(57)【要約】【課題】ＤＮＡプローブ等の生体関連物質を基板に高密度に固定化することができ、感度の高いマイクロアレイアッセイを可能とする生体関連物質固定用粒子およびこのような粒子を用いたマイクロアレイを提供する。【解決手段】生体関連物質を固定し、かつ、この固定した生体関連物質を基板に固定するために用いられる生体関連物質固定用粒子であって、粒子状基材の表面にチオール基と生体関連物質を導入可能な官能基とを有する生体関連物質固定用粒子であり、また、このような生体関連物質固定用粒子２と、表面にチオール基と化学的に結合する金属の層３を設けてなる基板１とを有し、生体関連物質固定用粒子２は、基板１の金属層３上に、それ自身が有するチオール基と金属との化学的結合によって固定されているマイクロアレイである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体関連物質を固定し、かつ、この固定した生体関連物質を基板に固定するために用いられる生体関連物質固定用粒子であって、
粒子状基材の表面にチオール基と生体関連物質を導入可能な官能基とを有することを特徴とする生体関連物質固定用粒子。
【請求項２】
前記生体関連物質を導入可能な官能基が、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、アルデヒド基、トシルオキシ基および酸クロライド基からなる群より選ばれること特徴とする請求項１記載の生体関連物質固定用粒子。
【請求項３】
識別のための蛍光色素をさらに含有していることを特徴とする請求項１または２記載の生体関連物質固定用粒子。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項記載の生体関連物質固定用粒子と、表面にチオール基と化学的に結合する金属の層を設けてなる基板とを有し、前記生体関連物質固定用粒子は、前記基板の金属層上に、それ自身が有するチオール基と前記金属との化学的結合によって固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項５】
前記金属層は金、銀および銅の群から選ばれる金属からなることを特徴とする請求項４記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
前記金属層は所定のパターン形状に設けられていることを特徴とする請求項４または５記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記生体関連物質固定用粒子に生体関連物質が固定されていることを特徴とする請求項４乃至６のいずれか1項記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ等の生体関連物質を固定するために用いられる生体関連物質固定用粒子およびこのような粒子を基板に固定させたマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムプロジェクトの進歩に伴って、大量の遺伝子情報を一度に処理、解析する必要性が高まり、このようなニーズを満たすための１つの有力な手段として、ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップ（以下、ＤＮＡマイクロアレイと称する。）が開発され、実用化されている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイは、多数のｃＤＮＡ、ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド等（以下、ＤＮＡプローブと称する。）をガラス基板またはシリコン基板上に固定したものであり、このＤＮＡマイクロアレイに固定されたＤＮＡプローブとこれに相補的なＤＮＡ断片試料とのハイブリダイゼーションを利用することにより、試料に含まれるＤＮＡの状態を定量的または定性的に解析するものである。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイを製造するには、基板表面に多数のＤＮＡプローブを高密度かつ安定に整列させ固定することが必要であり、その作製方法としては、従来から、基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法と、予め調製したＤＮＡプローブを基板上に固定する2つの方法が一般に用いられている。
【０００５】
前者の基板上で合成を行う方法は、基板表面に反応性保護基を有する化学リンカーを導入し、半導体製造で用いるフォトリソグラフィーの技術を用いて脱保護した後、固相合成の手法により保護基を有するヌクレオチドと反応させ、これを繰り返すことによって直接オリゴヌクレオチドを合成していく方法である（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
