(57)【要約】【課題】  微量のＤＮＡサンプルから複数の遺伝子部位をそれぞれ別の容器中で増幅させる簡便な方法を提供すること。【解決手段】  担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し；第１のプライマー対を用いて第１の標的領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し；第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し；第２のプライマー対を用いて第２の標的領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し；第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し；そして第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅することにより、１つのＤＮＡサンプルから２またはそれ以上の標的領域をＰＣＲ増幅する方法。【選択図】図１
2005198581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つのＤＮＡサンプルから２またはそれ以上の標的領域をＰＣＲ増幅する方法であって、
担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、
第１のプライマー対を用いて第１の標的領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、
第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、
第２のプライマー対を用いて第２の標的領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、
第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、そして
第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅する
の各工程を含む方法。
【請求項２】
担体が磁性粒子である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的領域がＳＮＰを含む領域である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
プライマー対が、トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
cgcctcccccattccgccct およびaccagtagccacagcagcggtagca；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
gatcgtcctggggtgcagおよびgacaggcggtcctggatg；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
ctgtttcccagagaccctgagおよびgaccaatgctcatcccaact；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
atctgagttccaaatgtcccaおよびtctgggaaacagagacaaagc
からなる群より選択されるプライマー対である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１つのＤＮＡサンプル中の２またはそれ以上のＳＮＰｓを検出する方法であって、
担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、
第１のプライマー対を用いて第１のＳＮＰｓを含む領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、
第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、
第２のプライマー対を用いて第２のＳＮＰｓを含む領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、
第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、
第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅し、そして
ＰＣＲ増幅産物をＳＮＰｓ検出用プローブとハイブリダイズさせることにより第１および第２のＳＮＰｓを検出する
の各工程を含む方法。
【請求項６】
担体が磁性粒子である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プライマー対が、トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
cgcctcccccattccgccct およびaccagtagccacagcagcggtagca；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
gatcgtcctggggtgcagおよびgacaggcggtcctggatg；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
ctgtttcccagagaccctgag およびgaccaatgctcatcccaact；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
atctgagttccaaatgtcccaおよびtctgggaaacagagacaaagc
