(57)【要約】【課題】  安全性が高く、かつ細胞内活性酸素誘発作用やアポトーシス誘導作用に優れた癌治療用組成物を提供すること。【解決手段】  Bortezomib（ＰＳ−３４１）等のプロテアソーム・インヒビター単独投与では、十分な効果の得られない疾患群に、もしくはプロテアソーム・インヒビターのさらなる抗腫瘍効果を期待して、抗炎症剤であるスリンダク及びこの代謝産物であるスリンダックスルフィド、スリンダックスルホン等の活性酸素誘発効果のある薬剤とを併用すると、各種癌細胞に酸化ストレスが増大し、このことが酸化的DNA傷害の増大を惹起し、抗腫瘍効果を相乗的に高めることが可能となる。癌細胞は、一般に酸化ストレスに対し抵抗力が弱く、ＤＮＡ修復能力も低下していることが知られている。さらに従来の抗癌剤の多くは、ＤＮＡ合成を阻害するものがほとんどであることから、従来の化学療法が無効、もしくは難治性となった癌種であっても、治療効果を発揮しうることが期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とする癌治療用組成物。
【請求項２】
非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項１記載の癌治療用組成物。
【請求項３】
プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項１又は２記載の癌治療用組成物。
【請求項４】
癌が、非ステロイド系抗炎により活性酸素の増加効果を示す癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の癌治療用組成物。
【請求項５】
非ステロイド系抗炎により活性酸素の増加効果を示す癌が、大腸癌、胃癌などの消化器腺癌、口腔癌、肺癌、子宮頚癌などの扁平上皮癌、メラノーマ、又は骨髄腫、リンパ性白血病などの血液癌であることを特徴とする請求項４記載の癌治療用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の癌治療用組成物を投与することを特徴とする癌の治療方法。
【請求項７】
非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とする細胞内活性酸素誘発剤。
【請求項８】
非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項７記載の細胞内活性酸素誘発剤。
【請求項９】
プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項７又は８記載の細胞内活性酸素誘発剤。
【請求項１０】
非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項１０記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１２】
プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項１０又は１１記載のアポトーシス誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スリンダクなどの非ステロイド系抗炎症剤（（Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs；ＮＳＡＩＤｓ））とBortezomibなどのプロテアソーム・インヒビターとを含有する癌治療用組成物、細胞内活性酸素誘発剤、アポトーシス誘導剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＳＡＩＤｓは、生体膜のリン脂質から遊離されるアラキドン酸に作用してプロスタグランジンを産生する酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−１，ＣＯＸ−２）を抑制し、その結果、抗炎症作用、解熱作用、鎮痛作用を示すことがよく知られている。これらの作用の他、ＮＳＡＩＤｓには大腸癌の発生抑制作用があることはよく知られている（例えば、非特許文献１〜５参照）。さらにＮＳＡＩＤｓは細胞分裂を阻害することができ、いくつかの癌細胞ではアポトーシスを誘導することもできることが報告されている（例えば、非特許文献６〜８参照）。これらの結果から、ＮＳＡＩＤｓの抗癌剤としての効能が示唆されるものの、抗癌効果が単独の薬剤のように充分に強くはないため、ＮＳＡＩＤｓは抗癌剤であるとは考えられていない。今日まで、ＮＳＡＩＤｓの抗癌効果の分子機序は明らかになっていないが、ＣＯＸ活性を阻害することによりプロスタグランジンの合成が減少することはよく知られている。しかしＮＳＡＩＤｓは、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２を発現していない大腸癌細胞株、及びＣＯＸ−１遺伝子もＣＯＸ−２遺伝子も保有していないマウス胚繊維芽細胞に対する抗癌効果を示すことが報告されている（例えば、非特許文献９、１０参照）。したがって、ＮＳＡＩＤｓの抗癌効果がＣＯＸ活性の阻害効果に依存しているというよりは、むしろ他の効果が関与していると考えられている。この点に関して、セラミドの過剰産生や、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質発現の増加等の、他の機序についても報告されている（例えば、非特許文献１１、１２参照）。したがって、化学防御剤又は抗癌剤として、ＮＳＡＩＤｓがどのように機能するかについては解明されていないというのが現状であり、ＮＳＡＩＤｓ単独ではその抗腫瘍効果は弱いことから実用化に至っていない。
【０００３】
核及び細胞質に局在する高分子プロテアーゼであるプロテアゾームは、ＡＴＰ依存タンパク質分解経路にとって必須の酵素複合体でありであり、様々な短命な機能タンパク質の急速分解に触媒作用を行うことが知られている。ユビキチン・プロテアゾーム経路は細胞分裂の進行、サイトカインによる転写の活性化及びアポトーシスに非常に重要な役割を果たしていると考えられている（例えば、非特許文献１３〜１６参照）。これは、酸化ストレス、熱損傷及び突然変異した遺伝子の転写から生じる、好ましくないタンパク質の急速除去のためにも必須である（例えば、非特許文献１７、１８参照）。プロテアソーム・インヒビターによってこの経路を阻害することで、細胞分裂の進行が強く阻害され、様々な悪性細胞のアポトーシスが引き起こされる。ホウ酸ジペプチドであるBortezomib（以下「ＰＳ−３４１」という）は、特異的プロテアソーム・インヒビターであり、ヒト骨髄腫細胞に対しアポトーシス及び細胞分裂の停止を強く誘導する（例えば、非特許文献１９参照）。ヒトへの副作用が比較的少ないことから、最近ＰＳ−３４１はこれらの患者に対して臨床的に用いられるようになり、非常に効果的であることが判明した（例えば、非特許文献２０〜２２参照）。ＰＳ−３４１は骨髄腫などの血液腫瘍細胞において、顕著な抗癌活性を示すが、固形腫瘍細胞に対しては抗癌効果をそれほど示さない。例えば、０．１μＭのＰＳ−３４１を用いると、多発性骨髄腫細胞の細胞分裂の進行はほぼ完全に阻害されるが、同量のＰＳ−３４１を用いても、非小細胞肺癌細胞に対してはほとんど影響を及ぼさない（非特許文献１９、２３参照）。ＰＳ−３４１の抗癌作用に対する分子機序は解明されていないが、ｐ５３、ｐ２１WAF1、ＭＤＭ２、サイクリンＡ、及びサイクリンＢの蓄積、Ｂｃｌ−２のリン酸化が生ずることが知られており、その結果、Ｇ2/Ｍ期における細胞分裂の停止及びアポトーシスを惹起する（非特許文献１９、２３、２４参照）。さらに重要なことには、ＰＳ−３４１は活性酸素（ＲＯＳ）の産生を引き起こし、このことが、ＰＳ−３４１によるアポトーシス誘導において重要な役割を担うことが示唆されている（例えば、非特許文献２５参照）。また、癌細胞は一般的に代謝が亢進された状態にあり、活性酸素のレベルも正常細胞に比して高いことも知られている（例えば、非特許文献２６，２７参照）。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５２７１１４号公報
