【００１０】
本発明において、上記官能基特異的蛍光試薬として、（例えば、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−Ｆ）、  ５−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＤＮＳ−ＣＬ）、Ｏｒｔｈｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ（ＯＰＡ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、  ９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ  （ＦＭＯＣ）等のアミノ基特異的蛍光試薬、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡｃＡＢＤ−Ｆ）、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＴｃＡｃＡＢＤ−Ｆ）、ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ等のチオール基特異的蛍光試薬、４−Ｎｉｔｒｏ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＰＺ）、４−Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＢＤ−ＰＺ）と縮合剤との組み合わせによるカルボキシル基特異的蛍光試薬、又は、４−（Ｎ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｙｌｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＣＯＣＬ）等の水酸基用蛍光試薬）が例示されるが、これらに制限されない。
【００１１】
本発明においては、必要により、加温する（例えば、３０−１００℃、望ましくは４０−７０℃で１０−３００分間、望ましくは６０−１８０分間）ことにより、タンパク質／ペプチドを蛍光標識する。その後、反応液のほぼ全量を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、又は逆相分配ＨＰＬＣ、又はゲル濾過ＨＰＬＣに付し、蛍光をモニターしながらピーク分画を分取する。この場合、蛍光検出は、標識蛍光体の励起・蛍光波長に相当する波長に設定して行う。例えば、ＮＢＤ−Ｆ、又はＳＢＤ−Ｆで標識した場合には、励起波長４８０ｎｍ或いは３８０ｎｍ、励起波長５２０ｎｍ又は５０５ｎｍに設定する。イオン交換ＨＰＬＣの場合には、塩、例えば、食塩、硫酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、酢酸アンモニウムなど、望ましくは酢酸アンモニウムのような揮発性の塩を段階的に増量し、それぞれの画分を得る。この画分そのもの又はこの画分を濃縮・乾固した試料を、酵素水解に付す。酵素としては、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンなど、適宜のタンパク質分解酵素が用いられる。この際、酵素カラムを接続してオンラインで酵素水解を行うこともできる。
【００１２】
この溶液の一部を蛍光検出器付き逆相分配ＨＰＬＣに付し、蛍光標識体の溶出位置を確認する。次いで、この逆相ＨＰＬＣカラムの出口を質量分析計（どの様な質量分析計でも対応可能であるが、望ましくはエレクトロスプレー型質量分析計を用いる）に接続し、酵素水解物の蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析（蛍光標識フラグメントは一回の質量分析、蛍光非標識フラグメントは親イオンを更に質量分析する）又は質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。この際、蛍光検出器と質量分析計を直列に接続することも可能である。このようにして得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターに接続したタンパク質／ペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析することにより、酵素水解以前のタンパク質／ペプチドの同定を行う。この場合、本発明では、タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合を行う。
【００１３】
本発明では、発現タンパク質及び／又はペプチドを含む被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化し、この蛍光誘導体をＨＰＬＣ／蛍光検出で分離し、蛍光ピークの強さを比較して標的発現タンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を分離し、得られた標的発現タンパク質及び／又はペプチドのピーク画分を酵素分解し、次いで、質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析、データベース照合、構造解析により、上記タンパク質及び／又はペプチドを同定する。タンパク質及び／又はペプチドのアミノ基、チオール基、水酸基及びカルボキシル基などの機能性部分を誘導化するための多くの蛍光試薬が存在するので、本発明では、その目的に応じて、適当な試薬を任意に選択して使用することができる。後記する実施例に示されるように、例えば、Ｃｙｓ−含有タンパク質を誘導化するためには、チオール基に特異的な試薬である、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）を使用することができる。図１に、本発明の方法のプロセスの一例を模式的に示す。後記する実施例に示されるように、実際、このようにして、ラットに１０ｍｇのデキサメタゾンを投与して２日後のランゲルハンス島におけるＰａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、プロインシュリン  ２、７８ＫＤ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、プロテイン結合フォスファチジルアミン及びチオレドキシンが強く誘導されたことが示された。
