(57)【要約】【課題】  大腸菌等で生産した高次構造未形成による不活性タンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し失活したタンパク質のリフォールディング、すなわち機能賦活方法等を提供する。【解決手段】  大腸菌等で生産した高次構造未形成による不活性タンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し失活したタンパク質を、ゼオライトベータで処理することにより、該タンパク質固有の本来の機能・活性を賦活する方法、及び該方法を利用した活性タンパク質の製造方法。【効果】  従来の方法と比べて、汎用性、普遍性が高く、かつ操作が簡単で容易であり、安価で、機能賦活剤の繰り返し使用も可能である新しいタンパク質の機能賦活方法を提供できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の機能を賦活する方法であって、該タ
ンパク質をゼオライトベータに接触させることにより、該タンパク質固有の本来機能を発
現させ得る状態にすることを特徴とするタンパク質の機能賦活方法。
【請求項２】
該タンパク質を、タンパク質変性剤、界面活性剤及び／又はリフォルディングバッファ
ーの存在下で、ゼオライトベータと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、大腸菌の発現系で産生されたタン
パク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、熱履歴の原因で失活したタンパク
質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ゼオライトベータを含む溶液との混合、又はゼオライトベータ充填カラムへの注入によ
り、タンパク質をゼオライトベータに吸着させ、次いで脱着させる、請求項１に記載の方
法。
【請求項６】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タ
ンパク質の立体構造をリフォルディングすることを特徴とするタンパク質の主体構造の改
変方法。
【請求項７】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タ
ンパク質の立体構造をリフォルディングすることにより、高次構造が制御されて該タンパ
ク質固有の本来機能が賦活されたタンパク質を製造することを特徴とする活性タンパク質
の製造方法。
【請求項８】
目的のタンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込んだ大腸菌により産生された不活
性タンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォルディン
グする、請求項７に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法に関するものであり、更に詳しくは、高次
構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、
失活したタンパク質をリフォルディングさせ、該タンパク質固有の本来機能を賦活・再生
させることを可能とする不活性タンパク質の機能賦活方法、及び該方法を利用した活性タ
ンパク質の製造方法に関するものである。本発明は、例えば、生化学品、医薬品製造の技
術分野において、大腸菌等の遺伝子発現系を利用して生産した高次構造未形成タンパク質
を、リフォルディングさせ、該タンパク質の本来の機能・活性を賦活させることが可能な
新しいタンパク質の機能賦活方法等を提供するものとして有用である。従来、一般に、大
腸菌等の発現系で得られるタンパク質は、立体構造が無秩序であり、該タンパク質の持つ
本来の機能・活性を持たず、活性を示さない、という問題があったが、本発明の方法は、
上記タンパク質に代表される不活性タンパク質の機能・活性を賦活し、所定の機能・活性
を有するタンパク質に再生することを可能にする革新的なタンパク質合成技術を提供する
ものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内で実際的に作用し、働くのは遺伝子ではなく、それから作られるタンパク質であ
る。したがって、タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に
直結し、極めて重要である。このため、従来、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生
産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行わ
れている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長
のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることが周知の
こととなっている。
【０００３】
タンパク質の合成は、一般には、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の発現系を用いて
行われる。昆虫細胞や哺乳動物細胞によるタンパク質合成では、得られるタンパク質は、
高次構造が制御され、秩序だった立体構造を取り、可溶性である場合が多い。しかし、こ
れらの方法は、タンパク質の分離精製の操作が非常に煩雑であり、目的タンパク質を得る
までに時間がかかり、コスト高となるばかりか、得られるタンパク質の量も極めて少ない
、という欠点がある。これに対して、大腸菌によるタンパク質合成は、操作が簡単であり
、目的タンパク質を得るのにさして時間を要せず、コストもさほどかからない。このため
、現在は、目的タンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込ませた大腸菌を用いる方法
が、タンパク質合成の主流となっており、その生産プロセスも確立されつつある。
【０００４】
ところが、ヒトなどの高等生物のタンパク質を大腸菌の発現系で合成した場合、アミノ
酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られ
るものの、その立体構造には秩序が無く、高次構造が制御されていないタンパク質、すな
わち、アミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タ
ンパク質が得られる。当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボデ
ィは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌によるタンパク質
生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった
立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリ
フォルディング（巻き戻し）が必要である。
【０００５】
この種のリフォルディングは、大腸菌により生産されたタンパク質のみならず、熱履歴
等のある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。
したがって、従来、このリフォルディングは、盛んに研究され、種々の方法が提案されて
いるが、それらのほとんどは、リフォルディング率が低いうえに、ある限定されたタンパ
