(57)【要約】【課題】  メルカプト基を有する疑似塩基をヌクレオシド又はヌクレオチドに導入した非天然核酸を合成し、これらを組み込んだＤＮＡは、天然のＤＮＡにおけるプリン―ピリミジン塩基対の水素結合より結合力が強い共有結合であるジスルフィド結合で二重らせん構造を形成すること。本非天然核酸の DNA 配列内への導入は、熱に対する安定性を高めると共に、酸化還元条件によりジスルフィド結合の形成・解除を容易に行うことができ、転写、複製を制御し、遺伝子のメカニズムの解明に利用可能とする。【解決手段】  一般式（Ｉ）［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3は、水素原子、又はメルカプト基の保護基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。【化１】2005162650.tif 000027【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2005162650.tif 000019
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基を示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基、又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。
【請求項２】
一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有する水酸基が、ジメトキシトリチルオキシ基であることを特徴とする請求項１記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。
【請求項３】
一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基が、一般式（II）
【化２】
2005162650.tif 000020
［式中、Ｒ8は、置換基を有していてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ9は置換基を有していてもよいアミノ基を示す。］で表される基であることを特徴とする請求項１又は２記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。
【請求項４】
一般式（Ｉ）におけるＲ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つが保護されたメルカプト基であり、その保護基はベンゾイル基、ターシャリーブチル基、２−ニトロフェニルスルフィド基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。
【請求項５】
一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシドが、１−β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２−デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド。
【請求項６】
一般式（III）
【化３】
2005162650.tif 000021
［式中、Ｒ10、Ｒ11は、ヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基を示し、Ｒ12は、ヌクレオシド合成のための官能基を示す。］で表されるデオキシリボース系化合物と、一般式（IV）
【化４】
2005162650.tif 000022
［式中、Ｒ13〜Ｒ18のうち少なくとも１つはヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるアリールチオールとを、カップリング剤存在下、溶媒中で反応させ、一般式（Ｖ）
【化５】
2005162650.tif 000023
［式中、Ｒ10及びＲ11は、一般式（III）におけるＲ10及びＲ11とそれぞれ同じ基を示し、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。］で表される化合物を得る工程を有することを特徴とするＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項７】
一般式（III）におけるＲ10、Ｒ11が示すヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基が、トルオイルオキシ基であることを特徴とする請求項６記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ18のうち少なくとも１つが示すメルカプト基の保護基が、フェニルチオ基であることを特徴とする請求項５又は６記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項９】
カップリング剤として、ルイス酸を用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項１０】
溶媒として、ジクロロメタン、ジクロロエタンを用いることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項１１】
一般式（Ｖ）で表される化合物を、溶媒中で水素化リチウムアルミニウムと接触させることにより、式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ13で表される保護基を脱保護し、一般式（VI）
【化６】
2005162650.tif 000024
［式中、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（Ｖ）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。但し、これらのうち、一般式（Ｖ）においてヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示す基は、脱保護されたメルカプト基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシドを得る工程を有することを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項１２】
水素化リチウムアルミニウムを用いて一段階で脱保護することを特徴とする請求項１１記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法。
【請求項１３】
一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシドと、溶媒と過酸化水素存在下、もしくは酸素雰囲気下で反応させることを特徴とするＣ−ヌクレオシドの二量体の製造方法。
【請求項１４】
一般式（Ｉ）
【化７】
2005162650.tif 000025
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが１つ又は２つ以上組み込まれた一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが、１’−β（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２’−デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１４記載の一本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
一般式（Ｉ）
【化８】
2005162650.tif 000026
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが１つ又は２つ以上組み込まれた１対の一本鎖ポリヌクレオチドを有し、該１対の一本鎖ポリヌクレオチドがジスルフィド結合を有する二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
