(57)【要約】【課題】迅速に海洋の状況を把握することができる、海洋モニタリング方法およびこれに用いられる分析器具等を提供することを目的とする。【解決手段】所定の海域から海水を採取して被検体とし、前記被検体中に含まれる微生物が有するポリヌクレオチドを抽出し、α−プロテオバクテリア網などの所定のバクテリア群のうちのいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチド３が固定された海洋微生物検出基板１に、前記被検体から抽出されたポリヌクレオチド５を供試して、前記被検体から抽出されたポリヌクレオチド５が前記海洋微生物検出基板に固定されたポリヌクレオチドとハイブリダイズしたか否かを検出して、前記海洋微生物検出基板に固定されたポリヌクレオチドの由来するバクテリア種あるいはアーキア種が前記海水中に存在するか否かを検出し、前記海洋微生物検出基板により検出された試験結果を解析する。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、δ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチドが固定された、海洋微生物検出基板。
【請求項２】
少なくとも、バクテロイデテス門に属するバクテリア、α−プロテオバクテリア網に属するバクテリア、およびγ−プロテオバクテリアに属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、請求項１に記載の海洋微生物検出基板。
【請求項３】
少なくともα−バクテリア網に属するバクテリア、δ／εバクテリア網に属するバクテリア、およびシアノバクテリア門に属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、請求項１または２に記載の海洋微生物検出基板。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の海洋微生物検出基板。
【請求項５】
所定の海域から海水を採取して被検体とし、前記被検体中に含まれる微生物が有するポリヌクレオチドを抽出し、
α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、δ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチドが固定された海洋微生物検出基板に、前記被検体から抽出されたポリヌクレオチドを供試して、
前記被検体から抽出されたポリヌクレオチドが前記海洋バクテリアあるいはアーキア検出基板に固定されたポリヌクレオチドとハイブリダイズしたか否かを検出して、前記海洋微生物検出基板に固定されたポリヌクレオチドの由来する微生物が前記海水中に存在するか否かを検出し、
前記海洋微生物検出基板により検出された試験結果を解析する、海洋モニタリング方法。
【請求項６】
前記海洋微生物検出基板が、少なくとも、バクテロイデテス門に属するバクテリア、α−プロテオバクテリア網に属するバクテリア、およびγ−プロテオバクテリアに属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された検出基板である、請求項５に記載の海洋モニタリング方法。
【請求項７】
前記海洋微生物検出基板が、少なくとも、α−バクテリア網に属するバクテリア、δ／εバクテリア網に属するバクテリア、およびシアノバクテリア門に属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された検出基板である、請求項５または６に記載の海洋モニタリング方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、請求項５から７のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
【請求項９】
複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果を比較解析する、請求項５から８のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
【請求項１０】
複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果について統計学的解析を行う、請求項５から９のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
【請求項１１】
前記統計学的解析が、クラスター解析である、請求項１０に記載の海洋モニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋微生物検出基板および海洋モニタリング方法に関し、詳しくは、迅速に所定の海洋微生物の存否を確認できる海洋微生物検出基板および海洋環境の状況を迅速に把握できる海洋モニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
海洋食料生産、海洋環境浄化などを行う際には、まず対象となる海域の環境状況を知る必要性がある。海洋環境の状態を知るには、その海域の生態系が一つの指標となり得る。特に、バクテリアなどの微生物は地球上のほぼ全ての環境に存在し、またその存在種は環境によって異なるため、特定海域において海洋バクテリア類（海洋細菌類）あるいは海洋アーキア類（海洋古細菌類）などの微生物を採取し、微生物の生息状況を把握することは、その特定海域における環境の状況、ひいては海洋食料生産の生産性や海洋環境浄化の必要性、浄化の手法などに係る情報を得ることができ、有益である。上記のような目的で特定海域における海洋微生物の生息状況を把握し、海洋食料生産や海洋環境浄化に役立てるためには、多数の微生物について同時に且つ迅速に検出および同定することが求められる。
【０００３】
すなわち、海洋食料生産や海洋環境浄化の現場に役立つ情報を提供するには、より迅速に大量の試験を行うことが求められているのである。例えば、魚病菌の感染予防、赤潮の発生予測、あるいは赤潮の終息を予測し餌の投与を再開することなど、現場の作業に情報を生かすには、迅速さおよび多量のサンプルを処理する必要性が高い。また、海洋環境浄化を行うにあたっても、海洋という対象は極めて広く、多数のサンプルを採取しなければ、海洋の全体像は把握しがたい。さらに、海洋環境は時間の経過と共に変動するため、迅速に試験をしなければ、所定の環境状況の拡大、縮小または移動など時系列的な環境状況の変動についていけず、試験結果が出た時点では既に情報が古くなってしまうというおそれがある。
【０００４】
近年、分子生物学的手法により、微生物の検出および同定が可能である。分子生物学的手法を用いる以前には、人が顕微鏡等で観察して、検出、同定および数などを調査した。顕微鏡で人が観察することに比べれば分子生物学的手法のほうが、迅速性、簡便性などの点で格段に進歩したといえる。
【０００５】
