(57)【要約】【課題】薬物代謝能力を有する微生物が薬物代謝体を効率的に製造すること。【解決手段】薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造方法において、（１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地中で、前記微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び（２）前記培養条件のうち、炭素源がその初発濃度の１／３倍以下の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間中において、当該炭素源を前記初発濃度の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である濃度になるように連続的又は非連続的に補給しながら、さらに前記培養期間の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である時間培養する工程を有することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造方法において、
（１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地中で、前記微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び
（２）前記培養条件のうち、炭素源がその初発濃度の１／３倍以下の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間中において、当該炭素源を前記初発濃度の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である濃度になるように連続的又は非連続的に補給しながら、さらに前記培養期間の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である時間培養する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地が、唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、かつ、液体培地中に含有される炭素源の初発濃度が、前記微生物による微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源がグルコースであり、前記微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の方法により製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法。
【請求項５】
液体培地中から回収して得られる、請求項１、２又は３記載の方法により製造された薬物代謝体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物を利用した有用物質の生産では、その有用物質に応じて微生物の各種培養条件が各種速度論等に基づき決定されており、これら技術はすでに確立されている。
例えば、有用物質が菌体そのものであり、菌体生産を目的にする場合には、通常、微生物の培養条件として最大菌体濃度が得られる培養条件が選択されている。
また、例えば、有用物質が微生物が産生する一次代謝生産物であり、一次代謝生産物の生産を目的にする場合には、通常、微生物の培養条件として当該生産物を蓄積する対数増殖期をできるだけ長くするように条件が設定されている。
さらにまた、例えば、有用物質が微生物が産生する二次次代謝生産物であり、二次次代謝生産物の生産を目的にする場合には、通常、微生物の培養条件として対数増殖期を短縮し定常期を引き延ばすかあえて対数増殖期に生育速度を低下させるような培養条件を与えて定常期に早く移行させるように条件が設定されている（非特許文献１参照。）。
【０００３】
【非特許文献１】
発酵工学の基礎−実験室から工場まで−、Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ、Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、石崎文彬訳、学会出版センター
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、生育にリンクしない基質である薬物を、生育にリンクしない生産物（ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｌｉｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）である薬物代謝酵素が有する薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造を目的にする場合には、未だ充分な技術が確立しておらず、回分操作、半回分操作、反復回分操作、反復半回分操作、連続操作等の各種操作での培養方法において経験的に各種の培養条件を設定しているにすぎない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと、培地の基本栄養成分の不足や培地中に微生物自体から排出される有害代謝産物の蓄積等の培養条件に基づく微生物の生育速度論や薬物代謝能力を有する微生物が産生する薬物代謝酵素の生成速度論等の観点から実験を積み重ねながら、鋭意検討した結果、薬物代謝能力を有する微生物が薬物代謝体を効率的に製造することを見出し、本発明に至った。
【０００６】
本発明は、
１．薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造方法において、
（１）哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地中で、前記微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び
（２）前記培養条件のうち、炭素源がその初発濃度の１／３倍以下（本願では、約１／３倍程度以下を意味する。）の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間中において、当該炭素源を前記初発濃度の１／２倍以上（本願では、約１／２倍程度以下を意味する。）３／２倍以下（本願では、約３／２倍程度以下を意味する。）の範囲である濃度になるように連続的又は非連続的に補給しながら、さらに前記培養期間の１／２倍以上（本願では、約１／２倍程度以下を意味する。）３／２倍以下（本願では、約３／２倍程度以下を意味する。）の範囲である時間培養する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
２．哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地が、唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、かつ、液体培地中に含有される炭素源の初発濃度が、前記微生物による微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源がグルコースであり、前記微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．前項１、２又は３記載の方法により製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）；
５．液体培地中から回収して得られる、前項１、２又は３記載の方法により製造された薬物代謝体；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明製造方法において、薬物代謝能力を有する微生物とは、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物（以下、本微生物と記すこともある。）を意味し、具体的には、例えば、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母等をあげることができる。尚、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母において、２種以上のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を組み合せて使用するには、たとえば、ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種への存在量に相当する割合で、本発明システムで用いられるヒト由来のチトｐクロムＰ４５０分子種をおのおの単独または混合した状態で組み合せて使用すればよい。なお、この組み合せ割合を適宜変えることにより、ヒトにおける人種差、個人差に対応することもできる。ここで、「おのおの単独または混合した状態」とは、上記の２種以上の分子種をおのおの別々の反応系で並列的に存在させる状態または上記の２種以上の分子種を混合し、１つの反応系で同時に存在させる状態を意味する。
【０００８】
人為的に作製される、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物は、突然変異処理により作製される微生物であってもよいし、遺伝子工学的な手法を用いて作製させる微生物（以下、本形質転換体と記すこともある。）であってもよい。尚、本形質転換体を作製する際に用いられる哺乳動物由来の薬物代謝酵素（以下、本酵素と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【０００９】
本遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
薬物代謝能力を有する哺乳動物由来の細胞等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【００１０】
