(57)【要約】【課題】  複合疾患と関連した多重ＳＮＰマーカーから最適のマーカーセットを選択する方法を提供する。【解決手段】  （ａ）複数のＳＮＰマーカーからセット関連法を利用して関連度の高いマーカーのセットを選別する段階と、（ｂ）前記セットに属するマーカーの任意の組合わせについて、判別分析を用いることによって関連度の高いマーカーを選別する段階と、（ｃ）選別されたマーカーの任意の組合わせについて、ＲＯＣ曲線分析を用いることによって選別基準を満足させる最適のマーカーの組合わせを選択する段階と、を含む、多重ＳＮＰマーカーから最適のマーカーセットを選択する方法。【選択図】図２
2005259132.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複数のＳＮＰマーカーからセット関連法を利用して関連度の高いマーカーのセットを選別する段階と、
（ｂ）前記セットに属するマーカーの任意の組合わせについて、判別分析を用いることによって関連度の高いマーカーを選別する段階と、
（ｃ）選別されたマーカーの任意の組合わせについて、ＲＯＣ曲線分析を用いることによって選別基準を満足させる最適のマーカーの組合わせを選択する段階と、を含むことを特徴とする多重ＳＮＰマーカーから最適のマーカーセットを選択する方法。
【請求項２】
前記セット関連法は、
（ａ−１）任意のＳＮＰマーカーのセットについて、正常人集団と患者集団との各ＳＮＰマーカーの出現頻度の差を計算して対立因子関連度値ｔｉを求める段階と、
（ａ−２）得られた各対立因子関連度値ｔｉを、大きい値から小さな値の順に順位を付与する段階と、
Ｓ（ｎ）＝ｔｉ、ここでｎは順位を表し、ｔｉは順位がｎであるｉ番目ＳＮＰマーカーの対立因子関連度値を表し、
（ａ−３）順位ｎまでの各和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）を求める段階と、
Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）；
（ａ−４）順列検定を通じて各和に対してｐ値を計算する段階と、
（ａ−５）順列検定を通じて有義度を評価し、有義度の最も低いマーカーセットを選択する段階と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記セット関連法は、
（ａ−１）下記数式（１）で表示される特定のＳＮＰマーカーのハーディー・ワインベルグ平衡値に対する前記ＳＮＰマーカーの実際頻度の偏差のχ２値である関連不平衡化値を計算し、前記関連不平衡化値が一定の値を超過する場合には、該当ＳＮＰマーカーは分析から除外する段階と、
【数１】
2005259132.tif 000008
式中、Ｏｉはｉ番目ＳＮＰマーカーのハーディー・ワインベルグ平衡値であり、
Ｅｉはｉ番目ＳＮＰマーカーの実際頻度値であり、
（ａ−２）任意のＳＮＰマーカーのセットについて、正常人集団と患者集団との各ＳＮＰマーカーの出現頻度の差を計算して得られた対立因子関連度値ｔｉに前記各ＳＮＰマーカーについての関連不平衡化値を乗算して、加重値が反映された対立因子関連度値を得る段階と、
（ａ−３）得られた各加重値が反映された対立因子関連度値を大きい値から小さな値の順に順位を付与する段階と、
Ｓ（ｎ）＝ｔｉ、ここでｎは順位を表し、ｔｉは順位がｎであるｉ番目ＳＮＰマーカーの対立因子関連度値を表し、
（ａ−４）順位ｎまでの各和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）を求める段階と、
Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）；
（ａ−５）順列検定を通じて各和に対してｐ値を計算する段階と、
（ａ−６）順列検定を通じて有義度を評価して有義度の最も低いマーカーセットを選択する段階と、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｂ）段階は、
多重ロジスティック回帰分析によって患者集団と正常人集団とを判別することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｃ）段階で、
前記ＲＯＣ判別曲線は、あらゆる発現レベルで偽陽性率に対して真陽性率をプロッティングしたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
各１ないしＮ個のＳＮＰマーカーに基づくものであり、Ｎは前記ＳＮＰマーカーセットに含まれたＳＮＰマーカーの数を表す請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記最適のマーカーセットの判別は、
