(57)【要約】【課題】微生物により製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するような方法、即ち、培養後の液体培地からの薬物代謝体の高い回収率を与える方法等が求められていた。【解決手段】液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体の選択方法であって、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体の選択方法であって、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択することを特徴とする方法。
【請求項２】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物であって請求項１記載の方法により選択された基質である薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法。
【請求項５】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体であって請求項１記載の方法により選択された薬物代謝体を培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法。
【請求項６】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地のｐＨの選択方法であって、前記薬物代謝酵素の基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲を選択することを特徴とする方法。
【請求項７】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを、請求項６記載の方法により選択されたｐＨ範囲を有する前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法。
【請求項１０】
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを、請求項６記載の方法により選択されたｐＨ範囲を有する前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法。
【請求項１１】
液体培地が唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物が哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする請求項１、４、５、６、９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
液体培地が唯一の炭素源としてグルコースを含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする請求項１、４、５、６、９又は１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体の選択方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物は、生体内に取り込まれた薬物を異物として認識し、極性を高めて体外に排泄するシステムを持っており、当該システムを薬物代謝と呼ぶことがある。薬物代謝において中心的な役割を担っているのが、例えば、チトクロームＰ４５０と呼ばれる一群の酸化還元酵素であり、薬物（特に医薬化合物）の薬理効果や毒性を決定する重要な因子の一つとして位置づけられている。
そのため、薬物の代謝に関わるチトクロームＰ４５０分子種の特定、またチトクロームＰ４５０の作用により産生した薬物代謝体の同定及び当該薬物代謝体の特性評価は、医薬用化合物の開発段階において必須となっている。
液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物は、上記のような開発研究において非常に有用で、特に薬物代謝体の大量製造に有効な手段であると考えられており、そのため、当該微生物の培養液からの薬物代謝体を抽出し、さらに回収する操作について種々の検討がすでに開始されている（非特許文献１参照。）。
【０００３】
【非特許文献１】
「生物化学工学」、海野肇、中西一弘、白神直弘共著、講談社サイエンティフィック発行、第１６０頁〜第１６６頁、「７．１  バイオプロダクトの分離に関する特性」
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、基質である薬物の種類によって培養後の液体培地からの薬物代謝体の回収率が異なり、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するような方法、即ち、培養後の液体培地からの薬物代謝体の高い回収率を与える方法等が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までの範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択することにより、培養後の液体培地からの薬物代謝体の回収率が高くなることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体の選択方法であって、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする前項１記載の方法；
４．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物であって前項１記載の方法により選択された基質である薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）；
５．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体であって前項１記載の方法により選択された薬物代謝体を培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法；
６．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物により当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地のｐＨの選択方法であって、前記薬物代謝酵素の基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲を選択することを特徴とする方法；
７．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする前項６記載の方法；
８．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物が、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする前項６記載の方法；
９．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを、請求項６記載の方法により選択されたｐＨ範囲を有する前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法；
１０．液体培地中で薬物代謝能力を有する微生物と、当該薬物代謝酵素の基質である薬物と成り得る被験薬物とを、前項６記載の方法により選択されたｐＨ範囲を有する前記微生物の培養条件下で接触させながら、前記微生物を培養する工程、及び、前記培養工程で製造された薬物代謝体を液体培地中から回収する工程を有することを特徴とする薬物代謝体の取得方法；
１１．液体培地が唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物が哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物であることを特徴とする前項１、４、５、６、９又は１０記載の方法；
