(57)【要約】【課題】  細菌細胞壁骨格成分を用いた癌免疫療法の有効性を判断するための診断マーカー及び診断方法を提供する。【解決手段】  ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン遺伝子から選択される１または複数の遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン遺伝子から選択される１または複数の遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー。
【請求項２】
細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の評価方法であって、
（１）  被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１に記載のマーカーとを結合させる工程、
（２）  請求項１に記載のマーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドの量を、該マーカーを指標として測定する工程、及び
（３）  （２）で得られる被験者の測定結果を、該癌免疫療法を開始する以前と比較し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを指標として、該免疫療法に対する応答性を評価する工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）ビタミンD結合蛋白質遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｂ）セルロプラスミン遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｃ）β−２−ミクログロブリン遺伝子に係るマーカーへの結合量が減少していること。
【請求項３】
生体試料が、血液であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンおよびβ−２−ミクログロブリンから選択される１または複数の蛋白質を特異的に認識する抗体からなる、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー。
【請求項５】
細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の評価方法であって、
（１）  被験者の生体試料から調製されたポリペプチドと、請求項４に記載のマーカーとを結合させる工程、
（２）  請求項４に記載のマーカーに特異的に結合したポリペプチドの量を、該マーカーを指標として測定する工程、及び
（３）  （２）で得られる被験者の測定結果が、該癌免疫療法を開始する以前と比較し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを指標として、該免疫療法に対する応答性を評価する工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）ビタミンD結合蛋白質遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｂ）セルロプラスミン遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｃ）β−２−ミクログロブリン遺伝子に係るマーカーへの結合量が減少していること。
【請求項６】
生体試料が、血液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法の有効性を判断するための診断マーカー及び診断方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の免疫療法剤として、微生物死菌、細菌の細胞壁骨格成分、ムラミルジペプチド（MDP）、リポ多糖（LPS）等の細菌菌体成分等からなる、BRM(biological response modifier, 生体反応修飾物質)と呼ばれる一連の物質がある。これらのうち、細菌の細胞壁骨格成分は、例えば実験的腫瘍系およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。しかも、菌体成分が鉱物油等の油状物質中に分散された場合に、特に優れた免疫賦活作用による、抗腫瘍効果や感染防御効果を示すことが知られている。菌体成分としては、例えば生菌そのものであるBCG(Bacille Calmette-Guerin)菌、またはBCG菌体を破砕して遠沈分画して得た細胞壁から調製された細胞壁骨格成分（cell-wall skeleton, CWS）、すなわちBCG-CWSが免疫療法剤として使用されている（非特許文献１を参照）。
特にBCG−CWSを用いた癌免疫療法においては、外科手術等により癌細胞をできるだけ減らしてから、化学療法または放射線照射療法等の従来からの癌治療と併用することなく、免疫療法を単独で実施することにより、従来にない優れた治療効果・再発防止効果が得られることがわかっている（特許文献１及び非特許文献２を参照）。従って、該免疫療法の効果を測る指標が重要である。
一方、BCG-CWSを用いた癌免疫療法の過程で、その有効性を判断する指標としては、インターフェロンγの血中濃度等が知られているが（特許文献１および非特許文献１を参照）、より精密な判断を行うための診断マーカーが求められていた。
【特許文献１】国際公開第９８／３９０１７号パンフレット
【非特許文献１】Hayashi, A. et al., Proc. Japan Acad., 74, Ser. B, 50-55, 1998
【非特許文献２】林  昭著、「免疫1999-2000」、220-229
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、細菌細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）を用いた癌免疫療法の有効性を判断するための診断マーカー及び診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは、癌モデル動物を用いて、BCG-CWS投与後、癌治療効果を示した動物群及び治療効果を示さなかった動物群の血液中に含まれるタンパク質を解析した。その結果、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミン及びβ−２−ミクログロブリンが、BCG-CWS投与により癌治療効果を示した動物に特異的に発現上昇又は発現低下していることがわかった。本発明は上記の知見をもとに完成するに至ったものである。
即ち本発明は、
〔１〕  ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン遺伝子から選択される１または複数の遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなる、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー、
〔２〕  細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の評価方法であって、
（１）  被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、〔１〕に記載のマーカーとを結合させる工程、
（２）  〔１〕に記載のマーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドの量を、該マーカーを指標として測定する工程、及び
（３）  （２）で得られる被験者の測定結果を、該癌免疫療法を開始する以前と比較し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを指標として、該免疫療法に対する応答性を評価する工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）ビタミンD結合蛋白質遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｂ）セルロプラスミン遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｃ）β−２−ミクログロブリン遺伝子に係るマーカーへの結合量が減少していること、
