(57)【要約】【課題】  副作用が軽減され、優れた抗腫瘍作用を有する抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】    式（Ｉ）    【化１】2005120083.tif 000010で表される化合物またはその医薬として許容される塩と、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる抗腫瘍剤、式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容される塩を有効成分として含有する、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強剤、およびアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、式（Ｉ）で表される化合物または医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強剤。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2005120083.tif 000004
で表される化合物またはその医薬として許容される塩と、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる抗腫瘍剤。
【請求項２】
肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍剤である、請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
式（Ｉ）
【化２】
2005120083.tif 000005
で表される化合物またはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍効果増強剤である、請求項３記載の増強剤。
【請求項５】
アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、式（Ｉ）
【化３】
2005120083.tif 000006
で表される化合物またはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍効果増強剤である、請求項５記載の増強剤。
【請求項７】
式（Ｉ）
【化４】
2005120083.tif 000007
で表される化合物またはその医薬として許容される塩とアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる併用剤、および該併用剤を抗腫瘍剤の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該併用剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
【請求項８】
式（Ｉ）
【化５】
2005120083.tif 000008
で表される化合物またはその医薬として許容される塩を含有する製剤、および該製剤をアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
【請求項９】
アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有する製剤、および該製剤を式（Ｉ）
【化６】
2005120083.tif 000009
で表される化合物またはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強の用途に使用することができる、または使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、後掲の式（Ｉ）で表される化合物またはその医薬として許容される塩と、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、腫瘍、特に悪性腫瘍の化学療法においては抗腫瘍剤を単独で投与しても所望の抗腫瘍効果が得られることはまれであり、その効果を増大させるために臨床の場では作用機序の異なった２剤あるいは３剤以上を組み合わせた多剤併用療法が行われている。この併用療法は、作用機序の異なった抗腫瘍剤を組み合わせることにより、１）非感受性細胞集団を減少させる、２）薬剤耐性出現を予防あるいは遅延させる、３）毒性の異なる薬剤の組み合わせにより毒性を分散させるなど、副作用の軽減や抗腫瘍作用の増強を目的としている。しかしながら作用機序の異なる抗腫瘍剤を漫然と組み合わせて併用療法を行っても必ずしも抗腫瘍作用の増強効果が得られるとは限らず、より高い抗腫瘍作用を示す抗腫瘍剤の組み合わせによる併用効果の研究がなされている。
【０００３】
式（Ｉ）
【０００４】
【化１】
2005120083.tif 000002
【０００５】
で表される化合物またはその医薬として許容される塩（以下、化合物Ａとも称する。配列番号１）は既知であり、特に式（ＩＩ）
【０００６】
【化２】
2005120083.tif 000003
【０００７】
で表される立体異性体（以下、ＦＫ２２８とも称する）またはその医薬として許容される塩は、ヒストンデアセチラーゼを強力かつ選択的に阻害することにより、強力な抗腫瘍活性を有すること、更にまた、当該物質は、処理した細胞にヒストンの高アセチル化を引き起こし、結果として、各種遺伝子の転写調節活性、細胞周期阻害活性およびアポトーシスを誘導することが報告されている（例えば特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００８】
しかしながら、化合物Ａとアンスラサイクリン系抗癌剤との併用、ならびに併用によって得られる効果についての報告はまだなされていない。
【０００９】
一方、アンスラサイクリン系抗癌剤である塩酸アムルビシンは、抗ＨＥＲ２抗体あるいはシスプラチンとの併用効果については報告されているが（特許文献２、特許文献３参照）、化合物Ａとの併用、ならびに併用によって得られる効果についての報告はまだなされていない。
【特許文献１】特公平７−６４８７２号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０９７５４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／６０４５３号パンフレット
【非特許文献１】「エクスペリメンタル  セル  リサーチ(Experimental Cell Research)」,（米国），１９９８年、第２４１号、ｐ.１２６−１３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、副作用が軽減され、優れた抗腫瘍作用を有する抗腫瘍剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意研究した結果、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせた併用により、抗腫瘍効果が顕著に増強されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
【００１２】
［１］化合物Ａと、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる抗腫瘍剤。
