(57)【要約】【課題】  インプラント治療後の骨吸収の遺伝的リスクを診断する手段を提供する。【解決手段】  以下の工程を含んでなる方法により、インプラント治療後の骨吸収の遺伝的リスク診断を行う：  (i)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程；  (ii)前記工程によって得た多型情報から、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；  (iii)決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程。【選択図】  図３
2005211053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含んでなる、核酸試料の遺伝子の型を検出する方法：
核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程。
【請求項２】
以下の工程(a)及び(b)を含んでなる、核酸試料の遺伝子の型を検出する方法：
(a)核酸試料における、カルシトニン受容体遺伝子の塩基番号1377位の多型を解析する工程；
(b)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程。
【請求項３】
以下の工程(i)〜(iii)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法：
(i)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程；
(ii)前記工程によって得た多型情報から、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(iii)決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程。
【請求項４】
前記工程(ii)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関するアリルＡの存否を決定し、
前記工程(iii)では、前記工程(ii)においてアリルＡが存在すると決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定し、アリルＡが存在しないと決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
請求項３に記載のリスク診断方法。
【請求項５】
前記工程(ii)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(iii)では、前記工程(ii)において遺伝子型がAV型又はAA型と決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定し、VV型と決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
請求項３に記載のリスク診断方法。
【請求項６】
以下の工程(I)〜(V)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法：
(I)核酸試料における、カルシトニン受容体遺伝子の塩基番号1377位の多型を解析する工程；
(II)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程；
(III)前記工程(I)によって得られる多型情報から、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(IV)前記工程(II)によって得た多型情報から、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(V)前記工程(III)及び(IV)によって決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程。
【請求項７】
工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関するアリルＴの存否を決定し、
工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関するアリルＡの存否を決定し、
工程(V)では、前記工程(III)においてアリルＴが存在すると決定されたとき及び／又は前記第(IV)工程においてアリルＡが存在すると決定されたときに骨吸収のリスクが高いと判定し、それ以外のときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
請求項６に記載のリスク診断方法。
【請求項８】
前記工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がTC型、TT型、及びCC型のいずれであるかを決定し、
前記工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(V)では、（前記工程(III)において決定したカルシトニン受容体遺伝子の遺伝子型）／（前記工程(IV)において決定した骨形成因子４遺伝子の遺伝子型）がTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、TT型／AA型、CC型／AV型、CC型／AA型、TC型／VV型、又はTT型／VV型のときにリスクが高いと判定し、CC型／VV型のときにリスクが低いと判定する、
請求項６に記載のリスク診断方法。
【請求項９】
前記工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がTC型、TT型、及びCC型のいずれであるかを決定し、
前記工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(V)では、（前記工程(III)において決定したカルシトニン受容体遺伝子の遺伝子型）／（前記工程(IV)において決定した骨形成因子４の遺伝子型）がTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、又はTT型／AA型のときにリスクが高いと判定し、CC型／AV型、CC型／AA型、TC型／VV型、TT型／VV型、又はCC型／VV型のときにリスクが低いと判定する、
請求項６に記載のリスク診断方法。
【請求項１０】
以下の核酸を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用キット：
骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
【請求項１１】
以下の(1)及び(2)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用キット：
(1)カルシトニン受容体遺伝子の1377位の多型を解析するための核酸；
(2)骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
【請求項１２】
以下の核酸が不溶性支持体に固定されてなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用固定化核酸：
骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
【請求項１３】
以下の(1)及び(2)が不溶性支持体に固定されてなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用固定化核酸：
(1)カルシトニン受容体遺伝子の1377位の多型を解析するための核酸；
(2)骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインプラント治療後の骨吸収に関連する遺伝子の利用に関する。詳しくはインプラント治療後の骨吸収に関連する遺伝子の型の検出方法、並びにインプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法及び該方法に用いられるキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨結合型インプラントに関する基礎的あるいは臨床的な研究により、特に歯科領域においてインプラントは予知性の高い治療となった。しかし、成功率は100%には達しておらず、インプラント体周囲の骨吸収が直接的な失敗の原因になっている(非特許文献１)。これまで、骨吸収のリスクファクターとして喫煙、脆弱な骨質、感染あるいは過度の加重などが報告されてきた(非特許文献２、３)。しかし、実際の臨床において、これらのリスクファクターでは説明がつかない骨吸収をしばしば経験する。特に、インプラントに加重がかかっていない二次手術時にみられる早期骨吸収は感染やカバースクリューの露出がなくても生じる場合がある(非特許文献４)。
本発明者らは骨の形成と吸収に関与しているカルシトニンレセプター（calcitonin receptor、以下「CTR」ともいう）遺伝子と早期骨吸収の関連性を検討し、下顎骨においてCTR遺伝子のTC型はCC型に比べて20倍のオッズで早期骨吸収を起こすことを報告した(非特許文献５)。この結果は骨代謝にかかわるタンパクの遺伝子多型が、インプラント体周囲骨の吸収におけるリスクファクターとなる可能性を示唆している。
【０００３】
【非特許文献１】M. Esposito, J.M. Hirsch, U. Lekholm, and P. Thomsen. 1998. Biological factors contributing to failures of osseointegrated oral implants. (II). Etiopathogenesis. Eur J Oral Sci 106,3:721-764.
【非特許文献２】C.A. Bain, and P.K. Moy. 1993. The association between the failure of dental implants and cigarette smoking. Int J Oral Maxillofac Implants 8,6:609-615.
【非特許文献３】S.R. Bryant. 1998. The effects of age, jaw site, and bone condition on oral implant outcomes. Int J Prosthodont 11,5:470-490.
【非特許文献４】J.A. Toljanic, M.L. Banakis, L.A. Willes, and L. Graham. 1999. Soft tissue exposure of endosseous implants between stage I and stage II surgery as a potential indicator of early crestal bone loss. Int J Oral Maxillofac Implants 14,3:436-441.
【非特許文献５】Y. Nosaka, Y. Tachi, H. Shimpuku, T. Kawamura, and K. Ohura. 2002. Association of calcitonin receptor gene polymorphism with early marginal bone loss around endosseous implants. Int J Oral Maxillofac Implants 17:38-43.
【非特許文献６】W.E. Roberts. 1988. Bone tissue interface. J Dent Educ 52,12:804-809.; L.P. Garetto, J. Chen, J.A. Parr, and W.E. Roberts. 1995.
【非特許文献７】Remodeling dynamics of bone supporting rigidly fixed titanium implants: a histomorphometric comparison in four species including humans. Implant Dent 4,4:235-243.
