(57)【要約】    【課題】  本発明は、従来にない良好な再現性と長期間生存という利点を有する脳梗塞のモデル動物、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供するものである。    【解決手段】  本発明は、免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮してなる脳梗塞用モデル動物、及びその製造方法、並びにＳＣＩＤマウスを脳梗塞用モデル動物として使用する方法、及びＳＣＩＤマウスの脳梗塞用モデル動物としての使用に関する。また、本発明は、本発明の脳梗塞用モデル動物を用いたスクリーニング方法に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮してなる脳梗塞用モデル動物。
【請求項２】
免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管が、中大脳動脈である請求項１に記載の脳梗塞用モデル動物。
【請求項３】
免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮することからなる脳梗塞用モデル動物の製造方法。
【請求項４】
結紮する方法が、クリップ法、血管の凝固・切断法、又は血管内栓子法である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
結紮される脳の血管が、中大脳動脈である請求項３又は４に記載の製造方法。
【請求項６】
免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮して、脳梗塞用モデル動物として使用する方法。
【請求項７】
免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の、脳梗塞用モデル動物として使用。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の脳梗塞用モデル動物に、被検薬物を投与して、当該被検薬物の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって脳梗塞に対する有効性が評価された薬剤、及び製薬上許容される担体を含有してなる脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法によって脳梗塞に対する有効性が評価された薬剤が、シロスタゾール、エリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選ばれる１種以上の薬剤である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞及び血管形成能を有する細胞からなる群から選ばれる１種以上の細胞を移植し、当該移植による脳梗塞発症後の脳機能の回復に対する有効性をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
神経幹細胞が、胎児脳若しくは成熟脳の脳室下帯組織(subventricular zone;ＳＶＺ）由来の神経幹細胞、又は骨髄成体多能性幹細胞(multipotent adult progenitor cell:ＭＡＰＣ）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
血管形成能を有する細胞が、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
移植される細胞がヒト由来のものである請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞を発症させ、脳梗塞発症後の脳に産生する神経幹細胞を採取する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により採取される、請求項１又は２に記載の脳梗塞用モデル動物の脳梗塞発症後の脳に産生する神経幹細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載される神経幹細胞を培養する方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の神経幹細胞を抗原とする抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、良好な再現性と長期間生存という利点を有する脳梗塞用モデル動物に関し、より詳細には、本発明は、免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮してなる脳梗塞用モデル動物、その製造方法、その使用方法、及び使用に関する。また、本発明は、本発明の脳梗塞用モデル動物を用いたスクリーニング方法、及び有効性が評価された薬剤、及び製薬上許容される担体を含有してなる脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物に関する。さらに本発明は、本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞を発症させ、脳梗塞発症後の脳に産生する神経幹細胞を採取する方法、当該方法により採取された神経幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳血管障害は我が国の死因の第３位であるが、重症要介護認定患者数では第１位を占める重篤な疾患であるが、これを治療し、また予防するための有効な薬剤がみいだされていないのが現状である。脳血管障害の予防法としては、生活習慣病を含む生活習慣の改善が重要であるとされている。脳梗塞の治療や予防を確立するためには、その発症機構を解明し、有効な治療法を探索するためのスクリーニング法を確立し、当該治療や予防方法の有効性を確認することができる厳格な脳梗塞モデルが必要である。
このように脳梗塞モデル動物の開発は、脳血管障害の病態解明や治療法の確立、薬剤の効果判定や有効性の評価などに必須のツールであり、各種の脳梗塞モデル動物が開発されてきた。例えば、マウスやラット、砂ネズミなどの齧歯類動物や犬、猫、豚などの大動物、猿などの霊長類などを使った、モデル動物が提案されているが、これらの脳梗塞モデルは脳血管を閉塞したり、心臓停止を施行したりして脳血流を途絶し、 脳虚血を起こすことにより作成されている。脳血管の閉塞法としては、結紮法、クリップ法、血管の凝固・切断法、血管内栓子法などの各種の手法が開発されてきており、全脳を虚血させたり、局所に虚血を生じさせたり、また一過性に虚血させたり、永久的に虚血させる方法など各種の虚血手法も開発されてきた。
【０００３】
犬、猫、豚などの大動物、猿などの霊長類などの動物では、実験が大がかりとなり、バラエティーに富んだ実験が困難なことから、マウスやラット、砂ネズミなど小動物の虚血モデルが扱いやすく普及している（非特許文献１及び２参照）。しかし、砂ネズミの一過性全脳虚血は再現性はあるが、これは虚血による神経細胞死モデルとしては適していても、脳梗塞自体のモデル動物としては有効ではない。ラットの中大脳動脈閉塞(田村のモデル)の梗塞範囲は一定で再現性はあるが、動物が長期間生存することができず、有効な実験を継続して行うことができない。また、マウスは扱いやすいのではあるが、従来のマウスの中大脳動脈閉塞による局所脳虚血は梗塞範囲にばらつきが大きく、再現性に乏しく薬剤評価に際しての大量の動物実験を行うことは不可能であるし、しかも長期間生存することができないので薬剤投与の慢性期予後に与える効果が判定できないだけでなく、脳梗塞発生後の脳機能の改善の実験することができなかった。
したがって、脳血管障害の有効な治療法や予防法を確立するための、良好な再現性を有し、かつ長期間生存な可能なモデル動物の開発が求められていた。
【０００４】
また、いったん発症した脳卒中後には脳機能改善対策を講じる必要がある。従来はこのためのリハビリテーションが唯一の手法であったが、近年になって造血幹細胞や神経幹細胞による細胞移植療法は、この問題を解決するための新戦略として注目されてきている（非特許文献３及び４参照）。神経幹細胞は胎児脳や成熟脳由来の脳室下帯組織(subventricular zone;ＳＶＺ）からも採取可能であり（非特許文献５参照）、胎児脳由来の神経幹細胞は神経細胞に分化するが、成熟脳ＳＶＺ由来の神経幹細胞は通常の培養条件では神経細胞には分化せず、グリア細胞に高率に分化するが、栄養因子の添加や、分化誘導因子(Notch1など)の導入により神経細胞への分化も可能である（非特許文献６参照）。このように、神経幹細胞は神経細胞に分化することができるが、脳組織内に組み込まれなければ脳機能の改善において意味はなく、細胞移植療法の評価には長期間の観察が必要であるが、従来の脳虚血モデル動物では虚血侵襲が強いため長期間の生存は不可能であり、また拒絶反応などにより移植効果を評価しうる適切な脳虚血実験モデルがないのが現状である。
このように、最新の移植再生による脳梗塞後の脳機能の回復における医療効果を判定することができるモデル動物の開発が求められていた。
【０００５】
一方、ＳＣＩＤ(Severe Combined Immunodeficient)マウスはその名が示すように液性免疫と細胞性免疫の機能的不全が見られるマウスである。ＳＣＩＤマウスはメルビン（Melvin Bosma）らによって１９８０年にＣ．Ｂ−１７系統マウスで発見された自然発症の突然変異体で、定染色体劣性の遺伝様式をとっているとされている。このマウスは梢血中の機能的なＴ細胞およびＢ細胞が欠失し、血清中には免疫グロブリンはほとんど見出されず、重度複合免疫不全を呈する。したがって、異種細胞、組織の移植に対する拒絶が少なく、ヒトの正常造血細胞ですら移植可能であることが報告されている。最近、この原因遺伝子が遺伝子組み替えによる再構成の段階で断片化したＤＮＡの結合を行うＤＮＡ依存性蛋白質リン酸化酵素のサプユニットＰ３５０の変異の結果であることが明らかにされた。このＳＣＩＤマウスの問題点は、重度の免疫不全であることから正常マウスでは全く問題にならない日和見感染病原体ですら場合によって致死的に働くこと、胸腺腫が高率に起こること、そして加齢によってＴ・Ｂ細胞が生じるLeaky現象と呼ばれるものなどである。それら現象をなくす幾つかの試みか行われている。さらにＳＣＩＤマウスといえども当然のことながら全ての異種細胞、組織が生着するわけでもなく、この生着率の向上の向上のために、ＳＣＩＤマウスのさらなる改良が行われている。
【０００６】
【非特許文献１】Kalka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3422-3427
【非特許文献２】Kawamoto et al, Circulation, 2001, 103:634-637
【非特許文献３】Arvidsson et al, Nat. Med., 2002, 8:92-930
【非特許文献４】Zao LR, et al., (2002) Exp. Neurol., 174:11-20
【非特許文献５】Tonchev  AB, et al., (2003) Mol. Cell Neurosci., 23:292-301
【非特許文献６】Chojnacki A, et al., (2003) J. Neurosci., 23:1730-1741
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脳梗塞の予防や治療法の確立のためには、その有効性が立証可能な厳格な脳梗塞モデルが必要であり、本発明は、従来にない良好な再現性と長期間生存という利点を有するモデル動物、及びそれを用いたスクリーニング方法を提供するものである。
また、いったん発症した脳卒中後には脳機能改善対策を講じる必要があり、そのための細胞移植療法の評価には長期間の観察が必要である。従来の脳虚血モデル動物では虚血侵襲が強いため長期間の生存は不可能であり、また拒絶反応などにより移植効果を評価しうる適切な脳虚血実験モデルがないのが現状である。本発明は、最新の移植再生医療効果を判定できる利点を有する従来にないモデル動物を提供するものである。
