(57)【要約】      （修正有）【課題】悪性疾患の検出および監視における前記モノクローナル抗体の使用方法とを提供する。【解決手段】ヒトのグリシンＮメチルトランスフェラーゼの一部に対する２種類のユニークなモノクローナル抗体と、それを用いて血液全体、血清、血漿、及び組織のグリシンＮメチルトランスフェラーゼの発現の下向き調節または不適切な発現によって肝癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌等の悪性疾患の検出および監視する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリシンＮメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）の状態のレベルの検出方法であって、（ａ）生物学的サンプルを用意すること、（ｂ）ＧＲＬ１ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５１９１）又はＧＲＬ７ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５３１９）から産生されるモノクローナル抗体を用意すること、（ｃ）前記サンプルを前記モノクローナル抗体に接触させること、および（ｄ）前記サンプル中のＧＮＭＴのレベルを決定することによる、検出方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルは、血液全体、血清、血漿および組織からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルは、肝癌、前立腺癌、乳癌および腎臓癌からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＲＬ１ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５１９１）のグリシンＮメチルトランスフェラーゼ抗体。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１がヒトＧＮＭＴのアミノ酸配列の２７２から２７８番までのアミノ酸残基である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２はヒトＧＮＭＴのアミノ酸配列の１０から１５番までのアミノ酸残基である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ＧＲＬ７ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５３１９）のグリシンＮメチルトランスフェラーゼ抗体。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項６に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号１はヒトＧＮＭＴのアミノ酸配列の２７２から２７８番までのアミノ酸残基である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と特異的に結合する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号２はヒトＧＮＭＴのアミノ酸配列の１０から１５番までのアミノ酸残基である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＧＲＬ１ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５１９１）から分泌される少なくとも１の抗体を含む、サンプル中のＧＮＭＴのレベルを決定するためのキット。
【請求項１５】
２以上の抗体を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ＧＲＬ７ハイブリドーマ細胞（ＰＴＡ−５３１９）から分泌される抗体を含む、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、グリシンＮメチルトランスフェラーゼの発現の下向き調節または不適切な発現によって特徴付けられる悪性疾患の検出、監視および診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞性癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）は、世界で最もありふれた悪性疾患の１つで、毎年ほぼ１００万人の死亡原因である。肝細胞性癌は不均一な地理的分布を示すので、世界の地域間で優勢なリスク因子が異なることとおそらく関係がある。肝細胞性癌はアジア、アフリカおよび地中海沿岸では最も高頻度で発生する新生物である。
【０００３】
肝細胞性癌の発症頻度は、Ｂ型及びＣ型の肝炎ウイルス感染者の頻度が高い地域とヘモクロマトーシス患者とでより高い。８０％を超える肝細胞性癌は肝硬変の患者で発症する。いったんウイルス感染が成立すると、患者が慢性肝炎を発症するのに約１０年を要し、肝硬変を発症するのに２０年を要し、肝細胞性癌を発症するのに３０年を要する。アフリカおよびアジアの諸国では、貯蔵が不完全な主食用作物へのアスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）による汚染の結果産生されたアフラトキシンが、おそらくｐ５３抑制遺伝子の突然変異を通じて、肝細胞性癌の発症の独立したリスク因子となるようである。
【０００４】
肝硬変の患者では、肝機能の低下、急性合併症（腹水、脳症、静脈瘤出血および黄疸）または上腹部の痛みおよび発熱があるときに肝細胞性癌の診断が疑われるべきである。超音波診断法はたいていの腫瘍を同定し、約５００ｎｇ／ｍｌを超える濃度のα−フェトプロテインを伴う硬変した肝臓内の不連続な塊の存在が診断基準である。生検は不要で、腫瘍の転移（ｔｕｍｏｒ  ｓｅｅｄｉｎｇ）のリスクを低減するために避けるべきである。外科的切除は治癒の可能性がある唯一の治療である。しかし、腫瘍の部域的な広がりと、既存の硬変の重篤性のために、かかる治療は患者の２０％未満でしか実行できない。平均手術死亡率は硬変患者で１２％で、５年生存率は約１５％である。
【０００５】
硬変および（５ｃｍ以下の）小さな腫瘍を有する患者は肝臓移植を受けるべきである。アルコール注入または高周波（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）切除は、移植に適さない小さな腫瘍を有する患者の生存率を改善することができる。より大きな腫瘍には、リピオドール（ｌｉｐｉｏｄｏｌ）および細胞毒性薬（シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）またはドクソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ））を併用する経動脈塞栓術（ｔｒａｎｓ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ）が一部の患者で腫瘍の壊死を誘発する場合がある。
【０００６】
腫瘍の悪性度を診断し、または評価するための絶対的な方法はない。しかし、利用可能な方法のなかで、組織の鏡検がいまだに最も信頼できる常用方法である。ある病理的研究では、腫瘍は、当該組織の切片を顕微鏡で検査することにより、組織学的および細胞学的な基準に基づいて構造的な脱分化（退形成（ａｎａｐｌａｓｉａ））の程度の大まかな評価をすることによって等級付けをすることができる。しかし一方では、一部の細胞は特異的な構造上の特徴を失っても生化学的な特性はいまだ保持するが、他の細胞は構造としては一見して分化しているようにみえても多くの正常な機能特性を失っている。他方では、腫瘍は均一的ではなく、複数の腫瘍等級の領域を含む場合がある。そこで、進行した腫瘍は、構造、機能、増殖能、薬剤またはＸ線に対する耐性および浸潤および転移の能力に違いがある細胞の混合集団からなる場合がある。これら２つの限界が腫瘍の鏡検の有効性を減少させる。別の面では、標本の試料作成によりかかる検査を行うことは大規模な調査には適さない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
