(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞微小管を構成するタンパク質、チューブリンにポリグリシンを付加する、ポリグリシン付加酵素、該酵素の活性測定方法、及び細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う細胞増殖の促進、又は該細胞増殖の抑制に関与する物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】特定の２種類のアミノ酸配列と相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素、及び細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：前記ポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、標準試料、及び被検物質を加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素。
【請求項６】
細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項２、又は請求項４記載のポリグリシン付加酵素を用いる、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記細胞増殖抑制剤が抗ガン剤である、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程が、ポリグリシン付加酵素の反応後、支持体に固定した該標準試料をトリクロロ酢酸で処理する工程を含む、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記標準試料が、動物細胞、又は植物細胞由来のチューブリンを含むものである、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、及び標準試料を含むことを特徴とする、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の増進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニングキット。
【請求項１２】
チューブリン、ポリグリシン付加酵素及び標識されたグリシンを含む反応液をインキュベートし、回収した反応液を固定した後、トリクロロ酢酸で該チューブリンを含む試料を処理することにより、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させ、次いで標識されたポリグリシンの量を測定することを特徴とする、ポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１３】
回収した反応液を固定した後、低温下、トリクロロ酢酸溶液中でインキュベートすることによりトリクロロ酢酸処理を行う、請求項１２記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１４】
０〜１０℃でトリクロロ酢酸処理をする、請求項１３記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１５】
１〜３０分間、トリクロロ酢酸処理を行う、請求項１２記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１６】
５〜１５分間、トリクロロ酢酸を行う、請求項１２記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１７】
トリクロロ酢酸として、トリクロロ酢酸１〜３０％の溶液を用いる、請求項１２記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【請求項１８】
トリクロロ酢酸として、トリクロロ酢酸５〜２０％の溶液を用いる、請求項１２記載のポリグリシン付加酵素の活性測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質にポリグリシンを翻訳後修飾するポリグリシン付加酵素、及びその使用方法に関するものである。さらに詳しく述べると、細胞微小管を構成するタンパク質であるチューブリンにポリグリシンを付加する、ポリグリシン付加酵素、該ポリグリシン付加酵素の活性測定方法、及び細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う細胞増殖の促進、又は該細胞増殖の抑制に関与する物質を、該ポリグリシン付加酵素を用いてスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとする多細胞生物の正常な機能維持には、秩序ある翻訳後修飾、それによる各種タンパク質の寿命の調節、さらにそのタンパク質機能の発現による細胞機能によって受け渡しされる情報に基づいて起きる細胞の応答といった一連の生命現象の時系列制御が極めて重要であると考えられている（非特許文献１，２及び３）。また、多細胞生物に生じる癌には多くの成因が存在するが、その多くは不明であり、該翻訳後修飾、それによる各種タンパク質の寿命の調節、及び該タンパク質機能の発現による細胞の応答の異常が、重要な因子であると考えられている。
特に、これら翻訳後修飾に伴うタンパク質発現による細胞機能には、細胞骨格の微小管を構成するタンパク質、チューブリンに対するポリグリシン付加による動態が深く関与していると予測され、この酵素の解明がタンパク質機能の発現による細胞機能、及び癌のメカニズムの解明に必須であると考えられている。
しかし、これまで該チューブリンにポリグルタミン酸を付加する酵素、ポリグルタミレース(Polyglutamylase)、及びその活性測定方法は報告されているが（非特許文献４）、ポリグリシンを付加酵素の活性測定方法はなく、該ポリグリシン付加酵素は見出されていなかった。
【０００３】
【非特許文献１】Nicolette Levilliers et. al., Journal of Cell Science 108, 30,3013-3028 (1995)
【非特許文献２】Thomas H. MacRAE, Eur. J. Biochem. 244, 265-278 (1997)
【非特許文献３】Virginie Redeker et. al., Science, Vol. 266, 9 December 1994.
