(57)【要約】【課題】  Ｆａｓにより媒介される肝障害の治療剤のスクリーニング法の提供。【解決手段】  Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法であって、（ａ）Ｓｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度を測定する工程を含んでなり、Ｓｔａｔ３の活性化が前記候補薬物により増強された場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法であって、
（ａ）Ｓｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および、
（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度を測定する工程
を含んでなり、
Ｓｔａｔ３の活性化が前記候補薬物により増強された場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される、方法。
【請求項２】
前記肝障害が、Ｆａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）が、細胞内における二量化Ｓｔａｔ３タンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）が、細胞の核内におけるＳｔａｔ３タンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、細胞内においてＤＮＡに結合したＳｔａｔ３タンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度が、候補薬物の不在下で培養された対照細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度との比較において増強されている場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法であって、
（ａ）Ｒｅｆ−１遺伝子プロモーターおよび機能しうる形で該プロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含んでなり、かつＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに、
（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程
を含んでなり、
前記レポーター遺伝子の発現量が前記候補薬物により増加した場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される、方法。
【請求項９】
前記肝障害が、Ｆａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ａ）において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）が、細胞内における前記レポーター遺伝子からのタンパク質を定量することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）が、細胞内における前記レポーター遺伝子からのｍＲＮＡを定量することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）により得られる細胞における前記レポーター遺伝子の発現量が、候補薬物の不在下で培養された対照細胞における前記レポーター遺伝子の発現量との比較において増加している場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
Ｓｔａｔ３活性増強剤および医薬上許容される担体を含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記肝障害が、Ｆａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
Ｓｔａｔ３活性増強剤が、Ｒｅｆ−１遺伝子の転写を促進するＳｔａｔ３の活性を増強するものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Ｓｔａｔ３活性増強剤が、Ｓｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Ｓｔａｔ３活性増強剤が、活性を有する二量化Ｓｔａｔ３を構成的に形成しうるように改変されたＳｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
Ｓｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いるための肝細胞。
【請求項２０】
前記肝障害が、Ｆａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものである、請求項１９に記載の肝細胞。
【請求項２１】
前記肝細胞が、治療の対象となる個体に由来するものである、請求項１９に記載の肝細胞。
【請求項２２】
活性を有する二量化Ｓｔａｔ３を構成的に形成しうるように改変されたＳｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いるための肝細胞。
【請求項２３】
前記肝障害が、Ｆａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものである、請求項２２に記載の肝細胞。
【請求項２４】
前記肝細胞が、治療の対象となる個体に由来するものである、請求項２２に記載の肝細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＳＴＡＴ３の活性化能を指標とする肝疾患治療剤のスクリーニング法、およびＳＴＡＴ３活性化剤を含む肝疾患を治療するための医薬組成物に関する。
【０００２】
背景技術
転写シグナル伝達／活性化因子−３（Ｓｔａｔ３）は、様々な場所で発現し、多種多様なリガンド、例えば、ＩＬ−６、白血病阻害因子、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦ等によって一時的に活性化され、また、いくつかの癌受容体型チロシンキナーゼおよび非受容体型（Ｓｒｃ様）チロシンキナーゼによっても一時的に活性化される（Darnell, J.E., Jr. 1997. STATs and gene regulation. Science. 277:1630‐1635；Schuringa, J.J., Jonk, L.J., Dokter, W.H., Vellenga, E., and Kruijer, W. 2000. Interleukin-6-induced STAT3 transactivation and Ser727 phosphorylation involves Vav, Rac-1 and the kinase SEK-1/MKK-4 as signal trans-duction components. Biochem. J. 347:89‐96；Leu, J.I., Crissey, M.A., Leu, J.P., Ciliberto, G., and Taub, R. 2001. Interleukin-6-induced STAT3 and AP-1 amplify hepatocyte nuclear factor 1-mediated transactivation of hepatic genes, an adaptive response to liver injury. Mol. Cell. Biol. 21:414‐424；Schuringa, J.J., van der Schaaf, S., Vellenga, E., Eggen, B.J., and Kruijer, W. 2002. LIF-induced STAT3 signaling in murine versus human embryonal carcinoma (EC) cells. Exp. Cell Res. 274:119‐129；Levy, D.E., and Lee, C.K. 2002. What does Stat3 do? J. Clin. Invest. 109:1143‐1148. doi:10.1172/JCI200215650）。Ｓｔａｔ３は、ＩＬ−６で刺激した肝細胞中で発見され、急性期応答要素として知られる急性期遺伝子のプロモーター中のエンハンサー要素と選択的に相互作用することのできる、ＤＮＡ結合活性を有する分子としてはじめて報告されたものである（Zhong, Z., Wen, Z., and Darnell, J.E. 1994. Stat3: a STAT family member activated by tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor and interleukin-6. Science. 264:95‐98；Lutticken, C., et al. 1994. Association of transcription factor APRF and protein kinase Jak1 with the interleukin-6 signal transducer gp130. Science. 263:89‐92）。Ｓｔａｔ３は、ｇｐ１３０およびその関連受容体を通してシグナル伝達を行なう全てのＩＬ−６型サイトカインによって活性化され、さらには、いくつかの増殖因子、癌タンパク質、およびインターフェロンによっても活性化される（Hirano, T., Ishihara, K., and Hibi, M. 2000. Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors. Oncogene. 19:2548‐2556；Bowman, T., Garcia, R., Turkson, J., and Jove, R. 2000. STATs in oncogenesis. Oncogene. 19:2474‐2488）。Ｓｔａｔ３の生理学的機能については多くの研究がなされており、Ｓｔａｔ３は様々な器官の発生および細胞増殖において重要な役割を果たすことが知られている（Levy, D.E., and L
ee, C.K. 2002. What does Stat3 do? J. Clin. Invest. 109:1143‐1148. doi:10.1172/JCI200215650）。Ｓｔａｔ３遺伝子を標的として遺伝子破壊を行なうと胚の早期死亡が起こるため（Takeda, K., et al. 1997. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:3801‐3804）、Ｓｔａｔ３の条件的ノックアウト（肝臓、リンパ球など）を有するマウスを用いた研究がなされている（Takeda, K., et al. 1997. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:3801‐3804；Li, W., Liang, X., Kellendonk, C., Poli, V., and Taub, R. 2002. STAT3 contributes to the mitogenic response of hepatocytes during liver regenera-tion. J. Biol. Chem. 277:28411‐28417）。肝臓特異的Ｓｔａｔ３ノックアウトマウス（ＬＳ３−ＫＯマウス）では、肝臓の発生および構造における異常は認められなかったが、部分的肝切除後のマイトジェン応答は減少した（Li, W., Liang, X., Kellendonk, C., Poli, V., and Taub, R. 2002. STAT3 contributes to the mitogenic response of hepatocytes during liver regenera-tion. J. Biol. Chem. 277:28411‐28417）。また、Ｓｔａｔ３が部分的肝切除の直後におけるいくつかの重要な早期応答遺伝子に関与することを示す、他の多くの研究が報告されている（Leu, J.I.,
