(57)【要約】      （修正有）【課題】  雑菌汚染を防止でき、且つ澱粉がα化することなく、さらには工場内の廃蒸気で充分設定出来うる５０〜６０℃で作用可能な新規アミラーゼを提供することに加え、該アミラーゼを効率よく生産する微生物、並びに該微生物を用いたその効率的な製造方法を提供すること。【解決手段】  ストレプトマイセス属由来の特定なアミノ酸配列を有するアミラーゼ、該アミラーゼの生産能を有するストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株、及び該アミラーゼの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有するアミラーゼ。
（１）作用及び基質特異性：本酵素は、マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、α化した澱粉及び生澱粉、さらにはそれらの部分分解物を分解し、主生成物としてマルトースを生成する。
（２）分子量：本酵素の分子量は、５０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）である。
（３）至適温度：本酵素の至適温度は、５０〜６０℃である。
（４）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは、６．０付近である。
（５）安定性：カルシウムイオン存在下ｐＨ５．０で３０分間処理した場合、５０℃以下で１００％、６０℃で５０％の残存活性を示す。また、カルシウムイオン存在下５０℃で１時間処理した場合、ｐＨ６．０で１００％、ｐＨ５．０で８２．１％の残存活性を示す。
（６）金属イオンの影響：本酵素の活性は、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋の金属イオンにより促進され、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋の金属イオンにより阻害される。
（７）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
（８）内部アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
請求項１記載のアミラーゼの生産能を有するストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）。
【請求項３】
請求項２記載のストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）又はその突然変異株もしくは遺伝子操作株を培養し、その培養物から請求項１記載のアミラーゼを採取することを特徴とするアミラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アミラーゼ、該アミラーゼを生産する微生物及びその製造方法に関し、詳しくは、雑菌汚染を防止でき、且つ澱粉がα化することなく、さらには工場内の廃蒸気で充分に設定し得る５０〜６０℃の温度で作用可能な新規アミラーゼ、該アミラーゼを効率よく生産する微生物及び該微生物を用いた、該アミラーゼの効率的な製造方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、澱粉は加熱及び液化酵素の作用により液化（α化）された後に、アミラーゼ等の糖化酵素により糖化処理されているが、この液化の際にハイドロヒーター（ジェットクッカー）など高価な機器が用いられており、また液化による粘度上昇を避けるため、澱粉仕込み濃度も３０％程度に抑えられているのが常である。
一方、主に実験室レベルではあるが、澱粉を加熱することなく、生澱粉のまま直接作用できる特殊なアミラーゼの研究も行われている。このように、生澱粉に作用できる酵素が開発されれば、加熱エネルギーが節約でき、処理物は蒸煮臭を回避できる。また、ハイドロヒーター（ジェットクッカー）などの高価な機器が不要となるほか、澱粉のα化工程を省略できるので工程日数、人件費、光熱費等を節約できる。更に、湿潤粉体で酵素処理を行うことができるので、実質上仕込み濃度に上限が無くなる。
【０００３】
とりわけ、加熱エネルギーが節約できる点には、多くの研究者が注目している。このため、研究対象は主に室温前後の反応温度を持つアミラーゼに限られており、耐熱性の低いものが殆どである。例えば、非特許文献１には、Zoogloea ramigera由来のマルトオリゴ糖生成型生澱粉分解酵素が挙げられており、２４℃での生トウモロコシ澱粉の糖化がなされているが、室温前後の酵素反応では雑菌汚染が甚だしいため、工業的規模での利用は事実上不可能であった。
【０００４】
【非特許文献１】応用糖質科学第４１巻  第２号  ｐ．２８３−２８９（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題点に鑑み、雑菌汚染を防止でき、且つ澱粉がα化することなく、さらには工場内の廃蒸気で充分に設定し得る５０〜６０℃の温度で作用可能な新規アミラーゼを提供すると共に、該アミラーゼを効率よく生産する微生物、並びに該微生物を用いたその効率的な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、雑菌汚染を防止でき、且つ澱粉がα化することなく、さらには工場内の廃蒸気で充分に設定できる５０〜６０℃の温度で作用可能な新規アミラーゼを見出すべく、各地で採取した土壌などから酵素生産菌を鋭意検索したところ、ストレプトマイセス属に属する放線菌の一菌株が、５０〜６０℃で優れた活性及び安定性を有する新規アミラーゼを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、下記の性質を有するアミラーゼである。