本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（以下、本補酵素再生酵素遺伝子と記すこともある。）は、例えば、本補酵素再生酵素遺伝子が本酵素とは異なる酵素である場合には、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する哺乳動物由来の細胞又は微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本補酵素再生酵素遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本補酵素再生酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。具体的には、たとえば、特開昭６２−１９０８５号公報に記載される方法等により単離することができる。
【００１１】
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、（１）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子が宿主微生物中で発現できるような単一な組換プラスミドを作製し、これを宿主微生物に導入することにより作製する方法、（２）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子のうちの一方の遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子のうちの一方の遺伝子が宿主微生物中で発現できるような組換プラスミドを上記遺伝子毎に別々に作製し、これらを宿主微生物に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主微生物の染色体中に導入する方法も利用することができる。
尚、上記単一な組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより作製する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミドを構築する方法等をあげることができる。
ここで上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主微生物中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物からの単離・精製が容易であり、宿主微生物中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより宿主微生物を形質転換させた際に、本還元遺伝子等が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素及び／又は本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，  ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ｐ２０２，  講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主微生物としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌、酵母等を好ましく挙げることができる。
本酵素及び／又は本補酵素再生酵素が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドを宿主微生物に導入する方法としては、用いられる宿主微生物に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ／Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法、プロトプラスミド法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等をあげることができる。
宿主微生物において本遺伝子及び／又は本補酵素再生酵素遺伝子が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主微生物（即ち、形質転換体）が本遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００１２】
このような形質転換体がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、用いられるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としては、例えば、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０２Ｄ６、Ｐ４５０２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４をあげることができる。ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種の存在量は人種差、個人差があるが、しかしながらいずれのヒトの場合においても、上記の１０種類のチトクロムＰ４５０分子種を用いることにより、ほとんどすべての場合を網羅することがてきる。さらに上記の１１種類のチトクロムＰ４５０分子種のうち、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が重要であり、その中でもＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が特に重要である。
【００１３】
上記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列は、例えば、特開平０８−５６６９５号公報等に開示されている。なお、これらのヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡは、たとえば、（１）（ａ）該遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製後、該ｃＤＮＡをファージベクター及びプラスミドベクターに挿入して得たｃＤＮＡライブラリー、または（ｂ）  市販のヒト肝由来のｃＤＮＡライブラリー、から目的とする遺伝子を、（ｉ）  その遺伝子と相同性を有するＤＮＡ断片や、（ｉｉ）その遺伝子により産生されるタンパク質を認識する抗体、を用いるような通常の方法に従いクローニングする方法、あるいは（２）  上記（１）  記載のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ  法を用いてクローニングする方法、等の通常の方法により調製することができる。
【００１４】
前記形質転換体において利用される酵母内で発現させるためのプロモーターとしては、通常の酵母発現系において用いられるプロモーターであれば特に制限されるものではないが、たとえば酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以下、ＡＤＨプロモーターと記す。）、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨプロモーターと記す。）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫプロモーターと記す。）等をあげることができる。なお、ＡＤＨプロモーターは、たとえば酵母ＡＤＨ１プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）から通常の遺伝子操作方法により調製することができる。
【００１５】
上記の酵母内で発現させるためのプロモーターおよび前記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを特開平２−２１１８８０等に記載されるＡＤＨプロモーターとＡＤＨターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  部位に挿入することにより構築する方法等をあげることができる。また必要に応じてｐＡＡＨ５ＮベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位を別な制限酵素用の部位に交換したベクターを利用して構築する方法もあげられる。
【００１６】
上記の酵母内発現プラスミドが酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む場合も通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、特開平２−２１１８０  等に記載されるＡＤＨプロモーターとターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片を特開平２−２１１８８０等に記載される酵母還元酵素遺伝子を保有するプラスミドｐＡＲＲＮのＮｏｔＩ部位に挿入し、得られたプラスミドｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを挿入することにより構築する方法等をあげることができる。こうして得られた酵母内発現プラスミドが導入された酵母においては大量に発現した酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素によりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種への電子伝達効率が上昇し、より高い代謝活性が検出される。このために大量の代謝産物が短時間で得られ、精密な分析が可能になる。また、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のキメラ人工融合酵素を用いても同様の効果が得られる。
【００１７】
