(57)【要約】      （修正有）【課題】複雑な生物学的材料、特に微生物の試料の特性を明らかにするＦＴＩＲ偏光解析装置と方法とを提供する。【解決手段】基板の上に生物学的材料を沈着させることにより調製した試料に可変波長の赤外線を照射し、既定の波長毎に測定をし、特性スペクトルを決定する。各測定で以下の値の中の一つを求める。複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΨ、複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΔ、ΨとΔの三角関数、これらの値の中の一つの何次かの導関数。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム可能な計算機を持つＦＴＩＲ偏光測定部を備え、微生物のような複雑な生物学的材料の試料の特性を明らかにするＦＴＩＲ偏光解析装置において、前記の試料は基板に生物学的材料を沈着させてつくり、前記のＦＴＩＲ偏光測定部は可変波長の赤外線で前記の試料を照射し可変波長の中のそれぞれの所定の波長で測定する手段を有し、特性スペクトルを与えるそれぞれの測定は、
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΨ、
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΔ、
ΨとΔの三角関数、
これらの値の中の一つの何次かの導関数
の一つを求めることを特徴としたＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項２】
試料の複素反射率に関する２つの偏光解析パラメーターΨとΔ、同じ２つの偏光解析パラメーターであるが、基板のための
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として定義される複素光学濃度もしくはそれの何次かの導関数の測定から特性スペクトルが生じる請求項１に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項３】
特性スペクトルは複素光学濃度Ｄの虚数部の２次導関数、ｌｍ”Ｄである請求項２に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項４】
赤外線は約２ないし１２μｍの中間赤外範囲に限定されている請求項１，２もしくは３に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項５】
幾つかの特性が求められた先行試料の特性スペクトルを参照して別の試料の特性スペクトルを特定する手段をさらに備えており、そして
計算機では
先行試料と別の試料の識別スペクトルを正規化し、可変波長の中の所定波長に関しての一連の測定から成る特性スペクトルは修正されて、すべてのスペクトルが一つの特定波長における同じ正規化データーポイントを通過するようになっており、
データー縮小を適用してそれぞれの先行特性スペクトルと別の特性スペクトルの測定を組として抜き出し、そしてこれはある数の決定された波長測定の組合せに相当しており、その数の決定された波長測定はスペクトルに含まれた情報の大部分を説明しており、
前記の組と組との間の統計的距離に従って測定の組を分類する
ようにしており、それにより
もしも別の試料が少なくとも一つの先行試料を持つグループ内にあると、その別の試料はそのグループに帰属するものとして認識され、そして
もしも別の試料がグループ内にあると、その別のグループは先行試料のいずれにも帰属しないものとして認識されるようにした
先の請求項のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項６】
先行試料と別の試料とが既知の試料であり、そして分類が既知の試料の参照データーベースとなる請求項５に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項７】
多変量統計解析により、そして好ましくは主成分解析によりデーター縮小を実施する請求項５または６に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項８】
一つの特定の波長における正規化データーポイントが特性スペクトルの屈曲の最大測定ポイントである請求項５、６または７に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項９】
分類を計算機により行うのに階層制群生スキムをユークリッド規範ｄｉｓｔＡ，Ｂを以って使用して測定の組と組との間の差を数量化し、前記の階層制群生スキムはワード法によりなすのが好ましく、そして前記のユークリッド規範は
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により計算するのが好ましい請求項５ないし８のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１０】
試料は複雑な生物学的材料の乾燥溶液であり、それは溶液を基板上に沈着させ、その基板上で乾燥させたものである先行請求項のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１１】
基板を乾燥中振動させる先行請求項のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１２】
溶液は、遠心沈殿法により得られる複雑な生物学的材料の濃縮物である請求項１０又は１１に記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１３】
複雑な生物学的材料は培養された微生物である先行請求項のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１４】
