(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ酵素及びその遺伝子を提供する。【解決手段】新規なアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列が提供される。また新規配列の変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を含み、前記配列を用いるアッセイ、アッセイの適用によって同定される化合物／組成物、前記配列を包含又は発現させるシステム、前記配列に基づいた治療方法および医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉとして示される配列又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を含むアミノ酸配列。
【請求項２】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を含むヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列を含むヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項３〜請求項５のいずれかに記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項３〜請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項３〜請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド配列が取り込まれた宿主細胞。
【請求項１０】
ＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を及ぼし得る薬剤を同定するアッセイ方法であって、前記アッセイ方法は、
前記薬剤を、請求項１又は請求項２に記載のアミノ酸又は請求項３〜請求項７のいずれかに記載のヌクレオチド配列と接触させ、
ＰＤＥ１１の活性又は発現を測定することを含み、
ａ）前記薬剤の非存在下でのＰＤＥ１１活性又は発現とｂ）前記薬剤存在下でのＰＤＥ１１活性又は発現の差を、前記薬剤がＰＤＥ１１活性又は発現に影響を及ぼすことの指標とするアッセイ方法。
【請求項１１】
前記アッセイが性機能障害の治療に有用な薬剤をスクリーニングすることを目的とする請求項１０に記載のアッセイ方法。
【請求項１２】
（ａ）請求項１０又は請求項１１に記載のアッセイを実施し、
（ｂ）ＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を及ぼす１つ又はそれ以上の薬剤を同定し、
（ｃ）１つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量に製造する工程を含む方法。
【請求項１３】
請求項１０又は請求項１１に記載のアッセイ方法であるインビトロのアッセイ方法において、
ＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を及ぼし得る薬剤によって、
インビボのＰＤＥ１１活性又は発現に影響を及ぼす方法。
【請求項１４】
ＰＤＥ１１に関連した疾患又は病態を治療する医薬組成物の製造における、請求項１０又は請求項１１に記載のアッセイ方法によってインビトロでアッセイされたときＰＤＥの活性又は発現に効果を及ぼし得る薬剤の用途。
【請求項１５】
ＰＤＥ１１に対する抗体と免疫反応し得る酵素。
【請求項１６】
ＰＤＥをコードする、ＮＣＩＭＢ４０９２５又はＮＣＩＭＢ４０９２６又はＮＣＩＭＢ４１００７より得られるヌクレオチド配列。
【請求項１７】
ＮＣＩＭＢ４０９２５又はＮＣＩＭＢ４０９２６又はＮＣＩＭＢ４１００７より得られるヌクレオチド配列から発現されるＰＤＥ。
【請求項１８】
ＰＤＥ１１に関連した疾患又は病態を治療する医薬組成物の製造における、ＰＤＥ１１の活性又は発現に効果を及ぼし得る薬剤の用途。
【請求項１９】
ＰＤＥ１１の不均衡又は障害に関連した障害を治療及び／又はモジュレートする薬剤の製造における、ＰＤＥ１１の遺伝子及び／又はその発現産物の用途。
【請求項２０】
ＰＤＥ１１及び／又はその発現産物がＰＤＥ１１及び／又はその発現産物の活性をモジュレートし得る薬剤をスクリーニングするのに使われる、請求項１９に記載の用途。
【請求項２１】
ＰＤＥ１１が請求項１に記載のものであるか又はそれをコードするヌクレオチド配列であるＰＤＥ１１作動薬。
【請求項２２】
ＰＤＥ１１が請求項１に記載のものであるか又はそれをコードするヌクレオチド配列であるＰＤＥ１１拮抗薬。
【請求項２３】
組換えＰＤＥ１１酵素。
【請求項２４】
ＰＤＥ１１酵素をコードする組換えヌクレオチド配列。
【請求項２５】
実質的にここに記載されるようなＰＤＥ１１酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素に関する。本発明はまたそれをコードするヌクレオチド配列に関する。
特に、本発明は新規なホスホジエステラーゼ酵素をコードする新規な核酸配列に関する。
【０００２】
本発明はまた疾患の診断及び治療における新規な核酸及びアミノ酸の用途に関する。
本発明はまたホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価する及び／又はスクリーニングするための新規な核酸及びアミノの用途に関する。
【０００３】
本発明はさらにホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価する及び／又はスクリーニングするための、新規核酸及びアミノ酸配列を包含する又は発現させる遺伝子工学的に処理された宿主細胞に関する。
【従来の技術】
【０００４】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）は、サイクリックヌクレオチドの分解を触媒する酵素ファミリーである。サイクリックヌクレオチド、特にｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン３'，５'−一リン酸）は、重要な細胞内の第二メッセンジャーである。ＰＤＥｓはサイクリックヌクレオチドの濃度を制御する細胞内の一因子である。
【０００５】
最近、少なくとも７種のＰＤＥ酵素（ＰＤＥＩ〜ＰＤＥＶＩＩ）が、これら酵素の多くのサブタイプとともに、基質親和性と補助因子の要求性に基づいて定義されている（Ｂｅａｖｏ  ＪＡ  ＆  Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ  ＤＨ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．１１：１５０[１９９０]；Ｂｅａｖｏ
Ｊ，「サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ：構造、調節及び薬物作用」Ｂｅａｖｏ  Ｊ  ＆  Ｈｏｕｓｌｅｙ  ＭＤ（編）ウィリー：チチェスター、３〜１５頁［１９９０］）。ＰＤＥｓ（即ち、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ）の例には、Ｃａ2+／カルモジュリン依存性ＰＤＥであるＰＤＥＩ、ｃＧＭＰによって刺激されるＰＤＥであるＰＤＥＩＩ、ｃＧＭＰによって阻害されるＰＤＥであるＰＤＥＩＩＩ、高親和性ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥＩＶ，ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥであるＰＤＥＶ等がある。
【０００６】
各ＰＤＥファミリーは２つ又はそれ以上のイソ型を含む可能性がある（つまり、２つ又はそれ以上のＰＤＥアイソザイムがある可能性がある）。例えば、ショウジョウバエのダンス（Ｄｕｎｃｅ）遺伝子の相同体である哺乳類のＰＤＥＩＶ（Ｃｈｅｎ  ＣＮ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：９３１３［１９８６］）にはラットで４種のイソ型があることが知られている（Ｓｗｉｎｎｅｎ  ＪＶ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：５３２５［１９８９］）。ヒトＰＤＥｓもまたイソ型として出現し、スプライシングの変異体があることが知られている。例えば、単球由来のヒトＰＤＥＩＶのイソ型をクローン化した１９９０年の報告がある（Ｌｉｖｉ  ＧＰ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，１０：２６７８［１９９０］。別の例として、他の研究者たちは別々に３種のＰＤＥＩＶスプライシング変異体をクローン化したが、それは今日ｈＰＤＥＩＶ−Ｂ１、ｈＰＤＥＩＶ−Ｂ２、ｈＰＤＥＩＶ−Ｂ３と命名されている。
【０００７】
別のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ−即ちＣＮ  ＰＣＤＥ８−に関する知見がＷＯ−Ａ−９７／３５９８９に見出される。ＷＯ−Ａ−９７／３５９８９によれば、ＣＮ  ＰＣＤＥ８には２種のアイソザイムがあり、ＣＮ
ＰＣＤＥ８Ａ及びＣＮ  ＰＣＤＥ８Ｂと命名された。「アイソザイム」という用語は当該技術分野では「イソ型」と言及される場合がある。
【０００８】
ＷＯ−Ａ−９７／３５９８９によると、様々なＰＤＥの多くの阻害剤が同定され、なかには臨床評価を受けたものもある。例えば、ＰＤＥＩＩＩ阻害剤は抗血栓薬、降圧薬及び鬱血性心不全の治療に有用である強心薬として開発されている。ＰＤＥＩＩＩ阻害剤であるロリプラム（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）は既にうつ病の治療に使われていて、ＰＤＥＩＩＩ阻害剤のなかには抗炎症剤として評価されているものもある。ロリプラムはまた、リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発され、インビトロでＨＩＶ−１の複製を高めるとされている、α−ＴＮＦの作用を阻害することが示されている。それ故、ロリプラムはＨＩＶ−１の複製を阻害する可能性がある（Ａｎｇｅｌ等、１９９５  ＡＩＤＳ  ９：１１３７〜４４）。さらに、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β及びγ−インターフェロンの産生を抑制する能力に基づいて、ロリプラムは、多発性硬化症の実験動物モデルである脳脊髄炎の治療に有効であることが示されていて（Ｓｏｍｍｅｒ等、１９９５  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １：２４４〜２４８）、遅発性異常運動症の治療にも有効である可能性がある（Ｓａｓａｋｉ等、１９９５  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２８２：７１〜７６）。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−９７／３５９８９によると、気管支喘息等の呼吸器系疾患の治療に使われているテオフィリンや間欠性跛行と糖尿病性末梢血管疾患の治療に使われているペントキシフィリンのような非特異的ＰＤＥ阻害剤もある。呼吸器系疾患の治療において、抗炎症作用と免疫調節作用を有するテオフィリンは、気道平滑筋の機能にも作用すると考えられている（Ｂａｎｎｅｒ等、１９９５  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  ８：９９６〜１０００）。ＣＮＰＤＥによるｃＡＭＰとｃＧＭＰの加水分解を阻害することによって作用すると考えられている（Ｂａｎｎｅｒ等、１９９５  Ｍｏｎａｌｄｉ  Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｓｔ  Ｄｉｓ  ５０：２８６〜２９２）。ＴＮＦ−αの産生を妨害することも知られているペントキシフィリンも、ＨＩＶ−１の複製を阻害する可能性がある（Ａｎｇｅｌ等、同上）。ＣＮＰＤＥ阻害剤のリストがＢｅａｖｏ（１９９５、同上）の論文にある。
【００１０】
ＰＤＥ、そのアイソザイム及びそのサブタイプの選択的阻害剤は、より副作用が少なくより効果的な治療薬になると示唆されている。例えば、Ｗｉｅｓｈａａｒ  ＲＥ等（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：５３７［１９８５］）、Ｇｉｅｍｂｙｃｚ  ＭＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．，４３：２０４１［１９９２］）、Ｌｏｗｅ  ＪＡとＣｈｅｎｇ  ＪＢ（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ，１７：７９９〜８０７［１９９２］）の概説を参照されたい。
【００１１】
従って、ある治療応用にとっては、ＰＤＥの個別タイプの選択的阻害を獲得することが望ましい。それ故、新規ＰＤＥのクローン化と発現は、選択的阻害剤の発見にとって大いに有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許請求の範囲と以下の説明には本発明の態様が示されている。
要約すれば、本発明の幾つかの態様は、
１．新規アミノ酸
２．新規核酸配列
３．前記新規配列を用いるアッセイ
４．前記アッセイの適用によって同定される化合物／組成物
５．前記新規配列を包含又は発現させる発現システム
６．前記新規配列に基づいた治療方法
７．前記新規配列に基づいた医薬組成物、に関する。
【００１３】
本発明のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列に関する他の態様には、本発明の配列を包含又は発現させ得る構築物、本発明の配列を包含又は発現させ得るベクター、本発明の配列を包含又は発現させ得るプラスミド、本発明の配列を包含又は発現させ得る組織、本発明の配列を包含又は発現させ得る器官、本発明の配列を包含又は発現させ得る形質転換された宿主、本発明の配列を包含又は発現させ得る形質転換された生物体、等がある。本発明はまた、本発明の配列を転移させる方法と、微生物における発現のように、それを発現させる方法も含む。  分かり易くするために、本発明の態様は以下のセクション見出しのもとに論じる。しかしながら、各セクションの教示は必ずしもそれぞれ特定のセクションに限定されるものではない。
【００１４】
以下の説明では、「本発明のヌクレオチド配列」及び「本発明のアミノ酸配列」は、それぞれ、ここに示される１以上のヌクレオチド配列及びここに示される１以上のアミノ酸配列のことを指す。また、ここに用いられているように、「アミノ酸配列」とはペプチド又はタンパク質配列を指し、その一部を指す場合もある。さらに、「本発明のアミノ酸配列」という用語は、「本発明のポリペプチド配列」と同義である。また、「本発明のヌクレオチド配列」という用語は、「本発明のポリヌクレオチド配列」と同義である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の態様によると、式Ｉ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示される配列を含む、ＰＤＥ活性を示すアミノ酸配列が提供される。
式Ｉ
ペプチド配列又はアミノ酸Ｚ１〜Ｚ２８の１以上を含む、１５９アミノ酸残基より長いアミノ酸配列であって、このペプチド配列又はアミノ酸Ｚ１〜Ｚ２８の１以上のいずれもが、適当なペプチド配列又はアミノ酸残基によって、他のペプチド配列又はアミノ酸Ｚ１〜Ｚ２８から分離されてよい。
ここでＺ１〜Ｚ２８は、
Z1= LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRK
Z2= NK
Z3= DE
Z4= PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDN
Z5= LLLYELSSII
Z6= IATKADGFALYFLGECNNSLC
Z7= F
Z8= PPG
Z9= KEG
Z10 = PRLIPAGPITQGTT
Z11 =
SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKP
Z12 =
FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLM
Z13  = F
Z14 = LP
Z15 = R
Z16 = C
Z17 = IELFHFDIGPFENMWPGIFVYM
Z18 = HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNN
Z19 = LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPL
Z20 =
ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRQLEEMYQTGSLNL
Z21 = NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTK
Z22 = WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDK
Z23 = DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNL
Z24 = QWEKVIRGEETA
Z25 = WIS
Z26 = P
Z27 = A
Z28 = E
便宜上、アミノ酸を示すコード表を示す。
--------------------------------------------------------------
アミノ酸            ３文字コード                １文字コード
--------------------------------------------------------------
アラニン            Ａｌａ                          Ａ
アルギニン          Ａｒｇ                          Ｒ
アスパラギン        Ａｓｎ                          Ｎ
アスパラギン酸      Ａｓｐ                          Ｄ
システイン          Ｃｙｓ                          Ｃ
グルタミン          Ｇｌｎ                          Ｑ
グルタミン酸        Ｇｌｕ                          Ｅ
グリシン            Ｇｌｙ                          Ｇ
ヒスチジン          Ｈｉｓ                          Ｈ
イソロイシン        Ｉｌｅ                          Ｉ
ロイシン            Ｌｅｕ                          Ｌ
リジン              Ｌｙｓ                          Ｋ
メチオニン          Ｍｅｔ                          Ｍ
フェニルアラニン    Ｐｈｅ                          Ｆ
プロリン            Ｐｒｏ                          Ｐ
セリン              Ｓｅｒ                          Ｓ
スレオニン          Ｔｈｒ                          Ｔ
トリプトファン      Ｔｒｐ                          Ｗ
チロシン            Ｔｙｒ                          Ｙ
バリン              Ｖａｌ                          Ｖ
任意の残基          Ｘａａ                          Ｘ
--------------------------------------------------------------
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１８及びＺ２０、又はその類縁体のうち少なくとも１つ又はそれ以上を含む。
【００１６】
ここに用いられている「類縁体」という用語は、式Ｉの配列に類似した配列を有するがアミノ酸の置換や欠損が悪影響を与えない（つまり、酵素活性に対して悪影響しない）アミノ酸配列を意味する。
【００１７】
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１８及びＺ２０、又はその類縁体のうち少なくとも各々を含む。
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１８及びＺ２０のうち少なくとも各々を含む。
【００１８】
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ１７、Ｚ１９、Ｚ２１、Ｚ２２及びＺ３３、又はその類縁体のうち少なくとも１つ又はそれ以上を含む。  好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ１７、Ｚ１９、Ｚ２１、Ｚ２２及びＺ３３、又はその類縁体のうち少なくとも各々を含む。
【００１９】
好ましくは、式Ｉのアミノ酸配列は、Ｚ１、Ｚ４、Ｚ１７、Ｚ１９、Ｚ２１、Ｚ２２及びＺ３３のうち少なくとも各々を含む。
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列の好ましい例は、式ＩＩ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式ＩＩ
X0-Z1-X1-Z2-X2-X3-Z3-X4-X5-Z4-X6-Z5-X7-Z6-X8-Z7-X9-Z8-X10-Z9-X11-Z10-X12-Z11-X13-Z12-X14-Z13-X15-Z14-X16-Z15-X17-Z16-X18-X19-Z17-X20-Z18-X21-X22-Z19-X23-Z20-X24-Z21-X25-Z22-X26-Z23-X27-Z24-X28-Z25-X29-Z26-X30-X31-Z27-X32-X33-X34-X35-X36-X37-Z28-X38
ここで、Ｚ１〜Ｚ２８はそれぞれ上記に定義したものであり、
Ｘ０〜Ｘ３８は、適当なペプチド配列又はアミノ酸から独立して選択され、
Ｘ０、Ｘ２８、Ｚ２５、Ｘ２９、Ｚ２６、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｚ２７、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｚ２８及びＸ３８の１つ又はそれ以上は任意である。
【００２０】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＩＩＩ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式ＩＩＩ
LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETA
ここで、
Ｘ1は、Ｎ又はＴ、
Ｘ2は、Ｓ又はＡ、
Ｘ3は、Ｅ又はＫ、
Ｘ4は、Ｓ又はＰ、
Ｘ5は、Ａ又はＳ、
Ｘ6は、Ｑ又はＨ、
Ｘ7は、Ｋ又はＲ、
Ｘ8は、Ｉ又はＶ、
Ｘ9は、Ｔ又はＩ、
Ｘ10は、Ｉ又はＭ、
Ｘ11は、Ｋ又はＱ、
Ｘ12は、Ｖ又はＩ、
Ｘ13は、Ｖ又はＩ、
Ｘ14は、Ｑ又はＲ、
Ｘ15は、Ｔ又はＮ、
Ｘ16は、Ｖ又はＡ、
Ｘ17は、Ｌ又はＩ、
Ｘ18は、Ｋ又はＲ、
Ｘ19は、Ｅ又はＤ、
Ｘ20は、Ｖ又はＩ、
Ｘ21は、Ｈ又はＮ、
Ｘ22は、Ｔ又はＧ、
Ｘ23は、Ｔ又はＡ、
Ｘ24は、Ｎ又はＨ、
Ｘ25は、Ｐ又はＬ、
Ｘ26は、Ｋ又はＲ、
Ｘ27は、Ｓ又はＮである。
【００２１】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＩＶ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式ＩＶ
X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETA
ここで、
Ｘ0は、Ｓ又はＧ、
Ｘ1は、Ｎ又はＴ、
Ｘ2は、Ｓ又はＡ、
Ｘ3は、Ｅ又はＫ、
Ｘ4は、Ｓ又はＰ、
Ｘ5は、Ａ又はＳ、
Ｘ6は、Ｑ又はＨ、
Ｘ7は、Ｋ又はＲ、
Ｘ8は、Ｉ又はＶ、
Ｘ9は、Ｔ又はＩ、
Ｘ10は、Ｉ又はＭ、
Ｘ11は、Ｋ又はＱ、
Ｘ12は、Ｖ又はＩ、
Ｘ13は、Ｖ又はＩ、
Ｘ14は、Ｑ又はＲ、
Ｘ15は、Ｔ又はＮ、
Ｘ16は、Ｖ又はＡ、
Ｘ17は、Ｌ又はＩ、
Ｘ18は、Ｋ又はＲ、
Ｘ19は、Ｅ又はＤ、
Ｘ20は、Ｖ又はＩ、
Ｘ21は、Ｈ又はＮ、
Ｘ22は、Ｔ又はＧ、
Ｘ23は、Ｔ又はＡ、
Ｘ24は、Ｎ又はＨ、
Ｘ25は、Ｐ又はＬ、
Ｘ26は、Ｋ又はＲ、
Ｘ27は、Ｓ又はＮである。
【００２２】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列のより好ましい例は、式Ｖ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式Ｖ
X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28WIS
ここで、
Ｘ0は、Ｓ又はＧ、
Ｘ1は、Ｎ又はＴ、
Ｘ2は、Ｓ又はＡ、
Ｘ3は、Ｅ又はＫ、
Ｘ4は、Ｓ又はＰ、
Ｘ5は、Ａ又はＳ、
Ｘ6は、Ｑ又はＨ、
Ｘ7は、Ｋ又はＲ、
Ｘ8は、Ｉ又はＶ、
Ｘ9は、Ｔ又はＩ、
Ｘ10は、Ｉ又はＭ、
Ｘ11は、Ｋ又はＱ、
Ｘ12は、Ｖ又はＩ、
Ｘ13は、Ｖ又はＩ、
Ｘ14は、Ｑ又はＲ、
Ｘ15は、Ｔ又はＮ、
Ｘ16は、Ｖ又はＡ、
Ｘ17は、Ｌ又はＩ、
Ｘ18は、Ｋ又はＲ、
Ｘ19は、Ｅ又はＤ、
Ｘ20は、Ｖ又はＩ、
Ｘ21は、Ｈ又はＮ、
Ｘ22は、Ｔ又はＧ、
Ｘ23は、Ｔ又はＡ、
Ｘ24は、Ｎ又はＨ、
Ｘ25は、Ｐ又はＬ、
Ｘ26は、Ｋ又はＲ、
Ｘ27は、Ｓ又はＮ、
Ｘ28は、Ｔ又はＭである。
【００２３】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＶＩ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式ＶＩ
X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28WISX29PX30X31A
ここで、
Ｘ0は、Ｓ又はＧ、
Ｘ1は、Ｎ又はＴ、
Ｘ2は、Ｓ又はＡ、
Ｘ3は、Ｅ又はＫ、
Ｘ4は、Ｓ又はＰ、
Ｘ5は、Ａ又はＳ、
Ｘ6は、Ｑ又はＨ、
Ｘ7は、Ｋ又はＲ、
Ｘ8は、Ｉ又はＶ、
Ｘ9は、Ｔ又はＩ、
Ｘ10は、Ｉ又はＭ、
Ｘ11は、Ｋ又はＱ、
Ｘ12は、Ｖ又はＩ、
Ｘ13は、Ｖ又はＩ、
Ｘ14は、Ｑ又はＲ、
Ｘ15は、Ｔ又はＮ、
Ｘ16は、Ｖ又はＡ、
Ｘ17は、Ｌ又はＩ、
Ｘ18は、Ｋ又はＲ、
Ｘ19は、Ｅ又はＤ、
Ｘ20は、Ｖ又はＩ、
Ｘ21は、Ｈ又はＮ、
Ｘ22は、Ｔ又はＧ、
Ｘ23は、Ｔ又はＡ、
Ｘ24は、Ｎ又はＨ、
Ｘ25は、Ｐ又はＬ、
Ｘ26は、Ｋ又はＲ、
Ｘ27は、Ｓ又はＮ、
Ｘ28は、Ｔ又はＭ、
Ｘ29は、Ｓ又はＧ、
Ｘ30は、Ｓ又はＧ、
Ｘ31は、Ｖ又はＰである。
【００２４】
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列のより好ましい例は、式ＶＩＩ又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸配列である。
式ＶＩＩ
X0LTDEKVKAYLSLHPQVLDEFVSESVSAETVEKWLKRKX1NKX2X3DEX4X5PKEVSRYQDTNMQGVVYELNSYIEQRLDTGGDNX6LLLYELSSIIX7IATKADGFALYFLGECNNSLCX8FX9PPGX10KEGX11PRLIPAGPITQGTTX12SAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWGKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIMIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPX13FKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCANMYHRIRHSECIYRVTMEKLSYHSICTSEEWQGLMX14FX15LPX16RX17CX18X19IELFHFDIGPFENMWPGIFVYMX20HRSCGTSCFELEKLCRFIMSVKKNYRRVPYHNWKHAVTVAHCMYAILQNNX21X22LFTDLERKGLLIACLCHDLDHRGFSNSYLQKFDHPLX23ALYSTSTMEQHHFSQTVSILQLEGHNIFSTLSSSEYEQVLEIIRKAIIATDLALYFGNRKQLEEMYQTGSLNLX24NQSHRDRVIGLMMTACDLCSVTKX25WPVTKLTANDIYAEFWAEGDEMKKLGIQPIPMMDRDKX26DEVPQGQLGFYNAVAIPCYTTLTQILPPTEPLLKACRDNLX27QWEKVIRGEETAX28WISX29PX30X31AX32X33X34X35X36X37EX38
