(57)【要約】      （修正有）【課題】スーパーオキシド産生酵素として利用可能なキサンチン酸化還元酵素変異体等の提供。【解決手段】（ａ）から（ｃ）のいずれかであるキサンチン酸化還元酵素変異体。（ａ）Rattus  norvegicusのキサンチン酸化還元酵素である特定なアミノ酸配列につき、334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、かつ336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる（ｂ）Rattus  norvegicus以外の総ての哺乳動物のXORのアミノ酸配列につき、（ａ）と相同の置換を有するアミノ酸配列からなる（ｃ）（ａ）及び（ｂ）のいずれかに記載のXOR変異体のアミノ酸配列につき、更に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつスーパーオキシド産生活性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサンチン酸化還元酵素の変異体であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかであることを特徴とするキサンチン酸化還元酵素変異体。
（ａ）  Rattus  norvegicusのキサンチン酸化還元酵素である配列番号１のアミノ酸配列について、334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体
配列番号１：
MTADELVFFVNGKKVVEKNADPETTLLVYLRRKLGLCGTKLGCGEGGCGACTVMISKYDRLQNKIVHFSVNACLAPICSLHHVAVTTVEGIGNTQKLHPVQERIARSHGSQCGFCTPGIVMSMYTLLRNQPEPTVEEIENAFQGNLCRCTGYRPILQGFRTFAKDGGCCGGSGNNPNCCMNQTKDQTVSLSPSLFNPEDFKPLDPTQEPIFPPELLRLKDTPQKKLRFEGERVTWIQASTMEELLDLKAQHPDAKLVVGNTEIGIEMKFKNMLFPLIVCPAWIPELNSVVHGPEGISFGASCPLSLVESVLAEEIAKLPEQKTEVFRGVMEQLRWFAGKQVKSVASIGGNIITASPISDLNPVFMASGAKLTLVSRGTRRTVRMDHTFFPGYRKTLLRPEEILLSIEIPYSKEGEFFSAFKQASRREDDIAKVTSGMRVLFKPGTIEVQELSLCFGGMADRTISALKTTPKQLSKSWNEELLQSVCAGLAEELHLAPDAPGGMVEFRRTLTLSFFFKFYLTVLQKLGRADLEDMCGKLDPTFASATLLFQKDPPANVQLFQEVPKDQSEEDMVGRPLPHLAANMQASGEAVYCDDIPRYENELSLRLVTSTRAHAKITSIDTSEAKKVPGFVCFLTAEDVPNSNATGLFNDETVFAKDEVTCVGHIIGAVVADTPEHAQRAARGVKITYEDLPAIITIQDAINNNSFYGSEIKIEKGDLKKGFSEADNVVSGELYIGGQEHFYLETNCTIAVPKGEAGEMELFVSTQNTMKTQSFVAKMLGVPDNRIVVRVKRMGGGFGGKETRSTVVSTALALAAHKTGRPVRCMLDRDEDMLITGGRHPFLAKYKVGFMKTGTVVALEVAHFSNGGNTEDLSRSIMERALFHMDNAYKIPNIRGTGRICKTNLPSNTAFRGFGGPQGMLIAEYWMSEVAITCGLPAEEVRRKNMYKEGDLTHFNQKLEGFTLPRCWDECIASSQYLARKREVEKFNRENCWKKRGLCIIPTKFGISFTLPFLNQGGALVHVYTDGSVLLTHGGTEMGQGLHTKMVQVASRALKIPTSKIHISETSTNTVPNTSPTAASASADLNGQGVYEACQTILKRLEPFKKKKPTGPWEAWVMDAYTSAVSLSATGFYKTPNLGYSFETNSGNPFHYFSYGVACSEVEIDCLTGDHKNLRTDIVMDVGSSLNPAIDIGQVEGAFVQGLGLFTMEELHYSPEGSLHTRGPSTYKIPAFGSIPIEFRVSLLRDCPNKRAIYASKAVGEPPLFLASSIFFAIKDAIRAARAQHGDNAKQLFQLDSPATPEKIRNACVDQFTTLCVTGVPENCKSWSVRI
（ｂ）  Rattus  norvegicus以外の哺乳動物のキサンチン酸化還元酵素のアミノ酸配列について、前記（ａ）と相同の置換を有するアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体
（ｃ）  前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体のアミノ酸配列について、さらに、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スーバーオキシド産生活性を有するキサンチン酸化還元酵素変異体
【請求項２】
前記334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が置換される前記他のアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンのいずれかであり、前記336番目のフェニルアラニンが置換される他のアミノ酸が非芳香族アミノ酸である請求項１に記載のキサンチン酸化還元酵素変異体。
【請求項３】
（ａ）が、配列番号１のアミノ酸配列について、335番目のトリプトファン及び426番目のアルギニンから選択されるいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体である請求項１及び２のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体。
【請求項４】
（ａ）が、配列番号１のアミノ酸配列について、335番目のトリプトファンが他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体である請求項１から３のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体をコードすることを特徴とするDNA。
【請求項６】
請求項５に記載のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有することを特徴とするDNA。
【請求項７】
請求項５及び６のいずれかに記載のDNAを含むことを特徴とするベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドを効率的に産生するキサンチン酸化還元酵素(xanthin  oxidoreductase  ;以下「XOR」と略称することがある)  変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーオキシドは反応性が高く、生体内の様々な物質と反応して障害を起こすため、最近、注目を集めており、スーパーオキシドの機能を解析したり、利用したりするために、スーパーオキシドを簡単に産生できる系が要望されている。現在、スーパーオキシドを多量に産生する酵素は、前記XORとNADPHオキシダーゼ(以下「NOX」と略称することがある)の2種しか知られていないが、前記NOXはその産生系の複雑さから利用が難しい。したがって、スーパーオキシドの産生には、前記XORの利用が考えられる。
