(57)【要約】【課題】  ハイブリッドライスの多収性に関与する遺伝子の同定と利用を課題としている。【解決手段】  マイクロアレイを利用したイネ遺伝子の網羅的な解析によって、ハイブリッドライスにおいて両親に比較して強く発現しているイネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を同定した。本遺伝子を過剰発現させたイネでは、出穂以後に葉が巻く事により葉面積を確保しながら葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめることができるため受光体勢の改善をする事ができること、葉緑素の分解を抑える事でイネの光合成活性を登熟後期まで保持する事ができることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を有するベクターを導入して得られたことを特徴とする形質転換イネ。
【請求項２】
イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼを過剰発現することを特徴とするイネ。
【請求項３】
巻き葉であることを特徴とする請求項１または請求項２記載のイネ。
【請求項４】
葉緑素の退化が抑制されていることを特徴とする請求項１または請求項２記載のイネ。
【請求項５】
イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、イネを巻き葉とすることを特徴とする巻き葉形成方法。
【請求項６】
イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、イネの葉緑素の退化を抑制することを特徴とする葉緑素退化の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ１）の遺伝子及びその利用に関するものである。本発明のイネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子は多収性のハイブリッドライス「みつひかり２００３」および「みつひかり２００５」において両親に比べて発現量が増大している遺伝子としてマイクロアレイによる解析によって同定された。本遺伝子を過剰に発現させたイネでは、出穂以後に葉が巻く事により葉面積を確保しながら葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめることができるため受光体勢の改善をする事が出きる。ハイブリッドライス「みつひかり２００３」および「みつひかり２００５」においても出穂期以後に葉が巻く事が観察されている。また、本遺伝子を過剰に発現させたイネでは、葉緑素の分解を抑える事でイネの光合成活性を登熟後期まで保持する事ができる。したがって、本遺伝子をイネに導入することによって、収量に影響する形質を改善する事が可能である。
【背景技術】
【０００２】
ハイブリッド動植物は、しばしば、収量をはじめとする様々な形質において両親の能力を凌ぐことから動植物の育種に利用されている。特に植物では、トウモロコシ、トマトをはじめとする各種野菜、花卉などで広く活用されている。イネでもハイブリッド品種が開発され、「みつひかり２００３」および「みつひかり２００５」の種子は、三井化学（株）より販売されている。Dooner (Proc.Natl.Sci.USA 99:9573, 2002)は、トウモロコシのゲノムの塩基配列の解析から、染色体上の別の位置にある働きの似ている遺伝子が交配によって集積されることがハイブリッドの雑種強勢の原因ではないかと推測した。しかし、ハイブリッド化による多収化の原理は、ほとんど解明されていない。
【０００３】
イネでは、ハイブリッド化以外にも多収化のための研究が盛んに行われてきており、突然変異であるV字葉や細葉のイネは、葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめて受光体勢を良好に保つことができるため、多収イネの育種素材として研究が行われてきた（Normile,Science 283:313,1999)。
【０００４】
また、C３植物であるイネより効率の良い光合成を行うC４植物のトウモロコシのC４光合成関連遺伝子をイネに導入して光合成能力を高めようとする研究も行われている（Matsuoka et al. 2001 Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52:297）。しかし、これらの研究は、実際の多収化にはまだ結びついていない。
【０００５】
ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼは、ミトコンドリアのピルベートデヒドロゲナーゼ複合体の負の調節因子でこの複合体の活性の調節を行うことでトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルや細胞の呼吸の調節に関与していることが知られている。糖から作られたピルビン酸は、ミトコンドリアにおいてピルベートデヒドロゲナーゼ複合体によってアセチル-CoAに酸化され、ＴＣＡ回路で二酸化炭素と水に酸化されてエネルギーを供給する。しかし、細胞のエネルギーレベルが飽和すると、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼはピルベートデヒドロゲナーゼ複合体を不活可してピルビン酸はグルコース合成系などに流れる。シロイヌナズナ（アラビドプシス）では、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の発現をアンチセンス法で抑制することで開花が早まることが報告されている(Zou et al. Plant Mol. Biol. 41:837-849, 1999)。しかし、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を植物に導入して過剰発現させた場合の効果については報告されていない。また、収量性が重要な穀物におけるピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の機能解析の報告は全くない。
