(57)【要約】    【課題】  Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上する方法を提供する。    【解決手段】  Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、細胞内のｐｐＧｐｐ合成能が上昇するように改変された細菌を用いる。    【選択図】  図１
2005021154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、細胞内のｐｐＧｐｐ合成能が上昇するように改変されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞内のｐｐＧｐｐ合成酵素の活性が上昇するように改変された請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐｐＧｐｐ合成酵素がＲｅｌＡタンパク質、またはＲｅｌＡタンパク質のカタリティックドメインである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌は、ｒｅｌＡ遺伝子、もしくはＲｅｌＡタンパクのカタリティックドメインをコードするｒｅｌＡ遺伝子の一部領域のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｒｅｌＡ遺伝子、もしくはＲｅｌＡタンパクのカタリティックドメインをコードするｒｅｌＡ遺伝子の一部領域の発現が増強するように同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、細胞内のＲｅｌＡタンパク質のｐｐＧｐｐ生成活性が上昇したことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲｅｌＡタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である請求項３又は４に記載の方法。
（Ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ｐｐＧｐｐ合成活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記ＲｅｌＡタンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡによりコードされる請求項３又は４に記載の方法。
（ａ）配列番号１９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｐｐＧｐｐ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンから選ばれる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−リジンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、エシェリヒア属細菌である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、細胞内のＲｅｌＡタンパク質の活性が上昇するように改変された細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物工業に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌及び同細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ppGpp（グアノシン３’二リン酸５’二リン酸 ）、及びpppGpp（グアノシン３’三リン酸５’二リン酸 ）は、微生物菌体内のシグナル物質として重要な役割を担っていることが、これまでに広く明らかになっている。増殖に必要な細胞内のアミノ酸や糖が枯渇したような条件で微生物が生存していくための適応装置を誘導するために、ppGppは必須の物質であるということが知られている。
【０００３】
エシェリヒア・コリにおいては、ppGppはrelA遺伝子の遺伝子産物であるRelAタンパク質、及びspoT遺伝子の遺伝子産物であるSpoTタンパク質によって生成することが報告されている。また、これらの遺伝子及びタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列も報告されている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
RelAタンパク質は、リボソームに結合した形で菌体内に存在し、アミノアシル化されていないtRNAがリボソームに結合することによりアミノ酸枯渇の信号を受け、GTP、GDPよりpppGppを生成する。一方、SpoTタンパクは、pppGppからppGppへの反応、GTPからppGppへの反応、及びppGppからGTPへの３種の反応を触媒する酵素であることが知られている。以下、pppGppとppGppの細胞内における生理機能は同一であると考えられていることから、両者を包括的に「ppGpp」と表記する。
【０００５】
一般的に、培地中及び菌体内のアミノ酸の急激な枯渇によって、RelAタンパクによりppGppが菌体内に蓄積すると、細胞はリボソーム合成の停止、リボソームタンパク質の分解、各種アミノ酸生合成経路の遺伝子発現の促進などの一連の応答を示すことが知られている。これは、一般的に緊縮応答（Stringent response）と呼ばれており、枯渇したアミノ酸を供給することにより、飢餓条件下で生存するために必要な応答であることが広く知られている（非特許文献４) 。
【０００６】
これまでに、物質生産に関してppGppに着目して解析を行った例としては、ppGpp生産能を消失させることにより、組み換えエシェリヒア・コリを用いたタンパク質の生産性を向上させるというもの（非特許文献５）、放線菌においてリボソームタンパクやRNAポリメラーゼのppGpp結合部位の改変による抗生物質生産性の向上などが挙げられる（非特許文献６、７）。
【０００７】
しかしながら、ppGppが直接作用することが広く知られているアミノ酸の生合成系と、ppGpp生産能との関連に関する研究は、これまでに報告されていなかった。
【非特許文献１】GenBank accession J04039
【非特許文献２】Metzger,S. et al., J. Biol. Chem., 1988, 263 (30), 15699-15704
【非特許文献３】GenBank accession AE000442 U00096
