(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、不飽和脂肪酸含量の増加した魚類の提供。【解決手段】脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されることにより、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現した不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であり、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、△４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、△５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び△６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子から選ばれるいずれか１又は２以上であり、これらは淡水魚由来のものが好ましく、淡水魚由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターにより発現が促進されるものであることが好ましい。 【効果】コスト、労力の軽減に貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてＥＰＡ、ＤＨＡを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂を利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類。
【請求項２】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする請求項１記載のトランスジェニック魚類。
【請求項３】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に連結されていることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニック魚類。
【請求項４】
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
【請求項５】
不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
【請求項６】
養殖魚であることを特徴とする請求項１〜５記載のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することにより不飽和脂肪酸含量の増加した魚や、これにこれら不飽和脂肪酸含量増加魚の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの健康及び発達における、ｎ−３高度不飽和脂肪酸（ＨＵＦＡ）、特にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）の優れた効果は、広範囲にわたって研究されてきた（例えば、非特許文献１、２、３、４、５参照）。ヒトにおいてはこれらの脂肪酸は、主として海水魚やその抽出物の魚油等から接種しているが、近年、海洋で捕獲する魚の数の減少に伴い、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産に必要な原料の安定供給が脅かされている（例えば、非特許文献６参照）。さらに、２００５年から２０１０年の間には、これらの供給が危機的になると推測されている（例えば、非特許文献７参照）。養殖により魚の生産量を増加させ、捕獲魚からのＥＰＡ及びＤＨＡの供給量の減少による影響を潜在的になくすことが考えられる。しかし、魚類の不飽和脂肪酸合成は魚類が持つ脂肪酸代謝酵素の種類およびその活性によって左右され、淡水魚においてはリノレン酸をＥＰＡやＤＨＡに代謝する酵素を持つが、海水魚においてはその成長及び通常の発達に必要である（例えば、非特許文献８、９、１０、１１参照）が、リノレン酸をＥＰＡやＤＨＡに代謝する酵素を持たないため、餌から摂取している。いわゆる青魚のＥＰＡやＤＨＡはプランクトン由来のＥＰＡやＤＨＡであり、これらの魚の養殖においてはＥＰＡ及びＤＨＡを高レベルで含む飼料が必要である（例えば、非特許文献９、１１参照））。このため、魚の養殖現場においてコスト面で不利なＥＰＡ及びＤＨＡを含む飼料を与えることに対する、海水魚中に含まれると同程度又はそれ以上のＥＰＡ及びＤＨＡを生産するバイオテクノロジーの適用等の代替方法が模索されてきた。
【０００３】
このような代替方法に関する数多くの研究において、魚を含む脊椎動物におけるＥＰＡの生合成が、Δ６及びΔ５不飽和化と鎖伸長反応とを組み合わせることにより、食餌したα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）が転換されて起きることが明らかにされている（例えば、非特許文献参照１２、１３、１４参照）。さらに、ＤＨＡは、２２：５ｎ−３まで、そこから２４：５ｎ−３まで順次、鎖を伸長することによってＥＰＡから合成され、さらに、２４：６ｎ−３までのΔ６不飽和化、最後に、β−酸化を経てペルオキシソームによって、逆転換（retroconverted）し産生されること（例えば、非特許文献１２、１５、１６、１７参照）や、海洋生物の２２：５ｎ−３のΔ４不飽和化によって直接転換するＤＨＡの一工程による合成方法等が報告されている（例えば、非特許文献１８参照）。
【０００４】
