(57)【要約】  【課題】  １００nm程度のサイズ径であり、微粒子の片側は分子モーターへの結合部位Aを持ち、他の片側はATPを作る酵素への結合部位Bを持ち、酵素とビオチンを異方的に担持した異方性ビチオン化ラテックス微粒子及び異方性ビチオン化ラテックス微粒子の水酸基をエポキシ基に修飾し、酵素を固定した異方性ビチオン化ラテックス微粒子を提供する。 【解決手段】  広い領域のドメインＡにある水酸基と狭い領域のドメインＢにあるエポキシ基を、それぞれ微粒子に持たせた異方性ラテックス微粒子を用いて、エポキシ側をビオチンに置き換えて、微粒子の片側のみをビオチン化した異方性ビチオン化ラテックス微粒子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
広い領域のドメインＡにある水酸基と狭い領域のドメインＢにあるエポキシ基を、それぞれ微粒子に持たせた異方性ラテックス微粒子であって、エポキシ側をビオチンに置き換えて、微粒子の片側のみをビオチン化した異方性ビチオン化ラテックス微粒子。
【請求項２】
エポキシ基をアミノ基に変換し、ビオチンを結合させた請求項１に記載した異方性ビチオン化ラテックス微粒子。
【請求項３】
ヒドロキシエチルメタクリレートモノマーとメチルメタクリレートモノマーとエチレンジメタクリレートモノマーを重合開始剤の存在下でソープフリー乳化重合させ、シードポリマー粒子を合成し、次いで、スチレンモノマーとグリシジルメタクリレートモノマーとジビニルベンゼンモノマー及び溶媒を加えて、水中でソープフリーシード乳化重合を行い、官能基として水酸基とエポキシ環をそれぞれ微粒子の異なる大きさのドメインに持たせた請求項１又は２に記載した異方性異方性ラテックス微粒子。
【請求項４】
粒子径が８０〜１２０ｎｍである請求項１〜請求項３のいずれかひとつに記載された異方性ビチオン化ラテックス微粒子。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかひとつに記載した異方性ビチオン化ラテックス微粒子の水酸基をエピクロルヒドリン等と反応させて、エポキシ基に変え、酵素を固定した異方性ビチオン化ラテックス微粒子。
【請求項６】
酵素が、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）である請求項５に記載した異方性ビチオン化ラテックス微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の生体・化学物質（例えば酵素など）を異方性ラテックス微粒子の各々の官能基を介して異方的に固定化することにより、多段階酵素反応や微小空間における物質輸送を行うナノバイオマシンの要素デバイスを創製する。
【背景技術】
【０００２】
近年、単一の官能基を有するラテックス微粒子は、ラテックス診断薬、アフィニティー生体物質分離、ドラッグデリバリーシステム、酵素の担体などのバイオ分野へ幅広く応用されている。これまでに、例えばタンパク質、DNA、医薬分子などがラテックス微粒子に固定化されてきた。このように、官能性ラテックス微粒子はナノバイオテクノロジーの重要な基盤的要素技術のひとつとして注目されている。
一方、固定化酵素はバイオ材料、食品工業と分析化学などに広く利用されてきた。様々な酵素は物理的吸着、共有結合及びカプセル化によって、異なった形（例えば、膜、ビーズなど）を持つ担体に固定化できる。このような不溶材質に固定化した酵素は、フリーな（固定化されていない）酵素と比べると、分離が容易、連続操作が可能、操作が簡単、ある種の酵素では安定性が向上するなどの利点がある。
ラテックス微粒子は粒子径が小さいゆえに、平面担体と比べると比表面積が大きく、より大量の酵素が固定化でき、酵素担体としての応用が期待されている。
一方、ソープフリー乳化重合により、ラテックスを得ることは知られている（非特許文献１）。
本発明者は、グリシジルメタクリレートモノマーとジビニルベンゼンモノマーを重合開始剤の存在下でソープフリー乳化重合を行い、シードポリマー粒子を合成し、次いで、スチレン、2-メルカプトエタノール及び溶媒を加えて、水中でソープフリーシード乳化重合を行い、官能基としてエポキシ環と水酸基をそれぞれ微粒子の異なるドメインに持たせた異方性高分子微粒子（異方性ラテックス微粒子）に関する発明を完成させて出願している（特許文献１）。
