(57)【要約】      （修正有）【課題】グラム陰性菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）を認識するＴｏｌｌ様受容体４に結合する新規アダプター分子およびその遺伝子、ならびにそれらを利用した薬剤等を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる新規アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲドメイン含有アダプター分子２）は、ＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−１を架橋することにより、ＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナルをＴＩＣＡＭ−１に伝え、Ｉ型インターフェロン産生を誘導する機能を有する。また、遺伝子はアダプター分子ＴＩＣＡＭ−２をコードする遺伝子である。これらのタンパク質および遺伝子は、Ｉ型インターフェロンが有効な疾患の予防・治療に役立つ薬剤、およびＩ型インターフェロンによる有害事象の予防・治療に役立つ薬剤の創薬、研究等に利用でき、広く医療分野に応用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合しタイプＩインターフェロン誘導を媒介する新規アダプター分子であって、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示される配列のうち７５−２１３番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４に示される配列のうち７２−２１０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質と、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を併せ持つタンパク質。
【請求項５】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質に異常を持つタンパク質。
【請求項６】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１１６番目のアミノ酸が置換または欠失された、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１１７番目のアミノ酸が置換または欠失された、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１１】
配列番号１または３に示される塩基配列を有する遺伝子。
【請求項１２】
配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質と、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を併せ持つタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質に異常を持つタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１４】
配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１５】
請求項９、１１、１２または１３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１０または１４のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１７】
配列番号１に示される塩基配列のうち、８７−７９１番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号３に示される塩基配列のうち、１２０−８１５番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項２０】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体であって、当該タンパク質に結合することにより、当該タンパク質のＩ型インターフェロン誘導を媒介する性質を阻害する抗体。
【請求項２１】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合する新規アダプター分子のＩ型インターフェロン誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２２】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合する新規アダプター分子のＩ型インターフェロン誘導を媒介する機能によりＩ型インターフェロンの産生を亢進することを作用機序とするウイルス感染症の予防・治療薬剤。
【請求項２３】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合する新規アダプター分子のＩ型インターフェロン誘導を媒介する機能によりＩ型インターフェロンの産生を亢進することを作用機序とするガンの治療薬剤。
【請求項２４】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合する新規アダプター分子のＩ型インターフェロン誘導を媒介する機能を抑制または阻害することにより、Ｉ型インターフェロンの産生を抑制することを作用機序とするエンドトキシンショックの予防・治療薬剤、自己免疫疾患の治療薬剤またはアトピー性疾患の治療薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に結合しタイプＩインターフェロン誘導を媒介する新規アダプター分子タンパク質およびその変異体、ならびにそれらをコードする遺伝子、それらの利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、細菌感染に対する生体防御機構は特異的なＴ細胞やＢ細胞を介した獲得免疫系から論じられてきた。しかし、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＴＬＲ」と略す）の発見以来、感染防御における自然免疫系（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）の役割が注目されるようになってきた。
【０００３】
ＴＬＲはハエからヒトまで普遍的に存在する重要な生体防御機構である自然免疫系において、微生物成分の認識に関与する細胞膜上のシグナル受容体であり、第２の免疫識別系として注目されている。現在ヒトではＴＬＲファミリーに属する１０種の受容体（ヒトＴＬＲ１−１０）が確認されており、これらのマウス相同体（マウスＴＬＲ１−１０）も確認されている。
【０００４】
ＴＬＲは、細胞外領域がロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）およびＣ末端隣接領域（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）から構成され、細胞内はインターロイキン１受容体と相同性のあるＴＩＲ（Ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ドメインから成る。このＴＬＲに関する研究により、自然免疫系における微生物成分の認識に関わるシグナル伝達経路が明らかにされつつある。
【０００５】
リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下「ＬＰＳ」と略す）は、グラム陰性細菌の細胞壁構成成分であり、エンドトキシン（内毒素）とも呼ばれ、哺乳動物に対して強い毒性がある。グラム陰性細菌の感染により引き起こされるエンドトキシンショックは、凝固系の活性化、ｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現誘導などを経て、末梢血管拡張、高心拍出、発熱などを呈し、末期には低心拍出状態となり死に至る。エンドトキシンショックを引き起こす宿主応答としては、ＴＬＲ／ＣＤ１４受容体を介する細胞内シグナル伝達によるＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）系の活性化と転写因子の活性化、そして炎症性サイトカインの産生が挙げられる。
【０００６】
ＬＰＳはＴＬＲ４のアゴニストであり、自然免疫系においてマクロファージや樹状細胞を活性化する。ＴＬＲ４はＭＤ−２（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−２）およびＣＤ１４と共に、細胞膜上でＬＰＳを認識し、ＮＦ−κＢ（核因子κＢ、ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒκＢ）およびＩＲＦ−３（インターフェロン調節因子３、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ３）を活性化する（非特許文献１）。細胞内において、インターフェロン（以下「ＩＦＮ」と略す）−β誘導に引き続いてＩＲＦ−３が活性化される（非特許文献２）。ＴＬＲ４のシグナル伝達は、アダプター分子ＭｙＤ８８を介してＮＦ−κＢを活性化するが、ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路はＬＰＳに起因する樹状細胞の成熟やＩＦＮ−β誘導を起こさない（非特許文献２、３）。このことはＭｙＤ８８欠損マウス由来細胞の分析により確認された（非特許文献４）。ＭｙＤ８８により誘導されない細胞の反応はＭｙＤ８８非依存性反応と呼ばれ、未知のアダプター分子が関与していることが予想された。
【０００７】
ＴＩＲＡＰ（Ｔｏｌｌ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍａｌとも呼ばれる）は、当初ＭｙＤ８８非依存性経路に必要であると考えられていた（非特許文献５、６）。実際に、ＴＩＲＡＰのドミナントネガティブ体および合成ＴＩＲＡＰペプチドはＩＦＮ−β誘導およびＰＫＲリン酸化を阻害したと報告された（非特許文献５、７）。しかし、ＴＩＲＡＰノックアウトの研究において樹状細胞の成熟およびＩ型ＩＦＮ誘導はＴＩＲＡＰとほとんど無関係で、ＴＩＲＡＰ−／−細胞の表現型はＭｙＤ８８−／−細胞の表現型と似ていた（非特許文献８、９）。したがって、ＩＦＮ−βを誘導する経路のＴＩＲＡＰを介する活性化は、培養系のマウス細胞および多くのヒト細胞においては、あったとしても僅かであると考えられる。
【０００８】
ＴＬＲ３はポリイノシン酸−ポリシチジル酸（以下「ポリ（Ｉ：Ｃ）」と略す）を認識してＩＦＮ−βプロモーターを活性化し、ＮＦ−κＢを活性化する程度はより低い（非特許文献１０、１１、１２）。Ｉ型ＩＦＮ産生および樹状細胞成熟は、ＴＬＲ３を介する樹状細胞活性化により誘導される典型的な細胞反応である。最近、ＴＩＲドメイン含有アダプター分子１（ＴＩＲ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、以下「ＴＩＣＡＭ−１」と略す）と名付けられたアダプター分子が直接ＴＬＲ３のＴＩＲに結合し、ＭｙＤ８８と無関係にＩＲＦ−３を活性化することが明らかとなった。しかし、酵母ツー・ハイブリッド系および哺乳類細胞由来の直接免疫沈降において、ＴＩＣＡＭ−１はＴＬＲ４のＴＩＲとほとんど結合しなかった（非特許文献１２）。この結果から、もう１つの因子または機構がＴＬＲ４のＭｙＤ８８非依存性経路に関与していることが予想されていた。
【０００９】
ところで、ＴＬＲによって誘導されるＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）は、抗ウイルス作用や抗がん作用を示すことが知られている。詳細には、Ｉ型ＩＦＮは、以下のような作用を持つことが知られている。
【００１０】
Ｉ型ＩＦＮは、以下のような複数の作用機序により抗ウイルス作用を奏することが知られている。
【００１１】
▲１▼ウイルスのｍＲＮＡを不安定化し、宿主のタンパク翻訳を抑制する細胞内遺伝子を活性化する。これにより、ウイルスの複製を抑制し、ウイルスの増殖を抑制する。
【００１２】
▲２▼ＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する抵抗性を誘導する。細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する感受性を亢進させる。さらに、Ｔ細胞の活性化の抑制およびＴ細胞サプレッサー活性の増強にも関与する。
【００１３】
▲３▼ウイルス感染細胞を選択的に障害するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるアポトーシスをウイルスに誘導する。
【００１４】
また、Ｉ型ＩＦＮは、以下のような複数の作用機序により抗腫瘍作用を奏することが知られている。
【００１５】
１）腫瘍細胞内のｍＲＮＡを不安定化し、宿主のタンパク翻訳を抑制する細胞内遺伝子を活性化する。これにより、腫瘍細胞内のタンパク質の合成を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制する。
【００１６】
２）マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等の抗腫瘍エフェクターを活性化し、これらの抗腫瘍エフェクターにより腫瘍細胞を障害することで、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する。
【００１７】
３）ウイルス感染細胞を選択的に障害するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるアポトーシスを腫瘍細胞に誘導する。
【００１８】
さらに、Ｉ型ＩＦＮは、前述したようにＴ細胞の活性化の抑制、Ｔ細胞サプレッサー活性の増強にも関与することから、ある種の自己免疫疾患を改善できると考えられる。
【００１９】
Ｉ型ＩＦＮは、以上のような抗ウイルス作用および抗腫瘍作用を持つことから、従来、ＩＦＮα製剤やＩＦＮβ製剤が、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｃ型肝炎から誘発される肝がん、腎臓がん等の治療剤として使用されている。例えば、天然型ＩＦＮα製剤である住友製薬株式会社製の「スミフェロン（登録商標）」などが、臨床応用において好成績を挙げている。
【００２０】
【非特許文献１】
Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  （２００１）  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：  １３５−１４５．
