(57)【要約】【課題】白血病細胞の分化誘導剤、および該分化誘導剤を含む白血病に対する治療薬の提供を課題とする。【解決手段】本発明者らはAML1複合体の機能は、AML1タンパク質のリン酸化により活性化されることを見いだし、AML1タンパク質のリン酸化を制御する特異的なタンパク質リン酸化酵素AML1Kを同定した。AML1Kの活性化剤は、AML1タンパク質のリン酸化を介してAML1複合体を活性化することにより、白血病細胞の分化を誘導できると考えられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの少なくとも１つを含有する、白血病細胞の分化誘導剤。
（ａ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質
（ｂ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＭＬ１Ｋタンパク質変異体であって、ＡＭＬ１Ｋタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、または該タンパク質を発現するベクター
【請求項２】
ＡＭＬ１タンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤。
【請求項３】
ＡＭＬ１タンパク質の機能活性化物質が、ＡＭＬ１タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質、もしくはＡＭＬ１タンパク質リン酸化酵素の活性化物質である、請求項２に記載の白血病細胞の分化誘導剤。
【請求項４】
ＡＭＬ１タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質が、オカダ酸またはCalyculin Aである、請求項３に記載の白血病細胞の分化誘導剤。
【請求項５】
ＡＭＬ１Ｋタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＬ１Ｋ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるＡＭＬ１Ｋタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項８】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＬ１タンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＡＭＬ１タンパク質のリン酸化状態を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項９】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＬ１タンパク質、ＡＭＬ１Ｋタンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＡＭＬ１タンパク質を基質とする、ＡＭＬ１Ｋタンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項１０】
工程（ｂ）において、リン酸化されるＡＭＬ１タンパク質上の部位が、２４９位および／または２７６位のセリン残基である、請求項８または９に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、AML1タンパク質の発現活性化剤または機能活性化剤を含む白血病細胞の分化誘導剤に関する。また、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血病やリンパ腫では、特異的な染色体転座が高い頻度で見られ、その結果生じる融合遺伝子産物の発現やがん遺伝子の発現異常が、ヒト白血病やリンパ腫の発症に関与する（非特許文献１参照）。AML1遺伝子は最も高頻度に染色体転座の標的となり、急性骨髄性白血病のM2サブタイプに高頻度にみられるt(8;21)転座における21番染色体の転座点に位置する遺伝子として同定された（非特許文献２参照）。その他、AML1遺伝子はこれまでにt(3;21)（非特許文献３および４参照）、t(12;21)（非特許文献５および６参照）、t(16;21)（非特許文献７および８参照）など様々な染色体転座に関与することが明らかにされている。また、AML1遺伝子は、染色体転座がみられない急性骨髄性白血病（AML）、骨髄異形成症候群(MDS)、および高頻度に白血病を発症する家族性血小板減少症（FPD）等においても突然変異がみられる（非特許文献９〜１１参照）。
【０００３】
AML1蛋白質はCBFβ蛋白質とヘテロ二量体を形成して特異的なDNA配列に結合することにより、多くの造血細胞特異的な遺伝子の発現を制御する。AML1およびCBFβは共に成体型造血に必須であることが遺伝子破壊マウスを用いた解析から明らかにされている（非特許文献１２〜１６参照）。AML1は他の転写因子、あるいはp300/CBP（非特許文献１７参照）あるいはMOZ（非特許文献１８参照）などの転写共役因子と結合して機能し、転写複合体を統合する因子として機能することが提唱されている。AML1と複合体を形成する因子の多くは、白血病でみられる染色体転座の標的になっていることは特筆すべきである。CBFβはinv(16)（非特許文献１９参照）に関与し、p300はt(8;22) 転座（非特許文献２０および２１参照）あるいはt(11;22)転座（非特許文献２１参照）、CBPはt(8;16)転座（非特許文献２３参照）あるいはt(11;16)転座（非特許文献２４〜２６参照）、そしてMOZはt(8;16)転座（非特許文献２３参照）、inv(8)（非特許文献２７参照）あるいはt(8;22) 転座（非特許文献２０および２１参照）に関与する。AML1の変異を含め、これらを総計すると、急性骨髄性白血病の40-50%でAML1複合体の構成因子のいずれかに異常が認められたため、AML1複合体が急性白血病における染色体転座の主要な標的であると考えられる。
【０００４】
【非特許文献１】Look, A.T.著、「Oncogenic transcription factors in the human acute leukemia.」、Science、1997年、Vol.278、p.1059-64.
【非特許文献２】Miyoshi, H.外５名著、「t(8;21) breakpoints on chromosome 21 in acute myeloid leukemia are clustered within a limited region of a single gene, AML1.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1991年、Vol. 88、p.10431-4.
【非特許文献３】Nucifora, G. 外４名著、「The 3;21 translocation in myelodysplasia results in a fusion transcript between the AML1 gene and the gene for EAP, a highly conserved protein associated with the Epstein-Barr virus small RNA EBER 1.」、 Proc Natl Acad Sci U S A、1993年、Vol.90、p.7784-8.