【０００３】
前記XORは、多くのプリン、プテリン、ピリミジン、アルデヒドを水酸化する酵素であり、その基質特異性は広い。ヒトでは、ヒポキサンチンをキサンチン、キサンチンを尿酸へと酸化する２段階の反応の際に、２個の電子を受け取り、電子受容体となる物質(NADまたは酸素)に電子を渡す酵素として知られている。
これまでの研究で、前記XORは、ウシ、ヒト、ラットなどの哺乳動物をはじめ、高等植物、細菌に至る生物で広くその存在が知られており、ウシ、ヒト、ラット等の哺乳動物においてはそのアミノ酸配列や機能などに多くの類似性がある。
【０００４】
前記XORは、細菌以外では分子量300kDaのホモ二量体として存在し、フラビンアデニンジヌクレオチド(以下FAD)等を補欠分子族として持つ。N末端側より20K、40K、85Kの3個のドメインから構成され、それぞれのドメインには[2Fe-2S]タイプの鉄―硫黄中心、FAD、及び、モリブドブテリンが酸化還元中心として存在している。すなわち、N末端側の20Kのドメインには、鉄―硫黄中心のリガンドとなっているそれぞれ4個のシステインからなるモチーフが2箇所存在する。これらのモチーフを含めたこのドメインのアミノ酸配列はすべての生物種でよく保存されている。中間の40Kドメインは、FAD結合部位であり、かつNAD+結合部位である。これは、NAD+がFADと反応することと対応している。C末端側の85Kのドメインはモリブドブテリンを有し、モリブデンは2個の硫黄原子を介してブテリンに結合している。
【０００５】
前記XORは、生体内において通常、前記NADを電子受容体とする脱水素酵素（キサンチン脱水素酵素型、以下「XDH型」ということがある）として、存在する。しかし、哺乳動物の前記XORは、前記FAD周囲の環境によってその構造と機能を変える。前記XDH型の酵素は、そのSH基が酸化、又は蛋白質分解酵素によって部分的に分解を受けると、酸素を電子受容体とする酸化酵素へと変換する（キサンチン酸化酵素型、以下「XO型」ということがある）。酵素のSH基が酸化して前記XO型へ変換した前記XORは、還元剤であるDTT(dithiothreitol)を用いて還元(DTT処理)することで元の前記XDH型に戻るが、蛋白質分解酵素によってXO型へ変換すると元には戻らない。
【０００６】
前記XDH型の主な電子受容体がβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「NAD」ということがある）であるのに対し、前記XO型の主な電子受容体は酸素分子である(例えば、非特許文献１参照)。前記XDH型でも前記NAD非存在下では弱い、酸素を電子受容体とする酸素電子受容体活性がある。
酸素が電子受容体となる場合、酸素に1電子渡ればスーパーオキシド、2電子渡れば過酸化水素を生成する。天然の前記XDH型の前記XORでは、酸素への電子の授受比において、スーパーオキシドの生成比(スーパーオキシド生成比)が34%で、残りが過酸化水素の産生に用いられる。また、XDHのシステインSH基を酸化または部分分解して得られる前記XO型の前記XORではスーパーオキシドの生成比(スーパーオキシド生成比)が15%で、残りが過酸化水素の産生に用いられる(例えば、非特許文献２参照)。したがって、非生理的条件下において、前記XORによるスーバーオキシドの産生は可能であるが、酸素電子受容体活性の強い前記XO型においては、還元された酸素のほとんどが過酸化水素になり、スーバーオキシドの生成比が低いという問題がある。なお、生理的には、生体内で前記XORは、前記XDH型として存在するため、生体内のNADと優先的に反応する。そのため、酸素とは反応せず、スーパーオキシドや過酸化水素も産生することはない。
【０００７】
Kuwabaraらは、立体構造解析及び変異体の機能解析の結果から、ウシミルクXDHの335番目のアルギニン(R)をアラニン(A)に変えた変異体(R335A)、336番目のトリプトファン(W)をアラニン(A)に変えた変異体(W336A)、及び、427番目のアルギニン(R)をグルタミン(Q)に変えた変異体(R427Q)は、DTT処理をしても、電子受容体を酸素とするXO型の活性を残すこと、また、549番目のフェニルアラニン（Phe）の変異についても同様の効果が考察されることを報告している(例えば、非特許文献３参照)。これらXO型の活性を有する酵素変異体についても、スーバーオキシドの産生は可能であるが、前述の酸化または部分分解により得られた前記XO型の前記XORと同様に、スーバーオキシド生成比が低いという問題は解消されない。
【０００８】
【非特許文献１】Della  Corte.E.,  Stirpe.F.,(1968)    FEBS  Lett.  2,  83-84,  The  regulation  of  rat-liver  xanthine  oxidase:  Activation  by  proteolytic  enzymes.
【非特許文献２】Saito.T.,Nishino.T.(1989)  J.Biol.  Chem.  264,  10015-10022,  Differences  in  redox  and  kinetic  properties  between  NAD-dependent  and  O2-dependent  type  of  rat  liver  xanthine  dehydrogenase.
【非特許文献３】Kuwabara.Y.,  Nishino.T.,  Okamoto.K.,  Matsumura.T.,  Eger.T.B.,  Pai.F.E.,  Nishino.T  (2003)  PNAS  100,  8170-8175,  Unique  amino  acids  cluster  for  switching  from  the  dehydrogenase  to  oxidase  form  of  xanthine  oxidoreductase.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、スーパーオキシド産生酵素として利用可能な高いスーパーオキシド産生能を持つXOR変異体、該XOR変異体を製造するために用いることができるDNA及びベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前述のDTT処理をしても、電子受容体を酸素とするXO型の活性を残す変異体に、さらに、別の変異を導入することにより、XO型活性を有し、かつ、スーバーオキシド生成比の顕著に高いXOR変異体を作ることに成功し、本発明に至った。
即ち、前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞  キサンチン酸化還元酵素（XOR）の変異体であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかであることを特徴とするキサンチン酸化還元酵素変異体である。
（ａ）  Rattus  norvegicusのXORである配列番号１のアミノ酸配列について、334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体
（ｂ）  Rattus  norvegicus以外の哺乳動物のキサンチン酸化還元酵素のアミノ酸配列について、前記（ａ）と相同の置換を有するアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体
（ｃ）  前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体のアミノ酸配列について、さらに、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スーバーオキシド産生活性を有するキサンチン酸化還元酵素変異体
