(57)【要約】【課題】肝癌、膵癌等の進行固形癌に対して繰り返し全身投与が可能なドラッグデリバリーシステム上有用な、腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドからなるペプチドベクター及び該環状ペプチドを用いた腫瘍指向性ペプチドベクターを提供すること。【解決手段】膵癌細胞株や該膵癌細胞株を接種することにより形成させた腫瘍に、両端にシステインをもつ９アミノ酸配列を有するペプチドを表面にディスプレイしたファージライブラリーを接触させ、実際に腫瘍細胞に取り込まれたファージを増幅させ、ＤＮＡを抽出してシークエンスに供し、決定された塩基配列より腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドを同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列からなることを特徴とする環状ペプチド。
【請求項２】
配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つ腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能であることを特徴とする環状ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載の環状ペプチドと、タンパク質又はペプチドとが結合したことを特徴とする環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体。
【請求項４】
タンパク質又はペプチドが、抗腫瘍作用又は抗腫瘍活性誘導作用を有することを特徴とする請求項３記載の環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体。
【請求項５】
請求項１又は２記載の環状ペプチドと、ポリ又はオリゴヌクレオチドとが結合したことを特徴とする環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体。
【請求項６】
ポリ又はオリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項５記載の環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体。
【請求項７】
請求項１又は２記載の環状ペプチドに、ヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されていることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター。
【請求項８】
請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子とヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドとを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されていることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター。
【請求項９】
請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子と２０〜４０個のリジン残基を有するポリリジンからなるペプチドとを結合させたことを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター。
【請求項１０】
請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子を結合させたことを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載の腫瘍指向性ペプチドベクターと、プラスミド、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター複合体。
【請求項１２】
プラスミドが、自殺遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、アポトーシス誘発遺伝子、サイトカイン遺伝子、新生血管抑制因子遺伝子の発現能を有するプラスミドであることを特徴とする請求項１１記載の腫瘍指向性ペプチドベクター複合体。
【請求項１３】
請求項３又は４記載の環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤。
【請求項１４】
請求項５又は６記載の環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤。
【請求項１５】
請求項１１又は１２記載の腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、両端にシステインを有する９アミノ酸配列からなる腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチド及びその変異体、これら環状ペプチドとタンパク質／ペプチドとの結合体、これら環状ペプチドとポリ／オリゴヌクレオチドとの結合体、これら環状ペプチドとヒスチジン化ポリリジンとの結合体からなる腫瘍指向性ペプチドベクター、この腫瘍指向性ペプチドベクターとプラスミド、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体、並びにこれらの進行固形癌の治療への利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の遺伝子治療の成功にはベクターの開発が不可欠であり、ウイルス性と非ウイルス性ベクターの研究が世界中で精力的に行われている。現在研究開発の中心となっているウイルス性ベクターは、遺伝子導入効率に優れているものの、その免疫原性や不利益な変異の可能性についての懸念がある。この点において、比較的安全な非ウイルス性ベクターの開発は重要であり、反復投与が可能となればその低い遺伝子導入効率を代償し得ると考えられている。また、癌の遺伝子治療では、抗癌作用の癌細胞選択性が必要で、これまでに治療導入遺伝子、ベクター、それらの投与方法などさまざまなレベルで工夫されているものの、いまだ生体で十分な有効性と安全性が期待されるシステムは開発されていない。
【０００３】
