(57)【要約】【課題】放線菌で遺伝子を発現させることができる発現ベクターを提供する。【解決手段】放線菌Ｌ１１蛋白質遺伝子（ｒｐｌＫ遺伝子）のプロモーター領域の塩基配列を含む発現ベクターを構築した。このベクターは、放線菌増殖期において異種遺伝子を高発現することができる。本発明のベクターは、多コピーまたは低コピーのプラスミドベクターとして、あるいはゲノム組み込み型ベクターとして利用することができた。本発明のベクターを利用すれば、放線菌等において所望の蛋白質を生産させることが可能である。また、このベクターを用いて任意の標的遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡを発現させれば、その標的遺伝子の機能を特異的に抑制することが可能である。本発明のベクターは、所望の蛋白質製造、特定の遺伝子の機能を促進または抑制した組み換え菌の製造、および放線菌遺伝子の機能解析などにおいて有用である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌において異種遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するＤＮＡの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された該異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項２】
放線菌において遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するＤＮＡの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）（ｂ）のクローニング部位の下流に転写終結配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項３】
転写終結配列が、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するＤＮＡの塩基配列である、請求項１または２に記載のＤＮＡベクター。
【請求項４】
低コピープラスミドである、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項５】
多コピープラスミドである、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項６】
ゲノム組み込みベクターである、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
蛋白質の製造方法であって、該蛋白質をコードする請求項１から６のいずれかに記載のＤＮＡベクターで形質転換した宿主細胞を培養する工程、および該宿主細胞またはその培養液から生産された該蛋白質を回収する工程を含む方法。
【請求項９】
遺伝子の機能を抑制する方法であって、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする請求項１から６のいずれかに記載のＤＮＡベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は放線菌発現ベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の放線菌における発現ベクターとしては、放線菌由来の誘導性プロモーターを利用した例が幾つか報告されている。抗生物質のチオストレプトン添加により転写が誘導されるｔｉｐＡプロモーター（Ｓｍｏｋｖｉｎａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  ９４：５３−５９；  Ｋｕｈｓｔｏｓｓ  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｒ．Ｎ．，  １９９１，  Ｇｅｎｅ  １０３：  ９７−９９；  Ｔａｋａｎｏ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｇｅｎｅ  １６６：  １３３−１３７）、グリセロールにより誘導されるｇｌｙＣＡＢプロモーター（Ｈｉｎｄｌｅ  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．  Ｐ．，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２：  ７３７−７４５）およびマイトマイシンＣにより誘導されるｍｃｒＡＢプロモーター（Ａｕｇｕｓｔ  Ｐ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅ  １７５：  ２６１−２６７）が発現ベクターに利用されている。ｔｉｐＡやｍｃｒＡＢプロモーターを利用する場合には、誘導に薬剤を用いるため発現タンパクを実用化する際に精製段階でこれら薬剤を除去する必要がある。また構成的プロモーターを利用した発現ベクターとしては、人工的に変異させたｅｒｍＥ＊プロモーター（Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｓ，  Ｊ．Ｗ．，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６：  ４９３−４９８；  Ｂｉｂｂ，  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４：  ５３３−５４５）を用いたものが報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｓｍｏｋｖｉｎａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  ９４：  ５３−５９
【非特許文献２】
Ｋｕｈｓｔｏｓｓ  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｒ．Ｎ．，  １９９１，  Ｇｅｎｅ  １０３：  ９７−９９
【非特許文献３】
Ｔａｋａｎｏ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｇｅｎｅ  １６６：  １３３−１３７
【非特許文献４】
Ｈｉｎｄｌｅ  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．  Ｐ．，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２：  ７３７−７４５
【非特許文献５】
Ａｕｇｕｓｔ  Ｐ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅ  １７５：  ２６１−２６７
【非特許文献６】
Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｌｓ，  Ｊ．Ｗ．，  １９９２，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６：  ４９３−４９８
【非特許文献７】
Ｂｉｂｂ，  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４：  ５３３−５４５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、増殖期の放線菌において高レベルで遺伝子を発現させることができる発現ベクターを提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
増殖期の放線菌において外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターを開発するため、本発明者らは放線菌リボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子のプロモーターに着目した。リボゾームは生命に必須のタンパク合成装置であり、Ｌ１１蛋白質の遺伝子は生育初期から発現され、生育の盛んな対数増殖期にはその発現は最大となると考えられる。本発明者らは以前、ストレプトミセス属  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来のＬ１１蛋白質遺伝子（ｒｐｌＫ遺伝子）を含むＤＮＡ断片を単離している  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５５：５４９−５６０）。また、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒでのみｒｐｌＫ上流領域の転写開始点に関する報告がされている（Ｐｕｔｔｉｋｈｕｎｔ，Ｃ．，  Ｔ．  Ｎｉｈｉｒａ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｙａｍａｄａ．  １９９５．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４７：  １１８−１２２）。しかしプロモーター領域を含むｒｐｌＫ遺伝子断片を多コピープラスミドに挿入して放線菌に導入しても、形質転換体を得ることはできなかった  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５５：５４９−５６０）。
【０００６】
そこで本発明者らは、約２８０塩基対からなるＬ１１蛋白質遺伝子のプロモーター断片を選び出し、これに異種遺伝子を連結して新たな発現ベクターを構築した。ベクターからの遺伝子発現を測定した結果、このＤＮＡの下流に連結した異種遺伝子の発現を非常に強く誘導することを突き止めた。すなわち、Ｌ１１蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流３番目から２７７番目のＤＮＡ断片を用い、さらに本来連結されているＬ１１蛋白質コード配列ではなく異種遺伝子を連結することにより、放線菌内で起こる転写抑制または他の有害な効果を回避することが可能となり、異種遺伝子を高発現するベクターを構築できることを実証した。このとき、転写終結配列  （ターミネーター）  として、ｓｓｇＡ遺伝子由来のターミネーター配列  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．  Ｅｎｓｉｇｎ，  １９９５，  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ９：１３６−１５１；  Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：１０７７−１０８６）  を用いることにより、異種遺伝子の持続的な高発現をより確実に実現させることに成功した。ｓｓｇＡ遺伝子のターミネーターは大きなステムループを形成し得るパリンドローム配列を含んでおり、これにより転写終結因子に依存しないで強力に転写を終結させることができた。ｒｐｌＫプロモーターとｓｓｇＡ遺伝子のターミネーター配列を組み合わせることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にし、なおかつ、強力なターミネーターの利用によりｍＲＮＡの安定化の向上を可能とする新たな発現ベクターを構築することに成功した。
【０００７】
上記のｒｐｌＫプロモーター−異種遺伝子の発現カセットは、低コピープラスミドの複製起点（ｏｒｉ）を持つプラスミド中に組み込むことにより低コピー型の発現プラスミドとして構築できたのみならず、多コピープラスミドの複製起点を持つプラスミド中に組み込むことにより、多コピー型の発現プラスミドとして構築することにも成功した。このように、本発明においてｒｐｌＫ遺伝子由来のプロモーター断片を持つ多コピー型の発現プラスミドが初めて提供された。
【０００８】
この発現ベクターにＥＧＦＰのコード配列を組み込み、放線菌に導入して発現を解析したところ、菌体からＥＧＦＰの強い発現が観察された。また、分泌性蛋白質であるアガラーゼ蛋白質のコード配列を組み込み、放線菌に導入して培養したところ、培養上清中に１４０  Ｕ／ｍｌを超えるアガラーゼが分泌された。本来のアガラーゼ遺伝子の発現は、グルコースによるカタボライト抑制およびリプレッサー蛋白質による転写抑制などを受けるため高発現は期待できないが、本発明の発現ベクターを利用することにより、発現させる遺伝子が本来受けるはずの発現抑制を受けることなく、高レベルで蛋白質を発現させることができた。
【０００９】
