(57)【要約】【課題】高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、液体だけでなく、固体または固体を含む試料にも応用でき、培養後の追加操作なしにできる迅速な微生物の培養・検出手段およびそれに用いる発色試薬を提供する。【解決手段】微生物を含有する懸濁液に半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを加え、この懸濁液を培地に添加して培養を行うことを特徴とする微生物の培養方法および該テトラゾリウム塩と該水溶性多価アルコールを含む微生物検出用発色試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含有する懸濁液に半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを加え、この懸濁液を培地に添加して培養を行うことを特徴とする微生物の培養方法。
【請求項２】
水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである請求項１に記載の微生物の培養方法。
【請求項３】
試料懸濁液に半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを加え、この試料懸濁液を培地に添加して培養を行うことを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項４】
水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである請求項３に記載の微生物の検出方法。
【請求項５】
半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを含む微生物検出用発色試薬。
【請求項６】
水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである請求項５に記載の微生物検出用発色試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物を培養・検出する方法に関する。さらに詳しくは食品や化粧品、環境中の微生物汚染を検出判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の微生物検査方法は、食品検査における一般生菌数の測定を例として説明すると、まず、粉末寒天培地を溶解、滅菌した後、約４５℃に保っておく。その寒天培地の一定量を、あらかじめ食品の懸濁液などの検査試料１ｍＬを入れた滅菌ペトリ皿などに分注し、混釈後、寒天を固化し、３５℃で２日間培養後、生じた微生物のコロニー数を計数する。このように従来の一般生菌検査方法は、前もって、培地を調製、滅菌した後、寒天培地が固化しない温度に保っておく必要があるなど、非常に手間と時間がかかる方法である。また、通常結果を得るためには２４〜４８時間以上、真菌の検査では５〜７日間の時間を要する。
【０００３】
一方、培地調製の手間を省いた生培地、スタンプタイプ（特許文献１）、フィルタータイプ、フィルム（シート）タイプ（特許文献２、特許文献３、特許文献４）、試験紙タイプなど、それぞれの目的にあわせ使いやすいように作られた簡易培地が提案されているが、検査時間は寒天培地と変わらず、２４〜４８時間以上を要する。
【０００４】
検査時間を短縮した例として、特許文献５に、濾過膜上に捕集した菌を短時間培養して界面活性剤や有機溶媒などで菌由来のアデノシン−三リン酸を細胞より抽出し、ルシフェラーゼの存在下にルシフェリンと反応させて発光させ、その発光輝点をイメージアナライザーで検出して生菌数を測定する方法が記載されている。上記以外にも、捕集した微生物を所定の時間培養して、発光色素で処理して、放射された蛍光を自動検出する方法、微小な光点を検出するためにスキャナーを使用する方法、或いはまた落射蛍光顕微鏡を使用する方法が提案されている。これらは高額な機器を必要とし、通常は液体試料の検査に応用できるだけである。高額な機器を必要としない方法として、特許文献６に、微生物を合成高分子製多孔質濾過膜上に捕集し、寒天培地上で短時間培養して形成された該微生物由来のコロニーに塩基性染料の有機溶媒溶液を添加して染色した後、該有機溶媒を揮散して顕微鏡下で該染色微小コロニーの数を計測する方法が記載されている。これは液体試料では有効な方法であるが、固体試料および固体を含む試料の検査は困難である。
【特許文献１】特開平４−１１７２９９
【特許文献２】特公平２−４９７０５
【特許文献３】特開平３−１５３７９
【特許文献４】特開２０００−５８９９９
【特許文献５】特開平４−３０７９８
【特許文献６】特開平９−３７７９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、液体だけでなく、固体または固体を含む試料にも応用でき、培養後の追加操作なしにできる迅速な微生物の検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）微生物を含有する懸濁液に半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを加え、この懸濁液を培地に添加して培養を行うことを特徴とする微生物の培養方法。
（２）水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである上記（１）項に記載の微生物の培養方法。
