(57)【要約】【課題】本発明は、PPARδ調節のマーカーとしてのANGPTL4/FIAFを提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、PPARδ活性のバイオマーカーとしてのANGPTL4、ならびに例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患を診断する方法、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4。
【請求項２】
筋細胞または肝臓または脂肪細胞におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4。
【請求項３】
PPARδ活性の調節不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのANGPTL4。
【請求項４】
ANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法。
【請求項５】
ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化する段階。
【請求項７】
ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した筋細胞から、mRNAを精製する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現を測定する段階。
【請求項９】
ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項4〜9のいずれか一項記載の方法により同定される化合物。
【請求項１１】
PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための、請求項4〜9のいずれか一項記載の方法により同定される化合物の使用。
【請求項１２】
ANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法。
【請求項１３】
ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化する段階。
【請求項１５】
ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した全血および/または筋細胞から、タンパク質を精製する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現を測定する段階。
【請求項１７】
ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項12〜17のいずれか一項記載の方法により同定される化合物。
【請求項１９】
PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法により同定される化合物の使用。
【請求項２０】
PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4の使用。
【請求項２１】
筋肉におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4の使用。
【請求項２２】
PPARδ活性の調節不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのANGPTL4の使用。
【請求項２３】
配列番号:22、26、30、34からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列。
【請求項２４】
配列番号:23、27、31、35からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列。
【請求項２５】
配列番号:24、28、32、36からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列。
【請求項２６】
配列番号:25、29、33、37からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列。
【請求項２７】
配列番号:38またはその断片を含む制御配列。
【請求項２８】
以下の段階を含む、PPAR活性の調節因子をスクリーニングする方法：
a) 検出可能な核酸に機能的に結合した1つまたは複数のPREEを含む宿主を提供する段階、
b) 該宿主を候補と接触させる段階、および
c) 該検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルを定量化する段階。
【請求項２９】
検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、請求項28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PPARδ活性のバイオマーカーとしてのANGPTL4、ならびに例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患を診断する方法、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)は、核ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである。PPARは、遺伝子発現を制御し、複数の代謝経路を調節するリガンド活性化転写因子である。PPARα、PPARδ（PPARβとしても知られる）、およびPPARγの3つのサブタイプが報告されている。PPARδは偏在的に発現する。PPARαは、主に肝臓、腎臓、および心臓において発現する。PPARγには少なくとも2つの主要なアイソフォームが存在する。PPARγ1はほとんどの組織で発現し、より長いアイソフォームであるPPARγ2はほぼ脂肪組織のみで発現する。PPARは、グルコースおよび脂質の恒常性および代謝、エネルギーバランス、細胞分化、炎症、ならびに心血管の現象を含む様々な生理反応を調節する。
【０００３】
冠動脈疾患を有する全患者の約半数は、低濃度の血漿高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)を有する。HDLのアテローム防御機能は約25年前に初めて明らかになり、これによって、HDLレベルに影響を及ぼす遺伝因子および環境因子の探索が促進された。HDLの防御機能は、逆コレステロール輸送と称される過程におけるその役割に由来する。HDLは、動脈壁のアテローム硬化性病変における細胞を含む、末梢組織の細胞からのコレステロールの除去を媒介する。次いでHDLは、胆汁に変換し排除するため、このコレステロールを肝臓およびステロール代謝器官に送達する。Framigham研究のデータから、HDL-Cレベルは、LDL-C（低密度リポタンパク質コレステロール）とは無関係に、肝動脈疾患の前兆となることが示された（非特許文献1参照）。35 mg/dl未満のHDL-Cを有する20歳以上のアメリカ人の年齢調整罹患率は、16%（男性）および5.7%（女性）である。HDL-Cの実質的増加は、現時点では、様々な製剤形態のナイアシンでの治療により達成される。しかし、実質的な副作用により、このアプローチの治療的可能性は制限される。
【０００４】
米国における1千4百万人の2型糖尿病と診断された患者の90%が過体重または肥満であり、2型糖尿病患者は高い割合で異常な濃度のリポタンパク質を有する。総コレステロール＞240 mg/dlの有病率は、糖尿病男性の37%および糖尿病女性の44%である。LDL-C＞160 mg/dlの比率はそれぞれ31%および44%であり、HDL-C＜35 mg/dlの比率はそれぞれ28%および11%である。糖尿病とは、部分的機能障害により、インスリン作用への応答の際、患者の血中のグルコースレベルを調節する能力が低下する疾患である。II型糖尿病(T2D)はインスリン非依存性真性糖尿病(NIDDM)とも称され、先進国における全糖尿病患者の80〜90%を苦しめている。T2Dでは、膵臓のランゲルハンス島はインスリンを産生し続ける。しかし、インスリン作用の標的器官、主に筋肉、肝臓、および脂肪組織が、インスリン刺激に対する深刻な抵抗性を示す。身体は非生理的な高レベルのインスリンを産生することにより補い続ける。これにより膵臓のインスリン産生能の消耗および障害に起因して、最終的に疾患の後期にインスリンは減少する。したがってT2Dは、インスリン抵抗性、異脂肪血症、高血圧症、内皮機能障害、および炎症性アテローム性動脈硬化症を含む複数の併存疾患と関連する心血管代謝症候群である。
【０００５】
