(57)【要約】【課題】ガン細胞を特異的かつ効果的に死滅させ得る殺ガン細胞剤及び、ガン疾患の予防や治療に有用な組成物を提供する。【解決手段】化学合成による３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を有効成分としてなる特異的殺ガン細胞剤。また、該殺ガン細胞剤を配合してなる医薬用あるいは食用組成物。【選択図】図１
2005029554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体
【請求項２】
化学的に合成された共役トリエン構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体
【請求項３】
化学的に合成された共役トリエン構造を有する共役イコサペンタエン酸
【請求項４】
請求項３項の化学構造式が５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び／又は５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸である化学的に合成された共役イコサペンタエン酸
【請求項５】
請求項３項の化学構造式が５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物である化学的に合成された共役イコサペンタエン酸
【請求項６】
請求項１〜５項に記載の化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造法
【請求項７】
請求項１〜５項に記載の化合物の生理活性がヒト由来のガン細胞に対する殺ガン細胞剤
【請求項８】
請求項７項に記載のヒト由来のガン細胞に対する殺ガン細胞剤を配合してなる医薬用組成物又は食用組成物
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【発明が属する技術分野】
【０００１】本発明は様々な生理活性を有する化学的に合成された化学合成した３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体とこれを有効成分する殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる組成物に関するものである。より詳しくは新規な合成法により製造された共役トリエン酸を有効成分として含有してなるヒト由来ガン細胞を効率的に死滅させる殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる医薬用組成物又は食用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】近年、脂質の生理活性や薬理作用についての研究が進み不飽和脂肪酸の代謝において様々の化学物質への変換とその働きについての解明がなされている。特に飽和脂肪酸、モノエン酸、不飽和脂肪酸の栄養学上の好ましい比率やイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの魚汕由来のω３系の脂肪酸とリノール酸を中心とする植物由来のω６系の脂肪酸の比率が疾病との関連の中で重用視されている。【０００３】ω６系のリノール酸は皮膚を形成する上で不可欠の脂肪酸であり人体において鎖延長、不飽和化を受けてアラキドン酸やω６ドコサペンタエン酸などになる。アラキドン酸は乳幼児期の成長に不可欠の脂肪酸でありかつアラキドン酸カスケードによりプロスタグランジンやロイコトリエンとなり人休の各部位で生理機能を果たしている。またαリノレン酸（ＡＬＮ）を出発物質として鎖延長、不飽和化してイコサペンタエン酸（ＩＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのω３系の脂肪酸の系列がある。ＩＰＡやＤＨＡは魚油などに多く含まれるω３系の多価不飽和脂肪酸で人休内ではω６系などの他の系列の脂肪酸からは変換されない。従ってこれらの脂肪酸の欠乏が様々の疾病の原因になると言われている。【０００４】これらの多価不飽和脂肪酸の生理機能としてＡＬＮの記憶学習能向上作用（特開平１−１５３６２９）、抗アレルギー作用、血清脂質改善作用などがありＡＡでは血小板凝集作用、乳児期の成長への影響、ＥＰＡでは高脂血症改善効果が医薬用に認められコレステロール低減効果や赤血球変形能の向上効果（田村泰ら「食の科学」第１６１巻、３３−３９頁１９９１年）など、ＤＨＡについては血中脂質低下作用（今泉勝巳、「臨床栄養」第８３巻４号４４０頁１９９３年等）血小板凝集抑制作用で（永川祐三ら「血液と脈管」第１５巻２号１３８−１４１頁１９８４年）記憶学習能の改善（Ａ．Ｈｕｃａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３９，２６１，１９９２）抗痴呆（Ｍ．Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９９３）、抗腫瘍効果（成沢富雄ら、「医学の歩み」第１４５巻９１１頁１９８８年）抗アレルギー効果（Ｍ．Ｓｈｉｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９３３）などの作用が見いだされておりさらにＤＰＡやミード酸について機能の研究が進められている。【０００５】一方多価不飽和脂肪酸の化学構造において共役リノール酸が牛の脂質の中に含まれこれが脂肪の蓄積を予防することが明らかになりアルカリ共役した共役リノール酸が体脂肪の低減効果（Ｌｉｐｉｄｓ，３１，８５３（１９９７））血中コレステロールの低下、抗腫瘍作用（Ｍ．Ａ．Ｂｅｌｕｒｙ，Ｎｕｔｒ．ＲｅＳ．，５３，８３，（１９９５））などの機能が見いだされている。また桐油やニガウリ種子油中に含まれるエレオステアリン酸などもより効果が高いものであることが公表されている。【０００６】すでに発明者らはアルカリで共役化した多価不飽和脂肪酸を有効成分とした殺ガン細胞剤について特開２０００−２８１５７２、特開２００１−２８８０７９に出願した。これらは共役トリエンを多く含むことから共役ジエンに比べ効果が高く、共役トリエンの中でも炭素数が��０以上である長鎖の脂肪酸が通常の細胞に対しより毒性が低いことが明らかになってきている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】記述したように共役トリエン構造を有するＩＰＡやＤＨＡは殺ガン細胞効果に優れるとともに正常細胞に影響を及ぼさない効果が認められたが実際の治療においてその作用機序などを研究していく上でアルカリ共役化した共役トリエンがきわめて多数の位置及び幾何異性体をもっていることがその構造的な面での確認を困難にしている。また医薬においてはその純度面で極力単一の成分であることが望ましく異性体が多く含まれる場合はその各々の構造体を単離しそれぞれの機能と毒性に関する評価結果が求められる。これらの異性体は数十種類にも及びそれぞれを単離しその毒性や殺ガン細胞作用を評価することは至難のことである。従って化学的に単一か極力異性体の少ない製造方法を確立して、その殺ガン細胞作用を評価し医薬として、また食品用の組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】本発明者らは、前記課題を解決するために、共役トリエン構造をもつ多価不飽和脂肪酸の合成法とその異性体の少ない方法にについて鋭意検討を加えた結果天然の多価不飽和脂肪酸から得られる共役トリエン型と同じ化学構造式を持つ共役トリエン型多価不飽和脂肪酸の合成法を確立し顕著な殺ガン細胞効果を有することを見いだし本発明を完成した。
【０００９】本発明においては単一の組成又は２から３つの化学構造の共役トリエンを有する組成物を得ることを目的とした。従って天然に存在する多価不飽和脂肪酸を選択的に単一の構造になるように共役化する方法や通常のアルカリ共役化した多数の異性体を含む多価不飽和脂肪酸をカラム分離などの方法によって異性体を数種にすることについて検討を加えているが良好な結果を得られていない。
