(57)【要約】【課題】  微量血液によるヒトの健康状態の判定方法および微量血液による疾患の重症度の判定方法の確立。【解決手段】  種々の血管内皮細胞を用いて、ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定し、前記血液によるインビトロ血管新生の程度からヒトの健康状態を判定するヒトの健康状態の判定方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
種々の血管内皮細胞を用いて、ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定し、前記インビトロ血管新生の程度から前記ヒトの健康状態を判定することを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項２】
請求項１において、前記ヒトの血液として、血清またはヘパリン血漿を用いること特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生の測定は、前記血管内皮細胞を細胞外マトリックス３次元培養環境下で培養した培養液中に、前記ヒトの血液を加えて行うことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項４】
請求項３において、前記ヒトの血液を、１％〜５％の濃度で、前記培養液中に加えることを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかにおいて、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定する際に、増殖因子を使用しないことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れかにおいて、前記血管内皮細胞が、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞または冠動脈、肺動脈、大動脈など他臓器の血管内皮細胞であることを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかにおいて、前記インビトロ血管新生の測定を、細胞の血管形成を一定時間後に定量評価することにより行うことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかにおいて、前記ヒトから、１０マイクロリットル前後の微量の血清、またはヘパリン血漿を採取することにより、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定することを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかにおいて、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生の程度から個体のもつ血管新生能力を判定し、これにより前記健康状態を判定することを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかの方法を患者に適用し、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生から、前記患者の疾患の重症度を判定することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法。
【請求項１１】
請求項１０において、前記患者の疾患の重症度を判定した後、当該患者に対して薬物治療を施し、その後、さらに当該患者の血液によるインビトロ血管新生を測定して前記疾患に対する薬物治療の効果を検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法。
【請求項１２】
請求項１１において、前記患者の血液によるインビトロ血管新生を経時的に測定して前記疾患に対する薬物治療の効果を経時的に検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法。
【請求項１３】
請求項１０において、前記患者の疾患の重症度を判定した後、当該患者に対して外科手術を施し、その後、さらに当該患者の血液によるインビトロ血管新生を測定して前記疾患に対する非薬物治療の効果を検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法。
【請求項１４】
請求項１３において、前記患者の血液によるインビトロ血管新生を経時的に測定して前記疾患に対する非薬物治療の効果を経時的に検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量のヒト血液によるインビトロ血管新生（実験室レベルでの血管新生能力）を判定することでヒトの健康状態を判定するヒトの健康状態の判定方法及び患者の微量血液によるインビトロ血管新生により患者が持つ種々の疾患の重症度の判定する微量血液による疾患の重症度の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトの臓器の再生や新生が研究対象となっているが、わたしたち自身が持っている新生能力や修復能力を判定する検査方法は医療現場では開発されていない。
