(57)【要約】【課題】血管疾患部位に選択的に造影剤の有効成分を集積させ、非疾患部位とコントラストをつけて造影する手段の提供。【解決手段】動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソームであって、ヨード化合物等の造影剤の有効成分を内包するリポソーム。及び該リポソームを含む造影剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソームであって、造影剤の有効成分を内包するリポソーム。
【請求項２】
有効成分がヨード化合物である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
リン脂質を膜構成成分として含む請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか一項に記載のリポソームを含む造影剤。
【請求項５】
血管疾患の造影に用いるための請求項４に記載の造影剤。
【請求項６】
泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した血管平滑筋細胞の造影に用いる請求項５に記載の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体を含むリポソームに関し、より詳しくは造影剤の有効成分を疾患部位に選択的に集積させることができる抗体を含むリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会、特に先進国社会においては、高カロリー・高脂肪の食事を取る機会が増大している。そのために、動脈硬化症が原因となる虚血性疾患（心筋梗塞・狭心症等の心疾患、脳梗塞・脳出血等の脳血管疾患）の死亡者数が増加しており、この症状を初期の段階で診断し適切な治療を行うことが求められている。しかし、上記疾患が発症する以前に動脈硬化の進行を初期の段階で診断する満足できる方法は存在しない。
【０００３】
動脈硬化症の診断方法としては、非侵襲的な方法と、動脈にカテーテル等を挿入する侵襲的な方法に大別される。このうち非侵襲的方法の主なものはX線血管造影と超音波であるが、初期の動脈硬化、特に心筋梗塞や狭心症の原因となる冠状動脈の狭窄を初期の段階で発症前に検出することはほとんど不可能である。
【０００４】
非侵襲的な方法としては他にCT、MRIなども用いられることがあるが、これらは主として腫瘍の発見のために開発された方法であり、動脈硬化病巣の解像度に問題があるばかりでなく、高値で大かがりな装置を必要とするため、実施できる病院数も限られ一般には利用されていない。またラジオアイソトープを用いる方法も検討されているが、実験の枠を出ていない。
【０００５】
一方侵襲的な方法としては、血管内エコー、血管内視鏡、等が用いられている。これらの方法によると動脈硬化の病巣を0.1mmの厚さまで測定することが可能と言われている。しかし、これらの方法は、カテーテルの先に装着した超音波発振器、内視鏡を動脈内に挿入する必要がある。これは患者に大きな肉体的精神的な負担を強いると共に、危険も伴う。従って、心筋梗塞等の発作をおこした患者の治療や二次予防のために実施されてはいるものの、発症以前の人に動脈硬化の有無もしくは進行を診断する目的には使用できない。
【０００６】
以上の中で、動脈の狭窄部位の特定に最も広く用いられているのはX線血管造影である。これは、水溶性のヨード造影剤を投与することにより血液の流れを造影し、その流れが滞っている箇所をみつける方法である。しかしこの方法では、通常狭窄が５０％以上進んだ病巣しか検出することができず、虚血性疾患の発作が発症する前に病巣を検出することは困難である。
【０００７】
これとは別に、疎水性ヨード造影剤もしくは親水性造影剤を製剤化し、目的とする疾患部位に選択的に集積させる試みが報告されている。例えば、疎水性化合物であるCholesteryl  Iopanoateの油滴分散液を注射することにより、該ヨード化合物が実験動物の動脈硬化部位に集積することが開示されている（非特許文献１参照）。また 、Cholesteryl IopanoateをアセチルＬＤＬに取り込ませて投与することによって該ヨード化合物が実験動物の動脈硬化部位に集積することが開示されている（非特許文献２参照）。
【０００８】
また、 Cholesteryl Iopanoateの油滴分散液を注射することによる肝臓や脾臓のX線造影の例（非特許文献３参照）や、diatrizoic acid のエステル体をリポソームに封入し、肝臓や脾臓の選択的造影を行う方法（特許文献１参照）、血管プールやリンパ系をイメージ化するための造影剤（特許文献２および３参照）が開示されている。しかしながら、これらの製剤方法は、血管疾患を選択的に造影する目的のためには、効率および選択性ともに十分でなく、Ｘ線照射により血管疾患を画像化した例も報告されていない。
【０００９】
さらに、２個の３−アミノ−２，４，６−トリヨードフェニル基を含むアルキルカルボン酸と飽和／不飽和脂肪酸からなるトリグリセリド化合物を、油滴分散（Lipid Emulsion）やTween20分散物として製剤化し、肝臓やBlood-poolの造影を目的として用いる方法が報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【００１０】