ク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに
過ぎないことも多く、現在、このリフォルディングは、種々のタンパク質に適用可能な、
一般性、普遍性のある、しかもリフォルディング率の高い効率的方法とはなっていない。
【０００６】
最も古くから良く用いられているリフォルディング操作には、透析や希釈が用いられて
いる。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを界面活性
剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タ
ンパク質をリフォルディングするもの（典型例： FoldIt キット、Hampton Research社製
）である。一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に
、これを単に希釈して行くことで界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォルディングさ
せるもの（典型例： FoldIt
キット、Hampton Research社製）である。これらが一般的で
あるが、その他にも、界面活性剤のSodium N-lauroyl sarcosinate溶液にグルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のTriton
X-100で希釈し
、巻き戻す方法（非特許文献１参照）など、希釈剤を用いてリフォルディングさせる場合
もある。
【０００７】
透析と希釈の両方に対し、Hampton Research社から使い捨てキットが市販されており、
これらの操作法では、Ligand binding domains from glutamate and kainate
receptors
、Lysozyme、 Carbonic anhydrase B などの極限られたタンパク質でリフォルディングが
起こることが発見されている（非特許文献２参照）、に過ぎず、試行錯誤法の域にとどま
っていると言っも過言ではない。したがって、たまたま上手くいった場合があっても他の
タンパク質に適用した場合はほとんどうまくいかないのが通例である。
【０００８】
リフォルディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジ
ンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻
き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォルディングは必ず
しも十分ではなく、他のタンパク質では満足できる結果が得られないのが通常である。構
造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンGroE
L を固定したカラムに、８M の尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと
尿素をそれぞれ２M 含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許
文献４参照）。
【０００９】
しかし、これらは、Cyclophilin A などの極めて限られたタンパク質で認められている
に過ぎない。また、リフォルディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、GroE
L 、DsbA（大腸菌のdisulfide
oxidereductase）及びPPI (human proline
cis-trans iso
merase）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Scorpion toxin
Cn5を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こること（非特許文献５参照）
、も報告されているが、これについては、Scorpion
toxin Cn5などの特定タンパク質にし
か適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑でコスト高とな
るという問題もある。
【００１０】
カラム上の固定物質として、巻き戻し、タンパク質の代わりに金属キレートを用いる場
合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液で溶
解変性したＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、変性剤を含まない緩衝溶液で洗う
と、該融合タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献６参照）。しかし、この方法の適
用は、このタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となることは前記
のものと同じである。
【００１１】
人工シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミラーゼを用い、このシャ
ペロン溶液に界面活性剤で変性したタンパク質を混ぜると、界面活性剤の人工シャペロン
による取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質が巻き戻るとの報告（非特許文献７〜
９参照）、もある。しかし、この方法は、carbonic anhydrase Bなどで成功しているに過
ぎないし、しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
【００１２】
【非特許文献１】Anal. Biochem. Vol. 210 (1993) 179-187
【非特許文献２】Protein Sci. Vol. 8 (1999):1475-83
【非特許文献３】Biochemistry, Vol. 26 (1987), 3135-3141
【非特許文献４】Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94 (1997) 3576-3578
【非特許文献５】Nat. Biotechnol. Vol. 17 (1999) 187-191
【非特許文献６】Life Science News(Japan Ed.) Vol. 3 (2001) 6-7
【非特許文献７】J. Am. Chem. Soc.Vol. 117 (1995) 2373-2374
【非特許文献８】J. Biol. Chem. Vol. 271 (1996) 3478-3487
【非特許文献９】FEBS Lett. Vol. 486 (2000) 131-135
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このように、従来、種々のリフォルディングの方法が報告されているが、これらの方法
には、上記のような問題があるのが実情であり、そのために、当技術分野においては、鎖
長の長短を問わず種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般
性、普遍性の高い、しかも繰り返し使用可能な低コストの高効率リフォルディング法を開
発することが急務の課題となっていた。
【００１４】
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上述の課題を解決
