(57)【要約】【課題】  培養容器内に雑菌が混入することを完全に防止することが出来、然も、初心者であっても容易に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る自動継代培養装置を提供する。【解決手段】  本発明の自動継代培養装置においては、複数の培養容器1a〜1cが配置され、これらの培養容器には、培地が収容された培地供給タンク２、洗浄液が収容された洗浄液供給タンク３、剥離液が収容された剥離液供給タンク４、及び処理容器５が接続されている。３つのタンク２〜４と複数の培養容器1a〜1cとの間にはバルブ31a〜31c、複数の培養容器1a〜1cと処理容器５との間にはバルブ32a〜32cが介在する。処理容器５内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ50が設けられると共に、該処理容器５には、フィルタ50を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されている。【選択図】      図１
2005198626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着系細胞の継代培養を行なう装置であって、複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、１つの共通の処理容器が接続されており、各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構、剥離液供給機構及びバルブ手段には、これらの機構の動作及びバルブ手段の開閉を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置。
【請求項２】
前記処理容器の排水口には、排水口から排出された培地、洗浄液及び剥離液を回収する排水機構が接続されており、該排水機構は、前記制御装置によって動作が制御されている請求項１に記載の自動継代培養装置。
【請求項３】
前記処理容器には、前記フィルタ手段の出口側に、第２の培地供給機構が接続されており、該培地供給機構は、前記制御装置によって動作が制御されている請求項２に記載の自動継代培養装置。
【請求項４】
前記複数の培養容器に接続された培地供給機構は、培地が供給された培地供給タンクと、前記複数の培養容器と培地供給タンクとの間に介在する培地供給用バルブとを具え、洗浄液供給機構は、洗浄液が供給された洗浄液供給タンクと、前記複数の培養容器と洗浄液供給タンクとの間に介在する洗浄液供給用バルブとを具え、剥離液供給機構は、剥離液が供給された剥離液供給タンクと、前記複数の培養容器と剥離液供給タンクとの間に介在する剥離液供給用バルブとを具え、前記排水機構は、前記処理容器から排出された培地、洗浄液及び剥離液を収容するための廃液タンクと、前記処理容器と廃液タンクとの間に介在する排水バルブとを具え、前記第２の培地供給機構は、培地が供給された第２の培地供給タンクと、前記処理容器と第２の培地供給タンクとの間に介在する第２の培地供給用バルブとを具えている請求項３に記載の自動継代培養装置。
【請求項５】
付着系細胞の継代培養を行なうべく複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、１つの共通の処理容器が接続されており、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構及び剥離液供給機構には、これらの機構の動作を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置を用いた継代培養方法であって、
前記複数の培養容器の内、一部の１或いは複数の培養容器に付着系細胞及び培地を収容して該細胞を培養する工程と、
前記１或いは複数の培養容器内の培地を処理容器に流入させる工程と、
洗浄液供給機構により洗浄液を前記１或いは複数の培養容器に供給し、該容器内の細胞を洗浄する工程と、
前記１或いは複数の培養容器内の洗浄液を処理容器に流入させる工程と、
剥離液供給機構により剥離液を前記１或いは複数の培養容器に供給し、該容器から細胞を剥離する工程と、
前記１或いは複数の培養容器内の細胞及び剥離液を処理容器に流入させる工程と、
前記洗浄液供給機構により洗浄液を少なくとも１つの培養容器に供給し、処理容器内の細胞を洗浄する工程と、
培地を処理容器に供給する工程と、
処理容器内の細胞及び培地を前記１或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する工程
とを有している継代培養方法。
【請求項６】
付着系細胞の継代培養を行なうべく複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、１つの共通の処理容器が接続されており、各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されており、培地供給機構、洗浄液供給機構、剥離液供給機構及びバルブ手段には、これらの機構の動作及びバルブ手段の開閉を制御する制御装置が接続されている自動継代培養装置を用いた継代培養方法であって、
前記複数の培養容器の内、一部の１或いは複数の培養容器に付着系細胞及び培地を収容して該細胞を培養する工程と、
