(57)【要約】【課題】特定の遺伝子にマーカー配列を導入したものを、この遺伝子に導入されたマーカー配列を含むプライマーとPCRで増幅することにより、この特定の遺伝子を特異的に検出する方法の提供。【解決手段】目的遺伝子に変異を導入する方法であって、変異を導入しようとする位置よりも前方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセット、及び後方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセットをそれぞれ用いて、目的遺伝子を増幅し、得られる前方領域の増幅断片と後方領域の増幅断片とを連結させることを特徴とする、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子に変異を導入する方法であって、変異を導入しようとする位置よりも前方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセット、及び後方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセットをそれぞれ用いて、目的遺伝子を増幅し、得られる前方領域の増幅断片と後方領域の増幅断片とを連結させることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
変異の導入箇所が少なくとも１箇所である請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異の導入が、目的遺伝子への塩基配列の付加、又は目的遺伝子の塩基配列の置換である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
塩基配列の置換が、アミノ酸をコードするコドンの同義コドンへの置換である請求項３記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸が、セリン、ロイシン及び/又はアルギニンを含むものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法を用いて2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列の３’末端側に塩基配列GTCATCGGAが付加された、変異型tfdAm1遺伝子。
【請求項７】
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、ラルストニア・ユートロファJMP134株由来のものである請求項６記載の変異型tfdAm1遺伝子。
【請求項８】
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼが、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を2,4-ジニトロフェノールへ変換する機能を有するものである請求項７記載の変異型tfdAm1遺伝子。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を用いて2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列の第274-288番目の塩基配列AACGTCAGTCTCGACがAATGTGTCGTTGGATに置換された、変異型tfdAm2遺伝子。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により変異が導入された変異型遺伝子、又は請求項６〜９のいずれか１項に記載の変異型遺伝子を、変異が導入された塩基配列を含むプライマーをフォワード又はリバースプライマーとして用いて増幅し、得られる増幅産物から変異型遺伝子を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定遺伝子をPCRにより特異的に検出する方法として、その遺伝子に変異を導入する方法に関する。すなわち、本発明は「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」、また、「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」に関するものである。本発明の方法によって構築された遺伝子は、その付加または置換した配列を標的にしたPCRにより特異的検出が可能になる。また本法は簡便かつ迅速な部位特異的変異導入を行うことが出来る。
【背景技術】
【０００２】
環境浄化を目的として、特定の微生物を環境中に導入する場合、微生物の有効性や安全性を判断するための指標として、環境中に多様多種な微生物が存在する中から、導入した微生物を検出・追跡する必要がある。そのために、微生物に固有に存在する遺伝子の塩基配列を標的にして、遺伝子の塩基配列に相同なオリゴヌクレオチドを利用したPCRやハイブリダイゼーションを行う方法がある。
【０００３】
しかしながら、従来から知られている検出方法には次のような問題点がある。すなわち、微生物の遺伝子配列から設計した検出プライマーを用いたときは、同じ塩基配列を有する微生物種を検出することが出来るが、微生物種の中の特定の個体を識別することは出来ない。また環境中に類似の遺伝子配列が存在する可能性があり、特に環境中においては、導入した微生物が移動するために、環境中の全ての場所における類似の遺伝子配列が存在する可能性を予測することは困難である。
【０００４】
さらに、環境に導入する特定遺伝子を含む微生物をDNAレベルで追跡する場合、以下の問題がある。すなわち、環境浄化を目的としてある微生物を環境中に導入しようとする場合において、汚染物質分解遺伝子を意図的にプラスミドなどの核外遺伝子上に導入するときは、プラスミドは接合伝達などによって他の微生物に水平伝搬する可能性がある。このため、宿主自身と共に組換えプラスミドも追跡しなければ、導入微生物の遺伝子を追跡することにはならない。また、分解遺伝子を意図的に染色体DNAに組み込んだ場合でも、やはりその遺伝子が他の微生物に伝播する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