することが可能な新しいリフォルディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発
を進めると共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等バイオポリマーのゼオライト等金属酸化
物上への吸着状況を詳細に調べ（Chem. Eur. J. Vol. 7 (2001) 1555-1560 ）、タンパク
質の分離精製方法を鋭意研究している過程で、大腸菌等の発現系で生産した高次構造未形
成タンパク質、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質をゼオライトベー
タで処理すると、それらのタンパク質が本来の機能・活性を示すようになること、そして
、この方法は、本発明を、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む種々の立体構造
無秩序タンパク質のリフォルディングに適用できる、一般性、普遍性の高い方法として使
用し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の機能を賦活する方法であって、
該タンパク質をゼオライトベータに接触させることにより、該タンパク質固有の本来機能
を発現させ得る状態にすることを特徴とするタンパク質の機能賦活方法。
（２）該タンパク質を、タンパク質変性剤、界面活性剤及び／又はリフォルディングバッ
ファーの存在下で、ゼオライトベータと接触させる、前記（１）に記載の方法。
（３）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、大腸菌の発現系で産生された
タンパク質である、前記（１）に記載の方法。
（４）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、熱履歴の原因で失活したタン
パク質である、前記（１）に記載の方法。
（５）ゼオライトベータを含む溶液との混合、又はゼオライトベータ充填カラムへの注入
により、タンパク質をゼオライトベータに吸着させ、次いで脱着させる、前記（１）に記
載の方法。
（６）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて
該タンパク質の立体構造をリフォルディングすることを特徴とするタンパク質の主体構造
の改変方法。
（７）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて
該タンパク質の立体構造をリフォルディングすることにより、高次構造が制御されて該タ
ンパク質固有の本来機能が賦活されたタンパク質を製造することを特徴とする活性タンパ
ク質の製造方法。
（８）目的のタンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込んだ大腸菌により産生された
不活性タンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォルデ
ィングする、前記（７）に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法等に係るものであり、本発明によって、１
）大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるい
はある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の機能・活性をリフォル
ディングにより賦活させることができる、２）この方法は、インクルージョンボディを効
率よくリフォルディングする方法として有用である、３）種々のタンパク質に適用可能な
、一般性、普遍性のある、しかもリフォルディング率の高い効率的方法を提供できる、４
）本発明で用いる機能賦活剤のゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し
使用可能である、５）この方法は、分子量１０万を超える大型のタンパク質を含む種々の
立体構造無秩序タンパク質のリフォルディングに適用できる、６）例えば、大腸菌の発現
系によるタンパク質合成プロセスと本発明の方法を組み合わせることにより、高次構造の
制御されて該タンパク質固有の本来機能がタンパク質を生産する新しい活性タンパク質の
製造プロセスを構築することができる、という効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明では、機能賦活の対象となるタンパク質としては、一般には、大腸菌等の発現系
で得られる立体構造が無秩序なタンパク質、いわゆるインクルージョンボディ、あるいは
熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質が用いられる。本発明では、これらのタン
パク質をゼオライトベータで処理して該タンパク質の立体構造をリフォルディングするこ
とにより、該タンパク質固有の本来機能の賦活を行う。賦活操作は、通常、該タンパク質
を変性剤や界面活性剤などを含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含
む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該タンパク質をゼオラ
イトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で
行われる。本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオ
ライトベータ、及び例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成
した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制御されるものではなく、これらと
同等のものであれば同様に使用することができる。
【００１８】
ゼオライトベータに吸着前のタンパク質の分散溶媒としては、一般には、それが大腸菌
等の発現系で生産されること、及びタンパク質は、通常、水溶液中で使われることが多く
、失活した場合でも水溶液中にあることが多いことから、好適には、例えば、水が用いら
れる。しかし、必ずしもこれに限定されるものではなく、該タンパク質と反応を起こさな
いもの、及び該タンパク質の立体構造を不本意な形に変えるものでなければ、基本的には
問題はなく、このような場合は、それらの溶媒単独あるいは水と混合して用いることが可
能である。この種の溶媒の典型例として、一価及び多価のアルコールをあげることができ
るが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
該タンパク質の吸脱着は、一般には、インクルージョンボディなど、縺れ絡んだタンパ
ク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐ
Ｈ調整剤、リフォルディング因子等の存在下、及び／又はタンパク質鎖長中に不本意に生
成したＳ−Ｓ結合を切断するために、ある種の還元剤の存在下、で行われる。この種の変
性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォルディング因子の典型例として、例えば、塩酸グ
アニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
acid (HEPES)、ポリ燐酸、スクロース
、グルコース、グリセロール、イノシトール、Dextran T-500 やFicol1400 などを挙げる