１２．液体培地が唯一の炭素源としてグルコースを含有する液体培地であり、薬物代謝能力を有する微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母であることを特徴とする前項１、４、５、６、９又は１０記載の方法；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明製造方法において、薬物代謝能力を有する微生物（以下、本微生物と記すこともある。）とは、例えば、哺乳動物由来の薬物代謝酵素を産生する微生物等を意味し、具体的には、例えば、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母等をあげることができる。尚、ヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母において、２種以上のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を組み合せて使用するには、たとえば、ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種への存在量に相当する割合で、本発明で用いられるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をおのおの単独または混合した状態で組み合せて使用すればよい。なお、この組み合せ割合を適宜変えることにより、ヒトにおける人種差、個人差に対応することもできる。ここで、「おのおの単独または混合した状態」とは、上記の２種以上の分子種をおのおの別々の反応系で並列的に存在させる状態または上記の２種以上の分子種を混合し、１つの反応系で同時に存在させる状態を意味する。
【０００７】
人為的に作製される本微生物は、突然変異処理により作製される微生物であってもよいし、遺伝子工学的な手法を用いて作製させる微生物（以下、本形質転換体と記すこともある。）であってもよい。尚、本形質転換体を作製する際に用いられる薬物代謝酵素（以下、本酵素と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。
【０００８】
本遺伝子は、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
例えば、薬物代謝能力を有する（例えば、哺乳動物由来の）細胞等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
【０００９】
本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素（以下、本補酵素再生酵素遺伝子と記すこともある。）は、例えば、本補酵素再生酵素遺伝子が本酵素とは異なる酵素である場合には、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
本酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する（例えば、哺乳動物由来の）細胞又は微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、本補酵素再生酵素のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅して本補酵素再生酵素遺伝子を調製する。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃（０．２５分間）‐５０℃（０．５分間）‐７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃（０．２５分間）‐５５℃（０．５分間）‐７２℃（２．５分間）のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，  Ｆｒｉｓｃｈ  Ｅ．  Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  （東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本補酵素再生酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。具体的には、たとえば、特開昭６２−１９０８５号公報に記載される方法等により単離することができる。
【００１０】
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、（１）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子が宿主微生物中で発現できるような単一な組換プラスミドを作製し、これを宿主微生物に導入することにより作製する方法、（２）本遺伝子と本補酵素再生酵素遺伝子との両遺伝子のうちの一方の遺伝子及び宿主微生物で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような遺伝子のうちの一方の遺伝子が宿主微生物中で発現できるような組換プラスミドを上記遺伝子毎に別々に作製し、これらを宿主微生物に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子又は両遺伝子を宿主微生物の染色体中に導入する方法も利用することができる。
尚、上記単一な組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより作製する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミドを構築する方法等をあげることができる。
ここで上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主微生物中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主微生物からの単離・精製が容易であり、宿主微生物中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主微生物に導入することにより宿主微生物を形質転換させた際に、本還元遺伝子等が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素及び／又は本補酵素再生酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ．ら（Ｃｅｌｌ  ２０，  ｐ５４３）や谷口ら（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ｐ２０２，  講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主微生物としては、例えば、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）もしくは真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）である微生物等を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌、酵母等を好ましく挙げることができる。
本酵素及び／又は本補酵素再生酵素が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドを宿主微生物に導入する方法としては、用いられる宿主微生物に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される塩化カルシウム法や、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ／Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  （１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法、プロトプラスミド法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等をあげることができる。