既知の遺伝子配列から設計した検出プライマーでは微生物種を検出することはできても、個体を識別することは出来ない。環境中には、互いに類似する遺伝子配列が存在する可能性があるため、導入した遺伝子のみを特異的に検出することが困難である。本発明は、上記のような問題点を鑑みてなされたものであり、その目的は、任意の遺伝子配列に任意の特異的検出の標的となる塩基配列を付加、または特異的検出の標的となる塩基配列に置換する方法を開発し、従来の種レベルの検出ではなく細胞、DNAレベルでの特異的検出を可能にすることである。すなわち、本発明は、特定の塩基配列を有する遺伝子を特異的に検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。そして、特定の微生物種の検出・追跡のために、その微生物の塩基配列にマーカーとなる配列を付加または置換した変異遺伝子を作製し、このマーカー遺伝子を含むプライマーとともにPCRを行うことにより簡便かつ迅速に、目的とする遺伝子の検出または追跡ができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
(1)目的遺伝子に変異を導入する方法であって、変異を導入しようとする位置よりも前方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセット、及び後方領域を増幅するためのプライマーセットのうち少なくとも一方のプライマーに変異の導入の目的配列が含まれるプライマーセットをそれぞれ用いて、目的遺伝子を増幅し、得られる前方領域の増幅断片と後方領域の増幅断片とを連結させることを特徴とする、前記方法。
【０００８】
(2)変異の導入箇所が少なくとも１箇所である(1)記載の方法。
(3) 変異の導入が、目的遺伝子への塩基配列の付加、又は目的遺伝子の塩基配列の置換である(1)又は(2)記載の方法。
(4) 塩基配列の置換が、アミノ酸をコードするコドンの同義コドンへの置換である(2)記載の方法。
【０００９】
(5) アミノ酸が、セリン、ロイシン及び/又はアルギニンを含むものである(4)記載の方法。
(6) 上記(1)〜(3)のいずれか１項に記載の方法を用いて2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列の３’末端側に塩基配列GTCATCGGAが付加された、変異型tfdAm1遺伝子。
(7) 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、ラルストニア・ユートロファJMP134株由来のものであ(6)記載の変異型tfdAm1遺伝子。
【００１０】
(8) 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼが、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を2,4-ジニトロフェノールへ変換する機能を有するものである(7)記載の変異型tfdAm1遺伝子。
(9) 上記(1)〜(5)のいずれか１項に記載の方法を用いて2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列の第274-288番目の塩基配列AACGTCAGTCTCGACがAATGTGTCGTTGGATに置換された、変異型tfdAm2遺伝子。
【００１１】
(10) 上記(1)〜(5)のいずれか１項に記載の方法により変異が導入された変異型遺伝子、又は上記(6)〜(9)のいずれか１項に記載の変異型遺伝子を、変異が導入された塩基配列を含むプライマーをフォワード又はリバースプライマーとして用いて増幅し、得られる増幅産物から変異型遺伝子を検出する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、特定の遺伝子を個体レベルで特異的に検出する方法が提供される。本発明の遺伝子の特異的検出方法は、環境浄化のために用いられる微生物を環境中で検出・追跡することができ、これにより、その微生物の効果・安全性を簡便かつ迅速に判断できる点で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
本発明は、特定の遺伝子を、マーカー配列を含むプライマーを用いて増幅することにより、上記特定の遺伝子にマーカー配列を導入し（変異を導入し）、この特定の遺伝子を特異的に検出する方法である。そして、本発明は汎用性の高い簡便な方法による遺伝子への特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)の導入方法を提供する。マーカー配列の導入方法として「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」と「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」という2種類の方法を提供するが、基本技術は同じであり、マーカー配列となる配列を含んだ複数セット（例えば2セット）のプライマーを用いてプライマーのセット数に対応した数のPCR（2セットのプライマーセットを用いた場合は2種類のPCR）を行い、それらのPCR産物を変性、会合、PCRによって結合することにより、特異的検出の標的となる塩基配列の導入が可能になる。
【００１４】
例えば、2セットのプライマーセットを用いて2種類のPCRを行う場合は、マーカー配列を導入する目的遺伝子をその導入位置で前方（前半）領域、後方（後半）領域と二分し、個別にPCRによる増幅を行う。「前方領域」とは、目的遺伝子のセンス鎖を基準としたときに、変異導入位置からみてその上流側（5'側）の領域を意味し、「後方領域」とは、目的遺伝子のセンス鎖を基準としたときに、変異導入位置からみてその下流側（3'側）の領域を意味する。
【００１５】
このときに前方領域を増幅するリバースプライマーと後方領域を増幅するフォワードプライマーのいずれか一方又は両方にそれぞれ相補的なマーカー配列を連結しておく。2種類の増幅産物、すなわち鋳型となる遺伝子の前半部の増幅断片と後半部の増幅断片を混合、変性、再会合し、DNA断片の前半領域と後半領域の相補的な付加又は置換する塩基配列で二つの断片を結合し、前半領域のフォワードプライマーと後半領域のリバースプライマーを用いて結合させたDNA断片の全長について増幅反応を行い、変異配列が導入された遺伝子の全長を増幅する。このようにして得られた変異型の遺伝子は、付加又は置換した塩基配列を標的としてPCRによる特異的検出が可能になる。
【００１６】
