(57)【要約】【課題】  妊娠の第１の三ヶ月の末期において利用できる出生前スクリーニングの方法の開発【解決手段】  （ａ）スクリーニングを受ける、異常のある胎児を身ごもった妊娠女性及び（ｂ）正常な胎児を身ごもった女性において、妊娠女性からの母親血液を遊離β−hCG 及び少なくとも１種の第２の血清マーカー並びに／又はこれらのマーカーの前駆体及び代謝産物のレベルに関して測定し、そしてこれらのマーカーの測定されたレベルを妊娠女性の在胎齢と共に、遊離β−hCG 及び第２の血清マーカーのレベルの種々の在胎齢における対照値と比較し、その比較がスクリーニングを受ける、異常のある胎児を身ごもった妊娠女性の危険率を示す染色体異常の出生前スクリーニング方法であって、第２の血清マーカーが妊娠関連血漿タンパク質Ａ（PAPPA)であり且つスクリーニングを妊娠期間の第13完了週の終わりまでに実施する方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の染色体異常を出生前スクリーニングする方法であって、
（Ａ）前記染色体異常を有する胎児の妊娠女性の事前年令関連危険率を計算し、
（Ｂ）遊離β−hCG 及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｃ）妊娠関連血漿タンパク質Ａ（PAPPA)及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｄ）上記（Ｂ）及び（Ｃ）で得られたそれぞれの濃度を、前記妊娠女性と同じ在胎齢で妊娠異常のない母集団の女性で求めた中央値で除算することによって標準化された値を計算し、
（Ｅ）標準化された値が前記染色体異常を有する妊娠女性で求めた二変量ガウス分布の一部である第一の確率を計算し、
（Ｆ）標準化された値が妊娠異常のない女性について求めた二変量ガウス分布の一部である第二の確率を計算し、
（Ｇ）前記第一の確率と第二の確率の比である尤度比を計算し、そして
（Ｈ）前記尤度比によって事前年令関連危険率を修正する
ことを含んでなる胎児染色体異常の出生前スクリーニング方法。
【請求項２】
前記染色体異常がダウン症候群である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記染色体異常がエドワード症候群、Pateaus症候群、ターナー症候群、モノソミーＸ、クラインフェルター症候群及びこれらの組合せから選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遊離β−hCG 、その前駆体及び代謝産物の、妊娠女性の母親血液濃度の測定値を受け入れるように適合させた手段並びに
（Ａ）前記染色体異常を有する胎児の妊娠女性の事前年令関連危険率を計算し、
（Ｂ）遊離β−hCG 及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｃ）妊娠関連血漿タンパク質Ａ（PAPPA)及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｄ）上記（Ｂ）及び（Ｃ）で得られたそれぞれの濃度を、前記妊娠女性と同じ在胎齢で妊娠異常のない母集団の女性について求めた中央値で除算することによって標準化された値を計算し、
（Ｅ）前記標準化された値が前記染色体異常を有する妊娠女性で求めた二変量ガウス分布の一部である第一の確率を計算し、
（Ｆ）規準化された値が妊娠異常のない女性で求めた二変量ガウス分布の一部である第二の確率を計算し、
（Ｇ）前記第一の確率と第二の確率の比である尤度比を計算し、そして
（Ｈ）前記尤度比によって事前年令関連危険率を修正する
各機能を実施するコンピュータ手段を含んでなる装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体異常に関する出生前スクリーニング方法及びその方法を実施するための装置、特にダウン症候群の出生前スクリーニングのための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎児におけるダウン症候群及びいくつかの他の染色体異常の危険は母体の年齢が増すに従って増加することが知られており、この知識が、更に調査する必要のある妊娠女性を選択するためのベースとなる。例えば、ダウン症候群の場合における更に進んだ研究は、羊水穿刺による羊水のサンプリングを伴い、その手法自体が胎児の母親に対する危険を伴い、流産の誘発がこの手法の危険として認められる。
【０００３】
