(57)【要約】      （修正有）【課題】ニューロン組織の神経栄養因子の影響に起因して、神経系の障害を診断および処置するためのさらなる神経栄養因子を同定および特徴付けをすること。【解決手段】短縮されたニューブラスチンポリペプチドであって、ここで、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドのアミノ末端が、成熟ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端アミノ酸を欠失し、かつ、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドの該アミノ酸配列が、１１３アミノ酸長より短く、かつ開示されたプレプロポリペプチドのアミノ酸配列の４２〜１４０番に少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含む、ニューブラスチンポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮されたニューブラスチンポリペプチドであって、ここで、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドのアミノ末端が、成熟ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端アミノ酸を欠失し、かつ、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドの該アミノ酸配列が、１１３アミノ酸長より短く、かつ配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含む、ニューブラスチンポリペプチド。
【請求項２】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが二量体化される場合に、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、ＲＥＴポリペプチドに結合する、請求項１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
【請求項３】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが二量体化される場合に、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、前記ＲＥＴポリペプチドの二量体化を誘導する、請求項１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
【請求項４】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１２の該ニューブラスチンポリペプチド配列の１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位、および１１１位に対応する位置に７つのシステイン残基を含む、請求項１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
【請求項５】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、以下の工程：
成熟ニューブラスチンポリペプチドを提供する工程；および
該短縮されたニューブラスチンポリペプチドを産生するのに十分な条件下で、該成熟ニューブラスチンポリペプチドと、少なくとも１つのプロテアーゼとを接触させる工程、
によって得られる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、前記成熟ニューブラスチンポリペプチドと、少なくとも１つのエキソプロテアーゼとを接触させることによって、エキソプロテアーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物として産生される、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記エキソプロテアーゼが、アミノペプチダーゼ、Ｅｎｄｏ  Ｌｙｓ  Ｃ、およびトリプシンからなる群より選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記エキソペプチダーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物とジペプチジルペプチダーゼとを接触させる工程をさらに包含する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の短縮されたニューロブラスチン核酸を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２の核酸を用いて形質転換された、細胞。
【請求項１５】
短縮されたニューロブラスチンポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
動物に、請求項１に記載の短縮されたニューロブラスチンポリペプチドを投与する工程を包含する、該動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経栄養因子ポリペプチド、神経栄養因子ポリペプチドをコードする核酸および神経栄養因子に特異的に結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経栄養因子は、生存を促進し、表現型の分化を維持し、退化を予防し、そしてニューロン細胞およびニューロン組織の活性を増強する天然に存在するタンパク質である。神経栄養因子は神経組織および神経系によって神経支配される非神経組織から単離され、そして機能的および構造的な関連グループ（ファミリー、スーパーファミリーまたはサブファミリーともいう）に分類されている。神経栄養因子スーパーファミリーには、線維芽細胞増殖因子スーパーファミリー、ニュートロフィンスーパーファミリーおよびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーがある。神経栄養因子の個々の種は、物理的構造、これらの複合体レセプターとの相互作用および種々の型の神経細胞に対する影響によって区別される。ＴＧＦ−βスーパーファミリー（Ｍａｓｓａｇｕｅ，ら、１９９４，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：１７２−１７８）に分類されるのは、神経膠細胞株由来の神経栄養因子リガンド（「ＧＤＮＦ」；ＷＯ９３／０６１１６、本明細書中で参考として援用される）であり、これにはＧＤＮＦ、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（「ＰＳＰ」；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０：２４５−２５３、本明細書中で参考として援用される）およびニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（「ＮＴＮ」；ＷＯ  ９７／０８１９６、本明細書中で参考として援用される）が含まれる。ＧＤＮＦサブファミリーのリガンドは、ＲＥＴレセプターチロシンキナーゼを介して、シグナル伝達を誘導する能力を共通して有する。ＧＤＮＦサブファミリーのこれらの３つのリガンドは、神経栄養レセプター（ＧＦＲαレセプター）のファミリーに対する相対親和性において異なる。
【０００３】
ニューロン組織の神経栄養因子の影響に起因して、神経系の障害を診断および処置するためのさらなる神経栄養因子を同定および特徴付けをする必要が残ったままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
項目１  短縮されたニューブラスチンポリペプチドであって、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドのアミノ末端が、成熟ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端アミノ酸を欠失する、ニューブラスチンポリペプチド。
項目２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが二量体化される場合に、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、ＲＥＴポリペプチドに結合する、項目１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
項目３  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが二量体化される場合に、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、前記ＲＥＴポリペプチドの二量体化を誘導する、項目１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
項目４  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１２の該ニューブラスチンポリペプチド配列の１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位、および１１１位に対応する位置に７つのシステイン残基を含む、項目１に記載の短縮されたニューブラスチンポリペプチド。
項目５  短縮されたニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該短縮されたニューブラスチンポリペプチドの該アミノ酸配列が、１１３アミノ酸長より短く、かつ配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
項目６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に少なくとも８０％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に少なくとも９０％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目８  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に少なくとも９５％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目９  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目１０  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に９９アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目１１  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に少なくとも８０％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目１２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に少なくとも９０％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目１３  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に少なくとも９５％相同である、項目５に記載のポリペプチド。
項目１４  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目１５  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０２アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目１６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、以下の工程：
成熟ニューブラスチンポリペプチドを提供する工程；および
該短縮されたニューブラスチンポリペプチドを産生するのに十分な条件下で、該成熟ニューブラスチンポリペプチドと、少なくとも１つのプロテアーゼとを接触させる工程、
によって得られる、項目５に記載のポリペプチド。
項目１７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、前記成熟ニューブラスチンポリペプチドと、少なくとも１つのエキソプロテアーゼとを接触させることによって、エキソプロテアーゼニューブラスチンポリペプチド消化物として産生される、項目１６に記載のポリペプチド。
項目１８  前記エキソプロテアーゼが、アミノペプチダーゼ、Ｅｎｄｏ  Ｌｙｓ  Ｃ、およびトリプシンからなる群より選択される、項目１６に記載のポリペプチド。
項目１９  前記エキソペプチダーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物とジペプチジルペプチダーゼとを接触させる工程をさらに包含する、項目１６に記載のポリペプチド。
項目２０  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、グリコシル化されている、項目５に記載のポリペプチド。
項目２１  項目５に記載のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、核酸。
項目２２  高度にストリンジェントな溶液ハイブリダイゼーション条件下で、項目２１に記載の核酸に特異的にハイブリダイズする、核酸。
項目２３  前記核酸によってコードされるポリペプチドを細胞中で発現させる工程を包含する、項目２１のニューロブラスチン核酸を使用する方法。
項目２４  動物に前記核酸を投与する工程、および前記ポリペプチドを該動物中で発現させる工程、をさらに包含する、項目２３に記載の方法。
項目２５  項目２１に記載の短縮されたニューロブラスチン核酸を含む、ベクター。
項目２６  前記ベクターが、発現ベクターである、項目２５に記載のベクター。
項目２７  前記核酸によってコードされるポリペプチドを該核酸から発現させる工程を包含する、項目２６に記載のベクターを使用する方法。
項目２８  項目２１の核酸を用いて形質転換された、細胞。
項目２９  前記細胞が、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および細菌細胞からなる群より選択される、項目２８に記載の細胞。
項目３０  前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目２９に記載の方法。
項目３１  前記哺乳動物細胞が、該哺乳動物の中枢神経系由来の細胞である、項目２９に記載の方法。
項目３２  前記方法が、項目２１に記載の核酸から、前記ポリペプチドを発現させる工程を包含する、項目５の短縮されたニューロブラスチンポリペプチドを作製する方法。
項目３３  前記短縮されたニューロブラスチンポリペプチドの産生を可能にする培養培地中で、前記核酸を含む細胞を培養する工程を包含する、項目３２に記載の方法。
項目３４  前記ポリペプチドを前記培養培地から回収する工程をさらに包含する、項目３３に記載の方法。
項目３５  項目３２の方法によって得られる、精製された短縮されたニューロブラスチンポリペプチド。
項目３６  短縮されたニューロブラスチンポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
項目３７  短縮されたニューロブラスチンポリペプチドをコードする核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
項目３８  単離された細胞に前記ポリペプチドを送達する工程またはインビボで哺乳動物に前記ポリペプチドを送達する工程を含む、項目１の短縮されたニューロブラスチンポリペプチドを投与する方法。
項目３９  前記インビボでの投与が、全身性投与を含む、項目３８に記載の方法。
項目４０  項目３９に記載の方法であって、前記哺乳動物が、以下：
虚血性神経損傷、外傷性脳傷害、末梢性ニューロパシー、神経障害性疼痛、アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および記憶欠陥からなる群より選択される状態に罹患している、方法。
項目４１  前記哺乳動物が、末梢神経系、髄質、または脊髄の神経障害に罹患している、項目３９に記載の方法。
項目４２  前記動物に、項目２１に記載の短縮されたニューロブラスチン核酸を投与する工程を包含する、動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法。
項目４３  前記動物に、項目１に記載の短縮されたニューロブラスチンポリペプチドまたは項目５に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法。
項目４４  前記哺乳動物に、治療有効量の短縮されたニューロブラスチンポリペプチドを投与する工程を包含する、哺乳動物の末梢ニューロパシーを処置する方法。
項目４５  項目４４に記載の方法であって、前記末梢性ニューロパシーが、以下：
外傷誘導性ニューロパシー、ウイルス誘導性ニューロパシー、化学療法誘導性ニューロパシー、毒素誘導性ニューロパシー、薬物誘導性ニューロパシー、ビタミン欠損誘導性ニューロパシー；特発性ニューロパシー；および糖尿病性ニューロパシー、
からなる群より選択される、方法。
項目４６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、中枢神経系へと直接送達される、項目４４に記載の方法。
項目４７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、皮下注射、静脈内投与、または静脈内注入によって全身送達される、項目４４に記載の方法。
項目４８  前記哺乳動物に、治療有効量の短縮されたニューブラスチンポリペプチドを投与する工程を包含する、動物の神経障害性疼痛を処置する方法。
項目４９  項目４８に記載の方法であって、前記神経障害性疼痛が、以下：
毒素誘導性神経障害、病原体誘導性神経障害、外傷誘導性神経障害、薬物誘導性神経障害、特発性神経障害、糖尿病性神経障害、炎症誘導性神経障害、または神経変性、
に関連する、方法。
項目５０  哺乳動物の末梢性ニューロパシーを処置する方法であって、該方法が、該哺乳動物に、短縮されたニューブラスチンポリペプチドをコードする治療有効量の核酸を投与する工程を包含する、方法。
項目５１  項目５０に記載の方法であって、前記末梢性ニューロパシーが、以下：
外傷誘導性ニューロパシー、ウイルス誘導性ニューロパシー、化学療法誘導性ニューロパシー、毒素誘導性ニューロパシー、薬物誘導性ニューロパシー、ビタミン欠損誘導性ニューロパシー；特発性ニューロパシー；および糖尿病性ニューロパシー、
からなる群より選択される、方法。
項目５２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドをコードする前記核酸が、前記中枢神経系に直接送達される、項目５０に記載の方法。
項目５３  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドが、皮下注射、静脈内投与、または静脈内注入によって全身送達される、項目５０に記載の方法。
項目５４  １つ以上の容器中に、短縮されたニューブラスチンポリペプチド、および短縮されたニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される物質を含む、キット。
項目５５  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４１〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目５６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１００アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目５７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸４０〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目５８  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０１アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目５９  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３８〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目６０  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０３アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目６１  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３７〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目６２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０４アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目６３  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３６〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目６４  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０５アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目６５  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３５〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目６６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０６アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目６７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３４〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目６８  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０７アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目６９  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３３〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目７０  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０８アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目７１  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３２〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目７２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１０９アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目７３  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３１〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目７４  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１１０アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目７５  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸３０〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目７６  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１１１
アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目７７  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸２９〜１４０を含む、項目５に記載のポリペプチド。
項目７８  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、本質的に１１２アミノ酸からなる、項目５に記載のポリペプチド。
項目７９  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９における対応する配列に少なくとも８０％相同である、項目５５〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
項目８０  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９における対応する配列に少なくとも９０％相同である、項目５５〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
項目８１  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９における対応する配列に少なくとも９５％相同である、項目５５〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
項目８２  前記短縮されたニューブラスチンポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号９における対応する配列に少なくとも９９％相同である、項目５５〜７８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
本発明は、本明細書中で「ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」または「ＮＢＮ」と呼ばれる新規の神経栄養因子に関する。ニューブラスチンは、ＧＤＮＦサブファミリーに分類される。なぜならこれは他のＧＤＮＦリガンドと相同な領域を共有し（以下の表３および表４を参照のこと）、そしてＲＥＴ（例えば、Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１３，ｐｐ．３１３−３２５（１９９９）を参照のこと）と相互作用する能力があるからであり、ニューロブラスチンは新規および独特な神経栄養因子である。他のＧＤＮＦリガンドとは異なり、ニューロブラスチンはＧＦＲα３−ＲＥＴレセプター複合体と高い親和性を示し、そしてそのアミノ酸配列に独特なサブ領域を有する。
【０００５】
ＮＢＮ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは本発明に含まれる。ＮＢＮポリペプチドは二量体として生物学的に活性であり、そしてモノマーとしてほとんど活性がない何らかの活性を有する。１つの局面において、本発明は短縮（型）ニューブラスチンポリペプチドを提供し、ここで短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸末端は、成熟
ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端アミノ酸を欠損する。好ましくは、二量体である場合、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、ＲＥＴポリペプチドに結合する。好ましくは、短縮型活性ニューブラスチンポリペプチドは、ＲＥＴポリペプチドの二量体化を誘導する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１２（成熟１１３ＡＡ）のニューブラスチンポリペプチドの１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位および１１１位に対応する位置に７つのシステイン残基を含み、これらは、例えば、配列番号９の４３位、７０位、７４位、１０７位、１０８位、１３６位、１３８位に対応する。配列番号９は、残基−８０〜残基−１は、短縮型ＮＢＮポリペプチドのプレプロセクションに対応し、そして残基１〜残基１４０は、成熟ＮＢＮ１４０の１４０アミノ酸に対応するように番号付けされる。この番号付けスキームは、便宜を図るためにのみ示され、そして本明細書中に開示されるプレプロＮＢＮ、プロＮＢＮ、成熟ＮＢＮまたは短縮型ＮＢＮのいずれかの１つ以上の形態に関してこのスキームから推論が引き出されることはない。
【０００７】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドはまた、本発明の範囲内にある。短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、１１３未満のアミノ酸長であり、そして配列番号９のアミノ酸２８〜１４０に対して少なくとも７０％相同なアミノ酸配列含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に対して少なくとも８０％相同である。より好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に対して少なくとも９０％相同である。なおより好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に対して少なくとも９５％相同である。さらなる実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０に対して少なくとも９９％相同である。最も好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０を含む。いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、本質的に配列番号４８の９９アミノ酸からなる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に対して少なくとも８０％相同である。好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に対して少なくとも９０％相同である。より好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に対して少なくとも９５％相同である。最も好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０を含む。さらなる実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０に対して少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、本質的に配列番号４８の１０２アミノ酸からなる。
【００１０】
さらなる実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸２９〜１４０と同一であるか、または少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％相同であり、そして本質的に１１２アミノ酸からなる。代替の実施形態において、上記の同一性または相同性パーセントは、配列番号９のアミノ酸３０〜１４０、配列番号９のアミノ酸３１〜１４０、配列番号９のアミノ酸３２〜１４０、配列番号９のアミノ酸３３〜１４０、配列番号９のアミノ酸３４〜１４０、配列番号９のアミノ
酸３５〜１４０、配列番号９のアミノ酸３６〜１４０、配列番号９のアミノ酸３７〜１４０、配列番号９のアミノ酸３８〜１４０、配列番号９のアミノ酸４０〜１４０または配列番号９のアミノ酸４１〜１４０に対してである。これらの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ本質的に１１１アミノ酸、１１０アミノ酸、１０９アミノ酸、１０８アミノ酸、１０７アミノ酸、１０６アミノ酸、１０５アミノ酸、１０４アミノ酸、１０３アミノ酸、１０１アミノ酸または１００アミノ酸からなる。特定の実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７または４８のいずれか１つのポリペプチドである。
【００１１】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、ＮＢＮ１１３のような成熟ニューブラスチンポリペプチドを提供し、そして短縮型ニューブラスチンポリペプチドを生成するに十分な条件下で少なくとも１つのプロテアーゼと成熟ニューブラスチンポリペプチドとを接触させることよって得られ得る。好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、少なくとも１つのエキソプロテアーゼと成熟ニューブラスチンポリペプチドとを接触させることによってエキソプロテアーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物として生成される。好ましいプロテアーゼは、アミノペプチダーゼ、Ｅｎｄｏ  ｌｙｓ  Ｃおよびトリプシンのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、この方法は、ジペプチジルペプチダーゼとエキソペプチダーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物とを接触させる工程をさらに包含する。
【００１２】
１つの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチドである。代替の実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、グリコシル化されていない。
【００１３】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む核酸もまた、本発明の範囲内にある。いくつかの実施形態において、核酸は、高ストリンジェンシーな液体ハイブリダイゼーション条件下で改変体ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする。
【００１４】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸は、細胞に核酸を導入しそして核酸によってコードされるポリペプチドを細胞中に発現させることによって使用され得る。所望である場合、この方法は動物に核酸を投与する工程、およびこのポリペプチドを動物中で発現させる工程を包含し得る。
【００１５】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）として提供され得る。このベクターを使用して、コードされた短縮型ニューブラスチンポリペプチドを発現し得る。
【００１６】
