(57)【要約】【課題】試料から発せられる光を測定するための測定装置を構成するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットを提供する。【解決手段】測定装置１００は、共焦点光学顕微鏡１１０と、蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を発する励起光源部１３０と、受光ユニット１４０とを有している。共焦点光学顕微鏡１１０は、励起光源部１３０からの励起光を取り込むための励起光入力ポート１１２と、励起光により発生された蛍光を出力するための出力ポート１１３とを有している。受光ユニット１４０は、共焦点光学顕微鏡１１０からの蛍光を含む信号光を取り込むための入力部１４１を有している。受光ユニット１４０の入力部１４１は、光ファイバー１５３を介して、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３と光学的に接続される。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から発せられる光を受光するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットであり、
共焦点光学顕微鏡から出力される信号光を取り込むための入力部と、
入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の光を抽出する光抽出部とを有している、受光ユニット。
【請求項２】
請求項１において、受光ユニットは、蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析のために共焦点光学顕微鏡に接続され、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は蛍光を含んでおり、光抽出部は、入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の蛍光を抽出する、受光ユニット。
【請求項３】
請求項２において、蛍光を検出するための光検出器と、光検出器の手前に配置されたピンホールとを有し、ピンホールはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にある、受光ユニット。
【請求項４】
請求項３において、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は複数種類の蛍光を含んでおり、光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し、受光ユニットは、使用する複数色の蛍光色素に対応する吸収波長毎の検出器を有している、受光ユニット。
【請求項５】
請求項２において、蛍光を出力するための蛍光出力部をさらに有し、蛍光出力部はピンホールを含み、ピンホールはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあり、蛍光出力部は蛍光を検出するための光検出器と光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項６】
請求項５において、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は複数種類の蛍光を含んでおり、光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し、受光ユニットは、蛍光の種類に対応した数の蛍光出力部を有している、受光ユニット。
【請求項７】
請求項５または請求項６において、蛍光出力部と光検出器とが光導体を介して光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項８】
請求項３〜請求項５のいずれかひとつにおいて、共焦点光学顕微鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポートを有し、共焦点光学顕微鏡の出力ポートに受光ユニットの入力部が直接取り付けられる、受光ユニット。
【請求項９】
請求項３または請求項５において、共焦点光学顕微鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポートを有し、共焦点光学顕微鏡の出力ポートと受光ユニットの入力部とが光導体を介して光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項１０】
請求項４または請求項６において、共焦点光学顕微鏡は蛍光を含む信号光を出力する出力ポートを有し、共焦点光学顕微鏡の出力ポートと受光ユニットの入力部とがマルチモード光導体を介して光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項１１】
請求項１において、共焦点光学顕微鏡は、試料に対向される対物レンズと、試料から光を発生させるための光を取り込むための光入力ポートと、信号光を出力するための出力ポートとを有し、受光ユニットの入力部は共焦点光学顕微鏡の出力ポートと光学的に接続され、入力部と光学的に接続される出力ポートは光入力ポートよりも対物レンズから遠くに位置している、受光ユニット。
【請求項１２】
請求項１１において、試料から光を発生させるための光は対物レンズによって一点に収束され、受光ユニットは、試料から光を発生させるための光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している、受光ユニット。
【請求項１３】
請求項１２において、ピンホールを通過した光を検出するための光検出器をさらに有している、受光ユニット。
【請求項１４】
請求項１２において、ピンホールを通過した光を出力するための光出力部をさらに有しており、光出力部は光検出器と光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項１５】
請求項１２において、入力部とピンホールの間に配置された、特定の偏光成分を選択的に透過する偏光素子をさらに有している、受光ユニット。
【請求項１６】
請求項１１において、試料から光を発生させるための光は対物レンズによって一点に収束され、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は複数の波長の光を含んでおり、光抽出部は光を種類毎に分離して抽出し、受光ユニットは、光抽出部で抽出される光の波長の種類に対応した数のピンホールを有し、それらのピンホールは共に、試料から光を発生させるための光の収束点に対して共焦点の位置関係にある、受光ユニット。
【請求項１７】
請求項１６において、ピンホールをそれぞれ通過した光を検出するための複数の光検出器をさらに有している、受光ユニット。
【請求項１８】
請求項１６において、ピンホールをそれぞれ通過した光を出力するための複数の光出力部をさらに有しており、光出力部はそれぞれ複数の光検出器と光学的に接続される、受光ユニット。
【請求項１９】
請求項１６において、光抽出部とピンホールの間にそれぞれ配置された、特定の偏光成分を選択的に透過する複数の偏光素子をさらに有している、受光ユニット。
【請求項２０】
請求項１１〜請求項１９のいずれかひとつにおいて、試料から光を発生させるための光が光パルスである、受光ユニット。
【請求項２１】
請求項１１〜請求項１９のいずれかひとつにおいて、信号光が試料から発せられた散乱光を含み、受光ユニットは、散乱光強度の測定と散乱光強度ゆらぎの相関解析と散乱光強度の偏光成分の測定との少なくとも一つに適用される、受光ユニット。
【請求項２２】
請求項１１〜請求項１９のいずれかひとつにおいて、信号光が試料から発せられた蛍光を含み、受光ユニットは、蛍光強度の測定と蛍光強度ゆらぎの相関解析と蛍光強度の偏光成分の測定との少なくとも一つに適用される、受光ユニット。
【請求項２３】
請求項１１〜請求項１９のいずれかひとつにおいて、化学発光と生物発光とりん光の測定のいずれか一つに適用される、受光ユニット。
【請求項２４】
試料から発せられる光を測定するための測定装置であり、
試料から光を発生させるための光を発する光源部と、
試料から光を発生させるための光を取り込むための光入力ポートと信号光を出力するための出力ポートとを有する共焦点光学顕微鏡と、
共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットとを備えており、受光ユニットは、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光を取り込むための入力部と、入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の光を抽出する光抽出部とを有している、測定装置。
【請求項２５】
請求項２４において、受光ユニットは、蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析のために共焦点光学顕微鏡に接続され、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は蛍光を含んでおり、光抽出部は、入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の蛍光を抽出する、測定装置。
【請求項２６】
請求項２５において、受光ユニットは、蛍光を検出するための光検出器をさらに有し、光検出器はその受光面の手前に配置されたピンホールを有し、ピンホールはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している、測定装置。
【請求項２７】
請求項２６において、光源部は複数種類の励起光を発し、共焦点光学顕微鏡は複数種類の蛍光を含む信号光を出力し、受光ユニットは蛍光の種類に対応した数の検出器を有し、光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し、検出器はそれぞれ対応する種類の蛍光を検出する、測定装置。
