(57)【要約】【課題】複数の走査光学系のいずれからの光ビームについても共焦点走査画像を得ることのできる走査型レーザー顕微鏡を提供する。【解決手段】走査型レーザー顕微鏡１００は、標本１０５が載置されるステージ１０１と、ステージ１０１に載置された標本１０５に対して第一光ビームを走査する第一走査光学系Ａと、ステージ１０１に載置された標本１０５に対して第二光ビームを走査する第二走査光学系Ｂと、共焦点走査画像を得るための検出光学系Ｃを備えている。検出光学系Ｃは、共焦点ピンホール１３３と、共焦点ピンホール１３３を通過した蛍光を検出する光検出器１３４とを備えている。走査型レーザー顕微鏡１００は、さらに、共焦点ピンホール１３３を検出光学系Ｃの光軸にほぼ直交する方向に移動させるためのＸＹ微動ステージ１３５を備えている。【選択図】      図１
2005189290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に対して光ビームを走査するための複数の走査光学系と、
標本の共焦点走査画像を得るための少なくとも一つの検出光学系とを備えており、
走査光学系は、それぞれ、光ビームを発するレーザー光源と、光ビームを走査する走査光学ユニットとを有しており、
検出光学系は、複数の走査光学系の一つの走査光学ユニットを介して標本と光学的に結合されており、共焦点ピンホールと、共焦点ピンホールを通過した光を検出する光検出器とを有しており、
複数の走査光学系のうちの所望の一つの走査光学系の共焦点位置と検出光学系の共焦点ピンホールの位置とを一致させるための共焦点位置調整手段をさらに備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、共焦点位置調整手段は、共焦点ピンホールを検出光学系の光軸にほぼ直交する方向に移動させるピンホール移動手段を備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項３】
請求項２において、走査光学系ごとの共焦点ピンホールの位置を記憶しておくとともに、走査光学系の振幅と周期を同一にするための制御手段とを備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項４】
請求項３において、制御手段に対して情報を入力するための入力手段をさらに備えており、制御手段は、入力された情報に対応する共焦点ピンホールの位置を読み出して、その位置に共焦点ピンホールを配置するようにピンホール移動手段を制御する、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項５】
請求項１において、共焦点位置調整手段は、共焦点ピンホールに向かう光ビームの光路を横切って配置された平行平面板と、検出光学系の光軸に対する平行平面板の傾斜角度を調整するための角度調整手段とを備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項６】
請求項５において、走査光学系ごとの平行平面板の傾斜角度を記憶しておくとともに、走査光学系の振幅と周期を同一にするための制御手段とを備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項７】
請求項６において、制御手段に対して情報を入力するための入力手段をさらに備えており、制御手段は、入力された情報に対応する平行平面板の傾斜角度を読み出し、その傾斜角度に平行平面板の傾斜角度を合わせるように角度調整手段を制御する、走査型レーザー顕微鏡。
【請求項８】
請求項１において、走査光学系は、それぞれ、レーザー光源からの光ビームを適宜遮断する遮断手段を備えている、走査型レーザー顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザー顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型レーザー顕微鏡は、レーザー光ビームを走査し光学系と対物レンズを介して標本のＸ軸、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、標本からの蛍光または反射光を再び対物レンズと走査光学系を介して検出器で検出して蛍光または反射光の二次元の輝度情報を得る顕微鏡である。また、この輝度情報をＸ−Ｙ走査位置に対応させてディスプレイなどに輝点の二次元分布として表示することによって、標本の蛍光像または反射光像を観察することも可能である。このレーザー顕微鏡の内、共焦点走査型レーザー顕微鏡は、検出光学系の標本と共役な位置に被測定光の回折限界程度の径の開口を持つ絞りを設けることによって、焦点の合っている面の情報のみを検出するものである。この共焦点走査型レーザー顕微鏡は、合焦面の情報だけを検出できるので、三次元情報を得ることができる。また、非合焦面の情報をカットすることによって、極めてシャープな画像を得ることができる。
【０００３】
さらに、最近では標本内の特定部位にイオン物質を出現させることができるケージド試薬が提案されている。ケージド試薬は空と異なるケージド基の中に、イオン物質を包含させたもので、標本内に注入した後、紫外線を照射することによってケージド基が開裂するため、所望の特定部位にイオン物質を出現させることができる。
【０００４】
