(57)【要約】【課題】  本発明は、イムノアッセイを電気化学的に分析するイムノアッセイ分析装置、並びに、そのイムノアッセイ分析装置に用いるチップ電極および検査チップに関し、ＰＯＣＴ（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）に適するとともに、ランニングコストを安価に抑える。【解決手段】  イムノアッセイを行う検査チップ１０と電気化学検出を行うチップ電極１０を分離して作製し、それらをチップホルダー４０により高精度に位置決めして重ね合わせて分析を行ない、白金や金などの貴金属をスパッタリングしたチップ電極を何度でも繰り返し使用可能とし、簡便で安価に作製可能な検査チップを使い捨てにする。【選択図】        図１０
2005227096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノアッセイを電気化学的に分析するイムノアッセイ分析装置において、
分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成されてなる検査チップと、
イムノアッセイが行なわれた後の検査チップに、前記凹部に形成された側の面に接するように重ね合わされた状態で用いられる、前記検査チップに形成された凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともに、前記凹部および前記検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなるチップ電極と、
前記検査チップと前記チップ電極を重ね合わせた状態で装抜自在に装着するとともに分析用の溶液を収容する測定セルと、
前記測定セルに収容され前記溶液導入流路を通って前記分析部に流入した溶液と該分析部の標識酵素との間の反応を電気化学的に分析するポテンシュスタット部とを備えたことを特徴とするイムノアッセイ分析装置。
【請求項２】
前記検査チップと前記チップ電極とを重ね合わせた状態に保持するチップホルダを備え、
前記測定セルは、前記検査チップと前記チップ電極を保持したチップホルダを装抜自在に装着することにより、前記検査チップと前記チップ電極を装抜自在に装着するものであることを特徴とする請求項１記載のイムノアッセイ分析装置。
【請求項３】
前記検査チップは、前記凹部を複数配列してなるものであり、
前記チップ電極は、前記検査チップに重ね合わされた状態における該検査チップに配列された複数の凹部それぞれに対面する位置にそれぞれ露出した、相互に独立な複数の検出電極を有するとともに、相互に対応する凹部と検出電極からなる複数の分析部それぞれに、分析用の溶液を、各分析部ごとに独立に流入させる複数の溶液導入流路が形成されたものであることを特徴とする請求項１記載のイムノアッセイ分析装置。
【請求項４】
分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成されイムノアッセイが行なわれた後の検査チップに、前記凹部が形成された側の面に接するように重ね合わされた状態で用いられる、前記凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともに、前記凹部および前記検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなることを特徴とするチップ電極。
【請求項５】
このチップ電極は、前記凹部が複数配列された検査チップと重ね合わされた状態で用いられるものであって、該検査チップに重ね合わせた状態における該検査チップに配列された複数の凹部それぞれに対面する位置にそれぞれ露出した、相互に独立な複数の検出電極を有するとともに、相互に対応する凹部と検出電極からなる複数の分析部それぞれに、分析用の溶液を、各分析部ごとに独立に流入させる複数の溶液導入流路が形成されたものであることを特徴とする請求項４記載のチップ電極。
【請求項６】
分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成され、イムノアッセイが行なわれた後に、該凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともに該凹部および該検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなるチップ電極に前記凹部が形成された側の面が接するように重ね合わされて、前記溶液導入流路を通って前記分析部に流入してきた溶液と該分析部の標識酵素との間の反応の電気化学的分析に用いられることを特徴とする検査チップ。
【請求項７】
この検査チップは、前記検出電極および前記溶液導入流路が複数配列されたチップ電極に重ね合わされるものであって、該チップ電極に配列された複数の検出電極それぞれに対面する位置それぞれ形成され対面する検出電極とのペアからなる複数の分析部を形成する複数の凹部が配列されたものであることを特徴とする検査チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノアッセイを電気化学的に分析するイムノアッセイ分析装置、並びに、そのイムノアッセイ分析装置に用いるチップ電極および検査チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、医療分野において患者や健常者から採取した血液、尿、その他の体液などのサンプルを分析する際に、病院検査室や外注検査センターに委託することが常套手段であった。それに対し、診断―看護等の医療現場で実施する簡易検査や、患者自身が在宅で実施する自己検査の必要性が提唱されている。これらに加え、外来での診療中において瞬時に結果が得られる簡易・迅速検査、入院患者のベットサイドでリアルタイムに健康状態を経常的にモニターする検査などを包含する概念としてｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）の重要性が認識されつつある。さらに、食品の安全性や環境モニタリングなど非医療分野においても、フィールドや現場における検査の重要性が叫ばれつつある。
【０００３】
抗原抗体反応の高選択性と高親和性を利用するイムノアッセイは、生体試料中の微量物質（タンパク質、ホルモン等）の分析法として幅広く活用されており、医療診断や生化学研究などの分野において不可欠な分析法である。現在では、９６ウェルプレートを用いて、アッセイされた成分を固定化し個々をアドレス化する方法が確立されている。しかしながら、煩雑な操作と長い反応時間を要するため改良が求められており、ハイスループットスクリーニングを目的とし貴重なサンプルの消費量の低減と反応場の微小化が検討されている。複数サンプルの同時分析のために、ガラス基板上の微小空間にタンパク質のマイクロアレイを集積化した研究が数多くなされている（非特許文献１など）。
【０００４】
さらには、複数種のタンパク質を同時に配列・反応させるためにマイクロ流路を利用したマイクロモザイクイムノアッセイも報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
現時点では、主に蛍光など光学的手法がプロテインマイクロアレイのイメージング（検出）に用いられている。しかし、装置の小型化が容易で、操作が簡便な電気化学検出法に注目が集められ精力的に研究されている。ガラス基板上に作製した微小な凹凸の上に複数の抗体をスポット固定し、サンプル抗原および酵素標識抗体を用いてサンドイッチ構造を作製し、酵素反応を電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）で検出する研究が報告されている（非特許文献３）。
【０００６】
さらに簡便な操作を目指し、微細加工技術を駆使して基板上に作製した小孔に、電気化学計測に必要な作用極、参照極および対極を組み込んだ構造が提案された（Ｚ．Ｐ．Ａｇｕｉｌａｒ，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，３３２１−３３２９）。抗体を固定化した高分子膜をアレイ電極上に配置した電気化学デバイスを用いた多項目同時分析システムの構築も試みられている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Ｇ．  ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９，１７６０−１７６３；Ｐ．Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５，４３６８−４３７２
【非特許文献２】Ａ．  Ｂｅｒｎａｒｄ，  ｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，７３，８−１２