分子生物学的手法としては、例えば、電気泳動を用いる方法が一般的である。一例を具体的に説明する。まず海洋サンプルを採取し、サンプルに含まれるバクテリア種やアーキア種等の微生物からＤＮＡを抽出する。抽出物は、所定のプライマーを用いてＰＣＲ処理し、特定の塩基配列部を有するＤＮＡを増幅した後、濃度勾配電気泳動にかける。電気泳動により表れた特定のバンドを切り出して、これに含まれるＤＮＡをクローニングし、塩基配列を特定する。特定された塩基配列に基づき微生物の同定が行われる。この方法であると、海洋サンプルの採取から微生物の同定までに約５日要する。微生物の数が多ければさらに日数を要する場合もある。
【０００６】
海洋食料生産や海洋環境浄化のための海洋モニタリング方法としては数日を要するのは時間的に満足のいくものではない。すなわち、大量の検体を処理する場合にも十分対応し得るほどに迅速であること、また、より人的な労力を軽減可能な海洋モニタリング方法が求められている。
【０００７】
近年ＤＮＡマイクロアレイ（またはＤＮＡチップという）が開発され、迅速な遺伝子の解析に道を開いた。特許文献１には、ＤＮＡマイクロアレイを用いた環境浄化関連遺伝子の検出方法等が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−２５３８８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のような状況の下、本発明は、迅速に海洋の状況を把握することができる、海洋モニタリング方法およびこれに用いられる分析器具等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を進めたところ、海洋の環境状態を把握するために適した、バクテリア種あるいはアーキア種などに属する微生物が存在することを見いだし、海洋モニタリングに適するという観点からバクテリアあるいはアーキア群などの微生物の分類を行った。本発明者らが作成した海洋モニタリングに適した微生物分類表に沿って、所定の海域から採取した海水中に含まれる微生物の検出および同定をすることにより、海洋環境状態を効率よくモニタリングすることができる。さらに、本発明者らは、海洋モニタリング用の微生物分類表に含まれるバクテリア種あるいはアーキア種を迅速に検出および同定する分析器具を開発すると共に、この分析器具を用いた試験データの比較および解析を効率的に行うことができる解析方法を組み合わせて、極めて迅速に海洋モニタリングを行うことができる発明を完成させた。
【００１１】
本発明は、下記、海洋微生物検出基板および海洋モニタリング方法を提供するものである。
〔１〕  α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、δ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチドが固定された、海洋微生物検出基板。
〔２〕  少なくとも、バクテロイデテス門に属するバクテリア、α−プロテオバクテリア網に属するバクテリア、およびγ−プロテオバクテリアに属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、上記〔１〕に記載の海洋微生物検出基板。
〔３〕  少なくともα−バクテリア網に属するバクテリア、δ／εバクテリア網に属するバクテリア、およびシアノバクテリア門に属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された基板である、上記〔１〕または〔２〕に記載の海洋微生物検出基板。
〔４〕  前記ポリヌクレオチドが、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の海洋微生物検出基板。
〔５〕  所定の海域から海水を採取して被検体とし、前記被検体中に含まれる微生物が有するポリヌクレオチドを抽出し、
α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、δ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチドが固定された海洋微生物検出基板に、前記被検体から抽出されたポリヌクレオチドを供試して、
前記被検体から抽出されたポリヌクレオチドが前記海洋微生物検出基板に固定されたポリヌクレオチドとハイブリダイズしたか否かを検出して、前記海洋バクテリアあるいはアーキア検出基板に固定されたポリヌクレオチドの由来する微生物が前記海水中に存在するか否かを検出し、
前記海洋微生物検出基板により検出された試験結果を解析する、海洋モニタリング方法。
〔６〕  前記海洋微生物検出基板が、少なくとも、バクテロイデテス門に属するバクテリア、α−プロテオバクテリア網に属するバクテリア、およびγ−プロテオバクテリアに属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された検出基板である、上記〔５〕に記載の海洋モニタリング方法。
〔７〕  前記海洋微生物検出基板が、少なくとも、α−バクテリア網に属するバクテリア、δ／εバクテリア網に属するバクテリア、およびシアノバクテリア門に属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドが固定された検出基板である、上記〔５〕または〔６〕に記載の海洋モニタリング方法。
〔８〕  前記ポリヌクレオチドが、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域の全部または一部を含む、上記〔５〕から〔７〕のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
〔９〕  複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果を比較解析する、上記〔５〕から〔８〕のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
〔１０〕  複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果について統計学的解析を行う、上記〔５〕から〔９〕のいずれか一項に記載の海洋モニタリング方法。
〔１１〕  前記統計学的解析が、クラスター解析である、上記〔１０〕に記載の海洋モニタリング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、迅速に海洋の状況を把握することができる、海洋微生物検出基板および海洋モニタリング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態に関し、
１．海洋微生物群のグループ化、
２．海洋微生物検出基板、
３．海洋モニタリング方法、
４．ＤＮＡマイクロアレイによる測定結果のデータベース化、
の順に説明する。なお、本発明を実施するにあたり、遺伝子工学的な処理、例えば、核酸、タンパク質、プラスミド、種々の酵素、形質転換体などの調製、形質転換体の選抜、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などの諸操作については、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Edition, J. Sambrookら編、1989、COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、それらが参照される。
