(57)【要約】      （修正有）【課題】  洗剤酵素として有用なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することを提供する。【解決手段】  自然界から分離されたバチルスエスピーに由来する、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１から４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号５〜８に示す塩基配列からなるアルカリセルラーゼ遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼ、それらをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは植物細胞壁の主成分であり、衣料、紙、建築材料などに有効利用されるバイオマスの代表的存在である。またバイオマスの有効的な利用方法としてセルロースを分解する酵素を用い糖類や更にエネルギー物質に変換しようとする試みが以前から行われている。従ってセルラーゼに関する研究は世界中の研究機関において多岐にわたり行われている。これらの研究対象となるセルラーゼは、一般的に中酸性に最適反応ｐＨを有し、結晶性セルロースを良好に分解できる真菌類や嫌気性細菌由来の酵素が中心となっている。  
【０００３】
一方、掘越によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出されて以来（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）、困難とされていたセルラーゼの衣料用重質洗剤への応用が可能となり、好アルカリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ（例えば、特許文献２〜４参照）が衣料用洗剤へ配合されるに至った。しかし、これらのアルカリセルラーゼは、結晶性セルロースを殆ど分解しない、所謂エンドグルカナーゼであることが判っている。洗剤用酵素の重要な要素として繊維を分解しない即ち繊維を傷めずに汚れを落とす、又は促進する働きが挙げられるが、これらの酵素はその意味で非常に有用なアルカリセルラーゼといえる。一方で衣類は何回も洗浄を繰返すことで毛羽立ちが生じたり、色褪せが起こる。このような現象を防止するには結晶性セルロース分解活性を有し、且つアルカリ性領域で作用するセルラーゼが望まれていることも事実である。
【０００４】
更に近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになってきている。アルカリセルラーゼについても例外ではなく既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある。
【０００５】
本発明は、洗剤用酵素として有用なアルカリセルラーゼを見出し、それをコードする遺伝子の取得並びにその遺伝子を用いた大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製造する方法を確立することを目的とする。
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【非特許文献１】Horikoshi & Akiba, Alkalophilic Microorganisms, Springer, Berlin (1982）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、自然界からアルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、更に当該微生物からアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１から４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質、
当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いれば、衣料用洗剤、繊維処理剤として有用なアルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリセルラーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１から４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリセルラーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
ここで、配列番号１から４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリセルラーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１１】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、自然界から取得すること以外にも部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラバイオ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００１２】
本発明の配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｅｇｌ−１４５と表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列とその同一性を比較すると、Paenibacillus lautus NCIMB 40250株が生産するエンドセルラーゼ３ａ（ＷＯ９１／１０７３２）との同一性が最も高く、８０．３％であり、次いでErwinia carotovora SCRI193株の生産するエンドグルカナ−ゼ（ＣｅｌＶ：Cooper & Salmond, Mol. Gen. Genet., 241, 341-350, 1993）との同一性は、４８．９％、Bacillus licheniformis GXN151株由来のセルラーゼ（ＣＥＬ５Ａ：ＥＭＢＬ登録番号、ＡＹ２９１５８３）との同一性は４５．８％であった。
【００１３】