【請求項２８】
請求項２５において、受光ユニットは、蛍光を出力するための蛍光出力部をさらに有し、蛍光出力部はピンホールを含み、ピンホールはその蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあり、測定装置はさらに、蛍光出力部と光学的に接続された、蛍光を検出するための光検出器を備えている、測定装置。
【請求項２９】
請求項２８において、光源部は複数種類の励起光を発し、共焦点光学顕微鏡は複数種類の蛍光を含む信号光を出力し、受光ユニットは蛍光の種類に対応した数の蛍光出力部を有し、光抽出部は蛍光を種類毎に分離して抽出し、蛍光出力部はそれぞれ対応する種類の蛍光を出力する、測定装置。
【請求項３０】
請求項２６〜請求項２８のいずれかひとつにおいて、受光ユニットの入力部が共焦点光学顕微鏡の出力ポートに直接取り付けられている、測定装置。
【請求項３１】
請求項２６または請求項２８において、共焦点光学顕微鏡の出力ポートと受光ユニットの入力部とが光導体を介して光学的に接続される、測定装置。
【請求項３２】
請求項２７または請求項２９において、共焦点光学顕微鏡の出力ポートと受光ユニットの入力部とがマルチモード光導体を介して光学的に接続される、測定装置。
【請求項３３】
請求項２４において、共焦点光学顕微鏡は、試料に対向される対物レンズを含み、受光ユニットの入力部は共焦点光学顕微鏡の出力ポートと光学的に接続され、出力ポートは光入力ポートよりも対物レンズから遠くに位置している、測定装置。
【請求項３４】
請求項３３において、試料から光を発生させるための光は対物レンズによって一点に収束され、受光ユニットは、試料から光を発生させるための光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している、測定装置。
【請求項３５】
請求項３４において、受光ユニットは、ピンホールを通過した光を検出するための光検出器をさらに有している、測定装置。
【請求項３６】
請求項３４において、受光ユニットは、ピンホールを通過した光を出力するための光出力部をさらに有しており、光出力部は光検出器と光学的に接続される、測定装置。
【請求項３７】
請求項３４において、受光ユニットは、入力部とピンホールの間に配置された、特定の偏光成分を選択的に透過する偏光素子をさらに有している、測定装置。
【請求項３８】
請求項３３において、試料から光を発生させるための光は対物レンズによって一点に収束され、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光は複数の波長の光を含んでおり、光抽出部は光を種類毎に分離して抽出し、受光ユニットは、光抽出部で抽出される光の波長の種類に対応した数のピンホールを有し、それらのピンホールは共に、試料から光を発生させるための光の収束点に対して共焦点の位置関係にある、測定装置。
【請求項３９】
請求項３８において、受光ユニットは、ピンホールをそれぞれ通過した光を検出するための複数の光検出器をさらに有している、測定装置。
【請求項４０】
請求項３８において、受光ユニットは、ピンホールをそれぞれ通過した光を出力するための複数の光出力部をさらに有しており、光出力部はそれぞれ複数の光検出器と光学的に接続される、測定装置。
【請求項４１】
請求項３８において、受光ユニットは、光抽出部とピンホールの間にそれぞれ配置された、特定の偏光成分を選択的に透過する複数の偏光素子をさらに有している、測定装置。
【請求項４２】
請求項３３〜請求項４１のいずれかひとつにおいて、光源が光パルスの試料から光を発生させるための光を発する、測定装置。
【請求項４３】
請求項３３〜請求項４１のいずれかひとつにおいて、信号光が試料から発せられた散乱光を含み、散乱光強度の測定と散乱光強度ゆらぎの相関解析と散乱光強度の偏光成分の測定との少なくとも一つを行なう、測定装置。
【請求項４４】
請求項３３〜請求項４１のいずれかひとつにおいて、信号光が試料から発せられた蛍光を含み、受光ユニットは、蛍光強度の測定と蛍光強度ゆらぎの相関解析と蛍光強度の偏光成分の測定との少なくとも一つを行なう、測定装置。
【請求項４５】
請求項３３〜請求項４１のいずれかひとつにおいて、化学発光と生物発光とりん光の測定のいずれか一つを行なう、測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から発せられる光を測定するための測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の特定部位から統計的な性質や分子レベルの機能を解析する測定装置として、例えば特表１１−５０２６０８号公報では、共焦点光学顕微鏡をベースとし、レーザー光を顕微鏡対物レンズを通して蛍光標識された試料に照射し、試料内の蛍光分子による蛍光強度ゆらぎを解析し（蛍光相関分光を行ない）、蛍光分子の並進拡散係数などの統計的な性質や分子間の相互作用などを求める方法と装置を開示している。
【０００３】
共焦点光学顕微鏡に関しては、例えば、”Confocal Microscopy” T. Wilson(ed.) Academic press (London)、主に生物試料を対象とした解説として、”Handbook of Biological confocal Microscopy” J. B. Pawley(ed.) Plenum Press (New York)などがある。蛍光相関分光法に関しては、例えば、”Fluorescence correlation spectroscopy” R. Rigler, E. S. Elson (eds.) Springer (Berlin)や金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, p1431-1437などの解説がある。
【０００４】
蛍光相関分光法では共焦点走査型レーザー顕微鏡の視野の中で蛍光物質で標識されたタンパク質や担体粒子を溶液中に浮遊させ、これらの微粒子のブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析して自己相関関数を求め、対象とする微粒子の数や並進拡散速度などを推測する。
【０００５】
一方、蛍光標識された標本試料にレーザー光を走査しながら照射し、試料の蛍光顕微鏡画像を生成する共焦点走査型レーザー顕微鏡がある。共焦点走査型レーザー顕微鏡に関しては、例えば特開平１０−２０６７４２号公報に記述されている。あるいは、大出孝博らによる解説（「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.392〜398）や、河田聡による解説（「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.380〜391）などがある。
【０００６】
米国特許第５，１２０，９５３号ではレーザー走査型共焦点光学顕微鏡において、レーザー光源からの光を光ファイバーに導光し、顕微鏡本体に導き、試料面に照射する。試料からの光信号を顕微鏡本体を介して再び光ファイバーに導き、光ファイバーに接続した光検出器で受光する。すなわち、光源と光検出器が顕微鏡本体と光ファイバーで光接続された装置構成となっている。また、米国特許第５，１６１，０５３号では共焦点光学顕微鏡の光源からの光を光ファイバーで顕微鏡本体に導き、試料からの光信号を光分岐して別の光ファイバーに導光し、これに光接続された光検出器で受光する。
【特許文献１】特表１１−５０２６０８号公報
【特許文献２】特開平１０−２０６７４２号公報
【特許文献３】米国特許第５，１２０，９５３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１６１，０５３号明細書
【特許文献５】特表２００１−５０５９９７号公報
【特許文献６】特表２００３−５２４１８０号公報
【非特許文献１】”Confocal Microscopy” T. Wilson(ed.) Academic press (London)
【非特許文献２】”Handbook of Biological confocal Microscopy” J. B. Pawley(ed.) Plenum Press (New York)
【非特許文献３】”Fluorescence correlation spectroscopy” R. Rigler, E. S. Elson (eds.) Springer (Berlin)
【非特許文献４】金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, p1431-1437
【非特許文献５】大出孝博ら「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.392〜398
【非特許文献６】河田聡「光学」Vol.18, Vol.8, p.p.380〜391
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特表２００１−５０５９９７号公報は、顕微鏡に接続してＦＣＳ測定を行なうための着脱自在のユニットを開示している。このユニット内には光源入出力ポートと光信号の出力ポートが設置されており、出力ポートから出力された信号光を光検出器で受光してＦＣＳ測定を行なう。
【０００８】
また特表２００３−５２４１８０号公報は顕微鏡に接続したＦＣＳ測定を行なうためのユニットを開示されている。このユニットでは光源本体が組み込まれている。このユニットから光を射出し、顕微鏡に導き、試料を光照射する。試料から発せられた光信号を顕微鏡を介してこのユニット内で受光し、ＦＣＳ測定を行なう。
【０００９】