〔３〕  生体試料が、血液であることを特徴とする、〔２〕に記載の方法、
〔４〕  ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンおよびβ−２−ミクログロブリンから選択される１または複数の蛋白質のアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体からなる、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー、
〔５〕  細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の評価方法であって、
（１）  被験者の生体試料から調製されたポリペプチドと、〔４〕に記載のマーカーとを結合させる工程、
（２）  〔４〕に記載のマーカーに特異的に結合したポリペプチドの量を、該マーカーを指標として測定する工程、及び
（３）  （２）で得られる被験者の測定結果が、該癌免疫療法を開始する以前と比較し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを指標として、該免疫療法に対する応答性を評価する工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）ビタミンD結合蛋白質遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｂ）セルロプラスミン遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｃ）β−２−ミクログロブリン遺伝子に係るマーカーへの結合量が減少していること、
〔６〕  生体試料が、血液であることを特徴とする、〔５〕に記載の方法、
〔７〕  細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳであることを特徴とする、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法、
である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、細菌細胞壁骨格成分を用いる癌免疫療法において、治療効果を予測するための診断マーカー及び診断方法を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書において、細胞壁骨格成分とは、微生物由来の細胞壁骨格成分（CWS）を含む任意の成分を表し、ヒト型結核菌の死菌等の微生物死菌そのものや、ある程度単離された細胞壁骨格成分（CWS)などを含む概念である。CWSの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌などが挙げられる。「ミコバクテリア属細菌」とは、抗酸菌のミコバクテリウム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌のMycobacterium tuberculosis（結核菌）、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌、ＢＣＧ菌を含む）、Mycobacterium africanum（アフリカ菌）、Mycobacterium microti（ネズミ型結核菌）があり、この他、Mycobacterium leprae（ライ菌)、非結核性抗酸菌群であるMycobacterium kansasii、Mycobacterium avium、Mycobacterium phlei等が挙げられる。中でも好ましいものとして、マイコバクテリア属ウシ型結核菌であるBCGおよびノカルディア・ルブラを挙げることができる。
「細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）」とは、細菌を物理的に粉砕した後、除核酸、除蛋白、脱脂などの精製工程を経て、不溶性残渣として得られるものを表し、その製法は公知である（J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)  ）。
【０００７】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
以下に本発明の実施の態様について具体的に説明する。
【０００８】
本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号：1、3または5）で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体(ホモログ)、変異体及び誘導体など）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「DNA」としては、具体的には、後述のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1、3または5で示される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を挙げることができる。
【０００９】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http: // www. ncbi. nlm. nih. Gov / HomoloGene/）により同定することができる。当該遺伝子（ホモログ）は、具体的には、例えば下記のようにして取得することができる：特定のヒト遺伝子の塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http: // www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜する。
【００１０】
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
【００１１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１２】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、および変異体が包含される。ここで同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、アミノ酸配列が少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
【００１３】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１４】
本明細書において「細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法に対する応答性の診断マーカー」とは、細菌細胞壁骨格成分（細菌−CWS）による癌免疫療法を実施する癌患者において、当該療法への応答性、すなわち当該療法が有効であるか否かを判断するために利用されるものである。例えば配列番号１で示されるヒトビタミンD結合蛋白質遺伝子、配列番号３で示されるヒトセルロプラスミン遺伝子、または配列番号５で示されるβ−２−ミクログロブリン遺伝子や、前記遺伝子によりコードされる配列番号２で示されるヒトビタミンD結合蛋白質、配列番号４で示されるヒトセルロプラスミンまたは配列番号６で示されるβ−２−ミクログロブリンを特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド（オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる）または抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００１５】
本明細書において「生体試料」は、具体的には被験者の生体試料であれば特に限定は無く、血液等の体液、リンパ腺組織、担癌組織等が挙げられる。前記担癌組織とは、被験者において癌の由来組織を表す。生体試料として、好ましくは血液を用いることができる。
【００１６】
