(57)【要約】      （修正有） 【課題】免疫システムに及ぼす光作用機序を明らかにし、免疫システム活性化をもたらす最適な光源手段とその構成方法を明らかにする。【解決手段】波長１．４-２．５μｍのレーザー光をパルス照射することで、皮下に存在するランゲルハンス細胞を活性化し、その結果として体内免疫系が活性化し腫瘍縮小が可能になり、免疫不全、腫瘍縮小に効果的な装置を提供し、光と生体細胞との相互作用をもとに、エネルギー密度強度、レーザー出力を選定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長域１．４ー２．５μｍに発振波長をもつレーザー光発振手段と、パルス発振化手段と、生体の皮膚表面に照射することのできる導光及び照射手段を有することを特徴とする免疫活性化装置
【請求項２】
発振波長が１．４ー２．０５μｍの範囲で可変であることを特徴とする請求項１に記載の免疫活性化装置
【請求項３】
発振波長が１．８５ー２．０５μｍであって、レーザー発振手段がファイバーレーザーであることを特徴とする請求項１乃至２に記載の免疫活性化装置
【請求項４】
発振波長１．８５ー２．０５μｍを発振するレーザー発振手段において、レーザー励起手段が半導体レーザーであり、レーザー発振をパルス化する手段がパルス幅変調方式で構成されていることを特徴とする請求項１乃至３に記載の免疫活性化装置
【請求項５】
レーザー光パルス化手段がパルス幅変調方式であって、パルスＯＮ時間が１ー２５０ｍｓでありパルスＯＦＦ時間が１ー２５０ｍｓを任意に設定できることを特徴とする請求項１乃至４項に記載の免疫活性化装置
【請求項６】
照射部位面での照射エネルギー密度が１０ー２００Ｊ/ｃｍ２、パルス繰返し数が２ー５００Ｈｚであって、照射部の直径が３-１５ｍｍであることを特徴とする請求項１乃至５に記載の免疫活性化装置
【請求項７】
免疫活性薬剤，免疫活性機能性食品等を併用する事ができる請求項１乃至６項に記載の免疫活性化装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、光学的、機械的手段あるいは免疫活性薬剤，免疫活性機能性食品等を併用することにより生体の免疫活性をもたらす装置に関する。
【背景技術】
【０００２】  生体と光との相互作用による治療効果は古くから知られている。特に日本においては「光線治療器」という名称で知られるカーボン電極に電流を流すことで生ずる発光を用いて、人体の治療に使用する方法が知られており現在も鍼灸治療法の一手段として使用されている。【０００３】  光線治療器においては、広範囲な症状に対して効果があるとされている。光線治療器には痛み、かゆみ、アレルギー性疾患、潰瘍、炎症性疾患などに有効であるとされている。（非特許文献１）【０００４】  一方、ここ２０年以上前からレーザーを使用した新規な医療装置が臨床使用されてきている。公知のように医療レーザーとして実用化されているレーザーは、炭酸ガスレーザー、Nd:YAGレーザー、ルビーレーザー、半導体レーザーなど多くの種類に及びその発振波長も紫外域から遠赤外域までに及んでいる。これらのレーザー光による適用例は生体の切開、蒸散、凝固および止血などである。【０００５】  光と生体との相互作用には前記適用例に加えて低出力エネルギーによる細胞レベルへの効果が知られている。低出力エネルギーによる生体作用には疼痛緩和、創傷治癒促進効果などが知られており、作用機序を含めて有効性などが広範囲に研究され、すでに臨床においてもこれらの装置が普及している。  また光と生体との相互作用のメカニズムにおいては（１）コラーゲン産生機構、（２）細胞活性化機構などが知られており、いずれにおいても光照射によって、細胞破壊を生ずることなしに、照射細胞に特定の作用を及ぼすことが知られている。【０００６】繊維芽細胞にレーザー光を照射をすると、細胞内のcGMP(タンパク産生回路)には光刺激依存性があり，この結果コラーゲンの産生増強がおこることが明らかになっている。実際に細胞実験において照射エネルギー５．４J/ｃｍ２(波長６３２．８nm)ではコントロールに比較して１．５倍のプロコラーゲン産生が得られた。一方、１５J/ｃｍ２の場合にはわずかに低く１．４倍の産生であった。また、細胞活性化においては連続光よりもパルス照射のほうが有効であることが知られている。基本になっているのはArndt Rudolph とSchultz Hugoによる法則である。すなわち「あらゆる刺激は、それが非常に弱い刺激である場合、生体の反応を刺激することはない。しかし、ある刺激域に達すると、生体の反応を促進させ、強い刺激は逆に抑制させる。さらに強い刺激は、生体の反応を停止させる」というものである。この法則は経験的にも実証できる場合がある。