前記１或いは複数の培養容器と処理容器との間に介在する１或いは複数のバルブ手段を開放して前記１或いは複数の培養容器内の培地を処理容器に流入させる工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段を閉止して洗浄液供給機構により洗浄液を前記１或いは複数の培養容器に供給し、該容器内の細胞を洗浄する工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段を開放して前記１或いは複数の培養容器内の洗浄液を処理容器に流入させる工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段を閉止して剥離液供給機構により剥離液を前記１或いは複数の培養容器に供給し、該容器から細胞を剥離する工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段を開放して前記１或いは複数の培養容器内の細胞及び剥離液を処理容器に流入させる工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段の内、少なくとも１つのバルブ手段を開放した状態で、前記洗浄液供給機構により洗浄液を少なくとも１つの培養容器に供給し、処理容器内の細胞を洗浄する工程と、
培地を処理容器に供給する工程と、
前記１或いは複数のバルブ手段よりも多くのバルブ手段を開いて、処理容器内の細胞及び培地を前記１或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する工程
とを有している継代培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーザの手動操作によることなく自動的に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る装置及びこれを用いた継代培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞のクローン化や細胞の変異化等を目的として継代培養が行なわれている。
細胞には浮遊系細胞と付着系細胞の２種類が存在し、付着系細胞の継代培養においては、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Salts)を用いて細胞を洗浄する作業、トリプシンを用いて培養容器から細胞を剥離する作業、トリプシンと細胞とを分離する作業、培養した細胞を複数の培養容器に分配する作業等、多数の作業が行なわれる。
【０００３】
尚、培養容器内の培地を循環させることが可能な培養装置(特許文献１及び２)や、培養容器内の培地を自動的に交換することが可能な培養装置が提案されている(特許文献３及び４)。
又、自動的に継代培養を行なうことが出来る培養装置が提案されているが、該培養装置は、浮遊系細胞を継代培養の対象とするものである(特許文献５)。
【特許文献１】特開平５−２６０９５８号公報
【特許文献２】特開平５−２７６９２２号公報
【特許文献３】特開平８−１７２９５６号公報
【特許文献４】特開２００２−２６２８５６号公報
【特許文献５】特開平６−３０７６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、付着系細胞の継代培養においては、細胞及び培地が収容された培養容器をインキュベータから取り出して上述の作業を行なっていたため、培養容器内に雑菌が混入することがあった。
又、付着系細胞の継代培養においては、多数の作業を行なわねばならず、付着系細胞の継代培養は初心者にとって困難である問題があった。
そこで本発明の目的は、培養容器内に雑菌が混入することを完全に防止することが出来、然も、初心者であっても容易に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る自動継代培養装置及びこれを用いた継代培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る自動継代培養装置は、付着系細胞の継代培養を行なうものであって、複数の培養容器が配置され、これら複数の培養容器には、これらの培養容器に培地を供給する培地供給機構、これらの培養容器に細胞を洗浄するための洗浄液を供給する洗浄液供給機構、及びこれらの培養容器に該容器から付着系細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構が接続されると共に、１つの共通の処理容器が接続されている。各培養容器と処理容器との間にはバルブ手段が介在し、処理容器内には、培地、洗浄液及び剥離液が通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ手段が設けられると共に、該処理容器には、フィルタ手段を通過した培地、洗浄液及び剥離液を外部へ排出するための排水口が開設されている。そして、培地供給機構、洗浄液供給機構、剥離液供給機構及びバルブ手段には、これらの機構の動作及びバルブ手段の開閉を制御する制御装置が接続されている。
【０００６】
上記本発明に係る自動継代培養装置を用いた継代培養においては、先ず、複数の培養容器の内、一部の１或いは複数の培養容器に付着系細胞及び培地を収容して該細胞を培養し、その後、１或いは複数のバルブ手段を開放する。これによって、前記１或いは複数の培養容器内の培地が、バルブ手段を通過して処理容器に流入し、更にフィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。一方、付着系細胞は、培養容器内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