本発明はまた、短縮型ニューブラスチンポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸で形質転換された細胞を含む。この細胞は、例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および細菌細胞であり得る。好ましい哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞、または哺乳動物の中枢神経系由来の細胞である。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸を発現することによって短縮型ニューブラスチンポリペプチドを作製する方法を包含する。好ましくは、この方法は、短縮型ニューブラスチンポリペプチドの生産を可能にする培養培地中で、核酸を含む細胞を培養する工程を包含する。この方法はまた、培養培地からポリペプチドを回収する工程を包含し得る。この方法によって得られた短縮型ニュー
ブラスチンポリペプチド（例えば、精製タンパク質）もまた本発明によって提供される。
【００１８】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた、本発明によって提供される。短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物もまた、本発明の範囲内にある。
【００１９】
なおさらなる局面において、本発明は、単離された細胞またはインビボで哺乳動物（例えば、ヒト）に短縮型ニューブラスチンポリペプチドを送達することによって短縮型ニューブラスチンポリペプチドを投与する方法を提供する。好ましくは、インビボでの投与は、全身投与を含む。動物は、例えば、虚血性神経損傷、外傷性脳損傷、末梢性神経障害、神経障害性疼痛、アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および記憶障害のような状態に苦しめられ得る。いくつかの実施形態において、動物は、末梢神経系、髄質または脊髄のニューロン障害に苦しめられる。
【００２０】
本発明はまた、短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物に投与することによって哺乳動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法を提供する。
【００２１】
短縮型ニューブラスチンポリペプチドを動物に投与することによって動物の神経変性疾患または神経変性障害を処置する方法もまた、本発明によって提供される。別の局面において、本発明は哺乳動物の末梢性神経障害を処置する方法を特徴とし、この方法は、治療的に有効量の短縮型ニューブラスチンポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する。末梢性神経障害は、例えば、以下の神経障害のうちの１つ以上であり得る：外傷誘発性神経障害、ウイルス誘発性神経障害、化学療法誘発性神経障害、毒素誘発性神経障害、薬物誘発性神経障害、ビタミン欠乏誘発性神経障害；突発性神経障害；および糖尿病性神経障害。いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、中枢神経系に直接送達される。他の実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、皮下注射、筋内投与、静脈内投与または静脈内注入によって好ましくは全身に投与される。
【００２２】
哺乳動物の神経障害性疼痛を処置する方法もまた、本発明の範囲内にあり、この方法は治療的有効量の短縮型ニューブラスチンポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、神経障害性疼痛は毒素誘発性神経損傷、病原体誘発性神経損傷、炎症誘発性神経損傷または神経変性に関連する。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は治療的有効量の短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物の末梢性神経障害を処置する方法を特徴とする。末梢性神経障害は、好ましくは以下の神経障害のうちの１つ以上である：外傷誘発性神経障害、化学療法誘発性神経障害、毒素誘発性神経障害、ウイルス誘発性神経障害、薬物誘発性神経障害、ビタミン欠乏誘発性神経障害；突発性神経障害；および糖尿病性神経障害。好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸は、中枢神経系に直接送達される。好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸は、皮下注射、静脈内投与または静脈内注入によって全身に送達される。
【００２４】
１つ以上の容器中に、短縮型ニューブラスチンポリペプチドおよび短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸からなる群から選択される物質を含むキットもまた、本発明によって提供される。
【００２５】
「ニューブラスチンポリペプチド」は、本明細書中で用いられる場合、神経栄養活性（例えば、実施例６、７、８および９に記載されるような）を保有するポリペプチドであり、そして配列番号２のＡＡ−９５−ＡＡ１０５、配列番号２のＡＡ１−ＡＡ１０５、配列番号４のＡＡ−９７−ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ−４１−ＡＡ１４０（「プロ」）、配列番号４のＡＡ１−ＡＡ１４０、配列番号９のＡＡ−８０−ＡＡ１４０（「野生型」プレプロＮＢＮ）、配列番号９のＡＡ−４１−ＡＡ１４０（プロＮＢＮ）、配列番号５のＡＡ１−ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ１−ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ１−ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ１−ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ１−ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ１−ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、ならびにそれらの配列番号３５〜４８の改変体および誘導体の短縮型ポリペプチドに示すヒト「ニューブラスチン」ポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。さらに、本発明は、配列番号１６のＡＡ１−ＡＡ２２４に示すマウス「ニューブラスチン」ポリペプチドまたは配列番号３４のＡＡ１−ＡＡ２２４に示すラットニューブラスチンポリペプチドに対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意図する。
【００２６】
好ましくは、上記で同定されたニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列は、配列番号２のＡＡ７２−ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ１０７−ＡＡ１４０）、より好ましくは配列番号２のＡＡ４１−ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ７６−ＡＡ１４０）に示すアミノ酸配列を、または配列番号１６または３４のＡＡ１９１−ＡＡ２２４に示すアミノ酸配列を有する。
【００２７】
また、ニューブラスチンポリペプチドが、ＧＤＮＦファミリーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーに特有の７つの保存されたＣｙｓ残基を保持することが好ましい。この７つの保存されたシステイン残基は、配列番号１２（成熟１１３ＡＡ）のニューブラスチンポリペプチドの１６位、４３位、４７位、８０位、８１位、１０９位および１１１位に位置する。これらは、例えば、配列番号９の４３位、７０位、７４位、１０７位、１０８位、１３６位および１３８位に対応するか、または例えば、配列番号１６もしくは３４の１２７位、１５４位、１５８位、１９１位、１９２位、２２０位および２２２位に対応する。
【００２８】
好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドは、上記の配列（すなわち、配列番号２のＡＡ−９５−ＡＡ１０５、配列番号２のＡＡ１−ＡＡ１０５、配列番号４のＡＡ−９７−ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ１−ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ−４１−ＡＡ１４０、配列番号９のＡＡ−８０−ＡＡ１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ−４１−ＡＡ１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ１−ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ１−ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ１−ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ１−ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ１−ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ１−ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１６または３４のＡＡ１−ＡＡ２２４、ならびに配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および４８（それぞれ、短縮型ＮＢＮ１１２〜短縮型ＮＢＮ９９））に対して、８５％より高い相同性を有する、より好ましくは９０％より高い相同性を有する、より好ましくは９５％より高い相同性を有する、最も好ましくは９９％より高い相同性を有する、アミノ酸配列を有する。
【００２９】
「ニューブラスチン核酸」は、本明細書中で用いられる場合は、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。従って、単離されたニューブラスチン核酸は、翻訳に必要な適切な構成要素に曝露されたならば、ニューブラスチンポリペプチドをコードする（ｅｎｃｏｄｅまたはｃｏｄｅ  ｆｏｒ）ヌクレオチドコドンのオープンリーディングフレームを有するポリヌクレオチド分子である。本発明のニューブラスチン核
酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、またはニューブラスチンｍＲＮＡに相補的であるＤＮＡおよび／もしくはニューブラスチンｍＲＮＡから転写されるＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）であり得る。従って、本発明のニューブラスチン核酸は、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して特異性を有してハイブリダイズするポリヌクレオチド分子をさらに包含する。本発明はまた、ニューブラスチンポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを同定、単離および増幅する際に有用である核酸プライマーに関する。本発明の特定の実施形態では、これらのプライマーのうちの特定のものは、ニューブラスチン核酸へのハイブリダイゼーションには有用であるが、ＧＤＮＦファミリーの他のメンバーをコードする核酸へのハイブリダイゼーションには有用でない、ニューブラスチン特異的プローブである。「特異的」、「特異性」または「特異的に」によって、ニューブラスチン核酸とハイブリダイズできかつ非ニューブラスチン核酸（他のＧＤＮＦリガンド（例えば、ＧＤＮＦ、パーセフィンおよびニュールツリン）を独自にコードする核酸とハイブリダイズできないことを含む）とハイブリダイズできないことを意味する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明のニューブラスチン核酸は、相補的核酸配列を有するか、またはニューブラスチンをコードするポリヌクレオチドに対して高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件で特異性を有してハイブリダイズすることを実証することのいずれかによって、ニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的であると同定される核酸である。特定のニューブラスチン核酸としては、本明細書中に示され、そして以下のように称される核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない：配列番号１、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２９および配列番号３０、ならびにプライマー配列番号１７〜２８、３１および３２。本発明のニューブラスチン核酸は、図８に示す核酸フラグメントを含むがこれらに限定されない、ニューブラスチン核酸の独特のサブ領域（またはフラグメント）をさらに包含する。
【００３１】
本発明のニューブラスチン核酸を用いて、例えば、ニューブラスチンポリペプチドをインビボで発現することによって、またはニューブラスチン核酸をインビボでの発現のために動物に投与することによって、ニューブラスチンポリペプチドを発現し得る。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクター（例えば、発現ベクターまたはクローニングベクター）中に含まれ得る。ニューブラスチン核酸は、核酸ベクターの一部として、維持、再生産、移入または発現され得るが、その必要はない。ニューブラスチンポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターは、細胞内に導入および／または維持され得る。ニューブラスチンベクターを保有する細胞は、原核生物であり得る。あるいは、ニューブラスチン核酸は、真核生物細胞（例えば、成熟タンパク質へのポリペプチドの適切な翻訳後プロセシング装置および／またはポリペプチドをその細胞の細胞外環境中に分泌するに適切な装置を含む真核生物細胞）中に導入され得る。
【００３２】
本発明は、ニューブラスチン神経栄養因子「ニューブラスチン」をさらに特徴とする。ニューブラスチンは、ポリペプチドの形態であってもよく、または２以上のニューブラスチンポリペプチドのマルチマー（例えば、ニューブラスチンダイマー）であってもよい。ニューブラスチンポリペプチドは、以下を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の分子間の構造的会合マルチマーとして会合する：システイン−システイン相互作用、ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用。特定のニューブラスチンポリペプチドとしては、本明細書中に開示され、そして以下のように称されるアミノ酸配列が挙げられるがこれらに限定されない：配列番号２；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号３４および配列番号３５〜４８。好ましくは、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、ダ
イマー化した場合、ＲＥＴに結合する。より好ましくは、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化した場合、ＲＥＴのダイマー化を誘導する。細胞表面でのＲＥＴのダイマー化は、ＲＥＴダイマーの自己リン酸化を、そして最終的にはＲＥＴ媒介細胞内シグナル伝達カスケードの活性化をもたらす。
【００３３】
本発明のニューブラスチンポリペプチドは、損傷したニューロンおよび外傷を受けたニューロンを含むがこれらに限定されない、ニューロンにおける欠損を処置するために有用である。外傷を経験した末梢神経としては、髄質の神経および脊髄の神経が挙げられるがこれらに限定されない。ニューブラスチンポリペプチドは、神経変性疾患（例えば、大脳虚血ニューロン損傷；神経障害（例えば、末梢神経障害）、アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））の処置において有用である。ニューブラスチンポリペプチドは、損なわれた記憶（例えば、痴呆に関連した記憶障害）の処置における使用がさらに意図される。
【００３４】
状態または疾患のさらなる例は、末梢神経系、髄質または脊髄の障害、ならびに外傷誘発性神経障害、化学療法誘発性神経障害、毒素誘発性神経障害、薬物誘発性神経障害、ビタミン欠損誘発性神経障害；特発性神経障害；および糖尿病性神経障害、毒素誘発性神経損傷に関連した神経障害性疼痛、病原体誘発性神経損傷、炎症誘発性神経損傷、または神経変性である。末梢神経障害のさらなる例としては、外傷誘発性神経障害、化学療法誘発性神経障害、毒素誘発性神経障害、薬物誘発性神経障害、ビタミン欠損誘発性神経障害；特発性神経障害；および糖尿病性神経障害が挙げれられる。
【００３５】
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または等価な方法および材料が本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾がある場合、本明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示にすぎず、そして限定されることを意図しない。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
出願人らは、本明細書中で「ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」または「ＮＢＮ」と呼ばれる新規の神経栄養性因子をコードする核酸を同定した。ニューブラスチンは、神経栄養性因子のトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのグリア細胞由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）サブクラスのメンバーである。ＮＢＮポリペプチドは、二量体として生物学的に活性であり、そして単量体では神経栄養性活性をほとんど有さないか全く有さない。従って、本発明の任意のニューブラスチンポリペプチドに対する本明細書中の言及は、他に特定されなければ、示されたニューブラスチンのホモ二量体形態を示すことが理解される。
【００３８】
ニューブラスチンをコードするｃＤＮＡは、もともとは、以下のように同定された。ＴＢＬＡＳＴＮ  １．４．１１アルゴリズム（Ａｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，ｐｐ．３３８９−３４０２（１９９７））およびクエリーとしてのヒトペルセフィン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０４０９６２）を使用して、２９０ｂｐのフラグメントが、２つのヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）（ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）の高スループットゲノム配列（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＨＴＧＳ）で最初に同定された。
ＡＣ００５０３８は、５コンティグの不規則配列からなる約１９０，０００ｂｐからなり、ＡＣ００５０５１は、１２コンティグの不規則配列からなる約１３２，０００ｂｐからなる。２つのＢＡＣクローン中で同定されるた２９０ｂｐのフラグメントは、神経栄養性因子であるヒトペルセフィンのｃＤＮＡのコード領域に対して相同であるが同一でない領域を有することが明らかとなった。
【００３９】
この２９０ｂｐの配列から、２つのニューブラスチン特異的ＰＣＲプライマー（Ｔｏｐ
Ｓｔａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１７）およびＢｏｔｔｏｍ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１８））が合成された。ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングが実施された。この最初のスクリーニングは、約５，０００クローン／ウエルを含む５００，０００ｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリー「マスタープレート」の、２つのＰＣＲプライマー（配列番号１７および１８）を用いる９６ウエルのＰＣＲベースのスクリーニングを含む。第２のＰＣＲベースのスクリーニングは、約５，０００クローン／ウエルのＥ．ｃｏｌｉグリセロールストックを含むヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー「サブプレート」上で実施された。
【００４０】
１０２ｂｐのフラグメント（配列番号１３）が、マスタープレートとサブプレートの両方のＰＣＲベースのスクリーニングにおいて同定された。ポジティブｃＤＮＡクローン（１０２ｂｐのフラグメントを保有する）が選択され、２つのＬＢ／抗生物質含有プレートにプレートされ、そして一晩成長させた。これらのプレートから、全部で９６個の細菌コロニーを選択し、そしてＰＣＲプライマー（配列番号１７および１８）および必用とされるＰＣＲ増幅試薬の両方を含む、新しい９６ウエルＰＣＲプレートのウエルに別々に配置した。次いで、ＰＣＲ増幅を実施し、そして９６の個々のＰＣＲ反応を２％のアガロースゲル電気泳動によって分析した。次いで、１０２ｂｐのフラグメントを含むクローンを有するポジティブコロニーを同定した。プラスミドＤＮＡを、１０２ｂｐのフラグメントを含むポジティブコロニーから得、そして配列決定した。続く配列決定分析によって８６１ｂｐの全長ｃＤＮＡ（配列番号８）の存在が明らかとなった。６６３ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（コード領域（ＣＤＳ）とも呼ばれる）は、配列番号８中で同定され、プレプロポリペプチド（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（「プレプロニューブラスチン（ｐｒｅ−ｐｒｏ−Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」と表される）をコードし、そして配列番号９に示される。配列番号９に基づいて、ニューブラスチンポリペプチドの３つの改変体が同定された。これらの改変体としては以下が挙げられる：
（ｉ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を保有する、本明細書中でＮＢＮ１４０と表される１４０ＡＡポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列を保有する、本明細書中でＮＢＮ１１６と表される１１６ＡＡポリペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を保有する、本明細書中でＮＢＮ１１３と表される１１３ＡＡポリペプチド。
【００４１】
ニューブラスチンの他の改変体は、切断されたＮＢＮ形態を含む。これらの例としては、以下が挙げられる：
（ｉｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１１２カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸２９〜１４０（配列番号３５）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１３〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１１２と表される１１２ＡＡポリペプチド配列；
（ｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１１１カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３０〜１４０（配列番号３６）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１４〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１１１と表される１１１ＡＡポリペプチド配列；
（ｖｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１１０カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列
番号９のアミノ酸３１〜１４０（配列番号３７）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１５〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１１０と表される１１０ＡＡポリペプチド配列；
（ｖｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０９カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３２〜１４０（配列番号３８）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１６〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０９と表される１０９ＡＡポリペプチド配列；
（ｖｉｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０８カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３３〜１４０（配列番号３９）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１７〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０８と表される１０８ＡＡポリペプチド配列；
（ｉｘ）ニューブラスチンポリペプチドの１０７カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３４〜１４０（配列番号４０）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１８〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０７と表される１０７ＡＡポリペプチド配列；
（ｘ）ニューブラスチンポリペプチドの１０６カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３５〜１４０（配列番号４１）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１１９〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０６またはＮ−７と代替的に表される、１０６ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０５カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３６〜１４０（配列番号４２）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２０〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０５と表される１０５ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０４カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３７〜１４０（配列番号４３）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２１〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０４またはＮ−９と代替的に表される、１０４ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｉｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１０３カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３８〜１４０（配列番号４４）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２２〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０３と表される１０３ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｉｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１０２カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸３９〜１４０（配列番号４５）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２３〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０２と表される１０２ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｖ）ニューブラスチンポリペプチドの１０１カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸４０〜１４０（配列番号４６）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２４〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１０１と表される１０１ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｖｉ）ニューブラスチンポリペプチドの１００カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸４１〜１４０（配列番号４７）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２５〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ１００と表される１００ＡＡポリペプチド配列；
（ｘｖｉｉ）ニューブラスチンポリペプチドの９９カルボキシ末端アミノ酸（例えば、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０（配列番号４８）または配列番号１６もしくは３４のアミノ酸１２６〜２２４）を保有する、本明細書中でＮＢＮ９９またはＮ−１４と代替的に表される、９９ＡＡポリペプチド配列。
【００４２】
本明細書中に記載されるニューブラスチンポリペプチドは、任意の生物活性形態で提供され得、その形態としては、以下が挙げられる：プレプロタンパク質、プロタンパク質、
成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、非グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質、非リン酸化タンパク質、切断された形態、または任意の他の翻訳後に修飾されたタンパク質。生物活性ニューブラスチンは、各ＮＢＮ改変体についての二量体化された形態で存在すると考えられ、この二量体の形成は、活性に必要とされる。単量体ＮＢＮポリペプチドにおいては、神経栄養性活性が、ほとんどまたは全く活性がないことが観察されている。生物活性ニューブラスチンポリペプチドは、補助因子（例えば、ＧＦＲα３またはＲＥＴ）の存在下において、ＧＦＲα３またはＧＦＲα３とＲＥＴの複合体に結合し、ＲＥＴの二量体化、およびＲＥＴの自己リン酸化を誘導する、二量体化されたポリペプチドを含む。本明細書中に開示されるニューブラスチンの切断された形態（例えば、それぞれ、配列番号３５〜４８に示される、１１２ＡＡ、１１１ＡＡ、１１０ＡＡ、１０９ＡＡ、１０８ＡＡ、１０７ＡＡ、１０６ＡＡ、１０５ＡＡ、１０４ＡＡ、１０３ＡＡ、１０２ＡＡ、１０１ＡＡ、１００ＡＡまたは９９ＡＡ形態）、ならびに上記のその他全てのＮＢＮポリペプチドは、二量体であること、および各二量体が神経栄養性活性を有することが理解される。
【００４３】
７８２ｂｐの５’非翻訳ＤＮＡ、６６３ｂｐのコードＤＮＡ、および４４７ｂｐの３’非翻訳ＤＮＡを含むｃＤＮＡ配列全体（合計１９９２ｂｐ）が、登録番号ＡＦ１２０２７４でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
【００４４】
このゲノムニューブラスチンコード配列を、以下のように同定した：
ゲノムニューブラスチンコード配列をクローニングする目的で、さらなるプライマーのセットを準備した。特に、プライマー対１は、配列番号２３として示されるセンスおよび配列番号２４として示されるアンチセンスを含み、プライマー対２は、配列番号２５として示されるセンスおよび配列番号２６として示されるアンチセンスを含む。
【００４５】
プライマー対２を使用して、８８７ｂｐのＤＮＡフラグメントをヒトゲノムＤＮＡの調製物からＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。生じたプラスミドを配列決定し、そして８６１ｂｐの推定ｃＤＮＡ配列（本明細書中でニューブラスチンと呼ばれるタンパク質をコードする）を予測した（配列番号３に示される）。同様に、プライマー対１を使用して、８７０ｂｐのＤＮＡフラグメントをヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲによって得た。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端にあるさらなる４２ｂｐの領域を、８８７ｂｐの配列と比較して、このフラグメント中に見出した。ニューブラスチン遺伝子のゲノム構造を、他の神経栄養性因子の核酸配列と比較し、エキソン−イントロンの境界をマッピングすることによって予測した。この分析によって、このニューブラスチン遺伝子が、７０ｂｐのイントロンに分けられた少なくとも２つのエキソンを有することが証明された。
【００４６】
この配列をまた、ニューブラスチンＥＳＴ配列についてＧｅｎＢａｎｋをスクリーニングするのに使用した。ＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＡ８４４０７２、ＡＡ９３１６３７およびＡＡ５３３５１２を有する３つを同定し、これによってニューブラスチン核酸がｍＲＮＡに転写されることが示された。
【００４７】
得られた全ｃＤＮＡ配列（ＡＦ１２０２７４）およびＧｅｎＢａｎｋエントリーＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１に存在する、本発明のゲノム配列の比較によって、ニューブラスチン遺伝子が、４つのイントロンによって分けられた少なくとも５つのエキソン（３つのコードを含む）からなることが明らかとなった（図７を参照のこと）。そして、このエキソンは、全長ニューブラスチンポリペプチドの予測されたアミノ酸配列を有する。８８７ｂｐフラグメントがプロニューブラスチンの完全コード領域を含むことが見出されたことに注意されたい。この予測されたｃＤＮＡ（配列番号３）は、プロニューブラスチン（１８１アミノ酸残基）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を
含み、これは、３つの公知のヒトタンパク質（ペルセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）、ニューツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、およびＧＤＮＦ）に対する相同性を示した。実施例中の表３を参照のこと。