【００１０】以下に示すように本発明の目的は化学合成によって共役トリエン構造を構成し化学反応で鎖延長することで目的とする化合物を作ることにある。化学合成によって単一か２，３の異性体のみから成り立つ化合物を作ることにある。これによって生理活性に有効な化合物の体内の代謝における化合物特定が容易になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】本発明における化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造方法は化学合成で単一か２，３の化学式で表現される異性体の少ない化合物を作ることにある。これらの化合物は脂肪酸の形でも良いが様々の誘導体の形でも使用可能である。通常のエステル体やアルカリ金属やアルカリ度類金属などの金属塩やアンモニウム、エタノールアミンなどとのアミドや単一の場合や他の脂肪酸も含めた混合のものも含めたトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドやリン脂質、セラミドやその配糖体を含むスフインゴ脂質、スルフォキノボシルジグリセリドやモノグルコシルジなどのグリセリド糖脂質などの誘導体で使用することが可能である。これら化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を殺ガン細胞剤の有効成分として医薬用組成物及び食用組成物を製造することが出来る。【００１２】本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体は特に限定するものではないが５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸、５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸、並びに５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ），２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ），２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸などがあげられる。本発明の基本的な化学反応は共役トリエン構造を形成することであり必ずしも化合物を限定するものではない。鎖延長したり二重結合をさらに増やすことは使用する原料を変更することで製造可能である。【００１３】本発明においては他の殺ガン細胞剤と同様に併用物質を使うことは可能である。また使用形態は通常の医薬組成物や食用の組成物として使用する形態は限定するものではない。また本発明で言う殺ガン細胞剤としての対象は人組織由来のモノであれば部位は特に限定するものではない。大腸、肝細胞、肺、胃や乳ガンなどのガン細胞に対して顕著な死滅効果を発揮するものである。【００１４】以下本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造法の実施例を示す。
【実施例】
【００１５】実施例１：化合物２の合成法
δ−バレロラクトン（５ｇ）をメタノール（１０４ｍｌ）に溶解した液に、濃硫酸（０．１ｍｌ）を加え６時間還流した。放冷した後、０℃下で炭酸水素ナトリウム（０．６ｇ）を加え１０分間攪拌した。セライト濾過後、減圧下で濃縮してエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）を得た。
このエステルをＳｗｅｒｎ酸化した。窒素雰囲気下、滴下ロートを付した三口フラスコにＯｘａｌｙ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（５ｍｌ）と無水塩化メチレン（７５ｍｌ）を入れ、−７８℃に冷却し、攪拌下にＤＭＳＯ（９ｍｌ）を塩化メチレン（１５ｍｌ）に溶かした溶液をゆっくりと滴下した。３０分間攪拌しこれにエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）（５０ｍｍｏｌ、）の無水塩化メチレン（６．４ｇ）溶液を滴下した。−７８℃で３０分間攪拌した後、トリエチルアミンを滴下した。冷却を止めて反応液を室温に戻した。その後反応液に水を加え、攪拌した。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで二回抽出した有機層は飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物は減圧蒸留（ｂ．ｐ：７２−７５℃／５ｍｍＨｇ）で精製し、無色透明の液休化合物２（３．１ｇ）を得た。【００１６】実施例２化合物３の合成法
滴下ロートと空冷管を付した三口フラスコにＷｉｔｔｉｇ試薬（Ｂｒ（Ｃ６Ｈ５）３ＰＣＨ２）２ＣＨ）（９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）−ＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液を入れ−７８℃に冷却した。ＫＨＭＤＳ（ＫＮ（ＳｉＭｅ３）２）トルエン溶液（２０％トルエン溶液、２５ｇ）を−７８℃、窒素雰囲気下でＷｉｔｔｉｇ試薬−ＴＨＦ懸濁液に滴下した。冷却槽をはずして反応溶液を室温に戻し、３０分攪拌した。ＨＭＰＡ（６ｍｌ）を加え、再び−７８℃に冷却した。このジイリド反応溶液にプロピオンアルデヒド（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨＯ）（１ｍｌ，１４ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、滴下後、反応液を２時間かけて０℃にし、３０分攪拌した。再び−７８℃に冷却した後、化合物２（１ｇ，７．７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）溶液を滴下した。反応液を室温に戻し、３０分攪拌した。
飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍｌ）を加え、攪拌し、有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、これらの有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥させた。乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチルー９０／１）で精製し、透明の液体の化合物３を得た（３０％）。【００１７】実施例３：化合物４の合成法
冷却管を付した三口フラスコで窒素雰囲気下、化合物３（２００ｍｇ）−無水塩化メチル（８ｍｌ）溶液を−７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ（水素化ジイソブチリルアルミニウム）のヘキサン溶液（１．１ｍｌ）を三口フラスコの壁を伝わらせてゆっくり滴下した。ＴＬＣ分析で化合物３がアルデヒドに還元されたことを確認してからさらに３０分攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液（３ｍｌ）を滴下した後、反応液を室温に戻した。エーテルで希釈し、セライトを加え１５分攪拌した。セライトを濾過し有機層を硫酸マグネシウム（無水）で乾燥、減圧下で濃縮した。この組成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチルー１００／１）で精製し、オイル状のアルデヒド化合物７を得た。この物質（１２０ｍｇ）のトルエン（１０ｍｌ）溶液にＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２４２ｍｇ）を入れ２時間還流した。その後さらにＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２１２ｍｇ）とトルエン５ｍｌを加え、一晩還流した。減圧下で濃縮した後にヘキサン抽出を行い、これを濃縮し、粗反応生成物を得た。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１）で精製し、化合物４を得た（１０％）。【００１８】実施例４：化合物５，６の合成法
窒素雰囲気下、Ｗｉｔｔｉｇ試薬（Ｐｈ３Ｐ（ＣＨ２）ＣＯＯＨ、１００ｍｇ）−無水ＴＨＦ（１ｍｌ）懸濁液にＬｉＨＭＤＳ（０．５ｍｌ）を滴下した。室温で３０分攪拌した後、化合物４（３４ｍｇ）−無水ＴＨＦを滴下し、室温２５℃で３０分攪拌した。シュウ酸飽和水溶液、エーテルを加え攪拌し有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、有機層と合わせた。この有機層を１ｍｌになるまで減圧下で濃縮し、三角フラスコに移し、ジアゾメタン／エーテル溶液を滴下した。エーテル層を減圧下で濃縮し粗反応生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製し化合物５，６の混合物を２２ｍｇ得た。（４７％）
化合物５，６混合サンプルをＨＰＬＣ分取（ヘキサン／アセトニトリル＝１００／０．３（ｖ／ｖ）、ＣＨＲＯＭＰＡＣ２５０×４．６ｍｍ、ＣＨＲＯＭＳＰＨＥＲ  ５  ＬＩＰＩＤＳ）し、ＮＭＲで構造を確認した。化合物５が優先的に合成されていた。【００１９】実施例５  化合物８の合成
