(57)【要約】【課題】  生体組織中を透過できる領域の蛍光を放射し、優れた水溶性と排出性を示す蛍光造影剤を提供すること。【解決手段】  下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有することを特徴とする近赤外蛍光造影剤。    【化１】2005120026.tif 000019【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有することを特徴とする近赤外蛍光造影剤。
【化１】
2005120026.tif 000016
（式中、Ｒ1及びＲ2は各々、水溶性基を置換している脂肪族基を表し、Ｒ3及びＲ4は各々、低級アルキル基或いはＲ3とＲ4の間で結合して炭素環を形成する非金属原子群を表し、Ｌ1〜Ｌ7は各々、同一或いは異なるメチン基を表す。Ｚ1及びＺ2は各々、５員或いは６員の縮合環を形成するに必要な非金属原子群を表し、Ｘは分子の電荷を中和するに必要な電荷を表し、ｐは分子全体の電荷を中和するに必要な数を表す。ｍは３〜６の整数を表し、ｎは１または２を表す。）
【請求項２】
前記水溶性基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）が分子内に少なくとも２個の水溶性基を有する下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の近赤外蛍光造影剤。
【化２】
2005120026.tif 000017
（式中、Ｊ1、Ｊ2は各々、炭素原子数が１〜５であるアルキレン基を表し、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1〜Ｌ7、ｍ、ｎ、ｐ及びＸは各々、一般式（Ｉ）における定義に同じであり、Ｒ10〜Ｒ17は各々、水素原子、π値が０．３より小さい置換基を表す。）
【請求項４】
前記スルホン酸基の数が少なくとも４であることを特徴とする請求項２または３に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項５】
前記一般式（II）で表される化合物が下記一般式（III）で表されることを特徴とする請求項３または４に記載の近赤外蛍光造影剤。
【化３】
2005120026.tif 000018
（式中、Ｒ5、Ｒ6は各々、スルホン酸基を置換している炭素原子数３〜５であるアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1〜Ｌ7、ｍ、ｎ、ｐ及びＸは各々、一般式（Ｉ）における定義に同じであり、Ｒ10〜Ｒ17は各々、水素原子、π値が０．３より小さい置換基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病気を治療する際に、病気の初期の段階においてその病気により生体内に引き起こされる形態変化を精密、且つ迅速に簡便な方法で検出することが要求される。特に癌を治療する場合、初期の小さい病変の場所と大きさの確定が早期治療する上で必要不可欠である。
【０００３】
この目的のために既に知られている方法として、内視鏡による生体検査、Ｘ線撮影、ＭＲＩ及び超音波撮影等のような映像診断を挙げることができる。生体検査は直接病変部を観察できるので診断確定に有効ではあるが、同時に被験者に痛みや苦痛を強いる。Ｘ線撮影及びＭＲＩは過度にすると有害となる放射線及び磁場を被験者にさらすものであり、時間的経過を追跡しようとするとその被爆時間は追跡時間に比例して増大してしまう。設備や装置も大掛かりになり、その設置と維持に多大の労力と費用が要求される。
【０００４】
一方、小型化が可能で運転の労力が軽減され、使用も簡便化される診断として近赤外蛍光撮影が最近注目されている。近赤外光はその領域のヘモグロビン吸収がないために生体組織を容易に透過し、厚さ１０〜２０ｃｍまでを検査診断できると言われている。そのため、臨床医学の分野で注目を集めつつ、近赤外ＣＴとする診断技術として開発されるようになった。この方法は造影剤として生体の吸収の少ない７００ｎｍから１０００ｎｍの近赤外の波長を有する励起光の照射により蛍光を放射する化合物を生体中に投与し、身体の外側から近赤外の波長である励起光を照射し、体内の投与された化合物、所謂、蛍光造影剤から放射される蛍光を検出して、病変部を確定する。
【０００５】
このような蛍光造影剤として、例えば、腫瘍中に蓄積するポルフィリン化合物やヘマトポルフィルンのような化合物が知られている。これらの化合物は、近赤外の光照射により励起され酸素分子が病変部の生体を酸化することが可能な３重項酸素を生成させ、癌のような病変部の細胞を死滅させて治療を可能にするが、病変部以外の組織を破壊してしまう危険性を孕んでいる。一方、フルオレセインやフルオレサミンのような既知の蛍光色素を用いた造影法が知られている（米国特許第４，９４５，２３９号明細書）が、これらの蛍光色素は生体の光透過が非常に低い青〜緑の光を発するもので、身体の奥の部分の病変の検出が充分にできない。