本発明において、「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」は、任意の遺伝子を鋳型に任意の付加配列を連結したセットのプライマーを用いて例えば2種類のPCRを行い、さらに2種類のPCR産物を結合するPCRを行うことによって遺伝子に任意のマーカー配列を付加する方法である。
【００１７】
特異的検出の際には、PCRに用いるフォワード・リバースプライマーのいずれか一方、または両方のプライマーにマーカー配列を含ませることで、上記遺伝子の特異的検出が可能になる。またプライマーセットを複数種用い、複数回のPCRを行うことにより、マーカー配列を持つDNAの検出感度をより高めることができる。
【００１８】
(1) 本発明の「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」は、組み換え対象となる遺伝子がpUC19などのプラスミドにクローン化されており、その遺伝子とその周辺領域のDNA塩基配列が決定されていることが必要である。
本方法は既知の遺伝子に任意のDNA塩基配列をマーカー配列として付加し、その配列を標的として特異的検出を可能にするものである。
【００１９】
特異的検出の標的として導入するDNA塩基配列は、後のPCRによる特異的検出を可能にするため、数塩基以上必要である。
特異的検出の標的とする塩基配列（マーカー配列）を遺伝子のコード領域内に付加する場合、マーカー配列は、アミノ酸に翻訳される際に読み枠がずれないように、3、6、9など3の倍数の塩基番号を有する塩基の後ろに付加するように設計し、また付加するマーカー配列もアミノ酸に翻訳される3塩基の塩基配列を単位として設計・調製する。さらに付加する塩基配列は、コードするアミノ酸自体が酵素の活性や立体構造に影響が少ないと考えられる配列を用いることが好ましい。
【００２０】
マーカー配列は上記の条件をふまえ、6、9、12、15、18塩基程度が適当であるが、これに制限されるものではない。
塩基配列を付加する位置はその導入によって元の遺伝子が機能を失ったり、低下したりしないように、検討する必要がある。タンパク質のN末またはC末領域に導入することが最もそれらの危険性を回避できると言える。
【００２１】
本発明において、2組のプライマーセットを用いた場合を説明する（図１）。
塩基配列を付加する位置を決定した後、その位置で遺伝子を前半領域、後半領域の2つの領域に分け、それぞれを増幅する2セットのPCR
プライマーを設計し、個々にPCRを行い、それぞれの増幅産物を得る。この時、前半領域を増幅するフォワードプライマー をA、リバースプライマー をB、また後半領域を増幅するフォワードプライマー
をC、リバースプライマー をDとする。プライマーBの5’側にはマーカー配列と相補的な配列を付加しておき、さらにその5’側には後半領域で増幅される部分のコード鎖の5’部を5〜20塩基程度、好ましくは10塩基程度付加しておく。このように、マーカー配列の5'側に10塩基程度付加された配列を、本発明においては「クランプ配列」という。
【００２２】
プライマー Cの5’側にはマーカーとなるDNA塩基配列を付加しておき、さらにその5’側には前半領域で増幅される部分のコード鎖の3’部を5〜20塩基程度、好ましくは10塩基程度、クランプ配列を付加しておく。それぞれのプライマーの本体部位(鋳型DNAと相同な、マーカー配列の3’側)を20塩基、マーカー配列を9塩基で設計した場合、A、D プライマーは20 塩基、B、C プライマーは20+9+10=39
塩基となる(図1参照)。 
【００２３】
本発明の方法で行うPCRに用いるDNA
ポリメラーゼには、Taq ポリメラーゼなどのPCR増幅産物の5’側にアデニン塩基を付加するようなものを使用するのではなく、何ら修飾をせず、鋳型の塩基配列に対して正確性の高い活性を有するポリメラーゼを使用することが好ましい。そのような正確性の高いポリメラーゼとしては、例えばPfuポリメラーゼ、Pyrobest
DNAポリメラーゼなどが挙げられる。
【００２４】
ここで、A、Dプライマーがアニーリングする位置は遺伝子をコードする領域である必要はなく、遺伝子を連結しているベクター部位でも可能である。
B、Cプライマーに付加した10塩基程度の配列(クランプ部位)は導入する塩基配列とともに2つのPCR断片を結合する相補部位となる塩基配列であり、マーカー配列とクランプ部位で計15
塩基程度の長さの場合に効果的である。但し、マーカー配列が長い場合、クランプ部位は必須ではない。Bプライマーのクランプ部位はCプライマーの本体部位の一部と、Cプライマーのクランプ部位は
Bプライマーの本体部位の一部とそれぞれ相補的になっている(図2参照)。
【００２５】
A、Bプライマーで増幅した遺伝子の前半領域のPCR産物を「A-B断片」とし、C、Dプライマーで増幅した遺伝子の後半領域のPCR産物を「C-D断片」とすると、増幅されたA-B断片及びC-D断片をそれぞれ精製した後、混合、熱変性、再会合を行なう。このとき前半領域を増幅したPCR産物のAプライマーが伸長して3’側にマーカー配列と相補部位が連結した分子（A-B断片のBプライマーのマーカー領域に対応する部分）と、後半領域を増幅したPCR産物のDプライマーが伸長して3’側にマーカー配列と相補部位が連結した分子（C-D断片のCプライマーのマーカー領域に対応する部分）が、それぞれマーカー配列とクランプ部位からなる相補部位で会合した部分二本鎖DNA分子が出来る(図1参照)。
【００２６】
この再会合したDNA分子を鋳型にDNA
polymeraseとdNTPを加え、 DNAの伸長反応を行う。このときプライマーAとDの伸長産物が会合した分子は部分的に二本鎖になっており、それぞれの3’側から伸長反応(A伸長産物（A-B断片の3'側）がプライマーとなりD伸長産物が鋳型となる反応と、D伸長産物（C-D断片の3'側）がプライマーとなりA伸長産物が鋳型となる反応)が起こり、マーカー配列を有する遺伝子の全体の二本鎖DNAが合成される(図3）。このときBプライマーの伸長産物とCプライマーの伸長産物が会合し、部分的に二本鎖になった分子は、それぞれが5’側で結合しているため、伸長反応は起こらない(図1、3参照)。
【００２７】
伸長反応を行ったDNAサンプルを鋳型に、プライマーA、Dを加え、マーカー配列を有する遺伝子の全体を増幅するためにPCRを行う(図1参照)。