異脂肪血症および糖尿病の一次治療は一般に、低脂肪食、低グルコース食、運動、ならびに減量を含む。しかし、遵守する者はあまり多くない可能性があり、疾患に応じて、例えば、異脂肪血症用のスタチンおよびフィブラート等の脂質調節薬、ならびにインスリン抵抗性用のスルホニル尿素またはメトホルミンといった血糖降下薬を用いた、様々な代謝障害の治療が必要になる。最近になって、自身のインスリンに対して患者の感受性を再度増加させ、これにより血糖値およびトリグリセリドレベルが正常まで回復し、多くの場合、外因性のインスリンの必要性がなくなるまたは減少する、有望な新しい種類の薬剤が導入された（インスリンセンシタイザー）。ピオグリタゾン（Actos(商標)）およびロシグリタゾン（Avandia(商標)）はチアゾリジンジオン(TZD)クラスのPPARγアゴニストに属し、数カ国においてNIDDMに対して認可されたそのクラス初のものである。しかし、これらの化合物は、稀ではあるものの重篤な肝臓毒性（トログリタゾンで見られるような）を含む副作用を受ける。また、これらにより患者の体重が増加する。したがって、より安全性が高くかつ副作用の頻度が低い、新規でより効果的な薬剤が早急に必要とされる。近年の研究から、PPARδのアゴニスト作用によって、治療可能性の増した化合物が得られる、すなわち、前記化合物が、現行の治療と比較してHDL-Cの上昇に優れた効果を有し、およびインスリンレベルの正常化にさらなるプラス効果を有して脂質プロファイルを改善するという証拠が提供されている（非特許文献2参照）。近年の研究から、トリグリセリドの低下の際のよく知られた役割に加えて、インスリン感受性増加への独立的なPPARαを介する効果があることも示唆されている（非特許文献3参照）。したがって、選択的PPARδアゴニストおよびさらなるPPARα活性を有するPPARδアゴニストが、PPARγアゴニストで見られる体重増加等の副作用のない、優れた治療有効性を示す可能性がある。
【０００６】
本発明は、PPARδ調節のマーカー、ならびにPPARδ活性の調節不全に関連する疾患を診断する方法、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【０００７】
【非特許文献１】Gordonら、Am. J. Med. 1977, 62, 707-714
【非特許文献２】Oliverら; Proc Nat Acad Sci USA 2001; 98: 5306-11
【非特許文献３】Guerre-Milloら; J Biol Chem 2000; 275: 16638-16642
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、PPARδ調節のマーカーとしてのANGPTL4/FIAFを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
空腹誘導性脂肪因子(FIAF)、PPARγアンジオポエチン関連タンパク質(PGAR)、および肝臓フィブリノーゲン/アンジオポエチン関連タンパク質(HFARP)としても知られる、アンジオポエチン様タンパク質4（ANGL-4、ANGPTL4）をコードする遺伝子が、直接的なPPARδ標的遺伝子として同定されたが、この遺伝子をPPARδのバイオマーカーとして使用することが可能である。
【００１０】
ANGPTL4はPPARαおよびPPARγの標的遺伝子として、すでに記載されている。肝臓ではPPARαによってANGPTL4のmRNA発現が促進されるのに対して、PPARγは脂肪および胎盤等の高度に血管性の組織においてANGPTL4の選択的発現を促進する。これは、空腹への代謝応答におけるANGPTL4の意義と一致する（Kerstenら、J. Biol. Chem. 2000, 275, 28488-28493；Yoonら、Mol. Cell. Biol. 2000, 20, 5343-5349）。
【００１１】
しかし、本発明は、特定の組織および細胞におけるANGPTL4遺伝子へのPPARδの寄与がPPARαまたはPPARγの寄与よりもはるかに大きいことを提供する。特に筋細胞では、ANGPTL4遺伝子は主にPPARδによって活性化される。したがって、本発明により、PPARδによって誘発される反応とPPARαによって誘発される反応を識別することが可能になる。
【００１２】
本発明は、PPARδ調節を検出またはモニターするためのマーカーとしてのANGPTL4の使用を提供する。好ましい態様においては、筋肉におけるPPARδ調節を検出またはモニターするためのマーカーとして、ANGPTL4を使用する。
【００１３】
本発明に係るANGPTL4は、（１）PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4であることを特徴とする。
また、本発明に係るANGPTL4は、（２）筋細胞または肝臓または脂肪細胞におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4であることを特徴とする。
また、本発明に係るANGPTL4は、（３）PPARδ活性の調節不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのANGPTL4であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（４）ANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（５）ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(4)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（６）以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法であることを特徴とする：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化する段階。
また、本発明に係る方法は、（７）ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(6)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（８）以下の段階を含む、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法であることを特徴とする：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した筋細胞から、mRNAを精製する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現を測定する段階。
また、本発明に係る方法は、（９）ANGPTL4のmRNA発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る化合物は、（１０）上記(4)〜(9)のいずれか一つに記載の方法により同定される化合物であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用は、（１１）PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための、上記(4)〜(9)のいずれか一つに記載の方法により同定される化合物の使用を特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（１２）ANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（１３）ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(12)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（１４）以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法であることを特徴とする：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化する段階。
また、本発明に係る方法は、（１５）ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(14)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（１６）以下の段階を含む、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法であることを特徴とする：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した全血および/または筋細胞から、タンパク質を精製する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現を測定する段階。
また、本発明に係る方法は、（１７）ANGPTL4のタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(16)記載の方法であることを特徴とする。
また、本発明に係る化合物は（１８）上記(12)〜(17)のいずれか一つに記載の方法により同定される化合物であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用は、（１９）PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための、上記(12)〜(17)のいずれか一つに記載の方法により同定される化合物の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用は、（２０）PPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用は、（２１）筋肉におけるPPARδ活性を決定するためのバイオマーカーとしてのANGPTL4の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る使用は、（２２）PPARδ活性の調節不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのANGPTL4の使用であることを特徴とする。