ここで、
Ｘ0は、Ｓ又はＧ、
Ｘ1は、Ｎ又はＴ、
Ｘ2は、Ｓ又はＡ、
Ｘ3は、Ｅ又はＫ、
Ｘ4は、Ｓ又はＰ、
Ｘ5は、Ａ又はＳ、
Ｘ6は、Ｑ又はＨ、
Ｘ7は、Ｋ又はＲ、
Ｘ8は、Ｉ又はＶ、
Ｘ9は、Ｔ又はＩ、
Ｘ10は、Ｉ又はＭ、
Ｘ11は、Ｋ又はＱ、
Ｘ12は、Ｖ又はＩ、
Ｘ13は、Ｖ又はＩ、
Ｘ14は、Ｑ又はＲ、
Ｘ15は、Ｔ又はＮ、
Ｘ16は、Ｖ又はＡ、
Ｘ17は、Ｌ又はＩ、
Ｘ18は、Ｋ又はＲ、
Ｘ19は、Ｅ又はＤ、
Ｘ20は、Ｖ又はＩ、
Ｘ21は、Ｈ又はＮ、
Ｘ22は、Ｔ又はＧ、
Ｘ23は、Ｔ又はＡ、
Ｘ24は、Ｎ又はＨ、
Ｘ25は、Ｐ又はＬ、
Ｘ26は、Ｋ又はＲ、
Ｘ27は、Ｓ又はＮ、
Ｘ28は、Ｔ又はＭ、
Ｘ29は、Ｓ又はＧ、
Ｘ30は、Ｓ又はＧ、
Ｘ31は、Ｖ又はＰ、
Ｘ32は、Ｑ又はＰ、
Ｘ33は、Ｋ又はＳ、
Ｘ34は、Ａ又はＫ、
Ｘ35は、Ａ又はＳ、
Ｘ36は、Ａ又はＴ、
Ｘ37は、Ｓ又はＰ、
Ｘ38は、Ｄ又はＫである。
式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列の好ましい例は、ＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９のアミノ酸またはその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体として示されるアミノ酸を含む。
式Ｉ及び／又は式ＩＩ〜式ＶＩＩのどれか１つ又はそれ以上について述べることは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９を含むアミノ酸のどれか１つ又はそれ以上にも同様に適用されることに留意されたい。  式ＩＩ〜式ＶＩＩのどれか１つの変異体の１例は、．．．ＫＲＫＸ1ＮＫＸ2Ｘ3．．．の基が．．．ＫＲＫＸ1ＤＫＸ2Ｘ3．．．に置換されているアミノ酸配列である。
【００２５】
式ＩＩ〜式ＶＩＩのどれか１つの変異体の１例は、．．．ＬＬＬＹＥＬＳＳＩＩＸ7．．．の基が．．．ＬＬＬＹＥＬＮＳＳＩＩＸ7．．．に置換されているアミノ酸配列である。
【００２６】
好ましくは、式Ｉ及び／又は式ＩＩ〜式ＶＩＩのどれか１つ又はそれ以上について述べることは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９を含むアミノ酸のどれか１つ又はそれ以上のことを意味する。
【００２７】
より好ましくは、式Ｉ及び／又は式ＩＩ〜式ＶＩＩのどれか１つ又はそれ以上について述べることは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４のどれか１つ又はそれ以上のことを意味する。
【００２８】
本発明の第二の態様によれば、式Ｉとして示される配列を含むアミノ酸配列が提供される。
本発明の第三の態様によれば、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。
【００２９】
本発明の第四の態様によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列を含むヌクレオチド配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を含むヌクレオチド配列が提供される。
【００３０】
本発明の第五の態様によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列を含むヌクレオチド配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列が提供される。
【００３１】
本発明の第六の態様によれば、本発明によるヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列が提供される。
本発明の第七の態様によれば、本発明の第六の態様によるヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列が提供される。
【００３２】
本発明の第八の態様によれば、本発明によるヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。
本発明の第九の態様によれば、本発明によるヌクレオチド配列が取り込まれた宿主細胞が提供される。
【００３３】
本発明の第十の態様によれば、ＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を与え得る薬剤を同定するアッセイ方法、つまり、薬剤を本発明によるアミノ酸又は本発明によるヌクレオチド配列と接触させ、ＰＤＥ１１の活性又は発現を測定し、ａ）薬剤の非存在下におけるＰＤＥ活性又は発現とｂ）薬剤の存在下におけるＰＤＥ活性又は発現との差をもって薬剤のＰＤＥ１１活性又は発現への効果の指標とするアッセイ方法が提供される。好ましくは、このアッセイは、男性の勃起不全又は女性の性機能不全のような性機能障害の治療に有用な薬剤をスクリーニングするためのものである。
【００３４】
本発明の第十一の態様によれば、（ａ）本発明によるアッセイを実施し、（ｂ）ＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を与える１つ又はそれ以上の薬剤を同定し、（ｃ）１つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量に製造する工程を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明の第十二の態様によれば、本発明のアッセイ方法であるインビトロのアッセイ方法においてＰＤＥ１１の活性又は発現に影響を与え得る薬剤でインビボのＰＤＥ１１活性又は発現に影響を与える方法が提供される。
【００３６】
本発明の第十三の態様によれば、本発明のアッセイ方法によってインビトロでアッセイするときＰＤＥの活性又は発現に効果を及ぼし得る薬剤の、ＰＤＥ１１に関連した疾患又は病態の治療に用いる医薬組成物の製造における用途が提供される。
【００３７】
本発明の第一四の態様によれば、ＰＤＥ１１に対して産生された抗体と免疫反応し得る酵素が提供される。
本発明の第十五の態様によれば、ＮＣＩＭＢ４０９２５、ＮＣＩＭＢ４０９２６又はＮＣＩＭＢ４１００７から得られる、ＰＤＥをコードするヌクレオチド配列が提供される。
【００３８】
本発明の第十六の態様によれば、ＮＣＩＭＢ４０９２５、ＮＣＩＭＢ４０９２６又はＮＣＩＭＢ４１００７から得られるヌクレオチド配列より発現されるＰＤＥが提供される。
本発明の第十七の態様によれば、ＰＤＥ１１の活性又はその発現に影響を与える薬剤の、ＰＤＥ１１に関連した疾患又は病態の治療に用いる医薬組成物の製造における用途が提供される。
【００３９】
本発明の更なる態様によれば、以下のヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列が提供される：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントであるヌクレオチド配列、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として述べられているヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列、
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントの相補体であるヌクレオチド配列、
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として述べられているヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
（ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
（ｇ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として述べられているヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列、
（ｈ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として述べられているヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の相補体とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
（ｊ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３又は１４として示されるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８を含むヌクレオチド配列の変異体、相同体、誘導体又はフラグメントの相補体とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
（ｋ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）又は（ｊ）で定義されたヌクレオチドに対して遺伝暗号の結果として縮重しているヌクレオチド配列、
（ｌ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）及び／又は（ｋ）のいずれか１つを含むヌクレオチド配列。
【００４０】
本発明の他の態様には以下のものがある。
本発明による単離されたヌクレオチド配列又はタンパク質配列。
本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性に影響を与え得る薬剤を同定するアッセイ方法であって、
本発明のヌクレオチド配列又はその発現産物（「ＥＰ」）に薬剤を曝露し、
本発明のヌクレオチド配列又はその発現産物を薬剤が（発現パターン又は活性に影響を与えるように）調節（モジュレート）するか否かを決定することから成る、アッセイ方法。
【００４１】
本発明のアッセイ方法によって同定される薬剤。
本発明のアッセイ方法によって同定され、本発明によるＰＤＥモジュレーション効果を有することがこれまで知られていなかった薬剤。
【００４２】
（ａ）本発明のアッセイを実施し、
（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性に影響を与える１つ又はそれ以上の薬剤を同定し、
（ｃ）１つ又はそれ以上の同定された薬剤を大量に製造する、
工程を含む方法。
【００４３】
（ａ）本発明によるアッセイを実施し、
（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性に影響を与える１つ又はそれ以上の薬剤を同定し、
（ｃ）１つ又はそれ以上の同定された薬剤を含む医薬組成物を製造する、
工程を含む方法。
【００４４】
（ａ）本発明によるアッセイを実施し、
（ｂ）本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性に影響を与える１つ又はそれ以上の薬剤を同定し、
（ｃ）１つ又はそれ以上の同定される薬剤を、本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物に対して別の効果を引き起こすように修飾する、
工程を含む方法。
【００４５】
本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性に影響を与える医薬品の製造に使用する、本発明によるアッセイによって同定された薬剤の用途。
対象（哺乳類、好ましくはヒトを含む）に対し、本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はその発現産物の活性を調節し得る薬剤の有効量をデリバリー（投与又は曝露等）することを含む、対象を治療する方法。
【００４６】
対象（哺乳類、好ましくはヒトを含む）に対し、本発明によるアッセイによって同定された薬剤の有効量をデリバリー（投与又は曝露等）することを含む、対象を治療する方法。
【００４７】
披検者に対し本発明のヌクレオチド配列又はその発現産物を投与し、披検者に免疫応答を引き起こす方法。
［ＰＤＥ１１（ＰＤＥＸＩ）]
以上のように、本発明は新規ＰＤＥ酵素−ＰＤＥ１１と呼ぶ（又はＰＤＥＸＩとも表記される）−及びそれをコードするヌクレオチド配列に関する。
【００４８】
本発明はまた新規な核酸及びアミノ酸配列の、疾患の診断及び治療における用途に関する。本発明はまた新規な核酸及びアミノ酸配列の、ホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価及び／又はスクリーニングするのに使用する用途に関する。本発明はさらにホスホジエステラーゼ活性を調節し得る薬剤を評価及び／又はスクリーニングする新規な核酸及びアミノ酸配列を包含又は発現する、遺伝子工学的に処理された宿主細胞に関する。
【００４９】
ここに使用される「ＰＤＥ１１」という用語はこれまで特徴づけされていなかった新規なＰＤＥファミリーを指す。例として、我々は２種のヒトＰＤＥ１１のアイソザイム−ＰＤＥ１１Ａ１及びＰＤＥ１１Ａ２と呼ぶ（それぞれＨＳＰＤＥ１１Ａ１、ＨＳＰＤＥ１１Ａ２と言及される場合もある）−を同定した。ＰＤＥ１１Ａ２はＰＤＥ１１Ａ１のスプライシング変異体であると考えられる。我々はまたマウスの配列−ＰＤＥ１１Ａ３と呼ぶ（ＭｍＰＤＥ１１Ａ３と言及される場合もある）−を同定した。我々はまたラットの配列を同定し−ＰＤＥ１１Ａ４と呼ぶ（ＲｔＰＤＥ１１Ａ４と言及される場合もある）−一部の配列を決定した。  便宜上、特に断らなければ、ＰＤＥ１１と言えば、ＰＤＥ１１Ａ１及び／又はＰＤＥ１１Ａ２及び／又はＰＤＥ１１Ａ３及び／又はＰＤＥ１１Ａ４を含むものとする。
【００５０】
ＰＤＥ１１（例えば、アイソザイムＰＤＥ１１Ａ１及び／又はＰＤＥ１１Ａ２）は、様々な源に存在し、そこから入手できると考えられる。例えば、ＰＤＥ１１は線条体及び海綿体に見出される。別の例では、ＰＤＥ１１はヒト及びマウスだけでなく、ラットからも採取できる。ＰＤＥ１１はまた、例えば、ウシ、羊、豚、ウマ、といった多くの他の源にも存在していると考えられる。好ましくは、本発明は上記の源の哺乳類のＰＤＥ１１を含むが、それらに限定されるものではない。
【００５１】
ＰＤＥ１１は自然界に存在している形体と同じものでもよいが、本態様にとっては、ＰＤＥ１１は、好ましくは非天然のアミノ酸配列（即ち、その自然の形体において及びその自然環境において存在していない）であるか又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体である。さらに、又は代わりに、ＰＤＥ１１は単離されたＰＤＥ１１及び／又は精製されたＰＤＥ１１である。ＰＤＥ１１は天然か否かを問わずあらゆる適切な源から入手又は生成し得るし、合成、半合成又は組換えのものであってもよい。
【００５２】
ＰＤＥ１１のコード配列は自然界に存在している形体と同じものでもよいが、本態様にとっては、ＰＤＥ１１のコード配列は、好ましくは非天然のヌクレオチド配列（即ち、その自然の形体において及びその自然環境において存在していない）であるか又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体である。さらに、又は代わりに、ＰＤＥ１１のコード配列は単離されたＰＤＥ１１のコード配列及び／又は精製されたＰＤＥ１１のコード配列である。ＰＤＥ１１のコード配列は天然か否かを問わずあらゆる適切な源から入手し又は生成し得るし、合成、半合成又は組換えのものであってもよい。
【００５３】
ＰＤＥ１１はｃＧＭＰからＧＭＰへの変換を触媒すると考えられる。ｃＧＭＰは男性の勃起反応におけるメッセンジャーである。それ故、ＰＤＥ１１の活性を阻害すれば、ｃＧＭＰ濃度を高め、男性の勃起反応を強める可能性がある。従って、ＰＤＥ１１及び／又はそのコード配列及び／又はそれとハイブリダイズし得る配列は、男性の勃起不全を治療する薬剤の候補物質をスクリーニングするのに有用である。さらに、ＰＤＥ１１及び／又はそのコード配列及び／又はそれとハイブリダイズし得る配列は、女性の性機能不全を治療する薬剤の候補物質をスクリーニングするのに有用であると考えられる。また、ＰＤＥ１１及び／又はそのコード配列及び／又はそれとハイブリダイズし得る配列は、薬剤の候補物質の様々なＰＤＥに対する選択性を試験するのに有用である。
【００５４】
本発明の好ましい態様は、組換えＰＤＥ１１酵素及びＰＤＥ１１酵素をコードする組換えヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、本発明の組換えＰＤＥ１１酵素及び／又は組換えヌクレオチド配列は、哺乳類の組換えＰＤＥ１１酵素及び／又は哺乳類の組換えヌクレオチド配列である。
【００５５】
本発明によれば、組換えＰＤＥ１１酵素は、式Ｉとして示された式を少なくとも有する。
ＰＤＥ１１をコードするヌクレオチド配列とＰＤＥ１１酵素そのもののいずれか又は両方は、ＰＤＥ１１活性に影響を与え得る薬剤をスクリーニングするために利用できる。特に、ＰＤＥ１１をコードするヌクレオチド配列又はＰＤＥ１１酵素そのものは、ＰＤＥ１１活性を阻害し得る薬剤をスクリーニングするために利用できる。さらに、ＰＤＥ１１をコードするヌクレオチド配列又はＰＤＥ１１酵素そのものは、ＰＤＥ１１活性を選択的に阻害するように、ＰＤＥ１１活性に選択的に影響を与える薬剤をスクリーニングするために利用できる。
【００５６】
さらに、ＰＤＥ１１をコードするヌクレオチド配列又はそれと相補的である配列は、ヒト細胞におけるＰＤＥ１１コード配列の存在を検出するアッセイに利用できる。このアッセイは、この酵素の組織分布及び特殊な病態との生物学的関連性に関する情報を提供するだろう。
【００５７】
本発明はまたＰＤＥ１１（その誘導体、フラグメント、相同体又は変異体を含む）に対する抗体も含む。ＰＤＥ１１の抗体は、ヒト細胞におけるＰＤＥ１１の存在を検出するアッセイに利用できる。このアッセイは、この酵素の組織分布及び特殊な病態との生物学的関連性に関する情報を提供する。
【００５８】
特に、ＰＤＥ１１のアイソザイム（即ち、ＰＤＥ１１Ａ１及びＰＤＥ１１Ａ２又はＰＤＥ１１Ａ３又はＰＤＥ１１Ａ４）、それらをコードするヌクレオチド配列、それらと相補的なヌクレオチド配列及びそれらに対する抗体のうち１つ又はそれ以上は、アイソザイムの１つに選択的に影響を与える薬剤をスクリーニングするアッセイに利用できる。このアッセイは、これらのアイソザイムそれぞれの組織分布及び特殊な病態との生物学的関連性に関する情報を提供する。このアッセイはまた、特殊な組織又は特殊な病態等においてＰＤＥ１１の発現又は活性に影響を与えるのに有用な薬剤を、試験して同定することを可能にするだろう。
［天然に存在している］
ここに使用される「天然に存在している」は、自然に見出されるアミノ酸配列を有するＰＤＥ１１を指す。
［単離／精製された］
ここに使用される「単離された]又は[精製された]は、自然環境から取り出され、本来共存している少なくとも１つの他の成分から単離又は分離された、核酸又はアミノ酸、いずれかの分子を指す。
［生理活性がある］
ここに使用される「生理活性がある」は、天然に存在しているＰＤＥ１１と類似の構造的機能（必ずしも同程度ではなくてもよい）及び／又は、類似の制御機能（必ずしも同程度ではなくてもよい）及び／又は、類似の生化学的機能（必ずしも同程度ではなくてもよい）及び／又は、類似の免疫活性（必ずしも同程度ではない）を有する本発明によるＰＤＥ１１、例えば組換えＰＤＥ１１を指す。特に、本発明のＰＤＥ１１はサイクリックヌクレオチドを加水分解する能力を有するが、それは本発明のＰＤＥ酵素の有する特徴的な活性の１つである。
［免疫活性］
ここに使用される「免疫活性」は、適切な動物又は細胞において特異的な免疫反応を引き起こして特異的な抗体と結合する、天然、組換え又は合成のＰＤＥ１１又はそのオリゴペプチドの有する能力として定義される。
［誘導体］
アミノ酸配列と関連して用いられている「誘導体」という用語は、ＰＤＥ１１の化学修飾を含む。そのような修飾の例は、水素をアルキル、アシル又はアミノ基で置換することである。
［欠失］
ここに使用される「欠失」は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列において、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸残基の１つ又はそれ以上が欠損している変化として定義される。
［挿入／付加］
ここに使用される「挿入」又は「付加」とは、天然に存在しているＰＤＥと比較して、それぞれ１つ又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基の追加をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化のことである。
［置換］
ここに使用される「置換」は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸をそれぞれ別のヌクレオチド又はアミノ酸に置き換えることより生じる。
［変異体／相同体］
本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列に関して用いられる「変異体」又は「相同体」という用語は、配列の対立遺伝子変異と同義である。
【００５９】
特に、ここで用いられている「相同性」という用語は「同一性」と同等である。つまり、本発明のヌクレオチド配列及び本発明のアミノ酸配列に関する配列の相同性は、１つ又はそれ以上の配列を他の配列と単純に「眼球」比較（即ち、厳密な比較）し、他の配列が当該の配列と少なくとも７５％の同一性を有するかどうか確かめることによって、決定し得る。相対的な配列相同性（即ち、配列同一性）は、２つ又はそれ以上の配列間の相同性（％）を計算できる市販のコンピュータ・プログラムによっても決定し得る。ＣＬＵＳＴＡＬはこのようなコンピュータ・プログラムの典型的な例である。
【００６０】
配列相同性（又は同一性）は、適切な相同性アルゴリズム、例えばデフォルト（ｄｅｆａｕｌｔ）・パラメータを利用しても決定され得る。有利には、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはパラメータをデフォルト値に設定して使用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌに記載されており、これを援用してここに取り込む。検索パラメータは以下のように定義され、有利には、定義されたデフォルト・パラメータに設定する。
【００６１】
有利には、ＢＬＡＳＴによって評価するとき、「実質的な相同」とは、少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０又はそれ以上のＥＸＰＥＣＴ値に一致する配列に等しい。ＢＬＡＳＴ検索におけるＥＸＰＥＣＴのデフォルト閾値は通常１０である。
【００６２】
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ
Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘというプログラムによって使用される帰納的な検索アルゴリズムであり、上記プログラムは地検の有意性を、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの統計手法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌを参照せよ）にいくつかの改良点を加えた手法を用いて判断するものである。これらのＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性を検索するために手を加え、例えば疑義配列との相同体を同定できるようにしたものである。これらのプログラムはモチーフのスタイルの検索には一般に有用ではない。配列データベースの類似性検索における基本的な課題に関する論議については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等の論文（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１１９〜１２９を参照せよ。
【００６３】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは以下のタスクを実行する：
ｂｌａｓｔｐは、アミノ酸の疑義配列をタンパク質の配列データベースに
対して比較する。
【００６４】
ｂｌａｓｔｎは、ヌクレオチドの疑義配列をヌクレオチドの配列データベ
ースに対して比較する。
ｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドの疑義配列（２本鎖）の６−フレーム（ｆ
ｒａｍｅ）の概念的翻訳産物をタンパク質の配列データベースに対して比較する。
【００６５】
ｔｂｌａｓｔｎは、タンパク質の疑義配列を全ての６−読み取りフレーム
（２本鎖）において力学的に翻訳されるヌクレオチドの配列データベースに対して比較する。
【００６６】
ｔｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドの疑義配列の６−フレーム翻訳をヌクレ
オチド配列データベースの６−フレーム翻訳と比較する。
ＢＬＡＳＴでは以下の検索パラメータを用いる。
【００６７】
ＨＩＳＲＴＯＧＲＡＭは、各検索スコアのヒストグラムを表示する。デフォルトはイエスである（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＨを参照せよ）。
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳは、報告される一致配列の簡略記載数を特定された数へ制限する。デフォルト限界は１００の記載である（マニュアルのパラメータＶの頁を参照せよ）。また、ＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦも参照せよ。
【００６８】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳはハイスコア・セグメント・ペア（ＨＳＰ）として報告されるデータベース配列を所定の数へ制限する。デフォルト限界は５０である。これよりも多くのデータベース配列が統計的有意性の報告閾値を満足させるならば（以下に示すＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦを参照せよ）、最大の統計的有意性に帰される一致だけが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＢを参照せよ）。
【００６９】
ＥＸＰＥＣＴはデータベース配列に対する一致を報告する統計的有意性の閾値であり、デフォルト値は１０である。１０の一致は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの推計モデル（１９９０）によれば、単なる偶然によって見出されると期待される。ある一致による統計的有意性がＥＸＰＥＣＴ閾値よりも大きければ、この一致は報告されない。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値はより厳格（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）であり、一致が報告される頻度を低くする。端数値は許容される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＥを参照せよ）。
【００７０】
ＣＵＴＯＦＦは、ハイスコア・セグメント・ペア（ＨＳＰ）の報告をカットオフする値である。デフォルト値はＥＸＰＥＣＴ値より算出される（上記参照）。データベース配列のＨＳＰが報告されるのは、それらの統計的有意性が、ＣＵＴＴＯＦＦ値に匹敵するスコアを有する唯一のＨＳＰによるものと少なくとも同じくらい高い場合だけである。より高いＣＵＴＯＦＦ値を設けるとより厳格（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）になり、偶然の一致はより報告されない（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳを参照せよ）。普通、有意性の閾値はＥＸＰＥＣＴを用いてより直感的に処理し得る。