酵母内でヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる酵母菌体は、構築された酵母内発現プラスミドを、たとえば、プロトプラスト法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等の通常の方法によって酵母に導入することで得ることができる。
前記形質転換体において利用される酵母菌株としては、たとえばサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等をあげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられる。
【００１８】
つぎに、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地中で、前記微生物（即ち、本微生物）と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養条件のうち、炭素源がその初発濃度の１／３倍以下の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間中において、当該炭素源を前記初発濃度の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である濃度になるように連続的又は非連続的に補給しながら、さらに前記培養期間の１／２倍以上３／２倍以下の範囲である時間培養する工程に関して説明する。
【００１９】
まず「薬物代謝体」とは、本微生物の生育にリンクしない生産物（ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｌｉｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であって、本微生物が産生する哺乳動物由来の薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物を当該薬物代謝酵素に基づく異化作用により分解して得られる化合物を意味し、具体的には、例えば、本微生物がヒト由来のチトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、ヒト由来のチトクロムＰ４５０の基質となる各種の脂溶性化合物を当該チトクロムＰ４５０に基づく酸化添加等の異化作用（即ち、モノオキシゲナーゼ反応）により分解して得られる化合物等をあげることができる。
【００２０】
本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地とは、その微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）が非常に高い炭素源を含有する液体培地を意味し、好ましくは、炭素源資化定数が小さくなるような（例えば、約５０ｍｇ／ｍｌ程度以下の値であるような）炭素源を含有する液体培地であることがよい。ここで「炭素源資化定数」とは、通常ミカエリス定数と呼ばれ、比増殖速度μ（ｈｒ）がその最大値（μｍａｘ）の１／２を示す炭素源濃度に等しい値を意味し、この値はその微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）を表す指標となるものである。代表的な炭素源資化定数として、例えば、本微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母のグルコースに対する炭素源資化定数は約２５ｍｇ／ｌであり、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の細菌のグルコースに対する炭素源資化定数は約６．８×１０−２ｍｇ／ｌである。
【００２１】
このような、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地中で、前記微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、当該微生物を培養するには、通常用いられるような本微生物の培養条件下で、前記微生物と当該薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物とを接触させながら、当該微生物を培養すればよい。
好ましくは、微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地は、唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、かつ、液体培地中に含有される炭素源の初発濃度が、薬物代謝能力を有する微生物による微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量であること等をあげることができる。
ここで「炭素数６個である単糖」としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等があげられる。また「微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量」とは、微生物菌体収率が低下する現象（即ち、クラブとリー効果（Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ））が発生させない量を意味する。例えば、微生物の培養において、炭素源濃度が高くなりすぎると、溶存酸素（ＤＯ）が充分に存在しても、当該炭素源から生育に不必要な生体物質や増殖阻害等を起こすような物質を副生した結果、生育に必要な生体物質を生成する量が減少するために、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。より具体的には、微生物が酵母の場合には、糖濃度が高くなりすぎると、当該糖からエチルアルコールが生成し、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。また大腸菌等の細菌の場合には、糖濃度が高いと、当該糖から酢酸、乳酸、蟻酸等の有機酸を副生し、増殖阻害を起こしたり代謝活性に悪影響を与える現象が発生する。
因みに、本微生物が容易に資化する炭素源の培地への添加量としては、例えば、培養液に対して約０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度、好ましくは約１〜２０％（ｗ／ｖ）程度、より好ましくは約５〜１０％（ｗ／ｖ）程度、をあげることができる。
【００２２】
本微生物の培養は、まず、本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地を用いる以外は微生物の培養において通常使用される方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、前記の炭素源、適当な窒素源、有機塩、無機塩およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。培地のｐＨは、本微生物に接触させる被験薬物によっても変わるが、例えば、約５〜８の範囲が好ましい。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用されることもあるが、本発明では便宜上炭素源としては取り扱わない。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００２３】
次いで、このような培養条件のうち、炭素源がその初発濃度の約１／３倍程度以下（好ましくは、炭素源がその初発濃度の約１／４倍程度以下）の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間中において、当該炭素源を前記初発濃度の約１／２倍程度以上約３／２倍程度以下の範囲である濃度になるように連続的又は非連続的に補給しながら、さらに前記培養期間の約１／２倍程度以上約３／２倍程度以下の範囲である時間培養するには、通常の微生物を利用した有用物質の生産における半回分操作のような、微生物の培養中、炭素源を培養容器へ供給するが、培養ブロス（培養上澄液と菌体とからなる薬物代謝体を含む液体培地）は収穫時まで抜き取らないような操作において、その炭素源の供給時期を炭素源がその初発濃度の約１／３倍程度以下（好ましくは、炭素源がその初発濃度の約１／４倍程度以下）の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間とし、またその供給量を当該炭素源の初発濃度の約１／２倍程度以上約３／２倍程度以下の範囲である濃度になるような量とし、さらに培養開始から供給時期までの培養期間の約１／２倍程度以上約３／２倍程度以下の範囲である時間培養すればよい。即ち、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収するまでの全培養時間は、培養開始から供給時期までの培養期間の約１．５倍程度以上約２．５倍程度以下の範囲である時間である。このような操作は、菌体増殖を抑えかつ有害代謝産物の蓄積を抑える効果が有り、薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造方法において極めて重要である。
【００２４】
反応は、酵母菌体を含む培養液等の溶液に被験薬物を添加し、該混合物をたとえば約１０℃〜約４０℃で、約０．１時間〜約４８時間インキュベートすることにより行なうことができる。なお、酵母菌体の溶液中、存在量および被験薬物の添加量は、反応温度、反応時間、被験薬物の種類等の各種条件によって異なるが、たとえば、酵母菌体の溶液中存在量としては溶液１ｍｌあたり約１０１０〜約１０１５程度のＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液１ｍｌあたり約１０５  〜約１０１０程度の菌体数）、好ましくは溶液１ｍｌあたり約１０１２〜約１０１３のＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液あたり約１０７  〜約１０８  の菌体数）であり、被験薬物の添加量としては、例えば、溶液１ｍｌあたり約０．０１μｍｏｌ  〜約１０μｍｏｌ  程度の範囲を望ましいものとしてあげることができる。なお、上記の範囲にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもない。