さらに本発明者は、エポキシ環と水酸基をそれぞれ微粒子の異なるドメインに持たせた異方性ラテックス微粒子を用いて、水酸基側を活性エステル型ビオチン誘導体と反応させ、微粒子の片側のみをビオチン化した異方性ビチオン化ラテックス微粒子に関する発明を完成させて出願している（特許文献２）。
【特許文献１】特願２００３−１３５５１９号公報
【特許文献２】特願２００３−２９２８８８号公報
【非特許文献１】Effects of ethyl acetate on the soap-free emulsionpolymerization of4-vinylpyridine and styrene. I. Aspectsof the mechanismNi HM, Ma GH, Nagai M, Omi SJOURNAL OF APPLIED POLYMER SCIENCEvol.82 (11), pp.2679-2691 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記の発明により得られる異方性ビチオン化ラテックス微粒子の粒子径は、２００nmのサイズ径であり、もっと小さい微粒子の異方性ビチオン化ラテックス微粒子が望まれていた。
生体系の多くの反応や輸送は酵素反応によって進むが、その中にはアデノシン三リン酸(ATP)という高エネルギー物質を必要とするものがある。生体系に存在する分子モーターとよばれる生体ナノマシンも、運動するためにはATPのエネルギーを必要とする。しかしながら、分子モーターはそれ自身ではATPを作ることができず、外から供給しなければならない。そこで、本発明で解決しようとする課題は、分子モーターに結合することができ、かつATPを生産することができる新規微粒子を開発することである。すなわち、１００nm程度のサイズ径であり、微粒子の片側は分子モーターへの結合部位Aを持ち、他の片側はATPを作る酵素への結合部位Bを持ち、酵素とビオチンを異方的に担持したラテックス微粒子を作り出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明において、上記の課題を解決すべく、鋭意研究した結果、広い領域のドメインＡにある水酸基と狭い領域のドメインＢにあるエポキシ基を、それぞれ微粒子に持たせた異方性ラテックス微粒子であって、エポキシ側をアミノ基に変換し、微粒子の片側のみをビオチン化した異方性ビチオン化ラテックス微粒子とすることにより、上記課題を解決することに成功した。
本発明で用いる二つの官能性を有する異方性複合ラテックス微粒子は、ソープフリー乳化重合によって合成され、約100 nmのサイズを持ち、種々の組み合わせの官能基を持つ微粒子を製造することができる。本発明者は、ヒドロキシエチルメタクリレートモノマーとメチルメタクリレートモノマーとエチレンジメタクリレートモノマーを重合開始剤の存在下でソープフリー乳化重合させ、シードポリマー粒子を合成し、次いで、スチレンモノマーとグリシジルメタクリレートモノマーとジビニルベンゼンモノマー及び溶媒を加えて、水中でソープフリーシード乳化重合を行い、官能基として水酸基とエポキシ環をそれぞれ微粒子の異なる大きさのドメインに持たせた異方性異方性ラテックス微粒子を調製できる。
本発明においては、水酸基とエポキシ基をそれぞれ微粒子の異なるドメインに持たせた異方性ラテックス微粒子の典型的な製造方法は、ヒドロキシエチルメタクリレートモノマーとメチルメタクリレートモノマーとエチレンジメタクリレートを重合開始剤の存在下でソープフリー乳化重合を行ってシードポリマー粒子を合成し、次いで、スチレンモノマーとグリシジルメタクリレートモノマーとジビニルベンゼンモノマー及び溶媒を加えて、水中でソープフリーシード乳化重合を行う方法である。エポキシ基はアミノ基に変換しビオチンを結合し、次に水酸基をエポキシ基へ変換する。この製造方法により得られた異方性ビチオン化ラテックス微粒子を用いて、２つの結合部位A、Bにそれぞれ独立に反応する性質をもつ異方性ビチオン化ラテックス微粒子を製造することができる。