複雑な生物学的材料は培養物内で成長した、もしくは宿主内で育った人もしくは動物の細胞である請求項１ないし１２のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１５】
複雑な生物学的材料はバイオプシーもしくは摘出により回復された人もしくは動物の細胞である請求項１ないし１２のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析装置。
【請求項１６】
プログラム可能な計算機を持つＦＴＩＲ偏光測定部を備えた装置内で行う、微生物のような複雑な生物学的材料の試料の特性を明らかにするＦＴＩＲ偏光解析方法において、前記の試料は基板に生物学的材料を沈着させてつくり、ＦＴＩＲ偏光測定装置の可変波長の赤外線で前記の基板上の試料を照射し可変波長の中のそれぞれの所定の波長で測定し、それぞれの測定は、
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΨ、
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΔ、
ΨとΔの三角関数、
これらの値の中の一つの何次かの導関数
の一つであることを特徴としたＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項１７】
試料の複素反射率に関する２つの偏光解析パラメーターΨとΔ、同じ２つの偏光解析パラメーターであるが、基板のための
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として定義される複素光学濃度もしくはそれの何次かの導関数の測定から特性スペクトルが生じる請求項１６に記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項１８】
特性スペクトルは複素光学濃度Ｄの虚数部の２次導関数、ｌｍ”Ｄである請求項１７に記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項１９】
赤外線は約２ないし１２μｍの中間赤外範囲に限定されており、そして幾つかの特性が求められた先行試料の特性スペクトルを参照して別の試料の特性スペクトルを特定し、そして
計算機では
先行試料と別の試料の識別スペクトルを正規化し、可変波長の中の所定波長に関しての一連の測定から成る特性スペクトルは修正されて、すべてのスペクトルが一つの特定波長における同じ正規化データーポイントを通過するようにようにし、
データー縮小を適用してそれぞれの先行特性スペクトルと別の特性スペクトルの測定を組として抜き出し、そしてある数の決定された波長測定の組合せに相当しており、その数の決定された波長測定はスペクトルに含まれた情報を大部分を説明しており、
前記の組と組との間の統計的距離に従って測定の組を分類し、
それにより
もしも別の試料が少なくとも一つの先行試料を持つグループ内にあると、その別の試料はその試料グループに帰属するものとして認識され、そして
もしも別の試料がグループ内にあると、その別のグループは先行試料のいずれにも帰属しないものとして認識されるようにした
請求項１２に記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項２０】
先行試料と別の試料とが既知の試料であり、そして分類が既知の試料の参照データーベースとなる請求項１９に記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項２１】
一つの特定の波長における正規化データーポイントが特性スペクトルの屈曲の最大測定ポイントであり、
多変量統計解析により、そして好ましくは主成分解析によりデーター縮小を実施し、
分類を計算機により行うのに階層制群生スキムをユークリッド規範ｄｉｓｔＡ，Ｂを以って使用して測定の組と組との間の差を数量化し、前記の階層制群生スキムはワード法によりなすのが好ましく、そして前記のユークリッド規範は
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により計算するのが好ましい請求項１９もしくは２０に記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【請求項２２】
試料は複雑な生物学的材料の乾燥溶液であり、それは溶液を基板上に沈着させ、その基板上で乾燥させたものであり、基板を乾燥中振動させる請求項１６ないし２１のいずれかに記載のＦＴＩＲ偏光解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物のような複雑な生物学的材料の試料の特性を明らかにするＦＴＩＲ偏光解析装置と方法とに係るものである。さらに本発明を利用してそのような複雑な生物学的材料を特定することができる。生物学的研究、診断、治療学、生化学の分野におけるまたは薬物における検出分析装置へ本発明を利用できる。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染により生じる伝染性の病気の診断とか、医療器具や手術室などの作業場の消毒管理と言った広範な医療活動において微生物検出と特定（もしくは認識、同定）は大きな問題を呈している。この分野において多くの技術が提案されてきている。それらは例えば細胞要素に対する化学反応による化学技術、例えば生物学的試料と光との相互作用による理学技術、遺伝学もしくはこれらの技術の組合せである。
【０００３】
事実、標準の微生物学的分析は有効ではあるが、場合によってはあまりにも長く時間がかかる、すなわち実用的でない４８時間から７２時間も試料を培養しなければならないという欠点がある。そのため、既存のものと同程度の精度で微生物学的分析を迅速化できる新しい技術に対する要望が強くなってきている。時間が少なくて済み、試料も少なくて済むというので、標準分析に代わるものとして光学技術が提案されてきた。さらに、光学機器の保存費用は最も低く、診療環境にも容易に適合する。