【００４８】
（本発明のニューブラスチン核酸）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを発現し得るポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列、ならびにアンチセンス配列が挙げられ、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子コードの結果として縮重しているが、ニューブラスチンポリペプチドについての発現をコードする配列を含む。
【００４９】
本明細書中で規定される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長、好ましくは少なくとも１５塩基長であるヌクレオチドの重合体形態を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、そのポリヌクレオチドが誘導された生物からの天然に存在するゲノム中では直接連続する両方のコード配列（１つは５’末端そして１つは３’末端）と直接連続しないポリヌクレオチドを意味する。従って、この用語は、発現ベクター、自律複製プラスミドもしくは自律複製ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ、タンパク質の配列とは独立して組み込まれるか、あるいは別の分子として存在する（例えば、ｃＤＮＡ）遺伝子組換えＤＮＡを含む。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、１つ以上のヌクレオチド位置に、対立遺伝子改変体および本明細書中に示されたヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する「変異ポリヌクレオチド」を含む。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖、またはこの部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、少なくとも中程度、中程度／高度、または高度なストリンジェンシー条件下で以下により詳細に記載するようにハイブリダイズし得る核酸（ＤＮＡ）配列を有する。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列、または配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％相同である核酸（ＤＮＡ）配列を有する。
【００５３】
最も好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号１として示されるＤＮＡ配列、配列番号３として示されるＤＮＡ配列、配列番号８として示されるＤＮＡ配列、または配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００５４】
本発明はまた、ニューブラスチンポリペプチドまたはそのフラグメントの発現をコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するための、新規のプライマーおよびＤＮＡ配列を提供する。このようなプライマーとしては、配列番号１７〜２８、および３１〜３２に示されるポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、本発明は、配列番号１３および１４に示される配列を含む、これらのプライマーから作製されたニューブラスチンＤＮＡ配列を提供する。さらに、本発明は、ニューブラスチンエキソンに隣接するゲノムＤＮＡ中の３’または５’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）由来のＤＮＡ配列を提供
する；このような配列は、ニューブラスチンポリペプチドまたはそのフラグメントの発現をコードするニューブラスチンポリヌクレオチドを同定、単離および増幅するのに有用である。
【００５５】
本発明の３’ＵＴＲ配列は、以下に示す配列を含む：
配列番号１のヌクレオチド７２１〜８６５、
配列番号３のヌクレオチド７１８〜８６１、
配列番号８のヌクレオチド７１８〜８６１、
配列番号１５のヌクレオチド１６４７〜２１３６、および
前述の配列から誘導される（すなわち、その中に含まれる）１０〜２５ヌクレオチドの間の（例えばプライマーとして有用な）連続配列。
【００５６】
本発明の５’ＵＴＲ配列は、以下に示す配列を含む：
配列番号１のヌクレオチド１〜１０、
配列番号８のヌクレオチド１〜５７、
配列番号１５のヌクレオチド１〜９７４、および
前述の配列から誘導される（すなわち、その中に含まれる）１０〜２５ヌクレオチドの間の（例えばプライマーとして有用な）連続配列。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、クローニング手順によって得られ得、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に記載される。好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドはクローン化された形態であるかまたはヒト脳のヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリに基づいて作成される。
【００５８】
（ＤＮＡ配列の相同性）
上記のＤＮＡ配列相同性は、第２の配列からの第１の配列の派生を示す２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。この相同性は、当業者に公知のコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ  Ｃ．Ｄ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９７０  ４８，４４３−４５３）によって適切に決定され得る。ＤＮＡ配列比較についての以下のセッティング：５．０のＧＡＰ生成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティーでＧＡＰを使用することによって、上記の類似のＤＮＡ配列のコード領域は、配列番号１に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分、または、配列番号３に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分、または、配列番号８に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分、または、配列番号１５に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性の程度を示す。
【００５９】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較される特定の領域に渡って、ヌクレオチド−ヌクレオチド規準で同一である程度を言う。用語「配列同一性％」は、比較領域に渡って最適に整列された２つの配列を比較することによって計算され、適合する位置の数を得るために両方の配列中に存在する同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ，Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）の位置の数を決定し、比較領域（すなわちウインドウサイズ）中の位置の総数で適合する位置の数を割り、そしてその結果に１００を掛けることによって配列同一性％を得る。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、このポリヌクレオチドは、比較領域における参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性およびしばしば９０％〜９５％の配列同一性、より通常は、少なくとも９９％の配列同一性を
有する配列を含む。配列同一性を決定する方法は、当該分野で周知である。例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０  ４８，４４３−４５３を参照のこと）。
【００６０】
（ハイブリダイゼーションプロトコル）
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列、または配列番号１５として示されるポリヌクレオチド、またはその相補鎖、またはこの部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と、少なくとも中程度、中程度／高度、または高度なストリンジェンシー条件下で以下により詳細に記載するようにハイブリダイズし得る核酸配列を有する。
【００６１】
ヌクレオチドプローブと相同なＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列との間のハイブリダイゼーションを測定するための適切な実験条件としては、以下が挙げられる：５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム：Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９を参照のこと）中でのハイブリダイズするＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含むフィルターの１０分間の前浸漬、および５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｏｐ  ｃｉｔ．を参照のこと）、０．５％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性され、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｏｐ  ｃｉｔ．を参照のこと）の溶液中におけるフィルターのプレハイブリダイゼージョン、続いて１０ｎｇ／ｍｌの濃度のランダムプライミングされ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ  Ｐ＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３  １３２  ６−１３）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識された（特異的活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含む同じ溶液中で、約４５℃、１２時間のハイブリダイゼージョン。次いで、このフィルターを０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで、少なくとも６０℃の温度で（中程度のストリンジェンシー条件）、好ましくは少なくとも６５℃（中程度／高度のストリンジェンシー条件）、より好ましくは、少なくとも７０℃の温度で（高度のストリンジェンシー条件）そしてさらにより好ましくは少なくとも７５℃（非常に高度のストリンジェンシー条件）で３０分間２度洗浄した。これらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出され得る。
【００６２】
（クローン化ポリペプチド）
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、特にクローン化ポリヌクレオチドであり得る。本明細書中で定義される場合、用語「クローン化ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡのセグメントを再配置するために遺伝子操作において近年使用される標準的なクローニング手順に従って、クローン化されたポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列をいい、これは、特にｃＤＮＡ、すなわち、自然の配置からそれが再生成される異なる部位へＲＮＡから酵素的に誘導されたものであり得る。本発明のクローン化ポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されるＮＢＮポリヌクレオチド（配列番号２、４〜７、９〜１２、１６、３４および３５〜４８に示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれか１つをコードし得る。
【００６３】
クローニングは、任意の適切な経路によって達成され得、そして逆転写技術、ＰＣＲ技術などのような技術、ならびに所望のＤＮＡセグメントの切除および単離を含み得る。
【００６４】
本発明のクローン化ポリヌクレオチドは、代替として「ＤＮＡ構築物」または「単離されたＤＮＡ配列」と称され得、そして特に相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。
【００６５】
（生物学的供給源）
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、任意の適切な供給源から入手され得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、以下のようなｃＤＮＡライブラリーからクローニングされるか、またはｃＤＮＡライブラリーに基づいて生成される；例えば、胎児の脳または成体の脳（特に、前脳、菱脳、皮質、線条、扁桃、小脳、尾状核、脳梁、海馬、視床核、視床下核、嗅覚核、被殻、黒質、脊髄神経節、三叉神経節、上腸間膜動脈、または視床）のｃＤＮＡライブラリー；脊髄のｃＤＮＡライブラリー；心臓のｃＤＮＡライブラリー；胎盤のｃＤＮＡライブラリー；肺のｃＤＮＡライブラリー；肝臓のｃＤＮＡライブラリー；骨格筋のｃＤＮＡライブラリー；腎臓のｃＤＮＡライブラリー；肝臓のｃＤＮＡライブラリー；膵臓のｃＤＮＡライブラリー；腸のｃＤＮＡライブラリー；眼のｃＤＮＡライブラリー；網膜のｃＤＮＡライブラリー；歯髄のｃＤＮＡライブラリー；毛包のｃＤＮＡライブラリー；前立腺のｃＤＮＡライブラリー；下垂体のｃＤＮＡライブラリー；あるいは気管のｃＤＮＡライブラリー。
【００６７】
ヒトおよび非ヒト両方の、種々の組織由来の市販のｃＤＮＡライブラリーは、例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、標準的な方法（例えば、操作例に記載される方法）によって得られ得る。
【００６８】
（本発明のニューブラスチンポリペプチド）
上記のように、本明細書中で使用される場合「ニューブラスチンポリペプチド」は、神経栄養活性を有するポリペプチド（例えば、実施例６、７、８および９に記載されるようなポリペプチド）であり、そして以下に記載されるような「ニューブラスチン」ポリペプチドに少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；配列番号２のＡＡ９５〜ＡＡ１０５、配列番号２のＡＡ１〜ＡＡ１０５、配列番号４のＡＡ９７〜ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ４１〜ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ１〜ＡＡ１４０、配列番号９のＡＡ８０〜ＡＡ１４０（「野生型」プレプロ（ｐｒｅｐｒｏ））、配列番号９のＡＡ４１〜ＡＡ１４０（プロ（ｐｒｏ））、配列番号５のＡＡ１〜ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ１〜ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ１〜ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ１〜ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ１〜ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ１〜ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１６のＡＡ１〜ＡＡ２２４（マウスプレプロ）、配列番号３４のＡＡ１〜ＡＡ２２４（ラットプレプロ）、切断型ＮＢＮ９９〜ＮＢＮ１１２（それぞれ、配列番号３５〜４８）ならびに前記のそれぞれの改変体および誘導体。
【００６９】
好ましくは、上記で同定されたニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列は、以下に記載されるようなアミノ酸配列を有する；配列番号２のＡＡ７２〜ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ１０７〜ＡＡ１４０）、より好ましくは、配列番号２のＡＡ４１〜ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ７６〜ＡＡ１４０）。
【００７０】
ニューブラスチンポリペプチドが、ＧＤＮＦファミリーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴である、７個の保存Ｃｙｓ残基を保持することもまた、好ましい。
【００７１】
好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドは、以下の配列（すなわち、配列番号２のＡＡ９５〜ＡＡ１０５、配列番号２のＡＡ１〜ＡＡ１０５、配列番号４のＡＡ９７〜ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ４１〜ＡＡ１４０、配列番号４のＡＡ１〜ＡＡ１４０、配列番号９のＡＡ８０〜ＡＡ１４０（「野生型」プレプロ）、配列番号９のＡＡ４１〜ＡＡ１４０（プロ）、配列番号５のＡＡ１〜ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号６のＡＡ１
〜ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号７のＡＡ１〜ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１０のＡＡ１〜ＡＡ１４０（成熟１４０ＡＡ）、配列番号１１のＡＡ１〜ＡＡ１１６（成熟１１６ＡＡ）、配列番号１２のＡＡ１〜ＡＡ１１３（成熟１１３ＡＡ）、配列番号１６のＡＡ１〜ＡＡ２２４（マウスプレプロ）、配列番号３４のＡＡ１〜ＡＡ２２４（ラットプレプロ）、短縮型ニューブラスチンポリペプチドＮＢＮ９９〜ＮＢＮ１１２（それぞれ、配列番号３５〜４８））に、８５％をこえるアミノ酸配列相同性、より好ましくは９０％をこえるアミノ酸配列相同性、より好ましくは９５％をこえるアミノ酸配列相同性、最も好ましくは９９％をこえるアミノ酸配列相同性を有し、そして好ましくは、上記で同定されたニューブラスチンポリペプチドのＣ末端配列を有する任意の前述のポリペプチドは、以下に記載されるようなアミノ酸配列を有する；配列番号２のＡＡ７２〜ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ１０７〜ＡＡ１４０）、より好ましくは配列番号２のＡＡ４１〜ＡＡ１０５（すなわち、配列番号９のＡＡ７６〜ＡＡ１４０）あるいは配列番号１６または３４のＡＡ１９１〜ＡＡ２２４。
【００７２】
さらに、本発明は、配列番号１６のＡＡ１〜ＡＡ２２４に記載されるマウス「ニューブラスチン」ポリペプチド、または配列番号３４のＡＡ１〜ＡＡ２２４に記載されるラットニューブラアスチンポリペプチドに少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを企図する。
【００７３】
本発明の好ましいポリペプチドについて、１つの実施形態は、（それぞれ、配列番号２、４、９、１６および３４に記載されるような）プレプロ配列、（それぞれ、配列番号２のＡＡ７５〜ＡＡ１０５、または配列番号４および９のＡＡ４１〜ＡＡ１４０に記載されるような）プロ配列、（配列番号５、６、７、１０、１１、または１２、好ましくは配列番号１０、１１、１２に記載されるような）成熟配列ならびに最も好ましくはニューブラスチンの短縮型配列（配列番号３５〜４８）を表す。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、改変体ポリペプチドを含む。本発明の文脈において、用語「改変体ポリペプチド」は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１６、配列番号３４、または配列番号３５〜４８に示される配列で１つ以上のアミノ酸の位置が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。このような改変体ポリペプチドは、上記のような修飾化ポリペプチド、ならびに、保存的置換、スプライス改変体、アイソフォーム、他の種由来のホモログ、および多型を含む。
【００７５】
本明細書中で定義される場合、用語「保存的置換」は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。例えば、特に、ポリペプチドまたはタンパク質中に総数の１０％未満の残基が表される場合、ほとんど、または全く生物学的活性に対する効果を有さない保存的アミノ酸置換が期待される。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドまたはタンパク質の５％未満の変化を表し、最も好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質の２％未満の変化を表す（例えば、ＮＢＮ１１３について計測される場合、最も好ましい保存的置換は、野生型アミノ酸配列において３アミノ酸置換未満を表す）。特に好ましい実施形態において、配列中に単一のアミノ酸置換があり、ここで、置換されたアミノ酸および交換されたアミノ酸の両方が、非環式である。
【００７６】
特に保存的な置換の他の例としては、別のものへの１つの疎水性残基の置換（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）、あるいは別のものへの１つの極性残基の置換（例えば、リジンへのアルギニンの置換、アスパラギン酸へのグルタミン酸の置換、またはアスパラギンへのグルタミンの置換など）が挙げられる。
【００７７】
用語、保存的置換はまた、非置換親アミノ酸残基の代わりの置換アミノ酸残基の使用を
含み、ただし、置換ポリペプチドに惹起する抗体はまた、非置換ポリペプチドと免疫反応する。
【００７８】
従って、用語「保存的置換改変体」は、野生型とは異なるニューブラシチンポリペプチドまたは少なくとも１個の保存的アミノ酸置換の存在による参照ニューブラスチンポリペプチドをいう。
【００７９】
ニューブラスチン１次アミノ酸配列の修飾は、非修飾化対応ポリペプチドと比較して実質的に等価の活性を有するタンパク質を生じ得、従って、親タンパク質の機能的アナログであると考えられ得る。このような修飾は、例えば、部位特異的変異によって意図され得るか、または自然に存在し得、そしてスプライス改変体、アイソフォーム、他の種由来のホモログ、および多型を含み得る。このような機能的アナログはまた、本発明に従って企図される。
【００８０】
さらに、１次アミノ酸配列の修飾は、親タンパク質の生物学的活性を保持しないタンパク質を生じ得、これは、ドミナントネガティブ形態などを含む。ドミナントネガティブタンパク質は、ポリペプチドと機能的に正常に相互作用する調節因子（例えば上流成分または下流成分）に結合するか、またはこの調節因子を隔絶することによって野生型タンパク質と干渉し得る。このようなドミナントネガティブ形態もまた、本発明に従うことが意図される。
【００８１】
「シグナルペプチド」は、シグナルペプチドに結合する新しく合成されたポリペプチドを、さらなる翻訳後プロセシングおよび分布のために小胞体（ＥＲ）に指向する、ペプチド配列である。
【００８２】
ニューブラスチンの文脈において本明細書中で使用される場合、「異種シグナルペプチド」は、ヒトニューブラスチンシグナルペプチドではないシグナルペプチド（代表的に、ニューブラスチン以外のいくつかの哺乳動物タンパク質のシグナルペプチド）を意味する。
【００８３】
当業者は、ヒトニューブラスチンＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれか）、またはサイレントコドン変化もしくは、保存的アミノ酸置換を生じるコドン変化に起因するヒトニューブラスチンＤＮＡとは異なる配列を認識し、酵素を過剰発現および分泌するように、培養されたヒト細胞を遺伝的に修飾するために使用され得る。
【００８４】
本発明のポリペプチドはまた、キメラポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを含み、ここで、別のポリペプチドが、そのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端、あるいはそのフラグメントで融合される。キメラポリペプチドは、本発明の核酸配列（または、その部分）に、別のポリペプチドをコードする核酸配列（または、その一部）を融合することによって、生成され得る。
【００８５】
キメラポリペプチドを生成するための技術は、標準的な技術である。このような技術は通常、配列の両方が同じリーディングフレームにあるような方法においてこの配列を接合すること、ならびに同じプロモーターおよびターミネーターの制御下での融合ポリペプチドの発現を必要とする。
【００８６】
本発明のポリペプチドはまた、短縮型形態のニューブラスチンポリペプチドを含む。このような短縮型分子において、１つ以上のアミノ酸は、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＮ末端から削除される。短縮型ニューブラスチンポリペプチドとしては、本明細書中でＮＢＮ１１２（配列番号３５）、ＮＢＮ１１１（配列番号３６）、ＮＢＮ１１０（配列番号
３７）、ＮＢＮ１０９（配列番号３８）、ＮＢＮ１０８（配列番号３９）、ＮＢＮ１０７（配列番号４０）、ＮＢＮ１０６（配列番号４１）、ＮＢＮ１０５（配列番号４２）、ＮＢＮ１０４（配列番号４３）、ＮＢＮ１０３（配列番号４４）、ＮＢＮ１０２（配列番号４５）、ＮＢＮ１０１（配列番号４６）、ＮＢＮ１００（配列番号４７）およびＮＢＮ９９（配列番号４８）として示されるヒトポリペプチド、ならびにこれらのヒト短縮型ニューブラスチンポリペプチドの対応するホモログ（ラットおよびマウスのニューブラスチンを含むが、これらに限定されない）が挙げられる。
【００８７】
例えば、本発明は、そのアミノ末端が、ニューブラスチンポリペプチドの１つ以上のアミノ末端のアミノ酸を欠く短縮型ニューブラスチンポリペプチドを含む。すなわち、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、ニューブラスチンの７個のシステインドメインを含む。いくつかの実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１２〜１１３（すなわち、ＮＢＮ１０２（配列番号４５））に少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１２〜１１３に少なくとも８５％相同である。より好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１２〜１１３に少なくとも９５％相同である。最も好ましくは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１２〜１１３に少なくとも９９％相同である。短縮型ニューブラスチンのさらなる類似の例としては、例えば、配列番号９のアミノ酸４２〜１４０；配列番号１６のアミノ酸１１３〜２２４；配列番号３４のアミノ酸１１３〜２２４を含むポリペプチドが挙げられる。さらなる詳細な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない；ヒトＮＢＮ９９（配列番号４８）、ＮＢＮ１００（配列番号４７）、ＮＢＮ１０１（配列番号４６）、ＮＢＮ１０２（配列番号４５）、ＮＢＮ１０３（配列番号４４）、ＮＢＮ１０４（配列番号４３）、ＮＢＮ１０５（配列番号４２）、ＮＢＮ１０６（配列番号４１）、ＮＢＮ１０７（配列番号４０）、ＮＢＮ１０８（配列番号３９）、ＮＢＮ１０９（配列番号３８）、ＮＢＮ１１０（配列番号３７）、ＮＢＮ１１１（配列番号３６）およびＮＢＮ１１２（配列番号３５）、上記またはそのホモログもしくは誘導体。短縮型ＮＢＮポリペプチドは、合成であり得るか、クローン化ＤＮＡ構築物から発現され得るか、または成熟ＮＢＮポリペプチドの酵素的切断から生じ得る。
【００８８】
好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、ニューブラスチンポリペプチドの少なくとも８５個のカルボキシ末端アミノ酸を含む。好ましい実施形態において、これは、ニューブラスリンポリペプチドの少なくとも９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個または１１２個のカルボキシ末端のアミノ酸を含む。
【００８９】
好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、ＲＥＴポリペプチドに結合し、好ましくは、ここでＲＥＴポリペプチドは、哺乳動物細胞（例えばニューロン）の表面上で発現される。
【００９０】
短縮型ニューブラスチンは、当該分野において公知の方法および本明細書中で提供される配列を用いて、短縮型ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸の組換え発現を用いて調製され得る。
【００９１】
あるいは、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、成熟ニューブラスチンポリペプチド（例えば、配列番号１２のＮＢＮ１１３）を提供すること、および短縮型ニューブラスチンポリペプチドを生成するのに十分な条件下で少なくとも１つのプロテアーゼと成熟ニューブラスチンポリペプチドとを接触させることによって得られ得る。好ましくは、少なくとも１つのプロテアーゼは、エキソプロテアーゼであり、そしてニューブラスチンポリペプチドを接触することによって、さらにジペプチジルペプチダーゼで消化され得る、エ
キソペプチダーゼニューブラスチンポリペプチド消化産物の形成を生じる。代替の実施形態において、このプロテアーゼは、アミノペプチダーゼ、Ｅｎｄｏ  Ｌｙｓ  Ｃまたはトリプシンである。
【００９２】
（アミノ酸配列相同性）
候補ポリペプチドが、本発明のニューブラスチンポリペプチドと共有する相同性の程度は、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度として決定される。高レベルの配列同一性は、第１の配列が、第２の配列から誘導される傾向があることを示す。
【００９３】
同一性は、コンピュータ分析（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸコンピュータ整列プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ，Ｐｌｅｗｎｉａｋ  Ｆ，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ  Ｆ，＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ：Ｔｈｅ  ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｗｉｎｄｏｗｓ
ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｉｄｅｄ  ｂｙ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５（２４）：４８７６−８２）（これに限定されない））および本明細書中で示唆されるデフォルトパラメータによって決定される。このプログラムを用いて、本発明のアナログＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの成熟部分は、本明細書中で以下のように示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を示す；配列番号２、配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；配列番号９；配列番号１０；配列番号１１；配列番号１２、配列番号１６、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９；配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７または配列番号４８。
【００９４】
相同性決定に基づいて、ＴＧＦ−βスーパーファミリに属する本発明のニューブラスチンポリペプチドが、ＧＤＮＦサブファミリーに関連するが、このサブファミリーの異なるメンバーを示すことが確認されている。
【００９５】
（生物学的活性ポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、任意の生物学的活性形態で提供され得、以下を含む；プレプロタンパク質の形態、プロタンパク質、成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、非グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質、非リン酸化タンパク質、短縮型形態または任意の他の翻訳後修飾化タンパク質。生物学的活性ニューブラスチンポリペプチドとしては、単独またはコファクター（例えば、ＧＦＲα３、またはＲＥＴ）の存在下で二量体化される場合、ＲＥＴに結合し、ＲＥＴの二量体化およびＲＥＴの自己リン酸化を誘導するポリペプチドが挙げられる。
【００９６】
本発明のポリペプチドは、特にＮ−グリコシル化ポリペプチドであり得、このポリペプチドは、好ましくは、配列の列挙において示されるＮ残基でグリコシル化される。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下を有する；１２２位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号９として示されるアミノ酸配列；１２２位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１０として示されるアミノ酸配列；９８位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１１として示されるアミノ酸配列；または９５位にグリコシル化アスパラギン残基を有する配列番号１２として示されるアミノ酸配列。
【００９８】
本発明はまた、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，４３４，１
３１号に記載されるＩｇ−融合物のようなニューブラスチン融合タンパク質、または血清アルブミン融合物を企図する。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２として示されるアミノ酸配列、または配列番号２として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１００】
別の実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０１】
第３の実施形態において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０２】
第４の実施形態において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０３】
第５の実施形態において、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０４】
本発明のニューブラスチンポリペプチドとしては、対立遺伝子改変体（例えば、配列番号５〜７のポリペプチドアミノ酸配列）を含み、ここで１番目のＸａａは、ＡｓｎまたはＴｈｒを示し、そして２番目のＸａａは、ＡｌａまたはＰｒｏを示す。
【０１０５】
第６の実施形態において、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０６】
第７の実施形態において、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０７】
