(57)【要約】【課題】  安定した酵素との結合を持ち、酵素固定化量の減少による酵素活性の低下を起こすことなく、また、複雑な前処理を必要とせずに調製することができるバイオリアクター用担体およびこれを用いたバイオリアクターを提供する。【解決手段】  基体ＳＢと基体ＳＢを被覆する次の一般式、2005287354.tif 000005で表されるポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）とを有するバイオリアクター用担体、およびそのバイオリアクター用担体表面に存在するマレイミド部位に酵素Ｅが共有結合により固定化されているバイオリアクターである。【選択図】  図１
2005287354.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と該基体を被覆する次の一般式、
2005287354.tif 000004
で表されるポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）とを有することを特徴とするバイオリアクター用担体。
【請求項２】
前記基体表面と前記ポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）のマレイミド部位の一部が共有結合を介して結合している請求項１記載のバイオリアクター用担体。
【請求項３】
前記基体表面と前記ポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）がそれらのアフィニティおよび／または相溶性により結合している請求項１記載のバイオリアクター用担体。
【請求項４】
前記基体が合成樹脂である請求項１〜３のうちいずれか一項記載のバイオリアクター用担体。
【請求項５】
前記合成樹脂がポリスチレンビーズである請求項４記載のバイオリアクター用担体。
【請求項６】
前記基体がセラミックスである請求項１または２記載のバイオリアクター用担体。
【請求項７】
前記セラミックスがガラスビーズである請求項６記載のバイオリアクター用担体。
【請求項８】
請求項１〜７のうちいずれか一項記載の担体表面に存在するマレイミド部位に酵素が共有結合により固定化されていることを特徴とするバイオリアクター。
【請求項９】
前記酵素がＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物によりメルカプト基が導入されている酵素である請求項８記載のバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオリアクター用担体およびこれを用いたバイオリアクターに関し、詳しくは、酵素を容易かつ強固な結合により固定化することが可能であるバイオリアクター用担体およびこれを用いたバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオリアクターは１９７０年代から酵素の固定化（不溶化）技術により、アミノ酸、有機酸、異性化糖の製造のみならず、外国においてはビールの製造にも広く用いられてきており、現在は一部医薬品の製造までその応用分野は広がっている。
【０００３】
従来の酵素固定化法には、ポリアクリルアミドゲル、多糖などを利用した包括法、ジアゾ化法などの担体結合法、グルタルアルデヒド法などの架橋法などがある。しかし、包括法は酵素がゲルなどの包括物質の網目から抜け出し、時間と共に酵素実質固定化量が減少することにより、固定化酵素ゲルの活性が低下することは避けられない。このことは、高価な酵素に対して用いるのに不向きであるといえる。また、包括法は樹脂や無機材料などの担体上への固定が極めて難しいという問題もある。
【０００４】
一方、ジアゾ化法、グルタルアルデヒド法などに代表されるこれまでの担体結合法や架橋法では、担体の表面処理によりアミノ基を導入するなどの複雑な前処理が必要となる。また、酵素を固定化している結合は共有結合ではあるが、グルタルアルデヒド法においては加水分解が生じることがある。更に、酵素反応を効率良く行うため反応温度をある程度上昇させることがあるが、上記共有結合は光や熱などにより切断を受け易い結合であり、更にまた、アゾ結合の場合、ラジカル発生を行わせる外的要因に極めて弱いという問題を有している。このため、これまでの担体結合法や架橋法では時間と共に酵素固定化量が低下することは避けられなかった。
【０００５】
特に、グルタルアルデヒド法は、酵素上の１級アミノ基との反応によって生成するアゾメチン結合を介して酵素を固定化するため、反応を水溶液中で行う酵素反応において加水分解による結合の切断は避けることができなかった。そのため、この方法は、高価な酵素に対して用いるのには不向きである。また、この方法は、担体表面にシリルアミノ化などでアミノ基などを反応により導入できる官能基（水酸基など）の存在が不可欠である。従って、ポリスチレン（ＰＳ）などの汎用樹脂上に、官能基を導入する極めて煩雑な前処理（スルホン化、ニトロ化、アミノ化など）なしに酵素を固定化することはできなかった。因に、汎用樹脂であるポリスチレンに酵素や微生物を固定するバイオリアクターはこれまでに数多く提案されている（特許文献１〜９参照）。
【特許文献１】特開２０００−３５４４８６号公報
【特許文献２】特開平１１−１６４６８２号公報
【特許文献３】特開平１１−７５８２２号公報
【特許文献４】特開平８−２２４０７６号公報
【特許文献５】特開平６−３１９５１５号公報
【特許文献６】特表２００２−５３５９８１号公報
【特許文献７】特表２００２−５２２０７２号公報
【特許文献８】特表平８−５０３３７５号公報
【特許文献９】再表０１／７０３０２号公報
【０００６】
さらに、これまでの担体結合法や架橋法は、酵素等のアミノ基を利用する反応が主であり、酵素等の表面に存在するメルカプト基などの他の官能基は殆ど利用されておらず、この点からしても安定な結合を得るのは容易ではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで本発明の目的は、安定した酵素との結合を持ち、酵素固定化量の減少による酵素活性の低下を起こすことなく、また、複雑な前処理を必要とせずに調製することができるバイオリアクター用担体およびこれを用いたバイオリアクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記に鑑み鋭意検討を行った結果、ポリスチレン骨格にマレイミド部位を密にペンダントした構造を有するポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）は共有結合を介して、または、主鎖と担体とのアフィニティおよび／または相溶性により容易に基体を被覆し、更に該マレイミド部位は容易に酵素を固定化してバイオリアクターとして機能し、その結果、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明のバイオリアクター用担体は、基体と該基体を被覆する次の一般式、