【００１４】
本発明の方法で重要な点は、各組織におけるタンパク質の量は、ＨＰＬＣ／蛍光検出で分離する前に、例えば、正常組織と非正常組織との組織間で定量、比較されるべきであることから、標的発現タンパク質を定量的に誘導体化することである。そのために、本発明では、適宜の界面活性剤が用いられるが、例えば、いくつかの界面活性剤についてＢＳＡにより検討したところ、ＣＨＡＰＳがｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと比べて高い強度を示した（図２参照）。本発明では、ｐＨ、温度、反応時間及び誘導体化反応の添加剤等について、標的発現タンパク質及び／又はペプチドに応じて、最適条件を設定することで定量的な蛍光誘導体化が可能である。本発明では、これらの条件は、発現タンパク質／ペプチドの種類、分析目的等に応じて、適宜設定することができる。本発明の方法により、試験タンパク質／ペプチドのクロマトグラムは単一の蛍光ピークを示した（図３参照）。本発明の方法において、タンパク質及び／又はペプチドの検出限界は、０．２−６．０ｆｍｏｌであり、最適条件下での１０−１０００ｆｍｏｌの範囲で良好な直線（γ＞０．９９９４）の測定曲線が得られ（表１参照）、検出性能は、従来法に比べて、顕著であることが分かる。表１に、蛍光検出／ＨＰＬＣによる各種タンパク質及び／又はペプチドの検出限界を示した。
【００１５】
【表１】
2005017264.tif 000006
【００１６】
更に、本発明では、上記方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムとして、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含む上記検出・分離・同定システムが用いられる。この場合、上記第一反応器、２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置することができる。これらの装置は、その使用目的に応じて、適宜の容量、形態に任意に設計することができる。
【００１７】
本発明は、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、前記一般式（１）〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但し、Ｒ′はＮ置換アルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は前記一般式（２）（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、を用いて、蛍光誘導体とすることができる。更に、本発明は、これらの化合物のいずれか１種を有効成分とする新規蛍光誘導体化試薬を提供することができる。
【００１８】
これらの化合物の具体例としては、好適には、例えば、以下の例があげられるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等ないし類似の化合物であれば同様に使用することができる。本発明の化合物は、後記する実施例に具体的に記載した方法と同様にして容易に合成することができる。
（１）ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-chloro-2,
1, 3-benzoxadiazole]
（２）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ（7-chloro-2,
1, 3-benzoxadiazole-4-sulfonylaminoethyl rimethylammonium
chloride）
（３）ＤＡＡＢＤ−Ｆ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-fluoro-2,
1, 3-benzoxadiazole]
（４）ＴＡＡＢＤ−Ｆ（7-fluoro-2,
1, 3-benzoxadiazole-4-sulfonylaminoethyl trimethylammonium
chloride）
（５）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-chloro-2,
1, 3-benzoselenadiazole]
（６）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ（7-chloro-2,
1, 3-benzoselenadiazole-4-sulfonylaminoethyl trimethylammonium
chloride）
（７）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-fluoro-2,
1, 3- benzoselenadiazole]
（８）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（7-fluoro-2,
1, 3-benzoselenadiazole-4-sulfonylaminoethyl trimethylammonium
chloride）
（９）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-chloro-2,
1, 3-benzothiadiazole]
（１０）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ（7-chloro-2,
1, 3-benzothiadiazole-4-sulfonylaminoethyl trimethylammonium