また本発明者らは、この発現ベクターに宿主ゲノムへの組み込みに必要なφ３１ファージのｉｎｔ遺伝子とａｔｔＰを挿入し、ゲノム組み込み型の発現ベクターを構築した。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤等により選択する必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。このゲノム組み込み型ベクターにそれぞれｓｓｇＡ遺伝子およびｅｓｈＡ遺伝子の部分配列をアンチセンスに組み込み、放線菌に導入して発現量の測定と表現型の変化を観察した。形質転換株におけるアンチセンスＲＮＡの転写をＲＴ−ＰＣＲにより解析したところ、それぞれｓｓｇＡおよびｅｓｈＡのアンチセンスＲＮＡが生育期を通じて発現されていることが明らかとなった。アンチセンスＲＮＡの転写レベルは、内在性のｈｒｄＢ遺伝子の転写レベルに匹敵していた。すなわち、ゲノムに組み込んだ形態においても、本発明のベクターは高いレベルで異種遺伝子を発現できることが証明された。ｓｓｇＡ遺伝子およびｅｓｈＡ遺伝子は共に必須遺伝子ではなく、これらの遺伝子を破壊した株は共に青色抗生物質アクチノロージンの生産が抑制される。上記のアンチセンスＲＮＡを発現する形質転換株では青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制されたことから、アンチセンスＲＮＡ発現により、ｅｓｈＡ遺伝子およびｓｓｇＡ遺伝子の機能が実際に抑制されたことが確認された。このように、本発明のベクターは、ゲノムに組み込まれ、安定に維持され、しかも遺伝子を高レベルで発現することもできる。本発明のベクターは遺伝子の高発現用ベクターとして、またはアンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制用のベクターとして極めて有用であることが証明された。
【００１０】
すなわち本発明は、新規な放線菌発現ベクター、該ベクターを保持する宿主細胞、および該ベクターによる蛋白質の製造方法等に関し、より具体的には、
（１）放線菌において異種遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するＤＮＡの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された該異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含むＤＮＡベクター、
（２）放線菌において遺伝子を発現させるためのＤＮＡベクターであって、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するＤＮＡの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）（ｂ）のクローニング部位の下流に転写終結配列を含むＤＮＡベクター、
（３）転写終結配列が、配列番号：３に記載の塩基配列、または該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつ転写を終結させる活性を有するＤＮＡの塩基配列である、（１）または（２）に記載のＤＮＡベクター、
（４）低コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡベクター、
（５）多コピープラスミドである、（１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡベクター、
（６）ゲノム組み込みベクターである、（１）から（３）のいずれかに記載のＤＮＡベクター、
（７）（１）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、
（８）蛋白質の製造方法であって、該蛋白質をコードする（１）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡベクターで形質転換した宿主細胞を培養する工程、および該宿主細胞またはその培養液から生産された該蛋白質を回収する工程を含む方法、
（９）遺伝子の機能を抑制する方法であって、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする（１）から（６）のいずれかに記載のＤＮＡベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む方法、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｌ１１蛋白質遺伝子プロモーター配列を利用した、放線菌で遺伝子を発現する発現ベクターに関する。Ｌ１１蛋白質遺伝子（ｒｐｌＫ遺伝子）はリボゾーム蛋白質Ｌ１１をコードする遺伝子であり、放線菌において高度に保存されている（図１参照）。本発明のベクターは、このＬ１１蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンの上流領域のＤＮＡを含む。本発明のベクターの１つの態様は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有するＤＮＡの塩基配列を含み、（ｂ）（ａ）の塩基配列の下流に機能的に結合された異種遺伝子の塩基配列を含み、（ｃ）（ｂ）の塩基配列の下流に転写終結配列を含む組み換えＤＮＡであって、放線菌において該遺伝子を検出可能に発現するＤＮＡベクターである。本発明者らは、配列番号：１に示した塩基配列からなるＤＮＡが、下流に連結した異種遺伝子を増殖期の放線菌において高レベルで発現させることを見いだした。本発明のＤＮＡベクターは、放線菌で所望の遺伝子を発現させるために用いる発現ベクターとして有用である。
【００１２】
本発明においてプロモーター活性とは、下流に連結した遺伝子を転写する活性を言う。プロモーター活性は、プロモーター活性について調べたい配列の下流に、発現を検出するための適当な指標遺伝子（例えばマーカー蛋白質をコードする遺伝子など）を連結し、放線菌等の宿主に導入する。宿主においてその指標遺伝子の発現（例えばマーカー蛋白質の活性など）が検出されれば、その配列はプロモーター活性を有すると判断される。また遺伝子の転写は、蛋白質を検出するかわりにＲＮＡの転写をＲＴ−ＰＣＲ等により検出して測定することもできる。なお、下流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の３’方向のことであり、上流とは、転写される側のポリヌクレオチド鎖の５’方向のことである。
【００１３】
また本発明において遺伝子とは、転写されるべき塩基配列を含む核酸を言う。また本発明において異種遺伝子とは、本発明のベクターのプロモーター配列が由来するＬ１１蛋白質遺伝子とは異なる遺伝子のことを言う。遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、していなくてもよい。蛋白質をコードする核酸は、本発明において、その蛋白質の遺伝子と呼ぶ。アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする核酸は、本発明においてそれらの遺伝子と呼ぶ。本発明のＤＮＡベクターに組み込む異種遺伝子はＬ１１蛋白質遺伝子以外の所望の遺伝子であってよく、好ましくはＬ１１蛋白質、Ｌ１蛋白質、およびＬ１０蛋白質のいずれもコードしない遺伝子である。ベクターに組み込む異種遺伝子は蛋白質をコードしていてもよく、あるいはアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない配列であってよい。蛋白質としては、所望の酵素、構造蛋白質、調節因子などであってよく、天然の蛋白質、変異蛋白質、人工的に作り出した蛋白質などであってよい。例えば、分泌蛋白質を本発明のベクターを利用して発現させれば、この蛋白質を培養液中に大量に分泌させることができる。天然には分泌されない蛋白質であっても、分泌シグナルを付加した融合蛋白質を発現させることで、その蛋白質を菌体外等に分泌させることができる。本発明のベクターは、挿入する遺伝子がコードする蛋白質を分泌するように、予めベクター配列中に分泌シグナル配列をコードしていてもよい。配列番号：１または２の塩基配列を含む本発明のベクターはＳＤ配列（ＡＧＧＡ）を含むが、目的の遺伝子の蛋白質コード配列の開始コドンからＳＤまでが離れている場合は、開始コドンの近くに適宜ＳＤ配列を挿入してよい。なお、本発明のＤＮＡベクターは通常は２本鎖ＤＮＡであるが、放線菌に導入した時に２本鎖ＤＮＡを生じる限り、どちらか一方の鎖からなるＤＮＡを含むベクター（例えば一本鎖ＤＮＡを含むファージなど）であってもよい。すなわち本発明においてある塩基配列を含むＤＮＡベクターとは、その塩基配列を含む２本鎖ＤＮＡを生じることができるように、該塩基配列および／またはその相補配列を含むＤＮＡベクターのことである。
【００１４】
本発明において放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌を言う。放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり主に土壌などに生息する。原核生物でありながら、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質および他の生物学的に重要な化合物が発見されている。放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕａｃｅａｅ）、およびノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。本発明において放線菌とは、特に好ましくは、ストレプトミセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、より好ましくはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。
【００１５】
本発明において好適に用いられるＬ１１遺伝子プロモーター断片の塩基配列を配列番号：１に示す。この配列は、放線菌  Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのＬ１１遺伝子のプロモーター断片であって、強力なプロモーター活性を持っている。本発明者らが、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ，  Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ，  Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ，  および  Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒを含む放線菌においてＬ１１遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析したところ、この領域の配列は極めて保存性が高いことが判明した（図１）。調べた放線菌４菌株で、−１０領域、転写開始点、およびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  （ＳＤ）  配列は１００％保存されており、それ以外の領域の保存性も極めて高かった。本発明においては、これらの放線菌のＬ１１蛋白質遺伝子のプロモーター配列を好適に用いることができる。例えば、本発明のベクターは、所望の放線菌のリボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の異種遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えＤＮＡが含まれる。
【００１６】
また、本発明のベクターは、Ｌ１１遺伝子上流領域を、翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列よりも広範囲にわたって有していてもよい。例えば、配列番号：１より長くＬ１１遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片である配列番号：２を好適に用いることができる。より具体的に例示すれば、本発明のベクターは、放線菌リボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流、約３塩基から約１９７塩基までの塩基配列、より好ましくは約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列を含み、その下流に機能的に結合された所望の遺伝子の塩基配列および転写終結配列を含む発現カセットを有する組み換えＤＮＡが含まれる。
【００１７】