【非特許文献１】Dooner, Proc.Natl.Sci.USA 99:9573, 2002
【非特許文献２】Normile, Science 283:313,1999
【非特許文献３】Matsuoka et al., Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52:297, 2001
【非特許文献４】Zou et al., Plant Mol. Biol. 41:837-849, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ハイブリッドライスの多収性に関与する遺伝子の単離と利用を目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記した目的を達成するためになされたものであって、マイクロアレイを利用したイネ遺伝子の網羅的な解析によって、ハイブリッドライスにおいて両親に比較して強く発現している遺伝子をスクリーニングし、イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を同定した。さらに、本遺伝子を過剰発現させたイネでは、出穂以後に葉が巻く事により葉面積を確保しながら葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめることができるため受光体勢の改善をする事ができること、葉緑素の分解を抑える事でイネの光合成活性を登熟後期まで保持する事ができることを見出した。即ち本発明は、イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の利用に関するものであって、その塩基配列は、配列表の配列番号：３に示される。
【０００８】
すなわち、本発明はイネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼの利用に関するものであり、より具体的には、以下の態様を含む。
（１）イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を有するベクターを導入して得られたことを特徴とする形質転換イネ。
（２）イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼを過剰発現することを特徴とするイネ。
（３）巻き葉であることを特徴とする上記（１）項または（２）項に記載のイネ。
（４）葉緑素の退化が抑制されていることを特徴とする上記（１）項または（２）項に記載のイネ。
（５）イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、イネを巻き葉とすることを特徴とする巻き葉形成方法。
（６）イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を過剰発現させることにより、イネの葉緑素の退化を抑制することを特徴とする葉緑素退化の抑制方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼは、ミトコンドリアのピルベートデヒドロゲナーゼ複合体の負の調節因子でこの複合体の活性の調節を行うことでトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルや細胞の呼吸の調節に関与している。イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を葉で過剰発現させた「みつひかり２００５」の母親品種では、出穂期以後に葉が巻く現象が観察された。この現象は、元の母親品種では全く認められず、ハイブリッドライス「みつひかり２００３」および「みつひかり２００５」では認められることから、葉が巻くことがハイブリッド化による多収の原因の一つであることが示された。また、光合成活性を登熟後期まで保持する事ができることもハイブリッド化による多収の原因の一つであることが示された。ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼの過剰発現で葉が巻いたり、葉緑素の退化を抑制する理由は不明であるが、強光下で光合成活性が高まり、糖の供給過剰により細胞のエネルギーレベルが飽和した場合に、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼは、ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体を不活化して余分なエネルギー生産を抑制してピルビン酸を貯蔵物質の生産にまわすことで物質生産量を増大させる可能性があると考えられる。
【００１０】
イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼを過剰発現させる事によって葉が巻いたり、葉緑素の退化抑制が引き起こされることは、本来のその活性からは全く予測できない現象であり、本発明によって始めて明らかにされた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係るイネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼとしては、配列表の配列番号：３に記載されているアミノ酸配列を有するものが好適に利用できる。そのアミノ酸配列は、配列表の配列番号：３に記載されている塩基配列の１２番目から１１００番目までによってコードされる。また、配列番号：３のアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、本発明において目的とするピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼの過剰発現を可能とするものも本発明に利用できる。
【００１２】
本発明は、イネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼの利用に関する。本発明に用いられる配列番号：３に記載のタンパク質は、多収のハイブリッドライス「みつひかり２００３」と「みつひかり２００５」において共通してそれらの両親より発現量が高いがマイクロアレイを用いた比較実験によって明らかとなった。従って、配列番号：３に記載のタンパク質は、イネの多収性に関与するタンパク質の１つであると考えられる。ちなみに、日本で市販されているハイブリッドライスは、これら２品種だけである。
【００１３】
マイクロアレイによる遺伝子発現のモニタリングシステムは、Amersham Pharmacia Biotech社やAffymetrix社などから販売されており、目的に応じて利用する事が可能である。
【００１４】
なお、同定した遺伝子の発現は、植物からRNAを抽出して、各種遺伝子をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション法（Alwine et al. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350、Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press）で検出することが可能である。
【００１５】
また、本発明で利用されるDNAは、配列番号：３のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、cDNAの他、ゲノミックDNA、および化学合成DNAなども本発明のDNAに含まれる。ゲノムDNAは、例えば、文献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69 (1985)）記載の方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、公開塩基配列データベースのAccession No.AY026039または配列番号：３に記載の塩基配列を基に作製したプライマーを用いてPCR（Saiki et al. Science 239:487(1988)）を行うことにより調製することが可能である。また、cDNAであれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press）により植物からmRNAを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムDNAやcDNAは、常法によりゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば配列番号：３に記載の塩基配列を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。なお、得られたDNAの塩基配列は、例えば「シークエンサーModel373」（ABI社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。
【００１６】
また、本発明で利用されるベクターとしては、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のタンパク質を発現させるためのベクターが含まれる。このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などが挙げられる。
【００１７】
なお、該ベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または組織特異的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al.1993 Plant Mol. Biol. 23:567）などが挙げられる。また、組織特異的に発現させるためのプロモーターとしては、緑色組織特異的な発現をするイネのＬＨＣＰプロモーター（Matsuoka 1990 Plant Cell Physiol. 31:519）やトウモロコシのＰＥＰＣプロモーター（Matsuoka and Minami 1989 Eur. J. Biochem 181:593）などが挙げられる。
【００１８】
また、本発明は、イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を含むベクターが導入された形質転換イネに関する。
