(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｘ線構造解析に供することが可能なα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶の提供。【解決手段】本結晶は、(Ａ)ヒト由来特定酵素のアミノ酸配列からなるタンパク質、(Ｂ)前記(Ａ)に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってα(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質、または、(Ｃ)前記(Ａ)または(Ｂ)に記載のタンパク質において、特定の位置のアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質の結晶である。また、分泌型ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼを昆虫細胞で発現させて培養し、その培養培地中に分泌された前記酵素を回収・精製して精製酵素試料とし、前記精製酵素試料を蒸気拡散法のハンギングドロップ法で結晶化することで製造できる。【選択図】図３
2005198623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(Ａ)から(Ｄ)のいずれかに記載の組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質の結晶。
(Ａ)  配列番号１の第３９番目から第５６４番目のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(Ｂ)  前記(Ａ)に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質。
(Ｃ)  前記(Ａ)または(Ｂ)に記載のタンパク質において、配列番号１の第３４１番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質。
(Ｄ)  前記(Ａ)または(Ｂ)に記載のタンパク質において、配列番号１の第３４２番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質。
【請求項２】
組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質の結晶であって、前記タンパク質が、ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するα(１-６)フコース転移活性を有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
前記α(１-６)フコシルトランスフェラーゼがヒト由来である請求項１または２に記載の結晶。
【請求項４】
単結晶である請求項１から３のいずれかに記載の結晶。
【請求項５】
結晶の形態が、六角紡錘形である請求項１から４のいずれかに記載の結晶。
【請求項６】
請求項１から５に記載の結晶の製造に使用するポリヌクレオチドであって、下記(ａ)から(ｅ)のいずれかのポリヌクレオチド。
(ａ)  配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(ｂ)  配列番号２の塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、昆虫細胞内で発現すると前記細胞外に分泌されるα(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ｃ)  前記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２１番目から第１０２３番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
(ｄ)  上記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２４番目から第１０２６番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
(ｅ)  上記(ａ)から(ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１から５に記載の結晶の製造に使用するバキュロウイルスであって、請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えバキュロウイルス。
【請求項８】
請求項１から５に記載の結晶の製造に使用する形質転換昆虫細胞であって、請求項７に記載の組み換えバキュロウイルスにより形質転換した形質転換昆虫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖転移酵素の遺伝子クローニングに伴い、生きた細胞や動植物に発現する糖タンパク質や糖脂質上の糖鎖を自由に改変することが可能となり、糖鎖の生物学的役割が急速に明らかにされつつある。なかでも、糖タンパク質や分泌タンパク質に普遍的に付加されるアスパラギン結合型糖鎖は、細胞表面や細胞外で働く多くの重要な生体分子の機能を調節することが知られるようになり、各々の糖タンパク分子における糖鎖の役割はポストゲノム研究で無視できない存在となりつつある。
【０００３】
例えば、上皮増殖因子（EGF）に代表される増殖因子等のシグナル伝達分子であるサイトカインや、細胞表面に存在するそれらの受容体のほとんどには、アスパラギン結合型糖鎖が付加されている。そして、これらの糖鎖の構造変化もしくは欠損は、リガンドとその受容体の結合能の変化やそれらの立体構造変化などが引き起し、それに続く細胞内へのシグナル伝達に大きな影響を与えることが知られている。これらの事実は、アスパラギン結合型糖鎖の重要性を示している。
【０００４】
更に、アスパラギン結合型糖鎖が応用面で着目されている例として、近年注目されている生物医薬品のタンパク質製剤がある。これらのほとんどは、糖鎖が付加されいる糖タンパク質であり、代表的なものに、造血ホルモンのエリスロポエチンや抗体がある。これらが薬として活性を示すためには、糖鎖付加が必須であり、糖鎖が付加されないとうまく標的細胞に運ばれなかったり、血中でたちまち分解されたりする。また、抗がん剤としての有効性が知られている抗体医薬品の主たる作用機構である抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）は、糖鎖構造の違いにより１００倍以上変動する。
