(57)【要約】【課題】生体適合性を有しており、生体組織再構築を促進する生体組織代替材料、人工歯根、人工骨、抗血栓性材料、組織工学スキャフォールドとして利用し得る、生物学的活性化物質を担持したチタンまたはチタン合金の提供。【解決手段】リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの共沈を行ない、タンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金およびその製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの共沈を行ない、タンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金。
【請求項２】
自発核形成を生じる不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの制御された遅延共沈を行ない、タンパク質を表面に担持させた請求項１に記載のアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金。
【請求項３】
タンパク質がチタンまたはチタン合金表面１ｃｍ２当たり、０．５μｇ以上担持されている、請求項１または２記載のアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金。
【請求項４】
担持するタンパク質が成長因子、アルブミンまたは細胞接着因子のうちの少なくとも一種を含んでいる請求項１から３のいずれか１項に記載したアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金。
【請求項５】
タンパク質を含むリン酸カルシウム過飽和溶液中にアルカリ処理チタンまたはチタン合金を浸漬し、タンパク質とリン酸カルシウムとの共沈を行なうことを含むタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項６】
自発核形成を生じる不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの制御された遅延共沈を行なう、請求項５に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項７】
担持するタンパク質が成長因子、アルブミンまたは細胞接着因子のうちの少なくとも一種を含んでいる、請求項５または６に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項８】
Ｃａ成分０．１〜５．０ｍＭ、リン酸成分０．１〜２０ｍＭ、Ｋ成分０〜４０ｍＭ、Ｎａ成分０〜２００ｍＭ、Ｍｇ成分０〜３．０ｍＭ、Ｃｌ成分０〜３００ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜２０ｍＭ、ＳＯ４成分０〜２ｍＭを含みｐＨが５．０〜９．０の水溶液を用いてタンパク質を担持する、請求項５から７のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項９】
Ｃａ成分１．２〜２．７５ｍＭ、リン酸成分０．６〜１５ｍＭ、Ｋ成分０〜３０ｍＭ、Ｎａ成分３０〜１５０ｍＭ、Ｍｇ成分０．１〜３．０ｍＭ、Ｃｌ成分３０〜１５０ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜６０ｍＭを含み、ｐＨ５．０〜９．０の水溶液を用いてタンパク担持する、請求項５から７のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項１０】
タンパク質を共沈させる水溶液がカルシウム不含有リン酸塩含有医療用電解質輸液、カルシウム含有リン酸塩不含有医療用電解質輸液、透析ろ過型人工腎臓用透析液、補正用電解質輸液、注射用炭酸水素ナトリウム液、透析ろ過型人工腎臓用透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液の中から選ばれた１種または２種以上の溶液を含んだ組成物である請求項５から９のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアリカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項１１】
カルシウム成分を含む溶液とリン酸成分を含む溶液をあらかじめ別々に作製しておき、両者を混合することでタンパク質の共沈を開始させる、請求項５から１０のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク担持アルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた生体材料。
【請求項１３】
請求項５から１１のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた生体材料の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工歯根。
【請求項１５】
請求項５から１１のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工歯根の製造方法。
【請求項１６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工骨。
【請求項１７】
請求項５から１１のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工骨の製造方法。
【請求項１８】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた組織工学スキャフォールド。
【請求項１９】
請求項５から１１のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた組織工学スキャフォールドの製造方法。
【請求項２０】
請求項１から４のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた抗血栓性材料。
【請求項２１】
