(57)【要約】【課題】新規なニトロフェノールモノオキシゲナーゼ遺伝子及びニトロフェノール類化合物の分解方法の提供。【解決手段】ロドコッカス属細菌由来の特定の塩基配列を有するニトロフェノールモノオキシゲナーゼ遺伝子およびハイドロキシジオキシゲナーゼ遺伝子またはこれら遺伝子がコードするするニトロフェノールモノオキシゲナーゼおよびハイドロキシジオキシゲナーゼの提供。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキゲナーゼコンポーネントである請求項３記載の遺伝子。
【請求項５】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項７】
タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである請求項6記載の遺伝子。
【請求項８】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号3に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号3に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項９】
タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネントである請求項8記載の遺伝子。
【請求項１０】
以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号5に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号5に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項１１】
請求項1〜10に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項11記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質との複合体からなるモノオキシゲナーゼ酵素。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１４】
(a)のタンパク質が、該タンパク質以外のレダクターゼ活性を有するタンパク質により置換されたものである、請求項13記載の酵素。
【請求項１５】
配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなるハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素。
【請求項１６】
請求項12に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からモノオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、モノオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
【請求項１７】
請求項12に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
【請求項１８】
請求項12に記載の形質転換体及び/又は請求項13若しくは14に記載の酵素とフェノール/カテコール類化合物とを接触させることを特徴とする、フェノール又はカテコール類化合物の分解方法。
【請求項１９】
フェノール又はカテコール類化合物が、ニトロフェノール、クロロフェノール、ニトロカテコール及びクロロカテコールからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
請求項12に記載の形質転換体及び/又は請求項15に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素とハイドロキシキノールとを接触させることを特徴とする、ハイドロキシキノールの分解方法。
【請求項２１】
請求項12に記載の形質転換体及び/又は請求項13若しくは14に記載の酵素を含有することを特徴とするフェノール又はカテコール類化合物の分解剤。
【請求項２２】
請求項12に記載の形質転換体及び/又は請求項15に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を含有することを特徴とするハイドロキシキノール分解剤。
【請求項２３】
配列番号7に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号8に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット。
【請求項２４】
配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列若しくはそれらの相補配列及び/又は配列番号2、4若しくは6に示されるアミノ酸配列に基づいて設計されるプライマーであって、ニトロフェノール、ニトロカテコール及びハイドロキシキノール代謝遺伝子の全部又は一部を増幅することができるプライマーを含むプライマーセット。
【請求項２５】
ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAを鋳型として、請求項23又は24記載のプライマーセットを用いて前記総DNAを増幅することを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２６】
配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列又はその相補配列のうち少なくとも一部の配列を含むプローブを用いて、ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAに対しハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトロフェノール類化合物分解酵素をコードする遺伝子、またはその遺伝子がコードする酵素の製造方法に関する。本発明はまた、上記遺伝子から得られる酵素によるフェノール類化合物の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトロ化芳香族化合物は工業的には薬品の原料として、染料として、またトリニトロトルエン(TNT)のように爆薬として生産・使用され、さらに農業的にはパラチオンに代表される農薬(殺虫剤)として広く使われてきたが、近年、他の難分解性芳香族化合物と同様に環境汚染物質として問題となっている。特に4-ニトロフェノールは農薬として使われたパラチオン、メチルパラチオンから環境中で比較的容易に酸化されて生成し、土壌中などに広く残存している事が示されている。このような汚染環境の浄化、あるいは工業廃液などの浄化にはこれらの化合物を分解できる微生物を活用することが期待されている。
【０００３】
微生物を用いた汚染環境修復技術、いわゆるバイオレメディエーションは、環境低負荷型の浄化技術として注目されている。ニトロフェノール類化合物の微生物分解は、4-ニトロフェノールを中心に研究されており、これまでに4-ニトロフェノールの分解あるいは資化能を有するいくつかの細菌が既に報告されている(例えば、Kadiyala,
V. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64: 2479-2484; Jain, R. K. et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 3030-3032; Chauhan, A. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 2000. 270: 733-740; Chauhan, A. et al., J. Appl.
Microbiol. 2000. 88: 764-772; Leung, K. T. et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999.
173: 247-253; Takeo, M. et al., J. Biosci. Bioeng. 2003. 95: 139-145; 及びSpain,
J. C. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57: 812-819参照)。
【０００４】