宿主微生物において本遺伝子及び／又は本補酵素再生酵素遺伝子が宿主微生物中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主微生物（即ち、形質転換体）が本遺伝子及び本補酵素再生酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００１１】
このような形質転換体がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、用いられるヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種としては、例えば、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｂ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｃ１８、Ｐ４５０  ２Ｃ１９、Ｐ４５０２Ｄ６、Ｐ４５０２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４等をあげることができる。ヒト肝臓における各種チトクロムＰ４５０分子種の存在量は人種差、個人差があるが、しかしながらいずれのヒトの場合においても、上記の１０種類のチトクロムＰ４５０分子種を用いることにより、ほとんどすべての場合を網羅することがてきる。さらに上記の１１種類のチトクロムＰ４５０分子種のうち、Ｐ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  ２Ｃ８、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が重要であり、その中でもＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｅ１およびＰ４５０  ３Ａ４が特に重要である。
【００１２】
上記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列は、例えば、特開平０８−５６６９５号公報等に開示されている。なお、これらのヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡは、たとえば、（１）（ａ）該遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分を調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製後、該ｃＤＮＡをファージベクター及びプラスミドベクターに挿入して得たｃＤＮＡライブラリー、または（ｂ）  市販のヒト肝由来のｃＤＮＡライブラリー、から目的とする遺伝子を、（ｉ）  その遺伝子と相同性を有するＤＮＡ断片や、（ｉｉ）その遺伝子により産生されるタンパク質を認識する抗体、を用いるような通常の方法に従いクローニングする方法、あるいは（２）  上記（１）  記載のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ  法を用いてクローニングする方法、等の通常の方法により調製することができる。
【００１３】
前記形質転換体において利用される酵母内で発現させるためのプロモーターとしては、通常の酵母発現系において用いられるプロモーターであれば特に制限されるものではないが、たとえば酵母アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（以下、ＡＤＨプロモーターと記す。）、グリセルアルデヒド−３リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨプロモーターと記す。）、フォスフォグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫプロモーターと記す。）等をあげることができる。なお、ＡＤＨプロモーターは、たとえば酵母ＡＤＨ１プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）から通常の遺伝子操作方法により調製することができる。
【００１４】
上記の酵母内で発現させるためのプロモーターおよび前記のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む酵母内発現プラスミドは通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを特開平２−２１１８８０等に記載されるＡＤＨプロモーターとＡＤＨターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５ＮのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  部位に挿入することにより構築する方法等をあげることができる。また必要に応じてｐＡＡＨ５ＮベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位を別な制限酵素用の部位に交換したベクターを利用して構築する方法もあげられる。
【００１５】
上記の酵母内発現プラスミドが酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む場合も通常の遺伝子組み換え方法を用いて構築することができる。たとえば、特開平２−２１１８０  等に記載されるＡＤＨプロモーターとターミネーターを保有する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片を特開平２−２１１８８０等に記載される酵母還元酵素遺伝子を保有するプラスミドｐＡＲＲＮのＮｏｔＩ部位に挿入し、得られたプラスミドｐＡＨＲＲのＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位にヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを挿入することにより構築する方法等をあげることができる。こうして得られた酵母内発現プラスミドが導入された酵母においては大量に発現した酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素によりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種への電子伝達効率が上昇し、より高い代謝活性が検出される。このために大量の代謝産物が短時間で得られ、精密な分析が可能になる。また、ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のキメラ人工融合酵素を用いても同様の効果が得られる。
【００１６】
酵母内でヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる酵母菌体は、構築された酵母内発現プラスミドを、たとえば、プロトプラスト法、アルカリ金属（ＬｉＣｌ）法等の通常の方法によって酵母に導入することで得ることができる。
前記形質転換体において利用される酵母菌株としては、たとえばサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等をあげることができる。好ましくはサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株（ＡＴＣＣ３８６２６）があげられる。
【００１７】
つぎに、このようにして作製された、薬物代謝能力を有する微生物が液体培地中で、前記微生物（即ち、本微生物）と当該薬物代謝酵素の基質から薬物代謝体を製造し、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するには、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないようにすることが重要である。
【００１８】