【０００４】
光学技術のなかでもスペクトル偏光解析法が生物学において適当な光学技術であると考えられるのは、それが表面に沈着した少量の試料に侵入でき、そしてそれの感度が高いということにある。このことは非生物学的試料について詳細に報告されている（Ｂ．Ｄrevillion：“Phase Modulated Ellipsometry from the Ultraviolet to the
Infrared: In Situ Application to growth of semiconductors”, Prog. Crystal
Growth and Charat.,27,1-87(1993)参照）。標準スペクトル偏光解析法は一般に、可視範囲と近紫外線範囲（２７０ないし８００ｎｍ）で行われ、何十年にもわたって微小構造（粗さ、多孔性、厚みそして構成）を決定するため表面や薄膜の特性を調べるのに利用されてきた。通常はそれを使って、試料の光学的応答を調べ、それの物理的構造についての情報例えば層の上の表面の存在とそれの厚みなどを調べる。しかしながら、スペクトル偏光解析法は、比較的簡単なそして均質な構造の非生物学的試料の特性検査に主として利用されてきた。偏光解析技術が本質的に複雑であるので、そして簡単な非生物学的構造でも既に困難に遭遇しているので、複雑な、非均質な構造、例えば微生物にそれを使用するということは考えにくかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そういうことで複雑な生物学的材料の特性解析にその技術が利用できることを示したことは驚きであり、このことが可能となったのは特殊な生物学的試料の調製の仕方と偏光解析測定とを適応させたことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、微生物のような複雑な生物学的材料を光と相互作用させる理学的技術であると概略することができ、具体的にいえば、複雑な生物学的材料にＦＴＩＲ偏光解析技術（フーリエ変換赤外線偏光解析）を使用する。そのようなものとして先ず、本発明は複雑な生物学的材料の試料の特性を決定するＦＴＩＲ偏光解析装置であって、プログラム可能な計算機を持つＦＴＩＲ偏光測定部を備えている。
【０００７】
本発明に従って試料は基板に生物学的材料を沈着させてつくり、ＦＴＩＲ偏光測定装置は可変波長の赤外線で前記の試料を照射し可変波長の中のそれぞれの所定の波長で測定をなし、これらの測定は特性スペクトルを与える。それぞれの測定値は次の値の一つである。
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΨ、
複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΔ、
ΨとΔの三角関数、
これらの値の一つの何次かの導関数。
【０００８】
以下に述べるファンクションをＦＴＩＲ偏光測定装置に単独でもしくは組合せて使用できる。
＊試料の複素反射率に関する２つの偏光解析パラメーターΨとΔ、同じ２つの偏光解析パラメーターであるが、基板に対する
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として定義される複素光学濃度もしくはそれの何次かの導関数の測定から特性スペクトルが生じる。
＊特性スペクトルは複素光学濃度Ｄの虚数部の２次導関数、ｌｍ”Ｄである。
＊赤外線は約２ないし１２μｍの中間赤外域に限定されている。
＊装置は特性スペクトルを相互間で特定する手段をさらに備えている。
＊特性が求められた幾つかの先行試料の特性スペクトルを参照して別の試料の特性スペクトルを特定する手段を装置はさらに備え、計算機では
先行試料と別の試料の認識スペクトルを正規化し、可変波長の中の所定波長に関しての一連の測定から成る特性スペクトルは修正されて、すべてのスペクトルが一つの特定波長における同じ正規化データーポイントを通過するようにしており、
データー縮小を適用してそれぞれの先行特性スペクトルと別の特性スペクトルの測定を組として抜き出し、そしてこれはある数の決定された波長測定の組合せに相当しており、その数の決定された波長測定はスペクトルに含まれた情報を大部分説明しており、
前記の組と組との間の統計的距離に従って測定の組を分類するようにしており、それにより
もしも別の試料が少なくとも一つの先行試料を持つグループ内にあると、その別の試料はそのグループに帰属するものとして認識され、そして
もしも別の試料がグループ内にあると、その別のグループは先行試料のいずれにも帰属しないものとして認識されるようにしている。
＊先行試料と別の試料とが既知の試料であり、そして分類が既知の試料の参照データーベースとなる。
＊多変量統計解析により、そして好ましくは主成分解析によりデーター縮小を実施する。
＊一つの特定の波長における正規化データーポイントが特性スペクトルの屈曲の最大測定ポイントである。
＊正規化段階の特定の波長は約１５５０ｃｍ−１である。
＊分類を計算機により行うのに階層制クラスタリング（群生）スキムをユークリッド規範ｄｉｓｔＡ，Ｂを以って使用して測定の組と組との間の差を数量化し、前記の階層制群生スキムはワード法によりなすのが好ましく、そして前記のユークリッド規範は
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により計算するのが好ましい。
＊試料は複雑な生物学的材料の乾燥溶液であり、それは溶液を基板上に沈着させ、その基板上で乾燥させたものである。
＊基板を乾燥中振動させる。溶液は、遠心沈殿法により得られる複雑な生物学的材料の濃縮物である。
＊複雑な生物学的材料は培養された微生物である。
＊複雑な生物学的材料は培養物内で成長した、もしくは宿主内で育った人もしくは動物の細胞である。
＊複雑な生物学的材料はバイオプシーもしくは摘出により回復された人もしくは動物の細胞である。
【０００９】
