(57)【要約】【目的】  バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基に対するリン酸化酵素、脱リン酸化酵素、および第696位Lys残基に対するアセチル化酵素、脱アセチル化酵素を特定するためのスクリーニング方法、並びにこれらの酵素の活性化物質および阻害物質を特定するためのスクリーニング方法を提供する。【構成】  反応基質となるVCPサンプルを候補酵素および／または候補物質と接触させた後、VCPサンプルの所定アミノ酸残基（S765およびK696）におけるリン酸化またはアセチル化を測定する。【選択図】図３
2005198534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基をリン酸化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位Ser残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Ser残基をリン酸化する可能性のある酵素を、リン酸基と共に前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするリン酸化酵素のスクリーニング方法。
【請求項２】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位リン酸化Ser残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  リン酸化Ser残基を脱リン酸化する可能性のある酵素を、前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱リン酸化酵素のスクリーニング方法。
【請求項３】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位Lys残基をアセチル化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位Lys残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Lys残基をアセチル化する可能性のある酵素を、アセチル基と共に前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするアセチル化酵素のスクリーニング方法。
【請求項４】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位アセチル化Lys残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  アセチル化Lys残基を脱アセチル化する可能性のある酵素を、前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱アセチル化酵素のスクリーニング方法。
【請求項５】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基をリン酸化する酵素を活性化する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位Ser残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Ser残基をリン酸化酵素、リン酸基および候補物質を前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするリン酸化酵素活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位リン酸化Ser残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素と候補物質とを前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱リン酸化酵素活性阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位Lys残基をアセチル化する酵素を活性化する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位Lys残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Lys残基をアセチル化する酵素、アセチル基および候補物質を前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするアセチル化酵素活性化物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位アセチル化Lys残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素と候補物質を前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱アセチル化酵素活性阻害物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、バロシン含有タンパク質（valosin-containing proteoin：以下「VCP」と記載することがある。）の特定アミノ酸残基（第765位Ser残基：以下「S765」と記載することがある。）に対するリン酸化酵素、脱リン酸化酵素、および第696位Lys残基（以下「K696」と記載することがある。）に対するアセチル化酵素、脱アセチル化酵素を特定するためのスクリーニング方法、並びにこれらの酵素の活性化物質および阻害物質を特定するためのスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バロシン含有タンパク質（valosin-containing proteoin：以下「VCP」と記載することがある。）はATP結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、小胞の輸送や融合、26Sプロテアソーム機能、ペリオキシゾームの集合化等に関している（非特許文献１）。またこのVCPは、神経変性疾患患者の神経系組織、あるいは癌患者の腫瘍組織においての発現亢進が報告され（例えば非特許文献２−４）、その発現レベルの検出は神経変性疾患における変性の程度、または腫瘍の悪性度を判定するための有効な手段となりうると考えられている。
【０００３】
しかしながら、大腸菌等で発現させた組換えVCPはほとんどATPase活性を持たないことから、VCPがその機能を発揮するためには、何からの修飾が必要と考えられている。VCPの修飾については、はじめにチロシン（Tyr）がリン酸化されていることが報告され（非特許文献５）、その後、そのリン酸化Tyrの部位が同定されている（非特許文献６）。
【０００４】
さらにこの出願の発明者らは、リン酸化を受ける20ヶ所のSer残基、リン酸化をうける10ヶ所のThr残基、リン酸を受ける1ヶ所のTyr残基、およびアセチル化を受ける15ヶ所のLys残基の位置を新たに同定し、それらを特異的に認識する抗体を既に特許出願している（特願2003-422365：2003年12月19日出願）。
【非特許文献１】Pleasure,I.T. et al. Nature 365 (6445), 459-462 (1993)
【非特許文献２】Yamamoto,S., et al. J. Clin. Oncol. 21 (3), 447-452 (2003)
【非特許文献３】Kobayashi,T., et al. J. Biol. Chem. 277 (49), 47358-47365 (2002)
【非特許文献４】Asai,T., et al. Jpn. J. Cancer Res. 93 (3), 296-304 (2002)
【非特許文献５】Egerton M. et al. EMBO J. 11 (10), 3533-40 (1992)
