(57)【要約】【課題】  ペプチド、タンパク質等の加水分解性化合物を、高純度で、しかも高い収率で製造することができる加水分解性化合物の製造方法、及び、該加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質を提供する。【解決手段】  超臨界状態又は亜臨界状態の水中で縮合性物質を脱水縮合して加水分解性化合物を合成する工程１と、工程１で得られた加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を断熱膨張させて常温常圧にする工程２とを有する加水分解性化合物の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界状態又は亜臨界状態の水中で縮合性物質を脱水縮合して加水分解性化合物を合成する工程１と、工程１で得られた加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を断熱膨張させて常温常圧にする工程２とを有することを特徴とする加水分解性化合物の製造方法。
【請求項２】
工程２において、加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を気相中又は液相中に噴射することにより常温常圧にすることを特徴とする請求項１記載の加水分解性化合物の製造方法。
【請求項３】
縮合性物質は、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１又は２記載の加水分解性化合物の製造方法。
【請求項４】
請求項３記載の加水分解性化合物の製造方法を用いてなることを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項３記載の加水分解性化合物の製造方法を用いてなることを特徴とするタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、タンパク質等の加水分解性化合物を、高純度で、しかも高い収率で製造することができる加水分解性化合物の製造方法、及び、該加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のバイオテクノロジーの発展に伴い、天然物中に含まれるペプチドやタンパク質等の生理活性物質が注目されている。しかしながら、天然物中の生理活性物質は物理化学的性質がきわめて類似した化合物の中に含まれていることが多く、目的物質によっては適当な高度濃縮が困難な場合も少なくない。そこで、アミノ酸等の縮合性物質を化学的に脱水縮合させることによりペプチドやタンパク質を合成する方法が行われている。
【０００３】
このような化学的なペプチドやタンパク質の製造方法としては、例えば、原料となるアミノ酸やペプチドを有機溶媒中で反応させて合成する液相法や、スチレン等の高分子担体に結合したアミノ酸の末端にアミノ酸を順次導入していきペプチドやタンパク質を合成する固相法等の種々の方法が提案されている。しかし、これらの化学的な製造方法では、得られた目的物質を単離するのに複雑な工程を要するうえ、ジメチルフォルムアミド等の大量の有機溶剤を用いる等、環境面での課題もあった。
【０００４】
これに対して、超臨界状態の媒体中でアミノ酸やペプチドを脱水縮合してペプチドやタンパク質を合成する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びそれらを構造の中に含む化学種を原料として、二酸化炭素等の超臨界流体、高圧ガス、液体並びにそれらと他の溶媒、ガス等の化学種の混合流体中において、高分子等の支持体を用いて、ペプチド、タンパク質並びにそれらを含む加水分解性化合物を合成する方法が開示されている。このような超臨界状態の媒体中でアミノ酸等を脱水縮合させる方法によれば、高純度のペプチド等が得られることからその単離も容易であり、しかも有機溶剤等による汚染の問題も全く発生しないと思われた。
しかしながら、現実にはこのような超臨界法によりペプチドやタンパク質を合成しようとしても、収率が極めて悪く工業的には利用価値が低いという問題があった。また、アミノ酸を脱水縮合してペプチドを製造しようとしても、６量体程度のごく短いペプチドまでしか製造することができないという問題もあった。