【００７１】
ＭＡＴＲＩＸは、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸの代替となるスコアリング・マトリックスを特定する。デフォルト・マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２）である。有効な代替選択は、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０及びＩＤＥＮＴＩＴＹを含む。ＢＬＡＳＴＮには代替となるスコアリング・マトリックスがないので、ＢＬＡＳＴＮリクエストにＭＡＴＲＩＸ指示を特定するとエラー応答が帰ってくる。
【００７２】
ＳＴＲＡＮＤは、ＴＢＬＡＳＴＮ検索をデータベース配列の上側鎖又は下側鎖に制限する、又は、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ又はＴＢＬＡＳＴＸ検索を疑義配列の上側又は下側の鎖上の読み取りフレームのみに制限する。
【００７３】
ＦＩＬＴＥＲは、疑義配列の、Ｗｏｏｔｔｏｎ  ＆  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１４９〜１６３のＳＥＧプログラムによって決定されるような組成上の複雑性が低い疑義配列セグメント又は、Ｃｌａｖｅｒｉｅ  ＆  Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１９１〜２０１のＸＮＵプログラム又は、ＢＬＡＳＴＮの場合はＴａｔｕｓｏｖ  ＆  ＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照せよ）によって決定されるような短周期性の内部リピートから成るセグメントを遮蔽する。フィルタリングは統計的に有意であっても生物学的には興味のない報告をｂｌａｓｔの出力(例えば、酸性、塩基性又は高プロリンの共通領域に対するヒット)から消去し、データベース配列に対する特異的な一致のために供される疑義配列のより生物学的に興味深い領域を残すことができる。
【００７４】
フィルター・プログラムによって見出される複雑性が低い配列は、ヌクレオチド配列中ではＮにより（例えば「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」のように）、タンパク質配列ではＸにより（例えば「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」のように）代用される。
【００７５】
フィルタリングは疑義配列（又はその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルト・フィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮに対してはＤＵＳＴであり、他のプログラムに対してはＳＥＧである。
【００７６】
ＳＥＧ、ＸＮＵ又はその両方にでも、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴの配列に適用したとき、何もマスクされないことは稀ではないので、フィルタリングがいつでも効果を生むと期待してはならない。さらに、配列が全体にマスクされてしまい、フィルターのかかっていない疑義配列に対して報告されたいかなる一致の統計的有意性も疑うべきであることを示す場合もある。
【００７７】
ＮＣＢＩ−ｇｉにより、登録（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）及び／又は（遺伝子）座の名称に加えて、ＮＣＢＩ  ｇｉの同定記号が出力に示される。
最も好ましくは、配列比較は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで提供される単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて実行される。
【００７８】
２つの配列の同一性及び類似性を決定する他のコンピュータ・プログラム方法の例には、ＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ４０３〜４１０）があるが、それに限定されるものではない。
【００７９】
配列の同一性を決定する際にＧａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓが用いられるならば
好ましくは、以下のパラメータを使用する：
----------------------------------------------------------------------
ＢＬＡＳＴについて
----------------------------------------------------------------------
ＧＡＰ  ＯＰＥＮ                  ０
----------------------------------------------------------------------
ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＴＩＯＮ        ０
----------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------
ＣＬＵＳＴＡＬについて        ＤＮＡ        ＰＲＯＴＥＩＮ
----------------------------------------------------------------------
ＷＯＲＤ  ＳＩＺＥ            ２            １        Ｋ  ｔｒｉｐｅ
----------------------------------------------------------------------
ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ        １０          １０
----------------------------------------------------------------------
ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＴＩＯＮ    ０．１        ０．１
----------------------------------------------------------------------
ここに使用される「変異体」、「相同体」、「フラグメント」及び「誘導体」は、配列の対立遺伝子変異を包含する。
【００８０】
「変異体」という用語はここに示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補的な配列も含む。
［ハイブリダイゼーション］
ここに使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＣＷ及びＧＳ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒの論文（１９９５、ＰＣＲプライマー、研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー出版、プレインビュー、ＮＹ）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応において実行されるような増幅工程だけでなく、「１本鎖の核酸が塩基対合を介して相補的な鎖と結合する工程」（Ｃｏｏｍｂｓ  Ｊ  （１９９４）「バイオテクノロジー辞典」、ストックトン出版、ニューヨーク、ＮＹ）も含む。
【００８１】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ（１９８７、分子クローニング技法のガイド、「酵素学の手法」１５２巻、アカデミック出版、サンディエゴ、ＣＡ）に示されるように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、「ストリンジェンシィ」の定義は以下のように説明される。
【００８２】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシィとはポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。このような条件は当業者には明らかである。当業者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、配列相同性が１％減少するごとに約１〜１．５℃減少するハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオンの濃度及び温度の関数である。通常、より高位のストリンジェンシィ条件下でハイブリダイゼーション反応を実施し、その後、様々なストリンジェンシィで洗浄する。
【００８３】
ここに使用される、高位のストリンジェンシィとは１Ｍナトリウムイオン、６５〜６８℃において安定なハイブリッドを形成する核酸配列にのみハイブリダイゼーションを許容する条件を指す。
【００８４】
最大ストリンジェンシィは通常約Ｔｍ−５℃（プローブの融点より５℃低い温度）で起こる。
高位ストリンジェンシィは、プローブの融点より約５℃〜１０℃低い温度で起こる。高位ストリンジェンシィ条件は、例えば、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）液、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｍピロリン酸ナトリウム、非特異的競合物としての変性サケ精子ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌを含む水溶液におけるハイブリダイゼーションによってもたらされる。ハイブリダイゼーションの後、高位ストリンジェンシィ洗浄が幾つかの工程においてなされてもよく、最終洗浄（約３０分）は、０．２〜０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度という条件下で実施する。
【００８５】
中位又は中間的ストリンジェンシィは通常プローブのＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度で起こる。
低位ストリンジェンシィは通常プローブのＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で起こる。
【００８６】
当業者に理解されるように、最大ストリンジェンシィ・ハイブリダイゼーションは同一のポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに利用され、中位（又は低位）ストリンジェンシィ・ハイブリダイゼーションは類似又は関連したポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに利用される。
【００８７】
中位ストリンジェンシィは、上記の溶液のハイブリダイゼーションと同じだが約６０〜６２℃である条件を指す。この場合、最終洗浄は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度という条件下で実施する。
【００８８】
低位ストリンジェンシィは、上記の溶液で約５０〜５２℃におけるハイブリダイゼーションに等しい条件を指す。この場合、最終洗浄は、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、ハイブリダイゼーション温度という条件下で実施する。
【００８９】
以上の反応条件は、様々な緩衝液（例、ホルムアミドを基本とする緩衝液）と温度を用いて構築し、繰り返してよい。デンハート溶液とＳＳＣは他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同じように当業者には良く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編（１９８９）分子クローニング：研究室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨーク、又はＡｕｓｕｂｅｌ等編（１９９０）分子生物学の最新プロトコール、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社を参照せよ）。最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブの長さ及びＧＣ含量もある役割を果たしているので、経験的に決定されるべきである。
［本発明のポリペプチド］
本発明のポリペプチドは実質的に単離された形態で存在する可能性がある。ポリペプチドはその意図された目的を干渉しない担体又は希釈剤と混合してよく、依然として実質的に単離されたものとみなされると理解される。本発明のポリペプチドはまた実質的に精製された形態で存在する可能性もあるが、この場合、一般に、調製物のポリペプチドの90％以上、例えば、95％、98％又は99％が本発明のポリペプチドである調製物中にポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、例えばヒスチジン残基の付加によりその精製を支援する、又はシグナル配列の付加により以下に論じるような細胞からの分泌を促進するように修飾してもよい。
【００９０】
本発明のポリペプチドは合成的手段（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ等（1996）により記載されているような）又は以下に論じるような組換え技術によって製造できる。
好ましい実施形態では、本発明のアミノ酸配列そのものには、本発明による天然のＰＤＥ１１は、それが自然環境に存在して、やはり自然環境に存在している天然のヌクレオチドコード配列によって発現され、そのヌクレオチド配列がやはり自然環境に存在している天然のプロモータのコントロール下にある場合は、包含されない。わかりやすくするために、この好ましい実施形態を「非天然型アミノ酸配列」と呼ぶ。
【００９１】
本発明の酵素のアミノ酸配列に関する「変異体」、「相同体」又は「フラグメント」という用語は、その配列から又はその配列に１つ（又はそれ以上）のアミノ酸が代替、変異、修飾、置換、欠損又は付加したものであり、その結果として生じる酵素は、ＰＤＥ１１活性、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５として示される酵素と少なくとも同等の生理活性を有する。特に、「相同体」という用語は構造及び／又は機能に関する相同性を包含する。配列相同性に関しては、式Ｉとして示される配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。式Ｉとして示される配列に対して、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１５として示される配列、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９を含むアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５として示される配列に対して、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【００９２】
通常、どんなアミノ酸置換をしても、このアミノ酸配列の疎水性／親水性は維持されるべきである。変更後の配列が、本発明によるＰＤＥ酵素として作用する能力を保持している限り、アミノ酸置換、例えば１、２又は３〜１０、２０又は３０の置換がなされてもよい。アミノ酸置換は、例えば血中半減期を増加させるために非天然に存在している類縁体を使用してもよい。
【００９３】
本発明のアミノ酸配列は、それをコードしているヌクレオチド配列の、適切な発現系における発現によって製造し得る。
さらに、又は他に、タンパク質そのものの全体又は部分は、ＰＤＥのアミノ酸配列を合成する化学的方法によって製造し得る。例えば、ペプチドは固相法によって合成し、樹脂から切離し、調製的高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）「タンパク質の構造と分子的原理」、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．ニューヨーク  ＮＹ）。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析又は配列決定法（例えば、エドマン分解法）によって確認し得る。
【００９４】
直接的ペプチド合成は様々な固相技術を利用してなし得る（Ｒｏｂｅｒｇｅ
ＪＹ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）。自動合成は、例えばＡＢＩ  ４３  １Ａ  ペプチド・シンセサイザー（パーキン・エルマー社）を製造業者の指示書に従って操作することによって、可能である。さらに、ＰＤＥのアミノ酸配列又はそのいかなる部分も直接合成の間に変更し得るし、及び／又は化学的方法を用いて、他のサブユニットからの配列又はそのいかなる部分をも結合して、変異したポリペプチドを製造することも可能である。
【００９５】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質をコードするために、ＰＤＥの天然型、修飾型又は組換え型の配列を異種の配列と結合させることが可能である。例えば、ＰＤＥ活性の阻害剤を求めてペプチド・ライブラリーをスクリーニングするためには、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラＰＤＥタンパク質をコードすることが有用であろう。融合タンパク質はまた、ＰＤＥ配列と異種タンパク配列の間に位置する開裂部位を含み、ＰＤＥを異種の部分から切離して精製することができるように設計され得る。
【００９６】
ＰＤＥはまた、タンパク精製を促進させるための１つ又はそれ以上のポリペプチド・ドメインが付加された組換えタンパク質としても発現される。このような精製促進ドメインは、固定化金属上の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファン・モジュールのような金属キレート・ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ  Ｊ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ３−．２６３２８  １）、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするプロテインＡドメイン及びＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システム（イミュネクス社、シアトル、ＷＡ）に利用される領域を含むが、これらに限定されない。精製ドメインとＰＤＥの間にＸＡ因子又はエンテロキナーゼ（インビトロジェン社、サンディエゴ、ＣＡ）のような切り離し可能なリンカー配列を導入することは、精製を促進する上で、有用である。
【００９７】
ＰＤＥ１１の特定のなアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２及びＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９として示される。しかしながら、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又は４又は１５又は１７又は１９というアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤＥ１１ファミリーに由来する他のものをコードするアミノ酸配列も含む。すでに示したように、本発明によるＰＤＥ１１ファミリーの適切な一般式は式Ｉ又は式ＩＩ〜式ＶＩＩの一つとして提示される。
【００９８】
本発明のポリペプチドはまた提示されたアミノ酸配列及びその変異体のフラグメントを含む。適切なフラグメントのサイズは少なくとも５つ、例えば、少なくとも１０、１２、１５又は２０個のアミノ酸である。
【００９９】
本発明のポリペプチドはまた、保存された置換を含めて、１つ又はそれ以上の（例えば、少なくとも２、３、５又は１０）置換、欠失又は挿入を含むように修飾してもよい。
保存された置換は、第二カラムの同一ブロック及び好ましくは第三カラムの同一ラインのアミノ酸がお互いに置換される、保守的な置換を示す以下の表によっ
てなされる。
----------------------------------------------------------------------
脂肪族                  非極性                      ＧＡＰ
------------------
ＩＬＶ
----------------------------------------------------------------------
極性−非荷電性              ＣＳＴＭ
------------------
ＮＱ
----------------------------------------------------------------------
極性−荷電性                ＤＥ
------------------
ＫＲ
----------------------------------------------------------------------
芳香族                                              ＨＦＷＹ
----------------------------------------------------------------------
その他                                              ＮＱＤＥ
----------------------------------------------------------------------
［本発明のヌクレオチド配列］
ここに使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリペプチドヌクレオチド配列及びその変異体、相同体、フラグメント及び誘導体（その一部等）を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換えを起源とし、センス又はアンチセンス鎖のいずれかを表わす２本鎖又は１本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
【０１００】
好ましくは、「ヌクレオチド配列」という用語はＤＮＡを意味する。
より好ましくは、「ヌクレオチド配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術を利用して製造されたＤＮＡ（即ち、組換えＤＮＡ）を意味する。
【０１０１】
好ましい実施形態では、自然環境に存在している本発明の天然のヌクレオチド配列は、それがやはり自然環境に存在している天然のプロモータのコントロール下にある場合は、本発明のヌクレオチド配列そのものには包含されない。わかりやすくするために、この好ましい実施形態を「非天然型ヌクレオチド配列」と呼ぶ。
【０１０２】
本発明のヌクレオチド配列はそこに合成的又は修飾されたヌクレオチドを含む場合がある。オリゴヌクレオチドに対する様々なタイプの修飾が多数この技術分野で知られている。それはホスホン酸メチル及びホスホロチオエート骨格分子の３'及び／又は５'末端にアクリジン又はポリリジン鎖を付加することを含む。本発明の目的のためにはここに示されているヌクレオチド配列は当該技術分野で利用し得るあらゆる方法によって修飾してよい。このような修飾は本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を高めるために実施され得る。
【０１０３】
本発明はまた、ここに示された配列に相補的なヌクレオチド配列又はあらゆるその誘導体、フラグメント又は誘導体を含む。その配列がそのフラグメントに相補的であるならば、その配列は他の生物体等に存在する同様のコード配列を同定するためのプローブとして利用し得る。
【０１０４】
本発明はまた、ここに示された配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列又はあらゆるその誘導体、フラグメント又は誘導体を含む。
本発明はまた、ここに示された配列と相補的である配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列又はあらゆるその誘導体、フラグメント又は誘導体を含む。  「変異体」という用語はまた、ここに示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補的である配列を含む。
【０１０５】
好ましくは、「変異体」という用語は、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃、０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０｝）下でここに示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補的である配列を含む。
【０１０６】
本発明はまた、（ここに示された配列の相補配列を含めて）本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、（ここに示された配列の相補配列を含めて）本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列と相補的であるヌクレオチド配列に関する。
【０１０７】
また、中位から最高のストリンジェンシィ条件下でここに示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。
好ましい態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば６５℃、０．１ｘＳＳＣ）下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む。
【０１０８】
典型的な核酸はまた、ＰＤＥ１１タンパク質をコードして、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されたＤＮＡ配列又はそのＤＮＡ配列から選択されたフラグメントにハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴づけることができる。好ましいのは、高位ストリンジェンシィ条件下でＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８の配列とハイブリダイズする、ＰＤＥ１１のコード配列である。
【０１０９】
有利には、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１のフラグメント又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３のフラグメント又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８のフラグメントと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸配列を提供する。好ましくは、フラグメントは長さが１５から５０塩基である。有利には、長さが約２５塩基である。
【０１１０】
本発明の好ましい酵素をコードするヌクレオチド配列に関する「変異体」、「相同体」又は「フラグメント」という用語は、その配列から又はその配列に１つ（又はそれ以上）の核酸が代替、変異、修飾、置換、欠損又は付加したものであり、その結果として生じるヌクレオチド配列は、ＰＤＥ１１活性、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列によってコードされる酵素と少なくとも同等の生理活性を有する酵素をコードする又はコードする能力がある。特に、「相同体」という用語は構造及び／又は機能に関する相同性を包含し、得られたヌクレオチド配列はＰＤＥ１１活性を有する酵素をコードする又はコードする能力がある。配列相同性に関しては、式Ｉとして示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。式Ｉとして示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列配列に対して、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。好ましくは、配列相同性に関して、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示される配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。ＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４として示される配列に対して、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。
