(57)【要約】【課題】  ヒト肝炎・肝硬変および肝癌の分子生物学的検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】  被験者から得た肝臓組織について、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAのレベルを測定することを含む、肝炎・肝硬変および肝癌の検出方法を提供する。【効果】  本発明により、分子生物学的手法に基づいた肝炎・肝硬変および肝癌の診断およびその悪性度の診断が可能となる。分子生物学的手法に基づくことにより、診断する医師の熟練度および主観的判断による誤差のない、客観的かつ精度の高い診断が可能となる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た肝臓組織について、ソルートキャリアファミリー7A2（Solute Carrier family 7A2：SLC7A2）およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAのレベルを測定することを含む、肝炎・肝硬変および肝癌の検出方法。
【請求項２】
上記で選択された少なくとも１つのmRNAについて定期的または不定期にそのレベルを繰り返して測定することをさらに含む請求項１記載の方法であって、そのmRNAレベルが、肝炎・肝硬変または肝癌を発症していない正常時のレベルに比べて上昇している場合には、肝炎・肝硬変または肝癌を発症していると判断することを特徴とする、上記方法。
【請求項３】
SLC7A2およびガレクチン1の両方のレベルを測定することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
被験者から得た肝臓組織について、ガレクチン1のmRNAレベルを測定することを含み、過去に測定した該被験者の肝炎・肝硬変患部組織におけるガレクチン1のmRNAレベルに比べて上昇している場合には、肝癌を発症していると判断することを特徴とする、肝癌の検出方法。
【請求項５】
被験者が肝炎ウイルス保有者であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
mRNAのレベルの測定をRT-PCR法により行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
SLC7A2のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブおよびガレクチン1のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブのうちの少なくとも一方のプローブを含有している、肝炎・肝硬変および肝癌を診断するためのマイクロアレイ。
【請求項８】
SLC7A2のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブおよびガレクチン1のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブの両方を含有している、請求項７記載の肝炎・肝硬変および肝癌を診断するためのマイクロアレイ。
【請求項９】
SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対およびガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対からなる群より選択される少なくとも１対のプライマー対を含む、肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット。
【請求項１０】
SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対およびガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対の両方を含む、請求項９記載の肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット。
【請求項１１】
SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対がヒトの該mRNAレベル測定用の配列番号１および配列番号２にそれぞれ示す配列を有するオリゴヌクレオチド対であり、ガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対がヒトの該mRNAレベル測定用の配列番号３および配列番号４にそれぞれ示す配列を有するオリゴヌクレオチド対である、請求項９または１０記載の肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎・肝硬変および/または肝癌の診断用プローブおよび診断用アレイ、ならびに新規診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は、死亡原因となり得る重篤な疾患であり、わが国においては、肝細胞癌の発症は、発症例の90%がC型またはB型肝炎に由来する。すなわち、肝細胞癌の発症前には、前癌症状として肝炎、さらにこれが進行した肝硬変を発症し、さらに進行して肝細胞癌へと至るという経過をたどる。したがって、C型またはB型肝炎ウイルス保有者は、肝細胞癌のリスクが高く、これらのハイリスク患者には、定期的（凡そ一月毎）に血清診断（AFP、PIVKA2検査）や、凡そ半年毎に腹部超音波、CT検査によるスクリーニングを実施して、肝炎・肝硬変の発症およびその進行の程度を検査している。しかしながら、その悪性度の確定診断のためには専ら手術組織や生検組織を用いた病理学的手法によらざるを得ないという現状があるが、かかる病理診断は、医師の熟練を必要とし、さらに医師による主観的判断に頼らざるを得ないため、診断に誤差が生じるという問題がある。