上記の2つのPCR産物の混合、変性、再会合、伸長反応のステップは必須ではなく、二つのPCR産物を直接鋳型にしてPCRを用い、プライマーA、Dを加えて、リンキングPCRを行うことも可能である。
【００２８】
上記のPCR産物を精製し、適当なベクター（例えばpUC19、pHSG396ベクターなど）にクローニングし、DNA塩基配列解析装置を用いてマーカー配列が導入されたことを確認し、遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)が付加された遺伝子を得る。
【００２９】
(2)本発明の「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」は、上記の「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」と同様、組換えの対象となる遺伝子がpUC19などのプラスミドにクローン化されており、その遺伝子とその周辺領域のDNA塩基配列が決定されていることが必要である。
【００３０】
本発明の方法は、既知の遺伝子の塩基配列をそのコードするアミノ酸に変化が起こらないような塩基配列に置換することにより、その塩基配列を標的として、遺伝子の特異的検出を可能にするものである。
特異的検出の標的とするために、塩基配列の置換はその翻訳されるアミノ酸に変化が無い様に設計する。すなわち遺伝暗号表を用い、マーカーとする位置のDNA塩基配列を出来るだけ異なるDNA塩基配列に置換しながら、同じアミノ酸をコードするコドンを選択する(表1参照)。
【００３１】
【表１】
2005287415.tif 000002
【００３２】
アミノ酸を置換しないように、特異的検出の標的とするために塩基配列に置換を導入する場合は、セリン(Ser)、ロイシン(Leu)、アルギニン(Arg)をコードする領域(枠で囲った部分)を用いることで置換率を高くすることが出来る。
特異的検出の標的とする塩基配列の位置は、その塩基配列の置換によって翻訳されるアミノ酸が変化しないように設計するので（同義コドンへの置換）、遺伝子のどの部位を選択する事も可能である。
【００３３】
塩基配列の置換を行う位置は、そのコードするアミノ酸を考慮に入れて選択することが望ましい。アミノ酸の置換を伴わない塩基配列の置換を行う場合、ほとんどのアミノ酸がコドンの3番目の塩基の置換のみ行うことが出来る。すなわち5アミノ酸をコードする15塩基を選択した場合、3塩基おきに5塩基の置換が可能である。一方、ロイシン(Leu)、アルギニン(Arg)
のコドンは1番目と3番目の塩基配列、すなわち 2塩基を置換することが可能であり、またセリン(Ser)のコドンは3塩基配列の全ての塩基配列を置換する事が可能である(表1参照)。すなわち、マーカーとしてアミノ酸置換を伴わない同義コドンへの塩基置換を行う場合、セリン(Ser)、ロイシン(Leu)、アルギニン(Arg)が隣接してコードされている領域をターゲットにすれば、置換率の高い、特異的検出に適した配列とする事が出来る。セリンを例に取ると、TCT、TCA、TCGでコードされるセリンはAGCに、TCC、TCA、TCGでコードされるセリンはAGTに、またそれらの逆の変異のように3塩基とも置換することが出来る。5アミノ酸をコードする15塩基を選択し、その中にセリン(Ser)とロイシン(Leu)またはアルギニン(Arg)が一つずつ含まれていた場合、少なくとも15塩基中8塩基の置換を導入する事が出来る(表1参照)。
【００３４】
置換する塩基配列を決定したのち、遺伝子をその置換する塩基配列の部位を含まない前半領域、その配列部位を含まない後半領域の2つの部位に分け、それぞれのDNA
断片を増幅する2セットのPCR プライマーを設計し、個々にPCRを行い、それぞれの増幅産物を得る。この時前半領域を増幅するフォワードプライマー をA、リバースプライマー
をE、また後半領域を増幅するフォワードプライマー をF、リバースプライマー をDとする。プライマーEの5’側には特異的検出の標的となる置換した塩基配列と相補的な配列を付加しておき、さらにその5’側には後半領域で増幅される部分のコード鎖の5’側を10 塩基程度付加しておく。プライマー
Fの5’側には特異的検出の標的となる置換した塩基配列を付加しておき、さらにその5’側には前半領域で増幅される部分のコード鎖の3’部を10 塩基程度付加しておく。それぞれのプライマーの本体部位を20
塩基、特異的検出の標的となる置換した塩基配列を15塩基の長さになるように設計した場合、A、D プライマーは20 塩基、E、F プライマーは20+15+10=45
塩基となる(図4参照)。 
【００３５】
本発明の方法により行うPCRには、上記の「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」と同様に、Taq
polymeraseのように産物の5’側にアデニン塩基を付加するようなDNA polymeraseではなく、何ら修飾をせず、鋳型の塩基配列に対して正確性の高い活性を有するポリメラーゼ（例えばPfuポリメラーゼ、
Pyrobestポリメラーゼ等）を使用する。
また「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」と同様に、A、Dプライマーがアニーリングする位置は、遺伝子の内部である必要はなく、遺伝子を連結しているベクター部位でも可能である。
【００３６】
E、Fプライマーに付加した10
塩基程度の配列(クランプ部位)は特異的検出の標的となる塩基配列とともに、リンキングPCRの際に互いに結合する相補的な塩基配列であり、特異的検出の標的となる塩基配列とクランプ部位で計15
塩基程度で効果的であるが、特異的検出の標的となる塩基配列が長い場合はクランプ部位は必須ではない。Eプライマーのクランプ部はFプライマーの本体部位(鋳型DNAと相同な、マーカー配列の3’側)の一部と、Fプライマーのクランプ部は Eプライマーの本体部位の一部とそれぞれ相補的になっているはずである(図4参照)。
「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」と同様の手順により、それぞれのプライマーから増幅したPCR産物から特異的検出の標的となる塩基配列が導入された遺伝子を得ることが可能である。
【００３７】