酸化還元条件を変化させることにより、ジスルフィド結合の形成・解除が可能であることを特徴とする請求項１６記載の二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが、１’−β（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２’−デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１６記載の二本鎖ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドや、その製造方法、新規なＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレイチドが組み込まれた一本鎖ポリヌクレオチドや二本鎖ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヌクレオシド類やオリゴヌクレオチド類は、抗ウイルス活性等の生物活性成分として注目されており、合成ヌクレオシド類や合成オリゴヌクレオチド類の研究が行われている。抗ウイルス活性を有する合成ヌクレオシドとしては、例えば、２' −ＯＨ基がエタノール又はフルオロアルキル基によってエーテル化されたリボヌクレオシド類似化合物が知られており、この合成ヌクレオシドは医薬品として用いることができ、また、それを含むオリゴヌクレオチドは、核酸との相互反応のために有効な生物学的活性を有し、薬学的に活性な成分又は診断薬として使用し得ることが知られている（特許文献１参照。）。また、抗エイズ活性を有する合成ヌクレオシドとして、ビシクロヌクレオシド類縁体が知られており、例えば、ビシクロヌクレオシド類縁体を含有する核酸試薬（特許文献２参照。）や、３' −４' 架橋ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体を含有する核酸試薬（特許文献３参照。）や、Ｎ３' −Ｐ５' 結合を有する２' ，４' −ＢＮＡオリゴヌクレオチド（特許文献４参照。）や、２' ，５' −オリゴアデニル酸類縁体（特許文献５参照。）が提案されている。
【０００３】
また、天然ＤＮＡの塩基を機能性分子に置き換えることにより人工遺伝子制御に関連する遺伝子暗号を拡張する努力がなされており、金属を介する塩基対及び塩基内の疎水性相互作用に依存する二重らせん形成に関する研究について報告がなされている。チオール基を有する抗ウイルス活性を有する化合物としては、６−メルカプトプリンが知られており、この６−メルカプトプリンは、抗腫瘍剤、特に白血病治療剤として使用されている（非特許文献１参照。）。しかしながら、骨髄機能抑制、肝障害といった副作用が強く、安全域が狭いという難点があり、また、６−メルカプトプリンは水に不溶であるため、非経口投与ができず、経口投与した場合も、消化管から５０％程度しか吸収されず、吸収効率が悪いという改善点があり、これを改良した６−メルカプトプリン誘導体及びその製法も提案されている（特許文献６，７参照。）。
【０００４】
一方、生理学的条件下で切断することができるジスルフィド結合を利用した、in situおよびin vivoでの組織内の実細胞中へのポリヌクレオチドや生理活性化合物の導入に関する研究も進められている。ジスルフィド結合を有した化合物としては、生理学的条件下で反応活性が高く、かつ酸化型グルタチオンよりも迅速に切断されるジスルフィド結合、またはチオールから構成され、その構成成分であるチオールの１つがグルタチオンよりも低いpKaを有するジスルフィド結合や、または遊離チオールからの分子内攻撃によって活性化されるジスルフィド結合が知られている（特許文献８参照）。このジスルフィド含有化合物によれば、ポリヌクレオチドや生物活性化合物と他の化合物とを結合したジスルフィド結合が還元されることにより、生体内でポリヌクレオチドや生物活性化合物を放出することが可能となった。
【０００５】
また、立体構造的なロックを提供するジスルフィド交差結合オリゴヌクレオチドに関するいくつかの報告があるが、天然のＤＮＡにおいてプリン塩基−ピリミジン塩基の塩基対が水素結合で形成されるのに対し、酸化剤によりＳ−Ｓ結合が形成され、還元剤により２つのメルカプト基に解離する可逆的な共有結合であるジスルフィド結合を有する非天然ＤＮＡやＲＮＡについては報告されていない。
【特許文献１】特開平７−３００４９３
【特許文献２】特開２００２−２８４７９３
【特許文献３】特開２００２−２６５４８９
【特許文献４】特開２００２−２５５９９０
【特許文献５】特開２００２−２４９４９７
【特許文献６】特開平０５−１９４５１８
【特許文献７】特開平０５-１９４５１７
【特許文献８】特表２００３−５０１４４０
【非特許文献１】クリニカル ファーマコロジー アンド セラピューティクス（Ｃｌｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第９巻、第１８０〜１９４頁（１９６８年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、天然ＤＮＡの水素結合に由来する塩基対より結合力が強く、熱に対する安定化を高め、化学的安定化を高めると共に、酸化還元条件によりジスルフィド結合の形成・解除を容易に行うことができるジスルフィド結合を形成するＤＮＡの構築を可能とするメルカプト基を有した疑似塩基を塩基部分に導入した非天然Ｃ−ヌクレオシドや、Ｃ−ヌクレオチドや、その製造方法を提供することにある。そして、ＤＮＡ 配列内の一部、もしくは複数部分に導入した一本鎖ポリヌクレオチドや、ジスルフィド結合塩基対が形成された二重らせんの二本鎖ポリヌクレオチドを提供することである。これらを組み込んだＤＮＡは、転写、複製を酸化剤還元剤と言う外部因子で制御するという新たな機能を付加したＤＮＡの創成を行う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、第１に、ルイス酸（ＢＦ3及びＥｔ2Ｏ複合体、ＳｎＣｌ4触媒存在下）存在下で、ベンジル基で保護されたチオフェノールと、３' ，５' −ジトルオイル−１' −α／β−メトキシ−２' −デオキシ−Ｄ−リボースとのフリーデルクラフツアルキル化カップリング反応を行い、３' ，５' −ジトルオイル−１' −β−（４−ベンジルチオ）フェニル−２' −デオキシ−Ｄ−リボースを高い収率（約６５％）で得たが、バーチ還元（Birch reduction）、強酸条件等では生成物のフェニルチオ保護基は脱離されなかった。このため、式（VII）に示すように、メルカプトフェニル−β−Ｃ−ヌクレオシド（３）の合成のための出発原料として、ジフェニルジスルフィドを用いた。    
【０００８】
【化９】
2005162650.tif 000002
【０００９】
ジフェニルジスルフィドはＳｎＣｌ4（２当量）の存在下で、３' ，５' −ジトルオイル−１' −α／β−メトキシ−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（１）と結合し、β−アノマー（２）がカラムクロマトグラフィー及び溶媒からの再結晶により、収率１８％で得られた（i）。３つの保護基、即ち、２つのトルオイル基とフェニルスルフィニル基は、水素化アルミニウムリチウム触媒下で、１段階で脱保護され、１' −（（４−メルカプト）フェニル−１' −イル）−β−２' −デオキシ−ヌクレオシド（３）を得た（収率  ３７％）（ii）。この化合物（３）の構造は1ＨＮＭＲ、13ＣＮＭＲ、1Ｈ−ＣＯＳＹ、ＵＶスペクトルより確認し、アノマー位の立体構造は1Ｈ−ＮＯＥ解析により確認した。ＣＤ3ＯＤにおけるメルカプトヌクレオシド（３）の1ＨＮＭＲデータ、13ＣＮＭＲデータをそれぞれ図１（ａ）、（ｂ）に、1Ｈ−ＣＯＳＹのデータを図２に、１Ｈ、４Ｈ、２αＨ、２βＨのＮＯＥ測定データをそれぞれ図３（ａ）〜（ｄ）および表１に、ＵＶスペクトルを図４に示す。βアノマーは、1ＨＮＭＲのδ５．０９ｐｐｍ付近に生ずる二つのダブルレット（Ｊ＝５．４、１０．７Hz）として表れる１' Ｈを示した。この１' Ｈ−２' Ｈのカップリング定数の傾向は関連するβ−Ｃ−ヌクレオシドとして報告されている同様のカップリング定数と一致していた。ＮＯＥ効果は、測定結果から、表１に示すように、１' Ｈの共鳴周波数の照射は４' Ｈ（５．１％）と２' Ｈ−α（３．０％）においてＮＯＥを増大させた。同様に、２' Ｈ−βにおける共鳴周波数の照射は３' Ｈ（７．１％）においてＮＯＥを増大させ、２' Ｈ−αの共鳴周波数の照射は１' Ｈ（９．１％）においてＮＯＥを増大させた。
【００１０】
【表１】
2005162650.tif 000003
【００１１】
この求電子置換反応の位置選択性は、1ＨＮＭＲスペクトルにおける化合物（３）のフェニル基のプロトンの多重度によって確認された。塩基のフェニル基の２つのプロトンはそれぞれδ７．２３ｐｐｍと、７．２５ｐｐｍの２つの二重線信号を示した。カップリング定数Ｊ値はそれぞれ１２．２Ｈｚと１１．８Ｈｚであり両者はカップリングしていた。ジフェニルジスルフィドにおけるＳ−Ｓ基に対するフェニル基のパラ位がリボースの１' β位を攻撃することにより、フェニルジスルフィド基はＣ−ヌクレオシドに対してパラ位に位置した。メルカプトフェニル−β−Ｃ−ヌクレオシド（３）は、更に、核酸合成のためメルカプト基の保護のためＳ−ベンゾイル化され、１' −（（４−ベンゾイルチオ）フェニル−１−イル）−β−２' −デオキシ−ヌクレオシド（５）（収率７１％）とした（iv）後、同様に水酸基の保護として５' −Ｏ−ジメトキシトリチル化し、１' −（（４−ベンゾイルチオ）フェニル−１−イル）−５' −ジメトキシトリチル−β−２' −デオキシ−ヌクレオシド（６）（収率７１％）（ｖ）とした。得られたヌクレオシド（６）は３' −Ｏ−リン酸化し、２−シアノエチルホスホラミチド（収率８９％）（７）を得た（vi）。このメルカプトフェニル−β−Ｃ−ヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドの合成は、通常の自動ＤＮＡ合成手段により行なった。