【０００５】
このように、さまざまな局面で糖鎖の重要な機能が明らかになるにつれ、医薬、食品、工業素材等の分野で、有用糖鎖を合成したり、有用タンパク質の糖鎖を改変して機能を強化する試みが広くなされるようになっている。糖鎖の構造は多様かつ複雑であるので、全てを化学合成することは難しく、まして、糖タンパク質を全て化学合成することは著しく困難である。したがって、酵素や生物の助けが必要となり、さらに、生体内における糖鎖構造を改変するためには、生体内での糖鎖合成酵素の活性を制御する必要がある。
【０００６】
α(１-６)フコシルトランスフェラーゼ（α(１-６)フコース転移酵素：ＦＵＴ８）は、アスパラギン結合型糖鎖の根元にフコース残基をα１-６結合で付加する酵素であって、線虫から動植物まで広く保存されている重要な糖転移酵素である。α(１-６)フコースの有無は、前記ＡＤＣＣの活性調節に最も重要な因子である。また、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖は、その構造ががん性変化することが知られており、例えば、α(１-６)フコシル化された糖鎖と肝癌の転移や予後との関連性が示唆されている。実際に、がん胎児性タンパク質の一種であるαフェトプロテインのα(１-６)フコシル化率が肝がんの鑑別診断の指標として応用利用されている。
【０００７】
これまでに、ブタ由来およびヒト由来のα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの均一精製および遺伝子のクローニングが行われ（例えば、特許文献１〜４参照）、粗精製酵素試料を用いた解析が行われている。そして、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの基質特異性や、血液型Ｈ(Ｏ)型抗原を合成するα(１-２)フコシルトランスフェラーゼおよび植物の窒素代謝に関わる根瘤菌のα(１-６)フコシルトランスフェラーゼとの間に保存されている供与体基質結合モチーフ中に高度に保存された２つのアルギニン残基が活性に不可欠であること等が調べられている。
【特許文献１】特開平９−２０１１９１号公報
【特許文献２】特開平１０−４９５９号公報
【特許文献３】特開平１０−４９６９号公報
【特許文献４】特開平１０−８４９７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの詳細な反応機構や触媒機構については、依然不明なままであるため、供与体や受容体基質の結合部位や触媒部位の同定等の構造学的見地から反応機構や触媒機構の解明につながる有益な情報を得ることが可能なα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのＸ線構造解析が望まれている。そこで、本発明は、Ｘ線構造解析に供することが可能なα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の結晶は、下記(Ａ)から(Ｄ)のいずれかに記載の組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質の結晶である。
(Ａ)  配列番号１の第３９番目から第５６４番目のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(Ｂ)  前記(Ａ)に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質。
(Ｃ)  前記(Ａ)または(Ｂ)に記載のタンパク質において、配列番号１の第３４１番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質。
(Ｄ)  前記(Ａ)または(Ｂ)に記載のタンパク質において、配列番号１の第３４２番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質。
【発明の効果】
【００１０】
従来、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの調製手法としては、ヒト培養細胞から調製する方法や、昆虫細胞を利用する方法が用いられていたが、前記タンパク質は、膜表在性であるため、その精製が困難であった。具体的には、前記ヒト培養細胞の系では、多段階にわたる精製手順が煩雑であり、また、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの収量が著しく低いため結晶化に供するのに充分な量を効率よく得ることが困難であった。他方、昆虫細胞を利用した系では、前記細胞からの可溶化が困難である等の理由により、均一、高純度の精製ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼを調製することは著しく困難であった。本発明者は、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのＮ末端にバキュロウイルス由来ｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルを導入すれば、酵素活性に影響を与えることなく、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼを分泌型にできることを見出し、組み換えヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの精製試料を容易に大量調製できる方法を確立した。さらに、本発明者は、鋭意研究を重ね、前記ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの精製試料を蒸気拡散法のハンギングドロップ法により結晶化する方法を見出し、本発明に到達した。
【００１１】