(3) 本発明の「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」、「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」は適切なプライマーを設計することにより同時に複数の箇所にマーカー配列を導入することが出来る。例えばマーカー配列を二カ所に導入する場合、鋳型遺伝子をマーカー配列を導入する位置で三カ所に分け、前部域、中部域、後部域を個別に増幅するプライマーによってPCR増幅する。この場合、前部域と中部域との間の変異導入位置からみれば、前部域が「前方領域」となり、中部域が「後方領域」となる。また、中部域と後部域との間の変異導入位置からみれば、中部域が「前方領域」となり、後部域が「後方領域」となる。
【００３８】
それぞれの フォワードプライマー、リバースプライマーを
GとH、IとJ、KとLとすると、HとIプライマーに相補的なマーカー配列とクランプ部位、またJとKプライマーに相補的なマーカー配列とクランプ部位を付加しておくことで二カ所へのマーカー配列の導入が可能になる。このとき二カ所のマーカー配列はそれぞれ異なる塩基配列を用いるべきである。塩基配列の付加、置換の導入を同時に行うことも可能である。
本発明の「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」は、置換した塩基によってアミノ酸置換も起こるようにプライマーを設計することにより簡便な部位特異的変異(Site
directed mutagenesis)を行うことが可能である。
【００３９】
(4) tfdAm1遺伝子/
tfdAm2遺伝子
本発明は、本発明の変異導入方法により、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸
ジオキシゲナーゼ遺伝子（tfdA）のDNA塩基配列の第6番の塩基の後に、マーカーとなる塩基配列GTCATCGGAが導入された変異型tfdAm1遺伝子（配列番号１）を提供する。tfdA遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia
eutropha）JMP134 株由来の遺伝子であり、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸 を2,4-ジニトロフェノール へ変換する機能を有する酵素をコードするものである。
【００４０】
本発明はまた、本発明の変異導入方法により上記tfdAm1のAsn-Val-Ser-Leu-Asp（配列番号３）をコードするDNA（塩基番号274-288）の塩基配列AACGTCAGTCTCGAC（配列番号４）を、マーカーとなるAATGTGTCGTTGGAT（配列番号５）へ置換した変異型tfdAm2遺伝子（配列番号２）を提供する。
本発明の方法により構築されたマーカー配列を含む遺伝子は、その塩基配列を含むプライマーを利用したPCRにより特異的検出が可能である。
本発明の遺伝子は後述するように、導入したマーカー配列を含むプライマーを利用したPCR
を行うことにより、本発明の遺伝子を特異的に高精度、しかも簡便に検出することができる。
【００４１】
なお、本発明においては、上記変異型遺伝子を適当なベクターに連結して組換えベクターを作成することができる。本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。
【００４２】
また、本発明においては、上記ベクターを含む形質転換体を提供することができる。ベクターを導入する宿主は、細菌（大腸菌等）、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、当分野において周知のものを任意に使用することができる。上記形質転換体は、公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの形質転換手法により作製することができる。またベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮し用いることによって、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸ジオキシゲナーゼ活性を持つ酵素を産生する微生物を作製することが可能である。
本発明のtfdAm1、tfdAm2遺伝子を発現した大腸菌の細胞抽出物は、野生型の遺伝子を発現したものと同程度の2,4-ジクロロフェノキシ酢酸分解活性を示す。
【００４３】
(5) 特異的検出の方法
本発明は、上記のように作製した変異遺伝子を用いて、導入されたマーカー配列を標的として特異的に検出する方法である。特異的検出に使用するマーカー配列は、PCRによって野生型の遺伝子と判別できるように設計されている。従って、検出は、検出の目的遺伝子を鋳型とし、マーカー配列を含む塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを標識し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、反応産物を確認すればよい。プライマーへの標識は、蛍光標識、放射標識のいずれを採用してもよい。蛍光物質としては、例えばAlexa系、Cy2、Cy3、Cy5、FITC、ローダミン、テキサスレッドなどが挙げられ、放射標識物質としては、3H、13C、15N、32P等が挙げられる。
【００４４】
マーカー配列を含むPCRプライマーを設計し、それぞれ野生型遺伝子と変異遺伝子を鋳型としてPCRを行うと、野生型では変異遺伝子をターゲットにしたプライマーを用いたPCRを行っても、DNA断片の増幅が確認することができない。これに対し変異遺伝子は、変異配列をターゲットとしたプライマーによりDNA断片の増幅が確認される。
増幅の条件は、94℃で30秒の変性工程、60℃で30秒のアニーリング工程、及び74℃で増幅長500-bpあたり30秒の伸長工程を１サイクルとしてこれを30サイクル行う。但し、鋳型DNA及びプライマーを十分変性させるために、上記増幅サイクルの前に94℃で５〜10分の変性工程を加えてもよい。さらに、増幅産物の検出を直ちに行わない場合は、非特異的な増幅が起こらないようにするために、増幅産物を4℃で保存する工程を加えることが好ましい。
このようにして、本発明のプライマーセットを用いて、目的のDNAを増幅することができる。
【実施例１】
【００４５】
塩基配列の付加
