(57)【要約】      （修正有）【課題】  糖尿病性腎症、蛋白尿、糸球体クリアランス障害、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される１またはそれ以上の疾患の治療およびアマドリ後の最終糖化産物（ＡＧＥ）形成を阻害する薬剤を提供する。【解決手段】  ピリドキサミンを包含する薬剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性腎症、蛋白尿、糸球体クリアランス障害、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される１またはそれ以上の疾患を治療するための、ピリドキサミンを包含する薬剤。
【請求項２】
疾患が糖尿病性腎症である、請求項１の薬剤。
【請求項３】
疾患が蛋白尿である、請求項１の薬剤。
【請求項４】
疾患が糸球体クリアランス障害である、請求項１の薬剤。
【請求項５】
疾患が糖尿病性網膜症である、請求項１の薬剤。
【請求項６】
アマドリ後の最終糖化産物（ＡＧＥ）形成を阻害するための、ピリドキサミンを包含する薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本題は、１９９５年９月１２日付けで出願された米国仮特許願第６０／００３，２６８号の優先権を主張するものである。なおこの仮特許出願の内容はすべて本題に採用するものである。
【０００２】
政府の権利に関する陳述
政府の権利に関する陳述 本題に開示された成果のいくらかは、ＮＩＨの助成金ＤＮ４３５０７号で一部援助されているので米国政府は本発明に特定の権利をもっている。
【０００３】
発明の背景
本発明は、最終糖化産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＡＧＥ）、その生成、検出、固定、阻害およびそのインヒビターの技術分野の発明である。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質の老化と最終糖化産物
グルコースなどの還元糖による非酵素的グリケーションは、多様な病状に関与していることが分かってきているタンパク質の重要な翻訳後の修飾反応である。グルコースが誘発する緩慢なプロセスによる不可逆の非酵素的グリケーションと架橋反応は、糖尿病に付随する多数の合併症を仲介する。糖尿病に付随する慢性高血糖症は、慢性の組織損傷を起こして、網膜症、腎障害およびアテローム性動脈硬化症などの合併症をもたらすことがある（ＣｏｈｅｎおよびＺｉｙａｄｅｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，７巻、１８３〜１９０頁、１９９６年）。長期間の真性糖尿病に付随して起こる慢性の組織損傷は、一部は、非酵素的グリコシレーションによって最終糖化産物（ＡＧＥ）が生成した長命の構造タンパク質に結合した免疫グロブリンおよび／または抗原が蓄積することによって、その場で免疫複合体が生成することが原因で起こる（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８巻、１７３９〜１７４４頁、１９８３年）。その主要なタンパク質の標的は細胞外マトリックス結合コラーゲンであると考えられる。タンパク質、脂質および核酸の非酵素的グリケーションは老化の自然のプロセスで重要な役割を演じているかもしれない。最近、タンパク質のグリケーションが、アルツハイマー症のβ−アミロイドの沈着および神経細線維もつれの生成、ならびにアミロイド症を含む可能性のある他の神経変性疾患に関連があることが分かった（ＣｏｌａｃｏおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｕｒｏ Ｒｅｐｏｒｔ、５巻、８５９〜８６１頁、１９９４年）。グリケーションを受けたタンパク質は、毒性であり抗原性でありかつ特異的な細胞受容体に取りこまれた後、細胞損傷の応答をトリガーすることができることも報告されている（例えば、Ｖｌａｓｓａｒａ，ＢｕｃａｌａおよびＳｔｒｉｋｅｒ，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７０巻、１３８〜１５１頁、１９９４年；Ｖｌａｓｓａｒａら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９１巻、１１７０４〜１１７０８頁、１９９４年；ＤａｎｉｅｌｓおよびＨａｕｓｅｒ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４１巻、１４１５から１４２１年、１９９２年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４３巻、８３６〜８４１頁、１９９４年；Ｃｏｈｅｎら，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，４５巻、１６７３〜１６７９頁、１９９４年；Ｂｒｅｔｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４３巻、１６９９〜１７１２頁、１９９３年；およびＹａｎら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９１巻、７７８７から７７９１頁、１９９４頁参照）。
【０００５】
食品を調理中に褐色の色素が出現することは、一般的に認識されている現象であるが、その化学現象についてメイラードが１９１２年に最初に報告し、その化学現象はその後研究の結果タンパク質の老化の概念まで導いた。貯蔵し次いで熱処理された食品が非酵素的反応で褐変し、これはタンパク質が架橋してその生物学的利用性が低下したことが特徴であることは公知である。このメイラード反応は生体内でも起こることが見出されたが、そのとき、グルコースがヘモグロビンのα鎖のアミノ末端に、アマドリの転位反応によって結合することが発見された。
【０００６】
本願の開示は、アマドリ転位後（以下アマドリ後と呼ぶ）の最終糖化産物（メイラード産物：ＡＧＥ）の生成の従来知られておらずかつ予測できない機序、およびアマドリ後のＡＧＥ生成の有効なインヒビターを同定し特性解析を行う方法を教示する。本願の開示は、アマドリ後のＡＧＥを生成する際の反応性タンパク質中間体成分の独特な単離法と動的な特性解析法を示し、第一に、タンパク質のグリケーション反応の『後期』段階の具体的な解明と迅速で定量的な動的研究ができる方法を教示する。
【０００７】
このような『後期』ＡＧＥ生成とは対照的に、グリケーション反応の『早期』ステップは比較的よく特性解析がなされ、いくつものタンパク質が同定されている［Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，３７巻、２４８〜３３４頁、１９８５年；ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｅｓ編、『Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ』、１９８９年（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，米国ニューヨーク）；Ｆｉｎｏｔら編、『Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．』１９９０年（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，スイスのバーゼル）］。グリケーション反応は、リシンの側鎖のε−アミノ基および末端のα−アミノ基との可逆的シッフ塩基（アルジミンまたはケチミン）付加反応で開始され、続いて、基本的に不可逆アマドリ転位反応によって、例えばアルドースの反応から１−アミノ−１−デオキシケトース類のようなケトアミン生成物が生成することが知られている［ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｎｅｓ編『Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ』、１９８９年（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，米国ニューヨーク）の４３頁〜６７頁のＢａｙｎｅｓらの報告］。一般に、糖は最初、シッフ塩基の不可逆縮合反応によって、その開環（優勢なピラノースおよびフラノースの構造ではない）したアルデヒド型またはケト型で、リシンの側鎖のε−アミノ基と末端のα−アミノ基と反応する（概略図Ｉ）。生成した生成物のアルジミンまたはケチミンは、次にアマドリ転位反応を受けて、アルドースの反応から、ケトアミンのアマドリ生成物すなわち１−アミノ−１−デオキシーケトース類を生成する（ＭｅａｎｓおよびＣｈａｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，３１巻、Ｓｕｐｐｌ．３：１〜４頁、１９８２年；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，３７巻、２４８〜３３４頁、１９８５年）。これらのアマドリ生成物は次に、数週間および数ヶ月の期間にわたって、緩慢で不可逆のメイラード『褐変』反応を受け、転位反応、脱水反応、酸化フラグメント化反応および架橋反応を介して蛍光生成物などの他の生成物を生成する。これらアマドリ後の反応（緩慢なメイラード『褐変』反応）によって、最終糖化産物（ＡＧＥ）が生成するがこれら産物は不充分な特性解析しか行われていない。
【０００８】
アマドリ反応などのグリケーションの中間体の場合、遊離のグルコース自体が酸化反応を受けて、過酸化物およびジカルボニル類のグリオキサールとグリコアルデヒドのような高度に反応性のフラグメントを生成することがある。したがって、大部分の生体外の試験は、極端に高い糖の濃度で行われているので、各種のＡＧＥが生成する機構を解明することは極めて複雑である。
【０００９】
これらの『早期』産物の生成は比較的よく特性解析がなされているのと対照的に、アマドリ転位後の反応で生成する『後期』メイラード産物を生成する機序は、これら産物が不均質で、反応時間が長くかつ複雑なため、明確には理解されていない。これら『後期』メイラード反応の化学について詳細な情報がないので、グルコースとポリペプチド類のアミノ基との反応から誘導される蛍光ＡＧＥ発色団を同定する研究が刺激された。このような発色団の一つ、２−（２−フロイル）−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）が、ウシ血清アルブミンとポリリシンのグルコースによる非酵素的褐変反応の後、同定され、無傷のポリペプチド中に存在するこの発色団を示すと想定された（Ｐｏｎｇｅｒら，ＰＡＮＳ（ＵＳＡ），８１巻、２６８４〜２６８８頁、１９８４年）。その後の研究で、ＦＦＩは、分析のために行った加水分解反応中に生成した人為結果であることが確認された。
【００１０】
このようなグリコシレーションと架橋反応の機序が、単一の基本反応と繰返し反応による飽和グリコシレーションとこれに続くタンパク質糖アミンの架橋によって起こるという前提に基づいた、タンパク質のグリコシレーションおよびタンパク質糖アミンの架橋反応の阻害に関する分野の一連の米国特許が発行されている。これらの特許としては、米国特許第４，６６５，１９２号；同第５，０１７，６９６号；同第４，７５８，８５３号；同第４，９０８，４４６号、同第４，９８３，６０４号；同第５，１４０，０４８号；同第５，１３０，３３７号；同第５，２６２，１５２号；同第５，１３０，３２４号；同第５，２７２，１６５号；同第５，２２１，６８３号；同第５，２５８，３８１号；同第５，１０６，８７７号；同第５，１２８，３６０号；同第５，１００，９１９号；同第５，２５４，５９３号；同第５，１３７，９１６号；同第５，２７２，１７６号；同第５，１７５，１９２号；同第５，２１８，００１号；同第５，２３８，９６３号；同第５，３５８，９６０号；同第５，３１８，９８２号；および同第５，３３４，６１７号がある（なお、引用したこれら特許はすべて、全体を本明細書に引用するものである）。
【００１１】
これら米国特許の主眼は、早期グリコシレーションのアマドリ産物のカルボニル部分に集中したＡＧＥ生成の阻害方法であり、そして、特に、例示されている最も有効な阻害方法は、アミノグアニジンを外因的に投与して使用することを教示している。ＡＧＥ生成のインヒビターとしてのアミノグアニジンの有効性は、現在、臨床試験で試験中である。
【００１２】
ＡＧＥの生成を阻害することは、例えば、食物の腐敗、動物タンパク質の老化および歯の褐変と闘うなどの個人衛生の分野で有用である。定量的には少量であるが、注目すべき最終糖化産物はペントシジンとＮε−カルボキシメチルリシンである（ＳｅｌｌおよびＭｏｎｎｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４巻、２１５９７〜２１６０２頁、１９８９年；Ａｈｍｅｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１巻、４８８９〜４８９４頁、１９８６年）。
【００１３】
アマドリ中間産物とその後のアマドリ後のＡＧＥ生成は、本発明によって教示されているように、アミノグアニジンによる反応では充分に阻害されない。つまり、アマドリ後のＡＧＥの生成は、本願の開示で教示されているように、いままで報告されていないかまたは分離して確認することが不可能であった重要でかつ独特の反応経路で起こるのである。この『後期』反応のアマドリ後ＡＧＥの有効なインヒビターを同定して特性を解析する効率的でかつ有効な方法を得ることが、非常に望ましい目標である。効率的な選別法とモデルシステムを提供することによって、コンビナトリアル化学を用いて、候補の化合物を有効に選別し、その結果、インヒビター化合物を最終的に確認するのに、時間、経費および労力を著しく減らすことができる。有効なインヒビターの効率的な特性解析を行うことができる、アマドリ後のＡＧＥ生成の効果をモデル化し試験する生体内の方法を得ることが非常に有効である。
【００１４】
生物分離性および／または自然に代謝される阻害化合物が、アミノグアニジンのような毒性副作用を有する著しく反応性の化合物より、治療剤として用いるのに望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明によって、アマドリ後のＡＧＥへのアマドリ後の変換反応を迅速に完了させるのに使用できる、安定なアマドリ後の最終糖化産物（ＡＧＥ）の前駆体が同定されたのである。この安定な産物は、早期段階のタンパク質／糖アマドリ産物と追加の糖とのその後の反応で生成する、推定糖飽和アマドリ／シッフ塩基産物である。好ましい実施態様で、このアマドリ後／シッフ塩基中間体は標的タンパク質とリボース糖の反応で生成する。
【００１６】
本発明は、高級糖の新規な阻害法によって、安定なタンパク質糖ＡＧＥを生成する中間前駆体を製造する方法を提供するものである。好ましい実施態様で、使用される糖はリボースである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、後期メイラード産物生成に対する有効なインヒビターを同定する方法を提供するものであり、その方法は、タンパク質を糖とともに、充分な濃度で充分な時間インキュベートして安定なアマドリ後ＡＧＥの中間体を生成させることによって、安定なタンパク質−糖であるアマドリ後の最終糖化産物中間体を生成させ；前記安定なタンパク質−糖のアマドリ後の最終糖化産物中間体を、インヒビターの候補と接触させ；安定なタンパク質−糖のアマドリ後の最終糖化産物の中間体を、糖が誘導する平衡状態から開放した後、アマドリ後ＡＧＥの生成を監視することによって、有効な阻害を確認することからなる方法である。適当な糖としては、限定はされないが、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、マンノース、フルクトースおよびガラクトースがある。好ましい実施態様で、用いられる糖はリボースである。