これまでに図1に示すような二つの経路での4-ニトロフェノール分解が報告されている(化合物名:A, 4-Nitrophenol (4-NP);
B, Benzoquinone; C, Hydroquinone; D, Hydroxymuconic semialdehyde; E,
4-Nitrocatechol (4-NCA); F, 1,2,4-Trihydroxybenzene (Hydroxyquinol, HQ); G,
Maleylacetate (MA); H, beta-Ketoadipate)。図1の経路の上側に示した化合物ABCD-GHを経由する分解経路は、Pseudomonas,
Burkholderia属細菌などの主にグラム陰性細菌で、また下側に示した化合物AEF-GHを経由する分解経路はBacillus, Arthrobacter属細菌などの主にグラム陽性細菌で示されている。しかしこれらの報告のいずれにおいても代謝経路の決定、あるいは一部の代謝酵素の精製と解析にとどまっており、遺伝子レベルでの4-ニトロフェノールの分解酵素、分解経路の解析は報告されていない。従って微生物あるいは微生物由来の酵素、組換え微生物などを4-ニトロフェノールの効率的な分解に用いるには、その代謝に関わる遺伝子を単離・解析し、応用することが強く期待される。
【非特許文献１】Kadiyala, V. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998. 64: 2479-2484
【非特許文献２】Jain, R. K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 3030-3032
【非特許文献３】Chauhan, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 270:733-740
【非特許文献４】Chauhan, A. et al., J. Appl. Microbiol. 2000. 88: 764-772
【非特許文献５】Leung, K. T. et al., FEMS Microbiol. Lett. 1999. 173: 247-253
【非特許文献６】Takeo, M. et al., J. Biosci. Bioeng. 2003. 95: 139-145
【非特許文献７】Spain, J. C. et al., Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57: 812-819
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規な4-ニトロフェノール分解酵素をコードする遺伝子、およびこの遺伝子が発現する酵素を用いた4-ニトロフェノールの分解方法を提供することを目的とする。また、本発明は上記遺伝子のスクリーニング方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、4-ニトロフェノール資化性菌から新規なニトロフェノールの分解に関与する酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、これらの遺伝子がコードする酵素が多種のニトロフェノール類化合物等に対して分解性を示すという知見を得て、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【０００７】
（1）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
（2）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである（1）記載の遺伝子。
【０００９】
（3）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
（4）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキゲナーゼコンポーネントである（3）記載の遺伝子。
【００１１】
（5）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
（6）以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号1に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号1に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１３】
（7）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネントである（6）記載の遺伝子。
【００１４】
（8）以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号3に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号3に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１５】
（9）タンパク質が、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネントである（8）記載の遺伝子。
【００１６】
（10） 以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。
(c) 配列番号5に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号5に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列に相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
【００１７】
（11）上記（1）〜（10）に記載の遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含むベクター。
【００１８】
（12）上記（11）記載のベクターを含む形質転換体。
【００１９】
（13）以下の(a)のタンパク質と(b)のタンパク質との複合体からなるモノオキシゲナーゼ酵素。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号2に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつレダクターゼ活性を有するタンパク質
(b) 配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００２０】
（14）(a)のタンパク質が、該タンパク質以外のレダクターゼ活性を有するタンパク質により置換されたものである、（13）記載の酵素。
【００２１】
（15）配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号6に示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質からなるハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素。
【００２２】
（16）上記（12）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からモノオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、モノオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
【００２３】
（17）上記（12）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を採取することを特徴とする、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素の製造方法。
【００２４】
（18）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（13）若しくは（14）に記載の酵素とフェノール/カテコール類化合物とを接触させることを特徴とする、フェノール又はカテコール類化合物の分解方法。
【００２５】
（19）フェノール又はカテコール類化合物が、ニトロフェノール、クロロフェノール、ニトロカテコール及びクロロカテコールからなる群から選択される１またはそれ以上の化合物であることを特徴とする、（18）に記載の方法。