【非特許文献４】Regnard et. al.,: Tubulin Polyglutamylase: Partial Purification AndEnzymatic Properties., Biochemistry, 37, 8395-0404, (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、これまで知られていなかったポリグリシン付加酵素、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法を提供することを目的とする。
さらに詳細に述べると、本発明は、ヒトの細胞の形成や分裂、癌の発生、増殖のメカニズムの解明、細胞分化の機能的、又は構造的障害を原因とする各種疾患の診断、予防、及び治療のための技術開発などに有用なポリグリシン付加酵素、及び該グリシン付加酵素を利用したスクリーニング法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者が前記課題を達成するため研究を行った結果、細胞微小管のチューブリンにポリグルタミンを付加するポリグルタミレースの活性を測定する公知の方法（＊１）を改良し、ＴＣＡ沈殿、すなわちトリクロロ酢酸(TCA)でチューブリンを含む試料を処理することにより、ポリグリシン付加酵素、及びチューブリン・ポリグリシン付加酵素を安定させ、該ポリグリシン付加酵素の活性を測定できるという知見を得た。
＊１：Regnard et al., :Tubulin Polyglutamilase: Partial Purification and
Enzymatic Properties., Biochemistry, 37, 8395-8404, 1998.
本発明者は、該知見に基づき、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法を確立し、本発明のポリグリシン付加酵素、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法を完成したのである。なお、特に断らない限り、本明細書において、該ポリグリシン付加酵素をポリグリシレースという。
【０００６】
したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列と所定の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素を提供する。また、該相同性は７０％以上、好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。
また、本発明は配列番号２、又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素を提供する。
また、本発明は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：
前記ポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法を提供する。
【０００７】
また、本発明は、該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程がTCA沈殿を含む、前記スクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、前記ポリグリシン付加酵素を含むことを特徴とする、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の増進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニングキットを提供する。
さらに、本発明は、チューブリン、ポリグリシン付加酵素及び標識されたグリシンを含む反応液をインキュベートし、回収した反応液を固定した後、トリクロロ酢酸で該チューブリンを含む試料を処理することにより、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させ、次いで標識されたポリグリシンの量を測定することを特徴とする、ポリグリシン付加酵素の活性測定方法を提供する。
【０００８】
（定義）
本明細書において、「ポリグリシレース」とは、タンパク質の翻訳後修飾において、タンパク質に特異的にポリグリシンを付加する酵素を意味する。本明細書において特に指摘しない限り、該ポリグリシレースとは、細胞微小管の構造タンパク質であるチューブリンに、特異的にポリグリシンを付加する酵素、すなわちポリグリシン付加酵素を意味する。
また、本明細書において「ポリグリシン」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基に結合した単独のグリシン残基、又はグリシン残基２〜５０個を有するアミノ酸重合体をいい、特に断らない限り、細胞微小管のチューブリンのＣ末端近傍のアミノ酸残基に結合しているものをいう。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規なポリグリシン付加酵素、ポリグリシン付加酵素活性の測定方法、及び該ポリグリシン付加酵素を用いる細胞増殖制御物質のスクリーニング法が得られる。
本発明により、ヒトの細胞の形成や分裂、癌の発生、増殖のメカニズムの解明、細胞分化の機能的、又は構造的障害を原因とする各種疾患の診断、予防、及び治療のための技術開発などに有用な新規ポリグリシン付加酵素が提供される。また、該ポリグリシン付加酵素を標的として利用する、本発明のスクリーニング法により、制ガン剤を含む、細胞増殖制御物質の効率的なスクリーニングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
