(57)【要約】    【課題】  アルツハイマー病、パーキンソン病、脳や心筋の虚血等の疾患の治療に有用な、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、及びカスパーゼ８等のカスパーゼを阻害する新規カスパーゼ阻害剤を提供すること。    【解決手段】  細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）の乾燥粉末を含有してなるカスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、及びカスパーゼ８等のカスパーゼ阻害剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ阻害剤。
【請求項２】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ１阻害剤。
【請求項３】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ３阻害剤。
【請求項４】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ６阻害剤。
【請求項５】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ７阻害剤。
【請求項６】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるカスパーゼ８阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８等のカスパーゼを阻害するためのカスパーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼは、プログラム化された細胞の死 (細胞死)（周囲の細胞に障害を与えたり、炎症反応を誘発することなく、特定の細胞や細胞タイプを排除するために生理学的に使用される正常過程）を執行する物質である。何れのカスパーゼも、活性部位におけるシステイン残基を特徴とするプロテアーゼ系に属し、Ａｓｐ残基に対して特異性を発揮する。カスパーゼは全ての細胞内にプロテアーゼとして存在し、他のプロテアーゼ（他のカスパーゼを含む）による蛋白質分解分割（proteolytic cleavage）によって活性化される。カスパーゼの阻害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳や心筋の虚血等の疾患の治療に有用と考えられる。
【０００３】
カスパーゼ阻害作用を有する化合物としては、特許文献１記載のスルホキノボシルジアシルグリセロール、特許文献２記載のアミノイミノキノン、及び特許文献３記載のプロスタグランジンＥ１活性を有する化合物等が知られているが、多様な局面でカスパーゼ活性を阻害する上で、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８等のカスパーゼを阻害するための更なるカスパーゼ阻害剤に対する要望は強い。
【特許文献１】特許第２９０２３１８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２０１８６号公報
【特許文献３】特開２００１−３０２５１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来技術に存した上記のような課題に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８等のカスパーゼを阻害する新規カスパーゼ阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８等のカスパーゼを阻害する上で有用な物質について研究を行った結果、本発明を完成したものである。
【０００６】
すなわち、上記目的を達成する本発明のカスパーゼ阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼを阻害する方法を提供するものである。
【０００７】
また本発明のカスパーゼ１阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼ１を阻害する方法を提供するものである。
【０００８】
更に、本発明のカスパーゼ３阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼ３を阻害する方法を提供するものである。
【０００９】
また更に、本発明のカスパーゼ６阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼ６を阻害する方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明のカスパーゼ７阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼ７を阻害する方法を提供するものである。
【００１１】
更に本発明のカスパーゼ８阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してカスパーゼ８を阻害する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のカスパーゼ阻害剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳や心筋の虚血等の疾患の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００１４】
本発明のカスパーゼ阻害剤（カスパーゼ１阻害剤、カスパーゼ３阻害剤、カスパーゼ６阻害剤、カスパーゼ７阻害剤、カスパーゼ８阻害剤を含む。以下同じ。）におけるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００１５】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００１６】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
【００１７】
本発明のカスパーゼ阻害剤は、経口適用が望ましい。経口適用の形態に特に限定はないが、好ましくは、栄養食品、栄養補助食品、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、又は飲料用液体の形態である。
【００１８】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００１９】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００２０】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００２１】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２２】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００２３】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００２４】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【実施例】
【００２５】
クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）乾燥粉末の製造
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］  WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末（株式会社サン・クロレラ製の細胞壁破砕クロレラ粉末）が得られた。
【００２６】
カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８阻害活性の測定
クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒を、カスパーゼ１、カスパーゼ３及びカスパーゼ８（Ｂｉｏｍｏｌ［米国］から入手）、カスパーゼ６及びカスパーゼ７（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ［米国］から入手）、及び蛍光基質（fluorogenic substrate）と共に、５０ｍＭの修飾ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ［米国］から入手）中でインキュベートした。インキュベート時間は、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、及びカスパーゼ８それぞれについて１８０分間、６０分間、１２０分間、６０分間、及び６０分間とした。
【００２７】
各カスパーゼ用の蛍光基質は、次のとおりである。カスパーゼ １用：Ac-YVAD-AMC 蛍光基質、カスパーゼ ３、７用：Ac-DEVD-AMC 蛍光基質、カスパーゼ８用：Ac-IETD-AMC 蛍光基質 (Ｂｉｏｍｏｌ［米国］から入手); カスパーゼ６、７用：Ac-VEID-AMC 蛍光基質  (Pharmingen［米国］から入手、); Ac-VEID-AMC 蛍光発生性基質（カスパーゼ 6用）
【００２８】
Spectrafluor Plus（Ｔｅｃａｎ［オーストリア］) を用いて蛍光分光測定法により励起３６０ｎｍ、放出４６５ｎｍで蛋白質分解物を測定することにより酵素活性を判定したところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）による５０％阻害濃度は、カスパーゼ１が３００μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ミリリットル）、カスパーゼ３が２０３μｇ／ｍｌ、カスパーゼ６が３０１μｇ／ｍｌ、カスパーゼ７が２９１μｇ／ｍｌ、カスパーゼ８が２６１μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサはカスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、及びカスパーゼ８の阻害作用を有していた。