敏感度、特異度、またはＲＯＣ曲線下の面積をマーカーの数に基づいて決定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数個のＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：単一塩基多型）マーカーから特定の疾病と関連性の高い最適ＳＮＰマーカーセットを選別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の遺伝的因子によって発生する疾病は複合疾病という。このような複合疾病において、いくつかの遺伝子が複雑なネットワークを形成させたり、あるいは疾病を発生または進行させるなどの影響を及ぼすことが知られている。したがって、多くのケースにおいて、メンデル遺伝疾患とは異なり、一つの遺伝子またはこれと関連したマーカーと前記疾病との関連性の程度が、大きくないために、疾病を診断し難い。これにより、原因遺伝子またはこれと関連したマーカーを発掘して活用するのは困難である。したがって、従来知られた一つの疾病と関連性のあるマーカーのみ使用する場合には、診断結果が不正確であるという問題点がある。
【０００３】
このような問題点を解決するために、従来より、多重疾病マーカーを開発して分析しようとする試みがあった。このような試みとして、いろいろな疾病マーカーのうち一つの遺伝子内に存在するマーカーが任意的に組合わせられた半数体（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）を分析する方法がある。しかし、この方法は一つの遺伝子内のマーカーを分析するものであるために、いろいろな遺伝子や染色体に分散されている遺伝的マーカーには適していないという問題点があった。
【０００４】
Ｏｔｔらは、特定の疾病と関連した多重ＳＮＰマーカーのうち対立因子関連値（Ａｌｌｅｌｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＡＡ）及びハーディー・ワインベルグ非平衡値（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ＬＤ）のような関連情報を反映するセット関連法を開発した（非特許文献１）。前記セット関連法は、関連性と関連するＡＡとハーディー・ワインベルグ非平衡値とを乗算して、それら２つの変数のいずれをも反映してさらに関連性の高いマーカーを選別するものである。
【０００５】
また、従来のＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線分析方法は、試験方法による正常個体から疾病個体を分別するための能力を評価するために用いられてきた。しかし、それらの方法が多重形質疾患についての最適ＳＮＰマーカーを選別するのに用いられた例はなかった。
【非特許文献１】「ゲノムリサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年，第１１巻，ｐ．２１１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、複数のＳＮＰマーカーから特定の疾病と関連性のある最適のＳＮＰマーカーセットを効率的に選別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を解決するために、（ａ）複数のＳＮＰマーカーからセット関連法を利用して関連度の高いマーカーのセットを選別する段階と、（ｂ）前記セットに属するマーカーの任意の組合わせについて、判別分析を用いることによって関連度の高いマーカーを選別する段階と、（ｃ）選別されたマーカーの任意の組合わせについて、ＲＯＣ曲線分析を用いることによって選別基準を満足させる最適のマーカー組合わせを選択する段階と、を含むことを特徴とする多重ＳＮＰマーカーから最適のマーカーセットを選択する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の最適ＳＮＰマーカーセット選別方法によれば、複数の遺伝子によって発病する疾病に特異的な複数個のＳＮＰマーカーのうち最も関連度の高い最適のＳＮＰマーカーセットを選別できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、添付した図面を参照して本発明の望ましい実施例について詳細に説明する。
【００１０】