また、疎水性、かつ加水分解抵抗性の放射性ヨード造影剤をマイクロエマルジョン製剤化、もしくはアセチルＬＤＬに取り込ませて実験動物に投与して、動脈硬化巣部位を放射性造影する例が開示されている（特許文献４参照）。また、上述のCholesteryl Iopanoateを用いて動脈硬化巣部位をＸ線造影する例が開示されているが（特許文献５参照）、この化合物は生体内で分解されず、生体臓器、特に肝臓に蓄積することが報告されている（非特許文献５参照）。このような化合物の性質は生体内に長期留まることを示しており、例えば、Ｘ線造影剤のような診断への用途を考えた場合には好ましい性質とはいえない。
【００１１】
一方、抗体を含むリポソームに関して、炎症部位のサイトカインに対する抗体を含むリポソームが知られている（"Liopsomes"（M.J.Ostro編、MARCELL DEKKER, INC.）。抗体を含むリポソームは、一般には、イムノリポソームとして知られ、種々薬物を含むリポソームの特定の組織あるいは細胞への到達性を改善させる試みが活発になされている。しかし、抗体を含むリポソームを造影剤に用いる試みはこれまでなされていない。また、動脈硬化巣特有のタンパクに対する抗体を含むリポソームは知られておらず、動脈硬化巣特有のタンパクに対する抗体を含むリポソームを用いても造影剤を動脈硬化巣部分に選択的に集積させることができるかどうかは全く未知であった。
【特許文献１】米国特許第4567034号
【特許文献２】国際公開WO96/28414
【特許文献３】国際公開WO96/00089
【特許文献４】国際公開WO01/93918
【特許文献５】国際公開WO01/82977
【非特許文献１】ファーマシューティカル・リサーチ（Pharmaceutical Research）, 6(12), 1011 (1989)
【非特許文献２】ファーマシューティカル・リサーチ（Pharmaceutical Research）, 16(3), 420 (1999)
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Journal of Pharmaceutical Science）, 72(8), 898 (1983)
【非特許文献４】ラジオロジー（Radiology）, 216(3)
【非特許文献５】ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（ Journal of Medicinal Chemistry）, 25, 1500 (1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、疾患部位に選択的に造影剤の有効成分を集積させ、非疾患部位とコントラストをつけて造影する手段を提供することである。より具体的には、本発明の課題は、造影剤の有効成分を血管疾患部位に選択的に集積させるためのリポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソームを用いることにより、動脈硬化巣の主構成成分である血管平滑筋および泡沫化マクロファージに造影剤の有効成分を集積させて、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこの知見を基に完成されたものである。
【００１４】
すなわち、本発明は、動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソームであって、造影剤の有効成分を内包するリポソームを提供する。この発明の好ましい態様によれば、有効成分がヨード化合物である上記リポソーム；リン脂質を膜構成成分として含む上記リポソームが提供される。
【００１５】
別の観点からは、上記いずれかのリポソームを含む造影剤が提供される。この発明の好ましい態様によれば、血管疾患の造影に用いるための上記造影剤；泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した血管平滑筋細胞の造影に用いる上記造影剤が提供される。
【００１６】
さらに別の観点からは、血管疾患の造影方法であって、ヒトを含む哺乳類動物に上記造影剤を投与する工程を含む方法；泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した血管平滑筋細胞の造影方法であって、ヒトを含む哺乳類動物に上記造影剤を投与する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のリポソームを用いることにより、血管疾患部位に選択的に造影剤の有効成分を集積させ、非疾患部位とコントラストをつけて造影することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書において、「抗体を含むリポソーム」としては、例えば、リポソーム表面に抗体を結合させたものが挙げられる。抗体を結合させる方法としては、一般にイムノリポソームを作成する際に用いられる方法を用いることができ、例えば、後述のホスファチジルエタノールアミンなどのアミノ基含有リン脂質のアミノ基を利用してリポソーム表面に抗体分子を共有結合させる方法などを用いることができる。また、抗体をリポソームの構成成分である脂質等と混合してリポソームを調製してもよい。具体的にはリン脂質のみのリポソーム溶液に得られた抗体を添加し、よくかき混ぜる事で作成される。
【００１９】