【００１２】
一方、メルカプトヌクレオシド（３）の二量化は、メルカプトヌクレオシド（３）の１％過酸化水素のメタノール液のＴＬＣ（薄膜クロマトグラフィー  ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ＝４：１）で追跡した。二量体（４）のＲf値（移動率）（０．１４）は単量体（３）のＲf値（０．３４）より低かった。３０分後、単量体（３）のＴＬＣのスポットは消失し、減圧下溶媒を除去した。粗生成物はクロマトグラフィーと、水からの再結晶により精製し、二量体（４）を得た（iii）。二量体（４）における塩基のフェニル基のプロトン（２つの二重線）に見られる電子密度の低減からジスルフィド二量体の形成が1ＨＮＭＲスペクトルにより示された（モノマーとの比較においてδ０．１３、０．２０ｐｐｍ）。フェニル基のプロトンの化学シフトは塩基からジスルフィド結合へπ共役が拡張していることを示している。電子衝撃イオン化法による質量分析でも二量体（４）の形成を明かにした。
【００１３】
更に、本発明者は、１５量体の二本鎖中の非自己相補性のメルカプトヌクレオシド（３）（Ｓ塩基ヌクレオシド）の安定性と対合性について熱変成実験から検討した。被検体の二本鎖の熱変成はＵＶ融解曲線により決定し、熱変成が生じる該当温度Ｔmを表２に示す。還元剤（メルカプトエタノール）の存在下、天然のオリゴヌクレオチドの二本鎖a−b が融点（Ｔm）４３℃であるのに対し、天然塩基対からなる二本鎖 a−b におけるＡ−Ｔ塩基対をそれぞれメルカプトヌクレオシドで置換した二本鎖 c−d は融点（Ｔm）３３℃であった。メルカプト基は非相補性の状態では二本鎖構造を不安定化する。これは二本鎖 a−d において融点（Ｔm）３２℃であることからも示される。更に、メルカプトエタノールの存在は二本鎖 a−b、a−d、a−f の融点（Ｔm）に影響を及ぼさなかった。
【００１４】
還元剤（メルカプトエタノール）の非存在下、二本鎖  c−d は融点（Ｔm）７３℃であった。二本鎖 a−b が還元剤に対して安定性を有することは天然塩基対からなる二本鎖 a−b にとっては意義のあることである。この結果から対向するメルカプト基が空気酸化により相互に結合してジスルフィド結合が形成されることが示唆された。ジスルフィド結合は共有結合であり、結合したメルカプト塩基対は水素結合により形成される天然Ａ−Ｔ塩基対より強い相互作用を有する。このことは、二本鎖c −d の融点が二本鎖 a−b のそれより高いことからも確認できた。末端から２つ目にメルカプトヌクレオシドを含む二本鎖 e−f も還元剤の存在下で融点（Ｔm）３９℃であるのに対し、還元剤の非存在下では高い融点（Ｔm）７０℃を有する。ジスルフィド結合が形成されない二本鎖 a−f はメルカプトエタノール存在下と不存在下とでほぼ同じ融点（Ｔm）（各Ｔmは３７℃、３８℃）を有することからもジスルフィド結合が形成されると、熱安定性が増大することが示された。
【００１５】
【表２】
2005162650.tif 000004
【００１６】
また、円二色性（ＣＤ）分光計を用いて、ＤＮＡに組み込まれたメルカプトヌクレオシドのらせん構造を調べた（図５）。種々の条件下における二本鎖 c−d、二本鎖 e−f のＣＤスペクトルは、Ａ−Ｔ対の二本鎖 a−c と同様の形状を示した。しかしながら、還元剤不存在下では、メルカプトヌクレオシドを中央に有する二本鎖 c−d は、二本鎖 a−b と比較して、２７５ｎｍにおけるコットン効果の山が高く、２４７ｎｍにおけるコットン効果の谷が浅いことを示した。メルカプトエタノールの存在下で、二本鎖Ｃ−Ｄは２７５ｎｍにおけるコットン効果の山と２４７ｎｍにおけるコットン効果の谷は二本鎖 a−b と同じであった。このことから、ジスルフィド塩基対はＤＮＡの構造を全体的に変えてはいないことがわかった。
【００１７】
以上から、新規なメルカプトヌクレオシドの合成とオリゴペプチドに組み込まれたジスルフィド塩基対の性質が明かになった。ジスルフィド塩基対は二本鎖内で形成され、二本鎖の熱安定性を顕著に増大させる。本発明者は二本鎖に組み込まれたジスルフィド塩基対は新たな遺伝子コードや、ヌクレオチド転写制御等の機能性を有するものとして使用できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）
【００１９】
【化１０】
2005162650.tif 000005
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基を示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基、又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド（請求項１）や、一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有する水酸基が、ジメトキシトリチルオキシ基であることを特徴とする請求項１記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド（請求項２）や、一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基が、一般式（II）
【００２０】
【化１１】
2005162650.tif 000006
［式中、Ｒ8は、置換基を有していてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ9は置換基を有していてもよいアミノ基を示す。］で表される基であることを特徴とする請求項１又は２記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド（請求項３）や、一般式（Ｉ）におけるＲ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つが保護されたメルカプト基であり、その保護基はベンゾイル基、ターシャリーブチル基、２−ニトロフェニルスルフィド基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド（請求項４）や、一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシドが、１−β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２−デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１記載のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチド（請求項５）に関する。
【００２１】
また本発明は、一般式（III）
【００２２】
【化１２】
2005162650.tif 000007
［式中、Ｒ10、Ｒ11は、ヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基を示し、Ｒ12は、ヌクレオシド合成のための官能基を示す。］で表されるデオキシリボース系化合物と、一般式（IV）
【００２３】
【化１３】
2005162650.tif 000008
［式中、Ｒ13〜Ｒ18のうち少なくとも１つはヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるアリールチオールとを、カップリング剤存在下、溶媒中で反応させ、一般式（Ｖ）
【００２４】
【化１４】
2005162650.tif 000009
［式中、Ｒ10及びＲ11は、一般式（III）におけるＲ10及びＲ11とそれぞれ同じ基を示し、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。］で表される化合物を得る工程を有することを特徴とするＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項６）や、一般式（III）におけるＲ10、Ｒ11が示すヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基が、トルオイルオキシ基であることを特徴とする請求項６記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項７）や、一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ18のうち少なくとも１つが示すメルカプト基の保護基が、フェニルチオ基であることを特徴とする請求項５又は６記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項８）や、カップリング剤として、ルイス酸を用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項９）や、溶媒として、ジクロロメタン、ジクロロエタンを用いることを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項１０）や、一般式（Ｖ）で表される化合物を、溶媒中で水素化リチウムアルミニウムと接触させることにより、式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ13で表される保護基を脱保護し、一般式（VI）