【００１９】
イネ細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al. 1993 Transgenic Res. 2:218、Hiei et al. 1994 Plant J.6:271）、エレクトロポレーション法（Tada et al. 1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri et al. 1991 Theor. Appl. Genet 81:437）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1987 J. Part. Sci. tech.5:27）などの方法を用いることが可能である。イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を含み、イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の発現を可能とする構成を有するベクター部分は、イネ細胞に導入された後、染色体の一部として取り込まれるなどのプロセスを経てイネ細胞中でのイネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼの過剰発現が生じる。
【００２０】
形質転換されたイネ細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は、例えばFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法やHiei ら（Plant J.6:271 (1994)）が挙げられる。
【００２１】
これにより得られた形質転換イネは、葉が巻く事により葉面積を確保しながら葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめることができるため受光体勢の改善をする事が出き、葉緑素の分解を抑える事でイネの光合成活性を登熟後期まで保持する事ができるため多収イネを育種するための母本として利用可能である。
【００２２】
なお、本発明において巻き葉とは、葉の表面を内側、裏面を外側としてイネの葉身が巻く現象を指す。この現象は目視による観察で容易に判別可能であるが、定量的には、巻き葉状態の葉身の中央部の幅（Ａ）と巻き葉を押し広げて測定した時の葉身の幅（Ｂ）から「巻き葉率」＝（Ｂ−Ａ）／Ｂを求めることが出来る。この値が０の場合は、葉が全く巻いていないことを示し、この値が１．０に近いほど巻き葉の程度が強いことを示す。葉緑素の退化抑制とは、登熟期以後のイネにおいて、葉の葉緑素が通常より長期間にわたり保持されて緑色を保持する現象を指す。葉緑素の測定は、非破壊的に葉緑素計（ＳＰＡＤ、オリンパス社製）、比色板などの測定機器を用いて定量することが出来る。
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。操作の手順は特に記述しない限りCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編集、John Wiley & Sons,Inc.,1987)に記載されている方法にしたがった。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
イネゲノムプロジェクトによってイネの多数の発現ｃＤＮＡ配列の断片（ＥＳＴ）の塩基配列が決定された(Yamamoto et al. Plant Mol. Biol. 35:135-144, 1997)。これらの配列から相同性検索によって１２６５個の独立したｃＤＮＡ配列を選び出し、Yazaki et al. (2000) DNA Res.7:367-370に記載の方法でイネマイクロアレイを作成した。この１２６５クローンおよびマイクロアレイの作製方法については、インターネット上のウェブサイトhttp://cDNA01.dna.affrc.go.jp/RMOS/index.htmlに詳細に記載されている。GenIII Array Spotter（Amersham Pharmacia社）を用いて、同社のプロトコールに従ってミラータイプのスライドガラス板（ｔｙｐｅ ７）上にｃＤＮＡをスポットしてイネマイクロアレーを作製した。作製したスライドグラスは、以下の前処理を行った。55℃で予熱済みの５×ＳＳＣ、0.2％ＳＤＳを用いて、マイクロアレイを55℃で２時間インキュベートした。その後、手早く滅菌蒸留水中でリンスし、引き続き、手早くイソプロパノール中でリンスし、直ちに圧縮空気（エアーダスター等）で乾かした。
（実施例２）
ハイブリッドライス「みつひかり２００３」とその両親であるＭＨＡ２３とＭＨＲ１８および、「みつひかり２００５」その両親であるＭＨＡ２５とＭＨＲ１８を同一圃場において慣行栽培し、各イネ品種から幼穂形成期の上部展開葉をサンプリングして常法によりＲＮＡを単離した。単離したｍＲＮＡ各４０μｇをＣｙ３でラベルしたｃＤＮＡとし、実施例１で作製したイネマイクロアレイにハイブリダイズさせた。ラベリング、ハイブリダイゼーション、洗浄の方法は、ウェブサイトhttp://cDNA01.dna.affrc.go.jp/RMOS/index.htmlに詳細に記載されているが、簡単に以下に示す。
【００２５】
Ａ．ｃＤＮＡの作製