【非特許文献６】Egerton M. and Samelson L.E. J Biol Chem. 269(15), 11435-41, (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この出願の発明者らは、前記の特許出願発明（特願2003-422365）の修飾化VCPについてその機能をさらに探索した結果、特定のアミノ酸残基の修飾化（S765のリン酸化、K696のアセチル化）を受けたVCPが、ポリグルタミン病神経変性疾患の症状を改善することを見出した。しかも、S765およびK696の前後のアミノ酸配列は、表1および表2に示すとおり、種を超えて高度に保存されている。
【０００６】
【表１】
2005198534.tif 000003
【０００７】
【表２】
2005198534.tif 000004
一方、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤が、わずかながら、ポリグルタミン病のモデル動物の症状を軽減したとの報告がある。このため、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の作用点は転写因子であると信じられている。これに対して、この出願の発明者らは、前記のとおりの知見から、特定の修飾化VCPタンパク質こそがポリグルタミン病の治療薬開発におけるターゲット分子であり、特定の修飾化（S765のリン酸化、K696のアセチル化）を促進する物質またはそれらの脱修飾化を阻害する物質の特定こそが最緊急の課題であるとの認識のものとにこの出願の発明を完成させた。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、VCPの特定アミノ酸残基を修飾化するための酵素と、この酵素活性を調節する物質を特定するためのスクリーニング方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明は、前記の課題を解決するものとして、以下の第1から第8の発明を提供する。
【００１０】
第1の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基をリン酸化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位Ser残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Ser残基をリン酸化する可能性のある酵素を、リン酸基と共に前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするリン酸化酵素のスクリーニング方法である。
【００１１】
第2の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位リン酸化Ser残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  リン酸化Ser残基を脱リン酸化する可能性のある酵素を、前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱リン酸化酵素のスクリーニング方法である。
【００１２】
第3の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位Lys残基をアセチル化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位Lys残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Lys残基をアセチル化する可能性のある酵素を、アセチル基と共に前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするアセチル化酵素のスクリーニング方法である。
【００１３】
第4の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位アセチル化Lys残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  アセチル化Lys残基を脱アセチル化する可能性のある酵素を、前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱アセチル化酵素のスクリーニング方法である。
【００１４】
第5の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基をリン酸化する酵素を活性化する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位Ser残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Ser残基をリン酸化酵素、リン酸基および候補物質を前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするリン酸化酵素活性化物質のスクリーニング方法である。
【００１５】
第6の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第765位リン酸化Ser残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  リン酸化Ser残基を脱リン酸化する酵素と候補物質とを前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第765位Ser残基のリン酸化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱リン酸化酵素活性阻害物質のスクリーニング方法である。
【００１６】
第7の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位Lys残基をアセチル化する酵素を活性化する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位Lys残基を含むポリペプチドまたはオリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  Lys残基をアセチル化する酵素、アセチル基および候補物質を前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記のポリペプチドまたはオリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とするアセチル化酵素活性化物質のスクリーニング方法である。
【００１７】
第8の発明は、バロシン含有タンパク質（VCP）の第696位アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素の活性を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
(1)  配列番号１のアミノ酸配列における第696位アセチル化Lys残基を含む修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドを調製するステップ；
(2)  アセチル化Lys残基を脱アセチル化する酵素と候補物質を前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドと接触させるステップ；および
(3)  前記の修飾化ポリペプチドまたは修飾化オリゴペプチドにおける第696位Lys残基のアセチル化を測定するステップ、
を含むことを特徴とする脱アセチル化酵素活性阻害物質のスクリーニング方法である。
【００１８】
なお、この出願の発明において、「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリペプチド」とは、配列番号１にアミノ酸配列を示した全長VCPタンパク質、またはその特定アミノ酸残基（S765またはK696）を含む31〜805アミノ酸残基からなるペプチドである。「オリゴペプチド」とは、配列番号１における特定アミノ酸残基（S765またはK696）を含む連続5〜30アミノ酸残基からなるペプチドである。
