(57)【要約】      （修正有）【課題】無細胞タンパク質合成法などの生物学的手法を用いて人工的に構造を改変したタンパク質を合成する方法に関する。また、無細胞タンパク質合成法により任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質、および該タンパク質の利用方法に関する。【解決手段】蛍光物質を用いて生物学的手法によりタンパク質をラベリングする方法であって、該蛍光物質が、アクリドン骨格を持つ蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を用いて生物学的手法によりタンパク質をラベリングする方法であって、該蛍光物質が、一般式（Ｉ）
【化１】
2005287327.tif 000004
で表されるアクリドン骨格を持つことを特徴とする蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項２】
蛍光物質が、アクリドニル基を側鎖に持つ蛍光性アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項３】
蛍光性アミノ酸が次の一般式（ＩＩ）
【化２】
2005287327.tif 000005
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアミノ基の保護基を示し、Ｒ２は、水酸基又はカルボキシル基の誘導体となる基を示す）で表されるアクリドニル−Ｌ−アラニン誘導体であることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項４】
生物学的手法が、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の一か所ないしは複数か所に、非天然アミノ酸または天然アミノ酸を導入する方法であることを特徴とする、請求項１〜３に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項５】
無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする請求項１〜４に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項６】
無細胞タンパク質合成系が、ウサギ網状赤血球由来、コムギ胚芽由来、大腸菌由来から選択されるいずれかの抽出液を用いることを特徴とする請求項１〜５に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法により合成した蛍光ラベル化タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の蛍光ラベル化タンパク質を用いて、細胞内追跡用のタンパク質分子プローブの作成、タンパク質のリガンド結合部位近傍へ蛍光アミノ酸を導入することによる基質あるいは阻害剤の検出プローブの作成、２種類以上の蛍光アミノ酸を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるタンパク質の立体構造変化の追跡などを行うことを特徴とする蛍光ラベル化タンパク質の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成法などの生物学的手法を用いて人工的に構造を改変したタンパク質を合成する方法に関し、より詳細には、無細胞タンパク質合成法により任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質を合成する方法に関する。また、無細胞タンパク質合成法により任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質、および該タンパク質の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質は、２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列はＤＮＡの塩基配列によって規定されている。そのタンパク質をＤＮＡの塩基配列を改変することで、遺伝子工学的手法により目的のタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変するという方法は比較的古くから用いられてきた。しかしながらこの方法では、可能なのはあくまで２０種類のアミノ酸からなる配列の組換えであり、２０種類のアミノ酸のいずれの構造中にも含まれない任意の機能基をタンパク質分子に導入することは事実上不可能であるため、タンパク質に人工機能を導入する手法としては限界があった。また一方で、タンパク質に任意の機能基を導入する手法としては、タンパク質分子の化学修飾という方法が用いられてきた。しかしこの方法では、タンパク質の特定の位置だけに機能基を導入することは非常に困難であり、そのため予測できない位置への化学修飾によってタンパク質本来の機能が著しく減じてしまう場合があるという問題があった。それに加え、化学修飾による方法ではタンパク質分子内部への機能基の導入を行うことができないといった欠点もあった。
【０００３】
種々の機能側鎖を持つ非天然アミノ酸を合成し、それらを天然のアミノ酸と同様に位置特異的に導入する非天然アミノ酸導入法は、これらの点を改善し、さらにタンパク質の機能をほとんど損なわずにさまざまな機能基を導入できるという点で優れている。天然のアミノ酸のみを用いた組換えタンパク質と比較して、導入した非天然アミノ酸に応じた種々の人工機能を発現することが期待でき、タンパク質の広範囲な機能拡張が可能となる。またさらに化学修飾法と比較しても、機能基を導入する位置を任意に決定することが可能であるため、タンパク質の本来の機能を損なう危険性を大幅に減じることができる。
【０００４】