【００２５】
【化１５】
2005162650.tif 000010
［式中、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（Ｖ）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。但し、これらのうち、一般式（Ｖ）においてヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示す基は、脱保護されたメルカプト基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシドを得る工程を有することを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項１１）や、水素化リチウムアルミニウムを用いて一段階で脱保護することを特徴とする請求項１１記載のＣ−ヌクレオシドの製造方法（請求項１２）や、一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシドと、溶媒と過酸化水素存在下、もしくは酸素雰囲気下で反応させることを特徴とするＣ−ヌクレオシドの二量体の製造方法（請求項１３）に関する。
【００２６】
さらに本発明は、一般式（Ｉ）
【００２７】
【化１６】
2005162650.tif 000011
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが１つ又は２つ以上組み込まれた一本鎖ポリヌクレオチド（請求項１４）や、一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが、１' −β（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１４記載の一本鎖ポリヌクレオチド（請求項１５）や、一般式（Ｉ）
【００２８】
【化１７】
2005162650.tif 000012
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが１つ又は２つ以上組み込まれた１対の一本鎖ポリヌクレオチドを有し、該１対の一本鎖ポリヌクレオチドがジスルフィド結合を有する二本鎖ポリヌクレオチド（請求項１６）や、酸化還元条件を変化させることにより、ジスルフィド結合の形成・解除が可能であることを特徴とする請求項１６記載の二本鎖ポリヌクレオチド（請求項１７）や、一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが、１' −β（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボースであることを特徴とする請求項１６記載の二本鎖ポリヌクレオチド（請求項１８）に関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドは、共有結合により相補的に結合しジスルフィド結合を形成するメルカプト基を有する塩基を導入し、天然ＤＮＡの二重らせん構造や、部分的二本鎖を形成したＲＮＡのヘアピン構造を形成するプリン塩基―ピリミジン塩基対の水素結合よりその結合力が強いジスルフィド結合により、安定化、特に熱に対する安定化を高めると共に、酸化還元条件によりジスルフィド結合の形成、解除を容易に行うことができる。かかるＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドを組み込んだ一本鎖ポリヌクレオチドや二本鎖ポリヌクレオチドは、天然対のＤＮＡやＲＮＡより安定化、特に熱に対する安定化を高めることができ、酸化還元条件を変化させることにより、即ち外部因子によりジスルフィド結合を可逆的に進行させ、安定性を制御することができる。このような新たな機能を付加したＤＮＡやＲＮＡの利用を図り、生物学的に有用な遺伝子制御の道を拓くことを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドは、一般式（Ｉ）
【００３１】
【化１８】
2005162650.tif 000013
で表され、式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基を示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示すものであれば特に制限されるものではない。
【００３２】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有する水酸基におけるカップリング基若しくは保護基は、核酸合成の際に目的とするカップリング反応に関与するカップリング基、あるいはカップリング反応に関与するのを抑制する基であればいずれのものであってもよいが、水酸基の保護基としてはジメトキシトリチル基であることが好ましい。また、一般式（Ｉ）におけるＲ1、Ｒ2が示すカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基は、核酸合成の際に目的とするカップリング反応に関与するカップリング基、あるいはカップリング反応に関与するのを抑制する基を有するリン酸基であればいずれのものであってもよいが、一般式（II）
【００３３】
【化１９】
2005162650.tif 000014
で表され、一般式（II）中、Ｒ8は、置換基を有していてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ9は、置換基を有していてもよいアミノ基を示すことが好ましい。かかる一般式（II）におけるＲ8が示す置換基を有していてもよいアルコキシ基における置換基としては、シアノ基、ハロゲン原子、イミダゾール、ヘテロ環状分子団等を挙げることができ、かかる置換基を有していてもよいアミノ基としては、具体的に、シアノメトキシ基、２−シアノメトキシ基、３−シアノプロポキシ基、クロロメトキシ基、ブチロメトキシ基、クロロメトキシ基、ブチロメトキシ基等を挙げることができ、このうち２−シアノメトキシ基が特に好ましい。また、一般式（II）中、Ｒ9が示す置換基を有していてもよいアミノ基における置換基としては、アルキル基等を挙げることができ、かかる置換基を有していてもよいアミノ基としては、具体的に、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、エチルプロピルアミノ基、ジｎ−プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基等を挙げることができ、このうちジイソプロピルアミノ基が特に好ましい。
【００３４】
ここで、一般式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2が共に水酸基又は保護基を有する水酸基を示す場合、ヌクレオシドとなり、いずれか一方がリン酸基又は保護基を有するリン酸基を示す場合、ヌクレオチドとなる。
【００３５】
一般式（Ｉ）中、Ｒ3〜Ｒ7のいずれかが示すメルカプト基の保護基は、核酸合成の際に目的とするカップリング反応に関与するカップリング基、あるいはカップリング反応に関与するのを抑制する基、また、デオキシリボースのＲ1、Ｒ2が示す水酸基に、カップリング基若しくは保護基を導入する際、反応に関与するのを抑制する基、また、デオキシリボースにＲ1、Ｒ2が示すリン酸基又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基を導入する際、反応に関与するのを抑制する基であればいずれのものであってもよいが、メルカプト基の保護基としてはベンゾイル基、ターシャリーブチル基、２−ニトロフェニルスルフィド基、カルバメート、エステル、アミド等であることが好ましい。かかる保護基を有するメルカプト基や、メルカプト基はＲ3〜Ｒ7のうち１つのみならず複数が示していてもよい。
【００３６】
また、一般式（Ｉ）におけるＲ3〜Ｒ7が示すアルキル基としては、具体的に、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基等を挙げることができ、Ｒ3〜Ｒ7が示すアシル基としては、具体的に、アセチル基、プロピオニル基等を挙げることができ、Ｒ3〜Ｒ7が示すアルコキシ基としては、具体的に、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等、その他水素原子、フッ素原子等を挙げることができる。
【００３７】
