(57)【要約】【課題】            ビフィズス菌の一種であるビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体について、これまで知られていなかったウイルス性肝炎治療効果が存在することを明らかにし、かかる知見に基づいて、全く新しいウイルス性肝炎治療剤を提供すること。【解決手段】        嫌気性菌であるにビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とするウイルス性肝炎治療剤であり、特に、ビフィドバクテリウム・ロンガムを、ゲル化剤であるコーンスターチを含有する培地を用いて培養して得た培養原液、培養上清液および／または培養菌体を有効成分とするＢ型慢性肝炎ならびにＣ型慢性肝炎の治療剤である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とすることを特徴とするウイルス性肝炎治療剤。
【請求項２】
ウイルス性肝炎が、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎である請求項１に記載のウイルス性肝炎治療剤。
【請求項３】
ビフィドバクテリウム・ロンガムを、ゲル化剤を含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするものである請求項１または２に記載の記載のウイルス性肝炎治療剤。
【請求項４】
ゲル化剤が、コーンスターチ、アルギン酸および寒天から選択される少なくとも１種である請求項３に記載のウイルス性肝炎治療剤。
【請求項５】
ゲル化剤がコーンスターチである請求項４に記載のウイルス性肝炎治療剤。
【請求項６】
培養物が、培養原液または培養上清液である請求項１ないし５のいずれかに記載のウイルス性肝炎治療剤。
【請求項７】
嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とすることを特徴とするＣ型慢性肝炎治療剤。
【請求項８】
ビフィドバクテリウム・ロンガムを、ゲル化剤を含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするものである請求項７に記載の記載のＣ型慢性肝炎治療剤。
【請求項９】
ゲル化剤が、コーンスターチ、アルギン酸および寒天から選択される少なくとも１種である請求項８に記載のＣ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１０】
ゲル化剤がコーンスターチである請求項９に記載のＣ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１１】
培養物が、培養原液または培養上清液である請求項７ないし１０のいずれかに記載のＣ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１２】
嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とすることを特徴とするＢ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１３】
ビフィドバクテリウム・ロンガムを、ゲル化剤を含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするものである請求１２に記載の記載のＢ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１４】
ゲル化剤が、コーンスターチ、アルギン酸および寒天から選択される少なくとも１種である請求項１３に記載のＢ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１５】
ゲル化剤がコーンスターチである請求項１４に記載のＢ型慢性肝炎治療剤。
【請求項１６】
培養物が、培養原液または培養上清液である請求項１２ないし１５のいずれかに記載のＢ型慢性肝炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性肝炎治療剤に係り、詳細には、嫌気性菌の一種であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とするＢ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性菌であるビフィズス菌（Bifidobacterium）は、母乳栄養児の腸内ではほとんど純粋培養に近い状態で存在しており、その一方、人工栄養児の腸内では、ビフィズス菌の菌数は少なく、大腸菌（Escherichia coli）、腸球菌（enterococcus）等が多く、腸内感染疾患が高くなることが知られている。
【０００３】