また、本発明に係る配列は、（２３）配列番号:22、26、30、34からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列であることを特徴とする。
また、本発明に係る配列は、（２４）配列番号:23、27、31、35からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列であることを特徴とする。
また、本発明に係る配列は、（２５）配列番号:24、28、32、36からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列であることを特徴とする。
また、本発明に係る配列は、（２６）配列番号:25、29、33、37からなる群より選択される1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列であることを特徴とする。
また、本発明に係る配列は、（２７）配列番号:38またはその断片を含む制御配列であることを特徴とする。
また、本発明に係る方法は、（２８）以下の段階を含む、PPAR活性の調節因子をスクリーニングする方法であることを特徴とする：
a) 検出可能な核酸に機能的に結合した1つまたは複数のPREEを含む宿主を提供する段階、
b) 該宿主を候補と接触させる段階、および
c) 該検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルを定量化する段階。
また、本発明に係る方法は、（２９）検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルを対照と比較して決定する段階を含む、上記(28)記載の方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、PPARδ活性のバイオマーカーとしてのANGPTL4、ならびに例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患を診断する方法、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法、およびPPARδ活性を調節する化合物を同定する方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書で用いる「調節」という用語は、PPARδの転写活性の活性化または阻害に関連する。したがって、ANGPTL4はPPARδ活性の調節のマーカーとして機能し得る。
【００１６】
本明細書で用いる「マーカー」という用語は、核酸またはポリペプチドに関する。
【００１７】
本発明はまた、例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全を含む疾患を診断するためのマーカーとしてのANGPTL4に関する。したがって、ANGPTL4はPPARδ活性の調節を検出するマーカーとして機能し得る。
【００１８】
本発明は、ANGPTL4 mRNAの発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法をさらに提供する。マウスANGPTL4の代表的なcDNAを配列番号:1に示す。
【００１９】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定する。
【００２０】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ転写を含むRNA転写を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は、異なる宿主におけるANGPTL4のmRNA発現レベルであってよい。
【００２１】
さらに本発明は、以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法を提供する：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化する段階。
【００２２】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定する。
【００２３】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ転写を含むRNA転写を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は未処理宿主におけるANGPTL4のmRNA発現レベルであり、未処理宿主は、処理前の前記宿主または異なる宿主、および/または処理前のレベルに標準化するために適切な期間処理した後の前記宿主であってよい。上記方法の好ましい態様において、PPARδ活性を調節する化合物はアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００２４】
本発明はまた、以下の段階を含む、例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法を提供する：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した筋細胞から、mRNAを精製する段階、および
b) ANGPTL4のmRNA発現を測定する段階。
【００２５】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のmRNA発現レベルは対照と比較して決定する。
【００２６】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ転写を含むRNA転写を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は未処理宿主におけるANGPTL4のmRNA発現レベルであり、未処理宿主は、処理前の前記宿主または異なる宿主、および/または処理前のレベルに標準化するために適切な期間処理した後の前記宿主であってよい。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって同定される化合物、および、本明細書に記載の一方法によって同定される、例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための化合物の使用に関する。
【００２８】
ANGPTL4 mRNAの発現レベルを測定するためのいくつかの方法を用いることが可能である。ノーザンブロッティング、デンシトメトリーによるバンドの定量化等の方法は当技術分野において周知であり、十分に正確ではないかもしれないがこれらを使用することができる。他の方法には、ジーンチップの使用、マイクロアレイ解析、ドットブロッティング、または別の定量PCR方法論が含まれる。タックマン(Taqman)つまりリアルタイム定量PCRを用いることが好ましい。ANGPTL4の転写された配列の任意の部分を、プローブとして用いることができる。好ましい態様においては、表2に挙げたフォワードプライマーおよびリバースプライマー（配列番号:4および5）を用いて、リアルタイム定量PCRによりANGPTL4のmRNA発現レベルを決定する。筋細胞内のANGPTL4のmRNA発現レベルを定量化することが好ましい。
【００２９】
本発明は、ANGPTL4タンパク質の発現レベルを定量化する段階を含む、宿主におけるPPARδの活性を検出またはモニターする方法をさらに提供する。配列番号:3は、マウスANGPTL4のタンパク質配列を示す。
【００３０】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定する。
【００３１】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ翻訳を含むタンパク質翻訳を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は、異なる宿主におけるANGPTL4のタンパク質発現レベルである。
【００３２】
これに加えて、本発明は、以下の段階を含む、宿主において試験化合物がPPARδ活性を調節するかどうかを決定する方法を提供する：
a) 宿主を試験化合物に曝露する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化する段階。
【００３３】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定する。