【００１４】
１．海洋微生物群のグループ化
本発明者らは、海洋環境の差異を反映するように微生物、より具体的にはバクテリアあるいはアーキアの分類を適切に行い、その分類に沿って海洋のバクテリアあるいはアーキアなどの微生物存在状況を把握できれば、より簡便に海洋モニタリングを行うことができるという着想に至った。海洋モニタリングに適した微生物として具体的には、下記の一群が海洋モニタリングに適切である。これらの海洋微生物が存在するか否かは、海洋の環境状況の違いを反映する蓋然性が高いものである。なお、海洋モニタリングに適したバクテリアあるいはアーキアの具体的分類手法については下記実施例にても別途詳説する。
【００１５】
[海洋モニタリングに適した微生物群]
以下、１３門および７網は真性細菌に属する。
α−プロテオバクテリア（α-Proteobacteria）網（Class）、
β−プロテオバクテリア（β-Proteobacteria）網、
γ−プロテオバクテリア（γ-Proteobacteria）網、
ｄ／ε−プロテオバクテリア（δ／ε-Proteobacteria）網、
バクテロイデテス（Bacteroidetes,(CFB Group)）門（Phylum）、
クロロビ門（Chlorobi(Green sulfur bacteria)）、
クロロフレキシ門（Chloroflexi(Green non-sulfur bacteria)）
アクイフィカエ門（Aquificae）、
シアノバクテリア門（Cyanobacteria）、
フソバクテリア（Fusobacteria）門、
モリクテス（Mollicutes）網、
クロストリディア（Chlostridia）網、
バッシィリ（Baccilli）網、
デフェリバクテレス（Deferribacteres）門、
プランクトマイセテス（Planctomycetes）門、
スピロヘーテス（Spirochaetes）門、
サーモトガエ（Thermotogae）門、
アクチノバクテリア（Actinobacteria）門、
デイノコッカス−サーマス（Deinococcus）門、
サーモデサルフォバクテリア（Thermodesulfobacteria）門、
以下２門は古細菌に属する。
クレンアーキオタ（Crenarchaeota）門、
ユーリアキオタ（Euryarchaeota）門
上記１５門および７網の一覧表を下記実施例中の表１に示す。
【００１６】
２．海洋微生物検出基板
本発明の海洋微生物検出基板は、α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、ｄ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の海洋微生物に由来するポリヌクレオチドが固定されたものである。
【００１７】
上記のバクテリアあるいはアーキア群からのバクテリア種あるいはアーキア種の選択は、所望の海域の調査に適する少なくとも１種を選択し、そのバクテリアあるいはアーキアの生息の有無を検出することにより行うができる。すなわち、上記の門および網のいずれかに属する１種から２２種まで、適宜選択してよい。また、同一門、同一網から異なる２種以上を選択してもよい。
【００１８】
海洋モニタリングを行うためには、好ましくは、上記の一群の中から最低３つ以上のグループを用いられる。少なくとも３種を用いることにより、海域の比較検討、グループ化を容易に行うことができる。例えば、海域表層で食料生産性の違いを観察したい場合は、少なくともα−プロテオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、およびバクテロイデテス門に属するバクテリアを用いるのが好適である。また、好気状態と嫌気状態の違いを検出したい場合には、少なくともα−バクテリア、δ／εバクテリア、およびシアノバクテリアに属するバクテリアを用いることが好適である。このように観察したい現象により、適宜バクテリア種あるいはアーキア種を選択することができる。
【００１９】
本発明の海洋微生物検出基板は、基板上に、海洋微生物に由来するポリヌクレオチドが、基板上に固定されている。本発明の海洋微生物検出基板は、例えば、ポリヌクレオチドの固定方法などの製法に限定されるものではない。また、本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップなどの名称による区別はぜず、双方とも含む意味で、ＤＮＡマイクロアレイという。
【００２０】
基板は、ポリヌクレオチドを固定し保持できるものであればよく、ガラス、プラスチック、繊維類などの各種材料を用いることができる。
【００２１】
海洋微生物に由来するポリヌクレオチドは、海洋微生物に特有の塩基配列を備えている部分を用いる。また、海洋バクテリアあるいはアーキアの種類ごとに保存性の高い領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。このような配列は、実験的に単離、精製し、単離されたポリヌクレオチドの塩基配列を解析し、その配列に基づいて決定してもよいし、また、塩基配列等の各種データベースで既知の塩基配列を検索し、アラインメントを取ることなどによって、In  Silicoで決定してもよい。核酸またはアミノ酸などのデータベースは、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan）、ＥＭＢＬ（European Molecular Biology Laboratry, EMBL nucleic acid sequence data library）、ＧｅｎＢａｎｋ（Genetic sequence data bank）、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のTaxonomyデータベースなどのデータベースを利用できる。
【００２２】
海洋バクテリアあるいはアーキアの種類に応じた特有の配列を見いだすためには、例えば、バクテリアあるいはアーキアに特有の遺伝子を選び、マルチプルアラインメントをとるなどの手段により行うことができる。アラインメントをとるためのアルゴリズムには特に限定はなく、より具体的な解析プログラムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８などのプログラムを利用することができる。アラインメントをとる際のパラメータは、各プログラムのデフォルト状態で実行してもよいが、プログラムの種類などに応じて適宜調整してよい。
【００２３】
