(57)【要約】  【課題】  脂肪細胞におけるクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現方法、抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質のスクリーニング方法及びキット、並びに肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法及びキットを提供する。  【解決手段】  脂肪細胞をクルクミノイド類及び／又はアントシアン類の存在下で培養して、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現を誘導又は抑制する。当該遺伝子の発現量を指標として、抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質をスクリーニングすることができる。さらに、当該遺伝子の発現量を指標として、肥満及び／又は糖尿病の改善状態を評価することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミノイド類の存在下で脂肪細胞を培養することによって脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子の発現を誘導又は抑制し、クルクミノイド類応答性遺伝子をクルクミノイド類の非存在下と比べて有意に高く又は低く発現させることを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項２】
前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現方法。
【請求項３】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項４】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子発現方法。
【請求項５】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１５表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子発現方法。
【請求項６】
前記クルクミノイド類がクルクミン又はクルクミン類縁体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の遺伝子発現方法。
【請求項７】
前記クルクミン類縁体がテトラヒドロクルクミンであることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子発現方法。
【請求項８】
アントシアン類の存在下で脂肪細胞を培養することによって脂肪細胞のアントシアン類応答性遺伝子の発現を誘導又は抑制し、アントシアン類応答性遺伝子をアントシアン類の非存在下と比較して有意に高く又は低く発現させることを特徴とする遺伝子発現方法。
【請求項９】
前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１０】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１１】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１２】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第１６表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１３】
前記アントシアン類がアントシアニン又はアントシアニジンであることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載の遺伝子発現方法。
【請求項１４】
前記アントシアニンがシアニジン−３−グルコシドであること特徴とする請求項１３に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１５】
前記アントシアニジンがシアニジンであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子発現方法。
【請求項１６】
被検物質の存在下で脂肪細胞を培養し、脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定し、当該発現量を指標として被検物質の抗肥満作用及び／又は抗糖尿病作用を評価することを特徴とする抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１７乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１７乃至１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１５表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第１６表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項１６又は２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
ＤＮＡチップを用いてクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項１６乃至２３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
被検物質が食品素材であること特徴とする請求項１６乃至２４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
生体より脂肪細胞を採取し、クルクミノイド類及び／又はアントシアン類の存在下で脂肪細胞を培養し、脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定し、当該発現量を指標として生体における肥満及び／又は糖尿病の改善状態を評価することを特徴とする肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法。
【請求項２７】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２６に記載の評価方法。
【請求項２８】
前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２６に記載の評価方法。
【請求項２９】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２６乃至２８のいずれかに記載の評価方法。
【請求項３０】
前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請求項２６乃至２８のいずれかに記載の評価方法。
【請求項３１】
請求項１６に記載のスクリーニング方法に用いるためのキットであって、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することができるＤＮＡチップを含むことを特徴とする抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質のスクリーニング用キット。
【請求項３２】
請求項２６に記載の評価方法に用いるためのキットであって、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することができるＤＮＡチップを含むことを特徴とする肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脂肪細胞における遺伝子発現方法、それを利用した物質のスクリーニング方法及びキット、並びにそれを利用した病態の評価方法及びキットに関し、さらに詳細には、脂肪細胞におけるクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現方法、それを利用した肥満及び／又は糖尿病の予防や改善に効果を有する物質のスクリーニング方法及びキット、並びにそれを利用した肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる肥満，糖尿病，動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発症、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、肥満、糖尿病、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
【０００３】