(1)本発明の「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」を用いてRalstonia
eutropha JMP134株由来の2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)を2,4-Dichlorophenolに変換する酵素遺伝子
tfdA（M16730 [GenBank]）への特異的検出の標的となる塩基配列の付加を行った(図5参照)。
特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する位置は酵素の活性が失われる危険性の少ないアミノ酸配列のN末側残基の2番目と3番目の間、塩基配列では塩基番号6番目の後ろとした。
【００４６】
マーカー配列は、Val-Ile-GlyをコードするGTCATCGGAの9塩基とした。このアミノ酸配列は構造的に小さいアミノ酸残基で酵素の立体構造や活性に影響が少ないこと、アミノ酸の反応性が低いことを考慮した。また付加するDNA配列は遺伝子をPCRにより特異的に検出する場合に、GC含量や遺伝子上の配置がPCRプライマーの設計に都合が良いことを考慮した。また元のtfdA遺伝子でも用いられているコドンを採用している。
tfdAの前半領域約450-bpを増幅するプライマーセット、フォワードプライマー
A、リバースプライマー B、また後半領域約1100-bpを増幅するプライマーセット、フォワードプライマーC、リバースプライマー Dを設計し、プライマーB、Cにはそれぞれマーカー配列(プライマーCにGTCATCGGA、プライマーBにその相補配列)とクランプ部位を付加した(図参照)。プライマーAはtfdAがクローン化された位置の約450-bp
5’側のベクター部位の配列であり、プライマーDはtfdA終止コドンより約180-bp  3’側と相補的な塩基配列を含むプライマーである(図5参照)。
【００４７】
プライマーA：5'-GCCTTTGAGTGAGCTGATACC-3'（配列番号６）
プライマーB：5'-TTGCGACGACTCCGATGACGCTCACTTTTTTGCTCCTTTTC-3'（配列番号７）
プライマーC：5'-AAAAGTGAGCGTCATCGGAGTCGTCGCAAATCCCCTTCATC-3'（配列番号８）
プライマーD：5'-CCAGCGTCATTTCGAGCACC-3'（配列番号９）
【００４８】
二つのプライマーセットにより二つのPCR増幅産物を得て、それぞれ精製した。PCRのプログラムは変性95度30秒、アニーリング60度30秒、伸長反応は74度で増幅長500-bpあたり30秒に設定し、30サイクル行った。DNA
ポリメラーゼはTAKARA社のPyrobest polymeraseを用いた。
精製した二つのPCR産物を混合、変性、再会合、伸長反応を行い、最終的にA、Dプライマーを用いマーカー配列が導入された遺伝子全体をPCR増幅した(図6参照)。
【００４９】
得られたPCR増幅配列をプラスミドベクターに連結し大腸菌に形質転換してクローン化し、DNA塩基配列解析装置にて塩基配列を決定し、マーカー配列が付加されていることを確認した。塩基配列を決定した全てのクローンにおいてその配列が付加されている事が確認され、マーカー配列を持ったtfdAm1遺伝子の取得に成功し、本手法の有用性が示された。
【実施例２】
【００５０】
塩基配列の置換
(2)本発明の「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」を用いて、上記で構築したtfdAm1遺伝子に塩基配列の置換による特異的検出の標的となる塩基配列の導入を行った。
マーカー配列とする塩基を置換する配列は、アミノ酸配列では92-96番目(野生型TfdAでは89-93)のアミノ酸配列Asn-Val-Ser-Leu-Asp（配列番号３）、DNAでは塩基番号274-288(野生型tfdAでは265-279)の塩基配列AACGTCAGTCTCGAC（配列番号４）であり、これをAATGTGTCGTTGGAT（配列番号５）に置換するプライマー設計を行った。この塩基置換により15塩基中8塩基を置換することが可能である。
【００５１】
塩基置換を行う位置でtfdAm1遺伝子を前半領域、後半領域に分け、置換する塩基配列を含まないPCRプライマーセットを設計した。前半領域を増幅するフォワードプライマーには上記のAプライマー、後半領域のリバースプライマーには上記のDプライマーをそのまま用い、前半領域のリバースプライマーは塩基配列を置換する位置の5’側に新たにEプライマー、後半領域のフォワードプライマーは塩基配列を置換する位置の3’側に新たにFプライマーを設計し、その5’側にそれぞれ塩基配列の置換を行う相補的な塩基配列(マーカー配列)を付加し、さらにその5’側にクランプ部位となる10 塩基の塩基配列を付加した。
【００５２】
以上のプライマーセットを用い、「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」で行った場合と同様に、前半領域、後半領域のPCR増幅、PCR産物の連結、マーカー配列を有する遺伝子のPCR増幅を行なった。得られたクローンをDNA塩基配列解析装置にて塩基配列を確認し、塩基置換の起こった変異体遺伝子tfdAm2を構築した。
上記のように得られたtfdAm1遺伝子は、野生型のtfdA遺伝子の塩基番号6の下流に9塩基長のマーカー配列を導入したものであり、野生型よりもDNAで9塩基、コードするアミノ酸は3残基が付加されている(野生型tfdAでは861塩基287アミノ酸、tfdAm1では870塩基290アミノ酸)。tfdAm2遺伝子はtfdAm1にさらに塩基配列274-288の位置の塩基配列を置換してマーカー配列を導入したものであり、塩基長はtfdAm1と同一である。
【実施例３】
【００５３】
2,4-Dの分解試験
本実施例は、構築したtfdAm遺伝子の2,4-Dの分解活性を調査するために行ったものであり、次の手順による。
【００５４】
(1) 粗酵素抽出液の調整
本発明に係る遺伝子を連結したベクターDNA
を導入した大腸菌(Escherichia coli DH5α)をシャーレから１白金耳採取し、Luria-Bertani(LB)培地3 ml を入れた試験管に添加する。これを30℃で6-12時間振盪培養(160
