(57)【要約】      （修正有）【課題】  レジオネラ属菌を効率的に検出できるレジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマーを提供する。【解決手段】特定の塩基配列を上流、下流プライマーとして用い、レジオネラ属菌一般を効率的に増幅、検出できる。即ち、標的塩基配列を含む核酸に、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'の塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-cgctcgtttccagctcccc-3'の塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップによってレジオネラ属菌の標的塩基配列を増幅することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）および5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）から選択された塩基配列を具備するレジオネラ属菌の標的核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
標的塩基配列を含む核酸に、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）の塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）の塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップと、
を具備するレジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法。
【請求項３】
前記増幅法がＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかである請求項２に記載のレジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法。
【請求項４】
5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号３）、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）、から選択された塩基配列を具備するレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
標的塩基配列を含む核酸に、5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）いずれかから選択された塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）いずれかから選択された塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップと、
を具備するレジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法。
【請求項６】
前記増幅法がＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかである請求項５に記載のレジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌（Legionella  species）は、自然界の土壌や淡水中に存在し、レジオネラ肺炎等のレジオネラ症（legionellosis）を引き起こすことで知られている。
レジオネラ・ニューモフィラを速やかに検出し、同定するために核酸増幅を用いる技術が公開されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００２−３２０４８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に開示された技術ではレジオネラ属菌一般を検出することは困難である。また、レジオネラ属菌の検出の定量性に優れるという訳でもない。
上記に鑑み、本発明はレジオネラ属菌を効率的に検出できるレジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
Ａ．上記目的を達成するために、本発明に係るレジオネラ属菌の標的核酸増幅用プライマーは、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）および5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）から選択された塩基配列を具備する。
配列番号１，２の塩基配列を上流、下流プライマーとして用い、レジオネラ属菌一般を効率的に増幅、検出できる。
【０００５】
即ち、標的塩基配列を含む核酸に、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）の塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）の塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップによってレジオネラ属菌の標的塩基配列を増幅することができる。
【０００６】
この増幅には、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかを用いることができる。
【０００７】
Ｂ．本発明に係る、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸増幅用プライマーは、5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）、から選択された塩基配列を具備する。
配列番号３，４の塩基配列の組、配列番号５，６の塩基配列の組、配列番号７，８の塩基配列の組、を上流、下流プライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラを効率的に増幅、検出できる。
【０００８】
即ち、標的塩基配列を含む核酸に、5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）いずれかから選択された塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）いずれかから選択された塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップによって、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列を増幅することができる。
【０００９】
この増幅には、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかを用いることができる。
【００１０】
増幅用のプライマーは、標的配列にハイブリダイズした後、プライマーの伸長によって標的配列を増幅するためのプライマーである。増幅用のプライマーは、一般に１０〜７５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００１１】
ＳＤＡ増幅用のプライマーの全長は約２５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ増幅用のプライマーの３’末端（標的結合性配列）は、標的配列の３’末端にてハイブリダイズする。標的結合性配列は約１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、増幅用のプライマーにハイブリダーゼーション特性を与える。ＳＤＡ増幅用のプライマーは、５’から標的結合性配列までの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさらに含む。認識部位は、認識部位を半修飾するときにＤＮＡ二重らせんにニックを入れる（鎖１本を切断する）。制限エンドヌクレアーゼのためである。５’から制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド（「尾部」）は、増幅用のプライマーの残りを切断し、ＳＤＡ中に置換するときにポリメラーゼリプライミング（ｒｅｐｒｉｍｉｎｇ）部位として機能する。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能によって、ＳＤＡ反応が持続し、１つの標的分子から多数のアンプリコンを合成することができる。この尾部は、一般に約１０〜２５ヌクレオチドの長さである。その長さおよび配列は概して重要ではなく、定型的に選択して修飾することができる。
【００１２】
標的結合性配列は、標的の末端において固有の配列を必要としない増幅方法の場合、増幅用のプライマーは概して、標的結合性配列のみで本質的に構成される。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した標的配列の増幅には、増幅用のプライマーの標的結合性配列からなる増幅用のプライマーを使用する。ＳＤＡのニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位および尾部以外の標的に付加した固有配列を必要とする増幅方法（たとえば、自続的配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）または転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター）の場合、定型的なオリゴヌクレオチド調製法を使用して、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変えることなく、必要な固有配列を標的結合性配列に連結することが可能である。
【００１３】
標的または標的配列という用語は、増幅されるべき核酸配列を指す。これらの中には、増幅されるべき本来の核酸配列、増幅されるべき本来の核酸配列の相補的な第２鎖、および増幅反応により生成される本来の配列のコピーのいずれかの鎖が含まれる。増幅可能な標的は、増幅用のプライマーがハイブリダイズする対象である配列のコピーを含むため、これらのコピーは増幅可能な標的の役割を果たす。
【００１４】
増幅反応中に生成された標的配列のコピーは、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼ばれる。
【００１５】
伸長生成物という用語は、プライマーのハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として使用したポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成されるコピーを指す。
【００１６】
種特異的という用語は、実質的な検出、増幅または同じ属の他種または異なる属の種へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションをしない、検出、増幅または生物の種または一群の関連種へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを指す。
【００１７】
アッセイプローブという用語は、核酸の検出または同定を促進するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。以下に記載の検出器プローブ、検出器プライマー、捕捉プローブ、シグナルプライマーおよびレポータープローブは、アッセイプローブの例である。
【００１８】
シグナルプライマーは、標的中の相補配列にハイブリダイズする３’標的結合性配列を含み、標的に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含む。このアダプター配列は、その相補配列が、以下に記載のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズするように選択される、間接的に検出できるマーカーである。シグナルプライマーは、増幅用のプライマーのハイブリダイゼーション部位の少なくともある程度下流で、標的配列にハイブリダイズする。このシグナルプライマーは、増幅用のプライマーの伸長に似た様式で、ポリメラーゼにより伸長される。増幅用のプライマーの伸長部は、標的増幅依存にシグナルプライマーの伸長生成物に取って替わる。下流標的結合性配列およびフランキングＳＤＡ増幅用のプライマーへのハイブリダイゼーション特異的３’結合性配列を含む、５’アダプター配列、一本鎖生成物を生成する。このフランキング増幅用のプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびに後続のニッキングおよび伸長により、アダプター配列の補体を含む増幅生成物が生じ、これを標的増幅の指標として検出することが可能である。