【００１９】
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【発明の効果】
【００２０】
第1の発明によれば、VCPのS765（以下「VCP-S765」と記載することがある。）をリン酸化する酵素を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された酵素を利用することによって、神経変性疾患の治療薬成分となり得るリン酸化酵素活性化物質をさらに特定することが可能となる。
【００２１】
第2の発明によれば、VCPのリン酸化S765（以下「VCP-S(P)976」と記載することがある。）を脱リン酸化する酵素を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された酵素を利用することによって、神経変性疾患の治療薬成分となり脱リン酸化酵素活性阻害物質をさらに特定することが可能となる。
【００２２】
第3の発明によれば、VCPのK696（以下「VCP-K696」と記載することがある。）をアセチル化する酵素を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された酵素を利用することによって、神経変性疾患の治療薬成分となり得るアセチル化酵素活性化物質をさらに特定することが可能となる。
【００２３】
第4の発明によれば、VCPのアセチル化K696（以下「VCP-K(Ac)696」と記載することがある。）を脱アセチル化する酵素を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された酵素を利用することによって、神経変性疾患の治療薬成分となり脱アセチル化酵素活性阻害物質をさらに特定することが可能となる。
【００２４】
第5の発明によれば、VCP-S765リン酸化酵素を活性化する物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された物質は神経変性疾患の治療薬成分となり得る。
【００２５】
第6の発明によれば、VCP-S(P)976脱リン酸化酵素の活性を阻害する物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された物質は神経変性疾患の治療薬成分となり得る。
【００２６】
第7の発明によれば、VCP-K696アセチル化酵素を活性化する物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された物質は神経変性疾患の治療薬成分となり得る。
【００２７】
第8の発明によれば、VCP-K(Ac)696脱アセチル化酵素の活性を阻害する物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。この方法で特定された物質は神経変性疾患の治療薬成分となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（A）VCPサンプルの調製
この出願の第1〜第8発明のそれぞれのステップ(1)におけるVCPサンプル（ポリペプチド、オリゴペプチド、修飾化ポリペプチド、修飾化オリゴペプチド）は、それぞれ以下のとおりに調製することができる。
（A-1）ポリペプチドおよびオリゴペプチドの調製
ポリペプチドは、全長VCPタンパク質であってもよく、あるいはS765および／またはK696を含むVCP部分タンパク質（31〜805アミノ酸残基）であってもよい。
【００２９】
全長のVCPタンパク質は、ヒト由来の細胞等から単離する方法、あるいは配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（VCP ｃDNA：GenBank/NM 007126）を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得できるが、組換えDNA技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調整し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでVCPタンパク質を発現できる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、全長VCPタンパク質を大量に発現させる事が出きる。
【００３０】
VCPの部分タンパク質は、全長VCPを適当な制限酵素で切断する方法や、あるいは例えばペプチド合成機を使用して、例えばFmoc-bop法（Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等によって合成することもできる。
【００３１】
一方、オリゴペプチドは、配列番号１におけるS765またはK696を含む連続5〜30アミノ酸残基からなるペプチドである。また、S765を含むオリゴペプチド（以下「S765オリゴ」と記載することがある。）は、その配列中に他のSer残基を含まないことが好ましい。そのようなS765オリゴとしては、例えば配列番号１における第749〜769位のアミノ酸配列からなるペプチドが例示される。またさらに、S765オリゴとしては、その配列中にリン酸化を受けるThr残基をも含まないものが好ましい。そのようなS765オリゴとしては、例えば配列番号１における第762〜796位アミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。一方、K696を含むオリゴペプチド（以下「K696オリゴ」と記載することがある。）は、他のLys残基を含まない配列（例えば、配列番号１における第678〜753位から選択される配列）であることが好ましい。
【００３２】
このようなS765オリゴやK696オリゴは、前記の公知方法（Fmoc-bop法）等によって化学合成して作成することができる。また、S765オリゴおよびK696オリゴは、天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、-C（=O）-CH2-に対する-C（=O）-NH-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH＝CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," Marcell Dekker, NYを参照）。
（A-1）修飾化ポリペプチドおよび修飾化オリゴペプチドの調製
修飾化ポリペプチドおよび修飾化オリゴペプチドは、S765がリン酸化修飾を受けているか、またはK696がアセチル化修飾を受けていることを除き、前記(A)のポリペプチドおよびオリゴペプチドと同様に調製することができるが、特にリン酸化Ser残基およびアセチル化Lys残基を用いて化学合成により調製することが好ましい。ペプチド合成の材料として使用するリン酸化Ser残基およびアセチル化Lys残基は、それぞれ市販品を使用することもでき、あるいは公知の方法によって各アミノ酸残基を所望の形態に修飾化することによって作成することもできる。すなわち、リン酸化Ser残基は、Serにセリンキナーゼを作用させてそのヒドロキシ基にリン酸基を付加することによって、またアセチル化Lys残基は、Lysにアセチラーゼを作用させてそのアミノ基にアセチル基を付加することによって作成することができる。
【００３３】
また、作成した修飾化ポリペプチドおよび修飾化オリゴペプチドが、所定のアミノ酸残基（S765およびK696）が目的のとおりの修飾化されていること［S(P)765およびK(Ac)696］は、それぞれを特異的に認識する抗体（下記の参考例を参照）を用いて確認することもできる。
（B）スクリーニング対象となる酵素
この出願の第1〜第4発明のそれぞれのステップ(2)における酵素は、各々、例えば以下の公知酵素が例示される。ただし、第1〜第4発明は、それぞれ公知の酵素のみを対象とするものではない。すなわち、これらの発明は、未知物質を対象とすることによって、VCPタンパク質の特定残基（S765およびK696）を特異的に修飾化する新規酵素をも特定することを可能とするものである。
