(57)【要約】【課題】  ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの製造のための酵素法の利点を改善する。【解決手段】  以下の工程：  (ａ)トリグリセリドを生成させるための、固定化酵素の存在下および真空下での、ポリ不飽和脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステルとグリセリンとの反応を、・弱塩基性塩、錯生成剤およびイオン交換体からなる群からの添加剤の添加、および／または、・弱塩基性塩の添加、および／または、・溶媒またはガスの形態の共留剤の添加、および／または、・グリセリン結合性吸着剤の添加、および／または、・部分グリセリド中間生成物の熱処理、によって促進する工程；  (ｂ)固定化酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および  (ｃ)残存する脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステルを、蒸留、精製または抽出によってトリグリセリドから除去する工程；を含んでなる方法によって上記課題が解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素触媒製造のための方法であって、以下の工程：
(ａ)トリグリセリドを生成させるための、酵素の存在下および真空下での、ポリ不飽和脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステルとグリセリンとの反応を、
(i)弱塩基性塩、錯生成剤および塩基性イオン交換体からなる群からの添加剤の添加、および／または、
(ii)溶媒またはガスの形態の共留剤の添加、および／または、
(iii)グリセリン結合性吸着剤の添加、および／または、
(iv)部分グリセリド中間生成物の熱処理、
によって促進する工程；
(ｂ)酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および
(ｃ)残存する脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステルを、蒸留、精製または抽出によってトリグリセリドから除去する工程；
を含んでなる方法。
【請求項２】
ポリ不飽和脂肪酸および／またはそのアルキルエステルを、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、γ-リノレン酸、リノール酸および共役リノール酸からなる群から選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
担体上に固定化したリパーゼ、ホスホリパーゼまたはエステラーゼを酵素として使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
反応を、少なくとも２００ｍバールの真空中で行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
反応を、弱塩基性イオン交換体、錯生成剤の塩、弱酸の塩および酸性イオン交換体の塩からなる群から選択される添加剤、好ましくは炭酸、クエン酸、酢酸およびリン酸のナトリウムおよびカリウム塩の添加によって促進することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
塩を、脂肪酸またはそのアルキルエステルの重量を基準に、０.００１〜５重量％の量で使用することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
水または短鎖アルコールとの共沸混合物を形成する溶媒を共留剤として使用することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
窒素を共留剤として使用することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
親水性ポリマーまたはシリカゲルをグリセリン結合性吸着剤として使用することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
部分グリセリド中間生成物の熱処理を８０〜１６０℃で行うことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは脂肪酸エステルに、より具体的には、促進された反応によって区別されるポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素合成のための新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ不飽和脂肪酸のエステルは、化学法および酵素法の両方によって製造することができる。化学合成は、通常は非常に高い温度を使用しなければならず、また大量の塩基性触媒が必要になるため、二次生成物および望ましくない異性化がかなり多く生じるという欠点を有する。ポリ不飽和脂肪酸のグリセリンエステルの化学合成において反応温度を低下させる１つの方法が、特許文献１に開示されている。弱酸の塩と強塩基からなる混合触媒を有機Ｃ２-２６酸の石鹸と共に使用することにより、反応温度を、１７５℃以下、好ましくは１００〜１４０℃に低下させている。しかし、一般にリパーゼを用いる酵素触媒反応は、さらにより穏やかな条件下で起こり、高純度の最終生成物を与える。
【０００３】
