(57)【要約】リアルタイムＰＣＲ法において非特異反応を抑制する手法を開発し、本発明を完成させるに至った。【課題】【解決手段】標的核酸の特定配列の増幅に必要なプライマー対の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程において、ＰＣＲのいずれかのステップで増幅された核酸を複数回検出する工程を含むリアルタイムＰＣＲであって、使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする方法。 【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸の特定配列の増幅に必要なプライマー対の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程において、ＰＣＲのいずれかのステップで増幅された核酸を複数回検出する工程を含むリアルタイムＰＣＲであって、使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする方法。
【請求項２】
使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
【請求項４】
使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、請求項３記載のリアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の研究やその応用に重要な核酸増幅技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する。本発明は、遺伝子発現解析や塩基多型解析等に際して特に有用であり、研究のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、２種類のプライマーを用いて特定配列を増幅する手法である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４，１９８５年）。原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。一方、増幅された核酸を検出する手法として、広く電気泳動法やプローブハイブリダイゼーション法が用いられてきた。
【０００３】
近年、ＰＣＲを実施する工程において、同時に増幅された核酸を検出する「リアルタイムＰＣＲ」が広く実施されるようになってきた。その理由として、検出時間の短縮とともに、定量性の確保が挙げられる。ＰＣＲでは最終の増幅核酸量は基質量などで上限が規定されるが、ＰＣＲは極めて効率よく核酸を増幅させるため、一定以上の標的核酸では上限に達してしまい、最終の増幅核酸の量がもとの標的核酸の量に必ずしも比例しない事態が発生する。そこでＰＣＲを実施しながら増幅核酸を検出し、一定量以上の増幅核酸が検出されたサイクル数を指標とする定量方法が考案された。この方法によれば、４０サイクルのＰＣＲでは、理論上は最大２の３９乗（１０桁以上）のダイナミックレンジを確保することができる。
【０００４】
現在実施されている主なリアルタイムＰＣＲに、各種蛍光プローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ  ｄｙｅ）を用いる手法がある。プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（たとえば、特許文献１を参照。）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅなど、いくつかの方法が提案されている。その多くが蛍光エネルギー転移などの技術を利用して、増幅核酸の量に相関して蛍光が増減するように工夫されており、結合体と遊離体の分離をすることなく検出が可能であることから、リアルタイムＰＣＲに使用されるようになった。
【特許文献１】特表２００２−５０５０７１
【０００５】
一方、インターカレーター蛍光色素には、一般的にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）などが用いられている。２本鎖核酸に結合したときに強い蛍光を発するインターカレーターを共存させておくことで、増幅核酸の検出が可能になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここでは、目的核酸に依存しない増幅という意味で、他の配列での反応やプライマー同士の反応によるプライマーダイマーの発生等を「非特異反応」と呼ぶが、上記のようなリアルタイムＰＣＲでは、分離操作を行うことなく検出するため、増幅後に検出する従来の方法に比べてより非特異反応を抑える必要がある。特にインターカレーター法では、非特異反応産物も検出してしまうので、目的核酸のみの特異的な増幅は必須条件となる。非特異反応を抑制するために、温度等で特異的な反応のみが発生する条件を厳守することが重要であるが、こと温度に関しては、試薬調製時はどうしてもＰＣＲ時より低温に晒されざるを得ない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、リアルタイムＰＣＲ法において非特異反応を抑制する手法を開発し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）標的核酸の特定配列の増幅に必要なプライマー対の存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程において、ＰＣＲのいずれかのステップで増幅された核酸を複数回検出する工程を含むリアルタイムＰＣＲであって、使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする方法。
（２）使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、（１）記載の方法。
（３）使用するＤＮＡポリメラーゼが、高温に一定時間晒されることによってはじめてＤＮＡポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性を発揮することを特徴とする、リアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
（４）使用するＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体とコンジュゲイトを形成した状態である、（３）記載のリアルタイムＰＣＲ用試薬キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、リアルタイムＰＣＲにおいて非特異増幅反応を抑制し、検出感度や定量性を向上させることが明らかとなった。本発明の方法は従来の方法に比べて極めて迅速、簡便に実施することができ、リアルタイムＰＣＲを実施するものに経済的に多大の利益をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
プライマーなどの核酸は、低温になるほど一致した配列でなくとも結合しやすくなることから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において非特異反応を低減するためには、温度などの条件を厳密に調整する必要がある。しかしながら、ＰＣＲは通常、５０℃以上の高温で実施するのに対し、試薬調製時はどうしても室温に晒さざるを得ず、この際に発生した非特異反応が増幅するため問題になっていた。これを防ぐため、ＰＣＲの直前まで氷上で操作して、ポリメラーゼの活性を抑制するなどの対策が採られていたが、操作が困難になる上、完全ではなかった。
【００１１】
そこで、ＤＮＡポリメラーゼを化学修飾し、事前にポリメラーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性をブロックする方法が開発された（欧州特許７７１８７０、米国特許５６７７１５２、米国特許５７７３２５８）。この方法では、９５℃に１０分程度晒すことによって酵素活性が回復するので、試薬調製後、ＰＣＲ反応の前に９５℃で１０分インキュベートする工程を加えることで、ＰＣＲまでポリメラーゼによる反応を抑制することができる。ただ、特に迅速性が特徴のリアルタイムＰＣＲでは、更にこの１０分の工程を短縮することが重要となっていた。
