(57)【要約】【課題】本発明では、全血を検体とし、血小板数低値検体も考慮して、簡便かつ高感度に血小板の凝集能を評価できる血小板凝集能測定装置を提供する。【解決手段】本発明の血小板凝集能測定装置は、全血検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加して測定用試料を調製する測定用試料調製手段と、測定用試料中の各粒子から光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段とを有する。【選択図】        図１１
2005017254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加して測定用試料を調製する測定用試料調製手段と、測定用試料中の各粒子から光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段とを有する血小板凝集能測定装置。
【請求項２】
全血検体から少なくとも２つの測定用試料を調製し、少なくともその一方の測定用試料には血小板の凝集を惹起する物質を添加する測定用試料調製手段と、測定用試料中の各粒子から光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段と、前記計数手段より得られた結果を出力する出力手段を有する血小板凝集能測定装置。
【請求項３】
全血検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加するとともに、血小板の凝集を惹起する物質を添加後の経過時間が異なる複数の測定用試料を順次調製する測定用試料調製手段と、測定部と、前記各測定用試料を前記の測定部へ送る送液手段と、前記測定部に送られてきた各測定用試料について光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段と、前記計数手段よって得られた結果を出力する出力手段とを有する血小板凝集能測定装置。
【請求項４】
測定用試料調製において、検体に添加する惹起物質の添加量を予め設定する設定手段を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の血小板凝集能測定装置。
【請求項５】
検出手段により検出される光学的情報が散乱光と蛍光とを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の血小板凝集能測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は検体中に含まれる血小板の凝集能を測定する装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血小板の機能低下や機能亢進を調べるため、血小板機能検査が行われている。この血小板機能検査には、血小板粘着能、顆粒放出能、血小板凝集能など種々の検査があるが、最も一般的に行われているのは血小板凝集能検査である。
【０００３】
従来、血小板凝集能検査には、血小板の凝集の程度を光透過度の変化として測定する透過光法が広く用いられてきた。この方法は、血液を遠心分離機にかけ血小板以外の血球成分を取り除いた血漿である多血小板血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｉｃｈ  Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）を試料として用い、このＰＲＰに血小板凝集惹起物質を加え、そこに光を照射して血小板凝集に伴う光の透過度の変化を測定するものである。
【０００４】
しかし、生体内の血液中には赤血球や白血球も同時に存在しており、これらが血小板の機能に影響を与えているとの報告があることから、ＰＲＰを用いた測定結果が必ずしも生体内での血小板機能を反映しているとはいえない。また、ＰＲＰの調製過程の遠心操作において、大血小板や血小板凝集塊が取り除かれてしまう可能性がある。以上のことから、全血を試料として血小板凝集を評価できる方法が望まれていた。
【０００５】
全血のまま血小板凝集が評価できる技術としては次のようなものがある。
全血を測定用試料とし、試料をフローサイトメーターで測定すると共に、微弱な血小板凝集の粒子画像を撮影し判別することにより、生体に近い状態で血小板凝集塊を測定する技術（例えば特許文献１）。
このような技術を用いると、生体に近い状態で血液中に存在する微弱な凝集を検出することができる。
【０００６】
血小板の凝集能異常には凝集能の亢進を伴うものと凝集能の低下を伴うものがあり、血小板凝集能の亢進は虚血性心疾患や脳梗塞などの病的血栓の形成に深く関与するといわれている。そしてこのような疾患を抱える患者では、血栓となる前のいわゆる血栓準備状態として血液中に血小板の微弱な凝集が現れる。ゆえに、上記の特許文献１の方法は血栓傾向や血栓準備状態を判断するのに有効であると考えられる。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１１−３０５８０号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