第２に本発明は方法である。この方法とそれのすべての変形態様とは上述の装置とそれのすべての手段の単独又は組合せたものと機能作用において一致している。この方法は、微生物のような複雑な生物学的材料の試料の特性を明らかにし、プログラム可能な計算機を持つＦＴＩＲ偏光測定部を備えた装置内で行われる。
【００１０】
この方法に従って、試料は基板に生物学的材料を沈着させてつくり、ＦＴＩＲ偏光測定装置の可変波長の赤外線で前記の基板上の試料を照射し可変波長の中のそれぞれの所定の波長で測定し、それぞれの測定は、
＊複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΨ、
＊複素反射率に関する偏光解析パラメーターの一つであるΔ、
＊ΨとΔの三角関数、
＊これらの値の中の一つの何次かの導関数
の一つである。
【００１１】
単独に又は組合せて使える、装置の手段に対応する方法における作動例としては以下のものがある。
＊試料の複素反射率に関する２つの偏光解析パラメーターΨとΔ、同じ２つの偏光解析パラメーターであるが、基板のための
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として定義される複素光学濃度もしくはそれの何次かの導関数の測定から特性スペクトルが得られる。
＊特性スペクトルは複素光学濃度Ｄの虚数部の２次導関数、ｌｍ”Ｄである。
＊赤外線は約２ないし１２μｍの中間赤外範囲に限定されており、そして幾つかの特性が求められた先行試料の特性スペクトルを参照して別の試料の特性スペクトルを特定し、そして
計算機では
先行試料と別の試料の識別スペクトルを正規化し、可変波長の中の所定波長に関しての一連の測定から成る特性スペクトルは修正されて、すべてのスペクトルが一つの特定波長における同じ正規化データーポイントを通過するようにようにし、
データー縮小を適用してそれぞれの先行特性スペクトルと別の特性スペクトルの測定を組として抜き出し、そしてこれはある数の決定された波長測定の組合せに相当しており、その数の決定された波長測定はスペクトルに含まれた情報の大部分を説明しており、
前記の組と組との間の統計的距離に従って測定の組を分類し、
それにより
もしも別の試料が少なくとも一つの先行試料を持つグループ内にあると、その別の試料はその試料グループに帰属するものとして認識され、そして
もしも別の試料がグループ内にあると、その別のグループは先行試料のいずれにも帰属しないものとして認識されるようにした。
＊先行試料と別の試料とが既知の試料であり、そして分類が既知の試料の参照データーベースとなる。
＊一つの特定の波長における正規化データーポイントが特性スペクトルの屈曲の最大測定ポイントである。
＊多変量統計解析により、そして好ましくは主成分解析によりデーター縮小を実施する。
分類を計算機により行うのに階層制クラスタリング（群生）スキムをユークリッド規範ｄｉｓｔＡ，Ｂを以って使用して測定の組と組との間の差を数量化し、前記の階層制群生スキムはワード法によりなすのが好ましく、そして前記のユークリッド規範は
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により計算するのが好ましい。
＊試料は複雑な生物学的材料の乾燥溶液であり、それは溶液を基板上に沈着させ、その基板上で乾燥させたものであり、基板を乾燥中振動させる。
【００１２】
用語、複雑な生物学的材料とは微生物、細胞、バクテリア、菌もしくはビールスのような同質でない分子集合体もしくは筋肉、血液などに含まれたそのような分子集合体からできた生物学的試料である。これは一つのもしくは一つよりも少し少ない分子種からできた同質の試料とは識別される。
【００１３】
赤外線の光と好ましくは中間範囲の赤外線の光を使うと試料の分子振動モードを立証し、かくして化学的感度を与えるという別の利点をもたらす。それぞれの生物分子は特定の中間赤外線輻射吸収パターンを有しているからである。本発明のお蔭で、ＦＴＩＲ偏光解析により測定された赤外線におけるスペクトル反応から生物学的材料を検出し、分類することができる。
【００１４】
ＦＴＩＲ偏光解析により得られたそれぞれのスペクトルに含まれる情報の統計的多変量処理を本発明は利用している。この方法の主たる利点は、所与の生物学的試料に対応するスペクトルをはっきりした群れとしてグループ分けできることである。そのようにして、種々の生物学的材料に対応するスペクトルの参照データーベースをつくって、それからそれを使ってどんな生物学的試料からの測定したスペクトルを特定する。非生物試料もしくは簡単な物質や化合物と比較して微生物は非常に複雑で非均質な構造となっているにもかかわらず、微生物である生物学的試料に本発明を利用するのが好ましい。本発明はどのような種類の微生物にも利用できる。
【００１５】
特定は絶対的であることに注意すべきである。すなわち、既知の参照試料と別の試料を比較してその別の試料の正しい名を（もしくはそれが知られていないことを）明らかにする。特定は相対的であることもある。すなわち、複数の未知の試料をそれらの間で比較し、そして試料のグループを特定することがある。この場合もしその複数の試料が知られていれば、参照データーベースを得ることができ、そのデーターベースの中では名前の判った試料グループは定義され、そして別の試料の絶対的な特定に使用される。
【００１６】
参照データーベースは生のデーター（特に、生の偏光解析測定及び又は光学的濃度及び又はｌｍ”Ｄ）及び又は既に処理されたデーター（特に、正規化された及び又は縮小及び又は分類されたデーター）からつくれることにも注目されたい。特定がなされる仕方と装置ができる特定のタイプ（絶対的及び又は相対的）とによって選択する。別の試料の特定が先の試料の参照データーベースと比較されてなされる場合、２つの可能性がある。第１の可能性は、すべての手元にあるデーター、すなわち先の試料からのデーターとその別の試料からのデーターとに対し処理ステップ（正規化、縮小そして分類）を実行することである。第２の可能性はその別の試料のデーターに対してだけ処理ステップを実行することである。この第２の場合正規化と縮小とは参照データーベースの創造に対して得られたのと同じ計算パラメーターを使って実施する。すなわち、正規化に対しては一つの特定値の波長の同じデーターポイント、そして縮小に対しては同じ種類の一組のポイントであって、分類は（先の試料と別の試料からの）凡てのデーターに対してなされなければならない。