いずれのユニットも、ユニット内に光源入出力ポートを備えており、光源から発せられた光ビームがユニット内を通過する。光源から発せられた光ビームはユニット内のレンズやミラーなどの光学素子に入射して反射や屈折や透過などを繰り返す。このとき、光学素子での透過損失や反射損失によって反射光や散乱光が生じ、生じた反射光や散乱光の一部はノイズ光となる。例えば、通常のアルミ平面ミラーでは１０％程度の反射損失がある。また、光源からの光ビームをユニット内に通過させて顕微鏡本体内に導くために少なくとも一個のハーフミラー（またはダイクロイックミラー）が必要であり、そのハーフミラー（またはダイクロイックミラー）でも反射損失がある。さらに、ユニットと顕微鏡本体を結合するファイバーなどの光学系が必要であり、その光学系でも例えばファイバーの入射端と射出端でも反射損失がある。結局、光源からの光の強度は、試料面上において、全体で１０〜２０％低下する。検出対象の光は、例えば試料内の蛍光物質から発せられる蛍光であり、その光強度が微弱である。このため、検出対象の光を確実に検出するためには、光源からの光が光路内でなるべく減衰しないようにしなければならない。また、光路の途中にある光学素子での減衰を見越して、光源の光出力を高くしなければならない。
【００１０】
しかも、ユニット内には光検出器が設置されており、光源からの光ビームが通過する経路に距離的に近いため、光学素子で生じた反射光や散乱光が光検出器に入射しやすい。このようなノイズ光は、試料から発せられる検出対象の光が微弱なため、信号のＳ／Ｎ比の低下を引き起こす危険性が高い。
【００１１】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その主な目的は、試料から発せられる光を測定するための測定装置を構成するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ひとつには、試料から発せられる光を受光するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットに向けられている。本発明の受光ユニットは、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光を取り込むための入力部と、入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の光を抽出する光抽出部とを有している。
【００１３】
また本発明は、ひとつには、試料から発せられる光を測定するための測定装置に向けられている。本発明の測定装置は、試料から光を発生させるための光を発する光源部と、試料から光を発生させるための光を取り込むための光入力ポートと信号光を出力するための出力ポートとを有する共焦点光学顕微鏡と、共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットとを備えており、受光ユニットは、共焦点光学顕微鏡から出力される信号光を取り込むための入力部と、入力部を介して取り込まれた信号光から検出すべき特定の光を抽出する光抽出部とを有している。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、試料から発せられる光を測定するための測定装置を構成するために共焦点光学顕微鏡に接続される受光ユニットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１６】
第一実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析（ＦＣＳ）を行なう測定装置に向けられている。図１は、本発明の第一実施形態に従う共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の全体構成を示している。図２は、図１に示される測定装置の外観を概略的に示している。図３は、図１に示される受光ユニットの構成を示している。図４は、図１に示される測定装置とその信号処理系とを示している。
【００１７】
図１と図２に示されるように、本実施形態の測定装置１００は、共焦点光学顕微鏡１１０と、蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を発する励起光源部１３０と、受光ユニット１４０とを有している。
【００１８】
図１に示されるように、共焦点光学顕微鏡１１０は、試料１２１が載せられる試料ステージ１２２と、試料ステージ１２２を移動させるための二つのステッピングモーター１２３とを有している。二つのステッピングモーター１２３は、駆動軸が互いに直交するように配置されており、試料ステージ１２２を互いに直交する二方向、いわゆるｘ方向とｙ方向に移動させ得る。ステッピングモーター１２３は（図示しない）コントローラーによって制御される。
【００１９】
測定装置１００は、通常の光学観察のための照明光を発するための照明光源１２５をさらに有し、共焦点光学顕微鏡１１０は、照明光源１２５からの照明光を取り込むための照明光入力ポート１１１と、励起光源部１３０からの励起光を取り込むための励起光入力ポート１１２と、励起光により発生された蛍光を出力するための出力ポート１１３とを有している。
【００２０】
照明光源１２５は、これに限定されないが、例えば、ハロゲンランプあるいはメタルハライドランプで構成される。
【００２１】
共焦点光学顕微鏡１１０は、試料ステージ１２２の下方に配置された対物レンズ１１４と、照明光入力ポート１１１から取り込まれた照明光を対物レンズ１１４に方向付けるダイクロイックミラー１１５と、観察者による試料１２１の目視観察を可能にする接眼レンズ１２６とを有している。
【００２２】
測定装置１００はさらに、試料１２１の光学像を取得するためのＣＣＤカメラ１２７と、ＣＣＤカメラ１２７で取得された光学像を抽出（表示）するＴＶモニター１２８とを有している。
【００２３】
励起光源部１３０は、二つのレーザー光源１３１と１３２と、レーザー光源１３１と１３２からのそれぞれの光ビームを平行化する二つのレンズ１３３と１３４と、レンズ１３３からの光ビームを励起光入力ポート１１２へ方向付けるミラー１３５と、レンズ１３４からの光ビームを励起光入力ポート１１２へ方向付けるダイクロイックミラー１３６とを有している。
【００２４】
励起光源部１３０のレーザー光源１３１と１３２は、励起する蛍光物質の種類に応じて、適した波長の光を発するものが使用される。これに限定されないが、例えば、蛍光物質はローダミン・グリーン（Rhodamine Green：ＲｈＧ）とサイファイヴ（Ｃｙ５）であり、これに対応して、レーザー光源１３１は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）を励起するために、波長４８８ｎｍの光を発するアルゴンレーザーであり、レーザー光源１３２は、サイファイヴ（Ｃｙ５）を励起するために、波長６３２．８ｎｍの光を発するＨｅ−Ｎｅレーザーである。
【００２５】
ダイクロイックミラー１３６は、レーザー光源１３１から射出される励起光を透過し、レーザー光源１３２から射出される励起光を反射する特性を有し、レーザー光源１３１からの励起光とレーザー光源１３２からの励起光とを結合して励起光入力ポート１１２に導く。
【００２６】
共焦点光学顕微鏡１１０は、励起光入力ポート１１２から導入された励起光を反射して対物レンズ１１４に方向付けると共に、試料１２１から発生した蛍光を透過するダイクロイックミラー１１６と、ダイクロイックミラー１１６からの蛍光のビームを反射して出力ポート１１３に方向付けるミラー１１７と、ミラー１１７からの蛍光のビームを収束させるレンズ１１８とを有している。
【００２７】
受光ユニット１４０は、図３に詳しく示されるように、共焦点光学顕微鏡１１０からの蛍光を含む信号光を取り込むための入力部１４１と、入力部１４１を介して取り込まれた信号光のビームを平行化するためのレンズ１４２と、信号光から蛍光をその種類毎に抽出する光抽出部１４３と、一方の蛍光のビームを収束させるためのレンズ１４６と、その蛍光を検出するための光検出器１４８と、光検出器１４８の手前に配置されたピンホールユニット１４７と、もう一方の蛍光のビームを収束させるためのレンズ１５０と、その蛍光を検出するための光検出器１５２と、光検出器１５２の手前に配置されたピンホールユニット１５１とを有している。
【００２８】
受光ユニット１４０の入力部１４１は、光ファイバー１５３を介して、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３と光学的に接続される。光ファイバー１５３は、共焦点光学顕微鏡１１０から二種類の蛍光を含む光を受光ユニット１４０に導くため、マルチモード光ファイバーで構成される。光ファイバー１５３は、これに限定されないが、例えば、コア直径１００μｍ、ＮＡ０．２２のマルチモード光ファイバーである。
【００２９】
より詳しくは、出力ポート１１３は、例えば写真撮影用のカメラを接続するためのポートであり、（図示しない）光ファイバー接続端子が取り付けられる。光ファイバー接続端子は、これに限定されないが、例えばＦＣコネクタやＳＣコネクタやＳＴコネクタなどである。受光ユニット１４０の入力部１４１にも、同様の（図示しない）光ファイバー接続端子が取り付けられる。光ファイバー１５３は、これらの光ファイバー接続端子に接続される。
【００３０】
光抽出部１４３は、一方の蛍光を含む波長帯域の光を透過し、もう一方の蛍光を含む波長帯域の光を反射する特性を有するダイクロイックミラー１４４と、一方の蛍光を選択的に透過する特性を有するフィルター１４５と、もう一方の蛍光を選択的に透過する特性を有するフィルター１４９とを有している。
【００３１】
例えば、前述の蛍光物質に対応して、ダイクロイックミラー１４４は、サイファイヴ（Ｃｙ５）から発生する蛍光を含む波長帯域の光を透過し、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）から発生する蛍光を含む波長帯域の光を反射し、フィルター１４５は、サイファイヴ（Ｃｙ５）から発生する蛍光を選択的に透過し、フィルター１４９は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）から発生する蛍光を選択的に透過する。
【００３２】
