(57)【要約】【課題】  変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法を提供すること。【解決手段】  細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、細胞の試料におけるテロメラーゼ活性の存在または量を決定し；そして細胞において検出されたテロメラーゼ活性の存在または量を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、の各工程を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、
細胞の試料におけるテロメラーゼ活性の存在または量を決定し；そして細胞において検出されたテロメラーゼ活性の存在または量を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、
の各工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞老化の治療および診断方法ならびに不死化に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の記載は、発明関連分野についての一般的記載である。本発明の先行技術は認められない。一般的には、この技術は、細胞老化、およびかかる加齢ならびに細胞が老化を免れる機構、そして不死化を説明する理論または仮説に関する。
【０００３】
正常なヒト・体細胞（例えば、繊維芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞）は、豊富な増殖因子の存在にかかわらず、５０〜１００回の集団倍加という限定された複製能を示す。このインビトロでの増殖の休止は、細胞老化または細胞の加齢によると言われることが多い。ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ），サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４９巻，１１２９頁（１９９０年）；ヘイフリック（Ｈａｙｆｌｉｃｋ）およびムーアヘッド（Ｍｏｏｒｅｈｅａｄ）イクスペ・セル・リサ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）第２５巻，５８５頁（１９６１年），ヘイフリック、同，第３７巻；６１４頁（１９８５年）；オーノ（Ｏｈｎｏ）メカ・エイジング・ディベ（Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．）第１１巻，１７９頁（１９７９年）；ニューヨークのアカデミック・プレスのメソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（ダブリュ・ビー・ジャコビー（Ｗ．Ｂ．Ｊａｃｏｂｙ）およびアイ・エム・パスタン（Ｉ．Ｍ．Ｐａｓｔａｎ）編）第５８巻；４４〜９３頁，ハム（Ｈａｍ）およびメキーハン（ＭｃＫｅｅｈａｎ），（１９７９年）「メディア・アンド・グロウス・リクワイアメンツ（Ｍｅｄｉｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）」参照。細胞の複製的寿命は、ドナーのインビボにおける年齢に反比例する（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、ラボ・インベスティ（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）第２３巻，８６頁（１９７９年）；ゴールドステインら、プロ・ナショ・アカデ・サイ・ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）第６４巻，１５５頁，（１９６９年）；およびシュナイザー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）およびミツイ（Ｍｉｔｓｕｉ），同，第７巻；３５８４頁（１９７６年））。それゆえ、細胞老化は、インビボにおける加齢において重要な役割を果していることが示唆される。
【０００４】
細胞の不死化（無限の複製能の獲得）は、細胞老化からの正常でない回避であると考えられる（シェイ（Ｓｈａｙ）ら、イクス・セル・リサ、第１９６巻；３３頁（１９９１年））。正常なヒト・体細胞は、死ぬべきものと考えられる。すなわち、限定された複製能を有すると考えられている。対照的に、悪性腫瘍細胞系列は無限の増殖能を有する。インビトロで培養されたヒト・細胞は、不死化し、ついで、１０-6ないし１０-7の不死化頻度となるためには形質転換性ウィルスの腫瘍蛋白の助けが必要である（シェイおよびライト（Ｗｒｉｇｈｔ），イクスペ・セル・リサ，第１８４巻，１０９頁（１９８９年）。数年来、細胞老化の原因を説明するために、種々の仮説がたてられた。かかる仮説の例を以下に記載するが、コンセンサスは得られておらず、あるいは一般的に受け入れられているものでもない。
【０００５】
例えば、ＤＮＡおよび他の巨大分子に対するフリーラジカルにより媒介されるダメージは、細胞機能の重大な損失により引き起こされるという加齢についてのフリーラジカル説がある（ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ジャーナル・ジェロントロ（Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．）第１巻，２９８頁（１９５６年）；ハーモン，ジャーナル・ジェロントロ，第１６巻，２４７頁（１９６１年））。ハーマン（Ｈａｒｍａｎ）は、「加齢はフリーラジカル反応によるダメージによるところが大きい．．．．．．．．」と言っている（ハーマン，プロ・ナショ・アカデ・サイ・ユーエスエイ，第７８巻，７１２４頁（１９８１年）。
【０００６】
老廃物蓄積説は、加齢している細胞における色素抱合体（しばしばリポフクシンと呼ばれる）の進行しつつある蓄積は、徐々に正常な細胞機能を阻害するということを提唱する（ストレーラー（Ｓｔｒｅｈｌｅｒ），アド・ジェロント・リサ（Ａｄｖ．Ｇｅｒｏｎｔ．Ｒｅｓ．）第１巻，３４３頁（１９６４年）；ボーン（Ｂｏｕｒｎｅ），プログ・ブレイン・リサ（Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．）第４０巻，１８７頁（１９７３年）；ヘイフリック，イクス・ジェロントロ，第２０巻，１４５頁（１９８５年））。
【０００７】
徐々に体細胞が変異するという説は、放射線および他の手段による体細胞に対する遺伝的ダメージの進行性蓄積が細胞機能に影響し、遺伝的組み換えなしに変異が起こる（例えば、系列細胞の減数分裂中に、体細胞が不明確に増殖する能力を失う）ということを提唱する（バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔ），「イントリンシック・ミュタジェネシス−ア．ジェネティック・アプローチ・トゥ・エイジング（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ−Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｇｉｎｇ）」，ニューヨークのワイル（Ｗｙｌｅ），１９７６年；ヘイフリック，イクス・ジェロントロ，第２７巻，３６３頁，１９９２年）。遺伝的にプログラムされた老化に関する理論は、老化特異的遺伝子の発現が、実際に、細胞増殖を阻害することを示唆している（マーティンら、アメ・ジャーナル・パソロ（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ）第７４巻，１３７頁（１９７４年）；ゴールドステイン，サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４９巻，１１２９頁（１９９０年））。
【０００８】
スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびホイットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ），サイエンス第２０７巻，８２頁（１９８０年）には、細胞加齢に関する機構が議論されており、そのデータには、「遺伝的にコントロールされた末端分化の過程と両立して．．．．．．．増殖能が徐々に減少することも、ダメージやエラーの継続的な発生と矛盾しない。これは理論づけられた過程である。しかしながら、特に有糸分裂のペアーにおけるさまざまな倍加能は、分裂におけるダメージまたはエラーの等分でない分配を示唆する。」とある。
【０００９】
シェイら、イクスペリメンタル・ジェロントロジー第２７巻、４７７頁（１９９２年）、およびイクスペ・セル・リサ第１９６巻，３３頁（１９９１年）には、ヒト・細胞を不死化させるシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０  Ｔ−抗原の能力を説明するためのヒト・細胞死滅に関する２段階モデルが記載されている。死滅段階１の機構（Ｍ１）は、ある種の腫瘍ウイルス蛋白の標的であり、独立した死滅段階２の機構（Ｍ２）は危機的状況を作り出し、これらの腫瘍ウイルスが直接ヒト・細胞を死滅させることを妨げる。該著者らは、マウス・腫瘍ウイルスプロモーターにより駆動されるＴ−抗原を用いて可逆的な細胞の不死化を引き起こした。シミアンウイルス４０  Ｔ−抗原は、ヒト・繊維芽細胞の複製的寿命をさらに４０〜６０％延長させると言われている。その著者らは、Ｍ１機構は、種々の細胞蛋白に結合しているか、またはＭ１死滅機構を抑制する新たな活性を誘導するＴ−抗原により打破されると考えている。次に、Ｍ１機構が遮断されたとしても、Ｍ２機構は増殖の休止を引き起こす。Ｍ２死滅機構までも妨げられた場合に不死化が達成される。
【００１０】
細胞の限定された複製能は、染色体のテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）（末端部分）におけるＤＮＡ合成と同様の「時計」の作用を反映しているかも知れないとも提案されている。オロフニコフ（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ），ジャーナル・オブ・セオレティカル・バイオロジー（Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第４１巻，１８１頁（１９７３年）には、体細胞における細胞倍加能の制限を説明するために、辺縁系切開（ｍａｒｇｉｎｏｔｏｍｙ）の理論が記載されている。該著者は、「テロメア遺伝子に続いてＤＮＡ中に構築され、分化のリプレッサーの合成を抑制する情報を有するオリゴヌクレオチドは、形態形成の仮定において行われる有糸分裂を継続させるための手段として役立つ。かかるヌクレオチドの辺縁系切開的除去は、さらなる分化の開始の適当な信号を提供するであろう。テロメア遺伝子の延長は、分化における可能な有糸分裂の回数を増加させるであろう。」と述べている。
【００１１】
ハーリー（Ｈａｒｉｅｙ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３４５巻，４５８頁（１９９０年）には、インビトロ（そしておそらくインビボにおいても）における加齢の間の一連の継代に対する機能として、ヒト・繊維芽細胞中のテロメアＤＮＡの量および長さが減少するが、このＤＮＡの損失が老化の原因としての役割を有するかどうかは不明であると述べられている。該著者らは、さらに、「腫瘍細胞は、短縮されたテロメアおよび増加し異数体になる頻度（テロメアの会合を含む）によっても特徴づけられる。テロメアＤＮＡが究極的に正常細胞における細胞周期の停止を引き起こすならば、この過程の最終段階は不死細胞中に固定されうる。比較的長いテロメアおよび老化の表現形を有する正常細胞は、テロメア活性が殆ど無いかまたは有していない可能性があるが、短いテロメアを有する腫瘍細胞は、有意なテロメア活性を有しうる。それゆえ、テロメラーゼは抗癌剤にとって有効な標的でありうる。．．．．．．．不完全な複製、末端の分解（特異的または非特異的）、および短いテロメアを伴う細胞の選択に関連した不平等な組換えをはじめとする加齢の間のテロメアＤＮＡの損失についての多くの可能な機構がある。我々のデータの２つの特徴はこの問題に関連している。まず、平均テロメア長の減少は平均集団倍加あたり約５０ｂｐであり、次に、その分散は増殖状態または細胞活動停止に関連しては実質的に変化しない。その３’末端の鋳型鎖の不完全なコピーにより、これらのデータは最も簡単に説明される。しかし、テロメアにおける複製様式または組換の程度についての詳細なデータがないことにより、これらの機構をいずれも除外できないことが意味される。さらなる研究を行って、ヒト・繊維芽細胞におけるテロメア短縮の機構およびその細胞老化に対する意義を調べる必要がある。」〔引用省略〕と述べている。
【００１２】
結腸腫瘍細胞について議論しているハスティ（Ｈａｓｔｉｅ）ら、ネイチャー第３４６巻，８６６頁（１９９０年）には、「同じ患者の正常な結腸粘膜に対してテロメア繰り返し配列の長さの減少がある。．．．．．．確証は得られていないが、成長した胎児の組織は２０〜５０回の細胞分裂により生じるが、６０才のヒト・結腸粘膜および血液細胞は数百または数千回の細胞分裂により生成される。よって、テロメア減少の程度は、多かれ少なかれ細胞分裂回数に比例している可能性がある。正常なテロメアのないドロソフィア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）の染色体の末端のサイズが１回の細胞分裂で４ｂｐずつ小さくなること、および酵母染色体末端は、テロメア機能を欠くと見られる変異株において同程度に減少することが示されている。ヒト・組織において体細胞分裂の間に同じ割合で減少していると考えるならば、ＴＲＡにおける１４ｋｂの減少は、３５００回の母細胞の分裂により６０才のヒトの血中細胞が生産されることを意味するのである。これとは別に、精子のテロメア長の評価を用いて、我々は、１０００〜２０００回という値を得た。これらの値は、マウス・血液細胞について仮定される値とうまく比較される。よって、我々はテロメラーゼが体組織において実際には欠乏していると提案する。この点において、トウモロコシの破壊された染色体は、胞子体組織（接合組織）においてのみ治癒されるが、胚乳（末端が分化している）においては治癒されないことは注目すべきことであり、分化した組織においてテロメラーゼ活性が欠乏していることを示唆するものである。」〔引用省略〕と述べられている。
【００１３】
該著者らは、ある種の腫瘍においては、テロメラーゼ活性を有することが知られている培養中のＨｅＬａ細胞について提案されたように、テロメラーゼが再活性化されると提案している。しかし、該著者らは、「われわれの知見に関する１つの別の説明は、腫瘍においては、短いテロメアを有する細胞は、長いテロメアを有する細胞よりも増殖において有利な面を有するということである。テトラヒメナの増殖性細胞について記載された状況」〔引用省略〕と述べている。
【００１４】
ハーリー，ミューティション・リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２５６巻，２７１頁（１９９１年）には、ヒト・体細胞のテロメアは、複製に依存したやり方でインビトロおよびインビボ両方における加齢を短縮する有糸分裂の時計として作用することを示すという伝聞した観察結果が議論されている。該著者は、「テロメラーゼの活性化は遅く、不死化における出来事に従属するものであるかも知れない。なぜならば、多くの形質転換細胞および腫瘍組織は、非常に短いテロメアを有するからである。よって、テロメア長およびテロメラーゼ活性は、細胞の複製履歴および増殖能のマーカーであるように思われる。テロメアの損失は遺伝的な時限爆弾であり、それゆえ、時々、細胞の老化および不死化に必要とされるという興味深い可能性が残っている。．．．．．．．種々の腫瘍組織または形質転換細胞系においてテロメア長は明らかに安定であるにもかかわらず、通常、この長さはもとの組織のテロメア長よりも短いように思われた。これらのデータは、テロメラーゼは、細胞の形質転換の最終段階で活性化され、細胞は、テロメラーゼにより安定に維持された短いテロメアを有しながら生きることができたことを示唆するものである（遺伝的には不安定であるにもかかわらず）。もし、テロメラーゼが正常細胞の小断片中に構成的に存在しており、これらが生存の危機に瀕するか、または形質転換されたものならば、我々は長いテロメアを有する形質転換細胞をずっと頻繁に見いだすことができると考えられる。」〔引用省略〕と述べている。
【００１５】
該著者は、ヒト・細胞の加齢および形質転換についての半定量的モデルにおいて、テロメアおよびテロメラーゼは、細胞老化および癌において偶発的な役割を果たしているという仮説を提案し、そして、この仮説に関するモデルを提案している。
【００１６】
ド・ランゲ（Ｄｅ  Ｌａｎｇｅ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第１０巻，５１８頁（１９９０年）において、ヒト・染色体末端またはテロメアについて一般的に議論されている。該著者らは、「テロメアの減少が細胞増殖と厳密に関連しているかどうかを我々は知らない。もし、減少がテロメアの不完全な複製により起こるのであれば、かかる関連がありうると考えられる。しかしながら、遺伝子の末端からの分解のごとき他の機構が細胞分裂とは独立して作用しているかも知れない。いかなる場合においても、テロメアの維持は体細胞において損なわれていることは明らかである。はっきりと減少し、損失していく活性がテロメラーゼである。Ｇに富むプライマーにＴＴＡＧＧＧの反復を付加することのできるヒト・テロメラーゼ活性が最近になって同定された（ジー・モリン（Ｇ．Ｍｏｒｉｎ），個人的情報）。興味深いことに、該活性はＨｅＬａ細胞の抽出液中に示され、我々は、該細胞が例外的に長いテロメアを有することを見いだした。他の細胞についてはまだ試験していないが、テロメラーゼ活性が（部分的に）ヒト・染色体末端の変動の原因であるかどうかについて、かかる実験を行って明らかにできるだろう。」と述べている。
【００１７】
スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎｇ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１８巻，６８８１頁（１９９０年）には、マウスが長いテロメアを有することが示されており、ヒト・テロメアとの関連においてこの長さについて議論されている。該著者らは、「最近、インビボにおけるヒト・繊維芽細胞の継代数にともないＴＲＡ長さが減少すること、および、老化細胞は、ある種の末端においてテロメアを全く欠いていることが示された。よって、インビトロにおけるテロメア損失は、老化において役割を果たしている。エス・セレビシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）においてそのシナリオは明らかである。我々が研究したある種のマウスは老齢（１年半）であるが、研究した組織すべてにおいてまだ３０ｋｂ以上のＴＲＡを有している。ヒトにおいては、年齢とともに１年に１００ｂｐの割合でテロメアが短縮されている。それゆえ、同じことがマウスに起こっていると考えられるが、その生涯における末端ＤＮＡの数百ｂｐの除去が検出されなかったのである。」〔引用省略〕と述べている。
【００１８】
ド・メロ（Ｄ’Ｍｅｌｌｏ）およびジャズウィンスキ（Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ），ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１７３巻，６７０９頁には、「我々は、生物が生きている間には、テロメアの短縮は正常な加齢過程においては役割を果たさないと提案する。しかしながら、他のすべての遺伝的変化のような、テロメラーゼ活性に影響する変異または外部からの遺伝的変化により、それぞれの寿命が影響されるのかもしれない。．．．．．．要約すると、ヒト・２倍体繊維芽細胞における加齢に伴うテロメアの短縮は、一般的現象とは言えないかも知れない。さらなる研究を行って、異なる種類の老化細胞のみならず、異なる寿命の異なる生物における同じ細胞型においてもテロメア長およびテロメラーゼ活性を調べる必要がある。これにより、テロメア短縮が、特別な細胞型または生物の老化に、偶発的に役割を果たしているかどうかが示されるであろう。」と述べられている。
【００１９】
ヒヤマ（Ｈｉｙａｍａ）ら、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）第８３巻、１５９頁（１９９２年）には、「テロメアの反復の減少は神経芽細胞の増殖能に関連しており、神経芽細胞の攻撃性の有用な指標と考えられる。．．．．．神経芽細胞におけるテロメアの反復の減少または延長の機構については不明であるが、少なくとも、テロメアの反復の長さが神経芽細胞の進化および／または退化に関連している可能性があることはわかっている。」と述べられている。
【００２０】
カウンター（Ｃｏｕｎｔｅｒ）ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第１１巻，１９２１頁（１９９２年）には、「細胞増殖の間のテロメアＤＮＡの損失は、加齢および癌化において役割をはたしている可能性がある。」と述べられている。該著者らは、テロメラーゼの発現は、細胞が不死性を獲得するために必要な１つの出来事であると提案しており、「このモデルは、インビボにおける癌発生と直接関連がありうる。例えば、部分的に形質転換された（不死化の前の）テロメラーゼを欠いている細胞の限定された寿命により、インビボにおける限定された増殖の後の頻繁な癌の退化が説明されうる。正常な複製の老化を示すチェックポイントを迂回した場合、形質転換により、さらに２０〜４０回の集団倍加が起こり、この間さらに約２ｋｂｐのテロメアＤＮＡが失われる。２０〜４０回の倍加（１０6〜１０12個の細胞となる）により、潜在的に広範囲の腫瘍サイズが示されるため、多くの良性腫瘍がテロメラーゼを欠いているかもしれず、テロメアが非常に小さくなった時に自然に退化するのである。我々は、より攻撃的な、おそらく転移性の腫瘍は、テロメラーゼを発現する不死化した細胞を含んでいるのであろう。この仮説を確かめるために、我々は、現在、種々の腫瘍組織からテロメラーゼを検出して活性と増殖能を関連づけようとしている。テロメラーゼ発現を抑制する抗テロメラーゼ剤または機構は、テロメアおよび継続的な細胞増殖に関して酵素に依存している癌に対する効果的な試薬でありうる。」と述べている。
【００２１】
レビー（Ｌｅｖｙ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）第２２５巻，９５１頁には、「テロメアの損失が多細胞生物の老化に関与するということは証明されていないが、いくつかの証拠により、偶発的な関連が存在することが示唆されている。．．．．．．．．加齢に伴うテロメアの損失はヒトにおいては重要であるが、マウスにおいては重要でない。」〔引用省略〕と述べられている。
【００２２】
ウィンドル（Ｗｉｎｄｌｅ）およびマクガイア（ＭｃＧｕｉｒｅ），プロシーディングス・オブ・ザ・アメリカン・アソシエイション・フォー・キャンサー・リサーチ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第３３巻，５９４頁（１９９２年）には、テロメアの役割について議論されており、「これらの、および他のテロメアの関する研究は、治療目標および癌撲滅の対策に関して新たな方向を示すものである。もし、細胞が破壊された染色体を治癒し、遺伝的不都合を回避できるならば、この方法を容易にし、あるいは人工的に作り出す方法が存在しうる。このことは、特に高い危険性を伴う患者に適用可能な、癌抑止のための予防的手段を提供するであろう。正常対腫瘍細胞のテロメア長の相違はまた、テロメアの損失が加速される場合の対策を示唆するであろう。転移性腫瘍細胞のごとき最も短いテロメアを有する細胞が最も感受性が高い。」と述べられている。
【００２３】
ゴールドステイン，サイエンス第２４９巻，１１２９頁（１９９０年）において、テロメアの減少についての理論を含め、細胞老化に関する種々の理論について議論されている。該著者は、「しかしながら、かかる機構は、融合ハイブリッド、特に短期間のヘテロカリオンにおける若いＨＤＦに対する老化したＨＤＦの優位性と容易には一致しない。１個または数個のテロメアの完全な損失が、ＤＮＡ合成の開始を阻害し、そのことにより分化状態を擬態する負の信号を発信するという従属状態およびＲＡＤ９遺伝子についての概念を再度導入することができよう。この考えは、推論的ではあるが、老化による複製の停止のみならず老化ＨＤＳに見られるテロメアの損失後の染色体の変化をも説明するものである。」〔引用省略〕と述べている。
【００２４】
さらに、ジャンコビッツ（Ｊａｎｋｏｖｉｃ）らおよびハスティ（Ｈａｓｔｉｅ）ら（いずれもネイチャー第３５０巻（１９９１年））により癌におけるテロメアの損失の役割が議論されている。その中で、ジャンコビッツは、テロメアの短縮はヒトおよびマウスにおける発癌に有意な影響を及ぼしそうにないことを示している。ハスティらは、もし、テロメアの減少が実際に細胞のターンオーバーを反映するのであれば、そのことに同意している。この現象は、小児癌および中枢神経の癌においては役割を果たしそうもないと述べている。しかしながら、ハスティらは、「我々の最もオリジナルで興味深い結論は、テロメアの損失が組織の履歴における細胞分裂の回数を反映し、１種の時計を構成しうるというものであった。」と述べている。
【００２５】
キプリング（Ｋｉｐｌｉｎｇ）およびクーク（Ｃｏｏｋｅ），ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第１巻，３頁（１９９２年）には、「ヒトの胚系細胞（例えば精子）におけるテロメアは、血液のごとき体組織の細胞におけるテロメアよりも長いことが知られるようになったのはここ数年のことである。このことに対する提案された１つの説明は、体細胞におけるテロメアの反復の付加の欠如（すなわちテロメア活性の欠如）である。もしそうであれば、不完全な末端の複製が、体細胞が連続的な分裂をへて経験するような末端部の反復の進行的損失を引き起こすと考えられる。このことは、実際には、ドナーの年齢が増加するにつれて短くなるテロメアを有するヒトの血液細胞および皮膚細胞について、インビボで何が起こるかということである。そして、テロメアの損失は、老化細胞に典型的に見られる染色体の変化に関与しうる。老化および細胞時間の測定は興味深く結び付いた主題であり、普通はどの程度までテロメアが短縮されるのかを調べるのは興味あることであろう。若いマウスおよび老マウスいずれにもある大きなテロメアは、テロメアの損失と加齢との単純な関連づけを妨げるものであるように思われるが、より丹念なスキームを排除するものではない。」と述べられている。
【００２６】
グレイダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ），バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）第１２巻，３６３頁は、テロメア，テロメラーゼおよび老化の間の関係についてのレビューを提供する。該著者は、テロメラーゼが、テロメアの反復の合成のための鋳型を提供するＲＮＡ成分を含んでいることを示している。該著者は、「該ＲＮＡに相補的であり、ＧＡＡＣＣＣＣＡＡ配列を含み、ｄ（ＴＴＧＧＧＧ）、プライマーと競争し、インビトロでテロメラーゼ活性を阻害する」オリゴヌクレオチドについて記載している（グレイダーおよびブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ），ネイチャー第３３７巻，３３１頁（１９８９年）を引用）。該著者は、「テロメラーゼがインビボにおけるテロメア合成に必要であるという直接的証拠を提供する」と確信する実験について記載している。該著者は、さらに、「多くの形質転換された細胞系におけるテロメアの制限断片は、体細胞のそれよりずっと小さい。さらに、腫瘍組織中のテロメア長は、隣接している腫瘍でない組織中のそれより有意に短い。形質転換細胞系が継代された場合には、テロメア長は変化しない。よって、形質転換されていない細胞がテロメア長の平衡を維持する能力を欠いているならば、大部分の形質転換細胞はその能力を回復し、平衡テロメア長をインビボにおける大部分の組織に見られるサイズよりも小さいサイズにリセットすると考えられる。これらのデータの最も単純な解釈は、テロメア長を維持するのに必要なテロメラーゼのごとき酵素が、形質転換細胞の増殖に必要であり、正常な体細胞の生存には必要でないということである。このことは、テロメラーゼが抗癌剤の好ましい標的でありうることを示唆する。」〔引用省略〕と述べている。
【００２７】
ブラックバーン，ネイチャー第３５０巻、５６９頁（１９９１年）には、テロメアにおける薬剤の作用についての潜在能力について議論されており、「テロメアのＧに富む鎖は、別々のＲＮＡ配列をコピーすることにより合成されることが知られている染色体ＤＮＡ配列にのみ必須である。テロメアＤＮＡのこのユニークな合成方法および特別な構造ならびに振舞いは、テロメア合成は選択的な薬剤の作用の標的となりうることを示唆する。テロメラーゼ活性は原虫および酵母にとり必須であると思われるが、哺乳動物の体細胞にとっては必須かどうかは明らかでない。著者は、伝染性原虫または病原微生物のごとき真核細胞の病原性あるいは伝染性微生物に対する薬剤の標的としてテロメアが調査されることを期待する。テロメラーゼに選択的に結合する薬剤（その逆転写酵素に結合する性質またはＤＮＡ基質に結合する性質いずれによってもよい）は、下等真核細胞の分裂の長期にわたる維持には選択的に作用するが、短時間では哺乳動物宿主を損なわないであろう。なぜならば、その体細胞中のテロメラーゼ活性は、通常は低いかまたは無いかであるからである。検討されているはっきりとした一群の薬剤は、他のＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼに対抗するものとしての逆転写酵素に特異的に指向される薬剤、およびテロメアＤＮＡ自体に結合する薬剤である。これらは、染色体末端のＧに富む鎖の突起部分のＧ０Ｇ塩基対の形態に選択的に結合する薬剤を包含するか、または不適当なＧ０Ｇ塩基対の形態を安定化して、インビボにおける適切な機能にとり必要な構造に適合しないようにしておく薬剤を包含する。テロメアは、染色体のアキレスけんとして記載されてきた。おそらく、薬剤による方法が現在目的となっている。」〔引用省略〕と述べられている。
【００２８】
ルンドブラッド（Ｌｕｎｄｂｌａｄ）およびブラックバーン，セル（Ｃｅｌｌ）第７３巻，３４７頁（１９９３年）には、酵母のテロメアの維持に関する別の経路が議論されており、「．．．．．この論文の研究は、テロメア複製の欠損は、必ずしもすべての細胞の死滅を引き起こすものではないことを示している。そしてテロメアの損失およびその哺乳動物細胞の老化との関連が、さらに研究されなくてはならない。」と述べられている。
【００２９】
テロメアに関する他のレビュー論文としては、ブラックバーンおよびソスターク（Ｓｚｏｓｔａｋ），アニュ・レビ・バイオケミ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第５３巻，１６３頁（１９８４年）；ブラックバーン，ネイチャー第３５０巻，５６９頁（１９９１年）；グレイダー，セル第６７巻，６４５頁（１９９１年）、およびモイジス（Ｍｏｙｚｉｓ），サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）第２６５巻，４８頁（１９９１年）が挙げられる。テロメアの種々の態様についての関連論文としては、クークおよびスミス，コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クワンタテイティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第ＬＩ巻，２１３〜２１９頁；モリン（Ｍｏｒｉｎ），セル第５９巻，５２１頁（１９８９年）；ブラックバーンら、ジェノム（Ｇｅｎｏｍｅ）第３１巻，５５３頁（１９８９年）；ソスターク，ネイチャー第３３７巻，３０３頁（１９８９年）；ゴール（Ｇａｌｌ），ネイチャー第３４４巻，１０８頁（１９９０年）；ヘンダーソン（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻，７８３２頁（１９９０年）；ゴットシュリング（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ）ら、セル第６３巻，７５１頁（１９９０年）；ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）およびグレイダー，ネイチャー第３５３巻，４５１頁（１９９１年）；ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、セル第６７巻，８１５頁（１９９１年）；ユー（Ｙｕ）およびブラックバーン，セル第６７巻，８２３頁（１９９１年）；およびグレイ（Ｇｒａｙ）ら、セル第６７巻，８０７頁（１９９１年）が挙げられる。いくらか関連のある他の論文または議論としては、ルンドバルドおよびソスターク，セル第５７巻，６３３頁（１９８９年）；およびユーら，ネイチャー第３４４巻，１２６頁（１９９０年）が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明は、テロメア長およびテロメラーゼ活性の調節に関連した方法を用いる細胞老化の治療および予防方法および不死化に関する。本発明治療方法は、テロメアの繰り返し部分の長さの損失の速度またはその損失の絶対量を減少させること、あるいは細胞増殖の間にテロメアの反復の長さを増加させることにより、細胞の老化を遅らせ、そして染色体の融合のレベルおよび他の染色体の変化を減少させることを包含する。さらに、インビボまたはインビトロにおけるテロメラーゼ活性の阻害を用いて新生物および病原性伝染病のごとき細胞の不死化に関連した疾患をコントロールする。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、細胞の試料におけるテロメラーゼ活性の存在または量を決定し；そして細胞において検出されたテロメラーゼ活性の存在または量を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、の各工程を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、細胞の試料におけるテロメアの長さを決定し；そして決定されたテロメア長を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、の各工程を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明はまた、細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、細胞の試料の増殖能力を決定し；そして細胞の増殖能力を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、の各工程を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、細胞の試料における変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患を検出する方法であって、細胞の試料におけるテロメラーゼの存在または量を決定し；そして細胞において検出されたテロメラーゼの存在または量を、変化したテロメラーゼ活性のレベルに関連する状態または疾患と関連づける、の各工程を含む方法を提供する。
【００３５】
出願人は、インビトロにおけるテロメアの短縮を抑制することが、偶然にも、細胞の複製的寿命の長さの延長に関連していることを見いだした。出願人は、インビトロにおける細胞のテロメラーゼ活性を阻害することが、偶然にも、細胞の不死的方法での増殖能を減少させることを見いだした。よって、出願人は、まず、インビボまたはインビトロにおいてテロメアの短縮を抑制すること、およびインビボまたはインビトロにおいてテロメラーゼ活性を阻害することが治療的に有利であることを明確に示すデータを提供する。出願人の実験以前には、上記したように、かかる実験が出願人により観察されたデータを提供すること、あるいはかかる操作が治療上有用であることを予測しうるという当業者の一致した意見は得られていなかった。
【００３６】
本発明はまた、テロメア長およびテロメラーゼ活性を分析する診断的方法により細胞の状態を調べること、すなわち細胞の増殖能の診断に関する。テロメア長のアッセイを行いうること、多くの組織中の広範囲なタイプの細胞の相対的年齢および残存する増殖能についての有用な情報が提供される。出芽酵母のテロメアの配列も記載する。該配列は、株によりさまざまである。また、酵母株の迅速な同定、そしてヒトおよび動物の病原体の場合には、その病原体株の診断を可能にするヌクレオチドプローブの配列を提供する。
【００３７】
テロメラーゼ活性および該酵素の存在を、新生物の診断および段階付け、そして病原性伝染病の検知のマーカーとして使用する。出願人は、最初に、テロメア長とインビボにおける細胞の加齢状態との関連のみならずテロメラーゼ活性と腫瘍細胞の表現形との関連を調べた。上記したように、当該分野においては、かかる関連があるという一致した意見は得られていない。対照的に、出願人は、この関連を明確にし、よって、ついに、有用な臨床的データを調べるための有用な診断手段を確立した。かかるデータを用いて治療プロトコールを確立することができ、さもなくばかかるプロトコールは無用なものとなる。
【００３８】
よって、第１の態様において、本発明は、細胞の老化または細胞の増殖速度の増加（例えば、テロメラーゼ不存在下での細胞増殖に関連したテロメアの反復の損失）に関連した症状の治療方法を提供する。第１の方法は、細胞増殖中にテロメアの反復の損失を減少させる活性のある治療上有効量の薬剤を細胞に投与することを包含する。かかる治療薬は、特に、上昇した細胞増殖速度の症状に適用することができる。
【００３９】
細胞の「上昇した増殖速度」は、細胞が、当該タイプの正常細胞と比較して、あるいは当該タイプの細胞の他の個体に含まれる正常細胞と比較して大きな増殖速度を有することを意味する。かかる細胞の例としては、ＨＩＶ感染個体のＣＤ４+細胞（下記実施例参照）、退行性関節疾患に関連した結合組織繊維芽細胞、老化に関連した黄斑変性、アルツハイマー症に関連した星状細胞、およびアテローム性動脈硬化に関連した内皮細胞（下記実施例参照）が挙げられる。それぞれの場合、ある種の特別な形態の細胞または細胞群が、その周辺の組織の細胞と比較して、あるいは正常個体（例えばＨＩＶウイルスに感染していない個体）と比較して増大したレベルで増殖していることが見いだされる。よって、本発明は、それらの細胞が増殖している間、それらの細胞におけるテロメア長の損失を減少させる薬剤をそれらの細胞に投与することを特徴とする。薬剤自身は増殖過程を遅くする必要はないが、むしろ、該薬剤の不存在下で観察されるよりも多くの細胞分裂のために増殖過程を継続させる必要がある。また該薬剤は、正常な加齢が起こっている間（細胞は正常な速度で増殖し、生涯の後半に老化する）におけるテロメアの反復の損失の遅延に有用であり得るし、細胞に基礎を置く治療（例えば、遺伝子治療の後の骨髄移植）のために、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で細胞数が増加している一方でテロメアの反復の損失を減少させることに有用でありうる。
【００４０】
本明細書記載のごとく、当業者は、常用されるスクリーニング法を用いて、有用な薬剤を容易に同定できる。例えば、既知のテロメア長を有する特定の細胞を選択し、増殖させ、増殖中のテロメア長を測定する。かかる増殖中のテロメア長の損失を減少させることが示されている薬剤は本発明に有用である。かかる薬剤に関する特定の実施例を下記に示す。例えば、テロメア末端においてＤＮＡ合成を促進しうるオリゴヌクレオチドは本発明に有用である。さらに、遺伝子治療法、あるいはテロメラーゼまたはその等価物を細胞に投与することのいずれかにより（例えば、注射またはリポジェクション（ｌｉｐｏｊｅｃｔｉｏｎ）により）、テロメラーゼを細胞に添加することができる。
【００４１】
細胞の老化を治療する第２の方法は、テロメラーゼが通常は抑制されている細胞においてテロメラーゼを脱抑制する薬剤の使用を包含する。テロメラーゼ活性は、ヒトのいかなる体細胞においても検出されないが、正常細胞が不死細胞へと形質転換されている間に該酵素が異常に再活性化された細胞において検出されうる。それゆえ、テロメラーゼ活性は、胚系細胞およびある種の幹細胞において適当に存在しうる（現在、ヒト組織においては、後者に存在する証拠はない）。体細胞を老化に導くテロメアの繰り返し部分の損失は、十分なテロメラーゼ活性がないことにより引き起こされるので、テロメラーゼを活性化する効果のある薬剤が、テロメアの反復配列をテロメアに付加する効果を有する。それにより、死ぬべき体細胞が複製能を与えられ、老化細胞に増殖能が与えられて、その細胞周期から出ることができるようになる（典型的に不適当に老化細胞中で発現されたコラゲナーゼ、ウロキナーゼおよび他の分泌性プロテアーゼならびにプロテアーゼインヒビターのごとき細胞周期に関連した遺伝子の適当な調節に関連した増殖因子の刺激の不存在下で）。テロメラーゼを脱抑制するかかる因子を一時的または長期的に投与してテロメア長を増加させ、ついで、これを除去し、これにより体細胞が本来の抑制機構を用いて再び該酵素の発現を抑制するようにすることができる。