【００２６】
（20）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（15）に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素とハイドロキシキノールとを接触させることを特徴とする、ハイドロキシキノールの分解方法。
【００２７】
（21）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（13）若しくは（14）に記載の酵素を含有することを特徴とするフェノール又はカテコール類化合物の分解剤。
【００２８】
（22）上記（12）に記載の形質転換体及び/又は（15）に記載のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ酵素を含有することを特徴とするハイドロキシキノール分解剤。
【００２９】
（23）配列番号7に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号8に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット。
【００３０】
（24）配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列若しくはそれらの相補配列及び/又は配列番号2、4若しくは6に示されるアミノ酸配列に基づいて設計されるプライマーであって、ニトロフェノール、ニトロカテコール及びハイドロキシキノール代謝遺伝子の全部又は一部を増幅することができるプライマーを含むプライマーセット。
【００３１】
（25）ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAを鋳型として、（23）又は（24）記載のプライマーセットを用いて前記総DNAを増幅することを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。
【００３２】
（26）配列番号1、3若しくは5に示される塩基配列又はその相補配列のうち少なくとも一部の配列を含むプローブを用いて、ニトロフェノール分解性又は資化性菌から得られた総DNAに対しハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする、ニトロフェノール、ニトロカテコール又はハイドロキシキノール代謝遺伝子のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により新規のニトロフェノール分解酵素をコードする遺伝子が提供される。これらの遺伝子がコードする酵素は、フェノール類化合物を分解することができるため、ニトロフェノールなどで汚染された環境や工業廃液のバイオレメディエーションとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３５】
１．ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ及びハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子
本発明者は、新規な4-Nitrophenol(4-ニトロフェノール、以下「4-NP」とも示す)代謝系遺伝子を単離するため、まずその中間代謝物であると考えられるHydroxyquinol(ハイドロキシキノール、以下「HQ」とも示す)の代謝遺伝子、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子の検索を行った。対象とする微生物として4-NP分解能を有するRhodococcus
opacus (ロドコッカス オパカス) SAO101を用いた。本菌株はジベンゾフラン/ジベンゾ-パラ-ダイオキシン分解菌として単離されたものである。
【００３６】
ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子を単離するため、これまでに報告されている他菌株の相当遺伝子に保存されている配列を元にPCR プライマーを設計し、PCRクローニングを行った。その結果、既知のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ遺伝子と相同性を有する新規の遺伝子断片の単離に成功した。またここでSAO101株から得られた遺伝子断片をプローブに用いることによって、SAO101の遺伝子ライブラリーよりその周辺領域をクローニングした。
【００３７】
この領域の塩基配列約3.5 kbを解析したところ、各種オキシゲナーゼのレダクターゼ(フラビンレダクターゼ)、クロロフェノールモノオキシゲナーゼ、およびハイドロキシキノールジオキシゲナーゼの各遺伝子と相同性を有する3つのオープンリーディングフレーム(ORF、それぞれORF1、ORF2、ORF3とした)が認められた。
【００３８】
本発明者はこれらの遺伝子が4-NPにより転写誘導され、単一の転写単位であることを証明した。さらにSAO101株のORF2、ORF3各遺伝子を不活化した遺伝子破壊株をそれぞれ構築し、4-NP分解・資化能を失うことを証明した。これらの結果からORF1-3の遺伝子がそれぞれニトロフェノールモノオキシゲナーゼ(以下「NPMO」とも示す)のレダクターゼコンポーネント(以下「NPMO・Red」とも示す)、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネント(以下「NPMO・Ox」とも示す)、及びハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(以下「HQDO」とも示す)をコードする遺伝子と同定し、nitrophenol
catabolismの略を用い、それぞれnpcB、npcA、npcCと命名した。またこれらの遺伝子、酵素がSAO101株の4-NP代謝において非常に重要な役割を果たし、さらに今後の4-NPの微生物分解に有用である可能性を示した。以下に本発明の遺伝子について説明する。
【００３９】
配列番号1にNPMO・Red遺伝子の塩基配列を、配列番号2にNPMO・Redのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、レダクターゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。レダクターゼ活性とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート(NADPH)存在下で酸化還元反応を触媒する活性を指す。この活性はオキシゲナーゼとともに発現させ、基質に酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。
【００４０】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。
【００４１】
配列番号3にNPMO・Ox遺伝子の塩基配列を、配列番号4にNPMO・Oxのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、NPMO・Oxとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。オキシゲナーゼ活性とは、基質との結合及び酸素添加反応を触媒する活性を持つものを指す。この機能はレダクターゼとともに発現させ、基質に酸素を添加する活性を観察することによって確認することができる。
【００４２】
例えば、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号4に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。配列番号5にHQDO遺伝子の塩基配列を、配列番号6にHQDOのアミノ酸配列を例示する。但し、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。HQDO活性とは、HQに酸素を添加、環開裂を起こし、Maleylacetate(マレイルアセテート、以下「MA」とも示す)に変換する活性を持つものを指す(hydroxyquinol
1,2-dioxygenase)。この機能は基質と反応させ、生じるマレイルアセテートを検出することによって確認することができる。
【００４３】
