(57)【要約】      （修正有）【課題】糖のグリコシド結合のα、β配置を簡便に測定する技術を提供すること。【解決手段】糖のα配置のグリコシド結合に起因する特定の吸収である、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の円二色性スペクトルを測定することにより、該試料中に特定のグリコシド結合を有する糖含有物質を検出することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の円二色性スペクトルを測定する工程を包含する、該試料中に特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の検出方法。
【請求項２】
前記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、分解能が２ｃｍ−１のとき、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記糖含有物質は、単純糖および複合糖からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記糖含有物質は、単純糖、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチド、プロテオグリカン、糖ペプチド、配糖体抗生物質および配糖体有機化合物からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記特定のグリコシド結合は、α配置のグリコシド結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記特定のグリコシド結合は、α配置およびβ配置のグリコシド結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。   
【請求項１０】
以下の工程：
（Ａ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の赤外領域円二色性スペクトルを測定する工程；
（Ｂ）該目的となる試料の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較する工程、
を包含する、特定のグリコシド結合を定量する方法。
【請求項１１】
前記測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収は、あらかじめ得られた測定値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記特定のグリコシド結合は、α配置のグリコシド結合を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記定量は、α配置のグリコシド結合とβ配置のグリコシド結合との比率の定量を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；および
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段、
を備え、ここで、該約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、       
特定のグリコシド結合の糖含有物質を検出する装置。
【請求項１５】
Ｅ−２）さらに、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲを測定する手段をさらに備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段；および
Ｆ）Ｅ手段において検知された吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較し、該測定対象となる糖含有物質の存在量を算出する手段、
を備える、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の定量装置。
【請求項１７】
Ｅ−２）さらに、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲを測定する手段をさらに備える、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記測定の対象となる糖含有物質に関する情報を格納する記録手段をさらに備える、請求項１６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖のα、β配置は、糖の立体構造を決める一つの大きなパラメータであり、その配置の相違は、生物学的活性に影響を及ぼし得る。従って、糖の結合の配置を決定することが重要である。
【０００３】
糖の分析に一般的に使用される、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、質量分析（ＭＳ）などの分析方法では、糖の立体構造を決めることは困難であり、できたとしても構造が単純なものに限られている。
【０００４】
α配置などのような糖の結合の配置を決定する目的で、種々の方法が報告されているが、どれも煩雑な手順を利用するものであり、精度もよくないものが多い。
【０００５】
過渡旋光分光法のように旋光度の光学的測定が物質の立体構造決定に使用されることがあるが、旋光度の測定は、基準データと種々の比較をする手法であるものの、キラル性についてはほとんど情報を得ることができない。従って、糖のα、β配置に関しては有用な情報を得ることができない。  
【０００６】
光学活性物質中を直線偏光が通過すると、出てきた透過光はその偏光面が旋光角αだけ回転しているのと同時に、楕円偏光となっている。これは、左および右回り偏光に対する吸収強度に差が生じるためである。この現象を円二色性（Circular Dichroism; CD）という。
【０００７】
ＣＤの一例として、円偏光二色性を測定する方法（紫外円二色性＝ＥＣＤ、Electronic Circular Dichroism）がある。ＥＣＤは、キラル性の分析に利用することができるとされているが、ＥＣＤが通常測定対象とする紫外線領域には糖自体に吸収がない。従って、糖の立体構造を決定するためには、発色団（chromophore）などの他の外来物質を利用して測定することが必要であり、煩雑な作業が必要である。
【０００８】
ＣＤの他の例として、光学活性物質に円偏光した赤外光を照射することにより観測される分子振動状態の遷移に基づく吸収を赤外領域円二色性（振動円二色性＝Vibrational Circular Dichroism; VCD）という。VCDを測定することにより鏡像体間で反転した吸収が観測されることから、分子の絶対配置および溶液中での立体配座の情報を得ることができる。しかし、糖類に関しては、VCDを測定した結果が非特許文献１〜２等において報告されているのみで、しかも特定の吸収とグリコシド結合の配置に関する記載はない。
【非特許文献１】Carbohydr.Res., 133 (1984) 163-167、Carbohydr. Res., 319 (1999) 172-183
【非特許文献２】P.K.Bose,et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 6094-6095
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、糖のグリコシド結合のα、β配置を簡便に測定する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題は、本発明において、本発明者らが特定の赤外領域において、糖のα配置のグリコシド結合に起因する特定の吸収を予想外に見いだしたことによって解決された。従って、本発明は、以下を提供する。