【非特許文献１】Rao, C.V., et al. Cancer Res. 55: 1464-1472, 1995
【非特許文献２】Jacoby, R.F. et al. Cancer Res. 56:710-714, 1996
【非特許文献３】Barnes, C.J., et al. Gastroenterology. 114:873-877, 1998
【非特許文献４】Janne, P.A., et al. N Engl J Med. 342:1960-1968, 2000
【非特許文献５】Bresalier, R.S. Gastroenterology. 123:379-381, 2002
【非特許文献６】Piazza, G.A. et al. Cancer Res. 57:2452-2459, 1997
【非特許文献７】Subbegowda, R.et al. T.O. Cancer Res. 58:2772-2776, 1998
【非特許文献８】Grosch, S. et al. FASEB J. 15:2742-2744. 2001
【非特許文献９】Hanif, R. et al. Biochem Pharmacol. 52:237-245. 1996
【非特許文献１０】Xhang, X. et al. J Exp Med. 190:451-459, 1999
【非特許文献１１】Chan TA et al. Proc Natl Acad Sci USA. 95:681-686, 1998
【非特許文献１２】Goel, A. et al. Clin Cancer Res. 9:383-390, 2003
【非特許文献１３】Hershko, A. Curr Opin Cell Biol. 9:788-799, 1997
【非特許文献１４】Ben-Neriah, Y. Nat Immunol. 3:20-26, 2002
【非特許文献１５】Yang, Y. et al. FASEB J. 17:790-799, 2003
【非特許文献１６】McBride, W.H. et al. Oncogene. 22:5755-5773, 2003
【非特許文献１７】Fuchs, S.Y. et al. Oncogene. 17:1483-1490, 1998
【非特許文献１８】Traenckner, E. B. et al. EMBO J. 13:5433-5441, 1994
【非特許文献１９】Hideshima, T. et al. Cancer Res. 61:3071-3076, 2001
【非特許文献２０】Richardson PG et al. Cancer Control. 10:361-369, 2003
【非特許文献２１】Richardson, P.G. et al. N Engl J Med. 348:2609-2617, 2003
【非特許文献２２】Barlogie, B. et al. Blood. 103:20-32, 2004
【非特許文献２３】Ling, Y.H. et al. Clin Cancer Res. 9:1145-1154, 2003
【非特許文献２４】Ling, Y.H.et al. Mol Cancer Ther. 1:841-849, 2002
【非特許文献２５】Ling, Y.H. et al. J Biol Chem. 278:33714-33723, 2003
【非特許文献２６】Pelicano H, et al. J Biol Chem 278:37832-37839, 2003
【非特許文献２７】Huang P, et al. Nature 407:390-395, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗炎症剤を用いた大腸癌の予防効果については、多くの論文があり、今後の臨床応用の期待が高まっている。特に遺伝的に大腸癌になるリスクの高い健常人に予防的に経口投与することが期待されており、実際にその有効性は証明されている。しかし、癌治療薬としては、抗炎症薬単独における効果が弱いことなどから臨床応用の可能性は困難とみなされてきた。また、プロテアソーム・インヒビターは既に多発性骨髄腫などの造血器腫瘍において米国で認可され、その高い有効性が認められたが、 必ずしも固形癌に有効な効果が認められているとは言い難い。インビトロの結果からも抗腫瘍効果に要するプロテアソーム・インヒビターの有効濃度は数倍必要であることが判明している。したがって、ヒトへの投与においても抗腫瘍効果を期待するためには投与量が数倍必要と思われるが、造血能への副作用が危惧され臨床実施は困難であるのが現状である。本発明の課題は、安全性が高く、かつ細胞内活性酸素誘発作用やアポトーシス誘導作用に優れた癌治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、プロテアソーム・インヒビター単独投与では、十分な効果の得られない疾患群に、もしくはプロテアソーム・インヒビターのさらなる抗腫瘍効果を期待して、抗炎症剤であるスリンダク及びこの代謝産物であるスリンダックスルフィド、スリンダックスルホンとを併用すると、各種癌細胞に酸化ストレスが増大し、このことが酸化的DNA傷害の増大を惹起し、抗腫瘍効果を相乗的に高めることが可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とする癌治療用組成物（請求項１）や、非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項１記載の癌治療用組成物（請求項２）や、プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項１又は２記載の癌治療用組成物（請求項３）や、癌が、非ステロイド系抗炎により活性酸素の増加効果を示す癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の癌治療用組成物（請求項４）や、非ステロイド系抗炎により活性酸素の増加効果を示す癌が、大腸癌、胃癌などの消化器腺癌、口腔癌、肺癌、子宮頚癌などの扁平上皮癌、メラノーマ、又は骨髄腫、リンパ性白血病などの血液癌であることを特徴とする請求項４記載の癌治療用組成物（請求項５）や、請求項１〜５のいずれか記載の癌治療用組成物を投与することを特徴とする癌の治療方法（請求項６）に関する。
【０００８】
また本発明は、非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とする細胞内活性酸素誘発剤（請求項７）や、非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項７記載の細胞内活性酸素誘発剤（請求項８）や、プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項７又は８記載の細胞内活性酸素誘発剤（請求項９）に関する。
【０００９】