【００１７】
ＦＴＩＲ偏光解析により測定された中間赤外域（２−１２μｍ）における偏光応答から微生物の特性分析と分類とを本発明により実施できる。偏光解析測定から離れて、試料作成の簡易化とデーター分析も本発明の課題である。スペクトル偏光解析は、試料が反射した光、もしくは試料を通った光の偏光に応じてなされる非侵入光学特性検出法である。偏光解析法の感度は極めて高く単分子層レベルにおける試料表面の変化でも検出できる。中間赤外域において各分子は特徴的吸収指紋もしくは識別特徴となり、偏光解析法を化学的に選択性とする。ここで初めて培地で成長しているバクテリアをＦＴＩＲ偏光分析法を使って分析する。試料の調製は非常に簡単であり、微生物が浮遊している水溶液を基板の平らな表面に滴下して蒸着させるだけである。その粒滴が蒸着した後表面に残った固体残留物に対して偏光分析測定を実施する。測定は特性スペクトルをつくる。この特性スペクトルに対するデーター分析は３つの主な段階に分けられる。第１は、特性スペクトルの正規化である。第２は特性スペクトルのデーター縮小（簡単化）であり、この縮小はプリンシパルコンポーネントアナリシス（ＰＣＡ）によって実施する。このプリンシパルコンポーネントアナリシスとは既存の多変数統計技術の一つであって重複した情報の除外整理に普通使われる。第３に，その簡単化されたスペクトルを分類するのであるが、それには標準のクラスタリング法を使う。本発明を採用して種レベルでバクテリアを特定できる。
【００１８】
最後に、本発明は分光器を有するどのような種類の偏光解析装置で利用できることを知るべきである。偏光解析装置の例を示し、偏光解析法の原理と応用を、R.A.M.AZZAMとN.M.BASHARA,“ELLIPSOMETRY AND POLARIZED LIGHT”,
North-Holland Personal Library ISBN 0 444 870164に記述しているので、必要であれば参照されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の実施例を以下に添付図を参照して説明する。
先ず、偏光解析測定法とＦＴＩＲ偏光解析の原理を説明する。偏光解析は試料表面からの輻射ビームの反射もしくは透過後の偏光状態の変化を測定する。これを図１に概略示す。図においてＥｉｐ、ＥｉそしてＥｉｓのパラメーターを持つ入射光が試料上の入射面に対して投射される（方向ｐとｓとはＥｉｐとＥｉｓに平行で、相互に垂直）。光が試料の分子成分と相互作用した後でＥｒｐ、ＥｒそしてＥｒｓのパラメーターを持つ反射光が得られる。反射中光の偏光状態は変わる。こうして反射光の偏光はＦＴＩＲ偏光解析器（これは分光式偏光解析器である）で分光分析される。
【００２０】
偏光解析測定は２つの角度ΨとΔにより表され、これらの角度は以下のように定義される複素反射率ρに関係している。
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ここでγｐとγｓは試料表面の入射面に対してそれぞれ平行であり、垂直である偏光におけるフレネル反射係数である。ΨとΔとで作動しているスペクトルの欠点は両方の大きさに対してベースラインの訂正をしなければならないということである。この問題を克服するため本発明は次のように定義される光学的濃度を使う。
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このＤは単一の層で被覆された半無限の基板に適用するのが普通である。どちらもバーのついたΨとΔとは
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これらの大きさが裸の基板に対応することを示している。光学的濃度の主な利点は基板の吸収により生じるスペクトル特性の影響を阻止し、それ故被膜の吸収に起因するスペクトル特性を、普通のスペクトルにおいて、強調して、ローレンツのような形がＤの実数部ＲｅＤにローレンツピークとして現れ、そしてその虚数部ｌｍＤに屈曲として現れる。試料吸収からくるものと異なる総てのスペクトル特性が光学的濃度により排除されることはできない。吸収に起因する上述の特性から離れて、基板を覆っている固体残留物の内側での光ビームの多重反射からのピークと屈曲とが普通のスペクトルに現れる。それらの特性の振幅とスペクトルバンド幅とは化学的吸収により生じた振幅とスペクトルバンド幅とは異なり、そして層の厚みと密度によって異なる。化学的吸収からの特性は本質的であり、多重反射からの特性は非本質的である。
【００２１】
それゆえ、Ｄの虚数部、ｌｍ”Ｄの第二次導関数を使う。それが非本質的寄与分を排除するか、少なくとも最小とするからである。ｌｍ”Ｄの別の利点は、吸収により残されたサインはゼロを中心とした鋭い屈曲として現れ、それはさらに統計分析するのに好都合な特性である。
【００２２】
図２に示すＦＴＩＲ偏光解析装置の光学的構成は、通常のＦＴＩＲ分光器、線形偏光プリズム、光弾性モジュレーター、試料、アナライザーと呼ぶ別の分析器（この別の分析器は試料により生じせしめられた変化を解析するのに使用する）そして検出系から成る。図２ではＭ１−Ｍ６は鏡であり、そしてＦは鏡Ｍ１の焦点である。検出器としては９００ないし３０００ｃｍ−１の範囲で測定させれるようにする液体窒素被膜ＨｇＣｄＴe検出器を使用する。他のタイプの検出器も使用できる。これだけに限定するものではないとして上に説明した光学要素の配列はポラライザー‐モジュレーター‐試料‐アナライザー形態として知られており、本発明の偏光解析装置で使用されるものである。必要なら、A
Canillas, E. Pascual, B. Drevillon, “Phase modulated ellipsometer using a