【非特許文献４】Cashel, M., Gentry, D.R., Hernadez, V.J., and Vinella, D. The stringent response. In: Neidhardt, F.C. et.al. (ed)  Escherichia coli and Salmonella; cellar and molecular biology, 2nd edition. 1458-1496 (ASM press, Washington D.C., 1996
【非特許文献５】Dedhia, N. et al., Biotechnol. Bioeng., 1997, vol.53, 379-386
【非特許文献６】Hu, H. and Ochi, K., Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol.67, 1885-18921,
【非特許文献７】Hu, H., Zhang, Q., and Ochi, K., J. Bacteriol., 2002, Vol.184, 3984-3991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が向上した細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を行った結果、細菌のppGpp生産能を高めることによって、特にＲｅｌＡタンパク質のppGpp合成活性を上昇させることによって、Ｌ−アミノ酸生産能を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、細胞内のｐｐＧｐｐ合成能が上昇するように改変されていることを特徴とする方法。
（２）細胞内のｐｐＧｐｐ合成酵素の活性が上昇するように改変された(1)の細菌。
（３）ｐｐＧｐｐ合成酵素がＲｅｌＡタンパク質、またはＲｅｌＡタンパク質のカタリティックドメインである(2)の方法。
（４）前記細菌は、ｒｅｌＡ遺伝子、もしくはＲｅｌＡタンパクのカタリティックドメインをコードするｒｅｌＡ遺伝子の一部領域のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｒｅｌＡ遺伝子、もしくはＲｅｌＡタンパクのカタリティックドメインをコードするｒｅｌＡ遺伝子の一部領域の発現が増強するように同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、細胞内のＲｅｌＡタンパク質のｐｐＧｐｐ生成活性が上昇したことを特徴とする(3)の方法。
（５）前記ＲｅｌＡタンパク質が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質である(3)又は(4)の方法。
（Ａ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ｐｐＧｐｐ合成活性を有するタンパク質。
（６）前記ＲｅｌＡタンパク質が、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡによりコードされる(3)又は(4)の方法。
（ａ）配列番号１９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｐｐＧｐｐ合成活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファンから選ばれる(1)〜(6)のいずれかの方法。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−リジンである(7)の方法。
（９）前記細菌が、エシェリヒア属細菌である(1)〜(8)のいずれかの方法。
（１０）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、細胞内のＲｅｌＡタンパク質の活性が上昇するように改変された細菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、細胞内のppGpp合成能が上昇するように改変された細菌である。
【００１４】
前記細菌としては、ppGpp合成能が上昇することによってＬ−アミノ酸生産能が向上する細菌であれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア属細菌、バチルス・ズブチリス等のバチルス属細菌等が挙げられる。
【００１５】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸生産能」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ酸生産能は、細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００１６】
前記Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン等が挙げられる。これらの中ではＬ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−リジンが好ましい。
【００１７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌として具体的には、目的とするＬ−アミノ酸がＬ−グルタミン酸の場合は、エシェリヒア・コリMG1655ΔsucA（後述の実施例参照）、エシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照）、エシェリヒア・コリのＬ−バリン耐性株、例えば、エシェリヒア・コリB11、エシェリヒア・コリK-12（ATCC10798）、エシェリヒア・コリB（ATCC11303）、エシェリヒア・コリW（ATCC9637）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参照）等が、
Ｌ−スレオニンの場合は、エシェリヒア・コリ VKPM B-3996（米国特許第5,175,107号参照）、エシェリヒア・コリMG442株（VKPM B-1628）（Gusyatiner et al., Genetika(in
Russian), 14, 947-956 (1978)参照、米国特許第4,278,765号）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等が、
Ｌ−イソロイシンの場合は、エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が、