【非特許文献４】Mitani, K.外８名著、「Generation of the AML1-EVI-1 fusion gene in the t(3;21)(q26;q22) causes blastic crisis in chronic myelocytic leukemia.」、Embo J、1994年、Vol.13、p.504-10.
【非特許文献５】Golub, T.R.外９名著、「Fusion of the TEL gene on 12p13 to the AML1 gene on 21q22 in acute lymphoblastic leukemia.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1995年、Vol.92、p.4917-21.
【非特許文献６】Romana, S.P.外６名著、「The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a tel-AML1 gene fusion.」、Blood、1995年、Vol.85、p.3662-70.
【非特許文献７】Berger, R.外３名著、「Secondary acute myeloblastic leukemia with t(16;21) (q24;q22). involving the AML1 gene.」、Hematol Cell Ther、1996年、Vol.38、p.183-6.
【非特許文献８】Gamou, T.外８名著、「The partner gene of AML1 in t(16;21) myeloid malignancies is a novel member of the MTG8(ETO) family.」、Blood、1998年、Vol.91、p.4028-37.
【非特許文献９】Osato M.外１０名著、「Biallelic and heterozygous point mutations in the runt domain of the AML1/PEBP2alphaB gene associated with myeloblastic leukemias.」、Blood、1999年Mar15、Vol.93(6)、p.1817-24.
【非特許文献１０】Imai Y, 外９名著、「Mutations of the AML1 gene in myelodysplastic syndrome and their functional implications in leukemogenesis.」、Blood、2000年Nov 1、Vol.96(9)、p.3154-60.
【非特許文献１１】Preudhomme C,外１２名著、「High incidence of biallelic point mutations in the Runt domain of the AML1/PEBP2 alpha B gene in Mo acute myeloid leukemia and in myeloid malignancies with acquired trisomy 21.」、Blood、2000年Oct 15、Vol.96(8)、p.2862-9.
【非特許文献１２】Okuda, T.外４名著、「AML1, the target of multiple chromosomal translocations in human leukemia, is essential for normal fetal liver hematopoiesis.」、Cell、1996年、Vol.84、p.321-30.
【非特許文献１３】Sasaki K, Y.H.外７名著、「Absence of fetal liver hematopoiesis in mice deficient in transcriptional coactivator core binding factor beta.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1996年、Vol.93、p.12359-12363.
【非特許文献１４】Wang Q,外５名著、「Disruption of the Cbfa2 gene causes necrosis and hemorrhaging in the central nervous system and blocks definitive hematopoiesis.」、Proc Natl Acad Sci U S A.、1996年Apr 16、Vol.93(8)、p.3444-9.
【非特許文献１５】Wang, Q.外15名著、「The CBFbeta subunit is essential for CBFalpha2 (AML1) function in vivo.」、Cell、1996年、Vol.87、p.697-708.
【非特許文献１６】Niki, M.外９名著、「Hematopoiesis in the fetal liver is impaired by targeted mutagenesis of a gene encoding a non-DNA binding subunit of the transcription factor, polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factor.」、Proc Natl Acad Sci U S A、1997年、Vol.94、p.5697-702.
【非特許文献１７】Kitabayashi, I.外３名著、「Interaction and functional cooperation of the leukemia-associated factors AML1 and p300 in myeloid cell differentiation.」、Embo J、1998年、Vol.17、p.2994-3004.
【非特許文献１８】Kitabayashi I, 外４名著、「Activation of AML1-mediated transcription by MOZ and inhibition by the MOZ-CBP fusion protein.」、EMBO J.、2001年Dec 17、Vol.20(24)、p.7184-96.
【非特許文献１９】Liu P, 外７名著、「Fusion between transcription factor CBF beta/PEBP2 beta and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia.」、Science、1993年Aug 20、Vol.261(5124)、p.1041-4.
【非特許文献２０】Chaffanet M, G.L., 外４名著、「MOZ is fused to p300 in an acute monocytic leukemia with t(8;22).」、Genes Chromosomes Cancer、2000年、Vol.28、p.138-144.
【非特許文献２１】Kitabayashi I, 外７名著、「Fusion of MOZ and p300 histone acetyltransferases in acute monocytic leukemia with a t(8;22)(p11;q13) chromosome translocation.」、Leukemia、2001年Jan、Vol.15(1)、p.89-94.
【非特許文献２２】Ida, K.著、「Adenoviral E1A-associated protein p300 is involved in acute myeloid leukemia with t(11;22)(q23;q13).」、Blood、1997年、Vol.90、p.4699-704.
【非特許文献２３】Borrow, J.著、「The translocation t(8;16)(p11;p13) of acute myeloid leukaemia fuses a putative acetyltransferase to the CREB-binding protein.」、 Nat Genet、1996年、Vol.14、p.33-41.
【非特許文献２４】Taki T, 外３名著、「The t(11;16)(q23;p13) translocation in myelodysplastic syndrome fuses the MLL gene to the CBP gene.」、Blood、1997年、Vol.89、p.3945-3950.
【非特許文献２５】Sobulo, O.M.著、「MLL is fused to CBP, a histone acetyltransferase, in therapy-related acute myeloid leukemia with a t(11;16)(q23;p13.3). 」、Proc Natl Acad Sci U S A、1997年、Vol.94、p.8732-7.