請求項５から１１のいずれか１項に記載のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた抗血栓性材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、タンパク質、特に成長因子や細胞接着因子のような、タンパク質を担持したチタンまたはチタン合金に関するものである。本発明によって得られるタンパク質担持チタンまたはチタン合金は、生体適合性が要求され、生体組織再構築を促進する生体組織代替材料、人工骨、人工歯根、抗血栓材料、組織工学スキャホールドとして利用される。
【０００２】
【従来の技術】
生体組織の再構築、組織誘導、細胞分化を図るために成長因子、細胞接着因子その他のタンパク、リン脂質、多糖類、ホルモン等の生物学的活性化物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）が使用される。これらの活性化物質はそのまま生体投与されるほか、何らかの生体材料等に担持させて、使用される。
薬剤や生物学的活性化物質を生体材料に担持する方法としては、例えば、有機高分子製またはセラミック製の生体材料に担持する方法がある。
【０００３】
しかし機械的強度が求められるためにチタンやチタン合金が使用されることの多い、荷重部骨組織、人工心臓、人工歯根では、チタンやチタン合金に生物学的活性化物質を担持して細胞を活性化させたり、組織再構築をはかるのが効率的である。
【０００４】
水溶液からリン酸カルシウムとタンパクを共沈させる方法は、有力な担持法であり、ポリマー又はチタン金属表面に析出させる方法（ＵＳ  ６，１３６，３６９、ＵＳ  ６，１４３，９４８、ＵＳ  ６，３４４，０６１、ＥＰ９６２０１２９３）が開示されている。一方、チタンまたはチタン合金表面にアルカリ処理を施すことで、安定リン酸カルシウム過飽和溶液や体液中で表面にリン酸カルシウムの一種であるアパタイトを形成しやすくさせ、その結果として、骨組織と直接結合させる技術が知られている（特開平７−５１１６１０）。しかし、アルカリ処理はもっぱらチタンやチタン合金表面にリン酸カルシウムのみを形成させる技術として使用されており、これを、タンパク担持のために使用することは知られていなかった。
【０００５】
単純なチタン金属表面にリン酸カルシウムとタンパクを共沈させる方法では、タンパクの担持量が少ない結果となる。本発明の発明者らは、チタン上へのタンパク担持量を増加させる研究を鋭意行った結果、チタン表面にアルカリ処理を施すことによって、タンパク担持量を飛躍的に増大させることをつきとめ、本発明を完成させた。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第６１３６３６９号明細書
【特許文献２】
米国特許第６１４３９４８号明細書
【特許文献３】
米国特許第６３４４０６１号明細書
【特許文献４】
欧州特許出願公開第９６２０１２９３号明細書
【特許文献５】
特開平７−５１１６１０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は生体適合性を有しており、生体組織再構築を促進する生体組織代替材料、人工歯根、人工骨、抗血栓性材料、組織工学スキャフォールドとして利用し得る、生物学的活性化物質を担持したチタンまたはチタン合金の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
水溶液を用いてチタンまたはチタン合金上にリン酸カルシウムとタンパクを共沈させる方法は、リン酸カルシウムに過飽和であるものの、自発核形成は生じないハンクス液などの安定過飽和溶液を使用し、不均一核形成を利用して基板上にリン酸カルシウムとタンパクを共沈させる。しかしこの方法ではリン酸カルシウムの析出量が少なく、担持できるタンパクの量も少ない結果となる。一方、チタンまたはチタン合金にアルカリ処理を施すことで、リン酸カルシウム過飽和溶液や体液中で表面にリン酸カルシウムの一種であるアパタイトを形成しやすくさせ、その結果として、チタンを骨組織と結合できるようにする技術が知られている。したがって、チタンまたはチタン合金にアルカリ処理を施すことで、リン酸カルシウムの析出量を増やし、その結果タンパク担持量を増やすことが期待できる。
【０００９】
本発明では、チタンまたはチタン合金にアルカリ処理を施すことで過飽和溶液からのリン酸カルシウムの析出量を増し、タンパク担持量を増加させたチタンまたはチタン合金を提供する。その際、過飽和溶液が自発核形成を生じる程過飽和な、不安定リンカルシウム過飽和溶液を使用する場合は、自発核形成までの時間を人為的に制御し、溶液全体で自発核形成する以前に、チタンまたはチタン合金基板上への共沈析出を終了させるか、あるいは、基板のごく近傍でのみ自発核形成させることで、リン酸カルシウムの析出量を増し、タンパク担持量を増加させたチタンまたはチタン合金を提供する。さらに、本発明では担持に使用する薬品の生体適合性が高く、なおかつ担持操作が単純な、生物学的活性化物質担持チタンまたはチタン合金が提供される。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］    リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの共沈を行ない、タンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金、
［２］    自発核形成を生じる不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの制御された遅延共沈を行ない、タンパク質を表面に担持させた［１］のアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金、
［３］    タンパク質がチタンまたはチタン合金表面１ｃｍ２当たり、０．５μｇ以上担持されている、［１］または［２］のアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金、
［４］    担持するタンパク質が成長因子、アルブミンまたは細胞接着因子のうちの少なくとも一種を含んでいる［１］から［３］のいずれかのアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金、