【０００３】
インビトロ血管新生そのものは、既に確立された研究手法であり、各種血管内皮細胞を細胞外マトリックス３次元培養環境下で培養し、新規薬物や新規分子の血管新生系への効果を判定する系として使用されている（特許文献１）。
【０００４】
このように、従来、インビトロ血管新生は、新規薬物や新規分子の血管再生系への効果を判定するために用いられており、血管再生を行う際には増殖因子を適宜用いる。
【０００５】
また、新規薬物や新規分子の血管再生系への効果を判定する以外の用途では、わずかに、妊娠中毒の少数例の患者血清を用いた研究で、患者血清がインビトロ血管新生を抑制し、血中の可溶性VEGF受容体抗体がその主たる抑制物質である可能性に言及した論文（非特許文献１）、及び成人の全身性血管炎患者血清がインビトロ血管新生を増加させた病態を解析した論文がある（非特許文献２）。非特許文献２では、生化学的手法を用いてヒト血液中の血管新生を促す主たる分子がハプトグロビンであることを突き止めている。
【０００６】
【非特許文献１】MaynardSE 他著、Journal of Clinical Investigation、Vol 111. p 649 (2003) (652頁第19行から653頁2行)
【非特許文献２】Cid MC 他著、Journal of Clinical Investigation、Vol 91. p977 (2003) (979頁第36行から981頁25行)
【特許文献１】特開２００２−３５０４３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述した事情に鑑み、インビトロ血管新生を患者の疾患の診断に応用した手法を確立し、微量血液によるヒトの健康状態の判定方法および微量血液による疾患の重症度の判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本来、われわれの体内を流れている血液には、組織の修復・再生・新生に関わる様々な増殖因子、サイトカイン、そして血管構成細胞となる幹細胞が流れている。組織の修復・再生・新生に関わるこれら一連のメカニズムには、いまだに不明な点が多々あり、現在、世界中の科学者や医学者の注目を集めている。
【０００９】
本発明者は、微量の患者血液によるインビトロ血管新生が、ヒトの健康状態、あるいは患者の疾患の重症度と大きく関連しており、これによりヒトの健康状態あるいは疾患の重症度を診断することができることを知見し、本発明を完成させた。
【００１０】
かかる本発明の第１の態様は、種々の血管内皮細胞を用いて、ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定し、前記インビトロ血管新生の程度から前記ヒトの健康状態を判定することを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１１】
本発明の第２の態様は、第１の態様において、前記ヒトの血液として、血清またはヘパリン血漿を用いること特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１２】
本発明の第３の態様は、第１又は２の態様において、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生の測定は、前記血管内皮細胞を細胞外マトリックス３次元培養環境下で培養した培養液中に、前記ヒトの血液を加えて行うことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１３】
本発明の第４の態様は、第３の態様において、前記ヒトの血液を、１％〜５％の濃度で、前記培養液中に加えることを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１４】
本発明の第５の態様は、第１〜４の何れかの態様において、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定する際に、増殖因子を使用しないことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１５】
本発明の第６の態様は、第１〜５の何れかの態様において、前記血管内皮細胞が、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞または冠動脈、肺動脈、大動脈など他臓器の血管内皮細胞であることを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１６】
本発明の第７の態様は、第１〜６の何れかの態様において、前記インビトロ血管新生の測定を、細胞の血管形成を一定時間後に定量評価することにより行うことを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１７】