（１）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の円二色性スペクトルを測定する工程を包含する、上記試料中に特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の検出方法。
（２）上記試料は、糖含有物質以外について実質的に除去されている、項目１に記載の方法。
（３）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む、項目１に記載の方法。
（４）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、分解能が２ｃｍ−１のとき、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの領域を含む、項目１に記載の方法。
（５）上記試料は、溶媒に溶解した後、上記測定前に静置する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（６）上記静置は少なくとも６時間である、項目５に記載の方法。
（７）上記糖含有物質は、単純糖および複合糖からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、項目１に記載の方法。
（８）上記糖含有物質は、単純糖、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチド、プロテオグリカン、糖ペプチド、配糖体抗生物質および配糖体有機化合物からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、項目１に記載の方法。
（９）上記測定は、溶媒として、ＤＭＳＯ、水、二硫化炭素、四塩化炭素、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、脂肪族アルコール、アセトニトリル、これらの重原子置換体、およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される溶媒を使用する、項目１に記載の方法。
（１０）上記試料は、糖含有物質の濃度が０．００１Ｍ〜５Ｍになるように調製されている、項目１に記載の方法。
（１１）上記測定は、変調周波数の波数として１７００ｃｍ−１〜８００ｃｍ−１を使用する、項目１に記載の方法。
（１２）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、項目１に記載の方法。
（１３）上記特定のグリコシド結合は、α配置のグリコシド結合を含む、項目１に記載の方法。
（１４）上記特定のグリコシド結合は、α配置およびβ配置のグリコシド結合を含む、項目１に記載の方法。
（１５）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１６）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程を包含する、上記試料中の特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の検出方法。  
（１７）  以下の工程：
（Ａ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の赤外領域円二色性スペクトルを測定する工程；
（Ｂ）上記目的となる試料の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較する工程、
を包含する、特定のグリコシド結合を定量する方法。
（１８）上記測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収を、上記（Ａ）の測定工程のときに測定する、項目１７に記載の方法。
（１９）上記測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収は、あらかじめ得られた測定値である、項目１７に記載の方法。
（２０）上記特定のグリコシド結合は、α配置のグリコシド結合を含む、項目１７に記載の方法。
（２１）上記定量は、α配置のグリコシド結合とβ配置のグリコシド結合との比率の定量を包含する、項目１７に記載の方法。
（２２）上記試料は、糖含有物質以外について実質的に除去されている、項目１７に記載の方法。
（２３）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む、項目１８に記載の方法。
（２４）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、分解能が２ｃｍ−１のとき、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの領域を含む、項目１７に記載の方法。
（２５）上記試料は、溶媒に溶解した後、上記測定前に静置する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（２６）上記静置は少なくとも６時間である、項目２５に記載の方法。
（２７）上記糖含有物質は、単純糖および複合糖からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、項目１７に記載の方法。
（２８）上記糖含有物質は、単純糖、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチド、プロテオグリカン、糖ペプチド、配糖体抗生物質および配糖体有機化合物からなる群より選択される少なくとも１つの糖含有物質を含む、項目１７に記載の方法。
（２９）上記測定は、溶媒として、ＤＭＳＯ、水、二硫化炭素、四塩化炭素、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、脂肪族アルコール、アセトニトリル、これらの重原子置換体、およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される溶媒を使用する、項目１に記載の方法。
（３０）上記試料は、糖含有物質の濃度が０．００１Ｍ〜５Ｍになるように調製されている、項目１７に記載の方法。
（３１）上記測定は、変調周波数の波数として１７００ｃｍ−１〜８００ｃｍ−１を使用する、項目１７に記載の方法。
（３２）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、項目１に記載の方法。
（３３）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（３４）以下の工程：
（Ａ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程；
（Ｂ）上記目的となる試料の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲ吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲ吸収とを比較する工程、
を包含する、特定のグリコシド結合を定量する方法。
（３５）以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；および
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段、
を備え、ここで、上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、     
特定のグリコシド結合の糖含有物質を検出する装置。
（３６）上記試料を、糖含有物質以外について実質的に除去する手段をさらに備える、項目３５に記載の装置。
（３７）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む、項目３５に記載の装置。
（３８）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、分解能が２ｃｍ−１のとき、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの領域を含む、項目３５に記載の装置。