【００４２】
かかるテロメラーゼ活性化剤を、ヒト・細胞を用いてＳＶ４０  Ｔ−抗原の発現により老化のＭ１機構を廃棄するスクリーニング法により見いだすことができる。かかる細胞は、Ｍ２機構がその増殖をさまたげているような危機的状況で増殖させた場合、テロメラーゼを脱抑制する薬剤に応答して増殖するであろう。かかる活性を、放射性標識したヌクレオチドの取り込みとして評価するか、または増殖しているクローンをコロニー形成アッセイにて選択することができる。
【００４３】
かかるテロメラーゼ活性化剤は、細胞の老化を遅らせ、または逆行させるための治療薬として有用であろう。しかし、細胞の老化に関連した症状に限定されない。細胞としては、例えば，（ａ）アルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン病、および卒中のごとき加齢に関連した疾患において役割を演じる星状細胞、内皮細胞および線維芽細胞をはじめとする中枢神経系における複製能を有する細胞、（ｂ）皮膚の萎縮、弾性組織分解および皮膚のしわ、皮脂腺の過血漿、老人性ほくろ、白髪および脱毛、慢性皮膚潰瘍のごとき加齢に関連した外皮疾患、および加齢に関連した傷の治療不全において役割を演じうる線維芽細胞、皮脂腺細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、ランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎ’ｓ）細胞、および毛包細胞をはじめとする外皮において有限の複製能を有する細胞、（ｃ）変質性関節疾患において役割を演じうる軟骨細胞および間隙ならびに滑液線維芽細胞のごとき関節の軟骨において有限の複製能を有する細胞、（ｄ）骨粗鬆症において役割を演じる骨芽細胞および骨前駆細胞のごとき骨において有限の複製能を有する細胞、（ｅ）加齢に関連した免疫系損傷において役割を演じうるＢおよびＴリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、ＮＫ細胞ならびにそれらの前駆細胞のごとき免疫系において有限の複製能を有する細胞、（ｆ）アテローム性動脈硬化、カルシウム沈着、血栓、および動脈瘤をはじめとする加齢に関連した血管系疾患において役割を演じうる内皮細胞、平滑筋細胞、および外膜の線維芽細胞をはじめとする血管系において有限の複製能を有する細胞、および（ｇ）加齢に関連した黄斑変性において重要な役割を演じうる色素上皮および内皮細胞のごとき目において有限の複製能を有する細胞も包含される。
【００４４】
第２の態様において、本発明は、細胞中のテロメラーゼ活性の上昇したレベルに関連した症状の治療方法を提供する。該方法は、治療上有効量のテロメラーゼ活性阻害剤を細胞に投与することを包含する。
【００４５】
下記のごとく、または他の現存する方法、あるいは等価な方法により、テロメラーゼ活性のレベルを測定することができる。かかる活性の「上昇したレベル」は、その個体における正常細胞と比較して、あるいは当該症状に苦しんでいない他の個体における正常細胞と比較して、個々の細胞における絶対的なテロメラーゼ活性のレベルが上昇していることを意味する。かかる症状の例としては、癌の症状、または通常はその個体に存在しない伝染性原虫または通性病原体のごとき細胞（その継続的複製のためにはテロメラーゼ活性を必要とする）の存在に関連した症状が挙げられる。阻害剤の投与を、当業者に知られたいかなる所望の方法により行ってもよい。
【００４６】
さらに、阻害剤の「治療上有効量」は、十分に知られた言い回しである。実際に適用される量は、治療される個人または動物による。好ましくは、有意な副作用なしに阻害効果が達成されるように量を最適化する（該阻害剤の使用により副作用が生じない程度とする）。すなわち、一定濃度の該阻害剤による副作用を伴わずに効果的な阻害が得られるならば、副作用が明確となるより高い濃度に対するものとして、その濃度を使用するべきである。しかしながら、副作用が回避できない場合は、所望の阻害が達成されるのに必要な最少量の阻害剤を使用することができる。
【００４７】
「阻害剤」は、単に、インビボまたはインビトロにおいてテロメラーゼ活性を阻害しうるすべての薬品、薬剤、または化学試薬を意味する。テロメラーゼ活性を有する細胞抽出液または他の標品を、潜在能力のある阻害剤に接触させて、ついで、該阻害剤の存在下または不存在下、あるいは種々の濃度の阻害剤の存在下でテロメラーゼ活性を測定するスクリーニングのプロトコールを用いて、かかる阻害剤を容易に同定することができる。このようにして、有用な阻害剤を見いだすことができるのみならず、かかる阻害剤の最適レベルを、さらなるインビボ試験のためにインビトロにおいて決定することができる。
【００４８】
適当なテロメラーゼ阻害剤のアッセイの一例を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で行う。１個のマイクロタイタープレートを用いて試験化合物の希釈を行い、もう１つのプレートで実際のアッセイを行う。各試料につき２系の反応を行う。適量の緩衝液、鋳型オリゴヌクレオチド、および試験すべき試料数のテトラヒメナまたはヒトのテロメラーゼ抽出液を含有する混合物を調製し、その一部をアッセイプレートに入れる。試験化合物を徐々に添加し、プレートを３０℃でプレインキュベーションする。ついで、32Ｐ−ｄＧＴＰを添加し、３０℃で１０分間反応を進行させる。個々の反応物の総体積は１０μｌである。ついで、ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡの添加により反応を停止し、その半量（５μｌ）をＤＥ８１濾紙にスポットする。試料を風乾し、濾紙を０．５Ｍリン酸ナトリウム中で数回濯いで取り込まれなかった標識ヌクレオチドを洗い落とす。乾燥後、濾紙をホスファー・イメイジング・プレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）に暴露し、シグナルを定量する。対照試料と個々の試験試料のシグナル量を比較することにより、阻害のパーセント値を決定することができる。
【００４９】
さらに、多くの潜在的に有用な阻害剤を、単一の試験でスクリーニングすることができる。なぜならば、所望なのはテロメラーゼ活性の阻害だからである。よって、１０００種の阻害剤のパネルをスクリーニングする場合、１０００種すべての阻害剤をマイクロタイタープレートに置くことが可能である。かかる阻害剤を発見したならば、１０００種のプールを１００種ずつ１０個のプールに分け、個々の阻害剤が確認されるまで該方法を繰り返す。本明細書記載のごとく、特別に有用な１セットの阻害剤は、テロメラーゼ中に存在するＲＮＡに結合しうるかまたは該ＲＮＡをそのＤＮＡ標的あるいはテロメラーゼ蛋白成分の１つに結合させないでおくことのできるオリゴヌクレオチドを包含する。テロメラーゼ中に存在するＲＮＡの阻害または開裂を引き起こすヌクレオチドがさらに好ましい。すなわち、かかるオリゴヌクレオチドは化学的に修飾されているかまたはかかる開裂を引き起こす酵素活性を有しているのである。上記スクリーニングは、異なる多くのかかるオリゴヌクレオチド配列のプールのスクリーニングを包含する。
【００５０】
さらに、多くの潜在的に有用な化合物を、天然生産物からの抽出物中においてスクリーニングすることができる。かかる抽出物の起源は、多種の菌類、放線菌、藻類、原虫、植物および細菌であってよい。ついで、阻害活性を示すそれらの抽出物を分析して当該活性分子を単離することができる。
【００５１】
関連した態様において、本発明は、医薬上許容される緩衝液中に治療上有効量の上記阻害剤または上記薬剤を含有する医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、１種またはそれ以上のこれらの阻害剤または薬剤を含有していてもよく、他の医薬と同時投与してもよい。例えば、ＡＺＴはＨＩＶの治療に通常用いられるのであるが、これを本発明阻害剤または薬剤と同時投与してもよい。
【００５２】
関連した態様において、本発明は、細胞の複製能を高める方法を提供する。この方法において、複製能を高める量の、細胞中のテロメア長の損失を抑制する活性のある薬剤を、細胞増殖の間において提供する。この薬剤は、細胞の上昇した増殖速度に関連した症状の治療に有用な薬剤と同様なものである。しかしながら、この方法は何等特別な症状に苦しんでいない個体の治療に有用であるが、該方法においては、当該患者において１種またはそれ以上の形態の細胞に限定され、当該細胞の複製を続ける能力を高めることによりその患者の寿命が延長される。すなわち、薬剤を添加して、当該細胞が個体中でさらに複製を続けることができないことにより特徴づけられる細胞の老化の発生を遅らせる。かかる一群の細胞の一例としては、ダウン症候群の患者中のリンパ球が挙げられる（かかる細胞の治療もまた何等特別な症状または疾患に苦しんでいるとは認められないのではなくて単に１種またはそれ以上の細胞あるいは細胞の集合が当該個体の寿命を限定するようになっていることが認められる個体において有用である）。
【００５３】
かかる阻害剤または薬剤の投与は、いかなる特定の個体に対しても有害であるとは考えられないということに注目すべきである。しかしながら、遺伝子治療を用いてテロメラーゼを何等かの特定の細胞群に導入するか、あるいは他の手段を用いて体細胞中のテロメラーゼ活性を可逆的に脱抑制するべきである。例えば、患者の食事により調節されうるプロモーターの使用により、当該テロメラーゼ活性が注意深く調節されていることを確認するために注意を払うべきである。よって、例えば、患者が特定の食事を摂取した場合に該プロモーターが活性化され、特定の食事を摂取しない場合には該プロモーターは不活性であるようにする。このようにして、細胞が悪性化した場合に、個体は、それ以上かかる食事を摂取しないことにより容易に細胞のテロメラーゼを不活性化させ、簡単に当該細胞を死滅させることができる。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、細胞中のテロメラーゼ活性の上昇したレベルに関連した患者の症状の診断方法を提供する。該方法は、当該患者の細胞中のテロメラーゼの存在または量を調べることを包含する。
【００５５】
さらに別の態様において、本発明は、個体中の当該細胞の増加した増殖速度に関連した症状の診断方法を提供する。詳細には、該方法は、細胞中のテロメア長を調べることを包含する。
【００５６】
診断が可能な種々の条件は前記した。後記にて例示するごとく、患者における細胞内のテロメラーゼの存在またはその量を測定するための、および該細胞内のテロメアの長さを測定するための多くの方法が存在する。テロメラーゼの存在またはその量は、個々の細胞内で、かつ（それが１の特定酵素または複数の酵素によって引き起こされるか否かに拘らず）いずれの個々のテロメラーゼ活性についても測定できることは明らかであろう。当業者ならば、細胞内、または個体内に存在するテロメラーゼの各タイプの間を区別するための抗体またはその同等物を容易に処方できるであろう。加えて、テロメアの長さは平均長として、または後記するごとき長さの範囲として決定できる。これらの各測定により、いずれの特定の個体の状態に関しても正確な情報を得ることができるであろう。
【００５７】
かくして、出願人の発明は、２つの選択技−診断的および治療的選択技を有する。これらを詳細に議論する。
【００５８】
本発明の治療的選択技は、不死のままでいる細胞の能力は、その細胞がその細胞内の染色体のテロメアの長さを維持または増大させる能力に存するという今回の明らかな観察に関係する。かかるテロメアの長さは、細胞内のテロメラーゼ、または同等の酵素の十分な活性の存在によって維持できる。かくして、細胞が不死のままでいる潜在能力を減少させることに対する治療的アプローチは、細胞の死滅を引き起こすが望ましいそれらの細胞内のテロメラーゼ活性の阻害に焦点を当てるものである。かかる細胞の例は癌細胞を包含し、これは、テロメラーゼを発現する能力を獲得して不死となった体細胞の一例である。今や、出願人は、かかる細胞は、テロメラーゼ活性の阻害によってもう１回死すべきものとできることを示した。それ自体、阻害は、後記するごとく、何らかの方法によって、テロメアをｉｎ  ｖｉｖｏにて伸長するテロメラーゼの能力を阻止するオリゴヌクレオチドの使用を含めた種々の方法で達成できる。
【００５９】
かくして、オリゴヌクレオチドはテロメアに結合して（そのテロメアに結合し、それにより、そのテロメアを伸長させるテロメラーゼの能力を阻止するか、）、あるいはテロメラーゼに存在する定住オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）に結合して、それにより、いずれかの核酸（テロメア）に対するテロメラーゼを阻害するように設計できる。かかるオリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチドから形成できるか、あるいは治療剤の安定性を向上させるか、またはテロメラーゼの永久的な不活化、例えば、テロメラーゼと共有結合を形成できる反応性基でもって、ヌクレオチド分子の３’末端に停止ヌクレオチドを位置させることを引き起こすための修飾したヌクレオチドを包含する。かかる分子はリボザイム配列も包含する。加えて、非オリゴヌクレオチドに基づく療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでテロメラーゼ活性を阻害する能力を有する分子をスクリーニングし、次いで、その分子をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することによって容易に行うことができる。かかるスクリーニングは容易になされ、多数の有用な治療上の分子を提供するであろう。これらの分子は、固形の腫瘍および白血病（アプドーマ（ａｐｕｄｏｍａ）、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心臓病、癌腫（例えば、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、基底細胞、基底有さく細胞、ブラウン−ペアス（Ｂｒｏｗｎ−Ｐｅａｒｃｅ）、管、エーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腫瘍、ｉｎｓｉｔｕ、クレブス（Ｋｒｅｂｓ）２、メルケル細胞、ムチン様、非小（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）細胞肺、燕麦細胞、乳頭様、硬性癌、細気管腫支、気管支原性、鱗状細胞、および移行性細胞）、組織球障害、白血病（例えば、ｂ細胞、混合細胞、ナル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、リンパ球急性、リンパ球慢性、肥満細胞、および骨髄様）、組織球症悪性、ホジキン病、免疫増殖小、非ホジキン病リンパ腫、形質細胞腫、網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨大細胞腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺線維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、栄養膜腫、腺癌、腺腫、胆管癌、コレステリン腫、円柱腫、嚢腫癌、嚢腺腫、顆粒層細胞腫瘍、男女性胚細胞腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫、ライジッヒ細胞腫瘍、乳頭腫、セルトリ細胞腫瘍、胞膜細胞腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、骨髄芽球腫、筋腫、筋肉腫、黄紋筋腫、黄紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、節筋肉腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、傍神経節腫ノンクロマフィン（ｎｏｎｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ）、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ球過形成、血管腫硬化、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、嚢肉腫葉状、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、黄紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーリング、実験的、��ポシ、および肥満細胞）、新生物（例えば、骨、胸、消化系、結腸直腸、肝臓、すい臓、下垂体、精巣、眼窩、頭部および首、中枢神経系、聴覚、骨盤、気管、および尿生殖器）、神経線維腫症、および頚形成異常）を含めた、細胞が不死となるものを含む）を包含するいずれものタイプの癌の治療、および細胞が不死となる他の疾患の治療にも用いることができる。
【００６０】
また、出願人は、特にある種の病気と関連する細胞でのテロメア配列の喪失を遅くするのが重要であると判断した（かかる治療はこれに限られず、通常の老化およびｅｘ  ｖｉｖｏ治療で使用できるが）。例えば、いくつかの病気は、細胞の１またはそれを超える特別のグループの異常に速い増殖速度によって発現される。出願人は、結局はその患者が死亡に至るのは、（患者の年齢と比較した）異常に早期の年齢におけるその細胞のグループの老化であると判断した。かかる病気の１の例はエイズであり、そこでは、死亡はＣＤ４+細胞の早期老化によって引き起こされる。テロメア配列の異常な喪失ではなく（これは因子であるかも知れないが）、むしろＣＤ４+細胞の複製速度のため、かかる細胞の年齢は増加し、テロメアの消耗がそのグループの細胞について通常よりも速い速度で引き起こされるのが重要であることに注意すべきである。かくして、出願人は、かかる病気の治療で用いることができる治療剤を提供し、また、適当な治療プロトコルがつくられ、進展されるように同様の病気がそれにより検出できる関連した診断手法を提供する。
【００６１】
特に、いずれかの特定の細胞集団内のテロメアの喪失は、細胞分裂の間のテロメア消耗の程度を減少させるオリゴヌクレオチドを供することによって低減化でき、かくして、細胞が老化する前に起こり得る細胞分裂の数を増大させる。テロメアの喪失を減少させるため、あるいはその細胞を不死とするために、他の試薬、例えば、テロメラーゼを細胞内に供することができる。当業者ならば、他の酵素活性を用いて、例えば、テロメアーゼを活性するか、あるいは細胞内でテロメアの配列を合成するように機能させるある種のウイルス配列を供することによって、かかる細胞内のテロメアを長くすることを促進できることを認識するであろう。加えて、同等のかかる分子、または他の分子を容易にスクリーニングしてテロメアの喪失を減少させるものを決定できる。かかるスクリーニングはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができ、前記ｉｎ  ｖｉｖｏで利用したスクリーニングによって治療剤が発見された。
【００６２】
他の治療処置は、菌類グループ、特に、いくつかの病原を含む出芽酵母のグループであるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジタ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・パラトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ならびに非病原性菌類における異常なテロメアＤＮＡ配列の発見に関する。これらの結果を以下に詳細に記載する。薬物または化学剤を用いて真菌類のテロメアＤＮＡの異常な性質を特に開発することができる。これは、これら、およびいずれかの関連病原においてテロメア合成を阻止するために、テロメア反復ＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスポリヌクレオチドの導入を含む。かかる阻止は菌類の死滅に導く。
【００６３】
これらの菌類におけるテロメアＤＮＡの異常な性質のため、このアプローチは有利である。これらの菌類のテロメア反復の異常に高いＤＮＡ配列の複雑さは、抗菌類剤または該アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡの、特異性および最小副作用の可能性を与える。
【００６４】
潜在的に有用な抗菌類剤である薬剤は：ＡＺＴ、ｄ４Ｔ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、およびｄｄＡを包含する。これらの菌類のテロメア合成はこれらの薬剤に対する異なる阻害を示し、ある場合には、ヒトもしくは他の動物または植物宿主細胞におけるテロメア合成よりも感受性となることが予測される。
【００６５】
本発明者らは、生きている菌類細胞でアンチセンス技術を使用する予備テストを行った。カンジダ・アルビカンス染色体ＤＮＡの領域の側にある保存された配列に埋設された、テロメアＤＮＡ配列の４０ｂｐのストレッチを環状分子に乗せてカンジダ・アルビカンス細胞に導入した。形質転換された細胞は高コピー数の導入テロメア細胞ＤＮＡ配列を有していた。形質転換体の１０％はテロメアＤＮＡの長さを大いに増大された（〜３倍）。この結果は、テロメアＤＮＡは、テロメア配列ポリヌクレオチドの細胞への導入によってｉｎ  ｖｉｖｏで調節できることを示す。これは、それが所望の活性を有することを保証するための特定のオリゴヌクレオチドをテストする要求を示す。
【００６６】
診断手法に関し、かかる手法の例は、治療に関する前記議論から明らかとなる。出願人は、テロメアの長さは、そのテロメアを含有する細胞、およびその細胞を含有する個体の寿命の指標となると判断した。かくして、テロメアの長さは個体細胞の寿命に直接相関する。前記したごとく、細胞のある種の集団は、個体内の他の細胞よりも大きい速度でテロメアを喪失し得、またそれらの細胞はかくして個々の生物内で年齢を限定するものとなる。しかしながら、今や、いずれかの個々の細胞タイプの可能な寿命を示し、その寿命に対する訂正された評価を経時的に共に行うことができるようにテロメアの喪失を追跡するのに使用できる診断手法が（本明細書に記載したごとくに）開発できる。
【００６７】
ある種の病気、例えば、前記したエイズにおいては、勿論、ＣＤ４+細胞におけるテロメアの長さを追跡するのが重要であろう。加えて、ＣＤ４+細胞はかかる個体において限定的であるという認識は、エイズがまず検出され、貯蔵箇所（ｂａｎｋ）に貯蔵され、次いで、その個体がもはや必要な利用可能なＣＤ４+細胞を持たない後の年齢にて当該個体に再導入される場合に、早期の年齢において個体からＣＤ４+細胞が除去できるという治療プロトコルの設計を可能とする。これらの細胞は、テロメア反復の喪失を遅延させる剤、例えば、テロメアーゼを一次的に脱抑制して、個体に再投与された細胞が最大複製能を有することを保証するためのＣ−リッチなテロメリック・オリゴヌクレオチドもしくは薬剤の存在下で数を増やすことができる。かくして、個体の寿命は、適当な時点におけるその個体の限定的細胞の継続的投与を含むプロトコルによって延長させることができる。これらの適当な時点は、ＣＤ４+細胞老化を追跡することによって、あるいは（細胞が老化した時の指標として）かかるＣＤ４+細胞内のテロメアの長さを測定することによって決定することができる。エイズの場合、依然複製能を有する骨髄幹細胞と共に末梢血液リンパ球において老化テロメアの長さの起伏があり得る。このように、細胞が老化するまで待ち（それにより、個体を死滅の危険にさらす）よりもむしろ、テロメアの長さが予め老化であると決定されたものを下回って減少するまで該長さを追跡し、それにより、新しいＣＤ４+細胞またはコロニー刺激因子の投与のタイミングを最適化することができる。
【００６８】
かくして、本発明の診断手法は、異なる細胞集団におけるテロメアの長さを測定して、いずれの特定の細胞集団が個体の寿命において限定的であるかを決定し、次いで、かかる細胞がもはやその個体にとって限定的でないことを保証する治療プロトコルを決定する手法を包含する。加えて、前記したごとく、特異的な薬物を投与して、テロメアの長さの喪失が減少するのを保証することによって、かかる細胞集団を特異的に標的化することができる。
【００６９】
他の診断手法は、個体内の不死細胞の存在の指標としてのテロメアーゼ活性の測定を含む。かかる不死性のより正確な測定は、テロメアーゼ酵素それ自体の存在である。かかる酵素は、テロメアーゼ活性のアッセイを含む標準的な手法を用いるが、テロメアーゼに対する抗体も用いることによって、あるいはテロメアーゼ、またはテロメアーゼ蛋白のｍＲＮＡについてのＤＮＡもしくはＲＮＡプローブに存在する核酸（鋳型ＲＮＡ）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用によって容易に検出することができる。免疫組織化学およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術により、診断および予後徴候テストのために組織学的検体中のテロメアーゼ陽性細胞の正確な同定が可能となる。テロメアーゼの存在は、不死であってしばしば転移性である細胞の指標であり、かかる診断剤はかかる転移性細胞を正確に決定することを可能とし、ましてや、ＣＤ４４はそうであると主張されている。レフ（Ｌｅｆｆ）、３（２１７）バイオワールド・トゥデイ（ＢｉｏＷｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ）１、３、１９９２参照。
【００７０】
本発明の診断方法は、ある個体がある病気においてどれ位進行しているかを決定するための第１の真実の方法を提供する。例えば、エイズ病において、これは、ＨＩＶ陽性個体が免疫無防備状態となった時点における事前投与を可能とする最初の方法である。この情報は、ＡＺＴ投与のごとき薬物投与のタイミングを決定するのに有用であり、新しい薬物投与法または療法の開発の助けとなる。加えて、ある種の薬物の投与の最適タイミングの決定は個体の治療費用を低減化させ、薬物が個体にとって毒性となる機会を減少させ、また、個体がかかる薬物に対して耐性となる可能性を低下させる。
【００７１】
他の関連態様において、本発明は、老化しつつある細胞においてテロメラーゼを抑制する活性のある薬剤の治療上有効量を投与することによって、細胞老化に関連する病気または疾患を治療することをその要旨とする。関連態様は、潜在的薬剤をテロメラーゼ活性を欠く細胞と接触させ、次いで、該薬剤がテロメラーゼ活性のレベルを増大させるか否かを、例えば、誘導性Ｔ抗原を発現する細胞を用いることによって決定することによる、テロメラーゼ抑制剤のスクリーニングを含む。かかるアッセイは、組合せライブラリーに存在する、あるいは癌原性物質であることが知られている薬剤の迅速なスクリーニングを可能とする。
【００７２】
出願人は、公知の薬剤はテロメラーゼそれ自体において、あるいはテロメラーゼを発現する遺伝子において活性であるので、癌の治療で有用であることを認識している。かくして、かかる薬剤は、本発明において、効果的であることが従前知られていなかった病気または疾患で有用であると確認される。事実、治療の２４〜４８時間後においてのみ細胞の生存に対してほとんど、あるいはあったとしても少ししか効果がない故に従前は利用性を欠くと考えられていた薬剤は、もしそれがｉｎ  ｖｉｖｏでテロメラーゼに対して活性であり、かくして、数回の細胞分裂の後においてのみ細胞生存に影響するならば、利用性を有すると示すことができる。
【００７３】
本発明の他の特徴および利点は、好ましい具体例および請求の範囲の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
テロメアおよびテロメラーゼ
すべての正常なジプロイド脊椎動物細胞は限定された増殖能、すなわち、Ｈａｙｆｌｉｃｋ限定または複製的老化として知られるに至った現象を有する。ヒト繊維芽細胞において、この限定は５０〜１００回の集団倍加の後に起こり、その後、細胞は生きたままであるが、何カ月も分裂しない老化状態にとどまる。これは、その増殖能を限定する制御から逃れ、効果的に不死となるほとんどの癌細胞の挙動とは対照的である。
【００７５】
細胞の老化の原因を説明する１つの仮説は、テロメアと呼ばれる染色体末端の役割に関する。該仮説は、体細胞はＤＮＡ分子のまさに末端を複製する能力を欠くというものである。この結果、いくつかの機能が変化し、その時点で細胞が増殖能を失うまで染色体の端部は徐々に短くなる。
【００７６】
ＤＮＡポリメラーゼは５’から３’の方向にＤＮＡを合成し、合成を開始するのにプライマーを必要とする。このため、「ラギング鎖」は直線状の染色体のまさに末端までは複製しない。かくして、染色体は各細胞分裂に伴い短くなる。染色体の末端はテロメアと呼ばれ、長いＴＴＡＧＧＧ反復よりなる。酵素テロメラーゼはテロメリックＤＮＡの３’末端にＴＴＡＧＧＧ反復を付加することができ、かくして、当該ＤＮＡを延長し、短縮化を防ぐ。
【００７７】
生殖細胞系は長いテロメアおよび活性なテロメラーゼを有する。体細胞はテロメラーゼ活性を欠き、そのテロメアはｉｎ  ｖｉｖｏおよび培養双方において細胞分裂に伴って短くなることが判明している。癌細胞は不死であり、テロメラーゼ活性を獲得しており、かくして、その染色体の端部を維持できる。テロメアの短化およびテロメラーゼの活性が細胞の老化および不死化における鍵となる因子であることを示す明確な実験を以下にて示す。
【００７８】
方法
前記したごとく、本発明は、テロメア長を測定し、テロメラーゼ依存性伸張またはテロメラーゼ非依存性短縮化を測定することに関連する診断および治療に関する。本発明はヒトに指向されるが、他の動物、特に、他の霊長類のごとき哺乳動物、およびウマ、ウシ、鳥、ヒツジ、ブタ、ネコ、およびイヌのごとき家畜に適用することもできる。本発明は治療および診断双方で用いることができる。治療の場合、例えば、テロメアの短縮化は、テロメラーゼ活性またはその機能的同等物を再活性化もしくは導入することによるＤＮＡオリゴヌクレオチドを供することによって遅らし、また阻止することができ、あるいは無限増殖はテロメラーゼを阻害することによって低減化することができる。診断の場合、特定の染色体または染色体群に関してテロメアの長さ、あるいはテロメアの平均長を検出できる。また、診断はテロメラーゼの活性、あるいは細胞、組織等において蛋白またはＲＮＡレベルについての酵素の成分の存在を測定することに関連する。
【００７９】
相対的年齢、残存する増殖能、ならびにテロメアおよびテロメラーゼの状態に関する他の細胞の特徴についての情報は、胚細胞、他の幹細胞、（肝硬変の文脈における肝細胞のごとき）体細胞、（繊維芽細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞のごとき）結合組織細胞、（内皮細胞および平滑筋細胞のごとき）血管細胞、（脳星状細胞のごとき）中枢神経系に存在する細胞、および種々の新生物組織、および増殖性細胞の残存する複製能および増殖潜在性を予測するための不死増殖についてのその能力の双方を測定するのが望ましい寄生虫病原のような広範囲の細胞型および組織で得ることができる。
【００８０】
テロメア長の維持
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞でのテロメア長は、有用には、種々の手法によって維持できる。これらは、後記にて例示する方法を包含する。しかしながら、これらの例は本発明では非限定的である。というのは、当業者ならば同等の方法を認識するであろうからである。すべての方法は、テロメア長を維持するのに有用であることが予測され、出願人は今回これを実験的に証明した。かかる方法はオリゴヌクレオチド、またはテロメアに干渉して細胞分裂の間における短縮化を防ぐ薬剤の提供に基づき得るものである。加えて、該方法は短縮化を防ぐために細胞内でテロメラーゼまたはその同等活性を包含する薬剤での処理を含む。最終的に、該方法は、細胞の老化に関連した遺伝子発現の調節も包含する。
【００８１】
有用な薬剤は、ルーチン的なスクリーニング手法によって決定できる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系にてテロメアに干渉し、テロメア端部の喪失を阻止するか、あるいはテロメア長の増大を助ける薬剤をスクリーニングすることによる。かかる方法の非限定的例を以下に述べる。テロメア端部の短縮化が細胞分裂の間に減少するか否かを決定するアッセイが必要なだけである。所望の結果が得られる限り、かかる薬剤が作用するメカニズムは知られている必要はない。しかしながら、有用な標的遺伝子（例えば、Ｍ２死滅調節遺伝子）を同定することによって、アンチセンスおよび同等の手法を、所望の遺伝子の発現または非発現（例えば、テロメラーゼの脱抑制）をより適当に引き起こすように設計することができる。
【００８２】
特別の例において（本発明では非限定的）、細胞へのプライマーとして、核酸、例えば（修飾形態も含めた）ＤＮＡもしくはＲＮＡを提供することによって、テロメアの短縮化速度を低減化させることができる。かかる核酸は、通常、２〜３個の反復、より通常には２個の反復を包含するが、そこでは、該反復はＤ−リッチＤＮＡテロメア鎖と相補的である。かかるオリゴヌクレオチドは細胞の増殖能を拡大するのに使用できる。
【００８３】
自然に（例えば、特別の修飾無しに）、または細胞膜と融合するリポソームを使用することによって、オリゴヌクレオチドを細胞質に移入することができるか、あるいは細胞の表面膜蛋白レセプターに結合するリガンドを用いることによって細胞質に取り入れて、エンドサイトーシスが起こる。別法として、細胞を透過性として、宿主細胞を傷つけることなく、オリゴヌクレオチドの細胞への輸送を促進することができる。もう１つの方法は、ＤＮＡ結合蛋白、例えば、オリゴヌクレオチドを細胞に輸送することが知られているＨＢＧＦ−１を用いることである。このようにして、分裂当たり平均約５０ｂｐから分裂当たり平均約６〜１２ｂｐヘテロメアの短縮化速度を実質的に減少させることができ（後記実施例参照）、かくして、誘導された細胞の老化前に起こる分裂の数を有意に拡大する。
【００８４】
「老化」とは、通常に適当な複製シグナルの存在下において複製する細胞の能力の喪失を意味し、コラゲナーゼのごとき分解的酵素の発現に関係し得る。該用語は、適当な条件下で複製することが誘導されるであろう静止状態細胞を包含しない。この用語は後記実施例で例示し、そこでは、老化に先立っての細胞倍加の数が増大する。
【００８５】
前記プロセスはｉｎ  ｖｉｖｏで有用である。すでに示したごとく、リポソームを使用することによって、リポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを担持するか、あるいはリポソームが特異的器管に優先的に向けられている場合、ｉｎ
ｖｉｖｏにて標的細胞にオリゴヌクレオチドを導入することができる。例えば、負傷した血管内皮細胞から放出されたホスファチジルセリンについてのリポコルチン親和性を利用して、オリゴヌクレオチドをかかる部位に向けることができる。別法として、カテーテル、シリンジ、デポー剤等を用いて高局在化濃度を供することもできる。かかるオリゴヌクレオチドの細胞への導入の結果、細胞分裂に応答して老化が減少することは治療効果を有する。
【００８６】
テロメア長の維持は、細胞老化の開始を遅らせる組織培養技術で応用を有する。例えば、自己患者への再導入については細胞のクローン伸張を要する細胞をベースとする療法は約２０〜３０の倍化に限定される。本発明は、遺伝的操作に先立ち、および、次いでの該操作した細胞の伸張、テロメア長の維持双方にての、遺伝子治療の場合における細胞の伸張を可能とする。これは、正常な細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏにて延長された倍化にて培養できることを可能とする。後記する実験はｉｎ  ｖｉｔｒｏにてのこの方法の有用性を証明し、またｉｎ  ｖｉｖｏにてのその応用を証明する。
【００８７】
テロメアの臨界的短縮化は「危機」またはＭ２老化なる語の現象に導く。シャイ（Ｓｈａｙ）ら、１９９２、前掲参照。危機にある細胞の中で、希に突然変異体が不死となり、そこでは、Ｍ２遺伝子は調節を変更しており、またそこではテロメラーゼの発現は再活性化されており、テロメアの長さを安定化する。Ｍ２調節遺伝子はテロメア長およびテロメラーゼ活性を調節する有用な手段を供するために調節できる。該Ｍ２遺伝子は、レトロウイルスを用いるＭ２危機への挿入的突然変異によって同定できる。該Ｍ２遺伝子がダメになった細胞はテロメラーゼの再活性化に応答して増殖し、かかる細胞は、それからＭ２遺伝子をクローンする源またはＤＮＡを供することができる。この技術は、レトロウイルスが共通の制限断片に挿入された多数の細胞クローンを有する。アンチセンスまたは他の手段によるＭ２調製遺伝子（類）の抑制は、テロメラーゼを可逆的に活性化する手段を与え、テロメアは伸張でき、次いで、テロメラーゼは再度抑制される。このようにして、増殖能力はオリゴヌクレオチドの添加または無添加にて伸張できて、テロメア短縮化を遅らすことができる。従って、かかる細胞は、骨髄移植、結合組織の再編成、および初期継代副腎皮質細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、および筋芽細胞の移植のごとき細胞ベースの療法で使用することができる。
【００８８】
テロメラーゼ調節
前記したごとく、癌細胞はテロメラーゼ活性を含有し、それにより不死となる。加えて、多数のタイプの寄生的病原は不死であって活性なテロメラーゼを有する。かくして、かかる細胞においてテロメラーゼ活性を調節（例えば、増加）して、有限の複製寿命を付与するのは有用である。正常なヒト細胞において長いテロメア・トラクトとは対照的に、原生動物細胞、菌類細胞、およびいくつかの寄生虫、ならびに多くの癌細胞におけるテロメアＤＮＡのトラクトは典型的にはより短い。これは、これらの細胞を、正常なヒト細胞（例えば、生殖系細胞）よりもテロメラーゼ阻害剤を弱くする。
【００８９】
かくして、テロメラーゼの阻害または誘導は、種々の状況において応用を有する。テロメラーゼを細胞内で阻害することによって、癌細胞が増殖する能力を減少させることができる。合成剤、例えば、５’−３’Ｇ−リッチ鎖（鋳型として働く鎖）のテロメアのモチーフの、２もしくはそれ以上、通常約５０反復以下よりなるオリゴヌクレオチドを添加することによって、テロメラーゼを競合的に阻害することができる。オリゴヌクレオチドは天然もしくは非天然ユニット、例えば、ホスフェート酸素が硫黄またはメチレンで置き換えられている炭素誘導体、修飾糖、例えば、アラビノース等から合成することができる。前記したごとく、他の同等の薬剤を用いてテロメラーゼ活性を阻害したりあるいはその発現を引き起こしたりできる。
【００９０】
前記したごとくオリゴヌクレオチドを導入して培養にてあるいはｉｎ  ｖｉｖｏにて不滅細胞で老化を誘導することができる。培養中の増殖する細胞の場合、不死細胞が培養を過剰増殖させるのを妨げるのを欲する時は、主題のオリゴヌクレオチドを用いてかかる過剰増殖の可能性を減じることができる。かくして、オリゴヌクレオチドを培地に維持することによって、オリゴヌクレオチドは細胞によって摂取され、テロメラーゼ活性を阻害する。金属キレートでテロメア配列への結合を提供することができる。かくして、テロメア・モチーフに結合した鉄キレートを供することによって、テロメラーゼＲＮＡを切断して非機能的とできる。別法として、反応性基を、テロメラーゼに共有結合するオリゴヌクレオチドにカップリングさせることができるか、あるいは３’残基をジデオキシとして、鎖停止を強制することができる。
【００９１】
別法として、テロメラーゼＲＮＡに相補的な５’および３’末端配列を有するリポザイムを導入して、該ＲＮＡの切断を提供できる。このようにして、テロメラーゼ活性を実質的に阻害して、癌細胞が増殖する能力を有意に制限することができる。また、Ｍ２レギュレーター遺伝子産物の投与によってテロメラーゼを阻害することもできる。テロメラーゼの発現を直接調節するいずれかの蛋白の発現を調節することによって、細胞テロメラーゼ活性を調節することもできる。
【００９２】
別法として、小さな分子、例えば、ヌクレオシドアナログ様ａｖａ−Ｇ、ｄｄＧ、ＡＺＴ等およびＲＮＡおよびＤＮＡプロセッシング酵素阻害剤、アルキル化剤、および種々の可能な抗腫瘍薬剤をスクリーニングするために、ヒトまたはテトラヒメナ・テロメラーゼを利用するスクリーニングアッセイを用いることができる。次いで、これらをさらに修飾する。
【００９３】
前記したごとく、核酸配列を細胞に導入することができる。腫瘍に関連したデポー剤を可能とする種々の技術が存在する。かくして、阻害剤または核酸を薬物として投与することができる。というのは、それらはテロメラーゼを誘導する細胞のみにおいて効果的であるからである。ほとんどの場合、ヒト体細胞はテロメラーゼを欠くので、それらは効果的でないであろう。テロメラーゼ活性を発現する生殖細胞にかかる薬物が侵入するのを防ぐために、いくらか注意を払わなければならない。
【００９４】