ピンホールユニット１４７は、その後ろの光検出器１４８で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している。同様に、ピンホールユニット１５１は、その後ろの光検出器１５２で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している。
【００３３】
光検出器１４８と１５２は、入射した光の強度を反映した電気信号を出力する。光検出器１４８と１５２は、これに限定されないが、例えば、いずれもアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ：Avalanche Photo Diode）である。あるいは、光電子増倍管であってもよい。ピンホールユニット１４７と１５１内のピンホールは、これに限定されないが、例えば、いずれも２００μｍの直径を有している。また、対物レンズ１１４は、微小な共焦点領域の形成のために、これに限定されないが、例えば、１．０程度のＮＡ（開口数）を有している。これにより、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円柱状の共焦点領域が得られる。
【００３４】
図４に示されるように、測定装置１００はさらに、受光ユニット１４０の光検出器１４８と１５２から出力される電気信号を波形整形してオン・オフの二値化パルスに変換する信号処理装置１６１と、信号処理装置１６１から出力される二値化パルスに対して相関演算を行なって自己相関関数を求める相関解析装置１６２と、相関解析装置１６２で得られた自己相関関数から蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などを求めるためのコンピューター１６３とを有し、さらには、相関解析装置１６２で得られた結果を表示するＴＶモニター１６４を有している。
【００３５】
本実施形態の測定装置１００において、蛍光相関分光測定は次のようにして行なわれる。
【００３６】
図１において、レーザー光源１３１から発せられた励起光ビームは、レンズ１３３で適当な径の平行光ビームに変えられ、ミラー１３５で反射され、ダイクロイックミラー１３６を透過し、励起光入力ポート１１２を通って空間伝播により共焦点光学顕微鏡１１０の内部に入る。なお、この空間伝播の部分はシングルモードファイバーにより光学的に接続した構成としてもよい。
【００３７】
また、レーザー光源１３２から発せられた励起光ビームは、レンズ１３４により適当な径の平行光ビームに変えられ、ダイクロイックミラー１３６で反射され、励起光入力ポート１１２を通って共焦点光学顕微鏡１１０の内部に入る。
【００３８】
共焦点光学顕微鏡１１０に入った励起光ビームは、ダイクロイックミラー１１６で反射され、ダイクロイックミラー１１５を透過し、対物レンズ１１４によって収束される。前述したように、対物レンズ１１４は、１．０程度の大きい開口数を有しており、これにより、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円柱状の共焦点領域が得られる。
【００３９】
この領域に存在する蛍光物質は、励起光により励起され、蛍光信号（フォトンパルス）を発生する。蛍光物質から発生された蛍光信号の一部は、試料１２１で反射された励起光の一部と共に、対物レンズ１１４に入射して信号光となる。対物レンズ１１４に入射した信号光は、ダイクロイックミラー１１５とダイクロイックミラー１１６を透過し、ミラー１１７で反射され、レンズ１１８で収束される。レンズ１１８で収束された信号光は、出力ポート１１３に取り付けられた光ファイバー接続端子から光ファイバー１５３内に入る。
【００４０】
光ファイバー１５３内に入った信号光は、光ファイバー１５３の内部を伝搬して、受光ユニット１４０の入力部１４１から射出される。図３に示されるように、入力部１４１から射出された信号光ビームは、レンズ１４２で適当な径の平行光ビームに変えられ、ダイクロイックミラー１４４により蛍光の種類毎に分離される。すなわち、サイファイヴ（Ｃｙ５）から発生した蛍光は、ダイクロイックミラー１４４を透過し、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）から発生する蛍光は、ダイクロイックミラー１４４で反射される。
【００４１】
ダイクロイックミラー１４４を透過した光は、フィルター１４５により不所望な成分が取り除かれ、レンズ１４６で収束され、ピンホールユニット１４７を介して光検出器１４８に入射して、光電変換される。同様に、ダイクロイックミラー１４４で反射された光は、フィルター１４９により不所望な成分が取り除かれ、レンズ１５０で収束され、ピンホールユニット１５１を介して光検出器１５２に入射して、光電変換される。
【００４２】
図４において、光検出器１４８と１５２で光電変換された電気信号は、信号処理装置１６１に送られて二値化パルス信号に変換される。二値化パルス信号は相関解析装置１６２に送られ、相関解析装置１６２において例えば自己相関関数が求められる。自己相関関数はコンピューター１６３に送られ、蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などの算出に利用される。
【００４３】
相関解析装置１６２は、二種類の蛍光分子（ローダミン・グリーン、サイファイヴ）による蛍光強度ゆらぎの相互相関関数を求めてもよい。あるいは、相関解析装置１６２を用いずに、信号処理装置１６１から出力される二値化パルス信号を直接コンピューター１６３に入力し、コンピューター１６３で相関解析を行なって、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数、あるいは相互相関関数を求めてもよい。
【００４４】
以下、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数について説明する。
【００４５】
光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光強度ゆらぎの自己相関関数Ｒ（τ）は次式で表される。
【数１】
2005017282.tif 000003
【００４６】
ただし、Ｉは光検出器で受光される蛍光物質からの蛍光の強度、ｔは時間、τは遅れ時間である。＜＞はアンサンブル平均を表わす。
【００４７】
蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を規格化すると、次のようになる。
【数２】
2005017282.tif 000004
【００４８】
【数３】
2005017282.tif 000005
【００４９】
ただし、Ｇ（τ）は規格化した蛍光強度ゆらぎの自己相関関数、Ｎは共焦点領域内に存在する平均分子数であり、共焦点領域内に存在する分子の存在確率がポアソン分布に従うと仮定している。
【００５０】
入射光がガウス分布を有する光（アルゴンレーザーやヘリウムネオンレーザーなど）であるとすると、光強度ゆらぎの自己相関関数Ｇ（τ）は次のようになる。
【数４】
2005017282.tif 000006
【００５１】
ただし、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数、ω1は共焦点領域を円柱と近似したときの高さの１／２、ω2は半径である。
【００５２】
このとき、τＤを蛍光物質の分子の拡散時間とすると、次のようになる。
【数５】
2005017282.tif 000007
【００５３】
蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のプロファイルから蛍光分子の大きさなどを推定する場合は、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数を蛍光強度ゆらぎの時間平均値の二乗で割って、カーブフィッティングを行なって拡散時間と、Ｙ軸切片（自己相関関数がｙ軸と交差する点のｙ座標）を求める。カーブフィッティング法としては最小二乗法などを用いればよい。例えば、非線形最小自乗法の一つであるレーベンバーグ・マーカート（Levenberg Marquard）法を用いて最適化してもよい（“Numerical Recipes in C”,  William H. Pressら著、丹慶勝市ら訳、技術評論社、１９９４）。
【００５４】
なお、蛍光強度ゆらぎの自己相関関数のＹ軸切片の値は（３）式からわかるように、共焦点領域内に存在する平均の蛍光分子の数に対応する。（参考文献：Single Molecule Detection in Solution, Ch. Zander, J. Enderlein, R. A. Keller(eds.)  WILEY-VCH, Germany）
本実施形態において、受光ユニット１４０は、図２に示されるように、共焦点光学顕微鏡１１０から独立した分離ユニット構造となっており、光ファイバーを介して共焦点光学顕微鏡１１０と光学的に接続される。受光ユニットは少なくとも集光レンズとフィルターを備えている。フィルターは、試料からの蛍光波長だけを選択的に透過させるスペクトル特性を持つフィルターで構成される。また受光ユニットは、図３に示されるように、集光レンズとフィルターに加えて光検出器を備えていてもよい。この光強度ゆらぎユニットは光接続端子により容易に着脱できる。光強度ゆらぎの測定を行なわないときは、光接続端子部分で顕微鏡本体から切り離しておいてもよい。
【００５５】
本実施形態において、励起光源部１３０と受光ユニット１４０はそれぞれ共焦点光学顕微鏡１１０から独立した分離ユニット構造となっており、励起光源部１３０は励起光入力ポート１１２を介して共焦点光学顕微鏡１１０と光学的に接続され、受光ユニット１４０は出力ポート１１３を介して共焦点光学顕微鏡１１０と光学的に接続される。
【００５６】
このため、通常の共焦点光学顕微鏡１１０に励起光源部１３０と受光ユニット１４０ほかを接続することにより、容易に蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう装置を構成することが可能となる。
【００５７】