Ｌ−リジンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,170号参照）、エシェリヒア・コリ WC196株（FERM BP-5252）（WO96/17930号）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照）等が、
Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ 12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等が、
Ｌ−ロイシンの場合は、β−２−チエニルアラニン耐性を有する菌株、β−２−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン耐性を有する菌株（以上、特公昭62-34397号公報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフルオロロイシン耐性を有する菌株（特開平8-70879号公報）、エシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭 62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（FERM P-2516)(米国特
許第3,970,519号参照）等が、
Ｌ−バリンの場合は、エシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照）等が、
Ｌ−ホモセリンの場合は、エシェリヒア・コリC600株（Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954)参照）のLeu+復帰変異株であるNZ10株が挙げられる。
【００１８】
前記菌株のうち、エシェリヒア・コリMG1655ΔsucAは、MG1655株（E. coli Genetic Stock Center (Yale University, Dept. Biology, Osborn Memorial Labs., 06511-7444 New Haven, Connecticut, U.S.A., P.O. Box 6666) から入手できる）のαKGDH（α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ）のE1サブユニットをコードする遺伝子（sucA）を破壊した株である（後述の実施例参照）。
【００１９】
また、エシェリヒア・コリB-3996株は、thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、ilvA遺伝子にリーキー変異を有している。同株は、スレオニン及びホモセリンに対する高度な耐性に関与するrht遺伝子（フランス特許出願公開第2804971号）に変異を有している。B-3996株は、スレオニンによるフィードバック耐性が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010由来のベクターに挿入することによって取得されたプラスミドpVIC40を保持している。B-3996株は、1987年4月7日に、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM)（住所：Dorozhny proezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation）に、B-3996の受託番号で寄託されている。
【００２０】
B-3996/pMWD5（特開平08-047397号公報、米国特許第5,998,178号）は、B-3996株に、アテニュエーションに必要な領域が除去されたilvGMEDAオペロンを含むプラスミドpMWD5（特開平08-047397号公報、WO96/26289）を導入することによって得られた菌株である。
【００２１】
本発明の細菌は、上記のようなＬ−アミノ酸生産能を有する細菌を、同細菌の細胞内のppGpp合成能が上昇するように改変することによって、取得することができる。また、本発明の細菌は、細胞内のppGpp合成能が上昇するように改変した細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与又は増強することによっても、取得することができる。
【００２２】
「細胞内のppGpp合成能が上昇するように改変された」とは、細胞当たりのppGpp合成能が、非改変株、例えば野生株のそれよりも高くなったことをいう。前記野生株としては、例えば、エシェリヒア・コリではエシェリヒア・コリMG1655が挙げられる。
【００２３】
細菌のppGpp合成能は、例えば、細胞内のppGpp合成酵素の活性が上昇するように細菌を改変することよって、上昇させることができる。ppGpp合成酵素としては、RelAタンパク質及びSpoTタンパク質が挙げられる。これらの中では、RelAタンパク質が好ましい。また、RelAタンパク質とSpoTタンパク質の両方の活性が上昇するように細菌を改変してもよい。
【００２４】
細菌の前記タンパク質の活性の上昇は、例えば、RelAをコードする遺伝子（relA）又はSpoTをコードする遺伝子（spoT）の発現を増強することによって達成される。こられの遺伝子の発現量の増強は、relA又はspoTGSのコピー数を高めることによって達成される。例えば、relA又はspoTを含むＤＮＡ断片を、細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを前記細菌に導入して形質転換すればよい。
【００２５】
relA遺伝子又はspoT遺伝子は、これらの遺伝子を導入する宿主細菌で機能するものであ
れば由来は特に問わないが、宿主と同種又は近縁の細菌に由来する遺伝子が好ましい。
【００２６】
エシェリヒア・コリのrelA及びspoTは、既に塩基配列が明らかにされている（relA：GenBank accession AE000362、塩基番号1667〜3901、spoT：GenBank accession AE000442 U00096塩基番号3791〜5899）ので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、エシェリヒア属細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、これらの遺伝子を取得することができる。他の微生物のrelA又はspoTのホモログも、同様にして取得され得る。
【００２７】