悪性度の絶対的なマーカーを見つけるための多くの試みが行われてきた。腫瘍特異的タンパク質または腫瘍関連タンパク質を、直接測定することにより、または、これらのタンパク質に対する特異的抗体を開発することにより同定する他の試みはいまだに行われている。これらは、診察だけでなく、癌細胞を破壊する戦略を提供するうえでも有望なアプローチのようである。例えばα−フェトプロティンのような癌胎児抗原や、例えばフェリチンのような血清タンパク質や、酵素や、ポリアミンや、異所的ホルモンや、細胞マーカーや、レセプターや、腫瘍関連ウイルス抗原のようなさまざまな物質であって、その物質の生体内での存在または濃度がある種の癌を示す場合がある物質が報告されてきた。しかし、最も慣用される癌の診断法は、上記の物質のいずれよりも組織学に依存する。絶対的なマーカーがないことは癌研究の大きな欠陥である。
【０００８】
最近の観察は、発癌に密接に関連する物質の探索にいささかの期待を与える。癌は、オンコジーンの活性化と腫瘍抑制遺伝子の不活性化との両方を起こす多発的な遺伝子異常の結果として理解される。さらに、オンコジーンと関連するこれらの重要な遺伝子の差次的発現は、細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルに反映する場合がある。非常に大量のｍＲＮＡの中から興味のある変化したものを有効にスクリーニングするために、強力なツール、具体的には、ディフェレンシャル・ディスプレイ法が確立され、腫瘍細胞と正常細胞との間で差次的に発現する少数の遺伝子を同定し単離された（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｌｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻、６９６６−６９６８頁、１９９２年
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＧＮＭＴのレベルが低下した細胞の異常を検出するモノクローナル抗体を提供する。肝細胞性癌（ＨＣＣ）患者由来の細胞株および組織中のＧＮＭＴの発現を評価するために、我々は、２つの組み換えＧＮＭＴ融合タンパク質を用いて、ＧＲＬ７およびＧＲＬ１という２つのモノクローナル抗体を作製した。Ｍ１３ファージペプチドディスプレイは、モノクローナル抗体ＧＲＬ７およびＧＲＬ１の反応エピトープがそれぞれヒトＧＮＭＴのアミノ酸配列の１０−１５番および２７２−２７８番のアミノ酸残基であることを証明した。
【００１０】
ＧＮＭＴとモノクローナル抗体との結合の解離定数は、モノクローナル抗体ＧＲＬ７については１．７ｘ１０−８Ｍで、ＧＲＬ１については１．８ｘ１０−９Ｍであった。これらのモノクローナル抗体の両方とも、ウェスタンブロッティング（ＷＢ）および免疫組織化学染色アッセイ（ＩＨＣ）を用いて正常なヒトおよびマウスの肝臓組織中に存在するＧＮＭＴを同定することができる。さらに、ＧＲＬ１でのウェスタンブロッティングは、２つの肝芽細胞腫株および５つの肝細胞性癌株がＧＮＭＴを発現していないことを示した。両方のモノクローナル抗体での免疫組織化学染色アッセイは、非腫瘍性の肝臓組織の５０％（１３／２６）および肝細胞性癌組織の９６％（２４／２５）はＧＮＭＴを発現していないことを示した。したがって、我々は、ＧＮＭＴの発現はヒトの肝細胞性癌では下向き調節されているという結論を得た。
【００１１】
前記モノクローナル抗体はヒトＧＮＭＴのアミノ酸残基１０から１５または２７２から２７８までと反応するモノクローナル抗体のグループから選択されることが好ましい。前記抗体はＧＲＬ１またはＧＲＬ７であることが好ましい。特異抗体ＧＲＬ７に係る生物材料は出願人により２００３年５月１４日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、特許受託指定ＰＴＡ−５１９１を受けた。特異抗体ＧＲＬ１に係る生物材料は出願人により２００３年７月１４日にＡＴＣＣに寄託され、特許寄託指定ＰＴＡ−５３１９を受けた。
【００１２】
ヒト血清中のＧＮＭＴの測定のための定量的な酵素免疫アッセイが確立された。健常者４１３名、慢性肝炎患者９０名、肝硬変患者２０名および肝細胞性癌患者２２名を調べた。結果は、これら４つのグループの患者のＧＮＭＴの血清レベルがそれぞれ１１．０４±１６．２４（健常者）、７．１９±９．２５（慢性肝炎）、３．１４±３．３８（肝硬変）および２．１９±２．５４ｎｇ／ｍｌ（肝細胞性癌）であることを示した（ＡＮＯＶＡテスト、ｐ＜０．０５）。
【００１３】
図面の説明
図１Ａおよび１Ｂは、２つの組み換えＧＮＭＴ発現プラスミドｐＧＥＸ−ＧＮＭＴおよびｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓの構築ダイアグラムである。
【００１４】
図２Ａから２Ｄは、モノクローナル抗体ＧＲＬ１およびＧＲＬ７を用いたＧＮＭＴの組み換え型及び天然型の同定を示す電気泳動結果である。パネルＡは、ＩＰＴＧ誘導前（レーン１、６）および後（レーン２、７）のｐＧＥＸ−ＧＮＭＴを含む大腸菌ＪＭ１０９またはｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓを含む大腸菌ＢＬ−２１由来の溶菌液（ｌｙｓａｔｅ）を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマジー・ブリリアント・ブルーＲ２５０染色である。Ｈｉｓタグ精製法用のグルタチオン・アガロース・ビーズおよびニッケルアフィニティカラム由来の非結合分画（レーン３、９）および結合分画の溶出物がそれぞれレーン４およびレーン８に泳動された。パネルＢは、ＧＳＴ−ＧＮＭＴおよびＧＮＭＴ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質のストリップに対してモノクローナル抗体を反応させたウェスタンブロッティングである。ストリップは、未免疫ウサギ血清（レーン１）、ウサギ抗ＧＳＴ−ＧＮＭＴ抗血清Ｒ４（レーン２）、正常マウス血清（レーン３）、モノクローナル抗体ＧＲＬ１（レーン４）およびモノクローナル抗体ＧＲＬ７（レーン５）と反応させられた。これらのストリップは間接法を用い、基質３−３’ジアミノベンジジンで発色させられた。パネルＣはｐＣＭＶ−ＧＮＭＴプラスミドＤＮＡでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を用いるストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイである。パネルＤは、ＧＳＴおよびＧＮＭＴのストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイである。パネルＣおよびＤに用いられた抗体は、レーン１が未免疫ウサギ血清、レーン２がＲ４で、レーン３が正常マウス血清で、レーン４がモノクローナル抗体ＧＲＬ７で、レーン５がモノクローナル抗体ＧＲＬ１である。分子量マーカーはパネルＡ（レーン５）を除いて左端に標識された（単位はｋｄ）。
【００１５】
図３Ａおよ３Ｂは、キュベットに結合されたＧＮＭＴの応答プロットである。ＡはＧＮＭＴの結合に対する酢酸ナトリウムバッファーの条件のテストで、１はｐＨ４，２はｐＨ４．５で、３および５はｐＨ５．０で、４および６はｐＨ５．５で、７はｐＨ６である。ＢはＧＮＭＴの結合反応で、ステージ１はＰＢＳＴの基線で、２はＥＤＣ／ＮＨＳ２００μｌ  ３Ｘ６分、３はＰＢＳＴ洗浄３回、４はｐＨ５．０の酢酸ナトリウムバッファー２００μｌ、５は５０μｌＧＮＭＴ（９μｇ）＋１５０μｌｐＨ５．０酢酸ナトリウムバッファー５分間、６は結合反応を停止するため２００μｌの１ＭエタノールアミンｐＨ８．５を５分間、７は１０ｍＭのＨＣｌおよびＰＢＳＴ洗浄３回による再生反応２サイクルである。
【００１６】
図４Ａおよび４Ｂは、組み換えＧＮＭＴと結合されたキュベットに対するモノクローナル抗体ＧＲＬ１およびＧＲＬ７の応答プロットである。２００μｌの培養上清をＰＢＳＴで２倍希釈した液が前記キュベットに添加され、応答がＩＡｓｙｓ制御ソフトウェアのバージョン３．０１により測定された。得られたこれら２つのモノクローナル抗体の解離定数はＦＡＳＴ  ｆｉｔにより計算された。ＧＲＬ１の免疫グロブリン濃度は、Ａの（１）４ｘ１０−１１Ｍ、（２）８ｘ１０−１１Ｍ、（３）１．６ｘ１０−１０Ｍ、（４）３．２ｘ１０−１０Ｍ、（５）６．３ｘ１０−１０Ｍ、（６）１．３ｘ１０−９Ｍ、（７）２．５ｘ１０−９Ｍ、（８）５．１ｘ１０−９Ｍ、（９）１．０ｘ１０−８Ｍであった。ＧＲＬ７の免疫グロブリン濃度は、Ｂの（１）４．７ｘ１０−１１Ｍ、（２）９．４ｘ１０−１１Ｍ、（３）１．９ｘ１０−１０Ｍ、（４）３．８ｘ１０−１０Ｍ、（５）７．５ｘ１０−１０Ｍ、（６）１．５ｘ１０−９Ｍ、（７）３ｘ１０−９Ｍ、（８）６ｘ１０−９Ｍ、（９）１．２ｘ１０−８Ｍであった。
【００１７】