また、後者の予め調製したＤＮＡプローブを基板上に固定する方法には、基板表面がプラスの電荷を有するように表面処理を行い、ＤＮＡプローブのもつ電荷を利用して担体表面に静電結合させる方法（例えば、特許文献２参照。）と、合成オリゴヌクレオチドに反応活性基を導入する一方、基板にも反応性基を有するように表面処理を行い、オリゴヌクレオチドを基板表面に共有結合させる方法（例えば、特許文献３参照。）とが知られている。
【０００７】
それぞれ一長一短があり、前者では、人工的に合成されたオリゴヌクレオチドが基板表面に共有結合で固定されるため、再現性に優れた測定を行うことができる利点があり、一方、後者では、前者に比べ再現性等に課題を残すものの、スポット用のＤＮＡプローブが用意できれば比較的低コストで製造することができ、また、使用者がカスタマイズを容易に行うことができるという利点を有する。
【特許文献１】米国特許第５４２４１８６号明細書
【特許文献２】特開２００２−７１６８６号公報
【特許文献３】特開２００２−６０６７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、前述したように、ＤＮＡマイクロアレイにおいては、多くのＤＮＡプローブを基板にいかに高密度にかつ安定に固定させるかが非常に重要である。高密度にかつ安定に固定させることにより、測定感度を高め、信頼性の高い解析が可能となる。しかしながら、上述した従来の技術はいずれも、基本的に平らな基板に直接ＤＮＡプローブを固定するものであるため、高密度化には限度があった。このため、ＤＮＡプローブを基板により高密度に固定化しうる技術が要望されている。
【０００９】
本発明はこのような要望に応えるためになされたもので、ＤＮＡプローブ等の生体関連物質を基板により高密度に固定化することができ、より感度の高いマイクロアレイアッセイを可能とする生体関連物質固定用粒子およびこのような粒子を用いたマイクロアレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記の目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡプローブ等の生体関連物質を粒子に固定し、この粒子を基板に固定することにより、基板におけるＤＮＡプローブ等の生体関連物質の固定面積を実質的に増大させることができ、これにより従来に比べより高密度な固定化が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本願の請求項１に記載の発明の生体関連物質固定用粒子は、生体関連物質を固定し、かつ、この固定した生体関連物質を基板に固定するために用いられる生体関連物質固定用粒子であって、粒子状基材の表面にチオール基と生体関連物質を導入可能な官能基とを有することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項２に記載の発明は、請求項１記載の生体関連物質固定用粒子において、前記生体関連物質を導入可能な官能基が、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、アルデヒド基、トシルオキシ基および酸クロライド基からなる群より選ばれること特徴とするものである。
【００１３】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２記載の生体関連物質固定用粒子において、識別のための蛍光色素をさらに含有していることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本願の請求項４に記載の発明のマイクロアレイは、請求項１乃至３のいずれか１項記載の生体関連物質固定用粒子と、表面にチオール基と化学的に結合する金属の層を設けてなる基板とを有し、前記生体関連物質固定用粒子は、前記基板の金属層上に、それ自身が有するチオール基と前記金属との化学的結合によって固定されていることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項５に記載の発明は、請求項４記載のマイクロアレイにおいて、前記金属層は金、銀および銅の群から選ばれる金属からなることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項６に記載の発明は、請求項４または５記載のマイクロアレイにおいて、前記金属層は所定のパターン形状に設けられていることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項７に記載の発明は、請求項４乃至６のいずれか１項記載のマイクロアレイにおいて、前記生体関連物質固定用粒子に生体関連物質が固定されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の生体関連物質固定用粒子およびマイクロアレイによれば、ＤＮＡプローブ等の生体関連物質を基板により高密度に固定化することができ、より感度の高いマイクロアレイアッセイが可能となる。しかも、製造にあたって特殊な装置を必要としないため、製造コストが従来に比べ大きく増大することもない。また、解析にあたっても特殊な測定装置を用いる必要がなく、簡易的かつ経済的な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、生体関連物質としては、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、抗体等が挙げられる。これらの生体関連物質には、次述する生体関連物質固定用粒子が有する官能基と結合可能な官能基が導入されていてもよい。