かかる一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドとしては、β−ヌクレオシドが好ましく、具体的には、１' −β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース、１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース、１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５' −（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボースを挙げることができ、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオチドとしては、具体的には、１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５' −（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース−３−ホスホラミダイト、１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５' −（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース−３' −（シアノエチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルホスホラミダイト）等を挙げることができる。
【００３８】
本発明のＣ−ヌクレオシドの製造方法は、一般式（III）
【００３９】
【化２０】
2005162650.tif 000015
［式中、Ｒ10、Ｒ11は、独立して、ヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基を示し、Ｒ12は、ヌクレオシド合成のための官能基を示す。］で表されるデオキシリボース系化合物と、一般式（IV）
【００４０】
【化２１】
2005162650.tif 000016
［式中、Ｒ13〜Ｒ18のうち少なくとも１つはヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表されるアリールチオールとを、溶媒中で反応させ、一般式（Ｖ）
【００４１】
【化２２】
2005162650.tif 000017
［式中、Ｒ10及びＲ11は、一般式（III）におけるＲ10及びＲ11とそれぞれ同じ基を示し、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。］で表される化合物を得る工程を有する。
【００４２】
上記一般式（III）中、Ｒ10、Ｒ11が示すヌクレオシド合成のための保護基を有する水酸基としては、アリールチオールとの反応において反応に関与するのを抑制するものであれば、いずれのものであってもよいが、かかる水酸基の保護基としては、トルオイル基であることが、保護基の除去が容易なため好ましい。また、一般式（III）中、Ｒ12が示すヌクレオシド合成のための保護基としては、アルコキシ基、ハロゲン原子が好ましく、アリールチオールとの結合を形成するものであり、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、クロロ基、ブロモ基等を挙げることができ、これらのうちメトキシ基がより好ましい。
【００４３】
また、一般式（III）で表されるデオキシリボース系化合物と反応するアリールチオールを表す一般式（IV）中、Ｒ13〜Ｒ18が示すヌクレオシド合成のためのメルカプト基の保護基は、デオキシリボース系化合物の官能基との反応に関与するのを抑制するものであればいずれのものであってもよいが、フェニルチオ基であることが、デオキシリボース系化合物の水酸基の保護基の脱保護と同時に脱保護が可能なため好ましい。かかるヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基はＲ13〜Ｒ18のうち１つのみならず複数であってもよい。また、一般式（IV）中、Ｒ13〜Ｒ18のうち保護基を有するメルカプト基を示す基の残りのＲ13〜Ｒ18が示す、アルキル基、アシル基、アルコキシ基としては、上述の一般式（Ｉ）におけるＲ4〜Ｒ7が示すアルキル基、アシル基、アルコキシ基と同様のものを具体的に挙げることができ、また、一般式（IV）中、Ｒ13〜Ｒ18のうち保護基を有するメルカプト基を示す基の残りのＲ13〜Ｒ18は、その他水素原子、フッ素原子を示す。
【００４４】
一般式（III）で表されるデオキシリボース系化合物と、一般式（IV）で表されるアリールチオールとの反応において用いられるカップリング剤は、ルイス酸であることが好ましい。ルイス酸触媒としては、四塩化スズ等を具体的に例示することができる。かかる触媒の使用量としては、１〜３当量、好ましくは２当量前後とすることができる。またこの反応において用いられる溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン等を挙げることができる。反応は−３０〜０℃、好ましくは−２０℃前後で５〜１０時間等、好ましくは８時間前後行うことができる。
【００４５】
上記反応により得られる生成物は一般式（Ｖ）で表される化合物であり、式中、Ｒ10及びＲ11は、一般式（III）におけるＲ10及びＲ11とそれぞれ同じ基を示し、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（IV）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。更に、本発明のＣ−ヌクレオシドの製造方法は、一般式（Ｖ）で表される化合物を溶媒中で水素化リチウムアルミニウムと接触させることにより、式中、Ｒ10、Ｒ11、における水酸基の保護基、及びＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18のいずれかが示すメルカプト基における保護基の総ての保護基を脱保護し、一般式（VI）で表されるＣ−ヌクレオシドを得る工程を有する。一般式（VI）中、Ｒ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18は、一般式（Ｖ）におけるＲ13〜Ｒ15、Ｒ17、Ｒ18とそれぞれ同じ基を示す。但し、これらのうち、一般式（Ｖ）においてヌクレオシド合成のための保護基を有するメルカプト基を示す基は、脱保護されたメルカプト基を示す。かかる反応において使用する試薬としては、具体的に水素化リチウムアルミニウム、ソディウムボロハイドライド等を挙げることができる。かかる試薬の使用量としては、３〜６当量、好ましくは５当量前後とすることができる。使用可能な溶媒としては、ＴＨＦ等エーテル系溶媒、ＴＨＦ−アルコール混合溶媒等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で０．５〜２時間、好ましくは１時間前後行うことができる。
【００４６】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドは、一般式（Ｉ）
【００４７】
【化２３】
2005162650.tif 000018
［式中、Ｒ1、Ｒ2は、独立して、水酸基、カップリング基若しくは保護基を有する水酸基、リン酸基、又はカップリング基若しくは保護基を有するリン酸基示し、Ｒ3〜Ｒ7のうち少なくとも１つはメルカプト基又は保護基を有するメルカプト基を示し、残りの基は、独立して、水素原子、フッ素原子、アルキル基、アシル基又はアルコキシ基を示す。］で表される上記本発明のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドが１つ又は２つ以上組み込まれたものであり、また、本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、上記本発明の一本鎖ポリヌクレオチドがジスルフィド結合を有し、二本鎖を形成したものであれば、特に限定されるものではない。
【００４８】
本発明の一本鎖ポリヌクレオチドを製造するには、本発明のＣ−ヌクレオシドの製造方法により得られる一般式（VI）で表される化合物においてメルカプト基に保護基、例えば、ベンゾイル基、ターシャリーブチル基、２−ニトロフェニルスルフィド基等の保護基を導入する。メルカプト基へのベンゾイル基の導入は一般式（VI）で表される化合物をジイソプロピルエチルアミン等と共にテトラヒドロフラン溶液とし、この溶液にベンゾイルクロリドを窒素雰囲気下、氷浴して添加した後、室温で反応させることができる。反応は、０〜４０℃等、好ましくは室温で、０．５〜３時間、好ましくは１時間前後等行なうことができる。生成物は公知の方法で精製することができる。
【００４９】