本発明は、多重ＳＮＰマーカーから特定の疾病の存在有無を判別するために用いられる最適ＳＮＰマーカーセットを選択する方法であって、（ａ）複数のＳＮＰマーカーからセット関連法を利用して関連度の高いマーカーのセットを選別する段階と、（ｂ）前記セットに属するマーカーの任意の組合わせについて、判別分析を用いることによって関連度の高いマーカーを選別する段階と、（ｃ）選別されたマーカーの任意の組合わせについて、ＲＯＣ曲線分析を用いることによって選別基準を満足させる最適のマーカーの組合わせを選択する段階と、を含む。
【００１１】
本発明の一実施例において、前記セット関連法は、（ａ−１）任意のＳＮＰマーカーのセットについて、正常人集団と患者集団との各ＳＮＰマーカーの出現頻度の差を計算して対立因子関連度値ｔｉを求める段階と、（ａ−２）得られた各対立因子関連度値ｔｉを、大きい値から小さな値の順に順位を付与する段階と、Ｓ（ｎ）＝ｔｉ、ここでｎは順位を表し、ｔｉは順位がｎであるｉ番目ＳＮＰマーカーの対立因子関連度値を表し、（ａ−３）順位ｎまでの各和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）を求める段階と、（ａ−４）順列検定を通じて各和に対してｐ値（有義度）を計算する段階と、（ａ−５）順列検定を通じて有義度を評価し、有義度の最も低いマーカーセットを選択する段階と、を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の（ａ−１）段階では、任意のＳＮＰマーカーのセットについて、正常人集団と患者集団との各ＳＮＰマーカーの出現頻度の差の平均値を計算して対立因子関連度値ｔｉを求める。ここで、対立因子関連度値は対立因子の関連度を表す値である。（ａ−２）段階では、得られた各対立因子の関連度値を大きい値から小さな値の順に順位を付与し、（ａ−３）段階では、順位の高いＳＮＰから始まって順位ｎまでの和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）をそれぞれ求める。ＳＮＰマーカーの数はセットに含まれた固定された数のマーカーであり、ｎ個まで増加する。
【００１３】
本発明の（ａ−４）では、順列検定を通じて各和について有義度ｐ値を計算する。このような有義度ｐ値の計算は、ｎ個の和と関連し、患者集団と正常人集団との値が順列で配列される無作為試験によって決定される。このようなｐ値は可能な総順列の数がとても大きいために、コンピュータを利用することによって計算できる。
【００１４】
本発明の（ａ−５）段階では、順列検定を通じて有義度を評価して有義度の最も低いマーカーセットを選択する。
【００１５】
このようなセット関連法は、商業的に自在に利用可能なプログラム、例えば、Ｓｕｍｓｔａｔ（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｋａｇｅ．ｒｏｃｋｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｏｔｔ／Ｓｕｍ Ｓｔａ．ｈｔｍｌ．）を利用することによって計算できる。
【００１６】
また、本発明の一具体例で、前記対立因子関連度値は関連不平衡化値（Ｌｉｎｋａｇｅ Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ：ＬＤ）によって加重値が付与された値に補正されて使われ得る。すなわち、ＡＡとＬＤとはいずれも敏感性遺伝子とＳＮＰマーカーと関連性を表す変数である。このようなＬＤは例えば、下記数式（１）のようにハーディー・ワインベルグ平衡値から偏差に対するχ２値として数値化できる。
【００１７】
【数１】
2005259132.tif 000003
【００１８】
式中、Ｏｉはｉ番目ＳＮＰマーカーのハーディー・ワインベルグ平衡値であり、Ｅｉはｉ番目ＳＮＰマーカーの実際頻度値である。
【００１９】
したがって、ＬＤをＡＡに乗算して加重値が付与されたＡＡを使用する場合、関連性がさらに向上したＳＮＰマーカーセットを選別できるとみなされる。一方、前記ＬＤは、敏感性遺伝子が相異なる遺伝子にある場合には、前記遺伝子との関連性を表す変数としての意味を失ってしまう。したがって、ＬＤが一定の値を超過するＳＮＰマーカーは分析対象から除外することによって、さらに効率的に特定疾病と関連性の高いＳＮＰマーカーセットを選別できる。
【００２０】
したがって、具体的に本発明のさらに他の一実施例において、前記セット関連法は、（ａ−１）下記数式（１）で表示される特定のＳＮＰマーカーのハーディー・ワインベルグ平衡値に対する前記ＳＮＰマーカーの実際頻度の偏差のχ２値であるＬＤを計算し、前記ＬＤが一定の値を超過する場合には該当ＳＮＰマーカーは分析から除外する段階と、
【００２１】
【数２】
2005259132.tif 000004
【００２２】