また、励起光源部１３０から射出された励起光は、受光ユニット１４０内を通ることなく、対物レンズの近くに配置された励起光入力ポート１１２を介して共焦点光学顕微鏡１１０に取り込まれる。このため、励起光が途中に経由する光学素子が少なく、励起光の強度の低下がわずかに抑えられる。これにより、励起光が試料に効率良く照射される。また、受光ユニット１４０内を通る光は、実質的に試料から発せられた信号光だけとなる。その結果、信号のＳ／Ｎ比の高い測定を行なうことができる。
【００５８】
第二実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう別の測定装置に向けられている。本実施形態の測定装置は、光検出器のレイアウトの点において、第一実施形態の測定装置と相違している。
【００５９】
図５は、本発明の第二実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している。図５において、図３に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６０】
図５に示されるように、本実施形態の測定装置１００Ａでは、受光ユニット１４０Ａは、共焦点光学顕微鏡１１０からの信号光を取り込むための入力部１４１と、信号光のビームを平行化するためのレンズ１４２と、信号光から蛍光をその種類毎に抽出する光抽出部１４３と、一方の蛍光のビームを収束させるためのレンズ１４６と、その蛍光を出力するための蛍光出力部１５４と、もう一方の蛍光のビームを収束させるためのレンズ１５０と、その蛍光を検出するための蛍光出力部１５５とを有している。
【００６１】
第一実施形態と同様に、受光ユニット１４０の入力部１４１は、マルチモード光ファイバー１５３を介して、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３と光学的に接続される。また、光抽出部１４３は、一方の蛍光を含む波長帯域の光を透過し、もう一方の蛍光を含む波長帯域の光を反射する特性を有するダイクロイックミラー１４４と、一方の蛍光を選択的に透過する特性を有するフィルター１４５と、もう一方の蛍光を選択的に透過する特性を有するフィルター１４９とを有している。
【００６２】
蛍光出力部１５４は、これに限定されないが、例えばシングルモード光ファイバー１５６を介して、光検出器１４８と光学的に接続される。また、蛍光出力部１５５は、これに限定されないが、例えばシングルモード光ファイバー１５７を介して光検出器１４８と光学的に接続される。
【００６３】
蛍光出力部１５４は、光検出器１４８で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している。同様に、蛍光出力部１５５は、光検出器１５２で検出される蛍光を発生させる励起光の収束点に対して共焦点の位置関係にあるピンホールを有している。例えば、蛍光出力部１５４と１５５は光ファイバー接続端子であり、ピンホールはそれらに取り付けられた光ファイバー１５６と１５７の端面であってもよい。
【００６４】
本実施形態の測定装置１００Ａの測定動作は、第一実施形態の測定装置１００と全く同じであり、その説明は省略する。
【００６５】
本実施形態の測定装置１００Ａでは、光検出器１４８と１５２が受光ユニット１４０Ａの外に配置されているため、その後段に接続される信号処理装置やコンピューターなどの配置に合わせた設置を行なうことが可能となる。
【００６６】
第三実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう別の測定装置に向けられている。本実施形態の測定装置は、共焦点光学顕微鏡と受光ユニットとの間の光学的接続の点において、第一実施形態の測定装置と相違している。
【００６７】
図６は、本発明の第三実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している。図６において、図２に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６８】
図６に示されるように、本実施形態の測定装置１００Ｂでは、共焦点光学顕微鏡１１０と受光ユニット１４０とが、光ファイバーを介することなく、単に空間を介して接続されている。すなわち、図６には見えないが、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３（図１や図３を参照）に受光ユニット１４０の入力部１４１（図１や図３を参照）が直接取り付けられている。勿論、共焦点光学顕微鏡１１０の出力ポート１１３と受光ユニット１４０の入力部１４１とは鏡筒などの部材を介して接続されてもよい。
【００６９】
本実施形態の測定装置１００Ｂの測定動作は、第一実施形態の測定装置１００と全く同じであり、その説明は省略する。
【００７０】
本実施形態の測定装置１００Ｂでは、共焦点光学顕微鏡１１０と受光ユニット１４０とが単に空間を介して接続されているので、蛍光の損失が少ない。
【００７１】
第四実施形態
本実施形態は、共焦点走査型レーザー顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置に向けられている。図７は、本発明の第四実施形態に従う共焦点走査型レーザー顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の全体構成を示している。
【００７２】
図７に示されるように、本実施形態の測定装置２００は、共焦点走査型レーザー顕微鏡２１０を含んでいる。共焦点走査型レーザー顕微鏡２１０は、顕微鏡本体２１２と、顕微鏡本体２１２に取り付けられた対物レンズ２１７と、対物レンズ２１７の上方に配置された、試料２１９が載せられる試料ステージ２１８と、蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を発する二つの走査光源部２３０と２４０とを有している。
【００７３】
顕微鏡本体２１２は、二つの走査光源部２３０と２４０からの励起光をそれぞれ取り込むための励起光入力ポート２１３と２１４と、励起光により発生された蛍光を出力するための二つの出力ポート２１５と２１６とを有している。
【００７４】
走査光源部２３０は、レーザー光源２３１と、レーザー光源２３１からの光ビームを平行化するレンズ２３２と、レンズ２３２からの光ビームを反射するミラー２３３と、光ビームを互いに直交する二方向（Ｘ方向とＹ方向）に走査するＸＹスキャナー２３４と、ＸＹスキャナー２３４を駆動するスキャナー駆動装置２３５とを有している。
【００７５】
同様に、走査光源部２４０は、レーザー光源２４１と、レーザー光源２３１からの光ビームを平行化するレンズ２４２と、光ビームを互いに直交する二方向（Ｘ方向とＹ方向）に走査するＸＹスキャナー２４４と、ＸＹスキャナー２４４を駆動するスキャナー駆動装置２４５とを有している。
【００７６】
ＸＹスキャナー２３４と２４４は、例えば、その各々が光ビームを一本の軸に沿って走査し得る二つのガルバノミラーで構成され、二つのガルバノミラーは好ましくはそれぞれの走査軸が互いに直交するように配置されている。あるいは、ポリゴンミラーやホログラムスキャナーなどで構成されてもよい。
【００７７】
ＸＹスキャナー２３４からの光ビームは、励起光入力ポート２１３から顕微鏡本体２１２内に取り込まれる。また、ＸＹスキャナー２４４からの光ビームは、励起光入力ポート２１４から顕微鏡本体２１２内に取り込まれる。
【００７８】
レーザー光源２３１と２４１は、第一実施形態と同様に、励起する蛍光物質の種類に応じて、適した波長の光を発するものが使用される。これに限定されないが、例えば、蛍光物質はローダミン・グリーン（Rhodamine Green：ＲｈＧ）とサイファイヴ（Ｃｙ５）であり、これに対応して、レーザー光源２３１は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）を励起するために、波長４８８ｎｍの光を発するアルゴンレーザーであり、レーザー光源２４１は、サイファイヴ（Ｃｙ５）を励起するために、波長６３２．８ｎｍの光を発するＨｅ−Ｎｅレーザーである。
【００７９】
顕微鏡本体２１２は、励起光入力ポート２１３から導入された励起光を反射して対物レンズ２１７に方向付けると共に、試料２１９から発生した蛍光を透過するダイクロイックミラー２２１と、励起光入力ポート２１４から導入された励起光を反射して対物レンズ２１７に方向付けると共に、試料２１９から発生した蛍光を透過するダイクロイックミラー２２２と、ダイクロイックミラー２２２を透過した光を収束させるレンズ２３２と、一方の蛍光を含む波長帯域の光を透過し、もう一方の蛍光を含む波長帯域の光を反射して出力ポート２１５に方向付けるダイクロイックミラー２２４と、ダイクロイックミラー２２４を透過した光を出力ポート２１６に方向付けるミラー２２５とを有している。
【００８０】
測定装置２００はさらに、二つの受光ユニット２５１と２５２を有している。受光ユニット２５１と２５２は、それぞれ、光ファイバー２５３と２５４を介して、顕微鏡本体２１２の出力ポート２１５と２１６と光学的に接続されている。例えば、出力ポート２１５と２１６は写真撮影用のカメラを接続するためのポートであり、光ファイバー２５３と２５４は光ファイバー接続端子を介して出力ポート２１５と２１６に取り付けられる。
【００８１】
受光ユニット２５１と２５２は、それぞれ、試料２１９から発生する蛍光をその種類毎に検出する。受光ユニット２５１と２５２は、第一実施形態の受光ユニット１４０と同じ構成であってもよいが、その各々が検出する蛍光の種類が一種類であることに対応して、一系統のフィルターと光検出器を有していればよい。
【００８２】
例えば、受光ユニット２５１と２５２は、図３に示される受光ユニット１４０から、ダイクロイックミラー１４４とフィルター１４９とレンズ１５０とピンホールユニット１５１と光検出器１５２が省かれた構成であってよい。勿論、フィルター１４５は、検出する蛍光の種類に適した特性のものが適用される。また、光検出器１４８は、第一実施形態と同様に、アバランシェ・フォトダイオードや光電子増倍管であってよい。