Crissey, M.A., Leu, J.P., Ciliberto, G., and Taub, R. 2001. Interleukin-6-induced STAT3 and AP-1 amplify hepatocyte nuclear factor 1-mediated transactivation of hepatic genes, an adaptive response to liver injury. Mol. Cell. Biol. 21:414‐424；Debonera, F., et al. 2001. Activation of interleukin-6/STAT3 and liver regeneration following transplantation. J. Surg. Res. 96:289‐295）。
【０００３】
増殖促進に加えて、Ｓｔａｔ３は抗アポトーシス特性を有する。血清供給停止およびＵＶ照射を用いて刺激した場合、繊維芽細胞中において、Ｓｔａｔ３は、Ｂｃｌ−ｘＬおよびサバイビン（Survivin）の発現を誘導することによりＳｔａｔ１のアポトーシス促進作用と競合する（非特許文献１：Shen, Y., Devgan, G., Darnell, J.E., and Bromberg, J.F. 2001. Constitutively activated Stat3 protects fibroblasts from serum withdrawal and UV-induced apoptosis and antagonizes the proapoptotic effects of activated Stat1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:1543‐1548）。Ｓｔａｔ３は、いくつかの細胞型において、アポトーシスの妨害により細胞増殖を引き起すこともある（非特許文献１：Shen, Y., Devgan, G., Darnell, J.E., and Bromberg, J.F. 2001. Constitutively activated Stat3 protects fibroblasts from serum withdrawal and UV-induced apoptosis and antagonizes the proapoptotic effects of activated Stat1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:1543‐1548；非特許文献２：Grandis, J.R., et al. 2000. Constitutive activation of Stat3 signaling abrogates apoptosis in squamous cell carcinogenesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:4227‐4232；非特許文献３：Takeda, K., et al. 1998. Stat3 activation is responsible for IL-6-dependent T cell proliferation through preventing apoptosis: generation and characterization of T cell-specific Stat3-deficient mice. J. Immunol. 161:4652‐4660）。しかし、Ｓｔａｔ３の抗アポトーシス特性の正確な作用機序は解明されていない。
【０００４】
アポトーシスは様々な生化学的過程によって媒介される。最もよく特徴づけられているアポトーシス経路の一つは、表面分子であるＦａｓによって誘導されるものである（非特許文献４：Nagata, S. 1999. Fas ligand-induced apoptosis. Annu. Rev. Genet. 33:29‐55；非特許文献５：Matsumura, H., et al. 2000. Necrotic death pathway in Fas receptor signaling. J. Cell Biol. 151:1247‐1256）。ＦａｓアゴニストはＦａｓの三量体化を引き起し、次いで、いくつかの分子を集めて細胞死誘導シグナル複合体（ＤＩＳＣ）を形成する。このＤＩＳＣの形成は、Ｆａｓとそのアダプタータンパク質であるＦＡＤＤとが互いの細胞死領域にて結合することにより、ＦＡＤＤを細胞膜に集めることから始まる。ＦＡＤＤの他方の末端部には２つの細胞死エフェクター領域（ＤＥＤ）が含まれており、これらのＤＥＤは、カスパーゼ−８（ＦＬＩＣＥ）、またはその酵素活性を持たない相同体であるＦａｓ阻害性ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）を集める。プロカスパーゼ−８は、ＦＡＤＤに結合した後に切断されて活性化される（非特許文献６：Siegmund, D., et al. 2001. Fas-associated death domain protein (FADD) and caspase-8 mediate up-regulation of c-Fos by Fas ligand and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) via a FLICE inhibitory protein (FLIP)-regulated pathway. J. Biol. Chem. 276:32585‐32590；非特許文献７：Kovalovich, K., et al. 2001. Interleukin-6 protects against Fas-mediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2, and Bcl-xL. J. Biol. Chem. 276:26605‐26613；非特許文献８：Budd, R.C. 2002. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis. J. Clin. Invest. 109:437‐442. doi:10.1172/JCI200215077）。これによりその後のカスケード反応が始まり、アポトーシスをもたらす。興味深いことに、Ｓｔａｔ３を介する肝臓再生において重要な役割を担うことが知られているＩＬ−６は、必要量の抗アポトーシスタンパク質、例えば、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−ｘＬを誘導することにより、Ｆａｓ媒介アポトーシスから肝臓を保護する（非特許文献７：Kovalovich, K., et al. 2001. Interleukin-6 protects against Fas-mediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2, and Bcl-xL. J. Biol. Chem. 276:26605‐26613）。
【０００５】
臨床分野では、Ｆａｓは、肝炎および他の肝疾患において重要であることが示されている（非特許文献９：Pinkoski, M.J., Brunner, T., Green, D.R., and Lin, T. 2000. Fas and Fas ligand in gut and liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278:G354‐G366；非特許文献１０：Galle, P.R., et al. 1995. Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor and ligand in liver damage. J. Exp. Med. 182:1223‐1230；非特許文献１１：Kanzler, S., and Galle, P.R. 2000. Apoptosis and the liver. Semin. Cancer Biol. 10:173‐184）。肝細胞上ではＦａｓ抗原が構成的に発現しているため、肝臓はＦａｓ媒介アポトーシスを受けやすい。抗Ｆａｓ抗体を投与したマウスは、肝不全により死亡する（非特許文献７：Kovalovich, K., et al. 2001. Interleukin-6 protects against Fas-mediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2, and Bcl-xL. J. Biol. Chem. 276:26605‐26613）。Ｆａｓ−／−マウスは肝過形成を示し、このことは、Ｆａｓ経路が肝臓の構造および大きさを決定づける上で重要であることを示唆している。Ｆａｓ／ＦａｓＬシステムは、多くの病的状態、例えば、移植片対宿主病、肝移植片、Ｂ型およびＣ型肝炎、急性アルコール性肝炎、およびいくつかの胆道疾患に関与しているようである（非特許文献９：Pinkoski, M.J., Brunner, T., Green, D.R., and Lin, T. 2000. Fas and Fas ligand in gut and liver. Am. J. Physiol. Gastroin
test. Liver Physiol. 278:G354‐G366；非特許文献１１：Kanzler, S., and Galle, P.R. 2000. Apoptosis and the liver. Semin. Cancer Biol. 10:173‐184；非特許文献１２：Faubion, W.A., et al. 1999. Toxic bile salts induce rodent hepatocyte apoptosis via direct activation of Fas. J. Clin. Invest. 103:137‐145）。
【０００６】
【非特許文献１】Shen, Y., Devgan, G., Darnell, J.E., and Bromberg, J.F. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:1543‐1548
【非特許文献２】Grandis, J.R., et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:4227‐4232
【非特許文献３】Takeda, K., et al. 1998. J. Immunol. 161:4652‐4660
【非特許文献４】Nagata, S. 1999. Annu. Rev. Genet. 33:29‐55
【非特許文献５】Matsumura, H., et al. 2000. J. Cell Biol. 151:1247‐1256
【非特許文献６】Siegmund, D., et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:32585‐32590
【非特許文献７】Kovalovich, K., et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:26605‐26613
【非特許文献８】Budd, R.C. 2002. J. Clin. Invest. 109:437‐442. doi:10.1172/JCI200215077