天然のタンパク質は、前述のように２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列は、そのタンパク質をコードしている遺伝子によって規定されている。遺伝子はＤＮＡ上の連続した３つの塩基の組み合わせからなる遺伝暗号（コドン）によりアミノ酸を指定している。塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の４種類があり、それらの組み合わせからなる３塩基コドンの総数は４ｘ４ｘ４＝６４種類であるが、その大半である６１種類のコドンは天然の２０種類のアミノ酸に割り当てられている。残りの３種類、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡの３種のコドンは終止コドンとよばれ、２０種類のどのアミノ酸にも対応せず、タンパク質のアミノ酸配列の終止を規定している。
【０００５】
非天然アミノ酸をタンパク質へ位置特異的に導入するには、それらを指定する専用のコドンが必要となる。しかしながら前述の様に３つの塩基で構成可能な６４種類のコドンは、すべて指定する情報が規定されている。
【０００６】
Ｓｃｈｕｌｔｚら（たとえば、非特許文献１を参照。）やＣｈａｍｂａｒｌｉｎら（たとえば、非特許文献２を参照。）は、終止コドンの一つであるＴＡＧを非天然アミノ酸に割り当てた。タンパク質上の任意の位置のコドンをＴＡＧに置き換え、天然には存在しない、終止コドンＴＡＧに対応するアンチコドンＣＵＡを持つｔＲＮＡを合成し、非天然アミノ酸を担持させて非天然アミノ酸を位置特異的に導入するという手法であった。しかしながらこの方法では、非天然アミノ酸の取り込みはタンパク質合成の終了と競合することになり、収率が低下してしまうという欠点があった。さらに、同一のタンパク質の複数箇所に別々の非天然アミノ酸を導入することも、非天然アミノ酸の指定に転用可能な終止コドンの種類数から考えて事実上不可能であった。
【非特許文献１】Ｎｏｒｅｎ，  Ｃ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４，  １８２−１８８
【非特許文献２】Ｂａｉｎ，  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ，  Ｓｏｃ．，  １１１，  ８０１３−８０１４
【０００７】
非天然アミノ酸の位置を決めるもう一つの手法として、通常の３塩基コドンを拡張した４塩基コドンを用いるという方法がある（たとえば、非特許文献３を参照。）。この方法では、たとえばＣＧＧＧからなる４塩基コドンが、４塩基のアンチコドンをもつ人工的に合成したｔＲＮＡによって翻訳されると、非天然アミノ酸が導入された完全長のタンパクが合成される。一方、ＣＧＧの３塩基のみに対する３塩基アンチコドンをもつ天然のｔＲＮＡによって翻訳されると、その後のコドンの読み枠がシフトし、終止コドンに出会うことによってタンパク質の合成は途中で終止してしまうことになる。このように、４塩基コドンを用いる方法は、６４種類存在する通常の３塩基コドンとは事実上独立に非天然アミノ酸を規定できる点が特徴であり、前述の終止コドンを用いる方法とくらべて多種類の非天然アミノ酸を同一のタンパク質分子にそれぞれ位置特異的に導入し、機能発現させることも可能である。実際に、一例としてストレプトアビジンの５４位に電子受容基を持つ非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを、８４位に蛍光基を持つ非天然アミノ酸アンスラニルアミドアラニンを導入した変異タンパク質を合成した報告がある（たとえば、非特許文献４を参照。）。その合成された非天然二重変異タンパク質は予測通り蛍光消光を示した。また更に最近、５塩基コドンも非天然アミノ酸を指定できることが明らかになっている（たとえば、非特許文献５を参照。）。
【非特許文献３】Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  ｉｂｉｄ．，  １１８，  ９７７８−９７７９
【非特許文献４】Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ｉｂｉｄ．，  １２１，  １２１９４−１２１９５）
【非特許文献５】Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９，  ３６４６−３６５１
【０００８】
このように、４塩基コドンを用いた位置特異的な非天然アミノ酸導入法は、効率的で応用性が高い方法として、既に確立されつつある技術であるが、この方法を用いてタンパク質に蛍光性アミノ酸を導入することで、もとのタンパク質本来の性質をほとんど損なわずに蛍光ラベルした細胞内追跡用のタンパク質分子プローブや、タンパク質のリガンド結合部位近傍へ蛍光アミノ酸を導入することによる基質あるいは阻害剤の検出プローブの作成、２種類以上の蛍光アミノ酸を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるタンパク質の立体構造変化の追跡などを行うことができる。また蛍光性アミノ酸としては、上述したアンスラニルアミドアラニンのほかに、Ｌ−２−アンスリルアラニン、γ−（７−メトキシクマリン−４−ｙｌ）ホモアラニン、β−（７−メトキシクマリン−４−ｙｌ）メチル−Ｌ−アスパラギン酸、γ−（７−メトキシクマリン−４−ｙｌ）メチル−Ｌ−グルタミン酸、ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）  ＦＬ結合型アミノフェニルアラニンなどが既にこの方法を用いてタンパク質に導入できることが証明されている。しかしながら、蛍光アミノ酸を含めた非天然アミノ酸のタンパク質への導入効率は、それぞれのアミノ酸の側鎖構造に大きく依存することが明らかとなっている。特に、芳香族アミノ酸については、２−ナフチルアラニンや２−アンスリルアラニンなどのように、側鎖が主鎖と直角方向に伸びているアミノ酸は比較的かさ高いものでも効率よく導入できるが、一方で１−ナフチルアラニンや９−アンスリルアラニンなどのように、側鎖が枝分かれしている構造のアミノ酸は導入しにくい。また、生物由来のシステムを用いることからも、天然のアミノ酸と比較して、あまりにも巨大な側鎖が付加されている場合、必然的に導入効率は著しく低下する。したがって、蛍光アミノ酸でタンパク質をラベリングするに際しても、構造的に取り込まれやすいものを選択的に使用する必要があった。