図５Ａおよび５Ｂは、ヒト肝臓、マウス肝臓、肝芽細胞種株細胞（ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ６）および肝細胞性癌株細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｕｈ７、ＨＡ２２Ｔ、Ｈｅｐ３ＢおよびＳｋ−Ｈｅｐ１）中のＧＮＭＴの存在をモノクローナル抗体ＧＲＬ１（パネルＡ）またはＧＲＬ７（パネルＢ）を用いてウェスタンブロッティング法で分析した結果である。レーン１は肝癌患者由来の非腫瘍性組織で、レーン２はＣ５７／ＢＬマウス由来の肝臓で、レーン３はＨｅｐＧ２で、レーン４はＰＬＣ／ＰＲＦ／５で、レーン５はＨｕｈ６で、レーン６はＨｕｈ７で、レーン７はＨＡ２２Ｔで、レーン８はＨｅｐ３Ｂで、レーン９はＳｋ−Ｈｅｐ１である。下のパネルは同一のレーンを抗β−アクチン抗体と反応させた結果である。分子量マーカーは各パネルの左端に標識された（単位ｋｄ）。
【００１８】
図６Ａから６Ｄは、モノクローナル抗体ＧＲＬ７またはＧＲＬ１を用いる肝細胞性癌患者２名由来のパラフィン固定肝臓組織切片中でのＧＮＭＴ発現の免疫組織化学的な分析結果である。前記切片は、１：２５希釈のモノクローナル抗体ＧＲＬ７（パネルＡ、Ｂ）または１：１００希釈のモノクローナル抗体ＧＲＬ１（パネルＣ、Ｄ）と反応させられ、標識ストレプトアビジン−ビオチン法により可視化された。パネルＡ（非腫瘍性）およびパネルＢ（腫瘍組織）は肝細胞性癌患者Ｈ１２６に由来した（１００倍拡大）。パネルＣ（非腫瘍性）およびパネルＤ（腫瘍組織）は別の肝細胞性癌患者Ｈ１４６に由来した（４００倍拡大）。
【００１９】
図７Ａおよび７Ｂは、ＧＮＭＴの定量的酵素免疫アッセイの結果の分布についての平均（ｍｅａｎ）プロットおよびボックス・プロットである。ジェン・イ（Ｊｅｎ−Ｉ）病院で健康診断を受診した健常者由来の健常血清４１３検体、慢性肝炎患者由来の９０検体、確認された肝硬変患者由来の２０検体および肝細胞性癌患者由来の２２検体を含む総数５４５検体の血清試料が我々の研究室で収集された。これらの血清の予備的スクリーニングでは、健常者と、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞性癌の患者の平均値および標準偏差は、それぞれ１１．０４±１６．２４ｎｇ／ｍｌ、７．１９±９．２５ｎｇ／ｍｌ、３．１４±３．３８ｎｇ／ｍｌおよび２．１９±２．５４ｎｇ／ｍｌであった。
【００２０】
グリシンＮメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ、ＥＣ２．１．１．２０）は、もともとグリシンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からのサルコシンの合成を触媒することによりＳ−アデノシルホモシステインに対するＳ−アデノシルメチオニンの比を調整する酵素であることが見つけられた（非特許文献２、３）。ＧＮＭＴは異なる動物種間で保存されている（非特許文献４、５、６および７）。好塩性メタン古細菌では、ＧＮＭＴは浸透圧調節に主要な役割を果たす（非特許文献８）。ウサギおよびラットの肝臓では、ＧＮＭＴは細胞質タンパク質の１−３％を含み、メチオニン代謝で重要な役割を果たすことが示唆されている（非特許文献３、１０および１１）。
【非特許文献２】Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４７巻、４２４８−４２５２頁、１９７２年
【非特許文献３】Ｏｇａｗａ、Ｈ．、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻、３４４７−３４５２頁、１９８２年
【非特許文献４】Ｂｏｒｋ、Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１巻、１６７７−１６９０頁、１９９２年
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５巻、７８７−７９３頁、１９９８年
【非特許文献６】Ｌａｉ、Ｍ．Ｃ．ら、米国微生物学会年会（要約Ｉ１７）、ワシントンＤ．Ｃ．、１９９９年
【非特許文献７】Ｏｇａｗａ、Ｈ．ら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｂ、１０６巻、６０１−６１１頁、１９９３年
【非特許文献８】Ｌａｉ、Ｍ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５巻、８２８−３３頁、１９９９年
【非特許文献９】Ｃｏｏｋ、Ｒ．Ｊ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、３６３１−３６３４頁、１９８４年
【非特許文献１０】Ｈｅａｄｙ、Ｊ．Ｅ．、Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３５巻、６４０−３、１９７５年
【００２１】
我々は、以前、ヒトの肝細胞性癌（ＨＣＣ）患者由来の肝臓の腫瘍と非腫瘍性肝臓組織とのｍＲＮＡディフェレンシャルディスプレイ法およびノザンブロット法の分析を通じて、ＧＮＭＴの発現レベルが腫瘍組織および肝細胞性癌株細胞では低下していることを報告した（非特許文献５）。その後、ヒトのＧＮＭＴ遺伝子が単離され、配列決定され、６ｐ１２染色体にマップされた（非特許文献１１）。さらに、ヒトＧＮＭＴ遺伝子の異なる多型の遺伝子型解析は、遺伝マーカーの３６−４７％は肝細胞性癌患者の腫瘍組織においてヘテロ接合性の喪失（ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｃｉｔｙ）を示すことを証明した（非特許文献１２）。ＧＮＭＴの機能的特徴付けは、ＧＮＭＴがベンゾ［ａ］ピレン（ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ  （ＢａＰ））と結合することができ、ＢａＰ−ＤＮＡ付加体（ａｄｄｕｃｔ）形成を減少させることを示した（非特許文献１３および１４）。したがって、ＧＮＭＴは発癌感受性遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ）に分類することができる。
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６巻、４３−４７頁、２０００年
【非特許文献１２】Ｔｓｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．ら、「発癌感受性遺伝子と推定されるＧＮＭＴの遺伝子型および表現型の特徴付け（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｇｅｎｅ，ＧＮＭＴ）」、Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ、（投稿中）
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｙ．ら、「ベンゾ［ａ］ピレン解毒経路における発癌感受性遺伝子と推定されるＧＮＭＴの機能的特徴付け（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ−ＧＮＭＴ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）」、（投稿中）
【非特許文献１４】Ｒａｈａ、Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、５７５０−５７５６頁、１９９４年
【００２２】
さらにＧＮＭＴは、多様な機能と、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）との結合についてＡｈ（ダイオキシン）レセプターと競合して、ＢａＰ依存性のシトクロムＰ４５０１Ａ１の発現を下向き調節し、ＢａＰ−ＤＮＡ付加体形成を減少させる能力とを有することが示された（非特許文献１３、１５）。ＧＮＭＴ活性がラット肝癌では著しく低下していることが示された（非特許文献１６）。さらに、Ｎ−２−フルオレニルアセトアミド（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）で誘発されたラット肝癌モデルでは、ＧＮＭＴ酵素活性は次第に低下して、処理の８ヶ月後の肝臓腫瘍では検出不可能になった（非特許文献１７）。これらの研究から、ＧＮＭＴ遺伝子発現の下向き調節は、自然発症および人工発癌の両方の肝癌で存在すると結論することができる。
【非特許文献１５】Ｋｒｕｐｅｎｋｏ、Ｎ．Ｉ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻、２７１４０−２７１４６頁、１９９７年
【非特許文献１６】Ｈｏｕｓｅｒ、Ｗ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４巻、７８３９−７８４５頁、１９８５年
