(57)【要約】【課題】非特異的増幅を防止し、簡便かつ正確に微量核酸を定量する方法を提供すること。【解決手段】標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内において該標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成し、該微小空間内における増幅産物を検出することにより標的核酸の初期量を定量する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法。
【請求項２】
標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内において該標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法。
【請求項３】
標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内において該標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成し、該微小空間内における増幅産物を検出することにより標的核酸の初期量を定量する方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、請求項３記載の方法：
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入して、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【請求項５】
反応液を一定速度で送液しながら核酸増幅反応および増幅産物の検出を行うことを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、請求項５記載の方法：
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入し、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するように反応的を一定速度で送液しながら核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【請求項７】
核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間が、キャピラリーまたは薄膜である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間が、キャピラリーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
キャピラリーの断面積が１μｍ２〜１ｍｍ２、長さが１〜１００ｍｍである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
反応液にさらに水溶性高分子を加えることを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
水溶性高分子が、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびアガロースからなる群より選ばれるいずれか１つ以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸増幅反応がＬＡＭＰ法を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸定量のための装置であって、
核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間からなる容器内に、標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；
前記容器内で核酸増幅反応を行わせるための手段と；
前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；
得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量する手段とを備えることを特徴とする一体型装置。
【請求項１４】
さらに、反応液を一定速度で送液する手段を備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微量核酸の検出方法に関する。より詳細には、ＬＡＭＰ反応を利用して試料中の極微量な核酸を簡便かつ正確に定量する方法と、そのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲに代表される遺伝子増幅技術の進歩により、生体内の微量核酸の検出が可能になった。特にＰＣＲを定量に用いる場合、増幅産物のチューブ間誤差やサイクル中期以降のプラトー効果の問題を解決する必要がある。このため、内部標準を使用する方法や、既知量の別な核酸を加えて競合的増幅を行い、その増幅産物量比から標的核酸の定量を行う競合的ＰＣＲなどが開発されてきた。しかし、これらの方法には測定範囲の狭さや操作の煩雑さといった問題点があった。
【０００３】
最近、デジタルＰＣＲという、極微量核酸を定量するための新しい技術が開発された（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。デジタルＰＣＲは、アナログ的なＰＣＲの特性を直線的なもの、すなわち定量に適したデジタルシグナルに変換することにより、標的核酸の定量と統計解析を行うものである。デジタルＰＣＲでは、被験試料を１／２  ｃｏｐｙ／ｗｅｌｌとなるように希釈して複数のウェルに分注し、ＰＣＲ増幅を行った後、蛍光プローブを用いて増幅産物中の標的核酸の有無を確認する。理論的には各ウェル内の鋳型標的核酸は０か１かであるため、増幅したウェルの数を計測することにより、サンプル中の鋳型標的核酸を正確に定量することが可能になる。しかしながら、デジタルＰＣＲでは微量核酸を増幅するために、６０回程度のＰＣＲ反応が必要であり、その間の非特異的増幅を防止するために煩雑な操作が不可欠となる。また、２  ｃｏｐｉｅｓ以上の標的核酸を含むウェルの存在率が無視できないといった問題点もある。