特開平１０−２０６７４２号公報は、蛍光指示薬とケージド試薬とを標本内に導入し、特定部位のケージド試薬を開裂させ、蛍光指示薬からの蛍光を観察する装置を開示している。この装置は、蛍光指示薬を励起して蛍光像を得るための走査光学系と、ケージド試薬を開裂させるための走査光学系とを備えている。
【０００５】
また、特開平２０００−２７５５２９号公報は、標本面への走査を精度良く行なうため、複数の走査光学系の走査を同期させることを開示している。
【特許文献１】特開平１０−２０６７４２号公報
【特許文献２】特開平２０００−２７５５２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、このような公知の装置では、複数の走査光学系のうち一つ以外の走査光学系はすべて標本刺激用として使用されている。このため、それらの走査光学系を用いた共焦点走査画像を得ることができない。
【０００７】
特開平１０−２０６７４２号公報に開示されている装置は、蛍光指示薬を励起して蛍光像を得るための走査光学系（第一走査光学系）と、ケージド試薬を開裂させるための走査光学系（第二走査光学系）と、共焦点ピンホールとこれを通過した光を検出する光検出器を含む検出光学系とを備えている。共焦点ピンホールは第一走査光学系に対して位置調整されている。第二走査光学系の光軸は、ダイクロイックミラーによって、第一走査光学系の光軸に結合されている。
【０００８】
通常、ダイクロイックミラーの組み付けは角度誤差を伴う。ダイクロイックミラーの組み付け角度誤差があると、第一走査光学系の光軸と第二走査光学系の光軸は完全には一致しない。従って、第一走査光学系の光ビームの照射位置と第二走査光学系の光ビームの照射位置とは異なる。
【０００９】
その結果、第二走査光学系の光ビームの照射によって発生した標本からの蛍光は、第一走査光学系に対して適切な位置に配置されている共焦点ピンホールを通ることができない。つまり、第二走査光学系による蛍光は、共焦点ピンホールでけられてしまうため、共焦点ピンホールの後方に配置された光検出器で検出できない。
【００１０】
ここでは、ダイクロイックミラーの組み付け誤差について述べたが、第二走査光学系の組み付け誤差によっても、共焦点位置はずれる。また、複数のダイクロイックミラーを切り換えて使用する構成では、ダイクロイックミラーごとに組み付け誤差が異なるため、選択されたダイクロイックミラーに応じて共焦点位置が変わる。
【００１１】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、複数の走査光学系のいずれからの光ビームについても共焦点走査画像を得ることのできる走査型レーザー顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の走査型レーザー顕微鏡は、標本に対して光ビームを走査するための複数の走査光学系と、標本の共焦点走査画像を得るための少なくとも一つの検出光学系とを備えている。走査光学系は、それぞれ、光ビームを発するレーザー光源と、光ビームを走査する走査光学ユニットとを有している。検出光学系は、複数の走査光学系の一つの走査光学ユニットを介して標本と光学的に結合されている。検出光学系は、共焦点ピンホールと、共焦点ピンホールを通過した光を検出する光検出器とを有している。走査型レーザー顕微鏡は、さらに、複数の走査光学系のうちの所望の一つの走査光学系の共焦点位置と検出光学系の共焦点ピンホールの位置とを一致させるための共焦点位置調整手段を備えている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の走査型レーザー顕微鏡によれば、複数の走査光学系のいずれからの光ビームについても共焦点走査画像を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
第一実施形態
図１は、本発明の第一実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。走査型レーザー顕微鏡１００は、標本１０５が載置されるステージ１０１と、ステージ１０１に載置された標本１０５に対して第一光ビームを走査する第一走査光学系Ａと、ステージ１０１に載置された標本１０５に対して第二光ビームを走査する第二走査光学系Ｂとを備えている。
【００１６】
第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂは、ステージ１０１の上方に配置された対物レンズ１０２と結像レンズ１０３を共通に含んでいる。
【００１７】
第一走査光学系Ａは、さらに、第一光ビームを射出する第一レーザー光源部１１１と、第一レーザー光源部１１１からの第一光ビームを適宜遮断するための第一レーザーシャッター１１２と、第一光ビームを偏向するためのダイクロイックミラー部１１３と、第一光ビームを走査するための第一走査光学ユニット１１４と、第一光ビームを収束させる瞳投影レンズ１１５と、第一光ビームを対物レンズ１０２と結像レンズ１０３に方向付けるミラー１１６とを備えている。
【００１８】
第一走査光学ユニット１１４は、例えば、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー１１４ａと、可変ミラー１１４ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー１１４ｂとを備えている。
【００１９】