例えば、配列番号6に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号6に示されるアミノ酸配列に1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の1-10個、好ましくは1-5個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。
【００４４】
上記遺伝子は、他の4-NP分解能を持つ細菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。遺伝子への変異の導入法は限定されないが、市販の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan-K
(TAKARA社製)やMutan-G (TAKARA社製))などを用いることができる。
【００４５】
これらの変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が酵素活性を有するか否かは、変異タンパク質を4-NPまたはHQと反応させることによって、上記のような機能、活性を測定することにより確認することができる。さらに、上記塩基配列からなるDNAの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、それぞれの機能又は活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明のNPMOもしくはHQDO遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性(70-80%以上)を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。例えば、高い相同性(70-80%以上)を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。また、本発明において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、2 x SSC、0.1％ SDS及び50％ホルムアミドの溶液中で25℃にて加温した後、0.1 x SSC、0.1 ％ SDSの溶液中で  68 ℃にて洗浄する条件をいう。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４６】
２．NPMO・Red、NPMO・Ox、及びHQDO酵素
本発明は、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼの機能を有するタンパク質等でもある。
【００４７】
本発明のNPMO・RedまたNPMO・Ox酵素は図1に示したA-E(4-NPから 4-Nitrocatechol (4-ニトロカテコール、以下「4-NCA」とも示す))の反応、さらにE-F(4-NCAからHQ)の反応を触媒する酸化酵素(ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ)である。
【００４８】
レダクターゼはNADH、NADPHなどの存在下で酸化還元反応を触媒し、オキシゲナーゼは実際に基質と反応しレダクターゼと共に酸素添加を触媒する。芳香環の酸化酵素の電子伝達コンポーネントが他の酸化酵素の電子伝達コンポーネントと置換可能である例やその可能性を示す論文はすでに報告されており(Larkin,
M. J., et al., J. Bacteriol. 1999. 181: 6200-6204; Treadway, S. L. et al., Appl.
Environ. Microbiol. 1999. 51: 786-793; Kitagawa, W. et al., J. Bacteriol. 2002.
184: 509-518など参照)、このオキシゲナーゼと反応するような置換可能なレダクターゼが存在すれば、このNPMO・Oxと共にNPMOとして機能しうる。
【００４９】
また本発明のHQDO酵素は図1に示したF-G(HQからMA)の反応を触媒する酸化酵素である。
【００５０】
３．NPMO遺伝子およびHQDO遺伝子を含むベクターと宿主
本発明のベクターは、適当なベクターにNPMO・Red、NPMO・Ox遺伝子および/もしくはHQDO遺伝子を連結することにより得られる。
【００５１】
本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。
【００５２】
ベクター中に導入する上記組み合わせの遺伝子の方向及び順序は、それぞれの遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。この場合、NPMO遺伝子はレダクターゼ及びオキシゲナーゼ遺伝子の2種類を連結する必要があるが、その順序は任意でよく、方向も任意である。さらに、レダクターゼとしての活性を有する限り、この該遺伝子の代わりに他のレダクターゼをコードする遺伝子が連結されてもよく、またこれらの遺伝子は必ずしも隣接していなくてよい。また必ずしも同一のベクター上に連結する必要もなく、活性が得られるかぎり異なるベクターにおいて同時に発現、または別個に発現したものを混合するなど、遺伝子を連結するベクターの種類や数、またその形式は限定されない。
【００５３】
４．本発明のベクターを含む形質転換体: 
本発明においては、上記ベクターを含む形質転換体として、天然にNPMO遺伝子およびHQDO遺伝子をコードするDNAを含む微生物と、人為的に上記作製したベクターを導入した微生物が包含される。天然にNPMO遺伝子およびHQDO遺伝子をコードするDNAの導入に適する微生物は、ロドコッカス
オパカスSAO101株やロドコッカス オパカスYTK32株などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
上記作製したベクターを導入した微生物は、公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの形質転換手法により作製することができる。形質転換に使用する宿主微生物としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。またベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮し用いることによって、高いニトロフェノール及びハイドロキシキノール分解活性を持つ微生物を作製することが可能である。以下にNPMO・Red遺伝子、NPMO・Ox遺伝子、およびハHQDO遺伝子を高発現プラスミドベクターに組み込み、大腸菌に導入し、発現させた例を示す。高発現プラスミドベクターとしては、T7プロモーターを有するベクターがあるが、pET17bベクター(Novagen社)が好ましい。
【００５５】
SAO101株より単離したnpcA、npcB、npcC遺伝子をPCRを用いて増幅し、それぞれpET17bベクター(Novagen社)に導入した。pET17bベクターは開始コドンとするATGとその上流にリボソームビンディングサイト(以下「RBS」とも示す)、さらに上流にT7プロモーターを含むもので、用いる遺伝子をその開始コドンと読み枠に合わせて導入することにより、他菌株からの遺伝子でも効率的な発現が期待できるものである。構築したプラスミドを宿主と
2005287429.tif 000002
【００５６】
2005287429.tif 000003
【００５７】
上記のように作製した大腸菌を培養し、IPTGで誘導発現させ、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析(SDS-PAGE)によって、その菌体の破砕抽出物の遠心分離後の上清にそれぞれの遺伝子の発現産物と認識されるタンパク質が高率に発現しうる。
【００５８】
この例に限らず宿主やベクター、発現制御系などをうまく機能する様に組み合わせ用いることによって、NPMO・Red遺伝子、NPMO・Ox遺伝子、およびHQDO遺伝子を高発現する微生物の作製が可能である。
【００５９】
５．NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO酵素の製造方法 
本発明において、目的のNPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６０】
上記で示した組み換え大腸菌の場合は当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてIPTGなどの誘導物質を加えることにより、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜抗生物質を加えたLB培地(1.0%
