(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト免疫不全ウイルスに対し、より強化された親和性、特異性および中和能をもつヒトモノクローナル抗体の提供。【解決手段】ランダム変異を誘発する合成法を用いて合成ヒトモノクローナル抗体を得た。該抗体はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と免疫反応し、かつこれを中和する。該合成ヒトモノクローナル抗体は、ｇｐ１２０に対して高い結合アフィニティーおよび中和能力を示した。さらに、該モノクローナル抗体を使用した免疫療法および診断法、並びに該モノクローナル抗体を製造する細胞系をも開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と免疫反応し、かつこれを中和することのできる合成ヒトモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、インビトロでのウイルス感染性アッセイにおいて、ＨＩＶ感染性力価を、１００ｎｇ／ｍｌ未満の抗体濃度において５０％減ずる能力を有することを特徴とする、上記ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
該抗体濃度が２０ｎｇ／ｍｌ未満である、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
該抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌ未満である、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
該ＨＩＶが予め選択された一次ＨＩＶ株であり、該モノクローナル抗体がＨＩＶの二次フィールド株の該ＨＩＶ感染性力価を、１０ｎｇ／ｍｌ未満の抗体濃度において５０％減ずる能力を有する、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
該抗体がＦａｂフラグメントである請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
該抗体が、配列番号：２、３、４および５、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
該モノクローナル抗体が、配列番号：２：６、３：６、４：６および５：６、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項８】
該モノクローナル抗体が、解離定数（Ｋｄ）約１×１０−８Ｍ以下で、ＨＩＶｇｐ１２０と免疫反応する、請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
該抗体が、配列番号：１、３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、８９、９０、９１および９２、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１０】
該抗体が、配列番号：６、６９、７０、７３、７５、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７および８８、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
該解離定数が約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍである請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
該モノクローナル抗体が、配列番号：３：６、３：６９、３：７０、３：７３、３：７５、３：７６、３：７７、３：７９、３：８０、３：８２、３：８３、３：８４、３：８７、５４：６、５５：６、５６：６、５７：６、５８：６、５９：６、９０：８８、９１：６、９１：８８および９２：８８、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第１１項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
該解離定数が約１×１０−１０Ｍ〜約１×１０−１１Ｍである請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
該モノクローナル抗体が、配列番号：３：８５、３：８６、８９：６および９０：８６、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第１３項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
該解離定数が約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−１２Ｍである請求の範囲第８項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
該モノクローナル抗体が、対として、配列番号：８９：８８で示される重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列、およびその保存性置換体を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第１５項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１７】
該抗体が、ＡＴＣＣ承認番号６９６９１中に含まれるプラスミドｐＰｈｏ−Ｈ３１／Ｌ４２−１によって生成されるモノクローナル抗体の結合特異性をもつ、請求の範囲第１６項に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質ｇｐ１２０と免疫反応し、かつＨＩＶを中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該モノクローナル抗体が、配列番号：１、２、３、４、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、８９、９０、９１および９２、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配列、又はこれに相補的なポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質ｇｐ１２０と免疫反応し、かつＨＩＶを中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該モノクローナル抗体が、配列番号：６、６９、７０、７３、７５、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７および８８、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配列、又はこれに相補的なポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖タンパク質ｇｐ１２０と免疫反応し、かつＨＩＶを中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該モノクローナル抗体が、配列番号：２：６、３：６、４：６、５：６、３：６９、３：７０、３：７３、３：７５、３：７６、３：７７、３：７９、３：８０、３：８２、３：８３、３：８４、３：８５、３：８６、３：８７、５４：６、５５：６、５６：６、５７：６、５８：６、５９：６、８９：６、８９：８８、９０：８６、９０：８８、９１：６、９１：８８および９２：８８、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配列、又はこれに相補的なポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
請求の範囲第１８、１９または２０項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２２】
請求の範囲第１８、１９または２０項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むものと推定されるサンプルを、診断上有効な量の請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程と、該モノクローナル抗体が該サンプルと反応するか否かを決定する工程とを含むことを特徴とする、ＨＩＶを検出する方法。
【請求項２４】
該検出がインビボで行われる、請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２５】
該モノクローナル抗体が、放射性同位元素および常磁性ラベルからなる群から選ばれるラベルによって、検出可能に標識されている、請求の範囲第２４項に記載の方法。
【請求項２６】
該検出がインビトロで行われる、請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２７】
該モノクローナル抗体が、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、化学発光化合物、生物発光化合物、および酵素からなる群から選ばれるラベルによって、検出可能に標識されている、請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
該モノクローナル抗体が、固体相に結合する、請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患に対する受動免疫治療を与える方法であって、該ヒトに免疫治療上有効な量の、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
該受動免疫治療が、予防の目的で与えられる、請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３１】
該投与が非経口投与である、請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３２】
該非経口投与が、皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮、または血管内による投与である、請求の範囲第３１項に記載の方法。
【請求項３３】
該非経口投与が、穏やかな灌流による投与である、請求の範囲第３１項に記載の方法。
【請求項３４】
該穏やかな灌流が、血管内または蠕動手段により行われる、請求の範囲第３３項に記載の方法。
【請求項３５】
該免疫療法上有効な量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇである、請求の範囲第２９項に記載の方法。
【請求項３６】
ヒトに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患に対する活性な免疫治療を誘発する方法であって、該ヒトに免疫原的に有効な量の、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
免疫療法上有効な量の請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を、少なくとも１単位投与量で、薬理学的担体中に含有することを特徴とする薬理組成物。
【請求項３８】
該組成物が２種以上の異なるモノクローナル抗体を含む、請求の範囲第３７項に記載の薬理組成物。
【請求項３９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むと推定される源中のＨＩＶを検出するのに有用なキットであって、請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を含有する１個の容器を含む、１またはそれ以上の容器を厳密な拘束状態で受け取るように区分されている、担体手段を含むことを特徴とするキット。
【請求項４０】
合成ヒト抗−ＨＩＶモノクローナル抗体の製法であって、
ａ）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインをもつヒトモノクローナル抗体をコードする、糸状ファージのゲノムを調製する工程と、ここで該重鎖可変ドメインは、糸状ファージ膜の固定ドメインを含む融合ポリペプチドとして存在し、該モノクローナル抗体はＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０と免疫反応する、
ｂ）該調製したゲノム中に存在する、該免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を突然変異させて、変異させた免疫グロブリン重鎖可変ドメインヌクレオチド配列を含む変異誘発されたファージ粒子の第一のライブラリーを作成する工程と、
ｃ）該工程（ｂ）で作成したライブラリーと、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０リガンドとを、該ライブラリーの構成員が該リガンドに結合し、かつ第一のリガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と、
ｄ）該第一の複合体中のファージ粒子を、非−結合ライブラリー構成員から分離して、第一のリガンドに富むライブラリーを形成する工程と、ここで該第一のリガンドに富むライブラリーは、該ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０リガンドに対する結合特異性をもつファージ粒子を含む、
ｅ）該第一のリガンドに富むライブラリーから、糸状ファージの該ゲノムを調製する工程と、
ｆ）該調製したゲノム中に存在する、該免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を突然変異させて、変異させた免疫グロブリン重鎖可変ドメインヌクレオチド配列を含む変異誘発されたファージ粒子の第二のライブラリーを作成する工程と、
ｇ）該工程（ｆ）で作成したライブラリーと、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０リガンドとを、該ライブラリーの構成員が該リガンドに結合し、かつ第二のリガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と、
ｈ）該第二の複合体中のファージ粒子を、非−結合ライブラリー構成員から分離して、第二のリガンドに富むライブラリーを形成する工程と、ここで該第二のリガンドに富むライブラリーは、該予め選択されたＨＩＶリガンドに対する結合特異性をもつファージ粒子を含み、これによってＨＩＶと免疫反応性の合成ヒトモノクローナル抗体を単離する工程、
を含むことを特徴とする、上記合成ヒト抗−ＨＩＶモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４１】
該工程（ｂ）および（ｆ）における変異形成が、該免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの同一の領域を指向する、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４２】
該工程（ｂ）および（ｆ）における変異形成が、該免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの異なる２つの領域を指向する、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４３】
該免疫グロブリンの重鎖可変ドメインが、ＣＤＲＩ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選ばれる相補性決定領域（ＣＤＲ）である、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４４】
該工程（ｂ）における変異形成が第一のＣＤＲを指向し、かつ該工程（ｆ）における変異形成が第二のＣＤＲを指向する、請求の範囲第４３項に記載の方法。
【請求項４５】
該第一および第二のＣＤＲが、それぞれＣＤＲ１およびＣＤＲ３である、請求の範囲第４４項に記載の方法。
【請求項４６】
該工程（ｂ）における変異形成が、該ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ中に変異形成を誘発する工程を含み、該変異誘発工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーオリゴヌクレオチドまたはその配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した、ＰＣＲによって、該免疫グロブリン遺伝子の該ＣＤＲの一部を増幅する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが５’および３’末端を有し、かつ
ａ）該５’末端に、該ＣＤＲの上流のフレームワーク領域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、
ｂ）該３’末端に、該ＣＤＲの下流のフレームワーク領域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、および
ｃ）該５’末端と該３’末端との間に、以下の式で表されるヌクレオチド配列：［ＮＮＳ］ｎ’ここで、Ｎは独立に任意のヌクレオチドを表し、ＳはＧ、Ｃまたはその類似体であり、ｎは３〜約２４である、
を含み、該３’および５’末端ヌクレオチド配列は約６〜５０個のヌクレオチドに相当する長さをもつ、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４７】
ｎが５であり、該ＣＤＲがＣＤＲ１であり、かつ該上流および下流フレームワーク領域がそれぞれＦＲ１およびＦＲ２である、請求の範囲第４６項に記載の方法。
【請求項４８】
該工程（ｆ）における変異形成が、該ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ中に変異形成を誘発する工程を含み、該変異誘発工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーオリゴヌクレオチドまたはその配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した、ＰＣＲによって、該免疫グロブリン遺伝子の該ＣＤＲの一部を増幅する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが５’および３’末端を有し、かつ
ａ）該５’末端に、該ＣＤＲの下流のアンチセンス（非コード）フレームワーク領域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、
ｂ）該３’末端に、該ＣＤＲの上流のアンチセンス（非コード）フレームワーク領域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、および
ｃ）該５’末端と該３’末端との間に、以下の式で表されるヌクレオチド配列：［ＭＮＮ］ｎ’ここで、Ｎは独立に任意のヌクレオチドを表し、ＭはＡ、Ｃまたはその類似体であり、ｎは３〜約２４である、を含み、該３’および５’末端ヌクレオチド配列は約６〜５０個のヌクレオチドに相当する長さをもつ、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４９】
ｎが４であり、該ＣＤＲがＣＤＲ３であり、かつ該上流および下流フレームワーク領域がそれぞれＦＲ３およびＦＲ４である、請求の範囲第４８項に記載の方法。
【請求項５０】
該第二のリガンドに富むライブラリーが、合成抗体分子を含むファージ粒子を含有し、該合成抗体分子が、インビトロウイルス感染アッセイにおいて、該アッセイにおける培地１ｍｌ当たり１００ｎｍ未満なる抗体濃度において、ＨＩＶ感染性力価を５０％減ずる能力をもつ、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項５１】
請求の範囲第５０項記載の方法により生成される合成モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野
本発明は、一般に免疫学分野、具体的にはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に結合し、これを中和する合成ヒト単クローン性（モノクローナル）抗体に関する。
背景
１．ＨＩＶ免疫療法
ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ，エイズ）の原因体であるがゆえに、集中的に研究されている。免疫療法は、ＨＩＶ感染およびＨＩＶ誘発疾患の予防または治療に対するいくつかのアプローチの１つである。特に、受動免疫療法での中和抗体の使用は、本発明にとって最も重要である。
ＨＩＶと免疫的に反応する多クローン性（ポリクローナル）抗体を含むヒト血清を用いたＨＩＶ−１感染者の受動免疫付与が報告されている。例えば、ジャクソンらの論文（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ，９月号１７：６４７−６５２（１９８８））、カーパスらの論文（Ｋａｒｐａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：７６１３−７６１６（１９９０））を参照されたい。
多くのグループが、分離ＨＩＶをインビトロで中和するヒトモノクローナル抗体の調製について報告した。報告された抗体は、典型的にはＨＩＶの糖蛋白ｇｐ１６０または関連糖蛋白ｇｐ１２０もしくはｇｐ４１上のエピトープに対して免疫特異性を有する。例えば以下の論文を参照のこと；Ｋａｒｗｏｗｓｋａら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８：１０９９−１１０６（１９９２）；Ｔａｋｅｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８９：１９５２−１９５７（１９９２）；Ｔｉｌｌｅｙら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８：４６１−４６７（１９９２）；Ｌａｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：１８２３−１８３１（１９９２）；Ｔｈａｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：６１８８−６１９３（１９９１）；Ｈｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９４８−８９５２（１９９１）；Ｄ’Ｓｏｕｚａら、ＡＩＤＳ，５：１０６１−１０７０（１９９１）；Ｔｉｌｌｅｙら、Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．，１４２：２４７−２５９（１９９１）；Ｂｒｏｌｉｄｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３：３７１−３７６（１９９１）；Ｍａｔｏｕｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：４３２５−４３３２（１９９１）；Ｇｏｒｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３２３８−３２４２（１９９１）。ＨＩＶ感染の病理および、抗ＨＩＶ抗体による受動免疫の使用を含む治療態様についての現時点での概論に関しては、レビーの論文（Ｌｅｖｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１８３−２８９（１９９３））を参照されたい。
【０００２】  これまでのところ、報告されたヒトモノクローナル抗体のいずれも、受動免疫付与療法での有効性が示されていない。さらに、モノクローナル抗体として、それらの各々はすべて、ＨＩＶエンベロープの表面糖蛋白（ｇｐ１２０またはｇｐ１６０）上の個々のエピトープ、またはｇｐ１２０のＶ３ループ、またはエンベロープのトランスメンブレン糖蛋白（ｇｐ４１）と反応する。有効な中和抗体と免疫学的に反応するエピトープは同定されていない。
顕著なＨＩＶ中和活性をもつヒトモノクローナル抗体調製物の開発の要請は依然として存在する。さらに、ＨＩＶｇｐ１２０上の別の多様な中和エピトープと免疫的に反応するモノクローナル抗体に対する要請がある。受動免疫付与に際して投与患者はその投与抗体に対して免疫反応を生じ、それによって特定の治療抗体を不活化するので、別の（新規な）エピトープ特異性が必要とされる。
さらに、そのエンベロープの糖蛋白構造に変異を生じ、したがって感染者の免疫系との反応性に変化を生じる、多くの証拠によって示されたこのＨＩＶの能力は種々の“野外分離株”をもたらし、これらは、個々の研究室のＨＩＶ株と免疫的に反応する個々の抗体調製物の有用性を損なう。現時点で存在する抗体調製物の野外分離株に対する有効性は、研究室株に対するものより弱い（Ｍｏｏｒｅら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ，１：２３５−２５０（１９９３））。さらに、多数のＨＩＶ株を有効に中和することを示したヒトモノクローナル抗体は未だ報告されていない。したがって、多数の異なるＨＩＶ株を中和する能力を有するヒトモノクローナル抗体の要請は依然として続いている。
【０００３】２．組み合わせファージミドライブラリーで生成された
ヒトモノクローナル抗体
糸状ファージディスプレーベクター（ファージミドと呼ばれる）の使用が、多様で新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大型ライブラリーの効率のよい調製を可能にすることは、繰り返し示されてきた。この技術は、糸状ファージ複製の組み立て工程時に遺伝子産物と遺伝子を連結する手段として糸状ファージコート蛋白の膜アンカードメインを利用し、これは、組み合わせライブラリーでの抗体のクローニングおよび発現のために用いられてきた（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６（１９９１））。抗体の組み合わせライブラリーは、ｃｐＶＩＩＩ膜アンカー（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６（１９９１））およびｃｐＩＩＩ膜アンカー（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１））の両方を用いて作製された。
糸状ファージをベースにした組み合わせ抗体ライブラリーの多様性は、重鎖および軽鎖遺伝子をシャフリングすることにより（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３（１９９１））、このライブラリーのクローン化重鎖遺伝子のＣＤＲ３領域を変化させることにより（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２））、さらにエラー多発性ポリメラーゼ鎖伸長反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，  ＰＣＲ）によってこのライブラリーにランダム変異を導入することによって（Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２））高めることができる。
【０００４】  糸状ファージディスプレーベクターはまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＨＩＶ抗原と免疫的に反応するヒトモノクローナル抗体を製造するために用いられた。例えば以下の論文をそれぞれについて参照のこと；Ｚｅｂｅｄｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３１７５−３１７９（１９９２）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）。ファージベクターの使用によってバクテリオファージの表面に出現したヒトモノクローナル抗体（この場合、この抗体はＨＩＶ−１抗原、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対して特異的である）は、組み合わせライブラリーのスクリーニングによって作製された。得られた抗体はＨＩＶと免疫反応性を有し、ＨＩＶを中和することが分かった（以下の文献を参照のこと：Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０：８１２−８２３（１９９３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４１４１−４１４５（１９９３）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５６：１１２−１２６（１９９３）；Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３３９−９３４３（１９９２））。
【０００５】  上記のファージディスプレー由来抗ＨＩＶ抗体はＨＩＶ感染を中和することが示されたが、一方、スクリーニングされた抗体は、免疫された宿主または感染宿主の免疫レパートリーの代表である。しかしながら、抗原に対するその親和性でインビトロで分離された重鎖と軽鎖のペアリングは、インビボでは必ずしもペアを形成しない。ファージディスプレー系は重鎖と軽鎖の固有のペアリングを可能にするが、多くの場合、親和性選別はおおよそのペアリングを回復させる（Ｂｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５９：７８２−７８３（１９９２））。そのような被免疫源または自然感染による免疫プライミングはいくつかの抗原に対する有用な抗体ライブラリーを提供するが、一方、何時でもそのようなライブラリーを入手することが可能とは限らない。  抗ＨＩＶ−１中和抗体は、ＨＩＶ−１陽性ドナーから調製したファージライブラリーのスクリーニングによって得られたが、得られた抗体は、その重鎖と軽鎖のアミノ酸残基配列のために特異性と親和性に限界がある。
【０００６】  糸状ファージをベースにした組み合わせ抗体ライブラリーの多様性は、しかしながら、最初のライブラリースクリーニングで得られる重鎖および軽鎖遺伝子をシャフリングすることによって高めることができる（Ｋａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３（１９９１））。別のアプローチは、エラー多発性ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって重鎖および軽鎖遺伝子にランダム変異を導入することである（Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９１））。蛋白の変異誘発は、蛋白の機能を変化させるために、さらにある場合には結合特異性を変えるために利用されてきた。典型的には、この変異誘発は位置特異的であり、したがって蛋白内に誘発される変異の体系的な選択に左右される骨の折れる作業である。例えばコーリーの論文を参照されたい（Ｃｏｒｅｙら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：１７８４−１７９０（１９９２））：この論文では、ラットのトリプシンは位置特異的変異誘発によって修飾された）。もっと最近では、リーヒマンら（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２：８８４８−８８５５（１９９３））は、位置特異的変異誘発およびファージディスプレー技術をランダム化ライブラリーのスクリーニングの前に使用し、ハプテン２−フェニルオキザゾル−５−オンに対して特異的な一本鎖Ｆａｂフラグメントの親和性を高めることを記載した。
【０００７】  抗体の構造および機能の潜在的能力のより広範囲な見本を得るための好ましいアプローチは、ファージディスプレーの内容で半合成抗体を調製することである。これらの分子では、ライブラリーのスクリーニングによって得られるクローン化重鎖または軽鎖遺伝子の１つまたは２つ以上の相補性決定領域が変化し、新規な可変ドメインのアミノ酸残基配列を生じる（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２））。
特定のドナーからクローン化された抗体と異なり、半合成抗体はどのような配列のどのような大きさのＣＤＲも含むことができる、したがって新規な特異性と親和性をもつ抗体を得る可能性が高まる。
発明の簡単な説明
【０００８】  以前に性状が明らかにされた抗体と比較して強化された親和性、特異性および中和能をもつ、ＨＩＶ−１糖蛋白に対して特異的な合成Ｆａｂ異種二量体を発見した。この新規な合成ＨＩＶ−１特異的Ｆａｂ異種二量体は、組換え体Ｆａｂ抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）にランダム変異を誘発する合成方法を用いて、ＨＩＶに結合してこれを中和する抗体を製造することによって得られる。
ランダム変異を起こさせた中和抗体は、ＨＩＶ特にＨＩＶ糖蛋白ｇｐ１２０上の新規なエピトープを明らかにし、したがって、非ランダム化組み合わせライブラリーで選別された抗体と比較して、より強いエピトープ結合親和性を示す新規な免疫療法用ヒトモノクローナル抗体の利用性を増進させた。
本発明は、非ランダム化組み合わせライブラリーから選別された抗体よりさらに効率よくＨＩＶを中和する合成ヒトモノクローナル抗体を提供する。また、モノクローナル抗体の抗原結合ドメインに強化中和機能を付与し、さらに、ＨＩＶに特異的に結合してこれを中和する他の抗体を同定するために免疫原として用いることができるアミノ酸配列を提供する。本発明の合成モノクローナル抗体は、ＨＩＶ誘発疾患の診断および免疫療法用試薬として特に有用である。
【０００９】  本発明のモノクローナル抗体の主要な利点は、それら抗体はヒトのポリヌクレオチド配列によってコードされる（すなわちそれらはヒトの抗体である）という事実に起因する。したがって、ＨＩＶ誘発疾患の診断および免疫療法のために本発明のモノクローナル抗体をインビボで使用することは、受動的態様で投与される抗体に対する重大な宿主免疫反応に関する問題（これは、外来性またはキメラ型派生物のモノクローナル抗体が用いられる場合に遭遇する共通の問題である）を大きく減少させる。
本発明のヒトモノクローナル抗体の別の主要な利点は、この抗体は標的抗原に対して顕著に強化された免疫親和性を有するということであり、このことは、この抗体を診断のためにも治療のためにも特別に効力のあるものにする。
ある実施例では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と免疫的に反応し、これを中和することができる合成ヒトモノクローナル抗体を目的とする。合成モノクローナル抗体は、１００ナノグラム（ｎｇ）／ｍｌ未満の抗体濃度で、インビトロウイルス感染性アッセーにおいてＨＩＶ感染力価を５０％減少させる能力を有する。好ましい実施例では、モノクローナル抗体は、２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で感染力価を５０％減少させる。
【００１０】  好ましい合成モノクローナル抗体はＦａｂフラグメントである。より好ましいものは、ＨＩＶ糖蛋白、特にＨＩＶ糖蛋白ｇｐ１２０と免疫的に反応する合成モノクローナル抗体分子である。
本発明はまた、多数の異なるＨＩＶ株に対して強化された、または改善されたウイルス中和能を示す、すなわちウイルス株中和能の幅が広くなったヒトモノクローナル抗体およびその調製方法も開示する。したがって、好ましいヒトモノクローナル抗体は、前もって選択した第一のＨＩＶ株を上記のように中和する能力を有し、さらに、１０マイクログラム（μｇ）／ｍｌの抗体濃度でインビトロウイルス感染性アッセーで第二のＨＩＶ野外株の感染性力価を５０％減少させる能力を有する。多数のＨＩＶ株を中和することにより、本抗体は、株間交差反応性および多株中和能を明らかにする。
好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号：２、３、４および５から成る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。別の好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号：６の軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
【００１１】  好ましい実施例では、本発明は、約１×１０−８Ｍまたはそれ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍから約１×１０−１０Ｍ、より好ましくは約１×１０−１０Ｍから約１×１０−１１Ｍ、最も好ましくは約１×１０−１１Ｍから約１×１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＨＩＶ糖蛋白ｇｐ１２０と免疫的に反応するような中和抗体を開示する。
上記の高親和性結合特異性を有する好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号：１、２、３、４、５、５４、５５、５６、５７、５８、５９、８９、９０、９１および９２並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含む。さらに、上記の高親和性結合特異性を有する好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号：６、６９、７０、７３、７５、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７および８８並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含む。特に好ましいものは、該モノクローナル抗体が、対として配列番号：２：６、３：６、４：６、５：６、３：６９、３：７０、３：７３、３：７５、３：７６、３：７７、３：７９、３：８０、３：８２、３：８３、３：８４、３：８５、３：８６、３：８７、５４：６、５５：６、５６：６、５７：６、５８：６、５９：６、８９：６、８９：８８、９０：８６、９０：８８、９１：６、９１：８８および９２：８８並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の結合特異性を有する、ヒトモノクローナル抗体である。
【００１２】  本発明の目的はまた、予め選択した１つまたは２つ以上の免疫グロブリン重鎖、好ましくは相補性決定領域（ＣＤＲ）に変異を連続的に誘発し、続いてＨＩＶと強力に免疫的に反応しこれを中和する抗体を選別するランダム変異誘発法を用いて合成抗ＨＩＶモノクローナル抗体を製造する方法である。
別の実施例では、本発明の合成ヒトモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列が開示される。また本発明の目的とすることは、このポリヌクレオチドを含むＤＮＡ発現ベクター並びに、このベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。
本発明はまたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を検出する方法を目的とするが、この方法は、ＨＩＶを含むと思われるサンプルを診断的に有効量の本発明の合成モノクローナル抗体と接触させ、この合成モノクローナル抗体がこのサンプルと免疫的に反応するか否かを決定することを含む。この方法はインビトロまたはインビボで実施でき、免疫反応生成物の存在を検出するための種々の方法が含まれる。
別の実施例では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス疾患に対する受動免疫療法を患者に提供する方法を開示するが、この方法は、患者に免疫療法的に有効な量の本発明の合成モノクローナル抗体を投与することを含む。投与は、予防的に非経口投与によって実施することができる。１種または２種以上の異なる合成ヒトモノクローナル抗体を含む医薬組成物が、本発明の治療方法で使用するために開示される。
【００１３】Ａ．定義
アミノ酸残基：  そのペプチド結合における化学的消化（加水分解）により形成されるアミノ酸。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、好ましくは“Ｌ”型異性体である。しかしながら、当該ポリペプチドが所望の機能的特性を保持するかぎり、“Ｄ”型異性形の残基もいずれのＬ−アミノ酸残基とも置換可能である。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、３７  ＣＦＲ  §１．８２２（ｂ）（２）で採用された）にしたがい、アミノ酸残基の略語を下記の対応表に示す。
【００１４】
2005198654.tif 000002
【００１５】  本明細書に提示した全てのアミノ酸残基配列式は、アミノ末端からカルボキシ末端の通常の向きで左から右の方向性を有することは留意されたい。さらに、“アミノ酸残基”という用語は、対応表に掲げたアミノ酸、並びに修飾および例外的アミノ酸（例えば３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に挙げられたもの、および参照により本明細書に含まれるもの）を含む広い定義を有する。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後の棒線は、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基をもつ別の配列へのペプチド結合、またはアミノ末端基（例えばＮＨ２またはアセチル）もしくはカルボキシ末端基（例えばＣＯＯＨ）への共有結合を示すことに留意されたい。
組換え体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：  ２つのＤＮＡセグメントを機能できるように連結することによって生成されるＤＮＡ分子。したがって、組換え体ＤＮＡ分子は、天然には通常結合した状態では見出されない、少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッド分子である。共通の生物学的起源をもたない（すなわち発生的に異なる）ｒＤＮＡ分子は、“異種”であると言う。
ベクター：  ＤＮＡセグメント（例えば遺伝子またはポリヌクレオチド）が機能的に連結され、その結果この添付されたセグメントの複製が起こる、細胞内で自律的に複製できるｒＤＮＡ分子。１つまたは２つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では“発現ベクター”と呼ばれる。特に重要なベクターは、ｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて生成されるｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にする。
【００１６】レセプター：  レセプターは、特異的に（任意ではなく）別の分子に結合することができる分子、例えば蛋白、糖蛋白などである。
抗体：  抗体という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子）を指すために本明細書では用いられる。代表的な抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の部分（当該技術分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ｖ）として知られるような部分を含む）である。
