(57)【要約】【課題】昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の生産を効率よく大量に且つ安価に実施できる方法の提供。【解決手段】昆虫細胞を浮遊培養する培養槽内に組換えウイルス感染開始時から一定期間酸素を間歇的に供給すること、あるいは酸素の間歇的供給に加えてウイルス感染開始時から酸素供給が完了するまでの期間の培養を約２９℃から約３１℃で行いその後約２５℃から約２８℃で培養することを特徴とする、組換えウイルス感染昆虫細胞の培養方法、該培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞の組換えタンパク質発現効率の促進方法および昆虫細胞による組換えタンパク質生産方法、並びに該培養方法に用いるガス自動供給装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた昆虫細胞を、容量５０ｍｌ〜６０００ｍｌの培養槽内で該容量の１０％〜５０％の培養容量にて浮遊培養し、感染期間中、該培養槽内に間歇的に酸素を供給することを特徴とする、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法。
【請求項２】
感染期間が、組換えウイルスの感染開始直後から４８時間後までの期間である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
間歇的に酸素を供給することが、組換えウイルスの感染開始１時間後から６時間後までに１回および感染開始１２時間後から３６時間後までに１回、酸素を供給することである請求項２に記載の培養方法。
【請求項４】
酸素を供給することが、供給１回あたり、培養槽気相部分全体容量の酸素を供給することである請求項３に記載の培養方法。
【請求項５】
酸素を供給することが、自動的に酸素を供給することである請求項１に記載の培養方法。
【請求項６】
ウイルス感染開始直後から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間の培養を２９℃ないし３１℃で行い、該期間が完了した後の培養を２５℃から２８℃で行うことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項７】
ウイルス感染開始直後から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間が、ウイルス感染開始直後から３６時間後までの期間である請求項６に記載の培養方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞の組換え蛋白質発現効率の促進方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載の培養方法を用いることを特徴とする組換え蛋白質の生産方法。
【請求項１０】
ガスの吸入口と、ガスの排出口と、該吸入口と該排出口とを接続するガス流路と、ガス流路を開閉する電磁弁とを具備するガス供給装置であって、所望の時間に所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムにより制御されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の培養方法に使用するガス供給装置。
【請求項１１】
所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムが、ガスが供給される容器中の培養容量に依存して所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムである請求項１０に記載のガス供給装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えウイルス感染昆虫細胞の培養方法および該培養方法に用いるガス自動供給装置に関する。より詳しくは、組換えウイルス感染昆虫細胞の培養において間歇的に酸素を供給することを特徴とする培養方法および該培養方法に用いる酸素ガス自動供給装置に関する。また、該培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞の組換えタンパク質発現効率の促進方法に関する。さらに、該培養方法を用いることを特徴とする組換え蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やペプチドの製造に用いられる遺伝子工学的手法の１つとして昆虫細胞発現系が知られている。昆虫細胞発現系では、発現ベクターとして組換えウイルスを用いることが多く、バキュロウイルスが汎用されている。昆虫細胞発現系においては、バキュロウイルスがもつ強力なプロモーター活性により宿主細胞すなわち昆虫細胞内で外来遺伝子が効率よく発現されるため、大量に組換えタンパク質を生産することが可能である。さらに、該発現系は真核細胞発現系であるため、微生物発現系とは異なり、通常、シグナルペプチドの切断、糖鎖付加、リン酸化、アミド化、ミリストイル化などの翻訳後修飾も生じるため、可溶性で天然型とほぼ同等の生物活性を有するタンパク質が容易に得られる。また、使用する組換えウイルスは安定で、再現性のあるタンパク質生産を行うことができる。
【０００３】
一方、昆虫細胞発現系には、大量系での昆虫細胞へのバキュロウイルス感染の進行の結果、該細胞のタンパク質合成処理能力が低下するという問題点がある。そのため、昆虫細胞発現系で効率よく組換えタンパク質を発現させる培養系としては、静置培養系が浮遊培養系より適していると考えられている。しかし静置培養系は大量培養への規模拡大が困難であり、それを行なうためには、培養器の数を増やすしかなく、煩雑な手間と労力を要する問題点がある。他方、浮遊培養系は大量培養への規模拡大は容易であるが発現効率が静置培養系より低いという問題がある。この解決法として、バイオリアクターという高価な装置を使用することによって解決することができるが、該装置および昆虫細胞用培地の値段が他の発現系で使用される培地より高価なため、昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の製造は経費が高いという欠点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、昆虫細胞発現系を用いて活性のある組換えタンパク質の生産を効率よく且つ安価に行うことのできる方法を提供することである。本発明の課題は、さらに、静置培養での数十ｍｌスケールの生産系と一般のバイオリアクターでの数千ｍｌスケールでの生産系の間のスケールでの生産効率を促進し、安価に行なうことのできる生産方法を提供することを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
昆虫細胞発現系では、昆虫細胞の培養を静置培養系で行う方が浮遊培養系と比較して組換えタンパク質の発現が高いことが多い。本発明者は、その原因の一つとして、培地中の溶存酸素量に着目した。
【０００６】