2005287354.tif 000003
で表されるポリ（Ｎ−ビニルフェニルマレイミド）（以下「ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）」と略記する）とを有することを特徴とするものである。
【００１０】
また、本発明は、上記担体表面に存在するマレイミド部位に酵素が共有結合により固定化されていることを特徴とするバイオリアクターである。
【００１１】
主鎖にスチレン骨格を有するポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は、合成樹脂、特にはポリスチレン（以下「ＰＳ」と略記する）の基体とのアフィニティおよび／または相溶性に優れ、容易かつ強固に基体表面を被覆でき、また、無機材料の基体、例えば、ガラスビーズ上にもポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位の一部が基体表面と共有結合することにより容易かつ強固に基体表面を被覆できる。また、担体の表面に存在するポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位に、特殊な操作をすることなく、例えば、単に浸漬するだけで酵素を固定化することができる。この固定化は、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位に、酵素表面に存在するメルカプト基やアミノ基が、酵素活性を失うことなく非加水分解性共有結合することにより行われる。
【００１２】
ここで、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）の代わりに低分子であるマレイミドやエチルマレイミドを使用した場合、酵素表面のメルカプト基やアミノ基のみならず、酵素活性中心に存在するメルカプト基やアミノ基にまで反応してしまい、酵素を失活させてしまうことになる。しかし、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は高分子であることから、ペンダント化したマレイミド部位が、いわゆる鍵穴にある酵素活性中心とは立体障害等のために反応できず、酵素を失活させることなく酵素を非加水分解性の共有結合にて固定化できる。
【００１３】
ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は水に不溶であるが、酵素水溶液と接触させるだけでポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）に酵素を固定化することができる。これは、マレイミド部位がポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）単独またはポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）とアフィニティを有する樹脂とのブレンド樹脂では、その親水性故、高分子（樹脂）内部より表面に多く存在するためである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のバイオリアクター用担体においては、安定した酵素との結合を持ち、酵素固定化量の減少による酵素活性の低下を起こすことなく、また、複雑な前処理を必要とせずに調製することができる。よって、このバイオリアクター用担体を用いれば、従来にない簡便で安価な方法により酵素を固定化できる。また、固定化手法が極めて単純であるため、不安定な酵素でも使用することができる。このため、多種多様なバイオリアクターを製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明において、基体を被覆するために使用するポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は、市販のＮ−（４−ビニルフェニル）マレイミドをモノマーとして用い、Macromolecules,1991,24,6856に記載の方法に従い合成することができ、その重合度（ｎ）は好ましくは１０〜５０程度である。Ｎ−（４−ビニルフェニル）マレイミドは、本来、スチレン部位のビニル基およびマレイミド部位のビニレンの二箇所の部位において重合が可能である。しかし、本発明に係るポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）への酵素の固定化は、図１に模式的に示すように、基体ＳＢを被覆するポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位に酵素Ｅを結合させることにより行うため、スチレン部位のビニル基を重合させる必要がある。
【００１６】
このため、本発明に係るポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を得るには、上記論文に記載さているようにカチオン重合を行わなければならない。この際、開始剤としてＢＦ3・Ｏ（Ｃ2Ｈ5）2等を好適に使用することができる。なお、ラジカル重合ではマレイミド部位とスチレン部位の両方で重合が起き、アニオン重合ではマレイミド部位のみにて重合が起こるため、本発明に係るポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を得るための重合反応としては不適当である。
【００１７】
基体は、合成樹脂でも無機材料でもよいが、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は主鎖にスチレン骨格を有するため、ポリスチレン（ＰＳ）基体とのアフィニティに特に優れており、容易かつ強固に基体表面を被覆できる。また、無機材料の基体、例えば、ガラスビーズの基体でも、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位の一部が基体表面と共有結合することにより容易かつ強固に基体表面を被覆できる。
【００１８】
ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を用いて基体表面を被覆するにあたり、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）とのアフィニティの高い基体を用いる場合、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）の溶解した有機溶媒へ基体を浸漬し、次いで引き上げ、乾燥することにより容易にポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を基体表面に被覆することができる。その際、使用する有機溶媒には基体が完全に溶解しないものを用い、必要に応じ貧溶媒を用いる。有機溶媒は、使用する基体により適宜選択することとなるが、アセトン、クロロホルムを好適に使用することができる。また、ジビニルベンゼンにより架橋ゲル化したＰＳビーズは、ＰＳが有機溶媒に溶解することがないので好ましい。