母乳栄養児は、母体からの母乳の免疫力により細菌、ウイルスなどの感染に対する抵抗力が強いとされているが、そればかりでなく、ビフィズス菌が腸内において嫌気性条件下で、ほとんど純粋培養に近い状態で培養され、その培養液が豊富に存在するであろうことも無関係ではない。
【０００４】
また、成人においても、ビフィズス菌は腸内において健康時の優勢菌の一つとして存在しているが、不健康な状態ではそのビフィズス菌が減少または消滅していることが確認されている。したがって、ビフィズス菌を用いた各種の医薬品、醗酵乳酸飲料をはじめとする健康食品、清涼飲料水等が提案、市販されており、ビフィズス菌を経口摂取することにより、成人あるいは乳児の下痢防止や、健康維持のために利用されている。
【０００５】
ビフィズス菌は、経口摂取された場合、腸内で多量の乳酸、揮発酸を産生し、腸内ｐＨを低下させ、それにより大腸菌などの病原菌の発育を抑制し、腸ぜん運動を促進し、腸内菌叢異常による便秘、下痢などを改善するものであるといわれている。
【０００６】
このように、ビフィズス菌はヒトの健康維持に極めて効果的なものであり、多くの場合、ビフィズス菌の培養液を用い、それに各種添加剤を添加した醗酵製品として健康飲料に調製し、提供されている。また、ビフィズス菌の生菌菌体を集め乾燥した後、デンプン、乳糖、白糖などの適当な賦形剤と混合し、散剤、錠剤などに成形し、整腸剤として用いられている。
【０００７】
ところで、ビフィズス菌のなかでもビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）については、これまであまり積極的に研究されてきていない。ごく最近になって、このビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物について、種々医薬品としての応用が提案されている。それらは、ビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体を含む培養物を含有する、飲食物（特許文献１）、糖尿病合併症の予防・改善・治療剤（特許文献２）、コレステロール低下剤（特許文献３）等である。
【特許文献１】特開２００３−２５０５３０
【特許文献２】特開２００３−２５２７７０
【特許文献３】特開２００３−２３８４２３
【０００８】
このように、ビフィドバクテリウム・ロンガムには優れた薬理効果が期待されており、本発明者等は、このビフィドバクテリウム・ロンガムの培養液が有する薬理作用に注目し、種々検討を加えてきた。その結果、驚くべきことに、ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体には、Ｂ型慢性肝炎ならびにＣ型慢性肝炎等のウイスル性肝炎を有効に治療する効果があることを新規に見出し、本発明を完成させるに至った。
ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する慢性肝炎に対する治療効果が存在することは、今まで全く知られていなかったものであり、その点で本発明は極めて特異的なものであるといえる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明は、ビフィズス菌の培養物および／または菌体が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する慢性肝炎に対し優れた治療効果があることを明らかにし、かかる知見に基づいて、全く新しいウイルス性肝炎、特にＣ型慢性肝炎またはＢ型慢性肝炎の治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するための本発明は、その一つの基本的態様として、嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とすることを特徴とするウイルス性肝炎治療剤である。そのなかでもより具体的には、上記のウイルス性肝炎が、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎であるウイルス性肝炎治療剤である。
【００１１】
このビフィドバクテリウム・ロンガムはビフィドバクテリウム属の嫌気性菌であり、培養は通常酸素のない状態で行われるものであるが、本発明においては、かかる嫌気性状態を保つため、ゲル化剤を含有する培地を用いて培養した場合に、得られた培養物および／または菌体には、より効果的なウイルス性肝炎治療効果があることが判明した。したがって本発明は、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガムを、ゲル化剤を含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするウイルス性肝炎、特に、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤である。
【００１２】