ことができるが、これらにとどまるものではなく、同様な作用を持つものはいずれも使用
可能である。
【００２０】
不本意に生成したS-S 結合を切断し、本来の構造に戻す還元剤としては、安価で入手し
易いことから、通常は２−メルカプトエタノールが用いられるが、これに限定されるもの
ではなく、同様な作用を有するものは全て使用可能である。当然のことながら、タンパク
質鎖長が解きほぐれやすい場合や、不本意にＳ−Ｓ結合が生成しない場合は、変性剤や界
面活性剤、及び／又は防止剤を必ずしも使う必要がないので、これらの存在は常に必須と
は限らず、状況に応じ適宜選択して用いられる。また、それらを用いる場合も、それらの
量は状況に応じ適宜決められることになる。
【００２１】
また、該タンパク質の脱着には、一般には、置換吸着が用いられるが、基本的には該タ
ンパク質の脱着後の機能賦活を阻まない操作であれば、いかなる操作も適用可能であり、
特に限定されるものではない。したがって、ｐＨ変化、温度変化なども用いることができ
る上に、これらと置換吸着を併用することもできる。置換吸着で該タンパク質の脱着を促
す物質には、一般的には、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）などの界面活性剤やハロゲン
化アルカリなどの塩が用いられるが、これらに限定されるものではなく、該タンパク質の
脱着後の機能賦活を阻まないものであれば、通常、カラムクロマトグラフィーでの溶離に
用いられるものなど、種々のものが使用可能である。
【００２２】
更に言えば、該タンパク質の該ケイ酸塩への吸着、あるいはそれからの脱着を促すため
に、上記操作と併用して、種々の付加的操作を行うこともできる。このような操作の典型
例には、例えば、超音波やマイクロ波の照射や、磁場や電場の印加等がある。以上述べて
きた本発明の手順・操作により、大腸菌等の発現系を用いて生産した高次構造未形成タン
パク質、並びにある種の原因で失活したタンパク質に、リフォルディングが起き、それら
のタンパク質が持つ本来の機能が速やかに賦活される。本発明の機能賦活剤のゼオライト
ベータは、熱的、化学的に極めて安定であり、しかも安価であるうえ、繰り返し使用が可
能であるので、本発明は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとってきわめて有用であ
り、その経済的効果は計り知れないものがある。
【実施例】
【００２３】
次に、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実
施例等によって何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例
以下、本実施例では、大腸菌発現系生産タンパク質及び変性タンパク質の機能賦活を説
明するが、本発明は、これら実施例に限定・制限されるものではない。
１）試料等の調製
（ａ）機能賦活剤
機能賦活剤として、後記する表１に示した未焼成ゼオライトベータ（Ｎａ−ＢＥＡ）、
表１に示した合成ゼオライトベータ、及びそれを焼成した焼成ゼオライトベータ及び表１
の比較例１〜１５に示した比較製品を使用した。
（ｂ）変性タンパク質溶液
タンパク質として、表１の「タンパク質」及び「備考」に示した内容のＲＰＡ７０（黄
色ショウジョウバエ由来）、Ｐ５３（ヒト由来）等を使用した。
（ｃ）リフォルディングバッファー
ゼオライトとしてＮａ−ＢＥＡ、タンパク質としてＲＰＡ７０を用いて、リフォールデ
ィングバッファーの塩濃度を検討した。リフォロールディングバッファーは、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノ
ール、２．５（ｗ／ｖ）％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ２０，０００、
非イオン系界面活性剤を用い、界面活性剤としては１（ｖ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔ
ｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びＮＰ−４０を用いた。後記する表２に、実施例及び比較例
で実際に用いたリフォルディングバッファーの詳細を示す。
【００２４】
２）リフォルディング操作
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに１００ｍｇの機能賦活剤を入れ、０．５ｍｌの
６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ  トリスアミノメタン三塩酸塩（ＴｒｉｓＨＣｌ）ｐＨ７
．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを加えて懸濁した
。これに、６Ｍ塩酸グアニジン、及び２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを加え、氷上で
１時間放置し、変性したタンパク質溶液（濃度は０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍ
ｌ加えた。この混合液を、該タンパク質の機能賦活剤上への吸着を確実にするために、低
温室に置かれたＲＯＴＡＲＹ  ＣＵＴＵＲＥ  ＲＣＣ−１００（ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳ
社製）で、１時間攪拌した。
【００２５】
その後、１００００×ｇで５秒間遠心して、機能賦活剤を沈殿させ、上澄みを除去した
。次に、この沈殿した機能賦活剤からタンパク質変性剤を完全に除去するために、これを
１ｍｌの２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール
で４回洗った後、１００００×ｇで５秒間遠心し、更に、生じた上澄みを捨てた。残った
機能賦活剤に、１ｍｌのリフォルディングバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．
５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、リフォルディング因子
及び非イオン系界面活性剤から構成）を加え、懸濁した。
【００２６】
機能賦活剤上に吸着した該タンパク質を脱着・溶離させるために、この懸濁液を再び低
温下のＲＯＴＡＲＹ  ＣＵＴＵＲＥ  ＲＣＣ−１００（ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳ社製）で
攪拌した。その後、１００００×ｇで５秒間遠心して、機能賦活剤を沈殿させ、該タンパ
ク質を含む上澄みを新しいエッペンドルフチューブに移し、活性測定（アッセイ）に用い
た。
なお、活性測定には、用いたタンパク質の働きに応じた方法を採用した。具体的には、
三種の測定、すなわちゲルシフトアッセイ、ポリメラーゼアッセイ及びリゾチーム活性測
定で行った。
【００２７】
３）活性測定操作
（ａ）ゲルシフトアッセイ
１ｐｍｏｌの放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドＤＮＡとリフォルディングし
たタンパク質を、組成２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０％
ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び１ｍｇ／ｍｌ  ｂｏｖ
ｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎの溶液中で、氷上３０分インキュベートし、４．５
％のポリアクリルアミノゲルで０．５×ＴＢＥのバッファーを使い、４℃で電気泳動した
。その結果を図１、及び図３に示す。
タンパク質にＤＮＡ結合性がある（すなわち活性がある）場合、ＤＮＡにタンパク質が
結合し、これにより、電気泳動が遅くなり、バンドがシフトするので、これにより活性（
すなわちリフォルディング率）を判定した。
【００２８】
（ｂ）ポリメラーゼアッセイ
鋳型ＤＮＡとして、ｐｏｌｙ（ｄＡ）ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）12-18 、あるいはＤＮａｓｅ
Ｉ−ａｃｔｉｖａｔｅ  ｃａｌｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを使用し、反応液には、組成
（終濃度）５０ｎｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５％  ｇｌｙ
ｃｅｒｏｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、０．５μＭ  ｄＴＴＰ（ｃｏｌｄ）（チミジル酸三リ
ン酸）、〔3 Ｈ〕−ｄＴＴＰ（５ｍＣｉ／ｍｌ：１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）のも
のを用いた。先ず、この反応液の濃度が２倍のもの１０μｌにタンパク質（酵素）サンプ
ル溶液を加え、懸濁した後３７℃で１時間インキュベートした後、氷上に置き反応を停止
させた。
【００２９】
その後、正方形に切ったＤＥ８１紙に反応液を滴下し、乾燥させた後、ビーカーの中に
移して、未反応ｄＴＴＰを溶解除去するために洗浄した。洗浄は、先ず５％リン酸水素二
ナトリウム水溶液で３回行い、次いで、蒸留水で３回、更に、エタノールで２回行い、そ
の後、乾燥した。このようにして得た乾燥ＤＥ８１紙を、シンチレーターが入ったバイア
ルに入れ、シンチレーションカウンターで放射活性（ｃｐｍ）を測定した。酵素サンプル
の活性が強いほど、それで合成されるＤＮＡに放射性同位体で標識したｄＴＴＰがより多
く取り込まれ放射性が高くなるので、これにより、タンパク質の活性を判定した。図２に
、Ｔｗｅｅｎ２０を用いてリフォールディングされたタンパク質の回収率、及び活性の回
復率を示す。
【００３０】
（ｃ）リゾチームの活性測定
基質に細菌Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓを選び、これを５０ｍＭリン酸バッファー
で懸濁し、０．１６ｍｇ／ｍｌ濃度の基質溶液を調製した。この基質溶液４８０μｌに２
０μｌのタンパク質（酵素リゾチーム）溶液を加え、室温で３０分間インキュベートした
。その後、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
リゾチームは細菌の細胞壁を分解する能力があるので、その能力、すなわち活性が高い
ほど吸光度は減少する。リゾチーム活性１  ｕｎｉｔは１分間当たりに４５０ｎｍの吸光
度が０．００１減少することと定義した。
【００３１】
上記手順・操作で得られた本実施例の結果である、活性（リフォルディング率）、タン
パク質回収率を、表１に、比較例の結果と共に纏めた。尚、実施例及び比較例で用いたリ
フォルディングバッファーを表２に示す。実施例に示されるように、リフォルディングに
より、ＤＮＡ結合活性等のタンパク質本来の活性が得られることが分かった。本発明は、
種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用できる、一般性、普遍性の高い
リフォルディング法として有用であり、その適用は、実施例に示されたタンパク質に限定
されるものではなく、任意のタンパク質に適用し得るものである。
【００３２】
【表１】
2005029531.tif 000002
【００３３】
【表２】
2005029531.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上詳述したように、本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法等に係るものであり
、本発明によって、１）大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性
なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の
機能・活性をリフォルディングにより賦活させることができる。２）この方法は、インク
ルージョンボディを効率よくリフォルディングする方法として有用である。３）種々のタ
ンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォルディング率の高い効率的
方法を提供できる。４）本発明で用いる機能賦活剤のゼオライトベータは、低コストであ
り、しかも、繰り返し使用可能である。５）この方法は、分子量１０万を超える大型のタ
ンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォルディングに適用できる。６）
例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明の方法を組み合わせるこ
とにより、高次構造の制御されて該タンパク質固有の本来機能がタンパク質を生産する新
しい活性タンパク質の製造プロセスを構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２】リフォルディングされたタンパク質の回収率、及び活性の回復率を示す。
【図３】電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１】
2005029531.tif 000004
【図２】
2005029531.tif 000005
【図３】
2005029531.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月16日(2004.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の機能を賦活する方法であって、該タンパク質をゼオライトベータに接触させることにより、該タンパク質固有の本来機能を発現させ得る状態にすることを特徴とするタンパク質の機能賦活方法。
【請求項２】
該タンパク質を、タンパク質変性剤、界面活性剤及び／又はリフォールディングバッファーの存在下で、ゼオライトベータと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、大腸菌の発現系で産生されたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、熱履歴の原因で失活したタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ゼオライトベータを含む溶液との混合、又はゼオライトベータ充填カラムへの注入により、タンパク質をゼオライトベータに吸着させ、次いで脱着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングすることを特徴とするタンパク質の主体構造の改変方法。
【請求項７】
高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングすることにより、高次構造が制御されて該タンパク質固有の本来機能が賦活されたタンパク質を製造することを特徴とする活性タンパク質の製造方法。
