(57)【要約】【課題】検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがなく、ハイブリダイゼーション並びに標識の修飾工程におけるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の検出方法。【解決手段】ＤＮＡチップの表面にプローブを固定した後、疎水性の表面処理剤にて表面処理して、チップ基板表面を疎水性とすることで、ハイブリダイゼーシヨンを行なう際に目的検体とプローブが反応し易くなり、またハイブリダイゼーシヨンの前後にかかわらず、プローブへの標識の修飾確率が向上し、いずれの検出方法でもその検出感度が著しく向上する。【選択図】        図１
2005017233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板又はその類似物表面にプローブ核酸を有するバイオチップを用いて生化学反応体を検出する方法において、プローブ核酸が配置される表面に表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性又は電荷あるいはその両方を付与し、その後、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程か、あるいは前記ハイブリダイゼーションする工程とその後プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に標識を修飾する工程を施す生化学反応体の検出方法。
【請求項２】
基板又はその類似物表面にプローブ核酸を有するバイオチップを用いて生化学反応体を検出する方法において、プローブ核酸が配置される表面に表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性又は電荷あるいはその両方を付与し、その後、該チップのプローブ核酸に標識を修飾する工程を有し、さらに該プローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程か、あるいは前記ハイブリダイゼーションする工程とその後プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に別の標識を修飾する工程を施す生化学反応体の検出方法。
【請求項３】
プローブ核酸がスペーサーを介して基板又はその類似物表面に配置される請求項１又は請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項４】
表面処理剤を用いた表面処理が、バイオチップを表面処理剤溶液に浸漬する請求項１又は請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項５】
表面処理剤を用いた表面処理が、表面処理剤溶液をバイオチップ表面に滴下又は噴霧した後に飽和水蒸気雰囲気で保持する請求項１又は請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項６】
表面処理剤が、直鎖アルキル化合物誘導体または芳香族化合物誘導体である請求項１又は請求項２に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項７】
表面処理剤が、ＥＴ、ＨＴ、ＯＤＴ、ＭＨ、ＴＴのいずれかの溶液である請求項６に記載の生化学反応体の検出方法。
【請求項８】
基板又はその類似物表面にプローブ核酸を有し、プローブ核酸が配置される表面が、表面処理剤を用いた表面処理により疎水性又は電荷あるいはその両方を具備したバイオチップ。
【請求項９】
プローブ核酸がスペーサーを介して基板又はその類似物表面に配置される請求項８に記載のバイオチップ。
【請求項１０】
表面処理剤を用いた表面処理が、ＥＴ、ＨＴ、ＯＤＴ、ＭＨ、ＴＴのいずれかの溶液を用い、バイオチップを該溶液に浸漬するか、バイオチップ表面に該溶液を滴下又は噴霧した後に飽和水蒸気雰囲気で保持する請求項８に記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の改良に係り、バイオチップのプローブ核酸が配列された基板に、表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性又は電荷あるいはその両方を付与することで、プローブ核酸と生化学検体とのハイブリダイゼーションや標識の修飾の工程における処理自体の確実性が大きく向上し、目的の生化学検体の検出が容易に高感度、高精度化できる生化学反応体の検出方法とバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオチップによる遺伝子検出の基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣ（５’→３’）のＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧ（３’→５’）の配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで目的ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発するものを検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
蛍光標識を用いるＤＮＡマクロアレイなどにおいて、蛍光検出におけるバックグラウンドノイズを低減し、検出感度と再現性を向上させるため、蛍光色素のクエンチング特性（蛍光分子が他の分子（消光剤）と衝突すると励起エネルギーが散逸して蛍光が消光する）を利用して、非特異吸着した蛍光色素誘導体のバックグラウンドノイズを軽減する方法が提案（特開２００３−８４００２）されている。