（３９）上記測定は、溶媒として、ＤＭＳＯ、水、二硫化炭素、四塩化炭素、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、脂肪族アルコール、アセトニトリル、これらの重原子置換体、およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される溶媒を使用する、項目３５に記載の装置。
（４０）上記測定は、変調周波数の波数として１７００ｃｍ−１〜８００ｃｍ−１を使用する、項目３５に記載の装置。
（４１）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを判定し、表示する手段、項目３５に記載の装置。
（４２）Ｅ−２）さらに、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲを測定する手段をさらに備える、項目３５に記載の装置。
（４３）検出結果を格納する記録媒体および検出結果を表示する手段からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる手段をさらに備える、項目３５に記載の装置。
（４４）以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；および
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲを測定する検知手段、
を備え、ここで、上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域におけるＩＲ吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す、  
特定のグリコシド結合の糖含有物質を検出する装置。
（４５）以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段；および
Ｆ）Ｅ手段において検知された吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較し、上記測定対象となる糖含有物質の存在量を算出する手段、
を備える、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の定量装置。
（４６）上記試料を、糖含有物質以外について実質的に除去する手段をさらに備える、項目４５に記載の装置。
（４７）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む、項目４５に記載の装置。
（４８）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、分解能が２ｃｍ−１のとき、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの領域を含む、項目４５に記載の装置。
（４９）上記測定は、溶媒として、ＤＭＳＯ、水、二硫化炭素、四塩化炭素、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、脂肪族アルコール、アセトニトリル、これらの重原子置換体、およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される溶媒を使用する、項目４５に記載の装置。
（５０）上記測定は、変調周波数の波数として１７００ｃｍ−１〜８００ｃｍ−１を使用する、項目４５に記載の装置。
（５１）上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを判定し、表示する手段、項目４５に記載の装置。
（５２）Ｅ−２）さらに、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲを測定する手段をさらに備える、項目４５に記載の装置。
（５３）上記測定の対象となる糖含有物質に関する情報を格納する記録手段をさらに備える、項目４５に記載の装置。
（５４）検出結果を格納する記録媒体および検出結果を表示する手段からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる手段をさらに備える、項目４５に記載の装置。
（５５）以下：
Ａ）光束発射手段；
Ｂ）偏光手段；
Ｃ）円偏光発生手段；
Ｄ）試料セル；
Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲスペクトルを測定する検知手段；および
Ｆ）Ｅ手段において検知されたＩＲ吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域のＩＲ吸収とを比較し、上記測定対象となる糖含有物質の存在量を算出する手段、
を備える、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の定量装置。
【００１１】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および添付の図面、ならびに当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、糖のグリコシド結合のα、β配置を簡便に測定することができるようになり、糖含有物質のα、β配置に関する立体異性体に関する定量も簡便に行うことができるようになった。この技術を応用すれば、他の物質を使用することなく、医薬品などの糖含有物質（例えば、単純糖、糖脂質、糖タンパク質など）の純度検定にも応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００１４】
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１５】
本明細書において「糖」および「糖鎖」とは、交換可能に使用され、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、通常、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類（グルコース（Glc）、ガラクトース（Gal）、マンノース（Man）、フコース（Fuc）、キシロース（Xyl）、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、シアル酸（SA）ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、これらの単糖が複数結合した多糖、オリゴ糖などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、狭義には「糖」という場合は単位糖のみから構成される物質（単純糖）を指す。したがって、本明細書では、糖は、「オリゴ糖」、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。ただし、一般的に糖という場合、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合糖、およびそれから分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、特に言及しない場合、本明細書において「糖」および「糖鎖」は、糖含有物質と同じ意味で使用され得る。
【００１６】