【００２１】
本発明の生体関連物質固定用粒子は、粒子状基材の表面にチオール基（−ＳＨ）と生体関連物質を導入可能な官能基を有するものである。
【００２２】
生体関連物質を導入可能な官能基は、上記のような生体関連物質が結合することができる官能基であれば特に限定されるものではなく、例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、ウレタン基、アミド基、ヒドラジド基、ウレア基、アルデヒド基、ケトン基、トシルオキシ基、酸クロライド基、エステル基等が挙げられる。これらの官能基のなかでも、結合の強さ、導入の容易さ等の観点から、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、水酸基、グリシジル基、アミノ基、アルデヒド基、トシルオキシ基、酸クロライド基が好ましい。
【００２３】
また、粒子状基材としては、アクリル系樹脂、ポリスチレン、アクリル酸−スチレン共重合体、メタクリル酸−スチレン共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、脂肪族ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリイソプレン、ポリジビニルベンゼン、ポリビニルピリジン、ポリジメチルシロキサン等の樹脂を主体とする微粒子が挙げられる。これらのなかでも、ポリスチレン、メタクリル酸−スチレン共重合体のようなスチレンと（メタ）アクリル酸（エステル）との共重合体が好ましい。これらの微粒子には、必要に応じて、識別のための蛍光色素が内包されていてもよい。このような蛍光色素としては、１,３−ビス[(１,３−ジヒドロ−１,３,３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン)メチル]−２,４−ジヒドロキシ−シクロブテンジイリウムおよびその塩、２−(３,５−ジメチルピロール−２−イル)−４−(３,５−ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン)−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オン、３,６−ジアミノ−２,５−ピラジンカルボニトリル等が例示される。これらの蛍光色素は1種を単独で使用してもよく、2種以上を適宜混合して使用してもよい。
【００２４】
本発明の生体関連物質固定用粒子を得るには、例えば、上記のような微粒子を製造する際に、重合成分としてチオール基および生体関連物質を導入可能な官能基を有するものを用いるようにすればよい。なお、このようにして得られた生体関連物質固定用粒子は、すぐに使用しない場合には、チオール基の酸化を防止するため、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を含有する溶液中に保存しておき、使用直前に、還元剤を除去するようにする。還元剤は、ゲルろ過法や酢酸エチル等の有機溶媒に溶解する方法等により除去することができる。
【００２５】
本発明の生体関連物質固定用粒子の粒径は、用途に応じて適宜選択することができるが、通常、0.1μｍ〜100μｍの範囲である。
【００２６】
次に、このような生体関連物質固定用粒子を用いたマイクロアレイについて説明する。
【００２７】
すなわち、図１は本発明のマイクロアレイの第１の実施形態を模式的に示した斜視図である。
【００２８】
図１に示すように、このマイクロアレイは、基板１と、この基板１上に固定された多数の前記した生体関連物質固定用粒子２とから構成されている。基板１の表面にはチオール基と化学的に結合（配位結合）する金属、例えば金、銀、銅等からなる層３が所定のパターンで設けられており、生体関連物質固定用粒子２は、この金属層３上に、それ自身が有するチオール基と前記金属とが配位結合することによって固定されている。
【００２９】
なお、この例は、測定用の生体関連物質を適宜結合させる操作を行うことで、使用者がカスタマイズできる構成をとっているが、図２に示すように、すぐに測定を行うことができるように、予め所定の生体関連物質４を生体関連物質固定用粒子２に固定させた構成としてもよい。生体関連物質４は、生体関連物質固定用粒子２表面の生体関連物質を導入可能な官能基に結合し、固定される。
【００３０】
基板１の材料としては、シリコン、ガラス、樹脂、セラミック等、従来よりマイクロアレイ用基板の材料として使用されているものを用いることができる。
【００３１】
金属層３の金属の種類としては、上述したように、金、銀、銅等が挙げられるが、結合強さの観点から、なかでも金および銀が好ましい。金属層３は、蒸着法、めっき法、スパッタ法、印刷法等により形成することができ、その層厚は、平均厚さとして0.5μｍ〜1μｍの範囲が適当である。