（B-1）S765をリン酸化する可能性のある酵素
第1発明の方法（VCP-S765リン酸化酵素のスクリーニング方法）においてスクリーニングの対象となるSer／Thr残基リン酸化酵素としては、例えば次の様な酵素およびファミリーが知られている。ファミリーの中には構造的に関連した複数の酵素が含まれている。これらにはそれぞれ他の生物種でも構造的に相当する遺伝子があり、公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、cyclic AMP-dependent protein kinase ファミリー、cyclic GMP-dependent protein kinaseファミリー、phosphorylase kinaseファミリー、myosin light chain kinaseファミリー、calcium/calmodulin-dependent protein kinaseファミリー、protein kinase Cファミリー、Heme-regulated protein kinaseファミリー、double stranded RNA dependent protein kinaseファミリー、pyruvate dehydrogenase kinaseファミリー、branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase kinase、casein kinase I、casein kinase II、hydroxymethylglutaryl-CoA reductase kinase、growth-associated histone H1 kinase、glycogen synthase kinase 3、hormone-stimulated ribosomal protein S6 kinase、isocitrate dehydrogenase kinase、thylakoid membrane kinases（例えば、Arthur M. Edelman, Donald K. Blumenthal, and Edwin G. Krebs 1987 Annual Reviews of Biochemistry 56:567-613参照）、G-protein coupled receptor kinaseファミリー (GRK1、GRK2、GRK3、GRK4、GRK5、GRK6：例えば、Julie A. Pitcher, Neil J. Freedman, and Robert J. Lefkowitz 1998 Annu. Rev. Biochem.. 67:653-692参照)などである。
【００３４】
またタンパク質リン酸化酵素の触媒活性のある蛋白質上の部位としては次のようなドメインが米国 National Center for Biotechnology Informationのデータベース上に登録されており、これらの領域及び相同性を持つタンパク質は公開されているデータベース（米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など）で容易に同定できる。すなわち、smart00220(S Tkc)、smart00146(PI3Kc)、smart00046(DAGKc)、smart00045(DAGKa)、pfam04452(DUF558)、pfam03370(CBM 21)、pfam02827(PKI)、pfam02816(Alpha kinase)、pfam00781(DAGKc)、cd00873(KU80)、cd00788(KU70)、cd00192(TyrKc)、cd00180(S Tkc)、cd00142(PI3Kc)、cd00137(PLCc)、cd00082(HisKA)、KOG0616等である。
（B-2）リン酸化S765を脱リン酸化する可能性のある酵素
第2発明の方法（VCP-S(P)765脱リン酸化酵素のスクリーニング方法）においてスクリーニングの対象となる脱リン酸化する酵素としては、例えば次のものが知られている。これらにはそれぞれ他の生物種でも構造的に相当する遺伝子があり、公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、CD45、LAR、DLAR、DPTP、PTPμ、HPTPβ、DPTP99A、DPTP10D、RPTPα、HPTPε、PTP1B、TC-PTP、PTP H1、MEG-01、PTP 1C(SH-PTP, SHP1)、SHP2、HePTP、STEP、MEG-2、PEP、PTP-PEST、pyp1+、 PTP1、PTP2、Yop 2b/51、VH1、cdc25、cdc25A、cdc25B、cdc25C、PP1、PPY、PPQ、PPZ1、PPZ2、PP2A、PP4、Pph3、PP6、PPV6A、Sit4、Ppe1、PP2B、RdgC、PP5、Ppt1、PP2C、Ptc1、Ptc2、Ptc3、PDP、PAC-1、CL-100(MKP1)（例えば、Harry Charbonneau and Nicholas K. Tonks 1992 Annual Reviews of Cell Biology 8:463-493, プロティンホスファターゼの構造と機能 1998 蛋白質核酸酵素 43 921-1216を参照）。
【００３５】
またタンパク質脱リン酸化酵素の触媒活性のある蛋白質上の部位としては次のようなドメインが米国 National Center for Biotechnology Informationのデータベース上に登録されており、これらの領域及び相同性を持つタンパク質は公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、smart00404(PTPc motif)、smart00194、smart00156(PP2Ac)、pfam04387(PTPLA)、pfam03370(CBM 21)、pfam00782(DSPc)、cd00144(PP2Ac)、KOG3187、KOG0374、KOG0371、COG5198(Ptpl)等である。
（B-3）K696をアセチル化する可能性のある酵素
第3発明の方法（VCP-K696アセチル化酵素のスクリーニング方法）においてスクリーニングの対象となるLys残基アセチル化酵素としては、例えば次のものが知られている。これらにはそれぞれ他の生物種でも構造的に相当する遺伝子があり、公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、TAFII250、p300/CBP、PCAF、ACTR、SRC-1、Tip60（例えば、Min-Hao Kuo and C. David Allis 1998 BioEssays 20:615-626参照）、HAT1、TET p55、GCN5、MOZ、MORE（例えば、Sharon Y. Roth, John M. Denu, and C. David Allis 2001 Annual Reviews of Biochemistry 70:81-120参照）、FUS2（例えば、Philip Zegerman, Andrew J. Bannister, and Tony Kouzarides 2000 Oncogene 19:161-163参照）等である。
【００３６】
