(57)【要約】【課題】  コスト，加工性等の観点で実用的であり，かつ安定した血栓溶解性能を含む，抗血栓性を有する新規な高分子組成物，およびこれからなる医療用抗血栓性高分子材料を提供する。【解決手段】  片方のアミノ基およびカルボキシル基がフリーなアミノ酸Ｌ−リジンを一部とする新規な高分子組成物を医療用材料に固定化することで，血漿タンパク質吸着抑制，血液凝固阻害，血栓溶解性の三重の機能を有する新規な抗血栓性医療用材料を得る。この抗血栓性医療用材料を用いて製造されたカテーテル，人工血管，注射器等の血液接触材料は，血液の凝固を有効に抑制する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化１で示される新規な高分子組成物。
【化１】
2005048061.tif 000006
【請求項２】
下記の化２で示される新規な高分子組成物。
【化２】
2005048061.tif 000007
【請求項３】
XがCH３である請求項１及び請求項２記載の新規な高分子組成物。
【請求項４】
アミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をクロロホルム溶媒中でトリエチルアミンを触媒として，メタクリル酸クロリドと反応させ，反応液を濃縮，洗浄，乾燥させ，濾過，濃縮後，石油エーテル：ジクロロメタンの混合溶媒を用いて精製し，２，２´アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にテトラヒドロフランに溶かし，凍結−脱気−窒素置換を行い，減圧下でフリーラジカル重合した後，熱ヘキサンで洗浄し，トリフルオロ酢酸水溶液と反応させ，反応液を濃縮した後にジエチルエーテルで洗浄して溶液を得，該溶液を中和した後に半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて得た請求項１記載の高分子組成物。
【請求項５】
アミノ酸Ｌ−リジンのαアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶媒中でトリエチルアミンを触媒として，メタクリル酸クロリドと反応させ，反応液を濾過して減圧濃縮した後，ヘキサンで洗浄して固形物を得，該固形物を２，２´アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にエチルアルコールに溶かし，凍結−脱気−窒素置換を行い，減圧下でフリーラジカル重合した後，熱ヘキサンで洗浄し，水酸化ナトリウム水溶液と反応させ，反応液を中和した後に半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて得た請求項２記載の高分子組成物。
【請求項６】
基材として高分子材料を用いた医療器具であって，使用に際して，生体と接触する該医療器具の表面に請求項１及び請求項２記載の高分子組成物が固定化されていることを特徴とする医療用材料。
【請求項７】
医療用材料がカテーテル，人工臓器，血液回路，注射器，人工血管である請求項６記載の医療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，抗血栓性に優れた新規な高分子組成物及びそれを用いた医療用材料に関する。さらに詳しくは，合成高分子からなる，抗血栓性に優れた高分子組成物，及びそれらを用いた，生体と接触して使用するための医療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年，合成高分子材料は人工臓器，カテーテルをはじめとする医療用材料に広く用いられている。その代表的なものは，医療用高分子材料としてはポリエステル，ポリ塩化ビニル，ポリスチレン，ポリメチルメタクリレート，ポリテトラフルオロエチレン等の疎水性高分子や，ポリビニルアルコール，ポリエーテルウレタン，メタクリル酸２−ヒドロキシエチル，ポリアクリルアミド，セルロース等の親水性材料である。これら従来の材料の大部分は，主にその物理的，機械的特性に着目され，使用されている。
【０００３】
一方，医療技術の進歩に伴って，生体組織や血液と材料が接触する機会は増加しており，材料の生体親和性が大きな関心時となってきている。
【０００４】
材料表面での血液凝固の防止に関しては，従来ヘパリンに代表される抗血液凝固剤の連続投与が行なわれてきたが，最近では，脂質代謝異常，出血時間の延長，血小板の減少，アレルギー反応といった長期にわたるヘパリン投与の影響が問題になってきている。
【０００５】
これらの問題を解消するため，ヘパリンを必要としないあるいは使用量を低減させることのできる，抗血栓性を備えた血液接触材料の開発が望まれている。
【０００６】
これら血液接触材料の開発を目的として，従来から医療用器具の血液と接触する表面に高分子を基材とした，抗血栓性を有する表面修飾を施す方式が実施されている。それらの修飾は主として，表面に物理的・化学的特徴を有する高分子材料をコーティングし，血液の凝固を最小限に抑制する方法と表面に抗血栓性物質を含浸付着させた高分子材料をコーティングし，そこから抗血栓性物質を徐放させる方法に大別される。