組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞発現系においては、昆虫細胞の組換えウィルス感染時に培地中の酸素が急激に消費されるため溶存酸素量が著しく低減する。その結果、細胞の代謝に必要な酸素量が欠乏し、その結果、細胞のタンパク質合成処理能力が低下するため、タンパク質の発現が抑制されると考えられる。小規模または中規模の浮遊培養系では、該発現系に必要な酸素の獲得を気相からしか行うことができないため、培養規模により酸素の絶対量が決定する。そのため、高濃度のタンパク質発現を望むことができない。この問題を解決するために従来感染後の空気を常時加える方法がある。しかし、このような方法では、乾燥ガスの通過により液体培養培地が蒸発して培地中の無機塩濃度の変化が生じるため、細胞にダメージが加わり、発現処理能力が低下する可能性が考えられる。そこで、昆虫細胞を浮遊培養する培養槽内に組換えウイルス感染開始時から一定の期間酸素を間歇的に供給したところ、従来と比較して組換えタンパク質の発現が高くなることを見出した。本発明では間歇的に酸素の供給を行なうため、乾燥による無機塩濃度の変化を無視できる利点が生じる。さらに、間歇的な酸素の供給に加え、昆虫細胞に組換えウイルスを感染させた後の一定期間の培養温度を約３０℃に上げることにより、発現効率が一層高くなることを見出した。本発明は、これら知見により達成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、
１．所望のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えウイルスを感染させた昆虫細胞を、容量５０ｍｌ〜６０００ｍｌの培養槽内で該容量の１０％〜５０％の培養容量にて浮遊培養し、感染期間中、該培養槽内に間歇的に酸素を供給することを特徴とする、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法、
２．感染期間が、組換えウイルスの感染開始直後から４８時間後までの期間である前記１．の培養方法、
３．間歇的に酸素を供給することが、組換えウイルスの感染開始１時間後から６時間後までに１回および感染開始１２時間後から３６時間後までに１回、酸素を供給することである前記２．の培養方法、
４．酸素を供給することが、供給１回あたり、培養槽気相部分全体容量の酸素を供給することである前記３．の培養方法、
５．酸素を供給することが、自動的に酸素を供給することである前記１．の培養方法、
６．ウイルス感染開始直後から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間の培養を２９℃ないし３１℃で行い、該期間が完了した後の培養を２５℃から２８℃で行うことを特徴とする前記１．から５．のいずれかの培養方法、
７．ウイルス感染開始直後から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間が、ウイルス感染開始直後から３６時間後までの期間である前記６．の培養方法、
８．前記１．から７．のいずれかの培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞の組換え蛋白質発現効率の促進方法、
９．前記１．から７．のいずれかの培養方法を用いることを特徴とする組換え蛋白質の生産方法、
１０．ガスの吸入口と、ガスの排出口と、該吸入口と該排出口とを接続するガス流路と、ガス流路を開閉する電磁弁とを具備するガス供給装置であって、所望の時間に所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムにより制御されることを特徴とする、前記１．から７．のいずれかの培養方法に使用するガス供給装置、
１１．所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムが、ガスが供給される容器中の培養容量に依存して所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムである前記１０．のガス供給装置、
からなる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、組換えウイルス、例えば組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞による組換えタンパク質の発現効率を促進することができる。特に、従来、昆虫細胞による組換えタンパク質の高発現が得られなかった浮遊培養系において、昆虫細胞による組換えタンパク質の発現効率を促進することができる。そのため、生物活性を有する組換えタンパク質を大量かつ安価に生産することができる。例えば、数十ｍｌスケールから数千ｍｌスケールの間のスケールの浮遊培養系での昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の生産を効率よく安価に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の生産においては一般的に、所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込んだウイルス（以下、組換えウイルスと称する）を昆虫細胞に感染させた後、昆虫細胞を慣用の培地で所望の期間培養することにより、組換えタンパク質を得ることができる。
【００１０】
本発明の一態様は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えウイルスの昆虫細胞への感染および感染させた昆虫細胞の培養を、小規模または中規模の培養槽内の培養培地中で行い、感染期間中、該培養槽内に間歇的に酸素を供給することを特徴とする、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法に関する。
【００１１】
本発明に係る昆虫細胞の培養方法は、培養を液体培養培地を用いる浮遊培養系で行う。培養培地は、昆虫細胞発現系において一般的に使用されるものであればいずれの培養培地であってもよい。好ましくは無血清培地を用いることが、組換えタンパク質の精製などの観点から推奨される。
【００１２】
昆虫細胞への組換えウイルス感染は昆虫細胞の培養系に組換えウイルスを添加することにより行われる。以下、「組換えウイルス感染開始時」とは、昆虫細胞の培養系に組換えウイルスを添加して、昆虫細胞に組換えウイルスを接触させた時点を意味する。
【００１３】
小規模または中規模の培養槽とは具体的に、容量が好ましくは５０ｍｌないし６０００ｍｌ、好ましくは２５０ｍｌないし３０００ｍｌの培養槽を意味する。培養槽は、細胞の培養に通常使用する容器であればいずれも利用可能である。具体的にはガラス製のフラスコなどが挙げられる。
【００１４】