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ、Ｙ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１巻、１７２０−１７２５頁、１９９１年
【００２３】
最近、Ｍｕｄｄらは、軽度の肝腫（ｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ）と血清トランスアミナーゼの慢性亢進とを有するイタリア人の同胞（ｓｉｂｌｉｎｇｓ）の２人がＧＮＭＴ欠損と診断されたという報告をした（非特許文献１８）。子供は両方ともミスセンス突然変異を有するＧＮＭＴ遺伝子の複合ヘテロ接合であった（非特許文献１９）。
【非特許文献１８】Ｍｕｄｄ、Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２４巻、４４８−６４頁、２００１年
【非特許文献１９】Ｌｕｋａ、Ｚ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１０巻、６８−７４頁、２００２年
【００２４】
したがって、本発明は、免疫組織化学およびＥＩＡ法によりＧＮＭＴのレベルの低下を検出し監視するためのモノクローナル抗体を提供する。
【００２５】
本文中に引用された全ての文書または刊行物は、引用によりここに取り込まれる。
【００２６】
ｇｎｍｔ遺伝子は正常細胞と腫瘍細胞とで発現が異なり、著しい相違があることは、本発明において驚くべきこととして見つけられた。本発明の目的は、ＧＮＭＴの遺伝子発現の相対的レベルを決定することにより細胞の異常を検出する方法を提供することである。
【００２７】
本発明では、血清または血漿中のＧＮＭＴと肝細胞性癌の発生との相関関係を監視する敏感な方法を確立するために、我々は抗ＧＮＭＴモノクローナル抗体を用いた。捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としての抗ヒトＧＮＭＴポリクローナル抗体が、血清または血漿中の前記ヒトＧＮＭＴを捕捉し、指示抗体（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてのモノクローナル抗体ＧＲＬ１によりさらに解析を行うために用いられた。我々は、血中のヒトＧＮＭＴ量を測定するための定量的酵素免疫アッセイ法を確立した。
【００２８】
さらに、前記モノクローナル抗体は、抗血清の作製またはその他の診断アッセイの作成に用いる合成ペプチドを製造するための参考として用いることができる免疫原性のあるエピトープを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の更なる詳細は以下の実施例に示されている。
【実施例１】
【００３０】
ｇｎｍｔ発現ベクターの構築
１．１．ｐＧＥＸ−ｇｎｍｔ
ｐＧＥＸ−ｇｎｍｔの構築のため、ｇｎｍｔの完全長ｃＤＮＡ断片は制限酵素ＳｍａＩおよびＳａｌＩ（ストラタジーン、米国、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＮＭＴ−９−１−２（非特許文献５）ファージミドＤＮＡから切断された。この１．２ｋｂＤＮＡ断片はＳｍａＩおよびＸｈｏＩで予め消化されたベクターｐＧＥＸ−ＫＧ（非特許文献２０）に連結された。
【非特許文献２０】Ｇｕａｎ、Ｋ．Ｌ．、Ｄｉｘｏｎ、Ｊ．Ｅ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９２巻、２６２−２６７頁、１９９１年
【００３１】
１．２．ｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓの構築
ｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓの構築のために、図１Ｂに示すとおり、プラスミドｐＣＭＶ−ｇｎｍｔ（非特許文献１３）がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として用いられた。ｇｎｍｔｃＤＮＡ配列と両端の制限酵素切断部位とを含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。２０回のＰＣＲサイクルがＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー・シータス、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）でパーキン・エルマー・シータスのアンプリタック・ゴールド（Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて実行された。上流プライマー（５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ）は、５’末端の３塩基対の「クランプ（ＧＣＧ）」と、これに続く１個の制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ）と、ｇｎｍｔｃＤＮＡ配列とからなる。下流プライマー（５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ）は、ｇｎｍｔｃＤＮＡの相補鎖の配列と、異なる制限酵素部位（ＸｈｏＩ）とから成ることを除いて、前記上流プライマーとお同様の構造的な配列モチーフを含む。前記ＰＣＲの後、前記１．２ｋｂＤＮＡ断片はゲルで精製され、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化されて、同じ組み合わせの制限酵素で消化されたベクターｐＥＴ２９ａ（ノバジェン社、米国、ウィスコンシン州、マジソン）に連結された。両方のプラスミドのＤＮＡ配列はＡＢＩプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット（パーキン・エルマー・シータス）を用いる自動ＤＮＡ配列決定により確認された。
【００３２】
大腸菌ＪＭ１０９またはＢＬ２１株が、ｐＧＳＴ−ｇｎｍｔの形質転換および発現の実験の受容体として用いられた。さらにプラスミドｐＧＥＸ−ＫＧ（非特許文献２１）が酵素免疫アッセイの平行対照実験の役割を果たすグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質の誘導および精製に用いられた。
【非特許文献２１】Ｇｕａｎ、Ｋ．Ｌ．、Ｄｉｘｏｎ、Ｊ．Ｅ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２巻、２６２−２６７頁、１９９１年
【００３３】
１．３．異なるＧＮＭＴ組み換えタンパク質の発現および精製
ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＧＮＭＴおよびＧＮＭＴ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質（ＲＰｓ）の全てがイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によりＪＭ１０９またはＢＬ２１細胞内で誘導された。ＧＳＴ−ＧＮＭＴおよびＧＮＭＴ−Ｈｉｓの形質転換体は、それぞれ０．６−０．７および０．７−０．８が誘導光学濃度であった。これらの誘導時間は、それぞれ３．５時間および１時間であった。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＧＮＭＴの組み換えタンパク質は、Ｇｕａｎら（非特許文献２１）に記載のとおり、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）を用いて精製された。ＧＮＭＴ−Ｈｉｓの組み換えタンパク質は、製造者（ノバジェン）によって提供される手法により、Ｎｉ２＋−を付加したヒスチジン（Ｈｉｓ）結合樹脂カラムを用いて精製された。結合したＧＳＴ−ＧＮＭＴ組み換えタンパク質は、５ｍＭの還元グルタチオンバッファーを用いてグルタチオン−セファロース４Ｂビーズから溶出された。トロンビン消化法が、上記のビーズに結合したＧＳＴ−ＧＮＭＴ融合タンパク質からＧＮＭＴ組み換えタンパク質を精製するのに用いられた。前記組み換えタンパク質の濃度はピアース社のＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ピアース、米国、イリノイ州、ロックフォード）を用いて測定され、純度は１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル（バイオラッド・ラボラトリーズ、米国、カリフォルニア州、リッチモンド）上でサンプルを泳動することにより解析された。