（１）作用及び基質特異性：本酵素は、マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、α化した澱粉及び生澱粉、さらにはそれらの部分分解物を分解し、主生成物としてマルトースを生成する。
（２）分子量：本酵素の分子量は、５０ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）である。
（３）至適温度：本酵素の至適温度は、５０〜６０℃である。
（４）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは、６．０付近である。
（５）安定性：カルシウムイオン存在下ｐＨ５．０で３０分間処理した場合、５０℃以下で１００％、６０℃で５０％の残存活性を示す。また、カルシウムイオン存在下５０℃で１時間処理した場合、ｐＨ６．０で１００％、ｐＨ５．０で８２．１％の残存活性を示す。
（６）金属イオンの影響：本酵素の活性は、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋の金属イオンにより促進され、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋の金属イオンにより阻害される。
（７）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
（８）内部アミノ酸配列：配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のアミラーゼの生産能を有するストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）である。
請求項３記載の本発明は、請求項２記載のストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）又はその突然変異株もしくは遺伝子操作株を培養し、その培養物から請求項１記載のアミラーゼを採取することを特徴とするアミラーゼの製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアミラーゼは、工場内の廃蒸気で充分に設定できる５０〜６０℃の温度で生澱粉に作用可能であるので、澱粉の糖化処理における雑菌汚染などの問題を解消することができる。
また、本発明に係る微生物Ｅ−２２４８株は、上記アミラーゼを効率よく生産する能力を有するので、この微生物を用いて目的とするアミラーゼを効率よく製造できる。更に、該アミラーゼを使用することにより、澱粉を効率よく糖化することができるので、澱粉糖化工業、その他の食品分野における広範な活用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明を詳しく説明する。
請求項１に係る本発明のアミラーゼは、以下に示す性質を有している。
【００１１】
（１）作用及び基質特異性
本酵素は、マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、α化した澱粉及び生澱粉、さらにはそれらの部分分解物を基質とする。
マルトテトラオース以上のマルトオリゴ糖とは、４個以上のＤ−グルコースがα１→４結合したオリゴ糖を意味する。
グリコーゲンとは、グルコースからなるホモ多糖であるグルカンの一種であり、動物の細胞中に存在する他、トウモロコシ等の植物にも存在する。
アミロースとアミロペクチンは、それぞれ澱粉を構成するα１→４結合の直鎖成分とα１→６結合の枝分かれした物質である。
可溶性澱粉とはごく稀薄な酸或いはごく少量の酵素によって処理された澱粉部分分解物を意味し、α化した澱粉とは、加熱及び液化酵素の作用により液化（α化）された澱粉を意味し、生澱粉とは、α化されていない状態の澱粉を意味する。本発明においては、これらのいずれも使用できるが、本発明の目的を達成するためには、特に生澱粉を用いることが好ましい。
【００１２】
これらの基質について、それらの由来は特に限定されず、小麦、米、餅米、トウモロコシの他、甘藷、馬鈴薯などの芋類由来のものであっても良いし、人工的に作られたものであっても良い。生澱粉の場合、特に、小麦由来の小麦澱粉に最も良く作用し、次いで米澱粉、餅米澱粉に良く作用する。
【００１３】
請求項１に係る本発明のアミラーゼは、これらの基質に対し作用し、主生成物としてマルトース（Ｇ２）を生成し、次いでマルトトリオース（Ｇ３）、グルコース（Ｇ１）などを生成する。
【００１４】
（２）分子量
本酵素の分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による測定の結果、５０ｋＤａである。
【００１５】
（３）至適温度
本酵素の至適温度は、５０〜６０℃である。
【００１６】
（４）至適ｐＨ