Fourier transform infrared spectrometer for real time applications”, Rev. Sci
Instrum, 64, 2153-2158 (1993) もしくはE. Garcia-Caurel, E. Bertrn, A. Canillas, “Optimized Calibration
Method for Fourier Transform Infrared Phase-Modulated Ellipsometry”, Thin Solid
Films, 354, 187-194 (1999)を参照すれば、光学要素のアライメントと較正手順とについてさらに知ることとなろう。以下に説明する応用例において試料に対する入射角は７２°に設定され、そして４ｃｍ−１における完全なスペクトルの取得は４秒しかかからず、信号対雑音比を改善するためそれぞれの測定は３００のスペクトルの平均とした。
【００２３】
微生物へ本発明を適用した例を示す。測定前に生物試料をつくらなければならない。それからそれを測定して特性スペクトルを計算する。さらに、正規化後（特定しようとする試料だけ処理する場合）もしくは（特定しようとする試料と参照データーベースからの先の試料の場合）特性値をスペクトルから、データー縮小のお蔭で、求められる。さらに特定するため分類法を使って試料間での比較をする。
【００２４】
この例では、特徴を示し、そして分類している表１に６つの既知のバクテリア種の名前を詳しく示した。この例に使用したバクテリアの名前、それぞれの種類のバクテリアに対してなされた測定の数、そして最後にそれぞれの測定のラベルを表１に示す。×を付けていない測定はデーターベースをつくるのに使用された。×を付けた測定は未知の測定としてデーターベースで分類するのに使用された。最後の欄は、試料がつくられ、測定された日も含んでいる。
表１
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【００２５】
分類法はスペクトル間の特性差を探すことに基づいている。原則的にはスペクトル間の差は本質的なものとしてもしくは非本質的なものとして決めることのできる２つの出所もしくはオリジンから生じる。本質とはそれぞれに独自の微生物の化学組成について言う。非本質とは試料の生成状態と培養媒体からの総ての影響を言う。本質的な影響と非本質的な影響とがスペクトル間の差に寄与しており、そしてそれらは一緒になっていると考えられ、分類法では区別できない。このことが試料調製手順を決め、それをキッチリ守っていくことが特徴を明らかにしたり、特定する上で、そして特に参考データーベースをつくり、そしてそれに続く測定にとって必要となる理由である。このことによって許容できる反復性が保証され、非本質的オリジンから生じることのある測定における変動をなくすのである。このことがまた、これから説明する試料調製法に加えて、分類法の実施前のデーター処理を選んでスペクトル間の非本質的変動の影響を最小となるようにする理由でもある。
【００２６】
試料生成に関して：４８時間別個の標準媒質で６つの異なる種（Bacilus subtilis, Citrobacter diversus, Escherichia celi, Enterocus
faecalis, Pantogea agglomerans, Proteus vulgaris）を成長させた。その後で成長コロニーの一部を純粋な水に希釈し、そして二重遠心にかけてできるだけ多くの培養媒体を取り除いた。水中でバクテリアを１０９／ｍｌまで濃縮した。試料調製は基板の裸の表面に１００μｌの溶液粒を滴下し、室温で乾かした。基板は結晶シリコンウエファーである。偏光解析測定は蒸着後シリコン表面の残留物に対して行った。蒸着物の形は円形で、平均の表面積は１±０．１ｃｍ２であって、赤外線ビームのスポット（１０ｍｍ２）の大きさに対して十分の大きさである。
【００２７】
基板を振動台の上に置いて３０ないし５０ヘルツの振動数で溶液粒滴を振動させて沈着物の均質性を高める。これらの振動数で振動台によりつくられる粒滴の機械的振動の振幅は共振となり、蒸発する水の中のバクテリアの混合とその結果としての沈着物の厚みの均一性とを最適ならしめる。
【００２８】
基板上での粒滴の拡散を改善するため溶液に所定量の張力活性剤を加えることもできる。反対に、最初の溶液で、粒滴拡散を改善するよう表面を処理された物質を使用することもできる。
【００２９】
一例として、試料の調製と測定プロセスとが数日かかった。個々の試料の調製に費やした日数についての詳細は表１に示されている。調製相互間の相違による影響を決定するため、換言すれば、同じ培養物からつくられた異なる試料で測定したスペクトル間の差を決定するため、それぞれの溶液から３つの試料をつくって測定し、相互間での変動の影響すなわち、同じバクテリア種に対応するが別個の培養物からつくって測定したスペクトル間の差を決定するため培養、調製そして測定を前に分析したバクテリア種の一つについて４日目に繰り返した。
【００３０】
計算に関して：光学的濃度スペクトルの虚数部の第二次導関数ｌｍ”Ｄのデーター処理が三つの主段階を経てなされる。第一段階はデーターの正規化である。スペクトルに現れる吸収の振幅は試料の本質によって変わり、そして光ビームによって探査される物質の総量によって変わる。データーの正規化を行う理由は、試料の生成中沈着したバクテリアの量を正確に調整できないからである。試料毎のバクテリア濃度の不一致に起因する変動を総てのスペクトルを正規化することにより補償するのであって、正規化では参考として約１５５０ｃｍ−１のスペクトルを中心とした屈曲の最大値をとっている。正規化の最初の段階の結果として総てのスペクトルは約１５５０ｃｍ−１の波長の特定値で同じデーターポイントを通過する。基板上での試料の調製が完全に制御されたバクテリアの量をもたらすのであれば、例えば、一つもしくはそれ以上の決まった層にバクテリアを凝固させるとか、またはバクテリアをよく捕まえておけるような構造の基板を使うとかすれば、この最初の段階は省略できる。