【００３４】
１．４．ウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清
ＧＮＭＴに対するウサギ抗体を作成するために、精製されたＧＳＴ−ＧＮＭＴ組み換えタンパク質がフロイントの完全（最初の免疫用）または不完全（ブースター注射用）アジュバント（シグマ、米国、ミズーリ州、セントルイス）と混合され、得られた混合物が免疫原として８週齢のＮＺＷウサギに皮下接種するのに用いられた（ウサギ１羽あたり組み換えタンパク質１５０−２００μｇ）。ウサギは最初の注射の後３週間ごとに同一の組み換えタンパク質の追加の投与量でブースター注射を受けた。ウサギの血清は免疫前および各回の注射の１週間後に採取された。全ての血清は５６°Ｃ３０分間熱非動化処理され、−２０°Ｃで保存された。
【００３５】
１．５．ＧＮＭＴに対するモノクローナル抗体の作成
マウスのモノクローナル抗体は、我々の研究室で慣用するハイブリドーマ技術により作成された。簡単には、ＢＡＬＢ／ｃマウスが、完全アジュバント（最初の免疫用）または不完全（ブースター注射用）アジュバント（シグマ）と混合されたＧＳＴ−ＧＮＭＴおよびＧＮＭＴ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質を投与量１回あたり２５μｇ１０日間隔の腹腔内注射（ｉ．ｐ．）で免疫された。血清サンプルは、免疫前および各回の注射の１週間後に尾の静脈から採取された。最後の組み換えタンパク質の静脈内注射（ｉ．ｖ．）の３日後、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマＮＳ１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリーランド州、ロックビル）とがＰＥＧ１５００（ロッシュ・ダイアグノスティクスＧｍｂＨ、ドイツ、マンハイム）を用いて融合され、９６穴プレート上で培養された（非特許文献２２）。培養上清が、ＧＳＴ／ＧＮＭＴのＥＩＡ法と、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＧＮＭＴ、ＧＮＭＴ−Ｈｉｓをブロッティングしたウェスタンブロッティング・ストリップとを用いてスクリーニングされた。選択されたハイブリドーマ細胞は、エキスパンドされ、限界希釈法で少なくとも２回クローニングされ、０．５ｍｌのプリスタン（シグマ）で刺激されたＢＡＬＢ／ｃマウス内の腹水腫瘍として増殖された。モノクローナル抗体は、プロティンＡ抗体精製キット（プロケム社（Ｐｒｏ−Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．）米国、マサチューセッツ州、アクトン）およびセントリコン・プラス−８０カラム（ミリポア、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）で精製され濃縮された。
【非特許文献２２】Ｃｈｕ、Ｔ．Ｍ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１２巻、４１７−４２９頁、１９９３年
【００３６】
１．６．細胞株および細胞培養
ハイブリドーマ細胞株および培養法
前記ハイブリドーマ細胞株は、非特許文献２２に記載のとおり１０％熱非動化ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、米国、メリーランド州、ゲイザースバーグ）中で培養された。
【００３７】
１．７．肝芽細胞腫および肝細胞性癌細胞株および培養法
２種類のヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２（非特許文献２３および２４）およびＨｕｈ６（非特許文献２５）と、５種類の肝細胞性癌細胞株Ｈｕｈ７（非特許文献２５）、ＨＡ２２Ｔ（非特許文献２６）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（非特許文献１９）、Ｈｅｐ３ＢおよびＳｋ−Ｈｅｐ１（非特許文献２３、２７および２８）とが本研究に用いられた。これらの細胞は、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で、１０％の熱非動化ウシ胎児血清（ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ユタ州、ローガン）と、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、ファンジゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ、２．５ｍｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）で培養された。
【非特許文献２３】Ａｄｅｎ、Ｄ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻、６１５−６１６頁、１９７９年
【非特許文献２４】Ｊａｖｉｔｔ、Ｎ．Ｂ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、４巻、１６１−１６８頁、１９９０年
【非特許文献２５】Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２巻、３８５８−３８６２頁、１９８２年
【非特許文献２６】Ｃｈａｎｇ、Ｃ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３巻、１１３３−１１３７頁、１９８３年
【非特許文献２７】Ｆｏｇｈ、Ｊ．、Ｔｒｅｍｐｅ、Ｇ．、分担執筆、Ｆｏｇｈ、Ｊ．編、Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ社刊）、１１５−１１９頁、１９７６年
【非特許文献２８】Ｆｏｇｈ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４１巻、２０９−２１４頁、１９７７年
【００３８】
１．８．ＧＮＭＴモノクローナル抗体をスクリーニングするための酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）
ＥＩＡ法は、上記の免疫された動物の抗体力価を監視するためと、異なるハイブリドーマの上清中のモノクローナル抗体をスクリーニングするためとに用いられた。濃度１μｇ／ｍｌ（ウェルあたり１００μｌ）のＧＳＴ−ＧＮＭＴまたはＧＮＭＴ−Ｈｉｓのいずれかでコーティングされた９６穴プレートが用いられた。ウサギまたはマウスの血清の抗体力価は、１０倍希釈系列で決定された。ＧＳＴ−ＧＮＭＴ組み換えタンパク質で免疫された動物由来のハイブリドーマをスクリーニングするために、ＧＳＴでコーティングされたＥＩＡプレートがＧＳＴと反応するモノクローナル抗体を除外するために用いられた。
【００３９】
さらに、ＧＮＭＴ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質で免疫された動物由来のハイブリドーマをスクリーニングするため、ＧＮＭＴ−Ｈｉｓでコーティングされたプレートでスクリーニングされた陽性クローンを確認するのにＧＳＴ−ＧＮＭＴでコーティングされたプレートが用いられた。ウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清（Ｒ４）と複数のマウス抗ＧＮＭＴ抗血清が前記ＥＩＡ法の陽性対照として用いられた。上記の手法の詳細は以前に説明されている（非特許文献２９）。
【非特許文献２９】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻、２３６８−２３７６頁、１９９１年
【００４０】
１．９．ＩｇＧのＥＩＡ定量キットによるモノクローナル抗体のＩｇＧ濃度の決定
モノクローナル抗体の濃度はマウスＩｇＧのＥＩＡ定量キット（ベチル・ラボラトリー（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、米国、テキサス州、モンゴメリー）により決定され、免疫グロブリン濃度は４パラメータロジスティック回帰仕様のＥＩＡ  ＥＩＸ８０８リーダー（バイオテック（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国、バーモント州、ウィノスキー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ））を用いて解析された。。アイソタイプ決定および軽鎖決定は、マウス免疫グロブリンアイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンシズ  ファーミンゲン、米国、カリフォルニア州、サンジエゴ）を用いて行われた。