現在最も有望視されている腫瘍崩壊ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）は、腫瘍細胞内でのみ増殖しその細胞を壊し、さらに周囲の腫瘍細胞に感染しその抗腫瘍効果を拡散していくというコンセプトのものである。しかしながら、そのウイルスの大きさによる浸透性の悪さと免疫原性のためか、その抗腫瘍効果はウイルスの注入部位周囲に限局されたものとなっているのが実情である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
非ウイルスベクターに関しては、遺伝子治療薬としての機能的なナノパーティクルの開発を目指して多くの研究がなされている。例えば、腫瘍標的機能を付加するため、抗体やリガンドを利用して腫瘍組織に誘導する試みの研究が行われている。腫瘍新生血管または腫瘍細胞に高発現するインテグリン、トランスフェリンレセプター、葉酸レセプターなどのリガンドとして、リガンドペプチドや葉酸の利用が検討されているが、その有効性は不明である。また、非ウイルスベクターの場合には、腫瘍組織に集合したのちに腫瘍細胞内に入り込みかつ細胞質内へ治療遺伝子を放出する機能も必要となる。これらの機能を併せ持つ腫瘍指向性ペプチドベクターの創作がこれまでに試みられている  （例えば、非特許文献２参照）が、実用化にはさらに一段と発展させる必要がある。このような非ウイルスベクターの研究の一環として、ファージディスプレーライブラリーを用いて、非ウイルスベクターとなるペプチドをスクリーニングすることも報告（例えば、非特許文献３参照）されている。
【０００５】
一方、ある種の生物（線虫：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）によって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが見い出されている（例えば、特許文献１、非特許文献４参照。）。この現象は、ある遺伝子と相同な、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡが、その遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相同部分を破壊するという現象で、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡ干渉）と呼ばれている。この現象は、その後、種々の動物（例えば、非特許文献５〜７参照。）や、植物（例えば、非特許文献８参照。）を含む下等な真核細胞において見い出されている。２０００年には、マウス初期胚や哺乳動物培養細胞においてもＲＮＡｉが起こりうることが示され、ＲＮＡｉの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することが明らかとなった（例えば、特許文献２、非特許文献９参照。）。
【０００６】
このようなＲＮＡｉの機能を利用して、哺乳動物においてもある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによって起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの疾病を治療するために使用することができる。また、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、このような場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることで、疾病の治療が可能となる。ＲＮＡｉの機能を引き起こすｄｓＲＮＡは、当初、約３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの細胞内への導入が必要と考えられていたが、最近、更に短い（２１〜２３ｂｐ）ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが明らかになっっている（例えば、非特許文献１０参照。）。最近、本発明者らは、ヒト腫瘍細胞に対してアンチセンスＲＮＡよりもｓｉＲＮＡがより有効であることを報告している（例えば、非特許文献１１、１２参照。）。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第ＷＯ０１／３６６４６号パンフレット
【非特許文献１】
Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：７８１，  ２００１
【非特許文献２】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：  ７８３−７８７，  ２００１
【非特許文献３】
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ５２，  ３１−４３，  ２００２
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６−８１１，  １９９８
【非特許文献５】
Ｃｅｌｌ，  ９５，  １０１７−１０２６，  １９９８
【非特許文献６】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５，  １４６８７−１４６９２，  １９９８
【非特許文献７】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ５０４９−５０５４，  １９９９
【非特許文献８】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５，  １３９５９−１３９６４，  １９９８
【非特許文献９】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ４７９，  ７９−８２，  ２０００
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８，  ２００１
【非特許文献１１】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：  １２５−１３３，  ２００３
【非特許文献１２】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ３０，  ９６−１０２，  ２００３
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