chloride）
（１１）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｆ[4-(dimethylaminoethyl aminosulfonyl)-7-fluoro-2,
1, 3-benzothiadiazole]
（１２）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｆ（7-fluoro-2,
1, 3-benzothiadiazole-4-sulfonylaminoethyl trimethylammonium
chloride）
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、１）遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる、２）本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる、３）また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる、４）本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である、という効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
ラット膵ランゲルハンス島（ラ島）中チオール含有タンパク質／ペプチドの分離・同定（１）ラ島中チオール含有タンパク質／ペプチドの蛍光誘導体化
ラ島に０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した６Ｍ塩酸グアニジン溶液５０μｌを加えて可溶化した。これに６Ｍ塩酸グアニジン溶液に溶解した１７．５ｍＭＴＣＥＰ、１７．５ｍＭＳＢＤ−Ｆ、１０ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭＣＨＡＰＳをそれぞれ５０μｌずつ加え、混合した。この溶液を４０℃にて３時間反応させることにより蛍光誘導体化を行った。
（２）イオン交換ＨＰＬＣによる１次分離
上記の反応溶液をイオン交換カラムに付し、ＮａＣｌのグラジエント（０、０．０４、０．０８、０．１２及び０．３Ｍ）により蛍光タンパク質／ペプチドを溶出させ、５つのフラクションに分離した。なお、蛍光タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光により行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００２２】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ  ７．５×７５ｍｍ（東ソー（株））
ガードカラム：Ｃ８−３００−Ｓ  ５４．０×１０ｍｍ（ＹＭＣ（株））
移動相：段階溶離〔０−５分：Ｃ１００％、５−１５分：Ａ１００％、１５−２５分：Ａ８７％Ｂ１３％、２５−３５分Ａ７３％Ｂ２７％、３５−４５分：Ａ６０％Ｂ４０％、４５−５５分：Ｂ１００％〕
Ａ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）
Ｂ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）                                    （０．３ＭＮａＣｌ含有）
Ｃ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
カラム温度：室温（約２５℃））
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、 Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：２００μｌ
【００２３】
（３）逆相ＨＰＬＣによる２次分離
上記の各画分を濃縮し、アセトニトリルを蒸発させた後、逆相カラムに付し、アセトニトリルの勾配溶離によりタンパク質／ペプチドをカラムから溶出させた。なお、タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光によりモニターした。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００２４】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：カプセルパックＣ８  ＳＧ３００  ２．０×１００ｍｍ（（株）資生堂）
移動相：勾配溶離（０→６０分：Ｂ４０％→１００％）
Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸
Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（４０：６０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、 Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：５０μｌ
【００２５】
（４）酵素処理
採取した画分をそれぞれのチューブに０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液５μｌを加えてトリフルオロ酢酸を中和後、濃縮してアセトニトリルを蒸発させた。残渣（約８０μｌ）に２０μｇ／ｍｌトリプシン（プロメガ）及び１０ｍＭ塩化カルシウムをそれぞれ１０μｌずつ添加した。これを３７℃で２時間インキュベートし、ＭＳ／ＭＳ測定用の試料とした。
【００２６】
（５）ＭＳ／ＭＳ測定によるタンパク質／ペプチドの同定
上記の試料を逆相カラムＨＰＬＣに付し、エレクトロスプレー法によるＭＳ／ＭＳ測定を行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。なお、タンパク質／ペプチドの同定はデータベースにＮＣＢＩ、サーチエンジンにＭＡＳＣＯＴを使用した。