＜２＞  前記334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が置換される前記他のアミノ酸がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンのいずれかであり、前記336番目のフェニルアラニンが置換される他のアミノ酸が非芳香族アミノ酸である前記＜１＞に記載のキサンチン酸化還元酵素変異体である。
＜３＞  （ａ）が、配列番号１のアミノ酸配列について、335番目のトリプトファン及び426番目のアルギニンから選択されるいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体である前記＜１＞及び＜２＞のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体である。
＜４＞  （ａ）が、配列番号１のアミノ酸配列について、335番目のトリプトファンが他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素変異体である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体である。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のキサンチン酸化還元酵素変異体をコードすることを特徴とするDNAである。
＜６＞  前記＜５＞に記載のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有することを特徴とするDNAである。
＜７＞  前記＜５＞及び＜６＞のいずれかに記載のDNAを含むことを特徴とするベクターである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、スーパーオキシド産生酵素として利用可能な高いスーパーオキシド産生能を持つキサンチン酸化還元酵素変異体、該キサンチン酸化還元酵素変異体を製造するために用いることができるDNA及びベクターを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のキサンチン酸化還元酵素（以下「XOR」ということがある）変異体は、キサンチン酸化還元酵素の変異体であって、配列番号１のアミノ酸配列について、334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるキサンチン酸化還元酵素（XOR）変異体を含む。
【００１３】
ここで、変異体とは、野生型酵素に対し、欠失、置換、付加等のアミノ酸変異を有する酵素をいう。
また、配列番号１のアミノ酸配列は、野生型ラットXORのアミノ酸配列を表す（図１−１から図１−４）。また、配列番号１のアミノ酸配列についてX番目とは、配列番号１のポリペプチドのN末端から数えてX番目のアミノ酸（残基）であることを表す。例えば、334番目のアルギニンとは、配列番号１のポリペプチドのN末端から数えて334番目のアミノ酸であるアルギニンを表す。
配列番号１における334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンは、ウシXDH型XORにおいて、相同するアミノ酸がFAD近傍にクラスターを形成していることが知られているアミノ酸である（図２）（前記非特許文献３参照）。即ち、ウシXORのフェニルアラニン549（549番目のフェニルアラニンを意味する、以下同様）（ラットXORのフェニルアラニン549と相同）は、XORの40Kのドメインと85Kのドメインをつなぐリンカーペプチド上のフェニルアラニンであり、該リンカーの位置はXO型とXDH型とで大きく位置移動すると考えられている。このウシXORのフェニルアラニン549とクラスターを形成することが知られているのが、ウシXORのアルギニン335（ラットXORのアルギニン334と相同）と、ウシXORのトリプトファン336(ラットXORのトリプトファン335と相同)と、活性中心ループ上のアルギニンであるウシXORのアルギニン427（ラットXORのアルギニン426と相同）である。それぞれのアミノ酸残基の側鎖は、残基間相互作用により安定化されている。
【００１４】
これに対し、XO型では、リンカー部分の移動によりリンカーペプチド上のフェニルアラニン549（ラットXORのフェニルアラニン549と相同）がアミノ酸クラスターから消失するので、それに伴って上記アミノ酸クラスターの残基間相互作用がなくなり、ウシXORのトリプトファン336（ラットXORのトリプトファン335と相同）の側鎖の配置構造が90度ほど回転し、アルギニン335（ラットXORのアルギニン334と相同）、トリプトファン336（ラットXORのトリプトファン335と相同）及びアルギニン427（ラットXORのアルギニン426と相同）の間隔は広がることが分かっている（図３）。前記トリプトファン336（ラットXORのフェニルアラニン335と相同）の配位の変化が、クラスターの崩壊とそれに伴う活性中心ループの移動を惹起すると考えられている。また、前記３アミノ酸のいずれかを分子間力の少ないアラニンやグルタミンに置換したXOR変異体はDTT処理をしても、XO型の活性を残し、特にウシXORのトリプトファン336を置換した場合（W336A）とウシXORのアルギニン427を置換した場合（R427Q）にXO型の活性が高いという知見が得られている（前記非特許文献３参照）。
【００１５】
なお、前記立体構造の機能への寄与は、XO型ではクラスターの解離に伴いアミノ酸残基間に溶媒が通過できる間隙が生じ、FADへの酸素分子の通路が開くこと。また、XO型では前記活性中心ループがFADのNAD+結合部位を塞ぐ位置にくることであると考察されている。
前記のように、配列番号１における334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンの少なくともいずれかのアミノ酸の置換は、酸素を電子受容体とするXO型活の立体構造を得るための置換であり、置換する他のアミノ酸としては、クラスターを形成しにくい観点から、分子間力の少ないグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン等のアミノ酸が好ましく、立体構造にターンや立体障害等の影響を与えないことも考慮して、アラニンが特に好ましい。
また、配列番号１における334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンのうちの2以上が置換されていてもよい。また、これらのアミノ酸の中では、335番目のトリプトファン及び426番目のアルギニンから選択されるいずれかのアミノ酸の置換が酸素を電子受容体にする活性が強いことから好ましく、335番目のトリプトファンの置換が特に好ましい。
【００１６】
本発明のXOR変異体は、前記変異に加え、立体構造においてFADの近傍に位置するフェニルアラニン、即ち、配列番号１のラットRXORにおいては336番目のフェニルアラニンに変異を導入することによって、顕著に高いスーパーオキシド産生比を実現した。