第８の実施形態において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０８】
第９の実施形態において、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ま
しくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１０９】
第１０の実施形態において、本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列、または配列番号１６として示される配列に少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である、アミノ酸配列を有するポリペプチド（これは、マウス起源のプレプロニューブラスチンである）を提供する。
【０１１０】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号３５〜４８のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３５〜４８として示される配列番号のいずれか１つに少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＧＤＮＦサブファミリーフィンガープリント（すなわち、実施例に示される、表３で下線を付されたアミノ酸残基）を有する。
【０１１２】
さらなる実施形態において、本発明は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそのサブ配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％の相同であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。最も好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１として示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１３】
なおさらなる実施形態において、本発明は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそのサブ配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列によってコードされる新規ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。最も好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３として示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１４】
より好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、成熟ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含む。なおさらに好ましくは、本発明は、ニューブラスチンタンパク質のアミノ酸配列中に存在する７個の保存されたシステイン残基を含むニューブラスチンポリペプチドの短縮型形態のアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそのサブ配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列によってコードされる新規ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。最も好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号８として示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１６】
なおさらなる実施形態において、本発明は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖、またはそのサブ配列にハイ
ブリダイズし得るポリヌクレオチド配列によってコードされる新規ポリペプチドを提供する。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも７０％であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。最も好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１５として示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１７】
（生物学的起源）
本発明のポリペプチドは、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞またはマウス起源の細胞から単離され得る。
【０１１８】
最も好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、ヒト心臓組織、ヒト骨格筋、ヒト膵臓、またはヒト脳組織（特に、尾状核または視床から）から単離され得るか、あるいは、以下により詳細に考察されるように、哺乳動物起源のＤＮＡから得られ得る。
【０１１９】
（神経栄養活性）
本発明の短縮型ニューブラスチンポリペプチドを含むニューブラスチンポリペプチドは、神経細胞またはニューロン細胞の代謝の調節、増殖、分化、または生存に有用である。特に、ニューブラスチンポリペプチドは、生きている動物（例えば、ヒト）の障害または疾患を処置または緩和するために使用され、この障害または疾患は、神経栄養剤の活性に応答性である。このような処置および方法は、以下により詳細に記載される。
【０１２０】
（抗体）
本発明のニューブラスチンポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、ニューブラスチン特異的抗体を生成するために使用される。本明細書中で使用される場合、「ニューブラスチン特異的抗体」は抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）であり、これは、ニューブラスチンポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントと免疫反応性であるか、またニューブラスチンポリペプチドのエピトープと特異的に結合する。
【０１２１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製は、当該分野において周知である。ポリクローナル抗体は、特に以下によって記載されるように得られ得る；例えばＧｒｅｅｎら、：「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ」Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）；Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ，  １９９２，１−５頁；Ｃｏｌｉｇａｎら、：「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９２，２．４．１節，ならびにＥｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  １９８８。これらのプロトコルは、本明細書中で参考として援用される。モノクローナル抗体は、特に、以下によって記載されるように得られ得る；例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９２，２．５．１−２．６．７節；およびＨａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｐｕｂ．，１９８８，７２６頁；これらのプロトコルは、本明細書中で参考として援用される。
【０１２２】
手短には、モノクローナル抗体は、（例えば、抗原を含む組成物を用いてマウスに）注射すること、血清サンプルを除去することにより抗体産物の存在を確認すること、脾臓を除去してＢリンパ球を得ること、Ｂリンパ球と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを
産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生するポジティブクローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得られ得る。
【０１２３】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製され得、技術としては以下が挙げられる；プロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９２，２．７．１−２．７．１２節，および２．９．１−２．９．３節；ならびにＢａｒｎｅｓら：「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，Ｖｏｌ．１０，７９−１０４頁を参照のこと）。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、抗体が惹起されるポリペプチドに結合するマトリクスに結合させ、そしてそれから溶出させることによって、必要に応じてさらに精製される。
【０１２４】
本発明のニューブラスチンポリペプチドに結合する抗体は、免疫化抗原として目的の小さいペプチドを含むインタクトなポリペプチドまたはフラグメントを用いて調製され得る。動物を免疫化するために使用されたポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によってか、または化学合成によって得られ得、そして必要に応じてキャリアタンパク質に結合され得る。ペプチドに化学的に結合された通常使用されるキャリアタンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風が挙げられる。次いで、結合されたペプチドは、動物（特に、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギであり得る）を免疫するために使用され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、抗体は、以下：
【０１２６】
【化１】
2005198656.tif 000002
（配列番号９のアミノ酸１０８〜１２４）；または
【０１２７】
【化２】
2005198656.tif 000003
（配列番号９のアミノ酸９３〜１０７）のペプチドを用いて産生される。これらのポリペプチドを用いて抗体を産生するための方法は、実施例１０に記載される。
【０１２８】
ウサギポリクローナル抗体がまた、以下：
【０１２９】
【化３】
2005198656.tif 000004
のペプチドに対して作製された。
【０１３０】
これらの群のうち、ペプチドＲ３０およびペプチドＲ３１（これらは、比較的Ｃ末端に
近い）のみが、ウエスタンブロットにおいて還元条件下で変性タンパク質を認識した。
【０１３１】
さらなるニューブラスチン由来のペプチドもまた、以下に詳述するように、ＮＢＮタンパク質から誘導し、これらは、公知のＧＤＮＦ構造に基づいて表面に曝されたループが予想され（ＥｉｇｅｎｂｒｏｔおよびＧｅｒｂｅｒ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，４，ｐｐ．４３５−４３８（１９９７））、ゆえに、抗体作製に対して有用である。
【０１３２】
【化４】
2005198656.tif 000005
本発明の別の局面において、ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）またはニューブラスチン由来のペプチドに特異的に結合する抗体が、種々の媒体中のそのようなニューブラスチン神経栄養因子の存在を検出するために使用され得、特に、本発明のニューブラスチン分子と関連する状態または疾患の診断のために使用され得る。このような検出のための種々のプロトコル（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含む）が、当該分野で公知である。
【０１３３】
本発明の抗体はまた、ニューブラスチン神経栄養因子の効果をブロックするために使用され得、特に、抗体を中和し得る。
【０１３４】
（本発明のポリペプチドを産生する方法）
本発明のニューブラスチンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む細胞を、以下に詳述されるように、そのポリペプチドの産生を可能にする条件下で培養し、続いて、その培養培地からそのポリペプチドを回収する。細胞がニューブラスチンポリペプチドを産生する目的のために遺伝子改変されている場合、その細胞は、従来の方法または遺伝子活性化によって改変され得る。
【０１３５】
従来の方法に従って、ニューブラスチンｃＤＮＡ配列またはニューブラスチンゲノムＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子は、発現構築物内に含まれ得、そして標準的な方法（リポソーム媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクションもしくはＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクションまたは速度駆動型微粒子銃（ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）（「微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）」）が挙げられるが、これらに限定されない）によって細胞にトランスフェクトされ得る。あるいは、ウイルスベクターによってＤＮＡを送達する系を使用し得る。遺伝子移入に有用であることが公知のウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルス（例えば、カナリア痘ウイルス）、ならびに昆虫細胞（特に、ＳｆＰ９昆虫細胞）のバキュロウイルス感染が挙げられる。
【０１３６】
あるいは、細胞は、米国特許第５，７３３，７６１号および同第５，７５０，３７６号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、遺伝子活性化（「ＧＡ」）アプローチを用いて改変され得る。
【０１３７】
従って、用語「遺伝子改変された」は、細胞に関して本明細書中に使用される場合、特定の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子および／またはその遺伝子産物のコード配列の発現を制御する調節エレメントの導入後にその遺伝子産物を発現する細胞を含むことを意味
する。ＤＮＡ分子は、遺伝子標的化によって導入され得、特定のゲノム部位でのＤＮＡ分子の組み込みを可能にする。
【０１３８】
（組換え発現ベクター）
さらなる局面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な真核生物発現ベクターであり得る。好ましい組換え発現ベクターは、ユビキチンプロモーターを含むベクターｐＴＥＪ−８（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０  ２６７  ２８９−２９４）およびその誘導体（例えば、ｐＵｂｉｌＺ）である。好ましい市販の真核生物発現ベクターは、例えば、ウイルスプロモーターを含むベクターｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）である。別の好ましい発現ベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２βから誘導される；ＮｏｒｔｏｎおよびＣｏｆｆｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２８１（１９８５））を使用する。
【０１３９】
本発明はまた、原核生物発現ベクターおよび原核生物発現に対するコドン最適化を伴なう合成遺伝子（合成遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅ））を提供する。合成遺伝子は、より低いＧＣ含量および好ましい細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）コドンで構築された。合成遺伝子は、２つのベクター（ｐＥＴ１９ｂおよびｐＥＴ１９ｂの誘導体であるｐＭＪＢ１６４）にクローニングされた。ｐＥＴ１９ｂを用いた構築物は、図１４に示される。この構築物において、ニューブラスチンのＮＢＮ１１３ドメインをコードする配列は、開始メチオニンに直接融合される。ｐＭＪＢ１６４を用いた構築物は、図１５に示される。
【０１４０】
（産生細胞）
なおさらなる局面において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および／または本発明の組換え発現ベクターを含むように遺伝子操作された産生細胞を提供する。本発明の細胞は、特に、本発明のポリペプチドを、一過性に発現するかもしくは安定に発現するように、過剰発現するようにかまたは同時発現するように、遺伝子操作され得る。一過性発現および安定発現を作製するための方法は、当該分野で公知である。
【０１４１】
本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、または他の発現ビヒクル）に挿入され得、そしてそのコード配列の発現が発現制御配列と適合性の条件下で達成される様式で、ライゲーションによってその発現制御配列に作動可能に連結され得る。適切な発現制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンに関するスプライシングシグナル、および終止コドンが挙げられ、これらは全て、ｍＲＮＡの正しい翻訳を可能にするように、本発明のポリヌクレオチドの正確なリーディングフレームで維持される。発現制御配列はまた、リーダー配列および融合パートナー配列のようなさらなる成分を含み得る。
【０１４２】
プロモーターは、特に、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。細菌系でのクローニングの場合、誘導性プロモーター（例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）が使用され得る。哺乳動物系でのクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、ユビキチンプロモーター、ＴＫプロモーター、またはメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が、使用され得る。組換えＤＮＡまたは合成技術によって得られるプロモーターもまた、本発明のポリヌクレオチドの転写を提供するために使用され得る。
【０１４３】
適切な発現ベクターは、代表的に、発現起点、プロモーターならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子を含み、そしてこれには、細菌中での発現のた
めのＴ７に基づく発現ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら；Ｇｅｎｅ  １９８７  ５６  １２５）、哺乳動物細胞中での発現のためのｐＴＥＪ−８発現ベクター、ｐＵｂｉｌＺ発現ベクター、ｐｃＤＮＡ−３発現ベクターおよびｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８  ２６３  ３５２１）、昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス由来のベクター、ならびに卵母細胞発現ベクターＰＴＬＮ（Ｌｏｒｅｎｚ  Ｃ，Ｐｕｓｃｈ  Ｍ  ＆  Ｊｅｎｔｓｃｈ  Ｔ  Ｊ：Ｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ＣＬＣ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６  ９３  １３３６２−１３３６６）のようなベクターが挙げられる。
【０１４４】
好ましい実施形態において、本発明の細胞は、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、卵母細胞、または酵母細胞）である。本発明の細胞は、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、ＢＨＫ２１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞（ＸＬＯ）であり得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、本発明の細胞は、真菌細胞（例えば、糸状菌細胞）である。なお別の実施形態において、細胞は、昆虫細胞であり、最も好ましくはＳｆ９細胞である。本発明のさらなる哺乳動物細胞は、ＰＣ１２細胞株、ＨｉＢ５細胞株、ＲＮ３３ｂ細胞株、ヒト神経前駆細胞、およびヒト細胞由来の他の細胞（特に、神経細胞）である。
【０１４５】
初代細胞および二次細胞の例としては、線維芽細胞、上皮細胞（哺乳動物上皮細胞および腸管上皮細胞）、内皮細胞、血液の形成されるエレメント（リンパ球および骨髄細胞を含む）、グリア細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋細胞、神経細胞、またはこれらの細胞型の前駆体が挙げられる。本発明の方法において有用な不死化ヒト細胞株の例としては、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ９６０７）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２１３）、ＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ細胞の誘導体（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２、ＣＣＬ２．１、およびＣＣＬ２．２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４０）、ＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１２１）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ１５２）、ＫＢ癌腫細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２４３）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＢＴＨ２２）、ＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ登録番号１５８２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ８６）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１５９３）、ＷＩ−３８ＶＡ１３亜株２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＬＬ７５．１）、および２７８０ＡＤ卵巣癌腫細胞（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｌｉｃｋら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５９２７−５９３２，１９８８）、ならびにヒト細胞と別の種の細胞との融合によって産生される異種ハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。二次ヒト線維芽細胞株（例えば、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ７５）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ１７１））もまた、使用され得る。
【０１４６】
本発明の細胞が真核生物細胞である場合、本発明の異種ポリヌクレオチドの組み込みは、特に、感染（ウイルスベクターを用いる）によってか、トランスフェクション（プラスミドベクターを用いる）によってか、リン酸カルシウム沈降を用いてか、マイクロインジェクションを用いてか、エレクトロポレーションを用いてか、リポフェクションを用いてか、または当該分野で公知の他の物理−化学的方法を用いて、実行され得る。
【０１４７】
より好ましい実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチド配列および／または本発明の組換え発現ベクターは、細胞の不死化および／またはトランスフォーメーションを媒介し得る少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、哺乳動物宿主の細胞、神経前駆細胞、神経膠星状細胞、Ｔ細胞、造血幹細胞、非分裂細胞、または大脳内皮細胞にトランス
フェクトされる。
【０１４８】
宿主細胞中での内因性遺伝子の活性化は、調節エレメントの導入によって、特に、本発明のニューブラスチンポリペプチドをコードする内因性遺伝子の転写をもたらし得るプロモーターの導入によって、達成され得る。
【０１４９】
（薬学的組成物）
本発明の別の局面は、治療有効量の本発明のポリペプチドを含む、新規薬学的組成物を提供する。
【０１５０】
治療における使用のために、本発明のポリペプチドは、任意の好都合な形式で投与され得る。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つ以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤と一緒に薬学的組成物中に組込まれ、そしてその薬学的組成物は、当該分野で公知の従来の方法を用いて当業者によって調製される。
【０１５１】
このような薬学的組成物は、本発明のポリペプチドまたはその抗体を含み得る。この組成物は、単独で投与され得るか、または１つ以上の他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組合わせて投与され得る。
【０１５２】
本発明の薬学的組成物は、任意の適切な経路（経口経路、静脈内経路、筋内経路、動脈内経路、骨髄内経路、鞘内経路、心室内経路、経皮経路、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、動脈経路、局所経路、舌下適用もしくは直腸適用、頬側経路、膣経路、眼窩内経路、大脳内経路、頭蓋内経路、脊椎内経路、心室内経路、槽内経路、包内経路、肺内経路、経粘膜経路、または吸入を介する経路が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与され得る。
【０１５３】
肺内送達方法、装置、および薬物調製は、例えば、米国特許第５，７８５，０４９号、同第５，７８０，０１９号、および同第５，７７５，３２０号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。投与は、調製物のボーラスの周期的な注射により得るか、または外部の容器（例えば、ＩＶバッグ）もしくは内部の容器（例えば、生体侵食可能なインプラント、生体人工臓器、または移植されたニューブラスチン産生細胞のコロニー）からの静脈内投与または腹腔内投与によって、より連続的に実行され得る。例えば、米国特許第４，４０７，９５７号、同第５，７９８，１１３号、および同第５，８００，８２８号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。肺内送達方法および肺内送達装置は、例えば、米国特許第５，６５４，００７号、同第５，７８０，０１４号、および同第５，８１４，６０７号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１５４】
特に、本発明に従うニューブラスチンの投与は、以下を含む任意の適切な送達手段を用いて達成され得る：
（ａ）ポンプ（例えば、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，２７：９１２（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ，４１：１２７０（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１６９８（１９８４）（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）、
（ｂ）ミクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）、
（ｃ）連続放出ポリマーインプラント（例えば、Ｓａｂｅｌ、米国特許第４，８８３，６６６号（これは、本明細書中に参考として援用される））、
（ｄ）マクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、同第５，１５８
，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）；
（ｅ）ＣＮＳへの裸の細胞移植片またはカプセル化されていない細胞移植片（例えば、米国特許第５，０８２，６７０号および同第５，６１８，５３１号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）；あるいは
（ｆ）皮下、静脈内、動脈内、筋内、または他の適切な部位のいずれかでの、注射；
（ｇ）カプセル、液体、錠剤、丸剤、または長時間放出処方物の、経口投与。
【０１５５】
本発明の１つの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドは、ＣＮＳに直接送達され、好ましくは、脳室、脳実質、鞘内空間、または他の適切なＣＮＳの位置に直接送達され、最も好ましくは鞘内に直接送達される。
【０１５６】
別の好ましい実施形態において、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、筋内注射、皮下注射、静脈内注射、または静脈内注入を介して全身送達によって提供される。
【０１５７】
他の有用な非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、ポンプ送達、カプセル化細胞送達、リポソーム送達、注射針により送達される注射、注射針を介さない注射、ネブライザ、エアロゾライザ（ａｅｏｒｏｓｏｌｉｚｅｒ）、エレクトロポレーション、および経皮パッチが挙げられる。
【０１５８】
処方および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見出され得る。
【０１５９】
活性成分は、１日当たり１回または複数回で投与され得る。現在意図される適切な投薬量は、１投与あたり０．５ｎｇのニューブラスチン／ｋｇ体重〜約５０μｇのニューブラスチン／ｋｇの間であり、そして１日に約１．０ｎｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。ＣＮＳに直接送達される場合、ニューブラスチン薬学的組成物は、約５ｎｇ／ｍｌ脳脊髄液（「ＣＳＦ」）〜２５ｎｇ／ｍｌ  ＣＳＦの神経栄養因子の局所濃度を提供するべきである。
【０１６０】
当然、投与される用量は、処置される個体の年齢、体重および状態、ならびに投与経路、投薬形態およびレジメン、および所望される結果に対して注意深く調整する必要があり、そして当然、正確な投薬量は、実施者によって決定されるべきである。
【０１６１】
さらなる実施形態において、本発明のニューブラスチンポリペプチドは、以下の処置方法において記載されるように、細胞株およびベクターを用いた遺伝子送達によって投与され得る。このような治療細胞株を作製するために、本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスまたは他の発現ビヒクル）に挿入され得、そしてそのコード配列の発現が発現制御配列と適合性の条件下で達成される様式で、ライゲーションによってその発現制御配列に作動可能に連結される。適切な発現制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンに関するスプライシングシグナル、および終止コドンが挙げられ、これらは全て、ｍＲＮＡの正しい翻訳を可能にするように、本発明のポリヌクレオチドの正確なリーディングフレームで維持される。発現制御配列はまた、リーダー配列および融合パートナー配列のようなさらなる成分を含み得る。
【０１６２】
プロモーターは、特に、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。構成性プロモーターは、合成プロモーターであっても、ウイルスプロモーターであっても、
哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンプロモーター）であってもよい。好ましい実施形態において、治療細胞株は、本発明のポリペプチドを発現する不死化されたヒト神経細胞株である。移植に関して、本発明者らは、約１０５〜１０１０個の間の細胞、より好ましくは１０６〜約１０８個の細胞を移植することを意図する。
【０１６３】
（治療方法）
ポリヌクレオチド、およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチドフラグメントまたはこれらから産生される誘導体、ならびにこのようなタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、生きている動物（ヒトを含む）の身体の障害または疾患（この障害または疾患は、神経栄養因子の活性に応答性である）を処置または軽減するために使用され得る。
【０１６４】
本発明のポリペプチドは、例えば、注射される薬学的組成物、移植される薬学的組成物、または摂取される薬学的組成物を介して直接使用されて、ニューブラスチンポリペプチドに応答性の病的プロセスを処置し得る。
【０１６５】
本発明のポリヌクレオチド（その相補配列を含む）は、本発明の神経栄養因子の発現のために使用され得る。これは、本発明のそのようなタンパク質、ペプチドもしくは誘導体を発現する細胞株によってか、または本発明のそのようなタンパク質、ペプチドもしくは誘導体をコードするウイルスベクターによってか、またはそのようなタンパク質、ペプチドもしくは誘導体を発現する宿主細胞によって、達成され得る。これらの細胞、ベクターおよび組成物は、標的領域を処置するために投与されて、ニューブラスチンポリペプチドに応答性の疾患プロセスまたは障害プロセスに影響を与え得る。
【０１６６】
適切な発現ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはワクシニアウイルスから誘導され得るか、または種々の細菌で産生されたプラスミドが、生物全体または標的器官、標的組織もしくは標的細胞集団へのヌクレオチド配列のインビボ送達のために使用され得る。他の方法としては、リポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション、核局在シグナルもしくは他の局在シグナルを含むキャリアペプチドを用いたトランスフェクション、ならびに遅延した放出系を介する遺伝子送達が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のなお別の局面において、ニューブラスチン遺伝子またはその一部に相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列が、ニューブラスチン発現を阻害または増強するために使用され得る。
【０１６７】
なお別の局面において、本発明は、生きている動物（ヒトを含む）の身体の障害または疾患（この障害または疾患は、神経栄養因子の活性に応答性である）を処置または軽減するための方法に関する。
【０１６８】
この障害または疾患は、特に、外傷、手術、虚血、感染、再灌流、代謝性疾患、栄養欠乏、悪性腫瘍、または毒性因子、または遺伝プロセスもしくは特発性プロセスによって引き起こされる神経系の損傷であり得る。
【０１６９】
