(57)【要約】【課題】      副作用等が少なく、有効に動脈硬化症、特に糖尿病の合併症である閉塞性動脈硬化症、を有効にを治療または予防できる医薬組成物を提供することを目的とする。また、動脈硬化症改善機能または予防機能を有する機能性食品及びその添加剤を提供することを目的とする。【解決手段】    センダングサ属植物を含む動脈硬化治療組成物及び機能性食品またはその添加剤により、7-ケトコレステロールによる血管内皮細胞の増殖抑制が回復し、また7-ケトコレステロールによるトロポエラスチン等の弾性繊維関連タンパクの発現抑制が見られなくなる。また、閉塞性動脈硬化症の患者に対しても、多くの指標について改善効果が認められる。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
センダングサ属植物抽出物を活性成分として含む動脈硬化症治療組成物。
【請求項２】
動脈硬化症が閉塞性動脈硬化症である、請求項1に記載の動脈硬化症治療組成物。
【請求項３】
センダングサ属植物がビデンス・ピローサである、請求項1または2に記載の動脈硬化症治療組成物。
【請求項４】
センダングサ属植物抽出物を活性成分として含む動脈硬化症予防組成物。
【請求項５】
動脈硬化症が閉塞性動脈硬化症である、請求項4に記載の動脈硬化症予防組成物。
【請求項６】
センダングサ属植物がビデンス・ピローサである、請求項4または5に記載の動脈硬化症予防組成物。
【請求項７】
センダングサ属植物抽出物を含む、動脈硬化症改善用または動脈硬化症予防用機能性食品。
【請求項８】
センダングサ属植物がビデンス・ピローサである、請求項7に記載の機能性食品。
【請求項９】
センダングサ属植物抽出物を含む、動脈硬化症改善機能または動脈硬化症予防機能を有する機能性食品用添加剤。
【請求項１０】
センダングサ属植物がビデンス・ピローサである、請求項9に記載の添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センダングサ属植物抽出物を含む動脈硬化症を治療または予防するための医薬組成物、及びセンダングサ属植物抽出物を含む動脈硬化症改善用または予防用機能性食品及びその添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビデンス・ピローサ（Bidens pilosa L.）を含むセンダングサ属植物は、日本、中国、さらに世界の熱帯地域に分布する植物であり、古くから、食用、飲用または薬草として用いられてきた。
動脈硬化は、動脈壁の脂質沈着と繊維化を主とした病変であり、その主な原因としては、脂質代謝異常、血管内膜障害、血液凝固異常等が考えられる。また、動脈硬化は加齢によって進展することは良く知られているが、その他にも動脈硬化を促進する因子が数多く存在しており、高脂質血症、高血圧症、糖尿病、肥満、喫煙その他の危険因子が知られている。動脈硬化は、大別して、大量の脂質沈着を伴うアテローム硬化症、筋型動脈の中膜に輪状の石灰化をきたす中膜動脈硬化症（Monckeberg型硬化）及び細動脈壁が肥厚し、内腔の狭窄をきたす細動脈硬化症の三つがある。なかでもアテローム硬化症は、二次的に血栓を伴い、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等の基盤となる病変であるため重要である。
アテローム硬化症の発症機序として、Rossによる傷害反応仮説があるが、これはアテローム硬化症の発端に血管内皮傷害や内皮機能障害が考えられるというものである。このような血管内皮細胞の機能障害を惹起する要因として様々な因子が挙げられるが、酸化変性を受けたLDL（酸化型LDL）がその因子の一つとして重要な役割を担うことが示唆されている。この酸化型LDLに含まれる7-ケトコレステロールについては、動脈細胞の傷害を起こし細胞のアポトーシスを招くことが知られている（非特許文献１参照）。従って、この7-ケトコレステロールの作用を指標として、動脈硬化症に対する治療または予防効果を推測することが可能である。
【０００３】
【非特許文献１】E.Nishio, S.Arimura and Y.Watanabe, Biochem.Biophys.Res. Commun. 223, 413-418 (1996)、
