(57)【要約】【課題】付着依存性細胞を、効率良く担体に接着することができる細胞接着方法を提供すること。【解決手段】本発明の細胞接着方法は、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に、付着依存性細胞を接着させるに際して、担体の表面に、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の少なくとも一方を主成分とするタンパク質を含む第１の液体を接触させることにより、タンパク質を吸着させる第１の工程と、担体の表面に、付着依存性細胞を含む第２の液体を接触させることにより、付着依存性細胞を接着させる第２の工程とを有する細胞接着方法である。付着依存性細胞としては、間葉系幹細胞のような骨髄幹細胞等がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に、付着依存性細胞を接着させる細胞接着方法であって、
前記担体の表面に、ＣＣＮ１（ＣＹＲ６１）およびＣＣＮ２（結合組織成長因子）の少なくとも一方を主成分とするタンパク質を含む第１の液体を接触させることにより、前記タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記担体の表面に、前記付着依存性細胞を含む第２の液体を接触させることにより、前記付着依存性細胞を接着させる第２の工程とを有することを特徴とする細胞接着方法。
【請求項２】
前記第１の液体を前記担体に接触させる時間は、０．１〜１０日間である請求項１に記載の細胞接着方法。
【請求項３】
前記第１の液体の温度は、０〜１０℃である請求項１または２に記載の細胞接着方法。
【請求項４】
前記第１の液体中における前記タンパク質の濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬである請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項５】
前記タンパク質は、ＣＣＮ２を主成分とするものである請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項６】
前記第２の液体を前記担体に接触させる時間は、６０〜４２０分間である請求項１ないし５のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項７】
前記第２の液体の温度は、３０〜４０℃である請求項１ないし６のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項８】
前記第２の液体は、培地を含む請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項９】
前記付着依存性細胞は、骨髄幹細胞である請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞接着方法。
【請求項１０】
前記骨髄幹細胞は、間葉系幹細胞である請求項９に記載の細胞接着方法。
【請求項１１】
前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの少なくとも一方を主成分とするものである請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞接着方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞接着方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある一定量以上の骨を再建させる場合には、十分な力学的強度をもつスキャフォード（足場）の存在が不可欠である。このようなスキャフォードとして、生体親和性や強度等の特性に優れることから、各種アパタイトを用いることが有望視されている。
【０００３】
しかしながら、アパタイトのブロック（以下、単に「ブロック」と言う。）を、単体で骨の欠損部位に移植した場合には、このブロックのサイズが大きくなるのにともなって、ブロック表面（生体）からブロック内部への拡散を主体とした養分の供給が不足する傾向を示す。このため、ブロック中心部に繊維化や壊死、骨への置換の遅延が生じるという問題がある。
【０００４】
このような問題を解決するために、骨芽細胞を担持するブロックを骨欠損部位に移植する方法が考えられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
この移植方法おいて、骨芽細胞を担持するブロックは、ブロック（担体）にあらかじめ間葉系幹細胞を付加し、三次元培養することによって十分に接着させた上で、骨芽細胞に分化させることによって作成される。
【０００６】
また、ハムスターやヒツジ等の動物細胞を宿主細胞として遺伝子組み換えタンパク質を産生させる方法も開発されている。
【０００７】
このような方法において、遺伝子組み換えタンパク質は、このタンパク質の遺伝子が導入された宿主細胞を、担体に接着させた上で、増殖させることによって産生（分泌）される。