【非特許文献８】M. Mangino, I. Torrente, A. De Luca, O. Sanchez, B. Dallapiccola, and G. Novelli. 1999. A single-nucleotide polymorphism in the human bone morphogenetic protein-4 (BMP 4) gene. J Hum Genet 44,1:76-77.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一次手術後の治癒期間中は、インプラント体周囲で骨の形成とリモデリングが活発に行われており、多数の骨代謝タンパクが関与していると考えられる(非特許文献６，７)。ゆえに、CTR遺伝子だけではなく、他の遺伝子についても検討する必要があると思われた。これまで骨代謝に関与するタンパクの一つとして知られている骨形成因子４（Bone morphogenetic protein-4、以下「BMP-4」ともいう）は、ヒト遺伝子内に多型が存在すると報告されている(非特許文献８)。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、その目的はインプラント治療後の骨吸収の遺伝子リスクを事前に判断する手段を提供し、予知性の高いインプラント治療の実現に貢献することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは以上の目的を達成するために、インプラント治療を受けた患者を対象として、早期骨吸収とカルシトニンレセプター(CTR)遺伝子の特定の多型、骨形成因子４（BMP-4)遺伝子の特定の多型、及び両者の組み合わせとの関連性について検討した。その結果、CTR遺伝子に関して特定の遺伝子型を保有する者は骨吸収が起こりやすい（即ち骨吸収のリスクが高い）ことが確認された。また、BMP-4遺伝子に関して特定の遺伝子型を保有する者は骨吸収が起こりやすい（即ち骨吸収のリスクが高い）ことを認めた。これによって、BMP-4遺伝子の多型を解析することが骨吸収のリスクを判定することに有用であるとの知見が得られた。一方、CTR遺伝子の多型の解析結果とBMP-4遺伝子の多型の解析結果とを組み合わせて用いることによって、より予知確率の高い骨吸収のリスク判定を行えることが判明した。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであって、次の構成を提供する。
［１］以下の工程を含んでなる、核酸試料の遺伝子の型を検出する方法：
核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程。
［２］以下の工程(a)及び(b)を含んでなる、核酸試料の遺伝子の型を検出する方法：
(a)核酸試料における、カルシトニン受容体遺伝子の塩基番号1377位の多型を解析する工程；
(b)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程。
［３］以下の工程(i)〜(iii)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法：
(i)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程；
(ii)前記工程によって得た多型情報から、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(iii)決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程。
［４］前記工程(ii)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関するアリルＡの存否を決定し、
前記工程(iii)では、前記工程(ii)においてアリルＡが存在すると決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定し、アリルＡが存在しないと決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
［３］に記載のリスク診断方法。
［５］前記工程(ii)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(iii)では、前記工程(ii)において遺伝子型がAV型又はAA型と決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定し、VV型と決定されたときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
［３］に記載のリスク診断方法。
［６］以下の工程(I)〜(V)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法：
(I)核酸試料における、カルシトニン受容体遺伝子の塩基番号1377位の多型を解析する工程；
(II)核酸試料における、骨形成因子４遺伝子の塩基番号9215位の多型を解析する工程；
(III)前記工程(I)によって得られる多型情報から、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(IV)前記工程(II)によって得た多型情報から、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関して前記核酸試料の遺伝子の型を決定する工程；
(V)前記工程(III)及び(IV)によって決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程。
［７］工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関するアリルＴの存否を決定し、
工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関するアリルＡの存否を決定し、
工程(V)では、前記工程(III)においてアリルＴが存在すると決定されたとき及び／又は前記第(IV)工程においてアリルＡが存在すると決定されたときに骨吸収のリスクが高いと判定し、それ以外のときに骨吸収の遺伝的リスクが低いと判定する、
［６］に記載のリスク診断方法。
［８］前記工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がTC型、TT型、及びCC型のいずれであるかを決定し、
前記工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(V)では、（前記工程(III)において決定したカルシトニン受容体遺伝子の遺伝子型）／（前記工程(IV)において決定した骨形成因子４遺伝子の遺伝子型）がTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、TT型／AA型、CC型／AV型、CC型／AA型、TC型／VV型、又はTT型／VV型のときにリスクが高いと判定し、CC型／VV型のときにリスクが低いと判定する、
［６］に記載のリスク診断方法。
［９］前記工程(III)では、カルシトニン受容体遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がTC型、TT型、及びCC型のいずれであるかを決定し、
前記工程(IV)では、骨形成因子４遺伝子の前記多型に関する遺伝子型がAV型、AA型、及びVV型のいずれであるかを決定し、
前記工程(V)では、（前記工程(III)において決定したカルシトニン受容体遺伝子の遺伝子型）／（前記工程(IV)において決定した骨形成因子４の遺伝子型）がTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、又はTT型／AA型のときにリスクが高いと判定し、CC型／AV型、CC型／AA型、TC型／VV型、TT型／VV型、又はCC型／VV型のときにリスクが低いと判定する、
［６］に記載のリスク診断方法。
［１０］以下の核酸を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用キット：
骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
［１１］以下の(1)及び(2)を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用キット：
(1)カルシトニン受容体遺伝子の1377位の多型を解析するための核酸；
(2)骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
［１２］以下の核酸が不溶性支持体に固定されてなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用固定化核酸：
骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
［１３］以下の(1)及び(2)が不溶性支持体に固定されてなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断用固定化核酸：