【実施例２】
【００４１】
モノクローナル抗体の特徴付け
２．１．Ｍ１３ファージペプチドディスプレイ法によるエピトープマッピング
抗体は０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）で１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈され、５ｍｌの無菌ポリスチレンペトリディッシュに添加された。保湿容器内で終夜４°Ｃでコーティングした後、上記のプレートはブロッキングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．０２％  ＮａＮ３、無菌フィルター処理、４°Ｃ保存）でブロッキングされ、４°Ｃで少なくとも１時間インキュベーションされた。マイナー・コートタンパク質（ｐＩＩＩ）のＮ末端にランダムなヘプタペプチドをディスプレイするＭ１３ファージが用いられた（Ｐｈ．Ｄ．−７ＴＭファージ・ディスプレイ・ペプチド・ライブラリ、ニュー・イングランド・バイオラブ社、米国、マサチューセッツ州、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ））。特異的に結合したファージの選択は製造者の指示書に従って行われた。選ばれたファージ由来の５’末端ヌクレオチドが配列決定され、エンコードされたペプチドが表１に示すとおり推定された（非特許文献３０）。
【非特許文献３０】Ｃｏｒｔｅｓｅ、Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７巻、６１６−６２１頁、１９９６年
【００４２】
【表１Ａ】
2005162714.tif 000002
【００４３】
結果は、モノクローナル抗体ＧＲＬ１が配列ＤＦＫＰＹＫＰ（配列番号１）および変性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に特異的に結合することを示す。
【００４４】
【表１Ｂ】
2005162714.tif 000003
【００４５】
結果は、モノクローナル抗体ＧＲＬ７がコンセンサス配列ＳＬＧＶＡＡ（配列番号２）および変性配列に特異的に結合することを示す。
【００４６】
２．２．ＧＮＭＴのバイオセンサー表面への結合
カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）サンプル用キュベットはテルモ・ラブシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）から購入された。初期の実験では、コーティングの条件はｐＨに関して最適化された。前記表面は、ｐＨ４から６までの範囲で０．５単位ごとのステップのｐＨの１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーに６分間平衡化された。同一のバッファー中の９μｇの（トロンビン切断された）ヒトＧＮＭＴ組み換えタンパク質のサンプルが前記キュベットに添加された。テストするために、最適化されたｐＨ条件が作成された。前記デキストランの負に荷電したカルボキシル基と正に荷電したタンパク質との間の静電引力による前記組み換えタンパク質のキュベットへの結合は６分間行われた。最適化された応答は、図３Ａに示すとおり、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーの条件下で起こった。トロンビンで切断された９μｇのＧＮＭＴが、図３Ｂに示される１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−ｅｔｈｙｌ−３−  （３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）法によって、最適化されたｐＨ条件下の１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー中で前記ＣＭＤ表面キュベットをコーティングするために用いられた。
【００４７】
２．３．ＩＡｓｙｓアフィニティセンサーを用いる解離定数の決定
２．３．１．モノクローナル抗体のＫｄの決定
ＧＮＭＴの不動化につづいて、ＰＢＳＴ／ツイーン２０（ＰＢＳＴ）の基線が確立され、前記キュベットの撹拌速度が全ての反応について１００ｒｐｍで一定に維持された。２倍希釈系列（２００μｌのＰＢＳＴ）の培養上清由来のモノクローナル抗体が前記キュベットに添加され、応答が図４Ａ、Ｂに示すとおり、ＩＡｓｙｓ制御ソフトウェア３．０１を用いて測定された。結合データの速度論的な解析は、ＩＡｓｙｓ用に設計された曲線適合速度論解析ソフトウェアＦＡＳＴｆｉｔ（テルモ・ラボシステムズ、アフィニティセンサー部門、英国、ケンブリッジ）を用いて実行され、以下の非特許文献３１に記載のとおりＫｄが決定された。
【非特許文献３１】Ｍｏｒｇａｎ、Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１７巻、５１−６０頁、１９９８年
【実施例３】
【００４８】
３．１．ウェスタンブロッティング法アッセイ（ＷＢ）
ウェスタンブロッティング法がＧＮＭＴに対するモノクローナル抗体の確認に用いられた。ＧＳＴ−ＧＮＭＴ（サイズ５８ｋｄ）、Ｈｉｓ−ＧＮＭＴ（サイズ３７．４ｋｄ）およびＧＳＴ（サイズ２６ｋｄ）という３種類の組み換えタンパク質と、ヒトおよびマウスの肝臓タンパク質とがウェスタンブロッティングの抗原として用いられた。ストリップ実験において、モノクローナル抗体ＧＲＬ１、ＧＲＬ７およびＲ４、正常マウス血清および未免疫ウサギ血清のインキュベーションの後、前記ストリップは洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（シグマ）と反応させられた。最後に、得られた血清は３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液（ザイメッド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）、米国、カリフォルニア州）で発色させた。ニトロセルロース膜の実験では、モノクローナル抗体ＧＲＬ１およびＧＲＬ７、抗βアクチン（シグマ）のインキュベーションの後、前記膜は洗浄され、西洋ワサビペロキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（シグマ）と反応され、最後に以下の非特許文献３２に記載のとおりＥＣＬ試薬（アマシャム）で発光させた。結果は図５Ａ、Ｂに示された。
【非特許文献３２】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、８巻、５４７−５５２頁、１９８８年
【００４９】
３．２．ＧＮＭＴに対する抗体による免疫組織化学
肝細胞性癌患者由来の腫瘍性および非腫瘍性の肝臓組織の２セットがモノクローナル抗体およびＲ４での免疫組織化学的手法に用いられた。第１のセットは１３個の非腫瘍性組織および９個の腫瘍性組織（７対）を含み、第２のセットは１３個の非腫瘍性組織および１６個の腫瘍性組織（９対）を含む。前記癌組織および非癌組織の標本の全ては病理学的検査により確認され、表２Ａ、Ｂに示された。パラフィンに固定された組織ブロックは６μｍ厚の切片に薄切され、脱パラフィン処理され、内在性ペロキシダーゼ反応を消去するために蒸留水中に過酸化水素を３％含む溶液中に５分間浸漬された。１次抗体であるモノクローナル抗体ＧＲＬ１（腹水の１：１００希釈）またはモノクローナル抗体ＧＲＬ７（腹水の１：２５希釈）またはＲ４（１：２００希釈）が前記組織に適用された。調製済みのビオチン化２次抗体前記１次抗体と結合するために適用された。ストレプトアビジン−ペロキシダーゼのコンジュゲートが、図６に示すとおり同一の組織のスライドに適用された（ＨｉｓｔｏＳＴ５０５０検出キット、ザイメッド・ラボラトリーズ）。ペロキシダーゼの存在は非特許文献５に記載のとおり発色用の３、３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド溶液の添加により明らかにされた。
【００５０】
【表２Ａ】
2005162714.tif 000004
【００５１】
【表２Ｂ】
2005162714.tif 000005
【００５２】
注記  ａ  モノクローナル抗体ＧＲＬ１およびＧＲＬ７（腹水）の希釈倍率はそれぞれ１：１００および１：２５であった。
【００５３】
３．３．血清および血漿ＧＮＭＴ定量ＥＩＡ法の確立