【非特許文献９】Pinkoski, M.J., Brunner, T., Green, D.R., and Lin, T. 2000. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278:G354‐G366
【非特許文献１０】Galle, P.R., et al. 1995. J. Exp. Med. 182:1223‐1230
【非特許文献１１】Kanzler, S., and Galle, P.R. 2000. Apoptosis and the liver. Semin. Cancer Biol. 10:173‐184
【非特許文献１２】Faubion, W.A., et al. 1999. J. Clin. Invest. 103:137‐145
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、マウスを用いて、Ｓｔａｔ３がＦａｓ媒介肝障害に対する保護をもたらすか否かを調べたところ、Ｓｔａｔ３の活性化が、レドックス依存性または非依存性の機構におけるカスパーゼ活性の阻害により、Ｆａｓにより媒介される肝障害に対する保護をもたらすことを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、Ｓｔａｔ３の作用の調節能に基づく、Ｆａｓにより媒介される肝障害の治療剤のスクリーニング法、ならびに該肝障害を治療するための医薬組成物および肝細胞を提供することを目的とする。
【０００９】
そして、本発明によるスクリーニング法は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法であって、（ａ）Ｓｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、および（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度を測定する工程を含んでなり、Ｓｔａｔ３の活性化が前記候補薬物により増強された場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される方法である。
【００１０】
本発明の他の態様によるスクリーニング法は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法であって、（ａ）Ｒｅｆ−１遺伝子プロモーターおよび機能しうる形で該プロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含んでなり、かつＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに（ｂ）工程（ａ）により得られる細胞における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程を含んでなり、前記レポーター遺伝子の発現量が前記候補薬物により増加した場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される方法である。
【００１１】
さらに、本発明による医薬組成物は、Ｓｔａｔ３活性増強剤および医薬上許容される担体を含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療するための医薬組成物である。
【００１２】
さらに、本発明による肝細胞は、Ｓｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いるための肝細胞である。
【００１３】
さらに、本発明の他の態様による肝細胞は、活性を有する二量化Ｓｔａｔ３を構成的に形成しうるように改変されたＳｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いるための肝細胞である。
【００１４】
本発明によれば、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療を目的とする、新たな創薬手段および医薬が提供される。
【発明の具体的説明】
【００１５】
転写シグナル伝達／活性化因子−３（Ｓｔａｔ３）は、肝発生および肝再生の開始に関与する最も重要な分子の一つである。本明細書においては、Ｓｔａｔ３の肝保護効果を調べることを目的とするマウスを用いた実験により、Ｓｔａｔ３がＦａｓ媒介肝障害に対する保護をもたらすことが実証されている。より具体的には、次のような実験結果が得られている。まず、構成的に活性型のＳｔａｔ３（Ｓｔａｔ３−Ｃ）を、アデノウイルスベクターの静脈注射によりマウス肝臓中に過剰発現させ、次いで、致死量に満たないＦａｓアゴニスト（Ｊｏ２）を前記マウスに腹腔内投与した（０．３μｇ／体重ｇ）。Ｓｔａｔ３−Ｃにより、Ｊｏ２により誘発されるアポトーシスおよび細胞壊死の両方が劇的に抑制された。これに対し、肝臓特異的Ｓｔａｔ３ノックアウトマウスは、Ｊｏ２の投与後に死亡した。Ｓｔａｔ３−Ｃは、ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２の発現量を増加させ、従って、レドックス非依存性であるＦＬＩＣＥおよびカスパーゼ−３の活性を減少させた。興味深いことに、Ｓｔａｔ３−Ｃは、レドックス関連タンパク質レドックス因子−１（Ｒｅｆ−１）の発現量をも増加させ、酸化ストレスおよびレドックスに感受性のカスパーゼ−３の活性を抑制することにより、Ｊｏ２投与後の肝臓におけるアポトーシスを低減する。これらの知見によれば、Ｓｔａｔ３の活性化が、レドックス依存性または非依存性の機構におけるカスパーゼ活性の阻害により、Ｆａｓにより媒介される肝障害に対する保護をもたらすことが示される。
【００１６】
以上のような知見から、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物を同定する方法が提供される。
【００１７】
本明細書において「Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害」という用語は、肝細胞表面上に存在するＦａｓ抗原に対して作動薬（アゴニスト）として作用しうる物質、例えばＦａｓリガンド（ＦａｓＬまたはＣＤ９５Ｌとも呼ばれる）、によって誘導される肝アポトーシス（細胞死）に起因する肝障害を意味する。ここで、Ｆａｓ作動性物質が肝アポトーシスを誘導するときの作用機序は、Ｆａｓ作動性物質のＦａｓ抗原への結合を含むものだけでなく、Ｆａｓ作動性物質による反応性酸素種（酸化ストレス）の誘導を介するものであってもよい。このような肝障害としては、例えば、劇症肝炎、脂肪肝、肝硬変、黄疸肝等が挙げられる。また、本発明の好ましい実施態様によれば、前記肝障害はＦａｓ作動性物質により誘導される反応性酸素種に起因するものとされ、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、劇症肝炎、移植片対宿主病、アルコール性肝炎等とされる。
【００１８】
本明細書において「治療」という用語は、既に確立された病態を緩和することだけでなく、後に発症すると予想される病態を予防することをも意味する。
【００１９】
本発明の第一の態様による薬物同定法は、Ｓｔａｔ３の活性化を増強する能力を指標とするものであり、よって、該方法により同定される薬物は、Ｓｔａｔ３活性増強剤である。従って、この方法は以下の工程を含むものとされる：
（ａ１）Ｓｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程；および
（ｂ１）工程（ａ１）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度を測定する工程。
【００２０】
本発明の第一の態様による薬物同定法では、Ｓｔａｔ３の活性化が前記候補薬物により増強された場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される。
【００２１】
工程（ａ１）においては、内因性Ｓｔａｔ３遺伝子を有する細胞をそのままの形で用いることができるが、内因性Ｓｔａｔ３遺伝子の有無にかかわらず、Ｓｔａｔ３遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞を用いてもよい。Ｓｔａｔ３のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：ＢＣ０００６２７）に示されるヒトＳｔａｔ３の配列、ならびに配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０１１４８６）に示されるマウスＳｔａｔ３の配列が挙げられる。当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法（例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）を用いて、細胞を適切にトランスフェクトすることができる。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ１）において用いられる細胞は哺乳動物細胞とされる。このような哺乳動物細胞としては、様々なものが当技術分野において知られており、例えば、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＯＡＳ−２細胞等が挙げられる。また、ヒト、マウス等の哺乳動物の肝臓または肝臓生検サンプルから単離される肝細胞を用いてもよい。さらに、哺乳動物細胞において用いられる発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなるものである。
【００２３】
工程（ａ１）における培養は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、候補薬物と前記細胞とをインキュベートすることによって行なうことができる。また、候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件は、当業者に公知の方法によって達成することができ、例えば、トランスフェクションに用いた発現ベクター中のプロモーターを活性化することによって達成することができる。培養における培地、温度、時間、候補薬物の量、細胞の量、添加物などは、当業者であれば適切に選択することができる。
【００２４】
工程（ｂ１）において、Ｓｔａｔ３の活性化の強度は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、活性化されたＳｔａｔ３タンパク質を定量することによって測定することができる。例えば、Ｓｔａｔ３は、活性化されると、そのＣ末端領域においてリン酸化され、ホモ二量体を形成し、その後に細胞核内に移行してＤＮＡ（プロモーター）に結合することが知られている。従って、第一の好ましい方法では、Ｓｔａｔ３活性化の強度測定は、細胞内における二量化Ｓｔａｔ３タンパク質の量を測定することによって行なわれ、より具体的には、細胞からのタンパク質抽出物を電気泳動し、二量化Ｓｔａｔ３タンパク質を抗Ｓｔａｔ３（例えば、BD Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USAから市販されているもの）などによって検出することにより行なうことができる。この方法において、検出されたＳｔａｔ３タンパク質が二量体か否かは、電気泳動度によって判別することが可能である。また、第二の好ましい方法では、Ｓｔａｔ３活性化の強度測定は、細胞の核内におけるＳｔａｔ３タンパク質の量を測定することによって行なわれ、より具体的には、細胞核からのタンパク質抽出物を電気泳動し、Ｓｔａｔ３タンパク質を上記の抗Ｓｔａｔ３などによって検出することにより行なうことができる。さらに、第三の好ましい方法では、Ｓｔａｔ３活性化の強度測定は、細胞内においてＤＮＡに結合したＳｔａｔ３タンパク質の量（すなわち、Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合活性）を測定することによって行なわれ、より具体的には、プローブとして標識化されたＳＩＥ−ｍ６７オリゴヌクレオチド（5'-actgGGATTTTTCCCGTAAATGGTC-3'：配列番号５）を用いる電気泳動度移動アッセイによって測定することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記工程（ａ１）により得られる細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度が、候補薬物の不在下で培養された対照細胞におけるＳｔａｔ３の活性化の強度との比較において増強されている場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される。前記対照細胞は、候補薬物を添加しないことを除き、工程（ａ１）と同一の方法によって得ることができる。