【００２１】
【非特許文献２】
Ｋａｗａｉ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｏ．，  Ｆｕｊｉｔａ，  Ｔ．，  Ｉｎｏｕｅ，  Ｊ．，  Ｍｕｈｌｒａｄｔ，  Ｐ．Ｆ．，  Ｓａｔｏ，  Ｓ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．  （２００１）  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：  ５８８７−５８９４．
【００２２】
【非特許文献３】
Ｋａｉｓｈｏ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  ｏ．，  Ｋａｗａｉ，  Ｔ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．  （２００１）  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭｙＤ８８−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：  ５６８８−５６９４．
【００２３】
【非特許文献４】
Ｋａｗａｉ，  Ｔ．，  Ａｄａｃｈｉ，  Ｏ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．  （１９９９）  Ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ＭｙＤ８８−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：  １１５−１２２．
【００２４】
【非特許文献５】
Ｈｏｒｎｇ，  Ｔ．，  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｇ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  （２００１）  ＴＩＲＡＰ：  ａｎ  ａｄａｐｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：  ８３５−８４１．
【００２５】
【非特許文献６】
Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｋ．Ａ．，  Ｐａｌｓｓｏｎ−ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｂｏｗｉｅ，  Ａ．Ｇ．，  Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，  Ｃ．Ａ．，  Ｍａｎｓｅｌｌ，  Ａ．Ｓ．，  Ｂｒａｄｙ，  Ｇ．，  Ｂｒｉｎｔ，  Ｅ．，  Ｄｕｎｎｅ，  Ａ．，  Ｇｒａｙ，  Ｐ．，  Ｈａｒｔｅ，  Ｍ．Ｔ．，  ＭｃＭｕｒｒａｙ，  Ｄ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｓｉｍｓ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｂｉｒｄ，  Ｔ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｌ．Ａ．  （２００１）  Ｍａｌ  （ＭｙＤ８８−ａｄａｐｔｅｒ−ｌｉｋｅ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：  ７８−８３．
【００２６】
【非特許文献７】
Ｔｏｓｈｃｈａｋｏｖ，  Ｖ．，  Ｊｏｎｅｓ，  Ｂ．Ｗ．，  Ｐｅｒｅｒａ，  Ｐ．Ｙ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｋ．，  Ｃｏｄｙ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｓ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ｒ．，  Ｍａｊｏｒ，  Ｊ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｔ．Ａ．，  Ｆｅｎｔｏｎ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌ，  Ｓ．Ｎ．  （２００２）  ＴＬＲ４，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＴＬＲ２，  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＩＦＮ−−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＳＴＡＴ１α／β−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：  ３９２−３９８．
【００２７】
【非特許文献８】
Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｓａｔｏ，  Ｓ．，  Ｈｅｍｍｉ，  Ｈ．，  Ｓａｎｊｏ，  Ｈ．，  Ｕｅｍａｔｓｕ，  Ｓ．，  Ｋａｉｓｈｏ，  Ｔ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｋ．，  Ｔａｋｅｕｔｉ，  Ｏ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｆｕｊｉｔａ，  Ｔ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．  （２００２）  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＴＩＲＡＰ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ＴＬＲ２  ａｎｄ  ＴＬＲ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：  ３２４−３２９．
【００２８】
【非特許文献９】
Ｈｏｒｎｇ，  Ｔ．，  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｆｌａｖｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  （２００２）  Ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＴＩＲＡＰ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：  ３２９−３３３．
【００２９】
【非特許文献１０】
Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｌ．，  Ｈｏｌｔ，  Ａ．Ｃ．，  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，  Ｒ．Ａ．  （２００１）  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：  ７３２−７３８．
【００３０】
【非特許文献１１】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｋｉｋｋａｗａ，  Ｓ．，  Ｋｏｈａｓｅ，  Ｍ．，  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｓｅｙａ，  Ｔ．  （２００２）  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９３：  １３６４−１３６９．
【００３１】
【非特許文献１２】
Ｏｓｈｉｕｍｉ，  Ｈ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｆｕｎａｍｉ，  Ｋ．，  Ａｋａｚａｗａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｅｙａ，  Ｔ．  （２００３）  ＴＩＣＡＭ−１，  ａｎ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  β−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４：  １６１−１６７．
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、ＬＰＳを認識したＴＬＲ４のシグナル伝達において、ＭｙＤ８８に依存しない別の経路が存在すること、このＭｙＤ８８非依存性経路によりＬＰＳに起因する樹状細胞の成熟およびＩ型ＩＦＮ誘導が起こることが報告されていた。これらの公知事実の総合的評価から、ＴＬＲ４のＭｙＤ８８非依存性経路には未知のアダプター分子が関与していることが予想されていたが、そのアダプター分子は未だ特定されていなかった。
【００３３】
ＴＬＲ４と直接結合し、シグナルを下流に伝達してＩ型ＩＦＮを誘導する分子が明らかとなれば、ＴＬＲ４を介する自然免疫応答においてＩ型ＩＦＮを誘導するシグナル伝達経路およびシグナル伝達調節機構の解明が進むこととなり、自然免疫系に関わる種々の病気の病態解明や、自然免疫応答の調節による治療薬等の開発に有効利用ができると考えられる。
【００３４】
また、前述したウイルス感染症や腫瘍の治療に用いられているインターフェロン製剤は、全身投与なので、治療効果の得られる濃度では、精神・神経症状（うつ病等）、自己免疫疾患（甲状腺機能異常、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ等）が悪化する等の副作用が強い。インターフェロン製剤による副作用は、本来はインターフェロンを産生しない正常な宿主細胞にまでインターフェロンが導入されてしまうために、本来は外部抗原に対する免疫応答時に行われるべきＴ細胞に対する自己抗原の提示が、インターフェロンの導入部位全体で誘導され、自己免疫現象が起こり易くなるためであると考えられる。
【００３５】
このように、インターフェロン製剤は、治療効果の得られる濃度では副作用が強いため、全身投与では十分な抗がん作用を維持するのが難しい。また、インターフェロン製剤を局所投与したとしても、副作用を完全に避けることは難しいと考えられる。
【００３６】
ＴＬＲ４と直接結合し、シグナルを下流に伝達してＩ型ＩＦＮを誘導する分子が明らかとなれば、生体内で局所的なＩ型インターフェロンの産生を亢進することによりウイルス感染症や腫瘍等を治療する新たな治療薬剤を開発することができると考えられる。また、この新規なタンパク質の機能解析を通じて生体内でＩ型インターフェロンの産生を阻害する物質を提供し、この物質により生体内でＩ型インターフェロンの産生を阻害することにより自己免疫疾患やアトピー性疾患等を治療する新たな治療剤を提供することができると考えられる。
【００３７】
さらに、ＴＬＲ４はＬＰＳを認識する受容体であることから、上記生体内でＩ型インターフェロンの産生を阻害する物質によりエンドトキシンショックを予防・治療することが可能となる。
【００３８】
グラム陰性細菌の感染により引き起こされるエンドトキシンショックは、炎症性サイトカインの産生に起因する凝固系の活性化、ｉＮＯＳの発現誘導などを経て、末梢血管拡張、高心拍出、発熱などを呈し、末期には低心拍出状態となり死に至るものであり、現在効果的な治療法は無く、有効な治療法の開発が急務である。
【００３９】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＴＬＲ４に直接結合し、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する新規アダプター分子およびその遺伝子、ならびにそれらを利用した薬剤等を提供することにある。
【００４０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＴＬＲ４に直接結合する新規なアダプター分子を同定し、この分子がＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−１を架橋することにより、ＴＬＲ４を介するＭｙＤ８８非依存的経路においてＬＰＳに起因するＩＲＦ−３活性化を誘導することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００４１】
すなわち、本発明に係る新規アダプター分子はＩ型ＩＦＮの誘導を司るアダプターであり、選択的にＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナル系の中からＩ型ＩＦＮの誘導系だけを調節できる点に特徴がある。
【００４２】
本発明者らは、この新規アダプター分子がＴＩＲドメイン含有アダプター分子１（ＴＩＲ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＴＩＣＡＭ−１）のＴＩＲドメインと相同性の高いＴＩＲドメインを有することから、ＴＩＲドメイン含有アダプター分子２（ＴＩＲ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−２）と名付けた。以下、本発明に係る新規アダプター分子を適宜「ＴＩＣＡＭ−２」と記載する。
【００４３】
上記アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２は、本発明者らが初めて同定し、その全長アミノ酸配列を明らかにした新規のアダプタータンパク質である。配列番号２にはヒト由来のアミノ酸配列を、配列番号４にはマウス由来のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
したがって、本発明に係るタンパク質は、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその変異体である。具体的には以下のタンパク質が本発明に含まれる。
（１）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示される配列のうち７５−２１３番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４の示される配列のうち７２−２１０番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（４）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質と、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を併せ持つタンパク質。
（５）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質に異常を持つタンパク質。