本酵素の至適ｐＨは、６．０付近である。
【００１７】
（５）熱安定性
本酵素は、５０℃以下で安定である。即ち、後述の実施例から明らかなように、カルシウムイオン存在下、ｐＨ５．０で３０分処理した場合、５０℃以下で１００％、６０℃で５０％の残存活性を示す。
【００１８】
（６）ｐＨ安定性
本酵素は、ｐＨ５．０〜６．０で安定である。即ち、後述の実施例から明らかなように、カルシウムイオン存在下、５０℃で１時間処理した場合、ｐＨ６．０で１００％、ｐＨ５．０で８２．１％の残存活性を示す。
【００１９】
（７）金属イオンの影響
本酵素をＥＤＴＡで処理した後、各種化合物の添加効果を調べたところ、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋の金属イオンにより活性が促進され、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋の金属イオンにより阻害された。この傾向は、α化した澱粉よりも生澱粉を基質とした場合に顕著である。
【００２０】
（８）各種澱粉粒への相対活性：本酵素は、上記したように、小麦澱粉粒に最も良く作用し、次いで米澱粉粒、餅米澱粉粒等に良く作用する。また、甘藷澱粉、馬鈴薯澱粉などの芋類の澱粉粒にも作用する。
【００２１】
（９）Ｎ末端アミノ酸配列
本酵素は、Ｎ末端に配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
（１０）内部アミノ酸配列
本酵素は、内部に配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
請求項１に係る本発明のアミラーゼは、上記のような性質を有するので、工場内の廃蒸気で充分に設定できる５０〜６０℃の温度で生澱粉に作用可能である。そのため、澱粉の糖化処理における雑菌汚染などの衛生的な問題を解消することができる。該アミラーゼを効率よく生産する能力を有する微生物を提供するのが、請求項２に係る本発明である。
即ち、請求項２に係る本発明は、請求項１に記載のアミラーゼの生産能を有するストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）である。
【００２３】
請求項２に係る本発明のＥ−２２４８株は、後述の実施例３に示すように、秋田県南秋田郡昭和町の土壌から採取した試料をＹＭ培地を用いて培養し、培養物からスクリーニングしたものである。
請求項２に係る本発明のＥ−２２４８株は、その１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列（配列表の配列番号５参照）が既知のストレプトマイセス属微生物のそれと高い相同性を示すことから、ストレプトマイセス属に属する放線菌の一菌株であることが明らかであり、また、上記のような性質を示す新規アミラーゼを生産するストレプトマイセス属菌は明らかにされていないことから、新菌種であると認められた。
【００２４】
本発明のストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１である。
尚、本菌のほか、請求項１に係る本発明のアミラーゼを生産する能力を有する限り、例えば本菌をニトロソグアニジンやＵＶ処理することによって生じた突然変異株であっても、或いは遺伝子操作によって得られた変異株であっても、本発明に包含される。
【００２５】
本発明に係る上記微生物は、請求項１に記載のアミラーゼを効率よく生産する能力を有するので、該アミラーゼの製造に適しており、このような製造方法を提供するのが、請求項３に係る本発明である。
即ち、請求項３に係る本発明は、請求項２記載のストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）又はその突然変異株もしくは遺伝子操作株を培養し、その培養物から請求項１記載のアミラーゼを採取することを特徴とするアミラーゼの製造方法である。
【００２６】
請求項３に係る本発明の製造方法において、微生物の培養は、基本的にはストレプトマイセス属微生物の培養に用いられる培地並びに培養条件に従って行えばよいが、培地の炭素源としては、通常プルラン、グリコーゲン等の多糖類；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉等の澱粉類を用いることが好ましい。また、窒素源としては、ペプトン、ポリペプトン、イーストエキス等を単独で、又は組み合わせて用いることができる。その他、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム七水塩等の無機塩や微量の重金属などを必要に応じて適宜添加することができる。
【００２７】
本発明に係る微生物の培養は、液体培地を用いて好気的条件下に行われる。培養温度は２５〜４０℃、好ましくは３０〜３５℃が適当であり、培養期間は２〜１０日間、好ましくは３〜６日間である。尚、培養期間中、培地のｐＨは６．５〜７．５に保つことが好ましい。
【００２８】
請求項３に記載の本発明の方法において、培養物からのアミラーゼの採取は、一般的な手法に従えば良く、例えば、培養物から遠心分離などの固−液分離手段により菌体などの固形物を除いて得た上清を、粗酵素液とする。