近年のトランスジェニック技術の発達により、ヒトの健康に有益な外来タンパク質を有する動物を作出することが可能になった（例えば、非特許文献１９参照）。この技術が、水産養殖にも適用され（例えば、非特許文献２０、２１、２２参照）、卵母細胞の胚胞（例えば、非特許文献２３参照）、又は１細胞期胚の細胞質（例えば、非特許文献２４参照）へのマイクロインジェクション、初期胚（例えば、非特許文献２５参照）又は精子（例えば、非特許文献２６参照）を用いたエレクトロポレーション、レトロウイルス感染（例えば、非特許文献２７、２８参照）及び粒子ガン照射（例えば、非特許文献２９参照）などの方法により、トランスジェニック魚を産生することができることが明らかにされている。これらの全ての方法は、いくつかの魚種における、導入遺伝子のデリバリーを容易にしたが、それぞれの種に適切な方法を選択しなければならず（例えば、非特許文献２２参照）、また、成長率、耐病性、極限環境条件への適応性の改善においても、トランスジェニック技術の適用が魚種により構築されている（例えば、非特許文献２１、３０参照）。
【０００５】
しかしながら、トランスジェニック技術を用いて魚類の代謝経路を改変することをターゲットとした研究はほとんど行われていなかった。かかる研究として、魚類におけるビタミンＣ生合成の欠如を補うための遺伝子導入の可能性について報告されている（例えば、非特許文献３１参照）。この研究は、ビタミンＣの末端反応に触媒として作用するＬ−グルノ−γ−ラクトンオキシダーゼ（ｒＧＬＯ）遺伝子の導入に関するものであるが、ビタミンＣの生成は観察されていない。また、ヒトグルコース輸送タンパク質（ｈＧｌｕＴ）及びラットヘキソキナーゼII（ｒＨＫII）ｃＤＮＡを含むコンストラクトの同時注入による、ニジマスの炭水化物の代謝の改善が試みられたが、ｒＨＫII及びｈＧｌｕＴ１の機能に関する直接的な証拠は観察されていない（例えば、非特許文献３２参照）。この実験で、yamame salmon （Oncorhynchus masou）から単離したΔ６不飽和化酵素様遺伝子が、脂肪酸生合成経路を改変するためにゼブラフィッシュに導入された。このΔ６不飽和化酵素遺伝子は、一般的にＨＵＦＡ生合成において、律速段階であると考えられているので最初のターゲットとされたことが報告されているに過ぎない（例えば、非特許文献３３、３４参照）。
【非特許文献１】Am. J. Clin. Nutr., 54:438-463, 1991
【非特許文献２】Nutrition, 16:143-145, 2000
【非特許文献３】Nutrition, 16:680-684, 2000
【非特許文献４】Prog. Lipid Res, 40:1-94, 2001
【非特許文献５】Nutrition, 18:178-188, 2002.
【非特許文献６】Proc. Nutr. Soc., 58:377-383, 1999
【非特許文献７】Aquaculture (In Press). 2002
【非特許文献８】J. World Aquacult. Soc., 24:152-161, 1993
【非特許文献９】J. Appl. Ichthyol., 11:183-198, 1995
【非特許文献１０】Aquaculture, 179:217-229, 1999
【非特許文献１１】Aquaculture, 200:203-222, 2001
【非特許文献１２】Biochim. Biophys. Acta, 1299: 235-244, 1996.
【非特許文献１３】Prog. Lipid Res., 37:73-117, 1998.
【非特許文献１４】Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000
【非特許文献１５】Biochem. Physiol, 116B:263-267,  1997
【非特許文献１６】FEBS Letters, 431:1-6,  1998
【非特許文献１７】Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000.
【非特許文献１８】J. Biol. Chem., 276: 31561-31566
【非特許文献１９】Transgenic Res., 9: 305-320, 2000.
【非特許文献２０】Biochemistry and molecular biology of fishes, vol. 2., pp: 207-240, 1993.
【非特許文献２１】Aquaculture, 197:191-204, 2001
【非特許文献２２】Suisanzoshoku, 49:137-142, 2001
【非特許文献２３】Cell Differen., 19:237-244, 1986.
【非特許文献２４】Aquaculture, 51:143-150, 1986
【非特許文献２５】Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1:301-308, 1992
【非特許文献２６】Aquaculture, 173:297-307, 1999
【非特許文献２７】Science, 265:666-668, 1994a
【非特許文献２８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:7777-7782,  1996
【非特許文献２９】FEBS Letters, 287:118-120, 1991.
【非特許文献３０】Aquaculture, 204:255-269, 2002
【非特許文献３１】Biochem. Biophys. Res. Commun., 223:650-653, 1996.
【非特許文献３２】Aquaculture, 173:319-332, 1999a
【非特許文献３３】Prog. Lipid Res., 20:13-22,  1981.
