(57)【要約】【課題】低分子、高分子から微粒子、細菌に渡る広範な測定対象物に対して、良好な測定感度を持つ光学プローブを得る。【解決手段】適度な量の光散乱要素を光学プローブ１内に設けることにより、励起光の内部伝播と外部遠方への放出のバランスを取り、エバネッセント波励起と通常光励起を混在させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブであって、前記基材はその内部に前記伝播光が２０％／ｃｍ以下の損失を生ずる光散乱要素を備えたことを特徴とする光学プローブ。
【請求項２】
前記損失は０．１〜１０％／ｃｍであることを特徴とする請求項１に記載の光学プローブ。
【請求項３】
前記損失は前記光学プローブの光入射側でより小さく、反入射側でより大きいことを特徴とする請求項１又は２に記載の光学プローブ。
【請求項４】
前記基材は樹脂材であることを特徴とする請求項１又は２又は３に記載の光学プローブ。
【請求項５】
前記樹脂材はポリスチレンであることを特徴とする請求項４に記載の光学プローブ。
【請求項６】
前記光散乱要素は前記基材とは異なる屈折率を有する材料から成る微粒子であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の光学プローブ。
【請求項７】
前記光散乱要素は前記基材中に設けた微小気泡であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の光学プローブ。
【請求項８】
測定に供する部分が板状又はファイバ状であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１つの請求項に記載の光学プローブ。
【請求項９】
前記発光は蛍光であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１つの請求項に記載の光学プローブ。
【請求項１０】
前記基材は前記発光の捕集を行うことを特徴とする請求項１〜９の何れか１つの請求項に記載の光学プローブ。
【請求項１１】
光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブであって、表面上の任意の位置においてエバネッセント波励起と散乱光による通常光励起が混在することを特徴とする光学プローブ。
【請求項１２】
光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブの製造方法であって、前記伝播に対して２０％／ｃｍ以下の損失を生ずる光散乱要素を前記基材の内部に設けることを特徴とする光学プローブの製造方法。
【請求項１３】
前記損失は光入射側でより大きく、反入射側でより小さくすることを特徴とする請求項１２に記載の光学プローブの製造方法。
【請求項１４】
前記光散乱要素は前記基材と異なる屈折率を有する材料から成る微粒子を混合するか又は生成させることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の光学プローブの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的手法の測定に用いる光学プローブ及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料による光の吸収や発光などの光学的変化を分析手法として利用することは、様々な分野において行われている。その場合の多くは、光透過性の容器（セル）に試料を入れ、容器内に光を通過させて観測を行うものである。
【０００３】
別の手法として、光透過性の材料から成る光導波路を光学プローブとし、これに光を導入及び／又は収集して、光学プローブ表面付近の対象を光学的に観測することも屡々行われている。この手法は、試料と光が有効に相互作用する面積を大きく取ることができ、また試料中を光が横切らずに済むので、試料が懸濁しているような場合にも観測を行い易い。
【０００４】
特に、プローブ内に内部全反射光を伝播させ、その際のプローブ表面に発生するエバネッセント波を励起光とする方法は、プローブ表面での現象を選択的に観測することに優れている。例えば、抗原抗体反応に基づく免疫測定法を高感度に行うために用いられる。
【０００５】