［５］    タンパク質を含むリン酸カルシウム過飽和溶液中にアルカリ処理チタンまたはチタン合金を浸漬し、タンパク質とリン酸カルシウムとの共沈を行なうことを含むタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［６］    自発核形成を生じる不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中で、タンパク質とリン酸カルシウムとの制御された遅延共沈を行なう、［５］のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［７］    担持するタンパク質が成長因子、アルブミンまたは細胞接着因子のうちの少なくとも一種を含んでいる、［５］または［６］のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［８］    Ｃａ成分０．１〜５．０ｍＭ、リン酸成分０．１〜２０ｍＭ、Ｋ成分０〜４０ｍＭ、Ｎａ成分０〜２００ｍＭ、Ｍｇ成分０〜３．０ｍＭ、Ｃｌ成分０〜３００ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜２０ｍＭ、ＳＯ４成分０〜２ｍＭを含みｐＨが５．０〜９．０の水溶液を用いてタンパク質を担持する、［５］から［７］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［９］    Ｃａ成分１．２〜２．７５ｍＭ、リン酸成分０．６〜１５ｍＭ、Ｋ成分０〜３０ｍＭ、Ｎａ成分３０〜１５０ｍＭ、Ｍｇ成分０．１〜３．０ｍＭ、Ｃｌ成分３０〜１５０ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜６０ｍＭを含み、ｐＨ５．０〜９．０の水溶液を用いてタンパク担持する、［５］から［７］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［１０］    タンパク質を共沈させる水溶液がカルシウム不含有リン酸塩含有医療用電解質輸液、カルシウム含有リン酸塩不含有医療用電解質輸液、透析ろ過型人工腎臓用透析液、補正用電解質輸液、注射用炭酸水素ナトリウム液、透析ろ過型人工腎臓用透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液の中から選ばれた１種または２種以上の溶液を含んだ組成物である［５］から［９］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアリカリ処理チタン合金の製造方法、
［１１］    カルシウム成分を含む溶液とリン酸成分を含む溶液をあらかじめ別々に作製しておき、両者を混合することでタンパク質の共沈を開始させる、［５］から［１０］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法、
［１２］    ［１］から［４］のいずれかのタンパク担持アルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた生体材料、
［１３］    ［５］から［１１］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた生体材料の製造方法、
［１４］    ［１］から［４］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工歯根、
［１５］    ［５］から［１１］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工歯根の製造方法、
［１６］    ［１］から［４］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工骨、
［１７］    ［５］から［１１］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた人工骨の製造方法、
［１８］    ［１］から［４］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた組織工学スキャフォールド、
［１９］    ［５］から［１１］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた組織工学スキャフォールドの製造方法、
［２０］    ［１］から［４］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金を用いた抗血栓性材料、ならびに
［２１］    ［５］から［１１］のいずれかのタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金の製造方法を用いた抗血栓性材料の製造方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、リン酸カルシウム過飽和溶液とは、リン酸カルシウムの溶解度以上にカルシウムとリンが溶けている溶液のことである。さらに本発明では、リン酸カルシウム過飽和溶液を安定リン酸カルシウム過飽和溶液と、不安定リン酸カルシウム過飽和溶液の２つに分ける。安定リン酸カルシウム過飽和溶液とは、リン酸カルシウムに過飽和であるものの、溶液調製後７日間はリン酸カルシウムの自発核形成を生じない液のことである。このような安定リン酸カルシウム過飽和溶液には、ハンクス溶液や１倍濃度擬似体液などがある。
【００１２】
本発明において、不安定リン酸カルシウム過飽和溶液とは、溶液調整後７日以内に、リン酸カルシウム沈殿が自発核形成で自然に生じてしまう溶液のことである。
【００１３】
本発明では、自発核形成とは、溶液の成分が基板や異物質や容器の壁の助けを借りずに、自然発生的に集合して溶液が目視で白濁すること又はこのようにして溶液中で粒径１μｍ以上の粒子に成長することである。溶液中の粒子の粒径は光散乱法で測定することができる。共沈とは、単独では析出または沈殿しないはずの目的物質が主沈殿または主析出物とともに沈殿または析出することであり、安定リン酸カルシウム過飽和溶液中での沈殿か不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中での沈殿かは問わない。また、安定リン酸カルシウム過飽和溶液中での析出か不安定リン酸カルシウム過飽和溶液中での析出かも問わない。リン酸カルシウムの析出とは、自発核形成によるリン酸カルシウムの粒子の発生だけではなく、基板や異物質や容器の壁の助けを借りて、これらの表面上にリン酸カルシウムが集合する不均一核形成によるリン酸カルシウム形成も含む。