数式（１）中、Ｏｉはｉ番目ＳＮＰマーカーのハーディー・ワインベルグ平衡値であり、Ｅｉはｉ番目ＳＮＰマーカーの実際頻度値であり、（ａ−２）任意のＳＮＰマーカーのセットについて、正常人集団と患者集団との各ＳＮＰマーカーの出現頻度の差を計算して得られたＡＡ ｔｉに前記各ＳＮＰマーカーについてのＬＤを乗算して、加重値が反映されたＡＡを得る段階と、（ａ−３）得られた各加重値が反映されたＡＡを大きい値から小さな値の順に順位を付与する段階と、Ｓ（ｎ）＝ｔｉ、ここでｎは順位を表し、ｔｉは順位がｎであるｉ番目ＳＮＰマーカーのＡＡを表し、（ａ−４）順位ｎまでの各和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）を求める段階と、（ａ−５）順列検定を通じて各和に対してｐ値を計算する段階と、（ａ−６）順列検定を通じて有義度を評価して有義度の最も低いマーカーセットを選択する段階と、を含むことを特徴とする。
【００２３】
前記（ａ−１）段階で、ＬＤが一定の値を超過する場合には、その値を超過するＳＮＰマーカーは以下の分析から除外する。すなわち、ＬＤの最大値が、任意的に設定した所定の値を超過するＳＮＰマーカーについては、０を付与する。このような（ａ−１）段階は、範囲を逸脱する（ｏｕｔｌｙｉｎｇ）ＬＤを決定してそれを除外することによって、分析の正確度を高めるためのものである。
【００２４】
前記（ａ−２）段階で、任意のＳＮＰマーカーのセットについて、ＡＡにＬＤを乗算して加重値が付与された対立因子関連度ｔｉ値を求める。
【００２５】
前記（ａ−３）段階では、得られた各加重値が反映されたＡＡｔｉを大きい値から小さな値の順に順位を付与する。すなわち、最も大きいｔｉに順位１を付与してＳ（１）と命名し、その次に大きいｔｉに順位２を付与してＳ（２）と命名する。このような過程は、順位ｎまで反復してあらゆるＳＮＰマーカーについて順位を付与し、Ｓ（ｎ）＝ｔｉの関係にする。ここで、ｎは順位を表し、ｔｉはｉ番目ＳＮＰマーカーの加重値が付与されたＡＡを表す。
【００２６】
本発明の（ａ−４）段階で、前記（ａ−３）段階で得られた順位によって、順位１番から、１ないしｎ個の加重値が付与されたＡＡを順次に合算した各和Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）を求める。すなわち、下記Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）値を求める。
【００２７】
Ｓｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）；
本発明の（ａ−５）では、順列検定を通じて各和に対する有義度ｐ値を計算する。このような有義度ｐ値の計算は、ｎ個の和と関連し、患者集団と正常の集団との値が順列に配列される無作為試験によって決定される。このようなｐ値は可能な総順列の数がとても大きいために、コンピュータを利用することによって計算できる。
【００２８】
本発明の（ａ−６）段階では、順列検定を通じて有義度を評価して有義度の最も低いマーカーセットを選択する。
【００２９】
本発明において、前記（ｂ）段階は、例えば、ロジスティック回帰分析、望ましくは、多重ロジスティック回帰分析によって関連度を判別する。本段階は、前記（ａ）段階で１次的に選別されたＳＮＰマーカーを、回帰分析を用いて２次的に選別する過程である。ロジスティック回帰分析または多重ロジスティック回帰分析は、当業界で公知のものであり、各種統計ソフトウェアを利用して比較的容易に分析でき、あるいはコンピュータプログラムを作成することによって分析できる。このときに、用いられる多重ロジスティック回帰モデルは以下の通りである。
【００３０】
【数３】
2005259132.tif 000005
【００３１】
ここで、ｉはｉ番目ＳＮＰマーカーである。
【００３２】
本発明において、前記（ｃ）段階は、前記（ａ）及び（ｂ）段階で選別されたマーカーの任意の組合わせについてのＲＯＣ曲線分析を用いることによって、一定の選別基準を満たす最適のマーカーセットを選択する。
【００３３】
本発明において、ＲＯＣ曲線分析とは、当業界において公知の分析方法であり、それぞれＳＮＰまたはＳＮＰのセットについて、あらゆる発現レベルで偽陽性率に対して真陽性率をプロッティングした曲線を利用して、特定のＳＮＰまたはＳＮＰセットと特定の疾病との関連性を分析する方法をいう。
【００３４】