【００３４】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ翻訳を含むタンパク質翻訳を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は未処理宿主におけるANGPTL4のタンパク質発現のレベルであり、未処理宿主は、処理前の前記宿主または異なる宿主、および/または処理前のレベルに標準化するために適切な期間処理した後の前記宿主であってよい。宿主は担体で処理してもよい。担体は、化合物を溶解または再懸濁する溶媒であってよい。本明細書で上記した方法の好ましい態様において、PPARδ活性を調節する化合物はアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００３５】
さらに、本発明はまた、以下の段階を含む、例えば異脂肪血症、肥満症、またはインスリン抵抗等の、PPARδ活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の治療をモニターする方法を提供する：
a) PPARδ活性の調節因子で治療した患者から単離した全血および/または筋細胞から、タンパク質を精製する段階、および
b) ANGPTL4のタンパク質発現を測定する段階。
【００３６】
上記方法の1つの態様において、ANGPTL4のタンパク質発現レベルは対照と比較して決定する。
【００３７】
宿主は、動物、組織、細胞、またはインビトロ翻訳を含むタンパク質翻訳を行い得る任意の他の生体系であってもよい。動物は非ヒト動物であることが好ましい。対照は未処理宿主におけるANGPTL4のタンパク質発現レベルであり、未処理宿主は、処理前の前記宿主または異なる宿主、および/または処理前のレベルに標準化するために適切な期間処理した後の前記宿主であってよい。
【００３８】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって同定される化合物、および本明細書に記載の一方法によって同定される、PPARδ活性の調節不全を含む疾患を治療する薬物を調製するための化合物の使用に関する。
【００３９】
ANGPTL4タンパク質の発現レベルを測定するためのいくつかの方法を用いることが可能である。これらの方法には、二次元ゲル分離法、質量分析法、抗体結合技法（ELISA、ウェスタンブロッティング）、および免疫沈降が含まれるが、これらに限定されない。筋細胞内または血液中のANGPTL4のタンパク質発現レベルを定量化することが好ましい。
【００４０】
本発明は、PPARの結合部位を含むFIAF/ANGPTL4の調節領域をさらに提供する。ヒト、マウス、ラット、およびイヌの調節領域は、対応するANGPTL4遺伝子（配列番号:8〜11）のイントロン3内に位置する。好ましくは、調節領域は4つの結合部位を含む。結合部位またはPPAR応答配列(PPRE)は、好ましくは13ヌクレオチドのコアDR1領域を含む（図3を参照のこと）。ヒトANGPTL4は、4つのPPREを有する：PPRE1（配列番号:25）、PPRE2（配列番号:29）、PPRE3（配列番号:33）、およびPPRE4（配列番号:37）。マウスANGPTL4は、4つのPPREを有する：PPRE1（配列番号:22）、PPRE2（配列番号:26）、PPRE3（配列番号:30）、およびPPRE4（配列番号:34）。ラットANGPTL4は、4つのPPREを有する：PPRE1（配列番号:23）、PPRE2（配列番号:27）、PPRE3（配列番号:31）、およびPPRE4（配列番号:35）。イヌANGPTL4は、4つのPPREを有する：PPRE1（配列番号:24）、PPRE2（配列番号:28）、PPRE3（配列番号:32）、およびPPRE4（配列番号:36）。他の種類の調節領域およびPPREはそれぞれ当技術分野で周知の方法により同定することが可能である：例えばMargulies E.H.およびBlanchette M.が記載のもの (NISC Comparative Sequencing Program, Haussler, D.およびGreen, E.D., Identification and Characterization of Multi-Species Conserved Sequences. Genome Res (2003), 13:2507-2518）。
【００４１】
本発明は、以下の群の1つもしくは複数の配列またはその断片を含む制御配列をさらに提供する、配列番号:22、26、30、34（マウス）からなる群、または配列番号:23、27、31、35（ラット）からなる群、または配列番号:24、28、32、36（イヌ）からなる群、または配列番号:25、29、33、37（ヒト）からなる群。さらに、本発明はまた配列番号:38を含む核酸またはその断片を提供する。好ましくは、PPREの断片は13コアDR1領域（類似したヘキサヌクレオチド部分2つの順方向反復配列(DR)および1つの介在ヌクレオチドを包含する13ヌクレオチド）を含む。本発明はまた、制御配列としての配列番号:22〜38の配列の使用に関する。
【００４２】
さらに、本発明は、少なくとも1つのPPREを含むベクターおよびそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、ベクターは配列番号:16または17の核酸を含む。
【００４３】
宿主細胞を遺伝子操作し（すなわち、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部を組み入れることができる。宿主細胞へのベクターの導入は、以下を含む多くの標準的な実験マニュアルに記載の、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、または感染等の方法により達成することができる：たとえば、Davisら、Basic methods in molecular biology、Elsevier、New York (1986)；Davis JM(編)：Basic cell culture: a practical approach、第2版、Oxford University Press (2002)；R. Ian Freshney: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、第4版、John Wiley & Sons (Sd) 1999；およびSambrookら、Molecular cloning: a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)。
【００４４】
宿主細胞は、BHK21、HEK293、CHO、COS、HeLa等の哺乳動物細胞、SH-SY5Y、PC12、HN-10のような神経、神経内分泌、神経芽細胞腫、またはグリア細胞株、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス属、および枯草菌等の細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス属細胞等の真菌細胞；ショウジョウバエS2およびヨトウガSf9細胞等の昆虫細胞、ならびに植物細胞であってよい。
【００４５】
多種多様な発現系を用いることができる。前記系には、特に、染色体に由来する系、エピソームに由来する系、およびウイルスに由来する系が含まれる；すなわち細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージに由来するベクター、トランスポゾンに由来するベクター、酵母エピソームに由来するベクター、酵母染色体エレメントに由来するベクター、バキュロウイルス、パポーバウイルス（SV40など）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、レトロウイルス等のウイルスに由来するベクター、ならびにそれらの組み合わせに由来するベクター（プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子（コスミドおよびファージミドなど）に由来するベクター等）。発現系は、発現を起こすばかりでなく制御もする調節領域を含んでもよい。一般に、宿主においてポリペプチドを産生するためにポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するのに適した任意の系またはベクターを使用し得る。例えばSambrookら、Molecular cloning: a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbour Laboratory Press、Cold Spring Harbour, N.Y. (1989)またはBorowskiら、Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors (Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98(16):8966-71)に記載されている技法などの、周知かつ日常的な様々な技法のいずれかにより、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。
【００４６】
本発明は、以下の段階を含む、PPAR活性の調節因子をスクリーニングする方法をさらに提供する：
a) 検出可能な核酸に機能的に結合した1つまたは複数のPPREを含む宿主を提供する段階、
b) 前記宿主を候補と接触させる段階、および