特許文献２および特許文献３は、グリセリンおよび遊離の共役リノール酸(ＣＬＡ)を、０.０１〜０.５トルの真空中、６５℃で固定化リパーゼと反応させて、ＣＬＡトリグリセリドを生成させる合成を記載している。同様に、特許文献４によれば、グリセリンおよび遊離ＣＬＡを、減圧下に７０℃でリパーゼと反応させている。
【０００４】
特許文献５は、ポリ不飽和共役脂肪酸のトリグリセリドを該不飽和脂肪酸のアルキルエステルおよびグリセリンから製造するためのリパーゼ触媒法であって、生成したアルコールを減圧下に反応から除去する方法を記載している。さらに、特許文献６は、生成した反応水またはアルコールを減圧下に除去することによって、グリセリンおよび遊離のポリ不飽和脂肪酸またはそのアルキルエステルをエステル化して、対応するトリグリセリドを生成させることを記載している。
【０００５】
しかし、酵素による合成は、反応が比較的遅いという欠点を有していることが多い。
【０００６】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１３５４９３４号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０９５０４１０号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／７８５３１号パンフレット
【特許文献４】欧州特許出願公開第１１７４４１６号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第１３２２７７６号明細書
【特許文献６】国際公開第９１／１６４４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明が解決しようとする課題は、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの製造のための酵素法の利点を改善することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素触媒製造のための方法であって、以下の工程：
(ａ)トリグリセリドを生成させるための、酵素の存在下および真空下での、ポリ不飽和脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステルとグリセリンとの反応を、
・弱塩基性塩、錯生成剤および塩基性イオン交換体からなる群からの添加剤の添加、および／または、
・部分グリセリド中間生成物の熱処理、
によって促進する工程；
(ｂ)酵素を、分離または濾過によってトリグリセリドから除去する工程；および
(ｃ)残存する脂肪酸および／またはそのエステルを、蒸留、精製または抽出によってトリグリセリドから除去する工程；
を含んでなる方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
驚くべきことに、トリグリセリドを生成させるためのポリ不飽和脂肪酸および／またはそのエステルとグリセリンとの反応を、真空中、添加剤、共留剤またはグリセリン結合性吸着剤の追加の存在下での合成によって、または合成中に中間生成物として生成する部分グリセリドの熱処理によって、有意に促進しうることがわかった。真空に加えて使用する助剤は、反応時間の有意の短縮を導く。ポリ不飽和脂肪酸のトリグリセリドの化学合成と比較して、反応をさらに低い温度で行うことができ、これが望ましくない二次生成物(例えば、望ましくない異性体など)の減少を導く。この酵素法の反応速度は、通常は極めて遅い。しかし、本発明の方法は、反応時間の短縮を導き、こうして酵素法を有利な方法にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本方法は、天然のポリ不飽和およびポリ共役不飽和脂肪酸ならびに共役リノールおよびリノレン酸からなる群から選択される、１つ以上の二重結合を含む直鎖の不飽和脂肪酸および／またはそのＣ１-４アルキルエステル(好ましくはメチルおよび／またはエチルエステル)に適用することができる。ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、γ-リノレン酸および共役リノール酸を使用するのが好ましく、共役リノール酸(ＣＬＡ)のｃ９,ｔ１１およびｔ１０,ｃ１２異性体ならびにそのエステルが特に好ましい。使用する原料に対して選択される濃度範囲は、１モルのグリセリンに対して３〜６モルの脂肪酸またはエステルであり、好ましくは１モルのグリセリンに対して３.２〜４.０モルの脂肪酸またはエステルを使用して最適の反応速度を達成する。
【００１１】
適する酵素の代表例(これらは、いかなる意味においても本発明の限定を意図するものではない)は、Alcaligenes、Aspergillus、Candida、Chromobacterium、Rhizomucor、Penicilium、Pseudomonas、Rhizopus、Thermomyces、Geotrichum、Mucor、Burkholderiaおよびこれらの混合物からなる群から選択される微生物のリパーゼ、ホスホリパーゼおよび／またはエステラーゼである。微生物 Candida、RhizomucorおよびRhizopusに由来するリパーゼおよびエステラーゼが好ましいが、これはこれらが特に活性であるためである。Candida antarctica BおよびRhizomucor mieheiが特に好ましい。選択したリパーゼ、ホスホリパーゼまたはエステラーゼを、担体上に固定して使用するのが好ましい。担体物質上に固定化したリパーゼが特に適しており、より具体的には、油脂含量(％)を基準に３〜１２重量％の固定体が適している。