からなる群より選択されるプライマー対である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＳＮＰｓ検出用プローブが、トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型を検出するための検出プローブ：
tgctgccgctgctおよびtgctgctgctgctg；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型を検出するためのプローブ：
atggcctcaatcagcgおよびtggcctcgatcagcg；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型を検出するためのプローブ：
cccaactctagaccac およびccaactccagaccaca；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型を検出するためのプローブ：
gtcccagctgttttatgおよびtgtcccagccgttttat
からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの増幅および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１つのＤＮＡ中の複数の遺伝子部位を増幅する場合、通常はＤＮＡを含むサンプルを小分けし、それぞれの標的とする遺伝子部位に特異的なプライマー対を用いて別々にＰＣＲ増幅を行う方法が用いられている。しかしこの方法では、サンプルＤＮＡが微量しか得られない場合には、多数の標的部位について増幅を行うことができない。このようにサンプルＤＮＡが微量の場合には、異なる複数のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行い、異なる遺伝子部位を含む複数のＤＮＡ断片を同時に増幅する方法も行われている（特開2002-300894）。しかしこの方法では、各標的部位について特異的にＰＣＲ増幅が進行するように複数のプライマーを設計することは容易ではない。また、一つの反応容器中に複数の遺伝子部位についてのＰＣＲ産物が混合された状態で含まれるため、これらの遺伝子部位のそれぞれを区別して特異的に検出することも容易ではない。
【特許文献１】特開2002-300894
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、微量のＤＮＡサンプルから複数の遺伝子部位をそれぞれ別の容器中で増幅させる簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、１つのＤＮＡサンプルから２またはそれ以上の標的領域をＰＣＲ増幅する方法を提供し、該方法は、
担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、
第１のプライマー対を用いて第１の標的領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、
第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、
第２のプライマー対を用いて第２の標的領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、
第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、そして
第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅する
の各工程を含む。
【０００５】
好ましくは、本発明の方法において用いられる担体は磁性粒子である。また好ましくは、本発明の方法における標的領域はＳＮＰを含む領域である。
【０００６】
本発明の１つの態様においては、本発明の増幅方法において用いられるプライマー対は、トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
cgcctcccccattccgccct（配列番号９） およびaccagtagccacagcagcggtagca（配列番号１０）；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
gatcgtcctggggtgcag（配列番号１１）およびgacaggcggtcctggatg （配列番号１２）；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
ctgtttcccagagaccctgag（配列番号１３) およびgaccaatgctcatcccaact（配列番号１４）；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
atctgagttccaaatgtccca（配列番号１５）およびtctgggaaacagagacaaagc（配列番号１６）
からなる群より選択される。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、１つのＤＮＡサンプル中の２またはそれ以上のＳＮＰｓを検出する方法を提供し、該方法は、
担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、
第１のプライマー対を用いて第１のＳＮＰｓを含む領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、
第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、
第２のプライマー対を用いて第２のＳＮＰｓを含む領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、