【０００９】
一方、近年、青色レーザーが実用化され、またさらにその汎用化・低価格化が進み、さまざまな解析機器等へ搭載されるようになってきた。青色レーザーは波長が短いことから、長波長の光では原理的に不可能であった微細な構造の解析等に用いることが可能である。これを応用した例といえば、次世代ＤＶＤ（デジタル多目的ディスク）の読み取りに青色レーザを使用し、記録密度を大幅に上げるといった目的に使用されていることなどが挙げられる。また、生命科学の分野でも、より微細な構造体を解析するために、波長の短い光で励起される蛍光色素を用いて、その分解能を上げて検出感度を向上させるといった手法が用いられている。このような手法は、青色レーザーの汎用化に伴い近年になって急速に広まったきたものであるが、その結果として、対象をラベリングするのに用いられる短波長で励起される蛍光色素の必要性もそれに付随して高まってきた。
【００１０】
しかしながら、短波長の光はエネルギーが強く、それらの光で励起される蛍光色素も、比較的短時間で蛍光が減衰してしまうという問題があった。そのため、短波長の光で励起され、なおかつ寿命が長い蛍光色素が待ち望まれている。そのような蛍光色素の開発は以前から行われており、いくつかの色素が実際に実用化されている。しかしながら、それらの蛍光色素をタンパク質へ位置特異的に導入しようとした場合、前述のように、４塩基コドン法をはじめとしたタンパク質翻訳系を利用した非天然アミノ酸導入法では、その導入効率はアミノ酸側鎖の形状や大きさに大きく依存しているため、多くの色素が蛍光特性に優れていながらタンパク質へ効率的に導入できないのが現状であった。
【００１１】
一方、アクリジンおよびその誘導体は、古くから多用されている蛍光色素であり、光や酸化、熱に対して強い安定性も兼ね備えている非常に有用な色素である。その誘導体の一種アクリドンをアミノ酸の側鎖に付加したアクリドニル−Ｌ−アラニンについては、最近になって、その簡便な合成法が開発された（たとえば、非特許文献６を参照。）。
【非特許文献６】Ｓｚｙｍａｎｓｋａ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上に述べたような理由から、短波長により励起され、なおかつ安定性に優れた蛍光色素をタンパク質に効率的に導入する方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目標を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、アクリジン誘導体型アミノ酸、具体的にはアクリドニル−Ｌ−アラニンを、４塩基コドン法によって効率的にタンパク質へ導入できることを見出し、本研究を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］  蛍光物質を用いて生物学的手法によりタンパク質をラベリングする方法であって、該蛍光物質が、一般式（Ｉ）
【００１５】
【化３】
2005287327.tif 000002
【００１６】
で表されるアクリドン骨格を持つことを特徴とする蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項２］  蛍光物質が、アクリドニル基を側鎖に持つ蛍光性アミノ酸であることを特徴とする項１に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項３］  蛍光性アミノ酸が次の一般式（ＩＩ）
【００１７】
【化４】
2005287327.tif 000003
【００１８】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアミノ基の保護基を示し、Ｒ２は、水酸基又はカルボキシル基の誘導体となる基を示す）で表されるアクリドニル−Ｌ−アラニン誘導体であることを特徴とする項１または２に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項４］  生物学的手法が、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の一か所ないしは複数か所に、非天然アミノ酸または天然アミノ酸を導入する方法であることを特徴とする、項１〜３に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項５］  無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする項１〜４に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項６］  無細胞タンパク質合成系が、ウサギ網状赤血球由来、コムギ胚芽由来、大腸菌由来から選択されるいずれかの抽出液を用いることを特徴とする項１〜５に記載の蛍光ラベル化タンパク質の合成方法。
［項７］  項１〜６に記載の方法により合成した蛍光ラベル化タンパク質。