さらに本発明は、非ステロイド系抗炎症剤とプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有することを特徴とするアポトーシス誘導剤（請求項１０）や、非ステロイド系抗炎症剤が、スリンダク又はその代謝産物であるスリンダックスルフィド若しくはスリンダックスルホンであることを特徴とする請求項１０記載のアポトーシス誘導剤（請求項１１）や、プロテアソーム・インヒビターが、Bortezomibであることを特徴とする請求項１０又は１１記載のアポトーシス誘導剤（請求項１２）に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、単独投与では有効な抗癌作用を示しえない二つの薬剤（スリンダクなどのＮＳＡＩＤｓとＰＳ−３４１などのプロテアソーム・インヒビター）を組み合わせて、相乗作用を惹起し、不可能と思われてきた大腸癌や扁平上皮癌などの固形癌においても、十分な治療効果が生じせしめることが可能となる。また、従来の抗癌剤の多くは、ＤＮＡ合成を阻害するものがほとんどであることから、本発明の二種類の併用による治療のメカニズムは活性酸素量を増やし酸化ストレスを増大させることによって、癌細胞をアポトーシスに陥らせるという異なったものということができる。このように、特異な作用機序による抗腫瘍効果であることから、従来の化学療法が無効、もしくは難治性となった癌種であっても、治療効果を発揮しうることが期待できるため、固形癌における治療戦略に新たな手段の一つを提供することができる。さらに、癌細胞は一般的に代謝が亢進された状態にあり、活性酸素のレベルも正常細胞に比して高いことが知られている(非特許文献２６、２７参照）ことから、酸化ストレスによる癌治療は正常細胞への障害を与えずに癌細胞のみを選択的にアポトーシスに陥らせることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の癌治療用組成物や、細胞内活性酸素誘発剤や、アポトーシス誘導剤としては、ＮＳＡＩＤｓとプロテアソーム・インヒビターとを有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、上記ＮＳＡＩＤｓとしては、イブプロフェン、フェノプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセン、トルメチン、スリンダク、セレコキシブ、ロフェコキシブ、インドメタシン、メフェナム酸、ケトロラック、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、ゾメピラック、アスピリン、カルプロフェン、サリチル酸コリン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、トロメタモール、ジフルニサル、ナブメトン、ニメスリド、タポキサリン、フロスリド等や、これらＮＳＡＩＤｓの塩、誘導体、代謝物を挙げることができるが、中でもスリンダクやその代謝産物であるスリンダックスルフィドやスリンダックスルホンを好適に例示することができる。さらに、本発明に基づいて活性酸素誘発効果をもつように改変されたＮＳＡＩＤｓの誘導体は、より好ましい組成物となる。これらＮＳＡＩＤｓは、市販品として、あるいは文献記載の方法により調製することにより、入手することができる。以下に、スリンダックの構造式を示す。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
また、上記プロテアソーム・インヒビターとしては、ＰＳ−３４１、Ｚ−Ｉｉｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（ＰＳＩ）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨＯといったプロテアゾーム阻害作用を有するペプチド、さらにペプチジルアルデヒド、ビニルスルホン、α',β'−エポキシケトン、ペプチドボロン酸、ラクタスチン等や、これらプロテアソーム・インヒビターのアナログを挙げることができるが、中でもＰＳ−３４１やＰＳＩを好適に例示することができる。これらプロテアソーム・インヒビターは、市販品として、あるいは文献記載の方法により調製することにより、入手することができる。以下に、ＰＳ−３４１の構造式を示す。
【００１４】
【化２】
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【００１５】
本発明の癌治療用組成物が有効な癌としては、ＮＳＡＩＤｓにより活性酸素の増加効果を示す癌、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、メラノーマ、グリオーマ、骨肉腫、骨髄腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、悪性リンパ腫や白血病等の造血器腫瘍が挙げられるが、なかでも大腸癌、胃癌などの消化器腺癌、口腔癌、肺癌子宮頚癌などの扁平上皮癌、メラノーマ、又は骨髄腫、リンパ性白血病などの血液癌を好適に例示することができる。本発明の癌治療用組成物は、ＮＳＡＩＤｓにより活性酸素の増加効果を示さない癌、例えば子宮癌に対しては余り有効といえない。したがって、ＮＳＡＩＤｓが癌細胞で活性酸素の増加効果を現すか否かを活性酸素の定量によって調べることにより、治療効果がえられる癌であるか否かを予知することが可能となる。
【００１６】
本発明の癌治療用組成物を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００１７】
経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤にはエタノール等にて溶解後生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。
【００１８】
本発明の癌の治療方法は、上記本発明の癌治療用組成物を投与する癌の治療・予防方法に関するが、本発明の癌治療用組成物の投与量は、癌の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができるが、有効成分であるＮＳＡＩＤｓとプロテアソーム・インヒビターとを同時に投与することが好ましいが、必ずしも抗腫瘍効果を発揮するのに同時投与する必要はない。例えば、有効成分であるＮＳＡＩＤとしてのスリンダク及びプロテアソーム・インヒビターとしてのＰＳ−３４１を成人に投与する場合、通常１回量としてスリンダクは約２０〜４００ｍｇ、好ましくは５０〜２００ｍｇであり、ＰＳ−３４１は約０．２〜１０ｍｇ、好ましくは１〜５ｍｇであり、この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。投与間隔は、連日投与後、休薬期間を設けることが望ましいが、ＰＳ−３４１の場合、週２回程度の投与が好ましい。
【００１９】
本発明の細胞内活性酸素誘発剤やアポトーシス誘導剤は、インビボ、インビトロ、エクスビボで使用可能であり、インビボやエクスビボでの使用は、癌の予防・治療に有用であり、インビトロでの使用は、細胞内活性酸素の発生、アポトーシスの発生、癌の発生のメカニズムを解明する上で有用であるとともに、この結果から本発明による治療薬の有効性を予測することが可能となる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
［ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１における併用療法の効果］
（１）細胞内活性酸素量に対する効果