本発明の第８の態様は、第１〜７の何れかの態様において、前記ヒトから、１０マイクロリットル前後の微量の血清、またはヘパリン血漿を採取することにより、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生を測定することを特徴とする微量血液によるヒトの健康状態の判定方法にある。
【００１８】
本発明の第９の態様は、第１〜８の何れかの態様において、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生の程度から個体のもつ血管新生能力を判定し、これにより前記健康状態を判定することを特徴とする健康状態の判定方法にある。
【００１９】
本発明の第１０の態様は、第１〜９の何れかの態様の方法を患者に適用し、前記ヒトの血液によるインビトロ血管新生から、前記患者の疾患の重症度を判定することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法にある。
【００２０】
本発明の第１１の態様は、第１０の態様において、前記患者の疾患の重症度を判定した後、当該患者に対して薬物治療を施し、その後、さらに当該患者の血液によるインビトロ血管新生を測定して前記疾患に対する薬物治療の効果を検出することを特徴とする微量血液による微量血液による疾患の重症度の判定方法にある。
【００２１】
本発明の第１２の態様は、第１１の態様において、前記患者の血液によるインビトロ血管新生を経時的に測定して前記疾患に対する薬物治療の効果を経時的に検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法にある。
【００２２】
本発明の第１３の態様は、第１０の態様において、前記患者の疾患の重症度を判定した後、当該患者に対して外科手術を施し、その後、さらに当該患者の血液によるインビトロ血管新生を測定して前記疾患に対する非薬物治療の効果を検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法にある。
【００２３】
本発明の第１４の態様は、第１３の態様において、前記患者の血液によるインビトロ血管新生を経時的に測定して前記疾患に対する非薬物治療の効果を経時的に検出することを特徴とする微量血液による疾患の重症度の判定方法にある。
【発明の効果】
【００２４】
以上詳述したとおり、本発明は、簡便な採血検査によって患者自身が持つ血管新生能力が検査室レベルで可能になる。くりかえし検査できるため、経時的、経年的に評価が可能で、薬物治療の効果判定にも役立つ。また、血液、すなわち、血清またはヘパリン血漿中のどんな物質が血管新生を調節しているかを種々の疾病で明らかにすることで、新たな病気の病態の解明や治療の開発につながる。
【００２５】
また、インビトロ血管新生の変化をみることで、患者の健康状態を把握できるため、患者が受けている治療の中止や変更、継続などの治療方針の決定に役立つ。
【００２６】
将来的に、この方法をさらに改良することで、臨床検査として有用な情報を与えてくれるものと期待できる。例えば、癌などの病的血管新生をもたらす疾患に対する抗癌剤などの薬物治療効果の判定方法として利用できる。癌などの病的血管新生をもたらす疾患に対する外科手術などの非薬物治療効果の判定方法として利用できる。あるいは患者個人のもつ血管新生能力に着目したテーラーメイド治療を実践する際、患者におこなった治療効果の判定方法として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を実施するための最良の形態を説明する。
本発明は、従来のインビトロ血管新生の測定方法を一部改変して、ヒトの血液によるインビトロ血管新生を種々の血管内皮細胞を用いて実験的レベルでおこない、血液によるこれら血管内皮細胞のインビトロ血管新生の程度がその血液の持ち主の健康状態、あるいは病気の重症度を反映しているという知見に基づいて完成されたものである。
【００２８】
本発明の健康状態の判断方法及び疾患の重症度の判定方法の利点は、わずか１０マイクロリットル前後の微量の血清、またはヘパリン血漿を、健康状態を判定する対象のヒト、あるいは疾患を有する患者より採取することで、繰り返し、簡便に評価できることである。さらに、患者の病気の重症度を評価できるため、薬物治療後に再度血液によるインビトロ血管再生を測定することにより、薬物治療の効果判定にもなりうる点である。
【００２９】
使用する血液は極めて微量であるため、患者への負担が少ない。採取方法は、ヘマトクリット管１本で足りるため耳朶でも可能である。また、採取する血液が微量であるため体重が小さい新生児や低出生体重児においても検査が可能である。検査室レベルでのひとつの評価方法として開発できる産業上の利点を有する。
【００３０】
さらに、具体的な方法を説明すると、本発明方法を実行するには、まず、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞または冠動脈、肺動脈、大動脈など他臓器の血管内皮細胞を細胞外マトリックス３次元培養環境下で培養する。ここで、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞または冠動脈、肺動脈、大動脈など他臓器の血管内皮細胞は従来から薬物の効果等を判定するために行うインビトロ血管新生に用いられるものであれば、特に限定されない。但し、本発明では、ヒト血液による血管新生を測定するのであるから、細胞外マトリックス３次元培養環境下の血管内皮細胞の培養には増殖因子を使用しないで実施する。