基板上に固定されるポリヌクレオチドとして好ましくは、これらの属それぞれにおいて特異的な塩基配列である。海洋バクテリアあるいはアーキアを区別して検出するために、バクテリアあるいはアーキアの種類によって配列が特異的であり、かつ、バクテリアあるいはアーキアが共通して有している遺伝子領域が好ましい。このような領域としては、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、ＤＮＡ  ｇｙｒａｓｅ  Ｂなどの遺伝子領域が挙げられる。基板に固定されるポリヌクレオチドには１６Ｓ  ｒＲＮＡなどの全領域を用いてもよいが、バクテリアあるいはアーキアの検出ができる範囲であればその一部を含む領域であってもよい。
【００２４】
所定の領域を含むポリヌクレオチドを多量に得るためには、ＰＣＲなどの手法を用いればよい。例えば、バクテリアあるいはアーキアにおける１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする領域を含むポリヌクレオチドを増幅するプライマーとして下記の配列を有するプライマーを用いることができる。
【００２５】
真性細菌用：
フォワードプライマー5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’（配列番号１）
リバースプライマー  5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’（配列番号２）
【００２６】
古細菌用：
フォワードプライマー5’-GGTTGATCCTGCCAG-3’（配列番号３）
リバースプライマー  5’-TTACCGCGGCGGCTG-3'（配列番号４）
【００２７】
基板に固定するポリヌクレオチドは、合成してもよいし、ＰＣＲ法などにより特定領域を増幅し、分離または精製して調製してもよい。基板に固定するポリヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションなどの条件にもよるが、検出しようとする配列以外の配列とのミスマッチを抑制し、検出目的の配列とハイブリダイズ可能な長さであればよい。ポリヌクレオチドの長さは塩基数にして、好ましくは１０bp〜１０００bp程度、より好ましくは２０bp〜４０bp程度である。
【００２８】
本発明の海洋微生物検出基板は、基板上に、所定のポリヌクレオチドフラグメントを整列させて固定することにより製造される。ポリヌクレオチドフラグメントを固定する方法は特に限定されず、光リソグラフィー技術等を利用して基板上でＤＮＡ合成を行う方法、あるいは、スポッター（アレイヤー）を用いてポリヌクレオチドフラグメントを固定していく方法などが例示される。
【００２９】
本発明の海洋微生物検出基板の具体的形態として、ＤＮＡマイクロアレイの一例の概要を図１に示す。図１中（Ｉ）はＤＮＡマイクロアレイの全体像を示し、（ＩＩ）は（Ｉ）の一部を拡大した図であり、（ＩＩＩ）は（ＩＩ）の一部を拡大した図であり、（ＩＶ）は（ＩＩＩ）の一部を拡大した図である。
【００３０】
ＤＮＡマイクロアレイ１は、ガラスプレート１１にＤＮＡフラグメントの固定領域１０に複数のテストサイトを備えてなる。なお、図１（ＩＩ）に示されるＤＮＡフラグメントの固定領域１０のテストサイトは一部のみを表示している。ウエルプレート１０の一部１０Ｘは、テストサイト中の２７サイトを拡大して示したものである。ウエルプレート１０上の個々のテストサイトには一本鎖ＤＮＡフラグメント３が固定されている。図１（ＩＶ）には、ハイブリダイゼーションが形成されたウエルの状況を模式的に示す。固定されたＤＮＡフラグメント３に、これと相補的な塩基配列を有する標識核酸５１がハイブリダイズしている。標識核酸５１には標識物質５２が結合されている。標識物質は、測定機器または目視などにより検出可能な物質であればよく、例えば、発色物質、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、抗原もしくは抗体、酵素などが用いられる。より具体的には、例えばｃｙ３、ｃｙ５などの標識物質が好適である。白丸で表されたテストサイト１０ａは標識物質が検出されなかった部位、黒丸で表されたテストサイト１０ｂは標識物質が検出された部位を示す。ＤＮＡフラグメント３がα−プロテオバクテリウムなど上記所定の微生物のいずれかに由来するＤＮＡフラグメントであり、標識核酸５１のＤＮＡフラグメント部分がＰＣＲなどによって増幅された供試サンプルにより構成される。
【００３１】
ハイブリダイゼーションによる検出仕様の異なる形態を図２に示す。ＰＣＲなどによって増幅したＤＮＡは一本鎖のＤＮＡフラグメント５３にして供試サンプルとし、ＤＮＡマイクロアレイに固定されたＤＮＡフラグメント３とハイブリダイゼーションさせ、さらに標識プローブ５４をハイブリダイズさせる。本形態において標識プローブ５４は、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡに共通する配列を有し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡフラグメントの一方の末端に、標識物質５２としてｃｙ５もしくはｃｙ３を結合させたものを用いている。
【００３２】
所定の海洋微生物を検出可能なポリペプチドを基板に固定しておくことにより、海洋バクテリアあるいはアーキアなどの微生物の存在の有無を迅速に検出することができる。本発明の海洋微生物検出基板を用いることにより、下記に詳説するように、海洋モニタリングを簡便にまた迅速に行うことができる。
【００３３】
３．海洋モニタリング方法
本発明の海洋モニタリング方法は、上記本発明の海洋微生物検出基板を用いて所定の海洋バクテリアあるいはアーキアなどの微生物の存在の有無を迅速に検出し、その検出結果を解析して、海洋の状況を推測するものである。本発明の海洋モニタリングの実施形態について図３および図４に示す例を参照しつつ以下説明する。図３は、本発明の海洋モニタリング方法の概要を模式的に示す図である。但し、図３は海洋微生物検出基板からその試験結果の解析までを示している。また、図４は、図３（ｂ）を拡大した模式図である。
【００３４】
３−１．海洋微生物の検出
まずモニタリングの対象とする所定の海域から海水を採取して被検体とする。被検体を採取する海域は特に限定されない。例えば海洋開発現場海域の海水、養殖場の海水、養殖場の海水、または、病気を発症している魚が生息する海水など、海洋の環境状況を知ろうとする海域からを採取すればよい。また、被検体は１つの海域採取しても複数の海域から採取しても良いが、複数の海域からサンプルを採取することにより、複数の海域についての比較検討を行う、また海域の状況ごとに海域のグループ分けを行うなど海洋モニタリングの様式を多様化させることが可能である。
【００３５】
次に、被検体の海水中に含まれるバクテリアあるいはアーキアなどの微生物からポリヌクレオチドを抽出する。核酸は、二本鎖ポリヌクレオチドとして回収することが好ましい。核酸の抽出方法は、定法によればよく、例えば、濾過、培養、遠心、溶解等を行い、回収できる。なお、本明細書において核酸とは、ポリヌクレオチドのことであり、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのハイブリッド等が含まれる。また、ポリヌクレオチドとは、少なくとも２以上のヌクレオチドが結合した高分子をいう。
【００３６】