肥満は、脂肪組織が異常に増加した状態と定義されている。肥満の主な原因は、摂取カロリーと消費カロリーのアンバランスにあり、摂取カロリーが消費カロリーを上回ると、余剰カロリーが脂肪となって体内に蓄積され、やがて肥満となる。肥満は、糖尿病、心臓病、動脈硬化等の他の生活習慣病を引き起こす万病の元凶であり、現代人にとって深刻な問題である。
【０００４】
一方、糖尿病は、インスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。糖尿病は、知覚麻痺、失明、動脈硬化等との合併症を引き起こすことも多く、日常生活に多大な障害をもたらす病気である。特に、インスリン非依存型糖尿病（２型糖尿病）は、環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、逆に膵臓が疲労してインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられ、さらに肥満が進むこととなる。このように、肥満と糖尿病はその発症メカニズムにおいて密接に関係している。
【０００５】
肥満や糖尿病に効果があるといわれている食品素材は多く知られている。日常の食事からこれらの成分を摂取することにより、容易かつ継続的に肥満や糖尿病を予防又は改善することが期待できる。
【０００６】
ポリフェノールの一種であるクルクミノイド（ｃｕｒｃｕｍｉｎｏｉｄ）は、ショウガ科植物であるウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）に含まれている色素であり、香辛料ターメリックの主色素成分として知られている。クルクミノイドは、強い抗酸化作用の他、抗癌作用、抗炎症作用、抗ウイルス作用、抗真菌作用、抗コレステロール作用をもつことが知られている。さらに、クルクミノイドは肥満及び糖尿病に効果があることが知られており、クルクミノイドがもつ抗酸化作用等と肥満や糖尿病との関係が研究されている。そして、以上の作用が期待されるクルクミノイドを含有する健康食品が多数存在する。
【０００７】
クルクミノイドは複数の化合物からなり、その主要な化合物がクルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）である。また、クルクミンを経口摂取すると、クルクミンは代謝されてより抗酸化力が強いテトラヒドロクルクミン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｕｒｃｕｍｉｎ）に変換され、腸管から吸収されることが知られている。クルクミンの薬理効果を示す例として、特許文献１には、ラット及びマウスを用いた動物実験より、クルクミンの代謝物であるテトラヒドロクルクミンが血中中性脂肪の増加を抑制する効果があること見出した旨が記載されている。
【０００８】
一方、アントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）はアントシアニジン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）の配糖体であり、植物の花、果実、葉などの赤、紫、青色を呈する色素として知られている。アントシアニンは抗酸化作用を有するポリフェノールの一種であり、機能性食品素材としての研究も進んでいる。このアントシアニンやアントシアニジンも肥満や糖尿病に効果があることが知られており、それらの効果が期待されるアントシアニンやアントシアニジンを含有する健康食品が多数存在する。これらの薬理効果を示す例として、例えば、特許文献２には、ラットを用いた動物実験及び成人ヒトを用いた実験により、アントシアニジンおよびその誘導体が肥満防止及び肥満症の改善と治療に効果があることが記載されている。また、特許文献３には、マウスを使った動物実験を行い、アントシアニンの一種であるシアニジン−３−グルコシド（ｃｙａｎｉｄｉｎ  ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）が抗肥満及び／又は抗糖尿病の作用を有することを見出し、ヒト糖尿病モデルマウスで糖尿病発症を抑えられることが記載されている。さらに、特許文献３にはマウスにシアニジンー３−グルコシドを与えたときの、肝臓の脂肪酸合成酵素及びレプチンのｍＲＮＡ発現量を調べた旨が記載されている。以上のように、クルクミノイド、アントシアニン、及びアントシアニジンが肥満及び／又は糖尿病に効果があることはよく知られており、その薬理効果を調べた報告もある。
【０００９】
肥満や糖尿病におけるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の実験系としては、脂肪細胞を用いた実験系がよく用いられている。脂肪細胞は脂肪組織を構成している主な細胞であり、その内部に脂肪を含んでいる。脂肪細胞はレプチン、アディポネクチン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）等の生理活性物質を分泌し、エネルギー代謝や摂食行動の制御に重要な機能を果たしている。すでに、マウス、ラット、ヒト等由来の脂肪細胞が研究用に市販されている。
【００１０】
一方、近年のＤＮＡマイクロアレイ技術の発達によって、大量の遺伝子発現プロファイルを短時間で調べることができるようなってきた。そして、脂肪細胞における遺伝子発現をＤＮＡマイクロアレイ法で解析した例もすでにある。例えば、非特許文献１には、マウスのレプチン遺伝子に変異を導入し、レプチン欠損による肥満が脂肪組織の遺伝子発現に与える影響をＤＮＡマイクロアレイ法で調べた例が記載されている。
【特許文献１】特開２００３−２８２７号公報
【特許文献２】特開２００２−１５３２４０号公報
【特許文献３】特開２００３−２５２７６６号公報
【非特許文献１】ナドラー（Ｎａｄｌｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ）第９７巻、第１１３７１〜１１３７６頁、２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、クルクミノイド又はアントシアニン若しくはアントシアニジン存在下における脂肪細胞の遺伝子発現プロファイルを網羅的に調べた例はなく、これらによって発現が誘導又は抑制される遺伝子群は知られていない。そのような遺伝子群を見出すことができれば、それらの遺伝子群を指標として、肥満や糖尿病に効果がある他の物質を大量かつ高速にスクリーニングすることができると考えられる。さらに、それらの遺伝子群を指標にして、肥満や糖尿病の改善状態の評価に使用することができると考えられる。しかしながら、そのような遺伝子群は知られていない。
【００１２】
本発明の目的は、脂肪細胞におけるクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現方法、それを利用した肥満及び／又は糖尿病の予防や改善に効果を有する物質のスクリーニング方法及びキット、並びにそれを利用した肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ法を用いることによって脂肪細胞における遺伝子発現プロファイルを解析し、クルクミン類及び／又はアントシアン類の存在に応答して発現が誘導又は抑制される遺伝子群が存在することを見出した。また、これらの遺伝子群の発現量を指標として、抗肥満及び又は抗糖尿病に効果を有する物質をスクリーニングすることができることを見出した。さらに、これらの遺伝子群の発現量を指標として、抗肥満及び／又は抗糖尿病の改善状態を評価することができることを見出した。さらに、これらの方法を簡便に行うためのキットを構築した。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１４】
（１）クルクミノイド類の存在下で脂肪細胞を培養することによって脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子の発現を誘導又は抑制し、クルクミノイド類応答性遺伝子をクルクミノイド類の非存在下と比べて有意に高く又は低く発現させることを特徴とする遺伝子発現方法。
【００１５】
（２）前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子発現方法。
【００１６】
（３）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２）に記載の遺伝子発現方法。
【００１７】
（４）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２）に記載の遺伝子発現方法。
【００１８】
（５）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１５表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の遺伝子発現方法。