アルデヒドである化合物７（１ｇ、６ｍｍｏｌ）にＭｅ−（４）−４−（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎｏａｔｅ（１．６ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、紛状のモレキュラーシーブス４Å（６．５ｇ）、水酸化リチウム／ＴＨＦ（２７５ｍｇＬｉ・Ｈ２Ｏ、５０ｍｌＴＨＦ）を加え、１４時間還流した。還流後、室温に戻し、エーテルでセライト濾過した。濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４０・１）で精製し、無色透明の液休、エステルである化合物８を６８４ｍｇ得た（４６％）。【００２０】実施例６  化合物９の合成法
エステル化合物８の無水塩化メチレン溶液（６７４ｍｇ、２．７ｍｍｏｌエステル、１５ｍｌＣＨ２Ｃ１２）にＤＩＢＡＬ−キサン溶液（０．９６ｍｏｌ／Ｌ，６．５ｍｌ）を−７８℃下でゆっくり滴下した。１時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、エーテルで希釈後にセライトを加え１５分間攪拌した。反応液をセライト濾過し減圧下で濃縮し粗反応生成物化合物９（アリルアルコール、５９４ｍｇ）を得た。【００２１】実施例７  化合物４の合成法
アリルアルコール化合物９（５８４ｍｇ）を含む塩化メチレン（２５０ｍｌ）の溶液に活性二酸化マンガン（ＭｎＯ２、８ｇ）を加え超音波で４時間攪拌した。反応液をセライト濾過し、減圧下で濃縮後、粗反応物である化合物４を４５６ｍｇを得た。【００２２】試験例１
前述の３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の殺ガン細胞作用を以下に述べる方法で評価した。すなわち東北大学加齢医学研究所付属ガン細胞施設より分譲され、入手したヒト由来の５種のガン細胞である大腸ガン細胞（細胞番号（以下同様）：ＴＫＧ０３７９、以下ＤＬＤ−１という）、肝臓ガン細胞（ＴＫＧ０２０５、以下ＨｅｐＧ２という）、肺ガン細胞（ＴＫＧ０１８４、以下Ａ５４９という）、乳ガン細胞（ＴＫＧ０４７９、以下ＭＣＦ７という）及び胃ガン細胞（ＴＫＧ０２２８、以下ＭＫＮ−７という）を用い、各細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、８０％コンフレント（細胞充満度）に達した時点で、１５μＭの５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物を含む０．５％血清アルブミンを加え、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした後に生細胞数をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルアゾール−２−イル）−２，５−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）法で調べた。なおＭＴＴ法は生細胞内酵素活性を指標としているためほとんどの細胞に適用でき、この結果も比較的安定しているので殺細胞作用の評価法として採用した。この結果を表１に示す。また非共役ＥＰＡ及び非共役ＤＨＡを構成脂肪酸とする魚油（比較試料２）について同様に試験した結果を併記した。【００２３】
【表１】
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【００２４】表１において、数値は試験試料を添加しない時のＭＴＴ活性（細胞生存率、％）を１００とし、試験試料の添加濃度（１５μＭ）における相対値を平均値±標準偏差（ｎ＝６）で示す（以下同様）。各試験試料の数値は比較試料１及び２の場合の値と比較して優位差があった（Ｐ＜０．０５）。このデータから、本発明に係る化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の値であり魚油に比べて大腸ガン細胞に対して殺細胞効果が認められた。また肝臓ガン細胞、肺ガン細胞、胃ガン細胞についても同様の殺細胞効果が認められた。【００２５】試験例２
前述の各種共役多価不飽和脂肪酸類の正常細胞に対する影響を試験例１に記載の方法と同様にして評価した。ヒト由来の正常細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪）から入手した肺線維芽細胞（以下ＭＲＣ−５という）、皮膚線維芽細胞（以下ＴＩＧ−１０３という）、肺線維芽細胞（以下ＫＭＳ−６という）を用いた。この結果を共役リノール酸エチルエステル及び魚油（未変性）についての結果とともに表２に示す。同表中の数値、記号の意味は表１と同じである。これらのデータから、ｎ−３系脂肪酸の一種であるαリノレン酸、ＥＰＡ，ＤＨＡなどの共役多価不飽和脂肪酸はヒト正常細胞の生育（分裂、増殖等）に対してほとんど影響を及ぼさず、とりわけ共役トリエン体を多く含むものはアルカリ共役でも化学合成品であっても当該作用が強いことが明らかになった。【００２６】
【表２】
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【００２７】実施例８
実施例４によって得られた化学構造式が５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物２５０ｍｇ、精製大豆油３０ｍｇ、蜜蝋１０ｍｇ、ビタミンＥ１０ｍｇを窒素ガス雰囲気下で約４０℃に加温し、十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル製剤を試作した。これらの製剤は医薬用組成物又は食用組成物として利用できるものである。
【発明の効果】
【００２８】本発明によれば３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を有効成分としてなる殺ガン細胞剤が提供される。この殺ガン細胞剤はヒト由来の大腸ガン、肝臟ガン、肺ガン、乳ガン、あるいは胃ガンのガン細胞を死滅させる効果を有しかつ正常細胞の維持に対しては悪影響を及ぼすことはない。このような効果は共役リノール酸などの共役ジエン類では認められることはない。本発明に従えば単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の効果を有しなおかつ単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体であることによりその代謝などが容易に研究することが出来、医薬用としての利用は容易である。本発明に従えば殺ガン細胞剤を配合してなる医薬用組成物又は食用組成物が提供される。該組成物はガン疾患の予防あるいは治療用途に利用され得るものである。
2005029554.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月15日(2003.12.15)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は様々な生理活性を有する化学的に合成された化学合成した３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体とこれを有効成分する殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる組成物に関するものである。より詳しくは新規な合成法により製造された共役トリエン酸を有効成分として含有してなるヒト由来ガン細胞を効率的に死滅させる殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる医薬用組成物又は食用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、脂質の生理活性や薬理作用についての研究が進み不飽和脂肪酸の代謝において様々の化学物質への変換とその働きについての解明がなされている。特に飽和脂肪酸、モノエン酸、不飽和脂肪酸の栄養学上の好ましい比率やイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの魚油由来のω３系の脂肪酸とリノール酸を中心とする植物由来のω６系の脂肪酸の比率が疾病との関連の中で重用視されている。【０００３】ω６系のリノール酸は皮膚を形成する上で不可欠の脂肪酸であり人体において鎖延長、不飽和化を受けてアラキドン酸やω６ドコサペンタエン酸などになる。アラキドン酸は乳幼児期の成長に不可欠の脂肪酸でありかつアラキドン酸カスケードによりプロスタグランジンやロイコトリエンとなり人体の各部位で生理機能を果たしている。またαリノレン酸（ＡＬＮ）を出発物質として鎖延長、不飽和化してイコサペンタエン酸（ＩＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのω３系の脂肪酸の系列がある。ＩＰＡやＤＨＡは魚油などに多く含まれるω３系の多価不飽和脂肪酸で人体内ではω６系などの他の系列の脂肪酸からは変換されない。従ってこれらの脂肪酸の欠乏が様々の疾病の原因になると言われている。