【００１８】
本発明は、『後期』反応によるアマドリ後のＡＧＥ生成に対する有効なインヒビターを、下記検定法でアマドリ後のＡＧＥの生成を阻害する性能によって同定し特性を解析できることを教示するものである。すなわちその検定法は、タンパク質と糖を、充分な濃度で充分な時間、インキュベートして、安定なアマドリ後ＡＧＥの中間体を生成させることによって安定なタンパク質−糖のアマドリ後の最終糖化産物中間体を生成させ；前記の安定なタンパク質−糖のアマドリ後の最終糖化産物中間体を、インヒビターの候補と接触させ；糖が誘導する平衡状態から、前記安定なタンパク質−糖のアマドリ後の最終糖化産物中間体を開放した後、アマドリ後ＡＧＥの生成を監視することによって、有効な阻害を確認することからなる検定法である。好ましい実施態様で、その検定法はリボースを使用する。
【発明の効果】
【００１９】
したがって、本発明の方法は、アマドリ後のＡＧＥ生成に対するインヒビターの候補を有効性について迅速に選別することができて、アマドリ後ＡＧＥの生成に対する有効な小分子インヒビターを開発するのに必要な経費と労力を著しく減らすことができる。本発明は、ＡＧＥを生成するアマドリ後の『後期』反応に対する有効なインヒビターとしては、ビタミンＢ6とビタミンＢ1の誘導体があり、好ましい実施態様で、特異的なものはピリドキサミンとチアミンピロリン酸であることを教示する。
【００２０】
本発明は、ラットにリボースを投与することからなる、その被検動物に糖尿病様症状を迅速に誘発する新しい方法を教示する。さらに、アマドリ後のＡＧＥが誘発する症状を阻止するための、確認されたインヒビターのピリドキサミンとチアミンピロリン酸の使用法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
蛋白質老化の動物モデル
生体内でのＡＧＥ形成阻害物質の有効性を実証するために、アロキサン誘発性糖尿病ルイス・ラットを蛋白質老化モデルとして使用してきた。後期糖尿病関連症とＡＧＥ形成阻害との間に相関関係があることが実証されている（Ｂｒｏｗｌｅｅ，ＣｅｒａｍｉおよびＶｌａｓｓａｒａ，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８巻２０号：１３１５〜１３２１頁、１９８８年）。ルイス・ラットにおけるストレプトゾトシンによる糖尿病誘発、糖尿病を誘発したニュージーランド白色ウサギ、遺伝的に糖尿病のＢＢ／ウスター・ラット（ＢＢ／Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ ｒａｔ）も利用されており、たとえば米国特許第５，３３４，６１７号（参考文献として組み入れ）に述べられている。これらのモデル系の主な問題点は、ＡＧＥ関連損傷を実証するのに長期間を要し、したがって化合物のＡＧＥ阻害について試験するのに長期間かかるという点である。たとえば、米国特許第５，３３４，６１７号で述べるラット試験には１６週を要し、ウサギ試験には１２週を要した。したがって、ＡＧＥ関連損傷ならびにアマドリ後ＡＧＥ形成阻害物質の有効性をより効率よくかつ迅速に実証できるようにするためには、より短期間で現れるようなＡＧＥ関連糖尿病性病理のモデル系が得られれば非常に望ましく、かつ有用であろう。
【００２２】
ＡＧＥに対する抗体
ＡＧＥ形成について調べるのに重要な手段は、様々な標的蛋白質と数種の糖との反応によって引き起こされるＡＧＥに特異的なポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体を利用することである。抗体は、ＡＧＥの蛋白質成分の性質とは無関係に生じるＡＧＥについての特異性度で選別される（Ｎａｋａｙａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅs．Ｃｏｍｍ．，１６２巻７４０〜７４５頁、１９８９年；Ｎａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４０巻１１９〜１２５頁、１９９１年；Ｍｏｒｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻７３２９〜７３３２頁、１９９１年；Ａｒａｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻１０２１１〜１０２１４頁、１９９２年；Ｍａｋｉｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻５１３３〜５１３８頁、１９９２年）。このような抗体を使って、生体内と生体外の双方でＡＧＥ形成について検討されてきた。
【００２３】
チアミン−ビタミンＢ1
ビタミンＢ複合体の中で最初に確認されたチアミンは、通常の治療有効量で投与した場合は現実には薬力学的作用はもたらさない。大量に投与した場合でさえも、どんな作用があるかはわかっていない。チアミンピロリン酸はチアミンの生理学的活性体で、主としてα−ケト酸の脱炭酸における補酵素として炭水化物代謝で働く。塩酸チアミン錠剤は５ｍｇ剤から５００ｍｇ剤まである。塩酸チアミン注射液は、１００ｍｇ／ｍｌ含有液から２００ｍｇ／ｌ含有液まである。
【００２４】
チアミン欠乏症の治療には１００ｍｇ／Ｌという高用量の非経口液の静注がよく利用され、５０〜１００ｍｇというのが標準的な投与量である。チアミンの消化管からの吸収は１日に８〜１５ｍｇに限られると考えられているが、分割して食物といっしょに経口投与するとこれより多く吸収されることがある。
【００２５】
グルコースを反復投与すると栄養不良患者ではチアミン欠乏症になることがあり、高血糖を是正しているときにこのような事態が認められている。
【００２６】
驚くべきことに本発明では、生体外試験でも示されているように、人体で通常見られる量もしくは食事療法で投与される量よりも高い用量でチアミンリン酸を投与すると、アマドリ後抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害物質になること、またこのような阻害はアミノグアニジン投与により生じうる阻害よりも完全であることがわかった。
【００２７】
ピリドキシン−ビタミンＢ6
様々な会社から出されている市販製剤では、ビタミンＢ6は塩酸ピリドキシンの形で含有されているのが標準的である。たとえばビーチ（Ｂｅａｃｈ）製薬のビーリス（Ｂｅｅｌｉｔｈ）錠には塩酸ピリドキシン２５ｍｇが含まれており、これはビタミンＢ6 ２０ｍｇに相当する。この他、マーリンヘルスケア（Ｍａｒｌｙｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）のマーリンフォーミュラ５０（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０）には塩酸ピリドキシン１ｍｇが、マーリンフォーミュラ５０メガフォルテ（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０ Ｍｅｇａ Ｆｏｒｔｅ）には塩酸ピリドキシン６ｍｇが含まれ、ワイエス−アイエルスト（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）のスチュアートプレネイタル（Ｓｔｕａｌｒｔ Ｐｒｅｎａｔａｌ）（登録商標）錠には塩酸ピリドキシン２．６ｍｇが、ジェイ・アンド・ジェイ−メルク社（Ｊ＆Ｊ−Ｍｅｒｃｋ）のスチュアートフォルミュラ（Ｓｔｕａｒｔ Ｆｏｒｍｕｌａ）（登録商標）錠には塩酸ピリドキシン２ｍｇが含まれている。またチバ・コンシューマー・サンキスト・チルドレン（ＣＩＢＡ Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｓｕｎｋｉｓｔ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）の噛める複合ビタミン剤には塩酸ピリドキシン１．０５ｍｇが含まれており、これは米国の２〜４歳幼児のＲＤＡ（１日摂取許容量）の１５０％、４歳以上から成人のＲＤＡの５３％に相当する。（医師向け非処方箋薬卓上必携（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｎｏｎｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｄｒｕｇｓ）第１４版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏ．）、ニュージャージー州モンベール、１９９３年）。
【００２８】
ピリドキシンには関連する３種類の形態があり、それぞれピリジン核の４位にある炭素原子の置換の点で異なっている。ピリドキシンは第一級アルコールで、ピリドキサールはそれに対応するアルデヒド、ピリドキサミンは前記の位置にアミノメチル基を有する。この３種類はいずれも、哺乳動物では肝臓でビタミン活性体ピリドキサール−５’−リン酸に変換されてから利用される。長年の間、この３種の形態は生物学的に等しい特性を有すると考えられ、これまでの技術ではビタミンＢ6の等しい形態として扱われてきた。薬学・化学委員会は、このビタミンをピリドキシンと命名している。
【００２９】
ピリドキシンに対する最も活性の大きい代謝拮抗物質は４−デオキシピリドキシンで、その代謝拮抗活性は生体内で複数のピリドキサールリン酸依存性酵素の競合的阻害物質である４−デオキシピリドキシン−５−リン酸を形成することによるとされている。ピリドキシンの薬理学的作用は限られており、経口投与でも静注でも目立った薬力学的作用はもたらされず、水溶性なので急性毒性はあまりない。１日に２００ｍｇという低用量でも長期にわたってピリドキシンを摂取し続けていると、神経毒性を生じる場合もあることが示されている。生理学的には、補酵素としてのピリドキシンリン酸は脱炭酸、アミノ基転移、ラセミ化などアミノ酸の代謝的変換の幾つかに関与し、またイオウ含有アミノ酸およびヒドロキシアミノ酸の代謝における酵素的ステップにも関与している。アミノ基転移の場合、ピリドキサールリン酸は供与体のアミノ酸によってアミノ化されてピリドキサミンリン酸になり、結合したピリドキサミンリン酸はその後α−ケト酸によって脱アミノ化されてピリドキサールリン酸になる。このようにビタミンＢ複合体はアミノ酸の特異な分解に関与するものとして食事で補給する必要があることがわかっている。ビタミンＢ複合体の全般的事柄についてはＧｉｌｍａｎ，Ｒａｌｌ，ＮｉｅｓおよびＴａｙｌｏｒ編『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ』第８版（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９０年）の１２９３−４頁および１５２３−１５４０頁を参照されたい。
【００３０】
驚くべきことに本発明では、ビタミンＢ6の代謝的に一過性のピロドキサールアミン形（ピリドキサミン）を人体で通常見られるよりも高いレベルの有効用量で投与するとアマドリ後抗原性ＡＧＥ形成の阻害物質として有効であること、またこのような阻害はアミノグアニジン投与により生じうる阻害よりも完全であることがわかった。
【００３１】
安定したアマドリ／シッフ塩基中間物質の形成
蛋白質がグルコースと反応してＡＧＥを形成することを調べる標準的な研究は、抗原性ＡＧＥに対する抗体を使ったＥＬＩＳＡ法ならびに酸加水分解後にＨＰＬＣで酸に安定な蛍光ＡＧＥであるペントシジンの生成を検出することによって行われてきた。標的蛋白質（すなわちＢＳＡまたはＲＮａｓｅ Ａ）のグルコースおよびリボースによるグリケーションを、ポリクロナールウサギ抗グルコース−ＡＧＥ−ＲＮａｓｅ抗体および抗グルコース−ＡＧＥ−ＢＳＡ抗体のＥＬＩＳＡ反応性を監視して比較した。抗原は、グルコース１ＭをＲＮａｓｅとは６０日間、ＢＳＡとは９０日間反応させて生成した。抗体（Ｒ６１８およびＲ４７９）を調べたところ、キャリヤー免疫原を除いてはＡＧＥに対してのみ反応し、蛋白質には反応しないことがわかった。
【実施例】
【００３２】
実施例１
チアミンピロリン酸およびピリドキサミンはグルコースの抗原性最終糖化産物の形成を阻害する：アミノグアニジンとの比較
一部のビタミンＢ6、特にピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）は、アルデヒドとしてそれ自体が蛋白アミノ基を有するシッフ塩基付加物を形成することができ（Ｋａｔａｍｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：４３巻１７２５〜１７３１頁、１９８８年）、したがってグルコース付着に利用できるアミンの量を限定するところから、早期グリケーションの「競合的阻害物質」として働くことがすでに提唱されている。ただし、初期の糖付着限定の有効性からアマドリ産物からＡＧＥへの変換の阻害を予測することはできない。本発明では、抗原性ＡＧＥの生体内形成（Ｂｏｏｔｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２２０巻：１１３〜１１９頁、１９９６年）に対する作用で示される「後期」グリケーション反応の阻害物質について述べる。
【００３３】
化学物質
ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ）は、クロマトグラフィーで純度が高く凝集しないものをウォーシントン・バイオケミカルズ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；画分Ｖ、脂肪酸なし）、ヒトのメトヘモグロビン（Ｈｂ）、Ｄ−グルコース、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサール−５’−リン酸、ピリドキサミン、チアミン、チアミンモノリン酸、チアミンピロリン酸、ヤギアルカリホスファターゼ抱合抗ウサギＩｇＧは、いずれもシグマ・ケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。塩酸アミノグアニジンはアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。
【００３４】
グルコースを使った妨害されないグリケーション
ウシ血清アルブミン、リボヌクレアーゼＡ、ヒトのヘモグロビンを、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、３７℃でグルコースとインキュベートした。蛋白質、グルコース（１．０Ｍ）、および阻害物質と予想されるもの（０．５、３、１５、５０ｍＭ）をインキュベーション混合液に同時に導入した。溶液は暗所でキャップをした試験管に保存した。液の一部を採って直ちに凍結し、反応終結時にＥＬＩＳＡ法で分析した。インキュベーション期間は３週間（Ｈｂ）または６週間（ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ）とした。
【００３５】
ＡＧＥ蛋白に対するポリクロナール抗体の調製