【００１９】
（６）前記クルクミノイド類がクルクミン又はクルクミン類縁体であることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれかに記載の遺伝子発現方法。
【００２０】
（７）前記クルクミン類縁体がテトラヒドロクルクミンであることを特徴とする（６）に記載の遺伝子発現方法。
【００２１】
（８）アントシアン類の存在下で脂肪細胞を培養することによって脂肪細胞のアントシアン類応答性遺伝子の発現を誘導又は抑制し、アントシアン類応答性遺伝子をアントシアン類の非存在下と比較して有意に高く又は低く発現させることを特徴とする遺伝子発現方法。
【００２２】
（９）前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする（８）に記載の遺伝子発現方法。
【００２３】
（１０）前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（９）に記載の遺伝子発現方法。
【００２４】
（１１）前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（９）に記載の遺伝子発現方法。
【００２５】
（１２）前記アントシアン類応答性遺伝子が第１６表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（８）に記載の遺伝子発現方法。
【００２６】
（１３）前記アントシアン類がアントシアニン又はアントシアニジンであることを特徴とする（８）乃至（１２）のいずれかに記載の遺伝子発現方法。
【００２７】
（１４）前記アントシアニンがシアニジン−３−グルコシドであること特徴とする（１３）に記載の遺伝子発現方法。
【００２８】
（１５）前記アントシアニジンがシアニジンであることを特徴とする（１３）に記載の遺伝子発現方法。
【００２９】
（１６）被検物質の存在下で脂肪細胞を培養し、脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定し、当該発現量を指標として被検物質の抗肥満作用及び／又は抗糖尿病作用を評価することを特徴とする抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質のスクリーニング方法。
【００３０】
（１７）前記脂肪細胞がヒト由来であることを特徴とする（１６）に記載のスクリーニング方法。
【００３１】
（１８）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１７）に記載のスクリーニング方法。
【００３２】
（１９）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１７）に記載のスクリーニング方法。
【００３３】
（２０）前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１７）乃至（１９）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００３４】
（２１）前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１７）乃至（１９）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００３５】
（２２）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１５表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１６）に記載のスクリーニング方法。
【００３６】
（２３）前記アントシアン類応答性遺伝子が第１６表又は第１７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（１６）又は（２２）に記載のスクリーニング方法。
【００３７】
（２４）ＤＮＡチップを用いてクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することを特徴とする（１６）乃至（２３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００３８】
（２５）被検物質が食品素材であること特徴とする（１６）乃至（２４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００３９】
（２６）生体より脂肪細胞を採取し、クルクミノイド類及び／又はアントシアン類の存在下で脂肪細胞を培養し、脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定し、当該発現量を指標として生体における肥満及び／又は糖尿病の改善状態を評価することを特徴とする肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法。
【００４０】
（２７）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２６）に記載の評価方法。
【００４１】
（２８）前記クルクミノイド類応答性遺伝子が第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２６）に記載の評価方法。
【００４２】
（２９）前記アントシアン類応答性遺伝子が第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２６）乃至（２８）のいずれかに記載の評価方法。
【００４３】
（３０）前記アントシアン類応答性遺伝子が第８表、第９表、第１１表又は第１２表に示される遺伝子の群から選択される１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする（２６）乃至（２８）のいずれかに記載の評価方法。
【００４４】
（３１）（１６）に記載のスクリーニング方法に用いるためのキットであって、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することができるＤＮＡチップを含むことを特徴とする抗肥満物質及び／又は抗糖尿病物質のスクリーニング用キット。
【００４５】
（３２）（２６）に記載の評価方法に用いるためのキットであって、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を測定することができるＤＮＡチップを含むことを特徴とする肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価用キット。
【発明の効果】
【００４６】
本発明によれば、脂肪細胞におけるクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現方法、それを利用した肥満及び／又は糖尿病の予防や改善に効能を有する物質のスクリーニング方法及びキット、並びにそれを利用した肥満及び／又は糖尿病の改善状態の評価方法及びキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下に、本発明を実施するための最良の形態について、詳細に説明する。
【００４８】
本発明においてクルクミノイド類とは、クルクミノイド及びその類縁体をいう。クルクミノイドの例としては、下記一般式（１）で表されるクルクミン及びその類縁体が挙げられる。より具体的には、クルクミン、デメトキシクルクミン（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）、ビスデメトキシクルクミン（ｂｉｓｄｅｍｅｔｈｏｘｙｃｕｒｃｕｍｉｎ）等が挙げられる。
【００４９】
【化１】
2005198640.tif 000002
【００５０】
また、クルクミノイドの類縁体としては、上記の特許文献１にも一部記載さ
れている下記一般式（２）で表されるテトラヒドロクルクミン及びその類縁体
が挙げられる。
【００５１】
【化２】
2005198640.tif 000003
【００５２】
前記一般式（１）及び一般式（２）におけるＲ1 〜Ｒ4 の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状アルキルであり、メチル又はエチルが特に好ましい。
【００５３】
クルクミノイド類の製造方法は特に制限はないが、例えば、クルクミン等のクルクミノイドは上記したウコンから抽出・精製することができる。また、クルクミノイド類縁体は、例えば、前記のクルクミノイドを原料に適宜の反応を加えることにより製造することができる。例えば、テトラヒドロクルクミンの製造方法としては、前記のように抽出・精製したクルクミンを原料に、化学反応、酵素反応、あるいは微生物による変換等でクルクミンを還元することによって得ることができる。