【０１１１】
すでに示したように、本発明はＰＤＥ１１をコードするＤＮＡ配列（好ましくはｃＤＮＡ配列）に関する。特に、本発明は、ＰＤＥ１１Ａ１又はＰＤＥ１１Ａ２又はＰＤＥ１１Ａ３又はＰＤＥ１１Ａ４をコードするｃＤＮＡ配列に関する。  本発明はまたＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はそれら配列の対立遺伝子変異のＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。
【０１１２】
本発明はまた前述のＤＮＡ配列又はその対立遺伝子変異が取り込まれた宿主細胞における発現によって製造されたポリペプチドに関する。
本発明の特に好ましい態様は、（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９のような）式Ｉのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。例えば、本発明は、（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９のような）式Ｉのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
【０１１３】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８またはその対立遺伝子変異のＤＮＡ配列を含むＤＮＡに関する。
【０１１４】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８またはその対立遺伝子変異のＤＮＡ配列を含む非天然型のＤＮＡに関する。  本発明の特に好ましい態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８またはその対立遺伝子変異のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡに関する。
【０１１５】
本発明のポリペプチドヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、ある特定のアミノ酸をコードするのに種々様々なポリヌクレオチドがあることが理解されよう。
【０１１６】
ここに説明されたアミノ酸配列を知ることによって、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ及び／又はゲノム・クローンのような部分長及び全長の核酸を設計することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドはここに示されたアミノ酸配列をコードする配列をターゲットするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを利用することによって得られる。通常プライマーには多種の縮重ポジションがある。しかしながら、縮重を最小化するためには、メチオニンのような唯一のトリプレットによってコードされるアミノ酸を含む、ここに示したようなアミノ酸配列の領域をコードする配列が選択される。さらに、配列は、その核酸がＰＣＲ手法の鋳型ＤＮＡとして用いられる生物体のコドン使用を考慮して選択される。ＰＣＲは、既知の配列に対して単一の配列（非縮重）プライマーで配列をクローニングするのに利用される条件よりも低位のストリンジェンシィ条件で用いられる。
【０１１７】
ＰＣＲによって得られる、本発明のポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列は、ハイブリダイゼーションによりライブラリーをスクリーニングする技術を利用して、より大きな配列を得るために利用される可能性がある。例えば、ＰＣＲクローンは放射活性原子で標識し、他の生物種、好ましくは他の哺乳類由来のｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーをスクリーニングするために利用される可能性がある。ハイブリダイゼーション条件は通常中位から高位のストリンジェンシィ（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃〜約６０℃）である。
【０１１８】
また、アミノ酸配列の全て又は部分をコードする縮重核酸プローブを利用して、ｃＤＮＡ及び／又は他の生物種、好ましくは他の哺乳類由来のゲノム・ライブラリーをプローブしてもよい。しかしながら、初めにＰＣＲ技術を実行して、さらなるスクリーニング工程に使用する単一の配列を得ることが望ましい。
【０１１９】
本発明によれば、ＰＤＥ１１、該ポリペプチドのフラグメント、その融合タンパク質又は機能的同等物をコードするＰＤＥ１１のポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞におけるＰＤＥ１１の発現を指令する組換えＤＮＡ分子を生産するために利用し得る。遺伝暗号本来の縮重性のために実質的に同じ又は機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列もＰＤＥ１１のクローン化及び発現に利用し得る。当業者に理解されるように、非天然に存在しているコドンを有するＰＤＥをコードするヌクレオチド配列を製造することが有利であろう。例えば、ＰＤＥ１１の発現速度を高める又は天然に存在している配列から産生される転写産物より半減期が長いというような所望の性質を有する組換えＲＮＡ転写産物を製造するために、特殊な原核又は真核細胞の宿主（Ｍｕｒｒａｙ  Ｅ等（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：４７７〜５０８）によって好まれるコドンが選択され得る。
【０１２０】
上記に記載した技術を利用して得られる本発明のポリヌクレオチド配列は、上記に記載した技術を利用して、さらに別の相同的な配列又は変異体を得るために利用し得る。それはまた、例えばポリヌクレオチド配列を発現させる特定の宿主細胞のコドン選択性を最適化することを目的として、多様な宿主細胞系において本発明のポリペプチドを発現させる用途のために修飾され得る。制限酵素の認識部位を導入する又はポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質又は機能を変更するためには他の配列変換も望ましい。
【０１２１】
本発明によって利用され得る変更されたＰＤＥ１１のポリヌクレオチド配列は、結果として同一又は機能的に同等なＰＤＥをコードするポリヌクレオチドを生じる種々のヌクレオチド残基の欠失、挿入又は置換を含む。ＰＤＥ１１タンパク質も、潜在的な変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅ）を生じているが機能的には同等なＰＤＥとなるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有していてもよい。ＰＤＥの生理活性が保持され得る範囲で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両性における類似性を慎重に考慮してアミノ酸置換はなされるであろう。例えば、電荷が陰性のアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、電荷が陽性のアミノ酸にはリジン及びアルギニンがあり、同様の親水性値を有する非荷電性の極性基頭部を有するアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンがある。
【０１２２】
本発明の範囲にはＰＤＥの対立遺伝子も含まれる。ここに使用される、「対立遺伝子」又は「対立遺伝子配列」とはＰＤＥの別の形態である。対立遺伝子は突然変異、即ち核酸配列における変化から生じて、一般に、構造又は機能が変化しているか又は変化していない変更されたｍＲＮＡ又はポリペプチドを産生する。どの特定の遺伝子も対立遺伝子の形態を持たないか又は１つ又は多く持つ。対立遺伝子を生む突然変異的変化は、通常、アミノ酸の欠失、付加又は置換に帰される。このようなタイプの変化はそれぞれ単独で発生するか又は他の変化とともに、ある特定の配列において１回又はそれ以上の回数で起こる。
【０１２３】
本発明のヌクレオチド配列は様々な理由のためにＰＤＥコード配列を変更する−遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を修飾する変更を含むがそれに限定されない−ために遺伝子工学的に処理され得る。例えば、新しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを変更する又はコドン選択性を変化させるための部位特異的突然変異誘発のような、本発明技術分野でよく知られている技術を利用して、突然変異を導入し得る。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばＰＣＲプライマー、別の増幅反応用プライマーのようなプライマー、例えば放射活性又は非放射活性標識体を用いる従来の方法によってラベル標識されている等のプローブを製造するために利用し得るし、又はポリヌクレオチドはベクターに導入してクローン化してもよい。このようなプライマー、プローブ及び他のフラグメントの長さは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０又は４０のヌクレオチドであり、ここで用いられているような本発明のポリヌクレオチドという用語にも含まれる。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチド又はプライマーには標識ラベルを付してよい。適切なラベルは32Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体、酵素ラベル又はビオチンのような他のタンパク質ラベルを含む。このようなラベルは本発明のポリヌクレオチド又はプライマーに付加してそれ自身知られている技術を用いて検出され得る。
【０１２６】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチド及びプライマーのようなポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に又は当業者が利用し得る手段によって製造し得る。それはまた標準的な技術によってクローン化し得る。
【０１２７】
一般に、プライマーは、所望の核酸配列を得るために、１回ごとに１つのヌクレオチドの段階的製造法によって、合成的手段によって製造される。自動化技術を利用してこれを達成する技術はこの技術分野で容易に実用化されている。
【０１２８】
より長いポリヌクレオチドは一般に組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を利用して製造される。この方法は、クローン化が望まれるヌクレオチド配列領域に一対のプライマー（例えば、約１５〜３０のヌクレオチド）を製造すること、このプライマーを真菌、植物又は原核細胞より得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させること、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実行すること、増幅されたフラグメントを（例えば反応混合物をアガロースゲル上で精製して）単離すること、及び増幅されたＤＮＡを回収すること、を含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニング・ベクターにクローン化され得るように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計し得る。
【０１２９】
ＤＮＡ分子は細胞内の安定性及び半減期を増加させるように修飾し得る。可能な修飾には、分子の５'及び／又は３'末端にフランキング配列を付加すること又は、分子骨格内部のホスホジエステラーゼ結合に代えてホスホロチオエート又は２'Ｏ−メチルを利用することが含まれるが、それに限定されるものではない。
【０１３０】
前述したように、本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異の全て又は部分にハイブリダイズできるヌクレオチド配列に関する。このヌクレオチド配列はＰＤＥ１１発現を修飾するアンチセンス技術に利用できる可能性がある。また、これらの配列（又はその一部）は、プローブとして、又はポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして利用されるときは、そのような配列の全て又は部分の増幅用に利用し得る。
【０１３１】
組換えＤＮＡ配列だけでなく、ゲノムの配列も新薬発見において有用である。ある特定のイソ型の翻訳タンパク質を阻害するよりそのｍＲＮＡ転写を阻害するのに極めて有用である場合がある。このことが特にＰＤＥ１１に当てはまるのは、様々なスプライシング変異体を様々なプロモーターから転写させ得るからである。マウスの脳の２'，３'−サイクリック−ヌクレオチド３'ホスホジエステラーゼの転写を複数のプロモータに指令させた例がある（Ｋｕｒｉｈａｒａ  Ｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７０：１０７４［１９９０］）。
【０１３２】
本発明の別の有用性は、このＤＮＡ配列がひとたび判明すれば、各アイソザイム又はスプライシング変異体を特異的に検出するアッセイを設計するのに必要な情報がもたらされることである。アイソザイム特異的ＰＣＲプライマー対は、アイソザイム又はスプライシング変異体の特異的ＤＮＡ配列に関する知識に完全に依存したアッセイの１例にすぎない。このようなアッセイによってアイソザイムのｍＲＮＡが検出され、各アイソザイムの組織分布やある特定の病態に対する生物学的関連性を知ることが可能になる。それはまた唯一のアイソザイムを自然に発現している可能性がある細胞系の同定も可能にするが、この発見があれば組換え遺伝子を発現させる必要性はなくなる。もし特定のＰＤＥ１１アイソザイムがある特定の病態に関連していることが示されたならば、本発明はアイソザイムｍＲＮＡの存在を検出する診断アッセイの設計において有用であろう。
【０１３３】
ある生物標本における、ＰＤＥ１１をコードしているヌクレオチド配列の異常レベルは、核酸欠失又は突然変異のような染色体異常を反映する可能性がある。それ故、ＰＤＥ１１をコードしているヌクレオチド配列は、ＰＤＥコード遺伝子における欠損、突然変異又は染色体転座のような染色体異常を検出する診断に利用され得るプローブの基礎を提供する。このような病態ではＰＤＥ１１遺伝子の発現が変化している可能性があるか又はＰＤＥ１１コード遺伝子領域に染色体異常が存在している可能性がある。
【０１３４】
本発明の別の実施形態では、ＰＤＥコード配列は、この技術分野でよく知られている化学的な方法を利用して、全体的又は部分的に、合成し得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ等（１９８０）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３、Ｈｏｒｎ  Ｔ等（１９８０）  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照せよ）。
［調節配列］
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞によるようなコード配列の発現を規定し得る調節配列と機能可能に結合している。例えば、本発明はこのような調節配列と機能可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。即ち、このベクターは発現ベクターである。
【０１３５】
「機能可能に結合している」という用語は、記載された成分がその意図されたやり方で機能し得る関係にあるように並置されることを指す。コード配列に「機能可能に結合している」調節配列は、コントロール配列と同じ条件下でコード配列の発現が達成されるように結びついている。
【０１３６】
「調節配列」という用語はプロモーター、エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。
「プロモーター」という用語は本技術分野の通常の意味で使われる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１３７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増加させることはまた、例えばプロモーターや分泌リーダー領域及び終始領域のような、選択された発現宿主由来の関心対象となるタンパク質の発現及び、所望により、分泌を増加させること及び／又は本発明のポリペプチドの発現の誘導コントロールを規定することに役立つ異種の調節領域の選択によっても達成し得る。
【０１３８】
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は少なくともプロモーターに機能可能に結合し得る。
本発明のポリペプチドの発現を指令するためには、本発明のポリペプチドをコードしている遺伝子に本来備わっているプロモーターとは別に、他のプロモーターを利用し得る。プロモーターは、所望の発現宿主における本発明のポリペプチドの発現を指令する効率性によって選択され得る。
【０１３９】
他の実施形態では、本発明の所望のポリペプチドの発現を指令するために、構成的プロモーターが選択され得る。このような発現構造体が更なる利点を提供し得るのは、それが誘導基質を含む培養液で発現宿主を培養する必要性を無くすからである。
【０１４０】
真菌の発現宿主において使用されることが好ましい強力な構成的及び／又は誘導的プロモーターの例は、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ−シンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子由来のＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）の各プロモーターの真菌遺伝子から入手できるものである。
【０１４１】
強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から入手できるものである。
【０１４２】
強力な細菌プロモーターの例は、α−アミラーゼ及びＳＰ０２のプロモーター及び細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターである。
発現構築体の誘導調節を改善するためにハイブリッド・プロモーターも利用され得る。
【０１４３】
プロモーターはさらに適切な宿主における発現を確保又は増加させる特徴を含み得る。例えば、この特徴とは、プリブナウ（Ｐｒｉｂｎｏｗ）ボックス又はＴＡＴＡボックスのような保存された領域であり得る。プロモーターはまた本発明のヌクレオチド配列の発現レベルに影響を与える（維持、増加、減少させる）他の配列を含む場合がある。例えば、適切な他の配列には、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンがある。他の配列は、温度、化学品、光又はストレスにより誘導されるような誘導要素配列を含む。また、転写又は翻訳を増加させるのに適した要素配列も存在し得る。後者の例はＴＭＶ５'シグナル配列（Ｓｌｅａｔ、Ｇｅｎｅ  ２１７［１９８７］２１７〜２２５、及びＤａｗｓｏｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３［１９９３］９７を参照せよ）である。
［分泌］
本発明のポリペプチドが発現宿主から培養液へ分泌されることがしばしば望ましいのは、そこから本発明のポリペプチドがより容易に回収されるからである。本発明によれば、分泌リーダー配列は、望ましい発現宿主を基に選択され得る。ハイブリッド・シグナル配列も本発明の文脈に沿って利用され得る。
【０１４４】
異種の分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えば、アスペルギルス属由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸体の双方）、ａ−ファクター遺伝子（サッカロミセス属及びクリーベロミセス属のような酵母）又はα−アミラーゼ遺伝子（バシラス属）由来のものである。
［構築体］
「結合体」、「カセット」及び「ハイブリッド」のような用語と同義である「構築体」という用語は、プロモーターと直接的又は間接的に付着した本発明によるヌクレオチド配列を含む。間接的な付着の例は、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンのようなイントロン配列のような、適当なスペーサーグループがプロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に割り込むことである。同じことは、本発明に関連した「融合した」という用語にも当てはまり、直接的又は間接的な付着を含む。いずれの場合でも、この用語は、野生型の遺伝子プロモーターと通常結合していていずれも自然環境に存在しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の自然の組み合わせを包含するものではない。
【０１４５】
構築体はマーカーを含む又は発現する可能性さえあるが、このマーカーによって、それが転移される、例えば枯草菌のような好ましくはバシラス属の細菌又はポテト、サトウキビのような植物において、この遺伝的構築体の選択が考慮される。例えば（特に植物の）マンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードしているマーカー、又は抗生物質への耐性−例えばＧ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン及びゲンタマイシンに対する耐性−を規定するマーカーのように、利用し得る様々なマーカーがある。
【０１４６】
好ましくは、本発明の構築体は、プロモーターに機能可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を少なくとも含む。
［ベクター］
「ベクター」という用語は発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
【０１４７】
「発現ベクター」はインビボ又はインビトロで発現できる構築体を意味する。  「形質転換ベクター」は、ある実体から別の実体−同じ生物種であるか別の生物種である−へ転移し得る構築体を意味する。この構築体がある種から別の種へ転移し得る−例えば、大腸菌プラスミドからバシラス属のような細菌へ−ならば、この形質転換ベクターは「シャトルベクター」と呼ばれることがある。これは、大腸菌プラスミドからアグロバクテリウム属、植物へ転移される構築体である場合もある。
【０１４８】
本発明のベクターは以下に述べられるように適切な宿主細胞へ形質転換されて本発明のポリペプチドの発現を規定し得る。従って、本発明の別の態様では、発現ベクターで形質転換された又はそれを移入された宿主細胞を、ポリペプチドをコードしているコード配列の発現をこのベクターによって規定する条件下で培養すること及び発現されたポリペプチドを回収することを含む、本発明によるポリペプチドを製造する方法を提供する。
【０１４９】
例えば、ベクターは、複製起点、所望により上記ポリヌクレオチドの発現プロモーター及び、所望によりプロモーターの調節部分を備えたプラスミド、ウィルス又はファージベクターである。
【０１５０】
本発明のベクターは１つ又はそれ以上の選択されるマーカー遺伝子を含み得る。工業用微生物に最も適した選択系は、宿主生物体における突然変異を必要としない選択マーカーのグループによって形成されるものである。真菌の選択マーカーの例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５'−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、フレオマイシン及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）の遺伝子である。非真菌の選択マーカーの例は、細菌のＧ４１８耐性遺伝子（これは酵母にも使えるが糸状真菌には使えない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）、ネオマイシン耐性遺伝子（バシラス）及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌のｕｉｄＡ遺伝子である。
【０１５１】
ベクターは、例えばＲＮＡの製造のためにインビトロで使用でき、又は宿主細胞を感染（トランスフェクト）又は形質転換するために使用できる。
従って、本発明のポリヌクレオチドは組換えベクター（通常は、複製可能なベクター）、例えばクローニング又は発現ベクターへ取り込むことができる。ベクターは適合可能な宿主細胞において核酸を複製するために利用し得る。従って、別の実施形態では、本発明は、複製可能なベクターに本発明のポリペプチドを導入すること、適合可能な宿主細胞へベクターを導入すること及びベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を培養することによって、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収し得る。適切な宿主細胞は発現ベクターに関連して以下に記載される。
【０１５２】
本発明はまた、ＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を発現する遺伝子工学的に処理された宿主細胞の、ホスホジエステラーゼ活性をモジュレートしてサイクリックヌクレオチドのレベルを調節するＰＤＥ１１の阻害剤及び拮抗剤を同定するスクリーニング方法における用途に関する。このような遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、ＰＤＥ１１活性を調節し得るペプチド・ライブラリー又は有機分子をスクリーニングするために利用し得る。抗体、ペプチド又は有機低分子のようなＰＤＥ１１の拮抗剤及び阻害剤は、例えば男性の勃起不全に関連した疾患の治療のための医薬組成物の基礎を提供する。このような阻害剤又は拮抗剤は単独で又はこのような疾患の他の治療薬と共に投与され得る。
【０１５３】
本発明はまた、ＰＤＥ１１タンパク質をインビボ又はインビトロで製造すること又はＰＤＥ１１の発現又は活性に影響を与え得る薬剤をスクリーニングすることを目的とする、ＰＤＥ１１をコードするポリヌクレオチド配列又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を含む発現ベクター及び宿主細胞に関する。［組織］
ここで用いられている「組織」という用語は、組織そのもの及び器官を含む。［宿主細胞］
本発明に関連した「宿主細胞」という用語は、本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれより得られる産物を含むあらゆる細胞を包含するものであって、プロモーターが宿主細胞の中に存在するとき、それにより本発明によるヌクレオチド配列が発現できる。
【０１５４】
従って、本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された又はそれに感染した宿主細胞を提供する。好ましくは、上記のポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドの複製及び発現のためにベクターに担われている。宿主細胞は上記ベクターと適合するものが選択され、例えば原核（例えば細菌）、真菌、酵母又は植物細胞である。
【０１５５】
グラム陰性菌である大腸菌は異種遺伝子発現の宿主として広く使われている。しかしながら、その内部では大量の雑多なタンパク質が蓄積しやすい。大腸菌の細胞内タンパク質全体から所望のタンパク質を引き続いて精製することは時に困難である。
【０１５６】
大腸菌に比較して、バシラス属の細菌が異種宿主として非常に適しているのはタンパク質を培養液に分泌する能力のためである。宿主として適している他の細菌は、ストレプトマイセス及びシュードモナス属のものである。