【非特許文献３】Ｈ．Ｓｈｉｋｕ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６８，１２７６−１２７８；Ｈ．Ｓｈｉｋｕ，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４３８，１８７−１９０；Ｓ．Ｋａｓａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，５７６１−５７６５
【非特許文献４】Ｋ．Ｋｏｊｉｍａ，ｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ２００３，７５，  １１１６−１１２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の研究中心の一つである光化学検出法を利用した免疫測定は、同一種類複数または多種類の抗体をアレイ状に配列して固定化したプロテインマイクロアレイを利用して、タンパク質（抗原）を任意の位置に捕捉させ、さらに標識抗体を反応させることにより、抗体―抗原―標識抗体と反応して固定されたサンドイッチ構造を構築し、微弱光検出システムを用いて得られる光の位置情報と強度から捕捉された抗原を定量的に多試料または多項目を一括で分析する方法である。この他にも、免疫計測において、抗原検出を目的とした競合法がある。競合法では、抗体固相化法と抗原固相化法が知られている。上記、背景技術に示した技術があるが、微弱な化学発光を検出するためには、超高感度発光検出システム、特殊な暗室を必要とする。装置は、かなり高額であるとともに、汎用性が低く問題となっている。
【０００８】
一方、電気化学的手法を用いた免疫測定も行われている。
【０００９】
しかしながら、電気化学的手法を用いた免疫計測では、抗体―抗原―標識抗体のサンドイッチ構造を電極表面上に構築していることが多い。この構造を構築するためには、タンパク質の固定化領域を既定する必要がある。この既定するために、微細加工技術を利用している。すなわち、微細加工技術を利用してマイクロメートルスケールの金電極を作製し、その金電極表面に抗体等のタンパク質を固定化している。しかしながら、電極上にタンパク質を固定化すると、使用後の完全な剥離が困難であるため再利用が難しい。電極材料として金や白金などの貴金属を用いる必要があり、貴金属を利用しているので、検出電極を使い捨てることは経済的であるといいがたく、電極を再利用できることが望ましい。
【００１０】
また、電気化学計測に必要な３つの電極（作用極、対極、参照極）をすべて組み込んだチップも作製されている。しかし、このチップは、製造工程が数段階以上から構成され複雑であり、作製に熟練者の技術と高コストを要する。この種のチップも再利用が困難であり、経済的といえない。
【００１１】
一方、電極上でなく、高分子やガラスのチップ上に抗体―抗原―標識抗体のサンドイッチ構造を作製し微小電極を近接させて電気化学的に検出した例もある。これは、電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）と呼ばれる手法を応用しているものであり、基板上の所定の領域に固定化された物質から放出または吸収される化学物質を、近傍に設置した微小な針型の電極（マイクロ電極）で電気化学的に検出する手法である。また、ＳＥＣＭでは、マイクロ電極を２次元に操作することにより、化学反応の拡がりをイメージとして得ることができる。その検出の際、電極電位を目的とする電気化学活性種を検出できる電位に設定しておく。免疫計測の際には、微小な特定領域に抗体―抗原−標識抗体のサンドイッチ構造を作製しマイクロ電極を近接させて標識抗体から生成される電気化学活性種やメディエータを介して標識酵素反応を検出する。捕捉された標識酵素抗体の活性から、サンプル抗原の量を決定できる。固定化された酵素の活性を電気化学的に電流情報として捕らえ、電流情報の位置と強度により、定性的および定量的に多項目または多検体を一括で検出する。しかし、酵素活性の評価にあたり、電流情報を得るための針型マイクロ電極のマイクロメートルオーダーでの位置制御を行う必要がある。ＳＥＣＭの検出系は、針型マイクロ電極、針型マイクロ電極の位置を制御するための３次元ステージ、光学顕微鏡、ＣＣＤ検出器、ポテンショスタットおよび電流情報を画像イメージに変換するソフトウェアで構成されており、かなり高額であるとともに、取り扱いに訓練を必要とする。
【００１２】
また、ＳＥＣＭでは、１チップを評価するために１０分から６０分程度の時間を必要とする。１チップにおける検査項目数または検査検体数を増やすと、さらに長時間の分析時間を必要となる。さらに、各サンプルを順番に計測するため、計測時間が少し異なる。
【００１３】
本発明は、上記事情に鑑み、ＰＯＣＴに適するとともにランニングコストが安価なイムノアッセイ分析装置、およびそのイムノアッセイ分析装置に用いるチップ電極、検査チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成する本発明のイムノアッセイ分析装置は、イムノアッセイを電気化学的に分析するイムノアッセイ分析装置であって、
分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成されてなる検査チップと、
イムノアッセイが行なわれた後の検査チップに、上記凹部が形成された側の面に接するように重ね合わされた状態で用いられる、検査チップに形成された凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともに、上記凹部および検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなるチップ電極と、
検査チップとチップ電極を重ね合わせた状態で装抜自在に装着するとともに分析用の溶液を収容する測定セルと、
測定セルに収容され溶液導入流路を通って分析部に流入した溶液とその分析部の標識酵素との間の反応を電気化学的に分析するポテンシュスタット部とを備えたことを特徴とする。
【００１５】
本発明のイムノアッセイ分析装置は、イムノアッセイを行う検査チップと電気化学検出を行うチップ電極を分離して作製し、それらを重ね合わせて分析を行うものである。これまでの検査チップやチップ電極に相当するものは、全てを使い捨てにすることを前提に作製されているが、本発明では、白金や金などの貴金属をスパッタリングしたチップ電極を何度でも繰り返し使用可能であり、簡便で安価に作製可能な検査チップを使い捨てにできる。このように、抗体が固定化された検査チップとその検出部であるチップ電極を別々に作製し重ね合わせることによりアドレス化し検出する方法は報告がない。さらに、本発明によれば、診断項目に応じた検査チップを作製することにより、多種類のタンパク質や小分子等、多種類の分析対象に対応可能である。
【００１６】
ここで、本発明のイムノアッセイ分析装置において、検査チップとチップ電極とを重ね合わせた状態に保持するチップホルダを備え、測定セルは、検査チップとチップ電極を保持したチップホルダを装抜自在に装着することにより、検査チップとチップ電極を装抜自在に装着するものであることが好ましい。
【００１７】
チップホルダを導入することにより、検査チップの凹部と検査電極を正確に位置決めすることができ、高精度の分析が可能となる。
【００１８】
また、本発明のイムノアッセイ分析装置において、検査チップは、上記凹部を複数配列してなるものであり、チップ電極は、検査チップに重ね合わされた状態におけるその検査チップに配列された複数の凹部それぞれに対面する位置にそれぞれ露出した、相互に独立な複数の検出電極を有するとともに、相互に対応する凹部と検出電極からなる複数の分析部それぞれに、分析用の溶液を、各分析部ごとに独立に流入させる複数の溶液導入流路が形成されたものであることが好ましい。
【００１９】
本発明のイムノアッセイ分析装置は、小型化に適し複数の分析部を並べることができる。また、相互に独立な溶液導入流路を形成することにより、溶液中に介在するメディエータ分子が各分析部間を行き来するクロストーク現象を十分に低いレベルに抑えることができ、複数の分析部において相互に影響を与えることなく独立した分析が可能である。
【００２０】
また、上記目的を達成する本発明のチップ電極は、分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成されイムノアッセイが行なわれた後の検査チップに、凹部が形成された側の面に接するように重ね合わされた状態で用いられる、凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともに、凹部および検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなることを特徴とする。
【００２１】