本発明は、前述するように、ビタミンD結合蛋白質（Vitamin D binding protein; 以下本明細書において、DBPと略する場合がある。）およびセルロプラスミン（Ceruloplasmin) が、細菌−CWSを投与した担癌モデル動物において、治療に対する応答性を示す個体で有意に発現上昇しており、一方でβ−２−ミクログロブリン（β-2-Microglobulin) 遺伝子が有意に発現低下していることを見出したことに基づくものである。すなわち、細菌−CWSによる癌免疫療法を実施する癌患者のうち、当該療法に対する応答性が優れている患者では、ビタミンD結合蛋白質およびセルロプラスミンが有意に発現上昇し、一方でβ−２−ミクログロブリンが有意に発現低下する。従って、これらの遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕並びにそれらの派生物（例えば、抗体など）は、細菌−CWSによる癌免疫療法を実施する癌患者における当該療法の有効性を判断する診断マーカーとして利用することができる。かかる利用によって、癌免疫療法に対する応答性を有する癌患者を選別することができる。
細菌−CWSによる癌免疫療法は、放射線治療もしくは抗癌剤等による化学療法等の癌患者の免疫力を低下させるような治療法を行うことなく、単独で実施することが好ましい。このため、細菌−CWSによる癌免疫療法に対して応答性が低い癌患者にとっては、癌細胞の増殖を抑制する化学療法などの治療法を行う機会を失うというリスクを伴う。従って、細菌−CWSによる癌免疫療法開始後、早急に当該療法の有効性を判断するために、本発明の診断マーカーは非常に有用である。
【００１７】
以下、ビタミンD結合蛋白質（Vitamin D binding protein; 以下本明細書において、DBPと略する場合がある。）遺伝子、セルロプラスミン（Ceruloplasmin) 遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン（β-2-Microglobulin) 遺伝子（これらの遺伝子をまとめて本発明遺伝子ともいう）、並びにこれらの発現産物であるビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンおよびβ−２−ミクログロブリン（以下まとめて本発明タンパク質ともいう）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００１８】
本発明の第１の態様は、細菌細胞壁骨格成分による癌免疫療法診断マーカーに関する。
(Ｉ) ポリヌクレオチド
本明細書において、ビタミンD結合蛋白質（Vitamin D binding protein; 以下本明細書において、DBPと略する場合がある。）遺伝子は特に言及しない限り、ヒト由来のビタミンD結合蛋白質遺伝子やそのホモログを包含する主旨で用いられる。本発明の配列番号１に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来のビタミンD結合蛋白質（Vitamin D binding protein; 以下本明細書において、DBPと略する場合がある。）として公知の遺伝子であり（Genbank Accession No. L10641 ）、その取得方法についても  Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 Dec;82(23):7994-8  に記載されているように公知である。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ〔例えば、マウス：AK010965  ラット：M60205〕等が挙げられる。
本明細書において、セルロプラスミン（Ceruloplasmin）遺伝子は特に言及しない限り、ヒト由来のセルロプラスミン遺伝子やそのホモログを包含する主旨で用いられる。本明細書において配列番号３に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来のセルロプラスミン（Ceruloplasmin）として公知の遺伝子であり（Genbank Accession No.M13699）、その取得方法についても、Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Jul;83(14):5086-90  に記載されているように公知である。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ〔例えば、マウス：U49430  ラット：L33869〕等が挙げられる。
本明細書において、β−２−ミクログロブリン（β-2-Microglobulin）遺伝子は特に言及しない限り、ヒト由来のβ−２−ミクログロブリン遺伝子やそのホモログを包含する主旨で用いられる。本明細書において配列番号５に示すポリヌクレオチドは、ヒト由来のβ−２−ミクログロブリン（β-2-Microglobulin）として公知の遺伝子であり（Genbank Accession No.M17987）、その取得方法についても、J Immunol. 1987 Nov 1;139(9):3132-8  に記載されているように公知である。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ〔例えば、マウス：X01838  ラット：Y00441〕等が挙げられる。
【００１９】
本発明は、癌モデル動物（モルモット）においてBCG-CWS投与後、癌治療効果を示した動物群では、ビタミンD結合蛋白質遺伝子およびセルロプラスミン遺伝子の発現量が特異的に増大しており、一方でβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現量が特異的に減少しているという知見に基づく。すなわち、ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現の有無や発現の程度を検出し、ビタミンD結合蛋白質遺伝子もしくはセルロプラスミン遺伝子の発現上昇、またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現低下を指標として、細菌−CWSによる癌免疫療法に対する患者の応答性を迅速かつ正確に判断できるという発想に基づくものである。
【００２０】
上記ポリヌクレオチドは、細菌−CWSによる癌免疫療法を実施する癌患者である被験者が、当該療法にたいする応答性を診断するためのツール（診断マーカー）として有用である。具体的には、当該ポリヌクレオチド（診断マーカー）は、被験者における本発明遺伝子の発現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用される。
【００２１】
かかる本発明の診断マーカーは、配列番号１に記載のビタミンD結合蛋白質遺伝子の塩基配列、配列番号３に記載のセルロプラスミン遺伝子の塩基配列、配列番号５に記載のβ−２−ミクログロブリンの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号1、3または5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１xSSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1xSSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、配列番号1、3または5に記載の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で診断マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で診断マーカーとして使用されてもよい。
【００２２】
本発明の診断マーカーは、具体的にはビタミンD結合蛋白質遺伝子の塩基配列に関する配列番号１、セルロプラスミン遺伝子の塩基配列に関する配列番号３、またはβ−２−ミクログロブリンに関する配列番号５に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、前記各配列番号で示される本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを特異的に（選択的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２３】
