(57)【要約】    【課題】  ＣＤ４５、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ及びＰＴＰ−ＴＣ等のチロシンホスファターゼ活性を阻害する、糖尿病、免疫機能不全、増殖障害、脳疾患、各種アレルギー、自己免疫疾患、腫瘍性疾患、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の治療並びにＴ細胞増殖調整、発ガン予防等に有用な新規チロシンホスファターゼ阻害剤を提供すること。    【解決手段】  細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）の乾燥粉末を含有してなる、ＣＤ４５、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ、及びＰＴＰ−ＴＣを含むチロシンホスファターゼの阻害剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるチロシンホスファターゼ阻害剤。
【請求項２】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＣＤ４５阻害剤。
【請求項３】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＰＴＰ１Ｃ阻害剤。
【請求項４】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項５】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＰＴＰ−ＴＣ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レセプター型の膜貫通チロシンホスファターゼであるＣＤ４５、非膜貫通の細胞質型チロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ、及び４８ｋＤａＴ−細胞チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ−ＴＣ）等のチロシンホスファターゼを阻害するためのチロシンホスファターゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レセプター型の膜貫通チロシンホスファターゼであるＣＤ４５は、Ｔ−細胞レセプターが副次的メッセンジャー経路と結合してＩＬ−２を産生し、Ｔ−細胞が特定の抗原に対して増殖反応を示す上で、必須であることが示されている。ＣＤ４５のチロシンホスファターゼ活性の阻害は、免疫調整因子としての役割を果し、腫瘍性疾患、糖尿病、免疫機能不全、増殖障害、脳疾患、各種アレルギー、自己免疫疾患等の治療や、発ガン予防等に有用であると考えられる。
【０００３】
細胞質型チロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｃは、ＨＣＰ、ＳＨＰ、ＳＨ−ＰＴＰ１としても知られており、二つのｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２（ＳＨ２）ドメインが含まれている。ＳＨ２ドメインには二つの役割があるものと考えられている。一つは活性化（すなわち、自己リン酸化成長因子レセプター上において、細胞質信号伝達分子と特定のホスフォチロシル残基との間の相互作用を促進する促進因子としての役割であり、もう一つはホスファターゼ活性の自己調整因子としての役割である。その機能は免疫調整作用と関連しており、ＰＴＰ１Ｃの阻害は、自己免疫疾患の治療に有用であると考えられる。
【０００４】
細胞質型のチロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｂは、単一の触媒性ドメインと疎水性カルボキシルターミナル部で構成されており、後者は酵素を小胞体に位置させる役目を果たす。ＰＴＰ１Ｂは、チロシンキナーゼのリン酸化状態をコントロールすることによって、チロシンキナーゼの調整に関与している。ＰＴＰ１Ｂは卵巣癌や乳癌等のいくつかの腫瘍性疾患、糖尿病、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病等と関連性があり、ＰＴＰ１Ｂの阻害は、卵巣癌や乳癌等の腫瘍性疾患、糖尿病、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
４８ｋＤａ細胞質型のチロシンホスファターゼであるＴ−細胞チロシンホスファターゼ（以下、ＰＴＰ−ＴＣとも言う。）は、各種のキナーゼと共に、細胞質信号伝達、細胞成長、及び分化にとって必要なリン酸化作用の臨界レベルを調整している。ＰＴＰ−ＴＣは４８ｋＤａ細胞質型ホスファターゼであり、単一の触媒性ドメインと非触媒性Ｃ−ターミナル部で構成されており、後者はホスファターゼ活性の調整と位置限定に重要な役割を果している。ＰＴＰ−ＴＣの阻害は、Ｔ細胞増殖調整剤として有用であると考えられる。
【０００６】
プロテインチロシンホスファターゼ阻害作用を有する化合物としては、特許文献１記載のピロール化合物のほか、特許文献２及び特許文献３にそれぞれ記載された化合物が知られているが、多様な局面で、ＣＤ４５、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ及びＰＴＰ−ＴＣ等のチロシンホスファターゼ活性を阻害する上で、更なるＣＤ４５、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ及びＰＴＰ−ＴＣ等のチロシンホスファターゼを阻害するチロシンホスファターゼ阻害剤に対する要望は強い。
【特許文献１】特開２００２−１２１１８６号公報
【特許文献２】ＷＯ９９／４６２４４
【特許文献３】ＷＯ９９／５８５２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来技術に存した上記のような課題に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、ＣＤ４５、ＰＴＰ１Ｃ、ＰＴＰ１Ｂ及びＰＴＰ−ＴＣ等のチロシンホスファターゼ活性を阻害する新規チロシンホスファターゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、レセプター型の膜貫通チロシンホスファターゼであるＣＤ４５、非膜貫通型チロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｃ、細胞質型のチロシンホスファターゼであるＰＴＰ１Ｂ、及び、４８ｋＤａ細胞質型のチロシンホスファターゼであるＴ−細胞チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ−ＴＣ）等のチロシンホスファターゼを阻害する上で有用な物質について研究を行った結果、本発明を完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明のチロシンホスファターゼ阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してチロシンホスファターゼを阻害する方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明のＣＤ４５阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＣＤ４５を阻害する方法を提供するものである。
【００１１】
更に、本発明のＰＴＰ１Ｃ阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＰＴＰ１Ｃを阻害する方法を提供するものである。
【００１２】
また本発明のＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＰＴＰ１Ｂを阻害する方法を提供するものである。
【００１３】