所定の海洋バクテリアあるいはアーキアなどの微生物の存在の有無を確認するために、上記本発明の海洋微生物検出基板を用いる。海洋微生物基板に固定されるポリヌクレオチドは、上記の海洋バクテリアあるいはアーキア群から、海洋モニタリングの目的等を考慮し適宜選択される。すなわち、α−プロテオバクテリア網、β−プロテオバクテリア網、γ−プロテオバクテリア網、δ／ε−プロテオバクテリア網、バクテロイデテス門、クロロビ門、クロロフレキシ門、アクイフィカエ門、シアノバクテリア門、フソバクテリア門、モリクテス網、クロストリディア網、バッシィリ網、デフェリバクテレス門、プランクトマイセテス門、スピロヘーテス門、サーモトガエ門、アクチノバクテリア門、デイノコッカス−サーマス門、サーモデサルフォバクテリア門、クレンアーキオタ門、およびユリアーキオタ門のいずれかに属する少なくとも１種の微生物に由来するポリヌクレオチドを固定する。好ましい一形態としては、少なくともバクテロイデテス門に属するバクテリア、α−プロテオバクテリア網に属するバクテリア、およびγ−プロテオバクテリアに属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドを固定する形態、あるいは、少なくともα−バクテリア網に属するバクテリア、δ／εバクテリア網に属するバクテリア、およびシアノバクテリア門に属するバクテリアに由来するポリヌクレオチドを固定する形態などが挙げられる。
【００３７】
図３に示す例では、１つの基板１に４９箇所のテストサイト２が設けられている（図３（ａ））。テストサイト上の番号は、テストサイトの位置を特定するために図面上付したものである。１つのテストサイト２には１種のポリヌクレオチド３を固定する。１種のポリヌクレオチドについて複数のテストサイトに固定してもよい。複数のテストサイト２に固定して、検出することにより、被検体中のバクテリアあるいはアーキアの定量がより正確になり、また、ミスマッチによる精度の低下も抑制できる。各種ポリヌクレオチドを固定する位置は特に限定されない。具体的な例を挙げると、例えば３種のバクテリアあるいはアーキアを固定する場合、テストサイトＮｏ１に第１種目を、テストサイトＮｏ２に第２種目を、テストサイトＮｏ３に第３種目を固定し、以下、Ｎｏ４テストサイト以降にこのサイクルで固定していくように配置するなどの形態が採られる。
【００３８】
他方、被検体から抽出された核酸の所定部位を増幅する。核酸の増幅は、例えばＰＣＲ法により、容易に行うことができる。ＰＣＲ法による核酸の増幅は、定法に従って行うことができる。
【００３９】
増幅する部位は、ＤＮＡマイクロアレイに固定したＤＮＡフラグメントと同じ核酸領域をコードする部位である。例えば、増幅する部位として好ましくは１６Ｓ  ｒＲＮＡの領域である。１６Ｓ  ｒＲＮＡを対象としている場合には、配列番号１および２の組み合わせ、または配列番号３および４の組み合わせなどが用いられる。
【００４０】
増幅したＤＮＡは一本鎖とし、海洋微生物検出基板に固定されたＤＮＡフラグメントとハイブリダイゼーションさせる（図３（ｂ））。図３（ｂ）および図４では、固定されたプローブは左側一列および上側一列のみ表示し、他のテストサイトについては省略している。図３（ｂ）およびこれを拡大表示した図４に示されるように、本例においては、被検体から抽出されたポリヌクレオチドをＰＣＲで増幅して得られたポリヌクレオチド断片５１に、標識物質５２結合させて標識プローブ５化している。また他の形態としては、海洋微生物検出基板に固定されたプローブと共通する配列を有し標識物質が結合された標識プローブを作製してもよい（図２と同様）。標識プローブを別途作製する後者の場合、被検体から抽出されたポリヌクレオチドと、標識プローブとをそれぞれ海洋微生物検出基板に供試する。
【００４１】
ハイブリダイゼーションあるいは洗浄は、ストリンジェントな条件下で行うことが好ましい。ストリンジェントな条件とは、類似配列によるクロスハイブリダイゼーションを生じにくい、あるいは類似配列によってクロスハイブリダイゼーションしたＤＮＡを解離させる条件である。
【００４２】
ハイブリダイゼーションあるいは洗浄におけるストリンジェントな条件について具体的に例示する。ハイブリダイズさせる際の温度条件としては、例えば、好ましくは２０〜６５℃である。また、ハイブリダイズさせる際の時間は、約１分〜１５時間である。さらに、洗浄の際の洗浄液は、好ましくは４×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、より好ましくは３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、もしくは５００ｍＭ  塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）が用いられる。また、洗浄時の温度は、好ましくは２０〜９５℃、より好ましくは３５〜６５℃である。また、ハイブリダイゼーション時に用いる緩衝液は、３×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、もしくは５０ｍＭヒスチジンバッファー、あるいは一般に市販されている緩衝液を用いることができ、核酸のハイブリダイゼーション用の混合液も市販品を入手可能である。
【００４３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄処理が完了後、蛍光スキャナーなど標識物質を検出し得る読みとり装置でスキャンする。読みとり装置の様式は特に限定されない。蛍光スキャナーの場合、例えばレーザーの出力、検出部の感度を調整して行うスキャンを行う。
【００４４】
図３（ｃ）に示す例では、被検体数１〜Ｘ個についてそれぞれの検出パターンとして試験結果を得ることができる。図３（ｃ）の白い部分は標識物質が検出されなかったテストサイトを示し、黒い部分は標識物質が検出されたテストサイトを示す。
【００４５】
スキャンの結果に基づく定量方法は、定量ソフトウエアにより行う。定量ソフトウエアに特に限定はない。また、定量にあたっては、ＤＮＡフラグメントのスポット位置、ＤＮＡフラグメントが固定されたスライドガラスの寸法精度などを考慮し、またバックグラウンド（ＢＧ）の調整を行うことが好ましい。
【００４６】
３−２．バクテリアあるいはアーキア検出結果の解析
前記海洋微生物検出基板により検出された試験結果について解析し、海洋の環境状況を推測する。具体的には、海洋微生物検出基板上に、標識物質が検出されたパターンが、その海域の特徴を示す。
【００４７】
１つの海域から被検体を採取した場合には、その海域に存在するバクテリアあるいはアーキアなどの微生物の有無から海洋の環境状況を推定できる。
【００４８】
複数の被検体を用いた場合には、多様な解析手法を取り得る。上記でも説明したが、具体的目的に応じて、例えば、海域表層で食料生産性の違いを観察したい場合は、α−プロテオバクテリア、γ−プロテオバクテリア、およびバクテロイデテス門に属するバクテリアなどを用いるのが好適である。また、好気状態と嫌気状態の違いを検出したい場合には、α−バクテリア、δ／εバクテリア、およびシアノバクテリアに属するバクテリアなどを用いるのが好適である。
