(57)【要約】      （修正有）【課題】血液などの水溶液性試料中の血清中性脂肪含量を、簡便迅速に、かつ再現性よく定量できる、自動化適性に優れた、かつ安価な、実質的に乾式の分析素子を提供する。【解決手段】水溶液性試料中の血清中性脂肪含量を定量するための実質的に乾式の分析素子において、試薬類の量比を規定する。【効果】中性脂肪測定用多層一体型乾式分析素子は、特に臨床検査のような、多量の検体を短時間で測定することが求められている分野において有効に適用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不透過性支持体と、前記支持体の片面に設けた主に親水性高分子からなるグリセロール検出用呈色試薬層と、前記呈色試薬層を直接または中間層を介在して被覆する多孔性展開層を有し、前記呈色試薬層が少なくともグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、電子受容体及びマグネシウムイオンを含有し、さらに前記展開層が少なくともリポプロテインリパーゼ、及び液体試料適用時のｐＨ値を６．０〜１０．０の範囲に維持し得るｐＨ緩衝剤を含有することを特徴とする中性脂肪定量用多層一体型乾式分析素子。
【請求項２】
前記展開層が織物、編物、多孔性ビーズまたはその他のポリマーの少なくとも１つからなる請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項３】
前記グリセロール検出用呈色試薬層が、少なくともグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、電子受容体及びマグネシウムイオンを含み、層塗布用水溶液のｐＨ値が６．０〜８．０の範囲である水溶液を塗布して設けられた層である請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項４】
前記電子受容体が酸素であり、前記グリセロール検出用呈色試薬層が過酸化水素の存在下に光学的に検出可能な変化を示す指示薬組成物を含む請求項３に記載の多層一体型分析素子。
【請求項５】
前記指示薬組成物として、ペルオキシダーゼ及びロイコ色素を含有する請求項４に記載の多層一体型分析素子。
【請求項６】
前記展開層にリポプロテインリパーゼを１ｍ2あたり６００〜４，８００単位含有する請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項７】
前記呈色試薬層にグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼを１ｍ2あたり各々３００〜２，４００単位、４００〜３，２００単位、５，０００〜３０，０００単位含有する請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項８】
前記リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼの含有単位比が２：１から１０：１の範囲にあり、かつ前記グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼの含有単位比が１：１から１：１０の範囲にある請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項９】
前記呈色試薬層にロイコ色素を１ｍ2あたり０．０５〜０．４ｇ含有する請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項１０】
前記呈色試薬層、前記展開層、または前記呈色試薬層と前記展開層を介在して被覆する前記中間層の少なくとも１つの層に、アスコルビン酸オキシダーゼを１ｍ2あたり１，０００〜１０，０００単位含有する請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項１１】
前記水不透過性支持体に、少なくともグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ＡＴＰ、電子受容体、マグネシウムイオン、ロイコ色素及び親水性高分子を含有する前記呈色試薬層が積層接着され、そして前記呈色試薬層の上に、織物、編物、多孔性ビーズまたはその他のポリマーの少なくとも１つからなり、前記呈色試薬層を直接または中間層を介在して被覆する多孔性展開層が積層接着されてなり、前記展開層に、少なくともリポプロテインリパーゼ、及び液体試料適用時のｐＨ値を６．０〜１０．０の範囲に維持し得るｐＨ緩衝剤が含まれてなる請求項１に記載の多層一体型分析素子。
【請求項１２】