【００３２】
このように構成されるマイクロアレイは、例えば次のように製造することができる。
【００３３】
すなわち、図３は、上記マイクロアレイの製造工程の一例を示す図である。
図３において、まず、基板１上にフォトレジストを塗布し乾燥させてフォトレジスト膜５を形成した後、このフォトレジスト膜５をフォトマスク６を介して露光し（図３（ａ））、現像して、所定のパターンを形成する（図３（ｂ））。フォトレジストには、例えば、ポリメチルメタクリレート系、ノボラック樹脂系、環化ゴム系、けい皮酸ポリマー系、ポリメチルイソプロペニルケトン系等の各種ポジ型およびネガ型のフォトレジストを使用することができる。
【００３４】
次いで、これらの上にチタンからなる被膜７およびチオール基と配位結合する金属として例えば金からなる被膜８を順に蒸着法などにより形成する（図３（ｃ））。続いて、フォトマスク６を、その上に形成されたそれぞれチタンおよび金等からなる被膜７、８とともに剥離し、さらに、フォトレジスト膜５も除去する。この結果、表面に所定パターンの金等からなる層３が形成された基板１が得られる（図３（ｄ））。
【００３５】
この後、上記基板１を、生体関連物質固定用粒子２を分散させた4℃〜100℃程度の緩衝液中に5分乃至24時間程度浸漬することによって（図３（ｅ））、生体関連物質固定用粒子２のチオール基と金とが配位結合し、生体関連物質固定用粒子２が金属層３上に固定され、上記構成のマイクロアレイが作製される。
【００３６】
生体関連物質４は、生体関連物質固定用粒子２の表面に設けられた官能基と生体関連物質が含有するもしくは導入された官能基を反応させ結合させることにより、生体関連物質固定用粒子２に固定することができる。例えば、生体関連物質４としてオリゴヌクレオチドを、表面にカルボキシル基を有する生体関連物質固定用粒子２に固定する場合、オリゴヌクレオチド末端にはアミノ基を導入しておき、これらの基を反応させて塩を形成させたり、あるいは縮合剤を共存させることによりアミド結合を形成させたりすることにより、オリゴヌクレオチドを生体関連物質固定用粒子２上に固定することができる。
【００３７】
なお、図２に示すマイクロアレイの場合には、生体関連物質固定用粒子２を基板１に固定する前に生体関連物質４を予め固定しておいてもよい。
【００３８】
本実施形態のマイクロアレイにおいては、基板１上に生体関連物質固定用粒子２を介して生体関連物質４が固定されるため、生体関連物質４を高密度に固定化することができる。したがって、感度の高いマイクロアレイアッセイが可能となる。しかも、生体関連物質固定用粒子２の基板１への固定は、生体関連物質固定用粒子２表面に設けたチオール基と基板１表面に設けた金属層３の金属との配位結合によってなされるため、作製にあたって特殊な装置を必要とせず、簡便かつ低コストで作製することができる。さらに、遺伝子発現等の解析に使用する場合、従来より知られる方法で行うことができ、特殊な装置を使用する必要もない。
【００３９】
次に、本発明の他の実施形態について説明する。
【００４０】
図４は、本発明のマイクロアレイの第２の実施形態にかかる斜視図であり、図１に共通する部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００４１】
本実施形態のマイクロアレイは、第１の実施形態において、生体関連物質固定用粒子２として、識別のための蛍光色素を内包したものを用いるとともに、基材１上のほぼ全面に金属層３を設けたものであり、生体関連物質固定用粒子２は金属層２上にランダムに固定されている。蛍光色素が内包された生体関連物質固定用粒子２は、それ自身で識別可能であるため、第１の実施形態のように金属層３をパターンニングして、生体関連物質固定用粒子２を所定の位置に配置せずとも、それぞれに固定されている生体関連物質４を特定し、解析することができる。
【００４２】
本実施形態のマイクロアレイにおいては、第１の実施形態の場合と同様、基板１上に生体関連物質固定用粒子２を介して生体関連物質４が固定されるため、生体関連物質４を高密度に固定化することができ、感度の高いマイクロアレイアッセイが可能となる、また、生体関連物質固定用粒子２の基板１への固定は、生体関連物質固定用粒子２表面に設けたチオール基と基板１表面に設けた金属層３の金属との配位結合によってなされるため、作製にあたって特殊な装置を必要とせず、簡便かつ低コストで作製することができる。さらに、遺伝子発現等の解析に使用する場合、従来より知られる方法で行うことができ、特殊な装置を使用する必要もない。そのうえ、金属層３をパターンニングする必要がないため、第１の実施形態のマイクロアレイに比べ、より簡単に製造することができる。
【００４３】
なお、本実施形態において、金属層３は基板１上のほぼ全面に設けられているが、所要の生体関連物質固定用粒子２を固定することができれば特にこのような例に限定されるものではなく、例えば網目状やドット状等であってもよい。
【００４４】