３．３．１患者および正常血清
台北市ジェン・アイ（Ｊｅｎ−Ａｉ）病院からの血清または血漿サンプル合計５４５サンプルが２０００年８月から２００２年２月までの間に我々の研究室で収集されたが、このうち４１３サンプルは健常者由来で、９０サンプルはウイルス性の慢性肝炎患者由来で、２０サンプルは病理学的方法により肝硬変と診断された患者由来で、２２サンプルは生理学的、超音波的および病理学的方法により確認された肝細胞性癌患者由来であった。
【００５４】
３．３．２．ＧＮＭＴ定量酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）法
非特許文献血清および血漿中のＧＮＭＴ濃度は間接ＥＩＡ法で測定された。簡潔には、９６穴プレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）３５９０、９６穴アッセイプレート、米国、ニューヨーク州、コーニング）が、ウェルあたり０．１μｌ（濃度７．１３ｍｇ／ｍＬ）の０．０２Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中の硫安沈殿されたウサギ抗ＧＮＭＴ血清（Ｒ４）で３７°Ｃ１時間コーティングされた。ウェルは５％スキムミルク添加ＴＢＳ（５０ｍＭトリス、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ）で３７°Ｃ２時間ポスト・コーティングされた。標準およびサンプルはサンプル希釈液（０．０５ツイーン−２０および１％ＢＳＡ添加ＴＢＳ）に添加された。プレートは５００ｎｇ／ｍｌから７．８ｎｇ／ｍｌまでの標準の２倍希釈と、血清サンプルの２倍希釈とを３７°Ｃ１時間添加された。ヤギ抗マウスペロキシダーゼ１：３０００倍希釈が３７°Ｃ１時間前記プレートに添加された。洗浄後ＯＰＤが添加され、室温３０分間反応させた。反応は１００μｌの３Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して停止させた。４９０ｎｍの吸光度はＥＩＡリーダーのＢｉｏＴｅｋ  Ｅｌｘ８０８によって測定された。標準の結果は２−パラメーターロジスティック曲線当て嵌め法により計算され、血清サンプルの濃度に外挿された。
【００５５】
３．３．３．統計解析
統計解析はＳＰＳＳ統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ社、イリノイ州、シカゴ）を用いて行われた。一元配置分散分析が、正常、慢性肝炎患者、肝硬変患者および肝細胞性癌患者という４つのグループの血清中のＧＮＭＴタンパク質濃度の違いの統計的有意性を決定するために実行された。ｐ値が０．５付近の場合に多重比較（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）が用いられ、ＬＳＤが図７に示されるグループ間の有意性を証明するために用いられた。
【００５６】
引用文献
１．Ａｄｅｎ  ＤＰ、Ｆｏｇｅｌ  Ｈ、Ｐｌｏｔｋｉｎ  Ｓ、Ｄａｍｊａｎｏｖ  Ｉ、Ｋｎｏｗｌｅｓ  ＢＢ、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻、６１５−６１６頁、１９７９年
２．Ｂｏｒｋ  Ｐ、Ｏｕｚｏｕｎｉｓ  Ｃ、Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ、Ｓｃｈａｒｆ  Ｍ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｒ、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ  Ｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１巻、１６７７−１６９０頁、１９９２年
３．Ｃｈａｎｇ  Ｃ、Ｌｉｎ  Ｙ、Ｏ−Ｌｅｅ  Ｔ、Ｃｈｏｕ  Ｃ、Ｌｅｅ  Ｔ、Ｌｉｕ  Ｔ、Ｐ’Ｅｎｇ  Ｆ、Ｃｈｅｎ  Ｔ、Ｈｕ  Ｃ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３巻、１１３３−１１３７頁、１９８３年
４．Ｃｈｅｎ  ＳＹ、Ｗｏｎｇ  ＦＨ、Ｌｉｎ  ＪＲ、Ｌｉｕ  ＴＹ、Ｌｉｎ  ＣＨ、Ｌｉｎ  ＰＰ、Ｈｓｉｅｈ  ＪＴ、Ｃｈｅｎ  ＹＭ、「ベンゾ［ａ］ピレン解毒経路における発癌感受性遺伝子と推定されるＧＮＭＴの機能的特徴付け（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ−ＧＮＭＴ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ）」、（投稿中）
５．Ｃｈｅｎ  ＹＭ、Ｈｕ  ＣＰ、Ｃｈｅｎ  ＰＨ、Ｃｈｕ  ＭＨ、Ｔｓａｉ  ＹＴ、Ｌｅｅ  ＳＤ、Ｃｈａｎｇ  ＣＭ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、８巻、５４７−５５２頁、１９８８年
６．Ｃｈｅｎ  ＹＭ、Ｓｈｉｕ  ＪＹ、Ｔｚｅｎｇ  ＳＪ、Ｓｈｉｈ  ＬＳ、Ｃｈｅｎ  ＹＪ、Ｌｕｉ  ＷＹ、Ｃｈｅｎ  ＰＨ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５巻、７８７−７９３頁、１９９８年
７．Ｃｈｅｎ  ＹＭ、Ｃｈｅｎ  ＬＹ、Ｗｏｎｇ  ＦＨ、Ｌｅｅ  ＣＭ、Ｃｈａｎｇ  ＴＪ、Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ  ＴＬ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６巻、４３−４７頁、２０００年
８．Ｃｈｅｎ  ＹＭ、Ｚｈａｎｇ  ＸＱ、Ｄａｈｌ  ＣＥ、Ｓａｍｕｅｌ  ＫＰ、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ  ＲＴ、Ｅｓｓｅｘ  Ｍ、Ｐａｐａｓ  ＴＳ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻、２３６８−２３７６頁、１９９１年
９．Ｃｈｕ  ＴＭ、Ｋａｗｉｎｓｋｙ  Ｅ、Ｌｉｎ  ＴＨ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１２巻、４１７−４２９頁、１９９３年
１０．Ｃｏｏｋ  ＲＪ、Ｗａｇｎｅｒ  Ｃ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、３６３１−３６３４頁、１９８４年
１１．Ｃｏｒｔｅｓｅ  Ｒ、Ｍｏｎａｃｉ  Ｐ、Ｌｕｚｚａｇｏ  Ａ、Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｃ、Ｂａｒｔｏｌｉ  Ｆ、Ｃｏｒｔｅｓｅ  Ｉ、Ｆｏｒｔｕｇｎｏ  Ｐ、Ｇａｌｆｒｅ  Ｇ、Ｎｉｃｏｓｉａ  Ａ、Ｆｅｌｉｃｉ  Ｆ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７巻、６１６−６２１頁、１９９６年
１２．Ｆｏｇｈ  Ｊ、Ｔｒｅｍｐｅ  Ｇ、分担執筆、Ｆｏｇｈ、Ｊ．編、Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ社刊）、１１５−１１９頁、１９７６年
１３．Ｆｏｇｈ  Ｊ、Ｗｒｉｇｈｔ  ＷＣ、Ｌｏｖｅｌｅｓｓ  ＪＤ、Ｊ．ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、４１巻、２０９−２１４頁、１９７７年
１４．Ｇｕａｎ  ＫＬ、Ｄｉｘｏｎ  ＪＥ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９２巻、２６２−２６７頁、１９９１年
１５．Ｈｅａｄｙ  ＪＥ、Ｋｅｒｒ  ＳＪ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３５巻、６４０−３頁、１９７５年
１６．Ｈｏｕｓｅｒ  ＷＨ、Ｈｉｎｅｓ  ＲＮ、Ｂｒｅｓｎｉｃｋ  Ｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４巻、７８３９−７８４５頁、１９８５年
１７．Ｊａｖｉｔｔ  ＮＢ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ、４巻、１６１−１６８頁、１９９０年
１８．Ｋｅｒｒ  ＳＪ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７巻、４２４８−４２５２頁、１９７２年