【０００６】
また、プローブＤＮＡの配列された基板表面に近接して光学的に各種標識を検出・識別する方法として、上記の蛍光検知法のほか、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、顕微鏡法、イメージング処理法などが提案されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８４００２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上述のＤＮＡを初めとして検出対象となる生化学検体には、ＲＮＡ及び核酸類似構造物などの多種多様の構造物が想定される。これらの生化学検体を効率よく検出するには、プローブとして機能する所要の塩基配列を有するＤＮＡやＲＮＡ構造体、ＰＮＡ構造体を所要のガラス基板などの基板上に配列してチップ化し、かかるバイオチップを基本単位として生化学検体とのハイブリダイゼーション操作を施し、当該ハイブリダイゼーションを完了した目的のプローブと生化学検体との複合体（生化学反応体）を確実に検出する必要がある。
【０００９】
検体側に蛍光標識を施す蛍光法を用い、前記バイオチップにハイブリダイゼーションを行いハイブリダイズしたＤＮＡを検出する方法では、蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記ハイブリダイゼーション並びに標識の修飾効率が異なること、さらに種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【００１０】
この発明は、前記バイオチップを用いた生化学検体の検出方法の問題に鑑み、検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがなく、ハイブリダイゼーション並びに標識の修飾工程におけるそれぞれの施術並びに効率の精度を高め、最終的に目的検体の検出精度の向上が可能となる生化学反応体の検出方法とバイオチップの提供を目的としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、目的の生化学検体の検出において、容易に高感度、高精度化を実現できる生化学反応体の検出方法とバイオチップを目的に、プローブ核酸と生化学検体とのハイブリダイゼーションや標識の修飾の工程における前記処理自体を確実に実施し得る条件や方法について種々検討したところ、ＤＮＡチップ上のプローブは、２次元的に配置されているのではなく、３次元的に配置されており、この３次元構造がＤＮＡチップの検出感度に大きな影響を及ぼすものと考えた。
【００１２】
発明者らは、ＤＮＡチップの表面にプローブを固定すると、短いプローブの場合は起きている状態であるが、長いプローブの場合は、基板に沿つて寝たような形になると推測し、基板に表面処理を施すことにより、ＤＮＡプローブが基板上に対して寝ないようにすることに着目した。
【００１３】
そこで、発明者らは、ＤＮＡチップの表面にプローブを固定した後、疎水性の表面処理剤にて表面処理して、チップ基板表面を疎水性としたところ、ハイブリダイゼーシヨンを行なう際、目的検体とプローブが反応し易くなり、いずれの種の検出方法でもその検出感度が著しく向上することを知見した。
【００１４】
さらに、発明者らは、前記表面処理によって、ハイブリダイゼーシヨンの前後にかかわらず、プローブへの標識の修飾確率が向上して、これも検出感度が向上すること、また、プローブと基板の間に間隔を設けるために脚部、スペーサーを導入する場合も前記の表面処理が有効に機能して前記と同様の作用効果が得られることを知見し、この発明を完成した。
【００１５】
すなわち、この発明は、基板又はその類似物表面にプローブ核酸を有するバイオチップを用いて生化学反応体を検出する方法において、プローブ核酸が配置される表面に表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性（撥水性）又は電荷あるいはその両方を付与したバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程か、あるいは前記ハイブリダイゼーションする工程とその後プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に標識を修飾する工程を施すことを特徴とする生化学反応体の検出方法である。
【００１６】
また、この発明は、基板又はその類似物表面にプローブ核酸を有するバイオチップを用いて生化学反応体を検出する方法において、プローブ核酸が配置される表面に表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性又は電荷あるいはその両方を付与したバイオチップを用い、該チップのプローブ核酸に標識を修飾する工程を有し、さらに該プローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程か、あるいは前記ハイブリダイゼーションする工程とその後プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に別の標識を修飾する工程を施すことを特徴とする生化学反応体の検出方法である。
【００１７】
さらに、発明者らは、上記構成の発明において、
プローブ核酸がスペーサーを介して基板又はその類似物表面に配置される構成、
表面処理剤を用いた表面処理が、バイオチップを表面処理剤溶液に浸漬する構成、
表面処理剤を用いた表面処理が、表面処理剤溶液をバイオチップ表面に滴下又は噴霧した後に飽和水蒸気雰囲気で保持する構成、
表面処理剤が、直鎖アルキル化合物誘導体または芳香族化合物誘導体である構成、