従って、主題の組成物は、腫瘍細胞がテロメラーゼの不適当な活性化を通じて不死の表現型を獲得した新生物、ならびに種々のヒトおよび動物寄生虫病（エンタアメバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）からのアメーバ症、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）属またはアカンタメバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）属からのアメーバ髄膜脳炎、プラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、プラスモジウム・オバレ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）およびプラスモジウム・ファシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からのマラリア、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ）、リーシュマニア・シャガシ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・マジョール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、リーシュマニア・エチオピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・メキシカナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）およびリーシュマニア・ブラジリエンシス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）のごとき原生動物からのリーシュマニア症、原生動物トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）からのシャガス（Ｃｈａｇａｓ）病、トリパノソーマ・ブルチェイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・ガンビエンシス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）およびトリパノソーマ・ロデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）からの睡眠病、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｅ  ｇｏｎｄｉｉ）からのトキソプラズマ症、ジアルジア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）からのジアルジア鞭毛虫症、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）からのクリプトスポリジウム症、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコモナス・テナクス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｔｅｎａｘ）、トリコモナス・ホミニス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）からのトリコモナス症、ニューモシスティス・カリニィ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）からのニューモシスチス肺炎、バンベシア・ミクロティ（Ｂａｍｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バンベシア・ディベルゲンス（Ｂａｍｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）およびバンベシア・ボリス（Ｂａｍｂｅｓｉａ  ｂｏｒｉｓ）からのベンジア症（ｂａｍｂｅｓｏｓｉｓ）、ならびにバランティジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ
ｃｏｌｉ）およびイソスポラ・ベリ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ）のごとき他の原生動物が引き起こす腸疾患のようなヒ原生動物病原を含む）の治療で用いることができる。また、テロメラーゼ阻害剤は、種テニア・ソリウム（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、テニア・サギナタ（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、ジフィロボシリウム・ラタ（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔａ）、エチノコッカス・グラニュロサス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、エチノコッカス・ムルティロクラリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、ヒメノレピス・ナナ（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎａ）、シストソマ・マンソミ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｍｉ）、シストソマ・ヤポニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シストソマ・ヘマトビウム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、クロノルキス・シネンシス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス・ウェステルマニ（Ｐａｒａｇｏｎｉｕｍ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、ファシオラ・ヘパティカ（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、ファシオロプシス・ブスキィ（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ  ｂｕｓｋｉ）、ヘテロフィエス・ヘテロフィエス（Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ）、エンテロビウス・ベルミクラリス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、トリクリス・トリキウラ（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、アスカリス・ルンブリコイデス（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アンシロストマ・ドゥオデナレ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、ネカトール・アメリカナス（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、ストロンギロイデス・ステルコラリス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、トリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、ウケレリア・バンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｌａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、オンコセルカ・ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ
ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、ロア・ロア（Ｌｏａ  ｌｏａ）、ドラクンクラス・メディネンシス（Ｄｒａｎｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）を含めたある種の寄生虫病、およびスポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、コクシィジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｉｄｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕ−ｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシィジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルグルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）のごとき真菌病原、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）およびリゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属の菌類、ならびにフィアロフォア（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）およびクラドスペリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属のごときクロモミセス症を引き起こす種、ならびに；バベシア・カバリィ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ）、バベシア・カニス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓ）、バベシア・エキィ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）、バベシア・フェリス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｆｅｌｉｓ）、バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ボスノイティア・ダルリンギ（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ  ｄａｒｌｉｎｇｉ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・アデノエイデス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ）、エイメリア・アヘサタ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｈｓａｔａ）、エイメリア・アラバメンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ
ａｌａｂａｍｅｎｓｉｓ）、エイメリア・アウブルネンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ
ａｕｂｕｒｎｅｎｓｉｓ）、エイメリア・ボビス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｏｖｉｓ）、エイメリア・ブラジリエンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・カナデンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、エイメリア・セルドニス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｃｅｒｄｏｎｉｓ）、エイメリア・クランダリス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｃｒａｎｄａｌｌｉｓ）、エイメリア・シリンドリカ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、エイメリア・デブリエッキィ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｄｅｌｂｉｅｃｋｉ）、エイメリア・デスペルサ（Ｅｉｍｅｒｉａ
ｄｅｓｐｅｒｓａ）、エイメリア・エリプソイダリス（Ｅｉｍｅｒｉａｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ）、エイメリア・ファウベイ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｆａｕｖｅｌ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、エイメリア・ギルルシィ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇｉｌｒｕｔｈｉ）、エイメリア・グラヌロセ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｇｒａｎｕｌｏｓａ）、エイメリア・ハガニ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｈａｇａｎｉ）、エイメリア・イリノイセンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、エイメリア・イノクア（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、エイメリア・イントリカタ（Ｅｉｍｅｒｉａｉｎｔｒｉｃａｔａ）、エイメリア・ロイトカルティ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｌｅｕｓｋａｒｔｉ）、エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・メレアグリディス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｄｉｓ）、エイメリア・メレアクセリミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｔｉｓ）、エイメリア・ミティス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ミバティ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ネカトリックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・ネオデブリエッキィ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｅｏｄｅｂｌｉｅｃｋｉ）、エイメリア・ニナコールヤキモレ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｎｉｎａｋｏｈｌｙａｋｉｍｏｒａｅ）、エイメリア・オビナ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｏｖｉｎａ）、エイメリア・パリダ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐａｌｌｉｄａ）、エイメリア・パルバ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、エイメリア・ペルミヌタ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｅｒｍｉｎｕｔａ）、エイメリア・ポルチ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｏｒｃｉ）、エイメリア・プレコックス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・プンクタタ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、エイメリア・スカルバ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｃａｂｒａ）、エイメリア・スピノザ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｉｎｏｚａ）、エイメリア・スブロテゥンダ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）、エイメリア・スブシェリカ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｂｓｈｅｒｉｃａ）、エイメリア・スイス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｕｉｓ）、エイメリア・テネッラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・ウォミングゲンシス（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｗｙｏｍｉｎｇｅｎｓｉｓ）、エイメリア・ズエルニィ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｚｕｅｒｎｉｉ）、エンドリマックス・グレガリニフォルミス（Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ  ｇｒｅｇａｒｉｎｉｆｏｒｍｉｓ）、エンドリマックス・ナナ（Ｅｎｄｏｌｉｍａｘ  ｎａｎａ）、エンタメバ・ボビス（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｂｏｖｉｓ）、エンタメバ・ガリナルム（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンタメバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンタメバ・スイス（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｓｕｉｓ）、ジアルディア・ボビス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｂｏｖｉｓ）、ジアルディア・カニス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｃａｎｉｓ）、ジアルディア・カティ（Ｇｉａｒｄｉａ  ｃａｔｉ）、ジアルディア・ランブリア（Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ）、ヘモプロテウス・メレアグリディス（Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、��キサミタ・メレアグリディス（Ｈｅｘａｍｉｔａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、ヒストモナス・メレアグリディス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）、イオダメバ・ブエツキリ（Ｉｏｄａｍｏｅｂａ  ｂｕｅｔｓｃｈｉｌｉ）、イソスポラ・バヒエシス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂａｈｉｅｎｓｉｓ）、イソスポラ・ブッロウシ（Ｉｓｏｓｐｏｒａｂｕｒｒｏｗｓｉ）、イソスポラ・カニス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｓ）、イソスポラ・フェリス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｆｅｌｉｓ）、イソスポラ・オヒエンシス（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｏｈｉｏｅｎｓｉｓ）、イソスポラ・リボルタ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｒｉｖｏｌｔａ）、イソスポラ・スイス（Ｉｓｏｓｐｏｒａｓｕｉｓ）、クロシエラ・エキ（Ｋｌｏｓｓｉｅｌｌａ  ｅｑｕｉ）、ロイコシトゾーン・カーレルギ（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｃａａｌｌｅｒｇｉ）、ロイコシトゾーン・スミシ（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｓｍｉｔｈｉ）、パラヒストモナス・ウェンリキ（Ｐａｒａｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｗｅｎｒｉｃｈｉ）、ペンタトリコモナス・ホミニス（Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、サルコシスティス・ボトラミ（Ｓａｒｃｏｃｙｔｉｓ  ｂｅｔｒａｍｉ）、サルコシスティス・ビゲミナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、サルコシスティス・クルジ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｃｒｕｚｉ）、サルコシスティス・ファイエビィ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｆａｙｅｖｉ）、ヘミオニラトランティス（ｈｅｍｉｏｎｉｌａｔｒａｎｔｉｓ）、サルコシスティス・ヒルスタ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｉｒｓｕｔａ）、サルコシスティス・ミエシェビアナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｍｉｅｃｈｅｖｉａｎａ）、サルコシスティス・ムリス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｍｕｒｉｓ）、サルコシスティス・オビカニス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｏｖｉｃａｎｉｓ）、サルコシスティス・テネッラ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｔｅｎｅｌｌａ）、テトラトリコモナス・ブッテレイィ（Ｔｅｔｒａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｂｕｔｔｒｅｙｉ）、テトラトリコモナス・ガリナルム（Ｔｅｔｒａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、セイレリア・ムタンス（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｍｕｔａｎｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、トキソプラズマ・ハモンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｈａｍｍｏｎｄｉ）、トリコモナス・カニストメ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｉｓｔｏｍａｅ）、トリコモナス・ガリネ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコモナス・フェリストメ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｅｌｉｓｔｏｍａｅ）、トリコモナス・エベルシ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｅｂｅｒｔｈｉ）、トリコモナス・エキ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｅｑｕｉ）、トリコモナス・フェタス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓ）、トリコモナス・オビス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｏｖｉｓ）、トリコモナス・ロトウンダ（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｒｏｔｕｎｄａ）、トリコモナス・スイス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｓｕｉｓ）、およびトリパノソーマ・メロファギウム（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｍｅｉｏｐｈａｇｉｕｍ）のごとき重要な獣医学的原生動��病原を治療するのにも有用である。加えて、それらは、細胞の老化、全能幹細胞、例えば、胚性幹細胞からの細胞の分化および突然変異におけるテロメアの役割、および精子形成におけるテロメラーゼの役割を研究するのに用いることができる。
【００９５】
テロメア長さ
テロメア長さの測定方法は、当該技術分野において公知であり、本発明において使用することができる。典型的には、（テロメアＤＮＡを切断しない酵素と一緒に）制限エンドヌクレアーゼ消化を利用し、検出可能なテロメアＤＮＡを有するフラグメントの長さは、アガロースゲル電気泳動によって、分子量に従って分離される。テロメアのＤＮＡ配列が知られているとすると、かかるＤＮＡの検出は、特異的なオリゴヌクレオチドの使用によって比較的容易である。これらの方法の実施例を以下に示す。
【００９６】
診断については、テロメア長さの検出において、特定の細胞タイプ、（種々の細胞が存在する）組織中の全細胞、または細胞タイプのサブセットなどが研究される。かかるテロメアを有するＤＮＡの調製は、テロメア長さの測定方法に依存して変化する。
【００９７】
好都合には、ＤＮＡは、抽出、次いで、沈殿によって、ＤＮＡをタンパクから遊離させる慣用手段に従って、単離される。次いで、全ゲノムＤＮＡを、少なくとも約８０℃、通常、少なくとも約９４℃に加熱することによって、または、６Ｘ
ＳＣＣ、チオシアン酸グアニジニウム、尿素などのカオトロピックイオンを有する高い塩分を使用することによって溶融させる。次いで、溶融方法の性質に依存して、媒質をＤＮＡ合成用媒質に換えてもよい。
【００９８】
（ａ）ＤＮＡ合成
１つの方法において、テロメア配列の少なくとも約２反復、好ましくは、少なくとも約３反復、一般に、約８以下の反復、好都合には、約６以下の反復を有するプライマーを使用する。（テロメアの突出またはＧ−リッチ鎖に相補的なヌクレオシド、例えば、ヒト染色体についてＡ、ＴおよびＣを有する）４ヌクレオシド三リン酸のうちの３つだけ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存在下、該プライマーをゲノムＤＮＡに付加する。通常、少なくとも該プライマーまたは少なくとも１つのトリホスフェートを、標識が該鎖における取込み後に保持される検出可能な標識、例えば、放射性同位元素で標識する。標識を使用しない場合、別の方法を使用して、ＤＮＡ合成を検出することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによって、該プライマーを伸長させる。
【００９９】
次いで、種々の技術、例えば、ゲル電気泳動などのその分子量に基づいて合成ＤＮＡを分離する方法によって、伸長したＤＮＡの長さを測定することができる。次いで、合成されたＤＮＡを標識に基づいて、例えば、ＤＮＡ１μｇ当たりに取り込まれた数を検出する。この数は、テロメア長さに正比例する。したがって、ＤＮＡの量に関係する放射能の測定は、テロメア長さを定量化するのに充分である。
【０１００】
所望により、既知の長さのテロメアを標準として使用し、これにより、テロメア長さに関係付けられた標準曲線から放射能の測定が読み取られる。代わりに、組織を調製し、その個々の細胞を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって相対的なテロメア長さについてアッセイする。このアプローチにおいて、例えば、プライマーを検出可能な標識、通常、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識する。アニーリングに付して、組織断片または細胞を調製した後、通常、オートラジオグラフィー（標識が放射性である場合）、アビジン／ストレプトアビジン（標識がビオチンである場合）またはアンチジゴキシゲニン抗体（標識がジゴキシゲニンである場合）を使用して、標識を組織化学的に示す。細胞当たりのシグナルの量は、テロメア反復の数に、したがって、テロメア長さに比例している。これは、微量蛍光光度法または同様の手段によって定量化することができ、既知のテロメア長さの標準的な細胞からのシグナルと比較して、試験試料におけるテロメア長さを測定することができる。
【０１０１】
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ消化
別法としては、テロメアＤＮＡに対するプライマーの共有結合を生じさせるプライマーを使用する。この場合、４塩基認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを全体的に消化させ、その結果、認識部位を欠失しているテロメアＤＮＡを除いて、ＤＮＡの比較的短いフラグメントを生成させる。使用が見いだされる制限エンドヌクレアーゼとしては、ＡｌｕＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｓｐＩ、ＲｓａＩおよびＳａｕ３Ａが挙げられ、該制限エンドヌクレアーゼは、個別に、または組み合わせて使用される。ゲノムＤＮＡの消化後、ハイブリダイゼーション条件下でプライマーを添加し、その結果、テロメア配列の突出鎖に結合させる。プライマーに結合した２つの部分、すなわち、テロメア配列に共有結合用の部分および特異的結合対メンバーとの複合体形成用の部分のために提供することによって、テロメア配列の表面への結合のために提供することができる。例えば、テロメア配列への共有結合のために、結合または鎖によってソラレンまたはイソソラレンをヌクレオチドの１つに結合させ、ＵＶ−照射後にプライマーとテロメアとの間の架橋を形成させる。
【０１０２】
特異的結合対メンバーは、通常、適切な相補的メンバーに結合するハプテン、例えば、ビオチンとストレプト／アビジン、トリニトロ安息香酸と抗トリニトロベンズアミド抗体、または、メトトレキセートとジヒドロ葉酸レダクターゼである。プライマーと共有結合した共有結合に関する部分を有するよりも、核酸中に挿入可能な化合物を媒質中に添加し、その結果、二本鎖核酸配列間に挿入することができる。この方法で、同一の目的を達成することができる。実質的に過剰な挿入可能な化合物の使用によって、存在する別のＤＮＡの部分の中に挿入させることもできる。サイズ分離などの、この方法の種々の変形例によって、標識含有ＤＮＡの量を減少させることできる。
【０１０３】
ビーズ上、カラム中の粒子上などに存在する相補的な対メンバーに結合させることによって、汚染ＤＮＡを含まないテロメアＤＮＡの分離のために、特異的結合対メンバーを使用する。該分離の性質にしたがって、共有結合したテロメア鎖を精製し、サイズまたは分子量について測定する。再度、所望により、分布値の比較のために標準を使用する。
【０１０４】
特異的結合対メンバーハプテンは、プライマーの５’−末端または中間ヌクレオチドに存在することができる。詳細には、ビオチンコンジュゲードヌクレオチドは、一般に、入手可能であり、公知の方法に従って、合成プライマー配列中に容易に導入される。
【０１０５】
前記方法は、テロメアに隣接するＤＮＡの単離および同定のために使用することもできる。
【０１０６】
（ｃ）平均テロメア長さ
本発明の方法において、染色体のテロメア部分の、染色体の他の部分からの分離前に、テロメアにプライマーを結合させることによって平均テロメア長さを測定することは有用である。これは、テロメアのオーバーハングおよびプライマーからなる二本鎖テロメアＤＮＡを提供する。次いで、存在する他のＤＮＡと比較して、テロメアＤＮＡを特異的に同定させる反応を行う。該反応は、標識ヌクレオチドを使用するヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のうち３つのヌクレオチドのみによるプライマーの伸長、プライマーのテロメア配列への共有結合、または、テロメア配列を他の配列から分離させる他の方法を含む。検出された合成ＤＮＡの長さは、平均テロメア長さを表す。
【０１０７】
テロメア長さは、「アンカード・ターミナル・プライマー」法（”ａｎｃｈｏｒｅｄｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ”ｍｅｔｈｏｄ）によって直接測定することもできる。この方法では、ゲノムＤＮＡの３’末端を、まず、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、ｄＧヌクレオチドで「テール化」する。そこで、３’オーバーハングを有することが知られているテロメアは、以下の３つの配列：.....5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGGGGGGGGGG...3’
.....5’-TTAGGGTTAGGGTTGGGGGGGGGGGG...3’
.....5’-TTAGGGTTAGGGTGGGGGGGGGGGGG...3’
のうちの１つを有する。剪断によって生じたゲノムＤＮＡの別の末端は、Ｇでテイル化されるが、隣接するＴＴＡＧＧＧ反復を有していない。したがって、以下の３つのビオチニル化オリゴヌクレオチドの混合物：
5’B-CCCCCCCCTAACCCTA
5’B-CCCCCCCCAACCCTAA  オリゴ混合物〔Ｍ〕
5’B-CCCCCCCCACCCTAAC
は、ストリンジェント条件下、全ての可能なテロメア末端に特異的にアニーリングに付される。オリゴ混合物〔Ｍ〕は、５’ビオチン（Ｂ）を有する１６塩基オリゴヌクレオチドからなっているが、Ｃ−リッチテロメア反復に隣接する５’−Ｃ−トラクトの他の組合せは、天然テロメアの３’末端に対して特異的なハイブリダイゼーションを提供することができる。
【０１０８】
ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰの存在下（ｄＧＴＰは存在せず、ｄｄＧＴＰを有するかまたは有せず）での、クレノウ、ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長は、プライマー−鋳型配置を安定化させ、ストレプトアビジンビーズを使用して、テロメアＤＮＡを含有するＤＮＡの末端フラグメントを選択させる。クレノウは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、ＣＴＲで行き詰まるので、クレノウを使用したプライマー伸長の長さ（標識ヌクレオチドでモニターした）は、テロメア（ＧＴＲ）３’オーバーハングの長さを示す。この長さ分布は、テロメラーゼ−ポジティブ細胞におけるテロメラーゼ活性のレベルを表示する（すなわち、より長い伸長は、より大きなテロメア活性に対応する）。反対に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を有する酵素ＤＮＡポリメラーゼＩによるプライマーの伸長は、鋳型鎖（ＧＴＲに対してサブテロメリック）においてＣが出会うまで、ＣＴＲを介して伸長させる。標識ヌクレオチドによってモニターされるこの反応の長さ分布は、ＧＴＲの長さ分布を表示する。両方の場合、ストレプトアビジンビーズを用いて、ビオチニル化プライマーから生じた標識生成物を選択して、非特異的プライミングからのシグナルを減少させる。別法としては、テール化した染色体末端のリプライミングおよび伸長は、部分的に伸長した生成物のストレプトアビジンビーズによる選択後、および、二重鎖からのＣ−リッチ鎖の変性後に起こすことができる。
【０１０９】
実験により、末端当たり約５０Ｇ残基が付加されるように染色体末端のＧ−テーリングを充分に行うことができること、ジャンクションオリゴヌクレオチド混合物によるプライミングがテール化したテロメア末端に対して非常に特異的であること、ならびに、ストレプトアビジンビーズが、ビオチニル化プライマーから生じるが、他の意外なプライミング事象からは生じない伸長生成物について特異的に選択することが確認された。したがって、概略前記した条件下での伸長生成物の長さは、末端ＴＴＡＧＧＧ反復トラクトの長さの直接推定値を提供する。この情報は、ＴＴＡＧＧＧ反復の伸長が染色体の末端ではなく近くで生じる場合に特に重要である。真の末端ＴＴＡＧＧＧ反復およびかかる内部反復の間で区別することができる他の方法は、今日まで開示されていない。
【０１１０】
前記のテロメア長さの測定は、診断的関心を有する種々の条件に関連させることができる。腫瘍細胞におけるテロメア長さの追跡によって、テロメラーゼの阻害剤の投与（または、前記テロメア長さを不安定にさせる他の治療）の前後のかかる細胞の増殖能に関する情報が提供される。いずれかの治療の効果を追跡し、疾患の経過の予後を提供する手段も提供する。
【０１１１】
疾患組織が含まれる場合、増幅能について天然組織を評価することができる。「増殖能」なる語は、組織中の細胞の、正常な増殖条件下で固定された分裂数についての先天的分裂能を意味する。すなわち、分裂の「ハイフリック」数は、実施例において以下に例示した。したがって、組織が異なる増殖能の細胞のスペクトルを有するという事実にもかかわらず、平均値は、一般に、組織の状態の情報を与える。組織の生検材料を採取し、平均テロメア長さを測定する。次に、該数値を使用して、増殖能について平均正常健康組織に対する値と比較し、この場合、特に、組織を同様の年齢の他の組織と比較する。
【０１１２】
肝臓疾患、例えば、肝硬変、または筋肉疾患、例えば、筋ジストロフィーなどの細胞疾患の場合、増殖能の認識は、ありそうな患者の回復能を診断するのに有用でありうる。他の事態は、手術、創傷、熱傷などの組織に対する損傷を含み、この場合、線維芽細胞の組織再生能は、関心のあるものである。同様に、骨の欠損、骨粗鬆症、または骨の再形成を必要とする他の疾患の場合、骨芽細胞および軟骨細胞の更新能は、関心のあるものである。
【０１１３】
テロメア長さの平均測定値を測定することによる組織の増殖能を評価するための方法は、本明細書に記載されているが、組織が、異なる増殖能の細胞のスペクトルを有することに注意する。実際、肝臓を含む多くの組織は、少数の幹細胞（全細胞の数％未満）だけから再生する。したがって、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光標識テロメアプローブを用いる）を使用すること、かかる幹細胞および／または集合的ではなく個別に基づいたかかる細胞のテロメア状態を同定および定量化することは、本発明において有用である。これは、例えば、自動化顕微鏡画像装置を使用して、個々の細胞核についての蛍光強度を測定することによって行われる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに加えて、ゲル電気泳動は、組織試料中の細胞における平均テロメア長さだけではなく、最長テロメア長さ（幹細胞の存在を示すことができる）およびテロメア長さのサイズ分布（組織内の異なる組織学的細胞タイプを反映する、図１０−１１を参照）を測定するためのオートラジオグラフィーと一緒に有用である。したがって、オートラジオグラム、または、その等価物は、細胞または細胞のグループの全テロメア状態に関する有用な情報を提供する。かかる情報の各セグメントは、本発明の診断方法において有用である。
【０１１４】
ｄ）変形したマキサム−ギルバート反応
現在、テロメア長さを測定するために使用されている最も一般的な技術は、ＨｉｎｆＩのような４塩基認識配列を有する制限酵素によりゲノムＤＮＡを消化すること、ＤＮＡを電気泳動に付すこと、ＤＮＡを放射性標識（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブにハイブリダイズさせるサザンブロットを行うことである。この技術の難点は、得られた末端制限フラグメント（ＴＲＦ）が、制限部位を欠失し、これによって、測定されたテロメア長さのサイズに有意に付加する３〜５ｋｂｐ伸張のサブテロメアＤＮＡを含有することである。このＤＮＡを削除し、テロメア長さアッセイの精度を改良するための別のアプローチは、このサブテロメアＤＮＡが両方の鎖にＧおよびＣ残基を含有しており、したがって、Ｇ残基で分解させる条件下で切断されるという事実を利用する。反対に、テロメア反復から排他的に構成されるＤＮＡは、Ｇ残基を欠失する１つの鎖を有しており、この鎖は、Ｇ−切断条件下で無傷のままである。マキサム−ギルバートＧ−反応は、ピペリジンを使用して、ジメチルスルフェート（ＤＳＭ）処理によってメチル化されたグアニジン残基を切断する。マキサム−ギルバートＧ−反応（９０℃で３０分間、１Ｍピペリジン中で処理）の初期条件は、未メチル化ＤＮＡを１〜２ｋｂｐのフラグメントに分解し、非特異的であるが、適度な条件（３７℃で３０分間、０．１Ｍピペリジン）は、未処理ＤＮＡを無傷のままにする。したがって、該ＤＮＡを前記のようにＤＳＭおよびピペリジンで処理し、エタノールで沈殿させ、電気泳動に付し、（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブに対してサザンブロットでハイブリダイズさせる。かかる試験の結果を図２６に示す。