抗体結合部位：  抗体結合部位とは、抗原と特異的に結合（免疫的に反応する重鎖および軽鎖可変領域並びに超可変領域を含む抗体分子の構造部分である。“免疫的に反応する”ということは、抗原性決定基含有分子と抗体結合部位を含む分子（例えば完全な抗体分子またはその部分）との間の特異的結合を意味する。
モノクローナル抗体：  モノクローナル抗体とは、特定のエピトープと免疫的に反応することができる、ただ１種の抗体結合部位を含む抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体は、典型的にはそれが免疫的に反応するエピトープに対してただ１つの結合親和性を示す。それゆえ、モノクローナル抗体は複数の抗体結合部位をもつ抗体分子を含み、この抗体結合部位の各々は、異なるエピトープに対して免疫的に特異性を有する可能性がある（例えば二特異性モノクローナル抗体）。歴史的にはモノクローナル抗体は、クローンとして純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の永久分裂能付与によって製造されたが、モノクローナル抗体として純粋な抗体分子集団はまた、本発明の方法によっても調製することができる。
【００１７】合成モノクローナル抗体：  “合成”という用語は、“合成モノクローナル抗体”という組み合わせで用いられる場合は、この抗体は天然には分離されないが、本明細書に記載されているようにむしろ、クローン化ヒト免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖可変領域の変異誘発の産物であることを意味する。これによって本明細書に開示されているように、免疫特異性、免疫親和性およびＨＩＶ中和活性を付与する特徴的なアミノ酸残基配列を有する人工的抗体が生成される。
融合ポリペプチド：  少なくとも２つのポリペプチド、およびこの２つのポリペプチドを機能的に連結して１つの連続したポリペプチドとする連結配列を含むポリペプチド。融合ポリペプチドにおいて連結されたこの２つのポリペプチドは、典型的には２つの別個の起源に由来し、したがって、融合ポリペプチドは、天然には通常連結した状態では見出されない２つの連結されたポリペプチドを含む。
上流：  ＤＮＡ転写の方向と反対の方向で、したがって非コード鎖では５’から３’に向かい、またｍＲＮＡでは３’から５’に向かう方向。
下流：  配列の転写または読み取りの方向に向かうＤＮＡ配列、すなわちＤＮＡの非コード鎖では３’−から５’−、ＲＮＡ転写物では５’−から３’−に向かう。
シストロン：  アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列で、上流および下流のＤＮＡ発現制御成分を含む。
リーダーポリペプチド：  ポリペプチドのアミノ末端にある長さの短いアミノ酸で、ポリペプチドに内膜を通過させ、または内膜を通過するようにポリペプチドを誘導し、それによって細胞質膜の間隙、おそらくは細胞質膜間隙の外へ最終的にポリペプチドを分泌させる。リーダー配列ポリペプチドは、ポリペプチドが活性をもつ前に通常は除去される。
読み枠：  翻訳に用いられる連続したヌクレオチドトリプレット（コドン）の特定の配列。読み枠は翻訳開始コドンの位置に左右される。
【００１８】Ｂ．合成ヒトモノクローナル抗体
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して特異的で、これを中和する合成ヒトモノクローナル抗体に関する。本発明の好ましい実施例では、ＨＩＶ蛋白、好ましくはＨＩＶ糖蛋白のｇｐ１２０またはｇｐ１６０のエピトープポリペプチド配列に結合することができるヒトモノクローナル抗体が開示される。
この合成モノクローナル抗体は、それらはヒトに由来するが、組換え体技術によって修飾され、それによって標的抗原に対して強い免疫反応親和性を示す合成生成物が得られるという点において通常とは異なる。さらに、この合成モノクローナル抗体は、ＨＩＶを中和する強力な能力を有する。ＨＩＶを中和するこの能力は、本明細書で開示するような典型的なインビトロ感染性アッセーで測定したときの、ＨＩＶ懸濁液の感染力価を減少させるために必要な抗体分子の濃度として表される。本発明の合成モノクローナル抗体は、インビトロウイルス感染性アッセーではアッセー培養液１ｍｌにつき１００ｎｇ未満、好ましくは２０ｎｇ未満、より好ましくは１０ｎｇ未満の抗体濃度でＨＩＶ感染力価を５０％減少させる能力を有する。
本明細書に開示する代表的で好ましい合成モノクローナル抗体は、５−２０ｎｇ／ｍｌで有効で、したがってＨＩＶをインビトロおよびインビボで抑制するために適している。
【００１９】  特定のアミノ酸配列を有する抗体もまた開示されるが、この配列は、特定のエピトープに結合し、さらにＨＩＶにこれらの抗体が結合するときウイルスを中和する能力を抗体に付与する。請求の範囲にいう特異性を有するヒトモノクローナル抗体、および同様な特異性を有する同様なヒトモノクローナル抗体は、ＨＩＶ誘発疾患の診断および免疫療法において有用である。
“ＨＩＶ誘発疾患”という用語は、直接または間接的にＨＩＶによって引き起こされる一切の疾患を指す。ＨＩＶ誘発疾患の例は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および、ＨＩＶ感染によって引き起こされる一般にエイズに付随する多数の症状である。
したがって、本発明の目的の１つは、ＨＩＶ中和部位と反応する合成ヒトモノクローナル抗体、およびそのような抗体を産生する細胞株である。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株の分離は、さらに本明細書に極めて詳細に開示されている。本明細書に開示したファージミドベクターライブラリーの方法並びに、対象となっているモノクローナル抗体の基本的な免疫反応および中和パターンを決定することを可能にする通常のスクリーニング技術を用いて、そのような細胞株の分離は達成できる。したがって、もし被験ヒトモノクローナル抗体がＨＩＶに結合し、これを中和した場合は、この被験ヒトモノクローナル抗体と本発明の細胞株によって産生されたヒトモノクローナル抗体は同等であると考えられる。
【００２０】  あるヒトモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体のＨＩＶ結合を妨げるか否かを確認することによって、前者が本発明のモノクローナル抗体と同じ（すなわち同等な）特異性を有するどうかを、過度の実験を行うことなく決定することもまた可能である。固相ｇｐ１２０抗原に結合させる標準的な競合アッセーで本発明のヒトモノクローナル抗体の結合の減少によって示されるように、被験ヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合には、この２種のモノクローナル抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープと結合するという蓋然性が高い。
あるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを決定するまた別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、通常当該抗体と反応するＨＩＶとともに予め保温し、続いて被験ヒトモノクローナル抗体を加えて、この被験ヒトモノクローナル抗体のＨＩＶ結合能が抑制されるか否かを決定するものである。被験ヒトモノクローナル抗体が抑制された場合は、おそらく当該被験抗体は、本発明のヒトモノクローナル抗体と同じまたは機能的に同等なエピトープ特異性を有するであろう。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、ＨＩＶ中和アッセーを用い、モノクローナル抗体がＨＩＶを中和するか否かを調べることによって実施できる。
【００２１】  ウイルス感染の１つまたは２つ以上の段階でＨＩＶを中和することができる能力は、本発明のヒトモノクローナル抗体の望ましい品質である。ウイルスの中和は、種々のインビトロおよびインビボの方法によって測定できる。本明細書で開示される中和能を測定する代表的な方法は、ＨＩＶ誘発合胞体形成の抑制を測定するインビトロアッセー、およびＨＩＶ感染細胞からのコアｐ２４抗原の産出抑制を測定するアッセーである。
本明細書に示すように、本発明のヒトモノクローナル抗体の免疫特異性は、ＨＩＶの血清型および／または株間で共有されるエピトープに対するものでもよく、またエピトープによっては単一のＨＩＶ株に特異的であってもよい。したがって、好ましいヒトモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２または両方と免疫反応性をもつものでもよく、さらにＨＩＶ−１の株、ＩＩＩＢ、ＭＮ、ＲＦ、ＳＦ−２、Ｚ２、Ｚ６、ＣＤＣ４、ＥＬＩおよび同様な株の１つまたは２つ以上と免疫的に反応するものでもよい。
特に好ましい実施例では、本方法によって製造された、各々がＨＩＶの多くの株、特に野外株を中和する能力を示す多数のヒトモノクローナル抗体が開示される。本明細書に開示されるように重鎖および／または軽鎖遺伝子のＣＤＲ領域の連続的ランダム化によって、幾つかの異なるＨＩＶ野外株を中和することができる多数の抗体種が製造された。
【００２２】  したがって、本発明はまた、予め選択された第一のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば実験室株ＭＮまたはＩＩＩＢ）と免疫反応し、これを中和することができ、さらに１つまたは２つ以上の他の（第二の）ＨＩＶ株、特に野外株と免疫反応しこれを中和することができるヒトモノクローナル抗体を含む。実施例の示すところによれば、この抗体は、第一のＨＩＶ株のインビトロウイルス感染アッセーでは１００ｎｇ／ｍｌ未満の抗体濃度でＨＩＶ感染力価を５０％減少させる能力を有し、さらに第二のＨＩＶ野外株の感染力価を同じインビトロウイルス感染アッセーで約１０μｇ／ｍｌ未満の抗体濃度で５０％減少させる能力がある。より好ましい実施例では特定のウイルス株の場合、感染力価を５０％減少させる能力は、もっと低い抗体濃度、例えば１μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下で示される。
抗体の免疫特異性、そのＨＩＶ中和能、および当該抗体がエピトープに対して示す抗体に付随する親和性は、当該抗体が免疫的に反応するエピトープによって決まる。このエピトープ特異性は、少なくとも部分的には、この抗体の免疫グロブリンの重鎖の可変領域のアミノ酸残基配列によって、さらに部分的には軽鎖可変領域のアミノ酸残基配列によって決まる。好ましいヒトモノクローナル抗体は糖蛋白ｇｐ１２０と免疫的に反応する。
【００２３】  本発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号：２、３、４および５並びにその保存的置換体から成る配列群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
本発明の別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号：６およびその保存的置換体の軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の結合特異性をもつ。
既知の組み合わせライブラリーのシャフリング法およびスクリーニング法を用いて、ＨＩＶ中和モノクローナル抗体として機能する新規な重鎖および軽鎖ペアを同定することができる。特に、本発明にしたがって、ＨＩＶ中和ヒトモノクローナル抗体に由来する既知の重鎖を軽鎖のライブラリーとシャフリングして、機能的な抗体を形成する新規なＨ：Ｌペアを同定することができる。同様に、ＨＩＶ中和ヒトモノクローナル抗体に由来する既知軽鎖を重鎖ライブラリーとシャフリングし、機能的な抗体を形成する新規なＨ：Ｌペアを本発明にしたがって同定することができる。
【００２４】  特に好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号：２：６、３：６、４：６および５：６並びにその保存的置換体から成る群から選ばれるペア（Ｈ：Ｌ）を形成した重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の免疫反応（結合）特異性を有するものである。コロンをもつ２つの配列番号、例えば２：６の名称は、それぞれ重鎖および軽鎖の、それぞれ配列番号：２および配列番号：６に示されるアミノ酸残基配列によって形成されたＨ：Ｌペアの意味を含む。
特に好ましいものは、配列番号：２、３、４または５に示された重鎖配列を有し、さらに本明細書で述べるように１９９３年１０月１９日にＡＴＣＣに寄託されたｐＭＴ４発現ベクターによってコードされる抗体分子ＭＴ４に存在する配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性をもつヒトモノクローナル抗体である。“結合特異性をもつ”とは、同じまたは類似の免疫反応特性および中和特性をを示し、さらにＨＩＶ抗原との結合について競合する同等なモノクローナル抗体を意味する。
【００２５】  好ましい実施例では、本抗体の免疫親和性は極めて強く、したがって治療的利用において高い有効性を提供し、さらに診断的利用では低いバックグラウンドと高い特異性を提供する。この実施例では、上記に述べた中和能に加え、本合成ヒトモノクローナル抗体は、約１×１０−８Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）でＨＩＶと免疫的に反応する。すなわち、１０−８Ｍより大きい親和性を有する抗体が特に好ましい。本合成方法によって、Ｋｄとして表した場合１０−９から１０−１２Ｍの範囲の親和性をもつ多数のモノクローナル抗体が産出される。
軽鎖または重鎖可変領域またはその両方の配列が、本発明の方法によって修飾されるかぎり、本発明の好ましい抗体は、好ましい重鎖、軽鎖またはその両方を含むことができる。したがって、好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号：１、３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、８９、９０、９１および９２並びその保存的置換体から成る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。さらに、好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号：６、６９、７０、７３、７５、７６、７７、７９、８０、８２、８３、８４、８５、８６、８７および８８並びその保存的置換体から成る群から選ばれる軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
【００２６】  特に好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約１×１０−９Ｍから約１×１０−１０Ｍの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、配列番号：３：６、３：６９、３：７０、３：７３、３：７５、３：７６、３：７７、３：７９、３：８０、３：８２、３：８３、３：８４、３：８７、５４：６、５５：６、５６：６、５７：６、５８：６、５９：６、９０：８８、９１：６、９１：８８および９２：８８並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列のペアを有するモノクローナル抗体の結合特異性をもつ。
さらにより好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約１×１０−１０Ｍから約１×１０−１１Ｍの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、配列番号：３：８５、３：８６、８９：６および９０：８６並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列のペアを有するモノクローナル抗体の結合特異性をもつ。
【００２７】  より好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約１×１０−１１Ｍから約１×１０−１２Ｍの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、配列番号：８９：８８で示されるものおよびその保存的置換体がペアとなった重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列のペアを有するモノクローナル抗体の結合特異性をもつ。特に好ましいものは、ＡＴＣＣ承認番号６９６９１に含まれるプラスミドｐＰＨＯ−Ｈ３１／Ｌ４２−１によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
上記の免疫親和性を有する代表的な抗体は実施例で述べる。
本明細書で用いられる“保存的変形”という用語は、別の生物学的に類似する残基によるアミノ酸残基の置換を指す。保存的変形の例は、１つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）を別のものの代わりに置換すること、または１つの極性残基を別のものの代わりに置換すること、例えばリジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸、またはアスパラギンの代わりにグルタミンを置換することなどを含む。“保存的変形”という用語はまた、置換ポリペプチドがＨＩＶを中和するということを条件として、未置換親アミノ酸の代わりにアミノ酸を置換することも含む。同様に、本発明の別の好ましい具体例は、上記の重鎖および／または軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列に関する。相補的なポリヌクレオチド配列は、厳格なハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列を含む。
【００２８】  本発明のヒトモノクローナル抗体を用いることによって、抗イディオタイプ抗体を製造することが可能になった。この抗体を用いて、ヒトモノクローナル抗体をスクリーニングし、それが本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有するか否かを同定することができ、さらにまた、このイディオタイプ抗体を能動的な免疫付与に用いることもできる（Ｈｅｒｌｙｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：１００（１９８６））。そのような抗イディオタイプ抗体は、周知のハイブリドーマ技術を用いて製造することができる（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））。抗イディオタイプ抗体は、対象となっている細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。これらの決定基は抗体の超可変領域に位置する。与えられたエピトープと結合するのはこの領域で、したがって、抗体の特異性をもたらす。抗イディオタイプ抗体は、対象となっているモノクローナル抗体で動物を免疫することによって調製できる。免疫された動物は、免疫に用いた抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これと反応して、これらイディオタイプ決定基に対する抗体を生じる。免疫動物の抗イディオタイプ抗体（これは、第二の動物を免疫するために用いられた、細胞株によって産生された本発明のヒトモノクローナル抗体に対して特異的である）を用いることによって、免疫に用いたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプをもつ他のクローンを同定することが可能になった。２種の細胞株のヒトモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性は、それらが同じエピトープ決定基を認識するという点に関して同じであるということを明らかにする。したがって、抗イディオタイプ抗体を用いることによって、同じエピトープ特異性を有する、他のハイブリドーマが発現するモノクローナル抗体を同定することが可能である。
【００２９】  また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を製造することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体が結合するエピトープの“外形”である超可変領域の結合ドメインを有するであろう。したがって、抗イディタイプモノクローナル抗体は免疫に用いることが可能である。なぜならば、この抗イディオタイプモノクローナル抗体の結合ドメインは抗原として効果的に作用するからである。
好ましい本発明の実施例では、本発明のヒトモノクローナル抗体に由来するＦａｂフラグメントを含む短縮免疫グロブリン分子が含まれる。Ｆｃレセプターを欠くこのＦａｂフラグメントは可溶性で、血清半減期に関して治療的に利点をもたらし、さらに可溶性Ｆａｂフラグメントを用いる場合には診断的利点を与える。可溶性Ｆａｂフラグメントの調製は、免疫学分野では一般に知られており、種々の方法によって達成できる。可溶性Ｆａｂフラグメントを製造する好ましい方法は本明細書で開示される。
【００３０】  ヒトモノクローナル抗体は、特にヒトの治療に用いられるかぎり、ネズミのモノクローナル抗体に較べて際立った利点を提供する。特に、ヒトモノクローナル抗体は、“外来”抗原のように迅速に血液循環から排除されず、外来抗原および外来抗体と同じ態様で免疫系を活性化させることはない。
本発明はまた、本方法によって産生される本発明のモノクローナル抗体を１実施例で示す。
Ｃ．免疫的治療方法と組成物
本発明の合成ヒトモノクローナル抗体は、明らかにされた標的抗原に対するその中和活性と強い免疫親和性のゆえに、ＨＩＶ疾患の免疫療法として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体と合わせて本明細書で用いられる“免疫治療として”または“免疫療法”という用語は、治療のための投与と同様予防のための投与も示す。したがってこのモノクローナル抗体は、ＨＩＶ誘発疾患の可能性および／または重篤性を減少させるためにハイリスク患者に投与でき、さらに、すでに活発なＨＩＶ感染を示している患者またはＨＩＶ感染の危険性がある患者にも投与できる。
【００３１】１．治療用組成物
本発明は、したがって、本明細書に開示する治療方法を実施するために有用な治療用組成物を目的とする。本発明の治療用組成物は、生理学的に許容できる担体を、当該担体中に活性成分として溶解または懸濁させた本明細書で開示する少なくとも１種のヒトモノクローナル抗体とともに含む。好ましい実施例では、この治療用組成物は、患者に治療目的で投与したとき（特に記載がない場合のように、免疫反応を誘発する目的でないときは）免疫反応を誘発しない。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容可能”または“生理学的に許容できる”という用語は、それらが組成物、担体、希釈液および試薬について言う場合は互換的に用いられ、さらに、それら物質が望ましくない生理学的影響（例えば吐き気、めまい、むかつきなど）を生じることなく患者に投与できることを示している。
【００３２】  溶解または懸濁された活性成分を含む医薬組成物の調製は、当該技術分野ではよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、滅菌された注射可能な溶液または懸濁液で水性または非水性の何れかとして調製されるが、溶液もしくは懸濁液に適し、使用前に液状になる個体形状もまた調製できる。
活性成分は、医薬的に許容でき、当該活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に開示する治療方法で使用するために適した量で混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせなどである。さらに所望される場合には、当該組成物は、少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、活性成分の有効性を高めるものを含むことができる。
本発明の治療用組成物は、医薬的に許容できる成分の塩を含むことができる。医薬的に許容可能な塩には酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基ともに形成される）が含まれるが、これらは、無機酸（例えば塩酸または燐酸）または有機酸（例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸など）を用いて形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）および有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から得ることができる。
【００３３】  生理学的に許容できる担体は当該分野で周知である。液状担体の例は、活性成分と水以外に物質を含まない滅菌水、または緩衝液、例えば生理的ｐＨ値でリン酸ナトリウムを含む滅菌水、食塩水または両方を含む滅菌水（例えば燐酸緩衝食塩水）である。さらにまた、水性担体は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質同様に１種以上の緩衝塩を含むことができる。
液状組成物はまた水の他に、または水を排除して液相を含むことができる、そのような付加液相の例は、グリセリン、植物油（例えば綿実油）、有機エステル（例えばオレイン酸エチル）および水中油滴乳濁液である。
治療用組成物は、本発明のＨＩＶ中和ヒトモノクローナル抗体を、典型的には全治療用組成物の重量に対して少なくとも０．１重量％の量で含む。重量％は、全組成物に対する抗体の重量による比率である。したがって、例えば０．１重量％は、全組成物１００グラム当たり０．１グラムの抗体である。
【００３４】２．治療方法
本発明のヒトモノクローナル抗体の明らかなＨＩＶ中和能に基づき、ＨＩＶをインビトロまたはインビボで中和する方法が提供される。この方法は、ＨＩＶを含むと考えられるサンプルを、治療的に有効量の本発明のヒトモノクローナル抗体を含む組成物と接触させることを含む。好ましい治療的有効量は、本明細書に開示したインビトロアッセーで測定したとき、感染性を５０％、好ましくは９０％、より好ましくは９９％減少させるために十分な量である。
インビボでの薬剤使用では、本方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を含む生理学的に許容できる組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。したがって、本発明は、免疫療法として有効量の本発明のヒトモノクローナル抗体を患者に投与することを含む、ヒトのＨＩＶ疾患に対する受動的免疫療法を実施例で開示する。
本受動的免疫治療方法を実施するための代表的な患者は、エイズまたはＨＩＶによって引き起こされたと考えられる関連症状を含むＨＩＶ誘発疾患の徴候を示している全ての患者、およびＨＩＶ感染の危険性がある（すなわち感染防止のための予防的処置）全ての人間である。ＨＩＶ感染の危険性がある患者には、ＨＩＶ感染妊婦の乳児、ＨＩＶを含むことが分かった輸液を受けた者、ＨＩＶ汚染針を使用した者、ＨＩＶ感染者との感染の危険性の高い性交渉を行った者、および同様な危険性のある状況が含まれる。
【００３５】  ある実施例では、この受動免疫の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を１種以上含む組成物を投与することを含む。これらの抗体は、受動免疫治療の有効性を高めるために好ましくは非競合エピトープに対する抗体、またはＨＩＶの異なる血清型もしくは株に対する抗体である。
治療的に（免疫療法的に）有効量のヒトモノクローナル抗体は、所望の効果を達成するように、すなわちサンプル中または患者に存在するＨＩＶを中和するように、したがってサンプル中または患者の検出可能なＨＩＶ量を減少させるよう計算された予め決定された量である。インビボの治療の場合、有効量は、患者に認められるＨＩＶ誘発疾患に付随する１つまたは２つ以上の徴候の改善、またはＨＩＶ抗原の血清学的減少によって測定できる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体の投与のための投与量範囲は、ＨＩＶ疾患の徴候が軽減し、または感染の可能性が減少する所望の効果をもたらすために十分多いものである。投与量は、副作用（例えば過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全など）を生じるほど多くてはいけない。一般に、投与量は、患者の年令、状態、性別および症状の程度によって左右され、当該技術分野で習熟した者によって決定される。
【００３６】  投与量は、個々の医師が合併症の有無にしたがって調整できる。
本発明の抗体の治療的に有効な量は、典型的には、生理学的に許容できる組成物として投与されたとき、約０．１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、通常は約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するために十分な抗体量である。別の表現をすれば、投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇで変動可能で、１日１回もしくは２回以上で１日または数日間の投与である。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、注射または時間をかけた緩徐な輸液によって非経口的に投与できる。ＨＩＶ感染は典型的には全身的であり、したがって、治療用組成物の静脈注射が最も頻繁な処置であるが、標的組織が感染性ＨＩＶを含む可能性が高い場合は他の組織または薬剤送達手段も考えられる。したがって、本発明のヒトモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、経皮的に投与でき、さらに蠕動性手段によって送り込むことができる。
【００３７】  本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療用組成物は、通常は静脈内に、例えば一回分の単位投与量の注射として投与できる。本発明の治療用組成物に関して用いられる場合は、“単位投与量”という用語は、患者に対して一定量の投薬として適切な物理的に限定された単位量を指し、各単位量は、必要な希釈剤（すなわち担体または賦形剤）とともに所望の治療効果を生じるように計算した予め定められた量の活性物質を含む。
この組成物は投与製剤に適合した態様で、さらに治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量は、治療されるべき患者、活性成分を利用する患者の身体機構の能力、および所望される治療効果の程度に左右される。投与に必要な活性成分の正確な量は、臨床医の判断に依存し、各個人に固有である。しかしながら、全身投与のための適切な投与範囲は本明細書に開示されるが、それは投与経路に依存する。適切な投与方法はまた様々であるが、典型的な方法は、最初の投与から１時間または２時間以上の間隔で続いて注射または他の投与が反復される。また別には、インビボ治療のために特定された範囲で血中濃度を維持するために十分な連続静脈内輸液も考えられる。
【００３８】  有効量のモノクローナル抗体投与の補助として、患者の血中のモノクローナル抗体を検出する診断方法が、投与された治療用組成物の消長を調べるために有用である。
本発明はまた、ＨＩＶ疾患の免疫治療に用いられる、本発明のモノクローナル抗体を含む医薬または医薬組成物を調製する方法に関する。
Ｄ．診断用アッセー方法
本発明はまた、サンプル（例えば生物学的液体または組織サンプル）中のＨＩＶの存在、および好ましくは量を決定する種々のアッセー方法を目的とする。これらの方法は、サンプル中のＨＩＶの量と直接または間接的な関連を有する免疫反応生成物を形成させるために、免疫化学試薬として本発明のヒトモノクローナル抗体を用いる。
本発明の免疫化学試薬を用いてインビトロまたはインビボで免疫反応生成物（その量は体サンプル中に存在するＨＩＶの量と相関する）を形成させる、化学的な臨床診断方法が多数知られていることは、当業者には理解されるところであろう。したがって、代表的なアッセー方法は本明細書で開示されるが、一方、本発明はそれに限られるものではない。
【００３９】  種々の混成および非混成プロトコール（競合的または非競合的）が、本発明のアッセー方法を実施するために用いられる。本発明のモノクローナル抗体を利用することができる免疫アッセータイプの例は、直接または間接形式の競合おとび非競合免疫アッセーである。そのような免疫アッセーの例は、放射性免疫アッセー（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（免疫計量）アッセーである。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原の検出は、進行、逆行または同時検出式の、生理学的サンプルの免疫組織化学的アッセーを含む免疫アッセーを用いて実施できる。当業者には、他の免疫アッセー様式を見出すことができるであろうし、また多くの実験を実施することなく容易にそれらを判別することも可能であろう。
本発明のモノクローナル抗体は多くの異なる担体に結合させることが可能で、ＨＩＶの存在を検出するために利用することができる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに磁鉄鉱が含まれる。担体の性状は、当該発明の目的により可溶性でも不溶性でもよい。当業者には、モノクローナル抗体を結合させる他の適切な担体も見出すことができるであろうし、また多くの実験を実施することなく容易にそれらを判別することも可能であろう。
【００４０】  当業者の知る種々の異なる標識および標識方法が存在する。本発明で用いることができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物が含まれる。当業者には、本発明のモノクローナル抗体に結合させるその他の適切な標識を見出すことができるであろうし、また通常の実験を用いて容易にそれらを確認することも可能であろう。さらに、本発明のモノクローナル抗体へのこれら標識の結合は、当業者にとって一般的な標準的技術を用いて実施することができる。
本発明の目的のためには、ＨＩＶは、それが生物学的液体および組織に存在する場合は、本発明のモノクローナル抗体によって検出できる。検出可能量のＨＩＶを含むいずれのサンプルも使用可能である。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清などの液体でもよく、また組織や糞便などの固形物もしくは半固形物でもよい。また別に、組織学的診断で一般的に用いられる固形組織でもよい。
より高い感度が得られる別の標識技術は、抗体を低分子ハプテンに共役させることから成る。これらのハプテンは、続いて第二の反応手段によって特異的に検出できる。例えば、ビオチン（これはアビジンと反応する）、ジニトロフェノール、ピリドキサールまたはフルオレセイン（これは特異的な抗ハプテン抗体と反応する）のようなハプテンを用いることが一般的である。
【００４１】  本発明のモノクローナル抗体はインビトロの使用に適している。例えば、上記で述べたようにサンプル中のＨＩＶを検出するために、これら抗体を液相で利用することができるか、または固相担体に結合させることができる免疫アッセーでの使用が適している。これら免疫アッセーのモノクローナル抗体は、インビトロで使用するために検出可能なように種々の方法で標識できる。
抗原をインビボで検出するために本発明のヒトモノクローナル抗体を用いる場合、検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体は、診断的に有効な投与量で与えられる。“診断的に有効な”という用語は、検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体が、当該抗体がそれに対して特性を有するＨＩＶ抗原部位の検出を可能にするために十分な量で投与されることを意味する。
検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体の投与濃度は、バックグラウンドに比較してＨＩＶへの結合が検出可能なように十分なものでなければならない。さらに、検出できるように標識されたモノクローナル抗体は、最良の標的／バックグラウンドシグナル比をもたらすように迅速に循環系から排除されることが望ましい。
【００４２】  一般に、検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体のインビトロ診断用投与量は、個々人の年令、性別および症状の程度にしたがって変動するであろう。ヒトモノクローナル抗体の投与量は、約０．０１ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ２から約１０ｍｇ／ｍ２で変動する。そのような投与量は、例えば複数注射が行われるか否か、さらに組織および当業者に既知の他の因子に左右されて変動することがある。
診断のためのインビボ画像化については、利用可能な検出装置の種類は、与えられる放射性同位元素を選択する場合の主要な因子である。選択される放射性同位元素は、与えられた装置の種類が検出可能な崩壊型をもたなければならない。インビボ診断のために放射性同位元素を選択する場合のまた別の重要な因子は、放射性同位元素の半減期が、標的取り込みが最大の時になお検出できるほど十分に長くなければならず、しかも患者にとって有害な放射線が最小になるように、十分短くなければならないということである。理想的には、インビボ画像化のために用いられる放射性同位元素は、粒子放出を欠くが、通常のγ線カメラで容易に検出できる大量の光量子を１４０−２５０ＫｅＶの範囲で生じる。
【００４３】  インビボ診断では、放射性同位元素は、直接または介在官能基を用いて間接的に免疫グロブリンに結合させることができる。金属性イオンとして存在する放射性同位元素に結合させるためにしばしば用いられる介在官能基は、二官能基性キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることができる典型的な金属性イオンの例は、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒおよび２０１Ｔｌである。
インビボ診断のために、例えば磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の場合は、本発明のモノクローナル抗体はまた常磁性同位元素で標識できる。一般に、診断用画像を可視化する通常のいずれの方法も利用することができる。通常は、γ線および陽電子放出放射性同位元素がカメラ画像化用に、常磁性同位元素がＭＲＩ用に用いられる。そのような技術に特に有用な元素には、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅが含まれる。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ＨＩＶ疾患の治療過程をモニターするためにインビトロおよびインビボで用いることができる。したがって、例えば、ＨＩＶ感染細胞の数の増減、または体内もしくは種々の体液に存在するＨＩＶの濃度の変化を測定することによって、ＨＩＶ疾患を改善することを目的とした特定の治療方法が有効か否かを決定することが可能であろう。
【００４４】Ｅ．診断系
本発明はまた、本明細書に開示する診断方法にしたがってサンプル中のＨＩＶの存在を調べるために、診断系（好ましくはキット形態）を開示する。診断系は、少なくとも１回のアッセーを実施するために十分な量の本題のヒトモノクローナル抗体を別個に包装した試薬として含む。
別の実施例では、診断系は、例えば治療的に投与された抗体の消長をモニターするために、体液中の抗ＨＩＶモノクローナル抗体の存在を調べることを目的とする。この診断系には、少なくとも１回のアッセーを実施するために十分な量のコントロール試薬としての本題の抗体、および好ましくは予め選択された量のＨＩＶ抗原が各々別個に包装された免疫化学試薬として含まれる。
典型的には包装された試薬の使用説明もまた含まれる。
“使用説明”は、典型的には試薬の濃度、または少なくとも１種類のアッセー方法の指標、例えば混合される試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプルの混合物の維持時間、温度、緩衝液の条件などを説明する重要な表現を含む。
体液中のＨＩＶを検出する実施例では、本発明の診断系は、本発明のヒトモノクローナル抗体を含む免疫複合体の形成を知らせることができる標識または表示手段を含むことができる。
【００４５】  ここで使用される語“複合体”は、特異的結合反応たとえば抗体−抗原反応の生成物に関する。例としての複合体は免疫反応生成物である。
ここで使用されるように、これらの様々な文法的形における用語“標識物”および“指示手段”は、複合体の存在を示すための検出可能なシグナルの生成に直接または間接的のいずれかで関係する一つの原子および分子である。標識物または指示手段のいずれも、発現したたんぱく質、ポリペプチド、または本発明の抗体もしくはモノクロナール抗体組成物の一部である抗体分子と結合しているかまたは含まれているか、または別々に使用され、そしてこれらの原子もしくは分子は単独でまたは別の薬剤と共に使用されうる。このような標識物はそれ自体臨床的診断化学でよく知られており、そしてこれらが他の点では新しいたんぱく質方法および／またはシステムで利用される限りにおいてのみ、本発明の一部を構成する。
標識手段は、これらを変性することなく抗体または抗原と化学的に結合して有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光クロム（染料）を形成する蛍光標識剤である。好適な蛍光標識剤は蛍光クロムたとえばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスサミン、ローダミン８２００  スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）などである。免疫フルオレセイン分析技術の記載は、デルカ（ＤｅＬｕｃａ）、“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ，マルシャロニスら（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）編、ジョン  ウィリー  アンド  サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．）、ｐ．１８９−２３１（１９８２）に見られ、これはここに参考として編入される。
【００４６】  好ましい実施態様において、指示群は、酵素たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等である。基本的指示群が酵素たとえばＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼであるような場合、レセプターリガンド複合体（免疫反応物）が形成されている事実を視覚化するために他の試薬が必要である。ＨＲＰに対するこのような他の試薬は、過酸化水素および酸化染料前駆体たとえばジアミノベンジジンである。グルコースオキシダーゼとともに有効な別の試薬は、２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