ダウン症候群に関する母親の血清マーカーが、この染色体異常に関する出生前スクリーニングのために広く使用されており、このマーカーの最も一般的なものはα−フェトプロテイン（AFP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG)−その無傷の分子又はそのβサブユニット−及び非結合（unconjugated）エストリオール（uE）である。ダウン症候群に関する出生前スクリーニングにおけるこれらのマーカーの使用に関する開示としては、特許文献１〜３が挙げられる。特許文献４は、エドワード症候群に関する出生前スクリーニングにおいてマーカーとして hCGのβサブユニットを使用することを開示している。
【０００４】
母親の血清のスクリーニングは、異常を有する子供を産む最大の危険にさらされ且つ異常の危険率が侵襲性診断操作の危険率を優ると考えられる女性の小群を選択することに基づく。この危険率は、事前年齢関連危険率に尤度比（likelihood ratio）を乗じることによって計算される。尤度比は、個々の血清マーカー濃度の値に対応する、障害のある妊娠及び障害のない妊娠におけるマーカー分析物の多変量ガウス分布関数の相対高さから計算される。
【０００５】
種々の分析物の濃度は通常は在胎齢によって変化するので、分析物濃度は補正されなければならない。補正は、分析物の濃度を、障害のない妊娠をしている女性の所定の在胎齢に関して期待される中央濃度で除することによって行われる。これは中央値の倍数（MoM)と称される。
【０００６】
出生前スクリーニングにおいて２種又はそれ以上のマーカーを一緒に使用することは有利であり得る。例えば、マーカーAFP 、hCG及びuEを一緒に使用することができる。マーカー分析物の組合せは、単一のマーカーのみによって又は順次に使用される複数のマーカーの群によって与えられるよりも有意に多くの情報を与える。多変量組合せから導かれる尤度比の使用は、女性が障害のある子供を身ごもる危険に関する情報を得る有効な手段である。
【０００７】
常用されている、又は近いうちに常用されるようになりそうな母親の血清マーカーを用いるこの出生前スクリーニング方法は、概ね14〜26週の妊娠の第２の三ヶ月期におけるスクリーニングによる。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４８７４６９３号明細書
【特許文献２】ＷＯ８９／００６９６号明細書
【特許文献３】ＷＯ９０／０８３２５号明細書
【特許文献４】米国特許第５１００８０６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、14週以下の妊娠の第１の三ヶ月期における母親の血清のスクリーニングは第２の三ヶ月期におけるスクリーニングよりもかなり有利である。第１の三ヶ月期においては、母親と胎児との結合が、第２の三ヶ月期よりも強くなく、従って、たとえ胎児が障害を有するとしても、精神的衝撃がより少ない。更に、妊娠中絶の方法は第２の三ヶ月期、特に第２の三ヶ月期の末期、即ち、概ね18週〜25週又は26週において利用できる方法より母親にとってはるかに精神的衝撃が少なく且つ安全である。出生前スクリーニングの現在の方法のいくつかが実施される必要があるのは第２の三ヶ月期の末期である。
【００１０】
従って、本発明の目的は、妊娠の第１の三ヶ月期において容易に実施できる、２種又はそれ以上の母親の血清マーカーを使用する染色体異常の出生前スクリーニング方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、胎児の染色体異常を出生前スクリーニングする方法であって、
（Ａ）前記染色体異常を有する胎児の妊娠女性の事前年令関連危険率を計算し、
（Ｂ）遊離β−hCG 及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｃ）妊娠関連血漿タンパク質Ａ（PAPPA)及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｄ）上記（Ｂ）及び（Ｃ）で得られたそれぞれの濃度を、前記妊娠女性と同じ在胎齢で妊娠異常のない母集団の女性で求めた中央値で除算することによって標準化された値を計算し、
（Ｅ）標準化された値が前記染色体異常を有する妊娠女性について求めた二変量ガウス分布の一部である第一の確率を計算し、
（Ｆ）標準化された値が妊娠異常のない女性について求めた二変量ガウス分布の一部である第二の確率を計算し、
（Ｇ）前記第一の確率と第二の確率の比である尤度比を計算し、そして
（Ｈ）前記尤度比によって事前年令関連危険率を修正することを含んでなる胎児染色体異常の出生前スクリーニング方法が提供される。
【００１２】
更に、本発明によれば、遊離β−hCG 、その前駆体及び代謝産物の、妊娠女性の母親血液濃度の測定値を受け入れるように適合させた手段並びに
（Ａ）前記染色体異常を有する胎児の妊娠女性の事前年令関連危険率を計算し、