ここで、「薬物代謝体」とは、本微生物の生育にリンクしない生産物（ｎｏｎ−ｇｒｏｗｔｈ  ｌｉｋｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）であって、本微生物が産生する（例えば、哺乳動物由来の）薬物代謝酵素の基質と成り得る被験薬物を当該薬物代謝酵素に基づく異化作用により分解して得られる化合物を意味し、具体的には、例えば、本微生物がヒト由来のチトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、ヒト由来のチトクロムＰ４５０の基質である薬物となる各種の脂溶性化合物を当該チトクロムＰ４５０に基づく酸化添加等の異化作用（即ち、モノオキシゲナーゼ反応）により分解して得られる化合物等をあげることができる。
【００１９】
本微生物の培養は、基本的には、微生物の培養において通常使用される方法によって行うことができる。好ましくは、本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地を用いることがよい。例えば大腸菌の場合、前記の炭素源、適当な窒素源、有機塩、無機塩およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００２０】
「本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地」とは、その微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）が非常に高い炭素源を含有する液体培地を意味し、好ましくは、炭素源資化定数が小さくなるような（例えば、約５０ｍｇ／ｍｌ程度以下の値であるような）炭素源を含有する液体培地であることがよい。ここで「炭素源資化定数」とは、通常ミカエリス定数と呼ばれ、比増殖速度μ（ｈｒ）がその最大値（μｍａｘ）の１／２を示す炭素源濃度に等しい値を意味し、この値はその微生物とその炭素源とのアフィニティ（親和性）を表す指標となるものである。代表的な炭素源資化定数として、例えば、本微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母のグルコースに対する炭素源資化定数は約２５ｍｇ／ｌであり、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の細菌のグルコースに対する炭素源資化定数は約６．８×１０−２ｍｇ／ｌである。
好ましくは、本微生物が容易に資化する炭素源を含有する液体培地は、唯一の炭素源として炭素数６個である単糖を含有する液体培地であり、かつ、液体培地中に含有される炭素源の初発濃度が、薬物代謝能力を有する微生物による微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量であること等をあげることができる。
ここで「炭素数６個である単糖」としては、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等があげられる。また「微生物菌体量の対糖収率の低下を発生させない量」とは、微生物菌体収率が低下する現象（即ち、クラブとリー効果（Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ｅｆｆｅｃｔ））が発生させない量を意味する。例えば、微生物の培養において、炭素源濃度が高くなりすぎると、溶存酸素（ＤＯ）が充分に存在しても、当該炭素源から生育に不必要な生体物質や増殖阻害等を起こすような物質を副生した結果、生育に必要な生体物質を生成する量が減少するために、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。より具体的には、微生物が酵母の場合には、糖濃度が高くなりすぎると、当該糖からエチルアルコールが生成し、それだけ菌体収率が低下する現象が発生する。また大腸菌等の細菌の場合には、糖濃度が高いと、当該糖から酢酸、乳酸、蟻酸等の有機酸を副生し、増殖阻害を起こしたり代謝活性に悪影響を与える現象が発生する。
因みに、本微生物が容易に資化する炭素源の培地への添加量としては、例えば、培養液に対して約０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度、好ましくは約１〜２０％（ｗ／ｖ）程度、より好ましくは約５〜１０％（ｗ／ｖ）程度、をあげることができる。
【００２１】
培養温度は、本微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。液体培地のｐＨついては、薬物代謝酵素の基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように選択したり、薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中、制御・モニターすることが好ましい。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用されることもあるが、本発明では便宜上炭素源としては取り扱わない。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００２２】
薬物代謝体の製造は、例えば、本微生物を含む液体培地に被験薬物を添加する操作、又は被験薬物を含む液体培地に本微生物を添加する操作等により開始される。なお、本微生物の液体培地中の存在量および被験薬物の添加量は、反応温度、反応時間、被験薬物の種類等の各種条件によって異なるが、たとえば、本微生物がヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母の場合には、溶液１ｍｌあたり約１０１０〜約１０１５程度のチトクロムＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液１ｍｌあたり約１０５  〜約１０１０程度の菌体数）、好ましくは溶液１ｍｌあたり約１０１２〜約１０１３のチトクロムＰ４５０分子数（酵母菌体として溶液あたり約１０７  〜約１０８  の菌体数）であり、被験薬物の添加量としては、例えば、溶液１ｍｌあたり約０．０１μｍｏｌ  〜約１０μｍｏｌ  程度の範囲を望ましいものとしてあげることができる。なお、上記の範囲にかかることなく適宜増加させたり、減少させることができることは言うまでもない。
【００２３】
尚、培養中、液体培地中に存在する薬物代謝体を分析する方法は、監修  塩川二郎ら機器分析のてびき（２）  （増補改訂版）第１刷，化学同人発行（１９８５年）、Ｒ．  Ｍ．  ＳＩＬＶＥＲＳＴＥＩＮ  ら，有機化合物のスペクトルによる同定法  第４版    第３刷，東京化学同人発行（１９８４年）等に記載される通常の分析方法を用いることができる。
【００２４】
このようにして製造された薬物代謝体を液体培地中から回収することにより、薬物代謝体を取得すればよい。
液体培地中から薬物代謝体を回収するには、触媒として微生物を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の回収方法により目的物を採取すればよい。例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒及びそれらの混合物で抽出する。必要に応じて反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去した後に前記抽出操作を行なえばよい。次に抽出された有機層を乾燥した後、濃縮物として目的物を回収することができる。目的物は、必要によりカラムクロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【００２５】
上述のような薬物代謝体の取得方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するには、前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までの範囲において、基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択すればよく、これが本発明の重要な特徴の一つである。