この損傷は、特に、感覚ニューロンまたは網膜の神経節細胞（後根神経節中のニューロンまたは以下の組織のいずれかの中のニューロンを含む：膝神経節、舌咽神経の下神経節および迷走神経の下神経節；第ＶＩＩＩ脳神経の前庭聴覚（ｖｅｓｔｉｂｕｌｏａｃｏｕｓｔｉｃ）複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹側外側極；および中脳三叉神経核）に対して生じ得る。
【０１７０】
本発明の方法の好ましい実施形態において、疾患または障害は、損傷したニューロンまたは外傷を受けたニューロンを含む神経変性疾患であり、例えば、以下である：末梢神経
の損傷、髄質の損傷、および／もしくは脊髄の損傷、大脳の虚血性ニューロン損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、末梢神経の外傷もしくは損傷、虚血性発作、急性脳損傷、急性脊髄損傷、神経系の腫瘍、多発性硬化症、神経毒素への曝露、代謝性疾患（例えば、糖尿病または腎不全）、および感染因子によって引き起こされる傷害、神経変性障害（アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、パーキンソン−プラス（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｐｌｕｓ）症候群、進行性核上麻痺（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ症候群）、オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ）、シャイ−ドレーガー症候群（複数の系の萎縮）、Ｇｕａｍａｎｉａｎ振せん麻痺痴呆複合、筋萎縮性側索硬化症を含む）、または任意の他の先天性疾患もしくは神経変性疾患、および痴呆につながる記憶欠陥。
【０１７１】
好ましい実施形態において、感覚系ニューロンおよび／または自律神経系ニューロンの処置が意図される。別の好ましい実施形態において、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）および棘筋萎縮）の処置が意図される。なお別の好ましい実施形態において、外傷性損傷後の神経回復を促進するための本発明のニューブラスチン分子の使用が意図される。１つの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドを含むマトリクスを用いた神経誘導チャネルの使用が意図される。このような神経誘導チャネルは、例えば、米国特許第５，８３４，０２９号（これは、本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【０１７２】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびにこれらを含む薬学的組成物）は、末梢ニューロパシーの処置に使用される。本発明の分子を用いた処置に対して意図される末梢ニューロパシーの間には、外傷誘導性のニューロパシー、例えば、物理的な損傷もしくは疾患状態、脳への物理的な傷害、脊髄への物理的な傷害、脳の傷害と関連する発作、ならびに神経変性に関連する神経学的障害によって引き起こされるニューロパシーがある。
【０１７３】
化学療法によって誘導されるニューロパシー（例えば、タキソールまたはシスプラチンのような化学療法剤の送達によって引き起こされるニューロパシー）；毒素によって誘導されるニューロパシー、薬物によって誘導されるニューロパシー、病原体によって誘導される（例えば、ウイルスによって誘導される）ニューロパシー、ビタミン欠乏によって誘導されるニューロパシー；特発性ニューロパシー；および糖尿病性ニューロパシーの処置もまた、意図される。例えば、米国特許第５，４９６，８０４号および同第５，９１６，５５５号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１７４】
本発明のニューブラスチンヌクレオチドおよびニューブラスチンポリペプチドを用いる、単一（ｍｏｎｏ）ニューロパシー、単一−複合（ｍｏｎｏ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ニューロパシー、および多性（ｐｏｌｙ）ニューロパシー（軸索ニューロパシーおよび脱髄性ニューロパシーを含む）の処置もまた、意図される。
【０１７５】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび核酸（ならびにこれらを含む薬学的組成物）は、黄斑変性、色素性網膜炎、緑内障および類似の疾患に罹患した患者における網膜中の光受容体の損失を含む、眼の種々の障害の処置に使用される。
【０１７６】
本発明はさらに、ニューブラスチンまたはニューブラスチン前駆体の生物学的に活性な形態を産生し得るベクターまたは細胞（すなわち、体によってニューブラスチンの生物学的に活性な形態に容易に変換され得る分子）を、哺乳動物の脳（ヒト）に移植することによって、上記の疾患および障害につながる変性変化を予防するための方法を提供するか、またはさらには、ニューブラスチンを分泌する細胞が、例えば、半透性膜にカプセル化され得る。
【０１７７】
ニューブラスチンを産生するように操作された細胞を含む適切な細胞が、哺乳動物の脳（ヒトを含む）への移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）において使用するために、インビトロで増殖され得る。
【０１７８】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば、国際特許出願ＷＯ９８／３２８６９に記載される発現ベクターを用いて、適切な細胞株に（例えば、不死化されたラット神経幹細胞株様ＨｉＢ５およびＲＮ３３ｂ、または不死化されたヒト神経前駆体細胞株に）トランスフェクトされ、そして得られる細胞株は、生存している身体の脳（ヒトを含む）に移植され、ＣＮＳ中に本発明の治療ポリペプチドを分泌する。
【０１７９】
（診断方法およびスクリーニング方法）
ニューブラスチン核酸を使用して、個体がニューブラスチン遺伝子における欠損に起因する神経学的障害を発症し易いか否かを決定し得、この欠損は、例えば、遺伝形質によってか、異常な胚性発生によってか、または後天性のＤＮＡ傷害によって獲得される、例えば、ニューブラスチン対立遺伝子における欠損である。この分析は、例えば、ニューブラスチン遺伝子内の欠失または点変異を検出することによるか、または特定の制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を有するそのような遺伝子欠損のそのような素因の遺伝形質を検出することによるか、患者由来の核酸サンプルをニューブラスチン遺伝子に特異的な核酸プローブとハイブリダイズすることによって正常なニューブラスチンの存在もしくは非存在を検出し、そしてその核酸にハイブリダイズするそのプローブの能力を決定することにより得る。
【０１８０】
特に、ニューブラスチン核酸は、ハイブリダーゼーションプローブとして使用され得る。そのようなハイブリダーゼーションアッセイは、ニューブラスチンタンパク質をコードするｍＲＮＡの異常なレベルに関連する種々の状態、障害、または疾患を、検出、予後判定、診断、またはモニターするために使用され得る。ニューブラスチン核酸は、ニューブラスチン神経栄養因子依存性生理学的過程に関する「マーカー」としてみなされ得る。これらの過程としては、「正常な」生理学的過程（例えば、ニューロンの機能）および病理学的過程（例えば、神経変性疾患）が挙げられるが、これらに限定されない。異常な（すなわち、増大したまたは不足した）レベルのニューブラスチンタンパク質および／またはニューブラスチンコードｍＲＮＡを有する特定の患者の部分集団の特徴付けによって、新たな疾患の分類が導かれ得る。本明細書に規定される場合、「異常なレベル」によって、定量的手段または定性的手段によって決定される障害を有さないコントロールサンプルもしくは個体におけるレベルに比べて増加したレベルまたは減少したレベルが意味される。
【０１８１】
本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドはまた、ニューブラスチンアナログ（ニューブラスチンの低分子模倣物を含む）をスクリーニングし、同定するために使用され得る。１つの企図される実施形態において、本発明は、ニューブラスチン媒介性生物学的効果を誘導する候補化合物を同定する方法を提供し、この方法は、ニューブラスチンと接触した場合に検出可能な生成物の発現を誘導する試験細胞を提供する工程、この細胞を候補化合物に曝す工程、およびこの検出可能な生成物を検出する工程を包含する。この検出可能な生成物の発現は、その候補化合物がニューブラスチン媒介性生物学的効果を誘導する能力を示す。
【０１８２】
さらに、本発明のニューブラスチン核酸およびニューブラスチンポリペプチドは、ＤＮＡチップもしくはタンパク質チップ、またはコンピュータープログラム上で使用され、関連する新規遺伝子配列ならびにこれら遺伝子配列によってコードされるタンパク質（対立遺伝子改変体および単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を含む）を同定し得る。そのよ
うな方法は、例えば、米国特許第５，７９５，７１６号；同第５，７５４，５２４号；同第５，７３３，７２９号；同第５，８００，９９２号；同第５，４４５，９３４号；同第５，５２５，４６４号に記載され、これらの米国特許各々は、本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１：ニューブラスチン核酸を単離する方法）
（方法１：ニューブラスチン遺伝子についてのヒト胎児脳ｃＤＮＡの迅速スクリーニング）
２９０ｂｐフラグメントを、ヒトペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）に対するその相同性によって、ＧｅｎＢａｎｋに提出された２つのハイスループットゲノム配列（ＨＴＧＳ）（登録番号ＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）に同定した。その２９０ｂｐフラグメントの核酸配列から、２つのニューブラスチン特異的プライマーを合成した。ニューブラスチントップ鎖プライマー（「ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｓｅ」）は、配列
【０１８４】
【化５】
2005198656.tif 000006
を有した。ニューブラスチンボトム鎖プライマー（「ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」）は、配列
【０１８５】
【化６】
2005198656.tif 000007
を有した。これらのプライマーを用いて、９６ウェルＰＣＲ反応を実行した。
【０１８６】
５００，０００個のｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡを含む、９６ウェルマスタープレートに、ウェル当たり約５０００クローンでローディングした。ウェル当たり５０クローンを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂグリセロールストックを含む９６ウェルサブプレートを、使用した。
【０１８７】
ニューブラスチン核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）技術を使用して、３回の増幅によって、同定し；増幅によって、サンプル中の核酸のコピー数が増加される。
【０１８８】
（マスタープレートスクリーニング：）
上記の９６ウェルＰＣＲスクリーニング技術を使用して、ヒト胎児脳ｃＤＮＡマスタープレートを、遺伝子特異的プライマーでスクリーニングし、ヒトニューブラスチンｃＤＮＡを単離した。
【０１８９】
３０ナノグラム（３０ｎｇ）のヒト胎児脳ｃＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ；Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、マスタープレートの対応するウェルから得、以下の試薬を含む総量２５μｌに入れた：各０．２ｍＭの前述の２つの遺伝子特異的プライマー（すなわち、ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｓｅおよびＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）。
【０１９０】
ＰＣＲ熱サイクリング反応を、以下の手順および条件を使用して実行した。ＤＮＡを、
最初に９４℃で３分間変性し、次いで、３５サイクルの［各９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、そして７２℃で９０秒間の第１の伸長］；そして７２℃で５分間の最終伸長。９６個の個々のＰＣＲ反応の生成物を、エチジウムブロマイド染料を含む２％アガロースゲルを使用して、ゲル電気泳動によって分析した。確察された、あるウェル由来の１０２ｂｐ陽性ＰＣＲ産物が、特有の９６ウェルサブプレートに対応することが見出された。
【０１９１】
この１０２ｂｐの核酸フラグメントは、以下の配列（配列番号１３）を有した：
【０１９２】
【化７】
2005198656.tif 000008
。
【０１９３】
（サブプレートスクリーニング）
９６ウェルヒト胎児脳サブプレートを、対応するサブプレートウェルからの１μｌのグリセロールストックを、各０．２ｍＭの２つの上記遺伝子特異的プライマー；１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を含む総量２５μｌに入れることによってＰＣＲ媒介性増幅をすることによって、スクリーニングされた。
【０１９４】
マスタープレートスクリーニングについて記載されたのと同一のＰＣＲ熱サイクリング条件を使用した。９６個の個々のＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル上で、分析し、１０２ｂｐのＰＣＲフラグメントを示す陽性ウェルを、同定した。
【０１９５】
（コロニーＰＣＲ）
陽性サブプレートウェルからの１ｍｌのグリセロールストックを、Ｌｕｒｉａ培地（ＬＢ）中に１：１００で希釈した。次いで、前述の希釈液１ｍｌおよび１０ｍｌを、Ｌｕｒｉａ培地（「ＬＢ」）および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む、２つの別々の寒天プレート上にプレートした。次いで、このＬＢプレートを、３０℃で一晩インキュベートした。これらのプレートから、９６個のコロニーを拾い、それを、各０．２ｍＭの２つの前述の遺伝子特異的プライマー；１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ；Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を最終容量２５μｌで含む、新しい９６ウェルＰＣＲプレートに入れた。
【０１９６】
マスタープレートスクリーニングについて記載されたのと同一のＰＣＲ熱サイクリング条件を使用した。次いで、９６の個々のＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル上で分析した。１０２ｂｐフラグメントを含む陽性コロニーを、続いて同定した。
【０１９７】
この陽性コロニーから調製されたプラスミドＤＮＡの配列決定によって、８６１ｂｐの全長ｃＤＮＡ（配列番号８）が示された。このｃＤＮＡは、プレプロニューブラスチン（
配列番号９）をコードした。自動化ＤＮＡ配列決定を、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用して実行した。このシークエンシングゲルをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）上で泳動した。
【０１９８】
（方法２：ヒト脳からのニューブラスチンｃＤＮＡのクローニング）
全長ニューブラスチンｃＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを増幅するさらなる方法を、例えば、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，カタログ番号Ｋ１８０２−１）を用いることによって、ベクター特異的プライマーまたはアダプター特異的プライマーと組合わせてＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）ならびに上記のニューブラスチン特異的プライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｓｅおよびＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）によって、実行し得る。
【０１９９】
ヒト全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，カタログ番号７４００−１）を使用して、全長ニューブラスチンｃＤＮＡを増幅し得る。増幅のための有用なプライマーは、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡに含まれるアダプタープライマーＡＰ１と組合わせて、ニューブラスチントップ鎖プライマー
【０２００】
【化８】
2005198656.tif 000009
（「ＮＢＮｅｘｔ．ｓｅｎｓｅ」）およびニューブラスチンボトム鎖プライマー
【０２０１】
【化９】
2005198656.tif 000010
（「ＮＢＮｅｘｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」）を含む。代替的なトップ鎖プライマー
【０２０２】
【化１０】
2005198656.tif 000011
もまた使用される。さらなる代替的なボトム鎖プライマー
【０２０３】
【化１１】
2005198656.tif 000012
もまた使用し得る。同様に、代替的なボトム鎖プライマー（配列番号２４および２６）もまた使用し得る。
【０２０４】
（方法３：ヒト脳からのニューブラスチンｃＤＮＡのクローニング）
ニューブラスチンｃＤＮＡをクローニングする別の方法は、本明細書中に記載される（そして、図１に例示されるような）１つ以上のニューブラスチンプローブを使用してヒト成人脳ライブラリーまたは胎児脳ライブラリーをスクリーニングすることによる。これらのライブラリーとしては：λｇｔ１１ヒト脳（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，カタログ番号ＨＬ３００２ｂ）またはλｇｔ１１ヒト胎児脳（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，カタログ番号ＨＬ３００２ｂ）が挙げられる。
【０２０５】
（方法４：ニューブラスチン遺伝子についてのマウス胎児ｃＤＮＡの迅速スクリーニン
グ）
ニューブラスチン遺伝子についての迅速スクリーニング手順を、以下の方法で実行した。５００，０００個のｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡを含む、９６ウェルマスタープレートに、ウェル当たり約５０００クローンをローディングした。ウェル当たり５０クローンを含むＥ．Ｃｏｌｉグリセロールストックを含む９６ウェルサブプレートを、使用した。目的の遺伝子（すなわち、ニューブラスチン）を同定するために、３回のＰＣＲ媒介性増幅を実行した。
【０２０６】
（マスタープレートスクリーニング）
遺伝子特異的プライマーを使用して、９６ウェルＰＣＲによって、マウス胎児ｃＤＮＡマスタープレートを、スクリーニングし、マウスニューブラスチンｃＤＮＡを単離した。以下の２つのプライマーを合成した：
（１）ニューブラスチンＣ２プライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｓｅ）：
【０２０７】
【化１２】
2005198656.tif 000013
および（２）ニューブラスチンＣ２ａｓプライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）：
【０２０８】
【化１３】
2005198656.tif 000014
これら２つの遺伝子特異的プライマーを使用することによって、２２０ｂｐの陽性ＰＣＲ産物を同定した。この２２０ｂｐ核酸は、以下の配列（配列番号１４）：
【０２０９】
【化１４】
2005198656.tif 000015
を有した。
【０２１０】
次いで、９６ウェルＰＣＲ反応を、以下の方法で実行した。３０ナノグラム（３０ｎｇ）のマウス胎児脳ｃＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ；Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、マスタープレートの対応するウェルから得、以下の試薬をまた含む総量２５μｌ中に入れた：各０．２ｍＭの２つの前述の遺伝子特異的プライマー（すなわち、Ｃ２プライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ｓｅｎｓｅ）およびニューブラスチンＣ２ａｓプライマー（ＮＢＮｉｎｔ．ａｎｔｉｓｅｎｓｅ））、１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ；Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）。
【０２１１】
以下のＰＣＲ熱サイクリング条件を、使用した：９４℃で３分間の初期変性、続いて、３５サイクルの［各９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で９０秒間の伸長］；そして、７２℃で５分間の最終伸長。９６個の個々のＰＣＲ反応物を、
エチジウムブロマイド染料を含む２％アガロースゲル上で分析した。確察された、あるウェル由来の２２０ｂｐ陽性ＰＣＲ産物が、特有の９６ウェルサブプレートに対応することが見出された。次いで、この９６個の個々のＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイド着色剤を含む２％アガロースゲル上で、ゲル電気泳動によって分析した。同定された２２０ｂｐの陽性ＰＣＲ産物は、９６ウェルサブプレートの特有のウェルに対応した。
【０２１２】
（サブプレートスクリーニング）
９６ウェルマウス胎児サブプレートを、対応するサブプレートウェルからの１μｌのグリセロールストックを：各０．２ｍＭの２つの前述の遺伝子特異的プライマー；１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を含む最終総量２５μｌに入れることによってＰＣＲ媒介性増幅をすることによって、スクリーニングした。ＰＣＲ熱サイクリングを、マスタープレートスクリーニングについて上に記載された条件に従って、実行した。
【０２１３】
次いで、９６の個々のＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル上で分析し、２２０ｂｐフラグメントを生成する陽性ウェルを同定した。
【０２１４】
（コロニーＰＣＲ）
陽性サブプレートウェルからの１ｍｌのグリセロールストックを、Ｌｕｒｉａ培地（ＬＢ）中に１：１００で希釈した。次いで、前述の希釈液１ｍｌおよび１０ｍｌを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む、２つの別々のＬＢプレート上にプレートし、このＬＢプレートを、３０℃で一晩インキュベートした。全部で９６個のコロニーを単離し、それを、：各０．２ｍＭの２つの前述の遺伝子特異的プライマー；１×標準ＰＣＲ緩衝液（緩衝液Ｖ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）；０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；０．１ＭのＣＧ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）；および０．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を最終容量２５μｌで含む、９６ウェルＰＣＲプレートに移した。
【０２１５】
ＰＣＲ熱サイクリングを、上に記載される条件に従って、実行した（「マスタープレートスクリーニング」（上述）を参照のこと）。９６個の個々のＰＣＲ反応物を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル上で、ゲル電気泳動によって分析した。陽性コロニーを、２２０ｂｐフラグメントの存在によって同定した。プラスミドＤＮＡを、この陽性コロニーから調製した。このクローンを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いるＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーターサイクル配列決定キットを使用して、自動化ＤＮＡ配列決定によって、配列決定した。このシークエンシングゲルをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で実行した。得られたこのクローンの配列は、２１３６ｂｐの全長ｃＤＮＡ（配列番号１５）を明らかにした。このｃＤＮＡは、配列番号１６に示される推定アミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームを含み、このオープンリーディングフレームは、マウスプレプロニューブラスチンポリペプチドをコードする。
【０２１６】
（実施例２：ゲノムニューブラスチンのクローニング）
上に議論されるように、本出願人は、ＧｅｎＢａｎｋに登録配列を有する２つのヒトＢＡＣクローン（登録番号ＡＣ００５０３８およびＡＣ００５０５１）中の２９０ｂｐ核酸フラグメントを同定し、このフラグメントは、ペルセフィンおよびペルセフィンの隣接配列に相同な領域を有した。本出願人は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡ
Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、さらなるニューブラスチン核酸をコードする核酸をクローニングするために、上に記載される８６１ｂｐの推定配列を使用して、さらなるプライマーを設計した。２つのプライマーの対を使用して、ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ反応を使用することによって、ニューブラスチン遺伝子をクローニングした。２つのプライマーの対は、以下に示される。
【０２１７】
（プライマー対番号１）
【０２１８】
【化１５】
2005198656.tif 000016
（プライマー対番号２）
【０２１９】
【化１６】
2005198656.tif 000017
プライマー対番号１を使用して、８８７ｂｐ  ＤＮＡフラグメントを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタログ番号６５５０−１）から購入したヒトゲノムＤＮＡの調製物から増幅した。
【０２２０】
（ＰＣＲプロトコル）
ＰＣＲは、ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、緩衝液１と共に使用して、実行した。ＰＣＲ反応混合物に、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および１７．５ｐｍｏｌの各ｄＮＴＰを、総量５０μｌで補充した。熱サイクリングを、９４℃で２分間のプレ変性工程、続いて、それぞれ、９４℃で１０秒間、および６８℃で１分間の３５回の二段階サイクルで行った。熱サイクリングを、６８℃で５分間のインキュベーションによって終結した。熱サイクリングを、ＰＴＣ−２２５  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ熱サイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＭＡ）中で実行した。ＰＣＲ産物を、２％アガロース（ＦＭＣ）上でのゲル電気泳動によって分析し、次いで、写真を撮った。
【０２２１】
プライマー対番号１を使用してヒトゲノムＤＮＡから増幅された８８７ｂｐのフラグメントを、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＸＬ  １−ＢｌｕｅコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。得られたプラスミド（ニューブラスチン−２と示される）を、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して配列決定した。シークエンシング産物を、ＡＬＦＥｘｐｒｅｓｓ自動化シークエンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で電気泳動することによって分析した。
【０２２２】
第２のプライマー対（上記、プライマー対番号１）を用いた、ヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得られたフラグメントを、配列決定し、オープンリーディングフレームの３’末端にある、さらなる４２ｂｐ領域を明らかにした。全長配列を、その配列を他の神経栄養因子の核酸配列と比較することによって、ならびに推定スプライス接合部を同定する遺伝子検知ソフトウェアプログラムを使用してエクソン−イントロン境界をマッピングすることによって、およびＮｅｔｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｒｋソフトウェア（Ｂｒｕｎａｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２０，ｐｐ．４９−６５（１９９１）；Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３，ｐｐ．３５５４−６２（１９９５））を使用してコード可能性が高い領域をマッピングすることによって、分析
した。エクソン−イントロン境界を、上に記載されるＲａｐｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎから得られるｃＤＮＡによって確認した。
【０２２３】
図７に示されるように、得られるニューブラスチン遺伝子は、７０ｂｐのイントロンによって隔てられる２つのエクソンを有する。まとめると、エクソンは、全長ニューブラスチンポリペプチドの推定アミノ酸配列を有する。この推定ｃＤＮＡ（配列番号３）は、２３８アミノ酸残基（配列番号４）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ニューブラスチン−２クローンは、プロニューブラスチンの完全コード配列を含んだ。この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、３つのタンパク質（ペルセフィン、ニューツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、およびＧＤＮＦ）に対して高い相同性を示した。
【０２２４】
（実施例３：ニューブラスチン核酸の発現）
ニューブラスチンＲＮＡの発現が、以下に記載される技術を使用して、齧歯類およびヒトの神経組織および非神経組織の両方で、そして種々の発生未成熟段階および成体段階の両方で検出された。
【０２２５】
（ＲＴ−ＰＣＲを使用してニューブラスチンＲＮＡ発現を検出する方法）
配列番号１として同定されたニューブラスチンＤＮＡ配列に基づいて、以下のプライマーを合成した：
（１）ニューブラスチンＣ２プライマー：
【０２２６】
【化１７】
2005198656.tif 000018
および（２）ニューブラスチンＣ２ａｓプライマー：
【０２２７】
【化１８】
2005198656.tif 000019
このプライマーセットを使用して、成人ヒト全脳ｍＲＮＡおよび胎児ヒト全脳ｍＲＮＡからのＤＮＡフラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲ増幅した。２２０ｂｐのＤＮＡフラグメントが、この反応によって生成されたＤＮＡフラグメントの中に存在した。この２２０ｂｐ  ＤＮＡフラグメントの同定によって、ニューブラスチン遺伝子が、成人脳組織および胎児脳組織中に発現されることが確認された。２２０ｂｐ  ＤＮＡフラグメントはまた、これらのプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡから増幅した。
【０２２８】
（ノーザンブロットハイブリダイゼーションによるニューブラスチンＲＮＡ発現を検出する方法）
成人ヒト組織由来のポリＡ＋ＲＮＡを使用するノーザンブロットは、商業的供給業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）から購入し、３２Ｐ標識ニューブラスチン  ｃＤＮＡを用いてプローブした。標識ニューブラスチンｃＤＮＡは、実施例１に記載される方法に従って、調製した。
【０２２９】
（プローブの調製）
ニューブラスチンン核酸ＤＮＡフラグメント（配列番号８のヌクレオチド２９６〜８１９）を、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために、製造業者によって推奨されるように、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログ番号ＲＰＮ１６３３）によって、標識した。簡単には、このＤＮＡサンプルを、４５μｌの１０ｍＭ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中
に、２．５〜２５ｎｇの濃度になるように希釈した。次いで、このＤＮＡを、沸騰水浴中で、９５〜１００℃で５分間サンプルを加熱することによって変性し、氷上に５分間、このサンプルを置くことによって、サンプルを迅速に冷却し、次いで、このサンプルを短く遠心分離し、内容物を反応チューブの底に移動させた。変性ＤＮＡの総量を、乾燥安定化形態で、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、エキソヌクレアーゼフリークレノー酵素およびランダムプライマーの緩衝化溶液を含む反応チューブ中に、５μｌのＲｅｄｉｖｕｅ（３２Ｐ）ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ）と一緒に加えた。この溶液を、上下に２回ピペッティングし、溶液中でピペットのチップをあちこち動かすことによって混合し、この反応混合物を、３７℃で１０分間インキュベートした。標識反応を、５μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡを加えることによって、停止した。ハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために、この標識ＤＮＡを、このＤＮＡサンプルを９５〜１００℃で５分間加熱し、次いで、このＤＮＡサンプルを氷上で５分間急速冷却することによって一本鎖へと変性した。このチューブを遠心分離し、その内容物をよく混合した。最後に、一本鎖ＤＮＡプローブを、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、精製した。
【０２３０】
（ハイブリダイゼーション技術）