(ポリグリシン付加酵素の活性測定方法）
前記Regnardらが報告した、細胞微小管のチューブリンにポリグルタミン酸を付加するポリグルタミレースの活性を測定する公知の方法では、ポリグリシン付加酵素の活性を正確に測定することはできかったが、本発明者らは、ＴＣＡ沈殿、すなわちトリクロロ酢酸(TCA)でチューブリンを含む試料を処理することにより、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させ、該ポリグリシン付加酵素の活性を測定する方法を確立した。本発明の活性測定方法を図１の工程図に基づき説明する。
【００１１】
反応液の調製
まず、チューブリン、ポリグリシン付加酵素を含む試料、及び標識されたグリシンを含む反応液を調製する。該試料は、多細胞生物の細胞の抽出液、抽出液を精製した分画、又は既にポリグリシン付加酵素とチューブリンとを含む細胞溶解液などを用いることができる。また、グリシンは精製された単品を標識して使用する。該標識は、チューブリンへのポリグリシンの結合量を測定するのに用いるもので、例えば、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕及び〔35Ｓ〕などの放射性元素、及び蛍光色素がある。
また、チューブリンとポリグリシンの付加反応を行うために、Tris-HClなどの緩衝液、ＡＴＰ、MgCl2などのマグネシウム塩、及びＤＴＴを加える。通常、該付加反応を行うためには、pH７〜１０，好ましくは８〜１０とし、かつ塩濃度を２〜１２mmol程度にするのが好ましい。該反応液を調製した後、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、１５〜４５分間、好ましくは２５〜３５分間、インキュベートする。
【００１２】
反応液の固定
ポリグリシンの付加反応終了後、反応液を支持体上に固定する。該支持体として、例えば、グラスファイバー、又はニトロセルロースのフィルター、ワットマンろ紙などを用いることができる。また、反応液の固定は、反応液を支持体上にスポットすることにより行うことができる。
ＴＣＡ沈殿
該ＴＣＡ沈殿は、支持体に固定した反応液を、トリクロロ酢酸溶液中でインキュベートすることにより行う。該インキュベートは、常温で行うこともできるが、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させるため、低温、例えば、０〜１０℃で、１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間で行う。また、該トリクロロ酢酸は、濃度１〜３０％、好ましくは５〜２０％のトリクロロ酢酸溶液として用いるのが好ましい。
ポリグリシン付加酵素を固定した支持体の洗浄
ＴＣＡ沈殿を行った後、まず、遊離の標識されたグリシンを除去するため、前記支持体を、固定されたチューブリン・ポリグリシン複合体の安定を損なわない溶媒で数回洗浄する。本発明では、フィルターなどの支持体を吸引状態で、適量の５％トリクロロ酢酸溶液により２〜５回程度洗浄するのが好ましい。ついで、残留トリクロロ酢酸を除去するため、固定されたポリグリシン・ポリグリシン付加酵素複合体の安定を損なわない溶媒で数回洗浄する。例えば、該支持体を吸引状態で、適量のメチルアルコール、又はエチルアルコールなどで２〜５回程度洗浄するのが好ましい。次いで、該支持体を無水硫酸などの乾燥剤、又は６０〜９０℃の温度で５〜３０分間乾燥させる。
【００１３】
標識されたポリグリシンの測定
トリチウムなどの放射性元素で標識された場合、乾燥させた支持体に含まれる放射線量を測定し、取り込まれたグリシンの量をコントロールと比較し、ポリグリシン付加酵素の活性を測定する。例えば、標識がトリチウムの場合、シンチレーションバイアルに支持体を入れ、トルエン系シンチレーションカクテルを加えて、液体シンチレーションカウンターで測定することができる。
(ポリグリシン付加酵素）
本発明のポリグリシン付加酵素（ポリグリシレース）は、配列番号２のアミノ酸配列と所定の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素である。該相同性はチューブリンに対するポリグリシン付加を維持できる範囲であり、例えば、７０％以上、特に８０％以上、好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは９５％以上である。また、本発明のポリグリシン付加酵素には、マウスのポリグリシン付加酵素のアミノ酸配列（配列番号４）、及びヒトのポリグリシン付加酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を有するポリグリシン付加酵素が含まれる。
【００１４】
本発明のポリグリシン付加酵素は、前記ポリグリシン付加酵素の活性測定方法を用いて、ブタ脳組織の細胞抽出液を分画し、ポリグリシン付加酵素を多く含む画分を特定して該酵素を採取し、次いで該酵素をプロテアーゼで断片とし、該断片のアミノ酸配列情報を用いてデータベース（ＮＣＢＩ）を検索することにより特定したものである。具体的な手順は後述する実施例２に記載されている。