骨髄成体多能性幹細胞(multipotent adult progenitor cell:ＭＡＰＣ）(Jiang Y, et al., Exp Hematol, 2002, 30:896-904）や神経幹細胞は神経細胞に分化するが、脳組織内に組み込まれなければ意味はない。本発明は、脳梗塞修復時に特異的に産生され、神経を再生するという本来の目的を果たすことが確約されている幹細胞を増殖させ、さらに移植することで脳梗塞治療の新たな治療法戦略を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、良好な再現性と長期間生存という利点を有する脳梗塞のモデル動物を各種探索してきたが、従来免疫関連細胞や腫瘍細胞などの移植用に使用されてきた重度複合免疫不全を呈するＳＣＩＤマウスが、脳梗塞のモデル動物として適していることを見出した。ＳＣＩＤマウスは、重度の免疫不全を呈し、日和見感染病原体ですら致死的な疾患になる極めて弱い動物であるが、これが良好な再現性と長期間生存という利点を有する脳梗塞のモデル動物に適しているということは驚くべきことである。
本発明者らは、ＳＣＩＤマウスの中大脳動脈結紮による脳梗塞を作成し、その循環諸量や神経障害、行動変化を検討することにより、ＳＣＩＤマウスが長期間観察できる脳梗塞実験モデルとして極めて適しており、かつ発症後の神経幹細胞の発生の観察や神経幹細胞などの移植に適していることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮してなる脳梗塞用モデル動物、及びその製造方法、並びに免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）を脳梗塞用モデル動物として使用する方法、及び免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳梗塞用モデル動物としての使用に関する。
また、本発明は、前記した本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞を移植し、当該移植による脳梗塞発症後の脳機能の回復に対する有効性をスクリーニングする方法、及び当該脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞及び血管形成能を有する細胞からなる群から選ばれる１種以上の細胞を移植し、当該移植による脳梗塞発症後の脳機能の回復に対する有効性をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、これらのスクリーニング方法によって脳梗塞に対する有効性が評価された薬剤、及び製薬上許容される担体を含有してなる脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物、それを用いた脳梗塞を治療・予防・処置する方法、及び脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物の製造のための使用に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の脳梗塞用モデル動物に脳梗塞を発症させ、脳梗塞発症後の脳に産生される神経幹細胞を分離して、神経幹細胞を採取する方法、採取された神経幹細胞、、それを培養する方法、及びそれを抗原とする抗体に関する。
【００１０】
本発明における免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）としては、末梢血中の機能的なＴ細胞およびＢ細胞が欠失し、血清中には免疫グロブリンはほとんど見出されない重度の複合免疫不全を呈するマウスであればよく、現在市販されている（例えば、FOX Chase Cancer Centerなど参照のこと）ＳＣＩＤマウスであってもよいし、また、この改良型のマウスであってもよい。
本発明における免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管としては、脳内の脳梗塞を発症させることができる血管であれば、いずれの血管であっても特に制限は無いが、発症例の多い血管や、また実験の行い安い表皮側の血管が好ましい。好ましい血管としては、中大脳動脈、内頚動脈、椎骨脳底動脈などが例示される。
また、結紮する部位としても特に制限はないが、結紮部位によっては、虚血領域の選択性が悪くなることもあることから、選択性を確保できる部位を設定することも必要である。例えば、結紮部位として、中大脳動脈が嗅索を通過した直後、すなわち遠位側Ｍ１部位（distal M1 portion）を選択することにより、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させることが可能である。
本発明における免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の脳の血管を結紮する手法としては、脳梗塞が発症できる結紮方法で有れば特に制限はなく、例えば、クリップ法、血管の凝固・切断法、血管内栓子法などの各種の手法を使用することができる。虚血を一過性にするか、永久的にするかにより、結紮方法を選定することも必要である。例えば、凝固用ピンセットにて電気凝固後に切断する永久結紮法、動脈瑠結紮用クリップを用いた一過性結紮法などが挙げられる。
具体的な結紮方法としては、例えば、ハロセンなどでマウスを麻酔し、マウスの左頬骨を切除し、頭蓋底を露出させ、中大脳動脈走行部位に直径１〜５ｍｍ程度のの骨窓を歯科用ドリルで作成し、硬膜、クモ膜を剥離し、中大脳動脈を分離して結紮を行うことができる。
【００１１】
本発明の脳梗塞用モデル動物は、前記したＳＣＩＤマウスの脳の血管を前記した手法により結紮することにより、一過性又は永久的モデルとして製造することができる。
また、本発明は、脳の血管が結紮された免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）を、脳梗塞用モデル動物として使用する方法、及びその使用（ｕｓｅ）を提供するものであり、本発明の脳梗塞用モデル動物は、一過性又は永久的な脳梗塞を選択的に再現性よく、かつ長期生存可能なモデル動物であり、脳梗塞のモデル動物として薬物のスクリーニング、治療や予防方法の開発、また脳梗塞後の脳機能の回復方法の開発などのために使用することができる。
【００１２】
また、本発明は、本発明の脳梗塞用モデル動物に、被検薬物を投与して、当該被検薬物の脳梗塞に対する有効性をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明のスクリーニング方法としては、例えば、本発明の脳梗塞用モデル動物に、被検薬物を投与して、カーボンブラック灌流法、脳の大きさの測定、ＭＲＩなどによる機器分析などにより脳梗塞の病巣部の大きさや容積の変化、形態学的検討（左右大脳皮質幅の比、ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシスの程度、ＢｒｄＵ標識による再生神経や再生血管内皮細胞数）、行動テスト（オープンフィールドテストや驚愕反射）などを測定し、これを対照群と比較して梗塞病巣部の拡大の阻止、脳機能の回復などの程度を評価する方法が挙げられる。
本発明は、これらのスクリーニング方法によって脳梗塞に対する有効性が評価された薬剤、及び製薬上許容される担体を含有してなる脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物、当該組成物の有効量を脳梗塞の患者に投与することからなる脳梗塞を治療・予防・処置する方法、及びこれらのスクリーニング方法によって脳梗塞に対する有効性が評価された物質の脳梗塞の治療・予防・処置のための医薬組成物の製造のための使用を提供する。
【００１３】
本発明の医薬組成物における製薬上許容される担体としては、医薬製剤を製造する際に使用される、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。
本発明の医薬組成物における有効成分の投与量としては、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される有効成分の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき１０μｇから１０００ｍｇ（あるいは１０μｇから５００ｍｇ）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もあり得る。
【００１４】
本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞及び血管形成能を有する細胞からなる群から選ばれる１種以上の細胞を移植し、当該移植による脳梗塞発症後の脳機能の回復に対する有効性をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明のこのスクリーニング方法としては、本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞及び血管形成能を有する細胞からなる群から選ばれる１種以上の細胞を移植し、当該移植による脳梗塞発症後の脳機能の回復に対する有効性をスクリーニングする方法としては、例えば、本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞発症後に神経幹細胞を移植し、カーボンブラック灌流法、脳の大きさの測定、ＭＲＩなどによる機器分析などにより脳梗塞の病巣部の大きさや容積の変化、形態学的検討（左右大脳皮質幅の比、ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシスの程度、ＢｒｄＵ標識による再生神経や再生血管内皮細胞数）、行動テスト（オープンフィールドテストや驚愕反射）などを測定し、これを対照群と比較して梗塞病巣部の拡大の阻止、脳機能の回復などの程度を評価し、脳梗塞の状態に適した移植すべき神経幹細胞の種類や移植部位や移植手法をスクリーニングする方法が挙げられる。
本発明のこのスクリーニング方法において使用される神経幹細胞としては、胎児脳由来の神経幹細胞、成熟脳由来の神経幹細胞、成熟脳の脳室下帯組織(subventricular zone;ＳＶＺ）由来の神経幹細胞、骨髄成体多能性幹細胞(multipotent adult progenitor cell:ＭＡＰＣ）などが挙げられる。また、血管形成能を有する細胞としては、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）などが挙げられる。このような神経幹細胞や血管形成能を有する細胞の移植は、これらの中の１種であってもよいし、２種以上を移植してもよく、またこれらの細胞はマウス由来のものであってもよいが、ヒト由来のものであってもい。とりわけ、本発明の脳梗塞用モデル動物は免疫不全のマウス由来のものであることから、移植に対する拒絶反応が少なく、ヒト由来の神経幹細胞の移植による作用効果を評価するスクリーニング方法に適しているものである。
【００１５】
また、本発明は、本発明の脳梗塞用モデル動物に、脳梗塞を発症させ、脳梗塞発症後の脳に産生する神経幹細胞を採取する方法、当該方法により採取される神経幹細胞を提供するものである。本発明の神経幹細胞は、脳梗塞の発症により誘導されるものであり、脳梗塞発症部位又はその周辺部から、脳梗塞発症後の脳に産生されるものであることを特徴とするものである。
本発明の神経幹細胞は、神経細胞やグリア細胞への分化誘導が比較的容易であり、脳梗塞により血損した部位の脳機能の回復に極めて有用である。
本発明の神経幹細胞は、従来の神経幹細胞の培養方法と同種の方法により培養可能である。例えば、ニューロスフィア（neurosphere）法、低密度単層培養法、高密度単層培養法などにより培養可能である。好ましい本発明の培養法としては、ニューロスフィア法が挙げられる。
【００１６】
また、本発明は、前記した本発明の神経幹細胞を抗原とする抗体を提供するものである。
