(57)【要約】      （修正有）【課題】  迅速かつ正確にＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群を簡便に検出する方法の提供。【解決手段】  （１）ペプトン、（２）塩化ナトリウム、（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤、（４）ピルビン酸ナトリウム、（５）硝酸カリウム、（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又は４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、並びに（８）ドデシル硫酸ナトリウム及び／又は牛胆汁末からなる培地を使用する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ペプトン０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（２）塩化ナトリウム０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤０．０１〜１mol／Ｌ、（４）ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（５）硝酸カリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩又は４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩、並びに（８）ドデシル硫酸ナトリウム０．００５〜１．０ｗ／ｖ％及び／又は牛胆汁末０．５〜２．０ｗ／ｖ％を含有する培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色の有無を検出することを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出法。
【請求項２】
（１）ペプトン０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（２）塩化ナトリウム０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤０．０１〜１mol／Ｌ、（４）ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（５）硝酸カリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩又は４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩、並びに（８）ドデシル硫酸ナトリウム０．００５〜１．０ｗ／ｖ％及び／又は牛胆汁末０．５〜２．０ｗ／ｖ％を含有する培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色の有無を検出し、さらに紫外線照射により蛍光の有無を検出することを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び大腸菌群の検出法。
【請求項３】
（１）ペプトン０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（２）塩化ナトリウム０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤０．０１〜１mol／Ｌ、（４）ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（５）硝酸カリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩又は４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩、並びに（８）ドデシル硫酸ナトリウム０．００５〜１．０ｗ／ｖ％及び／又は牛胆汁末０．５〜２．０ｗ／ｖ％を含有することを特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び／又は大腸菌群検出用培地。
【請求項４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び大腸菌群の同時検出用培地である請求項３記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水等の検体中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び／又は大腸菌群が存在するか否かを簡便、迅速かつ正確に判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水、飲食品等の細菌汚染を未然に防止するために、これらの検体中のＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群の検出は必須である。大腸菌群は、グラム陰性の無芽胞桿菌で、乳糖を分解して酸とガスを産生する好気性又は通性嫌気性菌の一群の細菌であり、Escherichia、Enterobacter、Citrobacter、Klebsiellaなどが含まれる。このうち、細菌学の分類により大腸菌と称されるEscherichia coli(E.coli）は、大腸菌群の中でも病原性が強い。従って、水、飲食品等の検体中のＥ．ｃｏｌｉを検出することは特に重要である。
【０００３】
Ｅ．ｃｏｌｉの迅速検出法としては、着色性基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加した培地を用いる方法（特許文献１）が知られている。しかしこの培地を用いる方法では、Ｅ．ｃｏｌｉ以外のShigellaやSalmonellaなども陽性になってしまうという問題があった。
【０００４】
また、ＭＭＯ−ＭＵＧ培地やピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は、生成した蛍光物質に紫外線を照射して励起された蛍光を目視で判定する必要があり、簡便性の面で充分満足できるものではなかった。さらに、ピルビン酸添加ＸＧａｌ−ＭＵＧ培地は、２価イオン、特にカルシウムやマグネシウムを多く含む井戸水などを検体とした場合には白濁して、Ｅ．ｃｏｌｉの有無の判定が困難であった。また、水中のＥ．ｃｏｌｉを同定するための改良された方法（特許文献２）はβ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ基質とトリプトファナ−ゼ基質が含まれている培地を用いる方法で、培養後Ｅ．ｃｏｌｉを確認するためにはインド−ル試薬（コバック試薬）を添加する必要があり煩雑であった。
【特許文献１】特許第３１９５４３２号公報
【特許文献２】特許第３０３４０３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は簡便な操作で、迅速かつ正確にＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記実状に鑑み、簡便性、迅速性を求めて培地成分、着色性基質及び蛍光性基質を種々検討した結果、特定の培地成分、特定の着色性基質、特定の蛍光性基質及び特定のpHのグッドの緩衝剤（Good's buffer)を組み合せて用いれば、水を検体に用いた場合でも濁りを生じず、短時間の簡便な操作で高感度にＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、（１）ペプトン０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（２）塩化ナトリウム０．１〜２．０ｗ／ｖ％、（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤０．０１〜１mol／Ｌ、（４）ピルビン酸ナトリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（５）硝酸カリウム０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）もしくはその塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩又はｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドもしくはその塩、（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩又は４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはその塩、並びに（８）ドデシル硫酸ナトリウム０．００５〜１．０ｗ／ｖ％及び／又は牛胆汁末０．５〜２．０ｗ／ｖ％を含有する培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色の有無を検出することを特徴とするＥ．ｃｏｌｉの検出法を提供するものである。