【００１２】
本発明者らは鋭意研究の結果、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体でＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインやエキソヌクレアーゼ活性ドメインをブロックすることでリアルタイムＰＣＲの非特異反応を抑制する方法を確立し、本発明を完成させるに至った。本発明の優位点は、ほぼ１００％酵素活性をブロックすることができることと、ごく短時間で酵素活性を回復させることである。９０℃で３０秒もインキュベートすれば交代は完全に変性し、酵素活性はほぼ完全に回復する。したがって、酵素再活性化の工程を特に設ける必要はなく、ＰＣＲの変性工程で十分に酵素活性は回復できるので、時間が節約され、酵素のダメージを少なくできるので使用量も減らすことができる。本技術は通常のＰＣＲでは既に使用されていたが、本発明者らは初めてリアルタイムＰＣＲにこれを適用することに成功した。
【実施例】
【００１３】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１４】
実施例１  インターカレーター検出によるリアルタイムＰＣＲへの適用
（１）ヒトベータアクチン遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー１と示す）および配列番号２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー２と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
【００１５】
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、蛍光インターカレーターとしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。その際、（Ａ）はそのままだが、（Ｂ）のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー１                                  ２ｐｍｏｌ
プライマー２                                  ２ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                                  １μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          １．２μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                            １μＬ
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（３０００倍希釈）    １μＬ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ                    ０．５Ｕ
サンプル                                      １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを５倍毎に希釈した溶液（５本）と、ブランクとしての蒸留水（２本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  -α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【００１６】
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・３０秒
９５℃・０秒、６０℃・０秒、７２℃・３０秒（４０サイクル）
【００１７】
（４）結果
図１および図２に示すような結果が得られた。
【００１８】
【表１】
2005176767.tif 000002
【００１９】
抗体を加えていない（Ａ）では、図１の増幅曲線ようにブランクサンプルでもシグナルの上昇が見られた。図３の融解曲線解析で、本来のＰＣＲ産物が９２℃付近にピークを形成するのに対し、ブランクサンプルでは８４℃付近にピークが見られ、これが非特異反応産物であるプライマーダイマーであることが確認された。また、陽性サンプルでも一部にプライマーダイマーのピークが見られた。これに対して、本発明を適用した（Ｂ）では図２のようにブランクサンプルでシグナルの上昇が見られず、図４融解曲線解析でもブランクサンプル、陽性サンプルともにプライマーダイマーのピークが見られなかった。これらの結果から、非特異反応を完全に抑制したことがわかる。更に、希釈系列の増幅曲線が（Ａ）では不均一であるのに対し、（Ｂ）では等間隔に並んでいることは、核酸定量アッセイに必須の「直線性」が優れていることを示している。本発明が、非特異反応の抑制と、直線性の向上に大きく寄与することが示された。
【００２０】
さらに、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、表１に示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。また、図１、図２に示された横線が閾値を示している。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。表１に示す通り、本発明を採用しなかった（Ａ）では、ブランクサンプルでもＣｔ値が算出され、陽性サンプルも本来一定であるはずの希釈系列のＣｔ値の間隔がばらついているのに対し、本発明を採用した（Ｂ）では、ブランクサンプルではＣｔ値が算出されず、陽性サンプルもＣｔ値の間隔が一定である。これらの結果から、本発明の効果が明らかとなった。
【００２１】
実施例２  化学修飾ポリメラーゼとの比較
（１）ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー４と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
【００２２】
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
（Ａ）では、化学修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた他社キットでＰＣＲ試薬を調製した。詳細は取扱説明書に従った。（Ｂ）では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡、コードＴＡＰ−２０１）、抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。この際、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー３                                  ２ｐｍｏｌ
プライマー４                                  ２ｐｍｏｌ
×１０緩衝液                                  １μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                          １．２μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                            １μＬ