水不透過性支持体の上に、グリセロール検出用呈色試薬組成物と親水性ポリマーバインダーを含有し、層塗布用水溶液のｐＨ値が６．０〜８．０の範囲を有する水溶液を塗布し乾燥してグリセロール検出用呈色試薬層を設け、次いで、前記呈色試薬層の上に直接または中間に介在する層を設けた後に、多孔性展開層を設け、しかる後に、少なくともリポプロテインリパーゼ及び液体試料適用時ｐＨ値を６．０〜１０.０に維持し得るｐＨ緩衝剤を、前記呈色試薬層の親水性ポリマーバインダーを実質的に膨潤させず、かつ前記展開層を実質的に溶解させない有機溶媒に分散または溶解させて含有する液を、前記展開層に塗布し乾燥させることを特徴とする中性脂肪定量用多層一体型分析素子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液などの体液その他の水溶液性試料中の中性脂肪の含量を定量的に分析するために使用する、多層一体型乾式分析素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液など水溶液性試料中の血清中性脂肪含量の定量的分析は、種々な型の過脂肪血症、動脈硬化症等の診断に重要である。測定原理上は、中性脂肪を脂肪酸とグリセロールに分解して、グリセロールを酵素的に反応せしめ、光学的または電気的に測定する方法が一般的である。すなわち、酵素としてリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）を用いて中性脂肪を脂肪酸とグリセロールに分解し、生じたグリセロールを、（１）グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、または（２）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれかの酵素を用いて反応させ、定量する方法が主流となっている。前者を用いる方法は特許文献１に、後者を用いる方法は特許文献２に、それぞれ詳述されており、これらの方法を用いた中性脂肪測定用多層一体型乾式分析素子が実用化されている。これらの方法においては、測定は、いわゆるエンドポイント法で行われる。
【０００３】
しかし、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いる方法は、一回の測定に要する時間が５分と長かった。一方、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いる方法は、妨害物質による影響を受けにくいが、ＮＡＤをＮＡＤＨに変換する系（または、ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに変換する系）であるため、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）の劣化を防ぐ方策が必要である（例えば特許文献３を参照）。また、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼは非常に高価であるため、単位面積当たりに含有可能な量に限界があり、この酵素処方量の制限のため、測定可能範囲上限付近での測定値の同時再現性などに問題があった。更に、一回の測定に要する時間が５分と長かった。
【特許文献１】特公昭６０−１２０４０号公報
【特許文献２】特開昭６３−１１９６９５号公報
【特許文献３】特開昭５９−８２３９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、血液などの水溶液性試料中の血清中性脂肪含量を、簡便迅速に、かつ再現性よく定量できる、自動化適性に優れた、かつ安価な、実質的に乾式の分析素子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、水溶液性試料中の血清中性脂肪含量を定量するための実質的に乾式の分析素子において、試薬類の量比を規定することにより課題を解決できることを見いだし、本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、血液などの水溶液性試料中の血清中性脂肪含量を、簡便迅速に、かつ再現性よく定量できる、自動化適性に優れた、かつ安価な、実質的に乾式の分析素子が完成された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明に係る乾式分析素子は、水不透過性支持体と、支持体の片面上に設けられた親水性高分子を含むグリセロール検出用呈色試薬層と、および呈色試薬層を直接または中間層を介して被覆する多孔性展開層を有する。
【０００８】
本発明で使用する水不透過性支持体としては、例えば上記特許文献に記載された、乾式分析素子の技術分野で公知の材料が使用可能であり、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン、セルロースエステル（例：セルロースジアセテート、セルローストリアセテート等）のポリマーからなる厚さ約５０μｍ〜約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍ〜約３００μｍの範囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体が挙げられる。より好ましくはＰＥＴフイルムを使用する。
【０００９】
検出用呈色試薬層を構成する高分子としては、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどがあるが、ゼラチンを使用することが好ましい。さらに必要に応じて、界面活性剤（カチオン性、両性、または非イオン性の界面活性剤）を含有させることも可能である。
【００１０】
多孔性展開層は、織物、編物、多孔性ビーズまたはその他のポリマーの少なくとも１からなり、ポリエステル系等の織物あるいは編物生地等が好ましい。