一方、血小板凝集能の機能低下が関与する疾患には血小板無力症が挙げられる。血小板凝集能の機能低下は、検体に凝集惹起物質を添加して血小板の凝集の有無・程度を調べることで評価することができる。そのような血小板凝集の有無・程度を評価する方法としては、前記した透過光法が用いられてきた。しかし前記の通りこの方法は、ＰＲＰを検体として用いるため、測定結果が必ずしも生体内での血小板機能を反映しているとはいえない。さらに、肝疾患や突発性血小板減少症の疾患、骨髄移植、化学療法などが原因で、血液中に含まれる血小板数が減少することがある。透過光法は、巨大な凝集塊が形成された後の光透過率の変化として血小板凝集を表現しているため、凝集塊の検出感度が低い。そのため、前記したようなもともとの血小板数が低値の場合においては血小板凝集の形成が正常であっても機能低下が疑われるような結果を示す。そこで、本発明では、全血を検体とし、血小板数が低値の検体も考慮して、簡便かつ高感度に血小板の機能低下を評価できる血小板凝集能測定装置を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑み本発明は、全血検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加して測定用試料を調製する測定用試料調製手段と、測定用試料中の各粒子から光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段とを有する血小板凝集能測定装置を提供する。
【００１０】
また、本発明は、全血検体から少なくとも２つの測定用試料を調製し、少なくともその一方の測定用試料には血小板の凝集を惹起する物質を添加する測定用試料調製手段と、測定用試料中の各粒子から光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段と、前記計数手段より得られた結果を出力する出力手段を有する血小板凝集能測定装置を提供する。
【００１１】
また、本発明は、全血検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加するとともに、血小板の凝集を惹起する物質を添加後の経過時間が異なる複数の測定用試料を順次調製する測定用試料調製手段と、測定部と、前記各測定用試料を前記の測定部へ送る送液手段と、前記測定部に送られてきた各測定用試料について光学的情報を検出する検出手段と、検出された光学的情報に基づき血小板の凝集塊を区別する区別手段と、区別された血小板凝集塊を計数する計数手段と、前記計数手段よって得られた結果を出力する出力手段とを有する血小板凝集能測定装置を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の１つの実施形態における血小板凝集能測定装置について、添付図面を参照して説明する。この血小板凝集能測定装置は、検体に血小板の凝集を惹起する物質（以下これを血小板凝集惹起物質と呼ぶ）を添加しない測定用試料と添加する測定用試料を調製し、それぞれについて血小板や血小板凝集塊を検出・計数するものである。さらに、血小板凝集惹起物質が添加された試料については経時的な測定を行うものである。
【００１３】
（血小板凝集能測定装置の概略構成）
図１は血小板凝集能測定装置１の外観を実線で、装置内部の概略構成を破線で示したものである。装置の最前面には実線で示すように、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル２、測定用試料調製部カバー３およびスタートスイッチ４が備えられている。また、破線で示す装置の内部構成において、上部には装置の動作や分析処理をつかさどる制御部５が配置されている。下部の手前側には、試料液を調製するための測定用試料調製部６が配置されている。下部の奥側には試料液から信号を検出するための測定部７が配置されている。
【００１４】
（測定用試料調製部の構成）
図２は測定用試料調製部６を示す説明図である。測定用試料調製部６は検体セット部８、試薬セット部９、試薬混合部１０、凝集反応部１１、染色部１２、分注装置１３および送液装置１４を含む。前記図１の測定用試料調製部カバー３を開けることにより、検体セット部８には検体の入った検体容器を、試薬セット部９には血小板凝集惹起物質の原液の入った微量試験管１５や血小板凝集惹起物質用の希釈液の入った微量試験管１６や染色液の入った微量試験管１７や希釈液の入った微量試験管１８をそれぞれセットするようになっている。また、試薬混合部１０には微量試験管１９がセットされており、そこで血小板凝集惹起物質の原液と血小板凝集惹起物質用の希釈液が混合され、血小板凝集惹起物質溶液が調製される。凝集反応部１１には微量試験管２０がセットされており、そこで検体と試薬混合部１０で調製された血小板凝集惹起物質溶液とが混合されて、血小板の凝集反応が起こる。なお図には示していないが、凝集反応部１１には微量試験管２０の中の溶液を一定の温度に保つための温度調節機構と微量試験管２０の中の溶液を攪拌させるための攪拌機構が備えられている。染色部１２には微量試験管２１がセットされており、そこで検体または凝集反応部１１で調製された試料に染色液と希釈液が混合されて、測定用試料が調製される。