(57)【要約】【課題】破傷風毒素結合活性を示すだけではなく、破傷風毒素に対する完全中和能を有する破傷風抗毒素製剤を提供すること。【解決手段】ヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有する真核細胞用発現ベクター、特に、酵母用発現ベクター、及び、該発現ベクターで形質転換した酵母を用いた該抗体フラグメントの製造方法【選択図】        図１１ 
2005176793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有する真核細胞用発現ベクター。
【請求項２】
真核細胞が酵母菌である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、夫々、図５及び図４に示された相補性決定領域群（ＣＤＲ）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、夫々、図５及び図４に示されたアミノ酸配列を有する、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
リンカーが［（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２又は３の整数を意味する）であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ｐＰＩＣ９ベクターにヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを導入して成る、請求項２ないし５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に（Ｈｉｓ）６タグ配列が含まれていることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に付加配列が含まれていないことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
更に薬剤耐性遺伝子を含有する、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか一項記載の発現ベクターにより形質転換された真核細胞。
【請求項１１】
宿主として栄養要求性酵母菌を用いた、請求項１０記載の形質転換真核細胞。
【請求項１２】
宿主としてメタノール資化性酵母菌を用いた、請求項１０又は１１記載の形質転換真核細胞。
【請求項１３】
酵母菌のプロテアーゼ欠損株である、請求項１０、１１又は１２記載の形質転換真核細胞。
【請求項１４】
発現ベクターを塩化リチウム形質転換法によって宿主細胞に導入することにより得られた、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の形質転換真核細胞。
【請求項１５】
発現ベクターを電気穿孔法によって宿主細胞に導入することにより得られた、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の形質転換真核細胞。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれか一項記載の形質転換真核細胞を培養してヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを生産させ、該形質転換細胞の培養上清を回収し、該培養上清から、ヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを精製することから成る、該抗体フラグメントの製造方法。
【請求項１７】
ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として生産されることを特徴とする、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の製造方法によって得られたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを有効成分として含有する、破傷風抗毒素製剤。
【請求項１９】
完全中和能を有することを特徴とする、請求項１８記載の破傷風抗毒素製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母菌（酵母細胞）を宿主として使用して、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメント（ScFv）を製造する方法等に関する。かかる抗体フラグメントは完全中和能を有し、破傷風抗毒素製剤の有効成分として使用することが出来る。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリア、破傷風のウマ抗毒素血清療法が実用化されて１００年以上になる。その間、抗毒素療法は、中毒性感染症の治療・予防に大きな効果をあげてきた。しかしウマ抗毒素は、ヒトにとって異種タンパク質であり、血清病などの副作用反応の危険がある。そこで、副作用のより少ない、より安全な破傷風抗毒素として、成人を破傷風毒素で免疫したヒト抗血清から調製した、ヒトにとって同種タンパク質である抗破傷風ヒト免疫グロブリンＧ製剤が先進工業国ではひろく用いられている。しかしながら、これは、ヒトの免疫血清を供給源としているため供給に限度があり、かつ肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の可能性がある。
【０００３】
このように、これまで実用化されている現行の抗毒素製剤はすべていわゆるポリクローナル抗体である。これに対して抗体産生能をもつリンパ球と試験管内で長期にわたる増殖能をもつミエローマ細胞とを融合させたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、試験管内で培養することができるので供給が十分でき、且つ、肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の可能性を回避することができる。特に、ヒト型モノクローナル抗体を用いる場合には、異種蛋白質としての抗原性の問題がないため、その他の中毒性感染症に対する抗毒素療法だけでなく、ウイルス感染症や、がんの免疫療法への応用も期待されている。
【０００４】
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をヒトに実用化するためには (1)ヒト型抗体であることが必要であることは勿論のことであるが、その他 (2)ハイブリドーマが安定して抗体を十分量産生し、(3)無血清培地で産生できて、しかも
(4)産生された抗体が高い中和活性をもち、(5)容易に精製できることなどが基礎的な必要条件となる。
【０００５】
これまでに本発明者等は、in vitro抗原刺激や自ら開発した高率に融合して安定したハイブリドーマをつくるための親細胞株を含め、考えられるあらゆる最適条件をとり入れて、世界に先駆けてこれらの条件を満たす抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体を産生する５株のハイブリドーマ株（Ｇ1，2，3，4，6）を取得することに成功している（Kamei M. et al., Eur. J.
Epidemiol., Vol.6, No. 4, p.386-397 (1990); 及び特開平２−５７１９５）。これらのモノクローナル抗体（MAb‐Ｇ1，2，３，4，6）は、破傷風毒素分子の3つの機能的ドメイン[Ａ](Ｇ4)、 [Ｂ](Ｇ6、Ｇ1、Ｇ3)および[Ｃ](Ｇ2)をそれぞれ認識する（表１、図１及び図２）。
【０００６】
【表１】
2005176793.tif 000003
【０００７】
本発明者等が開発したこれらのハイブリドーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の中和活性は非常に高く（表１）十分実用化に価する。
【０００８】
しかし、動物細胞を用いてヒトに注射できるヒト型モノクローナル抗体製品を作成するには、産生に設備、備品、培地などに高額の費用がかかるだけでなく、産生に用いる動物細胞に内在するウイルスないしウイルス顆粒、ウイルス核酸の混在などを避けるため、外注機関による高額の、多くの段階での検定要件に合格する必要があり、実用化にもっていくまでに、莫大な費用と長時間を必要とする。
【０００９】
最近、免疫グロブリンを産生する細胞からmRNAを抽出して逆転写酵素PCR(RT-PCR)法によって抗体可変部領域の遺伝子をクローニングする一般的方法（図３）が開発され、抗破傷風ヒト型抗毒素の組換え抗毒素フラグメントを大腸菌で作成し、その産物の抗原結合活性が報告された例はある（Rebecca L. Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, pp.
8095-8099 (1990)）が、これまでその産物の確実な毒素中和活性が得られたという報告はない。また一本鎖組換え抗体をCHO細胞など動物細胞で産生させて、その毒素中和活性を定性的に調べた報告はある (James W. Larrick, et al., Immunological Reviews 1992 No.130) が、中和活性を定量的に扱っていないし、その場合は、出発材料は低中和活性の抗毒素抗体しか産生していない（ポリクローナルの）ヒト末梢血Bリンパ球(PBL)集団であるので、高い中和活性をもつ抗体遺伝子を得る確率が極めて低く、実際に明確な中和活性は得られていない。
【００１０】
又、最近、抗体の重鎖および軽鎖可変部領域遺伝子［（VH、VL（G6の場合は軽鎖がκなので VK）］を適当なリンカーで連結して、ファージディスプレイ法によってファージ表面に発現させて固相抗原に特異的に吸着、濃縮（パンニング法）して目的とする組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv）のDNAをクローニングし、それを用いて可溶型リコビナント組換え抗体として特定の大腸菌に発現させる方法が報告されている (James W. Larrick et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,
Vol.160, No.3, pp. 1250-1256 (1989); Aparecida S. Tanaka, et al., FEBS Letters
458, pp.11-16 (1999))。
【００１１】
本発明者等は既に、上記の樹立した高中和活性ヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を出発材料として、RT-PCR法を用いて、抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより採取した伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をもとに作製した相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の中から、該ヒト型モノクローナル抗体を構成する重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、更にこれらのｃＤＮＡの塩基配列を決定してアミノ酸配列を推定することにも成功した（特開平１０−１４５７０号公報）。
【００１２】
更に、本発明者等は、以上の研究成果を基礎として、上記のファージを用いた新しい方法を導入して、簡便且つ経済的にヒト型抗体製剤をヒトに実用化するため、原核細胞である大腸菌を用いてヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを作成する系を構築した（特開２００１−２９９３６０号公報）。
【特許文献１】特開平１０−１４５７０号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の大腸菌を宿主とする系において発現されたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは高い毒素中和活性を有するものであるが、マウスを用いた動物実験結果によれば、破傷風毒素による症状進行に対して延命効果は認められたものの、このような破傷風中毒マウスを完全治癒（救命）するまでには至らなかった。更に、大腸菌を宿主とする系においては、発現されたヒト型一本鎖組換え抗体フラグメントの多くは大腸菌の細胞質画分に存在するために、かかる発現産物を実際に破傷風抗毒素製剤として用いるためには、その後に濃縮・高度精製等の操作を経る必要があった。
【００１４】
従って、本発明者は、このような従来のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの発現系にみられた課題を克服することを目的とし、鋭意研究の結果、今回、酵母に代表される真核細胞を宿主として用いたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの組換え発現系を構築することに成功し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、本発明は第一の態様として、高中和性のヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有する、酵母菌等の真核細胞用発現ベクター、に係る。
【００１６】
本発明のベクターには、挿入遺伝子を細胞外分泌タンパク質として発現することを可能とする、当業者に公知の適当な因子を含有することが好ましい。更に、薬剤耐性遺伝子が含有されていることが好ましい。この薬剤耐性による選択によって、多コピー（〜２０コピー程度）発現株を得ることが可能となり、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの発現量も約２００倍程度まで増大させることが可能となる。
【００１７】
薬剤耐性遺伝子は当業者に公知の任意のものを使用することができ、例えば、カナマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）が組み込まれた発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ及びブレオマイシン耐性遺伝子（ゼオシン耐性）組み込まれた発現ベクターｐＰＣＺα等を挙げることができる。
【００１８】
本発明は第二の態様として、本発明の発現ベクターにより形質転換された真核細胞に係る。真核細胞の種類に特に制限はないが、代表的な例として、Pichia酵母系のような酵母菌を挙げることが出来る。形質転換菌の選択の際の便宜の為に、このような宿主に使用する細胞は各種アミノ酸（例えば、ヒスチジン）要求性のような栄養要求性及び／又はメタノール資化性（Mut+）であることが好ましい。このような菌株の一例としてPichia pastoris GS115 株（Invitrogen）を挙げることが出来る。更に、例えば酵母系では、プロテアーゼ（ｐｒｂ１、ｐｅｐ４等）欠損株であるＳＭＤ系を使用ことによって産生されるタンパク質のプロテアーゼ分解による目減りを防ぐことが出来る。このような菌株の一例としてPichia pastoris SMD1168 株 (pep4Δhis4, Mut+His-