本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体（抗血清）、モノクローナル抗体のいずれでもよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。具体的には、本発明の神経幹細胞又はその細胞内の特異的なタンパク質に反応性を有する抗体である。本発明の抗体は、抗体作製の常法にしたがって抗原を非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換えキメラモノクローナル抗体及び組換えヒト型モノクローナル抗体（CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体を包含する。またモノクローナル抗体の場合には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭである。
本発明の抗体は、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、本発明のタンパク質又はその一部のアミノ酸配列からなるタンパク質を免疫原（抗原）として、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマあるいはウシ、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギに免疫することにより製造できる。ポリクローナル抗体（抗血清）は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た当該抗体産生細胞（脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓のＢ細胞）と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを免疫学的測定法（ELISAなど）により選択することによって製造される。
【００１７】
以下に、本発明の脳梗塞用モデル動物についてより具体的に説明するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
２５匹の免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の中大脳動脈をそれぞれ結紮し、大脳皮質中大脳動脈領域の血流変化を頭蓋骨に装着したアクリル製プローブを介してレーザードプラー血流計で測定した。結果を図１にグラフ化して示す。図１の横軸は結紮からの時間（分（’）又は時間（ｈ））を示し、縦軸は結紮前の血流量を１００％とした血流量の比（％）を示す。この結果、中大脳動脈結紮直後より脳血流は測定した２５匹全例で前値の２５％以下となり、本発明の脳梗塞用モデル動物が均一な血流低下をともなう虚血を再現できることが証明された。
【００１８】
次に、本発明の脳梗塞用モデル動物における虚血脳灌流領域を検討するために、中大脳動脈結紮による血流灌流領域の変化をカーボンブラック（carbon black）灌流法にて検討した。中大脳動脈結紮後３時間目に、カーボンブラックインク（carbon black ink）（２００μｌ）を心臓内に注入し、５分間間生存させた。その後、脳を摘出しブレインスライサー（brain slicer）にて冠状脳スライス（１ｍｍ厚）を作成してカーボンブラック（carbon black）灌流領域を観察した。その結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の上段は脳の外観を示したものであり、左側は下方向から観察した結果を、右側は上方向から観察した結果をそれぞれ示す。図２の下段は脳をスライスして観察した結果を示し、左側はカーボンブラック法を、右側はＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（2,3,5-triphenyltetrazolium））染色法による結果をそれぞれ示す。
この結果、施行した１５例全例で左中大脳動脈皮質枝領域に選択的にカーボンブラック（carbon black）が灌流されず、本発明の脳梗塞用モデル動物における脳虚血部位がきわめて均一であることが証明された。
【００１９】
次に、脳梗塞の領域を従来より脳梗塞モデルとして用いられている正常なマウスであるＣ５７Ｂ／６マウスと比較した。本発明のＳＣＩＤマウスの１群及びＣ５７Ｂ／６マウスの１群とし、各群４匹を用いて中大脳動脈結紮によって作成される脳梗塞領域を２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（2,3,5-triphenyltetrazolium ）（ＴＴＣ）染色法にて検討した。虚血作成後、脳梗塞は３日でほぼ完成することが知られている。中大脳動脈結紮後１、３、７日目に脳を摘出し脳スライサー（brain slicer）にて作成した冠状脳スライスにＴＴＣ染色を施行した。結果の一部を図３に図面に代わる写真で示す。図３は１日目のものであり、ＳＣＩＤ１匹とＣ５７Ｂ／６の３匹の脳冠状スライスを示している。上中下段に脳の前方から後方にかけての３スライスを示している。図３の左側が本発明のＳＣＩＤマウス、その右側３列は対照としたＣ５７Ｂ／６マウスの３群の例を示す。この結果、１，３，７日目のＳＣＩＤマウスの各群４匹、計１２匹はすべて左中大脳動脈皮質枝領域に選択的に梗塞が作成されていたが、比較のＣ５７Ｂ／６マウスでは梗塞の発生部位にバラツキが見られた。
さらに、２匹のＳＣＩＤマウスにおいて中大脳動脈結紮後、１日目にＭＲＩを施行し、Ｔ２強調画像を得た。結果を図４に図面に代わる写真で示す。Ｎｏ．１のマウス、Ｎｏ．２のマウスについてそれぞれ脳梗塞作成後２４時間目に７．５テスラーのＭＲＩ装置を用いて画像を作成した。それぞれ脳の前方（左上段）から後方（左下段）まで１ｍｍ幅で撮像した。これらの画像においては、いずれも均一な高信号領域（図４における白色部分）を明瞭に確認することができた。
これらの結果、本発明の脳梗塞用モデル動物による脳梗塞部位がきわめて均一であることが証明された。
【００２０】
次に本発明の脳梗塞用モデル動物の脳梗塞後の生存率を検討した。本発明の脳梗塞用モデル動物の中大脳動脈結紮による脳梗塞作成後のマウスの生存を観察した。長期観察目的で手術した動物４２匹は全例３５日目まで生存した（生存率１００％）。その内１６匹は３５日目以降も観察を続け、９０日目までは１６匹全例生存を確認したが、１８０日目までには１６匹中１匹が死亡した（１８０日目までの生存率９０％以上）。この結果、本発明の脳梗塞用モデル動物を用いた脳梗塞後の長期観察が可能であることが証明された。
【００２１】
次に、本発明の脳梗塞用モデル動物における脳梗塞による行動の変化を観察した。中大脳動脈領域の皮質脳梗塞がマウスの行動変化にいかに影響を与えるかを行動テストを用いて検討した。その結果大量のデータが得られたが、これらの主要な箇所をまとめて図６に示す。図６は脳梗塞後３５日目のマウス行動テストである。ａ、ｂ、ｃ、ｄはオープンフィールドテストの結果である。オープンフィールドテストでは一定時間内の活動量を測定する。この活動量は水平方向の活動量（Locomotion）と垂直方向（立ち上がり；rearing）それぞれで評価される。大脳皮質からの抑制がなくなると、これらの活動量は増える。また、明所（Light）から暗所（Dark）に変わると正常マウスでは活動量が増えるが、梗塞マウスではこの反応が消失する。ｅで示すように、Startle amplitude（驚愕反射の強さ）も梗塞マウスでは増強するし、明所から暗所へ移動する時間（潜時；Latency）も短くなる（図６ｆ）。ＣＤ３４−positive細胞注入治療群ではこれらの反応が正常マウスのそれに近づいている。
オープンフィールドテスト、聴覚性驚愕反射強度の馴化およびプレパルスインヒビションテスト（ＰＰＩ）、水迷路学習、受動的回避学習、積極的回避学習を脳梗塞後３−４週間目で施行した。脳梗塞マウス(７匹)と偽手術コントロール群(７匹)間では積極的回避学習や受動的回避学習には差がないが、水迷路学習機能の低下や、馴化機能の低下（ＰＰＩの抑制)、活動性の亢進など、大脳皮質機能の抑制が示された。受動的回避学習や積極的回避学習は主に海馬や扁桃体などの辺縁系機能を反映するテストである。一方水迷路やＰＰＩ、オープンフィールドテストは海馬のみならず大脳機能の障害もよく反映する。従って、本発明の脳梗塞用モデル動物が脳梗塞後遺症としての大脳皮質機能不全モデルとして適切であることが証明された。
【００２２】
次に、本発明の脳梗塞用モデル動物の脳梗塞後の脳の形態変化を調べるために、脳梗塞後の脳萎縮の程度を摘出脳で観察した。脳梗塞作成後１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、その脳を観察した。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５は８匹のマウスの梗塞脳を示し、すべて脳梗塞後１４日目のものである。この結果、摘出脳は全例中大脳動脈領域の欠損が観察された。次に、残存した大脳皮質の大きさを定量化する目的で、梗塞側大脳皮質の大脳裂からの幅を正常側と比較しその比をＣＩ（cortical width index）として算出した（図１５も参照のこと。）。
本発明のモデル動物では、虚血後の脳梗塞の進展（delayed infarct expansion）（Matsui T, et al. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22:711-722）は脳梗塞後３日で終了し、その後は脳萎縮の進展ではなく、脳形態上はむしろ回復することが明かとなった。このことは、本発明の脳梗塞用モデル動物が脳梗塞疾患モデルとしてのみならず、脳再生モデルとしても適していることを示している。
【００２３】
次に、中大脳動脈結紮によって生じる虚血性神経細胞傷害の程度を微小管結合タンパク質（microtuble associate protein）２（ＭＡＰ２）とＮｅｕＮ(Neuronal nuclear antigen)に対する免疫組織化学で検討した。
脳梗塞作成後１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後、得られた脳切片をＭＡＰ２に対する免疫組織化学に供した。即ち、脳切片をマウスモノクローナル抗ＭＡＰ２抗体を含むリン酸緩衝液（２０００倍希釈）にて１２時間反応させ（第一反応）、洗浄後ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（第二反応）、次いでアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体と反応させた。ＭＡＰ２、ＮｅｕＮの可視化はＤＡＢ反応によって行い、光学顕微鏡観察に供した。
脳梗塞作成後１日目以降の脳では全例中大脳動脈領域のＭＡＰ２染色の消失が観察された（図１６参照）。ＮｅｕＮの染色性は１日目ではまだ一部存在していたが、７日目以降では完全に消失していた。１日目までは中大脳動脈の穿通枝支配領域である線条体や後大脳動脈支配領域である海馬や視床など、中大脳動脈大脳皮質枝支配領域以外の脳ではＭＡＰ２染色の欠損はみられなかった。このことは、本発明の脳梗塞用モデル動物の虚血性の神経細胞傷害が大脳皮質神経に限局していることを示す。しかし、７日目以降には全例で後視床核群をふくむ後視床腹側核のＭＡＰ２染色の脱落がみられた。これは大脳皮質神経の脱落にともなう皮質視床路を介する視床神経の神経細胞死であると考えられる。この神経線維連絡の存在は逆行性トレーサーを用いた実験で証明された。即ち、４％フッ化金（Fluorogold）(0.1 μｌ)を後視床核に定位脳手術的に微量注入し、５日後に神経細胞によるフッ化金（Fluorogold）の取り込みを観察した。中大脳動脈領域にある大脳皮質の５層、７層の神経細胞を中心にフッ化金（Fluorogold）の取り込みが観察され、大脳皮質の脳梗塞による神経細胞の脱落が視床神経細胞死をもたらすことが明かとなった。従って、本発明の脳梗塞用モデル動物による神経脱落症状は大脳皮質と視床を結ぶ神経連絡機能に関することが予想される。
【００２４】
次に本発明の脳梗塞用モデル動物の脳梗塞容積の経時後変化を検討した。