調製済みノーザンブロットを、商業的供給業者から購入し（”Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ，カタログ番号７７６０−１および７７６９−１）、製造業者の使用説明書に従って、上で調製済みのニューブラスチン３２Ｐ標識プローブを用いて、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションについては、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を使用し、約３ｎｇ／ｍｌの濃度の上記標識プローブを使用した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を６８℃まで加熱し、次いで、攪拌し、全ての沈殿物を溶解した。各ノーザンブロット膜（１０×１０ｃｍ）を、製造業者の使用説明書に従って、Ｈｙｂａｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ中６８℃で３０分間、少なくとも５ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液中で、プレハイブリダイズした。このニューブラスチン３２Ｐ標識プローブを、９５〜１００℃で２分間変性し、次いで、氷上で迅速に冷却した。１４マイクロリットル（１４μｌ）の標識プローブを、５ｍｌの新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂに加え、そして完全に混合した。プレハイブリダイゼーションにおいて使用されるＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を、標識ＤＮＡプローブを含む５ｍｌの新鮮なＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液をブロットの上に均一に広げることによって、置換した。ブロットを、Ｈｙｂａｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ中６８℃で１時間、インキュベートした。インキュベーション後、このブロットを、リンスし、低ストリンジェンシー（０．０５％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液、室温）で数回洗浄し、続いて、高ストリンジェンシー（０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ、５０℃）洗浄を行った（２０×ＳＳＣは、０．３Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０である）。このブロットを、増感スクリーンを使用して−８０℃で、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）に曝した。
【０２３１】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション実験の結果を、図１に示す。図１Ａ（左）および図１Ｂ（右）は、実施例３に記載される３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡを使用してプローブされた、ポリＡ＋  ＲＮＡのノーザンブロットである。このマーカーは、大きさが、１．３５キロベース対（「ｋｂ」）、２．４ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂ、および９．５ｋｂのポリヌクレオチドを示す。図１Ａの膜は、種々の成人ヒト組織から抽出されたｍＲＮＡを用いて調製した。ノーザンブロットハイブリダーゼーション分析の結果から、本出願人は、ニューブラスチンｍＲＮＡが多くの成人ヒト組織で発現されると結論付ける。最高レベルのニューブラスチン発現は、心臓、骨格筋および膵臓で検出される。図１Ｂの膜は、成人の脳の種々の領域から抽出されたＲＮＡを使用して調製された。成人
の脳内で、最高レベルの発現は、尾状核および視床において見られる。約５ｋｂのｍＲＮＡ転写物が、脳で発現するニューブラスチンｍＲＮＡの優勢な形態であった。
【０２３２】
（インサイチュハイブリダイゼーションを使用した、組織でのニューブラスチンＲＮＡ発現の検出方法）
以下の技術は、ニューブラスチンアンチセンスプローブを使用して、動物組織、例えば、齧歯類組織におけるニューブラスチンＲＮＡの発現を測定するために使用される。
【０２３３】
（マウスにおける発現）
（組織サンプルの調製）
時期が合った妊娠マウス（Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、在胎日１３．５または１８．５に頚椎脱臼により殺傷した。胎児を、滅菌条件下で切開によって取り出し、直後にこの胎児を、４％パラホルムアルデヒド（「ＰＦＡ」）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）の溶液中に２４〜３０時間浸し、次いで、ＰＦＡから取り出し、そしてＰＢＳ中に保存した。この組織を、３０％スクロース溶液中に浸し、次いで、この組織を、ＴｉｓｓｕｅＴｅｃｈ（Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に包埋することによって、切片化の準備をした。６つの連続した冠状切片または矢状切片（各１２μｍ）を低温槽上で切断し、そして正に荷電したスライドガラス上に解凍封入した。新生児の頭／脳（Ｐ１、Ｐ７）を、胎児の段階と同じプロトコルに従って固定し、そして、成人の脳組織を切片化し、直ちに、ドライアイス上で凍結し、そしていずれの前包埋をせずに、低温槽上で切断した。
【０２３４】
（ニューブラスチンリボプローブ（ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）の調製）
アンチセンスニューブラスチンＲＮＡプローブ（本明細書中、以下では、「ニューブラスチン  リボプローブ」）を以下のように作製した。マウスニューブラスチンｃＤＮＡ配列（配列番号１５）のヌクレオチド１１０９〜１８６３を、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。得られたプラスミドを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して、直鎖状ＤＮＡへと切断した。このＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、製造業者の使用説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従って、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてインビトロで転写した。
【０２３５】
（ハイブリダイゼーション）
凍結切片を、４％  ＰＦＡ中で１０分間固定し、１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで５分間処理し、７０％エタノールおよび９５％エタノールでそれぞれ５分間および２分間連続的に脱水し、次いで、空気乾燥させた。１μｇ／ｍｌのＤＩＧ標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンホルムアミド，１０％の５０％硫酸デキストラン溶液，１％デンハートの溶液，２５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ，０．３Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＮａＰＯ４，１％サルコシル）を、８０℃で２分間加熱し、切片に適用した。次いで、この切片をパラフィルムで覆い、５５℃で１６〜１８時間インキュベートした。
【０２３６】
次の日、この切片を、高ストリンジェンシー（５０％ホルムアミドを含む２×ＳＳＣ）にて５５℃で３０分間洗浄して、次いで、ＲＮａｓｅ緩衝液中で洗浄して、そして３７℃で３０分間、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡとインキュベートした。ＤＩＧ標識されたプローブを検出するために、切片をブロッキング溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１０％熱不活性化ヤギ血清を含むＰＢＳ）中で１時間予めインキュベートして、次いで１：５０００希釈のアルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と４℃で一晩インキュベートした。その次の日、各切片を、０．１％  Ｔ
ｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で２時間の洗浄を４回行い、次いでＮＴＭＴ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１０分の洗浄を２回行った。次いで、この切片を、０．５ｍｇ／ｍｌのレバミゾール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）を含むＢＭ−パープル（ＢＭ−ｐｕｒｐｌｅ）基質中で４８時間インキュベートした。この呈色反応を、ＰＢＳ中で洗浄することにより停止させた。この切片を、風乾して、そしてＤＰＸと共に（ＫＥＢＯ−ｌａｂ、Ｓｗｅｄｅｎ）カバーストリップで覆った。
【０２３７】
このインサイチュハイブリダイゼーション反応の結果を、表１に示す。
【０２３８】
（表１：マウスにおけるニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）の発現）
【０２３９】
【表１】
2005198656.tif 000020
表１に示されるように、胎生１３．５日齢（「Ｅ１３．５」）では、ニューブラスチンは、脊髄および後脳において発現され、そして前脳においては弱く発現された。ニューブラスチンの発現はまた、発達中の網膜および感覚神経節（脊髄神経節および三叉神経節（Ｖ））においても検出された。神経系以外では、弱いシグナルが腎臓、肺、および小腸において見出され、このことはニューブラスチンがまた、これらの組織においても発現されることを示した。
【０２４０】
胎生１８．５日齢（「Ｅ１８．５」）では、ニューブラスチンは三叉神経節（Ｖ）において最も顕著に発現された。ニューブラスチンの発現はまた、網膜、線条および皮質においても検出された。さらに歯質原基において、発現が見られた。
【０２４１】
再度表１を参照すると、Ｅ１８．５の時点から出生１日および７日まで、増加したニューブラスチンの発現が、皮質、線条および三叉神経節（Ｖ）において見られた。ニューブラスチンの発現は、皮質の内部層よりも、皮質の外部層においてより顕著であった。Ｐ７の時点で、発現は１日齢での組織と同様の構成で見出されたが、さらにニューブラスチンの発現は、海馬、特に歯状回、および小脳において見出された。成体マウスの脳において、ニューブラスチンは歯状回において強く発現されており、試験された他の組織においては、非常に低度または検出不能なレベルのニューブラスチンの発現が検出された。
【０２４２】
（ラットにおける発現）
以下の実験は、アルカリホスファターゼ標識されたオリゴヌクレオチドのニューブラスチンアンチセンスプローブを用いた、ラット組織のハイブリダイゼーションを記載する。
【０２４３】
組織サンプルの調製：ラット胚（Ｅ１４）を、ペントバルビタール麻酔した後に、妊娠したウィスターラット（Ｍφｌｌｅｇａｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から採取した。出生後の
ラット（Ｐ０、Ｐ７、成体）を断頭により屠殺した。解剖された脳および頭部全体を、直ちに冷０．９％ＮａＣｌに浸して、すぐに凍結して、そして低温槽上で２０μｍで切り出した（冠状切片および矢状切片、１０系列）。
【０２４４】
インサイチュハイブリダイゼーション：２系列の切片を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドプローブ（５’−ＮＣＡ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  Ｇ−３’（配列番号２７）、Ｏｌｉｇｏ．Ｎｏ．１６４６７５，ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、ハイブリダイゼーションした。このプローブは、配列番号１５のマウスニューブラスチンｃＤＮＡの１１４０塩基〜１１６９塩基に相補的である。
【０２４５】
ハイブリダイゼーションの前に、切片を室温で風乾して、１０分間５５℃で加温して、次いで４℃で一晩９６％エタノールで処理した。次いでこれら切片を風乾して、そしてハイブリダイゼーション媒体（５．０ｐｍｏｌプローブ／ｍｌ）中で３９℃で一晩インキュベートした（Ｆｉｎｓｅｎら，１９９２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４７；１０５−１１３；Ｗｅｓｔら，１９９６，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３７０：１１−２２）。
【０２４６】
ハイブリダイゼーション後の処理は、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）中で５５℃で３０分リンス４回、続いてＡＰ発色剤を適用する前にＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）中で室温で１０分リンス３回から構成された。ＡＰ発色剤は、使用直前に調製され、そしてニトロブルーテトラゾリウム（ｔｅｔｒａｚｏｌｅｕｍ）（ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ）、５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ，Ｓｉｇｍａ）およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ−ＭｇＣｌ２緩衝液（ｐＨ９．５）（Ｆｉｎｓｅｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９２  ４７  １０５−１１３）を含んだ。ＡＰ発色を４８時間室温で暗所にて行った。この呈色反応を蒸留水中で切片をリンスすることにより停止させた。切片を段階的にアセトンで脱水して、キシレン−フェノールクレオソート（Ａｌｌｃｈｅｍ、ＵＫ）中で軟化させ、キシレン中で清澄にして、そしてＥｕｋｉｔｔ（Ｂｉｅ＆Ｂｅｒｎｔｓｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してカバースリップを置いた。
【０２４７】
コントロールの反応は、（１）ハイブリダイゼーション前に、切片をＲＮａｓｅＡ（５０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で前処理する工程；（２）切片を１００倍過剰の未標識プローブでハイブリダイズさせる工程；および（３）切片をハイブリダイゼーション緩衝液単独でハイブリダイズさせる工程、から構成された。これらのハイブリダイゼーション反応の結果を、表２に示す。
【０２４８】
（表２：ラットにおけるニューブラスチンの発現）
【０２４９】
【表２】
2005198656.tif 000021
胎生１４日齢（Ｅ１４）に、ニューブラスチンは、ラット胚の前脳、後脳、および脊髄において弱く発現された。ニューブラスチンのｍＲＮＡはまた、目（網膜）、脊髄神経節、三叉神経節（Ｖ）、ならびに腎臓、肺、心臓、肝臓および腸において検出された。新生児（Ｐ０）ラットにおいて、皮質および線条において、著明なニューブラスチン発現が存在した。ニューブラスチンの発現はまた、嗅球および海馬においても検出された。７日齢（Ｐ７）のラットにおいて、ニューブラスチンは、皮質、線条、嗅球、および小脳において発現された。著明なシグナルが海馬に見られた。成体のラットにおいて、非常に低度または検出不能なレベルのニューブラスチンの発現が、脳の大部分の領域において検出された。微弱なシグナルは、視床核において検出され、そして著明なニューブラスチンの発現が海馬において検出された。
【０２５０】
（実施例４：ニューブラスチンポリペプチド）
配列番号８において示される、オープンリーディングフレーム、すなわちコード領域（ＣＤＳ）は、プレプロポリペプチド（「プレプロニューロブラスチン」と称する）をコードする。このオープンリーディングフレームから予想されるアミノ酸配列は、配列番号９に示される。配列番号９を基に、ニューロブラスチンポリペプチドの３つの改変体を同定した。これらの改変体は：（ｉ）本明細書中でＮＢＮ１４０と称されるポリペプチド（これは、配列番号１０と示されるアミノ酸配列を有する）；（ｉｉ）本明細書中でＮＢＮ１１６と称されるポリペプチド（これは、配列番号１１と示されるアミノ酸配列を有する）；および（ｉｉｉ）本明細書中でＮＢＮ１１３と称されるポリペプチド（これは本明細書中で配列番号１２と示される）。
【０２５１】
同様に、アミノ酸配列（配列番号４として示される）を有するプレプロポリペプチドをコードする、配列番号３に示されるコード領域（ＣＤＳ）を基に、ニューブラスチンの３つの改変体を同定した。これらの改変体は：（ｉ）配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｉｉ）配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；および（ｉｉｉ）配列番号７として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【０２５２】
ＣｌｕｓｔａｌＷ（１．７５）に基づく複数配列のアラインメントを基に、配列番号９（行２）のニューブラスチンを、ニューチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）のアミノ酸配列（配列番号４９；行１）、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）のアミノ酸配列（配列番号５０；行３）およびＧＤＮＦのアミノ酸配列（配列番号５１；行４）と整列させた。このアラインメントを、表３に図示する。
【０２５３】
【表３】
2005198656.tif 000022
表３に示されるアミノ酸配列のアラインメントから、ニューブラスチンが、ＴＧＦ−βスーパーファミリー内で保存される位置で、７つの保存されるシステイン残基を有することを見い出し得る。１つの実施形態において、好ましいニューブラスチンポリペプチドは、配列番号２の８位、３５位、３９位、７２位、７３位、１０１位および１０３位におけるように、または配列番号４および配列番号９の４３位、７０位、７４位、１０７位、１０８位、１３６位および１３８位におけるように、保存された（７つの）システインを含む。これらの７つの保存されたシステイン残基は、３つの単量体分子内ジスルフィド結合（例えば、配列番号２において、システイン残基の８位−７３位、３５位−１０１位、３９位−１０３位の間、ならびに例えば配列番号４および配列番号９のシステイン残基の４３位−１０８位、７０位−１３６位および７４位−１３８位の間に予想される）を、そして１つの単量体間ジスルフィド結合（例えば、配列番号２における、システイン残基７２位−７２位の間、ならびに例えば配列番号４および配列番号９のシステイン残基１０７位−１０７位）を生成することが、ＴＧＦ−ｂスーパーファミリー内で公知であり、これらのジスルフィド結合は延びたβ鎖領域と一緒になって、ＴＧＦ−ｂスーパーファミリーに関する保存された構造的モチーフを構成する。例えば、Ｄａｏｐｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９３  １７  １７６−１９２を参照のこと。
【０２５４】
この配列アラインメントを基に、ニューブラスチンが、神経栄養因子（ＬＧＬＧ−ＦＲ（Ｙ／Ｆ）ＣＳＧＳＣ−ＱｘＣＣＲＰ−ＳＡｘｘＣＧＣ、ＧＤＮＦサブファミリーのフィンガープリント、表３において下線が描かれる）のＧＤＮＦスーパーファミリーのメンバーであることを示した。
【０２５５】
本明細書中で示される、短縮されたニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、ニューブラスチン配列中に保存された７つのシステイン残基を含むポリペプチド配列を含む。例えば、短縮されたニューブラスチンポリペプチドは、好ましくはＮＢＮ１１３ポリペプチドのアミノ酸１５−１１３（９９ＡＡのＮＢＮ形態）、またはＮＢＮ１１３ポリペプチドのアミノ酸１２−１１３（１０２ＡＡのＮＢＮ形態）のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸配列は、例えば、配列番号９に示される、ヒトＮＢＮポリペプチド配列のアミノ酸４２−１４０（９９ＡＡ  ＮＢＮポリペプチド；配列番号４８）；および配列番号９のアミノ酸３９−１４０（１０２ＡＡ  ＮＢＮポリペプチド；配列番号４５）にそれぞれ見出され得る。これらの配列はまた、例えば、配列番号３４のアミノ酸１２６−２２４（ラット  ９９ＡＡのＮＢＮポリペプチド）および配列番号３４のアミノ酸１２３−２２４（ラット  １０２ＡＡのＮＢＮポリペプチド）にも見出される。同様に、短縮されたニューブラスチンはまた、上記で規定されるように、ＮＢＮ９９、ＮＢＮ１００、ＮＢＮ１０１、ＮＢＮ１０２、ＮＢＮ１０３、ＮＢＮ１０４、ＮＢＮ１０５、ＮＢＮ１０６、ＮＢＮ１０７、ＮＢＮ１０８、ＮＢＮ１０９、ＮＢＮ１１０、ＮＢＮ１１１、ＮＢＮ１１２の配列も含まれる。
【０２５６】
ニューブラスチンの、ＧＤＮＦファミリーの他のメンバーとの相同性を計算し、そしてそれらの結果を以下の表４に示す。
（表４：ニューブラスチンポリペプチドの、ＧＤＮＦファミリーの他のメンバーとの相同性）
【０２５７】
【表４】
2005198656.tif 000023
ＧＤＮＦ      ＝  グリア細胞株由来神経栄養因子
ＮＴＮ        ＝  ニューチュリン
ＰＳＰ        ＝  パーセフィン
ＩＨＡ        ＝  インヒビン−α
ＴＧＦ−β２  ＝  トランスホーミング増殖因子−β２
強い相同性とは、以下の「強い」グループのうちの１つが保存されることを示す：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【０２５８】
（実施例５：ニューブラスチンの産生）
ニューブラスチンを、以下に示されるように、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において産生した。
【０２５９】
発現ベクター  ニューブラスチンをコードするｃＤＮＡ配列を、真核生物発現ベクターｐＵｂｉ１Ｚ中に挿入した。このベクターを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏの改変された型の中にヒトＵｂＣプロモーターをクローニングすることにより生成した。改変されていないｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏは市販されている（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。改変されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏは、アンピシリン遺伝子（３９３３位〜５０１５位）および２８３８位〜３１３４位の配列を取り除いたので、元のベクターよりも短い。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏのこの改変型は、ＣＭＶプロモーターを、ｐＴＥＪ−８（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９０  ２６７  ２８９−２９４）由来のＵｂＣプロモーターで置き換え、ｐＵｂｉ１Ｚを生じた。
【０２６０】
哺乳動物細胞発現  次いで、ニューブラスチンコード配列を含むｐＵｂｉ１Ｚベクターを哺乳動物細胞株ＨｉＢ５（不死化されたラット神経細胞株（Ｒｅｎｆｒａｎｚら、Ｃｅｌｌ、６６、第７１３−７２９頁（１９９１）））にトランスフェクションした。ニューブラスチンを安定して発現する（ＲＴ−ＰＣＲで決定された）いくつかのＨｉＢ５細胞株を樹立した。これらの安定な細胞株のうちの１つにおいて、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２発現を、ノーザンブロットで総ＲＮＡを３２Ｐ標識されたニューブラスチンプローブとハイブリダイズさせることにより確認した。これらの研究の結果を、図２に示す。次いで、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２を、ニューブラスチンの神経栄養活性についてのいくつかの研究のためのニューブラスチンの供給源として使用した。
【０２６１】
図２は、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローンにおけるニューブラスチンｃＤＮＡの発現（すなわち、以下に記載するように、本発明の３２Ｐ標識されたニューブラスチンｃＤＮＡを用いて探索されるノーザンブロット）を示す。このブロットを、示されるように、トランスフェクトされないＨｉＢ５細胞、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞およびＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＧＤＮＦ１４細胞それぞれから抽出された総ＲＮＡにより調製した。４．１ｋｂおよび１．９ｋｂのそれぞれに対応する２８Ｓ  ｒＲＮＡバンドおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの位置を、ブロット上に示す。
【０２６２】
図３に示されるように、ニューブラスチン由来のポリペプチドに対して惹起された抗体はまた、ＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローン由来の馴化培地中の約１３キロダルトン（「ｋＤ」）のタンパク質を認識したが、トランスフェクトされていないＨｉＢ５細胞からのものでは認識しなかった（実施例６を参照）。
【０２６３】
改変されない（すなわち、翻訳後修飾の欠損した）ニューブラスチンポリペプチドＮＢＮ１４０（配列番号１０）、ＮＢＮ１１６（配列番号１１）およびＮＢＮ１１３（配列番号１２）の予想される分子量は、それぞれ、１４．７キロダルトン（「ｋＤ」）、１２．４ｋＤおよび１２．１ｋＤであると決定した。
【０２６４】
方法：トランスフェクトされないＨｉＢ５細胞およびＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２クローンからの総ＲＮＡ（１０μｇ）を用いるノーザンブロットを、０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲルでの電気泳動により調製して、ナイロン膜（Ｄｕｒａｌｏｎｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上へとブロットした。このブロットを、実施例３に記載されるように、配列番号８、ならびにニューブラスチンｃＤＮＡの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ由来のさらなるヌクレオチドを網羅するランダム標識法により調製された、１．３ｋｂの３２Ｐ標識されたプローブとハイブリダイズして、そして洗浄した。このブロットを、増感スクリーンを使用して、−８０℃でＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光
した。
【０２６５】
Ｎ２サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１７５０２−０４８）を補充した無血清培地中で一晩インキュベートしたＨｉＢ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２細胞、またはトランスフェクトされていないＨｉｂ５細胞からの馴化培地を濃縮して、そして１５％ポリアクリルアミドゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号８０−１２６２−０１）上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＰＮ−３０３Ｆ）に転写し、そして非特異的なタンパク質結合部位を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロックした。膜を、ポリクローナルニューブラスチン抗体（１：１０００）と一晩インキュベートして、次いで、西洋ワサビパーオキシダーゼと結合した二次抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＮＡ９３４）（１：２０００）とインキュベートした。免疫染色を、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＰＮ２１０９）またはＥＣＬ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を用いて、製造業者の指示書（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って可視化した。
【０２６６】
これらの実験の結果を、図３に示す。図３Ａおよび図３Ｂは、トランスフェクトされたＨｉＢ５細胞におけるニューブラスチンタンパク質の発現の図示である。トランスフェクトされていないＨｉＢ５細胞（レーン１）、またはニューブラスチンｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨｉＢ５クローン（レーン２）からの一晩の培地を、以下に記載されるように濃縮した。次いで、その培地を、ニューブラスチンに特異的な２つの異なるポリクローナル抗体（実施例１０に記載される、Ａｂ−１およびＡｂ−２）を使用するウエスタンブロットにより分析した。トランスフェクトされた細胞からの培地にて、両方の抗体は、約１５ｋＤａの分子量のタンパク質を認識することが見出された。このタンパク質は、トランスフェクトされていないＨｉＢ５細胞においては見られなかった。
【０２６７】
ニューブラスチンをコードするクローン化されたｃＤＮＡをまた、他の真核生物細胞発現ベクター（例えば、真核生物細胞発現ベクターＴＥＪ−８（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６７：２８９−２９４）またはｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に挿入し得、そして生じた発現プラスミドを代替の哺乳動物細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＰＣ１２細胞株、もしくはＲＮ３３ｂ細胞株、またはヒト神経幹細胞）へとトランスフェクトした。ニューブラスチンを発現する安定な細胞株を使用して、例えば、ニューブラスチンタンパク質を生成する。
【０２６８】
（ＣＨＯ細胞における発現）
プラスミドｐＪＣ０７０．１４の構築  チャイニーズハムスター卵巣細胞においてニューブラスチンｃＤＮＡを発現させるために、ヒトニューロブラスチンのプレプロ形態をコードするｃＤＮＡフラグメントを、哺乳動物細胞発現ベクターｐＥＡＧ３４７の中へと挿入して、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を生成した。ｐＥＡＧ３４７は、タンデムなＳＶ４０初期プロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーター（プラスミドｐＡＤ２βに由来する；ＮｏｒｔｏｎおよびＣｏｆｆｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２８１（１９８５））、唯一のＮｏｔＩクローニング部位、それに続いてＳＶ４０後期転写終結シグナルおよびポリＡシグナル（プラスミドｐＣＭＶβに由来する；ＭａｃＧｒｅｇｏｒおよびＣａｓｋｅｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２３６５（１９８９））を含む。さらに、ｐＥＡＧ３４７はｐＵＣ１９由来のプラスミド骨格、ならびにＭＴＸ選択およびトランスフェクトされたＣＨＯ中での増幅のための、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ由来のｄｈｆｒを含む。
【０２６９】
プラスミドｐＪＣ０７０．１４を２工程で生成した。第１に、ヒトニューブラスチンのプレプロ形態をコードするフラグメントを、オリゴヌクレオチドＫＤ２−８２４  ５’  ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ  ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡ  ＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧ  ＡＣＴＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号３１）およびＫＤ２−８２５  ５’ＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴ  ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴ  ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ  ＡＧＣＣＧＣＡＧＧ３’（配列番号３２）、ならびにＰＦＵポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、プラスミドｐＵｂｉ１ｚ−ＮＢＮから単離した。このフラグメントを、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）のＳｒｆ−１部位にクローニングして、プラスミドｐＪＣ０６９を生成した。第２の工程として、プラスミドｐＣＪ０６９について部分的Ｎｏｔ−１消化を実施して６８５ｂｐのフラグメント（ニューブラスチン遺伝子を含む）を生成し、このフラグメントをプラスミドｐＥＡＧ３４７のＮｏｔ−１部位にクローニングして、プラスミドｐＪＣ０７０．１４を生成した。プラスミドｐＪＣ０７０．１４におけるニューブラスチン遺伝子の転写を、アデノウイルス主要後期プロモーターにより制御する。
【０２７０】
ニューブラスチンを発現するＣＨＯ細胞株の生成  ２００μｇのｐＪＣ０７０．１４を制限エンドヌクレアーゼＭｌｕ−１を用いる消化により直鎖状にした。このＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出して、そしてエタノール沈殿した。この直鎖状のＤＮＡを、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭ  デキストロース（ＨＥＢＳ）中に再懸濁して、そしてエレクトロポレーション（２８０Ｖおよび９６０μＦ）により、約４Ｅ７個のＣＨＯ  ｄｕｋｘ  Ｂ１（ｄｈｆｒ−）細胞（ｐ２３）に導入した。エレクトロポレーションに続いて、この細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したα＋Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）中で２日間培養するために戻した。次いで、細胞をトリプシン処理して、１０％の透析済みＦＢＳを補充したα−ＭＥＭ（リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを欠いている）中で１００ｍｍディッシュにおいて５日間再プレートした（１００，０００個の細胞／プレート）。続けて細胞を、１００ｍｍプレート当たり１００，０００個の細胞濃度で分割して、そして２００ｎＭのメトトレキセート中で選択した。耐性なコロニーを採取して、そして６ウェルプレートにスケールアップして；各クローン由来の馴化培地を、以下に記載のニューブラスチンに特異的なアッセイを使用してスクリーニングした。最も高レベルのニューブラスチンを発現する１２個のコロニーを、Ｔ１６２フラスコにスケールアップして、続けて再アッセイを行った。図１０に示されるように、これらのＣＨＯ細胞株は、２５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲でニューブラスチンを産生した。
【０２７１】
ニューブラスチンについての三重複合体アッセイ  ニューブラスチンの存在を、Ｓａｎｉｃｏｌａら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６２３８（１９９７））に記載された三重複合体アッセイの改変型を使用して、ＣＨＯ細胞株の上清の培地において評価した。
【０２７２】