【００１２】
反応に適する温度範囲は、酵素の最適活性によって決定される。４０〜９０℃の範囲の温度が、好ましく選択したリパーゼに特に適することがわかった。５５〜８０℃の範囲の温度が好ましい。少なくとも２００ｍバール、好ましくは１〜１００ｍバール、より好ましくは２０〜６０ｍバールの真空を適用すべきである。好ましい方法パラメーターは、反応速度において達成すべき促進によって決定される。
【００１３】
ここに驚くべきことに、ある種の添加剤(例えば、弱塩基性イオン交換体、錯生成剤の塩、弱酸の塩および酸性イオン交換体の塩)の添加によって、反応を有意に促進しうることがわかった。炭酸、クエン酸、酢酸およびリン酸のナトリウムおよびカリウム塩(特に炭酸ナトリウム)が、この目的に特に適することがわかった。全ての添加剤を、反応の開始時に、少量の水中の溶液または懸濁液の形態で反応混合物に添加する。イオン交換体は、予備懸濁することなく添加してよい。反応は、脂肪酸またはアルキルエステル成分の重量を基準に０.０１〜５重量％の添加剤の濃度範囲において、最適に起こる。塩の場合には、好ましい範囲は０.０５〜２重量％であるが、特に好ましい範囲は０.０１〜１重量％である。
【００１４】
また、共留剤(例えば、ガスまたは溶媒)を用いて反応を促進する。不活性ガスまたは溶媒(水または短鎖アルコールとの共沸混合物を形成する)が特に適している。特に窒素が最適の反応条件を導くことがわかった。全ての共留剤を、反応混合物に連続的に添加し、真空下に同じ速度でそれから除去する。共留剤の使用を添加剤の使用と組合せると、例えば弱塩基性塩(例えば炭酸ナトリウム)を共留剤としての窒素と組合せると、相乗効果を観察することができ、反応速度および収率の点で最適化された反応を達成することができる。従って、これら２つの方法を、ポリ不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドの酵素触媒製造において使用するのが好ましい。
【００１５】
グリセリン結合性吸着剤の添加によって、反応平衡に影響を与えることもできる(これも反応の促進を導く)。親水性ポリマー(例えばシリカゲル粉末など)が、この目的に適することがわかった。
【００１６】
さらに、驚くべきことに、反応中に中間生成物として生成する部分グリセリドの熱処理が別の反応促進手段であることがわかった。この目的のために、濾過によって固定化酵素を除去した後に、部分グリセリドを８０〜１６０℃の温度、好ましくは９０〜１２０℃の温度に加熱する。
【００１７】
反応後に、固定化酵素を分離または濾過によって除去し、未反応の脂肪酸またはそのアルキルエステルを精製または蒸留(好ましくは短路蒸留)によって除去する。
【実施例】
【００１８】
共役リノール酸のトリグリセリドの製造
実施例１：トリグリセリド合成のためのリパーゼのスクリーニング
種々のリパーゼ(表１を参照、バッチ１〜９)を、９個のボトルにおいて固定した。この目的のために、等量の酵素調製物および吸着剤樹脂 Amberlite XAD 16(Rohm & Haas)を、１０倍量の水中において３０℃で一晩振盪した。次いで、固定化した酵素を濾過し、濾紙上で一晩乾燥した。
１２個のボトルにおいて、種々の固定化リパーゼ(表１のバッチ１〜１２を参照；バッチ１〜９はAmberlite上に固定化したリパーゼであり、バッチ１０〜１２は製造元により製造されたリパーゼ固定体である)を、そのグリセリド合成能力について試験した。この目的のために、ＣＬＡ脂肪酸(０.７５ｇ)、グリセリン(０.０７ｇ)、ｔ-ブタノール(２.５ｇ)、モレキュラーシーブ(０.５ｇ)およびそれぞれの固定化リパーゼ(０.１５ｇ)を秤量して入れた。密閉したボトルを、２００ｒｐｍに設定した振盪器において、４５℃で４８時間インキュベートした。生成したグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって分析し、ピーク面積によって評価した。
【００１９】
同じ組成を用いて同様の試験を、６０℃で行った。１２個の密閉したボトルを、２００ｒｐｍに設定した振盪器において、６０℃で４８時間インキュベートした。
生成したグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって分析し、ピーク面積によって評価した。
さらに、撹拌バッチを、ｔ-ブタノールを使用することなく調製した。この目的のために、ＣＬＡ脂肪酸(０.７５ｇ)、グリセリン(０.０７ｇ)、モレキュラーシーブ(０.５ｇ)および固定化リパーゼ(０.１５ｇ)を、１２個のボトルに秤量して入れた。密閉したボトルを、磁気撹拌ロッドで撹拌しながら、４０℃で４８時間固定化した。生成したグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって分析し、ピーク面積によって評価した。
【００２０】
結果
結果を、達成される最大グリセリド含量として表した。分析は、２４時間後および４８時間後に行った。
Ａ：４５℃で振盪してインキュベート
Ｂ：６０℃で振盪してインキュベート
Ｃ：４０℃で振盪してインキュベート
【表１】
2005287510.tif 000002
多くのリパーゼは、選択した反応条件下でグリセリドを生成させることができる。リパーゼの合成性能の相違は、酵素調製物の単位活性の相違にも起因することができる。Novozym 435が、所望の反応のための好ましい酵素であることがわかった。