本発明のα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶は、例えば、供与体基質としてＵＤＰ-糖ではなくＧＤＰ-フコースを用いる糖転移酵素の結晶である点、活性に金属イオンを必要としない糖転移酵素の結晶である点、および、フコーストランスフェラーゼファミリーで初めての結晶である点で、学術的にも、産業的にも大きな意義がある。本発明の結晶を用いれば、例えば、Ｘ線構造解析等を行うことができ、例えば、供与体や受容体基質の結合部位や触媒部位の同定等の構造学的見地から反応機構や触媒機構の解明につながる有益な情報を得ることが可能となる。このような情報は、例えば、糖転移酵素の阻害剤の開発や機能改変酵素の設計等のような応用利用に供することができる。したがって、本発明は、例えば、生体内における糖鎖の生合成を制御する医薬品の開発に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の結晶は、組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質の結晶であって、前記タンパク質が、ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するα(１-６)フコース転移活性を有する結晶であることが好ましい。
【００１３】
前記α(１-６)フコシルトランスフェラーゼは、ヒト由来であることが好ましく、本発明の結晶は、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの単結晶であることが好ましい。また、本発明の結晶の形態としては、例えば、六角紡錘形があげられる。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の結晶の製造に使用するポリヌクレオチドであって、下記(ａ)から(ｅ)のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
(ａ)  配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(ｂ)  配列番号２の塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、昆虫細胞内で発現すると前記細胞外に分泌されるα(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ｃ)  前記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２１番目から第１０２３番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
(ｄ)  上記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２４番目から第１０２６番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
(ｅ)  上記(ａ)から(ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドの塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド。
【００１５】
本発明の組み換えバキュロウイルスは、本発明の結晶の製造に使用するバキュロウイルスであって、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えバキュロウイルスである。
【００１６】
本発明の形質転換昆虫細胞は、本発明の結晶の製造に使用する形質転換昆虫細胞であって、本発明の組み換えバキュロウイルスにより形質転換した形質転換昆虫細胞である。
【００１７】
まず、本発明の結晶に供するタンパク質について説明する。
【００１８】
本発明の結晶に供するタンパク質は、配列番号１の第３９番目から第５６４番目のアミノ酸配列からなる組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質(以下、タンパク質Ａと呼ぶ。)であって、ＧＤＰ−フコースのフコース（Ｆｕｃ）を、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（Ｒはペプチド鎖のアスパラギン残基を示す）受容体の、最もペプチド鎖に近いＧｌｃＮＡｃの６位の水酸基に転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→６（ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎα１→３）Ｍａｎβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４（Ｆｕｃα１→６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成するα(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質である。
【００１９】
前記タンパク質Ａは、配列番号１の第３９番目から第５６４番目の５２６アミノ酸残基からなるタンパク質であるが、その中で、配列番号１の第４４番目から５５１番目のアミノ酸配列は、特許文献１（特開平１０-８４９７５号公報）に記載されるヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの第６８番目から第５７５番目のアミノ酸配列と同一である。また、前記タンパク質Ａにおいて、Ｎ末端にあたる配列番号１の第３９番目から第４３番目のアミノ酸配列は、組み換えによるベクター由来の配列であり、Ｃ末端にあたる配列番号１の第５５２番目から第５６４番目のアミノ酸配列は、精製手順の簡便化や低廉化のために付加したヒスチジンタグの配列である。
【００２０】
本発明の結晶に供するタンパク質のその他の態様として、前記タンパク質Ａのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、前記α(１-６)フコース転移活性を有する組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質（以下、タンパク質Ｂと呼ぶ。）があげられる。前記タンパク質Ｂにおいて、欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残基数は、前記タンパク質Ｂのα(１-６)フコシル転移活性が阻害されない限り特に制限されないが、例えば、１〜２０であり、好ましくは、１〜１０であり、より好ましくは、１〜５であり、さらに好ましくは、１〜２である。