また、本発明においては、異方性ビチオン化ラテックス微粒子の粒子径は、１００ｎｍであることが好ましい。
さらに、本発明においては、異方性ラテックス微粒子の水酸基側をエピクロルヒドリン等でエポキシ基に変換し、これにアミノ基、水酸基、チオール基などから選ばれる官能基を有する化合物を反応させて、２つの結合部位A、Bにそれぞれ独立に反応する性質をもつ異方性ビチオン化ラテックス微粒子を得ることもできる。
さらにまた、本発明は、異方性ビチオン化ラテックス微粒子のエポキシ基に、酵素を固定した異方性ビチオン化ラテックス微粒子とすることができる。
このとき、酵素が、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）であることが好ましいが、原理的にはあらゆる酵素が可能である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明で開発した「酵素とビオチンを異方的に担持したラテックス微粒子」の出発原料である異方性ラテックス微粒子は二段階ソープフリー乳化重合によって合成される。ソープフリー乳化重合とは、モノマーと水の混合物にラジカル重合開始剤を導入し、ラテックス微粒子を作る方法であり、通常の乳化重合との違いは界面活性剤を使用しないので、粒子表面の電荷が、通常の乳化重合によって合成された微粒子の表面電荷よりも低く、また適度なサイズを持つので簡単に遠心分離できる。ラテックス微粒子の特徴は、得られた微粒子の単分散性（サイズの均一性）が高いことである。
また、カチオン性の重合開始剤2,2’-azobis(2-amidinopropane)2HCl (V-50)等を使用し、微粒子に正電荷を持たせた微粒子を用いて酵素を固定化すれば、酵素の固定化速度や固定化量が増加することができる。
さらに、アデノシン二リン酸(ADP)をATPに転換する酵素、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）をエポキシ基を介して直接微粒子に固定化したものは、図３に示すピルビン酸の時間 生成曲線特性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の異方性ビチオン化ラテックス微粒子は、表面の片側にエポキシ基ドメイン、他の片側に水酸基ドメインを有する異方性ラテックス微粒子（直径：約100nm程度）を用いて、まず、エポキシ基側をアミノ化しカルボン酸型ビオチン誘導体と反応させ、微粒子の片側のみをビオチン化する。ビオチンは緩やかな反応条件下でアビジンと特異的に結合するので、ビオチン化した微粒子はアビジン化したものに簡単に固定化できる。一方、ラテックス微粒子の水酸基側は、エピクロルヒドリン等によりエポキシ化し、アミノ基、水酸基、チオール基などを有する種々の物質を簡単に直接固定化、あるいは、エポキシ基にリンカーを導入してから様々な生体・化学物質を固定化することができる。
さらに、本発明では、異方性ラテックス微粒子は二段階ソープフリー乳化重合によって合成される。ソープフリー乳化重合とは、モノマーと水の混合物にラジカル重合開始剤を導入し、ラテックス微粒子を作る方法であり、通常の乳化重合との違いは界面活性剤を使用しない。したがって、粒子表面の電荷が、通常の乳化重合によって合成された微粒子の表面電荷よりも低く、また適度なサイズを持つので簡単に遠心分離できる。ラテックス微粒子の特徴は、得られた微粒子の単分散性（サイズの均一性）が高いことである。
この異方性ラテックス微粒子は、「酵素とビオチンを異方的に担持したラテックス微粒子」の出発原料となる。
また、固定化酵素に影響を与える重要な因子の一つは、担体表面の静電的性質である。多くの酵素やタンパク質の等電点はpH7以下であり、中性或いはその以上のpHではそれらは負の電荷を有する。本発明では、異方性ラテックス微粒子を調製する際に、カチオン性の重合開始剤2,2’-azobis(2-amidinopropane)2HCl (V-50)等を使用し、微粒子に正電荷を持たせた。このような正電荷を持った微粒子を用いて酵素を固定化すれば、酵素の固定化速度や固定化量が増加すると考えられる。