第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、そして
第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅し、
ＰＣＲ増幅産物をＳＮＰｓ検出用プローブとハイブリダイズさせることにより第１および第２のＳＮＰｓを検出する
の各工程を含む。
【０００８】
本発明の１つの態様においては、本発明の検出方法において用いられるプライマー対は、
トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
cgcctcccccattccgccct（配列番号９） およびaccagtagccacagcagcggtagca（配列番号１０）；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型に特異的な増幅プライマー対：
gatcgtcctggggtgcag（配列番号１１）およびgacaggcggtcctggatg （配列番号１２）；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
ctgtttcccagagaccctgag（配列番号１３) およびgaccaatgctcatcccaact（配列番号１４）；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型に特異的な増幅プライマー対：
atctgagttccaaatgtccca（配列番号１５）およびtctgggaaacagagacaaagc（配列番号１６）
からなる群より選択される。
【０００９】
本発明の１つの態様においては、本発明の検出方法において用いられるＳＮＰｓ検出用プローブは、
トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型を検出するための検出プローブ：
tgctgccgctgct（配列番号１） およびtgctgctgctgctg（配列番号２）；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型を検出するためのプローブ：
atggcctcaatcagcg（配列番号３）およびtggcctcgatcagcg （配列番号４）；
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型を検出するためのプローブ：
cccaactctagaccac（配列番号５) およびccaactccagaccaca（配列番号６）；および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型を検出するためのプローブ：
gtcccagctgttttatg（配列番号７）およびtgtcccagccgttttat（配列番号８）
からなる群より選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法は、２段階に分けてＰＣＲ増幅を行うことを特徴とする。まず、ＤＮＡサンプルをテンプレートとして、１つの標的領域に対応するプライマー対を用いてプレ増幅を行う。本明細書において用いる場合、「プレ増幅」とは、必要な増幅産物の量が得られる熱サイクル数より少ない熱サイクル数でＰＣＲ増幅を行うことをいう。好ましくは、プレ増幅の熱サイクル数は１−６、より好ましくは１−４、最も好ましくは３サイクルである。これより多い熱サイクル数を用いても本発明が実施可能であることはもちろんである。当業者は、増幅すべき配列の長さ、プライマーのＴｍ、サンプルの数、増幅装置の仕様、操作時間等を考慮して、プレ増幅の温度条件およびサイクル数を容易に選択することができる。この工程において得られたプレ増幅産物は、別の容器に移して一時保存する。次に、同じＤＮＡサンプルをテンプレートとして、別の標的領域に対応するプライマー対を用いてプレ増幅を行い、このプレ増幅産物をさらに別の容器に移して一時保存する。このようにして、すべての標的領域についてプレ増幅産物を用意した後に、これらを同時に熱サイクルに供して所望の量の増幅産物が得られるまで第２段階のＰＣＲ増幅を行う。このように、２段階に分けてＰＣＲ増幅工程を行うことにより、微量のＤＮＡサンプルから複数の遺伝子部位をそれぞれ別の容器中で増幅させることができる。本発明の方法は、少量のゲノムＤＮＡサンプルを用いて多数箇所のＳＮＰｓ部位を同時に増幅させるのに特に有用である。
【００１１】
本発明の方法において用いられるＤＮＡサンプルとしては、標的領域の存在または配列を調べることが望まれる任意のサンプルを用いることができる。例えば、動物の血液、体液、組織などの試料や、培養細胞または培養組織から、当該技術分野においてよく知られる方法によりＤＮＡを調製することができる。また、試料からＲＮＡを抽出した後に、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成してもよい。ＳＮＰｓの検出のためには、ヒトの末梢血から調製したゲノムＤＮＡが好適に用いられる。
【００１２】
ＤＮＡサンプルは、後の工程における分離を容易にするために、予め担体上に固定化させる。ＤＮＡを固定化する担体としては、プラスチック、ガラス、樹脂、金属、磁性粒子、セルロースおよびその誘導体等の、ＤＮＡを結合することができる任意の材料のものを用いることができる。担体は、プレート状、チューブ状、ビーズ状、スポンジ状、メンブレン状など、任意の形状として用いることができる。より好ましくは、担体として磁性粒子を用いる。最も好ましくは、磁性細菌の菌体内において産生される粒径約５０−１５０ｎｍのマグネタイトからなる微粒子を用いるのが良い。ＤＮＡは、架橋剤を用いて共有結合により、あるいは静電的相互作用により、容易に磁性粒子に固定化することができる。磁性粒子に固定化したＤＮＡは、磁石を用いて容易に溶液と分離することができるという利点を有する。