【発明の開示】
【０００４】これらの多価不飽和脂肪酸の生理機能としてＡＬＮの記憶学習能向上作用（特開平１−１５３６２９）、抗アレルギー作用、血清脂質改善作用などがありＡＡでは血小板凝集作用、乳児期の成長への影響、ＥＰＡでは高脂血症改善効果が医薬用に認められコレステロール低減効果や赤血球変形能の向上効果（田村泰ら「食の科学」第１６１巻、３３−３９頁１９９１年）など、ＤＨＡについては血中脂質低下作用（今泉勝巳、「臨床栄養」第８３巻４号４４０頁１９９３年等）血小板凝集抑制作用で（永川祐三ら「血液と脈管」第１５巻２号１３８−１４１頁１９８４年）記憶学習能の改善（Ａ．Ｈｕｃａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３９，２６１，１９９２）抗痴呆（Ｍ．Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９９３）、抗腫瘍効果（成沢富雜ら、「医学の歩み」第１４５巻９１１頁１９８８年）抗アレルギー効果（Ｍ．Ｓｈｉｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９３３）などの作用が見いだされておりさらにＤＰＡやミード酸について機能の研究が進められている。
【０００５】一方多価不飽和脂肪酸の化学構造において共役リノール酸が牛の脂質の中に含まれこれが脂肪の蓄積を予防することが明らかになりアルカリ共役した共役リノール酸が体脂肪の低減効果（Ｌｉｐｉｄｓ，３１，８５３（１９９７））血中コレステロールの低下、抗腫瘍作用（Ｍ．Ａ．Ｂｅｌｕｒｙ，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．，５３，８３，（１９９５））などの機能が見いだされている。また桐油やニガウリ種子油中に含まれるエレオステアリン酸などもより効果が高いものであることが公表されている。
【０００６】  すでに発明者らはアルカリで共役化した多価不飽和脂肪酸を有効成分とした殺ガン細胞剤について特開２０００−２８１５７２、特開２００１−２８８０７９に出願した。これらは共役トリエンを多く含むことから共役ジエンに比べ効果が高く、共役トリエンの中でも炭素数が２０以上である長鎖の脂肪酸が通常の細胞に対しより毒性が低いことが明らかになってきている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  記述したように共役トリエン構造を有するＩＰＡやＤＨＡは殺ガン細胞効果に優れるとともに正常細胞に影響を及ぼさない効果が認められたが実際の治療においてその作用機序などを研究していく上でアルカリ共役化した共役トリエンがきわめて多数の位置及び幾何異性体をもっていることがその構造的な面での確認を困難にしている。また医薬においてはその純度面で極力単一の成分であることが望ましく異性体が多く含まれる場合はその各々の構造体を単離しそれぞれの機能と毒性に関する評価結果が求められる。これらの異性体は数十種類にも及びそれそれを単離しその毒性や殺ガン細胞作用を評価することは至難のことである。従って化学的に単一か極力異性体の少ない製造方法を確立して、その殺ガン細胞作用を評価し医薬として、また食品用の組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】本発明者らは、前記課題を解決するために、共役トリエン構造をもつ多価不飽和脂肪酸の合成法とその異性体の少ない方法にについて鋭意検討を加えた結果天然の多価不飽和脂肪酸から得られる共役トリエン型と同じ化学構造式を持つ共役トリエン型多価不飽和脂肪酸の合成法を確立し顕著な殺ガン細胞効果を有することを見いだし本発明を完成した。
【０００９】本発明においては単一の組成又は２から３つの化学構造の共役トリエンを有する組成物を得ることを目的とした。従って天然に存在する多価不飽和脂肪酸を選択的に単一の構造になるように共役化する方法や通常のアルカリ共役化した多数の異性体を含む多価不飽和脂肪酸をカラム分離などの方法によって異性体を数種にすることについて検討を加えているが良好な結果を得られていない。
【００１０】以下に示すように本発明の目的は化学合成によって共役トリエン構造を構成し化学反応で鎖延長することで目的とする化合物を作ることにある。化学合成によって単一か２，３の異性体のみから成り立つ化合物を作ることにある。これによって生理活性に有効な化合物の体内の代謝における化合物特定が容易になる。
【発明の効果】
【００１１】本発明によれば３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を有効成分としてなる殺ガン細胞剤が提供される。この殺ガン細胞剤はヒト由来の大腸ガン、肝臓ガン、肺ガン、乳ガン、あるいは胃ガンのガン細胞を死滅させる効果を有しかつ正常細胞の維持に対しては悪影響を及ぼすことはない。このような効果は共役リノール酸などの共役ジエン類では認められることはない。本発明に従えば単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の効果を有しなおかつ単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体であることによりその代謝などが容易に研究することが出来、医薬用としての利用は容易である。本発明に従えば殺ガン細胞剤を配合してなる医薬用組成物又は食用組成物が提供される。該組成物はガン疾患の予防あるいは治療用途に利用され得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】本発明における化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造方法は化学合成で単一か２，３の化学式で表現される異性体の少ない化合物を作ることにある。これらの化合物は脂肪酸の形でも良いが様々の誘導体の形でも使用可能である。通常のエステル体やアルカリ金属やアルカリ度類金属などの金属塩やアンモニウム、エタノールアミンなどとのアミドや単一の場合や他の脂肪酸も含めた混合のものも含めたトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドやリン脂質、セラミドやその配糖体を含むスフィンゴ脂質、スルフォキノボシルジグリセリドやモノグルコシルジなどのグリセリド糖脂質などの誘導体で使用することが可能である。これら化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を殺ガン細胞剤の有効成分として医薬用組成物及び食用組成物を製造することが出来る。【００１３】本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体は特に限定するものではないが５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸、５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸、並びに５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ），２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ），２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸などがあげられる。本発明の基本的な化学反応は共役トリエン構造を形成することであり必ずしも化合物を限定するものではない。鎖延長したり二重結合をさらに増やすことは使用する原料を変更することで製造可能である。【００１４】本発明においては他の殺ガン細胞剤と同様に併用物質を使うことは可能である。また使用形態は通常の医薬組成物や食用の組成物として使用する形態は限定するものではない。また本発明で言う殺ガン細胞剤としての対象は人組織由来のモノであれば部位は特に限定するものではない。大腸、肝細胞、肺、胃や乳ガンなどのガン細胞に対して顕著な死滅効果を発揮するものである。【００１５】以下本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造法の実施例を示す。
【実施例】
【００１６】実施例１：化合物２の合成法
δ−バレロラクトン（５ｇ）をメタノール（１０４ｍｌ）に溶解した液に、濃硫酸（０．１ｍｌ）を加え６時間還流した。放冷した後、０℃下で炭酸水素ナトリウム（０．６ｇ）を加え１０分間攪拌した。セライト濾過後、減圧下で濃縮してエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）を得た。