【０００３】
本発明者らは、従来より、肝炎・肝硬変および肝癌患部組織での遺伝子発現パターンについて研究し、肝炎・肝硬変および肝癌患部組織における種々の遺伝子発現の変動を検出していた(非特許文献１〜５参照のこと)。
【０００４】
【非特許文献１】Kondohら、Cancer Res., 59: 4990-6, 1999
【非特許文献２】Shudaら、Anticancer Res., 20: 2489-98, 2000
【非特許文献３】Tanakaら、Biochim.Biophys.Acta, 1536: 1-12, 2001
【非特許文献４】Kondohら、Anticancer Res., 21: 2429-34, 2001
【非特許文献５】Shudaら、J.Hepatol., 38: 605-614, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような診断の誤差の問題を解決し得る、肝炎・肝硬変および肝癌の悪性度を診断するための組織学的な病理判断以外の手法、例えば分子生物学的手法が必要である。
【０００６】
従って本発明は、肝炎・肝硬変および肝癌の悪性度を診断するための分子生物学的手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、分子生物学的手法を用いて肝細胞癌（HCC）で特異的に発現の変化する遺伝子検索を行い、既に30種以上の遺伝子の同定と細胞生物学的な発現様式の検討を行ってきた。その過程において、HCCで発現の変化する遺伝子群には、リボソーマル蛋白質(Rp)、翻訳開始因子(eEF)、糖代謝、ガレクチン(galectin)、小胞体ストレス系(ATF6、GRP78、gp96)等が見い出されていたが、それらを発現様式で分類すると、組織学的分化度、細胞密度、増殖速度、血清刺激アミノ酸要求性、前癌病変（肝炎、肝硬変）などを反映して変化するもの、および、これらの影響を全く受けずにHCCで専ら恒常的に活性化しているものに大別されることがわかった。従って、一概に肝臓癌部または非癌部で活性化する遺伝子として分類されるものであっても、その中には異なる細胞生物学的性質や生育環境を反映して変動するものが含まれていることが示唆されていた。
【０００８】
これら癌化形質を表す発現遺伝子は、前癌状態、組織学的分化度や増殖速度など、種々の悪性化の指標となり得る、いわゆるマーカー遺伝子であり、これらのカスタムマイクロアレイを作製し、生検や手術摘出組織における遺伝子発現を一括して検索することができれば、単独の遺伝子発現を調べるよりも、より正確にその肝癌組織の悪性度を評価することが可能となる。従来、生検組織や手術摘出組織の悪性度の診断は、専ら医師の熟練および主観的判断に委ねられていたが、このカスタムマイクロアレイを用いれば、それに依存しない客観的評価が可能となると考えられる。
【０００９】
また、このカスタムマイクロアレイは、今現在の患者組織の評価に役立つばかりでなく、多数の肝癌患者サンプルの発現パターンをプールして、予後や治療成績などの臨床情報と照合して多変量解析処理を行うことにより、各症例の予後、治療の感受性にマッチした遺伝子発現パターンの分類およびデータベース化が可能となり、将来的にはその情報とマイクロアレイ解析を組み合わせた患者の予後判定、さらにはオーダーメード医療の実現に有効な補助手段となり得ると考えられる。
【００１０】
本発明者らはさらに、ヒト肝細胞癌で特異的に発現の変化する遺伝子群の検討を行い、低分化型ヒト肝細胞癌(HCC)では小胞体ストレス関連転写因子ATF6が活性化されており、これによってアミノ酸トランスポーターの一つである、ソルートキャリアファミリー7A2（Solute Carrier family 7A2：本明細書中、SLC7A2と称するが、一般にはCationic Aminoacid Transporter 2と称される場合もあり、CAT2とも称する）の発現の低下とアルギニン吸収の抑制が引き起こされ、癌細胞の飢餓耐性能を促進することが判明した。これらの事実から、肝炎、肝硬変から肝細胞癌に至る過程でアルギニンを始めとするアミノ酸代謝系の著しい変化が引き起こされていることが強く示唆された。
【００１１】
そこで、多くのアミノ酸トランスポーターを中心とした遺伝子の発現動向を前癌状態およびHCCの悪性化との関連について検討し、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン１遺伝子の発現が肝細胞癌や前癌病変の存在を反映して推移することを明らかにした。
【００１２】
すなわち、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン１の発現は正常肝組織よりもHCC患者の非癌部（肝硬変（LC）または肝炎（CH））において発現が有為に高く、前癌状態のマーカーとして機能した。さらにガレクチン1は非癌部（LC/CH）よりも癌部（HCC）で有意に発現が高かった。一方、SLC7A2/CAT2は非癌部（LC/CH）よりも癌部（HCC）において有意に低発現であることが観察された。これらは肝癌患者の癌部と非癌部を明確に区別するマーカーとして機能し得る。
【００１３】
したがって、本発明は、以上の知見に基づき、以下の態様：