表面処理剤が、ＥＴ（Ｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、ＨＴ（Ｈｅｘａｎｅｔｉｏｌ）、ＯＤＴ（ｎ−Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）、ＭＨ（Ｍｅｒｃａｐｔｏｈａｘａｎｏｌ）、ＴＴ（α−Ｔｏｌｕｅｎｔｈｉｏｌ）のいずれかの溶液である構成、の各生化学反応体の検出方法を併せて提案する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この発明の表面処理による生化学反応体の検出において、検出感度の増強効果が得られる機構の概念は、図１に示すとおりである。バイオチップの表面にプローブを固定することを想定すると、３０ｍｅｒ以下の短いプローブでは図１Ｂの表面処理済の例と同様に立っている（起きている）状態であるが、例えば５０〜６０ｍｅｒ以上の長いプローブの場合は、図１Ａに示すようにチップの表面に沿って寝たような形になると推測される。
【００１９】
バイオチップの表面にプローブを固定した後、図１Ｂに示すように疎水性の表面処理剤を用いて表面処理することにより、チップ表面に疎水性を付与すると、該表面とプローブとの分子間力により当該プローブが起きた状態になるものと考えられる。その結果、ハイブリダイゼーションを行なう際、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子（Ｔａｒｇｅｔ）が存在すると、ターゲットとプローブが反応し易くなり、目的検体の検出感度がよくなるものと考えられる。従って、より低濃度のサンプリング検体とのハイブリダイゼーションでも検出強度が増大し、高感度な検出が可能になる。
【００２０】
また、実施例に示すＳＰＲ分光法を採用する場合、ハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾をする際は、表面処理によりプローブが起きているため、同様に金コロイドとプローブの金コロイド修飾部位との反応が起こり易くなり、金コロイド修飾量の増大により、高感度な検出が可能となると考えられる。従って、前記ハイブリダイゼーションと修飾量の各増大効果に加えてこれらの相乗効果によって、より高感度、高精度の検出が可能となる。
【００２１】
さらに、前記バイオチップの構成で、プローブとチップ表面の間に脚部（スペーサー）を導入することにより、プローブ部分がより一層目的遺伝子と反応し易くなるものと想定したバイオチップの構成の場合、これに前記表面処理を施すと、図１Ｂに示す作用効果が同様に発揮され、スペーサーを配置したことが極めて効果的に作用して高感度、高精度の検出に著しい向上が得られる。なお、脚部、スペーサーは、生化学検体と相補的に結合する主要部位とは無縁であり、適宜の長さとすることから、必ずしも塩基等の配列である必要はなく、公知の核酸類似構造物としたり、前記の基板との隙間を設けるために他の分子と置換したり、種々構成を採用できる。
【００２２】
この発明による生化学反応体の検出方法は、バイオチップのプローブ核酸が配置される表面に表面処理剤を用いた表面処理を行った後、該チップのプローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程を実施することで上述の検出感度の増強効果が得られる。また、前記ハイブリダイゼーションする工程と、その後にプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に標識を修飾する工程を施すことにより、上述の検出感度の増強効果が得られる。
【００２３】
また、この発明による生化学反応体の検出方法は、同様に表面処理を行った後、該チップのプローブ核酸に標識を修飾する工程を実施し、さらに該プローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程を実施することで上述の検出感度の増強効果が得られる。また、前記ハイブリダイゼーションする工程と、その後にプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に別の標識を修飾する工程を施すことにより、上述の検出感度の増強効果が得られる。
【００２４】
発明者らは、表面処理剤としては、実施例には、エタンチオール（Ｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、ヘキサンチオール（Ｈｅｘａｎｅｔｉｏｌ）、メルカプトヘキサノール（Ｍｅｒｃａｐｔｏｈａｘａｎｏｌ）、ベンジルメルカプタン（Ｂｅｎｚｙｌ  Ｍｅｒｃａｐｔａｎ）、オクトデカンチオール（Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）の５種類を示すが、ＥＴ、ＨＴ、ＯＤＴのように同様基で炭素鎖長の異なるもの、水酸基が導入された構成など、溶液としてバイオチップの基板表面に疎水性（撥水性）又は電荷あるいはその両方を付与できるものであれば、これらに限定されることなく、直鎖アルキル化合物誘導体または芳香族化合物誘導体に属する材料より、適宜選択、利用可能であることを確認した。
【００２５】