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−３１０５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ペプチド、タンパク質等の加水分解性化合物を、高純度で、しかも高い収率で製造することができる加水分解性化合物の製造方法、及び、該加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、超臨界状態又は亜臨界状態の水中で縮合性物質を脱水縮合して加水分解性化合物を合成する工程１と、工程１で得られた加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を断熱膨張させて常温常圧にする工程２とを有する加水分解性化合物の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討の結果、超臨界法によるペプチド等の合成において、超臨界状態の媒体中で生成したペプチド等の加水分解性化合物を回収する際に、媒体を断熱膨張させて常温常圧にするようにすれば、飛躍的に加水分解性化合物の収量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
一般に、アミノ酸やペプチド等の縮合性物質を脱水縮合してペプチドやタンパク質の加水分解性化合物を製造する反応は可逆的な反応であることが知られている。このような反応式の一例を下記式（１）に示した。
【０００９】
【化１】
2005120004.tif 000002
上記式（１）においては、媒体を超臨界状態又は亜臨界状態の高温高圧状態にすることにより全体としての反応速度が速くなる。また、アミノ酸等の縮合性物質からペプチド等の加水分解性化合物を合成する反応は一般に吸熱反応であることから、媒体を高温高圧状態にすれば反応はペプチドを合成する方向に進む。しかし、このようにして生成した加水分解性化合物を回収するためには、超臨界状態又は亜臨界状態の媒体を常温常圧状態に戻さなければならない。従来の技術では、この超臨界状態又は亜臨界状態の媒体を常温常圧状態へ戻す工程を、例えば、水冷や空冷による自然冷却によって行っていた。ところが、超臨界状態又は亜臨界状態の媒体を常温常圧状態へ戻す過程においては、上記式（１）で表される反応が左方向に進む傾向にあることから、いったん生成したペプチド等の加水分解性化合物が加水分解して再びアミノ酸に分解してしまう。従って、従来の方法では、加水分解性化合物の収量が低く、また、上記式（１）のような反応を繰り返して生成される多量体の生成が難しかったものと考えられる。
【００１０】
これに対して、本発明の加水分解性化合物の製造方法では、超臨界状態又は亜臨界状態の媒体を断熱膨張させて常温常圧にする。このような方法によれば、ジュール−トムソン効果により瞬時に減圧と冷却とが進み、いったん生成したペプチド等の加水分解性化合物が加水分解して再びアミノ酸に分解してしまうのを抑制できることから、高い収率と多量体の生成が可能になったものと考えられる。
【００１１】
本発明の加水分解性化合物の製造方法では、まず、超臨界状態又は亜臨界状態の水中で縮合性物質を脱水縮合して加水分解性化合物を合成する工程１を行う。
工程１における媒体としては水を用いる。水は安価であることに加え、無毒であることから環境に悪影響を与えず、回収等のコストを抑えることができる。更に、水の臨界温度は６４７Ｋ、臨界圧力は２２ＭＰａであることから、超臨界状態又は亜臨界状態の水中では雑菌やプリオン等の異常タンパク質等の分解が進み、得られるペプチド等の加水分解性化合物中にこれらの雑菌や異常タンパク質が混入することを防ぐことができる。
【００１２】
なお、本明細書において、超臨界状態とは、臨界圧力（以下、Ｐｃともいう）以上、かつ臨界温度（以下、Ｔｃともいう）以上の状態を意味する。従って、水の場合には、６４７Ｋ以上かつ２２ＭＰａ以上において超臨界状態になる。
また、亜臨界状態とは、超臨界状態以外の状態であって、反応時の圧力、温度をそれぞれＰ、Ｔとしたときに、０．１＜Ｐ／Ｐｃ＜１．０かつ０．５＜Ｔ／Ｔｃ、又は、０．１＜Ｐ／Ｐｃかつ０．５＜Ｔ／Ｔｃ＜１．０の状態を意味する。従って、水の場合には圧力が２．２ＭＰａを超えて２２ＭＰａ未満かつ温度が３２４Ｋを超える場合、又は、圧力が２．２ＭＰａを超えかつ温度が３２４Ｋを超えて６４７Ｋ未満である場合に亜臨界状態となる。
【００１３】
また、上記水は、必要に応じてメタノール、エタノール、プロパノール等のアルコールや、二酸化炭素、窒素、酸素、ヘリウム、アルゴン、空気等の常温常圧で気体である流体等を併用してもよい。
【００１４】
目的とする加水分解性化合物の原料となる上記縮合性物質としては、脱水縮合し得るものであれば特に限定されないが、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等が好適に用いられる。
上記アミノ酸、ペプチド、タンパク質としては特に限定されず、例えば、通常一般に食品添加物や工業材料として用いられるアラニン（Ａｌａ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）等のアミノ酸及びそれらアミノ酸より構成されるオリゴペプチド等が挙げられる。また、分子中にペプチド構造等を有するものであれば、ペプチド等の環化物であっても、ペプチド以外の他の構造を有する化合物であっても用いることができる。