放射性元素もまた有用な標識剤であり、ここに説明的に使用される。例としての放射性標識剤は、γ線を放出する放射性元素である。これ自身でたとえば１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒのようなγ線を出す元素は、γ線放出−放射性元素指示基の一群を表す。特に好ましいのは１２５Ｉである。有用な標識手段の別の群は、たとえばそれ自身で陽電子を放出する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。このようにして放出された陽電子は、動物の体に存在する電子に遭遇するとγ線を作る。β線エミッターもまた有用である。
標識物の結合、すなわちポリペプチドおよびたんぱく質の標識化は当該技術においてよく知られている。たとえば、ハイブリドーマにより作られた抗体分子は、培養基中で成分として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝による取り込みにより標識化されうる。たとえば、ガルフリーら（Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）を参照せよ。活性化官能基を介したたんぱく質結合またはカップリングの技術は特に利用可能である。たとえば、アウラミスら（Ａｕｒａｍｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８（別冊）、７：７−２３（１９７８），ロッドウェルら（Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：８８９−８９４（１９８４）および米国特許第４，４９３，７９５号を参照せよ。
【００４７】  診断システムはまた、好ましくは別の包装体として、特異的結合剤を含むこともできる。“特異的結合剤”は、本発明の試薬種またはこのような種を含む複合体と選択的に結合しうるがしかしこれ自体は本発明のポリペプチドまたは抗体分子組成物ではない分子本体である。特異的結合剤の例は、第二の抗体分子、これらの補体たんぱく質またはフラグメント、Ｓ．ａｕｒｅｕｓたんぱく質Ａなどである。好ましくは、特異的結合剤は、試薬種が複合体の一部として存在する場合この種と結合する。
好ましい実施態様において、特異的結合剤は標識化される。しかしながら、診断システムが標識化されていない特異的結合剤を含む場合、この特異的結合剤は一般に増幅手段または試薬として使用される。これらの実施態様において、標識化特異的結合剤は増幅手段が試薬種含有複合体と結合している場合増幅手段と特異的に結合することができる。
本発明の診断キットは、血管性体液サンプルたとえば血液、血清または血漿において本発明のＡＰＣ阻害剤の量を検出するための“ＥＬＩＳＡ”フォーマットに使用される。“ＥＬＩＳＡ”は、固相に結合した抗体または抗原および酵素−抗原または酵素−抗体結合体を使用してサンプルに存在する抗原を検出し計量する酵素結合イムノソルベントアッセイに関するものである。ＥＬＩＳＡ技術の記載は、１９８２年にカリフォルニア州、ロスアルトス（Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ）のランゲ  メディカル  パブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）により刊行されたディ．ピィ．サイテスら（Ｄ．Ｐ．Ｓｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）によるＢａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、２２章および米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号および同第４，０１６，０４３号に記載されており、これらはすべて参考としてここに編入される。
【００４８】  すなわち、幾つかの実施態様において、本発明のヒトモノクロナール抗体は、固体マトリックスに固定されて対象となる診断システムにおいて包装体を含む固体支持体を形成することができる。
試薬は一般に水性基剤からの吸着により固体支持体へ固定されるがしかし当業者が熟知しているたんぱく質およびポリペプチドへ適用可能な固定の他のやり方を行うこともできる。
有用な固体マトリックスもまた当該技術で良く知られている。このようなマトリックスは、水不溶性であり、ファルマシア  ファイン  ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ニュージャージー州、ピスキカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））により登録商標セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）として市販されている架橋したデキストラン；寒天；イリノイ州、ノースシカゴ（Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）のアボット  ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能な直径約１ミクロンから約５ｍｍのポリスチレンビーズからなるビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース−またはナイロン系不織布たとえばシート、ストリップもしくはパッドレス；またはたとえばポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルで作られたチューブ、プレートもしくは微量滴定板の凹部などである。
ここに記載したいずれかの診断システムの試薬種、標識化された特異的結合剤または増幅試薬は、溶液において分散液または実質的に乾燥粉末として、たとえば凍結乾燥形で提供される。指示手段が酵素の場合、酵素の基質もまたシステムの別の包装体として提供される。固体支持体たとえば前記した微量滴定板および一つ以上の緩衝剤もまたこの診断分析システムにおいて別の包装体として含まれうる。
【００４９】  診断システムと関連してここで検討した包装材料は、診断システムに通常利用されるものである。
用語“包装”とは、固体マトリックスまたは材料で、たとえばガラス、プラスチック（たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）、紙、ホイルなど、決まった範囲内で診断試薬たとえば本発明のモノクロナール抗体を保持しうるものに関する。すなわち、たとえば包装は瓶、バイアル、プラスチックおよびプラスチック−ホイル積層容器（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）もしくは意図する診断試薬を含むために使用される同様な容器であるかまたはこれは意図する診断試薬の微量を操作により固定するすなわち検出すべき抗体またはポリペプチドが免疫学的に結合しうるように連結した微量滴定板凹部でもよい。
本発明の分析に使用される物質は、キットの製造に実際に適する。このようなキットは、たとえば厳重に密閉されたバイアル、チューブ等の容器一つ以上に受け取るために細分化された担体手段であって、容器手段の各々は方法に使用される別々の要素の一つを含む。たとえば、容器手段の一つは、検出可能に標識化されたまたはされうる本発明のヒトモノクロナール抗体を含む。キットはまた診断方法を行うために使用される他の前記免疫化学的試薬のいずれかを含んでもよい。
Ｆ．合成ＨＩＶヒトモノクロナール中和抗体を作る方法
【００５０】  本発明は、新規合成ＨＩＶヒトモノクロナール中和抗体を作る方法を記載するものである。この方法は一般に、様々な供給源から作られることができ、そして天然ライブラリー、変性ライブラリー、ＨＩＶ特異的免疫反応を示すヒトドナーから直接作られるライブラリーを含む抗体分子の組み合わせライブラリーの使用に基づく。
組み合わせライブラリーの製造および操作方法は文献に広い範囲で記載されており、ここで詳細に検討はしないが、ただし本発明独自の実施態様を作りそして使用するために必要な特徴については例外である。しかしながら、この方法は一般に、ライブラリーの抗体種をクローニングしそして発現するための糸状ファージ（ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ））表面発現ベクターシステムの使用を含む。組み合わせライブラリーを作るための様々なファージミドクローニングシステムが他に記載されている。たとえば、ファージミドにおける組み合わせ抗体ライブラリーの製造については、次のものを参照せよ：カンら（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６（１９９１）；バルバスら（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）；ゼベディら（Ｚｅｂｅｄｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３１７５−３１７９（１９９２）；カンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３（１９９１）；バルバスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）；およびグラムら（Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）；その記載は参考としてここに編入される。
【００５１】  一つの実施態様において、方法は、ＨＩＶ感染ドナーからのドナー免疫細胞メッセンジャーＲＮＡを用いてヒトモノクロナール抗体のファージミドライブラリーを最初に作ることを含む。ドナーは、ＡＩＤＳの兆候を示してもよいが、しかし好ましい実施態様ではドナーは兆候を示さず、したがって得られるライブラリーは実質的にＨＩＶ中和ヒトモノクロナール抗体のより高い値を含む。
他の実施態様において、ドナーは、ＨＩＶに対する免疫反応に関して純粋であり、すなわちドナーはＨＩＶに感染していない。これに代わって、出発ライブラリーは合成であるかまたは他の抗原に対する免疫反応を有するドナーから導いてもよい。
ヒトモノクロナール抗体のファージミドライブラリーを作る方法は、一般に、（１）ライブラリーに対する供給源としてヒト免疫グロブリン遺伝子を使用してベクターをクローニングすることにおいて別々にＨおよびＬ鎖コード遺伝子を作り、（２）ＨおよびＬ鎖コード遺伝子ライブラリーを、ヘテロ二量体抗体分子を発現し構成することのできる一つのジシストロン発現ベクターと組み合わせ、（３）糸状ファージ粒子の表面において構成したヘテロ二量体抗体分子を発現し、（４）予め選択した抗原に対するファージ粒子のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）のような免疫親和技術を用いて表面に発現したファージ粒子を単離し、これにより予め選択した抗原と免疫反応する抗体分子を形成する粒状ＨおよびＬ鎖コード遺伝子を含むファージミドの一つ以上の種を単離することを含む。
【００５２】  ここに記載した例として、得られるファージミドライブラリーを操作して、ライブラリーのモノクロナール抗体の免疫特異性を増加および／または変更し、“合成”抗体と言われる本発明の別の好ましいヒトモノクロナール抗体を作り、次いで同定する。なぜなら、これはヒトから直接得られないが、しかし合成操作に従ってヒト抗体から誘導されるからである。これに代わり、特定の予め選択されたモノクロナール抗体を操作してここに別に記載したように優れた性質を有する合成抗体を得ることができる。
たとえば、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖免疫グロブリン分子コード遺伝子は、ランダムに混合（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）され、組み立てた免疫グロブリン分子において新しいＨＬ対を作りだす。さらに、ＨおよびＬ鎖コード遺伝子のいずれかまたは両方は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の一つ（またはそれ以上）の相補的測定領域（ＣＤＲ）において突然変異誘発され、次いで好ましい免疫反応および中和化能力についてスクリーニングする。
一つの実施態様において、ＨおよびＬ鎖を、ここに記載した“二型（ｂｉｎａｒｙ）”システムとして言及される、別々のモノシストロン発現ベクターへクローニングすることができる。この方法において、上記（２）工程は、ＨおよびＬ鎖コード遺伝子の組み合わせが二つの二型プラスミドを表面受入れ可能な抗体ヘテロ二量体分子を有するファージミドの発現および組立のために一つの宿主細胞へ導入することにより生じる点で異なる。
【００５３】  本発明方法において、抗体分子はモノクロナールてあり、なぜならクローニング方法は抗体製造細胞列のクローン的に純粋な種の組成を可能にするからである。更に、モノクロナール抗体は、ＨおよびＬ鎖コード遺伝子がヒト免疫グロブリン産生免疫細胞たとえば脾臓、胸線、骨髄等から得られるものから誘導されるので、ヒトからである。
ＨＩＶヒトモノクロナール中和抗体を作る方法はまた、予め選択されたＨＩＶ抗原と免疫反応する得られる抗体ライブラリーが中和能力を測定するためにここに記載されている分析の一つ以上においてＨＩＶを中和するための能力を有する抗体種の存在についてスクリーニングすることが必要である。すなわち、ＨＩＶ抗原と結合する抗体分子、好ましくはｇｐ１６０，ｇｐ１２０，ｇｐ１６０のＶ３ループ領域、またはｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の好ましいライブラリーを最初に作り、次いでここに記載したようにＨＩＶ中和抗体の存在についてスクリーニングする。
別のライブラリーは、別のＨＩＶ−免疫反応性およびヒトモノクロナール中和抗体について混合ライブラリーからスクリーニングすることができる。
本発明の別の特徴として、抗体分子のＨおよびＬ鎖コード遺伝子のヌクレオチドおよび相当するアミノ酸残基配列が核酸配列決定により測定される。主なアミノ酸残基配列の情報は抗体分子のエピトープ反応性について重要な情報を提供する。
【００５４】  本発明の合成ヒトモノクロナール抗体は、モノクロナール抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を変えることにより作られる。たとえば、特定部位突然変異誘発により、発現ベクターのヌクレオチド配列を変え、これにより得られた発現アミノ酸残基の配列において変化をもたらすことができる。すなわち、たとえば配列番号：２のアミノ酸残基配列を、相当する核酸の突然変異を介して配列番号：３のアミノ酸残基へ転化することができる。同様に、公知ポリヌクレオチドをランダム突然変異によりこれをランダムに変え、変えたポリヌクレオチドを発現システムへ再導入しそして続いてＨＩＶ中和活性についてのＨ：Ｌ対の生成物をスクリーニングする。
特定部位およびランダム突然変異誘発方法は、ポリヌクレオチド技術でよく知られており、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変えるための方法として制限するものではない。
【００５５】  免疫親和性により分離された抗体におけるファージ粒子の存在のために、一つの実施態様は、ファージミドベクターを含む宿主大腸菌細胞により可溶性Ｆａｂフラグメントが分泌されるように免疫グロブリンコード遺伝子を切り取るために得られるクローン化遺伝子の操作に関連する。すなわち、得られる操作したクローン化免疫グロブリン遺伝子は可溶性Ｆａｂを産生し、これは、エピトープ結合研究についてＥＬＩＳＡ分析において、公知の抗−ＨＩＶ抗体分子との競合分析において、およびＨＩＶ中和分析において直ちに特性決定される。可溶化Ｆａｂは比較および特性決定研究のために再生産可能なそして比較可能な抗体調製を提供する。
可溶性Ｆａｂの調製は、一般に、免疫学的技術において記載され、そして実施例において記載したように実施されうるか、またはブルトンら（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）に記載されているように行われる。
さらに、よく知られているように、Ｆａｂをさらに処理して、Ｆｃを定義するポリペプチド配列を再度付け加えることにより機能的Ｆｃ領域を含む抗体分子全体を直ちに作ることができる。
１．抗−ＨＩＶモノクロナール抗体を発現するためのファージ表示発現ベクターおよびポリヌクレオチド
【００５６】  本発明のヒトモノクロナール抗体の調製は、一実施態様において、ここで記載した組み合わせ抗体ライブラリーーを調製するために使用されるベクターをクローニングしそして発現することによる。クローニングした免疫グロブリンの大きいおよび小さい鎖遺伝子はラムダベクター、ファージミドベクターおよびプラスミドベクターの間でここに記載した方法の様々な段階にて混ぜることができる。
ファージミドベクターは、構成した糸状ファージ粒子の表面に発現される融合たんぱく質を作る。ファージ表示（ｄｉｓｐｌａｙ）ベクターを使用すると、発現した表示たんぱく質の非常に大きな集団をスクリーニングしこれにより所望の結合反応をコードする一つ以上の特定クローンの位置を突き止める手段を提供することにより特に有利である。ファージ表示を使用すると、本発明の複数の種が迅速で再現性良く分離される。たとえば、四個の抗体が本発明の一つの実施例で産生された。
【００５７】  ファージ表示ベクターの使用は、ファージミドに基づく抗体分子の組み合わせライブラリーのすでに記載した使用から導かれる。組み合わせライブラリーーの産生および操作方法は文献において非常に広範囲に記載されており、ここで詳細には検討しないが、ただし本発明独自の実施態様を作り使用するために必要な特徴は除く。しかしながら、方法は一般に、ライブラリーの抗体種をクローニングし発現するための糸状ファージ（ファージミド）表面発現ベクターシステムの使用を含む。組み合わせライブラリーを作るための様々なファージミドクローニングシステムは他にも記載されている。たとえば、ファージミドにおける組み合わせ抗体ライブラリーの調製は、以下の文献に記載されたようなものである：カンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：４３６３−４３６６（１９９１）；バルバスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）；ゼベディら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３１７５−３１７９（１９９２）；カンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：１１１２０−１１１２３（１９９１）；バルバスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）；およびグラムら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）；これらの記載は参考としてここに編入される。
本発明のファージミドベクターは、アミノからカルボキシ末端の方向に向かって、（１）原核生物分泌シグナルドメイン、（２）免疫グロブリンの大きいまたは小さい鎖可変領域を定義する非相同ポリペプチド、および（３）糸状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドをコードしそして発現しうるヌクレオチド配列を含む組み換え体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）である。ベクターは融合ポリペプチド、好ましくは原核生物対照配列を発現するＤＮＡ発現対照配列を含む。
【００５８】  糸状ファージ膜アンカーは好ましくは、糸状ファージ粒子のマトリックスと結合することのできるｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコートたんぱく質のドメインであり、これによりファージ表面上に融合ポリペプチドを組み込む。
ベクターに対する好ましい膜アンカーは、糸状ファージＭ１３，ｆ１，ｆｄおよび同等の糸状ファージから得られうる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによりコードされるコートたんぱく質において見出される。糸状ファージ膜たんぱく質の膜アンカードメインは、好ましくはコートたんぱく質のカルボキシ末端領域の一部であり  脂質二重層膜にまたがる疎水性アミノ酸残基の領域および膜の細胞質面で通常見出され膜から延びる帯電アミノ酸残基の領域を含む。
ファージｆ１において、遺伝子ＶＩＩＩコートたんぱく質の膜間領域は残基Ｔｒｐ−２６からＬｙｓ−４０までを含み、細胞質領域は４１から５２のカルボキシ−末端１１残基を含む（オーカワら（Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：９９５１−９９５８，１９８１）。例としての膜アンカーは、ｃｐＶＩＩＩの残基２６から４０からなる。すなわち、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３糸状ファージ遺伝子ＶＩＩＩコートたんぱく質（これもまたｃｐＶＩＩＩまたはＣＰ８と指定される）から誘導される。遺伝子ＶＩＩＩコートたんぱく質はコートたんぱく質の一般的には約２５００から３０００のコピーを有するファージ粒子の大部分にわたって成熟糸状ファージに存在する。
【００５９】  さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３糸状ファージ遺伝子ＩＩＩコートたんぱく質（これもまたｃｐＩＩＩと指定される）から誘導される。遺伝子ＩＩＩコートたんぱく質はコートたんぱく質の一般的には約４から６のコピーを有するファージ粒子の一端部において成熟糸状ファージに存在する。
糸状ファージ粒子の構造、これらのコートたんぱく質および粒子構成体の詳細な記載については、次の文献を参照せよ：ラチェッドら（Ｒａｃｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５０：４０１−４２７（１９８６）；モデルら（Ｍｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、“Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ：Ｖｏｌ．２”、アール．カレンダー（Ｒ．Ｃａｌｅｎｄａｒ）編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ｐ．３７５−４５６（１９８８）。
分泌シグナルは、グラム陰性菌の原形質膜に対してたんぱく質を攻撃するたんぱく質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルは、ｐｅ１Ｂ分泌シグナルである。エウニア  カロトバ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａ）からの二つのｐｅ１Ｂ遺伝子生成物変種からの分泌シグナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列は、レイら（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３−５４６（１９８８）に記載されている。
【００６０】  ｐｅ１Ｂたんぱく質のリーダー配列は、融合たんぱく質に対する分泌シグナルとしてこれまで使用されてきた（ベターら（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；サストリーら（Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：５７２８−５７３２（１９８９）；ムリナックスら（Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７：８０９５−８０９９（１９９０））。
別の好ましい分泌シグナルは、ｏｍｐＡ分泌シグナルである。大腸菌からのｏｍｐＡ遺伝子生成物からの分泌シグナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列は、モッバら（Ｍｏｖｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：３１７−３２８（１９８０）に記載されている。
ｏｍｐＡたんぱく質のリーダー配列は、スケッラら（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４１（１９８８）による融合たんぱく質に対する分泌シグナルとしてこれまで使用されてきた。
本発明に有用な大腸菌からの他の分泌シグナルポリペプチドドメインに対するアミノ酸残基配列は次のものに記載されている：オリバー（Ｏｌｉｖｅｒ），Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，ニードハード、エフ．シィ．（Ｎｅｉｄｈａｒｄ，Ｆ．Ｃ．）編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１：５６−６９（１９８７）。
ＤＮＡ発現対照配列は、構造遺伝子生成物を発現するための一連のＤＮＡ発現シグナルからなり、そしてよく知られているように、シストロンが構造遺伝子生成物を発現することができるように、シストロンへ作動的に結合した５’および３’の単位を両方とも含む。５’対照配列は、転写を開始するプロモーターおよび上流の翻訳可能なＤＮＡ配列の５′末端で作動的に結合したリボソーム結合部位を定義する。
３′対照配列は、非相同融合ポリペプチドと作動的に結合して形成したフレームにおいて少なくとも一つの停止（ストップ）コドンを定義する。
【００６１】  好ましい実施態様において、利用されるベクターは、複製またはレプリコンの原核生物起点を含み、すなわち自己複製を行いそしてこれで形質転換された原核生物宿主細胞たとえば細菌宿主細胞において染色体外組み換えＤＮＡ分子を維持することができる。このような複製の起点は、当該技術で良く知られている。好ましい複製の起点は、宿主微生物において有効なものである。好ましい宿主細胞は大腸菌である。大腸菌にベクターを使用するために、好ましい複製の起点は、ｐＢＲ３２２および他の通常のプラスミドの変種に見られるＣｏ１Ｅ１である。また好ましくは、ｐＡＣＹＣｐおよびその誘導体に見られる複製のｐ１５Ａ起点である。Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５Ａレプリコンは、分子生物学で非常に広範囲に使用されており、これは様々なプラスミドにおいて利用可能であり、少なくとも次のものに記載されている：サムブロックら（Ｓｑａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）。
【００６２】  Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５Ａレプリコンは、二つの“二型”プラスミドを利用する本発明の一実施態様において使用するのに特に好ましい。なぜなら、これらは各々大腸菌においてプラスミドの複製を行うことができ、一方で他のレプリコンは同じ大腸菌の第二のプラスミドに存在するからである。換言すれば、Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５Ａは、同じ宿主において二つのプラスミドの維持を可能にする非−干渉性レプリコンである（たとえば、サムブルックら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ｐ．１．３−１．４）。この特徴は、二型ベクターを使用した場合に特に重要であり、なぜなら、たとえば第一のベクターが大きい鎖のポリペプチドを発現し第二のベクターが小さい鎖のポリペプチドを発現する場合、ファージ複製を許す一つの宿主細胞が二つの別々のベクターの別々の同時複製を維持しなければならないからである。
さらに、原核生物レプリコンを含む実施態様は、これで形質転換された細菌宿主に対しその発現により選択的利点、たとえば薬剤耐性を与える遺伝子を含むことができる。代表的細菌性薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与するものである。ベクターはまた一般的には翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入のために都合のよい制限部位を含む。このようなベクターの例は、プラスミドｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９であり、これらはカリフォルニア州、リッチモンドのバイオラド  ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手でき、そしてニュージャージィー州ピッツカタウェイのファルマシアからはｐＰＬおよびｐＫＫ２２３が入手できる。
【００６３】  ここで使用されるように、用語“ベクター”は、異なった遺伝的環境の間を、これが作動的（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）に結合している他の核酸まで移動しうる核酸分子に関する。好ましいベクターは、自己複製することができそしてこれが作動的に結合しているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子生成物の発現ができるものである。したがってベクターは、好ましくは前記したようなレプリコンおよび選択可能な標識物を含む。
ＤＮＡ配列またはセグメントに関しここで使用されているように、“作動的に結合した”とは、配列またはセグメントが、通常のリン酸ジエステル結合により、一重鎖または二重鎖形に係わらず、ＤＮＡの一つのストランドへ共有結合により結合していることを意味する。本発明の転写単位またはカセットが作動的に結合したベクターの選択は、当該技術でよく知られているように、所望の機能的性質、たとえばベクター複製、たんぱく質発現および形質転換される宿主細胞に依存するが、これらは組み換えＤＮＡ分子を構築する技術において特有の制限である。
【００６４】  好ましい実施態様において、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の技術にしたがってゲノムを封入した糸状ファージ粒子の形で通常の操作のためにデザインされる。この実施態様において、ＤＮＡ発現ベクターはさらに、複製の糸状ファージ起点を定義するヌクレオチド配列を含み、これによりベクターーが、適当な遺伝子相補性を示した時、一重鎖ストランド複製形の糸状ファージとして複製しそして糸状ファージ粒子へ包装されうる。この特徴はＤＮＡ発現ベクターがファージ粒子へ包装される能力を提供し、そしてここに含まれるベクターがファージ粒子の集団を含む他の粒子から離れる。
複製の糸状ファージ起点は、よく知られているように、複製の開始、複製の終結および複製により作られる複製可能形体の包装に対する部位を定義するファージゲノムの領域である（たとえば、ラスチェドら（Ｒａｓｃｈｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４０１−４２７，１９８６；およびホリウチ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８８：２１５−２２３，１９８６）。本発明に使用するための複製の好ましい糸状ファージ起点は、複製のＭ１３，ｆ１またはｆｄファージ起点である（ショートら（Ｓｈｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８）。
【００６５】  本発明のファージミド表示たんぱく質をクローニングし発現するための好ましいＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロンプラスミド発現ベクターｐＣｏｍｂ３，ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ  ｐＰＨＯ−ＴＴおよびｐＭＴ４−３である。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴおよびｐＰＨＯ−ＴＴの全ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号：４３および５１における配列リストで示す。
遺伝子コードおよびこれに付随する重複のために、多数のポリヌクレオチド配列は意図する大または小鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列をコードするようにデザインされる。すなわち、本発明は、遺伝子コードの重複の特徴を組み入れた変更したポリヌクレオチド配列を意図するものである。
本発明のファージミドおよび発現ベクターは、様々な方法で製造されうる。ベクターは好ましいベクターの開示した全ヌクレオチド配列を用いて成分の一部から構成されてもよいし、または存在するベクターを選択的に修飾することにより誘導してもよい。他の方法も、当業者にとって明らかであり、したがって、ベクターの製造および処理方法は本発明を限定するものと考えるべきではない。
【００６６】  本発明のヒトモノクロナール抗体を作るための発現ベクターーが抗体の発現と適合する宿主細胞に保持される限りにおいて、本発明はこの発明のベクターーまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意図する。好ましい宿主細胞はここに記載したように大腸菌である。
本発明のファージミド表示たんぱく質を作るために使用される好ましい発現ベクタープラスミドｐＭＴ４−３は、ここに記載したように、メリーランド州、ロックヴィレのアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）で、ブダペスト条約の要求に従って、１９９３年１０月１９日にｐＭＴ４の形で寄託された。
用語“ｐＭＴ４−３”は、遺伝子３膜アンカーが存在する特定のファージミド発現ベクターに関し、用語“ｐＭＴ４”は、同じベクターであるが但し遺伝子３膜アンカーが除去されて発現したＦａｂが実施例に記載のように可溶性であるようなものに関する。
ポリヌクレオチドがヒトモノクロナール抗体大および小鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を作るためのＤＮＡ発現ベクターの成分の一部であるかぎり、本発明はまたこのような大および小鎖配列をコードする分離したポリヌクレオチドをも意図するものである。
【００６７】２．オリゴヌクレオチド
この発明の合成ヒト抗体分子を形成するためのクローン化免疫グロブリンの修飾には、クローン化免疫グロブリン遺伝子の予め選択されたドメインに無作為突然変異を導入するように設計された合成オリゴヌクレオチドの使用が関与する。さらに、ここに記述されるオリゴヌクレオチド法には、変質オリゴヌクレオチドを用いることにより、単一の反応で異なる結合部位の巨大なポピュレーションが創出される特別な利点がある。
この方法の１つにおいて用いられる好ましいオリゴヌクレオチドの一般的な構造を以下にさらに記述する。
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドは、周知の様々な化学反応によって合成することができる。゛Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、ＪＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ＮＹ（１９９０）が優秀な書評誌である。適切な合成法には、例えば、ホスホトリエステル又はホスホジエステル法が含まれる。これらについては、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０、（１９７９）；米国特許４、３５６、２７０号；及びＢｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９、（１９７９）を参照のこと。プライマー伸長及びＰＣＲ反応で用いるための合成されたオリゴヌクレオチドの精製は周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、（１９８７）を参照のこと。例示合成は実施例に記述されている。
【００６８】３．プライマー伸長反応
プライマー伸長によって合成されるプライマー、プローブ及び核酸断片もしくは分節に関してここで用いられる“ポリヌクレオチド”という用語は、２以上、好ましくは３より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含んでなる分子であると定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存するであろうし、その因子はまた、使用の最終条件に依存する。
ここで用いられる“プライマー”という用語は、核酸制限分解から精製されたものであろうと、あるいは合成によって生成したものであろうと、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下におかれた場合、すなわち、ヌクレオチド及び重合の作用物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の存在下、並びに適切な温度及びｐＨにおかれた場合に、核酸合成の開始点として作用し得るポリヌクレオチドを指す。このプライマーは、最大の効率を得るためには好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖の形態であってもよい。二本鎖である場合には、伸長生成物の調製に用いる前に、まずプライマーを処理してその相補鎖から分離する。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合の作用物質の存在下において伸長生成物の合成を開始するに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度及びプライマーの源を含む多くの因子に依存するであろう。例えば、標的配列の複雑さによって、ポリヌクレオチドプライマーは、より少ない数のヌクレオチドであってもよいのであるが、典型的には１５ないし２５、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含む。短いプライマー分子は、テンプレートとの十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。
【００６９】  ここで用いられるプライマーは、合成もしくは増幅される特定の配列の各々の異なる鎖に“実質的に”相補的であるように選択される。これは、プライマーが、その各々のテンプレート鎖と選択的にハイブリダイズするに十分な相補性を有していなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映していても、いなくてもよい。例えば、非相補的なヌクレオチド断片が、配列の残りの部分がこの鎖に実質的に相補的なプライマーの５’末端に付着することが可能である。このような非相補的な断片は、典型的には、エンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。あるいは、プライマー配列が、合成もしくは増幅される鎖の配列と選択的にハイブリダイズするに十分な相補性を有しており、それによってポリヌクレオチド合成条件の下で伸長生成物が形成されるのであれば、非相補的な塩基もしくはより長い配列をこのプライマーの所々に挿入することもできる。
【００７０】  本発明のプライマーは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列またはその相補鎖を含んでいてもよい。例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：７０５７−７０（１９８４）；Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８９：１１３−１３０（１９８６）；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）を参照のこと。
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むプライマーが用いられる場合には、このプライマーを増幅されるポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせ、Ｅ．  ＣｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、又はＥ．ＣｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いることでＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモータの第２のポリヌクレオチド鎖を完成させる。出発ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドとＤＮＡポリヌクレオチドの生成を交互に行うことにより増幅される。
プライマーは、テンプレート配列又はＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼの複製開始部位を含んでいてもよい。典型的なＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼには、Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７−１２０２（１９８８）に記述されるＱＢレプリカーゼが含まれる。ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼは、テンプレート配列又は複製開始部位を含む少数のテンプレートＲＮＡ鎖から多数のＲＮＡ鎖を生成する。Ｋｒａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、８９：７１９−７３６（１９７４）に記述されているように、これらのポリメラーゼによって、典型的には、テンプレート鎖の１００万倍の増幅が得られる。
【００７１】  プライマーのヌクレオチドの選択は、結合部位が導入される、表示タンパク質（ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の領域からの核酸上の距離、あらゆる第２のプライマーに対する核酸上のハイブリダイゼーション部位のような因子に依存する。
ＰＣＲ反応は、あらゆる適当な方法を用いて行われる。一般には、ＰＣＲ反応は、緩衝水溶液、すなわち、好ましくはｐＨ７−９、最も好ましくは８のＰＣＲバッファー中で起こる。好ましくは、モル過剰量のプライマーをテンプレート鎖を含むバッファーに加える。このプロセスの効率を向上させるためには、プライマー対テンプレートが約１０４：１のモル大過剰量であることが好ましい。
また、ＰＣＲバッファーには、全てプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応に適当な量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに典型的には温度安定性のポリメラーゼも含まれる。得られた溶液（ＰＣＲ混合液）を、約１ないし１０分間、好ましくは約４分間、摂氏約９０度（９０℃）ないし１００℃に加熱する。この加熱期間の後、溶液を、プライマーハイブリダイゼーションに適当な５４℃に冷却する。この合成反応は、室温から、それより上ではポリメラーゼ（誘発作用物質）がもはや効率的に機能しない温度で起こり得る。このため、例えばＤＮＡポリメラーゼを誘発作用物質として用いた場合には、一般にこの温度は約４０℃以下である。例としてのＰＣＲバッファーには以下のものが含まれる：バッファー１００マイクロリットル（μｌ）当り、５０ミリモル（ｍＭ）ＫＣｌ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ；ｐＨ８．３；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．００１％（重量／容量）ゼラチン；２００マイクロモル（μＭ）ｄＡＴＰ；２００μＭ  ｄＴＴＰ；２００μＭ  ｄＣＴＰ；２００μＭ  ｄＧＴＰ；及び２．５ユニットのＴｈｅｒｍｕｓ  ａｇｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許４、８８９、８１８号）。