【０００７】  ロシア科学アカデミーのKaru TIは可視赤色光に対する生物学的光反応モデルを提唱している。細胞内のミトコンドリア内にある呼吸連鎖の化合物であるフラビンデヒドロゲナーゼ、チトクローム、チトクロームオキシダーゼなどが光エネルギーを吸収すると、ミトコンドリアが活性化され、NADが増加し、高い代謝状態になりATPを増加させ、これを細胞質に放出し、ミトコンドリアと細胞質の酸化還元状態を変化させる。光を介した一連の現象は細胞内で起こり、細胞膜内外での流れであるカルシュウムイオンに影響を与え、信号が増幅され、核にも影響をあたえ、RNA,DNAの合成を促進させ、細胞の分化に影響を与えるとしている(非特許文献１)。またアメリカのSmith KCは同様なモデルを提案し、可視赤色��と類似した作用によって、細胞分化をもたらすとしている(非特許文献２)。また、Young SRらはマクロファージによるカルシュウム取り込みの光照射効果を検討した。これは低出力レーザーによる生物学的な影響を明らかにしたものであって、光照射によって細胞活性が生じ、特に光波長、エネルギー密度、周波数による影響を調べた(非特許文献３)。この結果として光波長としては６００−９００nm、エネルギー密度としては最大４−８J/ｃｍ２に、周波数としては５−５０００Hzで細胞活性化が生じた。このデータは今までに得られている関係する傷の修復、痛みなどに関連する臨床的照射条件にほぼ等しく、したがって照射条件を決める基礎とみなすことができる。【０００８】  光と生体作用において生体の免疫活性についてはほとんど研究されていなかったが，前記光と細胞の作用において免疫をつかさどる細胞に対しても当然ある種の作用をもたらすという可能性は予測されている。これに関連して「免疫システムを刺激し、細胞レベルでの治癒を発生するための方法および装置」が開示されている(特許文献１)。この方法は免疫システムを刺激する方法として治療すべき疾患の皮膚にチューブあるいはガイドを通して１９１７nm近傍の波長を有する赤外線照射を行うことで、治癒を促進させるように免疫システムに刺激を与え、正常な細胞に害を及ぼすことなしに細胞レベルでの治癒を可能とする装置についてのものである。【０００９】  前記装置による光と生体作用については生体内のT細胞を含む免疫システムが刺激され、照射部位を選択することで骨髄におけるB細胞の生産を促すとされる。このような作用をもたらす装置は非コヒーレント光であって、その波長範囲は１８００-２４００nmであり、照射光は７．５Hzのパルス照射を推奨している。照射エネルギーとして平均照射径１０ｍｍに１０ー２００mWを設定している。【００１０】  以上詳細に説明したように、免疫システムへの刺激作用は非破壊的な細胞作用であるがその作用機序の詳細およびなぜ非コヒーレント光が有効であるかは明らかになっていないのが現状である。  【００１１】  手術療法，抗癌剤投与，放射線療法などでは生体の免疫システムの低下は避けられないが、この低下に対して免疫の活性手段として免疫活性薬剤や免疫活性機能性食品あるいは他の手段などが単独あるいは複数相補的に用いられることもある．本発明はこれら手段と併用することにより更なる効果の向上が期待できる。【特許文献１】特表２００２ー５１９１６２号公報
【非特許文献１】「可視総合光線治療」財団法人光線研究所刊
【非特許文献２】Karu TI,Biological action intensity visible monochromatic light and some of its medicalapplications. Laser ed. by Galletti G, p 381, Monduzzui Editore, Bologna, 1985
【非特許文献３】Smith KC, Thephotobilogical basis of low level laser therapy. Laser 3巻, 19頁，１９９１年
【非特許文献４】Young SR, DysonM and Bolton P，Effect of Light on Calcium Uptake by Macrophages, Laser Therapy，2巻，５３ー５７頁, 1990年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  解決しようとする課題は、免疫システムに及ぼす光作用機序を明らかにし、最適な光源手段とその構成方法を提供するものである。【００１３】  本発明は、免疫システムに及ぼす光照射条件を動物実験によって明らかにし、最適な光源手段としてレーザー装置、導光・照射手段、照射条件を確立することを最も主要な課題とする。
【発明の効果】