【００１４】
リン酸カルシウムとの制御された遅延共沈とは、溶液組成と温度の選択によって、リン酸カルシウムの析出に至るまでの時間を人工的に制御遅延させ、リン酸カルシウム析出のほとんど又は全てが基板上だけに生ずるようにし、核発生直後の高活性リン酸カルシウムナノ粒子が周囲のタンパク質を吸着又は化学結合でとり込んで共沈するようにした沈殿または析出である。具体的には、２種類以上の水溶液を順番に混合して不安定な過飽和リン酸カルシウム溶液を作製し、自発核形成によるリン酸カルシウム析出までの時間が最後の溶液混合から１０秒以上７日以下、好ましくは２分以上２日以下となる共沈を生じせしめる。自発核形成までの誘導時間は水溶液の化学組成、温度およびｐＨを至適値に選択することで制御する。共沈に至る待ち時間は、基板がない状態で過飽和リン酸カルシウム溶液を作製し、目視で溶液が白濁又は粒径１μｍ以上の沈殿粒子が光散乱法で検出されるまでの時間である。
【００１５】
析出に至る待ち時間が短い通常の沈殿形成の場合は、最後に添加した溶液液滴と周囲の溶液の界面での沈殿形成が卓越し、基板上へ沈殿を析出することは出来ない。しかし、自発核形成までの誘導時間を遅延させたり、又は界面自由エネルギーの低い基板を共存させる場合は、リン酸カルシウムの生成は界面自由エネルギーの低い基板上での析出が卓越し、リン酸カルシウムと共存タンパク質を基板上に固定することが可能となる。
【００１６】
本発明のリン酸カルシウム過飽和溶液は、カルシウムを含む試薬粉末、リンを含む試薬粉末、さらに必要であればｐＨ緩衝剤を順次水に溶解してゆくことで作製することができる。あるいは、少なくともカルシウム成分を含む溶液、少なくともリン酸成分を含む溶液、またはカルシウム成分とリン酸成分の両者を含む溶液、必要であればｐＨ緩衝剤を含む溶液を順次混合して作製することもできる。
【００１７】
不安定過飽和溶液の場合は、少なくともカルシウム成分を含む溶液、少なくともリン酸成分を含む溶液、またはカルシウム成分とリン酸成分の両者を含む溶液が自発核形成誘導時間の遅延成分を含んでいても良いし、自発核形成までの誘導時間を制御遅延する１種または２種以上の溶液をさらに混合してもよい。
【００１８】
カルシウム成分とリン酸成分は、混合前は異なる容器に別々に溶解させておくことが好ましい。
少なくともカルシウム成分を含む粉末及び溶液、少なくともリン酸成分を含む粉末及び溶液、またはカルシウム成分とリン酸成分の両者を含む溶液は限定されない。リン酸成分を含む粉末及び溶液の例としては、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸溶液、リン酸水素二カリウム粉末または溶液、リン酸二水素カリウム粉末または溶液、リン酸水素二ナトリウム粉末または溶液、リン酸二水素ナトリウム粉末または溶液などが挙げられる。カルシウム成分を含む粉末または溶液の例としては、塩化カルシウム粉末または溶液、乳酸カルシウム粉末または溶液、酢酸カルシウム粉末または溶液、グルコン酸カルシウム粉末または溶液、クエン酸カルシウム粉末または溶液などが挙げられる。カルシウム成分とリン酸成分の両者を含む溶液としては、ハンクス液や１倍擬似体液のような安定過飽和溶液や、リン酸カルシウム不飽和溶液を挙げることもできる。このようなリン酸カルシウム不飽和溶液の例としては、例えば、塩化カルシウム濃度２．５ｍＭ、リン酸水素カリウム濃度１．０ｍＭで、ｐＨ５未満の溶液を挙げることができる。
【００１９】
自発核形成の誘導時間を制御する溶液としては例えば、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの適当なアルカリ性物質、塩化カリウム、塩化ナトリウムなどを使用する。
【００２０】
カルシウム成分を含む溶液、リン酸成分を含む溶液、カルシウム成分とリン酸成分を含む溶液の各成分溶液と自発核形成誘導時間制御溶液は各々１種類の溶液でも良いし、組成の異なる複数種の溶液から成っていても良い。
【００２１】
ｐＨ緩衝剤としては、ｐＨ５〜９の間でｐＨを緩衝するものであれば、限定されない。そのようなｐＨ緩衝剤としては具体的には、トリスヒドロキシルアミノメタン、ＨＥＰＥＳ［２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ］、中性リン酸カリウム緩衝液などを挙げることができる。
これらの試薬または溶液の添加順序は、該過飽和溶液調整中または調整後１０秒未満で自発核形成しない限り、特に制限はない。
【００２２】
不安定リン酸カルシウム過飽和溶液の場合で具体的に言えば、１種類目の自発核形成誘導時間制御溶液に１種類目のリン酸成分溶液を混合し、次にカルシウム成分溶液を混合し、次に２種類目の自発核形成誘導時間制御溶液を混合し、最後に２種類目のリン酸成分溶液を混合することもできるし、例えば、リン酸成分溶液にカルシウム成分溶液を混合し、次に１種類目の自発核形成誘導時間制御溶液を混合し、最後に２種類目の自発核形成誘導時間制御溶液を混合することもできる。
【００２３】
タンパク質の変成や失活が生じなければ、調整前の水、または上述のどの溶液にタンパク質を添加溶解しても良いし、複数の溶液にタンパク質を添加溶解しても良いし、全ての試薬又は溶液が混合された後にタンパク質を添加溶解しても良い。すなわち、（１）カルシウム成分とリン酸成分の両方を含む溶液にタンパク質を添加しても良いし、（２）カルシウム成分を含む溶液、リン酸成分を含む溶液の一方または両方にタンパク質を添加溶解しても良いし、（３）自発核形成の誘導時間を制御する溶液に添加溶解しても良いし、（４）全ての試薬添加後のリン酸カルシウム過飽和溶液に添加溶解しても良い。添加溶解するタンパク質は、固体状のタンパク質でも良いし、すでに溶液に溶解しているものでも構わない。
【００２４】
以上の操作によりチタンまたはチタン合金上にリン酸カルシウムとタンパク質が共沈析出し、タンパク質を担持したアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金が得られる。