【００２７】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＴＣ−Ｃ１８  ２．０  ×１００ｍｍ（Ｉｍｔａｃｔ（株））
移動相：勾配溶離（０→３０分：Ｂ２０％→１００％）
Ａ：０．１％ギ酸
Ｂ：０．１％ギ酸／アセトニトリル（５０：５０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：５００−３０００ｍ／ｚ
注入量：５０μｌ
【００２８】
上記の方法により、約１３０のタンパク質／ペプチドのピークが分離できた。
そのうち、約５０のタンパク質／ペプチドが同定できた（表２、図６参照）。
【００２９】
【表２】
2005017264.tif 000007
【実施例２】
【００３０】
ＳＢＤ−Ｆで誘導体化したＢＳＡを、図１に示されるプロセスにより、トリプシンで酵素水解し、得られたペプチド混合物を逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）で分離し、蛍光検出器で検出した。次いで、各ペプチドをＥＳＩイオンタップ質量分析計によるＭＳ／ＭＳ分析に供した。原理的には、トリプシン分解により、ＢＳＡは、４個のアミノ酸残基以上の２５のシステイン含有ペプチド及
び３５のシステイン非含有ペプチドが生成されるが、本実施例では、２７以上の蛍光ペプチドが蛍光検出され、定量的に誘導体化が行われた（図４、Ａ）。
【００３１】
また、１１のシステイン含有ペプチド及び１７の非システイン含有ペプチドがマスクロマトグラフィーで検出された（図４、Ｂ）。  図５に、（Ｍ＋２Ｈ）2+プレカーサー、ｍ／ｚ＝８７３．４（図４で矢印で示した）から得たＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
全てのペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルにより、確率的プロテイン同定法に基づくＭＡＳＣＯＴによるデータベース照合を行い、予測通り、完全にＢＳＡとしてタンパク質を同定した（スコア：３９）。
【実施例３】
【００３２】
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）投与及び非投与のラット膵臓について試験した。
Ｄｅｘは、肝臓のグルコース産生の増加とインシュリン耐性の誘導により主なヒト糖尿病であるタイプ２の糖尿病を誘発する。実際に、Ｄｅｘ処理の２４時間後に、血中グルコースレベルは２０９．８ｍｇ／ｄＬに達し、処理前の値の１１８．３ｍｇ／ｄＬより著しく高い（ｐ＜０．０５）。本実施例では、２日間Ｄｅｘで処理又は未処理のラット膵臓からランゲルハンス島（６０島）を採取し、Ｓ
ＢＤ−Ｆで誘導体化した。本発明の方法を生物試料に適用するための重要な態様は、タンパク質混合物からＨＰＬＣで発現タンパク質を分離することである。本実施例では、蛍光タンパク質は、まず、ＳＢＤ−Ｆにより生成した多くのマイナス電荷と酸性アミノ酸部分に基づいてイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）で分離された。
【００３３】
ＩＥＣは、塩化ナトリウムの段階溶離（０、０．０４、０．０８、０．１２、及び０．３Ｍ  ＮａＣｌ）により行い、蛍光タンパク質混合物を５つの画分として得た。次いで、各画分は、更に、それらの疎水性に基づいて、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）により分離された。この実験でのピークの容量（ｎ＝Ｌ／（４σ）、但し、Ｌは分析のトータル時間及び４σはピーク幅、としてのＨＰＬＣの性能の理論値）は、各ＲＰＬＣフラクションにつき４０と計算され、ＩＥＣ−ＲＰＬＣ法の５つのステップのピーク容量は、約２００であった。本実施例では、各ＲＰＬＣサイクルで約３−５０ピーク、合計で１２９ピークであった（図６）。
【００３４】
微量タンパク質を検出するために、ＩＥＣの段階溶離ステップを増やしてピーク容量を増加させた。未処理及びＤｅｘ処理ラットから得られたＲＰＬＣクロマトグラムの全ての蛍光ピークを比較した。その結果、５本の蛍光ピークが１．８以上増加し、３本の蛍光ピークがＤｅｘ処理で約１．５倍減少したことが見出された（表２）。表２に、Ｄｅｘ投与２日後の発現タンパク質の変化を示した。これらのタンパク質（即ち、標的発現タンパク質）は、広い小孔を有するＲＰＬＣ（３０ｎｍ小孔径）で分離され、トリプシンで分解し、各ペプチド混合物とした。各ペプチド混合物は、通常の小孔を有するＲＰＬＣ（１０ｎｍ小孔径）に供し、ＭＳ／ＭＳ分析した。データベース照合により、Ｄｅｘ処理後２日で増加したピークは、各々、膵臓ポリペプチド、プロインシュリン２、７８ＫＤグルコース−調節タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、及びチオレドキシンであり、減少したピークは、各々、プロテイン３１、ｄｎａｋ−タイプ分子キャペロンｈｓｐ７２−ｐｓｌ、及びインシュリンであった。
【実施例４】
【００３５】
本実施例では、以下の化９の（１）及び（２）の反応式により、新規蛍光誘導体化試薬の合成を行った。
【００３６】
【化９】
2005017264.tif 000008
【００３７】
（１）DAAB-Clの合成
4-chlorosulfonyl-7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole(CBD-Cl)(126.53 mg)をCH3CN に溶解し、N,N-dimethylethylenediamineを滴下し、triethylamineを加えた。室温で約10分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、シリカゲルカラム(CH2Cl2)で精製し、4-(dimethylaminoethy laminosulfonyl)-7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole(DAABD-Cl) （20.2 mg, 87.4