【０００６】
近赤外領域で蛍光を発するシアニン色素は蛍光造影剤として期待され、各種のシアニン色素化合物が検討されている。シアニン化合物の蛍光造影剤が報告されて以来、親水性、モル吸光係数、量子収率の高い化合物に改変すべく、各種周辺シアニン化合物を造影剤とする技術が開示されている（例えば、特許文献１、２、３参照。）。しかしながら、正常な組織を病変組織と識別する能力（造影力）とともに、造影後に生体から完全に排出されること（非蓄積性）、を兼ねた安全な造影剤は見つかっていない。
【特許文献１】特開２０００−９５７５８号公報１〜２０頁
【特許文献２】特表２００２−５２６４５８号公報１〜３３頁
【特許文献３】特開２００３−１６０５５８号公報１〜６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、生体組織中を透過できる領域の蛍光を放射し、優れた水溶性と排出性を示す蛍光造影剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の上記目的は下記構成によって達成される。
（請求項１）
下記一般式（Ｉ）で表される化合物を含有することを特徴とする近赤外蛍光造影剤。
【０００９】
【化１】
2005120026.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ1及びＲ2は各々、水溶性基を置換している脂肪族基を表し、Ｒ3及びＲ4は各々、低級アルキル基或いはＲ3とＲ4の間で結合して炭素環を形成する非金属原子群を表し、Ｌ1〜Ｌ7は各々、同一或いは異なるメチン基を表す。Ｚ1及びＺ2は各々、５員或いは６員の縮合環を形成するに必要な非金属原子群を表し、Ｘは分子の電荷を中和するに必要な電荷を表し、ｐは分子全体の電荷を中和するに必要な数を表す。ｍは３〜６の整数を表し、ｎは１または２を表す。）
（請求項２）
前記水溶性基がスルホン酸基であることを特徴とする請求項１に記載の近赤外蛍光造影剤。
（請求項３）
前記一般式（Ｉ）が分子内に少なくとも２個の水溶性基を有する下記一般式（II）で表される化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の近赤外蛍光造影剤。
【００１１】
【化２】
2005120026.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｊ1、Ｊ2は各々、炭素原子数が１〜５であるアルキレン基を表し、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1〜Ｌ7、ｍ、ｎ、ｐ及びＸは各々、一般式（Ｉ）における定義に同じであり、Ｒ10〜Ｒ17は各々、水素原子、π値が０．３より小さい置換基を表す。）
（請求項４）
前記スルホン酸基の数が少なくとも４であることを特徴とする請求項２または３に記載の近赤外蛍光造影剤。
（請求項５）
前記一般式（II）で表される化合物が下記一般式（III）で表されることを特徴とする請求項３または４に記載の近赤外蛍光造影剤。
【００１３】
【化３】
2005120026.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ5、Ｒ6は各々、スルホン酸基を置換している炭素原子数３〜５であるアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ4、Ｌ1〜Ｌ7、ｍ、ｎ、ｐ及びＸは各々、一般式（Ｉ）における定義に同じであり、Ｒ10〜Ｒ17は各々、水素原子、π値が０．３より小さい置換基を表す。）
【発明の効果】
【００１５】
本発明の近赤外蛍光造影剤は、励起光によって生体組織の透過性に優れた蛍光を放射し、また水溶性、排出性に優れているため、安全に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳述する。
【００１７】
本発明の近赤外蛍光造影剤とは近赤外領域に蛍光を発する造影剤を意味する。
【００１８】