詳述すると表面処理剤は、後述の実施例で明らかにするように検出感度の増強に、炭素鎖が増えるほど増強効果があり、また、ＯＨ基により効果が増強される傾向にある。例えば、他の表面処理剤には、ブタンチオール（１−Ｂｕｔａｎｅｔｔｈｉｏｌ）、デカンチオール（１−Ｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ）、１−１０  Ｄｅｃａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ、ニトロベンゼンチオール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｔｈｉｏｌ）、アミノエタンチオール（Ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ）、メルカプトプロピオン酸（Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、メトキシベンゼンチオール（Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｔｈｉｏｌ）、アミノチオフェノール（Ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）などがある。
【００２６】
この発明において、生化学検体はＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、核酸類似構造物は、文字どおりの核酸に類似した構造物であり、例えば核酸のリボースあるいはリン酸ジエステル部位を修飾した分子やリボース−リン酸骨格をアミド結合に置き換えたペプチド核酸（ＰＮＡ）等がある。
【００２７】
この発明において、プローブ核酸は、ＤＮＡとＲＮＡ及び核酸類似構造物をいい、例えば、核酸類似構造物としては、上記と同様である。塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、例えば本来的に標識が修飾し難い塩基数が５０あるいは６０以上のものが検出精度の向上や検出時のノイズの低減に望ましく、さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００２８】
この発明において、プローブ核酸の構成は、公知のいずれの形態であっても採用できる。また、検出精度を高めるためにプローブに立体的な構造を与え、あえてハイブリダイズし難くするループ構造を取らせることが可能で、プローブＤＮＡやＲＮＡにループ構造を与えるには、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、形成方法も採用できる。
【００２９】
この発明において、バイオチップを形成するための基板又はその類似物には、純然たる板の基板の他、エッチングなどで溝や凹部などを形成して所要の凹部又は凸部を使用する基板構成や、基板などにピン等の突起物を形成した構成、棒や立方体などの表面等を利用する形態、構成など、それらの表面の所要箇所に電極を形成でき、プローブの配列やハイブリダイゼーションが可能であれば、採用する標識などの検出・識別方法等に応じて、種々の形態を採用することが可能である。
【００３０】
この発明において、基板としては、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等の硬質材料の他、メンブラン（例えばニトロセルロースなど）等の材料も採用可能で、また積層基板などプローブ核酸の配列が実施可能な基板であればいずれの材質、構成の基板も採用できる。また、基板に電極など種々の薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。
【００３１】
バイオチップの基板等の電極や表面にプローブ核酸を配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば電極膜上を酸や純水で洗浄後、プローブ核酸と緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００３２】
緩衝液としては、例えばＫＨ２ＰＯ４とＫ２ＨＰＯ４を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＢＳや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００３３】
バイオチップのプローブ核酸が配置される表面に、表面処理剤を用いた表面処理によって疎水性又は電荷あるいはその両方を付与するが、処理方法としては、バイオチップの構成や形態に応じて種々の方法が適宜採用でき、例えば、バイオチップを表面処理剤溶液に浸漬したり、該溶液をバイオチップ表面に滴下又は噴霧した後に飽和水蒸気雰囲気で保持する等の手段が採用できる。
【００３４】
また、表面処理剤は、上述のように浸漬、滴下、噴霧方法などで利用するために溶液として利用され、溶媒としては、水、エタノールなどがあり、濃度としては、特に限定しないが、５０μＭ〜１ｍＭが望ましい。
【００３５】
この発明において、プローブ核酸に生化学検体をハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に生化学検体と緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。前記の緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。
【００３６】
ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後に２本鎖を形成したプローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に標識を修飾する工程は、文字どおり２本鎖を形成したところのプローブ核酸か生化学検体、あるいはそれぞれに所要の標識を修飾するもので、２本鎖を形成して複合体となっている両者の結合部に選択的に入り込むようなインターカレーターを採用したり、前記標識と共に用いたりすることも可能である。
【００３７】
この発明において、前記標識には、Ｓｉを含む金属粒子、磁性体粒子、セラミックス粒子、蛍光標識、蛍光色素、色素、化学発色体、半導体あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブ核酸又は生化学検体に修飾できるもの、さらに前記の各種標識で再修飾できればいずれのものも利用できる。