またアセチル基転移酵素の触媒活性のある蛋白質上の部位としては次のようなドメインが米国 National Center for Biotechnology Informationのデータベース上に登録されており、これらの領域及び相同性を持つタンパク質は公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、pfam04775(Bile Hydr Trans)、pfam04768(DUF619)、pfam04691(ApoC-1)、pfam04658(TAFII55 N)、pfam04112(Mak10)、pfam02522(Antibiotic NAT)、pfam02474(NodA)、pfam02458(Transferase)、pfam01515(PTA PTB)、pfam00797(Acetyltransf2)、pfam00583(Acetyltransf)、pfam00302(CAT)、KOG4750、KOG4144: KOG4144、KOG4135、KOG3902、KOG3844、KOG3423、KOG3396、KOG3334、KOG3234、KOG3216、KOG3139、KOG3138、KOG3038、KOG3001、KOG2786、KOG2747、KOG2696、KOG2549、KOG2535、KOG2488、KOG2036、KOG1699、KOG1472、KOG1392、KOG1391、KOG1390、KOG1359、KOG1156、KOG1142、KOG0889、KOG0557、KOG0457、KOG0263、COG5628、COG5624、COG5162、COG5114、COG5095、COG5094、COG5027、COG4845、COG3981、COG3818、COG3393、COG3153、COG2746、COG2401、COG2388、COG4552、COG2162、COG2021、COG1444、COG1243、COG1207、COG1045、COG0454、COG0183、COG0110等である。
（B-4）アセチル化K696を脱アセチル化する可能性のある酵素
第4発明の方法（VCP-K(Ac)696脱アセチル化酵素のスクリーニング方法）においてスクリーニングの対象となる脱アセチル化酵素としては、例えば次のものが知られている。これらにはそれぞれ他の生物種でも構造的に相当する遺伝子があり、公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、HDAC1(Histone Deacetylase 1)、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、SIRT1(Silence Information Regulator 1)、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7（例えば、Saadi Khochibin et al. Current Opinion in Genetics & Development 2001, 11:162-166, Functional significance of histone deacetylase diversity参照）等である。
【００３７】
また脱アセチル化酵素の触媒活性のある蛋白質上の部位としては次のようなドメインが米国 National Center for Biotechnology Informationのデータベース上に登録されており、これらの領域及び相同性を持つタンパク質は公開されているデータベース(米国 National Center for Biotechnology Information,  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/など)で容易に同定できる。すなわち、pfam04748(div psaccdeacet)、pfam04042(DNA pol E B)、pfam03331(LpxC)、pfam01522(Polysacc deacet)、pfam00850(Hist deacetyl)、pfam00651(BTB)、KOG4466、KOG4204、KOG3892、KOG3703、KOG3554、KOG1515、KOG1344、KOG1343、KOG1342、COG5602(SIN3)、COG3458(deacetylase)、COG3233、COG1820(NagA)、COG0774(LpxC)、COG0726(CDA1)、COG0624(ArgE)、COG0123(AcuC)等である。
（C）スクリーニングの対象となる活性化物質および阻害物質の候補
この出願の第5〜8発明においてスクリーニングの対象となる候補物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、タンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が公知のものであって未知のものであってもよい。
【００３８】
また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための候補物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、試薬などの多くの化学的「ビルディングブロック」を結びつけることにより生成される種々の化学組成物のコレクションである。例えば、ペプチドライブラリーなどの直線的なコンビナトリアルケミカルライブラリーは、ビルディングブロック（アミノ酸）のセットを、所与の化合物の長さ（すなわちペプチドのサイズ）について可能なすべての方法で結びつけることにより形成される。化学的なビルディングブロックについてのこのようなコンビナトリアルミキシングを通して、多数の化学組成物を合成することが可能である。例えば、100の可換的な化学的ビルディングブロックについての系統的なコンビナトリアルミキシングは、結果として１億個の4量体化合物または100億個の5量体化合物を生じる（例えば、Gallop et al.,（1994）37（9）:1233-1250参照）。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照）。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、例えばペプチドライブラリー（例えば米国特許第5,010,175号；Furka（1991）Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493、Houghton et al.,（1991）Nature, 354:84-88参照）、ペプトイド(peptoids)（例えば、WO91/19735参照）、コード化ペプチド（例えば、WO93/20242参照）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、WO92/00091参照）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号参照）、ヒダントイン、ベンゾアゼピン、およびジペプチド（例えば、Hobbs（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913参照）などのダイバーソマー（diversomer）、ビニログ性ポリペプチド（例えば、Hagihara（1992）J. Amer. Chem. Soc. 114:6568参照）、β-D-グルコース骨格をもつ非ペプチド性ペプチド模倣物（例えばHirschmann（1992）J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218参照）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（例えば、Chen（1994）J. Amer. Chem. Soc. 116:2661参照）、オリゴカルバメート（例えば、Cho（1993）Science 261:1303）、および/またはペプチジルホスホネート（例えば、Campbell（1994）J. Org. Chem. 59:658参照）等である。また核酸ライブラリー（例えばGordon（1994）J. Med. Chem. 37:1385参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリー（例えばVaughn（1996）Nature biotechnology 14:309-314参照）、炭水化物ライブラリー（例えばLiang et al.,（1996）Science 274:1520-1522、米国特許第5,593,853号参照）、有機低分子ライブラリーとしてイソプレノイドライブラリー（例えば米国特許第5,569,588号参照）；チアゾリジノンおよびメタチアゾノンライブラリー（米国特許第5,549,974号参照）；ピロリジンライブラリー（米国特許第5,525,735号および5,519,134号参照）；モルフォリノ化合物ライブラリー（米国特許第5,506,337号参照）、ベンゾジアゼピンライブラリー（米国特許第5,288,514号参照）等も使用することができる。さらには、市販のライブラリー（例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos, Inc.社製、ロシアChemStar, Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー）を使用することもできる。