【００１９】
レポータープローブは、検出器オリゴヌクレオチドとして機能し、少なくとも１ドナー／消光剤色素対（すなわち、ドナーフルオロフォア用のドナー蛍光色素および消光剤）であることが好ましい標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズしないレポートプローブ中の配列または構造（レポーター部分）に連結される。レポータープローブ３’からレポーター部分までの配列は、シグナルプライマーアダプター配列の補体にハイブリダイズするように選択される。概して、レポータープローブの３’末端は、標的配列にかなりの相補性を有する配列を含まない。上述のアダプター配列の補体を含む増幅生成物が存在する場合、その増幅生成物はレポータープローブの３’末端にハイブリダイズすることができる。プライミングおよびアダプター補体配列の３’末端からの伸長により、レポーター部分補体を形成することが可能である。この形成によってレポーター部分は二本鎖になり、その結果、レポータープローブの標識を検出することができ、標的の存在または増幅を示すことができる。
【００２０】
アンプリコンという用語は、一対の増幅用のプライマーのいずれか一方または両者の伸長により生じる増幅反応の生成物を指す。使用する両プライマーが標的配列にハイブリダイズする場合、アンプリコンは、指数関数的に増幅した核酸を含んでもよい。あるいは、使用したプライマーの１つが標的配列にハイブリダイズしない場合、アンプリコンは、直線的増幅により生じてもよい。従って、この用語は、指数関数的に増幅された核酸の存在を意味するものではない。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によればレジオネラ属菌を効率的に検出できるレジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、レジオネラ属菌にある標的配列の増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。さらに詳細には、この標的配列は16S-23S rRNA intergenic region with tRNA-Ala-like sequence(GeneBank:AF000655)に含まれる（あるいは16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer、16S-23S ribosomal RNA gene spacer region、等とも呼ばれる）。また、本発明は、レジオネラ・ニューモフィラを特異的に検出するための標的配列の増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーも提供する。詳細には、この標的配列は熱ショック蛋白の１種をコードしている、grpE遺伝子（GeneBank:D89498）に含まれる。増幅用のプライマーは、高温にて高能率高特異性の増幅（たとえばｔＳＤＡやＰＣＲ）、およびＳＤＡ、３ＳＲ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ等の低温増幅反応のいずれでも有用である。標的特異的シグナルプライマーにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅生成物を間接的に検出するのに使用される。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後に、培養された微生物の同一性を確認するための手段として使用することが可能である。あるいは、既知の増幅方法を使用して、レジオネラ属菌の核酸を検出して同定するために、ヒトの臨床サンプル（呼吸器由来のサンプル）、または環境サンプル（たとえば、施設における冷却塔の水、温泉水、浴槽水等）に対して使用することができる。いずれの場合にも、本発明のオリゴヌクレオチドおよび分析方法を使用すると、レジオネラ属菌と他の微生物とを速やかに識別できる。
【００２４】
（塩基配列）
以下に、配列番号１〜８のオリゴヌクレオチドを示す。
配列番号１（LP/F2-1）：5'-ccttacatcctcctcggctc-3'
配列番号２（LP-R4） ：5'-cgctcgtttccagctcccc-3'
配列番号３（grpE1-f）：5'-cccttgctgaattggagaac-3'
配列番号４（grpE1-r）：5'-gttgcattgacattgcctca-3'
配列番号５（grpE2-f）：5'-tgctttaggacatcccagctat-3'
配列番号６（grpE2-r）：5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'
配列番号７（grpE3-f）：5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'
配列番号８（grpE3-r）：5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'
【００２５】
配列番号１は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用の上流（Forward）プライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。また、配列番号２は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用の下流（Reverse）プライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラに限らず、レジオネラ属菌一般の検出に利用できる。
【００２６】
一方、配列番号３〜８は、レジオネラ属菌一般ではなく、特にレジオネラ・ニューモフィラの検出に利用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３、４はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号５、６はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号７、８はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
【００２７】
配列番号３〜８のオリゴヌクレオチドは、レジオネラ・ニューモフィラに特異的なプライマーとして利用することができる。即ち、レジオネラ・ニューモフィラ以外のレジオネラ属菌はほとんど検出しないようにすることができる。また、検出感度が極めて高く、レジオネラ・ニューモフィラ３個相当から検出することができる。また、定量ＰＣＲ等を用いた定量検出にも容易に適用できる。
以上のように、配列番号３〜８のオリゴヌクレオチドの組は、１）、レジオネラ・ニューモフィラに特異的である配列を持ち、２）プライマーとしての検出感度が良好で、３）定量ＰＣＲへの適用が容易である。
【００２８】
配列番号３〜８は、熱ショック蛋白（Heat shock protein）の一種をコードしているgrpE遺伝子（GeneBank:D89498）を元に設計したものである。このgrpE遺伝子を元に設計したプライマーは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２９】
ハイブリダイズするために核酸は完全な相補性を必要としないため、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドの配列は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用のプライマーとしての有用性を失うことなく、ある程度修飾することが可能である。例えば、ストリンジェンシーを増強または低減するようにハイブリダイゼーション条件（すなわち、ハイブリダイゼーションｐＨ、温度または緩衝液の塩含量）を調節することにより、相補的な核酸配列および部分的に相補的な核酸配列を得ることができる。開示した配列のこのように僅かな修飾およびレジオネラ属菌への特異性を維持するために必要なハイブリダイゼーション条件の調節は、当分野で普通の技術の範囲内である。
【００３０】
本明細書に記載のプライマーを使用して生成した増幅生成物は、たとえば、臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミドゲル上またはアガロースゲル上の、特徴的なサイズによって検出することができる。あるいは、アッセイプローブ（検出可能な標識で標識したオリゴヌクレオチド）を使用して、増幅された標的配列を検出することができる。
【００３１】
アッセイプローブの検出可能な標識は、標的核酸の存在の指標として、直接的または間接的いずれでも検出できる。標識の直接検出の場合、アッセイプローブを放射性同位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出してもよく、蛍光部分で標識して蛍光で検出してもよい。あるいは、検出できるようにするにはさらなる試薬を必要とする標識で標識することにより、アッセイプローブを間接的に検出することが可能である。間接的に検出できる標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応生成物を生成する酵素、および標識された結合パートナーに結合させることにより検出できる（たとえば、抗体または抗原／ハプテン）リガンド（たとえば、ハプテン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、その検出を容易にするために、リガンド標識オリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を固相に固定するのにも有用である。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合させることにより検出できる）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素（酵素基質を加えて有色の反応性生物を生じさせることによって検出できる）などがある。
【００３２】
核酸を特異的に検出して同定するための増幅用のプライマーを、キットの形でパッケージすることが可能である。一般に、このようなキットは少なくとも一対の増幅用のプライマーを含む。標的特異的増幅用のプライマーと共に、核酸増幅反応を実施するための試薬、たとえば、緩衝液、さらなるプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素等々も含まれてもよい。他の任意の成分、たとえば、アッセイプローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための試薬または手段もキットに含まれてもよい。
【００３３】
使用できる具体的な検出方法の例として、米国特許第５，４７０，７２３号に記載の、ビオチニル化捕捉プローブおよび酵素複合検出器プローブを使用して、増幅生成物を検出する化学発光法などがある。これらの２つのアッセイプローブを、標的配列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅用のプライマーの結合部位の間）にハイブリダイズさせた後、捕捉プローブを用いて、この複合体をストレプトアビジン被覆微量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを生じさせ、照度計で読み取る。
増幅生成物を検出するための別の代替法として、欧州特許ＥＰ ０ ６７８ ５８２号に記載のシグナルプライマーを、ＳＤＡ反応に含めてもよい。増幅生成物を検出するためのさらに別の代替法では、シグナルプライマーは、標的配列にハイブリダイズしない配列、すなわちアダプター配列を含んでもよい。
【００３４】
標識が結合したレポータープローブは、アダプター配列の補体にハイブリダイズすることができる。シグナルプライマーの両実施形態において、ＳＤＡ中に、二次増幅生成物を標的増幅依存的に生じさせ、これを標的増幅の指標として検出することが可能である。
【００３５】
本発明の標的結合性配列を、ＳＤＡ以外の増幅方法に合わせて改変する場合、増幅用のプライマーを調製するためのルーチンの方法（たとえば化学合成）および選択された増幅反応のプライマーに必要な周知の構造上の条件を使用する。従って、本発明の標的結合性配列は、産生、スクリーニングおよび最適化のためのルーチンの方法のみを使用した様々な増幅反応における、レジオネラ属菌特異的標的増幅ならびに検出に合わせて容易に改変される。
【００３６】