また更に本発明のＰＴＰ−ＴＣ阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＰＴＰ−ＴＣを阻害する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のチロシンホスファターゼ阻害剤は、本発明のＣＤ４５阻害剤は、ＣＤ４５のチロシンホスファターゼ活性を阻害し免疫調整因子としての役割を果し、腫瘍性疾患、糖尿病、免疫機能不全、増殖障害、脳疾患、各種アレルギー、自己免疫疾患等の治療や、発ガン予防に有用である。また、本発明のＰＴＰ１Ｃ阻害剤は、自己免疫疾患の治療に有用である。更に、本発明のＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、卵巣癌や乳癌等の腫瘍性疾患、糖尿病、肥満症、アルツハイマー病、パーキンソン病等の治療に有用である。また更に、本発明のＰＴＰ−ＴＣ阻害剤は、Ｔ細胞増殖調整剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００１６】
本発明のチロシンホスファターゼ阻害剤（ＣＤ４５阻害剤、ＰＴＰ１Ｃ阻害剤、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及びＰＴＰ−ＴＣ阻害剤を含む。以下同じ。）におけるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００１７】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００１８】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
【００１９】
本発明のチロシンホスファターゼ阻害剤は、経口適用が望ましい。経口適用の形態に特に限定はないが、好ましくは、栄養食品、栄養補助食品、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、又は飲料用液体の形態である。
【００２０】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００２１】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００２２】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００２３】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２４】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００２５】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００２６】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【実施例】
【００２７】
クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）乾燥粉末の製造
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］  WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末（株式会社サン・クロレラ製の細胞壁破砕クロレラ粉末）が得られた。
【００２８】
ＣＤ４５阻害活性の測定
fynキナーゼにより燐酸化された基質ポリ（Glu:Tyr,4:1）（Ｓｉｇｍａ［米国］から入手）を用いてマイクロプレートウエルを一夜コートした。反応は、室温で、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒並びにイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．２）によるＣＤ４５（MDS Pharma Services［米国］から入手したヒト組替えＣＤ４５）の適切な濃度の希釈液を加えることにより開始し、２０分間行った。
【００２９】
Spectrafluor Plus（Ｔｅｃａｎ［オーストリア］) を用いてpoly (Glu: Tyr〜P)のELISA定量により測定を行ったところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）によるＣＤ４５の５０％阻害濃度は、０．６７８μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ミリリットル）であった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサは強いＣＤ４５阻害作用を有していた。
【００３０】
ＰＴＰ１Ｃ阻害活性の測定
fynキナーゼにより燐酸化された基質ポリ（Glu:Tyr,4:1）（Ｓｉｇｍａ［米国］から入手）を用いてマイクロプレートウエルを一夜コートした。反応は、室温で、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒並びにイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．２）によるＰＴＰ１Ｃ（ＵＢＩ［米国］から入手）の適切な濃度の希釈液を加えることにより開始し、３０分間行った。
【００３１】
Spectrafluor Plus（Ｔｅｃａｎ［オーストリア］) を用いてpoly (Glu: Tyr〜P)のELISA定量により測定を行ったところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）によるＰＴＰ１Ｃの５０％阻害濃度は、１．５６μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサは強いＰＴＰ１Ｃ阻害作用を有していた。
【００３２】
ＰＴＰ１Ｂ阻害活性の測定
基質チロシンホスフォペプチド（ＵＢＩ［米国］から入手）を用いてマイクロプレートウエルを一夜コートした。反応は、室温で、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒並びにイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．２）によるＰＴＰ１Ｂ（ＵＢＩ［米国］から入手）の適切な濃度の希釈液を加えることにより開始し、３０分間行った。
【００３３】
Spectrafluor Plus（Ｔｅｃａｎ［オーストリア］) を用いてチロシンホスフォペプチドのELISA定量により測定を行ったところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）によるＰＴＰ１Ｂの５０％阻害濃度は、６５．３μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサはＰＴＰ１Ｂ阻害作用を有していた。
【００３４】
ＰＴＰ−ＴＣ阻害活性の測定
基質チロシンホスフォペプチド（ＵＢＩ［米国］から入手）を用いてマイクロプレートウエルを一夜コートした。反応は、室温で、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒並びにイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．２）によるＰＴＰ−ＴＣ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ［米国］から入手）の適切な濃度の希釈液を加えることにより開始し、３０分間行った。
【００３５】
Spectrafluor Plus（Ｔｅｃａｎ［オーストリア］) を用いてチロシンホスフォペプチドのELISA定量により測定を行ったところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）によるＰＴＰ−ＴＣの５０％阻害濃度は、１１４μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサはＰＴＰ−ＴＣ阻害作用を有していた。