【０１１５】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性は、特に、新生細胞または始原細胞、例えば、胚幹細胞に関して、成長ポテンシャルのマーカーとして有用である。ヒトテロメラーゼ活性は、２以上、通常３以上のテロメア単位配列ＴＴＡＧＧＧの反復を有する適切な反復配列（プライマー）の伸長速度を測定することによって決定される。該配列は、好都合な部位、例えば、５’−末端で特異的結合対メンバーで標識され、該特異的結合対メンバーは、伸長した配列を分離させる。前記のように、１以上の放射性ヌクレオシド三リン酸または別の標識ヌクレオシド三リン酸を使用することによって、テロメラーゼ活性の尺度として、時間の単位の関数としてＤＮＡの単位重量当たりのｃｐｍとして取り込まれた放射能を測定することができる。他の検出可能なシグナルおよび標識、例えば、フルオレセインを使用することもできる。
【０１１６】
該活性は、細胞質抽出物、核抽出物、溶解細胞、全細胞などを用いて測定される。使用される特定の試料および予備処理方法は、主に、便利さの１つである。予備処理は、テロメラーゼの変性を避け、結果として、テロメラーゼ活性を維持することができる条件下で行われる。プライマー配列は、試料中に存在する他のＤＮＡから分離させることができるように、選択または標識化される。したがって、ハプテン標識を使用して、試料のテロメラーゼ活性を表す伸長した配列を容易に分離させることができる。使用されるヌクレオシド三リン酸は、標識される少なくとも１つのヌクレオシド三リン酸を含む。標識は、通常、放射性標識であるが、他の標識が存在してもよい。該標識は、特異的結合対メンバーを含んでおり、相互のメンバーは、フルオレサー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、酵素、または他の検出可能な標識で標識される。別法としては、ヌクレオシド三リン酸は、蛍光標識などの他の標識で直接標識される。
【０１１７】
配列伸長は、通常、好都合な温度、通常、約２０℃〜４０℃で、少なくとも約１００ｂｐを平均して初期配列に付加させるのに充分な時間、一般に、３０〜９０分間行われる。テロメラーゼ触媒伸長させるためのインキュベーション時間の後、慣用手段、例えば、変性、例えば、加熱、阻害剤の添加、標識による配列の迅速な取り出し、および洗浄などによって、該反応を停止させる。次いで、分離されたＤＮＡを洗浄して、非特異的結合ＤＮＡを除去し、次いで、慣用手段によって標識を測定する。
【０１１８】
テロメラーゼ活性の測定は、種々の方法で使用される。例えば、新生物に関連する組織を扱う場合、細胞が不死化されているかを測定するために使用することができる。したがって、細胞がテロメラーゼ活性を有しているか、不死化されているかを、腫瘍の周縁で測定することができる。テロメラーゼの存在および活性は、癌または他の疾患のステージングにも関連している。テロメラーゼに関連する他の診断的関心は、酵素を阻害するように設計された治療計画における効力についてのアッセイとしての活性の測定を含む。
【０１１９】
他のテロメラーゼ活性の測定方法は、テロメラーゼタンパクに対して特異的な抗体を使用することができ、種々の方法でテロメラーゼタンパクの量を測定することができる。例えば、表面に結合した第１エピトープに対するモノクローナル抗体の表面に結合したポリクローナル抗血清および媒質中で分散させられた第２エピトープに対する標識ポリクローナル抗血清または標識モノクローナル抗体を使用し、２つの抗体間に架橋するテロメラーゼまたはそのサブユニットの結果として表面に結合された標識の量を検出することができる。別法としては、テロメラーゼＲＮＡに対するプライマーを準備し、リバーストランスクリプターゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を使用して、細胞中に存在するテロメラーゼの量の指標としてテロメラーゼＲＮＡの存在および量を測定する。
【０１２０】
以下の実施例は、説明のために記載するのであって、限定のためではない。
【実施例】
【０１２１】
当業者に本発明を更に説明するために、本発明の詳細な態様の例を以下に記載する。これらの実施例は、本発明を限定するものではなく、本発明の実施において有用な特定の方法を示すものである。それらは、本発明の利用性、ならびに、テロメア長さ、テロメラーゼ活性および細胞の老化間の相互関係を明白に示すものでもある。かかる相互関係は、これらの実施例を超えて本発明の広さを当業者に示す。
【０１２２】
実施例１：テロメア長さおよび細胞増殖
細胞増殖に対するテロメア長さ変調の効果を研究した。体細胞中での細胞分裂当たり平均５０ｂｐが失われる。テロメア末端は、以下の一本鎖領域：
5’TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG
GGTTA GGG
3’AATCCCAATCCC  （配列番号１）
を有すると考えられる（しかし、オーバーハングの量は、未知である）。出願人は、細胞に配列ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号２）の合成オリゴヌクレオチドを提供する場合、この一本鎖オーバーハングの欠失が有意に遅くなると仮定した。このオリゴヌクレオチドは、露出した一本鎖領域にハイブリダイズし、体細胞中に存在する正常なＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のためのプライマーとして供される。この方法では、分裂当たり平均５０ｂｐによる短縮よりも、該テロメアは、より少量の分裂当たりの量による短縮だけであり、したがって、テロメア短縮が細胞老化を誘発する前に、分裂の数を有意に拡張することが必要であった。この仮説を、対照オリゴヌクレオチドに対するこの所定のオリゴヌクレオチドで処理された培養細胞中での増殖寿命の変化およびテロメア短縮速度を測定することによって試験した。
【０１２３】
ＣＴＯ−１２オリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’配列番号２）の細胞老化に関連するテロメア短縮低下能（図１）は、１０％ウシ胎児血清を補足した最少必須培地中、標準的な細胞培養条件下で培養された標的細胞を使用して研究した。該細胞は、コンフリューエンシーに達成した後、トリプシン化によって４日毎に継代培養し、継代培養時または２日毎に新しい培地を供給した。いずれも最初に行った。種々の集団倍加レベルの細胞をウエル当たり細胞１０，０００個の割合で接種し、種々の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する培地を供給した。研究したオリゴヌクレオチドは、シチジン−リッチ末端オリゴヌクレオチド（ＣＴＯ−１２）、グアニジン−リッチ末端オリゴヌクレオチド−１２ｂｐ（ＧＴＯ−１２、配列５’−ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号３））および位置毎にランダムヌクレオチドを有する１２塩基対ランダマー（ｒａｎｄｏｍｅｒ）であった。さらなる対照として、細胞にオリゴヌクレオチドを含有しない同一の培地を供給した。４８時間毎に１０Ｘ母液から細胞にオリゴヌクレオチドを供給した。（かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、ジチオエートおよび２−Ｏ−メチルＲＮＡを用いて、安定性を増強するために修飾した。）ホスホロチオエートの場合、５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ−３’、５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ−３’または５’−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣ−３’などの、より長いＣＴＯプライマーを使用するのが望ましい。
【０１２４】
詳細には、約５５回の集団倍加（ＰＤ）の増殖能を有するＩＭＲ−９０ヒト肺線維芽細胞を、４８ウエル組織培養皿中、ウエル当たり細胞１０，０００個の割合でＰＤ４５で接種し、培地のみまたはＣＴＯ−１２（１．０μＭおよび０．１μＭ）および１．０μＭの１２塩基対ランダマーを補足した培地を供給した。図１に示すとおり、オリゴヌクレオチドを含有しない培地または１．０μＭ未満のＣＴＯ−１２もしくはランダム配列のオリゴヌクレオチドを含有する培地中で増殖した細胞は、約５２回の集団倍加で同様に複製老化に達した。細胞に１．０μＭのＣＴＯ−１２オリゴヌクレオチドを供給したが、対照細胞よりも約１０回多い倍加の間増殖し続けた。
【０１２５】
実施例２：癌細胞におけるテロメラーゼの阻害
癌細胞が細胞老化を逃れることができる１つの方法は、複数回の細胞分裂にもかかわらず、それらのテロメアの長さを維持させるテロメラーゼ活性を回復させることによる。酵素テロメラーゼは、ＴＴＡＧＧＧに相補的なＲＮＡを含有しており、それにテロメアを認識させ、さらなるＴＴＡＧＧＧ反復の添加によってそれらを伸長させる。実際、テロメラーゼについての１つのアッセイは、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーを使用し、細胞抽出物の、この基質への６ｂｐ添加物のラダー（ｌａｄｄｅｒ）を合成する能力を測定する。癌細胞中のテロメラーゼ活性は、テロメア長さが比較的安定であるので、限定量中に存在すると思われる（したがって、延長および短縮が均衡するように、テロメア当たり約５０ｂｐを添加する）。
【０１２６】
出願人は、細胞に供給すると、合成ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧオリゴヌクレオチド（配列番号３）がテロメラーゼの染色体末端伸長能を競争的に阻害し、したがって、癌細胞中のテロメアを短縮および老化させると仮定した。体細胞は、テロメラーゼ活性を欠いているので、この治療の効果は、癌細胞および生殖細胞系に厳格に限定されるべきである。
【０１２７】
詳細には、１２ウエル組織培養皿中、ウエル当たり細胞１０，０００個の割合で、不死表現型を有するＭＤＡ  １５７ヒト乳癌細胞を接種し、培地のみまたはＧＴＯ−１２（１．０μＭ、０．１μＭおよび０．０１μＭ）を補足した培地を供給した。図２に示すとおり、オリゴヌクレオチドを含有しない培地または１．０μＭ未満の投薬を含有する培地中で増殖した細胞は、不死表現型において複製し続けた。細胞に１．０μＭのＧＴＯ−１２オリゴヌクレオチドを供給したが、１０回未満の倍加の後、増殖が止まった。１．０μＭ  ＣＴＯ−１２または１．０μＭ  ＣＴＯ−１２および１．０μＭ  ＧＴＯ−１２（Ｇ＋Ｃ）の存在下で増殖した細胞は、不死表現型を発現し続け、ＧＴＯ−１２オリゴヌクレオチドが本質的に毒性ではないことを示唆した（図３）。Ｇ＋Ｃ混合物の効果の欠失は、ＣＴＯ−１２オリゴヌクレオチドがＧＴＯ−１２オリゴヌクレオチドと競争または塩基対化することを示す。これは、癌細胞テロメラーゼに対するその阻害剤効果を予防する。
【０１２８】
実施例３；バイオマーカーとしてのテロメア長さ
アメリカ合衆国および西ヨーロッパでは、アテローム性動脈硬化症は、心臓血管疾患による死亡数に対する主要な因子である〔ロス（Ｒｏｓｓ）、３１４、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、４８８、１９８６〕。アテローム性動脈硬化症は、動脈組織の内膜表面上での脂質および細胞−リッチ病変または「プラーク」の壁状または巣状形成によって特徴付けられる。これに、病変の管腔中への年齢依存性拡大が続き、閉塞および心筋梗塞および／または脳梗塞を誘発する可能性がある〔ハウスト（Ｈａｕｓｔ）、（１９８１）バスキュラー・インジャリー・アンド・アセロウスクラロウシス（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ムーア，エス（Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．）編、（マーセル・デッカー・インコーポレイテッド（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク）、第１〜２２頁；ロスおよびグロムセット（Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｇｌｏｍｓｅｔ）、２９５（７）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３６９、１９７６；およびロス（Ｒｏｓｓ）、２９５（８）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４２０、１９７６〕。アテローム性動脈硬化症の病原を説明するために提案されたメカニズムのうち重要なものは、「損傷に対する応答」（ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｔｏ−ｉｎｊｕｒｙ）仮説であり〔ロス、３１４、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４８８、１９８６；ムーア、（１９８１）バスキュラー・インジャリー・アンド・アセロウスクラロウシス、ムーア，エス編、（マーセル・デッカー・インコーポレイテッド、ニューヨーク）、第１３１〜１４８頁；およびムーア、２９（５）、ラボラトリー・インベスティゲーション（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、４７８、１９７１〕、ここでは、内皮に対して繰り返される機械的、血流力学的および／または免疫学的損傷が開始事象である。
【０１２９】
この仮説の予言は、アテローム性動脈硬化性プラークからなる領域における内膜および中間組織が周囲の正常組織よりも高い細胞ターンオーバー速度を有することである。いくつかの証拠の系は、この予言を支持する。ロスら〔ロスおよびグロムセット、２９５（７）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３６９、１９７６；ロス、２９５（８）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、４２０、１９７６〕は、培養した線維性プラーク由来平滑筋細胞が、下にある中間層からの細胞と比較すると血清増殖に対して低い応答性を示すことを開示した。モスおよびベンディット（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｔｔ）７８（２）（１９７３）アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１７５、１９７３は、動脈プラークからの細胞培養物の複製寿命が非プラーク領域の細胞からの複製寿命と等しいかまたはそれ未満であることを開示した。ダルチュ（Ｄａｒｔｓｃｈ）ら、１０アーティリオウスクリロウシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）６２、１９９２は、原発性狭窄病変から得られたヒト平滑筋細胞が、培養物中で、再狭窄病変からの平滑筋細胞よりもかなり遅く老化することを開示した。これらの結果によって、アテローム性動脈硬化性プラークの領域から誘導された細胞が非プラーク領域からの細胞よりも多く細胞分裂を受け、その結果、それらをより古くさせ、それらの最大複製能に近づけることが示唆される。
【０１３０】
したがって、アテローム性動脈硬化症の病原を理解するために、動脈病変上またはそれに隣接する細胞ターンオーバーの行動の変調を試験しなければならない。内膜および中間組織の細胞ターンオーバーについてのバイオマーカーが必要である。数人の研究者は、アテローム性動脈硬化症の進行または個人のアテローム性動脈硬化症発病傾向についてのバイオマーカーを試験した。前者の目的は、血漿中で検出されるが、内皮に源を発する多くの生化学化合物の測定を伴った。例えば、血清ＩＩＩ型コラーゲン〔ボネット（Ｂｏｎｎｅｔ）ら、１８ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｅｖｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）１８、１９８８〕、フォン・ウイルブランド因子（ＶＩＩＩ因子）〔バロン（Ｂａｒｏｎ）ら、１０アーテイリオウスクリロウシス、１０７４、１９９０〕、コレステロール、トリグリセリド、アポリポ蛋白Ｂ〔ストリンジャーおよびカッカー（Ｓｔｒｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｋｋａｒ）、４（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、５１３、１９９０〕、リポ蛋白（ａ）〔ブレッケンリッジ（Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ）、１４３、カナディアン・メディシナル・アソシエイション・ジャーナル（Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．）、１１５、１９９０；メッダウー（Ｍｅｚｄｏｕｒ）ら、４８アナレ・ドウ・ビオロジー・クリニク（Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．）（パリ）、１３９、１９９０；およびスキャヌ（Ｓｃａｎｕ）、１４クリニカル・カルディオロジー（Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．）、１３５、１９９１〕、エンドテリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）〔ラーマン（Ｌｅｒｍａｎ）ら、３２５、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、９９７、１９９１〕およびヘパリン−放出可能な血小板第４因子〔サダヤス（Ｓａｄａｙａｓｕ）ら、１４（１９９１）クリニカル・カルディオロジー、７２５、１９９１〕が挙げられる。多くのマーカーは、細胞表面に源を発する〔ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、１１（１９９１）アーティリオウスクリロウシス・アンド・スロンボウシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．）７４５、１９９１；およびシブルスキーおよびガーンブロン（Ｃｙｂｕｌｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｉｒｎｂｒｏｎｅ）、２５１サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）７８８、１９９１〕。他のマーカーは、アテローム発生の結果として生理的異常をモニターする〔ヴィタ（Ｖｉｔａ）ら、８１（１９９０）サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）４９１、１９９０〕。アテローム性動脈硬化症に対して感作性のためのもののＲＦＬＰプロフィルを描くために使用された候補遺伝子〔セペフルニア（Ｓｅｐｅｈｒｎｉａ）ら、３８（１９８８）Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．１３６、１９８８；およびチャンバーレインおよびガルトン（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ａｎｄ  Ｇａｌｔｏｎ）、４６Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．９１７、１９９０〕も確立された。しかしながら、細胞ターンオーバーを直接モニターするために開発された比較的少ないマーカーがあった。
【０１３１】
今、出願人は、テロメア長さがアテローム発生に含まれる組織中の細胞ターンオーバーのバイオマーカーとして供されることを示す。この結果は、内皮細胞が複製年齢の関数としてｉｎ  ｖｉｔｒｏでテロメアを失い、ｉｎ  ｖｉｖｏテロメア損失が一般に非プラーク領域からの対照組織と比較してアテローム性動脈硬化性プラークの組織についての方が大きいことを示す。
【０１３２】
一般に、末端制限フラグメント〔ＴＲＦ、ヒトゲノムＤＮＡのＨｉｎｆＩ／ＲｓａＩ消化を介して生じた。ＴＲＦは、ゲル電気泳動によって分解され、テロメアオリゴヌクレオチド（32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3（配列番号４）とハイブリダイズさせた〕のサザン分析によって、テロメア長さを評価した。平均ＴＲＦ長さは、臍静脈からのヒト内皮細胞培養物における集団倍加の関数として（ｍ＝−１９０ｂｐ／ＰＤ、Ｐ＝０．０１）、ならびに回腸動脈におけるドナー年齢の関数（ｍ＝−１２０ｂｐ／ＰＤ、Ｐ＝０．０５）および回腸静脈におけるドナー年齢の関数（ｍ＝−１６０ｂｐ／ＰＤ、Ｐ＝０．０５）として減少した。したがって、平均ＴＲＦ長さは、全細胞培養物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ年齢に伴って減少した。初期に継代細胞培養物をドナー年齢の関数として平均ＴＲＦ長さについて評価すると、回腸動脈について有意な減少（ｍ＝−１０２ｂｐ／ｙ、Ｐ＝０．０１）があっが、回腸静脈についてはなかった（ｍ＝４７ｂｐ／ｙ、Ｐ＝０．１４）。中間組織の平均ＴＲＦ長さは、ドナー年齢の関数として有意に（Ｐ＝０．０５）減少した。アテローム性動脈硬化性プラークの広範囲にわたる発生を示した個人からの内膜組織は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで老化細胞について観察されたものと近接した平均ＴＲＦ長さを有した（−６ｋｂｐ）。これらの観察結果は、テロメアの大きさが、実際に、内膜および中間の複製暦についてのバイオマーカーとして供され、内皮細胞の複製老化がアテローム発生に含まれることを示す。
【０１３３】
詳細には、以下の物質および方法を使用して、以下の結果を得た。
【０１３４】
内皮細胞培養物
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、米国赤十字社のジェロウム・エイチ・ホーランド・ラボラトリー（Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のドクター・トーマス・マシアグ（Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｍａｃｉａｇ）から入手した。回腸動脈および回腸静脈からのヒト内皮細胞は、セル・リポジトリー・オブ・ザ・ナショナル・インスティチュート・オブ・エイジング（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ）（ニュージャージー州カンデン）から入手した。内部を０．４％ゼラチンの一晩コーティング（３７℃）で処理した１００ｍｍ組織プレート上で５％ＣＯ2中、３７℃で、細胞を増殖させた。補足された培地は、Ｍ１９９、１５％ウシ胎児血清、５Ｕ／ｍｌヘパリンおよび２０μｇ／ｍｌ粗製内皮細胞増殖補足（コラボレイティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））または粗製内皮細胞増殖因子（ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））からなっていた。培養物をコンフリューエンスでトリプシン化し（０．０５％、３分間）、最終細胞密度の２５％で再接種し、２〜３日毎に再供給した。
【０１３５】
組織試料
大動脈弓、腹大動脈、回腸動脈および回腸静脈からの組織試料は、マクマスター・ユニバーシナィ（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、デパートメント・オブ・パソロジー，ヘルス・サイエンシズ・センター（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）での剖検から入手した。死後５〜８時間の範囲であった。動脈または静脈を切開し、管腔表面をＮｏ．１０メス〔ランス・ブレイディズ（Ｌａｎｃｅ  Ｂｌａｄｅｓ）、シェフィールド〕で注意深く削り落とすことによって、内膜を得た〔リャン（Ｒｙａｎ）、５６Ｅｎｖｉｒ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐａｒ．１０３、１９８４〕。得られた物質をＤＮＡの抽出のために直接処理するか、または、細胞培養のために処理した。
【０１３６】
血管の非管腔側を切断または削り落とすことによって、外膜層を除去した。液体Ｎ2中で凍結させ、液体Ｎ2冷却した乳鉢および乳棒で粉砕し、残りの中間層を調製した〔ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１５８、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、４４５、１９８５〕。組織を粉末に磨砕した後、凍結消化バッファー（１０ｍＭトリス；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ；ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、粉末化した組織に磨砕した。次いで、該粉末を５０ｍｌファルコン管に移し、解凍するまで、４８℃でインキュベートした。０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にプロティナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。１２−１６時間インキュベーション後、該溶液を水浴から取り出し、ＤＮＡ抽出のために調製するか、または２０℃で貯蔵した。
【０１３７】
ゲノムＤＮＡの抽出および制限酵素消化
従前の記載に従い、ＤＮＡを抽出した〔ハーリィ（Ｈａｒｌｅｙ）ら、３４５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４５８、１９９０；オールソップ（Ａｌｌｓｏｐｐ）ら、８９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）１０１１４，１９９２〕。すなわち、プロテイナーゼＫ−消化溶解物を、１容量倍のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、次いで、クロロホルムで１回抽出した。水性層に２容量倍の１００％ＥｔＯＨを添加することによって、核酸を沈殿させ、７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し、最後に、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１００〜２００μｌに再懸濁させた。ＤＮＡを蛍光光度法によって定量化し、１μｇを、３７℃で３〜２４時間、各１単位のＨｉｎｆＩ／ＲｓａＩで消化させた。ゲル電気泳動によって、完全な消化をモニターした。消化前および後のＤＮＡの完全性を、ゲル電気泳動による対照試験でモニターした。
【０１３８】
サザンブロットハイブリダイゼーション
従前の記載に従い、全６５０−７００Ｖ／時間について、標準的なトリス、ホウ酸ナトリウム、ＥＤＴＡバッファー中で、消化したゲノムＤＮＡの電気泳動を行った〔ハーリィ（Ｈａｒｌｅｙ）ら、３４５ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４５８、１９９０；オールソップら、８９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ、１０１１４、１９９２〕。電気泳動後、該ゲルを３ｍｍワットマン濾紙上に置き、６０℃で２５分間、真空乾燥させた。ゲルを、室温で１０分間、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ中に浸漬させることによって変性させ、次いで、０．５Ｍトリス、１．５Ｍ  ＮａＣｌ中での浸漬を介して中和させた。ゲノムＤＮＡを、３７℃で１２〜１６時間、テロメア32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3プローブ（配列番号４）を有する標準ハイブリダイゼーション溶液〔ハーリィら、３４５、ネイチャー、４５８、１９９０〕（６Ｘ  ＳＣＣ）中に浸漬させた。テロメア塗抹標本を、予めフラッシュした（ＯＤ545＝０．１５）コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲ−５フィルム上でオートラジオグラフィを介して可視化した。従前の記載に従って、現像したフィルムの比重走査から、末端制限フラグメント（ＴＲＦ）の平均長さを算出した〔ハーリィら、３４５、ネイチャー、４５８、１９９０〕。
【０１３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果
アテローム性動脈硬化症における細胞ターンオーバーについてのバイオマーカーとしてテロメア長さを使用することの可能性を決定するために、本発明者らは、まず、細胞分裂をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接モニターすることができる培養した内皮細胞中のテロメア長さの変化を実験した。ＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩで消化し、得られた末端制限フラグメント（ＴＲＦ）をサザン分析に付した。ヒト皮膚線維芽細胞におけるように〔オールソップら、８９プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ、１０１１４、１９９２〕、平均ＴＲＦ長さは、集団倍加（ＰＤ）の関数として減少した。したがって、テロメア長さは、ヒト臍静脈内皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ年齢に伴って減少した。平均ＴＲＦ長さは、１９０±１０ｂｐ／ＰＤの速度で直線的に（Ｐ＝０．０１）減少した（図４を参照）。０  ＰＤＬでの平均ＴＲＦを表すＹ−切片は、１４．０ｋｂｐであり、一方、老化時の平均ＴＲＦは、５．７±０．４ｋｂｐであった。
【０１４０】
テロメア長さの減少が別の動脈および静脈供給源からの内皮細胞中で生じていることを証明するために、ヒト回腸動脈およびヒト回腸静脈からの内皮細胞のいくつかの株について、平均ＴＲＦ長さ対集団倍加レベル（ＰＤＬ）を測定した。回腸動脈および回腸静脈の両方において、培養物の年齢に伴う平均ＴＲＦ長さの有意な（Ｐ＝０．０５）直線的減少が見られた：内皮細胞からの、回腸動脈についての集団倍加当たり１２０±６０ｂｐおよび回腸静脈についての集団倍加当たり１６０±３０ｂｐ。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ結果
アテローム性動脈硬化性プラークの形成は、回腸静脈におけるよりも回腸動脈における方がよく生じ〔クロウフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、（１９８２）パソロジー・オブ・アセロウスクレロウシス（Ｐｈａｔｈｏｌｏｆｙ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（バターワース・アンド・カンパニー・リミテッド（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、Ｕ．Ｋ．）、第１８７〜１９９頁〕、したがって、回腸動脈からのｉｎ  ｖｉｖｏ内膜組織のターンオーバーが回腸静脈からよりも大きくあるべきであると思われる。これを試験するために、１４〜５８歳の年齢範囲のドナーからの回腸動脈および静脈からの内皮細胞培養物の９種類の株を培養し、最も初期の可能なＰＤＬからのＴＲＦ長さを測定した（図５）。
【０１４２】
静脈におけるよりも大きな、動脈におけるｉｎ  ｖｉｖｏ細胞ターンオーバーの仮説と一致する平均ＴＲＦ長さの減少速度は、回腸動脈について（−１００ｂｐ／ｙｒ、Ｐ＝０．０１）２０〜６０年の範囲よりも有意であり、回腸静脈について（−４７ｂｐ／ｙｒ、Ｐ＝０．１４）よりも大きい。内皮細胞の９種類の株の中に、ドナーのうち３人、２１歳、４７歳および４９歳のドナーについて同一の個体から回腸動脈および回腸静脈からの培養物があった。高齢ドナー２人については、静脈細胞と比較して、回腸動脈の培養物中の平均ＴＲＦ長さが有意に短かった。若いドナーは、２つの培養物間で平均ＴＲＦ長さの有意な差異を示さず、２１歳のドナーの血管間の細胞ターンオーバーの比較的小さな差異を示すことができた。
【０１４３】
異なる年齢のドナーにおける回腸動脈および回腸静脈からの細胞培養物の平均ＴＲＦ長さの差異は、一次組織の初期平均ＴＲＦ長さの差異だけではなく、分析のために充分な細胞を回収するために必要な時間じゅう、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの異なる培養物間のテロメア損失速度の差異も示す（約５〜１０ＰＤＬ）。細胞ターンオーバーおよびアテローム性動脈硬化性プラーク形成度の間に相関関係があるかを測定するために、本発明者らは、一次組織における平均ＴＲＦ長さを試験した。３歳、１１歳、１２歳、１４歳、１８歳、２６歳、７５歳の女性および７７歳の男性からの剖検を試験した。大動脈弓、腹大動脈、回腸動脈および回腸静脈の切片を採取し、内膜および中間組織を分離し、ＴＲＦ長さについて評価した。
【０１４４】
ＴＲＦ分析のために、３人のドナー（２７歳、７５歳および７７歳）の大動脈弓、腹大動脈、回腸動脈および回腸静脈から充分な内膜組織を入手することができた。２７歳の女性（１０．４±０．７ｋｂｐ）対７５歳（８．８＋０．６ｋｂｐ）および７７歳の男性（６．３＋０．４ｋｂｐ）において、これらの部位にわたって平均された平均ＴＲＦ長さの間に著しい差異があった。７７歳の男性は、血管系に広範囲のアテローム性動脈硬化性病変を有しており、彼の内膜組織の平均ＴＲＦ長さは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの老化時、内皮細胞のものと近接していること（約６ｋｂｐ、図４）は、注目すべきことである。
【０１４５】
図６は、中間組織（大動脈弓から）の平均ＴＲＦが、小さいが有意な速度（４７ｂｐ／ｙｒ、Ｐ＝０．０５）で、ドナー年齢に伴って減少することを示す。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの中間細胞ターンオーバーは、静脈または動脈内皮細胞のものよりも小さな速度で生じる。
【０１４６】
一般に、アテローム性動脈硬化性プラークの下にある中間組織におけるテロメア損失は、非プラーク領域での損失よりも大きかった（第１表）。７５歳の女性について、平均ＴＲＦは、大動脈弓（Ｐ＝０．０４）および腹大動脈（Ｐ＝０．０１）の両方の非プラーク領域に対するプラーク領域からの中間ＤＮＡにおいて有意に減少した。７７歳の男性については、これは、腹大動脈において観察された（Ｐ＝０．０１）。
【０１４７】
（表１）
プラークおよび非プラーク領域の一次中間組織についての平均ＴＲＦ値
プラーク領域        非プラーク領域      Ｐ
７５歳のドナー
大動脈弓    １０．２＋０．５    １１．１±０．１    ０．０４
腹大動脈      ９．５±０．６    １１．０±０．１    ０．０
１７７歳のドナー
大動脈弓      ８．２±０．４      ８．４±０．２      ＮＳ
腹大動脈      ７．１±０．１      ８．２±０．４    ０．０１
これらの結果は、平均ＴＲＦ長さが一次中間および内膜組織についてドナー年齢の関数として減少することを示しており、細胞ターンオーバーが心臓血管組織において生じることを示唆する。同一の血管からの中間組織の透明領域に対するプラーク領域についての平均ＴＲＦ長さの減少は、アテローム性動脈硬化性プラークに関連する組織の増加した細胞ターンオーバーと一致する。したがって、結果は、テロメア長さの測定が、心臓血管疾患に関連する組織、すなわち、内膜および中間の細胞中の細胞ターンオーバーの変調についてのバイオマーカーを提供することを示す。
【０１４８】
テロメア長さの測定は、増殖暦の直接的なレジスターであるが、テロメアＤＮＡを得るためには、内皮細胞の生検を入手しなければならない。内皮自体の除去は、プラーク形成を誘発するので、生検ストラテジーは、明らかに、倫理上および実用上の問題を伴う。剖検試料による経験に基づいて、本明細書の記載に従ってサザン分析を行うために、最小面積１ｃｍ2を必要とする。実用的な生検については、このことは、支持できない。この問題を回避するための検出技術は、同焦点蛍光顕微鏡である。
【０１４９】
実施例４：テロメア長さについての簡素化試験
テロメア長さは、異なる年齢のドナーから培養した細胞の残存寿命の最良の予言者である。したがって、テロメア長さ測定能は、有意な臨床用途を有する。それらの簡単な反復性質のために、テロメアは、多くの制限酵素によって認識されたＤＮＡ配列を欠失している。テロメア長さを測定する１つの方法は、ＤＮＡのほとんどを非常に小さな小片に切断し、比較的大きなＴＲＦ（末端制限フラグメント）におけるテロメアを離脱させる４塩基認識部位を有する制限酵素でＤＮＡを消化することである。次いで、ＤＮＡのサザンブロットを放射性ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号５）オリゴヌクレオチドでプローブ化し、ＴＲＦのサイズを測定する。
【０１５０】
テロメア長さを測定するための非常に簡単な方法は、テロメア配列がＣ−リッチ鎖におけるグアニジン残基を欠失しているという事実を利用する。ゲノムＤＮＡを溶融させ、ＤＮＡポリメラーゼおよび３種類だけのデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよび放射性ｄＣＴＰ）の存在下、ＤＮＡ合成プライマーＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号６）と混合させることができる。ゲノムの全体にわたって分散された稀な相補的配列は、ｄＧＴＰの欠失ために伸長し損じる。次いで、伸長したＤＮＡの長さを、簡単なゲル電気泳動から測定することができる。合成したＤＮＡの量（ＤＮＡ１μｇ当たりに取り込まれた数）は、テロメア長さに正比例し、診断目的のためには、簡単な放射能測定がテロメア長さを定量化するのに充分である。
【０１５１】
実施例５：テロメア付近のＤＮＡ配列の同定
細胞および生物老化を制御する調節因子がテロメア付近に配置されており、隣接するテロメアの長さによって自己調節されているということを信じるのに良好な理由がある。したがって、老化プロセスを理解し、操作することができるためには、それらを同定し、クローン化することが重要である。さらに、マッピングの目的のためのテロメアマーカーが染色体の末端について欠落しているので、ヒトゲノムプロジェクト内で固有のテロメアＤＮＡを同定するのに大きな関心がある。
【０１５２】
１つの方法では、大きなテロメアＤＮＡは、以下のとおり精製される。ビオチニル化したＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ（配列番号７）オリゴヌクレオチドを使用して、二本鎖ゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ合成を活性化させる。このオリゴヌクレオチドがアニールすることができる唯一の配列は、テロメア末端の一本鎖塩基オーバーハングである。次いで、伸長したＤＮＡをＮｏｔＩなどの制限酵素で消化して、大きな制限フラグメントを生成させる。ビオチニル化したフラグメントを、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して回収し、パルス化磁場電気泳動によって分析した。４６フラグメント（２３ヒト染色体の両端に１つずつ）が生成される。
【０１５３】
複数ストラテジーを使用して、大きなテロメアＤＮＡの好結果の単離を追跡することができる。テロメア近辺にある遺伝子を同定するために、ＤＮＡを標識し、これを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンにかける。次いで、これらのｃＤＮＡの発現を試験することができる。次いで、細胞老化の関数として別々に表され、したがって、加齢を制御する調節因子であるための候補であるこれらを同定するために、古い細胞に対する若い細胞において、これらのｃＤＮＡの発現を試験することができる。
【０１５４】
精製したテロメアＤＮＡをさらなる制限酵素で消化し、１００倍過剰のゲノムＤＮＡと混合し、溶融し、再アニールさせることもできる。これらの環境下で、テロメアＤＮＡ中の反復配列は、ゲノムＤＮＡでアニールし、一方、精製されたＤＮＡにおける固有の配列は、自己アニールする。自己アニールした固有の配列だけは、両端に制限オーバーハングを含有しており、したがって、アニールしたＤＮＡの簡単なクローニングは、固有のフラグメントだけの好結果のクローニングを生じる。