【００７２】  誘発作用物質は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を遂行する機能を果たすいかなる化合物またはシステムであってもよい。この目的に適切な酵素には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及び、熱安定性酵素を含めて、核酸鎖の各々に対して相補的なプライマー伸長生成物を形成するための正しい様式でのヌクレオチドの組み合わせを容易にする他の酵素が含まれる。一般に、この合成は各プライマーの３’末端で開始され、合成が終了するまでテンプレート鎖に沿って５’方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。しかしながら、５’末端で合成を開始し、上記プロセスを用いて上の方向に進行する誘発作用物質も存在し得る。
【００７３】  また、誘発作用物質は、酵素を含めて、ＲＮＡプライマー伸長生成物の合成を遂行する機能を果たす化合物またはシステムであってもよい。好ましい態様においては、この誘発作用物質は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。Ｃｈａｍｂｅｌｉｎら、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｐ．Ｂｏｙｅｒ編、ＰＰ．８７−１０８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８２）に記述されているように、高ターンオーバ率のＲＮＡポリメラーゼは出発ポリヌクレオチドを増幅する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの他の利点は、Ｊｏｙｃｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７：７１１−７２２（１９８９）に既述されているように、ｃＤＮＡのある部分を１以上の突然変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置換し、この部分的に組み合わせが不適切なテンプレートを直接転写することにより、ポリヌクレオチド合成に突然変異を導入できることである。転写に基づく増幅システムは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、ｐｐ．２４５−２５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ（１９９０）にＧｉｎｇｅｒａｓらによって記述されている。
誘発作用物質がＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼであり、したがってリボヌクレオチド三リン酸塩が組み込まれている場合には、十分な量のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰをプライマー伸長反応混合液に添加し、得られた溶液を上述の通り処理する。
【００７４】  新たに合成された鎖及びその相補核酸鎖は、ＰＣＲとして知られるこのプロセスの次工程において用いることができる二本鎖分子を形成する。
ＰＣＲは、典型的には、サーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）、すなわち、下限が約１０℃ないし約４０℃、かつ上限が約９０℃ないし約１００℃の温度範囲内でＰＣＲ反応混合液の温度の上昇及び下降を繰返すことにより行われる。この上昇及び下降は連続的なものであってもよいが、好ましくは、各々の温度がポリヌクレオチド合成、変性及びハイブリダイゼーションに有利な相対的温度安定期を有する段階的なものである。
ＰＣＲ増幅法は、米国特許４、６８３、１９２号、４、６８３、２０２号、４、８００、１５９号及び４、９６５、１８８号、並びに“ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）；及び“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９０）を含む少なくともいくつかのテキストに詳細に記述されており、これらの教示は参照することによりここに組み込まれる。
オリゴヌクレオチド及びこの発明の方法を用いる好ましいＰＣＲ反応は、実施例に記述されている。
【００７５】４．合成抗体の生成方法
本発明は、モノクローナル抗体又はこの発明のモノクローナル抗体のライブラリーの多様性を変化させる方法を提供する。これらの方法は一般にライブラリーの多様性を増大させ、それにより、所望の、かつ改良された結合活性及びＨＩＶ−中和活性についてスクリーニングを行うエピトープ結合複合体候補のプールを増加させる。あるいは、この方法は、エピトープ結合複合体のクラスを増加させることに向けることもできる。このクラスは、典型的には、予め選択された抗原もしくは抗原群に存在する特定のエピトープもしくはエピトープ系統群に結合する能力によって定義される。
合成モノクローナル抗体を生成する方法は、一般に、（１）ここに記述されているオリゴヌクレオチドを用いるプライマー伸長によってファージミド表示タンパク質ベクターにコードされている免疫グロブリン可変遺伝子の予め選択された部分に突然変異誘発によって無作為突然変異を導入し、各々ファージミド表面表示タンパク質上に現れる異なるモノクローナル抗体を発現し得る表示ベクター（ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒ）の大きなポピュレーションを形成し、（２）糸状ファージ粒子表面上に表示タンパク質及び抗体を発現させ、及び（３）予め選択された標的分子に対するファージ粒子のパンニングのような親和性技法を用いて表面発現ファージ粒子を単離し、それによって予め選択された標的分子に結合する合成モノクローナル抗体を含むファージミドの１種以上を単離することに関与する。
【００７６】  例としての、免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ３領域における結合部位の調製が実施例に記述されている。関心のある結合部位を発現し得る特定のベクターの単離は、糸状ファージ遺伝子の発現及びファージ粒子の組立てが可能な宿主細胞にジシストロニック（ｄｉｃｉｓｒｔｏｎｉｃ）発現ベクターを導入することに関与する。典型的には、宿主はＥ．ｃｏｌｉである。その後、ファージミド発現ベクターを有する宿主細胞にヘルパーファージゲノムを導入し、ファージ粒子の組立てに必要な遺伝的な補足を行う。得られた宿主細胞を培養して導入されたファージ遺伝子及び表示タンパク質遺伝子を発現させ、さらにファージ粒子を組み立てて宿主細胞から脱落させる。次いで、脱落したファージ粒子を宿主細胞培養培地から回収（収集）し、所望の結合特性についてスクリーニングする。典型的には、回収した粒子を予め選択した分子との結合について“パンニング”する。次に、強く結合する粒子を収集し、粒子の個々の種をコロニーによって単離して、標的分子に対する結合性及びＨＩＶ中和についてさらにスクリーニングする。所望の結合特性と中和能力の抗体分子を生成するファージを選択する。
【００７７】  本発明のさらなる特徴付けとして、この結合部位をコードするヌクレオチド及び対応するアミノ酸残基の配列が核酸配列決定法によって決定される。一次アミノ酸残基配列の情報によって結合部位の反応性に関する本質的な情報が得られる。
核酸の突然変異は様々な手段で発生させることができるが、本発明のＰＣＲ法の最中に，ＰＣＲ反応によって発生させることが最も好都合である。周知の通り、ＰＣＲ突然変異誘発は無作為のものでも、特定のヌクレオチド配列を指向するものでもよい。無作為突然変異誘発に有利な条件下でＰＣＲを行うことは以前に記述されており、“エラー傾向のあるＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）”と呼ばれている。同様に、指向性突然変異誘発は、特定のタイプの突然変異をヌクレオチド配列の特定の領域に狙いを定めて導入するように設計されたＰＣＲプライマーの使用に関与する。
態様の１つにおいて、本発明は、本発明のエピトープ結合複合体ポリペプチドに存在する抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のＰＣＲ指向性突然変異誘発によって、１以上のエピトープ結合複合体の多様性を増加することを目論んでいる。ＣＤＲ突然変異誘発は、以前に、ネズミ抗体のＣＤＲ領域にヒトの配列を導入することによる抗体の“ヒト化”について一般的な用語で記述されている。欧州特許出願ＥＰ２３９４００を参照のこと。
【００７８】  このように、本発明は、本発明のＤＮＡベクターに存在するクローン化免疫グロブリン遺伝子の免疫学的特異性を変える突然変異誘発法を目論んでいる。この方法は、免疫グロブリン遺伝子の予め選択されたＣＤＲにおける指向性突然変異誘発であって、標的ＣＤＲを有するクローン化免疫グロブリン遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）をＣＤＲの予め選択された領域の増幅に適したＰＣＲ条件に処することを包含する突然変異誘発を提供する。この方法においては、ｒＤＮＡ分子を、増幅ＰＣＲ生成物を生成することが知られているＰＣＲプライマー対の第１のプライマーを構成するＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドであって、予め選択されたＣＤＲから誘導されるものの上記ＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を含む下記プライマーを含むＰＣＲ条件に処する。このＰＣＲ増幅条件における第２のオリゴヌクレオチドは、ここに記述されているように、突然変異誘発を受ける免疫グロブリンから誘導されるいかなるＰＣＲプライマーであってもよい。
以下に記述されるように、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる方法が好ましい。
【００７９】  したがって、関連する態様においては、免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に突然変異を誘発するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドが目論まれている。このオリゴヌクレオチドは３’及び５’末端を有し、さらに（１）免疫グロブリン遺伝子の第１フレームワーク領域とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をその３’末端に含み、（２）免疫グロブリン遺伝子の第２フレームワーク領域とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をその５’末端に含み、かつ（３）免疫グロブリン遺伝子の第１及び第２フレームワーク領域の間に存在するＣＤＲへのＰＣＲ中の突然変異誘発に適しており、それによってＣＤＲに突然変異を生成させるヌクレオチド配列をその３’末端と５’末端との間に含んでいる。
免疫グロブリン遺伝子が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の両者に、各々個別のフレームワーク領域で分離されている３つのＣＤＲを有する限りにおいて、標的ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域とハイブリダイズするように上記５’及び３’ヌクレオチド配列を選択することにより、上記の例が特定のＣＤＲへの突然変異の導入に容易に適用可能であることが理解される。したがって、上記第１及び第２フレームワーク配列は、重鎖もしくは軽鎖のいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３に隣接する保存領域であればよい。
【００８０】  突然変異誘発を受けるオリゴヌクレオチドの３’及び５’末端ヌクレオチド配列の長さは、その長さがハイブリダイズさせようとする標的フレームワーク配列に相補的なヌクレオチドの広がりを提供するのであれば、周知の長さの範囲内で変化させることができる。３’末端ヌクレオチド配列の場合には、十分な長さと、突然変異を誘発させようとするＣＤＲに対して３’に位置する、ハイブリダイズさせようとする標的フレームワーク領域に対する相補性とを有しており、かつプライマー伸長反応を開始するための３’ヒドロキシル末端を提供しなればならない。５’末端ヌクレオチド配列の場合には、十分な長さと、突然変異を誘発させようとするＣＤＲに対して５’に位置する標的フレームワーク領域であって、完全な免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を組立てるために上記ＰＣＲ重複伸長反応においてハイブリダイズするための手段を提供するフレームワーク領域に対する相補性とを有していなければならない。
【００８１】  ＣＤＲに隣接するフレームワーク領域は免疫学分野において十分に特徴付けられており、この明細書の他の部分に記述されているように、周知のヌクレオチド配列及びコンセンサス配列が含まれる。単一の予め選択された免疫グロブリン遺伝子が突然変異を受ける場合には、特定のＣＤＲに隣接する、フレームワークが定義された配列が知られており、もしくはヌクレオチド配列決定プロトコルによって容易に決定することができる。可能な限りの免疫グロブリン遺伝子が突然変異を受ける場合には、この明細書の他の部分に記述されているように、フレームワークから誘導された配列は好ましくは保存される。
好ましくは、３’及び５’末端ヌクレオチド配列の長さは、それらの長さが正確かつ反復可能なハイブリダイゼーションを保証するために必要ではないとしても、各々少なくとも６ヌクレオチドの長さであり、５０ヌクレオチドもしくはそれ以上の長さまでであってもよい。１２ないし３０ヌクレオチドの範囲の長さ、典型的には約１８ヌクレオチドであることが好ましい。
【００８２】  ＣＤＲの突然変異誘発に適した、３’及び５’末端の間に位置するヌクレオチド配列は、上記方法によって新規の配列が組み込まれるのであれば、いかなるヌクレオチド配列であってもよい。しかしながら、本発明のアプローチは、突然変異を受けるＣＤＲにおいてランダム化もしくはほぼランダム化されたヌクレオチドを定義する冗長配列の集団を用いて、単一のＰＣＲ反応で突然変異が誘発されたＣＤＲの大集団を生成する手段を提供する。
ＣＤＲ１の突然変異誘発に好ましいオリゴヌクレオチドには、例えば、５’から３’に向かって式Ａ−Ｂ−Ｃで表されるヌクレオチド配列が含まれる。ここで、Ａ及びＢはそれぞれＦＲ１及びＦＲ２に相補的な核酸配列を表し、Ｂは式［ＮＮＳ］ｎ（ここで、Ｎは独立にいかなるヌクレオチドでもよく、ＳはＧもしくはＣ、ｎは３ないし約２４）を有する核酸配列を表し、ＦＲ１及びＦＲ２はそれぞれＣＤＲ１の５’及び３’末端に隣接するフレームワーク領域である。好ましくは、ｎは５である。
【００８３】  同様に、ＣＤＲ３の突然変異誘発に好ましいオリゴヌクレオチドには、例えば、５’から３’に向かって式Ｃ−Ｄ−Ａで表される、ＣＤＲ３のセンス（コード）鎖に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。ここで、Ａ及びＣはそれぞれＦＲ３及びＦＲ４に相補的な核酸配列を表し、Ｄは式［ＭＮＮ］ｎ（ここで、Ｎは独立にいかなるヌクレオチドでもよく、ＭはＣもしくはＡ、ｎは３ないし２４）を有する核酸配列を表し、ＦＲ３及びＦＲ４はそれぞれＣＤＲ３の５’及び３’末端に隣接するフレームワーク領域である。好ましくは、ｎは４である。
このように、本発明は、糸状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増大させる方法であって、ａ）本発明による１以上の糸状ファージ粒子を用意する工程、及びｂ）ＤＮＡ発現ベクターを有する用意されたファージ粒子の各々に存在する、免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に突然変異を誘発して、各々突然変異が誘発された免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を有するファージ粒子のライブラリーを形成する工程を具備する方法を目論んでいる。
【００８４】  この用意には、突然変異誘発ＰＣＲ反応の準備に核酸を単離するために、ライブラリーのファージ粒子のゲノムを操作することが含まれ得る。ＰＣＲ反応に用いるためのファージゲノム単離のためのファージライブラリーの操作は、この明細書の他の部分に記述されている。
合成モノクローナル抗体を含むファージのライブラリーを形成するための、ＣＤＲの予め選択された部分への突然変異誘発に続いて、本発明は、エピトープ結合複合体の予め選択されたクラスを富化することによる、ライブラリーの多様性を変化させる操作に関与する。これらのプロセスは、一般に、予め選択された抗原を結合し得る、ライブラリー中のファージ粒子の親和性選別に関与する。親和性選別、すなわちパンニングのプロセスは、実施例に詳細に記述されている。
関連する態様において、本発明は、糸状ファージ粒子のライブラリーの多様性を変化させる方法であって、ａ）本発明による糸状ファージ粒子のライブラリーを用意する工程、ｂ）用意されたライブラリーを予め選択されたリガンドと、ライブラリーの構成要素がこのリガンドに結合し、かつリガンド−ファージ粒子複合体を形成するに十分な条件下で、接触させる工程、及びｃ）複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成要素から単離して、予め選択されたリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含む、リガンド富化ライブラリーを形成する工程を具備する方法を目論んでいる。
【００８５】  好ましい態様において、この予め選択されたリガンドは固体支持体に固定されており、リガンド−ファージ粒子複合体はこの固相に形成される。この態様はさらに、ｉ）接触工程の後に固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成要素を濯ぐ工程、及びｉｉ）固体支持体から固相結合ファージ粒子を溶出する工程を具備する。溶出されたファージ粒子を収集し、それによって、富化されたライブラリーを含む単離ファージ粒子を形成する。
溶出は、リガンド−エピトープ結合複合体の相互作用を破壊する、様々な条件の下で行うことができる。典型的な条件には、高塩濃度又は低ｐＨバッファーが含まれる。ｐＨが約１ないし５、好ましくはｐＨが約２ないし３のバッファーが特に好ましい。あるいは、過剰量の予め選択されたリガンドを含む溶出バッファーを用いる競合によって相互作用を破壊することもできる。両溶出手順は、実施例に記述されている。
【００８６】  関連する態様では、突然変異によるライブラリーの多様性の増加、並びに予め選択されたリガンドに対するエピトープ結合複合体の親和性を“熟成”するためのパンニングによるライブラリーの富化の両者の特徴が組合わせられる。このように、ライブラリーの多様性を変化させる本発明の方法を用いて、新規の結合特異性、及びより潜在的な結合特異性を展開させることが可能である。
これらの方法の組合わせは、熟練した実行者には明らかなように、様々なやり方で設計することができる。例えば、ライブラリーを単離し、突然変異を誘発させ（多様性）、次いで特定の結合活性についてスクリーニングする（富化）することができる。あるいは、ライブラリーから特定の活性について富化し、特定のエピトープ結合複合体に突然変異を誘発させ、突然変異誘発によって生成したライブラリーをさらに富化することもできる。
このテーマに基づく他の順列においては、ｃｐＩＩＩ−及びｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカーをベースとするライブラリー間の、それら固有の価の相違による相違を利用することができる。ｃｐＩＩＩ誘導膜アンカーを有するファージのライブラリーは、典型的には各ファージ粒子の表面上に僅か１ないし４コピーのエピトープ結合複合体しか持たないため、このファージは比較的“低い”価の結合複合体を提示する。これが１つ。対照的に、ｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカーを有するファージのライブラリーは、典型的には各ファージ粒子の表面上に２０ないし１００コピーのエピトープ結合複合体を有しており、この粒子は比較的“高い”価を提示する。このため、ｃｐＩＩＩをベースとするライブラリーは単価と呼ばれ、ｃｐＶＩＩＩをベースとするライブラリーは多価と呼ばれる。
【００８７】  抗体親和性及び抗体価の周知の原理並びにここに記述される方法を適用すると、通常単離し得る、もしくは本発明によるｃｐＶＩＩＩをベースとするライブラリーにおいて見出される多価試薬を用いることによるより広い範囲の親和性（１０４ないし１０３Ｍ−１の結合定数）と比較して、１０６ないし１０１２Ｍ−１の解離結合定数（Ｋｄ）として表現される、非常に高い親和結合相互作用を有する抗体を含めるようにスクリーニングすることにより、ｃｐＩＩ１をベースとするライブラリーを生成し、及び／又は富化することができることが示される。したがって、ｃｐＶＩＩＩをベースとするライブラリーは、低いものから高いものまで広い範囲の親和性を有するエピトープ結合複合体の単離に有用であり、これに対して、ｃｐＩＩＩをベースとするライブラリーは、より狭い範囲の高親和性エピトープ結合複合体の単離に有用である。高親和性抗体は、ここに示されている通りの、それらの強い免疫反応性及びそれに付随する選択性、並びに強い中和能力のために特に好ましい。好ましい抗体は、少なくとも１０−９、好ましくは少なくとも１０−１０、より好ましくは少なくとも１０−１１、最も好ましくは少なくとも１０−１２の親和性を有している。
本発明はまた、ｃｐＶＩＩＩをベースとするライブラリーを富化することによって、第１の富化ライブラリーを生成することをも目論んでいる。その後、エピトープ結合複合体ポリペプチドをコードする遺伝子をｃｐＩＩＩをベースとするベクターに移し、次いで高親和結合相互作用について富化する。態様の１つにおいては、ｃｐＩＩＩをベースとするベクターに移す前に、突然変異生成工程を利用することが可能である。
【００８８】  このように、本発明はまた、本発明の糸状ファージによってコードされるエピトープ結合複合体の親和性を熟成する方法であって、ａ）糸状ファージのゲノムを用意する工程、ｂ）用意されたゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に突然変異を誘発して、突然変異が誘発された免疫グロブリン可変領域ドメインヌクレオチド配列を有するファージ粒子のライブラリーを形成する工程、ｃ）工程（ｂ）において形成されたライブラリーを予め選択されたリガンドと、ライブラリーの構成要素がリガンドと結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形成するに十分な条件下で接触させる工程、及びｄ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成要素から単離して、予め選択されたリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含むリガンド富化ライブラリーを形成する工程を具備する方法をも目論んでいる。
【００８９】  ここに示される特に好ましい態様においては、合成により非常に優れたモノクローナル抗体を進化させるために、突然変異誘発及び富化の一連のサイクルを通して多数のＣＤＲに突然変異が誘発される。
例えば、ファージ表現（ｄｉｓｐｌａｙ）タンパク質の形の抗ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０モノクローナル抗体をまずＣＤＲ１ドメイン内にランダムに突然変異を誘発させて合成抗体を有するファージミドの第１ライブラリーを作成し、次にそのライブラリーを固相で前選択リガンド、即ち、ＨＩＶｇｐ１２０に対してパンニングすることにより強化した。その後、ライブラリー中の最高親和性結合ファージミドを集め、更にＣＤＲ３ドメイン内にランダムに突然変異を誘発させるために１以上を選択して合成抗体を有するファージミドの第２ライブラリーを作成し、次に得られたライブラリーを前選択リガンドｇｐ１２０に対してパンニングすることにより強化してＨＩＶｇｐ１２０に高親和性結合することができる合成モノクローナル抗体を有する高親和性ファージミドを作成した。次に、得られた高親和性抗体を本明細書中に記載される慣用のウイルス中和分析でスクリーンして最高中和能を有する合成抗体を同定し、本発明の抗体として選ばれる。
【００９０】  突然変異誘発及びパンニングの場合の配列は変えることができる。例えば、ＣＤＲ１の前にＣＤＲ３の突然変異を誘発させることができ、その逆もできる。また、第２突然変異誘発及び強化工程の前に強化工程の精製としての中和のために第１ライブラリーを更にスクリーンすることができる。
従って、１実施態様において、本発明は下記工程を含む合成ヒト抗ＨＩＶモノクローナル抗体の産生方法を記載するものである。
ａ）免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体をコードする繊維状ファージのゲノムであって、前記重鎖可変領域が繊維状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドとして存在し、前記モノクローナル抗体がＨＩＶと免疫反応する前記ゲノムを与える工程；
ｂ）その与えられたゲノム内に存在する免疫グロブリン重鎖可変領域コーディングヌクレオチド配列を突然変異して突然変異した免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む突然変異を誘発させたファージ粒子の第１ライブラリーを作成する工程；
ｃ）工程（ｂ）で作られた該ライブラリーを前選択リガンドと該ライブラリーの構成部分が該リガンドに結合しかつ第１リガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程；
ｄ）前記第１複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成部分から分離して前記前選択リガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含む第１リガンド強化ライブラリーを作成する工程；
ｅ）前記第１リガンド強化ライブラリーからの繊維状ファージのゲノムを与える工程；
ｆ）その与えられたゲノム内に存在する免疫グロブリン重鎖可変領域コーディングヌクレオチド配列を突然変異して突然変異した免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む突然変異を誘発させたファージ粒子の第２ライブラリーを作成する工程；
ｇ）工程（ｆ）で作られた該ライブラリーを前選択リガンドと該ライブラリーの構成部分が該リガンドに結合しかつ第２リガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程；
ｈ）前記第２複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成部分から分離して前記前選択リガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含む第２リガンド強化ライブラリーを作成する工程。
【００９１】  好適実施態様においては、工程（ｂ）及び（ｆ）の突然変異は免疫グロブリン重鎖可変領域の同一領域に対するものである。また、工程（ｂ）及び（ｆ）の突然変異は免疫グロブリン重鎖可変領域の２つの異なる領域に対するものであることができる。例えば、好適方法においては、工程（ｂ）の突然変異は第１ＣＤＲに対し、工程（ｆ）の突然変異は第２ＣＤＲに対するものである。好適及び具体的方法においては、第１及び第２ＣＤＲは各々ＣＤＲ１及びＣＤＲ３である。
ＨＩＶに適用されるように、工程（ａ）のモノクローナル抗体がＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０と免疫反応しかつ強化工程（ｃ）及び（ｇ）に用いられる前選択リガンドがＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０である場合が特に好ましい。
工程（ｂ）において突然変異を誘発させる特に好ましい方法は、ファージミドゲノム内の免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲにおいて突然変異を誘発させる工程を含み、その免疫グロブリン遺伝子のそのＣＤＲの一部をＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することを含む工程であり、ここでそのオリゴヌクレオチドは５′及び３′末端を有しかつ下記配列を含む。
【００９２】  ａ）ＣＤＲの上流のフレームワーク領域に対してハイブリッド形成することができる５′末端のヌクレオチド配列；
ｂ）ＣＤＲの下流のフレームワーク領域に対してハイブリッド形成することができる３′末端のヌクレオチド配列；及び
ｃ）下記式を有する５′末端と３′末端間のヌクレオチド配列：
［ＮＮＳ］ｎ′
（式中、Ｎは独立して任意のヌクレオチドであり、ＳはＧ又はＣ又はその類縁体であり、ｎは３〜約２４である。なお、該３′末端及び５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する。）並びにそれに相補的な配列。特に好適で具体的なこの実施態様は、ｎが５であり、ＣＤＲがＣＤＲ１であり、上流及び下流フレームワーク領域が各々ＦＲ１及びＦＲ２である方法である。
また、工程（ｆ）において突然変異を誘発させる方法であって、ファージミドゲノム内の免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲにおいて突然変異を誘発させる工程を含み、その免疫グロブリン遺伝子のそのＣＤＲの一部をＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する工程を含む方法が好ましく、ここでそのオリゴヌクレオチドは５′及び３′末端を有しかつ下記配列を含む。
【００９３】  ａ）ＣＤＲの下流のアンチセンス（非コード）フレームワーク領域に対してハイブリッド形成することができる５′末端のヌクレオチド配列；
ｂ）ＣＤＲの上流のアンチセンス（非コード）フレームワーク領域に対してハイブリッド形成することができる３′末端のヌクレオチド配列；及び
ｃ）下記式を有する５′末端と３′末端間のヌクレオチド配列：
［ＭＮＮ］ｎ′
（式中、Ｎは独立して任意のヌクレオチドであり、ＭはＣ又はＡ又はその類縁体であり、ｎは３〜約２４である。なお、該３′末端及び５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する。）並びにそれに相補的な配列。特に好適で具体的なこの実施態様は、ｎが４であり、ＣＤＲがＣＤＲ３であり、上流及び下流フレームワーク領域が各々ＦＲ３及びＦＲ４である方法である。
また、本発明の、ＨＩＶと免疫反応する合成モノクローナル抗体が企図され、上記方法の実施態様によって産生される。
【００９４】実施例
本発明に関する下記実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、本発明を詳細に限定するものとして解釈されるべきでないことは当然のことである。更に、当該技術の範囲内である現在既知であるか又は後に開発される本発明の変更は下記請求の範囲の本発明の範囲内に包含するとみなされるべきである。
１．ＨＩＶ−１のｇｐ１２０に対する親和性を高めかつ中和する能力を高めた合成ヒトＦａｂヘテロ二量体の調製
Ａ．ｐＭＴ４の説明並びにＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化ｇｐ１２０特異的Ｆａｂ抗体を得る方法の概要
コードされたＦａｂ（ＭＴ４）よりむしろファージミドを示すｐＭＴ４と称する免疫グロブリン遺伝子ファージミド発現ベクターは、本明細書中に示されるように相補性決定領域（ＣＤＲ）のランダム化の鋳型として用いられるＦａｂヘテロ二量体を発現するための重鎖及び軽鎖配列を含む。寄託されたｐＭＴ４ファージミドは、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質、ｇｐ１２０に結合するＭＴ４と称する可溶性Ｆａｂ抗体を発現する。ＨＩＶ−１血清陽性個体（ＭＴ）から生じたＩｇＧ１Ｋ骨髄ライブラリーをスクリーニングすることからｐＭＴ４を選択すること及びその確認は、Ｂａｒｂａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０：８１２−８２３（１９９３）に記載されており、この開示を参考として引用する。ｐＭＴ４によってコードされたＦａｂの重鎖及び軽鎖可変領域双方の誘導アミノ酸残基配列もＢａｒｂａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０：８１２−８２３（１９９３）に発表されている。
【００９５】  ｐＭＴ４プラスミドをアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、１３０１パークラウンドライブ、ロックビル、メリーランド州、米国（ＡＴＣＣ）に寄託した。プラスミド含有細胞の寄託物はＭＴ４の名称で載せられ、ＡＴＣＣ受託番号７５５７４に指定された。この寄託は、実施例に記載されるように特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するプダペスト条約及びその規則（プダペスト条約）の規定により行われた。
寄託したｐＭＴ４は、ｇｅｎｅ３膜アンカーを挿入してそのアンカーをコードするヌクレオチド配列を実施例２Ｂに記載されるｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴから切断により、例えばＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断することにより誘導しかつその切断した断片を同じＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位でｐＭＴ４−３に移動させることによりｐＭＴ４−３を作成するように操作することができる。
ファージミドｐＭＴ４−３を本明細書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に用いてヌクレオチド突然変異とも言われるヌクレオチド置換をファージミド内のＦａｂ重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３の双方に導入し、結合特性及び中和特性を高めた新規なＦａｂ抗体を産生した。ｐＭＴ４−３ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で効率よく産生されかつｇｐ１２０に対する親和性及び細胞におけるＨＩＶ−１感染の中和が高いランダム化が行われる鋳型ＤＮＡとして選ばれた。
【００９６】  細胞のＨＩＶ−１感染の阻止能力を高めた本発明の高親和性ｇｐ１２０Ｆａｂ抗体の産生方法は、概要として示した下記工程を含んだ。１）ｐＭＴ４−３の重鎖ＣＤＲ１をまずポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によりランダム化する工程；２）ランダム化ＣＤＲ１を含むＰＣＲからの増幅産物をもとのｐＭＴ４−３に結合してランダム化ライブラリーを作成する工程；３）そのライブラリーからのバクテリオファージコートタンパク質３−アンカーＦａｂを発現した後、Ｆａｂ発現ファージをｇｐ１２０、ＩＩＩｂ株に対してパンニングし、ｇｐ１２０特異的ＣＤＲ１ランダム化Ｆａｂが選択される工程；４）次に、その選択されたＦａｂをコードするファージミドを一段ＰＣＲ増幅においてＣＤＲ３内の１２ヌクレオチドのランダム化に供する工程；５）次に、得られたランダム化したＣＤＲ１とＣＤＲ３の一部を共に有する増幅産物をもとのｐＭＴ４−３に結合し、発現及びパンニング過程を繰り返す工程；６）ｇｐ１２０特異的ＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化Ｆａｂを選択した後、対応するファージミドの配列を決定し、アミノ酸残基配列を誘導する工程；及び最後の７）得られたＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化ｇｐ１２０特異的Ｆａｂの最終確認として結合親和性を求めるための表面プラスモン共鳴分析及び抗体のＨＩＶ−１感染阻止能力を求めるための中和分析の双方を行う工程。
上記で挙げた工程は、下記の項で詳細に示される。
【００９７】  Ｂ．ファージミドＭＴ４−３の重鎖可変領域のランダム化ＣＤＲ１の調製
１．オーバーラップＰＣＲによるランダム化
重鎖可変領域ランダム化ＣＤＲ１を有するライブラリーを２種類の異なる方法で作製した。１つの方法に対してここに記載されるようにオーバーラップＰＣＲを用いた。別の方法は、下記実施例１Ｂ２）に記載される一段ＰＣＲ増幅法を用いた。本発明のＦａｂの重鎖ＣＤＲ１のランダム化は、後者の一段ＰＣＲ法から誘導した。
上記実施例１Ａに記載されたｐＭＴ４−３の重鎖可変領域のＣＤＲ１をランダム化するために、２つの別個のＰＣＲ増幅をここに記載されるように行った後に、第３オーバーラップＰＣＲ増幅を続け、前の２つの増幅産物のアニーリングを得、次に、第３増幅を続けた。鋳型ｐＭＴ４−３の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図４に示し、配列番号：７に示す。次のＰＣＲ増幅及びサブクローニングを促進するために、ｐＭＴ４−３鋳型をまずＰＣＲで突然変異を誘発させてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入して図４及び配列番号：７に示されるヌクレオチド位置６０で切断した。コード鎖中位置６０のもとのグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを、当業者に良く知られたＰＣＲ部位特異的突然変異誘発法を用いてアデニン（Ａ）に変えた。部位特異的突然変異誘発の結果として、ｐＭＴ４−３鋳型は位置６０にアデニンヌクレオチドをＰＣＲ増幅相補的チミンヌクレオチドと共に含有した。位置６０に突然変異誘発塩基を有するｐＭＴ４−３重鎖可変領域のコード配列を、図４及び配列番号：７に示す。次に、この突然変異を誘発させたｐＭＴ４−３を以後の全てのＰＣＲ増幅に用いてＣＤＲランダム化を導入した。
【００９８】  ｐＭＴ４−３の重鎖内にランダム化されるヌクレオチド位置は、ヌクレオチド位置８２で開始し位置９６で終止した。その指定した部位の鋳型ｐＭＴ４−３重鎖配列は、ＣＤＲ１に５つの全アミノ酸残基をコードした。ｐＭＴ４−３によってコードされたＣＤＲ１のアミノ酸残基配列は、ＭＴ４にラベルされた図１の重鎖可変領域の完全アミノ酸残基配列に示されるようにＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（配列番号：８）であった。図１及び対応する配列番号：１において、ＭＴ４−３のＣＤＲ１はアミノ酸残基位置２８で開始し３２で終止する。これは、保存Ｋａｂａｔ位置３１〜３５に対応する。
Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アラメダ、カリフォルニア州で合成された下記ヌクレオチド式を有する１２ｃｄｒ１ｈ３−ｆと称する縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールをｐＭＴ４−３の重鎖ＣＤＲ１をランダム化するために用いた。ランダム化ヌクレオチドを導入するための５つのトリプレットコドンは、反復配列ＮＮＳ（ＳはＧ又はＣであり、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴである。）を有した。
第１ＰＣＲ増幅により、ほとんどのフレームワーク領域１（ＦＲ１）のｐＭＴ４−３ファージミドベクタークローン中の重鎖フラグメントの領域の増幅が得られた。この領域を増幅するために、次のプライマー対を用いた。ヌクレオチド配列５′−ＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′（配列番号：９）を有する５′オリゴヌクレオチドプライマー、ＦＴＸ３は、ＦＲ１の領域５′（ベクター配列）に対応し最初の２つのヌクレオチドを含む重鎖の非コーディング鎖に対してハイブリッド形成した。ヌクレオチド配列５′−ＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＴＣ−３′（配列番号：１０）を有する３′オリゴヌクレオチドプライマー、１２ｈ３−ｂは、フレームワーク１の終わりから１５ヌクレオチドで終止する重鎖のコード鎖に対してハイブリッド形成した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成された。
【００９９】  ＰＣＲ反応は、各々１マイクログラム（μｇ）のオリゴヌクレオチドプライマーＦＴＸ３及び１２ｈ３−ｂ、２００ミリモル（ｍＭ）ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２Ｔａｑポリメラーゼ（５単位）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．、ノルウォーク、コネチカット州）、１０ナノグラム（ｎｇ）の鋳型ｐＭＴ４−３及び１０μｌの市販で購入された（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．）１０×ＰＣＲバッファーを含む１００マイクロリットル（μｌ）の反応中で行った。次に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ９６００  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  システムサーモサイクラーで３５ラウンドのＰＣＲ増殖を行った。増殖サイクルは、９４℃（９４Ｃ）で１分間変性し、５０Ｃで１分間アニーリングし、次に７２Ｃで２分間エクステンションすることから構成された。十分量の増幅産物を得るために、１５の同一ＰＣＲ反応を行った。
次に、得られたＰＣＲ増幅産物を“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている標準電気溶出法を用いて１．５％アガロースゲルによりゲル精製した。簡単に言えば、消化した合成結合部位をコードするＰＣＲ増幅Ｆａｂ表現断片をゲル電気泳動した後、所定のサイズのＤＮＡ断片を含むゲルの領域を切り取り、透析膜中に電気溶出し、エタノール沈澱し、１０ミリモル（ｍＭ）トリス−ＨＣｌ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩］、ｐＨ７．５及び１ｍＭＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するバッファーに５０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）の最終濃度まで再懸濁した。
【０１００】  次に、第１反応から得られた精製したＰＣＲ増幅産物を、下記で共に記載される第２ＰＣＲ反応の産物とのオーバーラップエクステンションＰＣＲ反応に用いて２つの産物をランダム化ＣＤＲ１を含む再構築重鎖に組換えた。