（D）スクリーニング方法
この出願の第1〜第4発明におけるスクリーニングは、反応基質となるVCPサンプルに候補酵素を接触させた後、VCPサンプルの所定アミノ酸残基（S765およびK696）におけるリン酸化またはアセチル化を測定することを特徴としている。また第5〜第8発明におけるスクリーニングは、VCPサンプルに、前記スクリーニングで特定した特異的酵素と候補物質（活性化物質、活性阻害物質の候補）とを接触させた後、前記の所定アミノ酸残基のリン酸化またはアセチル化を測定することを特徴としている。
【００３９】
リン酸化またはアセチル化の測定は、ラジオアイソトープ（RI）標識法や酵素標識法、特異的抗体を用いる方法など、当該技術分野で用いられている公知の活性評価方法を広く採用することができる。以下に、その内の代表的な方法を例示する。なお、バッファーの組成や反応条件は、対象とする酵素等に応じて適宜に変更可能である。また、以下の方法はそれぞれ、基質（VCPサンプル）の種類や候補酵素および／または候補物質を変更することにより、互いに他の酵素や物質のスクリーニングにも適用可能である。
（D-1）リン酸化酵素の活性評価方法
第1発明（VCP-S765リン酸化酵素のスクリーニング）は、例えば以下のステップで行うことができる。
（a）基質ペプチド（S765オリゴ）をキャリアタンパク質と共有結合させておく。陰性対照としてキャリアタンパク質を単独で用いる。キャリアタンパク質としては、BSA等を使用することができる。基質としてPCPタンパク質（またはポリペプチド）を用いる場合はキャリアタンパク質は必要ない。
（b）基質ペプチド（VCPサンプル）を15 mM MgCl2を含む緩衝液中(Tris-HCl, pH8.0など)で、候補酵素標品と混和する。
（c）最終濃度50 μM となるようにATP (3 μCiの[γ-32P]ATPを含む)を加えて反応を開始し、30℃で孵置した後にSDSを含む溶液を加えて反応を停止する。
（d）取り込まれたリン酸の量を、TCA沈殿後にシンチレーションカウンターで測定するか、あるいはSDS-PAGE電気泳動後にオートラジオグラフィーにより定量する。
【００４０】
なお、この方法は、第5発明（リン酸化酵素の活性化物質のスクリーニング）にも使用することができる。その場合には、前記ステップ（b）において候補物質を添加すればよい。そして、その場合のステップ（b）で使用する酵素標品は、前記のスクリーニングで特定されたS765リン酸化酵素である。
【００４１】
キャリアタンパク質を用いる方法の他にも、適切な方法で基質に転移したリン酸基を未反応のATPから分けることが出来ればよい。具体的にはVCPサンプルを磁気粒子に固相化する方法や、ビオチン化したVCPサンプルを用いて反応後にストレプトアビジンなどのビオチン結合性物質を利用して分離定量する方法などを用いる事が出来る。
【００４２】
この他にも、反応後の分離を必要としない方法としては次の２種類の方法が代表的である。RIを用いない方法としては、VCPサンプルと候補酵素および／または候補物質を反応させた後に減少したATP量をホタルルシフェラーゼを用いて定量する方法がある。また、固体シンチレーターを含む微少なビーズなどの固相にVCPサンプルを固定化して、ビーズから近接した部位に存在する、放射ラベルされたリン酸によって修飾されたVCPサンプルに由来するアイソトープの崩壊のみを定量する方法などがある。
（D-2）脱リン酸化酵素の活性評価方法
第2発明（VCP-S(P)765の脱リン酸化酵素のスクリーニング）は、例えば、遊離リン酸の非RI定量法による以下の方法によって実施することができる。
（a）活性を評価するホスファターゼに対応した反応バッファーを最終濃度の5倍で用意する。例えば、PPTase-2Cに近い活性が期待される場合は250mM imidazole (pH 7.2), 1mM EGTA, 25mM MgCl2, 0.1% β-mercaptoethanol, 0.5mg/ml BSAを用いる。リン酸を定量するための発色試薬は次のようにして作成する。300mlの精製水に60mlの硫酸を加えて冷却後440mgのmalachite greenを加えて溶かす。使用直前に、この液10mlに対して2.5mlのモリブデン酸アンモニウム液を加え更に0.2mlの11% Tween 20を加えてモリブデン-Malachite Green試薬とする。
（b）遊離したリン酸を定量する標準曲線を作成するために、96ウェルプレートに0、100、200、500、1,000、2,000 pmol/wellのリン酸水素カリウム溶液を分注し、50μlの反応バッファーを各ウェルに加える。
（c）各ウェルに10μlの5倍濃度の反応バッファーと5μlの基質となるリン酸化VCPサンプル(1mM)を加える。
（d）プレートを反応する温度で３分間平衡化を行う。
（e）酵素標品を加えて反応を開始する。
（f）一定時間反応させた後に、50μlのモリブデン-Malachite Green試薬を加えて反応を停止させる。
（g）室温で15分静置する（ウェルあたり5μg以上の蛋白質が含まれる時は30分）。
（i）反応停止後２時間以内に630nmの吸光度を測定する。
【００４３】
なお、第6発明（脱リン酸化酵素の活性阻害物質のスクリーニング）の場合には、前記ステップ（c）において候補物質を添加すればよい。
（D-3）アセチル化酵素の活性評価方法
第3発明（VCP-K696アセチル化酵素のスクリーニング）は、例えば、[3H]Acetyl CoAを利用する以下の方法で実施することができる。
（a）反応容器に10μlの5倍濃度アッセイバッファー(250mM Tris-HCl, pH8.0, 0.5mM EDTA, 5.0mM DTT, 50% glycerol)を入れ、ここに15μlの精製水を加える。
（b）5μlの候補酵素標品と10μlの希釈した[3H]Acetyl CoAを加えた後、10μlの基質（VCPサンプル）を加えて反応を開始する。30-60分間孵置したのち、5μlのサンプルをホスホニトロセルロース濾紙P81に吸着させる。
（c）この濾紙を50mlの50mM Na2PO4, pH9.0で5回洗浄してから50mlのアセトンで１回洗浄し、乾燥させた後に液体シンチレーターを用いて放射活性を測定する。
【００４４】
なお、第7発明（アセチル化酵素を活性化する物質のスクリーニング）では、前記ステップ（a）において、精製水の代わりに等量の候補物質を添加すればよい。
（D-4）脱アセチル化酵素の活性評価方法
第4発明（VCP-K(Ac)696の脱アセチル化酵素のスクリーニング）は、例えば、（5-5'-dithiobis (2-nitrobenzoic) acid (DTNB)を用いてAcetyl CoAの分解を定量する以下の方法によって実施することができる。
（a）反応容器に50μlのアッセイバッファー（50mM Tris-HCl, pH8.0, 10% glycerol, 5mM MgCl2, 200μM Acetyo-CoA, 200μM 基質［修飾化VCPサンプル］）を入れる。
（b）0.1μgの候補酵素標品を加えて反応を開始し、30-60分間孵置したのち、50μlの停止溶液（50mM Tris-HCl, pH 8.0, 6.4M Guanidium Hydrochloride）を加えて反応を停止させる。
（c）反応停止後に、50μlの発色試薬（50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 200μM DTNB）を加えて室温10分間静置した後に412nmの吸光度を測定する。