【００２６】
本発明において、上記のＳｔａｔ３活性増強剤は、Ｓｔａｔ３によるＲｅｆ−１遺伝子発現を増強するものであることが好ましい。よって、本発明の第二の態様による薬物同定法は、Ｒｅｆ−１遺伝子の転写を促進するＳｔａｔ３の活性を増強する能力を指標とするものである。従って、この方法は以下の工程を含むものとされる：
（ａ２）Ｒｅｆ−１遺伝子プロモーターおよび機能しうる形で該プロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含んでなり、かつＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに、
（ｂ２）工程（ａ２）により得られる細胞における前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程。
【００２７】
本発明の第二の態様による薬物同定法では、前記レポーター遺伝子の発現量が前記候補薬物により増加した場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される。
【００２８】
本明細書において「レポーター遺伝子」という用語は、その発現産物の定量的な検出が可能な遺伝子を意味し、そのヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列が知られている遺伝子、その発現量に応じて強度の異なる信号（蛍光など）を発することのできる遺伝子などが挙げられる。従って、Ｒｅｆ−１遺伝子をレポーター遺伝子として用いることも可能である。本発明による好ましい実施態様によれば、前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子またはｌａｃＺ遺伝子とされる。
【００２９】
工程（ａ２）においては、内因性Ｓｔａｔ３遺伝子および内因性Ｒｅｆ−１遺伝子を有する細胞をそのままの形で用いることができるが、これら内因性遺伝子の有無にかかわらず、Ｓｔａｔ３遺伝子を発現するように、および／またはＲｅｆ−１遺伝子プロモーターおよび機能しうる形で該プロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含むように遺伝子操作された細胞を用いてもよい。Ｓｔａｔ３のアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：ＢＣ０００６２７）に示されるヒトＳｔａｔ３の配列、ならびに配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０１１４８６）に示されるマウスＳｔａｔ３の配列が挙げられる。また、Ｒｅｆ−１遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号６に示されるヒトＲｅｆ−１遺伝子プロモーターの配列が挙げられる。さらに、Ｒｅｆ−１タンパク質の遺伝子配列およびアミノ酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号７および配列番号８に示されるヒトＲｅｆ−１の配列、ならびに配列番号９および配列番号１０に示されるマウスＲｅｆ−１の配列が挙げられる。当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法（例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照のこと）を用いて、細胞を適切にトランスフェクトすることができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ２）において用いられる細胞は哺乳動物細胞とされる。このような哺乳動物細胞としては、様々なものが当技術分野において知られており、例えば、ＣＯＳ−７細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＯＡＳ−２細胞等が挙げられる。また、ヒト、マウス等の哺乳動物の肝臓または肝臓生検サンプルから単離される肝細胞を用いてもよい。さらに、哺乳動物細胞において用いられる発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなるものである。
【００３１】
工程（ａ２）における培養は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、候補薬物と前記細胞とをインキュベートすることによって行なうことができる。また、候補薬物の不在下で前記細胞がＳｔａｔ３遺伝子を発現しうる条件は、当業者に公知の方法によって達成することができ、例えば、トランスフェクションに用いた発現ベクター中のプロモーターを活性化することによって達成することができる。培養における培地、温度、時間、候補薬物の量、細胞の量、添加物などは、当業者であれば適切に選択することができる。
【００３２】
工程（ｂ２）において、レポーター遺伝子の発現量の測定は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、該遺伝子の発現産物であるタンパク質またはｍＲＮＡを定量することによって行なうことができる。レポーター遺伝子からのｍＲＮＡ量は、これに特異的なプライマーペアを用いるＲＴ−ＰＣＲによる増幅の後に電気泳動を行なう方法等により測定することができる。また、レポーター遺伝子からのタンパク質の量は、細胞から得られるタンパク質抽出物を電気泳動した後に該タンパク質に特異的な抗体を用いてこれを検出するイムノブロット法等により測定することができる。レポーター遺伝子として、その発現量に応じて強度の異なる信号（蛍光など）を発することのできる遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子などが用いられる場合には、その信号（蛍光など）の強度を測定することによりレポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様によれば、工程（ａ２）により得られる細胞における前記レポーター遺伝子の発現量が、候補薬物の不在下で培養された対照細胞における前記レポーター遺伝子の発現量との比較において増加している場合に、その候補薬物がＦａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療のための薬物として同定される。対照細胞は、候補薬物を添加しないことを除き、工程（ａ２）と同一の方法によって得ることができる。また、前記レポーター遺伝子の発現量の増加がＳｔａｔ３の活性化によるものであることは、Ｓｔａｔ３を発現しない細胞を用いて上記工程（ａ２）および（ｂ２）を実施することにより確認することができる。すなわち、Ｓｔａｔ３を発現しない細胞において、前記レポーター遺伝子の発現量が、Ｓｔａｔ３を発現する細胞に比べて減少した場合には、前記レポーター遺伝子の発現量の増加がＳｔａｔ３の活性化によるものであると判定することができる。このようなＳｔａｔ３を発現しない細胞としては、内因性Ｓｔａｔ３遺伝子を有さない細胞を使用するか、あるいは、内因性Ｓｔａｔ３遺伝子を有する細胞において該遺伝子をノックアウトまたはノックダウンしたものを使用することができる。遺伝子のノックアウトまたはノックダウンには、当業者に公知の方法、例えば、アンチセンス法、ＲＮＡ干渉によるｓｉＲＮＡ法（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）などの技術を用いることができる。
【００３４】
Ｓｔａｔ３活性増強剤は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いることができる。従って、本発明によれば、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療するための、Ｓｔａｔ３活性増強剤の使用が提供される。さらに、本発明によれば、治療上有効な量のＳｔａｔ３活性増強剤を被検者に投与することを含んでなる、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療するための薬剤の製造における、Ｓｔａｔ３活性増強剤の使用が提供される。本発明の好ましい実施態様によれば、前記Ｓｔａｔ３活性増強剤は、天然に存在する物質ではなく、合成物質などの非天然の物質とされる。
【００３５】
Ｓｔａｔ３活性増強剤は、本発明の第一の態様による薬物同定法によって同定することができる。また、Ｓｔａｔ３活性増強剤はＲｅｆ−１遺伝子の転写を促進するＳｔａｔ３の活性を増強するものであることが好ましく、これは、本発明の第二の態様による薬物同定法によって同定することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記Ｓｔａｔ３活性増強剤は、Ｓｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとされる。このような発現ベクターは、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列などを参照して、当技術分野において周知の標準的な技術によって製造することができる。また、前記発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなることができる。さらに、前記発現ベクターとしては、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることもできる。
【００３７】
他の好ましい実施態様によれば、前記Ｓｔａｔ３活性増強剤は、活性を有する二量化Ｓｔａｔ３を構成的に形成しうるように改変されたＳｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとされる。Ｓｔａｔ３は、通常、そのＣ末端領域におけるリン酸化によって活性化され、ホモ二量体を形成する。前記の「構成的に」という用語は、発現されたＳｔａｔ３が、このようなリン酸化を必要とせずにホモ二量体を形成し、活性化されることを意味する。このように改変されたＳｔａｔ３（変異型Ｓｔａｔ３）は、配列番号２に示されるヒトＳｔａｔ３のアミノ酸配列、配列番号４に示されるマウスＳｔａｔ３のアミノ酸配列等を参照して、Ｃ末端領域において２つのジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）が形成されるように設計することができる。例えば、マウスに由来する変異型Ｓｔａｔ３は、第６６１番アラニン残基および第６６３番アスパラギン残基（それぞれ、配列番号４中の第６６２番残基および第６６４番残基に相当）をともにシステイン残基に変更することにより設計することができる。また、ヒトに由来する変異型Ｓｔａｔ３も同様に、第６６１番アラニン残基および第６６３番アスパラギン残基（それぞれ、配列番号２中の第６６２番残基および第６６４番残基に相当）をともにシステイン残基に変更することにより設計することができる（Bromberg J. and Darnell J. E., 2000, The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function., Oncogene 19, 2468-2473）。さらに、このような変異型Ｓｔａｔ３を発現する発現ベクターは、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列などを参照して、当技術分野において周知の標準的な技術によって製造することができる。また、前記発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位、スプライス受容部位、ターミネーター、５’非翻訳領域等を適宜含んでなることができる。さらに、前記発現ベクターとしては、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることもできる。