【００２５】
カルシウム成分とリン酸成分が同時に含まれている溶液が、リン酸カルシウムに対して過飽和になるｐＨは、カルシウムイオン濃度とリン酸イオン濃度に依存するが、例を挙げれば塩化カルシウム濃度２．５ｍＭ、リン酸水素カリウム濃度１．０ｍＭの場合はｐＨ５以上である。過飽和溶液が、安定な過飽和状態か、不安定な過飽和状態かは、共存イオンとイオン強度によって影響される。
【００２６】
自発核形成の誘導時間を遅延させる成分は、自発核形成までの誘導時間を１０秒以上遅延させるものであれば特に制限はないが、担持溶液の生体適合性の上から、ナトリウム成分かカリウム成分を主成分とする溶液が好ましい。このような溶液は具体的には５０〜２００ｍＭ、好ましくは１００〜１８０ｍＭ、さらに好ましくは１６６ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液、５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭ水酸化カリウム溶液、０〜４０ｍＭ、好ましくは０〜２０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭ塩化カリウム溶液を挙げることができ、例えば、塩化カルシウム濃度４２．９ｍＭ、リン酸濃度２８．６ｍＭの溶液４．９ｍＬに対しては、１２．５ｍＭのＫＣｌ溶液８０ｍＬと先に述べた溶液８８ｍＬに対しては、２０ｍＭ水酸化カリウム溶液１２ｍＬを添加すれば、最終ｐＨが７．４になり生体適合性が高く、析出に至る待ち時間が１０分に遅延されたリン酸カルシウム過飽和溶液となる。
【００２７】
リン酸カルシウム過飽和溶液とは具体的には、Ｃａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｍｇ−Ｃｌ−ＣＯ３−ＳＯ４系及び、Ｃａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｍｇ−Ｃｌ−ＣＯ３系のある特定組成範囲の水溶液である。安定リン酸カルシウム過飽和溶液になるか不安定リン酸カルシウム過飽和溶液になるかは、各成分濃度、ｐＨによってきまる。
【００２８】
Ｃａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｍｇ−Ｃｌ−ＣＯ３−ＳＯ４系の水溶液としては、Ｃａ成分０．１〜５．０ｍＭ好ましくは０．８〜４．０ｍＭ、リン酸成分０．１〜２０ｍＭ好ましくは０．５〜１０ｍＭ、Ｎａ成分０〜２００ｍＭ好ましくは０〜１５０ｍＭ、Ｋ成分０〜４０ｍＭ好ましくは０〜２０ｍＭ、Ｍｇ成分０〜３．０ｍＭ好ましくは０〜２．５ｍＭ、Ｃｌ成分０〜３００ｍＭ好ましくは０〜２００ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜２０ｍＭ好ましくは０〜１０ｍＭ、ＳＯ４成分０〜２ｍＭ好ましくは０〜１ｍＭを含み、ｐＨが５．０〜９．０好ましくは５．８〜８．５の溶液である。溶液のＣａ／Ｐモル比は特に規定しないが、好ましくは０．１〜３．０の範囲である。
【００２９】
Ｃａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｍｇ−Ｃｌ−ＣＯ３系の溶液としては、Ｃａ成分１．２〜２．７５ｍＭ好ましくは１．３９〜２．３３ｍＭ、リン酸成分０．６〜１５ｍＭ好ましくは１．１７〜１０ｍＭ、Ｋ成分０〜３０ｍＭ好ましくは４〜２０ｍＭ、Ｎａ成分３０〜１５０ｍＭ好ましくは４０〜１４５ｍＭ、Ｍｇ成分０．１〜３．０ｍＭ好ましくは０．２〜２．０ｍＭ、Ｃｌ成分３０〜１５０ｍＭ好ましくは４０〜１４５ｍＭ、ＨＣＯ３成分０〜６０ｍＭ好ましくは０〜４５ｍＭ含み、ｐＨ５．０〜９．０好ましくは５．８〜８．５の溶液である。溶液のＣａ／Ｐモル比は特に規定しないが、好ましくは２．５以下の範囲である。
【００３０】
さらに、析出に至る待ち時間が遅延されたＣａ−Ｐ−Ｎａ−Ｋ−Ｍｇ−Ｃｌ−ＣＯ３系のリン酸カルシウム不安定過飽和溶液は、医療用輸液剤、透析・腹膜灌流液、輸液の補正用製剤、カルシウム製剤、透析・腹膜灌流液の補充液、注射用液の中から選ばれた１種又は２種以上を混合することで作製することもできる。これらの溶液または薬剤は、Ｃａ、Ｐ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃｌ、ＣＯ３の供給源として使用でき、Ｃａ成分を含みＰ成分を含まない医療用電解質輸液、Ｐ成分を含みＣａ成分を含まない医療用電解質輸液、透析ろ過型人工腎臓用透析液、透析ろ過型人工腎臓用透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液、注射用液の中から選ばれた１種または２種を混合することで作製することもできる。この場合は、全ての溶液が既に医療用に認可されており、しかも滅菌済みであるため、手術室等で使用するのに好都合である。医療用輸液の、Ｃａ成分を含みＰ成分を含まない電解質輸液、Ｐ成分を含みＣａ成分を含まない電解質輸液、塩化ナトリウム輸液、透析・腹膜灌流液の補充液の透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液、注射用炭酸水素ナトリウム溶液は特に好適に使用されるが、これらに限定するものではない。Ｃａ成分を含みＰ成分を含まない電解質輸液、Ｐ成分を含みＣａ成分を含まない電解質輸液、透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液としては、例えばそれぞれ市販のリンゲル液（大塚製薬）、クリニザルツＢ（小林薬工）、生理食塩液（大塚製薬）、バイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液（武田薬品）を用いれば良い。
【００３１】