配列番号１９及び２０に、エシェリヒア・コリのrelA遺伝子の塩基配列及びRelAタンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号２１及び２２に、エシェリヒア・コリのspoT遺伝子の塩基配列及びSpoTタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２８】
本発明に用いるrelA及びspoTは、コードされるRelAタンパク質及びSpoTタンパク質のppGpp合成活性が損なわれない限り、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むRelA又はSpoTをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から500個、好ましくは、２から100個、より好ましくは２から20個である。
【００２９】
また、RelAタンパク質は、カタリティックドメインとリボゾーム結合ドメインからなるが、本発明においては、RelAタンパク質はリボゾーム結合ドメインを欠失していてもよい。配列番号２０に示すRelAタンパク質のアミノ酸配列において、カタリティックドメインはアミノ酸番号１〜４６４に相当する。このようなカタリティックドメインのみからなるRelAタンパク質も、本発明にいうRelAタンパク質に含まれる。尚、本明細書では、RelAタンパク質のカタリティックドメインのみをコードする遺伝子は、「relA*」と記載することがある。
【００３０】
上記のようなRelA又はSpoTと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、relA又はspoTの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３１】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、RelAまたはSpoTと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するRelAまたはSpoTをコードするＤＮＡまたは、これを保持する細胞から、例えば配列番号１９又は２１に記載の塩基配列又はそれらの一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ppGpp合成活性を有するタンパク質をコードするDNAを単離することによっても、RelA又はSpoTと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３２】
プローブとして、配列番号１９又は２１の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１９又は２１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１９又は２１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３３】
RelAと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２０に示すアミノ酸配列と、好ましくは７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上の相同性を有し、かつRelAと同様の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。RelAタンパク質がカタリティックドメインのみからなる場合は、カタリティックドメインが前記相同性を有することが好ましい。また、SpoTと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２２に示すアミノ酸配列と、好ましくは７０%以上、より好ましくは８０%以上、さらに好ましくは９０%以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつATase活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３４】
RelA又はSpoTを単離するための材料としての染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００３５】
relA増幅用のプライマーとしては後記表１に記載のrelA5及びrelA6が、relA*増幅用のプライマーとしては、relA5及びrelA7が挙げられる。また、spoT増幅用のプライマーとしては、spoT1及びspoT4が挙げられる。
【００３６】
PCR法により増幅されたrelA又はspoTを含むＤＮＡ断片は、エシェリヒア・コリ等の細菌細胞内において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えDNAを調製しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219、pSTV29等が挙げられる。
【００３７】
relA又はspoTとベクターを連結して組換えDNAを調製するには、これらの遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて連結すればよい。
【００３８】
上記のように調製した組換えDNAをコリネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ  Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,
S.and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、形質転換は、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。
【００３９】
遺伝子のコピー数を高めることは、遺伝子を細菌の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。
【００４０】
RelA又はSpoTの活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のrelA又はspoTのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935号パンフレットに開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりrelA又はspoTの発現が強化され、RelA又はSpoTの活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、各遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００４１】