Ｒ1、Ｒ2で表される「水溶性基を置換している脂肪族基」における「脂肪族基」は、アルキル基、アルケニル基、環状アルキル基、アルキニル基が挙げられる。アルキル基として好ましくは炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状の低級アルキル基であり、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、２−メチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基等が挙げられ、アルケニル基として好ましくは炭素数３〜５の直鎖状または分岐鎖状の低級アルケニル基であり、具体的にはアリル基、２−ブテニル基、イソブテニル基等が挙げられ、環状アルキル基として好ましくは炭素数３〜６の低級アルキル基であり、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチルチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、アルキニル基として好ましくは炭素数３〜５の直鎖状または分岐鎖状の低級アルキニル基であり、具体的には２−プロピニル基、２−ブチニル基等が挙げられる。
【００１９】
水溶性基としては、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基等を挙げることができる。水溶性基で置換されたアルキル基の具体的なものとしては、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基、３−ヒド−ヒドロキシプロピル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カルボキシブチル基、２−ホスフォノエチル基、３−ホスフォノプロピル基、スルホメチル基、２−スルホエチル基、３−スルホプロピル基、４−スルホブチル基、３−スルホブチル基、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基等が挙げられる。更に好ましくは、Ｒ1及びＲ2はスルホン酸基で置換されている炭素数１〜５の低級アルキル基（例えば、２−スルホエチル基、３−スルホプロピル基、４−スルホブチル基、３−スルホブチル基、２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基等）を表す。
【００２０】
Ｒ3及びＲ4で表される「低級アルキル基」としては炭素数１〜５のアルキル基であり、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基が挙げられる。Ｒ3とＲ4の間で結合して形成される炭素環としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環が挙げられる。
【００２１】
Ｚ1及びＺ2で表される非金属原子群によって形成される５員、６員の縮合環は、例えば、複素環縮合環、ベンゾ縮合環またはナフト縮合環であり、縮合環上の任意の位置に任意の基が置換できる。これら縮合環上の置換基として具体的には、スルホン酸基、カルボキシル基、水酸基、シアノ基、置換アミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチル−４−スルホブチルアミノ基、ジ（３−スルホプロピル）アミノ基等）、または直接もしくは２価の連結基を介して環に結合した置換または無置換のアルキル基（前述と同義）等が挙げられる。２価の連結基としては、例えば、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＳＯ2−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−、−ＳＯ2−等が好ましい。直接または２価の連結基を介して環に結合した置換または無置換のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基であり、置換基として好ましくはスルホン酸基、カルボキシル基、水酸基が各々挙げられ、特にスルホン酸基が好ましい。これら縮合環においては、水溶性基が置換した炭素縮合環、含窒素縮合複素環が好ましい。
【００２２】
Ｌ1〜Ｌ7で表されるメチン基の置換基としては、置換または無置換のアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、２−フェノキシエチル、２−スルホエチル等の置換、非置換の基）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、置換または無置換のアリール基（例えば、フェニル基、スルホン酸基置換フェニル基、メトキシ基置換フェニル基、ナフチル基等）、複素環基（例えば、フリル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピロリジノ基、モルホリノ基等）、低級アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、アミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、２−スルホエチルアミノ基等）等が挙げられる。また、Ｌ1〜Ｌ7で表されるメチン基の置換基どうしが結合して３つのメチン基を含む環を形成してもよく、この環は更に他のメチン基を含む環と縮合環を形成してもよい。Ｌ1〜Ｌ7で表されるメチン基の置換基として好ましいものはアルキル基、アミノ基、複素環基である。Ｌ1〜Ｌ7で表されるメチン基の置換基どうしが結合して形成される３つのメチン基を含む環としては、具体的にはシクロペンテン環、シクロヘキセン環及び４，４−ジメチルシクロヘキセン環等を挙げることができ、本発明において特に好ましくはシクロペンテン環である。