培養容量は、培養槽の容量の約１０％〜約５０％、より好ましくは約１０％〜約４０％、さらに好ましくは約１０％〜約３０％程度が適当である。培養容量が上記容量より少ないと、培養し得る細胞量が少なくなるため、組換えタンパク質の生産量が低下する。また、液体培養培地の量が上記容量より多いと、培養槽中の気相部分が少なくなるため、気相から液体培養培地中への酸素の供給を充分に行うことができない。したがって、上記例示した培養容量が適当である。培養容量は、具体的には、培養槽が５０ｍｌであるとき、約１０ｍｌ〜約１５ｍｌ、より好ましくは１０ｍｌ程度が適当である。培養槽が１００ｍｌであるときは、約４０ｍｌ〜約５０ｍｌ、より好ましくは４０ｍｌ程度が適当である。培養槽が２５０ｍｌであるときは、約９０ｍｌ〜約１１０ｍｌ、より好ましくは１００ｍｌ程度が適当である。培養槽が５００ｍｌであるときは、約１５０ｍｌ〜約２００ｍｌ、より好ましくは２００ｍｌ程度が適当である。培養槽が１０００ｍｌであるときは、約３００ｍｌ〜約４００ｍｌ、より好ましくは３００ｍｌ程度が適当である。培養槽が３０００ｍｌであるときは、約４００ｍｌ〜約６００ｍｌ、より好ましくは５００ｍｌ程度が適当である。培養槽が６０００ｍｌであるときは、約８００ｍｌ〜約１０００ｍｌ、より好ましくは１０００ｍｌ程度が適当である。
【００１５】
「間歇的に酸素を供給する」とは、酸素を供給する期間と次に酸素を供給する期間との間に、酸素を供給しない期間が存在するように、数回にわたって酸素を供給することを意味する。好ましくは所定の時機に酸素を供給することが推奨される。
【００１６】
培養期間中の間歇的な酸素の供給は、組換えウィルス感染時に昆虫細胞により著しく消費される液体培養培地中の溶存酸素量の補給により、細胞のタンパク質合成処理能力の低下を防止することを目的として行うため、かかる目的が達成できる範囲である限り、酸素供給の期間、回数および量は、特に制限されない。
【００１７】
培養槽内への酸素の供給は、気相部分に供給することが好ましい。酸素を培養培地中に直接供給すると細胞にダメージが与えられるため、組換えタンパク質発現処理能力が低下する可能性がある。
【００１８】
酸素の供給期間は、昆虫細胞への組換えウイルス感染期間であることが好ましい。より好ましくは、昆虫細胞への組換えウイルス感染開始時から約４８時間後まで、さらに好ましくは感染開始１時間後から約３６時間後までの期間が適当である。
【００１９】
酸素の供給回数は、上記期間中に好ましくは１回から１０回、より好ましくは１回から５回、さらに好ましくは２回である。
【００２０】
特に好ましくは、昆虫細胞への組換えウイルス感染開始約１時間後から約６時間後までに１回および感染開始約１２時間後から約３６時間後までに１回の２回酸素供給を行うことが推奨される。さらにより好ましくは、組換えウイルス感染開始約２時間後に１回および感染開始約２４時間後に１回の２回酸素供給を行うことが望ましい。
【００２１】
酸素の供給量は、１回の供給あたり培養槽気相部分全体容量を加えることが推奨される。具体的な供給量は、用いる培養槽の容量および培養容量から決定できる。例えば、培養槽容量２５０ｍｌに対して培養容量が約１００ｍｌの系で培養槽気相部分全体容量は、１回あたり約１５０ｍｌであり、この容量の酸素供給は酸素を０．１ＭＰａで５〜１０秒間、培養槽内に供給することにより達成できる。また、培養槽容量３０００ｍｌに対して培養容量が約４００〜約５００ｍｌの系で培養槽気相部分全体容量は、１回あたり約２５００〜２６００ｍｌであり、この容量の酸素供給は酸素を０．１ＭＰａで１５〜２０秒間、培養槽内に供給することにより達成できる。酸素を培養槽内に供給している時間は、酸素の供給量により異なるが、供給する酸素圧と供給量とから決定可能である。
【００２２】
酸素の供給は、酸素ガス自体の供給により行うことができ、また酸素を高濃度含む混合ガスの供給によっても行うことができる。混合ガスに含まれる酸素以外のガスは、昆虫細胞の培養および組換えタンパク質の発現に負の作用を及ぼすことがない限り、特に制限されない。かかる酸素供給源と培養槽とを例えば酸素供給用チューブにより接続し、該チューブを介して手動により酸素の供給を行うことができる。あるいは、例えば酸素ガス自動供給装置を用いて自動的に供給することが可能である。手動による供給であっても自動供給であっても、当然、酸素の供給は滅菌フィルター等を利用して無菌的に行う。以下、本明細書において酸素ガスとは、酸素のみを含むガス、および酸素を高濃度含む混合ガスのいずれをも包含する。
【００２３】
このような間歇的な酸素の供給を行いつつ、昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の発現を浮遊培養系で実施したとき、組換えタンパク質の発現は著しく高くなった（実施例１および２を参照。）。一方、空気の供給を培養期間中常時行った場合、組換えタンパク質の発現は低レベルであった。これらから、酸素の供給を間歇的に行うことが本発明の重要な特徴の１つであると考える。酸素の間歇的な供給により、組換えウイルス感染時に昆虫細胞により著しく消費される液体培養培地中の溶存酸素を補給することが可能であり、そのため細胞のタンパク質合成処理能力の低下が防止でき、組換えタンパク質の発現を効率よく行うことができる。
【００２４】
本発明の別の一態様は、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養において、上記のように培養槽内に間歇的に酸素を供給することに加え、組換えウイルス感染開始時から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間の培養を、昆虫細胞発現系で一般に用いられている培養温度より高い温度で行い、該期間が完了した後の培養を昆虫細胞発現系で一般的に用いられている培養温度で行なうことを特徴とする、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法に関する。
【００２５】
一般に昆虫細胞の培養は約２３℃から約２８℃で行なわれる。昆虫細胞は呼吸活性が高く、培養培地中の溶存酸素量が容易に低下するため、酸素供給が不十分な条件下では細胞のタンパク質合成処理能力が低下し、組換えタンパク質の発現が低減する。そのため、酸素供給が不十分な条件下での昆虫細胞発現系においては、昆虫細胞呼吸活性を低く保つことができる低温での培養が組換えタンパク質発現に好ましいと考えられている。
【００２６】
しかし、本発明によれば間歇的な酸素供給により培養培地中の溶存酸素量の維持が可能であるため、組換えウイルス感染開始時から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間における培養温度を、昆虫細胞発現系で一般に用いられている培養温度より一時的に高くすることができる。温度を高くすることにより、細胞活性を高く保つことができ、さらに培地中に十分量の溶存酸素を速やかに増加させることができるため、昆虫細胞による組換えタンパク質の発現効率を一層促進することが可能である。
【００２７】
組換えウイルス感染開始時から間歇的な酸素の供給が完了するまでの期間における好ましい培養温度は、例えば約２９℃から約３１℃、より好ましくは約３０℃である。例示した温度以上では、細胞にダメージが与えられることにより細胞のタンパク質合成処理能力が低下し、その結果、組換えタンパク質の発現が低減する。したがって、例示した温度が適当である。
【００２８】