【０００７】
前者に関する方法として，例えば特許文献１，特許文献２及び特許文献３が挙げられる。
【０００８】
特許文献１では，合成高分子中に血液適合性に優れるホスホリルコリン基，ならびに親水性と架橋性に優れるラクタム基を有する単量体単位やＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド単位を含む合成高分子が物理的・化学的処理で容易に不溶化され，血液適合性に優れた材料となることに着目したものである。血小板の粘着，凝集，血漿タンパク質の付着を抑制する効果のある２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）共重合体が長時間にわたって表面に保持されて血液の付着を最小限に抑制する効果が示されている。
【０００９】
特許文献２では，炭素数２〜１０のオレフィンモノマー及び炭素数４〜１５のジエンモノマーからなる群の中から選ばれる少なくとも一種のモノマーから誘導された繰り返し単位を有する少なくとも一種のポリマー１００重量部と，造核剤０．００３〜１．０重量部とからなる組成物を含有する材料がその表面に結晶領域と非結晶領域とからなるミクロ相分離構造を有し，もしくは吸着してもその脱着が容易という特徴に着目したものである。特許文献１同様，血液の付着を最小限に抑制する効果が示されている。
【００１０】
特許文献３は，リン酸カルシウムとチタンを主成分とする生体適合性多孔質結晶化ガラスにウロキナーゼや組織プラスミノーゲン活性化因子（以下，t−PAと省略する）などの線溶酵素を固定化することで，生体適合性に優れ，かつ血液中のプラスミノーゲンを連続的にプラスミンに変換しうる機能が付与された血栓溶解能を有する生体適合性材料に関する発明である。
【００１１】
後者に関する方法としては，例えば特許文献４が挙げられる。これは，（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−１−[Ｎ２−（（ＲＳ）−３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−アルギニル]―２−ピペリジンカルボン酸水和物（以下，アルガトロバン＜抗血栓剤として臨床的に用いられている。ヘパリンやウロキナーゼなどの抗血栓性物質とは異なり，アルコール等の有機溶剤に溶解する＞と記す）を２種以上の混合溶液で溶解して高分子基材に塗布する事により，表面からアルガトロバンが徐々に放出されることに着目したものである。
【００１２】
【特許文献１】特開平７−２８４５２８号
【特許文献２】特開平１０−９９４２６号
【特許文献３】特開平７−１０１８２８号
【特許文献４】特開２０００−０６０９６０号
【００１３】
以上に述べた血液接触材料は，血栓溶解性能を含む，安定した抗血栓性を発揮できる安価な医療用器具用高分子材料という観点からは十分ではない。また，ウロキナーゼは人尿，t−PAはヒトの子宮や血管壁などにごくわずかしかないことから，利用に関して高価で，人工高分子のように量産することも難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一般に，血液と接触した材料表面には，アルブミン，フィブリノーゲンといった血漿タンパク質が吸着し，これらタンパク質は，吸着により二次構造が変化する。この二次構造の変化により，さらなるタンパク質の吸着が促され，その結果，材料表面には多重のタンパク質吸着層が形成される。このような多重タンパク質吸着層が形成されると，これと接触する血小板が活性化され，最終的には血液を凝固させる。
【００１５】
また，血液の凝固は血液凝固系反応の活性化によって不溶性のフィブリンが形成される。凝固系には血液が接触して開始される内因系と，組織因子が血液内に流入して凝固因子と結合して開始される外因系があるが，いずれも最終的には，血液中のプロトロンビンから活性化された酵素トロンビンによって形成される。
【００１６】
また，形成された血栓は血栓線溶系（血栓溶解）によって分解されるが，その基本原理は酵素プラスミンによるフィブリンの分解である。プラスミンは血中では前駆体プラスミノーゲンとして存在し，組織プラスミノーゲンアクチベータやウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータといったプラスミノーゲン活性化因子によって活性化され，プラスミンとなり，フィブリンを分解する。
【００１７】
本発明者らは，合成高分子による抗血栓性材料に関わる一連の研究の結果，生体に無毒で安価なアミノ酸基を有する両性電解質の合成高分子が，血漿タンパク質の吸着を抑制する機能をもつことを見出した。
【００１８】
また本発明者らは，プラスミノーゲンが有するリジン結合部位に着目し，リジン基を有する両性電解質の合成高分子を固定化した材料は血液凝固を抑制するだけでなく，血栓溶解性能を有すると考えた。