【０００８】
上述したような方法で用いる細胞は、担体への接着を契機に増殖を開始する付着依存性細胞である。
【０００９】
したがって、この付着依存性細胞を増殖させるためには、この細胞を効率よく担体に接着させることが重要となる。
【００１０】
そこで、付着依存性細胞を効率よく担体に接着させ得る方法（細胞接着方法）の開発が強く要望されているが、現在のところ、そのような方法は、見出されていないというのが実情である。
【００１１】
【特許文献１】特開２００３−３２０００９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の細胞接着方法は、付着依存性細胞を、効率良く担体に接着させることができる細胞接着方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような目的は、下記（１）〜（１１）の本発明により達成される。
（１）  少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成された担体の表面に、付着依存性細胞を接着させる細胞接着方法であって、
前記担体の表面に、ＣＣＮ１（ＣＹＲ６１）およびＣＣＮ２（結合組織成長因子）の少なくとも一方を主成分とするタンパク質を含む第１の液体を接触させることにより、前記タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記担体の表面に、前記付着依存性細胞を含む第２の液体を接触させることにより、前記付着依存性細胞を接着させる第２の工程とを有することを特徴とする細胞接着方法。
これにより、付着依存性細胞を、効率良く担体に接着させることができる。
【００１４】
（２）  前記第１の液体を前記担体に接触させる時間は、０．１〜１０日間である上記（１）に記載の細胞接着方法。
【００１５】
これにより、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の少なくとも一方のタンパク質を、担体に十分に吸着させることができ、第２の工程において、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
【００１６】
（３）  前記第１の液体の温度は、０〜１０℃である上記（１）または（２）に記載の細胞接着方法。
【００１７】
これにより、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の少なくとも一方のタンパク質の本来の性質を、低下または消失させることなく、担体に吸着させることができる。その結果、第２の工程において、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
【００１８】
（４）  前記第１の液体中における前記タンパク質の濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞接着方法。
【００１９】
これにより、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の少なくとも一方のタンパク質を、担体に十分に吸着させることができ、第２の工程において、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
【００２０】
（５）  前記タンパク質は、ＣＣＮ２を主成分とするものである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞接着方法。
【００２１】
これにより、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。また、この付着依存性細胞が接着した担体を生体内に移植したときに、ＣＣＮ２により血管新生が促進され、付着依存性細胞に十分に養分を供給することができる。
【００２２】
（６）  前記第２の液体を前記担体に接触させる時間は、６０〜４２０分間である上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の細胞接着方法。
これにより、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
【００２３】
（７）  前記第２の液体の温度は、３０〜４０℃である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の細胞接着方法。
【００２４】
これにより、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の本来の性質が低下または消失すること、および、付着依存性細胞がダメージを受けることを好適に防止することができる。その結果、付着依存性細胞を、より効率よく担体に接着させることができる。
【００２５】