本明細書において「単糖」とは、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンならびにその誘導体をいう。通常単糖は、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表されるがそれらに限定されず、フコース（デオキシヘキソース）、Ｎ−アセチルグルコサミンなども含まれる。ここで、上の式において、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。本明細書において特に言及するときは、単糖の誘導体は、置換されていない単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質をいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（NANA、シアル酸の一種）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。本明細書では、単糖という場合は、上記誘導体も包含する。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の範囲内にある。これらの単糖が複数個結合したものがオリゴ糖もしくは多糖である。通常グリコシド結合による脱水縮合であるが、非還元末端側の糖の結合の方向性によりαとβ、また夫々のどの位置の炭素に結合するかにより物性に大きく影響することが知られている。従って糖鎖構造と言う場合には、β1,4結合など結合様式が、単糖の種類（構成糖）と共に重要な情報となる。オリゴ糖と多糖との間の明確な区分は無いが、大体10-50糖程度が境界となる。本明細書では、特に言及しない限り、オリゴ糖と多糖とは交換可能に使用される。
【００１７】
本明細書において「糖含有物質」とは、糖を含む物質をいう。このような糖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される単糖、オリゴ糖、多糖類などの単純糖の他、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合糖、およびそれら複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１８】
本明細書において「単純糖」とは、実質的に糖のみから構成される物質をいう。そのような単純糖としては、例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などが挙げられるがそれらに限定されない。単純糖はまた、Ｎアセチル基、メチル基などの通常置換される置換基が結合されていてもよい。
【００１９】
本明細書において「複合糖」とは、狭義の糖と狭義の糖以外の部分とから構成される物質をいう。そのような糖以外の部分は、どのようなものであってもよい。本明細書において、複合糖としては、例えば、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチド、ムチン、ムコ多糖、プロテオグリカン、ＧＰＩアンカーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２０】
本明細書において「糖タンパク質」とは、少なくとも１種の糖鎖を含む、好ましくはそのような糖鎖が結合したタンパク質をいう。従って、特に言及しない場合、糖タンパク質は、糖ペプチドを含む。ただし、糖ペプチドと糖タンパク質とを区別する場合は、糖ペプチドは、糖タンパク質よりも小さなポリペプチドをさすことがある。通常、糖タンパク質は、高等生物において機能を発揮するために必要な糖鎖を有している。そのような糖タンパク質しては、例えば、Ｎ結合型糖鎖、Ｏ結合型糖鎖、Ｃ結合型糖鎖を単独で、あるいはそれらの複数種類を有する糖タンパク質が挙げられるがそれらに限定されない。そのような糖タンパク質は、酵素（例えば、酸化還元酵素（レダクターゼ）、転移酵素(トランスフェラーゼ)、加水分解酵素(ヒドロラーゼ)、脱離酵素(リアーゼ)、異性化酵素(イソメラーゼ)、合成酵素(リガーゼ)など）；ホルモン（例えば、ペプチド系のホルモン(インスリン、エリスロポエチン、グルカゴン，下垂体の諸ホルモン，副甲状腺ホルモンなど)；サイトカイン（例えば、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類など）；増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）など）；結合因子；抗体；ワクチン；レセプター；構造タンパク質；血清タンパク質などを包含するが、それらに限定されない。
【００２１】
本明細書において糖の「構造」には、立体配置などが含まれる。本発明が測定の対象とする立体配置には、糖のグリコシド結合のα配置およびβ配置が挙げられるがそれらに限定されない。糖の構造としては、この他に、例えば、アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖（N結合型糖鎖）、ムチンおよびムチン結合型糖タンパク質糖鎖（O結合型糖鎖）、糖脂質、糖ヌクレオチド、プロテオグリカン、ＧＰＩアンカーなどに含まれる糖鎖ならびに遊離糖鎖、それらの前駆体の構造が挙げられるが、本発明の測定においてはこれらの他の構造もまた追加的に分析され得る。そのような他の構造の分析方法は、当該分野において公知の方法を用いて実施することができる。
【００２２】
ここで、本明細書において「α配置」、「β配置」とは、当該分野において使用されるのと同様の意味で用いられ、その配置を有する異性体をそれぞれαアノマー、βアノマーともいう。アノマーとは、C１の立体配置のみを異にする一対の異性体をいう。単糖をFischer投影で描いたとき、アノマー中心とアノマー参照原子の配置が同じ向き（右か左かで）のものをα-アノマー、逆向きのものをβ-アノマーという。例えば、以下のようなものが例示される。
【００２３】
┌−−−−┐
｜        │
Ｈ−Ｃ−ＯＨ  │  ←  右向き
｜        │
Ｈ−Ｃ−ＯＨ  │
｜        │
ＨＯ−Ｃ−Ｈ    │
｜        │
Ｈ−Ｃ−ＯＨ  │
｜        ｜
Ｈ−Ｃ−Ｏ−−┘  ←  右向き
｜        
ＣＨ2ＯＨ 
α-D-Glucopyranose [IUPAC-IUBMB/CAS]
α-D-グルコピラノース 
┌−−−−−−┐
｜            │
ＨＯ−Ｃ−ＣＨ2ＯＨ │  ←  左向き
｜            │
ＨＯ−Ｃ−Ｈ        │
｜            │
Ｈ−Ｃ−ＯＨ      │
｜            ｜
Ｈ−Ｃ−Ｏ−−−−┘  ←  右向き
｜        
ＣＨ2ＯＨ 
β-D-Fructofuranose [IUPAC-IUBMB/CAS]
β-D-フルクトフラノース。
【００２４】
α配置のグルコースとβ配置のグルコースとは、以下のようなヘミアセタール結合を通じて、互いに転移し得ることが知られている。
【００２５】
【化１】
2005069998.tif 000002
本明細書において、試料は、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質を検出することが目的であればどのような試料であってもよく、生体物質、医薬製品などが挙げられる。測定対象となる試料は、前処理なしに用いることができるが、好ましくは、測定対象となる波数領域（代表的に、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域）に干渉するような物質が実質的に除去されていることが有利である。ここで、実質的に除去されているとは、測定に影響がない程度に除去されていることを意味する。そのような干渉し得る物質としては、上記特定の領域に吸収がある糖含有物質以外の任意の物質が挙げられる。そのような干渉し得る物質は、可能性のある物質の単体または実質的に精製された標品を事前にＶＣＤおよび／またはＩＲで測定して、特定の波数領域に吸収があるかどうかを確認することによっても同定することができる。
【００２６】