【００２３】
Ｘで表される電荷を中和するに必要な電荷とは、一般式（Ｉ）で示される化合物と無毒性の塩を形成するものであればいかなるものであってもよく、カチオンの具体例としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属イオン、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、ピリジニウム等の有機アンモニウムイオン；リジン塩、アルギニン塩等のアミノ酸のアンモニウムイオン等を挙げることができ、アニオンの具体例として塩素、臭素、沃素等のハロゲンイオン、硫酸イオン、酢酸、クエン酸等の有機カルボン酸イオン、トルエンスルホン酸等を挙げることができる。特に好ましくは、生体に対してより毒性の軽減されたナトリムイオンや塩素イオンである。
【００２４】
一般式（II）に於て、Ｊ1及びＪ2で表される炭素原子数が１〜５のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンテン基、２−メチルプロピレン基等が挙げられ、エチレン基が好ましい。
【００２５】
次に、一般式（II）におけるＲ10〜Ｒ17の置換基の定義に用いられるπ値の定義について説明する。π値は化合物分子の親疎水性に及ぼす置換基の影響を示すパラメータであり、以下の式で定義される。
【００２６】
π＝ｌｏｇＰ（ＰｈＸ）−ｌｏｇＰ（ＰｈＨ）
上記の式で、Ｐは化合物のオクタノール／水に対する分配係数を意味し、置換ベンゼンＰｈＸのｌｏｇＰ値とベンゼンのｌｏｇＰ値の差が置換基Ｘのπ値として割り当てられる。ｌｏｇＰ値は下記文献（ａ）の方法で実測して求めることができ、また文献（ａ）記載のフラグメント法または文献（ｂ）記載のソフトウェアパッケージを用いて計算により求めることもできる。実測値と計算値が一致しない場合は原則として実測のπ値を用いることとする。
【００２７】
（ａ）Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ，Ａ．Ｊ．Ｌｅｏ著、”Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆ａｍｐ；Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９年刊、（ｂ）Ｍｅｄｉｃｈｅｍソフトウェア−パッケージ（Ｐｏｍｏｎａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから開発、販売されている第３．５４版）。
【００２８】
このようにして求められた置換基ごとのπ値は、文献（ａ）に一覧表としてまとめられている。π値が０．３以下である主なものを抜粋すると以下の通りである。
【００２９】
置換基                                    π値
ＯＨ                                    −０．６７
ＣＮ                                    −０．５７
ＣＯＣＨ3                               −０．５５
ＣＯＯＨ                                −０．３２
ＯＣＨ3                                 −０．０２
ＣＯＯＣＨ3                             −０．０１
Ｈ                                        ０．００
Ｆ                                        ０．１４
Ｎ（ＣＨ3）2                              ０．１８。
【００３０】