なお、ここで「特異的に認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いた場合は、ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子、β−２−ミクログロブリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法を用いた場合は、ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子、β−２−ミクログロブリン遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００２４】
そのような本発明の診断マーカーは、配列番号1、3または5で示される本発明遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
具体的にはビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子、またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の塩基配列をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００２５】
本発明で用いる診断マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００２６】
本発明において、細菌−CWSによる癌免疫療法に対する患者の応答性の診断は、被験者の生体試料、特に血液もしくはリンパ液等の体液における、ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子およびβ−２−ミクログロブリン遺伝子の少なくとも１つの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の診断マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００２７】
上記診断マーカーを、細菌−CWSによる癌免疫療法に対する患者の応答性の診断においてプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
本発明の診断マーカーは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによってビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。なお、測定対象試料としては、使用する検出方法の種類や目的に応じて、被験者の血液を採取するか、被験者の担癌組織やリンパ節組織の一部をバイオプシ等で採取することによって体外に取り出した生体試料から常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００２８】
また、被験者の生体試料における本発明遺伝子の遺伝子発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することもできる。この場合、本発明の診断マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる（例えば、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたは標識RNAとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズによって形成されたチップ上の上記プローブ（診断マーカー）と標識DNAまたは標識RNAとの複合体を、該標識DNAまたは標識RNAの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００２９】
本発明の診断マーカーは、細菌−CWSによる癌免疫療法に対する患者の応答性の診断に有用である。具体的には、被験者の生体試料におけるビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。すなわち、細菌−CWSによる癌免疫療法開始前後の本発明遺伝子の発現のあるなしの違い、または細菌−CWSによる癌免疫療法開始前の生体試料と当該免疫療法開始後の生体試料の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が1.2倍以上、好ましくは1．5倍以上、より好ましくは2倍以上、更に好ましくは3倍以上ある場合が含まれる。具体的にはビタミンD結合蛋白質遺伝子またはセルロプラスミン遺伝子は細菌−CWSによる癌免疫療法に対して応答性を有する被験者において発現誘導（増大）を示すので、当該免疫療法の前後でこれらの遺伝子発現が1.2倍以上、好ましくは1．5倍以上、より好ましくは2倍以上、更に好ましくは3倍以上多ければ、被験者は当該免疫療法に対して応答性を有すると判断できる。また、β−２−ミクログロブリン遺伝子は細菌−CWSによる癌免疫療法に対して応答性を有する被験者において発現低下（減少）を示すので、当該免疫療法の前後でこれらの遺伝子発現が1．5倍以下、好ましくは2倍以下、より好ましくは3倍以下であれば、被験者は当該免疫療法に対して応答性を有すると判断できる。
本発明において検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記本発明遺伝子のうちの2以上、好ましくは3個の遺伝子について、その発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。
【００３０】
（ＩＩ）抗体
また本発明は、癌免疫療法に対する応答性の診断マーカーとしてビタミンD結合蛋白質遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ビタミンD結合蛋白質」ともいう）、セルロプラスミン遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「セルロプラスミン」ともいう）、またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「β−２−ミクログロブリン」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００３１】
本明細書においてビタミンD結合蛋白質は、特に言及しない限り、前記ヒト由来のビタミンD結合蛋白質や、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ等が挙げられる。
本明細書においてセルロプラスミンは、特に言及しない限り、前記ヒト由来のセルロプラスミンや、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ等が挙げられる。
本明細書においてβ−２−ミクログロブリンは、特に言及しない限り、前記ヒト由来のβ−２−ミクログロブリンや、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ等が挙げられる。
ビタミンD結合蛋白質としては配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、セルロプラスミンとしては配列番号3に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、β−２−ミクログロブリンとしては配列番号5に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。
なお、配列番号1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、配列番号3に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を、また配列番号5に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
【００３２】
なお、ここで配列番号2に示すタンパク質は、ヒト由来のビタミンD結合蛋白質遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についてもMethods Enzymol. 1980;67 p449-59 又はProtein Expr Purif. 1995 Apr;6(2):185-8 に記載されるように公知である。