除去すべき物質がある場合、試料は、前処理によってそのような物質を除去することができる。そのような前処理は、当該分野において周知の任意の精製、分離方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、クロマトグラフィー、電気泳動などが挙げられる。そのようなクロマトグラフィーとしては、例えば、ＨＰＬＣ、中速クロマトのようなカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、糖に特異的な構造物（例えば、レクチン、抗体など）を使用するアフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２７】
（ＶＣＤの測定）
本明細書において「円二色性」（ＣＤ）と は、円偏光円二色性とも呼ばれ、キラル物質でみられ、円偏光に対する吸収が右偏光と左偏光とで異なる現象をいう。円二色性は、代表的に、左円偏光と右円偏光との吸収の差である差吸光度（ΔＡ）で表すことができる。ΔＡは、従って、ＡＬ−ＡＲで表すことができ、ここでＡＬは左円偏光であり、ＡＲは右円偏光である。
【００２８】
本明細書において「振動円二色性」（ＶＣＤ）とは、R. K. Dukor et al., Encyclopedia of Analitical Chemictry, John Wiley& Sons, New York,2000,pp.662-675などで報告されている手法であり、従来の電子励起を用いた円二色性の測定に代えて分子振動を用いた測定による検出法をいう。ＶＣＤでは、赤外領域の電磁波が利用され、分子振動遷移が引き起こされる。ＶＣＤでは、通常、８００ｎｍ以上の波長の光が観察され得る。ＶＣＤは、光学活性物質に円偏光した赤外光を照射することにより観測される分子振動状態の遷移に基づく。VCDを測定することにより鏡像体間で反転した吸収が観測されることから、分子の絶対配置および溶液中での立体配座の情報を得ることができる。
【００２９】
本発明において円二色性を測定するための測定装置は、代表的に、光束発射手段、偏光手段、円偏光発生手段、試料セルおよび検知手段を備える。この測定装置において、試料セルは、測定光が通過する任意の位置に配置されることができる。
【００３０】
光束発射手段は、代表的に、所望の単色光を発射することができるものを使用することができるが、それらに限定されない。そのような光束発射手段としては、任意のものを利用することができる。
【００３１】
偏光手段は、光束発射手段からの単色光を、所定の振動方向の直線偏光とすることができるものを使用することができるが、それに限定されない。そのような偏光手段としては、任意のものを利用することができる。
【００３２】
円偏光発生手段は、任意の光弾性変調素子を用いて偏光手段の直線偏光から左右円偏光を交互に作るものを使用することができるが、それに限定されない。そのような円偏光発生手段手段としては、任意のものを利用することができる。そのような光弾性変調素子としては、任意のものを利用することができる。
【００３３】
試料セルは、糖含有物質を含むまたは含むと推定される試料が入れられ、光弾性変調素子からの左右円偏光が、その試料を通過するように配置されるものが使用され得る。この測定装置において、検知手段は、試料からの透過光の光量を検出する。光の通過を安定にするために、試料セルを保持する保持手段を備えていてもよい。試料セルとしては、どのような材質のものを用いてもよいが、試料に適合するものを用いることが好ましい。そのような材質としては、例えば、フッ化バリウム、フッ化カルシウム、石英などが挙げられるがそれらに限定されない。試料セルは、所望の光路長を有することが好ましい、そのような光路長は、代表的に、１μｍ〜１００μｍのもの（例えば、７２μｍ）が使用され得るがそれらに限定されない。
【００３４】
本発明の装置において、検知手段は、所望の特定の波数（代表的に、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域）を測定することができれば、どのような検知器を用いてもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明の装置は、検知した測定値を表示する手段（例えば、ディスプレイ、プリンターなど）を備えていてもよい。
【００３６】
別の実施形態では、本発明の装置は、測定に必要な情報（例えば、測定の対象となる糖含有物質に関する情報など）および／または測定した情報を格納する記録媒体を備えることが好ましい。そのような記録媒体としては、例えば、ハードディスク、フレキシブルディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−Ｒ、またはネットワーク上の伝送媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３７】
本発明では、検知手段、測定値を表示する手段、記録媒体またはそれを読み書きするためのドライブ、計算をするＣＰＵなどはバスで接続されていることが好ましい。
【００３８】
ここで、円二色性の測定は、このような測定装置または他の円二色性分光器（ＣＤ分光器）を用いて行ない、測定値としては差吸光度（ΔＡ）などが求められ得る。
【００３９】
差吸光度（ΔＡ）は、左円偏光に対する吸光度（ＡＬ）から右円偏光に対する吸光度（ＡＲ）を引いた吸光度差であり、つぎの（１）式で定義される。
【００４０】
ΔＡ＝ＡＬ−ＡＲ＝Δε×ｃ×Ｌ（１）
ここで、Δεはモル吸光係数の差、ｃは濃度（mol／１）、Ｌは光路長（ｃｍ）である。ΔＡはそれぞれの波長で求めることができ、波長によってΔεが異なる。従って、モル吸光係数の差もまた、本発明の検出において利用することができる。
【００４１】
このように本発明では、ΔεおよびΔＡのいずれを使用しても、特定領域での吸収を観察することができるが、ΔεまたはΔＡを利用する場合、絶対値を用いて評価することもできるが、コントロール（すなわち、糖含有物質を含まない試料を用いた場合の値）を基準にそれとの相対値を用いて評価することもできる。
【００４２】
本明細書において、特定の波長の吸収は、波長自体で測定値を表すことができるが、その逆数である波数（代表的に、ｃｍ−１という単位が用いられる）を使用してもよい。ここで、円二色性を測定する際には、波数は、波長の逆数に１００００を乗じることによって得られる。
【００４３】
本発明の測定法は、特定の立体配置を有する糖含有物質の定量分析にも適用することができる。定量を行なう際には、ＣＤの測光値楕円率（θ）または差吸光度（ΔＡ）のいずれでも用いることができ、代表的にある波長で（１）式を用いて定量を行なうことができる。本発明では、特定の波数、代表的に、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、好ましくは、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部において円二色性スペクトルを測定し、吸収の存在を検出することによって、α配置のグリコシド結合を有する糖含有物質を検出することができる。本発明の測定法において、スペクトルがお互いに重なり合い、他の成分の寄与が無視できないとき、または、それぞれの成分がお互いに干渉しあったりする場合は、スペクトルのデータを重回帰分析、部分最小二乗法（ＰＬＳ＝Partial Least Squares）などの多変量解析で処理することができる。
【００４４】
測定する目的の試料は、測定に適した溶媒に溶解されていることが好ましい。本発明では、測定において使用することができる限り、どのような溶媒であっても使用することができるが、そのような溶媒としては、例えば、ＤＭＳＯ、水、二硫化炭素、四塩化炭素、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、脂肪族アルコール、アセトニトリル、これらの重原子置換体、およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される溶媒などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい溶媒としては、ＤＭＳＯ−ｄ６が挙げられる。測定領域における干渉がほとんどないからである。ここで、目的の試料は、測定に適した溶媒に溶解してから、一定時間静置してから、ＶＣＤまたはＩＲの測定がされることが好ましい。そのように一定時間静置させることによって、分子の振動状態が安定化し、より精度の高い測定を行うことができるからである。そのような静置の条件としては、例えば、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、より好ましくは少なくとも６時間などが挙げられるがそれらに限定されない。このような一定時間の最低限の数値、好ましい数値は、対象となる物質、溶媒などによっても変動し得る。