次に、配列番号２に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｅｇｌ−６５９と表記する）のアミノ酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列とその同一性を比較するとＥｇｌ−１４５の場合と同様に、Paenibacillus lautus NCIMB 40250株が生産するエンドセルラーゼ３ａとの同一性が最も高く、７４．４％であり、次いでErwinia carotovora SCRI193株の生産するＣｅｌＶとの同一性は、４８．７％、Bacillus licheniformis GXN151株由来のＣＥＬ５Ａとの同一性は４６．０％であった。
【００１４】
配列番号３に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｅｇｌ−１１５と表記する）並びに配列番号４に示すアルカリセルラーゼ（以下、Ｅｇｌ−４４０と表記する）のアミノ酸配列と公知のセルラーゼのアミノ酸配列との同一性を比較すると、上記と同様にいずれもエンドセルラーゼ３ａとの同一性が最も高く、８０％であり、次いでＣｅｌＶとの同一性は、４９％、ＣＥＬ５Ａとの同一性は４６％であった。
【００１５】
また、Ｅｇｌ−１４５は、Ｅｇｌ−６５９、Ｅｇｌ−１１５及びＥｇｌ−４４０とそれぞれ９９．７％、９９．３％、９２．０％の同一性を示し、お互いのセルラーゼは非常に高い同一性を示した。このようにＥｇｌ−１４５、Ｅｇｌ−６５９、Ｅｇｌ−１１５及びＥｇｌ−４４０は従来公知のセルラーゼの中においてPaenibacillus lautus NCIMB 40250株が生産するエンドセルラーゼ３ａとの同一性は比較的高いものの、他のセルラーゼとは極めて低い同一性を示す新規なアルカリセルラーゼであることが示唆される。
従って、配列番号１〜４に示したアミノ酸配列と相当する配列を適切にアライメントした時、最大８５％以上の同一性を有するセルラーゼは本発明に含まれる。本発明のアルカリセルラーゼは、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列における同一性として、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上であることが望ましい。
尚、ここで述べるアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を１として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、配列番号５〜８に示す塩基配列からなる遺伝子又は該塩基配列の１若しくは数個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有し、当該遺伝子と同一の機能を有する遺伝子であることが好ましい。
【００１７】
本発明のアルカリセルラーゼは、例えばバチルス属に属する微生物、好ましくはバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ６５９株、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１１５株及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ４４０株等を公知の方法により培養することで生産、取得することができる。また、その遺伝子を上記微生物の染色体ＤＮＡからショットガン法、ＰＣＲ法を用いクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産、取得することができる。
【００１８】
本発明遺伝子を用いてアルカリセルラーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリセルラーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリセルラーゼを採取すればよい。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。かくして得られた培養物中からのアルカリセルラーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１９】
本発明のアルカリセルラーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。即ち、分子量約６０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、カルボキシメチルセルロース分解における最適反応ｐＨ、結晶性セルロース分解における最適反応ｐＨを６〜８付近、最適温度を５５℃付近に有することが望ましい。
【００２０】
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、例えば下記の菌学的性質を有するバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５、Ｎ−６５９、Ｎ−１１５、Ｎ−４４０株等からクローン化することができる。
【００２１】
（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株の菌学的性質）
菌学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（１．０〜１．２×３．０〜５．０μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、２．０〜２．５×３．５〜４．０μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）オキシダ−ゼ：陽性
（ｇ）カタラーゼ：陽性
（ｈ）嫌気的生育：陽性
（ｉ）生育温度：２０〜５０℃
（ｊ）グルコースからのガス産生：陰性
【００２２】
尚、生理学的な性質については、ａｐｉ５０ＣＨ並びにａｐｉ２０Ｅ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を用いて検討した。その結果と上記の菌学的性質から、本菌はバチルス  サーキュランスに近縁であると判断された。
【００２３】
（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ６５９株の菌学的性質）