免疫原は、これまでのプロトコルに従って調製した（Ｎａｋａｙａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２巻：７４０〜７４５頁、１９８９年；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻：７３２９〜７３３２頁、１９９１年；Ｍａｋｉｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：５１３３〜５１３８頁、１９９２年）。簡単に説明すると、０．０５％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ７．４および３７℃の条件で１．５Ｍグルコースを使って、１５ｍｌ中に１．６ｇの蛋白質で６０〜９０日間ＢＳＡ（Ｒ４７９抗体）またはＲＮａｓｅ（Ｒ６１８抗体）のグリケーションを行って免疫原を作製した。８〜１２週齢の雄ニュージーランド白色ウサギに、フロイントアジュバントに１ｍｇ／ｍｌのグリコシル化蛋白質が入った溶液１ｍｌを皮下注して免疫化した。最初の注射には完全アジュバントを使用し、それからフロイントの不完全アジュバントで３週間おきに３回追加注射をした。最後の追加注射後でウサギを３週間育種した。凝塊した全血を遠心分離して血清を採取した。抗体はＡＧＥ特異性で、天然蛋白質（キャリヤーを除く）にもアマドリ中間物質にも反応しなかった。ポリクロナール抗ＡＧＥ抗体は、生体内でも生体外でも「後期」ＡＧＥ形成の試験における分析ツールとして感度がよく価値あることが立証されている。支配抗原性ＡＧＥエピトープまたはハプテンの性質はまだ疑わしいが、最近では蛋白質グリコシル化産物であるカルボキシメチルリジン（ＣｍＬ）が一部の抗体の支配抗原かもしれないと提唱されている（Ｒｅｄｄｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４巻１０８７２−１０８７８頁、１９９５年）。初期の研究では、モデルＣｍＬ化合物に対する反応性をＥＬＩＳＡ法で明らかにできていない（Ｍａｋｉｔａら，、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻：５１３３〜５１３８頁、１９９２年）。
【００３６】
ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ法による検出
ＥＬＩＳＡ法にはエングバルの一般法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０巻：４１９〜４３９頁、１９８１年）を使用した。標準的には、グリコシル化蛋白質試料をｐＨ９．５〜９．７の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で約１．５μｇ／ｍｌに希釈した。９６ウェルのポリスチレンプレートの各ウェルに蛋白溶液２００μｌ（０．３μｇ／ウェル）を分注して、室温で一晩被覆した。被覆後に、０．０５％トゥイーン−２０含有生理食塩液でウェルから蛋白質を洗い流した。それから１％カゼインの炭酸塩緩衝液溶液２００μｌを使って３７℃で２時間ウェルをブロックし、洗浄した。ウサギ抗ＡＧＥ抗体をインキュベーション緩衝液で１：３５０くらいの力価に希釈し、３７℃で１時間インキュベートしてから洗浄した。バックグラウンド値をできるだけ小さくするために、グリコシル化ＲＮａｓｅの検出に使用する抗体Ｒ４７９をグリコシル化ＢＳＡに対して、またグリコシル化ＢＳＡおよびグリコシル化Ｈｂの検出に使用する抗体Ｒ６１８をグリコシル化ＲＮａｓｅに対して高くした。その後、ウサギＩｇＧに対するアルカリホスファターゼ抱合抗体を二次抗体として１：２０００または１：２５００（ロットによる）の力価で加え、３７℃で１時間インキュベートしてから洗浄した。ｐ−ニトロフェニルリン酸基質液（２００μｌ／ウェル）をプレートに加え、ダイナテックＭＲ ４０００マイクロプレートリーダーを使って４１０ｎｍで放出されるＰ−ニトロフェノレートの吸光度をモニターした。
【００３７】
未修飾蛋白質を含有する対照を必ず入れて、それらの示値を差し引いたが、ふつうは補正はごくわずかであった。ＡＧＥ形成の反応速度について定量的に調べるのにＥＬＩＳＡ法を使用することの妥当性は、定量が線形になるかどうかにかかっている（ＫｅｍｅｎｙとＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ（ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）英国 チチェスター）。対照実験を行って、たとえばＲＮａｓｅの線形範囲が約０．２〜０．３ｍｇ／ウェルという被覆濃度より低いことを実証した。
【００３８】
結果
図１のＡ〜Ｄは、グルコースでグリコシル化したウシ血清アルブミンにおけるアマドリ後ＡＧＥ形成に対するビタミンＢ6誘導体の作用を示したグラフである。ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、示した様々な誘導体の存在する場合としない場合とで、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１．０Ｍグルコースと３７℃で６週間インキュベートした。液の一部を採って、Ｒ６１８抗ＡＧＥ抗体を利用したＥＬＩＳＡ法で定量した。阻害物質の濃度は３ｍＭ、１５ｍＭ、５０ｍＭであった。使用した阻害物質は、図（１Ａ）がピリドキサミン（ＰＭ）、図（１Ｂ）がピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、図（１Ｃ）がピリドキサール（ＰＬ）、図（１Ｄ）がピリドキシン（ＰＮ）である。
【００３９】
図１（対照曲線）から、ＢＳＡの１．０Ｍグルコースとの反応は遅く、糖の濃度を反応を加速化する高い濃度を用いた場合でさえも、４０日以上経過しても反応が不完全であることがわかる。様々なＢ6ビタミン誘導体が異なる濃度で同時に存在すると、アマドリ後抗原性ＡＧＥの形成に顕著な影響が見られる（図１Ａ〜Ｄ）。ピリドキサミンおよびピリドキサールリン酸は調べた濃度のうち最低濃度でもアマドリ後抗原性ＡＧＥの形成を強く抑制したが、ピリドキサールは１５ｍＭ以上の濃度でなければ有効でなかった。ピリドキシンは調べた濃度の最高の濃度でもわずかに有効なだけであった。
【００４０】
図２Ａ〜Ｄは、ウシ血清アルブミン中のアマドリ後ＡＧＥ形成に対するビタミンＢ1誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の影響を示したグラフである。ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、示した様々な誘導体の存在する場合としない場合とで、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１．０グルコースと３７℃で６週間インキュベートした。液の一部を採って、Ｒ６１８抗ＡＧＥ抗体を利用したＥＬＩＳＡ法で定量した。阻害物質の濃度は３ｍＭ、１５ｍＭ、５０ｍＭであった。使用した阻害物質は、図（２Ａ）がチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図（２Ｂ）がチアミンモノリン酸（ＴＰ）、図（２Ｃ）がチアミン（Ｔ）、図（２Ｄ）がアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【００４１】
同じようにして調べた様々なＢ1ビタミン誘導体のうち（図２ＡからＤ）、チアミンピロリン酸は調べたどの濃度でも有効であったが（図２Ｃ）、チアミンおよびチアミンモノリン酸には阻害能がなかった。中でも注目された重要な点は、チアミンピロリン酸、ピリドキサールリン酸およびピリドキサミンでは形成されたＡＧＥの最終濃度が低下していたことである。アミノグアニジン（図２Ｄ）はＢＳＡ中のアマドリ後ＡＧＥ形成をいくらか阻害したが、前記の化合物よりもその程度は小さかった。ヒトのメトヘモグロビンおよびウシリボヌクレアーゼＡでも同じ試験を行った。
【００４２】
図３Ａ〜Ｄは、ヒトメトヘモグロビン中のアマドリ後ＡＧＥ形成に対するビタミンＢ6誘導体の影響を示したグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、示した様々な誘導体の存在する場合としない場合とで、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１．０Ｍグルコースと３７℃で３週間インキュベートした。液の一部を採って、Ｒ６１８抗ＡＧＥ抗体を利用したＥＬＩＳＡ法で定量した。阻害物質の濃度は０．５ｍＭ、３ｍＭ、１５ｍＭ、５０ｍＭであった。使用した阻害物質は、図（３Ａ）がピリドキサミン（ＰＭ）、図（３Ｂ）がピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、図（３Ｃ）がピリドキサール（ＰＬ）、図（３Ｄ）がピリドキシン（ＰＮ）である。
【００４３】
糖尿病患者のＨｂには抗ＡＧＥ抗体と結合する成分があることがすでに報告されており、このグリコシル化Ｈｂ（ＨｂＡｌｃと混同しないようにＨｂ−ＡＧＥと呼ぶ）は長期にわたるグルコース曝露の測定に有用かもしれないと提唱された。Ｈｂを生体外でグルコースとインキュベートすると、ＢＳＡの場合よりも明らかに速い速度で抗原性ＡＧＥが生成される。それにもかかわらず、様々なＢ6ビタミン誘導体（図３ＡからＤ）およびビタミンＢ1誘導体（図４Ａ〜Ｄ）が、Ｈｂで同じ阻害傾向を示し、各誘導体群中ではいずれもピリドキサミンおよびチアミンピロリン酸が最も有効な阻害物質であった。重要なことには、Ｈｂではアミノグアニジンはアマドリ後ＡＧＥ形成の速度を阻害するだけで、アマドリ後ＡＧＥ形成の最終濃度は阻害しなかった（図４Ｄ）。
【００４４】
ＲＮａｓｅを使用した場合、グルコースによるアマドリ後抗原性ＡＧＥ形成の速度はＨｂとＢＳＡとの中間になったが、各ビタミン誘導体群内での阻害の程度に変わりはなかった。ここでもピリドキサミンとチアミンピロリン酸がアミノグアニジンよりも有効であった（図５）。
【００４５】
図４Ａ〜Ｄは、ヒトのメトヘモグロビン中のアマドリ後ＡＧＥ形成に対するビタミンＢ1誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の影響を示したグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、示した様々な誘導体の存在する場合としない場合とで、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１．０Ｍグルコースと３７℃で３週間インキュベートした。液の一部を採って、Ｒ６１８抗ＡＧＥ抗体を利用したＥＬＩＳＡ法で定量した。阻害物質の濃度は０．５ｍＭ、３ｍＭ、１５ｍＭ、５０ｍＭであった。使用した阻害物質は、図（４Ａ）がチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図（４Ｂ）がチアミン１リン酸（ＴＰ）、図（４Ｃ）がチアミン（Ｔ）、図（４Ｄ）がアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【００４６】
図５は、チアミンピロリン酸（ｔｐｐ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、アミノグアニジン（ＡＧ）によるリボヌクレアーゼＡのグリケーション阻害を比較した棒グラフである。ＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍｌ）を、示した様々な誘導体の存在する場合としない場合とで、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１．０Ｍグルコースと３７℃で６週間インキュベートした。液の一部を採って、Ｒ４７９抗ＡＧＥ抗体を利用したＥＬＩＳＡ法で定量した。ここに示した阻害率は、６週後における阻害物質のある場合とない場合のＥＬＩＳＡ法の示値から算出したものである。阻害物質の濃度は０．５ｍＭ、３ｍＭ、１５ｍＭ、５０ｍＭであった。
【００４７】
考察
以上の結果から、ビタミンＢ1およびＢ6の一定の誘導体は「後期」アマドリ後ＡＧＥ形成阻害能があることが実証される。これらのビタミン誘導体の一部はアミノグアニジンとは異なりアマドリ後ＡＧＥ生成の最終レベルを抑えるのに成功しており、アマドリまたはアマドリ後の抗原性ＡＧＥ前駆体との相互作用がより大きいことが示唆される。アマドリおよびアマドリ後中間物質は非常に重要な接合部であり、非酵素的グリケーションの「古典的」経路がここから基本的に不可逆的になる（概略図Ｉ）。以前の阻害研究では、「グリケーション」は形成されるシッフ塩基（標識したシアノボロハイドライドで還元後）として、あるいは形成されたアマドリ産物（標識した糖を使って酸析出後）としてのいずれかで測定するのが普通であった。このような定量法では「後期」アマドリ後ＡＧＥ形成へ向けてのアマドリ後変換ステップの阻害に関する情報は得られない。というのもこのようなステップでは蛋白質に付着する標識をした糖の量に変化が生じないからである。他の「グリケーション」定量法は糖による非特異的蛋白蛍光の増加に依存してきたが、これもアマドリ産物形成とは無関係にグリコアルデヒドまたはグリオキサールなど遊離糖のジカルボニル酸化的フラグメントによって誘発することができる（Ｈｕｎｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６巻：２０５〜２１２頁、１９８８年）。
【００４８】
ピリドキサール（ＰＬ）およびピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）の場合、グリケーション部位における蛋白アミノ基によるこれらのアルデヒドの競合的シッフ塩基縮合から成る単純な阻害機序がデータで裏付けられている。ピリドキサールでは内部でヘミアセタールが形成されるがピリドキサールリン酸では形成されないことから、ＰＬＰによるアマドリ後ＡＧＥ阻害のほうがより強いことが、この競合的機序から予想される。このことは実際にデータで確認できる（図１Ｂおよび１Ｃ、図３Ｂおよび３Ｃ）。ピリドキサミンにはアルデヒド基がないので、ピリドキサミンによる阻害は当然のことながら異なる。ただし、ピリドキサミンは非環式糖のカルボニル、ジカルボニルフラグメント、アマドリ産物、あるいはアマドリ後中間物質とシッフ塩基結合を形成する能力を潜在的に有するアミンと考えられる。Ｂ1化合物の阻害機序は明らかでない。いずれの形にもアミノの機能性があるのに、ピロリン酸の形だけが顕著に有効であることから、強い負の電荷の存在が重要なのではないかと考えられる。
【００４９】
予期しなかった重要な結果は、アミノグアニジンならびに他の一部の化合物による阻害の程度が、反応の初期に比べて後期になるとかなり小さくなった点である。このことから、ピリドキサミンおよびチアミンピロリン酸とは作用機序が異なると考えられ、これらの化合物の治療効果はアミノグアニジと同時投与すると強化されるものと思われる。
【００５０】
実施例２
非酵素的グリケーションの動態：リボースによる逆説的阻害および迅速アマドリ後ＡＧＥ形成についてのタンパク質中間体の容易な分離