１９．Ｋｒｕｐｅｎｋｏ  ＮＩ、Ｗａｇｎｅｒ  Ｃ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２７１４０−２７１４６頁、１９９７年
２０．Ｌａｉ  ＭＣ、Ｙａｎｇ  ＤＲ、Ｃｈｕａｎｇ  ＭＪ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５巻、８２８−３３頁、１９９９年ａ
２１．Ｌａｉ  ＭＣ、Ｙａｎｇ  ＤＲ、Ｃｈｕａｎｇ  ＭＪ、Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、（予稿Ｉ１７）、ワシントンＤＣ、１９９９年ｂ
２２．Ｌｕｋａ  Ｚ、Ｃｅｒｏｎｅ  Ｒ、ＩＩＩ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＪＡ、Ｍｕｄｄ  ＨＳ，  Ｗａｇｎｅｒ  Ｃ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１１０巻、６８−７４頁、２００２年
２３．Ｍｏｒｇａｎ  ＣＬ、Ｎｅｗｍａｎ  ＤＪ、Ｂｕｒｒｉｎ  ＪＭ、Ｐｒｉｃｅ  ＣＰ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１７巻、５１−６０頁、１９９８年
２４．Ｍｕｄｄ  ＳＨ、Ｃｅｒｏｎｅ  Ｒ、Ｓｃｈｉａｆｆｉｎｏ  ＭＣ、Ｆａｎｔａｓｉａ  ＡＲ、Ｍｉｎｎｉｔｉ  Ｇ、Ｃａｒｕｓｏ  Ｕ、Ｌｏｒｉｎｉ  Ｒ、Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｄ、Ｍａｔｉａｓｚｕｋ  Ｎ、Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ  ＤＳ、Ｓｃｈｗａｈｎ  Ｂ、Ｒｏｚｅｎ  Ｒ、ＬｅＧｒｏｓ  Ｌ、Ｋｏｔｂ  Ｍ、Ｃａｐｄｅｖｉｌａ  Ａ、Ｌｕｋａ  Ｚ、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＪＤ、Ｔａｎｇｅｒｍａｎ  Ａ、Ｓｔａｂｌｅｒ  ＳＰ、Ａｌｌｅｎ  ＲＨ、Ｗａｇｎｅｒ  Ｃ、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２４巻、４４８−６４頁、２００１年
２５．Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｈ、Ｔａｋｅｔａ  Ｋ、Ｍｉｙａｎｏ  Ｋ、Ｙａｍａｎｅ  Ｔ、Ｓａｔｏ  Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４２巻、３８５８−３８６２頁、１９８２年
２６．Ｏｇａｗａ  Ｈ、Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｍ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７巻、３４４７−３４５２頁、１９８２年
２７．Ｏｇａｗａ  Ｈ、Ｇｏｍ  Ｔ、Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｍ、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｂ、１０６巻、６０１−６１１頁、１９９３年
２８．Ｏｇａｗａ  Ｈ、Ｇｏｍｉ  Ｔ、Ｔａｋｕｓａｇａｗａ  Ｆ、Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｍ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂ、３０巻、１３−２６頁、１９９８年
２９．Ｒａｈａ  Ａ、Ｗａｇｎｅｒ  Ｃ、ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＲＧ、Ｂｒｅｓｎｉｃｋ  Ｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、５７５０−５７５６頁、１９９４年
３０．Ｔｓｅｎｇ  ＴＬ、Ｓｈｉｈ  ＹＰ、Ｈｕａｎｇ  ＹＣ、Ｗａｎｇ  ＣＫ、Ｃｈｅｎ  ＰＨ、Ｃｈａｎｇ  ＪＧ、Ｙｅｈ  ＫＴ、Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ  ＪＰ、Ｃｈｅｎ  ＹＭ、Ｂｕｅｔｏｗ  ＫＨ、「発癌感受性遺伝子と推定されるＧＮＭＴの遺伝子型および表現型の特徴付け（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｇｅｎｅ，  ＧＮＭＴ）」、Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ、（投稿中）
３１．Ｚｈａｎｇ  ＹＪ、Ｃｈｅｎ  ＣＪ、Ｈａｇｈｉｇｈｉ  Ｂ、Ｙａｎｇ  ＧＹ、Ｈｓｉｅｈ  ＬＬ、Ｗａｎｇ  ＬＷ、Ｓａｎｔｅｌｌａ  ＲＭ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１巻、１７２０−１７２５頁、１９９１年
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】組み換えＧＮＭＴ発現プラスミドｐＧＥＸ−ＧＮＭＴ構築ダイアグラム。
【図１Ｂ】組み換えＧＮＭＴ発現プラスミドｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓの構築ダイアグラム。
【図２Ａ】ＩＰＴＧ誘導前後のｐＧＥＸ−ＧＮＭＴまたはｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓを含む大腸菌由来の細胞溶解物のクーマジー・ブリリアント・ブルーＲ２５０染色されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル。
【図２Ｂ】ＧＳＴ−ＧＮＭＴおよびＧＮＭＴ−Ｈｉｓのストリップに対してモノクローナル抗体を反応させたウェスタンブロッティング。
【図２Ｃ】ｐＣＭＶ−ＧＮＭＴプラスミドＤＮＡでトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を用いるストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイ。
【図２Ｄ】ＧＳＴおよびＧＮＭＴのストリップ上でのウェスタンブロッティングアッセイ。
【図３Ａ】ＧＮＭＴの結合に対する酢酸ナトリウムバッファーの条件をテストするためのキュベットに結合されたＧＮＭＴの応答プロット。
【図３Ｂ】ＧＮＭＴの結合反応を示すキュベットに結合されたＧＮＭＴの応答プロット。
【図４Ａ】組み換えＧＮＭＴと結合されたキュベットに対するモノクローナル抗体ＧＲＬ１の応答プロット
【図４Ｂ】組み換えＧＮＭＴと結合されたキュベットに対するモノクローナル抗体ＧＲＬ７の応答プロット。
【図５Ａ】ヒト肝臓、マウス肝臓、肝芽細胞種株細胞および肝細胞性癌株細胞中のＧＮＭＴの存在をモノクローナル抗体ＧＲＬ１を用いて検出するウェスタンブロット。
【図５Ｂ】ヒト肝臓、マウス肝臓、肝芽細胞種株細胞および肝細胞性癌株細胞中のＧＮＭＴの存在をモノクローナル抗体ＧＲＬ７を用いて検出するウェスタンブロット。
【図６】ＧＮＭＴ発現を検出するためにモノクローナル抗体ＧＲＬ７またはＧＲＬ１を用いた免疫組織化学的染色を施した肝細胞性癌患者由来のパラフィン固定肝臓組織切片の顕微鏡写真。
【図７Ａ】ＧＮＭＴの定量的酵素免疫アッセイの結果の分布についての平均値（ｍｅａｎ）プロット。
【図７Ｂ】ＧＮＭＴの定量的酵素免疫アッセイの結果の分布についてのボックス・プロット。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列表の配列番号１：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
配列表の配列番号２：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2005162714.tif 000007
【図２Ａ】
2005162714.tif 000008
【図２Ｂ】
2005162714.tif 000009
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2005162714.tif 000011
【図３Ａ】
2005162714.tif 000012
【図３Ｂ】
2005162714.tif 000013
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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