第二走査光学系Ｂは、第二光ビームを射出する第二レーザー光源部１２１、第二レーザー光源部１２１からの第二光ビームを適宜遮断するための第二レーザーシャッター１２２、第二光ビームを走査するための第二走査光学ユニット１２４、第二光ビームを収束させる瞳投影レンズ１２５と、第一光ビームを対物レンズ１０２と結像レンズ１０３に方向付けるためのダイクロイックミラー部１２７とを備えている。
【００２０】
第二走査光学ユニット１２４は、例えば、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー１２４ａと、可変ミラー１１４ａの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー１２４ｂとを備えている。
【００２１】
第一レーザーシャッター１１２と第二レーザーシャッター１２２は、例えば、一般に広く知られている機械的なシャッターで構成されるが、これに限定されるものではなく、ＡＯＴＦなどの音響光学素子、電気光学素子（ＥＯＭ）、液晶シャッターなどで構成されてもよい。
【００２２】
第二走査光学系Ｂの光軸はダイクロイックミラー部１２７によって第一走査光学系Ａの光軸に合成されている。つまり、ダイクロイックミラー部１２７とステージ１０１の間では、第一走査光学系Ａの光軸と第二走査光学系Ｂの光軸はほぼ一致している。
【００２３】
ここで、第一走査光学系Ａの光軸は、第一レーザー光源部１１１から射出され、ステージ１０１に載置された標本１０５に到達する第一光ビームが通る経路を意味し、第二走査光学系Ｂの光軸は、第二レーザー光源部１２１から射出され、ステージ１０１に載置された標本１０５に到達する第二光ビームが通る経路を意味している。
【００２４】
第一走査光学系Ａの瞳投影レンズ１１５の焦点位置は、第一走査光学系Ａの光路上における結像レンズ１０３の焦点位置と一致するように配置されている。同様に、第二走査光学系Ｂの瞳投影レンズ１２５の焦点位置は、第二走査光学系Ｂの光路上における結像レンズ１０３の焦点位置と一致するように配置されている。
【００２５】
第一レーザー光源部１１１は、一つのレーザー光源で構成されてもよいが、好ましくは複数のレーザー光源を含んでいる。このため、ダイクロイックミラー部１１３は、第一レーザー光源部１１１内の複数のレーザー光源にそれぞれ対応している複数のダイクロイックミラーを含んでいる。第一レーザー光源部１１１内の使用されるレーザー光源に対応しているダイクロイックミラーが選択的に光路上に配置される。
【００２６】
同様に、第二レーザー光源部１２１も、一つのレーザー光源で構成されてもよいが、好ましくは複数のレーザー光源を含んでいる。このため、ダイクロイックミラー部１２７は、第二レーザー光源部１２１内の複数のレーザー光源にそれぞれ対応している複数のダイクロイックミラーを含んでいる。第二レーザー光源部１２１内の使用されるレーザー光源に対応しているダイクロイックミラーが選択的に光路上に配置される。
【００２７】
ダイクロイックミラー部１１３とダイクロイックミラー部１２７は同じ構成をしている。図２は、ダイクロイックミラー部の構成を模式的に示している。図２に示されるように、ダイクロイックミラー部は、複数のダイクロイックミラー１５１と、ダイクロイックミラー１５１を支持している支持台１５２と、支持台１５２を回転させるためのモーター１５３と、支持台１５２の移動を検出したときにダイクロイックミラー１５１の切り換えの認識信号を出力するダイクロイックミラー切換認識用センサー１５４とを備えている。
【００２８】
ダイクロイックミラー１５１は、ハーフミラーなどのビームスプリッターであってもよい。
【００２９】
走査型レーザー顕微鏡１００は、さらに、標本１０５の共焦点走査画像を得るための検出光学系Ｃを備えている。検出光学系Ｃは、標本１０５で発生した蛍光を選択的に透過する測光フィルター１３１と、標本１０５からの蛍光ビームを収束させるレンズ１３２と、共焦点ピンホール１３３と、共焦点ピンホール１３３を通過した蛍光を検出する光検出器１３４とを備えている。光検出器１３４は例えば光電変換素子で構成される。
【００３０】
検出光学系Ｃは、第一走査光学系Ａの第一走査光学ユニット１１４を介して標本１０５と光学的に結合されている。言い換えれば、検出光学系Ｃの光軸はダイクロイックミラー部１１３によって第一走査光学系Ａの光軸と合成されている。つまり、ダイクロイックミラー部１１３と標本１０５の間では、検出光学系Ｃの光軸と第一走査光学系Ａの光軸はほぼ一致している。
【００３１】
ここで、検出光学系Ｃの光軸は、ステージ１０１に載置された標本１０５から発生し、共焦点ピンホール１３３を通過して光検出器１３４に到達する蛍光が通る経路を意味している。
【００３２】
このため、ダイクロイックミラー部１１３は、第一レーザー光源部１１１からの第一光ビームは反射するが、標本１０５で発生した蛍光は透過する。つまり、ダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーは、第一レーザー光源部１１１内の対応するレーザー光源が発する光は反射するが、第一レーザー光源部１１１内の対応するレーザー光源からの光によって発生された蛍光と第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源からの光によって発生された蛍光は透過する。
【００３３】