【００１９】
また、本質的にポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）とはアフィニティを持たない無機材料のセラミックス、例えば、ガラスビーズに対しポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を被覆する場合、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の溶液にガラスビーズを浸漬し、ガラスビーズ表面の水酸基をアミノ基に変換する。次いで、そのガラスビーズをポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）溶液に浸漬することにより、一部のマレイミド基とアミノ基とが反応し、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被膜されたガラスビーズを得ることができる。この方法は、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）に対し、相溶性および／またはアフィニティを持たない有機材料（樹脂）にも適用できる。
【００２０】
次に、上述のようにして得られたバイオリアクター用担体表面のポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のマレイミド部位に酵素を非加水分解性の共有結合により固定化し、本発明のバイオリアクターを製造する方法について具体的に説明する。尚、本発明において使用し得る酵素は特に制限されるべきものではない。
【００２１】
本発明において酵素の固定化は、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）において密にペンダント化したマレイミド部位と酵素の有する官能基との自発的反応に基づくものであり、特殊な操作なしに、単に浸漬処理のみで固定化することができる。また、酵素表面に１級アミノ基が存在する場合、チオール化剤であるＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物をそのアミノ基と反応させ、メルカプト基を導入した酵素もポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）と固定化させる酵素として好適に使用することができる。  
【００２２】
上述のように、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）はＰＳ骨格を有し、アミノ基やメルカプト基と短時間で反応するマレイミド基を密にペンダント化した構造を有しているため、加水分解、ｐＨ変化、光、熱、力学的応力に安定なＣ−Ｓ結合およびＣ−Ｎ結合により酵素を固定化することができる。そのため、使用する度に固定化試薬と酵素、担体との反応を行わなくてよい。また、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆された本発明の担体は、酸素水溶液にただ数分間浸すだけで、容易に酵素をＣ−Ｓ結合およびＣ−Ｎ結合により担体に固定化することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるのものではない。
ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）の合成例
Ｎ−（４−ビニルフェニル）マレイミド（Ｎ−ＶＰＭＩ）の市販品（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ社製、ベルギー国）を精製し、０．５ｇをジクロロメタン９ｍＬに溶解させ、０℃に冷却し、そこにカチオン重合の開始剤である０．１ＭのＢＦ3・Ｏ（Ｃ2Ｈ5）2のジクロロメタン溶液１ｍＬを加え、０℃にて６時間反応を行った。次に、メタノールにより析出させ、メタノールにより三回洗浄を行い、減圧下にて乾燥させ、Ｎ−ＶＰＭＩのスチレン部位のビニル基により重合されたポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）を得た（重合度ｎ＝２０）。得られたポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）は僅かに黄色い粉体であり、収量０．１１ｇ（収率２２％）であった。得られたポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびピリジンに可溶であり、エーテル、アルコールおよび炭化水素には不溶である。得られた化合物を1Ｈ−ＮＭＲにて構造確認した結果、原料のＮ−ＶＰＭＩには確認されていた５．３、５．８、６．７ｐｐｍのスチレン部位のビニル基に由来するプロトンのシグナルが消失しており、代わりに１．３〜２．４ｐｐｍにポリスチレン主鎖に帰属される新しいシグナルが確認され、また、水素原子の割合も一致しており、マレイミド部位で重合が起こっていないことが確認された。
【００２４】
実施例１
ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの調製
先ず、市販のＰＳビーズ（２００−４００メッシュ  １％ジビニルベンゼン架橋）２．０ｇをアセトン（単蒸留）３０ｍＬ中に加え１時間撹拌後、そこにポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）０．０４ｇを添加し、更に２時間撹拌した。上澄み液を分光分析することによりアセトン溶液中のポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）の減少量を測定した。次に、ＰＳビーズをメタノール３００ｍＬ中に投入し、１時間撹拌後、ろ過にてビーズを取り出し、風乾し、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズを調製した。ＰＳビーズ表面はポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆することにより無色から淡黄色に変化した。
【００２５】