【００１９】
すなわち本発明は，従来方式の課題である，「血栓溶解性能を含む，安定した抗血栓性を発揮できる医療器具用高分子材料の提供」を目的としたものであり，さらに詳細には，コスト，加工性等の観点で実用的であり，かつ十分な抗血栓性を有する新規な高分子組成物，およびこれからなる医療用抗血栓性高分子材料を提供する事を目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
そして，本願発明は上記課題を解決するために，（１）抗血栓性，生体安定性，経済性等を考慮し，新規な高分子組成物,
【００２１】
【化１】
2005048061.tif 000002
（２）また，新規な高分子組成物，
【００２２】
【化２】
2005048061.tif 000003
（３）XがCH３である（１）及び（２）記載の新規な高分子組成物，（４）アミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をクロロホルム溶媒中でトリエチルアミンを触媒として，メタクリル酸クロリドと反応させ，反応液を濃縮，洗浄，乾燥させ，濾過，濃縮後，石油エーテル：ジクロロメタンの混合溶媒を用いて精製し，２，２´アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にテトラヒドロフランに溶かし，凍結−脱気−窒素置換を行い，減圧下でフリーラジカル重合した後，熱ヘキサンで洗浄し，トリフルオロ酢酸水溶液と反応させ，反応液を濃縮した後にジエチルエーテルで洗浄して溶液を得，該溶液を中和した後に半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて得た（１）記載の高分子組成物，（５）アミノ酸Ｌ−リジンのαアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶媒中でトリエチルアミンを触媒として，メタクリル酸クロリドと反応させ，反応液を濾過して減圧濃縮した後，ヘキサンで洗浄して固形物を得，該固形物を２，２´アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にエチルアルコールに溶かし，凍結−脱気−窒素置換を行い減圧下でフリーラジカル重合した後，熱ヘキサンで洗浄し，水酸化ナトリウム水溶液と反応させ，反応液を中和した後に半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて得た（２）記載の高分子組成物，（６）基材として高分子材料を用いた医療器具であって，使用に際して，生体と接触する該医療器具の表面に（１）及び（２）記載の高分子組成物が固定化されていることを特徴とする医療用材料，（７）医療用材料がカテーテル，人工臓器，血液回路，注射器，人工血管である（６）記載の医療用材料に関する。
【００２３】
本発明における抗血栓性とは，血漿タンパク質の吸着抑制・血液凝固阻害・血栓溶解性の三種類であり，本発明の新規な高分子組成物はこれらの機能をすべて含む，抗血栓性に優れた高付加価値な合成高分子材料である。
【００２４】
また本発明の高分子組成物は，生体無毒なアミノ酸L−リジンの一方のアミノ基とカルボキシル基がイオン化されている，両性電解質の人工高分子である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の高分子組成物は，血漿タンパク質吸着抑制・血液凝固阻害・血栓溶解性を有する新規な抗血栓性高分子材料で，血液に接触する人工材料に広く応用が可能である。また，副作用があり高価で複合化の難しいヘパリン等の抗凝固剤ならびにウロキナーゼ等の血栓溶解剤を精製・単離して固定化後，抗血栓性を発現させる材料とは異なり，生体無毒なアミノ酸を一成分とする，血液適合性ならびに耐久性に優れた合成高分子を樹脂表面に容易に固定化することができる本発明は，経済性・安全性のみならず市場性にも優れており，新規な抗血栓性医療用表面処理材料として優れた適性を有している。
【実施例１】
【００２６】
以下，本発明を実施例に基づいて説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
アミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をクロロホルム中溶媒中でトリエチルアミンを触媒とし，メタクリル酸クロライドと反応させ，反応液を濃縮した後，１％塩酸および水で数回洗浄し，無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ，反応液をろ過した後，濃縮して得た固体を石油エーテル：ジクロロメタン（５０：５０ vｏｌ％）の混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーで精製し，白色の個体を得る。得られた白色個体と２,２’アゾビス酪酸ジメチルエステルをガラス製重合管の中でテトラヒドロフランに溶かし，液体窒素中で凍結―脱気―窒素置換を数回行い，減圧下で密封し，６０℃，２０時間フリーラジカル重合した後，多量の熱ヘキサンで洗浄し，白色固体を得る。得られた白色固体をトリフルオロ酢酸水溶液で，５０℃，１２時間反応させた後，反応液を濃縮し，ジエチルエーテルで洗浄する。溶液を水酸化ナトリウム水溶液あるいは塩酸で中和した後、アセチルセルロース製半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて両性電解質の高分子組成物を製造する。以下，得た高分子組成物をP（α−LysMA）とする。