第２ＰＣＲ反応により、重鎖フレームワーク１を上記産物とオーバーラップし重鎖のフレームワーク４の３′を伸長する重鎖が増幅された。ＣＤＲ１の５つのコードされたアミノ酸残基配列をランダム化するこの領域を増殖するために、下記プライマー対を用いた。１２ｃｄｒ１ｈ３と称する上記５′コードオリゴヌクレオチドプライマープールは、下記式で表されるヌクレオチド配列を有した。
５′−ＧＡＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣ−３′（配列番号：１１）（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴであり、ＳはＧ又はＣである。）３′非コードプライマー、Ｒ３Ｂは、５′−ＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＧＧ−３′の配列（配列番号：１２）を有するＣＨ１の３′端のコード鎖に対してハイブリッド形成した。オリゴヌクレオチドプライマープールの５′端はフレームワーク１の３′端に相補的であり、オリゴヌクレオチドプライマープールの３′端はフレームワーク２の５′端に相補的である。プライマープールの指定した２つの端間の領域は、１５量体ＮＮＳ縮重で表される。第２ＰＣＲ反応は、１μｇの記載されたオリゴヌクレオチドプライマーを各々含む上記１００μｌ反応物中ｐＭＴ４−３鋳型の第２分割量で行った。得られたＰＣＲ産物は、長さが５アミノ酸残基のランダム化重鎖ＣＤＲ１領域の異種集団をコードした。次に、産物を上記のようにゲル精製した。
【０１０１】  次に、２つのＰＣＲ増幅のアニーリング反応の場合、各１ｍｇの第１及び第２ＰＣＲ反応からのゲル精製産物を混合し、上記のように３５サイクルのＰＣＲに対してプライマーを存在させずに融合した。次に、得られた融合産物を最終ＰＣＲ反応のプライマー対として各１μｇのＦＴＸ３及びＲ３Ｂオリゴヌクレオチドプライマーで増幅してオーバーラップエクステンションにより完全重鎖フラグメントを作成した。オーバーラップＰＣＲ増幅は上記のように行った。
十分量の増幅産物を得るために、１５の同一オーバーラップＰＣＲ反応を行った。得られた重鎖フラグメントは、５′のフレームワーク１からＣＨ１の終わりまで伸長し、５アミノ酸残基をコードするランダム化ＣＤＲ１を有した。１５反応の各々において長さが約８８０塩基対（ｂｐ）のＣＤＲ１ランダム化重鎖フラグメント増殖産物をまずプールし、次に上記のようにゲル精製した後、ｐＭＴ４−３表面表現ファージミド発現ベクターに再結合して以後のｇｐ１２０に対するスクリーニングのためのライブラリーを作成した。発現ベクターライブラリーを作成する際の連結反応手順、以後の重鎖ＣＤＲ１ランダム化ｐＭＴ４−３クローンの発現は、実施例１Ｃに記載されるように行った。
【０１０２】    ２）一段ＰＣＲによるランダム化
重鎖可変領域内のＣＤＲ１をランダム化して本発明の重鎖ＣＤＲ１ランダム化Ｆａｂを作製する他の方法は、ここに記載される一段ＰＣＲ突然変異誘発工程で行った。下記実施例に記載されるＣＤＲ１ランダム化重鎖可変領域を有する本発明のＦａｂは、一段ＰＣＲ法から作製されたファージミド表現Ｆａｂライブラリーをスクリーニングすることから得られた。
一段ＰＣＲにおいて、オーバーラップＰＣＲに対して実施例１Ｂ１）に記載された突然変異を誘発させたＣＤＲ１を有する全長可変領域を作製するために３回ＰＣＲ増幅を行う代わりに、実施例１Ｂ１）に記載されたｐＭＴ４−３ファージミドベクター鋳型に以前に導入された重鎖ＣＤＲ１の前にあるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を利用する増幅を行った。鋳型ｐＭＴ４−３の重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図４に示し、配列番号：７に示す。突然変異をＣＤＲ１に導入するためにランダム化される鋳型の領域は、オーバーラップＰＣＲに対して前述されたようにした。即ち、ＣＤＲ１をランダム化するために、前述のプライマー、突然変異を誘発させるコードプライマー１２ｃｄｒｌｈ３−ｆ（配列番号：１１）及び３′非コードプライマーＲ３Ｂ（配列番号：１２）を用いてランダム化されたヌクレオチドを重鎖ＣＤＲ１に実施例１Ｂ１）に記載されたＰＣＲプロトコールを用いて導入すると共に図４及び配列番号：７に示されるヌクレオチド位置で開始して前述のＣＨ１に伸びる配列を増幅した。
【０１０３】  得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩで消化し、ゲル精製した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｅＩ消化物により、ＨｉｎｄＩＩＩ５′コード突出端を有するＰＣＲ産物が得られ、その５′端は図４及び配列番号：７に示されるｐＭＴ４−３重鎖可変領域配列のヌクレオチド位置６０及び重鎖可変領域のフレームワーク４のＳｐｅＩ３′端と一致した。
次に、二重消化ＰＣＲ産物を同様に消化したｐＭＴ４−３ベクターに方向性をもって結合し、ＦａｂＭＴ４をコードする突然変異を誘発させていない軽鎖可変領域を保持した。実施例１Ｂ１）に記載された導入ＨｉｎｄＩＩＩに基づくｐＭＴ４−３のＨｉｎｄＩＩＩ消化物は、ｐＭＴ４−３の図４及び配列番号：７に示されるヌクレオチド位置５９と６０間で切断し、消化したＰＣＲ産物を消化したｐＭＴ４−３ベクターに方向性をもって結合することができる非コード突出端と共に線状にしたベクターの３′コード端の位置５９にアデニン塩基が残った。
【０１０４】  即ち、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩで二重に消化されるランダム化産物のライブラリーを同様に消化したｐＭＴ４−３ベクターに方向性をもって結合してＣＤＲ１ランダム化重鎖可変領域と実施例１Ｃに記載されたｐＭＴ４−３ベクターからの突然変異を誘発させていない軽鎖可変領域を有する環状にしたｐＭＴ４−３ベクターのライブラリーを作成した。連結反応により、位置６０で開始するＰＣＲ増幅ランダム化重鎖可変領域とヌクレオチド位置１〜５９からの重鎖の５′端をコードするヌクレオチド配列とのフレーム内結合が得られた。得られたファージミドライブラリーはランダム化ヌクレオチド配列をｐＭＴ４−３の重鎖可変領域に導入するために一段ＰＣＲから作製され、次に実施例１Ｄに記載されるようにスクリーンされ、本発明に記載されるＣＤＲ１ランダム化重鎖可変領域Ｆａｂを誘導するために用いた。
【０１０５】  Ｃ．ランダム化ＣＤＲ１を有するファージミド表現Ｆａｂの調製
重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むファージミドｐＭＴ４−３は、ファージ表現アンカータンパク質を発現するｐＣｏｍｂ３ファージミド発現ベクターである。ｐＣｏｍｂ３発現ベクターは、発現したタンパク質をバクテリオファージコートタンパク質３上にアンカーすることができるように設計された。繊維状ファージのＧｅｎｅＩＩＩはこの４０６残基微量ファージコートタンパク質、ｃｐＩＩＩ（ｃｐ３）をコードし、これを発現した後に細菌膜上のファージ集合過程に押し出されかつＥ．ｃｏｌｉの周縁細胞質に向いている内部膜上に蓄積される。
ファージ表面上でランダム化ＣＤＲを含むＦａｂ表現タンパク質の発現を得る本発明を実施するにあたり、ヘテロ二量体Ｆａｂ分子の集合のために抗体の重鎖（ＶＨ及びＣＨ１からなるＦｄ）及び軽鎖（κ）（ＶＬ、ＣＬ）をまずＥ．ｃｏｌｉの周縁細胞質の標的にした。
この系において、第１シストロンは融合タンパク質、Ｆｄ−ｃｐＩＩＩに操作的に連結した周縁細胞質分泌シグナル（ｐｅ１Ｂリーダー）をコードした。第２シストロンは、κ軽鎖に操作的に連結した第２ｐｅ１Ｂリーダーをコードした。ｐｅ１Ｂリーダーが存在すると、合成結合部位と軽鎖を含む融合タンパク質の双方を細菌細胞質から周縁細胞質空間へ協調されているが別個に分泌することが促進された。
【０１０６】  この過程において、各鎖はｐｅ１Ｂリーダー配列によって周縁細胞質空間に送られ、引き続き切断された。合成結合を含む重鎖は、ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインによって膜内に固定され、軽鎖は周縁細胞質に分泌された。Ｆａｂ分子は、重鎖と可溶性軽細胞を結合することから作成された。
ｐＣｏｍｂ３と称するファージミドベクターはＦａｂの表面表現及び可溶性形態の双方を可能にした。このベクターは、組合わせＦａｂライブラリーのクローニングのために設計された。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位は、フレームワーク１で開始しフレームワーク４中に伸びる領域からなる完全ＰＣＲ増幅重鎖（Ｆｄ）配列のクローニングを与えた。ｐＭＴ４−３の中に遺伝子操作されたＨｉｎｄＩＩＩ部位は、部分的ＰＣＲ増幅重鎖可変領域フラグメントを方向性のあるフレーム内連結反応を与えた。ＡａｔＩＩ制限部位は重鎖ＣＤＲ３にも存在する。ＡａｔＩＩ部位が存在すると、突然変異を誘発させたＣＤＲ１及びＣＤＲ３の双方をコードする配列が位置するフレーム１で開始しＣＤＲ３ドメインの終わりまで伸びる配列を含む実施例１Ｅで調製されるＰＣＲ産物のＸｈｏＩ／ＡａｔＩＩ消化物の挿入が可能であった。実施例１Ｆに記載されるようにＸｈｏＩ／ＡａｔＩＩ消化物をｐＭＴ４−３に挿入すると、ランダム化ｐＭＴ４−３重鎖可変領域とｐＭＴ４−３ベクターに既に存在するフレームワーク４との融合が得られた。即ち、実施例１Ｅで調製される最後の重鎖突然変異誘発ヌクレオチド配列を結合すると、ＣＤＲ３の中のＰＣＲ増幅フレームワーク１からなる完全重鎖フラグメントのフレーム内結合が得られ、ｐＭＴ４−３フレームワーク４が保持された。ｐＣｏｍｂ３発現ベクター内のクローニング部位は、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）及びＰｅｒｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６（１９９１）に記載されている以前に報告されているマウス及びヒトＰＣＲプライマーと一致した。ｐｅ１Ｂのヌクレオチド配列、発現タンパク質の周縁細胞質空間に対するリーダー配列は、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１に報告された通りであった。
【０１０７】  本ベクターは、また、Ｓｈｉｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２５４：３４（１９７５）に記載されているリボソーム結合部位を含有した。ＣｏｌＥ１及びＦ１起原及びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むファージミドベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの配列は、Ｓｈｏｒｔら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：７５８３−７６００（１９８８）に以前に記載されており、完全配列に対して遺伝子バンク受託番号５２３３０を有する。エンプティーベクターのＸｈｏＩとＳｐｅＩ部位間に位置した追加の制限部位、Ｓａ１Ｉ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｃ１ａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩは、Ｓｈｏｒｔら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：７５８３−７６００（１９８８）に記載されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの５１塩基対スタファーフラグメントから誘導された。規則正しい二次構造のない可変性５アミノ酸残基連鎖配列をコードするヌクレオチド配列は、Ｆａｂとｃｐ３ヌクレオチドドメイン間に並置されたので発現融合タンパク質中の相互作用が最少になった。
【０１０８】  即ち、得られた組合わせベクター、ｐＣｏｍｂ３は、１つの融合タンパク質、Ｆｄ／ｃｐ３と１つの可溶性タンパク質、軽鎖を発現する２つのカセットを有するＤＮＡ分子から構成された。本ベクターは、また、５′→３′方向に示された次の操作的に結合された要素のヌクレオチド残基配列を含有した：プロモーター／オペレーター配列からなる第１カセット；ＮｏｔＩ制限部位；リボソーム結合部位；ｐｅ１Ｂリーダー；スペーサー領域；５′Ｘｈｏと３′ＳｐｅＩ制限部位によって隣接したクローニング領域；連鎖配列；バクテリオファージｃｐ３をコードし、次に停止コドンが続く配列；２つのカセットの間に位置したＮｈｅＩ制限部位；第２ｌａｃＺプロモーター／オペレーター配列、次に発現制御リボソーム結合部位；ｐｅ１Ｂリーダー；スペーサー領域；５′ＳａｃＩと３′ＸｂａＩ制限部位によって隣接したクローニング領域、次に発現制御停止配列及び第２ＮｏｔＩ制限部位。
【０１０９】  上記発現ベクターにおいて、Ｆｄ／ｃｐ３融合タンパク質及び軽鎖タンパク質は、別個のｌａｃプロモーター／オペレーター配列の制御によって配置され、膜上の機能集合のｐｅ１Ｂリーダーによって周縁細胞質空間に特定された。ベクター内のファージＦ１遺伝子間領域の介在物は、ヘルパーファージによって一本鎖ファージミドのパッケージングを可能にした。ヘルパーファージ重感染を使用すると、ｃｐ３の２形態を発現することができた。従って、正常なファージ形態形成は、Ｆｄ／ｃｐ３融合とビリオンに取込むためのヘルパーファージの未変性ｃｐ３間の競合によって混乱した。得られたパッケージングファージミドは感染に必要な未変性ｃｐ３及び選択のために表現されるコードされたＦａｂ融合タンパク質を有した。Ｃ末端ドメインとの融合は、感染Ｎ末端ドメインとの融合が宿主細胞を感染に対して耐性にすることから、ファージミド法によって必要とされた。
上記ｐＣｏｍｂ３発現ベクターは、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０に対する合成ヒトＦａｂ抗体の産生のために本発明に用いられるｐＭＴ４−３とも呼ばれるＭＴ４Ｆａｂ表現ファージミド発現ベクターの基本的構築物を作成する。
【０１１０】    １）ファージミドライブラリーの構築
重鎖及び軽鎖可変領域を共に有する発現合成ヒトＦａｂ抗体を得るために、ファージミドライブラリーを構築した。これらのライブラリーは、ＣＤＲ１が実施例１Ｂに記載された重鎖内にランダム化される重鎖及び軽鎖を有する組換えヒトＦａｂ抗体の発現を与えた。
実施例１Ｂで調製されたＰＣＲ産物を発現するためのファージミドライブラリーの調製の場合、オーバーラップＰＣＲからのＰＣＲ産物をまずＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化し、実施例１Ａに記載されたように調製された同様に消化されたもとの（即ち、ランダム化されていない）ｐＭＴ４−３ファージミド発現ベクターと別個に結合した。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位は、各々フレームワーク１領域及びＣＨ１ドメイン内に存在した。連結反応により、５′の位置にあるｐＭＴ４−３に対するフレームワーク１からフレームワーク４の終わりまでの重鎖可変領域をｃｐ３遺伝子に操作的に結合することが得られた。増幅産物は本来はＦａｂＭＴ４を発現するために重鎖及び軽鎖可変領域配列の双方を有する鋳型ｐＭＴ４−３発現ベクターに挿入されるので、重鎖領域のみが置き換えられｐＭＴ４−３発現ベクターの残りは未変化のままであった。言い換えると、新たにランダム化されたＣＤＲ１重鎖増幅産物をもとのｐＭＴ４−３軽鎖可変領域を有するｐＭＴ４−３に再結合した。即ち、組換え体クローンからの発現の際に、発現したＦａｂはＣＤＲ１ランダム化重鎖とｐＭＴ４−３軽鎖配列を含み、その後者を図２及び配列番号：６に示す。一段ＰＣＲ法からのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｅＩで消化し、次に同様に消化したｐＭＴ４−３発現ベクターと別個に結合した。結果は、オーバーラップＰＣＲに対して記載されたものと同じであった。
【０１１１】  ｐＭＴ４−３軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、突然変異誘発手順中未変化のままであった。従って、実施例１に記載される本発明の方法によって得られた好ましい抗ｇｐ１２０Ｆａｂ抗体は全て、もとのｐＭＴ４−３によってコードされた軽鎖アミノ酸残基配列を含有する。
本発明のＦａｂ表現合成結合部位の各々を発現するためのファージミドを、次の手順で調製した。ＰＣＲ産物挿入断片を含む環状にしたベクターを作成するために、６４０ｎｇの消化ＰＣＲ産物を２μｇの線状にしたｐＭＴ４−３ファージミドベクターと混合し、１５０μｌの反応容量中ＢＲＬリガーゼバッファー中１０単位のＢＲＬリガーゼ（ガイザースバーグ、メリーランド州）を用いて室温で一晩連結反応を進行させた。ランダム化ＣＤＲ１を有するファージライブラリーのサイズを増大するために、５回の別個の連結反応を行った。連結反応後、環状にしたＤＮＡを２μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコン、１５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２及び３００μｌのエタノールの混合物により−２０℃（−２０Ｃ）で２時間沈澱した。次に、ミクロ遠心分離で４Ｃにおいて１５分間ＤＮＡを沈降した。ＤＮＡ沈降物を冷７０％エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥した。その沈降物を１０μｌの水に再懸濁し、電気穿孔により３００μｌのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞へ形質転換してファージライブラリーを作成した。
【０１１２】  形質転換後、突然変異を誘発させたＣＤＲ１を有するＦａｂが実施例１Ｄに記載されるｇｐ１２０糖タンパク質による次のパンニングに誘導されるファージを分離するために、３ｍｌのＳＯＣ培地（ＳＯＣは１リットルの水中２０グラム（ｇ）のバクト−トリプトン、５ｇの酵母エキス及び０．５ｇのＮａＣｌを混合し、ｐＨ７．５に調整し、オートクレーブにかけた後２０ｍＭグルコースを混合することにより調製した）を混合し、培養液を２２０ｒｐｍ、３７Ｃで１時間振盪した。その後、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１０ｍｌのＳＢ（ＳＢは１リットルあたり３０ｇのトリプトン、２０ｇの酵母エキス及び１０ｇのＭｏｐバッファーを混合しｐＨ７に調整することにより調製した）を混合し、この混合液を３００ｒｐｍで更に１時間振盪した。得られたこの混合液を５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する１００ｍｌのＳＢに混合し、１時間振盪し、その後ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０１２ｐｆｕ）を混合し、この混合液を３７Ｃで更に２時間振盪した。この後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを混合し、３０Ｃで一晩維持した。低温により、ファージの表面上に良好なヘテロ二量体の取込みが得られた。上清は遠心分離（ＪＡ１０ローター中４０００ｒｐｍ、４Ｃで１５分間）により透明になった。４％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００及び３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを混合することによりファージを沈澱し、氷上で３０分間維持した後、遠心分離（ＪＡ１０ローター中９０００ｒｐｍ、４Ｃで２０分間）した。ファージ沈降物を２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３分間ミクロ遠心分離してデブリを沈降し、新しい試験管に移して下に記載される次のスクリーニングのために−２０Ｃで貯蔵した。
【０１１３】  タイタリングコロニー形成単位（ｃｆｕ）を求めるために、ファージ（パッケージングファージミド）をＳＢに希釈し、１μｌを用いて１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＳＢ中で増殖した５０μｌの新たな（ＡＯＤ６００＝１）Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に感染させた。ファージと細胞を室温で１５分間維持し、次にＬＢ／カルベニシリンプレート上に直接播種した。これにより、得られたランダム化ＣＤＲ１重鎖遺伝子を含むファージライブラリーが約２×１０７ファージ粒子（ｃｆｕ）を含むことがわかった。
引き続きライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーを２×１０７粒子の多様性を含む約１０１１ｃｆｕの集団サイズに増幅し、必要なときにこの増幅したライブラリーを用いた。ファージライブラリーの増幅は、溶離したファージを増幅する下記実施例１Ｄ１）に記載されるように行われた。
【０１１４】  Ｄ．ファージ表面上で発現した抗ｇｐ１２０Ｆａｂヘテロ二量体の選択
１）ファージライブラリーの多重パンニング
一段ＰＣＲ法から実施例１Ｃで作製したファージライブラリーを、抗ＨＩＶ−１ヘテロ二量体に選んだ被覆マイクロタイタープレート上でここに記載されるＨＩＶ−１株ＩＩＩｂの組換え体ｇｐ１２０に対してパンニングした。
使用したパンニング手順は、数ラウンドの認識及び複製を含み、最初にＰａｒｍｌｅｙ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（Ｐａｒｍｌｅｙら，Ｇｅｎｅ，７３：３０５−３１８（１９８８）に記載されたものを変更した。特異抗原−結合クローンを強化するために４ラウンドのパンニングを行った。この手順に対して、４ウェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ３６９０）を０．１Ｍ重炭酸塩、ｐＨ８．６中２５μｌの上記で調製した４０μｇ／ｍｌｇｐ１２０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オシニング、ニューヨーク州）で４Ｃにおいて一晩被覆した。それらのウェルを水で２回洗浄し、ウェルをＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで完全に充填しかつプレートを３７Ｃで１時間維持することにより遮断した。その遮断溶液を振盪した後、５０μｌの上記で調製した増幅ファージ懸濁液（典型的には１０１１ｃｆｕ）を各ウェルに混合し、プレートを３７Ｃで２時間維持した。
【０１１５】  ファージを取り出し、プレートを水で１回洗浄した。次に、各ウェルをＴＢＳ／トウイーン（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％トウイーン２０）で１０回室温で１時間かけて洗浄し、洗浄はウェルを洗浄するためにピペットを上下することからなり、洗浄間にはウェルをＴＢＳ／トウイーンで完全に充填しておいた。プレートを蒸留水で１回以上洗浄し、５０μｌの溶離バッファー（０．１Ｍ  ＨＣｌ、固体グリシンでｐＨ２．２に調整、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有）を各ウェルに加えることにより粘着ファージを溶離した後、室温で１０分間維持した。この溶離バッファーをピペットで数回上下し、取り出し、５０μｌの使用溶離バッファーあたり３μｌの２Ｍトリス塩基で中和した。
【０１１６】  溶離したファージ集団を、ライブラリー中の粒子の全体数を増加させかつ引き続きライブラリーの力価測定を容易にするために増幅した。これを目的として、溶離したファージを用いて２ｍｌの新たな（ＯＤ６００＝１）Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に室温で１５分間感染させ、その後、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＳＢを混合した。２０、１０及び１／１０μｌの分割量を平板培養するために培養液から取り出してプレートから溶離するファージ数（パッケージングファージミド）を求めた。培養液を３７Ｃで１時間振盪し、その後、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに加え、１時間振盪した。次に、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０１２ｐｆｕ）を加え、培養液を更に２時間振盪した。その後、７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加え、培養液を３７Ｃで一晩インキュベートして増幅ファージ集団を形成した。ファージ調製及び次のパンニングを全４ラウンドのパンニングに対する上記のように繰り返した。
【０１１７】  各ラウンドのパンニング後、ファージの収率％を求めることができる。ここで収率％−（溶離したファージ数／加えたファージ数）×１００。各ラウンドのパンニングに対して約１０１１ｃｆｕであるように選択的プレート上で増幅したファージ集団の力価測定に基づいて最初のファージ播種時比率を計算した。２ｍｌの上記対数期ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に感染しかつ分割量を選択的プレート上に播種することにより最終ファージ播種後比率を求めることができる。典型的には、パンニング手順から溶離したファージの播種後量は約１０５〜１０６ｃｆｕであった。このパンニング手順から、ＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株からのグリコシル化組換え体ｇｐ１２０への結合能に対してクローンをＦａｂライブラリーから選択した。選択されたクローンは、ランダム化ＣＤＲ１重鎖可変領域とｐＭＴ４−３からの軽鎖可変領域配列を有した。
【０１１８】  得られたｇｐ１２０を結合した選択クローンの配列を決定して実施例１Ｄ１）に記載されたＣＤＲ１重鎖配列を求めた。
２）ＨＩＶ−１特異的モノクローナル抗体ＦａｂとＣＤＲ１のランダム化後の対応する誘導アミノ酸残基配列間の核酸配列分析
実施例１Ｄ１）で作製されたＣＤＲ１ランダム化クローンの核酸の配列決定は、シークエナーゼ１．０（ＵＳＢ、クレーブランド、オハイオ州）を用いて１２のランダムに選ばれた可溶性二本鎖Ｆａｂ発現ＤＮＡ上で行った。誘導された配列と相互の及び遺伝子バンクデータベースとの一列並びは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを利用した。１２の選択された特定の合成ｇｐ１２０特異的Ｆａｂ及びＭＴ４の誘導重鎖アミノ酸残基配列を実験Ａの項目の下の図５に示す。図５に示される重鎖可変領域の一列並びは、ＨＩＶ−１血清陽性個体からの骨髄ライブラリーをスクリーニングすることから得られたもとのＭＴ４ｇｐ１２０特異的ＦａｂのＣＤＲ１において、アミノ酸残基配列がＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（配列番号：８）であったことが明らかである。配列の比較は、位置３１にアスパラギン（Ｎ）、位置３２に芳香族残基、位置３３に主としてセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）、位置３４に分枝疎水残基及び位置３５に疎水及び／又は芳香族残基が好ましいことを示した。アミノ酸残基の位置３１〜３５は、保存Ｋａｂａｔ位置番号に基づいて表された。図１に示される完全可変領域アミノ酸残基配列の実際のアミノ酸残基位置は各々２８〜３２で開始及び終止し、短縮したフレームワーク１から得られた。１２の選択ＦａｂのＣＤＲ１に対する実験Ａに示される１２のアミノ酸残基配列は次の通り配列番号：１４〜２５に指定された。Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（配列番号：１４）、Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（配列番号：１５）、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号：１６）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号：１７）、Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号：１８）、Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１９）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（配列番号：２０）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（配列番号：２１）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ（配列番号：２２）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（配列番号：２３）、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号：２４）、及びＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（配列番号：２５）。
【０１１９】  次に、選択されたクローンの重鎖領域内のＣＤＲ３を実施例１Ｅに記載されるようにランダム化してｇｐ１２０による選択ためのタランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するファージミドを作成した。
Ｅ．ＣＤＲ１ランダム化Ｆａｂ発現クローンの重鎖可変領域のランダム化ＣＤＲ３の調製
実施例１Ｄからの選択ＣＤＲ１ランダム化重鎖Ｆａｂ発現クローンを、それらのクローンの重鎖ＣＤＲ３配列の１２のヌクレオチドを選択的にランダム化するために更にＰＣＲ増幅に供した。ヌクレオチドランダム化が特定されるヌクレオチド位置は、もとのｐＭＴ４−３ファージミドの重鎖配列の図４及び配列番号：７に示される位置２９２で開始し位置３０３で終止した。指定された１２のヌクレオチドをランダム化し、縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールはコーディング鎖の５′→３′方向に書かれたＮＮＫ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴであり、ＫはＧ又はＴである。）の反復を有する。この場合、重鎖の３′端がランダム化されているので、オリゴヌクレオチドプライマープールは３′プライマーであった。即ち、ランダム化ヌクレオチドを取込むために設計された縮重オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅においてコード鎖に対してハイブリッド形成されるアンチセンス又は非コード鎖であった。ＮＮＫの相補的配列はＮＮＭ（Ｎは上記で定義されており、ＭはＡ又はＣである）であり、ＮＮＭは３′→５′方向に書かれる。ＮＮＭ反復は慣例の５′→３′でＭＮＮと書かれる。縮重は、縮重オリゴヌクレオチドプール中４回反復する。
【０１２０】  １２−４−ｃｄｒ３と称する５′→３′方向に書かれた非コード縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド配列５′−ＣＣＣＴＴＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＣＣＣＡＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡ−３′（配列番号：１３）を有した。１２−４−ｃｄｒ３プライマーは、ＸｈｏＩ及びＡａｔＩＩ制限増幅産物を下記実施例１Ｆに記載される同様に消化されたｐＭＴ４−３ファージミドに挿入することを可能にするための自然ＡａｔＩＩ制限部位を有した。実施例１ＤからのＣＤＲ１突然変異誘発選択クローンを増幅するのに用いられる５′オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：９のヌクレオチドを有する実施例１Ｃに記載されたＦＴＸ３であった。
ＰＣＲ増幅は、実施例１Ｃに記載されたように、この場合には全重鎖可変領域が１反応において増幅されて前から伸びフレームワーク４の中央にフレームワーク１を含むのでオーバーラップＰＣＲを必要としないことを除いて行われた。得られたＰＣＲ産物を実施例１Ｃに記載されたように精製し、引き続き実施例１Ｆに記載されるようにｐＭＴ４−３の軽鎖可変領域を有する線状にしたｐＭＴ４−３ファージミドに再挿入した。
【０１２１】  Ｆ．ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するファージミド表現Ｆａｂの調製
次に、重鎖可変領域ＣＤＲ１及びＣＤＲ３の１２ヌクレオチド配列をランダム化した実施例１Ｅに記載されるように作製された増幅産物を、同様に消化したもとのｐＭＴ４−３ファージミド内で連結反応するためにＸｈｏＩ及びＡａｔＩＩで消化した。ＸｈｏＩ部位は重鎖フレームワーク１領域の最初の６ヌクレオチドに存在し、ＡａｔＩＩ部位はＣＤＲ３の最後の６ヌクレオチドであった。増幅したＸｈｏＩ／ＡａｔＩＩ制限消化重鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ３突然変異誘発産物の集団の連結反応により、重鎖のこの部分のｐＭＴ４−３から維持されたフレームワーク４領域へのフレーム内連結反応が得られた。即ち、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３の段階ランダム化において、指定されたヌクレオチドのみがｐＭＴ４−３重鎖可変領域のヌクレオチド配列内でランダム化した。前述のように、ｐＭＴ４−３の軽鎖は未変化のままであった。
次に、得られたＣＤＲ１及びＣＤＲ３のランダム化重鎖領域を有する連結したｐＭＴ４−３を、次のＸＬ１−Ｂｌｕｅへの形質転換に対して実施例１Ｃに記載されたように処理した。形質転換後、前述のように発現してファージライブラリーのＣＤＲ１及びＣＤＲ３のランダム化重鎖領域を有するＦａｂ抗体のファージ表現断片を得た。ファージライブラリーを前のように力価測定し、約８×１０６ファージ粒子（ｃｆｕ）を含有した。次の操作のために、このライブラリーをまず増幅して実施例１Ｄに記載された１０１１ｃｆｕの貯蔵ライブラリーを得た。
【０１２２】  次に、６ラウンドのパンニングを含む第２パンニング選択プロトコールを、実施例１Ｄに記載された増幅ライブラリーで行ってｇｐ１２０に結合したＦａｂを得た。パンニング手順から、重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化アミノ酸残基配列と図２に示され配列番号：６で示されたもとのＭＴ４軽鎖配列を有する８個のｇｐ１２０特異的Ｆａｂヘテロ二量体を選択し、更に実施例１Ｇ及び１Ｈに記載されるように確認した。
Ｇ．ＨＩＶ−１特異的モノクローナル抗体Ｆａｂと対応する誘導アミノ酸残基配列間の核酸配列分析の比較
更に上記のようにファージ表面で発現した突然変異誘発ヘテロ二量体の特異性を配列分析及び機能特性によって確認するために、酸で溶離したファージから可溶性Ｆａｂヘテロ二量体を調製した。
【０１２３】  可溶性ヘテロ二量体を調製するために、上記で調製したｇｐ１２０反応性クローンからのファージミドＤＮＡを単離し、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩで消化した。これらの制限酵素で消化すると、適合しうる付着端を生じた。ｇｅｎｅＩＩＩ部分を欠く４．７ｋｂＤＮＡ断片をゲル精製（０．６％アガロース）し、自己結合させた。Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換すると、ｃｐＩＩＩフラグメントを欠く組換え体が分離した。クローンの１．６ｋｂ断片を生じるにちがいないｃｐＩＩＩフラグメントのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化による除去を試験した。クローンを５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び２０ｍＭＭｇＣｌ２を含有する１００ｍｌＳＢ中３７ＣでＯＤ６０００．２が得られるまで増殖した。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を加え、培養液を３０Ｃで一晩増殖した（３７Ｃにおける増殖はヘテロ二量体の収率がわずかだけ減少する）。細胞をＪＡ１０ローター中４０００ｒｐｍ、４Ｃで１５分間遠心することにより沈降させた。細胞を３４μｇ／ｍｌのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む４ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で音波処理することにより溶解した（５０％処理に２〜４分）。デブリをＪＡ１０ローター中４０００ｒｐｍ、４Ｃで１５分間遠心することにより沈降させた。上清を−２０Ｃで貯蔵した。多量のクローンを調べるために、１０ｍｌの培養液は分析に十分なヘテロ二量体を与えた。この場合、音波処理は２ｍｌのバッファー中で行った。
【０１２４】  核酸の配列決定は、シークエナーゼ１．０（ＵＳＢ、クレーブランド、オハイオ州）を用いて可溶性二本鎖Ｆａｂ発現ＤＮＡについて行った。４つの選択された特定の合成ｇｐ１２０特異的Ｆａｂの誘導重鎖アミノ酸残基を図１に示す。選択されたＦａｂは３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９と称した。８種の選択された特定の合成ｇｐ１２０特異的Ｆａｂの誘導重鎖アミノ酸残基配列を図５に示す。図５に示される８配列は、図１に示される３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９のＣＤＲ１のＫａｂａｔ同定アミノ酸残基３１〜３５及びＣＤＲ３のアミノ酸残基９６〜９９が含まれる。Ｋａｂａｔ位置９６〜９９は、図１及び配列表（配列番号：１〜５）に示される実際のアミノ酸残基位置９８〜１０１に対応する。選択された合成Ｆａｂは、３ｂ１、３ｂ２、３ｂ３、３ｂ４、３ｂ６、３ｂ７、３ｂ８及び３ｂ９と称した。
【０１２５】  ＣＤＲ１のアミノ酸残基３１〜３５に対して図５の実験Ｂに示されたアミノ酸残基は、次の通り配列番号：２６〜３３に指定された：Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（３ｂ１、配列番号：２６）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（３ｂ２、配列番号：２７）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（３ｂ３、配列番号：２８）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ（３ｂ４、配列番号：２９）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（３ｂ６、配列番号：３０）、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（３ｂ７、配列番号：３１）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（３ｂ８、配列番号：３２）及びＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（３ｂ９、配列番号：３３）。ＣＤＲ３のＫａｂａｔ同定アミノ酸残基９６〜９９に対して図５の実験Ｂに示されたアミノ酸残基は、次の通り配列番号：３４〜４２に指定された：Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ（ＭＴ４、配列番号：３４）、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ（３ｂ１、配列番号３５）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ（３ｂ２、配列番号３６）、Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ（３ｂ３、配列番号３７）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ（３ｂ４、配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ（３ｂ６、配列番号３９）、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（３ｂ７、配列番号４０）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ（３ｂ８、配列番号４１）及びＰｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（３ｂ９、配列番号４２）。
誘導配列を相互に及び遺伝子バンクデータベースとの整合並びは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒプログラムを利用した。Ｓａｎｚ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１７２０−１７２９（１９９１）に記載されている重鎖ＣＤＲ３配列の分析の場合、Ｋａｂａｔら，免疫学的に関心のあるタンパク質の配列、米国保健社会福祉省、ワシントン、ＤＣ（１９９１）によればほとんどの５′ヌクレオチドがＨ鎖可変領域のコドン９５後の第１ヌクレオチドであるとみなされた。
【０１２６】  ＣＤＲ３のアミノ酸残基配列のランダム化後の６ラウンドのＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０に結合するための選択を評価するにあたり、具体的なアミノ酸残基の保存も留意される。詳細には、ＭＴ４Ｆａｂにランダム化されたアミノ酸残基は、ＭＴ４の３〜６番目のアミノ酸残基位置の図１に示されるＰｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐであった。これは、配列番号：１のアミノ酸残基位置９８〜１０１に対応する（Ｋａｂａｔ位置９６〜９９）。トリプトファン残基は、ランダム化及び選択手順中未変化のままであった。４つの好ましいＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化Ｆａｂ全てにおいて、チロシンアミノ酸残基はトリプトファンによって置き換えられ、その点でこの位置の具体的なアミノ酸残基に選択の強制を示した。３ｂ８の誘導アミノ酸残基配列は、ＭＴ４のものと同じであり、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３ランダム化ライブラリーに汚染を示すことがある。
重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３のランダム化アミノ酸残基配列が可溶性Ｆａｂの機能上の能力に効果があったことを評価するために、結合親和性の調査及び中和分析の双方を実施例１Ｈに記載されるように行った。４種のクローン、３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９を次の調査に選んだ。これらの４種のクローンは、アミノ酸配列の小さな変化により確認された相互に近い配列を有し、また、位置９６及び９８においてアミノ酸残基の同一性の最も劇的な変化を示すものである。
【０１２７】  Ｈ．ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３重鎖領域を有するｇｐ１２０特異的Ｆａｂの機能上の確認
１）結合親和性分析