（３）試料懸濁液に半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを加え、この試料懸濁液を培地に添加して培養を行うことを特徴とする微生物の検出方法。
（４）水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである上記（３）項に記載の微生物の検出方法。
（５）半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールを含む微生物検出用発色試薬。
（６）水溶性多価アルコールが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものである上記（５）項に記載の微生物検出用発色試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、また液体試料だけでなく、固体または固体を含む試料にも培養後の追加操作なしに応用できる迅速な微生物の検出手段を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
微生物を培養して集落が見えるようになるまでは通常少なくとも２０時間はかかる。特公平２−４９７０５（特許文献２）、特開平３−１５３７９（特許文献３）、特開２０００−５８９９９（特許文献４）に記載されているフィルムまたはシート状培地は微生物の生育を見やすくするように発色基質が加えられているが、それでも、２０時間以内に微生物の生育を観察することはできない。
【０００９】
テトラゾリウム塩などの還元系発色試薬は微生物の脱水素酵素によって容易に還元され、発色する。テトラゾリウム塩は、酸化還元電位の低いものほど還元が容易で発色しやすいが、酸化還元電位が低くなると微生物に対する生育阻害も強くなり、培地中にはじめから加えておく、または、微生物を含む懸濁液に加えると微生物は生育しないか生育が遅れることがある。しかし、水溶性多価アルコールを同時に加えると生育阻害は緩和されることがわかった。ＭＴＴなどの還元されやすい（酸化還元電位の低い）テトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールの溶液を添加した微生物を含む懸濁液を、シート状培地あるいはフィルム状培地、寒天培地、試験紙等の培地で培養すると７〜１４時間程度で微生物の生育を発色によって確認することができる。
【００１０】
食品などに滅菌生理食塩水または滅菌水を加えホモジナイズした懸濁液または食品製造環境などをガーゼまたは綿棒などで拭き取り、滅菌生理食塩水または滅菌水に懸濁した懸濁液などを適宜希釈する。この懸濁液（または希釈懸濁液）に酸化還元電位の低いテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールの水溶液を加える。撹拌後、懸濁液または希釈懸濁液の一定量をシート状培地あるいはフィルム状培地、寒天培地、試験紙等の培地に加え、培養する。培養５時間後から、微生物の集落が見え始め、９〜１４時間程度の培養により、希釈懸濁液に酸化還元電位の低いテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールの水溶液を加えないときの２４〜４８時間培養したときに匹敵する微生物の集落数が確認できる。（また、真菌用では３０時間程度の培養で、希釈懸濁液に酸化還元電位の低いテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールの水溶液を加えないときの３〜７日間培養したときに匹敵する微生物の集落数が確認できる。）
【００１１】
本発明に用いるテトラゾリウム塩としては比較的酸化還元電位の低い還元されやすいものが好ましい。酸化還元電位を表す値として、ポーラログラフィーにおける「半波電位（Ｅ１／２）」が用いられている。ポーラログラフィーにおける半波電位（Ｅ１／２）の測定法は、例えば日本化学会編「第４版実験化学講座」（丸善刊）、第９巻２９７〜９頁、「６・４・４  ポーラログラフィー」に詳しく記載されており、各種テトラゾリウム塩の半波電位についてはＥ．Ｓｅｉｄｌｅｒ，  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９１），  ２４（１），第２１〜３頁（特に第２２頁の「Ｔａｂｌｅ  ５」）やＦ．Ｐ．Ａｌｔｍａｎ，Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｚａｎｓ，（１９７６），Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ刊，第２３〜５頁（特に第２４頁の「Ｔａｂｌｅ  ７」）に記載されている。本発明では、この半波電位（Ｅ１／２）の絶対値を基準にテトラゾリウム塩を選ぶ。半波電位（Ｅ１／２）は、文献によって正負が逆に表されていることがあるので、絶対値を基準とする。本発明において、テトラゾリウム塩のＥ１／２の絶対値は２５０ｍｖ以下のものが好ましく、２００ｍｖ以下ならばさらに好ましい。
【００１２】