供試細胞であるヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１はＪＣＲＢ（Japanese Cancer Research Resources Bank；東京、日本）から入手した。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１のＮＳＡＩＤｓスリンダック（ＳＵＬ）、スリンダックスルフィド（ＳＵＤ）、スリンダックスルフォン（ＳＵＦ）、ＣＯＸ−２選択的ＮＳＡＩＤであるＮＳ−３９８、抗癌剤である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、Sigmaより購入した。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１を培養しているＲＰＭＩ６４０培養液（１０％仔牛血清を含む）中に、ＳＵＬ、ＳＵＤ、ＳＵＦ、ＮＳ−３９８又は５−ＦＵを添加し、２０時間後に１０μＭのcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡ（5-(and-６)−carboxy−2', 7'−dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy−H2DCFDA）C−400；molecular Probes）を３０分間ロード（細胞内に取りこませる）し、洗浄後さらに４時間、これまでと同一の培養液で培養を継続し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ＦＬ１）を用いて細胞内活性酸素量に与える反応性を調べた（carboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡは、細胞内で酸化されると緑の蛍光物質に変化するためこれをＦＬ１で検出した。）。
【００２２】
結果を図１に示す。０．５ｍＭ ＳＵＬ，０．１ｍＭ ＳＵＤ又は０．２ｍＭ ＳＵＦ添加後２４時間における活性酸素量の測定結果を図１左上に、１０μＭ ５−ＦＵ又は０．２ｍＭ ＮＳ−３９８添加後の活性酸素量の測定結果を図１右上に、０．５ｍＭ ＳＵＬ添加後の活性酸素量の経時的測定結果を図１左下に、それぞれ示す（薬剤処理が４時間以内のものは、carboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡをロードした後に薬剤を添加して測定）。また、０．２５〜１ｍＭ ＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量の測定結果を図１右下に示す。
【００２３】
その結果、ＳＵＬは添加後１２時間〜２４時間にピークとなる一過性の細胞内活性酸素量増加作用を有し、またその増加量はＳＵＬの用量依存的であった。一方、抗癌剤５−ＦＵやＣＯＸ−２選択的阻害作用を有するＮＳＡＩＤであるＮＳ−３９８にはこのような効果が認められなかった。
【００２４】
（２）細胞死誘導におけるプロテアゾーム阻害剤との併用効果
ＤＬＤ−１細胞を培養しているＲＰＭＩ６４０培養液（１０％仔牛血清を含む）中に、ＳＵＬ、ＳＵＤ、ＳＵＦ、ＮＳ−３９８又は５−ＦＵを添加し、４８時間後にトリパンブルー染色排出能によって細胞死を評価した。すなわち、トリパンブルー染色で青色に染色された細胞を死細胞とし光学顕微鏡を用いて計測した。さらに細胞死の解析としてアネキシンＶとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によるニ重染色によってアポトーシスか否かの検討を行った。すなわち、アポトーシス細胞を同定するため、Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit(ＭＢＬ)を使用し、１×１０6の細胞をＧＦＰ−アネキシンＶに３０分反応後、洗浄し、さらにＰＩに１５分反応させ、フローサイトメトリーを用い解析した。また、両者の必要量を詳細に検討するためにコロニーアッセイを行った。３０００個のＤＬＤ−１細胞を６０ｍｍシャーレにまき、様々な濃度のＳＵＬ及びＰＳ−３４１を添加しコロニー形成数を約９日後に数えた。
【００２５】
トリパンブルー染色排出能による細胞死の結果を図２に示す。その結果、プロテアゾーム阻害剤ＰＳ−３４１（２０ｎＭ）添加後４８時間において約１７％の細胞死が生じるが、０．５ｍＭ ＳＵＬを同時に添加することによって、約８０％の細胞死が生じることがわかった。０．５ｍＭ ＳＵＬ単独では約６％の細胞死が生じるのみでコントロールと同等と思われる。同様に０．１ｍＭ ＳＵＤ又は０．２ｍＭ ＳＵＦの併用によって、約４０〜５０％の細胞死が生じる。一方、活性酸素増加効果の認めない１０μＭ ５−ＦＵ又は０．２ｍＭ ＮＳ−３９８ではこのような細胞死の増強効果を認められなかった。
【００２６】
また、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムによるニ重染色の結果を図３に示す。その結果、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとの二重染色によってプロテアゾーム阻害剤ＰＳ−３４１（２０ｎＭ）と０．５ｍＭ ＳＵＬ併用療法によってアポトーシスが増加していることが明らかになった。さらに、コロニーアッセイの結果を図４に示す。その結果、コロニー形成能試験によってＰＳ−３４１（８ｎＭ）添加においても、０．０８ｍＭ ＳＵＬを併用することによって、コロニー形成がほぼ完全に阻害されることが判明した。
【００２７】
（３）併用療法の細胞内活性酸素量の増加効果
ＤＬＤ−１細胞におけるＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用による活性酸素量を、carboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。結果を図５に示す。ＰＳ−３４１（２０ｎＭ）自体も活性酸素量を増加させるが、その量はＳＵＬに比較してわずかであり、４８時間後にようやく明らかな増加が認められた（図５上）。しかし、０．５ｍＭ ＳＵＬ併用することによって、３６時間後においても著明に活性酸素の量が増加することが明らかになった（図５下）。
【００２８】
（４）細胞内酸化ストレスにおける併用療法の増強効果
細胞内酸化ストレスを評価するために、一般的なウエスタンブロット法（ＨＯ−１はトランスダクションラボラトリー社の抗体を用いた。また蛋白量の評価のために熱ショック蛋白７０の発現量もサンタクルーズ社の抗体を用いて評価した）により検討した。また、ＨＯ−１発現誘導に関わるストレスキナ−ゼ蛋白の活性化についてもウエスタンブロット法（ｐ３８、ＪＮＫ、及びそれらのリン酸化抗体はセルシグナリング社、及びサンタクルーズ社の抗体を用いて評価した）により検討した。すなわち、細胞抽出液を電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写後ブロッキングし、各１次抗体（抗Heme Oxygenage-1抗体、抗hsc-70抗体、抗p38抗体、抗phospho-p38抗体、抗ＪＮＫ抗体、抗phospho-JNK抗体）と４℃、一晩反応させ、その後適切な２次抗体（horseradish peroxidase (ＨＲＰ)標識抗マウス又は家兎ＩｇＧ抗体）と室温１時間反応させ、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムを用いてシグナルを検出した。
【００２９】
結果を図６に示す。ＳＵＬ単独では明らかなＨＯ−１の発現誘導は生じないが、ＰＳ−３４１単独添加後２４時間において発現の増加を認め、さらに両者の併用では明らかに発現誘導の増強効果があった（図６上）。同様にＳＵＤ及びＳＵＦにおいても発現誘導の増強効果を認め、一方、ＮＳ−３９８及び５−ＦＵでは、増強効果を認めなかった（図６中）。スリンダック及びＰＳ−３４１併用において、ｐ３８及びＪＮＫのリン酸化が亢進し両者の活性化が著明に生じていた（図６下）。