【００１５】
上記工程１においては、上記縮合性物質と水とを混合し、この混合物を加熱及び／又は加圧して超臨界状態又は亜臨界状態にしてもよいし、上記縮合性物質に超臨界状態又は亜臨界状態にした水を加えてもよい。
超臨界状態又は亜臨界状態の水中では、上記縮合性物質が脱水縮合して目的とする加水分解性化合物が生成する。
【００１６】
本発明の加水分解性化合物の製造方法では、次いで、工程１で得られた加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を断熱膨張させて常温常圧にする工程２を行う。このように断熱膨張させることにより、ジュール−トムソン効果により水は瞬時に減圧と冷却とが進む。
上記断熱膨張させる方法とてしは特に限定されないが、例えば、加水分解性化合物を含む超臨界状態又は亜臨界状態の水を気相中又は液相中に噴射する方法が好適である。このような方法によれば、水は瞬時に減圧と冷却とが進み常温常圧になる。このとき常温常圧になるまでに要する時間は、少なくとも１秒以下であり、好ましくは１０−３〜１０−５秒オーダーである。
【００１７】
超臨界状態又は亜臨界状態の水を噴射する気相としては特に限定されず、空気中でもよいが、不活性ガス等を用いる場合には得られた加水分解性化合物の分解を抑制することができる。
また、超臨界状態又は亜臨界状態の水を噴射する液相としては特に限定されず、水中でもよいが、有機溶剤等を用いる場合には得られた加水分解性化合物の分解を抑制することができる。
このようにして常温常圧にした水中から、目的とするペプチド等の加水分解性化合物を回収する。
【００１８】
本発明の加水分解性化合物の製造方法は、例えば、図１に示したような簡単な装置を用いて行うことができる。図１の装置を用いた加水分解性化合物の製造方法について説明する。
まず、水と原料となる縮合性物質とをポンプ１２を用いて製造容器１に送り込み、ヒーター２で加熱溶融された金属塩３を収容し熱電対４で温度が測定されている金属塩溶融浴５中において、水の温度及び圧力を所定の超臨界域又は高温高圧領域にして脱水縮合反応を開始させる。所定の時間、反応させた後、ニードルバルブ１１を開いて水を噴射させることにより断熱膨張させて常温常圧に戻す。
【００１９】
上記製造容器１は、超臨界域又は超臨界域近傍になる過酷な反応条件下でも反応を行うため、この条件に耐えられる材質及び肉厚の容器が使用される。
上記製造容器１の材質としては、例えば、炭素鋼、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｖ  、Ｍｏ等の特殊鋼、オーステナイト系ステンレス鋼、ハステロイ、チタン又はこれらにガラス、セラミック、カーバイト等をライニング処理した鋼材、他の金属をクラッドした鋼材等が挙げられる。
上記製造容器１の形状としては、特に制限はなく、槽型、管型、又は特殊な形状のものでも使用できる。しかし耐熱、耐圧性能が必要であるので槽型又は管型が好ましい。なお、管型としては直線状の管でもよいが、コイル状に巻いていたり、Ｕ字型に折り曲げられた構造の管でもよい。
【００２０】
上記製造容器１は、超臨界状態又は亜臨界状態にある水を噴射させるための手段を有する。このような手段として、例えば、図１に示した装置ではニードルバルブ１１を用いたが、特に限定されない。
上記製造容器１内には金属ボールや所定形状の障害物を置き、乱流を生じさせることが好ましい。製造容器１内に金属ボールが備えられていると振とうにより乱流が発生するので攪拌効率が高められ反応効率を上げることができる。更に、製造容器１が金属ボール等で充填されていると容器を振とうするだけで攪拌効率が高くなり好ましい。
また、上記金属ポールの充填率は２０〜８０％であることが好ましい。この範囲外であると、攪拌効率が悪くなる。なお、直径の異なる２種以上の金属ボールを用いれば、充填率を向上させることができ、攪拌効率を上げることができ好ましい。
また、上記製造容器１内にはオリフィスがあいている板が備えられていることが好ましい。製造容器１内にオリフィスがあいている板が備えられていると振とうにより乱流が発生するので攪拌効率が高められ反応効率を上げることができる。
【００２１】
本発明の加水分解性化合物の製造方法によれば、有機溶剤等を用いることなく高純度のペプチド等の加水分解性化合物を製造することができる。また、超臨界状態又は亜臨界状態の水を断熱膨張により冷却することにより、いったん生成した加水分解性化合物が再び加水分解することを防ぐことができ、従来の方法に比べて極めて高い収率で、しかも多量体を製造することができる。