精製酵素を得るには、この粗酵素液にコーンスターチなどの澱粉の粉末を加えて攪拌することにより、酵素活性を澱粉吸着せしめる。この後、遠心分離などにより澱粉粉末を回収する。次いで、適当な溶出液に溶解して、０〜１０℃、３０分〜２時間の条件で酵素活性を溶出させる。ここで、溶出液としては、例えば、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等の緩衝液及び塩化ナトリウムを含むβ−サイクロデキストリン等のサイクロデキストリンの０．５〜３．０％溶液が挙げられる。
更に、溶出液を透析後、イオン交換クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、逆相クロマトグラフ法、ゲルろ過などのクロマトグラフ法等により、高度に精製されたアミラーゼを得ることができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、本発明を実施例により詳しく説明する。
尚、以下の実施例において使用する酵素生産培地、酵素活性の測定法、タンパク質の定量法は、以下の通りである。
【００３０】
実施例１
［酵素生産培地］
アミラーゼの製造に使用した液体培地（以下、液体培地という。）は、１％  コーンスターチ（別途乾熱滅菌したもの）、０．５％  ポリペプトン、０．５％  イーストエキス、０．１％  燐酸二カリウム、及び０．０２％  硫酸マグネシウム七水塩を含む組成の培地である。
また、アミラーゼ生産用平板培地（以下、平板培地という。）は、上記液体培地に寒天１．５％を加えて固めたものである。
【００３１】
［酵素活性の測定法］
アミラーゼの澱粉分解活性（以下、酵素活性）の測定は、特に断らない限り次の方法で実施した。
すなわち、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び５ｍＭ  塩化カルシウムを含む１％  生澱粉（例えばコーンスターチ）懸濁液０．５ｍｌに酵素液０．０５ｍｌを加え、ｐＨ５．０、３７℃で一定時間反応させた後、生じた還元力をソモギー・ネルソン法にて定量した。１分間にマルトース１μｍｏｌに相当する還元力を生じる酵素力価を１Ｕ（単位）とした。
また、温度の推移に伴うアミラーゼの相対活性（残存活性）は、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び５ｍＭ  塩化カルシウムを含む酵素液を、所定の温度で３０分間加温処理後、残存する活性を上記の方法にて測定したものである。
一方、ｐＨの推移に伴うアミラーゼの相対活性（残存活性）は、所定のｐＨを示す１０ｍＭ  緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０  酢酸緩衝液、ｐＨ５．０〜９．０  リン酸緩衝液）及び５ｍＭ  塩化カルシウムを含む酵素液を、５０℃で６０分間加温処理後、残存する活性を上記の方法にて測定したものである。
【００３２】
［蛋白質の定量］
蛋白量はＢｉｏ−Ｒａｄ社のプロテインアッセイキットを使用し、ブラッドフォード法にて定量した。
【００３３】
アミラーゼ生産菌による酵素の製造
（１）粗酵素液の調製
予め滅菌処理した液体培地に、ストレプトマイセス属Ｅ−２２４８株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５８１）を接種し、３０℃で５日間、好気的に培養した。培養終了後、遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間）して得られた上清を粗酵素液とした。
この粗酵素液は、０．０７Ｕ／ｍｌの酵素活性を示した。また、該粗酵素液の総蛋白、全活性、及び比活性を測定したところ、表１に示す通りであった。
【００３４】
（２）酵素の精製
上記のようにして得られた粗酵素液に、３％（ｗ／ｖ）量のコーンスターチ粉末を加えて４℃で１時間撹拌し、酵素活性を澱粉に吸着せしめた。この後、遠心分離（１０，０００ｘｇ、１０分間）により回収したコーンスターチ粉末を、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む１％  β−サイクロデキストリン溶液に４℃で１時間懸濁して、酵素活性を溶出させた。この澱粉吸着処理により、比活性は約３３倍上昇した。また、澱粉吸着物の総蛋白、全活性、及び比活性、並びに粗酵素液に対する純度及び回収率を測定し、表１に示した。なお、純度及び回収率は、粗酵素液を基準とした値である。
【００３５】
本溶出液を１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で一夜透析後、同緩衝液で平衡化したDEAE-Toyopearlによるイオン交換カラム（０〜０．５Ｍ  塩化ナトリウムでのグラジェント溶出）で精製した。その結果、比活性は３８０倍に上昇した。なお、総蛋白、全活性、比活性、純度及び回収率の測定値を表１に示した。
次に、得られた活性画分をアミコン式限外濃縮にかけ、Toyopearl-HW55（Ｓ）によるゲル濾過を行ったところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一な酵素蛋白が得られ、その比活性は１１．７Ｕ／ｍｇで、純度は２１３０倍に上昇した。なお、得られた精製酵素の総蛋白、全活性、比活性、純度及び回収率を表１に示した。
【００３６】
【表１】