全ＣＤＲ１及びＣＤＲ３の１８のアミノ酸残基の４つにランダム化されたアミノ酸残基配列を有する４種の選択Ｆａｂ、３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９を結合親和性分析に用いた。表面プラスモン共鳴分析をＢＩＡｃｏｒｅ結合親和性測定装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウエイ、ニュージャージー州）で製造業者の説明書に従って行いランダム化Ｆａｂの親和性が新しいＦａｂが誘導されたもとのＭＴ４Ｆａｂに比べて結合親和性を改善したかを求めた。
【０１２８】  本分析において、ＨＩＶ−１のＭＮ（ＡｇＭｅｄ、ケンブリッジ、マサチューセツ州）及びＩＩＩｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）株の双方から単離したｇｐ１２０糖タンパク質をゴールドチップ上に被覆した。次に、ＭＴ４を含む上記の４種の可溶性Ｆａｂを別個にｇｐ１２０被覆ゴールドチップと混合し、Ｆａｂのリガンドへの結合をＢＩＡｃｏｒｅ装置で測定した。ゴールドチップの質量がＦａｂのリガンドへの結合のために増加するので、そのチップの屈折率が増加し質量の増加において同等の増加を示す。“ｏｎ”速度の測定が“ｏｆｆ”速度のほかに行われ、後者はＦａｂがリガンドから解離し始めかつ質量が同等に減少するにつれて生じ、もって、屈折率の変化を測定することができる。簡単に言えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−エチル−Ｎ′−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミドで固定化するためにセンサーチップを活性化した。５０μｌの５０μｇ／ｍｌ試料を注入することにより、ＭＮ由来又はＩＩＩｂ由来のｇｐ１２０タンパク質を表面に結合した。過剰の活性化エステルを１５μｌのエタノールアミン、１Ｍ  ｐＨ８．５で急冷した。典型的には、４０００共鳴単位を固定化した。濃度範囲（０．５〜１０μｇ／ｍｌ）のＦａｂを流速５μｌ／分で注入することにより、Ｆａｂフラグメントの固定化ｇｐ１２０への結合を調べた。１単位時間あたりの共鳴単位の増加として会合をモニターした。会合相の終わりに続いて流速５０μｌ／分で解離測定値を得た。結合表面をＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ３で再生し、２０〜４０の測定の間活性のままであった。会合及び解離速度定数、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆをＢａｒｂａｓら，Ｇｅｎｅ，印刷中（１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：６２９８−６３０４（１９９２）；及びＫａｒｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５：２２９−２４０，（１９９１）に記載されている一連の測定から求めた。平衡会合及び解離定数は、速度定数から演繹した。
【０１２９】  ４種のランダム化Ｆａｂ及びＭＴ４全てに対するｏｎ及びｏｆｆ測定値を共に集めた。これらの測定値から、ｏｎ定数（Ｋｏｎ（Ｍ−１ｓ−１）をｏｆｆ（Ｋｏｆｆ（ｓ−１）定数で割ることによりＫａを求めた。解離定数、Ｋｄもこれらの測定値から求め、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎとして示される。ＭＮ株及びＩＩＩｂ株の双方から単離したｇｐ１２０に対するｏｎ及びｏｆｆ値の双方の測定値を各々下記表１及び表２に示す。更に、分析したＦａｂ全てに対して結合親和性の測定から算出したＫａ及びＫｄ値を示す。
【０１３０】
2005198654.tif 000003
【０１３１】  表１及び表２のそれぞれのデータの分析、つまりＨＩＶ−１のＭＮ株及びＩＩＩｂ株からのｇｐ１２０へのランダム化Ｆａｂの結合親和性分析では、ランダム化Ｆａｂの結合親和性は、それらランダム化Ｆａｂが誘導された元のｇｐ１２０特異性Ｆａｂ、つまりＭＴ４に比較して高くなっている。ただ１つのＦａｂ、つまり３ｂ４だけが、表１に示すように、ＭＮ株からのｇｐ１２０への結合においてＫａの増加を示さなかった。ＭＮ由来ｇｐ１２０への結合において他の全てのＦａｂは、ＭＴ４のものよりも３〜１０倍の結合親和性の増加を有した。全てのランダム化Ｆａｂは、表２に示すように、ＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０に対してはより大きな親和性を示した。Ｆａｂ  ３ｂ３は、ＭＮ由来ｇｐ１２０でそうであるように、ＭＴ４よりも１０倍大きなＫａを有した。しかしながら、ＭＮ株への３ｂ３の結合親和性に対してＩＩＩｂ株への３ｂ３の結合親和性も、それぞれ１．３×１０８に対して１．３×１０９と１０倍高かった。
【０１３２】  このように、ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するＦａｂは、元のＭＴ４  Ｆａｂに比較して高まった結合親和性を示すだけでなく、その結合親和性はそのｇｐ１２０リガンドが誘導されたＨＩＶ−１株に依存して更に高まった。従って、４種のＦａｂ、つまり３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９内のＣＤＲ１及びＣＤＲ３アミノ酸残基配列のランダム化は、ＨＩＶ−１のＭＮ株及びＩＩＩｂ株の両方からのｇｐ１２０へのＦａｂの結合親和性の有意義かつ意外な増大をもたらした。この機能的側面は、既知のｇｐ１２０特異性抗体並びに他のＨＩＶ−１抗体に比較して高まった結合親和性が、以下に記載するように、標的設定機能及び中和機能を高めるであろうという点で、診断及び治療用途にとって重要な属性である。
２）ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するｇｐ１２０特異性Ｆａｂの中和活性
ウィルスへの抗体の結合は、感染力の低下又は中和をもたらし得るので、抗体はウィルスに対する防御メカニズムのほかにも果たすべき重要な役割を有することが幅広く受け入れられている。しかしながら、抗体中和の基礎をなす分子的原理の理解が限られており、抗体の他のエフェクター機能の理解に遅れをとっている。かかる理解は、ワクチンの理に適ったデザイン及び予防又は治療用に受動抗体を最も有効に用いるのに必要である。このことは、ヒト免疫不全ウィルスにとっては特に緊急事である。
【０１３３】  幾つかの研究で、ウィルスは１を越えるメカニズムにより中和され、そして採用されるそのメカニズムはウィルスの性質、認識されるエピトープ、抗体のアイソタイプ、ウィルスの侵入に使用される細胞レセプター、及びウィルス：抗体比の如き要因に依存するであろうという一般的結論が導かれた。中和の原理メカニズムは、ウィルス粒子の凝集、細胞レセプターへのウィルスの付着の阻害、及びウィルス膜と細胞膜の融合及びウィルス粒子の第２の脱外被の如き付着後の事象の阻害として考慮することができる。第３のメカニズムの重要な特徴の１つは、それが、最初の２つのメカニズムに期待される抗体の凡その理論量よりも遙かに少ない量を必要とするに過ぎないということである。というのは、中和にはウィルス粒子上の少数の重要部位を占拠するだけで十分であり得るからである。例えば、インフルエンザＡウィルス粒子の中和は、Ｏｕｔｌａｗら，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，１０６：２０５−２２０（１９９２）に記載された通り単一のヒット速度論に従うことが分かっている。
【０１３４】  ＨＩＶ−１の抗体中和に関して集中的な研究が行われてきた。委細については、Ｎａｒａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，５：２４３７−２４５５（１９９１）を参照のこと。その殆どのものは、Ｖ３ループとして知られるウィルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の第３超可変ドメイン内の単一線状エピトープに焦点を定めてきた。このループへの抗体は、ウィルス膜と細胞膜との融合を阻害することにより中和すると示唆されている。中和をもたらすこのループへの結合は、ウィルス−細胞相互作用の前又はＣＤ４へのｇｐ１２０結合の後に起こり得る。Ｎａｒａ，Ｉｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｉｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｇｉｒａｒｄら編，ｐｐ．１３８−１５０（１９８８）；Ｌｉｎｓｅｌｙら，Ｊ．ｖｉｒｏｌ．，６２：３６９５−３７０２（１９８８）；及びＳｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４１９５−４２００（１９８８）を参照のこと。Ｖ３ループの特徴は、そのループ内の配列可変性［Ｇｏｕｄｓｍｉｔら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，５：２４２７−２４３６（１９９１）及びＡｌｂｅｒｔら，ＡＩＤＳ，４：１０７−１１２（１９９０）］及びそのループの外側の配列変化へのそのループに対する中和抗体の感受性である［Ｎａｒａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，５：２４３７−２４５５（１９９１）；Ａｌｂｅｒｔら，ＡＩＤＳ，４：１０７−１１２（１９９０）；Ｍｃｋｅａｔｉｎｇら，ＡＩＤＳ，３：７７７−７８４（１９８９）；及びＷａｈｌｂｅｒｇら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，７：９８３−９９０（１９９１）］。このことから、抗Ｖ３ループ抗体はしばしば株特異的となるので、ループ内でのｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異が抗体中和からのウィルスの逃避のメカニズムを提供するのかも知れない。
【０１３５】  最近、ｇｐ１２０へのＣＤ４結合を遮断することができる抗体にかなりの興味が集中している。幾つかのグループは、これら抗体の特徴を次のように記載している：（ａ）配座性、即ち非線状エピトープと反応する、（ｂ）広範囲のウィルス分離株と反応する、及び（ｃ）長期間感染後にはヒトにおける優勢な中和抗体となる。Ｂａｒｋｏｗｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：５９８３−５９９０（１９９１）；Ｓｔｅｉｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１０５−１０８（１９９１）；Ｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：４８９−４９３（１９９１）；Ｋａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：６１７１−６１７５（１９９１）；Ｐｏｓｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：４３２５−４３３２（１９９１）；及びＴｉｌｌｅｙら，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．，１４２：２４７−２５９（１９９１）を参照のこと。
このタイプの中和抗体は、潜在的療法の有望な標的を提示するように思われる。これら抗体の中和のメカニズムは未知であるが、ウィルス付着の遮断ではないだろうという幾つかの指摘がある。というのは、ｇｐ１２０へのＣＤ４結合を阻害する幾つかのマウスモノクローナル抗体が非中和性であるか又は弱く中和するに過ぎないからである。
【０１３６】  Ｂｕｒｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）により記載された組み合わせライブラリーを用いるＨＩＶ−１のエンベロープに対するヒトモノクローナル抗体の産生で、中和の問題への新規なアプローチが可能になる。ｇｐ１２０のための３次元構造とウィルスの複雑性の欠如を前提として、重鎖、軽鎖のいずれか又はその両方におけるＣＤＲのランダム化を介してｇｐ１２０特異性Ｆａｂの機能的活性を高めるアプローチは、関連抗体の挙動を介して分子レベルで中和することを模索している。実施例１Ｆで調製したヒト組換えＦａｂに関してここに記載したようにして中和検討を行って、ＭＮ株又はＩＩＩｂ株のいずれかから誘導したｇｐ１２０への結合親和性について上記の通り分析した。
【０１３７】        ａ）ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するｇｐ１２０特異性ＦａｂのＭＮ由来ｇｐ１２０での中和活性
融合細胞アッセイを行って、組換えヒトＨＩＶ−１免疫反応性Ｆａｂの中和活性を測定した。これらアッセイの幾つかのために、まず組換えＦａｂを精製した。５０μｇ／ｍｌカルベニシリン及び２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＳＢの１リッター培養液に適切なクローンを接種し、７時間後に２ｍＭ  ＩＰＴＧで誘発し、そして３０℃で一晩増殖させた。細胞ペレットを音波処理して得られた上澄み液を５０ｍｌ容量まで濃縮した。濾過した上澄み液を２５ｍｌプロテインＧ−抗Ｆａｂカラムにかけ、３ｍｌ／分の速度で１２０ｍｌ緩衝液で洗浄してｐＨ２．３のクエン酸で溶離させた。次いで、中和した画分を濃縮してｐＨ６．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ中に交換して２ｍｌのＭｏｎｏ−Ｓカラムに１ｍｌ／分の速度でかけた。０〜５００ｍＭの勾配のＮａＣｌを１ｍｌ／分で流すと、Ｆａｂが２００〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの範囲内で溶離した。濃縮後、ＥＬＩＳＡでｇｐ１２０に対して滴定するとそのＦａｂは陽性で、１０〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより５０ｋＤの単一バンドを与えた。濃度は、１．４の吸光係数（１ｍｇ／ｍｌ）を用いる２８０ｎｍでの吸光度測定により出した。
【０１３８】  ＨＩＶ−１のＭＮ株での定量的中和アッセイをＮａｒａら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，３：２８３−３０２（１９８７）に記載された通りに行った。なお、その開示内容は参照によりここに組み入れられるものとする。ＣＥＭ−ＳＳ標的細胞の単層をＦａｂ抗体、つまり３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４、３ｂ９及びＭＴ４の存在下又は不存在下でウィルスと共に培養して、融合細胞形成単位の数を３〜５日後に測定した。試験する種々の抗体濃度を直接比較できるように等量のウィルスをこのアッセイに用いた。このアッセイは、２〜４倍の抗体濃度の差の範囲内で１〜０．００１のウィルス生存画分範囲にわたって反復可能であった（Ｐ＜０．００１）。
概して少なくとも２回アッセイを繰り返して再現性ある結果を得た。表３に示すデータについて、データをＩＣ５０（Ｍ−１）として及びナノグラム／ミリリッター（ｎｇ／ｍｌ）での中和力価としての両方で表している。中和力価は、１／ＩＣ５０×（５×１０１０）として計算される。元のｇｐ１２０特異性Ｆａｂ、つまりＨＩＶ−１血清陽性個体からの骨髄ライブラリーから最初に選択されたＦａｂは、Ｂａｒｂａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０：８１２−８２３（１９９３）により、融合細胞形成アッセイとｐ２４アッセイの両方において、高い結合親和性及び等しく有効な中和能力を有するとして、以前にその特徴が明らかにされている。ここに記載した通りに行った中和アッセイでは、ＭＴ４  Ｆａｂは、融合細胞形成の減少度により測定して、細胞内へのＨＩＶ−１の感染力を阻害する約３００ｎｇ／ｍｌの中和力価を示した。全く対照的に、全てが元のクローンｐＭＴ４−３から誘導されたこの発明の４種のランダム化Ｆａｂ、つまり３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９は、このアッセイで約５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌまでの中和力価を示した。これは、ＭＴ４及びＨＩＶ−１感染を中和することが知られている抗体と比較して、ランダム化Ｆａｂの中和能力の力価が１０倍を越えて増加するという、大きな向上に相当する。
【０１３９】
2005198654.tif 000004
2005198654.tif 000005
【０１４０】  このように、ｇｐ１２０への結合及びＨＩＶ−１感染の中和に元々有効なクローンの重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３の両方をランダム化するこの発明の方法は、高まった結合親和性並びに感染力の中和能を有するＦａｂの有意義かつ意外な改良をもたらした。更には、図３にグラフで示す通り、結合親和性の増加と細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する能力の間の相関関係が存在する。その図では、ＭＴ４と一緒にランダム化Ｆａｂの結合親和性をＩＣ５０により示される中和力価に対してプロットした。この図では５つの別々の四角形が、２つの機能的特性値に基づいてプロットされた５種のＦａｂそれぞれについて示されている。このグラフを見ると直線的関係が容易に理解できる。このように、結合親和性とＨＩＶ−１感染を中和する能力に相関関係がある。更には、この発明の全４種のランダム化Ｆａｂは、この図でそれらＦａｂが直線的に増加することが示されていると共にＭＴ４が最低の結合親和性と中和能力を有し、それに３ｂ４、３ｂ９と３ｂ１（比較的近い）及び最後に３ｂ３が続くことが示されているように、ＭＴ４に比較して高い相関関係を示した。後者のＦａｂはＭＮ株又はＩＩＩｂ株のいずれから誘導されたｇｐ１２０にも結合し、そしてこの発明の全てのランダム化Ｆａｂのうちで最低の中和力価を有した。このように、ＣＤＲ１及び３種のＣＤＲ３アミノ酸残基のランダム化（後者における６番目の位置のトリプトファンが選択全体を通して保存されている）が、非ランダム化ｇｐ１２０特異性Ｆａｂに比較して、結合親和性及びＨＩＶ−１感染を中和する能力の両方に有意な向上をもたらした。
【０１４１】        ｂ）ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するｇｐ１２０特異性ＦａｂのＩＩ  ｂ由来ｇｐ１２０での中和活性
実施例Ｈ２ａで記載した通りに、ＨＩＶ−１のＩＩＩｂ株で定量的中和アッセイを行った。表４に示す結果について、データをＩＣ５０（Ｍ）として及びナノグラム／ミリリッター（ｎｇ／ｍｌ）での中和力価としての両方で表している。中和力価は、１／ＩＣ５０×（５×１０１０）として計算される。ｇｐ１２０特異性Ｆａｂ  ＭＴ４、つまりＨＩＶ−１血清陽性個体からの骨髄ライブラリーから最初に選択したＦａｂは、Ｂａｒｂａｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０：８１２−８２３（１９９３）により、融合細胞形成アッセイとｐ２４アッセイの両方において、高い結合親和性及び等しく有効な中和能力を有するとして、以前にその特徴が明らかにされている。ここに記載した通りにＨＩＶ−１のＩＩＩｂ株からのｇｐ１２０で行った中和アッセイでは、ＭＴ４  Ｆａｂは、融合細胞形成の減少度により測定して、細胞内へのＨＩＶ−１の感染力を阻害するのに要求される約３９ｎｇ／ｍｌの中和力価を有した。全てが元のクローンｐＭＴ４−３から誘導されたこの発明の４種のランダム化Ｆａｂ、つまり３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９は、約２２〜６６ｎｇ／ｍｌの中和力価を有した。これは、類似の効力を有するＦａｂのクラスター化を表わすものである。ＨＩＶ−１のＩＩＩｂ株からのｇｐ１２０では、最も効力のあるＦａｂ、つまり３ｂ１で僅か３倍のレンジに過ぎない反応性が記録され、元のＭＴ４  Ｆａｂに比較すると２倍というあまり大きくない増加を示すに過ぎなかった。
【０１４２】
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【０１４３】  この発明のＦａｂ、つまり３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４及び３ｂ９は、ＭＮで示されたのと同じの目立った効力の増加をＩＩＩｂでは示さないが、これらＦａｂが誘導されたＭＴ４  Ｆａｂが、ＭＮ由来ｇｐ１２０でよりも１０倍大きな効力をＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０で示すということが注目されるべきである。
【０１４４】  ２つのタイプのｇｐ１２０への精製Ｆａｂの結合の速度が、高度に発散した分離株ＭＮ及びＩＩＩｂから比較された。Ｍｙｅｒｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ１９９２，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ，（１９９２）。組換えタンパク質ＭＮ由来ｇｐ１２０とＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０との比較で、８８のアミノ酸残基が整列させた配列内で変わっているだけでなく、１１のアミノ酸残基の欠失と５のアミノ酸残基の挿入が明らかになった。標的細胞の感染性には、その標的の表面上のＣＤ４分子へのウィルス表面糖タンパク質ｇｐ１２０の結合が要求されるので、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位が抗ウィルス抗体のとっての共通の標的である。Ｓｕｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３５７９−３５８５（１９８９）；Ｔｈａｌｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：６１８８−６１９３（１９９１）；Ｔｉｌｌｅｙら，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．，１４２：２４７−２５９（１９９１）；Ｋａｒｗｏｗｓｋａら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８：１０９９−１１０６（１９９２）；及びＭｏｏｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：８６３−８７５（１９９３）。しかしながら、この領域に対する抗体は、一般にウィルス中和の点で特に効力がない。更には、かかる抗体は、より普通に用いられている実験株よりもウィルスの一次分離株（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）に対して効力がより低い傾向さえある。Ｍｏｏｒｅら，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，１：２３５−２５０（１９９３）。従って、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合部位に向けられた、高い親和性、効力、及び幅広い株反応性を示すＨＩＶ−１中和ヒト抗体が、予防的及び治療的用途に非常の望ましい。
この発明のＦａｂは、ＨＩＶ−１のＭＮ及びＩＩＩｂ実験株から誘導されたｇｐ１２０の両方で１０−９レンジの格別な効力を示す。Ｆａｂ  ３ｂ３のＭＮ由来ｇｐ１２０への親和性が５４倍向上したことから、Ｆａｂ  ３ｂ３を一次臨床（フィールド）分離株での中和アッセイにおける更なる検討のために選択した。
【０１４５】        ｃ）ランダム化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するｇｐ１２０特異性Ｆａｂの一次臨床ＨＩＶ分離株での中和活性
治療又は予防目的のためにＨＩＶ−１に対する抗体を産生させるに際して鍵となる点は、それらが（高い親和性と中和能力という）高い効力を有しそして広い範囲の一次臨床（フィールド）分離株と交叉反応性でなければならないという点である。これらは、一般には、２つの相反する特性である。ＨＩＶの異なる患者分離株間での抗原的関連の度合いは、ミクロプラーク（ｍｉｃｒｏｐｌａｑｕｅ）アッセイにおける交叉中和（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）により検査されてきた。Ｗｒｉｎら，Ｊ．ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，７：２１１−２１９（１９９４）。１１個体からの異種の血清及びウィルス分離株での交叉中和アッセイで、個々の血清間の中和の幅が様々であること及び異なる一次臨床分離株間の中和の頻度が様々であることが明らかになった。
【０１４６】  ＨＩＶ−１の一次臨床分離株の感染力の低下を測定するためのＦａｂ  ＭＴ４及び３ｂ３の存在下での定量的アッセイを、Ｈａｎｓｏｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２０３０−２０３４（１９９０）に記載されたミクロプラークアッセイで行った。ＨＩＶ−１の一次臨床分離株は、Ｇａｌｌｏら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１２９１−１２９４（１９８７）に記載された通りに血清陽性ドナーから得られた凍結末梢血リンパ球から分離して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中で培養した。簡単に説明すると、ＨＩＶ分離株は、凍結ＨＩＶ感染患者ＰＢＭＣを血清陰性ドナーＰＢＭＣと共に、２０％熱不活化ウシ胎児血清、２μｇ／ｍｌポリブレン、５％インターロイキン−２、及び０．１％抗ヒト白血球インターフェロンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベートすることにより得られた。この培養物に新鮮なドナーＰＢＭＣを１週間に１回与え、そして１１日目に逆転写酵素（ＲＴ）活性初動の存在についてその上澄み液をアッセイした。ＲＴ数が２週間続けて血清陰性ドナーＰＢＭＣ単独の培養物中のものよりも１０倍を越えて多いならこの培養物は陽性と考えられる。
【０１４７】  得られたＲＴ陽性ウィルス分離株をＭＴ２（α−４クローン）内での細胞溶解について試験し（Ｈａｎｓｏｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２０３０−２０３４，１９９０）、これらウィルスが細胞溶解性であることが分かった。これは、後のＭＴ２ミクロプラークアッセイ系に使用できるウィルスの要件である。一次ＰＢＭＣ分離株培養物からの上澄み液を用いて、健康な血清陰性血液ドナーからのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）刺激ＰＢＭＣの拡大培養物を感染させた。これら感染ＰＢＭＣ培養物を、１５％ウシ胎児血清、５％インターロイキン−２、０．１％抗α−インターフェロン、２μｇ／ｍｌポリブレン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。その粗上澄み液を７日後に採取してウィルスストックとして−７０℃で凍結させた。
【０１４８】  このミクロプラークアッセイに用いたＨＩＶ−１の一次臨床分離株をＶＬ１３５、ＶＬ２６３、ＶＬ５９６、ＶＬ０６９、ＶＬ４３４、ＶＬ１１４、ＶＬ１７２、ＶＬ５３０、及びＶＬ７５０と名付ける。分離株ＶＬ１３５、ＶＬ４３４、ＶＬ０６９、ＶＬ２６３、及びＶＬ５９６は、以前にそれぞれ分離株１、３、４、５、及び７としてＷｒｉｎら，Ｊ，ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，７：２１１−２１９（１９９４）に記載されたものである。
実験ＨＩＶ−１株ＭＮ及びＩＩＩｂ並びに分離株ＶＬ０６９をこのミクロプラークアッセイにおける対照としてＨ９細胞内で増殖させた。Ｈ９細胞内でのＶＬ０６９の増殖は、分離株をＨ９細胞内で増殖させたときに感作をもたらす宿主細胞効果であって以前にＳａｗｙｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：１３４２−１３４９（１９９４）に記載された効果を示すために行ったものである。
【０１４９】  Ｆａｂ  ＭＴ４及び３ｂ３及び１３人のＨＩＶ−１血清陽性患者（＋ＰＨＰ）からのヒト血漿のプールを、Ｈａｎｓｏｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２０３０−２０３４（１９９０）に記載された通りに、９６ウェルマイクロタイタープラーク減少アッセイにおける中和抗体の供給源として用いた。簡単に説明すると、Ｆａｂ  ＭＴ４又は３ｂ３の段階的希釈液（５０μｇ／ｍｌで始めて下げてゆく）又は熱不活化プール患者血漿（１：１０希釈比で始めて１：２５６まで下げてゆく）をウェル当たり１０〜２５プラーク形成単位（ＰＦＵ）を含有する等容量のＨＩＶと混合して３７℃で１８時間インキュベートした。ウィルス及び患者血漿の両方の希釈に用いた希釈剤は、５６℃で６０分間熱不活化して補体を除去した５０％正常ヒト血清プール（ヒト血漿の再石灰化により調製したもの）を含有するものであった。陰性対照ウェルも、患者免疫血清のない５０％正常ヒト血清プールを含有するものであった。Ｆａｂ又は血清とウィルスとを１８時間インキュベートした後、ウェル当たり９０，０００のＭＴ２細胞を加えて３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３９．５℃のアッセイ媒質中のＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅを加えて１．６％の最終濃度にした。この温アガロースを融解させたまま、それらマイクロタイタープレートを２０℃で２０分間５００×ｇで遠心分離して細胞単層を形成させた。これらプレートを３７℃で５日間インキュベートしてから、５０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで１８〜２４時間染色した。それら蛍光プラーク数を低拡大能ステレオズーム顕微鏡を用いる３０４ｎｍ紫外線光源による透視で数えた。感染力の阻害性又は中和力価は、対照と比較してプラーク数の５０％阻害を与えるＦａｂのμｇ／ｍｌ数又は血漿希釈度として定義される。実験を行っている間、内挿力価（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｅｄ  ｔｉｔｅｒ）の固有統計的誤差は平均±３０％である。
【０１５０】  Ｆａｂ  ＭＴ４及び３ｂ３及び１３ドナーからのプールＨＩＶ血清陽性ヒト血漿（＋ＰＨＰ）についての感染力の阻害性又は中和力価を表５に示す。各ウィルス分離株についての中和力価を、対照に比較したプラーク数の５０％阻害に要求されるＦａｂ  ＭＴ４及び３ｂ３の最少μｇ／ｍｌ数として表わす。各ウィルス分離株についての中和力価を、対照に比較したプラーク数の５０％阻害に要求される１３ドナーからのプールＨＩＶ血清陽性ヒト血漿（＋ＰＨＰ）の最少力価として表わす。
Ｆａｂ  ＭＴ４は、対照に比較したプラーク数の５０％阻害に要求されるμｇ／ｍｌ数として測定して５０μｇ／ｍｌ及びそれ未満の濃度で、アッセイした９の一次臨床分離株のうち２だけを中和できたに過ぎなかった。対照的に、Ｆａｂ  ３ｂ３は、対照に比較したプラーク数の５０％阻害に要求されるμｇ／ｍｌ数として測定して５０μｇ／ｍｌ及びそれ未満の濃度で、９の一次臨床分離株のうち６を中和することができた。かくして、最も親和性が高いＦａｂ、つまり３ｂ３は、それが誘導されたＦａｂ  ＭＴ４に比較して更に４の一次臨床分離株を中和できた。Ｆａｂ  ３ｂ３によるそれぞれ３８．９及び２９．５μｇ／ｍｌでの分離株ＶＬ１３５及びＶＬ５３０の５０％中和はかなりのものである。というのは、３ｂ３が誘導されたＦａｂ  ＭＴ４は５０μｇ／ｍｌで大したこといのないレベルの中和（約１０％）を示したに過ぎないからである。ＭＮ及びＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０の中和は、実施例２Ｈで記載した先に行った融合細胞形成アッセイに比較した場合、このミクロプラークアッセイでは約５倍向上した。
【０１５１】
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【０１５２】  このように、ｇｐ１２０への結合及びＨＩＶ−１感染の中和に元来有効であるＦａｂクローンの重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３の両方をランダム化するこの発明の方法は、幅広い中和活性を有するＦａｂの有意義かつ意外な改良ももたらした。この幅広い中和活性は、まず、高度に発散したＨＩＶ−１  ｇｐ１２０分離株ＭＮ及びＩＩＩｂとの結合親和性の増加により証明された。パンニング過程の間の選択圧力を、発散したｇｐ１２０の混合物で選択することにより交叉反応性に有利なようにかけることができたであろうが、これは、ＭＮ及びＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０の両方への高まった結合親和性を有するＦａｂが同定されたので、必要ではなくなった。
ＭＮ及びＩＩＩｂ由来ｇｐ１２０ストックでの中和アッセイでの量的感染性により判定した効力もやはり向上している。親和性は、ＭＮ由来ｇｐ１２０では中和能力とよく相関している。この発明のＦａｂの効力は、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の効力と同等である。Ｌａｙｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：２７７−２７９（１９９０）。ｓＣＤ４と同等の効力で中和するこの能力は、特有のものである。
【０１５３】  この発明のＦａｂの幅広い中和活性は、ＨＩＶの一次臨床分離株での定量的中和アッセイで更に証明された。ＭＮ由来ｇｐ１２０への最高の親和性を示したＦａｂ  ３ｂ３は、それが誘導されたＦａｂ  ＭＴ４に比較して更に４の一次臨床分離株を中和することができる。中和アッセイにおいてこれら一次臨床分離株の特徴を明らかにしたところ、複数表現型を示唆する異種性中和のパターンが明らかになった（Ｗｒｉｎら，Ｊ．ｏｆ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，７：２１１−２１９，１９９４）。かくして、ｇｐ１２０に効果的に結合してＨＩＶ−１感染を中和するＦａｂの重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のランダム化が、複数表現型の一次臨床分離株との幅広い中和反応性を有するＦａｂをもたらした。
【０１５４】２．ランダム化重鎖及び軽鎖ＣＤＲを有する４種のファージミドライブラリーの調製及びそれから発現される親和性最適化Ｆａｂの分泌
Ａ．ランダム化重鎖及び軽鎖ｇｐ１２０特異性Ｆａｂ抗体を得るための方法の概説
実施例１に記載したｐＭＴ４−３の重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域の突然変異誘発で、ｇｐ１２０についての親和性の増加と共に複数表現型の一次臨床分離株との幅広い中和反応性を示す３ｂ３重鎖及び軽鎖Ｆａｂヘテロダイマー抗体を発現するためのｐ３ｂ３と名付けられるファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）が生成した。
この発明の高親和性ｇｐ１２０特異性Ｆａｂ抗体を産生する方法は、実施例２及び３に記載の通り、実施例１で得たｐＭＴ４−３又はｐ３ｂ３のいずれかのＣＤＲ特異的ランダム突然変異誘発法（ＣＤＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に基礎を置いている。より詳しくは、予め選択したＣＤＲを鋳型ＤＮＡ中でランダム化して基質ｇｐ１２０への結合性を最適化した。この選択的最適化の後、異なるｇｐ１２０反応性Ｆａｂからの突然変異ＣＤＲをコードするヌクレオチド断片を特定の組み合わせで結合させて、複合重鎖及び軽鎖ドメインを形成させた後、１０−１０Ｍ又はそれより大きな解離定数（Ｋｄ）を有する可溶性複合最適化ＣＤＲ含有Ｆａｂの発現のための発現ベクター内に挿入した。
【０１５５】  次の一般的アプローチを用いて、高まった親和性を有する複合最適化ＣＤＲ含有Ｆａｂを得た：１）予め選択したファージミド鋳型内での特定ＣＤＲのランダム突然変異誘発と結び付けた増幅から各ライブラリーを生じさせるこの発明の方法を用いて、新たなファージミドライブラリーを生じさせ；２）ファージミド−Ｆａｂディスプレイドライブラリー（ｐｈａｇｅｍｉｄ−Ｆａｂ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）をｇｐ１２０でスクリーニングした後、追加のライブラリーの調製用に特定クローンを選択してｇｐ１２０との高親和性Ｆａｂ抗体相互作用を付与するための複数の最適化ＣＤＲを有するクローンを得；３）次いで、好ましい突然変異Ｆａｂを発現するクローンを用いて、ランダム化して選択したＣＤＲ１及びＣＤＲ３重鎖及び軽鎖を有する、ｇｐ１２０への高親和性結合について最適化された特有のＦａｂ発現性クローンを作り出した。
【０１５６】  上の概説に記載した通りにライブラリーを作りそしてスクリーニングするに際し、発現されるＦａｂの配列及び親和性分析用に、次のライブラリーを調製してｇｐ１２０特異性クローンをそれから選択した。
１つのライブラリーについては、Ｆａｂ  ３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４、及び３ｂ９をコードするクローン内での第１回目のスクリーニングで得られた、グリコシル化反応性アスパラギン残基の代わりにヒスチジン残基をＣＤＲ１の最初の位置に有することによりグリコシル化されないＦａｂを発現する、追加のｇｐ１２０特異性クローンを得るために、ランダム化重鎖ＣＤＲ１（１５ヌクレオチド）を有するｐＭＴ４−３ライブラリーを、実施例１に記載した通りに第２回目のスクリーニングに付した。次いで、選択されたＦａｂをコードするＤＮＡを、親和性及びヌクレオチド配列決定用の可溶性Ｆａｂの調製のために、ｐＰｈｏ−ＴＴベクター内に挿入した。
【０１５７】  第２のライブラリーについては、ｐＣｏｍｂ３Ｈ内のファージミド３ｂ３の重鎖ＣＤＲ３も、Ｆａｂ  ３ｂ３を発現するファージミドを形成するために実施例１に記載した通りにｐＭＴ４−３内で先に突然変異誘発した１２ヌクレオチドに隣接する１５ヌクレオチドにわたって別々にランダム化した。ＣＤＲ３におけるこの突然変異域の拡張は、Ｆａｂ  ３ｂ３で得られるものと等しいか又はそれよりも大きなｇｐ１２０への親和性を有するＦａｂを得るために行った。新たにランダム化したＣＤＲ３を含有するオーバーラップＰＣＲからの増幅産物を３ｂ３中に連結し直して、ランダム化重鎖ＣＤＲ３を先にランダム化して選択した重鎖ＣＤＲ１及び元々ｐＭＴ４−３から誘導された非突然変異軽鎖と一緒に有するランダム化ライブラリーを形成させた。発現、選択及び特性決定は、上に記載した通りに行った。
【０１５８】  第３のライブラリーについては、ｐＣｏｍｂ３Ｈ内のファージミド３ｂ３の軽鎖ＣＤＲ１を、ＣＤＲ１内の１２アミノ酸のうちの６をコードする１８ヌクレオチドにわたって別々にランダム化した。次いで、ランダム化軽鎖ＣＤＲ１を有する得られた増幅産物を３ｂ３中に連結して、３ｂ３に基づく軽鎖ＣＤＲ１突然変異ライブラリーを形成させた。かくして、このライブラリーから選択したクローンは、元の３ｂ３突然変異重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３及び新たに突然変異誘発された軽鎖ＣＤＲ１を発現するためのヌクレオチド配列を含有した。
軽鎖ＣＤＲ３の一部分（１５ヌクレオチド）がランダム化された第４のライブラリーを上で第３のライブラリーについて記載した通りに調製した。得られた３ｂ３に基づくライブラリーは、３ｂ３突然変異重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３及び新たに突然変異誘発された軽鎖ＣＤＲ３を元の３ｂ３軽鎖ＣＤＲ１と共に発現するためのヌクレオチド配列を有するクローンを含有した。
【０１５９】  最適化軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するｇｐ１２０結合性合成Ｆａｂを作るために、好ましいクローン、つまりファージミドＤを、ランダム化して選択した軽鎖ＣＤＲ１を有する第４ライブラリーから選択してから、軽鎖ＣＤＲ３上でもう１回の突然変異誘発に付した。得られたライブラリーについて、発現及びパンニング過程を２種の異なる方法、つまり酸で特異的に溶離する方法対可溶性Ｆａｂ  ３ｂ３との競合後に酸で溶離する方法により行った。後者の溶離操作で、軽鎖及び重鎖突然変異ＣＤＲ１／ＣＤＲ３の両方を有する１０−１１Ｍ又はそれより大きなＫｄを示すＦａｂをコードするクローンの分離ができた。
別々に同定して特性決定したＦａｂ発現性クローンにより提供される複合ＣＤＲを有する個別の軽鎖配列及び重鎖配列を調製して、そのＣＤＲが得られるクローンに比較して親和性最適化された重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する特有のＦａｂを作り上げた。
当業者は、上に列挙した工程を示した順序で行っても異なる順序で行っても、突然変異重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域を有するＦａｂを調製できることが分かるであろう。前述のライブラリーの調製及びそれからのｇｐ１２０特異性Ｆａｂの選択を以下に詳細に示す。
【０１６０】    １）ｐＣｏｍｂ３Ｈ発現ベクターの調製
発現ベクター、つまりｐＣｏｍｂ３Ｈは、実施例１に記載した元のｐＣｏｍｂ３ファージミドの修飾型である。ｐＣｏｍｂ３でのように、ｐＣｏｍｂ３Ｈもファージディスプレイドバクテリオファージ外皮タンパク質３係留タンパク質（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を発現できる。糸状ファージの遺伝子ＩＩＩは、細菌膜上でのファージ組み立て過程における押出しの前に発現されそして大腸菌の周辺質内に面する内膜上に蓄積する４０６残基非主要ファージ外皮タンパク質、つまりｃｐＩＩＩ（ｃｐ３）をコードする。遺伝３及びコードされる外皮タンパク質の、それぞれヌクレオチド及びアミノ酸残基配列は当業者によく知られており、かつ国際出願ＷＯ９２／１８６１９に公表されている。なお、その開示内容は参照によりここに組み入れられるものとする。
修飾されたベクター、つまりｐＣｏｍｂ３Ｈは、以下に記載するように、重鎖のアミノ末端にヒトコンセンサス配列を与えるようにデザインされたものである。更には、そのベクターの安定性を高めるために、元のｐＣｏｍｂ３に見出される全ての相同性領域を除去した。ｌａｃＺプロモーターからＮｏｔＩ制限部位にかけてのｐＣｏｍｂ３Ｈベクターを図６に示し、抗破傷風毒素Ｆａｂをコードするヌクレオチド配列を含む完全ベクターのヌクレオチド配列であって、重鎖カセット及び軽鎖カセットを占める配列を配列番号：４３に掲げる。抗破傷風毒素（ＴＴ）コーディング配列を含有するｐＣｏｍｂ３ＨベクターをｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴと名付ける。このＴＴコーディングスタッファー（ＴＴ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｓｔｕｆｆｅｒ）をｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターから取り除くと、この発明の予め選択した重鎖及び軽鎖ヌクレオチド配列を指向的に挿入することができる。