また、本発明のベクターにおいては、放線菌Ｌ１１蛋白質遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を用いることもできる。このような塩基配列としては、図１に示した  Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ，  Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ，  および  Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来の配列（それぞれ配列番号：３６、３７、および３９）を含むＤＮＡが挙げられる。また、このような配列は人為的に変異させたものであってもよく、または天然に変異した配列であってもよい。例えば部位特異的変異導入による塩基置換、あるいは１または複数の塩基の欠失または挿入などにより塩基配列を改変し、プロモーター活性を上昇させたり、あるいはプロモーター活性に影響を与えない配列を除去することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ＮＹ）。このように改変した配列のプロモーター活性は、実施例に示したように発現ベクターを構築し、下流に連結した遺伝子の発現を調べることにより評価することができる。改変前の配列とプロモーター活性を比較し、プロモーター活性が維持された（またはより強い）配列を適宜選択することができる。
【００１８】
本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、具体的には、放線菌リボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）において、５０塩基以内、好ましくは４０塩基以内、より好ましくは３０塩基以内、さらに好ましくは２０塩基以内、最も好ましくは１０塩基以内（例えば５塩基以内）の塩基が置換、欠失、および／または付加した塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、野生型Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約６０塩基目から約８４塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より特定すれば、放線菌Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約５７塩基目から約８４塩基目までで保存された  ５’−ＡＴＡＣＣＣＧＴＴＡＴＣＧＴ［Ｇ／Ｔ］ＧＴＧＣＧＧＴＡＴＧＣＣＴ−３’  （配列番号：５）  を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。さらに好ましい態様では、野生型Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約１０１塩基目から約１１５塩基目までの配列が改変されずに保持されていることが好ましい。より具体的に記載すれば、Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約９８塩基目から約１１５塩基目までで保存された  ５’−ＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴ［Ｇ／Ｃ］ＧＧＴＴＴＴ−３’  （配列番号：６）  を含む（スラッシュはいずれかの塩基であることを示す）ことが好ましい。
【００１９】
また、本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列（例えば配列番号：１）、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）（ここでは、これらを基準配列と称す）と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば９５％以上）の同一性を有する塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、比較したい２つの配列を、塩基がなるべく一致するように適宜ギャップを挿入して整列させ、基準配列全長に対する一致する塩基の割合として算出することができる。塩基配列の整列（アライメント）は、所望のコンピュータプログラムを利用することができ、例えばＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０）、またはＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などを用いることができる。ギャップはミスマッチした塩基と同様に扱い、アライメントにおける基準配列全長の塩基数（ギャップを含む）のうち、両者の配列で一致した塩基数の割合として同一性が決定される。但し、両方の配列の同じ位置に共にギャップを入れた場合には、そのギャップは計算から除外する。後述するアミノ酸配列の同一性の算出も同様に行うことができる。
【００２０】
例えばＢＬＡＳＴにより塩基配列またはアミノ酸配列の同一性を決定する場合は、文献「Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０」に記載の方法に従って実施することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｎプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｐプログラムを用い、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブページにおいて”Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ”などのフィルターの設定は全てＯＦＦにして計算を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：２６６−２７２；  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６６：１３１−１４１；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  ＆  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．  （１９９７）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：６４９−６５６）。パラメータの設定は、例えばｏｐｅｎ  ｇａｐのコストはヌクレオチドは５で蛋白質は１１、ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐのコストはヌクレオチドは２で蛋白質は１、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈのペナルティーは−３、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈの報酬は１、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅは１０、ｗｏｒｄｓｉｚｅはヌクレオチドは１１で蛋白質は２、Ｄｒｏｐｏｆｆ  （Ｘ）  ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓはｂｌａｓｔｎでは２０で他のプログラムでは７、Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  （ｉｎ  ｂｉｔｓ）はｂｌａｓｔｎ以外では１５、ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  （ｉｎ  ｂｉｔｓ）はｂｌａｓｔｎでは５０で他のプログラムでは２５  にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２を用いることができる。２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。
【００２１】
また本発明のベクターに用いるために適した塩基配列としては、放線菌リボゾーム蛋白質Ｌ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約１７６塩基までの塩基配列（特に配列番号：１）またはその相補配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、より好ましくは翻訳開始コドンから上流約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列（例えば配列番号：２）またはその相補配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（ここではこれらを基準核酸と称す）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、互いにハイブリダイズさせる核酸のうち、一方の核酸をプローブとして、対象とする配列を持つ核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した２０塩基以上、好ましくは２５塩基以上、さらに好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、さらに好ましくは８０塩基以上、さらに好ましくは１００塩基以上を用いる。ハイブリダイズに用いる基準核酸にＬ１１遺伝子の翻訳開始コドンから上流約３塩基から約２７７塩基までの塩基配列またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ＮＹ）。
【００２２】
上記のストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば６×ＳＳＣ、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液中、４５℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらに好ましくは６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、４×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて  ４×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を２回、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて  ４×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を２回、続いて  １×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて  ２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回、続いて  １×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回、続いて  ０．５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて  ２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回、続いて  １×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回、続いて  ０．５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回、続いて  ０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、２０分を１回行う条件である。
【００２３】