例えば、配列番号１において、前記XO型の立体構造を得るための変異の一態様であるトリプトファン335のアラニンへの置換に加えて、フェニルアラニン336をロイシンへ置換したXOR変異体(F336L＋W335A)を作製したところ、DTT処理の有無に関わらず酸素を電子受容体とし、スーパーオキシド生成比はDTT処理酵素で74.4±1.2%、DTT無処理酵素で74.5±1.2%であった。また、生成するスーパーオキシドの絶対生成量も多かった。これは、前記フェニルアラニンの側鎖が変わることによって、FADの電子状態が変化したことによると考えられる。このF336L＋W335Aに代表されるXOR変異体は、酵素周囲の環境に関わらず、常に酸素を電子受容体とし、天然XORに比べてスーパーオキシドを多く生成をする性質を有する。置換する他のアミノ酸としては、フェニルアラニン以外のアミノ酸であれば得に制限はないが、FADの電子状態への影響の観点から芳香族アミノ酸ではないアミノ酸（非芳香族アミノ酸）が好ましい。非芳香族アミノ酸はとしては、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、ロイシン等が特に好ましい。
【００１７】
本発明のXOR変異体は、哺乳動物のXORのアミノ酸配列について、前記（ａ）における置換と相同の置換を有するアミノ酸配列からなるXOR変異体を含む。すなわち、前記（ａ）でラットのXORを配列番号１として挙げたのは、変異の位置を特定するための例示に過ぎず、これと相同の置換変異を有する哺乳動物のXORは、すべて本発明に含まれる。図１において明らかなように、哺乳動物のXORは一次構造において相同性が高く、これまでの種々の研究から、機能についても極めて高い共通性が認められており、立体構造も同様と考えられている（Hille.R.  and  Nishino.T.  FASEB  J.9,995-1003,1995）。また、本発明に導入される変異の周辺領域のアミノ酸配列も非常によく保存されている。
【００１８】
ここで、哺乳動物XORとしては、ラットXOR（配列番号１）、ヒトXOR（配列番号２）、ウシXOR（配列番号３）、ニワトリXOR（配列番号４）及びマウスXOR（配列番号５）が代表的に挙げられるが、これに限定されるものではない。また、「前記（ａ）における置換と相同の置換を有する」とは、前記（ａ）における置換と相同の位置において同様の置換を有することをいう。例えば、ヒトXORにおいて、ラットXORにおけるフェニルアラニン336のロイシンへの置換と相同の置換とは、フェニルアラニン337のロイシンへの置換を表す（図１−１から図１−４参照）。
【００１９】
また、本発明のXOR変異体は、前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかに記載のXOR変異体のアミノ酸配列について、さらに、１若しくは複数、好ましくは１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スーバーオキシド産生活性を有するXOR変異体を含む。XORについては、これまでに蓄積された多くの公知の知見があることから、機能上重要なアミノ酸や、変更しても機能に比較的影響が少ないアミノ酸がある程度明らかになっている。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかに記載のXOR変異体について、機能に比較的影響が少ないアミノ酸を改変して用いることもできる。このようなXOR変異体も野生型XORよりも高いスーバーオキシド産生活性がある限り本発明に含まれる。
スーパーオキシド産生活性は、還元型チトクロームC（CytC）の生成量から測定できる。即ち、XORがキサンチンから2個の電子を受け取り、酸素分子へ1個の電子を渡すとスーパーオキシドが生成するが、生成したスーパーオキシドはCytCに電子1個を渡すことで、CytCは還元型CytCとなる。この還元型CytCの生成量は550nmの吸光度の変化で測定データより算出できる。また、スーパーオキシドを不均化する酵素として知られるスーパーオキシドディスムターゼ（SOD）を、CytCの還元が十分に認められる時間で添加し、その還元が完全に止まることを確認することで、還元型CytCの生成はスーパーオキシドの生成に伴って起こることが実証できる。
【００２０】
本発明のDNAは、前記本発明のXOR変異体をコードするDNAであれば、特に制限はない。
Rattus  norvegicusのXORである配列番号１のアミノ酸配列について、334番目のアルギニン、335番目のトリプトファン、426番目のアルギニン及び549番目のフェニルアラニンから選択される少なくともいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されており、かつ、336番目のフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるXOR変異体をコードするDNAとしては、Rattus  norvegicus  XORのcDNA（（図４、配列番号６の塩基配列について、前記アミノ酸置換箇所のアミノ酸の変異に対応する塩基配列の変異を導入したDNAが挙げられ、縮退したコドンを有していてもよい。また、Rattus  norvegicus以外のすべての哺乳動物のXORのアミノ酸配列について、前記（ａ）と相同の置換を有するアミノ酸配列からなるXOR変異体をコードするDNAとしては、例えば、ヒトXORのcDNA（図５、配列番号７）、ウシXORのcDNA（図６、配列番号８）、ニワトリXORのcDNA（図７、配列番号９）及びマウスXORのcDNA（図８、配列番号１０）において、前記XOR変異体において述べたアミノ酸の変異に対応する塩基配列の変異を導入したcDNA等が挙げられる。さらに、これらのDNAの塩基配列について、さらに、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列をコードし、かつ、スーバーオキシド産生活性を有するXOR変異体をコードするよう、インフレームで塩基配列の変異を導入したDNAも含まれる。
【００２１】
更に好ましくは、前記cDNAにおいて、例えば図４から８に記載の下線部の6個の塩基を、アラニン（A）ロイシン（L）をコードする塩基に置換したcDNA（これは、例えばラットにおいてはF336L＋W335Aに対応）が挙げられる。このときアラニン（A）をコードする塩基配列が4通り（GCT、GCC、GCA、GCG）、ロイシン（L）をコードする塩基配列が6通り（TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG）あるので、ALをコードする塩基配列の組み合わせは24通りあり、どのような組み合わせであってもよい。また、変異部分以外が縮退するコードを有するものであってもよい。
また、本発明のDNAは、前述のDNAの塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであってもよい。
【００２２】
本発明のベクターは、前記DNAを含むこと以外特に制限はなく、公知のベクターに公知の方法で前記DNAを導入することにより作製することができる。前記ベクターとしては、酵素の大量合成用のバキュロウイルスベクター等であってもよいし、医療用の非ウイルスベクターや、アデノウイルス、レトロウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターであってもよい。酵素の大量合成用ベクターは、前記XOR変異体の合成に用いることができる。また、医療用ベクターは、細胞又は生体内の癌組織等の特定部位において前記酵素を発現させることによって、癌治療等への臨床応用が考えられる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２４】
＜XOR変異体の作製＞