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、動脈硬化症を治療または予防できる医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、副作用等が少なく、有効に動脈硬化症を治療または予防できる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明はまた糖尿病の合併症である、閉塞性動脈硬化症を有効に治療または予防できる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明はまた動脈硬化症改善用または動脈硬化症予防用機能性食品を提供することを目的とする。
本発明はさらに動脈硬化症改善機能または動脈硬化症予防機能を有する機能性食品用添加剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は、センダングサ属植物抽出物を活性成分として含む動脈硬化症治療組成物またはセンダングサ属植物抽出物を活性成分として含む動脈硬化症予防組成物により達成される。
上記課題はまた、センダングサ属植物抽出物を含む、動脈硬化症改善用または動脈硬化症予防用機能性食品、及びセンダングサ属植物抽出物を含む、動脈硬化症改善機能または動脈硬化症予防機能を有する機能性食品用添加剤により達成される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の、センダングサ属植物抽出物を活性成分として含む動脈硬化症治療組成物または動脈硬化症予防組成物により、副作用なしに、動脈硬化症を治療または予防することができる。また、糖尿病の合併症である、閉塞性動脈硬化症についても、上記組成物により有効に治療及び予防することができる。
また、本発明の、センダングサ属植物抽出物を含む機能性食品により、動脈硬化症または動脈硬化の傾向を改善し、または動脈硬化症を予防することができる。
また、本発明の、センダングサ属植物抽出物を含む機能性食品用添加剤により、動脈硬化症改善機能または動脈硬化症予防機能を有する機能性食品を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
まず、本発明の組成物、機能性食品、または機能性食品添加剤の構成及び製造方法について説明する。
本発明の組成物、機能性食品、または機能性食品添加剤は、センダングサ属植物抽出物を活性成分として含むことを特徴とする。
【０００８】
〔センダングサ属植物抽出物〕
本発明に使用されるセンダングサ属植物は、特開２００１−１７８３９０号公報および特開２００１−２３３７２７号公報に記載されるように、学名ではビデンス（Bidens）属と言われる一群の植物である。種類も多岐に亘り互いに交配するので変種も多く、植物学上も混乱が見られ、学名、和名、漢名、の対応も交錯していて同定することは極めて困難であるが、本発明で用いられるセンダングサ属植物は以下に掲げるものを包含する。
【０００９】
Bidens pilosa L.（コセンダングサ、コシロノセンダングサ、咸豊草）
Bidens pilosa L. var. minor （Blume）Sherff （シロバナセンダングサ、シロノセンダングサ、コシロノセンダングサ、コセンダングサ、咸豊草）
Bidens pilosa L. var. bisetosa Ohtani et S.Suzuki（アワユキセンダングサ）
Bidens pilosa L. f. decumbens Scherff （ハイアワユキセンダングサ）
Bidens pilosa L. var. radiata Scherff （タチアワユキセンダングサ、ハイアワユキセンダングサを含むこともある）
Bidens pilosa L. var. radiata Schultz Bipontinus （シロノセンダングサ、オオバナノセンダングサ）
Bidens biternata Lour. Merrill et Sherff（センダングサ）
Bidens bipinnata L.（コバノセンダングサ、センダングサ）
Bidens cernua L.（ヤナギタウコギ）
Bidens frondosa L.（アメリカセンダングサ、セイタカタウコギ）
Bidens maximowicziana Oett（羽叶鬼針草）
Bidens parviflora Willd（ホソバノセンダングサ）
Bidens radiata Thuill. var. pinnatifida （Turcz.）Kitamura（エゾノタウコギ）
Bidens tripartita L.（タウコギ）
【００１０】
上記センダングサ属植物の中で、特にビデンス・ピローサ（Bidens pilosa）類が好ましい。
上記センダングサ属植物は通常、生の植物を天日乾燥または熱風（例えば７０〜８０℃）乾燥したもの、又は蒸気で、例えば１時間〜１時間半程度蒸した後、乾燥したものを使用してもよい。