【００１３】
標的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー対は、標的領域の周辺の塩基配列に基づいて容易に設計することができる。そのようなプライマー対の設計および製造方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００１４】
本発明の方法においては、まず、担体に固定化されたＤＮＡサンプルを含む反応容器中に、ＰＣＲ増幅に適した緩衝液、第１の標的領域に対応するプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを加え、プレ増幅を行う。次に、このようにして得られた第１のプレ増幅産物をＤＮＡサンプルから分離して取り出して、一時貯蔵用の別の容器に移す。ＤＮＡサンプルが磁性粒子に固定化されている場合には、磁石を用いて固定化ＤＮＡサンプルと第１のプレ増幅産物を含む溶液とを容易に分離することができる。好ましくは、第１のプレ増幅産物を反応容器から取り出した後、固定化ＤＮＡサンプルを１−３回洗浄して、残留している可能性のあるプレ増幅産物およびプライマーを除去する。
【００１５】
別の容器に移されたプレ増幅産物は、次のＰＣＲ増幅を行うまで一時的に貯蔵する。貯蔵は室温で行ってもよく、低温で行ってもよい。ここで、後のＰＣＲ増幅の操作を簡単に行う目的で、プレ増幅産物の一時貯蔵用の容器として、複数のウエルを有するプレートを用いることが好ましい。例えば、市販の汎用９６ウエルプレートまたは３８６ウエルプレートなどを好適に用いることができる。
【００１６】
次に、固定化ＤＮＡサンプルを含む反応容器に第２のプライマー対およびＰＣＲ増幅に必要な他の試薬を加えて、第１の標的領域のプレ増幅について上述した工程と同様にして、第２の標的領域をプレ増幅する。生成した第２のプレ増幅産物を反応容器から取り出して、第１のプレ増幅産物とは別の容器、例えば同じプレート上の別のウエルに移す。増幅すべき領域が３以上ある場合には、同様にして上述の工程を繰り返す。
【００１７】
すべての領域についてプレ増幅産物が用意された後、それぞれのプレ増幅産物が入った容器を同時に熱サイクルに供することにより、すべての標的領域のＰＣＲ増幅を同時に行う。定量的ＰＣＲを行う場合には、このときのＰＣＲ増幅過程をモニターする。以上のようにして、１つのＤＮＡサンプルから、複数の標的遺伝子部位を同時に増幅することができ、各増幅産物を別々のウェルに得ることが可能となる。
【００１８】
このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を用いて、各標的領域の存在または配列を調べることができる。１つのＤＮＡサンプル中の複数のＳＮＰｓを検出するためには、本発明の方法により得られたＰＣＲ増幅産物を各ＳＮＰｓに特異的なプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションにより特定の領域を検出する方法は、当該技術分野においてよく知られている。１つの好ましい態様においては、ＰＣＲ増幅の際に用いるプライマー対の一方をビオチンで標識しておき、得られたＰＣＲ増幅産物をストレプトアビジン標識担体に結合させる。このことにより、ストレプトアビジン標識担体には標的領域に対応するＤＮＡフラグメントの一方の鎖のみが結合するため、これに相補的なプローブを用いて標的部位を特異的に検出することができる。
【００１９】
図１は、本発明の方法を実施するために適した装置の一例を示す。ＤＮＡ増幅検出装置１は、反応部１０、一時貯蔵部１２、チップラック・廃液部１４、溶液供給部１６およびヘッド部１８を有する。反応部１０、一時貯蔵部１２、チップラック・廃液部１４および溶液供給部１６はテーブル上に並んでいる。ヘッド部１８は、反応プレートの形状に合致して配置される複数本のチップノズルを有し、チップを装脱着し、液体を吸引・注入する機構を備える。ヘッド部１８は、アームユニットによりＸＹＺ方向に移動可能なように装着されており、その移動が制御ユニット（図示せず）により制御されることにより、所定の位置および順番で、チップの装脱着および液体分注を行うことができる。反応部１０には温度調節ユニットおよび磁気分離ユニットが備えられており、その上部に反応容器が置かれる。反応部１０においては、本発明の方法におけるプレ増幅の工程、第２段階のＰＣＲ増幅工程、ならびにハイブリダイゼーションによる検出工程を行うことができる。一時貯蔵部１２はその上部に一時貯蔵用の容器、例えば９６ウエルプレートを有し、次の工程までプレ増幅産物を保持することができる。一時貯蔵部１２はさらに、温度調節ユニットを有していてもよい。
【００２０】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
ＰＣＲ増幅
ゲノムＤＮＡは、ヒト末梢血液から定法により調製した。カルボン酸標識磁性粒子（Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, Dynal A.S, Norway）１２０μｇと１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、および１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド架橋剤ＥＤＣを、５０μｌのＭＥＳバッファ（１００ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ５．０）中で１時間反応させ（脱水縮合）、粒子上にゲノムＤＮＡを結合させた。この磁性粒子上のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。増幅部位としては、骨粗鬆症に関連する４種のＳＮＰｓ部位を選択した。用いたプライマー対は以下のとおりである：