（Ｂ）遊離β−hCG 及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｃ）妊娠関連血漿タンパク質Ａ（PAPPA)及び／又はその前駆体及び／又はその代謝産物の濃度に関して、妊娠期間の第１３完了週の終りまでに妊娠女性の血液を測定し、
（Ｄ）上記（Ｂ）及び（Ｃ）で得られたそれぞれの濃度を、前記妊娠女性と同じ在胎齢で妊娠異常のない母集団の女性について求めた中央値で除算することによって標準化された値を計算し、
（Ｅ）標準化された値が前記染色体異常を有する妊娠女性で求めた二変量ガウス分布の一部である第一の確率を計算し、
（Ｆ）標準化された値が妊娠異常のない女性で求めた二変量ガウス分布の一部である第二の確率を計算し、
（Ｇ）前記第一の確率と第二の確率の比である尤度比を計算し、そして
（Ｈ）前記尤度比によって事前年令関連危険率を修正する
各機能を実施するコンピュータ手段を含んでなる装置が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法は、広範囲の染色体異常に関する出生前スクリーニングに使用できる。これらのうち最も重要であり且つ最も頻度が高いのはダウン症候群（トリソミー(Trisomy) 21）である。本発明を使用してスクリーニングできる他の異常としては、エドワード症候群（トリソミー18）、 Pateaus症候群（トリソミー13）、ターナー症候群、モノソミーＸ及びクラインフェルター症候群が挙げられる。本発明の方法は、個々の異常をスクリーニングするため、又は異常の群を一緒にスクリーニングするために使用でき、例えばダウン症候群及びエドワード症候群の両者をスクリーニングするのに使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法は、hCG 及びPAPPA の他の、血液サンプル中の他の血清マーカーを測定するのに使用できる。このような他のマーカーとしては、α−フェトプロテイン（AFP)、非結合エストリオール（uE）、インヒビン（In）、プロゲステロン（Pr）、16−α−ヒドロキシ−デヒドロエピアンドロステロンサルフェート（16−α−ヒドロキシ−DHEAS)及びデヒドロエピアンドロステロンサルフェート（DHEAS)並びにこれらのマーカーの前駆体及び代謝産物が挙げられる。例えば、１種又はそれ以上のこれらの他のマーカーが本発明のアッセイキットの主要なマーカーと共に測定できる。例えば本発明の方法は、測定すべきマーカーとして、hCG 、PAPPA 及びAFP を用いて使用できる。
【００１５】
妊娠期間の第１の三ヶ月期の間に、即ち、妊娠の第13完了週の最後までに採取された血液サンプルに関して本発明の方法を用いて測定を実施する。好ましくは、測定は、妊娠の第８週最初と第13週の最後との間の期間（第８週〜第13週）に採取された血液サンプルに関して測定を行う。個々の血清マーカーに関する女性の測定血清値を、同一在胎齢の障害のない妊娠をしている女性において見られる期待中央値で除して、（MoM)を得る。試験された血清マーカーの組合せに関する（MoM)値が障害を持たない妊娠において見られる値の多変量分布に属する確率を計算する。同様な計算を、値の個々の組合せが異常な妊娠にみられる多変量分布の部分を形成する確率に関して行う。２つの確率の比を尤度比（LR）と称し、それは、個々の女性が障害のある妊娠をしているか否かの尤度を示す。障害のある妊娠の多変量分布と障害のない妊娠の多変量分布との間の分離度は在胎齢と共に変化する、即ち、在胎齢に依存する確率を計算する方法は連続的に変化する。この連続的変化は、計算において使用されるアルゴリズムに組み込むことができる。
【００１６】
個々の女性は、母親血清マーカー濃度とは独立した、事前年齢関連危険率を有する。ベイズの定理による、女性の年齢に関連した危険率は、あらかじめ得られた尤度比（LR）を掛けることによって修正されて、合計危険率が得られる。次いで、この合計危険率は、以後の侵襲性診断方法に関連した流産の危険とは異なって、異常の相対的危険に関して女性に助言するのに使用できるものである。
【００１７】
妊娠の第１の三ヶ月期において、hCG の遊離βサブユニットの濃度はダウン症候群の胎児を身ごもった女性においては比較的高く、エドワード症候群（トリソミー18）の胎児を身ごもった女性においては比較的低い。逆に、PAPPA のレベルは、妊娠の第１の三ヶ月期の間において、ダウン症候群又はトリソミー18の子供を身ごもった女性において正常よりも低い。第１の三ヶ月期にある、障害のある子供を身ごもった女性の危険率を計算するために、障害のある妊娠と障害のない妊娠の両者に関して PAPPA及び遊離β−hCG の測定値を合わせて、二変量分布（bivariate distribution）とすることがこれによって極めて適当になった。
【実施例】