脳梗塞作成後１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。脳梗塞容積は梗塞巣を含む脳切片上（２２０μｍ間隔、計１２枚）の残存する神経細胞領域（ＭＡＰ２陽性領域）を測定することで算出し、健常側脳より算出した全脳容積に対する比率（％Ｉ）を用いて評価した。結果をグラフ化して図７ａ（図７の左上側）に示す。グラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸は％Ｉを示す。この結果、脳梗塞容積（％Ｉ：% infarction）は梗塞後１日目は１８．２％で７日目には２１．６％とやや拡大したが、１４日目には１９．４％と縮小し、以後改善傾向が１８０日目まで持続した。
ここで観察された脳梗塞容積の縮小の原因を探るため、脳梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の大脳皮質の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した。結果をグラフ化して図７ｂ（図７の左下側）に示す。図７ｂのグラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸はＬ／Ｒ比を示す。同様に、梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の線条体の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した。結果をグラフ化して図７ｃ（図７の右下側）に示す。図７ｃのグラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸はＬ／Ｒ比を示す。大脳皮質の容積比は１日目に０．５３、７日目には０．３９と減少したが、１４日目には０．４５、３５日目には０．４９となった。即ち、大脳皮質は７日目に最小となり１４日目以降に増大していた。線条体は１日目では１．１２、７日目には１．００、１４日目には０．８６と縮小を認めたが、３５日目には０．９１と回復傾向を示し、１８０日目には０．９８とほぼ健常側と同じ大きさにまで回復した。即ち、線条体は１４日目に最小となり以後増大した。これは大脳皮質神経の脱落に伴いその通過線維も脱落するため、線条体の萎縮は遅れて出現するが、大脳皮質神経あるいはその通過線維の回復に伴い遅れて線条体容積も回復するものと考えられる。このように、本発明の脳梗塞用モデル動物は従来のモデルのような梗塞後の脳萎縮過程のみならず．脳回復（再生）過程も追跡可能であることを示している。
【００２５】
脳梗塞では、梗塞の予防や治療も重要であるが、脳梗塞後の脳機能の回復のための適切な処置方法を見出すことも極めて重要とされている。従来はリハビリテーションが主体であったが、回復効果が少ないことや、長時間と多大な努力が必要とされ、より確実で簡便な手法の開発が切望されている。
そこで、本発明者らは、このための神経幹細胞の産生に着目した。そして、まず、神経幹細胞を産生することができる動物の開発を行った。前記で説明してきたように、本発明の脳梗塞用モデル動物は脳回復（再生）過程も追跡可能であり、このことは神経細胞の機能の回復や神経幹細胞の産生やその分化が生じていることを示していると考えられることから、このモデル動物を用いて、脳梗塞後の神経幹細胞の産生について検討してみた。
【００２６】
まず、本発明の脳梗塞用モデル動物の虚血脳における脳再生過程を検討した。
本発明の脳梗塞用モデル動物に脳梗塞を作成する前後にブロモデオキシウリジン（5-Bromodeoxyuridine ）（ＢｒｄＵ）（２００ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、虚血脳における脳細胞再生を検討した。ＢｒｄＵは分裂期にある細胞がＤＮＡを複製するときにとりこまれるため、分裂増殖した細胞に存在する。すなわち、分裂増殖した細胞（神経幹細胞など）はＢｒｄＵに対する免疫組織化学で検出される。
脳梗塞作成後、１、３、７、１４、３５日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後脳切片をＢｒｄＵに対する免疫組織化学に供した。梗塞周辺及び側脳室下帯組織(subventricular zone: ＳＶＺ）におけるＢｒｄＵに対する免疫組織化学の結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の左側は、梗塞周辺におけるものであり、右側はＳＶＺにおけるものである。図８の上から梗塞発生前（sham）、梗塞後１日目、３日目、及び１４日目をそれぞれ示す。また、ＢｒｄＵ陽性の内皮細胞の数を測定した。その結果をグラフ化して図９に示す。図９Ａ（図９の左側）はスライス中の全陽性細胞数を示し、図９Ｂ（図９の右側）はスライス中の内皮細胞における陽性細胞数を示す。各グラフの横軸は梗塞発症からの日数を示し（ｃは対照を示す。）、縦軸は細胞数を示す。図９中の黒抜きの棒は梗塞発症部位と同じ側の場合を示し、白抜きの棒はその反対側の場合を示す。
この結果、脳梗塞作成後１日目以降の脳では全例虚血側の側脳室下帯組織(subventricular zone: ＳＶＺ）にＢｒｄＵ陽性細胞が発現していた。３日目、７日目には梗塞周囲の脳実質にも多くのＢｒｄＵ陽性細胞が認められた。これらの細胞数は３日目をピークに脳実質内で発現していたことから、ＳＶＺからの脳細胞の再生は梗塞後３日目をピークにみられることが明らかとなった（図１６）。また、ＳＶＺのＢｒｄＵ陽性細胞は７日目にもみられたが、１４日目には梗塞前のレベルにまで激減した。このことはＳＶＧ由来の神経幹細胞は梗塞後７日目まで産生されることを意味する。一方、梗塞後７日目以降にはＢｒｄＵ陽性細胞が梗塞組織と白質（脳梁）とが接する部分（梗塞下組織）に発現するようになり、これらの細胞は梗塞後３５日目まで存在しており梗塞周囲の脳実質に侵入していた。このＢｒｄＵ陽性細胞の一部は骨髄由来のマクロファージであり、脳由来の細胞とは異なっていた。これらのことから、脳再生過程ではＳＶＧ由来の再生細胞と骨髄由来の再生細胞が関与することが明らかとなった。
【００２７】
そこで、脳梗塞後にいかなる脳細胞が再生するかを神経幹細胞や神経、グリアの各種マーカーを用いた免疫組織化学で検討した。即ち、神経幹細胞に対しては抗ムサシ１（Musashi1）抗体を用い、未熟神経細胞の同定にはダブルコルチン（Doublecortin）（ＤＣＸ）を用いた。オリゴデンドロサイト前駆細胞は血小板由来成長因子受容体α（Platelet-derived Growth Factor Receptor α）（ＰＤＧＦＲα）とプロテオグリカンＮＧ２をマーカ−とし、前オリゴデンドロサイトおよび未熟オリゴデンドロサイトに対してはオリゴデンドロサイトマーカーＯ４と髄鞘関連グリコプロテイン（Myelin-associated Glycoprotein）（ＭＡＧ）を用いた。
アストロサイトは抗ＧＦＡＰ抗体で同定した。さらに、未熟神経細胞や軸素伸長過程にある神経のマーカーとしてＰＳＡ−ＮＣＡＭ（polysialylated neural cell adhesion molecule）を用いた。ＰＳＡ−ＮＣＡＭは培養神経幹細胞の細胞膜に発現することが示されている。また、Ｎ−カドヘリン（N-cadherin）もニューロスフィア（neurosphere）に発現することが確認されている。なお、ニューロスフィア（neurosphere）は、神経幹細胞の選択的な培養法のひとつであるニューロスフィア（neurosphere）法において、細胞を浮遊培養したときに形成される球状の細胞塊（neurosphere）であり、ニューロスフィア（neurosphere）は継代可能であり、かつ増殖因子を除いてコーティングを施した培養皿に接着させると、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの３種類の細胞をつくりだすことが可能となるものである。
そしてこれらは、ニューロスフィア（neurosphere）の分化誘導シグナル調節に深く関与している。また、ニューロスフィア（neurosphere）の分化や維持に本質的な役割を担うシグナル分子として、Ｎｏｔｃｈ１が注目されている（非特許文献６）。そこで、本発明においても脳梗塞後のＮｏｔｃｈ１発現も検討した。
【００２８】
まず、脳室下帯組織（subventricular zone:ＳＶＺ）における神経幹細胞の産生について検討した。
本発明の脳梗塞用モデル動物に脳梗塞作成後１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。これらの試料にＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα、及びムサシ１（Musashi1）をそれぞれ用いて、染色し、顕微鏡で観察した。この結果を図１０に図面に代わる写真で示す。図１０の左上は、梗塞側の梗塞周囲に出現したＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性構造（灰色（原図では黄色）の矢頭）とＳＶＺに出現したＰＳＡ−ＮＣＡＭ（黒色（原図では青）の矢頭）で、右下は健常側（反対側）のＳＶＺのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（黒色（原図では青）の矢頭）、中央上は右上の拡大像で、右上はその連続切片のムサシ１（Musashi1）、左下はその連続切片のＤＣＸ、中央下段はその連続切片のＮｅｕＮである。
この結果、梗塞後１日目にはＳＶＺの各種マーカーの発現はすべて正常側と差はなかった。７日目になるとムサシ１（Musahil）陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞がＳＶＺに増殖するようになった。１４日目になるとこれらの神経幹細胞は脳室膨大部から白質内に侵入するようにみられた。３５日目にはＳＶＺでの発現細胞は減少しコントロールレベルとなったが、脳室下の白質には多数のムサシ１（Musashi1）陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性の細胞が認められた(図１０参照)。同部位にはＤＣＸ陽性の未熟神経細胞や、小型のＮｅｕＮ陽性細胞もみられた。９０日目以降ではＳＶＺや脳室下の白質にはムサシ１（Musashi1）、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＤＣＸなどの幹細胞あるいは未熟神経はみられなくなり、多くはＭＡＰ２陽性、ＮｅｕＮ陽性の成熟神経細胞になったと思われる。また、梗塞後７日目よりＳＶＺにはＮＧ２陽性、ＰＤＧＦＲα陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞も発現するようになった。これらはオリゴデンドロサイトマーカーを有しておらず、１４日目までみられたが、３５日目以降には減少した。即ち、ＳＶＺでは梗塞後７日目以降、１４日目をピークに神経幹細胞増殖がみられ、以後減少する。神経幹細胞としては脳室下の白質に３５日目までは存在するが、以後は成熟して神経となるか、あるいは死滅してしまうと考えられる。ＳＶＺには梗塞後７日目にはＮｏｔｃｈ１陽性細胞がみられたが、それ以降はみられなかったことから、ＳＶＺ細胞の分化増殖シグナルは梗塞後１週間程度で終了すると考えられた。
【００２９】
また、脳室下と異なり、梗塞下の神経幹細胞は梗塞後１４日目以降に認められた。これらの細胞はムサシ１陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性であり、梗塞下の白質外側および大脳皮質断面に沿って広く認められた（このような多数の神経幹細胞が出現している箇所をステムロード(Stem Road)と称することにした。）(図１０参照)。この部位は同時にＮ−カドヘリン陽性であり、ＤＣＸ陽性やＮｅｕＮ陽性細胞も多数認められた。３５日目にはステムロード（Stem Road）から多数のムサシ１陽性細胞やＤＣＸ陽性細胞が大脳皮質に侵入してくる像が観察された(図１０参照)。９０日目以降にはこれらの細胞の皮質内への侵入像は減少してきたが、ステムロード（Stem Road）には多数の幹細胞が１８０目以降にも存在していた。これらはムサシ１陽性、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性、Ｎ−カドヘリン陽性でＮｏｔｃｈ１陽性細胞も存在した（図１１参照）。図１１は、梗塞巣内にみられるＮ−カドヘリン陽性細胞集団と梗塞周囲にみられるＮ−カドヘリン陽性構造（図１１左側）、及び梗塞巣内にあるＮｏｔｃｈ１陽性細胞集団（図１１右側）を示す図面に代わる写真である。図１１の右側では、一部のＮｏｔｃｈ１陽性細胞が梗塞巣周辺の大脳皮質に侵入している様子も示されている。