【００３８】
この発明において、上述の各種標識をプローブ核酸に修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００３９】
また、プローブ核酸の末端にビオチンを修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属やセラミックス等の微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブ核酸の末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした前記微粒子等を抗原−抗体反応を利用して修飾することが可能である。
【００４０】
さらに、生化学検体に前記各種の標識を修飾することも可能であり、修飾方法は、当該検体の所要箇所を適宜標識化できればよく、上述の公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。もちろん、生化学検体に標識を修飾しない場合もある。
【００４１】
生化学反応体の検出方法としては、ハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成したプローブ核酸と生化学検体との複合体で、プローブ核酸又は生化学検体あるいはその両方に予めあるいはハイブリダイゼーション後に修飾された標識を有した該複合体を検出するが、公知の電気的、磁気的、光学的手法のいずれもを採用できる。例えば、光学的な方法には、光散乱法、ＳＰＲ分光法、化学発色法、蛍光検知法、顕微鏡法、イメージング処理法などがある。
【００４２】
光散乱法は、金属粒子やセラミックス微粒子標識において、微粒子が反射する光で特定波長光を発したり、レーザー光による散乱光の検知を可能にするもので、一般的な構成例を説明すると、例えばこの発明による金薄膜を設けた検出チップ基板をプリズム上に載置し、Ｈｅ−Ｎｅレーザー光をプリズムの一方側より基板裏面に入射してプリズムの他方側へこれを全反射させるように条件設定することで、検出チップ基板を上面から観察するＣＣＤカメラ側に散乱光を検出することができる。
【００４３】
ＳＰＲ分光法は、貴金属薄膜表面における屈折率変化を検出するもので、例えばガラス基板上に金電極を形成し、金薄膜電極上にプローブ核酸を固定化し、プローブ核酸が検体中の目的ＲＮＡなどの核酸類とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成すると、金薄膜電極上の屈折率が変化するためにＳＰＲ角（反射率が最小となる入射角度）がシフトするが、ＳＰＲ角のシフトはハイブリダイゼーションした目的検体の量と対応するために、ＳＰＲ測定によって目的検体の定量的な解析が可能となる。
【００４４】
化学発色法は、免疫組織染色方法が応用できる。これは予め４つの結合部位をもつアビジンと複数箇所でビオチン化されたペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を適当な割合で混合し、多数のＨＲＰを含み一部にアビジンのビオチン結合部位を残す複合体（ＡＢＣ）を形成させて、この複合体（ＡＢＣ）と予め組織中の標的抗原と結合したビオチン化抗体とを反応させて標的抗原を検出するもので、例えばプローブにビオチンで修飾した箇所を用意することで容易に適用できる。また、ＡＰＲ法など公知の免疫組織染色方法も応用できる。
【００４５】
蛍光検知法は、種々の蛍光色素自体をプローブ核酸又は標識の所要部位に着設したり、又は蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり前述のごとく抗原−抗体反応を利用してプローブ核酸、生化学検体に修飾させたものを検出するが、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せた蛍光イメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されており、前記蛍光標識の種類やその蛍光自体の性状等、条件に応じて公知の検出方法や装置を適宜選定するとよい。また、蛍光でない色素も同様に検知できる。
【００４６】
顕微鏡観察法は、公知の蛍光や散乱光などの検出システムとして、顕微鏡とＣＣＤカメラを組み合せたイメージング検出システム、共焦点顕微鏡システム、金属顕微鏡等、また種々の光学装置やイメージング装置を併用した検出方法が提案されているが、これらをそのまま利用することが可能である。
【００４７】
イメージング処理法は、カメラ又は顕微鏡にてスキャニングした画像をディスプレイで目視で確認できるように拡大、鮮鋭化、着色化等、各種の公知の画像処理を施したり、あるいはコントラストや特定形状、寸法の粒子をソフトウェアー的に検出するために公知の画像処理を施すなどの方法である。
【００４８】
【実施例】
実施例１
バイオチップを作製するための基板にガラス基板を用い、これをアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面のエッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その後、所要パターンでレジスト層を設けた後スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、次いで約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００４９】