本発明の加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質もまた、本発明の１つである。このようなペプチド、タンパク質としては、例えば、ポリリジンや各種の生理活性ペプチド等が挙げられる。ポリリジンや各種の生理活性ペプチド等は、従来の方法では合成が難しく、仮に合成可能であったとしても極めて高価であったが、本発明の加水分解性化合物の製造方法によれば、容易かつ安価に製造することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ペプチド、タンパク質等の加水分解性化合物を、高純度で、しかも高い収率で製造することができる加水分解性化合物の製造方法、及び、該加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
（実施例１）
図１に示した流通式の製造容器１（管型容器、ＳＵＳ３１６製、Ｔｕｂｅ  Ｂｏｍｂ  Ｒｅａｃｔｅｒ 、内容積１０ｍＬ）に、２００ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン水溶液を１０ｍＬ／分の流速で送り込んだ。一方、製造容器１の他方の端からは、ニードルバルブ１１を開放して水溶液を噴射させた。このとき、製造容器１は、マイクロヒーター２（助川電気工業社製）を備えた金属塩溶融浴５（新日豊化学社製）中で２５０℃（５２３Ｋ）の温度に加熱されており、製造容器１内の圧力は１０ＭＰａであった。
噴射させた水溶液は別の容器に受け止めた。このとき水の一部は蒸散したが、８０重量％以上が回収できた。
【００２５】
得られた水溶液について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製、ＸｔｅｒｒａＭＳ  Ｃ１８（２．５μｍ）を用い、流速０．５ｍＬ／ｍの条件で紫外線吸収光度計（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて測定したところ、グリシン１〜６量体に該当するピークを確認できた。各ピークにについて質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製）により分析したところ、グリシン１〜６量体に該当する質量の他、グリシン７量体及び８量体に相当する質量の物質の存在を確認できた。
また、紫外線吸収光度計のピーク面積から定量したところ、得られた水溶液中のグリシン二量体の量は１５ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００２６】
（比較例１）
図１に示した製造容器１（管型容器、ＳＵＳ３１６製、Ｔｕｂｅ  Ｂｏｍｂ  Ｒｅａｃｔｅｒ 、内容積１０ｍＬ）の代わりに、片端にニードルバルブ１１がなく完全に閉鎖された製造容器を用いた。
この製造容器に、２００ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン水溶液を入れ、密封した後、マイクロヒーター２（助川電気工業社製）を備えた金属塩溶融浴５（新日豊化学社製）中に沈め、２５０℃（５２３Ｋ）で反応を行った。このとき製造容器１内の圧力は１０ＭＰａであった。
所定時間反応させた後、加熱を止めて常温常圧にまで冷却した後、水溶液を回収した。
【００２７】
得られた水溶液について、カラムとしてＷａｔｅｒｓ社製、ＸｔｅｒｒａＭＳ  Ｃ１８（２．５μｍ）を用い、流速０．５ｍＬ／ｍの条件で紫外線吸収光度計（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて測定したところ、グリシン１〜６量体に該当するピークを確認できた。各ピークにについて質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ社製）により分析したところ、グリシン１〜６量体に該当する質量の物質の存在は確認できたが、グリシン７量体及び８量体に相当する質量の物質の存在は確認できなかった。
また、紫外線吸収光度計のピーク面積から定量したところ、得られた水溶液中のグリシン二量体の量は１．５ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明によれば、ペプチド、タンパク質等の加水分解性化合物を、高純度で、しかも高い収率で製造することができる加水分解性化合物の製造方法、及び、該加水分解性化合物の製造方法を用いてなるペプチド、タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の加水分解性化合物の製造方法を実施するための製造装置の一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００３０】
１  製造容器
１１  ニードルバルブ
１２  ポンプ
１３  逆流防止弁
２  ヒーター
３  金属塩
４  熱電対
５  金属塩溶融浴
【図１】
2005120004.tif 000003