【請求項８】
目的のタンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込んだ大腸菌により産生された不活性タンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングする、請求項７に記載のタンパク質の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法に関するものであり、更に詳しくは、高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化し、失活したタンパク質をリフォールディングさせ、該タンパク質固有の本来機能を賦活・再生させることを可能とする不活性タンパク質の機能賦活方法、及び該方法を利用した活性タンパク質の製造方法に関するものである。本発明は、例えば、生化学品、医薬品製造の技術分野において、大腸菌等の遺伝子発現系を利用して生産した高次構造未形成タンパク質を、リフォールディングさせ、該タンパク質の本来の機能・活性を賦活させることが可能な新しいタンパク質の機能賦活方法等を提供するものとして有用である。従来、一般に、大腸菌等の発現系で得られるタンパク質は、立体構造が無秩序であり、該タンパク質の持つ本来の機能・活性を持たず、活性を示さない、という問題があったが、本発明の方法は、上記タンパク質に代表される不活性タンパク質の機能・活性を賦活し、所定の機能・活性を有するタンパク質に再生することを可能にする革新的なタンパク質合成技術を提供するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
ところが、ヒトなどの高等生物のタンパク質を大腸菌の発現系で合成した場合、アミノ酸の結合順序や数、すなわちアミノ酸鎖長に関しては、設計どおりのタンパク質が得られるものの、その立体構造には秩序が無く、高次構造が制御されていないタンパク質、すなわち、アミノ酸鎖が縺れ絡まった、いわゆるインクルージョンボディと呼ばれる不溶性タンパク質が得られる。当然のことながら、この不溶性タンパク質のインクルージョンボディは、欲する機能・性能を持たず、活性を示さない。このため、大腸菌によるタンパク質生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわちインクルージョンボディのリフォールディング（巻き戻し）が必要である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
この種のリフォールディングは、大腸菌により生産されたタンパク質のみならず、熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来、このリフォールディングは、盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング率が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことも多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的方法とはなっていない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
最も古くから良く用いられているリフォールディング操作には、透析や希釈が用いられている。前者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かし、これを界面活性剤や変性剤を含まない緩衝液で透析することで、界面活性剤や変性剤の濃度を下げて、タンパク質をリフォールディングするもの（典型例： FoldIt キット、Hampton Research社製）である。一方、後者は、タンパク質を界面活性剤や変性剤を含む水溶液に溶かした後に、これを単に希釈して行くことで界面活性剤や変性剤の濃度を下げ、リフォールディングさせるもの（典型例：FoldIt キット、Hampton Research社製）である。これらが一般的であるが、その他にも、界面活性剤のSodium N-lauroyl sarcosinate溶液にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を溶かし、それを１〜２％のTriton X-100で希釈し、巻き戻す方法（非特許文献１参照）など、希釈剤を用いてリフォールディングさせる場合もある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
透析と希釈の両方に対し、Hampton Research社から使い捨てキットが市販されており、これらの操作法では、Ligand binding domains from glutamate and kainate receptors 、Lysozyme、Carbonic anhydrase B などの極限られたタンパク質でリフォールディングが起こることが発見されている（非特許文献２参照）、に過ぎず、試行錯誤法の域にとどまっていると言っも過言ではない。したがって、たまたま上手くいった場合があっても他のタンパク質に適用した場合はほとんどうまくいかないのが通例である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
リフォールディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンで変性させたタンパク質、チオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にその巻き戻りが起こる（非特許文献３参照）。しかし、この方法では、リフォールディングは必ずしも十分ではなく、他のタンパク質では満足できる結果が得られないのが通常である。構造が壊れたタンパク質の巻き戻しを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンGroEL を固定したカラムに、８M の尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２M 含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質の巻き戻りが起こる（非特許文献４参照）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
しかし、これらは、Cyclophilin A などの極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。また、リフォールディング促進に関与すると考えられるタンパク質３種、GroEL 、DsbA（大腸菌のdisulfide oxidereductase）及びPPI (human proline cis-trans isomerase）を同時に固定した樹脂に、塩酸グアニジンで変性したタンパク質Scorpion toxin Cn5を混ぜると、このタンパク質の巻き戻りが樹脂上で起こること（非特許文献５参照）、も報告されているが、これについては、Scorpion toxin Cn5などの特定タンパク質にしか適用できない欠点に加え、タンパク質３種を固定した樹脂の調製が煩雑でコスト高となるという問題もある。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