発現調節配列の置換は、例えば後述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア細菌の温度感受性プラスミドとしては、pMAN031（Yasueda, H. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)）、pMAN997（WO
99/03988号）、及びpEL3（K. A. Armstrong et. al., J. Mol. Biol. (1984) 175, 331-347）等が挙げられる。pMAN997は、pMAN031（J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)）とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたものである。これらのプラスミドは、エシェリヒア・コリ中で少なくとも30℃では自律複製することができるが、42℃では自律複製できない。
【００４２】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培養物中に生成蓄積させ、該培養物より前記Ｌ−アミノ酸を採取することより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することができる。
【００４３】
本発明において使用する培地は、使用する細菌又は目的とするＬ−アミノ酸の種類に応じて、従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は特に必要とされない。
【００４４】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。
【００４５】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４６】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００４７】
培養は、使用する菌株に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない
。例えば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００４８】
培養終了後の培地からのＬ−アミノ酸の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、目的物質の採取は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を、目的とするＬ−アミノ酸の種類に応じて組み合わせることにより実施できる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
以下の実施例において、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸を示す。また、以下の実施例で用いたPCR用プライマーを、表１に示す。
【００５０】
【表１】
2005021154.tif 000003
【００５１】
〔実施例１〕
＜１＞エシェリヒア・コリ グルタミン酸過剰生成株の取得
はじめに、エシェリヒア・コリのグルタミン酸過剰生成株を取得するために、エシェリヒア・コリ野生株のsucA遺伝子破壊株の構築を行った。遺伝子破壊に用いる欠損型遺伝子の調製は、クロスオーバーPCR（Link AJ, Phillips D, Church GM、J.Bacteriol.Vol.179.p6228-6237,1997記載）によって行った。プライマーには、sucA1〜sucA4を用いた。sucA1及びsucA4は、sucA遺伝子全長及びその両端に隣接する領域各約1000bpを増幅するプライマーであり、sucA2及びsucA3は、遺伝子ORF内の一部を欠損させるようなプライマーのセットである。
【００５２】
プライマーsucA1とsucA2、及びsucA3とsucA4を組み合わせて、常法により調製したエシ
ェリヒア・コリ野生株MG1655株のゲノムDNAを鋳型に、一回目のPCR反応を行った。この際、プライマーsucA1とsucA2、及びsucA4とsucA3のモル比は10:1で行った。得られた一回目のPCR産物を鋳型に、プライマーsucA1とsucA4を用いて二回目のPCRを行った。二回目のPCRによって増幅されたsucA遺伝子は、ORFの内部を欠損している。増幅されたDNA断片の両端を、制限酵素EcoRIで切断した。
【００５３】
温度感受性の複製起点を有するプラスミドpMAN997を、同じ制限酵素EcoRIで切断、精製し、上記増幅断片とDNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結した。この連結反応液で、エシェリヒア・コリJM109コンピテント細胞（宝酒造）を形質転換し、アンピシリン（Ap）（シグマ）を25μg/mL含むLB寒天プレート（LB＋Ampプレート）にまき、30℃でコロニーを選択した。コロニーを25μg/mLのApを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、Wizard Plus Miniprep（Promega社）を用いてプラスミドを抽出した。EcoRIで切断して目的長断片が得られるプラスミドを、遺伝子破壊用プラスミド（pMANΔsucA）とした。
【００５４】
pMANΔsucAで目的の宿主を形質転換し、LB＋Ampプレートで30℃でコロニーを選択した。30℃で液体培養を一晩行った後、10-3希釈してLB＋Ampプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したコロニーを、LB+Ampプレートに塗り広げて、30℃で培養した後、1/8プレート分の菌体をLB培地2mLに懸濁し、42℃で4〜5時間震とう培養した。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋Ampプレートに植菌し、生育を確認することで、Apに対する感受性及び耐性を確認した。Ap感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の破壊を確認した。こうして、MG1655ΔsucAを得た。
【００５５】
＜２＞エシェリヒア・コリ グルタミン酸過剰生成株からのrelA遺伝子破壊株及びspoT遺伝子破壊株の取得