ここで、このチップ電極は、上記凹部が複数配列された検査チップと重ね合わされた状態で用いられるものであって、この検査チップに重ね合わされた状態におけるこの検査チップに配列された複数の凹部それぞれに対面する位置にそれぞれ露出した、相互に独立な複数の検出電極を有するとともに、相互に対応する凹部と検出電極からなる複数の分析部それぞれに、分析用の溶液を、各分析部ごとに独立に流入させる複数の溶液導入流路が形成されたものであることが好ましい。
【００２２】
また、上記目的を達成する本発明の検査チップは、分析対象の抗原と特異的に反応する抗体が固定化された凹部が形成され、イムノアッセイが行なわれた後に、その凹部に対面する位置に露出した検出電極を有するとともにその凹部および検出電極よりなる分析部に分析用の溶液を流入させる溶液導入流路が形成されてなるチップ電極にその凹部が形成された側の面が接するように重ね合わされて、溶液導入流路を通って分析部に流入してきた溶液とその分析部の標識酵素との間の反応の電気化学的分析に用いられることを特徴とする。
【００２３】
ここで、この検査チップは、検出電極および溶液導入流路が複数配列されたチップ電極に重ね合わされるものであって、チップ電極に配列された複数の検出電極それぞれに対面する位置それぞれ形成され対面する検出電極とのペアからなる複数の分析部を形成する複数の凹部が配列されたものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
以上説明したように、本発明によれば、ＰＯＣＴに適するとともに、ランニングコストを安価に抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下では、先ず、本発明の構成が有効であることの基礎的な検証実験について説明し、その後本発明の実施の形態について説明する。
（１）タンパク質および溶液
Ｃ反応性タンパク質抗原（ｒ−ＣＲＰ）、マウス単クローン性抗ＣＲＰ抗体（ＣＲＰ抗体）、マウス単クローン性抗ペプシノゲン１抗体（ＰＧ１抗体）、マウス単クローン性抗ペプシノゲン２抗体（ＰＧ２抗体）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識マウス単クローン性抗ＣＲＰ抗体（ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体）、西洋わさびパーオキシダーゼ標識マウス単クローン性抗ペプシノゲン１抗体（ＨＲＰ標識ＰＧ１抗体）および西洋わさびパーオキシダーゼ標識マウス単クローン性抗ペプシノゲン２抗体（ＨＲＰ標識ＰＧ２抗体）は、第一化学薬品工業製を用いた。ペプシノゲン１抗原（ＰＧ１）、ペプシノゲン２抗原（ＰＧ２）は、栄研製を用いた。抗原溶液および抗体溶液は、いずれもリン酸緩衝液（ＰＢＳ；８．１ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭＫＨ2ＰＯ4、２．７ｍＭＫＣｌ、１．４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で調整した。５０％（ｖ／ｖ）の牛血清を含むＰＢＳ溶液を用いて調整したＰＧ２抗原溶液も使用した。測定には、リン酸緩衝液（０．１ＭＮａ2ＨＰＯ4、０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4、０．１ＭＫＣｌ）で調節した０．５ｍＭ  フェロセンメタノール（ＦｃＯＨ、  ｐＨ６．８）水溶液を用いた。ＦｃＯＨは、酵素反応と電極反応のメディエータとして作用する。
（２）プロテインマイクロアレイおよび棒型作用電極を組み合わせたＣ反応性タンパク質の検出
（２−１）棒型作用電極の作製
ここでは抗体を固定化した分析用基板（後述する図１参照）を「プロテインマイクロアレイ」と称する。このプロテインマイクロアレイ上に構築した抗体−抗原−標識抗体のサンドイッチ構造を電気化学的に検出するために、棒型作用電極を作製した。銅リード線を溶接した直径３００μｍの金線を樹脂管（Ｓｔｒｉｐ  Ｓｔｙｒｅｎｅ  ２１７  ＳＡ、ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  ｓｃａｌｅ  ｍｏｄｅｌｓ社製）に挿入し、エポキシ樹脂（エポキシ樹脂Ｅｐｏｋ８１２、応研商事社製）を樹脂管の内部に充填して封入した。オーブン（６０℃）中で１２時間焼成してエポキシ樹脂を固化させ、片端をダイヤモンドグラインダー（ＥＧ−４００、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社製）で削り出し、金線の表面を露出させた。
【００２６】
（２−２）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）検出用チップの調整
図１に、構築したサンドイッチイムノアッセイ構造の概念図を示す。
【００２７】
ここでは、ポリスチレンの基体１１上にポリエステルフィルム１２が貼付されることにより分析用基板１０が構成されている。ポリエステルフィルム１２には貫通孔が形成されており、これによりその分析用基板１０に窪み（分析部１３）が形成されている。
【００２８】
この図１には、その窪み（分析部１３）に、一次抗体１−抗原２−ＨＲＰ標識二次抗体３のサンドイッチイムノアッセイ構造が模式的に示されている。
【００２９】
ここでは、５００μｇ／ｍｌ固相用一次抗体（ＣＲＰ抗体）０．８μｌを分析用基板の窪み（分析部１３）に滴下し、室温で３０分間感作した。Ｔｗｅｅｎ２０を体積比で０．０５％（ｖ／ｖ）含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で分析用基板１０を３回洗浄し、非特異吸着を抑制するため１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−を１ｍｌリットルあたり１０ｍｇ含むＰＢＳＴ溶液２μｌを窪み（分析部１３）に滴下して室温で２時間ブロッキング処理した。さらに、ＰＢＳＴで３回洗浄を行った。
【００３０】
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で任意に希釈した測定サンプル（抗原、ｒ−ＣＲＰ）０．８μｌをプロテインマイクロアレイの窪み（分析部）に滴下し、室温で１０分間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、３８１．２μＯ．Ｄ．／ｍｌ標識抗体（ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体）溶液を５，０００倍に希釈し、０．８μｌを窪みに滴下し、室温で１０分間反応させた。最後にＰＢＳＴで３回洗浄した。図１には窪み（分析部１３）が１つのみ示されているが、分析用基板１０には複数の分析部１３が配列されており、各分析部１３のｒ−ＣＲＰの濃度を、それぞれ、０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１，０００ｎｇ／ｍｌ、１０、０００ｎｇ／ｍｌとした。
【００３１】
（２−３）棒型作用電極の位置制御
プロテインマイクロアレイ上に構築した抗体−抗原−標識抗体のサンドイッチ構造を、棒型作用電極を検出プローブとして利用した電気化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）で評価した。図２に、評価法の説明図を示す。図２（Ｂ）は部分拡大図である。まず、０．５ｍＭ  ＦｃＯＨ水溶液２１で満たされた細胞培養用のプラスチックシャーレ２２にプロテインマイクロアレイ１０を挿入した。プロテインマイクロアレイに形成させた分析部（窪み）１３の位置を光学顕微鏡（ＴＭＤ３００、Ｎｉｋｏｎ社製）観察下で確認した。三極式の電気化学計測法を採用し、参照電極２３としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対極２４として白金電極を用いた。それぞれの電極をポテンショスタット（ＨＡ１０１０ｍＭ８、北斗電工社製）２５に接続した。任意のバルク溶液中でサイクリックボルタンメトリーを行い、さらに、サーボモーター駆動のＸＹＺ自動ステージ２６に装着された棒型作用電極２７を分析部１３の真上に移動させて上方から押し付け、再度、サイクリックボルタンメトリーを行った。
【００３２】
図３に、０．５ｍＭ  ＦｃＯＨ溶液中におけるサイクリックボルタモグラムを示す。図３（ａ）は、バルク溶液中で計測されたボルタモグラムである。Ａｇ／ＡｇＣｌからなる参照電極を用いその参照電極の電位を基準として棒状作用電極に初期電位として０．０Ｖを与えた（ここでは、これを「０．０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ」と表記する。以下同様）。その後、電位を０Ｖから正の方向へ速度５０ｍＶ／ｓで挿引し、０．５Ｖで負の方向に折り返して挿引した。０．０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから電位を正方向に挿引するとＦｃＯＨの酸化反応に起因した酸化電流が観測され、０．２７Ｖにピークを有する軌跡を描いた。挿引方向の折り返し後、酸化反応により電極表面で生成されたＦｃIIIＯＨの還元反応が観測され、酸化反応と同様にピーク（ピーク電位、０．２Ｖ）を有する波形となった。