【０１６１】  ｐＣｏｍｂ３Ｈを用いるに際し、周辺質分泌シグナル（ｏｍｐＡリーダー）をコードする第１シストロンをκ軽鎖に機能できるように連結する。このｏｍｐＡのヌクレオチド配列、つまり発現されたタンパク質を周辺質空間に向けるためのリーダー配列は、Ｓｋｅｒｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４１（１９８８）に報告されている。第２シストロンは、その融合タンパク質、つまりＦｄ−ｃｐＩＩＩに機能できるように連結されたｐｅ１Ｂリーダーをコードした。ｐｅ１Ｂ及びｏｍｐＡリーダーの存在で、細菌の細胞質から周辺質空間への、Ｆｄ／ｃｐ３融合タンパク質を含む融合タンパク質とκ軽鎖との両方の調和しているが別々の分泌が容易になった。
各鎖は、後で開裂してしまうｐｅ１Ｂ又はｏｍｐＡリーダー配列により周辺質空間に送られた。重鎖はｃｐ３膜アンカードメインにより膜内に係留され、軽鎖は周辺質空間内に分泌された。Ｆａｂ分子は、この係留された重鎖とこの可溶性軽鎖との結合から形成されたものである。
【０１６２】  ｐＣｏｍｂ３ＨベクターはｐＣｏｍｂ３ベクターから誘導されたものなので、以前にＳｈｏｒｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：７５８３−７６００（１９８８）に記載されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから誘導されたｌａｃＺプロモーター、リボソーム結合部位、ＣｏｌＥ１及びｆ１起点、及びペニシリナーゼ遺伝子を含有する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの完全ヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ５２３３０を有する。ｃｐ３のアミノ酸残基２３０〜４０６をコードするＤＮＡをＳｐｅＩ制限部位の３’であるＳｆｉＩ制限部位の後ろに挿入した（図６）。
ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターは２つのＳｆｉＩ制限部位を含有する（図６）。これらＳｆｉＩ部位の１つは、軽鎖の分泌を行わせるｏｍｐＡリーダーをコードするヌクレオチド配列内に含まれているので、ＳａｃＩ部位の５’に位置している。第２ＳｆｉＩ部位は、ＳｐｅＩ部位とｃｐ３膜アンカー配列の間にある。ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターが軽鎖及びＦｄをコードするＤＮＡを含有するときは、これら２つのＳｆｉＩ部位は、それぞれ軽鎖をコードするＤＮＡ配列の５’末端とＦｄをコードするＤＮＡ配列の３’末端に位置する。重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを含有するｐＣｏｍｂ３ＨベクターをＳｆｉＩで消化すると、軽鎖、翻訳停止配列、リボソーム結合部位、ｐｅ１Ｂリーダー及びＦｄをコードするＤＮＡを含むカセットが外れる。次いで、このカセットをこの発明に記載したｐＰｈｏ−ＴＴベクターの如き他の発現ベクターに指向的に挿入することができる。従って、ｐＣｏｍｂ３内の元の制限部位に加えて、ＳｆｉＩ制限部位を付け加えることは、１つの断片内の重鎖及び軽鎖カセット全体を以下に記載する通り可溶性Ｆａｂの発現用のｐＰｈｏと名付けられた発現ベクター内にサブクローン化できるもう１つの修飾である。
【０１６３】  かくして、得られた組み合わせベクター、つまりｐＣｏｍｂ３Ｈは、１種の融合タンパク質、つまりＦｄ／ｃｐ３、及び１種の可溶性タンパク質、つまり軽鎖を発現するための２つのカセットを有する３３９４塩基対ＤＮＡ分子からなるものとなった。このベクターは、以下に５’から３’方向で列挙した機能できるように連結された要素のためのヌクレオチド配列も含有した：ＬａｃＺプロモーター／オペレーター配列；ＥｃｏＲＩ制限部位；リボソーム結合部位；ｏｍｐＡリーダー；ＳｆｉＩ制限部位：スペーサー領域；５’ＳａｃＩ及び３’ＸｂａＩ制限部位により縁取られたクローニング領域からなる第１カセット；これら２つのカセット間に位置するＮｃｏＩ制限部位；及び発現制御リボソーム結合部位；ｐｅ１Ｂリーダー；アミノ酸残基Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号：４４）をコードするヒトコンセンサスアミノ末端スペーサー領域；５’ＸｈｏＩ及び３’ＳｐｅＩ制限部位により縁取られたクローニング領域であってＳｆｉＩ制限部位が後に続いている領域；バクテリオファージｃｐ３をコードする配列であって停止コドン及びＮｈｅＩ制限部位が後に続いている配列；発現制御停止配列及びＮｏｔＩ制限部位からなる第２カセット。
【０１６４】  配列番号：４３に示され、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴと名付けられたｐＣｏｍｂ３Ｈベクター配列は、長さが１，２００ｂｐである軽鎖ＴＴコーディングスタッファー及び長さが３００ｂｐである重鎖ＴＴコーディングスタッファーを含有する。この発明のＦａｂを発現するための軽鎖可変ドメインをクローニングするために、抗破傷風毒素Ｆａｂ軽鎖の軽鎖スタッファーを制限酵素ＳａｃＩ及びＸｂａＩで消化することにより除去してから、同じようにして消化した軽鎖を挿入した。この発明のＦａｂを発現するための重鎖可変ドメインをクローニングするために、抗破傷風毒素Ｆａｂ重鎖の重鎖スタッファーを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化することにより除去してから、同じようにして消化した重鎖を挿入した。
次いで、この重鎖の発現に要求される軽鎖配列をコードするＤＮＡ及びこの重鎖をコードするＤＮＡを含有するカセットを以下に記載するようにｐＣｏｍｂ３Ｈベクターから外し、そして制限酵素ＳｆｉＩでの消化により、可溶性Ｆａｂの産生用のｐＰｈｏ−ＴＴベクター内に指向的に挿入した。また別に、ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターを制限酵素ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩで消化してから再連結してｃｐ３膜アンカー配列を除去し、そして可溶性Ｆａｂを発現させることができる。
【０１６５】    ２）ファージミッド３ｂ３重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈの調製
重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方を有するＣＤＲランダム化発現合成ヒトＦａｂ抗体を得るために、各ＴＴスタッファーを続けざまに置換することにより、ファージミッド３ｂ３の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列をｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ内に指向的に連結した。次いで、ファージミッドベクターを含有するこのｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３と名付けたベクターを、後の突然変異誘発操作のための鋳型として用いた。３ｂ３由来Ｆａｂのランダム化は、実施例２Ｃから２Ｅにかけて記載されている。
ｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３を調製するために、まずファージミッド３ｂ３をＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化してから、その断片を同じように消化したｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターと連結してファージミッド３ｂ３の重鎖可変ドメインを含有するｐＣｏｍｂ３Ｈベクターを生成させた。３ｂ３から誘導される重鎖及び軽鎖の両方を発現するためのｐＣｏｍｂ３Ｈファージミッドを作るために、３ｂ３の軽鎖カセットをＳａｃＩ及びＸｂａＩで消化してから、３ｂ３重鎖を含有する同じように消化したｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクター内に挿入した。換言すると、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ内の重鎖及び軽鎖抗破傷風毒素スタッファーにそれぞれ置き換わった３ｂ３突然変異重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び３ｂ３由来軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含有するｐＣｏｍｂ３Ｈに基づくベクターである。この３ｂ３軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列は、図１０及び配列番号：６２に示すように、ｐＭＴ４−３の配列と同じである。
発現後、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ファージ係留Ｆａｂのライブラリーを先に記載した通りのパンニングすることによりスクリーニングした。
【０１６６】    Ｂ．ファージミッドｐＭＴ４−３の重鎖可変ドメインのランダム化ＣＤＲ１の調製
ｐＭＴ４−３内の重鎖可変ドメインのＣＤＲ１を実施例１に記載しかつＢａｒｂａｓ  ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３（１９９４）に記載された通りに突然変異誘発した。なお、その開示内容は参照によりここに組み入れられるものとする。しかしながら、全てのスクリーニング及び選択したｇｐ１２０特異性Ｆａｂは、ＣＤＲ１の最初の位置にアスパラギン（Ｎ）残基を含有した。これはグリコシル化部位として役立つので好ましい残基ではない。従って、その位置に好ましいヒスチジン（Ｈ）残基を有する更なるＦａｂを得るために、第２回目のスクリーニングを実施例１に記載した通りにｐＭＴ４−３内の重鎖ＣＤＲ１に関して行った。次いで、得られたｇｐ１２０反応性ファージディスプレイドＦａｂ（ｇｐ１２０−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  Ｆａｂｓ）をコードするヌクレオチド配列を以下に記載する通りにｐＰｈｏ−ＴＴベクター内にサブクローン化した。
【０１６７】    １）ランダム化重鎖ＣＤＲ１を有するｐＭＴ４−３由来Ｆａｂのアミノ酸残基配列分析
上で作ったＣＤＲ１ランダム化クローンの核酸配列決定を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ１．０（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、無作為に選んだ６種の二本鎖Ｆａｂ発現性ＤＮＡクローンについて行った。核酸配列決定は、この発明に記載したあらゆるＦａｂ発現性ベクターを鋳型として用いて行うことができ、そのベクター推進Ｆａｂ発現が可溶性であるか膜係留性であるかに依存しない。ＭａｃＶｅｃｔｏｒの一連のプログラムを用いて、誘導されるアミノ酸残基配列をお互いに及びＧｅｎｂａｎｋデータベースと一緒に整列させた。選択した６種の特定の合成ｇｐ１２０特異性Ｆａｂ及びＭＴ４の誘導された重鎖アミノ酸残基配列を図７Ａ及び７Ｂに示す。図７に示すように、可変重鎖ドメイン内のフレームワーク（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）を整列させると、無症候性ＨＩＶ−１個体からの骨髄ライブラリーのスクリーニングから得られた元のＭＴ４  ｇｐ１２０特異性Ｆａｂでは、ＣＤＲ１のアミノ酸残基配列は、Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（配列番号：１，残基２８〜３２より）であることが分かる。配列を比較して、位置３１ではアスパラギン（Ｎ）又はヒスチジン（Ｈ）のいずれかが好ましく、位置３２では芳香族残基が好ましく、位置３３では主としてスレオニン（Ｔ）が好ましく、位置３４ではイソロイシン（Ｉ）又はロイシン（Ｌ）が好ましく、そして位置３５では疎水性及び／又は芳香族残基が好ましいことが分かった。
【０１６８】  ＣＤＲ１について図７Ａ及び７Ｂに示したこれら６種のアミノ酸残基は、ランダム化されておりかつ示した各配列番号の位置２８〜３２、つまりＨ４ＨＩ−１：Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：４５）；Ｈ４Ｈ１−３：Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（配列番号：４６）；Ｈ４Ｈ１−５：Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（配列番号：４７）；Ｈ４Ｈ１−６：Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（配列番号：４８）；Ｈ４Ｈ１−７：Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ（配列番号：４９）；及びＨ４Ｈ１−８：Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ（配列番号：５０）から選択されるアミノ酸残基配列を有する。図７Ａ及び７Ｂに示すように、スクリーニングして選択した重鎖ＣＤＲ１突然変異Ｆａｂの６種のうち３種が、ＣＤＲ１内の最初の残基として、グリコシル化を回避する好ましいヒスチジン残基を含有した。このグリコシル化は、ＭＴ４の場合のようにアスパラギンが存在していると起こる。
次いで、ｇｐ１２０への結合について選択されたＣＤＲ１突然変異重鎖ＦａｂをコードするＤＮＡを可溶性Ｆａｂの発現用のベクターｐＰｈｏ−ＴＴに別々に移した。次いで、その可溶性Ｆａｂをｇｐ１２０への結合親和性について分析した。
【０１６９】    ２）ランダム化重鎖ＣＤＲ１を有するｇｐ１２０特異性Ｆａｂの結合親和性分析
次いで、ｇｐ１２０への結合性について選択したランダム化重鎖ＣＤＲ１を含有するＦａｂをコードしたＤＮＡを可溶性Ｆａｂの発現用のベクターｐＰｈｏ−ＴＴに移した。次いで、可溶性Ｆａｂの結合親和性の分析を以下に記載する通りに行った。この目的のためのｇｐ１２０特異性Ｆａｂコーディング領域をコードするヌクレオチド配列の移動は、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ及びｐＰｈｏ−ＴＴベクターの両方において、Ｆａｂコーディング領域の隣にあるＳｆｉＩ制限部位の存在により容易になった。
【０１７０】        ａ）ｇｐ１２０特異性Ｆａｂを含有するｐＰｈｏ−ＴＴの調製
発現ベクターｐＰｈｏ−ＴＴは、それぞれ実施例１及び２Ａに記載したｐＣｏｍｂ３及びｐＣｏｍｂ３Ｈファージミッド発現ベクターの修飾型である。これらｐＣｏｍｂ３及びｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターは、実施例１Ｇに記載した発現ベクターからｃｐ３をコードするファージミッド遺伝子３アンカー配列を除去することにより、可溶性Ｆａｂを発現できる。ｐＣｏｍｂ３及びｐＣｏｍｂ３Ｈベクターでのように、ｐＰｈｏ−ＴＴも、周辺質空間に分泌される可溶性Ｆａｂを発現できる。しかしながら、ｐＣｏｍｂ３及びｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターからの可溶性Ｆａｂの発現はｌａｃＺプロモーターにより調節される一方、ｐＰｈｏ−ＴＴベクターからの可溶性Ｆａｂの発現はアルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーターにより調節される。当業者にとって周知なように、このｐｈｏＡプロモーターはリン酸飢餓条件化で誘発性である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。
【０１７１】  ｐＰｈｏ−ＴＴベクターは、ＥｃｏＲＩ部位からＳｐｅＩ部位の後ろの第２ＳｆｉＩ部位まではｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターと同一である。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴのこの領域は、図６に示してある。ｐＰｈｏ−ＴＴ、つまり抗破傷風毒素Ｆａｂをコードするヌクレオチド配列であって重鎖及び軽鎖カセットを占める配列を含む完全ｐＰｈｏベクターは、配列番号５１に掲げられている。
ｐＰｈｏ−ＴＴを用いるに際し、その第１シストロンは、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ第１シストロンによりコードされるのと同一であるので、κ軽鎖の発現及び分泌ができる。第２シストロンは、重鎖タンパク質、つまりＦｄに機能できるように連結されたｐｅ１Ｂリーダーをコードした。ｏｍｐＡ及びｐｅ１Ｂリーダーの存在で、細菌の細胞質から周辺質空間へのκ軽鎖及びＦｄの両方の調和しているが別々の分泌が容易になった。
これらＦｄ及びκ軽鎖は、それらそれぞれの後で開裂してしまうリーダー配列により細胞質空間に分泌された。Ｆａｂ分子は、選択されたＦｄとκ軽鎖の結合から形成されたものである。
【０１７２】  その制限酵素地図が図８に図示されているｐＰｈｏ−ＴＴベクターは、実施例２Ｂ１ａ）でｐＣｏｍｂ３Ｈベクターについて記載したように、リボソーム結合部位、ＣｏｌＥ１及びｆ１起点、及びペニシリナーゼ遺伝子も含有した。このｐＰｈｏ−ＴＴベクターは、重鎖をコードするＤＮＡの指向的挿入のためのＸｈｏＩ部位及びＳｐｅＩ部位を含有し、軽鎖をコードするＤＮＡの指向的挿入のためのＳａｃＩ部位及びＸｂａＩ部位を含有した。加えて、このｐＰｈｏベクターは、ここに記載した可溶性Ｆａｂの発現のために、１つの断片内の重鎖及び軽鎖カセット全体をｐＣｏｍｂ３ＨベクターからｐＰｈｏベクター内に移すのを容易にする、ｐＣｏｍｂ３Ｈベクターのものと同一の２つのＳｆｉＩ部位を含有した。かくして、ｐＰｈｏベクター内のこれら部位は、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々の２工程で指向的に挿入するのを、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードするＤＮＡを含む単一カセットを１工程で指向的に挿入するのを可能にした。重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々の工程でｐＰｈｏ−ＴＴベクター内に挿入する場合、挿入されるＤＮＡの供給源は、同じＦａｂからであっても異なるＦａｂからであってもよい。加えて、更にここに記載するように、重鎖又は軽鎖ＤＮＡコーディング配列のいずれの部分をｐＰｈｏベクター内に挿入してもよい。
【０１７３】  かくして、このｐＰｈｏ−ＴＴベクターは、２種の可溶性タンパク質、重鎖（Ｆｄ）及び軽鎖を発現する２種のカセットを有するＤＮＡ分子からなるものとなった。このベクターは、以下に５’から３’方向で列挙した機能できるように連結された要素のためのヌクレオチド配列を含有した：ｐｈｏＡプロモーター／オペレーター配列；ＥｃｏＲＩ制限部位；リボソーム結合部位；ｏｍｐＡリーダー；ＳｆｉＩ制限部位；スペーサー領域；５’ＳａｃＩ及び３’ＸｂａＩ制限部位により縁取られたクローニング領域からなる第１カセット；これら２つのカセットの間に位置するＮｃｏＩ制限部位；及び発現制御リボソーム結合部位；ｐｅ１Ｂリーダー；アミノ酸残基Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（配列番号：４４）をコードするヒトコンセンサスアミノ末端スペーサー領域；５’ＸｈｏＩ及び３’ＳｐｅＩ制限部位により縁取られたクローニング領域であってＳｆｉＩ部位が後に続いている領域；発現制御停止配列、及びＮｏｔＩ制限部位からなる第２カセット。
【０１７４】  配列番号：５１に示すように、ｐＰｈｏ−ＴＴベクター配列は、長さが１，２００ｂｐである軽鎖スタッファー及び長さが３００ｂｐである重鎖スタッファーを含有する。これら重鎖及び軽鎖スタッファーのヌクレオチド配列は、それぞれ破傷風毒素（ＴＴ）特異性Ｆａｂの重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードした。かくして、配列番号：５１に示した軽鎖及び重鎖スタッファーを含有するｐＰｈｏベクター配列をｐＰｈｏ−ＴＴと名付けている。この発明のＦａｂを発現するための重鎖又は軽鎖可変ドメインを挿入するために、ｐＰｈｏ−ＴＴの重鎖及び軽鎖スタッファーを、この発明のＦａｂの発現のためのｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴベクターの調製についての実施例２Ｂ１ａ）に記載した通りに除去した。
【０１７５】  実施例２Ｃ〜２Ｅに記載した通りにｐＣｏｍｂ３Ｈベクターから可溶性ヘテロダイマーを調製するために、まずｇｐ１２０反応性クローンをコードするファージミッドＤＮＡを単離してから、ＳｆｉＩで消化した。ｐＰｈｏ−ＴＴを同じく消化した。このファージミッドＤＮＡ及びｐＰｈｏ−ＴＴのＳｆｉＩ制限酵素での消化で、両立性の粘着末端が生成した。ｇｐ１２０反応性重鎖及び軽鎖を含む１．６ｋｂ  ＤＮＡ断片及びｐＰｈｏベクターを含む４．７ｋｂ  ＤＮＡ断片をゲル精製（０．６％アガロース）して一つに連結した。大腸菌ＤＨ１０Ｂ（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を形質転換して、ｇｐ１２０反応性重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ及びｐＰｈｏ発現ベクターを含む組換え体を単離した。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化により、重鎖及び軽鎖コーディングＤＮＡ断片の挿入についてクローンを検査した。この消化で１．６ｋｂ断片が生成する筈である。かくして、ｇｐ１２０反応性重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡが、可溶性Ｆａｂの発現のために、ｐＣｏｍｂ３ＨからｐＰｈｏベクターに移された。
ＣＤＲ１ランダム化重鎖を有するベクターについて実施例２Ｂに記載した通りにｐＣｏｍｂ３に基づくベクターから可溶性ヘテロダイマーを調製するために、重鎖及び軽鎖カセットをそれぞれＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ及びＳａｃＩ／ＸｂａＩでの消化により別々に単離してから、同じようにして消化したｐＰｈｏ−ＴＴ内に続けて指向的に連結することにより、ＴＴ重鎖及び軽鎖スタッファー断片を連続的に置換した。
【０１７６】        ｂ）ｐＰｈｏ発現ベクターからの可溶性ｇｐ１２０特異性Ｆａｂの発現及び精製
ｇｐ１２０特異性可溶性Ｆａｂの発現及び精製のため、当業者にとって周知でありかつＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているように、クローンを低リン酸培地中で増殖させて誘発させ、そして可溶性Ｆａｂを実施例１Ｈ２ａ）に記載した通りに精製した。
ｃ）プラズモン共鳴を用いる結合親和性分析
実施例２Ｂ２）に記載した通りにｇｐ１２０に対してパンニングすることにより選択した重鎖ＣＤＲ１突然変異Ｆａｂの第２スクリーニンググループが、ｇｐ１２０の実験単離物との親和性測定に用いるために上に記載したｐＰｈｏから可溶型で発現された。実施例１Ｈに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、重鎖ＣＤＲ１の第１位置に好ましいヒスチジン残基を有する選択Ｆａｂの親和性を出した。
【０１７７】  ＩＩＩｂ株のｇｐ１２０にとって好ましいヒスチジン残基を有するＦａｂ（Ｈ４Ｈ１−１、Ｈ４Ｈ１−３及びＨ４Ｈ１−５）の平衡解離定数（Ｋｄ，Ｍ）により測定したＦａｂ結合親和性分析の結果を表６に列挙する。その表中の全ての測定値は、Ｋｄ，Ｍとして示されている。更に、予め選択した重鎖又は軽鎖ＣＤＲを突然変異誘発することの親和性への作用を患者から得られた非突然変異Ｆａｂ  ＭＴ４のもの比較するために、親和性の増加倍率が計算されている。これら増加倍率は、Ｆａｂ  ＭＴ４の測定Ｋｄ（６．３×１０−９）を、突然変異ＣＤＲを有するそれぞれの新たなＦａｂの測定Ｋｄで割ることにより計算される。
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【０１７８】  表６から明らかなように、誘導したＦａｂのＫｄは１０−９Ｍのレンジにあり、それぞれは元のＦａｂ  ＭＴ４のものよりも２〜３倍のｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株結合親和性の増加を示した。Ｈ４Ｈ１シリーズのＦａｂをコードするヌクレオチド配列を含有する各ｐＰｈｏベクターから、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ消化により、ヒスチジン含有重鎖ＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列を別々に単離し、そして実施例３（表１１）に記載する通りに用いて、好ましいＣＤＲ１を、以下のＣに記載する通りに調製した親和性最適化ＣＤＲ３と合わせて有する別々の複合重鎖を調製した。
【０１７９】    Ｃ．ファージミッドｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３の重鎖可変ドメイン内の先にランダム化されたアミノ酸に隣接するランダム化ＣＤＲ３の調製
実施例１に記載したオーバーラップＰＣＲにより調製したランダム化重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するＦａｂ  ３ｂ３のｇｐ１２０結合親和性を更に高めるために、実施例１Ａに記載した通りｐＣｏｍｂ３Ｈ内にサブクローン化したｐ３ｂ３の重鎖ＣＤＲ３内の追加の予め選択した１５ヌクレオチドをオーバーラップＰＣＲによる突然変異誘発に付した。実施例１に記載した通りにｐＭＴ４−３からＦａｂ  ３ｂ３を得るために、重鎖ＣＤＲ３内の第３〜第６アミノ酸残基位置に位置する４つのアミノ酸をコードする１２ヌクレオチドをランダム化した。次いで、これら第１ランダム化１２ヌクレオチドに対して３’である１５の隣接ヌクレオチドをｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３内で突然変異誘発して、図９Ａ及び９Ｂに示す通り第７〜第１１ＣＤＲ３残基の５つの新たなアミノ酸残基をコードさせた。その結果、以下に記載するようにこの新たなライブラリーから選択されるＦａｂは、Ｆａｂ  ３ｂ３重鎖のＣＤＲ３内の１８のアミノ酸残基のうち全部で９のランダム化アミノ酸残基、つまり５つの新たにランダム化して選択した４つのアミノ酸とＦａｂ  ３ｂ３内で先に突然変異誘発して選択したアミノ酸を合わせた残基を含有した。
【０１８０】  かくして、基本的には、Ｆａｂ  ３ｂ３は元々ｐＭＴ４−３から誘導されたものなので、９のアミノ酸突然変異がオーバーラップＰＣＲによりＦａｂ  ＭＴ４の重鎖ＣＤＲ３内に作られたことになる。
実施例１Ｂに記載したように、オーバーラップＰＣＲを先に得られたｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３発現ベクター鋳型上で同じように行った。第１回目のＰＣＲで、５’ＦＴＸ３オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９）を、ヌクレオチド配列５’−ＣＣＡＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号：５２）を有する３’非コーディング突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマー、つまり３ｂ３Ｃ３５ｏｂと共に用いて重鎖ＣＤＲ３を増幅し、そして上記の１５ヌクレオチド領域を突然変異誘発した。次いで、得られた増幅産物を実施例１Ｂに記載した通りに精製して第２回目からの産物とのオーバーラップＰＣＲに用いた。
【０１８１】  この後の回のＰＣＲも、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：５３）を有する５’コーディングオーバーラップオリゴヌクレオチドプライマー、つまりｈ４ｈ３ｏｆ及び３’非コーディングオリゴヌクレオチドプライマーＲ３Ｂ（配列番号：１２）で行った以外は、先に実施例１Ｂに記載した通りに行った。次いで、得られた増幅産物を実施例１Ｂに記載した通りに精製し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーペアＦＴＸ３及びＲ３Ｂを用いて第１回目からの産物でのオーバーラップＰＣＲに用い、新たに突然変異誘発されたＣＤＲ３を有する増幅重鎖可変ドメインの集団を生成させた。
次いで、これら重鎖ＣＤＲ３ランダム化増幅産物を、ＳａｃＩ／ＸｂａＩ消化ｐＭＴ４−３軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列（ｐ３ｂ３のものと同じ）が実施例２Ｂに記載の通りに連結されているｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ内に連結して、ｐ３ｂ３由来ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＣＤＲ３ランダム化発現ベクターのライブラリーを生成させた。次いで、それぞれが突然変異重鎖とｐＭＴ４由来軽鎖を有するファージディスプレイドＦａｂを発現させて実施例１に記載した通りにｇｐ１２０でパンニングした。
【０１８２】    １）ランダム化重鎖ＣＤＲ３を有するｐ３ｂ３由来Ｆａｂのアミノ酸残基配列分析
次いで、ｇｐ１２０に特異的に結合したファージディスプレイドＦａｂをコードするクローンを配列決定してその誘導されるアミノ酸残基配列を先に記載した通りに分析した。上で作ったＣＤＲ３ランダム化クローンの核酸配列決定を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ１．０（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、無作為に選んだ８種の二本鎖Ｆａｂ発現性ＤＮＡクローンについて行った。ＭａｃＶｅｃｔｏｒの一連のプログラムを用いて、誘導されるアミノ酸残基配列をお互いに及びＧｅｎｂａｎｋデータベースと共に整列させた。選択した８種の特定の合成ｇｐ１２０特異性Ｍ５５６シリーズＦａｂ及び３ｂ３の誘導された重鎖アミノ酸残基配列を図９Ａ及び９Ｂに示す。
選択した全てのＭ５５６  Ｆａｂは、先にＦａｂ  ３ｂ３を突然変異誘発して選択したＣＤＲ１（ＮＦＴＶＨ−配列番号：３の残基２８〜３２）及びＣＤＲ３（ＥＷＧＷ−配列番号：３の残基９８〜１０１）の両方を含有した。各Ｍ５５６  Ｆａｂは、Ｍ５５６シリーズの名称の後の番号により示されるように、突然変異誘発され選択されたアミノ酸配列を１０２〜１０６のアミノ酸残基位置に対応するＣＤＲ３内に有することにより特有なものとなっている。これらＭ５５６シリーズの完全重鎖可変ドメインアミノ酸残基配列は、選任した配列表確認者により、図９Ｂに示す通りに配列表に掲げられている。
【０１８３】    ２）ランダム化重鎖ＣＤＲ３を有するｇｐ１２０特異性Ｆａｂの結合親和性分析
次いで、上で得られたｇｐ１２０への結合性について選択されたＣＤＲ３突然変異重鎖Ｍ５５６シリーズＦａｂをコードするＤＮＡを、先に記載した可溶性Ｆａｂの発現のためのベクターｐＰｈｏ−ＴＴに移した。次いで、これら可溶性Ｍ５５６シリーズＦａｂをｇｐ１２０（ＩＩＩＢ株）への結合親和性について分析した。実施例１Ｈに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、選択したＦａｂの親和性を出した。
Ｍ５５６シリーズＦａｂの平衡解離定数（Ｋｄ，Ｍ）により測定したＦａｂ結合親和性分析の結果を表７に列挙する。加えて、親和性の増加倍率も先に記載した通りに計算する。
【０１８４】
2005198654.tif 000010
2005198654.tif 000011
【０１８５】  表７から明らかなように、これら８種のＭ５５６シリーズＦａｂのうち６種が、ｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株への結合のＫｄにより測定して１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍのレンジで、高められた親和性を示した。２種だけ、つまりＭ５５６−５とＭ５５６−１３だけが１０−９Ｍレンジで親和性を有した。１０−１０Ｍ又はそれより大きな親和性を有するＭ５５６  Ｆａｂの増加倍率は、元のＦａｂ  ＭＴ４の親和性に比べてＭ５５６−２についての１４からＭ５５６−３についての６３、及びＭ５５６−１０についての７０までの範囲であった。次いで、これら誘導したＭ５５６  Ｆａｂからの重鎖ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列をＳａｃＩＩ／ＳｐｅＩ消化によりｐＰｈｏベクターから別々に単離し、そして実施例３（表１１）に記載する通りに用いて、上で調製した好ましいＣＤＲ１をＭ５５６シリーズ親和性最適化重鎖ＣＤＲ３と合わせて有する別々の複合重鎖を調製した。
【０１８６】    Ｄ．ファージミッドｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３のκ軽鎖（ｐＭＴ４−３の元の軽鎖）可変ドメイン内のランダム化ＣＤＲ１の調製
実施例１に記載した通りのオーバーラップＰＣＲにより調製したランダム化重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を有するＦａｂ  ３ｂ３のｇｐ１２０結合親和性を更に高めるために、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３内の３ｂ３の軽鎖ＣＤＲ１内の予め選択した１５ヌクレオチドをオーバーラップＰＣＲによる突然変異誘発に付した。実施例１で調製したＣＤＲ１及びＣＤＲ３突然変異重鎖を有する３ｂ３ヌクレオチド配列をオーバーラップＰＣＲに付して、図１０に示しかつ配列番号：６２として掲げる通り、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３軽鎖可変ドメイン内の位置７６から９３の１８ヌクレオチドをランダム化した。ｐ３ｂ３配列はｐＭＴ４−３からその軽鎖を突然変異誘発することなく誘導したものなので、ｐＣｏｍｂ３Ｈ内の未突然変異３ｂ３軽鎖への関係は、ｐＭＴ４−３の軽鎖への関係と同じである。前述の１８ヌクレオチドのランダム化により、コードされるランダム化アミノ酸残基は、以下に記載する図１１Ａ及び１１Ｂに示す位置２２から３３までの完全ＣＤＲ１の位置２６から３１までのＣＤＲ１内にある。
【０１８７】  ｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３内の３ｂ３の軽鎖ＣＤＲ１突然変異誘発の結果として、以下に記載するこの新たなライブラリーから選択されるＦａｂは、Ｆａｂ  ３ｂ３軽鎖ＣＤＲ１内の１２のアミノ酸残基のうち全部で６のランダム化アミノ酸残基を含有し、そしてＦａｂ  ３ｂ３  ＣＤＲ１及びＣＤＲ３の突然変異され選択された重鎖を有した。
実施例１Ｂに記載したようにして、オーバーラップＰＣＲを先に得られたｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３発現ベクター鋳型上で同じように行った。第１回目のＰＣＲで、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ−３’（配列番号：６３）を有する５’オリゴヌクレオチドプライマー、つまりＫＥＦを、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＴＡＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＧＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＴ−３’（配列番号：６４）を有する３’非コーディング突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマー、つまりＨＩＶ４ｃｄｒｌ−ｏｖ−ｂと共に用いて、軽鎖ＣＤＲ１を増幅して上記の１８ヌクレオチド領域を突然変異誘発した。次いで、得られた増幅産物を実施例１Ｂに記載した通りに精製して第２回目からの産物とのオーバーラップＰＣＲに用いた。
【０１８８】  この後の回のＰＣＲも、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＴ−３’（配列番号：６５）を有する５’コーディングオーバーラップオリゴヌクレオチドプライマー、つまりＨＩＶ４ｃｄｒｌ−ｆｏ及びヌクレオチド配列５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号：６６）を有する３’非コーディングオリゴヌクレオチドプライマー、つまりＴ７Ｂで行った以外は、先に実施例１Ｂに記載した通りに行った。次いで、得られた増幅産物を実施例１Ｂに記載した通りに精製し、そしてオリゴヌクレオチドプライマーペアＫＥＦ及びＴ７Ｂを用いて第１回目からの産物でのオーバーラップＰＣＲに用い、新たに突然変異誘発されたＣＤＲ１を有する増幅軽鎖可変ドメインの集団を生成させた。
次いで、これら軽鎖ＣＤＲ１ランダム化増幅産物を、配列番号：３に示すアミノ酸残基配列をコードするｐ３ｂ３重鎖可変ドメインヌクレオチド配列が実施例２Ｂに記載の通りに連結されているｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴ内に連結して、ｐ３ｂ３由来ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＣＤＲ１軽鎖ランダム化発現ベクターのライブラリーを生成させた。次いで、それぞれが突然変異軽鎖とそのｐ３ｂ３由来重鎖を有するファージディスプレイドＦａｂを発現させて実施例１に記載した通りにｇｐ１２０でパンニングした。
【０１８９】    １）ランダム化軽鎖ＣＤＲ１を有するｐ３ｂ３由来Ｆａｂのアミノ酸残基配列分析
次いで、ｇｐ１２０に特異的に結合したファージディスプレイドＦａｂをコードするクローンを配列決定してその誘導されるアミノ酸残基配列を先に記載した通りに分析した。上で作ったＣＤＲ１ランダム化クローンの核酸配列決定を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  １．０（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、無作為に選んだ４種の二本鎖Ｆａｂ発現性ＤＮＡクローンについて行った。選択した４種の特定の合成ｇｐ１２０特異性Ａ〜ＤシリーズＦａｂ及び３ｂ３の誘導された軽鎖アミノ酸残基配列を図１１に示す。
選択した全てのＡ〜Ｄ  Ｆａｂは、ｐ３ｂ３由来重鎖可変ドメインを含有した。各Ａ〜Ｄ  Ｆａｂは、突然変異誘発され選択されたアミノ酸配列を、配列番号：６７〜７０に掲げる２２〜３３のアミノ酸残基位置の完全ＣＤＲ１内の２６〜３１のアミノ酸残基位置に対応する軽鎖ＣＤＲ１内に有することにより特有なものとなっている。これらＡ〜Ｄシリーズのこれら完全軽鎖可変ドメインアミノ酸残基配列を、選任した配列表確認者により、図１１に示す通りに配列表に掲げる。
【０１９０】    ２）ランダム化軽鎖ＣＤＲ１を有するｇｐ１２０特異性Ｆａｂの結合親和性分析
次いで、上で得られたｇｐ１２０への結合性について選択されたＣＤＲ１突然変異軽鎖Ａ〜ＤシリーズＦａｂをコードするＤＮＡを、先に記載した可溶性Ｆａｂの発現のためのベクターｐＰｈｏ−ＴＴに移した。次いで、これら可溶性Ａ〜ＤシリーズＦａｂをｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株への結合親和性について分析した。実施例１Ｈに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、これら選択したＦａｂの親和性を出した。
Ａ〜ＤシリーズＦａｂの平衡解離定数（Ｋｄ，Ｍ）により測定したＦａｂ結合親和性分析の結果を表８に列挙する。加えて、親和性の増加倍率も先に記載した通りに計算する。
【０１９１】
2005198654.tif 000012
【０１９２】  表８から明らかなように、これら４種のＡ〜ＤシリーズＦａｂのうち２種のＦａｂ、つまりＦａｂ  Ｃ及びＦａｂ  Ｄが、ｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株への結合のＫｄにより測定して１０−１０Ｍのレンジで、高められた親和性を示した。Ｆａｂ  Ａ及びＢは、１０−９Ｍレンジで親和性を有した。Ｆａｂ  Ｃ及びＦａｂ  Ｄの増加倍率は、Ｆａｂ  ３ｂ３が誘導された元のＦａｂ  ＭＴ４の親和性に比べてそれぞれ約９倍及び２８倍であった。Ｆａｂ  Ａ〜Ｄが誘導されたＦａｂ  ３ｂ３鋳型に比較した増加倍率も、７．７×１０−１０ＭであるＦａｂ  ３ｂ３のＫｄを用いることにより同じように計算することができる。
これらの誘導されたＣＤＲ１−変異誘発Ｆａｂ由来の軽鎖可変ドメインをコードする該ヌクレオチド配列を、次いで実施例３に記載の如く、更なる変異誘発手順のための鋳型として別々に使用した。更に、ここで得られたＦａｂ  Ａ−Ｄの軽鎖ＣＤＲ１をコードする該ヌクレオチド配列を、該ｐＰｈｏベクターから、Ｓａｃ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉ消化により別々に単離し、実施例３に記載したように使用して（第１１表）、別々の複合軽鎖を調製した。この複合軽鎖は、上で調製した好ましいＣＤＲ１を、以下で調製されるＨ４Ｌ３系のアフィニティー最適化軽鎖ＣＤＲ３との組み合わせとしてもつ。
【０１９３】Ｅ．ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３（該元のｐＭＴ４−３軽鎖）のκ軽鎖可変ドメインにおけるランダム化されたＣＤＲ３の調製
実施例１に記載したような、オーバーラップＰＣＲにより調製したランダム化された重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３を有するＦａｂ  ３ｂ３のｇｐ１２０結合アフィニティーを更に高めるために、ｐＣｏｍｂ３Ｈ中の３ｂ３の軽鎖ＣＤＲ３における予め選択された１５個の不連続なヌクレオチドを、オーバーラップＰＣＲによる変異形成に付した。実施例１で調製されたような、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３により変異誘発された重鎖をもつｐ３ｂ３から単離された３ｂ３ヌクレオチド配列を、オーバーラップＰＣＲにかけて、位置２６５〜２６７および次いで２７１〜２８２からの１５個のヌクレオチドをランダム化し、かくして該サイトは、第１０図に示され、かつ配列番号：６２として記載した、該ｐ３ｂ３−由来の軽鎖可変ドメインにおける単一の変異誘発されていないトリプレットによって分離されていた。ｐ３ｂ３は、該軽鎖を変異誘発することなしにｐＭＴ４−３から誘導されたので、該変異誘発されていないｐ３ｂ３−由来の軽鎖に対する言及は、ｐＭＴ４−３の軽鎖に対する言及と同一である。上記の１５個ヌクレオチドのランダム化によって、該コードされたランダム化アミノ酸残基は、ＣＤＲ３中の位置８９および位置９１〜９４にあり、それぞれ位置８８および９０にある保存されたグルタミンおよびチロシン残基およびそれぞれ位置９５および９６にある保存されたチロシンおよびスレオニン残基が残されており、結果として９個のアミノ酸の軽鎖ＣＤＲ３を構成する。