なお図には示していないが、染色部１２には微量試験管２１の中の溶液を一定の温度に保つための温度調節機構と微量試験管２１の中の溶液を攪拌させるための攪拌機構が備えられている。分注装置１３はその先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示していない駆動装置によって上下左右に移動可能となっている。送液装置１４は測定用試料を吸引するための吸引管２２と、吸引管２２から吸引した測定用試料を図３で示している測定部７へと送液する送液管２３と、測定部７へ送液した測定用試料を排出するためのポンプ２４からなる。吸引管２２は染色部１２にセットされた微量試験管２１に挿入され、そして所定の量の測定用試料が吸引される。吸引された測定用試料は送液管２３を通って測定部７へ送液される。
【００１５】
（測定部の構成）
図３は測定部７を示す説明図である。測定部７にはシースフローセル２５、レーザー光源２６、コンデンサレンズ２７、２つの集光レンズ２８、２９、２つのピンホール３０、３１、フィルタ３２、フォトダイオード３３およびフォトマルチプライヤーチューブ３４が設けられている。シースフローセル２５には、前記図２の測定用試料調製部６で調製された測定用試料が送られてくる。また、図４に示すようにシースフローセル２５は、測定用試料液を細孔部に向かって上方へ噴射する試料ノズル３５と、シース液供給口３６と廃液口３７を備える。集光レンズ２８、２９はレーザー光を受けた試料中の粒子一個一個から得られる光学的情報を集光する。フォトダイオード３３またはフォトマルチプライヤーチューブ３４は光学的情報を受光、光電変換し、光信号として出力する。出力された各信号は制御部へ送られる。
【００１６】
（制御部の構成）
図５は制御部５の構成、および制御部５と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部５は中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピューター、測定部７から送られてきた信号を処理する回路などを有する。制御部５は記憶部３９、分析部４０および動作制御部４１を有する。記憶部３９は、試料中の粒子から得た信号の分析に関する分析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを記憶している。また、測定部７で検出された信号のデータや、分析プログラムによる処理結果を記憶する。分析部４０は試料液を測定して測定部７で検出された信号を処理し、処理後の信号を分析して測定用試料液中に含まれる血小板の凝集能に関するデータを生成する。分析部４０で生成されたデータは液晶タッチパネル２に出力される。動作制御部４１は、記憶部３９に記憶されている制御プログラムに基づき装置各部の動作を制御する。制御プログラムは、液晶タッチパネル２より入力される測定条件に基づき各装置部の動作を制御する。
【００１７】
以下装置の動作について詳しく説明する。
図６は制御プログラムによる全体制御の流れを示すフローチャートである。電源を入れると制御プログラムが起動する。まずステップＳ１では、液晶タッチパネルに表示された条件設定画面によって、経時測定モードおよび濃度変更測定モード等の測定モードの設定入力を受け付ける。経時測定モードは、検体に血小板凝集惹起物質を添加してからの経過時間が異なるように複数回測定用試料の測定および分析を行う測定モードである。経時測定モードが設定されると、さらに経時測定の「時間間隔」および「測定時間」等の測定条件の入力を受け付ける。また、濃度変更測定モードは、同じ検体を用いて血小板凝集惹起物質の濃度の異なる測定用試料を調製して、それぞれの測定用試料について測定および分析を行う測定モードである。濃度変更測定モードが設定されると、血小板凝集惹起物質濃度等の測定条件の入力を受け付ける。そして検体や測定用試薬を測定用試料調製部６の所定の位置にセットし、スタートスイッチを押すと、入力した条件でステップＳ２（測定Ａ）、ステップＳ３（測定Ｂ）、ステップＳ４（総合分析）およびステップＳ５（出力）が順次実行される。測定用試料調製部６、測定部７、分析部４０は制御プログラムにより制御され、これより設定した条件で血小板凝集能測定装置１の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ２、Ｓ３、Ｓ４およびＳ５について以下に説明する。
【００１８】
ステップＳ２（測定Ａ）
図７は、測定Ａのフローチャートである。測定Ａは検体に血小板凝集惹起物質を添加せずに測定用試料を調製し、検体の中の凝集していない血小板である単一血小板や血小板凝集塊を検出するもので、図７でも示しているように、ステップＳ６（染色処理）、ステップＳ７（送液）、ステップＳ８（測定）およびステップＳ９（分析）から成る。それぞれのステップによる装置各部の動作を以下に説明する。なお、ステップＳ６（染色処理）とステップＳ７（送液）は測定用試料調製部６の動作である。
【００１９】
ステップＳ６（染色処理）
