(57)【要約】      （修正有）【課題】  タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体の提供。【解決手段】  好アルカリ性バチルス属細菌に由来する、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：  （ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、  （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号２に示す塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤へ配合されているアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。洗剤という大量消費剤に用いられることから、アルカリプロテアーゼは工業用酵素の中でも最も大量に生産されている酵素である。斯かるアルカリプロテアーゼの例としては、サビナーゼ、カンナーゼ（共に登録商標；ノボザイムズ）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００３】
これらのアルカリプロテアーゼは、バチルス属細菌由来であり、ズブチリシンスーパーファミリーの中においてファミリーＡを形成している。このファミリーは更に真性ズブチリシン、高アルカリプロテアーゼ、菌体内アルカリプロテアーゼなどに分類されている（例えば、非特許文献１参照）。一般に洗剤用アルカリプロテアーゼは高アルカリプロテアーゼに属しており、それぞれの特性、分子量並びにアミノ酸配列の同一性は高いことが知られている。
【０００４】
そこで、従来公知の高アルカリプロテアーゼとは異なる分子量、アミノ酸配列を有する洗剤用プロテアーゼを見出し、新たな遺伝子源として開発することが望まれていた。
【特許文献１】特開平４−３４９８８２号公報
【特許文献２】特表平６−２９２５７７号公報
【特許文献３】特表平８−５０８６４３号公報
【非特許文献１】Siezen, R.J. & Leunissen, J.A.M., Protein Sci., 6, 501-523, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、当研究室保有の好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから従来公知のズブチリシンとアミノ酸配列において同一性が低い新規なアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、更に新規なアルカリプロテアーゼを生産することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において同一性が低く、衣料用洗浄剤をはじめ各種産業用の酵素として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【０００９】
ここで、配列番号１示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列を意味し、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１０】
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、自然界から得ることも可能ではあるが、更に部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００１１】
本発明の配列番号１にはアルカリプロテアーゼとして機能する、即ち推定成熟タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１の１９４番目のアスパラギンから１４６７番目のアスパラギンまで）を含んでいる。本推定成熟酵素のアミノ酸配列と他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、ズブチリシンBPN'とズブチリシンCarlsbergとは３７．６及び３８．５％の同一性を示すにすぎない。更に洗剤用アルカリプロテアーゼとして用いられているサビナ−ゼ、エスペラーゼ、ＫＡＰとは３４．７−４１．０％の同一性を示すにすぎない。また、本発明のプロテアーゼを生産するBacillus sp. KSM-LD1株（FERM P-18576）由来のアルカリプロテアーゼで酸化剤耐性を有するＬＤ１（GenBank Accession No AB085752）とは３５．３％、他の好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼとは約３７％の同一性を示すにすぎなかった（例えば、Schmidtら、Appl. Environ. Microbiol., 61, 4490-4493, 1995等）。更にBacillus subtilis 168株由来のバシロペプチダーゼＦ（GenBank Accession No M29035）とは５３．８％、Oceanobacillus iheyensis HTE831株由来のバシロペプチダーゼＦ（GenBank Accession No AP004600-260）とは５６．５％の同一性を示した。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。即ち、本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、６０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものである。更に本発明においては、配列番号１に示すアミノ酸配列における同一性が、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を示すアルカリプロテアーゼであることが望ましい。
【００１２】
尚、ここで述べるアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を1として解析を行うことにより算出される。
【００１３】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであればよいが、配列番号２に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個以上のアミノ酸塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子又は該塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするＤＮＡを含有する遺伝子であるものが好ましい。尚、配列番号２に示す塩基配列は、本発明のアルカリプロテアーゼのプレプロ領域並びに成熟タンパク質を含む前駆体をコードするものである。
【００１４】
ここで「ストリンジェントな条件下」とは、例えばMolecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition (Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼは、その遺伝子を例えばバチルス属に属する微生物、好ましくはBacillus sp. KSM-LD1株(FERM P-18576)、等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１６】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１７】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【実施例】
【００１８】
実施例１  Bacillus sp. KSM-LD1株由来アルカリプロテアーゼ（ＳＣ）遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
枯草菌が産生するセリンプロテアーゼファミリー１において高度に保存されている領域である６４番目のＨｉｓ周辺及び２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列His-Gly-Thr-His-Val-Ala-Gly及びGly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser-Pro-His-Val-Ala-Glyに対して、これらの領域間を増幅させるように設計したプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＹＧＧＮＡＣＮＣＡＹＧＴＮＧＣＮＧＧ−３’）、プライマー２（配列番号４：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＮＧＡＮＧＴＮＣＣ−３’）、プライマー３（配列番号５：５’−ＣＣＮＧＣＮＡＣＲＴＧＮＧＧＮＧＮＮＧＣＣＡＴＲＣＴＮＧＴＮＣＣ−３’）を合成した。なお、アミノ酸番号はズブチリシンＢＰＮ’を基準に示したものである。
【００１９】