【０００４】
これに対し、複数のチャンネルを備えたキャピラリープレート上で微量の標的核酸と蛍光試薬を含む溶液をＰＣＲ増幅し、その蛍光画像を解析することによって、標的核酸の分子数を定量する方法（例えば、特許文献２参照）も開発されている。この方法では、４０サイクル程度のＰＣＲ反応で検出、定量が可能であるため、非特異的増幅による計数制度の低下はデジタルＰＣＲよりも改善されている。しかしながら、この方法によっても、非特異的増幅の問題を十分に解決できたとはいえない。
【０００５】
一方、本発明者らは、ＰＣＲ法において不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法であるＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功した（例えば、特許文献３および非特許文献２参照）。ＬＡＭＰ法では、特有のプライマーと鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。そして、この相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする前記プライマーによる伸長反応により、等温での増幅反応が従来にない高い増幅効率で進行する。また、ＬＡＭＰ法は６つの領域を含む４つのプライマーを用いることで、標的配列に対する特異性がＰＣＲに比較して格段に高いという特徴も有する。
【０００６】
【特許文献１】
特表２００３−５１１００９号公報
【特許文献２】
特開２００１−２６９１９６号公報
【特許文献３】
国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．  Ｋｉｎｚｌｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．  ９６，  ｐｐ．  ｐ９２３６−９２４１，（１９９９）
【非特許文献２】
Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８（１２）：ｅ６３  （２０００）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、非特異的増幅を防止し、簡便かつ正確に微量核酸を検出・定量する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間（例えば、キャピラリーや薄膜）に極微量の標的核酸を導入すると、当該空間内には標的核酸分子が０か１の微小空間ができることに注目した。そして、この微小空間を核酸検出のための「擬似的微小空間」として利用することにより、微量核酸の効率的な検出・定量が可能になることを見出した。例えば、単一キャピラリー内で極微量の標的核酸をＬＡＭＰ増幅し、生成する蛍光輝点を計測すれば、非特異的増幅を抑えて、標的核酸の初期量を簡便かつ正確に定量することができる。
【０００９】
すなわち、本発明は、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法に関する。
前記方法において、標的核酸は１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供されることが望ましい。
【００１０】
本発明はまた、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内において該標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成し、該微小空間内における増幅産物を検出することにより標的核酸の初期量を定量する方法を提供する。
【００１１】
前記定量方法は、例えば、以下の工程により実施される。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入して、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００１２】
本発明の定量方法では、反応液を一定速度で送液しながら核酸増幅反応および増幅産物の検出を行うこともできる。これにより標的核酸の初期量が多い場合であっても、限られた単一の空間内に標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態を作り出すことができる。
【００１３】
上記方法は、例えば以下の工程により実施できる。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入し、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するように反応的を一定速度で送液しながら核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００１４】
本発明において、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間としては、例えば、キャピラリーまたは薄膜を挙げることができる。特に、キャピラリーが好ましい。本発明において、キャピラリーの断面積は１μｍ２〜１ｍｍ２、また長さは１〜１００ｍｍであることが望ましい。
【００１５】
本発明においては、核酸分子の運動の自由度を制限するために、反応液にさらに水溶性高分子を加えてもよい。そのような水溶性高分子としては、例えば、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびアガロースを挙げることができる。
本発明において、核酸増幅反応は特にＬＡＭＰ法を用いて行われることが望ましい。
【００１６】
本発明はまた、本発明の方法に用いられる核酸定量のための装置を提供する。そのような装置としては、例えば、以下の手段を備えた一体型装置を挙げることができる。
核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間からなる容器内に、標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；