該データベース検索の結果、得られたポリグリシン付加酵素は、ヒト、及びマウスホスホグリセレートカイネース(PGK)と同じ配列を有することが判った。すなわち、従来、ＰＧＫとして知られていた酵素は、同時にポリグリシン付加酵素であること判明した。
【００１５】
(ポリグリシン付加酵素の製造）
本発明のポリグリシン付加酵素は、所望の動物、又は植物の細胞から、常法で細胞溶解液を作り、分画し、本発明の活性測定方法により、該ポリグリシン付加酵素に富む画分を選び、塩析、沈殿、アフィニティカラムなどにより精製することで製造することができる。また、本発明のポリグリシン付加酵素は、所望の多細胞生物のＰＧＫ１と同じアミノ酸配列を有するものであるから、入手しようとする多細胞生物のＰＧＫ１をコードするポリヌクレオチドを、cDNAライブラリーから調製して、常法により該ポリヌクレオチドを発現することで調製することができる。
例えば、本発明の配列番号２、又は配列番号４のアミノ酸配列を含むポリグリシン付加酵素は、配列番号１、又は配列番号３のポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換して培養することにより製造することができる。
【００１６】
ここで用いる発現ベクターは、本発明のポリグリシン付加酵素をコードするcDNA断片を作成し、該cDNA断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。
ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどがある。
また、該プロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどである。
【００１７】
さらに該発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いることができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適したシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡシグナル配列、OmpＡシグナル配列などが、該宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築したポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００１８】
ここで用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、及び動物細胞などがある。
該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法がある。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods  in  Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７５巻，１９２９(１９７８）などの方法がある。昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6,47-55(1988）などに記載の方法がある。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法がある。このようにして、本発明のポリグリシン付加酵素をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。
【００１９】
該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal  of  Experiments  in  Molecular  Genetics），４３１−４３３，Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  New  York１９７２〕が好ましい。
また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
【００２０】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian,  K.L.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter,  G.A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する場合、グレイスインセクト培地(Grace's  Insect  Medium：Grace,  T.C.C.,  Nature,  195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２１】
また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The  Journal  of  the  American  Medical  Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding  of  the  Society  for  the  Biological  Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などを用いる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のポリペプチドを産生させることができる。
【００２２】