(1)カルシトニン受容体遺伝子の1377位の多型を解析するための核酸；
(2)骨形成因子４の塩基番号9215位の多型を解析するための核酸。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法（遺伝子の型の検出方法又は診断方法）では、インプラント治療後のインプラント周囲の骨吸収に関連する遺伝子多型が解析される。解析結果を基に当該遺伝子多型に関して核酸試料の遺伝子の型が検出される。この遺伝子の型の検出によって得られる多型情報を用いることにより、骨吸収のリスク診断を行うことができる。このように、本発明はインプラント治療に際して骨吸収が生ずるリスクを事前に知る有効な手段となる。更に本発明はインプラント治療後に骨吸収が生ずるメカニズムを解明する上での有効な情報を提供することから、骨吸収を抑制ないし防止する方法の確立などにとって重要な一手段ともなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第１の局面は核酸試料の遺伝子の型を検出する方法に関し、その一態様は「核酸試料における、骨形成因子４（BMP-4）遺伝子の塩基番号9215位の多型：9215T→C（以下、「BMP-4(9215T→C)多型」ともいう）を解析する工程」を含むことを特徴とする。一方、本発明の他の態様は、以下の工程(a)及び(b)を含むことを特徴とする。
(a)核酸試料における、カルシトニン受容体（CTR）遺伝子の塩基番号1377位の多型：1377T→C（以下、「CTR(1377T→C)多型」ともいう）を解析する工程
(b)核酸試料における、骨形成因子４（BMP-4）遺伝子の塩基番号9215位の多型（BMP-4(9215T→C)多型）を解析する工程
尚、以上の方法を実施して得た多型情報から核酸試料の遺伝子の型を決定することにより、骨吸収の遺伝的リスクを求めることができる。尚、本明細書において「骨吸収」とは、インプラント治療後のインプラント周囲における骨の吸収のことをいい、特に治療後早期に生ずる骨の吸収のことをいう。また「骨吸収の遺伝的リスク」とは、遺伝的素因によって決定される、以上のような骨吸収が生ずるおそれの程度のことをいう。尚、ここでの「インプラント治療」は典型的には歯科領域における補綴治療を目的としたインプラントの埋入を意味するが、歯科領域以外における同様の施術をも含む概念として用いる。
以上において9215T→Cのような表記は、当該塩基番号位置の多型が矢印の前又は後の塩基である二つの遺伝子型からなることを意味する。
【０００８】
本明細書における各遺伝子の塩基番号及び多型位置は、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が提供する公共のデータベースであるGenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）やMolecular Databases（例えばdbSNP：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）に登録されている公知の配列を基準として表される。
BMP-4(9215T→C)多型は、BMP-4遺伝子（遺伝子座14q21）のエクソン４に存在する（refSNP ID: rs17563 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=17563)、当該多型部位を含むmRNAのAccession No.:NM_130851）。尚、図８〜図１１（配列番号１）の塩基配列（Genbank Accession No.U43842：Homo sapiens bone morphogenetic protein-4(hBMP-4)gene, complete cds）において9215番目の塩基がBMP-4(9215T→C)多型部位である。
一方、CTR(1377T→C)多型は、CTR遺伝子（遺伝子座7q21）の第３領域（3 region）に存在する（refSNP ID: 1801197 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=1801197)、当該多型部位を含むmRNAのAccession No.: X69920）。尚、図１２〜図１３（配列番号２）の塩基配列（Genbank Accession No. X69920: H. sapiens mRNA for calcitonin receptor）において1377番目の塩基がCTR(1377T→C)多型部位に相当する。
【０００９】
本発明において「多型を解析する」とは、解析対象の多型部位に関して核酸試料がどのような遺伝子の型を有するかを調べることを意味し、多型が存在する位置の塩基（塩基配列）の種類を調べる（決定する）ことと同義である。本発明において「遺伝子の型」とは、特定のアリルの存否で表される分類、又はアリルの組合せである遺伝子型で表される分類のことをいう。従って、本発明における「多型を解析する工程」では、核酸試料中における特定の多型のアリルの存否、又は遺伝子型（アリルの組合せ）が調べられ、決定される。具体的には、BMP-4遺伝子の上記多型が解析対象であれば、当該多型に関するアリルの一つであるアリルＡ（又はアリルＶ）の存否、又はBMP-4遺伝子に関して核酸試料がAV型（アリルＡとアリルＶのヘテロ接合型）、AA型（アリルＡ同士のホモ接合）、及びVV型（アリルＶ同士のホモ接合）のいずれであるかが調べられ、決定される。尚、ここでの「アリルＡ」とは、BMP-4遺伝子の上記多型部位の塩基がC（シトシン）であり、これによって当該多型部位に対応するアミノ酸がAla（アラニン）となるアリルをいい、他方の「アリルＶ」とは、BMP-4遺伝子の上記多型部位の塩基がT（チミン）であり、これによって当該多型部位に対応するアミノ酸がVal（バリン）となるアリルをいう。
一方、CTR遺伝子の上記多型が解析対象であれば、本発明の「多型を解析する工程」において、当該多型に関するアリルの一つであるアリルＴ（又はアリルＣ）の存否、又はCTR遺伝子に関して核酸試料がTC型（アリルＴとアリルＣのヘテロ接合）、TT型（アリルＴ同士のホモ接合）、及びCC型（アリルＣ同士のホモ接合）のいずれであるかが調べられ、決定される。尚、ここでの「アリルＴ」とは、CTR遺伝子の上記多型部位の塩基がT（チミン）であり、これによって当該多型部位に対応するアミノ酸がLeu（ロイシン）となるアリルをいい、他方の「アリルＣ」とは、CTR遺伝子の上記多型部位の塩基がC（シトシン）であり、これによって当該多型部位に対応するアミノ酸がPro（プロリン）となるアリルをいう。
【００１０】
各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく例えばアリル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アリル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、又はTaqMan-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat  Genet 19,225(1998))、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用できる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。また、PCR法又はPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。
【００１１】
多数の核酸試料を解析する場合には、アリル特異的PCR法、アリル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、又はDNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。
【００１２】
以上の方法では、各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸（本発明において「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸の例としては、解析対象の多型を含む遺伝子において、当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。また、解析対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントを特異的に増幅できるように設計された核酸（プライマー）を挙げることができる。このような核酸としては例えば、BMP-4遺伝子の9215位の多型が解析対象の場合では、9215位の塩基がT（チミン）であるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は9215位の塩基がC（シトシン）であるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸が該当する。
【００１３】