【００３８】
Ｓｔａｔ３活性増強剤は、局所、静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、粘膜など、治療または予防しようとする疾患または障害に応じて適切な経路で投与することができる。また、これらの治療上の有効量は、症状の重篤度、被検者の年齢、用いられる具体的な薬物の有効性、投与経路、投与の頻度などに従って、医師または獣医によって適宜決定される。一般的には、前記治療上有効量は、一日当たり、約０．００１〜約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約１ｍｇ／体重ｋｇである。
【００３９】
Ｓｔａｔ３活性増強剤は、医薬上許容される担体とともに投与することができる。従って、本発明によれば、Ｓｔａｔ３活性増強剤および医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害を治療するために用いることができる。医薬上許容される担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、投与経路、用いられる具体的な薬物の性質などに応じて、当業者により適宜選択される。本発明による医薬組成物は、好ましくは、治療上有効量のＳｔａｔ３活性増強剤および医薬上許容される担体を含んでなるものとされる。
【００４０】
さらに、本発明によれば、Ｓｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる肝細胞、および活性を有する二量化Ｓｔａｔ３を構成的に形成しうるように改変されたＳｔａｔ３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを含んでなる肝細胞が提供され、これらの肝細胞は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いることができる。このような肝細胞は、それぞれの発現ベクターを用いて肝細胞をトランスフェクトすることにより作製することができる。また、トランスフェクトする肝細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物の肝臓または肝臓生検サンプルから単離される肝細胞、樹立された細胞株などを用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記肝細胞は、治療の対象となる個体に由来するものとされる。
【００４１】
本発明による肝細胞は、細胞医療の分野において一般に用いられる投与経路および治療上有効量で投与することができる。よって、投与経路は特に限定されるものではないが、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与、皮内投与または皮下投与、さらに好ましくは静脈内投与とされる。治療上有効量もまた特に限定されるものではなく、被験者の状態、例えば、患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して適宜決定されるが、肝細胞画分換算で、好ましくは５×１０５〜１０９個、より好ましくは０．５〜６０×１０６個、さらに好ましくは２〜２０×１０６個とされる。投与の時期もまた特に限定されるものではなく、上記疾患が発症する前または後など、どの時期でもよい。
【００４２】
また、本発明によれば、上記の疾患の治療用医薬の製造のための、本発明による肝細胞の使用が提供される。さらに、本発明によれば、本発明による肝細胞を含んでなる医薬組成物が提供され、該医薬組成物は、Ｆａｓ作動性物質により誘導される肝障害の治療に用いることができる。この医薬組成物は、上述の投与経路および投与量に応じて、または細胞医療における周知技術に従い、当業者によって適宜製造されうる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４４】
例１：レドックス依存性または非依存性機構による、Ｆａｓ誘導性肝障害のＳｔａｔ３による保護
本例における実験は、Ｆａｓ媒介肝障害に対するＳｔａｔ３の保護効果を調べることを目的とするものである。本実験では、構成的に活性型のＳｔａｔ３（Ｓｔａｔ３−Ｃ）をアデノウイルスベクターを用いて過剰発現させることにより、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬおよびレドックス因子−１（Ｒｅｆ−１）のタンパク質濃度が増加し、Ｆａｓ媒介肝障害が劇的に抑制されることが示されている。
【００４５】
１．材料および方法
アデノウイルスベクター
Ｓｔａｔ３−Ｃ構築物は、マウスＳｔａｔ３において、第６６１番のアラニン残基および第６６３番のアスパラギン残基をともにシステイン残基に置換し、さらにＦＬＡＧタグを付したものである。このＳｔａｔ３−Ｃ分子は、第７０５番のチロシン残基がリン酸化されなくても、二量体を形成することができる（Bromberg, J., and Darnell, J.E. 2000. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19:2468‐2473）。Ｓｔａｔ３−Ｃをコードする自己複製能欠損アデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＳ３−Ｃ）を構築した。不活性の細菌β−ｇａｌをコードするアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ）を対照ベクターとして用いた。完全長Ｒｅｆ−１をセンス方向でコードするアデノウイルス（ＡｄＲｅｆ）およびアンチセンス方向でコードするアデノウイルス（ＡｄＦｅｒ）は、文献に記載の方法に従って構築した（Ozaki, M., Suzuki, S., and Irani, K. 2002. Redox factor-1/APE suppresses oxidative stress by inhibiting the rac1 GTPase. FASEB J. 16:889‐890）。
【００４６】
動物実験
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを実験に用いた。アデノウイルスベクターは、実験の３日前に、尾の静脈内に投与した（３×１０８ＰＦＵ／匹）。複数種のウイルスベクターを用いる実験では、投与するアデノウイルスの総量を３×１０８ＰＦＵ／匹とした。２４時間の断食の後、マウスにＪｏ２抗体（０．３μｇ／体重ｇ；BD PharMingen, San Diego, California, USA）を腹腔内投与した。いくつかの実験において、実験の１時間前に、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（２００ｍｇ／体重ｋｇ）（Yamakawa, Y., et al. 2000. Interaction of platelet activating factor, reactive oxygen species generated by xanthine oxidase, and leukocytes in the generation of hepatic injury after shock/resuscitation. Ann. Surg. 231:387‐398）、および一般的なアポトーシス阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１μｇ／体重ｇ；Enzyme Systems Products Inc., Livermore, California, USA）（Daemen, M.A.R.C., et al. 1999. Inhibition of apoptosis induced by ischemia-reperfusion prevents inflammation. J. Clin. Invest. 104:541‐549）を腹腔内投与した。
【００４７】
初代培養肝細胞を用いた実験
初代培養肝細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓から、コラーゲナーゼ灌流法によって調製した。アデノウイルス感染の２４時間前に、肝細胞を３×１０６細胞／１０ｃｍ培養皿で播種した。ＡｄＬａｃＺまたはＡｘＣＡＳ３−Ｃを２ＭＯＩで感染させ、その４８時間後に２．５μｇ／ｍｌのＪｏ２を投与した。アデノウイルス感染の４８時間後に細胞を回収してタンパク質発現分析を行ない、Ｊｏ２投与の８時間後にアポトーシスアッセイを行なった。
【００４８】
ＬＳ３−ＫＯマウスの作製
Ｓｔａｔ３−ｆｌｏｘマウス（Takeda, K., et al. 1998. Stat3 activation is responsible for IL-6-dependent T cell proliferation through preventing apoptosis: generation and characterization of T cell-specific Stat3-deficient mice. J. Immunol. 161:4652‐4660）と、アルブミンプロモーターの制御下で肝臓のみにＣｒｅリコンビナーゼを発現するアルブミン−Ｃｒｅトランスジェニック（Ａｌｂ−Ｃｒｅ）マウス（Yakar, S., et al. 1999. Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:7324‐7329）とを交配させることにより、ＬＳ３−ＫＯマウスを作製した。Ｓｔａｔ３破壊の効率を増加させるため、Ｓｔａｔ３ヘテロノックアウト（Ｓｔａｔ３＋／−）マウス（Takeda, K., et al. 1997. Targeted disruption of the mouse Stat3 gene leads to early embryonic lethality. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:3801‐3804）との交配により、ｆｌｏｘ化アレル上にＳｔａｔ３ヌルアレルを導入した。まず、Ｓｔａｔ３＋／−マウスとＡｌｂ−Ｃｒｅマウスとを交配させてＳｔａｔ３＋／−，Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスを作製し、次いで、このマウスと、Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ化アレルのホモ接合体を有するマウス（Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）とを交配させた。得られたＳｔａｔ３ｆｌｏｘ／−，Ａｌｂ−ＣｒｅマウスをＬＳ３−ＫＯマウスとして用いた。同様の交配によって得られたＳｔａｔ３ｆｌｏｘ／−マウスを対照マウスとして用いた。
【００４９】
ウェスタンブロット分析