有効な治療手段のない進行固形癌は極めて予後不良であり、新しい治療手段であり今後の発展が切望される遺伝子治療のよい対象とされている。遺伝子治療を可能とする一つの重要な要因としてドラッグデリバリーシステムの開発があり、現在ウイルスベクターと非ウイルスベクターについて精力的に研究が進められている。ウイルスベクターを用いた局所投与による癌の遺伝子治療は、すでに臨床治験が行われているものの、進行固形癌に対しては繰り返しの全身投与が必要であり、ウイルスベクターには抗原性や投与後の分布に関する大きな問題が残されている。一方、非ウイルスベクターは、操作性と安全性に優れているが、細胞に取り込まれた後のエンドソームからの遊離に難点があり、ベクターとしての効率が悪いという問題点がある。本発明の課題は、肝癌、膵癌等の進行固形癌に対して繰り返し全身投与が可能なドラッグデリバリーシステム上有用な、腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドからなるペプチドベクター及び該環状ペプチドを用いた腫瘍指向性ペプチドベクターを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、膵癌細胞株や該膵癌細胞株を接種することにより形成させた腫瘍に、両端にシステインをもつ９アミノ酸配列を有するペプチドを表面にディスプレイしたファージライブラリーを接触させ、実際に腫瘍細胞に取り込まれたファージを増幅させ、ＤＮＡを抽出してシークエンスに供し、決定された塩基配列より腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドを同定し、該環状ペプチドに結合されたタンパク質（ＧＦＰ）が実際に腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列からなることを特徴とする環状ペプチド（請求項１）や、配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つ腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能であることを特徴とする環状ペプチド（請求項２）や、請求項１又は２記載の環状ペプチドと、タンパク質又はペプチドとが結合したことを特徴とする環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体（請求項３）や、タンパク質又はペプチドが、抗腫瘍作用又は抗腫瘍活性誘導作用を有することを特徴とする請求項３記載の環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体（請求項４）や、請求項１又は２記載の環状ペプチドと、ポリ又はオリゴヌクレオチドとが結合したことを特徴とする環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体（請求項５）や、ポリ又はオリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項５記載の環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体（請求項６）に関する。
【００１１】
また本発明は、請求項１又は２記載の環状ペプチドに、ヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されていることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター（請求項７）や、請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子とヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドとを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されていることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター（請求項８）や、請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子と２０〜４０個のリジン残基を有するポリリジンからなるペプチドとを結合させたことを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター（請求項９）や、請求項１又は２記載の環状ペプチドに、脂肪酸分子を結合させたことを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター（請求項１０）や、請求項７〜１０のいずれか記載の腫瘍指向性ペプチドベクターと、プラスミド、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とする腫瘍指向性ペプチドベクター複合体（請求項１１）や、プラスミドが、自殺遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、アポトーシス誘発遺伝子、サイトカイン遺伝子、新生血管抑制因子遺伝子の発現能を有するプラスミドであることを特徴とする請求項１１記載の腫瘍指向性ペプチドベクター複合体（請求項１２）に関する。
【００１２】
さらに本発明は、請求項３又は４記載の環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤（請求項１３）や、請求項５又は６記載の環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤（請求項１４）や、請求項１１又は１２記載の腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を含有することを特徴とする進行固形癌の治療剤（請求項１５）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の環状ペプチドとしては、配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列からなる腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドや、配列表の配列番号１〜３４に示される両端にシステインを有する９アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたアミノ酸配列からなり、且つ腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチド（以下、これら環状ペプチドを「本件腫瘍侵入環状ペプチド」という）であれば特に制限されるものではなく、ここで、上記アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、配列番号１〜３４で示されるアミノ酸配列のいずれかからなるペプチドと同様に腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な同効物であれば特に制限されない。アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明は、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。