【非特許文献３４】J. Biol. Chem., 274:471-477, 1999  また、脂肪酸不飽和化酵素を発現させる遺伝子に関する技術としては、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物に導入して当該動物を形質転換し、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を当該動物において発現させることにより、前記動物において不飽和脂肪酸の含量が増加している形質転換動物（例えば、特許文献１参照）や、脂質に結合した脂肪酸のΔ９位を不飽和化するAnacystis属由来のΔ９不飽和化酵素をコードする遺伝子を導入した高等植物細胞の作出方法（例えば、特許文献２参照）や、単離された動物由来のΔ５−脂肪酸デサチュラーゼおよびその機能しうる部分（例えば、特許文献３参照）や、植物の種子中でのステアリドン酸の産生方法であって、前記方法が、植物のゲノムに、植物種子細胞中で機能的なプロモーター、Δ６−不飽和化酵素をコードするＤＮＡ配列、及び植物種子中で機能的な転写終止領域を５′→３′の転写方向で含む第１のＤＮＡ構築物を組込んだ植物を生長させる工程と、植物をΔ６不飽和化酵素が発現する条件下で生長させる工程とを含む方法（例えば、特許文献４参照）等が提案さている。
【特許文献１】特開２００３−２４５０７０号公報
【特許文献２】特開平１１−３３２４０８号公報
【特許文献３】特表平１４−５０８９３２号公報
【特許文献４】特表平１４−５１７２５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、魚類の脂肪酸代謝経路を改変することにより、従来、海産魚用の配合飼料には、ＥＰＡやＤＨＡを含む魚油を用いることが必要とされていたが、より安価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂を飼料とすることを可能とし、種苗生産現場におけるコスト、労力の軽減に大きく貢献し、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す魚や、その生産方法を提供することや、機能性食品としてＤＨＡを高レベルで含有する魚類や、その生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、不飽和脂肪酸含量が増加した魚を作出するため、外来遺伝子によってコードされている新しい表現型の導入において、宿主個体への外来遺伝子の効率的な転写は重要な要因の１つである（Hacket, 1993; Houdebine, 2000）ところから、最初の段階として、Δ６不飽和化酵素様遺伝子の発現を可能とする適切なコンストラクトを選択した。まず、２〜３ヶ月という比較的短い世代時間、卵の数の多さ、飼育の簡便さなどの複数の利点を有する硬骨ゼブラフィッシュ（Teleostean zebrafish）であるDanio rerio（Westerfield, 1995; Gong, 1999）をモデル魚として選択した。ヤマメ（masou salmon）（Oncorhynchus masou）由来のΔ６不飽和化酵素様ｃＤＮＡを、メダカ（Oryzias latipes）β−アクチンプロモーターの制御下で、ゼブラフィッシュに導入したところ、主に筋肉で発現し、ＥＰＡ及びＤＨＡの含量が増加することを見い出し、上記Δ６不飽和化酵素様遺伝子がΔ６不飽和化酵素活性を実際に有する遺伝子であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類（請求項１）や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする請求項１記載のトランスジェニック魚類（請求項２）や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に連結されていることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスジェニック魚類（請求項３）や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列；
（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；（請求項４）や、不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスジェニック魚類（請求項５）や、養殖魚であることを特徴とする請求項１〜５記載のいずれか記載のトランスジェニック魚類（請求項６）に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、種苗生産現場に於ける、コスト、労力の軽減に大きく貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてＥＰＡ、ＤＨＡを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂を利用することができる。また、本発明により生産された魚類は通常の個体より多くのＤＨＡを含有するため、閉鎖循環式陸上養殖システムを用いて健康食品としての付加価値を有する魚類生産の実現も可能となり、さらに、水産養殖における直接的な利用にとどまらず、魚類の脂肪酸代謝の機構を分子レベルで明らかにする際の極めて有用な研究ツールとして、かかる分野に対する貢献度は極めて高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のトランスジェニック魚類としては、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であれば特に制限されるものではなく、上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては動物由来、植物由来などその由来は特に制限されないが、Δ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を好適に例示することができ、これらは単独で又は多重に用いることができる。かかるΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、脂肪酸の末端カルボキシル基の炭素（デルタエンド）から数えて、それぞれ４番目、５番目、６番目の炭素において不飽和結合を形成するものであり、これらの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、淡水魚由来やプランクトン由来のものが魚類の正常な発育や機能に悪影響を及ぼさないため好ましく、例えば、微細藻類由来のΔ４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(Tonon, T., Harvey, D., Larson, T. R., and Graham, I. A. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acidΔ4-desaturase from the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett.553,440-444(2003).）や、大西洋産サケ由来のΔ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ジーンバンク：AF478472）や、ヤマメ由来のΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ジーンバンク：AB074149,AB070444）を具体的に挙げることができる。
【００１１】
好ましく用いることができるΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ヤマメ由来のΔ６脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列）をコードする塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列；（Ｄ）配列番号１に示される塩基配列（ヤマメ由来のΔ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列）；（Ｅ）配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は（Ｆ）配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなる遺伝子であれば特に制限されず、ここで「脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列」とは、魚類体内で不飽和脂肪酸の生成に何らかの形で関与するタンパク質をコードする塩基配列を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されない。
【００１２】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
【００１３】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００１４】
上記「配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列との相同性が６０％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００１５】
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００１６】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００１７】
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００１８】
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたヤマメより、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００１９】
また、上記（Ｂ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２０】
次に、魚体内で発現する脂肪酸不飽和化酵素により生成される不飽和脂肪酸としては、用いる脂肪酸不飽和化酵素の種類や脂肪酸基質の種類によって異なるが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を好適に例示することができ、ＤＨＡ（２２：６ｎ−３）やＥＰＡ（２０：５ｎ−３）の他、ＬＮＡ（１８：３ｎ−３）、ＯＴＡ（１８：４ｎ−３）、ＥＴＡ（２０：４ｎ−３）、ＤＰＡ（２２：５ｎ−３）、ＴＰＡ（２４：５ｎ−３）、ＴＨＡ（２４：６ｎ−３）、リノール酸（１８：２ｎ−６）、γ−リノレン酸（１８：３ｎ−６）、エイコサトリエン酸（２０：３ｎ−６）、アラキドン酸（２０：４ｎ−６）、ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明の不飽和脂肪酸含量増加される魚類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する魚類であれば、本来、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を有するものであっても、あるいは全く有しないものであってもよいが、養殖の対象とされている魚類、筋肉組織等の可食部分において選択的に不飽和脂肪酸含量が高まる魚類や、子孫にまで安定的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現する魚類等が好ましく、魚の種類としては硬骨魚類が好ましく、硬骨魚類の中でもで、Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae、Ictaluridaeに属する魚類が好ましい。