(57)【要約】【課題】  高い屈折率を有する接触液において、蒸発による重量変化が低減された物質を用いることで、蒸発による屈折率変化による干渉縞がみられない表面プラズモン測定方ｈ法を実現すること【解決手段】  金属をコーティングした透明基板チップと、プリズムの間に、接触液を用いる表面プラズモン共鳴測定方法において、接触液を３７℃で１時間開放放置したときの重量変化が１％以下である接触液を用いる。沸点が２００℃以上の接触液を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属をコーティングした透明基板チップと、プリズムの間に、接触液を用いる表面プラズモン共鳴測定方法であり、３７℃で１時間開放放置したときの重量変化が１％以下である接触液を用いることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定方法
【請求項２】
接触液の屈折率が１．６０以上である請求項１記載の表面プラズモン共鳴測定方法
【請求項３】
接触液の沸点が２００℃以上である請求項１〜２いずれか記載の表面プラズモン共鳴測定方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定中に干渉縞が生じない表面プラズモン共鳴測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年代に入ってから、生体分子の相互作用解析方法として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法が注目を浴び、分析手段として確立されてきた。ＳＰＲ法金属薄層基板上の屈折率の変化を、光学的手段によって解析する方法であり、ラベルフリーかつ、リアルタイムな解析手段であることが大きな利点である。すなわち、蛍光物質や放射線同位体などを用いたラベル操作が不要であるため、ラベル操作による生体分子の不活性化を心配する必要がない。また、リアルタイムに結合速度を解析できるため、結合と解離の速度に関する情報を得ることができる。
【０００３】
ＷＯＯＤは１９０２年に回折格子を用いてＳＰＲ現象を発見した（ＷＯＯＤ配置）。近年は、測定回数が増加する一方であるため、多くの測定表面が必要となっている。測定表面を有するチップをすべて回折格子に加工するのは甚大な努力が必要である。従って、近年のＳＰＲ装置の多くはＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置を呼ばれる光学系を有している。Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置においては、プリズム、もしくはプリズムに準じるブロックが用いられる。光を反射させるプリズムの底面を金属薄層でコーティングするのが最も簡単な配置方法である。しかし、プリズムは高価であり、測定毎にプリズムを廃棄するのは多大なコストがかかる。また再使用もコンタミネーションの問題があるため困難である。従って、金属をコーティングした透明基板の非金属面（透明面）をプリズムの底面と接触させる手段が用いられる。
【０００４】
透明基板とプリズムの底辺を接触させるために、接触液を用いる方法が一般的である。透明接着性ゲルを用いる方法もあるが、屈折率の範囲が限られる欠点を有する。透明基板、プリズム、接触液の屈折率はほぼ同一にするのが常識的である。屈折率が異なれば、界面で光が反射し、金属からの反射光と干渉を起こし、干渉縞が生じる。
【０００５】
ＳＰＲ装置において、相互作用をリアルタイムに解析するためには、相互作用する物質を含んだ溶液を連続的に装置に流しいれる必要がある。金属表面が空気に接している場合、ＳＰＲ現象をおこす角度（ＳＰＲ角）は比較的小さい（一般的に４０〜５０°）が、表面が水溶液に接している場合、ＳＰＲ角は大きくなる。
【０００６】
屈折率の低い材料を用いると、ＳＰＲ現象を起こす入射角が大きくなり、場合によっては９０度を越えて測定不可能となる。また、近年注目を浴びているＳＰＲイメージング法においては、反射像を撮影する手法を取るため、入射角が大きいと撮影される像が一軸方向に圧縮され、観察が非常に困難となる問題点が生じる。
【０００７】
従って屈折率の高い材料を用いることによって、ＳＰＲ測定が容易となり、特にＳＰＲイメージング法において、像の圧縮歪みが抑えられるために好ましい。
【０００８】