なお、本発明のベクターは、Ｌ１１蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない。また好ましくは、本発明のベクターはＬ１１蛋白質遺伝子とゲノム上でオペロンを構成するＬ１蛋白質の蛋白質コード配列の全長を含まない（Ｋｕｂｅｒｓｋｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １１９  （１−２），  ３３−３９；  Ｋｕｓｔｅｒ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５７  （２），  ２１９−２２９；  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｘ７２７８７）。より好ましくは、本発明のベクターはＬ１０蛋白質のコード配列の全長を含まない。具体的には、本発明のベクターは、例えば配列番号：８（Ｌ１１蛋白質）のアミノ酸からなる蛋白質またはこの蛋白質のアミノ酸配列と１０アミノ酸以内、好ましくは２０、３０、４０、または５０アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：８のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは８０、７０、または６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：７（Ｌ１１蛋白質  ＣＤＳ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含まない。また好ましくは、本発明のベクターは、配列番号：１０（Ｌ１蛋白質）、および／または１２（Ｌ１０蛋白質）、あるいはこれらの蛋白質のアミノ酸配列と１０アミノ酸以内、好ましくは２０、３０、４０、または５０アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号：１０または１２のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは８０、７０、または６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡを含まないことが好ましい。アミノ酸配列の同一性は上記の通りに算出することができる。また、本発明のベクターには、配列番号：９（Ｌ１蛋白質  ＣＤＳ）または１１（Ｌ１０蛋白質  ＣＤＳ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含まないことが好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は上記の通りである。
【００２４】
本発明のベクターは、異種遺伝子の下流に転写終結配列（ターミネーター）を含む。転写終結配列は、その上流のプロモーターからの転写を終結させる能力を持つ所望の配列を用いることができ、例えば所望の放線菌遺伝子の転写終結配列を用いることができる。但し、本発明のベクターにおいては、Ｒｈｏ因子非依存的に転写を終結させることができる転写終結配列（すなわちｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を用いることでより優れた効果を発揮する。このような転写終結配列は、一般に  ７  ｂｐから２０  ｂｐまたはそれ以上のステムループ構造をつくるパリンドローム配列を有している。また一般にＧＣに富む。特に、ステムループを形成させたときの自由エネルギー低下（ΔＧ）が−５０  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−５５  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−６０  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−６５  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−７０Ｋｃａｌ以下となる配列が好ましい。ステムループのΔＧは、例えばＲＮＡ二次構造予測プログラムを用いて計算することができる。具体的には、ＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）を利用することができる。
【００２５】
ステム部分は全域にわたって塩基対を形成しなくてもよい。好ましくは、２０塩基以上の領域にわたって７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、３０塩基の領域にわたって７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。さらに好ましくは、３５塩基の領域にわたって７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の塩基が塩基対を形成するステムが好ましい。ループ部分の大きさは特に制限はないが、典型的には２〜１００塩基、例えば３〜５０塩基である。
【００２６】
より好ましい態様では、転写終結配列としては放線菌ｓｓｇＡ遺伝子の転写終結配列が用いられる。ｓｓｇＡの転写終結配列は２０塩基対以上のステムを形成しＲｈｏ非依存的に転写を終結させることができる。ｓｓｇＡの転写終結配列を用いることによって、より性能の高い発現ベクターを構築することが可能である。好適に用いられるｓｓｇＡのＲｈｏ非依存的転写終結配列を配列番号：３に例示した。この配列はＳ．  ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｓｇＡの転写終結配列に由来し、２０塩基以上のステムを形成する。本発明のベクターにおいては、ｓｓｇＡの翻訳停止コドンの次の塩基から２００、２５０、または３００塩基を含む領域を用いてよい。例えば、配列番号：４に示した塩基配列を含むＤＮＡを転写終結配列として好適に用いることができる。また本発明においては、放線菌  ｓｓｇＡの転写終結配列（例えば配列番号：３または４）の塩基配列、または該配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または付加した塩基配列を含みプロモーター活性を有する塩基配列を含み、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。
【００２７】
具体的に例示すれば、放線菌ｓｓｇＡ遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）において５０塩基以内、好ましくは４０塩基以内、より好ましくは３０塩基以内、さらに好ましくは２０塩基以内、最も好ましくは１０塩基以内（例えば５塩基以内）の塩基が置換、欠失、および／または付加した塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列である。置換、欠失、および付加は任意に組み合わせてよい。塩基の改変にあたっては、上記したように、ΔＧが−５０  Ｋｃａｌ以下、好ましくは−５５  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−６０  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−６５  Ｋｃａｌ以下、より好ましくは−７０  Ｋｃａｌ以下となるように調整する。また、ステムの長さおよび塩基対の割合も上記に従うことが好ましい。あるいは、本発明のベクターに用いる転写終結配列は、放線菌ｓｓｇＡ遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば９５％以上）の同一性を有する塩基配列、あるいは、放線菌ｓｓｇＡ遺伝子の転写終結配列（例えば配列番号：３、より好ましくは配列番号：４）またはその相補配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、転写を終結させる活性を有する塩基配列を好適に用いることができる。塩基配列の同一性の算出、およびハイブリダイゼーションの条件は、本明細書に記載した通りである。
【００２８】
また本発明は、（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列、あるいは該塩基配列において１または複数の塩基を置換、欠失、および／または付加した塩基配列を含みかつプロモーター活性を有する塩基配列を含み、（ｂ）その下流に所望の遺伝子を連結させるためのクローニング部位を含み、（ｃ）その下流に転写終結配列を含む組み換えＤＮＡであって、該クローニング部位に挿入した遺伝子を放線菌において検出可能に発現することができるＤＮＡベクターを提供する。このクローニング部位に所望の遺伝子を挿入することによって、増殖期の放線菌においてその遺伝子を高発現させることができる。このようなベクターは、例えば上記の異種遺伝子を有する本発明のＤＮＡベクターにおいて、異種遺伝子が除去され、その部分にクローニング部位が残されたようなベクターが挙げられる。
【００２９】
クローニング部位とは、発現させたい核酸をベクターに組み込むための配列を言う。クローニング部位は、典型的には制限酵素認識配列を含む。クローニング部位は、複数の制限酵素認識配列（すなわちマルチクローニングサイト）を含むことが好ましい。別の態様では、クローニング部位は、例えば３’にチミジンが一塩基突出したＤＮＡ末端とすることもできる。このような発現ベクターは、直鎖状の二本鎖ＤＮＡとして提供される。このベクターには、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を、Ｔ：Ａ塩基対を利用したライゲーションにより簡便に組み込むことができる。また、クローニング部位は、例えば相同組み換えを利用してベクターに核酸を組み込むための配列であってもよい。クローニング部位以外の配列の構成は、本明細書に記載した通りである。
【００３０】
本発明のベクターの１つの態様はプラスミドベクターである。プラスミドには、放線菌で増幅するための複製起点（ｏｒｉ）が含まれている。さらに大腸菌で増幅するための複製起点を有していてもよい。放線菌と大腸菌の両方で増幅可能なベクターは、大腸菌−放線菌シャトルベクターとして利用することができる。放線菌で増幅するための複製起点（ｏｒｉ）は、低コピー型であっても多コピー型であってもよい。低コピープラスミドとは、放線菌内で１から１０コピー程度のプラスミド増幅をもたらすプラスミドを言い、多コピープラスミドとはそれ以上、具体的には４０コピーから４００コピー程度またはそれ以上のコピー数をもたらすプラスミドを言う。低コピーのｏｒｉを例示すれば、例えば  ＳＣＰ２＊ ｏｒｉ（Ｌｙｄｉａｔｅ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ３５（３）：２２３−２３５）が挙げられる。高コピーのｏｒｉとしては、例えば  ｐＩＪ１０１  ｏｒｉ（Ｋａｔｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２９：２７０３−２７１４）が挙げられる。またプラスミドベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適当な薬剤耐性遺伝子または代謝酵素などのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は、例えばアンピシリン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびアプラマイシン耐性遺伝子などが含まれ、これらはいずれも当業者にはよく知られている。また、放線菌プラスミドの構築には、ｐＩＪ４８６  （Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０３，  ４６８−４７８，  １９８６）、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ  １０３，９７−９９  （１９９１）  ）、ｐＵＷＬ−ＫＳ  （Ｇｅｎｅ  １６５，１４９−１５０  （１９９５））、ｐＩＪ７０２（Ｋａｔｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２９：２７０３−２７１４）、ｐＩＪ８６００（Ｓｕｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：２２２１−２２２７）などの配列を利用することができる。
【００３１】
本発明のＤＮＡベクターは、好ましい態様において、異種遺伝子としてＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｄａｇＡ遺伝子を挿入した場合、ｐＩＪ１０１  ｏｒｉなどを含む多コピープラスミドの形態で放線菌Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５株  （ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：  ＢＡＡ−４７１）に形質転換したときに、適当な培地（例えばＹＥＭＥ培地）で３０℃での振盪培養条件において、培養上清中のアガラーゼ活性の最大値が、ｄａｇＡ遺伝子を持たない空ベクターを挿入した対照におけるアガラーゼ活性との差として、５０  Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは６０  Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは７０  Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは８０  Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは９０  Ｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１００  Ｕ／ｍｌ以上となる発現能力を持つ。
【００３２】