【００３１】
第２段階はデーターの縮小（簡単化）である。各スペクトルは可変波長の既定値に関してシリーズとなっている測定から成る。ここに挙げる例では各シリーズは約３６０の測定を有する。本発明の装置で使用される好ましくはマイクロコンピューターである計算機の計算速度で妥当な時間内で特定もしくは認識の結果を出すには、これら総てのシリーズの測定にたいしてではなく減少した組の関連測定に対してだけ分類を行う。この縮小は、周知の統計／分析法であるプリンシパルコンポーネントアナリシス（ＰＣＡ）計算法を使ってなされるのが好ましい。要するに、ＰＣＡは元のシリーズの測定を元のものの線形組合せから成る、元の組に含まれている情報の大部分を説明している小さい組に変換する。新しい組の各要素は主要素と呼ばれ、そして所与の分析から生じる主要素の総量はこの新しい組により保持される元の情報の部分に応じて変わる。一般に、元の情報の８０％以上を保有するのに少数の主要素が必要とされるだけである。必要ならば、以下の文献を参照されたい。W.R.Dillion, M.Goldstein, “Multivariate analysis”, John Wiley &
Sons, 1984 p.p.23-99; もしくはI.T. Jolliffe, “Principal Component Analysis”,
Springer Verlag; 第２版、(２００２年１０月１日)。ここに挙げる例では６つの主要素を使っており、そしてそのＰＣＡ解析は約３６０の測定により較正された一つのスペクトルをたった６つの測定から成る新しいものに変換させたのであって、こうして劇的にそれの複雑性を減少させたのである。
【００３２】
第３段階はデーター分類である。これは、縮小した（簡単化した）スペクトルに続けて階層集落化するやり方もしくはスキムであるデータークラスタリングによって行うのが好ましい。そのような分類スキムは周知であって、必要なら次の文献を参照されたい。B.K. Lavine, “Clustering and classification of analytical data”,
Encyclopedia of Analytical Chemistry, Editor R. A. Mayers, John Wiley &
Sons (2002).データーをグループに分けるのに使うアルゴリズムは多くあるが、その中でワードの方法が優れた結果をもたらすので好ましい。ユークリアンノルムをスペクトル間の差を定量化する基準として使用する。例として挙げた総ての計算は市販のソフトウエアであるＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ（登録商標）で行った。
【００３３】
試料の特性記述と分類の結果を以下に説明する。特性記述の例として、Ｅｃｏｌｉ１に該当するスペクトルｌｍ”Ｄを図３に、参考としてのスペクトルｌｍＤと共に示す。ｌｍＤには幾つかの屈曲が現れているが、これらはバクテリアの多様な化学的結合に関連の吸収と試料調製条件に応じて形の変わるバックグラウンドとに起因するのである。ｌｍ”Ｄではそのバックグラウンドは除去されて、吸収に起因する屈曲だけが現れている。Ｅｃｏｌｉ１を例として選択したのはそれの複雑な形が他の試料のスペクトルを表しているからである。
【００３４】
所与のバクテリアのスペクトルを独自なものとしているのは吸収に起因する屈曲の相対位置と強度とであり、そしてこのことが試料の特性記述を十分なものとしている。総てのスペクトルで規則的にいくつもの顕著な吸収が表れており、それらは生物学的なキーの役割を演ずる分子に存在する化学的結合の既知の振動のせいである。９００と１２００ｃｍ−１のスペクトル領域はＣ−ＯとＰ−Ｏの引き合い振動に起因する吸収により支配されている。第１の振動はグリコーゲンのようなポリサッカライドの特性を示し、第２の振動は核酸とリン脂質の特性を示している。１０８０ｃｍ−１の際立った屈曲もイオン化したＰＯ２−グループのＰ−Ｏ対称的引き合いモードから発生するとも考えられる。１２００から１２５０ｃｍ−１の帯域は主として燐酸ジエステル、遊離リン酸塩そしてモノエステルリン酸塩のグループ（これらはすべて核酸とリン脂質に見出せる）のＰ＝Ｏ非対称引き合い振動に関連している。
【００３５】
１２５０から１５００ｃｍ−１の帯域にはメチレン、ＣＨ２とメチルＣＨ３グループの振動があり、それらは特定の意味を持つものではないのは微生物のすべての有機分子の部分であるからである。１５００から１８００ｃｍ−１のスペクトル帯域には、１６５０ｃｍ−１でいわゆるアミドＩ、１５４５ｃｍ−１でアミドＩＩが顕著である。アミドＩはＣ−Ｎ引っ張り振動（２０％）と弱く結合したＣ＝Ｏ二重結合（８０％）に主として起因している。Ｃ−Ｎ引っ張り（４０％）へのＮ―Ｈ屈曲モードの結合（６０％）からアミドＩＩが生じる。この領域では１７３０ｃｍ−１でピークがあり、これはコレステロールエステル、脂質そして炭酸を典型とする、Ｃ＝Ｏ二重結合引っ張りモードに原因している。
【００３６】
分類段階でクラスター間の重なりを回避するために必要なことは、同じバクテリア種のスペクトル間（イントラクラスタ）の差ができるだけ小さく、違うバクテリアのスペクトル間（インタークラスタ）の差ができるだけ大きいことである。ここに挙げている例では、イントラクラスタとインタークラスタの差の大きさ示すため図４で総ての測定をＥ．ｃｏｉｌとＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓに対してそれらのそれぞれのｌｍ”Ｄスペクトルの形で実施している。図４から判るように、同じバクテリアに該当するスペクトル（正規化されている）は殆ど同じであり、２つの異なる種に対応するスペクトルを比較するとき弱いが、それと認められる差が現れている。Ｅ．ｃｏｌｉとＰ．Ｖｕｌｇａｒｉｓの場合主な差は１４５９から１７００ｃｍ−１のスペクトル帯域に現れ、蛋白質と脂質の形についての情報を含んでいる。イントラクラスタとインタークラスタの差の定量測定を行うため下記のユークリッドノルムを６つの種に適用した。