【００３３】
図３（ｂ）は、棒型作用電極を分析部の上方から分析部に押し付けた際に計測されたボルタモグラムである。電極高さを降下させる、つまり、電極表面−プロテインマイクロアレイ間距離が小さくなると電極反応物質であるＦｃＯＨの電極表面への拡散による供給が妨害されるため、酸化電流は減少した。さらに、電極反応により生成されたＦｃIIIＯＨの分析部および電極により定義された微小空間からの拡散放出が妨害されるため還元電流は増加した。棒型作用電極を分析部の上方から分析部に押し付けた際、プロテインマイクロアレイの分析部と棒型作用電極で定義された空間は、完全に外部溶液と遮断されておらず、わずかな液絡が生じているため電気化学計測が可能である。棒型電極の押さえつけ強度に依存して、外部から分析空間内に拡散するＦｃＯＨの量が変化することによりＦｃＯＨの酸化還元電流波形が変化し、その波形や電流量から棒型作用電極のｚ方向位置情報を得ることができ、高精度にタンパク質検出を行うために棒型電極の押さえつけ強度を一定にすることができる。すなわち、サイクリックボルタモグラムの波形およびピーク電流値を一定にすることによって、電極の配置を決定した。今回、電極を押さえつけた際のボルタモグラムにおける酸化電流ピークをバルクにおけるそれの５０％である４０ｎＡに設定した。
【００３４】
（２−４）棒型作用電極を用いたプロテインマイクロアレイ上におけるＣ反応性タンパク質の電気化学的評価
免疫計測を行う電極位置を上記の手法を用いて決定した後、標識酵素（ＨＲＰ）の基質である過酸化水素溶液（最終濃度０．１０ｍＭ）を添加し、溶液をピペッティングにより攪拌し、４．５分間静置した。この際、プロテインマイクロアレイの分析部内に過酸化水素を十分供給するために、電極位置決定後、電極を１ｍｍ上昇させ保持した。再度、電極を決定位置に配置し、３０秒後にアンペロメトリー計測を行った。電極電位を、０．１６Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌまたは０．１２Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌに設定した。図４（Ａ）に、ｒ−ＣＲＰを（ａ）０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）１０００ｎｇ／ｍｌおよび（ｅ）１０、０００ｎｇ／ｍｌの濃度で反応させた各分析部を対象とした際のアンペログラムを示す。ここで、ｒ−ＣＲＰを反応させた後、３８１．２μＯ．Ｄ．／ｍｌのＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体をＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体を用いて反応させている。電位を、時間０秒で開回路電位から０．１６Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌへステップさせた。すべての分析部における計測で、電位ステップ直後にスパイク状に電流の増加が観測され徐々に減少して定常電流を得た。電流が酸化側（プラス側）に増加しているのは、分析チップ内に存在するＦｃＯＨが経常的に酸化されているためである。免疫反応により分析部に固定化された一次抗体（ＣＲＰ抗体）に抗原（ｒ−ＣＲＰ）および標識二次抗体（ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体）が捕捉されサンドイッチ構造が構築されていると、ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の酵素により過酸化水素の還元反応およびＦｃＯＨの酸化反応が進行するため、酵素によりＦｃＯＨは消費されるとともに生成されたＦｃIIIＯＨは電極表面に到達し還元される。図４（Ｂ）に、ｒ−ＣＲＰ抗原濃度に対する電流変化量を示す。この電流変化は、図４（Ａ）で得られた各アンペログラムの３００−４００秒に得られた電流値を平均して算出した値から、図４（Ａ）ａから得られた値を差し引いている。すなわち、図４（Ａ）ａで得られた値はｒ−ＣＲＰを反応させていないので、バックグラウンド電流を差し引いていることになる。プロテインマイクロアレイに作用させたｒ−ＣＲＰ抗原濃度を増加させると観測される電流変化量が増加した。これは、チップに固定化された一次抗体に特異的に反応したｒ−ＣＲＰ抗原量に依存している。ｒ−ＣＲＰ抗原濃度が濃いと固定化一次抗体との反応量が増加し捕捉量が増加する。さらには、標識二次抗体の反応量も増加しその捕捉量も増加する。すなわち、酵素反応によって消費されるＦｃＯＨの量が増加し、生成されるＦｃIIIＯＨの量も増加するため電流変化量の増加につながる。図４（Ｂ）をＣＲＰ抗原の検量線として使用することができ、未知の抗原濃度サンプルをプロテインマイクロアレイに作用させ、得られた還元電流応答からサンプル中に含まれていた抗原量を決定できる。
【００３５】
しかし、各濃度の抗原を作用させた分析部に対し、電極を測定ごとに分析部へと移動させ、正確な位置制御を行う必要がある。また、この手法を用いて複数のサンプルを検出する際には、各分析部を順番に計測するため測定時刻に時差が発生する。抗原の検出には標識酵素（ＨＲＰ）の酵素反応により生成される酸化型メディエータの電極による還元反応を利用しているので、基質である過酸化水素を添加した後に進行する酵素反応の進行程度の時間による相違から正確な測定が困難になる。
（３）プロテインマイクロアレイおよび棒型作用電極を組み合わせたペプシノゲン１（ＰＧ１）およびペプシノゲン２（ＰＧ２）の検出
（３−１）ペプシノゲン１（ＰＧ１）およびペプシノゲン２（ＰＧ２）検出用チップの調整
ペプシノゲン１およびペプシノゲン２検出用のチップ作製方法は同じである。まず、５μｇ／ｍｌ固相用一次抗体（ＰＧ１抗体、またはＰＧ２抗体）０．８μｌを分析用基板の窪み（貫通孔部分）に滴下し、室温で３０分間感作した。チップを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、非特異吸着を抑制するためブロックエース（ＢＡ、大日本製薬社製）２μｌを窪み（分析部１３）（図１参照）に滴下して室温で２時間ブロッキング処理した。さらに、ＰＢＳＴで３回洗浄を行った。
【００３６】
ＰＢＳで任意に希釈した測定サンプル（抗原、ＰＧ１またはＰＧ２）０．８μｌをプロテインマイクロアレイの窪み（分析部）に滴下し、室温で３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌ標識二次抗体（ＨＲＰ標識ＰＧ１抗体、またはＨＲＰ標識ＰＧ２抗体）溶液０．８μｌを窪みに滴下し、室温で３０分間反応させた。最後にＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＧ１の濃度を、それぞれ、０ｎｇ／ｍｌ、１．３ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、５．０ｎｇ／ｍｌ、１０．１ｎｇ／ｍｌとした．また、ＰＧ２の濃度を、それぞれ、０ｎｇ／ｍｌ、１．３ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、５．１ｎｇ／ｍｌ、１０．２ｎｇ／ｍｌとした。
【００３７】
（３−２）棒型作用電極を用いたプロテインマイクロアレイ上におけるペプシノゲン１およびペプシノゲン２の電気化学的評価