ＳＤＡは、プライマーの切除、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキング、一本鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来の標的配列）へのプライマーのアニーリングおよびその後のプライマーの伸長が、反応混合物中で同時に起こる等熱方法である。これは、反応のステップが、反応の温度循環特性の結果として非連続相または周期で行われるＰＣＲと対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌクレアーゼが、そのヘミホスホロチオエート型二本鎖認識／切断部位の未修飾の鎖を切断できることと、２）ある特定のポリメラーゼがニックにて複製を開始し且つ下流の非鋳型鎖を置換できることとに基づく。プライマーをアニーリングするために、高温（約９５℃）にて最初にインキュベートして二本鎖標的配列を変性させた後、続いて、新たに合成された鎖の増幅および置換を定温で行う。標的配列の新しい各コピーの作製は、１）増幅用のプライマーを本来の標的配列または予め重合して置換した一本鎖伸長生成物に結合するステップと、２）α−チオ デオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによりプライマーを伸長するステップと、３）半修飾された二本鎖制限部位を切断するステップと、４）制限酵素をニック部位から分離するステップと、５）５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端から伸長し、下流の新たに合成された鎖を置換するステップとの、５ステップからなる。ニックからの伸長は別の切断可能な制限部位を再生させるため、ニッキング、重合および置換は、定温で同時に且つ連続的に起こる。一対の増幅用のプライマーを使用し、それぞれが二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリダイズする場合、増幅は指数関数的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が、その後の循環の増幅において、反対側のプライマー用の鋳型の役割を果たすためである。１つの増幅用のプライマーを使用するとき、ただ１本の鎖がプライマー伸長用の鋳型の役割を果たすため、増幅は直線的である。
【００３７】
別の増幅生成物による、１つのＳＤＡ反応の交差汚染を防止するために、増幅反応を阻害せずに、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み込むことができる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、ウラシル修飾核酸を特異的に認識して不活化することが可能である。従って、事前の反応でｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み込まれるのであれば、二本鎖標的を増幅する前に、その後のＳＤＡ反応をＵＤＧで処理することができ、先に増幅された反応からのＤＮＡを含むｄＵを増幅不可能にする。その後の反応で増幅されるべき標的ｄＮＡはｄＵを含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、標的の増幅前にＵＧＩで処理することにより、ＵＤＧを阻害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱不活化してもよい。ｔＳＤＡの場合、反応の高温そのもの（≧５０℃）を同時に使用して、ＵＤＧを不活化し、標的を増幅することができる。
【００３８】
ＳＤＡは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸の一本鎖ニックにて重合を開始し、ニックの下流の鎖を置換させる一方で、未切断鎖を鋳型として使用して新たな相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドを遊離の３’−ＯＨに付加することによって伸長しなければならない。ＳＤＡ反応を最適化するためには、ポリメラーゼが、増幅できる標的配列の長さを最大化するのに極めて前進的であることも望ましい。極めて前進的なポリメラーゼは、伸長生成物を分離して終結する前に、かなりの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性は、さらなるコピーの合成に利用できる標的を作り、且つ指数関数的増幅反応で、第２の増幅用のプライマーがハイブリダイズすることが可能な対象である一本鎖伸長生成物を生成するため、増幅反応に不可欠である。制限酵素のニッキング活性は、反応を永続させ、標的増幅のその後の循環が開始するのを可能にするニッキングであるため、これも非常に重要である。
【００３９】
ｔＳＤＡは、適切な熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性制限エンドヌクレアーゼを取り替えて、本質的に、従来のＳＤＡと同様に実施される。反応温度は、取り替えられた酵素に適した高温に調節し、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択された熱安定性エンドヌクレアーゼに適切な制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位と取り替える。また、酵素が変性温度で十分に安定であれば、専門家は、最初の変性ステップの前に酵素を反応混合物に含める。ｔＳＤＡで使用するのに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＢｓｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。好ましい好熱性ポリメラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）である。
【００４０】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡは、ｔＳＤＡの改良型である。これは、検出器オリゴヌクレオチドを使用して、標的依存的様式で、低い蛍光消光をもたらす。この検出器オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下で蛍光消光が起こるように連結されたドナー／アクセプター色素対を含む。標的の存在下で、検出器オリゴヌクレオチドにおける分子内塩基対形成二次構造のアンフォールディングおよび直線化は、色素間の距離を増大し、蛍光消光を減少させる。塩基対形成二次構造のアンフォールディングは、一般に、二次構造が少なくとも部分的に乱されるように、二次構造の配列と相補鎖との間の分子間塩基対形成を含む。十分な長さの相補鎖の存在下で、二次構造を十分に直線化することが可能である。
【００４１】
好ましい実施形態では、二次構造と相補鎖との間の分子間塩基対形成によって、ＲＥＲＳが二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼで切断できるように、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、２つの色素の間に存在する。制限エンドヌクレアーゼで切断することにより、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸断片上に分離し、さらに、消光低下の一助となる。
いずれの実施形態でも、付随する蛍光パラメーターの変化（たとえば、ドナー蛍光強度の増強、アクセプター蛍光強度の低下、またはウンフォールディング前後の蛍光の比率）を、標的配列が存在する指標としてモニタリングする。ドナー蛍光強度の変化は、一般にアクセプター蛍光強度の変化より大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタリングすることが好ましい。蛍光寿命等の他の蛍光パラメーターをモニタリングしてもよい。
オリゴヌクレオチドの切断は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖のホスホジエステル結合を破壊すること、または一本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合を破壊することを指す。これは、ＤＮＡ二重らせんにおける二本の鎖のうちの１本のみのホスホジエステル結合を破壊することを指すニッキングと対照的である。
【００４２】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出器オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする一本鎖５'セクションまたは３'セクション（標的結合性配列）、ならびに標的結合性配列に隣接する分子内塩基対形成二次構造の両者を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましい実施形態では、検出器オリゴヌクレオチドは、表テロ配列にハイブリダイズしない一本鎖５'セクションまたは３'セクションを含むレポータープローブである。むしろ、一本鎖５'セクションまたは３'セクションは、シグナルプライマーアダプター配列の補体（アダプター−補体結合性配列）にハイブリダイズする。レポータープローブのさらなる特徴は、このハイブリダイズセクションが分子内塩基対形成二次構造に隣接することである。
【００４３】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の本発明の検出器オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長またはハイブリダイゼーションのために選択された反応条件で分子内塩基対形成二次高構造を形成する配列を含む。１つの実施形態では、標的結合性配列の少なくとも一部が一本鎖３'尾部または５'尾部を形成するように、この二次構造を検出器オリゴヌクレオチドの標的結合性配列の近くに配置してもよい。
好ましい実施形態では、アダプター−補体結合性配列の少なくとも一部が一本鎖３'尾部または５'尾部を形成するように、この二次構造は、レポータープローブ検出器オリゴヌクレオチドのアダプター−補体結合性配列の近くに配置される。本明細書で使用する用語「標的結合性配列の近く」または「アダプター−補体結合性配列の近く」は、標的／アダプター−補体結合性配列の全部または一部が、標的／アダプター−補体へのハイブリダイゼーションに使用できる５'尾部または３'尾部において一本鎖のままであることを意味する。すなわち、二次構造は標的／アダプター−補体結合性配列全体を含まない。
【００４４】
標的／アダプター−補体結合性配列は、その一部が二次構造における分子内塩基対形成に関与している可能性があり、二次構造における分子内塩基対形成に関与する第１の配列の一部または全部を含んでもよいが、その相補配列内に達しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、且つ検出器オリゴヌクレオチドの標的／アダプター−補体結合性配列が一本鎖３'尾部として存在するのであれば、標的／アダプター−補体結合性配列は、ステムの第１アームの全部または一部、および任意に、ループの全部または一部を通って伸びてもよい。しかし、標的／アダプター−補体結合性配列は、ステム分子内塩基対形成に関与する配列の第２アーム内に達しないことが好ましい。すなわち、標的／アダプター−補体にハイブリダイズすることができる二次構造において分子内塩基対形成に関与する両配列を有することを回避することが望ましい。
【００４５】
検出器オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対形成部分における不一致によって、標的の存在下で蛍光の変化の大きさが減少する可能性があるが、分析感度が問題でなければ許容できる。一本鎖尾部の標的／アダプター−補体結合性配列における不一致も許容できるが、分析感度および／または特異性が同様に低下する可能性がある。しかし、二次構造および標的／アダプター−補体結合性配列の両者における完全な塩基対形成により反応が損なわれないことが本発明の特質である。ハイブリダイゼーションに関与する配列における完全一致は、反応動力学に対してマイナスの影響を与えずに、分析特異性を向上させる。
【００４６】
本発明の検出器オリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅反応に加えられると、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって二本鎖型に転換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構造をほどくかまたは直線化し、これを相補鎖の合成によって二本鎖型に転換する。ＲＥＲＳも、存在する場合には、二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）になる。二次構造が、ポリメラーゼの鎖置換活性によってほどかれるかまたは直線化されるため、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離が増加し、その結果、ドナー蛍光の消光が減少する。随伴する、ドナー色素またはアクセプター色素のいずれかの蛍光の変化は、標的配列の増幅の指標としてモニタリングまたは検出することができる。