菌学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．９〜１．０×２．０〜２．５μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、０．９〜１．５×１．５〜２．０μｍ、中央準端、膨潤無し
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）オキシダ−ゼ：陽性
（ｇ）カタラーゼ：陽性
（ｈ）嫌気的生育：陽性
（ｉ）生育温度：２０〜４５℃
（ｊ）グルコースからのガス産生：陰性
【００２４】
尚、生理学的な性質については、ａｐｉ５０ＣＨ並びにａｐｉ２０Ｅを用いて検討した。その結果と上記の菌学的性質から、本菌はバチルス  コアギュランスに近縁であると判断された。
【００２５】
（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１１５株の菌学的性質）
菌学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．８〜１．０×２．０〜５．０μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、１．０〜１．２×１．８〜２．０μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）オキシダ−ゼ：陽性
（ｇ）カタラーゼ：陽性
（ｈ）嫌気的生育：陽性
（ｉ）生育温度：２０〜５０℃
（ｊ）グルコースからのガス産生：陰性
【００２６】
尚、生理学的な性質については、ａｐｉ５０ＣＨ並びにａｐｉ２０Ｅを用いて検討した。その結果と上記の菌学的性質から、本菌はバチルス  サーキュランスに近縁であると判断された。
【００２７】
（バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ４４０株の菌学的性質）
菌学的性質
（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．９〜１．１×３．０〜７．０μｍ）
（ｂ）多形性：無し
（ｃ）運動性：有り
（ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、１．０〜１．５×２．０〜２．５μｍ、準端、膨潤有り
（ｅ）グラム染色：陽性
（ｆ）オキシダ−ゼ：陽性
（ｇ）カタラーゼ：陽性
（ｈ）嫌気的生育：陽性
（ｉ）生育温度：２０〜５０℃
（ｊ）グルコースからのガス産生：陰性
【００２８】
尚、生理学的な性質については、ａｐｉ５０ＣＨ並びにａｐｉ２０Ｅを用いて検討した。その結果と上記の菌学的性質から、本菌はバチルス  サーキュランスに近縁であると判断された。
【００２９】
以上、ＫＳＭ−Ｎ１４５株、ＫＳＭ−Ｎ６５９株、ＫＳＭ−Ｎ１１５株、ＫＳＭ−Ｎ４４０株は既知のバチルス属細菌と完全には一致しないため新規なバチルス属細菌として各菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７)、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｎ６５９株(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０)、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｎ１１５株(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６)及びバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ４４０株(ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８)として寄託した。
【００３０】
上記の各菌株からのアルカリセルラーゼ遺伝子のクローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリセルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol. Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラ  バイオ）等が挙げられる。
【００３１】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがBacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌が挙げられる。
【００３２】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【実施例】
【００３３】
実施例１  アルカリセルラーゼ生産菌のスクリーニング
少量の日本各地の土壌サンプルを１０ｍＬの滅菌水に懸濁し、８０℃、１５分間熱処理した。室温で冷却した後、０．１ｍＬの上清を以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した［０．１％（ｗ／ｖ）トリプティケースソイブロス（ＢＢＬ）、０．１％酵母エキス（ディフコ）、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩、０．５％カルボキシメチルセルロース（Ｆ１０ＨＳ、日本製紙）、０．１％アルカリ膨潤セルロース（セルロースパウダーＫＣフロック  Ｗ−４００Ｇ、日本製紙）（別滅菌）、０．２５％（別滅菌）］。３０℃で７〜１０日間培養し、コロニーの周辺にハローを形成したものをアルカリセルラーゼ生産菌株として選択した。
【００３４】
実施例２  バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株のゲノムＤＮＡの調製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株の培養は、２．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（大日本製薬）、０．１％カルボキシセルロース（Ａ１０ＭＣ）、０．１％酵母エキス（ディフコ）、１．０％魚肉エキス（和光純薬）、０．１５％リン酸１カリウム、０．０３５％（ｖ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．３％炭酸ナトリウム（別滅菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２５ｒｐｍ）して行った。得られた培養液約３００ｍＬから遠心分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を回収した。この菌体からＧｅｎとるくん（タカラバイオ）によりゲノムＤＮＡを調製した。また、ＫＳＭ−Ｎ６５９株、ＫＳＭ−Ｎ１１５並びにＫＳＭ−Ｎ４４０株からのゲノムＤＮＡも同様に調製した。