【００１１】
展開層中には、少なくともリポプロテインリパーゼが含まれる。これは、定量対象物質である中性脂肪がポリマー層中を通過し難いので、試料適用後、速やかに加水分解させて低分子のグリセロールに変化させるためである。また、液体試料適用時に展開層においてその試料が展開しすぎないようにする目的で、親水性ポリマーおよび／または界面活性剤を含有させることも可能である。使用できる親水性ポリマーとしてはポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド等がある。
【００１２】
リポプロテインリパーゼとしては、従来公知のリゾプス属（Rhizopus）、カンジダ属（Candida）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）の他に、シュードモナス属（Pseudomonas）等の微生物由来のものを使用できる。これらの中で好ましいリポプロテインリパーゼとしては、例えば東洋紡製ＬＰＬ−３１４がある。リポプロテインリパーゼの含有量は６００〜４,８００Ｕ／ｍ2、好ましくは２,０００〜４,８００Ｕ／ｍ2、更に好ましくは２，４００〜３,６００Ｕ／ｍ2である。
【００１３】
呈色試薬層中には、少なくともグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ロイコ色素、ＡＴＰ、電子受容体およびマグネシウムイオンが含まれる。これらについても、乾式分析素子の分野で従来公知の材料を使用できる。例えば、グリセロールキナーゼにはフラボバクテリウム属（Flavobacterium）由来、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼには、ストレプトコッカス属(Streptcoccus)由来、ペルオキシダーゼには西洋ワサビ由来の酵素等が使用可能である。また、マグネシウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等を使用することができる。
【００１４】
呈色試薬層中の指示薬として使用する発色剤（すなわち色素前駆体）は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼの作用によりグリセロール−３−リン酸と酸素から生成した過酸化水素と、ペルオキシダーゼにより色素を生成させるものであればよく、例えばロイコ色素の酸化によって色素を生成する組成物（例、米国特許４，０８９，７４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ  ０１２２６４１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾールロイコ色素）などを使用することができる。
【００１５】
グリセロールキナーゼの含有量は３００〜２,４００Ｕ／ｍ2、好ましくは３００〜１,２００Ｕ／ｍ2、更に好ましくは５００〜１,０００Ｕ／ｍ2であり、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼの含有量は４００〜３,２００Ｕ／ｍ2、好ましくは８００〜２,４００Ｕ／ｍ2、更に好ましくは１,２００〜２,０００Ｕ／ｍ2であり、ペルオキシダーゼの含有量は５,０００〜３０,０００Ｕ／ｍ2、好ましくは８,０００〜２,４０００Ｕ／ｍ2、更に好ましくは１０,０００〜２０,０００Ｕ／ｍ2である。
【００１６】
試料中の中性脂肪の迅速なかつ再現性のよい定量を可能にするためには、これら含有される酵素の比率が重要であり、本発明においては、リポプロテインリパーゼ／グリセロールキナーゼ＝２／１〜１０／１、かつグリセロールキナーゼ／グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ＝１／１〜１／１０が好ましい。更に好ましくは、リポプロテインリパーゼ／グリセロールキナーゼ＝３／１〜５／１、かつグリセロールキナーゼ／グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ＝１／２〜１／５である。これにより、従来５分必要であった測定時間を３〜４分に短縮し、更に再現性を向上させることが可能になった。
【００１７】
呈色試薬層に含有されるＡＴＰは、リポプロテインリパーゼの作用により中性脂肪を加水分解して生じたグリセロールを、グリセロールキナーゼの作用によりリン酸化してグリセロール−３−リン酸を生じせしめる際に、リン酸基の供与体として添加される。また、マグネシウムイオンはその際、グリセロールキナーゼの活性発現に必須である。更に、電子受容体はこの場合酸素であり、グリセロール−３−リン酸がグリセロール−３−リン酸オキシダーゼによりジヒドロキシアセトンリン酸が生成する反応において、同時に過酸化水素が生じる。
【００１８】
展開層および呈色試薬層に各々含有される酵素の至適ｐＨは、下記の通りである。
リポプロテインリパーゼ                ：８．０
グリセロールキナーゼ                  ：７．８
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ  ：７．０