【実施例１】
【０００７】
１．異方性ラテックス微粒子の調製：
異方性ラテックス微粒子poly(2-hydroxylethylmethacrylate-co-methylmethacrylate)/poly-
(styrene-co-glycidylmethacrylate)(P(HEMA-MMA)/P(St-GMA)は二段階ソープフリー乳化重合により合成した。その合成ルートは下に示す。
【化１】
2005113034.tif 000002
まず、P(HEMA-MMA)シード粒子をソープフリー乳化重合により調製するが、その方法及び重合条件は以下の通りである。
最初に、純水 (285 g)中、重合開始剤2,2’-azobis(2-amidinopropane)2HCl(V-50) (0.45 g)の存在下、２−ヒドロキシメチルメタクリレート(HEMA)(0.6g)、メタクリル酸メチル(MMA) (11.4 g)、架橋剤エチレンジメタクリレート(EGDMA) (3 g)を80℃、200rpmの攪拌速度下で１５時間反応させた。得られたシード微粒子はセルロース膜を用いて、24時間水道水、24時間純水で透析を行い、未反応のモノマー、開始剤、オリゴマーを除去した。
次にEGDMAで架橋したP(HEMA-MMA)シード粒子を用い、ソープフリーシード乳化重合により多官能性ラテックス微粒子(P(HEMA-MMA)/P(St-GMA))を調製した。その方法と重合条件は以下の通りである。
純水 (154 g)中、P(HEMA-MMA) シードラテックス (40.6 g、ポリマー微粒子の含量は2 g)、スチレン(St)(1 g)、メタクリル酸グリシジル (0.05 g)、ジビニルベンゼン(DVB)(0.05 g)、V-50 (0.02 g)、トルエン (4 g)を反応させた。重合反応は200rpm、70℃で24時間行った。二段階の重合反応のモノマー変化率はすべて100%、得られた複合高分子ラテックスの固形分は1.5%、数平均直径は約100nmであった。ラテックス微粒子を四酸化ルテニウムによって染色して測定したTEM写真を図１に示す。
TEMの結果より、両側にそれぞれ水酸基ドメインとエポキシ基ドメインを有するラテックス微粒子が得られたことが示唆された。ここで、暗い部分はポリスチレンーメタクリル酸グリシジルドメイン（エポキシ基ドメイン）で、より明るい部分はポリＨＥＭＡ−ＭＭＡドメイン（水酸基ドメイン）を示す。
【０００８】
２．異方性ラテックス微粒子のエポキシ側のビオチン化：
まず、微粒子の表面のエポキシ基をアミノ基に転換させる。ラテックス微粒子(20g)に28%のアンモニア水溶液(5 g)を加え、その混合物を攪拌しながら、65℃、24時間を反応させた。得られたアミノ化微粒子を純水で６回洗った、得られたアミノ基をニンヒドリンテストにより定量した結果、約593個/微粒子であった。その後、アミノ基をカルボジイミドの存在下で、カルボン酸型ビオチン、d-biotin と反応させ、ビオチン化した。反応式は下に示す。
【化２】
2005113034.tif 000003
5g のアミノ化したラテックスをpH7.4のリン酸バッファーで置換させ、d-biotin (5 mg)と
1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.05 g)を含むリン酸バッファー溶液を混合した。反応は 室温で、攪拌しながら20時間行った。 
微粒子のビオチン結合を確認するために、ビオチン化した微粒子をアビジン化した金微粒子（Streptavidin 金微粒子：直径10 nm）と結合させ、図２に示すようにTEM観察（四酸化ルテニウムで染色せず）によって金微粒子を確認した。
その結果、明らかに金微粒子がラテックス微粒子の一端（ポリSt-GMA側）に局在していて、ビオチンの分布が偏っていることが判明した。
【０００９】
３．異方性ビチオン化ラテックス微粒子の水酸基側の酵素固定化：
アミノ基を有する酵素を直接共有結合により固定化するため、水酸基をアミノ基との反応性を富むエポキシ基へ変換した。5 gのビオチン化微粒子を5 gの1N NaOH水溶液で置換させ、5 gのepichlorohydrinを添加し、室温で攪拌しながら、16時間を反応させた。反応式は下に示す。得られたエポキシ基の定量はエポキシ基をアミノ基に転換させ、ニンヒドリンテストにより行った。その値は約2.9×104個/微粒子であった。