【００２５】
尚、培養中、液体培地中に存在する薬物代謝体を分析する方法は、監修  塩川二郎ら機器分析のてびき（２）  （増補改訂版）第１刷，化学同人発行（１９８５年）、Ｒ．  Ｍ．  ＳＩＬＶＥＲＳＴＥＩＮ  ら，有機化合物のスペクトルによる同定法  第４版    第３刷，東京化学同人発行（１９８４年）等に記載される通常の分析方法を用いることができる。
【００２６】
このような本発明製造方法により製造された薬物代謝体を液体培地中から回収することにより、薬物代謝体を取得すればよい。
液体培地中から薬物代謝体を回収するには、触媒として微生物を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒及びそれらの混合物で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【００２７】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ）
市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用プライマーを用いるＰＣＲ法およびヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用合成リンカー等を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを得た。
【００２９】
実施例２  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ１Ａ１、ｐ１Ａ１Ｒ）
プライマーを用いて、ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１遺伝子のタンパク質コーディング領域を、約１．０ｋｂと約０．５ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約１．０ｋｂの断片は、ＸｂａＩとＳａｃＩにより切断し、ｐＵＣＡベクター（ｐＵＣ１９  が有するＥｃｏＲＩ  部位をＨｉｎｄＩＩＩ  部位に改変し、形成されたＨｉｎｄＩＩＩ  とＨｉｎｄＩＩＩ  部位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイト（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳｐｅＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ）に交換することにより作製されたサブクローン用のプラスミド）にサブクローンした。増幅した約０．５ｋｂ断片は、一旦ｐＵＣ  １９ベクターをＨｉｎｃＩＩで切断したものにサブクローン化し、ＳａｃＩで切断後、１．０ｋｂ断片を持つベクターと連結した。こうして得られた１Ａ１遺伝子のコーディング領域をＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出した後、ＡＤＨプロモーターおよびターミネーター領域を有する酵母発現用ベクターｐＡＡＨ５Ｎ、及びその上流に酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素遺伝子を有するチトクロムＰ４５０と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時発現用ベクターｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１の酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０１Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１遺伝子断片を上記と同様に得て、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１の酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ１Ａ１  Ｖａｒｉａｎｔ２、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ１と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ１Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ１Ａ１Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ２を構築した。
【００３０】
実施例３  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ１Ａ２、ｐ１Ａ２Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約４０ｂｐを除く約１．５ｋｂを増幅した。得られた約１．５ｋｂ断片は、ＳａｃＩで切断し、ｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化した。Ｎ末端約４０ｂｐは図４で示す合成リンカーを用い、ｐＵＣ１１８ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ、ＳａｃＩ部位にサブクローン化した。１．５ｋｂ断片を持つベクターは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで処理後、平滑化し、ＥｃｏＲＩリンカーを挿入した。これをＥｃｏＲＩとＳａｃＩで切り出し、Ｎ末端４０ｂｐを含むベクターと連結した後、ＥｃｏＲＩで処理、平滑化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩリンカーを挿入、さらにＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２酵母内発現プラスミドｐ１Ａ２、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  １Ａ２酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ１Ａ２Ｒを構築した。
【００３１】
実施例４  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ａ６、ｐ２Ａ６Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６遺伝子のタンパク質コーディング領域を、約０．６ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。その結果、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６遺伝子断片が得られた。得られた約０．６ｋｂの断片は、ＸｂａＩとＨｉｎｃＩＩで切断してｐＵＣ  Ａベクターにサブクローン化し、さらに０．９ｋｂ断片をＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩ部位に組み込んで２つの断片を連結させた。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲに挿入し、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ａ６の酵母内発現プラスミドｐ２Ａ６、ｐ２Ａ６  Ｖａｒｉａｎｔ１及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０２Ａ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ａ６Ｒ、ｐ２Ａ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１を構築した。
【００３２】
実施例５  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｂ６、ｐ２Ｂ６Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６遺伝子全タンパク質コーディング領域を増幅した。得られた断片は、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで部分消化し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｂ６及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｂ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｂ６Ｒを構築した。
【００３３】
実施例６  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ８、ｐ２Ｃ８Ｒ）
ＰＣＲ法により、Ｐ４５０  ２Ｃ８遺伝子全タンパク質コーディング領域を増幅した。その結果、ごく一部の塩基配列のみが異なる３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８遺伝子が得られた。得られた断片は、ＸｂａＩで部分消化して、一旦ｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ及び、ｐＡＨＲＲベクターに挿入し、３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ８、ｐ２Ｃ８  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｃ８  Ｖａｒｉａｎｔ２、及び３種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ８酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ８Ｒ、ｐ２Ｃ８Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｃ８Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ２を構築した。