このエステルをＳｗｅｒｎ酸化した。窒素雰囲気下、滴下ロートを付した三口フラスコにＯｘａｌｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（５ｍｌ）と無水塩化メチレン（７５ｍｌ）を入れ、−７８℃に冷却し、攪拌下にＤＭＳＯ（９ｍｌ）を塩化メチレン（１５ｍｌ）に溶かした溶液をゆっくりと滴下した。３０分間攪拌しこれにエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）（５０ｍｍｏｌ、）の無水塩化メチレン（６．４ｇ）溶液を滴下した。−７８℃で３０分間攪拌した後、トリエチルアミンを滴下した。冷却を止めて反応液を室温に戻した。その後反応液に水を加え、攪拌した。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで二回抽出した有機層は飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物は減圧蒸留（ｂ．ｐ：７２〜７５℃／５ｍｍＨｇ）で精製し、無色透明の液体化合物２（３．１ｇ）を得た。【００１７】実施例２：化合物３の合成法
滴下ロートと空冷管を付した三口フラスコにＷｉｔｔｉｇ試薬（Ｂｒ（Ｃ６Ｈ５）３ＰＣＨ２）２ＣＨ）（９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）−ＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液を入れ−７８℃に冷却した。ＫＨＭＤＳ（ＫＮ（ＳｉＭｅ３）２）トルエン溶液（２０％トルエン溶液、２５ｇ）を−７８℃、窒素雰囲気下でＷｉｔｔｉｇ試薬−ＴＨＦ懸濁液に滴下した。冷却槽をはずして反応溶液を室温に戻し、３０分攪拌した。ＨＭＰＡ（６ｍｌ）を加え、再び−７８℃に冷却した。このジイリド反応溶液にプロピオンアルデヒド（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨＯ）（１ｍｌ，１４ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、滴下後、反応液を２時間かけて０℃にし、３０分攪拌した。再び−７８℃に冷却した後、化合物２（１ｇ，７．７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）溶液を滴下した。反応液を室温に戻し、３０分攪拌した。
飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍｌ）を加え、攪拌し、有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、これらの有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥させた。乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９０／１）で精製し、透明の液体の化合物３を得た（３０％）。【００１８】実施例３：化合物４の合成法
冷却管を付した三口フラスコで窒素雰囲気下、化合物３（２００ｍｇ）−無水塩化メチル（８ｍｌ）溶液を−７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ（水素化ジイソブチリルアルミニウム）のヘキサン溶液（１．１ｍｌ）を三口フラスコの壁を伝わらせてゆっくり滴下した。ＴＬＣ分析で化合物３がアルデヒドに還元されたことを確認してからさらに３０分攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液（３ｍｌ）を滴下した後、反応液を室温に戻した。エーテルで希釈し、セライトを加え１５分攪拌した。セライトを濾過し有機層を硫酸マグネシウム（無水）で乾燥、減圧下で濃縮した。この組成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）で精製し、オイル状のアルデヒド化合物７を得た。この物質（１２０ｍｇ）のトルエン（１０ｍｌ）溶液にＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２４２ｍｇ）を入れ２時間還流した。その後さらにＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２１２ｍｇ）とトルエン５ｍｌを加え、一晩還流した。減圧下で濃縮した後にヘキサン抽出を行い、これを濃縮し、粗反応生成物を得た。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１）で精製し、化合物４を得た（１０％）。【００１９】実施例４：化合物５，６の合成法
窒素雰囲気下、Ｗｉｔｔｉｇ試薬（Ｐｈ３Ｐ（ＣＨ２）ＣＯＯＨ、１００ｍｇ）−無水ＴＨＦ（１ｍｌ）懸濁液にＬｉＨＭＤＳ（０．５ｍｌ）を滴下した。室温で３０分攪拌した後、化合物４（３４ｍｇ）−無水ＴＨＦを滴下し、室温２５℃で３０分攪拌した。シュウ酸飽和水溶液、エーテルを加え攪拌し有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、有機層と合わせた。この有機層を１ｍｌになるまで減圧下で濃縮し、三角フラスコに移し、ジアゾメタン／エーテル溶液を滴下した。エーテル層を減圧下で濃縮し粗反応生成物を得た。これをシリカグルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製し化合物５，６の混合物を２２ｍｇ得た。（４７％）
化合物５，６混合サンプルをＨＰＬＣ分取（ヘキサン／アセトニトリル＝１００／０．３（Ｖ／Ｖ）、ＣＨＲＯＭＰＡＣ２５０×４．６ｍｍ、ＣＨＲＯＭＳＰＨＥＲ  ５  ＬＩＰＩＤＳ）し、ＮＭＲで構造を確認した。化合物５が優先的に合成されていた。【００２０】実施例５：化合物８の合成
アルデヒドである化合物７（１ｇ、６ｍｍｏｌ）にＭｅ−（４）−４−（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎｏａｔｅ（１．６ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、紛状のモレキュラーシーブス４Å（６．５ｇ）、水酸化リチウム／ＴＨＦ（２７５ｍｇＬｉ・Ｈ２Ｏ、５０ｍｌＴＨＦ）を加え、１４時間還流した。還流後、室温に戻し、エーテルでセライト濾過した。濃縮後、シリカグルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４０・１）で精製し、無色透明の液体、エステルである化合物８を６８４ｍｇ得た（４６％）。【００２１】実施例６：化合物９の合成法
エステル化合物８の無水塩化メチレン溶液（６７４ｍｇ、２．７ｍｍｏｌエステル、１５ｍｌＣＨ２Ｃｌ２）にＤＩＢＡＬＤキサン溶液（０．９６ｍｏｌ／Ｌ，６．５ｍｌ）を−７８℃下でゆっくり滴下した。１時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、エーテルで希釈後にセライトを加え１５分間攪拌した。反応液をセライト濾過し減圧下で濃縮し粗反応生成物化合物９（アリルアルコール、５９４ｍｇ）を得た。【００２２】実施例７：化合物４の合成法
アリルアルコール化合物９（５８４ｍｇ）を含む塩化メチレン（２５０ｍｌ）の溶液に活性二酸化マンガン（ＭｎＯ２、８ｇ）を加え超音波で４時間攪拌した。反応液をセライト濾過し、減圧下で濃縮後、粗反応物である化合物４を４５６ｍｇを得た。【００２３】試験例１
前述の３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の殺ガン細胞作用を以下に述べる方法で評価した。すなわち東北大学加齢医学研究所付属ガン細胞施設より分譲され、入手したヒト由来の５種のガン細胞である大腸ガン細胞（細胞番号（以下同様）：ＴＫＧ０３７９、以下ＤＬＤ−１という）、肝臓ガン細胞（ＴＫＧ０２０５、以下ＨｅｐＧ２という）、肺ガン細胞（ＴＫＧ０１８４、以下Ａ５４９という）、乳ガン細胞（ＴＫＧ０４７、以下ＭＣＦ７という）及び胃ガン細胞（ＴＫＧ０２２８、以下ＭＫＮ−７という）を用い、各細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、８０％コンフレント（細胞充満度）に達した時点で、１５μＭの５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物を含む０．５％血清アルブミンを加え、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした後に生細胞数をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルアゾール−２−イル）−２，５−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）法で調べた。なおＭＴＴ法は生細胞内酵素活性を指標としているためほとんどの細胞に適用でき、この結果も比較的安定しているので殺細胞作用の評価法として採用した。この結果を表１に示す。また非共役ＥＰＡ及び非共役ＤＨＡを構成脂肪酸とする魚油（比較試料２）について同様に試験した結果を併記した。【００２４】