多型解析用核酸の他の具体例としては、解析対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には解析対象の多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。このような核酸セットとしては例えば、BMP-4遺伝子の9215位の多型が解析対象の場合では、BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、9215位塩基がT（チミン）であるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セット、又は9215位塩基がC（シトシン）であるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分DNA領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば50bp〜200bp、好ましくは80bp〜150bpである。
【００１４】
以上の核酸プライマー、核酸プローブは単なる一例であって、核酸プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、他方核酸プローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば1〜7個、好ましくは1〜5個、更に好ましくは、1〜3個である。尚、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われる。
【００１５】
多型解析用核酸（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜DNA断片又はRNA断片が用いられる。多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては10〜50bp程度、好ましくは15〜40bp程度、更に好ましくは15〜30bp程度である。
尚、プライマーとして用いられる場合には増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。プローブの場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。
多型解析用核酸（プライマー、プローブ）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型解析用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばMolecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を参考にすることができる。
【００１６】
以下の実施例に示すように、BMP-4(9215T→C)多型及びCTR(1377T→C)多型の解析は、PCR-RFLP法によって簡便に行うことができる。PCR-RFLP法に使用する増幅用プライマーは、解析対象の多型部位を含むDNA断片を特異的に増幅でき、以降の操作に適切な長さの増幅産物を生じさせ得るものであれば、その配列、長さ等は特に問わない。BMP-4(9215T→C)多型解析に使用することができる増幅用プライマーセットの一例を以下に示す。
順方向（forward）: 5’-GCTATCTCTTGACTCTTCCATC-3’（配列番号３）
逆方向（reverse）: 5’-CATAGTTTGGCTGCTTCTCC-3’（配列番号４）
【００１７】
同様に、CTR(1377T→C)多型解析に使用することができる増幅用プライマーセットの一例を以下に示す。
順方向（forward）: 5’-TTCAGTGGAACCAGCGTTGG-3’（配列番号５）
逆方向（reverse）: 5’-CTCAGTGATCACGATACTGT-3’（配列番号６）
【００１８】
一方、PCR-RFLP法用の制限酵素についても、解析対象の多型部位の相違を反映した消化産物を生じさせ得るものであれば特に限定されない。例えば、BMP-4(9215T→C)多型解析に使用することができる制限酵素の一例としてHphIを、CTR(1377T→C)多型解析に使用することができる制限酵素の一例としてAluIをそれぞれ挙げることができる。
【００１９】
本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として多型の解析を行うことができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分DNA領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。このような標識化プライマーを用いた検出方法の具体例としては、多型を構成する各遺伝子型のセンス鎖にそれぞれ特異的にハイブリダイズする２種類の核酸プライマー（アリル特異的センスプライマー）をフルオレセインイソチオシアネートとテキサスレッドでそれぞれ標識し、これら標識化プライマーとアンチセンス鎖に特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとを用いて多型部位を含む部分DNA領域を増幅し、得られた増幅産物における各蛍光物質の標識量を測定して多型を検出する方法を挙げることができる。尚、ここでのアンチセンスプライマーを例えばビオチンで標識しておけば、ビオチンとアビジンとの特異的な結合を利用して増幅産物の分離を行うことができる。
【００２０】
多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては32Pなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質を例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた5'末端標識法、T4 DNAポリメラーゼやKlenow断片を用いた3'末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）などを例示できる。
以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。
【００２１】
核酸試料は、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。多型解析対象の遺伝子を含むものであれば、任意の長さのゲノムDNAを核酸試料として用いることができる。また、必ずしも解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在する核酸試料を用いる必要はない。即ち、本発明の核酸試料としては、解析対象の遺伝子のすべてが一の核酸上に存在しているもの、解析対象の遺伝子が複数の核酸上に分かれて存在しているもののいずれをも用いることができる。尚、核酸試料において解析対象の遺伝子が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくても、少なくとも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、部分的な状態であってもよい。
【００２２】
BMP-4遺伝子の上記多型の解析結果と、CTR遺伝子の上記多型の解析結果とを利用して遺伝子の型を検出する場合（又は骨吸収のリスク診断をする場合）には、BMP-4遺伝子の多型解析と、CTR遺伝子の多型解析とを別々に、或いは同時に実施する。前者の場合としては例えば、被験者から得た核酸試料を二つに分け（予め各解析用にそれぞれ核酸試料を採取してもよい）、各多型の解析を個別に行う。後者の場合としては例えば、各多型の同時検出を可能とする核酸プローブを固定したDNAチップまたはマイクロアレイによって行うことができる。尚、ここでいう同時とは解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、一部の操作（例えば核酸増幅操作、プローブのハイブリダイズ、又は検出）が同時に行われる場合も含む。
【００２３】
解析対象の遺伝子の転写産物であるmRNAを利用して各遺伝子の多型を解析することもできる。例えば被験者の血液、尿等から解析対象である遺伝子のmRNAを抽出、精製した後、ノーザンブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.42,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ドットブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、RT-PCR法（Molecular Cloning, Third Edition,8.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、DNAチップ（DNAアレイ）を用いた方法などを実行することにより、mRNAを出発材料として多型解析を行うことができる。
【００２４】
ここで、BMP-4遺伝子の上記多型とCTR遺伝子の上記多型とはいずれもアミノ酸変化を伴うことから、各遺伝子の発現産物を用いて多型解析を行うこともできる。この場合、多型部位に対応するアミノ酸を含んでいる限り、部分タンパク質、部分ペプチドであっても解析用試料として用いることができる。