より具体的には、例えば、間歇的な酸素の供給を組換えウイルス感染開始時からその約４８時間後まで行う場合は、感染開始２４時間後までの培養温度を好ましくは約２９℃から約３１℃、より好ましくは約３０℃に設定し、その後培養温度を昆虫細胞発現系で一般に用いられている培養温度に戻して培養を行う。また、例えば、間歇的な酸素の供給を組換えウイルス感染開始約１時間後から３時間後および１２時間後から３６時間後に各１回行う場合、組換えウイルス感染開始時からその約２４時間後まで、培養温度を上記温度に設定する。
【００２９】
昆虫細胞発現系で一般に用いられている培養温度は、好ましくは約２３℃から約２８℃、より好ましくは約２５℃から約２８℃、さらに好ましくは約２６℃から約２８℃、さらにより好ましくは約２７℃であることが推奨される。
【００３０】
組換えウイルス感染開始時から一定期間の昆虫細胞の培養温度を、昆虫細胞発現系で一般に用いられている培養温度より一時的に高くする方法と、間歇的に酸素を供給する方法とを組合わせることを特徴とする組換えウイルス感染昆虫細胞の培養方法は、間歇的に酸素を供給する方法のみを用いて該細胞を培養する方法と比較して、さらに組換えタンパク質の発現効率が促進されるため、有用性が一層高いと考えられる。
【００３１】
本発明において使用できる宿主細胞は、昆虫細胞、例えば鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫細胞である。具体的には例えば、ヨトウムシ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞（例えばＳｆ９、Ｓｆ２１またはこれらの改変体）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来細胞（例えばＴｎ５またはその改変体）、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来細胞、オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）由来細胞、タバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ）由来細胞などを挙げることができる。本発明において使用できる昆虫細胞はこれらの例に限定されず、昆虫細胞発現系において一般に使用されるものであればいずれの昆虫細胞であってもよい。
【００３２】
昆虫細胞の形質転換に用いるウイルスとしては、昆虫細胞ウイルスが挙げられ、例えばバキュロウイルスが好ましく用いられる。バキュロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  Ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＮＰＶ、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ  ＮＰＶまたはそれらの改変体などが例示できる。本発明において使用できるウイルスはこれらの例に限定されず、昆虫細胞発現系において一般的に使用されるものであればいずれのウイルスであってもよい。
【００３３】
ウイルスに所望のタンパク質をコードする遺伝子を組込む方法は、よく知られた一般的な遺伝子工学的手法を用いることができる。
【００３４】
本発明の範囲には、本発明に係る組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞の組換えタンパク質発現効率の促進方法が包含される。本明細書において「昆虫細胞の組換えタンパク質発現効率の促進」とは、組換えウイルスを感染させた昆虫細胞のタンパク質合成処理能力を促進させ、一定量の培養培地、例えば１ｍｌの培養培地中の組換えタンパク質の産生量を増加させることを意味する。
【００３５】
本発明の範囲にはまた、本発明に係る組換えウイルスを感染させた昆虫細胞の培養方法を用いることを特徴とする、昆虫細胞による組換えタンパク質生産方法が包含される。
【００３６】
本発明は、さらに、本発明に係る昆虫細胞の培養方法に用い得る酸素ガス自動供給装置に関する。本装置は、ガス吸入口と、ガス排出口と、該吸入口と該排出口とを接続するガス流路と、ガス流路を開閉する電磁弁とを具備するガス供給装置であって、所望の時間に所望の期間該電磁弁を動作させるプログラムにより制御されることを特徴とする。好ましくは、所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムが、ガスが供給される容器中の培養容量に依存して所望の期間該電磁弁を開放させるプログラムであることが望ましい。
【００３７】
本発明に係る酸素ガス自動供給装置を図１４に示した構成図により説明する。本装置（１）は、ガス吸入口（１１）と、ガス排出口（１２）と、ガス流路（ａ）と、電磁弁（１３）と、電磁弁作動制御手段（２）から主として構成されている。図１４に例示した構成図で示される装置は、その他、ガスの流量を測定する流量計（１４）を備える。
【００３８】
ガス吸入口（１１）は、装置の側面部に開口して取り付けられており、装置外部に設置されたガスボンベとガスラインを介して接続される。ガス排出口（１２）は、装置の側面部に開口して取り付けられており、装置外部に設置されたガスが供給される容器にガスラインを介して接続される。ガス流路（ａ）はガス吸入口（１１）とガス排出口（１２）とを接続するように設置され、電磁弁（１３）はガス流路（ａ）の所定の位置に設置されている。流量計（１４）は所望により、ガス流路（ａ）の所定の位置に設置される。
【００３９】
電磁弁作動制御手段（２）は電磁弁（１３）に電気接続され、予め設定された所定時間に切換え作動信号を出力するシーケンサー（２１）と、時間を計測するタイマー（２２）と、ガスが供給される容器の培養容量の情報をシーケンサーに送る切換えスイッチ（２３）とから主に構成される。シーケンサー（２１）は、タイマー（２２）により計測された時間が所定の時間に達したときに、切換えスイッチ（２３）から送られた情報に基づいて所定の期間だけ、電磁弁（１３）を開状態に保持しその期間が経過した後に再び閉状態を保持するように作動させるプログラムを担持している。
【００４０】
以上のように構成されたガス自動供給装置の作動を説明する。まず、該装置に取り付けられたスタートスイッチ（２４）に加えられた入力信号により、タイマー（２２）が始動する。タイマー（２２）が予め設定した時間に達したときに、シーケンサー（２１）からの作動信号に基づいて電磁弁（１３）が開状態になる。その後、シーケンサー（２１）は、切換えスイッチ（２３）から送られた情報に基づいて予め設定された期間経過後に、電磁弁（１３）に作動信号を送る。該作動信号により、電磁弁（１３）が閉状態に切換えられる。最初の作動信号により開状態になってから、次の作動信号により閉状態に切換えられるまでの期間、電磁弁（１３）は開状態を保持する。電磁弁（１３）の開閉動作は、所望により、１回に設定することができるし、２回以上に設定することも可能である。
【００４１】