【０１５７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの性質及び／又は発現されたタンパク質のさらなる処理の必要性に照らせば、酵母又は他の真菌のような真核宿主の方が好まれる。一般に、酵母細胞が真菌細胞よりも好まれるのはより操作しやすいためである。しかしながら、酵母細胞から分泌されにくいタンパク質もあれば、（例えば酵母内の過糖鎖形成（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）のために）うまく処理されないタンパク質もある。このような場合は、別の真菌宿主生物体が選択されるべきである。  本発明の範囲内にある適切な発現宿主の例は、アスペルギルス種（ＥＰ−Ａ−０１８４４３８及びＥＰ−Ａ−０２８４６０３に記載されているような種）及びトリコデルマ種のような真菌、バシラス属の細菌（ＥＰ−Ａ−０１３４０４８及びＥＰ−０２５３４５５に記載されているような種）、ストレプトマイセス種及びシュードモナス種、及び、クリーベロミセス種（ＥＰ−Ａ−００９６４３０及びＥＰ−Ａ−０３０１６７０に記載されているような種）及びサッカロミセス種のような酵母である。例えば、典型的な発現宿主は、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニガー・バー・チュビケニス、アスペルギルス・ニガー・バー・アワモリ、アスペルギルス・アクレアチス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・オーブツァエ、トリコデルマ・リーセイ、枯草菌、バシラス・リシェニフォルミス、バシラス・アミロリクェファシエンス、クリーベロミセス・ラクティス及びサッカロミセス・セレビシエから選択され得る。
【０１５８】
酵母、真菌及び植物宿主細胞のような適切な宿主細胞を用いると、本発明の組換え発現産物に最適な生理活性を与えるのに必要とされるような翻訳後の修飾（例えば、ミリスチン酸化、糖鎖形成、切断（トランケーション）、不活性化（ラピデーション）及びチロシン、セリン又はトレオニンのリン酸化）が行われる可能性がある。
［生物体］
本発明に関連した「生物体」という用語は、本発明による組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれより得られる産物を含み得るあらゆる生物体を包含するものであって、プロモーターが生物体の中に存在するとき、本発明によるヌクレオチド配列を発現させる。生物体の例は真菌、酵母又は植物を含み得る。
【０１５９】
本発明に関連した「トランスジェニック生物体」という用語は、本発明によるタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれより得られる産物を含むあらゆる生物体を包含するものであって、プロモーターは生物体の内部で、本発明によるヌクレオチド配列を発現させる。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物体のゲノムの中に取り入れられている。
【０１６０】
「トランスジェニック生物体」という用語は、自然環境に存在している天然のヌクレオチドコード配列がやはり自然環境に存在している天然のプロモータのコントロール下にある場合は、本発明による天然のヌクレオチドコード配列を包含しない。さらに、本発明は、天然のタンパク質が自然環境に存在していて、やはり自然環境に存在している天然のヌクレオチドコード配列によって発現され、そのヌクレオチド配列がやはり自然環境に存在している天然のプロモータのコントロール下にある場合は、本発明による天然のタンパク質を包含しない。
【０１６１】
それ故、本発明のトランスジェニック生物体は、本発明によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、本発明による構築体（その組み合わせたものを含む）、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織又はその産物のうち１つ又はその組み合わせを含む生物体を包含する。形質転換された細胞又は生物体は、細胞又は生物体から容易に回収し得る妥当量の所望化合物を製造し得る。
［宿主細胞／宿主生物体の形質転換］
前述したように、宿主生物体は、原核又は真核生物である。適切な原核宿主の例は大腸菌及び枯草菌を含む。原核宿主の形質転換に関する教示は本技術分野において十分文書化されていて、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（「分子クローニング：実験マニュアル」第２版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版）及びＡｕｓｕｂｅｌ等の「分子生物学の最新プロトコール」（１９９５）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、が参考になる。
【０１６２】
原核宿主が使われるならば、ヌクレオチド配列は、イントロン除去のように、形質転換の前に適切に修飾される必要がある場合がある。
別の実施形態では、トランスジェニック生物体は酵母である。この点で、酵母も異種遺伝子発現の運搬体として広く利用されてきた。サッカロミセス・セレビシエ種は、異種遺伝子発現の用途を含めて、長いこと工業的に利用されている。サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子の発現は、Ｇｏｏｄｅｙ等（１９８７、「酵母のバイオテクノロジー」、Ｄ  Ｒ  Ｂｅｒｒｙ等編、４０１〜４２９頁、アレン・アンド・アンウィン社、ロンドン）及びＫｉｎｇ等（１９８９、「酵母の分子細胞生物学」Ｅ  Ｆ  Ｗａｌｔｏｎ及びＧ  Ｔ  Ｙａｒｒｏｎｔｏｎ編、１０７〜１３３頁、ブラッキィ社、グラスゴー）に概説されている。
【０１６３】
幾つかの理由で、サッカロミセス・セレビシエは異種遺伝子発現に好適である。第一に、人体に無害であり、ある種の内毒素を産生できないこと。第二に、種々の目的で数世紀にわたって産業的に利用され、長く安全に使用されていること。このために広く一般に受け入れられている。第三に、この生物体に注がれた広範な産業利用と研究によって、サッカロミセス・セレビシエの大量発酵特性だけでなくその遺伝学及び生理学に関する豊富な知識がもたらされたこと。
【０１６４】
サッカロミセス・セレビシエにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌に関する原理は、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙ（１９９３、「異種遺伝子発現の運搬体としての酵母」、「酵母」、第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ  ＨＲｏｓｅ及びＪ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、アカデミック・プレス社）に概説されている。
【０１６５】
統合的ベクターを含めて数タイプの酵母ベクターが実用化されているが、それを維持して自動的にプラスミド・ベクターを複製させるには宿主ゲノムとの組換えが必要とされる。
【０１６６】
トランスジェニック・サッカロミセスを製造するには、酵母で発現するように設計された構築体の中へ本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって、発現構築体を製造する。異種発現のために利用される幾つかのタイプの構築体が開発されてきた。構築体は、本発明のヌクレオチド配列に融合した、酵母で活性のあるプロモーターを含むが、通常は、ＧＡＬ１プロモーターのような酵母起源のプロモーターが使われる。通常は、ＳＵＣ２シグナル・ペプチドをコードする配列のような、酵母起源のシグナル配列が使われる。酵母で活性のあるターミネーターがこの発現系を終了させる。
【０１６７】
酵母の形質転換のために、幾つかの形質転換プロトコールが開発されてきた。例えば、本発明によるトランスジェニック・サッカロミセスは、Ｈｉｎｎｅｎ等（１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５，１９２９）、Ｂｅｇｇｓ，ＪＤ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）及びＩｔｏ，Ｈ等（１９８３，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３，１６３〜１６８）の教示によって製造し得る。
【０１６８】
形質転換された酵母細胞は種々の選択的マーカーを利用して選択される。形質転換のために利用されるマーカーには、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４及びＴＲＰ１のような多くの栄養要求性マーカー、及びアミノグリコシド耐性マーカー（例、Ｇ４１８）のような主要抗生物質耐性マーカーがある。
【０１６９】
他の宿主生物体は植物である。遺伝学的に修飾された植物を構築するときの基本原理は、植物ゲノムに遺伝情報を挿入し、挿入された遺伝物質の安定な維持体を得ることである。
【０１７０】
遺伝情報を挿入する幾つかの技術が存在するが、２つの基本原理は、遺伝情報を直接導入することと、ベクター系を利用して遺伝情報を導入することである。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５〜２２５）及びＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７〜２７）の論文にある。植物の形質転換に関する更なる教示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出せる。
【０１７１】
従って、本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで宿主細胞を形質転換する方法を提供する。
【０１７２】
ＰＤＥヌクレオチドコード配列で形質転換された宿主細胞は、コードされたタンパク質が発現し、細胞培養液から回収されるのに適した条件の下で培養され得る。組換え細胞によって製造されたタンパク質は分泌されるか又は使われた配列及び／又はベクターによっては細胞内に封じられる。当業者に理解されるように、ＰＤＥコード配列を含む発現ベクターは、特定の原核又は真核細胞の膜を介したＰＤＥコード配列の分泌を指示するシグナル配列を付けて設計され得る。組換え構築物のなかには、ポリペプチド・ドメインをコードしているヌクレオチド配列へＰＤＥコード配列をつなげて、可溶性タンパク質の精製を促進させ得るものもある（Ｋｒｏｌｌ  ＤＪ等（１９９３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２：４４１〜５３、また、融合タンパク質を含むベクターに関する先述の議論も参照のこと）。
［ポリペプチドの生産］
本発明によれば、本発明のポリペプチドの生産は、例えば、本発明の１つ又はそれ以上のポリヌクレオチドで形質転換された微生物の発現宿主の、従来の栄養源を含む発酵培養液における培養によって影響され得る。培養液の選択は発現宿主の選択及び／又は発現構築体の調節的要求物に基づいてよい。このような培養液は当業者にはよく知られている。培養液には、所望されるならば、他の汚染している可能性のある微生物よりも形質転換された発現宿主により好都合な成分を付加してよい。
【０１７３】
従って、本発明はまた、ＰＤＥ１１活性を有するポリペプチドを生産する方法であって、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで宿主細胞を形質転換する、ｂ）この形質転換された宿主細胞をこのポリペプチドの発現に適した条件で培養する、という工程を含む方法を提供する。
【０１７４】
本発明はまた、ＰＤＥ１１活性を有するポリペプチドを生産する方法、つまり、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで形質転換された宿主細胞をこのポリペプチドの発現に適した条件で培養する、ｂ）このポリペプチドを宿主細胞培養液から回収する、という工程を含む方法を提供する。
【０１７５】
本発明はまた、ＰＤＥ１１活性を有するポリペプチドを生産する方法、つまり、ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されたヌクレオチド配列又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメントで形質転換する、ｂ）形質転換された宿主細胞をこのポリペプチドの発現に適した条件で培養する、ｃ）このポリペプチドを宿主細胞培養液から回収する、という工程を含む方法を提供する。
［リボザイム］
リボザイムはＲＮＡの特異的開裂を触媒し得る、酵素のようなＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、リボザイム分子が相補的なターゲットＲＮＡと配列特異的にハイブリダイゼーションした後に、エンドヌクレアーゼのようにそれを開裂することを含む。本発明の範囲には、ＰＤＥのＲＮＡ配列をエンドヌクレアーゼのように開裂することを特異的かつ効率的に触媒する、設計されたハンマーヘッド・モチーフ（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｍｏｔｉｆ）のリボザイム分子が含まれる。
【０１７６】
ターゲットになる可能性があるＲＮＡの内部に存在するリボザイム特異的な開裂部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣという配列を含むリボザイム開裂部位に対してターゲット分子をスキャンすることによって、初めは同定される。いったん同定されれば、開裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に相当する１５〜２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が二次構造上の特徴を評価されるが、そのような二次構造があるとオリゴヌクレオチド配列が作用できないことがある。ターゲット候補の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを利用して相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのしやすさを試験することによっても評価され得る。
【０１７７】
アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子と本発明のリボザイムは、いずれもＲＮＡ分子の合成法として本技術分野で知られている方法によって製造し得る。これには、固相ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学合成法のような化学的にオリゴヌクレオチドを合成する技術が含まれる。また、ＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写によって産生し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを有する多様なベクターの中へ組み込むことが可能である。また、アンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築体は、構成的に又は誘導可能的に細胞系、細胞又は組織へ導入できる。
［検出］
ＰＤＥコード配列の存在は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．１８として示された配列のプローブ、部分又はフラグメントを用いたＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション又は増幅によって検出される。核酸増幅に基づいたアッセイでは、ＰＤＥコード配列に基づいたオリゴヌクレオチド又はオリゴマーを用いてＰＤＥのＤＮＡ又はＲＮＡを含む形質転換体を検出する。ここに用いる「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」とは、プローブ又はアンプリマーとして利用し得る、少なくとも約１０のヌクレオチドないし約６０のヌクレオチドであり、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５のヌクレオチドからなる核酸配列を指す。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ
ＩＤ  Ｎｏ．１８として示されるヌクレオチド配列の３'領域から由来する。
【０１７８】
タンパク質特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用いるような、ＰＤＥポリペプチドの発現を検出及び測定する様々なプロトコールが本技術分野で知られている。例えば、酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）法である。ＰＤＥポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた２部位のモノクローナル抗体に基づいたイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用され得る。こういったアッセイ及び他のアッセイについては、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒ等（１９９０、「血清学の方法、実験マニュアル」、ＡＰＳ出版、セントポール、ＭＮ）及びＭａｄｄｏｘ  ＤＥ等（１９８３、Ｊ  ＥＸＰ  Ｍｅｄ  １５  ８：１２１  １）に詳しい。
【０１７９】
多種多様な標識物及び結合技術が当業者に知られていて、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに利用し得る。ＰＤＥポリヌクレオチド配列を同定するための標識ハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブを製造する手段は、オリゴラベリング、ニックトランスレーション、エンドラベリング又は標識ヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅を含む。また、ＰＤＥコード配列又はその任意の部分は、ｍＲＮＡプローブの生産用としてベクターへ組み込んでクローン化し得る。このようなベクターは本技術分野で知られていて市販されており、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識ヌクレオチドの付加によるインビトロのＲＮＡプローブ合成に利用できる。
【０１８０】
ファルマシア・バイオテク（ピスカタウェイ、ＮＪ）、プロメガ（マジソン、ＷＩ）及びＵＳバイオケミカル・コープ（クリーブランド、ＯＨ）のような多くの企業が上記手法用のキット製品及びプロトコールを供給している。適切なレポーター分子又はラベルは、基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子等だけでなく、放射活性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は色素産生剤を含む。このようなラベルの用途を教示している特許に、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１がある。また、組換え免疫グロブリンは、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されているように生産できる。
【０１８１】
特定分子の発現を定量化する別の方法は、ヌクレオチドの放射標識（Ｍｅｌｂｙ  ＰＣ等  １９９３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：２３５〜４４）又はビオチニル化（Ｄｕｐｌａａ  Ｃ等  １９９３  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９〜３６）、コントロール核酸の共増幅及び実験結果が内挿される標準曲線を含む。多数の標本の定量化は、対象となるオリゴマーが様々な希釈溶液の中にあるＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを実行すればスピード・アップできるし、分光測光又は熱量測定反応を利用すれば、迅速に定量される。
【０１８２】
マーカー遺伝子の発現の有無は対象となる遺伝子の存在を示唆するが、その存在及び発現は確証されるべきである。例えば、もしＰＤＥコード配列がマーカー遺伝子配列中に挿入された場合、ＰＤＥコード領域を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落によって同定される。また、マーカー遺伝子を単一プロモーターのコントロール下でＰＤＥコード配列と並んで配置することもできる。誘導又は選択に反応したマーカー遺伝子の発現は、通常はＰＤＥの発現も示している。
【０１８３】
また、ＰＤＥコード配列を含みＰＤＥコード領域を発現する宿主細胞は、当業者の知る様々な手法によって同定され得る。この手法には、核酸又はタンパク質の検出及び／又は定量のための膜、溶液又はチップを利用した技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイ技術があるが、それに限定されるものではない。
［抗体］
本発明のアミノ酸配列はまた、標準技術の利用等により、アミノ酸配列に対する抗体を生産するために利用し得る。
【０１８４】
この技術分野でよく知られている手法はＰＤＥ１１ポリペプチドに対する抗体の製造に利用し得る。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリーによって生産されたフラグメントを含むが、それに限定されるものではない。中和抗体、即ちＰＤＥポリペプチドの生理活性を阻害する抗体は、診断薬及び治療薬に特に向いている。
【０１８５】
抗体の製造のためにはヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む様々な宿主が、阻害剤又はその一部分、変異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又は免疫原性を保持するオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。
【０１８６】
宿主に依存して、様々なアジュバントが免疫反応を高めるために利用され得る。このようなアジュバントには、フロイント、水酸化アルミニウムのような無機ゲル及びリゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、アオガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン及びジニトロフェノールのような界面活性剤があるが、それに限定されるものではない。ＢＣＧ（カルメット−ゲラニンの桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴムは潜在的に有用なヒトアジュバントとして利用され得る。
アミノ酸配列に対するモノクローナル抗体は、継代培養細胞系による抗体分子の製造に供される技術を用いても製造され得る。これには、初めＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）によって記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ等（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅ等（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６〜２０３０）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等（１９８５）「モノクローナル抗体と癌治療」、アラン・アール・リス社、７７〜９６頁）があるが、それに限定されるものではない。また、「キメラ抗体」製造のために開発された技術、つまり、ヒト抗体遺伝子へマウス抗体遺伝子を接合し、適切な抗原特異性と生理活性を持った分子を得る技術も利用し得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａ等（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）。また、単鎖抗体の製造のために記載されている技術（ＵＳ−Ａ−４９４６７７９）を採用して阻害剤特異的な単鎖抗体を製造し得る。
【０１８７】
抗体はまた、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導すること又は、Ｏｒｌａｎｄｉ等（１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３８３３〜３８３７）及びＷｉｎｔｅｒ  Ｇ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９）に開示されたように、特異性の高い結合反応物の組換え免疫グロブリンのライブラリー又はパネル（ｐａｎｅｌ）をスクリーニングすることによって製造され得る。
【０１８８】
ＰＤＥ１１の特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも製造し得る。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって製造され得るＦ（ａｂ'）2フラグメント及びＦ（ａｂ'）2フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって生じるＦａｂフラグメントがあるが、それに限定されるものではない。また、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ簡便に同定できるように構築され得る（Ｈｕｓｅ  ＷＤ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５〜１２８１）。
【０１８９】
ＰＤＥ１１の特異抗体はＰＤＥ１１ポリペプチドの発現に関連した病態及び疾患の診断に有用である。確立された特異性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた競合結合又は免疫放射測定アッセイの種々のプロトコールが本技術分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは通常ＰＤＥ１１ポリペプチドとその特異抗体（又は類似のＰＤＥ１１結合性分子）との複合体形成及び複合体形成の測定を含む。特異的なＰＤＥ１１タンパク質上の２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた２部位のモノクローナル抗体に基づいたイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用され得る。このようなアッセイについては、Ｍａｄｄｏｘ  ＤＥ等（１９８３、Ｊ  ＥＸＰ  Ｍｅｄ  １５８：１２１１）に記載されている。
【０１９０】
抗ＰＤＥ１１抗体は炎症、造血細胞の異常増殖による病態及びＨＩＶ感染又はＰＤＥ１１の異常発現に特徴づけられる他の障害又は疾患の診断に有用である。ＰＤＥ１１の診断アッセイは、ヒト体液、細胞、組織又は組織の切片又は抽出物に存在するＰＤＥ１１ポリペプチドを検出するために抗体及びラベルを利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して又は修飾せずに使用し得る。しばしば、ポリペプチド及び抗体は、レポーター分子と共に、共有結合的又は非共有結合的につなげることによって標識される。様々なレポーター分子が当業者に知られている。
［アッセイ／同定法］
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異体のＤＮＡ配列から決定されるような、ＰＤＥ１１特異的な一対のポリメラーゼ連鎖反応プライマーを用いて、そのような細胞由来の（全ＲＮＡのような）ＲＮＡに対し逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を実施すること、及び（ｂ）適切なサイズのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの出現をアガロースゲル電気泳動のような方法で検出することを含む、（ヒト細胞のような）細胞におけるＰＤＥ１１の存在を検出するアッセイ法に関わる。
【０１９１】
本発明はまた、ＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）影響を与える（化合物、他の物質又はそれを含む組成物のような）薬剤を同定する方法、つまりＰＤＥ１１又はそれをコードするヌクレオチド配列を薬剤に接触させた後にＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を測定する方法に関する。