【００３０】
（５）スカベンジャー Ｎ−アセチルシステイン（Ｌ−ＮＡＣ）による併用療法の阻害効果Ｌ−ＮＡＣ（Sigma）は、活性酸素をグルタチオンペロキシダーゼの機能亢進によって低下させることが知られている。そこで、１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣ添加による併用療法の細胞死誘導に与える影響を調べた。結果を図７に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法による細胞死誘導が、Ｌ−ＮＡＣによってほぼ完全に阻害された。このことは、図８に示すように、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとの二重染色によるアポトーシスの検討においても著明に抑制された。また併用療法後４８時間における活性酸素量も著明に減少した（図８右上）。
【００３１】
（６）併用療法によって生じるＤＮＡ傷害の増強効果
ＤＮＡ傷害を一般的なウエスタンブロット法（ＨＯ−１はトランスダクションラボラトリー社の抗体を用いた。リン酸化ヒストンＨ２ＡＸに対する抗体はＵＢＩ社、また熱ショック蛋白７０に対する抗体はサンタクルーズ社の抗体を用いて評価した）により検討した。
【００３２】
ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法による酸化ストレス及びＤＮＡ傷害への影響とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果の結果を図９に示す。図９からわかるように、ＰＳ−３４１（２０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加２４時間後において細胞内酸化ストレスの増加（ＨＯ−１の発現亢進）に伴ってヒストンＨ２ＡＸのリン酸化が起こっているのに対し、単独添加では顕著な効果を認めなかった。このことは、酸化ストレスによってＤＮＡ傷害が生じていることを示唆している。
【００３３】
また、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法よって生じる酸化的ＤＮＡ傷害（８−oxoguanine）とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果を調べた。酸化的ＤＮＡ損傷の解析には、Oxidative DNA Damage Assay Kit(Kamiya Biomedical Company)を使用した。 8-oxoguanineの有無をフローサイトメトリーにて解析することにより酸化的ＤＮＡ損傷の程度を確認した。結果を図１０に示す。図１０からわかるように、酸化ストレスに特異的に見られる８−oxoguanineを検出すると単独にても増加しているが、併用療法でさらに増加しており、これらの増加はＬ−ＮＡＣでほぼ完全に抑制されていた。
【００３４】
さらに、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法よって生じる酸化的ＤＮＡ傷害（８−deoxyguanine）とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果を調べた。酸化的ＤＮＡ損傷の解析には、リン酸化Ｈ２ＡＸ及び８−deoxyguanineに対する特異的な抗体を使用し、共焦点顕微鏡（ZEISS社, Pascal）を用いて観察した。 結果を図１１に示す。上段は、リン酸化Ｈ２ＡＸを示された処理後に観察したものであり、下段は、リン酸化Ｈ２ＡＸとともに8-deoxyguanineの有無を同一細胞において観察したものである。図１１からわかるように、併用療法で明らかにリン酸化Ｈ２ＡＸが増加し、この細胞では、酸化ストレスに特異的に見られる８−deoxyguanineも強く検出された。さらに、これらの増加はＬ−ＮＡＣでほぼ完全に抑制されていた。
【００３５】
また、ＰＳ−３４１以外のプロテアソ−ム・インヒビターにおける効果をみるために、前述したＰＳ−３４１のかわりにＰＳＩを使用しＳＵＬとの併用療法をこれまで示されたと同様に、検討した。結果を図１２に示す。図１２からわかるように、ＰＳＩによってもＰＳ−３４１と同等な細胞死の増加が認められた。このことは、多くのプロテアソ−ム阻害剤がＳＵＬとの併用療法に利用できることを示している。
【実施例２】
【００３６】
［ヒト大腸癌細胞ＢＭ３１４における併用療法の効果］
実施例１に示されるＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法の効果を他の大腸癌細胞ＢＭ３１４についても検討した。ＪＣＲＢから入手したＢＭ３１４を用いて、実施例１と同様に、２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ及び１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣの添加後４８時間における細胞死、添加後２４時間における活性酸素量及び酸化ストレス関連蛋白の発現を調べた。結果を図１３に示す。その結果、添加４８時間後において明らかな細胞死の増加（図１３左）を、また添加２４時間後において明らかな活性酸素の増加（図１３中）及び酸化ストレスの増加（図１３右）が認められた。さらにＬ−ＮＡＣによって併用療法がもたらす細胞内酸化ストレス（ＨＯ−１発現亢進、ｐ３８及びＪＮＫのリン酸化）が著明に抑制されていた。したがって、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法の効果は、ＢＭ３１４においてもＤＬＤ−１と同等に奏されることがわかった。
【実施例３】
【００３７】
［ヒト大腸癌細胞ＣＯＬＯ２０１における併用療法の効果］
実施例１に示されるＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法の効果を他の大腸癌細胞ＣＯＬＯ２０１についても検討した。ＪＣＲＢから入手したＣＯＬＯ２０１を用いて、実施例１と同様に、２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ及び１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣの添加後７２時間における細胞死、添加後４８時間における活性酸素量及び酸化ストレス関連蛋白の発現を調べた。結果を図１４に示す。その結果、添加７２時間後において明らかな細胞死の増加（図１４左）を、また添加４８時間後において明らかな活性酸素の増加（図１４中）及び酸化ストレスの増加（図１４右）が認められた。さらにＬ−ＮＡＣによって併用療法がもたらす細胞内酸化ストレス（ＨＯ−１発現亢進、ｐ３８及びＪＮＫのリン酸化）が著明に抑制されていた。したがって、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法の効果は、ＤＬＤ−１と同様に、ＣＯＬＯ２０１においても奏されることがわかった。
【実施例４】
【００３８】
［ヒト口腔内扁平上皮癌細胞ＳＡＳ，ＯＳＣ２０及びＨＳＣ−２における併用療法の効果］
大腸癌は腺癌であるが他の癌種として扁平上皮癌も高頻度にみられる。ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法がこの扁平上皮癌に対しても同様の効果を示すか否かを３種類の細胞株を用いて検討した。３種類の細胞株（ヒト口腔内扁平上皮癌細胞ＳＡＳ，ＯＳＣ２０及びＨＳＣ−２）は、ＪＣＲＢから入手した。