即ち、ステムロード（Stem Road）には骨髄細胞由来の神経幹細胞が梗塞後１４日目以降に発現し、３５日目をピークに脳実質内に侵入する。そしてその後１８０日目までも分化誘導に不可欠なＮｏｔｃｈ１シグナルを有する幹細胞としてその部位に存在し続けることが明かとなった。以上のことは、本発明の脳梗塞用モデル動物が、脳梗塞下の組織に神経幹細胞を脳梗塞発症後長期間にわたって産生する神経幹細胞産生動物として有用であることを明かとしたものである。
【００３０】
以上の実験から、本発明のＳＣＩＤマウス由来の脳梗塞用モデル動物が脳梗塞下組織(Stem Road)由来の神経幹細胞を産生していることが判明したので、これを分離し、培養することを試みた。神経幹細胞の培養法としては、ワイス（Weiss）らのグループにより開発されたニューロスフィア（neurosphere）法、デイビス（Davis）らにより開発された低密度単層培養法、ガーゲ（Gage）らのグループにより開発された高密度単層培養法などが知られている。以下ではニューロスフィア（neurosphere）法による培養を行った。
脳梗塞作成後３５日目のＳＣＩＤマウスをクリーンベンチ内で断頭し、脳梗塞周囲の瘢痕組織および脳梗塞下組織を採取した。その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下に小細胞バインディング（low cell binding）プレート上で１０日間培養を行った。この培養結果を、図１２に図面に代わる写真で示す。図１２の上段は脳梗塞巣から得られた細胞を培養した結果の顕微鏡写真を示し、図１２の下段は、側脳室周囲から得られた細胞を培養した結果の写真を示す。
この結果、１０日後にはニューロスフィア（neurosphere）（球状の細胞塊）が細胞顕微鏡下で観察された(図１２参照)。次いでハイバインディング（high binding）プレート上でさらに培養した。１０日後に分化したニューロスフィア（neurosphere）をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、発現タンパクの検討を行った。これらはネスチン（Nestin）陽性、ムサシ１陽性の神経幹細胞であることが確認された。
また、同様に、浮遊しているニューロスフィア（neurosphere）を採取しハイバインディング（high binding）プレート上でさらに培養し、１０日後に分化したニューロスフィア（neurosphere）をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、発現タンパクの検討を行った。これらは、ＤＣＸ陽性で、一部ＮｅｕＮ陽性、ＭＡＰ２陽性の神経細胞であった。
【００３１】
以上のように本発明の脳梗塞用モデル動物は、従来にない良好な再現性と長期間生存という利点を有するモデル動物を提供するものである。及びそれを用いたスクリーニング方法を提供するものである
本発明の脳梗塞用モデル動物を使用したスクリーニング方法を具体的に説明するが、本発明のスクリーニング方法はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００３２】
まず、本発明のスクリーニング方法の薬剤評価系としての有用性を血小板凝集抑制剤の脳梗塞に及ぼす影響を検討することにより行った。このための被検物質として、シロスタゾールを用いた。
シロスタゾールは、抗血小板作用のみならず種々の血管内皮機能改善作用を有する薬剤である。虚血性神経障害に対しては実験的脳梗塞後１日目での軽減効果が示されているが、脳梗塞縮小効果を判定する観察期間は１日では不十分であったが、従来は長期間生存可能な実験動物が無かったことから、長期間にわたる試験による評価を行えなかった。本発明のモデル動物は、長期生存可能なマウス脳梗塞モデルであり、これを用いて同薬剤が脳梗塞急性期治療薬として有効かどうかを評価した。
まず、成熟雄ＳＣＩＤマウスの左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。血管閉塞１時間後よりシロスタゾール６０ｍｇ／ｋｇの投与を開始し、２日目まで計５回経口投与した。３日目以降は薬物濃度０．１％の混餌飼料で投与継続した。脳梗塞後１４日目に動物を灌流固定し、ＭＡＰ２及びＮｅｕＮに対する免疫組織化学を施行した。脳梗塞容積は梗塞巣を含む脳切片上（２２０μｍ間隔、計１２枚）の残存する神経細胞領域を測定することで算出し、健常側脳より算出した全脳容積に対する比率（％Ｉ）を用いて評価した。この結果をグラフ化して図１３に示す。図１３の左側は、梗塞部分の容積の変化を示し、グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は全脳容積に対する容積の比（％Ｉ）を示す。図１３の右側は、１４日後の対照（プラセボ）との比較を示し、グラフの横軸は左側が対照（プラセボ）で、右側がシロスタゾール投与群を示し、縦軸は全脳容積に対する梗塞の容積の比（％Ｉ）を示す。
梗塞後７、１４日目では大きな変化はないので、梗塞の進展（delayed infarct expansion）は７日目以降は見られない。１４日目でシロスタゾールノ効果を判定したところ（図１３右図）、有意差をもってシロスタゾール群が梗塞容積が小さかった。
【００３３】
この結果、シロスタゾール群とコントロール群の％Ｉは、それぞれ１９．４±３．２（Ｎ＝６）、２２．６±２．８（Ｎ＝１１）であり、シロスタゾール群の脳梗塞容積はコントロール群に比し有意に縮小していた（Ｐ＜０．０５）（図１３の右側参照）。
シロスタゾールには血流改善作用のあることが報告されているが、本発明のスクリーニング方法により、シロスタゾールに脳梗塞縮小効果のあることが示され、本発明のスクリーニング方法の薬剤評価系としての有用性が確認された。
【００３４】
同様に、エリスロポエチンの脳梗塞に及ぼす影響について検討した。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は赤血球の分化増殖のみならず、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に作用して血管新生作用も報告されている（Bahlmann, F.H., et al., (2004) Blood 103:921-926 ；Jaquet, K., et al., (2002) Microvasc. Res., 64: 326-333）。しかし、虚血性神経障害に対してはその効果は明かではない。そこで、本発明の長期生存可能なマウス脳梗塞モデルを用い、ＥＰＯが脳梗塞急性期に血管新生を誘導して治療薬として有効かどうかを評価した。
成熟雄ＳＣＩＤマウスの左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。血管閉塞後よりＢｒｄＵを投与し、さらに１、２、３日目にＥＰＯ（２５単位（Ｕ））を皮下注した。対照としてＰＢＳを投与した。脳梗塞後７、１４、２８日目に動物を灌流固定し、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、ＢｒｄＵ、ＣＤ１３に対する免疫組織化学を施行した。
ＣＤ１３で免疫染色した脈管形成におけるＥＰＯの効果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の左側はＥＰＯ投与群の場合を示し、右側は対照としたＰＢＳ投与群を示す。また、脳梗塞後７日目の時点ですでにＥＰＯ投与群では、ＰＢＳ投与コントロール群に比し、ＣＤ１３陽性の活性化血管内皮細胞数が有意に多く、梗塞と正常脳の境界部の有効血管数(angiographic score)も有意に高かった(図１４参照)。
さらに、梗塞後２８日目ではＢｒｕＵとＮｅｕＮ陽性の新生神経細胞細胞数もＥＰＯ群では３．８±１．１であるのに対して、ＰＢＳ投与群では０．５±０．３であり、Ｐ＜０．０５で有意に多かった。
この結果、エリスロポエチンは脳梗塞後の血管新生を促進し、神経再生を亢進させる効果のあることが示され、本発明のスクリーニング方法の薬剤評価系としての有用性が確認された。
【００３５】
次に、本発明のスクリーニング方法による移植療法評価系としての有用性を、血管内皮前駆細胞移植による脳梗塞治療の効果により検討した。
血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の移植は血管新生を促進することから虚血性心疾患や下肢虚血性疾患の治療に応用されている。そこで、本発明の長期生存可能なマウス脳梗塞モデルを用いて脳梗塞後のＥＰＣ移植が血管新生を介して脳障害を軽減するかを検討した。
成熟雄ＳＣＩＤマウスの左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（５×１０５個）を中大脳動脈閉塞後４８時間目に尾静脈より注入した（ＣＤ３４群）。コントロールとしてはＣＤ３４陰性細胞投与群（陰性群）とＰＢＳ投与群（ＰＢＳ群）を作成した。脳障害の程度は形態学的検討（左右大脳皮質幅の比、ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシスの程度、ＢｒｄＵ標識による再生神経や再生血管内皮細胞数）と行動テスト（オープンフィールドテストと驚愕反射）で評価した。形態学的検討は脳梗塞後７、１４、３５、９０日目の動物を用い、行動テストは梗塞後３５日目の動物を用いて施行した。ＣＤ３４陽性細胞による血管新生はヒトあるいはマウス特異的内皮細胞マーカー（ＣＤ３１抗体）とＢｒｄＵ標識を用いた免疫組織化学で評価した。また、抗血管再生作用をもつエンドスタチン（Endostatin）投与がＣＤ３４陽性細胞移植による血管新生にいかに影響を及ぼすかも検討した。
【００３６】
図１５は実施例１５として示したＣＤ３４−陽性細胞移植注入の脳梗塞に与える影響をみたものである。図１５には脳梗塞作成後２日目にＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞を静脈投与して１４日目(ｃ)、９０日目（ｆ）の脳である。また、それぞれコントロールとしてＣＤ３４−陰性(ＣＤ３４−negative)細胞（ｂ，ｅ）あるいはＰＢＳ（リン酸緩衝液添加生理食塩水）（ａ，ｄ）を注入したものの１４日目（ｂ，ａ）および９０日目（ｅ，ｄ）の脳である。ＣＩはそれぞれの群（ＣＤ３４−positive, ＣＤ３４−negative, ＰＢＳ）について７，１４，３５，９０日目のものを示す。ＣＩは嗅球を除く大脳皮質の前後長の半分の位置で測定した（右下段）、ＣＩ＝Ｂ／Ａで、単なる幅の比である。なお、これと似たCortical area indexは面積の比で、％Ｉは容積比となる。
図１５下左側のグラフの黒三角印（▲）はＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞の場合を示し、黒四角印（■）はＣＤ３４−陰性(ＣＤ３４−negative)細胞の場合を示し、及び黒丸印（●）はＰＢＳの場合を示す。ＣＩ値は、１日目から３日目までは減少傾向にあり、その後１４日目までは０．３４と一定であったが、３５日目以降は０．３７とむしろ増加した。この結果、左右大脳皮質幅の比（Cortical Width Index）（ＣＩ）は、７日目では０．３４と３群間で差はなかったが、１４日目以降はＣＤ３４群が陰性群とＰＢＳ群に比べて有意に増加していた。
また、図１６は実施例１５として示したＣＤ３４−陽性細胞移植注入の脳梗塞に与える影響をみたものである。図１６には脳梗塞作成後２日目にＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞、ＣＤ３４−陰性(negative)細胞、ＰＢＳを静脈投与して３５日目の脳である。梗塞面積を算出するために設定した領域を右中断のＡとＢで示す。Ｂ／Ａはcortical area indexであり、脳梗塞の広さを示す。左下段はそれぞれの群の３５日目のcortical area indexを示している。右下段はＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞注入後３５日目の脳で、血管再生をＣＤ３１に対する免疫組織化学でみたものである。ＣＤ３１は血管内皮細胞のマーカーである。右下段では新生血管が梗塞巣に向かって走行している様子が示されている。
