(57)【要約】【課題】  糸状菌の取り扱いに関して特別の熟知を必要とせず迅速、簡便な糸状菌の乳酸生成能の保持を判別する方法の提供。【解決手段】  乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子にもとづき作成したプライマーと対象とする糸状菌のＤＮＡとでＰＣＲ法を行うことで、増幅バンドの有無により乳酸生成能の判別が、増幅バンドの種類と本数により乳酸生成能の強弱が判別可能な糸状菌の判別法が提供できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに作成したプライマーと、対象糸状菌のＤＮＡを用いたＰＣＲ法とにより乳酸生成能を有する糸状菌を判別することを特徴とする乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子による糸状菌の乳酸生成能の判別法。
【請求項２】
上記乳酸デヒドロゲナーゼがリゾプス・オリゼの乳酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１記載の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子による糸状菌の乳酸生成能の判別法。
【請求項３】
上記糸状菌がリゾプス属、アミロマイセス属、ムコール属糸状菌であることを特徴とする請求項１又は２記載の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子による糸状菌の乳酸生成能の判別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の乳酸生成能の判別法に関し、さらに詳しくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子にもとづき作成したプライマーと、対象とする糸状菌のＤＮＡとでＰＣＲ法を行うことにより乳酸生成能を有する糸状菌の判別を行うものである。
【背景技術】
【０００２】
発酵食品の製造においては、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品、漬物の製造や清酒製造の殺菌工程など、乳酸菌による乳酸発酵が重要な役割を担うものが多数あり、乳酸発酵能を有することから乳酸菌は有用微生物として知られる。食品製造のみならずサイレージの製造や生分解プラスチックの原料としての乳酸製造においても、発酵菌として乳酸菌の担う役割は大きい。糸状菌は、一般に各種分解酵素の生産量が高く、糖質分解酵素や蛋白質分解酵素などを各種有用酵素の生産に利用されている。清酒醸造においては、それら複合酵素の供給源として麹菌が使われており、乳酸菌、糸状菌、酵母など複数の微生物が各役割を協調して担うことで製造される。
【０００３】
一方、これら各微生物が有する機能を一つの微生物が有する例として、リゾプス属糸状菌が挙げられる。リゾプス・オリゼなどの糸状菌は、清酒醸造において数種の微生物が担っている乳酸生成、糖質分解、蛋白質分解、エタノール発酵の能力を併せ持ち、老酒の製造などに用いられてきた。このような強力な分解酵素の供給と乳酸発酵能などを併せ持つ微生物を用いることにより、農産副産物などからの発酵製品の開発や乳酸生産が安価、簡便に行うことが可能である。このような乳酸生成糸状菌を農産副産物に利用し発酵製品や乳酸などを製造する技術としては、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５等の先行技術が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−３１０２４３号公報
【特許文献２】特開２００３−２６５１１８号公報
【特許文献３】特開２００３−２４０００号公報
【特許文献４】特開２００２−２３８５９０号公報
【特許文献５】特開平１１−３７２８６号公報
【０００５】
これら先行技術においては、リゾプス・オリゼが主に使われているが、このリゾプス・オリゼの中には、乳酸を生成するタイプと、生成しない２種類のタイプとが存在するとの報告（Y. Oda, Y. Yajima, M. Kinoshita and M. Ohnishi, Differences of Rhizopus oryzae strains in organic acid synthesis and fatty acid composition, Food Microbiol. 20, 371-375. 2003) があり、それらを選別して使用する必要がある。また、乳酸生成能に加えて糖質分解酵素や蛋白質分解酵素の種類が異なる様々なタイプの乳酸生成糸状菌を用いることで、原料に応じた速やかな乳酸発酵への適応が可能である。以上を行うにあたり、糸状菌の乳酸生成能の有無を第一に判別する必要があるが、糸状菌を様々な条件下で培養し実際に生成された乳酸を定性、定量する方法が従来用いられてきた。
【０００６】