板状（スラブ型）やファイバ形状の細長い光学プローブは、単位体積当りの内部全反射回数を多くとることが可能であり、効率の良い励起を行うことができる。板状の光学プローブを用いる形態は数多くの例があるが、特許文献１などのようにセルの壁面を兼ねているものは、利便性が高く有用である。
【０００６】
ファイバ状の光学プローブを用いる形態としては、光源又は検出器に直結した光学ファイバの一部をセンサとして用いるものもあるが、特許文献２〜４などのようにセンサとして使用する部分が物理的に独立したものがある。
【０００７】
これらの例は、装置に対して着脱可能な光学プローブとして使い易いものであり、使い捨て性やコストを考慮して、樹脂を射出成形などの成形法で加工して作製されることが多い。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−２７３０４２号公報
【特許文献２】特開平５−５７４２号公報
【特許文献３】米国特許４５８２８０９号公報
【特許文献４】米国特許６１３６６１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のような光学プローブにおいて、エバネッセント波による励起のみを用いる場合に、表面から数１００ｎｍのエバネッセント波が染み出す領域よりも遠方にある標識体を励起することはできない。分子サイズの測定対象には有利であるが、細胞のようにμｍを超える測定対象には十分な検出感度を得ることは困難である。また、遠方の励起を目的として通常光を発するプローブとする場合に、プローブ内の全反射による伝播が困難であるため、観測に有効な表面積を大きく取ることができない。
【００１０】
本発明の目的は、上述の問題点を解消し、励起光の内部伝播と外部遠方への放出のバランスが取れ、エバネッセント波励起と散乱光に因る通常光励起とが混在し、低分子、高分子を始め微粒子、細菌に渡る広範な測定対象物に対しても、良好な測定感度を得る光学プローブを提供することにある。
【００１１】
また、本発明の他の目的は、上述の性能の良い光学プローブを製造する光学プローブの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するための請求項１に係る本発明は、光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブであって、前記基材はその内部に前記伝播光が２０％／ｃｍ以下の損失を生ずる光散乱要素を備えたことを特徴とする光学プローブである。
【００１３】
また、請求項２に係る本発明は、前記損失は０．１〜１０％／ｃｍであることを特徴とする請求項１に記載の光学プローブである。
【００１４】
請求項３に係る本発明は、前記損失は前記光学プローブの光入射側でより小さく、反入射側でより大きいことを特徴とする請求項１又は２に記載の光学プローブである。
【００１５】
請求項４に係る本発明は、前記基材は樹脂材であることを特徴とする請求項１又は２又は３に記載の光学プローブである。
【００１６】
請求項５に係る本発明は、前記樹脂材はポリスチレンであることを特徴とする請求項４に記載の光学プローブである。
【００１７】
請求項６に係る本発明は、前記光散乱要素は前記基材とは異なる屈折率を有する材料から成る微粒子であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の光学プローブである。
【００１８】
請求項７に係る本発明は、前記光散乱要素は前記基材中に設けた微小気泡であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１つの請求項に記載の光学プローブである。
【００１９】
請求項８に係る本発明は、測定に供する部分が板状又はファイバ状であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１つの請求項に記載の光学プローブである。
【００２０】
請求項９に係る本発明は、前記発光は蛍光であることを特徴とする請求項１〜８の何れか１つの請求項に記載の光学プローブである。
【００２１】
請求項１０に係る本発明は、前記基材は前記発光の捕集を行うことを特徴とする請求項１〜９の何れか１つの請求項に記載の光学プローブである。
【００２２】
請求項１１に係る本発明は、光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブであって、表面上の任意の位置においてエバネッセント波励起と散乱光による通常光励起が混在することを特徴とする光学プローブである。