また本発明のベクターの他の１つの態様は、ゲノム組み込み型ベクターである。ゲノム組み込み型ベクターとは、放線菌に導入されたときに、放線菌ゲノムに組み込まれて、ゲノム上から組み込んだ遺伝子を発現できるベクターである。放線菌に導入する前では、このベクターは、プラスミドの形態で調製することもできる。ゲノム組み込み型ベクターの作成においては、放線菌ファージが持つ、宿主ゲノムへのファージＤＮＡの組み込みに必要な組み換え配列を利用することができる。具体的には、例えばφ３１ファージのｉｎｔ遺伝子とａｔｔＰをベクターに挿入すればよい（Ｂｉｅｒｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｇｅｎｅ  １１６：  ４３−４９）。プラスミドを菌体内で保持させ続けるには、通常プラスミドに組み込んだ薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤により選択し続ける必要があるが、ゲノム組み込み型の発現ベクターは安定であるため、一度組み換え菌を得た後では、薬剤選択の必要がない点で優れている。
【００３３】
本発明のベクターは蛋白質の製造に有用である。製造する蛋白質としては、例えばＬ１１蛋白質、Ｌ１０蛋白質、またはＬ１蛋白質以外の所望の蛋白質が挙げられる。また、蛋白質自体の製造ではなく、例えば抗生物質など、形質転換菌から生産される有用物質の生産量が、ある蛋白質を発現させることにより上昇する場合には、本発明のベクターを用いてこの蛋白質を発現させ、有用物質の生産を高めることができる。蛋白質の生産は、目的の蛋白質を発現する本発明のベクターで形質転換した放線菌を培養し、該蛋白質を含む培養物または培養上清を回収することにより得ることができる。得られる蛋白質溶液から、公知の方法により該蛋白質をさらに精製することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００３４】
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用する放線菌の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００３５】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、宿主として使用する放線菌が増殖し、目的の蛋白質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節する。温度は宿主とする放線菌の生育に適した温度を適宜選択する。培養時間は、十分量の蛋白質が宿主放線菌が得られれば特に制限はなく、通常は１日から１４日、このましくは１日から３日培養する。遺伝子発現に伴って生産蓄積された蛋白質は、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３６】
蛋白質が放線菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、放線菌をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチーム処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより放線菌を破砕し、発現させた蛋白質を抽出することができる。こうして得られた粗蛋白質は、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行う分離および等電点電気泳動、ｎａｔｉｖｅ−電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００３７】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８９年；  微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版）。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのＧｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （１９８５）に記載の方法に従って実施することができる。形質転換は、例えば文献（Ｈｏｐｗｏｏｄ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｍ．  Ｊ．  Ｂｉｂｂ，  Ｋ．  Ｆ．  Ｃｈａｔｅｒ，  Ｔ．  Ｋｉｅｓｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｂｒｕｔｏｎ，  Ｈ．  Ｍ．  Ｋｉｅｓｅｒ，  Ｄ．Ｊ．  Ｌｙｄｉａｔｅ，  Ｃ．  Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｗａｒｄ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈｒｅｍｐｆ．  １９８５．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）記載の方法に準じて実施することができる。
【００３８】
製造された蛋白質は、精製蛋白質および部分精製蛋白質として得ることもできる。また、蛋白質を公知の方法により不溶性の担体に固定化してもよい。本発明においては、このようにして製造された蛋白質も包含する。また、本発明においては、本発明のベクターで形質転換された放線菌にも関する。また本発明は、形質転換放線菌の処理物にも関する。処理物とは、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理処理、リゾチームなどの酵素処理のような生化学的処理、もしくは界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などの化学的処理等を行った産物を指す。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた放線菌、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００３９】
また本発明は、本発明のベクターを用いて、所望の遺伝子の機能を抑制する方法に関する。この方法は、該遺伝子またはその部分のアンチセンスをコードする核酸が組み込まれた本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む。アンチセンスとしては、標的遺伝子の転写領域全体のアンチセンスを用いることもできるし、あるいは該遺伝子の転写領域の連続した少なくとも１５塩基、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは８０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上（例えば１５０塩基以上）に対するアンチセンス配列を用いる。例えば、翻訳開始コドンを含む領域に対するアンチセンス配列は特に好ましい。
【００４０】
細菌でのｍＲＮＡの代謝回転は極めて速い。従ってアンチセンスＲＮＡを用いて遺伝子の発現を抑制するには、恒常的に高いレベルでアンチセンスＲＮＡを発現することが必要である。本発明の発現ベクターを用いれば、効果的に目的の遺伝子の発現をアンチセンス効果により抑制することができる。この系は、所望の遺伝子機能抑制への活用が期待される。特に二次代謝等の生育後期に開始される遺伝子の抑制（制御遺伝子のアンチセンスＲＮＡの発現による機能抑制）には、生育初期からアンチセンスＲＮＡの高発現が必要である。アンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制を利用した解析手法は、ポストゲノム解析の一手法として活用が期待される。従来の遺伝子破壊による解析では、その遺伝子の機能が失われるため、必須遺伝子の解析は不可能であった。一方アンチセンスＲＮＡ発現は、発現条件をコントロールすることにより必須遺伝子の解析も可能である。本発明のベクターからの発現は、増殖速度と比例すると考えられるため、培養条件を検討することにより、必須の未知機能遺伝子の解析も可能である。また本発明のベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。
【００４１】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来のＬ１１リボゾームタンパク遺伝子（ｒｐｌＫ）プロモーター領域を用いた発現カセットの構築
本発明者らは、Ｌ１１リボゾームタンパク遺伝子（ｒｐｌＫ）プロモーターとｓｓｇＡ遺伝子のターミネーター配列の特性を巧みに利用した新たな発現ベクターを開発するため、ｒｐｌＫ遺伝子プロモーター・マルチクローニング部位・ｓｓｇＡ遺伝子由来の強力な転写ターミネーターの配置を持つ発現カセットを構築した。
【００４２】
放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属において、ｒｐｌＫ遺伝子の推定プロモーター領域の塩基配列は極めて保存性が高いことを見出した（図１）。ＲＮＡポリメラーゼによる転写に必要な−３５と−１０認識配列および転写開始点を含む塩基配列領域の相同性は極めて高い。また翻訳に必要なリボゾーム結合ＳＤ配列を含む領域も１００％保存されている。ハウスキーピング遺伝子のＬ１１プロモーターを用いることにより、目的とする外来遺伝子の発現を生育期間中持続でき、しかも生育の栄養条件を変化させる事により、その発現量を調節可能にした。
また、本発明者らは、発現カセットの構築において、放線菌由来の転写終結因子非依存型のステム・ループ構造を持つターミネーターの中でも最強の一つと考えられる  Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓ由来ｓｓｇＡ遺伝子  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｅｎｓｉｇｎ．１９９５．  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ９：１３６−１５１．  Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｓ．，  Ｈ．Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ａ．Ｈｅｓｋｅｔｈ，  Ｊ．Ｃ．Ｅｎｓｉｇｎ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｏｃｈｉ．１９９７．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：１０７７−１０８６）  のターミネーター配列を組み合わせることにした  （図２）。すなわち強力なターミネーターの利用によりｍＲＮＡの安定化の向上を図った。
【００４３】