【００２８】
アミノ酸Ｌ−リジンのαアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をN，N−ジメチルホルムアミド溶媒中でトリエチルアミンを触媒とし，メタクリル酸クロライドと反応させ，反応液をろ過して減圧濃縮した後，ヘキサンで洗浄を繰り返し，白色の固体を得る。得られた白色固体と２，２’−アゾビス酪酸ジメチルエステルをガラス製重合管の中でエチルアルコールに溶かし，液体窒素中で凍結―脱気―窒素置換を数回行い，減圧下で密封し，６０℃，２０時間フリーラジカル重合した後，多量の熱ヘキサンで洗浄し，白色固体を得る。得られた白色固体を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かし，室温で１２時間反応させた後，反応液を塩酸または水酸化ナトリウム水溶液で中和し、アセチルセルロース製半透膜を用いて透析し，凍結乾燥させて両性電解質の高分子組成物を製造する。製造方法を図１に示す。以下，この高分子組成物をP（ε−LysMA）とする。
【００２９】
P（α−LysMA）の前駆体モノマーの構造をNMRならびに元素分析から確認した。１H―NMR（CDCｌ３）：１．４［ｓ，９H，−C（CH３）３］，１．４５［ｓ，９H，−C（CH３）３］，１．５［ｓ，２H，−CH２−］，１．７［ｄ，２H，−CH２−］，１．９［ｄ，２H，−CH２−］，２．０［ｓ，３H，−CH３］，３．１［ｄ，２H，−CH２−］，４．５［ｓ，１H，−CH＜］，５．３［ｓ，１H，−NH―］，５．４，５．８［ｓ，２H，＝CH２］，元素分析：C１９N２H３４として，計算値C：N：H＝６１．６１％：７．６０％：９．１９％，実測値C：N：H＝６２．２８％：７．４６％：９．４３％
【００３０】
P（ε−LysMA）の前駆体モノマーの構造をNMRならびに元素分析から確認した。１H―NMR（CDCｌ３）：１．４［ｓ，２H，―CH２］，１．６［ｓ，２H，―CH２］，１．８［ｄ，２H，−CH２−］，１．９［ｓ，３H，−CH３］，２．０［ｓ，３H，−CH３］，３．３［ｄ，２H，−CH２−］，３．７５［ｓ，３H，−CH３］，４．５［ｓ，１H，−CH＜］，５．４，５．８［ｓ，２H，＝CH２］，６．１［ｓ，１H，−NH―］，６．５［ｓ，１H，−CONH―］，元素分析：C１９N２H３４として，計算値C：N：H＝５７．７９％：８．１４％：１０．３７％，実測値C：N：H＝５７．１０％：８．３２％：１０．６３％
【００３１】
P（α−LysMA）ならびにP（ε−LysMA）がポリマー材料となったことは，１H−NMRより二重結合のピークが消失したことから確認した。
【００３２】
P（α−LysMA）ならびにP（ε−LysMA）の保護基が除去されたことは，１H−NMRならびに１３C−NMRより確認した。
【００３３】
P（α−LysMA）ならびにP（ε−LysMA）が両性電解質構造になっていることを酸塩基適定法による等電点測定から確認した（図２）。
【実施例２】
【００３４】
アルゴンプラズマ−後ポスト重合法で基材表面への高分子組成物の固定化を実施した。プラズマ照射装置のセパラブルフラスコの底に任意の大きさに調整した基材を置き，アルゴンの流量を調節して圧力を１．３パスカルとする。高周波の負荷には容量負荷型を用い，セパラブルフラスコに巻きつけた銅板２ヶ所に高周波電源（日本電子製ＪＲＦ−３００型）（周波数は１３．５６ＭＨｚ）を接続し，ＲＦ＝１０Ｗを印加してプラズマを発生させ，３０秒間照射する。１分間空気に暴露させた後，ガラス製重合管に所定濃度の高分子組成物の前駆体モノマーを含むテトラヒドロフラン１０ｍｌと基材を入れる。重合管は液体窒素浴で凍結―脱気を繰り返し溶存酸素を取り除いた後，減圧下で密封し，６０℃で振り混ぜながら所定時間ポスト重合する。ポスト重合後の基材を多量のテトラヒドロフランに２４時間侵漬し，テトラヒドロフランで洗浄した後２４時間真空乾燥させてグラフト化基材を得る。
【００３５】
本発明の高分子組成物を固定化する医療用基材は公知の医療用材料である合成樹脂等の高分子材料であれば問題ない。表面に官能基を有していない材料であっても，表面処理によって本発明の高分子組成物を固定化することができる。このような医療用材料としては，例えば，ポリウレタンやポリ塩化ビニル製でできたカテーテルや血液パック等，ポリテトラフルオロエチレン製でできた人工臓器等，ポリプロピレン等のポリオレフィンでできた注射器等，ナイロン等のポリアミド類で製造された人工血管等が挙げられる。