【０１５５】
実施例６：ダウン症候群患者におけるテロメア損失
ヒト染色体からのテロメアＤＮＡの損失は、最後には複製老化の間に細胞サイクル出口を生じる。リンパ球が限定された複製能を有しており、血球がｉｎ  ｖｉｖｏで加齢の間にテロメアＤＮＡを損失することを予め示したので、本発明者らは、加速されたテロメア損失がダウン症候群（ＤＳ）を有する個体におけるリンパ球の早期免疫老化に関連するか、および、テロメアＤＮＡもｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリンパ球の加齢の間に損失されるかを判定することを希望した。
【０１５６】
加齢および三染色体性２１のｉｎ  ｖｉｖｏテロメア損失に対する効果を研究するために、ゲノムＤＮＡを１４０個体（０〜１０７ｙ）および２１ＤＳ患者（０〜４５ｙ）の末梢血管リンパ球から単離した。制限酵素ＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩによる消化は、テロメア特異的プローブ（32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）3）を使用してサザン分析によって検出することができる末端制限フラグメント（ＴＲＦ）を生じた。テロメア損失速度を、ドナー年齢の関数として平均ＴＲＦ長さの減少から算出した。ＤＳ患者は、年齢匹敵対照（４１±７．７ｂｐ／ｙ）と比較して、ドナー年齢について有意に高いテロメア損失速度（１３３±１５ｂｐ／ｙ）を示し（Ｐ＜０．０００５）、これは、加速したテロメア損失がＤＳ患者の早期免疫老化のバイオマーカーであることを示した。
【０１５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの加齢の間のテロメア損失は、２０〜３０回の集団倍加のための培養中で増殖した２人の正常な個体からのリンパ球について算出した。テロメア損失速度は、９０ｂｐ／細胞倍加であった。すなわち、他の体細胞において見られたものと比較した。１００歳程度の人および年老いたＤＳ患者からのリンパ球のテロメア長さは、培養物中の老化リンパ球のものと同様であった。これは、複製老化が、特に、ＤＳ患者およびかなり年とった個体における免疫系の加齢の原因であることを示唆している。
【０１５８】
以下の物質および方法を使用して、以下の結果を得た。
【０１５９】
ヒト末梢血液Ｔリンパ球の培養
成人の末梢血液試料を回収し、フィコール−ハイパック比重差遠心によって単核細胞を単離し、次いで、液体窒素中で寒冷保存した。４８ウエルのクラスタープレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））の各ウエル中、１０-6単核細胞を１０6放射線照射（８０００Ｒａｄ）リンパ芽球様細胞（エプスタイン−パーウイルス形質転換Ｂ細胞）と混合するか、または１０6単核細胞を１０μｇ／ｍｌリンパフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ，ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））と混合することによって、培養を開始した。８〜１１日後、細胞を洗浄し、２〜４×１０5／ｍｌの濃度で、２４ウエルのクラスタープレートの２ｍｌウエル中で平板培養した。３〜４日毎に培養物を通過させたが、いかなる場合にも、生存細胞濃度（トリパンブルー排除法によって測定した）は、８×１０5／ｍｌを達成した。培養物が放射線照射リンパ芽球様細胞に対する増殖応答を示さなくなった時、および／または、血球計の全可視領域に存在する生存細胞がなくなった時に培養を停止させた。２ｍｌウエルに移した後、細胞を組換えインターロイキン−２（アムゲン（Ａｍｇｅｎ））２５Ｕ／ｍｌに連続的に暴露した。使用した培地は、（ａ）１０〜２０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭヘペスを捕捉したＲＰＭ１（アーヴィン・サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））；（ｂ）ＡＩＭ  ＶTM、２５％Ｅｘ−ｃｙｔｅ（リポタンパク、コレステロール、リン脂質および脂肪酸の混合水溶液（マイルズ・ダイアグノスティクス（Ｍｉｌｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を補足した精製ヒトアルブミン、トランスフェリン、および組換えインシュリン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含有するＤＭＥＭ／栄養混合物Ｆ−１２基本培地であった。
【０１６０】
各細胞継代時の集団倍加（ＰＤ）の数は、式：ＰＤ＝１ｎ（最終生存細胞数初期細胞数）／１ｎ２に従って算出した。
【０１６１】
ＤＮＡの単離
フィコール−ハイパック比重差遠心〔ボュム（Ｂｏｙｕｍ）ら、２１（９７）、Ｓｃａｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７７、１９６８〕を使用して、ＰＢＬ（＝１５％単球を含む）を単離し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞ペレットを０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するプロテイナーゼＫ消化バッファ−（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）５００μｌに再懸濁させ、次いで、４８℃で一晩インキュベートした。溶解物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で２回、次いで、クロロホルムで１回抽出した。９５％エタノールを用いて、ＤＮＡを沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝８）に溶解させた。
【０１６２】
テロメアＤＮＡの分析
ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）をＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩ（ＢＲＬ）（各々、２０Ｕ）で消化し、前記のとおり、再抽出し、９５％エタノールを用いて沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ  ５０μｌに溶解させ、蛍光光度法によって定量化した。７００Ｖ−ｈの間、ゲル・バウンド（Ｇｅｌ  Ｂｏｕｎｄ）〔ＦＭＣ・バイオプロダクツ（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）〕上に注いだ０．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中での電気泳動によって、消化したＤＮＡ１μｇを分離した。ゲルを６０℃で３０分間乾燥させ、変性させ、中和し、前記のような５’−末端標識32Ｐ−（ＣＣＣＴＡＡ）でプローブ化した。シグナル応答の直線領域内で暴露させたオートラジオグラムを、ヘファー（Ｈｏｅｆｅｒ）デシトメータで走査した。該シグナルをデジタル化し、式Ｌ＝Σ，（ＯＤiＬi ）／ΣＯＤi〔式中、ＯＤi＝間隔における総合シグナル、Ｌ＝間隔ｉの中間点でのＴＲＦ長さ〕を使用して、平均ＴＲＦ長さ（Ｌ）を算出するために、２ｋｂｐから２１ｋｂｐまで１ｋｂｐ間隔に微分割した。
【０１６３】
ＴＲＦ長さ対年齢
ドナー年齢の関数として測定した場合、１４０人の無関係正常個体（０〜１０７歳）のＰＢＳ中の平均ＴＲＦ長さは、４１±２．６ｂｐ／ｙの割合で傾斜した（ｐ＜０．００００５、ｒ＝０．８３）。ＰＢＬについてのこのＴＲＦ損失割合は、ハスティー（Ｈａｓｔｉｅ）ら、３４６ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）８６６、１９９０による末梢血球について予め見いだされているものと近接している。本発明者らのデータを性に従って分離すると、男性は、女性よりも僅かに速い速度でテロメアＤＮＡを損失するが（５０±４．２ｖｓ４０±３．６ｂｐ／ｙ）、この差異は、統計学的有意さ（ｐ＝０．１）に達していなかったことに注意した。本発明者らの正常な集団のうち１８人の１００歳程度の人（９９〜１０７歳）は５．２８±０．４ｋｂｐの平均ＴＲＦ長さを有していた（図７）。関心のあることには、１００歳の人の平均ＴＲＦ値（０．４ｋｂｐ）の標準偏差は、他の年齢グループのものよりも非常に小さかった。これは、年齢に伴う細胞より均一な集団の選択を表すこともあるが、１００歳程度の人のグループは、本発明者らの研究において、若い集団よりも遺伝子的にあまり多様ではないこともある。
【０１６４】
２１人のダウン症候群個体（２〜４５歳）のＰＢＬにおいて、平均ＴＲＦ長さを分析し、損失速度を６８歳適合対照（０〜４３歳）と比較した。本発明者らは、ＤＳ患者からの細胞が有意に大きなテロメア損失速度を示すことを見いだした（１３３±１５ｂｐ／ｙ対４１±７．７ｂｐ／ｙ；ワン・テイルド・ｔ−試験、ｔ＝５．７１、ｐ＜０．０００５）（図８）。
【０１６５】
細胞倍加の関数としてテロメア損失速度を測定するために、本発明者らは、複製老化まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの２人の個体からの正常なリンパ球を培養し、数回の集団倍加レベルでの平均ＴＲＦ長さを測定した（図９）。平均ＴＲＦ長さは、他のヒト体細胞タイプについて観察された範囲内で、これらの株中で９０ｂｐ／集団倍加減少した。ここに示したリンパ球細胞株についての老化時の平均ＴＲＦ長さおよび最終継代で分析したもう１つ（図９）は、５．１±０．３５ｋｂｐであった。１００歳程度の人（５．３±０．４ｋｂｐ）および年老いたＤＳ患者（４．８９±０．５９ｋｂｐ）のＰＢＬについてのｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたＴＲＦ値は、この値に近かった。これは、これらの個体からの細胞のフラクションがそれらの複製能の限界に近かったことを示唆している。
【０１６６】
正常な個体からのＰＢＬ中のテロメアがｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの加齢の間に短縮するということを示す結果は、ヒト線維芽細胞上での同様の観察結果を与え〔ハーリィ（Ｈａｒｌｅｙ）ら、３４５、ネイチャー、４５８、１９９０〕、テロメア損失が複製老化に含まれるという仮説を支持する。本発明者らは、またダウン症候群において、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＢＳにおけるテロメア損失速度が年齢匹敵正常ドナーにおけるよりも有意に高かったことも見いだした。したがって、早期免疫老化および他の加速加齢の特徴によって特徴付けられる症候群である三染色体性２１のＰＢＳ中の加速したテロメア損失〔マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、「ジェネティク・シンドロームズ・イン・マン・ウイズ・ポテンシャル・リバンス・トゥ・ザ・パソバイオロジー・オブ・エイジング」（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｍａｎｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ）：ジェネティク・エフェクツ・オン・エイジング（Ｇｅｎｅｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）、バーグスマ，ディ（Ｂｅｒｇｓｍａ，Ｄ．）およびハリソン・ディ・イー（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｄ．Ｅ．）（編集）、第５−３９頁、バース・ディフェクツ（Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ）：オリジナル・アーティクル・シリーズ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ａｒｔｉｃｌｅ  ｓｅｒｉｅｓ）、第１４号、ニューヨーク：アラン・アール・リス（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ）（１９７８）〕は、リンパ球の初期老化を示すことができた。
【０１６７】
ＤＳ患者からのＰＢＳにおける高いテロメア損失速度は、三染色体性２１細胞の低下した生存率のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い細胞ターンオーバー速度を示すことができた。しかしながら、ＤＳ患者からのＰＢＳにおけるテロメア損失速度は、細胞倍加当たり、正常な個体におけるよりも大きいこともある。
【０１６８】
ＤＳの病理学は、多くの場合、正常な加齢と類似している。ＤＳ患者は、高い癌出現率を有しており、自己免疫病に罹るので、免疫系の早期老化は、この類似性における役割を果たすのが可能である。この思想を支持して、年老いたＤＳ患者のリンパ球および年老いた個体は、抗原に対する応答において活性化および増殖されるためのＴ−細胞の減少した応答、低い複製能ならびに減少したＢ−およびＴ−細胞数を含むいくつかの特徴を共有している〔フランセス（Ｆｒａｎｃｅｓｈｉ）ら、６２１、Ａｎｎ，ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４２８、１９９１〕。本発明者らの、テロメア長さが正常な個体よりもＤＳ患者において速く減少したこと、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける１００歳程度の人および年老いたＤＳ患者の平均ＴＲＦ長さがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの老化リンパ球のものと同様であった（＝５ｋｂｐ）という発見は、これらの観察結果を与える。さらにまた、これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリンパ球系列内の複製老化が若い個体およびダウン症候群患者の両方の日和見免疫系に寄与することを示唆している。
【０１６９】
実施例７：卵巣癌およびテロメラーゼ活性
以下の記載はテロメラーゼ活性が癌細胞の存在と相関していることを示す方法の一例である。加えて、ＴＲＦ長を腫瘍細胞の存在を表示するものとして測定した。一般に、腫瘍細胞は、周辺の正常細胞よりも有意に低いＴＲＦ値を有し、テロメラーゼ活性を有することがわかった。かくして、これらの２つの特徴は腫瘍細胞の存在についてのマーカーである。
【０１７０】
以下に示す方法を用いてこれらの結果を得た：
腫瘍と非腫瘍細胞の分離
一の方法にて、（卵巣癌であると診断された患者から）診断側腹部切開または治療穿開により腹水を得、６００Ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離に付した。細胞ペレットを１０〜３０ｍｌのリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ：２．７ｍＭ  ＫＣ１、１．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭ  ＮａＣｌおよび８ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4）中に２回洗浄し、５７０Ｘｇで４分間、４℃で遠心分離に付した。最終洗浄を行った後、細胞ペレットを再びＰＢＳ２０ｍｌに懸濁させ、単細胞は保持しないが、腫瘍塊を保持する３０または１０μｍのナイロンメッシュフィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（スペクトル））を介して濾過した。フィルターを逆流させて洗浄し、高精製の腫瘍塊を遊離させた。フロースルーは、繊維芽細胞、リンパ球および腫瘍細胞の組み合わせであった。
【０１７１】
もう一つ別の方法にて、腹水細胞を収集し、前記の方法にて洗浄した。細胞ペレットを１０％ウシ胎児血清を含むａ−ＭＥＭに再び懸濁させ、１５０ｍｍ皿にて培養した。１２時間後、培地を取り除き、新たなプレートを用いて、該培地中の付着繊維芽細胞を非付着細胞より分離した。１２時間後、主として腫瘍塊を含有する培地をその第２のプレートから取り除き、３％ウシ胎児血清、５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５×１０-5Ｍのホスホエタノールアミンおよび５×１０-5Ｍのエタノールアミンを補足したＤＭＡ  Ｆ１２培地中にて付着させた。これらの腫瘍細胞をＤＮＡ分析およびＳ１００抽出物のために培養した。
【０１７２】
ＤＮＡ抽出
細胞を溶解させ、タンパクを１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、４８℃で一夜消化した。フェノールで２回、そしてクロロホルムで１回抽出した後、エタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）に溶かした。
【０１７３】
ＴＲＦ長およびテロマーＤＮＡの量の測定
ゲノムＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＲｓａＩで消化し、前記のように抽出および沈殿させ、ＴＥに再び溶かした。ＤＮＡ濃度を蛍光測定により測定した（モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、７  ヌクレイック・アシッド・レス（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．），５４７，１９７９）。ＤＮＡ試料（各１μｇ）を０．５％アガロースゲル上に負荷し、９０Ｖで１３時間電気泳動させた。該ゲルを６０℃で３０分間乾燥させ、１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５Ｍ  ＮａＯＨ中に１５分間変性させ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に１０分間中和させ、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭナトリウムシトレート）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ）溶液（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング；ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂａｒ）（１９８２）および０．１×Ｐ洗浄液（０．５ｍＭピロリン酸塩、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4）中、３７℃で１２時間、５’32Ｐ（ＣＣＣＴＡＡ）3テロマープローブと雑種形成させた。０．２４×ＳＳＣ中、２０〜２２℃で３回、厳重に洗浄を行った後（各洗浄、７分間）、ゲルを増強スクリーンを用いプレフラッシュ（ＯＤ＝０．１５）したコダックＸＡＲ−５  Ｘ線フィルムにて３日間オートラジオグラフィーに付した。各レーンを濃度計でスキャンし、そのデータを用い、前記したようにテロマーＤＮＡの量および平均ＴＲＦ長を測定した（ハーレー（Ｈａｒｌｅｙ）ら、３４５  ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４５８、１９９０）。
【０１７４】
Ｓ−１００細胞抽出物の調製
各抽出物について、最小６×１０8個の細胞を用いた。腹水または精製した腹水腫瘍細胞（前記の第１の方法による）を５７０×ｇで４分間４℃にて遠心分離に付した。前記の第２の方法により分離した腹水腫瘍細胞（単層にて増殖）をラバー冠ポリスマンでこすり落とすことで収穫し、前記のように遠心分離に付した。ペレットを冷ＰＢＳ中にて２回リンスし、つづいて前記のように遠心分離に付した。最終ペレットを冷２．３×Ｈｙｐｏ緩衝後（１×Ｈｙｐｏ緩衝液：１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０））、３ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１０Ｕ／ｍｌのＲＮＡｓｉｎ、１μＭロイペプチンおよび１０μＭペプスタチンＡ中にリンスし、５分間遠心分離に付し、０．７５倍容量の２．３×Ｈｙｐｏ緩衝液に再び懸濁させた。氷上で１０分間インキュベートした後、その試料を氷冷した７または１ｍｌのデュンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーに移し、Ｂペストル（２５〜５５μｍクリアランス）を用いて氷上にて均質化した。氷上にてさらに３０分間経過した後、１ｍｌより大きな容量の試料を、ベックマンＪ３−１３．１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ３−１３．１）スイングバケットローター中、１０，０００ｒｐｍ（１６，０００ｘｇ）で１０分間４℃で遠心分離に付した。１５分の１の容量の５Ｍ  ＮａＣｌを加え、その試料上澄をベックマンＴｉ５０ローター中、３８，０００ｒｐｍ（１００，０００ｘｇ）で１時間４℃で遠心分離に付した。２０％の最終濃度までグリセロールを加え、抽出物をアリコートし、−７０℃で貯蔵した。１ｍｌより小さな試料は、ＴＬＡ１００．２ローター（ベックマン）中、５５，０００ｒｐｍで１時間４℃で遠心分離に付し、ＮａＣｌおよびグリセロールを前記のようにその上清に加えた。典型的な抽出物中のタンパク濃度は約４ｍｇ／ｍｌであった。
【０１７５】
テロメラーゼ検定
テロメラーゼ活性をモリン（Ｍｏｒｉｎ）法、５９セル（Ｃｅｌｌ）５２１，１９８９の変形により検定した。Ｓ−１００細胞抽出物のアリコート（２０μｌ）を２ｍＭ  ｄＡＴＰ、２ｍＭ  ｄＴＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１μＭ（ＴＴＡＧＧＧ）3プライマー、３．１３μＭ（５０μＣｌ）ａ−32Ｐ−ｄＧＴＰ（４００Ｃｉ／ミリモル）、１ｍＭスペルミジン、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、５０ｍＭ酢酸カリウムおよび５０ｍＭトリス−酢酸塩（ｐＨ８．５）を含有する４０μｌの最終容量に希釈した。いくつかの実験において、反応容量を２倍にした。反応物を６０分間３０℃でインキュベートし、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡを含有）５０μｌを添加することにより反応を停止させ、つづいて３７℃で１５分間インキュベートした。タンパクを評価するのに、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５％ＳＤＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ  ５０μｌを３７℃で１０分間にわたって加えた。フェノールおよびクロロホルムで抽出した後、該試料を、ニック・スピン（ＮＩＣＫ  ＳＰＩＮ）カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を介し、スイング・バケット・ローター中、５００ｘｇで４分間遠心分離に付すことにより、組み込まれていないα−32Ｐ−ｄＧＴＰを分離した。４Ｍ  ＮａＣｌ  ５．３μｌ、キャリアｔＲＮＡ  ４μｇおよびエタノール５００μｌを−２０℃で加えることによりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡペレットをホルムアミド充填色素３μｌに再び懸濁させ、１分間煮沸し、氷上にて冷却し、８％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素の連続ゲル上に負荷し、０．６×ＴＢＥ緩衝液を用い、１７００Ｖで２時間操作した。乾燥ゲルを増強スクリーンと一緒に−７０℃でコダックＸＡＲ−５プレフラッシュフィルムに、またはホスホイメージャースクリーン（モレキュラー・ダイナミックス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）に７日間暴露した。
【０１７６】
前記実験の結果を以下の第２表および第３表に示す：
（表２）
ＡＴＣＣ卵巣細胞株の特徴
細胞株          平均ＴＲＦ長（ｋｂｐ）  テロメラーゼ活性
ＨＥＹ            ３．７で安定            ＋
ＣＡＯＶ−３      ３．７で安定            Ｎ．Ｄ．
ＳＫＯＶ−３      ６０ｂｐ／ｐｄで増加    Ｎ．Ｄ．
（表３）
腹水由来の卵巣癌腫瘍細胞の特徴
患者              記載        平均ＴＲＦ長  テロメラーゼ
（ｋｂｐ）  活性
Ｐｒｅｓ−３    精製した腫瘍細胞  ３．７      ＋
Ｍａｃ−２      精製した腫瘍細胞  ３．７      Ｎ．Ｄ．
Ｓｉｂ−１      精製した腫瘍細胞  ４．２      Ｎ．Ｄ．
Ｒｉｃ２０７    精製した腫瘍細胞  ３．３      Ｎ．Ｄ．
Ｃｒａ−１      精製した腫瘍細胞  ５．２      Ｎ．Ｄ．
Ｉｎｇ−１      精製した腫瘍細胞  ５．８      Ｎ．Ｄ．
Ｌｅｐ−１      精製した腫瘍細胞  ５．８      Ｎ．Ｄ．
Ｌｅｐ−４      精製した腫瘍細胞  ５．６      Ｎ．Ｄ．
Ｓｏｌ−１      精製した腫瘍細胞  ５．６      Ｎ．Ｄ．
Ｒｕｄ−１      腹水細胞          ３．４      ＋
Ｍｕｒｒ−１    腹水細胞          ３．８      ＋
Ｄｅｍ−１      腹水細胞          Ｎ．Ｄ．    ＋
Ｃａｓ−１      腹水細胞          ５．３      ＋
Ｗａｄ−１，２  腹水細胞          ４．９      Ｎ．Ｄ．＊
Ｎ．Ｄ．＝測定せず
＊  高バックグラウンド排除の検出
第４表は腹水由来の細胞のＴＲＦ長を示す。サイズの範囲２〜２１ｋｂｐにわたって２つのオートラジオグラフの最小値を濃度計でスキャンし、その温度計の値を用いて平均ＴＲＦ長をｋｂｐにて測定した。該データの平均標準偏差は０．５ｋｂｐであり、最大偏差は２ｋｂｐであった。３文字の患者コードの後の数は穿開数をいう（すなわち、ＯＣ１−１はＯＣ１患者の最初の試料をいう）。Ｅ（初期）と定義されている試料は提供時付近で得たのに対して、試料Ｌ（後期）は死亡付近で得た。穿開術を４〜２２カ月の過程で４〜１５回行った。
【０１７７】
【表４】
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＊  少なくとも３０ＰＤの経過にわたって各試料について平均ＴＲＦ長を測定した。ＴＲＦはすべての集団で安定しているため、平均化した。
【０１７８】
＊＊    すべての試料の平均ＴＲＦ長の平均値および標準偏差
＊＊＊  ＯＣ２２−１３を含む平均値
第５表は正常細胞および腫瘍細胞におけるテロメラーゼ活性を示す。白血球および腹水細胞を単離し、腹水細胞を正常および腫瘍フラクションに分別し、テロメラーゼ活性について検定した。すべての抽出物のタンパク濃度は＜２ｍｇ／ｍｌ、すなわち、対照の２９３ＣＳＨ抽出物にて活性が検出された最低濃度の２０倍であった。
【０１７９】
（表５）
分別                              非分別
テロメラーゼ                    テロメラーゼ活性
患者        活性              患者        正常        腫瘍
ＯＣ４−１    ＋              ＯＣ１９−３  Ｎ．Ｄ．      ＋
−５    ＋              ＯＣ１７−１    −        Ｎ．Ｄ．
ＯＣ２−１    ±              ＯＣ８−１      −        Ｎ．Ｄ．
ＯＣ１−１    ＋              ＬＥＫ          −        Ｎ．Ｄ．
ＯＣ２３−１  ＋
ＴＲＦ検定にて、腫瘍塊は、各々、関連する正常細胞よりもＴＲＦ長が有意に短かった。（第１０図参照）。
【０１８０】
テロメラーゼ検定にて、ある患者の腹水におけるテロメラーゼ活性は、対照腫瘍株ＨＥＹおよびＰＲＥＳ、または対照細胞株２９３ＣＳＨにおけるよりも有意に大きいことは明らかであった（第１１，３３図）。
【０１８１】
実施例８：ＴＲＦ長についてのＨＩＶ感染の効果
ＨＩＶ感染は、ウイルス様症候群としての徴候が現れる急性ウイルス感染症に、ついで症状および徴候のないことにより特徴付けられる長期間の潜伏期間に至る。この長期の無症候性期間（通常、７〜１０年続く）の間、ウイルス被覆タンパクに対する抗体の有無以外に感染症の過程の発達段階について利用できる診断法はない。これは疾患の発達の段階を明らかにし、または予防薬の効果を医者が測定する手助けとなることはほとんどない。
【０１８２】
メイアード（Ｍｅｙａａｒｄ）らは、２５７サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１７，１９９２にて、ＨＩＶ感染対象のＣＤ４+およびＣＤ８+細胞についてのプログラムされた細胞死を提案しているが、本願発明者らは、その７〜１０年間、免疫系が感染症を相対的に抑制された状態に維持しうるが、感染したＣＤ４+Ｔ−細胞のターンオーバーの著しい増加があることを提案する。これは、いくぶん、ウイルス媒介細胞破壊によるものである。本願発明者らは、このことが、本質的に、特定の副次集団のＴ−細胞の複製老化を促進し、時間と共に、増殖能が著しく減少した多能性細胞先駆体の集団を生じさせると提案している。最終的に、これは、刺激に対して相対的に非応答性であって増殖するＣＤ４+  Ｔ−細胞をもたらし、それはイン・ビトロにて観察される細胞の増殖性老化の典型である。
【０１８３】
本願発明者らはさらに、全末梢リンパ球またはＣＤ４+細胞の複製能が、特に、前記の方法を用い、例えば、分子の大きさのマーカーと一緒に、患者から単離されたＣＤ４+リンパ球ＤＮＡに雑種形成されたオリゴヌクレオチドプローブ５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（または同様のもしくは相補配列の一つ）を用いて、テロメア反復長を検定することにより効果的に測定できると提案している。これらの検定は、医者が、長い無症候性期間の間、該疾患の過程をチャートし、予防的療法の効果を評価することを可能とする。
【０１８４】
ＴＲＦ長がＨＩＶ感染症の診断における有用なマーカーであるかどうかを決定するために、無症候性ＨＩＶ−感染対象についてＣＤ４+細胞の計数を行い、前記のように測定したＴＲＦ長と比較した。前記に示されるように、末梢リンパ球は誕生の際には約１０ｋｂのＴＲＦ長であり、約年齢１２０歳で５．０のＴＲＦ長となる。結果は以下のとおりである：ＣＤ４数が４７６の３０歳のＨＩＶ＋は、７．６のＴＲＦを有した。
【０１８５】
４６歳のＨＩＶ−対照は、７．０のＴＲＦを有した。
【０１８６】
ＣＤ４数が３３６の３４歳のＨＩＶ＋は、７．７のＴＲＦを有した。
【０１８７】
４６歳のＨＩＶ−対照は、７．１のＴＲＦを有した。
【０１８８】
ＣＤ４数が４４８の３２歳のＨＩＶ＋は、６．９のＴＲＦを有した。
【０１８９】
ＣＤ４数が３５８の３３歳のＨＩＶ＋は、５．０のＴＲＦを有した（すなわち、老化細胞について観察される長さであった）。
【０１９０】
該結果は、３３歳のＨＩＶ＋患者がＣＤ４+細胞にて老化テロメア長を有することを示唆し、それは該細胞がその複製能が末期であることを意味する。対照的に、ＣＤ４+数はこの患者の症状について何ら徴候を示さなかった。実際、一の患者では、ＣＤ４+数が低かった。
【０１９１】
検定の２週間後、この患者はＣＤ４+数の著しい低下、３５８から１５９への低下を経験し、したがってＡＩＤＳと診断され、速やかに舌にてロイコプラキーを獲得した。他の患者は無症候性を保持した。すなわち、この診断操作は、ＨＩＶ感染症の過程の末期に近い患者を区別することができ、それに対して今まで使用されているマーカー（ＣＤ４+数）は区別することができなかった。
【０１９２】
ＨＩＶ感染症の過程の間で、ＣＤ４+リンパ球の促進された複製老化は、テロメア短縮を防止するようにデザインされた、例えば、前記のようなＣＴＯオリゴヌクレオチドを用いる、治療についての適当な必要性を示す。加えて、前記したように、感染の初期段階にある患者のＣＤ４+細胞を、その患者に後に投与するために預けることができる。ＡＴＺのような薬剤の効能はまた、該薬剤がＣＤ４+細胞の増殖速度を減少させるかどうか、すなわち該疾患のあらゆる段階で有用であるかどうかを研究するために測定される。有用でないならば、該薬剤は該疾患の過程で必要な場合にのみ投与できる。
【０１９３】
実施例９：ヒト哺乳動物上皮（ＨＭＥ）細胞のテロメア短縮
図１２を参照して、４−塩基の認識部位を有する制限酵素（Ｈｉｎｈ１のような）で消化した場合、ゲノムＤＮＡの大部分は小さなフラグメントに消化される。しかし、反復テロマー配列は制限部位を欠くため、テロメアは、２〜５ｋｂのサブテロマーＤＮＡと年齢依存のテロマー反復量からなる相対的に大きな末端制限フラグメント（ＴＲＦ）を保持する。ヒト繊維芽細胞、リンパ球および内皮細胞について前記したように、テロメア長は、イン・ビトロにおける細胞老化の間、（レーン１（ＰＤＬ２１）およびレーン２（ＰＤＬ４０）におけるＴＲＦ長と比較して）正常なヒト哺乳動物上皮細胞にて短縮される。ヒト乳頭腫ウイルス１６のＥ６を発現するヒト哺乳動物上皮細胞において、ＴＲＦ長は、危機的状況となり、その後に不死が起こるまで、伸長された寿命の間、短縮し続ける（レーン３（ＰＤＬ６８）。ＴＲＦは、一般に、不死細胞（レーン４（ＰＤＬ８１）およびレーン５（ＰＤＬ１０７））にて安定化し、テロメラーゼ活性の再発現と矛盾しない。
【０１９４】
実施例１０：哺乳動物の上皮細胞におけるテロメア喪失の遅れは複製寿命の増加をもたらす
正常なヒト哺乳動物上皮細胞はオルガノイド（乳房形成の減少により得られる）より確立でき、血清不含の標準培地（ＭＣＤＢ１７０）中、制限条件にて培養できる。典型的な丸石形態の上皮細胞がこの培地中に置かれたオルガノイドの回りに広がる。最初の二次培養後、小さな、高複屈折性の速やかに分割する細胞の集団がより大きな細胞の間に伸長するまで、これらの培養物は２〜３週間の増殖阻止期間にはいる。培地（ＭＣＤＢ１０４）は、明らかに、高増殖能を有するほとんど分化されていない細胞型を選択する。これらの細胞は、細胞老化を受ける前に、さらに４０〜４５回の倍加にて二次培養できる。
【０１９５】
実施例１にあるように、増殖寿命における変化および指示量のＣＴＯ（時に、Ｃ−リッチの末端反復単位（ＣＴＲ）という）で処理した培養哺乳動物上皮細胞におけるテロメア短縮速度を、対照のランダムオリゴヌクレオチドと比較した。ドナー（３１）からの正常なヒト哺乳動物上皮細胞をヒト乳頭腫ウイルス１６のＥ６遺伝子で感染させた。この遺伝子産物はｐ５３タンパクと結合し、危機的状況となった時に、ＨＭＥ３１細胞を、ＰＤＬ４２からＰＤＬ６２までの増殖により、寿命を伸長させることができる。この伸長された寿命の間に、ＴＲＦは平均が約５ｋｂから２．５ｋｂに短縮する（図１２のＨＭＥ３１  ＰＤ４０とＨＭＥ３１Ｅ６  ＰＤ６８の比較）。
【０１９６】
図１３にて示されるように、ＰＤＬ３６でのＨＭＥ３１Ｅ６を用いて開始した実験体を３、１０、３０および１００μＭのＣＴＯの存在下にて培養した。対照として、オリゴヌクレオチド（ｎｉｌ）なしで、または３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと一緒に細胞を培養した。図１３は、ｎｉｌ対照および３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと比較して、ＰＤＬ３６と５０の間で、ＴＲＦ短縮の用量関連の阻止があったことを示す。これは、別個のトレールバンドを付与する、レストよりもよりゆっくりと移動するテロメアＴＲＦの副次集団を試験することにより容易に観察される。培地を変え、１週間に３回新たなオリゴヌクレオチドを添加し、細胞を対数増殖に維持した。
【０１９７】
ＨＰＶ１６Ｅ６を発現するヒト哺乳動物上皮細胞はＭ１を迂回し、複製寿命を伸長させた。ＨＭＥ３１細胞は、通常、ＰＤＬ４２〜４５で老化する。Ｅ６を発現すると、Ｍ１を迂回し、ＰＤＬ５３〜６２で危機的状況（Ｍ２）に達するまで分割する。ＰＤＬ４０でのＨＭＥ３１（Ｅ６）細胞におけるＴＲＦは、約５〜６ｋｂであるのに対して、ＰＤＬ６２では３〜４ｋｂである（図１２参照）。図１７に示されるように、ＰＤＬ３６のＨＭＥ３１Ｅ６細胞を用いて開始した実験を、血清不含の制限培地中、３０μＭおよび１００μＭのＣＴＲの存在下にて培養した。対照として、細胞をオリゴヌクレオチド（対照）なしで、またはＣＴＲオリゴヌクレオチドに適合する塩基内容物を含む、３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと共に培養した。図１７は、対照および３０μＭのランダムオリゴヌクレオチドと比較した場合、ＣＴＲオリゴヌクレオチドで処理した細胞にて、用量に関連して複製寿命の伸長があった。対照細胞は実験の間に約２０回分割したのに対して、ＣＴＲ処理細胞は少なくとも４０〜５０回分割した。これらの結果は図１３にて観察されるテロメア短縮の阻止とよく相関する。
【０１９８】
実施例１１：ＩＭＲ９０繊維芽細胞の寿命の伸長
図１４を参照して、ＰＤＬ３０のＩＭＲ−９０肺繊維芽細胞ＴＲＦを１０μＭ、３０μＭまたは１００μＭのホスホジエステルＣＴＯで、または単に培地を添加するだけ（対照）で処理した。細胞をウシ血清を補足して制限されたレギュラー含有の培地にて培養した。細胞を２４個のウェル皿にて継代させ、ウェル当たり２５，０００細胞で全面成長するまでトリプシン処理に付すことで二次培養した。該細胞に、毎日、種々の濃度のオリゴヌクレオチド含有の培地を付与した。対照として、細胞にオリゴヌクレオチド不含の同一培地を付与した。図１４に示すように、ＣＴＯで、全寿命が約１２〜１５％伸びた。これらの実験にて、対照細胞は実験の間に約１５〜１８回分割したのに対して、処理細胞は２３〜２６回分割した。ＩＭＲ−９０テロメアは、１回の分割当たり約５０ｂ．ｐ．短縮し、老化の際の対照ＩＭＲ−９０繊維芽細胞のＴＲＦの長さは約９ｋｂであった。１００μＭのＣＴＯ処理ＩＭＲ−９０細胞はＰＤＬ５５で老化するため、対照と１００μＭのＣＴＯの間にあるＴＲＦ喪失速度の違い（９ｋｂ対９．４ｋｂ）は、非常に小さく、通常の技法を用いて分離できない。
【０１９９】
実施例１２：ＧＴＯ実験
実施例２に示すように、非常に短いＴＲＦを有する、不死ヒト繊維芽細胞株、ＩＤＨ４を、ＧＴＯオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートした。図１５および図１６を参照して、１０μＭ、３０μＭおよび１００μＭのＧＴＯの存在下、細胞を血清含有レギュラー培養培地にてインキュベートした。該細胞に、一日おきに新たなホスホジエステルＧＴＯオリゴヌクレオチドを付与し、二次培養し、合計９０日間で集密的状態になった。細胞は、たとえ、高ＧＴＯ濃度でさらにゆっくりと増殖し、わずかに集合倍加するとしても、用いた全ての濃度で、９０日経過後でもなおＧＴＯ中で増殖した（対照、４５ＰＤＬ；１０μＭ  ＧＴＯ４０ＰＤＬ；３５μＭ  ３５ＰＤＬ；１００μＭ  ２５ＰＤＬ）。ＴＲＦ分析を９０日後に行った場合、ＩＤＨ４細胞は、用量依存的方法にて、３０μＭと１００μＭで、ほぼ同じであるＴＲＦ長を得た（図１５）。これは、細胞中の過剰の一本鎖ＴＴＡＧＧＧ  ＤＮＡの存在が、おそらく、テロメラーゼのフィードバック調整に影響を及ぼし、実際、テロメラーゼ活性を増加させ、テロメア長を伸長させたことを示唆する。対照および３０μＭ  ＧＴＯをオリゴヌクレオチドの添加なくさらに９０日間継代した（約３５〜４０ＰＤＬ）。図１６に示されるように、ＴＲＦはゆっくりと短縮する。
【０２００】
これらのデータおよび実施例２のデータは、細胞株はＧＴＯオリゴヌクレオチドに対するその応答にて異なることを示す。かくして、治療用組成物にてそのようなオリゴヌクレオチドを使用する前に、標的細胞を所望のように応答させることが重要である。前記に示す効果が起こるならば、その場合、オリゴヌクレオチドはその応答を実施例２に示す応答に変えるように選択されるべきである。これは、ＧＴＯが結合する部位と異なる部位でテロメラーゼに結合するオリゴヌクレオチドを選択することにより行うことができる。本願出願人は前記の観察される効果がＧＴＯの必要なタンパクへの結合により引き起こされ、テロメラーゼが活性化し、テロメアを伸長させると考える。かくして、そのような蛋白質に結合しないオリゴヌクレオチドを選択することにより、テロメラーゼ活性を減少させる所望の効果を得ることができる。
【０２０１】
実施例１３：テロメラーゼの小分子阻害
以下はテロメラーゼの阻害剤としての小分子の活性をスクリーニングする方法の実施例である。類似の実施例が当業者には明らかであろう。スクリーン可能な化合物には、直ちには細胞死を引き起こさないため、細胞毒性があるとは考えられていないものも含まれる。どちらかといえば、そのような化合物はテロメラーゼ活性の阻害が数回生じた後にのみ作用する。それゆえ、標準的方法で試験された以前の薬剤は、本明細書中で請求されるごとく、それらの有益性を決定するために再試験されるべきである。テロメラーゼ活性を阻害し、もしくはある場合にはインビボ（例えば、転写段階のレベル）でそれを活性化する薬剤は、本明細書中に記載される病気の治療に有用である。