具体的には、ブリ（Seriola quinqueradiata)、マダイ（Pagrus major）、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）、トラフグ（Takifugu rubripes）、ヒラマサ（Seriola aureovittata）、クルマエビ（Penaeus japonicus）、ニジマス(Oncorhyncus mykiss)、カンパチ（Seriola dumerili）、シマアジ（Pseudocaranx dentex）、マハタ（Epinephelus septemfasciatus）、クロマグロ(Thunnus thynnus)等の養殖魚の他、コイ(例えばCyprinus carpio)、ゼブラフィッシュ(Danino rerio)、アフリカナマズ(Clarias gariepinus)、テラピア(Oreochronis niloticus)、タイセイヨウサケ(Salmo Salar)、メダカ(Oryzias latipes)等を好適に例示することができる。
【００２２】
魚類に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する発現ベクターを構築する場合、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を魚類細胞で効率よく発現するプロモーターの下流に連結した発現ベクターを作製することが好ましい。かかるプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、adipocyteP2(aP2)プロモーター、Mylz2 (Danio rerio myosin light polypeptide 2 skeletal muscle mylz2) プロモーター、UCP プロモーター、SV40プロモーター、サイトメガウイルスプロモーター、ＥＦ１ αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター等を例示することができるが、中でもメダカβ−アクチンプロモーターや、mylz2プロモーターが発現効率の点で好ましい。また、ｍＲＮＡを安定化させるために、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の下流にウシ成長ホルモンポリアデニル化配列等のポリアデニル化配列を連結することが好まし。その他必要に応じて、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やエンハンサー配列、転写終結を指令するターミネーター配列を用いることもできる。構築した発現ベクターの魚類への導入は、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウイルスベクター感染法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法によって行うことができる。
【００２３】
本発明のトランスジェニック魚類には、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された魚成体、その子孫の他、魚受精卵細胞、魚胚細胞なども便宜上含まれる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［ゼブラフィッシュの飼育と食餌］
ＡＢ株のゼブラフィッシュ（walker et al., 1999）を用い、Westerfield(1995)の概要にいくつかの修正を行い、魚に産卵させ、飼育した。親魚（broodstock）を、４０リットルの水槽で、明１４時間、暗１０時間の光周期で２８±１℃で飼育した。魚に、市販の餌オトヒメ（otohime）（商品名：Nisshin 社製）及びArtemia（Salt Creek 社製）ノープリウス幼生を、一日おきにそれぞれ給餌した。一日に２回のマイクロインジェクションを可能とするため、４つの水槽にそれぞれに親魚としてメス１２匹とオス８匹を入れた。これらの水槽を、２つのグループに分け、１つのグループは、１０：３０ａｍに産卵させ、他方は、１４：００ｐｍに産卵させた。
【実施例２】
【００２６】
［Δ６不飽和化酵素ｃＤＮＡのクローニング］
GenBank database （ＡＢ０７０４４４）に基づく２つの変性プライマーを用いて、ＰＣＲによりΔ６不飽和化酵素様ｃＤＮＡをヤマメの肝臓から単離した。２つの変性プライマーは、フォーワード及びリバースで、それぞれ、(5'-TACTCCATGGTTCAGCAAATGAATTGAACA-3'；配列番号３)及び（5'-TCGTCCATGGCCATTCACTGCTGACAAGGA-3'；配列番号４）であり、発現ベクターへのクローニングを容易にするため、それぞれNcoI部位（下線部）を含んでいた。ＰＣＲ増幅を下記の条件で行った。９４℃で３分間、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒を３０サイクル、７２℃で１．５分。その後、１６８０ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ｐGEM-T Easy ベクター（Promega社製）にサブクローニングした。