【００５４】
本発明においてアントシアン類とは、アントシアニン、アントシアニジン、及びこれらの類縁体をいう。なお、アントシアニンはアントシアニジンの配糖体であり、換言すれば、アントシアニジンがアグリコンである。本発明に使用されるアントシアン類としては、上記の特許文献２にも一部記載されている下記一般式（３）で表されるアントシアニン、アントシアニジン、及びこれらの類縁体が挙げられる。
【００５５】
【化３】
2005198640.tif 000004
【００５６】
前記一般式（３）におけるＲ1 〜Ｒ6 の低級アルコキシのアルキル部分は、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状アルキルであり、メチル又はエチルが特に好ましい。
【００５７】
アントシアニジンの具体的としては、例えば、シアニジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペチュニジンを挙げることができるが、シアニジンが代表的である。またアントシアニンの例としては、前記のアントシアニジンに１又は２以上の糖がＯ−グリコシド結合したものが挙げられる。糖の種類としては、グルコースが代表的であるが、その他にガラクトース、ラムノース、キシロース、アラビノース等が挙げられる。２以上の糖が結合している場合は、それらの糖は同一種でも別種でもよい。糖の結合部位に特に制限はないが、アントシアニジン骨格の３位（上記一般式（３）のＲ1 ）及び／又は５位（上記一般式（３）のＲ2 ）が代表的で、特に３位が代表的である。すなわち、本発明に使用されるアントシアニンの例としては、シアニジン−３−グルコシドが代表的である。
【００５８】
アントシアン類の製造方法は特に制限はないが、例えば、植物から抽出・精製することができる。植物の例としては、ブルーベリー等のベリー類、赤キャベツ、紫イモ、黒大豆等を用いることができる。植物の部位としては、果実、葉、茎、根、花、種子等を用いることができる。
【００５９】
本発明においてクルクミノイド類応答性遺伝子とは、クルクミノイド類に応答し、その発現が誘導又は抑制される遺伝子の総称である。換言すれば、クルクミノイド類の存在によってその発現量が影響を受ける遺伝子である。同様に、本発明においてアントシアン類応答性遺伝子とは、アントシアン類に応答し、その発現が誘導又は抑制される遺伝子の総称である。換言すれば、アントシアン類の存在によってその発現量が影響を受ける遺伝子である。クルクミノイド類やアントシアン類に遺伝子発現が応答する態様としては、インビトロの系では、例えば、細胞培養の際に培地中にクルクミノイド類やアントシアン類を添加することによって、培養細胞の遺伝子発現を誘導又は抑制する態様が挙げられ、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の系では、例えば、動物にクルクミノイド類やアントシアン類を経口投与することによって、生体内において遺伝子発現を誘導又は抑制する態様が挙げられる。なお、これらの遺伝子は少なくともＲＮＡに転写されるものであればよく、その種類を問わない。機能が不明の遺伝子であっても差し支えない。
【００６０】
本発明の遺伝子発現方法には、発現を誘導する態様と発現を抑制する態様とがある。すなわち、クルクミノイド類やアントシアン類に応答して発現が誘導される遺伝子の場合は、それらの非存在下に比べて有意に高く発現させることになる。逆に、クルクミノイド類やアントシアン類に応答して発現が抑制される遺伝子の場合は、それらの非存在下に比べて有意に低く発現させることになる。換言すれば、本発明の遺伝子発現方法は、クルクミノイド類やアントシアン類が存在しない状態、すなわち定常状態とクルクミノイド類やアントシアン類が存在する状態を比べた場合に、クルクミノイド類やアントシアン類が存在する状態の方が発現量が有意に高い（誘導された場合）又は有意に低い（抑制された場合）遺伝子発現方法である。
【００６１】
本発明で使用する脂肪細胞はその由来動物に特に限定はなく、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、脂肪細胞をヒトに対する抗肥満物質や抗糖尿病物質のスクリーニングや、ヒトの肥満や糖尿病の改善状態の評価をするために使用する場合は、ヒト由来の脂肪細胞を選択すればよい。また上記の目的であっても、他の動物、例えばラット、マウス等由来の脂肪細胞で代替できる場合は、それらの動物由来の脂肪細胞も選択することができ、例えば、より簡便に入手又は取り扱いができる方を選択すればよい。もちろん、その動物に対して物質のスクリーニングや評価を行う場合は、その動物由来の脂肪細胞を選択すればよい。なお、脂肪細胞は株化されたものでもよいし、生体試料から用時採取したものでもよい。研究用に市販されている脂肪細胞でもよい。生体試料から脂肪細胞を採取する場合は、内臓脂肪（腸間膜脂肪）、皮下脂肪、睾丸等から採取することができる。クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現を誘導するための脂肪細胞の培養方法については、動物細胞の培養に一般的に用いられている方法を使用することができる。培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０等の基礎培地にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清等の適宜の成分を添加したものに、クルクミノイド類及び／又はアントシアン類を添加したものを用いることができる。また、市販の脂肪細胞培養用にあらかじめ調製された培地を用いてもよい。培地に添加するクルクミノイド類又はアントシアン類の濃度としては、脂肪細胞の増殖を阻害しない範囲から選択することが好ましく、例えば終濃度５０μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは終濃度５０〜１００μＭである。なお、これらのクルクミノイド類又はアントシアン類は１成分を単独で用いてもよいし、２以上の成分を併用して用いてもよい。
【００６２】
本発明において遺伝子の発現量は、ＲＮＡへの転写又はタンパク質への翻訳における産物の量によって特定される。すなわち、転写産物であるＲＮＡ又はその翻訳産物であるタンパク質を定量することによって、発現量を測定することができる。
【００６３】
ＲＮＡの定量によって遺伝子の発現量を測定する場合の定量対象のＲＮＡとしては、ＤＮＡから直接転写された前駆体ＲＮＡ、前駆体ＲＮＡがスプライシングを受けて生成したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、あるいはリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等が挙げられるが、ｍＲＮＡが好適である。脂肪細胞からＲＮＡを抽出する方法は公知の方法が使用でき、例えば、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム法により抽出することができる。その他、市販のＲＮＡ抽出キットを使用することにより、ＲＮＡを簡便に抽出することができる。また、ＲＮＡを定量する方法としては、そのＲＮＡを特異的に定量できる方
法であれば採用可能であり、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いることができる。１から数十個程度の少数の遺伝子について発現量を調べる場合は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲあるいは定量ＰＣＲによって発現量を調べることができる。しかし、多数の遺伝子について発現プロファイルという形で調べる場合は、ＤＮＡマイクロアレイ法が特に好ましい。
【００６４】