【００３５】
実施例３  Ｅｇｌ−１４５、Ｅｇｌ−６５９、Ｅｇｌ−１１５及びＥｇｌ−４４０遺伝子のクローニング
実施例２で調製したバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株ゲノムＤＮＡ約２μｇを制限酵素Ｓａｕ３Ａ（ベーリンガーマンハイム）にて、３７℃、１０分間部分消化した後、７０℃、１０分間恒温して反応を停止させた。このうち５μＬを予め制限酵素ＢａｍＨＩ（ベーリンガーマンハイム）にて消化後、脱リン酸化したｐＵＣ１８（タカラバイオ）５０ｎｇと混合して８μＬとし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  キット  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）のＩ液  ８μＬを加えて１６℃、３０分間恒温してＤＮＡ連結反応を行った。反応液で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１．０％（ｗ／ｖ）カルボキシルメチルセルロース（関東化学）、０．００５％トリパンブルー（メルク）を含むＬＢ寒天培地に塗沫した。セルラーゼ生産によりハローを形成した形質転換体よりHight Pure Plasmid Purification キット（ベーリンガーマンハイム）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出されたプラスミドＤＮＡを鋳型に、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト近傍に相補的なＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ２及びＲＶ（タカラバイオ）を用い挿入された遺伝子の塩基配列を３７７ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ―アプライドバイオシステムズ）にて決定した。ＫＳＭ−Ｎ６５９株、ＫＳＭ−Ｎ１１５並びにＫＳＭ−Ｎ４４０株からのセルラーゼ遺伝子のクローニングも上記と同様に行った。
【００３６】
実施例４  形質転換枯草菌によるセルラーゼの生産
取得した4種類のセルラーゼを生産するにあたり、それぞれの酵素の成熟領域をコードする遺伝子をバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来アルカリセルラーゼ遺伝子（特願平１１−０１３０４９）の上流発現領域と下流領域の間に導入した。即ち、予めＳｍａＩで処理したｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）にバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｓ２３７株アルカリセルラーゼ遺伝子の上流発現領域からターミネーターを含む領域を連結したプラスミドｐＨＹＳ２３７から以下のようにＳ２３７セルラーゼの構造遺伝子を除き、そこへ各種セルラーゼの構造遺伝子を挿入することでプラスミドを作製した。
【００３７】
まず、ｐＨＹＳ２３７（約１００ｎｇ）を鋳型とし上流プライマー（配列番号９）、下流プライマー（配列番号１０）各２０ｐｍｏＬ及びＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ）を用い、ＰＣＲ（９４℃２０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物をHight Pure PCR Purification キット（ベーリンガーマンハイム）にて精製し、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ キット（タカラバイオ）を用いて末端の平滑化並びに５‘末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素ＸｂａＩにて処理しHight Pure PCR Purification キットで精製を行った。
【００３８】
次にバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１４５株のゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）を鋳型に上流プライマー（配列番号１１）、下流プライマー（配列番号１２）各２０ｐｍｏＬ及びＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼを用いてＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を１サイクルとして３０サイクル）を行った。得られたＰＣＲ産物を上記同様に精製し、末端の平滑化及び５‘末端のリン酸化を行った。その後、制限酵素ＸｂａＩにて処理し精製を行った。得られた増幅遺伝子断片と前述のｐＨＹＳ２３７から得た増幅断片をＴａＫａＲａ ＢＫＬ キットに付属のLigation Solutionを用いて連結した。ライゲーション溶液を精製し、乾燥後、３μＬの滅菌脱イオン水に溶解し、プロトプラスト法により枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行った。テトラサイクリン（７．５μｇ／ｍＬ、シグマ）を添加したＤＭ３再生培地[０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．３Ｍコハク酸二ナトリウム６水和物、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水和物。０．０１％牛血清アルブミン（シグマ）、０．５％ＣＭＣ（関東化学）０．００５％トリパンブルー（メルク）]上でハローを示すコロニーを目的のＰＣＲ産物を含む形質転換体として選択した。得られた形質転換体を、３．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、３．０％マルトース、０．５％魚肉エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μｇ／ｍＬ）からなる培地にて３０℃、７２時間振盪培養した。尚、Ｅｇｌ−６５９、Ｅｇｌ−１１５及びＥｇｌ−４４０も上記同様にプラスミドを構築後、形質転換、選抜並びに培養を行った。