【００３７】
また、オープンフィールドテストでは脳障害が強いほど動物の活動量は増えるが、ＣＤ３４群は他群に比し行動量が少なく、また暗所での行動パターンも偽手術正常群と同様のレベルであった（図６参照）。驚愕反射では大脳からの抑制がとれるとその強度は大きく持続時間も長くなるが、ＣＤ３４群は偽手術正常群と同様のレベルまで回復していた（図６参照）。
【００３８】
図１７は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞をマウス脳梗塞後に静脈投与して、１４日目にマウス脳をヒトＣＤ３１に対する抗体で免疫組織化学を行った結果を示す図面に代わる写真である。ＣＤ３１は血管内皮のマーカーであり、この抗体はヒト内皮細胞のみに反応し、マウスでは反応しない。同様にフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）抗体でも行った。これも同様に血管内皮細胞のマーカーである。これらがマウス脳内に存在するということは注入したヒトＣＤ３４細胞が血管内皮に分化し、生着したことを示す。この結果、注入移植したヒトＣＤ３４細胞はマウス脳の梗塞周辺部で血管内皮細胞に分化していたことがわかった。
図１８は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植の血管再生に及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ３４陰性細胞、ＰＢＳを静脈内注入し、その２４時間後にカーボンブラック注入法にて脳灌流領域を観察すると同時に同じ脳スライスをＴＴＣ染色した。梗塞（ＴＴＣ染色されていない部分）と正常脳（ＴＴＣ染色部）の境界部の有効血管（カーボンブラックで灌流されている血管）数（angiographic score）を３群間で比較した結果を示すグラフと、それらの図面に代わる写真である。左上と中央上ははＣＤ３４陽性細胞注入例とその拡大像で、下左、中央はそれぞれＣＤ３４陰性細胞、ＰＢＳ注入例である。右下グラフは脳１スライスあたりの平均有効血管数（angiographic score）を示す。梗塞と正常脳の境界部の有効血管数(angiographic score)や、ＢｒｕＵ  陽性の新生血管内比細胞数はＣＤ３４群で有意に多かった。
【００３９】
図１９は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植の神経再生に及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＰＢＳ（ａ）、ＣＤ３４陰性細胞（ｂ）、ＣＤ３４陽性細胞（ｃ）を静脈内注入した。再生細胞をＢｒｄＵで標識し、脳梗塞作成後３５日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成し、ＢｒｄＵとＮｅｕＮに対する二重標識間接蛍光抗体法を行い、共焦点レーザー顕微鏡にて再生神経を同定した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ａ，ｂ，ｃとも原写真で赤（白黒では黒い灰色）で示すのはＢｒｄＵ陽性細胞の核であり、原写真で緑（白黒では灰色）はＮｅｕＮ陽性の神経細胞核である。図１９ｃの原写真で黄色（白黒では灰色）に見えるのは赤とみどりが混合されてみえており、ＮｅｕＮ陽性の神経が同時にＢｒｄＵ陽性で再生したものであることを示す。グラフｄは３群における１脳切片あたりのＢｒｄＵ陽性／ＮｅｕＮ陽性細胞（再生神経細胞）の数を示す。グラフｅは３群における１脳切片あたりの全ＮｅｕＮ陽性細胞（再生神経細胞  ＋  既存の神経細胞）の数を示す。また、ＢｒｄＵ陽性の再生神経細胞数もＣＤ３４群で有意に多く、反対にＴＵＮＥＬ  陽性のアポトーシス細胞は少なく、結果として梗塞部ではない前大脳動脈領域の大脳皮質容積が増大していた。
また、図２０は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植のアポトーシスに及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＣＤ３４陰性細胞（ａ）、ＣＤ３４陽性細胞（ｂ）を静脈内注入した。脳梗塞作成後１４日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成し、ＴＵＮＥＬ（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling）法にてアポトーシス細胞を検討した結果を示す図面に代わる写真である。図２０はＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４−）、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）注入マウスの脳梗塞周囲の大脳皮質におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシス細胞）を示し、右側のグラフは１切片あたりのアポトーシス細胞数を示す。
次に、血管新生を抑制する作用のあるエンドスタチン（Endostatin）投与の脳梗塞および神経再生や血管再生に及ぼす影響を検討する目的で、梗塞作成直後よりエンドスタチンを持続皮下注入し、コントロールとしてはＰＢＳを持続皮下注した。また、再生細胞をＢｒｄＵにて標識した。梗塞作成後４８時間目にＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４−）、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）を静脈内注入した。脳梗塞作成後７日目あるいは１４日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成した結果を示すグラフである。ＢｒｄＵで標識された血管内皮細胞数（ＥＣｓ）（図２１ａ）、ＣＩ値（cortical width index）（図２１ｂ）、Ｓｍａｌｌ  ＮｅｕＮ細胞数（neuronal precursor cells；ＮＰＣｓ）（図２１ｃ）、及び大脳皮質における全神経細胞数（ＮｅｕＮ  positive cells）（図２１ｄ）を測定した結果をそれぞれしめしている。黒のグラフは梗塞後１４日目のものであり、白抜きのグラフは７日目のものである。この結果、エンドスタチン（Endostatin）投与により血管新生をはじめこれらＣＤ３４の効果は消失し、エンドスタチンを投与したＰＢＳ群ではむしろ脳萎縮が進行していた。
【００４０】
以上の結果から、ヒト由来血管内皮前駆細胞はＳＣＩＤマウス梗塞脳に生着して血管内皮細胞として機能することが明かとなった。血管新生による循環改善は神経細胞再生亢進とアポトーシス抑制をもたらして脳機能を改善することが示され、本発明のスクリーニング方法による細胞移植の評価系としての有用性が確認された。このような血管内皮前駆細胞移植は新たな脳梗塞治療戦略を生み出すと考えられた。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の脳梗塞用モデル動物は、ＳＣＩＤマウスの脳動脈を閉塞することにより、容易にかつ極めて再現性よく脳の一定部分に虚血領域を作成することができ、虚血の程度(脳血流の低下程度)は一定で個体差がなく、再現性が極めてよい。そして、当該虚血領域は一定時間を経過すると脳梗塞におちい、脳梗塞領域は一定で個体差がなく、再現性が極めてよく、モデル動物として優れたものである。また、本発明の脳梗塞用モデル動物は、長期間生存可能(６ヶ月以上)であり、脳梗塞病態のメカニズムの解明手段に適しているだけでなく、薬剤(痴呆治療薬、脳保護薬、抗血小板剤、抗浮腫剤、脳循環改善剤、高脂血症治療薬、高血圧治療薬など脳血管障害と血管性痴呆の治療を目的に使用される薬剤)の評価系としても極めて有効であり、本発明の脳梗塞用モデル動物を用いることにより、脳梗塞の治療薬だけでなく、脳梗塞後の脳機能の回復に有効な薬剤を簡便にスクリーニングすることが可能となる。さらに、本発明の脳梗塞用モデル動物は、脳再生のメカニズムの解明手段に適しており、脳再生に必要な神経幹細胞や血管形成細胞などの成熟脳における動態を解明することも可能となるだけでなく、これらの細胞の移植による有効性を簡便にスクリーニングすることができる。したがって、本発明の脳梗塞用モデル動物を用いることにより、脳梗塞に関連する各種の研究や開発において、使用される実験動物の数を最小限にとどめることができ、動物愛護の観点からも推奨される実験モデル動物である。
本発明の脳梗塞用モデル動物は、脳梗塞領域の周囲に極めて多量の神経幹細胞を発現させることができ、採取する神経幹細胞の分化ステージを選択することができると共に、成熟脳における神経幹細胞の分化の促進による脳機能の回復のためのモデルとして使用することも可能となる。また、本発明の脳梗塞用モデル動物が産生する神経幹細胞は分裂・増殖することが可能であり、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化することができ、脳実質にmigrateすることができる。そして、成熟マウス脳由来の神経幹細胞と発現蛋白が異なり、胎生期脳由来の神経幹細胞と同様の形質を保つことができることから、同個体あるいは別個体に移植することが可能であり、脳血管障害や神経変性疾患に対する神経移植治療法の研究や開発に広く応用可能である。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
ＳＣＩＤマウスの脳虚血の作成
３％ハロセン麻酔下に、ＳＣＩＤマウスの左頬骨を切除し、頭蓋底を露出させた。中大脳動脈の走行部位に直径１．５ｍｍの骨窓を歯科用ドリルで作成した。硬膜、クモ膜を剥離し、中大脳動脈を分離して結紮準備とした。中大脳動脈結紮法としては凝固用ピンセットにて電気凝固後に切断する永久結紮法、動脈瑠結紮用クリップを用いた一過性結紮法のいずれも行えた。結紮部位は、動脈が嗅索を通過した直後、すなわち遠位側Ｍ１部位（distal M1 portion）とした。この部分の結紮により、中大脳動脈の皮質枝の血流を選択的に途絶させた。
大脳皮質中大脳動脈領域の血流変化を頭蓋骨に装着したアクリル製プローブを介してレーザードプラー血流計で測定した。
結果を図１に示す。中大脳動脈の結紮直後より脳血流は測定した２５匹全例で前値の２５％以下となり、均一な血流低下をともなう虚血であることが証明された。
【実施例２】
【００４４】
虚血脳灌流領域の測定
実施例１で中大脳動脈を結紮したときの血流灌流領域の変化をカーボンブラック灌流法により測定した。即ち、中大脳動脈の結紮後３時間目にカーボンブラックインク２００μｌを心臓内に注入し、５分間間生存させた。その後、脳を摘出し、ブレインスライサー（brain slicer）にて冠状脳スライス（１ｍｍ厚）を作成してカーボンブラック灌流領域を測定した。
結果を図２に示す。施行した１５例、全例で左中大脳動脈皮質枝領域に選択的にカーボンブラックが灌流されず、本発明の方法による脳虚血部位がきわめて均一であることが証明された。
【実施例３】
【００４５】
脳梗塞領域の測定
実施例１で中大脳動脈を結紮して、中大脳動脈の結紮後１、３、７日目に脳を摘出しブレインスライサー（brain slicer）にて作成した冠状脳スライスを用いてＴＴＣ（2,3,5-triphenyltetrazolium）染色を行った。
結果を図３に示す。各群４匹、計１２匹はすべて左中大脳動脈皮質枝領域に選択的に梗塞が作成されており、本発明の方法による脳梗塞部位がきわめて均一であることが証明された。
【実施例４】
【００４６】
脳梗塞後の生存率
実施例１で中大脳動脈の結紮により脳梗塞を作成したマウスの生存を観察した。長期観察目的で手術した動物４２匹は全例３５日目まで生存した（生存率１００％）。その内１６匹は３５日目以降も観察を続け、９０日目までは全例生存を確認したが、１８０日目までには１６匹中１匹が死亡した（１８０日目までの生存率９０％以上）。本発明のモデル動物を用いた脳梗塞後の長期観察が可能であることが証明された。
【実施例５】
【００４７】