【００３４】
実施例７  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ９、ｐ２Ｃ９Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子のタンパク質コーディング領域を約０．９ｋｂと約０．６ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．９ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断してｐＵＣ  Ｂベクター（ｐＵＣ１９  が有するＥｃｏＲＩ  部位をＨｉｎｄＩＩＩ  部位に改変し、形成されたＨｉｎｄＩＩＩ  とＨｉｎｄＩＩＩ  部位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイト（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩ，ＳｐｅＩ，，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ）に交換することにより作製されたサブクローン用のプラスミド）にサブクローン化し、さらに約０．６ｋｂ断片をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を連結させた。このプラスミドのＫｐｎＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入したものからコーディング領域を含むＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣベクター中にＡＤＨプロモーター、ターミネーター領域を持つｐＵＣＡＮベクター（市販されるｐＵＣ１９  ベクターが有するＥｃｏＲＩ  部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれＮｏｔＩ部位に改変し、形成されたＮｏｔＩ部位とＮｏｔＩ部位の間にｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片を組み込んで得たベクター）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を平滑化、ＸｂａＩリンカーを導入したｐＵＣＡＮＸに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９Ｒを構築した。
【００３５】
実施例８  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ１８、ｐ２Ｃ１８Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８遺伝子のタンパク質コーディング領域を約１．４ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約１．４ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断してｐＵＣ  Ａベクターにサブクローン化し、さらに約０．９ｋｂ断片をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を連結させた。このプラスミドをＳｍａＩで切断後、ＸｂａＩリンカーを導入したものからＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣＡＮＸのＸｂａＩサイトに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１８及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１８酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１８Ｒを構築した。
【００３６】
実施例９  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ１９、ｐ２Ｃ１９Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅した（断片ａ，ｂ，ｃ）。他の領域については、ＰＣＲ法によってヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子に変異を導入しながらヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅（断片ｅ，ｆ）し、さらに残りの領域については、直接的にＤＮＡを合成することによって２種類のリンカーを得た（断片ｄ）。このようにして、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体をカバーする断片を調製した。
つぎに、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理された断片ａおよびＢａｍＨＩとＰｓｔＩで処理された断片ｂを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、さらにＸｂａＩとＸｈｏＩで処理された断片ｅを得られたプラスミドのＸｂａＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入することによって断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミドを得た。さらに、ＰｓｔＩとＫｐｎＩで処理された断片ｃおよびリンカーである断片ｄを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入後、再びＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得られた断片（断片ｃ，ｄ含む断片）およびＥｃｏＲＩで処理された断片ｆを同時に前記のプラスミド（断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミド）のＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。このようにしてヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体を含むプラスミドを構築した。構築されたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、同様にＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９Ｒを構築した。
【００３７】
実施例１０  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｄ６、ｐ２Ｄ６Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約２００ｂｐを除くを１．３ｋｂを約０．４ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．９ｋｂ断片はＫｐｎＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。Ｎ末端２００ｂｐは、３本の合成リンカーを用い、まずＮ末端側の２本のリンカーをＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  （＋）ベクターのＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込み、その後もう一本のリンカーをそのＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んだ。さらにこのプラスミドのＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位にＰＣＲ法で得られた約０．４ｋｂ断片を組み込み、その後ＮｓｐＶ、ＸｂａＩで切断し、０．９ｋｂ断片を含むプラスミドに挿入してコーディング領域を連結させた。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子断片を上記と同様に得て、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ２、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ２を構築した。
【００３８】
実施例１１  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｅ１、ｐ２Ｅ１Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子のタンパク質コーディング領域を約０．５ｋｂと約１．０ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．５ｋｂ断片はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化し、さらに約１．０ｋｂの断片をＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ部位に組み込んで２つの断片を連結させた。これをＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩで切断し、一旦ｐＵＣ  Ｂに挿入後、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１酵母内発現プラスミドｐ２Ｅ１、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｅ１Ｒを構築した。