しかし、従来法では、糸状菌は環境の微妙な変化で挙動を変え、判定に熟練を要し、また、時間も要する。それを改善する技術開発として、糸状菌のリボソームＤＮＡ配列を用いたＰＣＲ法により糸状菌を分類し乳酸生成能を推定する方法（Abe A, Sone T, Sujaya IN, Saito K, Oda Y, Asano K, Tomita F., rDNA ITS sequence of Rhizopus oryzae: its application to classification and identification of lactic acid producers. Biosci Biotechnol Biochem. 67(8), 1725-31. 2003）の開示が現在のところ唯一の方法として見られるが、本方法の場合、改めて乳酸生成能の判定を行う必要があり、より迅速、簡便な技術の開発が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、糸状菌の取り扱いに関して特別の熟知を必要とせず、迅速簡便な糸状菌の乳酸生成能の保持を判別する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成すべく本発明者らが鋭意研究した結果、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子にもとづき作成したプライマーと、対象とする糸状菌のＤＮＡとでＰＣＲ法を行うことにより、乳酸生成能を有する糸状菌が迅速、簡便に判別可能なことを見出し、本発明を完成させた。またこのプライマーにより、糸状菌の乳酸生成能の有無に加えて、乳酸生成能の強弱の判別も可能となることも見出した。
すなわち、糸状菌の乳酸生成能の判別法に関し、さらに詳しくは、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に基づき作成したプライマーと、対象とする糸状菌のＤＮＡとでＰＣＲ法を行うことにより、乳酸生成能を有する糸状菌の判別と乳酸生成能の強弱の判別を可能とする技術を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子による糸状菌の乳酸生成能の判別法によれば、従来特別の熟知を必要とし、時間も要した糸状菌の乳酸生成能の判別について、迅速簡便な糸状菌の乳酸生成能の保持についての判別法を提供することができる。また、糸状菌の乳酸生成能の有無に加えて、乳酸生成能の強弱の判別も可能である。これにより、使用目的に応じた異なるタイプの乳酸生成能を有する糸状菌の選抜が、迅速、簡便に行うことが可能となる。ひいては、農産副産物などを用いた乳酸製造や各種発酵品の製造の迅速化が図れ、本発明によりバイオマス資源の有効利用への寄与が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、まず糸状菌より抽出したゲノムＤＮＡと、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の配列に基づき設計したプライマーを用意する。これらを用いＰＣＲ法を行い、生じた産物のアガロース電気泳動などを行い、生じたバンドから乳酸生成能を判別するものである。
【００１１】
本発明で言う糸状菌とは、形態として菌糸形成が見られる微生物であればよく、これらの例として、リゾプス属、アミロマイセス属、ムコール属、アスペルジルス属、ペニシリウム属などの糸状菌が挙げられる。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、一般の遺伝子手法や市販のＤＮＡ抽出用試薬を用いた方法など、いずれの方法でもよい。また、ゲノムＤＮＡの形態も部分的に切断された状態や一部分を示す部分的なＤＮＡでもよく、異なる糸状菌のゲノムＤＮＡが混合された状態でなければよい。
【００１２】
プライマーの設計に用いる乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、生物種を問わず乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子配列から設計すればよいが、好ましくは、リゾプス・オリゼ由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、より好ましくは、EMBL/GenBank/DDBJのＤＮＡデータバンクにＡＢ111529〜ＡＢ111582、ＡＢ113546〜113567及びＡＦ226154，ＡＦ226155のアクセッション番号により登録されている乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることが望ましい。
【００１３】
ＰＣＲ法は、対象とする糸状菌のゲノムＤＮＡと、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に基づくプライマーが混合されていればよく、その他用いるＰＣＲ反応用の試薬の種類は問わない。また反応の条件、用いる機器の種類など、およそ一般的に用いられる方法であればよい。バンドの検出についても、アガロース電気泳動のほか、マイクロチップ電気泳動などＤＮＡの断片を検出する方法のいずれでもよい。
【００１４】
上述のような本発明により用いるプライマーにより、糸状菌の乳酸生成能の有無に加えて、乳酸生成能の強弱の判別も可能である。これは、リゾプス・オリゼの保持する２種類の乳酸デヒドロゲナーゼＡ，Ｂの微細な塩基配列の相違に基づき判別可能であり、本発明は、乳酸生成能を有する糸状菌の乳酸生成能の強弱の判別も包括するものである。
【００１５】
次に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