【００４９】
また、解析手法としては、例えば、複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果を比較解析する。存在するバクテリアあるいはアーキア群などの微生物の違いは海洋微生物検出基板の検出パターンの違いとして容易に把握できるため、検出パターンの違いを比較検討することにより、各海域の類比などを判別することができる。より具体的には、まず、検出されたバクテリアあるいはアーキアの種類を比較検討することができる。また、同じバクテリアあるいはアーキアについて複数のテストサイトにポリヌクレオチドが固定されている場合には、バクテリアあるいはアーキアの数を反映すると推定されることから、各海域における特定のバクテリアあるいはアーキアの存在数を相対的に推定し比較することもできる。さらに別途付加的な情報を組み合わせることによりより詳細に各海域の状況を推定することができる。
【００５０】
また、他の形態として、複数の海域から海水を採取して複数の被検体とし、複数の被検体についての試験結果について統計学的解析を行う形態が挙げられる。すなわち、海洋バクテリアあるいはアーキア検出基板の試験結果である検出パターンを統計的に解析するのである。統計的解析方法としては、例えば、相関解析、階層的クラスタリング、および非階層的クラスタリングなどがある。より具体的には、相関解析として、Pearson correlation、Cosine coefficient、Jaccard、Dice、Jeffrey's x、Ochiaiなどの手法が挙げられる。また、階層的クラスタリングとしては、ＵＰＧＭＡ（unweighted-pair group method using arithmetic averages ）、Ward，Single Linkage、Complete Linkage、Neighbor Joiningなどの手法が挙げられる。また、非階層的クラスタリングには、多次元尺度法（Multi-Dimensional Scaling (MDS)）、自己組織化マップ（Self-Organizing Maps (SOM)）、主成分分析 (Principal Component Analysis)、判別分析(Discriminant Analysis)がなどの手法が例示される。これらの解析手法を組み合わせることもできる。
【００５１】
一つの好ましい形態として、Pearson correlationにより相関解析を行い、ＵＰＧＭＡでクラスター解析を実施した例について説明する。Pearson correlation は次の式により求めた。
【００５２】
【数１】
2005176791.tif 000003
【００５３】
上記式（Ｉ）において、xiとyi はサンプルxとyのデータセットを表す。ＵＰＧＭＡはPearson correlationが最小となるペアを求め、このクラスターを形成したペアと他のデータとの距離を算術平均により求めて、その後、そのペアをあたかも一つのデータであるかのように扱って、同じことを繰り返していき、得られたクラスターから系統樹を作成することができる。クラスター解析を用いることにより、各海域のグループ化を容易に行うことができる。
【００５４】
図３（ｄ）には、クラスター解析を行った場合の模式図を示す。図３（ｄ）に示されるように、海洋微生物検出基板の測定結果を、被検体の番号を縦軸に、テストサイトＮｏを横軸にとり、標識物質の検出の有無が一覧化されている。黒四角で示した部分が、標識物質が検出されたテストサイトであることを示す。このように一覧化し、標識物質の検出パターンの類比をクラスター解析により行った結果得られる系統樹が、標識物質の検出パターンの左側に表されている。図３（ｄ）に示される例では、被検体Ｎｏ７と被検体Ｎｏ８の間が、系統樹を最も大きく２分する部分となった。すなわち、クラスター解析により、４９種の被検体が被検体Ｎｏ１−７と被検体Ｎｏ８−ｘの２つのグループに分類された。各グループで検出されたバクテリアあるいはアーキアの種類や、他の情報をさらに加味していくことにより、さらに詳細な分析が可能である。このように本発明の海洋モニタリング方法によれば、各海域の比較、グループ化などを容易に行うことができる。
【００５５】
４．ＤＮＡマイクロアレイによる測定結果のデータベース化
図５に、本発明のより具体的な応用例を示す。図５に示す例では、海洋開発による環境汚染の進行を推測する海洋モニタリング行い、海洋モニタリングの結果を海洋開発の現場にフィードバックする例を示している。海洋開発Ｓ１は産業の発展や生活レベルの向上のために必要なものであるが、他方海洋汚染Ｓ２等のおそれもある。そこで、適切な海洋開発を進めるために、海洋モニタリングを行う必要がある。
【００５６】
本実施形態では、海洋開発Ｓ１現場から海水を採取し、上記海洋微生物検出基板Ｓ３を用いて生態系の変化を検出する。経時的に海洋バクテリアあるいはアーキア検出基板をもちいて所定の海洋バクテリアあるいはアーキアなどの微生物の有無を調査することにより、海洋開発Ｓ１による生態系の変化を把握することができる。海洋微生物検出基板による検出Ｓ３で得られたデータは随時コンピューターに送られて、データの蓄積およびデータの解析およびデータベースの構築Ｓ５がなされる。構築されたデータベースはネットワークに接続してもよい。データベース構築Ｓ５に蓄積されたデータは、海洋開発現場へとフィードバックされ、適切な環境制御を行いつつ、海洋開発を進めることができる。
【実施例】
【００５７】
以下に、本発明の実施例を示し、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、下記実施例により本発明が限定されるものではない。
【００５８】
［実施例１］  海洋モニタリング用の海洋バクテリアあるいはアーキア分類表
海洋の環境状況を的確に把握することができる微生物を選び出すため、National Center for Biotechnology Information（略称「ＮＣＢＩ」という）のTaxonomyデータベースについて，Entrez（NCBI中のデータベースを検索するシステム）により検索を行った。
ＮＣＢＩのＵＲＬは次の通りであった。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Taxonomy
【００５９】
また、検索式として次の式を用いた。
((sea [All Fields] OR ocean [All Fields]) OR marine [All Fields]) AND ("Bacteria" [Organism] OR bacteria [All Fields]))
【００６０】
上記検索式による検索の結果、データベース中に、該当するバクテリアあるいはアーキアが１８４９種類が登録されていた。分類の結果、真性細菌（Eubakuteria）１６０５種類、古細菌（Archeae）２４４種類が登録されていた。そのうち真性細菌は１５門、古細菌は２門に分類された。なお、生物学的分類では、現在、全ての原核生物に対して真性細菌２３門、古細菌２門に分類されている。分類はTaxonomic outline of the prokaryotic genera, Bergey's manual of systematic biology second edition release 1.0, April 2001によった。