【００３１】
本発明方法では、次いで、培養液中に患者血清（またはヘパリン血漿）を１％〜５％の濃度で加えて、インビトロ血管新生を測定する。具体的には、例えば、これら血管内皮細胞の血管形成を１８時間後に定量評価することにより行う。定量の具体的方法は、倒立位相差顕微鏡にて４箇所の血管を写真撮影したのち、形成された血管の長さをそれぞれ計測し、その平均値をデータとして使用する。このとき、健常成人の血清を標準血清とし、この標準血清による血管形成を１００％とした場合の、患者血清の血管形成の割合を求める。血管内皮細胞は種々の増殖因子や細胞外マトリックスの存在のもとでは隣接する細胞同士が分化して、ネットワーク状に連結し血管を形成することが知られている。この現象はインビトロ血管新生と呼ばれ、血管新生能力の評価方法のひとつである。
【実施例】
【００３２】
本発明では、１）小児の血管の病気である川崎病、２）先天性心臓病、３）肺高血圧、４）拡張型心筋症について、詳細に検討した。これらの疾患を有する患者血清（またはヘパリン血漿）について、様々な病気のステージや治療の前後で検討した。その結果、インビトロ血管新生の結果と病気の重症度に相関関係があることを見出した。ただし、薬物の治療効果を判定する場合、その薬物そのものがインビトロ血管新生への促進作用や抑制作用がないことを確認する必要がある。
【００３３】
（実施例１）
以下に例を述べる。川崎病は小児の熱性疾患で、治療をしないと４人に１人の割合で、冠動脈の拡張や瘤を形成する血管の病気である。特に、瘤が巨大であると、発症後１年以内に死亡する危険性が高まる。この場合、死因の多くは、瘤のなかに血栓（血のかたまり）が生じ、血管が詰まるために引き起こされる心筋梗塞発作である。発症後１年を過ぎると死亡率は低くなることが判明しているが、何年も経ってから心筋梗塞による発作で亡くなる患者も存在する。一方、冠動脈瘤を発生しなかった患者の予後は良好で、死に至ることもない。冠動脈瘤を予防する治療として、免疫グロブリンの大量療法が最も有効であるとされている。原則として、非ステロイド抗炎症薬であるアスピリンを併用する。この治療を受けることにより、冠動脈瘤の発生率は２５％から５％に減少している。一旦、冠動脈瘤を発生すると、血栓が生じないように血液の凝集を防ぐような薬物であるアスピリンやワーファリンによる抗凝固治療（血液がかたまらないようにする治療）を外来でおこなう。この凝固療法をいつまで、どのくらい強力におこなうべきか議論の分かれるところで、確たる有用な情報がないまま画一的な治療をおこなっているのが現状である。
【００３４】
図１は、細胞外マトリックス３次元培養環境下にヒト臍帯静脈瘤血管内皮細胞を１８時間培養したときの写真である。図中、Ａは、血清無添加、Ｂは５％健康人血清添加、Ｃは５％川崎病冠動脈瘤患者血清添加の場合である。通常、インビトロ血管新生に用いる培養液や細胞外マトリックスから増殖因子を除くと血管形成が見られなくなるが、この系に、増殖因子の代わりとして、健康成人、健康小児の血清を添加すると、血管形成が見られる。
【００３５】
この実験条件下で、重い血管炎病変である冠動脈瘤を持っている川崎病患者の血清（またはヘパリン血漿）を添加した場合、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞やヒト冠動脈血管内皮細胞の血管形成が健康小児血清を用いた場合に比較して低下していた。とくに、巨大瘤を合併した患者血清の添加（Ｃ群）では、血管形成が殆ど見られなかった（図１（Ｃ））。従って、この場合、健康人血清添加によるＢ群と、患者血清添加によるＣ群とのそれぞれのインビトロ血管新生を比較することにより、Ｃ群の患者の疾患が重症である点が把握できる。発症後１ヶ月を過ぎると、Ｃ群患者の一般血液検査は正常化するため、一般血液検査によるＢ群との違いを判定することは困難になるが、インビトロ血管新生の程度を比較することにより、Ｃ群患者の健康度合いが以前正常化していないことが把握できる。
【００３６】
この異常所見は、多くの場合、病気の発症後約１年以内にみられるもので、１年を経ると正常化していた（図２参照）。
【００３７】
図２は、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の細胞外マトリックス３次元培養環境下での、ヒト血清によるインビトロ血管新生の結果を示す図である。図中、Ａは健康小児、Ｂは川崎病の治療により冠動脈が正常だった群、Ｃは川崎病の治療にもかかわらず、小〜中程度の冠動脈瘤を合併した群、Ｄは川崎病の治療にもかかわらず、巨大な冠動脈瘤を合併した群である。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の細胞外マトリックス３次元培養環境下に次の小児の血清を５％の濃度で加えて、血管形成の長さを定量化した。標準血清による血管形成の程度を１００％とした場合の患者血清や対照小児の血清による血管形成の割合を求め、図の縦軸に示している。図中、Ａは健康小児（黒）、Ｂは川崎病の治療により冠動脈が正常であった群（斜線）、Ｃは川崎病の治療にもかかわらず、小〜中等度の冠動脈瘤を合併した群（横線）、Ｄは川崎病の治療にもかかわらず、巨大な冠動脈瘤を合併した群（縦線）である。各棒グラフの正方向の線は２標準偏差（２ＳＤ）をあらわす。