２μｌ（４０μｇ）のRNA溶液を含む1.5ｍｌ チューブにAnchored oligo-(dT)25 ：2 μｌ、 Rondom Nonamer：2 μｌ、水：18 μｌを添加して70℃で5分間処理し、次に25℃で10分処理した。そのチューブに5×SSII reaction buffer：8 μｌ、0.1M DTT：4 μｌ、dNTP mix：2 μｌ、undiluted Cy3-dCTP：2 μlを加えた。次に2μｌの  SSIIを加え緩やかにピペッティングして混合した。これを42℃暗所で1時間処理してラベルされた１本鎖DNAを作製した。
【００２６】
次にRNAを除去するために、94℃で3分間インキュベートした後に2.5MNaOHを4 μｌ加えて37℃で15分間処理した。次に2MのMOPS：20μｌを加えて緩やかにピペッティングして混合した。このようにして作られたｃＤＮＡプローブをQIAquick ＰＣＲ purification Kit (Qiagen社)を使い精製した。精製後、バキュームコンセントレーター（Speedvac）で乾燥させた。
【００２７】
Ｂ．ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。
【００２８】
乾燥させたプローブを12μｌ滅菌蒸留水で溶かし、２本のチューブに６μlずつ分けた。（以下、チューブ１本分のハイブリダイゼーションのプロトコールを記す。）
６μｌの水に溶かしたプローブを95℃で4分間熱変性した後に、氷上で３０秒急冷した。ｃＤＮＡプローブに 1.5 μｌの oligo A80 ( 1ｍｇ/ｍｌ)を加え混合した。次に、70℃で45分間インキュベートした。7.5 μｌの４×マイクロアレイハイブリダイゼーション溶液 ver. 2 (Cat.No.RPK0325)と、15μｌの脱イオンホルムアミドを加え、なるべく泡を立てないようにピペッテイングして混合した。次に、スライドガラスとカバーグラス上のチリ・ホコリを、圧縮空気で除去した。プローブを、スライドグラスの短辺の近くにのせ、細いチップを用いて、徐々にカバーグラスをかぶせ、キャピラリーアクションにより、ｃＤＮＡプローブを自然に拡散させた。スライドグラスは、４２℃暗黒下で一昼夜、加湿状態でハイブリダイズさせた。
【００２９】
Ｃ．ハイブリダイゼーション後の洗浄
予め、第１洗浄液（１×ＳＳＣ, 0.2％ＳＤＳ）と第２洗浄液（0.１×ＳＳＣ, 0.2％ＳＤＳ）を55℃に暖めておき、スライドグラスをインキュベータから出し、未使用の第１洗浄液中に沈めながら、カバーグラスを取り除き、直ちに、新しい第１洗浄液で、暗黒下１０分間穏やかに振とうしながら洗浄した。次に、第２洗浄液で、暗黒下１０分間穏やかに振とうしながら洗浄した。この操作をもう一度繰り返した。次に、0.１×ＳＳＣで、室温、暗黒下１分間穏やかに振とうしながら洗浄した。この操作をもう一度繰り返した。次に、滅菌蒸留水で手早くリンスし、直ちに圧縮空気（エアーダスター等）で乾かした。
【００３０】
Ｄ．シグナルの検出
次に、スキャナーで、シグナルを検出して定量した。以下の解析は、Amersham Pharmacia社システムを利用した。スキャナーImage Quant(Molecular Dynamics社)でシグナルを検出した。得られた画像データからスポット部分を決定し、Array Visionでシグナルを定量した。得られたシグナル強度から水をスポットした部分のシグナルの平均値をバックグラウンドとして差し引いた。定量された各クローンのシグナル強度を「みつひかり２００３」とその両親であるＭＨＡ２３とＭＨＲ１８を比較し、「みつひかり２００３」で両親より４倍以上強く発現しているクローンを選んだ。さらに、「みつひかり２００５」その両親であるＭＨＡ２５とＭＨＲ１８を比較し、「みつひかり２００５」で両親より強く発現しているクローンをその中から選んだ（表１、表２）。その結果、スポット番号348番（Accession No.:C22439：DDBJ、GenBank、EMBLなどの塩基配列データベース登録番号）のクローンの発現がハイブリッドライス「みつひかり２００３」および「みつひかり２００５」においてそれらの両親より４倍以上強い事が明らかとなった。該クローンの「みつひかり２００３」、「みつひかり２００５」、その両親であるＭＨＡ２３またはＭＨＡ２５とＭＨＲ１８におけるシグナル強度を表１に示す。さらに、ノーザン解析によってもこのクローンがハイブリッドライスの葉で両親よりも強く発現している事を確認した。
【００３１】
【表１】
2005143313.tif 000002
【００３２】
【表２】
2005143313.tif 000003
次に、公開データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を利用したホモロジ−検索の結果、Accession No.:C22439 は、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の一部である事が示唆された。ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子は、ヒト、トウモロコシ（Thelen et al. 1998 J. Biol. Chem. 273:26618 ）、アラビドプシス、イネ（Accession No.AY026039：）などで単離されている。イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子は、全長ｃＤＮＡのデータベースへの登録がなされているが、その機能については解析されていない。アラビドプシスでは、ピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子の発現をアンチセンス法で抑制する事でミトコンドリアのピルベートデヒドロゲナーゼ複合体の活性が上昇した（Zou et al. 1999 Plant Mol. Biol.41:837）。また、この組換え植物では、栄養生長期間が短くなり、一世代の期間が短縮されたことが報告された。しかし、該遺伝子を高発現させた場合の効果については何ら解析されておらず、その機能はほとんどわかっていない。