高濃度のグルコースが使用されてタンパク質の非酵素的グリケーションが起る一方で、普通と異なり、高濃度でのリボースは、グリケーション反応のアマドリ後「後期」段階に作用することよって、リボヌクレアーゼ中でのアマドリ後ＡＧＥ形成を阻害することが分かった。この予期せぬ阻害効果は、「初期」の反応性中間体、おそらくアマドリ生成物が「後期」アマドリ後ＡＧＥ生成物（ＡＧＥ；メイラード生成物）をほとんど形成しないで蓄積されうることを示唆する。この現象についての研究は、（１）アマドリ（またはアマドリ後）グリケーション中間体（類）の速度論的単離についての条件を定める能力、（２）このような中間体の蓄積の急速な動態を研究する能力、（３）遊離または可逆的に結合した糖の不存在下でこのような中間体をＡＧＥ生成物に返還する意外にも迅速な動態を研究する能力、（４）ＡＧＥ形成のアマドリ後段階の阻害を研究し、特徴づけるためにこれらの中間体を使用する能力、したがってこれによりＡＧＥ形成を封鎖できた反応の機構および潜在的剤の効力を研究するための新規システムを供する、そして（５）この知見により、反応性中間体を研究し、様々なＡＧＥｓ候補への変換を観察するために１３Ｃ ＮＭＲを使用することもさらに可能であることを示した。（Ｋｈａｌｉｆａｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５巻１５号：４６４５〜４６５４頁、１９９６年）。
【００５１】
化合物および材料  上記実施例１と同様。
【００５２】
ＡＧＥｓに対するポリクローナル抗体の製造方法：上記実施例１と同様。
【００５３】
ＡＧＥ生成物のＥＬＩＳＡ検出：上記実施例１と同様。
【００５４】
アミノ酸分析
アミノ酸分析は、ザ・バイオテクノロジー・サポート・ファシリティー・オブ・ザ・カンサス・ユニバーシティー・メディカル・センターで行われた。６Ｎ ＨＣｌを用い、１１０℃で、１８−２４時間（シアノホウ水素化ナトリウムで還元された）グリケーション化タンパク質を加水分解した後、分析が行われた。誘導体化に、フェニル イソチオシアネートを使用し、そして応用バイオシステム・アミノ酸分析器（４２０Ａデリバタイザー、１３０Ａ分離系、９２０Ａデータ分析系）に逆相ＨＰＬＣをかけて、ＰＴＨ誘導体を分析した。
【００５５】
ペントシジン逆相ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによって、ＲＮａｓｅでのペントシジン生成物を定量した（ＳｅｌｌおよびＭｏｎｎｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４巻：２１５９７〜２１６０２頁、１９８９年；Ｏｄｅｔｔｉら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４１巻：１５３〜１５９頁、１９９２年）。リボース修飾タンパク質サンプルを、１８時間、１００℃で６Ｎ ＨＣｌを用いて加水分解し、その後スピードバキュームで乾燥させた。その後、そのサンプルを再溶解し、そして一定量を０．１％トリフルオロ酢酸に取り、そして０．１％ＴＦＡで平衡化したビダックＣ−１８カラムを使用したシマダ・システムでＨＰＬＣによって分析した。０−６％アセトニトリルの勾配を、約１ｍｌ／分の流速で３０分かけて行った。３３５ｎｍ励起／３８５ｎｍ蛍光照射により、ペントシジンを検出し、そして合成標品を流すことでその溶出時間を測定した。予測されるペントシジンが極めて低濃度であるため（ＧｒａｎｄｈｅｅおよびＭｏｎｎｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻：１１６４９〜１１６５３頁、１９９１年；Ｄｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻：１１６５４〜１１６６０頁、１９９１年）、絶対濃度を定量する試みはなされなかった。ピーク領域から相対濃度のみを測定した。
【００５６】
グリケーション修飾
リボースまたはグルコースでの修飾は、一般に３７℃で、０．０２％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸緩衝液中で行われた。高濃度の緩衝液は、常に０．５Ｍリボース修飾と一緒に使用された。その溶液を密栓付試験管に保存し、そして後に様々の分析を行うためにすぐに凍結されるのに適当な一定量量を取出すときのみに開けた。最初、タンパク質をリボースと一緒に、３７℃で８または２４時間インキュベートし、次に４℃に変えた反復冷緩衝液で即時および多量の透析を行うことによって、「中断グリケーション」試験を行った。その後、外因性リボースの不存在下ですばやく３７℃に加温してそのサンプルを再度インキュベートした。一定量量を取り、そして後の分析のために種々の間隔で凍結した。低分子量排除透析管を使用した場合でさえ、透析後、低分子量のＲＮａｓｅについて、タンパク質濃度を再度測定した。０．５Ｍリボースを含有する反応混合液からサンプルを１００倍希釈することによる代替法も考案された。ＵＶスペクトルからタンパク質濃度を算定した。ＵＶ吸光度で、グリケーションに伴う一般的な増加を補うために、ピーク（２７８ｎｍ）およびトラフ（谷）（２５０ｎｍ）の間のモル吸光度での差をＲＮａｓｅ濃度の決定に使用した。ＵＶスペクトルのグリケーションの寄与を特徴づけるために、時間依存ＵＶ差のスペクトル試験を行った。
【００５７】
動態のデータ解析および数量シミュレーション
動態データを、直線でない最小二乗法を用いた一次指数または二次指数関数に順次適合させた。反応の微分方程式の数量シュミレーションによって、概略図５−６の動態機構を試験した。観察された動態データのシュミレーションとの適合は、ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ２．０ソフトウエア・パッケージ（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。動態データから明白な半減期（図６Ｂ）を測定するのは、ＭａｔｈＣＡＤ４．０ソフトウエア（Ｍａｔｈｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）の「解決」関数を用いて行った。
【００５８】
結果
グルコースおよびリボースによるクルコシル化の比較
リボースおよびグルコースとのＲｎａｓｅ Ａの反応を、第一に、グルコース補足ＢＳＡによって発生したＲ４７９ラビットＡＧＥ特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で行った。最小範囲について、ペントシジンの生成物である唯一の公知の酸安定性蛍光ＡＧＥをＨＰＬＣ続いて酸加水分解を行うことによって定量した。３７℃での０．０５Ｍリボースを使用した予備試験では、抗原ＡＧＥ形成の速度は、そのｐＨが５．０から７．５に増やされる場合に、全ての場合で動態の始めに明白な少しの誘導期を伴って適度に増加する（明白な半減期によって測定された概ね２〜３倍）ように見えることを示した。ｐＨ７．５で０．０５ＭリボースとのＲＮａｓｅのグリケーション（半減時間６．５日付近）は、ほとんど１．０Ｍグルコースとのグリケーションのもの（半減時間３０日を越える、図７Ｂを参照、実線）より早い大きさの桁であるように思われる。後者の動態も少しの誘導期を示したが、６０日後でも横ばい状態に達しないで、真の半減時間を計算するのを困難にした。
【００５９】
リボース濃度への動態の依存度をｐＨ７．５で測定すると、最も予測されない結果が得られた。反応の速度は、最初リボース濃度の増加に伴って増加したが、０．１５Ｍを越える濃度では、反応の速度は、横ばい状態になり、その後かなり減少した（図６Ａ）。リボースの濃度への逆数半減時間の依存度のプロット（図６Ｂ）では、高濃度のリボースは、アマドリ抗原性ＡＧＥ形成に普通とはことなり阻害性がある。この通常ではないが一貫した効果が、緩衝液（２倍）またはＲＮａｓｅ（１０倍）のいずれかの濃度での変化に依存していることが分かり、そしてそれは、固定化ＡＧＥ−ＲＮａｓｅのカラムでのＲ４７９抗体のアフィニティー精製によっては変えられなかった。それは、ＥＬＩＳＡ法自身におけるリボースの効果によるものでもない。アマドリ後ＡＧＥ形成におけるリボースによる測定の阻害効果はＥＬＩＳＡ法でのタンパク質のＡＧＥ抗原部位の抗原認識についてのリボースの干渉のためでありそうもない。ＥＬＩＳＡ法プレート上での一次抗ＡＧＥ抗体との最初の接触の前に、グリケーションタンパク質を１０００倍以上に希釈し、吸収後Ｔｗｅｅｎ−２０で大量に洗浄し、１％カゼインで封鎖し、さらにＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した。
【００６０】
「中断グリケーション」によるアマドリ後抗原性ＡＧＥの形成の動態
見られた導入期がすくない点で、ＥＬＩＳＡ検出可能なアマドリ後抗原性ＡＧＥｓを産成する能力があって、アマドリ中間体のような初期の前駆体の、反応中にいくらか蓄積があるかどうかを測定する試みがなされた。０．５Ｍの高濃度のリボースを用い、ｐＨ７．５で、３７℃でＲＮａｓｅをグリケーションし、そしてその反応を２４時間後、４℃にただちに冷却して中断させ、２４時間かけて数回冷緩衝液を変えて透析して遊離で可逆的に結合した（シッフ塩基）リボースを除去した。その後、このようなリボース不含のサンプルを再度いかなるリボースも添加せずに３７℃まで急速に加温し、そして数日をかけて、アマドリ後ＡＧＥ形成についてサンプリングした。この２４時間「中断グリケーション」サンプルのＡＧＥ抗原産生は、図７Ａで破線および白抜き三角によって示され、ただし、冷透析に使われた時間は含まれない。中断されていない対照（実線とべた塗り円形）も比較として示される。アマドリ後抗原性ＡＧＥ形成の劇的に異なる動態は、この２つのサンプルで明白である。リボース不含の中断サンプルのＡＧＥ抗原産成の動態は、ここで（１）誘導期を伴わない一次指数動態、（２）１０時間の桁の目立った半減時間を伴う非常に増加した速度の抗原性ＡＧＥ形成、および（３）リボースの連続存在下で長期間インキュベートする場合に見られるものに匹敵する濃度の抗原の産成（図６Ａを参照）を示す。同様に重要に、そのデータも、図７Ａの時間１日で白抜き三角とべた塗り円形の間の少しの差によって示されるとおり、冷透析期間にごくわずかなＡＧＥ抗原が形成されることを例示する。「中断」手段自身によってＡＧＥが形成される場合はいずれも、非常にすくない。これらの観察は、抗原性ＡＧＥに対して十分に相当な単離可能な中間体または前駆体が、遊離および可逆的に結合した糖を除去する前に、リボースとの２４時間接触中に発生されることを示す。
【００６１】
わずか８時間後に中断されたサンプルは、２４時間中断のサンプルの約７２％である最終量のＡＧＥ抗原を産生した。０．０５ＭリボースのみでＲＮａｓｅのサンプルをグリケーションし、冷透析により８時間で中断し、そして３７℃での再インキュベーションは、９日後、ＥＬＩＳＡ反応性抗原を５％未満産生することを示した。しかし、２４時間での中断は、急速に上昇したＥＬＩＳＡ抗原（図７Ａと同様）を産生して、未中断の０．０５Ｍリボースの存在下で産生されたもののおおむね５０％のレベルになった。
【００６２】
他のタンパク質での同一の一般的中断効果も見られた（ＢＳＡおよびヘモグロビン）。速度一定のいくぶん異なる絶対値、および２４時間０．５Ｍリボースのインキュベート中に形成される抗原性ＡＧＥの量を除いて、ＡＧＥ抗原形成の速度における同じ劇的な増加が、０．５Ｍリボースを除去した後に観察された。
【００６３】
グルコースでのグリケーションは、リボースでのものよりいっそう遅い（図７Ａおよび図７Ｂの間の時間尺度に差があるとに注意）。しかし、リボースを用いた場合とは異なり、１．０Ｍグルコースによるグリケーションの３日後の中断は、ＥＬＩＳＡ反応性ＡＧＥ抗原に対する前駆体のごくわずかの蓄積を生じた（図７Ｂ、破線曲線）。
【００６４】
ペントシジン形成の動態
ＥＬＩＳＡ法に付されたサンプルも、酸安定ＡＧＥであるペントシジンの産生について分析した。ペントシジンの含量を、ＥＬＩＳＡ法によって抗原の反応性について分析した同じＲＮａｓｅサンプルについて測定した。ｐＨ７．５で０．４Ｍリン酸緩衝液中でリボースを用いたグリケーションにより、酸加水分解後蛍光物質によって定量されたＲＮａｓｅ Ａ中でペントシジンが産生された。図８Ａは、未中断の条件下で、０．０５Ｍリボースがペントシジンについて目覚しい増加を生じることを示す。しかし、グリケーションが０．５Ｍリボースを用いた「中断」条件下で行われると、過剰なリボースを除去した直後にペントシジン形成の速度に劇的な上昇が見られ（図８Ｂ）、それは、抗原性ＡＧＥの出現の動態と同様であるが、わずかに迅速である（図７Ａ）。８時間と比べて、２４時間中断でより多くの量のペントシジンも生成される。ペントシジンと抗原性ＡＧＥｓの形成についての動態の間の再現できる差も、注目できる。２４時間インキュベーション中、そして冷透析中にも、相当な量のペントシジンが形成されて、図８Ｂで垂直破線が急増する。したがって、我々の観察では、ペントシジン前駆体が、リボース除去後にペントシジンを急速に産生することができるリボースグリケーションの間に蓄積することが示される（比較、Ｏｄｅｔｔｉら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４１巻：１５３〜１５９頁、１９９２年）。
【００６５】
反応性中間体を蓄積する速度
上述の「中断グリケーション」試験は、アマドリ後抗原性ＡＧＥおよびペントシジンの両方に対する前駆体または前駆体類がリボースを用いたグリケーションの間に蓄積できるを例示する。この中間体の形成についての動態は、独立に行われ、そして上述の様々な試験によって定量できる。リボースとの接触時間の異なるＲＮａｓｅで発生した中間体の量は、その中間体が中断後抗原性ＡＧＥを産生できる最大範囲によって分析される。グリケーションを開始した後の可変時間で、冷却透析または迅速な希釈により遊離および可逆的に結合したリボースを除去する（以下参照）。その後、アマドリ後抗原性ＡＧＥの最大限発生させるために３７℃に加温した後十分な時間（５日、図７Ａによって、いくつかの半減を示す）放置する。その後、中断点の５日後、最大のＡＧＥ発生を示すＥＬＩＳＡ読取りは、中断の時間に存在する中間体濃度に比例する。
【００６６】
図９は、中間体蓄積の動態が０．５Ｍリボースの存在下でＲＮａｓｅ Ａについて測定されるような試験を示す（実符号および曲線）。比較のために、各中断点でリボースを除去する前に存在するＡＧＥの量も示される（白抜き符号および破線）。予想どおり（比較、図７Ａ）、リボース除去（希釈）前にはほとんどＡＧＥは形成されないので、５日間の第２のインキュベーション期後のＥＬＩＳＡ読取りは、ほとんどリボース除去後形成されたＡＧＥを測定することである。図９の結果では、０．５Ｍリボース中の中間体の蓄積速度は、約３．３時間の半減時間を示し、指数関数的であり、非常に早いことが示される。これは、中断後その中間体を抗原性ＡＧＥに変換するのに観測された速度より約３倍以上速い（図７Ａ、白抜き符号および破線曲線）。
【００６７】
これらの試験では、各中断時間でのリボースの除去は、１００倍希釈によって達成され、透析によっては達成されなかった。単純な希釈は、リボースの濃度を０．０５Ｍから０．００５Ｍに減少した。残さの５ｍＭリボースを用いこの時間尺度ではほとんどＡＧＥは産生されなかったことが独立に測定された（図６Ａ）。この希釈法は、定量的ポイント−ツー−ポイント精度の必要から予め書き取られた。このような精度は、各中断点で各サンプルについて単独に行われる透析手段によっては達成されたことがなかった。我々の結果では、希釈が透析に相当することを示される。
【００６８】
別の対照試験（以下の図１０参照）では、即座に１００倍希釈が透析手段にほとんど等しい結果が示された。これらの対照試験では、可逆可能なリボースタンパク質結合（シッフ塩基）平衡は、この時間尺度ではまったく速いことが示される。これは、０．５Ｍリボースを用いたシッフ塩基形成の半減期が数分の桁でなければならないことを示すＢｕｎｎおよびＮｉｇｇｉｎｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１３巻：２２２〜２２４頁、１９８１年）のデータと一致する。リボースを減少させるのに１００倍速い希釈法は、定量的精度が必須であり多くのサンプルの複数回の透析によって達成できない場合に価値のある方法である。