このような遺伝子の発現産物を用いて解析する方法としては、多型部位のアミノ酸を直接分析する方法、又は立体構造等の変化を利用して免疫学的に分析する方法などが挙げられる。前者としては周知のアミノ酸配列分析法（エドマン法を利用した方法）を用いることができる。後者としては、多型を構成するいずれかの遺伝子型を有する遺伝子の発現産物に特異的な結合活性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着定量法）、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫拡散法等を用いることができる。
【００２５】
以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報を骨吸収のリスク診断に利用することができる。即ち本発明は、以上の検出方法によって得た多型情報から核酸試料の遺伝子の型を決定する工程（遺伝子の型決定工程）、及び決定された遺伝子の型から骨吸収の遺伝的リスクを判定する工程（リスク判定工程）を含んでなる、インプラント治療後の骨吸収のリスク診断方法も提供する。
本発明のリスク診断方法の一態様では、BMP-4遺伝子の上記多型部位の解析結果を用いて核酸試料の遺伝子の型（BMP-4遺伝子に関する遺伝子の型）を決定した後、決定された型を指標として被験者（核酸試料の入手源）の遺伝的リスクを判定する。本発明者らの検討結果によれば、BMP-4遺伝子に関してアリルＡを持つ者では骨吸収が生じやすいことが判明した。従って、このアリルＡの存否は骨吸収の指標（リスクマーカー）となる。例えば、被験試料中にアリルＡが存在すると決定されたとき（アリルＡが検出されたとき）にリスク判定工程では被験者の骨吸収の遺伝的リスクが高い（ハイリスク）と判定することができる。一方、遺伝子の型決定工程において遺伝子型（アリルの組合せ）を決定する場合には例えば、決定された遺伝子型がAV型又はAA型のときにリスク判定工程では被験者の骨吸収の遺伝的リスクが高い（ハイリスク）と判定することができる（特に、AA型であるときには、よりハイリスクであると判定することができる）。
【００２６】
本発明の他の態様では、CTR遺伝子の上記多型部位の解析結果と、BMP-4遺伝子の上記多型部位の解析結果とを用いる。即ち、まずこれらの解析結果から核酸試料の遺伝子の型をCTR遺伝子とBMP-4遺伝子の双方に関して決定する。次に、決定された型の組合せを指標として被験者の骨吸収の遺伝的リスクを判定する。CTR遺伝子の多型解析の結果とBMP-4遺伝子の多型解析の結果とを利用することによって、一層予知確率の高い、骨吸収の遺伝的リスク診断を行うことができる。
【００２７】
本発明の検討結果によれば、CTR遺伝子に関してアリルＴを持つ者では骨吸収が生じやすいことが判明した。この知見とBMP-4遺伝子の多型に関連した同様の上記知見とを考慮すれば、例えば、被験試料中にCTR遺伝子に関するアリルＴが検出されるか又はBMP-4遺伝子に関するアリルＡが検出されるときにリスク判定工程では被験者の骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定することができる。また、被験試料中にCTR遺伝子に関するアリルＴとBMP-4遺伝子に関するアリルＡの双方が検出されるときにリスク判定工程では被験者の骨吸収の遺伝的リスクが特に高いと判定することができる。一方、遺伝子の型決定工程において遺伝子型（アリルの組合せ）を決定する場合には例えば、核酸試料のCTR遺伝子に関する遺伝子型がTC型又はTT型であるとき（BMP-4遺伝子に関する遺伝子型は考慮しなくてよい）、或いは核酸試料のBMP-4遺伝子に関する遺伝子型がAV型又はAA型であるとき（CTR遺伝子に関する遺伝子型は考慮しなくてよい）にリスク判定工程では被験者の骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定することができる。具体的には、核酸試料のCTR遺伝子の遺伝子型と、BMP-4遺伝子の遺伝子型とをまとめて「CTR遺伝子の遺伝子型／BMP-4遺伝子の遺伝子型」と表すことにすれば、核酸試料の遺伝子型がTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、TT型／AA型、CC型／AV型、CC型／AA型、TC型／VV型、及びTT型／VV型のいずれかであれば、被験者の骨吸収の遺伝的リスクが高いと判定することができる。これとは逆に、核酸試料の遺伝子型がCC型／VV型であれば被験者の骨吸収の遺伝的リスクが低い（ローリスク）と判定してもよい。
また、被験者のCTR遺伝子に関する遺伝子型がTC型又はTT型であり、同時にBMP-4遺伝子に関する遺伝子型がAV型又はAA型であれば（具体的には、上記の規定に従って核酸試料の遺伝子型を表した場合にTC型／AV型、TC型／AA型、TT型／AV型、及びTT型／AA型のいずれかである場合）、被験者の骨吸収の遺伝的リスクが特に高いと判定することができる。
【００２８】
骨吸収の遺伝的リスクを診断することにより、インプラント治療したときにインプラント周囲での骨吸収（特に早期骨吸収）が生ずるおそれの程度を予測できる。換言すれば、本発明の診断方法を利用してインプラント周囲での骨吸収のリスクを評価できる。骨吸収のリスクを事前に知ることができれば、リスクの低い患者に対しては安心して施術できる一方で、リスクの高い患者に対しては可能な限り長いインプラントを埋入したり、埋入するインプラントの数を増やしたりするなどの対応策を講じてできるだけ長期的な補綴物の使用を可能にすることができる。また、骨吸収のリスクが高いにも拘わらずインプラント治療をせざるを得ない場合にあっても予めリスクが高いことを承知しておれば、術後の経過を慎重に観察し、骨吸収が認められた時には迅速に適切な措置を講じることして、骨吸収による悪影響を最小限に留めることができる。このように、骨吸収のリスク評価を事前に行えることは臨床上極めて有意義である。
【００２９】
本発明の第２の局面は、上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用されるキット（遺伝子の型検出用キット、又は骨吸収のリスク診断用キット）を提供する。かかるキットにはBMP-4(9215T→C)多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）が含まれる。他の態様としてはCTR(1377T→C)多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）とBMP-4(9215T→C)多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）とを含んでキットが構築される。
多型解析用核酸は、それが適用される解析方法（上述したアリル特異的核酸等を用いたPCR法を利用する方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan-PCR法、Invader法等）において、解析対象の多型部分を含むDNA領域又はそれに対応するmRNAを特異的に増幅できるもの（プライマー）又は特異的に検出できるもの（プローブ）として設計される。以下に本発明において提供されるキットの具体例を示す。
【００３０】
以下の核酸を含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
【００３１】
以下の(1)及び(2)の核酸を含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
(1)1377位塩基がTであるCTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は1377位塩基がCであるCTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、
(2)9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸、又は9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸。
【００３２】
以下の核酸セットを含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
核酸試料中のBMP-4遺伝子の9215位塩基がTである場合にのみ、該BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のBMP-4遺伝子の9215位塩基がCである場合にのみ、該BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
【００３３】
以下の(1)及び(2)の核酸セットを含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
(1)核酸試料中のCTR遺伝子の1377位塩基がTである場合にのみ、該CTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のCTR遺伝子の1377位塩基がCである場合にのみ、該CTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、