染色処理における測定用試料調製部６の動作を、図２を用いて説明する。検体は全血とし、染色液はシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）染色液を、希釈液はシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）希釈液を用いる。まず分注装置１３が、検体セット部８にセットされている検体容器から全血試料を吸引し、染色部１２にセットされている微量試験管２１に４．５μＬを分注する。次に分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１８からシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）希釈液を吸引し、染色部１２にセットされている微量試験管２１に０．８９５５ｍＬを分注する。さらに分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１７からシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）染色液を吸引し、染色部にセットされている微量試験管２１に１８μＬを分注する。この後染色部１２が微量試験管２１を温度３７℃に保ちながら撹拌する。これより、微量試験管２１において惹起物質非添加の測定用試料が調製される。
【００２０】
ステップＳ７（送液）
ステップＳ６より測定用試料が調製されると、前記図２の送液装置１４により染色部１２の微量試験管２１から２．８μＬの測定用試料が吸引され、測定部７のシースフローセル２５に流される。
【００２１】
ステップＳ８（測定）
測定における測定部７の動作を、図３と図４を用いて説明する。測定用試料調製部６で調製された測定用試料はシースフローセル２５に導かれ、試料ノズル３５から試料液がシースフローセル内に吐出される。それと同時にシース液供給口３６からシース液がシースフローセル内に吐出される。これによって試料液はシースフローセル内でシース液に包まれ、さらに細孔部３８によって細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子経と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させて細孔部に流すことができる。
【００２２】
細孔部３８を流れる試料流へレーザー光源２６から出射されたレーザー光がコンデンサレンズ２７で絞られて照射される。レーザー光を受けた試料中の粒子一個一個から発せられる前方散乱光は集光レンズ２８により、側方蛍光は集光レンズ２９により集光され、それぞれピンホール３０、３１を通過する。そして前方散乱光はフォトダイオード３３で、側方蛍光はフォトマルチプライヤーチューブ３４で受光、光電変換されて、それぞれ前方散乱光信号、側方蛍光信号として出力される。各信号は制御部５へ送られ、粒子毎のデータとして記憶部３９に記憶される。
【００２３】
ステップＳ９（分析）
ステップＳ８の測定により前方散乱光信号や側方蛍光信号用が検出されると、次に分析プログラムに基づいて各信号を分析する。ステップＳ９における分析プログラムの動作について、図９のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下のとおりである。
【００２４】
ステップＳ１９：試料液から検出された前方散乱光信号や側方蛍光信号のデータを記憶部から読み出す。続いてステップＳ２０へ進む。
ステップＳ２０：試料液中の各粒子から得られた前方散乱光信号や側方蛍光信号に基づき、前方散乱光強度（Ｆｓｃ）や側方蛍光強度（Ｓｆｌ）を算出する。続いてステップＳ２１へ進む。
ステップＳ２１：ステップＳ２０で算出した粒子毎のＦｓｃ・Ｓｆｌをパラメーターとしたスキャッタグラムを作成する。続いてステップＳ２２へ進む。
ステップＳ２２：作成したスキャッタグラム上において、凝集していない血小板である単一血小板領域（ｓＰＬＴ）、小型の血小板凝集塊領域（ａｇｇＭ）および大型の血小板凝集塊領域（ａｇｇＬ）を分画する。続いてステップＳ２３へ進む。
ステップＳ２３：各分画各領域内のドット数（粒子数）を計数する。このようにして、単一血小板、小型血小板凝集塊、大型血小板凝集塊の数を算出する。続いてステップＳ２４へ進む。
ステップＳ２４：ステップＳ２３より計数された各分画領域内のドット数（粒子数）データを記憶する。
【００２５】
上記ステップＳ２２、ステップＳ２３により図１１のＡのスキャッタグラムが得られる。スキャッタグラムは，横軸にＳｆｌ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＳｆｌの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃの値が大きくなる。単一血小板はｓＰＬＴ領域に、血小板凝集塊の中でも４〜１０μｍ程度の小型血小板凝集塊はａｇｇＭ領域に、１０〜３０μｍ程度の大型血小板凝集塊はａｇｇＬ領域に出現する。
【００２６】
ステップＳ３（測定Ｂ）