より具体的には、本発明は、ゲル化剤を含有する培地としてのゲル化剤が、コーンスターチ、アルギン酸および寒天から選択される少なくとも１種であり、なかでもゲル化剤としてコーンスターチを含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするウイルス性肝炎、特に、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤である。
【００１３】
ビフィズス菌は嫌気性菌であり、一般的には、Bifidobacterium bifidiumが標準種である。このものは母乳あるいは人工授乳中の乳児および老人の糞便および消化管にみられ、ヒト、その他の動物に対する病原性は認められていない。また、乳酸桿菌属（Lactobacillus）のなかで、Lactobacillus bifidus susp. Pennsylvanicus（ペンシルバニア亜種ビフィズス菌）もビフィズス菌の１種として分類されている。本願発明は、これらの標準的なビフィズス菌ではなく、特に、ビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体に、ウイルス性の慢性肝炎に対する治療効果があることことが判明した。
【００１４】
したがって本発明は、最も具体的な態様としては、培養菌体としてビフィドバクテリウム・ロンガムをゲル化剤含有する培地を用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とする、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤であり、また、ゲル化剤としてコーンスターチを用いて培養して得た培養物および／または菌体を有効成分とするＢ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、上記したように嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の培養物および／または菌体を有効成分とするウイルス性肝炎、特に、Ｂ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎であるウイルス性肝炎治療剤である。
これまで、ビフィズス菌の生菌体（乾燥菌体）そのもの、あるいはその培養液全体を有効成分とする医薬品あるいは健康飲料、清涼飲料等は知られており、その作用は、腸内で多量の乳酸等を産生して、腸内ｐＨを低下させることによる大腸菌などの病原菌の発育を抑制作用であったが、肝炎治療効果が認められたのは全く新規なものである。また、ビフィズス菌であるビフィドバクテリウム・ロンガムは、病原性が認められないものであることから、極めて安全であり、したがって本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に起因する慢性肝炎疾患の治療に極めて有効なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に本発明の特徴を詳細に説明することにより、本発明を説明していく。
本発明が提供する治療剤で有効成分として使用されるビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体としての培養物は、培養原液または培養上清液の単独またはこれらの混合物をいう。
【００１７】
一般に、ビフィドバクテリウム・ロンガムの液体培養は、培養中の嫌気性条件を保持するため、培地にシステインまたはアスコルビン酸等の還元剤を添加して行っている。しかしながら、これらの還元剤は高価なものであり、工業的な培養には不向きである。その点を改良するべく、培養基礎培地をゲル状態とし、液体培地内への酸素の混入を抑えることにより嫌気性条件とした場合に、極めて良好にビフィドバクテリウム・ロンガムの培養が行い得ることが判明した。
【００１８】
用いられるビフィドバクテリウム・ロンガムの培養基礎培地としては、特に制限されるものではなく、通常のビフィズス菌の培養に用いられる液体培地を上げることができる。例えば、炭素源、窒素源、無機質その他の添加剤としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、グルコース、リン酸水素カリウムおよび精製水などからなる液体培地（そのｐＨとしては、ほぼ中性ないし弱酸性）を用いるのがよい。本発明にあっては、その液体培地をゲル化状態とするために、ゲル化剤を添加する。そのようなゲル化剤としては、コーンスターチ、アルギン酸および寒天から選択される少なくとも１種を選択することができ、そのなかでもコーンスターチを添加して培地に粘性を高めることにより酸素の混入を防ぎ、嫌気性条件とすればよい。なお、ゲル化にあたっては、液体培地の均一なゲル化状態を保持するために、例えば、Tween 80の乳化剤（界面活性剤）を一緒に少量添加するのがよい。
【００１９】