【実施例３】
【００２７】
［導入遺伝子発現の構築］
８．５ｋｂのプラスミドpActD6（図１）を用いて導入遺伝子を発現させた。すなわち、pRc/RSV （Invitrogen社製）をXhoIで処理して取り出したウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ poly(A)）配列を、pBluescriptSK(+/-) （Clontech社製）に結紮した。３．７ｋｂのメダカβ−アクチンプロモーター（ｍβ-Actin）をＰＣＲによって、pOBA-109から修飾し（Takagi et al., 1994）、ＢＧＨｐｏｌｙ（A）を含むpBluescriptSK（+/-）への結紮のためのEcoRI部位を付与した。実施例２で得られた１４７７ｋｂのヤマメ（O. masau）のΔ６不飽和化酵素様遺伝子（Ｄ６Ｄ）を、GenBank  database（ＡＢ０７０４４４）に基づいた２つのオリゴヌクレオチドプライマーとして、SalI認識部位（下線部）を含むフォーワードプライマーSalI-desF3（5'-TTGTCGACGGTCTGAGTGGAGCAGAGAGAA-3'；配列番号５）と、リバースプライマーdes-OmaR（5'-ATCCAGGAAATGTCCTCTCTGTTCGCA-3'；配列番号６）を用い、９４℃で３分、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒を３０サイクル、７２℃で１．５分の条件でＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅産物を、pGEM-T Easy ベクター（Promega社製）にクローニングし、SalIで処理して、Δ６不飽和化酵素様遺伝子断片を得、これをメダカβ−アクチンプロモーター（ｍβ-Actin）とＢＧＨｐｏｌｙ（Ａ）配列との間に挿入し、pActD6コンストラクトを調製した。
【実施例４】
【００２８】
［マイクロインジェクション用のＤＮＡの調製］
実施例３で得られた環状ＤＮＡを、０．１MのＫＣｌ／０．１２５％のテトラメチル−ローダミンデキストラン溶液に、３０μｇ／mｌの濃度で希釈した。ＤＮＡ溶液を、超ＭＣ遠心分離濾過機０．２２μｍ（MILLIPORE社製）で、４℃で５分間、５０００ｒｐｍで微量遠心機で回転し、混入している粒子を取り除いた。３〜４μＬのＤＮＡを、清潔なカバーガラスに移し、蒸発を防ぐために数滴のミネラルオイルで覆った。
【実施例５】
【００２９】
［マイクロインジェクションプレートの調製］
マイクロインジェクションプレートを作製するために、モールドを９０ｍｍのペトリ皿上に置き、約３０ｍｌの暖かい３％アガロース（蒸留水にて調製）を、プレートに注いだ。アガロースを室温で凝固した後、モールドを取り除き、マイクロインジェクションの針が貫通したときに胚を支えるための１２個の溝を作製した。使用したプレートを、プラスチック製ラップで覆い、使用するまで４℃で保管した。
【実施例６】
【００３０】
［マイクロインジェクションニードルの配置］
マイクロインジェクションニードルを、微細なガラスのマイクロインジェクションキャピラリーを用いて、マイクロピペットプーラー（ナリシゲ社製）（図２Ａ）から作製した。マイクロインジェクションニードルの先端は、約５〜８μｍであった。ニードルはホルダーに取りつけられ、シリンジから、マイクロマニピュレーターを右に回しフッ素樹脂製の管を通じて、針のなかにミネラルオイルを充填した。
【実施例７】
【００３１】
［マイクロインジェクションのセットアップ］
マイクロインジェクションは、立体化学マイクロスコープ、マイクロインジェクション工程中に実施例６で調製されたマイクロインジェクションニードルを制御するマイクロマニピュレーター、ＤＮＡ負荷用のマイクロマニピュレーターに付属するマクネチックスタンド（ナリシゲ社製）、プラスチック製のツーウェイストッパー、フッ素樹脂製の管（ナリシゲ社製）及びマイクロインジェクションプレートで構成されたシステムを用いて行った。ニードルホルダーを取り付けたＤＮＡ負荷用のマイクロマニピュレーターを、金属面に固定されたマグネチックスタンドに取り付け、シリンジを、３ｍｌのミネラルオイルで充填し、マイクロインジェクションニードルホルダーに取り付けられた１ｍｍのフッ素樹脂製の管の約４０ｃｍの部分に固定されたツーウエィストッパーに直接に取り付けた。
【実施例８】
【００３２】
［卵の回収及びマイクロインジェクション］
マイクロインジェクションの当日、ランプの作動する少なくとも１５分前に、実施例１のゼブラフィッシュのオス３匹とメス２匹を水槽から、３Ｌの飼育タンクに移した。産卵の約５分後に卵をペトリ皿に回収した。１細胞期胚を、ピペットを用いて、実施例５で調製したマイクロインジェクションプレートの溝に移した。胚盤は、マイクロインジェクションニードルに面していることが要求された。実施例４で得られたＤＮＡ溶液を、マイクロインジェクションプレート上の１細胞期胚の細胞質内に実施例７のマイクロインゼクションシステムを用いてマイクロインジェクションを行った。ＤＮＡが注入された胚を、２８±１℃で保存した。非受精卵及び変形した卵を、受精５〜６時間後に取り除いた。翌日、死亡又は変形した胚を取り除き、健康な胚を新しいペトリ皿に移した。
【実施例９】
【００３３】
［ＲＮＡ単離及び半定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