上記センダングサ属植物の使用部位は、根、地上部（茎、葉、花等）又は全草何れの部位を用いてもよい。特に、葉及び茎の部分を使用することが効力の点において好ましい。
【００１１】
〔その他の添加剤〕
また、本発明の組成物にはさらに酸化防止の目的で他の成分または植物を加えてもよい。他の成分または植物として具体的にはアセロラ抽出物またはアセロラ等の柑橘類の果実や茶葉などが挙げられる。このような成分または植物を添加する場合には、センダングサ属植物に添加して抽出してもよく、また、抽出後に添加してもよい。このような成分は、センダングサ属植物乾燥重量に対して、乾燥重量基準で１〜５０質量％添加してもよい。
【００１２】
〔センダングサ属植物の抽出方法〕
本発明の組成物に含まれるセンダングサ属植物抽出物を得る方法の一つの実施態様を示すと、上述したようにセンダングサ属植物を乾燥したもの又は蒸気で蒸した後乾燥したものに対して、乾燥または蒸気で蒸した後乾燥し、常温又は加温下に、溶媒を添加して抽出する。抽出方法としては例えば、浸漬して静置、またはソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出物を得ることもできる。
【００１３】
抽出に使用される溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等のアルコール類、並びにこれらの含水物、アセトン、エチルメチルケトン、クロロホルム、塩化メチレン及び酢酸エチル、並びにそれらの含水物を用いてもよい。また、上記溶媒を二種以上含む混合物であってもよい。溶媒の添加量は、例えば用いる植物の合計乾燥重量１ｋｇに対して１Ｌ〜１００Ｌ程度使用することができる。
抽出時の温度は、通常、室温〜沸点程度で行うことができる。また、抽出時間は、温度や溶媒にもよるが、室温〜沸点程度で抽出を行う場合には、１〜３００時間程度の範囲にわたって行うことができる。
【００１４】
抽出液は必要により溶媒を留去濃縮して濃縮物または固形物（乾燥物）としてもよい。濃縮物として使用する場合、濃度を調整した後そのまま用いてもよい。また、抽出物は、脱色、不要物除去のため活性炭処理、ＨＰ20等の樹脂処理、低温放置、瀘過等の処理を施してから用いてもよい。さらに当該抽出物を適当な分離手段、例えばゲル瀘過法やシリカゲルカラムクロマト法、又は逆相若しくは順相の高速液体クロマト法により活性の高い画分を分画して用いることもできる。本発明においてセンダングサ属植物抽出物にはこのような分画物も含むものとする。得られた抽出物はそのまま、あるいは濃縮物または固形物（例えば粉末）としてもよい。また使用目的に応じて他の成分を混合してもよい。
【００１５】
〔動脈硬化症治療組成物または動脈硬化症予防組成物〕
本発明のセンダングサ属植物抽出物を含む動脈硬化症治療組成物または動脈硬化症予防組成物は、いずれの形態であってもよく、抽出液原液、抽出原液を水等で希釈した水溶液等の溶液、または粉末、錠剤等の形態であってもよい。錠剤等に成型する場合には従来知られている医薬上許容される担体、倍散剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いることができる。いずれの薬剤形態も、製薬分野における当業技術に基づき、当業者が適宜作成することができる。センダングサ属植物抽出物は、抽出液、または抽出物を水等で希釈または溶解した液状物として、または、粉末等の固形物として組成物に添加してもよい。
組成物の投与経路は、様々な経路が可能であるが、経口投与することが、投与も簡単であり、好ましい。
【００１６】
本発明の組成物中におけるセンダングサ属植物抽出物の含有量は、乾燥固形分重量として、5〜100質量％程度含まれることが好ましい。ただし、活性の高い分画物を用いる場合にはその活性に応じた量を用いることができる。また、下記に示す一日あたりの投与量と投与回数との関係により適宜決定することができる。
【００１７】
動脈硬化症治療組成物として用いる場合、成人について一日あたり、センダングサ属植物抽出物（乾燥固形分）に換算して0.01〜1ｇ／ｋｇ（体重）程度投与することが好ましい。
動脈硬化症予防組成物として用いる場合、成人について一日あたり、センダングサ属植物抽出物（乾燥固形分）に換算して0.01〜1ｇ／ｋｇ（体重）程度投与することが好ましい。
【００１８】
〔動脈硬化症改善用または動脈硬化症予防用機能性食品、またはその添加剤〕
本発明の動脈硬化症改善用または動脈硬化症予防用機能性食品、またはその添加剤は上述したセンダングサ属植物を含むことを特徴とする。