具体的には、本発明に係るガス自動供給装置を、本培養方法に用いる場合、ガスは酸素ガスを用いることが好ましい。本培養方法において本装置を用いる場合、本装置のガス排出口（１２）に接続したガスラインと培養槽との間には滅菌フィルター等を設置し、培養槽内に供給される酸素ガスを無菌的に保つことが重要である。本培養方法において本装置を用いる場合、本装置を制御するプログラムは、タイマー（２２）が昆虫細胞の組換えウイルス感染開始時から４８時間後まで、好ましくは感染開始１時間後から３６時間後までの間の所定の時間に達したときに、シーケンサー（２１）からの作動信号に基づいて電磁弁（１３）が開状態になるように設定されていることが望ましい。より好ましくは、タイマー（２２）が感染開始１時間後から６時間後までの間の所定の時間、および感染開始１２時間後から２４時間後までの間の所定の時間に達したときに、シーケンサー（２１）からの作動信号に基づいて電磁弁（１３）が開状態になるように設定されていることが望ましい。さらに好ましくは、タイマー（２２）が感染開始２時間後および感染開始２４時間後に達したときに、シーケンサー（２１）からの作動信号に基づいて磁弁（１３）が開状態になるように設定されていることが適当である。またさらに、本装置を制御するプログラムは、培養槽内の培養容量が例えば１００ｍｌのときに、電磁弁（１３）の開状態を５〜１０秒間保持してその後電磁弁（１３）を閉状態に切換え、該容量が例えば５００ｍｌのときに、電磁弁（１３）の開状態をを１５〜２０秒間保持してその後電磁弁（１３）を閉状態に切換えるように設定されていることが好ましい。
【００４２】
本装置は、酸素ガス以外の、窒素ガスや炭酸ガスなどの供給にも適用できる。
【００４３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
本実施例においては、下記材料を用いて組換えブタインターロイキン−２（ブタＩＬ−２）を発現させた。
宿主細胞：昆虫細胞Ｓｆ２１ＡＥ
培養培地：Ｓｆ９００ＩＩ  ＳＦＭ（インビトロジェン社製）
組換えバキュロウイルス：組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス（動物衛生研究所供与）                        （ウイルス濃度２．４×１０７ＰＦＵ／ｍｌ）
【００４５】
組換えブタＩＬ−２の発現は下記のような種々の条件下で行った。発現の確認は、トリシンドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｔｒｉｃｉｎｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により発現タンパク質を分離し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色することにより行った。また、発現量は「ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ」ソフトにより解析した。
【００４６】
条件１：静置培養
７５ｃｍ２ＴＣ−フラスコ（住友ベークライト社製）に１×１０７個の細胞を入れ、室温で１０分間静置して細胞をフラスコに付着させた。細胞の付着を確認後、培地上清を除去して新鮮培地１０ｍｌを加えた（培養培地量１０ｍｌ）。その後、組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス溶液を感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）＝０．１になるように加えて静かに混合した後、２７℃インキュベーター内でインキュベーションした。経時的に培養培地１０ｍｌを採取して３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。組換えウイルス添加９６時間後にフラスコ内の培養培地１０ｍｌを採取して同様に遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。
【００４７】
条件２：浮遊培養／通常培養および間歇的酸素供給
２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ（ベルコ社製）を滅菌後に昆虫細胞Ｓｆ２１を入れ、培養培地量１００ｍｌ中で６０ｒｐｍの撹拌速度で撹拌しながら２７℃インキュベーターで培養した。また、２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコに滅菌フィルター（マイレクスＦＧ５０、ミリポア社製）を取り付けた改変フラスコを滅菌後に用いて、同様に細胞を培養した。細胞増殖後、２つのスピンナーフラスコの細胞濃度を２×１０６個／ｍｌに調整し、組換えブタＩＬ−２バキュロウイルスをＭ．Ｏ．Ｉ＝０．１になるように加えた。ついで、撹拌速度を４０ｒｐｍとし、２７℃でインキュベーションした。改変フラスコには、組換えウイルス添加２時間後と２４時間後に酸素ガス（０．１ＭＰａ）をフィルターを通して手動で５秒間通気した。経時的に培養培地１ｍｌを採取して３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。ウイルス添加９６時間後にフラスコ内の培養培地５０ｍｌを採取して同様に遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。組換えウイルス添加９６時間後にフラスコ内の培養培地５０ｍｌを採取して同様に遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。
【００４８】
条件３：浮遊培養／間歇的酸素供給
３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを滅菌後に用いて培養培地量４００ｍｌ中で条件２と同様に細胞を調達して組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス感染を行い、インキュベーション後、培養上清を得た。滅菌フィルターを取り付けた改変３０００ｍｌフラスコへの酸素供給は、供給時間を１５秒間とした以外は、条件２と同様に行った。
【００４９】
条件４：浮遊培養／常時空気供給
２５０ｍｌおよび３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコに滅菌フィルターを取り付けた改変フラスコを用いて、それぞれ培養培地量１００ｍｌおよび４００ｍｌ中で条件２と同様に細胞を調達して組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス感染を行い、インキュベーション後、培養上清を得た。ただし、改変フラスコへの空気の供給は、フィルターを通してエアーポンプにより常時空気（０．１Ｌ／分）を通気することにより行った。
【００５０】
条件５：浮遊培養／間歇的酸素供給
２５０ｍｌおよび３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコに滅菌フィルターを取り付けた改変フラスコを用いて、それぞれ培養培地量１００ｍｌおよび４００ｍｌ中で条件２と同様に細胞を調達して組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス感染を行い、インキュベーション後、培養上清を得た。ただし、改変フラスコへの酸素供給は、酸素ガス自動供給装置により行った。