rpm)する。この培養液に終濃度5 mMのIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を加え、30℃でさらに3-4時間培養し、酵素を誘導する。この培養液を6,000
rpm で5分間の遠心分離を行い、菌体を集めてTris-HClバッファー(pH8.0)で3回洗浄し、300μlのTris-HClバッファーに再懸濁し、超音波による細胞破砕を行った。これを遠心分離15,000
rpm で10分間行い、その上清を粗酵素抽出液とし、2,4-D ジオキシゲナーゼ活性(TfdA活性)の測定に用いた。
【００５５】
(2) 2,4-D分解活性の測定
2,4-Dの分解活性の測定用反応は30℃で行い、終濃度1mM
α-ketoglutarate、 50 μM Ascorbate、 50μM Fe(NH4)2(SO4)2、
20 mM Tris-HCl、 1mM 2,4-Dの反応バッファーに体積比1/10量の上記調整の粗酵素抽出液を加えることにより開始し、等量のメタノールを加えることで終了した。その反応終了液を遠心分離15,000
rpm で10分間行い、上清中に残存する2,4-Dの濃度を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて分析した。分析条件の固定相はOctadecyl
Silica (ODS)、移動相は水:アセトニトリル:リン酸=49.5:49.5:1で、流速1 ml/minで行なった。
【００５６】
(3) 野生型TfdA、特異的検出の標的となる塩基配列を導入した変異型TfdAm1、TfdAm2の活性
それぞれの粗酵素抽出液によるSpecific
activity(μmol/min/mg of protein)測定を行い、野生型TfdAは1.20 (μmol/min/mg of protein) の活性を示し、TfdAm1、TfdAm2ではそれぞれ1.16、1.15(μmol/min/mg
of protein) の活性を示した。野生型の活性値を100とすると、TfdAm1、TfdAm2では相対的にそれぞれ97、96となり、酵素活性値に有意な差は無く、特異的検出の標的となる塩基配列導入による2,4-D代謝活性の変化はほとんど無いことが結論付けられた。
【実施例４】
【００５７】
DNA 塩基配列を導入した2,4-D遺伝子の検出試験
本発明で構築した特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を導入した遺伝子tfdAm1、
tfdAm2はPCRによって野生型のtfdA遺伝子と判別できる様に設計されている。これを確認するためマーカー配列を含むPCRプライマーを設計し、それぞれ野生型tfdA遺伝子、tfdAm1、
tfdAm2を鋳型にPCR検出を行った。その結果、野生型ではtfdAm1、 tfdAm2をターゲットにしたプライマー(それぞれプライマーIとJ、及びプライマーIとK)を用いたPCRにより、DNA断片の増幅が確認されず、tfdAm1、
tfdAm2ではそれぞれをターゲットとしたプライマーでDNA断片の増幅が確認された。これらのことから構築したtfdAm1、 tfdAm2が野生型のtfdAとは区別してPCRにより増幅することが可能であり、特異的に検出できることを確認した(図7参照)。
【００５８】
プライマーI：5'-AAAAAGTGAGCGTCATCGGAG-3'（配列番号10）
プライマーJ：5'-GCCGAGATGTCGTACCTGCG-3'（配列番号11）
プライマーK：5'-TTGCCATCCAACGACACATTC-3'（配列番号12）
【実施例５】
【００５９】
環境サンプルからのtfdAm遺伝子の検出試験
本発明によるマーカー配列を導入した遺伝子は、環境サンプル中においても特異的に検出可能であることを示す。例として、下水処理場より採取した活性汚泥に混合したtfdAm1遺伝子が特異的に検出できることを示す。茨城県土浦市の霞ヶ浦下水処理場3池より採取した活性汚泥10
ml (MLSS=4877mg/L)にtfdAm1をプラスミドベクター上に持つ大腸菌を約101-106細胞(10-1,000,000)加え、その混合液から全DNAを抽出し、それを鋳型としてPCRを行った。またコントロールとして野生型tfdAを有する大腸菌を加えた活性汚泥、さらに何も加えない活性汚泥より抽出した全DNAを用いて実験を行った。活性汚泥10ml(乾燥重量約0.05g)から抽出した全DNA量は約12.5μgで、その1/10,000にあたる1.25ngを鋳型に20μlの反応系でtfdAm1をターゲットにしたプライマーIとJを用いたPCRを行った。その結果、活性汚泥から抽出した全DNAを鋳型にした場合、野生型tfdAを有する大腸菌を加えた活性汚泥DNAを鋳型にした場合おいて、DNA断片の増幅は確認されなかった。一方、tfdAm1をプラスミドベクター上に持つ大腸菌を含む活性汚泥から抽出したDNA試料からは1,000細胞以上加えた全ての試料においてDNA断片の増幅が確認された(図8参照)。
【００６０】
これらの結果から、本発明で示した「遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法」また「遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法」によって構築された遺伝子が環境サンプル中からも特異的に検出が可能であることを示した。
【００６１】
以上説明したように、本発明はマーカー配列を導入した遺伝子、具体的には、2,4-D
を分解し、2,4-ジクロロフェノールへ変換する酵素をコードする遺伝子、2,4-D ジオキシゲナーゼ遺伝子tfdA、および導入したDNA塩基配列とその導入方法を提供するものである。本発明に係る遺伝子は導入した特異的な塩基配列を含むプライマーを用いてPCR
を行うことにより、本発明の遺伝子を特異的かつ簡便に検出することが出来る。従って環境浄化を目的として、本発明の遺伝子を含む微生物を環境中に導入する場合、微生物の有効性や安全性を判断するための指標として、環境中に多様多種な微生物が存在する中から、導入した微生物や遺伝子を検出・追跡する事が出来る。
本発明において構築したtfdAm1遺伝子及びtfdAm2を以下に示す。
【００６２】
tfdAm1塩基配列(下線部は付加配列を示す)（配列番号１）