このように、従来、種々のリフォールディングの方法が報告されているが、これらの方法には、上記のような問題があるのが実情であり、そのために、当技術分野においては、鎖長の長短を問わず種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用可能な、一般性、普遍性の高い、しかも繰り返し使用可能な低コストの高効率リフォールディング法を開発することが急務の課題となっていた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
このような状況下にあって、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上述の課題を解決することが可能な新しいリフォールディング技術を開発することを目標として鋭意研究開発を進めると共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等バイオポリマーのゼオライト等金属酸化物上への吸着状況を詳細に調べ（Chem. Eur. J. Vol. 7 (2001) 1555-1560 ）、タンパク質の分離精製方法を鋭意研究している過程で、大腸菌等の発現系で生産した高次構造未形成タンパク質、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質をゼオライトベータで処理すると、それらのタンパク質が本来の機能・活性を示すようになること、そして、この方法は、本発明を、分子量１０万を越える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォールディングに適用できる、一般性、普遍性の高い方法として使用し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質の機能を賦活する方法であって、該タンパク質をゼオライトベータに接触させることにより、該タンパク質固有の本来機能を発現させ得る状態にすることを特徴とするタンパク質の機能賦活方法。
（２）該タンパク質を、タンパク質変性剤、界面活性剤及び／又はリフォールディングバッファーの存在下で、ゼオライトベータと接触させる、前記（１）に記載の方法。
（３）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、大腸菌の発現系で産生されたタンパク質である、前記（１）に記載の方法。
（４）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質が、熱履歴の原因で失活したタンパク質である、前記（１）に記載の方法。
（５）ゼオライトベータを含む溶液との混合、又はゼオライトベータ充填カラムへの注入により、タンパク質をゼオライトベータに吸着させ、次いで脱着させる、前記（１）に記載の方法。
（６）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングすることを特徴とするタンパク質の主体構造の改変方法。
（７）高次構造が無秩序なため不活性であるタンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングすることにより、高次構造が制御されて該タンパク質固有の本来機能が賦活されたタンパク質を製造することを特徴とする活性タンパク質の製造方法。
（８）目的のタンパク質の合成を担う遺伝子コードを組み込んだ大腸菌により産生された不活性タンパク質をゼオライトベータに接触させて該タンパク質の立体構造をリフォールディングする、前記（７）に記載のタンパク質の製造方法。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法等に係るものであり、本発明によって、１）大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の機能・活性をリフォールディングにより賦活させることができる、２）この方法は、インクルージョンボディを効率よくリフォールディングする方法として有用である、３）種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的方法を提供できる、４）本発明で用いる機能賦活剤のゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用可能である、５）この方法は、分子量１０万を超える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォールディングに適用できる、６）例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明の方法を組み合わせることにより、高次構造の制御されて該タンパク質固有の本来機能がタンパク質を生産する新しい活性タンパク質の製造プロセスを構築することができる、という効果が奏される。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明では、機能賦活の対象となるタンパク質としては、一般には、大腸菌等の発現系で得られる立体構造が無秩序なタンパク質、いわゆるインクルージョンボディ、あるいは熱履歴等のある種の原因で失活したタンパク質が用いられる。本発明では、これらのタンパク質をゼオライトベータで処理して該タンパク質の立体構造をリフォールディングすることにより、該タンパク質固有の本来機能の賦活を行う。賦活操作は、通常、該タンパク質を変性剤や界面活性剤などを含む溶液に先ず分散溶解し、その後、ゼオライトベータを含む溶液との混合や、ゼオライトベータ充填カラムへの注入により、該タンパク質をゼオライトベータに吸着させ、次いで、ゼオライトベータから該タンパク質を脱着させる手順で行われる。本発明で機能賦活剤として用いられるゼオライトベータとしては、未焼成ゼオライトベータ、及び例えば、合成ゼオライトベータを３００〜５００℃で３〜１０ｈ焼成した焼成ゼオライトベータが例示されるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等のものであれば同様に使用することができる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
該タンパク質の吸脱着は、一般には、インクルージョンボディなど、縺れ絡んだタンパク質鎖長を解きほぐし易くし、また、巻き戻り易くするために、変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子等の存在下、及び／又はタンパク質鎖長中に不本意に生成したＳ−Ｓ結合を切断するために、ある種の還元剤の存在下、で行われる。この種の変性剤や界面活性剤、ｐＨ調整剤、リフォールディング因子の典型例として、例えば、塩酸グアニジン、トリスアミノメタン塩酸塩、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)、ポリ燐酸、スクロース、グルコース、グリセロール、イノシトール、Dextran T-500 やFicol1400 などを挙げることができるが、これらにとどまるものではなく、同様な作用を持つものはいずれも使用可能である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