Ｊｏｒｄａｎらは溶液中（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ）での測定に、ガラス材料としてＳＦ１０（ｎd＝１．７２７）、接触液にカーギル社製のｎd＝１．７２５のｉｎｄｅｘ ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｆｌｕｉｄを用いた（非特許文献１）。ｎd＝１．７２５の接触液（Ｍシリーズ）にはジヨードメタン（ヨウ化メチレン）が含まれており、７６０ｍｍＨｇにおける沸点は１８１℃と示されている（非特許文献２）。
【０００９】
ジヨードメタンはやや揮発性を有し、強いにおいがあるため、３０℃以上のＳＰＲ測定においては、測定中に蒸発を起こす問題がある。測定中に接触液が蒸発すると、接触液の屈折率が変化し、干渉縞が生じる。また、蒸発による屈折率変化は均一に起こらないため、局所的に屈折率の分布が生じ、干渉縞が測定中に移動する。このような干渉縞が存在すると、測定に悪影響を与え、正しいデータを得ることができなくなる問題点があった。
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｏｒｄａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６９巻、１４４９−１４５６頁、１９９７年
【非特許文献２】カーギル社製  Refractive Index Liquids  Ｍシリーズ  1.705-1.735のＭＳＤＳ、インターネット＜ＵＲＬ：http://www.cargille.com/pdf2/MSDS-RI#Series#M#1705-1735.PDF＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、高い屈折率を有する接触液において、蒸発による重量変化が低減された物質を用いることで、蒸発による屈折率変化による干渉縞がみられないＳＰＲ測定を実現する。
本発明の課題は、高い屈折率を有する接触液において、蒸発による重量変化が低減された物質を用いることで、蒸発による屈折率変化による干渉縞がみられない表面プラズモン測定方法を実現することにある
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．金属をコーティングした透明基板チップと、プリズムの間に、接触液を用いる表面プラズモン共鳴測定方法であり、接触液を３７℃で１時間開放放置したときの重量変化が１％以下である表面プラズモン共鳴測定方法
２．接触液の屈折率が１．６０以上である１記載の表面プラズモン共鳴測定方法
３．接触液の沸点が２００℃以上である１〜２いずれか記載の表面プラズモン共鳴測定方法
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、蒸発による重量変化が低減された物質を用いることで、蒸発による屈折率変化による干渉縞がみられない表面プラズモン測定方法を実現し、精密な表面プラズモン（ＳＰＲ）測定を可能とする。特に屈折率の高い接触液を必要とするＳＰＲイメージング法において多大な効果を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のＳＰＲ測定方法においては、光学系はＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置が取られ、金属がコーティングされた透明基板チップとプリズムが使用される。コーティングされる金属は特に限定されるものではないが、金、銀、クロム、チタン、アルミなどが単独もしくは複合で用いられる。コーティングの厚みも特に限定されるものではないが、常識的には２０〜１００ｎｍの範囲でコーティングされる。コーティングの方法も特に限定されるものではなく、蒸着、スパッタリング、イオンコーティング法などが選択される。
【００１５】
透明基板とプリズムの間に入れる接触液は、蒸発による重量変化が少ない方が好ましく、３７℃で１時間開放放置したときの重量減少率が１％以下であることが好ましく、０．５％以下であるとさらに好ましい。重量減少率が１％を越えると、干渉縞が問題となることがある。
【００１６】
接触液の重量減少率の測定方法は詳細は実施例で示すが、以下の通りである。
１．接触液を２００μｌ採取し、胴径１８ｍｍ（内径１６ｍｍ）、高さ３５ｍｍの筒型秤量瓶（アズワン社製）に入れる。
２．接触液を入れた秤量瓶を、３７±０．５℃、湿度５０％ＲＨ以下にコントロールされた広さ０．５ｍ3以上の恒温恒湿室に、秤量瓶の蓋を取った状態で、また強い空気流が直接秤量瓶にあたらない状態で１時間放置し、接触液の蒸発による重量変化を測定する。
【００１７】
全く同型の秤量瓶がない場合は、大きさ等多少異なっても良いが、液の表面積Ｘ（ｃｍ2）に対する液量Ｙ（ｃｍ3）の比（Ｘ／Ｙ）はほぼ同じ必要がある（上記で約１０ｃｍ-1）。また、内径と高さの比も上記とほぼ同じ必要がある（上記で内径／高さは約０．５）。