プロテアーゼ欠損：Invitrogen）を挙げることことが出来る。
【００１９】
真核細胞の形質転換は、塩化リチウム形質転換法及び電気穿孔法等の当業者に公知の任意の方法で実施することが可能である。
【００２０】
更に本発明は第三の態様として、本発明の形質転換真核細胞を培養して本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを生産させ、該形質転換真核細胞の培養上清を回収し、該培養上清から、該一本鎖組換え抗体フラグメントを精製することから成る、該抗体フラグメントの製造方法に係る。この方法において、本発明の一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として生産される場合には、その後の精製操作等が極めて容易と成るため好適である。
【００２１】
更に、本発明は第四の態様として、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを有効成分として含有する、破傷風抗毒素製剤に係る。これは完全中和能を有することを特徴とする。ここで「完全中和能」とは、以下の実施例で示されるマウスを用いた破傷風中毒試験において、完全治癒（救命）効果が見られるような中和活性を意味する。
【発明の効果】
【００２２】
宿主として酵母を使用した本発明の好適な発現系においては、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として培養液中に発現されるために、菌体タンパク質の混入が少なく、その後の精製操作が非常に容易である。又、生産量が大腸菌を用いた系と比較して約１００〜３００倍高いために、濃縮操作等を経ることなく高濃度のタンパク質製剤を得ることができる。更に、マウスを用いた破傷風中毒試験における完全治癒（救命）効果に示されるように、このタンパク質製剤は完全中和能を有する。従って、本発明は、優れた破傷風抗毒素製剤を提供することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの好適態様として、抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された相補性決定領域群（ＣＤＲ）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
【００２４】
更に好適態様として、抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示されたアミノ酸配列を有する、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを挙げることが出来る。
【００２５】
更に、図４及び図５に示された抗体重鎖可変部領域又は抗体軽鎖可変部領域、特に、それらの相補性決定領域群（ＣＤＲ）以外の枠組残基群（ＦＲ）において、数個のアミノ酸が置換・欠失・付加されたアミノ酸配列を有し、上記のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントと実質的に等しい高中和活性を有するポリペプチドも，本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントに包含される。
【００２６】
リンカーは、抗原に結合する際に、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域が効率良く折りたたまれるようにさせることを目的として、それら領域の間に配置させるものであり、通常５〜１５個のアミノ酸から構成されており、例えば、［（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２又は３の整数を意味する）を代表例として挙げることが出来る。
【００２７】
従って、本発明で使用するリンカーは、上記目的を達成できる限り，アミノ酸の数・種類等に制限はない。
【００２８】
又、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントにおいては、、抗体軽鎖可変部領域のＮ末端側及び抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に更に適当なアミノ酸配列が付加されていてもいなくても良い。
【００２９】
例えば、以下の実施例で示されるように、抗体軽鎖可変部領域のＮ末端側に各種制限酵素切断部位又は分泌シグナル領域、発現タンパク質の検出用に抗体重鎖可変部領域のＣ末端側にエピトープタグ配列又は（Ｈｉｓ）６タグ配列を付加することが出来る。但し、得られる一本鎖組換え抗体フラグメントの中和活性を高めるためには、その立体構造を出来るだけnatural form とすることが好ましく、その意味では、このようなタグ配列のような付加配列はないほうが良い。
【００３０】
更に、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは可溶性であり、分泌型であることが好ましい。
【００３１】
尚、上記ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡの具体的例としては以下のとおりである。
【００３２】
例えば、本発明ＤＮＡの好適態様として、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域の相補性決定領域群（ＣＤＲ）の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された、塩基配列によりコードされているＤＮＡを挙げることが出来る。
【００３３】
更に好適態様として、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された塩基配列によりコードされているＤＮＡがある。
【００３４】
又、上記いずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントと実質的に等しい高中和活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも使用することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）3rd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab.
Press, 2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３６】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、DIG
DNA Labeling (ベーリンガー・マンハイム社製  Cat
No. 1175033）でプローブをラベルした場合に、３２℃のDIG
Easy Hyb 溶液(ベーリンガー・マンハイム社製  Cat No. 1603558）中でハイブリダイズさせ、４０℃の0.1xSSC 溶液(0.1%[w/v]SDSを含む)中でメンブレンを洗浄する条件（1xSSCは0.15Ｍ NaCl，0.015M クエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡにハイブリダイズする程度の条件である。
【００３７】
このようなＤＮＡは、以下の実施例に示すようにＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡとして製造することが出来る他、本明細書に開示した塩基配列に基づき、当業者に周知の方法で化学合成により合成ＤＮＡとして調製することも可能である。
【００３８】
本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは当業者に公知の任意の手段で製造することが出来る。例えば、shake-flask (tube) を使用する実験室的スケールでの製造、又は、ファーメンター及び培養装置等の手段を使用して実用的大量生産を行うことも可能である。こうして製造される本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは、破傷風毒素に対して完全中和能をもち、破傷風の予防・治療等の為の破傷風抗毒素製剤の有効成分として有効に使用することができる。
【００３９】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、当業者に公知の従来の抗破傷風人免疫グロブリン製剤（例えば、「テタノブリン（登録商標）−ＩＨ」）に準じて製造することが出来る。予防及び治療に有効な量の本発明のフラグメントの他に、当業者に公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことができる。
【００４０】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、当該技術分野で公知の任意の形態を採ることができ、例えば、様々な塩及び緩衝剤によって緩衝化した、溶液、懸濁液、乳濁液等の液体製剤とすることができる。塩は、大半のものをアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩及び硫酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、例えばクエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝剤が処置される対象に生理学的に許容され得る程度で使用することができる。更に、上記フラグメント及び上記の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂した製剤形態とすることも可能である。
【００４１】
該破傷風抗毒素製剤中に配合される本発明フラグメントの量は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。例えば、液体製剤の場合には、通常、有効成分として〜１００ＩＵ（国際単位）／ｍｌの濃度で本発明フラグメントを含有することができる。
【００４２】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、その製剤形態に応じて当業者に公知の任意の経路で患者に施すことができる。例えば、液体製剤の場合には、筋肉注射、静注、点滴注射等により患者に施すことができる。投与量としては、通常、予防を目的とする場合には数百ＩＵ程度、又、治療目的の場合には、その症状に応じて、１回当たり１，０００〜５，０００ＩＵ程度投与する。尚、症状に応じて、適宜反復投与することも可能である。
【００４３】
特開平２−５７１９５に詳しく記載されているように、本発明のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、以下の通り作製することができる。
【００４４】
破傷風毒素（Ｔ．Ｔ．）によって免疫され、高力価の抗破傷風中和抗体を有しているヒトから採取されたリンパ球を、 in vitro において更にＴ．Ｔ．により抗原刺激した後に親細胞との融合を行なう。リンパ球は末梢血から、例えば、フィコールパック（ファルマシア社）を用いた密度勾配遠心分離法により分離する。親細胞としては融合効率がよく、得られたハイブリドーマが比較的安定にＩｇＧタイプの抗体を産生し、しかもヌードマウスで腹水を容易に生産することのできるヒト・マウスヘテロミエローマ、例えば、ＲＦ−Ｓ１を用いる。親細胞との融合はポリエチレングリコールを用いた公知の方法で行ない、特異抗体を産生するハイブリドーマの判定は、Ｔ．Ｔ．をコートしたプレートを用いたＥＩＡ法（酵素免疫測定法）により行なう。クローニングは限界希釈法又は軟寒天法により行なう。抗体はヌードマウスの腹水、又は連続培養装置を用いた培養上清中から硫安分画法及び／又はProtein-A カラムクロマトグラフィーにより容易に高純度品を大量に得ることが可能である。こうして得られたハイブリドーマの産生するヒト型モノクローナル抗体のうち、破傷風毒素に対する中和抗体価が数ＩＵ／１００μg ＩｇＧに達するものもあり、その一具体例として、平成８年７月４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託したハイブリドーマＴＴＧ６（微工研菌寄第１５７１９号：ＦＥＲＭＰ−１５７１９）を挙げることができる。
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。尚、以下の実施例に特に記載されていない条件等は当業者に周知の通常のものである
又、本発明の技術的範囲はこれら実施例に何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
ｍＲＮＡの調製
（ａ）抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマＴＴＧ６（細胞株ＲＦ０８１０）〔前記 Kamei M. et al., Eur. J. Epidemiol., Vol. 6, No. 4, p.386-397 (1990）中に「Ｇ６」として記載されているものと同一である〕を、２０％ウシ胎児血清、１０mg／mlのトランスフェリン、０．００４３mg／mlの亜セレン酸ナトリウム、１．５３mg／mlのエタノールアミン、５mg／mlのインスリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中、３７℃、５％ＣＯ2 の環境下で培養した。
【００４７】
（ｂ）総ＲＮＡ回収対数増殖期にあり、モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ細胞株Ｇ６細胞の１０7 個をリン酸緩衝生理食塩液で洗浄後、ＲＮＡの回収に供した。総ＲＮＡの回収は、 Pharmacia社 QuickPrep
Total RNA Extraction Kit を用いて以下のように行なった。ハイブリドーマ細胞を２０％ FCS-DMEM 培地に１×１０5 cells/mlでまきこんだ。３日間培養の後、１×１０7 の細胞を得た。細胞を４℃においてＰＢＳ（予め氷冷しておく）で３回洗浄した（２，０００×ｇ，５min)。細胞を５２５μl のLithium Chloride Solution に懸濁し、更に４．５μl のβメルカプトエタノール、２２５μl の Extraction
bufferを加え、グラス−テフロンホモゲナイザーを用いて氷冷しながら破砕した（２〜３min)。７５０μl のＣｓＴＦＡを加えて攪拌した後、破砕液を１．５mlの遠心チューブに移し、１５，０００rpm で３０分遠心分離した。この沈渣を、１１３μl のExtraction buffer 、２６３μl のLithium Chloride Solution 、３７５μl のＣｓＴＦＡ混液に懸濁した後、１５０００rpm 、１０分間遠心分離した。沈渣を７０％エタノールで洗浄（１５０００rpm 、５分間）したのち、１００μl のＴＥ緩衝液に溶解し、以下のｃＤＮＡ合成に用いた。
【実施例２】
【００４８】
ファーストストランドｃＤＮＡの合成及びＲＴ−ＰＣＲ法による抗体可変領域ｃＤＮＡの増幅
各モノクローナル抗体の軽鎖、重鎖の可変部領域をコードするｃＤＮＡを得るために、Welschofらの方法（J. Immunol.