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（３０００倍希釈）    １μＬ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ                    ０．５Ｕ
サンプル                                      １μＬ
サンプルは、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを３倍毎に希釈した溶液（３本）と、ブランクとしての蒸留水（１本）である。ｃＤＮＡの作製にはＭＭＬＶ由来の逆転写酵素を用いたｃＤＮＡ合成キット（「ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  -α−」、東洋紡、コードＦＳＫ−１０１）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【００２３】
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００TM（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９５℃・１分あるいは１０分
９５℃・１５秒、６０℃・６０秒（４０サイクル）
【００２４】
（４）結果
下記表２に示すような結果が得られた。本実施例では、増幅曲線と融解曲線の提示は省略する。
【００２５】
【表２】
2005176767.tif 000003
【００２６】
表２では、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。化学修飾Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを採用した（Ａ）では、ＰＣＲサイクル前の工程（ｐｒｅＰＣＲ）が９５℃・１分では十分にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが活性化されず、低濃度域ではＣｔ値が算出すらされなかった。９５℃・１０分では活性化されて、増幅が確認できた。これに対して本発明を適用した（Ｂ）では、９５℃・１分でも１０分でも全く問題なく希釈系列に比例した増幅が確認され、極めて短時間でも十分に活性化されていることが示された。実施例１に示すように９５℃・３０秒でも全く問題なく使用できることから、その迅速性は明らかである。
【００２７】
実施例３  ワンステップＲＴ−ＰＣＲへの適用
（１）ヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプライマーの合成
配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー３と示す）および配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマー４と示す）を合成した。合成はプロリゴ・ジャパン株式会社に依頼した。
【００２８】
（２）リアルタイムＰＣＲ試薬の調製
ワンステップＲＴ−ＰＣＲキットである「ＲＴ−ＰＣＲ  ｈｉｇｈ  Ｐｌｕｓ」（東洋紡、コードＰＣＲ−３０１）、抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（東洋紡、コードＴＣＰ−１０１）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。この際、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼには抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（本品はＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼにも不完全ながら効果があることを確認している）を２．５Ｕあたり１μｇ投入し、緩やかに混和しておく。
プライマー３                                  ４ｐｍｏｌ
プライマー４                                  ４ｐｍｏｌ
×５緩衝液                                    １μＬ
２５ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２                    １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                        １．２μＬ
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（３０００倍希釈）    １μＬ
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ                    １Ｕ
サンプル                                      １μＬ
サンプルは、キットに添付されたコントロールＲＮＡを５倍毎に希釈した溶液（４本）と、ＨｅＬａ細胞（ヒト由来の細胞）ＲＮＡを５倍毎に希釈した溶液（３本）、ブランクとしての蒸留水（１本）である。
【００２９】
（３）リアルタイムＰＣＲの実施
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを実施した。詳細は機器の取扱説明書に従った。
増幅条件
９０℃・３０秒
６０℃・３０分
９５℃・３０秒
９５℃・０秒、６０℃・０秒、７２℃・３０秒（４０サイクル）
【００３０】
（４）結果
下記表３に示すような結果が得られた。本実施例では、増幅曲線と融解曲線の提示は省略する。
【００３１】
【表３】
2005176767.tif 000004
【００３２】
表３では、増幅曲線からＣｔ値（増幅曲線が閾値を越えた点のサイクル数）を算出し、示した。空欄は増幅曲線が閾値を越えなかったことを示す。Ｃｔ値は一般的にリアルタイムＰＣＲで核酸の定量を行う場合の指標として使用され、重要な数値である。本発明を使用しなかった（Ａ）では、プライマーダイマーと思われる非特異増幅産物が検出されるため、ブランクサンプル、陽性サンプルともに１４〜１５のＣｔ値が算出され、濃度依存的な数値が得られなかったのに対し、本発明を採用した（Ｂ）では、濃度依存的なＣｔ値が得られ、実質的に定量が可能となった。ブランクサンプルで３２．５５と、非特異反応を完全に抑制するにはいたらなかったが、本発明がＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼにも効果を発揮し、ワンステップＲＴ−ＰＣＲへも適用が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によって、ＲＮＡの定量や一塩基多型のタイピングなどを迅速・正確に実施することが可能となり、ポストゲノムの生物学研究に貢献することができるばかりでなく、臨床検査や食品分析など幅広い用途分野に利用することが出来、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１（Ａ）本願発明を採用しない場合の増幅曲線。ブランクの曲線も上昇し、最も薄い陽性サンプルとの識別が困難となっている。
【図２】実施例１（Ｂ）本願発明を採用した場合の増幅曲線。ブランクの曲線では上昇が全く見られない。
【図３】実施例１（Ａ）本願発明を採用しない場合の融解曲線。本来のＰＣＲ産物（９２℃付近）に加え、ブランクと一部の陽性サンプルでプライマーダイマーと思われる非特異増幅産物（８４℃付近）が確認された。
【図４】実施例１（Ｂ）本願発明を採用した場合の融解曲線。本来のＰＣＲ産物（９２℃付近）以外に増幅産物は確認されない。
【図１】
2005176767.tif 000005
【図２】
2005176767.tif 000006
【図３】
2005176767.tif 000007
【図４】
2005176767.tif 000008
【配列表】
2005176767000001.app