c) 前記検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルを定量化する段階。
【００４７】
上記方法の1つの態様において、検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現レベルは、対照と比較して決定する。
【００４８】
宿主は、非ヒト動物、組織、細胞、またはインビトロ転写インビトロ翻訳を含む、RNAまたはタンパク質転写を行い得る任意の他の生体系であってもよい。対照は未処理宿主における検出可能な核酸のmRNAまたはタンパク質発現のレベルであり、未処理宿主は、処理前の前記宿主または異なる宿主、および/または処理前のレベルに標準化するために適切な期間処理した後の前記宿主であってよい。本明細書で上記した方法の好ましい態様において、PPARδ活性を調節する化合物はアンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００４９】
mRNAまたはタンパク質の発現レベルを測定するためのいくつかの方法を用いることが可能である。mRNAの発現レベルを測定する方法には、ジーンチップの使用、マイクロアレイ解析法、ドットブロッティング法、または別の定量PCR方法論を含む方法が含まれるが、これらに限定されない。タックマンつまりリアルタイム定量PCRを用いることが好ましい。タンパク質の発現レベルを測定する方法には、二次元ゲル分離法、質量分析法、抗体結合技法（ELISA法、ウェスタンブロッティング法）、および免疫沈降法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
以上、本発明を一般的に記載したが、具体的な実施例を参照することにより同じことがより一層理解されるようになるであろう。実施例は、以下の図に関連して、特記されない限り説明の目的でのみ本明細書に含めるものであり、限定を意図するものでない。
【実施例】
【００５１】
本実施例において引用する商業的に入手可能な試薬は、特記しない限り製造業者の指示書に従って使用した。
【００５２】
実施例1：マイクロアレイ実験
細胞培養：C2C12細胞（ATCC: CRL1772）
細胞は、10%熱失活化ウシ胎児血清(FCS)を添加したDMEM（5 mMグルコース）中で培養した。使用する前に、完全培地を0.2μm孔を通して濾過した。細胞がコンフルエントに達した時点で、培地中の血清を減少させることにより（DMEM高グルコース、2% FCS）6ウェルディッシュにおいて分化を実施した。次いで、90%加湿、95%空気-5% CO2の無菌大気において細胞培養物を37℃で5日間インキュベートし、分化させた。
【００５３】
PPARリガンドを100% DMSO中に溶解し、DMSOの最終濃度が0.1% (v/v)になるように培地に添加し、通常の培養条件下で細胞をリガンドと共に20時間インキュベートした。各条件について3回繰り返し実施した。
【００５４】
RNA抽出
RNA抽出手順は、Qiagen QIAschredderおよびRNeasyキットを用いて行った。
【００５５】
1試料当たり約1×106個のペレット化した細胞を、RLTを含むグアニジンチオシアネート350μl中に再懸濁した。試料をQIAschredderカラムに添加し、最大速度で2分間遠心分離して溶解液をホモジナイズした。よりよい結合条件のためにフロースルーにエタノール350μlを添加した後、試料をRNeasyスピンに供した。最初の洗浄段階では、カラムにRW1緩衝液350μlをピペットで添加した。次に、DNase溶液10μlをRDD緩衝液70μlと穏やかに混合してカラムに添加し、室温で15分間インキュベートしてゲノムDNAを除去した。RW1緩衝液350μlでDNaseを洗浄除去した。精製洗浄段階を2回行った後、RPE緩衝液500μlを添加した。水中にRNAを溶出し、-70℃で保存した。
【００５６】
cDNA合成
cDNAは、Roche Diagnosticsが提供するcDNA合成システムキットを用いて、製造業者のマニュアルに従って合成した。全合成過程において、合成は氷上で行った。
【００５７】
第1鎖の合成のため、最大RNA 20μgに、オリゴd(T7)T24プライマー（5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T24)VN3'、200 pmol/μl）2μlおよび再蒸留水を最終反応容量が21μlになるように添加した。サーマルサイクラー中、70℃で10分間インキュベートし、RNAにプライマーをハイブリダイズさせた後、AMV逆転写酵素2μlおよびdNTP混合液（10 mM）4μlを添加した。補足のRT緩衝液8μl、DTT（0.1 mM）4μl、およびRNase阻害剤1μlを、混合液にピペットで添加した。続いて42℃で60分間インキュベートした。
【００５８】
第2鎖の合成のため、第1鎖反応チューブに試薬を直接添加した。第2鎖酵素混合物は、そのうちの6.5μlを混合液に添加したが、DNA/RNAハイブリッドのRNA内にニックを挿入するためのRNaseを含む。これによりDNAポリメラーゼIのための3'OHプライマーが提供されるが、このDNAポリメラーゼIも大腸菌リガーゼと共にやはり第2鎖酵素混合物中に存在する。さらにdNTP混合液1.5μl、第2鎖緩衝液30μl、および再蒸留水72μlを添加し、穏やかに混合した。反応混合液を16℃で2時間インキュベートした。T4ポリメラーゼ20μlを添加しり、16℃で5分間インキュベートして、cDNA末端を確実に平滑末端化した。次に、RNA鋳型を除去するために試料をRNaseで処理し（37℃で30分間）、プロテイナーゼKで処理した（37℃で30分間）。
【００５９】
cDNAの精製
QIAquick PCR精製キットを用いた精製は、Quiagenによって提供された。
【００６０】
cDNA反応チューブにPB緩衝液850μlを添加し、混合した。試料をQIAquickカラムに添加し、13,000 rpmで30秒間遠心分離した。PE緩衝液750μlをカラムに添加して、cDNAを洗浄した。最大速度でさらに遠心分離段階を行い、カラムを完全に乾燥させた。DNAを溶出するため、EB緩衝液（10 mM Tris-Cl、pH: 8.5）50〜80μlを膜の中心に添加し、試料を13,000 rpmで1分間遠心分離した。
【００６１】
アガロースゲル電気泳動法およびエチジウムブロマイド染色法により、cDNAの質を確認した。
【００６２】
100〜＞10000 bpのスメアが現れた。分光光度計で260 nmおよび280 nmにおける吸光度を測定することにより、合成したcDNAの質および精度を決定した。
【００６３】
濃度は以下の通りに計算した：c[μg/ml]＝A260×50×D、（50：dsDNA特異的係数、D：希釈係数）。cDNAは、A260/A280比1.8〜2.1を有する。
【００６４】
インビトロ転写(IVT)
この段階は、AmbionのMEGAscript T7キットを用いて行った。
【００６５】
各試料に由来するcDNA 5μgを鋳型として使用し、ATP、GTP、CTP、UTP（Ambion）、ならびにビオチン化CTP（Bio-11-CTP、ENZO）およびビオチン化UTP（Bio-15-UTP、ENZO）と混合した。T7酵素混合液により、37℃で4時間、RTを行った。試料のDNAse処理を行わずに、QIAgenのRNeasyキットをRNA抽出の場合と同じ手順に従って使用し、転写産物を精製した。
【００６６】
IVT産物の断片化
IVTによるRNA 15μgを、少量（20〜30μl）の200 mM Tris-酢酸、pH 8.1、500 mM KOAc、150 mM MgOAc中、95℃で35分間断片化した。
【００６７】
チップの取り扱い（DNAマクロアレイ手順V3-200.1. M Wilhelm-Seiler、U Certaを参照のこと）。
【００６８】
まず、ジーンチップに前処理溶液を添加した（アセチル化BSA（20μg/μl）6.25μl、サケ精子DNA（10μg/μl）12.5μl、2×MES Hyb緩衝液125μl、H2O 106.25μl）。ローティッセリーにおいて60 rpmで回転させながら、ジーンチップを40℃で15分間インキュベートした。
【００６９】
以下のように、ハイブリダイゼーション用に試料を調製した：断片化RNA15μgを、BioB、BioC、BioD、Cre（内部標準）を含む対照保存混合液2.5μl、サケ精子DNA（10μg/μl）2.5μl、アセチル化BSA（20μg/μl）6.25μl、2×MES Hyb緩衝液125μl、H2O 91.25μlと混合した。次いで、ローティッセリーにおいて回転させながら（60 rpm）、マイクロアレイを45℃で一晩インキュベートした。
【００７０】
試料を除去し、-20℃で保存した。フリューディクス(fluidics)において、マイクロアレイを6 SSPEで5分間洗浄した。次にチップにMES洗浄緩衝液230μlを添加し、60 rpmで45℃にて30分間インキュベートした。
【００７１】
チップを以下の溶液と15分間インキュベートすることにより、染色を行った：2×染色緩衝液125μl、アセチル化BSA 91.25μl、ストレプトアビジン（1 mg/ml）2.5μl。
【００７２】