【００３９】
遠心分離により得られた培養上清中のセルラーゼ活性は１７Ｕ／ｍＬ（Ｅｇｌ−１４５）、１６Ｕ／ｍＬ（Ｅｇｌ−６５９）、８Ｕ／ｍＬ（Ｅｇｌ−１１５）及び１８Ｕ／ｍＬ（Ｅｇｌ−４４０）であり、それぞれＳＤＳ電気泳動を行って検出された主要なタンパク質バンドの分子量は、アミノ酸配列から推定される分子量（５８．５ｋＤａ）とほぼ一致したが、Ｅｇｌ−１１５は３４ｋＤａに主要なタンパク質バンドが検出されたことから、培養中に分解された可能性が考えられた。
【００４０】
実施例５  Ｅｇｌ−１４５の調製
実施例４で得られた培養上清をペンシルモジュール（ＡＣＰ−００１３、分画分子量１３，０００；旭化成）を用い脱塩濃縮した後、予め、５０ｍＭ  トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しておいたＱＡＥトヨパール５５０Ｃ（トーソー）に供し、非吸着画分を限外濾過（ＰＭ１０膜、ミリポア）にて濃縮した。尚、Ｅｇｌ−１１５以外のセルラーゼも上記のように調製した。
【００４１】
実施例６  Ｅｇｌ−１４５の最適反応ｐＨ
（ＣＭＣを基質とした場合）
酢酸緩衝液（ｐＨ４．５〜５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）、トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７〜８）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．５）の各緩衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、実施例５に従って調製した組換えＥｇｌ−１４５はｐＨ６．５のリン酸緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ４．５〜９．５の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた。
【００４２】
（結晶性セルロースを基質とした場合）
上記に示した各緩衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、組換えＥｇｌ−１４５はトリス塩酸塩緩衝液中でｐＨ７の付近において最も高い反応速度を示した。また、ｐＨ５〜９の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた。
【００４３】
実施例７  Ｅｇｌ−１４５の最適反応温度
結晶性セルロースを基質とし、１００ｍＭ  グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中、５〜７０℃の範囲で最適反応温度を調べた結果、組換えＥｇｌ−１４５は３０〜４０℃の間で最も高い反応速度を示した。また、１０〜５５℃の間で最大活性の５０％以上の活性を有していた。
【００４４】
実施例８  Ｅｇｌ−１４５の基質特異性
下記の標準活性測定条件下において、ＳＩＧＭＡＣＥＬＬ  Ｔｙｐｅ１０１（シグマ）の分解活性を１００％とした場合、フナセルＳＦ（フナコシ工業化学）、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｐｏｗｄｅｒ（２０μｍ：シグマアルドリッチ)、ＳＩＧＭＡＣＥＬＬ  Ｔｙｐｅ２０（シグマ）、ＴＬＣ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ（生化学工業）に対しては、それぞれ７６％、７３％、６２％、３３％の相対分解活性を示した。
【００４５】
実施例９  Ｅｇｌ−４４０及びＥｇｌ−６５９の最適反応ｐＨ
結晶性セルロースを基質とし、各緩衝液（１００ｍＭ）を用いて最適反応ｐＨを調べた結果、組換えＥｇｌ−４４０及びＥｇｌ−６５９はｐＨ６−８において最も高い反応速度を示した。ＣＭＣを基質にした場合、Ｅｇｌ−６５９の最適反応ｐＨは、ｐＨ６−８であった。
【００４６】
（酵素活性測定法）
１．カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とする場合
０．２ｍＬの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐH９．０）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３ｍＬの脱イオン水から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃、２０分間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム）を添加し、沸水中で5分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【００４７】
２．結晶性セルロース（アビセル）を基質とする場合
０．５ｍＬの０．２Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐH８．５）、０．４ｍＬの２．５％（ｗ／ｖ）結晶性セルロース（ＳＩＧＭＡＣＥＬＬ  Ｔｙｐｅ１０１；シグマ）から成る反応液に０．１ｍＬの適当に希釈した酵素液を加え４０℃、３時間反応させた後、１ｍＬのジニトロサリチル酸試薬（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加、攪拌後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間、室温）を行った。上清１ｍＬを分取し、沸水中で５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、２ｍＬの脱イオン水を加え５３５ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
【配列表】
2005287441000001.app