前記ガラス基板を濃硫酸中に１時間程度浸漬した後、超純水で洗浄した。その後、プローブＤＮＡの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチン基で修飾したプローブＤＮＡ（Ｐｒｏｂｅ０４、５μＭ溶液、日清紡製）を用いたプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．０）を前記基板上に滴下し、飽和水蒸気中で約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板のＡｕ膜に付着させてバイオチップとなした。
【００５０】
プローブＤＮＡを固定したバイオチップを、Ｒ−ＢＦＲ（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後、穏やかに乾燥した後、ＥＴ（５０μＭ）を約５μｌ滴下し、飽和水蒸気中で約１５時間放置して、ＥＴによる表面処理を施した。
【００５１】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）で洗浄後に、所要濃度（１０μＭ溶液）からなる検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を最終濃度が約１０μＭとなるように滴下し、約３時間放置して実施した。
【００５２】
ハイブリダイゼーションを完了したチップを、Ｒ−ＢＦＲで洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させて、金コロイド（ＢＢＩｎｅｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）を滴下し、１〜３時間飽和水蒸気中で放置して、金コロイド修飾を行った。
【００５３】
次に、検出チップを、Ｒ−ＢＦＲ溶液、超純水の順に洗浄した後、窒素ガスで乾燥して速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００５４】
以上の▲１▼ガラス基板への金薄膜の形成、▲２▼プローブの固定、▲３▼表面処理、▲４▼ハイブリダイゼーション、▲５▼金コロイド修飾、▲６▼ＳＰＲ測定の工程を行うが、まず、表面処理剤がＳＰＲ強度に及ぼす影響を調べるために、目的検体がなく（▲４▼工程でＨ−ＢＦＲ溶液の滴下のみ）でかつ金コロイド修飾を行わず、表面処理しない場合の比較例１（▲１▼▲２▼▲６▼）、表面処理した場合の実施例Ａ（▲１▼▲２▼▲３▼▲６▼）を実施した。
【００５５】
次に、表面処理の有無によるＳＰＲ強度の増強効果を調べるために、目的検体があり、表面処理しないでハイブリダイゼーションし金コロイド修飾しない場合の比較例２（▲１▼▲２▼▲４▼▲６▼）、さらに金コロイド修飾した場合の比較例３（▲１▼▲２▼▲４▼▲５▼▲６▼）を実施した。また、表面処理を行った処理例で、金コロイド修飾しない場合の実施例Ｂ（▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼▲６▼）、さらに金コロイド修飾した場合の実施例Ｃ（▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼▲５▼▲６▼）を実施した。
【００５６】
目的検体のない場合、表面処理を行ってもＳＰＲ強度は増加しなかった（実施例Ａと比較例１の対比）。しかしながら、目的検体がある場合、表面処理により、ＳＰＲ強度は比較例２（表面処理無）が１２０〜１２８ａ．ｕ．で、実施例Ｂ（表面処理有）が１９０〜２０８ａ．ｕ．と著しく増加した。
【００５７】
また、目的検体の存在特、金コロイド修飾しない場合、表面処理により１．６倍以上のＳＰＲ強度の増強が得られた（非処理の比較例２と表面処理を行う実施例Ｂの対比）。また、金コロイド修飾する場合、表面処理により１．８倍以上のＳＰＲ強度の増強が得られた（非処理の比較例３と表面処理を行う実施例Ｃの対比）。
【００５８】
この発明による表面処理により、目的検体がある場合、ＳＰＲ強度の増強が見られることが分かる。また、この増強は単にプローブに表面処理しただけでは、ＳＰＲ強度の増強が見られず、金コロイドの修飾の有無に依らず、ＳＰＲ強度の増強が見られ、金コロイド修飾した場合の増幅率の方が大きいことから、この発明による表面処理によるＳＰＲ強度の増強は、ハイブリダイゼーション効率の上昇とともに金コロイド修飾量の増大があったことによると推測できる。
【００５９】
実施例２
表面処理剤の種類による検出強度の変化を比較するため、下記の５種類の表面処理剤を選択し、それぞれ実施例１の実施例Ｃと同様の工程で処理し、ＳＰＲ測定を実施した。Ｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ（ＥＴ  ｎ＝２）、Ｈｅｘａｎｅｔｉｏｌ（ＨＴ  ｎ＝６）、Ｍｅｒｃａｐｔｏｈａｘａｎｏｌ（ＭＨ  ｎ＝６）、Ｂｅｎｚｙｌ  Ｍｅｒｃａｐｔａｎ（α−Ｔｏｌｕｅｎｔｈｉｏｌ：ＴＴ）、ｎ−Ｏｃｔａｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（ｎ＝１８：ＯＤＴ）。以上の実施例Ｄ１〜５（▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼▲５▼▲６▼）。
【００６０】
表面処理を行わない実施例１の比較例３と同様工程の比較例４のＳＰＲ強度を１とした場合、ＴＴが１．７７０、ＥＴが２．１０８、ＨＴが２．２６６、ＭＨが２．６６５、ＯＤＴが５．３０６の強度比が得られた。
【００６１】
従って、直鎖（炭素鎖数）が大きくなるほど、表面処理剤の効果が大きくなることが示された。これは、炭素数が大きいほど疎水性になり、プローブを起こす力が大きいためと思われる。また、ＭＨとＨＴは、炭素数が等しいが、ＭＨでは、ＯＨ基があるため、溶液中でマイナスに荷電しているプローブとの電気的反発力により、より効果が高かったものと推測される。
【００６２】