本発明において、ＲＯＣ曲線分析は、当業界において常識的な範疇に含まれるものを意味する。具体的に、図１を参照して説明すれば次の通りである。図１で、ＴＮ（Ｔｒｕｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ）は真陰性、ＦＮ（Ｆａｌｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ）は偽陰性、ＦＰ（Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は偽陽性、ＴＰ（Ｔｒｕｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）は真陽性を表す。実際の実験結果、疾病の存在について真陽性の測定値がａであり、陰性がｂであり、疾病の不在について偽陽性がｃであり、真陰性がｄである場合、敏感度はａ／ａ＋ｂと表示され、特異度はｄ／ｃ＋ｄと表示される（表１参照）。
【００３５】
【表１】
2005259132.tif 000006
【００３６】
すなわち、敏感度は疾病が存在する場合、試験結果が陽性になる確率（百分率で表示した真陽性率）を表す。特異度は、疾病が存在しない場合、試験結果が陰性になる確率（百分率で表示した真陰性率）を表す。また、ＲＯＣ曲線分析でｘ軸にプロッティングされる偽陽性率は１−特異度と表示されることもある。
【００３７】
本発明のＲＯＣ曲線分析で、（ｂ）段階で選別されたＳＮＰマーカーのＮ個のうち、１個ないしＮ個までのＳＮＰマーカーに対して数を増加させつつＲＯＣ曲線をプロッティングし、それから得られた曲線を分析することによって最適のマーカーセットを選別できる。
【００３８】
前記ＲＯＣ曲線から最適のマーカーセットを選別する基準は、マーカーの個数、敏感度、特異度、及びＲＯＣ曲線下の面積よりなる群から選択され得る。このような選別基準は、選択された疾病や環境因子によって変わり得る。例えば、同一または類似した敏感度及び特異度を有するものならば、ＳＮＰマーカーを少なく使用するマーカーセットが選別できる。望ましくは、少数のマーカーセット、高い敏感度、高い特異度及び高いＲＯＣ曲線下の面積を持つことである。
【００３９】
以下、本発明の実施例を、詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞  大腸癌の特異的ＳＮＰマーカーの探索
本実施例では、２５６人の大腸癌の患者群と２９６人の正常人群から複数個のＳＮＰマーカーを選別し、それより大腸癌と関連した最適のＳＮＰマーカーセットを選別した。
【００４１】
本実施例では、韓国人女性のうち大腸癌患者と判明されて治療中の患者群（２５６人）と、患者群と同一年齢帯に該当しつつこれまで大腸癌の症状のない正常人（２９６人）との血液からＤＮＡを分離し、特定のＳＮＰの出現頻度を分析した。本実施例に選択されたＳＮＰは、データベース（ｒｅａｌＳＮＰ．ｃｏｍ）から選択した数万個のＳＮＰのうちからいろいろな段階の実験を通じて検証、疾病との関連があると推定して選別した後、ＳＮＰ周辺の配列を利用したプライマーを利用して試料中の単一塩基配列を分析した。
【００４２】
（１．ＤＮＡ試料の準備）
大腸癌患者及び正常人から収集した血液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出は公知の抽出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐ ３９２，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）と商業用キット（Ｇｅｎｔｒａ ｓｙｓｔｅｍ）の説明書に基づいて実施された。抽出されたＤＮＡのうち純度（Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍ）が１．７以上であるものだけ選別して使用した。
【００４３】
（２．標的ＤＮＡの増幅）
分析しようとするＳＮＰが含まれた一定のＤＮＡ領域の標的ＤＮＡを、ＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法は、通常実施される方法により進められ、その条件は次の通りである。まず、標的ゲノムＤＮＡを２．５ｎｇ／ｍｌで準備した。次いで、次のＰＣＲ反応液を準備した。
【００４４】
水（ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラィ)レベル）                    ２．２４μｌ
１０ｘバッファ（１５ｍＭＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有）     ０．５μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各）                   ０．０４μｌ