Bacillus sp. KSM-LD1株を1％トリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム（和光純薬）から成る培地にて３０℃、２４時間、好気的に振盪培養を行い、遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体から斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、プライマー1１と２、１と３の組み合わせを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇ、２０ｎｍｏｌの各プライマー、Pyrobest (Takara)から成る反応液（５０μＬ）に対し、Biometra：T-Gradient Thermocycler(ワットマン)を用いて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ断片をHigh Pure PCR Product Purification キット（ロッシュ）を用いて精製し、SmaＩにて消化したpUC18に連結し、大腸菌HB101株に導入した。形質転換体よりHigh Pure Plasmid Isolation キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、EcoRＩ、HindIIIで消化後1.2%アガロースゲル電気泳動により挿入断片の有無と大きさを確認した。挿入断片の大きさが200 bp〜1500 bpのもの選び、BigDye Terminator Cycle Sequencingキット（パーキンエルマー）及びDNAシークエンサー（377型：アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を決定した。なお、プライマーは、BcaBEST Sequencing Primer RV-M（Takara）又はBcaBEST Sequencing Primer M13-47（Takara）を用いた。塩基配列を比較し異なるものを選抜し、上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマー（同一種、同一方向につき2種ずつ：外側、内側）を合成した。Bacillus sp. KSM-LD1株のゲノムＤＮＡを、EcoRＩ又はHindIIIで消化し、LA PCR in vitro cloning キット（Takara）中のEcoRＩ又はHindIIIカセットに上記消化断片をそれぞれ連結させ、各々の外側プライマーと付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行なった。ＰＣＲの反応条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片０．１〜１．０ｎｇ、各プライマー１０〜２０ｐｍｏｌ並びにPyrobestから成る反応系（50μL）に対し、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。その後、増幅ＤＮＡ断片を各々の内側プライマーと付属のプライマーＣ２でＰＣＲを行ない増幅させた。この際のＰＣＲ条件は先に得られた増幅ＤＮＡ断片を１００００倍希釈したもの１μｌを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーを用い（５０μL）、９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとし３０サイクルにて行なった。増幅した断片の塩基配列を前述の方法と同様に決定した。新たに得られた塩基配列情報をもとに上流域、下流域の塩基配列を決定するためのプライマーを合成し、同様の手法によりアルカリプロテアーゼをコードすると思われる領域及びその上流、全塩基配列を決定した。
【００２０】
実施例２  アルカリプロテアーゼＳＣの組換え生産
実施例１にて決定したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子をプライマー４（配列番号６：５’−ＧＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣ−３、下線部は新たに付加したBamHＩサイトを示す）、プライマー５（配列番号７：５’−ＧＴＴＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧ−３、下線部は新たに付加したXbaＩサイトを示す）各２０ｐｍｏｌを用い、０．１〜１．０ｎｇのBacillus sp. KSM-LD1株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。得られたＰＣＲ増幅断片をHigh Pure PCR Product Purification キットにて精製し、BamHＩ、XbaＩにて消化した後、同様に処理したベクターｐＨＡ６４（特開平８−３２３０５０）に導入し、組換えプラスミドを調製した。これを用いてプロトプラスト法によりB.subtilis ISW1214株を形質転換した。得られた形質転換株を３％(w/v)ポリペプトンＳ、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、０．１％リン酸１カリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、３％マルトース(別滅菌)から成る培地にて３０℃、７２時間好気的に振盪培養を行なったところ、培養液当たりの生産量は約５Ｕ／ｍＬであった。
【００２１】
実施例３  アルカリプロテアーゼＳＣの調製法
実施例２で得た培養液２５０ｍＬに脱イオン水２５０ｍＬを加え、予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（２．５Ｘ９ ｃｍ；東ソー）に添着した。その後、同緩衝液にて洗浄し、０〜０．２Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（５００ｍＬ）にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。次いで０．２〜０．４Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（５００ｍＬ）にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。プロテアーゼ活性は０．２５〜０．３Ｍ塩化カリウムで溶出され、各フラクションを集め（１８０ｍＬ）、限外濾過膜（ＰＭ１０；アミコン）にて濃縮、脱塩を行った。この濃縮液を予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）にて平衡化しておいたＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（１．５×７ｃｍ；東ソー）に添着した。その後、同緩衝液にて洗浄し、０〜０．１Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（１５０ｍＬ）にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。次いで０．１〜０．２Ｍ塩化カリウムを含む同緩衝液（１５０ｍＬ）にて直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。プロテアーゼ活性は０．１８Ｍ塩化カリウムで溶出され、各フラクションを集め（２２ｍＬ）、限外濾過膜（ＰＭ１０；アミコン）にて濃縮、脱塩を行った。本標品のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のプロテアーゼバンドをイモビロン膜（ミリポア）にブロットした。アミノ末端配列を解析するため、その膜片をプロテインシークエンサー（４７６Ａ型；アプライドバイオシステムズ）に供した。その結果、２２番目までのアミノ末端配列は、ＮＤＮＶＥＷＮＩＱＱＶＧＡＰＱＡＷＥＭＧＶＤであることが判り、この配列は塩基配列から推定したアミノ酸配列（配列番号１及び２参照）の１９４番目のアスパラギンから２１５番目のアスパラギン酸までと完全に一致した。
【００２２】
［合成基質法］
０．０５ｍＬの０．５Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９）、０．０５ｍＬの２０ｍＭ塩化カルシウム、０．３５ｍＬの脱イオン水及び０．０２５ｍＬの５０ｍＭ ＡＡＰＦ（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide：シグマ）からなる反応液を３０℃で３分間恒温した後、０．０２５ｍＬの酵素液を加え反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１ｕｎｉｔは上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離する量とした。
【００２３】
参考例  最適反応ｐＨ
ｐＨ４〜１１の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼＳＣはｐＨ９〜１１のグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液中において最も高い分解活性を示した。また、ｐＨ９〜１１のホウ酸緩衝液中においても同様の傾向を示した。更にｐＨ７以上で最大活性値の８５％以上の相対活性値を示した。尚、使用した緩衝液は、酢酸（ｐＨ４〜６）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６〜８）、トリス／塩酸（ｐＨ７〜９）、グリシン／水酸化ナトリウム（ｐＨ９〜１１）及びホウ酸（ｐＨ９〜１１）であった。
【配列表】
2005287442000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月21日(2004.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005287442000001.app