ペプトン、0.5% 乾燥酵母エキス、0.5% NaClから成る)で37℃、8-12時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいLB培地に容量比1-5%植菌、37℃、2-4時間本培養し、IPTGを加えさらに30℃で2-4時間培養する。
【００６１】
天然に本発明のタンパク質を有する微生物の場合、たとえばSAO101株の様な4-NPで酵素の誘導が起こる場合は、カタボライトリプレッションによる栄養培地中での該酵素の発現抑制などを考慮に入れ、炭素源を含まない合成無機塩培地に4-NPを加えた培地で培養することによって酵素の発現を行うことができる。4-NPなどの酵素の発現を引き起こす物質のみでは良好に細胞が増殖しない場合、十分な量の酵素が得られない場合がある。このような場合はいったんその微生物の増殖性が良い栄養培地で十分に培養し、増殖した菌体を無機塩培地やリン酸緩衝液、滅菌水などで洗浄した後、合成無機塩培地またはリン酸、トリスなど各種緩衝液に4-ニトロフェノールを加えた培地等に再懸濁、培養(休止菌体での反応)することによって酵素の発現を行うことができる。通常に行う例としてLB培地で30℃、1-2日培養し十分増殖させた後、滅菌水で菌体を洗浄、4-NPを加えた無機塩培地または各種緩衝液に再懸濁し、30℃で3-6時間培養する。
【００６２】
培養後、目的の酵素のタンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合には、菌体または細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。目的のタンパク質が得られたか否かは、SDS-PAGE等により確認することができる。
【００６３】
６．フェノール類化合物等の分解方法: 
本発明のフェノール/カテコール類化合物の分解方法は、上記の微生物及び/又は酵素を利用して行うことを特徴とするものであり、具体的には、上記微生物の培養菌体若しくは休止菌体及び/又は上記単離した酵素とフェノール/カテコール類化合物とを接触させる方法である。本発明において、分解対象となるフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールとしては、限定されるものではないが、4-NP、4-NCA、2,4-Dichlorophenol(2,4-ジクロロフェノール、以下「2,4-DCP」とも示す)、2,4,6-Trichlorophenol(2,4,6-トリクロロフェノール、以下「2,4,6-TCP」とも示す)、HQなどである。これらの例のうち本発明においてはHQを除いたすべてがNPMOの、HQはHQDOの直接の分解対象になるが、酵素と反応する基質はその活性を示す限り限定するものではない。
【００６４】
培養菌体又は休止菌体は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤とする。緩衝液としては種々の緩衝液を使用でき、また緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。菌懸濁液の濃度は、600ナノメートルの濁度で1-2が好適であり、必要に応じて増減できる。また、本方法においては、NPMO、およびHQDO酵素を利用することも可能である。上述のように単離・精製したNPMO、およびHQDO酵素を、適当な緩衝液、水等に懸濁して調製した酵素懸濁液としてフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤とする。上記菌懸濁液又は酵素懸濁液としてのフェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤は、界面活性剤等その他の成分を含有してもよい。
【００６５】
上記フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノール分解剤は、散布、混合又は浸漬等により、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールを分解させる対象となるサンプルに作用させることができる。対象となるサンプルとしては、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールに汚染されたものであればどのようなものであってもよく、例えば限定するものではないが、ニトロフェノール、クロロフェノール類化合物に汚染された土壌・底質等、またニトロフェノール、クロロフェノール類化合物を排出する施設の汚染部位、材料、貯蔵設備等が挙げられる。
【００６６】
分解剤が作用する条件を選択し、分解剤を作用させた後、フェノール/カテコール類化合物、ハイドロキシキノールの分解率の測定は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、ガスクロマトグラフィー/質量スペクトル分析(GC/MS)などを使用して行うことができる。また、必要に応じて他の分析方法を併せて利用してもよい。
【００６７】
７．プライマーセット 
本発明において、新規なHQDO遺伝子を単離するために設計したプライマーセットを以下に示す。
【００６８】
BT-F190
: 5’-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3’ (配列番号7)
BT-R706
: 5’-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3’ (配列番号8)
【００６９】
上記プライマーセットは、数種の既知HQDOのアミノ酸配列をアライメントすることにより設計した。本発明者は、このプライマーセットを用いることにより、4-NP分解性ロドコッカス属細菌2種から新規のHQDO遺伝子断片(約550
bp)を増幅することができた。従って、上記プライマーセットは新規なHQDO遺伝子のスクリーニングに利用可能である。本発明においては、配列番号7に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列番号8に示される塩基配列のうち少なくとも12個の連続した塩基配列からなるプライマーとを組み合わせて用いることができる。
【００７０】
８．ニトロフェノールモノオキシゲナーゼ等のスクリーニング方法: 
配列番号1、3又は5に示される塩基配列とその相補配列、また配列番号2、4又は6に示されるアミノ酸配列の情報を利用して、本発明の遺伝子のすべてまたは一部を増幅するプライマーセットを設計することができる。このようにして設計されたPCRプライマーは、4-NP分解性・資化性を示す生物の全DNAを鋳型としてPCRすることにより、NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO遺伝子のスクリーニングに用いることができる。また土壌や河川、活性汚泥、工業廃液などから直接抽出したDNAもしくはRNAを鋳型として用いることにより本発明の遺伝子の存在や発現を診断することができる。例としてHQDO遺伝子(SAO101株のnpcC)の一部を増幅するプライマーセットを示す。
【００７１】
HQD-F
: 5’-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3’（配列番号9）
HQD-R
: 5’-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3’（配列番号10）
このプライマーセットを用いることにより約570-bpのHQDO遺伝子の一部を増幅することができる。また次にNPMO・Ox遺伝子(SAO101株のnpcAの一部を増幅するプライマーセットを示す。
【００７２】
RTpheA1F : 5’-CGCCTACCACGAATTCTGG-3’（配列番号11）
RTpheA1R : 5’-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3’（配列番号12）
このプライマーセットを用いることにより約580-bpのNPMO・Ox遺伝子の一部を増幅することができる。
【００７３】