脳梗塞による行動変化
実施例１の方法で作成した中大脳動脈領域の皮質脳梗塞がマウスの行動変化を、オープンフィールドテスト、聴覚性驚情反射強度の馴化およびプレパルスインヒビションテスト(PPI)、水迷路学習実験、受動的回避学習実験、及び積極的回避学習実験を、これらの試験ガイダンスに従って脳梗塞後３−４週間目に行った。
この結果、本発明の脳梗塞用モデル動物が脳梗塞後遺症としての大脳皮質機能不全モデルとして適切であることが証明された。
【実施例６】
【００４８】
脳梗塞後の脳形態変化
実施例１の方法により脳梗塞を作成した後、１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出した。摘出脳は全例中大脳動脈領域の欠損が観察された。残存大脳皮質の大きさを定量化する目的で、梗塞側大脳皮質の大脳裂からの幅を正常側と比較しその比をＣＩ（cortical width index）として算出した。
結果を図５及び図１５に示す。この結果、本発明の脳梗塞用モデル動物が脳梗塞疾患モデルとしてのみならず、脳再生モデルとしても適していることを示している。
【実施例７】
【００４９】
虚血性神経障害
実施例１の方法により脳梗塞を作成した後、１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後脳切片をＭＡＰ２に対する免疫組織化学に供した。即ち、脳切片をマウスモノクローナル抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）を含むリン酸緩衝液（２０００倍希釈）にて１２時間反応させ（第一反応）、洗浄後ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（第二反応）、次いでアビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体と反応させた。ＭＡＰ２、ＮｅｕＮの可視化はＤＡＢ反応によって行い、光学顕微鏡で観察した。
結果を図１６に示す。この結果、本発明の脳梗塞用モデル動物が、の虚血性の神経細胞傷害が大脳皮質神経に限局していることを示している。
【実施例８】
【００５０】
脳梗塞容積の経時後変化
実施例１の方法で脳梗塞を作成した後、１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。脳梗塞容積は梗塞巣を含む脳切片上（２２０μｍ間隔、計１２枚）の残存する神経細胞領域（ＭＡＰ２陽性領域）を測定することで算出し、健常側脳より算出した全脳容積に対する比率（％Ｉ）を算出した。結果をグラフ化して図７ａ（図７の左上側）に示す。
また、脳梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の大脳皮質の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した。結果をグラフ化して図７ｂ（図７の左下側）に示す。同様に、梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の線条体の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した。結果をグラフ化して図７ｃ（図７の右下側）に示す。
【実施例９】
【００５１】
虚血脳における脳再生過程
実施例１の方法により脳梗塞を作成する前後にブロモデオキシウリジン（5-Bromodeoxyuridine ）（ＢｒｄＵ）（２００ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与し、脳梗塞を作成した後、１、３、７、１４、３５日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。その後脳切片をＢｒｄＵに対する免疫組織化学に供した。結果を図８及び図９に示す。この結果、脳再生過程ではＳＶＧ由来の再生細胞と骨髄由来の再生細胞が関与することが明らかとなった。
【実施例１０】
【００５２】
脳室下帯組織（subventricular zone:ＳＶＺ）における神経幹細胞の産生
実施例１の方法により脳梗塞を作成した後、１、７、１４、３５、９０、１８０日目にマウスを経心的にＰＬＰ固定液で灌流固定後、脳を摘出し、ビブラトームを用いて脳切片を作成した。これらの試料にＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα、及びムサシ１（Musashi1）をそれぞれ用いて、染色し、顕微鏡で観察した。
結果を図１０に示す。ＳＶＺには梗塞後７日目にはＮｏｔｃｈ１陽性細胞がみられたが、それ以降はみられなかったことから、ＳＶＺ細胞の分化増殖シグナルは梗塞後１週間程度で終了すると考えられた。
【実施例１１】
【００５３】
梗塞下の神経幹細胞の産生
実施例１０と同様にして、梗塞下の神経幹細胞を梗塞後１４日目以降に観察した。
結果を図１１に示す。この結果、本発明の脳梗塞用動物モデルが、脳梗塞下の組織に神経幹細胞を脳梗塞発症後長期間にわたって産生する神経幹細胞産生動物として有用であることを明かになった。
【実施例１２】
【００５４】
脳梗塞下組織(Stem Road)由来の神経幹細胞の単離と培養
脳梗塞作成後３５日目のＳＣＩＤマウスをクリーンベンチ内で断頭し、脳梗塞周囲の瘢痕組織および脳梗塞下組織を採取した。その後、ＤＭＥＭとＮ−２の基本培養液内（２５０μｌ）で単細胞になるまでピペッティングし、１０ｍｌの培養液を加えて６００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を３ｍｌの培養液にて再浮遊させ、ｂＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ）とＥＧＦ（２０μｇ／ｍｌ）存在下に小細胞バインディング（low cell binding）プレート上で１０日間培養を行った。
結果を図１２に示す。この結果、１０日後にはニューロスフィア（neurosphere）（球状の細胞塊）が細胞顕微鏡下で観察された。次いでハイバインディング（high binding）プレート上でさらに培養した。１０日後に分化したニューロスフィア（neurosphere）をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、発現タンパクの検討を行った。これらはネスチン（Nestin）陽性、ムサシ１陽性の神経幹細胞であることが確認された。
また、同様に、浮遊しているニューロスフィア（neurosphere）を採取しハイバインディング（high binding）プレート上でさらに培養し、１０日後に分化したニューロスフィア（neurosphere）をパラフォルムアルデヒドを含む固定液にて固定し、発現タンパクの検討を行った。これらは、ＤＣＸ陽性で、一部ＮｅｕＮ陽性、ＭＡＰ２陽性の神経細胞であった。
【実施例１３】
【００５５】
血小板凝集抑制剤の脳梗塞に及ぼす影響の検討
成熟雄ＳＣＩＤマウス（１７−２０ｇ）の左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。血管閉塞１時間後よりシロスタゾール投与を開始し、２日目まで計５回経口投与した（６０ｍｇ／ｋｇ×５）。３日目以降は薬物濃度０．１％の混餌飼料で投与継続した。脳梗塞後１４日目に動物を灌流固定し、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮに対する免疫組織化学を施行した。脳梗塞容積は梗塞巣を含む脳切片上（２２０ｕ間隔、計１２枚）の残存する神経細胞領域を測定することで算出し、健常側脳より算出した全脳容積に対する比率（％Ｉ）を用いて評価した。
結果を図１３に示す。
【実施例１４】
【００５６】
エリスロポエチンの脳梗塞に及ぼす影響の検討
成熟雄ＳＣＩＤマウス（１７−２０ｇ）の左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。血管閉塞後よりＢｒｄＵを投与し、さらに１、２、３日目にＥＰＯ（２５Ｕ）を皮下注した。脳梗塞後７、１４、２８日目に動物を灌流固定し、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、ＢｒｄＵ、ＣＤ１３に対する免疫組織化学を行った。
結果を図１４に示す。
【実施例１５】
【００５７】
血管内皮前駆細胞移植による脳梗塞治療効果
成熟雄ＳＣＩＤマウス（１７−２０ｇ）の左側中大脳動脈を直達法により凝固切断することにより脳梗塞を作成した。ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（５×１０５個）を中大脳動脈閉塞後４８時間目に尾静脈より注入した（ＣＤ３４群）。コントロールとしてはＣＤ３４陰性細胞投与群（陰性群）とＰＢＳ投与群（ＰＢＳ群）を作成した。脳障害の程度は形態学的検討（左右大脳皮質幅の比、ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシスの程度、ＢｒｄＵ標識による再生神経や再生血管内皮細胞数）と行動テスト（オープンフィールドテストと驚愕反射）で評価した。形態学的検討は脳梗塞後７、１４、３５、９０  日目の動物を用い．  行動テストは梗塞後３５  日目の動物を用いて施行した。ＣＤ３４  陽性細胞による血管新生はヒトあるいはマウス特異的内皮細胞マーカー（ＣＤ３１抗体）とＢｒｄＵ  標識を用いた免疫組織化学で評価した。また、抗血管再生作用をもつエンドスタチンの投与がＣＤ３４陽性細胞移植による血管新生にいかに影響を及ぼすかも検討した。
結果を図６、及び図１７〜２１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
脳梗塞は重篤な疾患であり、発症後命を落とさなかったとしても重篤な後遺症が残り、脳梗塞の治療・予防、また発症後の脳機能の回復方法に関して、より有効な処置法の開発が切望されている。本発明は、脳梗塞に対して有効な治療・予防又は発症後の速やかな脳機能の回復方法を開発するための極めて有効な処方を提供するものであり、製薬産業をはじめとする各種の医療関連産業において有用であり、産業上の利用性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、免疫不全マウス(ＳＣＩＤマウス）の中大脳動脈を結紮し、大脳皮質中大脳動脈領域の血流変化をレーザードプラー血流計で測定した結果をグラフ化して示すものである。図１の横軸は結紮からの時間（分（’）又は時間（ｈ））を示し、縦軸は結紮前の血流量を１００％とした血流量の比（％）を示す。
【図２】図２は、本発明の脳梗塞用動物モデルの中大脳動脈結紮による血流灌流領域の変化をカーボンブラック（carbon black）灌流法にて検討した結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図３】図３は、本発明のＳＣＩＤマウスの１群及びＣ５７Ｂ６マウスの１群、各群４匹における中大脳動脈結紮によって作成される脳梗塞領域を２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（2,3,5-triphenyltetrazolium ）（ＴＴＣ）染色法にて検討した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図３上段は１日目のものであり、中段は３日目のものであり、下段は７日目のものである。図３の左側が本発明のＳＣＩＤマウス、その右側３列は対照としたＣ５７Ｂ／６マウスの３例を示す。
【図４】図４は、本発明のＳＣＩＤマウスの２匹のＳＣＩＤマウスにおいて中大脳動脈結紮後、１日目にＭＲＩを施行し、Ｔ２強調画像を得た結果を示す図面に代わる写真である。図４の各写真は、脳の前方（左上段）から後方（左下段）まで１ｍｍ幅で撮像したものである。
【図５】図５は、本発明の脳梗塞用動物モデルの脳梗塞後の脳の形態変化を調べるために、８匹のマウスの脳梗塞後の脳萎縮の程度を摘出脳で観察した結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【図６】図６は、脳梗塞後３５日目のマウス行動テストである。ａ、ｂ、ｃ、ｄはオープンフィールドテストの結果である。オープンフィールドテストでは一定時間内の活動量を測定する。この活動量は水平方向の活動量（Locomotion）と垂直方向（立ち上がり；rearing）それぞれで評価される。ｅは、Startle amplitude（驚愕反射の強さ）の結果を示し、ｆは明所から暗所へ移動する時間（潜時；Latency）を示す。