【００６９】
リボースおよびグルコースによる中間体からアマドリ後ＡＧＥ形成への直接阻害
中断および糖希釈後のＡＧＥ形成の速度が上がるのは、証明されてはいないが、高濃度のリボースが、おそらくアマドリ誘導体である第一の「安定な」中間体でまたはによってその反応を阻害していることを示唆する（概略図Ｉで囲まれた）。その後、アマドリ後反応について、直接的にリボースを添加することについての効果を調べることによって、これの試験を行った。中間体を製造するために、ＲＮａｓｅを最初２４時間０．５Ｍリボース中でインキュベートした。その後２つのプロトコールを行って、様々の濃度のリボースで、アマドリ後形成の可能性のある阻害を測定した。第一の実験では、２４時間補強されたサンプルを、０．００５Ｍから０．５０５Ｍの範囲にある様々の最終濃度のリボースを含有する溶液に１００倍希釈した（図１０Ａ）。ＡＧＥ形成の速度と範囲は、リボース濃度を増加させることによって減少されることが明瞭に分かった。十分に、０．５Ｍリボースの最高濃度まで、その動態は、指数的に見え、そして未中断のグリケーション（図６Ａ及び７Ａ）に生じる誘導期を示さない。
【００７０】
第二の試験（図１０Ｂ）も、２４時間リボースと一緒にインキュベートする間に形成される可能性のある任意の阻害生成物と同様に、２４時間中断サンプルが冷却下で激しく透析され、遊離で可逆可能に結合したリボースを放出するように行われた。この次に、一定量量を新たに造られた様々の濃度のリボースに１００倍希釈し、そして、抗原性ＡＧＥ生成物の形成を上述のように観察した。これらの結果は、透析段階が除かれた図１０Ａの実験とほとんど同じであった。両方の場合で、ＡＧＥ形成の速度と範囲は、リボースの濃度が増加するにつれて減少し、そしてその動態は、誘導期なしで対数で示された。
【００７１】
グルコースまたは他の糖も、０．５Ｍリボース中で中断グリケーションを行うことによって得られた反応性中間体からのＡＧＥの形成を阻害するかとうかという問題についても調べられた。１．０−２．０Ｍの濃度でのグルコースの効果を試験した（データは示されず）。グルコースは、明らかにリボースと同様には阻害性を示さない。２４時間リボース中断サンプルをこれらのグルコース溶液で１００倍希釈した場合、形成された抗原性ＡＧＥの量は、約３０％まで減少したが、見掛けの速度定数は、ほとんど減少しなかった。さらに、その動態は、対数的に見えた。
【００７２】
ＡＧＥ形成のアマドリ後動態でのｐＨの効果
中断グリケーション法を使用して、反応性中間体からのＡＧＥ形成のアマドリ後動態のｐＨ依存性を調べた。これらの実験で、ＲＮａｓｅ Ａを最初０．５Ｍリボースと、２４時間、ｐＨ７．５で反応させて、反応性中間体を発生した。その後、ＥＬＩＳＡ法によって、ＡＧＥに対する中間体の半減期の動態を測定した。図１１では、その動態を初期の速度によって測定する場合に、５．０−９．５の範囲の極めて広範なｐＨ範囲が達成可能であることが示されている。目立った釣鐘型の依存性が観察され、それは、抗原性ＡＧＥ形成の動態が酸性およびアルカリ性のｐＨ範囲、ｐＨ８付近で最適に減少することを示している。
【００７３】
抗原性ＡＧＥ形成の速度がもっとも遅い上で試験されたｐＨ５．０のサンプルについて、単独の「ｐＨ激増」試験も行った。３７℃、ｐＨ５．０で１２時間後、そのｐＨをただちに７．５に調整し、そして抗原性ＡＧＥ形成をＥＬＩＳＡ法によって観察した。実験上の誤差の範囲で、そのサンプルは、直接ｐＨ７．５で試験した中断グリケーションサンプルについてのＡＧＥ形成と同一の動態（速度定数の最初の桁が同じ）を示した（図１２）。
【００７４】
この試験で、相対量の抗原性ＡＧＥは、同じＥＬＩＳＡ法プレート上では直接比較できなかったが、ｐＨ激増サンプルは、いくぶん抗原性ＡＧＥのレベルが減少したが、実質的なものを形成しているように見えた。これらの結果は、中間体がＡＧＥ無しに製造でき、そしてＡＧＥへの変換の後者の試験からｐＨ５で貯蔵できることを示している。
【００７５】
アミノグアニジンによるアマドリ後ＡＧＥ形成の阻害
この中断グリケーション法、すなわち過剰で可逆的に結合したリボースを除去した後抗原性ＡＧＥのアマドリ後形成についての効果を試験することによって、アミノグアニジンの効力を試験した。図２０Ａは、これらの条件下でＲＮａｓｅ中に抗原性ＡＧＥを形成するのを封鎖する上で、アミノグアニジンが、わずか５０ｍＭ未満の阻害でもっとも穏やかな効果を示すことを例示している。たった１００以上−２５０ｍＭでおよそ５０％阻害が達成される。この試験で再度注目されるのには、中断後のみにそのタンパク質をアミノグアニジンに曝露し、そして遊離で可逆可能に結合したリボースを除去した。ＢＳＡの中断グリケーションと比較しうる結果も得られた（図２０Ｂ）。
【００７６】
中断グリケーションサンプルのアミノ酸分析
０．５Ｍリボース（未透析）との２４時間接触の後、24時間グリケーションサンプルを激しく透析した後、および３７℃で後者のサンプルを５日間インキュベートした後のＲＮａｓｅについてアミノ酸分析を行った。リシンまたは末端アミノ基に存在するシッフ塩基を還元する、シアノホウ水素化ナトリウム還元をした後、これらの例示を行った。アラニンでノーマライズされた（１２残基）全てのこれらのサンプルは、同じ残基リシン含量を示した（ＲＮａｓｅ中初原の１０の以外の４．０±０．５）。このことは、０．５Ｍリボースとの２４時間接触の後、ほとんどの形成シッフ塩基アダクトは、アマドリまたは続く生成物に変換されていることを示す。修飾によってアルギニンまたはヒスチジン残基はなんら失われない。
【００７７】
検討
迅速に反応するリボースを使用し、アマドリ後段階のその可逆可能な阻害を回復すると、ＲＮａｓｅ中でのタンパク質グリケーションの様々な段階の動態を解体し決定することを許した。タンパク質「グリケーション」についてのほとんどの先の動態研究は、実際には、シッフ塩基形成および連続アマドリ転換の「初期」段階に限定されてきた。ある種の動態研究は、合成フルクトシルアミン、すなわち、グルコースの小さなモデル化アマドリ化合物で出発して行われてきた（ＳｍｉｔｈおよびＴｈｏｒｎａｌｌｅｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１０巻：７２９〜７３９頁、１９９２年、本願に引用された文献）が、ほとんど例外なく、このような研究は、タンパク質についてはこれまで可能でなかった。１つの注目すべき例外としては、リボースで部分的にグリケーションされたＢＳＡはリボース除去後急速にペントシジンを産生するというＭｏｎｎｉｅｒ（Ｏｄｅｔｔｉら，同上、１９９２年）による例示がある。リボースのより高い反応性も、ＡＧＥ形成の時間経路を定量的に定義する上で際立った利益を証明した。グルコースおよびリボースが両方とも、ペントシジンのような同様のＡＧＥ生成物を産生する能力があることは注目され（Ｇｒａｎｄｈｅｅ およびＭｏｎｎｉｅｒ、１９９１年、同上；Ｄｙｅｒら，同上、１９９１年）、およびＡＤＰ−リボースと一緒にある種の１３Ｃ ＮＭＲモデル化合物の研究も行われた（Ｃｅｒｖａｎｔｅｅ−Ｌａｕｒｅａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２巻：１５２８〜１５３４頁、１９９３年）。これらの研究では、抗ＡＧＥ抗体とのリボースの十分な交差反応の抗原性ＡＧＥ生成物が、グルコース修飾タンパク質に指向したことを示していて、そのことがリボースおよびグルコースが、同様の抗原性ＡＧＥを生成することを示唆する。これらの２つの糖で観察される第一の動的差異は、おそらく、その機構よりもむしろアマドリ後ＡＧＥ形成を導く段階の速度定数における相対的差異によるものである。
【００７８】
示されたこの結果は、初期の研究で予想されなかった高濃度のリボースにより全てのＡＧＥ形成の目立った逆説的な阻害であることを示す（図６）。この阻害は、最初に修飾されたタンパク質を透析する（図７Ａ）、またはサンプルを１００倍希釈する（図１１で使用されるとおり）ことによって除去されるという点で迅速に可逆可能である。図１０の実験では、様々な濃度の新鮮なリボースを添加することによって行われる２４時間補足タンパク質を透析すると同じ阻害を誘導するので、初期のグリケーションの間に透析可能な阻害中間体を蓄積するためではないことが示される。図１０Ａ、Ｂのデータは、その阻害が、反応性アマドリ生成物を含有するタンパク質中間体とのリボースの可逆可能で迅速な作用によって生じることを示す。この阻害は、図９の実験で測定された推定アマドリ中間体が形成するのが迅速な速度であるため、アマドリ生成物の形成の初期段階に応用できそうにない。アマドリ生成物と反応性中間体を同定するのは、２４時間中断点で、透析の前後（シアノボロハイドレート ナトリウム還元後）に行われるアミノ酸分析によって十分に支持される。未変化の残基リシン含量は、すべての放出しうるシッフ塩基が、２４時間で（おそらくアマドリ転換によって）すでに不可逆的に変換されたことを示している。
【００７９】
「後期」であって、「初期」グリケーション段階でない第二のリボース抑制は、ほとんどＡＧＥを含有しない十分に反応能を持つ反応性アマドリ中間体を蓄積するのを増進する。中断手段によるこの単離は、遊離またはシッフ塩基結合糖、およびそれらの付随反応および複合体の不存在下で研究されるので、動態および構造の研究に重要である。例えば、抗原性ＡＧＥおよびペントシジンＡＧＥ生成物に対するアマドリ後変換速度は、測定され（図７Ａ、白抜き符号、および図８Ｂ）、そして未中断条件下（図６Ａおよび図８Ａ）での全動態に反映されるよりかなり速い（１／２−１０時間）ことが示される。測定されたペントシジンの迅速な形成は、Ｏｄｅｔｔｉら（１９９２年、同上）による初期の中断リボース試験と一致しているように見える。ＡＤＰ−リボースのようなリボースおよび誘導体は、通常の代謝物であり、観察されるＡＧＥ形成の速度が非常に速いことは、それらの濃度が、少ない相対的グルコースのものより十分に低いが、様々な細胞区分（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅａｎら，同上、１９９３年）で潜在的なグリケーションの源としてより慎重に考慮されるべきことを示唆する。
【００８０】
中間体の単離の別の新規用途は、この複合反応のｐＨ依存性を研究するうえにある。アマドリ後ＡＧＥ形成が見られる通常でない釣鐘型ｐＨのプロフィール（図１１）は、全ての反応の中程度のｐＨ依存性に明暗を与える場合である。後者の動態は、シッフ塩基およびアマドリ生成物形成を含めた反応中の全段階でｐＨの複合効果を反映し、その各々は、特定のｐＨ依存性を示しうる。これらの複合性は、ヘモグロビングリケーションの研究（Ｌｏｗｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６０巻：１１６１１〜１１６１８頁、１９８５年）によって例示されうる。釣鐘型ｐＨプロフィールは、立証されていはいないが、イオン化基の関与を示唆する。真実である場合、そのデータは、主要抗原性ＡＧＥの形成で、隣接するリシンからのように、第二のアミノ基の参与を意味しうる。観察されたｐＨプロフィールおよび記載されたｐＨ急増観察は、反応性中間体を単離し維持するのに有用な経路が２４時間中断後５．０付近にｐＨを急速に下げることによることを示唆する。
【００８１】
この動態の研究は、アマドリ中間体と組合わせて、Ｃｅｒａｍｉおよび共同研究者によって提案されたＡＧＥ阻害である、アミノグアニジン（グアニルヒドラジン）の作用の機構に新しい兆候を供する（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら，同上、１９８６年）。この提案された医薬製剤は、現在糖尿病を治療する際に可能な治療効果について治験段階ＩＩＩにある（Ｖｌａｓｓａｒａら，同上、１９９４年）。しかし、ＡＧＥ阻害の機構は、多機能であるので非常に複雑であると思われる。求核性のヒドラジンのように、開鎖グルコースおよびリボースのアルデヒドカルボニルおよびアマドリ化合物のケトカルボニルを含めて、活性カルボニルに可逆的に付加できる（Ｋｈａｔａｍｉら，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，４３巻：１７２５〜１７３１頁、１９８８年；Ｈｉｒｓｃｈら，Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．２６７巻：１７〜２５頁、１９９５年）。それは、グリオキサルおよびグルコソンのような高度に反応性のジカルボニルグリケーション中間体をスカベンジすることができるグアニジニウム化合物でもある（ＣｈｅｎおよびＣｅｒａｍｉ，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．，１２巻：７３１〜７４２頁、１９９３年；Ｈｉｒｓｃｈら，Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．，２３２巻：１２６〜１３０頁、１９９２年；ＯｕおよびＷｏｌｆｆ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４６巻：１１３９〜１１４４頁、１９９３年）。中断グリケーション法は、ＡＧＥ形成のアマドリ後段階のみについてアミノグアニジン効力を試験した。同様に重要に、アミノグアニジンと組合わせることができる遊離糖からのジカルボニル反応性フラグメントや遊離糖の不存在下で試験した（ＷｏｌｆｆおよびＤｅａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４５巻：２４３〜２５０、１９８７年；Ｗｅｌｌｓ−Ｋｎｅｃｈｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４巻：３７０２〜３７０９頁、１９９５年）。図２０の結果では、アミノグアニジンが、最善には、アマドリ後ＡＧＥ形成反応における適度な効果のみを示すことが例示され、それで１００−２５０ｍＭ以上の濃度で５０％阻害を達成する。したがって、アミノグアニジンの効力は、グリケーションの初期段階（シッフ塩基形成）を阻害するか、またはグリケーション中に発生された高度に反応のあるジカルボニルをスカベンジすることから、きわだって起こる。原請求項と反対に、アマドリ中間体を錯体にすることによってＡＧＥ形成を阻害するのは見られない。
【００８２】
中断グリケーションの使用は、動態試験に限定されない。中断グリケーションは、グリケーションタンパク質の構造試験を簡便化でき、そしてＲＮａｓｅのアマドリアダクトを検出するのに使用された１３Ｃ ＮＭＲのような技術を使用して未知のＡＧＥを同定する（Ｎｅｇｌｉａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２５８巻：１４２７９〜１４２８３、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻：５４０６〜５４１０頁、１９９５年）。構造的および動態の手法を組合せた使用は、特に興味深い。例えば、ポリクローナル抗体と主要な抗原性ＡＧＥが一致すると、最近提唱された（カルボキシメチル）リシンのような不特定の候補ＡＧＥが残るが、我々が観察した反応性中間体から同じ動態を示すにちがいない（Ｒｅｄｄｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４巻：１０６７２〜１０８７８頁、１９９５年；対比Ｍａｋｉｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻：５１３３〜５１３８頁、１９９２年）。中断動態手法の入手可能性も、このＡＧＥの形成に対する大切なアマドリ経路を決定する助けにもなる。同様に、１３Ｃ ＮＭＲのような技術で中断グリケーション反応を観察して、同様の見掛けの動態を示すものであるような他の候補である抗原性ＡＧＥの共鳴を同定する。表Ｉは、Ｃ−２富化リボースとの反応により製造されたＲＮａｓｅのアマドリ中間体の１３Ｃ ＮＭＲのピークを列記する。２０５ｐｐｍ付近の下降ピークは、おそらくアマドリ生成のカルボニルによる。全ての場合に、中断グリケーションを通して過剰の遊離およびシッフ塩基の糖を除去する能力は、相当に簡便に単離し、そして同定し、そして構造の特徴づけをおこなう。