走査型レーザー顕微鏡１００は、さらに、共焦点ピンホール１３３を検出光学系Ｃの光軸にほぼ直交する方向に移動させるためのＸＹ微動ステージ１３５を備えている。ＸＹ微動ステージ１３５は、第一走査光学系と第二走査光学系の所望の一つの共焦点位置と検出光学系Ｃ内の共焦点ピンホール１３３の位置とを一致させる共焦点位置調整手段を構成している。
【００３４】
ここで、走査光学系の共焦点位置とは、その走査光学系によって走査される光ビームの収束点から発生した蛍光が、第一走査光学系Ａの第一走査光学ユニット１１４を介して検出光学系Ｃによって収束される点の位置である。
【００３５】
走査型レーザー顕微鏡１００は、さらに、コントロールユニット１４１と、情報を表示するためのディスプレイ１４２と、コントロールユニット１４１に対して情報を入力するための入力手段１４３とを備えている。
【００３６】
コントロールユニット１４１は、第一レーザーシャッター１１２と第二レーザーシャッター１２２の開閉制御、第一走査光学ユニット１１４と第二走査光学ユニット１２４の走査制御、ＸＹ微動ステージ１３５の移動制御、ダイクロイックミラー部１１３とダイクロイックミラー部１２７の切り換え制御を行なったり、光検出器１３４、ダイクロイックミラー部１１３、ダイクロイックミラー部１２７、入力手段１４３から情報を取得したり、ディスプレイ１４２に情報を出力したり、共焦点ピンホール１３３の位置を記憶したりする。
【００３７】
以下、走査型レーザー顕微鏡１００の動作について述べる。
【００３８】
標本１０５は、第一レーザー光源部１１１からの光によって励起される蛍光指示薬と、第二レーザー光源部１２１からの光によって励起される蛍光指示薬とが導入され、ステージ１０１上に配置される。
【００３９】
第一レーザー光源部１１１からの第一光ビームは、第一レーザーシャッター１１２が開状態であれば第一レーザーシャッター１１２を通過し、ダイクロイックミラー部１１３によって第一走査光学ユニット１１４へ導かれ、第一走査光学ユニット１１４によって任意の方向に走査される。第一光ビームは、さらに、瞳投影レンズ１１５、ミラー１１６、ダイクロイックミラー部１２７、結像レンズ１０３、対物レンズ１０２を介して、標本１０５の断面１０６上に収束される。第一光ビームの収束点は、第一走査光学ユニット１１４によって断面１０６上を二次元走査される。
【００４０】
第一光ビームが断面１０６上を走査されることによって、標本１０５内の蛍光指示薬が励起されて蛍光が発生する。対物レンズ１０２によって捕らえられた蛍光は、第一光ビームと同じ光路を逆向きに進み、結像レンズ１０３、ダイクロイックミラー部１２７を透過し、ミラー１１６、瞳投影レンズ１１５、第一走査光学ユニット１１４を介してダイクロイックミラー部１１３へ導かれる。蛍光は、ダイクロイックミラー部１１３によって透過され、検出光学系Ｃへ導入される。
【００４１】
検出光学系Ｃにおいて、蛍光は、測光フィルター１３１によって特定の波長成分が選択的に透過され、レンズ１３２と共焦点ピンホール１３３によって断面１０６からの光のみが選択されて、光検出器１３４へ入射する。
【００４２】
光検出器１３４からの出力信号は、コントロールユニット１４１へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置に対応してディスプレイ１４２上に表示される。表示された画像は、断面１０６での蛍光画像（蛍光輝度の二次元分布）、すなわち所望のイオン濃度の断面１０６内での分布を示している。
【００４３】
一方、第二レーザー光源部１２１からの第二光ビームは、第二レーザーシャッター１２２が開状態であれば第二レーザーシャッター１２２を通過し、第二走査光学ユニット１２４、瞳投影レンズ１２５、ダイクロイックミラー部１２７を介して第一走査光学系Ａからの光軸と合成される。第二光ビームは、結像レンズ１０３と対物レンズ１０２を透過して、標本１０５の断面１０６上に収束される。
【００４４】
このときの、断面１０６上での第二光ビームの照射位置は、コントロールユニット１４１によって第二走査光学ユニット１２４を制御することによって、第一走査光学系の走査位置とは独立に選択することができる。
【００４５】
第二光ビームが断面１０６上を走査されることによって、標本１０５内の蛍光指示薬が励起されて蛍光が発生する。対物レンズ１０２によって捉えられた蛍光は、第一走査光学系Ａの第一光ビームの照射によって発生した蛍光と同様の経路を通り、光検出器１３４に入射する。
【００４６】
光検出器１３４からの蛍光輝度信号はコントロールユニット１４１でＡ／Ｄ変換され蛍光画像としてディスプレイ１４２へ出力して表示される。
【００４７】
次に、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正について述べる。つまり、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの共焦点位置と共焦点ピンホール１３３の位置とをそれぞれ一致させる動作について説明する。
【００４８】
まず、第二走査光学系Ｂの共焦点位置と共焦点ピンホール１３３の位置とを一致させる場合について説明する。
【００４９】
コントロールユニット１４１からの第一走査光学ユニット１１４と第二走査光学ユニット１２４の制御信号を調整して、第一走査光学ユニット１１４と第二走査光学ユニット１２４の振幅と周期を同一にする。
【００５０】
コントロールユニット１４１からの信号によって第一レーザーシャッター１１２を閉じ、第二走査光学系Ｂからの第二光ビームだけが標本１０５に照射されるようにする。コントロールユニットからの信号によってダイクロイックミラー部１１３とダイクロイックミラー部１２７内のモーター１５３を駆動して所望のダイクロイックミラー１５１に切り換える。