測定に用いた電極は、（２−１）で作製した棒型電極を用いた。棒型電極の位置制御は、（２−３）と同様に行った。電気化学顕微鏡システムを用いて、上記手法に基づいて棒型作用電極をＰＧ１検出用チップの分析部に配置し、アンペロメトリー（ＰＳＣＡ）計測を試みた。図５（Ａ）に、ＰＧ１を（ａ）０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１．３ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）２．５ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）５．０ｎｇ／ｍｌおよび（ｅ）１０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で反応させた分析部を対象とした際のアンペログラムを示す。ここで、ＰＧ１を反応させた後、１μｇ／ｍｌＨＲＰ標識ＰＧ１抗体および１μｇ／ｍｌＨＲＰ標識ＰＧ２抗体をそれぞれ反応させている。電位を、時間０秒で開回路電位から０．１２Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌへステップさせた。すべての分析部における計測で、電位ステップ直後にスパイク状に電流の増加が観測され徐々に減少して定常電流を得た。免疫反応により分析部に固定化された一次抗体（ＰＧ１抗体）に抗原（ＰＧ１）および標識二次抗体（ＨＲＰ標識ＰＧ１抗体）が捕捉されサンドイッチ構造が構築されていると、ＨＲＰ標識ＰＧ１抗体の酵素により過酸化水素の還元反応およびＦｃＯＨの酸化反応が進行するため、酵素によりＦｃＯＨは消費されるとともに生成されたＦｃIIIＯＨは電極表面に到達し還元される。図５（Ｃ）に、ＰＧ１抗原濃度に対する還元電流を示す。この還元電流値は、図５（Ａ）で得られた各アンペログラムの２００−３００秒に得られた電流値を平均して算出した値から、図５（Ａ）ａから得られた値を差し引いている。すなわち、図５（Ａ）ａで得られた値はＨＲＰ標識ＰＧ１抗体を反応させていないので、バックグラウンド電流を差し引いていることになる。プロテインマイクロアレイに作用させたＰＧ１抗原濃度を増加させると観測される還元電流が増加した。これは、チップに固定化された抗体に特異的に反応したＰＧ１抗原量に依存している。ＰＧ１抗原濃度が濃いと固定化一次抗体との反応量が増加し捕捉量が増加する。さらには、標識二次抗体の反応量も増加しその捕捉量も増加する。すなわち、酵素反応によって消費されるＦｃＯＨの量が増加し、生成されるＦｃIIIＯＨの量も増加するため電流変化量の増加につながる。図５（Ｃ）をＰＧ１抗原の検量線として使用することができ、未知の抗原濃度サンプルをプロテインマイクロアレイに作用させ、得られた還元電流応答からサンプル中に含まれていた抗原量を決定できる。
【００３８】
ＰＧ２を用いて上記と全く同様の計測を試みた。図５（Ｂ）に、ＰＧ２の濃度を、それぞれ、（ａ）０ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１．３ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）２．５ｎｇ／ｍｌ、（ｄ）５．１ｎｇ／ｍｌおよび（ｅ）１０．２ｎｇ／ｍｌの濃度で反応させた分析部を対象とした際のアンペログラムを示す。ＰＧ１の場合と比較して、ほぼ同様の結果が得られ、作製したＰＧ２検出用チップを用いるとＰＧ２抗原が電気化学的に検出可能であることが示された。
【００３９】
図５（Ｄ）に、ＰＧ２抗原濃度に対する還元電流を示す。図５（Ｄ）をＰＧ１抗原の検量線として使用することができ、未知の抗原濃度サンプルをプロテインマイクロアレイに作用させ、得られた還元電流応答からサンプル中に含まれていた抗原量を決定できる。
【００４０】
しかし、各濃度の抗原を作用させた分析部に対し、電極を測定ごとに分析部へと移動させ、正確な位置制御を行う必要がある。また、この手法を用いて複数のサンプルを検出する際には、各分析部を順番に計測するため測定時刻に時差が発生する。抗原の検出には標識酵素（ＨＲＰ）の酵素反応により生成される酸化型メディエータの電極による還元反応を利用しているので、基質である過酸化水素を添加した後に進行する酵素反応の進行程度の時間による相違から正確な測定が困難になる。そこで、複数の分析部アレイを有するプロテインマイクロアレイと、その分析部アレイと同配列を有するチップ電極を組み合わせた一括同時分析システムを構築した。
【００４１】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
（４）プロテインアレイチップおよびチップ電極を組み合わせたマルチイムノアッセイシステム
（４−１）ガラスチップ上アレイ電極（チップ電極）の作製
図６（同図（Ａ）上面図、（Ｂ）Ｘ軸（ｉ−ｉ）断面図、（Ｃ）Ｙ軸（ｉｉ−ｉｉ）断面図）に、８個の正方形金電極（５００μｍ×５００μｍ）の検出電極３１（上面図の左から検出電極をＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８と、それぞれ称す）、８本の金リード線３２と８個のボンディング部３３、その検出電極３１を定義しさらに金リード線３２を絶縁被服するためのポリイミド３４およびポリイミドで定義された検出電極３１（さらには、分析部）に測定溶液を導入するための溶液導入流路３５を有する検出用基板を示し、次に、その作製方法を説明する。ここで、作製した検出用基板を「チップ電極」３０と称す。ボンディング部３３は外部回路との接続部位である。
【００４２】
洗浄済みガラス基板３９（４１ｍｍ×２６ｍｍ、厚さ１ｍｍ、松浪社製）にフォトリソグラフィーを利用して８個の独立して作動する金電極をアレイ状に配置した。まず、ガラス基板上にプライマー（ＯＡＰ、東京応化社製）およびポジティブフォトレジスト（ＯＦＰＲ−５０００、東京応化社製）を順にスピンコートした。次に、基板をオーブン（９０℃）中で３０分間プレベークし、その上に予め作製したマスクパターンを密着させ、水銀ランプ（５００Ｗ）を用いて紫外光を照射（２５ｍＪ／ｃｍ2）した。マスクには、検出電極３１、金リード線３２およびボンディング部３３に相当する部分に照射された紫外光が到達するパターンがデザインされている。現像液（ＮＭＤ−Ｗ２．３８％、東京応化社製）中で１００秒間現像し、検出電極３１、金リード線３２およびボンディング部３３に相当する感光部分を溶出させた。蒸留水中で１５秒間ずつ２回洗浄し、１３０℃で３０分間ポストベークした。ガラス基板上にチタン（厚さ１０ｎｍ）および金（厚さ２００ｎｍ）を順にスパッタ蒸着し、アセトン溶液中に浸漬することによりフォトレジストおよびフォトレジスト上のチタンおよび金薄膜をリフトオフしアレイ電極を得た。検出電極３１の幅は５００μｍであり、隣接する検出電極どうしの間隔は３．５ｍｍ（検出電極中心間距離は４ｍｍ）である。ボンディング部３３の大きさは１０ｍｍ×２．５ｍｍで、それぞれのボンディング部の間隔は１．５ｍｍである。また、検出電極３１とボンディング部３３を接続する金リード線３２は、長さ９．９ｍｍ、幅１．５ｍｍおよび０．３ｍｍである。図７に検出電極、金リード線、およびボンディング部３３の形状を示す。
【００４３】
さらに、このアレイ電極基板に感光性ポリイミドプレポリマー（フォトニースＵＲ−３１４０、東レ社製）をスピンコートした。オーブン（７７℃）中で８５分間プレベークし、その上に予め作製したマスクパターンを密着させ、水銀ランプ（５００Ｗ）を用いて紫外光を照射（６０００ｍＪ／ｃｍ2）した。マスクには、ボンディング部周辺および流路部に相当する部分に照射された紫外光が到達しないパターンがデザインされている。現像液（ＴＯＲＡＹフォトニース、東レ社製）中で１５分間現像し、感光部分以外を溶出させた。２−プロパノール中で１分間ずつ２回洗浄し、１００℃、２００℃、３００℃の順で、それぞれ３０分間ポストベークした。ポリイミド薄膜の厚さは８μｍであり、金リード線の絶縁および検出電極への溶液導入流路の定義の役割を担う構成となっている。ポリイミドで定義された溶液導入流路３５は、長さ６．１５ｍｍ、幅０．６ｍｍであり、流路の端点に検出電極３１が配置されている。
【００４４】
（４−２）分析用基板の作製
図８（同図（Ａ）上面図、（Ｂ）ｉ−ｉ断面図）に、８個の正方形（１ｍｍ×１ｍｍ）の窪みで定義された分析部を有する分析基板１０を示し、次に、その作製方法を説明する。洗浄済みポリスチレン製基板１１（３５ｍｍ×１１ｍｍ）上に、ポリスチレン製基板（厚さ１．７ｍｍ）と同サイズの８個の正方形（１ｍｍ×１ｍｍ）の貫通孔を有する接着性ポリエステルフィルム１２（ＴＬ−８５−２５、厚さ５０μｍ、リンテック社製）を接着させた。８個の貫通孔はレーザー加工機（ＷＩＮ−ＬＡＳＥＲ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ社製）を用いて作製され、孔の位置はチップ電極３０の８個の検出電極３１（図６参照）と同じ配置に配列されており、孔中心間距離もチップ電極の検出電極と同じ４ｍｍとした。上面図（図８（Ａ））の右から分析部１３をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７およびＡ８と、それぞれ称す。このポリエステルフィルムで定義された貫通孔の底面のポリスチレン基板表面を抗体固定化相として利用した。
【００４５】
（４−３）プロテインマイクロアレイの作製およびプロテインマイクロアレイ上における免疫反応
図１に、構築したサンドイッチイムノアッセイ構造の概念図を示す。作製した分析用基板のポリエステルフィルム１２で定義された分析部１３の底面のポリスチレン基板１１表面上に、サンプル中に存在する分析対象物質（抗原）と特異的に反応する抗体（一次抗体）を固定化した。固定化には、物理吸着を利用している。この抗体を固定化した分析用基板１０を「プロテインマイクロアレイ」と称する。プロテインマイクロアレイ上に固定された抗体１に、抗原２およびＨＲＰ標識二次抗体３を順に反応させて抗体−抗原−ＨＲＰ標識抗体のサンドイッチ構造を構築した。
【００４６】
（４−４）チップホルダーの作製