発現カッセトの構築に際しては、Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓのｒｐｌＫ遺伝子プロモーター領域（図１に示した配列に加えさらに上流域１２０ｂｐを含む計約２８０ｂｐ配列領域）  （配列番号：２）  を、組換えプラスミドｐＰ３４  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５５：５４９−５６０）  を鋳型としてＰＣＲ増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩを導入した。Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓのｓｓｇＡ遺伝子ターミネーター領域  （図２に示した配列に加えさらに下流域  ５０  ｂｐを含む計約  ３４０  ｂｐ配列領域）  （配列番号：４）  を組換えプラスミド  ｐＮＹ２２  （Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．  Ｅｎｓｉｇｎ，  １９９５，  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ９：１３６−１５１）を鋳型としてＰＣＲ増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを導入した。ベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）  （Ｐｒｏｍｅｇａ社）  をＥｃｏＲＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｎｚｙｍｅでｆｉｌｌ  ｉｎした後、セルフライゲーションして、クローニング部位のＥｃｏＲＩ認識配列を潰したプラスミドｐＧΔＥを文献（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓａｎｂｒｏｏｋ．  １９８２．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）記載の方法に準じて構築した。次に、プライマー  Ｌ１１ＰＢａｍＦ  （５’−ＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＧＣＣＧ−３’／配列番号：１３）  （下線部は制限酵素部位）  および  Ｌ１１ＰＥｃｏＲ  （５’−ＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＧＧＧ−３’／配列番号：１４）  を用いて、ｒｐｌＫプロモーター領域をＰＣＲにより増幅し、２８０ｂｐのＰＣＲ産物を得た後、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。また、プライマー  ＳｓｇＡＴｅｒＥＦ  （５’−ＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧ−３’／配列番号：１５）  および  ＳｓｇＡＴｅｒＢＲ  （５’−ＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３’／配列番号：１６）  を用いて、ｓｓｇＡターミネーター領域をＰＣＲにより増幅し、３５０  ｂｐ産物を得た後、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ｐＧΔＥをＢａｍＨＩ切断後、ＢＡＰ処理し、制限酵素処理したｒｐｌＫプロモーター領域とｓｓｇＡターミネーター領域のＰＣＲ産物をライゲーションし、組換えプラスミドｐＳＫ２００を作製した。５’末端をキナーゼでリン酸化したプライマー  ＰｌｉｎｋＦ  （５’−ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧ−３’／配列番号：１７）および  ＰｌｉｎｋＲ  （５’−ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’／配列番号：１８）  をアニーリングして、複数の制限酵素認識配列（高ＧＣ含量のＤＮＡを持つ放線菌では稀にしか存在しないＡＴリッチな制限酵素認識配列）を持つ合成ＤＮＡリンカーを作成し、これを制限酵素ＥｃｏＲＩ（ｒｐｌＫ遺伝子プロモーター領域とｓｓｇＡ遺伝子ターミネーター領域の接続部に唯一認識配列が存在）で切断したｐＳＫ２００に挿入して組換えプラスミドｐＳＫ２０１を作製した。このプラスミドには、制限酵素ＢａｍＨＩで切り出し可能なｒｐｌＫ遺伝子プロモーター  −  クローニング部位  −  ｓｓｇＡ遺伝子ターミネーターから構成される約７００ｂｐ発現ＤＮＡカセットが挿入されている。
【００４４】
［実施例２］  各種発現プラスミドの構築
１．発現ベクターｐＳＫ２１０
ｐＳＫ２０１を鋳型として、プライマー  Ｌ１１ＰＳＫ  （５’−ＧＴＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧ−３’／配列番号：１９）  および  ＳｓｇＡＴｅｒＢＲ  （５’−ＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３’／配列番号：１６）を用いて発現ＤＮＡカセットをＰＣＲ増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端  と３’末端に制限酵素認識配列ＢａｍＨＩを導入した。５’末端のＢａｍＨＩ認識配列は、ＤＮＡ発現カセットのｒｐｌＫ遺伝子プロモーター５’末端部に存在するＢｇｌＩＩ認識配列を除去するため導入した。ＢａｍＨＩで切断した６５０ｂｐ  ＰＣＲ産物を放線菌  −  大腸菌シャトルベクターｐＶ１（Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：１０７７−１０８６）のＢｇｌＩＩクローニングサイトに挿入し発現ベクターｐＳＫ２１０を作製した（図３）。
ｐＳＫ２１０は放線菌で低コピー型であり、選択マーカーはアンピシリン耐性（ａｍｐ；大腸菌）、チオストレプトン耐性（ｔｓｒ；  放線菌）およびハイグロマイシン耐性（ｈｙｇ；  放線菌）である。
【００４５】
２．発現ベクターｐＳＫ２２０
上記のＢａｍＨＩで切断した６５０ｂｐ  ＰＣＲ産物を放線菌多コピーベクターｐＩＪ７０２  （Ｋａｔｚ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １２９：  ２７０３−２７１４）のＢｇｌＩＩクローニングサイトに挿入し、多コピー型の発現ベクターｐＳＫ２２０を作製した（図４Ａ）。本プラスミドの選択マーカーはチオストレプトン耐性である。
【００４６】
３．放線菌  −  大腸菌シャトルベクターｐＳＫ１９５５
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）  を鋳型として、プライマー  ＰＢｌｕｅＴ７Ｃ  （５’−ＣＧＣＴＧＧＣＡＴＡＴＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧ−３’／配列番号：２０）  および  ＰＢｌｕｅＴ３Ｎ  （５’−ＧＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’／配列番号：２１）  を用いて、このプラスミドの約５８０ｂｐのマルチクローニング部位−ｌａｃＺ遺伝子領域をＰＣＲ増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＡａｔＩＩとＮｄｅＩを導入した。ＡａｔＩＩとＮｄｅＩ  で切断したＰＣＲ産物、放線菌多コピーベクターｐＩＪ７０２から調製した約２．９  ｋｂのＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片（放線菌での複製に必要なｒｅｐ遺伝子とｐＩＪ１０１  ｏｒｉを含む）および放線菌ゲノム組込型ベクターｐＩＪ８６００  （Ｓｕｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：  ２２２１−２２２７）  から調製した約２．４  ｋｂのＡａｔＩＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片（アプラマイシン耐性遺伝子であるａｃｃ（３）ＩＶとｐＵＣ１８  ｏｒｉを含む）を連結することにより、放線菌  −  大腸菌シャトルベクターｐＳＫ１９５５を作製した（図４Ｂ）。ｐＳＫ１９５５は放線菌で多コピー型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４７】
４．発現ベクターｐＳＫ１１２７
ｐＳＫ２２０を鋳型として、プライマー  Ｌ１１ＣｌａＦ  （５’−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣ−３’／配列番号：２２）  （ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅの除去のため）  およびＳｓｇＡＴｍＮｄｅ  （５’−ＣＴＧＧＣＡＴＡＴＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧ−３’／配列番号：２３）  を用いてＰＣＲにより６０５ｂｐ発現ＤＮＡカセットを増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端  と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＣｌａＩとＮｄｅＩを導入した。ＣｌａＩとＮｄｅＩ  で切断したＰＣＲ産物、およびベクターｐＳＫ１９５５から調製した約５．１  ｋｂのＣｌａＩ−ＮｄｅＩ  ＤＮＡ断片（ｒｅｐ遺伝子，  ｐＩＪ１０１  ｏｒｉ，  ａｃｃ（３）ＩＶ遺伝子とｐＵＣ１８  ｏｒｉを含む）を連結することにより発現ベクターｐＳＫ１１２７を作製した（図５Ａ）。放線菌  −  大腸菌シャトルベクターのｐＳＫ１１２７は放線菌で多コピー型のであり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４８】
５．発現ベクターｐＳＫ８１１
ｐＳＫ２２０を鋳型として、プライマー  Ｌ１１ＣｌａＦ  （５’−ＣＣＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣ−３’／配列番号：２２）  （ＢｇｌＩＩ  ｓｉｔｅの除去のため）  および  ＳｓｇＡＴｅｒＢＲ  （５’−ＧＴＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３’／配列番号：１６）を用いてＰＣＲにより６５５ｂｐ発現ＤＮＡカセットを増幅した。なおＰＣＲ産物の５’末端  と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＣｌａＩとＢａｍＨＩを導入した。ＣｌａＩとＢａｍＨＩ  で切断したＰＣＲ産物、およびゲノム組込型ベクターｐＩＪ８６００から調製した約６．３  ｋｂのＣｌａＩ−ＢｇｌＩＩ  ＤＮＡ断片（ゲノム組込に必要なφ３１ファージのｉｎｔ遺伝子とａｔｔＰ，  ＲＫ２  ｏｒｉＴ，  ａｃｃ（３）ＩＶ遺伝子およびｐＵＣ１８  ｏｒｉを含む）を連結することにより発現ベクターｐＳＫ８１１を作製した（図５Ｂ）。放線菌−大腸菌シャトルベクターのｐＳＫ８１１はゲノム組込型であり、選択マーカーはアプラマイシン耐性（大腸菌・放線菌）である。
【００４９】
［実施例３］  発現ベクターｐＳＫ２１０とｐＳＫ２２０による蛍光タンパク質の発現
クラゲ由来の改変緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの構造遺伝子をプラスミドｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型としてＰＣＲ増幅した。ベクター上の発現ＤＮＡカセットへの挿入のためＰＣＲ産物（約７７０ｂｐ）の５’末端  と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩを導入した。具体的には、ＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＥｃｏＲＩサイトの間にＲＢＳ  （Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ用）−ＥＧＦＰコード配列  （ベーリンガー  ｐＳＰＴ１９由来。ただし、開始コドンを含むＮｃｏＩサイトからＥｃｏＲＩサイトまでは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＥＧＦＰ由来。ＲＢＳは、合成ＤＮＡリンカーを作って挿入したものである）  を含む断片  （図６Ａ）  を含むプラスミド  （ｐＳＰＴ１９）  を鋳型に、プライマー  ＥＧＦＰ−Ｎ  （５’−ＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧ−３’／配列番号：２４）  （ＨｉｎｄＩＩＩサイトをＢｇｌＩＩサイトに変換するため）  およびＥＧＦＰ−Ｃ（５’−ＴＡＣＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’／配列番号：２５）  を用いてＲＢＳ−ＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲを行った。これをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記で構築した発現ベクターｐＳＫ２１０（低コピーベクター）とｐＳＫ２２０（多コピーベクター）に挿入してそれぞれ組換えプラスミドｐＬＥＧＦＰとｐＭＥＧＦＰを作製した。これらプラスミドおよび空ベクター  （対照）  を、Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５株  （ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：  ＢＡＡ−４７１，  Ｈｏｐｗｏｏｄ，  Ｄ．Ａ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：  ２１８３−２２０２，  １９９９；  Ｂｅｎｔｌｅｙ，  Ｓ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：  １４１−１４７，  ２００２；  Ｈｏｐｗｏｏｄ，  Ｄ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  Ｕ．Ｋ．）  に文献（Ｈｏｐｗｏｏｄ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｍ．  