また配列番号4に示すタンパク質は、ヒト由来のセルロプラスミン遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献Biochem J. 1960;74 p279-87 又はBiol Pharm Bull. 2000 Dec;23(12):1406-9に記載されるように公知である。
また配列番号6に示すタンパク質は、ヒト由来のβ−２−ミクログロブリン遺伝子によってコードされる公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献Biochemistry. 1973 Nov 20;12(24):4811-22 又はFolia Biol (Praha). 1984;30(6):369-76.に記載されるように公知である。
【００３３】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本発明タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該本発明タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００３４】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンを用いて、あるいは常法に従って当該いずれかの本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリン、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。さらに、抗ヒトビタミンD結合タンパク質抗体（Biogenesis Ltd Cat#;95802710）、抗ヒトセルロプラスミン抗体（CORTEX BIOCHEM,Inc. Cat#;CR6010SP）又は抗ヒトベータ２ミクログロブリン（Research Diagnostic,Inc Cat#;RDICBL307）等の市販品を使用することもできる。
【００３５】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、後記配列表に記載する遺伝子の配列情報（配列番号1,3または5）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。具体的にはビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンは、後記配列表に記載するアミノ酸配列の情報（配列番号2,4または6）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００３６】
なお、本発明のビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンには、配列番号2,4または6に示すタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記配列番号で示されるタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／または免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、ここで配列番号2,4または6で示されるタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するタンパク質としては、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンと生化学的または薬理学的機能において同等の機能を有するタンパク質を挙げることができ、また上記タンパク質と免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンの生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００３７】
また本発明の抗体は、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンのアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
【００３８】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００３９】
本発明の抗体はビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記本発明タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンのタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００４０】
具体的には、被験者の血液を採取するか、被験者の担癌組織やリンパ節組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従ってタンパク質画分を調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによってビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンを検出することができる。
【００４１】
細菌−CWSによる癌免疫療法に対する患者の応答性の診断に際しては、被験者の生体試料におけるビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンおよびβ−２−ミクログロブリンのいずれか少なくとも１つの、当該療法の開始前後におけるこれらのタンパク質との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク質量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが1.2倍以上、好ましくは1．5倍以上、より好ましくは2倍以上、更に好ましくは3倍以上ある場合が含まれる。具体的には、ビタミンD結合蛋白質遺伝子またはセルロプラスミン遺伝子は細菌−CWSによる癌免疫療法に対して応答性を有する被験者において発現誘導（増大）を示すので、当該免疫療法の前後で該遺伝子の発現産物（ビタミンD結合蛋白質またはセルロプラスミン）が存在しており、該量が該免疫療法の前後で1.2倍以上、好ましくは1．5倍以上、より好ましくは2倍以上、更に好ましくは3倍以上多ければ、被験者は当該免疫療法に対して応答性を有すると判断できる。また、β−２−ミクログロブリン遺伝子は細菌−CWSによる癌免疫療法に対して応答性を有する被験者において発現低下（減少）を示すので、当該免疫療法の前後で該遺伝子の発現産物（β−２−ミクログロブリン）が存在しており、該量が該免疫療法の前後で1．5倍以下、好ましくは2倍以下、より好ましくは3倍以下であれば、被験者は当該免疫療法に対して応答性を有すると判断できる。
本発明において検出（診断）の精度や正確性を高めるためには、上記本発明蛋白質のうちの2以上、好ましくは3個の蛋白質について、その発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することが望ましい。
【００４２】
本発明の第２の態様は、細菌−CWSによる癌免疫療法に対する応答性の評価方法（診断方法）に関する。
本発明は、前述する本発明の診断マーカーを利用した細菌−CWSによる癌免疫療法に対する応答性の評価方法を提供するものである。
具体的には、本発明の診断方法は、被験者の血液を採取するか、被験者の担癌組織やリンパ節組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこに含まれるビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の遺伝子発現レベル、あるいはこれらの遺伝子に由来するタンパク質（ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリン）を検出し、その発現量またはそのタンパク質量を測定することにより、被験者の細菌−CWSによる癌免疫療法に対する応答性の有無またはその程度を評価するものである。以下に詳細に説明する。
【００４３】
(Ｉ) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