（６）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質。
（７）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１１６番目のアミノ酸が置換または欠失された、上記（６）に記載のタンパク質。
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１１７番目のアミノ酸が置換または欠失された、上記（６）に記載のタンパク質。
【００４５】
上記タンパク質はＴＩＲ４を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解明に有効利用できる可能性がある。
【００４６】
上記タンパク質のうち、（１）ないし（５）はＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を正常に有するタンパク質である。後述するように、ＴＩＣＡＭ−２はそれのみを単独で過剰発現させた場合に、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化することが確認された。したがって、上記タンパク質（１）ないし（５）はＩ型ＩＦＮの産生により改善可能な各種疾患に有効である。たとえば、ウイルス感染症を予防・治療する薬剤や、Ｉ型ＩＦＮが有効なガン（腎ガン、子宮頚ガン、肝炎後肝ガン等）を治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には上記（１）ないし（５）のＴＩＣＡＭ−２タンパク質またはＴＩＣＡＭ−２タンパク質変異体を含むことを特徴とするウイルス感染予防・治療薬剤、およびガン治療薬剤が含まれる。
【００４７】
上記（６）ないし（８）はＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能に異常を有するドミナントネガティブ変異体のタンパク質である。これらのドミナントネガティブ変異体は、ＴＬＲ４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を持ち、ＴＬＲ４のシグナルの伝達を遮断する。したがって、上記タンパク質（６）ないし（８）はＩ型ＩＦＮの産生を抑制することができ、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象、たとえば自己免疫疾患やアトピー性疾患を治療する薬剤として利用できる。さらに、ＴＬＲ４はＬＰＳを特異的に認識し、そのシグナル伝達がエンドトキシンショックの引き鉄となるため、上記タンパク質（６）ないし（８）はＬＰＳに起因するエンドトキシンショックを予防・治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には上記（６）ないし（８）のＴＩＣＡＭ−２タンパク質の変異体を含むことを特徴とする自己免疫疾患治療薬剤、アトピー性疾患治療薬剤、およびエンドトキシンショック予防・治療薬剤が含まれる。
【００４８】
本発明に係る遺伝子には、以下の遺伝子が含まれる。
（ａ）上記（１）ないし（８）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号１または３に示される塩基配を列有する遺伝子。
（ｃ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質と、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を併せ持つタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質に異常を持つタンパク質をコードする遺伝子。
（ｅ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロン誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質をコードする遺伝子。
【００４９】
上記遺伝子のうち、（ａ）の（１）ないし（５）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ないし（ｄ）はＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を正常に有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、上記（ａ）の（６）ないし（８）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｅ）はＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能に異常を有するドミナントネガティブ変異体のタンパク質をコードする遺伝子である。
【００５０】
上記遺伝子は、ＴＩＲ４を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解明に有効利用できる可能性がある。
【００５１】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）ないし（ｅ）の遺伝子を含むものである。
【００５２】
上記組換え発現ベクターを用いると、公知の遺伝子工学的手法により標的細胞を形質転換して標的細胞に上記遺伝子を導入することができる。形質転換により得られた形質転換体は、ＴＩＲ４を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解明に有効利用できる可能性がある。
【００５３】
上記組換え発現ベクターのうち、上記（ａ）の（１）ないし（５）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ないし（ｄ）の遺伝子を含む組換え発現ベクターは、ウイルス感染症を予防・治療する薬剤や、Ｉ型ＩＦＮが有効なガンを治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には上記（ａ）の（１）ないし（５）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｂ）ないし（ｄ）の遺伝子を含む組換え発現ベクターを含むことを特徴とするウイルス感染予防・治療薬剤、およびガン治療薬剤が含まれる。
【００５４】
上記組換え発現ベクターのうち、上記（ａ）の（６）ないし（８）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｅ）の遺伝子を含む組換え発現ベクターは、自己免疫疾患やアトピー性疾患を治療する薬剤、およびＬＰＳに起因するエンドトキシンショックを予防・治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には、上記（ａ）の（６）ないし（８）のタンパク質をコードする遺伝子、および（ｅ）の遺伝子を含む組換え発現ベクターを含むことを特徴とする自己免疫疾患治療薬剤、アトピー性疾患治療薬剤、およびエンドトキシンショック予防・治療薬剤が含まれる。
【００５５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のうち８７−７９１番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド、または配列番号３に示される塩基配列のうち、１２０−８１５番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドである。
【００５６】
上記ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）として利用することが可能である。これらのｓｉＲＮＡを用いてＲＮＡ干渉実験を行うことにより、ＴＩＲ４を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解明に有効利用できる可能性がある。
【００５７】
また、これらのｓｉＲＮＡを標的細胞にトランスフェクトすることにより、ＴＩＣＡＭ−２タンパク質の発現を抑制することができ、これにより、上記ポリヌクレオチドは自己免疫疾患やアトピー性疾患を治療する薬剤、およびＬＰＳに起因するエンドトキシンショックを予防・治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には、上記ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする自己免疫疾患治療薬剤、アトピー性疾患治療薬剤、およびエンドトキシンショック予防・治療薬剤が含まれる。
【００５８】
本発明に係る抗体には、以下の抗体が含まれる。
（ｉ）上記（１）ないし（８）のタンパク質に対する抗体。
（ｉｉ）上記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に対する抗体であって、当該タンパク質に結合することにより、当該タンパク質のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する抗体。
【００５９】
上記抗体は、ＴＩＣＡＭ−２タンパク質発現の検出、ＴＩＣＡＭ−２タンパク質の精製等に有用であると考えられる。
【００６０】
上記（ｉｉ）の抗体はＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害するので、自己免疫疾患やアトピー性疾患を治療する薬剤、およびＬＰＳに起因するエンドトキシンショックを予防・治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には、上記（ｉｉ）の抗体を含むことを特徴とする自己免疫疾患治療薬剤、アトピー性疾患治療薬剤、およびエンドトキシンショック予防・治療薬剤が含まれる。
【００６１】
本発明には、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質をスクリーニングする方法が含まれる。このスクリーニング方法では、上記（１）ないし（５）のタンパク質を用いればよい。また、このスクリーニング方法を用いて得られたＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質は、自己免疫疾患やアトピー性疾患を治療する薬剤、およびＬＰＳに起因するエンドトキシンショックを予防・治療する薬剤として利用できる。すなわち、本発明には、上記スクリーニング方法を用いて得られたＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質含むことを特徴とする自己免疫疾患治療薬剤、アトピー性疾患治療薬剤、およびエンドトキシンショック予防・治療薬剤が含まれる。
【００６２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００６３】
〔１〕本発明に係る新規アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２タンパク質、およびその遺伝子
ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナル伝達経路のこれまでの研究成果により、ＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナル伝達経路には、ＭｙＤ８８依存性経路とＭｙＤ８８非依存性経路とが存在し、ＭｙＤ８８非依存性経路には未知のアダプター分子が関与していることが予想されていた。
【００６４】
本発明者らは、上記未知アダプター分子の同定を試み、物理的にはＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−１とを架橋し、機能的にはＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナルをＴＩＣＡＭ−１に伝達して順次ＩＲＦ−３を活性化する新規アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２を同定し、ヒトおよびマウスのＴＩＣＡＭ−２遺伝子をクローニングした。
【００６５】
図１にヒトＴＬＲ２、３、４および５と各ＴＬＲ特異的シグナル伝達経路を決定するアダプターとの会合の概略を示した。図中のＭ−１はＭｙＤ８８、Ｍ−２はＴＩＲＡＰ（Ｍａｌ）、Ｔ−１はＴＩＣＡＭ−１、Ｔ−２はＴＩＣＡＭ−２を表す。ＴＬＲ５ではＭｙＤ８８が直接結合し、ＮＦ−κＢを活性化する。ＴＬＲ２ではＴＩＲＡＰ介してＭｙＤ８８にシグナルを伝達し、ＮＦ−κＢを活性化する。ＴＬＲ３ではＭｙＤ８８を介する経路（ＭｙＤ８８依存性経路）によりＮＦ−κＢを活性化、ＴＩＣＡＭ−１を介する経路（ＭｙＤ８８非依存性経路）によりＩＦＮ−βプロモーターを活性化する。ＴＬＲ４では、ＬＰＳのシグナルによりＴＬＲ４が２つのアダプターＴＩＲＡＰとＴＩＣＡＭ−２とを引き寄せ、それぞれＭｙＤ８８およびＴＩＣＡＭ−１に連結させることにより、その下流にＭｙＤ８８依存性経路およびＭｙＤ８８非依存性経路を構成する。
【００６６】
配列番号１にヒトＴＩＣＡＭ−２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号３にマウスＴＩＣＡＭ−２の完全長ｃＤＮＡの塩基配列を示した。配列番号１の塩基配列中、８７〜７９１番目の塩基配列がヒトＴＩＣＡＭ−２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当し、配列番号３の塩基配列中、１２０〜８１５番目の塩基配列がマウスＴＩＣＡＭ−２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。配列番号１および３に示される各ｃＤＮＡ配列は、このＯＲＦ領域のほか、５’側および３’側にそれぞれ非翻訳領域を含むものである。
【００６７】
配列番号２にヒトＴＩＣＡＭ−２タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号４にマウスＴＩＣＡＭ−２タンパク質のアミノ酸配列を示した。これらのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１および配列番号３に示した塩基配列のＯＲＦによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００６８】
本発明に係るタンパク質は上記配列番号２および配列番号４にアミノ酸配列を示した２つのタンパク質に限定されるものではなく、その一部が改変された変異タンパク質であってもよい。すなわち、本発明のタンパク質には（ｉ）配列番号２または４に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、のみならず、（ｉｉ）配列番号２または４に示される何れかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、も含まれる。