機能性食品の形態としては、単独に摂取するいわゆるサプリメント用食品（すなわち溶液、懸濁液、粉末、顆粒、錠剤、油状物等の加工食品）、あるいは味噌、ジャム、ドレッシング、等通常の食品、その他いずれの形態であってもよい。機能性食品の種類については特に限定されず、様々な食品が用いられる。具体的には、エキス錠、飴、菓子、健康茶などが挙げられ、特に、お茶等の飲料や味噌汁等、温かい状態で飲む食品が好ましい。
また、機能性食品の添加剤としては、溶液、粉末、タブレット、油状物いずれの形態であってもよい。添加される食品の種類については特に限定されず、上記機能性食品について挙げられた食品が挙げられる。
センダングサ属植物の使用量は、成人について一日あたり、センダングサ属植物抽出物（乾燥固形分）に換算して0.01〜1ｇ／ｋｇ（体重）程度であることが好ましいが、用いる食品の種類によって適宜決定することができる。
【００１９】
〔動脈硬化症〕
本発明において、動脈硬化症としては、アテローム硬化症、中膜動脈硬化症（Monckeberg型硬化）及び細動脈硬化等の異なる型の動脈硬化症を含む。
さらに詳細には、動脈硬化症として、ヒアリン動脈硬化症、高血圧性動脈硬化症、動脈内膜硬化症、動脈中層硬化症、結節性動脈硬化症、閉塞性動脈硬化症等が挙げられるが、本発明の組成物は特に、閉塞性動脈硬化症に対する効果が顕著であることが認められる。特に閉塞性動脈硬化症に対する効果が顕著である理由として、本発明の組成物により動脈の血流が改善されることも一因と考えられる。すなわち、ビデンス・ピローサを摂取した場合に、手足の冷感が改善される例が多数あり、またLivedo reticularisやLivedo vasculitisと呼ばれる下肢の重篤な潰瘍性疾患（夏季潰瘍）15例中13例という高率で改善が見られることが報告されており、これらの例からも動脈血流の改善効果が示唆される。
また、罹患臓器として、脳動脈、冠動脈、腎動脈、大動脈、末梢動脈等いずれも含む。本発明の組成物は特に末梢動脈硬化症に対して効果が顕著である。
【００２０】
本発明の組成物は上述した動脈硬化症の治療及び予防を目的として、上記疾患を有する、若しくは上記疾患に罹患する恐れのある患者に投与される。動脈硬化症に罹患する恐れのある患者とは、動脈硬化発症の因子である、高脂血症、高血圧症、喫煙習慣、ストレス、肥満、運動習慣、食生活、年齢等様々な因子を勘案して医師により決定される。
【００２１】
〔7-ケトコレステロールによる細胞傷害〕
本発明の組成物は、7-ケトコレステロールにより誘起された細胞障害を回復させる効果を示す。
7-ケトコレステロールは酸化LDL中に存在する動脈硬化促進因子で血管内皮細胞障害性がある。7-ケトコレステロールは動脈の細胞（内皮細胞と平滑筋細胞）を傷害し、これらを細胞死に至らせるが（図１参照）、この細胞死はDNAが分解されたために起こるアポトーシスであり、細胞の栄養不足のために起こる壊死とは区別されるものである（参照文献、1:E.Nishio, S.Arimura and Y.Watanabe, Oxidized LDL induces apoptosis in cultured smooth muscle cells: a possible role for 7-ketocholesterol, Biochem.Biophys.Res. Commun. 223, 413-418 (1996)、2:J.Yin, X.Chaufour, C.McLachlan, M.McGuire, G.White, N.King and B.Hambly, Apoptosis of vascular smooth muscle cells induced by cholesterol and its oxides in vitro and in vivo, Atherosclerosis, 148, 365-374(2000)、3:H.Sugitan, H.Wachi, R.P.Mecham and Y.Seyama, Accelerated calcification represses the expression of elastic fiber components and lysyl oxidase in cultured bovine aortic smooth muscle cells, J.Ateroscler.Thromb., 9, 292-298(2002)、4:Y.Miyashita, H.Ozaki, N.Koide, M.Otsuka, T.Oyama, Y.Hoh, T.Mastuzaka and K.Shirai, Oxysterol induced apoptosis of vascular smooth muscle cells is reduced by HMG-CoA reductase inhibitor, Pravastatin, J.Atheroscler.Throm., 9, 65-71(2002)）。