Meth., vol. 179, p.203-214 (1995))に従い、ＲＴ−ＰＣＲ (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction）を行なった。抗破傷風ヒトモノクローナル抗体Ｇ６はＩｇＧ１サブクラスに属し、κ軽鎖を有しているので、ＰＣＲには、ヒトＩｇＧのκ軽鎖のアミノ酸の１から１０（kappaCL primer)及びγ重鎖のアミノ酸の１から７（IgG
primer) のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを forward primer として用いた。また、ヒトＩｇＧκ軽鎖のアミノ酸１０９から１１６（κシリーズ primer)、及びγ重鎖のアミノ酸１１５から１２１（ＶＨシリーズ primer)のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含んだオリゴヌクレオチドを back primerとして用いた（表２）。
【００４９】
【表２】
2005176793.tif 000004
【００５０】
上記ハイブリドーマ株より得た総ＲＮＡ１μg を鋳型に、Superscript II reverse transcriptase
(GIBCO-BRL社）を用い、５０mM Tris-HCl (pH
8.3)、４０mM KCl、６mM MgCl2、１mM DTT、0.７５mM dNTP 、２００unit Superscript II reverse transcriptase を含む反応液中で４５℃、１時間反応させて第一鎖を合成した。沸騰水中に１０分間放置し、逆転写酵素を失活させた後、終濃度１μM のforward 並びにback primer と混合し、Boehringer Mannheim 社 Expand Long Template PCR Systemを用いて、ＰＣＲを行ない〔５０mM Tris-HCl (pH 9.2)、１６mM (NH4)2SO4、1.７５mM MgCl2、0.３５mM dNTP を含む反応液中、９４℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃３０秒を１サイクルとし、３５サイクル〕、重鎖ｃＤＮＡ、軽鎖ｃＤＮＡを増幅した（図３）。
【実施例３】
【００５１】
増幅断片のサブクローニング
増幅したｃＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡ
polymerase （宝酒造株式会社）を用いて末端を平滑化した後、Ｔ４ polynucleotide kinase（宝酒造株式会社）を用いてリン酸化し、ＥｃｏＲＶ（New England Biolab社）で切断した後、E. coli alkaline phosphatase（宝酒造株式会社）で脱リン酸化したpBluescript ＳＫ−（Stratagene社）ベクターに挿入し、常法に従い、大腸菌ＤＨ−５α株を形質転換した。以上の増幅ｃＤＮＡ断片のサブクローニングの過程を図７に示した。次に塩基配列決定を行った。
【実施例４】
【００５２】
塩基配列の決定及びアミノ酸配列の解析
pBluescript ＳＫ−にサブクローニングした軽鎖、重鎖のｃＤＮＡクローンの塩基配列は、Amersham社、Thermo Sequenase Fluorescent labelled primer
cycle sequencing kit によりシークエンス反応を行なった後、自動シークエンサー（LI-COR社、DNA sequencer
model 4000) を用いて解析し、決定した。シークエンス反応は、Ｍ１３forward primer（５′−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ−３′）およびＭ１３ reverse primer （５′−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３′）を用いて sense並びにanti-sense鎖の両方について行ない確認した。その結果、図４及び図５に夫々示されるような、本発明抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列が得られた。
【００５３】
塩基配列および各塩基配列から予想されるアミノ酸配列は、GENETYX-MAC（Version 8.0、ソフトウエア開発株式会社）にて解析した。また抗体遺伝子検索プログラムAbCheckを用いて、各クローンのアミノ酸配列が、既知のヒト型抗体のアミノ酸配列データのデータベース（Elvin
A. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, FIFTH
EDITION, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,Public Health Service,
National Institute of Health (1991))に掲載されている抗体のアミノ酸配列に対するホモロジーを有するか検討し、得られたクローンが抗体遺伝子の可変部領域を含み、Ｇ６の重鎖、軽鎖はそれぞれKabatの分類のＶＨ３、Ｖκ１サブグループに属することが明らかとなった。こうして解明された抗体重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を１文字表記で夫々の図４及び図５中に示した。
【実施例５】
【００５４】
ヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv)発現ファージミドの構築
pBluescript SK−vectorに組み込んだVH,VKのcDNA 断片にそれぞれSac IとNot I、Sfi IとMlu Iの制限酵素切断部位を付加するため、実施例３で得たプラスミドを鋳型とし、各制限酵素による認識配列を含んだプライマーを用いて再度PCRを行った。これら制限酵素の付加部位は図４及び図５中に示されている。
【００５５】
増幅したcDNA断片を実施例３と同様の方法でpBluescript SK- に導入し、それぞれの認識配列が付加されたことをDNAシークエンシングにより確認した。VH、VKをコードするcDNA断片は、各プラスミドからSac
IとNotIおよびSfi Iと Mlu Iの二重消化により単離した。単離したcDNA断片をオリゴヌクレオチドリンカーとともに図６に示したpCANTAB 5Eファージミド
(Pharmacia) に導入して、ファージミドpCANTAB
5E-G6と名づけたファージミドを構築した(図７)。
【００５６】
尚、以上のpCANTAB 5E-G6ファージミドの構築に関しては、特開２００１−２９９３６０号公報に記載されている。
【実施例６】
【００５７】
酵母発現系ベクターpPIC9-G6の構築
実施例５で得られたｐCANTAB
5E-G6に含まれる本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントScFv-G6 (H-L1-K) 遺伝子をpBluescript SK−(Stratagene)にサブクローニングし、そのN末端にEcoRI制限酵素切断部位、C末端に6つのヒスチジンが連なった構造である(His)6タグと、AvrII制限酵素切断部位を付加するため、上記のpBluescript SK−10ng/μ1を鋳型DNAとして、5pmolフォワードプライマー、5pmolリバースプライマー(塩基配列はともに表３に示す)、40μMdNTPs、Expand High Fidelity PCR System (Roche)を用いて、PCR(95℃30秒、50℃30秒、72℃1分を1サイクルとし、30サイクル)を行なった。増幅したcDNA断片を、EcoRI(Takara)、AvrII(New England
BioLabs)制限酵素で切断し、酵母発現系のベクターであるpPIC9ベクター(Invitrogen：細胞外分泌タンパク質として発現できるα因子プロプレ配列（S）、及び異種タンパク質を大量に発現できるAOX１プロモーターを含む)のEcoRI、AvrII切断部位に導入し、こうして得られた本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv-G6)
を発現する酵母系発現ベクターをpPIC9-G6と命名した（図８）。
【００５８】
【表３】
2005176793.tif 000005
【実施例７】
【００５９】
ScFv-G6発現酵母の作成
pPIC9-G6をBgl II(New England BioLabs) もしくは、Sal I(Takara)で切断し、直鎖状DNAにしたものを、GeitzとSchiestlのlithiumacetateを用いた方法（R. D. Giltz, R. H. Schiestl. (1995) Transforming yeast with DNA. -
Methods in Molecular Cellular Biology 5 : 255-2693)の変法(1MLiCl)(Lithium Chloride Transformation Method)を用いて、YPD培地(1% yeast extract、2% peptone、2% D-glucose) 50m1に30℃でOD600=0.8-1.0まで培養した酵母菌Pichia pastoris GS115株(Invitrogen)に導入した(GS115 pPIC9-G6)。宿主として用いたPichia pastoris GS115株は、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１，ＡＯＸ２）を有しメタノール資化性（Ｍｕｔ＋）であり、且つ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＨＩＳ４の変異株his4である（ヒスチジン合成阻害：Ｈｉｓ−）。
【００６０】
その結果、Bgl IIで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6が酵母DNAに導入されると、酵母DNAのAOX１遺伝子領域と置き換わることによってMutｓ（メタノール資化性、slow）となる。この場合は、RDB Agarプレートで30℃、2日間、酵母を培養した。
【００６１】
一方、Sal Iで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6が酵母DNAに導入されると、酵母DNAのhis４遺伝子に挿入される結果、ヒスチジン要求性だった酵母はヒスチジン非要求性となる。したがって、この場合は、ヒスチジン欠乏培地RDB Agarプレート(1M sorbitol、2%D-glucose、1.34%YNB( Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate without amino acids)、4×10-5 %ビオチン、2% agar) で30℃、2日間、酵母を培養した。
【００６２】
培養の結果、Bgl IIで切断した直鎖状DNAを使用した場合には4コロニー、Sal Iで切断した直鎖状DNAを使用した場合には8コロニーを得た。プレート上でコロニーを形成した酵母を、MD培地10mlに接種し、30℃、3~4日間培養した。培養後、25℃、1,500×ｇ、10分間遠沈し、10mlの滅菌蒸留水に再懸濁した後、再び25℃、1,500×ｇ、10分間遠沈した。
【００６３】
こうして得られた合計１２個のコロニーを2mlのSCED buffer(1M solbitol、、10mM EDTA、10mM DTT、10mM sodium citrate,
pH7.5) に懸濁し、これに3mg/mlのZymolyase-100T (生化学工業株式会杜) を100μ1入れ、37℃、50分間反応させた。その後、1% SDS溶液を2ml入れ、穏やかに混和した後、5分間氷中に静置した。5M potassium acetate,
pH8.9を加え、穏やかに混和し、4℃、10,000×g、10分間遠沈した。遠心で得た上清に対して2倍容量のethanolを加え、室温で15分間静置した。これを4℃、10,000×ｇ、10分間遠沈し、得られた沈殿物を0.7mlのTE bufferに溶かし、等量のPCI(phenol:chloroform:isoamylalcohol=25:24:1)を加えてフェノール抽出を行なった。
【００６４】
フェノール抽出によって得られた水層に、2分の1量の7.5M ammonium acetate, pH7.5と2倍量のethanolを加え、エタノール沈殿した後、4℃、15,000 × g、20分間遠沈した。こうして得られた酵母DNAを減圧下で乾燥させ、50μ1のTE buffer,pH7.5と1μ1の10mg/ml RNaseを加え、4℃、17時間静置した。このDNA溶液0.2mg/mlをサンプルとして、5'AOX1プライマー及び3'AOX1プライマー(表3に示す)を用いて、PCR(94℃1分、55℃1分、72℃1分を1サイクルとし、25サイクル)を行ない、PCR産物を電気泳動(100V、30分間)して、抗破傷風ScFv-G6 DNAが酵母に導入されているかどうかを調べた。その結果、SalIで切断したDNAを導入した酵母の5クローンからG6-ScFvのDNAが導入されていることを示すバンドが認められた（図９）。
【実施例８】
【００６５】
酵母系発現ベクター導入ＳｃＦｖ−Ｇ６ＤＮＡの塩基配列の確認
ｐPIC9-G6に導入したｃDNAの塩基配列が元のDNAと同一であることを、α―プライマー、及び3'AOX1プライマー(表3に示す)、DNA Sequencing Kit BigDye
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems) によりシークエンス反応を行ない、ABI Sequencer 377 (Applied Biosystems)
で確認した。塩基配列および各塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、GENETYX-MAC(V6rsion11、ソフトウェア開発株式会杜)にて解析した。