実施例３
実施例１は、いずれもハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行う工程における本発明の表面処理の影響を検討した。ここではハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾を行う場合の実施例Ｅ（▲１▼▲２▼▲３▼▲５▼▲４▼▲６▼）を実施例１の条件に準じて実施した。
【００６３】
なお、プローブには、プローブＰＴＰＧＰＴ配列品（日清紡製）を用い、これと完全相補の配列を有するＴＧＴをハイブリダイゼーションのターゲットとして使用した。また、表面処理剤としては、実施例２のＭＨを使用した。
【００６４】
上述のこの発明の表面処理を行わない以外は同じ検出工程の比較例５のＳＰＲ強度を１とした場合、この発明の実施例Ｅは、２．７４３倍のＳＰＲ強度の増強が見られた。すなわち、ハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾を行う場合もこの表面処理が有効であることが示された。
【００６５】
実施例４
実施例３と同様条件下で表面処理剤がＳＰＲ強度の定量性に及ぼす影響を検討した。検出工程は、実施例３のＭＨを使用し、ハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾を行う実施例Ｅの工程であり、プローブとターゲットの組合せには、実施例Ｆ（▲１▼▲２▼▲３▼▲５▼▲４▼▲６▼）がＰＴＰＧＰＴ用とＴＧＴ、実施例Ｇ（▲１▼▲２▼▲３▼▲５▼▲４▼▲６▼）がＰｒｏｂｅ６０Ｃと０−１９  Ｔａｒｇｅｔ６０を用いた。
【００６６】
ＳＰＲ測定結果を、ハイブリダイゼーション時のターゲット濃度とＳＰＲ強度比（ターゲット濃度が１０μＭの時のＳＰＲ強度を１とする）との関係を示すグラフに示す。図２Ａと図２Ｂは、実施例Ｆの場合であり、図中の黒四角が表面処理された場合、白色四角が表面処理なしの場合である。また、図２Ａはハイブリダイゼーション時のターゲット濃度が０〜１０μＭの場合、図２Ｂはより低濃度の１μＭまでの場合を示す。
【００６７】
また、図３Ａと図３Ｂは、実施例Ｇの場合であり、図中の黒四角が表面処理された場合、白色四角が表面処理なしの場合である。また、図３Ａはハイブリダイゼーション時のターゲット濃度が０〜１０μＭの場合、図３Ｂはより低濃度の１μＭまでの場合を示す。
【００６８】
プローブが異なる実施例Ｆ、実施例Ｇの両方とも同傾向を示したことから、この発明の表面処理による作用効果は、ＤＮＡプローブの塩基配列に依存しないことが示された。また、グラフに示すように定量性の立ち上がりが速いということは、より低濃度で強い強度が得られ、高感度な測定が可能であることを示しており、この表面処理がＳＰＲによる核酸検出に極めて効果的であることが確認された。
【００６９】
実施例５
表面処理剤としてＥＴ  １ｍＭを用い、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行う実施例１の実施例Ｃと同様の工程で処理し、ＳＰＲ測定に換えて原子間力顕微鏡（ＡＦＭ、ＪＯＥＬ製）による観察▲７▼を行なった（実施例Ｈ（▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼▲５▼▲７▼））。金コロイド数の計測は、ＡＦＭで３箇所撮影した写真（１０００ｎｍ×ｌ０００ｎｍ）を用いて計測し、データ化した。なお、プローブには、プローブＰＴＰＧＰＴ配列品を用い、これと完全相補の配列を有するＴＧＴをハイブリダイゼーションのターゲットとして使用した。
【００７０】
表面処理を施したサンプルのＡＦＭで撮影した写真を図４Ａに、非処理のサンプルを図４Ｂに示すように、表面処理を施すと金コロイドの修飾量が増加することが明らかであり、カウントした金コロイド量（個／μｍ２）は、表面処理を行うと８８０〜８９５で、非処理の８００〜８４０に対し約１０％の増量効果があることが分かった。
【００７１】
従って、表面処理剤によるＳＰＲ強度の増強に、金コロイド修飾量の増加が寄与していることが明らかである。
【００７２】
実施例６
表面処理剤としてＭＨ  １ｍＭを用い、ハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾を行う実施例３の実施例Ｅと同様の工程で処理し、ＳＰＲ測定に換えてＡＦＭによる観察▲７▼を行なった（実施例Ｉ（▲１▼▲２▼▲３▼▲５▼▲４▼▲７▼））。金コロイド数の計測は、ＡＦＭで３箇所撮影した写真（１０００ｎｍ×ｌ０００ｎｍ）を用いて計測し、データ化した。なお、プローブには、プローブＰＴＰＧＰＴ配列品を用い、これと完全相補の配列を有するＴＧＴをハイブリダイゼーションのターゲットとして使用した。
【００７３】
表面処理を施したサンプルのＡＦＭで撮影した写真を図５Ａに、非処理のサンプルを図５Ｂに示すように、表面処理を施すと金コロイドの修飾量が一様にかつ高効率で増加することが明らかであり、カウントした金コロイド量（個／μｍ２）は、表面処理を行うと８５０〜８５５で、非処理の７００〜７４０に対し２０％以上の増量効果があることが分かった。
【００７４】
ハイブリダイゼーション前に金コロイド修飾を行った場合も、この発明の表面処理により金コロイド修飾量の増加が観察されたことから、表面処理には、金コロイド修飾効率の向上作用があることが示された。
【００７５】
以上を総括すると、実施例５の実施例Ｈより、表面処理によるＳＰＲの増強の一因が、プローブの基板表面での構造変化による金コロイド修飾効率の増加であることが示される。また、表面処理剤はＥＴよりＭＨの方が効果が大きいにもかかわらず、ハイブリダイゼーション後の金コロイド修飾（ＥＴ処理）の方が、ハイブリダイゼーション前の金コロイド修飾（ＭＨ処理）と比べ、金コロイド修飾量が多かったことから、この発明の表面処理には、ハイブリダイゼーション効率向上効果もあると考えられる。