【００１４】
本件腫瘍侵入環状ペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００１５】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えば  ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００１６】
上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸やペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００１７】
その他、本件腫瘍侵入環状ペプチドは、その塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本件腫瘍侵入環状ペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。本発明の本件腫瘍侵入環状ペプチドは、腫瘍指向性を有しかつ細胞内に取り込まれ細胞質に移行可能であることから、ドラッグデリバリーシステム上有用な非ウイルス性のペプチドベクターとしてきわめて有用である。
【００１８】
本発明の環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体としては、本件腫瘍侵入環状ペプチドと、タンパク質やペプチドとの結合体であれば、環状ペプチドがＮ末端にあろうがＣ末端にあろうが特に制限されず、本件腫瘍侵入環状ペプチドとタンパク質又はペプチドとの結合は、一般的な化学合成法により行うこともできるが、それらの塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法を用いて常法により融合タンパク質／融合ペプチドとして調製することもできる。上記本件腫瘍侵入環状ペプチドと結合するタンパク質又はペプチドとしては、抗腫瘍作用又は抗腫瘍活性誘導作用を有する公知のタンパク質やペプチドを挙げることができ、より具体的には、アポトーシス誘導ペプチド（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ５：  １０３２−１０８３，  １９９９）等を例示することができる。
【００１９】
本発明の環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体としては、本件腫瘍侵入環状ペプチドと、ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドとの結合体であれば、ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドが環状ペプチドのＮ末端にあろうがＣ末端にあろうが特に制限されないが、例えば、ｓｉＲＮＡ機能に影響を及ばさないとされるセンス鎖の３’末端に直接環状構造の本件腫瘍侵入環状ペプチドを結合させた環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体を好適に例示することができる。本件腫瘍侵入環状ペプチドとポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドとの結合は、文献（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：  ５５７５−５５８２，  ２０００）記載の方法に準じて行うことができる。上記ポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドとしては、ｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２：６６８−６７５，１９９６）、変異Ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８０：５５３−５５８，１９９９）、その他Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ、ｃｄｃ２キナーゼｍＲＮＡ、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１  ｍＲＮＡなどに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、リボザイムなどを挙げることができる。
【００２０】
本発明の腫瘍指向性ペプチドベクターとしては、本件腫瘍侵入環状ペプチドに、ヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されているペプチドベクターを例示することができる。この腫瘍指向性ペプチドベクターに含まれるリジンは陽性荷電を帯びており、陰性荷電のプラスミドやオリゴ核酸とイオン的に結合し、それらの担体となる。プラスミドに対しては、多数のペプチドベクターが結合することによりプラスミドが濃縮され細胞に取り込まれやすくなる。ｓｉＲＮＡやオリゴヌクレオチドに対しては、通常モル比１：１で結合する。また、腫瘍指向性ペプチドベクターを構成するアミノ酸としてＬ体のアミノ酸のみを用いることが、生体内で分解されやすいことから、安全性や抗原性の点で好ましい。これら腫瘍指向性ペプチドベクターは、それぞれ公知のペプチド合成法により作製した本件腫瘍侵入環状ペプチドとヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドとを結合させることにより、調製することができる。
【００２１】