【００８３】
表Ｉは、それらの不変または時間にともなって減少する強度のためにアマドリ後中間体に挙げられたピークを列記する。ピーク位置は、ＴＭＳから下向きにｐｐｍで記載される。
【００８４】
【表１】
2005170935.tif 000002
リボヌクレアーゼＡを２４時間、Ｃ−２で９９％富化した０．５Ｍリボースと反応させ、さらに過剰でシッフ塩基に結合したリボースを、冷却中に激しく透析することによって除去した。その後、２時間のＮＭＲスキャンを行う直前に、そのサンプルを３７℃に再度加温した。同じ条件で、天然に主要なリボースと反応したＲＮａｓｅからの信号を、ＮＭＲスペクトルから減じる。したがって、全てのピークは、Ｃ−２の位置に元をたどる富化Ｃ−１３による。いくつかのピークは、中間体の分解生成物から生じ、そしてこれらは、時間にわたってピーク強度で増加することによって同定されることもできる。図３１は、得られたＮＭＲスペクトルを示す。
【００８５】
実施例３
抗原性最終糖化産物（ＡＧＥ）の形成に対するビタミンＢ1およびＢ6誘導体ならびにアミノグアニジンによる生体外での阻害。アマドリ後動態の阻害は、全体的な糖化の阻害とは異なる
ＡＧＥ形成の以下のアマドリ後動態についての中断糖化法では、糖化反応の「後期」段階の迅速な定量試験が考慮されている。重要なことは、この方法が、概略図１に示すように、遊離糖またはシッフ塩基（Ｎａｍｉｋｉ経路）の糖酸化産物から生ずるＡＧＥ形成の経路を利用しない阻害試験を考慮に入れているということである。そのため、中断糖化法では、抗原性ＡＧＥ形成を誘導する糖化の「後期」段階の阻害剤の迅速で独特な同定および性質検討が考慮されている。
【００８６】
検討対象となったビタミンＢ1およびＢ6誘導体の中で、ピリドキサミンおよびチアミンピロリン酸は、ＡＧＥ形成のアマドリ後経路の独特の阻害剤である。重要なことに、高濃度の糖の存在下でのタンパク質の全体的なグリケーションの阻害の有効性からは、遊離糖を除去した場合のＡＧＥ形成のアマドリ後段階の阻害能が予測できない。したがって、ピリドキサミン、チアミン、ピロリン酸およびアミノグアニジンは、グルコースによるタンパク質の全体的なグリケーションでのＡＧＥ形成の強力な阻害剤であるが、アミノグアニジンは、アマドリ後ＡＧＥ形成の有効な阻害剤ではないという点で、他のふたつとは異なっている。アミノグアニジンは非中断条件下でリボースによるＡＧＥ形成の初期速度を著しく低下させるが、産生される抗原性ＡＧＥの最終量には影響を及ぼさない。異なるタンパク質（ＲＮａｓｅ、ＢＳＡおよびヘモグロビン）の検討から、ＡＧＥ形成および阻害の速度に個別変動があるとしても、阻害結果は一般的に使用されたタンパク質について非特異的であることが確認された。
【００８７】
化合物および材料  上述の実施例１と同様。
【００８８】
ＡＧＥに対するポリクローナル抗体の調製  上述の実施例１と同様。
【００８９】
ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ検出法  上述の実施例１と同様。
【００９０】
非中断リボースグリケーション分析
ウシ血清アルブミン、リボヌクレアーゼＡおよびヒトヘモグロビンを、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で３７℃にてリボースと共にインキュベートした。タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ）、０．０５Ｍリボースおよび予想阻害剤（０．５、３、１５および５０ｍＭ）をインキュベーション混合物中に同時に入れた。溶液は、蓋付き試験管に入れて暗所に保存した。一定量を採取し、反応終了時にＥＬＩＳＡ法により分析するまで、直ちに凍結した。インキュベーションは３週間（Ｈｂ）または６週間（ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ）とした。グリケーション反応では、実験期間中を通じてｐＨが一定であることを監視した。
【００９１】
中断（アマドリ後）リボースグリケーション分析
グリケーションはまず、タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を、０．２％アジ化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸緩衝液中で３７℃にて０．５Ｍリボースと共に阻害剤の非存在下で２４時間インキュベートすることによって実施された。ついで、グリケーションを中断して、冷緩衝液を頻繁に交換しながら４℃で長時間透析することにより、可逆的に結合した（シッフ塩基）過剰の糖を除去した。その後、リボースを再添加することなく、最大量のアマドリ産物と少量のＡＧＥ（タンパク質に依存）を含有するグリケーションされた中間試料を速やかに３７℃に加温した。これにより、種々の濃度（通常は３、１５および５０ｍＭ）の予想阻害剤の存在下および非存在下で、アマドリ中間産物のＡＧＥ産物への変換を開始した。種々の間隔で一定量を採取して凍結し、後に分析を行った。溶液は蓋付き試験管に入れ、決まった時間に一定量を採取する場合にのみ蓋を開け、採取物は直ちに凍結して、その後、種々の分析を行った。
【００９２】
動態的データの数値的解析
動態的データ（経時的曲線）は、ユーザーが関数を決めてパラメータを制御することにより反復することができる、ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ ２．０マイクロマス社（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．）またはＯＲＩＧＩＮマイクロカル社（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアを用いて、非線形最小二乗法により、一般的手順で一次または二次指数関数に適合させた。適合関数のパラメータの標準偏差（初期および最終縦座標値および速度定数）は、適合の精密度の測定値として回帰させた。二次指数的動態適合についての見かけ上の半減期は、ＭａｔｈＣａｄソフトウェアマイクロソフト社（ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．）の「解釈」機能を用いて決定した。
【００９３】
結果
リボースからのＡＧＥ形成の全般的動態に対するビタミンＢ6誘導体による阻害
抗原性ＡＧＥ形成の動態に対するビタミンＢ1およびＢ6誘導体の阻害作用は、ＡＧＥに特異的なポリクローナル抗体により評価した。初期阻害試験は、０．０５Ｍのリボースの継続的存在下でウシのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ）のグリケーションに対して行われ、このリボース濃度はＡＧＥ形成速度がほぼ最大となる場合のものである。図１３（対照曲線、黒四角）は、０．０５Ｍのリボースと共にインキュベートした場合、ＲＮａｓｅに対する抗原性ＡＧＥの形成が比較的迅速であることを示すもので、これらの条件下では半減期は約６日である。ピリドキサール−５’−リン酸（図１３Ｂ）およびピリドキサール（図１３Ｃ）は、濃度５０ｍＭおよび１５ｍＭでＲＮａｓｅに対するＡＧＥ形成の速度を有意に阻害した。驚くべきことに、ビタミンＢ6のアルコール型であるピリドキシンも、ＲＮａｓｅに対するＡＧＥ形成を中等度に阻害した（図１３Ｄ）。検討対象となったビタミンＢ6誘導体の中では、試験期間の６週間にわたり、５０ｍＭのピリドキサミンがＲＮａｓｅに対するＡＧＥ形成の「最終」濃度で最良の阻害作用を示した（図１３Ａ）。
【００９４】
リボースからのＡＧＥ形成の全般的動態に対するビタミンＢ1誘導体による阻害
ビタミンＢ1はいずれも高濃度でＲＮａｓｅに対する抗原性ＡＧＥを阻害したが、阻害作用はビタミンＢ6誘導体の場合に比べてより複雑であると思われた（図１４Ｃ）。阻害剤としてのチアミンピロリン酸の例では（図１４Ａ）、ＡＧＥ形成の速度およびプラトー状態での最終的なＡＧＥ産生量はいずれも低下していると思われた。阻害剤としてのチアミンリン酸（図１４Ｂ）およびチアミン（図１４Ｃ）の例では、ＡＧＥ形成速度にはほとんど影響がないと思われたが、最高のうどの阻害剤の存在下では、形成されたＡＧＥの最終濃度が実質的に低下していた。一般的に、チアミンピロリン酸は、検討対象となった低濃度では、他のふたつの化合物に比べて良好な阻害作用を示した。
【００９５】
リボースからのＡＧＥ形成の全般的動態に対するアミノグアニジンによる阻害
アミノグアニジンによるＡＧＥ形成の阻害（図１４Ｄ）は、Ｂ1およびＢ6の実験で認められたものとは明確に異なっていた。アミノグアニジンの濃度を上昇させるとＲＮａｓｅに対するＡＧＥ形成の速度が低下したが、形成されたＡＧＥの最終濃度は低下しなかった。６週間後に形成されたＡＧＥの最終濃度は、検討対象となったいずれのアミノグアニジン濃度についても対照試験の最終濃度とほぼ同一であった。
【００９６】
血清アルブミンおよびヘモグロビン中でのリボースからのＡＧＥ形成の全般的動態に対する阻害
ＢＳＡおよびヒトメトヘモグロビン（Ｈｂ）を用いて比較試験を実施し、観察された阻害がタンパク質特異的なものであるか否かを検討した。ビタミンＢ6（図１５Ａ−Ｄ）およびビタミンＢ1（図１６Ａ−Ｃ）の種々の誘導体は、各群の中で最も有効な阻害剤であるＲＮａｓｅ、ピリドキサミンおよびチアミンピロリン酸と同様に、ＢＳＡと共にインキュベートした場合、類似の阻害傾向を示した。ピリドキシンはＢＳＡに対するＡＧＥ形成を阻害しなかった（図１５Ｄ）。ピリドキサールリン酸およびピリドキサール（図１５Ｂ−Ｃ）は、ＡＧＥ形成の速度をかなり阻害したが、ＡＧＥの最終形成濃度は阻害しなかった。ピリドキサミン（図１５Ａ）は低濃度である程度の阻害を示し、検討した最高濃度ではＡＧＥ形成の最終濃度を他のＢ6誘導体のいずれに比べても有効に阻害すると思われた。Ｂ1誘導体の場合は、ＢＳＡを用いたＡＧＥ形成の阻害の全体的な度合い（図１６Ａ−Ｃ）は、ＲＮａｓｅ（図１４Ａ−Ｃ）で観察されたものに比べて小さかった。チアミンおよびチアミンピロリン酸の濃度が高くなると、ＡＧＥ形成速度には著しい影響を及ぼすことなく、形成されるＡＧＥの最終濃度が阻害された（図１６Ｃ）。ここでもアミノグアニジンはＲＮａｓｅの場合に認められたと同様、ＢＳＡを用いた場合にある程度の阻害作用を示し（図１６Ｄ）、形成されるＡＧＥの最終濃度には有意な影響を及ぼすことなく、ＡＧＥ形成速度を低下させると思われた。
【００９７】
ビタミンＢ6およびＢ1誘導体ならびにアミノグアニジンの存在下でＨｂを用いてＡＧＥ形成の動態も検討された。Ｈｂを用いてのＡＧＥ形成の見かけ上の絶対速度は、ＲＮａｓｅまたはＢＳＡのいずれかを用いた場合に比べて有意に高かった。しかし、検討した阻害剤は基本的に類似した挙動を示した。ビタミンＢ6誘導体の作用を図１７に示す。ピリドキサミンは濃度３ｍＭ以上で最大阻害を示し（図１７Ａ）、ピリドキサールリン酸（図１７Ｂ）、ピリドキサール（図１７Ｃ）およびピリドキシン（図１７Ｄ）に比べて最も効果が高かった。ビタミンＢ1誘導体の場合は（データに示さず）、阻害作用はＲＮａｓｅよりもＢＳＡの阻害傾向に、より類似していた。検討した高濃度（５０ｍＭ）での阻害はわずかに過ぎず、３種いずれのＢ1誘導体についてもほぼ３０−５０％であった。阻害の最初の発現は、形成されるＡＧＥの最終濃度の低下であった。
【００９８】
アマドリ後リボースＡＧＥ形成の動態に対するビタミンＢ6誘導体による阻害
「後期」アマドリ後ＡＧＥ形成の阻害を測定するために中断グリケーションモデルを用い、ＲＮａｓｅまたはＢＳＡの単離したアマドリ中間体を、遊離または可逆的に結合したリボースの非存在下で３７℃にてインキュベートすることによって、動態を測定した。最初に中間体を調整するために使用されたリボースは、２４時間の初期グリケーション反応後の冷透析により除去した。ＡＧＥ形成を再開させると、阻害剤の存在下でのＡＧＥの形成は極めて速やかである（半減期は約１０時間）。図１８に、ＢＳＡのアマドリ後動態に対するピリドキサミン（図１８Ａ）、ピリドキサールリン酸（図１８Ｂ）およびピリドキサール（図１８Ｃ）の影響を示す。ピリドキシンはまったく阻害を示さなかった（データに示さず）。ＲＮａｓｅに対して同様の実験を行った。ピリドキサミンは１５ｍＭおよび５０ｍＭのＲＮａｓｅを用いたＡＧＥ形成にほぼ完璧な阻害を示した（図１８Ｄ）。ピリドキサールは１５ｍＭでは有意な阻害を示さなかったが、ピリドキサールリン酸は１５ｍＭで有意な阻害を示した。ピリドキサールリン酸は、ＲＮａｓｅの活性部位に対し親和性標識能のあることが知られている（ＲａｅｔｚとＡｕｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１巻：２２２９〜２２３６頁、１９７２年）。
【００９９】
図１８Ａ−Ｃでは、ゼロ時間にリボースを除去した後にＥＬＳＡ読み取り値が高いことによって証明されるように、ＢＳＡを用いると、ＲＮａｓｅとは異なり、ＲＮａｓｅ（２５−３０％）とのインキュベーションの最初の２４時間のあいだに有意な量の抗原性ＡＧＥが形成された。ＢＳＡおよびＲＮａｓｅは共に、阻害を示す場合には、ＡＧＥ形成速度の低下としてではなく、形成されるＡＧＥの最終濃度の減少として阻害を示すと思われる。
【０１００】
アマドリ後リボースＡＧＥ形成の動態に対するビタミンＢ1誘導体による阻害
チアミンピロリン酸は、ＲＮａｓｅおよびＢＳＡを用いた場合とも、ＡＧＥ形成を他のＢ1誘導体に比べて効果的に阻害した（図１９）。チアミンは作用を示さなかったが、チアミンリン酸は中等度の作用を示した。Ｂ6測定と同様、アマドリ後阻害は、形成されるＡＧＥの最終濃度の低下として最も顕著に出現するようであった。
【０１０１】
アマドリ後リボースＡＧＥ形成の動態に対するアミノグアニジンおよびＮα−アセチル−Ｌ−リシンの作用
図２０に、ＢＳＡおよびＲＮａｓｅを用いた場合のアマドリ後ＡＧＥ形成動態の阻害に対しアミノグアニジンを検討した場合の結果を示す。５０ｍＭでは、阻害はＢＳＡの場合には約２０％で（図２０Ｂ）、ＲＮａｓｅの場合には１５％未満であった。遊離Ｎε−アミノ基のみを含有するＮα−アセチル−Ｌ−リシンを用いて、単純なアミノ酸含有機能による阻害の可能性も検討した（図２１）。Ｎα−アセチル−Ｌ−リシンは５０ｍＭまではＡＧＥ形成には有意な阻害を示さなかった。
【０１０２】
考察
多数の試験から、アミノグアニジンが非酵素的グリケーションの出現に対して強力な阻害作用を示すと思われることが立証されている（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら，Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，１９９２、１９９４、１９９５頁、１９８６年）。糖を減少させることによって誘発される種々の現象に対するアミノグアニジンの阻害作用は、これらの現象の多くでグリケーションが関与している証拠であると、広く考えられている。アミノグアニジンは近年、高濃度の糖による結合組織タンパク質のグリケーションによって引き起こされると考えられる糖尿病合併症の改善についての、第ＩＩＩ相臨床試験の第２ラウンドに投入されている。