Ｔａｑ ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒ）（５Ｕ／μｌ）                    ０．０２μｌ
前位／後位プライマーミックス（１μＭ／各）                       １．００μｌ
ＤＮＡ（２．５ｎｇ／反応）                                       １．００μｌ
総反応体積                                                       ５．００μｌ
ここで、前記前位（ｆｏｒｗａｒｄ）及び後位（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーは、公知のデーデータベースのＳＮＰの上流及び下流において適当な位置を選択した。
【００４５】
熱循環反応は、９５℃で１５分間維持し、９５℃で２０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４５回反復して、７２℃で３分間維持した後、４℃に保管した。その結果、２００個のヌクレオチド以下の長さを持つ標的ＤＮＡ断片が得られた。
【００４６】
３．増幅された標的ＤＮＡ中のＳＮＰの分析
標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰの分析は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社製の均質的Ｍａｓｓ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍａｓｓ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：以下、ｈＭＥともいう）技法を利用した。前記Ｍａｓｓ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ技法の原理は次の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰ直前までの塩基に相補的なプライマー（延長用プライマーともいう）を製作する。次いで、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片に混成化させてＤＮＡ重合反応を生じさせる。このとき、反応液中の対象ＳＮＰ対立因子のうち第１対立因子塩基（例えば、Ａ対立因子）に相補的な塩基が添加された後、反応を止めさせる試薬（例えば、ｄｄＴＴＰ）を含める。その結果、標的ＤＮＡ断片に第１対立因子（例えば、Ａ対立因子）が存在する場合には、前記第１対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｔ）だけが添加された産物が得られる。一方、標的ＤＮＡ断片に第２対立因子（例えば、Ｇ対立因子）が存在する場合には、前記第２対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｃ）が添加された最も近接した第１対立因子塩基（例えば、Ａ）まで延びた産物を得る。このように得られた前記プライマーから延びた産物の長さを質量分析を行なって決定することによって、標的ＤＮＡに存在する対立因子の種類を決定できる。具体的な実験条件は次の通りである。
【００４７】
まず、前記ＰＣＲ産物から結合されていないｄＮＴＰを除去した。そのために純水１．５３μｌ、ＨＭＥバッファ０．１７μｌ、ＳＡＰ（Ｓｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）０．３０μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合してＳＡＰ酵素溶液を準備した。続いて、前記チューブを５０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。次いで、ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液チューブに入れて密封した後、３７℃で２０分、８５℃で５分間維持した後、４℃で保管した。
【００４８】
次に、前記標的ＤＮＡ産物を鋳型として均質的延長反応を実施した。反応液は次の通りである。
【００４９】
水（ナノレベル純水）                                          １．７２８μｌ
ｈＭＥ延長ミックス（２．２５ｍＭｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０ｘバッファ）