【００２１】
実施例２：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応に対する塩基性塩の影響
グリセリン(２.５ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(２７.５ｇ)を、１：３.６のモル比で８個のフラスコに秤量して入れた。同量の水中に懸濁させた０.３３重量％の種々の塩(下記の表を参照)を、各バッチに添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ[Novozymes(デンマーク)からのリパーゼ](１.２５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。１７時間後に、油相の試料を取り、反応したＣＬＡ脂肪酸の含量を、酸価の測定によって決定した。出発の酸価は１８１であった。
【００２２】
結果
【表２】
2005287510.tif 000003
これらの結果は、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムが、遊離酸からのＣＬＡトリグリセリドの合成を明らかに促進し、最良の結果が炭酸ナトリウムを用いて達成されることを示す。
【００２３】
実施例３：添加した炭酸ナトリウムの濃度への反応速度の依存
グリセリン(９ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(１００ｇ)を、１：３.７のモル比で３個のフラスコに秤量して入れた。同量の水に懸濁させた０.１％の炭酸ナトリウムをバッチ２に添加し、同量の水に懸濁させた１％の炭酸ナトリウムをバッチ３に添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(７ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。油相の試料を２４および４８時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００２４】
結果
【表３】
2005287510.tif 000004
炭酸ナトリウムは、特に０.１〜１.０重量％の濃度範囲で、反応促進作用を有する。
【００２５】
実施例４：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応に対する錯生成剤の影響
グリセリン(５ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(５５ｇ)を、１：３.６のモル比で５個のフラスコに秤量して入れた。同量の水に懸濁させた０.４２重量％の種々の錯生成剤(下記の表を参照)を、各バッチに添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(２.５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。油相の試料を１７時間後に取り、反応したＣＬＡ脂肪酸の含量を、酸価の測定によって決定した。出発の酸価は１８１であった。
【００２６】
結果
【表４】
2005287510.tif 000005
完全に塩の形態で存在する錯生成剤は、特に、遊離酸からのＣＬＡトリグリセリドの合成を促進する。
【００２７】
実施例５：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応に対するイオン交換体の影響
グリセリン(５ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(５５ｇ)を、１：３.６のモル比で８個のフラスコに秤量して入れた。３.３重量％の種々のイオン交換体(下記の表を参照)を各バッチに添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(２.５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。油相の試料を２５時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００２８】
結果
【表５】
2005287510.tif 000006
これらの結果は、弱塩基性イオン交換体および酸性または錯生成樹脂(その塩の形態にある)は、遊離酸からのＣＬＡトリグリセリドの合成を促進することを示す。対照的に、酸性イオン交換体はトリグリセリド合成を抑制する。
【００２９】
実施例６：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応に対する窒素ガスシールの影響
グリセリン(１０.９ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(１００ｇ)を、１：３.０のモル比で２個のフラスコに秤量して入れた。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。１つのバッチは、連続的に窒素ガスシールした。油相の試料を２４、７２および９６時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。さらに、酸価を上記した時間に測定した。出発の酸価は１７９であった。
【００３０】
結果
【表６】
2005287510.tif 000007
窒素ガスシールは、遊離脂肪酸からのトリグリセリドの合成における反応速度を、特に反応の後半において増大させる。