【００３９】
（１）細胞内活性酸素量に対する効果
０．２５ｍＭ ＳＵＬをＳＡＳ又はＨＳＣ−２細胞に添加、また０．５ｍＭ ＳＵＬをＯＳＣ２０細胞に添加後、２４時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。結果を図１５に示す。その結果、いずれの細胞株に対しても、ＳＵＬ添加２４時間後において明らかな細胞内活性酸素量の増加を認めた（図１５；太い実線）。
【００４０】
（２）併用療法の細胞死誘導能
ＰＳ−３４１（１０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．２５ｍＭ）をＳＡＳ細胞及びＨＳＣ−２細胞に、ＰＳ−３４１（２０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．５ｍＭ）をＯＳＣ２０細胞にそれぞれ添加し、添加４８時間後における細胞死をトリパンブルー染色排出能によって評価した。結果を図１６に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用により、添加４８時間後において明らかな細胞死の増加効果を認めた（図１６；黒棒）。したがって、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法は、扁平上皮癌においても大腸癌と同様の効果を奏することがわかった。
【実施例５】
【００４１】
［マウスＢ１６メラノーマ癌細胞における併用療法の効果］
次に、宿主がマウスの場合、またメラノーマに対してもＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法が同様の効果を示すか否かについて検討した。ＪＣＲＢから入手したマウスメラノーマＢ１６細胞に０．１又は０．５ｍＭのＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。結果を図１７（左）に示す。その結果、ＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加２４時間後において明らかな細胞内活性酸素量の増加を認めた（太い実線）。また、Ｂ１６細胞にＰＳ−３４１（２０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加３６時間後における細胞死をトリパンブルー染色排出能によって評価した。結果を図１７（右）に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用は明らかに細胞死誘導の増強効果を示した（灰色棒と黒棒）。したがって、マウスのメラノーマに対しても併用療法が有効であることがわかった。
【実施例６】
【００４２】
［ヒトリンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔにおける併用療法の効果］
リンパ性白血病細胞Ｊｕｒｋａｔに対しての併用療法の効果を検討した。ＪＣＲＢから入手したＪｕｒｋａｔ細胞に０．１又は０．５ｍＭのＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。結果を図１８（左）に示す。その結果、ＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加２４時間後において明らかな細胞内活性酸素量の増加を認めた（太い実線 ０．５ｍＭ；細い実線 ０．１ｍＭ）。また、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＰＳ−３４１（１０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．２５ｍＭ）添加３６時間後における細胞死をトリパンブルー染色排出能によって評価した。結果を図１８（右）に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用は明らかに細胞死誘導の増強効果を示した（黒棒）。したがって、リンパ性白血病細胞に対しても併用療法が有効であることがわかった。
【実施例７】
【００４３】
［ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５における併用療法の効果］
ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５に対しての併用療法の効果を検討した。ＪＣＲＢから入手したＭＫＮ４５細胞に０．１又は０．５ｍＭのＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。結果を図１９（左）に示す。その結果、ＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加２４時間後において明らかな細胞内活性酸素量の増加を認めた（太い実線 ０．５ｍＭ；細い実線 ０．１ｍＭ）。また、ＭＫＮ４５細胞にＰＳ−３４１（２０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．５ｍＭ）添加４８時間後における細胞死をトリパンブルー染色排出能によって評価した。結果を図１９（右）に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用は明らかに細胞死誘導の増強効果を示した（黒棒）。したがって、ヒト胃癌細胞に対しても併用療法が有効であることがわかった。
【実施例８】
【００４４】
［ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａにおける併用療法の効果］
ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａに対しての併用療法の効果を検討した。ＪＣＲＢから入手したＨｅＬａ細胞に０．２５ｍＭのＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量を、carboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した結果を図２０（左）に示す。その結果、ＳＵＬ（０．２５ｍＭ）添加２４時間後において明らかな細胞内活性酸素量の増加を認めなかった。また、ＭＫＮ４５細胞にＰＳ−３４１（１０ｎＭ）及びＳＵＬ（０．２５ｍＭ）添加４８時間後における細胞死をトリパンブルー染色排出能によって評価した。結果を図２０（右）に示す。その結果、ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用は明らかな細胞死誘導の増強効果を示さなかった（黒棒）。したがって、ＳＵＬによる活性酸素増量作用のみられないヒト子宮癌細胞に対しては、十分な併用療法の効果が得られないことがわかった。
【００４５】
［考察］
ＮＳＡＩＤであるＳＵＬとその代謝物が大腸癌細胞株において活性酸素（ＲＯＳ）を生成し、プロテアソーム・インヒビターであるＰＳ−３４１の抗腫瘍効果を高めることがわかった。この効果はＨｅｌａ細胞では見られなかったことから大腸癌により選択的にみられ、この併用療法が癌のターゲティング療法として有用であることを示している。さらにこれら薬剤はコロニー形成試験で示されたように臨床で使用できる濃度（ＰＳ−３４１の常用量投与後の最高血中濃度は、０．１―１mＭであり、またＳＵＬのそれは、１０〜２０μＭとされている）で効果があることも非常に有利である。