上記培養物からの該ポリグリシン付加酵素の分離精製は、常法に従って行うことができる。例えば、本発明の付加酵素を培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に該付加酵素が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれる該付加酵素の精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行う。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがある。このようにして製造した本発明のポリグリシン付加酵素は、本発明の活性測定方法により活性を測定するか、又は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００２３】
（細胞増殖の促進剤、又は抑制剤のスクリーニング方法）
さらに本発明は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進剤、又は該細胞増殖の抑制剤のスクリーニング方法であって：ポリグリシン付加酵素、標識されたグリシン、被検物質、及び標準試料に加える工程；及び該標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程；を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法を提供する。なお、該スクリーニング方法は、前述のポリグリシン付加酵素の活性測定方法を基本的に同じ工程により行われる。
本発明の方法でスクリーニングする細胞増殖の促進剤は、特に制限されるものではなく、例えば、毛髪生育促進剤、外傷治療薬、角膜外傷治療薬など動物組織の再生を促す薬剤、神経細胞の再生剤、植物組織の選択的増殖促進剤、多細胞生物の選択的細胞分化の促進剤などを挙げることができる。また、該細胞増殖の抑制剤としては、例えば、イボの治療剤、特定の細菌、又はウイルス感染細胞の増殖抑制剤、神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病の治療薬、及び抗ガン剤を挙げることができる。
【００２４】
該スクリーニング方法で用いるポリグリシン付加酵素は、配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、特に８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素である。特に、ヒト細胞、又はその抽出物を標準試料とする場合は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素が、また、マウス細胞、又はその抽出物を標準試料とする場合は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、チューブリンに対するポリグリシン付加酵素が好ましい。
また、本発明のスクリーニング方法で用いる被検物質は、細胞微小管のチューブリンに対するポリグリシン付加に伴う、細胞増殖の促進、又は抑制に関与する物質であれば特に制限することなく用いることができる。例えば、被検物質として、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などを挙げることができ、これら被検物質は新規な化合物であっても、公知の化合物であってもよい。
【００２５】
なお、近年発展しているコンビナトリアルケミストリー（Combinatrial  Chemistry、コンビケム）の手法を用い、特定の基本骨格(scaffold)に、複数の置換基を組合せて導入することで、短時間で多数かつ多様な化合物のライブラリーを形成することができる。該コンビケムで得られた化合物ライブラリーを被検物質として、本発明のスクリーニング方法を適用することにより、非常に多数の候補化合物を効率的、かつ大規模にスクリーニングすることができる。また、該化合物ライブラリーは合成分子、及び天然分子双方を含むことができる。
例えば、１０００個の化合物からなるライブラリーをスクリーニングする場合、原理的には、１０００個の化合物のすべてをマイクロタイタープレートのウエルに入れて、同時に試験することができる。このような合成分子に由来する大きなライブラリーの作製、及び同時スクリーニングを、コンビナトリアル化学の公知の方法により行うことができる（Van  Breemen、Anal．Chem．69(1997)、2159〜2164、又はLam、Anticancer  Drug  Des．12(1997)、145〜167）。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法に用いる標準試料は、動物細胞、又は植物細胞など多細胞生物由来の細胞微小管の構造タンパク質であるチューブリンを含む試料をいう。該標準試料は、使用するポリグリシン付加酵素が反応するチューブリンを含む限り特に制限なく使用することができるが、使用するポリグリシン付加酵素と同じ由来の多細胞生物から由来したものを用いるのが好ましい。また、該標準試料は、多細胞生物由来のチューブリンを含む試料であって、例えば、細胞溶解液、細胞微小管を含む特定の細胞溶解溶液の画分、又は精製されたチューブリンを含む画分のいずれであってもよい。