１．被験者から得た肝臓組織について、SLC7A2およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAのレベルを測定することを含む、肝炎・肝硬変および肝癌の検出方法；
２．上記で選択された少なくとも１つのmRNAについて定期的または不定期にそのレベルを繰り返して測定することをさらに含む上記１記載の方法であって、そのmRNAレベルが、肝炎・肝硬変または肝癌を発症していない正常時のレベルに比べて上昇している場合には、肝炎・肝硬変または肝癌を発症していると判断することを特徴とする、上記方法；
３．SLC7A2およびガレクチン1の両方のレベルを測定することを含む、上記１または２記載の方法；
４．被験者から得た肝臓組織について、ガレクチン1のmRNAレベルを測定することを含み、過去に測定した該被験者の肝炎・肝硬変患部組織におけるガレクチン1のmRNAレベルに比べて上昇している場合には、肝癌を発症していると判断することを特徴とする、肝癌の検出方法；
５．被験者が肝炎ウイルス保有者であることを特徴とする、上記１〜４のいずれかに記載の方法；
６．mRNAのレベルの測定をRT-PCR法により行うことを特徴とする、上記１〜５のいずれかに記載の方法；
７． SLC7A2のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブおよびガレクチン1のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブのうちの少なくとも一方のプローブを含有している、肝炎・肝硬変および肝癌を診断するためのマイクロアレイ；
８． SLC7A2のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブおよびガレクチン1のmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブの両方を含有している、上記７記載の肝炎・肝硬変および肝癌を診断するためのマイクロアレイ；
９． SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対、およびガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対からなる群より選択される少なくとも１対のプライマー対を含む、肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット；
１０．SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対およびガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対の両方を含む、上記９記載の肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット；
１１．SLC7A2のmRNAレベルを測定するためのプライマー対がヒトの該mRNAレベル測定用の配列番号１および配列番号２にそれぞれ示す配列を有するオリゴヌクレオチド対であり、ガレクチン1のmRNAレベルを測定するためのプライマー対がヒトの該mRNAレベル測定用の配列番号３および配列番号４にそれぞれ示す配列を有するオリゴヌクレオチド対である、上記９または１０記載の肝炎・肝硬変および肝癌診断用キット；
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、分子生物学的手法に基づいた肝炎・肝硬変および肝癌の診断およびその悪性度の診断が可能となる。分子生物学的手法に基づくことにより、診断する医師の熟練度および主観的判断による誤差のない、客観的かつ精度の高い診断が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の第1の態様は、被験者から得た肝臓組織のSLC7A2およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAのレベルを測定し、そのレベルが正常肝臓組織のレベルに比べて上昇している場合には、肝炎・肝硬変および肝癌であると診断することを特徴とする、肝炎・肝硬変および肝癌の診断方法に関する。ここで、正常肝臓組織のレベルと比較する場合、肝炎・肝硬変および肝癌のいずれの疑いもない肝臓組織についても被験者の組織と同様の条件下でmRNAレベルを測定し、その値と比較するとよい。ここで、正常肝臓組織は、他の個体に由来するものでもよく、その場合は複数、好ましくは5検体以上、さらに好ましくは10検体以上の正常肝臓組織についてmRNAレベルを測定して、その平均値または正常組織のmRNAレベルの分布範囲の上限を定めることができ、これと被験者の組織サンプルのmRNAレベルの値を比較するとよい。被験者の組織のmRNAレベルが、正常組織のmRNAレベルの分布範囲の上限を上回る場合、肝炎・肝硬変または肝癌であると判断することができる。あるいはまた、比較対象とする正常肝臓組織は、被験者に由来するものであってもよい。肝炎・肝硬変および肝癌は、肝炎ウイルス（特にC型またはB型）保有者の発症率が極めて高いため、該ウイルス保有者については定期的な診断が実施される。したがって、被験者本人の、過去の(例えば定期的診断における前回、例えば1ヶ月、6ヶ月、または1年前の)診断の際に生検により得た肝臓組織サンプルであって、該診断の結果、肝炎・肝硬変および肝癌のいずれの疑いもなかった際の組織サンプル中のmRNAレベルを測定し、その値と比較することもできる。また、定期的(例えば1ヶ月毎、6ヶ月毎、または1年毎)または不定期にmRNAレベルを繰り返し測定してモニターし、そのレベルの上昇が認められた場合には、肝炎・肝硬変または肝癌であると診断することができる。