続いて、前記１或いは複数のバルブ手段を閉止して、洗浄液供給機構により前記１或いは複数の培養容器に洗浄液を供給する。供給された洗浄液は培養容器に溜まり、該容器内の細胞はその洗浄液によって洗浄されることになる。その後、前記１或いは複数のバルブ手段を開放する。これによって、前記１或いは複数の培養容器内の洗浄液は、バルブ手段を通過して処理容器に流入し、更にフィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。一方、付着系細胞は、培養容器内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
【０００７】
次に、前記１或いは複数のバルブ手段を閉止して、剥離液供給機構により前記１或いは複数の培養容器に剥離液を供給する。供給された剥離液は培養容器に溜まり、該容器に付着している細胞はその剥離液によって容器から剥離されることになる。その後、前記１或いは複数のバルブ手段を開放する。これによって、前記１或いは複数の培養容器内の細胞及び剥離液は、バルブ手段を通過して処理容器に流入する。処理容器に流入した細胞は、フィルタ手段により受け止められて処理容器内に残存する一方、剥離液はフィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。
続いて、前記１或いは複数のバルブ手段の内、少なくとも１つのバルブ手段を開放した状態で、前記洗浄液供給機構により少なくとも１つの培養容器に洗浄液を供給する。培養容器に供給された洗浄液は、前記少なくとも１つのバルブ手段を通過して処理容器に流入し、該容器内の細胞はその洗浄液によって洗浄されることになる。その後、洗浄液は、フィルタ手段を通過して排水口から外部へ排出される。
次に、培地を処理容器に供給する。例えば、前記処理容器には、前記フィルタ手段の出口側に第２の培地供給機構が接続されており、該培地供給機構により処理容器に培地が供給される。又、少なくとも１つのバルブ手段を開放して、培養容器に接続された培地供給機構により少なくとも１つの培地容器に培地を供給し、該培地を処理容器に流入させることも可能である。
最後に、前記１或いは複数のバルブ手段よりも多くのバルブ手段を開放して、処理容器内の細胞及び培地を前記１或いは複数の培養容器よりも多くの培養容器に分配する。この様にして、１回の継代が終了する。
【０００８】
具体的には、前記処理容器の排水口には、排水口から排出された培地、洗浄液及び剥離液を回収する排水機構が接続されており、該排水機構は、前記制御装置によって動作が制御されている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る自動継代培養装置によれば、培養容器に付着系細胞及び培地を収容する作業を行なえば、その後は、自動的に継代培養に必要な一連の処理が実行されるので、初心者であっても容易に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る。
又、継代培養に必要な全ての処理が密閉系内で行なわれるので、培養容器内に雑菌が混入することはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づき具体的に説明する。尚、以下では、３つの培養容器を具えた自動継代培養装置について説明するが、４以上の培養容器を具えた自動継代培養装置についても同様に実施可能である。
図１は、本発明に係る自動継代培養装置の系統図を表わしており、該自動継代培養装置においては、３つのプラスチック製の培養容器(1a)(1b)(1c)が配置され、これらの容器には夫々、溶液供給用配管(10a)(10b)(10c)が接続されている。第１の溶液供給用配管(10a)の途中に、第３の溶液供給用配管(10c)の終端が接続され、該溶液供給用配管(10c)の途中に、第２の溶液供給用配管(10b)の終端が接続されている。
第１の溶液供給用配管(10a)の終端には、３本の配管(11a)(11b)(11c)が接続されており、これらの配管の終端には夫々、細胞を培養するための栄養分を含む培地が収容された培地供給タンク(２)、細胞を洗浄するための洗浄液であるＰＢＳが収容されたＰＢＳ供給タンク(３)、及び培養容器に付着した細胞を該容器から剥離するための剥離液であるトリプシンが収容されたトリプシン供給タンク(４)が接続されている。
【００１１】
第１の溶液供給用配管(10a)には、第３の溶液供給用配管(10c)との接続位置よりも上述の３つのタンク(２)(３)(４)側に、溶液供給用ポンプ(20)が取り付けられると共に、該接続位置よりも培養容器(1a)側に、溶液供給用バルブ(30a)が取り付けられている。又、第２の溶液供給用配管(10b)の途中にも、溶液供給用バルブ(30b)が取り付けられており、第３の溶液供給用配管(10c)にも、第２溶液供給用配管(10b)との接続位置よりも培養容器(1c)側に、溶液供給用バルブ(30c)が取り付けられている。
又、培地供給タンク(２)、ＰＢＳ供給タンク(３)及びトリプシン供給タンク(４)に接続された上述の３つの配管(11a)(11b)(11c)の途中には夫々、培地供給用バルブ(31a)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)及びトリプシン供給用バルブ(31c)が取り付けられている。