また、使用にあたって、生体関連物質固定用粒子２に生体関連物質４を予め固定しておくだけでなく、緩衝液に生体関連物質固定用粒子２を懸濁した状態で、予め固定した生体関連物質４と解析対象の生体関連物質とを反応させた後、基板１上に固定化するようにしてもよい。このような手法を用いることにより、解析対象の生体関連物質との反応を促進し、反応効率を高めることができる。
【実施例】
【００４５】
次に本発明の具体的な実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００４６】
実施例１
窒素雰囲気下、ジメルカプトジフェニルスルフィド10.7g（43mmol）、ｐ−ジビニルベンゼン5.57g（43mmol）、２,２′−アゾビスイソブチロニトリル0.13g（0.79mmol）およびポリビニルピロリドン1.71gを、テトラヒドロフラン51mlおよびメタノール34mlの混合溶媒に溶解し、60℃で12時間反応させた。反応終了後、分散液を室温まで降温し、遠心分離によって微粒子を分離した。この分離した微粒子をメタノールで洗浄し、平均粒径4μｍの生体関連物質固定用粒子を得た。
【００４７】
また、シリコン基板（50mm×90mm×0.6mm）上にビーム径3μｍの電子ビームを用いて正方格子（5μｍ×5μｍ）を描画し、その上にチタンおよび金を順にそれぞれ30nm厚および500nm厚に蒸着した。
【００４８】
この基板を、上記生体関連物質固定用粒子を濃度が1wt％となるように分散させた緩衝液（ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）中に80℃で約1時間浸漬して、生体関連物質固定用粒子を基板上に固定させた。固定量は約600万個であった。
【００４９】
次いで、末端にアミノ基を導入したプローブＤＮＡを、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が0.5mg／mlとなるように溶解した溶液に、上記の生体関連物質固定用粒子を固定した基板を浸漬して、75℃で1時間インキュベートし、さらに、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、純水およびエタノールに順に浸漬した後、室温で乾燥して、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００５０】
得られたＤＮＡマイクロアレイ上に、ターゲットＤＮＡとしてその配列が先に固定したプローブＤＮＡに相補的な配列を有し、蛍光色素（フルオレセイン）で標識したオリゴヌクレオチドを0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が200ng／mlとなるように溶解した溶液をスポットし、45℃で約24時間インキュベートした。その後、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液で洗浄し、乾燥させた。基板上の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で計測したところ、蛍光が確認され、ハイブリダイズ体が得られたことが確認された。
【００５１】
実施例２
パラ位にチオール基を導入し、このチオール基をアセチル基で保護したスチレン26.7g（0.17mol）およびアクリル酸アセチル4.58g（0.04mol）をトルエンに溶解した後、２,２′−アゾビスイソブチロニトリル0.45g（2.74mmol）を加え、70℃で10時間反応させた。反応終了後、反応液を室温まで降温し、メタノールを60ml加えた後、水酸化ナトリウムを加えて加水分解を行い、チオール基とカルボキシル基を有するスチレン−アクリル共重合体を得た。
【００５２】
上記スチレン−アクリル共重合体100重量部を熱ロールにより120℃〜180℃で加熱混練した。冷却後、ハンマーミルで粗粉砕し、さらにジェットミルを用いて微粉砕し、分級して、平均粒径10μｍの生体関連物質固定用粒子を得た。
【００５３】
また、シリコン基板（50mm×90mm×0.6mm）上に、図３に示した方法で、正方格子（12μｍ×12μｍ）が縦横に配列された形状の金からなるパターンを形成した。すなわち、まず、基板１上にフォトレジストとしてノボラック樹脂を塗布し乾燥させて2μｍ厚のフォトレジスト膜５を形成した後、このフォトレジスト膜５をフォトマスク６を介して露光し現像した。次いで、これらの上にチタンおよび金を順にそれぞれ50nm厚および500nm厚に蒸着した。続いて、フォトマスク６を、その上に形成されたそれぞれチタンおよび金からなる被膜とともに剥離し、さらに、フォトレジスト膜５を除去した。
【００５４】
この基板を、上記生体関連物質固定用粒子を濃度が1wt％となるように分散させた緩衝液中に80℃で約1時間浸漬して、生体関連物質固定用粒子を基板上に固定させた。固定量は約180万個であった。
【００５５】
次いで、末端にアミノ基を導入したプローブＤＮＡを、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が0.5mg／mlとなるように溶解した溶液に、上記の生体関連物質固定用粒子を固定した基板を浸漬して、75℃で1時間インキュベートし、さらに、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、純水およびエタノールに順に浸漬した後、室温で乾燥して、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００５６】