【００５１】
コントロールユニット１４１は、ダイクロイックミラー切換認識用センサー１５４からの切り換えの認識信号を受けると、光検出器１３４から出力される光量信号をモニターしながらＸＹ微動ステージ１３５を駆動して共焦点ピンホール１３３をＸＹ方向に例えば一定のパターンに従ってスライド移動させて、光検出器１３４で検出される光量が最も大きくなるピンホール位置を探し出す。
【００５２】
さらに、コントロールユニット１４１は、探し出したピンホール位置を、そのとき使用されている、ダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーと第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とに対応させて記憶する。
【００５３】
記憶されたピンホール位置は、それに対応するダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーと第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とが入力手段１４３から設定された際にコントロールユニット１４１によって読み出され、コントロールユニット１４１は、ＸＹ微動ステージ１３５を駆動して共焦点ピンホール１３３の位置を、呼び出したピンホール位置に合わせる。
【００５４】
入力手段１４３から設定されたダイクロイックミラーとレーザー光源の組み合わせが新しい場合には、前述した動作に従って、そのダイクロイックミラーとレーザー光源の組み合わせに対応した新しいピンホール位置を探し出して記憶する。
【００５５】
第一走査光学系Ａの共焦点位置の補正は、第二レーザーシャッター１２２を閉じ、第一レーザーシャッター１１２を開く点が異なるだけで、そのほかは第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正と同様である。
【００５６】
このように使用する走査光学系と使用するレーザー光源とに応じて共焦点ピンホール１３３の位置を調節することによって、第一走査光学系Ａの第一光ビームについての共焦点走査画像と第二走査光学系Ｂの第二光ビームについての共焦点走査画像とを取得することができる。
【００５７】
図３は、第一走査光学系Ａを用いて得られる共焦点走査画像範囲１６１と、第二走査光学系Ｂを用いて得られる共焦点走査画像範囲１６２とを示している。
【００５８】
また、例えば第二走査光学系Ｂによる第二光ビームの走査の間、第二レーザーシャッター１２２の開閉を制御して第二光ビームを適宜遮断することによって、標本１０５に対する光ビームの照射領域を調整することもできる。これにより、取得する共焦点走査画像範囲を制限することができる。図４は、このような制御において第二走査光学系Ｂを用いて得られる共焦点走査画像範囲１６４を示している。共焦点走査画像範囲１６４は、第二走査光学系Ｂの第二光ビームの走査範囲１６３のうち、第二レーザーシャッター１２２が開いている状態に対応している。
【００５９】
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡１００によれば、使用する走査光学系と使用するレーザー光源とに応じて共焦点ピンホール１３３の位置を調節することによって、一つの検出光学系で第一走査光学系Ａによる共焦点走査画像と第二走査光学系Ｂによる共焦点走査画像とを取得することができる。
【００６０】
言い換えれば、本実施形態によれば、既存の走査型レーザー顕微鏡１００に別の走査光学系を追加し、その走査光学系を用いて共焦点走査画像を取得することができる。従って、新しく開発された蛍光色素に対してその蛍光色素を励起するための走査光学系を新しく付け加える場面において良好に適用できる。
【００６１】
第二実施形態
図５は、本発明の第二実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。図５において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６２】
図５に示されるように、本実施形態の走査型レーザー顕微鏡２００は、検出光学系Ｃに加えて、標本１０５の共焦点走査画像を得るための別の検出光学系Ｄをさらに備えている。検出光学系Ｄは、共焦点ピンホール２３３と、共焦点ピンホール２３３を通過した蛍光を検出する光検出器２３４と、ダイクロイックミラー部２３６とを備えている。光検出器２３４は、光検出器１３４と同様に、例えば光電変換素子で構成される。
【００６３】
検出光学系Ｄの光軸はダイクロイックミラー部２３６によって検出光学系Ｃの光軸と合成されている。つまり、ダイクロイックミラー部２３６と標本１０５の間では、検出光学系Ｃの光軸と検出光学系Ｄの光軸はほぼ一致している。
【００６４】
ここで、検出光学系Ｄの光軸は、ステージ１０１に載置された標本１０５から発生し、共焦点ピンホール２３３を通過して光検出器２３４に到達する蛍光が通る経路を意味している。
【００６５】
ダイクロイックミラー部２３６は、第一走査光学系Ａによる第一光ビームの照射によって標本１０５から発生した蛍光と、第二走査光学系Ｂによる第二光ビームの照射によって標本１０５から発生した蛍光とを分離する。例えば、ダイクロイックミラー部２３６は、第一走査光学系Ａからの第一光ビームによって発生した蛍光は透過し、第二走査光学系Ｂからの第二光ビームによって発生した蛍光は反射する。