Ｒ10〜Ｒ17で表されるπ値が０．３より小さな好ましい置換基としては、ホスフォノ基、スルホン酸基、カルボキシル基、水酸基、シアノ基、置換アミノ基（例えば、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基等）、π値が０．３より小さな２価の連結基（例えば、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＳＯ2−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯ−、−ＳＯ2−等）を介して環に結合したπ値が０．３以下となる置換または無置換のメチル基又はエチル基（例えば、メトキシ基、２−スルホエチル基、２−ヒドロキシエチル基、メチルアミノカルボニル基、メトキシカルボニル基、アセチル基、アセトアミド基、ポロピオニルアミノ基、ウレイド基、メタンスルホニルアミノ基、エタンスルホニルアミノ基、エチルアミノカルボニルオキシ基、メタンスルホニル基等）等が挙げられる。特に好ましい基はスルホン酸基である。
【００３１】
一般式（III）に於て、Ｒ5、Ｒ6で表される水溶性基を置換している炭素原子数が３〜５であるスルホアルキル基における水溶性基としては、上記一般式（Ｉ）に於て定義した基に加えて親水性のノニオン基が挙げられ、例えば、カルバモイル基、スルファモイル基、アセトアミド基、スルホンアミド基、メタンスルホンアミド基等が挙げられ、具体的には２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基、２−カルバモイルメチル−４−スルホブチル基、２−アセトアミド−４−スルホブチル基、２−スルファモイル−３−スルホプロピル基、３−メタンスルホンアミド−５−スルホペンチル基、３−メタンスルホニル−４−スルホブチル基、２−カルボキシ−４−スルホブチル基、３−ホスフォノオキシ−５−スルホブチル基、等の基が挙げられ、特に２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル基が好ましい。
【００３２】
一般式（Ｉ）、一般式（II）、一般式（III）においては、ｎは１のものが好ましい。
【００３３】
蛍光造影剤を生物体内で使用する際に、特に必要な特性として水溶性であることが挙げられるが、本発明の近赤外蛍光造影剤においては、当該化合物中にスルホン酸基を３個以上導入することにより水溶性において顕著な改善効果がみられる。水溶性においてスルホン酸基の数は好ましくは４個以上である。
【００３４】
スルホン酸基は、一般式（Ｉ）においてはＲ1、Ｒ2、Ｚ1及び／またはＺ2の位置に、一般式（III）においてはＲ5、Ｒ6及びＲ10〜Ｒ17のいづれかの位置に導入されることが好ましい。更に、当該スルホン酸基は共役メチン鎖のＬ4にアルキレン基等の２価の基を介して導入することも好適に行われる。前記一般式（III）で表され、Ｒ5及びＲ6にノニオン性の水溶性基とスルホン酸基で置換されている炭素数１〜５の低級アルキル基で、且つスルホン酸基を分子内に３個以上有する化合物のナトリウム塩が特に望ましい。
【００３５】
本発明において用いられる前記一般式（Ｉ）で表される化合物（一般式（II）及び一般式（III）で表される化合物を含む）の具体例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
【化４】
2005120026.tif 000005
【００３７】
【化５】
2005120026.tif 000006
【００３８】
【化６】
2005120026.tif 000007
【００３９】
【化７】
2005120026.tif 000008
【００４０】
【化８】
2005120026.tif 000009
【００４１】
【化９】
2005120026.tif 000010
【００４２】
【化１０】
2005120026.tif 000011
【００４３】
【化１１】
2005120026.tif 000012
【００４４】
本発明の近赤外蛍光造影剤に含められる化合物は、一般式（Ｉ）〜一般式（III）で表される化合物であって、その分子中にスルホン酸基を３個以上、好ましくは４個以上有するものであれば特に限定されない。
【００４５】
当該化合物は、Ｆ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６４、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１０  （１９８９）３−１０、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１１（１９９０）４１８−４３０、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１２（１９９０）７２３−７３０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４（１９９３）１０５−１１１、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１７（１９９４）１９７−２０４、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４５（１９８９）４８４５−４８６６、欧州特許出願公開第５９１，８２０Ａ１号明細書、同５８０，１４５Ａ１号明細書、特開平４−１４７１３１号公報、特開２００３−４８８９１号公報、同２００３−６４０６３号公報、同２００３−２６１４６４号公報等に記載されている公知のシアニン系化合物の製造方法に準じて合成することができ、更に市販のシアニン系化合物から適宜公知の手法により半合成することもできる。より具体的には、ジアニル化合物とヘテロ環４級塩との反応により合成することができる。