＜１＞で得られたMG1655ΔsucAから、relA遺伝子、spoT遺伝子、又はこれらの両遺伝子を破壊した株を構築した。各遺伝子の破壊は、クロスオーバーPCRによって行った。relA遺伝子及びspoT遺伝子用プライマーとして、relA1〜relA4、及びspoT1〜spoT4を用いた。relA1、relA4、spoT1及びspoT4は、各々relA遺伝子又はspoT遺伝子全長及びそれらの両端に隣接する領域各約1000bpを増幅するプライマーであり、relA2、relA3、spoT2及びspoT3は、各遺伝子のORF内の一部を欠損させるようなプライマーのセットである。
【００５６】
プライマーrelA1とrelA2、及びrelA3とrelA4を組み合わせて、常法により調製したエシェリヒア・コリ野生株MG1655株のゲノムDNAを鋳型に、一回目のPCR反応を行った。この際、プライマーrelA1とrelA2、及びrelA4とrelA3のモル比は10:1で行った。得られた一回目のPCR産物を鋳型に、プライマーrelA1とrelA4を用いて二回目のPCRを行った。
【００５７】
また、プライマーspoT1とspoT2、及びspoT3とspoT4を組み合わせて、常法により調製したエシェリヒア・コリ野生株MG1655株のゲノムDNAを鋳型に、一回目のPCR反応を行った。この際、プライマーspoT1とspoT2、及びspoT4とspoT3のモル比は10:1で行った。得られた一回目のPCR産物を鋳型に、プライマーspoT1とspoT4を用いて二回目のPCRを行った。
【００５８】
二回目のPCRによって増幅されたrelA遺伝子及びspoT遺伝子は、各々の遺伝子のORFの内部を欠損している。
温度感受性の複製起点を有するプラスミドpMAN997を、同じ制限酵素EcoRIで切断、精製し、上記増幅断片とDNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結した。この連結反応液で、エシェリヒア・コリJM109コンピテント細胞（宝酒造）を形質転換し、アンピシリン（Ap）（シグマ）を25μg/mL含むLB寒天プレート（LB＋Ampプレート）にまき、30℃でコロニーを選択した。コロニーを25μg/mLのApを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、Wizard Plus Miniprep（Promega社）を用いてプラスミドを抽出した。EcoRIで切断して目的
長断片が得られるプラスミドを、遺伝子破壊用プラスミド（pMANΔrelA, pMANΔspoT）とした。
【００５９】
pMANΔrelA及びpMANΔspoTで、＜１＞で得たMG1655ΔsucAを形質転換し、LB＋Ampプレートで30℃でコロニーを選択した。30℃で液体培養を一晩行った後、10-3希釈してLB＋Ampプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。選択したコロニーを、LB+Ampプレートに塗り広げて、30℃で培養した後、1/8プレート分の菌体をLB培地2mLに懸濁し、42℃で4〜5時間震とう培養した。10-5希釈した培養液をLBプレートにまき、得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋Ampプレートに植菌し、生育を確認することで、Apに対する感受性及び耐性を確認した。Ap感受性株の数株についてコロニーPCRを行い、sucA遺伝子の破壊を確認した。こうして、MG1655ΔsucAΔrelA、及びMG1655ΔsucAΔspoTを得た。
【００６０】
また、上記と同様にして、MG1655ΔsucAΔrelAのspoT遺伝子を破壊し、MG1655ΔsucAΔrelAΔspoTを得た。
【００６１】
上記にようにして得られた各遺伝子破壊株を用いて、グルタミン酸の生産能を評価した。これらの株を、グルコースを40g/L、MgSO4・7水和物を1g/L、KH2PO4を1g/L、(NH4)2SO4を16g/L、FeSO4・7水和物を10mg/L、MnSO4・4〜5水和物を10mg/L、酵母エキスを2g/L、CaCO3を50g/L含む培地で、500mL容坂口フラスコを用いて培養した。培養開始時の培養液量は20mLとし、回転速度120rpmで往復振とうし、37℃で24時間培養を行った。培地、容器等は、全てオートクレーブ滅菌を行った後に使用した。このとき、培養液中の菌体濃度、グルコース濃度、及びグルタミン酸蓄積を測定した。菌体濃度は、0.1規定塩酸で適当倍率に希釈した培養液を用い、562nmの濁度を分光光度計（ベックマン社）で測定した。残存グルコース濃度、及びグルタミン酸濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定した。結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2005021154.tif 000004
【００６３】
表２に示すように、relAを欠損した株では、生育、糖消費、グルタミン酸収率のいずれもが大幅に低下することが確認された。一方、spoT遺伝子の欠損による影響はほとんど観察されなかった。
【００６４】
〔実施例２〕ppGpp過剰生成プラスミドの構築
ppGppを過剰生成する菌株の構築は、relA遺伝子全領域、又はrelA遺伝子産物のカタリティックドメインをコードする領域（relA*）を増幅することにより行った。増幅用プラスミドとしては、異なる４種類のプラスミド（pMrelA、pMrelA*、pSTVrelA、pSTVrelA*）
を構築した。
【００６５】
＜1＞pMrelA、pMrelA*の構築
プラスミドpMrelA、pMrelA*の構築は以下のようにして行った。
プラスミドpMW119（ニッポンジーン社）を制限酵素PvuIIで切断し、自己環状化することにより、プラスミドpMW1を得た。次に、プラスミドpMW1に、mini-Mud 4041ベクター（Miller, “A short course in bacterial genetics”, Cold Springs Harbor press (1992) 385-400）を定法に従い組み込み、プラスミドpMu11を得た。pMu11を制限酵素HindIIIで切断後、自己環状化して、Muファージ由来のトランスポゼースをコードする遺伝子A、B及び負の制御因子をコードするner遺伝子を除去したプラスミドpM12を得た。次に、プラスミドpM12を制限酵素BamHI、HindIIIで切断後、プラスミドpMD4041-cat-2Tfdを制限酵素BamHI、HindIIIで切断して切り出したter及びfd領域を含む領域（2Tfd）を連結して、プラスミドpM14を得た（図１）。