【００４７】
一般に、ＲＥＲＳが切断されると、それぞれ、２個の色素のうちの一方を有する２個の別個の二本鎖二次増幅生成物断片が生成することにより、蛍光の変化の大きさがさらに増大する。これらの断片は、反応溶液中で自由に拡散し、ドナー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。
ドナー蛍光強度の上昇またはアクセプター蛍光強度の低下は、標的増幅が起きているまたは起きた指標として、検出および／またはモニタリングしてもよいが、ドナー／アクセプター色素対の接近により影響を受ける他の蛍光パラメーターをモニタリングしてもよい。
ドナーまたはアクセプターの蛍光強度の変化は、ドナーおよび／またはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出することもできる。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次構造の直線化またはアンフォールディング後のドナーフルオロフォア蛍光と直線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるフルオロフォア蛍光との比率の上昇、またはｂ）二次構造の直線化またはアンフォールディング後のアクセプター色素蛍光と直線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低下として検出することが可能である。
【００４８】
ＰＣＲでＰＣＲ増幅プライマーおよび５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が欠如した標準置換ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、ＰｒｏｍｅｇａのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＧｒａｄｅＴａｑまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ- Ｖｅｎｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）を使用することにより、ＰＣＲ向けに方法を改変してもよい。シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的に少なくとも部分的にハイブリダイズし、検出器オリゴヌクレオチドレポータープローブへのハイブリダーゼーションおよび後続の伸長後、置換され、二本鎖にされる。
ＰＣＲでは、ＲＥＲＳの切断よりむしろニッキングを誘導しかねない、修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸が一般に存在しないため、ＲＥＲＳを、検出器オリゴヌクレオチド向けに任意に選択することが可能である。熱循環はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限エンドヌクレアーゼは、プライマーアニーリングの最終周期および増幅のエンドポイント検出のための伸長の後で、低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通じて活性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼも、リアルタイムアッセイを提供するための増幅中ずっと存在し得る。ＳＤＡシステムの場合と同様、色素対の分離により蛍光消光が減少し、強度等の蛍光パラメータの変化が標的増幅の指標の役割を果たす。
【００４９】
検出器オリゴヌクレオチドのアンフォールディングまたは直鎖状にすることによる蛍光の変化を、反応の選択されたエンドポイントで検出することができる。しかし、直鎖状にされた二次構造はハイブリダイゼーションまたはプライマー伸長と同時に生じるため、反応が起こるにつれて、すなわち、「リアルタイム」で、蛍光の変化もモニタリングすることが可能である。この同種リアルタイムアッセイ形式を使用して、存在する標的の初期量に関する半定量的情報または定量的情報を提供することが可能である。たとえば、（標的増幅の一部としての、または非増幅検出法における）アンフォールディング反応または直鎖状反応中に蛍光強度が変化する速度は、初期の標的レベルの指標である。結果として、標的配列の最初のコピーがもっと多く存在するとき、ドナー蛍光は選択された閾値にもっと急速に到達する（すなわち、短時間で確実になる）。アクセプター蛍光強度の低下は、同様に、より短時間で確実になり、選択された最小値に達するまでに要する時間として検出される。
【００５０】
本発明の方法に従って選択された標的配列の存在に関するアッセイは、溶液または固相で実施することが可能である。検出器オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するリアルタイムまたはエンドポイント同種アッセイは、一般に溶液で実施される。本発明の検出器オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーションアッセイは溶液でも実施することが可能であるが（たとえば、同種リアルタイムアッセイ）、標的のリアルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相アッセイに特に適している。固相アッセイでは、当技術分野で周知の方法を使用した内部標識または末端標識によって、検出器オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビーズ、膜または反応容器）上に固定することが可能である。たとえば、ビオチン標識検出器オリゴヌクレオチドをアビジン修飾固相上に固定することが可能であり、そこで、適切なハイブリダイゼーション条件で標的に曝露すると、蛍光の変化を生じる。この方式で標的を捕捉することにより、サンプルからの標的の分離が容易になり、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨害する恐れのあるサンプル中の物質を除去することができる。使用することができる固相系の一例は、当技術分野で周知のもの等の、アレー形式である。
【実施例】
【００５１】
以下に本発明の具体的な実施例を説明する。
Ａ．配列１，２による検出結果
（１）検出感度
図１は、配列１，２をプライマーとして用いた場合でのレジオネラ・ニューモフィラの検出結果を表す図である。
【００５２】
この検出結果は以下のようにして得られた。
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に含まれるレジオネラ・ニューモフィラの個数が判っている菌液を１０、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍に希釈した（原液を１ｍＬ抽出し、希釈用のリン酸緩衝液を９ｍＬ加えることを各濃度で繰り返す）。
希釈液それぞれから２．５μＬを抽出する。この抽出液には希釈の段階に応じて、レジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが約１４００，１４０，１４，１．４、０．１４個含まれる。
配列１，２をプライマーとして用いたＰＣＲ法によって標的配列を増幅する。このとき、ＰＣＲに用いた溶液の全量は２５μＬであり、ＰＣＲのサイクルは４０サイクルとした。
さらに、アガスローゲル電気泳動法を用いて、増幅した標的配列を検出した。
【００５３】
図１では、分子量マーカー（Ｍ）と各希釈液での電気泳動の結果を対比して表している。なお、「２７７ｂｐ」は、配列１，２をプライマーペアとして用いた場合の増幅産物のサイズである。
図１から判るように、２．５μＬ中にＮ＝１４個からレジオネラ・ニューモフィラが検出可能であることが判る。
【００５４】
（２）実サンプルでの検出
図２は、実サンプルでのレジオネラ・ニューモフィラの検出結果を表す図である。
この検出結果は以下のようにして得られた。
［下線部に濾過器の詳細をご記入願います］
循環式浴槽に設置された濾過器内部の水を原液とし遠心濃縮してリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えることで、１００倍濃縮液（サンプル水）を得る。
この濃縮液２．５μＬに対して配列１，２をプライマーとして用いたＰＣＲ法によって標的配列を増幅する。このとき、ＰＣＲに用いた溶液の全量は２５μＬであり、ＰＣＲのサイクルは４０サイクルとした。
【００５５】
ここで、他の方法でリン酸緩衝液（サンプル水）中の細菌を検出したところ、以下のような結果であった。
レジオネラ菌数：  ９．９×１０４／100 ｍＬ
一般性細菌数：                    ３．８×１０５／ｍＬ
従属栄養細菌数：                  １．２×１０６／ｍＬ
【００５６】
この濾過器内部水には、一般性細菌の他に、一般性細菌の増幅しにくい低栄養、低温の水環境でも増幅、生存可能な従属栄養細菌が棲息している。
【００５７】
図２には、分子量マーカー（Ｍ）と、レジオネラ属菌のみが１０５／ｍＬ含まれる溶液（ＳＴ：基準水）、サンプル水（Ｓａｍｐ）、緑膿菌シュードモナス・エルジノーサ (Pseudomonus aeruginosa)が含まれる溶液（Ｐ．ａ．：比較水）での電気泳動の結果を対比して表している。これらの溶液はいずれも、ＰＣＲ法によって標的配列を増幅し、その後に電気泳動法が適用されている。
シュードモナス・エルジノーサは、土、 水、汚水など、自然界に広く分布しており、レジオネラの生存する場所にもしばしば存在している。
【００５８】
図２に示されるように、基準水ＳＴ、サンプル水Ｓａｍｐから検出反応が有り、比較水Ｐ．ａ．からは検出されない。
図２の結果は、配列１，２をプライマーとして用いることで、レジオネラ・ニューモフィラを増幅し、他の一般性細菌、従属栄養細菌、ささには遺伝子配列の近似するシュードモナス・エルジノーサを増幅しないことを示す。即ち、配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラを他の細菌と区別して特異的に識別できることを示す。
【００５９】
（３）レジオネラ属菌の検出
図３は、レジオネラ属菌一般での検出結果を表す図である。
ここでは、レジオネラ属菌を培養した培地のコロニー（菌の集落）をサンプルとして用い、配列１，２をプライマーとするＰＣＲ法により増幅し、電気泳動で測定を行った。
【００６０】
図３には、分子量マーカー（Ｍ）と、それぞれレジオネラ属菌が含まれる溶液での電気泳動の結果を対比して表している。
図３から配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラのみではなく、多くの血清群があるレジオネラ属菌一般を検出できることを表す。
なお、ここでは精製された純粋な菌のＤＮＡと比べて実サンプルに近い培地のコロニー（菌の集落）をそのまま用いてＰＣＲを行っている。
【００６１】
Ｂ．配列５，６による検出結果
図４は、配列５，６をプライマーとして用いた、レジオネラ・ニューモフィラを定量的に検出した結果を表すグラフである。
ここでは、２．５μＬ中でレジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが３，３０，３００，３０００含まれるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をサンプルに用い、ロッシュ社製ライトサイクラーによる定量ＰＣＲ法によって定量的に検出した。このグラフの横軸はＰＣＲのサイクル数であり、縦軸は蛍光の強度である。個数Ｎが０．３ではレジオネラ属菌の増幅がなされないが、個数Ｎが３以上ではレジオネラ・ニューモフィラの増幅がなされていることが判る。即ち、サイクル数に応じて蛍光の強度（標的配列の濃度に対応）が増加している。
以上から判るように、２．５μＬ当たりの個数Ｎが３個からレジオネラ・ニューもフィラを定量的に検出できることが判る。
【００６２】
図５は、図４の配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果から作製された標準曲線である。縦軸がサイクル数、横軸が対数値を示す。この標準曲線を用いる事で、未知の濃度のサンプルについて定量PCRを行う事も技術的に可能である。
【００６３】
図６は、配列５，６をプライマーとして用いた、レジオネラ・ニューモフィラの検出限界を示した結果を表す電気泳動写真である。