【００６１】
バクテリアあるいはアーキアの分類は伝統的には生理学的および生化学的な形質によるものである。従って、分類群は生理的および生化学的群としての特徴をもつことになる。また、近年は遺伝子分類が主流となっているが、この分類方法は、バクテリアあるいはアーキアの進化の過程を追い、その過程で分化してきたバクテリアあるいはアーキアグループを分類の単位として考えるという方法である。遺伝子分類によっても、同じ分類に属するものは、生理的な特徴および生化学的特徴などを含めた生物学的性質について類似の性質を有するものと考えられる。
【００６２】
以上の点に着目し、海洋バクテリアあるいはアーキアの分類を適切に行うことにより、海洋バクテリアあるいはアーキアが環境の中でどのような生理や生化学的活性を持つことがわかり、ひいてはその海洋バクテリアあるいはアーキアが存在する環境がどのような状態であるかということを推測できる、という結論に至った。
【００６３】
上記の観点から、まず大きな分類であるPhylum（門）によりグループ化を行った。例えば、バクテロイデテス（Bacteroidetes,（CFB group））門に分類されるバクテリアは、広く海洋に存在しており、高分子分解能を持つことから（Shewan, J. M., and T. A. McMeekin. 1983. Taxonomy (and ecology) of Flavobacterium and related genera. Annu. Rev. Microbiol. 37:233−252.）、ＣＦＢグループにおける代表的な属であるサイトファーガ（Cytophaga）属のバクテリアが存在する海域は一次生産が盛んに行われている海域であると推定される。しかしながら、CFB groupのバクテリアは増殖基質の選択性がないため、これ以上の分類をしたとしても詳細な情報は得ることは困難である。
【００６４】
一方、プロテオバクテリア（Proteobacteria）門に分類されるバクテリアも広く海洋に存在しているが、それに属するClass（綱）によって存在する海域が異なることが報告されている。したがって、Phylumに分類されることだけでなく、さらに網まで分類することにより、海域ごとの情報をより詳細に得ることができる。
【００６５】
海水に栄養塩（グルコース、リン酸塩など）を添加した実験で、栄養塩添加した海水中ではγ-Proteobacteriaが優占し、無添加の海水ではα-Proteobacteriaが優占するという報告がされている（Jarone Pinhassi and Tom Berman, 2003）。したがって、富栄養な海水中ではγ-Proteobacteriaが多く存在し、栄養が比較的少ない表層海水ではα-Proteobacteriaが多く存在することが推定される。
【００６６】
また、海洋に存在するβ-Proteobacteriaは硝化細菌であり、β-Proteobacteriaが多く存在する海域では硝化作用が盛んである推定される。さらに、海洋に存在するε/δ-Proteobacteriaは硫黄酸化や硫酸還元菌であり、好気的環境では増殖しないため、ε/δ-Proteobacteriaが多く存在する海域が微好気から嫌気状態であることが推定される。
【００６７】
以上のような情報をまとめ、Proteobacteria門のバクテリアは網（Class）まで分類することで海域の情報が得られるものと考えられた。このようにグループ化はそのバクテリアあるいはアーキアの分類と海域環境の関連に着目して実施した。
【００６８】
Firmicutes門 (Gram-positive bacteria)に含まれるバクテリアのうち、Bacilli綱に属するものは好気的環境で増殖するが、Chlostridia綱に属するものは嫌気的環境でしか増殖しない。また、Mollicutes綱は現状の知見では増殖の場は限定されていないが細胞壁を欠く、呼吸をしないなどの独自の特徴を持っており、また寄生体として他の生物の病気の原因となる場合がある。これらのことから、Firmicutes門のバクテリアは綱まで分類することで海域の情報が得られるものと考えられた。
【００６９】
最終的に、真性細菌１５門のうち、Proteobacteria門はさらに４綱、Firmicutesは３綱に分けられ、全部で２２のグループに分類した。海洋バクテリアあるいはアーキアのモニタリングに適した微生物群の分類を一覧表にしたものが表１である。以上のようにして選出された海洋バクテリアあるいはアーキア群は、海洋の環境状況の違いを反映する蓋然性が高い一群であり、海洋モニタリングのために有用である。
【００７０】
【表１】
2005176791.tif 000004
【００７１】
［実施例２］  ＤＮＡマイクロアレイによる海洋微生物の検出方法
菌株は実施例１の分類に含まれるものを選択した。Proteobacteria門γ-Proteobacteria 綱に属する海洋バクテリアであるマリノバクターハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus（ＡＴＣＣ  ２７１３２））、Actinobacteria門に属するRhodococcus sp.、Firmicutes門Baccilli綱に属するBaccillus sp.を用いた。Rhodococcus sp.、Baccillus sp.に関しては、環境中から分離し１６S  ｒRNA遺伝子の塩基配列より分類を行った。なお、ＡＴＣＣ番号が記載されているものは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, USA）に寄託されており、各番号を参照して分譲を受けることができる。
【００７２】
ハイブリダイゼーションのプローブとしては、γ-Proteobacteria綱に含まれる菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の一部とし配列表の配列番号５に示す配列を用いた。
5'-GAC TTA GGC TCA TCC AAT AGC GCA-3'（配列番号５）
【００７３】
選定したプローブはＤＮＡマイクロアレイの基盤に固定し、ターゲットとするバクテリアの検出および同定について検討を行った。なお、ＤＮＡマイクロアレイは、ＮａｎｏＣｈｉｐTM（日製産業株式会社製）を用いた。プローブの固定等ＤＮＡマイクロアレイの調整、ＤＮＡチップでのハイブリダイゼーションの検出などＤＮＡマイクロアレイを用いた測定は、Molecular Biology Work Station（日製産業株式会社製）のマニュアルに従って行った。
【００７４】