【００１４】  本発明の免疫活性化装置は，現在主要な癌治療法である手術療法、抗がん剤治療および放射線治療後における免疫システムの低下をもたらす作用を減少させ、また他の免疫活性法に相加的、相乗的にがん治療方法の安全性、有効性をもたらすと共に、単独使用においては腫瘍増殖を低下させる効果を持つという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】生体細胞に光照射をする場合には、光と細胞との相互作用を考慮する必要がある。この場合の相互作用は照射エネルギー（J/ｃｍ２）、照射時間、および照射出力密度（W/ｃｍ２）が関係することは良く知られている。細胞への照射エネルギー、出力密度については生体表面での反射率、吸収係数、散乱係数などの相違によって、レーザー光が生体内にどの程度伝達されるかが規定される。一般的には可視光域では血液中のヘモグロビン、メラニン吸収が強くまた、透過光の吸収以外にも散乱が強く生じ、このために照射光作用は複雑になる。概してこの波長域の光は生体内部にまで透過される。これに反して１μｍ以上の赤外光はヘモグロビン、メラニンなどの吸収および散乱作用が少なくなり、逆にＯＨによると思われる吸収が強く作用する。この結果、光透過距離は非常に短くなり光の作用は皮膚表面に限定される。細胞と光との相互作用，特に細胞活性化については前記Young SRらが検討しているが、一般的には効果的な条件はほぼ次の範囲に存在しているようである。  エネルギー密度：４ー８Ｊ/ｃｍ２  照射条件：５ー１００Ｈｚもちろんこの値は一般的であって概略的なものである。免疫システムを刺激する方法の前記特許によれば、最適照射条件は以下に記載される。波長：1.917nm周波数：７．５Ｈｚ  照射エネルギー密度：１４J/ｃｍ２  （出力２００ｍＷ，周波数７．５Ｈｚ，on:25ms、 照射面積１０ｍｍ円状、照射時間5分）  この照射エネルギー密度は最大値であり最小値ではこの十分の一程度であって、どの条件を選択するかは治療対象によって異なる。いずれにしても、細胞に対しての照射条件としては上記の範囲にあると想定できる。【００１６】  皮膚への光吸収・散乱との関係については光と生体との相互作用を考察する場合の重要なパラメータである。一般的な可視光範囲では生体内では酸化ヘモグロビン、還元ヘモグロビン、およびメラニンが主な吸収物質として知られている。免疫システムに及ぼす光照射作用を考慮する場合には生体内部まで光を伝達することによる免疫細胞の刺激および生体表面直下での免疫細胞の刺激が考えられる。しかしながら、生体内部での免疫細胞は主として血液、リンパ管、消化管，肺，他の臓器およびその周辺のリンパ組織中に存在するため、光が内部まで透過させる必要がある。生体内に深く透過させるには可視光が有用であるが、この場合には前記血液中のヘモグロビン、酸化ヘモグロビンおよびメラニン色素に吸収されるため、目的とする免疫細胞に対して光照射が可能であるかどうかは疑問がある。【００１７】  一方、免疫に関与する細胞として近年注目されるものとしてランゲルハンス細胞(樹状細胞)がある。このランゲルハンス細胞は皮膚直下に存在し、体表面に広く分布している。このランゲルハンス細胞の機能としては皮膚外から侵入してきた細菌、ウイルスなどの捕捉による抗原提示、免疫反応の誘発、T細胞誘発など体内に免疫システムにおいて重要な役割をしていることが明らかにされつつある。本発明においてはこのランゲルハンス細胞が光照射によって活性化ないし細胞分化によるランゲルハンス細胞を増加させ、その結果として体内の免疫システムが活性化されるという事実によって実施されたものである。【００１８】  樹状��胞は多くの長い腕をもつ免疫細胞の一種で、さまざまな組織に見られる。特に皮膚や粘膜に多く、皮膚の表皮層に分布している樹状細胞を特にランゲルハンス細胞と称している。この樹状細胞はごくわずかな抗原を見つけ出し、効率よく捕まえて抗原提示する。抗原を提示した樹状細胞は血液に乗って脾臓に向かうほか、リンパ液と共にリンパ節へ向かい、成熟し、抗原を抱えたMHC分子を未感作T細胞に提示する。免疫刺激細胞となった樹状細胞は抗原を未分化T細胞に提示し、ヘルパーT細胞を活性化させる。活性化したヘルパーT細胞はリンホカインを産生し、B細胞に抗体産生を誘導、マクロファージを活性化あるいは、細胞障害性T前駆細胞を細胞障害性リンパ球にする。【００１９】  ヒト皮膚の樹状細胞の分布状態は遅延型過敏反応の過程の研究で既に調べられており、通常、皮層表面に存在する皮膚ランゲルハンス細胞は、反応の過程で表皮の上皮に移動し、数日で表皮表面から剥奪・離脱するといわれる。また感作後２４時間以内に、ヘルパーT細胞と単球およびランゲルハンス細胞が皮膚血管周囲に集まり、抗原提示が行われる。