ここでは、２．５μＬ中でレジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが３，３０，３００，３０００含まれるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をサンプルに用い、ＰＣＲ法によって検出した。この写真はＰＣＲ法で増幅した産物をアガロースゲル電気泳動法で視認化させたものである。ここからわかるように、個数Ｎが３以上でレジオネラ・ニューモフィラの検出がなされていることが判る。
なお、本発明の実施形態は上記の実施形態に限られず拡張、変更可能であり、拡張、変更した実施形態も本発明の技術的範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】配列１，２をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラを検出した結果を表す図である。
【図２】配列１，２をプライマーとして用い、実サンプルでレジオネラ・ニューモフィラを検出した結果を表す図である。
【図３】配列１，２をプライマーとして用い、レジオネラ属菌一般を検出した結果を表す図である。
【図４】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果を表すグラフである。
【図５】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果から作製された標準曲線である
【図６】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをPCR法で増幅し、アガロース電気泳動によってレジオネラ・ニューモフィラの検出限界を示した写真である。
【図１】
2005211027.tif 000002
【図２】
2005211027.tif 000003
【図３】
2005211027.tif 000004
【図４】
2005211027.tif 000005
【図５】
2005211027.tif 000006
【図６】
2005211027.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月6日(2004.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌（Legionella  species）は、自然界の土壌や淡水中に存在し、レジオネラ肺炎等のレジオネラ症（legionellosis）を引き起こすことで知られている。
レジオネラ・ニューモフィラを速やかに検出し、同定するために核酸増幅を用いる技術が公開されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００２−３２０４８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に開示された技術ではレジオネラ属菌一般を検出することは困難である。また、レジオネラ属菌の検出の定量性に優れるという訳でもない。
上記に鑑み、本発明はレジオネラ属菌を効率的に検出できるレジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
Ａ．上記目的を達成するために、本発明に係るレジオネラ属菌の標的核酸増幅用プライマーは、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）および5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）から選択された塩基配列を具備する。
配列番号１，２の塩基配列を上流、下流プライマーとして用い、レジオネラ属菌一般を効率的に増幅、検出できる。
【０００５】
即ち、標的塩基配列を含む核酸に、5'-ccttacatcctcctcggctc-3'（配列番号１）の塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-cgctcgtttccagctcccc-3'（配列番号２）の塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップによってレジオネラ属菌の標的塩基配列を増幅することができる。
【０００６】
この増幅には、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかを用いることができる。
【０００７】
Ｂ．本発明に係る、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸増幅用プライマーは、5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）、から選択された塩基配列を具備する。
配列番号３，４の塩基配列の組、配列番号５，６の塩基配列の組、配列番号７，８の塩基配列の組、を上流、下流プライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラを効率的に増幅、検出できる。
【０００８】
即ち、標的塩基配列を含む核酸に、5'-cccttgctgaattggagaac-3'（配列番号３）、5'-tgctttaggacatcccagctat-3'（配列番号５）、5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'（配列番号７）いずれかから選択された塩基配列を含む第１のプライマーと、5'-gttgcattgacattgcctca-3'（配列番号４）、5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'（配列番号６）、5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'（配列番号８）いずれかから選択された塩基配列を含む第２のプライマーと、をハイブリダイズさせるステップと、ハイブリダイズした前記第１、第２のプライマーを前記核酸上で伸張させるステップによって、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列を増幅することができる。
【０００９】
この増幅には、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ｔＳＤＡ法、リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ法のいずれかを用いることができる。
【００１０】
増幅用のプライマーは、標的配列にハイブリダイズした後、プライマーの伸長によって標的配列を増幅するためのプライマーである。増幅用のプライマーは、一般に１０〜７５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００１１】
ＳＤＡ増幅用のプライマーの全長は約２５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ増幅用のプライマーの３’末端（標的結合性配列）は、標的配列の３’末端にてハイブリダイズする。標的結合性配列は約１０〜２５ヌクレオチドの長さであり、増幅用のプライマーにハイブリダーゼーション特性を与える。ＳＤＡ増幅用のプライマーは、５’から標的結合性配列までの、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位をさらに含む。認識部位は、認識部位を半修飾するときにＤＮＡ二重らせんにニックを入れる（鎖１本を切断する）。制限エンドヌクレアーゼのためである。５’から制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド（「尾部」）は、増幅用のプライマーの残りを切断し、ＳＤＡ中に置換するときにポリメラーゼリプライミング（ｒｅｐｒｉｍｉｎｇ）部位として機能する。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能によって、ＳＤＡ反応が持続し、１つの標的分子から多数のアンプリコンを合成することができる。この尾部は、一般に約１０〜２５ヌクレオチドの長さである。その長さおよび配列は概して重要ではなく、定型的に選択して修飾することができる。
【００１２】
標的結合性配列は、標的の末端において固有の配列を必要としない増幅方法の場合、増幅用のプライマーは概して、標的結合性配列のみで本質的に構成される。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した標的配列の増幅には、増幅用のプライマーの標的結合性配列からなる増幅用のプライマーを使用する。ＳＤＡのニック可能な制限エンドヌクレアーゼ認識部位および尾部以外の標的に付加した固有配列を必要とする増幅方法（たとえば、自続的配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）または転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）用のＲＮＡポリメラーゼプロモーター）の場合、定型的なオリゴヌクレオチド調製法を使用して、プライマーのハイブリダイゼーション特異性を変えることなく、必要な固有配列を標的結合性配列に連結することが可能である。
【００１３】
標的または標的配列という用語は、増幅されるべき核酸配列を指す。これらの中には、増幅されるべき本来の核酸配列、増幅されるべき本来の核酸配列の相補的な第２鎖、および増幅反応により生成される本来の配列のコピーのいずれかの鎖が含まれる。増幅可能な標的は、増幅用のプライマーがハイブリダイズする対象である配列のコピーを含むため、これらのコピーは増幅可能な標的の役割を果たす。
【００１４】
増幅反応中に生成された標的配列のコピーは、増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと呼ばれる。
【００１５】
伸長生成物という用語は、プライマーのハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として使用したポリメラーゼによるプライマーの伸長によって生成されるコピーを指す。
【００１６】
種特異的という用語は、実質的な検出、増幅または同じ属の他種または異なる属の種へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションをしない、検出、増幅または生物の種または一群の関連種へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを指す。
【００１７】
アッセイプローブという用語は、核酸の検出または同定を促進するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。以下に記載の検出器プローブ、検出器プライマー、捕捉プローブ、シグナルプライマーおよびレポータープローブは、アッセイプローブの例である。
【００１８】
シグナルプライマーは、標的中の相補配列にハイブリダイズする３’標的結合性配列を含み、標的に相補的でない５’尾部配列（アダプター配列）を含む。このアダプター配列は、その相補配列が、以下に記載のレポータープローブの３’末端にハイブリダイズするように選択される、間接的に検出できるマーカーである。シグナルプライマーは、増幅用のプライマーのハイブリダイゼーション部位の少なくともある程度下流で、標的配列にハイブリダイズする。このシグナルプライマーは、増幅用のプライマーの伸長に似た様式で、ポリメラーゼにより伸長される。増幅用のプライマーの伸長部は、標的増幅依存にシグナルプライマーの伸長生成物に取って替わる。下流標的結合性配列およびフランキングＳＤＡ増幅用のプライマーへのハイブリダイゼーション特異的３’結合性配列を含む、５’アダプター配列、一本鎖生成物を生成する。このフランキング増幅用のプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびに後続のニッキングおよび伸長により、アダプター配列の補体を含む増幅生成物が生じ、これを標的増幅の指標として検出することが可能である。
【００１９】
レポータープローブは、検出器オリゴヌクレオチドとして機能し、少なくとも１ドナー／消光剤色素対（すなわち、ドナーフルオロフォア用のドナー蛍光色素および消光剤）であることが好ましい標識を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイズしないレポートプローブ中の配列または構造（レポーター部分）に連結される。レポータープローブ３’からレポーター部分までの配列は、シグナルプライマーアダプター配列の補体にハイブリダイズするように選択される。概して、レポータープローブの３’末端は、標的配列にかなりの相補性を有する配列を含まない。上述のアダプター配列の補体を含む増幅生成物が存在する場合、その増幅生成物はレポータープローブの３’末端にハイブリダイズすることができる。プライミングおよびアダプター補体配列の３’末端からの伸長により、レポーター部分補体を形成することが可能である。この形成によってレポーター部分は二本鎖になり、その結果、レポータープローブの標識を検出することができ、標的の存在または増幅を示すことができる。