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ここでＡとＢとは全組の２つのスペクトルを表し、そしてΣは総てのスペクトル成分にわたっている。結果として、表２に集約したユークリッド距離のマトリックスを得た。
【００３７】
表２
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【００３８】
列１−３と行１−３に対応する記載事項はEcoliのイントラクラスタ距離を表し、同様に列４−６と行４−６に対応する記載事項はPvulgariのイントラクラスタ距離を表している。列４−６と行１−３に対応する記載事項はインタークラスタの距離を表している。インタークラスタ距離はイントラクラスタ距離よりも平均ではるかに大きい、８０倍も大きく、EcoliからのスペクトルとPvulgariからのスペクトルとは十分に距離があって相互にクラスタが重なるようなことはない、換言すればクラスタは十分離れていることがこの表から判る。この研究で考えられている６つのバクテリア種に対応するスペクトルへこのプロセスを一般化することにより、考慮しているスペクトルをクラスタにグループ分けする基準として使える距離のマトリックスを構築することができる。図５の系統樹は、例示の試料の特性スペクトル（正規化されそして縮小されている）により形成された６つのクラスタについてのクラスタリングプロセスの結果を示している。この分類は正確になされている。各クラスタは只一つのバクテリア種から測定されたスペクトルを含んでいるからである。
【００３９】
その系統樹はデーターの組における試料相互の距離を樹木の形にした図である。系統樹は分析の様々な段階で試料をクラスタにしていることと、階層的に示されるクラスタになっていく点での類似性とを示している。図５の系統樹は、スペクトルが明確なクラスタにグループ分けされてデーターベースをつくっていく仕方を示している。クラスタを視覚で特定認識するのを容易とするためそれぞれを太い線で囲っている。
【００４０】
プリオリ未知特性スペクトル、換言すれば参照データーベースをつくるのに使われなかったスペクトルの特定認識を目的として参照データーのデーターベースの作成に本発明を利用できる。その目的のため必要となることは、データーベースをつくるのに使うスペクトルと特定しようとしているスペクトルの両方を考慮してクラスタリングアルゴリズムを作動させることである。理想的には、クラスタリングアルゴリズムを一旦作動させると、もしもデーターベース内でバクテリア種の一方に「未知の」スペクトルが関連していると、それらは同じバクテリアに対応するクラスタにグループ分けされる。反対に、データーベース内にないバクテリアからその「未知の」スペクトルが来ていると、それらは新しいクラスタを形成するようグループ分けされる。
【００４１】
この特定認識を説明している次の例では、２つの試料の２つの種Paggi_1×とPaggi_２×の２つのスペクトルが未知のものとして考えられている。これら２つのスペクトルは、データーベースをつくるのに使ったものよりも数日後に培養され、調製され、そして測定されたP．agglomeranの２つの試料から測定された。図６の系統樹はその結果のクラスタを示している。「未知の」スペクトルを特定認識するのにデーターベースを使うとき６つのクラスタがつくられる。特定は正確に行われる。P．agglomeranから測定された「未知の」スペクトルは、これもP．agglomeranから測定されたデーターベースをつくるのに使われたスペクトルと一緒のグループとなっているからである。この場合、分類はうまく行われる。Paggi_1×とPaggi_２×とはキッチリ決められたクラスタに、P．agglomeranから得たデーターベースのものと一緒に明瞭にグループ分けされているからである。この点で注目すべき重要なことは、異なる日になされた別個の試料調製から出たスペクトルを明確に特定できるのは、提案した試料調製の再現性に関する確実性にもよるのであるということである。
【００４２】
結論として、一般に表面の特性を明らかにするのに用いられているＦＴＩＲ偏光解析を用いて微生物の特性を明らかにし、そして特定できるようにできたのは、異なる微生物の一組の偏光解析測定の多変数データー処理（縮小＋クラスタリング）によるのである。それは他の未知の個体を分類しそして特定するための参照データーベースを構成させれる。提案した試料調製手順だからこそ、別々に調整した試料から測定したスペクトルを扱ってもそれらの特性を明らかにし，特定することができるのである。上に説明した特定、認識のための異なる処理段階は例示に過ぎず、他の縮小及び又は分類アルゴリズムを本発明の装置に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】試料と偏光ビームとの相互作用を示す。
【図２】ＦＴＩＲ偏光解析装置の光学系を示す。
【図３】Ｅｃｏｌｉ１に対するｌｍ”ＤとｌｍＤとを示す。
【図４】ＥｃｏｌｉとＰ．ｖｕｌｇａｒｉｓに対するｌｍ”Ｄスペクトルを示す。
【図５】既知のバクテリアに対するクラスタリングによる分類段階の結果を示す系統樹である。
【図６】既知のバクテリアの参照データーベースに照らして未知のバクテリアを特定する系統樹である。
【符号の説明】
【００４４】
Eip    入射光のパラメーター
Ei    入射光のパラメーター
Eis    入射光のパラメーター
Erp    反射光のパラメーター
Er    反射光のパラメーター
Ers    反射光のパラメーター
M1 〜M6    鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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