０．２００μｌ
＊８６延長プライマー（各１００μＭ）                          ０．０５４μｌ
Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（３２Ｕ／μｌ）                ０．０１８μｌ
総体積                                                        ２．００μｌ
前記反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応液が入っているチューブまたはプレートをよく密封して９４℃で２分間維持した後、９４℃で５秒、５２℃で５秒、７２℃で５秒を４０回反復した後、４℃で保管した。このように得られた均質的延長反応産物をレジン（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ）を用いることによって洗浄した。
【００５０】
得られた延長反応産物を質量分析方法のうちＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）を利用して、多型性成部位の配列を分析した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、分析対象の物質が、レーザービームを受けることにより、イオン化されたマトリックスと共に真空状態にある反対側に位置する検出器まで飛んで行くのにかかる時間を計算することにより、質量を分析するものである。質量の小さな物質は検出器に速く到達する。これにより得られる質量の差及び既知のＳＮＰの配列に基づいて、標的ＤＮＡのＳＮＰの配列を決定できる。
【００５１】
前記のようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて標的ＤＮＡの多型性部位の配列を決定した結果、６１個のＳＮＰマーカーを得ることができた。この時、各対立因子は各個体において同型接合子または異型接合子の形で存在し得る。しかし、集団単位では、異型接合子頻度と同型接合子頻度間の組成は統計的に有義なレベルを越えない。メンデルの遺伝法則とハーディー・ワインベルグ法則とによれば、集団を構成する対立因子の組成は一定の頻度に維持され、統計的に有義な場合に生物学的機能上の意味を付与できる。本発明におけるＳＮＰは、大腸癌患者から統計的に有義なレベルで出現し、本発明が大腸癌の診断などに用いられることが可能であることが把握される。
【００５２】
＜実施例２＞ 最適ＳＮＰマーカーセットの探索
本実施例では、実施例１で選択された６１個の大腸癌の特異的ＳＮＰマーカーについて、敏感度、特異度及びＲＯＣ曲線下の面積が最も大きい最適のＳＮＰマーカーセットを探索した。
【００５３】
（１）個別ＳＮＰマーカーの回帰分析及びＲＯＣ分析を通じる最適ＳＮＰマーカーセットの選別（従来の方法）
まず、一つのＳＮＰマーカーを利用した場合のマーカーの正確性を分析した。６１個のＳＮＰマーカーそれぞれについて多重ロジスティック回帰分析及びＲＯＣ曲線分析を行った結果、単一マーカーのうち最も高い正確性を示したＳＮＰマーカーにおいて、（特異度、敏感度）＝（０．９４、０．６１）、ＲＯＣ曲線下の面積＝０．７７９であった。
【００５４】
次いで、個別マーカーの疾病関連性順位について疾病との関連程度を基準に順位を付けた後、１位から順次にＳＮＰマーカーを追加して一つ以上のマーカーで構成されたマーカーの組合わせを構成した。それらの各組合わせについて、多重ロジスティック回帰分析及びＲＯＣ曲線分析を行った。その結果として、個別マーカーの順位１位から２３位までのＳＮＰマーカー２３個を利用した場合が、（特異度、敏感度）＝（０．８０、０．８８）、ＲＯＣ曲線下の面積＝０．９２８で結果が最も良好であった。しかし、組合わせに使われたマーカー数が増加するにつれて、多重回帰分析実行のためにデータの欠測値を除去する過程での情報損失が大きく、計算過程での計算実行時間が長くなるという問題が生じた。したがって、最小マーカー数で構成されたマーカー組合わせを利用した分析がデータ欠測値を下げることができ、計算過程などでの効率が高いと推定できる。
【００５５】
（２）セット関連法、回帰分析及びＲＯＣ曲線分析を利用した最適ＳＮＰマーカーセットの選別
本発明の方法における最適ＳＮＰマーカーの選別結果は次の通りである。まず、多重ロジスティック回帰分析を行う前に、セット関連法を導入して分析した結果、５個のマーカーを組合わせとして選定した。このとき、セット関連法による計算は、商業的に利用可能なＳｕｍｓｔａｔプログラムを利用した。したがって、５個のマーカーについて、以下に示すように、マーカーの個数を異にしたそれぞれの場合について多重ロジスティック回帰分析及びＲＯＣ曲線分析を行った。