ＤＮＡマイクロアレイ法に使用するＤＮＡチップは、スライドガラス等にのせるプローブ群がクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の転写産物（又はその同等物）に特異的にハイブリダイズして、その量を測定できるものであれば何でもよい。プローブの種類に関しては、オリゴヌクレオチドをプローブとしたオリゴヌクレオチドアレイ（いわゆるアフィメトリクス型）とｃＤＮＡをプローブとしたｃＤＮＡアレイ（いわゆるスタンフォード型）のいずれも使用することができる。オリゴヌクレオチドアレイとしては、例えば、２５ｍｅｒの各種オリゴヌクレオチドをのせた、ＧｅｎｅＣｈｉｐ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、登録商標）の各種ＤＮＡチップが使用可能である。ｃＤＮＡアレイを使用する場合は、プローブに用いるｃＤＮＡとしては、完全長ｃＤＮＡ、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）のいずれでもよく、それらはプラスミドに挿入した状態でもよいし、ＰＣＲ等で増幅した断片であってもよい。また本発明においては、使用する脂肪細胞の由来に適したプローブをのせたＤＮＡチップを用いることがより好ましい。例えば、オリゴヌクレオチドアレイであれば、ヒトの脂肪細胞の発現プロファイルを調べるときは、上記したＧｅｎｅＣｈｉｐのＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  Ａｒｒａｙ、あるいはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｒｒａｙ等を用いることができる。同様に、ラットの脂肪細胞の発現プロファイルを調べるときは、上記したＧｅｎｅＣｈｉｐのＲａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ３４Ａ  ＡｒｒａｙやＲａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  ２３０Ａ、マウスの脂肪細胞であればＭｏｕｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  ４３０を用いることができる。またｃＤＮＡアレイであれば、使用する脂肪細胞と同じ由来の生物の臓器・組織から調製されたｃＤＮＡをのせたＤＮＡチップを使用することができる。なお、本発明においては糸状ＤＮＡチップのようなチップ形状ではない発展型のＤＮＡチップも使用可能である。
【００６５】
ＤＮＡマイクロアレイ法にて各遺伝子の転写産物（又はその同等物）を定量する場合は、脂肪細胞から抽出した全ＲＮＡから定量に直接供される標識した核酸サンプルを調製する必要がある。さらにその標識は蛍光標識が好ましい。核酸サンプルの種類としては、例えば、抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを用いることができる。具体的には、例えばｃＤＮＡの場合は、オリゴｄＴプライマーと蛍光標識したデオキシリボヌクレオチドを用いた逆転写反応にて蛍光標識化ｃＤＮＡを得ることができる。また、ｃＲＮＡの場合は、例えば、オリゴｄＴプライマーとデオキシリボヌクレオチドを用いてｃＤＮＡを合成して、さらにそれを鋳型として蛍光標識したリボヌクレオチドを取り込ませて蛍光標識化ｃＲＮＡを得ることができる。あるいは、ビオチンで標識したｃＲＮＡを合成した後に蛍光標識したストレプトアビジンを反応させて、蛍光標識化ｃＲＮＡを得ることもできる。標識に用いる蛍光物質の種類としては、フィコエリシン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５等が挙げられる。
【００６６】
ＤＮＡチップと上記の標識した核酸サンプルとをハイブリダイズさせる条件としては、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子由来の核酸サンプルが特異的にハイブリダイズする条件であればよく、例えば、１００ｍＭ  ＭＥＳ，１Ｍ  ナトリウム塩，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０中、４５℃にて１６時間、の条件が挙げられる。
【００６７】
また、ＲＮＡの定量方法としてノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ等を用いる場合は、それらに使用するプローブやプライマーは、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズ又は当該遺伝子の転写産物を特異的に増幅できるものであれば何でもよい。適宜の方法で標識されたプローブ又はプライマーを用いることで、ＲＮＡを定量することができる。
【００６８】
一方、タンパク質の定量によって遺伝子の発現量を測定する場合は、まず、脂肪細胞からタンパク質を抽出する。タンパク質を抽出する方法は公知の方法が使用でき、例えば、回収した脂肪細胞を低張処理あるいは機械的処理等によって破砕し、細胞内の全タンパク質を得ることができる。得られたタンパク質は必要に応じて粗精製等の前処理を行ってもよい。タンパク質を定量する方法としては、各々のタンパク質を特異的に定量できる方法であればよく、例えば免疫測定法、ウエスタンブロッティング等を用いることができる。免疫測定法の例としては、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオレセインイムノアッセイ（ＦＩＡ）等が挙げられる。
【００６９】
第１表から第１４表に、ヒト由来のクルクミノイド類応答性遺伝子及びアントシアン類応答性遺伝子の例を示す。表中の登録番号は、アフィメトリクス社が付与したアクセッション（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号である。アクセッション番号を特定することにより同社のデータベースからその塩基配列を照会することができる。また、表中の「遺伝子名」は、各登録番号の遺伝子名、コードするタンパク質名、又は遺伝子の機能（推定されるものも含む）を表している。表中の最左欄は通し番号である。
【００７０】
第１表から第７表に示される遺伝子は、クルクミノイド類又はアントシアン類によって発現が誘導される遺伝子群であり、第８表から第１４表に示される遺伝子は、クルクミノイド類又はアントシアン類によって発現が抑制される遺伝子群である。より詳細には、第１表、第３表、第６表又は第７表に示される遺伝子が、クルクミノイド類によって発現が誘導されるヒト由来のクルクミノイド類応答性遺伝子の例である。また、第１表、第２表、第４表又は第５表に示される遺伝子が、アントシアン類によって発現が誘導されるヒト由来のアントシアン類応答性遺伝子の例である。また、第８表、第１０表、第１３表又は第１４表に示される遺伝子が、クルクミノイド類によって発現が抑制されるヒト由来のクルクミノイド類応答性遺伝子の例である。また、第８表、第９表、第１１表又は第１２表が、アントシアン類によって発現が抑制されるヒト由来のアントシアン類応答性遺伝子の例である。
【００７１】
また、第１５表から第１７表にラット由来のクルクミノイド類応答性遺伝子及びアントシアン類応答性遺伝子の例を示す。表中の登録番号は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ）所管の核酸データベースであるＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号である。アクセッション番号を特定することによりＧｅｎＢａｎｋからその塩基配列を照会することができる。また、表中の「遺伝子名」は、各登録番号の遺伝子名、コードするタンパク質名、又は遺伝子の機能（推定されるものも含む）を表している。表中の最左欄は通し番号である。
【００７２】
第１５表又は第１７表に示される遺伝子が、クルクミノイド類によって発現が誘導されるラット由来のクルクミノイド類応答性遺伝子の例である。また、第１６表又は第１７表に示される遺伝子が、アントシアン類によって発現が誘導されるラット由来のアントシアン類応答性遺伝子の例である。より詳細には、第１５表に示される２４７個の遺伝子が、クルクミノイド類応答性遺伝子であってアントシアン類応答性遺伝子でないものの例である。第１６表に示される７９個の遺伝子が、アントシアン類応答性遺伝子であってクルクミノイド類応答性遺伝子でないものの例である。第１７表に示される２２４個の遺伝子が、クルクミノイド類応答性遺伝子であってかつアントシアン類応答性遺伝子であるものの例である。
【００７３】