【実施例９】
【００６６】
酵母Pichia
pastoris発現系によるScFv-G6の産生
ScFv-G6発現酵母Pichia pastoris GS115 pPIC9-G6株（実施例７においてSal Iで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6を酵母DNAに導入して得られた形質転換菌）を、YPD培地50m1に接種し、30℃で前培養した。2日間培養後、20℃、3,000×g、10分間遠沈して菌体を集め、これをBMMY培地(1% yeast extract、2% peptone、100mM K・K phosphate buffer
(1M K2HPO4、1M KH2PO4, pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5 %ビオチン、0.5%メタノール)10m1に懸濁し、30℃、4日間培養した。
【００６７】
培地容量に対して終末濃度0.5%になるようにメタノールを加えて培養し、24時間ごとに1mlずつ菌液を回収して、4℃、15,000rpm、3分間遠沈し、培養上清を得た。得た培養上清をSDS-PAGE、Tetra‐抗His抗体(QIAGEN)を用いたウェスタンブロッティング法にて解析した。
【００６８】
以上の方法で定量した結果を図１０に示す。ウェスタンブロッテイング法では、ScFv-G6の予想分子量約30kDa付近に抗体と反応する1本のバンドが検出された。
【００６９】
ScFv-G6産生の前培養には２日間、メタノール誘導による本培養には３日間が至適であった。
【００７０】
尚、ELISA法は以下のとおり実施した。
精製破傷風トキソイド(3,125
Lf/mgタンパク質：財団法人阪大微生物病研究会観音寺研究所より分与) 5μ1/mlを抗原とし、96穴マイクロプレートを用いて、破傷風トキソイドヘの結合活性の測定を行なった。二次抗体は、HRP標識抗His-tag抗体(Clonetech) (酵母発現系)を用い、ABTS(2,2'−amino-bis−(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfbnicacid) diammonium salt：和光純薬)を基質とし、発色をマイクロプレートリーダーにてOD415で読み取った。発色対照として、既知単位のテタノブリン（登録商標）（抗破傷風ヒトIgG:三菱ウェルファーマ株式会杜）、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(TAGO)で発色させた。抗体結合活性は、テタノブリン1/125 IU/mlの104倍希釈の発色度が、OD415=0.5のときを1EU(ELISA Units)/mlとして算出した。
【実施例１０】
【００７１】
マウスを用いた毒素中和試験
ScFv-G6標品（実施例９で得られた培養上清を、０.２%ゼラチン加（M/60）NaK リン酸緩衝食塩水pH7.0 で希釈して調製したもの）、または力価対照として単位既知の上述のテタノブリンを、10MLDの破傷風試験毒素(国立感染症研より分与)と混合し、37℃、60分間反応させた後、0.1〜0.4m1をddYマウス(♀、18〜229)の左下肢上腿に筋注し、破傷風症状の進行をスコア法（M.Matsuda, M.Kamei, N.Sugimoto,
Y.Ma, S.Hashizume.(1992) Characteristics of toxin-neutralization by anti-tetanus
human monoclonal antibodies directed against the three functional domains [A],[B]
and [C] of the tetanus toxin molecule and a reliable method for evaluating the protective
effects of monoclonal antibodies.- Eur.J. Epidemiol. 8:1-8.2)で観察した。
【００７２】
得られたScFv-G6標品と破傷風毒素との反応物を注射した後の中毒症状の進行を観察したところ、大腸菌系産物と比べて、はるかに少ないScFv-G6標品が破傷風中毒を完全に中和し、救命した（図１１）。また、ScFv-G6の用量を変量して調べたところ、培養ろ液を100.5段階希釈したものでも救命した（図１２）。
【００７３】
特開２００１−２９９３６０号公報に開示された、大腸菌発現系で得られたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントでは、破傷風中毒症状を完全には中和することが出来ずに、中毒死（スコア６の状態）を約２００時間程度遅延することが出来たのみであった。
【００７４】
上述の実験結果（図１１）から、この酵母系のScFv-G6の培養ろ液は、従来のポリクローナルな抗破傷風ヒトIgG免疫製剤（図１１中の「AT」）の0.003 IU/ml以上で、0.01 IU/mlにほぼ相当する最小救命活性(MSD)（上記文献参照）をもっていると考えられる。したがって、この中和活性からMAb-G6の中和活性 (30 IU/70μg) と比較して計算すると、酵母系培養液は0.006μg以上のScFv-G6/mlを含むことになる。
【実施例１１】
【００７５】
pPIC9及びpPIC9Kをベクターとして用いて、実施例６と同様に、実施例５で得られたpCANTAB 5E-G6に含まれる本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントScFv-G6 (H-L1-K) 遺伝子をpBluescript SK−(Stratagene)にサブクローニングしたが、本実施例においては、C末端に(His)6タグに対応する配列を含まないプライマーを使用した。その結果、C末端に(His)6タグを付加されていない本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv-G6) を発現する酵母系発現ベクターpPIC9(His)6−-G6及びpPIC9K(His)6−-G6が得られた。
【００７６】
次に、これらの酵母系発現ベクターを用いて、実施例７と同様に、ScFv-G6を発現する発現酵母GS115 pPIC9-G6及びGS115 pPIC9K-G6株を作成した。尚、GS115 pPIC9K-G6株については、G418の濃度を4.0μg/ml にまで上げて多コピーを有する形質転換菌を選択した。更に、プロテアーゼ欠損株であるSMD1168株を用いて、ScFv-G6を発現する発現酵母SMD1168 pPIC9-G6（２株）を作成した。
【００７７】
上記の組換え発現酵母により産生されたC末端に(His)6タグを付加されていない本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメントは、サンドイッチ法により、該抗体に破傷風トキソイドを結合させた後、テタノブリンと反応させ、更に、HRP標識抗ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG抗体(Biosource International, Camarillo, CA USA) と反応させ、ウェスタンブロッテイング法にてECLキット（Amersham, Bioscience）で検出した。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の発現系によって製造されたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは完全中和能を有しており、安全で経済的な抗毒素抗体製剤の実用化を可能としたものである。
【００７９】
更に、Pichia
pastoris のScFv発現系に関しては、DMI(desipramine) に対するもの（P.Eldin,M.E.Pauza,Y.Hieda,G.Lin,M.P.Murtaugh,P.R.Pente1,C.A.PenneU.(1997)
High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pichia
pastoris.- J.Immunol.Meth.201:67-75.）について250mg/L、CEA(carcinoembryonicantigen)に対するもの(F.M.Freyre,J.E.%zquez,M.Ayala,L.Canaan-Haden,H.Bell,1.Rodriguez,A.Gonzalez,A.Cintado,J.V.Gavilondo.(2000)Very
high expression of ananti-caecinoembryonic antigen single chain Fv antibody fragment
in the yeast Pichia pastoris.- J.Biotechnol.76:157-163)について1.29ｇ/Lの産生が報告されている。従って、本発明の酵母による発現系これらの系における各種生産条件を改良することによって発現タンパク質の生産量を更に増大することができる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】破傷風毒素分子のサブユニット構造（Ａ−Ｂ・Ｃ）とヒト型モノクローナル抗体Mab-Ｇ4，Ｇ1、Ｇ3、Ｇ6及びＧ2に対する破傷風毒素分子上でのエピトープの局在を示す。
【図２】ボツリヌス毒素の立体構造及びサブユニット構造（Ｌ，ＨＮ，Ｈｃ）、並びに破傷風毒素のサブユニット構造（Ａ，Ｂ，Ｃ）との相同性を示す。
【図３】ヒト免疫グロブリン産生細胞から、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域をコードするｃＤＮＡ断片をクローニングする方法を示す。
【図４】抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体ＭＡｂ‐Ｇ６の抗体重鎖可変部領域のアミノ酸及び塩基配列を示す。
【図５】抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体ＭＡｂ‐Ｇ６の抗体軽鎖可変部領域のアミノ酸及び塩基配列を示す。
【図６】pCANTAB 5Eファージミドベクターを示す。
【図７】増幅ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及びファージミドベクターpCANTAB 5E-G6の構築の過程を示す。
【図８】酵母系発現ベクターpPIC9-G6の構築の過程を示す。
【図９】抗破傷風ScFv-G6DNAが酵母に導入されていることを示す、PCR産物の電気泳動の写真である。
【図１０】培養上清中のScFv-G6の抗原結合値を示すSDS-PAGEの結果、及びウェスタンブロッティング法にて解析した電気泳動の写真を示す。
【図１１】得られたScFv-G6標品と破傷風毒素との反応物を注射した後の中毒症状の進行の結果を示すグラフである。縦軸は、無症状を「０」、死亡を「６」とした重症度点数（スコア）を示し、横軸は注射後の経過時間と日数を示す。
【図１２】ScFv-G6の用量を変量した場合の中毒症状の進行の結果を示すグラフである。縦軸は、無症状を「０」、死亡を「６」とした重症度点数（スコア）を示し、横軸は注射後の経過時間と日数を示す。
【図１】
2005176793.tif 000006
【図２】
2005176793.tif 000007
【図３】
2005176793.tif 000008
【図４】
2005176793.tif 000009
【図５】
2005176793.tif 000010
【図６】
2005176793.tif 000011
【図７】
2005176793.tif 000012
【図８】
2005176793.tif 000013
【図９】
2005176793.tif 000014
【図１０】
2005176793.tif 000015
【図１１】
2005176793.tif 000016
【図１２】
2005176793.tif 000017
【配列表】
2005176793000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月13日(2004.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有する真核細胞用発現ベクター。
【請求項２】
真核細胞が酵母である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、夫々、図５及び図４に示された相補性決定領域群（ＣＤＲ）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する、請求項２記載の発現ベクター。
【請求項４】
抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、夫々、図５及び図４に示されたアミノ酸配列を有する、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
リンカーが［（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２又は３の整数を意味する）であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ｐＰＩＣ９ベクターにヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを導入して成る、請求項２ないし５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に（Ｈｉｓ）６タグ配列が含まれていることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に付加配列が含まれていないことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
更に薬剤耐性遺伝子を含有する、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか一項記載の発現ベクターにより形質転換された真核細胞。