【００３９】
実施例１２  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ３Ａ４、ｐ３Ａ４Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４遺伝子のタンパク質コーディング領域を約０．６ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．６ｋｂ断片はＳａｃＩで切断してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化した。その後、ＥｃｏＲＩで切断、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものに、ＸｂａＩ、ＳａｃＩで切断した０．９ｋｂ断片を組み込み、２つの断片を連結させた。このプラスミドをＳｐｈＩで切断後、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものからＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣＡＮＸのＸｂａＩ部位に挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４Ｒを構築した。
【００４０】
実施例１３  （人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドの構築）
実施例１２で構築されたプラスミドｐ３Ａ４を鋳型としＸｂａＩ−ＸｈｏＩ  断片を得た。また、プラスミドｐＢＦＣＲ１  （特願平４−２０９２２６）  から得た約２．１ｋｂ  のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を市販のベクターＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ  部位に挿入した後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで同時消化し、断片を得た。これら両断片を同時に、ベクターｐＵＣＡＮ  のＸｂａＩ部位に挿入することにより得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩにより消化して約５．６ｋｂの断片を得た。この断片とベクターｐＡＡＨ５Ｎから得た約１０．５ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することにより目的とする人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドｐＦ３Ａ４  を得た。該人工融合酵素は１１５６アミノ酸残基から成り、その構造はＮ末端からヒト肝チトクロムＰ４５０  ３Ａ４をコードする全アミノ酸配列（５０３残基）  、リンカーに由来する配列  （Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ）、酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素Ｎ末端４２番目からＣ末端と続いている。
【００４１】
実施例１４  （形質転換酵母菌体の作製）
ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％グルコース）１．０ｍｌにサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  により集菌した。得られた菌体を１．０ｍｌの０．２Ｍ  ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再度遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  し、得られたペレットに２０μｌの１Ｍ  ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００溶液、約１．０μｇの実施例２から１３によって構築された各種の酵母内発現プラスミドをおのおの単独で含む１０μｌの溶液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加えて攪拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２．０％グルコース、０．６７％窒素源アミノ酸不含（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  Ｄｉｆｃｏ製）、２０μｇ／ｍｌヒスチジン２．０％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベートし、上記の酵母内発現プラスミドを保有する形質転換酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内でヒト由来のＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体を作製した。
【００４２】
実施例１５  （酵母内で発現したヒト由来のチトクロムＰ４５０の定量）
実施例１４によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体おのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約１．５×１０７  菌体／ｍｌ）２００ｍｌを集菌し、該菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を懸濁した後、遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）した。得られたペレットを新たに２．０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０  ）に懸濁した後、ジチオナイト５−１０ｍｇを添加し撹拌した。これを２本のキュベットに１．０ｍｌずつ分注し、サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、４００−５００ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母内に存在するチトクロムＰ４５０濃度を算出した。各種の形質転換酵母菌体における各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０の発現量はすべて約１０５  −約１０６  分子／菌体のレベルであった。
実施例１６  （ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築および酵母内発現）
ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築法を示す。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した後、ＮｏｔＩリンカーを挿入して得たプラスミドｐＵＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＡＲＲＮ（特開平２−２１１８８０に記載）から得たＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．０Ｋｂ）を挿入し、ｐＵＲを得た。一方、プラスミドｐＡＡＨ５のＸｈｏＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入した後、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩにより切断し、得られた断片（約２．２Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ、ＳａＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより切断して得た断片（約２．２Ｋｂ）、サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株から調製した２μｍＤＮＡから切り出したＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．３Ｋｂ）、およびｐＵＲをＰｓｔＩで切断して得た断片、の３断片を連結することによりｐＵＲＬを得た。さらに、ｐＵＲＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断し平滑化した後連結することによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を消失させた。次に、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターを含むＮｏｔＩ断片（約１．６Ｋｂ）〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，５１，１６４１−１６４７（１９８７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６７，１６４９７−１６５０２（１９９２）  に記載される方法により得る〕をｐＵＲＬのＮｏｔＩ部位に挿入することによりｐＵＲＬＧを得た。ｐＵＲＬＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位に、実施例１に準じて得られた各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ又は実施例２〜１３に準じて得られた各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素若しくは人工融合酵素をコードするＤＮＡを挿入することにより、各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミド若しくは人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを得た。このプラスミドをサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株に実施例１４に準じて導入したところ、各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の産生が認められた。