%)を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
1H-NMR (CD3OD) : 7.94 (1H, d,
J=7.5), 7.65 (1H, d, J=7.5), 3.06 (2H, t, J=6.7), 2.30 (2H, t, J=6.7), 2.02
(6H, s)。ESI-MS : m/z 305 (M+H)+
【００３８】
（２）TAABD-Clの合成
4-chlorosulfonyl-7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole(CBD-Cl)(126.53 mg)をCH3CN に溶解し、H2Oに溶かした aminoethyl trimethylammonium chlorideを滴下し、triethylamineを加えた。室温で約20分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、0.1%トリフルオロ酢酸（TFA）に溶かし、ODSカラムを用いて分取し、画分には、SBD-Cl (化１０)が不純物として入っていたため、陰イオン交換カラムを用いて分取し、減圧乾固して、7-chloro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfoneaminoethyl trimethylammonium chloride (TAABD-Cl)
(127.2 mg, 58.8 %)を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
1H-NMR (CD3OD) : 8.01 (1H, d,
J=7.3), 7.69 (1H, d, J=7.3), 3.46-3.48 (4H, m), 3.12 (9H, s)。ESI-MS : m/z 319 (M)+
【００３９】
【化１０】
2005017264.tif 000009
【実施例５】
【００４０】
本実施例では、新規蛍光誘導体化試薬の反応性について検討した。
DAABD-C、TAABDD-ClのSBD-Fとの比較
１０μＭ還元型グルタチオン、システイン、ホモシステイン混合液100μＬとDAABD-Cl又はTAABD-Cl 100 μLを混合し、pH 9、40℃、10〜120分間反応させた。尚、各試薬は5 ｍM EDTA含む0.10 M ホウ酸緩衝液 (pH 9) に溶解した。0.1 % ぎ酸で反応停止後、生成物をＨＰＬＣを用いて測定した。
【００４１】
図７に、蛍光誘導体化反応時間と蛍光強度との関係（左図： DAABD-Cl、右図： TAABD-Cl）を示す。
SBD-F（化１１）の場合、40℃で誘導体化を行うと120分間の反応時間が必要であったが、DAABD-Clは10〜20分、TAABD-Clは20〜30分で反応が終了することがわかった。
したがって、反応時間はDAABD-Clの場合は20分、TAABD-Clの場合は30分が好適である。
【００４２】
【化１１】
2005017264.tif 000010
【００４３】
（２）新規蛍光誘導体化試薬のMSでの感度
上記（1）で作成したサンプルをLC-MSにより検出し、蛍光誘導体化試薬でラベル化していないもの及びSBD-Fで誘導体化したものと、相対強度を比較した。
【００４４】
蛍光誘導体化試薬でラベル化していないcysteine、homocysteine、GSHの高さをそれぞれ１としたときの相対強度は表3の通りであった。これより、DAABD-Cl がMSでの感度が最も高いことがわかった。また、移動相が酸性であるので、DAABD化誘導体はプラスに荷電され水溶性であると考えられる。
【００４５】
【表３】
2005017264.tif 000011
【実施例６】
【００４６】
（１）TAABD-Clのペプチドへの応用
10μMの以下に示した4種類のペプチド標品、17.5 mM TAABD-Cl、10 mM EDTA、50 mM CHAPS（界面活性剤）、2.5 mM TCEP（還元剤）それぞれ50μLを混合し、pH 9、40℃で、30, 60, 90, 120 分間反応させた。尚、各試薬は6.0
M 塩酸グアニジン（タンパク変性剤）を含む0.10
M ホウ酸緩衝液 (pH9) に溶解した。生成したTAABD化ペプチドをHPLCを用いて測定した。
1. vasopressin
2. oxytocin 
3. somatostatin
4. amylin (rat)
図８に TAABD-Clとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
図８より、反応時間が60分までは生成量が増加した。反応停止後は氷冷下で保存し、-20℃にて保存すると、48時間はほとんど分解しなかった。
【００４７】
（２）DAABD化ペプチド・タンパクの検出限界
表４に示した１０種類のペプチド・タンパク標品10
μM混合液、2.5 mM TCEP、17.5 mM DAABD-Cl、10 mM EDTA、50 mM CHAPSそれぞれ50μＬを混合し、pH 9、４０℃で、30分間反応させた。尚、各試薬は6.0
M 塩酸グアニジンを含む0.10 M ホウ酸緩衝液 (pH9) に溶解した。生成したDAABD化ペプチド・タンパクはHPLCを用いて測定し、蛍光検出の検出限界をSBD-Fと比較した。
【００４８】
【表４】
2005017264.tif 000012
【００４９】
（３）DAABD化ペプチド・タンパクの同定
上記（２）で誘導体化した物質のうち、vasopressin、oxytocin、somatostatin、calcitonin、amylinはLC-MSにより同定できた。それらの分子量を以下に示す。
m/z 
541.8 (M+3H)3+ [DAABD-vasopressin]
516.0 (M+3H)3+
[DAABD-oxytocin]
726.6 (M+3H)3+
[DAABD-somatostatin]
989.9 (M+4H)4+