【００６６】
上記プラスミドpMD4041-cat-2Tfdは、以下のようにして得た。プラスミドpML24（Trukhan et al., Biotechnologiya (in Russian) 4, No.3 (1988), 325-334；欧州特許公開第1234883号）を制限酵素BamHI、AccIにより切断し、T4 DNAポリメラーゼにて平滑化した。ここに、BglII、SmaIにより切断してT4 DNAポリメラーゼで平滑化したプラスミドpMD4041を連結することにより、プラスミドpMD4041-cat-2Tfdを得た（図２）。尚、pMD4041は、pMu4041（mini-Mud 4041、Faelen, M. Useful Mu and mini-Mu derivatives. In: Phage Mu. Symonds et al.,eds.. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1987, pp.309-316）をHindIIIにより切断し、Muファージのトランスポゼースをコードする遺伝子A、B及び負の制御因子をコードするner遺伝子を切り出し、再環状化することにより得られたプラスミドである（欧州特許公開第1149911号）。
【００６７】
プラスミドpM14を制限酵素AvaIII、HindIIIにより切断し、プラスミドpM2（特開2001-346578号公報、欧州特許公開第1149911号）を制限酵素AvaIII、BglIIで切り出したλファージ由来のPRプロモーターを含む断片と連結した。この様にしてプラスミドpM15を得た（図１）。
【００６８】
プラスミドpM15を制限酵素HindIII、XbaIで切断し、ベクター断片を得た。また、エシェリヒア・コリ野生株MG1655のゲノムDNAを鋳型として、プライマーrelA5及びrelA6を用いてPCR反応を行い、増幅産物をHindIII、XbaIで切断し、relA遺伝子を含むDNA断片を得た。このDNA断片と、前記ベクター断片（pM15）を、DNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結した。この様にして、プラスミドpMrelAを得た。
【００６９】
一方、MG1655のゲノムDNAを鋳型として、プライマーrelA5及びrelA7を用いてPCR反応を行い、増幅産物をHindIII、XbaIで切断し、relA*遺伝子を含むDNA断片を得た。このDNA断片と、前記ベクター断片（pM15）を、DNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて連結した。この様にして、プラスミドpMrelA*を得た。
【００７０】
＜２＞pSTVrelA、pSTVrelA*の構築
プラスミドpSTVrelA、pSTVrelA*の構築は以下のように行った。
プラスミドpSTV29（宝酒造）を制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断し、ベクター断片を得た。また、エシェリヒア・コリ野生株MG1655のゲノムDNAを鋳型として、プライマーrelA8及びrelA9を用いてPCR反応を行い、増幅産物を制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断し、relA遺伝子を含むDNA断片を得た。これらのDNA断片を連結し、プラスミドpSTVrelAを得た。
【００７１】
一方、MG1655のゲノムDNAを鋳型として、プライマーrelA9及びrelA10を用いてPCR反応を行い、増幅産物を制限酵素EcoRI及びHindIIIで切断し、relA*遺伝子を含むDNA断片を得
た。これを前記ベクター断片（pSTV29）と連結し、プラスミドpSTVrelA*を得た（図３）。
【００７２】
〔実施例３〕 エシェリヒア・コリ グルタミン酸過剰生成株、およびそのrelA遺伝子破壊株へのrelA遺伝子の導入と、グルタミン酸生成に対する効果
実施例２で得られたプラスミドpM15、pMrelA、及びpMrelA*を用いて、実施例１で得たMG1655ΔsucA、及びMG1655ΔsucAΔrelAを形質転換した。
【００７３】
各形質転換株について、グルタミン酸の生産能を評価した。グルコースを40g/L、MgSO4・7水和物を1g/L、KH2PO4を1g/L、(NH4)2SO4を16g/L、FeSO4・7水和物を10mg/L、MnSO4・4〜5水和物を10mg/L、酵母エキスを2g/L、CaCO3を50g/L、アンピシリンを100μg/mL含む培地で、500mL容坂口フラスコを用いて、各々の株を培養した。培養開始時の培養液量は20mLとし、回転速度120rpmで往復振とうし、37℃で24時間培養を行った。培地、容器等は全てオートクレーブ滅菌を行った後に使用した。このとき、培養液中の菌体濃度、グルコース濃度、及びグルタミン酸蓄積を測定した。菌体濃度は、0.1規定塩酸で適当倍率に希釈した培養液を用い、600nmの濁度を分光光度計（ベックマン社）で測定した。残存グルコース濃度、及びグルタミン酸濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定した。結果を表３に示す。
【００７４】
【表３】
2005021154.tif 000005
【００７５】
pMrelA*導入株ではグルタミン酸収率の向上が認められたが、relA破壊株の生育回復に対する効果はほとんど認められなかった。一方、pMrelA導入株ではグルタミン酸収率の向上と共に、relA欠損株の生育も完全に回復し、かつグルタミン酸収率は対照（MG1655ΔsucA/pM15）よりも大幅に向上した。すなわち、relA遺伝子を複数コピー有することで、グルタミン酸収率が向上することを確認した。
【００７６】
〔実施例４〕 エシェリヒア・コリ スレオニン過剰生成株へのrelA、relA*遺伝子の導入と、スレオニン生産に対する効果
実施例２で得られたプラスミドpM15、pMrelA、及びpMrelA*を用いて、エシェリヒア・コリ スレオニン生産菌VKPM B-3996（特許第2775948号公報）を形質転換した。
グルコースを40g/L、MgSO4・7水和物を1g/L、KH2PO4を1g/L、(NH4)2SO4を16g/L、FeSO4・7水和物を10mg/L、MnSO4・4〜5水和物を10mg/L、酵母エキスを2g/L、CaCO3を50g/L、アンピシリンを100μg/mL含む培地で、500mL容坂口フラスコを用いて、各々の株を培養した。培養開始時の培養液量は20mLとし、回転速度120rpmで往復振とうし、37℃で24時間培養を行った。培地、容器等は全てオートクレーブ滅菌を行った後に使用した。このとき、培養液中の菌体濃度、グルコース濃度を測定した。菌体濃度は、0.1規定塩酸で適当倍率に希釈した培養液を用い、600nmの濁度を分光光度計（ベックマン社）で測定した。残存グ