抗原を提示されたヘルパーT細胞は抗体を作るB細胞や、感染細胞を攻撃する細胞障害性T細胞といった免疫細胞と相互作用が行われる。このようにランゲルハンス細胞は、何らかの刺激を受けたあとに、皮下の血管周辺に集まり、ヘルパーT細胞に抗原提示を行う機構を有する。したがって、ランゲルハンス細胞が光照射によって刺激を受け、その結果として抗原提示と同様な作用を産む生むことが仮説的に成立する。【００２０】  前記０００８において記載したように細胞が光照射によって活性化することは明らかになっているが、同様にしてランゲルハンス細胞が光照射によって活性化することにも妥当性がある。【００２１】  光を生体に照射した場合、皮膚直下のある範囲で光エネルギーが吸収されるためには、照射光波長と生体吸収物質の関係が重要になる。この要件としては（１）血液による吸収がないこと、（２）メラニンによる吸収がないことである。このような吸収があれば、免疫細胞に作用するための必要とする生体表面への照射光エネルギーは大きくなり、装置の大型化、皮膚障害などの問題が生じる。したがって、上記ランゲルハンス細胞に作用させるためには、皮膚表面から少なくとも１ｍｍ以下で光照射効果が得られるように照射光波長を選択する必要がある。このような効果を生むための光波長としては１μｍ以上の赤外線光が選択される。【００２２】  一般的に知られているNd:YAGレーザー光においては皮膚の減衰係数として５．７ｃｍー１が得られている。この値をLambert-Beerの式に代入して、照射エネルギーが入射光の１０％まで低下する距離を求めると、概略４ｍｍとなりこの波長域では光透過強度が大きすぎることになる。これに対して波長1.9μｍでの吸収係数はおよそ１５０ｃｍー１とされるが、別途実験結果によれば７５ｃｍー１であった。吸収係数として１５０ｃｍー１をもとに光透過を前記と同様な計算を行うと、０．１５ｍｍ程度になる。表皮の厚さはおよそ０．１ｍｍ程度とされているから、ランゲルハンス細胞が存在している表皮内には作用するが、それより深い皮下組織には作用が及ばないという条件を満たしている。加えて、この波長による生体作用としては皮膚内での光散乱がほとんどなく、照射面に垂直方向に透過していくという吸収特性を有していることも特徴になる。照射部位近傍での散乱係数が大きい光波長としては一般には１μｍ以下であると知られているが、散乱係数が大きい場合には、照射部位近傍での光強度が大きくなってしまうことが指摘されていることから、細胞活性ではなくて、細胞にダメージを与えてしまう恐れが生じる。したがって、免疫細胞を安全に活性化させるには照射光による体内組織での散乱が生じないような波長を選択する必要があるが、この点でみれば１．９μｍ帯の光は好適である。【００２３】  前記００１５に記載したように細胞活性化をもたらす照射エネルギー密度として一般には４ー１０J/ｃｍ２とされている。もとよりこの照射エネルギー密度がすべての細胞活性化において適用されるかどうかは不明としても、条件設定のための指標にはなる。このための一例として照射部位面積を５．５ｍｍ径としてレーザー光強度を１００mＷとした場合には表面から０．３ｍｍのところでの照射エネルギー値は１．４J/ｃｍ２になり、細胞作用範囲として０．３ｍｍ以内では十分可能な条件を満たすことがわかる。【００２４】  一方ＨｅーＮｅレーザー光などの赤色光域での吸収は１０ｃｍ-1程度であり、主としてメラニン色素による吸収が支配的である。一方、酸化ヘモグロビン、還元ヘモグロビンの吸収係数はほぼメラニンより一桁ひくいため結果的には光作用距離は５ｍｍ以上に及ぶと判断できる。加えて、この波長域では生体内部からの反射が大きく、皮膚色によって異なるとしてもほぼ５０％程度とされている。この結果作用に必要とする光照射エネルギーは大きくなると同時に生体内へ深く浸透する結果、目的とする免疫細胞への相互作用をもたらすことが困難になると思われる。以上の概略的説明によって、レーザー照射によって伝達する光作用距離としては表面直下のランゲルハンス細胞に作用させるためには波長選択が重要な条件になる。このような光作用距離を持つ光波長範囲は１．４ー２．５μｍである。【００２５】  光照射によって細胞との相互作用を効果的に実施するためにはほぼ皮下の表皮層内に分布しているランゲルハンス細胞に光照射が行われる必要がある。一般的に非コヒーレント光の場合には照射光の入射角度は照射部位内の場所ごとによって異なり、その入射角に応じて生体内部へ透過角度は分散する。このために細胞との作用は入射光強度が同じであっても細胞ごとに異なることになる。このためには、作用効果を一定に保つためにはコヒーレント光を用いるのが肝要であるが、そうであっても非コヒーレント光が使用できないということではないことも自明である。【００２６】  所定の作用を実現するには照射部位での光照射面積が重要な条件になる。