ＰＳビーズの数平均粒径（５．２×１０μｍ、ＳＥＭによる）、比重（０．９９）および分光分析により得られたポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）減少量からポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のＰＳビーズへの被覆量を求めた。ＰＳビーズ１ｇあたりポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）６．０×１０-2ｍｇつまりマレイミド基３．０×１０-4ｍｍｏｌであり、ＰＳビーズ１μｍ2あたりポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）９．２×１０-10ｍｇつまりマレイミド基４．６×１０-11ｍｍｏｌであった。
【００２６】
実施例２
ウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによる尿素の加水分解
実施例１で調製したポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ０．１ｇを透析精製したウレアーゼ１０ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬ中に加え撹拌下３０分浸漬し、その後、ｐＨ７．１の０．１Ｍリン酸緩衝液により５回、さらに超音波照射により５回洗浄し、ウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズを調製した。
【００２７】
尿素を基質とし、調製したウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズに固定化されたウレアーゼの酵素活性の測定を１８℃でアンモニア電極を用いて電気化学的応答により行った。０．１Ｍ尿素リン酸緩衝溶液に０．１ｇのウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズを加えた場合のアンモニア電極の応答曲線を図２に示す。図２よりウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの固定化されたウレアーゼにより尿素がアンモニアに変化する応答が観測され、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズはその活性を保持したまま酵素を固定化しており、バイオリアクターとして機能していることが確認された。
【００２８】
実施例３
フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによるフマル酸の生成
フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズにつき、Ｌ−リンゴ酸の製造のためのバイオリアクターとしての利用可能性の検討を行った。フマラーゼによるフマル酸からＬ−リンゴ酸への変換が可逆反応であることに注目し、反応の追跡および分析が容易なフマラーゼによるフマル酸からＬ−リンゴ酸への逆反応を用いて、フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの活性を評価した。
【００２９】
ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ１０ｍｇを透析精製したフマラーゼ１０ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬ中に加え撹拌下３０分浸漬し、その後、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液により５回、さらに超音波照射により５回洗浄し、フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズを調製した。
【００３０】
次に、得られたビーズ１ｍｇを０．０５ＭのＬ−リンゴ酸を含むｐＨ７．０の０．０５Ｍリン酸緩衝液３ｍＬ中に入れ、１８℃で撹拌を行いながら２５０ｎｍの吸光度の経時的変化を測定した。別途２５０ｎｍでの吸光度−フマル酸濃度の検量線を作成し、生成したフマル酸量を求めた。図３にフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによる０．０５ＭのＬ−リンゴ酸からフマル酸への反応における、フマル酸の生成の時間変化を示す。図３の曲線の初期の傾きからフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの活性を求めると１２ｕｎｉｔ／ｇであった。これより、フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズは固定化したフマラーゼによる反応により、Ｌ−リンゴ酸からフマル酸を生成する機能を有していることが確認された。
【００３１】
また、フマラ−ゼの固定化による活性の変化の有無を調べるため、固定化していないフマラーゼ０．０３ｍｇでフマル酸からＬ−リンゴ酸の生成反応の逆反応について、固定化フマラーゼと同じ条件である０．０５ＭのＬ−リンゴ酸を含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液３ｍＬを用いて同様の操作を行った。その結果を図４に示す。
【００３２】
図３と４を比較するとフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被膜ＰＳビーズは反応に作用する実質フマラーゼ量が異なるため見かけの活性は小さいように見えるが、固定化基体であるビーズの重量を考慮すれば十分に高い活性を有していることがわかる。また、平衡に達するリンゴ酸−フマル酸濃度がフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被膜ＰＳビーズは反応に作用する実質フマラーゼ量が異なるため見かけの活性は小さいように見えるが、固定化基体であるビーズの重量を考慮すれば十分に高い活性を有していることが分かる。また平衡に達するリンゴ酸−フマル酸濃度がフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズとフマラーゼ自身とで変わらないことが観測され、フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズにおいて固定化されたフマラーゼが変性を受けていないことが分かる。Ｌ−リンゴ酸の製造はここでフマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの活性評価に用いた反応の逆反応であり、固定化されたフマラーゼが変性を受けていないことなどから、固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズはＬ−リンゴ酸の製造のためのバイオリアクターとして利用できると考えられる。
【００３３】
実施例４
グルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによるグルコースの酸化