本発明の遺伝子発現方法を用いることにより、抗肥満作用や抗糖尿病作用を有する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、クルクミノイド類やアントシアン類は肥満や糖尿病に効果があり、かつ上記した脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子やアントシアン類応答性遺伝子はクルクミノイド類やアントシアン類によってその発現が誘導又は抑制される。したがって、当該遺伝子の発現をクルクミノイド類やアントシアン類と同様に誘導又は抑制することができる物質があれば、その物質は肥満や糖尿病に効果を有することが予想される。本発明のスクリーニング方法に使用される被検物質としては、食品素材や医薬原体が挙げられるが、食品素材が好適である。すなわち本発明のスクリーニング方法は、多数の食品素材からの中から肥満や糖尿病に効果がある新しい機能性食品素材を探索するのに効果的である。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法は、例えば以下のように行うことができる。被検物質を例えば終濃度５０〜１００μＭとなるように培地に添加する。この際、被検物質をあらかじめ溶かす溶媒は、細胞の成育にできるだけ悪影響を及ぼさないものを選択し、培地への持ち込み量も悪影響を及ぼさない範囲とする。そのような条件下で脂肪細胞を培養し、例えば２４時間後に細胞を回収する。回収した細胞から全ＲＮＡを抽出し、適宜の方法でｃＤＮＡ合成を行い、さらに標識化合物を取り込ませながら標識化ｃＲＮＡを合成する。この標識化ｃＲＮＡに対してＤＮＡマイクロアレイ解析を行い、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現プロファイルをみる。例えば、第１表〜第７表、第１５表〜第１７表に示される遺伝子群の全部又は一部の発現が被検物質を添加しない対照に比較して有意に高い場合、あるいは、第８表〜第１４表に示される遺伝子群の全部又は一部の発現が被検物質を添加しない対照に比較して有意に低い場合は、当該被検物質は肥満あるいは糖尿病に効果を有する可能性がある。この方法は、特に抗肥満物質又は抗糖尿病物質の１次スクリーニングに有効である。本発明のスクリーニング方法で選抜された被検物質は、次は動物実験等のインビボ試験へと供され、所望の効果を有する被検物質がさらに選抜される。
【００７５】
上記のスクリーニング方法を簡便に行うために、使用する細胞や試薬類をまとめて、抗肥満・抗糖尿病物質スクリーニング用キットを構築することができる。キットには少なくとも、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を定量することができるＤＮＡチップが含まれることが好ましく、その他に、脂肪細胞、培地、ＲＮＡ抽出・精製用試薬、ｃＤＮＡ合成用試薬、標識化ｃＲＮＡ合成用試薬、ハイブリダイゼーションバッファー等の一部又は全部を組み合わせてもよい。
【００７６】
また、本発明の遺伝子発現方法を用いることにより、生体における肥満や糖尿病の改善状態を評価することができる。すなわち、クルクミノイド類やアントシアン類は肥満や糖尿病に効果があり、かつ上記した脂肪細胞のクルクミノイド類応答性遺伝子やアントシアン類応答性遺伝子はクルクミノイド類やアントシアン類によってその発現が誘導又は抑制される。したがって、当該遺伝子の発現がクルクミノイド類やアントシアン類存在下と同様に誘導又は抑制されている状態は、肥満や糖尿病が改善された状態あるいは改善傾向にある状態であることが予想される。本発明の評価方法は、例えば以下のように行うことができる。まず、検体となる脂肪細胞を生体から採取する。採取源としては、例えば皮下脂肪が挙げられる。採取した脂肪細胞を、上記と同様にクルクミノイド類及び／又はアントシアン類含む適宜の培地で培養し、同様にしてＤＮＡマイクロアレイ解析でクルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現プロファイルをみる。例えば、第１表〜第７表、第１５表〜第１７表に示される遺伝子群の全部又は一部の発現が経時的に高い傾向を示している場合、あるいは、第８表〜第１４表に示される遺伝子群の全部又は一部の発現が経時的に低い傾向を示している場合は、肥満あるいは糖尿病が改善していると評価することができる。なお、培地に含めるクルクミノイド類やアントシアン類の代替物として、例えば、上記のスクリーニング方法によってスクリーニングされた抗肥満作用や抗糖尿病作用を有する物質を使用することもできる。
【００７７】
上記の評価方法を簡便に行うために、使用する細胞や試薬類をまとめて、抗肥満・抗糖尿病物質スクリーニング用キットを構築することができる。キットには少なくとも、クルクミノイド類応答性遺伝子及び／又はアントシアン類応答性遺伝子の発現量を定量することができるＤＮＡチップが含まれることが好ましく、その他に、検体採取容器、細胞懸濁用バッファー、培地、ＲＮＡ抽出・精製用試薬、ｃＤＮＡ合成用試薬、標識化ｃＲＮＡ合成用試薬、ハイブリダイゼーションバッファー等の一部又は全部を組み合わせてもよい。
【実施例】
【００７８】
以下に、本発明を実施例をもって具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７９】
（実施例１）ヒト脂肪細胞における遺伝子発現
１．食品因子存在下でのヒト脂肪細胞の培養
食品因子として、クルクミン（日研化成社）、テトラヒドロクルクミン（日研化成社）、シアニジン（フナコシ社）及びシアニジン−３−グルコシド（フナコシ社）の４種を選択した。脂肪細胞培養用培地ＡＭ−１（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社）に、あらかじめジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した各食品因子を、最終濃度がクルクミンは５０μＭ、テトラヒドロクルクミンは７５μＭ、シアニジンとシアニジン−３−グルコシドは１００μＭとなるようにそれぞれ添加して、培地を調製した。この培地に正常ヒト白色脂肪細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社、分化誘導後１３日後）を播種し、５％ＣＯ2 の下、３７℃で２４時間培養した。対照には食品因子を添加せずにＤＭＳＯのみを最終濃度０．１％となるように添加した。
【００８０】
２．ヒトｃＲＮＡの調製
培養２４時間目にヒト脂肪細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、全ＲＮＡを調製した。次に、得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＴ７−ｄ（Ｔ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１本鎖のｃＤＮＡを合成した。続いて、デオキシリボヌクレオチドミクスチャー（ｄＮＴＰ），ＤＮＡリガーゼ，ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨ（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して反応させ、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加して２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、得られたｃＤＮＡを精製後、ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用い、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ビオチン化ＵＴＰ、及びビオチン化ＣＴＰを加えてラベル化反応を行った。反応生成物を精製後、４０ｍＭ  トリス−酢酸（ｐＨ８．１），３０ｍＭ  酢酸マグネシウム，１００ｍＭ  酢酸カリウム中で９４℃にて３５分間加熱して、断片化したビオチン化ヒトｃＲＮＡを調製した。
【００８１】
３．ＤＮＡチップとのハイブリダイズと蛍光測定
断片化したビオチン化ヒトｃＲＮＡを、１００ｍＭ  ＭＥＳ，１Ｍ  ナトリウム塩，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（以下、ハイブリダイゼーションバッファーと称する）中、４５℃にて１６時間、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、登録商標） Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｒｒａｙにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎに添付のプロトコールに従い、ＧｅｎｅＣｈｉｐを洗浄し、染色した。染色にはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）とｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（フナコシ社）を用いた。染色後のＧｅｎｅＣｈｉｐをＧｅｎｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ社）を用いてスキャンし、４８８ｎｍの励起光を用い、５７０ｎｍの蛍光をシグナルとしてとらえ、その蛍光強度を測定した。
【００８２】
４．データ解析