得られたＤＮＡマイクロアレイ上に、ターゲットＤＮＡとしてその配列が先に固定したプローブＤＮＡに相補的な配列を有し、蛍光色素（フルオレセイン）で標識したオリゴヌクレオチドを0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が200ng／mlとなるように溶解した溶液をスポットし、45℃で約24時間インキュベートした。その後、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液で洗浄し、乾燥させた。基板上の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で計測したところ、蛍光が確認され、ハイブリダイズ体が得られたことが確認された。
【００５７】
実施例３
パラ位にチオール基を導入し、このチオール基をアセチル基で保護したスチレン23.2g（0.15mol）およびメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル7.01g（0.04mol）をトルエン160mlに溶解した後、２,２′−アゾビスイソブチロニトリル0.39g（2.38mmol）を加え、70℃で10時間反応させた。反応終了後、反応液を室温まで降温し、メタノールを53ml加えた後、水酸化ナトリウムを加えて加水分解を行い、チオール基とカルボキシル基を有するスチレン−アクリル共重合体を得た。
【００５８】
上記スチレン−アクリル共重合体100重量部を熱ロールにより120℃〜180℃で加熱混練した。冷却後、ハンマーミルで粗粉砕し、さらにジェットミルを用いて微粉砕し、分級して、平均粒径10μｍの微粒子を得た。
【００５９】
また、赤蛍光染料１,３−ビス[(１,３−ジヒドロ−１,３,３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン)メチル]−２,４−ジヒドロキシシクロブテンジイリウムと、オレンジ染料２−(３,５−ジメチルピロール−２−イル)−４−(３,５−ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン)−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オンとを異なる比率でクロロホルムとエタノールの混合溶媒（混合比 2:3）に溶解して、2種の染料の混合比の異なる64種の混合染料液を調製した。
【００６０】
これらの各混合染料液0.6mlに上記微粒子60mgをそれぞれ懸濁させ、2時間の超音波処理を行った。処理後、各懸濁液から微粒子を分離し、1.2mlのメタノールに懸濁させた後、さらに超音波処理およびメタノール洗浄を行い、64個（種）の微粒子ライブラリー（同種の蛍光染料を異なる比率で配合したもの）を作成した。
【００６１】
得られた64個の微粒子ライブラリーをそれぞれ緩衝液に濃度が1wt％となるように懸濁させた後、これらの各懸濁液に、末端にカルボキシル基を導入したプローブＤＮＡを、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が0.5mg／mlとなるように溶解した溶液を混合して、75℃で1時間インキュベートし、微粒子にプローブＤＮＡを導入した。この後、微粒子を分離し、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、純水およびエタノールに順に浸漬した後、純水に濃度が1wt％となるように懸濁させた。なお、64個の微粒子ライブラリーのうちの1つに、目的遺伝子検出のためのプローブＤＮＡを導入し、その他には目的遺伝子を有さないプローブＤＮＡを導入した。
【００６２】
次いで、これらのプローブＤＮＡを導入した64個の微粒子ライブラリーを含む懸濁液を混合し、この混合液中に、実施例２の場合と同様にして、シリコン基板（50mm×90mm×0.6mm）上に、正方格子（12μｍ×12μｍ）が縦横に配列された形状の金からなるパターンを形成した基板を、80℃で約1時間浸漬して、プローブＤＮＡを導入した微粒子を基板上に固定させた。
【００６３】
この後、上記基板上に、ターゲットＤＮＡとしてその配列が先に固定した目的遺伝子検出のためのプローブＤＮＡに相補的な配列を有し、蛍光色素（フルオレセイン）で標識したオリゴヌクレオチドを0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が200ng／mlとなるように溶解した溶液をスポットし、45℃で約24時間インキュベートした。その後、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液で洗浄し、乾燥させた。基板上の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で計測したところ、フルオロセイン蛍光が確認され、ハイブリダイズ体が得られたことが確認された。また、微粒子の染色蛍光によって目的遺伝子が確認された。