【０２０２】
本発明者らは、テトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のインビボのテロメラーゼ活性、およびテロメアの長さ、ならびにテトラヒメナ細胞のインビボにおける維持、細胞分裂、接合におけるレトロウイルスの逆転写酵素の鎖終結阻害剤である種々のヌクレオシドアナログの効果を分析した。テロメラーゼ活性のインビトロ分析より、低い阻害剤濃度においてさえも、アラビノフラニル−グアノシントリホスフェート（Ａｒａ−ＧＴＰ）およびｄｄＧＴＰは、双方とも、ラベルしたヌクレオチドのテロメアＤＮＡ繰り返し配列への取り込みの、非常に効果的な阻害剤である一方で、アジドチミジントリホスフェート（ＡＺＴ−ＴＰ）、ジテオキシイノシントリホスフェート（ｄｄＩＴＰ）もしくはｄｄＴＴＰは取り込みの、あまり効果的な阻害剤ではないことが示された。しかしながら、これら全てのヌクレオシド三リン酸のアナログは、テロメラーゼの合成産物の電気泳動に見られる通常のバンディング・パターン（ｂａｎｄｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）の、アナログ特異的な変化を生み出し、これはＲＮＡ鋳型に沿った、異なる位置では異なっている拮抗および／または鎖終結作用を示唆する。
【０２０３】
テトラヒメナ細胞の成長、接合、およびテロメア長に対するこれらのアナログの効果を試験した。細胞の分裂速度および生存能力は、Ａｒａ−Ｇを加えた培養中において、数週間後でも影響を受けなかったが、テロメア長さは、ＡＺＴもしくはＡｒａ−Ｇを含む培養中では、一貫して、そして急速に短縮され、細胞分画の成育速度および生存率は、ＡＺＴ中では減少した。ｄｄＧ、ｄｄＩ、もしくは３’デオキシ−２’，３’−ジデハイドロチミジン（ｄ４Ｔ）を含む培養での短期間の実験では、ｄ４Ｔもまた短縮されたテロメアを示した。ｄｄＧまたはｄｄＩはテロメアの長さにおいて効果がなかった。ＡＺＴＮ  Ａｒａ−Ｇ、アシクログアノシン（Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ）、ｄｄＧおよびｄｄＩが接合している細胞に添加されたが、いずれも子孫細胞形成における効果の定量により示されるように、接合もしくは大核の形成の不可逆的崩壊を示さなかった。ＡＺＴ中で交配した細胞からのＤＮＡのＰＣＲ分析は、大核の形成の間のテロメア付加のマーカーである１１ｋｂのｒＤＮＡの形成における減少を示した。
【０２０４】
以下の材料および方法は、これらの結果を得るために使用された：テトラヒメナ・サーモフィラ株  ＳＢ２１０（ＶＩ）およびＰＢ９Ｒ（ＩＩ）〔ここに丸括弧内の数字は交配型を示す〕は、１％ＰＰＹＳ（１％プロテオースペプトン（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、０．１％酵母エキス（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））および０．００１５％セクエストリン（チバ−ガイギー（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）））中、室温において、ストックとして維持された。ストックは毎三週〜四週ごとに継代された。
【０２０５】
ヌクレオシドアナログＡＺＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む培養からの、またはアナログを欠く対照からの、栄養分裂中様々な時点における大核ＤＮＡの分析のために、静置ストックカルチャーからの細胞は、２５０ｍｌフラスコ中の、２５ｍｌのチミン欠乏イソ−センシテストブロス（「イソ−ブロス（ｉｓｏｂｒｏｔｈ）」、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）ＵＳＡ）に接種した。培養を、振とう（１００ｒｐｍ）しながら、３０℃で４８時間インキュベートした。細胞を計数し、２４ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）中１０００細胞／１．５ｍｌの割合で接種し、４８時間にわたり、振とうせずに、３０℃で成育させた。これらの対数期の細胞５μｌを、ヌクレオシドアナログの様々な濃度を含む１ｍｌの培地（イソブロス）に接種するために使用した。その後、毎二日後ないし毎四日後に、細胞を、多枝型レプリケーターを用いて、ウェルあたり５μｌ、または１ないし３μｌを、ＡＺＴを含む新鮮な１ｍｌのブロスに移した。残った細胞を沈澱させ、ＤＮＡ分析のために処理するまで−８０℃に保存した。
【０２０６】
ヌクレオシドアナログＡｒａ−Ｇ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、ｄｄＧ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、もしくはｄｄＩ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を含む栄養培養からの大核ＤＮＡの分析のために、記載されるごとくストックカルチャーを一晩２％ＰＰＹＳ中で成育させた。細胞を計数し、アナログの種々の量、１％  ＤＭＳＯ（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ））（ｄｄＧおよびＡｒａ−Ｇの対照のため）、もしくは２％ＰＰＹＳのみを含む、２ｍｌの２％ＰＰＹＳ当たり１００細胞の割合で接種した。細胞を毎二日ないし毎六日ごとに、新鮮な培地にレプリカプレートし、残渣の細胞を沈澱させ、ＤＮＡ分析に使用するまで−８０℃に保存した。
【０２０７】
ｄ４Ｔ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む栄養培養から、またはそのアナログを欠く対照からの大核ＤＮＡの分析のために、ストックカルチャー（ＳＢ２１０ＶＩ）を、記載されたごとくイソブロス中で一晩培養した。次いで細胞を計数し、二連の培養を５０ｍｌコニカルチューブ中、５００細胞／５ｍｌイソブロスの割合で接種し、８０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。５００ないし２０００個の細胞を毎二日ないし毎四日ごとに新鮮なブロスに移し、残渣を沈澱させ、ＤＮＡ分析のために処理するまで−８０℃に保存した。
【０２０８】
ヌクレオシドアナログの存在下で接合した細胞からのｒＤＮＡ分析のため、５０ｍｌの一晩培養液（２％ＰＰＹＳ）を、細胞を沈澱させ、等容のドリル（Ｄｒｙｌ’ｓ）溶液に再懸濁することにより飢えさせた後、１８時間にわたり３００℃の振とう（１００ｒｐｍ）インキュベーターに戻した。（１×ドリル溶液＝０．５ｇ  クエン酸ナトリウム、０．１６ｇ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇＮａ2ＨＰＯ4／リットル）。次いで、細胞を計数し、等しい数を混合した後沈澱させ（ＩＥＣ卓上遠心機、３／４スピード）、１．５ないし２×１０6個／ｍｌになるようにドリル溶液に再懸濁した。細胞を、６ウェルプレート（ファルコン）に平均密度１．５細胞／ウェルになるように接種し、振とうせずに３０℃において６時間接合させた。擬接合したＳＢ２１０細胞を同様に処理したが、ＰＢ９Ｒ細胞とは混合しなかった。６時間で培養は接合をチェックされ（＞９０％、ＳＢ２１０の照を除く）、緩やかに渦巻かせながら１ｍｌのドリル溶液、またはヌクレオシドアナログ（シグマから購入するＡｃｙｃｌｏ−Ｇ）を含む２％ＰＰＹＳをゆっくりと添加するか、対照としては何の薬剤も添加しなかった。培養をさらに１８時間３０℃に戻した後、ＤＮＡ分析のために収集した。
【０２０９】
ヌクレオシドアナログＡＺＴもしくはＡｒａ−Ｇを含む単細胞培養からの栄養成長および大核ＤＮＡの分析のために、静置ストックカルチャーからのＳＢ２１０（ＶＩ）細胞を、５０ｍｌのＰＰＹＳまたはイソブロス中で、振とう（１００ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩培養した。細胞を計数し、適当な培地およびアナログ（２％ＰＰＹＳ中Ａｒａ−Ｇを１ｍＭになるように、またはＤＭＳＯを対照として１％になるように；イソブロス中ＡＺＴを１０μＭまたは１ｍＭになるように、または対照としては何も添加しない）に添加し、ウェル当たり１細胞の密度で、ウェル当たり１００μｌを、９６ウェルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に接種した。各のアナログまたは対照につき５プレートを調製した。ウェルの細胞増殖を測定し、各々の継代当たり、ウェル当たり約１ないし１０細胞の接種濃度を維持するよう、毎一日ないし毎二日（Ａｒａ−ＧおよびＤＭＳＯプレート）または毎二日ないし毎四日（ＡＺＴおよびイソブロスの対照プレート）ごとにプレートをレプリカプレートした。単細胞培養は各継代で移される際の低い見込みにより、時間がたつにつれ失われるので、プレート当たり使えるウェルの数を拡大するため、時々、手で（ピペッターを用い、ウェル当たり１μｌ接種）いくつかの空のウェルに入れることにより個々のウェルを継代した。継代後、細胞を収集し、沈澱させ、ＤＮＡ分析のために処理するまで−８０℃で保存した。
【０２１０】
ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３５２８−ＣｓＣｌグラジエント精製工程を省略する以外は、ラルソン（Ｌａｒｓｏｎ）らの、セル（Ｃｅｌｌ）、第５０巻、第４４７頁（１９８７年）に記載されるごとく、実質的に全細胞ＤＮＡを調製した。
【０２１１】
制限消化、アガロースゲル電気泳動、ナイトランフィルター（Ｎｙｔｒａｎｆｉｌｔｅｒ）（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）・アンド・シュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））へのＤＮＡのトランスファーおよび、32Ｐ−ニック−トランスレイテッド（ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）もしくはランダム−プライムド（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）プローブとのハイブリダイゼーションを、標準的工程（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８９年）により行った。テロメアの長さを、以前テトロヒメナについて記載されたごとく〔ラルソン（Ｌａｒｓｏｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第５０巻、第４７７頁、１９８７年〕、分析した。
【０２１２】
アナログの存在下において接合する細胞のシクロヘキシミド（ＣＨＸ）感受性分析のために、各細胞タイプの５０ｍｌの培養を、２％ＰＰＹＳ中で一晩培養し、ドリル中で１８時間飢えさせ、６時間にわたり接合（５×１０5細胞／ｍｌ）させ、ついでアナログを添加した。細胞を、アナログの存在下、接合を完結させた。混合後２４時間で、細胞をドリル溶液で希釈し、計数し、アナログ無しの１％ＰＰＹＳ中、９６ウェルプレートのウェル当たり１細胞の割合で接種した。細胞を、振とうせずに、３０℃において加湿チャンバー中４日間培養した。細胞を、次いで１％ＰＰＹＳおよび１５μｇ／ｍｌシクロヘキサミドの上にレプリカプレートし、計数前に４日間成長させ、ＣＨＸ耐性細胞の割合を計算した。シクロヘキサミドマーカーを発現している子孫の誕生には、新しい大核がうまく生産されることが要求されるので、大核の形成がアナログにより中断された細胞は、ＣＨＸ中で殺される。
【０２１３】
アナログの存在下接合した培養からのｒＤＮＡの１１ｋｂの型のＰＣＲ分析のために、各テロメアのプライマー（Ｃ4Ａ2）4１．２５μＭ、およびｒＤＮＡの５’末端から１３７１塩基に位置した２５マーのｒＤＮＡプライマー（５’ＧＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＣＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣＧＣ  ３’）を、１ｍＭ各ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ反応緩衝液（パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、および０．５μｌアンプリタック・ポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含む反応の「ホット・スタート（ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）」において用いられた。試料ＤＮＡとポリメラーゼを、製造者の指示に従い、アンプリワックス（Ａｍｐｌｉｗａｘ）ＰＣＲ  Ｇｅｍ  １００  Ｗａｘビーズ（（パーキン・エルマー・シータス（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ））の使用により分離した状態に保った。試料を９５℃で１分、次いでパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）サーモサイクラーにおいて以下のように４０回循環した：９４℃で１分、５８℃において３０秒、６８℃において３分。同一の反応を、５’末端から９６１０塩基の位置にある３’大核ｒＤＮＡプライマー、および、５’末端から１０３００塩基の位置にある（５’ＣＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＧＣＡＴＴＡＴＣ  ３’）を用いて行なった。
【０２１４】
合成オリゴマーを、グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５年に記載されているごとく調製した。抽出物を、ブラックバーン（Ｂｌａｃｂｕｒｎ）ら、ゲノム（Ｇｅｎｏｍｅ）、第３１巻、第５５３頁、１９８９頁に記載されるごとく調製した。
【０２１５】
標準的分析は、無塩緩衝液中の、体積にして５０％のヘパリン−アガロースにより精製したテロメラーゼ、２５μＭ  ＴＴＰ、１．２５μＭ  32ＰでラベルしたｄＧＴＰ（４００Ｃｉ／ｍＭｏｌ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、１μＭ
オリゴ（水と混合した（Ｔ2Ｇ4）4または（Ｔ2Ｇ4）2のいずれかであって、２分間９０℃で加熱し、１０分間３０℃で冷却したもの）、および０．１μｌＲＮａｓｉｎ  （４０Ｕ／ｍｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含んでいた。ＡＺＴ−トリホスフェートはブロウズ・ウェルカム（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、ノース・キャロライナから入手した。Ａｒａ−Ｇ−トリホスフェートはカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から、ｄｄＮＴＰ混合物はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。反応混合物を使用の準備が整うまで氷上に放置し、次いで、アナログを含むチューブに混合し、３０℃でインキュベーションした。対照として、同一の反応をプライマー無しで行った。反応を、次いで、グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）およびブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３７巻、第３３１頁、１９８９年に記載されるごとく実質的に行った。定量分析のために、グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）の、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５年に記載されるごとく、反応混合物の一部分をＤＥ８１ペーパーに三連でスポットし、洗浄した。反応速度をモニターするために、32Ｐ−ＴＴＰまたは32Ｐ−ｄＧＴＰからの32Ｐラベルの取り込みを測定した。伸長反応混合物の視覚化のために、試料を９５℃で２分間加熱し氷上で冷却した後、１２％ポリアクリルアミドゲル／８Ｍ尿素ゲルに負荷した。
【０２１６】
テトラヒメナ由来のテロメラーゼ・リボヌクレオプロテイン・エンザイムの機構モデルを図１８Ａに示す。該酵素は、酵素のＲＮＡ部分にある鋳型配列をコピーすることにより、適当なＤＮＡプライマーの３’末端にＴＴＧＧＧＧ繰り返し配列を合成する。結果を議論する際の参考の容易のために、鋳型領域の塩基には１から９までの番号（ＲＮＡに沿って５’から３’方向に）を付ける。この実施例で用いられる標準的テロメラーゼ分析は、１つの三リン酸が32Ｐでラベルされた、ｄＧＴＰあるいはＴＴＰ基質の、図１８Ａに示される反応中の合成ＤＮＡへの取り込みからなる。この実施例で議論される実験のために、ラベルの全体の取り込み率が、時間がたつにつれて直線になるように予め決定された条件下で、１μＭ（Ｔ2Ｇ4）4または（Ｔ2Ｇ4）2のいずれかをＤＮＡプライマーとして使用した。反応速度をモニターするために、32Ｐ−ＴＴＰまたは32Ｐ−ｄＧＴＰからの32Ｐラベルの取り込みを測定し、伸長生産物の分布は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０２１７】
ＡＺＴ−トリホスフェート（ＡＺＴ−ＴＰ）の量に増加分を添加することによる、テロメラーゼ活性の標準的分析への効果を図１９Ａに示す。ＡＺＴ−ＴＰと同一濃度で添加した、ラベルされていないＴＴＰを用いた、一連の対照実験を平行して行った（図１９Ａ）。ＡＺＴの取り込みは鎖終結につながるので、この結果は、ＡＺＴがテロメラーゼに対し、ＴＴＰほどには効果的に競合しないことを示している。類似の結果が、32Ｐ−ｄＧＴＰの取り込みをモニターした際に得られ（図１９Ｂ）、ＡＺＴ−ＴＰの濃度が約８０μＭの場合に、５０％の阻害が起こった。
【０２１８】
反応中にアラビノフラニル−グアノシン・トリホスフェート（Ａｒａ−ＧＴＰ）の濃度を増加させていく類似の実験において、全体の取り込みの顕著な低下が、低いアナログの濃度においてさえも起こった（図１９Ｃ）。ラベルしないｄＧＴＰを拮抗剤として加えた平行する実験より（図１９Ｃ）、これらの反応条件下でのｄＧＴＰに対するＫｍ値は、１ないし２μＭであることが判明した。０．７μＭ  Ａｒａ−ＧＴＰで５０％阻害が起こり、それゆえＡｒａ−ＧＴＰは、ラベルしていないｄＧＴＰと同様に、32Ｐ−ＧＴＰに対して、潜在的に競合する。しかしながら、Ａｒａ−Ｇの取り込みは鎖終結を引き起こすので、取り込まれた各Ａｒａ−Ｇが、ラベルしていないｄＧＴＰとの競合よりむしろ、全体の取り込みにより大きな影響を与えることが期待される。
【０２１９】
本発明者らは、テロメラーゼ反応に対するジデオキシヌクレオシドトリフェーツ（ｄＮＴＰｓ）の影響も試験した。テロメラーゼに対して以前示されたように〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５年〕、また、多くの他のリバース・トランスクリプターゼの例のごとく、ｄｄＮＴＰは、該酵素により認識され、取り込まれ、バンディングパターンにおいて、続いておこるシフトによる鎖終結と、生産物の、平均の長さの減少を引き起こす。テトロヒメナとヒト・テロメラーゼの、以前の定量分析と矛盾せず〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５；モリン（Ｍｏｒｉｎ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第５９巻、第５２１頁、１９８９年〕、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰは、各、伸長生産物への、ラベルした32Ｐ−ＮＴＰの取り込みを阻害する（図１９ＤおよびＥ）。ｄｄＧＴＰはｄｄＴＴＰよりもずっとより効果的な阻害剤であった：これらの条件下において、５０％阻害が、＜０．１および５μＭ  ｄｄＧＴＰならびにｄｄＴＴＰのそれぞれにおいて起こった。以前にテトラヒメナ・テロメラーゼにおいてみられたように〔グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第４３巻、第４０５頁、１９８５〕、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＡＴＰのいずれに対しても、顕著な効果は見られなかった。それに加え、ｄｄＩＴＰはテロメラーゼを阻害するが（図１９Ｅ）、ｄｄＧＴＰほどは効果的でなく、３μＭ  ｄｄＩＴＰにおいて５０％の阻害が起こった。
【０２２０】
ラベルした生産物のサイズ分布は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。鎖終結因子の期待と矛盾せず、コールド（ｃｏｌｄ）・ＴＴＰ拮抗剤の対照と比較して、ＡＺＴの存在下では、長いほうのテロメラーゼ生産物の割合が減少した（図２０Ａ；レーン１および２を、レーン３ないし７と比較されたし）。生産物の平均の長さもまた、Ａｒａ−ＧＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＩＴＰの存在下で減少した（図２０ＡおよびＢ）。それに加え、特有に生産された各ヌクレオシド三リン酸アナログおよび、鎖終結の特徴的なパターンを、伸長生産物のバンディングパターンにおけるシフトの分析に示されるごとく生み出す。ＡＺＴについて、本発明者らは、Ｔ残基の取り込みに対応するバンドの、増加した相対強度を見いだした。（鋳型ＲＮＡの２および３の位置でＡ残基をコピーする（図１８Ａ参照））。バンディングにおけるこの変化は、単純な鎖終結と矛盾せず、このことは、双方の取り込まれたＴ残基と関連するバンドの増加を予言する。類似の効果がｄｄＴＴＰに関して見られた。本発明者らは、このことを、ＡＺＴが該酵素により認識され、成長途中のテロメアの配列の正しい位置に取り込まれたのだと解釈する。しかしながら、二番目のＴの付加に先立つ、鋳型の３の位置に対応するバンドの相対強度の増加もまた、ＴＴＰとの競合および位置２でのＡＺＴ−トリホスフェートのより遅い反応速度に帰することができることには疑いの余地がない。
【０２２１】
Ａｒａ−ＧＴＰに関する結果はまた、Ａｒａ−Ｇの取り込みと、それに続く鎖終結とも矛盾しない（図２０Ａ、レーン７および８）。Ｇ残基が取り込まれ得る、そしてそれゆえ鎖終結が起こり得る４つの位置があるが、最も強い増加は、テロメラーゼＲＮＡ鋳型の中央の、位置４により特徴付けられるＧ残基に関するバンドにある（図１８Ａ）。ｄｄＧＴＰに関しては、鎖終結は位置６および５において最も効率的に起こるように思われ（図２０Ｂ、レーン１を、レーン４ないし６と比較されたし）、ｄｄＩＴＰに関しては、位置５においてそうであるように思われる（レーン７ないし９）。
【０２２２】
図１８Ｂには、鋳型に沿った６つの点の各における多量化に対する種々のトリホスフェートアナログの効果を、模式的に示す。鋳型上の最大の鎖終結が起こる位置では、阻害剤としてのヌクレオシドアナログの効率の間に何の関連もない。例えば、テロメラーゼＲＮＡ鋳型上の異なる位置において、潜在的阻害剤であるｄｄＧ−およびＡｒａ−Ｇ−トリホスフェートは、最大の鎖終結を起こす（ｄｄＧに関しては５の位置および６の位置、Ａｒａ−Ｇに関しては４の位置）。
【０２２３】
鎖終結因子として作用すると期待されるヌクレオシドトリホスフェートアナログに加えて、本発明者らは細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤であるリファンピンおよびストレプトマインシ硫酸をも試験した。ストレプトマイシン硫酸は、高濃度において、グループＩのセルフ−スプライシングイントロンの活性を阻害することが知られており〔フォン・アーセン（Ｖｏｎ  Ａｈｓｅｎ）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第１９巻、第２２６１頁、１９９１年〕、Ｇ−リッチなＤＮＡプライマーに対する特異性の一部分として、テロメラーゼにより認識され得るであろうグアニジノ基を有する（グライダー（Ｇｒｅｉｄｅｒ）、セル（Ｃｅｌｌ）、第５１巻、第８８７頁、１９８７年）。１００μｇ／ｍｌの濃度までリファンピンを加えることによっても、定量的なラベルの取り込みに影響したり、あるいは伸長生産物のバンディング・パターンを変化させたりはしなかった。４０ｍＭ  ストレプトマイシン硫酸は量を劇的に減少させ（図１９Ｆ）、４０ｍＭ硫酸ナトリウムの対照に見られるような微量な活性の減少を伴い、伸長生産物の平均長を減少させた。しかしながら、ヌクレオシドトリホスフェートアナログとは異なり、繰り返し配列の特別な位置における取り込みには、ストレプトマイシンによる阻害は影響しないように思われた。ストレプトマイシンによる阻害は、インビトロにおけるテロメラーゼ活性の基準として、実験的に有用であり得る。しかしながら、ストレプトマインシンによる阻害の重要性は、その効果がテロメラーゼのＲＮＡ部分あるいはＤＮＡプライマーのいずれかへの非特異的結合の結果である可能性を否定するのは困難であるため、はっきりしていない。
【０２２４】
アナログ類ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、ｄｄＴおよびｄｄＩの三リン酸の付いた形は、各々インビトロにおいてテロメラーゼを阻害する（種々の効率で）ので、本発明者らは、これらヌクレオシドアナログの各々を、細胞成長培地に供給することにより、テロメアの長さあるいは老化における、インビボの変化が引き起こされるかどうかを試験した。付加的に、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇおよびｄ４Ｔを、接合および栄養細胞の各々に対して試験した。
【０２２５】
テトラヒメナに関する以前の研究により、テロメラーゼＲＮＡの、少なくとも一カ所の変化がテロメアの短縮および細胞の老化を引き起こすことが示された〔ユ（Ｙｕ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４４巻、第１２６頁、１９９０年〕。テトラヒメナにおいて、そのような表現型が、テロメラーゼの阻害剤により生み出されるのかどうかを試験するために、二連の対数期の培養を、アナログの種々の濃度の存在下で、延長した期間、培養した。これらの培養の成長と細胞の形態学をモニターし、テロメア長分布のために、ＤＮＡを異なる時期に単離した。５ないし１０ｍＭのＡＺＴを、イソブロス培地に添加した際に、強く細胞成長を阻害し、一日のうちに細胞を殺し、それゆえ、これらの濃度において、老化よりむしろ、細胞への即時の毒性を示唆するような方法で作用する。低濃度（１ｍＭまで）でＡＺＴをイソブロス培地に添加しても、トランスファー当たり約１０3細胞の継代培養で維持されている培養の老化を起こさず、これら細胞培養の５０日にわたる継続的な成長およびサブカルチャリングを続けた。成長速度の測定により、細胞は、この５０日間に、１５０ないし２００の細胞世代を通過したと見積もられた。類似の大量移行の実験においては、２％ＰＰＹＳに、２ｍＭ、すなわち即時的な毒性を引き起さなかった最大濃度のＡｒａ−Ｇを加えた細胞に関して得られた、細胞倍加速度、形態学、あるいは長期間生存率に対する効果は得られなかった。
【０２２６】
異なったアナログ類の存在下で増殖している細胞のテロメア長が、継代培養している間の、一連の時点に抽出したＤＮＡサンプルのサザン・ブロット分析によりモニターした。薬剤の非存在下で、２％ＰＰＹＳ培地中の１および５ｍＭ  ＡＺＴの存在下で栄養的に成長している対照の培養と比較し、平均して１７０塩基まで、再現性をもって短縮された（図２１ＡおよびＢ）。このテロメアの短縮は、濃度に依存して起こり（図２１Ｂ）、試験された最低濃度である１０μＭ  ＡＺＴによって引き起こされる、少なくとも５０％の最大短縮を起こした。試験された各ＡＺＴ濃度に対し、最大の減少は、薬剤の存在下における培養の三日間に見られた（１５ないし３０細胞分裂）が、この最初の長さの調整後、各薬剤濃度において、テロメアはその後、経時的に、統計学的に有意な短縮を示さず、平均のテロメア長は、少なくとも２８日間の大量移行継代培養を行っている間は、首尾一貫して静止していた。
【０２２７】
１または２ｍＭのＡｒａ−Ｇを２％ＰＰＹＳ培養培地に添加すると、同様な程度かつタイミングでのテロメア短化が誘起された（図２１Ｃ）。イソブロス（Ｉｓｏｂｒｏｔｈ）培養培地に１０μＭないし１ｍＭの濃度範囲のｄ４Ｔを添加すると、培養５日後（１６世代）に、１００μＭおよび１ｍＭにて短化テロメアが再度、濃度依存的に誘起された。それに対して、１ｍＭまでのｄｄＧまたはｄｄＩでは、２％ＰＰＹＳ培地中での５日間のサブ培養（１５−２０細胞世代）にわたり、対照培養に比してテロメア長の変化は誘起されなかった。
【０２２８】
テロメラーゼが試験したアナログの少なくともいくつかによりイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）にて強く阻害されること、ならびに、これらのアナログによるイン・ビボでのテロメア長が１５ないし３０細胞世代の範囲で影響を受けることを以前に本発明者らは見い出しているので、テロメア付加が実際にはイン・ビボで中断され、テロメア短化または老化の進行が、該アナログのテロメラーゼへの阻害効果を回避する細胞集団の一部に起因するいずれの事実も見い出せなかった可能性があった。以前に本発明者らは、ほとんどの細胞中の老化テロメラーゼＲＮＡを突然変異させることによりイン・ビボでテロメラーゼを損傷させることを示したが、これらの実験においては、わずか〜１０2単細胞のサブクローンを分析したに過ぎなかった（ユウ（Ｙｕ）、３４４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第１２６巻、１９９０年）。一世代につき約１０3細胞を移行させる本発明者らの大量移行継代培養のプロトコールの下では、細胞のうち〜１％程度の少ない画分が老化を回避した場合、ならびに、それらの増殖優位性がテロメアを失した細胞に比して十分に高い場合には、それらはいずれの細胞世代においても優勢な集団となり得、いずれの表現型も検出できないであろう。かかる細胞亜集団を見過ごしたかどうかを試験するため、本発明者らは、これらの実験において、１０μＭおよび１ｍＭのＡＺＴならびに１０μＭおよび１ｍＭのＡｒａ−Ｇの存在下のミクロタイター・プレートウェルでウェル当たり平均１ないし１０の細胞を平板することによってサブ培養を行うことを除いて、薬物の存在および不在下で栄養分裂テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）細胞での同実験を行った。各々の薬物について、この方法にて連続して３０日（９０ないし１５０細胞世代）、ならびに、連続して１６日（５０ないし８０細胞世代）、それぞれ１０μＭおよび１ｍＭの薬物濃度にて細胞を平板培養した。該ウェルの合一した試料から間隔をおいてテロメア長を分析するためのＤＮＡを抽出した。
【０２２９】
１０μＭのＡＺＴならびに１０μＭまたは１ｍＭのＡｒａ−Ｇ中で増殖させた細胞の該実験過程にわたっては、該ヌクレオシドアナログを欠く対照培地に比しての平板効率の変化が認められなかった。しかしながら、１ｍＭのＡＺＴの存在下にて、単一細胞を移行させる方法で維持した細胞の増殖速度をモニターすると２つの一般的な増殖クラス、すなわち、遅いもの（一日当たり０ないし１回の細胞分裂）および速いもの（一日当たり２ないし４回の細胞分裂）を同定できた。速い細胞の増殖速度は、ＡＺＴを含有しないイソブロスで増殖させた対照のものと同様であった。遅い細胞が単に移行可能性が低い場合には、実験期間中に予想したように遅い細胞のウェルの比率は減少した。なぜなら、遅い細胞は速い細胞よりも低細胞密度で存在しており、速い細胞はより高い細胞密度で増殖し、平板プロトコールのタイミングがうまくいったからである。しかしながら、それらから移行させた後に残った細胞をモニターすると、完了時には該遅い細胞が死滅していることが示された。加えて、該移行のプロセスを通して、先の速い細胞ウェルから遅い細胞が出現した。本発明者らは、遅い増殖ウェルからの細胞を保存し（サザン・ブロッティング用の十分なＤＮＡを得るためにいくつかのミクロタイターウェルの保存が必要）、それらのテロメア長分布を、保存した速い細胞のものと比較した。保存した速い細胞からの平均テロメアＤＮＡ長および平均の大きさの分布は、ＡＺＴなしに増殖させた対照細胞のものと区別できなかった。それに対して、保存した遅い細胞ＤＮＡは、テロメアの平均長および不均一性がわずかに減少していることが示された（図２１Ｄ）。イソブロス培地中にて増殖させた対照細胞は、１％ＰＰＹＳ培地中で増殖させた細胞より平均１６５ｂｐ短いテロメアを有していた。イソブロス培地中にて増殖させた細胞の該テロメアＧ4Ｔ2リピート域は、豊富なＰＰＹＳ培地中にて増殖させた細胞のもよりすでに著しく短いため、１ｍＭのＡＺＴ中で増殖させることにより多いテロメア短化量は、テロメア画分を連続的かつ確率論的に、作用するに要する臨界低閾値（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｏｗｅｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｕｌｄ）以下に減じるに十分であり、かくして亜集団の細胞を生存能力を減じると本発明者らは確信する。
【０２３０】
本発明者らは、接合した細胞により子孫形成に対する、ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、ｄｄＩおよびｄｄＧの影響を評価した。このプロセスは、子孫細胞中での新しい大核テロメアのデ・ノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）形成を包含する。テトラヒメナのごとき繊毛のある原生動物中の大核発生は、発生的にプログラムされた、生殖系染色体の（末端が、テロメアのデ・ノボ付加により修復されている）直鎖状サブ染色体への部位特異的断片化を含有する。テロメラーゼが、栄養細胞分裂の間に予め存在していたテロメアのみをイン・ビボにて伸長させるのみならず（ユウ（Ｙｕ）、３４４、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第１２６巻、１９９０年）、この発生的制御された染色体の修復の間に、非テロメア配列上にテロメアＤＮＡを直接付加するようにも作用することを我々は以前に示した。断片化したＤＮＡへのテロメア付加が即時に要求されるため、その後のプロセスが、栄養増殖の間のテロメア維持よりテロメラーゼ阻害に感受性かもしれない。ヌクレオシドアナログが、テロメア形成の分解に起因する大核発生を阻害を誘起するかどうかを試験するために、本発明者らは（シクロヘキシミド感受性であるが、接合後の子孫はシクロヘキシミド抵抗性である）２株のテトラヒメナを接合させた。同時に接合させた細胞を、１０μＭないし５ｍＭの濃度範囲のＡＺＴで、大核の発生が始まる直前に開始して大核の発生の間に続けて処理した（接合開始後６−２４時間の期間）。この時点で、アナログを欠く新しい培地中のミクロタイター・プレートウェルに、ウェル当たり１細胞の平均細胞密度で細胞を希釈し、子孫を形成するのに成功した細胞を選抜する前に、最も短い時間増殖させた。ＡＺＴの効果を最大化させる試みにおいては、細胞を、２％のＰＰＹＳもしくはイソブロス培地で６時間付するか、あるいは２４時間（ＡＺＴ処理の期間）まで飢餓状態にする。かかる飢餓状態は、大核の発生を中間期に拘束する。再度フィードすると、大核の発生がＡＺＴの存在下にて推し進められる。対照として、非接合の親細胞も平板し薬物に暴露させた。同様な実験をＡｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、ｄｄＩおよびｄｄＧで行った。その結果を表４に示す。
【０２３１】
該対照平板は、ＣＨＸ中の細胞が９９−１００％死滅する一方で、アナログと接合させたものや、させていない大多数の細胞は生存したことを示した。該ヌクレオシドアナログは、いずれの統計学的に有意な効果も子孫形成に効果を奏さなかった。この実験の意図は、前記したごとく、該薬剤の効果を回避した少数集団による該培養の支配を妨げることである。従って、減損したテロメラーゼ活性による大核発生の不可逆的な中断はほとんどまたは全くなく、ＡＺＴ、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、ｄｄＧまたはｄｄＩの存在下でテロメア形成が起きた。
【０２３２】
大核発生は有意に中断されなかったが、大核発生の間のテロメア付加のマーカー形成の分析は、ＡＺＴがテロメア付加の効率を減じることを示唆している。
【０２３３】
アナログの存在または不在下に接合させ、それを６時間再フィードした細胞あるいは接合の期間中十分に飢餓させた細胞のいずれからのＤＮＡを、テロメア・プライマーおよび５’ｒＤＮＡプライマーと共にＰＣＲに用いた。これにより、テロメアを付加した１１ｋｂのｒＤＮＡの断片を選抜した。該１１ｋｂのｒＤＮＡは、大核発生の間またはこのプロセスの中間かのいずれかに生成した該２１ｋｂのｒＤＮＡの副産物である。それは、新しい大核発生の間に一時的にだけ提示され、それ自体はイン・ビボのテロメア付加の優れたマーカーである。１１ｋｂｒＤＮＡからの１４００ヌクレオチドの相対量のＰＣＲ生成させた断片のノック−ダウンは、ＡＺＴの存在下で接合させた細胞からのＤＮＡには見い出されたが、Ａｒａ−Ｇ、Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ、水またはＤＭＳＯを含有する対照、あるいはｍｏｃｋ−接合させたＳＢ２１０細胞には見い出されなかった。該ＰＣＲ反応に用いたＤＮＡが存在し、ＰＣＲに適することを示すため、ｒＤＮＡの３’−小核複製物からのプライマーを用いて同一反応を行った。全ての試料において、予期した８１０ヌクレオチドの断片が実質量で生成すること（図２２）は、ＡＺＴ中にて接合させた細胞からの試料の１４００ヌクレオチドのテロメアを含有するＰＣＲ生成物の減少が、該ＤＮＡまたは試薬中の夾雑物よりむしろアナログの存在によることを示している。５’−ｒＤＮＡプローブでのサザーン・ブロッティングにより、該テロメア−含有ＰＣＲ生成物が予期したｒＤＮＡ配列からのものであり（図２２Ｂ）、３’ＰＣＲ生成物には交差ハイブリダイゼーションしないことが確認された。テロメア−含有ＰＣＲ生成物の全体的な減少は、混合後６時間に再度フィードした全ての試料で見い出されたが、ＡＺＴの存在下に接合させた試料での減少はさらに顕著であった。
【０２３４】
（表６）
ヌクレオシド・アナログの生殖能形成への影響
細胞処理                ＃ＣＨＸ−Ｒ      ＃全細胞    ％ＣＨＸ−Ｒ
ＳＢ２１０（非接合）            １          ２１５              ０．５
ＰＢ９Ｒ（非接合）              ３          ３０７              １
ＡＺＴ（ｍＭ）０              １３９          ２１２            ６６
０．０１        １２１          １６９              ７２
０．１        １００          １４８        ６８
１．０              ９１          １６６        ５５
５．０              ７５          １２０        ６３
ＳＢ２１０（非接合）            ０            ５７          ０
ＡＺＴ（ｍＭ）０            １６５          ２１４        ７７
０．０１        ６７            ９２        ７３
０．１        １２８          １９０        ６７
１．０          ６０          １２５        ４８
５．０          ８９          １６８        ５３
１％  ＤＭＳＯ                ８４          １０９        ７７
ＡＲＡ−Ｇ（ｍＭ）０．０１  １１４          １４１        ８１
０．１    １３４          １６７        ８０
１．０      ８９          １６１        ５５
１％  ＤＭＳＯ                ５１            ７５        ６８
ＡＲＡ−Ｇ（ｍＭ）１．０      ５１            ８６        ５９
２．０      ４０            ９２        ４３
ＳＢ２１０（非接合）            ０              ９          ０
ＰＢＰＲ（非接合）              ０            ３７          ０
ｄｄＩ（ｍＭ）  ０            ６３            ７５        ８４
０．００１    ５９            ７１        ８３
０．０１      ８５            ９６        ８９
０．１        ８３          １０６        ７８