【００６９】
上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｉｉ）のタンパク質は、上記（ｉ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００７０】
また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓ  やＭｙｃ  、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００７１】
さらに、上記（ｉｉ）のタンパク質にはＴＩＣＡＭ−２の有するＴＬＲ４に直接結合する性質およびＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質のうち、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するタンパク質と、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を有するタンパク質とが含まれる。
【００７２】
前者のタンパク質の例としては、▲１▼ＴＩＲドメイイン（ヒトでは配列番号２に示される配列のうち７５−２１３番目のアミノ酸配列部分、マウスでは配列番号４に示される配列のうち７２−２１０番目のアミノ酸配列部分）以外の部分に上記変異を有するタンパク質、▲２▼上記変異を有し、かつＴＬＲ４に直接結合する性質およびＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を併せ持つタンパク質、▲３▼上記変異を有し、かつＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を持つ一方、ＴＬＲ４に直接結合する性質に異常を持つタンパク質、がある。「ＴＬＲ４に直接結合する性質に異常を持つ」とは、ＴＬＲ４に結合する性質が欠失したこと、すなわちＴＬＲ４と結合しないことを意味する。
【００７３】
後者のタンパク質の例としては、▲４▼上記変異を有し、かつＴＬＲ４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質、がある。「Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を持つ」とは、〔実施例５〕の図１０（ａ）および図１１（ａ）に示すように、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化しないことを意味する。具体的には、１１６番目のプロリンがヒスチジンに置換されたタンパク質、または１１７番目のシステインがヒスチジンに置換されたタンパク質は、ＴＬＲ４に直接結合する性質を持つ一方、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を持つタンパク質であることが知られている。
【００７４】
本発明に係る遺伝子は、（Ｉ）上記（ｉ）または（ｉｉ）のタンパク質をコードする遺伝子、（ＩＩ）配列番号１または３に示されるいずれかの塩基配列を有する遺伝子、および（ＩＩＩ）配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子が含まれる。
【００７５】
上記（ＩＩＩ）の「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる。）。
【００７７】
上記（ＩＩＩ）の遺伝子には、ＴＩＣＡＭ−２の有するＴＬＲ４に直接結合する性質およびＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質のうち、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するタンパク質をコードする遺伝子と、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を有するタンパク質をコードする遺伝子とが含まれる。
【００７８】
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコードＤＮＡであってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。
【００７９】
さらに、本発明の「遺伝子」は、タンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８０】
〔２〕本発明に係る遺伝子およびタンパク質の取得方法
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記配列番号１または３を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００８１】
たとえば、配列番号１または３に示される塩基配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒト又はマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、配列番号１または３に示される塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００８２】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００８３】
また、上記プローブの配列を、ＴＩＣＡＭ−２の機能上重要と考えられるＴＩＲドメインの中から選択し、ヒト、マウスその他の哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、ＴＩＣＡＭ−２と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる。
【００８４】
本発明に係る遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、配列番号１または３に示される塩基配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト又はマウスのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００８５】
本発明に係るタンパク質の取得する方法についても、特に限定されるものではなく、たとえば、上述のようにして取得した遺伝子を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、その遺伝子がコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００８６】
なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクターおよび宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【００８７】
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、たとえば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上記各ｃＤＮＡの塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。
【００８８】
〔３〕組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前述したＴＩＣＡＭ−２またはその変異体をコードする遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００８９】
本ベクターを用いてヒトにＴＩＣＡＭ−２タンパク質またはその変異体を導入する場合には、本発明に係る組換え発現ベクターはウイルスベクターであることが好ましい。このウイルスベクターとしては特に限定されるものではないが、たとえば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターを挙げることができる。遺伝子治療のような医療用途に用いる場合には、使用実績のあるベクターを選択することが、遺伝子治療の安全性や有効性の予測が可能であるため有利である。
【００９０】
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係るタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
【００９１】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００９２】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００９３】
〔４〕ポリヌクレオチド
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のうち、８７〜７９１番目の塩基配列（ＯＲＦ領域）、または配列番号３に示される塩基配列のうち、１２０〜８１５番目の塩基配列（ＯＲＦ領域）の一部を含むポリヌクレオチドである。
【００９４】
本発明に係るポリヌクレオチドには、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、クローニング、化学合成、ＰＣＲ等の増幅技術により得ることができる。一本鎖でも二本鎖でもよく、長さ（塩基数）も特に限定はない。このポリヌクレオチドはＴＩＣＡＭ−２遺伝子検出のためのプローブ、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉法等に使用することができる。
【００９５】
ポリヌクレオチドをＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）として使用する場合には、二本鎖ＲＮＡであることが好ましく、２１ないし２３塩基であることが好ましい。ここで、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、細胞に導入された二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、それと同じ配列をもつ遺伝子の発現（タンパク質合成）を抑制する現象のことで、標的遺伝子（ｍＲＮＡ）を破壊することで発現を抑制する方法である。
【００９６】
ＲＮＡｉによりＴＩＣＡＭ−２遺伝子の発現を抑制するために、ＯＲＦの塩基配列を有するｓｉＲＮＡを設計する必要がある。ｓｉＲＮＡは、ＯＲＦの塩基配列を有するものであれば特に限定されるものではないが、スタートコドンより７５塩基以上下流の塩基配列を有することが好ましく、ＴＩＲドメインの塩基配列であることがより好ましい。
【００９７】
〔５〕抗体
本発明に係る抗体は、本発明に係るタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。公知の方法としては、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））、岩崎らの「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」講談社（１９９１））に記載の方法が挙げられる。こうして作製した抗体は、本発明のタンパク質の検出に有効である。
【００９８】
また、本発明に係る抗体は前述した（ｉ）配列番号２または４に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｉｉ）配列番号２または４に示される何れかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するタンパク質に対する抗体であって、当該タンパク質のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する抗体である。
【００９９】
このような抗体も、目的のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。得られた抗体が、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する性質を有するか否かは、たとえば、ＴＩＣＡＭ−２を発現させた培養細胞を用いて、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質が抗体を加えることにより阻害されるか否かを確認すればよい。
【０１００】
〔６〕スクリーニング方法およびスクリーニング方法により得られた物質
本発明に係るスクリーニング方法は、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質をスクリーニングする方法で、本発明に係るタンパク質を用いて行うものである。用いるタンパク質としては、前述の（ｉ）配列番号２または４に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｉｉ）配列番号２または４に示される何れかのアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有るタンパク質、を挙げることができる。
【０１０１】
スクリーニングの方法は、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する性質の有無を調べる従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。
【０１０２】
スクリーニングにより得られた、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質も本発明に含まれ、後述する用途に利用することができる。
【０１０３】
〔７〕ウイルス感染症予防・治療薬剤およびガン治療薬剤
ＴＩＣＡＭ−２はＩ型ＩＦＮの誘導を司るアダプターであり、選択的にＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナル系の中からＩ型ＩＦＮの誘導系だけを調節できる点に特徴がある。また、ＴＩＣＡＭ−２はそれのみを単独で過剰発現させた場合にも、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化することできる。
【０１０４】
したがって、ＴＩＣＡＭ−２タンパク質およびＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するＴＩＣＡＭ−２の変異タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮが有効な各種疾患の予防または治療に利用することができる。たとえば、ウイルス感染症を予防・治療する薬剤や、Ｉ型ＩＦＮが有効なガン（腎ガン、子宮頚ガン、肝炎後肝ガン等）を治療する薬剤として利用することができる。具体的には、前述の実施の形態〔１〕で示した（ｉ）、または（ｉｉ）の▲１▼、▲２▼または▲３▼のいずれかのタンパク質を含むウイルス感染症の予防・治療薬剤、またはガンの治療薬剤として実施することができる。