【００４６】
上記実施例からもわかるように、ＳＵＬとその代謝物は薬剤添加４時間後よりＲＯＳを生成することがわかった。ＲＯＳ生成の時間経過はＰＳ−３４１によるものと全く異なるため、ＲＯＳ生成機序は明らかではないが、いくつかの機序が考えられる．一つはＳＵＬがミトコンドリアの電子伝達系に作用する可能性である．これを確認するために、電子伝達系を阻害するサイクロスポリンによる影響をみたがＳＵＬによるＲＯＳ生成には明らかな効果は認められなかった。
【００４７】
ＳＵＬがＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＳＯＤ、グルタチオン ペロキシダーゼ（ＧＰＸ）、カタラーゼなどの酵素活性に作用する可能性も考えられる。以前の報告では、ＮＳＡＩＤｓがＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害する、あるいは影響を与えないなど様々であり、細胞によって異なる結果が報告されていることから、今後ＳＵＬが与えるこの活性への影響を検討すべきと思われる。また、ＳＵＬ単独によるＲＯＳ生成は一過性なものであって、細胞死を引き起こすまではいかないことから細胞毒性の少ない・Ｏ2- とＨ2Ｏ2が主に産生されている可能性がある。このことは、ＯＮＯＯ- やＨＯ・ などへの変換をＳＵＬが抑制している可能性を示唆している。さらにＳＵＬがＲＯＳのスカベンジャーであるＳＯＤ、ＧＰＸ、カタラーゼに影響している可能性も否定できない。
【００４８】
本発明者らは、ＮＳＡＩＤｓとＰＳ−３４１が大腸癌で細胞死を増強することを明らかにした。ここで重要なのはそれぞれの薬剤のＲＯＳを生成する時間の違いである。ＳＵＬにおけるＲＯＳ生成のピークは１２時間でありその後徐々に低下し、７２時間後には全くみられなくなる。しかしＰＳ−３４１によるＲＯＳ生成は２４時間後より検出できその後徐々に増加する。これらを併用することによりＲＯＳを高濃度に維持することができ、酸化ストレスを強めることにより細胞死を増強すると考えられる。
【００４９】
さらにＰＳ−３４１単独にても酸化的ＤＮＡ障害がおこるがＳＵＬでみられたようなＲＯＳの生成はみられないことから、ＰＳ−３４１によるＤＮＡ障害はＲＯＳの産生亢進によるものと異なる機序が関与している可能性もある。実際ＰＳ−３４１がＤＮＡ修復酵素活性を抑制するとの報告もあり、ＰＳ−３４１単独で8-oxoguanineもしくは8-deoxyguanineの量が増えていることから、ＰＳ−３４１がＤＮＡ修復機能を阻害し、このことが酸化ストレスによるＤＮＡ障害の蓄積に関与した可能性もある。また、プロテアゾーム阻害作用に基づく分解・除去機能の抑制によって傷害をうけた蛋白質が蓄積する可能性もある。
【００５０】
ＳＵＬとその代謝物がＰＳ−３４１との併用に優れており，さらにこの効果はＳＵＦ（Sulindac sulfone）でも同様の効果があることからＣＯＸ非依存性であることがわかった。ＳＵＬによる粘膜障害などの副作用を考えると、ＳＵＦもしくはこの誘導体が最も良い併用薬になりうると考えられる。
【００５１】
ＳＵＬとその代謝物及びＰＳ−３４１の併用による細胞死の分子機序は未だ明確になっていないが、ＲＯＳ産生に依存することが明らかとなった。このことは現在使用されているＤＮＡ合成をターゲットとする抗癌剤とは全くことなるものであり、今後大腸癌等の各種癌に対する抗癌剤治療の新たなストラテジーとなるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞におけるＳＵＬ及びその代謝産物による活性酸素産生能を示す図である。左上；０．５ｍＭ ＳＵＬ，０．１ｍＭ ＳＵＤ又は０．２ｍＭ ＳＵＦ添加後２４時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。右上；１０μＭ ５−ＦＵ又は０．２ｍＭ ＮＳ−３９８添加後２４時間の活性酸素量を測定した。左下；０．５ｍＭ ＳＵＬ添加後の活性酸素量を経時的（２時間から２４時間まで）に測定した。右下；異なった濃度のＳＵＬ（０．２５から１ｍＭ）添加後２４時間における活性酸素量を測定した。
【図２】ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞におけるＳＵＬ・ＰＳ−３４１併用療法の細胞死増強効果を示す図である。図に示された各薬剤（濃度は０．５ｍＭ ＳＵＬ，０．１ｍＭ ＳＵＤ、０．２ｍＭ ＳＵＦ、１０μＭ ５−ＦＵ又は０．２ｍＭ ＮＳ−３９８）単独（白）又は２０ｎＭ ＰＳ−３４１との併用（黒）をＤＬＤ−１細胞の培養液中に添加し、４８時間後にトリパンブルー排出試験によって細胞死を評価した。
【図３】細胞死の解析としてアネキシンＶとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とのニ重染色によってアポトーシスか否かの検討結果を示す図である。アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとのニ重染色はＭＢＬ社（名古屋）のキットを用いて測定した。記載された薬剤（ＰＳ−３４１ ２０ｎＭ、ＳＵＬ ０．５ｍＭ）をＤＬＤ−１細胞の培養液中に添加後、３６時間において評価した。アネキシンＶ陽性でＰＩ陰性がアポトーシスを生じている細胞の割合を示す（％）。
【図４】ＰＳ−３４１とＳＵＬとの併用療法のコロニーアッセイによる抗腫瘍効果の検討結果を示す図である。３０００個のヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１を６０ｍｍシャーレにまき、様々な濃度のＳＵＬ（０から８０μＭ）に、０（細線）、４（破線）、又は８ｎＭ（太線）のＰＳ−３４１を添加し、コロニー形成数（２５以上の細胞集団）を約９日後に数えた。コントロール実験の結果と比較した割合を示す。
【図５】ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞におけるＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用による活性酸素量の測定結果を示す図である。上；２０ｎＭ ＰＳ−３４１添加後２４又は４８時間における活性酸素量をcarboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡを用いて測定した。下；２０ｎＭ ＰＳ−３４１及び／又は０．５ｍＭ ＳＵＬ添加後３６時間における活性酸素量を測定した。
【図６】ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞におけるＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用による酸化ストレス関連蛋白発現の変化を示す図である。上；２０ｎＭ ＰＳ−３４１及び／又は０．５ｍＭ ＳＵＬ添加後、示された３〜２４時間後のＨＯ−１蛋白の発現を検出した。中；同様に０．１ｍＭ ＳＵＤ、０．２ｍＭ ＳＵＦ、０．２ｍＭ ＮＳ−３９８、１０μＭ ５−ＦＵ及びそれらの２０ｎＭ ＰＳ−３４１との併用（＋）による２４時間後のＨＯ−１発現を検出した。下；２０ｎＭ ＰＳ−３４１及び／又は０．５ｍＭ ＳＵＬ添加後、１２時間のＪＮＫ及びＰ３８のリン酸化レベルをウエスタンブロットで検出した。各蛋白質の発現は、ＨＯ−１はトランスダクションラボラトリー社，ＪＮＫ及びｈｓｃ７０はサンタクルーズ社、リン酸化ｐ−３８、リン酸化ＪＮＫ及びｐ３８はセルシグナリング社の抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。