評価(診断）に用いる生体試料としてRNAを利用する場合は、本発明の評価方法（診断方法）は該RNA中のビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。すなわち、本発明の評価方法は次の(１)、(２)及び(３）の工程を含むものである：
（１）  被験者の生体試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１に記載のマーカーとを結合させる工程、
（２）  請求項１に記載のマーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドの量を、該マーカーを指標として測定する工程、及び
（３）  （２）で得られる被験者の測定結果を、該癌免疫療法を開始する以前と比較し、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも一つを指標として、該免疫療法に対する応答性を評価する工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）ビタミンD結合蛋白質遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｂ）セルロプラスミン遺伝子に係るマーカーへの結合量が増大していること、
（ｃ）β−２−ミクログロブリン遺伝子に係るマーカーへの結合量が減少していること。
【００４４】
ここで用いられるRNAまたはそれから更に調製されるポリヌクレオチドは、被験者から採取される血液、あるいはバイオプシ等で被験者から採取される担癌組織やリンパ節組織から常法に従って、調製することができる。
【００４５】
本発明の癌免疫療法に対する応答性の診断方法は、特に測定対象の生体試料としてRNAを利用して、該RNA中のビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の診断マーカー（ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００４６】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記診断マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中のセルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の診断マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体試料由来のRNAとハイブリダイズさせた後（工程(１)）、形成された診断マーカー（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、診断マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する（工程(２)）方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って診断マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体試料由来のRNAとハイブリダイズさせた後（工程(１)）、診断マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する（工程(２)）方法を使用することもできる。
【００４７】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記診断マーカーをプライマーとして用いることによって、RNA中のビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体試料由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の診断マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて（工程(１)）、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する（工程(２)）方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した診断マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００４８】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記診断マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体試料由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて（工程(１)）、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の診断マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する（工程(２)）方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、ビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。
【００４９】
(ＩＩ) 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の評価方法（診断方法）は生体試料中のビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、抗体に関する本発明の診断マーカー（配列番号2，4または6で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体）を用いてウエスタンブロット法などの公知方法で、ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリンを検出、定量する方法を挙げることができる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記診断マーカーを用いて測定対象タンパク質と結合させた後（工程(１)）、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、測定対象タンパク質を間接的に標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質由来のシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定する（工程(２)）ことによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記診断マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定することもできる。
【００５０】
測定対象物としてRNAを用いる場合、及びタンパク質を用いる場合のいずれも、工程(３)は下記のようにして行うことができる。
まず、被験者の血液もしくはリンパ液等の体液、担癌組織またはリンパ節組織等におけるビタミンD結合蛋白質遺伝子、セルロプラスミン遺伝子またはβ−２−ミクログロブリン遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（ビタミンD結合蛋白質、セルロプラスミンまたはβ−２−ミクログロブリン）の量を、細菌−CWSによる癌免疫療法を実施する前後で比較し、両者の違いを判定する。
【００５１】
ここで、「該療法を実施する以前」とは、該療法を開始する直前、具体的には細菌−CWSの初回接種時、または１〜7日前を示し、通常は被験者自らの測定値を用いる。あるいは、「該療法を実施する以前の測定値」として被験者以外の測定値を用いることも可能であり、その場合は、複数（少なくとも２、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の、癌免疫療法を実施していない被験者と同一種類の癌に罹患している複数の患者、又は癌に罹患していない健常人における、前記工程（１）および工程（２）に基づく測定値の平均値もしくは統計的中間値を、「該療法を実施する以前」の値として採用することもできる。
【００５２】
本発明の評価方法の実施時期としては、細菌−CWSの２回以上接種した後であって直前の接種から16〜24時間が挙げられ、好ましくは4回以上接種後が挙げられる。