【０１９４】  ｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３中の３ｂ３の軽鎖ＣＤＲ３変異誘発の結果として、以下に記載するこの新規なライブラリーから選択されるＦａｂは、全体として、該Ｆａｂ  ３ｂ３軽鎖ＣＤＲ３中の９個のアミノ酸残基のうちの５個のアミノ酸残基を含み、かつ変異誘発されかつ選択された重鎖Ｆａｂ  ３ｂ３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ３を有していた。
実施例１Ｂに記載したように、オーバーラップＰＣＲは、同様に以前に得られたｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３発現ベクター鋳型上で実施した。ＰＣＲの第一ラウンドにおいては、５’オリゴヌクレオチドプライマー、ＫＥＦ（配列番号：６３）を、３’非コード変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーｈ４ｋｃｄｒ３−ｂｏ（これはヌクレオチド配列：５’−ＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＴＧＴＡＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＡＴＡＭＮＮＣＴＧＡＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号：７１）を有する）と共に使用して、軽鎖ＣＤＲ３を増幅し、かつ上記の１５ヌクレオチド領域を変異誘発した。得られる増幅された生成物を、次いで実施例１Ｂに記載のように精製し、かつ第二ラウンドからの生成物と共にオーバーラップＰＣＲで使用した。
【０１９５】  該ＰＣＲの後者のラウンドも、前に実施例１Ｂに記載したように実施したが、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号：７２）をもつ５’コードオーパーラップオリゴヌクレオチドプライマーｈｖｋｆｒ４−ｆｏおよび３’非コードオリゴヌクレオチドＴ７Ｂ（配列番号：６６）を使用した。得られた増幅生成物を、次に実施例１Ｂに記載のように精製し、かつ該オリゴヌクレオチドプライマー対ＫＥＦ  Ｔ７Ｂを使用して、該第一のラウンドの生成物と共に、オーバーラップＰＣＲで使用して、一群の新たに変異誘発させたＣＤＲ３をもつ、増幅された軽鎖可変ドメインを形成した。
該軽鎖ＣＤＲ３−ランダム化増幅生成物を、次にｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴと連結した。ここで、ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＴＴには、配列番号：３に示したアミノ酸残基配列をコードするｐ３ｂ３重鎖可変ドメインヌクレオチド配列が、実施例２Ｂに記載したように連結されていて、ｐ３ｂ３−由来のｐＣｏｍｂ３Ｈ−ＣＤＲ３ランダム化発現ベクターのライブラリーを形成している。各々変異誘発された軽鎖およびｐ３ｂ３−由来の重鎖をもつ、ファージ−表示Ｆａｂが次に発現され、これを実施例１に記載のようにｇｐ１２０についてパンニングした。
【０１９６】１）ランダム化軽鎖ＣＤＲ３をもつｐ３ｂ３由来のＦａｂのアミノ酸残基配列分析
次いで、特異的にｇｐ１２０に結合するファージ−表示Ｆａｂをコードするクローンを配列決定し、誘導されるアミノ酸残基配列を前に記載したよに分析した。上で製造した該ＣＤＲ３ランダム化クローンの核酸配列決定を、シーケナーゼ１．０（ＵＳＢ，クリーブランド，ＯＨ）を使用して、３個の無作為に選択した二本鎖Ｆａｂ−発現ＤＮＡクローン上で実施した。Ｆａｂおよび３ｂ３の３種の選択された特定の合成ｇｐ１２０−特異的Ｈ４Ｌ３系列に関する、誘導された軽鎖アミノ酸残基配列を第１２Ａおよび１２Ｂ図に示す。
全ての選択されたＨ４Ｌ３  Ｆａｂは該ｐ３ｂ３−由来の重鎖可変ドメインを含んでいた。各Ｈ４Ｌ３  Ｆａｂは、上に示した位置に対応するＣＤＲ３中に、変異誘発され、選択されたアミノ酸配列をもつことから、類のないものである。該Ｈ４Ｌ３系列の、完全な軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、付与された配列表の識別名によって、第１２Ｂ図に示されたように、配列表中に掲載されている。
【０１９７】２）ランダム化された軽鎖ＣＤＲ３を有するｇｐ１２０−特異的Ｆａｂの結合アフィニティー分析
上で得たｇｐ１２０に結合するために選択された、該ＣＤＲ３−変異誘発された軽鎖Ｈ４Ｌ３系列のＦａｂをコードするＤＮＡを、次に前に記載されたような可溶性のＦａｂの発現のために、該ベクターｐＰｈｏ−ＴＴに転移した。この可溶性のＨ４Ｌ３系列のＦａｂを、次にｇｐ１２０株ＩＩＩＢに対する結合アフィニティーにつき解析した。表面プラスモン共鳴を、実施例１Ｈに記載の如く実施して、該選択されたＦａｂのアフィニティーを測定した。
Ｈ４Ｌ３系列Ｆａｂの平衡解離定数（Ｋｄ，Ｍ）により測定した、該Ｆａｂの結合アフィニティー解析の結果を第９表に記載した。更に、アフィニティーの増加倍率をも前に記載の如く算出した。
【０１９８】
2005198654.tif 000013
【０１９９】  第９表から明らかな如く、該３種のＦａｂのうちの２種、即ちＨ４Ｌ３−２およびＨ４Ｌ３−４は、Ｆａｂ  ３ｂ３およびその結果としてのＡ−Ｄ  Ｆａｂが由来とする、元のＦａｂ  ＭＴ４のＫｄのそれぞれ約４５および２６倍の増加倍率に相当する、ｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株に対する結合の平衡解離定数Ｋｄにより測定した、１０−１０Ｍの範囲の高いアフィニティーを示した。Ｆａｂ  Ａ−Ｄが由来とする、該Ｆａｂ  ３ｂ３鋳型と比較した該増加倍率は、同様にＦａｂ  ３ｂ３のＫｄ（７．７×１０−１０Ｍ）を使用して算出することもできる。
これらの誘導されＣＤＲ３変異誘発されたＦａｂ由来の軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、次に別々に使用して、最適化され、変異誘発され、かつ選択されたＣＤＲを有する複合軽鎖可変ドメインを生成した。具体的には、該変異誘発された軽鎖ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列を、該Ｈ４Ｌ３−ｐＰｈｏベクターから、Ｋｐｎ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ消化により単離し、実施例３（第１１表）に記載のように使用して、上で調製した好ましいＣＤＲ３を、上で調製したＡ−Ｄ系列のアフィニティーを最適化した軽鎖ＣＤＲ１との組み合わせとしてもつ、別々の複合軽鎖を調製した。
【０２００】３．ファージミド３ｂ３およびＭＴ４の、予備選択しランダム化したＣＤＲに基づき、ｇｐ１２０に対して最適化されたアフィニティーを有する、ランダム化ＣＤＲ複合Ｆａｂの調製
Ａ．ランダム化したＣＤＲ１をもつファージミドＤに基づく、ランダム化したＣＤＲ３軽鎖の調製
ランダム化されたＣＤＲ１およびＣＤＲ３両者をもつ軽鎖を作成するために、実施例２Ｄで調製した、ランダム化ＣＤＲ１を有するファージミドの一方、即ちファージミドＤを、後のＣＤＲ３のランダム化のための鋳型として使用した。実施例１および２に記載した如く、ファージミドＤの変異誘発した軽鎖は、ランダム化されていない軽鎖３ｂ３（これは元の軽鎖ＭＴ４または４Ｌとも呼ばれる）から誘導された。３ｂ３において、ＭＴ４のランダム化されていない軽鎖は保持され、一方重鎖はＣＤＲ１およびＣＤＲ３においてランダム化された。ファージミドＤはｐＣｏｍｂ３Ｈ−３ｂ３のファージミド３ｂ３から誘導されたので、このファージミドＤは前にランダム化された３ｂ３−由来の重鎖と、ＣＤＲ１中の新たにランダム化されたＭＴ４または３ｂ３軽鎖とをもつ。
【０２０１】  本実施例においては、ランダム化されたＣＤＲ１およびＣＤＲ３重鎖配列およびランダム化されたＣＤＲ１軽鎖配列を有するファージミドＤを、ここに記載したように、軽鎖ＣＤＲ３変異形成に付した。ファージミドＤのＣＤＲ３軽鎖の予め選択した部分を、実施例１Ｂに記載した如く、オーバーラップＰＣＲ法によるランダム化のために選択した。上記の如く元々ＭＴ４由来のＣＤＲ３は、２７個のヌクレオチドを含み、これは９個のアミノ酸残基配列：ＱＶＹＧＡＳＳＹＴ（配列番号：６；アミノ酸残基位置８８から９６まで）を発現した。該ＣＤＲ３軽鎖を変異誘発する際に、第二（バリン）、および第四乃至第七のアミノ酸残基（グリシン、アラニン、セリン、セリン）を、該領域を変異誘発するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの設計によって指示されるようにして、ランダム化した。該軽鎖ＣＤＲ３の第一、第三、第八および第九残基は、これらが軽鎖に見出される保存性残基であることから、保持されていた。
【０２０２】  ＰＣＲ増幅の第一のラウンドにおいて、該ファージミドＤ鋳型は、実施例２Ｄに記載した５’オリゴヌクレオチドプライマーＫＥＦ（配列番号：６３）および３’非コードランダム化オリゴヌクレオチドプライマーｈ４ｋｃｄｒ３−ｂｏ（配列番号：７１）を使用して変異誘発された。このＰＣＲ生成物を上記のように精製し、かつオーバーラップＰＣＲにおいて、該第二のＰＣＲ生成物と共に使用した。
後者は、５’コードオリゴヌクレオチドプライマーｈｖｋｆｒ４−ｆｏ（配列番号：７２）および実施例２Ｄに記載した３’非コードオリゴヌクレオチドプライマーＴ７ｂ（配列番号：７２）を使用して、ファージミドＤについて実施した。
この第二の増幅のＰＣＲ生成物を上記の如く精製し、該第一のＰＣＲ生成物と共にオーバーラップＰＣＲで、該プライマー対ＫＥＦとＴ７Ｂとを用いたオーバーラップＰＣＲ使用した。該プライマー対は該コードｈｖｋｆｒ４ｆｏプライマーの５’末端と、該非コードランダム化ｈ４ｋｃｄｒ３−ｂｏプライマーの５’末端との間にオーバーラップを有していた。該ファージミドＤ配列の残りの部分に、一群のランダム化されたＣＤＲ３を有し、既にランダム化され選択された軽鎖ＣＤＲ１および重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３を有している、該ファージミドＤ−由来の軽鎖のオーバーラップＰＣＲ生成物のライブラリーを、次に後のファージ−表示Ｆａｂ発現のために実施例１Ｂに記載の如く精製し、以下に記載のようにスクリーニングした。
【０２０３】２）ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ランダム化軽鎖を有する抗−ｇｐ１２０  Ｆａｂの選別
ｐＣｏｍｂ３Ｈ−ファージミドＤ由来のおよび新たに変異誘発した、軽鎖ＣＤＲ３−含有ライブラリーの構築を、前に実施例２Ｂに記載したように実施した。但し、該重鎖可変ドメインのカセットはファージミドＤから得、かつ軽鎖可変ドメインは変異誘発されたＣＤＲ３をもつ増幅されたフラグメント中に与えた。上記のような発現およびパンニングに引き続き、ｇｐ１２０−反応性ファージ−表示Ｆａｂを上記の如く酸溶出にかけた。ＱＡ１〜ＱＡ９と名付けたＦａｂをコードする該クローンを、この標準的な溶出手順を使用して得た。該対応する可溶性Ｆａｂのアフィニティーを、以下に記載するように測定した場合、第１０表に示した如く、該アフィニティーは予想された程には、この変異誘発により高められなかった。
【０２０４】  従って、別の溶出手順を使用して、ｇｐ１２０に対してより高いアフィニティーをもつＦａｂ  Ｄ−由来のＦａｂを得た。この手順において、該洗浄したｇｐ１２０−結合ファージ−表示Ｆａｂを、全容積２５μｌ中で１〜２時間、可溶性Ｆａｂ  ３ｂ３の１０μｇ／ウエルをインキュベートすることにより競合させた。このようにして、過剰のＦａｂと競合させることにより、低アフィニティー結合体は、ｇｐ１２０に固定化されたより高いアフィニティーをもつ結合体から分離され、上記のように実施される酸による後の溶出により溶出された。このＦａｂ競合／酸溶出手順により得られたクローンは、第１３Ａおよび１３Ｂ図および以下の第１０表に示すように、ＱＡ１０、ＱＡ１１およびＱＡ１２と名付けられたＦａｂをコードした。
【０２０５】３）アミノ酸残基配列解析、親Ｆａｂ  Ｄと、該Ｆａｂ  Ｄ−に基づくＣＤＲ１およびＣＤＲ３軽鎖ランダム化Ｆａｂとの間の比較
特異的にｇｐ１２０に結合し、かつ上記の溶出手順を利用して回収される、上で調製したファージミドＤ−由来のＦａｂをコードするクローンを、ついで配列決定し、かつ誘導されたアミノ酸残基配列を解析した。上で作成したＣＤＲ３ランダム化クローンの核酸配列決定は、シーケナーゼ１．０（ＵＳＢ，クリーブランド，ＯＨ）を使用し、４種の無秩序に選択した二本鎖Ｆａｂ−発現ＤＮＡクローンに基づいて実施した。Ｆａｂおよび３ｂ３の、１２個の選択された特定の合成ｇｐ１２０−特異的ＱＡ系列の、該誘導された軽鎖アミノ酸残基配列を第１３Ａおよび１３Ｂ図に示した。
全ての選択されたＱＡ系列のＦａｂは、該ファージミドＤ−由来の重鎖可変ドメイン（これは実施例２Ｄに記載した如く、ｐ３ｂ３重鎖である）と、アミノ酸残基配列：ＲＳＳＨＱＬＤＧＳＲＶＡ（配列番号：７０；残基位置２２〜３３）を有する、前に変異誘発されかつ選択された軽鎖ＣＤＲ１とを含む。各ＱＡ  Ｆａｂは、上に明記した位置に対応する該軽鎖ＣＤＲ３中に、変異誘発されかつ選択されたアミノ酸配列をもつ点で他に類をみないものである。該ＱＡ系列の競合軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、与えられた配列表の識別名によって第１３Ｂ図に示されたように、配列表に掲載されている。ＱＡ１１と名付けられたＦａｂ由来のヌクレオチド配列および対応するコードされた軽鎖可変ドメインは、以下に記載する複合Ｆａｂの調製に対してＬＨと呼ぶ。
【０２０６】４）ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ランダム化軽鎖ドメインをもつファージミドＤ由来のｇｐ１２０−由来のＦａｂの結合アフィニティー解析
上で得たｇｐ１２０への結合のために選択された、該ＣＤＲ３−変異誘発された軽鎖ＱＡ系列ＦａｂをコードするＤＮＡを、次に前に記載した如く可溶性Ｆａｂの発現のために、ベクターｐＰｈｏ−ＴＴに転移させた。この可溶性ＱＡ系列Ｆａｂを、次にｇｐ１２０株ＩＩＩＢに対する結合アフィニティーにつき分析した。表面プラスモン共鳴を、実施例１Ｈに記載のように実施して、該選択されたＦａｂのアフィニティーを測定した。
該ＱＡ系列Ｆａｂの平衡解離定数（Ｋｄ，Ｍ）によって測定した、該Ｆａｂの結合アフィニティー分析の結果を第１０表に示した。更に、アフィニティーの増加倍率をも前に記載した如く算出した。
【０２０７】
2005198654.tif 000014
2005198654.tif 000015
【０２０８】  第１０表に示した如く、該Ｆａｂ競合／酸溶出により得られた、該Ｆａｂ−発現ファージ−表示クローンは、予想されたようにより高いｇｐ１２０に対するアフィニティーを示した。該ＱＡＦａｂの殆どが１０−１０Ｍを越えるＫｄをもつのに対して、ＱＡ１０およびＱＡ１１Ｆａｂはｇｐ１２０  ＩＩＩＢ株に対する結合について１０−１１Ｍを越えるＫｄを示した。後者はそれぞれ、Ｆａｂ  ３ｂ３およびＦａｂ  Ｄが由来とする元のＦａｂ  ＭＴ４のＫｄに対して約８６および９４倍の増加倍率に相当する。
これらの誘導されたＣＤＲ３−変異誘発Ｆａｂからの軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、次に以下に記載しかつ第１２および１３表に示した、新規な重鎖および軽鎖を有する固有の複合アフィニティー−最適化Ｆａｂを製造するのに使用した。
【０２０９】Ｂ．予め選択した重鎖および軽鎖構築物を結合することによる複合Ｆａｂの調製
１）複合重鎖または軽鎖の何れかを発現するためのｐＰｈｏ構築物の調製
本発明および実施例１、２および３Ａにおいて教示されたＣＤＲ−特異的変異誘発法により製造されるｇｐ１２０−特異的高アフィニティーＦａｂをコードするヌクレオチド配列を、次いで新規な重鎖および軽鎖可変ドメイン構築物を作成するのに使用した。次に、該構築物を、以下の実施例３Ｂ２）に記載するような、本発明の新規なＦａｂ組成物の成分としての、新規なｇｐ１２０アフィニティー−最適化した重鎖および軽鎖可変ドメインを発現するために使用した。
【０２１０】  第１１表において、４種の新規な重鎖（ＶＨ）ファージミド構築物および１種の新規な軽鎖（Ｖｋ）構築物を、特異的に同定されたＦａｂをコードするヌクレオチド配列を含む該ｐＰｈｏに基づく構築物から調製した。この新規な重鎖または軽鎖複合構築物を形成するために、選択されたｐＰｈｏ−Ｆａｂの二重制限酵素消化を実施して、変異誘発されたＣＤＲを含有するＤＮＡフラグメントを単離した。該重鎖の消化の全てに対して、第４図に示されかつ配列番号：７に示した如く、ヌクレオチド位置２０３〜２０８において、Ｘｈｏ  ＩはフレームワークＩに、Ｓｐｅ  Ｉはフレームワーク４におよびＳａｃ  ＩＩはフレームワークＩＩに切断する。該軽鎖の消化全てに対して、第１０図に示されかつ配列番号：６２に示した如く、ヌクレオチド位置１００〜１０５において、Ｓａｃ  ＩはフレームワークＩに、Ｘｂａ  Ｉはフレームワーク４におよびＫｐｎ  ＩはフレームワークＩＩに切断する。
各複合重鎖または軽鎖を形成するための、特定の消化されたフラグメントを、該複合ヌクレオチド配列によってコードされる各アミノ酸残基配列に関するそれぞれの配列番号：と共に、第１１表に示した。更に、Ｌ４２と名付けられた該軽鎖複合体に対する複合アミノ酸残基配列は、第１４Ａおよび１４Ｂ図に示され、またＨ３１、Ｈ３３、Ｈ１０１およびＨ１０３と名付けられた、該重鎖複合体に対する複合アミノ酸残基配列を第１５Ａおよび１５Ｂ図に示した。
【０２１１】
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【０２１２】  該重鎖および軽鎖複合体を発現するために、該単離したフラグメントを、まず該消化により得られる相補性末端と連結して、１個の重鎖または軽鎖フラグメントを形成した。この後者を、次に同様に消化したｐＰｈｏ−ＴＴベクターと別々に連結して、以下に記載するように、結合アフィニティーを解析し、後に該ベクターを発現するために、該ベクター内に方向性連結した。更に、実施例１、２および３Ａで製造し、最適化したＦａｂをコードするクローンを使用して、付随的な重鎖および軽鎖複合体を、予め選択し、単離した重鎖または軽鎖ＤＮＡフラグメントを連結することにより、同様にして調製した。
【０２１３】２）予め選択された重鎖および軽鎖構築物を結合することによる、ランダム化されたＣＤＲをもつ固有のＦａｂを発現するためのｐＰｈｏ構築物の調製
４Ｌと名付けられた、元のｐＭＴ４−由来の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と共に、上で調製した該重鎖および軽鎖複合ＤＮＡ構築物を使用して、該ＱＡ１１−由来の軽鎖（ＬＨとも呼ばれる）をコードするヌクレオチド配列、および４Ｈと名付けられた該本来のｐＭＴ４重鎖をコードするヌクレオチド配列、重鎖および軽鎖の予め選択された対をコードする固有のＤＮＡ構築物を調製した。
Ｘｈｏ  Ｉ／Ｓｐｅ  Ｉ重鎖構築物と、Ｓａｃ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ軽鎖構築物とを、連続連結により、ｐＰｈｏ−ＴＴ中で結合することによって、この新規なＦａｂ−コードｐＰｈｏ構築物を調製した。また、予め選択した重鎖または軽鎖構築物が既に存在する該ｐＰｈｏ構築物を、該ベクター中に存在する連鎖によって指定されるような他の連鎖と連結するために、制限酵素で消化した。例えば、ＭＴ４を発現するための、該重鎖および軽鎖構築物をもつ発現ベクター、ｐＰｈｏ−ＭＴ４を、上で調製したＬ４２複合軽鎖構築物の方向性連結のために、Ｓａｃ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉで消化した。同様な構成は、当業者には周知の方法によって達成される。
【０２１４】  本発明の好ましい固有の高アフィニティー結合Ｆａｂをコードするための、好ましい最適化された複合構築物を第１２表に掲載した。各好ましい複合Ｆａｂの重鎖および軽鎖アミノ酸残基配列の対をも、１個のコドンによって分離された配列番号：の対、例えば元の変異誘発されていない軽鎖４Ｌと対となった、該変異誘発された複合重鎖Ｈ３１をもつ複合Ｆａｂについては８９：６として、第１２表に示した。
【０２１５】
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第１２表に記載したもの以外の重鎖および軽鎖の他の対は、ｇｐ１２０に対する結合性を示す追加の固有の複合Ｆａｂの発現のために、同様にして構築される。
【０２１６】３）ｇｐ１２０に対する改善されたアフィニティーをもつ最適にＣＤＲランダム化された複合Ｆａｂの結合アフィニティー分析
これら実施例において記載されたような、該重鎖および軽鎖ＣＤＲ−特異的変異誘発最適化手順により達成される改善されたアフィニティーの測定のために、溶解型の該選択された複合Ｆａｂを、上で調製した該ｐＰｈｏ複合構築物から発現させた。次いで、該可溶性複合Ｆａｂをｇｐ１２０株ＩＩＩＢに対する結合アフィニティーにつき分析した。表面プラスモン共鳴を実施例１Ｈに記載の如く実施して、該選択された複合Ｆａｂのアフィニティーを測定した。
結合速度定数ＫｏｎおよびＫｏｆｆによって測定した、該複合Ｆａｂ結合アフィニティー分析の結果を第１３表に示し、計算された平衡会合および解離定数（Ｋａ，Ｍ−１，Ｋｄ，Ｍ）を第１４表に記載した。選択された個々のクローンを、該Ｆａｂ名称からダッシュによって分離された数値により示す。更に、アフィニティーの増加倍率をも、該複合Ｆａｂ各々について上記のように算出し、該変異誘発されていないかつ最適化されていないｇｐ１２０−結合ＭＴ４  Ｆａｂの値と比較した。
【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】  上記表に示したように、変異誘発−最適化重鎖および軽鎖可変ドメインＤＮＡカセットの選択的組み合わせにより得た、該Ｆａｂ−発現ファージ−表示クローンは、ｇｐ１２０に対する高い結合アフィニティーを示すＦａｂをコードした。特に、重鎖または軽鎖ＣＤＲの何れかを変異誘発し、かつ最適ｇｐ１２０結合性につき選択されたＦａｂは、１０−１０Ｍを越えるＫｄを示し、２個のＦａｂは１０−１１Ｍを越えるＫｄを有し、１個の好ましい、Ｈ３１／Ｌ４２−１と命名されたＦａｂは１０−１２Ｍを越えるＫｄを示した。ｇｐ１２０結合アフィニティーの対応する増加倍率は元のＦａｂ  ＭＴ４の値の約１６倍〜２４００倍以上であった。更に、該ｇｐ１２０−反応性Ｆａｂのｇｐ１２０に対する結合の半減期は自然対数（ｌｎ２）を該Ｋｏｆｆ速度定数で割ることにより得ることができ、これによって相互作用の特徴に関連するもう一つのパラメータが得られる。Ｈ３１／Ｌ４２−１と命名されたＦａｂについては、ｇｐ１２０に対する結合の計算された半減期は４４．５日であり、一方ＨＩＶに対して血清学的に正の無症候性患者由来の、ランダム化されておらずかつ最適化されていないＦａｂ  ＭＴ４の値は２４分である。かくして、この半減期の測定は、本発明の合成最適化Ｆａｂの、ＨＩＶのｇｐ１２０に対する高い結合アフィニティーを特徴付けるもう一つの方法である。
【０２２０】  最大のアフィニティーをもつ、Ｈ３１／Ｌ４２−１と命名された該Ｆａｂは、該重鎖複合Ｈ３１を含むＦａｂ複合体であって、軽鎖複合体Ｌ４２との組み合わせとして添加された、重鎖ＣＤＲ１−変異誘発されたＦａｂ  Ｈ４Ｈ１および重鎖ＣＤＲ３−変異誘発されたＦａｂ  Ｍ５５６−３を含み、該軽鎖複合体Ｌ４２はＦａｂ  Ｄからの軽鎖ＣＤＲ１−変異誘発領域および軽鎖ＣＤＲ３−変異誘発されたＦａｂ  Ｈ４Ｌ３−２を含んでいた。
該Ｆａｂ  Ｈ３１／Ｌ４２−１をコードするヌクレオチド配列が存在する、該ｐＰｈｏ構築物を含む、Ｅ．コリ菌株ＤＨ１０Ｂの細胞培養物は、実施例４に記載した通り、１９９４年９月１６日付けで、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されており、ＡＴＣＣ承認番号６９６９１が与えられている。
【０２２１】  従って、重鎖および軽鎖遺伝子両者を含むＣＤＲ−特異的変異形成を利用する本発明の方法は、これまでに進化的選択圧によっては得られておらず、またＨＩＶのｇｐ１２０に対する内因性の抗体を生成する患者中にも存在しない、固有のＦａｂを生成した。実施例３で調製された該複合Ｆａｂは、実施例２で調製され、４つのライブラリーから選択された該ｇｐ１２０−反応性Ｆａｂと共に、任意の他の公知のｇｐ１２０−反応性Ｆａｂまたは完全な免疫グロブリンよりも高い、ｇｐ１２０に対する結合アフィニティーを示すＦａｂの典型である。
本明細書に記載の如く生成され、かつ特徴付けされた、ｇｐ１２０に対して高い結合アフィニティーを示す、好ましい合成Ｆａｂを第１５表に掲載した。第１５表には、各Ｆａｂの名称が、Ｋｄ，Ｍで表した対応するアフィニティー測定値と共に与えられている。また、本発明の好ましいＦａｂを含む、該重鎖および軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、１個のコドンによって分離された配列番号：の対によって第１５表に示されている。例えば、最大の結合アフィニティーをもつＦａｂ、即ちＨ３１／Ｌ４２−１の重鎖および軽鎖のアミノ酸残基配列は、それぞれ配列番号：８９および８８に対応し、これら自体は配列表に掲載されている。
【０２２２】
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【０２２３】４．物質の寄託
プラスミド、ｐＭＴ４は、１９９３年１０月１９日付けで、１３０１パークローンドライブ，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡの、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）に寄託されており、ＡＴＣＣ承認番号７５５７４が与えられている。この寄託物は、ＭＴ４と命名されたＦａｂ抗体をコードかつ発現するプラスミドを与え、その重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１および６に記載され、かつ第１図および第２図に示されている。
プラスミドｐＰｈｏ−Ｈ３１／Ｌ４２−１を含む、ＤＨ１０Ｂ−ｐＰｈｏ−Ｈ３１／Ｌ４２−１と命名された細胞培養物は１９９４年９月１９日にまたはその前に、ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ承認番号６９６９１が与えられている。この寄託物は、ｐＰｈｏを主体とするプラスミドを含むＥ．コリ細胞培養物を与え、これからＨ３１／Ｌ４２−１と命名されたＦａｂ抗体が発現され、その重鎖および軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：８９および８８に記載され、かつ第１５図および第１４図に示されている。
【０２２４】  これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託についての国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびその規則（ブダペスト条約）に基づきなさせれた。これは、該各寄託の日から３０年間に渡り、生きたプラスミドおよび生きた細胞培養物の維持を保証する。これらのプラスミドおよび細胞培養物は、該ブダペスト条約の定めに基づいて、ＡＴＣＣから入手可能であるはずであり、該条約は、該プラスミドおよび培養物の子孫の恒久的かつ制約の無い入手性を、該関連するＵＳ特許の許可時点または任意のＵＳまたは外国特許出願の公開時点の何れか早い時期に公に対して保証し、また３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２および該規定に準ずるコミッショナーの規則（３７  ＣＦＲ  §１．１４、特に８８６  ＯＧ  ６３８を含む）に従って資格あるものとされた、ＵＳパテンツ＆トレードマークス（Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓ）の長官によって決定された者に対して、該子孫の入手性を保証している。本特許出願の譲受け人は、該プラスミドおよび培養物の寄託物が死滅し、あるいは適当な条件下で培養した場合に喪失し、もしくは破壊された場合に、通知に基づき、速やかに同一のプラスミドおよび培養物の生きた試料と交換することに同意している。該寄託物の入手性は、特許法に従ってあらゆる政府の権威の下に許可された権利に違反する、本発明の実施に対するライセンスとして解釈すべきものではない。
【０２２５】  上記の詳細は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。本発明の範囲は、寄託された細胞系によって制限されるものではない。というのは、該寄託された態様は、本発明の一局面の単なる例示と考えるべきであり、機能的に等価なあらゆる細胞系が本発明の範囲内に入るからである。物質の寄託は、本明細書に含まれる説明が、本発明の最良の態様を含めて、本発明の任意の局面の実施を可能とするのに不十分であることを認めたものではなく、また請求の範囲を該寄託物が代表する特定の例示に限定されるものと解釈すべきでもない。実際に、本明細書に示しかつ記載したもの以外に、本発明の種々の改良が、上記説明から当業者には明らかであり、添付した本発明の範囲に入る。
【図面の簡単な説明】  本明細書の一部分を構成する図面は下記の通りである：
図１は、ｇｐ１２０に結合するヒトＦａｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。このＦａｂ異種二量体が発現されるＤＮＡクローンに対応するそのＦａｂの名称は、左手の欄に示されている。このＦａｂ（ＭＴ４、３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４および３ｂ９）はそれぞれ配列番号：１−５に割り当てられ、配列表に掲げた通りである。ＦａｂＭＴ４は、患者ＭＴから作製したプラスミドライブラリーから選ばれた最初のクローンから発現された。このライブラリーは、実施例１Ａで述べるようにｇｐ１２０に対してスクリーニングされた。合成ヒトＨＩＶ−１中和Ｆａｂ（３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４および３ｂ９）は、実施例１（特に実施例１Ｂおよび１Ｅ）で述べるように、重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３をランダム化して得られるＦａｂである。左から右に表示した各Ｆａｂの配列決定領域はフレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、相補性決走領域２（ＣＤＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）である。
図２は、ｇｐ１２０に結合するＦａｂの可変カッパ軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。このＦａｂ異種二量体の名称は左手の欄に示されている。ＦａｂＭＴ４の軽鎖は配列番号：６に割り当てられており、配列表に表示した通りである。ＦａｂＭＴ４は、患者ＭＴから作製したプラスミドライブラリーから選ばれた最初のクローンから発現された。このライブラリーは、実施例１Ａで述べるようにｇｐ１２０に対してスクリーニングされた。さらに、ＭＴ４の軽鎖は図１で述べた合成Ｆａｂの作製時にランダム化されなかったので、ＭＴ４の軽鎖のアミノ酸配列は、実施例１で述べるようにＦａｂの３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４および３ｂ９の各々に存在する。
図３は、本発明の合成Ｆａｂ（３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４および３ｂ９）の結合親和性とＨＩＶ−１ＭＮ株由来ｇｐ１２０に対する中和能との相関性を示すグラフである。結合親和性（Ｋａ  Ｍ−１）は、指数値Ｅ＋として示したようにＸ軸に、中和能（Ｎｅｕｔ５０、ＩＣ５０  Ｍ−１）に関してはＹ軸にプロットした。中和のデータのためにはグラフではＩＣ５０値（中和力価ではなく）が記入されている。このグラフを作製するための結合親和性データは、実施例１Ｈの表１で欄の見出しＫａ（Ｍ−１）の下に示されている。中和データは、実施例１Ｈの表３で欄の見出しＩＣ５０（Ｍ−１）の下に示されている。各Ｆａｂについてのデータはグラフに表示されている。結合親和性と中和能との間の関係は、最高の結合親和性と中和能を示すＦａｂの３ｂ３について実施例１Ｈで述べるように比較的直線状である。その重鎖内にランダム化されたＣＤＲ１およびＣＤＲ３をもつ本発明の４種の合成Ｆａｂの全てが、最初のクローンＭＴ４より強化された結合親和性と中和能を示した。
図４は、最初のクローンｐＭＴ４の重鎖可変ドメインの５’から３’方向で表示したヌクレオチドのコード鎖を示している。この配列は配列番号：７にも示されている。対応するコードされた重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は図１に示されている。このｐＴＭ４ヌクレオチド配列は、ＣＤＲ１に対応する残基８２−９６の領域で本発明にしたがいランダム化され、さらに別の変異誘発で残基２９２−３０３で、続いてＣＤＲ３の３０４−３１８の領域でランダム化された。残基の位置は、星印を付けた１０残基毎に数字で示されている。
図５は、ｇｐ１２０に結合するヒトＦａｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸残基配列を示している。実験Ａでは、ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１−３５に亙ってランダム化される。ＣＤＲ１ランダム化ライブラリーは、実施例１Ａおよび実施例１Ｄで述べるようにｇｐ１２０に対してスクリーニングされた。実験Ａの１２種の選択されたＦａｂのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸残基３１−３５は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）として右から左に表示されている。この１２種のＦａｂを、この欄の上から下へそれぞれ配列番号：１４−２５と呼び、配列表に示されている。他のＦａｂがそれから派生したＭＴ４のＣＤＲ１配列は配列番号：８と呼ぶ。このＣＤＲ１ランダム化ライブラリーは、実施例１Ｂおよび１Ｅで述べるように相補性決定領域３（ＣＤＲ３）でさらにランダム化された。ランダム化ＣＤＲ１およびＣＤＲ３ライブラリーから選別された８種のＦａｂのＣＤＲ１およびＣＤＲ３の推定アミノ酸配列は、実験Ｂで与えられる。このＦａｂがそれから発現されるＤＮＡクローンに対応するＦａｂ異種二量体の名称は、右側の欄に示されている。ＦａｂのＭＴ４、３ｂ１、３ｂ３、３ｂ４および３ｂ９の完全なＶＨ可変ドメインの配列はそれぞれ配列番号：１−５に割り当てられ、配列表に示されている。Ｆａｂの３ｂ１、３ｂ２、３ｂ３、３ｂ４、３ｂ６、３ｂ７、３ｂ８および３ｂ９のＣＤＲ１はそれぞれ配列番号：２６−３３に割り当てられ、配列表に示されている。ＦａｂＭＴ４は、患者ＭＴから作製されたプラスミドライブラリーから選別された最初のクローンから発現される。それから他のＦａｂが派生したＭＴ４のＣＤＲ３の配列は配列番号：３４と呼ばれる。左から右に示した各Ｆａｂのこの配列決定領域は、ＣＤＲ３のアミノ酸残基９６−９９である。このＦａｂ３ｂ１、３ｂ２、３ｂ３、３ｂ４、３ｂ６、３ｂ７、３ｂ８および３ｂ９のＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：３５−４２に割り当てられ、配列表に示されている。
図６は、実施例２で述べるように、ファージミドＦａｂディスプレー発現ベクター（ｐＣｏｍｂ３Ｈ）の重鎖および軽鎖の発現制御領域の模式図である。
図７Ａおよび７Ｂは、ファージミドＭＴ４−３（ｐＭＴ４−３）の重鎖ＣＤＲ１の変異誘発に由来するｇｐ１２０特異的ヒトＦａｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。それからＦａｂが発現されるＤＮＡクローンに対応するＨ４Ｈ１シリーズのＦａｂ異種二量体の名称は、左側の欄に示されている。鋳型のＦａｂＭＴ４の重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように指示領域の下に示されている。鋳型Ｆａｂと同一である派生Ｆａｂのアミノ酸残基配列の部分は、省略記号（〃）で表示される。各派生Ｆａｂの変異誘発ＣＤＲは表示されている。変異誘発重鎖ＣＤＲ１をもつ各派生Ｆａｂの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号に対応して配列表に示されている。このＦａｂは実施例２の記載にしたがって得られた。
図８は、実施例２で述べるようにｐＰｈｏ−ＴＴ発現ベクターの制限地図を示す。破傷風毒素（ＴＴ）誘導Ｆａｂの重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むｐＰｈｏ−ＴＴ発現ベクターの完全なヌクレオチドのコード配列が５’から３’の向きで、配列番号：５１として配列表に示されている。このベクターおよび、抗ＴＴＦａｂを置き換えて本発明の可溶性Ｆａｂを発現させるためのその使用については、実施例２に述べられている。
図９ＡおよびＢは、ファージミド３ｂ３（ｐ３ｂ３）の重鎖ＣＤＲ３の変異誘発に由来するｇｐ１２０特異的ヒトＦａｂの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。それからＦａｂが発現されるＤＮＡクローンに対応するＭ５５６シリーズのＦａｂ異種二量体の名称は、図９Ａの左側の欄に示されている。鋳型のＦａｂ３ｂ３の重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように指示領域の下に示されている。鋳型Ｆａｂと同一である派生Ｆａｂのアミノ酸残基配列の部分は、省略記号（〃）で表示される。各派生Ｆａｂの変異誘発ＣＤＲは表示されている。変異誘発重鎖ＣＤＲ３をもつ各派生Ｆａｂの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号に対応して配列表に示されている。このＦａｂは実施例２の記載にしたがって得られた。
図１０は、最初のクローンｐＭＴ４−３の軽鎖可変ドメインのヌクレオチドのコード鎖を５’から３’の向きで示す。この配列はまた配列番号：６２として示されている。対応するコードされた軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は図２に示されている（配列番号：６）。
図１１Ａおよび１１Ｂは、図２に示したｐＭＴ４−３（配列番号：６）によってコードされる軽鎖と同じである、ファージミド３ｂ３（ｐ３ｂ３）の軽鎖のＣＤＲ１を変異誘発して得られたｇｐ１２０特異的ヒトＦａｂの可変カッパ軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Ｆａｂがそれから発現されるＤＮＡクローンに対応するこのＡ−ＤシリーズのＦａｂ異種二量体の名称は、図１１Ａの左側の欄に示されている。鋳型Ｆａｂ３ｂ３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように表示された領域の下に示されている。鋳型Ｆａｂと同一である派生Ｆａｂのアミノ酸残基部分は省略記号（〃）で表示される。各派生Ｆａｂの変異誘発ＣＤＲは表示されている。変異誘発軽鎖ＣＤＲ１をもつ各派生Ｆａｂの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号で配列表に示されている。このＦａｂは実施例２の記載にしたがって得られた。
図１２Ａおよび１２Ｂは、図２に示したｐＭＴ４−３（配列番号：６）のそれと同じ軽鎖である、ファージミド３ｂ３（ｐ３ｂ３）の軽鎖のＣＤＲ３を変異誘発して得られたｇｐ１２０特異的ヒトＦａｂの可変カッパ軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Ｆａｂがそれから発現されるＤＮＡクローンに対応する、このＨ４Ｌ３シリーズのＦａｂ異種二量体の名称は、図１２Ａの左側の欄に示されている。鋳型Ｆａｂ３ｂ３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように表示された領域の下に示されている。鋳型Ｆａｂと同一である派生Ｆａｂのアミノ酸残基部分は省略記号（〃）で表示される。各派生Ｆａｂの変異誘発ＣＤＲは表示されている。変異誘発軽鎖ＣＤＲ３をもつ各派生Ｆａｂの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号で配列表に示されている。このＦａｂは実施例２の記載にしたがって得られた。
図１３Ａおよび１３Ｂは、図１１Ａ、１１Ｂ、１３Ａおよび１３Ｂで示した先にＣＤＲ１を変異誘発しさらに選別したＦａｂＤ（配列番号：７０）をコードするファージミドＤの軽鎖ＣＤＲ３を変異誘発して得たｇｐ１２０特異的ヒトＦａｂの可変カッパ軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Ｆａｂがそれから発現されるＤＮＡクローンに対応する、このＱＡシリーズのＦａｂ異種二量体の名称は、図１３Ａの左側の欄に示されている。鋳型ＦａｂＤの軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように表示された領域の下に示されている。鋳型Ｆａｂと同一である派生Ｆａｂのアミノ酸残基部分は省略記号（〃）で表示される。各派生Ｆａｂの変異誘発ＣＤＲは表示されている。変異誘発軽鎖ＣＤＲ３をもつ各派生Ｆａｂの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号で配列表に示されている。このＦａｂは実施例３の記載にしたがって得られた。
図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｌ４２と呼ばれるｇｐ１２０特異的ヒト複合軽鎖の可変カッパ軽鎖（ＶＫ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Ｌ４２軽鎖をコードするためのＬ４２ファージミドは、ファージミドＤ（図１１Ａ、１１Ｂ、１３Ａおよび１３Ｂで示したＦａｂＤをコードする）のＳａｃＩ／ＫｐｎＩフラグメントをファージミドＨ４Ｌ３−２（図１２Ａおよび１２Ｂに示したＦａｂＨ４Ｌ３−２をコードする）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結して得られた。Ｌ４２複合軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように表示された領域の下、および配列番号：８８として配列表に示されている。Ｌ４２軽鎖は実施例３の記載にしたがって得られた。
図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ１０１およびＨ１０３と呼ばれるｇｐ１２０特異的ヒト複合重鎖の可変重鎖（ＶＨ）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。この複合物は実施例３で述べるように調製された。各複合重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図１の説明で述べたように表示された領域の下、および該当配列番号内に示されている。Ｈ３１として示したものと同一である複合重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸残基部分は、省略記号（〃）で表示される。変異誘発ＣＤＲ１およびＣＤＲ３は、各々の重鎖複合体について別々に表示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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