トランスフォーミング増殖因子β１遺伝子の多型（TGF-b1）に特異的な増幅プライマー対：
cgcctcccccattccgccct（配列番号９） およびaccagtagccacagcagcggtagca（配列番号１０）；
ビタミンＤ受容体遺伝子の多型（VDR）に特異的な増幅プライマー対：
gatcgtcctggggtgcag（配列番号１１）およびgacaggcggtcctggatg （配列番号１２）、
エストロゲン受容体遺伝子XbaIサイト多型（ER-Xbal）に特異的な増幅プライマー対：
ctgtttcccagagaccctgag（配列番号１３) およびgaccaatgctcatcccaact（配列番号１４）、および
エストロゲン受容体遺伝子PvuIIサイト多型（ER-PvuII）に特異的な増幅プライマー対：
atctgagttccaaatgtccca（配列番号１５）およびtctgggaaacagagacaaagc（配列番号１６）。
【００２２】
ＤＮＡ固定磁気粒子をプレートの１つのウエルに入れ、１００μｌのＰＣＲ反応混合物（２．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１×ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＰＣＲバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３［２５℃］，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，０．００１％ｗ／ｖゼラチン）、および片側の鎖をビオチン標識した０．２μＭ  ＴＧＦ−ｂ１プライマー対）を加えて、以下の条件で３サイクルのプレＰＣＲ増幅を行った：熱変性９５℃を３分に続き、９５℃を３０秒と５５℃を６０秒と７２℃を６０秒の温度制御を１サイクルとして３サイクルを行った。ＤＮＡ固定磁気粒子を磁気分離した後、上清を取り出して、別のプレートのウエルに移し、４℃で保存した。ＤＮＡ固定磁気粒子をＰＢＳバッファ（１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，２％ＢＳＡ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＣＲ反応混合物およびＶＤＲプライマー対を加え、上記と同じ条件で３サイクルのＰＣＲを行った。上清を別のウエルに移し、ＤＮＡ固定磁気粒子を洗浄した。同様にして、ＥＲ−ＸｂａＩおよびＥＲ−ＰｖｕＩＩ多型部位のプレ増幅を行った。次に、これらのプレ増幅産物を各ウエルに含むプレートを熱サイクルに供して、以下の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った：熱変性９５℃を３分に続き、９５℃を３０秒と５５℃を６０秒と７２℃を６０秒の温度制御を１サイクルとして３０サイクルを行った。
【００２３】
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲルで分析した結果を図２に示す。レーン２−５は同じ固定化ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅産物である（レーン１：２０ｂｐマーカー、レーン２：ＴＧＦ−ｂ１、レーン３：ＶＤＲ、レーン４：ＥＲ−ＸｂａＩ、レーン５：ＥＲ−ＰｖｕＩＩ）。コンタミネーションなどの問題もなく目的のバンドが得られていることから、本発明の方法により１つのＤＮＡサンプルから多部位増幅が行われたことが示された。
【実施例２】
【００２４】
血液からのＤＮＡ抽出とダイレクトＰＣＲ増幅
ＤＮＡ抽出磁性粒子の調整
血液からのＤＮＡ抽出は、表面にアミノ基をデンドリマー状に導入したデンドリマー磁性細菌粒子を用い、静電的相互作用によって負電荷を帯びているＤＮＡを粒子上に吸着させる原理に基づいて行った（Yoza et al., 2003, J Biotechnol 94:217-24）。このデンドリマー磁性細菌粒子の調整方法を以下に示す。
【００２５】
(Matsunaga et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol 35:651-655)に示された方法に基づき、培養された磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1から磁性細菌粒子を抽出・精製した。この磁性細菌粒子は、表面の脂質二重膜を剥すため、１Ｍ  ＮａＯＨ中で３０分間煮、ネオジウムボロン磁石を用いて磁気回収した。その後、滅菌した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で超音波バスを用いて３回洗浄し、４℃で保存した。
【００２６】
分取した膜除去磁性細菌粒子は、クロロホルム、メタノール、ヘキサンが１：１：１の溶液中で洗浄した後、完全に乾燥させ、１ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）中で加水分解させたシランカップリング剤ＡＥＥＡと２０分間反応させた。その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで３回リンスし、更に滅菌水で３回洗浄した。
【００２７】
２５０ｍｇのＡＥＥＡコート磁性細菌粒子を、２０ｍｌのアクリル酸メチル中に導入し、ロータリーエバポレータを用いて、超音波バス中で粒子を分散させながら、室温で３時間反応させた。粒子をメタノールでリンスした後、４ｍｌのメタノールとエチレンジアミンを１：１で混合した溶液を導入し、同条件にて反応させた。これらの反応はデンドリマー状に５世代まで繰り返され、２５ｍｌのメタノール、エタノール、滅菌水でそれぞれ３回ずつ洗浄した（Yoza et al., 2003, J Biotechnol 94:217-24）。