【００２３】
請求項１２に係る本発明は、光透過性基材により励起光を伝播し、前記基材に接触する検体中の特定対象に対応する発光を測定する光学プローブの製造方法であって、前記伝播に対して２０％／ｃｍ以下の損失を生ずる光散乱要素を前記基材の内部に設けることを特徴とする光学プローブの製造方法である。
【００２４】
請求項１３に係る本発明は、前記損失は光入射側でより大きく、反入射側でより小さくすることを特徴とする請求項１２に記載の光学プローブの製造方法である。
【００２５】
請求項１４に係る本発明は、前記光散乱要素は前記基材と異なる屈折率を有する材料から成る微粒子を混合するか又は生成させることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の光学プローブの製造方法である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る光学プローブ及びその製造方法によれば、エバネッセント波励起と散乱光に因る通常光励起とが混在する光学プローブが得られ、低分子、高分子を始め、微粒子、細菌に渡る広範な測定対象物に対して、良好な測定感度を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明を図示の実施例を基に詳細に説明する。
図１は実施例のプローブの側面図を示し、光学プローブ１はフランジ２の片側に円柱状のファイバ状部位３が設けられ、フランジ２上の光入射側に凸レンズ状部位４が形成され、ファイバ状部位３の内部に光散乱要素が付加されている。
【００２８】
光学プローブ１の基材として用いる材料は、量産性、使い捨て性を求める場合には樹脂が好ましいが、接触する媒質の屈折率に応じて選択する必要がある。入射光を内部伝播させるためには、屈折率が媒質のそれよりも高いことが必要である。バイオセンサのように主に水溶液中で使用する場合には、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートなどの使用が挙げられる。ポリスチレンは良好な成形性を有するために、内部に光散乱要素を設ける制御が行い易いので特に好ましい。また、頻用される水溶液検体に対して屈折率がより大きいので、入射光の内部伝播が容易であり好ましい。
【００２９】
光学プローブ１の内部に光散乱要素を与える方法としては、基材の分子構造に依存する方法、基材の物理的欠陥を利用する方法、基材とは異なる屈折率を有する微粒子を混在させる方法などが挙げられる。
【００３０】
基材の分子構造に依存する方法としては、結晶性・非結晶性の領域を適度に分布させる方法や、ブロック共重合体の凝固においてミクロ相分離を生起させる方法などが挙げられる。
【００３１】
基材の物理的欠陥を利用する方法としては、マイクロクラックの利用が挙げられ、成形時の冷却条件や、二次的な延伸、曲げにより生成させることができる。
【００３２】
しかし、光散乱要素は基材とは異なる屈折率を有する材料から成る微粒子を用いる方法が、工業的に容易、かつ制御性が高く望ましい。このような微粒子は成形前に混合、或いは成形中に内部に生成（析出）させることで光学プローブ１内に分散され、シリカ、炭酸カルシウムといった無機材料の微粒子や、基材と相溶しない樹脂の微粒子を混合する方法が挙げられる。例えば、ポリメチルメタクリレート中で有機ケイ素化合物を縮合した有機無機ハイブリッド反応に基づく、高分散な析出を利用することも有用である。
【００３３】
また、基材中の微小気泡を光散乱要素として利用することもできる。樹脂製基材の場合に、ペレットの貯蔵雰囲気の制御に基づく樹脂中の水分量、各部温度、各種圧力、各種速度、添加剤等の成形条件を精密に調整することによって適当な微小気泡を付与できる。ただし、その条件はプローブの形状、型の構成に依存するので一義的には定まらない。前述の添加剤は、内部潤滑剤、外部潤滑剤を含んでおり、詳細な原理は不明であるが、これらの添加によって微小気泡の生成が適度に助長されると見られる場合があり、製造方法として有用である。
【００３４】
光学プローブ１の各部分で散乱光にまわる割合は、一定である必要はない。入射側では散乱が少なく反入射側では多いという形態は極めて好ましい。反入射側の先端ほど先に伝播すべき光量は少なくてよいので、散乱光にまわすことができる。