【請求項１１】
宿主として栄養要求性酵母を用いた、請求項１０記載の形質転換真核細胞。
【請求項１２】
宿主としてメタノール資化性酵母を用いた、請求項１０又は１１記載の形質転換真核細胞。
【請求項１３】
酵母のプロテアーゼ欠損株である、請求項１０、１１又は１２記載の形質転換真核細胞。
【請求項１４】
発現ベクターを塩化リチウム形質転換法によって宿主細胞に導入することにより得られた、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の形質転換真核細胞。
【請求項１５】
発現ベクターを電気穿孔法によって宿主細胞に導入することにより得られた、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の形質転換真核細胞。
【請求項１６】
請求項９ないし１５のいずれか一項記載の形質転換真核細胞を培養してヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを生産させ、該形質転換細胞の培養上清を回収し、該培養上清から、ヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを精製することから成る、該抗体フラグメントの製造方法。
【請求項１７】
ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として生産されることを特徴とする、請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７記載の製造方法によって得られたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを有効成分として含有する、破傷風抗毒素製剤。
【請求項１９】
完全中和能を有することを特徴とする、請求項１８記載の破傷風抗毒素製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母（酵母細胞）を宿主として使用して、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメント（ScFv）を製造する方法等に関する。かかる抗体フラグメントは完全中和能を有し、破傷風抗毒素製剤の有効成分として使用することが出来る。
【背景技術】
【０００２】
ジフテリア、破傷風のウマ抗毒素血清療法が実用化されて１００年以上になる。その間、抗毒素療法は、中毒性感染症の治療・予防に大きな効果をあげてきた。しかしウマ抗毒素は、ヒトにとって異種タンパク質であり、血清病などの副作用反応の危険がある。そこで、副作用のより少ない、より安全な破傷風抗毒素として、成人を破傷風毒素で免疫したヒト抗血清から調製した、ヒトにとって同種タンパク質である抗破傷風ヒト免疫グロブリンＧ製剤が先進工業国ではひろく用いられている。しかしながら、これは、ヒトの免疫血清を供給源としているため供給に限度があり、かつ肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の可能性がある。
【０００３】
このように、これまで実用化されている現行の抗毒素製剤はすべていわゆるポリクローナル抗体である。これに対して抗体産生能をもつリンパ球と試験管内で長期にわたる増殖能をもつミエローマ細胞とを融合させたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、試験管内で培養することができるので供給が十分でき、且つ、肝炎やＡＩＤＳなどのウイルス感染の可能性を回避することができる。特に、ヒト型モノクローナル抗体を用いる場合には、異種蛋白質としての抗原性の問題がないため、その他の中毒性感染症に対する抗毒素療法だけでなく、ウイルス感染症や、がんの免疫療法への応用も期待されている。
【０００４】
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をヒトに実用化するためには (1)ヒト型抗体であることが必要であることは勿論のことであるが、その他
(2)ハイブリドーマが安定して抗体を十分量産生し、(3)無血清培地で産生できて、しかも (4)産生された抗体が高い中和活性をもち、(5)容易に精製できることなどが基礎的な必要条件となる。
【０００５】
これまでに本発明者等は、in vitro抗原刺激や自ら開発した高率に融合して安定したハイブリドーマをつくるための親細胞株を含め、考えられるあらゆる最適条件をとり入れて、世界に先駆けてこれらの条件を満たす抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体を産生する５株のハイブリドーマ株（Ｇ1，2，3，4，6）を取得することに成功している（Kamei
M. et al., Eur. J. Epidemiol., Vol.6, No. 4, p.386-397 (1990); 及び特開平２−５７１９５）。これらのモノクローナル抗体（MAb‐Ｇ1，2，３，4，6）は、破傷風毒素分子の3つの機能的ドメイン[Ａ](Ｇ4)、 [Ｂ](Ｇ6、Ｇ1、Ｇ3)および[Ｃ](Ｇ2)をそれぞれ認識する（表１、図１及び図２）。
【０００６】
【表１】
2005176793.tif 000018
【０００７】
本発明者等が開発したこれらのハイブリドーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の中和活性は非常に高く（表１）十分実用化に価する。
【０００８】
しかし、動物細胞を用いてヒトに注射できるヒト型モノクローナル抗体製品を作成するには、産生に設備、備品、培地などに高額の費用がかかるだけでなく、産生に用いる動物細胞に内在するウイルスないしウイルス顆粒、ウイルス核酸の混在などを避けるため、外注機関による高額の、多くの段階での検定要件に合格する必要があり、実用化にもっていくまでに、莫大な費用と長時間を必要とする。
【０００９】
最近、免疫グロブリンを産生する細胞からmRNAを抽出して逆転写酵素PCR(RT-PCR)法によって抗体可変部領域の遺伝子をクローニングする一般的方法（図３）が開発され、抗破傷風ヒト型抗毒素の組換え抗毒素フラグメントを大腸菌で作成し、その産物の抗原結合活性が報告された例はある（Rebecca
L. Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, pp. 8095-8099 (1990)）が、これまでその産物の確実な毒素中和活性が得られたという報告はない。また一本鎖組換え抗体をCHO細胞など動物細胞で産生させて、その毒素中和活性を定性的に調べた報告はある
(James W. Larrick, et al., Immunological Reviews 1992 No.130) が、中和活性を定量的に扱っていないし、その場合は、出発材料は低中和活性の抗毒素抗体しか産生していない（ポリクローナルの）ヒト末梢血Bリンパ球(PBL)集団であるので、高い中和活性をもつ抗体遺伝子を得る確率が極めて低く、実際に明確な中和活性は得られていない。
【００１０】
又、最近、抗体の重鎖および軽鎖可変部領域遺伝子［（VH、VL（G6の場合は軽鎖がκなので
VK）］を適当なリンカーで連結して、ファージディスプレイ法によってファージ表面に発現させて固相抗原に特異的に吸着、濃縮（パンニング法）して目的とする組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv）のDNAをクローニングし、それを用いて可溶型リコビナント組換え抗体として特定の大腸菌に発現させる方法が報告されている
(James W. Larrick et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS,
Vol.160, No.3, pp. 1250-1256 (1989); Aparecida S. Tanaka, et al., FEBS Letters
458, pp.11-16 (1999))。
【００１１】
本発明者等は既に、上記の樹立した高中和活性ヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を出発材料として、RT-PCR法を用いて、抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより採取した伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をもとに作製した相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の中から、該ヒト型モノクローナル抗体を構成する重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、更にこれらのｃＤＮＡの塩基配列を決定してアミノ酸配列を推定することにも成功した（特開平１０−１４５７０号公報）。
【００１２】
更に、本発明者等は、以上の研究成果を基礎として、上記のファージを用いた新しい方法を導入して、簡便且つ経済的にヒト型抗体製剤をヒトに実用化するため、原核細胞である大腸菌を用いてヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを作成する系を構築した（特開２００１−２９９３６０号公報）。
【特許文献１】特開平１０−１４５７０号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の大腸菌を宿主とする系において発現されたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは高い毒素中和活性を有するものであるが、マウスを用いた動物実験結果によれば、破傷風毒素による症状進行に対して延命効果は認められたものの、このような破傷風中毒マウスを完全治癒（救命）するまでには至らなかった。更に、大腸菌を宿主とする系においては、発現されたヒト型一本鎖組換え抗体フラグメントの多くは大腸菌の細胞質画分に存在するために、かかる発現産物を実際に破傷風抗毒素製剤として用いるためには、その後に濃縮・高度精製等の操作を経る必要があった。
【００１４】
従って、本発明者は、このような従来のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの発現系にみられた課題を克服することを目的とし、鋭意研究の結果、今回、酵母に代表される真核細胞を宿主として用いたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの組換え発現系を構築することに成功し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、本発明は第一の態様として、高中和性のヒト型抗破傷風モノクローナル抗体由来の抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域、並びにこれら領域の間にリンカーを含むことを特徴とするヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含有する、酵母等の真核細胞用発現ベクター、に係る。
【００１６】
本発明のベクターには、挿入遺伝子を細胞外分泌タンパク質として発現することを可能とする、当業者に公知の適当な因子を含有することが好ましい。更に、薬剤耐性遺伝子が含有されていることが好ましい。この薬剤耐性による選択によって、多コピー（〜２０コピー程度）発現株を得ることが可能となり、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの発現量も約２００倍程度まで増大させることが可能となる。
【００１７】
薬剤耐性遺伝子は当業者に公知の任意のものを使用することができ、例えば、カナマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）が組み込まれた発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ及びブレオマイシン耐性遺伝子（ゼオシン耐性）組み込まれた発現ベクターｐＰＣＺα等を挙げることができる。
【００１８】
本発明は第二の態様として、本発明の発現ベクターにより形質転換された真核細胞に係る。真核細胞の種類に特に制限はないが、代表的な例として、Pichia酵母系のような酵母を挙げることが出来る。形質転換菌の選択の際の便宜の為に、このような宿主に使用する細胞は各種アミノ酸（例えば、ヒスチジン）要求性のような栄養要求性及び／又はメタノール資化性（Mut+）であることが好ましい。このような菌株の一例としてPichia
pastoris GS115 株（Invitrogen）を挙げることが出来る。更に、例えば酵母系では、プロテアーゼ（ｐｒｂ１、ｐｅｐ４等）欠損株であるＳＭＤ系を使用ことによって産生されるタンパク質のプロテアーゼ分解による目減りを防ぐことが出来る。このような菌株の一例としてPichia
pastoris SMD1168 株 (pep4Δhis4, Mut+His- プロテアーゼ欠損：Invitrogen）を挙げることことが出来る。
【００１９】
真核細胞の形質転換は、塩化リチウム形質転換法及び電気穿孔法等の当業者に公知の任意の方法で実施することが可能である。
【００２０】
更に本発明は第三の態様として、本発明の形質転換真核細胞を培養して本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを生産させ、該形質転換真核細胞の培養上清を回収し、該培養上清から、該一本鎖組換え抗体フラグメントを精製することから成る、該抗体フラグメントの製造方法に係る。この方法において、本発明の一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として生産される場合には、その後の精製操作等が極めて容易と成るため好適である。
【００２１】