【００５３】
次いで、上記判定の結果に基づいて細菌−CWSによる癌免疫療法に対する応答性の有無を判断する。被験者が、応答性を有するかどうかの判断は、具体的には該被験者の生体試料における前記ビタミンD結合蛋白質遺伝子またはセルロプラスミン遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるビタミンD結合蛋白質またはセルロプラスミンの量が、癌免疫療法開始以前のそれらと比較して1.2倍以上、好ましくは1．5倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上多いことを指標として行うことができる。また、被験者が、応答性を有するかどうかの判断は、該被験者の生体試料における前記β−２−ミクログロブリン遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるβ−２−ミクログロブリンの量が、癌免疫療法開始以前のそれらと比較して1.2倍以下、好ましくは1．5倍以下、より好ましくは２倍以下、さらに好ましくは３倍以下少ないことを指標として行うことができる。
ゆえに、工程(３)は、より詳細には、「工程(２)で得られた被験者の生体試料中の各遺伝子の発現レベルまたは各タンパク質の量を、これに対応する当該免疫療法開始以前の各遺伝子の発現レベルまたは各タンパク質の量と比較し、その増減を指標として被験者について当該免疫療法に対する応答性の有無を判断する工程」ということができる。
【００５４】
なお、評価（診断）の精度や正確性を高めるために、本発明遺伝子もしくは蛋白質のうち２以上、好ましくはすべての遺伝子もしくは蛋白質について、発現の有無または発現のレベル（発現量）を評価し、その結果から細菌−CWSによる癌免疫療法に対する応答性を検出（診断）することが望ましい。複数個の遺伝子もしくは蛋白質について評価する場合には、個々の遺伝子もしくは蛋白質での評価をスコア化し、総合的に癌免疫療法に対する応答性を診断することが可能である。なお、この場合、評価する遺伝子数、スコアあるいは診断基準は限定されない。
【００５５】
本発明の評価方法は、通常癌に罹患した患者に用いられるが、被験者のかわりに癌モデル非ヒト動物を用いた薬物評価試験等において当該非ヒト動物の薬物による癌治療に対する応答性を評価するために用いることもできる。すなわち、薬物を投与された癌モデル非ヒト動物が、癌免疫療法に対する応答性を有するか否かを評価することができる。
ここで用いられる薬物とは癌免疫療法剤（免疫賦活剤）であり、好ましくは細菌細胞壁骨格成分を有効成分として含有する薬物を表す。当該癌モデル非ヒト動物としては、癌細胞を静脈内もしくは皮下に注入する癌モデル非ヒト動物等が挙げられ、動物種としては、げっ歯類動物、ウサギ、イヌ等が挙げられる。げっ歯類動物としては、モルモット、マウス、ラット等が例示される。
【００５６】
以下の実施例で本発明について具体的に例を挙げて説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
モルモットline10ヘパトーマリンパ節転移モデルにおける薬理試験
１）材料
動物：日本SLC株式会社より雄性Strain 2モルモットを購入して用いた。
細胞：腹水肝臓癌細胞株line10（Rapp HJら、. J Natl Cancer Inst 41:1, 1968 ）を雄性Strain2モルモットの腹腔内に移植し、in  vivoで継代したものを用いた。
被験物質：BCG-CWSは、J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)  に記載された方法に準じて調製したものを用いた。BCG−CWS2.64gをスクワラン35.2gおよび10%エタノール／90%ヘプタン400mLの混合液に加え室温で分散した。その後、60℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、0.02w/w%ポリソルベート80水溶液924gを添加し、粗乳化（7,000rpm（逆回転）/min×5分間）を行い、さらに、36.6gの10w/w%ポリソルベート80水溶液を添加し本乳化（12,000rpm（正転）/min×10分間）を行った。最後に、1.5gの10w/w%ポリソルベート80溶液を添加混合し攪拌（7,000rpm（逆回転）×1分間）し、ポリソルベート80最終濃度を0.4w/w%に調整し、水中油型エマルジョンを得た。その後、4w/w%マンニトール水溶液3500gを添加し、4000gの最終製剤を得た。この水中油型エマルション製剤を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥製剤 1.2mgに2mLの注射用蒸留水を添加して攪拌した溶液を被験物質水縣濁液として用いた。
HANKS液：インビトロジェン社より購入したものを用いた。
純水：大塚製注射用蒸留水を用いた。
２）方法
(i)腫瘍移植
HANKS液を用いて、腫瘍細胞1 x 107個/mLの細胞浮遊液を調製した。無麻酔下で、モルモットの腹側部をバリカンで剃毛し、細胞浮遊液を26G注射針と1 mLシリンジを用いてモルモット腹側皮内に移植し（1 x 106個/0.1mL）、飼育を継続した。
(ii）被験物質投与
被験物質縣濁液（0.1ml）を、腫瘍移植日、腫瘍移植3日後および腫瘍移植6日後の計3回、または腫瘍移植日、腫瘍移植7日後および腫瘍移植14日後の計3回、モルモット腹側皮内に投与した。ただし、被験物質投与部位は、腫瘍移植同側かつ、腫瘍移植部位とは離れた部位に投与した。
（iii）プロテオーム解析用生体試料のサンプリング
被験物質3回目投与18時間後に、エーテル麻酔下にてモルモット眼窩採血（約2mL）を実施した。採取した血液を血清分離試験管を用いて、血清を分離回収した。本血清をプロテオーム解析用生体試料サンプルとした。
（iv）薬効評価
腫瘍移植28-33日後にモルモットをエーテル高濃度吸引により安楽死させ、腫瘍移植側の所属リンパ節（accessory axillary lymph node）を摘出し、微量天秤(METTLER製、AE200)を用いて各リンパ節の重量を測定した。また、移植癌の増殖抑制又は退縮についても観察して薬効評価を行った。
３）結果
下記に、移植した癌（原発巣）の増殖抑制・退縮効果と、リンパ節転移抑制効果について評価を行った結果を示した。A群：原発巣完全退縮(0 mm2)かつリンパ節湿重量が930 mg未満（４サンプル）
B群：原発巣の大きさが0 mm2より大きく64.8 mm2未満であり、かつリンパ節湿重量が930 mg未満（７サンプル）
C群：原発巣の大きさが64.8 mm2以上であり、かつリンパ節湿重量が930 mg未満（６サンプル）D群：原発巣の大きさが64.8 mm2以上であり、かつリンパ節湿重量が930 mg以上（１サンプル）
上記の結果から、BCG-CWS投与群のうち薬効を示した群をA群及びB群、薬効を示さなかった群をC群及びD群とした。
【実施例２】
【００５８】
プロテオーム解析
１）方法
・蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法（2D-DIGE）
BCG-CWS投与群のうち薬効を示した群から６サンプルの血清（A群及びB群）と、薬効を示さなかった群から４サンプルの血清（C群及びD群）を使用する。これらの血清サンプルを、Cibacron Blue樹脂でアルブミンを除去する。アルブミンを除去したサンプルは、最終濃度８０％になるようアセトンを添加し、−２０℃で１時間放置した。その後、４℃、１２０００回転で１０分間遠心して沈殿を回収した。この沈殿に、冷却した８０％アセトンを加え、懸濁した後、−２０℃で１時間放置した。その後、４℃、１２０００回転で１０分間遠心して沈殿を回収した。沈殿したサンプルに、適当量の蛍光色素ラベル化用バッファー（８M尿素、４％CHAPS、50mM Tris-HCl pH8.0）を添加して再懸濁を行った。このサンプルは、プロテインアッセイリージェント（バイオラッド社）でタンパク定量を行った。