【０１０３】
グルコースにより誘導された、ＲＮａｓｅを用いての非中断「後期」ＡＧＥ形成の動態的試験からのデータ（実施例１）からは、アミノグアニジンが有効な阻害剤であることが確認され、さらに、多数のビタミンＢ1およびＢ6誘導体は同等またはわずかにそれを上回る阻害剤であることが認められた。しかし、アミノグアニジンによる阻害は、予想外なことに、ＡＧＥ形成反応の後期段階での作用が低下するようであった。グルコースを用いてのタンパク質のグリケーションが緩慢であるため、この驚くべき観察所見を十分に検討することができなかった。さらに、アミノグアニジンの長期安定性についての疑問が存在する可能性が示唆されている（ＯｕとＷｏｌｆｆ，１９９３、上述）。
【０１０４】
リボースを用いてのより迅速なグリケーションを用いた解析は、タンパク質の非中断グリケーション中に十分な観察とて医療を行うことを目的とした、ＡＧＥ形成の十分な経時変化を考慮したものであった。中断グリケーションの利用により、独自に、遊離および可逆的に結合した（シッフ塩基）リボースの非存在下でのアマドリ後抗原性ＡＧＥ形成のみの更なる単離と検討をすることが可能となった。これらのふたつのアプローチからのデータを、初期のグルコースグリケーション動態と比較することにより、種々の阻害剤の機序および有効性に対しての新たな洞察が加えられている。図２２は、種々の濃度の阻害剤を使用した場合の一定の時間での阻害率を比較した要約データを示す棒グラフである。図２２Ａのグラフは、リボースでのＲＮａｓｅ ＡＧＥ形成の中断グリケーション後の阻害についてのデータを示す。図２２Ｂは、リボースによるＢＳＡ ＡＧＥ形成の中断グリケーション後の阻害についてのデータを示す。
【０１０５】
全般的な結果から、アミノグアニジンが糖の存在下でアマドリ後抗原性ＡＧＥの形成速度を遅延させるが、形成されるアマドリ後ＡＧＥの最終量にはほとんど影響を及ぼさないことが立証される。これより、観察所見はＡＧＥ形成の最初の「初期」段階のみに限定されるものであり、阻害剤としての有効性は実際には、アマドリ後ＡＧＥ形成の阻害の真の有効性については実際には誤って認識されている可能性のあることが示される。したがって、リボースおよび中断グリケーションを用いて反応の完全な経過を観察できるということは、アマドリ後ＡＧＥ形成の阻害の有効性についてのより完全な像を与えるものである。
【０１０６】
実施例４
ＡＧＥ形成／阻害の生体内効果の動物モデル及び試験
高血糖は、ストレプトゾシン（別名、ストレプトゾトシン、ＳＴＺ）又はアロキサンを投与することにより、ラットに迅速に誘発することができる（１もしくは２日以内）。これは糖尿病の一般的なモデルとなっている。しかしながら、これらのラットは高血糖を長い月日患った後、通常は最終段階の腎疾患（ＥＳＲＤ）による死の直前にのみ腎障害を示す。この症状は、基底膜のコラーゲンのような長命タンパク質の不可逆的なグルコース化学修飾によって引き起こされるものと信じられる。ＳＴＺ−糖尿病ラットは、高血糖誘発から大きく遅れて約４０週間で、通常は死の直前に、アルブミン尿を示す。
【０１０７】
上記実施例においてリボースの劇的な急性効果が生体外で示されたため、ラットへのリボース投与の効果及び急速なリボースグリケーションによるＡＧＥの誘発の可能性を試験した。この研究から、リボース誘発の症状が促進されたラットモデルが開発されている。
【０１０８】
生体内での非常に短期間のリボース投与の効果
第Ｉ相プロトコル
各々６匹のラットの２つの群に以下のいずれかを１日に投与した。
【０１０９】
ａ．３００ｍＭリボース（各々ｍｌで体重の５％の、６−８時間おいた２回の腹腔内注射）又は
ｂ．５０ｍＭリボース（１回の注射）。
【０１１０】
その後、ラットをさらにリボースを投与することなく４日間保ち、４日目にそれらを犠牲にして以下の生理学的測定を行った：（ｉ）初期及び最終体重；（ｉｉ）最終段階の腎臓重量；（ｉｉｉ）初期及び最終テイル−カフ血圧；（ｉｖ）体重１００ｇ当りのクレアチニンクリアランス。
【０１１１】
最初に急速な変化が予想されなかったため、アルブミン濾過速度は測定しなかった。ＳＴＺ−糖尿病ラットを用いる過去の実験では、アルブミン尿は高血糖の誘発から非常に遅れて（おそらく４０週）、動物が息絶える直前に発症することが示されている。
【０１１２】
腎臓生理の結果
ａ．最終体重及び最終的な１個の腎臓の重量は低及び高リボース処置群で同じであった。
【０１１３】
ｂ．テイル（尾部）−カフ血圧は、低リボース（１×５０ｍＭ）で処置したラットで６６±４から８３±３に、高リボース（２×３００ｍＭ）で処置したラットで６６±４から１０６±５に増加した。これらの結果を図２３の棒グラフに示す。
【０１１４】
ｃ．体重１００ｇ当りのｃｃでのクレアチニンクリアランスは、低リボース群については用量依存性の様式で０．８７±０．１５に減少し（正常範囲は約１．０−１．２と予想される）、高リボース群についてはさらに３０％、０．６２±０．１３に減少した。これらの結果を図２４の棒グラフに示す。
【０１１５】
第Ｉ相の結論
１日のリボース処置で、用量依存性の高血圧及び４日後に現われる糸球体クリアランス機能の用量依存性の低減が生じた。これらは、最後期のＳＴＺ−糖尿病ラットにのみ見られる糖尿病の重大な代謝的な変化である。これらの減少は、生体内におけるリボースによるタンパク質の不可逆的化学修飾（グリケーション）によるものであると仮説を立てることができる。
【０１１６】
より高いリボース濃度に長期間晒すことの効果
第ＩＩ相プロトコル
ラットの群（３−６）に、０．３Ｍ“低リボース用量”（ＬＲ）又は１．０Ｍ“高リボース用量”（ＨＲ）を、１日２回の注射により、（ｉ）１日、（ｉｉ）４日間の“短期間”（Ｓ）、又は（ｉｉｉ）８日間の“長期間”（Ｌ）のいずれか投与した。加えて、これらの濃度のリボースを飲料水に含めた。
【０１１７】
腎臓生理の結果
ａ．テイル−カフ血圧はリボース処置ラットの全ての群で増加し、これは第Ｉ相の結果を裏付ける（図２３）。
【０１１８】
ｂ．クレアチニンクリアランスは、リボース用量依存性及び時間依存性の様式で、全ての群において減少した（図２４）。
【０１１９】
ｃ．アルブミン浸出速度（ＡＥＲ）は、１日及び４日の露出で、リボース依存性の様式で有意に増加した。しかしながら、高用量群においては４日に対して８日で幾らかの回復が見られたが、低用量群では見られなかった。これらの結果を図２５の棒グラフに示す。
【０１２０】
ｄ．体重１００ｇ当りのクレアチニンクリアランスは、低及び高リボース群の両者について、時間依存性の様式で同程度まで減少した（図２４）。
【０１２１】
第ＩＩ相の結論
４日という少ない期間リボースに晒すことによっても、高血圧と、クレアチニンクリアランスの減少及びアルブミン濾過の増加によって表されるように腎機能障害が生じる。これらの変化は糖尿病に典型的なものであり、ＳＴＺ−糖尿病ラットにおいて最後期に見られるものである。
【０１２２】
２種類の新規治療化合物及びアミノグアニジンによる処置
第ＩＩＩ相プロトコル
６０匹のラットを以下のように９つの異なる群に無作為に分けた。これらの群には、アミノグアニジン、ピリドキサミン、及びチアミンピロリン酸の存在下及び非存在下において１Ｍリボースに８日間晒したものが含まれる。
【０１２３】
対照群
（ｉ）処置無し；
（ｉｉ）高用量（２５０ｍｇ／体重ｋｇ）のピリドキサミン（“化合物−Ｐ”）；
（ｉｉｉ）高用量（２５０ｍｇ／体重ｋｇ）のチアミンピロリン酸（“化合物−Ｔ”もしくは“ＴＰＰ”）；及び
（ｉｖ）低用量（２５ｍｇ／体重ｋｇ）のアミノグアニジン（“ＡＧ”）。
【０１２４】
試験群
（ｉ）１Ｍリボース−生理食塩水（９日間、２×９ｃｃを毎日ＩＰ）のみ；
（ｉｉ）リボースに加えて低用量（“ＬＰ”）のピリドキサミン（２５ｍｇ／体重ｋｇを９ｃｃのリボースを含む５ｍｌとして注射）；
（ｉｉｉ）リボースに加えて高用量（“ＨＰ”）のピリドキサミン（２５０ｍｇ／体重ｋｇを９ｃｃのリボースを含む０．５ｍｌとして注射）；
（ｉｖ）リボースに加えて高用量（“ＨＴ”）のチアミンピロリン酸（２５０ｍｇ／体重ｋｇを９ｃｃのリボースを含む０．５ｍｌとして注射）；及び
（ｖ）リボースに加えて低用量のアミノグアニジン（２５ｍｇ／体重ｋｇを９ｃｃのリボースを含む０．５ｍｌとして注射）。
【０１２５】
第ＩＩ相とは異なり、飲料水にはリボースは添加しなかった。リボースを導入する１日前に処置化合物を予備投与した。
【０１２６】
腎臓生理の結果
ａ．血圧は３種類の化合物単独（対照群）によって非常に僅かに増加した；リボース上昇ＢＰは化合物の同時投与によっては回復しなかった。これらの結果を図２６の棒グラフに示す。
【０１２７】
ｂ．対照群におけるクレアチニンクリアランスは、それを減少させるＴＰＰを除いて変化しなかった。
【０１２８】
ｃ．リボースを低用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のアミノグアニジン又はピリドキサミンのいずれかと同時投与した場合、クレアチニンクリアランスは正常化した。これらの結果を図２７の棒グラフに示す。
【０１２９】
ｄ．高濃度（２５０ｍｇ／ｋｇ）のピリドキサミン及びＴＰＰは、クレアチニンクリアランスのリボース誘発性の減少に対する部分的な防御のみを示した（図２７）。
【０１３０】
ｅ．アルブミン浸出速度（ＡＥＲ）は、リボースの非存在下における高用量のピリドキサミン及びＴＰＰ、並びに低用量のアミノグアニジンに加えて、リボースによっても上昇した。これらの結果を図２８の棒グラフに示す。
【０１３１】
ｆ．アルブミン浸出速度は、低用量のアミノグアニジン及びピリドキサミンの両者を同時投与することにより、正常に回復した。これらの結果を図２９の棒グラフに示す。
【０１３２】
第ＩＩＩ相の結論
腎臓機能の２つの指標によって測定されるように、ピリドキサミン及びアミノグアニジンは、共に２５ｍｇ／ｋｇで、リボース誘発性のクレアチニンクリアランスの減少及びリボース誘発性のアルブミン尿の穏やかな増加の予防において明らかに有効であり、等しく有効である。
【０１３３】
（ｉ）チアミンピロリン酸は２５ｍｇ／ｋｇでは試験しておらず；（ｉｉ）２５０ｍｇ／ｋｇのチアミンピロリン酸及びピリドキサミンはクレアチニンクリアランスの予防においては部分的に有効であるが、穏やかなタンパク尿の予防においてはおそらく有効ではなく；（ｉｉｉ）これらの非常に高い濃度及びリボースの非存在下においては、チアミンピロリン酸は単独でクレアチニンクリアランスの減少を生じ、両者はアルブミン尿の穏やかな増加を生じる。
【０１３４】
要約
腎臓機能及び糖尿病
糖尿病における持続的な高血糖は、ヒト患者のおそらく１／３において、糖尿病性の腎障害につながる。臨床的には、糖尿病性腎障害は以下のものの存在によって定義される。
【０１３５】
１．腎臓機能の低下（糸球体クリアランスの悪化）
２．尿タンパクの増加（濾過の悪化）
３．高血圧の同時存在 腎臓機能は血流（測定せず）及び糸球体クリアランスに依存し、後者はイヌリンクリアランス（測定せず）又はクレアチニンクリアランスのいずれかによって測定することができる。糸球体透過率はアルブミン濾過速度によって測定するが、このパラメータは大きく変動する。これは対数分布関数でもあり、アルブミン排泄の１００倍の増加は濾過能力の僅かに２倍の減少を示す。
【０１３６】
リボース糖尿病ラットモデル
上記基準により、リボースは、糖尿病性腎障害の徴候を、高血圧、クレアチニンクリアランス及びアルブミン尿に反映されるものとして、後に行くほど大きくはないものの、非常に迅速に誘発するものと思われる。確立されているＳＴＺ糖尿病ラットにおいては、高血糖は１−２日で迅速に確立されるが、糖尿病性腎障害の臨床的徴候には非常に遅れて、アルブミン尿についてはおそらく４０週も後に到達する。一般には、アルブミン尿は日毎及び動物毎に非常に変動し得るものであり、ヒトとは異なるが、大部分のＳＴＺラットは結局は腎障害を発症しない。
【０１３７】
化合物による処置
リボース処置動物を用いて、ピリドキサミンは、２５ｍｇ／体重ｋｇで、通常糖尿病に起因する３つの徴候のうちの２つ、すなわちクレアチニンクリアランス及びアルブミン濾過の悪化、を有効に予防するように思われる。これは、アミノグアニジンと同様に有効であった。チアミンピロリン酸の有効性は明らかではなかったが、これは２５０ｍｇ／体重ｋｇという高い濃度でそれを用いたことによるものである可能性があることは強調されるべきである。２５０ｍｇ／体重ｋｇでの結果のみを考慮した場合、ピリドキサミンは有効性がより小さいように思われる。
【０１３８】
化合物単独の効果
全般的には、ラットはこれらの化合物に対して十分に寛容であるように思われる。腎臓の重量は異常なものではなく、高血圧はほとんど発症しなかった。これらの化合物の効果は２５０ｍｇ／ｋｇでのみ試験した。チアミンピロリン酸はこの濃度でクレアチニンクリアランスを減少させるように思われるが、ピリドキサミンではそのようなことはない。両者はアルブミン尿を僅かに増加させるように思われたが、これらの測定はおそらくはほとんど信頼することはできないものであった。
【０１３９】
ヒトへの投与
平均のサイズの典型的な成人のヒトは体重が６６−７７ｋｇである。典型的には、糖尿病患者は太り過ぎである傾向にあり、１１２ｋｇを超えることもあり得る。６６−７７ｋｇの成人男性に対する推奨される摂取許容量は、１９８９年の改訂では、１日あたり１．５ｍｇのチアミン及び１日当り２．０ｍｇのビタミンＢ6が必要とされた（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６版（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｒａｔｈａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２年）９３８〜９３９頁）。
【０１４０】
ラットモデルでのアプローチに基づくと、アマドリ後ＡＧＥ形成を阻害し、それにより関連症状を阻害するのに有効であると予想されるピリドキサミン又はチアミンピロリン酸の投与量の範囲は、１ｍｇ／体重１００ｇないし２００ｍｇ／体重１００ｇの範囲に入る。アミノグアニジンと同時投与した場合の適切な範囲はより小さい。７５ｋｇの平均的な成人ついて計算すると、この範囲（１０ｍｇ／体重１ｋｇ）は約７５０ｍｇから１５０ｇ（２ｇ／体重１ｋｇ）を超える。もちろん、これは個々の患者に従って変化する。
【０１４１】
本発明は、それらの精神又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の形態で具現化し、又は他の方法で実施することが可能である。したがって、本開示及び列挙される実施例は全て説明のためのもので制限するものではないと考えられるものであって、本発明の範囲は添付の請求の範囲によって示されるものであり、全ての均等物はそこに包含されることが意図される。当該技術分野における通常の技術を有する者は本発明と等価の態様を認識することが可能であり、かつそのような態様を本開示の教示及び日常的な実験のみを用いて実施することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す一連のグラフである。図１Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１Ｂはピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、図１Ｃはピリドキサール（ＰＬ）、図１Ｄはピリドキシン（ＰＮ）の効果を示す。