ラットXOR（RXOR）に関し、RXORcDNAへの部位特異的変異の導入は、以下のように行った。RXORのアミノ酸コード領域から数えて1003番目から1006番目の塩基配列TGGTをGCGCに変えるようなプライマーである、W335A＋F336L-FW(GGA  GCA  GCT  GCG  CGC  GCT  TGC  CGG  CAA  GCA  GG（配列番号１１）)とW335A＋F336L-RV(CCT  GCT  TGC  CGG  CAA  GCG  CGC  GCA  GCT  GCT  CC（配列番号１２）)とを合成した。このプライマーと鋳型となる完全長RXORcDNAを含むpBluescriptベクター(STRATAGENE)、Quikchange  site-Directed  mutagenesis  kit((STRATAGENE社、カタログ番号200518-5  Lot  0830552)を用いて、添付のプロトコールに従って変異を導入した。
また、導入した変異の確認は、BigDye  Terminator  v1.1  Cycle  Sequencing  kit(Applied  Biosystems、カタログ番号4336774  Lot  0305014)を用いて、付属のプロトコールに従って、シークエンサー(ABI  PRISM310  Genetic  Analyzer、PERKIN  ELMER社)にて解析した。その結果、RXORのアミノ酸コード領域から数えて1003番目から1006番目の塩基配列TGGTをGCGC目的とする変異が入った完全長RXORcDNAが得られた。
【００２５】
次に、ウイルス作製用ベクターを以下のように作製した。バキュロウイルスへの遺伝子導入には、pJV(NheI)ベクターを元に作製されたpJVP10Zベクターを用いた(Vialard.J.,  Lalumiere.M.,  Vernet.T.,  Briedis.D.,  Alkhatib.G.,  Henning.D.,  Levin.D.,  Richaedson.C.(1990)  J.Virol.  64,37-50,  Synthesis  of  the  membrane  fusion  and  hemagglutinin  proteins  of  measles  virus,  using  a  novel  baculovirus  vector  containing  the  beta-galactosidase  gene.)。ベクターのNheIサイトに完全長のRXOR  W335A＋F336L遺伝子を導入し、pJVP10Z-RXDH  W335A＋F336Lを作製した。NheIは、NewEngland  BIOLABS社、カタログ番号  R0131L  Lot25を用いた。そしてpJVP10Z-RXDH  W335A＋F336Lを用いて、以下のように昆虫細胞(Sf9細胞)を用いたRXOR  W335A＋F336L遺伝子の組換えウイルスの作製を行った。
【００２６】
組換えウイルスの作製はBacVector-2000  transfection  kit(Novagen社、カタログ番号70058-3  Lot  N37172)を用いて、付属のプロトコールに従って行った。一部、プロトコールを改変し、プロトコールではBacVector  Insect  Cell  Mediumを用いているのをグレース培地（Grace’s  Insect  Cell  Culture  Medium  (INVITROGEN)  11300-027  Lot  1184871）に、1時間放置するところをシーソー型シェイカーにて5時間、穏やかに振とうし、BacVector  Insect  Cell  Mediumを6ml添加するところをSf9培地(グレース培地1本/L、ラクトアルブミン水解物（Lactalubumin  enzymatic  hydrolysate、SIGMA社  カタログ番号  L9010  Lot  051K1260）0.264mg/ml、イーストレート（BactoTM  TC  Yeastolate、Becton  Dickinson  社、カタログ番号255772  Lot  3057970）0.264mg/ml、炭酸水素ナトリウム（Sodium  Bicarbonate、INVITROGEN社、11810-025  Lot  1024296）0.27mg/ml、ゲンタマイシン（Gentamicin  Sulfate、Wako社、077-02974  Lot  ASK7138）50μg/ml、8vol/vol%  ウシ胎仔血清（Foetal  Bovine  Serum、SIGMA社、F3297  Lot  80K23831）、20vol/vol%  Sf-900IISFM（INVITROGEN社、10902-088  Lot  1182700）を混合し、3M水酸化ナトリウム溶液（Sodium  Hydroxide、Wako社、197-02125  Lot  LDM3934にてpH6.1に調製)1mlを添加した。組換えバキュロウイルスの純化は、用いる培地中のウシ胎仔血清を5vol/vol%からvol/vol%にした点、Bac  plaque  agaroseをシープラークアガロース（SeaPlaque  Agarose、FMC  BioProducts社、カタログ番号50102  Lot620995）にした点の2点で改変したが、それ以外はBacVector-2000  transfection  kit付属のプロトコールに従って行った。
【００２７】
また、目的の組換えウイルスの選別は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド(以下X-gal、Wako社、カタログ番号027-07854  Lot  SEJ7995)を用いて以下のように行った。
即ち、相同組換えによってRXDH  W335A＋F336L遺伝子がバキュロウイルスに導入され、発現した場合、pJVP10Zベクターに含まれるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子も発現することになることを利用し、この酵素の基質であるX-gal添加することで、目的のウイルスが存在する場所が青色のプラークとなって検出できる。できたウイルスを2回純化し、ウイルスによる発現プラークが青色を示したウイルス5種(ウイルスNo.1-1、2-1、5-1、4-1、9-1)が得られた。
【００２８】
次に、この5種のウイルスを用いて、BacVector-2000  transfection  kit付属のプロトコールに従って2回のウイルスの増幅を行った。2回目のウイルスの増幅で得られた上清をウイルス液として回収し、さらに残った細胞も回収した。そしてこの細胞を使ってRXORXOR変異体の蛋白質発現を以下のように確認した。まず、ドデシル硫酸ナトリウム(以下SDS)-ポリアクリルアミド電気泳動（以下SDS-PAGE）は、10%ポリアクリルアミドゲルを用いてLaemmliの方法（Laemmli.U.K.  (1970)  ,Nature  227,  680-685  ,Cleavage  fo  structural  proteins  during  the  assembly  of  the  head  of  bacteriophage  T4.）に従って行った。2回目のウイルス増幅で回収した細胞の一部に２倍希釈のサンプル緩衝液[125mM  トリス-塩酸、pH6.8（トリス：  2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol  999  Ultra、Wako社  カタログ番号  016-18313  Lot  PKK  0775、塩酸：  Hydrochloric  Acid、Wako社、カタログ番号  083-03435  Lot  TCJ7350）、4%（g/100ml）SDS（Sodium  Dodecylsulfate、Wako社、カタログ番号、191-07145  Lot  DWH6885）、20vol/vol%グリセロール（Glycerol、シグマアルドリッチジャパン株式会社、カタログ番号12-1120-5）、10vol/vol%  2-メルカプトエタノール（2-Mercaptoethanol、KANTO  CHEMICAL  CO.INC、カタログ番号  25099-00  Lot  105B4121）、0.04%（g/100ml）ブロモフェノールブルー溶液（Bromophenol  Blue、Nacalai  tesque社、カタログ番号  058-08  Lot  M8K9720）]を添加し、100度10分間の熱処理を行った後、電気泳動に用いた。