【表１】
2005029554.tif 000006
【００２５】表１において、数値は試験試料を添加しない時のＭＴＴ活性（細胞生存率、％）を１００とし、試験試料の添加濃度（１５μＭ）における相対値を平均値±標準偏差（ｎ＝６）で示す（以下同様）。各試験試料の数値は比較試料１及び２の場合の値と比較して優位差があった（Ｐ＜０．０５）。このデータから、本発明に係る化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の値であり魚油に比べて大腸ガン細胞に対して殺細胞効果が認められた。また肝臓ガン細胞、肺ガン細胞、胃ガン細胞についても同様の殺細胞効果が認められた。【００２６】試験例２
前述の各種共役多価不飽和脂肪酸類の正常細胞に対する影響を試験例１に記載の方法と同様にして評価した。ヒト由来の正常細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪）から入手した肺線維芽細胞（以下ＭＲＣ−５という）、皮膚線維芽細胞（以下ＴＩＧ−１０３という）、肺線維芽細胞（以下ＫＭＳ−６という）を用いた。この結果を共役リノール酸エチルエステル及び魚油（未変性）についての結果とともに表２に示す。同表中の数値、記号の意味は表１と同じである。これらのデータから、ｎ−３系脂肪酸の一種であるαリノレン酸、ＥＰＡ，ＤＨＡなどの共役多価不飽和脂肪酸はヒト正常細胞の生育（分裂、増殖等）に対してほとんど影響を及ぼさず、とりわけ共役トリエン体を多く含むものはアルカリ共役でも化学合成品であっても当該作用が強いことが明らかになった。【００２７】
【表２】
2005029554.tif 000007
【００２８】実施例４によって得られた化学構造式が５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物２５０ｍｇ、精製大豆油３０ｍｇ、蜜蝋１０ｍｇ、ビタミンＥ１０ｍｇを窒素ガス雰囲気下で約４０℃に加温し、十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル製剤を試作した。これらの製剤は医薬用組成物又は食用組成物として利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】  図１の反応スキーム１には実施例１から４に関わる合成ルートと各化合物の番号に対応する構造式が記載されている。
【図２】  図２の反応スキーム２には実施例３と実施例５から７に関わる合成ルートと各化合物の番号に対応する構造式が記載されている。
【符号の説明】
【００３０】  各図の反応スキーム１，２に記載している化学構造式の下に記載されている数字は各反応に表示されている化合物の数字に対応している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
2005029554.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月23日(2004.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】手続補正書
【補正対象項目名】手続補正２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は様々な生理活性を有する化学的に合成された化学合成した３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体とこれを有効成分する殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる組成物に関するものである。より詳しくは新規な合成法により製造された共役トリエン酸を有効成分として含有してなるヒト由来ガン細胞を効率的に死滅させる殺ガン細胞剤及びこれを配合してなる医薬用組成物又は食用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  近年、脂質の生理活性や薬理作用についての研究が進み不飽和脂肪酸の代謝において様々の化学物質への変換とその働きについての解明がなされている。特に飽和脂肪酸、モノエン酸、不飽和脂肪酸の栄養学上の好ましい比率やイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの魚油由来のω３系の脂肪酸とリノール酸を中心とする植物由来のω６系の脂肪酸の比率が疾病との関連の中で重用視されている。【０００３】ω６系のリノール酸は皮膚を形成する上で不可欠の脂肪酸であり人体において鎖延長、不飽和化を受けてアラキドン酸やω６ドコサペンタエン酸などになる。アラキドン酸は乳幼児期の成長に不可欠の脂肪酸でありかつアラキドン酸カスケードによりプロスタグランジンやロイコトリエンとなり人体の各部位で生理機能を果たしている。またαリノレン酸（ＡＬＮ）を出発物質として鎖延長、不飽和化してイコサペンタエン酸（ＩＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのω３系の脂肪酸の系列がある。ＩＰＡやＤＨＡは魚油などに多く含まれるω３系の多価不飽和脂肪酸で人体内ではω６系などの他の系列の脂肪酸からは変換されない。従ってこれらの脂肪酸の欠乏が様々の疾病の原因になると言われている。
【発明の開示】
【０００４】これらの多価不飽和脂肪酸の生理機能としてＡＬＮの記憶学習能向上作用（特開平１−１５３６２９）、抗アレルギー作用、血清脂質改善作用などがありＡＡでは血小板凝集作用、乳児期の成長への影響、ＥＰＡでは高脂血症改善効果が医薬用に認められコレステロール低減効果や赤血球変形能の向上効果（田村泰ら「食の科学」第１６１巻、３３−３９頁１９９１年）など、ＤＨＡについては血中脂質低下作用（今泉勝巳、「臨床栄養」第８３巻４号４４０頁１９９３年等）血小板凝集抑制作用で（永川祐三ら「血液と脈管」第１５巻２号１３８−１４１頁１９８４年）記憶学習能の改善（Ａ．Ｈｕｃａｓ，ｅｌ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３３９，２６１，１９９２）抗痴呆（Ｍ．Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９９３）、抗腫瘍効果（成沢富雄ら、「医学の歩み」第１４５巻９１１頁１９８８年）抗アレルギー効果（Ｍ．Ｓｈｉｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５０，３５２５，１９３３）などの作用が見いだされておりさらにＤＰＡやミード酸について機能の研究が進められている。
【０００５】一方多価不飽和脂肪酸の化学構造において共役リノール酸が牛の脂質の中に含まれこれが脂肪の蓄積を予防することが明らかになりアルカリ共役した共役リノール酸が体脂肪の低減効果（Ｌｉｐｉｄｓ，３１，８５３（１９９７））血中コレステロールの低下、抗腫瘍作用（Ｍ．Ａ．Ｂｅｌｕｒｙ，Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．，５３，８３，（１９９５））などの機能が見いだされている。また桐油やニガウリ種子油中に含まれるエレオステアリン酸などもより効果が高いものであることが公表されている。
【０００６】  すでに発明者らはアルカリで共役化した多価不飽和脂肪酸を有効成分とした殺ガン細胞剤について特開２０００−２８１５７２、特開２００１−２８８０７９に出願した。これらは共役トリエンを多く含むことから共役ジエンに比べ効果が高く、共役トリエンの中でも炭素数が２０以上である長鎖の脂肪酸が通常の細胞に対しより毒性が低いことが明らかになってきている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  記述したように共役トリエン構造を有するＩＰＡやＤＨＡは殺ガン細胞効果に優れるとともに正常細胞に影響を及ぼさない効果が認められたが実際の治療においてその作用機序などを研究していく上でアルカリ共役化した共役トリエンがきわめて多数の位置及び幾何異性体をもっていることがその構造的な面での確認を困難にしている。また医薬においてはその純度面で極力単一の成分であることが望ましく異性体が多く含まれる場合はその各々の構造体を単離しそれぞれの機能と毒性に関する評価結果が求められる。これらの異性体は数十種類にも及びそれぞれを単離しその毒性や殺ガン細胞作用を評価することは至難のことである。従って化学的に単一か極力異性体の少ない製造方法を確立して、その殺ガン細胞作用を評価し医薬として、また食品用の組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】本発明者らは、前記課題を解決するために、共役トリエン構造をもつ多価不飽和脂肪酸の合成法とその異性体の少ない方法にについて鋭意検討を加えた結果天然の多価不飽和脂肪酸から得られる共役トリエン型と同じ化学構造式を持つ共役トリエン型多価不飽和脂肪酸の合成法を確立し顕著な殺ガン細胞効果を有することを見いだし本発明を完成した。