レーザー光が皮下に存在するランゲルハンス細胞に作用する場合には照射部位の面積内にどの程度の細胞が分布しているかによる。ランゲルハンス細胞分布は表皮内に空間的に存在するとしても機能的に見た場合、複層的に存在するよりも並行的に存在しているとされる。したがって作用効果は照射部位面積に依存する。この結果として所定の照射エネルギー密度を確保でき、皮膚への熱的障害を生じない条件を満たす必要がある。このための照射面積としては３ー１５ｍｍ径が選定することが肝要である。【００２７】  光照射による細胞活性化を効率化する手段として、パルス光照射が知られている。照射光をパルス化するためには一般的には光源そのものをパルス化するか、光源出射端と導光部との間に連続的に光を間欠的に遮蔽できるチョッパーを具備する方法が知られている。装置の小型化をはかるには光源側でパルス化する方法が好都合である。パルス光の場合にはパルスのデューテイを変化させる必要が生じる場合がある。特に、細胞作用を効率的に行うためには、臨床的には照射条件を対象とする照射部位ごとに最適化する必要が生じる。このためにはレーザー出力の設定はパルス幅変調によって可変されることが肝要である。【００２８】  前記００１５に記載したように光と生体作用を規定するパラメータとしては照射時間、照射エネルギーおよび照射強度が知られている。細胞活性化をもたらす一つの条件としてエネルギー密度が４ー８J/ｃｍ２であるとされているが、照射時間については十分には知られていない。パルス照射条件においてはパルス幅変調方式ではパルス・デューテイを変化させた場合にはピーク照射値を変えずに、平均照射エネルギーを変化させることができるが、機械的なパルス化の場合にはデューテイは固定される。したがって、機械的パルス化方式（チョッパー方式）の場合には出力可変は励起エネルギーを連続的に変化させる必要がある。この場合には、ピーク照射強度および照射エネルギーとも変動することになる。【００２９】  前記のパルス化方式の相違が生体作用においてどのような相違を生むかを具体的に説明する。実験的に細胞活性の最適条件が照射エネルギー密度として１０J/ｃｍ２、照射強度が０．１２７W/ｃｍ２（レーザー出力１００mW,  照射ビーム径１０mm）とすれば、照射時間は７９秒必要になる。この条件は機械的チョッパー(デューテイ５０％)を使用した場合には照射時間を２倍にするか、出力を２倍にする必要がある。しかしこの場合には出力を変化させれば照射強度は最適条件からずれることになる。また照射エネルギー密度を変化させた場合には必然的に照射強度が変わってしまう欠点がある。一方、パルス幅変調方式の場合には、出力条件を変えてもレーザー照射値は一定であるため、所定の照射エネルギーを得るには照射時間を変えるのみで最適条件からのずれは生じない。【００３０】  波長域１．４ー２．５μｍのコヒーレント光を発振できる装置としては一般にNaCl（F２＋）H  による色ガラスレーザー(発振波長：１．４ー１．８μｍ波長可変)、CO２＋：MgF２レーザー(発振波長１．６３-２．５０μｍ波長可変)および半導体レーザー励起によるEｒ３+:ガラス「ファイバーレーザー」(発振波長：１．５２２-１．５７５、１．５９０ー１．６０３μｍ波長可変)  レーザーなどが知られている。【００３１】  波長１．９μｍ帯でのレーザー装置は小型で導光用ファイバーへの結合効率がよく、操作性に優れた半導体レーザー励起によるファイバーレーザーが好適である。励起用レーザーには波長８００±10nmの半導体レーザーを用いてTmドープフッ化物ファイバーを励起することでレーザー発振が得られる。ファイバーレーザーは連続発振光が一般的である。本発明においては励起用半導体レーザーの駆動回路にはパルス幅変調回路を具備させ、パルス発振を行うものである。
【実施例１】
【００３２】  図１に本発明の構成を示す。図１において１は 励起用半導体レーザー、２は 半導体レーザーの駆動回路、３は８００ｎｍ透過、１９００ー２０００ｎｍ反射ミラー、４ はＴｍドープフッ化物ファイバーであり、５は 波長選択装置で全反射ミラー、グレーティング、レンズから構成される。６はＴｍドープフッ化物ファイバーからのレーザー光を導光ファイバーに伝達するための光学系、７は導光ファイバー、８は 照射用ハンドピースである。半導体レーザー駆動回路においてはパルス幅変調回路が具備されており、レーザー光出力ピーク値Pmax、レーザー光平均出力値Pave、パルスON時間Ton、パルスOFF時間Toffとの間には以下の関係が成立する。  Pave ＝ Pmax × Ton/ (Ton＋Toff)パルスON時間は１ｍｓから２５０ｍｓ、パルス停止時間は１ｍｓから２５０ｍｓまで可変できるように設定できる。