上記ヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドとしては、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されているペプチドであれば特に制限されるものではなく、リジンの側鎖にヒスチジンが付加されていることにより、エンドソームに取り込まれた後のプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のエンドソームからの遊離が促進される点で好ましい。エンドソーム内はプロトンポンプにより酸性に傾いており、酸性下に荷電の変化するヒスチジンがエンドソームの膜の不安定化をもたらし、エンドソームからの遊離が促進される。ヒスチジンがリジン残基４個に対して１個程度の割合で付加されているものがエンドソームからの遊離効率を促進する点で好ましい。また、上記ヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドにおけるリジン残基数が２０個未満であると、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等とのイオン結合が不十分なものとなる可能性があり、他方リジン残基数が４０個を越えると、プラスミドに対する腫瘍指向性ペプチドベクターの結合数が減少し、プラスミド等の細胞内への取り込み効率が低下する。
【００２２】
本発明の他の態様の腫瘍指向性ペプチドベクターとしては、本件腫瘍侵入環状ペプチドに、脂肪酸分子とヒスチジン化ポリリジンからなるペプチドとを結合させた腫瘍指向性ペプチドベクターであって、前記ヒスチジン化ポリリジンが、２０〜４０個のリジン残基を有し、かつリジン残基４個に対して１個の割合でヒスチジンが付加されているペプチドベクターや、本件腫瘍侵入環状ペプチドに、脂肪酸分子と２０〜４０個のリジン残基を有するポリリジンからなるペプチドとを結合させたペプチドベクターや、本件腫瘍侵入環状ペプチドに脂肪酸分子を結合させたペプチドベクターを例示することができる。本件腫瘍侵入環状ペプチドに、例えばスペーサーとしてのグリシン２分子を介して、脂肪酸を１分子結合させた上記腫瘍指向性ペプチドベクターは、遺伝子導入用リポソームまたは脂質と組み合わせると本件腫瘍侵入環状ペプチド部分が外側に向く構造とすることができる点で好ましい。
【００２３】
次に、本発明の腫瘍指向性ペプチドベクター複合体としては、上記の本発明の腫瘍指向性ペプチドベクターと、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等とから構成されるものであれば特に制限されるものではなく、かかる腫瘍指向性ペプチドベクター複合体は、例えば、上記腫瘍指向性ペプチドベクターと、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等とを緩衝液中等で混合し、室温で３０分静置することにより調製することができる。用いるプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等はそれぞれ２種以上の混合物でもよく、また、これらプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等の混合物と腫瘍指向性ペプチドベクターとの複合体とすることもできる。また、腫瘍指向性ペプチドベクターとプラスミドとの構成比は用いるプラスミドの大きさにもよるが、リジン残基を２４個含む場合、通常２０００：１〜４０００：１（モル比）とすることができ、腫瘍指向性ペプチドベクターとｓｉＲＮＡとの構成比は、通常１：１〜３：１（モル比）とすることができ、腫瘍指向性ペプチドベクターとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの構成比は、通常１：１〜２：１（モル比）とすることができる。
【００２４】
また、腫瘍指向性ペプチドベクター複合体が腫瘍細胞内に取り込まれた後の実際の変化については、正確には解明されていないが、細胞に取り込まれてエンドソーム内でペプチドベクターとプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等とが解離し、分解を逃れた一部のプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等が核に向かうとされている。ペプチドベクターとプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等の解離に先だって、ペプチドベクターが分解されることが必要か否かも明らかにされていないが、少なくともプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等の核に向かう効率を良くするためにヒスチジンを利用したことになる。ペプチドベクターとプラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸等は希釈されることにより解離する。そして、核に移行したプラスミドよりｍＲＮＡが転写され、細胞質でｍＲＮＡより蛋白が翻訳されることになる。
【００２５】
上記腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を構成するプラスミドとしては、公知の自殺遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、アポトーシス誘発遺伝子、サイトカイン遺伝子、新生血管抑制因子遺伝子、蛍光物質産生酵素遺伝子、あるいは今後開発される抗腫瘍効果を発揮する人工遺伝子等の発現能を有するプラスミドであることが好ましく、自殺遺伝子としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子等を、アンチセンス遺伝子としては、アンチセンスＫ−ｒａｓ  ＲＮＡ発現遺伝子等を、リボザイム遺伝子としては、Ｋ−ｒａｓ  ＲＮＡに対するリポザイム発現遺伝子等を、アポトーシス誘発遺伝子としては、Ｆａｓ遺伝子、ＴＮＦ受容体遺伝子、ｐ５３癌抑制遺伝子等を、サイトカイン遺伝子としては、ＴＮＦα発現遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ発現遺伝子、ＩＬ２発現遺伝子、ＩＦＮγ発現遺伝子等を、新生血管抑制因子遺伝子としては、アンギオスタチン遺伝子等を、それぞれ具体的に例示することができる。
【００２６】