染色液を除去し、フリューディクスステーションにおいてマイクロアレイを6×SSPEで5分間洗浄し、増幅溶液で処理した：2×染色緩衝液125μl、H2O 99μl、ビオチン化抗ストレプトアビジン（500μg/ml）1μl、アセチル化BSA（20μg/μl）25μl。ローティッセリーにおいて60 rpmで回転させながら、40℃で30分間インキュベートした。フリューディクスステーションにおいて6×SSPEで洗浄した後、マイクロアレイをフィコエリトリン溶液（2×染色緩衝液125μl、H2O 91.25μl、アセチル化BSA 31.25μl、フィコエリトリン（1 mg/ml）2.5μl）と共に60 rpmで40℃にてインキュベートした。
【００７３】
溶液：
12×MES保存液：MES遊離酸一水和物70.4 g、MESナトリウム塩193.3 g、pHを6.6に調製、トライデストH2Oで1000 mlに調整
2×MES-Hyb緩衝液：12×MES保存液8.3 ml、5M NaCl 17.7 ml、0.5 M EDTA 4 ml、10% Tween 20 0.1 ml、トライデストH2O19.9 ml
MES洗浄緩衝液：12×MES保存液83.3 ml、5M NaCl 5.2 ml、10% Tween 20 1 ml、トライデストH2Oで1000 mlに調整
6×SSPE Tween：20×SSPE 300 ml、10% Tween 20 1 ml、トライデストH2Oで1000 mlに調整
2×染色緩衝液：12×MES保存液41.7 ml、5M NaCl 92.5 ml、10% Tween 20 2.5 ml、トライデストH2O113.3 ml
【００７４】
Affymetrixスキャナーによりスキャンを行い、結果はAffymetrixのジーンチップソフトウェアで提供された。
【００７５】
チップデータの解析
データは、Race Aソフトウェア（Bioinformatic Roche）を用いて解析した。各条件について3回実施し、対照（未処理の細胞試料）を参照して各条件について比較値を算出した。研究した化合物によって調節を受ける、統計学的に最も関連性のある遺伝子のリストを得るため、各遺伝子の解析に関していくつかの基準を考慮に入れた：各条件におけるp値、コール(Call)平均値、合計平均値の相違、変化因子(Change Factor)、および分散。
【００７６】
結果
新規な選択的PPARδバイオマーカー遺伝子を、Affimetrixマイクロアレイ実験により同定した（図1を参照のこと）：ANGPTL4（アンジオポエチン様タンパク質4）（配列番号:2）。このマーカー遺伝子により、PPARα活性とPPARδ活性の識別が可能になる。
【００７７】
試験したリガンドは、PPARαアゴニスト（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸））、PPARδアゴニスト（C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸）、およびPPARδ-αコアゴニスト（B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸）であった。
【００７８】
表1および図1に示すように、PPARδアゴニスト(C)およびPPARδ-αコアゴニスト(B)によって誘発されるマーカー遺伝子ANGPTL4の応答は、PPARα特異的リガンド(A)によって誘発される応答よりもはるかに大きい。
【００７９】
（表１）Affymetrixマイクロアレイによって測定された、PPARリガンド：A 300μM、B 100 nM、C 500 nMにより誘導される、C2C12マウス筋細胞におけるANGPTL4遺伝子発現倍率変化。（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸）はPPARαアゴニストである、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸はPPARδ-αコアゴニストである、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸はPPARδアゴニストである) 
2005287509.tif 000002
【００８０】
実施例2：定量PCR
C2C12マウス筋細胞の培養、RNA抽出、cDNA合成、および精製は、実施例1記載の通り実施した。
【００８１】
PCRプライマーの設計
MedlineによるmRNA/cDNA配列に基づいて、PE Applied Biosystemsのソフトウェア、プライマーエクスプレス(Primer express)1.0によりプライマー対を設計した。各プライマーの長さの基準は19〜21ヌクレオチド、融解温度の基準は60℃±1、G/C含量の基準は40〜60%とし、ヘアピンまたはプライマー二量体等の二次構造を回避した。さらに、短い単位複製配列ほど長い単位複製配列よりも効率よく増幅され、かつ反応条件に対してより寛容であるため、単位複製配列の長さを調節した（通常、約100 bp）。プライマーを100μM高濃度溶液になるようにDEPC処理水（Ambion）に溶解し、-20℃で保存した。
【００８２】
（表２）遺伝子S12（内部標準）およびANGPTL4のフォワードおよびリバースプライマー
2005287509.tif 000003
【００８３】
Corbett RG3000およびABI 7000を用いたqPCR
QiagenのQuantitech SYBRグリーンキットを用いて、製造業者のマニュアルに従ってRT-PCRを行った。各成分を96ウェルプレートに添加した：マスターミックス25μl、各プライマー（100μM保存用液）0.16μl、H2O 22.7μl、およびcDNA 2μl。
【００８４】
蛍光色素SYBRグリーンIは二本鎖DNAの副溝に結合し、これによりサイクルごとのDNA量の測定が可能になる。プログラムは3つの異なる段階からなる：最初の鋳型の変性およびTaq DNAポリメラーゼの熱活性化（95℃、15分）、サイクル（95℃変性、60℃プライマー-鋳型アニーリング、72℃伸長、蛍光取得）、および最終的な融解（融解曲線55〜95℃、0.5℃段階での測定）。融解曲線により、特異的増副産物と非特異的増幅産物（プライマー二量体）との識別が可能になる。
【００８５】
リアルタイムPCRを用いた相対的定量化
相対的定量化は、標準遺伝子に対する標的遺伝子の相対的発現に基づく。蛍光がバックグランド蛍光を超える点として定義される閾値蛍光の概念により、遺伝子発現の正確かつ再現性のある定量化が可能になる。閾値蛍光に到達するサイクル数をct値と称する。増幅反応の対数期には、ct値と最初の分子数の対数との間に直線関係が得られる。したがって、定量化はその段階で信頼性があり、成分のいかなる限定効果の影響も受けないことになる。対照または未処理試料における内部標準のct値に対する標的遺伝子の相対的ct値は、Δct.対照＝ct対照の標準-ct対照の標的として表され、処理した未知試料における内部標準のct値に対する標的遺伝子の相対的ct値は、Δct.試料＝ct試料の標準-ct試料の標的として表される。
【００８６】
理論的なPCR反応は、式N＝N0×2n（N：増幅された分子の数、N0：最初の分子数、n＝増幅サイクル数）（ベースの2は最適効率を表す（サイクルごとに倍化））によって表される。この式により、ct値の代わりにmRNAコピー数の差異的な発現を明らかにすることができる：理論的な効率による指数値、2Δctを得る。
【００８７】
定量研究のための内部標準として、リボソームタンパク質S12遺伝子発現を用いた。この遺伝子は、構成的にかつ全試料において同じレベルで発現する。ライトサイクラーソフトウェアにより、蛍光閾値の設定を決定する。得られたct値（1試料につき2回、1条件当たり2試料）をMicrosoft Excelに出力し、上記のように解析した。
【００８８】
結果
Affimetrixマイクロアレイ実験により同定された新規な選択的PPARδバイオマーカー遺伝子（配列番号:2）（図1を参照のこと）が、qPCR（定量ポリメラーゼ連鎖反応法）により確認された。
【００８９】
試験したリガンドは、PPARαアゴニスト（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸））、PPARδアゴニスト（C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸）、および2つのPPARδ-αコアゴニスト（B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸およびD：(2-メチル-4-{メチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸）であった。
【００９０】
表3および図2に示すように、PPARδアゴニスト(C)およびPPARδ-αコアゴニスト(BおよびD)によって誘発されるマーカー遺伝子ANGPTL4の応答は、PPARα特異的リガンド(A)によって誘発される応答よりもはるかに大きい。
【００９１】