【００２９】
また、ウエスタンブロッティングはHiranoらの方法（Hirano.H.,(1989)  J  Protein  Chem.  8,  115-30  ,Microsequence  analysis  of  winged  bean  seed  proteins  electoroblotted  from  two-dimensional  gel.)に従って行った。まず、SDS-PAGEにて分子量ごとに分離した後、それをPVDF膜（Fluorotrans  membrane  、Nippon  Genetics  Co.,  Ltd.、カタログ番号  PVM020C3R  Lot  042342）に転写した。この膜を目的の蛋白質(ここではRXOR)をウサギに免役して作製した抗体(一次抗体)で処理した。次いで、ウサギの血清をヤギに免役して得られた抗体をペルオキシダーゼ標識したもの(二次抗体)（Peroxidase-conjugated  goat  IgG  fraction  to  Rabbit  IgG、CAPPEL社、カタログ番号  55676  Lot  01708）で処理した。さらにPOD  immunostain  kit（POD  Immunostain  Set、Wako社、カタログ番号299-18841  Lot  HNF2964）を用いて、ペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素を利用して、目的蛋白質のある場所にホルマザンの色素沈着を起こさせて検出した。なお、SDS-PAGEでは二量体を形成しているRXDHを2つの単量体に切断するため、300kDaのホモ二量体であるRXDHは150kDaの2つの単量体となって検出される。
実際に、このウエスタンブロッティングによって、150kDaの位置にRXDH  W335A＋F336Lタンパク質の発現を確認した。その結果、ウイルスNo.1-1より回収した細胞中に最も多くRXDH  W335A＋F336Lの蛋白質発現がみられた(図９)。図９中左側のセットは、CBBによるタンパク質染色の結果を表し、右側のセットは、ウエスタンブロッティングの結果を表す。したがって、このウイルスを今後の実験に用いることに決め、数回のウイルスの増幅を行い、RXOR  F336L＋W335Aの大量発現に用いた。
【００３０】
＜XOR変異体の発現と精製＞
変異酵素の大量発現及び精製は既に確立された公知の手法に従って行った（Nishino.T.,Amaya.Y.,Kawamoto.S.,Kashima.Y.,Okamoto.K.,Nishino.T.  (2002),  J.Biochem.132,  597-606,  Purification  and  characterization  of  multiple  forms  of  rat  liver  xanthine  oxidoreductase  expressed  in  baculovirus-insect  cell  system.）。
簡単に説明すると、RXOR  W335A＋F336L変異蛋白質の大量発現は、15mlの培地に約9×108個の細胞を懸濁したものを１Lスピナーフラスコへ入れた後、ウイルス溶液を加えて27℃で1時間、静置感染させた。次に、このフラスコに総計300mlとなるように培地を加えた後、サプリメント[5.7μMリボフラビン（Riboflavin、SIGMA社、R-9504  Lot97H0433）、10μMグアノシン（Guanosine、ヤマサ醤油株式会社）、500μMモリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物（Disodium  Molybdate(VI)  Dihydrate、Wako社  カタログ番号198-02471  Lot  WAG  3405）、400μM硫酸鉄(II)七水和物（Iron(II)  Sulfate  Heptahydrate、Wako社  カタログ番号098-01085  Lot  SKF  2301）、10vol/vol%ウシ胎仔血清(FBS)]を加え、27℃で48時間培養した。
また、精製はリン酸カルシウムカラム（Macro-Prep  Ceramic  Hydroxyapatite  TYPE  I  40μm  BIO-RAD社、カタログ番号  157-0040）を用いて行った。
【００３１】
リン酸カルシウムカラムで得られた活性部分を濃縮し、50mMリン酸緩衝液（1）（0.4mM  EDTA（2NA(EDTA・2Na)  同仁化学研究所  カタログ番号345-01865  Lot  NH023）を含む50mMリン酸緩衝液  pH7.4  [次の試薬より調製：  リン酸水素一ナトリウム  （Disodium  Hydrogenphosphete  12-water、  Wako社、カタログ番号196-02835  Lot  PKL  3187）、リン酸水素二ナトリウム  （Sodium  Dihydrogenphosphete  Dihydrate、Wako社、192-02815  Lot  PKK  3344]にて緩衝液を交換した後、あらかじめリン酸緩衝液（2）で平衡化しておいた葉酸アフィニティーカラム(Ikegami.T.,Nishino.T.(1986),  Archives  of  Biochemistry  and  Biophysics,  The  presence  of  desulfo  xanthine  dehydrogenase  in  purified  and  crude  enzyme  preparations  from  rat  liver.)にて活性部分を分離した。ここでいう葉酸アフィニティーカラムは、RXORの補欠分子族であるモリブドプテリンに特異的に結合する葉酸を用いて作製した単体を充填したカラムを指す。酵素中にモリブドプテリンが結合していない酵素(活性を持たない)はこの単体に結合できないが、酵素中にモリブドプテリンを結合している酵素(活性を持つ)は結合できるため、この2つを分離するために用いる。葉酸アフィニティーカラムの洗浄にはＡ緩衝液（15%（g/100ml）のEDTAを含むピロリン酸緩衝液pH8.5(Sodium  Diphosphate  Decahydrate、Wako社  195-03025  Lot  PKP  2286)、85vol/vol%の0.4mM  EDTAを含む50mMリン酸緩衝液  pH7.4）を用い、溶出には10mMサリチル酸（Sodium  Salicylate、Wako社、カタログ番号  195-03145  Lot  SDG  4081）を含むＡ緩衝液を用いた。そして濃縮した後、450nmの吸収が0.1となるように50mMリン酸緩衝液（1）にて希釈した。
【００３２】