【００６６】
そのため、ダイクロイックミラー部２３６は、第一走査光学系Ａの第一レーザー光源部１１１内のレーザー光源と第二走査光学系Ｂ内の第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源との組み合わせに対応している複数のダイクロイックミラーを含んでいる。第一レーザー光源部１１１内の使用されるレーザー光源と第二レーザー光源部１２１内の使用されるレーザー光源との組み合わせに対応しているダイクロイックミラーが選択的に光路上に配置される。
【００６７】
ダイクロイックミラー部２３６の構成は、ダイクロイックミラー部１１３またはダイクロイックミラー部１２７と同様である。
【００６８】
また、走査型レーザー顕微鏡２００は、第一実施形態のコントロールユニット１４１に代えて、コントロールユニット２４１を備えている。そのほかの構成は、第一実施形態と同じである。
【００６９】
コントロールユニット２４１は、第一実施形態のコントロールユニット１４１の機能に加えて、さらに、ＸＹ微動ステージ２３５を移動制御したり、ダイクロイックミラー部２３６を切り換え制御したり、光検出器２３４とダイクロイックミラー部２３６から情報を取得したり、共焦点ピンホール２３３の位置を記憶したりする機能を有している。
【００７０】
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡２００では、例えば、第一走査光学系Ａによる第一光ビームの照射によって標本１０５から発生した蛍光を検出光学系Ｃによって検出する動作と同時に、第二走査光学系Ｂによる第二光ビームの照射によって標本１０５から発生した蛍光を検出光学系Ｄによって検出することができる。
【００７１】
以下、第一走査光学系Ａによって発生された蛍光を検出光学系Ｃで検出すると同時に、第二走査光学系Ｂによって発生された蛍光を検出光学系Ｄで検出する動作について説明する。
【００７２】
第一レーザーシャッター１１２と第二レーザーシャッター１２２が共に開かれる。第一走査光学ユニット１１４と第二走査光学ユニット１２４は振幅と周期が同一に調整される。
【００７３】
第一レーザー光源部１１１からの第一光ビームは、第一レーザーシャッター１１２を通過し、ダイクロイックミラー部１１３で偏向され、第一走査光学ユニット１１４、瞳投影レンズ１１５、ミラー１１６、ダイクロイックミラー部１２７、結像レンズ１０３、対物レンズ１０２を通り、標本１０５の断面１０６上に収束される。第一光ビームの収束点は、第一走査光学ユニット１１４によって断面１０６上を二次元走査される。
【００７４】
第一光ビームの照射によって標本１０５内の対応する蛍光指示薬が励起されて蛍光が発生する。対物レンズ１０２によって捕らえられた蛍光は、結像レンズ１０３、ダイクロイックミラー部１２７、ミラー１１６、瞳投影レンズ１１５、第一走査光学ユニット１１４、ダイクロイックミラー部１１３、測光フィルター１３１、レンズ１３２を通り、ダイクロイックミラー部２３６を透過し、共焦点ピンホール１３３に到達する。断面１０６からの蛍光だけが、共焦点ピンホール１３３を通過し、光検出器１３４に入射する。
【００７５】
光検出器１３４からの出力信号は、コントロールユニット２４１によって、第一走査光学ユニット１１４による走査位置に同期させて処理され、標本１０５の断面１０６の蛍光画像（蛍光輝度の二次元分布）が形成される。蛍光画像はディスプレイ１４２に表示される。
【００７６】
一方、第二レーザー光源部１２１からの第二光ビームは、第二レーザーシャッター１２２、第二走査光学ユニット１２４、瞳投影レンズ１２５を通り、ダイクロイックミラー部１２７で偏向され、結像レンズ１０３、対物レンズ１０２を通り、標本１０５の断面１０６上に収束される。第二光ビームの収束点は、第二走査光学ユニット１２４によって断面１０６上を二次元走査される。
【００７７】
第二光ビームの照射位置は、第二走査光学ユニット１２４によって、第一走査光学ユニット１１４による第一光ビームの照射位置とは独立に設定される。
【００７８】
第二光ビームの照射によって標本１０５内の対応する蛍光指示薬が励起されて蛍光が発生する。対物レンズ１０２によって捕らえられた蛍光は、結像レンズ１０３、ダイクロイックミラー部１２７、ミラー１１６、瞳投影レンズ１１５、第一走査光学ユニット１１４、ダイクロイックミラー部１１３、測光フィルター１３１、レンズ１３２を通り、ダイクロイックミラー部２３６で偏向され、共焦点ピンホール２３３に到達する。断面１０６からの蛍光だけが、共焦点ピンホール２３３を通過し、光検出器２３４に入射する。
【００７９】
光検出器２３４からの出力信号は、コントロールユニット２４１によって、第二走査光学ユニット１２４による走査位置に同期させて処理され、標本１０５の断面１０６の蛍光画像（蛍光輝度の二次元分布）が形成される。蛍光画像はディスプレイ１４２に表示される。
【００８０】
本実施形態においても、第一レーザー光源部１１１と第二レーザー光源部１２１でのレーザー光源の切り換えと、ダイクロイックミラー部１１３とダイクロイックミラー部１２７とダイクロイックミラー部２３６でのダイクロイックミラーの切り換えとに応じて、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正、すなわち、共焦点ピンホール１３３と共焦点ピンホール２３３の位置調整が行なわれる。