［項８］  項７に記載の蛍光ラベル化タンパク質を用いて、細胞内追跡用のタンパク質分子プローブの作成、タンパク質のリガンド結合部位近傍へ蛍光アミノ酸を導入することによる基質あるいは阻害剤の検出プローブの作成、２種類以上の蛍光アミノ酸を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるタンパク質の立体構造変化の追跡などを行うことを特徴とする蛍光ラベル化タンパク質の利用方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により提供される人工タンパク質合成方法により、従来法に比べて短波長で励起され、励起光に対する耐性が強い蛍光色素を位置特異的に導入したタンパク質を効率的に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、蛍光物質を用いて生物学的手法によりタンパク質をラベリングする方法である。ここでいう生物学的手法とは、生細胞、あるいは生物から抽出・精製された因子、あるいは生物中に存在する因子と同等のものを人工合成した因子などを用いて、生物内で行われている反応またはそれに類似した反応を再現させて利用する手法であり、その形態は特に限定されないが、好ましくは、停止コドンあるいは４塩基コドン、５塩基コドンを用いた位置特異的アミノ酸導入法や、ピューロマイシンあるいはピューロマイシン誘導体を用いてタンパク質のカルボキシル末端をラベリングするＣ末端ラベリング法、抗原抗体反応を用いる方法、ビオチン−アビジン結合を用いる方法などが用いられ、より好ましくは４塩基コドンを用いた位置特異的アミノ酸導入法が用いられる。
【００２２】
本発明におけるアクリドン骨格を持つ蛍光物質は、アクリドン骨格の２位の炭素原子に側鎖を持つものが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明におけるアクリドニル基を持つアミノ酸は、天然アミノ酸あるいは非天然アミノ酸の側鎖にアクリドン骨格を持つアミノ酸を言い、その形態は特に限定されないが、好ましくはＬ−アラニンの側鎖の炭素原子にアクリドニル基を持つアミノ酸アクリドニル−Ｌ−アラニンを用いるのが良い。
【００２４】
本発明における一般式（ＩＩ）の基Ｒ１におけるアミノ基の保護基としては、通常のペプチド合成における保護基であってよく、必要に応じて脱離させることができ遊離のアミノ基を再生することができるものであれば特に制限はない。このような保護基としては、炭素数１〜２０、好ましく１〜１５、より好ましくは１〜１０の直鎖条又は分枝状のアルキル基、炭素数７〜２０、好ましくは７〜１５の単環式、多環式又は縮合環式のアラルキル基、前記したアルキル基からなるアルキルカルボニル基、炭素数６〜２０、好ましくは６〜１５の単環式、多環式又は縮合環式のアリール基からなるアリールカルボニル基、環中に１〜４個の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有する５〜７員の環を１〜５個、好ましくは１〜３個有する単環式、多環式又は縮合環式の飽和又は不飽和の複素環式基からなる複素環式カルボニル基、前記したアルキル基からなるアルコキシカルボニル基、前記したアリール基からなるアリールオキシカルボニル基、前記したアラルキル基からなるアラルキルオキシカルボニル基、前記した複素環式基からなる複素環式オキシカルボニル基などが挙げられる。
【００２５】
好ましいアミノ基の保護基としては、ベンゾイル基、イソブチロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｆｍｏｃ基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基などを挙げることができる。
【００２６】
また、前記一般式（Ｉ）の基Ｒ２における、カルボキシル基の誘導体となる基としては、例えば、エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物などのカルボン酸誘導体を形成し得る基が挙げられる。エステルを形成し得る基Ｒ２としては、前記したアルキル基からなるアルコキシ基、前記したアラルキル基からなるアラルキルオキシ基、前記したアリール基からなるアリールオキシ基などが挙げられ、好ましい基Ｒ２としては水酸基の他に、メトキシ基、エトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ベンジルオキシ基などが挙げられる。
【００２７】
本発明の一般式（ＩＩ）で表されるアクリドニル−Ｌ−アラニン誘導体は、種々の方法で製造することができる。例えば、Ｌ−（ｐ−ニトロ）フェニルアラニンを出発原料として、窒素原子を還元し、ｏ−クロロベンゾイル酸による修飾を行い、ポリホスホリン酸により環状化することにより得ることができる。
【００２８】
本発明における無細胞タンパク質合成とは、細胞を用いずに核酸類内に含まれる情報を元にタンパク質やポリペプチドを合成する技術を言い、具体的にはｍＲＮＡを添加してタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞翻訳系、あるいはＤＮＡからの情報を元にしてｍＲＮＡを合成し、さらにタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞転写翻訳系のいずれでもよい。
【００２９】
無細胞タンパク質合成方法を用いてタンパク質を合成する方法としては公知の方法をそのまま用いることができ、市販のキットを用いる場合にはその説明書に従って合成することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に具体例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｐｄＣｐＡの合成
５ｍｇのＢｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ＯＨを秤取し、反応容器に入れた。アセトニトリル６０μｌとトリエチルアミン３０μｌを加え攪拌した。クロロアセトニトリル７．９ｍｇを加え、室温約１８時間反応させた。反応後の試料をシリカゲルカラムにより精製し、シアノメチルエステル化産物Ｂｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ＯＣＭを回収した。回収されたＢｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ＯＣＭを、最終濃度が２００ｍＭになるように、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。２０ｍＭ  塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣｌ）  ／  １００ｍＭ  イミダゾールバッファ  （ｐＨ  ８．０）を１８μｌ、２００ｍＭ  Ｂｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ＯＣＭ  ／  ＴＨＦ液を１μｌ、５ｍＭ  ｐｄＣｐＡ  ／  Ｈ2Ｏを５μｌ混合し、１．５  ｍｌのマイクロチューブ中に入れ、それを３７℃でＢｉｏｓｈａｋｅｒ  （Ｍ−ＢＲ−０２２，  タイテック）  にて１時間撹拌させ（振とう速度６８０ｒｐｍ）、Ｂｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｐｄＣｐＡを合成した。
【００３２】
実施例２
（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｔＲＮＡの合成
酵母由来のフェニルアラニン用ｔＲＮＡを元にした、アンチコドンＣＣＣＧをコードするｔＲＮＡ（−ＣＡ）をＳｃｒｉｐｔＭＡＸTM  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （東洋紡績製）を用いてＤＮＡから転写合成した。合成したｔＲＮＡをフェノール／クロロホルム処理により精製し、２００ｍＭのｔＲＮＡ溶液を作成した。Ｂｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｐｄＣｐＡ  １０μｌ、５ｘ  ライゲーションバッファ（５５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、２５０μＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）  ４μｌ、２００ｍＭ  ｔＲＮＡ（−ＣＡ）溶液  ２．５μｌ、０．１％  ＢＳＡ  ０．４μｌ、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）  １．２μｌ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）  ２μｌを混合し、４℃の冷蔵庫中で静置し２時間反応させた。０．６  Ｍ  酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ  ４．５）を４０μｌ加えて反応を終了させた。反応終了液を、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿により精製した。得られたＢｏｃ−（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｔＲＮＡから、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を除去し、（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｔＲＮＡを合成した。
【００３３】
実施例３
アクリドニル−Ｌ−アラニンのストレプトアビジンへの導入およびウェスタンブロッティングによる導入効率の検討
大腸菌由来の無細胞タンパク質合成システムによる、アクリドニル−Ｌ−アラニンのストレプトアビジンへの導入を行った。Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｓ３０  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）  ２μｌ、最終濃度１２ｍＭ  酢酸マグネシウム、最終濃度０．１ｍＭ  各アミノ酸、１６μｇ  Ｎ末Ｔ７タグ／Ｃ末６ｘＨｉｓタグ融合型ストレプトアビジンｍＲＮＡ（アミノ酸配列８３番目の位置をコドンＣＧＧＧに置換）、６．２５μｇ  アミノアシルｔＲＮＡを混合（最終液量１０μｌ）し、３７℃で一時間反応を行った。  反応終了液を２μｌ分取し、水８μｌ、２ｘ電気泳動バッファ  １０μｌを混合し、１５％  ポリアクリルアミドゲルに５μｌをアプライして１５ｍＡ、２時間ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）にタンパク質を転写し、抗Ｔ７タグマウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）および抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体／アルカリフォスファターゼ標識（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を反応させ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて化学発色を行った。その結果を図１に示す。８３番目の位置に４塩基コドンが導入されたｍＲＮＡからは、野生型（ｗｔ）と比較して分子量の小さいバンド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）が検出されるが、（アクリドニル−Ｌ−アラニン）−ｔＲＮＡを混合したことにより、８３番目にアクリドニル−Ｌ−アラニンが導入されたタンパク質（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）を確認することができた。野生型（ｗｔ）の希釈系列から算出される、ストレプトアビジン  ８３  アクリドニル−Ｌ−アラニンの発現効率は、約７０％と算出された。