そのようなテトラゾリウム塩として、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、Ｅ１／２＝１１０ｍｖ）、ＩＮＴ（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ、Ｅ１／２＝９０ｍｖ）、ニトロブルーテトラゾリウムブルー（３，３’［３，３’Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−（１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−４，４’−ｄｉｙｌ］−ｂｉｓ［２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ］）、テトラゾリウムブルー（３，３’［３，３’Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−（１，１’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ）−４，４’−ｄｉｙｌ］−ｂｉｓ（２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ）などを挙げることができる。ＭＴＴ、ニトロブルーテトラゾリウムブルーなど還元されて生じた色素ホルマザンのモル吸光係数の高いものは、より早く発色が確認できるので特に好ましい。
【００１３】
水溶性多価アルコールとしては、２つ以上の水酸基を持ち、微生物の生育を著しく阻害するものでなければどのようなものでもよいが、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものが好ましい。水溶性多価アルコールとして該テトラゾリウム塩に対して還元性を有さないものを選択することにより、培養を行う前にテトラゾリウム塩がホルマザンに還元され発色してしまうことを防止することができる。したがって、該テトラゾリウム塩に対して還元性を有さない水溶性多価アルコールとは、該テトラゾリウム塩と共存させた場合に発色反応を起こさないもののことである。
【００１４】
そのような好ましい水溶性多価アルコールとしては、エチレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコールなど２以上の水酸基をもつ水溶性アルコール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトールなどの糖アルコール、水酸基を有するノニオン系界面活性剤、水溶性ポリビニルアルコールなどを挙げることができる。ノニオン系界面活性剤としては、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ８０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ２０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ４０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ６０）、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅなどが好ましく使える。
【００１５】
半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩は、菌懸濁液に対して１〜５００μｇ／ｍｌ程度の濃度になるよう加えることが適切である。また、水溶性多価アルコールは菌懸濁液に対して０．００５〜１０重量％程度、好ましくは０．０２〜５重量％の濃度になるよう加えることが適切である。上述した半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩と水溶性多価アルコールの混合物およびその水溶液は、それ自体で微生物検出用発色試薬として使用することができる。
【００１６】
本発明に使用する培地としては、一般の寒天培地でも良いが、微生物の培養・検出を簡便にしたシート状培地が一層好ましい。このようなシート状培地として、例えばチッソ(株)製シート状培地「サニ太くん」（商品名、ポリビニルアルコールシートと不織布を積層した微生物検査用シート状培地）、３Ｍ社製「ペトリフィルム」（商品名）、サン化学製「サンコリ」（商品名）等が市販されている。なお、使用する培地がチッソ(株)「サニ太くん」のように水溶性ポリビニルアルコールを含有するものであるときには、それ自体が水溶性多価アルコールとして作用するため、あらかじめ試料懸濁液に多価アルコールを加えることなく微生物の培養・検出を行うことができるので好ましい。そのような培地を使用する場合でも、ポリビニルアルコール以外の多価アルコール、例えばノニオン系界面活性剤を併用することにより、さらに好ましい効果を得ることができる。
【００１７】
培地の栄養成分には、半波電位の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩に対して還元性を有する成分、例えばグルコース等が含まれる場合もある。そのような場合には、培養を開始するまではテトラゾリウム塩を加えた試料懸濁液と培地を分けて取り扱うとよい。一般に、微生物の培養を行う条件では、グルコース等が含まれていても微生物の集落成長による発色が確認できなくなるほどのバックグラウンドの発色は起こらないからである。
【実施例】
【００１８】
次に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例中に使用したチッソ（株）製シート状培地「サニ太くん」（商品名）は、以下のような構成のシート状培地である。
【００１９】
「サニ太くん」一般生菌用