【００２０】
アンプリコンという用語は、一対の増幅用のプライマーのいずれか一方または両者の伸長により生じる増幅反応の生成物を指す。使用する両プライマーが標的配列にハイブリダイズする場合、アンプリコンは、指数関数的に増幅した核酸を含んでもよい。あるいは、使用したプライマーの１つが標的配列にハイブリダイズしない場合、アンプリコンは、直線的増幅により生じてもよい。従って、この用語は、指数関数的に増幅された核酸の存在を意味するものではない。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によればレジオネラ属菌を効率的に検出できるレジオネラ属菌の標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ属菌の標的塩基配列の増幅方法、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列増幅用プライマー、レジオネラ・ニューモフィラの標的塩基配列の増幅方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、レジオネラ属菌にある標的配列の増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。さらに詳細には、この標的配列は16S-23S rRNA intergenic region with tRNA-Ala-like sequence(GeneBank:AF000655)に含まれる（あるいは16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer、16S-23S ribosomal RNA gene spacer region、等とも呼ばれる）。また、本発明は、レジオネラ・ニューモフィラを特異的に検出するための標的配列の増幅に使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーも提供する。詳細には、この標的配列は熱ショック蛋白の１種をコードしている、grpE遺伝子（GeneBank:D89498）に含まれる。増幅用のプライマーは、高温にて高能率高特異性の増幅（たとえばｔＳＤＡやＰＣＲ）、およびＳＤＡ、３ＳＲ、ＴＡＳまたはＮＡＳＢＡ等の低温増幅反応のいずれでも有用である。標的特異的シグナルプライマーにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅生成物を間接的に検出するのに使用される。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後に、培養された微生物の同一性を確認するための手段として使用することが可能である。あるいは、既知の増幅方法を使用して、レジオネラ属菌の核酸を検出して同定するために、ヒトの臨床サンプル（呼吸器由来のサンプル）、または環境サンプル（たとえば、施設における冷却塔の水、温泉水、浴槽水等）に対して使用することができる。いずれの場合にも、本発明のオリゴヌクレオチドおよび分析方法を使用すると、レジオネラ属菌と他の微生物とを速やかに識別できる。
【００２４】
（塩基配列）
以下に、配列番号１〜８のオリゴヌクレオチドを示す。
配列番号１（LP/F2-1）：5'-ccttacatcctcctcggctc-3'
配列番号２（LP-R4） ：5'-cgctcgtttccagctcccc-3'
配列番号３（grpE1-f）：5'-cccttgctgaattggagaac-3'
配列番号４（grpE1-r）：5'-gttgcattgacattgcctca-3'
配列番号５（grpE2-f）：5'-tgctttaggacatcccagctat-3'
配列番号６（grpE2-r）：5'-cactgttcttgtccgctaattg-3'
配列番号７（grpE3-f）：5'-tcgtcgtatggaacgagaagt-3'
配列番号８（grpE3-r）：5'-gagggtcaaatgtctgtccaa-3'
【００２５】
配列番号１は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用の上流（Forward）プライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。また、配列番号２は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用の下流（Reverse）プライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラに限らず、レジオネラ属菌一般の検出に利用できる。
【００２６】
一方、配列番号３〜８は、レジオネラ属菌一般ではなく、特にレジオネラ・ニューモフィラの検出に利用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３、４はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号５、６はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号７、８はそれぞれ、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列増幅用の上流、下流プライマーの組として使用できるオリゴヌクレオチドの配列である。
【００２７】
配列番号３〜８のオリゴヌクレオチドは、レジオネラ・ニューモフィラに特異的なプライマーとして利用することができる。即ち、レジオネラ・ニューモフィラ以外のレジオネラ属菌はほとんど検出しないようにすることができる。また、検出感度が極めて高く、レジオネラ・ニューモフィラ３個相当から検出することができる。また、定量ＰＣＲ等を用いた定量検出にも容易に適用できる。
以上のように、配列番号３〜８のオリゴヌクレオチドの組は、１）、レジオネラ・ニューモフィラに特異的である配列を持ち、２）プライマーとしての検出感度が良好で、３）定量ＰＣＲへの適用が容易である。
【００２８】
配列番号３〜８は、熱ショック蛋白（Heat shock protein）の一種をコードしているgrpE遺伝子（GeneBank:D89498）を元に設計したものである。このgrpE遺伝子を元に設計したプライマーは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２９】
ハイブリダイズするために核酸は完全な相補性を必要としないため、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドの配列は、レジオネラ属菌の標的配列増幅用のプライマーとしての有用性を失うことなく、ある程度修飾することが可能である。例えば、ストリンジェンシーを増強または低減するようにハイブリダイゼーション条件（すなわち、ハイブリダイゼーションｐＨ、温度または緩衝液の塩含量）を調節することにより、相補的な核酸配列および部分的に相補的な核酸配列を得ることができる。開示した配列のこのように僅かな修飾およびレジオネラ属菌への特異性を維持するために必要なハイブリダイゼーション条件の調節は、当分野で普通の技術の範囲内である。
【００３０】
本明細書に記載のプライマーを使用して生成した増幅生成物は、たとえば、臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミドゲル上またはアガロースゲル上の、特徴的なサイズによって検出することができる。あるいは、アッセイプローブ（検出可能な標識で標識したオリゴヌクレオチド）を使用して、増幅された標的配列を検出することができる。
【００３１】
アッセイプローブの検出可能な標識は、標的核酸の存在の指標として、直接的または間接的いずれでも検出できる。標識の直接検出の場合、アッセイプローブを放射性同位元素で標識してオートラジオグラフィーで検出してもよく、蛍光部分で標識して蛍光で検出してもよい。あるいは、検出できるようにするにはさらなる試薬を必要とする標識で標識することにより、アッセイプローブを間接的に検出することが可能である。間接的に検出できる標識としては、たとえば、化学発光剤、目に見える反応生成物を生成する酵素、および標識された結合パートナーに結合させることにより検出できる（たとえば、抗体または抗原／ハプテン）リガンド（たとえば、ハプテン、抗体または抗原）などがある。リガンドは、その検出を容易にするために、リガンド標識オリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を固相に固定するのにも有用である。特に有用な標識としては、ビオチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合させることにより検出できる）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素（酵素基質を加えて有色の反応性生物を生じさせることによって検出できる）などがある。
【００３２】
核酸を特異的に検出して同定するための増幅用のプライマーを、キットの形でパッケージすることが可能である。一般に、このようなキットは少なくとも一対の増幅用のプライマーを含む。標的特異的増幅用のプライマーと共に、核酸増幅反応を実施するための試薬、たとえば、緩衝液、さらなるプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素等々も含まれてもよい。他の任意の成分、たとえば、アッセイプローブとして使用するのに適した標識で標識されたオリゴヌクレオチド、および／または標識を検出するための試薬または手段もキットに含まれてもよい。
【００３３】
使用できる具体的な検出方法の例として、米国特許第５，４７０，７２３号に記載の、ビオチニル化捕捉プローブおよび酵素複合検出器プローブを使用して、増幅生成物を検出する化学発光法などがある。これらの２つのアッセイプローブを、標的配列のアッセイ領域の異なる部位（２つの増幅用のプライマーの結合部位の間）にハイブリダイズさせた後、捕捉プローブを用いて、この複合体をストレプトアビジン被覆微量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを生じさせ、照度計で読み取る。
増幅生成物を検出するための別の代替法として、欧州特許ＥＰ ０ ６７８ ５８２号に記載のシグナルプライマーを、ＳＤＡ反応に含めてもよい。増幅生成物を検出するためのさらに別の代替法では、シグナルプライマーは、標的配列にハイブリダイズしない配列、すなわちアダプター配列を含んでもよい。
【００３４】
標識が結合したレポータープローブは、アダプター配列の補体にハイブリダイズすることができる。シグナルプライマーの両実施形態において、ＳＤＡ中に、二次増幅生成物を標的増幅依存的に生じさせ、これを標的増幅の指標として検出することが可能である。
【００３５】
本発明の標的結合性配列を、ＳＤＡ以外の増幅方法に合わせて改変する場合、増幅用のプライマーを調製するためのルーチンの方法（たとえば化学合成）および選択された増幅反応のプライマーに必要な周知の構造上の条件を使用する。従って、本発明の標的結合性配列は、産生、スクリーニングおよび最適化のためのルーチンの方法のみを使用した様々な増幅反応における、レジオネラ属菌特異的標的増幅ならびに検出に合わせて容易に改変される。
【００３６】
ＳＤＡは、プライマーの切除、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位のニッキング、一本鎖伸長生成物の置換、伸長生成物（または本来の標的配列）へのプライマーのアニーリングおよびその後のプライマーの伸長が、反応混合物中で同時に起こる等熱方法である。これは、反応のステップが、反応の温度循環特性の結果として非連続相または周期で行われるＰＣＲと対照的である。ＳＤＡは、１）制限エンドヌクレアーゼが、そのヘミホスホロチオエート型二本鎖認識／切断部位の未修飾の鎖を切断できることと、２）ある特定のポリメラーゼがニックにて複製を開始し且つ下流の非鋳型鎖を置換できることとに基づく。プライマーをアニーリングするために、高温（約９５℃）にて最初にインキュベートして二本鎖標的配列を変性させた後、続いて、新たに合成された鎖の増幅および置換を定温で行う。標的配列の新しい各コピーの作製は、１）増幅用のプライマーを本来の標的配列または予め重合して置換した一本鎖伸長生成物に結合するステップと、２）α−チオ デオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによりプライマーを伸長するステップと、３）半修飾された二本鎖制限部位を切断するステップと、４）制限酵素をニック部位から分離するステップと、５）５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによってニックの３’末端から伸長し、下流の新たに合成された鎖を置換するステップとの、５ステップからなる。ニックからの伸長は別の切断可能な制限部位を再生させるため、ニッキング、重合および置換は、定温で同時に且つ連続的に起こる。一対の増幅用のプライマーを使用し、それぞれが二本鎖標的配列の２本の鎖のうちの１本にハイブリダイズする場合、増幅は指数関数的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖が、その後の循環の増幅において、反対側のプライマー用の鋳型の役割を果たすためである。１つの増幅用のプライマーを使用するとき、ただ１本の鎖がプライマー伸長用の鋳型の役割を果たすため、増幅は直線的である。