得られたサンプルは、50マイクログラムづつを混合し、50マイクログラム当たり20nmols のTCEP 「（Tris-(2-carboxyethyl)phosphine）  , hydrochloride」を添加し、 ３７℃で１時間反応させる。この工程によって、システイン残基のS-S結合を切断する。その後、タンパク質50マイクログラムに対し40nmolsのCy3（サチュレーションラベリング、マレイミドタイプ  アマシャムバイオサイエンス社製）を添加して３７度で３０分反応させ、システインのチオール基を標識する。一方、各々のサンプルについては、上記と同様にCy5にて標識を行う。標識後、同量の反応停止バッファー（８M尿素、４％CHAPS、20mg/ml DTT、2%IPGバッファー）を添加し、氷上で１５分間放置し反応を停止する。反応停止後、Cy5で標識した各々のサンプルに対し、Cy3で標識した混合サンプルを等量加える。その後、等電点電気泳動用の泳動バッファー（８M尿素、４％CHAPS、2mg/ml DTT、1%IPGバッファー）で350μｌにする。これを、イモビラインストリップ１８ｃｍ/ｐH4-7（アマシャムバイオサイエンス社製）に終夜、膨潤させる。膨潤させたストリップを、マルチフォアＩＩ（アマシャムバイオサイエンス社製）で等電点電気泳動展開を行う。展開条件としては、温度は２０℃、電流は2mAに設定し、電圧は500Vで１時間、1000Vで１時間、1500Vで１時間、2000Vで1時間、2500Vで１時間、3000Vで１時間展開した後、3500Vで終夜展開させた。
等電点電気泳動展開が終了したストリップは、平衡化バッファー（８M尿素、100mM Tris-HCl pH8.0、5mg/ml DTT、30%グリセロール）で15分間緩やかに振盪した。平衡化の終わったストリップは、第一化学社のゲルのウェルに乗せ、1%アガロースで固定化した。Iso-DALT泳動装置（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて、温度10℃、120Vの定電圧で終夜泳動を行った。翌日、300Vに電圧を上げフリーのCy試薬が泳動先端から出るまで泳動を行った。
泳動が終了したゲルは、2920-2Dマスターイメージャー（アマシャムバイオサイエンス社）でスキャンを行った。Cy3ラベルイメージは、Ex540nm、Em590nmで、Cy5ラベルイメージはEx620nm、Em680nmでスキャンを行った。
まず最初に、スキャン時間はCy3で200msec、Cy5は100msecで行い、得られたピクセル強度の最大のスポットを、約65000ピクセルになるようスキャン時間を調整し、再度スキャンを行った。得られたイメージは、16ビットのtifフォーマットで保存した。スキャンの終了したゲルは、１０％メタノール、１０％酢酸溶液中で保存した。
比較解析は、Decyderソフト（アマシャムバイオサイエンス社）で行った。ソフトにある統計解析で、薬効を示した群と薬効を示さなかった群について比較解析を行い、有意に変動（P＜0.05）しているスポットを選択した。
選択したスポットは、Ettanスポットピッカー（アマシャムバイオサイエンス社）にて切り出しを行った。
切り出したスポットは、文献（Proteomics 2003, 3,13181324）に記載されている方法によりゲル内酵素消化を行い、LC-Q/MS分析した後得られたデータをMASCOTで解析して、同定を行った。
２）結果
蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法（2D-DIGE）によって、β−２−ミクログロブリンがC及びD群に対し、A及びB群で-1.3倍の減少していた（図１を参照）。また、上記と同様にA群とD群を用いて解析を行った場合についても、D群に対してA群ではβ−２−ミクログロブリンが有意に減少していた。
【実施例３】
【００５９】
18Oラベル化ディファレンシャルMS解析法
１）方法
まず、BCG-CWS投与群のうち薬効を示したA群の3サンプルと、薬効を示さなかったD群1サンプルを用いた。A群3サンプルをそれぞれ30μgずつ、18O水中でトリプシン消化をおこない、D群1サンプルのトリプシン消化物と等量混合（15μgずつ）し、nanoLC-MS（LCQ）で定量解析をおこなった。尚、酵素消化前に各サンプルは、90℃で10分間加熱処理をおこなった。
さらに、低分子領域に特化した解析をおこなうため、Waters社のOasis固相抽出カートリッジを用いた。A群１サンプル100μgとB群１サンプル100μgをこのカートリッジで処理後、A群サンプルを蒸留水中で、B群サンプルを18O水中でトリプシン消化をおこないnanoLC-MSで定量解析をおこなった。
また得られたペプチドは、MS/MS解析を行い、MASCOT検索によってタンパク質の同定を行った。
２）結果
18Oラベル化ディファレンシャルMS解析法によっては、ビタミンD結合タンパク質が約1.8倍の増加、セルロプラスミンが、約２倍の増加していた（表２を参照）。また、β−２−ミクログロブリンは約-2.5倍の減少していた（表３を参照）。
【００６０】
【表１】
2005176646.tif 000002
表２において、「Swiss-plot」はタンパク質配列データベース：Swiss-plotにおけるアクセッション番号を表し、A1、A2、A3はA群から選んだサンプルの各々のサンプル番号を表す。
【００６１】
【表２】
2005176646.tif 000003
表３において、「Swiss-plot」はタンパク質配列データベース：Swiss-plotにおけるアクセッション番号を表す。
【実施例４】
【００６２】
ＢＣＧ−ＣＷＳ投与患者における診断
１）方法
（被験サンプルの採取）
非小細胞肺癌の罹患が認められた癌患者に対して、原発巣を外科的に切除し手術後７〜１４日目から、前記同様の頻度でBCG-CWSの接種を継続する。BCG-CWSの接種開始後３週間後、患者の血清を採取し、BCG-CWS接種開始前の当該患者の血清サンプルの本発明の診断マーカー値の測定に供する。
（蛋白質の検出）
血清サンプル中のビタミンD結合タンパク質、セルロプラスミン、β−２−ミクログロブリンのタンパク質量を、前記、抗ヒトビタミンD結合タンパク質抗体（Biogenesis Ltd Cat#;95802710）、抗ヒトセルロプラスミン抗体（CORTEX BIOCHEM,Inc. Cat#;CR6010SP）又は抗ヒトβ−２−ミクログロブリン（Research Diagnostic,Inc Cat#;RDICBL307）等の市販の抗体を用いてELISA系を構築し、選択的に測定する事ができる。
（RNAの検出）
RNAの検出は、各マーカーに特異的なプライマーを設計し、ノーザンブロット法を用いて、検出する事が可能である。すなわち、β−２−ミクログロブリンの検出に用いるプローブは、遺伝子コード領域から制限酵素PstIのよって得られる７２１ｂｐの下記配列（配列番号７）を挙げる事が出来る。
また、セルロプラスミンの検出に用いるプローブは、遺伝子コード領域から制限酵素EcoR1によって得られる６９０ｂｐの下記配列（配列番号：８）を挙げる事が出来る。
また、ビタミンＤ結合蛋白質の検出に用いるプローブは、遺伝子コード領域から制限酵素EcoRIとBamH1によって得られる２６４７ｂｐの下記配列（配列番号：９）を用いる事も出来る。
【００６３】
（患者における治療効果の診断）
上記で測定した、血清中の診断マーカー値を治療前後で比較し、ビタミンＤ結合蛋白質及びセルロプラスミンについては治療開始後の測定値が治療開始前の測定値の1.5倍以上であれば、β−２−ミクログロブリンについては治療開始後の測定値が治療開始前の測定値の1.5倍以下であれば、BCG-CWSによる免疫療法の効果があると診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法で変動が確認されたβ−２−ミクログロブリンの結果を示す図である。「危険率」とは、薬効を示した群と示さなかった群との有意差検定を行った際の結果を表す。Decyderソフトにて解析を行ったA群およびB群の代表的なスポットを示した（青線で囲んであるスポット）。薬効を示したA群でβ−２−ミクログロブリンの発現量が減少している事が確認された。グラフでは統計処理にて解析した結果を示した。A群のスポット値の平均とB群のスポット値を、比較したところ1.4倍の変動であった。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列番号７：ノーザンブロットのためのプローブ
配列番号８：ノーザンブロットのためのプローブ
配列番号９：ノーザンブロットのためのプローブ
【図１】
2005176646.tif 000004
【配列表】
2005176646000001.app