前記容器内で核酸増幅反応を行わせるための手段と；
前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；
得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量する手段。
上記装置は、さらに、反応液を一定速度で送液する手段を備えていてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．  擬似的微小空間の形成方法
本発明は、標的核酸を含む反応液を、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内で核酸増幅反応に供し、これにより該単一の空間内に標的核酸検出のための擬似的な微小空間を形成する方法に関する。
【００１８】
本発明において「標的核酸」とは、検出すべき核酸分子を意味する。「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよく、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＰＮＡ等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸および２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
【００１９】
本発明において、「核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間」とは、例えば、キャピラリーや薄膜のように、核酸分子の運度の自由度が実質的に線上、平面内（２次元以下）に限定されている単一の空間を意味する。また、「単一の空間」とは複数ウェルや複数チャネルのような単離された複数空間ではなく、連続した１つの空間を意味する。
【００２０】
この核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に極微量な標的核酸を導入すると、該標的核酸は実質的に単一の核酸分子として当該空間内に局在する。その結果、該単一の空間内に標的核酸を１分子含むかあるいは全く含まない２種類の仮想の微小空間が多数作り出されることになる。すなわち、本発明にかかる「擬似的微小空間」とは、単一の空間内に形成される、標的核酸を１分子含むかあるいは全く含まない仮想の微小空間を意味する。
【００２１】
この状態で核酸増幅反応を行うと、「標的核酸を含む擬似的微小空間」では増幅産物が生成するが、「標的核酸を含まない擬似的微小空間」ではそのような増幅産物は生成しない。核酸分子の運動の自由度は制限されているため、増幅産物は拡散することなく、単一の空間内に「標的核酸の増幅産物を含む擬似的微小空間」と「標的核酸の増幅産物を含まない擬似的微小空間」が形成される。この「擬似的微小空間」は、微量核酸の検出・定量、および変異検出など、核酸検出に好適に利用することができる。
なお、前記擬似的微小空間が区別しうる状態で単一の空間内に形成されるために、標的核酸は単一の空間内に１６ｎＭ以下の状態で存在することが望ましい。
【００２２】
２．  核酸の定量方法
本発明は、本発明の擬似的微小空間を利用した微量核酸の定量方法を提供する。本発明においては、反応液中の標的核酸濃度は極微量に設定されているため、各擬似的微小空間内に存在する鋳型標的核酸分子の数は確率的に１か０である。つまり、検出される「標的核酸を含む擬似的微小空間」の数は、標的核酸の初期量と等しくなる。かくして、各擬似的微小空間における個々の増幅産物を検出することにより、該標的核酸の初期量を定量することができる。
【００２３】
ここで、増幅産物の検出方法は特に限定されず、蛍光測定、蛍光偏光測定、濁度測定、吸光度測定、旋光度測定、屈折率測定、電流測定等を挙げることができる。特に、簡便性の点から蛍光核酸検出試薬を用いた蛍光測定が好ましい。
【００２４】
例えば、本発明の定量方法は、以下の工程により実施される。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入して、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態で核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００２５】
上記方法で用いられる「核酸検出試薬」は特に限定されず、二本鎖ＤＮＡと結合して蛍光等を発する色素、いわゆる蛍光インターカレータ等を用いることができる。該蛍光インターカレーターとしては、例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５５、ＹＯなどが挙げられ、なかでもＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８が好適である。
【００２６】
本発明の方法で用いられる「プライマー」は、標的核酸の配列に従い、用いられる核酸増幅反応に適したプライマーを適宜調整する。プライマーの設計については、後述する核酸増幅方法において詳述する。また、「基質ヌクレオチド」は、市販のｄＮＴＰやその修飾物を用いればよい。
【００２７】
本発明の方法で用いられる「ＤＮＡポリメラーゼ」は特に限定されず、市販の核酸増幅に適した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを適宜使用することができる。特に、後述するＬＡＭＰ法を利用して核酸増幅反応を行う場合には、ＤＮＡポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。そのような鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明の方法では、さらに反応液内における核酸分子の運動の自由度を制限するために、ポリアクリルアミド、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、およびアガロース等の水溶性高分子を加えてもよい。
【００２９】
３．キャピラリーチップによる定量法