本発明のスクリーニング方法における、ポリグリシン付加酵素と、標識されたグリシン、標準試料に含まれるチューブリンの割合は、特に制限されないが、通常、ポリグリシン付加酵素（２unit/l）２〜８l、好ましくは約４〜６l、標識されたグリシン（１６Ci/mmol）１〜５l、好ましくは２〜４l、及びチューブリン（１mg/ml）１〜７l、好ましくは１〜３lとする。また、被検物質の適用量は、該被検物質の性質により変化するが、通常１〜１０gとすることが好ましい。
【００２７】
また、本発明のスクリーニング方法においても、標準試料に含まれるチューブリンとグリシンの付加反応を行うために、Tris-HClなどの緩衝液、ＡＴＰ、MgCl2などのマグネシウム塩、及びＤＴＴを加える。通常、該付加反応を行うためには、pH７〜１０，好ましくは８〜１０とし、かつ塩濃度を２〜１２mmol程度にするのが好ましい。該反応液を調製した後、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、１５〜４５分間、好ましくは２５〜３５分間、インキュベートする。
さらに、本発明のスクリーニング方法は、前記標準試料におけるポリグリシン付加反応の促進、又は抑制を検出する工程に、ポリグリシン付加酵素の反応後、支持体に固定した標準試料をトリクロロ酢酸で処理する工程を含む。該工程は、前述のＴＣＡ沈殿に相当する工程であり、支持体に固定した標準試料を、トリクロロ酢酸溶液中でインキュベートすることにより行う。該インキュベートは、常温で行うこともできるが、チューブリン・ポリグリシン複合体を安定させるため、低温、例えば、０〜１０℃で、１〜３０分間、好ましくは５〜１５分間で行う。また、該トリクロロ酢酸は、濃度１〜３０％、好ましくは５〜２０％のトリクロロ酢酸溶液として用いるのが好ましい。
このようにして標準試料のチューブリンに付加されたポリグリシンを固定し、標識されたポリグリシンの量を測定することにより、ポリグリシン付加酵素に対する被検物質の影響を測定することができる。なお、該スクリーニング方法で用いる標識、及びその測定方法は、前記ポリグリシン付加酵素の活性測定方法と同様なものである。
【実施例】
【００２８】
（参考例１）  ポリグルタミレース(Polyglutamylase)の活性測定法
細胞微小管のチューブリンにポリグルタミンを付加する、Regnardらが既に報告したポリグルタミレースの活性測定法１）を用いて、ポリグリシン付加酵素、ポリグリシレース活性の測定を試みた。その測定法を以下に記す。
50mM  Tris-HCL(pH9.0),２mM ATP(pH7),８mM  MgCl2,２．５mM  DTT,１０M  taxotere,  L-[3H]グルタミン酸(45-55Ci/mmol),適当な濃度の未標識L-グルタミン酸、0.1mg/mlのマイクロチューブルを混合し、30℃で30分間インキュベートした。5%トリクロロ酢酸と10mMグルタミン酸を各5倍量加えることで反応を停止させ、吸引状態下でニトロセルロースにフィルターした。1%酢酸で過渡に洗浄した後、0.5mlの0.1M  NaOHに浸してからシンチレーションカクテル6mlに入れて液体シンチレーターで測定した。
この測定法によりポリグルタミレース活性、ポリグリシレース活性を測定してみたところ、ポリグルタミレース活性は再現性が得られたが、ポリグリシレース活性に関しては再現性が得られないことから、上記の従来技術の活性測定方法は、ポリグリシレース活性の測定方法としては使用できないと判断した。
【００２９】
（実施例１）  ポリグリシレースの活性測定法
参考例１に記した測定方法を改良し、本発明のポリグリシレースの活性測定法を確立した。そして、下記のとおり本発明の活性測定方法によりポリグリシレースの活性を測定した。
50mM  Tris-HCL(pH8.0),２mM  ATP(pH7),８mM  MgCl2,２．５mM  DTT,１０M  taxotere,  L-[3H]グルタミン酸(45-55Ci/mmol)、0.1mg/mlのマイクロチューブルを混合し、30℃で30分間インキュベートした。変更点は50mM  Tris-HClのpHを9.0から8.0とし、未標識のL-グルタミン酸を省いたことである。その後、該混合液をガラスフィルター（GF/Fフィルター、Whatman）にスポットし、冷却した10%トリクロロ酢酸(TCA)を適量入れたビーカーを氷水中に置き、フィルターを浸すことでTCA沈殿を起こさせた。10分間放置した後で該混合液を棄てた。このTCA沈殿を3回行った後、濾紙を敷いたブフナーロートにフィルターを乗せ、さらにその上に濾紙を敷き、吸引状態下で冷却した5%TCAを適量入れ、遊離のL-[3H]グリシンを洗い流した。この作業を3回繰り返した。次に100%エタノールを適量入れ、TCAを洗い流す作業を2回繰り返した。この洗浄したフィルターを濾紙上から取り出しアルミホイルの上に乗せ、80℃に設定したオーブンの中で10分間乾燥させた。乾燥したフィルターをシンチレーションバイアルに入れ、5mlのトルエン系シンチレーションカクテルを加え液体シンチレーターで測定した。その結果、ポリグリシレースの活性を測定することができた。
【００３０】
（実施例2）  ポリグリシレースの製造
（実施例2−1）  ブタ由来チューブリンの調製
ブタ脳6個（620g）をA液（5mM PIPES, 50M EGTA, 50M MgSO4）１リットルで洗浄した。脳の総量と等量の20×A液を加え、プロテアーゼインヒビターであるPMSFとロイペプチンを最終濃度0.1mMと10g/ml、さらにATPを最終濃度1mMとなるように加え、ホモゲナイズした（細胞溶解物）。60,000×g、２℃で60分間遠心分離し、分取した上清（S1）を計量した。4分の1量のグリセロールと最終濃度が1mMとなるようにATPを加え混合し、37℃の恒温水槽で35分間インキュベートすることでチューブリンを重合させた。次に27,400×g、37℃で40分間遠心分離し、分取した沈殿（P2）を計量した。4倍量の20×A液と最終濃度が0.5mMとなるようにATPを加えホモゲナイズし、氷中でインキュベートすることでチューブリンを脱重合させた。