【００３１】
実施例７：ＣＬＡ遊離酸の反応に対する窒素ガスシールおよび塩基性添加剤の相乗効果
グリセリン(５ｇ)およびＣＬＡ脂肪酸(５５ｇ)を、１：３.６のモル比で４個のフラスコに秤量して入れた。同量の水に懸濁させた０.３６重量％の酢酸ナトリウムを、バッチ３および４に添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(３.０ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、６０ｍバールの真空を適用した。バッチ２および４は、連続的に窒素ガスシールした。油相の試料を２４時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。
【００３２】
結果
【表７】
2005287510.tif 000008
これらの結果も、窒素ガスシールが、遊離脂肪酸からのトリグリセリドの合成における反応速度を有意に増大させることを示す。塩基性添加剤および窒素ガスシールは相乗効果を与える。真空の適用に加えて窒素ガスシールを行ったときの効果は、塩基性添加剤の存在下に大きくなる。
【００３３】
実施例８：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応に対する、共留剤としての溶媒２-メチル-２-ブタノールの影響
グリセリン(４ｇ)およびＣＬＡ遊離酸(５０ｇ)を、１：４.１のモル比で２個のフラスコに秤量して入れた。Novozym 435(３ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、６０ｍバールの真空を適用した。２-メチル-２-ブタノールを、１つのバッチに０.０５ｍｌ／分の流速で連続的に導入し、真空の適用下にこのバッチから蒸発させた。油相の試料を１８時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００３４】
結果
【表８】
2005287510.tif 000009
共留剤としての２-メチル-２-ブタノールの使用は、ＣＬＡ遊離酸からのトリグリセリドの合成における反応速度を増大させる。
【００３５】
実施例９：炭酸ナトリウムの存在下でのＣＬＡエチルエステルとグリセリンとの反応に対する窒素ガスシールの影響
グリセリン(５ｇ)およびＣＬＡエチルエステル(６０ｇ)を、１：３.６のモル比で２個のフラスコに秤量して入れた。同量の水に懸濁させた０.１５重量％の炭酸ナトリウム(下記の表を参照)を各バッチに添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(２.５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。１つのバッチは、連続的に窒素ガスシールした。油相の試料を１６、４０および６３時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００３６】
結果
【表９】
2005287510.tif 000010
窒素ガスシールは、反応の全過程にわたり、ＣＬＡエチルエステルからのトリグリセリドの合成における反応速度を増大させる。共留剤 窒素なしでは、反応は極めて遅い。
【００３７】
実施例１０：ＣＬＡメチルエステルとグリセリンとの反応に対するシクロヘキサン添加の影響
グリセリン(１１ｇ)およびＣＬＡメチルエステル(１２０ｇ)を、１：３.６のモル比で２個のフラスコに秤量して入れた。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(６ｇ)を添加した後、バッチ１においては５０℃の内部温度およびバッチ２においては５５〜６０℃の内部温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、１２０ｍバールの真空を適用した。シクロヘキサンを、両バッチに０.１ｍｌ／分の流速で連続的に加えた。油相の試料を２０、４８および７２時間後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００３８】
結果
【表１０】
2005287510.tif 000011
シクロヘキサンの添加は、ＣＬＡトリグリセリドの生成を促進する。さらに、内部温度を５０℃から５５〜６０℃に高めると、トリグリセリドの生成が改善される。
【００３９】
実施例１１：ＣＬＡトリグリセリドの合成中の部分グリセリド中間生成物の熱処理による反応促進
グリセリン(２５ｇ)およびＣＬＡメチルエステル(２７５ｇ)を、１：３.４のモル比でフラスコに秤量して入れた。次いで、同量の水に懸濁させた０.３３％の炭酸ナトリウムを添加した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(１２.５ｇ)を添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。５時間の反応時間の後に、固定化酵素を濾過によって除去した。このバッチのグリセリド分布をガスクロマトグラフィーによって分析し、次いで４×５０ｇバッチに分割した。５時間の反応時間の後に、ＣＬＡトリグリセリドは生成せず、ジグリセリドの含量(％)は、全グリセリド含量を基準に９２％であった。第１のバッチは処理しなかった。第２のバッチは、１２０℃に３０分間加熱した。第３のバッチは、２重量％のLewatit S 100を添加した後、８０℃に３０分間加熱した。第４のバッチは、０.２重量％の塩化鉄(II)を添加した後、８０℃に３０分間加熱した。加熱の後、Lewatitおよび塩化鉄を、濾過によってバッチ３および４から除去した。固定化 Candida antarctica B リパーゼ(３ｇ)を各バッチに添加し、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。１６時間後に油相の試料を取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。