本発明の動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソームは、血管疾患部位に選択的に集積する。動脈硬化巣に存在するタンパクとしては、血小板由来増殖因子（PDGF）、マクロファージ由来増殖因子（MDGF）、内皮細胞由来増殖因子（ECDGF）、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、血管内皮細胞増殖因子（VEPF）、インターロイキン１（IL-1）、腫瘍壊死因子（TNF）、アルファインターフェロン（INF-α）が挙げられ、好ましくはMDGF、ECDGF、PDGFが挙げられる。
【００２０】
本発明に用いられる抗体としては、各種動物のポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒト−マウスのキメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体などが挙げられるが、ヒトモノクローナル抗体がより好ましい。さらに、抗体としては、抗体自体、又は抗体フラグメント、誘導化又は修飾した抗体などを用いてもよい。
抗体の作製方法としては、例えば、ラット又はウサギにMDGF、ECDGF、PDGFを血中に投与し、１日間飼育後全血を採血し、その血清から抗体を得る方法が挙げられる。
【００２１】
「動脈硬化巣に存在するタンパクに対する抗体を含むリポソーム」に造影剤の有効成分を内包させることにより、血管疾患部位に選択的に造影剤の有効成分を集積させることが可能である。本明細書において「内包」とは、溶液としてリポソームの内部水相に保持されている場合、リポソームの膜構成成分として存在する場合を包含する。
【００２２】
造影剤の有効成分としてはヨード化合物が挙げられる。ヨード化合物は特に限定されず、水溶性のものとして、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオメプロール、イオプロミド、イオキシラン、イオキサグル酸、イオトロクス酸、アミドトリゾ酸、イオトロラン、イオタラム酸、イオジキサノール等、疎水性ヨード化合物として、ヨードベンゼン誘導体等が挙げられる（特開２００３−１２８５９１号公報；特開２００３−０６４０３１号公報；特開２００３−０５５２６８号公報；特開２００３−０５５２６７号公報；特開２００３−０５５１９６号公報；特開２００３−０１２６９２号公報；特開２００３−０１２６９１号公報等参照）。シンチグラフィー造影のために放射性ヨード化合物も使用可能である。これらのヨード化合物の使用可能量は、例えば膜構成成分として存在する場合、リポソーム膜構成成分の５から２０重量％であるが、好ましくは５から１５％であり、さらに好ましくは１０から１５％である。
【００２３】
本発明のリポソームの膜構成成分としては、当該技術で通常用いられている脂質化合物をいずれも用いることが可能である。例えば、Biochim. Biophys. Acta 150(4), 44 (1982)、Adv. in Lipid. Res. 16(1) 1 (1978)、"RESEARCH IN LIPOSOMES"（P.Machy, L.Leserman著、John Libbey EUROTEXT社）、「リポソーム」（野島、砂本、井上編、南江堂）、 等に記載されているものを用いることができる。中でもリン脂質が好ましく、特に好ましいのはホスファチルジルコリン（PC)類である。PC類の中で好ましい例としては、eggPC、ジミリストリルPC（DMPC)、ジパルミトイルPC（DPPC)、ジステアロイルPC（DSPC)、ジオレイルPC（DOPC）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の別の好ましい態様によると、リポソームの膜構成成分として、PCとホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）のいずれかを組み合わせて使用することが挙げられる。この場合PCとPS或いはPI或いはPEの好ましい使用モル比はPC：（PS或いはPI或いはPE）＝９０：１０から１０：９０の間であり、さらに好ましくは、３０：７０から７０：３０の間である。
【００２５】
本発明のさらに別の好ましい態様によると、膜構成成分として、PCとPS或いはPI或いはPEに加えて、リン酸ジアルキルエステルを含むことが挙げられる。この場合各々のアルキル基は同じものであることが好ましい。アルキル基の炭素数は６以上であり、１０以上が好ましく、１２以上がさらに好ましい。好ましいリン酸ジアルキルエステルの例としては、ジラウリルフォスフェート、ジミリスチルフォスフェート、ジセチルフォスフェート、等が挙げられるが、これに限定されるものではない。この場合、PCとPSの合計量に対するリン酸ジアルキルエステルの好ましい使用量は１から５０％までであり、好ましくは１から３０％であり、さらに好ましくは１から２０％である。
【００２６】
例えば、PC、PS或いはPI或いはPE、リン酸ジアルキルエステル、ヨード化合物の４者を含むリポソームを形成する場合、好ましい重量比はそれぞれ５％から４０％、５％から４０％、１％から１０％、１０％から１５％の間で選択することができる。
【００２７】
本発明のリポソームの構成成分としては、上術の成分以外に、さらに別の成分を加えることができる。その例としては、コレステロール、コレステロールエステル、スフィンゴミエリン、FEBS Lett. 223, 42 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6949 (1988)等に記載のモノシアルガングリオシドGM1誘導体、Chem. Lett. 2145 (1989); Biochim. Biophys. Acta 1148, 77 (1992)等に記載のグルクロン酸誘導体、Biochim. Biophys. Acta 1029, 91 (1990); FEBS Lett. 268, 235 (1990)等に記載のポリエチレングリコール誘導体が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００２８】