また、液量は０．５ｍｌ以下であることが好ましい。液量が多いと、実験にかかるコストが高くなるためである。
【００１８】
１時間放置する場所は、３７．０℃±０．５℃、湿度５０％以下である。湿度が高いと、接触液が空気中の水分を吸収して、重量が増加することも考えられ、蒸発による質量変化を捉えることができないためである。
また、放置する空間の大きさは０．５ｍ3以上である。密閉した小さなデシケーター内で測定することはできない。小さな密閉容器の中では、接触液から蒸発した物質が、飽和に達することで、それ以上の蒸発を妨げる恐れがあるため、不適当である。放置場所を恒温、恒湿に保つため、放置場所の空気は循環させておく必要があるが、強い空気流が秤量瓶に当たる場所は避けるか、もしくは当たらないような構造を設ける。強い空気流が接触液面に直接当たると、接触液の揮発が大きくなり、一定した測定ができなくなる。
【００１９】
接触液の屈折率（ｎd）は１．６０以上が好ましく、１．６５以上がさらに好ましい。屈折率が高い方が、ＳＰＲを測定する入射光角度が小さくなり、測定が容易となる。特にＳＰＲイメージング法において、像の一軸方向への歪みが低減されるため、高い屈折率を有する接触液であることが望まれる。
【００２０】
接触液の沸点は２００℃以上であることが好ましい。２００℃未満であると、やや揮発性があり、液に強いにおいを感じる。測定中に接触液が蒸発して、測定に悪影響を与える危険性が高い。
【００２１】
具体的には、沸点１８１℃であるジヨードメタンを用いずに、沸点２７９℃である１−ブロモナフタレンや、さらに沸点の高い１−ヨードナフタレンを用いることが好ましい。１−ブロモナフタレンや１−ヨードナフタレンを配合することでｎｄ＝１．７０までの屈折率を有する接触液が調合可能である。
【００２２】
本発明における接触液は、沸点が高く、蒸発が低減されているため、接触液の蒸発による屈折率変化によって生じる干渉縞が、ほとんど観察されない利点を有している。本発明により、精密なＳＰＲ測定方法が実現される。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例］
カーギル社製接触液シリーズＢ  ｎｄ＝１．７００を２００μｌ採取し、胴径１８ｍｍ（内径１６ｍｍ）、高さ３５ｍｍの筒型秤量瓶（アズワン社製）に入れた。液の表面積Ｘ（ｃｍ2）に対する液量Ｙ（ｃｍ3）の比（Ｘ／Ｙ）は１０．１（ｃｍ-1）である。この接触液の沸点は２７９℃である。１−ヨードナフタレン、１−ブロモナフタレンが含まれており、蒸発しにくい物質で構成されている。
【００２５】
３７±０．５℃、湿度４２±３％ＲＨにコントロールされた広さ１．２１ｍ3の恒温恒湿室に、秤量瓶の蓋を取った状態で放置し、接触液からの蒸発による重量変化を測定した。測定した重量の一覧を表１に示す。接触液の重量変化は０．１１％であり、ほとんど蒸発はみられなかった。
【００２６】
この接触液を表面プラズモン共鳴イメージング装置：ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（東洋紡績製）に用いてＳＰＲ測定を試みた。測定にはＳＦ１５製（ｎｄ＝１．６９８９）のガラスから成るプリズムとチップを用いた。接触液の蒸発による干渉縞の移動は全くみられなかった。
【００２７】
［比較例］
カルニュー光学製接触液ｎｄ＝１．７０を２００μｌ採取し、実施例と同様に胴径１８ｍｍ、高さ３５ｍｍの筒型秤量瓶（アズワン社製）に入れた。この接触液の沸点は１８１℃と実施例と比べて約１００℃低い。ジヨードメタンが含まれており、やや臭いの強く、やや揮発性のある物質で構成されている。
【００２８】
３７℃、湿度４２％の恒温恒湿室に、秤量瓶の蓋を取った状態で放置し、接触液からの蒸発による重量変化を測定した。測定した重量の一覧を表１に示す。接触液の重量変化は５．２４％であり、蒸発がみられた。
【００２９】
この接触液を表面プラズモン共鳴イメージング装置：ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（東洋紡績製）に用いてＳＰＲ測定を試みた。接触液の蒸発による干渉縞の移動が観測され、実験に支障が生じた。
【００３０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、蒸発による重量変化が低減された物質を用いることで、蒸発による屈折率変化による干渉縞がみられない表面プラズモン測定方法を実現し、精密な表面プラズモン（ＳＰＲ）測定を可能とする。特に屈折率の高い接触液を必要とするＳＰＲイメージング法において多大な効果を発揮する。