また、上述のような薬物代謝体の取得方法において前記薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地のｐＨを選択するには、前記薬物代謝酵素の基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲を選択すればよく、これも本発明の重要な特徴の一つである。
【００２６】
本発明における「水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）」とは、例えば、技術情報協会，  “分配係数”  構造決定および物性の測定・解析と規格試験法設定，  技術情報協会，  ｐｐ．１３０−１４２  （２００１）  等に記載されているような、水とオクタノールとの溶媒混合物に少量の薬物又は薬物代謝体が溶け込んで、その薬物又は薬物代謝体について分配平衡が成立しているときの、両溶媒中の薬物又は薬物代謝体の組成の比等であって、化合物の中性形とイオン形との混合物の、一定のｐＨにおける水とオクタノールとの両溶媒への分配係数の対数を意味し、一般にｌｏｇＤとして表されるものである。この値は生体膜と水溶液系との間の化合物の、種々のｐＨにおける分配状態を示す尺度としてしばしば利用されている。
当該水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を測定・算出するには、例えば、上記技術文献等に記載されているような、直接測定方法、間接測定方法、計算化学による算出方法等をあげることができるが、各方法の特徴を考慮し、目的や状況に応じて適宜適切な方法を選択すればよい。
例えば、実験上で薬物の挙動を予想する場合には、みかけの分配係数が重要なパラメータとなり、分配係数を実測する必要なく簡便な測定・算出方法が適しているために、計算化学による算出方法を好ましいものとしてあげることができる。
具体的には、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＡＣＤ）社製の化学計算ソフトウェアであるＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｂａｔｃｈ等を使用する算出方法があげられる。当該算出方法に用いられるアルゴリズムに関する情報はＡＣＤ社のＷｅｂサイト（ｗｗｗ．ａｃｄｌａｂｓ．ｃｏｍ）で確認することができる。尚、当該算出方法により計算されたｌｏｇＤは、ＣＡＳのＲＥＧＩＳＴＲＹファイルにすでに収録されており、これを利用してもよい。
【００２７】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ）
市販のヒト肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用プライマーを用いるＰＣＲ法およびヒト由来チトクロムＰ４５０遺伝子クローニング用合成リンカー等を用いることによりヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡを得た。
【００２９】
実施例２  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ９、ｐ２Ｃ９Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子のタンパク質コーディング領域を約０．９ｋｂと約０．６ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．９ｋｂ断片はＰｓｔＩで切断してｐＵＣ  Ｂベクター（ｐＵＣ１９  が有するＥｃｏＲＩ  部位をＨｉｎｄＩＩＩ  部位に改変し、形成されたＨｉｎｄＩＩＩ  とＨｉｎｄＩＩＩ  部位の間のクローニングサイトを下記のクローニングサイト（ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＸｂａＩ，ＳｐｅＩ，，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＳａｃＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ）に交換することにより作製されたサブクローン用のプラスミド）にサブクローン化し、さらに約０．６ｋｂ断片をＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んで、２つの断片を連結させた。このプラスミドのＫｐｎＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入したものからコーディング領域を含むＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣベクター中にＡＤＨプロモーター、ターミネーター領域を持つｐＵＣＡＮベクター（市販されるｐＵＣ１９  ベクターが有するＥｃｏＲＩ  部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位をそれぞれＮｏｔＩ部位に改変し、形成されたＮｏｔＩ部位とＮｏｔＩ部位の間にｐＡＡＨ５Ｎから調製したＮｏｔＩ断片を組み込んで得たベクター）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を平滑化、ＸｂａＩリンカーを導入したｐＵＣＡＮＸに挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ９Ｒを構築した。
【００３０】
実施例３  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｃ１９、ｐ２Ｃ１９Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅した（断片ａ，ｂ，ｃ）。他の領域については、ＰＣＲ法によってヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９遺伝子に変異を導入しながらヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域の一部を増幅（断片ｅ，ｆ）し、さらに残りの領域については、直接的にＤＮＡを合成することによって２種類のリンカーを得た（断片ｄ）。このようにして、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体をカバーする断片を調製した。
つぎに、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理された断片ａおよびＢａｍＨＩとＰｓｔＩで処理された断片ｂを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ部位に挿入し、さらにＸｂａＩとＸｈｏＩで処理された断片ｅを得られたプラスミドのＸｂａＩ、ＸｈｏＩ部位に挿入することによって断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミドを得た。さらに、ＰｓｔＩとＫｐｎＩで処理された断片ｃおよびリンカーである断片ｄを同時にＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入後、再びＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得られた断片（断片ｃ，ｄ含む断片）およびＥｃｏＲＩで処理された断片ｆを同時に前記のプラスミド（断片ａ，ｂ，ｅを含むプラスミド）のＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。このようにしてヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９遺伝子のタンパク質コーディング領域全体を含むプラスミドを構築した。構築されたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、同様にＨｉｎｄＩＩＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９及び、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９と酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｃ１９Ｒを構築した。