【００２２】
7-ケトコレステロールは酸化LDL中に存在する動脈硬化促進因子で血管内皮細胞障害性があり、血管内皮細胞の増殖を低下させ、内皮細胞における弾性繊維の発現を抑制する。
発明者らは、ウシ大動脈平滑筋細胞と内皮細胞を用い、7-ケトコレステロール処理による細胞増殖抑制作用を確認した。さらに同条件下で、この2種の細胞の弾性繊維関連タンパク質である、トロポエラスチン（tropoelastin）、フィブリリン（fibrillin）、リジルオキシダーゼ（lysyl oxidase）の遺伝子並びに対応するタンパク質の発現を抑制することを確認した（後述する実施例１及び２参照）。これらの弾性繊維関連タンパク質の発現低下が動脈の弾力性を低下させ、動脈硬化が発症すると考えられる。
【００２３】
発明者らはこの実験系を用いてビデンス・ピローサの効果を試験したところ、ビデンス・ピローサは、7-ケトコレステロールの細胞増殖抑制並びにこれら弾性繊維関連タンパク質の発現抑制に拮抗して用量依存的に抑制を解消することを発見した。
すなわち、本発明の組成物は内皮細胞の増殖と内皮細胞における弾性繊維の発現を促進し、抗動脈硬化作用が細胞レベルで認められる。従って、本発明の組成物は、細胞に直接作用して動脈硬化を抑制または回復させる効果があると考えられる。
【実施例】
【００２４】
本発明について以下に実施例をもって詳細に説明する。
実施例１：7-ケトコレステロールの細胞増殖阻害に対する本発明の組成物の効果
〈組成物の調製〉
ビデンス・ピローサは1g/10mLの割合で水を溶液として100℃で12時間抽出した後、上清を1500rpmで10分間遠心し、フィルターで滅菌して使用した。
【００２５】
〈細胞増殖〉
細胞計測キット（Cell counting kit-8、製造者名：同仁化学研究所）を使用して比色定量で細胞数の測定を行った。96穴マイクロタイタープレートにBEC（ウシ大動脈内皮細胞）を1×104 cell/wellで各ウェルに播種し、10％FBSを含むDMEMを用いて37℃、5％CO2条件下で培養した。24時間後、BECをPBSで2回洗浄し、0.5％透析済（dialyzed)FBSを含むDEMEに交換し、再び同条件下で培養することで、静止期に導入した。24時間後、表１に示す濃度（0.5％透析済FBSを含むDEME中の濃度）で薬物処理を行った。なお、薬物処理はビデンス・ピローサの各濃度で、30分間前処理を行った。24時間後、同様に再び薬物処理を行った。その24時間後、Cell counting kit-8溶液を各ウェルに10μLずつ添加し、更に4時間培養した。マイクロプレートリーダー（Micro Plate Reader MPR-A4i、東ソー株式会社）（測定波長450nm、対照波長600nm）で吸光度を測定し細胞数の指標とした。
【００２６】
【表１】
2005120038.tif 000002
【００２７】
得られた結果を図２に示す。
7-ケトコレステロール15μg/mLとビデンス・ピローサを同時に内皮細胞に対し処理することにより、ビデンス・ピローサは濃度依存的に細胞数の減少を抑制した。図２の２（7-ケトコレステロール処理）から明らかなように、7-ケトコレステロール（15μg/mL）単独では１のコントロールと比較して細胞数が減少した。7-ケトコレステロールとビデンス・ピローサ（1mg/mL）を同時に内皮細胞に処理すると、図２の３に示したように、1（コントロール）とほぼ同程度の細胞数を示し、7-ケトコレステロールによる細胞数の減少を抑制した。なお、図２の４に示されるように、ビデンス・ピローサ単独処理では細胞数は１のコントロールと同等以上であった。
【００２８】
実施例２：血管内皮細胞の遺伝子発現における7-ケトコレステロールの障害作用に対するビデンス・ピローサの効果
〈RNAの抽出〉