【非特許文献２６】Satake N, I.Y., 外６名著、「Novel MLL-CBP fusion transcript in therapy-related chronic myelomonocytic leukemia with a t(11;16)(q23;p13) chromosome translocation.」、Genes Chromosomes Cancer、1997年、Vol.20、p.60-63.
【非特許文献２７】Carapeti M, 外３名著、「A novel fusion between MOZ and the nuclear receptor coactivator TIF2 in acute myeloid leukemia.」、Blood、1998年May 1、Vol.91(9)、p.3127-33.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、白血病細胞の分化誘導剤、並びに、該分化誘導剤を含む白血病の治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行なった。
白血病の治療薬として、第一に考えられるのは、白血病特異的に発現する融合蛋白質の活性を抑制する、分子標的試薬である。既に臨床応用されているグリベック（ノバルティスファーマ株式会社）は、慢性骨髄性白血病において９０％以上で発現するBCR-ABL融合チロシンキナーゼを特異的に阻害する。しかしながら、急性白血病では染色体転座の種類が多様で、急性骨髄性白血病で最も多いとされるAML1-MTG8、CBFβ-MYH11、PML-RARαの発現は、それぞれ全体の10-20%程度であり、これらの融合蛋白質が共通の分子標的にはなりにくかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは次に期待できる治療薬として、染色体転座の主要な標的であるAML1複合体を活性化する試薬に注目した。これまでに機能が解析されたAML1-MTG8、CBFβ-MYH11、MOZ-CBPはいずれもAML1タンパク質に対しドミナントネガティブに作用し、AML1タンパク質による転写活性化を抑制することが明らかになった。多くの白血病では対立遺伝子は正常であることから、正常なAML1複合体も共存していると考えられ、融合蛋白質により抑制されたAML1複合体を再活性化する試薬は急性白血病の治療への応用が期待できる。実際、本発明者らは、AML1遺伝子を強制発現することにより、白血病細胞の分化が促進されることを証明した。これらの結果から、実際に白血病治療に有効である可能性が高いと考えられる。
【０００８】
また本発明者らは、AML1複合体の機能は、AML1タンパク質のリン酸化により活性化されることを見い出し、AML1タンパク質のリン酸化を制御する特異的なタンパク質リン酸化酵素AML1Kを同定することに成功した。AML1Kの活性化剤は、AML1タンパク質のリン酸化を介してAML1複合体を活性化することにより、白血病細胞の分化を誘導できると考えられる。即ち、AML1K自体も、白血病細胞の分化誘導剤となることが期待される。これらAML1Kタンパク質の機能に関する知見についても、本発明者らによって初めて見出されたものである。
【０００９】
本発明は、AML1タンパク質の発現活性化剤または機能活性化剤を含む白血病細胞の分化誘導剤、並びに、該分化誘導剤を含む白血病の治療薬に関し、より具体的には、
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの少なくとも１つを含有する、白血病細胞の分化誘導剤、
（ａ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質
（ｂ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＭＬ１Ｋタンパク質変異体であって、ＡＭＬ１Ｋタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、または該タンパク質を発現するベクター
〔２〕  ＡＭＬ１タンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤、
〔３〕  ＡＭＬ１タンパク質の機能活性化物質が、ＡＭＬ１タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質、もしくはＡＭＬ１タンパク質リン酸化酵素の活性化物質である、〔２〕に記載の白血病細胞の分化誘導剤、
〔４〕  ＡＭＬ１タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質が、オカダ酸またはCalyculin Aである、〔３〕に記載の白血病細胞の分化誘導剤、
〔５〕  ＡＭＬ１Ｋタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤、
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬、
〔７〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＭＬ１Ｋ遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるＡＭＬ１Ｋタンパク質の発現量または活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、発現量または活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔８〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＭＬ１タンパク質および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＡＭＬ１タンパク質のリン酸化状態を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を上昇させる化合物を選択する工程
〔９〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法、
（ａ）ＡＭＬ１タンパク質、ＡＭＬ１Ｋタンパク質、および被検化合物を接触させる工程
（ｂ）ＡＭＬ１タンパク質を基質とする、ＡＭＬ１Ｋタンパク質のリン酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔１０〕  工程（ｂ）において、リン酸化されるＡＭＬ１タンパク質上の部位が、２４９位および／または２７６位（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、２４９位および／または２７６位）のセリン残基である、〔８〕または〔９〕に記載のスクリーニング方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