（表３）qPCRによって測定された、PPARリガンド：A 300μM、B 100 nM、C 500 nM、D 500 nMにより誘導される、C2C12マウス筋細胞におけるANGPTL4遺伝子発現倍率変化。（A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸）はPPARαアゴニストであり、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸はPPARδ-αコアゴニストであり、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸はPPARδアゴニストであり、D：(2-メチル-4-{メチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸はPPARδ-αコアゴニストである)
2005287509.tif 000004
【００９２】
GW501516等の特異的PPARδリガンドは、インビトロおよびインビボの両方において、周知のPPARαリガンド（フィブラート）の効果に類似した多くの生物学的反応を誘発し得る。オリゴヌクレオチドアレイおよび定量PCRによって実証されるように、主要な生物学的相違の一つはANGPTL4発現の差異的制御である。新たに発見された循環サイトカインであるANGPTL4は、肝臓、脂肪細胞、および筋肉において空腹により制御される；すなわちANGPTL4は、直接的なPPAR標的遺伝子であること、および脂肪分解に関与していることが最近になって実証された。したがって、ANGPTLにより、i. PPARδの役割をPPARαの役割と選択的に識別するため、およびii. 異脂肪血症および2型糖尿病のためのより差別化された薬物を開発するための新たなアプローチが提供されうる。
【００９３】
実施例3：
比較によるゲノム解析
ヒト（NCBIゲノムbuild 35.1；2004年6月18日）、ラット（NCBIゲノムbuild 2.1；2004年7月22日）、マウス（NCBIゲノムbuild 33.1；2004年6月18日）、およびイヌ（NCBIゲノムbuild 1.1；2004年8月30日）のANGPTL4遺伝子を比較した。まず、オルソロガスゲノム領域をより感度を高めて綿密に解析するため、BLAST比較を行い簡便な「アンカーポイント」を提供した。次に、相同性に基づく遺伝子予測により、保存されたゲノム領域をさらに解析した。ANGPTL4遺伝子に関して、ヒトおよびマウスのゲノム領域を比較したドットプロット（図3A）に示されるように、この遺伝子のイントロン内に様々な保存されたひと続きの配列が認められ
た。最も保存されているひと配列は、イントロン3内に位置する。これはBLAST検索によって容易に検出され、ANGPTL4遺伝子のタンパク質をコードするエキソンよりもさらに高度に保存されている。
【００９４】
これらの保存されたイントロンのひと配列の潜在的関連性をさらに明らかにするため、既知の転写因子結合部位(TFBS)をマッピングした。マトリックスに基づいた記述が利用できるTransFac8.1［BIOBASE（生物学的データベース）、Halchtersche Straβe 33, D-38304 Wolfenbuttel、ドイツ］による全TFBSを含めた。使用したマッピングアルゴリズムはTFBS一致の統計的有意性に合わせて調整するが、100 bpの一続きの任意のゲノム配列に対して約5つのTFBS予測がなお得られる。しかし、制御機構および共通TFBSが高等脊椎動物間で保存される傾向があるという仮説に基づいて、TFBS予測と、対応するオルソロガスゲノム領域のアラインメント、およびそれらのアラインメントに由来する保存プロファイルを組み合わせることができる。これにより、十分に保存されているように見えないTFBS予測の排除が可能になる。
【００９５】
結果
ANGPTL4遺伝子のイントロン3の保存されたひと続きにおいて、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体応答配列モチーフ(PPRE/DR1)に対するいくつかの一致を含む、TransFac8.1のTFBSに対する約50の一致が同定された。PPREに関連する一致のうちの4つすべてが、保存プロットにおいて最も高い4つのピークと一致した。予測された他のTFBSは、保存的ピークのいずれとも重複しなかった。さらに、最も保存的な領域の外側には、予測されるさらなるPPREは存在しなかった。ヌクレオチドレベルにおいて、推定上のPPREのすべてが4種間でよく保存されており、共通PPRE-DR1エレメントに良好に一致している（図3B）。したがって、コンピューターを利用した解析により、ANGPTL4のイントロン3内に4つの別々のPPREが同定され、そのうちの3つは順（コード）鎖上に存在し、1つは逆鎖上に存在する。
【００９６】
実施例4：
マウスおよびヒトANGPTL4調節領域のPCR増幅
マウスおよびヒトゲノムDNAから、4つの推定上のPPREを包含するANGPTL4遺伝子イントロン3の部分を増幅するために、PCRプライマー対を設計した。実施例2に記載したパラメータと類似のパラメータを使用し、PE Applied Biosystems（本社：850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404、米国）のソフトウェア、プライマーエクスプレス(Primer Express)2.0を用いてプライマー対を設計した。PCR増幅は、Stratageneのpfu PCR混合液を用いて行った。各反応について、最終反応量50μl中に、鋳型DNA 50 ng、フォワードおよびリバースプライマーそれぞれ10 pモル、推奨される量のdNTP、10×緩衝液、およびPCR酵素を用いた。
【００９７】
（表４）ANGPTL4調節領域をPCRクローニングするためのフォワードおよびリバースプライマー配列
2005287509.tif 000005
【００９８】
PCR増幅は、Biometra（Whatman Biometra, Biometra GmbH i. L., Rudolf-Wissell-Straβe 30, 37079 Goettingen、ドイツ）のT3サーモサイクラーで行った。増幅プログラムは、最初の鋳型の変性（95℃、2分）、95℃で60秒間の変性；50〜65℃勾配での30秒間のアニーリング；72℃で4分間の伸長の35回繰り返しからなった。PCRの後、一定分量をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色することにより増幅されたバンドの質および大きさを可視化した。
【００９９】
ANGPTL4調節領域-ルシフェラーゼレポーターベクターの構築
PCR産物をTAベクターにサブクローニングし、そのDNA配列を決定した。インサートを含むTAプラスミドを制限酵素消化することにより、予想される配列を有する挿入されたPCR産物を回収し、最小37 TKプロモーターを含むルシフェラーゼレポーターベクター（pGL3basic-pTK-37Luc：pGL3-Basicベクター（Promega、アクセッション番号:U47295）のBglII制限酵素部位とEcoRI制限酵素部位の間に、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子に由来する最小プロモーター領域（pTK37）（配列番号:39）を挿入）にサブクローニングした。これにより、2つのプラスミドが得られた；それぞれマウスANGPTL4調節領域およびヒトのANGPTL4調節領域によってルシフェラーゼ発現が指示されるmANGPTL4調節領域-LucおよびhANGPTL4調節領域-Luc。次の研究のために、大腸菌でこれらプラスミドを大量に調製した。
【０１００】
突然変異誘発
ANGPTL4調節領域のPPARδ転写調節が4つの同定されたPPREに依存していることを確認するため、mANGPTL4調節領域-Lucプラスミドを部位特異的突然変異誘発し、4つのPPREを個々におよび組み合わせて、非機能的にした。各PPREの13コアDR1コードヌクレオチドを欠失させるため、プライマーを設計した。突然変異誘発は、StratageneのQuickchange Multi Site Directed Mutagenesis Kitを使用して行った。PPREの1つまたは複数の欠失を含む適切に突然変異誘発されたベクターを、DNA配列決定により同定した。次の研究のために、大腸菌でこれらプラスミドを大量に調製した。
【０１０１】
【表５】
2005287509.tif 000006
mFIAF/ANGPTL4調節領域内のPPREを突然変異誘発するためのプライマー配列
【０１０２】
ルシフェラーゼアッセイ
仔ハムスター腎細胞（BHK21 ATCC CCL10）を、10% FBSを含むDMEM培地中、95%O2：5%CO2大気中で37℃にて培養した。細胞を2×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、適切なANGPTL4調節領域-Lucレポータープラスミドと共に全長ヒトPPARδ、PPARγ、またはPPARα受容体を発現するベクターをバッチトランスフェクションした。トランスフェクションは、推奨される手順に従ってFugene 6試薬（Roche Molecular Biochemicals）を用いて達成した。トランスフェクションしてから6時間後に、トリプシン処理により細胞を回収し、104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。細胞を付着させるために24時間経過してから培地を除去し、試験物質または対照リガンドを含む（最終DMSO濃度：0.2%）フェノールレッドを含まないDMEM培地100μlで置換した。細胞を物質と共に24時間インキュベートした後、上清50μlを捨て、次いで細胞を溶解しルシフェラーゼ反応を開始するために、Steady-Gloルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）50μlを添加した。ルシフェラーゼの発光を、Packard TopCountで測定した。試験物質存在下での転写活性化を、物質非存在下でインキュベートした細胞に対する活性化倍率として表した。