【００２１】
本発明の結晶に供するタンパク質のさらにその他の態様として、前記タンパク質ＡまたはＢのアミノ酸配列において、配列番号１の第３４１番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質（以下、タンパク質Ｃと呼ぶ。）があげられる。前記アルギニン残基は、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの活性に重要なアミノ酸残基であって、アラニンへ置換するだけで、α(１-６)フコース転移活性を完全に失活させることができる。したがって、前記タンパク質Ｃは、前記アルギニン残基の置換により完全に失活した組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質である。前記タンパク質Ｃのような不活性型タンパク質の結晶であっても、活性型タンパク質の結晶の比較対照例となりうることから、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶解析およびその結果をもとにした触媒機能の解明において非常に有用である。
【００２２】
本発明の結晶に供するタンパク質のさらにその他の態様として、前記タンパク質ＡまたはＢのアミノ酸配列において、配列番号１の第３４２番目に該当するアルギニン残基を、アラニンに置換したタンパク質（以下、タンパク質Ｄと呼ぶ。）があげられる。前記アルギニン残基は、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの活性に重要なアミノ酸残基であって、アラニンへ置換するだけで、α(１-６)フコース転移活性を１０分の１以下とすることができる。したがって、前記タンパク質Ｄは、前記アルギニン残基の置換により活性が著しく低下した組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質である。前記タンパク質Ｄの結晶も、前記タンパク質Ｃの結晶と同様に、α(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶解析において有用である。
【００２３】
次に、本発明の結晶に供する組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの調製方法について説明する。
【００２４】
組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの調製方法としては、前記タンパク質ＡからＤの少なくともいずれかを調製できる方法であれば、特に制限されないが、分泌シグナルを利用する方法が好ましい。前記タンパク質Ａ〜Ｄが分泌されるタンパク質であれば、例えば、細胞を培養するだけで、前記培養培地中に大量に前記目的タンパク質が分泌されるから、タンパク質の大量調製を簡便かつ迅速にできる。また、前記タンパク質Ａ〜ＤのＣ末端部分には、前述のとおり、ヒスチジンタグが付加してあるので、前記培地中に分泌された前記タンパク質Ａ〜Ｄの回収および精製のさらなる簡略化・低廉化が可能である。
【００２５】
前記タンパク質Ａ〜Ｄを分泌型とするには、分泌シグナルを付加する方法があげられ、前記分泌シグナルとしては、例えば、配列番号１の第１番目から第３８番目のアミノ酸配列からなるバキュロウイルス由来のｇｐ６７タンパク質の分泌シグナルがあげられる。前記分泌シグナルがＮ末端に付加された前記タンパク質Ａ〜Ｄは、昆虫細胞内で発現されると、前記分泌シグナルが切断されるとともに、細胞外に放出される。前記タンパク質Ａに前記分泌シグナルが付加されたタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドは、前記分泌シグナルが付加された前記タンパク質ＡからＤをコードするポリヌクレオチドであって、それぞれ、下記(ａ)から(ｄ)のポリヌクレオチドである。
(ａ)  配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(ｂ)  配列番号２の塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、昆虫細胞内で発現すると前記細胞外に分泌されるα(１-６)フコース転移活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(ｃ)  前記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２１番目から第１０２３番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
(ｄ)  上記(ａ)または(ｂ)に記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号２の第１０２４番目から第１０２６番目の塩基配列が、アラニンをコードする塩基配列に置換されたポリヌクレオチド。
【００２７】
前記（ｂ）において、欠失、置換もしくは付加される塩基数は、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜２０であり、より好ましくは、１〜１０であり、さらに好ましくは、１〜５であり、特に好ましくは、１〜２である。また、本発明のポリヌクレオチドは、前記(ａ)から(ｄ)のポリヌクレオチドに加え、これらの塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドが含まれることは言うまでもない。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドを、昆虫細胞内で発現させると、前記昆虫細胞を培養するだけで、その培養培地中に、前記組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質Ａ〜Ｄのいずれかのタンパク質が分泌されることとなる。前記(ａ)の配列番号２の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチドから発現されるタンパク質の構成を図１に示す。