【００３１】
実施例４  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドの構築：ｐ２Ｄ６、ｐ２Ｄ６Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子のタンパク質コーディング領域のＮ末端約２００ｂｐを除くを１．３ｋｂを約０．４ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．９ｋｂ断片はＫｐｎＩで切断してｐＵＣ  Ａにサブクローン化した。Ｎ末端２００ｂｐは、３本の合成リンカーを用い、まずＮ末端側の２本のリンカーをＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  （＋）ベクターのＸｂａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込み、その後もう一本のリンカーをそのＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位に組み込んだ。さらにこのプラスミドのＰｓｔＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位にＰＣＲ法で得られた約０．４ｋｂ断片を組み込み、その後ＮｓｐＶ、ＸｂａＩで切断し、０．９ｋｂ断片を含むプラスミドに挿入してコーディング領域を連結させた。これをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切り出し、ｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲベクターに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒを構築した。
さらに、ごく一部の塩基配列のみが異なる２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６遺伝子断片を上記と同様に得て、２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６  Ｖａｒｉａｎｔ２、及び２種のヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ１、ｐ２Ｄ６Ｒ  Ｖａｒｉａｎｔ２を構築した。
【００３２】
実施例５  （ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の酵母内発現プラスミドの構築：ｐ３Ａ４、ｐ３Ａ４Ｒ）
ＰＣＲ法により、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４遺伝子のタンパク質コーディング領域を約０．６ｋｂと約０．９ｋｂの２つの断片に分けて増幅した。得られた約０．６ｋｂ断片はＳａｃＩで切断してｐＵＣ１１８ベクターにサブクローン化した。その後、ＥｃｏＲＩで切断、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものに、ＸｂａＩ、ＳａｃＩで切断した０．９ｋｂ断片を組み込み、２つの断片を連結させた。このプラスミドをＳｐｈＩで切断後、平滑化し、ＸｂａＩリンカーを導入したものからＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＵＣＡＮＸのＸｂａＩ部位に挿入した。これをＮｏｔＩで切り出し、同様にＮｏｔＩ処理したｐＡＡＨ５Ｎ、及びｐＡＨＲＲに挿入し、ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４、及びヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミドｐ３Ａ４Ｒを構築した。
【００３３】
実施例６  （人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドの構築）
実施例５で構築されたプラスミドｐ３Ａ４を鋳型としＸｂａＩ−ＸｈｏＩ  断片を得た。また、プラスミドｐＢＦＣＲ１  （特願平４−２０９２２６）  から得た約２．１ｋｂ  のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を市販のベクターＢｌｕｅ  Ｓｃｒｉｐｔ（＋）のＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ  部位に挿入した後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで同時消化し、断片を得た。これら両断片を同時に、ベクターｐＵＣＡＮ  のＸｂａＩ部位に挿入することにより得られたプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩにより消化して約５．６ｋｂの断片を得た。この断片とベクターｐＡＡＨ５Ｎから得た約１０．５ｋｂのＮｏｔＩ断片を連結することにより目的とする人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドｐＦ３Ａ４  を得た。該人工融合酵素は１１５６アミノ酸残基から成り、その構造はＮ末端からヒト肝チトクロムＰ４５０  ３Ａ４をコードする全アミノ酸配列（５０３残基）  、リンカーに由来する配列  （Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ）、酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素Ｎ末端４２番目からＣ末端と続いている。
【００３４】
実施例７  （形質転換酵母菌体の作製）
ＹＰＤ培地（１％酵母エキス，２％ポリペプトン、２％グルコース）１．０ｍｌにサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  により集菌した。得られた菌体を１．０ｍｌの０．２Ｍ  ＬｉＣ１溶液に懸濁した後、再度遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間）  し、得られたペレットに２０μｌの１Ｍ  ＬｉＣ１溶液、３０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００溶液、約１．０μｇの実施例２から６によって構築された各種の酵母内発現プラスミドをおのおの単独で含む１０μｌの溶液を添加した。これを十分に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さらに１４０μｌの滅菌水を加えて攪拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２．０％グルコース、０．６７％窒素源アミノ酸不含（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  Ｄｉｆｃｏ製）、２０μｇ／ｍｌヒスチジン２．０％寒天）上に蒔き、３０℃で３日間インキュベートし、上記の酵母内発現プラスミドを保有する形質転換酵母菌体を選抜した。このようにして、酵母内でヒト由来のＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体を作製した。
【００３５】
実施例８  （酵母内で発現したヒト由来のチトクロムＰ４５０の定量）