（８）  前記第２の液体は、培地を含む上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞接着方法。
【００２６】
これにより、付着依存性細胞に生物活性の低下等のダメージを与えることを好適に防止することができる。
【００２７】
（９）  前記付着依存性細胞は、骨髄幹細胞である上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞接着方法。
【００２８】
この場合には、骨髄幹細胞を担体に付着させた後に、培養する際の条件を適宜設定することにより、各種細胞に分化させることができる。このような細胞が接着した担体は、例えば医療（治療）や基礎研究等の幅広い分野に用いることができる。
【００２９】
（１０）  前記骨髄幹細胞は、間葉系幹細胞である上記（９）に記載の細胞接着方法。
骨髄幹細胞の中でも、間葉系幹細胞は、特に利用価値が高いものである。
【００３０】
（１１）  前記リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムの少なくとも一方を主成分とするものである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞接着方法。
これにより、担体に高い生体親和性を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の細胞接着方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
図１〜図３は、本発明の細胞接着方法で用いる担体を示す斜視図である。
【００３２】
本発明の細胞接着方法は、［１］タンパク質吸着工程と、［２］細胞接着工程を有している。以下、これらの各工程について順次説明する。
【００３３】
まず、付着依存性細胞を接着させる担体１を用意する。
担体１としては、少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであればよい。
【００３４】
具体的には、例えば、Ｉ：図１に示すように、担体１の全体がリン酸カルシウム系化合物を主材料として構成されたものであってもよく、II：担体１の形状に成形された基材の表面に、リン酸カルシウム系化合物を主材料とする被覆層が設けられた構成のものであってもよい。
【００３５】
ここで、Ｉのような構成の担体１は、担体１を骨欠損部位に移植する場合等に、好適に適用される。
【００３６】
また、IIのような構成の担体１は、付着依存性細胞を培養する場合等に、好適に適用される。
【００３７】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、Ｃａ／Ｐモル比が１．０〜２．０の各種化合物が挙げられる。
【００３８】
具体的には、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸二カルシウム、フッ素アパタイト等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００３９】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムを主成分とするものが好ましい。これらのものは、骨の主成分または骨に近い成分であるため、特に優れた生体親和性（生体適合性）を有するものである。
【００４０】
この担体１の形状としては、特に限定されず、その用途に応じて適宜選択するようにすればよい。例えば、この担体１を骨欠損部位に対する移植用のスキャフォード（足場）として用いる場合には、その骨欠損部位に対応した形状とするのが好ましい。
【００４１】
また、この担体１は、表面が粗面とされているのが好ましい。これにより、付着依存性細胞を、次工程［２］において、担体１に、より容易かつ確実に接着させることができる。
【００４２】
この担体１の表面粗さは、極端に大きくないのが好ましい。具体的には、前記粗面は、平均粒径が５〜３０μｍ程度（好ましくは５〜２５μｍ程度）の粒子を含む研磨材で研磨して得られたもの、または、それとほぼ同等のものであるのが好ましい。これにより、担体１への細胞の接着率をより向上させることができる。
【００４３】
この研磨材に用いられる粒子（砥粒）としては、例えば、ダイヤモンド、アルミナ、シリカ、酸化セリウム、窒化ホウ素、べんがら等の粒子（微粒子）が挙げられる。
【００４４】
また、担体１は、図２、３に示すように、直線状の溝がほぼ平行となるよう、複数配設されてなる凹部２が形成されていてもよい。この凹部２を形成することにより、表面積を増大させることができる。これにより、付着依存性細胞のより迅速な担体１への接着が促進される。ここで溝の形状は、図２に示すような、ほぼコ字状であってもよく、図３に示すような、ほぼＶ字状またはＵ字状等であってもよい。
【００４５】
全体がハイドロキシアパタイトを主材料として構成された担体１は、例えば、次のようにして製造することができる。
【００４６】