培地供給用バルブ(31a)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、培地供給用タンク(２)内の培地が第１の培養容器(1a)に供給され、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳが第１の培養容器(1a)に供給される。又、トリプシン供給用バルブ(31c)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を開放すると共に溶液供給用ポンプ(20)を駆動することによって、トリプシン供給用タンク(４)内のトリプシンが第１の培養容器(1a)に供給される。同様にして、培地供給用タンク(２)内の培地、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳ及びトリプシン供給タンク(４)内のトリプシンが第２及び第３の培養容器(1b)(1c)に供給される。
【００１２】
又、上述の３つの培養容器(1a)(1b)(1c)には夫々、接続用配管(12a)(12b)(12c)が接続されており、これらの配管の終端には、１つの円柱状処理容器(５)が接続され、これらの配管の途中には夫々、流出遮断バルブ(32a)(32b)(32c)及び細胞計数センサ(40a)(40b)(40c)が取り付けられている。
第１の流出遮断バルブ(32a)を開放することによって、第１の培養容器(1a)内の溶液が処理容器(５)に供給されると共に、処理容器(５)内の溶液が第１の培養容器(1a)に供給される。同様にして、第２及び第３の培養容器(1b)(1c)内の溶液が処理容器(５)に供給されると共に、処理容器(５)内の溶液が第２及び第３の培養容器(1b)(1c)に供給される。
細胞計数センサ(40a)(40b)(40c)は、接続用配管(12a)(12b)(12c)内を通過する溶液に含まれる細胞の数を計数するためのものであって、例えば光センサによって構成される。
【００１３】
上記処理容器(５)の下部には、培地、ＰＢＳ及びトリプシンが通過可能であって細胞の通過を阻止するためのフィルタ(50)が取り付けられている。尚、該フィルタ(50)は、成長した大きな細胞の通過を阻止できるものであればよく、成長していない小さな細胞の通過をも阻止できるものでなくてもよい。又、該処理容器(５)の底部には、排水口(図示省略)が開設されており、該排水口には、排水用配管(13)が接続されている。排水用配管(13)の終端には、廃液タンク(６)が接続され、排水用配管(13)の途中には、排水ポンプ(21)及び排水バルブ(33)が取り付けられている。
上述の第１流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放すると共に、排水ポンプ(21)を駆動することによって、第１の培養容器(1a)内の溶液が廃液として廃液タンク(６)に収容される。同様にして、第２及び第３の培養容器(1b)(1c)内の溶液が廃液として廃液タンク(６)に収容される。ここで、該溶液に含まれている細胞は、フィルタ(50)に受け止められて、フィルタ(50)の表面に堆積する。
【００１４】
又、上記処理容器(５)には、フィルタ(50)よりも下方位置に、培地供給用配管(14)が接続されており、該配管(14)の終端には、培地が収容された培地供給用タンク(７)が接続され、該配管(14)の途中には、処理容器(５)から培地供給用タンク(７)へ溶液が流入することを防止するための逆止め弁(60)と、培地供給用ポンプ(22)が取り付けられている。培地供給用ポンプ(22)を駆動することによって、培地供給用タンク(７)内の培地が処理容器(５)に供給される。
更に、上記処理容器(５)には、フィルタ(50)よりも上方位置に、細胞取出し用配管(15)が接続されており、該配管(15)の途中には、細胞取出し用バルブ(34)が取り付けられている。該バルブ(34)を開放することによって、処理容器(５)内の細胞及び培地が外部に取り出される。
図１に示すバルブ(30a)〜(34)及びポンプ(20)〜(22)には、例えばマイクロコンピュータからなる制御回路(図示省略)が接続されており、該制御回路によって、これらのバルブの開閉及びポンプの駆動が制御されている。
【００１５】
上記自動継代培養装置による一連の継代培養動作について、図１〜図１０に基づき具体的に説明する。尚、継代培養の開始時には、全てのバルブは閉止されている。
付着系細胞と培地を第１の培養容器(1a)に収容した後、先ず工程Ｐ１では、図２及び図４に示す如く、該培養容器(1a)内の細胞の一次培養を行なう。
続いて工程Ｐ２では、図１０に示す如く、第１流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放すると共に、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、第１培養容器(1a)内の培地が、第１接続用配管(12a)及び第１流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(５)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
【００１６】