重ね合わせたチップ電極３０（図６参照）およびプロテインマイクロアレイ１０（図８参照）を保持するために、チップホルダーを作製した。図９に、チップホルダーの部品図を示す（同図（Ａ）部品ａ、（Ｂ）部品ｂ、（Ｃ）部品ｃ、（Ｄ）部品ｄ、（Ｅ）部品ｅおよび（Ｆ）チップ電極保持基板）。チップホルダーは、５個の部品で構成されており、そこにチップ電極およびプロテインマイクロアレイが組み込まれる。部品ａ、ｂ、ｃおよびｅは厚さ１ｍｍのアクリル基板（アクリサンデー板、アクリサンデー社製）、部品ｄは厚さ１．７ｍｍのポリスチレン基板をレーザー加工機で加工して作製されている。まず、切り出した部品ａ、ｂおよびｃをアクリル樹脂用接着剤（アクリサンデー、アクリサンデー社製）で貼り合わせ、電極保持基板４３（図８Ｆ）を作製した。電極は、チップ電極保持基板４３の部品ｂおよびｃで定義された部分（図８Ｆにハッチングで示したチップ電極保持部４１）に嵌め込まれる。部品ｄは、プロテインマイクロアレイと同様にポリスチレン製であり同じ厚さである。また、部品ｄの中央には、プロテインマイクロアレイをはめ込むための３５ｍｍ×１１ｍｍの孔４２が準備されている。このサイズは、プロテインマイクロアレイと同じ大きさである。
【００４７】
（４−５）チップホルダーの組み立て
部品ａ、ｂおよびｃを用いて作製した電極保持基板４３（図９Ｆ参照）に、チップ電極を組み込んだ。電極保持基板４３および部品ｅを用いて、プロテインマイクロアレイをはめ込んだ部品ｄを挟み込みチップホルダー４０（図１０参照）を組み立てた。これによりプロテイン同時分析チップ５０が完成した。図１０（同図（Ａ）上面図、（Ｂ）Ｘ軸（ｉ−ｉ）断面図、（Ｃ）（Ｂ）の拡大図）および（図１１）に、電極チップ３０およびプロテインマイクロアレイ１０を組み込んだチップホルダー４０、すなわち、プロテイン同時分析チップ５０の概略図を示す。
【００４８】
（４−６）測定セルの作製
図１２に測定セルの部品図、図１３に組み立てた状態の測定セルの構成を示す。この測定セル６０は、下方（１０ｍｍ）が液絡したスペーサ６１を含む直方体（２０．７ｍｍ×７０．０ｍｍ×２８．６ｍｍ）構造である。測定セル６０の上面図下方の入口６２（４．７ｍｍ×６１ｍｍ）から、組み立てたチップホルダー４０すなわちプロテイン同時分析チップ５０（図１０，図１１参照）を挿入し、上面図上方の入口６３から、１４ｍｌの測定溶液を注入した。構成部品を、それぞれ、レーザー加工機を用いて作製したアクリル基板をアクリル樹脂用接着剤で固定して組み立てた。
【００４９】
（４−７）マルチチャンネルプロテイン同時分析装置
図１４に、ＰＯＣＴを目的としたプロテインマイクロアレイの携帯型８チャンネル同時分析装置の構成図を示す。装置は、測定部７０とマルチポテンショスタット部８０から構成されている。測定部７０には、測定セル６０（図１３参照）に組み込まれたプロテイン同時分析チップ５０、参照電極７１および対極７２が収納される。測定部全体をノイズ低減のためアルミニウム板製のシールドボックスで覆う。測定部７０に収納されたプロテイン同時分析チップ５０のチップ電極３０、参照電極７１および対極７２をそれぞれコネクタ（図示せず）に接続し、測定電流をプリアンプ７３により増幅する。マルチポテンショスタット部８０は、マルチポテンショスタット（メインアンプ）８１、電位をコントロールするＤＡコンバータ８２、測定電流をデジタル信号に変換するＡＤコンバータ８３、それぞれを制御するＣＰＵ８４、および記録メモリ８５から構成されている。さらに、外部コンピュータ９０によりインターフェース８６を介してチップ電極３０の電位を制御し、測定結果を処理し出力表示する。すでに、この装置は、携帯可能なサイズにまで小型化（サイズ：Ｗ１５ｃｍ×Ｄ２２ｃｍ×Ｈ１０ｃｍ）されている。
【００５０】
（４−８）マルチチャンネルプロテイン同時分析システムの評価
上記で組み立てられたチップ電極３０およびプロテインマイクロアレイ１０を含むチップホルダー４０（プロテイン同時分析チップ５０）を測定セル６０に組み込み、マルチチャンネルプロテイン同時分析システムを構築して電気化学的に評価した。チップ電極３０にカードエッジコネクタ（図示せず）を取り付け、測定セル６０（図１３参照）に挿入された参照電極７１および対極７２とともに８チャンネルマルチポテンショスタットに接続した。
【００５１】
（４−９）マルチチャンネル測定システムの構築と電気化学的基礎評価
作製されたチップ電極およびプロテインマイクロアレイをチップホルダーに組み込み、測定セルに挿入し、マルチチャンネルプロテイン同時分析システムを構築して電気化学的に評価した。プロテイン分析システムにおいて、検出電極Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８は、それぞれ窪み（分析部）Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７およびＡ８と対応して配列された。測定溶液（０．５ｍＭＦｃＯＨ）をセルに注入すると、溶液は電極チップおよびプロテインマイクロアレイで定義された溶液導入流路を通って検出電極および分析部に到達することを確認した。
【００５２】
まず、７チャンネル同時に電極電位を挿引し、７チャンネル同時サイクリックボルタンメトリーを行った。図１５に、７チャンネル同時に計測したボルタモグラムを示す。電位を０Ｖから正の方向へ速度２０ｍＶ／ｓで挿引し、０．５Ｖで負の方向に折り返して挿引した。電位を０Ｖｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから正方向に挿引すると、ＦｃＯＨの酸化反応に起因した酸化電流が観測され始め、０．２６Ｖにピークを有する軌跡を描いた。挿引方向の折り返し後、酸化反応により電極表面で生成されたＦｃIIIＯＨの還元反応が観測され、酸化反応と同様にピーク（０．１９Ｖ）を有する波形となった。全ての電極において得られたボルタモグラムはほぼ同じ波形であり、ピーク電流値もほぼ等しい。これは、セルに組み込んで構築したプロテイン分析チップの各検出電極部は、ほぼ同等のレイアウトであり、さらに、ほぼ同等の環境下にあることが示された。
【００５３】
（４−１０）プロテイン同時分析システムを用いたＰＧ２の６チャンネル同時検出
８チャンネルのプロテイン同時分析システムを用いて６種類の濃度の異なるＰＧ２サンプルの同時検出を試みた。分析部Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６およびＡ７に、それぞれ０ｎｇ／ｍｌ、０．９５ｎｇ／ｍｌ、１．９ｎｇ／ｍｌ、３．８ｎｇ／ｍｌ、１５．３ｎｇ／ｍｌ、３０．５ｎｇ／ｍｌのＰＧ２抗原を作用させた。さらにＨＲＰ酵素標識抗体を作用させた後、プロテイン同時分析システムを組み上げ、測定セルに挿入し、０．１０ｍＭ過酸化水素を含む０．５ｍＭＦｃＯＨ溶液１４ｍｌを測定セルに注入した。５分間静置後、これらの測定部に対応する検出電極Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７に０．１２ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を同時に印加し、それぞれの分析部内においてＨＲＰ酵素反応により酸化された酸化型ＦｃＯＨをアンペロメトリックに同時計測した。この電位は、免疫反応により分析部に固定化された標識二次抗体のＨＲＰ酵素反応にともない生成されるＦｃIIIＯＨを検出電極で十分還元できる電位である。図１６（Ａ）に、それぞれの検出電極における還元電流応答を示す。還元電流値は、電位印加後２００−３００秒の間に得られた還元電流を平均し、さらに、抗原を作用させなかった（濃度０ｎｇ／ｍｌ）分析部Ａ１において検出された電流応答との差を算出した。プロテインマイクロアレイに作用させたＰＧ２抗原濃度が濃い場合には、観測される還元電流が増加した。これは、チップに固定化された抗体に特異的に反応したＰＧ２抗原量に依存している。ＰＧ２抗原濃度が濃いと固定化抗体との反応量が増加し、さらには、標識二次抗体の反応量も増加する。よって、酵素反応によって生成される酸化型ＦｃＯＨの量も増加し大きな還元電流が観測される。以上より、プロテイン同時分析システムを用いたＰＧ２の６チャンネル同時検出が可能であるとが示された。このプロテイン同時分析システムに抗原濃度が既知のサンプルと抗原濃度が未知のサンプルを同時に作用させ、そして、同時に上記手法を用いて計測することにより、一括で既知のサンプルの結果から検量線を得るとともに未知のサンプル内に含まれていた抗原濃度を検出することが可能である。ここで行った、濃度１−３０ｎｇ／ｍｌのＰＧ２抗原の検出は、現在、実際の疾患診断が要求している感度を満たしており、プロテインマイクロアレイを用いた電気化学計測法による免疫化学測定の有用性が実証された。また、電気化学測定に有した時間は５分程度とかなり短く、実用化に不可欠な迅速性も達成された。
【００５４】