更に言えば、該タンパク質の該ケイ酸塩への吸着、あるいはそれからの脱着を促すために、上記操作と併用して、種々の付加的操作を行うこともできる。このような操作の典型例には、例えば、超音波やマイクロ波の照射や、磁場や電場の印加等がある。以上述べてきた本発明の手順・操作により、大腸菌等の発現系を用いて生産した高次構造未形成タンパク質、並びにある種の原因で失活したタンパク質に、リフォールディングが起き、それらのタンパク質が持つ本来の機能が速やかに賦活される。本発明の機能賦活剤のゼオライトベータは、熱的、化学的に極めて安定であり、しかも安価であるうえ、繰り返し使用が可能であるので、本発明は、例えば、生化学品製造、医薬品製造にとってきわめて有用であり、その経済的効果は計り知れないものがある。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
次に、実施例及び比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等によって何ら限定されるものではない。
実施例及び比較例
以下、本実施例では、大腸菌発現系生産タンパク質及び変性タンパク質の機能賦活を説明するが、本発明は、これら実施例に限定・制限されるものではない。
１）試料等の調製
（ａ）機能賦活剤
機能賦活剤として、後記する表１に示した未焼成ゼオライトベータ（Ｎａ−ＢＥＡ）、表１に示した合成ゼオライトベータ、及びそれを焼成した焼成ゼオライトベータ及び表１の比較例１〜１５に示した比較製品を使用した。
（ｂ）変性タンパク質溶液
タンパク質として、表１の「タンパク質」及び「備考」に示した内容のＲＰＡ７０（黄色ショウジョウバエ由来）、Ｐ５３（ヒト由来）等を使用した。
（ｃ）リフォールディングバッファー
ゼオライトとしてＮａ−ＢＥＡ、タンパク質としてＲＰＡ７０を用いて、リフォールディングバッファーの塩濃度を検討した。リフォールディングバッファーは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２．５（ｗ／ｖ）％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ２０，０００、非イオン系界面活性剤を用い、界面活性剤としては１（ｖ／ｖ）％  Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及びＮＰ−４０を用いた。後記する表２に、実施例及び比較例で実際に用いたリフォールディングバッファーの詳細を示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
２）リフォールディング操作
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに１００ｍｇの機能賦活剤を入れ、０．５ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン、２０ｍＭ  トリスアミノメタン三塩酸塩（ＴｒｉｓＨＣｌ）ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを加えて懸濁した。これに、６Ｍ塩酸グアニジン、及び２０ｍＭ２−メルカプトエタノールを加え、氷上で１時間放置し、変性したタンパク質溶液（濃度は０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ加えた。この混合液を、該タンパク質の機能賦活剤上への吸着を確実にするために、低温室に置かれたＲＯＴＡＲＹ  ＣＵＴＵＲＥ  ＲＣＣ−１００（ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳ社製）で、１時間攪拌した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
その後、１００００×ｇで５秒間遠心して、機能賦活剤を沈殿させ、上澄みを除去した。次に、この沈殿した機能賦活剤からタンパク質変性剤を完全に除去するために、これを１ｍｌの２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールで４回洗った後、１００００×ｇで５秒間遠心し、更に、生じた上澄みを捨てた。残った機能賦活剤に、１ｍｌのリフォールディングバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、リフォールディング因子及び非イオン系界面活性剤から構成）を加え、懸濁した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
３）活性測定操作
（ａ）ゲルシフトアッセイ
１ｐｍｏｌの放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドＤＮＡとリフォールディングしたタンパク質を、組成２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＤＴＴ、及び１ｍｇ／ｍｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎの溶液中で、氷上３０分インキュベートし、４．５％のポリアクリルアミノゲルで０．５×ＴＢＥのバッファーを使い、４℃で電気泳動した。その結果を図１、及び図３に示す。
タンパク質にＤＮＡ結合性がある（すなわち活性がある）場合、ＤＮＡにタンパク質が結合し、これにより、電気泳動が遅くなり、バンドがシフトするので、これにより活性（すなわちリフォールディング率）を判定した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
上記手順・操作で得られた本実施例の結果である、活性（リフォールディング率）、タンパク質回収率を、表１に、比較例の結果と共に纏めた。尚、実施例及び比較例で用いたリフォールディングバッファーを表２に示す。実施例に示されるように、リフォールディングにより、ＤＮＡ結合活性等のタンパク質本来の活性が得られることが分かった。本発明は、種々の高次構造未形成並びに変性・失活タンパク質に適用できる、一般性、普遍性の高いリフォールディング法として有用であり、その適用は、実施例に示されたタンパク質に限定されるものではなく、任意のタンパク質に適用し得るものである。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
以上詳述したように、本発明は、不活性タンパク質の機能賦活方法等に係るものであり、本発明によって、１）大腸菌等の発現系で産生された高次構造が未形成なために不活性なタンパク質、あるいはある種の原因で立体構造が変化して失活したタンパク質の本来の機能・活性をリフォールディングにより賦活させることができる。２）この方法は、インクルージョンボディを効率よくリフォールディングする方法として有用である。３）種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかもリフォールディング率の高い効率的方法を提供できる。４）本発明で用いる機能賦活剤のゼオライトベータは、低コストであり、しかも、繰り返し使用可能である。５）この方法は、分子量１０万を超える大型のタンパク質を含む種々の立体構造無秩序タンパク質のリフォールディングに適用できる。６）例えば、大腸菌の発現系によるタンパク質合成プロセスと本発明の方法を組み合わせることにより、高次構造が制御されて該タンパク質固有の本来機能が発揮されるタンパク質を生産する新しい活性タンパク質の製造プロセスを構築することができる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【図１】電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２】リフォールディングされたタンパク質の回収率、及び活性の回復率を示す。
【図３】電気泳動によるゲルシフトアッセイの結果を示す。