【００５１】
各条件下で発現された組換えブタＩＬ−２量を比較した。図１には、条件１〜条件３において組換えブタＩＬ−２バキュロウイルス添加９６時間後に回収した培養培地中に発現された組換えブタＩＬ−２量を示した。図２と図３には、スピンナーフラスコを用いた浮遊培養における経時的な組換えブタＩＬ−２の発現量を示した。スピンナーフラスコを用いた浮遊培養において、酸素無供給のときには組換えブタＩＬ−２が殆ど発現されていなかったのに対し（図１のレーン３および５、並びに図２および図３）、酸素を間歇的に２回供給したとき（図１のレーン４および６、並びに図２および図３）には、静置培養（図１のレーン２）とほぼ同等の発現が認められた。
【００５２】
この結果は２５０ｍｌおよび３０００ｍｌ容量のスピンナーフラスコのいずれを用いた場合でも同様であった（図２および図３）。また、酸素ガス自動供給装置を用いて酸素供給を行なったときでも、手動により酸素供給したときと同様の結果が得られた（図４）。一方、空気を常時供給しても組換えブタＩＬ−２は、ある程度の発現は見られたが、酸素供給を行なったときの発現レベルではなく、培養槽スケールが大きくなるほどその差が顕著に見られた（図５および図６）。
【００５３】
このように、組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の発現を浮遊培養系で実施する場合、培養槽への酸素供給を組換えウイルス感染開始２時間後および２４時間後の２回行うことにより、組換えタンパク質の発現を著しく高くすることができた。浮遊培養系では昆虫細胞の組換えウイルス感染時に培地中の酸素が急激に消費され溶存酸素量が著しく低減して昆虫細胞の代謝に必要な酸素量が欠乏するため、昆虫細胞のタンパク質合成処理能力が低下して組換えタンパク質の発現が抑制されると考えられる。
【００５４】
本実施例では、組換えウイルス感染時に減少する培養培地中の溶存酸素量を補給することにより、組換タンパク質の発現効率を促進することができることを明らかにした。さらに浮遊培養系は、静置培養系と比較して、培養上清の回収量が多いため、大量に組換えタンパク質を得るのに有効な手段であることをその総量により再認識させた。
【実施例２】
【００５５】
宿主細胞としてＳｆ２１ＡＥ細胞の代わりに一般に組換えタンパク質の発現量がＳｆ系昆虫細胞に比べより高発現といわれる昆虫細胞ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いて、組換えブタＩＬ−２バキュロウイルスの添加をＭ．Ｏ．Ｉ＝１になるように行った以外は実験例１に記載した条件と同条件で、組換えブタＩＬ−２の発現を行った。その結果を図７から図１２に示した。
【００５６】
ＴＮ５／ＮＩＡＨ細胞においても同様に、スピンナーフラスコを用いた浮遊培養において、酸素無供給のときには組換えブタＩＬ−２は殆ど生産されなかったのに対し（図７のレーン３および５）、酸素を間歇的に２回供給したとき（図７のレーン４および６）には静置培養（図７のレーン２）とほぼ同等の発現が認められた。
【００５７】
この結果は２５０ｍｌ容量および３０００ｍｌ容量のスピンナーフラスコのいずれを用いた場合でも同様であった（図８および図９）。また、酸素ガス自動供給装置を用いて酸素供給を行なったときでも、手動により酸素供給したときと同様の結果が得られた（図１０）。一方、空気を常時供給しても組換えブタＩＬ−２は殆ど発現されなかった（図１１および図１２）。
【００５８】
組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の発現を浮遊培養系で実施する場合、培養槽への酸素供給を組換えウイルス感染開始２時間後および２４時間後の２回行うことにより、Ｓｆ２１ＡＥ細胞（実施例１）およびＴＮ５／ＮＩＡＨ細胞のいずれを用いたときも、発現が著しく高くなった。特にＴＮ５／ＮＩＡＨ細胞は、図１１および図１２から分かるように空気通気によっても組換えタンパク質の発現効率が殆ど上がらず、酸素供給時の発現効率と顕著に差が出ることから、組換えタンパク質発現時の酸素要求度が非常に高いことが判明した。このことから、これら細胞に限らず他の細胞を用いて浮遊培養系での組換えウイルス感染による組換えタンパク質の発現を行う場合、組換えタンパク質の高発現のために、酸素供給が有効であると考えられる。
【実施例３】
【００５９】
組換えバキュロバキュロウイルスを用いる昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の発現を浮遊培養系で実施する場合、発現を高くするために培養槽への酸素供給が有効であることを、実施例１および２において明らかにした。培養培地中の溶存酸素量が組換えタンパク質の高発現に寄与すると考えられることから、溶存酸素量の増加を目的として培養温度の検討を行った。
【００６０】
３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコに滅菌フィルター（マイレクスＦＧ５０、ミリポア社製）を取り付けた改変フラスコを滅菌後に用い、ＴＮ５／ＮＩＡＨ細胞を、培養培地量４００ｍｌ中で６０ｒｐｍの撹拌速度で撹拌しながら２７℃インキュベーターで培養した。培養培地はＳｆ９００ＩＩ  ＳＦＭ（インビトロジェン社製）を用いた。これを２つ用意した。
【００６１】
２つの改変フラスコの細胞濃度を２．０×１０６個／ｍｌに調整し、組換えブタＩＬ−１２バキュロウイルス（５．０×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）をＭ．Ｏ．Ｉ＝１になるように加えた。一方の改変フラスコの方は、組換えウイルス添加時からその２４時間後までは３０℃でインキュベーションし、撹拌速度を４０ｒｐｍまで低下させ、その後、組換えウイルス添加２４時間後からは２７℃でインキュベーションした。他方の改変フラスコは、組換えウイルス添加時から撹拌速度を４０ｒｐｍまで低下させ、２７℃でそのままインキュベーションした。また、組換えウイルス添加２時間後と２４時間後に酸素ガス（０．１ＭＰａ）を滅菌フィルターを介して通気した。酸素ガスの通気は、１回につき１５秒間行った。組換えウイルス添加７２時間後に培養上清５０ｍｌを採取して３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、その上清を−８０℃で凍結保存した。
【００６２】
組換えブタＩＬ−１２の発現は、ＩＬ−１２依存性細胞株１０Ｂ１０株細胞を用いてＩＬ−１２の活性を測定することにより確認した。該細胞株は、ＩＬ−１２の刺激に応じてヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を産生する。したがって、産生されたＩＦＮ−γを酵素免疫固定法（ＥＬＩＳＡ法）で測定することにより、組換えブタＩＬ−１２の活性を測定することができる。
【００６３】