図８は、測定Ｂのフローチャートである。測定Ｂは、前記の測定Ａで用いた検体と同じ全血試料を用い、それに所定の濃度の血小板凝集惹起物質を添加して血小板の凝集反応を引き起こし、その反応時間ごとに血小板や凝集塊を検出するものである。図８でも示しているように、測定ＢはステップＳ１０（血小板凝集惹起物質処理）、ステップＳ１１（サンプリング）、ステップＳ１２（送液）、ステップＳ１３（染色処理）、ステップＳ１４（送液）、ステップＳ１５（測定）、ステップＳ１６（分析）、ステップＳ１７（同じ試料について測定するのかを判別）およびステップＳ１８（血小板凝集惹起物質の異なる濃度で測定するのかを判別）から成る。それぞれのステップによる装置各部の動作を以下に説明する。なお、ステップＳ１０（血小板凝集惹起物質処理）、ステップＳ１１（サンプリング）、ステップＳ１２（送液）、ステップＳ１３（染色処理）およびステップＳ１４（送液）は測定用試料調製部６の動作である。
【００２７】
ステップＳ１０（血小板凝集惹起物質処理）
血小板凝集惹起物質処理における測定用試料調製部６の動作を、図２を用いて説明する。検体は測定Ａで用いた検体と同じ全血試料を用いる。血小板凝集惹起物質にはＳＩＧＭＡ社製アデノシン二リン酸（以下ＡＤＰと呼ぶ）を、血小板凝集惹起物質用の希釈液には精製水を用いる。まず分注装置１３が検体セット部８にセットされている検体容器から全血試料を吸引し、凝集反応部１１にセットされている微量試験管２０に９９０μＬを分注する。また、分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１５からＡＤＰ原液（１０００μＭ）を吸引し、試薬混合部１０にセットされている微量試験管１９に５μＬを分注する。さらに分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１６からＡＤＰ希釈液を吸引し、試薬混合部１０にセットされている微量試験管１９に４５μＬを分注する。このようにして試薬混合部１０において１００μＭのＡＤＰ溶液が調製される。そして分注装置１３がこのＡＤＰ溶液を吸引し、凝集反応部１１にセットされている微量試験管２０に１０μＬを分注する。この後凝集反応部１１は血小板凝集惹起物質を添加した検体が入っている微量試験管２０を温度３７℃に保ちながら撹拌する。これより、微量試験管２０においてＡＤＰ濃度１μＭで血小板の凝集が惹起された反応液が調製される。
【００２８】
ステップＳ１１（サンプリング）とステップＳ１２（送液）
ステップＳ１０で反応液が調製されると、分注装置１３が反応液を吸引し、染色部１２にセットされている微量試験管２１に４．５μＬを分注する。
【００２９】
ステップＳ１３（染色処理）
染色処理における測定用試料調製部６の動作を、図２を用いて説明する。染色液はシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）染色液を、希釈液はシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）希釈液を用いる。ステップＳ１１、Ｓ１２より反応液が染色部１２の微量試験管２１に送られると、次に分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１８からシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）希釈液を吸引し、染色部１２にセットされている微量試験管２１に０．８９５５ｍＬを分注する。さらに分注装置１３が試薬セット部９にセットされている微量試験管１７からシスメックス株式会社製レットサーチ（ＩＩ）染色液を吸引し、染色部１２にセットされている微量試験管２１に１８μＬを分注する。この後染色部１２が微量試験管２１を温度３７℃に保ちながら撹拌する。これより、染色部１２の微量試験管２１において血小板の凝集が惹起された測定用試料が調製される。
【００３０】
ステップＳ１４（送液）
ステップＳ１３より測定用試料が調製されると、前記図２の送液装置１４により染色部１２の微量試験管２１から２．８μＬの測定用試料が吸引され、測定部７のシースフローセル２５に流される。
【００３１】
ステップＳ１５（測定）
測定における測定部７の動作は、測定ＡのＳ８と同様に動作し、前方散乱光信号や側方蛍光信号が検出され、検出された各信号は分析部４０に送られる。
【００３２】
ステップＳ１６（分析）
分析については、測定ＡのステップＳ９と同様に、測定部７で検出された各信号に基づいて単一血小板、小型血小板凝集塊、大型血小板凝集塊の数が算出され、各データが記憶される。なお、これより図１１のＢのスキャッタグラムが得られる。スキャッタグラムは，横軸にＳｆｌ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＳｆｌの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃの値が大きくなる。単一血小板はｓＰＬＴ領域に、血小板凝集塊の中でも４〜１０μｍ程度の小型血小板凝集塊はａｇｇＭ領域に、１０〜３０μｍ程度の大型血小板凝集塊はａｇｇＬ領域に出現する。
【００３３】
ステップＳ１７（同じ試料について測定するのかを判別）