【０００９】本発明においては単一の組成又は２から３つの化学構造の共役トリエンを有する組成物を得ることを目的とした。従って天然に存在する多価不飽和脂肪酸を選択的に単一の構造になるように共役化する方法や通常のアルカリ共役化した多数の異性体を含む多価不飽和脂肪酸をカラム分離などの方法によって異性体を数種にすることについて検討を加えているが良好な結果を得られていない。
【００１０】以下に示すように本発明の目的は化学合成によって共役トリエン構造を構成し化学反応で鎖延長することで目的とする化合物を作ることにある。化学合成によって単一か２，３の異性体のみから成り立つ化合物を作ることにある。これによって生理活性に有効な化合物の体内の代謝における化合物特定が容易になる。
【発明の効果】
【００１１】本発明によれば３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を有効成分としてなる殺ガン細胞剤が提供される。この殺ガン細胞剤はヒト由来の大腸ガン、肝臓ガン、肺ガン、乳ガン、あるいは胃ガンのガン細胞を死滅させる効果を有しかつ正常細胞の維持に対しては悪影響を及ぼすことはない。このような効果は共役リノール酸などの共役ジエン類では認められることはない。本発明に従えば単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の効果を有しなおかつ単一か又は２，３の異性体に限定された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体であることによりその代謝などが容易に研究することが出来、医薬用としての利用は容易である。本発明に従えば殺ガン細胞剤を配合してなる医薬用組成物又は食用組成物が提供される。該組成物はガン疾患の予防あるいは治療用途に利用され得るものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】本発明における化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造方法は化学合成で単一か２，３の化学式で表現される異性体の少ない化合物を作ることにある。これらの化合物は脂肪酸の形でも良いが様々の誘導体の形でも使用可能である。通常のエステル体やアルカリ金属やアルカリ度類金属などの金属塩やアンモニウム、エタノールアミンなどとのアミドや単一の場合や他の脂肪酸も含めた混合のものも含めたトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドやリン脂質、セラミドやその配糖体を含むスフィンゴ脂質、スルフォキノボシルジクリセリドやモノグルコシルジなどのグリセリド糖脂質などの誘導体で使用することが可能である。これら化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体を殺ガン細胞剤の有効成分として医薬用組成物及び食用組成物を製造することが出来る。【００１３】本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体は特に限定するものではないが５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸、５（Ｚ）７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）ドコサペンタエン酸、並びに５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）、２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸及び５（Ｅ）７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ），２０（Ｚ）ドコサヘキサエン酸などがあげられる。本発明の基本的な化学反応は共役トリエン構造を形成することであり必ずしも化合物を限定するものではない。鎖延長したり二重結合をさらに憎やすことは使用する原料を変更することで製造可能である。【００１４】本発明においては他の殺ガン細胞剤と同様に併用物質を使うことは可能である。また使用形態は通常の医薬組成物や食用の組成物として使用する形態は限定するものではない。また本発明で言う殺ガン細胞剤としての対象は人組織由来のモノであれば部位は特に限定するものではない。大腸、肝細胞、肺、胃や乳ガンなどのガン細胞に対して顕著な死滅効果を発揮するものである。【００１５】以下本発明で言う化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の製造法の実施例を示す。
【実施例】
【００１６】実施例１：  化合物２の合成法
δ−バレロラクトン（５ｇ）をメタノール（１０４ｍｌ）に溶解した液に、濃硫酸（０．１ｍｌ）を加え６時間還流した。放冷した後、０℃下で炭酸水素ナトリウム（０．６ｇ）を加え１０分間攪拌した。セライト濾過後、減圧下で濃縮してエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）を得た。
このエステルをＳｗｅｒｎ酸化した。窒素雰囲気下、滴下ロートを付した三口フラスコにＯｘａｌｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（５ｍｌ）と無水塩化メチレン（７５ｍｌ）を入れ、−７８℃に冷却し、攪拌下にＤＭＳＯ（９ｍｌ）を塩化メチレン（１５ｍｌ）に溶かした溶液をゆっくりと滴下した。３０分間攪拌しこれにエステル（ＨＯ（ＣＨ２）４ＣＯＯＭｅ）（５０ｍｍｏｌ、）の無水塩化メチレン（６．４ｇ）溶液を滴下した。−７８℃で３０分間攪拌した後、トリエチルアミンを滴下した。冷却を止めて反応液を室温に戻した。その後反応液に水を加え、攪拌した。有機層を分取し、水層を酢酸エチルで二回抽出した有機層は飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物は減圧蒸留（ｂ．ｐ：７２〜７５℃／５ｍｍＨｇ）で精製し、無色透明の液体化合物２（３．１ｇ）を得た。【００１７】実施例２：化合物３の合成法
滴下ロートと空冷管を付した三口フラスコにＷｉｔｔｉｇ試薬（Ｂｒ（Ｃ６Ｈ５）３ＰＣＨ２）２ＣＨ）（９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）−ＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液を入れ−７８℃に冷却した。ＫＨＭＤＳ（ＫＮ（ＳｉＭｅ３）２）トルエン溶液（２０％トルエン溶液、２５ｇ）を−７８℃、窒素雰囲気下でＷｉｔｔｉｇ試薬−ＴＨＦ懸濁液に滴下した。冷却槽をはずして反応溶液を室温に戻し、３０分攪拌した。ＨＭＰＡ（６ｍｌ）を加え、再び−７８℃に冷却した。このジイリド反応溶液にプロピオンアルデヒド（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨＯ）（１ｍｌ，１４ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、滴下後、反応液を２時間かけて０℃にし、３０分攪拌した。再び−７８℃に冷却した後、化合物２（１ｇ，７．７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ｍｌ）溶液を滴下した。反応液を室温に戻し、３０分攪拌した。
飽和塩化アンモニウム水溶液（３０ｍｌ）を加え、攪拌し、有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、これらの有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム（無水）で乾燥させた。乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９０／１）で精製し、透明の液体の化合物３を得た（３０％）。【００１８】実施例３：化合物４の合成法