【００３５】
微小気泡はファイバ形状のような細長い形状の成形品において、型内におけるゲートから遠い側により生成し易い。これを利用して、光入射側でより小さく、反入射側でより大きい光散乱要素を与えることができる。一般に、樹脂を型内先端まで完全に充填させるには、射出圧量を或る程度高く設定するか、或いは早い速度で樹脂を充填させるが、例えば保持圧力を若干下げることにより、溶融樹脂先頭の充填圧力が低くなり、ガスが樹脂内に残留し易くなるために微小気泡がより多く生成する。結果として、型のキャビティ側に設定した光学プローブ１の反入射側付近に光散乱要素をより多く与えることができる。
【００３６】
図２に示すように、或る割合の光は全反射で光学プローブ１の内部を伝播し、残る割合の光は光散乱要素に基づくプローブ外への漏れ光として利用することで、作用表面積及びファイバ状部位３の表面からの作用長の大きい効率的な光の利用が可能になる。なお、ここで云う損失とは、散乱によって臨界角未満の出射角となった光がプローブ外に漏れる分であり、基材の吸収によるものを含まない。この損失は伝播に対して２０％／ｃｍ以下、特に０．１〜１０％／ｃｍの損失であることが好ましい。
【００３７】
この数値は光路長１０ｃｍ程度までの小型のプローブを想定して設定されており、２０％／ｃｍの損失は光路長１０ｃｍのプローブにおいて、総計で約９０％の光が散乱光に配分されることに相当し、これを散乱光成分の割合が十分に大きい上限とした。２０％／ｃｍを超える伝送損失は反入射側への伝播が十分でなく好ましくない。また、樹脂製プローブの製造を考えると、０．１〜１０％／ｃｍの損失が安定的に製造できる範囲としてより好ましい。
【００３８】
また、光学プローブ１は前述の内部伝播分及び外部漏れ分に相応して、エバネッセント波励起と通常光励起とが混在する。つまり、光学プローブ１においては、エバネッセント波による励起を併用できる。例えば、１つの光学プローブ１に複数種の捕捉抗体を固定して、細胞とタンパクを同時に測定するようなことも可能である。
【００３９】
図３は本発明の光学プローブ１の効果を示す測定対象の例を誇張して描いた模式図である。光学プローブ１のファイバ状部位３に固定した捕捉抗体Ａにより細菌Ｂを捕捉し、次いで蛍光標識抗体Ｃを作用させて抗原抗体サンドイッチを形成させている。
【００４０】
光学プローブ１に内部全反射光を導入した場合に、光学プローブ１外に発生するエバネッセント波の有効到達範囲Ｌはおおよそ数１００ｎｍ以下の範囲であり、それよりも遠方では励起効率が１／１０未満になる。
【００４１】
しかし、散乱に基づく漏れ光が混在する場合には、数１００ｎｍ超の範囲まで励起することが可能になる。この際に、結合していない液相中の標識抗体や蛍光性の夾雑物を励起してしまう可能性があるが、これらは洗浄操作により回避又は軽減することができる。
【００４２】
同様な効果が期待される系としては、免疫法を例にすると、（ａ）光学プローブ１に固定された細胞を用いた抗体（標識抗体）の力価測定、（ｂ）光学プローブ１の表面から伸ばした高分子鎖に抗体を固定し、実質的な表面積を増加させたサンドイッチ法測定、（ｃ）予めビーズ上でサンドイッチ法により捕捉と標識を行い、ビーズを例えば磁力により光学プローブ１上に集めることで濃縮効果を付与した測定などが挙げられる。
【００４３】
また、測定対象としては、抗原−抗体反応に限らず、金属イオンの錯形成、吸着剤による吸着、表面に固定した触媒による反応なども、適当な標識体の存在下で測定が可能である。
【００４４】
以下に、特許文献４に記載されている光学プローブと同様の形状を有する光学プローブ１を２種の条件で作製し、これを蛍光免疫法測定に供した例を測定例として説明する。光学プローブ１は主として円柱形の長さ３８ｍｍ、直径０．７ｍｍのファイバ状部位３から成り、反入射側の端部には余剰光の吸収を目的として黒色塗料を塗布した。
【００４５】
材料はポリスチレン樹脂を８０℃、４時間以上乾燥して使用した。２種類の条件として、一方には何も添加しない光学プローブ１Ａと、他方には外部潤滑剤であるステアリン酸亜鉛を２００ｐｐｍ添加した光学プローブ１Ｂとした。これらの成形は１点ゲートのコールドランナ方式の金型、及びスクリュー径φ２２ｍｍの射出成形機を使用した。また、透過率測定用に板状試料を成形した。
【００４６】