【０１９２】
本発明はまた、ＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）選択的に影響を与える（化合物、他の物質又はそれを含む組成物のような）薬剤を同定する方法、つまりＰＤＥ１１又はそれをコードするヌクレオチド配列を薬剤に接触させた後にＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を測定する方法に関する。
【０１９３】
本発明はまた、ＰＤＥ１１Ａ１又はＰＤＥ１１Ａ２又はＰＤＥ１１Ａ３又はＰＤＥ１１Ａ４の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）選択的に影響を与える（化合物、他の物質又はその組成物のような）薬剤を同定する方法、つまり関連するＰＤＥ１１又はそれをコードするヌクレオチド配列を薬剤に接触させた後に関連するＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を測定する方法に関する。
【０１９４】
本発明はまた、ＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）影響を与える（化合物、他の物質又はそれを含む組成物のような）薬剤を同定する方法、つまりＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を薬剤の存在下又は薬剤の添加後に、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異体のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡが取り込まれた細胞系、又は（ｂ）ＰＤＥ１１を自然にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞系、において測定する方法に関する。好ましくは、ＰＤＥ１１の活性は上記のアッセイ法によって決定される。
【０１９５】
本発明はまた、ＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）選択的に影響を与える（化合物、他の物質又はそれを含む組成物のような）薬剤を同定する方法、つまりＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を薬剤の存在下又は薬剤の添加後に、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異体のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡが取り込まれた細胞系、又は（ｂ）ＰＤＥ１１を自然にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞系、において測定する方法に関する。好ましくは、ＰＤＥ１１の活性は上記のアッセイ法によって決定される。
【０１９６】
本発明はまた、ＰＤＥ１１Ａ１又はＰＤＥ１１Ａ２又はＰＤＥ１１Ａ３又はＰＤＥ１１Ａ４の活性及び／又はその発現に（阻害する又はそれ以外のやり方で修飾するように）選択的に影響を与える（化合物、他の物質又はそれを含む組成物のような）薬剤を同定する方法、つまりそれぞれのＰＤＥ１１の活性及び／又はその発現を薬剤の存在下又は薬剤の添加後に、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異体のそれぞれのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡが取り込まれた細胞系、又は（ｂ）それぞれのＰＤＥ１１を自然にかつ選択的に発現する細胞集団又は細胞系、において測定する方法に関する。好ましくは、ＰＤＥ１１の活性は上記のアッセイ法によって決定される。
【０１９７】
本発明はまたＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）の活性又はそれをコードするヌクレオチド配列（その誘導体、相同体、変異体又はフラグメントを含む）の発現をモジュレートする（好ましくは、特異的モジュレーション）薬剤をスクリーニングする方法、つまり、ａ）候補薬剤を用意すること、ｂ）ＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）を適切な条件下でのモジュレーションを可能にするのに十分な時間候補薬剤と結合させること、及びｃ）候補薬剤のＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）へのモジュレーションを検出し、候補薬剤がＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）の活性又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）の発現をモジュレートするか確かめること、という工程を含む方法を提供する。
【０１９８】
本発明はまたＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（その誘導体、相同体、変異体又はフラグメントを含む）に対して特異的な結合親和性を有する薬剤をスクリーニングする方法、つまり、ａ）候補薬剤を用意すること、ｂ）ＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）を適切な条件下での結合を可能にするのに十分な時間候補薬剤と結合させること、及びｃ）候補薬剤のＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）への結合を検出し、候補薬剤がＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）の活性又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）と結合するか確かめること、という工程を含む方法を提供する。
【０１９９】
本発明はまたＰＤＥ１１をモジュレートする能力がある薬剤を同定する方法、つまり、ａ）ＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）と薬剤を接触させること、ｂ）この工程ａ）の混合物をサイクリックヌクレオチドの加水分解に適した条件下でサイクリックヌクレオチドと共にインキュベーションすること、ｃ）加水分解したサイクリックヌクレオチドの量を測定すること、及びｄ）この工程ｃ）の加水分解したサイクリックヌクレオチドの量を、ＰＤＥ１１（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）又はそれをコードするヌクレオチド配列（又はその誘導体、相同体、変異体又はフラグメント）をその薬剤非存在下でインキュベーションして得られた加水分解したサイクリックヌクレオチドの量と比較することによって、この薬剤がサイクリックヌクレオチドの加水分解に影響を与える（例えば、刺激する又は阻害する）かどうかを決定すること、という工程を含む方法を提供する。
【０２００】
従って、本発明のある実施形態では、ＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体及び／又はＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を発現する細胞系は、ホスホジエステラーゼ活性又はその発現のモジュレーターとして作用する抗体、ペプチド又は有機又は無機分子のような他の薬剤をスクリーニングすることで、サイクリックヌクレオチドのレベルをモジュレートする能力がある治療薬を同定するために利用され得る。例えば、ＰＤＥ１１の活性を中和する能力がある抗ＰＤＥ１１抗体は、ＰＤＥ１１によるサイクリックヌクレオチドの加水分解を阻害することを介してそのレベルを高めることに利用され得る。また、組換え体で発現されたＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又は細胞系で発現されたＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を用いて、コンビナトリアル・ケミストリーによって合成されたペプチド・ライブラリー又は有機物ライブラリーをスクリーニングすることは、ＰＤＥ１１によるサイクリックヌクレオチドの加水分解をモジュレートすることによって機能する治療薬の同定に有用であろう。合成化合物、天然産物及び他の潜在的に生理活性がある物質は、当業者にはごく普通と考えられている多くのやり方でスクリーニングされ得る。例えば、ＰＤＥ１１のＮ末端をコードしているヌクレオチド配列は、ＰＤＥ１１活性のアロステリックモジュレーター（作動薬又は拮抗剤）のスクリーニングに利用し得る細胞系において発現され得る。また、ＰＤＥ１１の保存された触媒ドメインをコードしているヌクレオチド配列は、細胞系において発現され、サイクリックヌクレオチドの加水分解を阻害する薬剤のスクリーニングに利用され得る。
【０２０１】
被験薬がＰＤＥ１１活性又はサイクリックヌクレオチドの加水分解に干渉する能力があるかどうかは、（Ｓｍｉｔｈ等、１９９３  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４１：１８９−２１８に開示されているように）ＰＤＥ１１のレベル又はサイクリックヌクレオチドのレベルを測定することによって決定される。また、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ測定用イムノアッセイキットも市販されている（例えば、アマシャム・インターナショナル社、アーリントンハイツ、ＩＬ及びデュポン社、ボストン、ＭＡ）。ＰＤＥ１１の活性はまたこの目的のために開発された従来技術を利用して、他のタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化のような他の反応を測定することでモニターされ得る。
【０２０２】
従って、  本発明は、ＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体のサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性をモジュレートする能力がある化合物を同定する方法、つまり、ａ）ＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体と化合物を接触させること、ｂ）工程ａ）の混合物をサイクリックヌクレオチドの加水分解に適した条件下でサイクリックヌクレオチドと共にインキュベーションすること、ｃ）加水分解したサイクリックヌクレオチドの量を測定すること、及びｄ）工程ｃ）の加水分解したサイクリックヌクレオチドの量を、ＰＤＥ１１又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体をその化合物非存在下でインキュベーションして得られた加水分解したサイクリックヌクレオチドの量と比較することによって、この化合物がサイクリックヌクレオチドの加水分解を刺激する又は阻害するかを決定すること、という工程を含む方法を提供する。本方法の一実施形態では、フラグメントはＰＤＥ１１のＮ末端領域由来であり、ＰＤＥ１１のアロステリックモジュレーターを同定する方法を提供する。本発明の別の実施形態では、フラグメントはＰＤＥ１１のカルボキシル末端領域由来であり、サイクリックヌクレオチド加水分解の阻害剤を同定する方法を提供する。
【０２０３】
ＰＤＥ１１ポリペプチド、その免疫原性フラグメント又はそのオリゴペプチドは様々な医薬スクリーニング技術のいずれにおいても治療用化合物をスクリーニングするために利用され得る。このような試験において使用されるポリペプチドは溶液状態、固体支持体に固定された状態、細胞表面に埋め込まれた状態又は細胞内に局在化した状態にあってよい。活性の消失又はＰＤＥ１１ポリペプチドと被験薬剤との結合複合体の形成が測定され得る。
【０２０４】
それ故、本発明は、ＰＤＥ１１又はその発現又はその一部分又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体のモジュレーション（好ましくは、特異的な結合親和性のような、特異的モジュレーション）に対して１つ又は複数の化合物をスクリーニングする方法、つまり、１つ又は複数の化合物を用意すること、ＰＤＥ１１又はそれをコードするヌクレオチド配列又はその一部分又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体を、適切な条件下でのモジュレーションを可能にするのに十分な時間、１つ又は複数の化合物の各々と結合させること、及びＰＤＥ１１又はその一部分又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体と複数の化合物の各々との結合を検出することを介して、ＰＤＥ１１又はそれをコードするヌクレオチド配列をモジュレートする１つ又は複数の化合物を同定する、という工程を含む方法を提供する。このようなアッセイでは、複数の化合物は当業者に知られたコンビナトリアル・ケミストリー技術によって製造され得る。
【０２０５】
医薬スクリーニングの他の技術は、ＰＤＥ１１ポリペプチドに対して適度な結合親和性を有する化合物をハイスループット・スクリーニングする方法であり、１９８４年９月１３日に公表されたＧｅｙｓｅｎのヨーロッパ特許出願８４／０３５６４に詳細に記載された方法に基づいている。要約すると、大量の様々な小さなペプチド被験化合物がプラスチックピンのような固体基質又は他の何らかの表面の上で合成される。ペプチド被験化合物はＰＤＥ１１フラグメントと反応させた後洗浄される。その後、本技術分野で良く知られている方法を適切に用いる等して、結合したＰＤＥ１１が検出される。精製されたＰＤＥ１１はまた上記の医薬スクリーニング技術に使用するために直接プレート上でコーティングされ得る。また、ペプチドを捕捉しそれを固体支持体に固定化させるために非中和抗体が利用される。
【０２０６】
本発明はまた、ＰＤＥ１１と結合し得る中和抗体がＰＤＥ１１との結合に対して被験化合物と特異的に競合する、競合的医薬スクリーニングアッセイの用途について考察している。このように、この抗体は、ＰＤＥ１１と１つ又はそれ以上の抗原決定基を共有するペプチドの存在を検出するために利用し得る。
［薬剤］
本発明はまた本発明のアッセイ法及び同定法によって同定される１つ又はそれ以上の薬剤を提供する。
【０２０７】
本発明の薬剤は、例えば、有機化合物又は無機化合物である。この薬剤は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ
Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８として示される配列の全て又は部分に対してアンチセンスなヌクレオチド配列で有り得る。
【０２０８】
本発明はさらに、本発明の薬剤（又は製剤的に許容されるその塩、又は製剤的に許容されるその溶媒和物）又は上記のいずれをも含む医薬組成物を、医薬品としての用途のために、提供する。
【０２０９】
本発明はまた、脳層に存在するＰＤＥ１１活性に影響を与える（阻害する、モジュレートする、拮抗する、等）薬剤の用途を提供する。
［診断薬］
本発明はまたＰＤＥ１１ポリヌクレオチド配列検出用の診断組成物を提供する。診断組成物は、ポリヌクレオチド、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体、又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６又はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８又はその対立遺伝子変異とハイブリダイズし得る配列を含んでよい。
【０２１０】
疾患の診断を基礎づけるには、ＰＤＥ１１ポリペプチド発現の正常値又は標準値が確立されなければならない。このことは、動物又はヒトの正常披検者から採取した体液又は細胞抽出物を、本技術分野でよく知られている複合体形成に適した条件の下で、ＰＤＥ１１ポリペプチドの抗体と結合させることによって達成される。標準的な複合体形成の量は、既知量の抗体が既知濃度の精製ＰＤＥ１１ポリペプチドと結合する陽性対象の希釈系列に対してそれを比較すれば定量化され得る。その後、正常サンプルより得られた標準値は、ＰＤＥ１１ポリペプチド発現に関連した障害又は疾患に罹患している可能性がある患者より採取した標本より得られる値と比較される。標準値と披検者の値のズレから疾患状態の存在が確かめられる。
【０２１１】
ＰＤＥ１１ポリペプチド又はその任意の部分は診断薬及び／又は治療化合物の基礎を提供する。診断目的で、ＰＤＥ１１ポリヌクレオチド配列は、ＰＤＥ１１活性が影響を与える可能性がある、男性の勃起不全のような病態、障害又は疾患における遺伝子発現を検出及び定量化するために利用し得る。
【０２１２】
ＰＤＥ１１をコードするポリヌクレオチド配列はＰＤＥ１１の発現より生じる疾患の診断に利用し得る。例えば、ＰＤＥ１１をコードするポリヌクレオチド配列は、ＰＤＥ１１発現における異常を検出する目的で、生検又は剖検に由来する組織又は血清、骨液又は腫瘍生検のような生物体液のハイブリダイゼーション又はＰＣＲアッセイに利用し得る。このような定性的又は定量的方法には、サザン又はノーザン分析、ドット・ブロットのような膜利用技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック、ピン又はチップ技術及びＥＬＩＳＡ等の多標本形式技術がある。これらの技術はすべて本技術分野でよく知られていて、事実、多くの市販診断キット製品の基礎になっている。
【０２１３】
このようなアッセイは特定の治療用薬剤の有効性を評価するように調整可能であり、動物研究、臨床試験又は各患者の治療モニタリングに利用され得る。疾患の診断を基礎づけるには、ＰＤＥ発現の正常又は標準プロフィールが確立されなければならない。このことは、動物又はヒトの正常披検者から採取した体液又は細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション又は増幅に適した条件の下で、ＰＤＥ１１又はその一部分と結合させることによって達成される。標準的なハイブリダイゼーションは、正常披検者から得られた数値を、既知量の精製ＰＤＥ１１を用いた同一の実験において実施された陽性対照の希釈系列と比較することによって定量化され得る。正常サンプルより得られた標準値は、ＰＤＥのコード配列の発現に関連した障害又は疾患に罹患している可能性がある患者より採取した標本より得られる値と比較される。標準値と披検者の値のズレから疾患状態の存在が確かめられる。疾患が確認されれば、既存の治療薬が投与され、治療プロフィール又は数値が得られる。最終的に、このアッセイは定期的に繰り返され、その数値が進行するか正常又は標準パターンに戻るかどうかが評価される。継続的な治療プロフィールは、数日又は数ヶ月に及ぶ治療の有効性を示すことに利用できる。
【０２１４】
従って、本発明は、例えば病態におけるＰＤＥ１１のレベルを検出及び定量化して診断に利用し得る抗ＰＤＥ１１抗体を製造するための、ＰＤＥ１１ポリペプチド又はその変異体、相同体、フラグメント又は誘導体の用途に関する。
【０２１５】
本発明はさらに細胞及び組織中のＰＤＥ１１を検出するための、陽性対照として使用される精製ＰＤＥ１１及び抗ＰＤＥ１１抗体を含む、診断アッセイ及びキットを提供する。このような抗体は、ＰＤＥ１１タンパク質の発現、その欠失又は変異体、相同体、フラグメント又は誘導体の発現に関連した疾患又は病態を検出するための、溶液、膜又は組織に基づいた技術に利用され得る。
［プローブ］
本発明の別の態様は、ゲノム配列、ＰＤＥコード領域又は対立遺伝子のような緊密に関連した分子を含むポリヌクレオチド配列を検出し得る核酸ハイブリダイゼーション又はＰＣＲプローブの提供である。プローブの特異性（即ち、それが高度に保存された、保存された又は保存されていない領域又はドメインのいずれから由来しているかということ）及びハイブリダイゼーション又は増幅のストリンジェンシィ（高位、中位、低位）によって、プローブが天然に存在しているＰＤＥコード配列又は関連した配列だけを同定するかどうかが決定される。関連した核酸配列を検出するプローブは、３'領域のような、サイクリックヌクレオチドＰＤＥファミリーメンバーの保存された又は高度に保存されたヌクレオチド領域から選択され、そのようなプローブは縮重プローブのプールで使用され得る。同一の核酸配列を検出する場合又は最大の特異性が所望される場合、核酸プローブはＰＤＥポリヌクレオチドの非保存的なヌクレオチド領域又はユニーク領域から選択される。ここに用いられている「非保存的なヌクレオチド領域」という用語は、ここに開示されたＰＤＥコード配列特有のヌクレオチド領域を指し、既知のサイクリックヌクレオチドＰＤＥのような関連ファミリーメンバーには出現しない。
【０２１６】
ＵＳ−Ａ−４，６８３，１９５、ＵＳ−Ａ−４，８００，１９５及びＵＳ−Ａ−４，９６５，１８８に記載されているＰＣＲは、ＰＤＥ１１配列に基づいたオリゴヌクレオチドの別の用途を提供する。一般に、このようなオリゴマーは化学的に合成されるが、酵素によって生産されたり、組換え体から製造される場合もある。オリゴマーは一般に、センス配位（５'−＞３'）及びアンチセンス配位（３'＜−５'）という２つのヌクレオチド配列を含み、最適な条件下で、特異的な遺伝子又は病態を同定するために利用される。同じ２つのオリゴマー、入れ子状オリゴマー又は縮重オリゴマーのプールは、よりストリンジェンシィが緩い条件下で、緊密に関連したＤＮＡ又はＲＮＡの配列を検出及び／又は定量化するために利用し得る。
【０２１７】
ＰＤＥ１１の核酸配列はまた、内因性ゲノム配列のマッピングのために、前述したようなハイブリダイゼーション・プローブを生産するのに利用し得る。その配列は、既知の技術を利用して、ある特定の染色体又は染色体の特異領域に対してマップされ得る。この技術は、染色糸へのインシトゥ（生体内）ハイブリダイゼーション（Ｖｅｒｍａ等（１９８８）「ヒト染色体：基本技術マニュアル」、ペルガモン・プレス、ニューヨーク市）、流れソート式（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）の染色体調製又は、ＹＡＣ、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性ＰＩ構築体又は単鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーのような人工染色体の構築を含む。
【０２１８】
染色体調製物のインシトゥ・ハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカーを利用した連鎖分析のような物理的マッピング技術は、遺伝子地図を拡張する上で極めて有用である。遺伝子地図の例はＳｃｉｅｎｃｅ（１９９５；２７０：４１０ｆ及び１９９４；２６５：１９８１ｆ）に見出せる。しばしば、ある遺伝子を別の哺乳類種の染色体に配置すると、たとえ特定のヒト染色体の番号や腕についてわかっていなくても、関連するマーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新しい配列が染色体の腕又はその部分に位置づけられる。このことは位置クローニング又は他の遺伝子発見技術を利用して疾患遺伝子を捜している研究者にとって貴重な情報を提供する。毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患又は症候群が、例えばＡＴが１１ｑ２２−２３に位置づけられたように（Ｇａｔｔｉ等（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：５７７〜５８０）、遺伝子連鎖によって特定のゲノム領域におおまかに位置づけられると、その領域付近の配列マッピングは更なる研究対象となる関連又は調節遺伝子を表わす可能性がある。本発明のヌクレオチド配列はまた、転座、逆位等による染色体の座における、正常人、キャリアー、罹患者間の違いを検出するのに利用し得る。
医薬品
また、本発明は、ＰＤＥ１１の活性のために同様のものを必要とする個人を治療するための医薬組成物をも提供し、該組成物は治療上有効な量の、該活性に影響を及ぼす（例えば、阻害する）薬剤（ａｇｅｎｔ）及び薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を含む。
【０２１９】
したがって、本発明は、本発明の薬剤（本発明のヌクレオチド配列の発現パターン又はそれらの発現産生物の活性を調節することが可能な薬剤及び／又は本発明による検定によって同定される薬剤）を含む医薬組成物も包含する。これに関して、特にヒトの治療に関して、本発明の薬剤は単独で投与することもできるが、一般には、意図する投与経路及び標準的な医薬実務に関して選択された医薬担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与される。
【０２２０】
例として、本発明の医薬組成物においては、本発明の薬剤を適切な結合剤（１種もしくは複数）、滑沢剤（１種もしくは複数）、懸濁剤（１種もしくは複数）、コーティング剤（１種もしくは複数）、又は可溶化剤（１種もしくは複数）と混合することができる。
【０２２１】
一般には、本発明の薬剤の治療上有効な一日経口もしくは静脈内用量は、０．０１ないし５０ｍｇ／治療しようとする被験者の体重ｋｇ、好ましくは０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲と考えられる。また、本発明の薬剤は静脈内注入により、０．００１−１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲と考えられる用量で投与することもできる。
【０２２２】
これらの薬剤の錠剤及びカプセルは、適宜１つずつ又は一度に２つ以上を投与することができる。また、本発明の薬剤を徐放性製剤として投与することも可能である。
本発明は、よって、ＰＤＥ１１の活性のために同様のものを必要とする個人を治療するための方法であって、該個人に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを包む前記方法も提供する。
【０２２３】
典型的には、医師が個々の患者に最も適切な実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重及び応答に従って変化する。上述の投与量は平均的な事例の典型的な例である。もちろん、より低い、もしくはより高い投与量範囲に利点がある個々の事例が存在する可能性があり、そのようなものも本発明の範囲内にある。
【０２２４】
適切であるならば、この医薬組成物は吸入により、座剤もしくは膣座薬の形態で、ローション、溶剤、クリーム、軟膏剤もしくは粉剤の形態で局所的に、皮膚パッチの使用により、デンプンもしくは乳糖のような賦形剤を含む錠剤の形態、又は単独の、もしくは賦形剤と混合したカプセル剤もしくは膣坐剤（ｏｖｕｌｅ）の形態、又は香味料もしくは着色料を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形態で経口により投与することができ、あるいは非経口的に、例えば、空洞内、静脈内、筋肉内もしくは皮下に注射することができる。非経口投与に対しては、これらの組成物は無菌の水溶液の形態で最良に用いることができ、これは他の物質、例えば、その溶液を血液と等張にするのに十分な塩もしくは単糖を含んでいてもよい。頬もしくは舌下投与に対してはこれらの組成物を錠剤もしくはトローチ剤の形態で投与することができ、これらは慣用された方式で処方することができる。
【０２２５】
幾つかの適応については、好ましくは、これらの組成物はデンプンもしくは乳糖のような賦形剤を含む錠剤の形態で、又は単独の、もしくは賦形剤と混合したカプセル剤もしくは膣坐剤の形態で、又は香味料もしくは着色料を含むエリキシル、溶液もしくは懸濁液の形態で経口投与する。
【０２２６】
非経口投与に対しては、これらの組成物は無菌の水溶液の形態で最良に用いられ、これは他の物質、例えば、その溶液を血液と等張とするのに十分な塩もしくは単糖を含んでいてもよい。
【０２２７】
頬もしくは舌下投与に対しては、これらの組成物は錠剤もしくはトローチ剤の形態で投与することができ、これらは慣用ざれた方式で処方することができる。
被験者（例えば、患者）への経口、非経口、頬及び舌下投与については、本発明の薬剤の一日投与量は典型的には１０ないし５００ｍｇ（一回もしくは分割用量で）であり得る。したがって、そして例として、錠剤又はカプセルは、適宜１個ずつの又は一度に２個以上の投与に対して、５ないし１００ｍｇの活性薬剤を含むことができる。上に示されるように、医師が個々の患者に最も適切である実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重及び応答に応じて変化する。上述の投与量は平均的な事例の典型的な例であるが、もちろん、より高い、もしくはより低い投与量範囲に利点がある個々の事例が存在する可能性もあり、そのような用量範囲も本発明の範囲内にある。