【図７】図７は、本発明の脳梗塞用動物モデルの脳梗塞容積の経時後変化を検討した結果をグラフ化したものである。図７ａ（図７の左上側）は、残存する神経細胞領域（ＭＡＰ２陽性領域）を測定することで算出し、健常側脳より算出した全脳容積に対する比率（％Ｉ）を用いて評価した結果を示す。グラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸は％Ｉを示す。図７ｂ（図７の左下側）は、脳梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の線条体の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した結果を示す。図７ｂのグラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸はＬ／Ｒ比を示す。図７ｃ（図７の右下側）は、図７ｂと同様にして梗塞作成後の左脳（梗塞側）と右脳（健常側）の大脳皮質の容積の比（Ｌ／Ｒ比）を測定した結果を示す。図７ｃのグラフの横軸は脳梗塞作成後の日数（日）を示し、縦軸はＬ／Ｒ比を示す。
【図８】図８は、本発明の脳梗塞用動物モデルの虚血脳における脳再生過程をブロモデオキシウリジン（5-Bromodeoxyuridine ）（ＢｒｄＵ）を皮下投与し、虚血脳における脳細胞再生を検討した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図８の左側は、梗塞周辺におけるものであり、右側はＳＶＺにおけるものである。図８の上から梗塞発生前（sham）、梗塞後１日目、３日目、及び１４日目をそれぞれ示す。
【図９】図９は、本発明の脳梗塞用動物モデルの虚血脳における脳再生過程をブロモデオキシウリジン（5-Bromodeoxyuridine ）（ＢｒｄＵ）を皮下投与し、虚血脳における脳細胞再生を検討した結果をグラフ化して示したものである。図９Ａ（図９の左側）はスライス中の全陽性細胞数を示し、図９Ｂ（図９の右側）はスライス中の内皮細胞における陽性細胞数を示す。各グラフの横軸は梗塞発症からの日数を示し（ｃは対照を示す。）、縦軸は細胞数を示す。図９中の黒抜きの棒は梗塞発症部位と同じ側の場合を示し、白抜きの棒はその反対側の場合を示す。
【図１０】図１０は、本発明の脳梗塞用動物モデルに脳梗塞を作成後、脳を摘出し、脳切片を作成し、これらの試料にＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ＤＣＸ、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲα、及びムサシ１（Musashi1）をそれぞれ用いて、染色し、顕微鏡で観察した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１０の左上は、梗塞側の梗塞周囲に出現したＰＳＡ−ＮＣＡＭ陽性構造（灰色（原図では黄色）の矢頭）とＳＶＺに出現したＰＳＡ−ＮＣＡＭ（黒色（原図では青）の矢頭）で、右下は健常側（反対側）のＳＶＺのＰＳＡ−ＮＣＡＭ（黒色（原図では青）の矢頭）、中央上は左上の拡大像で、右上はその連続切片のムサシ１（Musashi1）、左下はその連続切片のＤＣＸ、中央下段はその連続切片のＮｅｕＮである。
【図１１】図１１は、梗塞巣内にみられるＮ−カドヘリン陽性細胞集団と梗塞周囲にみられるＮ−カドヘリン陽性構造（図１１左側）、及び梗塞巣内にあるＮｏｔｃｈ１陽性細胞集団（図１１右側）を示す図面に代わるカラー写真である。
【図１２】図１２は、本発明の脳梗塞用動物モデルが、脳梗塞発症後、産生した脳梗塞下組織(Stem Road)由来の神経幹細胞を分離し、ニューロスフィア（neurosphere）法により培養した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１２の上段は脳梗塞巣から得られた細胞を培養した結果の顕微鏡写真を示し、図１２の下段は、側脳室周囲から得られた細胞を培養した結果のカラー写真を示す。
【図１３】図１３は、本発明のスクリーニング方法の薬剤評価系としての有用性を血小板凝集抑制剤シロスタゾールを用いて脳梗塞に及ぼす影響を検討した結果をグラフ化したものである。図１３の左側は、梗塞部分の容積の変化を示し、グラフの横軸は経過日数（日）を示し、縦軸は全脳容積に対する容積の比（％Ｉ）を示す。図１３の右側は、１４日後の対照（プラセボ）との比較を示し、グラフの横軸は左側が対照（プラセボ）で、右側がシロスタゾール投与群を示し、縦軸は全脳容積に対する梗塞の容積の比（％Ｉ）を示す。
【図１４】図１４は、血管再生作用のあるエリスロポエチンの脳梗塞および血管新生に与える効果をみた結果を示す図面に代わるカラー写真である。ＥＰＯ（エリスロポエチン）投与群では７日目のＣＤ１３陽性内皮細胞で示される新生血管内皮細胞数がＰＢＳ投与（コントロール）に比べて有意に多く（図左）、また梗塞容積も小さかった。
【図１５】図１５は、本明細書において実施例１５として示したＣＤ３４−陽性細胞移植注入の脳梗塞に与える影響の結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１５には脳梗塞作成後２日目にＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞を静脈投与して１４日目(ｃ)、９０日目（ｆ）の脳である。また、それぞれコントロールとしてＣＤ３４−陰性(ＣＤ３４−negative)細胞（ｂ，ｅ）あるいはＰＢＳ（リン酸緩衝液添加生理食塩水）（ａ，ｄ）を注入したものの１４日目（ｂ，ａ）および９０日目（ｅ，ｄ）の脳である。図１５下左側のグラフは、ＣＩ値の変化を示し、黒三角印（▲）はＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞の場合を示し、黒四角印（■）はＣＤ３４−陰性(ＣＤ３４−negative)細胞の場合を示し、及び黒丸印（●）はＰＢＳの場合を示す。図６右下は、ＣＩ値算出のための計測箇所を示す。
【図１６】図１６は、本明細書の実施例１５として示したＣＤ３４−陽性細胞移植注入の脳梗塞に与える影響をみた結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１６には脳梗塞作成後２日目にＣＤ３４−陽性(ＣＤ３４−positive)細胞、ＣＤ３４−陰性(negative)細胞、ＰＢＳを静脈投与して３５日目の脳である。梗塞面積を算出するために設定した領域を右中断のＡとＢで示す。Ｂ／Ａはcortical area indexであり、脳梗塞の広さを示す。左下段はそれぞれの群の３５日目のcortical area indexを示している。
【図１７】図１７は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞をマウス脳梗塞後に静脈投与して、１４日目にマウス脳をヒトＣＤ３１に対する抗体で免疫組織化学を行った結果を示す図面に代わるカラー写真である。図１７の左側は血管内皮のマーカーのＣＤ３１の場合を示し、中側は血管内皮細胞の１種であるマーカーフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）抗体の場合であり、右側はこれらをマージしたものである。
【図１８】図１８は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植の血管再生に及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ３４陰性細胞、ＰＢＳを静脈内注入し、その２４時間後にカーボンブラック注入法にて脳灌流領域を観察すると同時に同じ脳スライスをＴＴＣ染色し、梗塞（ＴＴＣ染色されていない部分）と正常脳（ＴＴＣ染色部）の境界部の有効血管（カーボンブラックで灌流されている血管）数（angiographic score）を３群間で比較した結果を示すグラフと、それらの図面に代わるカラー写真である。左上と中央上ははＣＤ３４陽性細胞注入例とその拡大像で、下左、中央はそれぞれＣＤ３４陰性細胞、ＰＢＳ注入例である。右下グラフは脳１スライスあたりの平均有効血管数（angiographic score）を示す。
【図１９】図１９は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植の神経再生に及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＰＢＳ（ａ）、ＣＤ３４陰性細胞（ｂ）、ＣＤ３４陽性細胞（ｃ）を静脈内注入し、再生細胞をＢｒｄＵで標識し、脳梗塞作成後３５日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成し、ＢｒｄＵとＮｅｕＮに対する二重標識間接蛍光抗体法を行い、共焦点レーザー顕微鏡にて再生神経を同定した結果を示す図面に代わるカラー写真である。ａ，ｂ，ｃとも原写真で赤（白黒では黒い灰色）で示すのはＢｒｄＵ陽性細胞の核であり、原写真で緑（白黒では灰色）はＮｅｕＮ陽性の神経細胞核である。図１９ｃの原写真で黄色（白黒では灰色）に見えるのは赤とみどりが混合されてみえており、ＮｅｕＮ陽性の神経が同時にＢｒｄＵ陽性で再生したものであることを示す。グラフｄは３群における１脳切片あたりのＢｒｄＵ陽性／ＮｅｕＮ陽性細胞（再生神経細胞）の数を示す。グラフｅは３群における１脳切片あたりの全ＮｅｕＮ陽性細胞（再生神経細胞＋既存の神経細胞）の数を示す。
【図２０】図２０は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞移植のアポトーシスに及ぼす影響を検討する目的で、脳梗塞作成後４８時間後にＣＤ３４陰性細胞（ａ）、ＣＤ３４陽性細胞（ｂ）を静脈内注入した。脳梗塞作成後１４日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成し、ＴＵＮＥＬ（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling）法にてアポトーシス細胞を検討した結果を示す図面に代わるカラー写真である。図２０はＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４−）、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）注入マウスの脳梗塞周囲の大脳皮質におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞（アポトーシス細胞）を示し、右側のグラフは１切片あたりのアポトーシス細胞数を示す。
【図２１】図２１は、梗塞作成直後よりエンドスタチンを持続皮下注入し、コントロールとしてはＰＢＳを持続皮下注し、それを再生細胞をＢｒｄＵにて標識し、梗塞作成後４８時間目にＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４−）、ＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）を静脈内注入し、脳梗塞作成後７日目あるいは１４日目にマウスを灌流固定して脳切片を作成した結果を示すグラフである。ＢｒｄＵで標識された血管内皮細胞数（ＥＣｓ）（図２１ａ）、ＣＩ値（cortical width index）（図２１ｂ）、Ｓｍａｌｌ  ＮｅｕＮ細胞数（neuronal precursor cells；ＮＰＣｓ）（図２１ｃ）、及び大脳皮質における全神経細胞数（ＮｅｕＮ  positive cells）（図２１ｄ）を測定した結果をそれぞれ示している。黒のグラフは梗塞後１４日目のものであり、白抜きのグラフは７日目のものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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