2005143440.tif 000002
【００３７】
実施例２（酵素の性質）
実施例１で得られた精製酵素の性質について検討した。
【００３８】
（１）分子量
実施例１の粗酵素液及び各精製処理段階のサンプルについて、Ｌａｅｍｍｌｉ法に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。
即ち、各サンプルをＳＤＳ１％、２−メルカプトエタノール１％及びグリセリン２０％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ６．８）と溶解してサンプル溶液１０μｌを調製した。電気泳動装置（商品名：ラピダス、メーカー名：アトー（株））上のアクリルアミド５〜２０％グラジエントゲルに、このサンプル溶液を載せ、２０ｍＡで泳動した。分子量マーカーとして、Calibration Kits For Molecular Weight Determination Using Electrophoresis（ファルマシアバイオテク社製）に付属したマーカーを使用し、同時に泳動した。
泳動終了後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０で染色した。
図１にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図１中、レーン１〜４はそれぞれ粗酵素液、澱粉吸着処理後のサンプル、DEAE-Toyopearlによるイオン交換カラム処理後のサンプル及び精製酵素（即ち、Toyopearl-HW55（Ｓ）によるゲル濾過処理後のサンプル）の結果をそれぞれ示す。
【００３９】
図１に示すように、各サンプルと分子量マーカーとの相対距離を比較した結果、各サンプルにおいて約５０ｋＤａの位置にバンドが観察され、精製が進むサンプルほどバンドが明瞭となった。
このことから、本酵素の分子量は５０ｋＤａであることが明らかとなった。
【００４０】
（２）至適温度
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用い、澱粉として可溶性澱粉及び生澱粉（トウモロコシ）のそれぞれを用いたこと、及び所定の温度にて３０分間反応させたこと以外は、同様の条件で測定し、可溶性澱粉の最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を測定した。温度の推移に伴う相対活性の変化を図２に示す。図２中、実線は生澱粉の結果を、破線は可溶性澱粉の結果をそれぞれ示す。
【００４１】
図２から明らかなように、可溶性澱粉の場合、温度の上昇と共に緩やかに活性が上昇し、４０〜６０℃の範囲で高い活性が観察された後は緩やかに下降した。
生澱粉でも同様に温度上昇と共に緩やかな上昇が見られ、５０〜６０℃で高い活性が観察され、更に７０℃で極端に高い活性に達した後、低下した。このように極端に高い活性が見られたのは、高温により澱粉がα化したためと考えられる。
これらの結果を総合すると、本酵素の至適温度は５０〜６０℃であることが明らかとなった。
【００４２】
（３）至適ｐＨ
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用い、澱粉として生澱粉（トウモロコシ）を用いたこと、及び緩衝液として１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）又は１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）を用いてｐＨを所定の値に調整し、各ｐＨ下で３０分間反応させたこと以外は、同様の条件で測定し、酵素力価の最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を測定した。ｐＨの推移に伴う相対活性の変化を図３に示す。図３中、実線は酢酸緩衝液の結果を、破線はリン酸緩衝液の結果をそれぞれ示す。
【００４３】
図３から明らかなように、ｐＨの上昇と共に活性が上昇し、６．０付近で高い活性が観察され、その後は緩やかに下降した。
このことから、本酵素の至適ｐＨは６．０付近であることが明らかとなった。
【００４４】
（４）熱安定性
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用い、澱粉として生澱粉（トウモロコシ）を用いたこと、及び緩衝液として１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いたこと、並びに所定の温度下で３０分間反応させたこと以外は、同様の条件で測定し、残存活性の最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を測定した。温度の推移に伴う相対活性（残存活性）の変化を図４に示す。図４中、実線は酢酸緩衝液の結果を、破線はリン酸緩衝液の結果をそれぞれ示す。
図４から明らかなように、５０℃における相対活性は１００％であり、３０℃、４０℃においても１００％に近い活性を示した。一方、５０℃を超えると活性は低下し、７０℃では全く活性がなかった。
このことから、本酵素は５０℃以下で安定であることが明らかとなった。
【００４５】
（５）ｐＨ安定性