これに最終濃度が1mMとなるようにGTPを加えてから、27,400×g、4℃で40分間遠心分離し、分取した上清（S3）を計量した。4分の1量のグリセロールと最終濃度が1mMとなるようにGTPを加え混合し、37℃の恒温水槽で35分間インキュベートした。その後、27,400×g、37℃で40分間遠心分離し、分取した沈殿を計量した。3倍量の20×A液と最終濃度が1mMとなるように還元剤DTTを加えホモゲナイズすることでブタ由来チューブリンの粗精製物（P4）を得た。
【００３１】
（実施例2−2）  ブタ由来チューブリン分画を用いたポリグリシレースの活性測定法
実施例2−1で得たP2をP4と同様に懸濁し、細胞溶解物、S1、P2、S3、P4について、実施例１と同じ方法でポリグリシレース活性を測定した。すなわち、ポリグリシレース活性測定用の混合液に所定量の各分画を加え、30分間、30℃でインキュベートし、実施例１の測定方法に従い活性を測定した。その結果、図２、及び表１に示すように精製が進んだP4においても十分な比活性が得られていることが明らかとなった。なお、ここで精製の進んだP４は、全画分を含む細胞溶解物と比較しても同様の比活性を有していた。
【００３２】
【表１】
2005198530.tif 000002
【００３３】
（実施例2−3）  高比活性を有する分画(P4)からのポリグリシレースの精製
ブタ由来チューブリン粗精製物P4に、0.1%  TX-100を加え、50mM  BICINE（pH9.0）,１mM  2-メルカプトエタノールを外液として一晩透析した。予めA液（50mM  BICINE（pH9.0）,１mM  EGTA,１mM  MgSO4,１mM  DTT,０．０１%  TX-100,０．１M  NaCl）で平衡化しておいたホスホセルロースカラム（ベッドボリューム3ml）に注入し、A液3mlでカラムを6回洗浄した。次に0.3M  NaClを加えたA液1mlで5回溶出した。そして1.0M  NaCl溶液を加えたA液1mlで5回溶出した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、1.0M  NaClにより溶出された分画において高い活性が得られた。また図３に示すように電気泳動ゲルで50kDa付近にチューブリンの濃いバンドが見られた。前記５回溶出分画から3つの分画を選んだ。
また、図４に示すように、0.3M  NaCl、及び1.0M  NaClのそれぞれの濃度で５０kDa付近にバンドが見られるが、0.3M  NaClのバンドの抽出物では、117cpmの活性しか見られなかったのに対し、0.1M  NaClのバンドの抽出物では608cpmと極めて高い活性が得られた。なお、電気泳動には12%ポリアクリルアミドゲルを用い、染色には和光純薬製のクイックCBB（クーマシーブリリアントブルー）を使用した。
【００３４】
これらの分画をNAP-10カラムにより脱塩、及びB液（10mM  KH2PO4（pH6.8）,０．０１%  TX-100,１mM  DTT）に交換し、予めB液で平衡化しておいたハイドロキシアパタイトカラム（ベッドボリューム1ml）に注入し、B液250lで4回洗浄した。そしてリニアーグラジエントによりB液のKH2PO4濃度を10mMから100mMへ上昇させることにより溶出された分画を1mlずつ分取した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、KH2PO4濃度が90mM前後で溶出された分画において高い活性が得られたため3つの分画を選んだ。図５に示すように、KH2PO4濃度が90mM前後で溶出された分画において、矢印→で示す42kDa付近のバンドをポリグリシレースと判断した。この電気泳動では10.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、染色は第一化学薬品(株)の銀染色キットを使用した。
選んだ分画を予めC液（100mM  KH2PO4（pH6.8）,０．０１%  TX-100,１mM  DTT）で平衡化しておいたブルーセファロースカラム（ベッドボリューム300l）に注入し、リニアーグラジエントによりC液に1M  NaCl溶液を加えていくことにより溶出された分画を500lずつ分取した。これらの溶出された分画についてポリグリシレース活性を測定したところ、図６に示すように、電気泳動したゲル上の矢印→で示される0.3M  NaCl前後で溶出された分画で高いポリグリシレース活性が得られたため2つの分画を選んだ。
選んだ分画を1つにまとめアセトン沈殿、そして引き続きTCA沈殿を行い、作製した10.5%ポリアクリルアミドゲルのウェルに注入し、SDS-PAGE電気泳動を行い、銀染色した。その結果42kDa付近にバンドが得られた。
【００３５】
該バンドを切り出し、プロテアーゼ消化を行い、切断されたポリペプチドをHPLCにより分離・分取し、プロテインシークエンサーにより分析した。検出されたポリペプチド断片のアミノ酸配列は下記の通りであった。
(1) YSLEPVAVELK          （配列番号：５）
(2) LGDVYVNDAFGT         （配列番号：６）