【００７６】
よって、この発明の表面処理によるＳＰＲ測定強度の増強効果は、金コロイド修飾量の増加とハイブリダイゼーション効率の向上の２つの効果の組み合わせによるものと考えられる。
【００７７】
実施例７
以上、ガラス基板表面に金薄膜を設けたバイオチップに表面処理を施したが、ガラス基板に金薄膜を成膜することなくガラスに直接プローブを固定する場合におけるこの発明の表面処理の有効性を検討した。
【００７８】
まず、ガラス基板表面を、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面エッチングを行い、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。次に、アミノ基修飾した後、無水マレイン酸と一定時間反応させた。
【００７９】
その後、チオール基を有する実施例１と同じ核酸プローブとマレイミドを用いて一定時間反応させ、結合固定した。これを超純水で洗浄後、１ｍＭのＨＴとマレイミドを用いて同様に一定時間反応させた後、超純水で洗浄し、窒素ガスで乾爆させた。
【００８０】
次に、実施例１に準じて、ハイブリダイゼーション、金コロイドの修飾、ＳＰＲ測定を行ない、これを実施例Ｊ（▲２▼▲３▼▲４▼▲５▼▲６▼）とした。比較として、上記核醸プローブの固定後、表面処理を行なわない比較例５（▲２▼▲４▼▲５▼▲６▼）を実施した。
【００８１】
その結果、比較例５のＳＰＲ強度を１とした場合、ＨＴによる表面処理を行なうことにより、実施例ＪのＳＰＲ強度は１．５２となり、ＳＰＲ強度が約１．５倍増強されたことを確認した。
【００８２】
実施例８
以上には、ガラス基板表面に金薄膜を設けるかそのまま使用したバイオチップに表面処理を施した例を示したが、ここではチップ基板に半導体シリコン基板を用いた場合の表面処理の有効性を検討した。
【００８３】
シリコン基板に直接、実施例７と同様の処理を施し乾燥させた後、チオール基を有する実施例１と同じ核酸プローブとマレイミドを用いて一定時間反応させ、結合固定した。これを超純水で洗浄後、１ｍＭのＨＴとマレイミドを用いて同様に一定時間反応させた後、超純水で洗浄し、窒素ガスで乾爆させた。
【００８４】
このように、実施例１に準じて、プローブの固定、表面処理、ハイブリダイゼーションを行なった後、金コロイドの換わりにストレプトアビジンをコートした蛍光色素を用い、プローブ核酸を蛍光修飾（▲８▼）した後、蛍光イメージング装置で、蛍光強度を測定（▲９▼）した。これを実施例Ｋ（▲２▼▲３▼▲４▼▲８▼▲９▼）とし、比較として、表面処理を行なわない比較例６（▲２▼▲４▼▲８▼▲９▼）を実施した。比較例６の蛍光強度を１とした場合、実施例Ｋの蛍光強度は２．１となり、蛍光強度が約２倍増強された。
【００８５】
また、シリコン基板を、実施例１の方法に準じて金薄膜を形成、プローブの固定、表面処理、ハイブリダイゼーションを行なった後、金コロイドの換わりにストレプトアビジンをコートした蛍光色素を用い、プローブ核酸を蛍光修飾後、蛍光イメージング装置で蛍光強度を測定した。これを実施例Ｌ（▲１▼▲２▼▲３▼▲４▼▲８▼▲９▼）とし、比較として、表面処理を行なわない比較例７（▲１▼▲２▼▲４▼▲８▼▲９▼）を実施した。比較例７の蛍光強度を１とした場合、実施例Ｌの蛍光強度は２．２となり、蛍光強度が約２倍増強された。
【００８６】
【発明の効果】
発明者らは、実施例１により、ＥＴによる表面処理がＳＰＲ測定強度の増強に有効であることを示した。また、実施例２では、各種表面処理剤を検討した結果、炭素直鎖数が大きいほど表面処理効果が大きいことを示した。実施例３では、表面処理効果がハイブリダイゼーション後の金コロイド修飾のみならず、ハイブリダイゼーション前の金コロイド修飾でも有効であることを示した。実施例５〜実施例８で、この発明の表面処理がＳＰＲのみならず、他の検出技術でも有効であることを示した。実施例４では、ＳＰＲ測定の定量曲線に及ぼす影響を示すことにより、この表面処理が高感度化に有効であることを証明した。以上の実施例より明らかなように、この表面処理によるＳＰＲ測定強度の増強効果は、従来法の２〜６倍であり、他の測定方法でも同様の効果が得られている。
【００８７】
また、発明者らは、実施例７、実施例８において、ガラス基板や半導体シリコン基板に直接、プローブを固定して表面処理を施し、蛍光修飾を施した場合も同様に、測定強度の増強が明確に現れることを立証しており、この発明の表面処理方法が、チップ基板材質や表面の薄膜の有無にかかわらず、有効であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バイオチップの表面のプローブと目的検体（ターゲット）とのハイブリダイゼーションを行なう際の機構を示す概念説明図であり、Ａは表面処理がない場合、Ｂは表面処理を行った場合を示す。
【図２】Ａ，Ｂは、ハイブリダイゼーション時のターゲット濃度とＳＰＲ強度比との関係を示すグラフである。
【図３】Ａ，Ｂは、ハイブリダイゼーション時のターゲット濃度とＳＰＲ強度比との関係を示すグラフである。
【図４】ＡＦＭで撮影したバイオチップの表面写真の模式図であり、Ａは表面処理された場合、Ｂは表面処理しない場合を示す。
【図５】ＡＦＭで撮影したバイオチップの表面写真の模式図であり、Ａは表面処理された場合、Ｂは表面処理しない場合を示す。
【符号の説明】
１  基板
２  プローブ
３  ターゲット
【図１】
2005017233.tif 000003
【図２】
2005017233.tif 000004
【図３】
2005017233.tif 000005
【図４】
2005017233.tif 000006
【図５】
2005017233.tif 000007