【０１０５】
また、上記ＴＩＣＡＭ−２タンパク質またはＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するＴＩＣＡＭ−２の変異タンパク質のいずれかをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを、ウイルス感染部位やその周辺部位、あるいは上記Ｉ型ＩＦＮが有効なガンの病巣に導入することにより、ウイルス感染の予防・治療、ガンの治療が可能となる。
【０１０６】
したがって、上記組換え発現ベクターはウイルス感染症予防・治療薬剤またはガン治療薬剤として利用することができる。具体的には、前述の実施の形態〔１〕で示した（ｉ）、または（ｉｉ）の▲１▼、▲２▼または▲３▼のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１または３に示されるいずれかの塩基配列を有する遺伝子、配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子のうちＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を正常に有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれかを含む組換えベクターを含むウイルス感染症の予防・治療薬剤、またはガンの治療薬剤として実施することができる。
【０１０７】
なお、上記タンパク質または組換え発現ベクターを適用できる疾患はこれらに限定されるものではなく、Ｉ型ＩＦＮの産生により改善可能な疾患に対して広く適用することができる。
【０１０８】
〔８〕エンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤およびアトピー性疾患治療薬剤
ＬＰＳはグラム陰性細菌の細胞壁構成成分であり、エンドトキシン（内毒素）とも呼ばれ、哺乳動物に対して強い毒性がある。グラム陰性細菌の感染により引き起こされるエンドトキシンショックは、凝固系の活性化、ｉＮＯＳの発現誘導などを経て、末梢血管拡張、高心拍出、発熱などを呈し、末期には低心拍出状態となり死に至る。エンドトキシンショックを引き起こす宿主応答としては、ＴＬＲ／ＣＤ１４受容体を介する細胞内シグナル伝達によるＭＡＰＫ系の活性化と転写因子の活性化、そして炎症性サイトカインの産生が挙げられる。現在効果的な治療法は無く、有効な治療法の開発が期待されている。
【０１０９】
ＴＩＣＡＭ−２はＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナルを媒介しＩ型ＩＦＮの産生を誘導するアダプター分子であるので、ＴＩＣＡＭ−２のシグナル媒介機能を抑制または阻害することにより、エンドトキシンショックを予防・治療することが可能である。また、ＴＩＣＡＭ−２のシグナル媒介機能を抑制または阻害してＩ型ＩＦＮの産生を抑制することにより、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象の改善に有効である。Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象としては、たとえば自己免疫疾患やアトピー性疾患を挙げることができる。
【０１１０】
したがって、Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を有するＴＩＣＡＭ−２の変異タンパク質は、エンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として利用することができる。具体的には、前述の実施の形態〔１〕で示した（ｉｉ）の▲４▼のタンパク質を含むエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として実施することができる。
【０１１１】
同様に、上記Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を有するＴＩＣＡＭ−２の変異タンパクをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターをヒトに適用して生体内で当該タンパク質を発現させれば、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象の改善に有効である。
【０１１２】
したがって、上記Ｉ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常を有するＴＩＣＡＭ−２の変異タンパクをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターはエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として利用することができる。具体的には、前述の実施の形態〔１〕で示した（ｉｉ）の▲４▼のタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子のうちＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質に異常に有するタンパク質をコードする遺伝子のいずれかを含む組換えベクターを含むエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として実施することができる。
【０１１３】
本発明に係るポリヌクレオチドをｓｉＲＮＡとして用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、ＴＩＣＡＭ−２遺伝子の発現（ＴＩＣＡＭ−２タンパク質合成）を抑制すれば、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象の改善に有効である。
【０１１４】
したがって、上記ポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）はエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として利用することができる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列のうち、８７−７９１番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド、または配列番号３に示される塩基配列のうち、１２０−８１５番目の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチドを含むエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として実施することができる。
【０１１５】
本発明に係るＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する抗体をヒトに適用すれば、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象の改善に有効である。
【０１１６】
したがって、上記ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する抗体はエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として利用することができる。具体的には、前述の実施の形態〔１〕で示した（ｉ）または（ｉｉ）の▲１▼、▲２▼または▲３▼のいずれかのタンパク質に対する抗体であって、当該タンパク質のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する性質を阻害する抗体を含むエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として実施することができる。
【０１１７】
本発明に係るスクリーニング法によって得られた、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質をヒトに適用すれば、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象の改善に有効である。
【０１１８】
したがって、上記スクリーニング法によって得られた、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質は、エンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として利用することができる。具体的には、本発明に係るスクリーニング法によって得られた、ＴＩＣＡＭ−２のＩ型ＩＦＮ誘導を媒介する機能を抑制または阻害する物質を含むエンドトキシンショック予防・治療薬剤、自己免疫疾患治療薬剤またはアトピー性疾患治療薬剤として実施することができる。
【０１１９】
なお、Ｉ型ＩＦＮの産生によって引き起こされる有害事象は、エンドトキシンショック、自己免疫疾患およびアトピー性疾患に限られるものではない。
【０１２０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例において用いた細胞株および具体的な実験方法について先に説明する。
【０１２２】
〔細胞および試薬〕
ヒト肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５はＲｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（茨城県つくば市）から入手した。上皮細胞株ＨｅＬａは東京都立臨床医学研究所から入手した。ＭＲＣ−５およびＨｅＬａはそれぞれ５％および１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）と抗生物質とを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。
【０１２３】
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６７．４は１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した（Ｈｉｒａｎｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．  １３２，  ８３−９１参照）。
【０１２４】
ＨＥＫ２９３細胞株（理化学研究所から入手）は１０％のウシ胎児血清と抗生物質とを添加したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。使用したＨＥＫ２９３細胞株はＴＩＣＡＭ−２のｍＲＮＡを発現しているが、ＴＬＲ３のｍＲＮＡは発現しておらず、ＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡは極僅かのみ発現していた。
【０１２５】
ポリ（Ｉ：Ｃ）はアマシャム・ファルマシア・バイオテク社から購入した。ポリミキシンＢ、ＬＰＳ（大腸菌、血清型０１１１：Ｂ４由来）およびマウスＩｇＧ１はシグマ社から購入した。マイコプラズマのリポペプチドＭＡＬＰ−２は文献（Ｎｉｓｈｉｇｕｔｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６，  ２６１０−２６１６．）に記載された方法で調製した。ＬＰＳ以外の試薬類は、細胞の刺激前にポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃１時間の処理をした。
【０１２６】
ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体（ＴＬＲ３．７）およびヒトＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体（ＴＬＲ２．４５）は文献（非特許文献１０、およびＵｅｈｏｒｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  （ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）  ）に記載された方法で作製した。ヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体は、東京大学医科学研究所の三宅健介博士から提供を受けた（作製法については、Ｓｈｉｍａｚｕ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８９，  １７７７−１７８２参照）。抗ＩＲＦ−３抗体は文献（Ｉｗａｍｕｒａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ６，  ３７５−３８８．）に記載されたＩＲＦ−３活性の定量に用いた。
【０１２７】
〔発現ベクター〕
全長のヒトＴＩＣＡＭ−２をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＦＢＯＳプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入した。ＴＩＣＡＭ−２の６８−２３５番目のアミノ酸部分に相当するｃＤＮＡを、ｐＥＦＢＯＳプラスミドのコザック配列下流のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入してｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲ）を作製した。ｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−２（Ｐ１１６Ｈ）およびｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）は、位置指定突然変異導入法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により１１６番目のプロリンをヒスチジンに、１１７番目のシステインをヒスチジンに変化させることにより作製した。プラスミドはエンドトキシンフリーのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）を用いて調製した。
【０１２８】
〔実施例１：ＴＩＣＡＭ−２分子のクローニング〕
ＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲと類似するＴＩＲを含む配列をＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースで検索し、ヒトおよびマウスの関連した部分的ｃＤＮＡを特定した。すなわち、ｔｂｌａｓｔｎプログラムを使用しているＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーバーで、ヒトＴＩＣＡＭ−１タンパク質配列についてＢＬＡＳＴ検索を行い、ＴＩＣＡＭ−２のＥＳＴを発見した。ＤＤＢＪデータベースでヒトのＥＳＴを検索し、ＴＩＣＡＭ−２のｃＤＮＡ配列を予測した。その結果、２種類のＥＳＴクローン、ＢＱ４３８８４７およびＡＷ０８０８７９がＴＩＣＡＭ−２の推定される全配列をカバーすることを見出した。さらにＢＬＡＳＴ検索を行い、ヒトＴＩＣＡＭ−２と非常によく似たマウスのｃＤＮＡ配列を見出した（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＫ０８０８７９）。
【０１２９】
ＭＲＣ５細胞を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ヒトＴＩＣＡＭ−２の全長ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲのプライマーには、Ｆ１およびＲ１を用いた（配列番号５、６）。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、マウスＴＩＣＡＭ−２の全長ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲのプライマーには、ｍＦ１およびｍＲ１を用いた（配列番号９、１０）。
【０１３０】
ヒトＴＩＣＡＭ−２のアミノ酸配列と、マウスＴＩＣＡＭ−２のアミノ酸配列とのアライメントはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて行った。その結果を図２に示す。図中の上線はＴＩＣＡＭ−２のＴＩＲ様モチーフを示し、アステリスク（＊）は同一の残基、２点（：）は同種アミノ酸への置換、１点（・）は類似アミノ酸への置換、ｈｕはヒト、ｍｕはマウスを表す。
【０１３１】
図２に示すように、ヒトＴＩＣＡＭ−２タンパク質は２３５アミノ酸から構成され、短い（約７０アミノ酸）のＮ末端セリン／スレオニンリッチドメイン、ＴＩＲモチーフおよびＣ末端の２０アミノ酸伸長部を有する。ＴＩＣＡＭ−２のＮ末端およびＣ末端ドメインはＴＩＣＡＭ−１と似ていない。ＴＩＲモチーフ部分およびＣ末端部分は、ヒトおよびマウスＴＩＣＡＭ−２間で非常によく保存されている。
【０１３２】
ヒトＴＩＣＡＭ−２（アミノ酸７５−２１３）、マウスＴＩＣＡＭ−２（アミノ酸７２−２１０）、ヒトＴＩＣＡＭ−１（アミノ酸３９４−５３２）、マウスＴＩＣＡＭ−１（アミノ酸３９６−５３４）、ヒトＭｙＤ８８（アミノ酸１６０−２９６、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ７０４５１）、ヒトＴＩＲＡＰ（アミノ酸８５−２１４、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ４０６６５２）の各ＴＩＲドメインおよびヒトＴＬＲ２のＴＩＲ（アミノ酸６４０−７８４、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ８８８７８）のアライメントはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて行った。その結果を図３に示す。図中のアステリスク（＊）は同一の残基、２点（：）は同種アミノ酸への置換、１点（・）は類似アミノ酸への置換、ｈｕはヒト、ｍｕはマウスを表す。
【０１３３】
図３に示すように、ＴＩＣＡＭ−２のＴＩＲモチーフと既知アダプターＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８のＴＩＲモチーフとの類似性は低いが、ＴＩＣＡＭ−２のＮ末端ドメインにはタンデムに配置された塩基性アミノ酸とセリンを有し、これはＴＩＲＡＰにもみられる。ＴＩＣＡＭ−２はＴＩＣＡＭ−１と同様に、他のＴＩＲを含むタンパク質に存在する保存的な配列を欠いている。保存的配列とは、図３のＢｏｘ１の（Ｆ／Ｙ）Ｄ、Ｂｏｘ２のＲＤおよびＢｏｘ３のＦＷである（Ｘｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：  １１１−１１５）。ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰおよびＴＩＣＡＭ−１にみられるように、ＴＩＲを介したシグナル伝達に必須であるＢＢループのプロリンは、ＴＩＣＡＭ−２では保存された場所の１つ前に位置するか、またはシステインと置換されている。
【０１３４】
ＴＬＲアダプター分子のＴＩＲドメインのアライメントにおける各アダプター分子間のアミノ酸の一致率を表１に示す。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
また、各アダプター分子のドメイン構造を図４に示す。図４において黒く塗った部分がＴＩＲドメインである。ヒトＴＩＣＡＭ−２は２３５アミノ酸残基からなり、ＴＩＲドメインは７５−２１３番目のアミノ酸残基に相当する。同様に、ＴＩＲＡＰは２３５アミノ酸残基からなり、ＴＩＲドメインは８５−２１４番目のアミノ酸残基に相当、ＭｙＤ８８は２９６アミノ酸残基からなり、ＴＩＲドメインは１６０−２９６番目のアミノ酸残基に相当、ＴＩＣＡＭ−１は７１２アミノ酸残基からなり、ＴＩＲドメインは３９４−５３２番目のアミノ酸残基に相当する。
【０１３７】
ヒトゲノムデータベース解析により、ＴＩＣＡＭ−２遺伝子は染色体５ｑ２２に位置することが明らかとなった。
【０１３８】
なお、ヒトＴＩＣＡＭ−２およびマウスＴＩＣＡＭ−２のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、ＤＤＢＪデータベースに登録済みであり（本願出願時には未公表）、それらのＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号はそれぞれＡＢ０９１０５４およびＡＢ１００４４１である。
【０１３９】
〔実施例２：ノーザンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲによるＴＩＣＡＭ−２ｍＲＮＡの検出〕
ヒト１２レーンＭＴＮ  Ｂｌｏｔおよびヒト１２レーンＭＴＮ  ＢｌｏｔＩＩＩ（商品名、クロンテック社製）を用いて、３２Ｐで標識した全長ヒトＴＩＣＡＭ−２ｃＤＮＡプローブでストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、その後標識したβ−アクチンプローブで再ハイブリダイズした。ＢＡＳ２０００画像解析装置（富士写真フィルム株式会社製）を用いて４〜２４時間露光し、ｍＲＮＡのシグナルを検出した。その結果を図５（ａ）に示す。
【０１４０】
図５（ａ）から明らかなように、３．３−３．６ｋｂのｍＲＮＡがリンパ節、前立腺、胃、甲状腺、気管、心臓、骨格筋および胎盤を含む多くの組織で検出された。リンパ節、前立腺、胃、甲状腺、筋肉および肺では３．６および３．３ｋｂの２つのバンドが認められた。１．８ｋｂのバンドは胎盤のみに特異的に認められた。
【０１４１】
ｍＲＮＡの検出および半定量の目的で、ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーは、ヒトＴＩＣＡＭ−２検出にはＦ１およびＲ１を用い（配列番号５、６）、β−アクチン検出にはｈＢＡＣＴ−Ｆ１およびｈＢＡＣＴ−Ｒ１を用いた（配列番号７、８）。トータルＲＮＡは各種ヒト細胞または細胞株から分離し、ＴＩＣＡＭ−２は３５サイクル、β−アクチンは２０サイクルのＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を図５（ｂ）に示す。
【０１４２】
図５（ｂ）から明らかなように、ヒト末梢血由来の未熟な樹状細胞（ｉＤＣ）、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）においてＴＩＣＡＭ−２のｍＲＮＡが存在した。また、ＴおよびＢリンパ球系細胞株、線維芽細胞株にもＴＩＣＡＭ−２のｍＲＮＡが存在した。
【０１４３】
〔実施例３：酵母ツー・ハイブリッド法によるＴＩＣＡＭ−２と他の分子との会合の検討〕
酵母培地は文献（Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  ＵＳＡ．  ｐｐ．２２−４６．  （１９８６））に記載されたものを使用した。酵母ＡＨ１０９株（クロンテック社製）をｂａｉｔおよびｐｒｅｙプラスミドで形質転換した。形質転換した酵母をストリークし、３ないし５日間インキュベートした。ＢＤ−ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９はＴＬＲのＴＩＲドメインをｐＧＢＫＴ７（クロンテック社製）に挿入して作製した。ＢＤ−ＴＩＣＡＭ−２およびＡＤ−ＴＩＣＡＭ−２は全長野生型ＴＩＣＡＭ−２ｃＤＮＡをｐＧＢＫＴ７（ｂａｉｔ）またはｐＧＡＤＴ７（ｐｒｅｙ）に挿入して作製した。ＢＤ−ＴＩＣＡＭ−１はＴＩＣＡＭ−１フラグメント（開始コドンに対応する１１０２ｂｐから２１４２ｂｐの部分）をｐＧＢＫＴ７に挿入して作製した。ＡＤ−ＴＩＲＡＰおよびＡＤ−ＭｙＤ８８は全長タンパク質をコードするｃＤＮＡフラグメントをｐＧＡＤＴ７に挿入して作製した。
【０１４４】
ＳＤ−ＷＬＨはトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンを欠失した酵母合成デキストロース培地であり、ＳＤ−ＷＬＨＡはさらにアデニンを欠失した培地である。ＳＤ−ＷＬＨプレートは中程度の厳密度のプレートであり、ＳＤ−ＷＬＨＡプレートは高い厳密度のプレートである。すなわち、ＳＤ−ＷＬＨは弱い相互作用を反映し、ＳＤ−ＷＬＨＡは強い相互作用を反映する。上記結果を図６（ａ）〜（ｃ）に示す。
【０１４５】
図６（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、ＳＤ−ＷＬＨＡプレートにおいてＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲ４との間に強い会合が観察され、ＳＤ−ＷＬＨＡプレートにおいてＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲ３間の弱い会合が観察された（図６（ａ）参照）。また、ＴＩＣＡＭ−２はホモ２量体を形成し（図６（ｂ）参照）、ＴＩＣＡＭ−１とヘテロ２量体を形成することが観察された（図６（ｃ）参照）。
【０１４６】
〔実施例４：免疫沈降法によるＴＩＣＡＭ−２と他の分子との会合の検討〕
〈実験方法〉
ＨＥＫ２９３細胞を６ウエルプレートに培養し、リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＬＲ社製）を用いてｐＥＦＢＯＳ／ＴＩＣＡＭ−２（０．５μｇ）またはｐＥＦＢＯＳ／ＴＩＣＡＭ−２−ＨＡ（０．５μｇ）と共に以下に示すベクターを一過性にトランスフェクトした。なお、「ＨＡ」はＨＡタグが付いていることを表す。
【０１４７】
ｐＣＭＶ／ＴＬＲ４またはｐＣＭＶ／Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４（２μｇ）、ｐＥＦＢＯＳ／ＴＬＲ３またはｐＥＦＢＯＳ／Ｆｌａｇ−ＴＬＲ３（３μｇ）、ｐＣＭＶ／ＴＬＲ２またはｐＣＭＶ／Ｆｌａｇ−ＴＬＲ２（２μｇ）、ｐＥＦＢＯＳ／ＴＩＣＡＭ−１−ＨＡ（０．５μｇ）、ｐＥＦＢＯＳ／ＭＤ−２（１μｇ）。これらを上記ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。なお、「Ｆｌａｇ」はＦｌａｇタグが付いていることを表す。
【０１４８】
トランスフェクトするＤＮＡの総量（４μｇ）は、空ベクターを加えて一定にした。ここで「空ベクター」とは発現させるための遺伝子を挿入していないベクターを意味する。
【０１４９】
トランスフェクションの２４時間後に、培地のみ、またはＬＰＳで１５ないし６０分間細胞を刺激した。その後、細胞溶解用緩衝液（２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、２ｍＭＰＭＳＦ、２５ｍＭヨードアセトアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ）で細胞を溶解した。遠心分離後、細胞溶解液に抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体Ｍ２（シグマ社製）を加えて４℃で２時間インキュベートした。マウスＩｇＧ１をコントロールに用いた。プロテインＧセファロースと共に免疫複合体を沈降させ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）で３回、十分に洗浄した。免疫沈降したタンパク質を１％ＳＤＳ、０．２％ＮＰ−４０および５％２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳで溶出し、煮沸後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。引き続き、各抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。いくつかの実験では、細胞溶解液を直接免疫ブロッティングに使用した。
【０１５０】
〈実験結果〉
上記結果を図７（ａ）〜（ｃ）に示す。図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）とも、上段は抗ＨＡ抗体でプローブされた結果を示し、下段は抗Ｆｌａｇ抗体で再プローブされた結果を示す。各レーンの上部にトランスフェクションされた発現ベクターを示している。「＋Ｆ」はＦｌａｇタグが付いていることを表す。
【０１５１】
図７（ａ）から明らかなように、ＴＩＣＡＭ−２はＴＬＲ４と結合することが確認された（レーン６）。また、ＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲ２またはＴＬＲ３との会合は、この条件では検出されなかった（レーン１〜４）。ＴＬＲ２はＭＤ−２と共発現した場合でもＴＩＣＡＭ−２と共沈降しなかった（レーン１、２）。５０ｋＤａ付近の微量のバンドは非特異的で、すべてのレーンでみられている。図７（ａ）上段の矢印はＨＡタグを付けたＴＩＣＡＭ−２を示す。下段の括弧はＦｌａｇタグを付けたＴＬＲタンパク質を示す。図７（ａ）に示した結果は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４に対する特異的モノクローナル抗体を用いて確認した。
【０１５２】
ＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−２との相互作用に関して、ＬＰＳの効果を検討した結果、図７（ｂ）に示すように、ＴＬＲ４発現細胞をＬＰＳで刺激しても、ＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−２との会合は影響を受けなかった（レーン３、４）。（ａ）と同様に５０ｋＤａ付近のバンドは非特異的なバンドである。図７（ｂ）上段の矢印はＴＩＣＡＭ−２のバンドを示す。下段の矢頭はＴＬＲ４を示す。
【０１５３】
ＴＩＣＡＭ−２とＴＩＣＡＭ−１、ＴＩＣＡＭ−２およびＴＬＲ４との会合について検討した結果、図７（ｃ）に示すように、ＴＬＲ４はＴＩＣＡＭ−２が存在するときのみＴＩＣＡＭ−１を引き寄せることが示された（レーン６）。同一条件下で、ＴＬＲ３は直接ＴＩＣＡＭ−１を引き寄せることが知られている（非特許文献１２）。また、ＴＩＣＡＭ−２−ＨＡとＴＩＣＡＭ−２−Ｆｌａｇが共沈降したことから、ＴＩＣＡＭ−２は２量体を形成することが示された（レーン１）。ＴＩＣＡＭ−２−ＨＡのバックグランドレベルは極微量であった（レーン２）。ＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲ４は会合した（レーン３）。ＴＩＣＡＭ−２はＴＬＲ４非存在下ではＴＩＣＡＭ−１とほとんど結合しなかった（レーン４）。ＴＩＣＡＭ−１とＴＬＲ４との間の会合は検出されなかった（レーン５）。図７（ｃ）上段の矢印はＴＩＣＡＭ−１およびＴＩＣＡＭ−２のバンドを示す。下段の矢頭（白抜き）はＴＬＲ４を示す。
【０１５４】
なお、データを示していないが、ＴＩＣＡＭ−２のドミナントネガティブ体であるＴＩＣＡＭ−２（Ｐ１１６Ｈ）およびＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）は、ＴＩＣＡＭ−１およびＴＩＣＡＭ−２と２量体を形成する能力を失った。また、ＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−１との関係は、抗ＴＬＲ４モノクローナル抗体を用いて確認した。
【０１５５】
〔実施例５：レポーター遺伝子分析によるＴＩＣＡＭ−２の機能分析〕
〈実験方法〉
ＨＥＫ２９３細胞を２４ウエルプレートに培養し（２×１０５個／ウエル）、リポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＬＲ社製）を用いてルシフェラーゼに結合したＮＦ−κＢレポーター遺伝子（０．１μｇ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）またはｐ−１２５ｌｕｃレポータープラスミド（０．１μｇ）と共に以下に示すベクターを一過性にトランスフェクトした。
【０１５６】
なお、〔細胞および試薬〕の項に記載したように、本ＨＥＫ２９３細胞はＴＩＣＡＭ−２のｍＲＮＡを発現しているが、ＴＬＲ３のｍＲＮＡは発現しておらず、ＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡは極僅かのみ発現していた。
【０１５７】
ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４＋ＭＤ−２を発現させるｐＥＦＢＯＳ（以上は０．１μｇ）。ＴＩＣＡＭ−１、ドミナントネガティブ体のＴＩＣＡＭ−１［ＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）］、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＴＩＣＡＭ−２、ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲ）、ＴＩＣＡＭ−２（Ｐ１１６Ｈ）、ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）、ＩＲＡＫ−１（１−２１１）、ＩＲＡＫ−１（１−９６）を発現させるｐＥＦＢＯＳ（以上は１０、１００または２００ｎｇ）。コントロールとしてベクターのみ。これらを上記ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。
【０１５８】
なお、図８にＴＩＣＡＭ−２、ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲ）（図８ではＴＩＣＡＭ−２−ＴＩＲと表している。）、ＴＩＣＡＭ−２（Ｐ１１６Ｈ）（図８ではＴＩＣＡＭ−２−ＰＨと表している。）およびＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）（図８ではＴＩＣＡＭ−２−ＣＨと表している。）の構造を示した。黒く塗っている部分はＴＩＲドメインを示す。ＴＩＣＡＭ−２−ＴＩＲは６８〜２３５番目のアミノ酸部分を含む。ＴＩＣＡＭ−２−ＰＨは１１６番目のプロリンをヒスチジンに置換し（白丸）、ＴＩＣＡＭ−２−ＣＨは１１７番目のシステインをヒスチジンに置換した（白丸）。
【０１５９】
ドミナントネガティブ体のＴＩＣＡＭ−１、ＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）の構築は非特許文献１２に記載されている。ｐ−１２５ｌｕｃレポーターは谷口維紹博士（東京大学）から提供を受けたもので、ピッカジーンルシフェラーゼレポータープラスミド（東洋インキ社製）に挿入されたヒトＩＦＮ−βプロモーター領域を含む。ｐＡＰ−１−ＬｕｃレポータープラスミドはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。ＥＬＡＭ−１プロモーターを含むレポータープラスミドは自製した（Ｌｉｅｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ３３４１９−３３４２５．）。
【０１６０】
トランスフェクトするＤＮＡの総量（０．８−１．０μｇ）は、空ベクターを加えて調整した。また、５ｎｇのｐＣＭＶβプラスミド（クロンテック社製）を内部コントロールに使用した。
【０１６１】
ドミナントネガティブ体（ＭｙＤ８８［ＭｙＤ８８（ＴＩＲ）］、ＴＩＲＡＰ［ＴＩＲＡＰ（Ｐ１２５Ｈ）］、ＴＩＣＡＭ−１［ＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）］またはＴＩＣＡＭ−２［ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）］）発現ベクターを細胞に共トランスフェクトした。２４時間後に、培地のみ、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ポリミキシンＢで処理したＭＡＬＰ−２（１００ｎＭ）またはポリミキシンＢで処理したポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）で細胞を６時間刺激した。細胞溶解用緩衝液（プロメガ社製）を用いて細胞を溶解し、製造業者の取扱説明書に従って、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。数値は少なくとも３回の独立した実験（それぞれの実験はデュプリケートで行った）の平均値と標準偏差で表した。
【０１６２】
〈実験結果〉
ルシフェラーゼに結合したＮＦ−κＢレポーター、ｐ−１２５ｌｕｃレポーター（ＩＦＮ−β）またはＡＰ−１レポータープラスミドを有するＨＥＫ２９３細胞に、空ベクターまたはＴＩＣＡＭ−２発現ベクター（１０、１００または２００ｎｇ）をトランスフェクションし、レポーター活性を検討した。その結果を図９（ａ）〜（ｃ）に示す。ＴＩＣＡＭ−２タンパク質を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞はＩＦＮ−βプロモーター（図９（ａ）参照）およびＮＦ−κＢ（図９（ｂ）参照）をマイルドに誘導した。一方、ＡＰ−１を誘導しなかった（図９（ｃ）参照）。
【０１６３】
野生型および変異型ＴＩＣＡＭ−２をＨＥＫ２９３細胞に過剰発現させ、ＮＦ−κＢおよびＩＦＮ−βプロモーターの活性化を検討した。その結果を図１０（ａ）〜（ｃ）に示す。
【０１６４】
全長のＴＩＣＡＭ−２およびＮ末端領域を欠失したＴＩＣＡＭ−２−ＴＩＲはＩＦＮ−βプロモーターを活性化し、ホモ２量体形成を経由していることが示唆された。ＴＩＲドメインに変異を有するＴＩＣＡＭ−２−ＣＨはＩＦＮ−βプロモーターを活性化しなかった（図１０（ａ）参照）。ＮＦ−κＢについては、ＴＩＣＡＭ−２のみがＮＦ−κＢを活性化し、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化したＴＩＣＡＭ−２−ＴＩＲはＮＦ−κＢを活性化しなかった（図１０（ｂ）参照）。
【０１６５】
ＴＬＲ４、ＣＤ１４およびＭＤ−２を発現させたＨＥＫ２９３に、さらに野生型および変異型ＴＩＣＡＭ−２を発現させ、ＩＦＮ−βプロモーター活性化に関してＬＰＳ刺激の影響を検討した（図１０（ｃ）参照）。その結果、ＴＩＣＡＭ−２およびＴＩＣＡＭ−２−ＴＩＲはＬＰＳ刺激によりＩＦＮ−βプロモーター活性が僅かに強くなった。また、野生型ＴＩＣＡＭ−２はバックグランドを増加したが、おそらく２量体形成によるものと考えられた。ＴＩＣＡＭ−２−ＣＨ（ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ））はドミナントネガティブとして機能し、ＬＰＳ−ＴＬＲ４を介するＩＦＮ−β活性化を効果的に阻害した。
【０１６６】
ＴＬＲ３を発現させたＨＥＫ２９３、またはＴＬＲ４、ＣＤ１４およびＭＤ−２を発現させたＨＥＫ２９３に、さらにＴＩＣＡＭ−２−ＣＨを発現させた。ＴＬＲ３を発現させた細胞に対しては５０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ４を発現させた細胞に対しては１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで６時間刺激し、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した。その結果を図１１（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１６７】
図１１（ａ）・（ｂ）から明らかなように、ＴＩＣＡＭ−２−ＣＨは、ＬＰＳ−ＴＬＲ４を介するＮＦ−κＢおよびＩＦＮ−βプロモーター活性化の両方を阻害し、ドミナントネガティブな調節因子として働いた。一方、ＴＩＣＡＭ−２−ＣＨは、ｄｓＲＮＡ−ＴＬＲ３を介するＮＦ−κＢおよびＩＦＮ−βプロモーター活性化をどちらも阻害しなかった。なお、データを示していないが、ＴＩＣＡＭ−２（Ｐ１１６Ｈ）についてもＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）と同じ結果であり、ドミナントネガティブとして機能することを確認した。
【０１６８】
ＴＬＲ３を発現させたＨＥＫ２９３、またはＴＬＲ４、ＣＤ１４およびＭＤ−２を発現させたＨＥＫ２９３に、さらにＴＩＣＡＭ−１のドミナントネガティブ体であるＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）（図ではＴＩＣＡＭ−１ＤＮ）を発現させた。上記と同様に、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＬＰＳで刺激し、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した。その結果を図１２（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１６９】
ＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）はＬＰＳ−ＴＬＲ４を介するＩＦＮ−β活性化を阻害したが、阻害の効力はポリ（Ｉ：Ｃ）−ＴＬＲ３を介するＩＦＮ−β活性化の阻害より小さかった（図１２（ａ）参照）。一方、ＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）はポリ（Ｉ：Ｃ）−ＴＬＲ３を介するＮＦ−κＢ活性化を阻害したが、ＬＰＳ−ＴＬＲ４を介するＮＦ−κＢ活性化を阻害しなかった（図１２（ｂ）参照）。
【０１７０】
ＴＩＣＡＭ−１とＴＩＣＡＭ−２の効果が相乗的か否かを評価するため、ＴＩＣＡＭ−１とＴＩＣＡＭ−２の両方を過剰発現させた細胞とＴＩＣＡＭ−２のみを過剰発現させた細胞におけるＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した。その結果を図１３（ａ）・（ｂ）に示す。ＩＦＮ−βプロモーターは高用量のＴＩＣＡＭ−２で相乗的に活性化されたが、ＴＩＣＡＭ−２はＴＩＣＡＭ−１より効果が小さかった（図１３（ａ）参照）。この結果から、ＴＬＲ４を介したＩＦＮ−β誘導機能においてＴＩＣＡＭ−１が主に関与していることが示唆された。一方、ＮＦ−κＢ活性化には相乗効果が認められなかった（図１３（ｂ）参照）。
【０１７１】
ＴＩＣＡＭ−２過剰発現細胞に、ＴＩＣＡＭ−１、ＭｙＤ８８およびＴＩＲＡＰのそれぞれのドミナントネガティブ体（図ではＤＮと表示）を共発現させ、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した。その結果を図１４（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１７２】
図１４（ａ）・（ｂ）から明らかなように、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢの活性化はＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）により強く抑制された。このＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ（Ｐ４３４Ｈ）の効果はＴＩＣＡＭ−２機能の妨害に対して特異的であり、ＭｙＤ８８およびＴＩＲＡＰのドミナントネガティブ体は、ＩＦＮ−βプロモーターまたはＮＦ−κＢのＴＩＣＡＭ−２を介した活性化を妨害しなかった。
【０１７３】
ＴＩＣＡＭ−１過剰発現細胞に、ＴＩＣＡＭ−２のドミナントネガティブ体である。ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）（図ではＴＩＣＡＭ−２−ＣＨ）を共発現させ、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した。その結果を図１５（ａ）・（ｂ）に示す。図１５（ａ）・（ｂ）から明らかなように、ＴＩＣＡＭ−２（Ｃ１１７Ｈ）はＴＩＣＡＭ−１を介するＩＦＮまたはＮＦ−κＢの活性化を阻害しなかった。
【０１７４】
上記、図１４（ａ）・（ｂ）および図１５（ａ）・（ｂ）の結果から、ＴＩＣＡＭ−２自体よりむしろＴＩＣＡＭ−１がＴＩＣＡＭ−２に近づくことがアダプター機能として重要であると考えられた。