さらに本発明の遺伝子の塩基配列のすべてまたは一部をプローブとして用いることにより4-NP分解性・資化性を示す生物の全DNAを対象にしたサザンブロット解析などのハイブリダイゼーションを行い、NPMO・Red、NPMO・OxおよびHQDO遺伝子のスクリーニングに用いることができる。プローブとして用いるDNAはPCRで増幅したものや制限酵素で遺伝子の一部を切り出して調製したものなどが利用できる。例としては上記に示したHQDO遺伝子を増幅するプライマーで増幅したDNAをDIG標識(DIGキット、Roche社)し、4-NP分解性を示すロドコッカスYTK32などから抽出した全DNAを対象にサザン解析し、該遺伝子のスクリーニングを行うことができる。ここで用いられるプライマーセットやプローブは本発明の遺伝子DNA配列の一部を含み、特異的なPCR増幅や特異的なハイブリダイゼーションが行える限りその塩基配列は特に限定されるものではない。
（実施例）
【００７４】
2005287429.tif 000004
【００７５】
培養培地としては、LB培地上を用いて、37℃もしくは30℃にて培養した。組換えプラスミド選択のために、必要に応じAmpicilin(アンピシリン)、Chloramphenicol
(クロラムフェニコール)、Kanamycin (カナマイシン)、IPTG及び5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside
(X-gal)をそれぞれ最終濃度が100 μg/ml、30 μg/ml、50 μg/ml、1 mM及び40 μg/mlとなるように培地に添加して使用した。固形培地に関しては、1.6%寒天粉末を添加した。ロドコッカス属細菌用の培地も大腸菌と同様にLB培地を使用し、無機培地(最少培地)としてW培地(´1 solution と´100 solutionを99:1で混合し調製:
×1 solution; 0.85 g KH2PO4, 4.9 g Na2HPO4・12H2O,
0.5g (NH4)2SO4 /990ml water: ´100 solution; 10 g MgSO4・7H2O, 0.5 g FeSO4・7H2O,
100 ml S.S.S. /1l water: S.S.S. (Stock Salt Solution); 10.75 g MgO, 2 g CaCO3,
4.5 g FeSO4・7H2O, 1.44 g ZnSO4・7H2O,
1.12 g MnSO4・4H2O, 0.25 g CuSO4・5H2O, 0.28 g
CoSO4・7H2O, 0.06 g H3BO3, 51.3 ml
conc. HCl /l water)を使用し、30℃で培養した。
【００７６】
遺伝子工学用試薬、キット、装置としてTAKARA社のLigation Kit, 各種制限酵素、EASY TRAP(アガロースゲルからのDNA抽出)、Taq DNA
polymerase、Pyrobest DNA Polymerase、Thermal Cycler TP3000、TOYOBO社のReverTra Ace -a-(Reverse transcriptase)、Ligation
High、Blunting Kit、Cosmo Bio社のMupid (電気泳動装置)、Qiagen社のQIAquick PCR Purification
Kit、QIAprep Spin Miniprep Kit (プラスミドDNA精製)、RNeasy Mini Kit (RNA抽出・精製)、QIAquick
Gel Extraction Kit (アガロースゲルからのDNA抽出)、Novagen社のpT7Blue-T vector、pET17b vector、Roche
Diagnostics社のDIG DNA Labeling and Detection Kit、PCR DIG Probe Synthesis Kit (以上2つサザンハイブリダイゼーション用試薬キット)、Bio-Rad
Laboratories社のGene Pulser II system (エレクトロポレーションシステム)、Model 785 Vacuum Blotter
(DNAブロッティング機器)、Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis System (SDS-PAGE機器)、Beckman
Coulter社のCEQ2000 DNA Analysis System (DNA塩基配列解析装置)、TOMY SEIKO社のUR-200P (超音波破砕装置)、Waters社のAlliance
2690 system (HPLC装置)、SHIMADZU社のGC-17A、GCMS-QP5050 (以上2つGC-MS装置)
等を用いた。
【００７７】
遺伝子解析ソフトウェアとしてSoftware Development社のGENETYX、Intelligenetics社のGeneWorks、さらにオンラインでCLUSTAL
W (多重配列解析、DNA Data Bank of Japan)、BLAST (相同性検索、National Center for
Biotechnology Information)を使用した。
【実施例１】
【００７８】
ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(HQDO)遺伝子断片のPCR増幅
本実施例では、4-NP資化性ロドコッカス属細菌より4-NP代謝系遺伝子を得るため、まずその中間代謝物と考えられるHQの代謝酵素遺伝子、HQDO遺伝子をターゲットとしたPCRを試みた。これは4-NPを直接基質とする酵素遺伝子はこれまで報告がないため、代謝遺伝子の報告例がある中間体のHQの酵素遺伝子をターゲットとしたものである。これまでにHQのジオキシゲナーゼ(hydroxyquinol
1,2-dioxygenase)遺伝子として報告されている Burkholderia piketti のhadC, Burkholderia cepacia
AC1100のtftH, Sphingomonas wittichii RW1のdxnFの遺伝子配列を基に下記のプライマーセットを設計した。
【００７９】
BT-F190
: 5’-TGCGATGACAAGCGGCAGGAATTCATCCTG-3’ (配列番号7)
BT-R706 : 5’-CACAGCGTCGGAATCAAGATACTGGTCGCC-3’ (配列番号8)
【００８０】
このプライマーセットを用いて本研究室で所持している4-NP分解菌Rhodococcus opacus SAO101 (ロドコッカス・オパカスSAO101)の全DNAを鋳型にPCRを行った
(94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、72℃ 1 minを30サイクル)。その結果約550 bpの増幅断片を得、pT7Blue-T vectorを用いてTA-クローニングを行った。このDNAの塩基配列を決定し、推定アミノ酸配列において相同性検索を行ったところ、既知のHQDOとの相同性が認められた。最も高い相同性が認められたのはArthrobacter
sp. BA-5-17のORF2(hydroxyquinol 1,2-dioxygenase)の一部で約80%を示した。またダイオキシン分解菌であるSphingomonas
wittichii RW1のDxnFの一部と約45%の相同性を示した。このプライマーセットでは同じくロドコッカス属細菌のYTK32株からも同様の増幅DNA断片を得ることに成功している。
この遺伝子が4-NP代謝に関わる可能性を調べるためReverse transcription-PCR (RT-PCR)を行った。RT-PCR はReverTra
Ace -α-を用い、操作はこのプロトコールに従った。SAO101株をLB培養し、菌体を増やした後、1 mMの4-NPを加えたW培地に植え換え3時間培養した菌体から全RNAを抽出し、それを鋳型にRT-PCRを行った。またコントロールとしてLB培養した菌体からも全RNAを抽出し、鋳型とした。その結果LB培養した菌体ではこの遺伝子は転写されておらず(もしくは検出限界下の転写量)、4-NP培養した菌体では大量に転写されていることが明らかになった。
【実施例２】
【００８１】
HQDO遺伝子周辺領域の取得
実施例1で得られた遺伝子断片をもとにこのDNAの周辺領域のクローニングを試みた。コスミドで作製したSAO101ゲノムの遺伝子ライブラリーを持つ大腸菌に対して上記遺伝子断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーハイブリダイゼーションの方法はDIG
DNA Labeling and Detection Kitに従った。その結果ハイブリダイゼーションのシグナルの強いポジティブクローンの取得に成功し、プローブに使用した配列を含むコスミドの塩基配列の一部、約3.5
kbを決定した。この領域から3つの推定ORFが認められ、ORF1、2、3とした(遺伝子構成は図2を参照)。これらのORFの推定アミノ酸配列をもとに相同性検索を行い、最も高い相同性が認められたものはORF1がChelatobacter