[DAABD-calcitonin]
892.8 (M+5H)5+
[DAABD-amylin]
【００５０】
これら全ての分子量は、それぞれのペプチドの２つのシステイン残基にDAABDが付加したとしたときの分子量であり、多価イオンピークの検出結果よりDAABD-Clによる誘導体化において、これらのペプチドのシステイン残基間のS-S結合が還元され、二つのチオール基両方に試薬が反応したことがわかった。
また、タンパク質の場合は酵素によってペプチドに分解する必要があるため、酵素トリプシンで消化し、LC-MS/MS検出及びMASCOTによるデータベース検索を行って同定を試みた結果、システインを含まないペプチドのアミノ酸配列を同定し、タンパク質を同定することができた。
【実施例７】
【００５１】
（ＳＢＳｅＤ−Ｆの合成）
2-fluoroacetanilideを硝酸で処理して、1-acetylamino-2-nitro-6-fluorobenzeneとし、これを脱アルミ化して、2-fluoro-6-nitroanillineとし、次いで、パラジウム担持炭素触媒を用いて水素化して、3-fluoro-o-phenylenediamineを得た。
Selenium dioxideエタノール加熱溶液を、3-fluoro-o-phenylenediamine (60 mg,
0.48 mmol)のエタノール加熱溶液に加え、混合物を３０分加熱した。これを、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のジクロロメタンで溶出し、4-fluoro-2, 1, 3-benzoselenadiazoleを白色粉末（８８mg）として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
mp. 129℃、NMR (methanol-d4): δＨ７．５５（１H, d, J=9.2）、７．４１(１Ｈ,  ｍ）、７．０６（１Ｈ,  ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２０２．８［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００５２】
このようにして得た4-fluoro-2, 1,
3-benzoselenadiazoleをfuming sulfuric
acid (60%)に溶かし、１３０℃で３時間還流した。この溶液を冷却し、冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％  ammonium hydroxideで中和した。この中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、濾過物を減圧乾固させた。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶解し、更に、以下のＨＰＬＣで精製した。即ち、残渣の１００μｌをＨＰＬＣ分離に供した。ＳＢＳｅＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧して白色粉末（５０ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｍ．P． > 300℃、NMR (methanol-d4): δＨ７．９７（１H, d d,  J=７．６,  J=５．４）、７．１１(１Ｈ,  d d，J=７．６,  J=１０．１）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２８０．８［（Ｍ−Ｈ）］。
【実施例８】
【００５３】
（ＳＢＴｈＤ−Ｆの合成）
Ｎ−thionylaniline (0.49 g, 3.5 mmol)を3-fluoro-o-phenylenediamine（200mg, 1.6mmol）トルエン（2 ml）溶液に加えた。反応混合物を１００−１２０℃で４時間加熱し、溶媒を濾別した後、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％ＨＣｌ溶液及び水で各々洗浄した。有機相を乾燥し、減圧乾固させた。これをシリカゲルによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のクロロホルムで溶出し、4-fluoro-2, 1, 3-benzothiadiazoleを淡黄色油として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
NMR(methanol-d4): δH７．６９（１H, d, J=８．９）、７．５０(１Ｈ,  ｍ）、７．２０（１Ｈ，ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１５４．９［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００５４】
このようにして得た4-fluoro-2, 1,
3-benzothiadiazole（３０ml）をfuming sulfuric acid (60%)に溶かし、１３０℃で３時間還流した。次いで、この溶液を冷却し、ゆっくり冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％  ammonium hydroxideで中和した。中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、得られた濾過物を減圧乾固した。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶かし、更に、以下の条件でＨＰＬＣで精製した。ＳＢＴｈＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧し、白色粉末（２５ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
decomp. 