水２５０ｍｌに鹸化度８９％、分子量８３０００のポリビニルアルコール３０ｇを加え加熱溶解後、得られた水溶液を厚さ２０μｍでサイズ０．５ｍ×１ｍのポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃で５分間乾燥して最初の水溶性高分子化合物層を形成させた。前記のポリビニルアルコール１５ｇ、ペプトン２．３ｇ、肉エキス１．０ｇ、酵母エキス０．６ｇ、炭酸ナトリウム０．０７５ｇおよびグルコース０．４ｇを水２５０ｍｌに溶解し、得られた水溶液を最初の層の上に塗布して１１０℃で７分間乾燥し、第２の水溶性高分子化合物層を形成させた。この層の上に、前記のポリビニルアルコール５ｇ、ペプトン０．８ｇ、肉エキス０．３ｇ、酵母エキス０．２ｇ、炭酸ナトリウム０．０２５ｇおよび塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリム２０ｍｇを水１００ｍｌに溶解して得た水溶液を塗布し、その上に目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ／（ｍ2・ｓｅｃ）のナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃で３０秒間乾燥した。ペプトン１５ｇおよびリン酸二ナトリウム４０ｇを水１Ｌに溶解し、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて不織布上に塗布し、１００℃で２０秒間乾燥した。このようにして得られた培地積層物を４５ｍｍ×４５ｍｍの正方形に切断し、白色ポリエステル粘着シート（基板）上に接着した後、ポリプロピレンフィルムでカバーし、エチレンオキサイドガス滅菌を行ったものである。なお、「サニ太くん」一般生菌用には、Ｅ１／２が４９０ｍｖの塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリムが予め添加されているが、Ｅ１／２の絶対値が２５０ｍｖ以下のテトラゾリウム塩を使用することの妨げにはならない。
【００２０】
「サニ太くん」真菌用
水０．３Ｌに鹸化度８９％、分子量８３０００のポリビニルアルコール３５ｇを加え加熱溶解後、厚み２０μｍで０．５ｍ×１ｍのポリエステルフィルム上にすべて塗布し、１２０℃で６分間乾燥した。得られた最初の水溶性高分子化合物層の上に、前記のポリビニルアルコール１５ｇ、酵母エキス１．２ｇ、グルコース４．５ｇ、およびクロラムフェニコール０．３７５ｇを水０．２５Ｌに溶解して得た溶液をすべて塗布し、１１０℃で７分間乾燥して第２の水溶性高分子化合物層を形成させた。この第２の層の上に、前記のポリビニルアルコール５ｇ、酵母エキス０．４ｇ、グルコース１．５ｇ、クロラムフェニコール０．１２５ｇおよび酢酸５−ブロモインドキシル０．０３ｇを水０．１Ｌに溶解して得た溶液をすべて塗布し、その上に目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ／（ｍ2・ｓｅｃ）のナイロンメルトブロー不織布を貼り合わせて、１００℃で３０秒間乾燥した。ペプトン２０ｇを水１Ｌに溶解し、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて不織布上に塗布し、１００℃で２０秒間乾燥した。このようにして得られた培地積層物を４５ｍｍ×４５ｍｍの正方形に切断し、白色ポリエステル粘着シート（基板）上に接着した後、ポリプロピレンフィルムでカバーし、エチレンオキサイドガス滅菌を行ったものである。
【００２１】
実施例１
普通ブイヨンで培養した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ１３５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＩＦＯ１２６８１）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ２８７４）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した菌懸濁液１０ｍＬに、Ｔｗｅｅｎ８０とＭＴＴの水溶液（２重量％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液にＭＴＴを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した水溶液）１００μＬを加え撹拌した。この溶液１ｍＬずつを「サニ太くん」一般生菌用（商品名、チッソ(株)製）に加え、３５℃で培養した。
枯草菌は培養約５時間後に、黄色ブドウ球菌は約７時間後に、他の細菌は約６時間後に、青紫色に発色したコロニーが確認できた。上記菌懸濁液に何も加えず「サニ太くん」一般生菌用で培養した場合は赤色のコロニーが確認できるまで枯草菌の場合１３時間、黄色ブドウ球菌では２２時間、他の細菌では１８時間かかった。
【００２２】
実施例２
実施例１の培地を３Ｍ社製「ペトリフィルム」、サン化学製「サンコリ」一般生菌用（両者とも市販されているシート状培地である）に変えて行った。背景の色が「サニ太くん」一般生菌用に比べると濃いため、約１時間程度、時間は遅くなったが、同様に青紫色に発色したコロニーが確認できた。
【００２３】
実施例３
普通ブイヨンで培養した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ１３５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＩＦＯ１２６８１）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ２８７４）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した菌懸濁液１０ｍＬに、Ｔｗｅｅｎ８０とＭＴＴの水溶液（２重量％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液にＭＴＴを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した水溶液）１ｍＬを加え撹拌した。この溶液１ｍＬずつをシャーレに加えた。あらかじめ溶解滅菌し、約４５℃に保っておいたＳＣＤ寒天培地を分注、混釈して、３５℃で培養した。