【００３８】
この結果、川崎病の治療にもかかわらず、巨大な冠動脈瘤を合併した患者（Ｄ群）では、川崎病の治療前より、すでにインビトロ血管新生は低下しており、治療後１年までは、健康小児に比し統計学的に有意な低下を認めた。すなわち、これにより、治療効果が十分には得られていないと判断できる。
【００３９】
また、冠動脈瘤の程度とインビトロ血管新生の結果に相関がみられた。すなわち、重い病変である巨大冠動脈瘤患者（Ｄ群）では、冠動脈瘤の程度の軽い小〜中等度瘤患者（Ｃ群）よりも、これら患者の血清によるインビトロ血管新生は落ちていた。これにより、Ｃ群よりもＤ群がより重症であることが判断できる。
【００４０】
さらに、川崎病の治療に反応して、冠動脈瘤を発生しなかった冠動脈の正常患者（Ｂ群）では、患者血清によるインビトロ血管新生は正常範囲内であった。なお、患者が服用している薬物の影響はみられなかった。この結果、疾患が治癒されて健康に近い状態にまで戻っていることが確認される。
【００４１】
さらに、この１年の間に、瘤の修復がなされている患者では、患者血清によるインビトロ血管新生の改善が早期にみられた。
【００４２】
従って、患者の血液によるインビトロ血管新生の程度を測定することにより、川崎病の重症度、及び治療の短期的、長期的な効果が判定でき、例えば、上述した凝固療法をいつまで、どのくらい強力におこなうべきかを判断する、確たる有用な生体情報として利用することができる。
【００４３】
（実施例２）
次に、チアノーゼを来す先天性心臓病の患者について検討した。チアノーゼとは、からだにあらわれる症状のひとつで、血液中の酸素が不足することで、組織に運ばれる酸素が減少するような病態でみられる。多くは、口唇や爪、皮膚の色が暗赤色になる。酸素と結合しない血液中のヘモグロビン量が増えるとチアノーゼが出現する。多くの場合、先天性心臓病にみられる症状である。言いかえれば、これら患者では慢性的な低酸素状態にある。こうした条件下では、一般に、生体は血管数や赤血球数を増やすことで、酸素不足に対応する。しかしながら、これら患者の血管新生能力を評価した論文はみあたらない。また、この能力をインビトロ血管新生により評価した論文はみあたらない。チアノーゼが強い重症の患者では、その血液のもつインビトロ血管新生は高まっているものと予想されるが、このことを証明した論文はみあたらない。
【００４４】
インビトロ血管新生によりこれら患者血清を検討した結果、チアノーゼが存在し、しかもチアノーゼの程度の重い患者では、その血清による臍帯静脈血管内皮細胞のインビトロ血管新生は健康人に比較して高まっていた。そして、外科治療によりチアノーゼが改善するとこの亢進したインビトロ血管新生は正常化していた。また、手術後の経過が思わしくない場合には、この正常化の過程が遷延していた。
【００４５】
このように、先天性心臓病については、チアノーゼが重い患者では血液によるインビトロ血管新生が健康人より高まり、手術後の経過が良くしかもチアノーゼが改善すると、血液によるインビトロ血管新生がすみやかに正常化することから、患者の重症度及び治療の効果を判定することができる。
【００４６】
（実施例３）
更に、健康成人に対してであるが、ヒト血清によるインビトロ血管新生と喫煙との相関についても検討した。なお喫煙が人の健康状態に及ぼす影響については種々報告がなされているが、インビトロ血管新生に影響を及ぼすこと、更にはその新生能力を評価する例は報告されていない。
【００４７】
本検討におけるインビトロ血管新生については、先述の実施例と同様、増殖因子を使用しない細胞外マトリックス３次元培養環境下にヒト臍帯静脈血管内皮細胞を１８時間培養し、この培養した細胞を倒立位相差顕微鏡にて４箇所の血管を写真撮影し、形成された血管の長さをそれぞれ計測して評価した。なお例は喫煙を行う健康な成人（喫煙成人）２０名、喫煙しない成人（非喫煙成人）２０名を対象に行った例である。
【００４８】
図３は上記の検討におけるインビトロ血管新生の一例を示す写真であって、図中Ａは血清無添加、Ｂは非喫煙成人血清添加、Ｃは喫煙成人血清添加の場合をそれぞれ示している。通常、インビトロ血管新生に用いる培養液や細胞外マトリックスから増殖因子を除くと血管形成が見られなくなるが、この系に、増殖因子の代わりとして、健康成人の血清を添加すると、血管形成が見られる。なお図３で示すとおり、喫煙成人のインビトロ血管新生は非喫煙成人に比べて低下している様子が見て取れる。
【００４９】