次に工程Ｐ３では、先ず、第１流出遮断バルブ(32a)を閉止する一方、第１溶液供給用バルブ(30a)及び図１に示すＰＢＳ供給用バルブ(31b)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳが配管(11b)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給される。ここで、第１流出遮断バルブ(32a)は閉止されているので、第１培養容器(1a)に供給されたＰＢＳは該容器内に溜まり、該容器内の細胞はＰＢＳによって洗浄されることになる。
その後、第１溶液供給用バルブ(30a)及びＰＢＳ供給用バルブ(31b)を閉止する一方、第１流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、第１培養容器(1a)内のＰＢＳが、第１接続用配管(12a)及び第１流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(５)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
【００１７】
続いて工程Ｐ４では、先ず、第１流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を閉止する一方、第１溶液供給用バルブ(30a)及びトリプシン供給用バルブ(31c)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、トリプシン供給タンク(４)内のトリプシンが配管(11c)、トリプシン供給用バルブ(31c)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給される。ここで、第１流出遮断バルブ(32a)は閉止されているので、第１培養容器(1a)に供給されたトリプシンは該容器内に溜まり、該容器内に付着している細胞はトリプシンによって容器から剥離されることになる。
次に、第１溶液供給用バルブ(30a)の開放状態及び溶液供給用ポンプ(20)のオン状態を維持して、トリプシン供給用バルブ(31c)を閉止する一方、培地供給用バルブ(31a)を開放する。これによって、培地供給タンク(２)内の培地が配管(11a)、培地供給用バルブ(31a)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給され、培地によって該容器(1a)内のトリプシンの作用が止められることになる。
【００１８】
その後、工程Ｐ５では、第１溶液供給用バルブ(30a)及び培地供給用バルブ(31a)を閉止する一方、第１流出遮断バルブ(32a)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、第１培養容器(1a)内の混合溶液、即ち細胞、トリプシン及び培地の混合溶液が、第１接続用配管(12a)及び第１流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(５)に流入する。処理容器(５)に流入した混合溶液に含まれる細胞は、図５に示す如くフィルタ(50)により受け止められてフィルタ(50)の表面に堆積するのに対し、トリプシン及び培地は、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。ここで、フィルタ(50)には、一次培養開始時の細胞数の約３倍の細胞が堆積する。
【００１９】
続いて工程Ｐ６では、先ず、第１流出遮断バルブ(32a)の開放状態を維持して、排水バルブ(33)を閉止する一方、第１溶液供給用バルブ(30a)及び図１に示すＰＢＳ供給用バルブ(31b)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳが配管(11b)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給される。ここで、第１流出遮断バルブ(32a)は開放されているので、第１培養容器(1a)に供給されたＰＢＳは、第１接続用配管(12a)及び第１流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(５)に流入する。処理容器(５)に流入したＰＢＳは、該容器(５)に溜まり、フィルタ(50)の表面に堆積している細胞はＰＢＳによって洗浄されることになる。
その後、第１溶液供給用バルブ(30a)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)及び第１流出遮断バルブ(32a)を閉止する一方、排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、処理容器(５)内のＰＢＳは、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。
【００２０】