１．０      １００          １１０        ９１
１％  ＤＭＳＯ                ２１            ４４        ４８
ｄｄＧ（ｍＭ）  ０．００１    ８６          １０２        ８４
０．１        ７３            ８６        ８５
１．０        ５１            ６６        ７７
ＡＣＹＣＬＯ−Ｇ
（ｍＭ）        ０            ３６            ４５        ８０
０．０１７    ８０          １０７        ７５
０            ７８          １１６        ６７
０．０１７  １０１          １４６        ６９
実施例１４：末端制限断片の大きさの減少に関するＧ−反応
制限酵素で消化し、電気泳動に対し、サザーンブロットによってハイブリダイズさせたヒト繊維芽細胞ＤＮＡは、テロメア反復配列の相対的長さを反映する末端制限断片（ＴＲＦ）の分割を可能とする（図２６参照、Ｈｉｎｆ消化ＤＮＡ、記号「Ｈｉｎｆｌ」；消化していないＤＮＡ、記号「Ｏ」）。このサザーン分析は、ヒトおよび多くの他の種が、ＴＲＦサイズに付加するサブテロメア反復配列の長いストレッチを有するという事実によって複雑化されている。テロメア反復長の測定へのこのサブテロメア反復の人為的導入を排除する手段として、修飾したマキサム−ギルバート反応を用いてＧ残基においてＤＮＡを加水分解した。記号「Ｐのみ」（下に負荷）のレーンにおいて、それ自体ＤＮＡのサイズを減少させない温和な条件においてピペリジンでＤＮＡを処理する。記号「Ｐ＋ＤＭＳ」のレーンにおいて、試料をＤＭＳで予備処理する。ＴＲＦのサイズの実質的でない減少を、Ｇ残基を含有する富Ｃ鎖におけるサブテロメア配列の欠失を反映するＨｉｎｆｌ消化と比較する。すべてのレーンを（ＴＴＡＧＧＧ）3でプローブした。このアッセイは、かくして、診断手法においてテロメア長の分析で有用である。
【０２３５】
実施例１５：菌類テロメア
以下の実施例は、特異的菌類を同定するのに用いることができる種々の特異的テロメア配列を説明する。当業者ならば、かかる配列はオリゴヌクレオチドでプローブして、選択された菌類の存在を特異的に診断できることを認識するであろう。加えて、菌類の特異的処理は、かかる配列に結合し、菌類細胞の長期間の生存を減少させる薬剤を使用することによって行うことができる。
【０２３６】
本明細書中に記載するごとく、テロメアＤＮＡは特異的薬物療法の魅力的な標的である。テロメアは、特異的薬物に接近可能な短い一本鎖の突出である。かかる薬物による結合は、正常なテロメアの機能に干渉し、かくして、菌類の細胞の生存に干渉する。同様の実験（本明細書に記載したごとくに実行すれば当業者にとってルーチン的）において、かかるテロメアの複製（またはテロメラーゼの活性）の阻害剤または促進剤を見いだすことができ、それを抗癌剤、抗寄生虫剤および抗菌類剤として使用できる。
【０２３７】
菌類テロメアの有意に増大した長さは、それらをアンチセンス療法もしくは診断を理想的な標的とする。加えて、この異なるテロメア構造は、テロメラーゼの作用の異なるメカニズムを示し、かくして、ヒトもしくは他の動物細胞に対して不活性な抗菌類剤についての標的としてのその利用可能性を示す。
【０２３８】
テロメアＤＮＡ配列は、一般に、進化において顕著に保存されており、典型的には、Ｇ残基のクラスターを含有する、反復され、非常に短い配列単位であることが判明している。しかしながら、最近、出芽酵母のカンジタ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のテロメアＤＮＡはかなり長い反復単位よりなることが見いだされている。本明細書において、本発明者らは、出芽酵母からの７つのさらなる新しいテロメア配列の同定を報告する。出芽酵母内では、長さ（８−２２５ｂｐ）、配列および組成において、テロメア配列は、他の真核生物の全系統発生的範囲を通じて従前に見られるものよりも、より多くの系統発生的発散を示すにも拘わらず、本発明者らは、すべての公知の出芽酵母テロメア反復は、より典型的なテロメア配列に似たＴおよびＧ残基の顕著に保存された６ｂｐモチーフを含有することを示す。本発明者らは、テロメアにおけるＧクラスターは、テロメアＤＮＡの特異的共通構造特性についての基本的要件によるよりもむしろ合成のその態様によって課される制限のため、保存されていると提案する。
【０２３９】
テロメアのＤＮＡ配列、すなわち、真核生物染色体の端部は、典型的には、Ｇ残基のクラスターによって特徴付けられる５〜８ｂｐの反復する単位のタンデム配列よりなり、非常に発散した真核生物の間においてさえ保存されており、これは顕著な鎖組成の偏りを生じていることが従前に見いだされている。しかしながら、日和見病原カンジタ・アルビカンスのテロメア反復は、いずれの認識可能な鎖組成の偏りをも欠く２３ｂｐの均質反復よりなることが示されている。
【０２４０】
より通常で単純なテロメア配列に対して、見掛け上例外的で複雑なカンジダ・アルビカンスのテロメア反復配列の関係を調べるために、シイ・アルビカンスおよびエス・セレビシエ双方に関係する出芽酵母種からのゲノミックＤＮＡを、クローン化シイ・アルビカンスのテロメア反復をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、サザーンブロットによって分析した。低ストリンジェンシィのハイブリダイゼーション条件下、本発明者らは、いくつかの種における多重クロス−ハイブリダイズするバンドを検出した（図２８）。いくつかの場合において、クロス−ハイブリダイズするバンドは明らかにブロードであり、細胞集団の中で個々のテロメアにおけるテロメア反復の異なる数によってテロメア制限断片の特徴が引き起こされた。
【０２４１】
テロメアが豊富なライブラリーは、７つの出芽細胞種および株からのゲノミックＤＮＡから構築した。テロメアクローンは、公知の酵母テロメア反復（２３ｂｐのシィ・アルビカンス反復またはエス・レセビシエのＴＧ1-3反復いずれか）にハイブリダイズするその能力によって、あるいは特異的プローブを使用することなく、端部が連結した反復的ＤＮＡ配列についてスクリーニングすることによって同定した。７つの種からの推定テロメア断片インサートの配列を決定することにより、単位長さが８〜２５ｂｐであるタンデム反復を含有するクローンを同定した。１の例外があるが、該反復は種内で配列の変異を示さなかった。各場合において、反復配置は、クローン化テロメアについて予測されるごとく、ベクター配列に直接隣接して、インサートのまさに端部に存在した。各種からの反復含有クローンは、ライブラリースクリーニングで用いたシイ・アルビカンスまたはエス・レセビシエのプローブで元来観察された制限断片の同一パターンにバックハイブリダイズした。バンドのほとんどは、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼに対して優先的に感受性であり（図２９）、これは、反復配列のバルクが染色体の端部に存在することを示す。異なる酵母種からクローン化した反復のトラクトの長さは、典型的には、２５０〜６００ｂｐであった（２つのシイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）株からのものは１３０〜１７５ｂｐにすぎなかったが）。この種が特に短いテロメアを有することは、Ｂａｌ３１消化の間におけるその非常に迅速な喪失によって、および比較的弱いハイブリダイゼーションによって、種特異的テロメアプローブをもってさえ、支持される。
【０２４２】
図３０は、シイ・アルビカンスおよびエス・セレビシエのものと一緒に、これらの新しく発見されたテロメアの反復単位の配置を示す。２つの顕著な特徴は明らかである：反復単位長および配列の複雑性に関するかなり多数の出芽酵母テロメア、およびほとんどが典型的なテロメア配列に似たＴおよびＧ残基の保存された６塩基クラスター。
【０２４３】
テロメア反復の中での配列の関係は、一般に、これらの出芽酵母の系統発生的関係と一致する。２つのシイ・トロピカリス株のテロメア反復は、単一塩基多形性のみが異なる。密に関連するケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）およびシイ・シュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の２５ｂｐテロメア反復は、１つの位置においてのみ異なる。シイ・アルビカンス、シイ・マルトサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、シイ・シュードトロピカリス、シイ・トロピカリスおよびケイ・ラクティスからのテロメア反復配列は長さが２３〜２５ｂｐであり、反復の中央部分に大いにまたは完全に限定された差異がある。シイ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）（エス・レセビシエに最も密に関連している可能性のあるこの実験における種）からの１６ｂｐ反復単位は非常にＧに富んでおり、これは、恐らくは、異種であってより小さいエス・レセビシエのテロメア反復に対するそのクロス−ハイブリダイゼーションに寄与する。不規則なエス・レセビシエの反復を含めたすべての出芽酵母配列は完全な、あるいは５／６のマッチないし６ｂｐＴ／Ｇの配列を有する（ボックス）。
【０２４４】
シイ・トロピカリス株Ｂ−４４１４からのクローン化テロメアにおいて、本発明者らは、Ｂ−４４１４テロメアにおける図３０の反復単位に示したごとく、反復の第２塩基位置で異なる２つのテロメア反復配列は均質であったが（「ＡＣ反復」なる語で示す）、残りの反復（以後、「ＡＡ反復」と示す）は株シイ・トロピカリスＢ−４４４３からクローンした均質なテロメア反復と同一であることを見い出した。
【０２４５】
シイ・トロピカリスのテロメアおよび株の間におけるこれらの変異反復の分布を調べるために、Ｂ−４４１４およびＢ−４４４３を含めたいくつかのシイ・トロピカリス株、ならびに対照のシイ・アルビカンス株からのゲノミックＤＮＡを、ＡＡまたはＡＣ反復いずれかに特異的なオリゴヌクレオチドプローブでプローブした（図３１左パネル）。株Ｂ−４４１４および１７３９−８２のみが、また、ある程度ならばシイ・アルビカンスのテロメアが、ＡＣ反復特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした（図３１左パネル）。しかしながら、シイ・アルビカンスからのものを除き、Ｂ−４４４３を含めテストしたシイ・トロピカリス株のすべてからのゲノミックＤＮＡは、「ＡＡ」反復に特異的なオリゴヌクレオチドと十分にハイブリダイズした（図３１右パネル）。これらの結果は、Ｂ−４４１４および１７３９−８２は、共に、２つのプローブに関するシグナルの定量は個々のテロメア断片の間で異なるので、異なるテロメアで非常に可変的に分布している。少なくとも２つの形態のテロメア反復を含有することを明らかに示す（図３１ＡおよびＢ、レーン１および２）。
【０２４６】
実施例１６：ヒト腫瘍細胞増殖に対するテロメラーゼ阻害剤の影響
テトラヒメナからのテロメラーゼを阻害することが示されている薬剤、例えば、ＡＺＴ、ｄｄＴおよびａｒａ−Ｇをテストして、ヒト・テロメラーゼ活性、テロメア反復長および細胞増殖の不死性について調べた。テストした化合物のうち、ｄｄＧおよびａｒａ−Ｇは、腫瘍細胞系２９６から得られたヒト・テロメラーゼの効果的な阻害剤であった。ｄｄＧについてのデータを図２７に示す。次いで、０．２５Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））に維持されたリンパ腫細胞系ＪＹ６１６を用いて、完全な細胞におけるテロメラーゼに対する薬剤の効果を実験した。該細胞を、２連にて、ウェル当たり５．０ＭＬの培地を含む６−ウェルのプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））で培養した。細胞を７〜１０日毎に継代したが、これは、５〜７回の平均集団倍加（ＭＰＤ）に相当し、ウェル当たり３×１０4細胞にて、アナログまたは対照を含有する新鮮な培地に接種した。ヘモサイトメーターで計数する間、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）株（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）を利用して収穫前に細胞の生存をモニターした。染色された：未染色細胞（死滅：生存）の平均比率は９０％を超えた。該ＤＮＡの完全性を、制限酵素による消化に先立ってゲル中でその移動性を観察することによって平行して測定した。
【０２４７】
図２３から分かるように、低濃度の潜在的テロメラーゼ阻害剤の存在下で、すべてのＪＹ細胞は不死状態にて増殖した。高濃度においては（図２４）、５０μＭ
ＡＺＴの存在下では細胞は増殖を停止し、２０μＭ  ａｒａ−Ｇの存在下においては遅延された増殖を示した。５０μＭ  ＡＺＴの存在下における細胞増殖のこの阻害はテロメラーゼ阻害によるものであると信じることの裏付けは、細胞は３週まで正常の速度で増殖し、継いで、分割を停止したという観察である。これは、細胞増殖の阻害はテロメラーゼ阻害を介するものである（すなわち、細胞はそのテロメア反復を失うのに多数ラウンドの細胞分裂を要する）ことを予期するであろうという効果である。また、ＡＺＴはテロメラーゼの阻害を介して細胞の増殖を阻害したという信念の裏付けは図２５に示された知見であり、そこでは、第１週、および細胞が分裂を停止した第３週と比較して、ＡＺＴで処理した細胞は、同時点における対照培地「Ｒ」と比較して平均テロメア長が顕著に増加していた。
【０２４８】
加えて、１０μＭ  ｄｄＧは対照（この場合、ＤＭＳＯ対照）と比較してテロメア長の減少を引き起こすことが示された。図３２において、前記したのと同様に実験し、ｄｄＧで処理したＪＹ細胞は、ＤＭＳＯ対照と比較して、９および１０週の後、顕著により短いテロメア反復長を示したことが分かる。記載した条件下で培養した場合、ＪＹ細胞は不死であるが、１０週間にわたっていくらかテロメア反復を失うことに注意すべきである。ｄｄＧの添加はこの喪失を顕著に加速した。
【０２４９】
組成物
本発明に関する組成物または生成物は、非経口または鼻腔内投与もしくは経口投与に適当な溶液の形態にて簡便に提供されうる。多くの場合においては、投与用として一回使用溶液での剤で提供されるのが簡便であろう。
【０２５０】
該剤が両性の場合、それらは遊離塩基、酸付加塩または金属塩として利用しうる。勿論、該塩は、医薬上許容されるものでなければならず、これらとしては、金属塩、特に例えばカリウムまたはナトリウムの塩のごときアルカリおよびアルカリ土類金属塩が包含されよう。広範な医薬上許容される酸付加塩が利用できる。これらとしては、有機酸および無機酸、好ましくは鉱酸から調製したものを包含する。その例として記載しうる典型的な酸としては、クエン酸、コハク酸、乳酸、塩酸および臭化水素酸を包含する。かかる生成物は、当業者によく知られている方法により容易に調製できる。
【０２５１】
本発明の該剤（および阻害剤）は、通常、注射または点滴用の非経口組成物として提供されよう。それらは、例えば、不活性油、適当にはゴマ、落花生またはオリーブ油のごとき植物油の中に懸濁できる。別法として、それらは、約ｐＨ５．６ないし７．４の水性の等張緩衝液に懸濁することもできる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸緩衝液を包含する。
【０２５２】
所望の等張圧は、塩化ナトリウムまたはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機溶質あるいは有機溶質のごとき他の医薬上許容される剤を用いて達成しうる。ナトリウムイオンを含有する緩衝液は、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【０２５３】
所望により、前記の組成物の溶液は、メチルセルロースのごとき増粘剤で増粘化させることもできる。それらは、油中水型または水中油型のいずれの乳化形態にて調製することができる。例えば、アカシア粉末、または硫酸アルカリポリエーテルアルコールもしくはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）のごときスルホネートを包含するいずれの広範な医薬上許容される乳化剤も用いることができる。
【０２５４】
本発明の治療的に有用な組成物は、一般的に認められている方法に従って該成分を混合することにより調製する。例えば、選択した成分を、ブレンダーまたは他の標準的な装置中にて単純に混合して、濃縮混合物を製造し、次いで、それを水または増粘剤を添加することにより最終濃度および粘度に調整したり、緩衝液を添加してｐＨをコントロールしたり、あるいは、さらなる溶質を添加して張度をコントロールすることができる。
【０２５５】
医薬用途としては、所望の機能を奏させるには、１回または複数回用量にて有効な剤の量を含有する単位投与形態で該組成物が提供されよう。当業者には認識されるであろうごとく、治療剤の有効量は、患者の年齢および体重、患者の身体状態、結果そうなる血糖レベル、および他の要因を包含する多くの要因で変化するであろう。
【０２５６】
投与
選択した剤、例えば、オリゴヌクレオチドまたはリボザイムは予防的に投与するか、あるいは、イオン導入、エレクトロポレーションまたはイオン対分子もしくは共有結合させた付加物、および他の薬理的に許容されたデリバリー方法を用いることにより、例えば、制御された放出ビヒクルであるリポソームのごとき適当なデリバリービヒクルの手段により、例えば、感染組織に外因的に剤をデリバリーすることにより、標的疾病に苦しむ患者に投与することができる。投与経路としては、筋肉内、エアロゾール、（錠剤または丸剤形態の）口腔、局所、全身、眼、腹膜内および／またはクモ膜下を包含する。リボザイムで免疫するための発現ベクターおよび／またはオリゴヌクレオチドのデリバリーも適当である。
【０２５７】
選択したいずれの剤の特定のデリバリー経路は、該剤の用途によるであろう。一般的に、各々の剤の特定のデリバリー・プログラムは、細胞内の局在化に関する裸の剤の取り込み、それに続く効力の証明に焦点が当てられるであろう。別法として、動物の器官または動物の組織の中のこれら同じ細胞へのデリバリーも追跡することができる。取り込み実験は、デリバリー担体またはデリバリー戦略にかかわりなく、例えば、細胞性オリゴヌクレオチドの取り込み、を評価する取り込みアッセイを包含するであろう。また、かかるアッセイは、取り込んだ後の該剤の細胞内局在化を評価し、究極的には、該標的配列（核および／または細胞質）を含有する細胞コンパートメント内の安定状態濃度の維持に対する要望を確立するであろう。次いで、効力および細胞毒性を試験できる。毒性は、細胞生存性のみならず細胞機能をも含有するであろう。
【０２５８】
例えば、オリゴヌクレオチドの用いうるいくつかのデリバリー方法は：
ａ．リポソーム中へのカプセル化、
ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入、
ｃ．コレステロールでの接合、
ｄ．ほとんどのｓｎＲＮＡに見い出される抗原結合部位を利用した核コンパートメントへの局在化、
ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いることによるオリゴヌクレオチド電荷の中和、および
ｆ．血液幹細胞を用いてオリゴヌクレオチドを全身を通して分布させることを包含する。
【０２５９】
本発明に有用なデリバリー戦略の少なくとも３つのタイプは：剤の修飾、粒子担体ドラッグデリバリービヒクルおよびレトロウイルス発現ベクターを含有する。非修飾は、ゆっくりとではあるが、細胞により取り込まれうる。細胞への取り込みを向上させるため、剤の電荷は減じうるが特定の官能基は残す方法により、該剤をランダムに本質的に修飾しうる。その結果、細胞膜を通過して拡散できる分子が得られ、かくして透過性の遮蔽物がなくなる。
【０２６０】
電荷を減じる剤の修飾は、これらの大きな分子の細胞への取り込みを向上させる１アプローチにすぎない。剤の活性を維持するために必要な構造要件は、当業者によりよく理解されている。細胞へのデリバリーを向上させる修飾を設計する場合にはこれらの要件を考慮する。また、該修飾は、酵素分解に対する感受性を減じるように設計される。これらの性質の双方は、該剤の効力を大いに改善させるものでなければならない。
【０２６１】
オリゴヌクレオチドのリン酸骨格の化学的な修飾は、該膜を通過しての自由な拡散を許容する負電荷を減じるであろう。この原理は、アンチセンスＤＮＡ技術に関して成功したことが立証されている。身体内においては、該修飾オリゴヌクレオチドを組織の細胞に拡散を駆動するためには、外部濃度の維持が必要であろう。発病組織を一時的に高濃度のオリゴヌクレオチドに暴露でき、全身的な吸着により徐々に放散させる投与経路が好ましい。オリゴヌクレオチドの循環半減期を高めるよう設計した薬物担体での静脈内投与を用いることができる。該薬物担体の大きさおよび組成は、血流からの迅速な消失を制限する。感染部位に蓄積するよう作製した担体は、該オリゴヌクレオチドを分解プロセスから保護できる。
【０２６２】
ドラッグデリバリービヒクルは、全身投与および局所投与の双方に有効である。それらは、徐放性貯蔵器として機能するよう、あるいは、それらの内容物を直接標的細胞にデリバリーするよう設計できる。直接デリバリーする薬物ビヒクルを用いる利点は、１回の取り込み当たりに複数の分子がデリバリーされる点である。かかるビヒクルが、他の方法では血流から迅速に消失するであろう薬物の循環半減期を向上させることが見い出された。この範疇に入るかかる特化されたドラッグデリバリービヒクルのいくつかの例としては、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体粘着性ミクロスフィアである。
【０２６３】
このデリバリー・システムの範疇からは、リポソームが好ましい。リポソームは、細胞内安定性を向上し、取り込み効率を向上し、生物活性を改善する。
【０２６４】
リポソームは、細胞膜を構成する脂質と同じ様式で配列した脂質より構成される中空の球形ベシクルである。それらは、水溶性化合物を捕捉する内部水性空間を有し、直径０．０５マイクロないし数ミクロンの範囲の大きさである。リポソームが細胞まで剤をデリバリーし、該剤が生物活性を維持していたことを、いくつかの研究が示している。
【０２６５】
例えば、元来は探査ツール「リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）」として設計されたリポソームデリバリービヒクルは、無傷のｍＲＮＡ分子を細胞にデリバリーし、相当する蛋白を生成させることが示されている。
【０２６６】
リポソームはいくつかの利点を供する：それらは、組成物において非毒性かつ生分解性であり；それらは、長い循環半減期を示し；また、組織を標的とするそれらの表面に、認識分子が容易に結合しうる。最終的に、リポソームを基礎とする医薬のコスト有効産業は、液体懸濁剤または凍結乾燥生成物のいずれかにおいて、許容できる薬物デリバリーシステムとしてのこの技術の実行可能性を立証した。
【０２６７】
ナノ粒子およびハイドロゲルのごとき他の制御放出ドラッグデリバリーシステムは、潜在的な剤のデリバリービヒクルたり得る。これらの担体は、化学療法剤および蛋白を基礎とする医薬物用に開発された。
【０２６８】
投与部位の局在した濃度が最小限の全身吸着となるため、剤の局所投与が有利である。これは、該剤の発病部位へのデリバリー戦略を単純なものとし、毒性の程度を減じる。さらに、適用する物質量が、他の投与経路に要するものよりはるかに少なくて済む。有効なデリバリーは、該剤が感染細胞内に拡散していくことを要する。該剤の負電荷または正電荷を中和する化学修飾が、浸透するのに要する全てとなり得る。しかしながら、電荷の中和が不十分な場合には、該修飾剤を、アゾン（Ａｚｏｎｅ）またはオレイン酸のごとき浸透向上剤とリポソーム中にて一緒に処方することができる。該リポソームは、該修飾剤および浸透向上剤がリポソームから該標的細胞中に移行する徐放性提示ビヒクル、あるいは、細胞性デリバリーを促進するのに、該修飾剤および浸透向上剤と直接関係しうるリポソームリン脂質のいずれかで表すことができる。いくつかの場合においては、徐放させるために、該剤および透過向上剤の両方を坐薬処方に処方化できる。
【０２６９】
また、剤は全身投与することもできる。全身吸収とは、血流中の剤の蓄積に続く身体全体を通しての分布を示す。全身吸収に導く投与経路としては；静脈内、皮下、腹膜内、鼻腔内、クモ膜下内および経眼を包含する。これら各々の投与経路は、該剤を近付きやすい発病組織または他の組織に暴露する。皮下投与は、リンパネットワークを通して循環系に伸びる局在したリンパ節に排出する。該循環への流入速度は、分子量または分子サイズの関数であることが示された。リポソームまたは他のドラッグ担体を使用して、該剤をリンパ節に局在させる。該剤を細胞内へ拡散するよう修飾したり、非修飾または修飾した剤を細胞にデリバリーするのに該リポソームを直接関係させることができる。
【０２７０】
最も好ましいデリバリー方法としては、リポソーム（１０−４００ｎｍ）、ハイドロゲル、放出が制御されたポリマー、マイクロインジェクションまたは（例えば、生体外治療のごとき）エレクロトポレーションおよび他の医薬上許容されるビヒクルを包含する。該用量は、疾病の標徴および投与経路によるであろうが、１０−２０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間とすべきである。治療期間は、疾病症状の過程を通して、通常少なくとも１４−１６日、恐らく連続して延長されよう。複数の日用量は、局所適用、眼（ｏｃｕｌａｒ）適用および膣適用では予測される。用量数は、疾病デリバリービヒクルおよび臨床的試行からの効率データによるであろう。
【０２７１】
該標的細胞内の剤の治療レベルの確立は、取り込みおよび分解の速度による。分解の程度を減じることは、該剤の細胞内半減期を延ばすことになろう。かくして、化学修飾剤、例えば、リン酸骨格を修飾したオリゴヌクレオチド、または該オリゴヌクレオチドの５’および３’末端をヌクレオチド・アナログでキャップするには異なった用量を要しうる。
【０２７２】
テロメラーゼ活性を調整し、テロメア長およびテロメラーゼ活性をモニターすることにより、増殖性疾病の治療を提供でき、新生組織細胞および／または細胞の増殖能をモニターでき、ここにおいて特定の細胞型の再生を研究することができることは、前記の結果から明らかである。特に細胞集団の平均値としてのテロメア長、または細胞集団のテロメラーゼ活性を測定できるアッセイが提供される。次いで、疾病診断、結果の予想、および特定の治療法を提供するのにこの情報を用いることができる。
【０２７３】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、各々の刊行物および特許出願を特別かつ個別に本明細書に明示したものとして出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０２７４】
理解を明瞭なものにする目的の図示および実施例の方法にて先行発明を詳細に記載したが、添付した請求の範囲の趣旨から逸脱することなく、ある種の変化および修飾を行いうることは、本発明の教示の見地から当業者には自明であろう。
【０２７５】
実施例１７：テロメア反復長を測定する別法
テロメア長を測定する別法が、該テロメア配列がＣに富んだ鎖中のグアニン残基を欠くという事実を明らかにする。未融解のゲノムＤＮＡを、Ｇに富んだ一本鎖化した突出部にアニーリングする配列ビオチニル−Ｘ−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡを含有するビオチン化オリゴヌクレオチドと混合し、続いてｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび放射能のｄＣＴＰの存在下にて、ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で伸長させる。次いで、該ＤＮＡをストレプトアビジンを被覆させた磁性ビーズと混合し、ＤＮＡ−ビオチン−ストレプトアビジン複合体を磁石で回収する。この手法によりテロメアが精製され、この段階で回収された放射能はテロメア数に比例する。次いで、該ＤＮＡを融解し、新しいＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡオリゴヌクレオチド、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよび放射能のｄＣＴＰでＤＮＡ合成を開始させる。この段階の間に取り込まれた放射能は、第一段階の間に測定した存在するテロメア数を補正した後のテロメア反復数（テロメア長）に比例する。次いで、予め測定した長さのテロメアから作成した標準曲線と比較することによって、この値を実際のテロメア長に変換できる。
【０２７６】
実施例１８：テロメア配列を単離する別法
大きなテロメアＤＮＡは以下のごとく精製する。配列が、ビオチニル−Ｘ−ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡであるビオチン化オリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡでのＤＮＡ合成を開始させる。このオリゴヌクレオチドがアニーリングできる唯一の配列はテロメア末端としての一本鎖化した塩基突出部であろう。今や、最初の１２ｂｐの重複で提供したものよりより安定な構造を有する伸長させたＤＮＡを、次いで、ストレプトアビジンを用いて回収する。大きなＤＮＡに関しては、該ＤＮＡをＮｏｔＩごとき稀にしか切断しない制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで、基準近くのアガロースブロックに共有結合させたストレプトアビジンのパルス−フィールド電気泳動に付すと、該ストレプトアビジンがビオチン化ＤＮＡに結合し、大きなゲノムＤＮＡのゲル中への移動を許容する一方でテロメアの移動を制限するであろう。次いで、テロメアＤＮＡを回収し、クローン化して特徴付ける。
【０２７７】
別法として、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて、剪断したＤＮＡから小さなテロメアＤＮＡ断片を回収する。以下の方法を用いてこれらの結果を得た：指針実験は、混合および分離工程の間に生じる剪断力により約２０ｋｂｐ長のＤＮＡ断片が得られることを示した。得られるサブテロメアＤＮＡ量を最大化とするために、Ｔ−抗原無限増殖細胞系（ＩＭＲ９０  ヒト肺フィブロブラスト由来のＩＤＨ４）からのものであって、ほんどテロメア反復がほとんどないＤＮＡ（短いＴＲＴ）をＤＮＡ源として用いた。５０μｇのＩＤＨ４  ＤＮＡを、１．２５ｐｍｏｌのビオチン化ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡプライマー、各々３３μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに２ＵのＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片とを最終容量１００μｌのベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）制限エンドヌクレアーゼ緩衝液Ａと混合し、３７℃にて３時間伸長させた。同量の（Ｇに富んだテロメア突出部にはアニーリングするはずのない）ビオチン化ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーを第２反応に陰性対照として添加した。次いで、５μｌのＭ−２８０ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（ダイナル・インコーポレイション社製（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．））を添加し、室温にて２時間静かに混合し、次いで、試験管の側壁に対して磁石を保持することによりビオチン化ＤＮＡ−ストレプトアビジン−ビーズ複合体を回収し、最初に０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および０．１％の牛血清アルブミンを含有する等張のセーラインで、次にＳａｕ３ａ制限酵素消化緩衝液で洗浄した。次いで、該ＤＮＡを２０μｌのＳａｕ３ａ消化緩衝液（ニュー・イングランド・バイオラボズ社製（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））に懸濁し、サブテロメアＤＮＡを遊離させるために、３ＵのＳａｕ３ａで消化してビーズに結合した末端の制限断片を得た。該ビーズ−ＴＲＦ複合体を磁石で除去し、サブテロメアＤＮＡを含有する上清を７０℃にて１時間加熱しＳａｕ３ａを不活化させた。該緩衝液を５ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＡＴＰに調整することにより、２５ｐｍｏｌアニーリングしたＰＣＲリンカーと１．５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃にて一晩インキュベートすることによってＰＣＲリンカーを該サブテロメアＤＮＡ断片に付加した。用いたＰＣＲリンカーの配列は：
OLM2: 5’TGGTACCGTCGAAAGCTTGACTG 3’
DMO1: 3’ATGAACTGACCTAG  5’
これらのリンカーは、アニーリングしたリンカーがＳａｕ３ａ親和性末端（５’ＧＡＴＣ３’）を有し、（リン酸化されていない）ＤＭＯ１の５’末端は結合しないまま残す一方でＯＬＭ２の３’末端はサブテロメアＤＮＡ断片に結合するよう設計されている。ＯＬＭ２およびＤＭＯ１の間の重複部位は、結合した混合物を７０℃にて２０分間加熱するとリガーゼが不活化しＤＭＯ１を解離するよう、約２４℃の融点を有する。次いで、結合混合物の半分を１００ｐｍｏｌのＯＬＭ２／１００μｌを唯一のプライマーとして有するＰＣＲ緩衝液に希釈した。７２℃×１分間、（該ＤＮＡを融解させる前にＯＬＭ２に相補的な配列を満たすために）８５℃×１分間の熱サイクルを３回行った後に、該ＤＮＡを２０サイクルの（９４℃×１分間、５５℃×１分間、７２℃×３分間の）ＰＣＲ増幅に付した。
【０２７８】
中期の染色体へのイン・サイチュー・ハイブリダイゼーションにより、該ＰＣＲ増幅させたサブテロメア・ライブラリーの純度を評価した。ジゴキシゲニン標識ＵＴＰの存在下にてライブラリーを増幅させることにより３つのプローブを調製した：ＰＣＲリンカーを鎖状化ＴＴＡＧＧＧオリゴヌクレオチドに結合させて、約１ｋｂｐの平均サイズのテロメア反復を含有する増幅混合物を生成させた陽性対照（「鎖状化ＧＴＲ」）；ビオチン化ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧプライマーで選択したＤＮＡの陰性対照（「ＧＴＲ−選択」）；および、ビオチン化ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡプライマーで選択した実験ライブラリー（「ＣＴＲ−選択」）。該スライド（ｓｌｉｄｅ）を異なったプローブにハイブリダイズさせ、抗−ジゴキシゲニンモノクローナル抗体、続いてアルカリホスファターゼ結合抗−マウス抗体で染色し、次いで、テロメア末端に対する内部部位におけるシグナルの存在につきコードしスコアを採った。分析を行った後にのみ、該コードが破壊された。その結果を表７に示す：
（表７）
サブテロメアＤＮＡのイン・サイチュー・ハイブリダイゼーション分析
（２実験）
プローブ        末端シグナル    内部シグナル        ％テロメア
鎖状化ＧＴＲ      １０４，４６      ２０，１９      ８１％，７１％
ＧＴＲ−選択        ２０，３２      ９０，９５      １８％，２５％
ＣＴＲ−選択        ７６，７９      ５７，２９      ５７％，７３％
次いで、該ＣＴＲ−選択ＰＣＲ増幅生成物をクローン化し、３７の個別のクローンを採り出し、イン・サイチュー・ハイブリダイゼーションにより分析した。これらのクローンのうち１０／３７（２７％）がテロメアシグナルを呈した。はるかに少数の画分の個々のクローンが、表７中のシグナル画分よりテロメリックである理由は、ＰＣＲ増幅物質の複雑さによるものである：実際のテロメアＤＮＡは、相対的に豊富であり、かくしてシグナルを呈しうる一方で、混入した内部配列は高度に発散しており、かくして混合物中の各々個々の配列が稀すぎてシグナルを呈せないのであろう。各々の４６本の染色体末端の２０ｋｂｐのＤＮＡは、ゲノムの約１／３０００を表す。クローン化したＣＴＲに富んだＤＮＡの約１／３のテロメア位置は、かくして、ビオチン化ＣＴＲを用いるとテロメアＤＮＡについて１０００倍に富んだものとなる。
【０２７９】
３つのクローンが複数のテロメアにハイブリダイズした一方で、７つのテロメアクローンが個々のテロメア上に指示された。１０のテロメアクローンの性質を表８に示し、クローンＣＳＩＴＵ６以外の全てからの部分ＤＮＡ配列を表９に示す。
【０２８０】
（表８）
サブテロメアクローンの性質
クローン        だいたいの大きさ  テロメアシグナル数
ＣＳＩＴＵ５        １．５Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ６        ０．５Ｋｂｐ        複数
ＣＳＩＴＵ９        ０．９Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ１３      ０．９Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ２２      ０．９Ｋｂｐ        複数
ＣＳＩＴＵ２４      ０．９Ｋｂｐ        複数
ＣＳＩＴＵ３３      ０．８Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ３７      ０．９Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ３８      ０．９Ｋｂｐ        単一
ＣＳＩＴＵ５１      １．５Ｋｂｐ        単一
（表９）
サブテロメア５ａクローンの配列
CSITU5  1 GATCTAGGCACAGCTGCTTCTCATTAGGCAGGTCTCAGCTAGAAGACCAC
51  TTCCCTCCCTGAGGAAGTCAACCCTTCTGCCACCCCATGGCCTTGCTTAA
101 TTTTCAGACTGTCGAATTGGAATCCTACCTCCATTAGCTACTAGCTTGGG
151 CAAGATACAGAGCCCTCCC
全塩基数：１６９
ＤＮＡ配列組成：３９Ａ；５４Ｃ；３３Ｇ；４３Ｔ；その他０
CSITU9  1 ATATATGCGCTACATAAATGTATCTAGATGCAATTATCTAGATACATATA
51  AGAAAGTATTTGAAGGCCTTCTACAAGGCTTAGTTATTATATTGGTTCAT
101 ACAAGTTCTTCTTCAG
全塩基数：１１６
ＤＮＡ配列組成：３９Ａ；１７Ｃ；１８Ｇ；４２Ｔ；その他０
CSITU13 1  ATCCTTCTCCGCAAACTAACAGGAACAGAAAACCAAACACTGCATGTTCT
51  CACATCATTGTGGGAGTTGAACAATGAGAACACATGGACACAGGGAGGGG
101 AACATCACACACTCGGGGTGTCAGCCGGGTGGGAGGGTAGAGGAGGAGAA
151 ATACCTAAGTTCCAGATGACAGGTTG
全塩基数：１７６
ＤＮＡ配列組成：５８Ａ；３７Ｃ；５０Ｇ；３１Ｔ；その他０
CSITU22 1  GATCTATGCTACCTCTAGGGATGGCACCATTCACAAGCACAAAGGAGATG
51  TCAGTGATTAAAAACACATGCTCTGGAGTCTGAGAGACTTTGAGACTTGC
101 TAGCTTGTGACTCTGCAGAGTTTAAGGTATCTGGACCCCTTTTTCCCTCA
151 TGTGCATAATGAAGAGATT
全塩基数：１６９
ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３５Ｃ；３９Ｇ；４８Ｔ；その他０
CSITU24 1  GATCAACACTGTTAGTTGAGTACCCACATCACAAACGTGATTCTCAGAAT
51  GCCTTCCTTCCTGTCTAGTTTCTATAGGTAGATATTTCCTTTTTCAGCAT
101 AGGCCTGAAAAGCCGCCTCCAAATGCCCGCCTTCCAGACACTATAAAAAG
151 AGGGTTCAAACCTACTCTATGAAAGGGAATGTTCAACACAGA
全塩基数：１９２
ＤＮＡ配列組成：５８Ａ；４９Ｃ；３３Ｇ；５２Ｔ；その他０
CSITU33 1  GATCTGTTTATTATTCTTCCAATATCTCCCCATCTCTTAAAAATTGGTTA
51  TTTCTTCGTTCATACATTTTTATCTCCCAAATTANNNNTGAGACTGGTTT
101 GAAGAGAGGAAAGCAATGTACACACTTTTATATTCCACCATGTATATCCG