タンパク質を添加しておく溶液は、特に限定されない。具体的には、例えば、全部の試薬又は溶液を混合した後にタンパク質を添加してもよい。あるいは、混合前の溶液に添加してもよい。混合前の溶液とは例えば、上述の少なくともカルシウム成分を含む溶液、少なくともリン酸成分を含む溶液、カルシウム成分とリン酸成分の両方を含む溶液、自発核形成までの誘導時間を制御する溶液を含む。ただし、タンパク質の変性を防止する観点からｐＨ５以上８以下の溶液に添加しておくことが望ましい。この際のタンパク質の添加量は、タンパク質の種類やタンパク質を担持するチタン又はチタン合金の用途により異なるが、０．１μｇ／ｍＬ〜数ｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬである。本発明のアルカリ処理チタンまたはアルカリ処理チタン合金が担持しているタンパク質は、タンパク質の種類および担持チタンまたは担持チタン合金の用途にもよるがタンパク質の質量／チタンまたはチタン合金面積で０．５μｇ／ｃｍ２以上、好ましくは１μｇ／ｃｍ２以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｃｍ２以上である。
【００３２】
各成分溶液の温度とｐＨは、タンパク質の変性を防止できる温度とｐＨであれば特に制限はない。一般的には、多くのタンパク質は体温以上では変成することが多いので、各成分溶液と混合後の溶液の温度は３７℃以下であることが望ましい。しかし、タンパク質の変性温度は、タンパク質の種類によって異なるので、使用するタンパク質によっては３７℃以下に限るものではない。
【００３３】
本発明で、チタン又はチタン合金のアルカリ処理とは、チタン又はチタン合金をアルカリ性水液中に浸漬した後に転移温度以下の温度に加熱し、厚さ０．１〜１０μｍで酸化チタン相及びアルカリチタン酸塩相を含む被膜を形成させる公知の処理、またはチタンまたはチタン合金をアルカリ性水溶液に浸漬した後、水又は温水に浸漬し、さらに加熱することにより厚さ０．１〜１０μｍで酸化チタン相を含む被膜を形成させる公知の処理のことである。具体的には、例えば、まず第一段階として、ナトリウムＮａ＋イオン、カリウムＫ＋イオン及びカルシウムＣａ２＋イオンのうち１種以上を含み、アルカリイオン濃度０．０１〜１５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／Ｌのアルカリ性水溶液中で、チタン又はチタン合金を２０〜９５℃、好ましくは４０〜８０℃で、１時間以上、好ましくは１〜４８時間浸漬する。アルカリイオン濃度０．０１ｍｏｌ／Ｌ未満ではチタンとアルカリ溶液の反応が進まず、１５ｍｏｌ／Ｌより高いとアルカリイオンが飽和して溶解しない、また容器の腐食が生じる。加熱温度２０℃未満ではやはりチタンとアルカリ溶液の反応が進まず、９５℃より高温では事実上沸騰状態であり水分の蒸発が早すぎる。反応時間１時間未満ではチタンとアルカリ溶液の反応が進まない。浸漬時間の上限は特にない。第２段階として、このように浸漬したチタン又はチタン合金を３００〜８００℃、好ましくは５５０〜６５０℃の温度で、空気中、０．２〜２４時間、好ましくは０．５〜３時間加熱する。加熱処理温度が３００℃未満では空気が拡散せず酸素の供給不足となり、酸化チタン相及びアルカリチタン酸塩相を含む被膜が厚くならない。他方、８００℃を越えるとＴｉの転移温度に達するので好ましくない。加熱時間０．２時間未満では、同様に被膜が厚くならず、加熱時間が２４時間より長いと機械的性質の低下をもたらして好ましくない。
【００３４】
この様な条件でチタン又はチタン合金をアルカリ性水液中に浸漬すると、反応量の少ない内部から反応量の多い外部に向かって漸増する濃度勾配をもって、表面に非晶質のアルカリチタン酸塩が生成する。その後、チタン又はチタン合金の転移温度以下の温度に１〜２４時間加熱することによって、酸素が拡散して酸化チタン相及びアルカリチタン酸塩相を含む被膜が形成され、その厚さが増加する。
【００３５】
生成物質となるアルカリチタン酸塩相にはアルカリイオン（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等）が含まれ、アルカリイオンに富んでいるので、リン酸カルシウム過飽和溶液中で、そのアルカリイオンが水素イオンと交換され、カルシウムＣａやリンＰと反応し易い表面層が生成される。一方、過飽和リン酸カルシウム溶液は溶解度以上のカルシウムＣａとリンＰを含んでいるので、リン酸カルシウム結晶を成長させる能力を有しているが、基板表面の表面エネルギーが大きいと、それが障壁となって単独ではリン酸カルシウム結晶核を表面に形成する能力が小さい。これに対し、アルカリ処理チタンまたはチタン合金の表面層ではリン酸カルシウム結晶核の形成に必要なエネルギー障壁が低い。その結果、大量のリン酸カルシウムがタンパクと共に表面に共沈する結果となる。
【００３６】
本発明でいうチタンまたはチタン合金とは、チタンを主成分とする金属のことであり、具体的には、純チタン、Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ、Ｔｉ−６Ａｌ−４ＶＥＬＩ、Ｔｉ−６Ａｌ−６Ｖ−２Ｓｎ、Ｔｉ−６Ａｌ−７Ｎｂ、Ｔｉ−６Ａｌ−２Ｓｎ−４Ｚｒ−２Ｍｏ、Ｔｉ−５Ａｌ−２．５Ｓｎ、Ｔｉ−３Ａｌ−１３Ｖ−１１Ｃｒ、Ｔｉ−１５Ｍｏ−５Ｎｂ−３Ｔａ、Ｔｉ−６Ａｌ−２Ｍｏ−Ｔａなどを含む。
【００３７】
担持するタンパク質は水溶性のタンパク質であり、生物学的活性化物質を使用することができる。水溶性タンパク質には、非水溶性のタンパク質をアルブミンなどの水溶性担体タンパク質またはポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルポキメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリピニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマ）などの水溶性ポリマーに結合させることで水可溶性とした非水溶性タンパク質も含む。非水溶性のタンパク質と上記水溶性担体タンパク質または水溶性ポリマーとの結合は両方の物質の官能基を利用すればよく、種々の公知の方法で結合させることができる。ここで生物学的活性化物質は生物に対して生物活性を有する、すなわち生物に作用することで生物体に何らかの変化を誘起し得る物質をいう。生物学的活性化物質として、生体の調節や生体の機能を変化させ得るサイトカイン、ホルモン等の生理活性物質が含まれ、例えば成長因子や細胞接着因子がある。