上記腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を構成するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸としては、癌の増殖、進展に関与する遺伝子のセンス鎖に結合するものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、ｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２：６６８−６７５，１９９６）、変異Ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８０：５５３−５５８，１９９９）、その他Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡ、ｃｄｃ２キナーゼｍＲＮＡ、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１  ｍＲＮＡなどに対するｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸を具体的に例示することができる。アンチセンスオリゴ核酸には、非修飾体であるフォスフォジエステル体とヌクレアーゼ耐性のフォスフォチオエイト体があるが、共に用いることができる。
【００２７】
本発明の進行固形癌の治療剤は、上記環状ペプチド−タンパク質／ペプチド結合体や、環状ペプチド−ポリ／オリゴヌクレオチド結合体や、腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を含有するものであればどのようなものでもよく、腫瘍指向性ペプチドベクター複合体を含有する治療剤は便宜上前記腫瘍指向性ペプチドベクターと上記プラスミド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸とが複合体を形成する前の別キットとされているものも含まれる。また、上記進行固形癌としては、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、胆道癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌等を挙げることができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実験の材料及び方法
（材料）
・膵癌細胞株（Ｈｓ７００Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）
・ヌードマウス（ｍａｌｅ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ）：Ｃｌｅａ  Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）
・ファージライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ  ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）
・シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
【００２９】
（方法）
（１）培養実験
一回目のファージの選別：
膵癌細胞株（Ｈｓ７００Ｔ細胞）を６ウェルプレート上で、１０％胎児牛血清（１０％ＦＢＳ）を含む培養液中で培養した。培養液を１ｍｌの新鮮な１０％ＦＣＳ培養液に取り替えた後に、５μｌのファージライブラリーの原液（Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）を加えた。一晩（約１６時間）培養後にリン酸化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、細胞表面に付着するファージを不活化するためアルカリプロテア−ゼであるズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）１ｍｌ（３ｍｇ／ｍｌ）で４℃、１時間ゆっくり震盪させながら処理した。エッペンドルフチューブに細胞および溶液を移し、ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）０．７ｍｌ（１ｍＭ）を加えて４℃で１５分間インキュベートしズブチリシンを不活性化した。そして細胞を洗浄後、表面活性剤である２％ＤＯＮａ（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）０．５ｍｌ中で、室温１時間震盪させながらインキュベートし、細胞膜を溶解した。この溶解液中に存在する選別されたファージを、Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔの指示書通りに回収増幅し、そして濃縮ファージ液とした。
【００３０】
二回目のファージの選別：
６ウェルプレート上のＨｓ７００Ｔ細胞の培養液を１ｍｌの新鮮な１０％ＦＣＳ培養液に取り替え３０分後に、今度は１０μｌの一回目の選別で得た濃縮ファージを加えさらに３０分間培養した。細胞をＰＢＳで４回洗浄して培養液中のファージを取り除き、２ｍｌの新鮮な１０％ＦＣＳ中でさらに８時間培養を続けた。この条件で生き延びた、つまり細胞内に取り込まれエンドゾームから脱出できたと予想されるファージ（Ｉｖａｎｅｎｋｏｖ  ＶＶ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４４８：  ４５０−４６２，  １９９９）を、一回目のファージの選別の場合と同様に回収した。Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔの指示書通りに、プレート上で回収したファージのコロニーを形成させ、それぞれのコロニーを溶液中でさらに増幅させ、ＤＮＡを抽出しシークエンスに供した。決定された塩基配列より、二つのシステイン（Ｃ）の間のライブラリーとしての任意の１０個のアミノ酸配列を同定した。
【００３１】
（２）ヌードマウス実験
ヌードマウスの側腹部の皮下に二箇所にＨｓ７００Ｔ細胞を接種して、二つの独立した腫瘍を形成させた。腫瘍が２ｃｍ大以上になったところで、一つの腫瘍の一端に、５μｌのファージライブラリーの原液を加えた５０μｌＰＢＳを注入し、約１６時間後に注入部位から約２ｃｍ離れた同じ腫瘍の他端と、注入部位から約４ｃｍ離れたもう一つの腫瘍の部位から５〜６ｍｍ立方の腫瘍組織を摘出した。１８ゲージ付き注射器を用いて、ＰＢＳ中で摘出した腫瘍組織の細胞を分離させ、培養実験と同様ズブチリシン、ＰＭＳＦ、２％ＤＯＮａで処理をして、細胞内のファージを回収した。ここでは、回収したファージをそのままプレート上にコロニーを形成させて、ＤＮＡの抽出、シークエンス、そして任意の１０個のアミノ酸配列を同定した。