ｍＲＮＡを単離するために、２０個の胚のサンプルを受精８時間後に取り出し、転写レベルを定量した。全ＲＮＡはISOGEN（Nippon Gene社製）で、製造者からの指示に従って単離した。微量のＤＮＡを、ＲＱ１ RNase-free Dnase（Promega社製）２Ｕ／μｇで、３０分、３７℃で分解した。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、ペレットをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水に溶解した。１本鎖ｃＤＮＡを、Ready-to-Go You-Prime First-Strand Beads（Amersham Pharmacia Biotech社製）で、２〜３μｇの全ＲＮＡから、製造者の指示に従って合成した。この反応において、ｄＴ３RACE-VECTプライマー(5'-GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGG(T)17-3'；配列番号７)を用いた。
【００３４】
外来不飽和化酵素遺伝子の転写レベルを定量するために、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ分析を、２０μｌの１０×Ex Taq緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、０．１２５ＵのEx Taqポリメラーゼ（Takara社製）、２μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして、及びそれぞれ１ｐmolを下記の条件下で行った。９４℃で３分間、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒を２４サイクル、７２℃で１．５分。デサチュラーゼ用のフォーワードプライマーとしてOmar（5'-AGGACTGGCTCACCATGCAGTTGAGT-3'；配列番号８）を、リバースプライマーとして前記des-Omar（配列番号４）を用いた。β‐アクチン遺伝子発現を、同量のＲＮＡ負荷の内部標準として分析した。β‐アクチン遺伝子のフォーワードプライマーとして（5'-ACTACCTCATGAAGATCCTG-3'；配列番号９）を、リバースプライマーとして（5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3'；配列番号１０）を用いた。反応液の２μｌを、０．７％アガロースゲルで電気泳動して単離し、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射で撮影した。各バンドの蛍光強度を、Densitogragh（ATTO社製）により定量化した。もっとも強い発現を示すコンストラクトを、安定した系統を作出するために使用した。
【００３５】
Ｆ１及びＦ２の不飽和化酵素遺伝子発現を、Ｆ０に使用した方法で分析した。全ＲＮＡを、一匹のＤＮＡ陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、Ｆ１における外来遺伝子の発現を同定した。Ｆ２世代の全ＲＮＡを、少なくとも２０匹の２日齢の稚魚及び、少なくとも１０匹の成魚の筋肉及び肝臓から抽出した。
【実施例１０】
【００３６】
［ＤＮＡ単離及びＰＣＲ増幅］
トランスジェニック個体の同定は、ＰＣＲにより尾ヒレ組織から抽出したＤＮＡテンプレートで行った。ＤＮＡを、ＤＮＡ陽性Ｆ０と非トランスジェニック魚を交配して生産した２日齢の保存した稚魚から抽出し、生殖系列伝達物質を同定した。ゲノムＤＮＡの単離は、ＤＮＡ Isolation Kit（Puregene製）を用いて、製造者の指示に従って行った。ＰＣＲ反応及び使用したプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲに使用した方法と同じものを使用した。
【実施例１１】
【００３７】
［安定した株の調製］
ＤＮＡ陽性Ｆ０を、成魚になるまで飼育した。成熟したＦ０を、非トランスジェニックゼブラフィッシュと交配し、生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、交配によって得た少なくとも２０匹の２日齢の稚魚を蓄積した。 次に生殖系列が陽性なF０を用いて、Ｆ１及びＦ２世代を作出した。Ｆ１及びＦ２の作出及びスクリーニングの工程は、Ｆ０に用いた方法と同じである。
【実施例１２】
【００３８】
［脂肪酸分析］
全脂質は、ヤマメΔ６不飽和化酵素遺伝子を含む非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚から抽出した。非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚は、同じ水槽で飼育し、全脂肪酸は魚全体より抽出した。抽出した脂肪酸は水素フレームイオン化検知器及びキャピラリーカラム３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ（Supelco社製）を装備したガスクロマトグラフィー（Shimadzu 14B： Shimadzu 社製）を用いて分離し、脂肪酸から脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、文献（引用文献）記載の方法で調製した。上記ガスクロマトグラフィーの測定により、脂肪酸メチルエステルピークを、保持時間と適切なＦＡＭＥ標準（Supelco社製）とを比較して同定した。
【実施例１３】
【００３９】
［安定した系統の調製；結果］