また、前記培地に被検体を加えて培養し、当該培地の着色を検出し、さらに紫外線照射により蛍光の有無を検出することを特徴とするＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群の検出法を提供するものである。
さらには、前記培地を含有するＥ．ｃｏｌｉ及び／又は大腸菌群検出用培地を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の培地を用いれば、肉眼観察により簡便かつ迅速にＥ．ｃｏｌｉを正確に検出でき、同時に大腸菌群も検出できる。本発明の培地は、カルシウムやマグネシウムを多く含む井戸水等の水を被検体とした場合でも白濁が生じず、正確な検出が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の培地には、前記（１）〜（８）の成分が含まれる。このうち、（１）ペプトンは、栄養成分であり、培地中に０．１〜２．０ｗ／ｖ％、特に０．１〜１．０ｗ／ｖ％含有するのがより好ましい。ここで、培地中の濃度は、培養時の濃度である。（２）塩化ナトリウムは、培地中に０．１〜２．０ｗ／ｖ％、特に０．１〜１．０ｗ／ｖ％が好ましい。
【００１０】
（３）pHが６．５〜７．５のグッドの緩衝剤としては、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（PIPES）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（HEPES）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（TES）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ACES）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ADA）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（BES）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis-Tris）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（MOPSO）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸及びこれらの塩等が挙げられる。これらの緩衝剤は、培地中に、それぞれ０．０１〜１mol／Ｌ、好ましくは０．０２〜１mol／Ｌ含有する。本発明の培地が、井戸水等を被検体とした場合でも白濁が生じないのは、これらの緩衝剤がカルシウムイオンやマグネシウムイオンとの間で水不溶性物質を生成しないためと考えられる。
【００１１】
（４）ピルビン酸ナトリウムは、培地中に０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜２ｗ／ｖ％含有する。（５）硫酸カリウムは、培地中に０．０５〜５．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜２ｗ／ｖ％含有する。
【００１２】
（６）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）又はその塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド又はその塩は、着色性基質であり、Ｅ．ｃｏｌｉが産生する酵素、グルクロニダーゼにより分解し、色素を生成する。これらの塩としては、シクロヘキシルアンモニウム塩が好ましい。これらの着色性基質の培地中の含有量は、０．００１〜０．１ｗ／ｖ％が好ましい。
【００１３】
（７）４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ＭＵＧＡＬ）又はその塩、４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド又はその塩は、蛍光性基質であり、大腸菌群が産生する酵素、β−Ｄ−ガラクトシダーゼにより分解し、蛍光色素を生成する。これらの蛍光性基質の培地中の含有量は０．００１〜０．１ｗ／ｖ％が好ましい。
【００１４】
（８）ドデシル硫酸ナトリウム及び／又は牛胆汁末は、界面活性剤であり、グラム陽性菌の発育を抑制する作用を有する。ドデシル硫酸ナトリウムは培地中に０．００５〜１．０ｗ／ｖ％、特に０．００５〜０．５ｗ／ｖ％含有するのが好ましい。また牛胆汁末の場合は、０．５〜２．０ｗ／ｖ％、特に１．０〜２．０ｗ／ｖ％含有するのが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明の培地には、酵母エキス、アミノ酸類、グリセロール（０．５〜１．５ｗ／ｖ％）等が含まれていてもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを０．００１〜０．１ｗ／ｖ％含有するのが、大腸菌群が産生する酵素β−ガラクトシダーゼの産生を促進し、酵素反応をより正確にする点から好ましい。
【００１６】
本発明の培地は、使用時のpHが６．５〜７．５、特に６．８〜７．３とするのが好ましい。
【００１７】
本発明の培地は、前記成分を混合して液体培地として用いることもできるが、これに寒天０．１〜１．５ｗ／ｖ％配合して寒天培地として用いることもできる。
【００１８】
本発明の培地を用いて、被検体中のＥ．ｃｏｌｉの存在を検出するには、当該培地に被検体を加えて３０〜４４．５℃で数時間〜十数時間培養した後、当該培地の着色の有無を肉眼観察すればよい。
【００１９】
さらに、Ｅ．ｃｏｌｉを確認するために紫外線を照射し、蛍光を確認できれば大腸菌群であることを認め、さらにＥ．ｃｏｌｉが存在する確立を高めることができる。
【００２０】
ここで被検体としては、水、飲食品等が挙げられるが、本発明は水を被検体とする場合に特に有用である。被検体を予めトリプトソーヤブイヨン等の培地で培養した培養液として用いることもできる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
表２〜６記載の微生物６３株をトリプトソーヤブイヨン又はブドウ等ペプトン水で３５℃、２４時間培養した。この培養液１０μＬを下記表１の培地１０mLに接種後、３５℃、２４時間培養し、培地の着色の有無並びに紫外線照射による蛍光の有無を肉眼観察した。その結果を表２〜６に示す。
【００２３】
【表１】
2005176640.tif 000002
【００２４】
【表２】
2005176640.tif 000003
【００２５】
【表３】
2005176640.tif 000004
【００２６】
【表４】
2005176640.tif 000005
【００２７】
【表５】
2005176640.tif 000006
【００２８】
【表６】
2005176640.tif 000007
【００２９】
表２〜６から明らかなように、Ｅ．ｃｏｌｉ（E.coli O157:H7を除く）は１００％着色及びＥ．ｃｏｌｉを含む大腸菌群は１００％蛍光が観察された。他の菌株では全く着色が見られず、本発明方法が正確であることが確認された。