ルコース濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定した。スレオニン濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を0.02規定塩酸で適当倍率に希釈した後に、L-8500形アミノ酸アナライザー（日立製作所）により測定した。結果を表４に示す。
【００７７】
【表４】
2005021154.tif 000006
【００７８】
pMrelA*導入株では約1％のスレオニン収率向上が認められ、pMrelA導入株では約4％のスレオニン収率の向上を認めた。すなわち、relA*遺伝子又はrelA遺伝子を複数コピー有することで、スレオニン収率が向上することを確認した。
【００７９】
〔実施例５〕 エシェリヒア・コリ イソロイシン過剰生成株へのrelA、relA*遺伝子の導入とイソロイシン生産に対する効果
実施例２で得られたプラスミドpSTV29、pSTVrelA、及びpSTVrelA*を用いて、エシェリヒア・コリ イソロイシン生産菌B-3996/pMWD5（特開平08-047397号公報、米国特許第5,998,178号）を形質転換した。
【００８０】
グルコースを40g/L、MgSO4・7水和物を1g/L、KH2PO4を1g/L、(NH4)2SO4を16g/L、FeSO4・7水和物を10mg/L、MnSO4・4〜5水和物を10mg/L、酵母エキスを2g/L、CaCO3を50g/L、アンピシリンを100μg/mL、クロラムフェニコールを25μg/mL含む培地で、500mL容坂口フラスコを用いて、各々の株を培養した。培養開始時の培養液量は20mLとし、回転速度120rpmで往復振とうし、37℃で24時間培養を行った。培地、容器等は全てオートクレーブ滅菌を行った後に使用した。このとき、培養液中の菌体濃度、グルコース濃度を測定した。菌体濃度は、0.1規定塩酸で適当倍率に希釈した培養液を用い、600nmの濁度を分光光度計（ベックマン社）で測定した。残存グルコース濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定した。イソロイシン濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を0.02規定塩酸で適当倍率に希釈した後に、L-8500形アミノ酸アナライザー（日立製作所）により測定した。結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
2005021154.tif 000007
【００８２】
pSTVrelA*導入株では約3％のイソロイシン収率向上が認められ、pSTVrelA導入株では約2％のイソロイシン収率の向上を認めた。すなわち、relA*遺伝子又はrelA遺伝子を複数コピー有することで、イソロイシン収率が向上することを確認した。
【００８３】
〔実施例６〕 エシェリヒア・コリ リジン過剰生成株へのrelA、relA＊遺伝子の導入とリジン生産に対する効果
エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株を用いた。本菌株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-14690として寄託され、平成７年９月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）。また、リジン過剰生成株作製用のプラスミドとしてpCAB1を用いた。本プラスミドは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする変異型lysC遺伝子、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリンシンターゼをコードする変異型dapA遺伝子、及びジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子を搭載したものである（特開平11-192088、米国特許第6,040,160号）。本プラスミドを用いてエシェリヒア・コリ リジン生産菌WC196を形質転換し、リジン過剰生成株WC196/pCAB1を得た。
更に、実施例２で得られたプラスミドpM15、及びpMrelAを用いて、エシェリヒア・コリ
リジン生産菌WC196/pCAB1を形質転換し、WC196/pCAB1/pM15及びWC196/pCAB1/pMrelAを得た。
【００８４】
グルコースを40g/L、MgSO4・7水和物を1g/L、KH2PO4を1g/L、(NH4)2SO4を16g/L、FeSO4・7水和物を10mg/L、MnSO4・4〜5水和物を10mg/L、酵母エキスを2g/L、CaCO3を50g/L、アンピシリンを100μg/mL、ストレプトマイシンを100μg/mL含む培地で、500mL容坂口フラスコを用いて、各々の株を培養した。培養開始時の培養液量は20mLとし、回転速度120rpmで往復振とうし、37℃で42時間培養を行った。培地、容器等は全てオートクレーブ滅菌を行った後に使用した。このとき、培養液中の菌体濃度、グルコース濃度を測定した。菌体濃度は、0.1規定塩酸で適当倍率に希釈した培養液を用い、600nmの濁度を分光光度計（ベックマン社）で測定した。残存グルコース濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定し
た。リジン濃度は、遠心分離により除菌した培養液上清を水で適当倍率に希釈した後に、バイオテックアナライザー（サクラ精器）を用いて測定した。培地中の全てのグルコースを消費した時点（培養時間42時間）での結果を表６に示す。
【００８５】
【表６】
2005021154.tif 000008
カッコ内の数値はｎ＝３の標準偏差を示す。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】プラスミドpM14及びpM15の構築を示す図。
【図２】プラスミドpMD4041-cat-2Tfdの構築を示す図。
【図３】プラスミドpSTVrelA、及びpSTVrelA*の構築を示す図。
【図１】
2005021154.tif 000009
【図２】
2005021154.tif 000010
【図３】
2005021154.tif 000011
【配列表】
2005021154000001.app