本発明の好ましい態様の１つとして、キャピラリーチップを用いた定量方法について説明する。本発明で用いられる「キャピラリーチップ」は、例えば数センチ四方の基板内に、単一のキャピラリーを切削することによって作製することができる。図１に、そのようなキャピラリーチップの１例を示す。図１では、２つの試料導入口と１つのドレインを設けているが、試料導入口は、１つであっても、２つ以上であってもよいし、ドレインも１つであっても、２つ以上であってもよい。キャピラリーの断面積は、限定するものではないが、１μｍ２〜１ｍｍ２であることが好ましく、またキャピラリーの長さは１〜１００ｍｍであることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法で用いられるキャピラリーチップを構成する基板としては、ガラス（石英）製、プラスチック（アクリル）製など特に限定されない。但し、導入口やドレインに封（シール）を施す場合、アクリル等のプラスチック製基板を用いる方がガラス製基板よりも接着が容易である。また、プラスチック製チップは低廉という点でも優れている。以上のようなキャピラリーチップは、公知の方法に基づき作製してもよいが、市販のガラス製キャピラリーや電気泳動用チップを用いてもよい。
【００３１】
本発明では、上記キャピラリーに標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製して導入するか、あるいは、これらを別々に順次キャピラリーに導入する。反応液導入後の導入口は、必要であれば、封を施し密封してもよい。封は、例えば市販の９６穴ＰＣＲ用粘着シートやセロハンテープなどのシールを貼ることにより実施できる。シールは透明であれば、加熱による気泡の発生を確認することができるので好ましい。特に、９６穴ＰＣＲ用粘着シートは、剥離が容易で、粘着力があり、加熱にも耐えうるという点で優れている。
【００３２】
増幅反応後、核酸検出試薬により各増幅産物を検出する。蛍光核酸検出試薬を用いた場合、各増幅産物は蛍光輝点として得られるため、その数を計測することにより、標的核酸の初期量を定量することができる。蛍光輝点は、例えば、蛍光顕微鏡を用いて目視観察できるが、蛍光像を撮影して画像処理することにより計数することが好ましい。
【００３３】
４．核酸増幅反応
本発明の方法で用いられる核酸増幅反応は特に限定されないが、ＬＡＭＰ法が好ましい。ＬＡＭＰ法は増幅効率が高く、短時間で微量の標的核酸を効率よく増幅することができる。しかも、後述するように、６つの領域を含む４つのプライマーを用いることで、標的核酸に対する特異性がＰＣＲに比較して格段に向上しているため、非特異的増幅の問題なく、微量核酸を増幅することができる。
【００３４】
１）ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の概要
「ＬＡＭＰ法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、２種、４種或いは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼおよび基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡまたはＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の概要については、文献：Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８（１２）：ｅ６３（２０００）、特許：国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／）を参照されたい。
【００３５】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、微量核酸を効率的に増幅することができる。
【００３６】
２）ＬＡＭＰ法用プライマー
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３７】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３８】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
【００３９】
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００４０】
上記インナープライマーおよびアウタープライマーは、２本鎖（ＦおよびＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００４１】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離およびＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列およびＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列およびＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００４２】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００４３】
３）増幅用鋳型核酸
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織または細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、および当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側および３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
【００４４】
４）反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、あるいは（ＮＨ４）２ＳＯ４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００４５】