肝臓ホモジネートを遠心分離し、上清をアッセイに用いた。５０μｇのタンパク質を用いて１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。ニトロセルロース膜に転写したタンパク質を、適切な抗体：抗Ｆａｓ、抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂｃｌ−ＸＬ、抗サバイビン（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）、抗ＦＬＩＰ−ＣＴ（Cell Signaling Technology Inc., Beverly, Massachusetts, USA）、抗Ｒｅｆ−１、抗マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（抗ＭｎＳＯＤ；Transduction Laboratories, San Diego, California, USA）、抗チオレドキシン（BD PharMingen）、および抗ＦＬＡＧ（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA）とともにインキュベートした。
【００５０】
電気泳動度移動アッセイ
Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合活性を、プローブとしてＳＩＥ−ｍ６７オリゴヌクレオチド（5'-actgGGATTTTTCCCGTAAATGGTC-3'：配列番号５）を用いてアッセイした。反応混合物は、核タンパク質抽出物（５μｇ）、ＤＴＴ（２ｍＭ）、ｄＩ−ｄＣ（２μｇ）、ｓｓＤＮＡ（１０μｇ／ｍｌ）、および３２Ｐ標識ＳＩＥ−ｍ６７プローブ（５×１０５ｃｐｍ）を含むものとした。このサンプルを、０．２５×トリス−ホウ酸／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中、４℃において、５％ポリアクリルアミド未変性ゲル上で電気泳動した。
【００５１】
組織学実験
肝組織を採取して１０％緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに埋包された切片をＨ＆Ｅで染色した。Ｓｔａｔ３タンパク質の存在を免疫組織化学的に分析するため、サンプルを、２．５μｇ／ｍｌの一次抗体（抗Ｓｔａｔ３；BD Transduction Laboratories, Lexington, Kentucky, USA）とともに、４℃で一晩インキュベートし、その後、二次抗体（ビオチン結合抗マウスＩｇＧ）を添加した。
【００５２】
アポトーシスアッセイ
In situ Cell Death Detection Kit（Roche Diagnostics Corp., Basel, Switzerland）を用いて、肝組織のアポトーシスによる細胞死を分析した。パラフィンに埋包された肝臓サンプルを、キットに添付の説明書に従って、ＴＵＮＥＬ反応混合物とともにインキュベートした。また、Cell Death Detection ELISA PLUS（Roche Diagnostics Corp.）を用いて、アポトーシスを起こした細胞を定量的に評価した。このアッセイでは肝組織の溶解物をそのまま用い（４０μｇのタンパク質）、キットに添付の説明書に従ってアッセイを行なった。
【００５３】
カスパーゼ活性アッセイ
カスパーゼ−３、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９の活性は、それぞれ、CPP32/Caspase-3 Colorimetric Protease Assay Kit、FLICE/Caspase-8 Colorimetric Protease Assay Kit、およびCaspase-9/Mch6 Colorimetric Protease Assay Kit（いずれも、Medical and Biological Laboratories Co., Tokyo, Japan）を用いて測定した。肝臓ホモジネートの上清を調製し（５０μｌ中に２００μｇ）、アッセイの前に１時間、３７℃で基質と反応させた。
【００５４】
肝組織における肝活性酸素種アッセイ
肝組織における反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生を、２種の方法、すなわち、ルシゲニン−増強化学発光法および過酸化水素アッセイ（Ozaki, M., et al. 2000. Inhibition of the Rac1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo. FASEB J. 14:418‐429）によって測定した。灌流法によって肝細胞を単離した後、１００μｌの細胞懸濁液（１０５細胞）を１ｍｌのルシゲニン緩衝液（ＨＢＳＳ中の７５ｍＭルシゲニン）に添加した。化学発光シグナルを、５分おきに３０分間モニタリングした。放射光単位（ブランク試料の測定値を差し引き、１５分以上にわたって積算）を、スーパーオキシド産生の測定値とした。過酸化水素の産生は、Amplex Red Hydrogen Peroxide Assay Kit（Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA）を用いて測定した。肝臓ホモジネートの上清を用いて、キットに添付の説明書に従ってアッセイを行なった。ブランク試料の測定値を差し引いた後、赤色蛍光シグナルをタンパク質濃度によって標準化し、過酸化水素濃度（ｍｍｏｌ／タンパク質ｍｇとして表される）を標準曲線に基づいて算出した。
【００５５】
ｍＲＮＡ分析
マルチプローブ・リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを行なうため、目的とする遺伝子の転写産物の存在および内部対照であるＬ３２を、マルチプローブテンプレートセット（BD PharMingen）を用いて検出した。プローブの合成、ハイブリダイゼーション、およびＲＮアーゼ処理は、キットに添付の説明書に従って行なった。保護された転写産物を、変性４．７５％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって展開し、PhosphorImager（Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey, USA）を用いて定量した。
【００５６】
ノーザンブロット分析を行なうため、細胞から全ＲＮＡを抽出し、これを１．４％アガロースゲル上で電気泳動した。ＲＮＡをナイロン膜に転写し、３×１０７ｃｐｍの３２Ｐ標識一本鎖Ｒｅｆ−１ｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。この膜を洗浄した後、オートラジオグラフィーにて分析した。
【００５７】
一過性トランスフェクション実験およびルシフェラーゼレポーターアッセイ
ヒトＲｅｆ−１プロモーターを、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡからＰＣＲによってクローニングし（Grosch, S., Fritz, G., and Kaina, B. 1998. Apurinic endonuclease (Ref-1) is induced in mammalian cells by oxidative stress and involved in clastogenic adaptation. Cancer Res. 58:4410‐4416；Grosch, S., and Kaina, B. 1999. Transcriptional activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease (Ape, Ref-1) by oxidative stress requires CREB. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261:859‐863）、これをｐＧＬ３（Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA）中にクローン化した。ＨｅＬａ細胞を１．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、トランスフェクション試薬としてLipofectAMINE（Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA）を用い、添付の説明書に従ってトランスフェクションを行なった。Ｒｅｆ−１プロモーター遺伝子のトランスフェクションの４８時間後、アデノウイルスベクターを所定の様々なＭＯＩにて感染させた。アデノウイルス感染の３６時間後に、Bright-Glo luciferase assay system（Promega Corp.）を用い、添付の説明書に従ってルシフェラーゼ活性を評価した。それぞれのレポーターアッセイの結果は、３回の独立した実験において再現性を有するものと確認された。
【００５８】
統計学的分析
複数の群の間における差の分析にはフィッシャー検定を用い、９５％信頼区間にある場合に有意差があるものとした。各実験に用いた動物の数（ｎ）は括弧内に示した。
【００５９】
２．結果
ＡｘＣＡＳ３−Ｃを投与したマウスおよびＬＳ３−ＫＯマウスの肝臓におけるＳｔａｔ３の発現および活性
構成的に活性型のＳｔａｔ３遺伝子をコードするアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＳ３−Ｃ）を、マウスに静脈内投与（１×１０８ＰＦＵ／匹）した。
【００６０】
アデノウイルス感染の３日後、マウスの肝臓について、抗Ｓｔａｔ３および抗ＦＬＡＧのそれぞれを用いたイムノブロット分析、ならびに抗Ｓｔａｔ３を用いた免疫組織化学分析を行なった。抗Ｓｔａｔ３を用いたイムノブロット分析および免疫組織化学分析によれば、ＡｘＣＡＳ３−Ｃを接種したマウス（Ｓｔａｔ３−Ｃマウス）の肝臓中におけるＳｔａｔ３タンパク質の総量は、生理食塩水を接種したマウス（ＰＳマウス）およびＡｄＬａｃＺを接種したマウス（ＬａｃＺマウス）に比べて多いことが実証された。外来遺伝子から発現するＳｔａｔ３−Ｃタンパク質の発現は、Ｓｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓内における抗ＦＬＡＧの結合によって確認された。免疫組織化学分析によれば、ＰＳマウスおよびＬａｃＺマウスの肝臓からはＳｔａｔ３タンパク質はほとんど検出されなかったのに対し、Ｓｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓では、細胞質および核の双方においてＳｔａｔ３−Ｃタンパク質が検出された。これらの結果から明らかなように、ＡｘＣＡＳ３−Ｃの投与により、マウス肝臓中において構成的に活性型のＳｔａｔ３タンパク質（Ｓｔａｔ３−Ｃ）が良好に過剰発現した。また、このＳｔａｔ３−Ｃによる肝臓の異常な構造は見られなかった。
【００６１】
アデノウイルス感染の３日後、マウスの肝臓について、電気泳動度移動アッセイ（ＥＭＳＡ）を行なった。また、特異的なＳｔａｔ３のＤＮＡ結合を確認するため、冷やしたＳＩＥ−ｍ６７プローブおよび抗Ｓｔａｔ３を用いる競合アッセイおよびスーパーシフトアッセイを行なった。Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合活性は、ＰＳマウスにおける静止状態の肝臓では活性化されなかった。ＡｄＬａｃＺ感染はＳｔａｔ３のＤＮＡ結合活性を部分的にしか活性化しなかったのに対し、Ｓｔａｔ３−Ｃの過剰発現はそのＤＮＡ結合活性の強力な活性化をもたらした。
【００６２】
対照マウスおよびＬＳ３−ＫＯマウスの様々な組織について、ウェスタンブロット分析を行なった。ＬＳ３−ＫＯマウスの肝臓におけるＳｔａｔ３タンパク質の量は、Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ／−マウスの５％未満であったのに対し、他の様々な組織、すなわち、膵臓、腎臓、心臓、肺、脂肪組織、および骨格筋においては、対照マウスとＬＳ３−ＫＯマウスとの間でＳｔａｔ３発現量の差は見られなかった。
【００６３】
Ｆａｓアゴニストにより誘導される肝障害のＳｔａｔ３−Ｃによる抑制