［２］肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍剤である、上記［１］記載の抗腫瘍剤。
［３］化合物Ａを有効成分として含有する、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強剤。
［４］肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍効果増強剤である、上記［３］記載の増強剤。
［５］アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、化合物Ａの抗腫瘍効果増強剤。
［６］肺癌、悪性リンパ腫、消化器癌、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫、膀胱癌、白血病、腎臓癌、または前立腺癌に対する抗腫瘍効果増強剤である、上記［５］記載の増強剤。
［７］化合物Ａと、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる併用剤、および該併用剤を抗腫瘍剤の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該併用剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
［８］化合物Ａを含有する製剤、および該製剤をアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
［９］アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有する製剤、および該製剤を化合物Ａの抗腫瘍効果増強の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージ。
【発明の効果】
【００１３】
化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩との併用により、抗腫瘍効果が顕著に増強される。
したがって、化合物Ａおよびアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を組み合わせてなる本発明の抗腫瘍剤は、化合物Ａまたはアムルビシンまたはその医薬として許容される塩をそれぞれ単独で投与する場合に比べ、低用量でより高い癌の治療効果が得られ、副作用を低く抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で使用される化合物Ａは、不斉炭素原子および二重結合に基づく光学活性体または幾何異性体等の立体異性体を有することがあるが（例えばＦＫ２２８）、これらすべての異性体及びそれらの混合物もこの発明において用いられる化合物Ａの範囲に含まれる。
さらに、化合物Ａ、ＦＫ２２８またはそれらの医薬として許容される塩の溶媒和化合物（例えば包接化合物（例えば水和物等））もこの発明の範囲に含まれる。
以下、本明細書中、特に断りのない限り、単に化合物Ａと言う場合にはＦＫ２２８またはその医薬として許容される塩も含む、立体異性を問わない化合物群を意味する。
【００１５】
化合物Ａは、公知の物質であり、入手可能である。例えば、化合物Ａの立体異性体の一つであるＦＫ２２８は、それを生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株を好気性条件下に培養、当該培養ブロスから当該物質を回収することによって得ることができる。ＦＫ２２８を生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株としては、例えばクロモバクテリウム・ビオラセウムＷＢ９６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６８）が挙げられる。ＦＫ２２８はより具体的には特公平７−６４８７２号（対応米国特許４９７７１３８号）公報に記載したとおりにして当該生産菌から得ることができる。ＦＫ２２８は、より容易に入手できるという点で、ＦＫ２２８を産生しうるクロモバクテリウム属に属する菌株からの回収が好ましいが、さらなる精製工程が不要あるいは少なくてすむという点で、合成あるいは半合成のＦＫ２２８もまた有利である。同様にＦＫ２２８以外の化合物Ａについても、従来公知の方法により半合成、前合成することができる。より具体的にはKhan W.Li,らによって報告されている方法（J. Am. Chem. Soc., Vol. 118, 7237-7238 (1996)）に準じて製造することができる。
【００１６】
化合物Ａにおける医薬として許容される塩の形態としては、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロへキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸・スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩または酸付加塩が挙げられる。
【００１７】
本発明で使用されるアムルビシン （（＋）−（７Ｓ，９Ｓ）−９−アセチル−９−アミノ−７−［（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，１１−ジヒドロキシ−５，１２−ナフタセンジオン）は、既存のアンスラサイクリン系化合物であり、例えば特公平３−５３９７号（対応米国特許４６７３６６８号）公報に記載の方法によって製造することができる。
【００１８】
アムルビシンの医薬として許容される塩としては、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸・スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、酸付加塩が挙げられる。
【００１９】
本発明において、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩との併用により、抗腫瘍作用が顕著に増強される。したがって、本発明の抗腫瘍剤および抗腫瘍効果増強剤は、血液癌および固型癌等を含む癌疾患、より具体的には、肺癌、悪性リンパ腫(例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等)、消化器癌（例えば、胃癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等）、乳癌、卵巣癌、骨軟部肉腫(例えば、骨肉腫等)、膀胱癌、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病の急性転化を含む急性白血病等）、腎臓癌、および前立腺癌等の治療薬として有用である。
【００２０】
本発明の抗腫瘍剤は、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなるもの（即ち、併用剤）であり、投与時に化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わすことができるものであればよい。従って、本発明の抗腫瘍剤は、投与時に化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わすことができるものであれば、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを同時に製剤化して得られる単一の製剤であっても、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを別々に製剤化して得られる少なくとも二種の製剤を組み合わせたものであってもよい。