【００３４】
実施例４
アクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したストレプトアビジンの精製と蛍光測定
上記の無細胞タンパク質合成反応液（４０μｌ分）を、それぞれＴＡＬＯＮ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ベクトンディッキンソン社製）を用いてＣ末端側のＨｉｓタグによるアフィニティカラム処理し、アクリドニル−Ｌ−アラニンが導入されたストレプトアビジンタンパク質のみを分離精製した（図１、右端のレーン）。また、上記の方法を用いて、２２番目および１２０番目の位置にアクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したストレプトアビジンについても、同様に合成、精製を行った。精製したタンパク質は３０μｌのＰＢＳ（＋０．０２％  ＰＥＧ）で溶出した。溶出液を１ｍｌにメスアップし、タンパク質の蛍光スペクトルと、ストレプトアビジンの結合相手であるビオチン添加による蛍光変化を測定した。測定は、４０５ｎｍで励起し、４４５ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図２に示す。アクリドニル−Ｌ−アラニンの蛍光は、導入位置、ビオチン濃度に依存して変化することが観察された。
【００３５】
実施例５
アクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したラクダ一本鎖抗体の蛍光測定
実施例１〜４に記載の方法を用いて、１０７番目、１０６番目、１０３番目、１２３番目の位置にアクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したラクダ一本鎖抗体についても、それぞれ同様に合成、精製を行い、ラクダ一本鎖抗体の抗原であるリゾチーム添加による蛍光強度変化を測定した。測定は、３８５ｎｍで励起し、４２０ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果を図３に示す。アクリドニル−Ｌ−アラニンの蛍光は、導入位置、リゾチーム濃度に依存して変化することが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の蛍光物質をタンパク質に導入する方法、および蛍光物質を導入したタンパク質は、細胞内追跡用のタンパク質分子プローブの作成、タンパク質のリガンド結合部位近傍へ蛍光アミノ酸を導入することによる基質あるいは阻害剤の検出プローブの作成、２種類以上の蛍光アミノ酸を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるタンパク質の立体構造変化の追跡などに用いることができ、産業界に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】８３位にアクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したストレプトアビジンタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果を示す図。ｗ．ｔは、野生型ストレプトアビジンタンパク質をポジティブコントロールとして、希釈系列により電気泳動したもの。右側の３レーンは、８３位にアクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したストレプトアビジンタンパク質（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ８３  ａｃｒｉｄｏｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ）を電気泳動したもので、左が反応液原液、中がＴＡＬＯＮカラムのフロースルー、右がＴＡＬＯＮカラムにアフィニティ−吸着した精製タンパク質を示す。Ｔｒｕｎｃａｔｅｄは、８３位に４塩基コドンをもったｔＲＮＡが導入されず、読み枠がずれて翻訳が途中で終了したもので、４塩基コドンを持ったｔＲＮＡが導入されたものは全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）のタンパク質が合成される。ｗ．ｔの希釈系列と、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ８３  ａｃｒｉｄｏｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅのｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈのバンドの濃さから、アクリドニル−Ｌ−アラニンの導入効率を算出した。
【図２】アクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したストレプトアビジンタンパク質の導入位置、ビオチン添加による蛍光変化の解析結果を示す図。
【図３】アクリドニル−Ｌ−アラニンを導入したラクダ一本鎖抗体の導入位置、リゾチーム添加による蛍光変化の解析結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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