【００５６】
分析結果、５個のＳＮＰマーカーをいずれも含むＳＮＰマーカー組合わせが、（特異度、敏感度）＝（０．９３、０．６７）、ＲＯＣ曲線下の面積＝０．９であり、比較的正確な結果を表した。これは、単一マーカーについての分析結果より良好であり、２３個よりなるＳＮＰマーカーセットとほぼ類似した特異度、敏感度及びＲＯＣ曲線下の面積を持つことが把握される。結果的に、５個のＳＮＰマーカーとして２３個のＳＮＰマーカーを使用したのと類似した結果を得られるので、本実施例ではそれら５個のＳＮＰマーカーセットを最適のマーカーセットとして選別した。
【００５７】
図２ないし図４は、前記５個のＳＮＰマーカーセットを６１個のＳＮＰマーカーから、セット関連法、多重回帰分析及びＲＯＣ曲線分析を行なうことによって選別した結果を表したものである。図２は、６１個のＳＮＰマーカーそれぞれについて、セット関連法を適用して５個のＳＮＰマーカーを選別した結果を示す図面である。図２は、６１個のＳＮＰマーカーそれぞれについてＡＡを求め、それらを大きい値から小さな値の順序に順位を付与してＳ（ｎ）＝ｔｉを得て、１順位から順次に一つずつ増加させつつ各順位に該当するＡＡを合算したＳｕｍ Ｓ（ｎ）＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）を計算した。次いで、該当順位に該当するＡＡのＳｉを該当順位までのＡＡの和に該当するＳｕｍ Ｓ（ｎ）で割って各ＳＮＰがＳｕｍ Ｓ（ｎ）に寄与する寄与度をｙ軸とし、ｘ軸をＳＮＰマーカーの個数でプロッティングした。図２に図示されたように、５順位ＳＮＰマーカーの寄与度は９．７％であったが、６順位ＳＮＰマーカーの寄与度は２．４％と急激に減少した。すなわち、５順位で変曲点が発生し、それにより５順位までのＳＮＰマーカーを一つの組合わせとして選択した。
【００５８】
このように選別された５個のＳＮＰマーカーの組合わせを、多重ロジスティック回帰分析方法を用いることによって患者と正常人集団とを区別するための判別分析を実施した。このときに用いられた多重ロジスティック回帰モデルは次の通りである。
【００５９】
【数４】
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【００６０】
ここで、ｉはｉ番目ＳＮＰマーカーである。本実施例では、６個の回帰係数（α、β１ないしβ５：推定せねばならない母数）がある場合である。このような５個のＳＮＰマーカーの組合わせの多重ロジスティックモデルについて、統計分析ツールを利用すれば、それぞれの回帰係数及び事後確率を推定して判別分析が行える。この場合、事後確率の分類基準によって新たな観測値がどの範ちゅうに属しているかを決定できる。例えば、事後確率０．５８を基準とする場合、新たな試料についての５個のＳＮＰマーカーの組合わせの分析結果において、事後確率が０．５８より小さければ正常人、大きければ患者と分類する。１ないし５個までマーカー数を順次に増やしつつ色々な事後確率による敏感度及び特異度を計算する。このように得られた二値を利用してＲＯＣ曲線を描いた後、ＲＯＣ曲線の面積などを分析してＳＮＰマーカーの組合わせの予測される正確性を分析する。
【００６１】
図３は、セット関連法によって選別された５個のＳＮＰマーカーセットについてＲＯＣ曲線を分析した結果を表す。図４は、前記図３に表した５個のＳＮＰのＲＯＣ曲線下に位置する領域の面積を表す。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の最適ＳＮＰマーカーセット選別方法は、複合疾患を診断、治療及び研究するのに好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】試験結果の分布が重なることを示すグラフである。
【図２】６１個のＳＮＰマーカーそれぞれについて関連値Ｓｉを求め、それらを大きい値から小さな値の順に配列した後、個数を１から１ずつ増加させつつ大きい値から小さな値まで合算した値Ｓｎ＝Ｓ（１）＋Ｓ（２）＋…＋Ｓ（ｎ）（ここで、ｎは１ないし６１の整数）を得た後、各ＳＮＰマーカーの寄与度Ｓｉ／Ｓｕｍ Ｓｎを示すグラフである。
【図３】ＳＮＰマーカーの組合わせによるＲＯＣ曲線を示すグラフである。
【図４】ＳＮＰマーカーの組合わせによるＲＯＣ曲線下の面積を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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