【０２２８】
一般に、ヒトにおいては、本発明の薬剤の経口投与が好ましい経路であり、これは最も好都合で、かつ、例えば男性の勃起不全（ＭＥＤ）において、空洞内（ｉ．ｃ．）投与に関与する公知の不利益を回避する。典型的な男性に対する、ＭＥＤにおける好ましい経口投与措置は、必要なときに２５ないし１００ｍｇの薬剤を投与するものである。レシピエントが嚥下障害を患い、又は経口投与後の薬物吸収の障害を患う状況においては、この薬物を非経口的に、例えば、舌下又は頬から投与することができる。
【０２２９】
獣医学的な使用に対しては、本発明の薬剤は、典型的には、通常の獣医学的実務に従って適切に受け入れられる製剤として投与され、獣医が特定の動物に最も適切である投与措置及び投与経路を決定する。しかしながら、ヒトの治療と同様に、獣医学的治療のためにこの薬剤を単独で投与することも可能である。
【０２３０】
典型的には、医薬組成物−これはヒト又は動物に使用するためのものであり得る−は、薬学的に許容し得る希釈剤、担体、賦形剤又は補助剤のいずれか１種類以上を含む。医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路又は標準的な医薬実務に関して選択することができる。上に示されるように、この医薬組成物は、担体、賦形剤もしくは希釈剤として、又はそれらに加えて、適切な結合剤（１種もしくは複数）、滑沢剤（１種もしくは複数）、懸濁剤（１種もしくは複数）、コーティング剤（１種もしくは複数）、可溶化剤（１種もしくは複数）を含むことができる。
【０２３１】
本発明の幾つかの態様において、この医薬組成物は下記のものの１つ以上を含む：本発明の検定によってスクリーニングされている薬剤；配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４もしくは配列番号１４もしくは配列番号１５もしくは配列番号１６もしくは配列番号１７もしくは配列番号１８もしくは配列番号１９又はそれらの誘導体、断片、相同体もしくは変異体のいずれか１つ以上と反応することが可能な薬剤、あるいは配列番号１もしくは配列番号３もしくは配列番号１４もしくは配列番号１６もしくは配列番号１８とハイブリダイズすることが可能な配列。
【０２３２】
ＰＤＥ１１  ｍＲＮＡを不安定化し、又はＰＤＥ１１の翻訳を阻害するように作用するオリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子並びにリボザイムが本発明の範囲内に含まれる。このようなヌクレオチド配列は、環状ヌクレオチドの濃度を高めることが好ましい状態、例えば炎症、において用いることができる。
【０２３３】
ＰＤＥ１１アンチセンス分子は、例えばＰＤＥ１１の活性の増加に関連する様々な異常な状態、例えば男性の勃起不全、の治療の基礎を提供し得る。
ＰＤＥ１１核酸アンチセンス分子は、環状ヌクレオチドの濃度を上昇させることが好ましい状況において、ＰＤＥ１１の活性を遮断するのに用いることができる。
【０２３４】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクチニアウイルス、又は様々な細菌プラスミドから誘導される発現ベクターを、組換えＰＤＥ１１センスもしくはアンチセンス分子を標的とされる細胞集団に送達するために用いることができる。ＰＤＥ１１を有する組換えベクターを構築するには当業者に公知の方法を用いることができる。あるいは、組換えＰＤＥ１１は、リポソームに封入して標的細胞に送達することができる。
【０２３５】
完全長のｃＤＮＡ配列及び／又はその調節要素は、研究者が遺伝子の機能のセンス（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ  Ｈ及びＨＦ  Ｌｏｄｉｓｈ  １９９３  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３：９８−１０４）又はアンチセンス（Ｅｇｕｃｈｉら  （１９９１）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６０：６３１−６５２）研究のツールとしてＰＤＥ１１を用いることを可能にする。ゲノムＤＮＡから得られたｃＤＮＡ又は制御配列から設計されたオリゴヌクレオチドを、イン・ビトロ又はイン・ビボにおいて、発現の阻止に用いることができる。このような技術は現在当該技術分野において公知であり、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大きい断片をコーディング又は制御領域に沿って様々な位置から設計することができる。長さが２０ヌクレオチドであり得る適切なオリゴヌクレオチドを、ヒトライブラリーからＰＤＥ１１配列又は密接に関連する分子を単離するのに用いることができる。
【０２３６】
加えて、ＰＤＥ１１の発現は、細胞又は組織に、ホスホジエステラーゼの活性を遮断し、それにより環状ヌクレオチド濃度を高めることが好ましい状態において高濃度のＰＤＥ１１断片を発現する発現ベクターを形質移入することにより調節することができる。このような構築体は細胞を翻訳できないセンスもしくはアンチセンス配列であふれさせることができる。ＤＮＡへの組み込みが存在しない状態であっても、このようなベクターは、そのベクターの全てのコピーが内在性ヌクレアーゼによって無能化されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。このような一過性の発現は、非複製ベクターで１ヶ月もしくはそれ以上、そして適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合はそれよりも長く持続し得る。
【０２３７】
ＰＤＥ遺伝子の制御領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、及びイントロンに対するアンチセンス配列を設計することにより、遺伝子の発現を変更させることができる。
転写開始部位、例えば、リーダー配列の−１０ないし＋１０領域から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、転写物がリボソームに結合するのを妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することもできる。同様に、“三重らせん”塩基対形成としても知られるホジブーム塩基対形成法（Ｈｏｇｅｂｏｏｍ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子の結合に十分な程度に開く二重らせんの能力を危ういものにする。
【０２３８】
本発明は、よって、本発明の薬剤（又はそれらの薬学的に許容し得る塩、又はそれらの薬学的に許容し得る溶媒和物）を薬学的に許容し得る希釈剤、賦形剤又は担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【０２３９】
この医薬組成物は獣医学的に（すなわち、動物に）用いるもの、又はヒトに用いるものであり得る。
したがって、本発明は、有効量のＰＤＥ１１タンパク質の阻害剤又はアンタゴニスト（アンチセンス核酸配列を含む）を薬学的に許容し得る希釈剤、担体、賦形剤又は補助剤（それらの組み合わせを含む）と混合された状態で含む医薬組成物にも関する。
【０２４０】
本発明は、ＰＤＥ１１ポリヌクレオチド配列、ＰＤＥ１１アンチセンス分子、ＰＤＥ１１ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又はＰＤＥ１１生理活性の有機修飾因子、例えば阻害剤、アンタゴニスト（抗体を含む）もしくはアゴニスト、の全てもしくは一部を単独で、又は少なくとも１種類の他の薬剤、例えば安定化化合物、との組み合わせで含むことができ、かつ生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水を含むがこれらに限定されるものではないあらゆる無菌の生体適合性医薬担体中で投与することができる医薬組成物に関する。
要約
要約すると、本発明は、とりわけ、以下のものを提供する：
１．  新規アミノ酸。
【０２４１】
２．  新規ヌクレオチド配列。
３．  前記新規配列を用いる検定。
４．  前記検定を用いることにより同定される化合物／組成物。
【０２４２】
５．  前記新規配列を含み、又はそれを発現する発現系。
６．  前記新規配列に基づく治療方法。
７．  前記新規配列に基づく医薬組成物。
寄託
以下の試料を、ブダペスト条約に従い、ＡＢ２  １ＲＹ、英国スコットランド、アバディーン、マハルドライブ，２３ストリートの認定寄託機関ザ・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミッテッド（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（ＮＣＩＭＢ）に、１９９８年３月６日に寄託した。
大腸菌ｐＰＤＥ１１Ａ１    ＮＣＩＭＢ番号ＮＣＩＭＢ  ４０９２５
大腸菌ｐＰＤＥ１１Ａ２    ＮＣＩＭＢ番号ＮＣＩＭＢ  ４０９２６
ＮＣＩＭＢ  ４０９２５はＨＳＰＤＥ１１Ａ１を含む。
【０２４３】
ＮＣＩＭＢ  ４０９２６はＨＳＰＤＥ１１Ａ２を含む。
以下の試料を、ブダペスト条約に従い、ＡＢ２  １ＲＹ、英国スコットランド、アバディーン、マハルドライブ，２３ストリートの認定寄託機関ザ・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミッテッド（ＮＣＩＭＢ）に、１９９９年２月９日に寄託した。
大腸菌ｐＭｍＰＤＥ１１Ａ３    ＮＣＩＭＢ番号ＮＣＩＭＢ  ４１００７
ＮＣＩＭＢ  ４１００７はＭｍＰＤＥ１１Ａ３を含む。
また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び／又は発現可能である配列並びにそれらを含む態様をも包含する。また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び／又は発現可能である部分的な配列並びにそれらを含む態様をも包含し、これらの部分的な配列は活性酵素部位をコードするものである。また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び／又は発現可能である配列を含むタンパク質並びにそれらを含む態様をも包含する。また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び／又は発現可能である部分的な配列を含むタンパク質並びにそれらを含む態様をも包含し、これらの部分的な配列は活性酵素部位をコードするものである。
【０２４４】
また、本発明は、これらの寄託物から誘導可能及び／又は発現可能である配列並びにそれらを含む態様をも包含する。
実験の部及び図面の序文
本発明を、例のみとして、添付の図面を参照して説明する。添付の図面において：
図１は模式図を示し；
図２はノーザンブロットの写真画像を示し；
図３は模式図を示し；
図４はヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示し；
図５はヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びタンパク質配列の整列を示し；
図６はグラフを示し；
図７はヘインズプロットを示し；
図８は顕微鏡写真を示し；
図９は写真を示し；
図１０は配列の整列を示し；及び
図１１は配列の整列を示す。
【０２４５】
多少詳細には、図１はウシＰＤＥ５、ＩＭＡＧＥクローン２９８９７５及びＰＤＥ１１Ａ１の模式的整列であり、ＰＤＥ１１Ａ１が他のホスホジエステラーゼと共有する様々な関連機能的ドメイン及びＩＭＡＧＥクローン２９８９７５に存在する部分的なＰＤＥ１１Ａ１配列が含む領域を示す。
【０２４６】
多少詳細には、図２はＰＤＥ１１Ａの発現の組織分布を示すノーザンブロットである。
多少詳細には、図２はＰＤＥ１１Ａ１の完全長ｃＤＮＡのクローン化に用いられる戦略を示す模式図であり、バーは一定の比率ではなく、ＣＮは尾状核を指す。
【０２４７】
多少詳細には、図４Ａは配列番号１であって、これはＰＤＥ１１Ａ１をコードするヌクレオチド配列であり、ＡＴＧ翻訳開始が二重下線で示されている。
多少詳細には、図４Ｂは配列番号２であり、これはＰＤＥ１１Ａ１のタンパク質配列である。
【０２４８】
多少詳細には、図５Ａは配列番号３であって、これはＰＤＥ１１Ａ２をコードするヌクレオチド配列であり、ＡＴＧ翻訳開始コドンが二重下線で示されている。
多少詳細には、図５Ｂは配列番号４であり、これはＰＤＥ１１Ａ２のタンパク質配列である。
【０２４９】
多少詳細には、図５ＣはＰＤＥ１１Ａ１及びＰＤＥ１１Ａ２のアミノ末端の整列であり、この２つのスプライス変異体の間で相違する領域を示す。
多少詳細には、図６は、ＰＤＥ１１感染もしくは疑似感染のいずれかのＳｆ９細胞におけるｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰに対するＰＤＥ１１の相対加水分解活性を示すグラフである。
【０２５０】
多少詳細には、図７は、ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰのいずれかに対するＰＤＥ１１Ａ１のＫｍ及びＶｍａｘ値を算出するのに用いられるヘインズプロットを示す。
多少詳細には、図８は、ＰＤＥ１１の発現を示す様々な組織のＰＤＥ１１発現顕微鏡写真インサイツハイブリダイゼーション分析のインサイツ分析を示す。より詳細には、図８は様々な組織におけるＰＤＥ１１の発現を示す顕微鏡写真であって、左側は明視野で撮影された顕微鏡写真であり、かつ右側は発現部位周辺の銀粒子の検出を可能にするために暗視野で撮影された顕微鏡写真である。パネルＡは前立腺内の上皮細胞のサブセットにおけるＰＤＥ１１の発現を示し、領域１は前立腺管におけるＰＤＥ１１の発現を、領域２は発現のない前立腺管を示す。パネルＢはヒト脳の線条体領域におけるＰＤＥ１１の発現を示す。発現は明らかに灰白質（領域１）に存在するニューロン核に限定され、これに対して白質（領域２）にはＰＤＥ１１の発現はない。パネルＣは食道括約筋の神経節細胞におけるＰＤＥ１１の発現を示す。パネルＤは海綿体血管内の内皮細胞のサブセットにおけるＰＤＥ１１の発現を示す。矢印は発現の正確な領域を示す役目を果たす。
【０２５１】
多少詳細には、図９は、ＰＤＥ１１抗体がＰＤＥ１１タンパク質を検出できることを示す写真を提示する。ＰＤＥ１１バキュロウイルスに感染した昆虫細胞又は非感染細胞からの粗製溶解物をＰＡＧＥで電気泳動した。次に、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜にブロットした。このブロットを、２種類のＰＤＥ１１抗体の相対特異性の研究に用いた。Ａｂ−１はペプチド配列番号８から誘導し、Ａｂ−２はペプチド配列番号９から誘導した。
【実施例】
【０２５２】
実施例
実験の部
材料及び方法
ノーザンハイブリダイゼーション及びプローブの調製
クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ９４３０３，  ＵＳＡ）から入手したノーザンブロットを１時間、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）ハイブリダイゼーション溶液（クローンテック−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ９４３０３，  ＵＳＡ）中において５５℃で予備ハイブリダイズさせた後、放射標識ＰＤＥ１１Ａ１断片（ＤＮＡを、メガプライム（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ）ランダム標識システム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）｛Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｌａｃｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｂｕｃｋｓ，  ＨＰ７  ９ＮＡ  ＵＫ｝を製造者の指示に忠実に従って用いて、５０μＣｉの３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した）を新鮮なエクスプレスハイブに添加し、５５℃で一晩、穏やかに攪拌しながらブロットにハイブリダイズさせた。次に、ブロットを室温で各々１０分間、２×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸Ｎａ）中で３回洗浄した後、０．２×ＳＳＣ（１５ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸Ｎａ）中、５５℃で各々２０分間、２回洗浄した。その後、ブロットをオートラジオグラフィーフィルムに露出した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲを標準的な試薬及び条件を用いて行った。簡単に述べると、全ての反応バッファー及び酵素はキットの体裁でクローンテック｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ９４３０３，  ＵＳＡ｝（ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）反応の急速増幅用）又はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（３  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＰＡ４  ９ＲＦ  ＵＫ）（標準ＰＣＲ用）のいずれかから入手した。オリゴヌクレオチドは市場供給者（ＯＳＷＥＬ  ＤＮＡ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｌａｂ  ５００５，  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，Ｂｏｌｄｅｒｗｏｏｄ，Ｂａｓｓｅｔｔ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｅａｓｔ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＳＯ１６  ７ＰＸ  ＵＫ）から入手し、４００ｎＭの濃度で用いた。反応はＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ＰＴＣ−２００サーマルサイクラーで、用いるキットの製造者が推奨するサイクリングパラメータを用いて行った。
ＰＣＲ産生物のクローン化
ＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片を、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｄｅ  Ｓｃｈｅｌｐ  １２，  ９３５１  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって供給されるＴＯＰＯクローニングシステム（カタログ番号Ｋ３００１−０−１）を用いて、製造者の手法本に略述される方法に従い、かつ供給される試薬を用いて単離した。
粗製昆虫細胞溶解物に対するホスホジエステラーゼ検定
粗製溶解物を、［３Ｈ］−ｃＧＭＰ又は［３Ｈ］−ｃＡＭＰ（アマシャム−Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｌａｃｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｂｕｃｋｓ，  ＨＰ７  ９ＮＡ  ＵＫ）を用いてホスホジエステラーゼ活性について検定した。２５μｌの粗製溶解物に１５μｌのバッファーＣ（２０ｍＭ  トリスＨＣＬ（ｐＨ９．４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）及び２５μｌのバッファーＤ（バッファーＣ＋ＢＳＡ＠２ｍｇ／ｍｌ）を添加した。５０μｌの基質を用いて反応を開始させ、管を振盪しながら３０℃で１５分間インキュベートした。次に、これらの管を沸騰水浴に２分間移した後、氷上に１０分間移した。次いで、ヘビ毒（オフィオファグス・ハンナ（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ  ｈａｎｎａｈ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ）｛Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ，  Ｐｏｏｌｅ，  Ｄｏｒｓｅｔ，  ＢＨ１２  ４ＱＨ  ＵＫ｝、Ｖ−０３７６）の１．５ｍｇ／ｍｌ水溶液２５μｌを添加して混合し、攪拌しながらさらに１０分間３０℃まで戻した。次に、管を氷に戻して５分後に５００μｌの樹脂スラリーを添加し、完全に混合して氷上にさらに１５分間静置した。次いで管を２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その後、１５０μｌの上清を取り除いて２ｍｌのスターシント（Ｓｔａｒｓｃｉｎｔ）（パックハード（Ｐａｃｋｈａｒｄ））を添加し、混合して液体シンチレーション計数に処した。
【０２５３】
存在するホスホジエステラーゼの活性を以下の式によりピコモル／分／ｍｌの割合で表す：
｛（試料のＤＰＭ−ブランクのＤＰＭ）／（合計の平均ＤＰＭ−バックグランドの平均ＤＰＭ）｝×（６２５／１５０）×（５０ピコモル／１０分）×１００
その後、活性粗製溶解物をドライアイスエタノール浴においてフラッシュ凍結し、−８０℃で保存した。
粗製溶解物からのタンパク質の精製
発現したタンパク質−ＦＬＡＧ融合体を含む粗製Ｓｆ９溶解物を、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＦＰＬＣシステム（ＬＫＢ．ＵＶ−ＭＩＩ）｛Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２３  Ｇｒｏｓｖｅｎｏｒ  Ｒｏａｄ，  Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ，  Ｈｅｒｔｓ，  ＡＬ１  ３ＡＷ．ＵＫ｝を用いて、ＦＬＡＧ抗体アフィニティカラム（精製ＩｇＧ１モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体がヒドラジド結合により結合しているアガロースＭ２アフィニティゲルビーズ）に流した。精製されたタンパク質を厳密にアフィニティビーズの製造者によって指定される条件下で溶出し、等量に分割して続く分析のために−８０℃で保存した。
アフィニティ精製タンパク質に対するホスホジエステラーゼ検定
１４．７μｌの［３Ｈ］−ｃＧＭＰ（アマシャム−Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｌａｃｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｂｕｃｋｓ，  ＨＰ７  ９ＮＡ  ＵＫ）を２０μｌのバッファーＣ（上述の通り）に添加することにより基質を調製した。９６ウェルの構成において、２５μｌのバッファーＤ（上を参照）を全てのウェルに添加した。２５μｌの試料を全てのウェルに添加した後、５０μｌの基質を添加して反応を開始させた。試料を３０℃で３０分間インキュベートした後、５０μｌのＳＰＡビーズを添加し、２０分間放置した後シンチレンショーンカウンターで読み取った。
ウェスタンブロット
昆虫細胞を遠心によりペレット化し、溶解バッファー（５０ｍＭ  トリスＨＣＬ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオトレイトール、２％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）に再懸濁し、超音波処理し、沸騰水浴に１０分間入れて、還元条件下においてＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ還元ゲル、キットＮＰ００００）で電気泳動した。次に、これらのタンパク質を、ノベックスＮｕＰＡＧＥウェスタン移行システムを用いてニトロセルロース膜に移した。次いで、このウェスタンブロットをＰＢＳ／０．１％ツィーン２０／５％乾燥ミルク中、４℃で一晩インキュベートした。その後、このブロットをＰＢＳ／０．１％ツィーン２０／５％乾燥ミルク／一次抗体の１／５００希釈液中で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ／ツィーン２０で３×１分及び１×１０分洗浄した後、ＰＢＳ／ツィーン２０／５％乾燥ミルクで３×１分及び１×１０分洗浄した。次いで、二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリホスファターゼ結合体（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１７０６５１８）をこの溶液に添加し、室温で４５分間、振盪しながらインキュベートした。次に、ブロットをＰＢＳ／ツィーン２０中で３×１分及び１×１０分洗浄し、その後５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、シグマＢ１９１１｛Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ，  Ｐｏｏｌｅ，  Ｄｏｒｓｅｔ，  ＢＨ１２  ４ＱＨ  ＵＫ｝）を用いて検出した。
実施例１  ＰＤＥ１１Ａ１の同定
クローン（ＩＭＡＧＥクローン  ｉｄ  ２９８９７５）をリサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（２１３０，  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｐｋｗｙ，ＳＷ  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ３５８８０１，ＵＳＡ）からＬ−寒天中の穿刺培養として入手した。穿刺培養からの細菌を、１００ｍｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンの存在下において、３７ｍｍ  Ｌ−寒天プレート上に画線した。３７℃で一晩成長させた後、１つのクローンを無菌技術を用いて、アンピシリンを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む５ｍｌのＬＢ−ブロスに摘み入れ、振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３７℃で一晩成長させた。標準的な市販のミニプレップキット（キアゲンＴＭ（ＱｉａｇｅｎＴＭ））を用い、製造者の指示に厳密に従って細菌からプラスミドＤＮＡを単離した。次に、単離したＤＮＡを、標準的なキット及び試薬及びＡＢＩ（ＰＥアプライド・バイオシステムズ社（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））自動シーケンサーを用いて、完全長配列決定に処した。
【０２５４】
完全長配列決定で、ＩＭＡＧＥクローン２９８９７５は１７７９ｂｐのヌクレオチドインサートを有することが明らかになった。ＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｈｕｌ  ＳＦ  （１９９３）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｈｕｌ，  ＳＦら  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０）を用いるデータベース相同性検索を行い、このＩＭＡＧＥクローン２９８９７５中のＤＮＡインサートがＥＳＴ（発現した配列（発現した配列タグ））データベースに存在する配列を有し、この配列が既知ＰＤＥと相同であり、かつ２９８９７５がＥＳＴの５’側に追加ＤＮＡ配列の大きな伸長をも有し、これも既知ＰＤＥと相同であることが示された。読取り枠、ＡＴＧ翻訳開始コドン及びＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ終止コドンの存在を決定するため、この配列のさらなる分析を行った。これにより、クローン２９８９７５が、ＡＴＧイニシエーターの塩基対位置＋１３からこの配列の３’側限界まで全てにわたって伸びる推定ＯＲＦ（読取り枠）を有することが明らかになった。このクローンの３’側にはターミネーターコドンを示すものがなく、このｃＤＮＡが３’末端で完全ではないことが示唆される。
ＰＤＥの潜在的な新規クラスの断片を有するＩＭＡＧＥクローン２９８９７５