メルカプト基の保護基を導入した後、ヌクレオシドの水酸基のうちリン酸エステルとしない水酸基について保護基を導入する。かかる水酸基の保護基としては、４，４' −ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等を挙げることができる。ヌクレオシドの水酸基への４，４' −ジメトキシトリチル基の導入は、ヌクレオシドをピリジン溶液とし、この溶液に、アルゴン雰囲気下、０〜４０℃等、好ましくは室温で固体の４，４' −ジメトキシトリチルクロリドを添加し、０．５〜３時間、好ましくは１時間前後等反応を行なうことができる。
【００５０】
ヌクレオシドの水酸基のうちリン酸エステルとしない水酸基を保護した後、保護基が導入されていない水酸基のリン酸エステル化によりＣ−ヌクレオチドを得る。ヌクレオシドのリン酸エステル化は、リン酸化を目的としない水酸基を保護したヌクレオシドをジクロロメタン等の溶媒中でリン酸化化合物、例えば、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルクロロホスホラミダイト等のホスホラミダイトを作用させ、保護基が導入されていない水酸基をリン酸エステル基とし、Ｃ−ヌクレオチドを得ることができる。
【００５１】
本発明のＣ−ヌクレオシドから二量体を生成するには、１−β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２−デオキシ−Ｄ−リボース（３）等の一般式（Ｉ）で表されるＣ−ヌクレオシドを溶解した溶液、例えばメタノール溶液に、過酸化水素水溶液を氷浴中に添加して反応させる方法、ヨウ素酸化、酸素酸化等を挙げることができる。
【００５２】
また、本発明の一本鎖ポリヌクレオチドや二本鎖ポリヌクレオチドは、本発明のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドを用いて公知の方法により製造することができ、かかるポリヌクレオチドとしてはＤＮＡやＲＮＡを好適に例示することができる。本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは酸化還元条件を変化させることにより、二本鎖の対向する位置に組み込まれた本発明のＣ−ヌクレオシド又はＣ−ヌクレオチドにおいてジスルフィド結合が容易に形成・解除される。ジスルフィド結合が形成された二本鎖ポリヌクレオチドは、水素結合によるプリン塩基−ピリミジン塩基対と比較して、共有結合の存在により、安定性、特に熱に対する安定性が増大する。また、二本鎖ＤＮＡの場合、転写、複製において、それが阻害されることにより、遺伝子のメカニズムの解明に利用することができる。
【００５３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
全ての溶液及び試薬は、試薬グレードの品質であり、さらなる精製をせずに用いた。ＴＬＣ分析は、シリカゲル（silica gel 60 F254 1.05554（Merck社製）を用いて行った。カラムクロマトグラフィーは、Wakogel C-300（silica gel, 和光純薬工業社製）又はSilica gel 60N（関東化学株式会社製）を用いて行った。1Ｈ、13Ｃ、ＣＯＳＹ及びＮＯＥ  ＮＭＲスペクトルは、JEOL（日本電子社製） EX 400 分光計（1Ｈでは４００．０ＭＨｚ、13Ｃでは１００．４ＭＨｚ）を用いて記録した。スペクトルは、クロロホルム−ｄ3又はＣＤ3ＯＤ−ｄ4中におけるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を基準とした。化学シフト（σ）は、ｐｐｍで表示し、多重度を、それぞれｓ（１重線）、ｄ（２重線）、ｔ（３重線）、ｑ（４重線）、ｍ（多重線）及びｂｒ（ブロード）と表示した。結合定数Ｊを、Ｈｚで示し、ＥＩＭＳ及びＦＡＢＭＳは、それぞれKRATOS CONCEPT IS（島津製作所社製）及びVoyager DE-STR（Applied Biosystems社製）で測定した。ＵＶスペクトルは、１ｃｍ石英セル中で、UV 2100分光計（spectrometer）（島津製作所社製）を用いて測定した。ＣＤスペクトルは、１ｃｍの歪のない（strain-free）石英セル中で、JASCO J-725 分光偏光計（日本分光社製）を用いて測定した。
【実施例２】
【００５５】
［１−β−（４−（フェニルジチオ）−フェニル−１−イル）−３，５−ジトルオイル−２−デオキシ−Ｄ−リボース（２）の調製］
ジフェニルスルフィド２１８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）と３，５−ジトルオイル−１−α／β−メトキシ−２−デオキシ−Ｄ−リボース１９２．２ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２ｍＬに溶解し、−２０℃、アルゴン雰囲気下に保った。塩化スズ（ＳｎＣｌ4）１７５．２μＬ（ｄ＝２．２３、１．５ｍｍｏｌ）を加えて反応を開始し、−２０℃、アルゴン雰囲気下で攪拌した。８時間で反応は終了し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１０ｍＬを加えて反応を停止し、２０ｍＬのジクロロメタンで２回抽出した。有機層を合わせ、飽和食塩水で２回洗浄後、無水硫酸マグネシウムで有機層を乾燥し、ろ過、エバポレートした。シリカゲルクロマトグラフィーを行い（溶離液  へキサン：酢酸エチル＝５：１）、メタノールから再結晶し、目的とする化合物を無色の針状結晶５０ｍｇ（収率１８％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：σ２．２０（１Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．４３（３Ｈ，ｓ），２．４９（１Ｈ，Ｊ＝９．３，１４．１Ｈｚ，ｄｄ），４．５２（１Ｈ，ｍ），４．６３（２Ｈ，ｍ），５．２１（１Ｈ，Ｊ＝５．１，１１．２Ｈｚ，ｄｄ），５．５９（１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ｄ），７．２７（９Ｈ，ｍ），７．４６（４Ｈ，ｍ），７．９４（４Ｈ，Ｊ＝８．３，２４．０Ｈｚ，ｄｄ）。
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：σ２１．７，２１．７，４１．７，６４．７，８０．３，８３．０，１２６．７，１２６．９，１２７．０，１２７．２，１２７．５，１２７．６，１２７．７，１２７．８，１２９．２，１２９．５，１２９．７，１３６．６，１３６．９，１４３．９，１４４．２，１６６．１，１６６．４；ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｅ  ５７１（Ｍ＋Ｈ）+；Anal. Calcd for Ｃ33Ｈ30Ｏ5Ｓ2：６９．４５；Ｈ，５．３０；Ｎ，０．００；Ｓ，１１．２４。Found：Ｃ，６９．４５；Ｈ，５．２６；Ｎ，０．００；Ｓ，１１．１８。
【実施例３】
【００５６】
［１' −β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（３）の調製］
三口フラスコに水素化リチウムアルミニウム０．５２４ｇ（１３．８ｍｍｏｌ）を秤量し、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍＬに溶解した１−β−（４−（フェニルジチオ）−フェニル−１−イル）−３，５−ジトルオイル−２−デオキシ−Ｄ−リボース（ビストルオイルエステル（２））１．５８ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）を加えて室温、アルゴン雰囲気下で反応を行った。１時間で反応は終了し、１Ｎ希硫酸で反応を停止し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、エバポレートした。シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  ９：１）で精製し、水から再結晶させ、目的とする化合物の無色針状結晶０．２３１ｇ（収率３７％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：σ１．９０（２Ｈ，Ｊ＝９．３，１４．１，ｄｄｄ），２．１５（１Ｈ，Ｊ＝２．４，５．１，５．１Ｈｚ，ｄｄｄ），４．３（１Ｈ，Ｊ＝６．１，１０．８，１２．７Ｈｚ，ｄｄｄ），３．６５（２Ｈ，ｍ），３．９１（１Ｈ，１０．７Ｈｚ，ｄｄ），７．２３（１Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，ｄ），７．２５（１Ｈ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ｄ），13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：σ４４．９，６４．１，７４．５，８１．３，８９．２，１２８．０，１２９．９，１３０．５，１３２．２，１４０．４；ＥＩＭＳ  ｍ／ｅ  ２２６［Ｍ］+；Anal. Calcd for Ｃ11Ｈ14Ｏ3Ｓ：Ｃ，５８．３８；Ｈ，６．２４；Ｎ，０．００；Ｓ，１４．１７。Found：Ｃ，５８．２５；Ｈ，６．１８；Ｎ，０．００；Ｓ，１４．１８。