【００３６】
上記の抗血栓性医療用材料の基材への表面処理は公知の方法によって行なうことができる。本発明は上記の固定化方法に限られるものではないが，プラズマ処理を用いた表面修飾は，医療用材料を短時間で大量に処理することができ，さらにガス中で処理を行なうために清潔を保つことができ，好ましい。
【実施例３】
【００３７】
一般に，血液と接触した材料表面にはアルブミン，フィブリノーゲンといった血漿タンパク質が吸着・変性し，血小板が活性化されることで，血液は凝固する。そこで，血漿タンパク質を用いた蛍光測定を行い，リジンメタクリルアミド存在下における血漿タンパク質の吸着を定量的に測定した。血漿タンパク質は血液中のアルブミン，γ―グロブリン，フィブリノーゲン，プラスミン，プラスミノーゲンを用いた。また，比較物質として生体適合性が知られるポリエチレングリコール（以下，PEGと省略する。）を用いて同様に試験を行なった。蛍光強度の減少は，材料とタンパク質との吸着または変性を示す。結果を図３〜７に示す。また，これらすべてにおける蛍光強度の減少は蛍光波長がシフトしていなかったことから，材料存在下におけるタンパク質の変性は認められなかった。また，本発明の高分子組成物はアルブミン，γ―グロブリン，フィブリノーゲン，プラスミンをやや吸着させたが，その吸着量はＰＥＧとそれほど変わらなかった。またP（α−LysMA）はプラスミノーゲンとのみ，相互作用を示した。
【００３８】
血栓溶解作用に大きく関与しているプラスミノーゲンと高分子組成物との相互作用を生体分子間相互作用解析装置（以下，ＩＡｓｙｓと省略する）を用いて評価した。化学的に固定化したプラスミノーゲン表面に高分子組成物を添加し，光の共鳴角の変化を追跡することで，リアルタイムに相互作用を解析した。高分子組成物添加における曲線はプラスミノーゲンとの特異的な相互作用を示す。結果を図８に示す。
【００３９】
血漿タンパク質の吸着を抑制した理由として，高分子組成物の構造が挙げられる。通常，人工材料と生体成分が接触したらまず血漿タンパク質の吸着作用が進む。従って，生体成分に似た構造をもつ材料は体内に挿入する際，人工的な材料だと認識されにくい，ステルス性の効果をもつと考えられる。本願発明の高分子組成物は，血液と接触する生体膜のリン脂質表面と同様に両性電解質構造をもつ合成高分子であるため，生体成分にとって人工材料だと認識されにくい，ステルス性の材料だと考えられる。
【実施例４】
【００４０】
本発明の高分子組成物の血液凝固に関する影響を検討するため，発色性合成基質を用いたトロンビン活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のトロンビンと高分子組成物を添加し１０分間攪拌した後，トロンビンを特異的に認識して発色性を示す基質Ｓ−２２３８を添加してＳ−２２３８から遊離するｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡した。得られた曲線の傾きの減少は，血液凝固活性の阻害を示す。結果を図９に示す。
【００４１】
血栓の主要成分はフィブリノーゲンから活性化されて形成されるフィブリンである。そこで，本発明の高分子組成物のフィブリン形成における影響を検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のトロンビンと高分子組成物を添加し１０分間攪拌した後，フィブリノーゲンを添加して形成されるフィブリンの濁度変化を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡した。得られた曲線の傾きの減少は，血液凝固活性の阻害を示す。結果を図１０に示す。
【００４２】
トロンビン活性阻害における本発明の高分子組成物の添加効果を酵素反応速度論的に検討した。結果を図１１に示す。
【００４３】
本発明の高分子組成物の存在下において凝固因子トロンビンがその活性を抑制されたのは，生体高分子ヒルジンのトロンビン活性抑制に例えられる。ヒルジンはヒルジンが有するＮ末端あるいはＣ末端がトロンビンと結合する。特に，Ｃ末端部位がトロンビンのフィブリノーゲン結合部位と同じであることで，血液凝固を抑制している。また，トロンビン活性阻害における本発明の高分子組成物の添加効果を酵素反応速度論的に検討した結果，本発明の高分子組成物はトロンビンの活性を反競合的に阻害した。従って，本発明の高分子組成物はトロンビンの血液凝固活性部位と直接的に相互作用することで，フィブリノーゲンとトロンビンの結合を阻害し，血液凝固を抑制していると考える。
【実施例５】
【００４４】
高分子組成物の血栓溶解性における影響を検討するために，発色性合成基質を用いたプラスミン活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のプラスミンと高分子組成物を添加し１０分間攪拌した後，基質Ｓ−２２５１を添加してＳ−２２５１から遊離するｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡した。得られた曲線の傾きの増大は，酵素活性の増大を示す。結果を図１２に示す。