【００８３】
例えば、ダイクロイックミラー２２４は、サイファイヴ（Ｃｙ５）から発生する蛍光を含む波長帯域の光を透過し、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）から発生する蛍光を含む波長帯域の光を反射する。これに対応して、受光ユニット２５２は、サイファイヴ（Ｃｙ５）から発生する蛍光を検出し、受光ユニット２５１は、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）から発生する蛍光を検出する。
【００８４】
測定装置２００はさらに、受光ユニット２５１と２５２内の光検出器から出力される電気信号を波形整形してオン・オフの二値化パルスに変換する信号処理装置２６１と、信号処理装置２６１から出力される二値化パルスに対して相関演算を行なって自己相関関数を求める相関解析装置２６２と、相関解析装置２６２で得られた自己相関関数から蛍光物質の並進拡散速度や測定領域中の蛍光分子の数の変化などを求めるためのコンピューター２６３とを有し、さらに、信号処理装置２６１で得られた結果に対してコントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なう画像処理装置２６４と、画像処理装置２６４で得られた画像を表示するＴＶモニター２６５を有している。
【００８５】
本実施形態の測定装置２００において、レーザー光源２３１から発せられた励起光ビームは、レンズ２３２で適当な径の平行光ビームに変えられ、ミラー２３３で反射され、ＸＹスキャナー２３４を経た後、励起光入力ポート２１３を介して顕微鏡本体２１２内に入り、ダイクロイックミラー２２１で反射され、対物レンズ２１７で収束され、試料２１９内で光スポットを形成する。この光スポットは、ＸＹスキャナー２３４によりＸＹ方向に走査され得る。
【００８６】
試料からの反射光と蛍光の一部（すなわち信号光）は、対物レンズ２１７に入り、二つのダイクロイックミラー２２１と２２２を透過し、ダイクロイックミラー２２４で反射されて出力ポート２１５に方向付けられる。信号光は、出力ポート２１５に取り付けられた光ファイバー２５３を、受光ユニット２５１に入る。
【００８７】
受光ユニット２５１は、信号光から不所望な成分を除去し、目的の蛍光を光検出器で受光する。光検出器は、受光した光の強度を反映した電気信号を出力する。
【００８８】
受光ユニット２５１内の光検出器から出力される電気信号は、画像処理装置２６４によりコントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なった後、コンピューター２６３に導かれ、ＴＶモニター２６５上に試料の二次元顕微鏡画像あるいは三次元顕微鏡画像として生成される。
【００８９】
また、レーザー光源２４１から発せられた励起光ビームは、レンズ２４２で適当な径の平行光ビームに変えられ、ＸＹスキャナー２４４を経た後、励起光入力ポート２１４を介して顕微鏡本体２１２内に入り、ダイクロイックミラー２２２で反射され、ダイクロイックミラー２２１を透過し、対物レンズ２１７で収束され、試料２１９内で光スポットを形成する。この光スポットは、レーザー光源２３１からの励起光の光スポットとは異なる位置に形成される。また、この光スポットは、ＸＹスキャナー２４４によりＸＹ方向に走査され得る。
【００９０】
試料からの反射光と蛍光の一部（すなわち信号光）は、対物レンズ２１７に入り、三つのダイクロイックミラー２２１と２２２と２２４を透過し、ミラー２２５で反射されて出力ポート２１６に方向付けられる。信号光は、出力ポート２１６に取り付けられた光ファイバー２５４を通って、受光ユニット２５２に入る。
【００９１】
受光ユニット２５２は、信号光から不所望な成分を除去し、目的の蛍光を光検出器で受光する。光検出器は、受光した光の強度を反映した電気信号を出力する。
【００９２】
受光ユニット２５２内の光検出器から出力される電気信号は、画像処理装置２６４によりコントラスト向上や輪郭強調などの画像処理を行なった後、コンピューター２６３に導かれ、ＴＶモニター２６５上に試料の二次元顕微鏡画像あるいは三次元顕微鏡画像として生成される。
【００９３】
本実施形態の測定装置２００においては、蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数に限らず、蛍光の強度ゆらぎの相互相関関数についても測定を行なうことができる。蛍光の強度ゆらぎの相互相関関数から、異なる二種類の蛍光物質の分子に対して、以下の情報が得られる。
【００９４】
蛍光の強度ゆらぎの相互相関関数をそれぞれの光検出器で受光された蛍光強度ゆらぎの時間平均値の積で割って、カーブフィッティングを行ない、Ｙ軸切片の値を求める。すなわち、（６）式を用いて二種類の蛍光物質の分子の結合体の数が求められる。（Fliuorescence Correlation Spectroscopy, R. Rigler and E. S. Elson eds. 15, Springer, Berlin）
【数６】
2005017282.tif 000008
【００９５】
ただしＧ（０）は二種類の蛍光物質（ＢとＲ）の分子の結合体による蛍光強度ゆらぎの相互相関関数のＹ軸切片の値、Ｎｂｒは共焦点領域内の二種類の蛍光物質（ＢとＲ）の分子の結合体の数、Ｎｒは蛍光物質Ｒの分子の数、Ｎｂは蛍光物質Ｂの分子の数である。
【００９６】
第五実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の時間分解測定を行なう測定装置に向けられている。本実施形態の測定装置の構成は、第二実施形態の測定装置とほとんど同じである。
【００９７】
図８は、本発明の第五実施形態の蛍光の時間分解測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。図８において、図５に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００９８】
図８に示されるように、本実施形態の測定装置１００Ｃは、第二実施形態の測定装置１００Ａの励起光源部１３０に代えてパルス励起光源部１３０Ａを備えている。他の構成は、第二実施形態と同じである。
【００９９】
パルス励起光源部１３０Ａは、パルスレーザー光源１３１Ａとレンズ１３３とを備えている。パルスレーザー光源１３１Ａは、これに限らないが、例えば、波長５１４．５ｎｍ、平均出力１００ｍＷ、パルス幅２００ピコ秒のＣＷモード同期アルゴンイオン・レーザーで構成される。
【０１００】
図８には、代表的に一組のパルスレーザー光源１３１Ａとレンズ１３３が描かれているが、図１に示される励起光源部１３０と同様に、パルス励起光源部１３０Ａは、複数の組のパルスレーザー光源とレンズとを備えていてもよい。
【０１０１】
本実施形態の測定装置１００Ｃでは、光検出器１４８には時間−電圧変換回路（Time-to-Amplitude Converter）１７１、続いて波高分析器（Multi-channel analyzer）１７２が接続されており、さらに波高分析器１７２にはコンピューター１７５が接続されている。また光検出器１５２には時間−電圧変換回路１７３と波高分析器１７４が接続されており、波高分析器１７４にはコンピューター１７５が接続されている。
【０１０２】
試料は、細胞や、蛍光物質を塩基にラベルされたＤＮＡや、担体物質を含む媒質などである。
【０１０３】
パルスレーザー光源１３１Ａから発せられたパルス光は、励起光入力ポート１１２を通って共焦点光学顕微鏡１１０に取り込まれ、試料ステージ上の蛍光物質を含む試料に照射される。試料内の蛍光物質から発せられた信号光は、共焦点光学顕微鏡１１０に結合された光ファイバー１５３を通って受光ユニット１４０Ａに達する。受光ユニット１４０Ａは、信号光から特定の蛍光を抽出して出力する。受光ユニット１４０Ａから出力された蛍光は、光ファイバー１５６と１５７を介してそれぞれ接続された光検出器１４８と１５２で検出される。光検出器１４８と１５２は蛍光の光子を検出して光電子パルスを発生する。この検出パルス信号は時間−電圧変換回路１７１と１７３に導かれて、時間−電圧変換回路１７１と１７３のストップ信号となる。一方、時間−電圧変換回路１７１と１７３へはパルスレーザー光源１３１Ａの発光に同期した信号が送られる。この信号を時間−電圧変換回路１７１と１７３のスタート信号とする。時間−電圧変換回路１７１と１７３はスタート信号とストップ信号の二つの出力信号の間の時間差に比例した電圧パルス信号を出力する。この出力パルス信号は波高分析器１７２と１７４に導かれて、出力パルスの高さに変換されてコンピューター１７５に送られ、コンピューター内のメモリー（図示しない）に記憶される。メモリーに記憶された出力信号パルスの高さを時間との関係にしてグラフ化することにより、試料内の蛍光分子の蛍光寿命を求めることができる。
【０１０４】
図９Ａと図９Ｂは、図８に示した測定装置による測定結果であり、試料内の蛍光分子から発せられた蛍光強度の時間変化を表わしている。図９Ａは蛍光寿命の長い試料の測定結果、図９Ｂは蛍光寿命の短い試料の測定結果である。
【０１０５】
本実施形態では、パルス励起光源部１３０Ａから射出されたパルス光は、受光ユニット１４０Ａ内を通ることなく、対物レンズの近くに配置された励起光入力ポート１１２を介して共焦点光学顕微鏡１１０に取り込まれる。このため、パルス光が途中に経由する光学素子が少なく、パルス光の強度の低下がわずかに抑えられる。これにより、パルス光が試料に効率良く照射される。また、受光ユニット１４０Ａ内を通る光は、実質的に試料から発せられた信号光だけとなる。その結果、信号のＳ／Ｎ比の高い測定を行なうことができる。
【０１０６】
本実施形態の測定装置の構成は必要に応じて適当に変更されてもよい。例えば、パルスレーザー光源１３１ＡをＣＷモード同期色素レーザー光源に変更してパルス光の波長を変えて測定を行なってもよい。また、第一実施形態と同様に、光検出器１４８と１５２を受光ユニット内に配置してもよい。つまり、受光ユニット１４０Ａと光ファイバー１５６と１５７と光検出器１４８と１５２を、第一実施形態に示した受光ユニット１４０に変更してもよい。