このような駆動回路によって半導体レーザーを発振させ、Ｔｍドープフッ化物ファイバーを励起することにより波長１．９５μｍのパルス発振レーザー光が得られた。また、Tmドープふっ化物ファイバーの長さを調節することにより発振波長を１．８５〜２．１０μｍの範囲で調節することができた。励起用半導体レーザー出力０．７Wの場合には１．９５μｍレーザー出力として２００mＷが得られる(最大値)。パルス繰返し数を１０Hzに設定でき、またデューテイを５０％に設定するために、TonとToffをそれぞれ５０ｍｓに設定したところ、パルス繰返し１０Hz、レーザー出力１００mＷ、波長１．９μｍ帯のレーザー光が得られた。本装置の動物実験による免疫活性化の確認では上記設定条件でレーザーを動作させた。また、レーザー光出力値のみの変化を確認するために、別途出力可変機構を用いて、パルス条件は変化させずに出力５５ｍＷの発振をおこない、この設定条件下でも動物実験をおこなった。照射面積は５．５ｍｍ径に設定し、照射時間をそれぞれ１０分とした場合には、皮膚への入射エネルギー密度はそれぞれ63J/ｃｍ２、126J/ｃｍ２になる。この値は皮膚表面化での反射、皮膚内部での吸収などを考慮すれば妥当であるが最適値であるかは確認できていない。照射面積は固定であるよりは対象部位によって可変する場合もあるので、照射部位を可変する場合もある。このような場合にはハンドピース出射端から皮膚照射面までの距離を可変させるか、ハンドピース部にズーム光学系を具備させることで対応できる。
【実施例２】
【００３３】上記実施例１による装置をもちいて、本装置が免疫活性化をもたらすかどうかを確認するための動物実験を行い、その効果について確認した。  この確認実験においては正常な免疫状態下で、腫瘍細胞を移植した場合の免疫細胞の挙動を実験的に明らかにするものであって、自己の体内に腫瘍が自然に形成された条件下での光照射による腫瘍細胞の挙動を検討したものでないことに注意する必要がある。したがって、本実験においては次の点が課題である。１）  生体にとって異物である細胞が移植された場合に対象とする免疫細胞はいかなる挙動をしめすか２）  腫瘍細胞に変化を示すもたらす免疫細胞は何であり、この細胞の挙動は光照射によってどう変化するか３）  光照射によって、実際の移植腫瘍細胞はどのように変化するか４）  その形態変化の観察結果【００３４】実験動物には腫瘍細胞の腹腔継代マウスおよび担癌マウス共にC3H/HeNCrjマウス(8-12週齢、雌)を使用した。担癌マウス作成における腫瘍細胞移植は、マウス腹腔内より細胞を回収し、リンゲル液で数回洗浄後、腫瘍細胞１０６個/0.1mlの細胞浮遊液を作製した。移植部位は剃毛したマウス臀部皮下とし、その部位に細胞浮遊液０．１mlを注入した。レーザー光照射は、腫瘍細胞の移植前照射群(Group２)，移植後照射群(Group３),  移植前後照射群(Group４)および腫瘍細胞を移植しレーザー光の非照射群、コントロール（Group１）の４つの実験群で比較検討を行った。移植前照射は３日間、移植後照射は７日間行い、全ての実験群において移植より８日目に犠牲死させた。レーザー光照射部位は、腫瘍移植部位及び剃毛した臀部の非腫瘍部位の２方法の比較検討を行った。非腫瘍部への照射出力は１００ｍＷとした。【００３５】  腫瘍部の温度が４３度以上に増加した場合、腫瘍細胞が選択的に死滅することから、レーザー照射によって照射部位での皮膚温度の上昇状態をモニターするために、レーザー出力１００ｍＷにおける温度上昇挙動を赤外線サーモグラフィー(FAIRIS, Nikon )で計測した。【００３６】  犠牲死させたマウスより腫瘍組織を回収し、約４％のパラホルムアルデヒド溶液で固定し、ヘマトキシリンーエオジン（ＨＥ）染色の組織標本を作製し、腫瘍組織観察を行った。ＨＥ染色は、組織の形態を観察するために細胞核・細胞質を染色する方法で、もっとも標準的な組織染色法であり、組織解析に適している。【００３７】  光照射による免疫細胞の挙動を明らかにするために、細胞分析装置による解析を行った。使用した色素は２種類である。その一つはＦＩＴＣ（Fluorescein Isothiocyanate）でこの色素は４８８nmの励起光を吸収し、主に５３０nmの蛍光を発する。抗体にあらかじめＦＩＴＣを標識しておけば、細胞表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果ＦＩＴＣの蛍光強度が異なってくるために、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。他の一つはＰＥ（Phycoerythrin）を用いており、主に５８５nmの蛍光を発する。回収した脾臓細胞をこれら二つの抗体により蛍光標識し、細胞分析装置(EPICS Elite, BECKMAN COULTER)  により解析した。