10cmシャーレにてBECがほぼ一面に増殖した時点でPBSにて2回洗浄した。その後、表２に示す濃度（0.5％透析済FBSを含むDEME中の濃度）で薬物処理を行った。なお、薬物処理はビデンス・ピローサの各濃度で、30分間前処理した。24時間後、同様に再び薬物処理を行った。その24時間後にmRNA抽出を行った。抽出は、酸性グアニジニウム チオシアネート・フェノール・クロロホルム法に準じて以下のように行なった。BSMC又はBECをPBSで1回洗浄し、Ｄ液（4Mグアニジニウム チオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、0.5％Na-ザルコシル、0.1M 2−メルカプトエタノール）を加えて、BSMC又はBECを溶解した。溶解した試料に4M酢酸ナトリウム、pH4.0フェノール−クロロホルム−イソミルアルコール（125:24:1）を順次加え、添加毎によく混和して4℃で20分間放置した。その後、10,000rpmで4℃で20分間遠心分離し、RNAとDNAを分離した。遠心分離した水層（上層）を別のチューブに分取し、等量のイソプロパノールを加え、よく混和して−20℃で1時間放置した。10,000rpmで4℃で20分間遠心分離して上清を除去後、沈殿したRNAを再びD液で十分溶解して等量のイソプロパノールを加えて、前述のようにRNAを沈殿させた。沈殿したRNAを80％エタノールで洗浄し、nuclear-free-water（Ambion）で溶解して、凍結乾燥後、再度一定量のnuclear-free-waterで溶解して、260nmの吸光度を測定し、総RNA濃度を算出した。
【００２９】
【表２】
2005120038.tif 000003
【００３０】
〈相補鎖DNAの合成と逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）〉
抽出したRNAを鋳型としてTE（tropoelastin）、Fib-1（fibrillin）、LO(lysyl oxidase）、GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)のそれぞれのmRNA発現をRT-PCRにて解析した。具体的には、RNA 1μgとアンチセンスプライマー20pmolにH2O 9μLを加え、72℃で10分間変性させた後、氷上で10分間放置した。その後、RT反応緩衝液（1stストランド緩衝液4μL、100mMジチオスレイトール2μL、10mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート、RNase阻害剤1μL）を加え、42℃で2分間反応させ、また、M-MLVリバーストランスクリプターゼ1μLを加え、再び、42℃で1時間逆転写反応を行い、cDNAを作製した。その後、70℃で15分間、4℃で2分間インキュベートし、合成したcDNAを鋳型とし、PCR法にてTE、Fib-1、LOとGAPDH遺伝子断片の増幅を行なった。センスプライマー20pmol、TaqDNAポリメラーゼ2.5μL、PCR緩衝液（10倍濃度、MgCl2含有）8μL、H2O 68.5μLを順次加え、4℃で8分間、94℃で5分間インキュベートを行なった後PCR反応を行なった。熱変性を94℃で1分間、アニーリング反応を60℃で30秒間行い、伸長反応を72℃で90秒間行い、これを1サイクルとして30サイクル繰り返した。PCR反応の後、エチジウムブロミド1μg／mL含有2%アガロースゲルで電気泳動し、紫外線照射下、目的バンドを可視化した。なお、使用したプライマーについては以下に示す（参照文献:H.Sugitan, H.Wachi, R.P.Mecham and Y.Seyama, J.Ateroscler.Thromb., 9, 292-298(2002)）。
【００３１】
ウシTE
アンチセンスプライマー  5'-GGAGAAGTGCTAATGAAGTACAGTG-3'
センスプライマー        5'-CACTCTCCATCTCTAGGGGAACTTG-3'
ウシFib-1
アンチセンスプライマー  5'-TTGGTAACAGCACCAAACAAGG-3'
センスプライマー        5'-TCTTACACCTGTCAGTGCCGAC-3'
ウシGAPDH
アンチセンスプライマー  5'-ATACTTGGCAGGTTTCTCCAGG-3'
センスプライマー        5'-ATCAATGACCCCTTCATTGACC-3'
ラットLO
アンチセンスプライマー  5'-CCTGTGTAGCGAATTTCACAGC-3'
センスプライマー        5'-ATGTACAACCTGAGATGCGCTG-3'
【００３２】
〈結果〉
得られた結果を図３に示す。
図３から、7-ケトコレステロール15μg/mLとビデンス・ピローサ1mg/mLを同時に処理することにより、7-ケトコレステロールにより発現が抑制されたトロポエラスチン、フィブリリン、及びリジルオキシダーゼの各mRNAの回復が認められる。一方、GAPDHは細胞の代謝（糖の分解系、解糖系）の酵素であり、細胞機能を示すものであるが、このmRNAの発現が一定であることから、7-ケトコレステロールによる細胞傷害は、細胞機能全般に及ぶものではなく、トロポエラスチンをはじめとする弾性繊維関連タンパクが特異的に減少したものであり、ビデンス・ピローサはこの弾性繊維関連タンパクのmRNAの発現抑制を回復し得たものである。