【００１６】
SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1のいずれのmRNAも、肝炎・肝硬変および肝癌のいずれの患部組織でも正常組織に比べて増加しているため、これらの中から任意のものを１つ選択してそのmRNAレベルを測定するとよい。好ましくは、両方のmRNAレベルを測定するとよい。
【００１７】
特に、ガレクチン１は、正常組織に比べて、肝炎・肝硬変および肝癌のいずれの患部組織でもそのmRNAレベルが上昇しているが、肝癌の場合、肝炎・肝硬変の患部組織に比べてもそのmRNAレベルがさらに上昇しているので、上記方法においてガレクチン１のmRNAを測定した場合、そのmRNAレベルの上昇の程度で肝炎・肝硬変であるか、または肝癌であるかの診断も行うことができる。例えば、複数の正常組織サンプルについて該mRNAレベルを測定し、正常組織における該mRNAレベルの分布範囲の上限を定めることができ、さらに同様に肝炎・肝硬変は発症しているが肝癌には至っていない複数の患部組織サンプルについて該mRNAレベルを測定し、肝炎・肝硬変患部組織における該mRNAレベルの分布範囲の上限を定めることができる。被験者の肝臓生検サンプルについての該mRNAの測定値をこれらと比較して、その正常組織の分布範囲内にある場合には被験者は正常であり、肝炎・肝硬変患部組織における該mRNAレベルの分布範囲内にある場合には被験者は肝炎・肝硬変を発症しており、または、肝炎・肝硬変患部組織における該mRNAレベルの分布範囲の上限を上回っている場合には、被験者は肝癌であると診断することができる。あるいはまた、定期的または不定期に該mRNAレベルを繰り返して測定している被験者である場合、そのレベルの上昇の経過を記録しておき、正常時の測定レベルに比べて上昇した場合、肝炎・肝硬変を発症しているかまたはその可能性が高いと判断することができ、さらに肝炎・肝硬変と診断した際の測定レベルに対してさらに上昇している場合には、肝癌に至ったかまたはその可能性が高いと判断することができる。
【００１８】
mRNAレベルの測定方法は多数の方法が公知であり、例えば、リアルタイムPCR法またはRT-PCR法等で実施可能であり、かかるPCR法を用いて実施するためには、それぞれのmRNA配列に基づいて、それを特異的に増幅し得るプライマー対を設計する必要がある。ヒトのSLC7A2（CAT2）およびガレクチン1のいずれのmRNA配列も公知であるため、データベース等からこれらの配列情報を得ることができ、それに基づいてかかるプライマー対を設計することは当業者であれば容易に達成できる。プライマー対の例としては、SLC7A2（CAT2）のmRNAレベルを検出するための配列番号１および配列番号２、ならびにガレクチン1のmRNAレベルを検出するための配列番号３および配列番号４のそれぞれからなるプライマー対を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
本発明の第2の態様は、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAと特異的にハイブリダイズするプローブを含有する、肝炎・肝硬変および肝癌を診断するためのマイクロアレイである。特にSLC7A2（CAT2）mRNAについての特異的プローブおよびガレクチン1のmRNAについての特異的プローブの両方のプローブを含有するマイクロアレイが好ましい。かかるマイクロアレイは、被験者の生検肝臓組織サンプルから抽出したmRNA中に含まれる上記mRNAレベルの検出が可能であり、確実かつ簡便に、肝炎・肝硬変または肝癌の検出が可能となる。
【００２０】
かかるマイクロアレイはまた、今現在の患者組織の評価に役立つばかりでなく、多数の肝癌患者サンプルの発現パターンをプールして、予後や治療成績などの臨床情報と照合して多変量解析処理を行うことにより、各症例の予後、治療の感受性にマッチした遺伝子発現パターンの分類およびデータベース化を可能とし、将来的にはその情報とマイクロアレイ解析を組み合わせた患者の予後判定、さらにはオーダーメード医療の実現に有効な補助手段となりうる。
【００２１】
また、本発明の第3の態様は、肝炎・肝硬変および/または肝癌を診断するために用いるためのキットである。該キットは、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1からなる群より選択される少なくとも１つのmRNAのレベルを測定するためのプローブまたはプライマー対を含む。かかるプライマー対は、RT-PCRまたはリアルタイムPCR等のPCR法を応用したmRNAレベル測定法に用いることができるプライマー対である。例えば、SLC7A2（CAT2）のmRNAレベルを測定するための配列番号１および配列番号２、ならびにガレクチン1のmRNAレベルを測定するための配列番号３および配列番号４などが好ましい。該キットを用いて、対象とするmRNAのレベルを測定することができる。
【００２２】
本発明のいずれかの態様を用いて、肝炎・肝硬変および/または肝癌を検出する場合、公知の肝炎・肝硬変および/または肝癌の診断方法(例えば、病理学的手法)を併せて実施して、その診断をより確実なものとすることが可能である。
本発明の被験者は、哺乳動物であってよく、特にヒトが好ましい。
【実施例】
【００２３】