このアッセイにおいて、ＧＤＮＦ様分子の能力を、ＲＥＴの細胞外ドメインと、種々の副レセプター（ＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３）との間の結合を媒介するＧＤＮＦ様分子の能力について、評価し得る。ＲＥＴおよびこれら副レセプターの可溶性形態を、融合タンパク質として生成した。ラットＲＥＴの細胞外ドメインと胎盤のアルカリホスファターゼとの間の融合タンパク質（ＲＥＴ−ＡＰ）、およびラットＧＦＲα１の細胞外ドメイン（公開された出願ＷＯ９７４４３５６；１９９７年１１月２７日において開示され、本明細書中で参考として援用される）とヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとの間の融合タンパク質（ｒＧＦＲα１−Ｉｇ）は、記載されている（Ｓａｎｉｃｏｌａら、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６２３８（１９９７））。
【０２７３】
マウスＧＦＲα３の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとの間の融合タンパク質（ｍＧＦＲα３−Ｉｇ）を生成するために、マウスＲＥＴＬ３のアミノ酸１〜３５９位をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含むフラグメントとライゲーションを行って、そして発現ベクターｐＥＡＧ３４７の中にクローニングして、プラスミドｐＧＪ１４４を生成した。プラスミドｐＧＪ１４４を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）にトランスフェクトして、融合タンパク質を産生する安定な細胞株を生成し、この融合タンパク質を標準的な方法を使用してプロテインＡセファロース免疫親和性カラムで精製した。要約すると、このＧＤＮＦ様分子がこのアッセイにおいて副レセプターのＲＥＴとの結合を媒介し得る場合、このＲＥＴ−ＡＰ融合タンパク質はプレート上に保持されて、そしてその保持された量を、アルカリホスファターゼの化学発光基質を使用して測定し得る。
【０２７４】
Ｄｙｎｅｘ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ−１  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５０ｍＭ重炭酸／炭酸、ｐＨ９．６中のヒトＦｃ特異的ヤギ抗体（１μｇ／ｍｌ）で１６時間コーティングした。このプレートを空にし、そしてＴＢＳ／０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）中の３００μｌの１％  Ｉ−ブロック（Ｔｒｏｐｉｘ）で１時間満たした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＲＥＴ−ＡＰ融合遺伝子を発現する２９３  ＥＢＮＡ細胞由来の馴化培地中に希釈した１００μｌの１μｇ／ｍｌ  ｒＧＦＲα１−ＩｇまたはｍＧＲＦα３−Ｉｇで、このウェルを満たした。次いで、ＣＨＯニューブラスチンクローン由来の１００μｌの馴化培地をウェルの縦列の一番上のウェルに添加し、そして２倍の連続希釈を、ウェルの各横列の下に向かって実施し、そして室温にて１．５時間インキュベートした。次いで、このプレートをＴＢＳＴで３回、そして２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＣＳＰＤ緩衝液）で２回洗浄した。次いで、この洗浄溶液を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ化学発光エンハンサー（Ｔｒｏｐｉｘ）を含有するＣＳＰＤ緩衝液中の４２５μＭ  ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）で置換し、そして室温にて３０分間インキュベートした。化学発光の発生を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ照度計を用いて測定した。
【０２７５】
最初の実験により、ＣＨＯ細胞株により産生されるニューブラスチンが、ＲＥＴの細胞外ドメインへのＧＦＲα１またはＧＦＲα３の結合を媒介し得るか否かを調査した。図１１に示されるように、ＣＨＯ細胞クローン＃５３由来の馴化培地は、ｍＧＦＲα３−Ｉｇ融合タンパク質を加えた場合に三元複合体アッセイ（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ）において強いシグナルを生じたが、ｒＧＦＲα１−Ｉｇ融合タンパク質を加えた場合はシグナルを生じなかった。このことは、ニューブラスチンが、ＧＦＲα３に結合するが、ＧＦＲα１には結合しないことを示す。この挙動は、ＧＤＮＦとニューブラスチンとを明確に区別する（図１１に示されるように、ＧＤＮＦは、ＧＦＲα１に結合するが、ＧＦＲα３には結合しない）。親のＣＨＯ細胞株由来の馴化培地または純粋な培地（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｍｅｄｉｕｍ）をアッセイした場合、いずれのコレセプター融合タンパク質を用いてもシグナルは観察されなかった。
【０２７６】
ＣＨＯ細胞株におけるニューブラスチンの発現レベルを定量するために、標準曲線を、１ｎｇ／ｍｌの濃度で開始するｒＧＦＲα１−ＩｇおよびＧＤＮＦを用いて作成した。次いで、異なるＣＨＯ細胞株についてのニューブラスチン濃度を、この標準曲線を用いて算出した（５つのＣＨＯ細胞株により生成されるレベルを図１０に示す）。この概算は、ＧＤＮＦとＧＦＲα１との間の結合親和性が、ニューブラスチンとＧＦＲα３との間の結合親和性と類似するという未試験の仮定に基づくので、これらのレベルは近似値にすぎない。
【０２７７】
（ＣＨＯ細胞株上清由来のニューブラスチンの分析）
ＣＨＯ細胞株により産生されるニューブラスチンをさらに分析するために、このタンパ
ク質を、ＧＦＲα３−Ｉｇ融合タンパク質を用いて培地から抽出し、そしてニューブラスチンペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって分析した。
【０２７８】
第１の実験において、ニューブラスチンを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに結合したｍＧＦＲα３−Ｉｇを用いて抽出した。ｍＧＦＲα３−Ｉｇを、製造元であるＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．により示された条件を用いてＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズに結合させた。１００μＬのｍＧＦＲα３−Ｉｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、ネガティブコントロールのＣＨＯ細胞株またはニューブラスチンを産生するＣＨＯ細胞株＃１６由来の馴化培地の１．０ｍＬサンプルに添加した。この上清を、振動するプラットホーム上で２時間インキュベートした。各懸濁物を遠心分離し、そしてその上清を除去した後、１．０ｍＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で３回洗浄した。各々の樹脂を、１００μＬの２×還元サンプル緩衝液中に再懸濁し、そして５分間１００℃に加熱した。２０μＬのサンプル緩衝液上清および１０μＬの分子量標準（ＦＭＣ）を１０〜２０％プレキャストＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｏｗｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにアプライした。このゲルを、４０ｍＡの定電流で７２分間電気泳動した。
【０２７９】
ウェスタンブロット分析のために、このタンパク質を、１０ｍＭ  ＣＡＰＳ、１０％メタノール、０．０５％  ＳＤＳ、ｐＨ１１．２緩衝系中にて、Ｈｏｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ機器でニトロセルロース（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に電気ブロットした（４００ｍＡの定電流にて４５分間）。転移させた後、ニトロセルロースフィルターをカセットから取り外し、そして０．１％  Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓの１％酢酸溶液で６０秒間染色することにより、分子量マーカーを可視化した。このメンブレンを２つの切片に切断し、そして蒸留水中で穏やかに振盪することにより過剰な染色を除去した。このメンブレンを、４℃にて一晩、２％脱脂粉乳を含むＴＢＳ中でブロックした。このメンブレンを、２％脱脂粉乳を含むＴＢＳ中で１．０μｇ／ｍＬの濃度の、２つのアフィニティー精製した抗ニューブラスチンペプチド抗体（Ｒ３０およびＲ３１）の個々と共にインキュベートした。このメンブレンを、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１０分間、３回洗浄し、そして１：５０００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｂｉｏｒａｄ）中で３０分間インキュベートした。このメンブレンを、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて１０分間、３回洗浄し、そしてＥＣＬ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて発色させた。図１２に示されるように、ネガティブコントロールの細胞株から抽出したタンパク質（レーン１および３）において観察されたバンドと比較して、両方の抗体を用いてニューブラスチンを産生するＣＨＯ細胞株から抽出したタンパク質（レーン２および４）において、特異的なバンドを検出した。
【０２８０】
下方の種の分子量は約１３ｋＤであり、おそらく、ニューブラスチンのプロドメインの切断後に生成された成熟ドメインを表す。この切断は、プレプロニューブラスチンタンパク質に存在する３つの切断モチーフのいずれか１つにおける４番目の位置のＡｒｇ残基の後（例えば、−ＲＸＸＲ↓−）で起こり得、１４０ＡＡ、１１６ＡＡ、または１１３ＡＡのいずれかの形態を生成する（それぞれ、配列番号１０、１１、または１２に示される）。この非修飾（すなわち、翻訳後修飾を欠く）ニューブラスチンポリペプチドＮＢＮ１４０（配列番号１０）、ＮＢＮ１１６（配列番号１１）、およびＮＢＮ１１３（配列番号１２）の推定分子量を、それぞれ、１４．７ｋＤ、１２．４ｋＤ、および１２．１ｋＤと決定した。この種および他のニューブラスチンの特異的なバンドの構造を確認するために、さらなる分析が必要とされる。
【０２８１】
第２の実験において、ニューブラスチンを、ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたｈＧＦＲα３−Ｉｇにより抽出した。ヒトＧＦＲα３の細胞外ドメイン（本明細書中で参考として援用される、公開された出願ＷＯ９７／４４３５６；１９９７年１１月２７日に開示さ
れている）とヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（ｈＧＦＲα３−Ｉｇ）との間で融合タンパク質を作製するために、ヒトＧＦＲα３のアミノ酸１〜３６４をコードするＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含むフラグメントに連結し、そしてＳａｎｉｃｏｌａら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：６２３８（１９９７））により記載された発現ベクターＣＨ２６９中にクローニングした。このプラスミドによりコードされる融合タンパク質を、２９３−エプスタイン−バーウイルスコード核抗原（ＥＢＮＡ）細胞において一過的に発現させ、そして標準的な方法を用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅイムノアフィニティーカラム上で精製した。
【０２８２】
９６ウェルプレートの６つのウェルを、４℃にて一晩、ＰＢＳ中の２５μｇ／ｍｌの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγフラグメント特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｕｌｏｇｉｃｓ）（３００μｌ／ウェル）でコーティングした。このウェルを、室温にて１時間、４００μｌの１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロックした。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、３００μｌのｈＧＦＲα３−Ｉｇ（０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ）を、各ウェルに添加した。このプレートを室温にて１時間インキュベートし、そして結合を最大にするために穏やかに振盪した（２００ストローク／分）。次いで、このウェルを空にし、そして再度、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ネガティブコントロールのＣＨＯ細胞株またはニューブラスチンを産生するＣＨＯ細胞株＃２５由来の馴化培地２５０μｌを３ウェル各々に添加した。このプレートを室温にて３時間インキュベートし、そして穏やかに振盪した（３００ストローク／分）。次いで、このウェルを、ＰＢＳＴで２回洗浄した。２５μｌの非還元Ｌａｅｍｌｉローディング緩衝液を第１のウェルに添加し、そしてこのプレートを５分間高速（１３００ストローク／分）で振盪して結合したタンパク質を溶出させた。内容物を次のウェルに移し、そしてこの手順を繰り返して、第２および第３のウェルに結合したタンパク質を溶出した。β−メルカプトエタノール（最終５％）を添加した後、サンプルを５分間沸騰させ、そして１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２８３】
ウェスタンブロット分析のために、このタンパク質をニトロセルロースに移した。このメンブレンを、５％脱脂粉乳、ＰＢＳＴ中でブロックおよびプローブし、そしてＰＢＳＴ中で洗浄した。ニューブラスチンを、２つのニューブラスチンペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体（Ｒ３０およびＲ３１）（１μｇ／ｍｌ）と反応させ、その後ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＢｉｏＲａｄ）と反応させた後に、電気化学発光により検出した。図１３に示されるように、５つのニューブラスチンに特異的なバンドを、ニューブラスチン産生ＣＨＯ細胞株由来の抽出タンパク質（レーン２）において検出した。下方の２つのバンドは、図１２において観察されたバンドと非常に類似する（繰り返しになるが、下方のバンドはおそらく、ニューブラスチンのプロドメインの切断後の成熟ドメインを表す）。
【０２８４】
図１３におけるバンドのその後の分析（データは示していない）は、約１８ｋＤのバンドをＰＧＮａｓｅＦにより脱グリコシルすることによって、このバンドの大きさが図１３のゲルにおける最も下方のバンドに相当する大きさに減少することを示す。このことは、ニューブラスチンが、哺乳動物細胞においてグルコシル化されたタンパク質として産生され得ることを示唆する。
【０２８５】
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニューブラスチンの発現）
Ｅ．ｃｏｌｉにおいてニューブラスチン遺伝子を発現させるために、低ＧＣ含量でありかつ優先的なＥ．ｃｏｌｉコドンを有する同系遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅ）を構築した。この同系遺伝子を、２つのベクターｐＥＴ１９ｂおよびｐＭＪＢ１６４（ｐＥＴ１９ｂの誘導体）にクローニングした。ｐＥＴ１９ｂを用いた構築物を図１４に示す。この構築物において、ＮＢＮ１１３をコードする配列は、開始メチオニンに直接融合されている。ＮＢ
Ｎについてのさらなる合成遺伝子構築物を、配列番号５２〜５４に示す。ｐＭＪＢ１６４を含む構築物を図１５に示す。この構築物において、ＮＢＮ１１３は、エンテロキナーゼ切断部位により分離されたヒスチジンタグ（すなわち、１０個のヒスチジン）に融合されている。ヒスチジンタグに融合された、ＮＢＮについてのさらなる合成遺伝子構築物を、配列番号５５〜５７に示す。開始メチオニンは、ヒスチジンタグの前に存在する。
【０２８６】
（図１４においてニューブラスチンをコードするヌクレオチド配列）
【０２８７】
【化１９】
2005198656.tif 000024
（図１５においてヒスチジンタグを付加されたニューブラスチンをコードするヌクレオチド配列）
【０２８８】
【化２０】
2005198656.tif 000025
（実施例６：ラット胚ドパミン作用性ニューロンの生存度およびＣｈＡＴ活性に対するニューブラスチンの効果）
この系統の実験において、上記のニューブラスチンを産生するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞由来の馴化培地の効果を評価した。
【０２８９】
（培養物の調製）
腹側中脳または脊髄を、冷やしたハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中のラットＥ１４胚から切除した。組織片を、３７℃にて２０分間、滅菌濾過した０．１％トリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および０．０５％ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳ中でインキュベートした。次いで、組織片を、ＨＢＳＳ＋０．０５％ＤＮａｓｅ中で４回リンスし、そして１ｍｌ自動ピペットを用いて分離した。次いで、この懸濁物を６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そしてそのペレットを血清馴化培地（ＳＣＭ；１０％胎仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ）中に再懸濁した。細胞の総数を、トリファンブルー色素排除法により評価し、そしてドパミン作用性ニューロンの生存度の評価のためにポリ−Ｌ−リジンをコーティングした８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に１００．０００細胞／ｃｍ２の密度で、またはＣｈＡＴ活性測定のために４８ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２０００００細胞／ｃｍ２でプレーティングした。細胞を、３７℃で２４〜４８時間、５％  ＣＯ２／９５％  Ｏ２および湿度９５％にてＳＣＭ中でインキュベートし、その後、神経栄養因子を添加した無血清培地（ＳＦＭ）に移した。
【０２９０】
ドパミン作用性ニューロンの生存度を評価するための細胞を、ＳＦＭ＋栄養性因子中で５日間維持し、次いで４％  ＰＦＡ中で５分間固定し、そして免疫組織化学によりチロシ
ンヒドロキシラーゼについて染色した。
【０２９１】
ＣｈＡＴ活性のための細胞を、ＳＦＭを用いて３日間維持し、次いで、ＨＢＳＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解し、そしてＣｈａｔ活性測定までドライアイスを用いて直ちに凍結させた。
【０２９２】
（栄養因子の添加）
馴化培地を、トランスフェクトしていないＨｉＢ５コントロールまたはニューブラスチンを産生するＨｉＢ５（ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２）またはＧＤＮＦを産生するＨｉＢ５（ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＧＤＮＦ−Ｌ１７）から収集した。ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２は、この細胞から回収された馴化培地に対するＧＤＮＦ−ＥＬＩＳＡにより決定した場合、およそ２０ｎｇ  ＧＤＮＦ／２４時間／１０５細胞を産生する。各々の細胞株を、ＤＭＥＭ＋１％  ＦＣＳと共に一晩インキュベートし、そしてその上清を収集し、使用するまで−２０℃で保存した。この上清を、細胞に添加する際に、ＳＦＭ中に１：５０に希釈した。別のウェルを、ＨｉＢ５コントロール上清（１：５０）＋精製組換えラットＧＤＮＦ（０．０３〜１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。
【０２９３】
これらの実験の結果を図４に示す。図４Ａ〜４Ｃは、培養したラット胚ドパミン作用性腹側中脳ニューロンの生存度に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果、および以下の実施例５．１に記載されるような無血清培地中のコリン作用性脳神経運動ニューロンにおけるＣｈＡＴ活性の実例である。
【０２９４】
図４Ａは、Ｅ１４腹側中脳から最初に確立された無血清培地においてＤＩＶ５で測定されたＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）に対する組換えＧＤＮＦについての用量応答曲線の実例である（すなわち、ＨｉＢ５；ＧＤＮＦ  ０．０３ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  ０．１ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  ０．３ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  １ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  １０ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  １００ｎｇ／ｍｌ）。
【０２９５】
図４Ｂは、Ｅ１４腹側中脳から最初に確立された無血清培地においてＤＩＶ５で測定されたＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）の実例である。ニューブラスチンを産生するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＧＤＮＦを産生するＨｉＢ５ＧＤＮＦＬ−１７（ＧＤＮＦＬ−１７）細胞のいずれか由来の希釈した馴化培地を、図に示すように添加した（すなわち、ニューブラスチン１：１０；ニューブラスチン１：５０；ＧＤＮＦ  Ｌ−１７  １：５０）。
【０２９６】
図４Ｃは、Ｅ１４ラット腹側中脳から最初に確立された無血清培地におけるＤＩＶ７でのウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数（Ｎｏ．ＴＨ＋細胞／ウェル）の実例である。種々の濃度の非トランスフェクトＨｉＢ５細胞（ＨｉＢ５）またはニューブラスチンを産生するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）または組替えＧＤＮＦのいずれか由来の希釈した馴化培地を、図に示すように添加した（すなわち、ＨｉＢ５  １：１０；ＨｉＢ５  １：４０；ＧＤＮＦ  ０．１ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  １０ｎｇ／ｍｌ；ＧＤＮＦ  １００ｎｇ／ｍｌ；およびニューブラスチン１：４０）。
【０２９７】
１：４０に希釈した、ニューブラスチンをトランスフェクトしたＨｉＢ５細胞由来の馴化培地は、等価およびそれより低い希釈（１：１０および１：４０）のコントロール（非トランスフェクト）ＨｉＢ５細胞と比較して、ウェルあたりのＴＨ免疫反応性細胞の数を有意に増加させる（例えば、図４Ｂを参照のこと）。ＴＨ免疫反応性細胞の増加は、最大ＧＤＮＦ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）で見られる増加に相当する。このことは、培地に分泌されたニューブラスチンが、ラット胚腹側中脳由来のドパミン作用性ニューロン集団の生存
度に対する効果を有することを示す。対照的に、トランスフェクトされたＨｉＢ５細胞から分泌されるＧＤＮＦと異なり、ニューブラスチンをトランスフェクトしたＨｉＢ５細胞由来の馴化培地の効果は、同じ培養物中の別のニューロン集団（コリン作用性ニューロン）に対して見られなかった（例えば、図４Ａを参照のこと）。
【０２９８】
（実施例７：ブタ胚ドパミン作用性腹側中脳ニューロンのスライス培養物の生存度に対するニューブラスチンの効果）
この実験により、ブタ胚由来の腹側中脳のスライス培養物と同時培養したニューブラスチン産生ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞の効果を評価した。
【０２９９】
（培養物の調製）
腹側中脳（ＶＭ）を、滅菌条件下でブタ胚（Ｅ２８；ｎ＝１２）から単離し、４００μｍスライスに切り刻み、そしてグルコース（６．５ｍｇ／ｍｌ）を含む冷凍したゲイ平衡塩溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＧＩＢＣＯ）中に置いた。この組織スライスを、Ｓｔｏｐｐｉｎｉら（Ｌ．Ｓｔｏｐｐｉｎｉ，Ｐ．Ａ．Ｂｕｃｈｓ，Ｄ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１  ３７  １７３−１８２）により最初に開発された界面培養法により培養した。
【０３００】
簡単に言うと、スライスを、血清含有培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において挿入物として配置された準多孔性（ｓｅｍｉ  ｐｏｒｏｕｓ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．３μｍ；８スライス／メンブレンが１つのＶＭに対応する）上に配置した。各ウェルは、１ｍｌの培地（最終濃度２５ｍＭまでＤグルコースを補充した５０％  Ｏｐｔｉｍｅｍ、２５％ウマ血清、２５％ハンクス平衡塩溶液（全てＧＩＢＣＯ））を含んだ。第０日に、７０００個のトランスフェクトしたＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２（ニューブラスチン）または７０００個のトランスフェクトしていないＨｉＢ５細胞（コントロール）を、各組織スライスに接種した。この同時培養物を、まず、３３℃のインキュベーターにて４８時間増殖して、温度感受性癌遺伝子を有する不死化されたＨｉＢ５細胞を増殖させ、次いで、３７℃のインキュベーターに入れて、ＨｉＢ５細胞を分化させた。培地を１週間に２度交換した。全ての段階において、抗有糸分裂剤および抗生物質を使用しなかった。
【０３０１】
（ＨＰＬＣによるドパミンの決定）
第１２日および第２１日に、インビトロで培養培地を収集し、そしてＨＰＬＣを用いて電気化学的検出によりドパミンについて分析した（Ｗ．Ｎ．Ｓｌｏｏｔｈ，Ｊ．Ｂ．Ｐ．Ｇｒａｍｓｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．１９９５  ６０  １４１−４９）。
【０３０２】
（組織の処理および免疫組織化学）
第２１日に、培養物を、４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝液中で６０分間固定し、２０％スクロース溶液中で２４時間脱水し、凍結し、クリオスタットで２０μｍに切断し（４系統）、そしてゲラチンをコーティングした顕微鏡スライドに乗せた。１つの系統の切片をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）について免疫染色した。簡単に言うと、切片を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．０５Ｍトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）中で、１５分間洗浄し（３回）、そしてＴＢＳ中の１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、この組織を、１０％  ＦＢＳを含むＴＢＳ中で１：６００希釈したモノクローナルマウス抗ＴＨ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と共に、４℃にて２４時間インキュベートした。１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳ中で１５分間リンスした後（３回）、切片を、１０％  ＦＢＳを含むＴＢＳ中に１：２００希釈したビオチニル化抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に６０分間インキュベー
トした。次いで、この切片を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳ中で洗浄し（１５分間を３回）、そして１０％  ＦＢＳを含むＴＢＳ中に１：２００希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）と共に６０分間インキュベートした。ＴＢＳ中で洗浄した後（１５分間を３回）、結合した抗体を、０．０１％  Ｈ２Ｏ２を含有するＴＢＳ中の０．０５％  ３，３−ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ）による処理により可視化した。最後に、この切片を、アルコール中で脱水し、キシレン中で洗浄し、そしてＥｕｋｉｔｔ中でカバースリップをした。
【０３０３】
（細胞の計数および形態測定分析）
免疫反応性ＴＨ−ｉｒニューロンの定量を、明視野顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて実施した。十分に保存された細胞構造および明確な核を有する強い染色を示す細胞のみを計数した。この概算は、２０倍対物レンズを用いた各々の４番目の培養切片における細胞計数に基づいた。細胞数を、ＴＨ−ｉｒニューロンの核の平均直径（６．６±０．２μｍ、ｎ＝３０）を用いて、Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅの式（Ｍ．Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１９４６  ９４  ２３９−４７）に従い二重計数（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を補正した。核の大きさを、ニューロン追跡システム（ｎｅｕｒｏｎ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ，ＭｉｃｒｏＢｒｉｇｈｔＦｉｅｌｄ，Ｉｎｃ）を用いて概算した。
【０３０４】
これらの実験の結果を図５に示す。図５Ａ〜５Ｃは、以下に記載されるようなＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（コントロール）のいずれかと同時培養したブタ胚ドパミン作用性腹側中脳ニューロンのスライス培養物の機能および生存度に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果の実例である。
【０３０５】
図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、ＤＩＶ１２（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第１２日）およびＤＩＶ２１（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−第２１日）に培地に放出されたドパミンを示す。図５Ｃは、ＤＩＶ２１の培養物当たりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞（培養物当たりのＴＨ−ｉｒ細胞）の数の実例である。
【０３０６】
第１２日のＨＰＬＣ分析は、ＨｉＢ５−ニューブラスチン同時培養物由来の培地が、ＨｉＢ５−Ｃ同時培養物由来の培地よりも８４％多いドパミンを含むことを明らかにした（図５Ａ）。第２１日に、その差は、７８％であり（図５Ｂ）、そして細胞計数は、ＨｉＢ５−ニューブラスチン同時培養物が、ＨｉＢ５−Ｃ同時培養物よりも６６％多いチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性ニューロンを含む（Ｐ＜０．０５）ことを示した（図５Ｃ）。このことは、ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２クローンから分泌されたニューブラスチンが、胚性ブタドパミン作用性ニューロンに対する強力な生存効果を有することを示す。
【０３０７】
（実施例８：無血清培地における脊髄神経節細胞の生存度）
この実施例は、既知の神経栄養因子との比較におけるニューブラスチンポリペプチドの神経栄養活性を示す。
【０３０８】
妊娠雌マウスを頚椎脱臼により屠殺した。その胚を、以下のように培養のために処理した。
【０３０９】
電気分解により鋭利にしたタングステン針を用いて、示される段階のＣ５７／Ｂ１６マウス（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から脊髄神経節を切除した。胚性神経節を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液中で、０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）と共に、３７℃にて５分間インキュベートした。出生後の神経節を、コラゲナーゼ／ディスパーゼ１ｍｇ／ｍｌで３０〜４５分
間処理し、次いで、トリプシン／ＤＮａｓｅ０，２５％で１５分間処理した。トリプシン溶液を除去した後、神経節を、１０％熱不活性化ウマ血清を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭで１度洗浄し、そして炎で磨いだパスツールピペットを用いて穏やかに摩砕し、単一細胞の懸濁物を得た。
【０３１０】
この細胞を、ポリオルニチン（０．５ｍｇ／ｍｌ、一晩）およびラミニン（２０ｍｇ／ｍｌ、４時間；Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で予めコーティングした２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上にプレートした。ニューロンを、２ｍＭグルタミン、０．３５％ウシ血清アルブミン、６０ｎｇ／ｍｌプロゲステロン、１６ｍｇ／ｍｌプトレシン、４００ｎｇ／ｍｌ  Ｌ−チロキシン、３８ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、３４０ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニン、６０ｍｇ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＨａｍｓ  Ｆ１４からなる規定された培地中で、加湿した５％  ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。
【０３１１】
４８時間のインキュベーション後、ニューロンは、位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｏｐｔｉｃｓ）の下でのそれらの双極性の形態によりはっきりと認識された。栄養因子の非存在下または存在下（ニューロンのプレーティングの前に１０ｎｇ／ｍｌで培養培地に添加された）でのニューロンのパーセント生存度、あるいはニューブラスチンを産生するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞由来の馴化培地の非存在下または存在下でのニューロンのパーセント生存度を、４８時間でのウェルにおけるニューロンを計数することにより評価した。
【０３１２】
これらの実験の結果を図９に示す。図９において：
０は、コントロール実験（因子の非存在下）を表す；
１は、ＧＤＮＦの存在下での実験を表す；
２は、ニューツリン（Ｎｅｕｔｕｒｉｎ）の存在下での実験を表す；
３は、本発明のニューブラスチンの存在下での実験を表す。
【０３１３】
図９は、以下に示されるような種々の時点で成長中の胎児から単離されたＤＲＧ細胞において実施された実験からのデータを示す：
Ｅ１２は、第１２日の胚を表す；
Ｅ１６は、第１６日の胚を表す；
Ｐ０は、誕生日を表す；
Ｐ７は、誕生の７日後を表す；
Ｐ１５は、誕生の１５日後を表す。
【０３１４】