混釈時に培地全体の着色が認められたが、枯草菌は培養約６時間後に、黄色ブドウ球菌は約８時間後に、他の細菌は約７時間後に、青紫色に発色したコロニーが確認できた。
【００２４】
実施例４
普通ブイヨンで培養した枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３１３４）、エンテロバクターエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ１３５３４）、クレブシエラニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＪＣＭ１６６２）、シトロバクターフレンディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＩＦＯ１２６８１）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＪＣＭ２８７４）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した菌懸濁液１０ｍＬに濃度５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ水溶液１００μＬを加え、撹拌後１ｍＬずつを「サニ太くん」一般生菌用（チッソ(株)製）に加え、３５℃で培養した。
実施例１に比べると発色が確認できるまでの時間がやや長くなる傾向にあったが、実施例１と同様な結果であった。
【００２５】
実施例５
豚肉、牛肉、各種野菜類に９倍量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加え、９０秒間ストマッカー処理した。懸濁液およびこれを滅菌リン酸緩衝生理食塩水で適宜希釈した希釈懸濁液９〜１０ｍＬに、Ｔｗｅｅｎ８０とＭＴＴの水溶液（２重量％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液にＭＴＴを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した水溶液）５０μＬを加え撹拌した。この溶液１ｍＬずつを「サニ太くん」一般生菌用に加え、３５℃で培養した。
９〜１４時間の培養で、ＭＴＴ溶液を加えず２４時間培養したときとほぼ同等な集落数が認められた。
【００２６】
実施例６
実施例１のＭＴＴの代わりにＩＮＴ、ニトロブルーテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルーを、２％Ｔｗｅｅｎ８０の代わりに０．１〜５％のＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ、０．５〜１０％のエチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトールを用いて、実施例１と同様に行った。
界面活性剤、エチレングリコール、グリセロール、糖アルコールはどれも同様な結果を示し、ＭＴＴに比べ、ニトロブルーテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルーは約３０〜６０分、ＩＮＴは１〜２時間遅くなったが、発色した集落が確認された。
【００２７】
実施例７
普通ブイヨンで培養した黒麹かび（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＦＯ４０９１）、キャンディダトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ＩＦＯ５８９）、ピキアアネモラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｅｍｏｌａ  ＩＦＯ１４２）、ロドトルーラグルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ  ＩＦＯ３８９）、ヤローウィアリポリチカ（Ｙａｒｒｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＩＦＯ７４６）を滅菌水で１０〜１０００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した菌懸濁液１０ｍＬに、Ｔｗｅｅｎ８０とＭＴＴの水溶液（２重量％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液にＭＴＴを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した水溶液）１００μＬを加え撹拌した。この溶液１ｍＬずつを「サニ太くん」真菌用（チッソ(株)製）に加え、２５℃で培養した。
２０時間後に観察したとき、青紫色に発色した集落が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、高価な機器や顕微鏡を必要とすることなく、かつ、液体試料だけでなく、固体または固体を含む試料にも適用できる迅速かつ安価な微生物の検出方法および微生物検出用試薬が提供される。本発明では、例えば食品、化粧品、環境中の微生物汚染を迅速かつ安価に検出することができる。