ε260：７０８０ｃｍ-1Ｍ-1（１０ｍＭ  リン酸ナトリウム溶液、１０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）。
【実施例４】
【００５７】
［１' −β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（３）のジスルフィド二量体（４）の調製］
１' −β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（３）５０．０ｍｇ（０．２２１ｍｍｏｌ）のメタノール２ｍＬ溶液に、３０％過酸化水素水溶液６６μＬ（終濃度１％）を３分以上かけて滴下して加えた。３０分後、反応混合物をエバポレートし、粗生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（４：１））を用いて精製した。得られた無色固体を水から再結晶し、無色針状結晶として目的とする化合物を得た（０．０１１ｇ、２０％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：σ１．９０（１Ｈ，ｍ），２．１７（１Ｈ，Ｊ＝５．４，１３．２Ｈｚ，ｄｄ），３．６４（２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，ｄ），３．９２（１Ｈ，ｂｒ），４．２９（１Ｈ，ｂｒ），５．０９（１Ｈ，Ｊ＝５．４，１０．７Ｈｚ，ｄｄ），７．３６（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），７．４５（１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ｄ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｅ  ４５０［Ｍ］+；Anal. Calcd for Ｃ22Ｈ26Ｏ6Ｓ2：Ｃ，５８．６４；Ｈ，５．８２；Ｎ，０．００；Ｓ，１４．２３。Found：Ｃ，５７．８８；Ｈ，５．６２；Ｎ，０．００；Ｓ，１４．０２。
【実施例５】
【００５８】
［１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（５）の調製］
１' −β−（４−メルカプトフェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（３）１１８ｍｇ（０．５２０ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン１３４ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）とを溶解したＴＨＦ３ｍＬ溶液に、ベンゾイル塩酸８０．４ｍｇ（０．５７２ｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、氷浴中で、１０分以上かけて滴下した。反応混合物を室温で１時間攪拌し、１ｍＬのメタノールを加えて反応を停止した。この混合物に、ジクロロメタン３０ｍＬを加えた、水３０ｍＬで２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を、濾過、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（９：１））で精製した。目的物を、トルエンから再結晶させ、無色針状結晶１２２ｇ（７１％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3Ｃｌ3）：σ１．９４（２Ｈ，ｂｒ），２．０６（１Ｈ，Ｊ＝４．６，６．３，１９．５Ｈｚ，ｄｄｄ），２．３７（１Ｈ，Ｊ＝１．５，５．９，１３．２Ｈｚ，ｄｄｄ），３．８２（２Ｈ，ｍ），４．０２（１Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｂｒ），５．２２（１Ｈ，Ｊ＝５．６，１０．３Ｈｚ，ｄｄ），７．４７（６Ｈ，ｍ），７．６２（１Ｈ，Ｊ＝７．３，７．３Ｈｚ，ｔ），８．０３（２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ｄ）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：σ４４．１，６３．４，７３．８，７９．６，８７．４，１２６．５，１２６．８，１２７．５，１２８．８，１３３．７，１３５．２，１３５．２，１３６．６，１４２．２，１９０．３；ＥＩＭＳ  ｍ／ｅ  ３３０［Ｍ］+；Anal. Calcd for Ｃ18Ｈ18Ｏ4Ｓ：Ｃ，６５．４３；Ｈ，５．４９；Ｎ，０．００；Ｓ，７．９１。Found：Ｃ，６５．２８；Ｈ，５．４４；Ｎ，０．００；Ｓ，９．８７。
【実施例６】
【００５９】
［１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５' −（４，４'−ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（６）の調製］
１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（５）４２．７ｍｇ（０．１８９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン３ｍＬにより３回エバポレートした。固体を無水ピリジン１ｍＬ中に溶解した。アルゴン雰囲気下で、４，４' −ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）９５．９ｍｇ（０．２８３ｍｍｏｌ）を攪拌溶液中に加え、室温で継続して攪拌した。１時間の反応の後、エタノール０．５ｍＬを加え反応を停止させた。混合物を氷冷した水１０ｍＬに注ぎ、１５ｍＬのジクロロメタンで３回抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。ヘキサン：酢酸エチル（３：１）を用いたシリカゲルカラムで精製し、黄色の発泡体の目的の化合物（６）８４．８ｍｇ（収率７１％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3Ｃｌ3）：σ２．０１（２Ｈ，ｂｒ），２．２２（１Ｈ，Ｊ＝１．８，７．４，１４．７Ｈｚ，ｄｄｄ），３．２７（１Ｈ，Ｊ＝５．４，９．８Ｈｚ，ｄｄ），３．３５（１Ｈ，Ｊ＝４．０，８．０Ｈｚ，ｄｄ），４．０８（１Ｈ，ｂｒ），４．４０（１Ｈ，ｂｒ），５．２１（１Ｈ，Ｊ＝５．６，１０．２Ｈｚ，ｄｄ），６．８１（４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｄ），７．１９−７．６０（１６Ｈ，ｍ），８．０１（２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ｄ）；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：σ４３．９，５５．２，６４．４，７４．６，７９．５，８６．３，８６．４，１１３．１，１２６．１，１２６．８，１２７．５，１２７．９，１２８．２，１２８．７，１３０．１，１３３．６，１３５．０，１３６．０，１３６．６，１４３．６，１４４．８，１５８．５，１９０．２；ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｅ  ６３３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＲＭＳ. Calcd for Ｃ39Ｈ36Ｎ11Ｏ6Ｓ  ６３３．２３１１，Found：６３３．２３４７。
【実施例７】
【００６０】
［１'−β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５'−（４，４' −ジメトキシトリチル）−２'−デオキシ−Ｄ−リボース−３−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルホスホラミダイト）（７）の調製］