265℃、NMR (methanol-d4):
δＨ８．０６（１H,   d d，  J=７．９,  J=４．９）、７．１１(１Ｈ,  d d，J=７．９,  J=９．８）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２３２．８［（Ｍ−Ｈ）］。
上記方法により合成したＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを下記の化１２に示す。
【００５５】
【化１２】
2005017264.tif 000013
【実施例９】
【００５６】
（１） システイン誘導体の蛍光スペクトル
１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）による上記ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆの各蛍光試薬溶液（４ｍＭ）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）によるシステイン（０．４ｍＭ）溶液の同量と混合した。この混合物を６０℃で８時間放置した。反応の後、反応混合物をＨＰＬＣ分離し、各システイン誘導体に相当するフラクションを集め、それらの蛍光スペクトルを測定した。
【００５７】
ＳＢＳｅＤ−ＦとＳＢＴｈＤ−Ｆのシステインに対する反応性
４ｍＭの各試薬、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）によるシステイン溶液（０．４ｍＭ）の同量と混合した。反応混合物をＨＰＬＣ分離し、６０℃での反応をモニターした。
【００５８】
（２）  結果
ＳＢＤ−Ｆのような水溶性試薬は、そのｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ残渣により水溶体中での誘導体の可溶性を増加させ、結果として、誘導体の吸収又は沈殿が減少する。したがって、インシュリンのような比較的疎水性ペプチドのＳＢＤ−Ｆによる誘導体は、逆相カラムで溶出され、高感度に検出されたが、本実施例では、更に、ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ又はｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ骨格をもつ蛍光試薬としてＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを合成し、それらのシステインに対する反応性及びその誘導体の蛍光特性を調べた。
【００５９】
最大励起（λｅｘ）及び発光波長（λｅｘ）、及び誘導体のリテンションタイムを表５に示す。各システイン誘導体のｍａｓｓ  ｎｕｍｂｅｒ（[Ｍ＋Ｈ]）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３８１．９）、ＳＢＴｈＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３３４．０）及びＳＢＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３１８．０）について、理論値（各々３８２．０、３３４．０及び３１８．０）と一致した。誘導体の最大励起波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（３４０ｎｍ）及びＳＢＴｈＤ−Ｆ（３１５ｎｍ）はＳＢＤ−Ｆ（３６５ｎｍ）より短く、誘導体の最大発光波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５４２ｎｍ）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５１７ｎｍ）及びＳＢＤ−Ｆ（５１４ｎｍ）よりも長かった。ＳＢＳｅＤ−Ｆ自体は蛍光が少ないが、ＳＢＴｈＤ−Ｆは多少の蛍光を与えた（λｅｘ  ；３５０ｎｍ，λｅｍ：４２４ｎｍ）。ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ及びＳＢＤ−Ｆのシステイン誘導体の逆相カラム（Ｃ１８）に対するｐＨ２．０の移動相によるリテンションタイム（ｔｐ）は、各々４．５、５．３及び４．８分であった。これから、ＳＢＳｅＤ−Ｆは、これらの中で最も親水性の蛍光試薬であった。
【００６０】
ＳＢＤ−Ｆの場合、至適反応条件は６０℃でｐＨ９．５で１時間であるが、ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆの反応性は、ＳＢＤ−Ｆと比べて低く、蛍光強度は８−２４時間で徐々に増加し（図９、１０）、２４時間後でも、反応は最大に達しなかった(図９)。ｐＨ１０．０及び６０℃では、ＳＢＳｅＤ−Ｆ又はＳＢＴｈＤ−Ｆとシステインの量的反応時間は、８時間以上であり、ＳＢＤ−Ｆでは、１時間以内で完全に反応した（図１０）。
このように、水溶性の蛍光試薬ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆは、ＳＢＤ−Ｆと比べて蛍光特性及び疎水性の点で異なっており、プロテオーム解析のための新規蛍光誘導体化試薬として有用である。
【実施例１０】
【００６１】
ＤＡＡＢＤ−ＣｌによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質の誘導体化及び同定
（１）方法
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｎ２株）を、Ｅ．ｃｏｌｉのＯＰ５０株を栄養源として２０℃で、ＮＧＭ寒天上に培養し、Ｍ９バッファーにより浮遊させてバクテリアから分離した。上記線虫をＭ９バッファーで２回洗った後、−８０℃で保管して用いた。この線虫を等量の１０ｍＭ  ＣＨＡＰＳに懸濁し、超音波で溶解した。可溶性のフラクションを４℃で１０，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集めた。上澄を可溶性フラクションとして−２０℃で保管した。このフラクションのタンパク質濃度をＢＳＡを標準に用いるＢｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄで決定した。上澄の約２０μＬ（１００μｇタンパク質）を同容量の２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ，１７．５ｍＭ  ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2 ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ  ＣＨＡＰＳを６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸塩バッファー（ｐＨ９．０）中で混合した。反応混合物を４０℃で３０分インキュベートした後、反応を２００μＬの０．１％ギ酸で停止し、次いで、反応混合物（１０μｇタンパク質）の３０μＬをＨＰＬＣシステムに注入した。