【００４６】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、以下の方法により合成され、その他の化合物も同様に合成することができる。
【００４７】
化合物Ｎｏ．３の合成
Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．３９，２，２００２，２５２〜２６２を参照して合成した４．２ｇのヘテロ環４級塩化合物Ｑ−１に、酢酸２０ｍｌ、トリエチルアミン３ｇ、ジアニル化合物Ｄ−１を１．５８ｇ、及び無水酢酸３ｇを加えて室温で６時間攪拌した。不溶物を濾過して除き、室温下に減圧留去濃縮した濾液に酢酸ナトリウム２ｇを溶解したメタノール溶液１５ｍｌを加え、室温で１時間攪拌した後、生じた結晶を濾取し、少量のメタノールで洗浄した。得られた粗結晶２．７ｇを１５ｍｌの水に溶かし、酢酸ナトリウム１ｇを加えた後、メタノール３０ｍｌを加え、１時間攪拌した。生じた結晶を濾取し、少量のメタノールで洗浄し、乾燥して２．２ｇの化合物Ｎｏ．３を得た。吸収極大波長（ＭｅＯＨ）：７７１ｎｍ、モル吸光係数（ＭｅＯＨ）：２６０，０００。
【００４８】
【化１２】
2005120026.tif 000013
【００４９】
本発明の化合物に使用可能な塩は、一般式（Ｉ）の化合物と非毒性の塩を形成するものであるばよい。それらの例としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のようなアルカリ土類金属塩、トリプトファン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、アルギニン等の塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。特に好ましいのは生体内での毒性が低いナトリウム塩である。
【００５０】
本発明の近赤外蛍光造影剤は、血管（静脈、動脈）内、経口内、腹腔内、皮下、皮内、膀胱内、気管（支）内等へ注入、噴霧もしくは塗布等の手段により生体内に投与することができる。本発明の近赤外蛍光造影剤の投与量は、最終的に診断する部位を検出できる量であれば特に限定されず、使用する近赤外蛍光を発する化合物の種類、投与される対象の年齢や身体の大きさ及び標的とする臓器等によって適宜増減できるが、通常、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは０．５〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重の範囲の投与である。
【００５１】
本発明の近赤外蛍光造影剤は動物用の造影剤としても好適に用いることができ、その投与形態、投与経路、投与量等は対象となる動物の体重や状態によって適宜選択する。
【００５２】
本発明の近赤外造影剤は、ある濃度において腫瘍組織に集積し、ある濃度以下になると体外に排出されやすくなる性質を有し、その特性を利用して腫瘍組織を、選択的、且つ特異的に造影することが可能な蛍光造影剤として使用できる。また、本発明の化合物は血管内に一旦注入されると血管壁外に拡散しにくく、血管内に留まる性質が高く、血管造影剤としても使用できる。
【００５３】
本発明に係る蛍光造影方法は、本発明の近赤外蛍光造影剤を用いることを特徴とする。その測定方法は当業者には公知の方法を用いて行われ、励起波長、検出のための蛍光波長等の各条件は、最適で最高の検出能状態を得るために、投与する蛍光造影剤の種類、投与する対象等に応じて適宜決定される。本発明の近赤外蛍光造影剤を測定対象物に投与してから、本発明に係る蛍光造影方法を用いて測定を開始するのに要する時間も、投与する蛍光造影剤の種類、投与する対象等によって異なるが、例えば、腫瘍や癌造影を目的として投与する場合には、投与後１０分〜６時間程度の経過時間を選択することが好ましい。経過時間が短すぎると、全体に蛍光が偏在して目的とする部位とそれ以外の部位との識別が困難であり、長すぎると当該造影剤が体外に排泄されてしまう。血管造影を目的とする場合には投与直後〜１時間の経過時間で測定することが好ましい。