さらに、ＰＢＳ中５０％（ｖ／ｖ）の牛血清溶液で調整した測定サンプル（抗原、ＰＧ２）で作製したチップを用いて６種類の濃度の異なるＰＧ２サンプルの同時検出を試みた。ＰＧ２濃度を、それぞれ、０ｇ／ｍｌ、１．６ｎｇ／ｍｌ、３．１ｎｇ／ｍｌ、６．３ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、５０．０ｎｇ／ｍｌとした。上記と全く同じ方法を用いて計測を行ったところ、ＰＧ２濃度に依存して検出された還元電流が変化した。図１６（Ｂ）に、それぞれの検出電極における還元電流応答を示す。結果も上記と同じで、プロテインマイクロアレイに作用させたＰＧ２抗原濃度が濃い場合には、観測される還元電流が増加した。以上より、測定対象物質であるＰＧ２以外のタンパク質がサンプル内に含まれていた場合でも、プロテイン同時分析システムを用いることによりＰＧ２を６チャンネル同時に検出可能であることを示している。しかし、牛血清溶液で調整したサンプルを作用させた際に検出された還元電流は、バッファー溶液で調整したサンプルを作用させた場合の還元電流と比較して約３０％に減少した。これは、牛血清溶液に含まれる測定対象物質以外のタンパク質がプロテインマイクロアレイの抗体固定化領域に非特異的に吸着し、測定対象物質であるＰＧ２の反応部位を大きく減少させたことに起因する。
【００５５】
（４−１１）マルチチャンネルプロテイン同時分析システムを用いたクロストークの検証
分析部内の溶液（溶液内に存在する基質である過酸化水素およびメディエータであるＦｃＯＨとその酸化体ＦｃIIIＯＨ）が、隣接する分析部へ移動し高精度計測に影響を及ぼすクロストーク現象を調査するために、クロストーク探索用ＰＧ２チップを作製した。分析用基板上の窪み（分析部）Ａ３およびＡ５に１０μｇ／ｍｌＨＲＰ標識ＰＧ２抗体０．８μＬを滴下して室温で２時間感作し、ＨＲＰ標識ＰＧ２抗体を固定化相に直接、物理的吸着を利用して固定した。
【００５６】
分析部内の溶液（溶液内に存在する分析対象物質およびメディエータであるＦｃＯＨ）が、隣接する分析部へ移動し高精度計測に影響を及ぼすクロストーク現象の調査を試みた。プロテインマイクロアレイの分析部Ａ３およびＡ５にＨＲＰ標識ＰＧ２抗体を物理吸着により固定した。分析部Ａ２およびＡ４は無処理のままである。このプロテインマイクロアレイをチップホルダーに装着し、セルに組み込んでプロテイン分析システムを構築した。検出電極Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＥ５に０．１２ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌの電位を印加し、ＨＲＰ酵素反応により酸化された酸化型ＦｃＯＨをアンペロメトリックに同時計測した。図１７に、それぞれの分析部におけるアンペログラム（Ａ）およびそれぞれの検出電極における還元電流応答（Ｂ）を示す。還元電流値は、電位印加後２００−３００秒の間に得られた還元電流を平均して算出した。ＨＲＰ標識ＰＧ２抗体を固定化した分析部の検出電極部であるＥ３およびＥ５において大きな還元電流応答の増加が観測された。一方、Ｅ２とＥ４における還元電流値は、ほぼバックグラウンド電流値と同等であった。従って、分析部Ａ３およびＡ５に固定化されたＨＲＰ酵素反応によって生成されたＦｃIIIＯＨは、拡散現象により隣接する検出電極Ｅ２およびＥ４へ到達しない。すなわち、隣接する電極間でのクロストーク現象の影響は無視できると結論付けた。よって、プロテイン同時分析システムを用いると電気化学的な免疫反応の同時分析が可能である。さらに、分析部間の距離を小さくした場合においても、分析部を電極チップによって押さえつけているため、分析部間におけるメディエータの相互作用はほとんど無視できる。
【００５７】
電極および分析部を微小化・集積化した際のクロストークについて検討を行った。電極として３つの白金マイクロ電極アレイを用いた。電極は１００μｍ×１００μｍの正方形であり、それぞれ独立して作動する。電極のリード部分はネガティブフォトレジスト（ＳＵ−８、厚さ１０μｍ）で被服されており、電極活性部位を定義づけてある。３つの電極は、一列に配列されており、ギャップ間距離は１００μｍである。左から電極Ａ、ＢおよびＣと名づける。電極Ａ、Ｂ間のギャップは１００μｍ、電極Ａ、Ｃ間のギャップは３００μｍとなる。２つの電極を選択し、ジェネレータ／コレクタモードでアンペロメトリーを試みた。溶液には、４ｍＭフェロシアン化カリウムを用いた。フェロセンメタノールおよびフェロシアンイオンの拡散係数は、それぞれ６．５×１０-6ｃｍ2／ｓ、７．０×１０-6ｃｍ2／ｓとほぼ同じである（Ｙａｓｕｋａｗａｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９８，１３６９，１５２−１５８．）。ジェネレータ電極の電位をフェロシアンイオンが十分に酸化される０．５ＶｖｓＡｇ／ＡｇＣｌに、コレクタ電極の電位を生成されたフェリシアンイオンが十分に還元・捕捉される０．０５ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌに設定した。ジェネレータ電極にて酸化反応を開始し、５分後にコレクタ電極にて捕捉を開始した。捕捉率をコレクタ電極で観測された還元電流値をジェネレータ電極で観測された酸化電流で割った値と定義して算出した。酸化・還元電流値は、それぞれ捕捉電位印加後２００秒から３００秒の値を平均して求めた。バルク溶液中における計測と電極デバイスの表面をカバーガラスでカバーした場合の捕捉率を比較検討した。この測定では、ジェネレータ電極での酸化・生成反応が、酵素によるフェロセンメタノールの酸化反応に対応している。
【００５８】
まず、電極Ａをジェネレータ電極、電極Ｂをコレクタ電極として使用し、アンペロメトリーを行った。図１８にジェネレータ／コレクタモードで検出した酸化還元電流応答を示す。図１８（Ａ）はバルク溶液中、図１８（Ｂ）はカバーガラスでカバーした際のアンペログラムである。カバーをするとジェネレータ電流は減少し、コレクタ電流は増加した。ジェネレータ電流の減少は、カバーによるフェロシアンイオンの供給が阻害されるためである。コレクタ電流の増加は、ジェネレータ電極により生成されたフェリシアンイオンの散逸がカバーにより阻害されるためである。バルク溶液中での捕捉率は３．５±０．２％、カバー時の捕捉率は１６．０±０．２％であった。バルク溶液中では、ジェネレータ電極にて生成されたフェリシアンイオンは、横方向だけでなく上方へも拡散し散逸される。しかし、カバー時では、フェリシアンイオンは上方に拡散できず隣の電極に到達し捕捉されるため捕捉率の増加が観測された。カバー時において、幾何学的には１２％程度の捕捉率であると考えられる。幾何学的な計算と比較して計測値が大きい原因は、コレクタ電極近傍によるフェリシアンイオンの消費に伴う拡散の増加にある。次に、電極Ａをジェネレータ電極、電極Ｃをコレクタ電極として使用し、アンペロメトリーを行った。バルク溶液中での捕捉率は０．７±０．３％、カバー時の捕捉率は７．０±０．５％であった。電極間ギャップを３００μｍと大きくすると捕捉されるフェリシアンイオンの量が減少する。カバー時において、幾何学的には４．４％程度の捕捉率であると考えられる。幾何学的な計算と比較して計測値が大きい原因は、コレクタ電極近傍によるフェリシアンイオンの消費に伴う拡散の増加にある。
【００５９】
カバーをした場合、生成されたフェリシアンイオンは全て横方向に拡散してしまう。しかし、この状態においても電極間距離３００μｍでの捕捉率は７％と小さい。実際に採用している測定系では溶液導入用の流路を設けてあるため、生成された酸化型メディエータのほとんどは流路を介して拡散すると考えられ捕捉率は低下する。よって、デバイスの全体サイズを微小化し電極および分析部を集積化した際において、導入流路を作製することによって捕捉率の低減を実現できる。さらには、分析部への導入流路の構築またはチップ電極上への多重リソグラフィーによる３次元流路構造の構築により、測定溶液または新たに準備したバッファー溶液と接続することが可能になり、ほとんどの拡散の方向は流路方向に限定され、クロストークの影響を抑制する。図１９に、多重フォトリソグラフィーを用いた３次元微小流路構造の概念図を示す。これは本発明のチップ電極の第２の実施形態に相当する。ガラス基板３９上に形成した一段目のポリイミド３４を用いて検出電極３１および溶液導入流路３５を定義し、二段目のポリイミド３８を用いて一段目の流路と反対側に、および一段目のポリイミドの上に段差をつけて流路３７を作製する。この方法を用いると、金リード線３２（図６、７参照）上にあるポリイミド上に流路を作製することが可能であるため、溶液が金リード線３２と接触することなく流路３７を作製できる。
【００６０】