(2)核酸試料中のBMP-4遺伝子の9215位塩基がTである場合にのみ、該BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のBMP-4遺伝子の9215位塩基がCである場合にのみ、該BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
【００３４】
以下の核酸を含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子において9215位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、BMP-4遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
【００３５】
以下の(1)及び(2)の核酸セットを含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
(1)CTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、1377位塩基がTであるCTR遺伝子において1377位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は1377位塩基がCであるCTR遺伝子において1377位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、CTR遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット、
(2)BMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子において9215位塩基を含む部分DNA領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、BMP-4遺伝子の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット。
【００３６】
以下の核酸セットを含んでなる、遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びBMP-4遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
【００３７】
以下の(1)及び(2)の核酸セットを含んでなる遺伝子の型検出用（骨吸収のリスク診断用）キット、
(1)1377位塩基がTであるCTR遺伝子のセンス鎖において1377位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、-850位塩基がCであるCTR遺伝子のセンス鎖において1377位塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びCTR遺伝子のアンチセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてCTR遺伝子の1377位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット、
(2)9215位塩基がTであるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第１の標識物質で標識された第１核酸と、9215位塩基がCであるBMP-4遺伝子のアンチセンス鎖において9215位塩基に対応する塩基を含む部分領域、に対して特異的にハイブリダイズし且つ第２の標識物質で標識された第２核酸と、及びBMP-4遺伝子のセンス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズし且つ前記第１核酸又は前記第２核酸とともに使用されてBMP-4遺伝子の9215位塩基を含む部分DNA領域を特異的に増幅することが可能な第３核酸と、からなる核酸セット。
【００３８】
以上の各キットにおいては、キットの使用方法に応じた一又は二以上の試薬（バッファー、反応用試薬、検出用試薬など）などを組み合わせてもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００３９】
＜BMP-4遺伝子多型と骨内インプラント周囲に見られる早期骨吸収との関連性の検討＞
1.材料及び方法
1-1.対象の選定
対象は、1999年から2001年までの期間に、上顎あるいは下顎のインプラント治療をうけた41名の血縁関係のない健康な日本人で、男性16名、女性25名、年齢は29〜74歳（平均54.8±9.4歳）であった。既往歴、喫煙歴および月経の有無を記録し、LeckholmとZarbの分類（U. Lekholm, and G.A. Zarb. 1985. Patient selection and preparation. In: Branemark P-I, Zarb GA, Albrektsson T (eds). Tissue-Integrated Prostheses: Osseointegration in Clinical Dentistry. Chicago: Quintessence:199-209.）に準じて骨質を評価した。また、コントロール群として、血縁関係がなく、口腔疾患に罹患していない健康な日本人50名（男性23名、女性27名、年齢は30〜70歳、平均50.9±11.9歳、）について、BMP-4遺伝子多型の分布を調べた。一人の口腔外科医がブラスト処理されたインプラント（Astra Tech, Molndal, Sweden）を埋入し、２次手術時にインプラント周囲の骨吸収を認めた患者を骨吸収群とした。
【００４０】
1-2.術式
すべてのインプラントは、清潔な環境下で、通常の２回法術式に準じて埋入された。適切な治癒期間（下顎：平均4.5ヶ月、上顎：平均6.9ヶ月）の後に２次手術を行い、患者の情報を全く知らない一人の観察者が、インプラント周囲の骨レベルを直視下で評価した。
【００４１】
1-3.DNAの抽出と遺伝子型の分析
BMP-4遺伝子のエクソン４内の多型（14q21, exon 4, 9215T→C, refSNP ID: rs17563 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=17563), Shore EM, Xu M, Shah PB, et al. The human bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) gene: Molecular structure and transcriptional regulation. Calcif Tissue Int 1998;63:221-229）を分析対象とした。
症例のDNAは採取した抹消血よりDNA抽出キット（Qiagen社、Valencia、CA、USA）を用いて抽出した。BMP-4遺伝子多型は、polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）法により決定した。BMP-4遺伝子多型の多型部位を含むDNAの増幅に使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。
順方向（forward）: 5’-GCTATCTCTTGACTCTTCCATC-3’（配列番号３）
逆方向（reverse）: 5’-CATAGTTTGGCTGCTTCTCC-3’（配列番号４）
【００４２】
2 μlのPCR産物をHphIにて3時間消化した後、3％アガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。アガロースゲルをエチジウムブロマイド染色に供し紫外線照射下で検出した。遺伝子型はその断片ペプチドの長さにより、172bpと232bpの断片ペプチドが生じたものをアリルV、404bpの断片ペプチドのみが生じたものをアリルAとした。
【００４３】
1-4.統計学的解析
骨吸収群と非骨吸収群における性別、喫煙歴、月経の有無、骨質およびBMP-4遺伝子多型の分布について、カイ二乗検定およびFisherの直接確率検定を用いて統計学的に解析した。また、骨吸収群と非骨吸収群における年齢の検定にはStudent t検定をもちいた。さらに、喫煙歴、閉経、骨質などの既知の骨吸収における危険因子を考慮したロジスティック解析を行い、BMP-4遺伝子型に関するオッズ比と95％信頼区間を算出した。すべての検定における有意水準は0.05未満とした。
【００４４】
2.結果
インプラント埋入患者群とコントロール群において、BMP-4遺伝子多型であるAV型とVV型の分布に有意差は認められなかった（図１（表１））。上顎に109本、下顎に153本、総数262本のインプラントが埋入され、上顎で25本（22.9％）、下顎で14本（9.2％）に早期骨吸収が認められた（図２（表２））。下顎では、BMP-4遺伝子多型（AV型とVV型）において、骨吸収群と非骨吸収群の分布に有意差が認められた（P=0.012）が、上顎では有意差を認めなかった。骨吸収群と非骨吸収群において、年齢、性別、喫煙歴、月経の有無および骨質の分布に有意差は認めなかった（図３（表３））。さらに、下顎の骨吸収におけるロジスティック解析では、BMP-4遺伝子AV型のオッズ比はVV型に対して8.106で、有意差が認められた(P＝0.025、図４（表４）)。