GTGAGCGTCATCGGAGTCGTCGCAAATCCCCTTCATCCTCTTTTCGCCGCAGGGGTCGAAGACATCGACCTTCGAGAGGCCTTGGGTTCGACCGAGGTCCGAGAGATCGAACGGCTAATGGACGAGAAGTCGGTGCTGGTGTTCCGGGGGCAGCCCCTGAGTCAGGATCAGCAGATCGCCTTCGCGCGCAATTTCGGGCCACTCGAAGGCGGTTTCATCAAGGTCAATCAAAGACCTTCGAGATTCAAGTACGCGGAGTTGGCGGACATCTCGAACGTCAGTCTCGACGGCAAGGTCGCGCAACGCGATGCGCGCGAGGTGGTCGGGAACTTCGCGAACCAGCTCTGGCACAGCGACAGCTCCTTTCAGCAACCTGCTGCCCGCTACTCGATGCTCTCCGCGGTGGTGGTTCCGCCGTCGGGCGGCGACACCGAGTTCTGCGACATGCGTGCGGCATACGACGCGCTGCCTCGGGACCTCCAATCCGAGTTGGAAGGGCTGCGTGCCGAGCACTACGCACTGAACTCCCGCTTCCTGCTCGGCGACACCGACTATTCGGAAGCGCAACGCAATGCCATGCCGCCGGTCAACTGGCCGCTGGTTCGAACCCACGCCGGCTCCGGGCGCAAGTTTCTCTTCATCGGCGCGCACGCGAGCCACGTCGAAGGCCTTCCGGTGGCCGAAGGCCGGATGCTGCTTGCGGAGCTTCTCGAGCACGCGACACAGCGGGAATTCGTGTACCGGCATCGCTGGAACGTGGGAGATCTGGTGATGTGGGACAACCGCTGCGTTCTTCACCGCGGACGCAGGTACGACATCTCGGCCAGGCGTGAGCTGCGCCGGGCGACCACCCTGGACGATGCCGTCGTCTAG
【００６３】
TfdAm2塩基配列(最初の下線部は付加配列、２番目の下線部は置換配列を示す)
（配列番号２）
GTGAGCGTCATCGGAGTCGTCGCAAATCCCCTTCATCCTCTTTTCGCCGCAGGGGTCGAAGACATCGACCTTCGAGAGGCCTTGGGTTCGACCGAGGTCCGAGAGATCGAACGGCTAATGGACGAGAAGTCGGTGCTGGTGTTCCGGGGGCAGCCCCTGAGTCAGGATCAGCAGATCGCCTTCGCGCGCAATTTCGGGCCACTCGAAGGCGGTTTCATCAAGGTCAATCAAAGACCTTCGAGATTCAAGTACGCGGAGTTGGCGGACATCTCGAATGTGTCGTTGGATGGCAAGGTCGCGCAACGCGATGCGCGCGAGGTGGTCGGGAACTTCGCGAACCAGCTCTGGCACAGCGACAGCTCCTTTCAGCAACCTGCTGCCCGCTACTCGATGCTCTCCGCGGTGGTGGTTCCGCCGTCGGGCGGCGACACCGAGTTCTGCGACATGCGTGCGGCATACGACGCGCTGCCTCGGGACCTCCAATCCGAGTTGGAAGGGCTGCGTGCCGAGCACTACGCACTGAACTCCCGCTTCCTGCTCGGCGACACCGACTATTCGGAAGCGCAACGCAATGCCATGCCGCCGGTCAACTGGCCGCTGGTTCGAACCCACGCCGGCTCCGGGCGCAAGTTTCTCTTCATCGGCGCGCACGCGAGCCACGTCGAAGGCCTTCCGGTGGCCGAAGGCCGGATGCTGCTTGCGGAGCTTCTCGAGCACGCGACACAGCGGGAATTCGTGTACCGGCATCGCTGGAACGTGGGAGATCTGGTGATGTGGGACAACCGCTGCGTTCTTCACCGCGGACGCAGGTACGACATCTCGGCCAGGCGTGAGCTGCGCCGGGCGACCACCCTGGACGATGCCGTCGTCTAG
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】遺伝子配列に特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)を付加する方法の概要を示す図。
【図２】プライマーB、プライマーCの構造とクランプ部位及び相補領域を示す図。  プライマーB、プライマーCはそれぞれ別のPCR反応を行うが、そのお互いのPCR産物が相補領域を持つように設計する。
【図３】Aプライマー、Dプライマー伸長分子の結合を示す図。それぞれの分子が互いの鋳型、またプライマーとなって伸長反応が起こる。
【図４】遺伝子配列を特異的検出の標的となる塩基配列(マーカー配列)に置換する方法の概要を示す図。
【図５】tfdAへのマーカー配列を導入する位置及びプライマー設計、並びにtfdAへの特異的検出の標的となる塩基配列を導入するための設計を示す図。
【図６】tfdA遺伝子へのマーカー配列を導入する各過程のDNA断片の電気泳動写真。
【図７】導入したマーカー配列を利用したPCRによるtfdAm1、tfdAm2遺伝子の特異的検出結果を示す図。  特異的PCRにより増幅したDNA断片の電気泳動写真。野生型tfdA遺伝子の増幅はみられず、本発明の手法で構築したtfdAm1、tfdAm2遺伝子が特異的に検出可能であることを示した。
【図８】tfdAm1の活性汚泥中からの特異的検出結果を示す図。活性汚泥中のtfdAm1遺伝子の特異的PCR増幅断片の電気泳動写真。環境サンプル中に存在するマーカー配列を導入した遺伝子の特異的検出が可能であることを示した。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号３：合成ペプチド
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号10：合成DNA
配列番号11：合成DNA
【図１】
2005287415.tif 000003
【図２】
2005287415.tif 000004
【図３】
2005287415.tif 000005
【図４】
2005287415.tif 000006
【図５】
2005287415.tif 000007
【図６】
2005287415.tif 000008
【図７】
2005287415.tif 000009
【図８】
2005287415.tif 000010
【配列表】
2005287415000001.app