【００８１】
第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正は、第一実施形態と同様に行なわれる。
【００８２】
例えば、第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正は、光検出器２３４から出力される光量信号をモニターしながらＸＹ微動ステージ２３５を駆動して共焦点ピンホール２３３をＸＹ方向に例えば一定のパターンに従ってスライド移動させて、光検出器２３４で検出される光量が最も大きくなるピンホール位置を探し出すことによって行なわれる。
【００８３】
そのピンホール位置は、ダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部２３６内のダイクロイックミラーと第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とに対応させて記憶される。
【００８４】
記憶されたピンホール位置は、それに対応するダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーとダイクロイックミラー部２３６内のダイクロイックミラーと第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とが入力手段１４３から設定された際に読み出される。コントロールユニット２４１は、ＸＹ微動ステージ２３５を駆動して共焦点ピンホール２３３の位置を、呼び出したピンホール位置に合わせる。
【００８５】
第一走査光学系Ａの共焦点位置の補正は、共焦点ピンホール２３３の位置調整と同様であり、上述した説明の中の共焦点ピンホール２３３と光検出器２３４とＸＹ微動ステージ２３５と第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とを、それぞれ、共焦点ピンホール１３３と光検出器１３４とＸＹ微動ステージ１３５と第二レーザー光源部１２１内のレーザー光源とに置き換えることによって理解できよう。
【００８６】
このように、本実施形態は、第一実施形態の利点に加えて、二つの蛍光画像を同時に得ることができるという利点を有している。このため、二重染色された試料について同時に異なる色の画像を得ることができる。
【００８７】
本実施形態では、例えば共焦点ピンホール１３３と共焦点ピンホール２３３の位置をそれぞれ第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂに対応させて調整しておき、走査光学系を切り換えに応じて検出光学系を切り換えることによって、第一実施形態では必要であった走査光学系の切り換え時の共焦点ピンホールの位置調整を必要としない。
【００８８】
ここでは、第一走査光学系Ａによって発生された蛍光を検出光学系Ｃで検出し、第二走査光学系Ｂによって発生された蛍光を検出光学系Ｄで検出する動作について説明したが、もちろん、第一走査光学系Ａによって発生された蛍光を検出光学系Ｄで検出し、第二走査光学系Ｂによって発生された蛍光を検出光学系Ｃで検出してもよい。
【００８９】
また、第一走査光学系Ａと第二走査光学系Ｂの一方によって発生された蛍光を検出光学系Ｃと検出光学系Ｄの両方で検出してもよい。
【００９０】
第三実施形態
図６は、本発明の第三実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。図６に示されるように、本実施形態の走査型レーザー顕微鏡３００は、所望の一つの走査光学系の共焦点位置と検出光学系の共焦点ピンホールの位置とを一致させる共焦点位置調整手段として、第一実施形態のＸＹ微動ステージ１３５に代えて、平行平面板ユニット３５０を備えている。また、走査型レーザー顕微鏡３００は、第一実施形態のコントロールユニット１４１に代えて、コントロールユニット３４１を備えている。そのほかの構成は、第一実施形態と同じである。
【００９１】
図７は、図６に示された平行平面板ユニットの一具体例の構成を示している。図７に示されるように、平行平面板ユニット３５０は、共焦点ピンホールに向かう光ビームの光路を横切って配置された平行平面板３５１と、平行平面板３５１をＹ軸周りに回転させるための回転ステージ３５４と、平行平面板３５１をＸ軸周りに回転させるための回転ステージ３５６とを備えている。回転ステージ３５４と回転ステージ３５６は、検出光学系Ｃの光軸に対する平行平面板３５１の傾斜角度を調整するための角度調整手段を構成している。
【００９２】
平行平面板３５１は支持棒３５３を介して回転ステージ３５４に固定されている。回転ステージ３５４は回転軸３５５を介して回転ステージ３５６に固定されている。
【００９３】
平行平面板３５１は回転ステージ３５４の矢印方向の回転に応じて回転中心３５２を中心としてＹ軸周りに回転される。また、平行平面板３５１は回転ステージ３５６の矢印方向の回転に応じて回転ステージ３５４と一緒にＸ軸周りに回転される。
【００９４】
従って、平行平面板３５１は光軸に対して傾斜可能である。光軸に対して傾斜した平行平面板３５１は、光軸に沿って入射した光ビームを、傾斜方向に平行に移動させる。
【００９５】
本実施形態の走査型レーザー顕微鏡３００の動作は、第二走査光学系Ｂの共焦点位置と共焦点ピンホールの位置の補正を除けば、第一実施形態と同様である。以下、第一実施形態と相違している第二走査光学系Ｂの共焦点位置と共焦点ピンホールの位置の補正の仕方について説明する。