１'−β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５'−（４，４'−ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（６）２７０ｍｇ（０．４２６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン３ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下で２分間洗浄した。攪拌した溶液にＮ，Ｎ' −ジイソプロピルルチルアミン１１０ｍｇ（０．８５２ｍｍｏｌ）と、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ' −ジイソプロピルクロロホスホラミダイト１２１ｍｇ（０．５１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下、遮光条件下で１時間攪拌した。反応混合物にジクロロメタン３０ｍＬを加えた後、水３０ｍＬで２回洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過及びエバポレートを行った。得られた針状化合物を、ヘキサン：酢酸エチル（３：１）中で、１％トリメチルアミンを用いてクロマトグラフィーを行い、無色固体の目的物を得た（２７６ｍｇ、８９％）。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3Ｃｌ3）：σ１．１２−１．３１（１４Ｈ，ｍ），１．６５（１Ｈ，ｂｒ），２．０４（１Ｈ，ｍ），２．３８（１Ｈ，ｍ），２．４６（１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，ｔ），２．６２（１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ｔ），３．３１（２Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ），４．２７（１Ｈ，ｂｒ），４．５３（１Ｈ，ｂｒ），５．２２（１Ｈ，Ｊ＝４．６，９．６Ｈｚ，ｄｄ），６．８４（４Ｈ，Ｊ＝５．０，９．０Ｈｚ，ｄｄ），７．１９−７．６６（１６Ｈ，ｍ），８．０４（２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ）；ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｅ  ８３３［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＲＭＳ. Calcd for Ｃ48Ｈ54Ｎ2Ｏ7ＰＳ  ８３３．３３８９，Found：８３３．３３７６。
【実施例８】
【００６１】
［メルカプト−ヌクレオシド（３）のＮＯＥ効果の測定］
実施例３で得られた化合物（３）のβ−グリコシド構造のコンフォメーションは、ＮＯＥ効果実験（NOE difference experiments）において、ＣＤ3ＯＤ中、内部標準としてＴＭＳを用いた。結果を表２、図３（ａ）〜（ｄ）に示す。
【実施例９】
【００６２】
１５量体の各オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法に従い、ＤＮＡ合成機で合成した。実施例７で得られた１' −β−（４−（ベンゾイルチオ）−フェニル−１−イル）−５' −（４，４' −ジメトキシトリチル）−２' −デオキシ−Ｄ−リボース（６）は、目的の位置、順番で導入するために ５' −位を４，４' −ジメトキシトリチル化、３' −位をホスホロアミダイト化し、ＤＮＡ合成機に導入した。オリゴヌクレオチドの詳細な合成法、メカニズムは常法に従った。
【実施例１０】
【００６３】
［ＵＶ測定による熱安定性の評価］
実施例９で得られたオリゴニクレオチドの融解温度を測定した。二本鎖の融解温度は、窒素雰囲気下において、テフロン（登録商標）−１ｃｍ光路長石英セル中で、温度可変装置を備えたShimazu UV 2100 UV-vis  分光光度計を用いて行った。熱変成実験は、リン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ（ｐＨ７．０）に、１５対塩基のオリゴヌクレオチド１５μＭ／塩基を加えたものを用い、１分間あたり１．０℃の割合で１０℃から９０℃まで上昇させ、吸光度を２６０ｎｍ下で測定した。結果を表２、図６、図７に示す。
【００６４】
還元剤（メルカプトエタノール）の存在下、天然塩基対からなるオリゴヌクレオチドの二本鎖 a−b が融点（Ｔm）４３℃であるのに対し、天然塩基対からなる二本鎖 a−b におけるＡ−Ｔ塩基対をそれぞれ本発明のＣ−ヌクレオシドで置換した二本鎖 c−d は融点（Ｔm）３３℃であった。メルカプト基は非相補性の状態では二本鎖構造を不安定化する。これは二本鎖 a−d において融点（Ｔm）３２℃であることからも示される。尚、メルカプトエタノールの存在は二本鎖 a−b、a−d、a−f の融点（Ｔm）に影響を及ぼさないことから、天然塩基対からなるオリゴヌクレオチドにおいては還元剤の存在により結合が解除されることはないことが示された。
【００６５】
還元剤（メルカプトエタノール）の不存在下、二本鎖 c−d は融点（Ｔm）７３℃であり、この結果から対向するメルカプト基が空気酸化により相互に結合してジスルフィド結合が形成されることが示唆される。ジスルフィド結合は共有結合であり、結合したジスルフィド結合は水素結合により形成される天然のＡ−Ｔ塩基対より強い相互作用を有することが示された。末端から２つ目にメルカプトヌクレオシドを含む二本鎖 e−f も還元剤の不存在下では、還元剤の存在下で融点（Ｔm）３９℃であるのに対し、高い融点（Ｔm）７０℃を有する。ジスルフィド結合が形成されない二本鎖 a−f はメルカプトエタノール存在下と不存在下とでほぼ同じ融点（Ｔm）（各Ｔmは３７℃、３８℃）を有することからもジスルフィド結合が形成されると、熱安定性が増大することが示された。
【実施例１１】
【００６６】
［ＣＤの測定］
円偏光二色性（circular dichroism）スペクトルは、リン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ（ｐＨ７．０）に、実施例９で得られた１５対塩基のオリゴヌクレオチド１５μＭを加えたものを用い、asco J-725 分光偏光計を用いて、３５０〜２００ｎｍ、１０℃の条件下で測定した。スペクトルは、１ｎｍごとに１ｎｍのバンド幅、５０ｎｍ／分の速度条件下で、平均５回のスキャンにより得られた。結果を図５に示す。
【００６７】
メルカプト塩基（Ｓ−Ｓ塩基対）を有する二本鎖 c−d、e−f はＡ−Ｔ対の二本鎖 a−b と同様の形状を示した。しかしながら、メルカプトヌクレオシドを中央に有する二本鎖 c− dは、二本鎖 a−b と比較して還元剤非存在下で、２７５ｎｍにおける正のコットン効果が高く、２４７ｎｍにおける負のコットン効果が低いことを示した。二本鎖 c−d は、二本鎖 a−b と比較してメルカプトエタノールの存在下で、２７５ｎｍにおける正のコットン効果と２４７ｎｍにおける負のコットン効果は同じであった。このことから、メルカプトヌクレオシドはＤＮＡの構造を全体的に変えてはいなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】（ａ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける1Ｈ  ＮＭＲの測定結果を示す図である。（ｂ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける13Ｃ  ＮＭＲの測定結果を示す図である。
【図２】本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおけるＨ−Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲの測定結果を示す図である。
【図３−１】（ａ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける１ＨのＮＯＥ測定データを示す図である。（ｂ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける４ＨのＮＯＥ測定データを示す図である。
【図３−２】（ｃ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける２αＨのＮＯＥ測定データを示す図である。（ｄ）本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＣＤ3ＯＤにおける２βＨのＮＯＥ測定データを示す図である。
【図４】本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）のＵＶスペクトルを示す図である。
【図５】本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）を組み込んだＤＮＡ（３．１５μＭ）の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中におけるＵＶスペクトルの測定結果を示す図である。
【図６】本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）を組み込んだＤＮＡの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す図である。
【図７】本発明のＣ−ヌクレオシド（化合物３）を組み込んだＤＮＡの融点を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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