【００３２】
（３）蛍光蛋白と環状ペプチドの融合蛋白発現プラスミドの構築
まず、大腸菌でのタグ蛋白発現ベクターであるｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）のクローニングサイトＢｇｌＩＩとＫｐｎＩの部位に、蛍光蛋白のひとつＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現ベクターｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を鋳型にしてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で増幅したＧＦＰフラグメントを組み入れた。次に、この組み込まれたＧＦＰのＣ末端に任意の環状ペプチドを融合させるために、ファージＤＮＡより環状ペプチドを含むＰＣＲフラグメントを得るためのファージＤＮＡに相補的な共通のプライマーを次のように設計した。
上流プライマー；  ５’−ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣ−３’（配列番号３５）
下流プライマー；  ５’−ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＣＡ−３’（配列番号３６）
【００３３】
上流プライマー部位より下流で環状ペプチド部位より上流のファージＤＮＡに、ＫｐｎＩの認識部位が存在している。下流プライマーは５’側にＨｉｎｄＩＩＩのタグを持ち、また環状ペプチドのＣ末端のシステインの次のグリシンの直後がストップコドンとなるように、３’側から７番目の塩基に、相補的なＧからＴへと一塩基変異を挿入した。したがって、両プライマーで任意のファージＤＮＡを鋳型としてＰＣＲフラグメント生成し、制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し得られた断片を、ＧＦＰを組み入れたｐＲＳＥＴ−ＡのＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位にさらに組み入れると、ＧＦＰのＣ末端にグリシンが付加させた任意の環状ペプチドを融合させることができる。
【００３４】
このようにして構築されたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１にトランスフォームし、６ｘＨｉｓタグ付のＧＦＰと環状ペプチドの融合蛋白を発現させた。大腸菌を０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶菌し、発現した融合蛋白を６ｘＨｉｓに結合するニッケルビーズで回収した。ニッケルビーズをＰＢＳで洗浄後、１００ｍＭイミダゾールを加えたＰＢＳ中で６ｘＨｉｓとニッケルビーズを分離し、ＧＦＰと環状ペプチドの融合蛋白の溶解液を作製した。
【００３５】
（４）ＧＦＰと環状ペプチドの融合蛋白の細胞内取り込み実験
８ウェルのカバースライドグラス上にＨｓ７００Ｔ細胞を培養し、培養液を２００μｌの新鮮な１０％ＦＣＳ培養液に取替え、得られたＧＦＰと環状ペプチドの融合蛋白を１００μｇ／ｍｌの濃度で加え、さらに２時間３７℃で培養を続けた。１ｍｇ／ｍｌウシアルブミンを加えた０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で２回、さらにＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で融合蛋白の細胞内取り込みを観察した。
【００３６】
（結果）
（１）培養Ｈｓ７００Ｔ細胞に対して２回選別し同定されたアミノ酸配列
２６コロニーをシークエンスした結果：
2005021021.tif 000002
【００３７】
（２）ヌードマウスの皮下接種腫瘍組織（Ｈｓ７００Ｔ細胞）に対して選別同定されたアミノ酸配列：
（ａ）ファージライブラリー注入部位（皮下腫瘍組織の一端）から約２ｃｍ離れた部位（腫瘍組織の他端）から回収したファージ（全体のおよそ１／５にあたる１０コロニーのみシークエンス）
2005021021.tif 000003
【００３８】
（ｂ）ファージライブラリーを注入した腫瘍組織と約４  ｍ離れ、独立した皮下腫瘍組織（Ｈｓ７００Ｔ細胞）から回収したファージ（得られた１４コロニーすべてをシークエンス）
2005021021.tif 000004
【００３９】
（３）ＧＦＰと環状ペプチドの融合蛋白の細胞内取り込み
同定された環状ペプチドの中で＃２，５，６，１０，２５，３５について、ＧＦＰとそれら環状ペプチドの融合蛋白を作成しその細胞内取り込みについて実験した。実験した６種類の融合蛋白が、ＨＳ７００Ｔ細胞内に取り込まれることを蛍光顕微鏡で確認した。その代表例として、＃１０の結果を図１に示す。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によると、肝癌、膵癌等の進行固形癌に対して繰り返し全身投与が可能なドラッグデリバリーシステム上有用な、腫瘍細胞に取り込まれ細胞質に移行可能な環状ペプチドからなるペプチドベクター及び該環状ペプチドを用いた腫瘍指向性ペプチドベクターを提供することができ、これらのペプチドベクターは、腫瘍指向性を有しかつ細胞内に取り込まれた後にプラスミドやオリゴ核酸のエンドソームからの遊離を促進する要素を有するので、進行固形癌患者の遺伝子治療や進行固形癌の診断が可能となる。
【００４１】
【配列表】
2005021021.tif 000005
2005021021.tif 000006
2005021021.tif 000007
2005021021.tif 000008
2005021021.tif 000009
2005021021.tif 000010
2005021021.tif 000011
2005021021.tif 000012
2005021021.tif 000013
2005021021.tif 000014
2005021021.tif 000015
2005021021.tif 000016
2005021021.tif 000017
2005021021.tif 000018
2005021021.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の環状ペプチドベクターとＧＦＰとの融合蛋白の腫瘍細胞内への取り込みを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１】
2005021021.tif 000020