Ｓｔａｔ３−Ｃの発現によりもたらされる肝臓は、ウイルス投与の３日後において、巨視的には正常な大きさおよび色を有しており、微視的には軽度の炎症細胞の浸潤が見られた。図１は、各種マウスに０．３μｇ／体重ｇのＪｏ２を腹腔内投与し、その後７２時間にわたってマウスの生存率を調べた結果を示す図である。ＦａｓアゴニストであるＪｏ２の投与により重篤な肝障害が誘導されたが、ＰＳマウスおよびＳｔａｔ３−Ｃマウスでは、投与後７２時間までに死亡する個体は見られなかった。ＬａｃＺマウスでは、全８匹のうちの３匹がＪｏ２投与後１２時間までに死亡し、ＬＳ３−ＫＯマウスでは、Ｊｏ２投与後１２時間の時点で全５匹が死亡した。
【００６４】
Ｊｏ２投与後６時間の時点で、肝臓の色は暗赤色に変化したが、マウスは生存していた。組織学的分析によれば、投与後６時間および２４時間の時点で、壊死を伴う広範囲の肝出血が見られ、投与後７２時間の時点で、重篤な好中球浸潤が見られた。Ｓｔａｔ３−Ｃの発現により、Ｆａｓ媒介肝障害が顕著に抑制された。その肝臓は、外見上、構造が保たれており、所々に赤色への変化が見られた。また、この肝臓では、微視的には、Ｊｏ２投与後６時間および２４時間の時点で顕著に少ない出血および壊死が観察された。
【００６５】
図２は、Ｊｏ２投与後７２時間にわたる、血清中におけるグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の濃度を示す図である。図２において、「＊」はＪｏ２（Ｆａｓアゴニスト）投与後２４時間の時点でのＬａｃＺマウスの測定値に対するＰ＜０．０１での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。ＧＯＴおよびＧＰＴの血清濃度は、ＬａｃＺマウスにおいて、Ｊｏ２投与後６時間および２４時間の時点で顕著に増加した。一方で、このようなＧＯＴ濃度およびＧＰＴ濃度の増加の程度は、Ｓｔａｔ３−Ｃマウスでは劇的に減少した。これらの実験結果によれば、Ｓｔａｔ３−ＣがＦａｓ媒介肝障害に対する耐性を提供することが証明される。
【００６６】
Ｆａｓアゴニストにより誘導されるアポトーシスのＳｔａｔ３−Ｃによる抑制
Ｓｔａｔ３の抗アポトーシス特性を確認するため、Ｊｏ２により誘導される肝アポトーシスを３種の異なる方法、すなわち、組織学的切片のＴＵＮＥＬ染色、ＤＮＡラダーアッセイおよびＥＬＩＳＡによって分析した。
【００６７】
ＴＵＮＥＬ染色の結果から、ＰＳマウス、ＬａｃＺマウスおよびＬＳ３−ＫＯマウスの肝臓においてＪｏ２投与の６時間後に観察された広範囲のアポトーシス細胞死は、Ｓｔａｔ３−Ｃの発現によって劇的に減少することが明らかとなった。また、Ｊｏ２投与の６時間後におけるＤＮＡラダーアッセイでは、ＰＳマウス、ＬａｃＺマウスおよびＬＳ３−ＫＯマウスからのサンプルは典型的なＤＮＡラダーパターンを示した。
【００６８】
図３は、一般的なカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１μｇ／ｇ）または抗酸化剤であるＮＡＣ（２００ｍｇ／ｋｇ）で予め処置し、その１時間後にアポトーシス細胞死をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す図である。図３において、「＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示し、「＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルおよびＳｔａｔ３−Ｃ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニストおよびカスパーゼ阻害剤投与サンプルならびにＬａｃＺ／ＦａｓアゴニストおよびＮＡＣ投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。
【００６９】
図４は、Ｆａｓアゴニスト投与後の肝アポトーシスに対するカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）または抗酸化剤（ＮＡＣ）の用量依存的な効果を示す図である。図４において、「＊」は未処理の対照サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示し、「＊＊」はＦａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊＊」はＦａｓアゴニスト投与およびカスパーゼ阻害剤投与（１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。
【００７０】
図３および図４によれば、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１μｇ／ｇ）またはＮＡＣ（２００ｍｇ／ｋｇ）で予め処置した場合には、Ｊｏ２により誘導される肝アポトーシスが顕著に阻害されるが、これら薬剤の用量を増やした場合でも、完全な阻害は認められないことが明らかとなった。しかしながら、図３によれば、これらの薬剤を同時に投与した場合には、より良好にアポトーシスが抑制され、その相乗的な抑制効果はＳｔａｔ３−Ｃに匹敵するものであることが明らかとなった。これらの結果によれば、活性化されたＳｔａｔ３は、カスパーゼに依存する作用機序および／またはレドックスに依存する作用機序によりＦａｓ媒介肝障害を抑制することが示される。
【００７１】
Ｓｔａｔ３−Ｃを発現する肝臓における抗アポトーシスタンパク質の誘導
Ｆａｓ媒介肝障害に作用するＳｔａｔ３の抗アポトーシス機構を解明するため、まず、アポトーシス関連タンパク質の発現を調べた。具体的には、ＰＳマウス、ＬａｃＺマウスおよびＳｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓組織における、Ｆａｓ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２およびサバイビンの発現量を調べ、さらには、Ｊｏ２（Ｆａｓアゴニスト）の投与前および投与後７２時間までのこれらタンパク質の発現量を調べた。過剰発現したＳｔａｔ３−Ｃは肝細胞におけるＦａｓの発現を抑制するのではなく、その発現量を増加させた。しかし、ＡｄＬａｃＺの感染により、Ｓｔａｔ３−Ｃマウスと同程度にＦａｓが誘導された。Ｓｔａｔ３−Ｃは、抗アポトーシス特性を有するＢｃｌファミリータンパク質（Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢｃｌ−２）を増加させたのに対し、アデノウイルスそのものはこれらのタンパク質を誘導しなかった。ＬａｃＺマウスにおいては、Ｊｏ２投与により、投与後２４時間の時点でＦａｓおよびＢｃｌ−ＸＬタンパク質が誘導されていた。Ｓｔａｔ３−Ｃは、いくつかの細胞型においてＳｔａｔ３により誘導されることが報告されているサバイビンタンパク質（Shen, Y., Devgan, G., Darnell, J.E., and Bromberg, J.F. 2001. Constitutively activated Stat3 protects fibroblasts from serum withdrawal and UV-induced apoptosis and antagonizes the proapoptotic effects of activated Stat1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:1543‐1548）の発現量に影響を与えなかった。
【００７２】
Ｓｔａｔ３−ＣによるＦＬＩＰタンパク質の誘導および活性化、ならびにその後のＦＬＩＣＥ活性およびカスパーゼ−３活性の減少
ＰＳマウス、ＬａｃＺマウスおよびＳｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓組織における、ＦＬＩＣＥおよびその活性型である切断型ＦＬＩＣＥ、カスパーゼ−３およびその活性型である切断型カスパーゼ−３、ならびにＦＬＩＰおよびその活性型である切断型ＦＬＩＰの発現量を調べ、さらには、Ｊｏ２（Ｆａｓアゴニスト）の投与前および投与後７２時間までのこれらタンパク質の発現量を調べた。また、図５は、各マウスの肝臓組織におけるカスパーゼ−３およびカスパーゼ−８の酵素活性アッセイの結果を示す図である。図５において、「＊」はＦａｓアゴニスト未投与のＬａｃＺサンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。
【００７３】
Ｓｔａｔ３−ＣマウスとＰＳマウスおよびＬａｃＺマウスとの比較によれば、Ｓｔａｔ３−ＣはＦＬＩＣＥタンパク質の発現を抑制し、さらには、ＦＬＩＣＥタンパク質の場合よりも少ない程度ではあるが、カスパーゼ−３の発現を抑制することが明らかとなる。ＬａｃＺマウスにおいて、ＦＬＩＣＥおよびカスパーゼ−３はともにＪｏ２投与後６時間の時点でプロセシングされて活性化されていたのに対し、Ｓｔａｔ３−Ｃは、Ｆａｓアゴニストによるこれらタンパク質の発現および活性化の両方を阻害した。ＦＬＩＰタンパク質もまたＳｔａｔ３−Ｃによって誘導され、これはＪｏ２投与後７２時間にわたって顕著に活性化されていた。ＦＬＩＰタンパク質は、ＰＳおよびＬａｃＺによっては誘導されなかった。Ｓｔａｔ３の主要なリガンドの一つであるＩＬ−６は、肝臓中のＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬの発現量を増加させることが報告されている（Kovalovich, K., et al. 2001. Interleukin-6 protects against Fas-mediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2, and Bcl-xL. J. Biol. Chem. 276:26605‐26613）。さらに、Ｓｔａｔ３−Ｃは、カスパーゼ阻害剤と同程度にカスパーゼ活性を抑制した。これらの実験結果によれば、Ｓｔａｔ３は肝臓におけるＩＬ−６関連抗アポトーシス作用において重要な役割を果たすことが示される。
【００７４】
Ｓｔａｔ３−Ｃによるレドックス関連タンパク質Ｒｅｆ−１の誘導
抗酸化剤であるＮＡＣでの前処理によりＦａｓ媒介肝アポトーシスが部分的に改善されたため（図３）、Ｓｔａｔ３−Ｃを過剰発現する肝臓におけるレドックス関連タンパク質の発現を調べた。具体的には、ＰＳマウス、ＬａｃＺマウスおよびＳｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓組織における、Ｒｅｆ−１、チオレドキシンおよびＭｎＳＯＤの発現量を調べ、さらには、Ｊｏ２（Ｆａｓアゴニスト）の投与前および投与後７２時間までのこれらタンパク質の発現量を調べた。Ｒｅｆ−１のタンパク質発現量は、Ｊｏ２投与の前において、Ｓｔａｔ３−Ｃにより顕著に増加していたのに対し、この発現量はＬａｃＺによりやや減少していた。増加したＲｅｆ−１タンパク質の量は、Ｊｏ２の投与後に減少した。この結果は、ＡｘＣＡＳ３−Ｃの投与後４８〜７２時間の時点でＳｔａｔ３−ＣによりＲｅｆ−１転写産物が誘導されたのに対し（下記の図７を参照）、ＰＳまたはＡｄＬａｃＺを投与したマウスの肝臓ではＲｅｆ−１転写産物が全く誘導されないという実験結果からも支持される。しかし、Ｓｔａｔ３−Ｃは、他の２つのレドックス関連タンパク質、チオレドキシンおよびＭｎＳＯＤの量には影響しなかった。ＭｎＳＯＤは、Ｓｔａｔ３−Ｃを過剰発現する肝臓においてＪｏ２投与後に一時的に増加し、このことから、Ｆａｓ媒介肝障害における酸化剤依存性の作用機序の存在が示唆される。これらの実験結果によれば、活性化されたＳｔａｔ３はマウス肝臓においてＲｅｆ−１の量を特異的に増加させることが示される。
【００７５】
Ｓｔａｔ３に関連するタンパク質の転写促進