【００１８】
本発明を以下の実施例によって説明する：
例１
PAPPA と遊離β−hCG との組合せを用いて個々の女性の危険率を測定することができる方法の例を、一例として年齢35才の女性を用いて以下に示す。
【００１９】
例中、多数の一連の計算は以下のようにして行う。
【００２０】
ａ）事前年齢危険率
これは、ダウン症候群の子供を産む女性の危険率及び出産日におけるその女性の年齢に関連する疫学的調査データから求められる（Cuckle, H.S., Wald, N.J.及びThompson, S.G., British Journalof Obstetrics and Gynaecology (1987), 94巻, 387〜402頁）。
【００２１】
出産の危険率は以下の式を用いて計算する。
【００２２】
【数１】
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【００２３】
ｂ）中央値の倍数の計算
妊娠期間の第１の三ヶ月期において、PAPPA 及び遊離β−hCGレベルは有意に変化する。これを考慮に入れて、母親血清からの全てのアッセイの結果を最初に、中央値の倍数に変換して、その分析物に関する実際の結果を、障害を持たない妊娠のその週に関して期待されるであろうものに関連づける。
【００２４】
在胎齢（日まで評価）に関する期待値に対する個々の女性のアッセイ結果の比は中央値（MoM)の倍数と称され、その女性の危険率の計算に必要とされるのがこの値である。
【００２５】
尤度比の計算−これを計算するのに使用される統計的方法は三変量ガウス度数分布分析（trivariate Gaussian frequency distribution analysis）である。一連の定数が尤度比を計算するのに必要とされる。これらは以下の通りである：
−ダウン症候群の及び障害のない妊娠の両者に関するPAPPA 及び遊離β−hCG の度数分布の平均及び標準偏差（ガウス分布を保証するために変換させられたlog）
−ダウン症候群の及び障害のない妊娠に関するPAPPA 及び遊離β−hCG の各対の組合せの間の相関係数。
【００２６】
障害のない妊娠及びダウン症候群に関係のある妊娠の確率を求めるのに使用される方法の説明は以下の通りである。
確率の決定
単一のアッセイに関しては、確率の数値計算は極めて簡単である。
単一の結果が正常範囲であるか又はダウン症候群の範囲であるかの確率は下記式によって示される。
【００２７】
【数２】
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【００２８】
［式中、μ＝障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母平均
σ＝障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母集団の標準偏差
Ｘ＝変換されたサンプル値］
一対のアッセイを使用する場合には、下記の二変量分布関数を使用する。
【００２９】
【数３】
2005017305.tif 000005
【００３０】
［式中、μx ＝分析物ｘの、障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母平
均
μy ＝分析物ｙの、障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母平
均
σx ＝分析物ｘの、障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母集
団の標準偏差
σy ＝分析物ｙの、障害のない妊娠又は障害のある妊娠に関する変換された母集
団の標準偏差
Ｘ＝変換されたサンプル値、分析物ｘ
Ｙ＝変換されたサンプル値、分析物ｙ
ρ＝障害のある妊娠又は障害のない妊娠に関する変換されたｘ及びｙの間の相
関係数］
【００３１】
合計危険率の計算
最後の工程は、合計危険率の計算である。これは以下の式によって示される。
合計危険率  ＝  年齢関連危険率  ×  尤度比
障害のない妊娠又はダウン症候群の妊娠に関する単変量（univariate）又は二変量（bivariate)ガウス分布に使用される統計的分布を表Ｉに示す。これらは、16例の第１の三ヶ月期のダウン症候群のサンプル及び 350例の障害のない対照サンプルの研究から得られた。 Logガウス単変量及び二変量分布はデータによく一致した。従って、表Ｉの統計的分布は自然対数変換後の MoM値に関係する。全てのデータは中央値（MoM)の倍数の自然対数として表した。障害のない妊娠及びダウン症候群の障害のある妊娠においては、共分散は統計学的に有意差がなかったので、前に示すようにプールした。
【００３２】
【表１】
2005017305.tif 000006