多くの白血病では対立遺伝子は正常であることから、正常なAML1複合体も共存していると考えられ、融合蛋白質により抑制されたAML1複合体を再活性化する試薬は急性白血病の治療への応用が期待できる。実際、AML1遺伝子を強制発現することにより、白血病細胞の分化が促進されることを証明された。これらの結果から、AML1の発現もしくは機能を活性する化合物は、実際に白血病治療に有効であると考えられる。
【００１１】
また本発明者らによって見出された知見を基に、白血病治療薬の新規なスクリーニング方法が提供された。本発明のスクリーニング方法によって、新規な作用機序による白血病治療効果を有する化合物を、効率的に取得することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らによって初めて、AML1複合体の機能が、AML1タンパク質のリン酸化により活性化されることが見い出された。また、AML1タンパク質のリン酸化を制御するAML1タンパク質に特異的なタンパク質リン酸化酵素であるAML1Kが同定された。従ってAML1Kの発現あるいは機能を活性化する化合物は、AML1タンパク質のリン酸化を介してAML1複合体を活性化し、白血病細胞の分化を誘導することによって、白血病の治療に有効であると考えられる。
【００１３】
白血病とは一般的に、骨髄中の造血幹細胞と呼ばれる血液細胞の基になる細胞またはこれに由来する前駆細胞が異常に増殖する疾患である。この原因は一つまたはいくつかの遺伝子に突然変異や染色体転座により異常が生じ、その結果として細胞分化・増殖・アポトーシス（細胞死）の制御異常が起こり、そのため骨髄中で白血球が増殖し、血液中に芽球と呼ばれる未成熟な白血球が増える。正常な状態では白血球は体内に入ってきた細菌やウイルスなどを攻撃し身体を保護する働きがあるため、白血病に罹患すると身体を保護する働きが失われる。また、急性白血病では、未熟な白血球だけが作られ、正常な白血球や血小板、赤血球が全く作られなくなり病気が急速に進行する。
【００１４】
また本発明において「白血病細胞」とは、白血病患者に由来する骨髄細胞および末梢血細胞、これらをそのまま或いは不死化した後試験管内で培養した細胞、および実験動物や培養細胞への遺伝子の導入や白血病ウイルスの感染により誘導した白血病を模倣する細胞を指す。具体的には、Ｋ５６２、ＭＬ１、Ｕ９３７などの白血病由来の培養細胞を挙げることができる。
【００１５】
本発明者らは、AML1タンパク質がリン酸化され活性化されることにより、白血病細胞が分化誘導されることを見出した。また、このリン酸化を制御するキナーゼ（リン酸化酵素）のAML1Kを強制発現させることにより、AML1がリン酸化され活性化されることを見出した。従って、AML1Kタンパク質は、白血病細胞の分化誘導作用を有するものと考えられる。
【００１６】
本発明は、まず、AML1Kタンパク質（AML1キナーゼ）を含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
【００１７】
本発明におけるAML1Kとは、AML1のリン酸化を制御するキナーゼ（リン酸化酵素）をさす。詳しくはAML1のセリン249と276のリン酸化を制御するキナーゼである。本発明においてはAML1K遺伝子を強制発現することにより、AML1がリン酸化され活性化し、白血病細胞が分化誘導されると考えられる。従って本発明は白血病細胞の分化誘導剤としてAML1Kタンパク質を提供する。
【００１８】
また本発明の好ましい態様においては、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの少なくとも１つを含有する白血病細胞の分化誘導剤である。（尚、本発明においては、以下の（ａ）および（ｂ）のタンパク質をまとめて、「AML1Kタンパク質」と記載する場合あり）
（ａ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質
（ｂ）ＡＭＬ１Ｋタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、ＡＭＬ１Ｋタンパク質変異体であって、ＡＭＬ１Ｋタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、または該タンパク質を発現するベクター
【００１９】
本発明におけるAML1Kタンパク質において、ヒトの白血病細胞の分化誘導を行いたい場合には、本発明のAML1Kタンパク質は、ヒトAML1Kタンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、マウス等の哺乳動物のAML1Kタンパク質を挙げることができる。本発明において、AML1Kタンパク質について、ヒト以外の生物におけるホモログとして、例えばマウスHIPK2（Genbankアクセッション番号：NM_010433）を挙げることができる。
【００２０】
一例として、本発明のヒトAML1Kタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に、該タンパク質をコードする遺伝子(AML1K遺伝子)の塩基配列を配列番号：３に示す。
【００２１】
本発明の上記分化誘導剤の好ましい態様としては、ヒトAML1Kタンパク質を含むものであり、より具体的には、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、白血病細胞の分化誘導剤を好適に示すことができる。なお、本発明のヒトAML1Kは、HIPK2とも呼ばれる。
【００２２】
本発明の白血病の分化誘導剤の成分である「AML1Kタンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばAML1Kタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、AML1Kタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、AML1Kタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００２３】
本発明において、「機能的に同等なタンパク質」とは、AML1Kタンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質である。上記「活性」とは、例えば、AML1タンパク質を基質として、リン酸化する活性を挙げることができる。リン酸化活性の測定は、当業者においては、公知の方法によって、適宜実施することができる。
【００２４】
また、本発明の上記AML1Kタンパク質として、AML1Kタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：４に記載の配列）に対して、たとえば７０%以上、望ましくは９０%以上、更に望ましくは９５%以上の相同性を有するタンパク質は、AML1Kタンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。また、本発明におけるアミノ酸の改変は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。
【００２５】