【００４５】
測定する試料は、少なくとも、０．００１Ｍの濃度で測定対象である糖含有物質を含んでいることが好ましいがそれに限定されない。通常、その程度の濃度で検出することができるからである。従って、そのような最低限の濃度に達していない場合、試料を濃縮してから、検出をおこなってもよい。
【００４６】
測定する試料は、変調周波数の波数として、本発明の目的に適する波数であれば、どのような波数であっても用いることができ、通常、１７００ｃｍ−１〜８００ｃｍ−１、代表的には例えば約１２００ｃｍ−１を用いることができるが、それに限定されず、この範囲以外の波数もまた、任意の使用することができる。
【００４７】
（ＩＲの測定）
別の局面において、本発明ではまた、特定の領域（代表的に、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域）において、赤外線分光（ＩＲ）自体を測定し、吸収の存在により試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質を検出する方法および装置を提供する。
【００４８】
赤外線分光測定は、当該分野において周知の方法であり、本明細書においては、どのような方法および装置（島津製作所、日本分光などから市販される装置でよい）を用いて測定することができる。
【００４９】
（定量測定）
本発明は、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質を定量する方法および装置を提供する。ここで、「定量」とは、本明細書において、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質が、ある試料においてどの程度の量含まれているかどうかを決定することをいう。
【００５０】
本明細書において、定量は、測定の対象となる糖含有物質について、本発明の手法によりＶＣＤおよび／またはＩＲの吸収に関する測定値（標準値、基準値ともいう）を得、その測定値に基づいて検量線を作成し、検量線と、測定対象の試料のＶＣＤおよび／またはＩＲの測定値とから外挿することによって、行うことができる。ここで、「測定の対象となる糖含有物質」とは、既知量の特定のグリコシド結合（例えば、α配置）を有する糖含有物質をいう。
【００５１】
本明細書において、定量は。特定量のグリコシド結合の比率を定量することを包含する。そのような定量としては、代表的に、α配置のグリコシド結合とβ配置のグリコシド結合との比率が挙げられるがそれに限定されない。
【００５２】
（本発明を実施するための好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。  
【００５３】
１つの具体的な局面において、本発明は、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質（例えば、単純糖、糖タンパク質のような複合糖）を試料中において検出する方法を提供する。本発明の方法は、特定の赤外線領域の波長または波数において、α配置を有する糖含有物質が吸収を有し、β配置を有する糖含有物質がその吸収を阻害する傾向を有することを発見したことによって達成された。従って、本発明の方法は、この特定の領域において、目的となる試料の円二色性スペクトルを測定する工程を包含することを特徴とする。本発明において、その特定の波数は、代表的には、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域であるが、その近傍における赤外吸収もまた、α配置の糖含有物質の測定に使用され得ることがあることは理解され得る。ここで、「少なくとも一部を含む」とは、少なくとも１点の波数において、円二色性スペクトルが測定されることを含む。この領域がα配置を有する糖含有物質の特定の吸収を示すことから、本発明において、この領域における吸収は、α配置を有する糖含有物質の存在を示すと解釈する。
【００５４】
好ましくは、本発明の方法における赤外吸収の波数の領域は、少なくとも約１１５４ｃｍ−１〜１１３７ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む。この領域において、特にα配置を有する単純糖（例えば、単糖、二糖など）の特徴的吸収のピークが見られていることから、この領域の円二色性スペクトルを測定することによって、より精度の高い測定を行うことができる。
【００５５】
より好ましい実施形態において、分解能が２ｃｍ−１のとき、本発明の上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域は、約１１５４ｃｍ−１、約１１５０ｃｍ−１、約１１４６ｃｍ−１、約１１４４ｃｍ−１、約１１４２ｃｍ−１および約１１３８ｃｍ−１からなる群より選択される少なくとも１つの点を含み得る。この特定の波数は、分解能が２ｃｍ−１のときの数値であり、より分解能が上がればその間の点においてもピークが見出され得ることが理解され得る。この特定の領域には、特にα配置を有する単純糖（例えば、単糖、二糖など）の特徴的吸収のピークがあることから、これら特定の点での円二色性スペクトルを測定することによって、特定のグリコシド結合の（代表的に、α配置を有する）糖含有物質のより効率のよい測定を行うことができる。
【００５６】
本発明では、単純糖としては、Ｎアセチル化、メチル化などの通常置換され得る置換基が結合したものも測定することができる。
【００５７】
本発明の方法は、単純糖以外に複合糖も測定することができる。通常、複合糖において、特定のグリコシド結合に起因する吸収は、対応する単純糖の吸収とほぼ同様であることから、上記特定の領域はまた、複合糖における特定のグリコシド結合の測定に適用することができる。本発明では、そのような複合糖としては、例えば、任意の生体物質、医薬品などが挙げられるがそれらに限定されず、例えば、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチドなどが挙げられる。
【００５８】
本発明の方法では、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す。理論に束縛されないが、β配置のグリコシド結合を有する糖含有物質は、この領域においては吸収がほとんどないようである。従って、本発明では、測定の対象となる特定のグリコシド結合は、通常α配置のグリコシド結合を含むが、それに限定されず、別の実施形態では、特定のグリコシド結合は、α配置およびβ配置のグリコシド結合の両方を含み得る。このような場合、例えば、α配置およびβ配置の両方の糖含有物質の総量を算出することによって、α配置のものとβ配置のものとの量を決定することができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＶＣＤの測定に加え、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程をさらに包含していてもよい。ＩＲもまた、同様の領域に特定のグリコシド結合に由来する吸収を示すことから、本発明の方法の検出を確実にするために利用され得る。
【００６０】
あるいは、本発明では、約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料のＩＲを測定する工程のみを用いて、試料中の特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の検出することもできる。