heintzii ATCC29600のNtaB (nitrilotriacetate monooxygenase component B)と約37%、
ORF2がRalstonia eutropha JMP134のTcpA (2,4,6-trichlorophenol monooxygenase)と約44%、ORF3がArthrobacter
sp. BA-5-17の ORF2 (hydroxyquinol 1,2-dioxygenase)と約74%をそれぞれ示した。また表1にも相同性検索した結果を示す。
【表１】
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【００８２】
ORF1、2、3の塩基配列をそれぞれ実施例文末の配列番号1、3、5に、またそれぞれの推定アミノ酸配列を配列番号2、4、6に示した。
【００８３】
これらの遺伝子ORFについて4-NP培養時での転写誘導とその転写単位を調べるため4-NP培養した菌体から抽出したRNAを鋳型に、下記の様に設計したプライマーセットA-Eを用いRT-PCRを行った。また設計したプライマーセットの部位とRT-PCRの結果を図2に示す。
【００８４】
プライマーセットA: ORF1内部409 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-TCGGACACTTCGCAAGTGG-3’（配列番号13）
Reverse; 5’-CGGTAGTACGACAGTGGATTGC-3’（配列番号14）
プライマーセットB: ORF2内部583 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-CGCCTACCACGAATTCTGG-3’（配列番号15）
Reverse; 5’-ATTGCCGATGTGCTGAACG-3’（配列番号16）
プライマーセットC: ORF3内部567 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-CAGGAGTTCATCCTGCTCTCC-3’（配列番号17）
Reverse; 5’-CACGAAGTCCTTGATCAGCG-3’（配列番号18）
プライマーセットD: ORF1とORF2をスパンする領域388 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-GCAATCCACTGTCGTACTACCG-3’（配列番号19）
Reverse; 5’-CCAGAATTCGTGGTAGGCG-3’（配列番号20）
プライマーセットE: ORF2とORF3をスパンする領域1,122 bpを増幅するプライマーセット
Forward; 5’-TTCAGCACATCGGCAATCC-3’（配列番号21）
Reverse; 5’-GAGAGCAGGATGAACTCCTGG-3’（配列番号22）
RT-PCRを行った結果すべてのプライマーセットにおいて予測されるサイズのDNA断片の増幅が確認された。これらのことからSAO101株のORF1-3が単一の転写単位で、4-NP培養時に誘導的に転写される事が示された。
【００８５】
表1に示したように、ORF2は JMP134株の2,4,6-Trichlorophenol (2,4,6-トリクロロフェノール、以下「2,4,6-TCP」とも示す)
代謝に関わる2,4,6-トリクロロフェノールモノオキシゲナーゼ、TcpAと相同性を示し、ORF3は同じく JMP134株のハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ、TcpCと相同性を示した。4-NPの推定代謝経路(図1、下部経路)はこのJMP134株の2,4,6-TCP代謝経路(図3、Louie,
T. M. et al., J. Bacteriol. 2002. 184: 3492-3500)と類似しており、また上記のようにSAO101株のORF1-3が4-NPで誘導的に転写されていることから、実際にORF1、2、3が4-NPの代謝にニトロフェノールモノオキシゲナーゼのレダクターゼコンポーネント(NPMO・Red)、ニトロフェノールモノオキシゲナーゼのオキシゲナーゼコンポーネント(NPMO・Ox)、ハイドロキシキノールジオキシゲナーゼ(HQDO)として関わる可能性が考えられたため、これらの遺伝子をnitrophenol
catabolism遺伝子、ORF1をnpcB、ORF2をnpcA、ORF3をnpcCと名付け、さらなる解析に用いた。
【実施例３】
【００８６】
SAO101株でのnpc遺伝子の機能の解明
本実施例においてはSAO101株におけるnpc遺伝子の機能を明らかにするためnpcA、npcCの遺伝子破壊株を作製しその解析を行った。本発明者は遺伝子破壊株の作製のため、ロドコッカス属細菌で実績のあるシングルクロスオーバーによる遺伝子破壊法(Kitagawa,
W. et al., J. Bacteriol. 2001. 183: 6598-6606)を試み、それぞれの遺伝子破壊株を得ることに成功した。これらの株を4-NP培養した結果、npcA、npcCの双方の遺伝子破壊株において4-NPの資化性を完全に失っており、これらの遺伝子がSAO101株において4-NP代謝に重要な役割を果たす遺伝子であることが示された。
【実施例４】
【００８７】
大腸菌で発現させた酵素によるnpc遺伝子の機能の解明
本実施例では遺伝子破壊株で認められたnpc遺伝子の機能をさらに確認するため、高発現した大腸菌の粗酵素を用い、その機能の解析を行った。まずnpcB、npcA、npcCのそれぞれの遺伝子を大腸菌で用いられる高発現プラスミドベクター、pET17bに導入した。このベクターはT7プロモーターとリボソーム結合部位(RBS)、それに続く開始コドンATGを有しており、導入する遺伝子の開始コドンとベクター上の開始コドンを融合させるようにクローニングする事によって、その遺伝子の高い発現を期待する事ができる。本発明者はこれら3つの遺伝子npcB、npcA、npcCを別個にベクターの開始コドンATGと合わせて導入し、3つのプラスミドpETnpcB、pETnpcA、pETnpcCをそれぞれ構築した。
【００８８】
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【００８９】
1) 組み換え大腸菌を3 ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
2) 新しい40 mlのLB培地に種菌として前培養液を0.4-2 ml植菌しOD600が0.5-0.6になるまで37℃で2-4時間培養した。
3) OD600が0.5-0.6に達した時点で最終濃度1 mMになるようにIPTGを加え、培養温度を30℃に変え、さらに3時間培養した。
4)
菌液を50 ml容量の遠心チューブに入れ6,000 rpmで5分遠心、集菌し、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)で菌体を洗浄し、2 mlのGPME
bufferに再懸濁 した (GPME buffer; 10% glycerol, 2.5 mM 2-mercaptoethanolを含む50 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.2)。
5)
超音波破砕機で細胞を破砕、エッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 min遠心分離を行い、上清を得て、これを粗酵素抽出液とした。
6)
GMPE bufferに最終濃度10 μM FAD、2 mM NADH、および200 μMの反応基質(4-NPなど)を加えた酵素反応液を調製。
7) 酵素反応液 と粗酵素抽出液を1:1の割合で混合し、30℃で撹拌しながら反応させた。
以下8)9)はHPLC分析用サンプル調製、10)11)12)はGC-MS分析用サンプル調製。
8) 反応溶液中から1、2、3、5、10分の間隔で100 μlのサンプルを抜き取り、等量のメタノールと混合して反応を停止させた。
9) 各サンプルをエッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 分間遠心分離を行い、上清をさらに孔経0.22μmのフィルターに通し、HPLC分析用のサンプルとした。