【化３】
2005113034.tif 000004
その後、アデノシン二リン酸(ADP)をATPに転換する酵素、ピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase）をエポキシ基を介して微粒子へ固定化した。1 g のラテックスをpH 7.4のリン酸緩衝液で二回洗浄後、2 ml のpH 7.4のリン酸緩衝液に分散した。その後、約790 mgのピルビン酸キナーゼを添加した。酵素固定化反応は、室温（約25℃）で回転しながら16時間を行った。固定化後、微粒子を遠心分離し、1 M の塩化カリウム（KCl）溶液を用いて、物理的に吸着している酵素の洗浄を四回行った。遠心分離後の上澄みと洗浄後分離した塩化カリウム溶液を収集し、その溶液中のタンパク質を280nmにおけるUV吸収より計測し、微粒子への酵素固定化量を算出した。酵素の固定化量は酵素添加量の増加に連れて増加することが分かった。例えば、790 mgのピルビン酸キナーゼを添加したとき、微粒子への固定化量は1gのラテックス微粒子あたり約150 mgであった。
【００１０】
４．異方性ビチオン化ラテックス微粒子に固定した酵素の活性測定：
固定化酵素の活性は下に示した二段階酵素反応により計測した。
【化４】
2005113034.tif 000005
この方法により、ピルビン酸の生成速度はNADHの減少速度により求められる。NADHの消失量は340nmでのUV吸収の減少より測定した。
ホスホエノールピルビン酸（PEP）(26.5 mg)、ADP (50.3 mg) と 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH) (70.9 mg)を37 mMKCl と 10 mM MgSO4 を含むpH7.4のリン酸緩衝液1Lに添加し、よく混合後、混合液の340nmでのUV吸収を測定した。その後、110 mgの固定化ピルビン酸キナーゼ（1gのラテックス微粒子に約150mgのピルビン酸キナーゼを固定した微粒子）或いはフリーのピルビン酸キナーゼ (110 mg)と100 mg の乳酸脱水素酵素を添加し、二段階酵素反応を開始させた。反応は25 ℃の恒温水槽で攪拌しながら行った。ピルビン酸の時間 生成曲線を図３に示す。用いたピルビン酸キナーゼの活性は200 units/mg、乳酸脱水素酵素の活性は1000
units/mgであるので、一段目の酵素反応で生成したピルビン酸は速やかに乳酸へ転換させることができる。そのために、NADHの減少量はピルビン酸の生成量に一致すると考えられる。酵素の活性は基質PEP濃度の逆数対反応時間のプロットの傾きから計算され、固定化酵素の活性は約フリーな酵素の活性の20%であった。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本微粒子のエポキシ基はほとんどの酵素と結合可能であり、またビオチンはアビジンを介して種々の物質と結合可能であるため、本微粒子は一種の「固定化酵素カセット」あるいは「固定化酵素デバイス」と考えられ、広い分野での応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】異方性ラテックス微粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)写真
【図２】異方性ビオチン化ラテックス微粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)写真
【図３】ピルビン酸の時間 生成曲線
【図３】
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【図１】
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【図２】
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