ステップＳ１７では、前記図６のステップＳ１における測定モードの設定の有無に基づき、経時的な測定を行うのか否かを判断する。図６のステップＳ１で経時測定モードが予め設定されていると、ステップＳ１において予め設定された経時的な測定の「時間間隔」や「測定時間」といった測定条件に基づき、同じ測定用試料についてステップＳ１１（サンプリング）からステップＳ１６（分析）が繰り返される。なお、図６のステップＳ１において、経時測定モードが設定されていない場合には、続いてステップＳ１８へ進む。本実施形態では経時測定モードを設定し、経時的な測定の時間間隔を１０秒、測定時間を５分と設定する。これにより、凝集反応開始から１０秒ごとにステップＳ１１（サンプリング）からステップＳ１６（分析）が自動的に３０回繰り返され、各時間における血小板の凝集を調べる。そして凝集反応開始から、測定時間である５分が経過すると、続いてステップＳ１８へ進む。
【００３４】
ステップＳ１８（血小板凝集惹起物質の異なる濃度で測定するのかを判別）
ステップＳ１８では、図６のステップＳ１における濃度変更測定モードの設定の有無に基づき、同じ検体について血小板凝集惹起物質の異なる濃度で測定を行うか否かを判断する。図６のステップＳ１で、濃度変更測定モードが予め設定されていると、ステップＳ１において予め設定された測定条件の血小板凝集惹起物質の濃度に基づき、同じ検体について血小板凝集惹起物質の濃度を変えてステップＳ１０（血小板凝集惹起物質処理）からステップＳ１７（分析）が行われる。なお図６のステップＳ１において、濃度変更測定モードが設定されていない場合には、測定Ｂが終了する。本実施形態ではＡＤＰの最終濃度が１μＭと５μＭのそれぞれで測定が行えるように予め設定する。これにより、自動的に同じ検体についてＡＤＰの最終濃度が５μＭの場合のステップＳ１０（血小板凝集惹起物質処理）からステップＳ１７（分析）が行われる。このときのステップＳ１０では、ＡＤＰ原液（１０００μＭ）２５μＬとＡＤＰ希釈液２５μＬにより５００μＭの  ＡＤＰ溶液が調製される。そして、このように調製されるＡＤＰ溶液（５００μＭ）を用いてステップＳ１０からステップＳ１３が行われることにより、ＡＤＰ添加（５μＭ）の測定用試料が調製される。このように調製された測定用試料について前記したのと同じ手順でステップＳ１４からステップＳ１６が行われる。
【００３５】
なお、これより図１１のＣのスキャッタグラムが得られる。スキャッタグラムは、横軸にＳｆｌ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＳｆｌの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃの値が大きくなる。単一血小板はｓＰＬＴ領域に、血小板凝集塊の中でも４〜１０μｍ程度の小型血小板凝集塊はａｇｇＭ領域に、１０〜３０μｍ程度の大型血小板凝集塊はａｇｇＬ領域に出現する。
【００３６】
また、ＡＤＰの最終濃度が５μＭの場合においても、前記したのと同じ条件で経時的な測定が行われる。これにより、凝集反応開始から１０秒ごとにステップＳ１１（サンプリング）からステップＳ１６（分析）が自動的に３０回繰り返され、各時間における血小板の凝集を調べる。そして凝集反応開始から、測定時間である５分が経過すると、測定Ｂが終了する。
【００３７】
ステップＳ４（総合分析）
測定Ａと測定Ｂより得られたデータを分析プログラムに基づいて分析する。この総合分析における分析プログラムの動作については、図１０のフローチャートを用いて説明する。フローチャートのステップは以下のとおりである。
【００３８】
ステップＳ２５：測定Ａと測定Ｂより得られた単一血小板、小型血小板凝集塊、大型血小板凝集塊それぞれの計数データを読み出す。続いてステップＳ２６に進む。
ステップＳ２６：各データに基づいて、反応時間経過における単一血小板数の変動を示すグラフ、反応時間経過における小型血小板凝集塊数の変動を示す凝集曲線、反応時間経過における大型血小板凝集塊数の変動を示す凝集曲線を作成する。続いてステップＳ２７に進む。
ステップＳ２７：作成した各グラフを記憶する。
【００３９】
上記ステップＳ２６により図１２のようなグラフが得られる。図１２の（Ｉ）はＡＤＰ１μＭ（最終濃度）添加時の結果である。（ＩＩ）はＡＤＰ５μＭ（最終濃度）添加時の結果である。（Ｉ）Ａと（ＩＩ）Ｄは反応時間経過における小型血小板凝集塊数の変動を示す凝集曲線を示すグラフである。（Ｉ）Ｂと（ＩＩ）Ｅは反応時間経過における大型血小板凝集塊数の変動を示す凝集曲線である。（Ｉ）Ｃと（ＩＩ）Ｆは反応時間経過における単一血小板数の変動を示すグラフである。
【００４０】
ステップＳ５（出力）
測定Ａ、測定Ｂより得られたスキャッタグラムや単一血小板、小型血小板凝集塊、大型血小板凝集塊それぞれの計数結果や各グラフを液晶タッチパネル２に出力し、表示する。以上がこの実施形態における測定のフローチャートであり、４つのステップ（Ｓ１からＳ５）が各検体ごとに繰り返される。
【００４１】
分析結果の例
上記に説明してきた血小板凝集能測定装置１を用いて得られたスキャッタグラムを図１１に示した。図１１のスキャッタグラムのうちＡは、ＡＤＰ非添加の測定用試料を測定した結果である。ＢはＡＤＰ添加（最終濃度１μＭ）の測定用試料について、凝集反応開始から６０秒後に測定した結果である。ＣはＡＤＰ添加（最終濃度５μＭ）の測定用試料について、凝集反応開始から６０秒後に測定した結果である。また、前記したように、いずれのスキャッタグラムも、横軸にＳｆｌ、縦軸にＦｓｃをとっている。横軸においては、右へ行くほどＳｆｌの値が大きくなる。縦軸においては、上へ行くほどＦｓｃの値が大きくなる。単一血小板はｓＰＬＴ領域に、血小板凝集塊の中でも４〜１０μｍ程度の小型血小板凝集塊はａｇｇＭ領域に、１０〜３０μｍ程度の大型血小板凝集塊はａｇｇＬ領域に出現する。