生物活性を持つタンパク質、すなわち生物学的活性化因子の例としては、塩基性繊維芽細胞成長因子、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、エリスロポエチン、ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、トロンボポエチン、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＴＧＦ−α（トランスフォーミング増殖因子−α）、ＨＢ−ＥＧＦ（へパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子）、エピレグリン、ニューレグリン１，２，３、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、インスリン、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ミッドカイン、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）、ベータグリカン、アクチビン、ＢＭＰ（骨形成因子）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＩＦＮ−α／β（インターフェロン−α／β）、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、フィブロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチンなどを挙げることができるが、これらに限定はされない。水溶性であれば動物に対して生物活性を有する成長因子や細胞接着因子を使用することができる。その他のタンパク質の例としては、アルブミン、チトクロムＣ、グロブリン、などを挙げることができる。
【００３８】
アルカリ処理チタンまたはチタン合金上へ共沈するかどうかは、リン酸カルシウム過飽和溶液中のタンパク濃度減少量と、走査型電子顕微鏡または薄膜Ｘ線回折によるチタン又はチタン合金表面へのリン酸カルシウム析出の確認、の２つをくみあわせて評価できる。あるいは、ＥＬＩＳＡ法で評価することもできる。共沈物は剥離して粉末Ｘ線回折法  、走査型電子顕微鏡観察で評価できる。アルカリ処理チタンまたはチタン合金へのタンパクの共沈と担持したタンパクの効果を同時に評価するには、タンパク担持アルカリ処理チタンまたはチタン合金に対する、細胞の接着性、細胞の活性、細胞分化、血液凝固、血小板付着を評価すればよい。タンパク量はビュレット法にＢｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄを組み合わせた、比色分析で定量することができる。あるいは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法や同様のクーマシアンブリリアントブルーを用いた比色分析で定量することもできる。微量であれば、ＥＬＩＳＡ法で評価することもできる。
【００３９】
本発明のタンパク質を表面に担持させたアルカリ処理チタンまたはチタン合金は、人工骨、人工歯根、抗血栓性材料等の生体材料として用いることができる。表面に担持しているタンパク質である生物学的活性化因子が生体組織再構築に有用である。例えば、人工骨の場合には、骨形成を促進するタンパク質を担持した本発明のチタンまたはチタン合金を骨組織内に埋め込んで用いればよい。また、人工歯根の場合は、上皮接着や歯根膜形成を促がすタンパクを担持した本発明のチタンまたはチタン合金を顎骨に埋め込んで用いればよい。抗血栓性材料の場合には、直接または間接的に抗血栓性作用を示すタンパクを担持した本発明のアルカリ処理チタンまたはチタン合金を、人工心臓や人工血管として用いればよい。さらに、本発明のタンパク質を担持したチタンまたはチタン合金を組織工学スキャホールドとして用いることができる。すなわち、タンパクを担持したアルカリ処理チタン又はチタン合金上で細胞を培養して、骨等のヒトの組織を形成させることが可能である。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
〔実施例１〕
超純水に、ＮａＣｌ  １４２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３．７５ｍＭ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．５ｍＭとなるように各試薬を溶解し、その後トリスヒドロキシメチルアミノメタンと塩酸を用いて２５℃でｐＨ７．４０となるように調整した。以後この溶液をＣＰＳと呼ぶ。この溶液は安定リン酸カルシウム過飽和溶液である。またＣＰＳに４０μｇ／ｍｌの濃度でラミニンを加えた溶液をＬ−ＣＰＳと呼ぶ。
【００４２】
大きさ１１×１１×１ｍｍ３の純チタン金属板を＃４００のダイヤモンドプレートで研磨し、５ＭのＮａＯＨ水溶液に６０℃で２４時間浸漬した後、蒸留水で洗浄し乾燥させた。さらに同基板を６００℃で１時間加熱処理した。以後、未処理のチタン基板をＵＮ−Ｔｉ、ＮａＯＨ処理、及び加熱処理を施したチタン基板をＮＨ−Ｔｉと略記する。
【００４３】
２５℃に温度に保った３ｍｌのＬ−ＣＰＳにＵＮ−Ｔｉまたは、ＮＨ−Ｔｉを種々の期間浸漬した。種々の期間基板を浸漬した後のＬ−ＣＰＳ中に含まれるラミニンの量をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定したところ、ＵＮ−Ｔｉを浸漬したＬ−ＣＰＳでは浸漬３日後にも溶液中のラミニンはほとんど減少していなかったのに対して、ＮＨ−Ｔｉを浸漬したＬ−ＣＰＳ中のラミニンは浸漬１日後に約９０μｇまで減少していることが解った（図１）。従って、Ｌ−ＣＰＳに１日間浸漬したＮＨ−Ｔｉ表面には約３０μｇのラミニンが担持されていると考えられる。
【００４４】
〔実施例２〕
実施例１で得られた試料の表面構造変化を薄膜Ｘ線回折により測定したところ、Ｌ−ＣＰＳに浸漬したＮＨ−Ｔｉでは浸漬１日でアパタイトに帰属されるピークが認められたのに対して、ＵＮ−Ｔｉでは浸漬３日後にも大きな変化が見られなかった（図２、図３）。以上の結果より、ＮＨ−ＴｉはＬ−ＣＰＳ中でその表面に選択的にアパタイトの核を形成することが分かった。Ｌ−ＣＰＳはアパタイトに対して過飽和の状態にあるので、いったんアパタイトの核が形成されるとそれは自発的に成長する。ラミニンは、アパタイトが成長する際同時に取り込まれることにより、ＮＨ−Ｔｉ上に担持されていると推察される。