なお、RXORは精製過程における空気酸化によって、XO型に変換する。従って、XDH型酵素の活性測定を行うためには、精製した酵素を還元剤であるDTT（(±)-Dithiothreitol、Wako社、カタログ番号049-08972  Lot  PKH  7746）で処理する必要がある。そこで450nmの吸収が0.1となるように調製したXO型酵素(DTT無処理酵素)に最終濃度5mMとなるようにDTTを加え、25℃、60分の処理を行ったものをDTT処理酵素とした。また、酵素がこのDTT処理によって切断されていないこと等を確認するため、このDTT処理酵素とDTT無処理酵素の両方を用いて、10%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを行った。DTT無処理酵素またはDTT処理酵素は適量の2×サンプル緩衝液を添加し、100度10分間の熱処理を行った後、SDS-PAGEを行った。その結果、どちらの酵素も150kDaの位置に単一のバンドが認められた(図１０)。このことから、この実験に用いた酵素は、完全に精製されていること、精製過程において蛋白質分解酵素による部分的な分解を受けていないこと、DTT処理による部分的な分解も受けていないことがわかった。
【００３３】
＜XOR変異体が持つ機能の測定＞
DTT処理酵素とDTT無処理酵素の各活性測定は以下のように行った。
（実験１）
DTT処理酵素またはDTT無処理酵素において、キサンチン（Xanthine(2,6-Dihydroxypurine)、SIGMA社、カタログ番号  X-4002  Lot  80K5314）を電子供与体とし、(1)電子受容体を酸素とした場合(X-O2)の295nmの吸光度の変化(X-O2Δ295、尿酸生成量)、(2)電子受容体を酸素とNAD（β-Nicotinamide  Adenine  Dinucleotide、SIGMA社、カタログ番号  N-6522  Lot  69H7008）とした場合(X-NAD)の  295nmの吸光度の変化(X-NADΔ295、尿酸生成量)、(3)電子受容体を酸素とアセチルピリジン(3-Acetylpyridine  Adenine  Dinucleotide（以下ACPY）、SIGMA社  カタログ番号  A-5251  Lot  21K7042)とした場合(X-ACPY)の  295nmの吸光度の変化(X-ACPYΔ295、尿酸生成量)を測定した。さらに、(4)X-NADにおける340nmの吸光度の変化(X-NADΔ340、還元型NAD  (NADH)生成量)、(5)X-ACPYにおける360nmの吸光度の変化(X-ACPYΔ360、還元型ACPY生成量)も測定した。なお、Δの後の数字は、吸光度変化を測定するために用いた波長を示す。また、ここで用いた溶液は以下のように調製した。
(1)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.885μl
(2)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.875μl、50mM  NAD  10μl
(3)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.875μl、30mM  ACPY  10μl
(4)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.875μl、50mM  NAD  10μl
(5)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.875μl、30mM  ACPY  10μl
【００３４】
活性測定は25℃で行い、酵素10μlを添加することで反応を開始した。295nmの変化は尿酸の生成量に対応し、340nmの変化はNADHの生成量に対応し、360nmの変化は還元型ACPYの生成量に対応する。したがって、前記(1)〜(5)の溶液を用いた実験によって以下のデータが得られた。
(1)X-O2Δ295：
酸素のみを電子受容体とした場合の１分間あたりの295nmの変化(尿酸生成量)
(2)X-NADΔ295：
酸素とNADを電子受容体とした場合の１分間あたりの295nmの変化(尿酸生成量)
(3)X-ACPYΔ295：
酸素とACPYを電子受容体とした場合の１分間あたりの295nmの変化(尿酸生成量)
(4)X-NADΔ340：
酸素とNADを電子受容体とした場合の１分間あたりの340nmの変化(NADH生成量)
(5)X-ACPYΔ360：
酸素とACPYを電子受容体とした場合の１分間あたりの360nmの変化(還元型ACPY生成量)
【００３５】
一方、均一な物質が溶液に溶けている場合、その物質の持つ特定の波長の吸光度はその物質の濃度に比例する。そのため、既にモル吸光係数が知られている物質においては、その物質が試料中に均一に溶けている場合、その吸光度を測定すれば、その溶液中の物質の濃度がわかる。尿酸の295nmにおけるミリモル吸光係数は9.6、NADH(還元型NAD)の340nmにおけるミリモル吸光係数は6.22、ACPH(還元型ACPY)の360nmにおけるミリモル吸光係数は9.1、還元型チトクロームC（CytC）の550nmにおけるミリモル吸光係数は21、RXDHの450nmにおけるミリモル吸光係数は35.8である。この各生成物のミリモル吸光係数と、(1)〜(5)の実験によって得られたデータとより以下の値を算出した。
【００３６】
X-O2Δ295の1分間あたりの尿酸の比活性（酸素のみを電子受容体とした場合の比活性）：  RXORの450nmにおけるミリモル吸光係数は35.8、使用した酵素の450nmの吸光度は0.1であるので今回測定に用いた酵素液には0.1÷35.8mmol/Lの酵素がある。また、尿酸の295nmにおけるミリモル吸光係数は9.6であるので、酵素反応液中で生成した尿酸はX-O2Δ295/分×1/9.6ミリモルであるこの酵素反応液は総計1mlでその中に酵素液を10μl入れているので、(X-O2Δ295/分×1/9.6)×1000/10これが0.1÷35.8mmol/Lの酵素によって生成される尿酸量となる。従って、X-O2Δ295の1分間あたりの尿酸の比活性は、
(X-O2Δ295/分×1/9.6)×1000/10÷0.1÷35.8
によって算出される。なお、ここで言う比活性は、代謝回転数(ターンオーバーナンバー)として表す。単位時間あたりに1モルの酵素から生成される各生成物のモル数を意味する。
【００３７】
同様にして、NADH(還元型NAD)の340nmにおけるミリモル吸光係数が6.22、ACPH(還元型ACPY)の360nmにおけるミリモル吸光係数が9.1であることから以下の比活性を算出する。
X-NADΔ295の比活性（酸素とNADを電子受容体とした場合の1分間あたりの尿酸の比活性）
X-ACPYΔ295の比活性（酸素とACPYを電子受容体とした場合の1分間あたりの尿酸の比活性）
X-ACPYΔ340の比活性（酸素とNADを電子受容体とした場合の1分間あたりのNADHの比活性）
X-ACPYΔ360の比活性（酸素とACPYを電子受容体とした場合の1分間あたりの還元型ACPYの比活性）
これらの結果を図１１に示す。変異体酵素は、DTT処理酵素でX-O2Δ295(3回の測定の平均値)が336、X-NADΔ295が310であり、DTT無処理酵素でX-O2Δ295(3回の測定の平均値)が430、X-NADΔ295が429であった。これに対して、天然XORはXDH型（DTT処理酵素）でX-O2Δ295が93、X-NADΔ295が608であり、XO型（DTT無処理酵素）でX-O2Δ295が940、X-NADΔ295が850である(非特許文献２参照)。つまり、天然XORはXDH型（DTT処理酵素）で存在すると電子は主にNADへと渡り、XO型（DTT無処理酵素）で存在すると電子は主に酸素へと渡ることがわかる。これに対して、この変異体酵素はDTT処理酵素でもDTT無処理酵素でも、電子は主に酸素へと渡ることがわかった。これは、X-NADΔ340から得られる比活性がDTT処理酵素で20.7、DTT無処理酵素で2.2であり、これは、それぞれ尿酸の比活性の6.1%と、0.5%にあたることからも裏付けられる。