図１Ａが、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼであり、図１Ｂが、前記(ａ)の配列番号２の塩基配列からなる本発明のポリヌクレオチドから発現されるタンパク質であり、ｇｐ６７分泌シグナルの切断部位(Cleavage site)からＣ末端までが、前記タンパク質Ａに該当する。図１Ａに示すとおり、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｎ末端の６７アミノ酸残基には、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、および、膜貫通ドメインが含まれるが、触媒ドメインが含まれない。そのため、図１Ｂのタンパク質も、前記ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼと同様にα(１-６)フコース転移活性を有する。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドを昆虫細胞内で発現させる方法としては、特に制限されず、従来公知の技術を適宜適用できるが、例えば、本発明の組み換えバキュロウイルスを使用して、昆虫細胞内に前記ポリヌクレオチドを導入する方法があげられる。本発明の組み換えバキュロウイルスは、例えば、ポリヘドリン（多核体）プロモーター等の昆虫細胞内で機能するプロモーターと、前記プロモーターの下流に発現可能なように連結された本発明のポリヌクレオチドとを含むバキュロウイルスである。その作製方法は、とくに制限されず、例えば、トランスファーベクターと相同性組み換えを利用する従来公知の方法により作製してもよく、または、市販のバキュロウイルスシャトルベクターを利用して作製してもよい。
【００３０】
本発明の形質転換昆虫細胞は、本発明の組み換えバキュロウイルスを感染させた細胞であって、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を発現し、本発明の結晶に供する前記タンパク質Ａ〜Ｄのいずれかを分泌する細胞である。前記昆虫細胞としては、特に制限されず、例えば、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、および HighFive(Invitrogen社製）等の従来公知の細胞が使用でき、前記組み換えバキュロウイルスの感染方法や感染した細胞の培養方法も、従来公知の方法が適用できる。
【００３１】
培地中に分泌された前記組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼタンパク質を回収して精製する方法は、特に制限されず、従来公知の方法で行える。例えば、Ｃ末端に融合させたヒスチジンタグを利用すれば、例えば、硫安沈殿とアフィニティーカラムの組合せのみで精製タンパク質試料を得ることが可能である。前記ヒスチジンタグに適したアフィニティーカラムとしては、例えば、Ｎｉを結合した金属アフィニティーカラムがあげられる。
【００３２】
以上のようにして、本発明の結晶に供する組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの精製試料を調製できる。次に、調製された前記精製タンパク質試料を結晶化する方法について説明する。
【００３３】
本発明の結晶化は、例えば、蒸気拡散法のハンギングドロップ法で行うことができ、具体的には、例えば、前記精製酵素試料を純水に対して充分に透析を行い、タンパク質濃度が５〜２０ｍｇ/ｍｌとなるように濃縮した酵素試料とリザーバー溶液とをシリコン処理したカバーグラス上で等量混合してドロップを形成させ、前記カバーグラスを反転させ前記リザーバー溶液が入ったウェルの蓋をするように配置し、密閉状態でインキュベーションすることで結晶化をする方法である。前記リザーバー溶液としては、例えば、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＨＣｌ、１.４Ｍ〜１.８Ｍ 硫酸リチウムを含むｐＨ７.０〜８.０のバッファーを使用することができ、好ましくは、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ-ＨＣｌ、１.５Ｍ 硫酸リチウムを含むｐＨ７.５のバッファーである。前記リザーバー溶液には、必要に応じて、例えば、２０％のグリセロールを添加してもよい。前記インキュベーションの温度は、例えば、４℃〜３０℃であり、好ましくは、１０℃〜３０℃であり、より好ましくは、２５℃〜３０℃である。また、前記インキュベーションは、結晶化されるまで行えばよいが、その時間は、例えば、３日〜数週間である。
【００３４】
以下に、本発明の実施例について説明する。
【実施例１】
【００３５】
（組み換えバキュロウイルスのコンストラクション）
まず、全長ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのC末端へヒスチジンタグ導入をKunkel等の方法により行った。全長ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んだcDNAを制限酵素NcoI及びEcoRIで消化し得られたヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのC末端部分をコードするポリヌクレオチドを含んだ0.3kbの断片をクローニングベクター pBluescript SK+  (Stratagene社製)にサブクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌CJ236株に形質転換しM13ヘルパーファージを用いてウラシル置換一本鎖鋳型DNAを調製した。ウラシル置換一本鎖鋳型DNAと同時に使用したヒスチジンタグ導入のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-TCCATCTGAGCTTTATCCACCTCCATGATGATGATGATGATGACCTCCACCAGCTTTCTCAGCCTCAGG-3'（配列番号３）を用いた。
【００３６】