【００６１】
別の局面において、本発明は、（Ａ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域において、目的となる試料の赤外領域円二色性スペクトルを測定する工程；（Ｂ）該目的となる試料の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較する工程、を包含する、特定のグリコシド結合を定量する方法を提供する。ここで、工程（Ａ）は、上述の測定方法と同様に行うことができる。工程（Ｂ）では、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収を、（Ａ）を測定するときに、同時に測定してもよく、あるいは、予め標準曲線を作成していてもよい。大量に測定する場合は、予め標準として測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収を測定しておき、Ａ工程ごとに新たに標準検量線を測定することなく比較することができる。より正確な測定を行いたいとき、あるいは、測定条件が変更したかまたは変更された可能性がある場合は、新たに標準検量線を測定し直すことが好ましい。
【００６２】
本発明の上記定量方法では、α配置のグリコシド結合を含む糖含有物質を定量することができる。別の実施形態では、本発明の定量は、α配置のグリコシド結合とβ配置のグリコシド結合との比率の定量を行うことができる。理論に束縛されないが、α配置を有する糖含有物質は、上記特定の赤外領域において、特定の吸収ピークを有し、他方、β配置を有する糖含有物質は、同様の赤外領域において、その特定の吸収ピークにおいて少なくとも影響がないようであるからである。
【００６３】
別の局面において、本発明は、本発明の上記方法を実現するための装置を提供する。従って、本発明は、Ａ）光束発射手段；Ｂ）偏光手段；Ｃ）円偏光発生手段；Ｄ）試料セル；およびＥ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段を備える、特定のグリコシド結合の糖含有物質を検出する装置を提供する。ここで、上記約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域における吸収は、試料中にα配置のグリコシド結合を有する糖含有物質が存在することを示す。本発明においては、光束発射手段、偏光手段、円偏光発生手段、試料セル、検知手段は、上記本発明の方法を実現することができる限り、どのようなものであっても用いることができる。これらの手段の配置は、通常、光束発射手段、偏光手段、円偏光発生手段、試料セル、検知手段の順に並んでいる。
【００６４】
他の局面において、本発明は、Ａ）光束発射手段；Ｂ）偏光手段；Ｃ）円偏光発生手段；Ｄ）試料セル；Ｅ）約１１７０ｃｍ−１〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の円二色性スペクトルを測定する検知手段；およびＦ）Ｅ手段において検知された吸収と、測定の対象となる糖含有物質の約１１７０〜１１３０ｃｍ−１の領域の少なくとも一部を含む赤外領域の吸収とを比較し、該測定対象となる糖含有物質の存在量を算出する手段、を備える、特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の定量装置を提供する。
【００６５】
好ましくは、本発明の装置は、ＶＣＤを測定する手段に加えて、ＩＲを測定する手段および／またはＩＲに基づいて特定対象の糖含有物質の存在を検出する手段を備えていてもよい。
【００６６】
別の局面では、本発明は、ＩＲを測定する手段および／またはＩＲに基づいて特定対象の糖含有物質の存在を検出する手段を用いて特定のグリコシド結合を有する糖含有物質の定量装置を提供する。
【００６７】
本発明の具体的に使用される上記装置は、上記本発明の方法を具現化するためのより好ましい実施形態を実現する手段を任意に用いてもよい。
【００６８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明の実施例を記載する。実施例では、まず市販の糖を用いて行った。
【００７０】
（実施例１：単糖類のＶＣＤおよびＩＲ測定）
この実施例では、例示的に、単純糖として単糖類を測定した。
以下に示す単糖類（１）〜（１０）を以下の条件でVCDおよびＩＲを測定した。その結果を図１（図１Ａ〜図１Ｂ）に示す。単糖類（１）〜（１０）は試薬として購入可能であり、本実施例では、和光純薬、ＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈから購入したものを使用した。
【００７１】
［使用した単糖］
（１）Ｄ−グルコース  
（２）Ｄ−ガラクトース
（３）Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ
（４）Ｄ−マンノース
（５）Ｄ−キシロース
（６）Ｄ−ＧａｌＮＡｃ
（７）Ｌ−フコース
（８）Ｎｅｕ５Ａｃ
（９）Ｄ−グルクロン酸
（１０）Ｄ−リキソース。
【００７２】
［測定条件］
使用機器：Chiralir（Bomem/BioTools社）
濃度：0.16M
使用セル：フッ化バリウム窓板セル（光路長72マイクロメートル）
測定時間：3時間（積算回数13500回）
分解能：8cm-1
modulationfrequency （至適波長）：1200cm-1中心。
使用溶媒：DMSO-d6（サンプルを溶かしてから6時間以上静置したものを測定）。
【００７３】
以上の条件で測定した結果を図１に示す。本実施例で使用した化合物は、平衡により、αアノマーとβアノマーとの混合物になることから、α配置のグリコシド結合を有する糖が存在するというのではなく、平衡により一部がα配置をもった糖混合物として存在する。図１から明らかなように、α配置のグリコシド結合を有する糖を含む混合物は、約１１７０−１１３０ｃｍ−１の領域の波数にＶＣＤおよびＩＲの特徴的な吸収が存在することがわかった。さらに、αアノマーとβアノマーとの対比で測定結果を図２に示す。図２からわかるように、１位にα配置のグリコシド結合を有する糖は、分解能が本実施例におけるように２ｃｍ−１であるとき、1150、1146、1144、1142、1138 cm-1で示される波数にＶＣＤおよびＩＲの特徴的な吸収ピークを示し、約１１７０−１１３０ｃｍ−１の領域の波数にＶＣＤおよびＩＲの特徴的な吸収が存在することがわかった。
【００７４】
（実施例２：単糖類の水での測定）
実施例１と同様の条件で、使用溶媒としてDMSO-d6に代えてＨ２Ｏを用いて同様の測定を行ったところ、同様のピークが観察され、約１１７０−１１３０ｃｍ−１の領域の波数に特徴的な吸収が存在することがわかった。
（実施例３：二糖類のVCDおよびIR測定）
以下に示す二糖類（１１）〜（２１）を以下の条件でVCDおよびIRを測定した。使用した二糖の構造を図３に示す。その結果を図４に示す。二糖類（１１）〜（２１）として、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、和光純薬（株）などから試薬として購入下ものを使用した。
【００７５】
[使用した二糖]
（１１）α，α−トレハロース
（１２）α，β−トレハロース（ネオトレハロース）
（１３）β，β−トレハロース（イソトレハロース）
（１４）コジビオース（Ｋｏｊｉｂｉｏｓｅ）
（１５）ソフォロース（Ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）
（１６）ニゲロース（Ｎｉｇｅｒｏｓｅ）
（１７）ラミナリビオース（Ｌａｍｉｎａｒｉｂｉｏｓｅ）
（１８）マルトース（Ｍａｌｔｏｓｅ）
（１９）セロビオース（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）
（２０）イソマルトース（Ｉｓｏｍａｌｔｏｓｅ）