【００４５】
3.考察
インプラント埋入患者群とコントロール群において、BMP-4遺伝子多型（AV型とVV型）の分布に有意差がなかったことから、対象は遺伝子学的に特異ではなく、研究対象として適切な集団であったと考えられた。インプラント周囲の骨吸収に関する危険因子として喫煙（C.A. Bain, and P.K. Moy. 1993. The association between the failure of dental implants and cigarette smoking. Int J Oral Maxillofac Implants 8,6:609-615.; L.W. Lindquist, G.E. Carlsson, and T. Jemt. 1996. A prospective 15-year follow-up study of mandibular fixed prostheses supported by osseointegrated implants. Clinical results and marginal bone loss. Clin Oral Implants Res 7,4:329-336.）、骨質（S.R. Bryant. 1998. The effects of age, jaw site, and bone condition on oral implant outcomes. Int J Prosthodont 11,5:470-490.; R.A. Jaffin, and C.L. Berman. 1991. The excessive loss of Branemark fixtures in type IV bone: a 5-year analysis. J Periodontol 62,1:2-4.）および骨粗鬆症(Linder L, Carlsson A, Marsal L, Bjursten LM, Branemark P-I. Clinical aspects of osseointegration in joint replacement A histological study of titanium implants. J Bone Joint Surg [BR] 1998; 70:550-555.)などが報告されているが、本研究における早期骨吸収に関してはこれらの危険因子に有意差は認められなかった。さらに、今回埋入されたインプラントには感染やカバースクリューの露出などの合併症は全く認めず、早期骨吸収は既知の危険因子により生じているのではなく、個人の体質が関与している可能性が考えられた。
図３より、下顎においてBMP-4遺伝子AV型を保有する患者は、VV型を保有する患者よりも早期骨吸収を起こしやすいことが示された。また、ロジスティック解析でも同様の結果が得られた（図４）。但し、本研究の対象人数が少なかったため95%信頼区間が1.30-50.51と広い。インプラント埋入後はインプラント周囲に骨形成が生じ、治癒期間中にはリモデリングが起こっていると考えられ、BMP-4はリモデリングに関与するタンパク質の一つであるといわれている。本研究のターゲットはBMP-4遺伝子エクソン内でみられる多型で、アミノ酸の置換（Val→Ala）が起こっている。したがって、遺伝子多型によってBMP-4の表現型が変化し、AV型ではVV型に比べてBMP-4の機能低下や量の減少が起こり、インプラント周囲に骨吸収を生じている可能性があると考えられた。
本研究により、BMP-4遺伝子多型は、インプラント周囲の早期骨吸収における危険因子の一つとして考えられた。早期骨吸収の発生は補綴後の骨吸収を助長し、最終的にはインプラント治療の失敗につながる可能性がある。術前に骨吸収の危険性を把握することは、インプラント治療の成功率の向上に寄与すると考えられる。したがって、早期骨吸収に関する危険因子を遺伝子学的に証明することは、成功率向上の新しい戦略につながると思われた。
【実施例２】
【００４６】
＜カルシトニン受容体遺伝子多型及びBMP-4遺伝子多型とインプラント体周囲の早期骨吸収との関連性の検討＞
1.材料及び方法
1-1.対象の選定
1999年から2001年までに同じ歯科医院において、同一術者により下顎歯牙欠損に対してインプラント治療をうけた36人の日本人をインプラント治療群とした（男性14人、女性22人、年齢29〜74歳（平均55.3歳）、実施例１の治療群と同一）。また、インプラント治療群のうち、インプラント体周囲に早期骨吸収を起こしている症例を骨吸収群とし、骨吸収が認められなかった症例を非骨吸収群とした。治療の際に全身的あるいは歯科的既往歴、喫煙歴および月経の有無を記録した。さらにLeckholmとZarbの分類（U. Lekholm, and G.A. Zarb. 1985. Patient selection and preparation. In: Branemark P-I, Zarb GA, Albrektsson T (eds). Tissue-Integrated Prostheses: Osseointegration in Clinical Dentistry. Chicago: Quintessence:199-209.）により骨質を診断した。一方、全身疾患および歯科疾患のない健康な50人の日本人（男性23人、女性27人、年齢30〜70歳（平均50.9歳））を対照群とした。治療に先立ち、被験者全員に対して研究の目的と内容について書面と口頭による説明を行い、同意と承諾のサインを得た。
【００４７】
1-2.術式
インプラントの埋入は清潔な環境で、局所麻酔下にておこなった。歯槽頂切開ののち、頬舌的に粘膜骨膜弁を作製し、通常の２回法に従って粗な面が骨内に埋まるまでインプラントを埋入した。カバースクリューを装着したのちに、粘膜骨膜弁を復位し、垂直マットレス縫合をおこなって10日後に抜糸した。術後感染を予防するために、術中にホスホマイシン2gとクリンダマイシン600mgを点滴投与し、セフジトレン・ピヴォキシル1日300mgを術後1週間経口投与した。インプラント周囲骨の治癒を妨げないようにするため、術後2週間以降に、使用していた義歯の内面を軟性裏装材で調整し、暫間義歯として装着した。
適切な治癒期間の後に、軟組織を挙上して２次手術をおこなった。インプラントの位置を確かめ、連続した歯槽頂切開によってカバースクリューを露出させた。被験者の遺伝子型、喫煙および骨質を全く知らない一人の観察医により、インプラント周囲骨の状態を評価した。骨レベルは、インプラントの粗な面の頂上から、最初に骨がインプラントに接している高さまでをノギスで測定することにより決定した。
【００４８】
1-3.DNA抽出と遺伝子型の分析
CTR遺伝子の第3領域内の多型（7q21, 3 region, 1377T→C, refSNP: rs1801197 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=1801197)と、BMP-4遺伝子のエクソン４内の多型（14q21, exon 4, 9215T→C, refSNP ID: rs17563 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=17563)）を分析対象とした。
症例のDNAは採取した頬粘膜よりDNA抽出キット（Qiagen社、Valencia、CA、USA）を用いて抽出した。またCTRおよびBMP-4遺伝子多型の多型部位を含むDNAの増幅はpolymerase chain reaction（PCR）法により行った。各々のプライマーの塩基配列は次の通りである。
CTR用：順方向（forward）: 5’-TTCAGTGGAACCAGCGTTGG-3’（配列番号５）
逆方向（reverse）: 5’-CTCAGTGATCACGATACTGT-3’（配列番号６）
BMP-4用：順方向（forward）: 5’-GCTATCTCTTGACTCTTCCATC-3’（配列番号３）
逆方向（reverse）: 5’-CATAGTTTGGCTGCTTCTCC-3’（配列番号４）
【００４９】
増幅産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動した後、アガロースゲルをエチジウムブロマイド染色に供し紫外線照射下で検出した。遺伝子型の決定はrestriction fragment length polymorphism（RFLP）法により行った。3 μLのPCR産物をCTRではAluI、BMP-4ではHphIにてそれぞれ3時間消化した後、3％アガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。遺伝子型はその断片ペプチドの長さにより、CTRでは108bpと120bpの断片ペプチドが生じたものをアリルT、228bpの断片ペプチドのみが生じたものをアリルCとした。同様に、BMP-4では172bpと232bpの断片ペプチドが生じたものをアリルV、404bpの断片ペプチドのみが生じたものをアリルAとして遺伝子型を決定した。
【００５０】
1-4.統計学的解析