ペルオキシダーゼ                      ：６．５
【００１９】
従って、液体試料適用時のｐＨを６．０〜１０．０の範囲、より好ましくは６．５〜８．０の範囲になるよう設定するのがよい。また使用可能なｐＨ緩衝剤としては、上記ｐＨ範囲で緩衝能を有す試薬、例えばトリスヒドロキシアミノメタン等が使用可能である。
【００２０】
呈色試薬層と多孔性展開層の間には、接着性の改良等のために接着層を設けることができる。水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤したときに展開層を接着することができるような親水性ポリマーが使用可能である。例としてゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等があるが、より好ましくはゼラチンを用いる。接着層中にも、試料中に予め含まれるアスコルビン酸の影響を除去する、あるいはその他の目的で、酵素アスコルビン酸オキシダーゼやその他の試薬を添加することができる。
【００２１】
上記の材料を用いて、上記特許文献に詳述されている方法を参照して、本発明になる中性脂肪定量用多層一体型乾式分析素子を作成することができる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
ゼラチン下塗りの施された厚さ約１８０μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)フイルム上に、乾燥後に下記含有量になるよう下記試薬を含む水溶液を塗布し、乾燥して、中性脂肪検出用呈色試薬層を設けた。
ゼラチン                                        １８ｇ／ｍ2
ロイコ色素                                    ０．２ｇ／ｍ2
ＡＴＰ                                        １．５ｇ／ｍ2
トリスヒドロキシアミノメタン                  １．５ｇ／ｍ2
硫酸マグネシウム                              １．６ｇ／ｍ2
ペルオキシダーゼ                        １５，０００Ｕ／ｍ2
グリセロールキナーゼ                          ８００Ｕ／ｍ2
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ      １，９００Ｕ／ｍ2
【００２３】
上記呈色試薬層の上に、乾燥後に下記含有量になるよう下記試薬を含む水溶液を塗布し、乾燥して、接着層を設けた。
ゼラチン                                          ７ｇ／ｍ2
アスコルビン酸オキシダーゼ                ７，９００Ｕ／ｍ2
【００２４】
上記接着層の上に、ニット編物生地を圧着ラミネートして展開層を設けた。この上に、下記の組成のエタノール分散液を塗布し、乾燥した。
エタノール                                    １４７ｇ／ｍ2
リポプロテインリパーゼ                    ２，６００Ｕ／ｍ2
（東洋紡製ＬＰＬ−３１４）
【００２５】
前記のようにして作製した中性脂肪測定用多層一体型乾式分析素子を用いて、基準法となる溶液法により予め中性脂肪濃度を決定しておいたヒト血清を測定した。一定時間インキュベートさせた後、ＰＥＴ面より反射測光して、ＯＤ値を求めた。特許文献２に開示された方法に則って作製した従来製品と今回の発明品の結果を図１に比較した。従来製品は５分インキュベートさせて波長６００ｎｍで測定したのに対して、発明品では４分インキュベートさせて波長６５０ｎｍで測定した。従来製品と比較して、発明品では濃度３００ｍｇ／ｄＬ以上の高値血清においても検量線の傾きが保たれていた。また、測定時間が従来製品よりも１分短いにも関わらず、同等の相関係数を得ることができた。
【００２６】
次に、得られた検量線を用いて個々のＯＤ値を中性脂肪濃度に変換して、基準法(溶液法)との相関を比較した。結果を図２に示す。やはり、従来製品よりも測定時間が１分短いにも関わらず、同等の相関係数を得ることができた。
【００２７】
次ぎに、種々の中性脂肪濃度のヒト血清５検体を各々２０回測定して、その同時再現性をみた。結果を表１に示す。何れも変動係数（ＣＶ）にして２．５％以下の良好な結果を得た。
【００２８】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明になる中性脂肪測定用多層一体型乾式分析素子は、特に臨床検査のような、多量の検体を短時間で測定することが求められる分野において有効に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】従来製品と発明品の検量線の比較である。
【図２】従来製品と発明品における、基準法(溶液法)との相関比較である。
【図１】
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【図２】
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