使用した抗体は、抗ＣＤ３，抗ＣＤ４，抗ＣＤ８，抗ＣＤ２５，抗ＣＤ２８および抗ＣＤ８０抗体である。ＣＤ３は免疫細胞の一つであるＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)を含む���きな複合体の一部であり、成熟Ｔ細胞および胸腺細胞を発現する。ＣＤ４はＭＨＣクラスII拘束性の抗原刺激活性化における補助レセプターである。ＣＤ８分子は末梢血リンパ球のＴ細胞サブセットに見られ、ＮＫ細胞のサブセットにもＣＤ抗原が見られる。ＣＤ８は補助レセプターとして、Ｔ細胞レセプターのＭＨＣクラスI拘束性抗原認識に関与し、細胞障害性Ｔ細胞マーカーとして用いられる。ＣＤ２５は活性化したＴおよびＢ細胞に存在し、活性化マクロファージやＴ細胞クローンにも見られる。ＣＤ２８は全てのＴ細胞に、ヒトではＣＤ３陽性Ｔ細胞に大半に発現しＣＤ４陽性Ｔ細胞により高頻度にＣＤ２８抗原を発現する。この抗原はＴ細胞活性化における主要な副刺激シグナルをもたらす。ＣＤ８０はＣＤ２８との結合によりＴ細胞活性化の補助刺激シグナルがでる。これらの抗体をもちいてレーザー照射による免疫活性化についての実験的確認が可能になる。実験においては細胞の調整が必要であるが、以下の方法で実施した。細胞の調整はC3H/HeNCrjマウス(８-１２週齢、雌)より回収した脾臓から脾臓細胞浮遊液を作成し、回収した細胞をカウンターにより細胞数を計測した。細胞数１×１０６cellsに対して、１０μmの蛍光標識モノクロール抗体を添加し、暗所にて氷冷しながら、４０分間放置した。反応後細胞分析装置にて細胞の発現を解析した。【００３８】  １００ｍＷ出力によるレーザー光照射時の照射部の皮膚温度の測定は、照射開始時、開始後２,４,６,８,１０分とした。その結果照射直後の温度は３４．４度、最高温度は照射開始後１０分の時点で３９．０度であった。【００３９】  前述００３４項の腫瘍細胞移植後の腫瘍形状を測定し、重量に換算する方式によって重量を算出した。この結果はレーザー照射出力５５ｍＷの場合を図２のａに、レーザー出力１００ｍＷの場合を図２のｂに、非腫瘍部へのレーザー出力１００ｍＷ照射時の腫瘍成長曲線を図２のｃに示す。目視上では照射群の腫瘍が大きく成長しない傾向がみられたが、Ｔ検定の結果では腫瘍重量の解析からは有意差は見られなかった。この理由は外見的な形状測定では判断できない腫瘍減少の要因が寄与していることが判明した。【００４０】  ＨＥ染色による腫瘍組織観察結果は非照射群（Group1）、腫瘍部照射群（Group 3）(出力１００ｍＷ)、および非腫瘍照射群（Group３ ）(出力１００ｍＷ)の腫瘍組織を図３に示した。図３のｂ，図３のｃは腫瘍細胞移植前後にレーザー光照射を行った担癌マウス腫瘍である。図の右側から表皮側を示し、左側に行くにしたがって腹腔側を現す。顕微鏡による観察は、対物レンズ倍率２倍、接眼レンズ倍率２．５倍に設定した。この標本観察結果から腫瘍部照射群の腫瘍では、腫瘍領域中の腹腔側に淡赤色の広い領域が現れ、腫瘍細胞が障害を受け、核が消失し、結合組織になっている。一方、腫瘍組織でも結合組織化した部位に近接する部分は核の消失にいたる状態を示している。非腫瘍部照射での腫瘍組織でも同様に見られた。組織標本上観察された腫瘍全体の大きさに対する、壊死あるいは結合組織化部の割合を算出すると、非照射腫瘍でほぼ０％（図３のａ）、腫瘍への照射では約５９．７％（図３のｂ）、非腫瘍部への照射では約６１．８％（図３のｃ）であり腫瘍細胞（組織）は実質的に��幅に減少していた。【００４１】  腫瘍部へのレーザー光照射における担癌マウスより回収した脾臓細胞に含まれる免疫系細胞のＣＤ発現を解析した結果を示す。それぞれ出力５５ｍＷおよび１００ｍＷにおいての結果を図４のａと図４のｂに示す。非照射部への照射出力における担癌マウスの免疫系細胞のＣＤ発現の結果を図４のｃに示す。この実験結果から照射出力５５ｍＷでの解析結果からは腫瘍細胞移植の有無による抗ＣＤ３抗体の発現に差がみられ（Ｐ＜０．０１＊）、腫瘍存在下で抗ＣＤ抗体の発現が低値であった。Group１，２，３，４においては成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞の発現に差は見られなかった。照射出力１００ｍＷでの解析結果からは、同様に腫瘍細胞移植の有無による抗ＣＤ３抗体の発現に有意差がみられ、腫瘍存在下で抗ＣＤ３抗体の発現が低値であり、Group1 とGroup ３の比較において抗ＣＤ３抗体発現に有意差がみられた（Ｐ＜０．０１＊）。また抗ＣＤ４および２８抗体において、Group 2 とGroup4 において、Group1との比較において有意差がみられ（Ｐ＜０．