【００４３】
実施例１７  （形質転換酵母生菌体を用いる薬物代謝体の製造における培養条件の検討（その１：培養期間中における炭素源の残存濃度））
哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物として、実施例１６で作製された人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドが実施例１４に準じて導入されてなる形質転換酵母菌体（即ち、ＧＡＰＤＨプロモーター制御下にある人工融合酵素遺伝子を含む形質転換酵母菌体）を用いた。
容易に資化する炭素源を含有する液体培地として、下記の調製方法により調製された液体培地（以下、ＳＤＨ液体培地と記すこともある。）を用いた。
（ＳＤＨ液体培地の調製方法）
まず、微量成分ストック溶液を調製するために、１６微量成分［（１）ビオチン：１．５ｍｇ（ナカライテスク製）、（２）Ｄ−パントテン酸カルシウム：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（３）イノシトール：１５００ｍｇ（ナカライテスク製）、（４）ニコチン酸：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（５）ｐ−アミノ安息香酸：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（６）ピリドキシン塩酸塩：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（７）チアミン：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（８）ホウ酸：３７５ｍｇ（和光純薬製）、（９）モリブデン酸ナトリウム：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１０）硫酸銅（ＩＩ）：３０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１１）ヨウ化カリウム：７５ｍｇ（ナカライテスク製）、（１２）塩化鉄：１５０ｍｇ（和光純薬製）、（１３）硫酸マンガン：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（１４）硫酸亜鉛：３００ｍｇ（ナカライテスク製）、（１５）リボフラビン：１５０ｍｇ（ナカライテスク製）、（１６）葉酸：１．５ｍｇ（ナカライテスク製）］を個別に計り取り、それぞれ１００ｍＬの蒸留水を加えて溶解した。溶解後、微量成分（１）〜（１４）の水溶液を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで滅菌処理し、また（１５）及び（１６）  の水溶液をオートクレーブ（１２１℃，２０ｍｉｎ）で滅菌処理した。このようにして各微量成分ストック溶液を調製した。
また、微量成分混合液を調製するために、上記で作製された各微量成分ストック溶液を等量づつ混合した。
次いで、主成分溶液（１Ｌ）を調製するために、（１）硫酸アンモニウム：４７ｇ（ナカライテスク製）、（２）リン酸一カリウム：９．４ｇ（和光純薬製）、（３）硫酸マグネシウム：４．７ｇ（ナカライテスク製）、（４）塩化ナトリウム：０．９ｇ（和光純薬製）、（５）塩化カルシウム溶液（６０ｇ／１６０ｍＬ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：２．５ｍＬ（和光純薬製）、（６）微量成分混合液：２０ｍＬ／１Ｌを計り取り、１０００ｍＬの蒸留水を加えて溶解した。溶解後、これをオートクレーブ（１２１℃，２０ｍｉｎ）で滅菌処理した。このようにして主成分溶液を調製した。
次に、ＳＤＨ液体培地を調製するために、上記で調製された主成分溶液（１Ｌ）に、２５０ｍＬ  の４０％グルコース溶液（和光純薬製、オートクレーブ滅菌、終濃度８％）及び２．５ｍＬ  の８０ｍｇ／ｍＬヒスチジン溶液（和光純薬製、オートクレーブ滅菌、終濃度１６０μｇ／ｍＬ）を添加することにより、ＳＤＨ液体培地を調製した。
予め凍結保存によりストックされていた上記の形質転換酵母菌体（０．５ｍＬ）を５ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養することにより前々培養液を得た。得られた前々培養液から２×１０８相当分の菌体液（約５ｍＬ）を採取し、これを２５０ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養（培養条件：３０℃，２００ｒｐｍ）することにより前培養液を得た。得られた前培養液から６．６×１０９相当分の菌体液（約１００〜１４０ｍＬ）を採取し、これを１．６ＬのＳＤＨ液体培地に加え、ＭＤＬ３Ｌ型ミニ培養ジャーで培養（培養条件：３０℃、ｐＨ５．５）した。同時に、予めガラス製サンプル瓶に取りおいた被験薬物（本実験：テストステロン使用）が１７ｍＬのＤＭＳＯに溶解されてなる被験薬物溶解液を、被験薬物終濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ（但し、被験薬物溶解液中に含まれるＤＮＳＯ量が全培養液量の１重量％以下にする。）になるように、上記の培養ジャー内に添加した。
次に、培養期間の各々の時点（培養開始後０ｈｒ、４ｈｒ、８ｈｒ、１２ｈｒ、１８ｈｒ、２４ｈｒ、３０ｈｒ、３５ｈｒ、又は４８ｈｒ経過）において、各５ｍＬ（×２）の培養液を無菌的に採取し、採取された培養液中に含まれる炭素源（即ち、グルコース）の残存濃度を市販キット（グルコースＢ−テストワコ−：測定原理は、グルコース＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→（グルコースオキシダーゼ）→  Ｈ２Ｏ２＋グルコン酸、２  Ｈ２Ｏ２＋４−アミノアンチピリン＋フェノール→（ペルオキシダーゼ）→赤色キノン色素＋４  Ｈ２Ｏという反応において生じた赤色キノン色素の量を吸光度（５０５ｎｍ）を指標にして間接的に算出する。）を用いて測定した。その結果を表１に示した。
【００４４】
【表１】
2005021104.tif 000002
【００４５】
上記の培養条件において、炭素源（即ち、グルコース）がその初発濃度の１／３倍以下の残存濃度に低下した時点から完全に消費される直前までの培養期間とは、少なくとも培養開始後２４時間以降であって培養開始後３５時間以前であることが判った。
【００４６】
実施例１８  （形質転換酵母生菌体を用いる薬物代謝体の製造における培養条件の検討（その２：培養期間中における炭素源の補給））
液体培地としては、実施例１５で使用されたＳＤＨ液体培地を用いた。
予め凍結保存によりストックされていた前記の形質転換酵母菌体（０．５ｍＬ）を５ｍＬのＳＤＨ液体培地に加え、約２４ｈｒ培養することにより前培養液を得た。得られた前培養液（約０．０５ｍＬ）を採取し、これを５ｍＬのＳＤＨ液体培地（本培養液）に加え、約４８ｈｒ培養（培養条件：３０℃，２００ｒｐｍ）した。
同時に、予めガラス製サンプル瓶に取りおいた被験薬物（ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の場合にはトルブタマイド（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）であり、その薬物代謝体はヒドロキシトルブタマイド（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｍｉｄｅ）である。ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の場合にはＳ−メフェニトイン（Ｓ−Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）であり、その薬物代謝体は４’−ヒドロキシメフェニトイン（４’−  Ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）である。ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合にはブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）であり、その薬物代謝体は１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）である。ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の場合にはテストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）であり、その薬物代謝体は６β−ヒドロキシテストステロン（６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）である。）が１７ｍＬのＤＭＳＯに溶解されてなる被験薬物溶解液を、基質終濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ（但し、被験薬物溶解液中に含まれるＤＮＳＯ量が全培養液量の１重量％以下にする。）になるように、上記の本培養液中に添加した。