本発明における上記の機能的に同等なタンパク質とは、例えば、リン酸化酵素活性を有するヒトAML1Kタンパク質変異体、ヒトAML1Kタンパク質のヒト以外の生物におけるホモログ等を挙げることができる。また、AML1Kと構造の類似したヒトHIPK1（Genbankアクセッション番号：NM_198268）、ヒトHIPK3（Genbankアクセッション番号：NM_005734）はAML1Kと同様な作用を有することが期待される。
【００２６】
また、本発明の分化誘導剤の成分であるAML1Kタンパク質をコードするDNAもまた、本発明に含まれる。本発明のAML1Kタンパク質をコードするDNAは、染色体DNAであっても、cDNAであってもよい。AML1Kタンパク質をコードする染色体DNAは、例えば、細胞等から染色体DNAのライブラリ−を調製し、AML1Kタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプローブを用いた、該ライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。またAML1Kタンパク質をコードするcDNAは、AML1Kタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）からRNA試料を抽出し、AML1Kタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプライマーを用いたRT-PCR法等の遺伝子増幅技術により取得することができる。
【００２７】
本発明のAML1Kタンパク質または該タンパク質をコードするDNAは、AML1Kタンパク質と機能的に同等であれば、その塩基配列やアミノ配列が改変された変異体であってもよい。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Kunkel法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）などが知られている。
【００２８】
本発明においては、白血病細胞の分化誘導剤として、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA、または該タンパク質を発現するベクターを使用することも可能である。
（ａ）AML1Kタンパク質、
（ｂ）AML1Kタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、AML1Kタンパク質変異体であって、AML1Kタンパク質と機能的に同等なタンパク質
【００２９】
上記タンパク質をコードするDNAは、効率的な発現のために機能的にプロモーターと結合していることが好ましい。本発明に用いられるプロモーターとしては、本来のAML1K遺伝子プロモーターを利用することができるが、これ以外にも、公知の種々のプロモーター、例えばCMVプロモーター等を用いることができる。また、当業者であれば、公知の種々の発現ベクターを用いて、容易に本発明のタンパク質を発現するベクターを作製することができる。
【００３０】
本発明の上記ベクターは、遺伝子治療用に使用することも可能である。遺伝子治療とは、機能を有するタンパク質をコードするDNAを含むベクターを患者に投与し、治療または予防することをいう。遺伝子治療に使用することができるベクターには、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdex1cw）やレトロウイルスベクター（例えばpZIPneo）等が挙げられるが、これに制限されない。ベクターへの本発明のタンパク質をコードするDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことができる。生体内への投与はex vivo法でもよいが、in vivo法が好ましい。
【００３１】
また、多くの急性白血病で発現が抑制されているAML1タンパク質の発現を活性化することにより、白血病細胞の分化誘導が促進され、結果として本発明のAML1タンパク質の発現活性化物質は、例えば白血病の治療薬となると考えられる。
【００３２】
従って本発明は、AML1タンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
【００３３】
本発明における「タンパク質の発現活性化物質」は、タンパク質の発現を有意に活性化（上昇）させる物質である。本発明の上記「発現活性化」には、該タンパク質をコードする遺伝子の転写活性化、および／または該遺伝子の転写産物からの翻訳活性化が含まれる。
【００３４】
本発明のAML1タンパク質の発現活性化物質としては、例えば、AML1遺伝子の転写調節領域（例えば、プロモーター領域）に結合して、該遺伝子の転写を促進する物質（転写活性化因子等）を挙げることができる。
【００３５】
また、本発明においてAML1タンパク質の発現活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により、容易に実施することができる。
【００３６】
上記のAML1タンパク質は、通常、分化誘導を行うべき白血病細胞に由来する（内因性の）タンパク質である。ヒト白血病細胞について分化誘導を行いたい場合には、上記のAML1タンパク質は、通常、ヒトAML1タンパク質である。ヒトAML1遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、該遺伝子がコードするヒトAML1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００３７】
またAML1タンパク質の機能活性化物質とは、AML1タンパク質の機能を有意に活性化させる物質である。本発明者らによって、AML1タンパク質はリン酸化によってその機能が活性化されることが見出された。従って、本発明の機能活性化物質としては、例えば、AML1タンパク質のリン酸化を促進する物質を挙げることができる。また、本発明者らによって、AML1タンパク質上の249位および276位のセリン残基のリン酸化が、白血病細胞の分化誘導に関与することが明らかとなった。従って、本発明の上記機能活性化物質とは、AML1タンパク質上の249位および276位のセリン残基のリン酸化を促進する物質であることが好ましい。
【００３８】
また、本発明のAML1タンパク質の機能活性化物質としては、例えば、AML1タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質、もしくはAML1タンパク質リン酸化酵素の活性化物質を挙げることができる。上記脱リン酸化酵素とは、AML1タンパク質上のリン酸基を除去する反応を担う酵素を指す。上記脱リン酸化酵素としては、AML1タンパク質上の249位および276位のセリン残基のリン酸基を除去する活性を有するものが好ましい。
【００３９】
上記のAML1タンパク質脱リン酸化酵素の阻害物質の具体例としては、オカダ酸またはCalyculin A等を挙げることができる。即ち本発明は、オカダ酸またはCalyculin Aを含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