５）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）  インナープライマー２種、或いはさらにアウタープライマー２種、或いはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）  鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）  基質ヌクレオチド
【００４６】
５．フロー法を利用した標的核酸の定量方法
本発明の定量方法では、反応液を一定速度で送液しながら核酸増幅反応および増幅産物の検出を行うこともできる。これにより標的核酸の初期量が多い場合であっても、限られた単一の空間内に標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するような状態を作り出すことができる。
【００４７】
上記方法は、例えば以下の工程により実施できる。
１）標的核酸、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製する；
２）上記反応液を核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間内に導入し、上記標的核酸が１６ｎＭ以下で存在するように反応的を一定速度で送液しながら核酸増幅反応を行う；
３）得られた増幅産物の輝点を検出することにより、上記標的核酸の初期量を定量する。
【００４８】
反応液の送液は、例えば微量吐出ポンプを利用することにより、一定速度で一定方向に行うことができる。送液速度は特に限定されないが、０．１〜１００  ｎｌ／ｓｅｃが望ましい。
【００４９】
図４に、フロー法を利用した標的核酸の定量方法の一例を示す。
装置は、１）２つの試料導入口と１つのドレインを有するキャピラリー（直径：３００μｍ）、送液手段としての２）微量吐出ポンプＩおよび３）微量吐出ポンプＩＩ、４）蛍光検出装置、および５）温度制御のためのラバーヒーターを備える。２つの微量吐出ポンプＩおよびＩＩは、シリコンチューブＩおよびＩＩを介して、それぞれ試料導入口ＩおよびＩＩに接続される。蛍光検出装置は、キャピラリーのドレインに近い特定位置に接続される。ラバーヒーターは、キャピラリーの下側に図４Ｂのように配置される。
【００５０】
この装置を鋳型核酸の定量は次のようにして行う。キャピラリー内に、予め基質ヌクレオチド、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、および蛍光インターカレーターを含むＬＡＭＰ反応液（表１参照）を満たし、ラバーヒーターで６５℃になるよう制御しておく。微量吐出ポンプを用いて、試料導入口Ａから前記ＬＡＭＰ反応液を、試料導入口Ｂより鋳型核酸を、それぞれ一定速度でキャピラリー内に導入しながら、ＬＡＭＰ反応を行わせる。蛍光検出装置で蛍光強度を測定し、鋳型核酸量の定量を行う。
【００５１】
図４Ｃに、９ｎｌ中に５００分子の鋳型核酸を含む反応液を９ｎｌ／ｓｅｃで送液しながらＬＡＭＰ増幅させた場合における、擬似的微小空間形成の概念図を示す。９ｎｌの擬似的微小空間には、平均１／２分子の鋳型核酸が存在する。したがって、確率的には９ｎｌの微小空間２個に１個の割合で増幅が起きる（すなわち、１秒おきに蛍光ピークが観察される）ことになる。
【００５２】
６．  核酸定量装置
本発明はまた、核酸定量のための装置を提供する。該装置は、核酸分子の運動の自由度が実質的に２次元以下に制限された単一の空間からなる容器内に、核酸検出試薬、基質ヌクレオチド、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを導入する手段と；前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段と；前記増幅反応によって得られた増幅産物を計測するための手段と；得られた計測結果を解析して、標的核酸の初期量を定量するための手段とを備える。
【００５３】
ここで、容器に標的核酸、核酸検出試薬、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドを導入する手段は、標的核酸、プライマー、ポリメラーゼ、および基質ヌクレオチドをそれぞれを順番に、あるいはこれら全て含む反応液を、一定量自動的に導入する手段である。
【００５４】
また、前記容器を一定温度に加熱して核酸増幅反応を行わせるための手段としては、例えば、装置内に備えられたヒートブロックによって容器を上または下から、好ましくは上下両面から挟んで、増幅反応に適した一定温度に加熱する手段が挙げられる。この手段には、試料を導入口を密封する手段を含みうる。
【００５５】
前記増幅反応によって得られた蛍光輝点等を計測するための手段については、公知の蛍光画像解析手段を利用することができる。本発明の装置には、さらに得られた測定データをコンピューター処理する手段を備えていてもよい。
【００５６】
上記装置は、また反応液を一定速度で送液するための手段を備えていてもよい。そのような手段としては、例えば、微量送液ポンプ（微量吐出ポンプ）を使用することができる。該微量送液ポンプは、試料導入口に直接あるいはシリコンチューブ等のチューブを通して間接的に接続され、容器内に反応液を一定速度で送液する。なお、微量送液ポンプは周知の方法に従って作製してもよいが、市販のもの（例えばテルモ社製  ｍｏｄｅｌ  ｓｔｃ５３１、武蔵エンジニアリング社製  ＳＭＰ−ＩＩＩ型微量定量吐出装置、メクト社製  ｍｏｄｅｌ  ＭＤ−９９９等）を好適に用いることができる。図４に送液手段を備えた本発明の装置の一例を示す。
【００５７】
７．その他
本発明の方法を利用すれば、効率的な変異検出や、核酸検出における相対的感度を上昇させることが可能になる。すなわち、標的核酸を擬似的な微少空間に入れることによって、それ以外のＤＮＡによる検出阻害効果を軽減することができる。
【００５８】