更に、本発明は第四の態様として、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを有効成分として含有する、破傷風抗毒素製剤に係る。これは完全中和能を有することを特徴とする。ここで「完全中和能」とは、以下の実施例で示されるマウスを用いた破傷風中毒試験において、完全治癒（救命）効果が見られるような中和活性を意味する。
【発明の効果】
【００２２】
宿主として酵母を使用した本発明の好適な発現系においては、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントが分泌タンパク質として培養液中に発現されるために、菌体タンパク質の混入が少なく、その後の精製操作が非常に容易である。又、生産量が大腸菌を用いた系と比較して約１００〜３００倍高いために、濃縮操作等を経ることなく高濃度のタンパク質製剤を得ることができる。更に、マウスを用いた破傷風中毒試験における完全治癒（救命）効果に示されるように、このタンパク質製剤は完全中和能を有する。従って、本発明は、優れた破傷風抗毒素製剤を提供することを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントの好適態様として、抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された相補性決定領域群（ＣＤＲ）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を有する。
【００２４】
更に好適態様として、抗体重鎖可変部領域及び抗体軽鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示されたアミノ酸配列を有する、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントを挙げることが出来る。
【００２５】
更に、図４及び図５に示された抗体重鎖可変部領域又は抗体軽鎖可変部領域、特に、それらの相補性決定領域群（ＣＤＲ）以外の枠組残基群（ＦＲ）において、数個のアミノ酸が置換・欠失・付加されたアミノ酸配列を有し、上記のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントと実質的に等しい高中和活性を有するポリペプチドも，本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントに包含される。
【００２６】
リンカーは、抗原に結合する際に、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域が効率良く折りたたまれるようにさせることを目的として、それら領域の間に配置させるものであり、通常５〜１５個のアミノ酸から構成されており、例えば、［（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ］ｎ（ｎは１、２又は３の整数を意味する）を代表例として挙げることが出来る。
【００２７】
従って、本発明で使用するリンカーは、上記目的を達成できる限り，アミノ酸の数・種類等に制限はない。
【００２８】
又、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントにおいては、、抗体軽鎖可変部領域のＮ末端側及び抗体重鎖可変部領域のＣ末端側に更に適当なアミノ酸配列が付加されていてもいなくても良い。
【００２９】
例えば、以下の実施例で示されるように、抗体軽鎖可変部領域のＮ末端側に各種制限酵素切断部位又は分泌シグナル領域、発現タンパク質の検出用に抗体重鎖可変部領域のＣ末端側にエピトープタグ配列又は（Ｈｉｓ）６タグ配列を付加することが出来る。但し、得られる一本鎖組換え抗体フラグメントの中和活性を高めるためには、その立体構造を出来るだけnatural form とすることが好ましく、その意味では、このようなタグ配列のような付加配列はないほうが良い。
【００３０】
更に、本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは可溶性であり、分泌型であることが好ましい。
【００３１】
尚、上記ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントをコードするＤＮＡの具体的例としては以下のとおりである。
【００３２】
例えば、本発明ＤＮＡの好適態様として、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域の相補性決定領域群（ＣＤＲ）の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された、塩基配列によりコードされているＤＮＡを挙げることが出来る。
【００３３】
更に好適態様として、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域の少なくとも一方が、好ましくはそれらの両者が、夫々、図５及び図４に示された塩基配列によりコードされているＤＮＡがある。
【００３４】
又、上記いずれかのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントと実質的に等しい高中和活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも使用することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）3rd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３６】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、DIG DNA
Labeling (ベーリンガー・マンハイム社製  Cat No. 1175033）でプローブをラベルした場合に、３２℃のDIG Easy Hyb 溶液(ベーリンガー・マンハイム社製  Cat
No. 1603558）中でハイブリダイズさせ、４０℃の0.1xSSC 溶液(0.1%[w/v]SDSを含む)中でメンブレンを洗浄する条件（1xSSCは0.15Ｍ
NaCl，0.015M クエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ＤＮＡにハイブリダイズする程度の条件である。
【００３７】
このようなＤＮＡは、以下の実施例に示すようにＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡとして製造することが出来る他、本明細書に開示した塩基配列に基づき、当業者に周知の方法で化学合成により合成ＤＮＡとして調製することも可能である。
【００３８】
本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは当業者に公知の任意の手段で製造することが出来る。例えば、shake-flask (tube) を使用する実験室的スケールでの製造、又は、ファーメンター及び培養装置等の手段を使用して実用的大量生産を行うことも可能である。こうして製造される本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは、破傷風毒素に対して完全中和能をもち、破傷風の予防・治療等の為の破傷風抗毒素製剤の有効成分として有効に使用することができる。
【００３９】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、当業者に公知の従来の抗破傷風人免疫グロブリン製剤（例えば、「テタノブリン（登録商標）−ＩＨ」）に準じて製造することが出来る。予防及び治療に有効な量の本発明のフラグメントの他に、当業者に公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことができる。
【００４０】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、当該技術分野で公知の任意の形態を採ることができ、例えば、様々な塩及び緩衝剤によって緩衝化した、溶液、懸濁液、乳濁液等の液体製剤とすることができる。塩は、大半のものをアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩及び硫酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、例えばクエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝剤が処置される対象に生理学的に許容され得る程度で使用することができる。更に、上記フラグメント及び上記の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂した製剤形態とすることも可能である。
【００４１】
該破傷風抗毒素製剤中に配合される本発明フラグメントの量は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。例えば、液体製剤の場合には、通常、有効成分として〜１００ＩＵ（国際単位）／ｍｌの濃度で本発明フラグメントを含有することができる。
【００４２】
本発明の破傷風抗毒素製剤は、その製剤形態に応じて当業者に公知の任意の経路で患者に施すことができる。例えば、液体製剤の場合には、筋肉注射、静注、点滴注射等により患者に施すことができる。投与量としては、通常、予防を目的とする場合には数百ＩＵ程度、又、治療目的の場合には、その症状に応じて、１回当たり１，０００〜５，０００ＩＵ程度投与する。尚、症状に応じて、適宜反復投与することも可能である。
【００４３】
特開平２−５７１９５に詳しく記載されているように、本発明のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、以下の通り作製することができる。
【００４４】
破傷風毒素（Ｔ．Ｔ．）によって免疫され、高力価の抗破傷風中和抗体を有しているヒトから採取されたリンパ球を、 in vitro において更にＴ．Ｔ．により抗原刺激した後に親細胞との融合を行なう。リンパ球は末梢血から、例えば、フィコールパック（ファルマシア社）を用いた密度勾配遠心分離法により分離する。親細胞としては融合効率がよく、得られたハイブリドーマが比較的安定にＩｇＧタイプの抗体を産生し、しかもヌードマウスで腹水を容易に生産することのできるヒト・マウスヘテロミエローマ、例えば、ＲＦ−Ｓ１を用いる。親細胞との融合はポリエチレングリコールを用いた公知の方法で行ない、特異抗体を産生するハイブリドーマの判定は、Ｔ．Ｔ．をコートしたプレートを用いたＥＩＡ法（酵素免疫測定法）により行なう。クローニングは限界希釈法又は軟寒天法により行なう。抗体はヌードマウスの腹水、又は連続培養装置を用いた培養上清中から硫安分画法及び／又はProtein-A
カラムクロマトグラフィーにより容易に高純度品を大量に得ることが可能である。こうして得られたハイブリドーマの産生するヒト型モノクローナル抗体のうち、破傷風毒素に対する中和抗体価が数ＩＵ／１００μg
ＩｇＧに達するものもあり、その一具体例として、平成８年７月４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託したハイブリドーマＴＴＧ６（微工研菌寄第１５７１９号：ＦＥＲＭＰ−１５７１９）を挙げることができる。
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。尚、以下の実施例に特に記載されていない条件等は当業者に周知の通常のものである
又、本発明の技術的範囲はこれら実施例に何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
ｍＲＮＡの調製
（ａ）抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマＴＴＧ６（細胞株ＲＦ０８１０）〔前記 Kamei M. et al., Eur. J. Epidemiol., Vol. 6, No. 4, p.386-397 (1990）中に「Ｇ６」として記載されているものと同一である〕を、２０％ウシ胎児血清、１０mg／mlのトランスフェリン、０．００４３mg／mlの亜セレン酸ナトリウム、１．５３mg／mlのエタノールアミン、５mg／mlのインスリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中、３７℃、５％ＣＯ2 の環境下で培養した。
【００４７】
（ｂ）総ＲＮＡ回収対数増殖期にあり、モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマ細胞株Ｇ６細胞の１０7 個をリン酸緩衝生理食塩液で洗浄後、ＲＮＡの回収に供した。総ＲＮＡの回収は、
Pharmacia社 QuickPrep Total RNA Extraction Kit を用いて以下のように行なった。ハイブリドーマ細胞を２０％
FCS-DMEM 培地に１×１０5 cells/mlでまきこんだ。３日間培養の後、１×１０7 の細胞を得た。細胞を４℃においてＰＢＳ（予め氷冷しておく）で３回洗浄した（２，０００×ｇ，５min)。細胞を５２５μl
のLithium Chloride Solution に懸濁し、更に４．５μl のβメルカプトエタノール、２２５μl の Extraction bufferを加え、グラス−テフロンホモゲナイザーを用いて氷冷しながら破砕した（２〜３min)。７５０μl
のＣｓＴＦＡを加えて攪拌した後、破砕液を１．５mlの遠心チューブに移し、１５，０００rpm で３０分遠心分離した。この沈渣を、１１３μl のExtraction
buffer 、２６３μl のLithium Chloride Solution 、３７５μl のＣｓＴＦＡ混液に懸濁した後、１５０００rpm 、１０分間遠心分離した。沈渣を７０％エタノールで洗浄（１５０００rpm
、５分間）したのち、１００μl のＴＥ緩衝液に溶解し、以下のｃＤＮＡ合成に用いた。
【実施例２】
【００４８】
ファーストストランドｃＤＮＡの合成及びＲＴ−ＰＣＲ法による抗体可変領域ｃＤＮＡの増幅
各モノクローナル抗体の軽鎖、重鎖の可変部領域をコードするｃＤＮＡを得るために、Welschofらの方法（J.