【００４０】
また本発明においては、AML1タンパク質のリン酸化を促進させる、即ち、当該リン酸化を担うAML1Kタンパク質の発現もしくは機能を活性化させることによっても、白血病細胞の分化を誘導させることが可能である。従って本発明は、AML1Kタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を含む、白血病細胞の分化誘導剤を提供する。
【００４１】
本発明のAML1Kタンパク質の発現活性化物質としては、例えば、AML1K遺伝子の転写調節領域（例えば、プロモーター領域）に結合して、該遺伝子の転写を促進する物質（転写活性化因子等）を挙げることができる。
【００４２】
またAML1Kタンパク質の機能活性化物質とは、AML1Kタンパク質の機能を有意に活性化させる物質である。AML1Kタンパク質の機能としては、例えば、AML1タンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を挙げることができる。該機能は、AML1タンパク質上の249位および276位のセリン残基をリン酸化する活性であることが好ましい。
【００４３】
また本発明の薬剤によって白血病細胞の分化が促進されれば、白血病の治療へ応用することが可能である。本発明の白血病細胞の分化誘導剤は、白血病の治療薬となるものと考えられ、この治療薬もまた、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の白血病細胞の分化誘導剤を有効成分として含む、白血病治療薬（白血病治療のための医薬組成物）を提供する。
【００４４】
白血病患者においては、未分化な白血病細胞が増殖していることから、本発明の白血病細胞の分化誘導剤は、未分化の細胞を正常細胞へ分化誘導する作用を有すると考えられ、所謂、分化誘導療法に利用できると考えられる。従って、本発明の白血病細胞分化誘導剤は白血病の治療薬として大いに有用である。本発明の治療薬が有効な白血病としては、特に制限されるものではないが、例えば、急性骨髄性白血病が挙げられる。
【００４５】
本発明の分化誘導剤または白血病治療薬は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の分化誘導剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００４６】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の分化誘導剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００４７】
本発明による分化誘導剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００４８】
また注射剤は、主成分である本発明の分化誘導剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００４９】
本発明の白血病治療薬は、本発明の分化誘導剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００５０】
本発明の分化誘導剤または白血病治療薬は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【００５１】
また本発明は白血病治療薬のための候補化合物のスクリーニング方法（白血病治療薬のスクリーニング方法）を提供する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、AML1Kタンパク質の発現量または活性を指標とする方法である。即ち、AML1Kタンパク質の発現もしくは活性を上昇させる化合物は、該タンパク質のAML1タンパク質のリン酸化を促進させることにより、白血病細胞の分化を誘導し、その結果、白血病に対して治療効果を有することが期待される。
【００５３】
本発明の上記方法においては、まず、AML1K遺伝子を発現する細胞に被検化合物を接触させる。
【００５４】
本方法に用いる「細胞」は、特に制限されないが、好ましくはヒト由来の細胞である。「AML1K遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のAML1K遺伝子を発現している細胞、または外来性のAML1K遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のAML1K遺伝子が発現した細胞は、通常、AML1K遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法に供する被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
また、これらの被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００５７】
AML1K遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、AML1K遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
【００５８】
本方法においては、次いで、AML1K遺伝子を発現する細胞におけるAML1Kタンパク質の発現量または活性を測定する。発現量の測定は、当業者が簡便に行ない得るものであり、一般的な方法、例えばノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により適宜実施することが可能である。例えば、AML1K遺伝子を発現する細胞に接触させた被検化合物に付した標識を指標にして測定することも可能である。
【００５９】
尚、本発明において「発現」とは、タンパク質をコードする遺伝子からの転写（mRNAの生成）、または該遺伝子の転写産物からの翻訳のいずれの場合をも意味する。
【００６０】
また、AML1Kタンパク質の活性を指標にして上記スクリーニング方法を実施する場合には、通常、AML1Kタンパク質のAML1タンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を指標とする。即ち、AML1Kタンパク質のAML1タンパク質を基質とするリン酸化酵素活性を上昇させる化合物は、AML1タンパク質におけるリン酸化を促進させ、白血病細胞の分化誘導を促進させ、その結果、白血病に対して治療効果を有することが期待される。
【００６１】
AML1Kタンパク質の活性の測定は、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することができる。一例を示せば、AML1Kタンパク質のリン酸化酵素活性は、後述の実施例に記載の方法によって、適宜測定することができる。
【００６２】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、AML1Kタンパク質の発現量または活性を上昇させる化合物を選択する。