【００３３】
実施例３：糖尿病患者における閉塞性動脈硬化症に対する本発明の組成物の効果
〈組成物の調製〉
ビデンス・ピローサ（タチアワユキセンダングサ）を流水で洗浄して異物を取り除いた後、数センチ程度に裁断した。裁断物を底が網状の円筒形容器に入れ、１時間〜１時間半程度蒸気で蒸煮した。その後ニーダーで圧潰し、７０〜８０℃程度の熱風で乾燥した（特開平２００１−１７８３９０号公報参照）。
得られた乾燥物１３０ｇ及び焙煎した大麦１５０ｇ、乾燥生姜１０ｇの混合物を均一に混合して１包３ｇのティーバッグに仕立てた。このティーバッグ１個を約２ Ｌの水を加えて５分間煮沸抽出し、その全量を１日で飲んでもらい、これを３カ月間毎日行った。
【００３４】
〈臨床試験〉
実験は、閉塞性動脈硬化症を伴う糖尿病患者15名(男性9名、女性6名、年齢55〜84歳、平均年齢69.8歳)により行った。各被験者について、飲用前及び飲用3カ月後における下記各数値を測定して比較し、本発明の効果を評価した（表３〜表８）。
【００３５】
表３〜表８において評価した項目について、評価方法及び評価基準を簡単に説明する。
表３：試験前後の患者の血液を採取し、末梢血液への効果を評価した。
・RBC（Red Blood Cell）：血液中の赤血球の濃さ。酸素運搬能力を示す。基準値  男427〜570、女376〜500。
・WBC（White Blood Cell）：白血球数のレベル。免疫抵抗力を示す。基準値  男3.9〜9.8×103、女3.5〜9.1×103。
・Hgb（Hemoglobin）：赤血球中の血色素の濃さを示す。基準値  男13.5〜17.6、女11.3〜15.2。
・Ht（Hematocrit）：赤血球、白血球、血小板などの血球成分の嵩を示す。基準値  男39.8〜51.8、女33.4〜44.9。
・Thromb（Thrombocyte）：血小板濃度。低いと血液が凝固しにくいことを示す。基準値  男女13.0〜36.9。
【００３６】
表４：試験前後の患者の血液を採取し、肝機能及び血中脂質濃度に及ぼす影響について評価した。
・GOT（Glutamic Oxaloacetic Trancsaminnase）：肝機能の指標。基準値  男女 10〜40。
・GPT（Glutamic Pyruvic Transaminase）：肝機能の指標。基準値  男女5〜45。
・γ-GTP（γ-Glutamyl Transeptidase）：肝機能の指標。基準値  男＜75、女＜45。
・T-ch（Total cholesterol）：善玉＋悪玉コレステロール総量。基準値150〜220。高すぎても低すぎてもよくない。
・HDL-ch（High Densiy Lipid cholesterol）：善玉コレステロール。高いほど良好。基準値  男40〜80、女40〜85。
・TG（Total Glyceride）：総脂質。高いほど血液濃度が高くドロドロする。基準値  男女35〜149。
・BNP(Brain Natriuretic Peptide): 冠動脈狭窄の有無の指標。この数値が高いと、狭窄（詰まり）があることを示す。基準値＜18.4。
【００３７】
表５：試験前後の患者の血液を採取し、動脈硬化の指標としてアジポネクチン及びTNF-αを測定した。
・アジポネクチン(Adiponectin): 血管壁障害の有無の指標。アジポネクチンは脂肪細胞から主に分泌され血管内皮細胞からも分泌される。血中に5〜10μg/ml存在し、動脈硬化の初期の段階で、単球の血管内皮細胞への接着の抑制や平滑筋細胞の増殖抑制作用など、動脈硬化の進展を抑制する作用を発揮する。糖尿病患者、肥満者、内臓脂肪蓄積者で低下しており、動脈硬化の基盤となっているものと見られている。
・TNF-α（Tumor Necrosis Factor）：腫瘍壊死因子の一つ。TNF-αは主に単球マクロファージから分泌されるサイトカインで、インスリン作用を減弱させ、糖尿病の進展を促進し、動脈硬化へと導く。
・BUN（Blood Urea Nitrogen）：血中尿素態窒素。腎機能低下で高くなる。基準値  男女 8〜12。
・SCr（Serum Creatinin）：血中クレアチニン。腎機能低下で高くなる。基準値  男0.7〜1.3、女0.5〜1.0。
【００３８】