【００９６】
本実施形態では、光軸に対する平行平面板３５１の傾斜角度を変化させることによって、平行平面板３５１を通る光ビームを平行移動させることで、所望の走査光学系の共焦点位置を共焦点ピンホール１３３の位置に一致させる。
【００９７】
コントロールユニット１４１は、ダイクロイックミラー切換認識用センサー１５４から切り換えの認識信号を受けると、光検出器１３４から出力される光量信号をモニターしながら平行平面板３５１の傾斜角度を変化させて、共焦点ピンホール１３３を通過して光検出器１３４で検出される光量が最も大きくなる平行平面板３５１の傾斜角度を探し出す。
【００９８】
平行平面板３５１の傾斜角度は例えば一定のパターンに従って変更される。ここでは、光検出器１３４で検出される光量が最も大きくなる平行平面板３５１の傾斜角度を探し出す代わりに、光検出器１３４で検出される光量が所定のしきい値を超える平行平面板３５１の傾斜角度を探し出してもよい。
【００９９】
平行平面板３５１の傾斜角度は、ダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーの種類とダイクロイックミラー部１１３内のダイクロイックミラーの種類と走査光学経路とともに、コントロールユニット１４１に記憶される。この場合では、記憶される走査光学経路は、第二走査光学系Ｂを通って標本に至り、さらに標本から第一走査光学系Ａの走査光学ユニットを通って検出光学系Ｃに至る経路である。
【０１００】
記憶された平行平面板３５１の傾斜角度は、そのときのダイクロイックミラー部１２７内のダイクロイックミラーと走査光学経路の二つの条件がコントロールユニット１４１に入力手段１４３から設定されたときに呼び出され、平行平面板ユニット３５０は平行平面板３５１を記憶された傾斜角度に調節する。
【０１０１】
第一走査光学系Ａの共焦点位置の補正は、第二レーザーシャッター１２２を閉じ、第一レーザーシャッター１１２を開く点が異なるだけで、そのほかは第二走査光学系Ｂの共焦点位置の補正と同様に行なわれる。
【０１０２】
ここでは、平行平面板ユニット３５０が一枚の平行平面板３５１を持っている例をあげたが、平行平面板ユニット３５０は、厚さの異なる複数の平行平面板を持っていてもよい。厚さの異なる平行平面板は、同じ傾斜角度に対して、光ビームを光軸に平行に移動させる量が異なる。具体的には、厚い平行平面板は、薄い平行平面板よりも、光ビームを移動させる。
【０１０３】
平行平面板ユニット３５０が厚さの異なる複数の平行平面板を持っている場合、光ビームを移動させる際には、厚い平行平面板から薄い平行平面板の順に、傾斜角度の調整を行なうとよい。そうすることによって、光ビームを粗く移動させて大まかな調整を行なった後に、光ビームを細かく移動させて微調整を行なうことができる。
【０１０４】
このように、平行平面板ユニット３５０が厚さの異なる複数の平行平面板を持つ構成であれば、共焦点位置の粗微動を行なえる。
【０１０５】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の第一実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。
【図２】ダイクロイックミラー部の構成を模式的に示している。
【図３】第一走査光学系を用いて得られる共焦点走査画像範囲と、第二走査光学系を用いて得られる共焦点走査画像範囲とを示している。
【図４】第二走査光学系の光ビームを適宜遮断して得られる共焦点走査画像範囲を示している。
【図５】本発明の第二実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。
【図６】本発明の第三実施形態の走査型レーザー顕微鏡の光学系のブロック図である。
【図７】図６に示された平行平面板ユニットの一具体例の構成を示している。
【符号の説明】
【０１０７】
１００…走査型レーザー顕微鏡、１０１…ステージ、１０２…対物レンズ、１０３…結像レンズ、１０５…標本、１１１…第一レーザー光源部、１１２…第一レーザーシャッター、１１３…ダイクロイックミラー部、１１４…第一走査光学ユニット、１１５…瞳投影レンズ、１１６…ミラー、１２１…第二レーザー光源部、１２２…第二レーザーシャッター、１２４…第二走査光学ユニット、１２５…瞳投影レンズ、１２７…ダイクロイックミラー部、１３１…測光フィルター、１３２…レンズ、１３３…共焦点ピンホール、１３４…光検出器、１３５…ＸＹ微動ステージ、１４１…コントロールユニット、１４２…ディスプレイ、１４３…入力手段、１５１…ダイクロイックミラー、１５２…支持台、１５３…モーター、１５４…ダイクロイックミラー切換認識用センサー、２００…走査型レーザー顕微鏡、２３３…共焦点ピンホール、２３４…光検出器、２３５…ＸＹ微動ステージ、２３６…ダイクロイックミラー部、２４１…コントロールユニット、３００…走査型レーザー顕微鏡、３４１…コントロールユニット、３５０…平行平面板ユニット、３５１…平行平面板、３５２…回転中心、３５３…支持棒、３５４…回転ステージ、３５５…回転軸、３５６…回転ステージ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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