【００３３】
（実施例３）
本発明者らは、イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子を単離するために、登録されている塩基配列（Accession No.AY026039）を参考に制限酵素ＳｍａＩ認識部位を付加したプライマーPDK-F1（配列番号：１）と制限酵素ＫｐｎＩ認識部位を付加したPDK-R2（配列番号：２）を設計した。次にイネ品種IR36の葉のRNAから常法によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、PDK-F1とPDK-R2をプライマーとしてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法によってイネのピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号：３）を増幅した。増幅した遺伝子は、ベクターＰＣＲ2.1-TOPO(Invitrogen社)にクローニングした後、常法により塩基配列の確認を行った。配列番号３に示す塩基配列において１２番から１１００番までの塩基配列が、イネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼをコードしている。該遺伝子をイネの緑色組織で強く発現するプロモーターであるLHCPプロモーター（特2086045、Matsuoka 1990 Plant Cell Physiol. 31:519)と発現増強因子であるヒマカタラーゼのイントロンを有するベクター(Takeuchi et al. 2000 Planta 211:265)のトウモロコシ由来リンゴ酸酵素ｃＤＮＡと置換してpCab-PDK1を構築した（図１）。本発現ベクターは、選択マーカー遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）とカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴII）を併せ持っている。また、ＬＨＣＰプロモーターとカタラーゼのイントロンを恒常的な発現をするカリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターに置き換えた発現プラスミドp35S-PDK1を構築した（図２）。
【００３４】
（実施例４）
これらのプラスミドpCab-PDK1及びp35S-PDK1をそれぞれ個々にアグロバクテリウムを介した方法（Hiei et al. 1994 Plant J. 6:271 ）によってイネの品種キヌヒカリの細胞に導入し、ハイグロマイシンで選抜した細胞から組換えイネ植物を再分化させた。得られた組換えイネが導入遺伝子を保有する事は、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法で確認した。
【００３５】
得られた組換えイネの当代を人工気象室内で栽培し、幼穂形成期の上位の展開葉からRNeasy Mini Kit（QIAGEN社）によってRNAを抽出し、Gene Images Random-Prime Labelling and Detection System (Amersham Biosciences社)によってイネピルベートデヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ１）遺伝子をプローブとしたノーザン解析を行った。非組換えイネ（キヌヒカリ）では、ＰＤＫ１遺伝子の発現量が低いため本法の検出限界以下となり転写物は検出できなかったが、ほとんどの組換え植物では、転写産物に相当するシグナルが認められた。その中でも、ＣＰ１０（pCab-PDK1導入）では特に転写量が多い事が判明した。これらのイネから自殖種子を採取した。
【００３６】
（実施例５）
組換えイネ（ＣＰ１０）と非組換えイネ（キヌヒカリ）に実った種子を同時に播種して次世代植物を27℃の人工気象室内で栽培して、形質発現に与える導入遺伝子の影響を調べた。本年（平成１５年）４月15日に播種を行い、３ヶ月間は14.5時間の日長、その後は12時間の日長とした。調査した各種形質の結果を表３に示す。組換えイネを非組換えイネと比較した場合に、稈長の若干の低下が認められた。到穂日数、穂長、穂数、稔実籾数などの値には組換えイネに特異的な変異は認められなかった。
【００３７】
また、PDK1遺伝子を高発現する組換えイネに特徴的な形質として、出穂期前後から上位の展開葉が巻く現象が観察された。葉の巻き方は、明条件で強く巻き、光強度を弱めると緩和された。葉を巻く強さは、ＰＤＫ１遺伝子の発現が強いCP10で最も強かった。また、遺伝子を導入して２世代目の植物では、メンデルの分離の法則によって導入遺伝子を保持する個体と保持しない個体が得られ、これらは導入遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法によって区別できる。巻き葉現象は、導入遺伝子を保持する個体のみに観察されたことから、巻き葉現象は導入遺伝子による影響である事が確認された。しかし、ＰＤＫ１遺伝子を高発現することで葉が巻く機構については不明である。同様な巻き葉現象は、「みつひかり２００３」と「みつひかり２００５」でも観察された。