これらの結果は、本発明の神経栄養因子が、十分に確立された神経栄養因子の活性に相当するか、またはそれよりも良好な活性を示すことを明確に示す。
【０３１５】
（実施例９：黒質ドパミンニューロンに対するニューブラスチンのインビボでの効果）
６−ヒドロキシドパミンにより誘導される変性から成体の黒質ドパミン（ＤＡ）ニューロンを保護するニューブラスチン（ニューブラスチン）の能力を試験するために、本発明者らは、パーキンソン病のラットモデル（ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４  ５９，４０１−４１５）およびニューブラスチンのレンチウイルス遺伝子移入を用いた。
【０３１６】
（レンチウイルス生成）
ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）をコードするレンチウイルス移入ベクターを生成するために、ｐＨＲ’−ニューブラスチン（ニューブラスチンｃＤＮＡに由来する１３３１ｂｐのＢａｍＨ１フラグメント）を、ｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の
ＢａｍＨ１／Ｂｇｌ  ＩＩ部位にサブクローンした。この構築物から、１５１９ｂｐのＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１フラグメントを切り出し、そしてマーモット肝炎ウイルスの翻訳後フラグメントを保有するｐＨＲ’のＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ部位に連結した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒ，Ｄｏｎｅｌｌｏ  ＪＥ，Ｔｒｏｎｏ  Ｄ，Ｈｏｐｅ  ＴＪ：「Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ」；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９  ７３（４）２８８６−２８９２）。ｐＨＲ−ＧＤＮＦを生成するために、ｐＵｂｉ１ｚ−ＧＤＮＦ由来の７０１ｂｐのＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１フラグメントを、ｐＨＲ’のＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１部位に連結した。
【０３１７】
レンチウイルスベクターの生成は、例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒ，Ｎａｇｙ  Ｄ，Ｍａｎｄｅｌ  ＲＪ，Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ，Ｔｒｏｎｏ
Ｄ：「Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｃｈｉｅｖｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７  １５（９）８７１−８７５）に記載されている。簡単に言うと、移入構築物ならびにヘルパープラスミドｐＲ８．９１およびｐＭＤＧを、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションした。培地中に放出されたビリオンを、トランスフェクションの４８〜７２時間後に回収した。このウイルスを濃縮するために、培地を、１．５時間、１４１０００ｇで遠心分離し、ペレットを、ＤＭＥＭに溶解した。グリーン蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）についての遺伝子を保有するコントロールの力価を、ＧＦＰ蛍光により、２９３Ｔ細胞において１０８形質転換ユニット（ＴＵ）／ｍｌであると決定した。ＲＮＡスロットブロット（ｓｌｏｔ  ｂｌｏｔ）技術（ｖｏｎ  Ｓｃｈｗｅｄｌｅｒ  Ｕ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ａｉｋｅｎ  Ｃ，Ｔｒｏｎｏ  Ｄ：「Ｖｉｆ  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９３  ６７（８）４９４５−４９５５）を、ウイルス粒子力価を決定するために使用した。ＧＤＮＦ上清およびニューブラスチン上清において、ＧＦＰ上清と比較して、１０分の１より少ない粒子が、存在した。
【０３１８】
（外科手順）
動物を用いる全ての作業を、Ｅｔｈｉｃａｌ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅによるＵｓｅ  ｏｆ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｔ  Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの規則セットに従って行った。
【０３１９】
全部で２１匹の若い成体雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用し、そしてラットが食餌および水へ自由に接触させて１２時間の光：暗周期の下で収容した。逆行性標識化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）および６−ＯＨＤＡ病変を、ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ［ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４  ５９：４０１−４１５］に従って、病変の３週間前に実施した。簡単に言うと、エクイスセシン（ｅｑｕｉｔｈｅｓｉｎ）麻酔（０．３ｍｌ／１００ｇ）の下で、ラットに、逆行性追跡Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ＦＧ；Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）の２％溶液（０．９％  ＮａＣｌに溶解）０．２μｌを左右相称に注射した。注射を、２μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して以下の座標で、行った：ＡＰ＝＋０．５ｍｍ；ブレグマに関してＭＬ＝±３．４ｍｍ；硬膜に関してＤＶ＝−５．０ｍｍ、そして切歯バー（ｉｎｃｉｓｏｒ  ｂａｒ）を０．０ｍｍに設定した。さらに、針を引き抜く前に、もう５分間、０．０５μｌ／分で注射した。
【０３２０】
ＦＧ注射の１４日後、動物に、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ニューブラスチン
またはＧＤＮＦについての遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを、合計５デポジット（ｄｉｐｏｓｉｔ）（１μｌ／１デポジット）与えた。４つのデポジットを、以下の座標で２つの針管（ｎｅｅｄｌｅ  ｔｒａｃｔ）に沿って線条中に与えた：ＡＰ＝＋１．０ｍｍ，ＭＬ＝−２．６ｍｍ，ＤＶ１＝−５．０ｍｍ，ＤＶ２＝−４．５ｍｍおよびＡＰ＝０．０ｍｍ，ＭＬ＝−３．７ｍｍ，ＤＶ１＝−５．０ｍｍ，ＤＶ２＝−４．５ｍｍ。中枢神経デポジットを、ＡＰ＝−５．２ｍｍ，ＭＬ＝−２．０ｍｍ，ＤＶ１＝−６．３ｍｍで行った。歯バーを、−２．３ｍｍに設定した。
【０３２１】
逆行性標識化の２１日後、およびレンチウイルス注射の７日後、動物を、再麻酔し、そして１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、２０μｇの６−ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ；遊離塩基として計算し、そして０．０２％のアスコルビン酸を補充し３μｌの氷冷生理食塩水に溶かした）の単一デポジットを、ＦＧデポジットと同じ配置で、右の線条の中に注射した。針を引き抜く前に、１μｌ／分の注射速度で３分間おいた。
【０３２２】
（組織処理）
６−ＯＨＤＡ注射の２１日後、動物を、抱水クロラールを用いて深く麻酔し、生理食塩水（ｐＨ７．４；室温）を使用して、噴門を越えて（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）１分間灌流し、次いで、２００ｍｌの氷冷のホルムアルデヒド溶液（０．１Ｍ  リン酸緩衝液中４％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で灌流した。脳を切開し、そして同じ固定液中で３〜４時間固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）し、次いで、２５％ショ糖／０．１Ｍリン酸緩衝液に移し４８時間おいた。線条から黒質（ＳＮ）にかけての５連の４０μｍの切片を、凍結ミクロトームで切り出した。
【０３２３】
（ＳＮにおけるドパミン作用性ニューロンの定量的評価）
ＳＮ部コンパクタ（ＳＮ  ｐａｒｓ  ｃｏｍｐａｃｔａ）中のＦＧ標識の数を、以前に記載されたように［ＳａｕｅｒおよびＯｅｒｔｅｌ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４  ５９，４０１−４１５］、盲検観察者によって評価した。簡単に言うと、副視索（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｏｐｔｉｃ  ｔｒａｃｔ）の内側終止核（ｍｅｄｉａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ）（ＭＴＮ；ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎの図譜における−５．３（１９９７））の周囲のレベルに集中した３つの連続的なセクションを使用し、そしてＭＴＮに対して側面の全ての標識／染色されたニューロンを、４０倍の倍率で計数した（ｎ＝６〜７／群）。３３０ｎｍでの落射照明の下で明るい蛍光を示し、ニューロンプロフィールを表示し、そして少なくとも１つの神経突起が伸びた場合に、ＦＧ標識されたニューロンを含めた。
【０３２４】
ＧＦＰを保有するレンチウイルスの注入を受けている動物における病変側でのＦＧ陽性黒質ニューロンの数は、インタクトな側の数の１８％にまで減少した。反対に、レンチ−ニューブラスチンを注射された動物は、ＦＧ陽性黒質ニューロンの数についてほぼ完全な防御（８９％）を示した。これは、逆行的に標識されたニューロンの８７％が、病変側に留まったレンチ−ＧＤＮＦ処置された動物と、同様に有効であった。このことは、ニューブラスチンが、損傷した成体の黒質ドパミンニューロンに対する強力な生存因子であり、ＧＤＮＦと同程度に強力であることを示す。
【０３２５】
図６は、黒質ドパミンニューロンに対する、レンチウイルスが生成したニューブラスチンのインビボでの効果の説明である。雌性のＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＳＮ部コンパクタのニューロンを、６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）の右の線条での単回注射の３週間前に、Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ（ＦＧ）で、退行的に標識した。６−ＯＨＤＡ注射の１週間前に、動物は、図に示すように、ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）、ＧＤＮＦ（ＧＤＮＦ）またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを用いる注射を受けた。６−ＯＨＤＡ注射の２１日後、線条体
の両側のＦＧ標識されたニューロンの数を決定した。図は、３つの群の動物の線条体の病変側（右）対インタクトな側（左）におけるＦＧ標識されたニューロンの百分率（％ＦＧ病変／インタクト）を示す。
【０３２６】
（実施例１０：抗体の生成）
ニューブラスチンに対する抗体を調製するために、２匹のウサギを、キャリアタンパク質に結合体化したペプチド１：ＣＲＰＴＲＹＥＡＶＳＦＭＤＶＮＳＴ（配列番号９のアミノ酸１０８〜１２４）；またはペプチド２：ＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰＣ（配列番号９のアミノ酸９３〜１０７）のいずれかで、３週間の間隔で免疫した。それぞれのペプチドについて、２匹のウサギを、０週目、３週目、６週目および１０週目に免疫し、そして採血を７週目および１１週目に回収した。第２の採血を、ペプチド親和性カラムを用いて親和性精製した。この抗体を、ペプチドに従って、Ａｂ−１およびＡｂ−２と名付けた。
【０３２７】
（ウエスタンブロット）
ニューブラスチンについてのｃＤＮＡを用いて安定にトランスフェクトされた２×１０６のＨｉＢ５細胞（Ｈｉｂ５ｐＵｂｉ１ｚＮＢＮ２２）、またはトランスフェクトされていないＨｉＢ５細胞を、Ｎ２補充をした無血清培地（ＧＩＢＣＯ）中で一晩インキュベートした。この培地を、５ｋＤａのカットオフ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて小型濃縮機で濃縮した。濃縮したサンプルに、５×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を添加し、そして９５℃で５分間加熱した。サンプルを、１５％アクリルアミドゲル上で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そしてＰＶＤＦ−膜に移した。残りのタンパク質−結合部位を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂粉乳を用いてブロッキングした。膜を、ニューブラスチン抗体（１：１０００）と共に一晩インキュベートし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した抗ウサギＩｇＧ２次抗体または抗マウスＩｇＧ２次抗体（１：２０００）とともにインキュベートした。
【０３２８】
免疫染色を、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｌｕｓ（ＥＣＬ＋）を製造業者の説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って使用し、可視化した。これらの実験の結果を、図３および実施例５に示す。
【０３２９】
標準的な技術を使用して、本発明者らはまた、以下のペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を惹起した：
【０３３０】
【化２１】
2005198656.tif 000026
比較的Ｃ末端に近いペプチドＲ３０およびＲ３１のみが、ウエスタンブロットにおいて還元条件下で変性したタンパク質を認識した。
【０３３１】
（実施例１１：最後のカルボキシ末端の１０２アミノ酸を含む短縮型ラットニューブラスチンポリペプチドの生物学的活性）
ラットプレプロニューブラスチンのアミノ酸配列を、以下の配列番号３４に与える：
【０３３２】
【化２２】
2005198656.tif 000027
以下に記載される短縮型ニューブラスチンの各々を、対応する開始残基（上記の配列中の太字）として上で特定する。１１３アミノ酸のニューブラスチン形態（ＮＢＮ１１３）の開始もまた、標識する。
【０３３３】
ラットニューブラスチンの１０２カルボキシ末端アミノ酸を含むニューブラスチンの短縮形態の生物学的活性を、細胞中で試験した。配列番号３４のアミノ酸１１１〜２２４（ラットＮＢＮ１１３、上記にて下線を付した）を有するアミノ酸配列を有する、ラットニューブラスチンの１１３アミノ酸形態を、非特異的アミノペプチダーゼ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）で室温で２時間消化することにより、短縮型ニューブラスチンを生成した。この消化に続き、タンパク質からの任意の混入成分を分離するために、ニューブラスチンをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供した。短縮型ニューブラスチン（「ＮＢＮ１１３（Ｎ−１１）」と記載される）の分子量を、質量分析によって確認し、そして１０２アミノ酸ポリペプチド（ＮＢＮ１０２）の予測分子量である１０．９３１ｋＤａであると決定した。コントロールとして、ラットＮＢＮ１１３を、酵素緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）単独と並行して処理した。このコントロールにおいて、消化は観察されず、適切な１２．０４７ｋＤａポリペプチドが、同定された。
【０３３４】
ＮＢＮ１１３、酵素緩衝液で処理されたＮＢＮ１１３およびＮＢＮ１１３（Ｎ−１１）の生物学的活性を、細胞ＲＥＴ（ｃ−ＲＥＴ）活性アッセイにおいて比較した。ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞（マウスＧＦＲα３で安定にトランスフェクトされた接着性マウス神経芽腫細胞株であり、そしてこれはＲＥＴおよびＧＦＲα３を発現する）において、ニューブラスチン活性を、それがｃ−ＲＥＴリン酸化を刺激する能力によって決定した。ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞を、１ウェル当たり２×１０５細胞で、２４ウェルプレートに１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中でプレートし、１８時間３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。培地の除去および１ウェル当たり１ｍｌのＰＢＳでの細胞の洗浄に次いで、細胞を、ＮＢＮ１１３、酵素緩衝液で処理されたＮＢＮ１１３またはＮＢＮ１１３（Ｎ−１１）のいずれかを含むＤＭＥＭで、１０分間、３７℃、５％ＣＯ２にて刺激した。活性を停止するために、培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄し、直後に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．５％  ＮＰ４０、０．２％  ＤＯＣ、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１ｍＭ
Ｎａ３ＶＯ４および１ｍＭ  ＰＭＳＦを用いて溶解した。４℃での１時間のインキュベーションの後、溶解産物を、ピペッティングの反復により攪拌し、そして抗ＲＥＴ  ｍＡｂ（ＡＡ．ＧＥ７．３）で被覆された９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移した（１ウェル当たり０．２５ｍｌ）。このウェルを、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中に１％正常マウス血清および３％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ）で１時間、室温にてブロッキングし、次いでＴＢＳＴ（ＴＢＳＴ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）単独で６回洗浄した。
【０３３５】
リン酸化されたＲＥＴを、捕捉されたレセプターを４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＹ）（ＨＰＲ結合体化ホスホチロシン抗体）（１ウェル当たり０．２μｇ）と共にインキュベート（２時間）することによって検出した。インキュベーションに続き、このウェルを、ＴＢＳＴで６回洗浄し、そしてＨＰＲ活性を、比色定量アッセイにより４５０ｎｍにて検出した。溶解産物または溶解緩衝液単独で処理したウェル
の吸光度値を測定し、バックグラウンドを補正し、そしてデータを、活性化混合物中に存在するニューブラスチンの濃度の関数としてプロットした。この結果を、図１６に示す。溶解産物または溶解緩衝液で処理したウェルからの吸光度値を、測定し、そして、バックグラウンドを補正したシグナルを、ニューブラスチンの濃度の関数としてプロットした。
【０３３６】
これらの結果は、アミノ末端短縮形態（１０２アミノ酸）のニューブラスチンが細胞で生物学的活性を示すこと、すなわち、ＮＢＮ１１３形態のニューブラスチンと区別不可能であることを実証する。
【０３３７】
（実施例１２：ニューブラスチンの３つのアミノ末端短縮形態（９９アミノ酸、１０４アミノ酸および１０６アミノ酸）の生物学的活性）
細胞ＲＥＴ活性アッセイでの短縮型ニューブラスチンポリペプチド（９９アミノ酸および１０６アミノ酸）の活性を試験し、そしてこの結果を、図１７に示す。９９アミノ酸形態および１０６アミノ酸形態に加えて、比較のために他の２つのニューブラスチン分子を、このアッセイに含めた：ラットＮＢＮ１１３、（これは参照として役立つ）および、１１３アミノ酸ラットニューブラスチンムテイン（これは、ラットＮＢＮ１１３配列の位置１４でアルギニンが、リジン残基で置換されている（「ＮＢＮ  Ｒ１４Ｋ（Ｎ）」））。このムテインは、リジン特異的プロテアーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｌｙｓ  Ｃ；ＷＡＫＯ，ＶＡ）を使用してこの部位で切断される場合、１４個のアミノ末端残基を欠く９９アミノ酸形態（「ＮＢＮ  Ｒ１４Ｋ（Ｎ−１４）」）の産生を促進した。７つのアミノ末端残基を欠く１０６アミノ酸形態（「ＮＢＮ  １１３（Ｎ−７）」）を、トリプシン（Ｂｉｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用する部分的タンパク質分解によって、ラットＮＢＮ１１３から産生した。全ての短縮産物を、上記の実施例１１に示すに、よう質量分析によって特徴付けた。
【０３３８】
ＮＢＮ１１３、ＮＢＮ  Ｒ１４Ｋ（Ｎ）、ＮＢＮ  Ｒ１４Ｋ（Ｎ−１４）およびＮＢＮ１１３（Ｎ−７）の活性をそれぞれ、０．００５ｎＭ〜１００ｎＭ、０．０５ｎＭ〜１００ｎＭ、０．００６ｎＭ〜１１４ｎＭおよび０．０５ｎＭ〜１０７ｎＭの濃度で試験した。活性を、実施例１１に記載されるようにＡ４５０ｎｍでの吸光度として測定した。ニューブラスチン形態の各々は、試験した濃度の各々で、類似の活性を示した。これらの結果は、１４アミノ末端残基または７アミノ末端残基のいずれかを欠くラットＮＢＮ１１３の短縮型形態が、ＫＩＲＡ活性アッセイにおいてラットＮＢＮ１１３と同じくらい活性であることを実証する。
【０３３９】
図１８に示されるＫＩＲＡ活性アッセイを、１０４アミノ酸ニューブラスチン形態（「ＮＢＮ１０４（Ｎ−９）」）の生物学的活性を決定するために実施した。野生型ラットＮＢＮ１１３分子において存在する９つのアミノ末端残基を欠くこのポリペプチドを、ラットＮＢＮ１１３を発現するＣＨＯをトリプシンで処理することによって生成した。前に述べたように、この分子量を、質量分析によって確認した。２つのポリペプチド（ＮＢＮ１０４（Ｎ−９）およびＮＢＮ１１３）の活性を、０．０５ｎＭ〜１１５ｎＭの濃度にて試験した。活性を、実施例１１に記載されるようにＡ４５０ｎｍでの吸光度として測定した。Ｎ−９形態の活性は、少なくともラットＮＢＮ１１３の活性と同じくらい高かった。これらの結果は、ラットＮＢＮ１１３ポリペプチドの９つのアミノ末端アミノ酸を欠く短縮型形態（１０４アミノ酸）が、ＫＩＲＡ  ＥＬＩＳＡ活性化アッセイにおいて、少なくともラットＮＢＮ１１３と同じくらい活性であることを実証する。
【０３４０】
表５は、本発明の開示されたプレプロニューブラスチンポリペプチド配列間の関係を図示する。１行目は、配列番号２のポリペプチドを示し、２行目は、配列番号４のポリペプチドを示し、そして３行目は、配列番号９のポリペプチドを示す。７つの保存されたシステイン残基を、成熟したダイマー化ニューブラスチンリガンドにおいて形成される分子内
（＊と＊、＃と＃および＋と＋）ジスルフィド架橋ならびに分子間（「｜」）ジスルフィド架橋を示すために記号（「＊」、「＃」、「＋」および「｜」）で表す。短縮型ニューブラスチンポリペプチドの各々のアミノ末端を、ＮＢＮ１１２からＮＢＮ９９について、それぞれ「ｏ」と示す。
【０３４１】
【表５】
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（等価物）
前述の本発明の特定の実施形態の詳細な説明から、核酸、ポリペプチド、抗体、検出および処理に関する特定の新規の組成物および方法が記載されていることが、理解されるべきである。これらの特定の実施形態は、本明細書中において詳細に開示されてきたが、これは、例示のみの目的のための例として、そして上記に添付される特許請求の範囲に関して制限することを意図しない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとっては慣用として行われ得ることが、本発明者らによって企図される。実際に、本明細書中に記載されたことに加えて、以下の記載および添付の図面から、本発明の種々の改変は、当業者にはとっては明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０３４２】
【化２３】
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【図面の簡単な説明】
【０３４３】
【図１】図１は、種々のヒト成体組織型（パネルＡ）および成体ヒト脳の種々の領域（パネルＢ）におけるニューブラスチン遺伝子の発現の相対レベルを比較する、３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブした２つのノーザンブロットの写真の図である。
【図２】図２は、非トランスフェクト細胞株ＨｉＢ５において発現されたニューブラスチンｃＤＮＡの量と、ニューブラスチンｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞株において発現されたニューブラスチンｃＤＮＡの量と、そしてＧＤＮＦ−ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞株において発現されたニューブラスチンｃＤＮＡの量とを比較する、３２Ｐ標識ニューブラスチンｃＤＮＡでプローブしたノーザンブロットの写真の図である。
【図３】図３は、ニューブラスチンタンパク質が、非トランスフェクトＨｉＢ５細胞（レーン１）において発現される程度を、ニューブラスチンｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨｉＢ５細胞株（レーン２）に対して比較する、２つのウェスタンブロット（ニューブラスチン特異的抗体Ａｂ−２（左のブロット；パネルＡ）またはニューブラスチン特異的抗体Ａｂ−１（右のブロット；パネルＢ）のいずれかでプローブされた）の写真の図である。
【図４】図４は、無血清培地中での、培養ラット胚ドパミン作用性腹側中脳ニューロンの生存およびコリン作用性頭蓋神経運動ニューロンにおけるＣｈＡＴ活性に対するニューブラスチンの効果のグラフによる図示である。特に、図４Ａは、ＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）での組換えＧＤＮＦについての用量応答曲線の図示である。図４Ｂは、ニューブラスチン産生細胞またはＧＤＮＦ産生細胞のいずれか由来の希釈した馴化培地を用いたＣｈＡＴ活性（ｄｐｍ／時間）の図示である。図４Ｃは、１ウェルあたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞の数の図示である。
【図５Ａ】図５は、ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（コントロール）のいずれかと共存培養したブタ胚性ドパミン作用性腹側中脳ニューロンのスライス培養物の機能および生存に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果の図示である。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、ＤＩＶ１２（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−１２日目）およびＤＩＶ２１（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−２１日目）に培地中に放出されたドパミンを例示する。図５Ｃは、ＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞（１培養あたりＴＨ−ｉｒ細胞）の数の図示である。
【図５Ｂ】図５は、ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（コントロール）のいずれかと共存培養したブタ胚性ドパミン作用性腹側中脳ニューロンのスライス培養物の機能および生存に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果の図示である。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、ＤＩＶ１２（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−１２日目）およびＤＩＶ２１（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−２１日目）に培地中に放出されたドパミンを例示する。図５Ｃは、ＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞（１培養あたりＴＨ−ｉｒ細胞）の数の図示である。
【図５Ｃ】図５は、ＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞（ニューブラスチン）またはＨｉＢ５細胞（コントロール）のいずれかと共存培養したブタ胚性ドパミン作用性腹側中脳ニューロンのスライス培養物の機能および生存に対するＨｉＢ５ｐＵｂｉｌｚＮＢＮ２２細胞から分泌されたニューブラスチンの効果の図示である。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、ＤＩＶ１２（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−１２日目）およびＤＩＶ２１（ドパミン（ｐｍｏｌ／ｍｌ）−２１日目）に培地中に放出されたドパミンを例示する。図５Ｃは、ＤＩＶ２１での１培養あたりのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性細胞（１培養あたりＴＨ−ｉｒ細胞）の数の図示である。
【図６】図６は、黒質ドパミンニューロンに対するレンチウイルス産生性ニューブラスチンのインビボ効果の図示である。
【図７】図７は、ニューブラスチン遺伝子（全長ニューブラスチン遺伝子を同定するために用いられ得る核酸プライマーを含む）のゲノム構造、およびゲノムニューブラスチンコード配列（すなわち、遺伝子）に関するそれらの空間的配置の模式図である。
【図８】図８は、ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズするが、他の既知のＧＤＮＦファミリーメンバー（すなわち、ＧＤＮＦ、パーセフィンおよびニュールツリン）をコードする核酸にハイブリダイズしない、ヒトニューブラスチンポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定するために用いられたニューブラスチン特異的プライマーの図示である。
【図９】図９は、本発明で開示したポリペプチドの、異なる発生段階由来の解離したラット後根神経節細胞の培養物に対する神経栄養活性を、既知の神経栄養因子（０コントロール実験（因子の不存在下）；１  ＧＤＮＦの存在下；２  ニュールツリンの存在下；３  本発明のニューブラスチンの存在下；Ｅ１２  胚１２日目；Ｅ１６  胚１６日目；Ｐ０  出生日；Ｐ７  生後７日目；およびＰ１５  生後１５日目）を用いて得られた神経栄養活性と比較して例示する。
【図１０】図１０は、ＣＨＯ細胞からのニューブラスチンの生成を図示する。
【図１１】図１１は、ＧＦＲα−１レセプターおよびＧＦＲα−３レセプターに対するニューブラスチンおよびＧＤＮＦの結合の比較を図示する。
【図１２】図１２は、ニューブラスチンに対するＲ３０抗ペプチド抗体およびＲ３１抗ペプチド抗体の結合を表すウエスタンブロットの画像である。
【図１３】図１３は、ＲＥＴＬ３−Ｉｇに対する親和性結合によるニューブラスチンの抽出を示すゲルの写真である。
【図１４】図１４は、ニューブラスチンの合成遺伝子の配列を含む、ｐＥＴ１９ｂ−ニューブラスチンのプラスミドマップである。
【図１５】図１５は、Ｈｉｓニューブラスチンの合成遺伝子の配列を含む、ｐＭＪＢ１６４−Ｈｉｓニューブラスチンのプラスミドマップである。
【図１６】図１６は、細胞内ＲＥＴ活性アッセイにおける、切断されたニューブラスチン（ＮＢＮ）の１０２アミノ酸形態とニューブラスチンの１１３アミノ酸形態との比較を図示する。
【図１７】図１７は、細胞内ＲＥＴ活性アッセイにおける、種々のニューブラスチン形態とニューブラスチンムテインとの比較を図示する。
【図１８】図１８は、細胞内ＫＩＲＡ  ＥＬＩＳＡアッセイにおけるニューブラスチンの成熟形態（１１３ａａ）および切断された形態（１０６ａａ、１０４ａａまたは９９ａａ）あるいはニューブラスチンＲ１４Ｋムテインの比較を図示する。  （配列表）
【数１】
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【数２】
2005198656.tif 000034
【数３】
2005198656.tif 000035
【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
2005198656.tif 000039
【数８】
2005198656.tif 000040
【数９】
2005198656.tif 000041
【数１０】
2005198656.tif 000042
【数１１】
2005198656.tif 000043
【数１２】
2005198656.tif 000044
【数１３】
2005198656.tif 000045
【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
2005198656.tif 000049
【数１８】
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【数１９】
2005198656.tif 000051
【数２０】
2005198656.tif 000052
【数２１】
2005198656.tif 000053
【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
2005198656.tif 000056
【数２５】
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【数２６】
2005198656.tif 000058
【数２７】
2005198656.tif 000059
【数２８】
2005198656.tif 000060
【数２９】
2005198656.tif 000061
【数３０】
2005198656.tif 000062
【図１】
2005198656.tif 000063
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2005198656.tif 000067
【図５Ｂ】
2005198656.tif 000068
【図５Ｃ】
2005198656.tif 000069
【図６】
2005198656.tif 000070
【図７】
2005198656.tif 000071
【図８】
2005198656.tif 000072
【図９】
2005198656.tif 000073
【図１０】
2005198656.tif 000074
【図１１】
2005198656.tif 000075
【図１２】
2005198656.tif 000076
【図１３】
2005198656.tif 000077
【図１４】
2005198656.tif 000078
【図１５】
2005198656.tif 000079
【図１６】
2005198656.tif 000080
【図１７】
2005198656.tif 000081
【図１８】
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