本発明のリポソームは、当該分野で公知のいかなる方法でもっても作成できる。作成法の例としては、先に挙げたリポソームの総説成書類の他、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980) 、"Liopsomes"（M.J.Ostro編、MARCELL DEKKER, INC.）等に記載されている。具体例としては、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００２９】
本発明のリポソームのサイズは、上記の方法で作成できるサイズのいずれであっても構わないが、通常は平均が400nm以下であり、200nm以下が好ましい。
【００３０】
本発明のリポソームは血管疾患の造影剤として用いることができ、好ましくは非経口的に投与することができる。通常は造影の目的で患者に静脈内投与することができる。本発明のリポソームを含む造影剤は、注射剤や点滴剤の形態で調製することが可能であり、凍結乾燥形態の粉末状組成物として提供し、用時に水又は他の適当な媒体（例えば生理食塩水、ブドウ糖輸液、緩衝液など）に再懸濁させて用いることも可能である。本発明のリポソームを含む造影剤の投与量及び投与回数は特に限定されないが、造影すべき部位、照射光線の量、疾患の種類、患者の年齢、体重などの種々の条件に応じて、適宜の投与量を決定することができる。通常は、0.001〜100 mg/kgを一回又は数回に分けて投与するのが好ましい。
【００３１】
動脈硬化、もしくはPTCA後の再狭窄等の血管疾患においては、血管の中膜を形成する血管平滑筋細胞が異常増殖をおこすと同時に内膜に遊走し、血流路を狭くすることが知られている。正常の血管平滑筋細胞が異常増殖を始めるトリガーはまだ完全に明らかにされていないが、マクロファージの内膜への遊走と泡沫化が重要な要因であることが知られており、その後に血管平滑細胞がフェノタイプ変換（収縮型から合成型）をおこすことが報告されている。実施例に述べるように、本発明のリポソームを用いると、泡沫化マクロファージの影響で異常増殖した血管平滑筋に造影剤の有効成分、例えばヨード化合物を選択的に取りこませることができる。その結果、疾患部位と非疾患部位とをコントラストをつけて造影することが可能である。検出の方法は、X線照射による方法、放射性ヨード化合物を用いる核医学的方法が挙げられるが、これに限るものではない。
【００３２】
造影剤としては、Ｘ線造影剤及びシンチグラフィー造影剤が好ましいが、これらに限られるものではない。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：リポソームの調製
表１に示した割合で、Phosphatidylcholine,Egg（フナコシ社製、商品コード830051L）
Phosphatidylserine,Bovine Brain（フナコシ社製、商品コードＡ−３７）のクロロホルム溶液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、薄膜を作る。これに直前に蒸留したエーテルを３ml加え、脂質を溶解させた。
ついで１mlの0.9%生理食塩水（光製薬社製、No.512）に下記に示した量のイオパミドール（日本シェーリング社製、イオパミドール粉末）を加え、窒素気流下、浴槽型ソニケーター（ヤマト科学社製、No.145-50481）を用いて２０℃で５分間超音波処理する。生成するエマルジョンを減圧下（350-400mmHg）でロータリーエバポレーターを用いてエーテルを除去した。これを更にVortexミキサー上で振とうして懸濁液にし、再び680-700mmHgの減圧下で残っているエーテルを除去した。次に、この溶液を
20000G、４℃で２０分遠心し、ペレットに1mlの0.9%生理食塩水を加え、再度、懸濁液を作った。この懸濁液に、ラットにおいて作成したMDGFに対するモノクローナル抗体0.5ngを添加しVortexミキサー上で振とうした。この操作により、MDGFに対するモノクローナル抗体を含む７０〜２００nmサイズのリポソーム溶液が完成した。
【００３４】
【表１】
2005170807.tif 000002
例２：造影剤の有効成分の疾患部位への集積
ＷＨＨＬウサギ♂２ヵ月齢を北山ラベスにて購入し２週間、馴化飼育を行なった。0.9%
生理食塩水に溶解したイオパミドールを耳下静脈より投与し１時間後麻酔処理した。
大動脈弓部の動脈硬化巣を摘出し、病巣に取り込まれたイオパミドールをＨＰＬＣにて定量した（実験１）。次に、例１で示したイオパミドールリポソーム製剤に関しても同様の定量実験を行なった（実験２）（各ｎ＝３羽 投与量：イオパミドールとして400mg/kg）。結果を図１に示す（結果は平均値）。リポソーム製剤投与により、イオパミドールを病巣に効率よく取り込ませる事ができた。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】生理食塩水に溶解したイオパミドール（実験１）及びイオパミドールリポソーム製剤（実験２）の動脈硬化巣への取り込み量を示した図である。
【図１】
2005170807.tif 000003