実施例７によって作製されたヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種を発現させる各種の酵母菌体おのおのの培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約１．５×１０７  菌体／ｍｌ）２００ｍｌを集菌し、該菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を懸濁した後、遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）した。得られたペレットを新たに２．０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０  ）に懸濁した後、ジチオナイト５−１０ｍｇを添加し撹拌した。これを２本のキュベットに１．０ｍｌずつ分注し、サンプル側のキュベットに一酸化炭素を吹き込んだ後、４００−５００ｎｍの差スペクトルを測定し、酵母内に存在するチトクロムＰ４５０濃度を算出した。各種の形質転換酵母菌体における各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０の発現量はすべて約１０５  −約１０６  分子／菌体のレベルであった。
【００３６】
実施例９  （ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築および酵母内発現）
ＧＡＰＤＨプロモーターを用いる酵母内発現プラスミドの構築法を示す。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した後、ＮｏｔＩリンカーを挿入して得たプラスミドｐＵＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位にｐＡＲＲＮ（特開平２−２１１８８０に記載）から得たＨｉｎｄＩＩＩ断片（約３．０Ｋｂ）を挿入し、ｐＵＲを得た。一方、プラスミドｐＡＡＨ５のＸｈｏＩ部位を平滑化し、ＸｂａＩリンカーを挿入した後、制限酵素ＸｂａＩおよびＳａｌＩにより切断し、得られた断片（約２．２Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ、ＳａＩＩ部位に挿入した。得られたプラスミドをＸｂａＩおよびＰｓｔＩにより切断して得た断片（約２．２Ｋｂ）、サッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株から調製した２μｍＤＮＡから切り出したＸｂａＩ−ＰｓｔＩ断片（約１．３Ｋｂ）、およびｐＵＲをＰｓｔＩで切断して得た断片、の３断片を連結することによりｐＵＲＬを得た。さらに、ｐＵＲＬをＨｉｎｄＩＩＩで切断し平滑化した後連結することによりＨｉｎｄＩＩＩ部位を消失させた。次に、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびターミネーターを含むＮｏｔＩ断片（約１．６Ｋｂ）〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，５１，１６４１−１６４７（１９８７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６７，１６４９７−１６５０２（１９９２）  に記載される方法により得る〕をｐＵＲＬのＮｏｔＩ部位に挿入することによりｐＵＲＬＧを得た。ｐＵＲＬＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位に、実施例１に準じて得られた各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種をコードするｃＤＮＡ又は実施例２〜６に準じて得られた各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素若しくは人工融合酵素をコードするＤＮＡを挿入することにより、各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素同時酵母内発現プラスミド若しくは人工融合酵素遺伝子を含む酵母内発現プラスミドを得た。このプラスミドをサッカロミセス・セレビシェーＡＨ２２株に実施例７に準じて導入したところ、各種のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種の産生が認められた。
【００３７】
実施例１０  （薬物及びその薬物代謝体が有する水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）のｐＨ依存的変動）
４種類のヒト由来のチトクロムＰ４５０分子種（２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４）により代謝される薬物及びその薬物代謝体（全１０化合物：表１参照）について、その水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）のｐＨ依存的変動を検討した。
水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を算出する手段としては、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製の化学計算ソフトウェアであるＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｂａｔｃｈを使用する計算法を選択し、これを採用した。これは、実験上で薬物の挙動を予想する場合には、みかけの分配係数が重要なパラメータとなり、分配係数を実測する必要なく簡便な測定・算出方法が適しているためであった。
まず、チトクロムＰ４５０分子種（２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４）により代謝される薬物及びその薬物代謝体（全１０化合物）について、前記の化学計算ソフトウェアを使用してｐＨ  １〜１４の範囲でｐＨ  １毎に水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を算出した。次いで、算出された各値をグラフ上にプロットした（図１参照：図中にある黒丸は薬物の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を表し、白四角は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を表している。）。
その結果、いずれの薬物及びその薬物代謝体においても、全ｐＨ範囲において薬物代謝体の方が水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）のプロット曲線が約１〜２程度低くなっており、さらに解離基を有する化合物においては、特定のｐＨを境に前記プロット曲線が急カーブを描き低下することが明らかになった。
【００３８】
【表１】
2005021105.tif 000002
【００３９】
実施例１１  （薬物及び薬物代謝体における水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）と回収率との相関性）
実施例９で作製されたヒト由来チトクロムＰ４５０産生酵母により、ヒト由来チトクロムＰ４５０の基質である薬物から薬物代謝体を製造する際に、液体培地をｐＨ  ５．５に制御しながら当該酵母を培養する場合を想定し、ｐＨ  ５．５における薬物及び薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を算出し、算出された値を比較した（表３参照）。
また、薬物及び薬物代謝体を培養前の新鮮な前記液体培地に添加し、当該混合物中から薬物及び薬物代謝体を酢酸エチルで抽出した。抽出された薬物及び薬物代謝体の回収率を算出し、算出された値を表３に併記した（表３参照）。
【００４０】
尚、液体培地からの薬物及び薬物代謝体の抽出・測定手順は下記の通りであった。
（１）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９、２Ｃ１９及び３Ａ４の場合：
（１）液体培地に酢酸エチル５ｍＬを混ぜｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（２）遠心分離により分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。