次に工程Ｐ７では、排水バルブ(33)を閉止する一方、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、培地供給用ポンプ(22)をオンに設定する。これによって、培地供給用タンク(７)内の培地が、培地供給用配管(14)、培地供給用ポンプ(22)及び逆止め弁(60)を通過して処理容器(５)に供給される。処理容器(５)に供給された培地はフィルタ(50)を通過し、フィルタ(50)の表面に堆積していた細胞は、培地に押し流されて、図６に示す如く処理容器(５)内で培地と略均一に混ざり合う。更に培地を処理容器(５)に供給することによって、細胞及び培地の混合溶液は、３本の接続用配管(12a)〜(12c)及び流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を通過して、図７に示す如く３つの培養容器(1a)〜(1c)に供給される。このとき、細胞計数センサ(40a)〜(40c)の出力信号に基づいて、接続用配管(12a)〜(12c)をそれぞれ通過した細胞の数が計数され、計数結果に応じて、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)の開度が制御される。この様にして、処理容器(５)内の混合溶液が３つの培養容器(1a)〜(1c)に均等に分配されることになる。
その後、工程Ｐ８では、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を閉止すると共に、培地供給用ポンプ(22)をオフに設定して、３つの培養容器(1a)〜(1c)内の細胞の二次培養を行なう。
【００２１】
続いて工程Ｐ９では、図１、図３及び図１０に示す如く、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を開放すると共に、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、３つの培養容器(1a)〜(1c)内の培地が、接続用配管(12a)〜(12c)及び流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を通過して処理容器(５)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)〜(1c)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
【００２２】
次に工程Ｐ１０では、先ず、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を閉止する一方、３つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)及びＰＢＳ供給用バルブ(31b)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳが配管(11b)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給される。又、第１溶液供給用配管(10a)内のＰＢＳが第３溶液供給用配管(10c)に流入し、第３溶液供給用バルブ(30c)を通過して第３培養容器(1c)に供給され、更に、第３溶液供給用配管(10c)内のＰＢＳが第２溶液供給用配管(10b)に流入し、第２溶液供給用バルブ(30b)を通過して第２培養容器(1b)に供給される。ここで、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)は閉止されているので、培養容器(1a)〜(1c)に供給されたＰＢＳは該容器内に溜まり、該容器内の細胞はＰＢＳによって洗浄されることになる。
その後、３つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)及びＰＢＳ供給用バルブ(31b)を閉止する一方、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、培養容器(1a)〜(1c)内のＰＢＳが、接続用配管(12a)〜(12c)及び流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を通過して処理容器(５)に流入し、更にフィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。一方、付着系細胞は、培養容器(1a)〜(1c)内に付着しているため、該容器内に残存することになる。
【００２３】
続いて工程Ｐ１１では、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を閉止する一方、３つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)及びトリプシン供給用バルブ(31c)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、トリプシン供給タンク(４)内のトリプシンが、上述のＰＢＳと同様の経路で３つの培養容器(1a)〜(1c)に供給される。ここで、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)は閉止されているので、培養容器(1a)〜(1c)に供給されたトリプシンは該容器内に溜まり、該容器内に付着している細胞はトリプシンによって容器から剥離されることになる。
次に、３つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)の開放状態及び溶液供給用ポンプ(20)のオン状態を維持して、トリプシン供給用バルブ(31c)を閉止する一方、培地供給用バルブ(31a)を開放する。これによって、培地供給タンク(２)内の培地が、上述のＰＢＳと同様の経路で３つの培養容器(1a)〜(1c)に供給され、培地によって培養容器(1a)〜(1c)内のトリプシンの作用が止められることになる。
【００２４】