【００３８】
次に、このXOR変異体がNADを電子受容体にできない原因が、酸化還元電位の上昇によって起こっている可能性を考え、NADよりも酸化還元電位が高く、NADの類似物質として知られるACPYを用いた。その結果、X-ACPYΔ360はDTT無処理酵素で39.3、DTT無処理酵素で0であり、これは尿酸の比活性の12%と、0%にあたる。したがって、この変異体酵素はNADと同様にACPYも主な電子受容体とならないことがわかった。
【００３９】
（実験２）
次に、スーパーオキシド絶対生成量とスーパーオキシド生成比を算出するための実験を行った。ここでのスーパーオキシド生成比は、キサンチンからXORへと渡った電子が、酸素分子にどれだけスーパーオキシド生成として渡ったかを百分率で示したものである。XORがキサンチンから2個の電子を受け取り、酸素分子へ1個の電子を渡すとスーパーオキシドが生成する。そして、生成したスーパーオキシドはCytCに電子1個を渡すことで、CytCは還元型CytCとなる。この還元型CytCの生成量は550nmの吸光度の変化で測定データより算出できる。また、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）はスーパーオキシドを不均化する酵素として知られる。CytCの還元が十分に認められる時間でSODを添加し、その還元が完全に止まることを確認することで、還元型CytCの生成はスーパーオキシドの生成に伴って起こることがわかり、還元型CytCの生成量からスーパーオキシドの生成量が算出できる。
【００４０】
DTT処理酵素またはDTT無処理酵素において、酸素を電子受容体とした場合の295nm(X-O2Δ295)の吸光度の変化を測定し、それに依存したスーパーオキシド生成量を550nm(X-CytCΔ550、還元型チトクロームC（Cytochrome  C  from  Horse  Heart、SIGMA社、カタログ番号C-7752  Lot  80k7042）の特異波長)の吸光度の変化にて還元型CytCを測定することで算出した。測定法に関しては、前述の非特許文献２に詳述されている。
【００４１】
溶液は以下のように調製した。
(1)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.885μl
(2)  500mMリン酸緩衝液  pH7.8  100μl、10mMキサンチン  15μl、D.W.865μl、20mM  CytC  20μl
(2)の場合については、活性が十分に認められる時間でスーパーオキシドディスムターゼ  (以下SOD、Superoxide  Dismutase  from  Bovine  Liver、SIGMA社、カタログ番号  S-8160  Lot  111K7037)を添加することにより、CytCの還元が100%失われることを確かめた。
(1)〜(2)の実験によって以下のデータが得られる。
(1)X-O2Δ295（酸素のみを電子受容体とした場合の１分間あたりの295nmの変化）
(2)X-CytCΔ550（酸素を電子受容体とした場合の１分間あたりの還元型CytCの変化(還元型CytCの生成量)）
(1)〜(2)の実験によって得られたデータと各生成物のミリモル吸光係数より、既述の方にて以下の値を算出する(還元型CytCの550nmのミリモル吸光係数は21である)。
X-O2Δ295の比活性（酸素のみを電子受容体とした場合の1分間あたりの尿酸の比活性）
X-CytCΔ550の比活性（酸素を電子受容体とした場合の1分間あたりの還元型CytCの比活性）
これらの値をもとにスーパーオキシド生成比の算出する。すなわち、尿酸は2電子が与えられてできるのに対し、還元型CytCは1電子が与えられてできるため、尿酸を生成する酵素の比活性を倍にした値で、還元型CytCを生成する酵素の比活性を割ることで、この値を算出できる。
【００４２】
各比活性を算出すると、RXDH  F336L＋W335A変異体酵素ではDTT処理酵素でX-O2Δ295が335.6、320.7、350.5、X-CytCΔ550が485.9、491.0、523.4であった。さらに、DTT無処理酵素でX-O2Δ295が428.9、447.5、413.9、X-CytCΔ550が629.1、654.6、635.9であった。そして、それぞれ3回ずつとったこのデータを3つのペアにしてスーパーオキシド生成比を算出した。その結果、DTT処理酵素のスーパーオキシド生成比は72.4%、76.5%、74.7%(74.4±1.2%)であり、DTT無処理酵素のスーパーオキシド生成比は73.3%、73.1%、76.8%(74.5±1.2%)であった(図１１下表)。これに対して天然XORの各比活性は、XDH型でX-O2Δ295が93、X-CytCΔ550が63であり、XO型でX-O2Δ295が940、X-CytCΔ550が290である(前記非特許文献２参照)。つまり、天然XORのスーパーオキシド生成比は、XDH型で34%、XO型で15%となる。しかし生理的には、生体内でXORはXDH型として存在するため、生体内のNADと優先的に反応する。そのため、酸素とは反応せず、スーパーオキシドや過酸化水素も産生することはない。それに対して、このXOR変異体はDTT処理の有無に関わらず、酸素への電子の授受比からみてスーパーオキシドの産生が高いことがわかった。さらに、スーパーオキシドの絶対生成量も、このXOR変異体は天然XORに比べてXDH型で8倍、XO型で1.5倍と多い。
【００４３】
以上のことから、RXDH  F336L＋W335AXOR変異体は酵素周囲の環境に関わらず、常に酸素を電子受容体とし、天然XORに比べてスーパーオキシドを多く生成をする性質を有することがわかった。また、本発明のXOR変異体は、アミノ酸配列の変異によるものであるため、酸化等の化学修飾されたXO型XORのように、還元等により元に戻ることがなく、環境を選ばずスーバーオキシドの産生が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のキサンチン酸化還元酵素変異体は、スーパーオキシド産生酵素として研究用試薬および医療用組成物として利用可能であり、本発明のDNA、それを含むベクターは前記スーパーオキシド産生酵素の工業的製造、研究用試薬および医療用組成物として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１−１】図１−１は、哺乳動物XORの比較配列図である。
【図１−２】図１−２は、哺乳動物XORの比較配列図である（続き）。
【図１−３】図１−３は、哺乳動物XORの比較配列図である（続き）。
【図１−４】図１−４は、哺乳動物XORの比較配列図である（続き）。
【図２】図２は、XORのXO型及びXDH型の活性に関与するクラスターを表す図である。
【図３】図３は、XDHとXO間でのクラスターの構造変化を表す図である。
【図４】図４は、ラットXORのアミノ酸配列を表す。
【図５】図５は、ヒトXORのアミノ酸配列を表す。
【図６】図６は、ウシXORのアミノ酸配列を表す。
【図７】図７は、ニワトリXORのアミノ酸配列を表す。
【図８】図８は、マウスXORのアミノ酸配列を表す。
【図９】図９は、RXDH  W335A＋F336Lタンパク質の発現確認を表す図である。
【図１０】図１０は、SDS−PAGEの結果を表す図である。
【図１１】図１１は、XORの活性測定の結果を表す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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