まず、ＩＬ−１２依存性細胞株を１×１０５個／ｗｅｌｌでマイクロタイタープレートに播種した。ついで、０．１％フィトヘムアグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）および５０ｎｇ／ｍｌホルボル１２−ミリステート１３−アセテート（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）の存在下で種々の量の上記上清を添加し、５％ＣＯ２の条件下３７℃で４８時間培養した。培養上清５０μｌを採取し、該上清中のヒトＩＦＮ−γ含有量をヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）を用いて測定した。このキットによるヒトＩＦＮ−γ測定は吸光度測定により行なわれるため、測定結果は吸光度（ＯＤ４９０／６２０）の値として示した。
【００６４】
組換えブタＩＬ−１２発現量を、上記測定したヒトＩＦＮ−γ量から換算するために、リファレンスを利用した。リファレンスとして静置系で発現させた組換えブタＩＬ−１２を用い、上記同様の測定を行なった。静置系で発現させた組換えブタＩＬ−１２は、市販のＩＬ−１２と同等の活性を持つ。組換えブタＩＬ−１２発現量の換算は、「吸光度の最大値の１／２がＩＬ−１２の１ユニット相当／ｍｌにあたる」ことを利用して行なった。
【００６５】
代表的な結果を図１３に示した。酸素ガスを組換えウイルス添加２時間後および２４時間後の２回供給する条件下で、組換えウイルス添加時から２４時間後までの培養温度を３０℃にし、その後２７℃に戻して培養して得られた上清（培養上清Ｂ：図１３Ｂ、−□−）では、培養開始から終了まで２７℃で培養して得られた上清（培養上清Ａ：図１３Ａ、−□−）と比較して、組換えブタＩＬ−１２の発現が著しく高くなった。リファレンスの最大吸光の１／２を１ユニット相当と考えると、計算により、培養上清Ｂ中の組換えブタＩＬ−１２発現量はおよそ１６ユニット相当／ｍｌと考えられる。一方、培養上清Ａ中の組換えブタＩＬ−１２発現量はおよそ０．２ユニット相当／ｍｌと考えられる。このように、培養上清中の組換えブタＩＬ−１２の活性が、酸素ガスの供給を行いかつ組換えウイルス添加の培養温度を一定時間高くする条件下で、著しく高くなったことが判明した。
【００６６】
組換えバキュロウイルスを用いる昆虫細胞発現系による組換えタンパク質の発現を浮遊培養系で実施する場合、組換えウイルス感染開始時からその２４時間後までの期間、間歇的に培養槽内に酸素を供給しかつ培養温度を上昇させることにより、生物活性のある組換えタンパク質をさらに効率的に発現させ得ることが判明した。
【実施例４】
【００６７】
組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞の培養を、実施例１の条件５と同様の条件で実施した。すなわち、２５０ｍｌおよび３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコに滅菌フィルターを取り付けた改変フラスコを用いて、それぞれ培養培地量１００ｍｌおよび５００ｍｌ中で細胞に組換えバキュロウイルス感染を行い、インキュベーション後２時間後および２４時間後の２回酸素ガスを、酸素ガス自動供給装置を用いて行った。酸素ガス自動供給装置は、そのガス吸入口（１１）を酸素ガスボンベにガスラインを介して接続し、そのガス排出口（１２）を滅菌フィルターを取り付けた改変フラスコにガスラインを介して接続した。このときの、該装置の動作を説明する（図１５）。
【００６８】
切換えスイッチが１００ｍｌである時、本装置を稼動させることによりタイマー（２２）が始動、タイマー（２２）が２時間目に達したときに電磁弁（１３）が開放され、５秒間電磁弁（１３）の開放状態が保持され、その後、閉鎖した。さらにタイマー（２２）が２４時間目に達したときに電磁弁（１３）が再び開放され、５秒間電磁弁（１３）が開放状態を保持し、その後、閉鎖した。切換えスイッチが５００ｍｌである時は、本装置は電磁弁（１３）が開放状態が保持される時間が１５秒間である以外は、上記と同様に動作した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
タンパク質やペプチドの製造は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学から医学などの基礎研究、さらにその応用としての医薬開発や医薬製造などに至る広い分野において必要とされている。本発明によれば生物活性のある組換えタンパク質を大量かつ安価に生産することができるため、本発明はこれら分野において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。レーン２は静置培養系、レーン３からレーン６は浮遊培養系（レーン３およびレーン４は２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用；レーン５およびレーン６は３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用）での発現結果を示す。また、レーン３およびレーン５は、通常状態での感染で、レーン４およびレーン６は、酸素ガスを間歇的に供給したときの結果を示す。レーン１およびレーン７は分子量マーカーである。図中、楕円で示した領域は、組換えブタＩＬ−２のバンドが認められる領域である。（実施例１）
【図２】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを５秒間ずつ供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを供給したとき、−○−は酸素ガスを供給しない通常のときの結果を示す。（実施例１：条件２）
【図３】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを１５秒間ずつ供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを供給したとき、−○−は酸素ガスを供給しない通常のときの結果を示す。（実施例１：条件３）
【図４】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内への酸素ガス供給を酸素ガス自動供給装置で行なった。このような条件下での組換えブタＩＬ−２発現の発現は、手動で酸素供給を行ったときと同等量であることが確認できた。レーン２からレーン６は２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用（レーン２は組換えウイルス添加直後、レーン３は組換えウイルス添加２４時間後、レーン４は組換えウイルス添加４８時間後、レーン５は組換えウイルス添加７２時間後、レーン６は組換えウイルス添加９６時間後を示す。）、レーン７からレーン１１は３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用（レーン７は組換えウイルス添加直後、レーン８は組換えウイルス添加２４時間後、レーン９は組換えウイルス添加４８時間後、レーン１０は組換えウイルス添加７２時間後、レーン１１は組換えウイルス添加９６時間後を示す。）での発現結果を示す。レーン１およびレーン１２は分子量マーカーである。図中、楕円で示した領域は、組換えブタＩＬ−２のバンドが認められる領域である。