Immunol. Meth., vol. 179, p.203-214 (1995))に従い、ＲＴ−ＰＣＲ (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction）を行なった。抗破傷風ヒトモノクローナル抗体Ｇ６はＩｇＧ１サブクラスに属し、κ軽鎖を有しているので、ＰＣＲには、ヒトＩｇＧのκ軽鎖のアミノ酸の１から１０（kappaCL
primer)及びγ重鎖のアミノ酸の１から７（IgG primer) のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを forward primer
として用いた。また、ヒトＩｇＧκ軽鎖のアミノ酸１０９から１１６（κシリーズ primer)、及びγ重鎖のアミノ酸１１５から１２１（ＶＨシリーズ
primer)のアミノ酸配列に相当する塩基配列を含んだオリゴヌクレオチドを back primerとして用いた（表２）。
【００４９】
【表２】
2005176793.tif 000019
【００５０】
上記ハイブリドーマ株より得た総ＲＮＡ１μg を鋳型に、Superscript II
reverse transcriptase (GIBCO-BRL社）を用い、５０mM Tris-HCl (pH 8.3)、４０mM KCl、６mM MgCl2、１mM
DTT、0.７５mM dNTP 、２００unit Superscript II reverse transcriptase を含む反応液中で４５℃、１時間反応させて第一鎖を合成した。沸騰水中に１０分間放置し、逆転写酵素を失活させた後、終濃度１μM
のforward 並びにback primer と混合し、Boehringer Mannheim 社 Expand Long Template PCR
Systemを用いて、ＰＣＲを行ない〔５０mM Tris-HCl (pH 9.2)、１６mM (NH4)2SO4、1.７５mM MgCl2、0.３５mM dNTP を含む反応液中、９４℃３０秒、５５℃６０秒、６８℃３０秒を１サイクルとし、３５サイクル〕、重鎖ｃＤＮＡ、軽鎖ｃＤＮＡを増幅した（図３）。
【実施例３】
【００５１】
増幅断片のサブクローニング
増幅したｃＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡ polymerase （宝酒造株式会社）を用いて末端を平滑化した後、Ｔ４
polynucleotide kinase（宝酒造株式会社）を用いてリン酸化し、ＥｃｏＲＶ（New England Biolab社）で切断した後、E.
coli alkaline phosphatase（宝酒造株式会社）で脱リン酸化したpBluescript ＳＫ−（Stratagene社）ベクターに挿入し、常法に従い、大腸菌ＤＨ−５α株を形質転換した。以上の増幅ｃＤＮＡ断片のサブクローニングの過程を図７に示した。次に塩基配列決定を行った。
【実施例４】
【００５２】
塩基配列の決定及びアミノ酸配列の解析
pBluescript ＳＫ−にサブクローニングした軽鎖、重鎖のｃＤＮＡクローンの塩基配列は、Amersham社、Thermo
Sequenase Fluorescent labelled primer cycle sequencing kit によりシークエンス反応を行なった後、自動シークエンサー（LI-COR社、DNA
sequencer model 4000) を用いて解析し、決定した。シークエンス反応は、Ｍ１３forward primer（５′−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ−３′）およびＭ１３
reverse primer （５′−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３′）を用いて sense並びにanti-sense鎖の両方について行ない確認した。その結果、図４及び図５に夫々示されるような、本発明抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列が得られた。
【００５３】
塩基配列および各塩基配列から予想されるアミノ酸配列は、GENETYX-MAC（Version
8.0、ソフトウエア開発株式会社）にて解析した。また抗体遺伝子検索プログラムAbCheckを用いて、各クローンのアミノ酸配列が、既知のヒト型抗体のアミノ酸配列データのデータベース（Elvin
A. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, FIFTH
EDITION, U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES,Public Health Service,
National Institute of Health (1991))に掲載されている抗体のアミノ酸配列に対するホモロジーを有するか検討し、得られたクローンが抗体遺伝子の可変部領域を含み、Ｇ６の重鎖、軽鎖はそれぞれKabatの分類のＶＨ３、Ｖκ１サブグループに属することが明らかとなった。こうして解明された抗体重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を１文字表記で夫々の図４及び図５中に示した。
【実施例５】
【００５４】
ヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv)発現ファージミドの構築
pBluescript SK−vectorに組み込んだVH,VKのcDNA
断片にそれぞれSac IとNot I、Sfi IとMlu Iの制限酵素切断部位を付加するため、実施例３で得たプラスミドを鋳型とし、各制限酵素による認識配列を含んだプライマーを用いて再度PCRを行った。これら制限酵素の付加部位は図４及び図５中に示されている。
【００５５】
増幅したcDNA断片を実施例３と同様の方法でpBluescript
SK- に導入し、それぞれの認識配列が付加されたことをDNAシークエンシングにより確認した。VH、VKをコードするcDNA断片は、各プラスミドからSac
IとNotIおよびSfi Iと Mlu Iの二重消化により単離した。単離したcDNA断片をオリゴヌクレオチドリンカーとともに図６に示したpCANTAB 5Eファージミド
(Pharmacia) に導入して、ファージミドpCANTAB 5E-G6と名づけたファージミドを構築した(図７)。
【００５６】
尚、以上のpCANTAB 5E-G6ファージミドの構築に関しては、特開２００１−２９９３６０号公報に記載されている。
【実施例６】
【００５７】
酵母発現系ベクターpPIC9-G6の構築
実施例５で得られたｐCANTAB 5E-G6に含まれる本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントScFv-G6 (H-L1-K)
遺伝子をpBluescript SK−(Stratagene)にサブクローニングし、そのN末端にEcoRI制限酵素切断部位、C末端に6つのヒスチジンが連なった構造である(His)6タグと、AvrII制限酵素切断部位を付加するため、上記のpBluescript
SK−10ng/μ1を鋳型DNAとして、5pmolフォワードプライマー、5pmolリバースプライマー(塩基配列はともに表３に示す)、40μMdNTPs、Expand
High Fidelity PCR System (Roche)を用いて、PCR(95℃30秒、50℃30秒、72℃1分を1サイクルとし、30サイクル)を行なった。増幅したcDNA断片を、EcoRI(Takara)、AvrII(New
England BioLabs)制限酵素で切断し、酵母発現系のベクターであるpPIC9ベクター(Invitrogen：細胞外分泌タンパク質として発現できるα因子プロプレ配列（S）、及び異種タンパク質を大量に発現できるAOX１プロモーターを含む)のEcoRI、AvrII切断部位に導入し、こうして得られた本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv-G6)
を発現する酵母系発現ベクターをpPIC9-G6と命名した（図８）。
【００５８】
【表３】
2005176793.tif 000020
【実施例７】
【００５９】
ScFv-G6発現酵母の作成
pPIC9-G6をBgl II(New England BioLabs) もしくは、Sal I(Takara)で切断し、直鎖状DNAにしたものを、GeitzとSchiestlのlithiumacetateを用いた方法（R.
D. Giltz, R. H. Schiestl. (1995) Transforming yeast with DNA. - Methods in
Molecular Cellular Biology 5 : 255-2693)の変法(1MLiCl)(Lithium Chloride Transformation
Method)を用いて、YPD培地(1% yeast extract、2% peptone、2% D-glucose) 50m1に30℃でOD600=0.8-1.0まで培養した酵母Pichia pastoris
GS115株(Invitrogen)に導入した(GS115 pPIC9-G6)。宿主として用いたPichia pastoris GS115株は、アルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１，ＡＯＸ２）を有しメタノール資化性（Ｍｕｔ＋）であり、且つ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＨＩＳ４の変異株his4である（ヒスチジン合成阻害：Ｈｉｓ−）。
【００６０】
その結果、Bgl IIで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6が酵母DNAに導入されると、酵母DNAのAOX１遺伝子領域と置き換わることによってMutｓ（メタノール資化性、slow）となる。この場合は、RDB
Agarプレートで30℃、2日間、酵母を培養した。
【００６１】
一方、Sal Iで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6が酵母DNAに導入されると、酵母DNAのhis４遺伝子に挿入される結果、ヒスチジン要求性だった酵母はヒスチジン非要求性となる。したがって、この場合は、ヒスチジン欠乏培地RDB
Agarプレート(1M sorbitol、2%D-glucose、1.34%YNB( Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate
without amino acids)、4×10-5 %ビオチン、2% agar) で30℃、2日間、酵母を培養した。
【００６２】
培養の結果、Bgl IIで切断した直鎖状DNAを使用した場合には4コロニー、Sal Iで切断した直鎖状DNAを使用した場合には8コロニーを得た。プレート上でコロニーを形成した酵母を、MD培地10mlに接種し、30℃、3~4日間培養した。培養後、25℃、1,500×ｇ、10分間遠沈し、10mlの滅菌蒸留水に再懸濁した後、再び25℃、1,500×ｇ、10分間遠沈した。
【００６３】
こうして得られた合計１２個のコロニーを2mlのSCED buffer(1M solbitol、、10mM EDTA、10mM DTT、10mM sodium citrate,
pH7.5) に懸濁し、これに3mg/mlのZymolyase-100T (生化学工業株式会杜) を100μ1入れ、37℃、50分間反応させた。その後、1% SDS溶液を2ml入れ、穏やかに混和した後、5分間氷中に静置した。5M
potassium acetate, pH8.9を加え、穏やかに混和し、4℃、10,000×g、10分間遠沈した。遠心で得た上清に対して2倍容量のethanolを加え、室温で15分間静置した。これを4℃、10,000×ｇ、10分間遠沈し、得られた沈殿物を0.7mlのTE
bufferに溶かし、等量のPCI(phenol:chloroform:isoamylalcohol=25:24:1)を加えてフェノール抽出を行なった。
【００６４】
フェノール抽出によって得られた水層に、2分の1量の7.5M ammonium acetate,