（２１）ゲンチオビオース（Ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）
［測定条件］
使用機器：Chiralir（Bomem/BioTools社）
濃度：0.08M
使用セル：フッ化バリウム窓板セル（光路長72マイクロメートル）
測定時間：3時間（積算回数13500回）
分解能：8cm-1
modulationfrequency （至適波長）：1200cm-1中心。
使用溶媒：DMSO-d6（サンプルを溶かしてから6時間以上静置したものを測定。）
図４からわかるように、１位にα配置のグリコシド結合を有する糖は。1154、1150、1146、1142、1138 cm-1で示される波数にＶＣＤおよびＩＲの特徴的な吸収ピークを示し、約１１７０−１１３０ｃｍ−１の領域の波数にＶＣＤおよびＩＲの特徴的な吸収が存在することがわかった。
【００７６】
（実施例４：水を用いた二糖類の測定）
実施例３において使用した溶媒に代えてＨ２Ｏを使用して同様の測定を行ったところ、実施例３と同様のピークにおいて特徴的な吸収を観測した。従って、本発明は、単糖類のみならず、多糖類でも、かつ、どのような溶媒であっても、測定することができることが分かる。
【００７７】
従って、実施例１〜４の結果から、
【００７８】
【化２】
2005069998.tif 000003
【００７９】
で表される糖は、約１１４５ｃｍ−１の周辺、特に、１１７０〜１１３０ｃｍ−１、特に１１５４〜１１３７ｃｍ−１に特徴的な吸収を示すことがわかる。
【００８０】
（実施例５：多糖類の測定）
実施例１〜４における測定において、対象としてさらに大きな分子（多糖類）を用いて実験を行う。その結果、実施例１〜４における領域において同様のピークを観察することができる。
【００８１】
（実施例６：複合糖の観察）
実施例１〜４における測定において、対象として複合糖（ここでは、糖タンパク質、糖脂質）を用いて実験を行う。その結果、実施例１〜４における領域において同様のピークを観察することができる。
【００８２】
（実施例７：糖のジアステレオ選択性の定量）
以下に示すマルトース0.25Mとセロビオース0.25Mに調製した溶液を、０：１００、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、および１００：０の比で混合した溶液を調製した。それぞれの溶液について、以下の条件でVCDを測定した。その結果を図５に示す。本実施例では、糖として、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ社、和光純薬（株）などから購入したものを使用した。
【００８３】
［測定条件］
使用機器：Chiralir（Bomem/BioTools社）
使用セル：フッ化バリウム窓板セル（光路長72マイクロメートル）
測定時間：1時間（積算回数4500回）
分解能：8cm-1
modulationfrequency （至適波長）：1200cm-1中心。
使用溶媒：DMSO-d6（サンプルを溶かしてから6時間以上静置したものを測定。）。
【００８４】
マルトース：セロビオースの比が0:100および100:0のときのバンド（本明細書において、グリコシドバンド（Glycoside band）ともいう）の強度を基準に、各組成のVCDにおけるGlycosidebandの強度からマルトースの割合の予想値を算出した。実際に含まれているマルトースの割合と予想値の関係を表１および図６に示す。
【００８５】
【表１】
2005069998.tif 000004
【００８６】
表１および図６からわかるように、VCDの測定結果から予想されるマルトースの割合は、実際に含まれているマルトースの割合とほぼ一致する。したがって、VCDの測定結果を利用することにより、溶液中に含まれているα結合を有する糖の含有量を予測することが可能である。
【００８７】
（実施例８：未知試料の定量）
次に、未知試料の定量を行った。
【００８８】
以下に示すマルトース0.25Mに調製した溶液を用いて、０．２５Ｍ、０．２２５Ｍ、０．２Ｍ、０．１７５Ｍ、０．１５Ｍ、０．１２５Ｍ、０．１Ｍ、０．０７５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０２５Ｍおよび０Ｍの溶液を調製した。ランダムにおよそ０．１１Ｍおよび０．２９Ｍのマルトース溶液を未知試料として調製した。それぞれの溶液について、以下の条件でVCDを測定した。本実施例では、糖として、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ社、和光純薬（株）などから購入したものを使用した。
【００８９】
［測定条件］
使用機器：Chiralir（Bomem/BioTools社）
使用セル：フッ化バリウム窓板セル（光路長72マイクロメートル）
測定時間：1時間（積算回数4500回）
分解能：8cm-1
modulationfrequency （至適波長）：1200cm-1中心。
使用溶媒：DMSO-d6（サンプルを溶かしてから6時間以上静置したものを測定。）
マルトースの濃度と、グリコシドバンド（Glycoside band）の強度とから検量線を作成した。これに、未知試料の測定値から、マルトースの割合の予想値を算出したところ、それぞれ０．１１４Ｍおよび０．２９５Ｍであった。従って、本発明のほうほうでは、実際に、α配置のグリコシド結合を有する糖含有物質の絶対量の定量を行うことができることが実証された。
【００９０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によって、糖のグリコシド結合のα、β配置を簡便に測定することができるようになり、糖含有物質のα、β配置に関する立体異性体に関する定量も簡便に行うことができるようになった。この技術を応用すれば、他の物質を使用することなく、医薬品などの糖含有物質（例えば、単純糖、糖脂質、糖タンパク質など）の純度検定にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】単糖のＶＣＤおよびＩＲのスペクトル測定結果例を示す。図１Ａでは、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−フコースおよびＤ−リキソースの測定結果を示す。
【図１Ｂ】単糖のＶＣＤおよびＩＲのスペクトル測定結果例を示す。図１Ｂでは、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−ＧａｌＮＡｃの測定結果を示す。
【図２Ａ】αアノマーとβアノマーとの間のＶＣＤ／ＩＲのスペクトル比較例を示す。図２Ａでは、左から、Ｄ−グルコース、１−メチル−Ｄ−グルコースおよび１−メチル−Ｄ−ガラクトースを示す。上段はαアノマーを示し、下段はβアノマーを示す。
【図２Ｂ】αアノマーとβアノマーとの間のＶＣＤ／ＩＲのスペクトル比較例を示す。図２Ｂでは、左から、Ｄ−マンノースおよび１−メチル−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃを示す。上段はαアノマーを示し、下段はβアノマーを示す。
【図３】本発明の1実施形態である二糖の例示として実施例において測定したグルコビオースの構造およびそのグリコシド結合様式を示す。
【図４】本発明の1実施形態である二糖の例示として実施例において測定したグルコビオースのＶＣＤ／ＩＲスペクトルの測定例を示す。
【図５】本発明の別の実施形態である、定量のための測定結果を示す。マルトース／セルビオース混合物のＶＣＤ測定結果を示す。
【図６】図５の結果に基づいた標準検量線を示す。
【図１Ａ】
2005069998.tif 000005
【図１Ｂ】
2005069998.tif 000006
【図２Ａ】
2005069998.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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