【００３３】
35才の女性の事前危険率（表Ｉに従う）＝１：384 。
【００３４】
種々のレベルの遊離β−hCG 及びPAPPA を有する35才の女性に関する危険因子を表IIに示す。これは、尤度比及び最終危険率を示す２つのセクション（各々、２ａ及び２ｂ）に分ける。
【００３５】
【表２】
2005017305.tif 000007
【００３６】
表IIの結果は、最初の試験の結果がわかっていたとしても、他の結果が更に情報を提供することを示す。例えば、35才の女性が1.0MoM の PAPPAレベルを有していた場合には、１：384 の事前年齢関連危険率は、0.5 MoM の遊離β−hCG においては１：3670に、2.0MoM の遊離β−hCGレベルにおいては１：215 に修正されていたであろう。
【００３７】
例２
所期の臨床の場においてスクリーニングの成績を現実的に評価するためには、スクリーニングされる一般的な母集団に適用された場合の成績をシミュレートすることが必要である。
【００３８】
5000組の値は、 MINITAB(TM)（統計パッケージ）を用いて、表Ｉに記載した障害のない妊娠に関する単変量及び二変量logガウス分布から構成された。
【００３９】
ダウン症候群の障害を持つ妊娠に関する分布に対応する5000組のデータも同様に構成された。
【００４０】
各サンプルに関して、尤度比は例１に記載したのと同様にして、PAPPA 及び遊離β−hCG に関して単変量的に、且つ両者を組み合わせて用いて二変量的に計算した。
【００４１】
イングランド（England)及びウェールズ（Wales)における1986年〜1988年の妊娠の年齢分布を、対照母親年齢分布として使用した。
【００４２】
シミュレーションは以下のようにして行った：
種々の危険率カットオフ（１：100〜１：500）を調べた。各危険率カットオフ及び各母親年齢（11才〜55才）に関して、年齢危険率をそのカットオフ以下に変えるのに必要な尤度比を計算した。5000例のシミュレートされた障害のないサンプルにおける尤度比の割合は、スクリーニング陽性であろう、その年齢の障害のない女性の割合を決定する。5000例のシミュレートされたダウン症候群の障害のあるサンプルにおける尤度比の割合は、スクリーニング陽性であろうその年齢の女性の割合を決定する。
【００４３】
それらの割合にその年齢の女性の実際の数を掛けることによって、その母親の年齢における偽陽性率（スクリーニング陽性である、障害のない女性の百分率）及び検出率（スクリーニング陽性である、ダウン症候群の障害のある女性の百分率）が示される。
【００４４】
全年齢の女性についての各数の合計は、一般的母集団全体における偽陽性率及び検出率全体を示す。
【００４５】
種々の危険率カットオフ値の調査によって、偽陽性率を検出率に関連づける受信者動作特性曲線（ROC曲線）の構築が可能になる。
【００４６】
ROC曲線は第３図に示され、この図は、マーカーとして遊離β−hCGのみ＋年齢（曲線５）、 PAPPAのみ＋年齢（曲線６）及びこれらの２種のマーカーの組合せ＋年齢（曲線７）を用いてスクリーニング陽性率と検出率との関係を示す。第３図から、マーカーの組合せを用いる場合には検出率はいずれかのマーカーを別個に用いる場合の検出率よりもかなり増大することがわかる。
【００４７】
表IIIは、血清マーカーの種々の組合せに関する、種々のスクリーニング陽性率における実際の検出率を示す。
【００４８】
【表３】
2005017305.tif 000008
【００４９】
表IIIの結果は、血清マーカーとして遊離β−hCG とPAPPA とを組み合わせる場合には検出率が有意に改良されることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ダウン症候群（曲線２）の及びダウン症候群でない（曲線１）の第１の三ヶ月期の妊娠におけるMoM として表される、母親血清PAPPA の度数分布を示す、 log目盛のPAPPA MoM に対する度数のグラフである。
【図２】ダウン症候群（曲線３）の及びダウン症候群（曲線４）でない第１の三ヶ月期の妊娠におけるMoM として表される母親血清遊離β−hCG の度数分布を示す log目盛のβ−hCG MoM に対する度数のグラフである。
【図３】検出率（異常の合計危険率が所定のカットオフ危険率よりも大きい女性の割合）とスクリーニング陽性率（所定のカットオフ危険率よりも大きい合計危険率を有する、障害のある及び障害のない全ての女性の割合）との間の関係を示す、一連の受信者動作特性曲線を含む。第３図中の個々の曲線の詳細は例２中に後述する。
【図１】
2005017305.tif 000009
【図２】
2005017305.tif 000010
【図３】
2005017305.tif 000011