【００３７】
別の増幅生成物による、１つのＳＤＡ反応の交差汚染を防止するために、増幅反応を阻害せずに、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み込むことができる。次いで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、ウラシル修飾核酸を特異的に認識して不活化することが可能である。従って、事前の反応でｄＵＴＰがＳＤＡ増幅ＤＮＡに組み込まれるのであれば、二本鎖標的を増幅する前に、その後のＳＤＡ反応をＵＤＧで処理することができ、先に増幅された反応からのＤＮＡを含むｄＵを増幅不可能にする。その後の反応で増幅されるべき標的ｄＮＡはｄＵを含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次いで、標的の増幅前にＵＧＩで処理することにより、ＵＤＧを阻害することができる。あるいは、ＵＤＧを熱不活化してもよい。ｔＳＤＡの場合、反応の高温そのもの（≧５０℃）を同時に使用して、ＵＤＧを不活化し、標的を増幅することができる。
【００３８】
ＳＤＡは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼを必要とし、二本鎖核酸の一本鎖ニックにて重合を開始し、ニックの下流の鎖を置換させる一方で、未切断鎖を鋳型として使用して新たな相補鎖を生成する。ポリメラーゼは、ヌクレオチドを遊離の３’−ＯＨに付加することによって伸長しなければならない。ＳＤＡ反応を最適化するためには、ポリメラーゼが、増幅できる標的配列の長さを最大化するのに極めて前進的であることも望ましい。極めて前進的なポリメラーゼは、伸長生成物を分離して終結する前に、かなりの長さの新しい鎖を重合することができる。置換活性は、さらなるコピーの合成に利用できる標的を作り、且つ指数関数的増幅反応で、第２の増幅用のプライマーがハイブリダイズすることが可能な対象である一本鎖伸長生成物を生成するため、増幅反応に不可欠である。制限酵素のニッキング活性は、反応を永続させ、標的増幅のその後の循環が開始するのを可能にするニッキングであるため、これも非常に重要である。
【００３９】
ｔＳＤＡは、適切な熱安定性ポリメラーゼおよび熱安定性制限エンドヌクレアーゼを取り替えて、本質的に、従来のＳＤＡと同様に実施される。反応温度は、取り替えられた酵素に適した高温に調節し、ＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択された熱安定性エンドヌクレアーゼに適切な制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位と取り替える。また、酵素が変性温度で十分に安定であれば、専門家は、最初の変性ステップの前に酵素を反応混合物に含める。ｔＳＤＡで使用するのに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＢｓｔＯＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。好ましい好熱性ポリメラーゼは、Ｂｃａ（Ｐａｎｖｅｒａ）およびＢｓｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）である。
【００４０】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡは、ｔＳＤＡの改良型である。これは、検出器オリゴヌクレオチドを使用して、標的依存的様式で、低い蛍光消光をもたらす。この検出器オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下で蛍光消光が起こるように連結されたドナー／アクセプター色素対を含む。標的の存在下で、検出器オリゴヌクレオチドにおける分子内塩基対形成二次構造のアンフォールディングおよび直線化は、色素間の距離を増大し、蛍光消光を減少させる。塩基対形成二次構造のアンフォールディングは、一般に、二次構造が少なくとも部分的に乱されるように、二次構造の配列と相補鎖との間の分子間塩基対形成を含む。十分な長さの相補鎖の存在下で、二次構造を十分に直線化することが可能である。
【００４１】
好ましい実施形態では、二次構造と相補鎖との間の分子間塩基対形成によって、ＲＥＲＳが二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼで切断できるように、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＲＥＲＳ）は、２つの色素の間に存在する。制限エンドヌクレアーゼで切断することにより、ドナー色素とアクセプター色素を別個の核酸断片上に分離し、さらに、消光低下の一助となる。
いずれの実施形態でも、付随する蛍光パラメーターの変化（たとえば、ドナー蛍光強度の増強、アクセプター蛍光強度の低下、またはウンフォールディング前後の蛍光の比率）を、標的配列が存在する指標としてモニタリングする。ドナー蛍光強度の変化は、一般にアクセプター蛍光強度の変化より大きいため、ドナー蛍光強度の変化をモニタリングすることが好ましい。蛍光寿命等の他の蛍光パラメーターをモニタリングしてもよい。
オリゴヌクレオチドの切断は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖のホスホジエステル結合を破壊すること、または一本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合を破壊することを指す。これは、ＤＮＡ二重らせんにおける二本の鎖のうちの１本のみのホスホジエステル結合を破壊することを指すニッキングと対照的である。
【００４２】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出器オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズする一本鎖５'セクションまたは３'セクション（標的結合性配列）、ならびに標的結合性配列に隣接する分子内塩基対形成二次構造の両者を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。好ましい実施形態では、検出器オリゴヌクレオチドは、表テロ配列にハイブリダイズしない一本鎖５'セクションまたは３'セクションを含むレポータープローブである。むしろ、一本鎖５'セクションまたは３'セクションは、シグナルプライマーアダプター配列の補体（アダプター−補体結合性配列）にハイブリダイズする。レポータープローブのさらなる特徴は、このハイブリダイズセクションが分子内塩基対形成二次構造に隣接することである。
【００４３】
同種リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の本発明の検出器オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長またはハイブリダイゼーションのために選択された反応条件で分子内塩基対形成二次高構造を形成する配列を含む。１つの実施形態では、標的結合性配列の少なくとも一部が一本鎖３'尾部または５'尾部を形成するように、この二次構造を検出器オリゴヌクレオチドの標的結合性配列の近くに配置してもよい。
好ましい実施形態では、アダプター−補体結合性配列の少なくとも一部が一本鎖３'尾部または５'尾部を形成するように、この二次構造は、レポータープローブ検出器オリゴヌクレオチドのアダプター−補体結合性配列の近くに配置される。本明細書で使用する用語「標的結合性配列の近く」または「アダプター−補体結合性配列の近く」は、標的／アダプター−補体結合性配列の全部または一部が、標的／アダプター−補体へのハイブリダイゼーションに使用できる５'尾部または３'尾部において一本鎖のままであることを意味する。すなわち、二次構造は標的／アダプター−補体結合性配列全体を含まない。
【００４４】
標的／アダプター−補体結合性配列は、その一部が二次構造における分子内塩基対形成に関与している可能性があり、二次構造における分子内塩基対形成に関与する第１の配列の一部または全部を含んでもよいが、その相補配列内に達しないことが好ましい。たとえば、二次構造がステム・ループ構造（たとえば、「ヘアピン」）であり、且つ検出器オリゴヌクレオチドの標的／アダプター−補体結合性配列が一本鎖３'尾部として存在するのであれば、標的／アダプター−補体結合性配列は、ステムの第１アームの全部または一部、および任意に、ループの全部または一部を通って伸びてもよい。しかし、標的／アダプター−補体結合性配列は、ステム分子内塩基対形成に関与する配列の第２アーム内に達しないことが好ましい。すなわち、標的／アダプター−補体にハイブリダイズすることができる二次構造において分子内塩基対形成に関与する両配列を有することを回避することが望ましい。
【００４５】
検出器オリゴヌクレオチド二次構造の分子内塩基対形成部分における不一致によって、標的の存在下で蛍光の変化の大きさが減少する可能性があるが、分析感度が問題でなければ許容できる。一本鎖尾部の標的／アダプター−補体結合性配列における不一致も許容できるが、分析感度および／または特異性が同様に低下する可能性がある。しかし、二次構造および標的／アダプター−補体結合性配列の両者における完全な塩基対形成により反応が損なわれないことが本発明の特質である。ハイブリダイゼーションに関与する配列における完全一致は、反応動力学に対してマイナスの影響を与えずに、分析特異性を向上させる。
【００４６】
本発明の検出器オリゴヌクレオチドレポータープローブは、増幅反応に加えられると、ハイブリダイゼーションおよび伸長によって二本鎖型に転換される。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構造をほどくかまたは直線化し、これを相補鎖の合成によって二本鎖型に転換する。ＲＥＲＳも、存在する場合には、二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより切断可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）になる。二次構造が、ポリメラーゼの鎖置換活性によってほどかれるかまたは直線化されるため、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離が増加し、その結果、ドナー蛍光の消光が減少する。随伴する、ドナー色素またはアクセプター色素のいずれかの蛍光の変化は、標的配列の増幅の指標としてモニタリングまたは検出することができる。
【００４７】
一般に、ＲＥＲＳが切断されると、それぞれ、２個の色素のうちの一方を有する２個の別個の二本鎖二次増幅生成物断片が生成することにより、蛍光の変化の大きさがさらに増大する。これらの断片は、反応溶液中で自由に拡散し、ドナー／アクセプター対の色素間の距離がさらに増大する。
ドナー蛍光強度の上昇またはアクセプター蛍光強度の低下は、標的増幅が起きているまたは起きた指標として、検出および／またはモニタリングしてもよいが、ドナー／アクセプター色素対の接近により影響を受ける他の蛍光パラメーターをモニタリングしてもよい。
ドナーまたはアクセプターの蛍光強度の変化は、ドナーおよび／またはアクセプター蛍光強度の比率の変化として検出することもできる。たとえば、蛍光強度の変化は、ａ）二次構造の直線化またはアンフォールディング後のドナーフルオロフォア蛍光と直線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるフルオロフォア蛍光との比率の上昇、またはｂ）二次構造の直線化またはアンフォールディング後のアクセプター色素蛍光と直線化またはアンフォールディング前の検出器オリゴヌクレオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低下として検出することが可能である。
【００４８】