【００６４】
実施例４
パラ位にチオール基を導入し、このチオール基をアセチル基で保護したスチレン23.2g（0.15mol）およびメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチルエステル7.01g（0.04mol）をトルエン160mlに溶解した後、２,２′−アゾビスイソブチロニトリル0.39g（2.38mmol）を加え、70℃で10時間反応させた。反応終了後、反応液を室温まで降温し、メタノールを53ml加えた後、水酸化ナトリウムを加えて加水分解を行い、チオール基とカルボキシル基を有するスチレン−アクリル共重合体を得た。
【００６５】
上記スチレン−アクリル共重合体100重量部を熱ロールにより120℃〜180℃で加熱混練した。冷却後、ハンマーミルで粗粉砕し、さらにジェットミルを用いて微粉砕し、分級して、平均粒径10μｍの微粒子を得た。
【００６６】
また、赤蛍光染料１,３−ビス[(１,３−ジヒドロ−１,３,３−トリメチル−２Ｈ−インドール−２−イリデン)メチル]−２,４−ジヒドロキシシクロブテンジイリウムと、オレンジ染料２−(３,５−ジメチルピロール−２−イル)−４−(３,５−ジメチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン)−３−ヒドロキシ−２−シクロブテン−１−オンと、黄緑蛍光染料３,６−ジアミノ−２,５−ピラジンカルボニトリルとを、異なる比率でクロロホルムとエタノールの混合溶媒（混合比 2:3）に溶解して、3種の染料の混合比の異なる128種の混合染料液を調製した。
【００６７】
これらの各混合染料液0.6mlに上記微粒子60mgをそれぞれ懸濁させ、2時間の超音波処理を行った。処理後、各懸濁液から微粒子を分離し、1.2mlのメタノールに懸濁させた後、さらに超音波処理およびメタノール洗浄を行い、128個（種）の微粒子ライブラリー（同種の蛍光染料を異なる比率で配合したもの）を作成した。
【００６８】
得られた128個の微粒子ライブラリーをそれぞれ緩衝液に濃度が1wt％となるように懸濁させた後、これらの各懸濁液に、末端にカルボキシル基を導入したプローブＤＮＡを、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が0.5mg／mlとなるように溶解した溶液を混合して、75℃で1時間インキュベートし、微粒子にプローブＤＮＡを導入した。この後、微粒子を分離し、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、純水およびエタノールに順に浸漬した後、純水に濃度が1wt％となるように懸濁させた。なお、128個の微粒子ライブラリーのうちの1つに、目的遺伝子検出のためのプローブＤＮＡを導入し、その他には目的遺伝子を有さないプローブＤＮＡを導入した。
【００６９】
次いで、これらのプローブＤＮＡを導入した128個の微粒子ライブラリーを含む懸濁液を混合し、この混合液中に、実施例２の場合と同様にして、シリコン基板（50mm×90mm×0.6mm）上に、正方格子（12μｍ×12μｍ）が縦横に配列された形状の金からなるパターンを形成した基板を、80℃で約1時間浸漬して、プローブＤＮＡを導入した微粒子を基板上に固定させた。
【００７０】
この後、上記基板上に、ターゲットＤＮＡとしてその配列が先に固定した目的遺伝子検出のためのプローブＤＮＡに相補的な配列を有し、蛍光色素（フルオレセイン）で標識したオリゴヌクレオチドを0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液に、その濃度が200ng／mlとなるように溶解した溶液をスポットし、45℃で約24時間インキュベートした。その後、0.15M塩化ナトリウムおよび15mMクエン酸水溶液で洗浄し、乾燥させた。基板上の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で計測したところ、フルオロセイン蛍光が確認され、ハイブリダイズ体が得られたことが確認された。また、微粒子の染色蛍光によって目的遺伝子が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明のマイクロアレイの第１の実施形態を模式的に示す斜視図。
【図２】本発明のマイクロアレイの第１の実施形態の変形例を模式的に示す図。
【図３】本発明のマイクロアレイの製造工程の一例を模式的に示す図。
【図４】本発明のマイクロアレイの他の実施形態を模式的に示す図。
【符号の説明】
【００７２】
１…基板、２…生体関連物質固定用粒子、３…金属層、４…生体関連物質、５…フォトレジスト膜、６…フォトマスク、７…チタン被膜、８…金被膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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