(3) DVLFK                （配列番号：７）
これらのアミノ酸配列を、データベース(NCBI)で検索した結果、ホスホグリセレートカイネース（PGK）であることが判明した。PGKは生体内全体に多く発現しているPGK1と精子に特異的に発現しているPGK2が存在するが、今回はブタの脳を用いていることからPGK1であると判断した。すなわち、これまでホスホグリセレートカイネース１（PGK1）が、同時に、翻訳後修飾において、細胞微小管のチューブリンに特異的にポリグリシンを付加する酵素であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によりポリグリシレースの活性測定法を確立したことで、チューブリンC末端側に存在するグルタミン酸へのグリシン付加を行う現象であるポリグリシン付加反応を検出することが可能となった。該チューブリンは細胞内で分子を輸送するモータータンパク質に対する、いわばレール的な働きをするタンパク質である。したがって、該ポリグリシン付加反応は、そのモータータンパク質の方向性を決定するものと考えられる。
該ポリグリシンの活性測定法を確立したことから、今後、ポリグリシレースの活性を制御する薬剤などの開発に利用することが可能となった。これにより細胞内における分子輸送の方向性の制御が可能となる。
例えば、現在、死亡原因の上位にあるガン治療に有用である。ガン治療に用いられている薬剤の多くはガン細胞だけを攻撃するのではなく、全身を攻撃するものであり、その中でガン細胞に特異的に攻撃する薬剤は今のところわずかである。今回確立したポリグリシレースの活性測定法を用いて、ポリグリシン付加反応を制御する薬剤がガン細胞を特異的に攻撃することができれば、ガンの治療に関して大変有用である。
このように、本発明は、癌を含む細胞増殖制御物質を検索する上で、すなわち創薬において、極めて重要な標的ポリペプチド、及びスクリーニング方法を提供するものである。
【００３７】
(配列番号の示す配列の説明）
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
(配列番号１)  本発明のヒトチューブリンをコードするヌクレオチド配列を示す。該配列は、NCBI  Accession  No．NM_000291(Version  NM_000291.2)のヒトPGK１(Phosphoglycerate  kinase１)のヌクレオチド配列に対応する。
(配列番号２)  本発明のヒトチューブリンのアミノ酸配列を示す。該配列は、NCBI  Accession  No．NM_000291(Version  NM_000291.2)のヒトPGK１(Phosphoglycerate  kinase１)のアミノ酸配列に対応する。
(配列番号３)  本発明のマウスチューブリンをコードするヌクレオチド配列を示す。該配列は、NCBI  Accession  No．NM_008828(Version  NM_000291.1)のマウスPGK１(Phosphoglycerate  kinase１)のヌクレオチド配列に対応する。
(配列番号４)  本発明のマウスヒトチューブリンのアミノ酸配列を示す。該配列は、NCBI  Accession  No．NM_008828(Version  NM_000291.1)のマウスPGK１(Phosphoglycerate  kinase１)のアミノ酸配列に対応する。
(配列番号５)  実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(1)のアミノ酸配列である。
(配列番号６)  実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(2)のアミノ酸配列である。
(配列番号７)  実施例２−３で得られた、ブタ由来チューブリンのポリペプチドフラグメント(3)のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、本発明のポリグリシン付加酵素の活性測定方法の工程を示す。
【図２】図２は、実施例２−２で、より精製されたP4画分における、ポリグリシン付加酵素の比活性を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例２−３で得たブタ由来チューブリン粗精製物P4について、1.0M NaCl溶液により溶出し、その分画を電気泳動したゲルの像であり、50kDa付近にチューブリンの濃いバンドが見られる。
【図４】図４は、実施例２−３における、0.3M NaCl、及び1.0M NaClのそれぞれの濃度における抽出物の電気泳動の結果、及びそれぞれのバンドの抽出物が示したポリグリシレース活性を示す。
【図５】図５の下のグラフは、実施例２−３において、KH2PO4濃度が90mM前後で溶出された分画において高い活性が得られることを示し、また電気泳動したゲルで矢印→で示す42kDa付近のバンドがポリグリシレース示す。
【図６】図６は、電気泳動したゲル上の矢印→で示される0.3M NaCl前後で溶出された分画が、高いポリグリシレース活性を有することを示す。
【図１】
2005198530.tif 000003
【図２】
2005198530.tif 000004
【図３】
2005198530.tif 000005
【図４】
2005198530.tif 000006
【図５】
2005198530.tif 000007
【図６】
2005198530.tif 000008
【配列表】
2005198530000001.app