【００４５】
血中濃度のフィブリノーゲンとトロンビンから人工的にフィブリンを作製し，高分子組成物およびプラスミンを添加し，フィブリン分解によって生じる濁度の変化を２４０分追跡した。プラスミン添加後の濁度の低下が大きいほど，フィブリン分解を促進していることを示す。結果を図１３に示す。
【００４６】
Ｓ−２２５１を用いたプラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。プラスミノーゲンおよび高分子組成物を添加して１０分間攪拌した後，Ｓ−２２５１およびｔ−ＰＡを加え，ｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて２４０分追跡した。得られた曲線の傾きの増大は，酵素活性の増大を示す。結果を図１４に示す。
【００４７】
人工的に作製したフィブリンを用いてプラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性を測定した。人工的に作製したフィブリンに高分子組成物およびプラスミノーゲンを添加し，１０分間攪拌した後，ｔ−ＰＡを加えてフィブリン分解によって生じる濁度の変化を２４０分追跡した。ｔ−ＰＡ添加後に得られた直線の傾きが大きいほど，プラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性におけるフィブリン分解を促進していることを示す。結果を図１５に示す。
【００４８】
プラスミン反応系における高分子組成物の添加効果を酵素反応速度論から検討した。結果を図１６に示す。
【００４９】
プラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ反応系における高分子組成物の添加効果を酵素反応速度論から検討した。結果を図１７に示す。
【００５０】
以下に，本発明のP(α−ＬｙｓＭＡ)が血液中のプラスミノーゲンと特異的に相互作用を示して，血栓溶解性を増大させたメカニズムを示す。
【００５１】
血中に存在するプラスミノーゲンにはフィブリンが有するアミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基を特異的に認識する部位（リジン結合部位）があり，プラスミノーゲンはそのリジン結合部位を介してフィブリンと結合し，血栓溶解性を示す。また，フィブリン上で血栓溶解作用が起こる時，プラスミンはプラスミン阻害因子であるα２−プラスミンインヒビターとの結合部位であるリジン結合部位がフィブリンによって占拠されているため，血栓溶解作用の阻害を受けることなくフィブリンを分解することができる。本願発明のＰ（α−ＬｙｓＭＡ）はＬ−リジン基を有する合成高分子で，Ｌ−リジンのεアミノ基とカルボキシル基がフリーの状態となっているため，プラスミノーゲンのリジン結合部位と特異的に相互作用を示し血栓溶解性を増大させているが，Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）はＬ−リジンのαアミノ基とカルボキシル基がフリーの状態となっているため，プラスミノーゲンのリジン結合部位と特異的に相互作用を示さず，血栓溶解性には直接影響を与えないと考える。
【００５２】
また，下記の化３および化４記載の本願発明における高分子組成物はＸが例えば，Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ３等の構造であっても，抗血栓性における同様の性能を示すと考えられる。
【００５３】
【化３】
2005048061.tif 000004
【００５４】
【化４】
2005048061.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の高分子組成物の製造方法。Ｌ−リジン基をもつ高分子組成物の前駆体モノマーをフリーラジカル重合した後，保護基を除去して両性電解質の高分子組成物を得た。
【図２】酸塩基適定法による高分子組成物の等電点測定。●：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），■：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図３】血漿タンパク質アルブミンの蛍光測定。タンパク質がもつトリプトファンの２８０ｎｍの励起波長で３７℃，６０分ごとに計３６０分測定した。アルブミンと高分子組成物は同じ濃度とした。図は時間と３５０ｎｍ付近の最大蛍光強度をプロットしたものである。蛍光強度の減少は，タンパク質との吸着もしくは相互作用を示す。■：ｎｏｎｅ，□：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），○Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ），●ＰＥＧ