【０１７５】
〔実施例６：ＴＩＣＡＭ−２によるＩＲＦ−３の活性化およびＴＩＣＡＭ−２とＩＲＡＫとの関係の検討〕
ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１およびＩＲＦ−３はＩＦＮ−βを誘導する転写因子であることが知られている（Ｔａｎｉｇｕｔｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９，  ６２３−６５５．）。また、ＩＲＦ−３はＨｅＬａ細胞でＴＬＲ３アゴニストに対する反応において活性化されることが示された（非特許文献１２、およびＩｗａｍｕｒａ，  Ｔ．  （２００１）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ６，  ３７５−３８８．）。そこで以下の実験を行った。
【０１７６】
ＨｅＬａ細胞に、空ベクター、ＭｙＤ８８プラスミド、ＴＩＲＡＰプラスミド、ＴＩＣＡＭ−１プラスミドおよびＴＩＣＡＭ−２プラスミド（各１μｇ）をトランスフェクトした。２４時間後に、培地のみ、または２０μｇ／ｍｌのＬＰＳで１時間処理し、細胞溶解液を調製してｎａｔｉｖｅＰＡＧＥに供した。その結果を図１６（ａ）に示す。
【０１７７】
図１６（ａ）から明らかなように、ＴＩＣＡＭ−１のトランスフェクションによりＩＲＦ−３の活性化が認められたが、ＴＩＣＡＭ−２、ＭｙＤ８８またはＴＩＲＡＰのトランスフェクションでは認められなかった。ＡＰ−１活性化はＴＩＣＡＭ−２のみがトランスフェクションされた細胞においては観察されなかったが（図９（ａ）〜（ｃ）参照）、ＴＩＣＡＭ−１がトランスフェクションされた場合はＡＰ−１活性化が認められた（非特許文献１２）。しかし、ＩＦＮ−βプロモーターはＴＩＣＡＭ−２のみのトランスフェクションによってＮＦ−κＢ活性化と同時に活性化された（図９（ａ）〜（ｃ）参照）。したがって、ＩＦＮ−βプロモーターはＴＩＣＡＭ−２過剰発現の場合にはＮＦ−κＢを経由して活性化された。
【０１７８】
ＴＩＣＡＭ−２のトランスフェクションは弱いＮＦ−κＢ活性を誘導するので、次にＩＲＡＫ−１および−２がアダプターを介したＮＦ−κＢ活性化に貢献するかどうかを検討した。すなわち、ＨＥＫ２９３細胞にｐ−１２５ｌｕｃレポータープラスミドをトランスフェクトし、さらに空ベクター、ＴＩＣＡＭ−２プラスミド（１００ｎｇ）またはＴＩＣＡＭ−２プラスミド＋ＩＲＡＫ−１（１−２１１）プラスミドを同時にトランスフェクトした。２４時間後にルシフェラーゼレポーター活性を測定した。その結果を図１６（ｂ）に示す。なお、図中のＣｏｎｔｒｏｌ（斜線のバー）は空ベクターのみをトランスフェクトした細胞、黒塗りのバーはＴＩＣＡＭ−２のみをトランスフェクトした細胞を表す。値は３回の独立した実験の代表値である。
【０１７９】
図１６（ｂ）から明らかなように、ＩＲＡＫ−１のドミナントネガティブ体（ＩＲＡＫ−１（１−２１１））はＴＩＣＡＭ−２によるＩＦＮ−βプロモーター活性化を阻害した。また、ＮＦ−κＢの活性化を阻害した（示していない）。同様の実験において、ＩＲＡＫ−２のドミナントネガティブ体はＴＩＣＡＭ−２を介するＮＦ−κＢおよびＩＦＮ−βプロモーター活性化をほとんど阻害しなかった（示していない）。このように、ＩＲＡＫ−１はＴＩＣＡＭ−２の下流で作用するようであり、ＮＦ−κＢを介するＩＦＮ−βプロモーター活性化に関連がある。
【０１８０】
〔実施例７：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および定量ＰＣＲ法を用いた、ＴＬＲ４を介するＩＦＮ−β誘導におけるＴＩＣＡＭ−２およびＴＩＣＡＭ−１の関与の検討〕
ＴＩＣＡＭ−１／ＴＩＣＡＭ−２を介するＩＦＮ−β産生への関与を調べるために、マクロファージ様細胞であるマウスＲＡＷ２６４．７を用いてｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）のトランスフェクションによりＴＩＣＡＭ−２ノックダウン細胞を作製し、ＬＰＳに対する反応におけるＩＦＮ−β誘導を検討した。
【０１８１】
〈実験方法〉
マウスＲＡＷ２６４．７細胞を６ウエルプレートに播種し（５×１０６細胞／ウエル）２４時間培養した。細胞に、バッファーのみ、コントロールｓｉＲＮＡ（ヒトＴＬＲ３またはヒトＬａｍｉｎＡ／Ｃに対するもの、配列番号２７〜３０、非特許文献１１参照）、マウスＴＩＣＡＭ−２に対するｓｉＲＮＡ（配列番号２１〜２４）またはマウスＴＩＣＡＭ−１に対するｓｉＲＮＡ（配列番号２５、２６）をオリゴフェクタミン試薬（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後に、５ｍＭのＥＤＴＡを含む生理食塩液で処理して細胞を集め、２４ウエルプレートに播種した。翌日、細胞は３０−５０％のコンフルエント状態であった。再度オリゴフェクタミンを用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、２日間培養した。培養上清を除去し、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含む培地を各ウエルに加えた。刺激前および刺激６時間後にＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。
【０１８２】
ヒトＴＬＲ３に対するｓｉＲＮＡをコントロールとして用いた。標的のＴＬＲ３の塩基配列はヒトとマウスの間で保存されていないので、コントロールｓｉＲＮＡはマウスＴＬＲ３をダウンレギュレートしないからである。ＲＮＡ干渉に使用したオリゴヌクレオチドはＪｂｉｏＳ社から購入した。
【０１８３】
定量ＰＣＲ分析はｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて実施した。定量ＰＣＲのプライマーには、ＴＩＣＡＭ−２用にｍＦ１、ｍＲ２、ｍＦ３およびｍＲ３を用い、ＴＩＣＡＭ−１用にｍＴ−１−Ｆ１およびｍＴ−１−Ｒ１、ＩＦＮ−β用にｍＩＦＮ−Ｆ１、ｍＩＦＮ−Ｒ１およびｍＩＦＮ−Ｒ２を用い、β―アクチン用にｍＢＡＣＴ−Ｆ１およびｍＢＡＣＴ−Ｒ１を用いた。（配列番号９、１１〜２０）ＰＣＲのサイクル数は、ＴＩＣＡＭ−２が２７サイクル、ＩＦＮ−βが３０サイクル、β−アクチンが２２サイクルとした。
【０１８４】
マウスＴＩＣＡＭ−２に対する２種類のｓｉＲＮＡの標的部位を図１７（ａ）に示す。図中サイトＡはＮ末端側に位置し、サイトＢはＴＩＲドメイン内に位置する。
【０１８５】
〈実験結果〉
図１７（ｂ）に、定量ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル電気泳動像（エチジウムブロマイド染色）を示す。左がＬＰＳ刺激前のトータルＲＮＡを試料として用いた場合、右がＬＰＳ刺激後のトータルＲＮＡを試料として用いた場合の結果である。使用したｓｉＲＮＡを上部に表示した。「Ｍｏｃｋ」はｓｉＲＮＡのトランスフェクト時にバッファーのみを用いたものである。ＴＩＣＡＭ−２のｍＲＮＡレベルは、サイトＡを標的としたＲＮＡ干渉により約６０％まで抑制され、サイトＢを標的としたＲＮＡ干渉により約２６％まで抑制された。
【０１８６】
ＩＦＮ−β用プライマーを用いて定量ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の相対的コピー数を図１７（ｃ）に示す。数値はβ−アクチンにより補正した。Ｍｏｃｋの平均値を基準に（１．００として）、各値を計算した。なお、数値は３回の実験の平均値である。また、使用したｓｉＲＮＡを下部に示した。ＴＩＣＡＭ−２のノックダウンはＩＦＮ−βの誘導を特異的に阻害した。ＩＦＮ−βｍＲＮＡレベルは、サイトＡを標的としたＲＮＡ干渉により約６０％まで抑制され、サイトＢを標的としたＲＮＡ干渉により約３５％まで抑制された。
【０１８７】
マウスＴＩＣＡＭ−１に対するＲＮＡ干渉によりＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−β誘導を調べた。その結果を図１７（ｄ）に示す。数値は、図１７（ｃ）の実験と同様に計算した。また、使用したｓｉＲＮＡを下部に示した。ＬａｍｉｎＡ／ＣおよびヒトＴＬＲ３のｓｉＲＮＡｓはコントロールとして使用した。ＴＩＣＡＭ−１のノックダウンによっても、ＩＦＮ−βｍＲＮＡレベルは抑制された。なお、データを示していないが、ＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルは約７０％まで抑制された。
【０１８８】
以上の結果より、ＴＩＣＡＭ−１およびＴＩＣＡＭ−２の両方ともマクロファージ様細胞においてＬＰＳを介してＩＦＮ−βを最大限に誘導するために必要ナ分子であることが明らかとなった。また、実施例４に示した免疫沈降の実験結果（図７（ａ）〜（ｃ）参照）と合わせて、ＴＩＣＡＭ−２は物理的にＭｙＤ８８非依存性経路の一部としてＬＰＳを介するＩＦＮ−β誘導のための、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインとＴＩＣＡＭ−１を架橋するアダプターであることが明らかとなった。
【０１８９】
【発明の効果】
本発明は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）に結合し、ＴＬＲ４とＴＩＣＡＭ−１を架橋することによりＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナルをＴＩＣＡＭ−１に伝え、Ｉ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）産生を誘導する機能を有する新規アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２を同定したことにより完成されたものである。新規アダプター分子ＴＩＣＡＭ−２は、Ｉ型ＩＦＮ誘導を司るアダプターであり、選択的にＬＰＳ／ＴＬＲ４のシグナル系の中からＩ型ＩＦＮ誘導系だけを調節できる。
【０１９０】
本発明はＩ型ＩＦＮ誘導を増強することによりＩ型ＩＦＮが有効なウイルス感染症の予防・治療薬剤、Ｉ型ＩＦＮが有効なガン治療薬剤等等に有用である。一方Ｉ型ＩＦＮ誘導を抑制することにより、エンドトキシンショック、自己免疫疾患、アトピー性疾患等の予防・治療薬剤等にも有用である。したがって、広く創薬、医療の分野での応用が大いに期待できる。
【０１９１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＬＲ２、３、４および５と各ＴＬＲ特異的シグナル伝達経路を決定するアダプターとの会合の形態を示す模式図である。
【図２】ヒトＴＩＣＡＭ−２のアミノ酸配列と、マウスＴＩＣＡＭ−２のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図３】ヒトＴＩＣＡＭ−２、マウスＴＩＣＡＭ−２、ヒトＴＩＣＡＭ−１、マウスＴＩＣＡＭ−１、ヒトＭｙＤ８８、ヒトＴＩＲＡＰの各ＴＩＲドメイン、およびヒトＴＬＲ２のＴＩＲのアライメントを示す図である。
【図４】４種類のヒトアダプター分子のドメイン構造を示す模式図である。
【図５】（ａ）は、特定の組織由来のＴＩＣＡＭ−２ｍＲＮＡのノーザンブロット結果を示す図であり、（ｂ）は、様々なヒト細胞およびヒト細胞株におけるＴＩＣＡＭ−２  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す図である。
【図６】（ａ）〜（ｃ）は、酵母ツー・ハイブリッド法によるＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲｓまたはアダプターとの間の会合実験の結果を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、免疫沈降法によるＴＩＣＡＭ−２とＴＬＲｓまたはアダプターとの間の会合実験の結果を示す図である。
【図８】野生型および変異型ＴＩＣＡＭ−２の構造を示す模式図である。
【図９】（ａ）〜（ｃ）は、ＴＩＣＡＭ−２発現によるＮＦ−κＢ、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＡＰ−１の活性化を検討した結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｃ）は、野生型および変異型ＴＩＣＡＭ−２発現によるＮＦ−κＢおよびＩＦＮ−βプロモーターの活性化を検討した結果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）・（ｂ）は、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４のシグナル伝達に対する変異型ＴＩＣＡＭ−２の影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）・（ｂ）は、ＴＬＲ３およびＴＬＲ４のシグナル伝達に対する変異型ＴＩＣＡＭ−１の影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）・（ｂ）は、ＴＩＣＡＭ−１とＴＩＣＡＭ−２の相乗効果を検討した結果を示すグラフである。
【図１４】（ａ）・（ｂ）は、ＴＩＣＡＭ−２と、ＴＩＣＡＭ−１、ＭｙＤ８８およびＴＩＲＡＰのそれぞれのドミナントネガティブ体とを共発現させた場合の、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した結果を示すグラフである。
【図１５】ＴＩＣＡＭ−１とＴＩＣＡＭ−２のドミナントネガティブ体とを共発現させた場合の、ＩＦＮ−βプロモーターおよびＮＦ−κＢ活性化について検討した結果を示すグラフである。
【図１６】（ａ）は、各アダプター分子を発現させたＨｅＬａ細胞をＬＰＳで処理し、その細胞溶解液をｎａｔｉｖｅＰＡＧＥに供した結果を示す図であり、（ｂ）は、ＴＩＣＡＭ−２またはＴＩＣＡＭ−２＋ＩＲＡＫ−１ドミナントネガティブ体を発現させた細胞におけるＩＦＮ−βプロモーター活性化を検討した結果を示すグラフである。
【図１７】（ａ）は、マウスＴＩＣＡＭ−２のＲＮＡ干渉に用いたｓｉＲＮＡの部位を示す模式図であり、（ｂ）は、ＲＮＡ干渉後のＩＦＮ−βｍＲＮＡおよびＴＩＣＡＭ−２  ｍＲＮＡを定量ＰＣＲ法で増幅したＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図であり、（ｃ）は、ＴＩＣＡＭ−２に対するＲＮＡ干渉後、ＩＦＮ−βｍＲＮＡを定量ＰＣＲ法により定量した結果を示すグラフであり、（ｄ）は、マウスＴＩＣＡＭ−１に対するＲＮＡ干渉によりＬＰＳ刺激後のＩＦＮ−βｍＲＮＡを定量ＰＣＲ法で定量した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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