【００４０】
結果
【表１１】
2005287510.tif 000012
生成したジグリセリドの中間処理により、ＣＬＡトリグリセリドが、より早く合成される結果になる。この中間処理は、恐らくは、主に生成する１,３-ジグリセリドから、より早い速度で酵素によりエステル化しうる１,２-ジグリセリドへの、アシル移動を触媒するのであろう。
【００４１】
実施例１２：グリセリンの存在下での低含水リパーゼ触媒反応におけるシリカゲル粉末の酵素安定化特性
Candida antarctica B リパーゼに対する安定化作用を、４８日間にわたるヒマワリ油から対応するモノグリセリドへのグリセリン分解を参考にして説明する。この目的のために、２個のボトルに、ヒマワリ油(１０ｇ)、グリセリン(６ｇ)およびｔ-ブタノール(７.５ｇ)を入れた。さらに、シリカゲル粉末(２ｇ)をバッチ２に添加した。固定化 Candida B リパーゼ(１.５ｇ)を添加した後、これらバッチを、振盪器において４５℃でインキュベートした。２４時間後に試料を取り、そのグリセリド分布を分析した。４８日間にわたり、これら２つのバッチについて８回の再使用を行った(濾過によってバッチの残りから固定体を取り出し、次のバッチに再添加した)。４８日後に、２４時間後の第８のバッチから試料を取り、そのグリセリド分布を分析した。結果を、モノグリセリドのジおよびトリグリセリドに対する比として表した。
【００４２】
【表１２】
2005287510.tif 000013
シリカゲル粉末の添加は、グリセリン過剰の存在下の低含水媒体において、Candida antarctica B リパーゼを安定化する。
他の試験は、特にグリセリン濃度がリパーゼの失活に影響を有することを示した。シリカゲルはグリセリンを吸着することができ、これにより、液相中のグリセリン濃度を低下させる。
【００４３】
実施例１３：ＣＬＡ遊離酸とグリセリンとの反応および精製による生成物の後処理
グリセリン(２１.８ｇ)およびＣＬＡ遊離酸(２１０ｇ)を、１：３.１６のモル比で２個のフラスコに秤量して入れた。Lipozym RM １M(１５ｇ)をバッチ１に、そして固定化 Candida antarctica B リパーゼ(１５ｇ)をバッチ２に添加した後、６０℃の温度で磁気撹拌フィッシュを用いて撹拌しながら、２０ｍバールの真空を適用した。これらのバッチを、連続的に窒素でパージした。バッチ１の合成を９６時間後に終了させ、バッチ２の合成を９２時間後に終了させ、固定化酵素を濾過によって除去した。これら２つのバッチをケイ酸ナトリウムで精製した。この目的のために、２重量％のケイ酸ナトリウムをこれらバッチに添加し、次いで６０℃で１時間撹拌した。次いで、この懸濁液を濾紙で濾過した。油相の試料を、精製の前後に取り、生成したＣＬＡグリセリドの含量を、ガスクロマトグラフィーによって測定した。結果を、生成したジおよびトリグリセリドの合計を基準に、トリグリセリド含量(％)として表した。別の試料を、精製の前後に取り、その酸価を分析した。
【００４４】
【表１３】
2005287510.tif 000014
ＣＬＡトリグリセリド中の遊離ＣＬＡ脂肪酸の含量を、ＣＬＡトリグリセリドの分解なしに精製によって減少させることができる。
【００４５】
実施例１４：ＣＬＡメチルエステルとグリセリンとの反応ならびに蒸留による生成物の後処理
使用した原料：
グリセリン(９９.９％)：２.９ｋｇ
ＣＬＡメチルエステル：３４.５ｋｇ
酵素 (Novozym 435)：１.３ｋｇ
装置：
ヒーター、温度コントロール、コントロールおよびポンプを含む真空接続を備えた６０Ｌの撹拌容器。
使用原料を、撹拌容器に撹拌しながら導入し、反応を開始させた(反応条件：６０℃内部温度、５０ｍバール真空)。４８時間の反応時間後に、４７.９％のトリグリセリドが反応混合物中に生成し、これを短路蒸留によって精製した。
条件：
短路蒸留、１工程：
温度、供給：８０℃
温度、蒸発器：１９０℃
温度、冷却フィンガー：４０℃
流量：２００ｍｌ／時
真空：＜０.５ｍバール
７３.９％のトリグリセリドが、蒸留の終了時に得られた。
【００４６】
実施例１５：ＣＬＡエチルエステルとグリセリンとの反応ならびに蒸留による生成物の後処理
使用した原料：
グリセリン(９９.９％)：２.９ｋｇ
ＣＬＡエチルエステル：３５.５ｋｇ
酵素 (NovozymesからのNovozym 435)：１.３ｋｇ
装置：
ヒーター、温度コントロール、コントロールおよびポンプを含む真空接続を備えた６０Ｌの撹拌容器。
使用原料を、撹拌容器に撹拌しながら導入し、反応を開始させた(反応条件：６０℃内部温度、５ｍバール真空)。７２時間の反応時間後に、６２.１％のトリグリセリドが反応混合物中に生成し、これを短路蒸留によって精製した。
条件：
脂肪酸の短路蒸留、１工程：
温度、供給：８０℃
温度、蒸発器：１９０℃
温度、冷却フィンガー：４０℃
流量：２００ｍｌ／時
真空：＜０.５ｍバール
７３.９％のトリグリセリドが、蒸留の終了時に得られた。