次に、培養期間の各々の時点（培養開始後１８ｈｒ、２４ｈｒ又は３０ｈｒ経過）において、８重量％に相当する炭素源（即ち、初発濃度と同等のグルコース）を無菌的に補給し、さらに培養終了の時点まで培養を継続した（表３参照）。ここで、培養期間の各々の時点における炭素源（即ち、グルコース）の初発濃度に対する残存濃度の割合は、培養開始後１８ｈｒ、２４ｈｒ又は３０ｈｒ経過時点において、約９／１０程度、約１／３程度又は約１／２０程度であった。
培養終了後、各々の本培養液における被験薬物及び薬物代謝体の濃度を、下記の抽出・測定手順を用いて測定した。
【００４７】
（１）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、２Ｃ１９及び３Ａ４に係る試料としての本培養液の処理：
（１）当該試料を遠心して上清（培地）と沈渣（菌体）に分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，１０ｍｉｎ）した。
（２−１）分離された上清（培地）に酢酸エチル５ｍＬを混ぜｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（２−２）遠心分離により分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。
（２−３）溶媒層を回収した。水層に対しては再び酢酸エチルを加え、ｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（２−４）上記分離の操作を２回繰り返した（計３回）。
（２−５）回収された全ての溶媒層を集めて、これを濃縮乾固した。得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを加え、当該残渣を溶解した。
（３−１）次に、分離された沈渣（菌体）に酢酸エチル２ｍＬを加え、これを超音波処理（２０分）した後、当該処理物をｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（３−２）遠心分離により分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。
（３−３）溶媒層を回収した。水層に対しては再び酢酸エチルを加え、これを超音波処理（２０分）した後、当該処理物をｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（３−４）上記分離の操作を２回繰り返した（計３回）。
（３−５）回収された全ての溶媒層を集めて、これを濃縮乾固した。得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを加え、当該残渣を溶解した。
（４）上記（２−５）及び（３−５）で得られた抽出物等を下記の分析条件を用いてＨＰＬＣで分析した。
【００４８】
（２）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６に係る試料としての本培養液の処理：
（１）当該試料に塩化ナトリウムを飽和になるよう加え（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ菌培養液）、これに抽出用溶媒（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／２−プロパノール（ＭＴＢＥ／ＩＰＡ）＝３：１）５ｍＬを混ぜｖｏｒｔｅｘで攪拌（２分）した。
（２−２）遠心分離により分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。
（２−３）溶媒層を回収した。水層に対しては再び酢酸エチルを加え、ｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（２−４）上記分離の操作を２回繰り返した（計３回）。
（２−５）回収された全ての溶媒層を集めて、これを濃縮乾固した。得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを加え、当該残渣を溶解した。
（３）上記（２−５）で得られた抽出物等を下記の分析条件を用いてＨＰＬＣで分析した。
【００４９】
（３）分析条件
（１）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の場合
被験薬物：トルブタマイド（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）
薬物代謝体：ヒドロキシトルブタマイド（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｍｉｄｅ）］
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２３０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液／０．０１％ＴＦＡ−メタノール溶液＝５０／５０
【００５０】
（２）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の場合
被験薬物：メフェニトイン（Ｓ−Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）
薬物代謝体：４‘−ヒドロキシメフェニトイン（４’−  Ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、水／メタノール＝６５／３５
（３）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合
被験薬物：ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
薬物代謝体：１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：〔Ａ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液と〔Ｂ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸メタノール溶液とのグラジエント法（表２参照）
【００５１】
【表２】
2005021104.tif 000003
【００５２】
（４）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の場合
被験薬物：テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
薬物代謝体：６β−ヒドロキシテストステロン（６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：４０℃、検出波長：ＵＶ２４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、水／メタノール＝４５／５５
【００５３】
当該試験の結果を表４〜７に示した。
【００５４】
【表３】
2005021104.tif 000004
【００５５】
【表４】
2005021104.tif 000005
【００５６】
【表５】
2005021104.tif 000006
【００５７】
【表６】
2005021104.tif 000007
【００５８】
【表７】
2005021104.tif 000008
【００５９】
上記の表４〜７から明らかなように、炭素源（即ち、グルコース）がその初発濃度の約１／３倍程度以下の残存濃度に低下していた時点（即ち、２４ｈｒ：試験区名Ｃに相当する。）、炭素源（即ち、グルコース）がその初発濃度の約１／４倍程度以下の残存濃度に低下していた時点（即ち、３０ｈｒ：試験区名Ｄに相当する。）において、当該炭素源を補給することにより、いずれのチトクロムＰ４５０分子種を産生する形質転換酵母菌体においても顕著に薬物代謝体を製造できることが見出された。
【００６０】
実施例１９  （形質転換酵母生菌体を用いる薬物代謝体の製造における培養条件の検討（その３：培養期間中における微生物と被験薬物との接触））
チトクロムＰ４５０分子種を産生する形質転換酵母菌体としてチトクロムＰ４５０  ３Ａ４又はチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９を用いた。
培養期間中における炭素源の補給を培養開始後３０ｈｒ経過した時点に固定し、かつ、培養開始前において予め液体培地中に被験薬物を添加せず、培養開始後３０ｈｒ経過した時点において液体培地中に被験薬物を添加すること、及び、全培養時間を４８ｈｒから５４ｈｒ又は７８ｈｒに変更すること以外には実施例１８に記載される方法と同様な方法に準じて、培養期間中において微生物と被験薬物とを接触させる時期を検討した。尚、液体培地中への被験薬物の添加方法としては、１回操作当たりの被験薬物の添加量が０．１ｍＭ以上にならないように１０分間隔で０．１ｍＭずつに数回に分けて添加する方法を用いた。
その結果、表８及び表９から明らかなように、いずれのチトクロムＰ４５０分子種を産生する形質転換酵母菌体においても、培養開始前において予め液体培地中に被験薬物を添加して微生物と被験薬物とを培養開始時点から接触させることにより、顕著に薬物代謝体を製造できることが見出された。
【００６１】
【表８】
2005021104.tif 000009
【００６２】
【表９】
2005021104.tif 000010
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、生育にリンクしない基質である薬物を、生育にリンクしない生産物（ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｌｉｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）である薬物代謝酵素が有する薬物代謝能力を有する微生物による薬物代謝体の製造を目的にする場合において、薬物代謝能力を有する微生物が薬物代謝体を効率的に製造することが可能となった。