投与形態は、特に限定されず、例えば、（１）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを含有する組成物、即ち、単一の製剤としての投与、（２）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与（例えば化合物Ａ、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）、（４）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば化合物Ａ、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。
なお、時間差をおいての投与の場合、抗腫瘍効果を増強するに足る時間、両者が体内で共存していることが必要である。
【００２１】
本発明の増強剤は、化合物Ａあるいはアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有してなるものであり、投与時に化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わすことができるものであればよい。従って、本発明の増強剤は、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を単一の製剤中に含有するものであってもよく、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を別々に製剤化して得られる製剤であっても併用剤として他方を別途投与すればよい。
投与形態は、特に限定されず、例えば、（１）アムルビシンまたはその医薬として許容される塩と化合物Ａとを単一の製剤中に含有する本発明の増強剤の投与、（２）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の同一投与経路での同時投与、（３）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の同一投与経路での時間差をおいての投与（例えばアムルビシンまたはその医薬として許容される塩、化合物Ａの順序での投与、あるいは逆の順序での投与）、（４）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の異なる投与経路での同時投与、（５）化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えばアムルビシンまたはその医薬として許容される塩、化合物Ａの順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。
なお、時間差をおいての投与の場合、上記抗腫瘍剤と同様に両者が体内で共存していることが必要である。
【００２２】
本発明において、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩との組合せの割合は、両者が単一製剤とされる場合、別個の製剤とされる場合のいずれにおいても、重量比率として、通常１：１０００〜１００：１の範囲であり、１：１０〜１０：１の範囲が好ましく、１：５〜１：１の範囲がさらに好ましい。
【００２３】
更に、本発明の抗腫瘍効果を増強させるために、ＡＴＲＡ（all-trans-retinoic acid）と併用して投与（例えば合剤として投与、別々の製剤として同時または前後別々に投与）することも好ましい。
【００２４】
本発明の抗腫瘍剤は、医薬製剤の形態、例えば、有効成分として化合物Ａ、および／またはアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有し、経直腸、外用（局所）、経口または非経口（皮下、静脈内および筋肉内を含む）投与に適した固体、半固体または液体（錠剤、ペレット剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾール剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、注射液など）の形態で使用できる。
【００２５】
本発明の抗腫瘍効果増強剤は、医薬製剤の形態、例えば、有効成分として化合物Ａおよび／またはアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有し、経直腸、外用（局所）、経口または非経口（皮下、静脈内および筋肉内を含む）投与に適した固体、半固体または液体（錠剤、ペレット剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾール剤、散剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、注射液など）の形態で使用できる。
【００２６】
本発明の抗腫瘍剤および抗腫瘍効果増強剤は、製薬目的で慣用されている種々の有機または無機担体、例えば賦形剤（例えばスクロース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなど）、縮合剤（例えばセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、スクロース、デンプンなど）、崩壊剤（例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、エアロシル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、矯味剤（例えばクエン酸、メントール、グリシン、オレンジ末など）、保存剤（例えば安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベンなど）、安定化剤（クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸など）、懸濁剤（例えばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウムなど）、分散剤（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、希釈剤（例えば水など）、基材ワックス（例えばカカオバター、ポリエチレングリコール、白色ワセリンなど）を用いる常法によっても製造することができる。
また、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有する医薬製剤は、例えば特許第２６０３４８０号（対応米国特許４９５２５６６号）明細書に記載の方法によっても製造することができる。
【００２７】
本発明の抗腫瘍剤および抗腫瘍効果増強剤は、ヒトを含む哺乳動物に上記慣用の医薬製剤の形で、特に限定なく投与することができるが、その中でも静脈内、筋肉内または経口投与するのが好ましい。
【００２８】
本発明における投与量は、化合物Ａまたはアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を単独で投与した場合より低用量（例えば、単独で投与した場合の最高投与量の約０．４倍〜約１．０倍）に設定することができる。