【図７】スカベンジャーＮ−アセチルシステイン（Ｌ−ＮＡＣ）による併用療法の阻害効果（細胞死）を示す図である。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ１細胞に２０ｎＭ ＰＳ−３４１と０．５ｍＭ ＳＵＬもしくはこれにさらに１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣ添加後、４８時間における細胞死を測定した。
【図８】スカベンジャーＮ−アセチルシステイン（Ｌ−ＮＡＣ）による併用療法の阻害効果（アネキシンＶ染色）を示した図である。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ１細胞に２０ｎＭ ＰＳ−３４１又は０．５ｍＭ ＳＵＬを示されたように添加し３６時間後に行ったアネキシンＶ染色である。アネキシンＶ陽性、PI陰性細胞がアポトーシスを生じた細胞であり、その割合を示している（％）。さらに、１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣを添加（黒棒）した場合の結果を示す。右上；２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．１２５ｍＭ ＳＵＬさらに、１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣを添加し４８時間後における活性酸素量を測定した。
【図９】ＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用療法による酸化ストレス及びヒストンH2AXのリン酸化への影響とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果を示す図である。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ又は１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣを、示されたように添加し２４時間後に細胞のライセートを抽出した。酸化ストレス蛋白ＨＯ−１の発現は、トランスダクションラボラトリー社，ＤＮＡ傷害は、Ｈ２ＡＸのリン酸化をセルシグナリング社の抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。
【図１０】ＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用療法によって生じる酸化的ＤＮＡ傷害（８−oxoguanine）とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果を示した図である。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ又は１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣを、示されたように添加し３６時間後に酸化的ＤＮＡ傷害アッセイキット（Kamiya Biomedical社）を用いて８−oxoguanineを測定した。
【図１１】ＰＳ−３４１及びＳＵＬとの併用療法によって生じる酸化的ＤＮＡ傷害（８−deoxyguanine）とＬ−ＮＡＣによるその阻害効果を、共焦点顕微鏡を用いて観察した図である。ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ又は１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣを、示されたように添加し２４時間後にメタノール固定し、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化（上段）、さらにこれと酸化的ＤＮＡ傷害の代表とされる８−deoxyguanineの二重染色をし、これを重ねた画像を示している(下段)。
【図１２】ヒト大腸癌ＤＬＤ−１細胞における併用療法の効果を示す図である。図に示された薬剤（２５ｎＭ ＰＳI、０．５ｍＭ ＳＵＬ）添加後４８時間における細胞死をトリパンブルー排出能により調べた。併用療法の結果を黒棒にて示す。
【図１３】ヒト大腸癌ＢＭ３１４における併用療法の効果を示す図である。図に示された薬剤（２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ又は１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣ）添加後４８時間における細胞死（左）、２４時間における活性酸素量（中）、及び酸化ストレス関連蛋白の発現（右）を調べた。
【図１４】ヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０１における併用療法の効果を示す図である。示された薬剤（２０ｎＭ ＰＳ−３４１、０．５ｍＭ ＳＵＬ又は１０ｍＭ Ｌ−ＮＡＣ）添加後７２時間における細胞死（左）、４８時間における活性酸素量（中）、及び酸化ストレス関連蛋白の発現を調べた。
【図１５】ヒト扁平上皮癌ＳＡＳ、ＯＳＣ２０、ＨＳＣ−２細胞における併用療法による活性酸素量の増加効果を示す図である。０．２５ｍＭ ＳＵＬをＳＡＳ又はＨＳＣ−２細胞に添加、また０．５ｍＭ ＳＵＬをＯＳＣ２０細胞に添加後、２４時間における活性酸素を測定した（太線）。carboxy−Ｈ2ＤＣＦＤＡをロードしていない細胞（灰色）またＳＵＬ非添加細胞（細線）をコントロールとして示す。
【図１６】ヒト扁平上皮癌ＳＡＳ、ＯＳＣ２０、ＨＳＣ−２細胞における併用療法による細胞死に対する効果を示す図である。１０ｎＭ ＰＳ−３４１／０．２５ｍＭ ＳＵＬをＳＡＳ又はＨＳＣ−２細胞に添加、また２０ｎＭ ＰＳ−３４１／０．５ｍＭ ＳＵＬをＯＳＣ２０細胞に添加後、４８時間における細胞死を評価した。
【図１７】マウスメラノーマＢ１６細胞における併用療法による活性酸素量（左図）及び細胞死（右図）に対する効果を示す図である。０．１（細線）又は０．５ｍＭ（太線）の各ＳＵＬ添加後２４時間における活性酸素量を測定し、非添加コントロール細胞は検出されない（黒）。右図において示された薬剤を、示された濃度添加後３６時間における細胞死を評価した。
【図１８】ヒト白血病細胞Ｊｕｒｋａｔにおける併用療法による活性酸素量（左図）及び細胞死（右図）に対する効果を示す図である。０．１（細線）又は０．５ｍＭ（太線）ＳＵＬ添加後、又は非添加後（黒）における２４時間後の活性酸素量を測定した。右図は、１０ｎＭ ＰＳ−３４１又は０．２５ｍＭＳＵＬを示された如く添加後３６時間における細胞死を評価した。
【図１９】ヒト胃癌細胞ＭＫＮ４５における併用療法による活性酸素量（左図）及び細胞死（右図）に対する効果を示す図である。０．１（細線）又は０．５ｍＭ（太線）ＳＵＬ添加後、又は非添加後（黒）２４時間における活性酸素量を測定した。右図は、２０ｎＭ ＰＳ−３４１又は０．５ｍＭ ＳＵＬを示された如く添加後４８時間における細胞死を評価した。
【図２０】ヒト子宮癌細胞ＨｅＬａにおける併用療法による活性酸素量（左図）及び細胞死（右図）に対する効果を示す図である。非添加（細線）又は０．２５ｍＭ（太線）ＳＵＬ添加後、２４時間における活性酸素量を測定した。右図は、１０ｎＭ ＰＳ−３４１又は０．２５ｍＭ ＳＵＬを示された如く添加後４８時間における細胞死を評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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