【図２】図２は、ウシ血清アルブミン中のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ1誘導体とアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す一連のグラフである。図２Ａはチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図２Ｂはチアミンモノリン酸（ＴＰ）、図２Ｃはチアミン（Ｔ）、図２Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す。
【図３】図３は、ヒトのメトヘモグロビン（Ｈｂ）中のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す一連のグラフである。図３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図３Ｂはピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、図３Ｃはピリドキサール（ＰＬ）、図３Ｄはピリドキシン（ＰＮ）の効果を示す。
【図４】図４は、ヒトのメトヘモグロビン中のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ1誘導体とアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す一連のグラフである。図４Ａはチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図４Ｂはチアミンモノリン酸（ＴＰ）、図４Ｃはチアミン（Ｔ）、図４Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す。
【図５】図５は、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびアミノグアニジン（ＡＧ）による、リボヌクレアーゼＡのグリケーションの阻害を比較する棒グラフである。
【図６】図６Ａは、ＥＬＩＳＡ法で監視した、リボースによるＲＮアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）のグリケーションの動力学を示すグラフである。図６Ｂは、ｐ７．５におけるリボース濃度に対する相反性半減時間（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｈａｌｆ−ｔｉｍｅ）の依存性を示すグラフである。
【図７】図７は、グルコース（図７Ｂ）およびリボース（図７Ａ）によるＲＮアーゼの非遮断グリケーション（ｕｎｉｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）と遮断グリケーション（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）（ＥＬＩＳＡ法で検出）を比較して示す二つのグラフである。
【図８】図８は、リボースによるＲＮアーゼの非遮断グリケーションと遮断グリケーション中のペントシジンの蛍光（任意単位）の増加の動力学を示す二つのグラフである。図８Ａは０．０５Ｍのリボース存在下での非遮断グリケーションの場合を示し、図８Ｂは、インキュベーションを８時間および２４時間行った後の遮断グリケーションの場合を示す。
【図９】図９は反応性中間体の蓄積の動力学を示すグラフである。
【図１０】図１０は、リボースによるＡＧＥ生成のアマドリ後の阻害を示すグラフである。図１０Ａは、アリコートをゼロ時点でインヒビター含有緩衡液で希釈した場合のデータのグラフである。図１０Ｂは、試料を２４時間遮断し、次にインヒビター含有緩衡液で希釈した場合のデータを示すグラフである。
【図１１】図１１は、抗原性ＡＧＥの初期生成速度の、グリケーションの遮断後のｐＨに対する依存性を示すグラフである。
【図１２】図１２は、遮断されたグリケーションの後にＥＬＩＳＡ法で検出したＡＧＥ生成に対するｐＨジャンプの効果を示す二つのグラフである。ｐＨ５．０の緩衡液中に３７℃で１２日間放置した遮断試料は、ｐＨを７．５に変えたとき、低いｐＨに暴露しなかった正常な対照の試料（図１２Ａ）に比べてかなりの量のＡＧＥを産出した（３３％；図１２Ｂ）。
【図１３】図１３は、リボースによる、リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）の遮断グリケーションの間のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す。図１３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１３Ｂはピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、図１３Ｃはピリドキサール（ＰＬ）、図１３Ｄはピリドキシン（ＰＮ）の効果を示す。
【図１４】図１４は、リボースによる、リボヌクレアーゼＡの非遮断グリケーションの間のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ1誘導体とアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す一連のグラフである。図１４Ａはチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図１４Ｂはチアミンモノリン酸（ＴＰ）、図１４Ｃはチアミン（Ｔ）、図１４Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す。
【図１５】図１５は、リボースによる、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非遮断グリケーションの間のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す一連のグラフである。図１５Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１５Ｂはピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、図１５Ｃはピリドキサール（ＰＬ）、図１５Ｄはピリドキシン（ＰＮ）の効果を示す。
【図１６】図１６は、リボースによる、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非遮断グリケーションの間のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ1誘導体とアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す一連のグラフである。図１６Ａはチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、図１６Ｂはチアミンモノリン酸（ＴＰ）、図１６Ｃはチアミン（Ｔ）、図１６Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示す。
【図１７】図１７は、リボースによる、ヒトのメトヘモグロビン（Ｈｂ）の非遮断グリケーションの間のＡＧＥ生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す一連のグラフである。図１７Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１７Ｂはピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、図１７Ｃはピリドキサール（ＰＬ）、図１７Ｄはピリドキシン（ＰＮ）の効果を示す。
【図１８】図１８は、リボースによる遮断グリケーションの後のアマドリ後ＡＧＥの生成に対するビタミンＢ6誘導体の効果を示す一連のグラフである。図１８ＡはＢＳＡとピリドキサミン（ＰＭ）、図１８ＢはＢＳＡとピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、図１８ＣはＢＳＡとピリドキサール（ＰＬ）、図１８ＤはＲＮアーゼとピリドキサミン（ＰＭ）の場合を示す。
【図１９】図１９は、リボースによる遮断グリケーションの後のアマドリ後ＡＧＥ生成に対するチアミンピロリン酸の効果を示すグラフである。図１９ＡはＲＮアーゼ、図１９ＢはＢＳＡの場合を示す。
【図２０】図２０は、リボースによる遮断グリケーションの後のアマドリ後ＡＧＥ生成に対するアミノグアニジンの効果を示すグラフである。図２０ＡはＲＮアーゼ、図２０ＢはＢＳＡの場合を示す。
【図２１】図２１は、リボースによる遮断グリケーション後のアマドリ後のＡＧＥの生成に対するＮα−アセチル−Ｌ−リシンの効果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、リボースによる、ＲＮアーゼ（図２２Ａ）とＢＳＡ（図２２Ｂ）の遮断グリケーションの後のＡＧＥ生成の、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびアミノグアニジン（ＡＧ）によるアマドリ後の阻害を比較して示す棒グラフである。
【図２３】図２３はラットの尾部カフ血圧に対する、リボースによる生体内処置だけの効果を示す棒グラフである。処置は０．０５Ｍ、０．３０Ｍおよび１Ｍのリボース（Ｒ）を、１、２または８日間（Ｄ）注射して行った。
【図２４】図２４は、ラットのクレアチニン・クリアランス（体重１００ｇ当りのクリアランス）に対するリボースによる生体内だけの処置の効果を示す棒グラフである。処置は、０．０５Ｍ、０．０３Ｍおよび１Ｍのリボース（Ｒ）を１、２または８日間（Ｄ）注射して行った。
【図２５】図２５は、ラットアルブミン尿症に対するリボースによる生体内だけの処置の効果（アルブミン滲出速度）を示す棒グラフである。処置は０．３０Ｍと１Ｍのリボース（Ｒ）を１、２または８日間（Ｄ）注射して行った。
【図２６】図２６は、ラットの尾部カフ血圧に対する、リボースの存在下または非存在下でのインヒビターによる生体内処置の効果を示す。処置群は、体重１００ｇ当り２５ｍｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、体重１００ｇ当り２５ｍｇまたは、２５０ｍｇのピリドキサミン（Ｐ）、体重１００ｇ当たり２５０ｍｇのチアミンピロリン酸（Ｔ）であり、リボース存在時のリボース（Ｒ）は１Ｍである。
【図２７】図２７は、ラットのクレアチニン・クリアランス（体重１００ｇ当りのクリアランス）に対する、リボース存在下または非存在下でのインヒビターによる処置の効果を示す棒グラフである。処理群は、体重１００ｇ当り２５ｍｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、体重１００ｇ当り２５ｍｇまたは２５０ｍｇのピリドキサミン（Ｐ）、体重１００ｇ当り２５０ｍｇのチアミンピロリン酸（Ｔ）であり、リボース存在時のリボース（Ｒ）は１Ｍである。
【図２８】図２８は、ラットのアルブミン尿症に対する、リボースなしで生体内でインヒビターにより処置した場合と、リボースだけで処置した場合の効果を（アルブミン滲出速度）を示す棒グラフである。治療群は、体重１００ｇ当り２５ｍｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、体重１００ｇ当り２５ｍｇまたは２５０ｍｇのピリドキサミン（Ｐ）、体重１００ｇ当り２５０ｍｇのチアミンピロリン酸（Ｔ）であり、リボースだけの処理は、１Ｍのリボース（Ｒ）を用いて８日間（Ｄ）行った。対照群は処置していない。
【図２９】図２９は、ラットのアルブミン尿症に対する、１Ｍリボース存在下でのインヒビターによる生体内処置の効果（アルブミン滲出速度）を示す棒グラフである。治療群は、体重１００ｇ当り２５ｍｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、体重１００ｇ当り２５ｍｇと２５０ｍｇのピリドキサミン（Ｐ）、体重１００ｇ当り２５０ｍｇのチアミンピロリン酸（Ｔ）であり、リボースによる処置は１Ｍのリボース（Ｒ）による８日間の処理である。対照群は処置していない。
【図３０Ａ】図３０Ａはタンパク質からＡＧＥが生成する図を示す概略図１である。
【図３０Ｂ−Ｃ】図３０Ｂはアミノグアニジンの化学構造の概略図２である。図３０Ｃは、チアミン、チアミン−５’−リン酸およびチアミンピロリン酸の化学構造の概略図３である。
【図３０Ｄ】図３０Ｄはピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール−５’−リン酸およびピリドキサールの化学構造の概略図４である。
【図３０Ｅ−Ｆ】図３０ＥはＡＧＥ生成の動力学の模式図５を示す。図３０Ｆは、ＡＧＥの生成と中間体の生成の動力学の概略図６を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、９９％の［２−Ｃ１３］リボースとの２４時間の反応で得られたリポヌクレアーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚのＣ−１３ＮＭＲ共鳴スペクトルを示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、９９％の［２−Ｃ１３］リボースとの２４時間の反応で得られたリポヌクレアーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚのＣ−１３ＮＭＲ共鳴スペクトルを示すための対照図。
【図１】
2005170935.tif 000003
【図２】
2005170935.tif 000004
【図３】
2005170935.tif 000005
【図４】
2005170935.tif 000006
【図５】
2005170935.tif 000007
【図６】
2005170935.tif 000008
【図７】
2005170935.tif 000009
【図８】
2005170935.tif 000010
【図９】
2005170935.tif 000011
【図１０】
2005170935.tif 000012
【図１１】
2005170935.tif 000013
【図１２】
2005170935.tif 000014
【図１３】
2005170935.tif 000015
【図１４】
2005170935.tif 000016
【図１５】
2005170935.tif 000017
【図１６】
2005170935.tif 000018
【図１７】
2005170935.tif 000019
【図１８】
2005170935.tif 000020
【図１９】
2005170935.tif 000021
【図２０】
2005170935.tif 000022
【図２１】
2005170935.tif 000023
【図２２】
2005170935.tif 000024
【図２３】
2005170935.tif 000025
【図２４】
2005170935.tif 000026
【図２５】
2005170935.tif 000027
【図２６】
2005170935.tif 000028
【図２７】
2005170935.tif 000029
【図２８】
2005170935.tif 000030
【図２９】
2005170935.tif 000031
【図３０Ａ】
2005170935.tif 000032
【図３０Ｂ−Ｃ】
2005170935.tif 000033
【図３０Ｄ】
2005170935.tif 000034
【図３０Ｅ−Ｆ】
2005170935.tif 000035
【図３１Ａ】
2005170935.tif 000036
【図３１Ｂ】
2005170935.tif 000037