すなわち、このような担体１は、ハイドロキシアパタイト粉体の製造工程１００と、圧粉体の製造工程２００と、圧粉体の整形工程３００と、圧粉体の焼成工程４００と、焼結体の研磨工程５００とによって製造することができる。以下、各工程について順次説明する。
【００４７】
［１００］ハイドロキシアパタイト粉体の製造
まず、カルシウム源とリン酸源とを反応させて、ハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）を合成する。なお、ここで、ハイドロキシアパタイトとは、Ｃａ／Ｐモル比が１．６０〜１．７０のものを指す。
【００４８】
このハイドロキシアパタイトの合成には、湿式合成法、乾式合成法、水熱合成法等のいかなる方法を用いてもよいが、カルシウム源とリン酸源との少なくとも一方を溶液として用いる湿式合成法を用いるのが好ましい。これにより、高価な製造設備を必要とせず、容易かつ効率よくハイドロキシアパタイトを合成することができる。
【００４９】
湿式合成法を用いる場合、カルシウム源としては、例えば、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、硝酸カルシウム等を用いることができる。一方、リン酸源としては、リン酸、リン酸アンモニウム等を用いることができる。これらの中でも、特に、カルシウム源として水酸化カルシウムまたは酸化カルシウムを主成分とするものが、また、リン酸源としてリン酸を主成分とするものが好ましい。かかるカルシウム源およびリン酸源を用いることにより、ハイドロキシアパタイトをより効率よくかつ安価に合成することができる。
【００５０】
次に、合成されたハイドロキシアパタイトのスラリーを、例えば噴霧乾燥等することにより、ハイドロキシアパタイト粉体（以下、単に「粉体」と言う。）を製造する。
【００５１】
粉体の平均粒径は、特に限定されないが、１〜３０μｍ程度であるのが好ましく、８〜２５μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の粉体を用いることにより、より高密度の焼結体を得ることができる。
【００５２】
なお、得られた粉体は、より緻密な圧粉体を得るために、例えば５００〜８００℃×２〜６時間程度の処理条件で熱処理した後、例えばジェットミルやターボミル等で粉砕して、平均粒径６〜２０μｍ程度（粉砕前の５０〜９０％程度の平均粒径）とするようにしてもよい。
【００５３】
［２００］圧粉体の製造
次に、得られた粉体（またはこれを予め所望の形状に圧粉成形したもの）に対し、圧力を加え、圧密化する。
【００５４】
加圧の方法としては、等方的に加圧する方法や、１軸プレスのように１方向（１軸方向）にのみ加圧する方法等のいずれであってもよいが、等方的に加圧する方法、特に静水圧加圧が好ましい。これにより、加圧後の圧粉体の密度を均一にすることができ、その結果、より高密度の焼結体を得ることができる。
【００５５】
［３００］圧粉体の整形
次に、必要に応じて、得られた圧粉体の形状または寸法を整える。
【００５６】
この圧粉体の整形は、例えば、圧粉体に所定の機械加工を施すことにより行われる。機械加工としては、例えば、切削加工、研削加工、研磨加工等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて行うことができる。
【００５７】
圧粉体自体は、得られる焼結体に比べてその硬度がはるかに低いため、機械加工等による圧粉体の整形は、容易に行うことができ、特に、低硬度の工具を用いても行うことができ、また、機械加工の加工速度も速い。
【００５８】
［４００］圧粉体の焼成
以上のようにして得られた圧粉体は、例えば焼成炉内で、大気の酸素分圧より高い酸素分圧の酸素含有雰囲気中で焼結（焼成）され、焼結体とされる。
【００５９】
［５００］焼結体の研磨
次に、得られた焼結体の両面を、それぞれ、目的に応じた研磨材により研磨する。
【００６０】
なお、この研磨処理を省略して、得られた焼結体をそのまま担体１とすることもできる。
【００６１】
以上のような工程を経て得られる担体１は、高密度（緻密）なものであるが、本発明では担体１として、多孔質なものを用いるようにしてもよい。
【００６２】
［１］タンパク質吸着工程
次に、担体１の表面に、ＣＣＮ１およびＣＣＮ２の少なくとも一方を主成分とするタンパク質（以下、単に「吸着タンパク質」と言う。）を含む第１の液体を接触させる。これにより、吸着タンパク質を担体１の表面に吸着させる。
【００６３】
ＣＣＮ１およびＣＣＮ２は、ＣＣＮ遺伝子ファミリーに属するｃｃｎ１遺伝子、ｃｃｎ２遺伝子がコードするタンパク質であり、Ｎ末端から、ＩＧＦＢＰ様、ｖｏｎ  ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｒｅｐｅａｔおよびｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｅａｔの３つのモジュール構造と、Ｃ末端のｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔｓの合計４つのモジュール構造を有するタンパク質である。