トランジェントな外来遺伝子発現を、受精８時間後に、注入した胚から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡで、外来遺伝子のトランジェントな発現を分析した。トランジェントな発現を示す結果を図２に示す。また、ＤＮＡ陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、Ｆ１における外来遺伝子の発現を同定した結果を図３に示す。図３には、メダカβ−アクチンプロモーターに代えてMylz2プロモーターを用いる以外は同条件で行った結果も記載されている。図３からわかるように、メダカβ−アクチンプロモーターとMylz2プロモーターのいずれのプロモーターを使用しても、ヒレと筋肉に外来遺伝子の発現を認めた。
【００４０】
トランスジェニック個体は、ヤマメ不飽和化酵素遺伝子に特異的なプライマーを使用してヒレから抽出したゲノムＤＮＡによるＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、ＤＮＡ陽性魚と非トランスジェニック魚とを交配し、結果を表１及び図４に示す。表１に示すように、ＤＮＡを注入した胚４００個のうち１０９匹が成魚となり、このうち４匹が胚細胞にpActD6遺伝子コンストラクトを保有していた。これらの魚を用いて、Ｆ１及びＦ２世代を作出した。外来遺伝子のＦ１世代への伝達率は、表２に示すように、４．２％から４４．１％の間で変化した。これらの結果により、トランスジェニックＦ０魚がモザイクであることを確認した。ＲＴ−ＰＣＲによって分析したより高いｍＲＮＡ転写レベルを有するＦ１トランスジェニック株を用いて、Ｆ２世代を作出した。Ｆ１魚の代表的な外来遺伝子の発現を図５に示す。導入遺伝子のＦ２世代への伝達は、メンデルの分離パターンの通りだった。これらの結果は、各Ｆ１のトランスジェニック系統の全てのディプロイド細胞が、トランスジーンを含有していることを裏付けていた。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
【表２】
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【実施例１４】
【００４３】
［トランスジェニック魚における脂肪酸組成］
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）は、非トランスジェニック及びトランスジェニック両方の魚の全身から調製し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析した。トランスジェニック魚のｎ−３脂肪酸構成組成を表３に示す。ヤマメ不飽和化酵素遺伝子を発現するトランスジェニック魚におけるＥＰＡ及びＤＨＡの生産は、対応する非トランスジェニック魚の１．４±０．１倍（１．８６±０．０３ｍｇ／ｇ対１．３２±０．０５ｍｇ／ｇ）及び２．１±０．２倍（４．６２±０．２２ｍｇ／ｇ対２．２２±０．０８ｍｇ／ｇ）（ｐ＜０．０５）であった。しかし、トランスジェニック系統間のＥＰＡ及びＤＨＡ生産の量にかなり高い割合の相違があった。可食部におけるＥＰＡ及びＤＨＡ生産量は、全魚体中のそれぞれ７５％及び７８％であった。
【００４４】
【表３】
2005287424.tif 000004
表３に示された結果は、３回の実験の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。ＳＤ＝０．０で、ＳＤ＜０．００５を示す。括弧内の数値は、全脂肪酸の内、各脂肪酸の比率を示す。非トランスジェニック及びトランスジェニック魚は、同じ水槽で飼育した。全脂肪酸は、ＧＣで分析、定量した脂肪酸メチルエステルで魚全体より抽出した。構築物の後ろの数字は、個別のトランスジェニック株を示す。
【００４５】
導入した遺伝子が、Δ６又はΔ５不飽和化酵素のどちらであるか確認するために、不飽和化の基質以外の脂肪酸を合計した。トランスジェニック魚のΔ６及びΔ５不飽和化生成物は、図６に示すように、非トランスジェニック魚より高かった（ｐ＜０．０５）。導入遺伝子を示すΔ６不飽和化脂肪酸生成物のより高い値は、外来のΔ６デサチュラーゼに起因している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の不飽和脂肪酸含量の増加した魚類の作出に使用した発現ベクターに挿入されたデサチュラーゼ遺伝子構築物の概要を示す図である。
【図２】デサチュラーゼ遺伝子のトランジェントな発現結果を示すＲＴ−ＰＣＲの図である。
【図３】Ｆ１世代のｃＤＮＡにおけるデサチュラーゼ遺伝子のヒレ、肝臓、筋肉における発現結果を示すＲＴ−ＰＣＲの図である。
【図４】蓄積した稚魚から抽出したＤＮＡテンプレートを用いたＰＣＲ分析により、生殖系列の伝達物質をスクリーニングした結果の代表例を示すＲＴ−ＰＣＲの図である。ＤＮＡ陽性Ｆ０と非トランスジェニックの個体とを交配して得た約２０匹の２日齢の稚魚からＤＮＡを抽出した。レーン１〜６；トランスジェニックＦ０個体からのゲノムＤＮＡサンプルを用いたＰＣＲ増幅産物。レーンＣ；非トランスジェニック魚を用いたＰＣＲ増幅産物、レーンＮ；ＤＮＡテンプレートなしのを用いたＰＣＲ増幅産物、レーンＰ；増幅したpActD6プラスミドＤＮＡ（０．６ｐｇ）。
【図５】異なるＦ１世代における導入遺伝子発現の検出結果を示すＰＴ−ＰＣＲの図である。全ＲＮＡは尾ヒレ組織から抽出した。構築物の後の数字は、個別のトランスジェニック系統を示す。
【図６】本発明の不飽和脂肪酸含量の増加した魚類における不飽和化生成物の含量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005287424.tif 000009
【図６】
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【配列表】
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