例えば、患者の体重および／または年令ならびに／または疾病の程度さらには投与経路のような種々の要因によって適宜選択されるが、通常、化合物Ａおよびアムルビシンまたはその医薬として許容される塩を合わせた投与量として、静脈内投与の場合には、ヒトの体表面積ｍ２あたり１日量５〜３００ｍｇ、好ましくは２０〜２５０ｍｇ、更に好ましくは３５〜１６０ｍｇの範囲で連続点滴投与して処置することができる。この場合、化合物Ａの投与量としては、ヒトの体表面積ｍ２あたり化合物Ａの量で１日量０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇ、更に好ましくは５〜３０ｍｇが挙げられる。また、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩の投与量としては、ヒトの体表面積ｍ２あたりのアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の量で１日量５〜２００ｍｇ、好ましくは２０〜２００ｍｇ、更に好ましくは３０〜１３０ｍｇである。アムルビシンまたはその薬学上許容される塩の投与スケジュールとしては、例えば単回投与、１日１回３日間投与等を挙げることができる。アムルビシンまたはその薬学上許容される塩を単回投与する際のヒトの体表面積ｍ２あたり投与量としては、例えば約８０〜約１３０ｍｇ、好ましくは約１１０〜約１３０ｍｇ、特に好ましくは約１２０ｍｇ等を挙げることができる。３日間連日投与をする際のヒトの体表面積ｍ２×１日当たりの投与量としては、例えば約２５〜約５０ｍｇ、好ましくは約３０〜約４５ｍｇ、さらに好ましくは約３５〜約４５ｍｇを挙げることができる。
【００２９】
本発明には、化合物Ａとアムルビシンまたはその医薬として許容される塩とを組み合わせてなる併用剤、および該併用剤を抗腫瘍剤の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該併用剤に関する記載物を含む、商業パッケージ；化合物Ａを含有する製剤、および該製剤をアムルビシンまたはその医薬として許容される塩の抗腫瘍効果増強の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージ；および、アムルビシンまたはその医薬として許容される塩を含有する製剤、および該製剤を化合物Ａの抗腫瘍効果増強の用途に使用することができるまたは使用すべきであることを記載した該製剤に関する記載物を含む、商業パッケージが含まれる。
【００３０】
本発明の有用性を示すために、薬理試験結果を以下に示す。
【実施例１】
【００３１】
試験例１：
肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＴＣ(AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION)より入手）を１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地で培養した。
３×１０３個/ウェルの各肺腺癌細胞を９６ウェルプレートで終夜培養後、種々の濃度のＦＫ２２８（１．５６２ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭおよび２５ｎＭ）、アムルビシン（０．１５６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭおよび５μＭ）、あるいは両薬剤（前記各濃度の組み合わせ）を含む１００μｌ培地と交換し、さらに４８時間の培養を行った。
各処理による抗腫瘍活性の評価はＭＴＴアッセイにより行った。すなわち、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾニウム ブロミド (ＭＴＴ)を１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解し、各ウェルに１０μｌ加え４時間培養した。生細胞により形成されたホルマザンを酸性イソプロパノール１００μｌを加え溶解し、５７０ｎｍの波長（リファレンス波長６５０ｎｍ）で各ウェルの吸光度を測定した。
無処置の細胞における吸光度(ＯＤ)を１００％として、各薬剤単独あるいは併用での抗腫瘍活性の濃度反応曲線を作成した。図１および図２に示す。
【００３２】
ＦＫ２２８とアムルビシンの併用効果はＳｔｅｅｌらの方法（Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 5: 85-91, 1979）にしたがって、アイソボログラム解析で評価した。すなわち、各薬剤単独の濃度反応曲線より、併用した際の５０％増殖抑制濃度(ＩＣ５０)を理論的に求めグラフ上に曲線で示し、実際の併用でＩＣ５０となった薬剤濃度をプロットした(図３参照)。プロットが曲線に囲まれた範囲（ｂ）に位置した場合には相加効果、それより原点に近い範囲（ａ）に位置した場合には相乗効果、原点から遠い範囲（ｃ）に位置した場合には拮抗効果があると判定した。なお、単剤でのＩＣ５０値を1として相対値で表現した。
試験例１のアイソボログラムを図４に示す。ＦＫ２２８とアムルビシンの併用により、顕著な抗腫瘍活性の増強が認められた。
【実施例２】
【００３３】
試験例２
肺腺癌細胞株としてＡ５４９の代わりにＰＣ１４細胞（国立がんセンター・西條長宏先生より譲渡）を用いたこと以外は、試験例１と同様にして、ＦＫ２２８とアムルビシンの併用効果を評価した。アイソボログラム解析の結果を図５に示す。
ＦＫ２２８とアムルビシンの併用により、顕著な抗腫瘍活性の増強が認められた。
【実施例３】
【００３４】
製剤例１
ＦＫ２２８          ２０ｍｇ
生理食塩水            ４ｍｌ
ＦＫ２２８ ２０ｍｇを生理食塩水４ｍｌに溶解・希釈し注射用製剤を得る。
【実施例４】
【００３５】
製剤例２
塩酸アムルビシン  １００ｍｇ
生理食塩水            ４ｍｌ
塩酸アムルビシン １００ｍｇを生理食塩水４ｍｌに溶解・希釈し注射用製剤を得る。
【実施例５】
【００３６】
製剤例３
ＦＫ２２８          ２０ｍｇ
塩酸アムルビシン  １００ｍｇ
生理食塩水            ４ｍｌ
ＦＫ２２８ ２０ｍｇおよび塩酸アムルビシン１００ｍｇを生理食塩水４ｍｌに溶解・希釈し注射用製剤を得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ａ５４９細胞に対するＦＫ２２８とアムルビシンの併用による抗腫瘍活性の濃度反応曲線を示すグラフである（実施例１）。
【図２】Ａ５４９細胞に対するＦＫ２２８とアムルビシンの併用による抗腫瘍活性の濃度反応曲線を示すグラフである（実施例１）。
【図３】アイソボログラム解析の概念を示すグラフである。
【図４】Ａ５４９細胞に対するＦＫ２２８とアムルビシンの併用におけるアイソボログラム解析を示すグラフである（実施例１）。
【図５】ＰＣ１４細胞に対するＦＫ２２８とアムルビシンの併用におけるアイソボログラム解析を示すグラフである（実施例２）。
【図１】
2005120083.tif 000011
【図２】
2005120083.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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