【００６４】
これらのＣＣＮ１およびＣＣＮ２は、いずれも付着依存性細胞の接着を促進させる作用（細胞接着促進作用）を有するタンパク質である。したがって、このようなＣＣＮ１および／またはＣＣＮ２を担体１の表面に吸着させることにより、次工程［２］において、付着依存性細胞の担体１の表面への接着を促進させることができる。
【００６５】
ここで、ＣＣＮ２は、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）と称されるものであり、特に優れた細胞接着促進作用と、血管誘導作用（血管内皮細胞増殖遊走促進作用）とを併せ持つタンパク質である。
【００６６】
そこで、例えばＣＣＮ２を吸着させ、かつ、このＣＣＮ２の細胞接着促進作用により付着依存性細胞を接着させた担体１を、生体の骨欠損部位（骨の欠損部位および歯の欠損部位の双方を含む）に移植した場合には、担体１の表面に血管内皮細胞が増殖遊走促進される。これにより、新生血管の形成が促進されて、担体１に接着する付着依存性細胞への養分供給が十分となる。
【００６７】
そして、この供給された養分により、例えば付着依存性細胞が間葉系幹細胞である場合には、骨化が促進される。これにより、再生骨が形成される時間が短縮されることから、比較的短時間で、骨欠損部位の強度の増加を図ることができる。
【００６８】
また、ＣＣＮ１は、ＣＹＲ６１と称される血管新生因子であり、付着依存性細胞に対してＣＣＮ２と同様の作用を有するものである。
【００６９】
なお、これらＣＣＮ１およびＣＣＮ２は、単独で使用してもよく、２種類を組み合わせて使用するようにしてもよい。
【００７０】
ＣＣＮ２は、特に細胞接着促進作用および血管誘導作用に優れるものであることから、これらの中でも、ＣＣＮ２を主成分とするものを用いるのが好ましい。
【００７１】
ここで、本発明で用いるＣＣＮ１およびＣＣＮ２としては、前述したような細胞接着促進作用を有するものであれば、天然（生物由来）に存在するもの、遺伝子組み換えのものいずれのものであってもよく、また、これらのタンパク質のアミノ酸配列の一部が、欠失、置換および／または付加しているものであってもよい。
【００７２】
第１の液体を調整するために用いられる溶媒としては、例えば水または水にｐＨ調整剤等の添加剤を溶解（添加）したもの等が用いられる。
【００７３】
水としては、例えば蒸留水、イオン交換水、純水、超純水およびＲＯ水等が挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば炭酸塩、リン酸塩等が挙げられる。
【００７４】
第１の液体中における吸着タンパク質の濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬであるのが好ましく、８０〜１００ｎｇ／ｍＬであるのがより好ましい。吸着タンパク質の濃度が、前記下限値未満の場合には、担体１への吸着タンパク質の吸着量が少なくなり、付着依存性細胞の種類等によっては、接着率が低下するおそれがある。また、吸着タンパク質の濃度を、前記上限値を超えて高くしても、それ以上の効果の増加は期待できない。
【００７５】
第１の液体を担体１に接触させる時間は、０．１〜１０日間であるのが好ましく、２〜３日間であるのがより好ましい。接触させる時間が短すぎると、担体１への吸着タンパク質の吸着量が少なくなり、付着依存性細胞の種類等によっては、接着率が低下するおそれがある。また、接触させる時間を長くしても、それ以上の効果の増加が期待できないばかりか、細胞接着に要する時間が長くなり好ましくない。
【００７６】
担体１を接触させる際の、第１の液体の温度は、吸着タンパク質の種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、０〜１０℃であるのが好ましく、３〜５℃であるのがより好ましい。第１の液体の温度が、前記範囲を逸脱した場合、吸着タンパク質の本来の性質が低下または消失するおそれがある。
【００７７】
以上のようにして担体１に、第１の液体を接触させることにより、担体１の表面に吸着タンパク質を吸着させることができる。
【００７８】
なお、このようにして担体１を第１の液体と接触させた後に、溶媒等で洗浄し、この担体１に吸着していない吸着タンパク質を除去するのが好ましい。溶媒としては、例えば、水、または水にｐＨ調整剤や血清アルブミン等の添加剤を溶解させたもの等を用いることができる。
【００７９】
［２］細胞接着工程
次に、担体１の表面に、付着依存性細胞を含む第２の液体を接触させる。これにより、吸着タンパク質を介して担体１の表面に付着依存性細胞を接着させる。
【００８０】
ここで、付着依存性細胞とは、担体１に付着することが契機となり、増殖が促進される細胞であり、例えば骨芽細胞、歯髄細胞、象牙芽細胞のような硬組織形成関連細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞のような骨髄幹細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｃ６／３６細胞、ハムスター由来腎細胞、ヒツジ由来上皮細胞等が挙げられる。