151 GATATCC
全塩基数：１５７
ＤＮＡ配列組成：４３Ａ；３２Ｃ；１９Ｇ；５９Ｔ；その他４
CSITU37 1  AATCCTCCTACCTTAACCTCCCTTTGTTAGCCTGCCATTACAGGTGTGAG
51  CCACCATTGCTCATTCGTCCGTTTATTCATTCAACAAATCAATCGATCTA
101 TTACATGTGAGGGACTCTTCAGGTCATGGGAATTC
全塩基数：１３５
ＤＮＡ配列組成：３２Ａ；３７Ｃ；２２Ｇ；４４Ｔ；その他０
CSITU38 1  GATCACTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGGGTGACATGGCAAAAC
51  CCCATCTCTACCAAAAGAAAAAAANNNNACAAATTGGTGGTGTTGATGGT
101 CGGCGACCATTGATCCC
全塩基数：１１７
ＤＮＡ配列組成：３５Ａ；２７Ｃ；２８Ｇ；２３Ｔ；その他４
CSITU51 1  GATCAGGGAGGGGCCGAAAACTGGAGATGCAGGTGTGCTGTAAGACACTG
51  CAGAGAGGGCATTTACCTGCCCCATCATCCAGCACAGGAACAGCGACTGA
101 CAGCGCTCACCCACCCACCATCGCCAGTCACACTGGG
全塩基数：１３７
ＤＮＡ配列組成：３７Ａ；４２Ｃ；３９Ｇ；１９Ｔ；その他０
また、該ＣＴＲに富んだサブテロメアＰＣＲ増幅ライブラリーを用いてもｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。３２クローンが単離され、５クローンから部分配列が得られた。それらの配列を表１０に示す。
【０２８１】
これらのクローンのうち２つ、すなわち、ＰｈＣ４およびＰＨＣ５を、ノーザン・ブロッティングで特徴付けた。その双方は、約６．２および７．７Ｋｂの同じ２つのｍＲＮＡにハイブリダイスした。ＰＨＣ４およびＰＨＣ５の３’配列は異なるため、このことは、同一遺伝子の別のスプライシング生成物を表しうることを示唆している。双方のメッセージは、比較的長いテロメアを有するＰＤＬ３８ＩＭＲ９０細胞に豊富にあり、ＩＭＲ９０由来の（非常に短いテロメアを有する）無限増殖性ＩＤＨ４細胞には双方とも発現されていない。これは、サブテロメアＤＮＡに位置する遺伝子の発現がテロメア長により調節されているという仮説を支持する。このデータは、前記した工程がテロメアに隣接して位置する配列（そのいくつかはｍＲＮＡをコードしている）を得る手段を提供する証拠である。個々の染色体に独特のこれらの配列は、ゲノム・マッピングに有用であろう。異なったテロメア長を有し、細胞中で活性な遺伝子であって、該細胞中で分化中に発現するものは、テロメアの長さに関連した該細胞への伝達情報に重要な役割を担っているかもしれない。Ｍ１老化の開始を調節する遺伝子、ならびにテロメラーゼ活性を調節する遺伝子はこれらの手段により単離されうる。該テロメア遺伝子の機能は、若くて老化した無限増殖細胞中での過発現またはノック−アウトにより同定しうる。かかるｃＤＮＡ、アンチセンス分子、およびコードされている蛋白は、年齢関連性の疾病および癌のごとき増殖疾病の細胞増殖のそれらの調節に関して、重要な治療および診断価値を有し得る。
【０２８２】
（表１０）
サブテロメアｃＤＮＡクローンの部分配列
PHC4-5’末端
1 GGCTCGAGAACGGGAGGAGGGGGCTCTTGTATCAGGGCCCGTTGTCACAT
51  CTGCTCTCAGCTTGTTGAAAACTCATAATC
全塩基数：８０
ＤＮＡ配列組成：１７Ａ；１９Ｃ；２４Ｇ；２０Ｔ；その他０
PHC5-3’  末端
1 AGGTCCCTTGGTCGTGATCCGGGAAGGGGCCTGACGTTGCGGGAGATCGA
51  GTTTTCTGTGGGCTTGGGGAACCTCTCACGTTGCTGTGTCCTGGTGAGCA
101 GCCCGGACCAATAAACCTGCTTTTCTTAAAAGGAAAAAAAAAAAAAAAAA
151 AAAAAAA
全塩基数：１５７
ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３１Ｃ；４４Ｇ；３５Ｔ；その他０
PHC7  1 ATCTAGGTTTTTTAAAAAAGCTTTGAGAGGTAATTACTTGCATATGAGAG
51  AATAAAACATTTGGCACATTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
101 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
全塩基数：１２０
ＤＮＡ配列組成：７３Ａ；７Ｃ；１４Ｇ；２６Ｔ；その他０
PHC8  1 CTCATTTACTTTTCTCTTATAGCGTGGCTTTAAACATATATACATTTGTA
51  TATATGTATATATGAATATAATGTATAAAATGTATGTAGATGTATATACA
101 AAAAATAAACGAGATGGGTTAAAGATATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
全塩基数：１４９
ＤＮＡ配列組成：６９Ａ；１１Ｃ；１９Ｇ；５０Ｔ；その他０
PHC9  1 AGTCCCAGCTACTCGGGAGGGCTGAGGCAGGAGAATGGCGTGAACCCAGG
51  AGGCGAAGCTTGCAGTGAGCTGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGA
101 CGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
全塩基数：１６９
ＤＮＡ配列組成：４７Ａ；３５Ｃ；３９Ｇ；４８Ｔ；その他０
実施例２９：テロメラーゼの発現を抑制する因子の単離
不十分な数のテロメア反復が持続した細胞増殖性を支持するままでいる場合には、細胞老化のＭ２機構が起こる。該Ｍ２機構および不死化からの回避は、テロメラーゼ活性の誘導およびテロメア長の安定化と同時に起こり、かくしてＭ２機構の不活化が直接的または間接的にテロメラーゼの発現を抑制する。
【０２８３】
Ｍ２機構を調節する遺伝子は、レトロウイルス配列で釣り上げた。これを達成する方法は、最初にＳＶ４０  Ｔ−抗原をトランスフェクトしたヒト肺フィブロブラストのクローンがＭ２を回避し不死化となりうる（Ｔ−抗原がＭ１機構を遮断し、かくして、Ｍ２機構がこれらの細胞の不死化に対する唯一の残ったものである）頻度を測定することからなる。次いで、潜在的なＭ２遺伝子を挿入的に突然変異させるために、該前−危機（ｐｒｅ−ｃｒｉｓｉｓ）細胞を欠損レトロウイルスで感染させると、不死化の頻度はほぼ３倍に増加することが示された。最後に、異なって不死化された挿入的突然変異系のパルス−フィールド電気泳動を用いて、どの系が同一のＭ２遺伝子への挿入により不死化となったのかを同定する。今やＭ２機構遺伝子はレトロウイルス配列で釣り上げたため、当業者なら該特定遺伝子をクローン化でき同定できる。用いた方法は以下の通りであった：（例えば、Ｔ−抗原発現細胞の不死化頻度である）危機から回避する頻度は、本質的には以前に記載した（シェイ，ジェイ・ダブリュ（Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．）およびライト，ダブリュ・イイ（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｅ．）、（１９８９年）、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．）、第１８４巻、１０９−１１８頁）ごとき変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）解析の本質に基づいたアプローチを用いて算出する。（ＳＶ４０の大きなＴ抗原を発現するベクターでトランスフェクトしたＩＭＲ９０正常ヒト肺フィブロブラストから単離したクローンである）ＳＷ２６細胞を、危機の前に約１５ＰＤＬにて、６６６７細胞／ｃｍ-1の一定の細胞密度で複数のシリーズに拡げた。続いて、該実験の終了時に、不死細胞系を生じる各々のシリーズを特定しうるように、各々のシリーズを別々の培養として維持した。６６６７細胞／ｃｍ-1にて密集した時またはその丁度前に培養を分けた。一旦細胞が危機に達したら、それらを少なくとも毎３週間に一度は分割し、それを実質上生存細胞が残っていないか該培養が不死化するまで続けた。得られた細胞が少なすぎる場合には、全ての細胞を単一のデッシュ中の培養に戻した。１０００細胞を５０ｃｍ2のディッシュに植え、各サイクルにつき３週間の増殖を許容するサブ培養を２回行う間に、危機の後の急成長が起こった場合には、フィブロブラストを不死化したと判断した。
【０２８４】
ＳＷ２６細胞はおよそＰＤＬ８２−８５で危機に入る。（８×１０6細胞／バイアルの）ＳＷ２６細胞の膨大な数のバイアルをＰＤＬ７１にて凍結し、自然発生の不死化がまだ起きていないことを確認するテストを行った。５つのバイアルを解凍し、約１０8細胞に約４日間でスケールアップし（かくして、およそＰＤＬ７４）、次いで、トリプシン処理して、４０ｍｌの培地中の単一細胞プールに合わせて、２００の１０ｃｍ2デッシュに撤いた。３０のディシュを１日後に無血清培地中の２５μｇ／ｍｌの硫酸ブレオマイシン（化学突然変異剤）で２時間処理した。この濃度の硫酸ブレオマイシンでは、約５０％のＩＭＲ−９０  ＳＷ２６細胞が死滅するため、これらのディシュ残りとして２倍の細胞密度で平板培養した。
【０２８５】
該デッシュの残りを、対照（７０デッシュ）として用いるか、またはＬＮＬ６欠損レトロウイルスで感染させた（１００デッシュ）。以前に記載された方法（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびロスマン（Ｒｏｓｍａｎ）、１９８９年、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、９８０−９９０頁）に従って、ＬＭＬ６を両性充填系（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ
ｌｉｎｇ）ＰＡ３１７中で生成させた。ＰＡ３１７細胞に感染したＬＭＬ６からの培養上清を用いて、２μｇ／ｍｌのポリブレン存在下にて約５×１０5細胞を含有する１００デッシュを感染させた。ポリブレンを含有する非感染のＰＡ３１７細胞からの対照培養上清を用いて７０デッシュを処理し対照として供した。感染後数日以内に、全ての対照および実験デッシュを計数すると、各々のデッシュは１−２×１０6細胞を含有していた。各々のデッシュのＰＤＬを算出し、次いで、細胞を５０ｃｍ2デッシュ中に０．３３×１０6にて置換し、変動解析を行うため別々に維持した。
【０２８６】
ブレオマイシン処理したＳＷ２６細胞は、自然発生率（４．７×１０-7）に比して約２倍も高い頻度（７．７×１０-7）で危機を回避した。非感染充填系からの培養上清で同時にｍｏｃｋ−感染した対照シリーズの比率によりも２−３倍も高い頻度（１０．９×１０-7）で危機から回避できる挿入突然変異を生成させるために、前−危機のＳＷ２６細胞を欠損したレトロウイルスＬＮＬ６で感染させた。
【０２８７】
（表１１）
硫酸ブレオマイシン暴露およびレトロウイルス感染は不死化を増加させる
添加物                    不死化          頻度
Ｎｉｌ                    １０／６８    ４．４×１０-7
硫酸ブレオマインシ          ７／２７    ７．７×１０-7
ＬＮＬ６レトロウイルス    ３６／９９  １０．９×１０-7
不死化は、培養シリーズ数当たりの不死化系の数で示し、各々のシリーズは実験初期の単一のデッシュ由来である。頻度は、（細胞分裂当たりではなく）各継代にて平板培養した細胞数に基づいて不死化細胞系が得られる確率として示す。
【０２８８】
ＬＮＬ６での挿入突然変異に従い得た３６の独立細胞系のうち２３からＤＮＡを単離し、サザーン・ブロッティングで分析したところ、残りのほとんどが単一の挿入を含有していた一方でこれらの７（３０％）はレトロウイルス配列を含有していなかった。レトロウイルス挿入を持たないものは自然発生の不死化現象を表すはずであったと仮定すれば、永続性の頻度が実際に２−３倍も上昇している場合には、レトロウイルス挿入を有する残りのほとんどのクローンは挿入突然変異に起因するにちがいない。１２の系からのＤＮＡを、稀にしか切断しない酵素Ｓｆｉ１で消化し、続いてパルス−フィールド電気泳動に付し、ナイロン膜に移してレトロウイルスＬＴＲで探査する。１２の系のうち６は、レトロウイルスＬＴＲにハイブリダイズする約３５０Ｋｂｐの共通のバンドを含有していた。これらの６のうちの４についても、ＢａｍＨ１消化により分析したところ、これらの４のうちの３も約２０Ｋｂｐの共通のバンドを含有していた。レトロウイルスが６Ｋｂｐ長であるとすれば、これは、ＤＭＮＡの１４Ｋｂｐ領域内にレトロウイルスが複数回数挿入されたことを強く示唆し、このことは単一の遺伝子であることを強く示唆している。レトロウイルス内で切断するＥｃｏＲ１で消化すると、各々の系で異なった大きさの断片が得られ、それらに異なった挿入があったことを表し、真に独立した単離物であることが明確にされる。レトロウイルス配列を用いて挿入部位につながったゲノムＤＮＡをクローン化することで、今やＭ２機構に関与する遺伝子を積極的に同定できる。（例えば、アンチセンス技術を用いて）その遺伝子の機能を妨害することにより、テロメラーゼが脱抑制され、正常ヒト細胞の寿命を延ばすこととなるであろう。また、この遺伝子が、種々の癌細胞中で突然変異したものであり、かくして癌において優れた診断価値および治療価値がありそうであることが判明するにちがいない。
【０２８９】
実施例２０：霊長類におけるテロメラーゼ活性の組織分布１２歳の健康なオスのレーサス・マカークザル（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ）からＳ１００抽出物を調製して、テロメラーゼ活性の組織分布を検討した。豊富なテロメラーゼ活性は、精巣からのみ検出された。脳、腎臓および肝臓からの組織試料では、活性を検出できなかった。このことは、癌の治療療法としてのテロメラーゼ阻害が、生殖系を除く通常の組織には豊富にないという独特の利点を有することを示している。従って、テロメラーゼ阻害剤は、出生欠陥の機会を減じるため、生殖年齢の個体の生殖系細胞から離れて標的とするものでなければならない。かかる標的化は、該腫瘍部位近くに有効な剤を局所注射または局所放出させることにより達成しうる。オスにおける該テロメラーゼ阻害剤の効果は、精子中のテロメア反復長を測定することにより容易に評価しうる。
【図面の簡単な説明】
【０２９０】
【図１】図１は、細胞型および／または培養条件を変更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とをプロットしたグラフである。
【図２】図２は、細胞型および／または培養条件を変更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とをプロットしたグラフである。
【図３】図３は、細胞型および／または培養条件を変更し、培養長の日数（水平軸）と細胞数（垂直軸）とをプロットしたグラフである。
【図４】図４は、平均末端制限断片（ＴＲＦ）の長さと、ヒト臍静脈内皮細胞培養についてのＰＤＬとの直線プロットである。該プロットは、−１９０±１０ｂｐ／ＰＤ、ｒ＝−０．９８、Ｐ＝０．０１の傾き（ｍ）を有する。
【図５】図５は、供与者の年齢の関数としての、ヒト腸骨動脈および腸骨静脈からの内皮細胞培養の平均ＴＲＦのプロットである。腸骨動脈についてのパラメーターは：ｍ＝−１０２  ｂｐ／ｙｒ、ｒ＝−０．９８、Ｐ＝０．０１であって、腸骨静脈については：ｍ＝−４２  ｂｐ／ｙｒ、ｒ＝−０．７１、Ｐ＝０．１４である。
【図６】図６は、供与者の年齢の関数としての、大動脈弓、腹大動脈、腸骨動脈および腸骨静脈からの内側組織の平均ＴＲＦの減少のプロットである。直線プロットについてのパラメーターは：ｍ＝−４７  ｂｐ／ｙｒ、ｒ＝−０．８５、Ｐ＝０．０５である。
【図７】図７は、供与者の年齢の関数としてプロットしたＰＢＬからの平均ＴＲＦ長のプロットである。直線回帰線の傾き（−４１±２．６  ｂｐ／ｙ）は０とは有意に異なる（ｐ＜０．００００５）。
【図８】図８は、ダウン症候群（ＤＳ）患者において促進されたテロメア喪失を示すプロットである。ＤＳ患者のＰＢＬから単離したゲノミックＤＮＡを図７に記載したごとくに分析した。平均ＴＲＦ長は、ＤＳ患者（中空き四角の記号）および年齢を合致させた対照（塗り潰した四角の記号）につき、供与者の年齢の関数として示す。直線回帰線の傾き（−１３３±１５  ｂｐ／ｙ、トリソミー、ｖｓ−４３±７．７、通常）は有意に異なる（ｐ＜０．０００５）。
【図９】図９は、（２の正常な個体からのＤＮＡについて示した）集団倍加の関数としての、培養したＴ−リンパ球における平均ＴＲＦ長の減少を示すプロットである。これらの細胞の供与者年齢は入手できなかった。これらの線の傾き（−８０±１９（°）および−１０２±５．４（０）ｂｐ／倍加）はゼロから有意に異なる（ｐ＜０．０００１）。複数継代が利用できなかった第３の供与体からの最後の継代における平均ＴＲＦ長も示す（上下反対のＶ−記号）。
【図１０】図１０は、卵巣肉腫および対照の正常細胞のＴＲＦ長を示すオートラジオグラムのコピーである。２の患者からの腹水中の細胞からのＤＮＡ（ｃａｓおよびｗａｄ）をＨｉｎｄｆＩおよびＲｓａＩで消化し、電気泳動によって分離し、テロメリック・プローブ32Ｐ（ＣＣＣＴＡＡ）3にハイブリダイズさせ、厳密に洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた。７の他の患者からの腹水の細胞を、接着性の通常細胞（Ｎ）に分離し、腫瘍を培地に集めた（Ｔ）。該ＤＮＡを抽出し、前記したごとくに泳動させた。患者からのＤＮＡは第１および第４穿開から得た。患者からの腫瘍細胞を培養し、ＤＮＡは関係する集団倍加（ｐｄ）から得た。
【図１１】図１１は卵巣肉腫細胞におけるテロメラーゼ活性を示す。前に実験した形質転換体細胞系２９３ＣＳＨ、腫瘍細胞系ＨＥＹ、精製した腫瘍細胞集団および患者の腹水からの直接の細胞からのＳ１００抽出物を、ｄＡＴＰおよびＴＴＰ、32ＰｄＧＴＰおよび緩衝液の存在下、テロメアプライマー（ＴＴＡＧＧＧ）3と共にインキュベートした。反応生成物を配列決定用ゲルで分離し、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒスクリーンにさらした。単一（１）または２の反応（２）をテストした。
【図１２】図１２は、延長された寿命（ＰＤ６８）に対するＨＭＥ−３１細胞およびＨＥＭ３１−Ｅ６細胞におけるＴＲＦ長を示すオートラジオグラフィー、および続いての不死化およびテロメア長の安定化のコピーである（ＰＤ８１、１０７）。
【図１３】図１３は、ＨＭＥ３１：Ｅ６細胞の老化の間におけるテロメア長に対するＣＴＯの効果を示すオートラジオグラムのコピーである。中間の時点を選択してＣＴＯオリゴヌクレオチドの用量依存性保護効果を示す。
【図１４】図１４は、該ＣＴＯオリゴヌクレオチドに応答するＩＭＲ９０肺腺維芽細胞の寿命の延長を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＩＤＨ４細胞のテロメア長に対するＧＴＯの効果を示すオートラジオグラムのコピーである。
【図１６】図１６は、ＩＤＨ４細胞のテロメア長に対するＧＴＯの効果を示すオートラジオグラムのコピーである。
【図１７】図１７は、該ＣＴＯオリゴヌクレオチドに応答するＨＭＥ３１：Ｅ６ヒト胸内皮細胞の寿命の延長を示すグラフである。
【図１８】図１８は、テロメラーゼＲＮＡ鋳型およびその上の主要な鎖終止の位置を示す。図１８Ａは、残基にその下に１（５’）から９（３’）の番号を付した、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）テロメラーゼＲＮＡの鋳型部分を示す。配列Ｔ2Ｇ4Ｔ2Ｇ4を持つオリゴヌクレオチドプライマーは示した塩基対合によって鋳型に結合する。エロンゲーション、続いての鋳型トランスロケーションは示したように起こると考えられる。図１８Ｂは、異なるヌクレオシド三リン酸アナログによるテロメラーゼＲＮＡ鋳型上の主要な鎖終止の位置を示す。テロメラーゼＲＮＡ鋳型配列は図１８Ａに示す。矢印は、示した各ヌクレオシド三リン酸（該ヌクレオシド由来）についての最大鎖終止の位置を示す。
【図１９】図１９は、ヌクレオシドアナログ三リン酸がテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）テロメラーゼアッセイにおける32Ｐ標識の取り込みを阻害することを示すグラフである。該アナログ、非標識ｄＧＴＰまたは非標識ＴＴＰの添加濃度を順次増加させたときの、標識ヌクレオチドの取り込みに対する影響を、定量的テロメア反応アッセイを用いて測定した。取り込まれた放射能（ｃｐｍ）を各パネルに示した競合物質の濃度に対してプロットした。（Ａ．〔α−32Ｐ〕ＴＴＰで標識  Ｂ−Ｆ、〔α−32Ｐ〕ｄＧＴＰで標識  Ｆ．ストレプトマイシン硫酸塩のテロメラーゼ反応に対する効果。４０ｍＭ硫酸ナトリウムの存在下における取り込みをストレプトマイシン硫酸塩についての対照として示す）。
【図２０】図２０はヌクレオシド三リン酸アナログが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてのテロメラーゼのパターンおよび進行度を中止させることに対する効果を示す。特に、図２０Ａは、示したヌクレオシド三リン酸アナログの存在下および不存在下におけるテロメラーゼ反応を示す。また、反応ミックス中にプライマー有りと無しの場合において、非標識ＴＴＰ競合物質を対照として分析した。次いで、生成物を変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。図２０Ｂは、標準テロメラーゼ反応は、ｄｄＧＴＰ（レーン４〜６）、ｄｄＩＴＰ（レーン７〜９）、またはＤＭＳＯ（レーン１）の存在下で行ったことを示す。ＤＭＳＯはｄｄＧＴＰについての溶媒であり、テストした最大濃度（１％）において、アナログまたはＤＭＳＯ無しでの対照反応泳動と比較して反応に影響を示さなかった（対照レーン２〜３）、生成物を変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【図２１】図２１は、ニック−トランスレーションを行った、３’ｒＤＮＡ断片をプローブとして含有する〔α−32Ｐ〕標識プラスミドを用い、テロメア長に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレオシドアナログの影響を示すためのサザーンブロット分析を示す。ゲノミックＤＮＡをＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、該ｒＤＮＡテロメアを分析した。該ｒＤＮＡからのテロメリックＰｓｔＩ断片は１．６および１．０ｋｂのマーカーの間にあり、各パネルの両側に線として示す。一定の２．８ｋｂバンドは隣接する内部ＰｓｔＩ  ｒＤＮＡ断片である。特に、図２１Ａは、５ｍＭ  ＡＺＴの不存在下（−）、２％ＰＰＹＳ中で増殖させたテトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のクローン、および５ｍＭ  ＡＺＴの存在下（＋）での３のクローンについての結果を示す。３つのレーンの各セットは、３日（レーン１、４、７、１０）、１０日（レーン２、５、８、１１）および１６日（レーン３、６、９、１２）後に栄養的に増殖させ、移した単一の細胞クローンについての結果を示す。図２１Ｂは、ＡＺＴの異なる濃度における増殖の結果、チミン欠乏ブロス（Ｉｓｏｂｒｏｔｈ）＋ＡＺＴで増殖させた対数相細胞においてテロメアの濃度依存性短縮となることを示す。６、１０および１６日にサンプリングした細胞から作製したＤＮＡは、短縮されたテロメア長は、培養中６および１６日の間、一定であることを示す。レーン１、５、９  ０ｍＭ  ＡＺＴ対照；レーン２、６、１０  ０．０１ｍＭ  ＡＺＴ；レーン３、７、１１  ０．１ｍＭ  ＡＺＴ；レーン４、８、１２１ｍＭ  ＡＺＴ。図２１Ｃは、培養中、１４および２７日において、添加無し（レーン１）、１％ＤＭＳＯ（Ａｒａ−Ｇ用溶媒）添加、（「Ｃ」、レーン２および５）、およびＡｒａ−Ｇ（レーン３  １ｍＭ；レーン４および６  ２ｍＭ）添加にて、２％ＰＰＹＳ中で栄養的に増殖させた細胞を示す。図２１Ｄは、増殖速度：「遅い」（「Ｓ」、１日当たり０〜１倍加、レーン２）または「速い」（「Ｆ」、１日当たり２〜４倍加、レーン３）に基づいて２つのクラスに分けた。Ｉｓｏｂｒｏｔｈ＋１ｍＭ  ＡＺＴ（レーン２および３）で増殖させた単一細胞培養からのＤＮＡの分析を示す。ＡＺＴの不存在下で増殖させた対照培養からのＤＮＡを示す（「Ｃ」、１日当たり２〜４倍加、レーン１）。分析用に十分なＤＮＡを得るためにいくつかの培養をプールした。
【図２２】図２２は、アナログの存在下で連結させ、接合の間飢餓としたテトラヒメナ細胞からのＤＮＡのＰＣＲ分析を示す。テロメリックプライマーおよび５’ｒＤＮＡプライマーを、アナログの存在下または不存在下で連結させた細胞からのＤＮＡと共にＰＣＲ反応で用いて、大核発生の間に形成された１１ｋｂ  ｒＤＮＡへのテロメアの付加を検出した。対照としてＤＮＡ無しで反応を行った。テストは、５ｍＭ  ＡＺＴ；１ｍＭ  Ａｒａ−Ｇ、および１ｍＭ  Ａｃｙｃｌｏ−Ｇの使用を含むものであった。また、ＳＢ２１０細胞を対照として模擬連結させた。予期された生成物はほぼ１４００ｂｐである。加えて、３’小核ｒＤＮＡプライマーを同ＤＮＡで用いて、ＰＣＲ用のＤＮＡ試料の存在およびコンピテンスを証明した。予期されたバンドは８１０ｋｂｐである。図面において、ランダム起点とした32Ｐ−標識５’ｒＤＮＡプローブを用いる５’ｒＤＮＡテロメリックＰＣＲ反応のサザーンブロット分析により、大核発生の間に一時的に形成された１１ｋｂ  ｒＤＮＡ種からの、テロメアを持つ５’ｒＤＮＡの部分としての１４００ｂｐ  ＰＣＲ生成物が確認された。該ＤＮＡ対照において（レーン１）、あるいはＳＢ２１０模擬連結対照（レーン６）においてハイブリダイゼーションが観察されなかった。レーン２、アナログ無添加；レーン３  ５ｍＭ  ＡＺＴ、レーン４  １ｍＭ  Ａｒａ−Ｇ；レーン５  １ｍＭ  Ａｃｙｃｌｏ−Ｇ；レーン６  模擬連結ＳＢ２１０細胞ＤＮＡ。これらの結果は、３つの別の実験で再現された。
【図２３】図２３は、ＲＰＭＩ培地、薬剤無添加にて（対照）および比較的低用量のｄｄＧ、ＡＺＴ、ａｒａ−Ｇ、およびｄｄＩにて培養したＪＹリンパ腫細胞の増殖を示す。該ＤＭＳＯはｄｄＧ用の対照である。
【図２４】図２４は、図２３と同様にして培養したが、比較的高用量の潜在的なテロメラーゼ阻害剤で処理した培養ＪＹリンパ腫細胞の増殖を示す。
【図２５】図２５は、テロメリック反復配列（ＴＴＡＧＧＧ）3でプローブをした第１週および第３週におけるＪＹリンパ腫細胞から単離したＤＮＡのサザーンプロットを示す。最初のレーンは実験の開始時における細胞からのＤＮＡであって、３番目は示した時間についてのＡＺＴで処理した細胞である。
【図２６】図２６は、サザーンブロットによって該テロメリック（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブにハイブリダイズした腺維芽細胞ＤＮＡを示す。「ＨｉｎｆＩ」の記号を付したレーンは制限酵素ＨｉｎｆＩで消化したＤＮＡであり、「Ｏ」の記号を付したレーンは処理を受けていないものであり、「Ｐのみ」の記号を付したレーンはピペリジンで処理したものであり、「Ｐ＋ＤＭＳ」の記号を付したレーンはピペリジンおよびジメチル硫酸で処理したものである。
【図２７】図２７は、３つの別々の実験において、種々の用量の薬剤ｄｄＧによって達成されたヒト・テロメラーゼの阻害を示す。該テロメラーゼは腫瘍細胞系２９３に由来するものであった。
【図２８】図２８は、種々の他のカンジタ種のゲノミックＤＮＡへの、シイ・アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）のテロメリック反復のハイブリダイゼーションを示す。酵母の８の種のゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロース上で電気泳動に付し、ブロットを行い、次いで、シイ・アルビカンスＷＯ−１からの32Ｐ−標識テロメリック断片でプローブした。ハイブリダイゼーションは５５℃で行い、洗浄は２００ｍＭ  Ｎａ+および２％ＳＤＳにおけるＮａ2ＨＰＯ4中にて同温におけるものであった。キロ塩基対（ｋｂ）で測定したＤＮＡサイズマーカーは右に示す。用いた種はシイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シイ・シュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シイ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、シイ・マルトサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、シイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、およびシイ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）である。星印は、テロメアがそれからクローン化された特定の株を示す。「Ｂ」で始まる株はビイ・ウィッケス（Ｂ．Ｗｉｃｋｅｓ）から得られたＮ．Ｉ．Ｈ．株である。
【図２９】図２９は、ケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ３２１４３（左パネル）およびシイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）Ｂ−３１６３（右パネル）におけるタンデム反復のゲノミックコピーのＢａ１３１の感度を示す。未切断酵母ゲノミックＤＮＡを時間を増大させてＢａ１３１ヌクレアーゼと共にインキュベートし（各レーンにおいて分で表す）、次いで、ＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動に付し、ナイロン膜にブロットした。ケイ・ラクチスについては、図３０に示したケイ・ラクチスのテロメリック反復と配列が同一の32Ｐ−キナーゼ処理した２５塩基のオリゴヌクレオチドでプロービングを行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は４９℃で行った。シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）については、32Ｐ−標識ｐＣｇｕｉ３、シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）からのα−２  ｋｂテロメリッククローンを担持するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ（ＬａＪｏｌｌａ）、カリフォルニア州）でプロービングを行った。ハイブリダイゼーションおよび（２００ｍＭ  Ｎａ+中での）洗浄は５４℃で行った。ほとんどのバンドは１分の地点までは進行するほぼ３つの他のバンドは順次短くなっているが、３分においては進行しない。これらの後者のバンドは、推定すると、ｐＣｇｕｉ３に存在する特定のサブテロメリック配列に相同である。ＤＮＡサイズマーカー（ｋｂ）は各パネルの右に示す。
【図３０】図３０は、いくつかの出芽酵母種からのテロメリック反復の配列を示す。特に、テロメアが豊富なライブラリーは標準的な方法によってゲノミックＤＮＡから構築した。未切断酵母のゲノミックＤＮＡを平滑末端直線化プラスミドベクターに結び、次いで、この結んだミックスを、ベクターのポリリンカー内および問題とする種の推定テロメリック端部の少なくともいくつかにおける数キロ塩基内で共に切断する制限酵素で消化した。最初の連結に先立ち、ゲノミックＤＮＡにおいてテロメアの平滑末端を生じさせるために酵素による予備処理は行わなかった。次いで、プラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼで再環化し、コロニーハイブリダイゼーションによって推定テロメアクローンについてのスクリーニングに先立ってイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。シイ・マルトサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、シイ・シュードトロピカリス（Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、２つの株シイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ３２１４３（これらは、シイ・アルビカンスのテロメリック反復プローブへクロスハイブリダイズした多重バンドを示した種である）からのライブラリーをこのプローブでスクリーニングした。クローン化エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）テロメアプローブ（反復単位ＴＧ2-3（ＧＴ）1-3）を用いて、そのゲノミックＤＮＡがこれとクロスハイブリダイズしたがシイ・アルビカンスのテロメリック反復プローブとはクロスハイブリダイズしなかった、該テロメアが豊富なシイ・グラブラダ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）からのライブラリーをスクリーニングした。シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＤＮＡは、テストしたストリンジェンシィにおいて、シイ・アルビカンスまたはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）テロメックプローブいずれともクロスハイブリダイズが認められなかった。該テロメアが豊富なこの種からのライブラリーを、全ゲノミック・シイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）ＤＮＡをプローブとして用いてスクリーニングした。この手法は反復的配列を含有するすべてのクローンを同定するのに用いることができ、本発明者らは、テロメアは、テロメア豊富ライブラリーで見い出された反復的配列の合理的パーセントであるべきであると理由付けした。典型的には、数百のイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体が各小さなライブラリーにつき得られ、９つまでの推定テロメアクローンが各々から得られた。９の反復的ＤＮＡクローンがシイ・ギレルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ）から得られ、そのうち３つのテロメリックであることが判明した。
【図３１】図３１は、ある種のシイ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）株に存在するテロメリック反復の２つのタイプを示す。１０（ここでは５つのみ示す）のシイ・トロピカリス株およびシイ・アルビカンスＷＯ−１からのゲノミックＤＮＡをＣｌａＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動に付し、ブロットし、シイ・トロピカリスのテロメリック反復（左パネル）からの「ＡＣ」形態または反復からの「ＡＡ」形態いずれかに対して特異的なオリゴヌクレオチドでプローブした。これらの２つのオリゴヌクレオチドの配列は：５’ＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＣＧ（「ＡＣ」）および５’ＧＴＧＴＡＡＧＧＡＴＧ（「ＡＡ」）であり、下線で示したのは二形態性塩基の位置である。キナーゼ処理した「ＡＣ」プローブでのハイブリダイゼーションは４７℃におけるものであり、「ＡＡ」プローブでのハイブリダイゼーションは２４℃におけるものであった。両者についての洗浄は５００ｍＭ  Ｎａ+を含む２％ＳＤＳにおけるものであった。「ＡＡ」プローブの特異性は、ただ１つのみミスマッチがあり、用いたシイ・アルビカンス細胞はシイ・トロピカリス株よりもかなり長いテロメアを有し（従って、多くのテロメリック反復を有する）という事実にも拘わらず、シイ・アルビカンスのテロメアとハイブリダイズしないことによって示される。シイ・トロピカリスのテロメアの短いことは、個々のテロメリックバンドが比較的鋭いことによって示唆されるごとく、それがサイズが特に均一のようであることによって説明されよう。
【図３２】図３２は、（ＴＴＡＧＧＧ）3プローブにハイブリダイズしたＪＹ細胞から単離したＤＮＡのサザーンブロットを示す。細胞を、０．０１％ＤＭＳＯ中の１０μＭ  ｄｄＧまたは０．０１％ＤＭＳＯのみを含む培地のいずれかで１０週間にわたって処理した。ｄｄＧで処理した細胞は、テロメラーゼ活性の阻害と矛盾しない平均テロメア長の顕著な減少を示した。
【図３３】図３３は、腹水からの細胞におけるテロメラーゼ活性を示す。特に、Ｓ１００抽出物を調製し、蛋白濃度を測定し、緩衝液、テロメアプライマー（ＴＴＡＧＧＧ）3、α32ＰｄＧＴＰ、ＴＴＰおよびｄＡＴＰを含有する等容量の反応混合物と共に３０℃で１時間インキュベートすることによってテロメラーゼ活性を検定した。反応はＲＮａｓｅで終了させ、プロテイキナーゼＫで脱蛋白した。取り込まれなかったα32ＰｄＧＴＰは、供給業者の指示に従い、ＮＩＣＫ  ＳＰＩＮカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて除去した。生成物は配列決定ゲルで分割し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーン（モレキュラー・ダイナミックス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｍａｎｉｃｓ））に暴露した。ラダー（Ｌ）およびキナーゼ処理した５’32Ｐ（ＴＴＡＧＧＧ）3（Ｏ）をマーカーとして泳動させた。図３３Ａは、対照ヒト細胞系２９３ＣＳＨ、２９３細胞系のサブ系、および患者Ｄｅｍ−１およびＲｕｄ−１からの未分画腹水細胞から調製した同等の蛋白濃度（〜１１ｍｇ／ｍｌ）でのＳ１００抽出物でアッセイしたテロメラーゼを示す。レーン１において３および５のＲＮＡｓｅを、α32ＰｄＧＴＰの添加に先立って抽出物に加えた。図３３Ｂは、単離し、２９３細胞と比較した患者Ｐｒｅｓ−３およびＮａｇ−１からの細胞の早期継代培養からのテロメラーゼ活性につき検定したＳ１００抽出物を示す。すべての抽出物は〜２−３ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度でアッセイした。  （配列表）＜１１０＞  マイケル、ディイ・ウェスト（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄ．Ｗｅｓｔ），ジェリー、ダブリュ・シェイ（Ｊｅｒｒｙ  Ｗ．Ｓｈａｙ），ウッドリング、イイ・ライト（Ｗｏｏｄｒｉｎｇ  Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔ）＜１２０＞  テロメア長および／またはテロメラーゼ活性に関連する治療および診断＜１３０＞＜１５０＞  ＵＳ０７／８８２４３８＜１５１＞  １９９２．５．１３＜１５０＞  ＵＳ０８／０３８７６６＜１５１＞  １９９３．４．２４＜１６０＞  ７＜２１０＞  １＜２１１＞  ６０＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  １TTAGGGTTAG  GGTTAGGGTT  AGGGTTAGGG  TTAGGGTTAG  GGTTAGGGTT  50AGGGTTAGGG  60＜２１０＞  ２＜２１１＞  １２＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ２CCCTAACCCT  AA  12＜２１０＞  ３＜２１１＞  １２＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ３TTAGGGTTAG  GG  12＜２１０＞  ４＜２１１＞  １８＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ４CCCTAACCCT  AACCCTAA  18＜２１０＞  ５＜２１１＞  １８＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ５TTAGGGTTAG  GGTTAGGG  18＜２１０＞  ６＜２１１＞  ２４＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ６CCCTAACCCT  AACCCTAACC  CTAA  24＜２１０＞  ７＜２１１＞  １２＜２１２＞  ＤＮＡ＜２１３＞  Artificial  Sequence＜４００＞  ７CCCTAACCCT  AA  12
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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