【００４５】
なお、第8発明（脱アセチル化酵素の活性阻害物質のスクリーニング）の場合には、ステップ（a）のアッセイバッファーに候補物質を添加すればよい。
（D-5）特異的抗体を用いた各酵素の活性評価方法
第1〜第4発明（リン酸化／脱リン酸化／アセチル化／脱アセチル化酵素のそれぞれのスクリーニング）はまた、S765オリゴ／S(P)765オリゴ／K696オリゴ／K(Ac)696オリゴの各々に対する特異的抗体を用いる方法によっても実施することができる。
（a）VCPサンプル（非修飾VCPサンプルまたは修飾化VCPサンプル）溶液を96穴プレートの各ウエルに100μlずつ分注し、37℃で2時間、または4℃で10時間放置することによって、抗原を固定する。
（b）固定化後0.05％ Tween 20/PBS等で洗浄したのち、0.2％ゼラチン/PBSを各ウエルに300μl加え、37℃で1時間、または4℃で10時間以上放置してブロッキングを行った後、再び洗浄する。この固定化したプレートを候補酵素の活性評価する際の基質として用いる。
（c）活性評価を行う酵素標品を基質固定化プレートの各ウェルに加え、一定温度で孵置する。必要な場合は、ATPや補酵素あるいは安定化剤などを加える。
（d）反応停止後、各ウェルを洗浄し、次いでこれらの修飾部位特異的なモノクローナル抗体または抗血清（ポリクローナル抗体）を各ウエルに添加し、37℃で1時間反応させた後、洗浄する。
（e）結合した特異的抗体量を測定する。抗体の定量には種種の方法を用いることが出来る。典型的には、ペルオキシダーゼ標識した抗免疫グロブリン抗体（抗IgG抗体）を用いて、適切な基質溶液で発色させて定量する。
【００４６】
なお、第5〜第8発明（それぞれ酵素の活性化物質または活性阻害物質のスクリーニング）は、前記のステップ（c）において候補物質を酵素とともに基質固定化プレートに添加すればよい。
（E）特異的抗体作成の参考例
前記（D-5）に例示したようなスクリーニング方法において使用することのできる特異的抗体の具体例を示す（詳細は、特願2003-422356に記載）。
（E-1）修飾化ペプチドの合成
修飾化S765オリゴおよび修飾化K696オリゴを、文献（Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）に記載の方法に従い、Rainin Symphony 12-channel合成機を用いて合成した。
【００４７】
修飾化K696オリゴは、配列番号２（配列番号１の691-704アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その６番目（配列番号１の696番目）Lys残基がアセチル化している（H-CQRACK(Ac)LAIRESIE-NH2）。修飾化S765オリゴは、配列番号３（N末端のCys残基以降が、配列番号１の756-770アミノ酸配列に相当）のアミノ酸配列からなり、その11番目（配列番号１の765番目）Ser残基がリン酸化している（H-CEMFAQTLQQS(PO3H2)RGFGS-NH2）。
【００４８】
また、コントロールとして、配列番号４（N末端のCys残基以降が、配列番号１の662-673アミノ酸配列に相当）の８番目（配列番号１の668番目）Lys残基がアセチル化している修飾化K668オリゴ（H-CRKSPVAK(Ac)DVDLE-NH2）を合成した。すなわち、修飾化K696オリゴおよび修飾化K668オリゴはFmoc-Glu(OtBu)-O-樹脂上で、また修飾化S765オリゴはFmoc-Amide樹脂上でそれぞれ合成した。保護されたアミノ酸は、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Valである。またリン酸化SerはFmoc-Ser[P(Obzl)O2H]、リン酸化TyrはFmoc-Tyr[P(Obzl)O2H]、リン酸化ThrはFmoc-Thr[P(Obzl)O2H]、アセチル化LysはFmoc-Lys(Ac)として合成に用いた。
【００４９】
合成および最終Fmoc除去の後、ペプチドの側鎖脱保護を行い、樹脂から分離した。得られた粗ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を用いて精製した。固定相としてC18由来のシリカを用いた。この精製ペプチドを、RP-HPLCおよび質量分析機を用いて分析し、目的のアミノ酸残基が目的の修飾を受けている修飾化ペプチドを単離した。さらに、精製ペプチドを水に溶解し、Waters Alliance HPLCシステムを連結したFinnigan MAT-LCQ mass spectrometerを用いて分析した。
【００５０】
以上のRP-HPLC分析および質量分析法によって、所定のアミノ酸が修飾された目的の修飾化ペプチド３種を得た。
（E-2）マウス抗血清の作成
免疫動物は、1抗原当たり4匹の雌性マウス（Balb/c）を用いた。初回免疫は、１匹当たり100−200μgの各修飾化ペプチドをキャリヤータンパク質（Keyhole Lymphet Hemocyanin: KLHやオボアルブミンなど）と結合させ、FCAと等量混合し、背部および腹部皮下、足裏10箇所に投与した。追加免疫は、１匹当たり50−100μgの各修飾化ペプチドを前記キャリヤータンパク質と結合させてFIAに混合し、2、4、6週目に投与した。7週目に測定採血を行い、8週目に全採血を行った。測定採血は眼窩静脈叢から0.5 mlを、全採血は腋下静脈または心室から可能な限りの血液を採取した。測定採血から得られた血清の抗体力価をELISAにより測定した。得られた血液を遠心分離（3000 rpm、20分間）して血清を得、NaN3を0.05％添加し、4℃で保存した。以上の手続により、各修飾化ペプチドのそれぞれを抗原とするマウス抗血清を作成した。
（E-3）ウサギ抗血清の作成
免疫動物は、１抗原当たり２匹のウサギ（Kbl:JW）を用いた。初回免疫は、１匹当たり800μgの各修飾化ペプチドを前記キャリヤータンパク質と結合させた後、フロイント完全アジュバント（FCA）と等量混合し、背部皮下20箇所に投与した。追加免疫は、１匹当たり400μgの各修飾化ペプチドを前記キャリヤータンパク質と結合させ、フロイント不完全アジュバント（FIA）に混合し、2、4、6週目に皮下投与した。7週目に測定採血を行い、8週目に全採血を行った。測定採血は耳静脈から2 mlを、全採血は頸動脈から可能な限りの血液を採取した。測定採血から得られた血清の抗体力価をELISAにより測定した。得られた血液を遠心分離（3000 rpm、20分間）して血清を得、NaN3を0.05％添加し、4℃で保存した。以上の手続により、各修飾化ペプチドのそれぞれを抗原とするウサギ抗血清を作成した。
（E-4）ELISA法
修飾化K696オリゴペプチド（H-CQRACK(Ac)LAIRESIE-OH）、その非修飾化ペプチド（H-CQRACKLAIRESIE-NH2）、およびコントロールの修飾化K668オリゴペプチド（H-CRKSPVAK(Ac)DVDLE-NH2）、の溶液を96穴プレートの各ウエルに100μlずつ分注し、37℃で2時間、または4℃で10時間放置することによって、抗原を固定した後、0.05％ Tween 20/PBSで3回洗浄した。0.2％ゼラチン/PBSを各ウエルに300μl加え、37℃で1時間、または4℃で10時間以上放置してブロッキングを行った後、0.05％ Tween 20/PBSで3回洗浄した。次いで、前記（E-2）で作成したマウス抗血清（ポリクローナル抗体）の溶液50μlを各ウエルに添加し、37℃で1時間反応させた後、0.05％ Tween 20/PBSで3回洗浄した。さらに、酵素標識した抗免疫グロブリン抗体（抗IgG抗体）の溶液100μlを各ウエルに添加し、37℃で1時間反応させた後、0.05％ Tween 20/PBSで3回洗浄した。最後に、基質溶液100μlを各ウエルに添加し、37℃で7分間反応させて発色させた後、1.5％シュウ酸溶液100μlを各ウエルに添加して発色反応を停止させ、ELISA用マイクロプレート分光光度計を用いて415 nmおよび486 nm（コントロール）の吸光度を測定した。