ＰＳ（未処理）マウスならびにアデノウイルスによる遺伝子導入の４８時間後のＬａｃＺマウスおよびＳｔａｔ３−Ｃマウスの肝臓組織について、ＦＬＩＣＥ、ＦＬＩＰ、Ｆａｓ、Ｒｅｆ−１、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２を対象とするマルチプローブ・リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを行なった。図６は、未処理マウスについての定量値を１としたときの定量値の倍率を示す棒グラフである。図６において、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。
【００７６】
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果によれば、アデノウイルスによる遺伝子導入の４８時間後において、ＦａｓのｍＲＮＡの濃度がＬａｃＺおよびＳｔａｔ３−Ｃによって増加し、さらに、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２、ＦＬＩＰおよびＲｅｆ−１のｍＲＮＡの濃度が、Ｓｔａｔ３−Ｃによってのみ増加した（図６）。しかし、ＦＬＩＣＥのｍＲＮＡの濃度は、ＬａｃＺおよびＳｔａｔ３−Ｃによって変化しなかった。
【００７７】
Ｒｅｆ−１はその抗酸化特性および抗アポトーシス特性により肝障害の抑制において重要な役割を担っている可能性があるため（Ozaki, M., Suzuki, S., and Irani, K. 2002. Redox factor-1/APE suppresses oxidative stress by inhibiting the rac1 GTPase. FASEB J. 16:889‐890）、Ｒｅｆ−１のｍＲＮＡ発現をノーザンブロット分析により確認した。図７は、アデノウイルス感染後の各マウスの肝臓組織におけるＲｅｆ−１ｍＲＮＡ濃度の経時変化を示す図であり、各プロットは、各マウスについての感染前の測定値を１としたときの測定値の倍率を表している。
【００７８】
ノーザンブロット分析の結果によれば、Ｓｔａｔ３−Ｃは、ＡｘＣＡＳ３−Ｃ感染の４８〜７２時間後において、Ｒｅｆ−１タンパク質発現の前にＲｅｆ−１ｍＲＮＡ濃度を増加させたが（図７）、このようなＲｅｆ−１ｍＲＮＡ濃度の増加は、ＰＳまたはＡｄＬａｃＺを投与したマウスの肝臓ではほとんど見られなかった。
【００７９】
Ｒｅｆ−１の転写がＳｔａｔ３−Ｃによって促進されるか否かを調べるため、Ｓｔａｔ３−ＣによるＲｅｆ−１プロモーターの活性化を測定した。具体的には、ＡｘＣＡＳ３−ＣまたはＡｄＬａｃＺにより刺激されたＲｅｆ−１プロモーター活性について、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行なった。このアッセイでは、Ｒｅｆ−１プロモーターを含まないｐＧＬ３を対照として用いた。図８は、このアッセイの結果を示す棒グラフであり、各測定値は、アデノウイルスを感染させていないサンプルについての測定値を１としたときの倍率として表されている。図８において、「＊」は未感染サンプル（０ＭＯＩ）およびＬａｃＺ（２５ＭＯＩ）サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示し、「＊＊」は未感染サンプル（０ＭＯＩ）およびＬａｃＺ（１２５ＭＯＩ）サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。ＡｄＬａｃＺがＲｅｆ−１プロモーター活性を中程度に刺激したのに対し、Ｓｔａｔ３−Ｃは、Ｒｅｆ−１プロモーター活性を用量依存的に顕著に刺激した（図８）。
【００８０】
初代培養肝細胞におけるＳｔａｔ３の効果
Ｓｔａｔ３−Ｃが肝細胞を直接的に標的とするか否かを調べるため、初代培養マウス肝細胞を用いて実験を行なった。
【００８１】
図９は、初代培養肝細胞のアポトーシス細胞死のＥＬＩＳＡによる定量的測定結果を示す棒グラフである。図９において、「＊」はアデノウイルス未感染のＦａｓアゴニスト未投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。
【００８２】
外因性のＳｔａｔ３−Ｃは、初代培養肝細胞におけるＡｘＣＡＳ３−Ｃの２ＭＯＩでの感染により良好に発現し、Ｆａｓ誘導性アポトーシスを減少させた（図９）。Ｓｔａｔ３−Ｃでの処理により、初代培養肝細胞および肝臓において、Ｒｅｆ−１、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬのタンパク質が過剰発現した。この実験結果によれば、Ｓｔａｔ３は少なくとも肝細胞を直接的に標的とし、肝細胞に対する抗アポトーシス効果および抗酸化効果を有することが示される。
【００８３】
肝ＲＯＳ産生およびアポトーシスのＲｅｆ−１による減少をもたらすＳｔａｔ３−Ｃの効果
肝ＲＯＳ産生およびＦａｓ媒介肝障害におけるＲｅｆ−１の役割を調べるため、完全長Ｒｅｆ−１遺伝子のアンチセンス鎖をコードするアデノウイルスベクター（ＡｄＦｅｒ）をマウスに投与した。具体的には、マウスに、ＡｄＬａｃＺ単独、ＡｘＣＡＳ３−Ｃ：ＡｄＬａｃＺ（１：１）、およびＡｘＣＡＳ３−Ｃ：ＡｄＦｅｒ（１：１）をそれぞれ接種し、ＬａｃＺマウス、Ｓｔａｔ３−Ｃ：ＬａｃＺマウス、およびＳｔａｔ３−Ｃ：ＡｄＦｅｒ（Ｓｔａｔ３−Ｃ：Ｆｅｒ）マウスとした。
【００８４】
肝臓におけるＲｅｆ−１タンパク質およびＳｔａｔ３タンパク質についてのイムノブロット分析によれば、ＡｄＬａｃＺを同時感染させたＳｔａｔ３−ＣマウスではＲｅｆ−１タンパク質の量が増加したのに対し、ＡｄＦｅｒを同時感染させたＳｔａｔ３−ＣマウスではＲｅｆ−１タンパク質の量が減少した。ＬＳ３−ＫＯマウスの肝臓では、Ｒｅｆ−１タンパク質が発現していた。
【００８５】
図１０は、各種マウスにおける肝活性酸素種アッセイの結果を示す棒グラフである。図１０において、「＊」はＬａｃＺサンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊＊」はＳｔａｔ３−Ｃ：ＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示す。「Casp inh」はカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋを投与したことを意味し、「ＲＬＵ」は相対的光単位（relative light unit）を意味している。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。肝ＲＯＳはＪｏ２投与の１時間後に産生したが、これはＳｔａｔ３−ＣおよびＲｅｆ−１の過剰発現によって減少し、また、ＮＡＣでの前処理によっても減少した。しかし、ＲＯＳ産生量は、カスパーゼ阻害剤のみによっては変化しなかった。このようなＳｔａｔ３−Ｃの抗酸化効果は、ＡｄＦｅｒの同時感染によって部分的に低下した。Ｓｔａｔ３−Ｃは、Ｒｅｆ−１の誘導を介する抗酸化効果を有するものと考えられた（図１０）。
【００８６】
図１１は、各種マウスにおける肝組織のアポトーシスアッセイの結果を示す棒グラフである。図１１において、「＊」はＬａｃＺサンプルに対するＰ＜０．０１での有意差を示し、「＊＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示し、「＊＊＊」はＳｔａｔ３−Ｃ：ＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。ＦａｓアゴニストであるＪｏ２により誘導される肝アポトーシスは、ＮＡＣでの前処理によって抑制され、さらに、Ｓｔａｔ３−Ｃによっても抑制された。Ｓｔａｔ３−Ｃによるアポトーシスの抑制効果は、ＡｄＦｅｒの同時感染によって低下した（図１１）。
【００８７】
図１２は、各種マウスの肝臓におけるカスパーゼ−３、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９の酵素活性アッセイの結果を示す棒グラフである。図１２において、「＊」はＬａｃＺ／Ｆａｓアゴニスト投与サンプルに対するＰ＜０．０５での有意差を示す。また、各データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）として表されている。カスパーゼ活性アッセイの結果から、Ｒｅｆ−１およびＮＡＣは、カスパーゼ−３活性を同程度に低下させ、Ｊｏ２投与により誘導されたカスパーゼ−９活性を部分的に低下させるが、カスパーゼ−８活性は低下させないことが明らかとなった（図１２）。
【００８８】
Ｒｅｆ−１は、酸化ストレスを減少させることによりカスパーゼ活性（カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９）を低下させたものと考えられる。これらの結果から、Ｓｔａｔ３は、Ｒｅｆ−１の発現量を増加させ、これによりカスパーゼ−３およびカスパーゼ−９が不活性化され、その結果としてアポトーシスが抑制されるという、レドックス依存性の抗アポトーシス特性を有することが示される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、各種マウスに０．３μｇ／体重ｇのＪｏ２を腹腔内投与し、その後７２時間にわたってマウスの生存率を調べた結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｊｏ２投与後７２時間にわたる、血清中におけるグルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）の濃度を示す図である。
【図３】図３は、一般的なカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１μｇ／ｇ）または抗酸化剤であるＮＡＣ（２００ｍｇ／ｋｇ）で予め処置し、その１時間後にアポトーシス細胞死をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す図である。
【図４】図４は、Ｆａｓアゴニスト投与後の肝アポトーシスに対するカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）または抗酸化剤（ＮＡＣ）の用量依存的な効果を示す図である。
【図５】図５は、各マウスの肝臓組織におけるカスパーゼ−３およびカスパーゼ−８の酵素活性アッセイの結果を示す図である。
【図６】図６は、各種マウスにおける、ＦＬＩＣＥ、ＦＬＩＰ、Ｆａｓ、Ｒｅｆ−１、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２を対象とするマルチプローブ・リボヌクレアーゼプロテクションアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図７】図７は、アデノウイルス感染後の各マウスの肝臓組織におけるＲｅｆ−１ｍＲＮＡ濃度の経時変化を示す図である。
【図８】図８は、ＡｘＣＡＳ３−ＣまたはＡｄＬａｃＺにより刺激されたＲｅｆ−１プロモーター活性についてのルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図９】図９は、初代培養肝細胞のアポトーシス細胞死のＥＬＩＳＡによる定量的測定結果を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、各種マウスにおける肝活性酸素種アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、各種マウスにおける肝組織のアポトーシスアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、各種マウスの肝臓におけるカスパーゼ−３、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−９の酵素活性アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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