【００８１】
これらの中でも、付着依存性細胞として骨髄幹細胞を用いた場合には、骨髄幹細胞を担体１に付着させた後に、培養する際の条件を適宜設定することにより、骨芽細胞、歯髄細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞のような細胞に分化させることができる。このような細胞が接着した担体１は、例えば医療（治療）や基礎研究等の幅広い分野に用いることができる。
【００８２】
例えば、骨髄幹細胞を骨芽細胞に分化させた場合には、前述したように、この担体１を骨欠損部位への移植等に好適に適用することができる。
【００８３】
第２の液体を調整するために用いられる溶媒としては、水または水にｐＨ調整剤等の添加剤を溶解したもの等が用いられる。
【００８４】
水またはｐＨ調整剤としては、第１の液体で挙げたものと、同様のものを用いることができる。
【００８５】
また、第２の液体は、培地を含有しているのが好ましい。これにより、本工程の際に、付着依存性細胞にダメージ（例えば、生物活性の低下等）を与えないようにすることができる。
【００８６】
培地としては、用いる付着依存性細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地、ＭＳＣＢＭ培地等が挙げられる。
【００８７】
また、培地中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、各種アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【００８８】
第２の液体中における付着依存性細胞の細胞数は、１万〜１０万個／ｍＬであるのが好ましく、２万〜３万個／ｍＬであるのがより好ましい。細胞数が、前記下限値未満の場合には、付着依存性細胞の種類等によっては、細胞と担体１との接触の機会が低下し、接触率の低下を招くおそれがある。また、細胞数を、前記上限値を超えて多くすると、第２の液体中で、付着依存性細胞の生物活性の低下を招くおそれがあり、好ましくない。
【００８９】
第２の液体を担体１に接触させる時間は、６０〜４２０分間であるのが好ましく、１８０〜３００分間であるのがより好ましい。接触させる時間が短すぎると、担体１への付着依存性細胞の接着量が少なくなり、付着依存性細胞の種類等によっては、接着率の低下を招くおそれがある。また、接触させる時間を長くしても、それ以上の効果の増加が期待できないばかりか、細胞接着に要する時間が長くなり好ましくない。
【００９０】
担体１を接触させる際の、第２の液体の温度は、吸着タンパク質および付着依存性細胞の種類等によっても若干異なり、特に限定されないが、３０〜４０℃であるのが好ましく、３６〜３８℃であるのがより好ましい。第２の液体の温度が、前記範囲を逸脱した場合、吸着タンパク質の本来の性質が低下または消失したり、付着依存性細胞がダメージを受けるおそれがある。
【００９１】
以上のように、本発明では、付着依存性細胞を担体１に接触するのに先立って、担体１にＣＣＮ１および／またはＣＣＮ２（吸着タンパク質）を吸着させるので、このものが有する細胞接着促進作用により、付着依存性細胞を担体１に効率よく接着させることができる。
【００９２】
以上、本発明の細胞接着方法について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００９３】
例えば、本発明の細胞接着方法は、任意の目的の工程が１または２以上追加されてもよい。
【実施例】
【００９４】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．担体への細胞の接着
【００９５】
（実施例１）
＜１＞タンパク質吸着工程
まず、ハイドロキシアパタイトをディスク状に成型、焼結することによって得られた担体（ペンタックス社製  商品名ＡＰＰ−６００）を用意した。
【００９６】
次に、この担体を、室温下、１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）中に２４時間浸漬した。
【００９７】
その後、蒸留水中で、１０分間の超音波洗浄を３回行った後、オートクレーブ滅菌を行った。
【００９８】
次に、この担体を、シリコーン製リングによって培養プレートに固定した。培養プレートは、担体を収納可能な穴（ウェル）を複数有するものであり、各穴に担体が収納される。
【００９９】
次に、ヒトリコンビナントＣＴＧＦ（ＣＣＮ２：岡山大学大学院医歯学総合研究科口腔生化・分子歯科学分野より供与）を２０ｎｇ／ｍＬ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）を０．１％含有する第１の液体を調製した。
【０１００】
次に、この第１の液体を、担体を収納した培養プレートの各穴に供給した。