【００６２】
ＲＰカラムがＰＲＯＴＥＩＮ（３０ｎｍポアサイズ、２５０×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．）（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相が溶離液（Ａ）０．１％トリフルオロ酢酸及び溶離液（Ｂ）水／ＣＨ3 ＣＮ／トリフルオロ酢酸（７０／３０／０．１）、グラジエントシステムが流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで１００分以上の３０から７０％Ｂの条件でＨＰＬＣを行った。蛍光検出は５０８nm、励起波長は３８７nmで行った。同定のために、蛍光タンパク質誘導体のいくつかのピークフラクションを分離し、減圧下に１０μＬに濃縮した。各フラクションは、２μｇ／ｍＬトリプシン及び１．０ｍＭ塩化カルシウムを含む９０μＬの５．０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．８）で希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。各タンパク質加水分解ペプチド混合物を直接ＥＳＩイオントラップ質量分析装置を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。クロマトグラフィーは、ＨＰ１０９０シリーズIIシステム及びＣａｄｅｎｚａ  ＴＣ−１８  ｃｏｌｕｍｎ（１２ｎｍポーラスシリカ、１００×２．０ｍｍ  ｉ．ｄ．）のカラムを用いて実施した。移動相は溶離液（Ａ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム及び溶離液（Ｂ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム／ＣＨ3 ＣＮ（５０／５０）とした。グラジエント溶出は、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで６０分以上の０から１００％で行った。タンパク質の同定は、システインのチオール残基に結合したＤＡＡＢＤを記憶するＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，Ｕ．Ｋ．）データベースサーチアルゴリズムを有するＮＣＢＩｎｒデータベースを用いて実施した。
【００６３】
（２）結果
図１１は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの可溶性フラクションから得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。本実施例では、タンパク質の分離、トリプシンによる加水分解及び任意に選択されたピークフラクションのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定により、１０種類のタンパク質が同定された。
図中、１はリボゾームタンパク質Ｓ３ａ（ＭＷ＝２８９４２）、２はカルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）前駆体（ＭＷ＝４５５８８）、３はリボゾームタンパク質Ｌ１（ＭＷ＝３８６３５）、４は伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１−アルファ（ＭＷ＝５０６３６）、５はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＷ＝３５０９８）、６は４０Ｓリボゾームタンパク質（ＭＷ＝２２０４４）、７はビテロゲニン（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）（ＭＷ＝１９３０９８）、８はアルギニンキナーゼ（ＭＷ＝４１９６９）、９はＨＳＰ−１熱ショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）７０ｋｄタンパク質Ａ（ＭＷ＝６９６８０）及び１０はリボゾームタンパク質Ｌ７Ａｅ（ＭＷ＝１３９９２）を示す。本実施例では、任意に選択された１０種類のタンパク質が同定されたが、本発明では、同様にして、他のタンパク質の同定をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上詳述したように、本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法及びそのシステムに係るものであり、本発明により、遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる。本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる。また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる。本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の方法の操作工程の一例を示す。
【図２】界面活性剤の種類と蛍光誘導体の生成の度合いとの関係を示す。
【図３】本発明の方法により試験した蛍光誘導体タンパク質／ペプチドのそれぞれの蛍光ピークを示す。
【図４】酵素水解物の蛍光クロマトグラム（Ａ）、及びマスクロマトグラム（Ｂ）を示す。
【図５】ＭＳ／ＭＳによるマススペクトルを示す。
【図６】実施例３における逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるクロマトグラムを示す。
【図７】蛍光誘導体化の反応時間と蛍光強度との関係を示す（左図：ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ，右図：ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）。
【図８】ＴＡＡＢＤ−Ｃｌとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
【図９】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ９．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１０】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ１０．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１１】ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、線虫（C.elegans）の可溶性フラクションが得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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