一般的に、標的配列とよく似た配列（究極的には１塩基のみ違う変異配列）が近傍に存在していると、この類似配列が阻害的にはたらいて、検出感度が低下する。これは、プライマーが、類似配列に弱く結合して効率的に働かなくなるためである。この場合、通常はそのような類似配列を有するＤＮＡを除去して分析を行うが、本発明の方法によれば、擬似的微少空間を形成させるとで類似配列を排除して高感度に検出を行うことが可能になる。
【００５９】
さらに、前述のフロー法を利用した定量方法のように、一定速度で反応液を流しながら増幅反応を行ったり、最終反応溶液を回収するなど、完全分離型微少空間ではできない応用も可能になると考えられる。
【００６０】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１：キャピラリー内におけるＬＡＭＰ反応
１．試験方法
１）キャピラリー
図１に本実施例で利用したチップ型のキャピラリーを示す。材質はアクリルで切削方式で作製した。２種類の試料をキャピラリーに導入できるように、試料導入口は２つ（導入口１および導入口２）作られており、本実施例では、両導入口から同一の試料溶液を導入した。キャピラリー部分の体積は５μｌである。したがって、導入した試料の約半分がキャピラリー内で反応する。
【００６２】
２）ＬＡＭＰ反応
所定量の鋳型ＤＮＡを含むＬＡＭＰ反応液を２つの試料導入口から５μｌづつキャピラリーに導入した。各導入口とドレインをシールで塞ぎ、６５℃に加温したサーマルサイクラーに載せることでＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応時間は９０分とした。実施したＬＡＭＰ反応の詳細は以下のようである。
【００６３】
鋳型ＤＮＡ：  ｐＢＲ３２２にクローニングしたＨＢＶ  ＤＮＡ（配列番号１）
ｐｒｉｍｅｒ  ：
ＦＩＰ：５’−ＣＣＴＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号２）
ＲＩＰ：５’−ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＣＡＡＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号３）
Ｆ３  ：５’−ＡＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号４）
Ｒ３  ：５’−ＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＧＴ−３’（配列番号５）
【００６４】
【表１】
2005021015.tif 000003
＊）  日立化成工業株式会社製  ｉ−チップＤＮＡキット付属の泳動ゲルを濃度が１／２となるように添加した。
【００６５】
３）検出
増幅後のキャピラリーチップをオリンパス光学工業社製の落射蛍光顕微鏡（ＢＸ−ＦＬＡ）で、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８用のフィルター（Ｅｘ  ＝  ３３０  −  ３８５  ｎｍ、Ｅｍ  ＝  ４２０  ｎｍ）を用いて観察した。蛍光が観察されている部分を輝点とし、キャピラリー内の輝点の数を目視で数えた。このとき、輝点の大きさについては考慮しなかった。つまり、輝点が大きくても小さくても一つと数えた。
【００６６】
２．試験結果
１）局所的増幅の有無
図２に増幅後のキャピラリーの蛍光写真を撮影した結果を示す。鋳型ＤＮＡ量が少ない場合（図２−Ａ；  １０コピー）、局所的な増幅が起きた（黄色い円で囲んだ部分）。また、これより少し鋳型ＤＮＡ量が多い場合（図２−Ｂ；  ２０コピー）は、輝点の数が多かった。さらに多量の鋳型ＤＮＡを含む場合（図２−Ｃ；  １０７コピー）は、キャピラリー全体が蛍光を発した。この結果から、ゲルを詰めたキャピラリー内で、擬似的な微少空間が形成されており、そのような擬似的な微少空間内でＬＡＭＰ反応が起きていることがわかった。
２）輝点数と初期鋳型ＤＮＡ数の関係
キャピラリー全体にわたって輝点の数を数え、それを初期鋳型数に対してプロットした結果、直線が得られた（図３）。したがって、キャピラリー内の輝点を計測することによって初期鋳型ＤＮＡ数を定量できることが確認された。
今回は、初期鋳型ＤＮＡ数は２０分子までしか定量ができなかったが、キャピラリーをさらに細く長くすれば、より多くの鋳型ＤＮＡを定量できるようになると考えられた。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、非特異的増幅を抑えて、簡便かつ正確に微量核酸を定量することができる。
【００６８】
【配列表】
2005021015.tif 000004
2005021015.tif 000005
2005021015.tif 000006
2005021015.tif 000007
2005021015.tif 000008
【００６９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で用いたチップ型キャピラリーを示す写真である。
【図２】図２は、キャピラリー内でのＬＡＭＰ反応結果を示す写真である（（Ａ）  鋳型ＤＮＡ数，  １０コピー；  （Ｂ）  同，  ２０コピー；  （Ｃ）  同，  １０７コピー）図中、黄色い円は、増幅が起きた部分を示す。ただし、（Ｃ）は全体で蛍光が起きているので黄色い円を省略した。
【図３】図３は、初期鋳型ＤＮＡ数と輝点の数の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、フロー法を利用した標的核酸の定量装置の概要を示す図である。Ａは装置上面図、Ｂは装置側面図を示す。Ｃは装置内における擬似的微小空間形成の概念を示す。
【符号の説明】
１：キャピラリー
２：微量吐出ポンプＩ
３：微量吐出ポンプＩＩ
４：蛍光検出装置
５：ラバーヒーター
６：試料導入口Ｉ
７：試料導入口ＩＩ
８：シリコンチューブＩ
９：シリコンチューブＩＩ
１０：ドレイン
【図１】
2005021015.tif 000009
【図２】
2005021015.tif 000010
【図３】
2005021015.tif 000011
【図４】
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