この流路３７を形成すると溶液導入流路３５内の空気は流路３７を通って流れるため、制御しきれない微小な隙間を通って流出する事態が防止され、したがって分析部の溶液が隣接する分析部に入り込むことが一層確実に抑制されクロストークの一層の低減化が図られる。デバイスを微小化した際には、検出電極３１および流路の形成において２次元的に十分なスペースを確保することが困難であるため、図１７に示すように３次元構造を利用することが望ましい。また、分析部を定義しているポリエステルフィルム１２の分析部近傍に両面接着性ポリエステルフィルムを採用することにより、分析部近傍とチップ電極に強固な接着が達成されクロストークの影響をさらに低く抑えることができる。プロテインアレイチップの材料にポリジメチルシロキサンなどの柔らかい高分子を使用することによる接着性の向上も期待できる。
【００６１】
以上の実施形態の説明をまとめると以下のとおりとなる。
【００６２】
分析対象物質（抗原）に特異的に反応する抗体を固定配列した複数の微小孔分析部を有するプロテインマイクロアレイと、分析部に構築された抗体―抗原―標識抗体のサンドイッチ構造によって発生する信号を電気化学的に検出する複数の微小電極が配列されたチップ電極を分離して作製する。
【００６３】
両者を分離して作製することにより、検出用チップ電極を再利用し、プロテインマイクロアレイのみを使い捨てる。
【００６４】
両者を別途作製したチップホルダーに組み込んで各チップに配列した分析部および電極を高精度で一括した配列・配置を達成する。
【００６５】
プロテインマイクロアレイの抗原捕捉部位（微小孔分析部）とチップ電極の検出電極部に同じ配列構造を有するプロテインマイクロアレイとチップ電極をチップホルダーに組み込むことにより、毎回、抗原捕捉部と検出微小電極の間の位置合わせを再現性よく高精度で簡便に実現する。
【００６６】
それぞれのチップの分析部および検出電極は、チップホルダーに組み込まれた際に空間的に高精度で一致してペアを形成するように配列され、溝構造を有するチップホルダーに挿入することにより、分析部である孔表面と検出電極部である電極表面の正確な距離制御を実現可能にする。
【００６７】
さらに、チップホルダーを測定セルに挿入した際に、プロテインマイクロアレイの各分析部とチップ電極の各電極間の空間には毛細管現象により測定溶液が充填されるシステムを採用している。
【００６８】
上記を達成するために、チップ電極の各電極から測定セルの溶液間を貫通する流路をチップ電極上に配置しておく。
【００６９】
各分析部において捕捉されたサンプルと反応して分析部に捕捉された酵素標識抗体により進行する酵素反応は、それぞれの分析部においてお互いの分析部に影響を与えることなく独立して進行することが正確な計測のために必要不可欠である。
【００７０】
測定溶液中に介在させたメディエータ分子が各分析部間を行き来するクロストーク現象が存在すると、正確なサンプルの計測を阻害する。
【００７１】
すなわち、本システムにおいて、分析部において捕捉されたサンプルは、酵素標識抗体の酵素反応により生成される酸化型メディエータあるいは還元型メディエータを電極で電気化学的に検出することによって測定されているため、各分析部で生成された酸化型メディエータあるいは還元型メディエータが目的の電極で検出されず、近傍の分析部に拡散した場合は、測定誤差となり正確な計測が行えない。
【００７２】
この、目的としている分析部外へのメディエータの流出を抑制し、各分析部において独立して正確に分析するために、プロテインマイクロアレイおよびチップ電極をチップホルダーに組み込み、同サイズの測定セルに挿入することによりプロテインマイクロアレイとチップ電極との間に印加される圧力を両者が接触している領域全域にわたって一定にし各分析部間の溶液の流れを抑制する。
【００７３】
また、酵素標識抗体の酵素反応により生成された酸化型メディエータまたは還元型メディエータ分子の中で、電極により検出されなかったメディエータのほとんどが他の分析部に拡散しないように、それぞれの分析部に微小流路構造を構築し、その流路部分に拡散できる構成を採用する。
【００７４】
以上より、サンプル溶液に含まれている測定対象物質をプロテインマイクロアレイで捕捉し、多項目同時分析および多検体同時分析を高感度で迅速に定性的におよび定量的に分析可能な、新規な高感度同時分析電気化学プロテインマイクロアレイ分析システムが提供される。
【００７５】
このように、上述の実施形態によれば、細胞チップを利用した電気化学的診断システムに関する基盤技術が確立できる。実際にヒトから採取した極微少量血液等の体液をサンプルとして計測することにより、疾病の早期発見や疾病の進行程度の経常的なモニタリングシステムを提供できる。極少量の試料を短時間で簡便に計測可能であり、多検体同時計測および多項目同時計測システムへの可能性を有している。さらに、８チャンネル同時分析システムを用いるとサンプル計測と同時に検量線を作成することも可能であるため、チップ間の誤差による測定誤差を解消できる。
【００７６】
さらに、プロテインマイクロアレイの効率的計測技術の開発は、医療、環境、食品等の実用面においても飛躍的なインパクトを与えるため、広く利用されることになる。チップ等の一部を変更すると、健康モニタリング、医療診断、医薬品開発におけるスクリーニング、環境モニタリングなど幅広い用途があり波及効果は極めて大きい。このように、汎用性のある高感度で小型な簡易分析デバイスが実現可能である。
【００７７】
上述の実施形態は、このような従来の電気化学検出法の課題を解決するものであり、複数の抗体を固定化した分析部に捕捉された極微量の抗原を一括して同時にそして簡便に計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】構築したサンドイッチイムノアッセイ構造の概念図である。
【図２】図１に示すサンドイッチイムノアッセイ構造の評価法の説明図である。
【図３】０．５ｍＭ  ＦｃＯＨ溶液中におけるサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【図４】棒状作用電極を用いた各分析部におけるアンペログラム（Ａ）、およびｒ−ＣＲＰ濃度に対する還元電流応答を示す図である。
【図５】棒状作用電極を用いた各分析部におけるアンペログラム（Ａ：ＰＧ１、Ｂ：ＰＧ２）、および各濃度に対する還元電流応答（Ｃ：ＰＧ１、Ｄ：ＰＧ２）を示す図である。
【図６】チップ電極を示す図である。
【図７】検出電極、金リード線、およびボンディング部の形状を示す図である。
【図８】分析基盤（プロテインマイクロアレイ）を示す図である。
【図９】チップホルダーの部品図である。
【図１０】プロテインマイクロアレイ、チップ電極、およびチップホルダーの組立状態を示す図である。
【図１１】プロテインマイクロアレイ、チップ電極、およびチップホルダーの組立状態を示す分解斜視図である。
【図１２】測定セルの部品図である。
【図１３】組み立てた状態の測定セルの構成を示す図である。
【図１４】ＰＯＣＴを目的としたプロテインマイクロアレイの携帯型８チャンネル同時分析装置の構成図である。
【図１５】７チャンネル同時に計測したボルタモグラムを示す図である。
【図１６】それぞれの検出電極における還元電流応答を示す図である。
【図１７】それぞれの分析部におけるアンペログラム（Ａ）およびそれぞれの検出電極における還元電流応答（Ｂ）を示す図である。
【図１８】ジェネレータ／コレクタモードで検出した酸化還元電流応答を示す図である。
【図１９】多重フォトリソグラフィーを用いた３次元微小流路構造の概念図を示す図である。
【符号の説明】
【００７９】
１    一次抗体
２    抗原
３    ＨＲＰ標識二次抗体
１０    分析用基板
１１    基体
１２    ポリエステルフィルム
１３    窪み
２０    Ｔｗｅｅｎ
２１    ＦｃＯＨ水溶液
２２    プラスチックシャーレ
２３    参照電極
２４    対極
２５    ポテンショスタット
２６    ＸＹＺ自動ステージ
２７    棒型作用電極
３０    チップ電極
３１    検出電極部
３２    金リード線
３３    ボンディング部
３４    ポリイミド
３７    流路
３８    ポリイミド
３９    洗浄済みガラス基板
４０    チップホルダー
４１    電極保持部
４２    孔
４３    電極保持基板
５０    プロテイン同時分析チップ
６０    測定セル
６１    スペーサ
６２    上面図下方の入口
６３    上面図上方の入口
７０    測定部
７１    参照電極
７２    対極
７３    プリアンプ
８０    マルチポテンショスタット部
８１    マルチポテンショスタット（メインアンプ）
８２    ＤＡコンバータ
８３    ＡＤコンバータ
８４    ＣＰＵ
８５    記録メモリ
８６    インターフェース
９０    外部コンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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