Ｊ．  Ｂｉｂｂ，  Ｋ．  Ｆ．  Ｃｈａｔｅｒ，  Ｔ．  Ｋｉｅｓｅｒ，  Ｃ．  Ｊ．  Ｂｒｕｔｏｎ，  Ｈ．  Ｍ．  Ｋｉｅｓｅｒ，  Ｄ．Ｊ．  Ｌｙｄｉａｔｅ，  Ｃ．  Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｗａｒｄ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓｃｈｒｅｍｐｆ．  １９８５．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）記載の方法に準じて形質転換した。得られた形質転換株をＹＥＭＥ培地（組成：マルトエキス  ０．３％，  Ｄｉｆｃｏ酵母エキス  ０．５％，  Ｄｉｆｃｏバクトペプトン  ０．３％，  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  グルコース  １％，  ショ糖  ３４％）を用いて３０℃で振盪培養し経時的に蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製：蛍光フィルターブロックＮ３；Ｓ（ＮＥＷ）励起光グリーンを使用）を用いて菌体を観察した。図６Ｂ〜Ｄは、各形質転換株の対数増殖中期の菌糸細胞の蛍光顕微鏡写真である。図６から明らかなようにｐＬＥＧＦＰとｐＭＥ���ＧＰ形質転換株では、蛍光タンパク質ＥＧＦＰの発現により菌糸全体に渡り緑色蛍光が観察された。一方、対照として用いたベクターｐＳＫ２２０形質転換株の菌糸細胞では蛍光は全く観察されなかった。多コピー型ベクター由来のｐＭＥＦＧＰ形質転換株の方が低コピー型ベクター由来のｐＬＥＧＦＰ形質転換株に比べ遺伝子増幅効果によりはるかに高い蛍光強度を示した。なお、発現ＤＮＡ  カッセトのｒｐｌＫプロモーター配列は、Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓ由来であるが図１に示した配列の高い相同性からも予想されたようにＳ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  においても機能することが明らかとなった。
【００５０】
［実施例４］  発現ベクターｐＳＫ２２０による放線菌寒天分解酵素アガラーゼの高発現
Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５株のＳＤ配列（リボゾーム結合配列）を含む寒天分解酵素アガラーゼ構造遺伝子（ｄａｇＡ遺伝子）を本菌株ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅した。ベクター上の発現ＤＮＡカセットへの挿入のためＰＣＲ産物（約９７０ｂｐ）の５’末端  と３’末端にそれぞれ制限酵素認識配列ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩを導入した。具体的には、Ｍ１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー  ｄａｇＡＳＤ  （５’−ＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＧＴＧ−３’／配列番号：２６）  および  ｄａｇＡＴｅｒ（５’−ＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＧＴＧＣＴＧ−３’／配列番号：２７）  を用いてｄａｇＡ遺伝子のＰＣＲを行った。得られた約９７０ｂｐのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記で構築したｐＳＫ２２０（多コピーベクター）に挿入して組換えプラスミドｐＭＤａｇＡを作製した。
【００５１】
ｄａｇＡ  遺伝子産物のアガラーゼは、細胞内で前駆体タンパク質（３０  ｋＤａ）として合成され細胞外に分泌される分泌酵素（２８  ｋＤａ）である  （Ｂｉｂｂ，  Ｍ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３３：２０８９−２０９６）。また本来のｄａｇＡ遺伝子の発現は、グルコースによる強力なカタボライト抑制や形態分化と連動した複雑な転写発現制御を受けることが知られている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｌ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０：２５５５−２５６５）。
【００５２】
Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５株のｐＭＤａｇＡ形質転換株をＹＥＭＥ培地（組成前述）を用いて対数増殖後期まで３０℃で振盪培養した。遠心分離により得た培養上清のアガラーゼ活性を文献  （Ｂｉｂｂ，  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  １９８７．  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３３：２０８９−２０９６）  記載の方法に準じて測定したところ、対照のｐＳＫ２２０形質転換株（２．５  Ｕ／ｍｌ）に比べてｐＭＤａｇＡ形質転換株は約６０倍高い  １４３  Ｕ／ｍｌ  の活性を示した。また２％寒天固形培地のウェルに培養上清を添加し３０℃一晩反応を行うことにより活性染色を行った（図７Ａ）。さらに培養上清中の分泌タンパク質を６０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより電気泳動分析を行った（図７Ｂ）。図７Ａから明らかなように上述のアガラーゼ活性測定結果と一致してｐＭＤａｇＡ形質転換株では中央部が陥没した大きな透明ハローを形成した。一方対照のｐＳＫ２２０形質転換株でのハロー形成は極めて小さかった。また図７Ｂから明らかなようにｐＭＤａｇＡ形質転換株では、アガラーゼ分子量から予想される位置に分泌タンパク質バンドが観察された。
【００５３】
以上結果から、ｐＭＤａｇＡ形質転換株では、対数増殖期からアガラーゼが高発現され培地中に大量に分泌されることが明らかとなった。対照のベクターｐＳＫ２２０形質転換株とｐＭＤａｇＡ形質転換株共にゲノム中には本来のｄａｇＡ  遺伝子が存在する。しかしながら用いた培地にはグルコースが炭素源として１％添加されているためカタボライト抑制によりゲノム上のｄａｇＡ遺伝子発現が強く抑制されることは、ベクターｐＳＫ２２０形質転換株の活性測定結果から明らかである。従ってｐＭＤａｇＡ形質転換株のアガラーゼ活性のほとんどはプラスミドｐＭＤａｇＡ中のｄａｇＡ遺伝子の発現によるものと考えられる。
放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のカタボライト抑制等の複雑な遺伝子発現制御を受ける有用分泌タンパクの大量発現には、本発明の発現ＤＮＡカセットを持つベクターの利用が極めて効果的であることは明らかである。
また、本来分泌されな蛋白質であっても、放線菌の分泌シグナル配列を挿入したベクターにこの蛋白質をコードする遺伝子を組み込めば、放線菌の分泌系を利用して細胞内酵素の大量生産も可能である。これにより、異種タンパク質の細胞内大量発現による生産菌への悪影響を回避することができる。
【００５４】
［実施例５］  ゲノム組み込み型ベクターｐＳＫ８１１を用いたアンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制
本発明の発現ＤＮＡカセットのマルチクローニング部位に目的の遺伝子を挿入することにより、放線菌で培養初期から恒常的に発現できることが前述のように明らかとなった。高等動植物では、アンチセンスＲＮＡ発現による特定遺伝子機能の抑制（遺伝子機能サイレンシング：遺伝子を破壊することなくアンチセンスＲＮＡの発現によりｍＲＮＡからのタンパク合成すなわち遺伝子産物生成を阻害することにより遺伝子機能を抑制する方法）が基礎・応用面で利用されている。しかしながらｍＲＮＡの代謝回転が極めて速い細菌でのアンチセンスＲＮＡ発現利用は困難であった。そこで発現ＤＮＡカセットを持つゲノム組込型ベクターｐＳＫ８１１を用いてアンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制効果の検証を行った。放線菌Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの二次代謝誘発制御に関与する既知遺伝子ｓｓｇＡ（Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３：１０７７−１０８６；  Ｗｅｚｅｌ，  Ｇ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８２：５６５３−５６６２）とｅｓｈＡ（Ｋａｗａｍｏｔｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８３：６００９−６０１６）遺伝子をモデルとして用いて実験を行った。
ｓｓｇＡとｅｓｈＡ遺伝子は必須遺伝子ではないが、いずれの遺伝子を破壊してもＳ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの青色抗生物質アクチノロージン生産が極端に低下する。一方、赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンの生産はほとんど影響を受けない。ＳｓｇＡ（１３５アミノ酸よりなる酸性タンパク質）とＥｓｈＡ（４７１  アミノ酸よりなるタンパク質）遺伝子産物共に二次代謝が開始される生育後期に出現し、その発現は転写レベルで時期特異的に制御されている。従って両遺伝子はＲＮＡの代謝回転が速い放線菌でアンチセンスＲＮＡ発現による機能抑制が特に困難と考えられる。
【００５５】
Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｍ１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｓｓｇＡ遺伝子（Ｎ−末端から約７５アミノ酸に相当する塩基配列領域：約２３５ｂｐ）とｅｓｈＡ遺伝子（Ｎ−末端から約８５アミノ酸に相当する塩基配列領域：約２８０ｂｐ）の一部をＰＣＲ増幅した。両ＰＣＲ産物の５’末端  と３’末端にはそれぞれ制限酵素認識配列ＢｇｌＩＩとＳｐｅＩを導入した。具体的には、Ｍ１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＳＣｐ５２−Ｂｇ  （５’−ＴＣＣＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’／配列番号：２８）  および  ＳＣｐ５２−Ｓｐｅ  （５’−ＣＴＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣ−３’／配列番号：２９）  を用いてｅｓｈＡ遺伝子  （アンチセンス発現方向へ挿入）のＰＣＲを行い、得られた２８０ｂｐ産物をＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩ  で切断した。この断片は、５’−上流領域約２０ｂｐとＥｓｈＡタンパク質（４７１アミノ酸）のＮ末端から約８５アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。また、Ｍ１４５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー  ＳＣｓｓｇＡ−Ｂｇ  （５’−ＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧ−３’／配列番号：３０）  および  ＳＣｓｓｇＡ−Ｓｐｅ  （５’−ＧＧＣＡＣＴＡＧＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＴＣ−３’／配列番号：３１）  を用いてｓｓｇＡ遺伝子（アンチセンス発現方向へ挿入）のＰＣＲを行い、得られた２３５ｂｐ産物をＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで切断した。この断片は、ＳｓｇＡタンパク質（１３５アミノ酸）のＮ末端から約７５アミノ酸配列に相当する塩基配列領域にあたる。これらをＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩ  処理したゲノム組込型ベクターｐＳＫ８１１にアンチセンスＲＮＡ発現方向に挿入して組換えプラスミドｐＥＬ７（ａｎｔｉ−ｅｓｈＡ  ＲＮＡ発現）とｐＳＥ１（ａｎｔｉ−ｓｓｇＡ  ＲＮＡ発現）を作製した。