【図４】血漿タンパク質γ−グロブリンの蛍光測定。条件は図４と同様である。■：ｎｏｎｅ，□：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），○Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ），●ＰＥＧ
【図５】血漿タンパク質フィブリノーゲンの蛍光測定。条件は図４と同様である。■：ｎｏｎｅ，□：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），○Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ），●ＰＥＧ
【図６】血漿タンパク質プラスミンの蛍光測定。条件は図４と同様である。■：ｎｏｎｅ，□：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），○Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ），●ＰＥＧ
【図７】血漿タンパク質プラスミノーゲンの蛍光測定。条件は図４と同様である。■：ｎｏｎｅ，□：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），○Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ），●ＰＥＧ
【図８】ＩＡｓｙｓ測定による分子間相互作用解析。時間経過に伴う光の共鳴角の変化をプロットした。測定開始から２分後，プラスミノーゲン固定化表面に所定濃度の高分子組成物を添加した。
【図９】基質Ｓ−２２３８を用いたトロンビン活性阻害評価。時間の経過に伴うｐ−ニトロアニリンの吸光度の変化をプロットした。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１０】本発明の高分子組成物のフィブリン形成阻害試験。時間経過とフィブリン形成に伴う濁度変化をプロットした。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１１】基質Ｓ−２２３８を用いたトロンビン活性阻害の速度論的解析。基質濃度の逆数と反応速度の逆数をプロットしている。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１２】基質Ｓ−２２５１を用いたプラスミン活性評価。時間の経過に伴うｐ−ニトロアニリンの吸光度の変化をプロットした。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１３】プラスミン活性による人工フィブリンの分解を濁度変化の追跡によって評価した。まず，トロンビンとフィブリノーゲンを４０分間反応させて人工的にフィブリンを作製する。次に高分子組成物およびプラスミンを加えてフィブリン分解における高分子組成物の添加効果を検討した。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１４】基質Ｓ−２２５１を用いたプラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性評価。図７と同様の方法で行なった。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１５】プラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性における人工フィブリンの分解を濁度変化の追跡によって評価した。図８と同様の方法で行なった。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１６】プラスミン活性における酵素反応速度論的解析。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  Ｐｌｏｔから評価した。基質濃度の逆数を横軸に，反応速度の逆数を縦軸にプロットしている。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１７】プラスミノーゲン/ｔ−ＰＡ活性における酵素反応速度論的解析。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  Ｐｌｏｔから評価した。基質濃度の逆数を横軸に，反応速度の逆数を縦軸にプロットしている。■：ｎｏｎｅ，▲：Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ），●：Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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