【００４２】
ｓＰＬＴ領域のドット数は血液中に含まれる単一血小板数を反映している。ゆえに、図１１のＡ（ＡＤＰ非添加）のｓＰＬＴ領域に出現するドット数のレベルから、血小板数が低値であるかどうかを判断することができる。また、ａｇｇＭ領域のドット数は血液中に含まれる小型血小板凝集塊数を、ａｇｇＬ領域のドット数は血液中に含まれる大型血小板凝集塊数を反映している。ゆえに、図１１のＢ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）、Ｃ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）のａｇｇＭ領域やａｇｇＭ領域に出現するドット数のレベルから、血小板の凝集能を推測することができる。
【００４３】
さらに、図１１のＡ（ＡＤＰ非添加）とＢ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）を比較すると、ＢのａｇｇＭ領域にドット数の顕著な増加が見られる。この位置は小型の凝集塊が出現する位置である。Ａ（ＡＤＰ非添加）とＣ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）を比較すると、ＣのａｇｇＭ領域だけでなくａｇｇＬ領域においてもドット数の顕著な増加が見られる。ａｇｇＬ領域は大型の凝集塊が出現する位置である。また、ＣではｓＰＬＴ領域におけるドット数の顕著な減少が見られた。ｓＰＬＴ領域は単一血小板が出現する位置である。以上のことから、ＡＤＰが低濃度の場合は主に小型の凝集塊が形成され、ＡＤＰが高濃度の場合は主に大型の凝集塊が形成されると推測できる。このように、Ａ（ＡＤＰ非添加）、Ｂ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）、Ｃ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）の結果をそれぞれ比較することで、血液中に含まれる血小板の凝集能の詳細な評価ができる。
【００４４】
次に、経時的な測定により得られた結果に基づき、各領域における単一血小板数、小型血小板凝集塊数、大型血小板凝集塊数の変動を図１２に示した。図１２の（Ｉ）はＡＤＰ１μＭ（最終濃度）添加時の結果である。（ＩＩ）はＡＤＰ５μＭ（最終濃度）添加時の結果である。（Ｉ）Ａと（ＩＩ）Ｄは横軸に反応時間を、縦軸に蛍光強度（凝集塊数）をとり、ａｇｇＭ領域における血小板凝集塊数について示したものである。（Ｉ）Ｂと（ＩＩ）Ｅは横軸に反応時間を、縦軸に蛍光強度（凝集塊数）をとり、ａｇｇＬ領域における血小板凝集塊数について示したものである。（Ｉ）Ｃと（ＩＩ）Ｆは横軸に反応時間を、縦軸に蛍光強度（単一血小板数）をとり、ｓＰＬＴ領域における単一血小板数について示したものである。
【００４５】
（Ｉ）のＡＤＰ１μＭ（最終濃度）添加時では、Ａ（ａｇｇＭ領域）における血小板凝集塊数の顕著な増加がみられた。さらに、その増加は反応開始からおよそ６０秒でピークをむかえ、その後減少することが分かった。一方、Ｂ（ａｇｇＬ領域）おいては血小板凝集塊数の顕著な増加が見られなかった。（ＩＩ）のＡＤＰ５μＭ（最終濃度）添加時では、Ｄ（ａｇｇＭ領域）においては血小板凝集塊数の顕著な増加が見られなかったが、Ｂ（ａｇｇＬ領域）においては血小板凝集塊数の顕著な増加がみられた。さらに、その増加は反応開始からおよそ６０秒でピークをむかえることが分かった。これらのことから、ＡＤＰが低濃度の場合は、主に小型の凝集塊数が形成され、その凝集は一定時間経過後に乖離することが分かる。また、ＡＤＰが高濃度の場合は、主に大型の凝集塊が形成され、その凝集は一定時間経過しても乖離しないということが分かる。さらに、Ｃ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）とＦ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）を比較するとＡＤＰが高濃度のほうで単一血小板数の減少が大きいが、これは大型の血小板凝集塊が形成されることによるということが分かる。このように、血小板や血小板凝集塊の数だけでなく、それぞれについて凝集反応経過における変動を確認することにより、血小板凝集能のより詳細な評価ができる。
【００４６】