【００６３】
本方法により単離される化合物は、白血病細胞の分化誘導作用を有することが期待され、さらに、白血病治療薬として有用である。
【００６４】
また、本発明の上記方法に従って、被検化合物から白血病細胞の分化誘導剤をスクリーニングすることも可能である。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、AML1タンパク質のリン酸化状態を指標とする方法が挙げられる。AML1タンパク質はAML1Kタンパク質によってリン酸化され活性化する。従って、AML1のリン酸化状態を検出し、リン酸化の程度が上昇するかどうかを指標とすることにより、白血病治療薬の候補化合物のスクリーニング（白血病治療薬のスクリーニング）が可能である。
【００６６】
本方法においては、まずAML1タンパク質と被検化合物とを接触させる。通常、AML1タンパク質を発現する細胞もしくは該細胞の抽出液と被検化合物とを接触させるが、単離・精製されたAML1タンパク質に被検化合物を接触させてもよい。
【００６７】
次いでAML1タンパク質のリン酸化状態を測定する。リン酸化状態の測定は、当業者においては一般的な方法、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により、適宜実施することができる。
【００６８】
本発明の上記方法において、リン酸化状態を測定するAML1タンパク質上の部位は、特に制限されないが、好ましくは、AML1タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において249位および／または276位のセリン残基である。
【００６９】
また、基質となるAML1タンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、AML1Kタンパク質によってリン酸化を受ける部位（例えば、上記の249位および／または276位のセリン残基）を含む、部分ポリペプチドもしくは、該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。
【００７０】
本方法においては次いで、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記リン酸化の程度を上昇させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、白血病細胞の分化誘導作用を有することが期待され、白血病治療薬として有用である。
【００７１】
また、本発明の上記方法に従って、被検化合物から白血病細胞の分化誘導剤をスクリーニングすることも可能である。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法のさらに別の態様としては、AML1Kタンパク質のリン酸化酵素活性を指標とする方法である。即ち、AML1タンパク質を基質とする、AML1Kタンパク質のリン酸化活性を指標とする方法である。AML1Kタンパク質のリン酸化活性を上昇させる化合物は、AML1タンパク質のリン酸化を促進し、その結果、白血病細胞の分化が誘導され、白血病に対する治療効果が期待される。
【００７３】
本方法においては、まずAML1タンパク質、AML1Kタンパク質、および被検化合物を接触させる。次いで、AML1タンパク質を基質としたAML1Kタンパク質のリン酸化活性を測定する。
【００７４】
上記方法において使用するAML1Kタンパク質は、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、AML1タンパク質をリン酸化する活性を有するものであれば、AML1Kタンパク質の一部のアミノ酸配列が置換・欠失されたタンパク質（ポリペプチド）であって構わない。
【００７５】
また、基質となるAML1タンパク質も、変異を含まない野生型タンパク質であることが好ましいが、AML1Kタンパク質によってリン酸化を受ける部位を含む、部分ポリペプチドもしくは、該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。
【００７６】
上記方法においてAML1Kタンパク質によってリン酸化を受けるAML1タンパク質上の部位は、特に制限されるものではないが、好ましくは、AML1タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）において249位および／または276位のセリン残基である。
【００７７】
AML1Kタンパク質のリン酸化酵素活性は、上述のように、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により、測定するすることができる。
【００７８】
上記方法においてはさらに、被検化合物を接触させない場合と比較して、前記AML1Kタンパク質のリン酸化活性を上昇させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、AML1Kタンパク質のAML1タンパク質を基質とするリン酸化活性を促進する結果、白血病細胞の分化を誘導し、白血病に対する治療効果を有するものと考えられる。
【実施例】
【００７９】
以下本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００８０】
〔実施例１〕  骨髄性細胞におけるAML1のリン酸化
マウス骨髄性細胞M1は、IL-6存在下で培養することによりマクロファージ様に分化する。この過程でAML1のリン酸化が誘導され、AML1とMOZとの複合体が増加する(Kitabayashi et al., Embo J, 20, 7184-96, 2001)。この結果は、AML1のリン酸化が複合体形成の制御に重要であることを示唆している。
【００８１】
AML1はMAPキナーゼ（Erk）経路によりリン酸化されることが報告されている。L-G細胞を含む多くの骨髄性細胞ではAML1は高度にリン酸化されていたので、まずL-Gでのリン酸化がMAPキナーゼ経路によるものであるかどうかを、MAPキナーゼ経路阻害剤であるPD98059（Dudley DT, Pang L, Decker SJ, Bridges AJ, Saltiel AR. A synthetic inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Aug 15;92(17):7686-9.）およびU0126（Favata MF, Horiuchi KY, Manos EJ, Daulerio AJ, Stradley DA, Feeser WS, Van Dyk DE, Pitts WJ, Earl RA, Hobbs F, Copeland RA, Magolda RL, Scherle PA, Trzaskos JM. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem. 1998 Jul 17;273(29):18623-32.）を用いて調べた。
【００８２】