本発明が提供するビフィドバクテリウム・ロンガム培養上清液を得るため行うビフィドバクテリウム・ロンガムの培養は、例えば、以下のようにして行うことができる。
上記した、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、グルコース、リン酸水素カリウムおよび精製水からなる液体培地（ｐＨ６．８）に、例えばコーンスターチの１０％水溶液を加え、さらに精製水を加えた後、Tween 80を少量添加し、約８０℃程度に加熱し、コーンスターチにより培地を糊化させる。次いで、冷却した後培地のｐＨ調整（中性ないし弱酸性）を行い、さらに精製水を加えてビフィドバクテリウム・ロンガムの培養液体培地とする。
なお、この液体培地の調製は、ビフィドバクテリウム・ロンガムが培養し得る液体培地である限り、種々の変形を行うことができることはいうまでもない。
【００２０】
上記で得られた液体培地を用いたビフィドバクテリウム・ロンガムの培養は、具体的には以下のようにして行うことができる。すなわち、上記で得た液体培地を高圧滅菌した後、例えば、培地１００ｍＬあたりビフィドバクテリウム・ロンガムの培養液を５ｍＬ程度接種し、通常の条件下で培養を行う。例えば、増殖度（液の白濁度）を目安に、３７℃にて約７２時間程度培養を行う。
【００２１】
以上の基本的培養方法により、ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養が完了する。なお、上記の培養方法は、その一例として記載したものであり、種々の変形を行い得ることはいうまでもない。
本発明が提供する治療剤は、このようにして培養されたビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体であるが、培養物としては、その培養原液そのまま、または培養上清液を単独で、またはこれらの混合物として使用することができる。
【００２２】
この場合の上清液を得る場合には、培養が完了した液体培地を遠心分離し、菌体を分離することにより行い得る。なお、培養液の遠心分離にあたって、培養終了後の培地の粘度が高い場合には、例えばデンプン分解酵素であるアミラーゼを添加し、デンプンの分解を行った後、遠心分離すればよい。
【００２３】
一方、培養上清液を採取した残りの培養菌体は、そのまま凍結乾燥等の手段により乾燥を行い、製剤学的に許容される担体と共に混和し、適宜、散剤として経口投与製剤とすることもできる。また得られた散剤を、適当な賦形剤、滑沢剤と練合し、顆粒剤、錠剤等とすることもできる。
【００２４】
また、培養原液、あるいは、培養上清液は、製剤学的に許容される適当な希釈剤を用い、そのまま適宜希釈して、液剤として調製することができる。さらに、培養原液または培養上清液を製剤学的に許容される担体とともに混和し、噴霧乾燥し、散剤としてあるいは得られた散剤を、適当な賦形剤と、滑沢剤と練合し、顆粒剤、錠剤とすることができる。
これらの製剤は、いずれも日本薬局方の「製剤総則」に記載の方法に準じ調製することができ、用いられる担体、賦形剤、滑沢剤、流動化剤、崩壊剤、結合剤、等張化剤、安定化剤等としては、製剤学的に汎用されている各種のものを適宜選択して、使用することができる。
【００２５】
本発明が提供する治療剤における有効成分であるビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物、すなわち培養原液または培養上清液、および／または菌体の投与量は、一概に限定されない。一般的には、投与されるべき患者の性別、年齢、体重、その症状等により異なるが、要は、特に経口的投与により、ＨＣＶあるいはＨＢＶなどの肝炎ウイルス量の減少が得られる用量を投与すればよい。なお、ＨＣＶあるいはＨＢＶなどの肝炎ウイルスに起因するＣ型慢性肝炎あるいはＢ型慢性肝炎の治療においては、ある程度の長期にわたる薬剤投与治療でないと、そのウイルス量の減少は認められない。本発明が提供する治療剤にあっても、例えば経口的に投与したとしても、即座にそのウイルス量の減少が認められるものではなく、ある程度の期間の投与によりその効果が発現する点に注意すべきである。
【実施例】
【００２６】
以下に本発明を、実施例、具体的使用例等によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１：ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養による培養原液、培養上清液および菌体の調製（その１：ゲル化条件下での培養）
基礎培地として、以下の組成からなる液体培地（ｐＨ６．８）を用いた。
ペプトン              １０．０ｇ
肉エキス                ５．０ｇ
酵母エキス              ５．０ｇ
グルコース            １０．０ｇ
リン酸水素カリウム      ３．０ｇ
Tween 80                １．０ｍＬ