上記のヒスチジンタグ導入のための変異を行ったプラスミドからNcoI及びEcoRI消化で得られるヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのヒスチジンタグが導入されたC末端をコードするポリヌクレオチドを含んだ0.3kbの断片と、全長ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含んだcDNAを制限酵素BspEI及びNcoIで処理することにより得られるヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼのN末端部分をコードするポリヌクレオチドを含んだ1.3kbの断片とを、ともに、XmaI及びEcoRI消化したバキュロウイルストランスファーベクターpAcGP67B(BD biosciences社製)にサブクローニングすることで分泌型α(１-６)フコシルトランスフェラーゼを発現するための組み換えバキュロウイルストランスファーベクターとした。前記トランスファーベクターとBaculoGold linealized Baculovirus DNA(BD biosciences社製)を用いて、常法に従い、組み換えバキュロウイルスを作製した。
【００３７】
（組み換えバキュロウイルスのインフェクション）
前記組み換えバキュロウイルスを増殖させてさらに力価を上げて1 x 108  PFU/ml 以上の発現用ウイルス液とした後、単層培養により増殖させたＳｆ２１細胞にＭＯＩ(multiplicity of infection)が８以上で感染させ、組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼを培地中に放出させた。その結果、前記培地中には、効率よく組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼが分泌されていた。
【００３８】
（組み換えヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの精製）
分泌された前記組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼを含む前記培地を透析チューブに入れて硫酸アンモニウム粉末中に放置しておくことで硫安沈殿を得た後、少量のバッファーＡ (50mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5)に溶解させて透析を行った。この操作は、前記培地をＮｉを結合させた金属アフィニティークロマトグラフィーに使用した場合に、前記Ｎｉが支持体から遊離するのを防ぐため、および、濃縮のためのものである。前記透析終了後、前記バッファーＡで平衡化したＮｉキレーティングセファロースカラム（Amersham Pharmacia社製）に供与し、前記バッファーＡおよびバッファーＢ (50mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 50mM imidazole pH 7.5)で充分に洗浄した後、バッファーＣ (50mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, 200mM imidazole pH 7.5)で溶出した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）で分析したところ、分子量約６０ｋＤａの均一なバンドが確認された。その結果を図２に示す。この画分を精製酵素試料とし、結晶化に使用した。この精製において、１Ｌの培地から約１ｍｇの精製酵素試料を得ることができ、その精製倍率は、2100倍であり、収率は、２８％であった。
【００３９】
（組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの結晶化）
蒸気拡散法のハンギングドロップ法により、前記精製酵素試料の結晶化を行った。前記精製酵素試料を純水に対して充分に透析を行い、タンパク質濃度が５〜２０ｍｇ/ｍｌとなるように濃縮した酵素試料とリザーバー溶液(１００ｍＭ HEPES-HCl，１.５Ｍ硫酸リチウム,ｐＨ７.５)とをシリコン処理したカバーグラス上で速やかに等量混合してドロップを形成させ、前記カバーグラスを反転させ1mlもしくは0.5mlの前記リザーバー溶液が入った24穴プレートのウェルの蓋をするように配置し、グリースを用いてウェル内を密閉状態とした。２５℃〜３０℃の温度で３日〜数週間静置してインキュベーションした後、六角紡錘形の単結晶を得た。得られた組み換えα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの単結晶の一例を図３に示す。なお、前記リザーバー溶液に２０％のグリセロールを添加しても、結果に影響しなかった。また、インキュベーションの温度は、前記温度範囲でも、高めに設定したほうが、結晶が出易い傾向があった。
【００４０】
得られたα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの単結晶をＸ線構造解析したところ、空間群および単位格子係数は、以下の通りであった。
p6522 (α = 90°β = 90°γ = 120°）  a = 92.692A  b = 92.692A  c = 380.954A
【産業上の利用可能性】
【００４１】
以上説明したとおり、本発明の結晶は、例えば、Ｘ線結晶解析に基づく生物医薬品の設計・開発の分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１Ａは、ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの構成を示し、図１Ｂは、分泌型ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの構成の一例を示す。
【図２】図２は、精製された分泌型ヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＣＢＢ染色した結果の一例である。
【図３】図３は、本発明のヒトα(１-６)フコシルトランスフェラーゼの単結晶の一例を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号３  合成プライマー
【図１】
2005198623.tif 000003
【図２】
2005198623.tif 000004
【図３】
2005198623.tif 000005
【配列表】
2005198623000001.app