【００４５】
〔実施例３〕
種々の温度に保ったＬ−ＣＰＳ中にＮＨ−Ｔｉを２日間浸漬した後、溶液中のラミニンの減少量から基板表面に担持されたラミニンの量を見積もったところ、４℃に保ったＬ−ＣＰＳ表面にはごく微量のラミニンが担持されていることが分かった。一方、２５℃、及び３７℃に保ったＬ−ＣＰＳ中に浸漬したＮＨ−Ｔｉ上には共に約３０μｇのラミニンが担持されていることが分かった（図４）。
【００４６】
〔実施例４〕
Ｌ−ＣＰＳ中に１日間浸漬したＵＮ−ＴｉをＵＬ−Ｔｉ、ＣＰＳ、及びＬ−ＣＰＳに１日間浸漬したＮＨ−Ｔｉをそれぞれ、ＨＡ−Ｔｉ、及びＡＬ−Ｔｉと略称する。ＵＮ−Ｔｉ、及びＵＬ−Ｔｉ、ＨＡ−Ｔｉ、ＡＬ−Ｔｉの４種類の試料を１２ウェルの細胞培養用マイクロプレートに静置した。ヒト口腔由来の扁平上皮細胞ＨＳＱ−８９を６×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように懸濁させた、血清を含まないＤＭＥＭ細胞培養液２ｍｌを各ウェルに注いだ後、同プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気に保ったインキュベーター中で２時間培養した。
【００４７】
培養終了後１０％中性緩衝ホルマリン溶液を用いて細胞を試料上に固定化した後、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。同試料表面を光学顕微鏡で観察したところ、ＨＡ−Ｔｉ及びＵＮ−Ｔｉ上で培養した細胞では偽足の伸展が見られなかったのに対して、ＡＬ−Ｔｉ及びＵＬ−Ｔｉ上で培養した細胞では偽足の伸展が観察された（図５）。また、試料上に認められる細胞の数は、ＵＬ−ＴｉよりＡＬ−Ｔｉの方が多かった。以上の結果より、４種類の試料のなかで、ＡＬ−Ｔｉが細胞の初期接着性に最も優れていることが分かった。これは基板上に担持されたラミニンの効果によると推測される。
【００４８】
〔実施例５〕
ＵＮ−Ｔｉ、及びＵＬ−Ｔｉ、ＨＡ−Ｔｉ、ＡＬ−Ｔｉの４種類の基板を１２ウェルの細胞培養用マイクロプレートに静置した。ヒト口腔由来の扁平上皮細胞ＨＳＱ−８９を１５×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように懸濁させた血清を含まないＤＭＥＭ細胞培養液２ｍｌを各ウェルに注いだ後、同プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気に保ったインキュベーター中で２時間培養した。培養終了後培養液を吸引し、試料をＰＢＳ（−）で二回洗浄し、０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ混合溶液で試料から細胞を剥がし、０．３％のトリパンブルーで細胞を染色した。同溶液中の細胞数をタタイ式細胞計数盤で測定することにより試料上に接着していた細胞数を求めた。ＡＮＯＶＡ統計処理により解析したところ、ＡＬ−Ｔｉ上にはＵＬ−Ｔｉ、ＨＡ−Ｔｉ及びＵＮ−Ｔｉ上よりも統計的に有意に多数の細胞が接着していたことが分かった（図６）。以上の結果より、４種類の試料のなかで、ＡＬ−Ｔｉが細胞の初期接着性に最も優れていることが分かった。これは基板上に担持されたラミニンの効果によると推測される。
【００４９】
〔実施例６〕
ＣＰＳに４０μｇ／ｍｌの濃度でアルブミン又はフィブロネクチンを加えた溶液を作製した。２５℃に保った３ｍｌの同溶液にＮＨ−Ｔｉを１日間浸漬した後、同溶液中のアルブミン及びフィブロネクチンの減少量から基板表面に担持された各タンパク質の量を見積もったところ、アルブミンの場合は約５４μｇ、フィブロネクチンの場合は約５５μｇが基板上に担持されていることが分かった（図７）。また、各試料の表面構造変化を薄膜Ｘ線回折により測定したところ、どちらの試料表面にもアパタイトが形成していることが分かった（図８）。従ってアルブミン、及びフィブロネクチンはラミニンの場合と同様、基板上でのアパタイト成長時に同時に取り込まれ基板上に担持されたと推測される。
【００５０】
〔実施例７〕
リンゲル輸液６．５７ｍｌ、クリニザルツ輸液２．９５ｍｌ、及びバイフィル専用炭酸水素ナトリウム補充液０．４８ｍｌを混合した後、４０μｇ／ｍｌの濃度でラミニンを加えた溶液を作製した。この溶液は不安定リン酸カルシウム過飽和溶液である。２５℃、及び３７℃に保った３ｍｌの同混合溶液にＮＨ−Ｔｉを１日間浸漬した後、同溶液中のラミニンの減少量から基板表面に担持されたラミニンの量を見積もったところ、２５℃の場合は約３μｇ、３７℃の場合は約１３μｇのラミニンが基板上に担持されていることが分かった（図９）。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は、生物学的活性化物質であるタンパク質を担持したチタンまたはチタン合金であり、生体適合性を有しており、担持したタンパク質の作用により、生体組織再構築が促進され、生体組織代替材料、人工歯根、人口骨、抗血栓材料、組織工学スキャホールドとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ処理チタンまたは未処理チタン浸漬後のラミニン溶液中のラミニンの減少量を示す図である。
【図２】ラミニン溶液に浸漬したアルカリ処理チタンにおける薄膜Ｘ線回折の結果を示す図である。
【図３】ラミニン溶液に浸漬した未処理チタンにおける薄膜Ｘ線回折の結果を示す図である。
【図４】種々の温度に保ったラミニン溶液に浸漬したアルカリ処理チタンのラミニン担持量を示す図である。
【図５】ラミニン担持チタン上での扁平上皮細胞ＨＳＱ−８９の偽足の伸展を示す図である。
【図６】ラミニン担持チタン上での扁平上皮細胞ＨＳＱ−８９の接着数を示す図である。
【図７】アルカリ処理チタンへのアルブミンおよびフィブロネクチンの担持量を示す図である。
【図８】アルブミン溶液またはフィブロネクチン溶液に浸漬したアルカリ処理チタンにおける薄膜Ｘ線回折の結果を示す図である。
【図９】ラミニン担持処理後のラミニン溶液（不安定リン酸カルシウム過飽和溶液）中のラミニンの減少量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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