図４は各光学プローブ１Ａ、１Ｂに対応する光路長５０ｍｍの板状試料の直線透過率を示したものである。光学プローブ１Ｂにおいて散乱に基づく透過率の減少が確認された。この減少は光学プローブ１Ａに対して６３５ｎｍ付近で４．９％／ｃｍの損失に相当する。
【００４７】
次いで、光学プローブ１Ａ及び１Ｂを用いて免疫法に基づく大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の測定を行った。各プローブ１Ａ、１Ｂのファイバ状部位表面には抗大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ポリクローナル抗体を固定した。励起及び測光には、図５に示す測定光学系を用いた。
【００４８】
図５において、液を注入口１１ａ、抽出口１１ｂを介して内部に注排出が可能な測定ポート１１中に、光学プローブ１をそのフランジ２を用いて固定した。測定には、半導体レーザー１２からの光（６３５ｎｍ）を、レンズ１３、ハーフミラー１４、レンズ１５を介して光学プローブ１の上方の凸レンズ状部位４からファイバ状部位３に入射する。光学プローブ１からの帰還光はレンズ１５、ハーフミラー１４を経て水平方向に取り出され、フィルタ１６で分光され、レンズ１７を経てフォトダイオード１８で検出される。
【００４９】
測定ポート１１に注入する洗浄液は、０．５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含む０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。蛍光標識抗体は抗体にCy5 bisfunctional reactive dye（アマシャムバイオサイエンス社製）を作用させて作製し、洗浄液に２μｇ／ｍｌで溶解して用いた。検体は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を所定の濃度で洗浄液に分散して調整した。そして、測定を次の手順で行った。
【００５０】
（１）検体溶液１ｍｌを０．１ｍｌ／分で測定ポート１１内に送液する。
（２）測定ポート１１内に洗浄液２ｍｌを１０ｍｌ／分で送液する。
（３）測定ポート１１内に洗浄液が満たされた状態で励起及び測光し、これをゼロ点とする。
（４）測定ポート１１内に標識抗体溶液を注入し、５分間静置後に排出する。
（５）洗浄液２ｍｌを１０ｍｌ／分で測定ポート１１内に送液する。
（６）測定ポート１１内に洗浄液が満たされた状態で、励起及び測光する。
【００５１】
この測定の結果を次の表１に示し、微小気泡である光散乱要素を設けた光学プローブ１Ｂにおいて、より大きな蛍光信号（ｐＡ）が得られた。
【００５２】
表１
菌濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）      光学プローブ１Ａ      光学プローブ１Ｂ
４５００              ９．３（ｐＡ）      １５．４（ｐＡ）
４５０００            ８０．７            １４８．９
４５００００          ４２１．６          １３４０．３
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の適用に当り、光学プローブ１の測定に供する部分は、板状又はファイバ状のような単位体積当りの内部全反射回数が多くなる形状のものが好適である。また、光学プローブ１が励起光の伝播のみならず、発光の捕集を併せて行うようにすると更に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】光学プローブの側面図である。
【図２】原理的模式図である。
【図３】測定における模式図である。
【図４】光学プローブに相当する樹脂板の透過率特性図である。
【図５】測定光学系の構成図である。
【符号の説明】
【００５５】
１  光学プローブ
２  フランジ
３  ファイバ状部位
４  凸レンズ状部位
１１  測定ポート
１１ａ  注入口
１１ｂ  排出口
１２  半導体レーザー
１４  ハーフミラー
１６  フィルタ
１８  フォトダイオード
【図１】
2005189085.tif 000003
【図２】
2005189085.tif 000004
【図３】
2005189085.tif 000005
【図４】
2005189085.tif 000006
【図５】
2005189085.tif 000007