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用い、澱粉として生澱粉（トウモロコシ）を用いたこと、及び緩衝液として１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４〜６）又は１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）を用いてｐＨを所定の値に調整し、各ｐＨ下で５０℃、１時間反応させたこと以外は、同様の条件で測定し、残存活性の最大活性値を１００とした場合の相対活性（％）を測定した。ｐＨの推移に伴う相対活性（残存活性）の変化を図５に示す。図５中、実線は酢酸緩衝液の結果を、破線はリン酸緩衝液の結果をそれぞれ示す。
【００４６】
図５から明らかなように、ｐＨ４．０では低い活性であったが、ｐＨの上昇と共に活性が上昇し、ｐＨ５．０〜６．０における相対活性はほぼ１００％であった。その後は緩やかに下降し、ｐＨ９．０ではほとんど活性がなかった。ｐＨ５．０〜６．０における結果は、１０ｍＭ  酢酸緩衝液、１０ｍＭ  燐酸緩衝液のいずれにより調整した場合も同様であった。
このことから、本酵素は、ｐＨ５．０〜６．０で安定であることが明らかとなった。
【００４７】
（６）各種澱粉粒への相対活性
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用い、澱粉として表２に示す各種植物由来の生澱粉を使用して、それぞれ１時間反応させたこと以外は、同様の条件で測定し、小麦澱粉粒の酵素力価を１００とした場合の各種澱粉の相対活性を算出した。結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2005143440.tif 000003
【００４９】
表２から明らかなように、小麦澱粉に最もよく作用し、次いで米澱粉、餅米澱粉などによく作用した。また、甘藷澱粉、馬鈴薯澱粉などの芋類の澱粉にも作用を示した。
このことから、本酵素は種々の生澱粉に作用することが明らかとなった。
【００５０】
（７）各種化合物の添加効果
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を５ｍＭのＥＤＴＡで一夜透析したものを用いたこと、澱粉として生澱粉及びα化した澱粉（いずれもトウモロコシ）を用いたこと、塩化カルシウムの代わりに表３に示す各金属イオン（１０ｍＭ、何れも塩化物）を用い、それぞれ３０分反応させたこと、並びに酢酸緩衝液の代わりに５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を用いたことの他は、同様の条件で測定した。一方、対照として、金属イオン無添加とした他は同様にして測定した。無添加の場合の酵素力価を１００とした場合の各種澱粉の相対活性を算出した。結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
2005143440.tif 000004
【００５２】
表３から明らかなように、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋の金属イオンでは活性が促進し、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋の金属イオンでは阻害された。これらの傾向は、可溶性澱粉よりも、生澱粉を基質とした場合に顕著であった。
【００５３】
（８）作用及び基質特異性
実施例１の［酵素活性の測定法］において、酵素として実施例１の精製酵素を用いたこと、反応時間を４８時間としたこと、反応温度を５０℃としたこと、澱粉として可溶性澱粉を使用して４８時間反応させた他は、同様の条件で測定し、生成物の総量を１００とした場合のＧ１（グルコース）、Ｇ２（マルトース）、Ｇ３（マルトトリオース）、Ｇ４（マルトテトラオース）、及びＧ５（マルトペンタオース）の生成量の相対値を経時的に算出した。各生成物の生成量の経時的変化を図６に示す。図６中、◆はＧ１の結果を、●はＧ２の結果を、△はＧ３の結果を、×はＧ４の結果を、○はＧ５の結果をそれぞれ示す。
【００５４】
図６から明らかなように、Ｇ２（マルトース）が最も多く生成し、ついでＧ３（マルトトリオース）、Ｇ１（グルコース）の生成量が多かった。Ｇ５（マルトペンタオース）及びＧ４（マルトテトラオース）の生成量は少なかった。
このことから、本酵素は特に生澱粉に作用し、主生成物はマルトースであり、次いでマルトトリオース、グルコースなどを生成することが明らかとなった。
【００５５】
（９）Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列
実施例１の精製酵素をリシルエンドペプチダーゼ処理し、アクリルアミド１５％ゲルを用いた他は（１）と同様の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ウエスタンブロットにより各フラグメントを回収した。即ち、ＰＶＤＦ膜へ転写し、各フラグメントを切り取り、プロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（島津製作所）にて解析した。図７に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と共に解明したアミノ酸配列を示す。