データ解析は、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いて行った。発現量の比較を行うために、シグナルが検知不能であった遺伝子、シグナルの再現性が悪い遺伝子、及びシグナルが弱い遺伝子を除き、解析対象として５３２１個の遺伝子を抽出した。これらの遺伝子について、各食品因子を添加したものが対照と比較して１．５倍以上の蛍光強度の差を示したものについて、その遺伝子の発現が有意に増加又は減少したものと判定した。
【００８３】
５．食品因子に応答した遺伝子発現
データ解析の結果、第１表から第７表に示される遺伝子について発現が有意に増加していた。また、第８表から第１４表に示される遺伝子について発現が有意に減少していた。まず第１表から第７表について順次説明すると、第１表に示される３３個の遺伝子は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、シアニジン、シアニジン−３−グルコシドのいずれを添加した場合でも発現が有意に増加した遺伝子群である。第２表に示される６３個の遺伝子は、シアニジンとシアニジン−３−グルコシドのいずれを添加した場合でも発現が有意に増加する９６個の遺伝子から、第１表に示された３３個の遺伝子を除いた遺伝子群である。第３表に示される１０５個の遺伝子は、クルクミンとテトラヒドロクルクミンのいずれを添加した場合でも発現が有意に増加する１３８個の遺伝子から、第１表に示された３３個の遺伝子を除いた遺伝子群である。
【００８４】
第４表に示される１３２個の遺伝子は、シアニジンを添加した場合には有意に発現が増加するが、シアニジン−３−グルコシドを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第５表に示される６１個の遺伝子は、逆に、シアニジン−３−グルコシドを添加した場合には有意に発現が増加するが、シアニジンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第６表に示される３０６個の遺伝子は、クルクミンを添加した場合には有意に発現が増加するが、テトラヒドロクルクミンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第７表に示される１２１個の遺伝子は、逆に、テトラヒドロクルクミンを添加した場合には有意に発現が増加するが、クルクミンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。
【００８５】
次に第８表から第１４表について順次説明すると、第８表に示される１０個の遺伝子は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、シアニジン、シアニジン−３−グルコシドのいずれを添加した場合でも発現が有意に減少した遺伝子群である。第９表に示される７２個の遺伝子は、シアニジンとシアニジン−３−グルコシドのいずれを添加した場合でも発現が有意に減少する８２個の遺伝子から、第８表に示された１０個の遺伝子を除いた遺伝子群である。第１０表に示される９７個の遺伝子は、クルクミンとテトラヒドロクルクミンのいずれを添加した場合でも発現が有意に減少する１０７個の遺伝子のうち、第８表に示された１０個の遺伝子を除いた遺伝子群である。
【００８６】
第１１表に示される１０８個の遺伝子は、シアニジンを添加した場合には有意に発現が減少するが、シアニジン−３−グルコシドを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第１２表に示される２２３個の遺伝子は、逆に、シアニジン−３−グルコシドを添加した場合には有意に発現が減少するが、シアニジンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第１３表に示される２６３個の遺伝子は、クルクミンを添加した場合には有意に発現が減少するが、テトラヒドロクルクミンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。第１４表に示される１１８個の遺伝子は、逆に、テトラヒドロクルクミンを添加した場合には有意に発現が減少するが、クルクミンを添加した場合には発現量が変化しない遺伝子群である。
【００８７】
【表１】
2005198640.tif 000005
【００８８】
【表２】
2005198640.tif 000006
【００８９】
【表３】
2005198640.tif 000007
【００９０】
【表４】
2005198640.tif 000008
【００９１】
【表５】
2005198640.tif 000009
【００９２】
【表６】
2005198640.tif 000010
【００９３】
【表７】
2005198640.tif 000011
【００９４】
【表８】
2005198640.tif 000012
【００９５】
【表９】
2005198640.tif 000013
【００９６】
【表１０】
2005198640.tif 000014
【００９７】
【表１１】
2005198640.tif 000015
【００９８】
【表１２】
2005198640.tif 000016
【００９９】
【表１３】
2005198640.tif 000017
【０１００】
【表１４】
2005198640.tif 000018
【０１０１】
【表１５】
2005198640.tif 000019
【０１０２】
【表１６】
2005198640.tif 000020
【０１０３】
【表１７】
2005198640.tif 000021
【０１０４】
【表１８】
2005198640.tif 000022
【０１０５】
【表１９】
2005198640.tif 000023
【０１０６】
【表２０】
2005198640.tif 000024
【０１０７】
【表２１】
2005198640.tif 000025
【０１０８】
【表２２】
2005198640.tif 000026
【０１０９】
【表２３】
2005198640.tif 000027
【０１１０】
【表２４】
2005198640.tif 000028
【０１１１】
【表２５】
2005198640.tif 000029
【０１１２】
【表２６】
2005198640.tif 000030
【０１１３】
【表２７】
2005198640.tif 000031
【０１１４】
【表２８】
2005198640.tif 000032
【０１１５】
【表２９】
2005198640.tif 000033
【０１１６】
【表３０】
2005198640.tif 000034
【０１１７】
【表３１】
2005198640.tif 000035
【０１１８】
【表３２】
2005198640.tif 000036
【０１１９】
【表３３】
2005198640.tif 000037
【０１２０】
【表３４】
2005198640.tif 000038
【０１２１】
【表３５】
2005198640.tif 000039
【０１２２】
【表３６】
2005198640.tif 000040
【０１２３】
【表３７】
2005198640.tif 000041
【０１２４】
【表３８】
2005198640.tif 000042
【０１２５】
【表３９】
2005198640.tif 000043
【０１２６】
【表４０】
2005198640.tif 000044
【０１２７】
【表４１】
2005198640.tif 000045
【０１２８】
【表４２】
2005198640.tif 000046
【０１２９】
【表４３】
2005198640.tif 000047
【０１３０】
【表４４】
2005198640.tif 000048
【０１３１】
【表４５】
2005198640.tif 000049
【０１３２】
【表４６】
2005198640.tif 000050
【０１３３】
（実施例２）ラット脂肪細胞における遺伝子発現
１．ラット脂肪細胞の調製
体重１６０ｇのウイスター（Ｗｉｓｔｅｒ）系雄ラットを屠殺後、副睾丸脂肪組織を取り出した。次に、取り出した副睾丸脂肪組織を直ちにコラゲナーゼ（ＳＩＧＭＡ社、ｔｙｐｅＩＩ）７６．６単位／Ｌを含む０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／３０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ／２００ｎＭアデノシン・クレブス・リンゲル・バイカーボネートバッファー（以下、ＢＳＡ−ＫＲＢＨと略す）に浸漬して、３７℃で９０分間保持し、脂肪細胞を結合組織から遊離させた。その後、遊離させた脂肪細胞をＢＳＡ−ＫＲＢＨで４回洗浄し、次いで脂肪細胞を０．５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ（ＢＳＡ−ＤＭＥＭ）に懸濁した。
【０１３４】
２．食品因子存在下でのラット脂肪細胞の培養