【００５１】
結果は図1に示したとおりである。コントロールの非修飾化ペプチドおよび修飾化K668オリゴペプチドペプチドに比べ、修飾化K696オリゴペプチドに対して、マウス抗血清は高い抗体力価を示すことが確認された。
【００５２】
また、修飾化S765オリゴペプチド（H-CEMFAQTLQQS(PO3H2)RGFGS-NH2）およびその非修飾化ペプチド（H-CEMFAQTLQQSRGFGS-NH2）を用いて、前記と同様ELISA法により、前記（E-3）で作成したウサギ抗血清の特異性を確認した。
【００５３】
結果は図２に示したとおりである。ウサギ抗血清は、非修飾化ペプチドに比べ、修飾化S765オリゴペプチドに対して高い抗体力価を示すことが確認された。
（F）この出願の発明の基礎となる実験データ
文献（Higashiyama H. et al., Cell Death and Differentiation 2002 9, 264-273）記載の方法に従い、ポリグルタミンの発現によるショウジョウバエの複眼変性に対するVCPタンパク質の効果を試験した。
（F-1）発現ベクターの調製
VCPタンパク質（配列番号１）をコードするcDNA（GenBank/NM 007126）を基に、S765のリン酸化を模倣する変異体VCPとして、第765位Ser残基がAsp残基に置換したVCP(S765D)をコードするポリヌクレオチドを作成した。また、同様に、K696のアセチル化を模倣する変異体VCPとして、第696位Lys残基がAla残基に置換したVCP(K696A)をコードするポリヌクレオチドを作成した。これらのポリヌクレオチドを、P-element由来の配列を持つpUASベクターにサブクローニングした（それぞれVCP(S765D)ベクター、VCP(K696A)ベクター）。
【００５４】
また、伸張したポリグルタミン鎖をコードするCAGの繰り返し配列92個を持つDNA断片をP-element由来の配列を持つpGMRベクターのStuIサイトに常法を用いてサブクローニングした（Q92ベクター）。
【００５５】
対照として、野性型VCPをコードするポリヌクレオチドを保有するプラスミドDNA（wtVCPベクター）、およびEGFPコード配列を保有するプラスミドDNA（EGFPベクター）を調製した。
（F-2）ショウジョウバエの複眼変性に対する変異体VCPの効果の解析
ショウジョウバエは専用フード中で25℃で飼育した。トランスジェニックショウジョウバエは、顕微鏡下で上述の発現ベクター（EGFPベクター； Q92ベクター； wtVCPベクター；VCP (S765D)ベクター； VCP (K696A)ベクター）を、それぞれ常法によりショウジョウバエ卵に微量注入して作成した (Drosohila protocols 2000 William Sullivan, Michael Ashburner, and R. Scott Hawley Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
【００５６】
具体的には、トランスポーゼスを持つ系統であるw;;TmS/+のハエの受精卵を分離し、玉子の尾部に発現ベクター溶液（DNA 0.5〜1.0ug/ul, 5mM KCl, 0.1mM Na3PO4(pH6.8)）を注入した。一つの発現ベクター当たり平均200個の卵に微量注入した。卵を通常通り飼育して発生を進め、羽化した個体のオスとywのメスとを掛け合わせ、次の世代のハエのうち複眼が白色ではなく黄色になったものを形質転換体として得た。
【００５７】
得られた形質転換体を、ダブルバランサー(w;Sp/Cy;Dr/Sb)とを掛け合わせ、挿入遺伝子の染色体番号を決定し、同時にライン化した。ポリグルタミンを単独で発現するショウジョウバエ系統と、細胞死への影響を評価したい系統（EGFP； wtVCP； VCP (S765D)； VCP (K696A)）を掛け合わせて、両者を共発現する系統を得た（Q92＋EGFP；Q92＋wtVCP；Q92＋VCP (S765D)；Q92＋VCP (K696A)）。
【００５８】
ショウジョウバエ複眼の変性は、実体顕微鏡下で次の指標を基準に評価した。すなわち、複眼の形、色素着色の程度、個眼の形態の保存性でポリグルタミン発現による細胞死を評価した。
【００５９】
図３は、左から、EGFP単独；Q92＋EGFP；Q92＋wtVCP；Q92＋VCP（S765D）をそれぞれ発現させたショウジョウバエの複眼の顕微鏡写真像である。また図４は、EGFP単独；Q92＋EGFP；Q92＋wtVCP；Q92＋VCP（K696A）をそれぞれ発現させたショウジョウバエの複眼の顕微鏡写真像である。これらの結果から明らかなように、S765のリン酸化を模倣する変異体VCP（S765D）およびK696のアセチル化を模倣する変異体VCP（K696A）を共発現させた場合には、ポリグルタミン（Q92）による複眼変性が劇的に改善されることが確認された。
【００６０】
なお、より精細に複眼変性を評価する為には走査型電子顕微鏡（Hitachi S-100等）を用いて複眼レンズ層の凹凸の保存性、形、複眼表面の微小棘の方向と数で評価することも出来る。また、細胞レベルでの細胞死に対する影響は次のように免疫化学的方法を用いて見ることが出来る。複眼あるいは蛹から取り出した成虫原基を4%パラホルムアルデヒド中で12時間固定した後に、10%-30% sucroseの上昇系列中で処理した後に包埋剤中に埋め込んで固化し、10μmの薄切切片を作成する。切片は通常の免疫化学の手法により、洗浄・透過・ブロッキングを行ってから、適切な抗体で細胞の生存状態を評価する。抗ポリグルタミン抗体や抗ユビキチン抗体により細胞中の凝集体数を定量することも出来る。細胞死の程度はDAPI等の細胞核染色試薬で染色して核の形態を観察して定量しても良いし、また、TUNEL法により細胞中での切断されたDNA末端を定量して評価しても良い。ポリグルタミンによるショウジョウバエの複眼変性に対する変異体VCP（S765D）および変異体VCP（K696A）の効果は、以上のとおりの詳細な解析によっても確認された。
【００６１】
以上の結果から、S765がリン酸化したVCPタンパク質およびK696がアセチル化したVCPタンパク質が、ポリグルタミン病の治療薬開発におけるターゲット分子として極めて有望であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、バロシン含有タンパク質（VCP）の第765位Ser残基に対するリン酸化酵素、脱リン酸化酵素、および第696位Lys残基に対するアセチル化酵素、脱アセチル化酵素を特定するためのスクリーニング方法、並びにこれらの酵素の活性化物質および阻害物質を特定するためのスクリーニング方法が提供される。これらの方法によって特定された物質は、例えばポリグルタミン病の治療薬剤の成分として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】特異的抗体を用いたELISA分析（E-4）の結果を示すグラフである。黒丸は修飾化K696オリゴペプチド、白四角は非修飾化K696オリゴペプチド、黒三角はコントロール修飾化K668オリゴペプチドのそれぞれに対するマウス抗血清の抗体力価を示す。
【図２】特異的抗体を用いたELISA分析（E-4）の結果を示すグラフである。黒丸は修飾化S765オリゴペプチド、白丸は非修飾化S765オリゴペプチドに対するウサギ抗血清の抗体力価を示す。
【図３】左から、EGFP単独；Q92＋EGFP；Q92＋wtVCP；Q92＋VCP（S765D）をそれぞれ発現させたショウジョウバエの複眼の顕微鏡写真像である。
【図４】左から、EGFP単独；Q92＋EGFP；Q92＋wtVCP；Q92＋VCP（K696A）をそれぞれ発現させたショウジョウバエの複眼の顕微鏡写真像である。
【図１】
2005198534.tif 000005
【図２】
2005198534.tif 000006
【図３】
2005198534.tif 000007
【図４】
2005198534.tif 000008
【配列表】
2005198534000001.app