図７に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果のうち、右上のバンドの解析結果から明らかなように、本酵素タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなることが明らかとなった。
【００５６】
また、図７に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果のうち、中央に２列に並列した６つのバンドの解析結果から明らかなように、本酵素タンパク質は、内部に配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列及び配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することが明らかとなった。
【００５７】
実施例３（酵素生産菌の同定）
実施例１で用いた微生物Ｅ−２２４８株について、その遺伝的情報により微生物の同定を行った。
すなわち、秋田県南秋田郡昭和町の土壌からの検索菌であるＥ−２２４８株を、ＹＭ培地（Becton Dicknson社製）で３０℃にて２日間培養後、集菌し、得られた菌体よりＰｒｅｐＭａｎ法（Applied Biosystems社製）によりゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＤＮＡのうち５'末端側約５００ｂｐ領域を増幅した。この増幅された塩基配列をシーケンシングし、配列表の配列番号５に記載のＥ−２２４８株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列を得た。
【００５８】
ＰＣＲ産物の精製、サイクルシーケンスにはMicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を使用した。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR System 9600を、ＤＮＡシーケンサーはABI PRISM 3100 DNA Sequencer（何れもApplied Biosystems社製）を使用した。
得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列をＢＬＡＳＴ検索した結果のうち、上位２０位までを表４に、うち上位５塩基配列とのアイデンティティを表５に示す。
【００５９】
【表４】
2005143440.tif 000005
【００６０】
【表５】
2005143440.tif 000006
【００６１】
表４及び表５、特に表５に示すように、土壌検索菌Ｅ−２２４８株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、ストレプトマイセス属各微生物のそれとの相同性が高い。このことから、Ｅ−２２４８株は、ストレプトマイセス属微生物であると同定した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のアミラーゼは、工場内の廃蒸気で充分に設定し得る５０〜６０℃の温度で生澱粉に作用可能であるので、澱粉の糖化処理における雑菌汚染などの問題を解消し、工業規模で利用することができる。
また、本発明のＥ−２２４８株は、上記アミラーゼを効率よく生産するので、この微生物を用いたアミラーゼの製造方法により澱粉を効率よく糖化することができ、澱粉糖化工業、その他の食品分野における広範な活用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明のアミラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真図である。
【図２】温度の推移に伴う本発明のアミラーゼの相対活性の変化を示すグラフである。
【図３】ｐＨの推移に伴う本発明のアミラーゼの相対活性の変化を示すグラフである。
【図４】温度の推移に伴う本発明のアミラーゼの相対活性（残存活性）の変化を示すグラフである。
【図５】ｐＨの推移に伴う本発明のアミラーゼの相対活性（残存活性）の変化を示すグラフである。
【図６】本発明のアミラーゼによる各生成物の生成量の経時的変化を図６に示すグラフである。
【図７】本発明のアミラーゼの部分アミノ酸配列のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と共に解明したアミノ酸配列を示す写真図である。
【符号の説明】
【００６４】
図１中、レーン１〜４はそれぞれ粗酵素液、澱粉吸着処理後のサンプル、DEAE-Toyopearlによるイオン交換カラム処理後のサンプル及び精製酵素（即ち、Toyopearl-HW55（Ｓ）によるゲル濾過処理後のサンプル）の結果をそれぞれ示す。
図２中、実線は生澱粉の結果を、破線は可溶性澱粉の結果をそれぞれ示す。
図３〜５中、実線は酢酸緩衝液の結果を、破線はリン酸緩衝液の結果をそれぞれ示す。
図６中、◆はＧ１の結果を、●はＧ２の結果を、△はＧ３の結果を、×はＧ４の結果を、○はＧ５の結果をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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