０１＊，Ｐ＜０．０３＊＊）、双方において高値であった（Ｐ＜０．０３＊＊）。非腫瘍部への照射を行った照射出力１００ｍＷでの解析結果からは腫瘍部への照射を行った解析結果と同様に、Group１と比較したところ、抗ＣＤ３抗体ではGroup３ とに（Ｐ＜０．０１＊）、抗ＣＤ８抗体ではGroup ２とに（Ｐ＜０．０３＊）、抗ＣＤ２８抗体ではGroup2およびGroup ４とに（Ｐ＜０．０１＊）有意差が認められた。ただし、抗ＣＤ４抗体においてはGroup ２，３，４ に有意差は認められなかった。【００４２】  以上の実験結果を整理すると以下に要約できる。１．腫瘍細胞移植前のレーザー光照射がヘルパーＴ細胞および、細胞障害性Ｔ細胞の増加に効果的であった。２．レーザー光照射によってランゲルハンス細胞が何らかの刺激をうけ、活性化し、ヘルパーＴ細胞にシグナルを伝達し、細胞障害性Ｔ細胞に刺激伝達した。３．移植後のレーザー光照射によって、成熟Ｔ細胞の発現が優位に増加した。４．ヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞は照射出力が高いほど、より効果的に増強された。５．非腫瘍部にレーザー照射を行った場合でも腫瘍部照射と同様な結果が得られた。６．すべての照射条件下において。腫瘍細胞非移植群と腫瘍細胞移植群との間に、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびマクロファージの活性化にわずかに増加現象がみられた。７．これとの対比においてＨｅーＮｅレーザー光を照射した比較実験では上記の１．９μｍで得られた実験結果と異なり、光照射が免疫系に対して有意な差異を生じなかった。なお、本実験結果については詳細を省略して結論のみを示すものとする。【００４３】  以上詳細な実験結果から１．９μｍ帯レーザー光照射によって免疫系が活性化することが示された。レーザー光の発振波長は照射部位皮膚表面から１ｍｍ以下において入射エネルギー強度が１０％程度までに減少できるものであれば同様な結果がえられることは明らかである。また免疫細胞の活性化は皮膚表皮内に存在するランゲルハンス細胞が直接関与していることは、照射光の作用距離からみても明らかであるが、しかしながらランゲルハンス細胞がどのように活性していくかの作用機序については現時点ではあたかも���ンゲルハンス細胞が抗原を捕捉したと同様な作用が光作用によって起こっていると想定しているが、前駆細胞である単球の分化によるランゲルハンス細胞数の増加の可能性も否定できない。いずれの作用機序であっても、実質的にランゲルハンス細胞が活性化し、体内免疫システムが活性化し免疫力の向上が得られたことから、本装置の有用性は明らかである。【００４４】  本発明は単独使用においては腫瘍増殖を低下させる効果を持つと同時に他の免疫活性剤等を併用することにより相加的、相乗的にがん治療方法の安全性、有効性をもたらすという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本装置の全体構成を示す説明図である。（実施例１）
【図２】のａは腫瘍部への出力５５ｍＷ照射時の腫瘍成長曲線を示す説明図である。(実施例２)          ｂは腫瘍部への出力１００ｍＷ照射時の腫瘍成長曲線を示す説明図である。(実施例２)          ｃは非腫瘍部への出力１００ｍＷ照射時の腫瘍成長曲線を示す説明図である。(実施例２)
【図３】のａは非照射群における腫瘍組織標本を示す説明図である。(実施例２)          ｂは腫瘍部への出力１００ｍＷ照射時の組織標本を示す説明図である。(実施例２)          ｃは非腫瘍部への出力１００ｍＷ照射時の組織標本を示す説明図である。(実施例２)
【図４】のａは腫瘍部への出力５５ｍＷ照射担癌マウスの免疫系細胞ＣＤ発現を示す説明図である。(実施例２)          ｂは腫瘍部への出力１００ｍＷ照射担癌マウスの免疫系細胞ＣＤ発現を示す説明図である。(実施例２)          ｃは非腫瘍部への出力１００ｍＷ照射担癌マウスの免疫系細胞ＣＤ発現を示す説明図である。(実施例２)
【符号の説明】
【００４６】実施例１における図面の符号説明を示す。  １  励起用半導体レーザー  ２  半導体レーザー駆動回路  ３  ８００ｎｍ透過、１９００ー２０００ｎｍ反射ミラー  ４  希土類元素ドープフッ化物ファイバー  ５  波長選択装置  ６  結合光学系  ７  導光ファイバー  ８  照射用ハンドピース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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