【００２８】
サンプル血液中ＤＮＡの粒子への固定化
血液２００μｌに対し、凝固防止のために１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを６０μｌ加え、よく撹拌したものをサンプルとした。分取したサンプル１５μｌとＬｙｓｉｓバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０％Ｔｗｅｅｎ２０，１Ｍ  ＮａＯＨ）２５μｌ、および４ｍｇ／ｍｌデンドリマー磁性細菌粒子２．５μｌを加えた。この混合物を５６℃で１５分間インキュベート後、５６℃に保ったまま粒子を４回洗浄することで（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ，ｐＨ７．４）、サンプルＤＮＡが固定化した磁性細菌粒子を調整した。
【００２９】
サンプルＤＮＡ固定化磁性細菌粒子に対するダイレクトＰＣＲ増幅
前述の方法で取得したサンプルＤＮＡ固定化磁性細菌粒子に対し、ＴＧＦ−ｂ１遺伝子の８６９番目に存在するＳＮＰサイトを含む６９ｂｐのＰＣＲ断片を増幅するよう設計されたプライマー対を加えた２５μｌのＰＣＲミクスチャー（０．２μＭ  プライマー対，０．５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，ＰＣＲバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５［２５℃］，５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）を加え、以下の条件で３サイクルのプレＰＣＲ増幅を行った：熱変性９５℃を３分に続き、９５℃を３０秒と５５℃を６０秒と７２℃を６０秒の温度制御を１サイクルとして３サイクルを行った。ＤＮＡ固定磁性細菌粒子を磁気分離した後、上清を取り出して、別のプレートのウエルに移し、４℃で保存した。ＤＮＡ固定磁性細菌粒子をＰＢＳバッファで３回洗浄し、ＰＣＲ反応混合物およびＶＤＲプライマー対を加え、上記と同じ条件で３サイクルのＰＣＲを行った。上清を別のウエルに移し、ＤＮＡ固定磁性細菌粒子を洗浄した。同様にして、ＥＲ−ＸｂａＩおよびＥＲ−ＰｖｕＩＩ多型部位のプレ増幅を行った。次に、これらのプレ増幅産物を各ウエルに含むプレートを熱サイクルに供して、以下の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った：熱変性９５℃を３分に続き、９５℃を３０秒と５５℃を６０秒と７２℃６０秒の温度制御を１サイクルとして３０サイクルを行った。
【実施例３】
【００３０】
ＳＮＰｓ検出
実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物１０μｌとストレプトアビジン固定化磁気粒子２５μｇを、１５μｌのＴＥＮバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２Ｍ塩化ナトリウム）中で１５分間、室温でインキュベートした後、１０ｍＭ  ＮａＯＨで洗浄することにより、磁気粒子上にビオチン標識一本鎖ＤＮＡを結合させた。溶媒のｐＨを７．４に調節した後、５０ｐｍｏｌのＳＮＰｓ検出プローブ（Ｃｙ５−１型、Ｃｙ３−２型）を加えた。検出プローブの配列は以下のとおりである：
TGF-b1を検出するための検出プローブ：
tgctgccgctgct（配列番号１） およびtgctgctgctgctg（配列番号２）；
VDRを検出するためのプローブ：
atggcctcaatcagcg（配列番号３）およびtggcctcgatcagcg （配列番号４）；
ER-Xbalを検出するためのプローブ：
cccaactctagaccac（配列番号５) およびccaactccagaccaca（配列番号６）；および
ER-PvuIIを検出するためのプローブ：
gtcccagctgttttatg（配列番号７）およびtgtcccagccgttttat（配列番号８）。
【００３１】
反応溶液を７０℃で２分間ディネーチャーを行った後、２５℃まで毎秒０．１℃の速度で低下させながらアニーリングを行った。次に、ＴＧＦ−ｂ１検出プローブについては５６℃で、残りの３種の検出プローブについては４０℃で、ＰＢＳ−Ｔバッファ（（１０  ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，１０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４））で３回洗浄を行った。再び７０℃に昇温することにより、ハイブリダイズした蛍光標識プローブを上清中に解離させ、この上清を蛍光プレートリーダーにて検出を行った。
【００３２】
ハイブリダイゼーションによるＳＮＰｓの検出結果を図３に示す。Ｓ１−Ｓ３は３つの異なるサンプルを示し、Ｎは増幅産物を含まないでＳＮＰｓ検出処理を行ったネガティブコントロールである。また黒棒および白棒は、２つの検出プローブそれぞれを用いたときの蛍光強度を示す。増幅時に使用したプライマに対応した検出プローブを用いた場合にのみ、蛍光強度の向上および検出差異が見られた。このことから、本発明の方法により１つのＤＮＡサンプルから多部位のＳＮＰ検出が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の方法を実施するのに適した装置の一例を示す。
【図２】図２は、実施例１におけるＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図３】図３は、実施例２におけるＳＮＰｓ検出の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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