【０１０３】
結果
図4Aは、PPARδが、FIAF/ANGPTL4調節領域を介して異種性ルシフェラーゼレポーターの転写調節を媒介することを示す。ルシフェラーゼレポーターと共にPPARδ受容体ベクターをトランスフェクションした細胞は、レポーターのみをトランスフェクションした細胞と比較して、転写活性化の増加を示さなかった。しかし、PPARδアゴニストで処理した後では、マウスおよびヒトFIAF/ANGPTL4調節領域-Lucレポーターに関して、ルシフェラーゼ活性はそれぞれ39倍および25倍増加した。図4Bでは、1つまたは複数のPPREを欠失させたmFIAF/ANGPTL4調節領域-Lucレポーターを用いて、同様の実験を行った。PPRE1、2、および4単独の欠失により、PPARδの媒介する転写は減少した。2つ以上のPPREの欠失により転写活性化はさらに減少し、4つのPPREすべてを欠失させると全制御が失われた。したがって、PPARδは、マウスおよびヒトFIAF/ANGPTL4調節領域内に含まれる4つのPPREを介して、強力にかつ特異的に転写を制御する。
【０１０４】
PPARαおよびPPARγアゴニストはそれぞれ肝臓および脂肪組織においてFIAF/ANGPTL4発現を誘導することが示されているため、それらもまたANGPTL4調節領域の制御に関して試験した。図5は、PPARαおよびPPARγが両方とも、マウスおよびヒトANGPTL4調節領域を転写制御し得ることを示す。PPARδとは対照的に、PPARαおよびPPARγを用いて細胞をトランスフェクションすると、アゴニストの非存在下においても活性化が増加し、その活性は選択的アゴニストで処理するとさらに増加した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】Affymetrixマイクロアレイによって測定された、C2C12マウス筋細胞における、表1のPPARリガンド（A 300μM、B 100 nM、C 500 nM）により誘導されるANGPTL4遺伝子発現倍率変化のグラフを示す図である。ANGPTL4：アンジオポエチン様タンパク質［PPARδ活性のマーカー］、A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸）［PPARαアゴニスト］、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸）［PPARδ-αコアゴニスト］、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸［PPARδアゴニスト］。
【図２】qPCRによって測定された、C2C12マウス筋細胞における、表3のPPARリガンド（A 300μM、B 100 nM、C 500 nM、D 500 nM）により誘導されるANGPTL4遺伝子発現倍率変化のグラフを示す図である。ANGPTL4：アンジオポエチン様タンパク質4［PPARδ活性のマーカー］、A：2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸（フェノフィブリン酸）［PPARαアゴニスト］、B：{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル]-フェノキシ}-酢酸）［PPARδ-αコアゴニスト］、C：[rac]-(4-{シクロペンチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-ペニル)-チアゾール-5-イル]-メチルスルファニル}-ナフタレン-1-イルオキシ}-酢酸［PPARδアゴニスト］、D：(2-メチル-4-{メチル-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチル]-アミノ}-フェノキシ)-酢酸［PPARδ-αコアゴニスト］。
【図３Ａ】ヒトとマウスのANGPTL4遺伝子座のヌクレオチド配列間の核酸保存を示すドットプロットの図である。E1〜7は、ANGPTL4遺伝子エキソン1〜7を表す。イントロン3は実線で示し、保存的ABGPTL4調節領域は両矢印で示す。
【図３Ｂ】コアDR1エレメント(太字)および保存的隣接配列を共通DR1エレメントと比較して示す、ヒト(h)、マウス(m)、ラット(r)、およびイヌ(d)ANGPTL4遺伝子の4つのペルオキシソーム増殖因子応答配列 (PPRE)のアラインメントを示す図である。保存的制御領域を特定するために異種間比較することにより、ANGPTL4遺伝子のイントロン3内に位置するPPAR応答配列が同定された。全エレメントは、すべての種で高度に保存されている約500ヌクレオチド領域内に、おおよそ均等に位置する。特定される座位は、以下のゲノムドラフトおよび染色体アクセッション番号を参照する：ヒト：NCBIゲノムbuild 35.1；2004年6月18日/Genbank 配列番号：NT_077812；マウス：NCBIゲノムbuild 33.1；2004年6月18日/Genbank 配列番号：NT_39649；ラット：NCBI；ゲノムbuild 2.1；2004年7月22日/Genbank 配列番号：NW_04773；イヌ：NCBIゲノムbuild 1.1；2004年8月30日/Genbank 配列番号：NW_139889。
【図４】マウスおよびヒトのANGPTL4調節領域（配列番号:16、17）を、ベクター内のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ/luc）をコードする核酸配列に機能的に連結した。得られたレポーターベクターを、PPARδ発現プラスミドと共に宿主細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした宿主を、100 nM PPARδアゴニスト{2-メチル-4-[4-メチル-2-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チアゾール-5-イルメチルスルファニル}-フェノキシ}-酢酸で処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。A：PPARδ発現ベクターおよびヒトまたはマウスのいずれかのANGPTL4調節領域ルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクションした細胞における、ルシフェラーゼ発現の誘導倍率を示す図である。ルシフェラーゼは、レポーターのみを発現する細胞と比較した活性化倍率として表す。これらのデータから、マウスANGPTL4調節領域およびヒトANGPTL4調節領域がPPARδにより制御されることが示される。B：マウスレポーター構築物内のPPREを部位特異的突然変異誘発により特異的に欠失させた、同様の実験を示す図である。ルシフェラーゼは、PPARδおよびルシフェラーゼレポーターを同時にトランスフェクションした細胞における、アゴニストによる活性化倍率として表される。PPREの欠失により、PPARδによって媒介される転写活性化が失われる。
【図５】PPARα（A)またはPPARγ(B)発現ベクターおよびヒトまたはマウスのいずれかのANGPTL4調節領域ルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクションした細胞における、ルシフェラーゼ発現の誘導倍率を示す図である。ANGPTL4調節領域はまた、PPARγおよびPPARα制御も媒介する。マウスおよびヒトのANGPTL4調節領域ルシフェラーゼレポーターベクターを、PPARαまたはPPARγ発現ベクターと共に、宿主細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、200μM PPARαアゴニスト2-[4-(4-クロロベンゾイル)-フェノキシ]-2-メチルプロパン酸［フェノフィブリン酸］、または100 nM PPARγリガンド5-[[4-[2(メチル-2-ピリジニルアミノ)エトキシ]フェニル]-メチル]-2,4-チアゾリジンジオン［ロシグリタゾン］で処理した。ルシフェラーゼは、レポーターのみを発現する細胞に対する活性化倍率として表す。
【図１】
2005287509.tif 000007
【図２】
2005287509.tif 000008
【図３Ａ】
2005287509.tif 000009
【図３Ｂ】
2005287509.tif 000010
【図４】
2005287509.tif 000011
【図５】
2005287509.tif 000012
【配列表】
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