糸状菌として、リゾプス・オリゼＮＢＲＣ4707株、リゾプス・オリゼＮＢＲＣ4736株、アミロマイセス・ルキシーＣＢＳ438.76、アスペルジルス・オリゼＮＢＲＣ30113を用い、最小培地（５％グルコース，０．６７％ Yeast Nitorogen Base w/o Amino Acid，０．５％カザミノ酸）で２５℃，１週間振とう培養した。１週間後培養上清を採取し、島津製作所製高速液体クロマトグラフで乳酸生成量を分析した。カラムはShodex Ionpak KC-811 (昭和電工)を用い、カラム温度６０℃、溶媒０．１％リン酸、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、ＲＩ検出器の条件で分析した。また、１２１℃，５分間高圧滅菌したポテトパルプ１０ｇに、各糸状菌を摂取しチャック付ポリ袋（縦７０ｍｍ，横４０ｍｍ，厚さ０．０４ｍｍ）に入れて２５℃で発酵させた。ポテトパルプは毎日ポリ袋の上からよくかき混ぜ、一週間後に発酵したポテトパルプ１０ｇを蒸留水３０ｍｌと十分混和させ、遠心分離後の上清を試料として採取し、高速液体クロマトグラフで乳酸生成量を分析した。その結果を、表１に示した。その結果、リゾプス・オリゼＮＢＲＣ4707株、リゾプス・オリゼＮＢＲＣ4747株、アミロマイセス・ルキシーＣＢＳ438.76で乳酸生成が見られ、その中でもリゾプス・オリゼＮＢＲＣ4707株、アミロマイセス・ルキシーＣＢＳ438.76の乳酸生成量が高く、乳酸生成能が強いことがわかった。アスペルジルス・オリゼＮＢＲＣ30113は最小培地、ポテトパルプの発酵ともに乳酸生成が見られず、乳酸生成能を保持しないことがわかった。
【００１７】
【表１】
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【実施例２】
【００１８】
実施例１に記載の糸状菌を最小培地で２５℃、１日間振とう培養した各菌体を減圧濾過で回収した。菌体を凍結乾燥した後、乳鉢、クールミル、ホモジナイザーあるいはショッカーで菌体を破砕した。粉末状菌体５００ｍｇを５０ｍｌファルコンチューブに入れ、抽出用緩衝液（200 mM Tris-HCl[pH8.5]、250 mM NaCl、25 mM EDTA、0.5% SDS）５．０ｍｌを加え、ホモジナイザーまたはショッカーで懸濁し、フェノール３．５ｍｌを添加して撹拌、さらにクロロホルム１．５ｍｌを添加して撹拌後、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１時間遠心分離した。得られた上清をフェノール５．０ｍｌで抽出、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。さらに上清にフェノール２ｍｌを添加して撹拌、クロロホルム２ｍｌを添加して撹拌後、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。上清にRNase溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃、１時間反応させ、フェノール２ｍｌを添加して撹拌、クロロホルム２ｍｌを添加して撹拌後、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。この上清に０．６倍容量のイソプロパノールを添加、撹拌し、室温に２０分間置き、４℃、１０，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した。この沈殿を７０％エタノール１０ｍｌで洗浄し、４００μｌのTE(10mM Tris-HCl[pH7.5]、1mM EDTA)に溶解してゲノムＤＮＡ溶液とした。
【００１９】
EMBL/GenBank/DDBJのＤＮＡデータバンクでＡＦ226154，ＡＦ226155のアクセッション番号で登録されているリゾプス・オリゼNRRL395株の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子Ａ、Ｂをもとにプライマーを作成した。そのプライマーの塩基配列を表２に示した。ＰＣＲ法の反応液組成は全量５０μｌとして、０．１μｇゲノム DNA，0.2mM dNTP，０．２μＭ各プライマー、1.0 U Z-Taq DNAポリメラーゼ（Takara Shuzo，Kyoto，Japan）、10×PCRバッファーを用いた。反応条件は、プレ変性（９８ ℃，５ｓｅｃ）、それに続いて変性（９８℃，５ｓｅｃ）、アニーリング（４０ ℃，５ｓｅｃ）、伸長反応（７２ ℃，２０ｓｅｃ）を３０サイクル行い、最後に変性（９８℃，２０ｓｅｃ）を行った。サーマルサイクラーはTaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONALを用いた。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
反応終了後の反応液の一部をH14アガロース (Takara)を用いアガロース電気泳動を行い増幅産物の確認を行った。その結果の一部を図１に示した。その結果、乳酸生成量が高い糸状菌では２本のバンドが、比較的生成量が少ない糸状菌では１本のバンドの増幅がそれぞれ確認できた。また、乳酸生成のない糸状菌ではバンドは増幅されなかった。このように乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ上の有無により、容易に乳酸生成能の判別が可能であり、また、増幅されるバンドの本数により乳酸生成能の強弱の判別が可能であることがわかった。これら乳酸生成の強弱についての詳細は不明であるが、２種類存在する乳酸デヒドロゲナーゼを２種類ともゲノム上保持するものが乳酸生成量が高く、１種類しか保持しない場合生成能が弱まると推察され、それがＰＣＲ法での結果に反映されるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子による糸状菌の乳酸生成能の判別法により、従来特別の熟知を必要とし、時間も要した糸状菌の乳酸生成能の判別について、迅速簡便な糸状菌の乳酸生成能の保持についての判別法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に基づき作成したプライマーと各糸状菌のゲノムＤＮＡにより行ったＰＣＲ産物のアガロース電気泳動写真である。
【図１】
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