食品因子として、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、シアニジン及びシアニジン−３−グルコシドの４種を選択した。ＢＳＡ−ＤＭＥＭに、あらかじめＤＭＳＯに溶解した各食品因子を最終濃度１００μＭとなるようにそれぞれ添加して、培地を調製した。この培地に懸濁した脂肪細胞を播種し、５％ＣＯ2 の下、３７℃で２４時間培養した。対照には食品因子を添加せずにＤＭＳＯのみを最終濃度０．１％となるように添加した。
【０１３５】
３．ラットｃＲＮＡの調製
培養２４時間目にラット脂肪細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、全ＲＮＡを調製した。次に、得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＴ７−ｄ（Ｔ）２４プライマーを用いて１本鎖のｃＤＮＡを合成した。続いて、ｄＮＴＰ，ＤＮＡリガーゼ，ＤＮＡポリメラーゼＩ及びＲＮａｓｅＨを添加して反応させ、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩを添加して２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、得られたｃＤＮＡを精製後、ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ を用い、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ビオチン化ＵＴＰ、及びビオチン化ＣＴＰを加えてラベル化反応を行った。反応生成物を精製後、４０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ８．１），３０ｍＭ  酢酸マグネシウム，１００ｍＭ  酢酸カリウム中で９４℃にて３５分間加熱して、断片化したビオチン化ラットｃＲＮＡを調製した。
【０１３６】
４．ＤＮＡチップとのハイブリダイズと蛍光測定
断片化したビオチン化ラットｃＲＮＡを、ハイブリダイゼーションバッファー中、４５℃にて１６時間、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ３４Ａ  Ａｒｒａｙにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎに添付のプロトコールに従い、ＧｅｎｅＣｈｉｐを洗浄し、染色した。染色にはｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ とｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ を用いた。染色後のＧｅｎｅＣｈｉｐをＧｅｎｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ を用いてスキャンし、４８８ｎｍの励起光を用い、５７０ｎｍの蛍光をシグナルとしてとらえ、その蛍光強度を測定した。
【０１３７】
５．データ解析
データ解析は、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇを用いて行った。発現量の比較を行うために、シグナルが検知不能であった遺伝子、シグナルの再現性が悪い遺伝子、及びシグナルが弱い遺伝子を除き、解析対象として３９６２個の遺伝子を抽出した。これらの遺伝子について、各食品因子を添加したものが対照と比較して１．５倍以上の蛍光強度を示したものについて、その遺伝子の発現が有意に増加したものと判定した。
【０１３８】
６．食品因子に応答した遺伝子発現
データ解析の結果、第１５表から第１７表に示される計５５０個の遺伝子について発現が有意に増加していた。なお、表中の登録番号はＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号であり、表中の「遺伝子名」は、各登録番号の遺伝子名、コードするタンパク質名、又は遺伝子の機能（推定されるものも含む）を表している。第１５表に示される２４７個の遺伝子は、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの添加で発現量が有意に増加したが、シアニジン又はシアニジン−３−グルコシドの添加では発現量が有意に増加しなかった遺伝子群である。また、第１６表に示す７９個の遺伝子は、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの添加では発現量が有意に増加しなかったが、シアニジン又はシアニジン−３−グルコシドの添加で発現量が有意に増加した遺伝子群である。さらに、第１７表に示す２２４個の遺伝子は、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの添加、及びシアニジン又はシアニジン−３−グルコシドの添加のいずれでも発現量が有意に増加した遺伝子群である。
【０１３９】
【表４７】
2005198640.tif 000051
【０１４０】
【表４８】
2005198640.tif 000052
【０１４１】
【表４９】
2005198640.tif 000053
【０１４２】
【表５０】
2005198640.tif 000054
【０１４３】
【表５１】
2005198640.tif 000055
【０１４４】
【表５２】
2005198640.tif 000056
【０１４５】
【表５３】
2005198640.tif 000057
【０１４６】
【表５４】
2005198640.tif 000058
【０１４７】
【表５５】
2005198640.tif 000059
【０１４８】
【表５６】
2005198640.tif 000060
【０１４９】
【表５７】
2005198640.tif 000061
【０１５０】
【表５８】
2005198640.tif 000062
【０１５１】
【表５９】
2005198640.tif 000063
【０１５２】
【表６０】
2005198640.tif 000064
【０１５３】
【表６１】
2005198640.tif 000065
【０１５４】
【表６２】
2005198640.tif 000066
【０１５５】
【表６３】
2005198640.tif 000067
【０１５６】
【表６４】
2005198640.tif 000068
【０１５７】
第１７表に示された、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの添加、及びシアニジン又はシアニジン−３−グルコシドの添加のいずれでも発現量が有意に増加した遺伝子のうち、その機能が特徴的である３３個の遺伝子を第１８表に示す。第１８表に示すように、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの添加、及びシアニジン又はシアニジン−３−グルコシドの添加のいずれでも発現量が有意に増加した遺伝子の群は、抗酸化酵素、インスリンシグナル伝達、脂肪酸酸化、糖代謝、分泌型タンパク質、コラーゲン、又はヒートショックに関連するタンパク質の遺伝子を含んでいた。
【０１５８】
【表６５】
2005198640.tif 000069
【０１５９】
【表６６】
2005198640.tif 000070
【０１６０】
（実施例３）抗肥満・抗糖尿病物質スクリーニング用キットの構築
ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｒｒａｙ又はＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  Ａｒｒａｙ  １個、ハイブリダイゼーションバッファー  １０ｍＬ、テトラヒドロクルクミン（対照用）  １ｇ、シアニジン（対照用）  １ｇ、を１セットとして、抗肥満・抗糖尿病物質スクリーニング用キットを構築した。本キットは２〜８℃で輸送及び保存することとした。なお、発現プロファイルを調べるためのヒト脂肪細胞は、本キットには含めずにユーザーにて別途調製するものとした。本キットに使用できるヒト脂肪細胞としては、例えば、市販の正常ヒト白色脂肪細胞又は正常ヒト白色前駆脂肪細胞が挙げられる。
【０１６１】
（実施例４）肥満・糖尿病改善状態評価用キットの構築
滅菌済み５０ｍＬ容遠沈管  １個（検体採取用）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｆｏｃｕｓ  Ａｒｒａｙ又はＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  Ａｒｒａｙ  １個、ハイブリダイゼーションバッファー  １０ｍＬ、テトラヒドロクルクミン  １ｇ、シアニジン  １ｇ、を１セットとして、肥満・糖尿病改善状態評価用キットを構築した。本キットは２〜８℃で輸送及び保存することとした。