pH7.5と2倍量のethanolを加え、エタノール沈殿した後、4℃、15,000 × g、20分間遠沈した。こうして得られた酵母DNAを減圧下で乾燥させ、50μ1のTE
buffer,pH7.5と1μ1の10mg/ml RNaseを加え、4℃、17時間静置した。このDNA溶液0.2mg/mlをサンプルとして、5'AOX1プライマー及び3'AOX1プライマー(表3に示す)を用いて、PCR(94℃1分、55℃1分、72℃1分を1サイクルとし、25サイクル)を行ない、PCR産物を電気泳動(100V、30分間)して、抗破傷風ScFv-G6
DNAが酵母に導入されているかどうかを調べた。その結果、SalIで切断したDNAを導入した酵母の5クローンからG6-ScFvのDNAが導入されていることを示すバンドが認められた（図９）。
【実施例８】
【００６５】
酵母系発現ベクター導入ＳｃＦｖ−Ｇ６ＤＮＡの塩基配列の確認
ｐPIC9-G6に導入したｃDNAの塩基配列が元のDNAと同一であることを、α―プライマー、及び3'AOX1プライマー(表3に示す)、DNA
Sequencing Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems)
によりシークエンス反応を行ない、ABI Sequencer 377 (Applied Biosystems) で確認した。塩基配列および各塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、GENETYX-MAC(V6rsion11、ソフトウェア開発株式会杜)にて解析した。
【実施例９】
【００６６】
酵母Pichia pastoris発現系によるScFv-G6の産生
ScFv-G6発現酵母Pichia pastoris GS115 pPIC9-G6株（実施例７においてSal Iで切断されて直鎖状DNAとなったpPIC9-G6を酵母DNAに導入して得られた形質転換菌）を、YPD培地50m1に接種し、30℃で前培養した。2日間培養後、20℃、3,000×g、10分間遠沈して菌体を集め、これをBMMY培地(1%
yeast extract、2% peptone、100mM K・K phosphate buffer (1M K2HPO4、1M
KH2PO4, pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5 %ビオチン、0.5%メタノール)10m1に懸濁し、30℃、4日間培養した。
【００６７】
培地容量に対して終末濃度0.5%になるようにメタノールを加えて培養し、24時間ごとに1mlずつ菌液を回収して、4℃、15,000rpm、3分間遠沈し、培養上清を得た。得た培養上清をSDS-PAGE、Tetra‐抗His抗体(QIAGEN)を用いたウェスタンブロッティング法にて解析した。
【００６８】
以上の方法で定量した結果を図１０に示す。ウェスタンブロッテイング法では、ScFv-G6の予想分子量約30kDa付近に抗体と反応する1本のバンドが検出された。
【００６９】
ScFv-G6産生の前培養には２日間、メタノール誘導による本培養には３日間が至適であった。
【００７０】
尚、ELISA法は以下のとおり実施した。
精製破傷風トキソイド(3,125 Lf/mgタンパク質：財団法人阪大微生物病研究会観音寺研究所より分与) 5μ1/mlを抗原とし、96穴マイクロプレートを用いて、破傷風トキソイドヘの結合活性の測定を行なった。二次抗体は、HRP標識抗His-tag抗体(Clonetech)
(酵母発現系)を用い、ABTS(2,2'−amino-bis−(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfbnicacid) diammonium
salt：和光純薬)を基質とし、発色をマイクロプレートリーダーにてOD415で読み取った。発色対照として、既知単位のテタノブリン（登録商標）（抗破傷風ヒトIgG:三菱ウェルファーマ株式会杜）、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗ヒトIgG抗体(TAGO)で発色させた。抗体結合活性は、テタノブリン1/125
IU/mlの104倍希釈の発色度が、OD415=0.5のときを1EU(ELISA Units)/mlとして算出した。
【実施例１０】
【００７１】
マウスを用いた毒素中和試験
ScFv-G6標品（実施例９で得られた培養上清を、０.２%ゼラチン加（M/60）NaK リン酸緩衝食塩水pH7.0 で希釈して調製したもの）、または力価対照として単位既知の上述のテタノブリンを、10MLDの破傷風試験毒素(国立感染症研より分与)と混合し、37℃、60分間反応させた後、0.1〜0.4m1をddYマウス(♀、18〜229)の左下肢上腿に筋注し、破傷風症状の進行をスコア法（M.Matsuda,
M.Kamei, N.Sugimoto, Y.Ma, S.Hashizume.(1992) Characteristics of toxin-neutralization
by anti-tetanus human monoclonal antibodies directed against the three functional
domains [A],[B] and [C] of the tetanus toxin molecule and a reliable method for
evaluating the protective effects of monoclonal antibodies.- Eur.J. Epidemiol. 8:1-8.2)で観察した。
【００７２】
得られたScFv-G6標品と破傷風毒素との反応物を注射した後の中毒症状の進行を観察したところ、大腸菌系産物と比べて、はるかに少ないScFv-G6標品が破傷風中毒を完全に中和し、救命した（図１１）。また、ScFv-G6の用量を変量して調べたところ、培養ろ液を100.5段階希釈したものでも救命した（図１２）。
【００７３】
特開２００１−２９９３６０号公報に開示された、大腸菌発現系で得られたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントでは、破傷風中毒症状を完全には中和することが出来ずに、中毒死（スコア６の状態）を約２００時間程度遅延することが出来たのみであった。
【００７４】
上述の実験結果（図１１）から、この酵母系のScFv-G6の培養ろ液は、従来のポリクローナルな抗破傷風ヒトIgG免疫製剤（図１１中の「AT」）の0.003
IU/ml以上で、0.01 IU/mlにほぼ相当する最小救命活性(MSD)（上記文献参照）をもっていると考えられる。したがって、この中和活性からMAb-G6の中和活性
(30 IU/70μg) と比較して計算すると、酵母系培養液は0.006μg以上のScFv-G6/mlを含むことになる。
【実施例１１】
【００７５】
pPIC9及びpPIC9Kをベクターとして用いて、実施例６と同様に、実施例５で得られたpCANTAB
5E-G6に含まれる本発明のヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントScFv-G6 (H-L1-K) 遺伝子をpBluescript SK−(Stratagene)にサブクローニングしたが、本実施例においては、C末端に(His)6タグに対応する配列を含まないプライマーを使用した。その結果、C末端に(His)6タグを付加されていない本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメント（ScFv-G6)
を発現する酵母系発現ベクターpPIC9(His)6−-G6及びpPIC9K(His)6−-G6が得られた。
【００７６】
次に、これらの酵母系発現ベクターを用いて、実施例７と同様に、ScFv-G6を発現する発現酵母GS115 pPIC9-G6及びGS115 pPIC9K-G6株を作成した。尚、GS115 pPIC9K-G6株については、G418の濃度を4.0μg/ml にまで上げて多コピーを有する形質転換菌を選択した。更に、プロテアーゼ欠損株であるSMD1168株を用いて、ScFv-G6を発現する発現酵母SMD1168 pPIC9-G6（２株）を作成した。
【００７７】
上記の組換え発現酵母により産生されたC末端に(His)6タグを付加されていない本発明のヒト型抗破傷風組換え一本鎖抗体フラグメントは、サンドイッチ法により、該抗体に破傷風トキソイドを結合させた後、テタノブリンと反応させ、更に、HRP標識抗ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG抗体(Biosource
International, Camarillo, CA USA) と反応させ、ウェスタンブロッテイング法にてECLキット（Amersham,
Bioscience）で検出した。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の発現系によって製造されたヒト型抗破傷風一本鎖組換え抗体フラグメントは完全中和能を有しており、安全で経済的な抗毒素抗体製剤の実用化を可能としたものである。
【００７９】
更に、Pichia pastoris のScFv発現系に関しては、DMI(desipramine) に対するもの（P.Eldin,M.E.Pauza,Y.Hieda,G.Lin,M.P.Murtaugh,P.R.Pente1,C.A.PenneU.(1997)
High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pichia pastoris.-
J.Immunol.Meth.201:67-75.）について250mg/L、CEA(carcinoembryonicantigen)に対するもの(F.M.Freyre,J.E.%zquez,M.Ayala,L.Canaan-Haden,H.Bell,1.Rodriguez,A.Gonzalez,A.Cintado,J.V.Gavilondo.(2000)Very
high expression of ananti-caecinoembryonic antigen single chain Fv antibody fragment
in the yeast Pichia pastoris.- J.Biotechnol.76:157-163)について1.29ｇ/Lの産生が報告されている。従って、本発明の酵母による発現系これらの系における各種生産条件を改良することによって発現タンパク質の生産量を更に増大することができる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】破傷風毒素分子のサブユニット構造（Ａ−Ｂ・Ｃ）とヒト型モノクローナル抗体Mab-Ｇ4，Ｇ1、Ｇ3、Ｇ6及びＧ2に対する破傷風毒素分子上でのエピトープの局在を示す。
【図２】ボツリヌス毒素の立体構造及びサブユニット構造（Ｌ，ＨＮ，Ｈｃ）、並びに破傷風毒素のサブユニット構造（Ａ，Ｂ，Ｃ）との相同性を示す。
【図３】ヒト免疫グロブリン産生細胞から、抗体軽鎖可変部領域及び抗体重鎖可変部領域をコードするｃＤＮＡ断片をクローニングする方法を示す。
【図４】抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体ＭＡｂ‐Ｇ６の抗体重鎖可変部領域のアミノ酸及び塩基配列を示す。
【図５】抗破傷風ヒト型モノクローナル抗体ＭＡｂ‐Ｇ６の抗体軽鎖可変部領域のアミノ酸及び塩基配列を示す。
【図６】pCANTAB 5Eファージミドベクターを示す。
【図７】増幅ｃＤＮＡ断片のサブクローニング及びファージミドベクターpCANTAB5E-G6の構築の過程を示す。
【図８】酵母系発現ベクターpPIC9-G6の構築の過程を示す。
【図９】抗破傷風ScFv-G6DNAが酵母に導入されていることを示す、PCR産物の電気泳動の写真である。
【図１０】培養上清中のScFv-G6の抗原結合値を示すSDS-PAGEの結果、及びウェスタンブロッティング法にて解析した電気泳動の写真を示す。
【図１１】得られたScFv-G6標品と破傷風毒素との反応物を注射した後の中毒症状の進行の結果を示すグラフである。縦軸は、無症状を「０」、死亡を「６」とした重症度点数（スコア）を示し、横軸は注射後の経過時間と日数を示す。
【図１２】ScFv-G6の用量を変量した場合の中毒症状の進行の結果を示すグラフである。縦軸は、無症状を「０」、死亡を「６」とした重症度点数（スコア）を示し、横軸は注射後の経過時間と日数を示す。