グルコースオキシターゼは卵白から乾燥卵白を製造するために用いられる酵素である。ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ１０ｍｇを透析精製したグルコースオキシターゼ１０ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬ中に加え撹拌下３０分浸漬し、その後、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液により５回、さらに超音波照射により５回洗浄し、グルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズを調製した。
【００３４】
グルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズの活性を、２０℃で基質であるグルコースの酸化において発生する過酸化水素の電解酸化電流を検知する電気化学的方法によって評価した。図５にｐＨ７．０リン酸緩衝液中でグルコース濃度を変化させた場合のグルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ１０ｍｇ、白金電極＋０．７Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）におけるグルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによるグルコース酸化において発生する過酸化水素の電解酸化電流の応答曲線を示す。その結果、グルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズにより、グルコースが酸化され過酸化水素に変化する応答が観測され、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズは酵素活性を保持したまま酵素を安定に固定化しており、バイオリアクターとして機能していることが確認された。
【００３５】
実施例５
グルコースイソメラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズによるグルコースのフルクトースへの異性化
先ず、０．１ｇのポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）が溶解しているクロロホルム溶液５ｍＬに市販のアミノプロピル基を導入したガラスビーズ１２０ｍｇを入れ室温で３０分間撹拌の後、ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）のペンダントマレイミド基の一部とガラス表面のアミノ基が反応してポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）にて被覆された得られたガラスビーズをろ過にて取り出し乾燥した。次に、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物を用いて酵素表面にメルカプト基を導入、透析精製したグルコースイソメラーゼ１０ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬ中に得られたポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズ１００ｍｇを加え、撹拌下３０分浸漬し、その後ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液にて５回洗浄することにより、グルコースイソメラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズを調製した。
【００３６】
次に、Ｍｇ2+を添加した１．０ｍＭグルコース１０ｍＬへグルコースイソメラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズ１００ｍｇを加え、異性化によって生じるフルクトースおよび基質のグルコースを液体クロマトグラフィによって定量することによりグルコースイソメラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズの活性を評価した。その結果、グルコースイソメラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ガラスビーズは２２℃１５分間でグルコースの１３％をフルクトースに異性化させており、バイオリアクターとして機能していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、食品関連工業にて従来行なわれてきた異性化糖の製造、アミノ酸の製造の他、リンゴ酸などの天然有機酸の安価な生産が可能となる。また、酵素の固定化法が酵素溶液に数分間担体を浸漬するだけで行えるという、極めて簡単な操作である。また、その固定化が安定な非加水分解性共有結合で行なえる。それゆえ、今まで固定化対象とならなかった高価な酵素を簡便に固定化することや不安定な酵素を固定化でき、医薬品関連品の製造に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）への酵素の固定化の模式図である。
【図２】ウレアーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ０．１ｇ存在下でのｐＨ７．１のリン酸緩衝液中における尿素添加に対するアンモニア電極の応答曲線を示すグラフである。
【図３】フマラーゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズ１ｍｇを０．０５ＭのＬ−リンゴ酸を含むｐＨ７．０である０．０５Ｍリン酸緩衝液３ｍＬ中に加えた時のフマル酸生成量の時間変化を示すグラフである。
【図４】フマラーゼ０．０３ｍｇを０．０５ＭのＬ−リンゴ酸を含むｐＨ７．０である０．０５Ｍリン酸緩衝液３ｍＬ中に加えた時のフマル酸生成量の時間変化を示すグラフである。
【図５】ｐＨ７．０のリン酸緩衝液中の各グルコース濃度に対するグルコースオキシターゼ固定化ポリ（Ｎ−ＶＰＭＩ）被覆ＰＳビーズによるグルコースの酸化における発生過酸化水素の電解酸化電流応答曲線を示すグラフである。
【符号の説明】
【００３９】
ＳＢ  基体
Ｅ  酵素
【図１】
2005287354.tif 000006
【図２】
2005287354.tif 000007
【図３】
2005287354.tif 000008
【図４】
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【図５】
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