【図５】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを５秒間ずつ供給する条件下と常時空気を通気させる条件下で発現の比較を行ったところ、前者では後者より発現が高くなった。浮遊培養系として、２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを間歇的に供給したとき、−□−は常時空気を通気させたときの結果を示す。（実施例１：条件２および５）
【図６】昆虫細胞株Ｓｆ２１ＡＥを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを１５秒間ずつ供給する条件下と常時空気を通気させる条件下で発現の比較を行ったところ、前者では後者より発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを間歇的に供給したとき、−□−は常時空気を通気させたときの結果を示す。（実施例１：条件３および５）
【図７】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。レーン２は静置培養系、レーン３からレーン６は浮遊培養系（レーン３およびレーン４は２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用；レーン５およびレーン６は３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用）での発現結果を示す。また、レーン３およびレーン５は、通常状態での感染で、レーン４およびレーン６は、酸素ガスを間歇的に供給したときの結果を示す。レーン１およびレーン７は分子量マーカーである。図中、楕円で示した領域は、組換えブタＩＬ−２のバンドが認められる領域である。
【図８】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを５秒間ずつ供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを供給したとき、−○−は酸素ガスを供給しない通常のときの結果を示す。（実施例２）
【図９】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを１５秒間ずつ供給する条件下で、その発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを供給したとき、−○−は酸素ガスを供給しない通常のときの結果を示す。（実施例２）
【図１０】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内への酸素ガス供給を酸素ガス自動供給装置で行なった。このような条件下での組換えブタＩＬ−２発現の発現は、手動で酸素供給を行ったときと同等量であることが確認できた。レーン２からレーン６は２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用（レーン２は組換えウイルス添加直後、レーン３は組換えウイルス添加２４時間後、レーン４は組換えウイルス添加４８時間後、レーン５は組換えウイルス添加７２時間後、レーン６は組換えウイルス添加９６時間後を示す。）、レーン７からレーン１１は３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコ使用（レーン７は組換えウイルス添加直後、レーン８は組換えウイルス添加２４時間後、レーン９は組換えウイルス添加４８時間後、レーン１０は組換えウイルス添加７２時間後、レーン１１は組換えウイルス添加９６時間後を示す。）での発現結果を示す。レーン１およびレーン１２は分子量マーカーである。図中、楕円で示した領域は、組換えブタＩＬ−２のバンドが認められる領域である。（実施例２）
【図１１】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを５秒間ずつ供給する条件下と常時空気を通気させる条件下で発現の比較を行ったところ、前者では後者より著しく発現が高くなった。浮遊培養系として、２５０ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを間歇的に供給したとき、−□−は常時空気を通気させたときの結果を示す。（実施例２）
【図１２】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に培養槽内に酸素ガスを１５秒間ずつ供給する条件下と常時空気を通気させる条件下で発現の比較を行ったところ、前者では後者より発現が著しく高くなった。浮遊培養系として、３０００ｍｌμキャリアースピンナーフラスコを使用した。図中、−●−は、酸素ガスを間歇的に供給したとき、−□−は常時空気を通気させたときの結果を示す。（実施例２）
【図１３】昆虫細胞株ＴＮ５／ＮＩＡＨを用いた昆虫細胞発現系による組換えブタＩＬ−１２発現を浮遊培養系で行った結果を示す図である。組換えブタＩＬ−１２発現量は、ＩＬ−１２依存性ヒトＩＦＮ−γ生産細胞株１０Ｂ１０株細胞を利用して、上記培養で得られた上清を添加して培養した該細胞から産生されるＩＦＮ−γの生産量を指標にて測定した。ＩＦＮ−γの生産量は、ＥＬＩＳＡにより測定し、吸光度（ＯＤ４９０／６２０）で表示した。したがって、図の縦軸は、吸光度（ＯＤ４９０／６２０）で表示し、横軸は添加した培養上清の量を対数で表示した。ブタＩＬ−１２遺伝子を含む組換えバキュロウイルス添加２時間後および２４時間後に浮遊培養系の培養槽内に酸素ガス供給する条件下で、培養温度を組換えウイルス添加後から２４時間後までは３０℃としその後２７℃として培養して得られた上清（培養上清Ｂ：図１３Ｂ、−□−）では、培養開始から終了まで２７℃で培養して得られた上清（培養上清Ａ：図１３Ａ、−□−）と比較して、組換えブタＩＬ−１２の発現が著しく高くなった。各培養上清中の組換えブタＩＬ−１２発現量を、リファレンスを利用してＩＦＮ−γ量から換算したところ、培養上清Ｂではおよそ１６ユニット相当／ｍｌ、培養上清Ａではおよそ０．２ユニット相当／ｍｌの発現量であった。（実施例３）
【図１４】ガス自動供給装置の構成図を示す。
【図１５】ガス自動供給装置の動作を説明する工程図である。
【符号の説明】
【００７１】
（１）ガス自動供給装置
（２）電磁弁作動制御手段
（１１）ガス吸入口
（１２）ガス排出口
（１３）電磁弁
（１４）流量計
（２１）シーケンサー
（２２）タイマー
（２３）切換えスイッチ
（２４）スタートスイッチ
（２５）直流電源
（２６）電源スイッチ
（２７）電源口
（２８）電源ヒューズ
（ａ）ガス流路
【図１】
2005287453.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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