なお、前記図１１のスキャッタグラムにおいて、１０〜３０μｍ程度の大型血小板凝集塊が出現するａｇｇＬ領域に白血球や有核赤血球が出現し、ａｇｇＬ領域に出現したドット数が実際の大型血小板凝集塊の数よりも多くなる場合がある。そこで、図１１のＢ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）やＣ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）のａｇｇＬ領域に出現したドット数から図１１のＡ（ＡＤＰ非添加）のａｇｇＬ領域に出現したドット数を差し引くことによって、ＡＤＰの添加によりＢ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）やＣ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）のａｇｇＬ領域に出現した大型血小板凝集塊をより正確に計数することができる。このように、図１１のＢ（ＡＤＰ添加・最終濃度１μＭ）やＣ（ＡＤＰ添加・最終濃度５μＭ）のａｇｇＬ領域に出現したドット数から図１１のＡ（ＡＤＰ非添加）のａｇｇＬ領域に出現したドット数を差し引く処理を、前記ステップＳ４（総合分析）において行い、処理結果をステップＳ５（出力）で出力するようにしてもよい。
【００４７】
上記の実施形態の血小板凝集能測定装置は、すべての構成を一体化した装置であるが、本発明はこの構成に限定されない。例えば、図１３で示しているような一部の構成を別体とした装置でもよい。図１３の血小板凝集能測定装置４２は測定装置本体４３とパーソナルコンピューター４４からなる。また、図には示していないが、測定装置本体４３はスタートスイッチ、試料液を調製するための測定用試料調製部、試料液から信号を検出するための測定部および装置の動作をつかさどる第一の制御部を有する。第一の制御部は、各装置の動作を制御する制御プログラムを記憶している第一の記憶部、および第一の記憶部に記憶されている制御プログラムに基づき各装置の動作を制御する動作制御部を有する。パーソナルコンピューター４４は、測定結果を表示出力するための出力画面４５、各種設定入力を行うための入力部４６および分析処理をつかさどる第二の制御部４７を有する。第二の制御部４７は、分析プログラムや分析プログラムによる処理結果を記憶する第二の記憶部、および測定より得られたデータに基づいて分析する分析部を有する。図１３の測定装置本体４３とパーソナルコンピューター４４は、接続コネクタにより接続されている。各装置部の動作は、パーソナルコンピューター４４の入力部４６より入力される測定条件に基づき、測定装置本体４３の第一の制御部により制御される。測定装置本体４３で得られる測定データは、パーソナルコンピューター４４の第二の記憶部に記憶され、分析部により分析される。
【００４８】
本発明の血小板凝集能測定装置に用いる血小板凝集惹起物質について、前記したＡＤＰ以外にもコラーゲン、エピネフリンおよびリストセチンというような血小板凝集惹起物質を用いることができる。また、血小板凝集惹起物質用の希釈液には、前記した精製水以外にも各血小板惹起物質に最適な希釈液を用いることができる。
【００４９】
【発明の効果】
この発明によれば、全血を検体として測定に用いることで、生体に近い状態で血小板凝集能を評価できる。また、検体に血小板の凝集を惹起する物質を添加しないで調製する第１の測定用試料と血小板の凝集を惹起する物質を添加して調製する第２の測定用試料を用いて、血小板や形成される凝集塊の数を経時的に測定することにより、血小板凝集能のより詳細な評価ができる。さらに、検体の血小板数や凝集塊形成に伴う血小板数・血小板凝集塊数の経時的な変動を高感度に検出することより、血小板数が低値の検体においても血小板の凝集能の評価が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の血小板凝集能測定装置の装置構成を示す図である。
【図２】本発明の血小板凝集能測定装置の測定用試料調製部を示す図である。
【図３】本発明の血小板凝集能測定装置の測定部を示す図である。
【図４】本発明の血小板凝集能測定装置のシースフローセル部分を示す図である。
【図５】本発明の血小板凝集能測定装置の制御部と装置各部との関係を示す図である。
【図６】本発明の血小板凝集能測定装置の全体制御のフローを示す図である。
【図７】本発明の測定Ａのフローを示す図である。
【図８】本発明の測定Ｂのフローを示す図である。
【図９】本発明の測定Ａや測定Ｂにおける分析のフローを示す図である
【図１０】本発明の血小板凝集能測定装置における総合分析のフローを示す図である。
【図１１】本発明の実施形態におけるスキャッタグラムである
【図１２】本発明の実施形態における総合分析により得られるグラフである。
【図１３】本発明の血小板凝集能測定装置の装置構成を示す図である。
【符号の説明】
１  血小板凝集能測定装置
２  液晶タッチパネル
３  測定用試料調製部カバー
４  スタートスイッチ
５  制御部
６  測定用試料調製部
７  測定部
８  検体セット部
９  試薬セット部
１０  試薬混合部
１１  凝集反応部
１２  染色部
１３  分注装置
１４  送液装置
２５  シースフローセル
３９  記憶部
４０  分析部
４１  動作制御部
４２  血小板凝集能測定装置
４３  測定装置本体
４４  パーソナルコンピューター
４５  出力画面
４６  入力部
４７  第二の制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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