インプラント治療群と対照群の遺伝子型の出現頻度の検定はカイ二乗検定を用いて行った。骨吸収群と非骨吸収群における性別、喫煙、月経の有無、骨質、遺伝子型およびアリルの出現頻度はカイ二乗検定およびFisherの直接確率検定により比較検討した。また骨吸収群と非骨吸収群における年齢の検定はstudent-t検定を用いた。さらに、遺伝子型およびアリルに関するオッズ比と95％信頼区間についても検討した。すべての検定における有意水準は0.05未満とした。
【００５１】
2.結果
図５（表５）より、インプラント治療群と対照者群間においてCTRおよびBMP-4遺伝子多型の発現に有意な差は認めなかった。
また、図６（表６）より骨吸収群と非骨吸収群において年齢、性別、喫煙、月経の有無および骨質に有意な差は認めなかった。153本のインプラントが36人の患者に植立され、14本に早期骨吸収が認められた（平均骨吸収1.5±0.5mm）。治癒期間の平均は4.1ヶ月で（SD 0.9ヶ月、2.4-6.0）、感染やカバースクリューの露出はすべてのインプラント体においてみられず、臨床的およびX線学的に骨結合が得られていた。
図７（表７）より、CTRの遺伝子型およびアリル分布において骨吸収群と非骨吸収群間に有意な差が認められた（オッズ比=15.63; 95%信頼区間=2.22-109.86; P=0.006、オッズ比=10.00, 95%信頼区間=1.74-57.49; P= 0.009）。同様に、BMP-4の遺伝子型およびアリルの分布においても骨吸収群と非骨吸収群間に有意な差が認められた(オッズ比=8.80; 95%信頼区間=1.62-47.81; P=0.012、オッズ比=4.90; 95%信頼区間=1.28-18.80; P=0.023)。さらに、CTRとBMP-4の遺伝子型を組み合わせた遺伝子型においても骨吸収群と非骨吸収群間に有意な差が認められた(オッズ比=22.86; 95%信頼区間=2.41-216.91; P=0.002)。インプラント治療群36人のうち、CTR遺伝子におけるTT型およびBMP-4遺伝子におけるAA型の保有者は存在しなかった。
【００５２】
3.考察
本研究は下顎のインプラント治療における２次手術時の早期骨吸収の発生率を遺伝子学的に検討したものであるが、まず本発明者らが対象としたグループが適当であったか否かを検討する必要がある。そこで、CTRとBMP-4の遺伝子型の分布を健常者群とインプラント治療群で検討した。図５より、CTR遺伝子におけるTC型とCC型さらにBMP-4遺伝子におけるAV型とVV型の分布は健常者群とインプラント治療群の間で有意な差は認めなかった。したがって、本研究におけるインプラント治療群は、遺伝子学的に特異的な集団ではなく、研究対象として妥当であったと考えられた。
図６より、骨質（S.R. Bryant. 1998. The effects of age, jaw site, and bone condition on oral implant outcomes. Int J Prosthodont 11,5:470-490.; R.A. Jaffin, and C.L. Berman. 1991. The excessive loss of Branemark fixtures in type IV bone: a 5-year analysis. J Periodontol 62,1:2-4.）、喫煙（C.A. Bain, and P.K. Moy. 1993. The association between the failure of dental implants and cigarette smoking. Int J Oral Maxillofac Implants 8,6:609-615.; L.W. Lindquist, G.E. Carlsson, and T. Jemt. 1996. A prospective 15-year follow-up study of mandibular fixed prostheses supported by osseointegrated implants. Clinical results and marginal bone loss. Clin Oral Implants Res 7,4:329-336.）および閉経など全身的な骨吸収に関する危険因子は骨吸収群と非骨吸収群において、有意な差は認められなかった。また、埋入されたすべてのインプラント体において感染やカバースクリューの露出は認められなかったため、２次手術時にみられる早期骨吸収と既知の骨吸収に関する危険因子との因果関係はないと考えられた。
図７より、骨吸収群においてCTR遺伝子のTC型およびアリルTの発現頻度は非骨吸収群と比べて有意に高く、オッズ比はそれぞれ15.63と10.00であった（P=0.006, 0.009）。さらに、BMP-4遺伝子においても、AV型およびアリルAの発現頻度は非骨吸収群に比べて有意に高く、オッズ比はそれぞれ8.80と4.90（P=0.012, 0.023）であった。しかし、CTR遺伝子多型のオッズ比と比較するとBMP-4遺伝子多型のオッズ比は小さく、単独ではCTR遺伝子多型の方が骨吸収に及ぼす影響が大きいと推察された。次に骨代謝が多数のタンパクにより調節されていることを考慮して、組み合わせ遺伝子を構成した。CTR遺伝子のアリルTあるいはBMP-4遺伝子のアリルAをもつ集団をグループI、両者をもたない、つまりCTR遺伝子のCC型とBMP-4遺伝子のVV型をもつ集団をグループIIに分類し、組み合わせ遺伝子と骨吸収との関連を検討した。骨吸収群の88.9％がグループIに、非骨吸収群の74.1％がグループIIに属し、グループIの発現頻度は骨吸収群に有意に高く、オッズ比は22.86（P=0.002）であった。また、グループIにおいてCTR遺伝子のTC型とBMP-4遺伝子のAV型の両方を保有していた症例が36人中3人存在したが、全員が骨吸収群であった。このことは、骨吸収を生じやすい遺伝子多型を多く持つほど骨吸収を生じる危険性が高くなることを示唆している。また、これら2つの遺伝子型をあわせ持つ患者には、手術計画において、可能な限り長いインプラント体を埋入したり、埋入するインプラントの数を増やすといった対応策をとることが長期に補綴物を使用できることにつながる可能性がある。一方、グループIIに属する被験者は21人であったが、20人は非骨吸収群であった。このことはCTR遺伝子のアリルTとBMP-4遺伝子のアリルAをもたない被験者は骨吸収を生じにくいことを示している。
本研究によりインプラント治療の開始前に骨吸収を生じる危険性を遺伝子学的に診断できることが示された。インプラント治療は医療訴訟に発展する可能性が大きいため、科学的に治療のリスクを把握し、治療方針を検討できることは臨床医にとって大きな福音になると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の検出方法は、インプラント治療後のインプラント周囲での骨吸収に関与する遺伝子についての多型情報を与える。この多型情報を利用することによって、インプラント治療後にインプラント周囲で骨吸収が生ずるおそれ（骨吸収のリスク）を事前に把握することが可能となる。本発明（遺伝子の型の検出方法、或いは診断方法）は、歯科領域におけるインプラント治療に際しての事前診断として好適に利用できる。但し、本発明の方法が適用できる対象はこれに限られるものではなく、例えば大腿骨頭置換の治療、顎顔面補綴の治療など、歯科領域以外におけるインプラント治療に際しての事前診断に本発明を利用してもよい。
【００５４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１はインプラント埋入患者群とコントロール群におけるBMP-4遺伝子型の分布を示す表（表１）である。
【図２】図２は埋入されたインプラントと早期骨吸収の関係を示す表（表２）である。
【図３】図３は骨吸収群と非骨吸収群におけるリスクファクターの分布を示す表（表３）である。
【図４】図４は骨吸収のリスクファクターに対するロジスティック解析の結果を示す表である（表４）。
【図５】図５はインプラント治療群と健常者群におけるCTRおよびBMP-4遺伝子型の分布を示す表（表５）である。
【図６】図６は骨吸収群と非骨吸収群における既知の骨吸収リスクファクターの分布を示す表（表６）である。
【図７】図７は骨吸収群と非骨吸収群におけるCTRとBMP-4の遺伝子型および各アリルの分布を示す表（表７）である。
【図８】図８はBMP-4遺伝子の配列（complete cds）の一部を示す。
【図９】図９はBMP-4遺伝子の配列（complete cds）の一部（図８の続き）を示す。
【図１０】図１０はBMP-4遺伝子の配列（complete cds）の一部（図９の続き）を示す。
【図１１】図１１はBMP-4遺伝子の配列（complete cds）の一部（図１０の続き）を示す。
【図１２】図１２はCTR遺伝子の配列（mRNA、complete cds）の一部を示す。
【図１３】図１３はCTR遺伝子の配列（mRNA、complete cds）の一部（図１２の続き）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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