【０１０７】
第六実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して、蛍光偏光解消など、試料内の蛍光物質から発せられる蛍光の偏光特性の変化や偏光度などの測定を行なう測定装置に向けられている。本実施形態の測定装置の構成は、第二実施形態の測定装置に似ている。
【０１０８】
図１０は、本発明の第六実施形態の蛍光の偏光に関する測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。図１０において、図５に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【０１０９】
図１０に示されるように、本実施形態の測定装置１００Ｄでは、共焦点光学顕微鏡１１０は、励起光源部１３０からの励起光の光路上に、特定の偏光成分を選択的に透過する偏光素子１８１を備えている。また受光ユニット１４０Ｄは、第二実施形態の測定装置１００Ａの受光ユニット１４０Ａに、特定の偏光成分を選択的に透過する偏光素子１８２と１８３を追加した構成になっている。他の構成は、第二実施形態と同じである。
【０１１０】
より詳しくは、共焦点光学顕微鏡１１０は、励起光入力ポート１１２とダイクロイックミラー１１６との間の光路上に偏光素子１８１を備えている。受光ユニット１４０Ｄは、受光ユニット１４０Ａの構成に加えて、フィルター１４５とレンズ１４６の間に配置された偏光素子１８２と、フィルター１４９とレンズ１５０の間に配置された偏光素子１８３とを備えている。偏光素子１８２と偏光素子１８３の透過軸は、偏光素子１８１の透過軸に対して直交している。つまり、偏光素子１８２と偏光素子１８３を透過する光の偏光方向は、偏光素子１８１を透過する光の偏光方向と直交している。
【０１１１】
偏光素子１８１と偏光素子１８２と偏光素子１８３は共に、これに限らないが、例えば偏光板で構成されるが、より好ましくは、グラントムソン・プリズム（Glan Thompson Prism）など、消光比の高い偏光素子で構成されるとよい。
【０１１２】
励起光源部１３０は、連続発振のレーザー光源１３１を有している。レーザー光源１３１は、これに限らないが、例えば波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷのアルゴン・レーザーで構成される。
【０１１３】
図１０には、代表的に一つのレーザー光源１３１が描かれているが、励起光源部１３０は、複数のレーザー光源を有していてもよい。
【０１１４】
レーザー光源１３１から発せられた励起光は、励起光入力ポート１１２を通って共焦点光学顕微鏡１１０に取り込まれ、偏光素子１８１により特定の偏光成分が抽出され、試料ステージ上の蛍光物質を含む試料に照射される。試料内の蛍光物質から発せられた信号光は、共焦点光学顕微鏡１１０に結合された光ファイバー１５３を通って受光ユニット１４０Ａに達する。受光ユニット１４０Ｄは、光抽出部１４３により信号光から特定の蛍光を抽出し、さらに偏光素子１８２と偏光素子１８３により試料に照射される励起光の偏光成分と直交する偏光成分を抽出して出力する。受光ユニット１４０Ａから出力された特定の偏光成分の蛍光は、光ファイバー１５６と１５７を介してそれぞれ接続された光検出器１４８と１５２で検出される。
【０１１５】
本実施形態では、蛍光分子を含む試料に直線偏光の励起光を照射し、試料から発せられる蛍光のうち、励起光に直交する直線偏光を二つの光検出器１４８と１５２により検出する。これにより試料内の蛍光分子の蛍光の異方性や偏光度などを測定することができる。例えば、蛍光分子の回転ブラウン運動の速度を反映する回転拡散係数などを求めることができる。本実施形態の測定装置１００Ｄでは、高い開口数の対物レンズ（ＮＡ０．９）を用いており、このため、蛍光色素分子で標識された細胞内ＤＮＡ、細胞膜などの組織の偏光性も調べることができる。またＬＢ（Langmuir-Blodgett）膜の揺動運動などについても測定することができる。
【０１１６】
さらに、試料から発せられる散乱光の強度を検出することにより、抗原抗体反応の測定を行なうこともできる。例えば、試料として直径０．２ミクロンのアルファ・フェト・プロテイン（ＡＦＰ）抗体を感作させたラテックス粒子懸濁液（重量濃度０．００５％）を用い、これに血液などの検体を注入して抗原抗体反応を起こさせる。このとき検体にＡＦＰ抗原が含まれていると、抗原抗体反応によりラテックス粒子が凝集する。ラテックス粒子が単分散している場合は、その散乱光は異方性を持たず、入射光の偏光方向と同一の偏光成分を持った光を散乱光として発する。ところが、ラテックス粒子の凝集により、散乱光が異方性を持つようになる。これにより未反応の分散状態と明瞭な区別を行なうことができる。従って、高感度に抗原抗体反応を測定することができる。
【０１１７】
本実施形態においても、励起光源部１３０から射出された励起光は、受光ユニット１４０Ｄ内を通ることなく、対物レンズの近くに配置された励起光入力ポート１１２を介して共焦点光学顕微鏡１１０に取り込まれる。このため、励起光が途中に経由する光学素子が少なく、励起光の強度の低下がわずかに抑えられる。これにより、励起光が試料に効率良く照射される。また、受光ユニット１４０Ｄ内を通る光は、実質的に試料から発せられた信号光だけとなる。その結果、信号のＳ／Ｎ比の高い測定を行なうことができる。
【０１１８】
本実施形態の測定装置の構成は必要に応じて適当に変更されてもよい。例えば、偏光素子１８１と１８２と１８３のすべてまたは一部の外形を円形とし、中心軸の周りに回転可能に配置してもよい。偏光素子の回転の制御は手動で行なってもよいし、偏光素子の回転軸にステッピングモーターを接続して、ステッピングモーターの回転に合わせて電動で行なってもよい。このように偏光素子を回転可能にすることにより、試料に応じて入射光の偏光方向を自在に変化させ、それに応じて受光ユニット１４０Ｄ内の二枚の偏光素子１８２と１８３の偏光方向を変化させて、試料によって最適な条件で測定を行なうことができる。
【０１１９】
レーザー光源１３１は、直線偏光を発するレーザー光源で構成されてもよく、その場合には、共焦点光学顕微鏡１１０内の偏光素子１８１は省略されてよい。
【０１２０】
第七実施形態
本実施形態は、共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の偏光に関する測定を行なう別の測定装置に向けられている。本実施形態の測定装置の構成は、第六実施形態の測定装置とほとんど同じである。
【０１２１】
図１１は、本発明の第七実施形態の蛍光の偏光に関する測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。図１１において、図１０に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材である。
【０１２２】
図１１に示されるように、本実施形態の測定装置１００Ｅは、第六実施形態の励起光源部１３０に代えて、第五実施形態で述べたパルス励起光源部１３０Ａを備えている。他の構成は、第六実施形態と同じである。つまり、本実施形態の測定装置１００Ｅは、第六実施形態の測定装置１００Ｄの励起光源部１３０を、第五実施形態の測定装置１００Ｃのパルス励起光源部１３０Ａに変更した構成である。
【０１２３】
本実施形態では、パルスレーザー光源１３１Ａから発せられた超短パルス光は共焦点光学顕微鏡１１０に取り込み、共焦点光学顕微鏡１１０内の偏光素子１８１により直線偏光とし、試料ステージ上の蛍光物質を含む試料に照射される。このとき試料内の蛍光物質は、照射されたパルス光のうち、蛍光物質の持つ遷移モーメントの方向と一致した方向の偏光成分だけを吸収して励起され、蛍光物質から蛍光が発せられる。蛍光物質から発せられる蛍光は蛍光物質の持つ遷移モーメントの方向と一致した方向の偏光成分を持つ。このように偏光した超短パルス光で蛍光物質を励起し、蛍光物質から発せられる蛍光の偏光成分について時間分解測定を行なえば、蛍光物質の分子配向の時間的な変化を求めることができる。
【０１２４】
他の実施形態
例えば図８の測定装置を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer：FRET）を求め、たんぱく質の結合や解離を知ることができる。例えば細胞内カルシウムイオン濃度の定量測定を行なうことができる。また、生体高分子のさまざまな部位間の距離や、生体高分子の三次元構造、四次元構造、その動的変化も測定することができる。
【０１２５】
また、細胞内でカルモジュリン（Calmodulin）にカルシウムイオン（Ca2+）が結合すると活性化されて、カルモジュリンは構造変化を起こす。カルモジュリンの異なる部位にそれぞれ異なる蛍光物質を用いて標識し、一方の蛍光物質を励起して、蛍光共鳴エネルギー移動によって得られる、他方の蛍光物質からの蛍光を測定することにより、細胞内でのカルモジュリンの構造変化を知ることができる。またタンパク質の両端に異なる二種類の蛍光タンパク質、例えば藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ：cyan fluorescent protein）と黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ：yellow fluorescent protein）を標識し、タンパク質のリン酸化を測定することができる。タンパク質がリン酸化することによってタンパク質の構造に変化が起こる。この構造変化により双方の蛍光タンパク質が極めて接近する（１０ナノメートル程度以下）とＦＲＥＴが起こる。このＦＲＥＴを測定することによりタンパク質のリン酸化を明らかにすることができる。
【０１２６】
また、例えば図８の測定装置は、蛍光の測定のほかに、りん光の測定に適用されてもよい。その場合、光抽出部１４３は、りん光の抽出に適用される。