精製水                １０００ｍＬ
【００２８】
上記の液体培地２５ｍＬに、１０％コーンスターチ水溶液１０ｍＬを加え、さらに精製水にて全量を４０ｍＬとした。この液体培地を７５〜８０℃に加熱して、コーンスターチを糊化させ、均質なゲル状溶液とし、冷却し、液体培地のｐＨを５．８に調製した。
【００２９】
次いで、上記で得られた液体培地２０ｍＬを試験管にとり、１１５℃／２０分の高圧滅菌をした後、ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養液０．５ｍＬを接種し、３７℃にて７２時間培養を行った。培養が進むにつれて液体培地は白濁した。
【００３０】
培養終了後、培養液をｐＨ５．０〜６．０に調整し、適量のアミラーゼを添加し、約５０℃にて３０分間放置し、デンプンの分解を行った。冷却後、溶液を適宜精製水にて希釈することにより、培養原液を含有する液を得た。
一方、冷却後の溶液を３０００ｒｐｍ／２０分間の遠心分離を行い、培養上清液と、培養菌体とを得た。
【００３１】
実施例２：ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養による培養原液、培養上清液および菌体の調製（その２：ゲル化条件でない培養）
基礎培地として実施例１に記載の組成中、Tween 80を除いた液体培地を用いた。
液体培地２０ｍＬを試験管にとり、１１５℃／２０分の高圧滅菌をした後、ビフィドバクテリウム・ロンガムの培養液０．５ｍＬを接種し、嫌気性条件下で３７℃にて７２時間培養を行った。培養が進むにつれて液体培地は白濁した。
培養終了後、実施例１と同様にして、培養原液、培養上清液および培養菌体を得た。
【００３２】
試験例１：培養原液によるＣ型慢性肝炎の治療効果
上記の実施例１で得られた培養原液を、Ｃ型肝炎患者１０名に経口的に投与し、ウイルス量の変化を検討した。なお、実際の投与に当てっては、患者全員にインフォームドコンセントによる説明を行い、その合意を得ている。
その結果、培養原液を毎日経口的に投与し、１ヶ月経過後のＰＣＲによるウイルス量を検討したところ、ＨＣＶウイルスの顕著な減少が認められ、ＣＴで精査した結果、癌の転移もしくは増殖は認められなかったものであった。
例えば、Ｃ型慢性肝炎で、本発明の培養原液の投与前におけるＰＣＲによるＨＣＶウイルス量が８５０以上を有していた男性患者（５６歳）において、１ヶ月経過後のＰＣＲによるＨＣＶウイルス量は４４０と低下していた。
また、Ｃ型慢性肝炎で、本発明の培養原液の投与前におけるＰＣＲによるＨＣＶウイルス量が２５０を有していた男性患者（４０歳）において、１ヶ月経過後のＰＣＲによるＨＣＶウイルス量は１５０と低下していた。
さらに、Ｃ型慢性肝炎で、本発明の培養原液の投与前におけるＰＣＲによるＨＣＶウイルス量が８３０を有していた女性患者（７０歳）において、１ヶ月経過後のＰＣＲによるＨＣＶウイルス量は２３０と顕著に低下していた。
これらの患者では、いずれもＣＴで精査した結果、癌の転移もしくは増殖は認められていなかった。
【００３３】
製剤例１：液剤
上記実施例１で得た培養上清液を用いた、液剤を調製した。
処方：
実施例１で得た培養上清液      １０ｍＬ
エチルパラベン              ０．１ｇ
香料                            微量
精製水                          残部
上記処方により、全量１００ｍＬの溶液を調製し、高圧滅菌後、汎用されている容器に充填し、液剤を得た。
【００３４】
製剤例２：顆粒剤
上記実施例１で得た培養上清液を用いた、顆粒剤を調製した。
処方：
実施例１で得た培養上清液        １００ｍＬ
乳糖                            ２００ｇ
トウモロコシデンプン              １５ｇ
ヒドロキシプロピルセルロース      ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム            ５ｇ
上記処方により、乳糖、トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルセルロースを混合造粒機により造粒し、そこに実施例１で得た培養上清液を噴霧し、さらに練合、乾燥して顆粒剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
以上記載のように、本発明により、嫌気性菌であるビフィドバクテリウム・ロンガムの培養物および／または菌体を有効成分とするウイルス性肝炎であるＢ型慢性肝炎またはＣ型慢性肝炎治療剤である。この培養物および／または菌体は、効果的にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を減少させるものであり、安全性が高く、したがってその医療上の価値は多大なものである。