【００３８】
また、出穂後も同条件で２ヶ月間栽培して組換えイネと非組換えイネの表現型を比較した。その結果、非組換えイネは葉の葉緑素がほとんど失われたのに対して、これらの組換えイネでは、主葉脈を中心に緑色を維持していた。出穂２ヶ月後の葉の中心付近の葉緑素を葉色計SPAD502(ミノルタ社)で測定したところ、キヌヒカリで2.0、組換えイネのCP10で13.0であり、組換えイネは有意に高い葉緑素含量を示した。同一の組換えイネから由来し、分離によって生じた導入遺伝子を保有しないイネではSPAD値が3.3である事から、この現象は明らかに導入遺伝子によって葉緑素の分解が抑制されているとために生じると考えられた。しかし、ＰＤＫ１遺伝子を高発現することで登熟後も葉の葉緑素が保持される機構については不明である。
【００３９】
【表３】
2005143313.tif 000004
CP10、CP16：pCab-PDK1導入個体
SP30：p35S-PDK1導入個体
(+)：導入遺伝子保持個体、(-)：分離による導入遺伝子非保持個体
（実施例６）
ＰＤＫ１を過剰発現させたイネの葉の形態と葉緑素量を詳細に調べるために、組み換えイネCP10の第３世代とキヌヒカリのそれぞれの８個体を28℃の人工気象室内で栽培して、葉色の変化を経時的に葉色計SPADで測定して調べた。また、登熟期の葉の形態について調査した。本年（平成１５年）６月１１日に播種、７月８日に移植を行い、８月１８日までは１４．５時間の日長、その後は１２時間の日長とした。調査したSPAD値の結果を図３に示す。７月９日より２週間ごとに各個体について最上位の展開葉３枚の葉身の中央部付近をSPADで測定した平均を各個体の値とした。SPAD値は、１０月１日まではCP10とキヌヒカリの間で差異は認められなかったが、登熟後期である１０月１５日では、キヌヒカリの葉緑素が急激に減少しているのに対して、ＰＤＫ１遺伝子を過剰発現するCP10は比較的高い葉緑素含有量を示した。また、登熟中期に巻き葉状態の葉身の中央部の幅（Ａ）と巻き葉を平面上に平らな状態に押し広げて測定した時の葉身の幅（Ｂ）を測定し、「巻き葉率」＝（Ｂ−Ａ）／Ｂを計算することで巻き葉の程度を定量化した。各個体につき２枚の止葉を測定したところ、平均の巻き葉率は、キヌヒカリの９．４に対し、CP10は37.9であり、ＰＤＫ１の過剰発現によりイネの葉が強く巻くことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明により得られる形質転換イネは、葉が巻く事により葉面積を確保しながら葉同士による光の遮蔽を最小限にとどめることができるため受光体勢の改善をする事が出き、葉緑素の分解を抑える事でイネの光合成活性を登熟後期まで保持する事ができるため多収イネを育種するための母本として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】PDK1遺伝子を緑色組織特異的に発現させるためのイネのＬＨＣＰプロモーターを含むベクターpCab-PDK1の挿入遺伝子部位を示す図である。図中の制限酵素認識部位はそれぞれSp:SphI、P:PstI、H:HindIII、Ss:Sse8387I、P:PstI、S:SalI、X:XbaI、E:EcoRI、Sm:SmaI、K:KpnI、Sc:SacI、B:BamHIであり、BRはT-DNA のright border配列、BLはT-DNAのleft border配列を示し、P-CabはLHCPプロモーター、P-nosはAgrobacteriumのノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、T-nosはAgrobacteriumのノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター、IntCはヒマカタラーゼ遺伝子のイントロンをそれぞれ示す。
【図２】PDK1遺伝子を恒常的に発現させるためのカリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモーターを含むベクターp35S-PDK1の挿入遺伝子部位を示す図である。図中の制限酵素認識部位はそれぞれSp:SphI、P:PstI, H:HindIII、Ss:Sse8387I、P:PstI、S:SalI、X:XbaI、E:EcoRI、Sm:SmaI、K:KpnI、Sc:SacI、B:BamHIであり、BRはT-DNA のright border配列、BLはT-DNAのleft border配列を示し、P-35Sは35Sプロモーター、P-nosはAgrobacteriumのノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、T-nosはAgrobacteriumのノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをそれぞれ示す。
【図３】葉中の葉緑素含有量（SPAD値）を示す図である。キヌヒカリとCP10の各８個体について上位展開葉の３枚を測定した。
【図１】
2005143313.tif 000005
【図２】
2005143313.tif 000006
【図３】
2005143313.tif 000007
【配列表】
2005143313000001.app