【０１２７】
また、例えば図８の測定装置は、化学発光や生物発光などの発光現象の測定に適用されてもよい。その場合、光抽出部１４３は、化学発光や生物発光の光の抽出に適用される。また、光源は必要ないので、光源を取り除くか、光源の電源スイッチを切っておけばよい。例えば主要な癌マーカーであるアルファ・フェト・プロテイン（ＡＦＰ）の酵素免疫測定を図８の測定装置（ただし光源は取り除く）を用いて化学発光により測定を行なう場合について説明する。まず、直径１〜１０μｍ程度のガラス微粒子に抗ＡＦＰ抗体を感作し、これを酵素アルカリフォスファターゼで標識し、緩衝液中に懸濁して試料容器内に収容する。これに血液などの検体を加え、室温で抗原抗体反応を起こさせる。ここで反応に関与しないガラス微粒子を洗浄により除去し、残りの溶液に化学発光基質ＡＭＰＰＤ（２−ジオキセタン２ナトリウム塩）を加える。このときＡＭＰＰＤが酵素アルカリフォスファターゼと反応し、化学発光が生じる。この化学発光の発光強度を光検出器により測定し、コンピューターに導いて光強度の解析を行ない、検体中のＡＦＰ濃度を定量することができる。
【０１２８】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【０１２９】
例えば、一種類の蛍光物質による測定であれば、図５のマルチモード光ファイバー１５３を一個の光検出器１４８または１５２に対して直接接続させた単純な構成にしてもよい。
【０１３０】
また、本発明は、上述した実施形態以外の測定に適用されてもよい。例えば、測定対象としての試料の特定部位または特定領域に限定して種々の光学特性（偏光、散乱、電気化学発光、共鳴エネルギー転移、プラズモン共鳴等）を測定する任意の微小光学測定に適用されてもよい。  本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、以下の各項に記す測定信号処理ユニットと測定機器システムも含んでいる。
【０１３１】
１．  測定信号を外部に出力する外部出力部を有する測定機器に接続可能な接続部と、
測定機器からの出力信号（光、音波、電流等）に応じた伝播手段を有する信号伝播機構と、
信号伝播機構により伝播された信号を受信してその信号に含まれる特定のパラメータを取得する素子とを有することを特徴とする測定信号処理ユニット。
【０１３２】
２．  第１項において、パラメータを取得する素子が、演算可能な電気信号に変換するデータ変換手段を有する測定信号処理ユニット。
【０１３３】
３．  第２項において、演算後データを視認可能な表現形式（数値、グラフ、画像、文字、記号等）により可視化するデータ可視化手段を有する外部機器に対して演算後データを出力する外部出力部を有することを特徴とする測定信号処理ユニット。
【０１３４】
４．  第３項において、演算後データの外部出力部は伝播手段および接続部を含んでいることを特徴とする測定信号処理ユニット。
【０１３５】
５．  第１項において、接続部はマルチモードな導波手段を含んでいる測定処理ユニット。
【０１３６】
６．  第１項〜第５項のいずれかひとつにおいて、演算部が光強度ゆらぎを解析するアルゴリズムを有するソフトウエアにより機能する構成である測定処理ユニット。
【０１３７】
７．  第３項に記載の測定処理ユニットと、
測定処理ユニットと接続した測定機器とを備え、
測定機器が、演算後データを視認可能な表現形式により可視化するデータ可視化手段を有することを特徴とする測定信号処理ユニットを有する測定機器システム。
【０１３８】
８．  第１項に記載の測定処理ユニットと、
測定処理ユニットと接続した測定機器とを備え、
測定機器が測定に必要な信号源（光、音波、電流等）を伝播する伝播手段を有するとともに伝播手段に対して機器の外部から伝播信号を入力可能な外部入力部を有し、
外部入力部に接続可能な接続部と接続部を通じて測定処理ユニットによる演算に必要な伝播信号を導入する信号源導入ユニットとを有する測定機器システム。
【０１３９】
９．  第８項において、信号源導入ユニットの接続部はシングルモードな導波手段を含んでいる測定機器システム。
【０１４０】
１０．  第９項において、測定処理ユニットの接続部はマルチモードな導波手段を含んでいる測定機器システム。
【０１４１】
１１．  第７項〜第１０項のいずれかひとつにおいて、測定機器が顕微鏡、内視鏡、分析機の何れかであることを特徴とする測定機器システム。
【０１４２】
１２．  第７項〜第１０項のいずれかひとつにおいて、測定機器が光信号による測定手段を有する測定機器システム。
【０１４３】
１３．  第１２項において、演算部が光強度ゆらぎを解析するアルゴリズムを有するソフトウエアにより機能する構成である測定機器システム。
【０１４４】
以上のように、本発明は、超音波顕微鏡やトンネル顕微鏡等の他の信号源による測定機器にも応用可能な測定処理ユニットであり得る。また本発明は、特異な信号源を別途接続可能な測定機器システムであり得る。また本発明は、顕微鏡以外にも、内視鏡や分析機とも接続可能なシステムであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明の第一実施形態に従う共焦点光学顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の全体構成を示している。
【図２】図１に示される測定装置の外観を概略的に示している。
【図３】図１に示される受光ユニットの構成を示している。
【図４】図１に示される測定装置とその信号処理系とを示している。
【図５】本発明の第二実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している。
【図６】本発明の第三実施形態の蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の構成を概略的に示している。
【図７】本発明の第四実施形態に従う共焦点走査型レーザー顕微鏡を利用して蛍光の強度ゆらぎの相関分光解析を行なう測定装置の全体構成を示している。
【図８】本発明の第五実施形態の蛍光の時間分解測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。
【図９Ａ】図８に示した測定装置による蛍光寿命の長い試料の測定結果であり、試料内の蛍光分子から発せられた蛍光強度の時間変化を表わしている。
【図９Ｂ】図８に示した測定装置による蛍光寿命の短い試料の測定結果であり、試料内の蛍光分子から発せられた蛍光強度の時間変化を表わしている。
【図１０】本発明の第六実施形態の蛍光の偏光に関する測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。
【図１１】本発明の第七実施形態の蛍光の偏光に関する測定を行なう測定装置の構成を概略的に示している。
【符号の説明】
【０１４６】
１００…測定装置、１００Ａ…測定装置、１００Ｂ…測定装置、１００Ｃ…測定装置、１００Ｄ…測定装置、１００Ｅ…測定装置、１１０…共焦点光学顕微鏡、１１１…照明光入力ポート、１１２…励起光入力ポート、１１３…出力ポート、１１４…対物レンズ、１１５…ダイクロイックミラー、１１６…ダイクロイックミラー、１１７…ミラー、１１８…レンズ、１２１…試料、１２２…試料ステージ、１２３…ステッピングモーター、１２５…照明光源、１２６…接眼レンズ、１２７…ＣＣＤカメラ、１２８…ＴＶモニター、１３０…励起光源部、１３０Ａ…パルス励起光源部、１３１…レーザー光源、１３１Ａ…パルスレーザー光源、１３２…レーザー光源、１３３…レンズ、１３４…レンズ、１３５…ミラー、１３６…ダイクロイックミラー、１４０…受光ユニット、１４０Ａ…受光ユニット、１４０Ｄ…受光ユニット、１４１…入力部、１４２…レンズ、１４３…光抽出部、１４４…ダイクロイックミラー、１４５…フィルター、１４６…レンズ、１４７…ピンホールユニット、１４８…光検出器、１４９…フィルター、１５０…レンズ、１５１…ピンホールユニット、１５２…光検出器、１５３…光ファイバー、１５４…蛍光出力部、１５５…蛍光出力部、１５６…光ファイバー、１５７…光ファイバー、１６１…信号処理装置、１６２…相関解析装置、１６３…コンピューター、１６４…ＴＶモニター、１７１…電圧変換回路、１７２…波高分析器、１７３…電圧変換回路、１７４…波高分析器、１７５…コンピューター、１８１…偏光素子、１８２…偏光素子、１８３…偏光素子、２００…測定装置、２１０…共焦点走査型レーザー顕微鏡、２１２…顕微鏡本体、２１３…励起光入力ポート、２１４…励起光入力ポート、２１５…出力ポート、２１６…出力ポート、２１７…対物レンズ、２１８…試料ステージ、２１９…試料、２２１…ダイクロイックミラー、２２２…ダイクロイックミラー、２２４…ダイクロイックミラー、２２５…ミラー、２３０…走査光源部、２３１…レーザー光源、２３２…レンズ、２３３…ミラー、２３４…ＸＹスキャナー、２３５…スキャナー駆動装置、２４０…走査光源部、２４１…レーザー光源、２４２…レンズ、２４４…ＸＹスキャナー、２４５…スキャナー駆動装置、２５１…受光ユニット、２５２…受光ユニット、２５３…光ファイバー、２５４…光ファイバー、２６１…信号処理装置、２６２…相関解析装置、２６３…コンピューター、２６４…画像処理装置、２６５…ＴＶモニター。
【図１】
2005017282.tif 000009
【図２】
2005017282.tif 000010
【図３】
2005017282.tif 000011
【図４】
2005017282.tif 000012
【図５】
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【図６】
2005017282.tif 000014
【図７】
2005017282.tif 000015
【図８】
2005017282.tif 000016
【図９Ａ】
2005017282.tif 000017
【図９Ｂ】
2005017282.tif 000018
【図１０】
2005017282.tif 000019
【図１１】
2005017282.tif 000020