その後、工程Ｐ１２では、３つの溶液供給用バルブ(30a)〜(30c)及び培地供給用バルブ(31a)を閉止する一方、３つの流出遮断バルブ(32a)〜(32c)及び排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、培養容器(1a)〜(1c)内の混合溶液、即ち細胞、トリプシン及び培地の混合溶液が、接続用配管(12a)〜(12c)及び流出遮断バルブ(32a)〜(32c)を通過して処理容器(５)に流入する。処理容器(５)に流入した混合溶液に含まれる細胞は、図８に示す如くフィルタ(50)により受け止められてフィルタ(50)の表面に堆積するのに対し、トリプシン及び培地は、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。ここで、フィルタ(50)には、一次培養の開始時の細胞数の約９倍の細胞が堆積する。
【００２５】
続いて工程Ｐ１３では、先ず、第１流出遮断バルブ(32a)の開放状態を維持して、第１溶液供給用バルブ(30a)及びＰＢＳ供給用バルブ(31b)を開放する。又、排水ポンプ(21)をオフに設定する一方、溶液供給用ポンプ(20)をオンに設定する。これによって、ＰＢＳ供給タンク(３)内のＰＢＳが配管(11b)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)、第１溶液供給用配管(10a)、溶液供給用ポンプ(20)及び第１溶液供給用バルブ(30a)を通過して第１培養容器(1a)に供給される。ここで、第１流出遮断バルブ(32a)は開放されているので、第１培養容器(1a)に供給されたＰＢＳは、第１接続用配管(12a)及び第１流出遮断バルブ(32a)を通過して処理容器(５)に流入する。処理容器(５)に流入したＰＢＳは、該容器(５)内に溜まり、フィルタ(50)の表面に堆積している細胞はＰＢＳによって洗浄されることになる。
その後、第１溶液供給用バルブ(30a)、ＰＢＳ供給用バルブ(31b)及び第１流出遮断バルブ(32a)を閉止する一方、排水バルブ(33)を開放する。又、溶液供給用ポンプ(20)をオフに設定する一方、排水ポンプ(21)をオンに設定する。これによって、処理容器(５)内のＰＢＳは、フィルタ(50)、排水用配管(13)、排水バルブ(33)及び排水ポンプ(21)を通過して廃液タンク(６)に収容されることになる。
【００２６】
続いて工程Ｐ１４では、排水バルブ(33)を閉止すると共に排水ポンプ(21)をオフに設定し、培地供給用ポンプ(22)をオンに設定する。これによって、培地供給タンク(７)内の培地が培地供給用配管(14)、培地供給用ポンプ(22)及び逆止め弁(60)を通過して処理容器(５)に供給される。処理容器(５)に供給された培地は、フィルタ(50)を通過し、フィルタ(50)の表面に堆積していた細胞は、培地に押し流されて、図９に示す如く処理容器(５)内で培地と略均一に混ざり合う。
【００２７】
最後に工程Ｐ１５では、培地供給用ポンプ(22)をオフに設定した後、細胞取出し用バルブ(34)を開放することによって、処理容器(５)内の混合溶液、即ち細胞と培地の混合溶液の一部を試験管に注入し、細胞の品質検査を行なった後、残りの混合溶液を後工程へ供給する。或いは、細胞と培地の混合溶液を図１に示す培養容器に収容し、三次培養を行なう。
【００２８】
本発明に係る自動継代培養装置においては、第１の培養容器(1a)に付着系細胞及び培地の混合溶液を収容する作業を行なうだけで、自動的に工程Ｐ１〜Ｐ１５が実施されるので、初心者であっても容易に付着系細胞の継代培養を行なうことが出来る。
又、工程Ｐ１〜Ｐ１５の全ての工程が密閉系内で実施されるので、培養容器内に雑菌が混入することはない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係る自動継代培養装置の系統図である。
【図２】上記自動継代培養装置における一連の継代培養動作の前半を表わす工程図である。
【図３】上記動作の後半を表わす工程図である。
【図４】一次培養工程における装置内の状態を表わす図である。
【図５】一次培養後のフィルタ処理工程における装置内の状態を表わす図である。
【図６】一次培養後の培地供給工程における装置内の状態を表わす図である。
【図７】二次培養工程における装置内の状態を表わす図である。
【図８】二次培養後のフィルタ処理工程における装置内の状態を表わす図である。
【図９】二次培養後の培地供給工程における装置内の状態を表わす図である。
【図１０】上記自動継代培養装置における一連の継代培養動作を表わすタイムチャートである。
【符号の説明】
【００３０】
(1a)〜(1c)  培養容器
(２)  培地供給タンク
(３)  ＰＢＳ供給タンク
(４)  トリプシン供給タンク
(５)  処理容器
(６)  廃液タンク
(７)  培地供給タンク
(20)  溶液供給用ポンプ
(21)  排水ポンプ
(22)  培地供給用ポンプ
(30a)〜(30c)  溶液供給用バルブ
(31a)  培地供給用バルブ
(31b)  ＰＢＳ供給用バルブ
(31c)  トリプシン供給用バルブ
(32a)〜(32c)  流出遮断バルブ
(33)  排水バルブ
(34)  細胞取出し用バルブ
(40a)〜(40c)  細胞計数センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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