その結果、図１に示すようにPD98059およびU0126はMAPキナーゼのリン酸化をほぼ完全に抑制したが、AML1のリン酸化は全く阻害しなかった。これらの結果から、AML1の骨髄性細胞おけるリン酸化はMAPキナーゼ経路以外のリン酸化酵素が関与していることが示唆された。
【００８３】
〔実施例２〕  リン酸化部位の決定
AML1のリン酸化部位を同定するため、レトロウイルスベクターを用いて骨髄性細胞L-GにFLAGタグ付きのAML1b（全長）を発現させ、FLAG抗体ビーズを用いてAML1を精製し(Kitabayashi et al., Embo J, 20, 7184-96, 2001)、LC/MS/MS解析によりリン酸化部位を同定した。
【００８４】
その結果、アミノ酸249番と276番のセリン残基がリン酸化されていることが示された（図２A）。特筆すべきは、これらの残基の一方のみがリン酸化されているものやMAPキナーゼによりリン酸化されるアミノ酸266番のセリンがリン酸化されたものは同定されなかったことである。
【００８５】
この結果を確認するため、これらのセリン残基をアラニンに置換したAML1の変異体を作成し、これらをL-G細胞にレトロウイルスベクターを用いて導入し、電気泳動上の移動度を調べた。結果、図２Bに示すように、変異体249Aおよび276Aは野生型に比べて移動度が速かった。また、249および276の両方を置換した変異体はさらに移動度が速かったことから、これらのアミノ酸残基がリン酸化されていることが確認された。一方、MAPキナーゼによりリン酸化される266セリン残基の変異体は移動度に大きな変化がみられなかった。
【００８６】
〔実施例３〕  AML1リン酸化によるMOZあるいはp300との協調作用の促進
AML1のセリン249と276のリン酸化がAML1による転写活性化に及ぼす効果を調べるため、これらの残基をアラニンに置換した変異体（S249/276A）とアスパラギン酸に置換した疑似リン酸化変異体（S249/276D）を、AML1結合部位を持つレポーター遺伝子（MPO-luc）とAML1のコアクチベーターであるMOZおよびp300と共にトランスフェクションした。
【００８７】
結果、図３に示すように野生型AML1による転写活性化は、MOZおよびp300により促進されるが、これらの転写促進はS249/276A変異体では殆ど見られず、逆にS249/276D変異体では顕著になることが示された。これらの結果から、これらのリン酸化によりMOZやp300との協調作用が促進されることが示唆された。
【００８８】
〔実施例４〕  AML1のリン酸化を制御するキナーゼ
次にAML1のセリン249と276のリン酸化を制御するキナーゼ（リン酸化酵素）を同定することを試みた。本発明者らはAML1複合体を精製し、この複合体に含まれる因子を多数同定している(Kitabayashi et al., Embo J, 20, 7184-96, 2001)が、この中にセリン・スレオニンキナーゼ(AML1キナーゼ)が含まれていた（図４）。そこで、このキナーゼがAML1をリン酸化するかどうかを調べるため、AML1の野生型および変異体をAML1キナーゼと共に細胞にトランスフェクションしてAML1のリン酸化が誘導されるかどうかを検討した。
【００８９】
結果、図５Aに示すように野生型のAML1はAML1キナーゼにより強くリン酸化されるが、249および276のセリンをアラニンに置換した変異体はリン酸化されないことが示された。また、精製したAML1キナーゼはAML1を試験管内で強くリン酸化した(図５B)。これらの結果から、AML1キナーゼは249および276のセリン残基をリン酸化することが示された。
【００９０】
〔実施例５〕  AML1キナーゼによる転写活性化
AML1を介した転写活性化に対するAML1キナーゼの効果を、AML1結合部位を持つレポーター遺伝子MPO-lucを用いて調べた。図６に示すようにAML1KキナーゼをAML1およびMOZと共にトランスフェクションしMPO-lucの発現を調べた結果、AML1キナーゼはAML1とMOZによる転写活性化を顕著に増強することが示された。
【００９１】
この効果はS249/276A変異体を用いたときには殆ど見られず、S249/276D変異体を用いたときには逆にさらに顕著になった。これらの結果から、AML1キナーゼによるリン酸化はAML1を介した転写を促進することが示された。
【００９２】
〔実施例６〕  AML1キナーゼの活性化剤およびAML1フォスファターゼ阻害剤の開発
このようにAML1キナーゼはAML1をリン酸化し活性化する。AML1キナーゼを活性化する薬剤あるいはAML1フォスファターゼの阻害剤を開発し、白血病治療薬として応用することができると考えられる。
【００９３】
図５A及び図５Bに示すように、AML1キナーゼの活性のアッセイ方法については、培養細胞を用いる方法と試験管内でリン酸基取り込みを定量する方法を確立した。前者は、AML1およびAML1キナーゼを安定に発現させた培養細胞を用いて細胞内で発現するAML1のリン酸化を検出する方法である。リン酸化はAML1のリン酸化特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により容易に検出できる。
【００９４】
後者は、精製したAML1およびAML1キナーゼを用いて、試験管内でAML1へのリン酸基の取り込みを定量する方法である。標識γ-ATPあるいはリン酸化特異的抗体を用いたウエスタンブロット法により検出できる。
【００９５】
これらのアッセイ法を用いてAML1キナーゼの活性化剤をスクリーニングする。また、AML1フォスファターゼは未同定であるが、図５Aの方法により同様にAML1フォスファターゼの阻害剤をスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、PD98059およびU0126はMAPキナーゼのリン酸化について示す写真である。
【図２】図２Aは、AML1のリン酸化部位を示す図である。アミノ酸249番と276番のセリン残基がリン酸化されている。図２Bは、これらのセリン残基をアラニンに置換したAML1の変異体を作成し、これらをL-G細胞にレトロウイルスベクターを用いて導入して電気泳動上の移動度を測定した結果を示す写真である。
【図３】図３は、AML1のセリン249と276のリン酸化がAML1による転写活性化に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】図４は、AML1複合体に含まれる因子を同定した写真である。
【図５】図５Aは、野生型および変異体AML1がAML1キナーゼによりリン酸化が誘導されたかどうかを示す写真である。図５Bは、精製したAML1キナーゼがAML1を試験管内で強くリン酸化した結果を示す写真である。
【図６】図６は、AML1KキナーゼをAML1およびMOZと共にトランスフェクションしMPO-lucの発現を調べた結果を示すグラフである。
【図３】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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