（３）溶媒層を回収した。水層に対しては再び酢酸エチルを加え、ｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（４）上記分離の操作を２回繰り返した（計３回）。
（５）回収された全ての溶媒層を集めて、これを濃縮乾固した。得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを加え、当該残渣を溶解した。
（６）上記（５）で得られた抽出物等を下記の分析条件を用いてＨＰＬＣで分析した。
【００４１】
（２）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合：
（１）当該試料に塩化ナトリウムを飽和になるよう加え（２ｇ  ＮａＣｌ／５ｍＬ菌培養液）、これに抽出用溶媒（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／２−プロパノール（ＭＴＢＥ／ＩＰＡ）＝３：１）５ｍＬを混ぜｖｏｒｔｅｘで攪拌（２分）した。
（２）遠心分離により分離（３０００ｒｐｍ，３０℃，５ｍｉｎ）した。
（３）溶媒層を回収した。水層に対しては再び酢酸エチルを加え、ｖｏｒｔｅｘ（２分）で攪拌した。
（４）上記分離の操作を２回繰り返した（計３回）。
（５）回収された全ての溶媒層を集めて、これを濃縮乾固した。得られた残渣にホールピペットを使って５ｍＬのメタノールを加え、当該残渣を溶解した。
（６）上記（５）で得られた抽出物等を下記の分析条件を用いてＨＰＬＣで分析した。
【００４２】
（分析条件）
（１）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ９の場合
薬物：トルブタマイド（Ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）
薬物代謝体：ヒドロキシトルブタマイド（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｍｉｄｅ）］
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２３０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液／０．０１％ＴＦＡ−メタノール溶液＝５０／５０
【００４３】
（２）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の場合
薬物：メフェニトイン（Ｓ−Ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）
薬物代謝体：４’−ヒドロキシメフェニトイン（４’−  Ｈｙｄｏｒｏｘｙｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、水／メタノール＝６５／３５
（３）  ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ２Ｄ６の場合
薬物：ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
薬物代謝体：１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：３０℃、検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：〔Ａ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液と〔Ｂ液〕０．０１％トリフルオロ酢酸メタノール溶液とのグラジエント法（表２参照）
【００４４】
【表２】
2005021105.tif 000003
【００４５】
（４）ヒト由来のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４の場合
薬物：テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
薬物代謝体：６β−ヒドロキシテストステロン（６β−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ｃ−０５−４６１５（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ，  ５μｍ）
ガードカラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＰＧ−ＯＤＳ
温度：４０℃、検出波長：ＵＶ２４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量：１０μＬ
移動相：アイソクラティック法、水／メタノール＝４５／５５
【００４６】
【表３】
2005021105.tif 000004
【００４７】
表３中の注釈は下記のとおりである。
１）ｐＨ  ５．５における水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）
２）添加した薬物及び薬物代謝体の量を１００％として換算
３）上清抽出液及び菌体抽出液の合計
【００４８】
その結果、ブフラロール（Ｂｕｆｕｒａｌｏｌ）のｐＨ  ５．５における水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）が他の薬物と比較して低く、その薬物代謝体である１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）はマイナスの値となり、極端に低いことが判明した。また、１’−ヒドロキシブフラロール（１’−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｆｕｒａｌｏｌ）の回収率が他の薬物及びその薬物代謝体と比較して非常に悪いことが実験的に確認され、水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）と回収率との相関性の存在が明らかとなった。
以上の実験結果から、薬物代謝酵素の基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地の初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までのｐＨ範囲において基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択すること、又は、薬物代謝酵素の基質である薬物及び／又は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）がマイナス値にならないように、基質である薬物から薬物代謝体を製造する期間中の液体培地のｐＨ（初発ｐＨ値から最終到達ｐＨ値までの範囲）を制御・モニターすることが、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において極めて重要であることが見出された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、製造された薬物代謝体を液体培地中から回収して取得する方法において効果的に利用され得る基質である薬物及び／又は薬物代謝体を選択するような方法、即ち、培養後の液体培地からの薬物代謝体の高い回収率を与える方法等が提供可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、チトクロムＰ４５０分子種（２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４）により代謝される薬物及びその薬物代謝体（全１０化合物）について、化学計算ソフトウェアを使用してｐＨ  １〜１４の範囲でｐＨ  １毎に水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を算出し、算出された各値をグラフ上にプロットした図である。図中にある黒丸は薬物の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を表し、白四角は薬物代謝体の水−オクタノール分配係数（ｌｏｇＤ）を表している。
【図１】
2005021105.tif 000005