ＰＣＲでＰＣＲ増幅プライマーおよび５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が欠如した標準置換ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、ＰｒｏｍｅｇａのＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＧｒａｄｅＴａｑまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓのｅｘｏ- Ｖｅｎｔまたはｅｘｏ- Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）を使用することにより、ＰＣＲ向けに方法を改変してもよい。シグナルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的に少なくとも部分的にハイブリダイズし、検出器オリゴヌクレオチドレポータープローブへのハイブリダーゼーションおよび後続の伸長後、置換され、二本鎖にされる。
ＰＣＲでは、ＲＥＲＳの切断よりむしろニッキングを誘導しかねない、修飾されたデオキシヌクレオチド三リン酸が一般に存在しないため、ＲＥＲＳを、検出器オリゴヌクレオチド向けに任意に選択することが可能である。熱循環はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限エンドヌクレアーゼは、プライマーアニーリングの最終周期および増幅のエンドポイント検出のための伸長の後で、低温で加えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通じて活性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼも、リアルタイムアッセイを提供するための増幅中ずっと存在し得る。ＳＤＡシステムの場合と同様、色素対の分離により蛍光消光が減少し、強度等の蛍光パラメータの変化が標的増幅の指標の役割を果たす。
【００４９】
検出器オリゴヌクレオチドのアンフォールディングまたは直鎖状にすることによる蛍光の変化を、反応の選択されたエンドポイントで検出することができる。しかし、直鎖状にされた二次構造はハイブリダイゼーションまたはプライマー伸長と同時に生じるため、反応が起こるにつれて、すなわち、「リアルタイム」で、蛍光の変化もモニタリングすることが可能である。この同種リアルタイムアッセイ形式を使用して、存在する標的の初期量に関する半定量的情報または定量的情報を提供することが可能である。たとえば、（標的増幅の一部としての、または非増幅検出法における）アンフォールディング反応または直鎖状反応中に蛍光強度が変化する速度は、初期の標的レベルの指標である。結果として、標的配列の最初のコピーがもっと多く存在するとき、ドナー蛍光は選択された閾値にもっと急速に到達する（すなわち、短時間で確実になる）。アクセプター蛍光強度の低下は、同様に、より短時間で確実になり、選択された最小値に達するまでに要する時間として検出される。
【００５０】
本発明の方法に従って選択された標的配列の存在に関するアッセイは、溶液または固相で実施することが可能である。検出器オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するリアルタイムまたはエンドポイント同種アッセイは、一般に溶液で実施される。本発明の検出器オリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーションアッセイは溶液でも実施することが可能であるが（たとえば、同種リアルタイムアッセイ）、標的のリアルタイム検出またはエンドポイント検出のための固相アッセイに特に適している。固相アッセイでは、当技術分野で周知の方法を使用した内部標識または末端標識によって、検出器オリゴヌクレオチドを固相（たとえば、ビーズ、膜または反応容器）上に固定することが可能である。たとえば、ビオチン標識検出器オリゴヌクレオチドをアビジン修飾固相上に固定することが可能であり、そこで、適切なハイブリダイゼーション条件で標的に曝露すると、蛍光の変化を生じる。この方式で標的を捕捉することにより、サンプルからの標的の分離が容易になり、アッセイのシグナルまたは他の特徴の検出を妨害する恐れのあるサンプル中の物質を除去することができる。使用することができる固相系の一例は、当技術分野で周知のもの等の、アレー形式である。
【実施例】
【００５１】
以下に本発明の具体的な実施例を説明する。
Ａ．配列１，２による検出結果
（１）検出感度
図１は、配列１，２をプライマーとして用いた場合でのレジオネラ・ニューモフィラの検出結果を表す図である。
【００５２】
この検出結果は以下のようにして得られた。
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に含まれるレジオネラ・ニューモフィラの個数が判っている菌液を１０、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍に希釈した（原液を１ｍＬ抽出し、希釈用のリン酸緩衝液を９ｍＬ加えることを各濃度で繰り返す）。
希釈液それぞれから２．５μＬを抽出する。この抽出液には希釈の段階に応じて、レジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが約１４００，１４０，１４，１．４、０．１４個含まれる。
配列１，２をプライマーとして用いたＰＣＲ法によって標的配列を増幅する。このとき、ＰＣＲに用いた溶液の全量は２５μＬであり、ＰＣＲのサイクルは４０サイクルとした。
さらに、アガスローゲル電気泳動法を用いて、増幅した標的配列を検出した。
【００５３】
図１では、分子量マーカー（Ｍ）と各希釈液での電気泳動の結果を対比して表している。なお、「２７７ｂｐ」は、配列１，２をプライマーペアとして用いた場合の増幅産物のサイズである。
図１から判るように、２．５μＬ中にＮ＝１４個からレジオネラ・ニューモフィラが検出可能であることが判る。
【００５４】
（２）実サンプルでの検出
図２は、実サンプルでのレジオネラ・ニューモフィラの検出結果を表す図である。
この検出結果は以下のようにして得られた。
［下線部に濾過器の詳細をご記入願います］
循環式浴槽に設置された濾過器内部の水を原液とし遠心濃縮してリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えることで、１００倍濃縮液（サンプル水）を得る。
この濃縮液２．５μＬに対して配列１，２をプライマーとして用いたＰＣＲ法によって標的配列を増幅する。このとき、ＰＣＲに用いた溶液の全量は２５μＬであり、ＰＣＲのサイクルは４０サイクルとした。
【００５５】
ここで、他の方法でリン酸緩衝液（サンプル水）中の細菌を検出したところ、以下のような結果であった。
レジオネラ菌数：  ９．９×１０４／100 ｍＬ
一般性細菌数：                    ３．８×１０５／ｍＬ
従属栄養細菌数：                  １．２×１０６／ｍＬ
【００５６】
この濾過器内部水には、一般性細菌の他に、一般性細菌の増幅しにくい低栄養、低温の水環境でも増幅、生存可能な従属栄養細菌が棲息している。
【００５７】
図２には、分子量マーカー（Ｍ）と、レジオネラ属菌のみが１０５／ｍＬ含まれる溶液（ＳＴ：基準水）、サンプル水（Ｓａｍｐ）、緑膿菌シュードモナス・エルジノーサ (Pseudomonus aeruginosa)が含まれる溶液（Ｐ．ａ．：比較水）での電気泳動の結果を対比して表している。これらの溶液はいずれも、ＰＣＲ法によって標的配列を増幅し、その後に電気泳動法が適用されている。
シュードモナス・エルジノーサは、土、 水、汚水など、自然界に広く分布しており、レジオネラの生存する場所にもしばしば存在している。
【００５８】
図２に示されるように、基準水ＳＴ、サンプル水Ｓａｍｐから検出反応が有り、比較水Ｐ．ａ．からは検出されない。
図２の結果は、配列１，２をプライマーとして用いることで、レジオネラ・ニューモフィラを増幅し、他の一般性細菌、従属栄養細菌、ささには遺伝子配列の近似するシュードモナス・エルジノーサを増幅しないことを示す。即ち、配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラを他の細菌と区別して特異的に識別できることを示す。
【００５９】
（３）レジオネラ属菌の検出
図３は、レジオネラ属菌一般での検出結果を表す図である。
ここでは、レジオネラ属菌を培養した培地のコロニー（菌の集落）をサンプルとして用い、配列１，２をプライマーとするＰＣＲ法により増幅し、電気泳動で測定を行った。
【００６０】
図３には、分子量マーカー（Ｍ）と、それぞれレジオネラ属菌が含まれる溶液での電気泳動の結果を対比して表している。
図３から配列１，２は、レジオネラ・ニューモフィラのみではなく、多くの血清群があるレジオネラ属菌一般を検出できることを表す。
なお、ここでは精製された純粋な菌のＤＮＡと比べて実サンプルに近い培地のコロニー（菌の集落）をそのまま用いてＰＣＲを行っている。
【００６１】
Ｂ．配列５，６による検出結果
図４は、配列５，６をプライマーとして用いた、レジオネラ・ニューモフィラを定量的に検出した結果を表すグラフである。
ここでは、２．５μＬ中でレジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが３，３０，３００，３０００含まれるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をサンプルに用い、ロッシュ社製ライトサイクラーによる定量ＰＣＲ法によって定量的に検出した。このグラフの横軸はＰＣＲのサイクル数であり、縦軸は蛍光の強度である。個数Ｎが０．３ではレジオネラ属菌の増幅がなされないが、個数Ｎが３以上ではレジオネラ・ニューモフィラの増幅がなされていることが判る。即ち、サイクル数に応じて蛍光の強度（標的配列の濃度に対応）が増加している。
以上から判るように、２．５μＬ当たりの個数Ｎが３個からレジオネラ・ニューもフィラを定量的に検出できることが判る。
【００６２】
図５は、図４の配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果から作製された標準曲線である。縦軸がサイクル数、横軸が対数値を示す。この標準曲線を用いる事で、未知の濃度のサンプルについて定量PCRを行う事も技術的に可能である。
【００６３】
図６は、配列５，６をプライマーとして用いた、レジオネラ・ニューモフィラの検出限界を示した結果を表す電気泳動写真である。
ここでは、２．５μＬ中でレジオネラ・ニューモフィラの個数Ｎが３，３０，３００，３０００含まれるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をサンプルに用い、ＰＣＲ法によって検出した。この写真はＰＣＲ法で増幅した産物をアガロースゲル電気泳動法で視認化させたものである。ここからわかるように、個数Ｎが３以上でレジオネラ・ニューモフィラの検出がなされていることが判る。
なお、本発明の実施形態は上記の実施形態に限られず拡張、変更可能であり、拡張、変更した実施形態も本発明の技術的範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】配列１，２をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラを検出した結果を表す図である。
【図２】配列１，２をプライマーとして用い、実サンプルでレジオネラ・ニューモフィラを検出した結果を表す図である。
【図３】配列１，２をプライマーとして用い、レジオネラ属菌一般を検出した結果を表す図である。
【図４】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果を表すグラフである。
【図５】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをロッシュ社製ライトサイクラーによるリアルタイム定量PCRで検出した結果から作製された標準曲線である
【図６】配列５，６をプライマーとして用い、レジオネラ・ニューモフィラをPCR法で増幅し、アガロース電気泳動によってレジオネラ・ニューモフィラの検出限界を示した写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
上流プライマー（Sence primer）として使用できる配列である。
下流プライマー（Antisence primer）として使用できる配列である。
上流プライマー（Sence primer）として使用できる配列である。
下流プライマー（Antisence primer）として使用できる配列である。
上流プライマー（Sence primer）として使用できる配列である。
下流プライマー（Antisence primer）として使用できる配列である。
上流プライマー（Sence primer）として使用できる配列である。
下流プライマー（Antisence primer）として使用できる配列である。