正常、前癌状態すなわち肝炎または肝硬変の患部、HCC患部のヒトの肝臓組織について、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1の２種のタンパク質のmRNA量を測定した。
【００２４】
組織からのRNAの抽出
ヒトHCCおよび非癌部肝組織（1〜2mgの凍結標本）を50mlの遠心管に取り、ISOGEN（ニッポンジーン）を10ml加えてPolytron (KINEMATICA)を用いてホモゲナイズした。クロロフォルム2mlを加えた後、20秒間激しく攪拌し、3000rpmにて15分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、４mlのイソプロパノールを添加後、再び攪拌して3000rpmにて20分間遠心した。ペレットを70%エタノールで洗浄、乾燥後、水に溶解し、吸光度をもとに定量した。
【００２５】
逆転写PCR反応 (RT-PCR)
RT-PCR法によって遺伝子発現を測定した。癌部、非癌部肝組織より抽出した全RNA4μgにオリゴｄT 400ng/μlを加え容量を7μlとし、65℃にて5分間加熱の後、氷上で急冷する。逆転写はSuperScript II RnaseH free Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いて行った。
【００２６】
反応液組成は以下の通りである。
全RNA４μｇ＋オリゴｄT 400ng/μl                    7   μl
10mM dNTP(dGTP, dATP, dCTP, dCTP各2.5mM)            1   μl
100mM  DTT                                          2   μl
５倍バッファー                                      4   μl
RNase inhibitor(40u/μｌ)                           1   μl
Reverse Transcriptase (200u/μｌ)                   1   μl
蒸留水                                              4   μl
42℃にて50分、70℃にて15分処理し、逆転写産物を得た。
【００２７】
続いて、PCRはTaq DNA polymerase (Invitrogen)を用いて行った。PCR反応液組成は以下の通りである。
逆転写産物サンプル                                  1   μl
10mM dNTP                                           0.2 μl
10倍バッファー                                      1   μl
50 mM MgCl2                                         0.6 μl
Taq polymerase                                      1   ユニット
32P ( dCTP)                                          0.37 MBq
各forward/reverseプライマー                       各0.25 μM
蒸留水を、全量10μlになるように添加する。
【００２８】
各標的逆転写産物（cDNA）に対するプライマーは表１に示す通りである。
【００２９】
【表１】
2005287400.tif 000002
【００３０】
上記表中、プライマー名の末尾にFとあるものはフォワードプライマー、Rとあるものはリバースプライマーである。
【００３１】
PCR増幅サイクルは、96℃にて2分後、94℃にて30秒/56℃にて30秒/72℃にて1分を20サイクル、そしてその後72℃にて2分とした。
【００３２】
得られたPCR産物を6%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ゲルをろ紙上に移し、ドライヤーにて乾燥させたのち、Imaging PlateおよびBas2000（フジフィルム）で現像および定量を行った。
【００３３】
各定量結果を、図１に示す。
ガレクチン１のmRNAレベルは、正常に比べて、肝炎・肝硬変患部組織で上昇する傾向を示し、さらに肝癌患部組織においてはさらに上昇していた（p<0.003）。
【００３４】
SLC7A2（CAT2）のmRNAレベルは、正常に比べて、肝炎・肝硬変患部組織で上昇したが（P=0.005）、肝癌患部組織においては肝炎肝炎・肝硬変患部組織より低下していた（p=0.015）。
【００３５】
以上より、ガレクチン１およびSLC7A2（CAT2）のmRNAについて、肝炎・肝硬変患部組織および肝癌患部組織においてのそのレベルの変動が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、SLC7A2（CAT2）およびガレクチン1それぞれについての、mRNAレベルの測定結果である。正常組織については3検体、肝炎・肝硬変組織および肝癌組織については11検体について、それぞれのmRNAレベルを測定している。なお、肝炎・肝硬変組織と肝癌組織とは同一の検体中のそれぞれの患部について測定した。全測定値に対してβ2ミクログロブリンのmRNAレベルを内因性コントロールとして用いた。
【図１】
2005287400.tif 000003
【配列表】
2005287400000001.app