図４は、本実施例で行ったインビトロ血管新生についての検討結果を示したものであり、縦軸は標準血清による血管形成に対する割合（実施例１と同様）を示し、図中左側が非喫煙成人の結果を、右側が喫煙成人の結果をそれぞれ示している。本検討では図４の結果が示すとおり、非喫煙成人はインビトロ血管新生の長さが１１２．３％程度であったのに対し、喫煙成人では９８．６％程度となっており、喫煙成人の方が非喫煙成人に対し有意な低下を示している。これによりインビトロ血管新生を考慮することで血管新生喫煙成人の健康状態の低下を判定できる。なお非喫煙成人のインビトロ血管新生における標準偏差は±１６．９％、喫煙成人のインビトロ血管新生における標準偏差は±９．８％であった。
【００５０】
図５は、本実施例で行ったインビトロ血管新生についての検討結果について更に喫煙指数とインビトロ血管新生との相関を考慮して検討した結果を示す図である。図中縦軸は標準血清による血管形成に対する割合（実施例１と同様）を示し、横軸は喫煙指数（一日あたりの喫煙本数×喫煙年数）をそれぞれ示す。
【００５１】
図５で示すとおり、喫煙指数の増加に伴い標準血清による血管形成に対する割合が減少傾向を示していることが分かる。即ち喫煙成人と非喫煙成人との間にそれぞれの血液によるインビトロ血管新生に対して統計学的に有意な差がみられる。従って、本検討に基づき、標準血清による血管形成に対する割合を求めて喫煙指数を定量的に推測すること、喫煙指数を求めて標準血清による血管形成に対する割合を定量的に推測すること、喫煙指数及び標準血清による血管形成に対する割合を求めて、判定対象者となる成人がより詳細にはどの程度ハイリスク者と判断できるかを定量的に推定すること、ができるようになる。なお、図４においてローリスク者であると考えられる非喫煙成人の血管形成に対する割合は１１２．３％程度、その標準偏差は１６．９％であるため、統計上１１２．３−２×１６．９≒７８．５％が極めて高いリスクを有する者と考えることができる。これを図５で確認すると、喫煙指数が５５０近傍の例、４５０近傍の例がこれらに近い値となっており、喫煙指数４００以上がハイリスク者であろうと一般に考えられているデータと概ね良好な整合性を示す。従って、上記を考慮し、より高精度に健康状態の判定を行うことができるようになる。なお本実施例にもとづいて考えられうる態様としては、インビトロ血管新生の程度を測定し、この測定の程度に基づいて喫煙指数を推定する方法が考えられる。また、インビトロ血管新生の程度を測定し、この測定の程度と予め求めてある非喫煙成人におけるインビトロ血管新生の程度（図４、５の例では平均値から標準偏差の２倍の値を引いた値）とを比較検討する（この値よりも低い場合はハイリスクと判断する）方法が考えられる。
【００５２】
以上、実施例により説明したとおり、臨床症状の重症度や予後との相関が強くみられるため、実験的レベルではあるものの本方法による経時的なインビトロ血管新生の評価は、病気の治療効果や、治療内容の変更に重要な情報を与えてくれるものと考えられる。また、新規薬物の治療効果を判定する方法になりうる。更に、健康成人であった場合であっても喫煙成人と非喫煙成人との間にそれぞれの血液によるインビトロ血管新生に関して統計学的に有意な差がみられるため、喫煙成人に対する健康状態の判定方法として利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
将来的に、この方法をさらに改良することで、臨床検査として有用な情報を与えてくれるものと期待できる。たとえば、癌などの病的血管新生をもたらす疾患に対する抗癌剤などの薬物治療効果の判定方法として利用できる。癌などの病的血管新生をもたらす疾患に対する外科手術などの非薬物治療効果の判定方法として利用できる。あるいは患者個人のもつ血管新生能力に着目したテーラーメイド治療を実践する際、患者におこなった治療効果の判定方法として利用できる。また、健康成人であった場合であっても喫煙成人と非喫煙成人との間にそれぞれの血液によるインビトロ血管新生に関して統計学的に有意な差がみられるため、喫煙成人に対する健康状態の判定方法として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】細胞外マトリックス３次元培養環境下にヒト臍帯静脈血管内皮細胞を１８時間培養した場合の写真である。
【図２】ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いたインビトロ血管新生を示す図である。
【図３】喫煙成人と非喫煙成人それぞれのヒト臍帯静脈血管内皮細胞を１８時間培養した場合の写真である。
【図４】喫煙成人と非喫煙成人との間のインビトロ血管新生長さの比較を示す図である。
【図５】喫煙指数とインビトロ血管新生の相関示す図である。
【符号の説明】
【００５５】
Ａ（図２）      健康小児
Ｂ（図２）      川崎病の治療により冠動脈が正常だった群
Ｃ（図２）      川崎病の治療にもかかわらず、小〜中程度の冠動脈瘤を合併した群
Ｄ（図２）      川崎病の治療にもかかわらず、巨大な冠動脈瘤を合併した群
【図１】
2005198649.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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