10) 反応溶液中から3、10分の時点で500μlのサンプルを抜き取り、直ちに飽和量のNaClと1/50容量(10μl)の濃塩酸を加え反応を停止し、3分間ボルテックスミキサーで撹拌した。
11) 等量の酢酸エチルを加え、10分間ボルテックスミキサーで撹拌した後、15,000 rpmで10分間遠心分離を行い、酢酸エチル層(上層)のみをガラスのバイアルに移した。
12) 窒素ガス吹きつけによってガラスバイアル中の酢酸エチルを気化し、トリメチルシリル化剤(B0911;東京化成工業)を加えてボルテックスミキサーで撹拌、GC-MSサンプルとした。
【００９０】
HPLC分析条件 (Waters社 Alliance 2690 system)
固定相カラム; 内径6 mm長さ15 cm、粒径5μmオクタデシルシリカ充填
移動相; アセトニトリル : 水0.1%酢酸 = 1 : 1、流速2 ml/min
GC-MS分析条件 (SHIMADZU社 GC-17A、GC-MS-QP5050)
カラム; Agilent Technologies社 DB-5、内径0.25 mm、長さ30 m
温度設定; 50℃ 2分保持後30℃/minで250℃まで上昇、250℃で5分保持
【００９１】
まず上記の様に調製した粗酵素液をSDS-PAGEで分析し、目的遺伝子の発現の有無を調べた。その結果図4のレーン2、3に示すpETnpcB、pETnpcAの各プラスミドを持つ大腸菌粗酵素液で、コントロールのレーン1と比較して強く発現している特異的なバンドが認められた。NpcB、NpcAの推定分子量はそれぞれ20.1
kDa、60.0 kDaであるが、これら特異的バンドはほぼ同じサイズに位置していたことから、これらがnpcB、npcAの発現産物であることが強く示唆された。
【００９２】
次に4-NP、4-NCAに対する酵素活性を測定した。HPLC分析の結果pETnpcB、pETnpcA双方の粗酵素抽出液に4-NP、4-NCAを変換する活性がないことが示された。しかしpETnpcB、pETnpcAの粗酵素液を等量混合し、この混合粗酵素液を活性測定に用い、HPLC分析したところ、4-NP、4-NCAのピークが減少しており、これらの基質に対する酵素活性が認められた。続いて2、4-DCP、2,4,6-TCPの変換活性も認められた。それぞれの基質に対する活性比は4-NPと4-NCAがほぼ同様に高く、続いて2、4-DCP、2,4,6-TCPであった。また2,4-Dinitrophenol(2,4-ジニトロフェノール)に対する活性は認められなかった。HPLCを用いて基質の減少を指標にした活性測定の結果を表2に示す。
【表２】
2005287429.tif 000007
【００９３】
また4-NPと4-NCA変換活性が得られたサンプルについてGC-MS分析を行ったところ、双方ともわずかな量のHQが検出された。上記の通りHQは水相では非常に不安定であるため、4-NPや4-NCAの変換量と量的な相関については不明であった。これらの結果、npcB、npcAの発現産物であるNpcB、NpcAの双方が4-NPを4-NCA経由でHQに変換する4-ニトロフェノール/4-ニトロカテコールモノオキシゲナーゼとして機能し、双方ともその活性に必須である事が示された。
【００９４】
続いてHQDO酵素遺伝子と考えているnpcCを導入したプラスミドpETnpcCをもつ大腸菌の粗酵素抽出液を以下のように調製し、その活性を試験した。
1) 組み換え大腸菌を3 ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
2) 新しい40 mlのLB培地に種菌として前培養液を0.4-2 ml植菌しOD600が0.5-0.6になるまで37℃で2-4時間培養した。
3) OD600が0.5-0.6に達した時点で最終濃度1 mMになるようにIPTGを加え、培養温度を30℃に変え、さらに3時間培養した。
4)
菌液を50 ml容量の遠心チューブに入れ6,000 rpmで5分遠心、集菌し、50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)で菌体を洗浄し、2 mlのbufferAに再懸濁した
(bufferA; 10% glycerol, 7.5% n-propanol, 1 mM 2-mercaptoethanolを含む25 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.5)。
5)
超音波破砕機で細胞を破砕、エッペンチューブに入れ15,000 rpmで30 min遠心分離により上清を得て、これを粗酵素抽出液とした。
6)
0.5 mM FeSO4, 1 mM HQを含む10 mMリン酸カリウムbuffer、pH7.2を調製し、酵素反応液とした。
7)
酵素反応液 と適宜bufferAで希釈した粗酵素抽出液を9:1の割合で混合し、30℃で撹拌しながら反応させた。
以下サンプル調製と分析条件はnpcB、npcAで行ったものと同様に行った。
【００９５】
npcB、npcAと同様に粗酵素抽出液をSDS-PAGEで分析し、目的遺伝子の発現の有無を調べた。図4のレーン4に示すように特異的に強く発現しているタンパク質のバンドが認められた。NpcCの推定分子量は33.2
kDaであるが、この特異的バンドはほぼ同じサイズに位置していたことから、これがnpcCの発現産物であることが強く示唆された。
【００９６】
次にHQに対する酵素活性を測定した。前述のようにHQは水溶液中で非常に不安定であり、ネガティブコントロールでもHQの減少が見られたことから、粗酵素抽出液での基質の減少による反応速度を計算することはできなかった。また反応産物をHPLCで検出することはできなかった。しかし5分、10分後の酵素反応溶液についてGC-MS分析を行ったところ極微量のMAが検出された。MAはHQがHQDOによる環開裂を受けて生成されるものであり、HQの減少が見られたネガティブコントロールでは検出されなかった事から、HQが酵素反応によってMAに変換されたことが示された。これらの結果からnpcCの発現産物であるNpcCがHQDOとして機能することが確認された。
【００９７】
以上、SAO101株の遺伝子破壊株と大腸菌で発現させた酵素遺伝子の結果からSAO101株の4-NPの代謝系の一部と関連する酵素遺伝子ついて図5にように推定した。すなわち4-NPをnpcB、npcAの両遺伝子産物、NPMOが4-NCAを経由してHQへ変換し、そのHQをnpcCの遺伝子産物、HQDOがMAに変換するというものである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】バクテリアによる4-ニトロフェノールの推定代謝経路を示す。  A．4-ニトロフェノール (4-NP)  B．ベンゾキノリン（Benzoquinone）  C．ヒドロキノリン（Hydroquinone）  D．ヒドロキシムコニックセミアルデヒド（Hydroxymuconic semialdehyde）  E．4-ニトロカテコール (4-Nitrocatechol；4-NCA)  F．1,2,4-トリヒドロキシベンゼン（1,2,4-Trihydroxybenzene） (ハイドロキシキノール（Hydroxyquinol）、HQ)  G．マレイルアセテート (Maleylacetate；MA)  H．β−ケトアジペート（beta-Ketoadipate）
【図２】4-ニトロフェノール培養菌体の全RNAを鋳型にしたRT-PCRの電気泳動像とプライマー設計位置を示す。
【図３】JMP134株で示されている2,4,6-Trichlorophenol代謝経路を示す。
【図４】pETnpcB、pETnpcA、pETnpcCを持つ大腸菌粗酵素抽出液のSDS-PAGE分析を示す。
【図５】SAO101株の推定4-ニトロフェノール代謝経路と反応に関わる酵素遺伝子を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号10：プライマー
配列番号11：プライマー
配列番号12：プライマー
配列番号13：プライマー
配列番号14：プライマー
配列番号15：プライマー
配列番号16：プライマー
配列番号17：プライマー
配列番号18：プライマー
配列番号19：プライマー
配列番号20：プライマー
配列番号21：プライマー
配列番号22：プライマー
【図１】
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【図２】
2005287429.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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