【００５４】
本発明に使用する近赤外蛍光造影剤を測定対象物に投与した後、励起光源により励起光を測定対象物へ照射し、該励起光により生じる蛍光造影剤からの蛍光を蛍光検出器で検出する。励起するための波長は、使用する蛍光造影剤によって異なり、本発明の化合物が効率よく蛍光を発すればとくに限定されないが、好ましくは生体透過性に優れた近赤外光が用いられる。通常６００〜１０００ｎｍ、好ましくは７００〜８５０ｎｍの波長の励起光で励起し、蛍光を高感度に検出する。この場合、蛍光励起光源としては、各種レーザー光源、例えば、イオンレーザー、色素レーザー、半導体レーザー等、或いはハロゲン光源、キセノン光源等の通常の励起光源を使用してもよく、更に最適な励起波長を得るために各種光学フィルターを使用することができる。同様に、蛍光の検出に際しても、蛍光造影剤からの蛍光のみを選択する各種光学フィルターを使用して、蛍光の検出感度を高めることができる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００５６】
（乳癌発癌モデルマウスの作製）
乳癌発癌モデルマウスの作出老化促進マウス、所謂ＳＡＭ系の１系統であるＳＡＭＰ６／Ｔａ系マウスに乳癌を発症させるために発癌物質７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を投与して乳癌発癌モデルマウスを作出した。マウスの発癌方法は、特開２００３−３３１２５号公報に準じて行った。
【００５７】
ＳＡＭＰ６／Ｔａ系マウスを各２０匹に、ＤＭＢＡを０．５ｍｇ／マウス／週で計６回投与した。飼料としては高タンパク質高カロリーのＣＡ−１固形（日本クレア社製）を与えた。発癌物質の第６回目の投与の後、第１回目投与から起算して第２０週迄までを休薬期間とした。乳癌及び乳癌の肺転移を病理組織学的に検索した。ＤＭＢＡを１週間隔で６回投与し、その後の投与開始より第２０週目まで休薬し、乳癌発生したマウス（乳癌発生率７５％）を使用した。
【００５８】
（蛍光造影試験）
乳癌マウスの腫瘍組織断片（２ｍｍ×２ｍｍ角辺）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５週齢、クレアジャパン社）の左胸部の乳房部皮下に移植した。１０日後、腫瘍が直径約５ｍｍに成長した時点で上記マウスを試験に供した。蛍光励起光源としてチタンサファイアレーザーを使用した。照射の分散が２％以内になるように、リングタイプの光ガイド（住田光学グラス社）を用いて試験用マウスにレーザー光を均一に照射した。照射出力はマウスの皮膚表面付近で約３６μＷ／ｃｍ2になるように調整した。蛍光は各化合物の最大励起波長で励起させ、マウスからの蛍光放射をＣＣＤカメラ（Ｃ４８８０、浜松フォトニクス社）を用いて短波長カットフィルターを通して検出及び造影した。カットフィルターは化合物の励起波長（８００〜９００ｎｍ）に適合するように選択した。照射時間は各化合物の蛍光強度によって調整した。
【００５９】
表１記載の各試験化合物を生理食塩水に（０．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度になるよう溶解し、マウスに尾血管から投与した。用量は各１ｍｇ／ｋｇであった。化合物投与の１２分後にマウスをジエチルエーテルで麻酔し、マウス全身の蛍光イメージを造影した。センサーは蛍光光度計（日本分光ＦＰ−７５０）のフォトダイオード（波長範囲２２０〜７３０ｎｍ）を使用した。
【００６０】
蛍光相対感度は、比較（１０２）の腫瘍部の蛍光強度を１００とした場合の各近赤外造影剤の腫瘍部の蛍光強度で表した。造影剤の血中残存量は、造影剤投与後の化合物の体内量（１ｍｇ／ｋｇ）を１００とし、１時間後、２４時間後、４８時間後の血漿中の濃度を、液体クロマトグラフ２０１０Ａ（島津製作所社製）から求めた。結果を表１に示す。尚、比較用造影剤として、特開２０００−９５７５８号公報記載のインドシアニングリーン（Ｃ−１）と特開２００３−２６１４６４号公報記載の（Ｃ−２）、（Ｃ−３）を使用した。
【００６１】
【化１３】
2005120026.tif 000014
【００６２】
化合物の水溶性試験は、試料０．５ｍｇを０．９％の生理的食塩水で１ｍｌに仕上げ溶解し、暗所で４０℃の保存温度で２週間静置放置し、析出、沈殿物を確認した。全くないレベルを◎、わずかヘイズがかかって見られるが、攪拌により消失してしまうレベルを○、ヘイズがかかっているが、攪拌では消失しないレベルを△、析出してしまうレベルを×として評価した。
【００６３】
【表１】
2005120026.tif 000015
【００６４】
表１より、本発明の化合物は生体組織の透過性に優れた蛍光を放射するとともに、水溶性、排出性に優れていることが分かる。