冷却管を付した三口フラスコで窒素雰囲気下、化合物３（２００ｍｇ）−無水塩化メチル（８ｍｌ）溶液を−７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ（水素化ジイソブチリルアルミニウム）のヘキサン溶液（１．１ｍｌ）を三口フラスコの壁を伝わらせてゆっくり滴下した。ＴＬＣ分析で化合物３がアルデヒドに還元されたことを確認してからさらに３０分攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液（３ｍｌ）を滴下した後、反応液を室温に戻した。エーテルで希釈し、セライトを加え１５分攪拌した。セライトを濾過し有機層を硫酸マグネシウム（無水）で乾燥、減圧下で濃縮した。この組成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／１）で精製し、オイル状のアルデヒド化合物７を得た。この物質（１２０ｍｇ）のトルエン（１０ｍｌ）容液にＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２４２ｍｇ）を入れ２時間還流した。その後さらにＰｈ３＝ＣＨＣＨＯ（２１２ｍｇ）とトルエン５ｍｌを加え、一晩還流した。減圧下で濃縮した後にヘキサン抽出を行い、これを濃縮し、粗反応生成物を得た。これをシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１）で精製し、化合物４を得た（１０％）。【００１９】実施例４：化合物５，６の合成法
窒素雰囲気下、Ｗｉｔｔｉｇ試薬（Ｐｈ３Ｐ（ＣＨ２）ＣＯＯＨ、１００ｍｇ）−無水ＴＨＦ（１ｍｌ）懸濁液にＬｉＨＭＤＳ（０．５ｍｌ）を滴下した。室温で３０分攪拌した後、化合物４（３４ｍｇ）−無水ＴＨＦを滴下し、室温２５℃で３０分攪拌した。シュウ酸飽和水溶液、エーテルを加え攪拌し有機層を分取した。水層をさらにエーテルで抽出し、有機層と合わせた。この有機層を１ｍｌになるまで減圧下で濃縮し、三角フラスコに移し、ジアゾメタン／エーテル溶液を滴下した。エーテル層を減圧下で濃縮し粗反応生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３０／１）で精製し化合物５，６の混合物を２２ｍｇ得た。（４７％）
化合物５，６混合サンプルをＨＰＬＣ分取（ヘキサン／アセトニトリル＝１００／０．３（ｖ／ｖ）、ＣＨＲＯＭＰＡＣ２５０×４．６ｍｍ、ＣＨＲＯＭＳＰＨＥＲ  ５  ＬＩＰＩＤＳ）し、ＮＭＲで構造を確認した。化合物５が優先的に合成されていた。【００２０】実施例５：化合物８の合成
アルデヒドである化合物７（１ｇ、６ｍｍｏｌ）にＭｅ−（４）−４−（ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎｏａｔｅ（１．６ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、紛状のモレキュラーシーブス４Å（６．５ｇ）、水酸化リチウム／ＴＨＦ（２７５ｍｇＬｉ・Ｈ２Ｏ、５０ｍｌＴＨＦ）を加え、１４時間還流した。還流後、室温に戻し、エーテルでセライト濾過した。濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４０・１）で精製し、無色透明の液体、エステルである化合物８を６８４ｍｇ得た（４６％）。【００２１】実施例６：化合物９の合成法
エステル化合物８の無水塩化メチレン溶液（６７４ｍｇ、２．７ｍｍｏｌエステル、１５ｍｌＣＨ２Ｃｌ２）にＤＩＢＡＬヘキサン溶液（０．９６ｍｏｌ／Ｌ，６．５ｍｌ）を−７８℃下でゆっくり滴下した。１時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、エーテルで希釈後にセライトを加え１５分間攪拌した。反応液をセライト濾過し減圧下で濃縮し粗反応生成物化合物９（アリルアルコール、５９４ｍｇ）を得た。【００２２】実施例７：化合物４の合成法
アリルアルコール化合物９（５８４ｍｇ）を含む塩化メチレン（２５０ｍｌ）の溶液に活性二酸化マンガン（ＭｎＯ２、８ｇ）を加え超音波で４時間攪拌した。反応液をセライト濾過し、減圧下で濃縮後、粗反応物である化合物４を４５６ｍｇを得た。【００２３】試験例１
前述の３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸とその誘導体の殺ガン細胞作用を以下に述べる方法で評価した。すなわち東北大学加齢医学研究所付属ガン細胞施設より分譲され、入手したヒト由来の５種のガン細胞である大腸ガン細胞（細胞番号（以下同様）：ＴＫＧ０３７９、以下ＤＬＤ−１という）、肝臓ガン細胞（ＴＫＧ０２０５、以下ＨｅｐＧ２という）、肺ガン細胞（ＴＫＧ０１８４、以下Ａ５４９という）、乳ガン細胞（ＴＫＧ０４７９、以下ＭＣＦ７という）及び胃ガン細胞（ＴＫＧ０２２８、以下ＭＫＮ−７という）を用い、各細胞を９６穴マイクロプレートに播種し、８０％コンフレント（細胞充満度）に達した時点で、１５μＭの５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物を含む０．５％血清アルブミンを加え、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした後に生細胞数をＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルアゾール−２−イル）−２，５−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）法で調べた。なおＭＴＴ法は生細胞内酵素活性を指標としているためほとんどの細胞に適用でき、この結果も比較的安定しているので殺細胞作用の評価法として採用した。この結果を表１に示す。また非共役ＥＰＡ及び非共役ＤＨＡを構成脂肪酸とする魚油（比較試料２）について同様に試験した結果を併記した。【００２４】
【表１】
2005029554.tif 000009
【００２５】表１において、数値は試験試料を添加しない時のＭＴＴ活性（細胞生存率、％）を１００とし、試験試料の添加濃度（１５μＭ）における相対値を平均値±標準偏差（ｎ＝６）で示す（以下同様）。各試験試料の数値は比較試料１及び２の場合の値と比較して優位差があった（ｐ＜０．０５）。このデータから、本発明に係る化学的に合成された３個以上の共役型２重結合構造を有する高度不飽和脂肪酸はアルカリ共役化したＥＰＡ，ＤＨＡと同様の値であり魚油に比べて大腸ガン細胞に対して殺細胞効果が認められた。また肝臓ガン細胞、肺ガン細胞、胃ガン細胞についても同様の殺細胞効果が認められた。【００２６】試験例２
前述の各種共役多価不飽和脂肪酸類の正常細胞に対する影響を試験例１に記載の方法と同様にして評価した。ヒト由来の正常細胞はヒューマンサイエンス研究資源バンク（大阪）から入手した肺線維芽細胞（以下ＭＲＣ−５という）、皮膚線維芽細胞（以下ＴＩＧ−１０３という）、肺線維芽細胞（以下ＫＭＳ−６という）を用いた。この結果を共役リノール酸エチルエステル及び魚油（未変性）についての結果とともに表２に示す。同表中の数値、記号の意味は表１と同じである。これらのデータから、ｎ−３系脂肪酸の一種であるαリノレン酸、ＥＰＡ，ＤＨＡなどの共役多価不飽和脂肪酸はヒト正常細胞の生育（分裂、増殖等）に対してほとんど影響を及ぼさず、とりわけ共役トリエン体を多く含むものはアルカリ共役でも化学合成品であっても当該作用が強いことが明らかになった。【００２７】
【表２】
2005029554.tif 000010
【００２８】実施例４によって得られた化学構造式が５（Ｚ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸及び５（Ｅ），７（Ｅ），９（Ｅ），１４（Ｚ），１７（Ｚ）イコサペンタエン酸の混合物２５０ｍｇ、精製大豆油３０ｍｇ、蜜蝋１０ｍｇ、ビタミンＥ１０ｍｇを窒素ガス雰囲気下で約４０℃に加温し、十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル製剤を試作した。これらの製剤は医薬用組成物又は食用組成物として利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】  図１の反応スキーム１には実施例１から４に関わる合成ルートと各化合物の番号に対応する構造式が記載されている。  図１の反応スキーム２には実施例３と実施例５から７に関わる合成ルートと各化合物の番号に対応する構造式が記載されている。
【符号の説明】
【００３０】  図１の反応スキーム１，２に記載している化学構造式の下に記載されている数字は各反応スキームに表示されている化合物の数字に対応している。