次に、４℃で２日間インキュベートした後、第１の液体を６％ＢＳＡ溶液に交換し、室温で１時間ブロッキングを行った。さらに、ＰＢＳ（−）による洗浄を３回行った。
【０１０１】
＜２＞細胞接着工程
次に、ヒト由来骨髄幹細胞（付着依存性細胞）を、ＦＢＳ非添加のＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＢＭ；ＴＡＫＡＲＡ社製）に懸濁させて、第２の液体を調整した。
【０１０２】
次に、この第２の液体を、担体を収納した培養プレートの各穴に供給することによって、ヒト由来骨髄幹細胞を播種した。
【０１０３】
次に、この細胞播種から１時間後または３時間後に、ＦＢＳ添加のＭＳＣＢＭを、担体を収納した培養プレートの各穴に供給し、パラフィルムで密閉した。その後、この培養プレートを、室温で１５分間倒立させた状態で静置し、担体に接着していないヒト由来骨髄幹細胞を除去した。
以上の工程により、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０４】
（実施例２、３）
第１の液体におけるＣＣＮ２の濃度を表１に示すように変更した以外は、実施例１と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０５】
（比較例１）
第１の液体として、ＣＣＮ２の代わりに、骨の増殖因子であるヒトリコンビナントｂＦＧＦ（ＫＣＢ−１：科研製薬株式会社より供与）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０６】
（比較例２、３）
第１の液体におけるｂＦＧＦの濃度を表１に示すように変更した以外は、比較例１と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０７】
（比較例４）
第１の液体として、ＣＣＮ２の代わりに、骨の増殖因子であるヒト精製ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０８】
（比較例５、６）
第１の液体におけるＴＧＦ−β１の濃度を表１に示すように変更した以外は、比較例４と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１０９】
（比較例７）
第１の液体として、ＣＣＮ２を含有しない０．１％ＢＳＡ溶液を使用した以外は、実施例１と同様にして、ヒト由来骨髄幹細胞を担体に接着させた。
【０１１０】
【表１】
2005287409.tif 000003
【０１１１】
２．評価
各実施例および各比較例について、担体に接着した細胞の数を測定した。
【０１１２】
まず、各実施例および各比較例における培養プレートの各穴から培地を除去し、培地とＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５：１で混合した試薬を、各穴に５００μＬずつ添加した。
その後、培養プレートを、５％ＣＯ２気相下、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１１３】
次に、インキュベート後の前記試薬を分取して、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１４】
この測定値は、細胞数と比例関係にあり、担体に接着した細胞数の指標となる。
この測定結果を図４に示す。
【０１１５】
図４に示すように、担体を、ＣＣＮ２を含有する第１の液体で処理した実施例１〜３の吸光度は、いずれも担体を、ＣＣＮ２を含有していないＢＳＡ溶液で処理した比較例７の吸光度に比べて、高い値を示した。これにより、実施例１〜３の担体に接着した細胞数は、いずれも比較例７に接着した細胞数よりも多いことが明らかとなった。
【０１１６】
また、この細胞数は、第１の液体におけるＣＣＮ２の濃度に依存して増加する傾向を示した。
【０１１７】
これに対して、担体を、ｂＦＧＦを含有する液体で処理した比較例１〜３およびＴＧＦ−β１を含有する液体で処理した比較例４〜６は、いずれも比較例７に比べて、担体に接着した細胞数が少なく、細胞の接着を促進しないばかりか、逆に阻害する傾向を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明の細胞接着方法で用いる担体を示す部分断面斜視図である。
【図２】本発明の細胞接着方法で用いる担体の他の例を示す斜視図である。
【図３】本発明の細胞接着方法で用いる担体のさらに他の例を示す斜視図である。
【図４】実施例１〜３および比較例１〜７における吸光度（担体に接着した骨髄幹細胞の細胞数の指標）を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１１９】
１……担体、２……凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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