表６：試験前後において、患者の下肢のサーモグラフィー負荷試験の回復率を評価した。試験方法は、皮膚表面（下肢）をアルコールで拭い、蒸散熱による皮膚温低下の回復率を、サーモグラフィーで測定し対照と比べた。
・R-ratio（Recovery ratio）：サーモグラフィー負荷試験の回復率。
【００３９】
表７：試験前後における患者の血圧を測定した。
・SBP（Systolic Blood Pressure）：収縮期血圧。
・DBP（Diasolic Blood Pressure）：拡張期血圧。
【００４０】
表８：試験前後における患者のPWV（脈波伝播速度）、ABI(足首最高血圧／上腕最高血圧比)、UTを測定した。
・PWV(Pulse Wabe Velocity (cm/sec)、脈波伝播速度): 動脈壁の硬化度を示す指標。この数値が大きいほど動脈壁が固いことを示すが、狭窄していると値が小さくなる。従ってABI＞0.8のあまり狭窄が無い状態における動脈の固さを表す。基準値＝1600cm／sec。
・ABI(Ankle/Brachial Index、足首最高血圧/上腕最高血圧比): 動脈の詰まりの指標であり、動脈血流を反映する。0.9以下の数値は、症状の有無に関わらず閉塞性動脈硬化症が疑われる。
・UT(Upstroke Time (msec)、波形の立ち上がりからピークまでの時間): 動脈の狭窄を示す指標。動脈の狭窄があるとこの時間が長くなる。動脈腔内径を反映する。基準値＝180msec。
【００４１】
【表３】
2005120038.tif 000004
n:14,  M±SEM
【００４２】
【表４】
2005120038.tif 000005
n:14,  M±SEM
【００４３】
【表５】
2005120038.tif 000006
n:14, M±SEM     *1：P<0.02(服薬前との比較） *2：P<0.05(服薬前との比較)）
【００４４】
【表６】
2005120038.tif 000007
【００４５】
【表７】
2005120038.tif 000008
n:14, M±SEM
【００４６】
【表８】
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n:14,   M±SEM   *3 ：P<0.05(服薬前との比較）  rt：right, lt:left
【００４７】
〈結果〉
表３の結果から、本発明の組成物の摂取による末梢血液の血球に関しては影響がほとんど無いことが分かる。
表４の結果から、有意差検定を行ったところ、GPTのみが有意差があり肝機能の改善傾向が見られた。その他、有意差はなかったがγ-GTP、血糖、総コレステロール、中性脂肪は低下傾向にあり、HDL-コレステロールは上昇傾向にあっておおむね良好に推移している。冠動脈狭窄の指標であるBNP（脳性ナトリウム利尿ペプチド）は幾分上昇しているが意味のある変化ではないと考えられる。
表５の結果から、アジポネクチンは有意に増加し、TNF-αは有意に減少したことがわかる。このことから、本発明の組成物の摂取により、動脈硬化が改善傾向にあることがわかる。またBUN（血中尿素態窒素）とSCｒ（血中クレアチニン）の変化は見られず腎機能には影響がなかったものと考えられる。
表６のサーモグラフィー測定の結果、R-ratio（回復率）が上昇していることは末梢の血液循環が改善されてきたものと考えられる。すなわち動脈硬化が改善され血管の狭窄が緩和される傾向にあると考えられる。
表７の血圧については有意差はないが平均値では低下傾向にあり動脈硬化の改善の方向と整合する。
表８の脈波伝播速度（PWB）は左右とも低下し、有意差はないものの動脈硬化改善の方向と整合する。またＡＢＩ（Ankle／Brachial Index、足首最高血圧／上腕最高血圧比）値も右は微増、ＵＴ値も僅かながら低下し、いずれも改善傾向に整合している。
以上のように、本発明の組成物の摂取により、糖尿病に伴う閉塞性動脈硬化の症状が改善する傾向が有意に見られた。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】7-ケトコレステロールと動脈硬化発症との関係を示す図である。
【図２】血管内皮細胞における7-ケトコレステロールの障害作用に対するビデンス・ピローサの作用を示す図である。
【図３】血管内皮細胞における遺伝子発現に対する7-ケトコレステロールとビデンス・ピローサの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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