２９８９７５のインサートと既知ＰＤＥとの配列を比較する詳細な生命情報科学分析により、２９８９７５の配列がＰＤＥｓの新規集団のメンバーの断片をコードする可能性があることが示される。その理由は、例えばＰＤＥ６ＡとＰＤＥ６Ｂとが比較的類似するのと比較して、２９８９７５と他のＰＤＥとの類似性が比較的欠如していることである。２９８９７５と他のＰＤＥとの類似性は、例えばＰＤＥ５とＰＤＥ６Ａとの類似性により匹敵する。これは表１（下記）に示されており、この表は２９８９７５、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｂ及びＰＤＥ５の間の、２９８９７５からの配列を利用することができる領域（同様に以下を参照）全体にわたる類似性のパーセンテージを示す。
表１
ＰＤＥ６Ａ    ＰＤＥ６Ｂ      ＰＤＥ５      ＰＤＥ１１
ＰＤＥ６Ａ    １００        ７７．７      ３９．７      ３４．１
ＰＤＥ６Ｂ                １００          ４１．１      ３４．１
ＰＤＥ５                                １００          ３５．５
ＰＤＥ１１                                            １００
表１はＰＤＥ１１と他のＰＤＥ遺伝子集団のメンバーとの類似性のパーセンテージを示し、かつ、互いに高い程度の類似性を有するＰＤＥ６とは対照的に、ＰＤＥ１１がＰＤＥ５、ＰＤＥ６Ａ及びＰＤＥ６Ｂから等しく隔たっていることを示す。これは、ＰＤＥ１１が既知集団のサブタイプではなく、新たなＰＤＥ遺伝子集団を構成することを示唆する。
【０２５５】
このような理由から、ＩＭＡＧＥクローン２９８９７５内に含まれるこの部分配列を、ＰＤＥ命名法の現行ガイドライン（Ｂｅａｖｏら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ４６：３９９−４０５）に従ってＰＤＥ１１Ａ１と命名した。
【０２５６】
他のＰＤＥにおいて観察される機能的ドメインの存在を、それが存在するのであれば、決定するため、クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２：４６７３−４６８０）を用いて、ＰＤＥ１１Ａ１配列断片とウシＰＤＥ５（ＰＤＥ５は、これが機能的に最も十分に特徴付けられている既知ＰＤＥのうちの１つであることから選択した）との整列化を行った。これは図１（パネルＢ）に模式的に示され、２９８９７５に含まれるＰＤＥ１１Ａ１の配列断片が実質的にＰＤＥ５と重なるが、ＰＤＥ５配列の残基６６９で終止することを示している。これは、２９８９７５内に含まれるものに加えて、ＰＤＥ１１Ａ１の実質的な３’配列が存在する可能性があることを示す。ＰＤＥ１１Ａ１における２つの推定亜鉛結合モチーフ（ＨＸＸＸＨＸ８−２０Ｄ）の存在は、ＰＤＥ１１Ａ１が機能的ホスホジエステラーゼ酵素をコードするという仮説を支持する。
実施例２  ＰＤＥ１１Ａ１の推定完全長ｃＤＮＡクローンの単離
コーディング領域の３’末端及びターミネーターコドンを含むＰＤＥ１１Ａ１の完全長ｃＤＮＡの単離を容易にするため、ノーザンハイブリダイゼーションを用いて一続きの組織においてＰＤＥ１１Ａ１の発現を決定した。このデータ（図２に示される）は、ＰＤＥ１１Ａ１とハイブリダイズする伝令ＲＮＡ（長さ９．５ｋｂ）が幾つかの組織に存在するものの、それが脳の尾状核及び被殻領域において特に高度に発現することを示す。したがって、尾状核ｃＤＮＡ（クローンテック−Ｃｌｏｎｔｅｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ）を、余分の３’配列を生成するためのＰＣＲベースのアプローチ（方法を参照）のテンプレートとして用いた。３’ＲＡＣＥでの最初の試みが不成功であったため、代わりの方策を工夫してさらなる３’配列を生成させた。これは、以下のオリゴヌクレオチドを用いることにより達成した：
ＲＰ１：
５’−TCNCCYTGRTCRTARAAYTC−３’  （配列番号５）
これは、ＰＤＥ５及び６の整列において観察される保存配列に基づくものであり、３’プライマーとして用いた。
【０２５７】
以下の第２オリゴヌクレオチド、５’プライマーも用いた：
ＧＳＰ１：
５’−TACTTCAGAACAATCACACG−３’  （配列番号６）
これは既知ＰＤＥ１１Ａ１配列に基づくものである。これらのプライマーを用いて行われたＰＣＲ（このＰＣＲは、ＰＣＲリエージェント・システム（ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）キット（ライフ・テクノロジーズ−３  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＰＡ４  ９ＲＦ  ＵＫ）から入手した試薬を用い、製造者の指示に従って、標準的なサイクリングパラメータを用いて設定した）により断片が生成され、これは、ＴＯＰＯベクターにクローン化して完全長配列決定を行うことにより、ＩＭＡＧＥクローン２９８９７５から誘導されるＰＤＥ１１Ａ１配列とその５’末端が重なり、かつＰＤＥ１１Ａ１の３’末端に向かってさらに４００ｂｐ  ３’側に伸びることが立証された。しかしながら、この断片はターミネーターコドンを含んでおらず、これは単離しなければならないさらなるＰＤＥ１１Ａ１が３’末端に残ることを示していた。
【０２５８】
この仮説を試験するため、３’ＲＡＣＥを、配列番号６（上を参照）を有する尾状核マラトン・レディＴＭ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＲｅａｄｙＴＭ）ｃＤＮＡ（クローンテック−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ）及び３’ＲＡＣＥキットと共に供給される３’プライマー（クローンテック｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ｝、製造者が推奨する試薬及び方法を用いる）で行った。これらのＲＡＣＥ産物を用いて、２０００クローンのミニライブラリーをＴＯＰＯベクター（インビトロゲン−Ｄｅ  Ｓｃｈｅｌｐ  １２，９３５１  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に作製した。このミニライブラリーを、上で誘導される伸長断片の３’末端から誘導されるプローブとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。５つのクローンが同定され、これらは、配列決定によりさらなる３’ＰＤＥ関連配列を有することが立証された。また、これらのクローンは枠内ターミネーターコドンをも有しており、これはこのｃＤＮＡ内の推定コーディング配列の３’限界を示していた。完全長ＰＤＥ１１Ａ１  ｃＤＮＡの単離に用いられる手順が図３に模式的にまとめられている。３つの断片の全てを分析することで２５５７ｂｐの隣接配列を組み立てることが可能となり、これは７８９残基のＯＲＦを含む。ＰＤＥ１１Ａ１の完全長ｃＤＮＡ配列が図４Ａ（配列番号１）に示され、このｃＤＮＡ内の最大読取り枠の翻訳が図４Ｂ（配列番号２）に示されている。
【０２５９】
現在までに配列決定されている全ての哺乳動物ホスホジエステラーゼと同様に、ＰＤＥ１１Ａ１は、触媒活性に必須であるものと考えられるこのタンパク質のカルボキシル末端側半分の約２５０アミノ酸の保存触媒ドメイン配列を有する。このセグメントは配列番号４のアミノ酸４９９ないし７３１を含み、図１（パネルＣ）に模式的に示され、かつ他のＰＤＥの対応領域と同じ配列保存を示す。
実施例３  ＰＤＥ１１Ａ１の５’スプライス変異体の単離
図４Ａに示される翻訳開始コドンであるＡＴＧがＰＤＥ１１Ａ１における最も５’側のＡＴＧである可能性から守るため、５’ＲＡＣＥを尾状核マラトン・レディＴＭｃＤＮＡ（クローンテック−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ）に対して行い、さらに上流の配列を単離した。用いた５’プライマーは５’ＲＡＣＥキット（クローンテック−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ）内に供給されるアダプタープライマーであり、用いた３’プライマーは以下のオリゴヌクレオチドであった：
ＧＳＰ３：
５’−TCTCCAAGGAAATACAGTGC−３’  （配列番号７）
反応条件は製造者の指示によって指定される通りであった。生じた５’ＲＡＣＥ産生物をＴＯＰＯベクター（インビトロゲン−Ｄｅ  Ｓｃｈｅｌｐ  １２，９３５１  ＮＶ  Ｌｅｅｋ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）にクローン化し、ＰＤＥ１１Ａ１の５’末端から誘導したプローブを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングによりＰＤＥ１１Ａ１関連配列の存在について分析した。この分析により、上流１９０ｂｐコーディング配列の存在が明らかになった。図４Ａに示されるＡＴＧがＰＤＥ１１Ａ１の真の翻訳開始コドンを表し得るものと結論付けられる。幾つかの５’ＲＡＣＥクローンの配列解析により、ＰＤＥ１１Ａ２と命名されるＰＤＥ１１Ａ１のスプライス変異体の存在が明らかになり、これはコーディング領域が異なり、それによりＰＤＥ１１Ａ２においては末端２３コドンが代わりの２５コドンで置換されている。図５Ｃは、比較のため、ＰＤＥ１１Ａ１及びＡ２のアミノ末端の整列を示す。完全なｃＤＮＡ配列及び翻訳は図５Ａ及び５Ｂに示されている。ＰＤＥ１１Ａ１とＰＤＥ１１Ａ２とは既知ＡＴＧ開始コドンに対して５’側の配列においても異なる。興味深い観察の１つは、プロサイト（ｐｒｏｓｉｔｅ）プログラム（Ｂａｉｒｏｃｈら，Ｔｈｅ  ＰＲＯＳＩＴＥ  ｄａｔａｂａｓｅ，  ｉｔｓ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  １９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２１７−２２１（１９９７））を用いて検出した場合、ＰＤＥ１１Ａ２がプロテインキナーゼＡ潜在的リン酸化部位を持たない可能性があることである。
実施例４  ＰＤＥ１１Ａ１は、バキュロウイルス系で発現した場合、環状ヌクレオチド加水分解活性を示す
スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）感染に基づくバキュロウイルス発現系を用いて、ＰＤＥ１１Ａ１タンパク質を産生した。簡単に述べると、ＰＤＥ１１を、ミニ−Ｔｎ７転移要素を有するドナープラスミドｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＦＬＡＧにクローン化した。この組換えプラスミドを、親バクミド（ｂａｃｍｉｄ）ｂＭＯＮ１４２７２（ＡｃＮＰＶ感染性ＤＮＡ）及びヘルパープラスミドを有するＤＨ１０ＢＡＣ適格細胞に形質転移した。ｐＦＡＳＴＢＡＣドナー上のミニ−Ｔｎ７要素はこのバクミド上でａｔｔＴｎ７付着部位に置き換わることが可能であり、それによりＰＤＥ１１がウイルスゲノムに導入される。組換えバクミドを含むコロニーをｌａｃＺ遺伝子の破壊により同定する。その後、ＰＤＥ１１／バクミド構築体を単離して昆虫細胞（Ｓｆ９細胞）に感染させ、それにより感染性組換えバキュロウイルス粒子を産生させて組み換えＰＤＥ１１Ａ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現させることができる。
【０２６０】
粗製細胞抽出物のホスホジエステラーゼ活性を、Ｍａｒｔｉｎｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７：１９７３−１９７９にｃＧｓ−ＰＤＥについて記載される検定手順の変法（材料及び方法も参照）を用いて測定した。細胞を回収し、形質移入の２４、４８及び７２時間後に抽出物を調製した。それらの検定の結果が図６に示され、ここで示される結果は３回の別々の感染の平均である。昆虫Ｓｆ９細胞の感染により、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰホスホジエステラーゼ活性の両者の、疑似感染細胞よりも約１０−１５倍高い水準の発現が生じた。これらの結果は、ＰＤＥ１１Ａ１  ｃＤＮＡが、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両者を加水分解することが可能なホスホジエステラーゼをコードすることを確証する。
【０２６１】
この粗製溶解物質を、精製ＩｇＧ１モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体がヒドラジド結合により結合しているアガロースビーズ（Ｍ２アフィニティゲル）を収容するカラム（イーストマン・コダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ））を用いるＦＰＬＣにより精製した。これは、内在性昆虫タンパク質は溶出液中に洗い流しながら、組換え物質（これがＦＬＡＧエピトープに融合するため）をカラムに特異的に保持させる。次に、この組換え物質を低ｐＨ条件下で洗い流す。この精製物質は詳細な酵素及び阻害物質研究により適する。この物質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後のクーマシー染色又は非染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（組換えＰＤＥ１１Ａ１を含む）のニトロセルロース膜へのウェスタンブロット及びＩｇＧ１モノクローナル抗ＦＬＡＧエピトープ抗体を用いる分析により検定する。ＰＤＥ１１Ａ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体とＰＤＥ１１Ａ１タンパク質に融合するＦＬＡＧエピトープとの相互作用により検出される。
【０２６２】
精製したＰＤＥ１１Ａ１−ＦＬＡＧ融合タンパク質のホスホジエステラーゼ活性を、市販のＳＰＡ（シンチレーション近接検定）キット（アマシャム−Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｌａｃｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，  Ｈｐ７  ９ＮＡ  ＵＫ）を用いて、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰのいずれかについて検定した。これは、酵素の近似Ｖｍａｘ値の算出を可能にする所定の範囲の基質濃度での酵素活性を決定することによりｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対するＰＤＥ１１Ａ１のＫｍ値の決定を可能にするために用いた。これらの実験の結果が図７に示されており、ＰＤＥ１１Ａ１のＫｍはｃＡＭＰに対しては４００ｎＭ、ｃＧＭＰに対しては約４ｍＭであることが示され、これはこの酵素がｃＡＭＰに対してｃＧＭＰよりも高い親和性を有することを示す。このように、本発明のＰＤＥ１１酵素はｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する親和性を有するが、ｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して高い親和性を有する。好ましくは、この酵素は、ｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して少なくとも約５のオーダーの親和性、より好ましくはｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して少なくとも約６のオーダーの親和性、より好ましくはｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して少なくとも約７のオーダーの親和性、より好ましくはｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して少なくとも約８のオーダーの親和性、より好ましくはｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して少なくとも約８のオーダーの親和性、より好ましくはｃＧＭＰよりもｃＡＭＰに対して約１０（もしくはそれ以上）のオーダーの親和性を有する。
実施例５  ＰＤＥ１１Ａ１を用いるインサイツハイブリダイゼーション研究
この分析は、ＰＤＥ１１Ａ１の潜在機能を研究するために、及びこの酵素を阻害することによりどのような治療機会を開拓することができるのかに関して行った。したがって、ＰＤＥ１１Ａ１リボプローブ（方法を参照）を生成し、３５Ｓで放射標識した。この種の分析の例が図８に示されており、海綿体の内皮細胞、腸における神経節、前立腺の上皮細胞及び脳の線条体領域のニューロン核における発現が示されている。これらのデータは、ＰＤＥ１１の活性の阻害が表し得る多くの機会を説明するのに役立ち得る。
実施例６  ＰＤＥ１１抗体の産生
２種類の抗ペプチドＰＤＥ１１抗体が、これらの試薬の商業供給者（ゼネカＣＲＢ（Ｚｅｎｅｃａ  ＣＲＢ）−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｇａｄｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋ，  Ｎｏｒｔｈｗｉｃｈ，  Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＣＷ９  ７ＲＡ．ＵＫ）により生成されている。
【０２６３】
第１のペプチドの配列は：
MEDGPSNNASC  （配列番号８）
であり、ＰＤＥ１１Ａ１の残基０１ないし１２に対応する。
【０２６４】
第２のペプチドの配列は：
EDESAPKEVSRYC  （配列番号９）
であり、ＰＤＥ１１Ａ１の残基６４−７７に対応する。
【０２６５】
これらの配列をゼネカＣＲＢ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｇａｄｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋ，  Ｎｏｒｔｈｗｉｃｈ，  Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，  ＣＷ９  ７ＲＡ．  ＵＫ）による標準手順を用いて生成し、標準的な抗原注射措置を用いてウサギに注射した。抗体が血清として供給され、これを組換えにより生じたＰＤＥ１１Ａ１タンパク質に対するウェスタンブロットにより特徴付けた。この実験からのデータが図９に示され、両抗体（Ａｂ−１及びＡｂ−２）が、粗製溶解物中に存在する昆虫タンパク質のバックグランド内に存在する場合、組換えＰＤＥ１１タンパク質の検出が可能であることが示されている。
実施例７
ＰＤＥ１１Ａ１の完全なコーディング配列を含むｃＤＮＡを、ヒト尾状核ｃＤＮＡ（クローンテックカタログ番号７１９１−１｛Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  １０２０  Ｅａｓｔ  Ｍｅａｄｏｗ  Ｃｉｒｃｌｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４３０３，ＵＳＡ｝から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び以下のオリゴヌクレオチド：
５’プライマー：
TTCGGATCCGACATGGAAGATGGACC  （配列番号１０）
及び３’プライマー：
GGTGACTAGTGCTCAATCTTCAGATGC  （配列番号１１）
を用い、ＰＣＲ試薬システム（ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号１０１９８−０１８｛３  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｉｎｃｈｉｎｎａｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  ＰＡ４  ９ＲＦ  ＵＫ｝）を１００μｌの反応容積で用いて、又は通常のハイブリダイゼーションスクリーニングを用いることにより得た。
【０２６６】
ＰＤＥ１１Ａ１の完全な配列は本明細書中に提供されている。また、我々は、アミノ末端がここに示されるものとは異なるＰＤＥ１１Ａ１のスプライス変異体、すなわちＰＤＥ１１Ａ２も単離している。ＰＤＥ１１Ａ２の配列の残部はＰＤＥ１１Ａ１と同一である。ＰＤＥ１１Ａ２も、尾状核ｃＤＮＡから、適切なプライマー及びＰＣＲプロトコルを用いて、又はハイブリダイゼーションスクリーニングにより得ることができる。
【０２６７】
ＰＤＥ１１Ａ１  ｃＤＮＡのコーディング配列は７８９アミノ酸残基のタンパク質をコードする。ＰＤＥ１１Ａ２  ｃＤＮＡのコーディング配列は７９１アミノ酸残基のタンパク質をコードする。
【０２６８】
配列番号１はＰＤＥ１１Ａ１  ｃＤＮＡの完全な配列である。配列番号２はＰＤＥ１１Ａ１の翻訳されたタンパク質の配列である。配列番号３はＰＤＥ１１Ａ２  ｃＤＮＡの完全な配列である。配列番号４はＰＤＥ１１Ａ２の翻訳されたタンパク質の配列である。
実施例８  マウスの配列
ＰＤＥ１１のマウス相同体がクローン（ＩＭＡＧＥクローン７６０８４４）中に見出された。この相同体を、ヒトＰＤＥ１１Ａ１について上に提示されるプロトコルに従って分析した。このクローン内のインサートの完全長配列決定により、それが１０６８  ｂｐのインサートを含み、その内部９００  ｂｐがヒトＰＤＥ１１に非常に密接に対応することが明らかになった。
【０２６９】
以下のものはＩｍａｇｅクローン７６０８４４から誘導される部分的ヌクレオチド配列である。下線を付した配列は、ヒトＰＤＥ１１と高い相同性を有するこのクローンのインサートの領域を示す。
配列番号１２
ATTTGCACTGTACTTTCCTTGGAGAGTGCAATAATAGCCTGTGTGTGTTCATACCACCCGGGATGAAGGAAGGCCAACCCCGGCTCATCCCTGCGGGGCCCATCACCCAGGGTACCACCATCTCTGCCTACGTGGCCAAGTCTAGGAAGACGTTGTTGGTAGAGGATATCCTTGGGGATGAGCGATTTCCTCGAGGTACTGGCCTGGAATCAGGAACCCGCATCCAGTCTGTTCTTTGCTTGCCCATTGTCACTGCCATTGGAGACTTGATTGGCATCCTTGAACTGTACAGGCACTGGGACAAAGAGGCCTTCTGCCTCAGCCATCAGGAGGTTGCAACAGCCAATCTTGCTTGGGCTTCCGTAGCAATACACCAGGTGCAGGTGTGTAGAGGTCTCGCCAAACAGACCGAACTGAATGACTTCCTACTCGACGTATCAAAGACATACTTTGATAACATAGTTGCCATAGACTCTCTACTTGAACACATCATAATATATGCAAAAAATCTAGTGAACGCCGACCGCTGCGCGCTCTTCCAGGTGGACCACAAGAACAAGGAGCTGTACTCGGACCTGTTTGACATTGGGGAGGAGAAGGAGGGGAAGCCCATCTTCAAGAAGACCAAGGAGATCAGATTTTCCATTGAGAAAGGGATTGCTGGTCAAGTGGCAAGAACAGGCGAAGTCTTGAACATTCCCGATGCCTACGCGGACCCTCGCTTTAACAGGGAGGTGGACCTGTACACAGGCTACACCACGAGGAACATTCTGTGTATGCCCATAGTGAGCCGAGGCAGCGTGATTGGCGTGGTGCAGATGGTGAACAAGATCAGCGGTAGCGCCTTCTCCAAGACAGACGAGAACAACTTCAAGATGTTTGCTGTCTTCTGCGCACTGGCCTTGCACTGTGCTAACGCCAGATGGAAAAGCCTAGCTTCTCTCCCCTGGGTCAGCTGGGAAGGTTTGCTAGCTTGCCTGCACTGTGGCAAAGACCTGAGGACCTGGAATGGTGACCACTGTCTGACGTGCACAGTCTTTCCTGCCTCTGTGACACCCGCTTGGGATA
以下のものは上で下線を付した配列のタンパク質翻訳物であり、これは３００残基の長さであって、ＡＴＧ翻訳イニシエーターコドン又はＴＧＡ、ＴＡＡもしくはＴＡＧターミネーターコドンのいずれをも含まない。したがって、我々は、これがマウスＰＤＥ１１  ｃＤＮＡの断片を表すものと確信した。
配列番号１３
FLGECNNSLCVFIPPGMKEGQPRLIPAGPITQGTTISAYVAKSRKTLLVEDILGDERFPRGTGLESGTRIQSVLCLPIVTAIGDLIGILELYRHWDKEAFCLSHQEVATANLAWASVAIHQVQVCRGLAKQTELNDFLLDVSKTYFDNIVAIDSLLEHIIIYAKNLVNADRCALFQVDHKNKELYSDLFDIGEEKEGKPIFKKTKEIRFSIEKGIAGQVARTGEVLNIPDAYADPRFNREVDLYTGYTTRNILCMPIVSRGSVIGVVQMVNKISGSAFSKTDENNFKMFAVFCALALHCA
図１０はヒトＰＤＥ１１Ａ１の残基１２６ないし４２５に対する配列の整列を示す。これは、ヒトＰＤＥ１１Ａ１タンパク質配列及びマウスＰＤＥ１１タンパク質配列のＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて作成した整列である。
【０２７０】
このように、我々は、ＩＭＡＧＥクローン７６０８４４が、その大部分がヒトＰＤＥ１１と非常に密接に関連し、したがって、ヒトＰＤＥ１１遺伝子のマウス相同体を表すＤＮＡ配列を含むものと確信した。このｃＤＮＡがマウス遺伝子の断片のみを含む可能性もあるが、これはヒトＰＤＥ１１  ｃＤＮＡ配列の変異体を表す。
【０２７１】
この信念に基づき、次にマウスＰＤＥ１１及びそのコーディング配列を完全に配列決定した。
これに関して、クローン化マウスＰＤＥ１１の完全なｃＤＮＡ配列がここに配列番号１４として提供されている。マウスＰＤＥ１１配列それ自体は配列番号１５として示されている。このマウスの配列は時折ＭＭＰＤＥ１１Ａ３と呼ばれる。
【０２７２】
図１１はヒトＰＤＥ１１配列（ＨＳＰＤＥ１１Ａ１、ＨＳＰＤＥ１１Ａ２）とマウスＰＤＥ１１配列（ＭＰＤＥ１１Ａ３）との配列の比較を示す。見てわかるように、これらの配列の間にはほぼ完全な一致が存在する。
【０２７３】
インサイツハイブリダイゼーション研究により、ＭＭＰＤＥ１１Ａ３コーディング配列がマウスの線条体に高水準で局在することが示された。
実施例９  ラットの配列
ＰＤＥ１１のラット相同体が見出され、これを我々はＰＤＥ１１Ａ４と命名している。我々はこの相同体の一部を配列決定することが可能である。これに関して、２種類のヌクレオチド配列が配列番号１６及び配列番号１８に示されている。２種類の、それらのそれぞれのアミノ酸配列は配列番号１７及び配列番号１９である。データ解析により、ここに示されるヒト及びラットの配列に関する非常に高い相同性が明らかになる。
要約
要約すると、とりわけ以下のものを本発明が提供し、かつ実施例が示す：
１．  新規アミノ酸。
【０２７４】
２．  新規ヌクレオチド配列。
３．  前記新規配列を用いる検定。
４．  前記検定を用いることにより同定される化合物／組成物。
【０２７５】
５．  前記新規配列を含み、又はそれを発現する発現系。
６．  前記新規配列に基づく治療方法。
７．  前記新規配列に基づく医薬組成物。
上記明細において言及される全ての刊行物は参考文献として本明細書中に援用される。記載される本発明の方法及びシステムの様々な変更及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい態様に関して記載しているが、請求される発明はそのような特定の態様に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、生化学及び生物工学又は関連分野における熟練者に明白である、記載される本発明の実施様式の様々な変更が以下の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】図１は模式図を示す。
【図２】図２はノーザンブロットの写真画像を示す。
【図３】図３は模式図を示す。
【図４】図４はヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図５】図５はヌクレオチド配列、アミノ酸配列及びタンパク質配列の整列を示す。
【図６】図６はグラフを示す。
【図７】図７はヘインズプロットを示す。
【図８】図８は顕微鏡写真を示す。
【図９】図９は写真を示す。
【図１０】図１０は配列の整列を示す。
【図１１】図１１は配列の整列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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