これらプラスミドをＳ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ｊ１０５１株  （Ｃｈａｔｅｒ，  Ｋ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｇｅｎｅ  １９，  ２１−３２；  Ｃｈａｔｅｒ，  Ｋ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８２）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９７，  ６９−９５；  Ｋｅｌｅｍｅｎ，  Ｇ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７，  ２２１−２３０）  に形質転換し、アプラマイシン耐性で組換えプラスミドがゲノムに挿入された形質転換株を選択した。得られた形質転換株を０．１％  Ｄｉｆｃｏカザミノ酸を添加したＲ５寒天培地（１リットル当たりの組成：Ｋ２ＳＯ４  ０．２５ｇ，  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０  １０．１２ｇ，  Ｄｉｆｃｏ酵母エキス  ５ｇ，  ＴＥＳ  ５．７３ｇ，  グルコース１０ｇ，  寒天２０ｇ，  微量元素溶液＊  ２ｍｌ）で３０℃、４日間培養して抗生物質生産性を調べた（図８）。＊微量元素溶液（１リットル当たりの組成）：ＺｎＣｌ２  １０ｍｇ，  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇ，  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ，  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ，  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ，  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ
【００５６】
図８から明らかなようにベクターｐＳＫ８１１形質転換株では赤色抗生物質ウンデシルプロディギオシンと青色抗生物質アクチノロージンが生産されるのに対して、ｐＥＬ７およびｐＳＥ１形質転換株共に予想されたように青色抗生物質アクチノロージンの生産が著しく抑制された。すなわちゲノムに挿入された組換えプラスミドからのアンチセンスＲＮＡ発現がｅｓｈＡおよびｓｓｇＡ遺伝子機能を抑制したことが強く示唆された。ｐＳＫ８１１はゲノム組込み型であり、培養する際に選択マーカーの抗生物質を添加しなくても安定に維持される利点がある。この様な条件でも遺伝子機能を充分抑制可能なアンチセンスＲＮＡ発現が行われることが証明された。
【００５７】
次に形質転換株のアンチセンスＲＮＡ発現に関するＲＴ（逆転写）−ＰＣＲ解析を行った（図９）。０．２％  カザミノ酸を添加したＲ５培地で各形質転換株を３０℃で振盪培養した。対数増殖の初期・中期・後期の培養菌糸から全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製した。さらにＲＮＡ試料中に微量存在するＤＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ社）により分解した。ＲＮＡ  濃度は、波長２６０ｎｍ  の吸光度測定により定量した。ＲＴ−ＰＣＲはＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、製造社のプロトコールに従い反応を行った。アンチセンスＲＮＡ検出のための特異的プライマーは図９Ａに示したものを用いた。具体的にはａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＲＮＡ検出用プライマー  （ｐＳＫ８１１，  ｐＥＬ７，  ｐＳＥ１）  としては、ＲＴ−Ｌ１１Ｆ  （５’−ＧＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣ−３’／配列番号：３２）  （予想されるｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物のサイズ：ｐＳＫ８１１，  １１４ｂｐ；  ｐＥＬ７，  ４００ｂｐ）、および  ＲＴ−ｓｓｇＡＲ  （５’−ＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧ−３’／配列番号：３３）  （予想されるｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物のサイズ：ｐＳＥ１，  ３５０ｂｐ）  を用いた。放線菌で生育期を通じて比較的高レベルで発現されており、転写解析に際して内部標準として用いられるｈｒｄＢ遺伝子に関するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ反応も同時に行った。使用したプライマーは、ＲＴ−ｈｒｄＢＦ  （５’−ＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＧＣＡＣＣＣＧＡＡＡＧＡＧ−３’／配列番号：３４）および  ＲＴ−ｈｒｄＢＲ  （５’−ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧＡＡＧ−３’／配列番号：３５）  である  （Ｋｅｌｅｍｅｎ，  Ｇ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｇｅｎｅ  ９８：５３−６０；  Ｋｅｌｅｍｅｎ，  Ｇ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２１：５９３−６０３）。ｈｒｄＢのＲＴ−ＰＣＲ反応に用いたプライマーで増幅される産物のサイズは３７０  ｂｐである。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲは５０μｌ反応容量で行い、反応に添加した全ＲＮＡ量は１０  ｐｇ或いは１００  ｐｇであった。Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲは、５０℃，  ３０ｍｉｎ（逆転写酵素反応）次いで９５℃  １５ｍｉｎ  （逆転写酵素の不活性化と耐熱性ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性化）、そして９５℃  ３０  ｓｅｃ，  ６４℃  ３０  ｓｅｃ，  ７２℃  １  ｍｉｎを５サイクルと９５℃  ３０ｓｅｃ，  ６２℃  ３０ｓｅｃ，  ７２℃  １ｍｉｎ  を３０サイクル、さらに７２℃  １０ｍｉｎの反応条件で行った。なおＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲにおいて最初の逆転写酵素反応を行わずに進めた場合には、増幅産物は全く得られないことから全ＲＮＡ試料へのＤＮＡの混入がないことを確認した。図９Ｂ  から明らかなようにｐＳＥ１とｐＥＬ７形質転換株においてそれぞれ予想されるサイズのａｎｔｉ−ｓｓｇＡとａｎｔｉ−ｅｓｈＡ  ｍＲＮＡが生育期を通じて内部標準として同時に測定したｈｒｄＢ遺伝子発現に匹敵するレベルで発現していた。以上の結果から、前述のｐＳＥ１とｐＥＬ７形質転換株の表現型は、アンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制効果に起因することが明らかとなった。
ｐＳＫ８１１ベクターはゲノム組込型であり形質転換株において発現ＤＮＡカセットは１コピーで存在する。前述の結果から１コピーで存在しても遺伝子機能を抑制するのに充分なアンチセンスＲＮＡ発現が可能であることを示している。
発現ＤＮＡカセットを持つ放線菌低コピーベクターｐＳＫ２１０や多コピーベクターｐＳＫ２２０とｐＳＫ１１２７  を活用することにより今回検証したｓｓｇＡやｅｓｈＡ遺伝子に比べさらに発現レベルの高い遺伝子の機能抑制を充分期待できる。
従って本発明の発現ＤＮＡカセットを持つベクターは目的遺伝子の放線菌における高発現に有効なばかりでなく今まで細菌で困難であったアンチセンスＲＮＡ発現による遺伝子機能抑制（遺伝子サイレンシング）をも可能にするものである。
これらベクターを用いた遺伝子サイレンシング手法は、放線菌における有用物質生産のためのメタボリックエンジニアリングにも応用可能である。また放線菌のポストゲノム解析の遺伝子機能解析の手法として利用できる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、放線菌で所望の遺伝子を高レベルで発現させることが可能な発現ベクターが提供された。このベクターは、プラスミドとして、あるいはゲノム組み込み型ベクターとして使用することができる。本発明のベクターを用いれば、放線菌を宿主として所望の蛋白質を生産させることが可能であるほか、アンチセンスＲＮＡやその他の所望の遺伝子を放線菌において高レベルで発現させることが可能である。
【００６０】
【配列表】
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【００６１】
【図面の簡単な説明】
【図１】放線菌株間のｒｐｌＫ（リボゾームタンパク質Ｌ１１遺伝子）プロモーター領域塩基配列の相同性を示す図である。Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ  （Ｓ．  ｌａｖ），  Ｓ．ｖｉｒｇｉｎｉａ  （Ｓ．  ｖｉｒ），  Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  （Ｓ．  ｇ），  Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  （Ｓ．  ｃ）  のｒｐｌＫプロモーターの塩基配列を示した（順に配列番号：３６〜３９）。４種で同一の塩基はアルタリスクで示した。−３５、−１０、およびＳＤ配列を囲みで示した。主要な転写開始点を太矢尻で、マイナーは転写開始点を小矢印で示した。
【図２】ベクターｐＳＫ８１１に挿入した、Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓのｓｓｇＡ遺伝子のターミネーター配列（配列番号：４０）を示す図である。ΔＧ＝−７１．７  ｋｃａｌのステムループを形成するパリンドローム配列を含む。塩基対を形成する塩基を囲みで示した。
【図３】ｐＳＫ２１０の構造を示す図である。
【図４】ｐＳＫ２２０（パネルＡ）およびｐＳＫ１９５５（パネルＢ）の構造を示す図である。
【図５】ｐＳＫ１１２７（パネルＡ）およびｐＳＫ８１１（パネルＢ）の構造を示す図である。
【図６】ｐＳＫ２２０とｐＳＫ２１０による蛍光タンパク質の  Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒでの高発現を示す図である。Ａは放線菌用ＥＧＦＰ発現カセットの構造、Ｂ〜Ｄは  Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＥＧＦＰの発現の蛍光顕微鏡観察を示す。Ａにおいて、ＥＧＦＰの５’側および３’側に示した配列を、それぞれ配列番号：４１および４２とした。
【図７】アガラーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換した放線菌からのアガラーゼの発現を示す図である。（Ａ）  形質転換株の培養上清のアガラーゼ活性を示す図である。培養上清１０μｌをＲ２ＹＥ寒天培地のウェルに添加し、３０℃で一晩インキュベートした。（Ｂ）  形質転換株の培養上清のＴｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。１，  分子量マーカー；  ２，  ｐＳＫ２２０形質転換株；  ３，  ｐＭＤａｇＡ形質転換株。矢印はアガラーゼタンパク質のバンドを示す。
【図８】アンチセンスＲＮＡ発現によるｅｓｈＡおよびｓｓｇＡ遺伝子機能の抑制を示す図である。空ベクター  （ｐＳＫ８１１）  形質転換株と比較すると、ｐＳＥ１形質転換株およびｐＥＬ７形質転換株共に、青色抗生物質アクチノロージンの生産が明らかに抑制された。
【図９】アンチセンスＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。ＡはＲＴ−ＰＣＲの増幅断片の位置を、ＢはＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＥＬ，  対数増殖初期；  ＭＬ，  対数増殖中期；  ＬＬ，  対数増殖後期。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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