基盤に固定したプローブと、それぞれの菌より抽出したＤＮＡの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅させたものとハイブリダイゼーションさせた。ＰＣＲのプライマー配列はバクテリア特異的な配列を選定し、フォワードプライマーとして5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’（配列表配列番号１）、リバースプライマーとして5’- ATTACCGCGGCTGCTGG -3’（配列表配列番号２）を用い、増幅されるＤＮＡ断片のサイズは約５００ｂｐであった。なお、検出のためフォワードプライマーには蛍光標識したものを用いた。
【００７５】
結果および考察
ＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーションの結果を図６に示す。プローブとM. hydrocarbonoclasticus由来のＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションさせた場合にはバックグラウンドの約５倍の蛍光強度が観察されたが、他の菌株に対してはシグナルはバックグラウンドと同レベルであった。従って、ＤＮＡチップにより実施例１の分類に含まれる菌株が正しく検出できた。検出までにかかった時間は５時間であった。
【００７６】
［実施例３］
表１の２２グループの菌を検出する特異的なプローブを固定したＤＮＡマイクロアレイを用いて実験を行った。表１に示す２２種の各菌株のプローブは、真性細菌については、配列表の配列番号１の配列を有するフォワードプライマー、配列番号２の配列を有するリバースプライマーを用いて増幅した一本鎖ＤＮＡを、古細菌については、配列番号３の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号４の配列を有するリバースプライマーを用いて増幅した一本鎖ＤＮＡを用いた。ＤＮＡチップは、ＮａｎｏＣｈｉｐTM（日製産業株式会社製）を用いた。プローブの固定等ＤＮＡチップの調整、ＤＮＡチップでのハイブリダイゼーションの検出などＤＮＡチップを用いた測定は、Molecular Biology Work Station（日製産業株式会社製）のマニュアルに従って行った。
【００７７】
被検体として、海域の異なる２７の海水サンプル１リットルを採取した。各海水サンプル１リットルを０．２μｍヌクレポアフィルターで濾過し、フィルター上に残った菌よりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として用い実施例２と同様にＰＣＲを行い、分析を行った。ＤＮＡマイクロアレイの結果をクラスター解析を行った。クラスター解析の具体的手法は、Pearson correlationによる相関解析を採用し、ＵＰＧＭＡでクラスター解析を実施した。Pearson correlation は上記式１により求めた。
【００７８】
クラスター解析の結果を図７に示す。クラスター解析の結果から、上から被検体１−８のグループと、被検体９−１９とに大別された。被検体１−８のグループは好気性状態を示すバクテリア群が含まれており、他方、被検体９−１９のグループには、嫌気性状態を示すバクテリアが含まれていた。
【００７９】
各被検体の溶存酸素量（ＤＯ）を、ＤＯセンサーを用いて測定したところ、被検体１−８についてはＤＯが５ｐｐｍ以上であり、他方被検体９−１９については４ｐｐｍ以下というように大別できた。以上の結果から、上記ＤＮＡマイクロアレイによる測定結果をクラスター解析することにより、海洋環境の状態をモニタリングできることが示された。
【００８０】
［実施例４］
新たに１５の海水サンプルを検体として採取した。ＤＮＡチップおよびこれを用いた測定は、実施例３と同様に行った。  ＤＮＡマイクロアレイでの分析結果をクラスター解析した。クラスター解析の手法は、実施例３と同様に行った。
【００８１】
クラスター解析の結果を図８に示す。各被検体を採取した海域の環境状況を別途追跡調査したところ、３つのグループがそれぞれ、赤潮藻類（Heterosigma akasiwo）がまったく存在しない海水（図８中、Control）、対数増殖を開始した時点の海水（被検体１４）、および減少を開始した時点の海水（被検体１２、１３）、その他の海水（被検体１−１１）にグループ化され、赤潮藻類の増殖の状態を反映して分類された。この結果は、クラスター分析による得られたクラスター上位からの３つのグループ分けにほぼ合致した。すなわち、クラスター分析の結果が、海洋環境の状態を的確に反映していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明にかかる海洋微生物検出基板および海洋モニタリング方法は、海洋食料生産および海洋環境浄化などの分野において好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイの概要を示す図である。
【図２】ＤＮＡマイクロアレイを用いて、海洋微生物由来のＤＮＡを検出する状態を模式的に示した図である。
【図３】本発明の海洋モニタリング方法の概要を模式的に示す図である。
【図４】図３（ｂ）を拡大した模式図である。
【図５】本発明の海洋モニタリング方法を海洋開発に利用する形態を示す図である。
【図６】実施例２のＤＮＡチップを用いた測定の結果を示す図である。
【図７】実施例３の試験結果に基づくグループ分けを示す図である。
【図８】実施例４の試験結果に基づくグループ分けを示す図である。
【符号の説明】
【００８４】
１  海洋微生物検出用基板（ＤＮＡマイクロアレイ）
２  テストサイト
３  基板に固定されたＤＮＡフラグメント
５  標識核酸
５１  標識核酸が結合された核酸
５２  標識物質
５３  ＰＣＲ法により増幅された被検体由来のＤＮＡフラグメント
５４  標識プローブ
１０  ＤＮＡフラグメントの固定領域
１０Ｘ  ＤＮＡフラグメントの固定領域の一部
１０ａ  テストサイト（標識物質検出されず）
１０ｂ  テストサイト（標識物質検出）
１１  ガラスプレート
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１；ＰＣＲ用プライマー
配列番号２；ＰＣＲ用プライマー
配列番号３；ＰＣＲ用プライマー
配列番号４；ＰＣＲ用プライマー
配列番号５；γ-Proteobacteria綱に属するバクテリアの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の一部に基づくプローブ（probe based on a part of 16S rRNA sequence derived from a bacteria belongs to the Class γ-Proteobacteria）
【図１】
2005176791.tif 000005
【図２】
2005176791.tif 000006
【図３】
2005176791.tif 000007
【図４】
2005176791.tif 000008
【図５】
2005176791.tif 000009
【図６】
2005176791.tif 000010
【図７】
2005176791.tif 000011
【図８】
2005176791.tif 000012
【配列表】
2005176791000001.app