(57)【要約】【課題】ハスモンヨトウのγ−アミノ酪酸受容体遺伝子を発現する細胞を構築し、これを利用して当該受容体に作用するアゴニスト或いはアンタゴニストをスクリーニングすることにより、ハスモンヨトウ等の害虫に有効な殺虫剤を見出す。【解決手段】ハスモンヨトウよりγ−アミノ酪酸受容体サブユニットの遺伝子をクローニングし、昆虫細胞内で発現させることによりＧＡＢＡ受容体様のイオンチャンネルが形成される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項２】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項３】
請求項1に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え細胞を用いたハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＧＡＢＡ（ガンマ−アミノ酪酸：γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）受容体クロライドイオンチャンネルは、殺虫剤の標的作用点として知られている。本発明は、日本の主要害虫であるハスモンヨトウ（鱗翅目昆虫）のＧＡＢＡ受容体クロライドイオンチャンネルを構成するサブユニット蛋白質をコードする遺伝子、その遺伝子を発現させた組換え細胞、および同細胞を用いたハスモンヨトウなど鱗翅目害虫に有効な殺虫剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）は、興奮を抑制する働きを持つ神経伝達物質である。哺乳類の受容体の構造は、４回膜貫通疎水性領域を含むポリペプチド鎖が５個集合して、その中央に塩素イオン透過孔を形成している。哺乳類ではスプライスバリアントを除いて、１７サブユニット（６α、３β、３γ、１δ、３ρ、１ε、１π、１θ）がクローニングされている。哺乳類脳のＧＡＢＡＡ受容体の主要な構成サブユニットはα１、β２、γ２であり、その化学量論は２α：２β：１γあるいは２α：１β：２γと考えられている。昆虫においては、１９９１年に初めてショウジョウバエからのサブユニット遺伝子Ｒｄｌのクローニングが報告された。このＲｄｌのホモログが他の昆虫からも単離されていることから、このＲｄｌがＧＡＢＡ受容体サブユニットをコードする普遍的な遺伝子と考えられる。しかし、昆虫のＧＡＢＡ受容体がＲｄｌのホモオリゴマーか、未知のサブユニットを含むヘテロオリゴマーかについては、今日でも明らかになっていない。
【０００３】
最近になって、鱗翅目害虫のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓからＲｄｌ遺伝子が単離され、その遺伝子を単独でアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させた際に、ＧＡＢＡ受容体のクロライドイオンチャンネルがボルテージクランプ法で検出されることが報告された（Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.  ３（４）：３０５−１５，１９９８）。この遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞やＳｆ９昆虫細胞などに発現させた組換え細胞は、ＧＡＢＡ受容体に作用するアゴニストやアンタゴニストなどの殺虫剤となりうる化合物のスクリーニングに有用である。
【０００４】
これまでに、Ｒｄｌ遺伝子は、上記のＨｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓのほか、ショウジョウバエやカでその遺伝子が単離されたのみであり、様々な昆虫に有効な、ＧＡＢＡ受容体を作用点とする殺虫剤のスクリーニングを行うためには、昆虫ごとにＲｄｌ遺伝子を取得し、スクリーニング系を構築する必要がある。
【非特許文献１】Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.  ３（４）：３０５−１５，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
日本における主要な鱗翅目害虫としてハスモンヨトウが知られている。ハスモンヨトウの全遺伝子は解読されておらず、ハスモンヨトウに対して有効なＧＡＢＡ受容体を作用点とする殺虫剤のスクリーニング系を構築することは、ＧＡＢＡ受容体サブユニット遺伝子（Ｒｄｌ）が単離されていないことから、これまで実施不可能であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の結果、これまで単離されたことのなかったハスモンヨトウのＲｄｌ遺伝子を初めて単離した。この遺伝子を昆虫細胞などの細胞に発現させるためには、細胞を形質転換可能なベクターに組み込み、常法のベクターで細胞を形質転換する方法により形質転換体を構築することができる。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子。
［２］  配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
［３］  上記［１］に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
［４］  上記［３］に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。
［５］  上記［４］に記載の組換え細胞を用いたハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【０００８】
単離した遺伝子を、アフリカツメガエルの卵母細胞に遺伝子導入する方法やＳｆ９昆虫細胞を同遺伝子含有の適当なベクターで形質転換させる方法により組換え細胞を構築し、その細胞を用いて殺虫剤のスクリーニングの実施が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、配列番号1に記載のＤＮＡ塩基配列のものであるが数塩基の置換を含む配列も本特許の範疇である。本発明の遺伝子は、実施例に記載のようにハスモンヨトウの受精卵から、容易に調製可能である。
【００１０】
本発明の蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものであるいが、数アミノ酸の置換、脱落、挿入された配列で、昆虫細胞等に発現させた際にＧＡＢＡ受容体イオンチャンネル機能を有するものも本発明の範疇である。本発明のタンパク質を調製する方法は、配列番号１に記載の遺伝子を昆虫細胞で発現可能なベクター（ｐＸｉｎｓｅｃｔ、ｐＩＺＴ、いずれもＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）あるいはバキュロウイルス（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に組み込み、同細胞を培養し、その培養細胞から精製することにより容易に可能である。本発明のベクターは、配列番号１に記載の遺伝子を発現可能なベクターあるいはバキュロウイルスであればいずれのものでもよい。これらのベクターは、市販されているものを適宜選択して使用することができる。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、調製した蛋白質を用いて合成化合物との親和性を評価するバインディングアッセイや、ＧＡＢＡ受容体を発現させた組換え昆虫細胞を用いたパッチクランプ法や蛍光プローブ法などが挙げられる。これらの方法により活性を有する合成化合物を効率的にスクリーニングすることができる。
【実施例１】
【００１２】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明を制限するものではない。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体的使用方法は市販品のプロトコールに従った。
（Ａ）ハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体α２サブユニット遺伝子の取得
ハスモンヨトウ受精卵２塊を乾熱滅菌したホモジナイザーに入れ、ホモジナイズした。その後、ＱＩＡＧＥＮ社ＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉキットを使用し、プロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡ５μｇを鋳型とし、ＱＩＡＧＥＮ社Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用い、プロトコールに従って配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用して一本鎖ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行った。このＤＮＡ断片を市販ベクターｐＴ７ｂｌｕｅに組み込み、同ベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養しコロニーを形成させた。培養後、白色のコロニーを数個選び、２ｍｌのＬＢ培地で培養後、常法のアルカリ抽出法でプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００１３】
さらに、得られた配列を基に、再度一本鎖ｃＤＮＡの合成とＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行った。５’側ＰＣＲ用には配列番号：５および配列番号：６のプライマーを使用した。また、３’側ＰＣＲ用には、配列番号：７および配列番号：８のプライマーを使用した。得られたＤＮＡについて、上記の方法により、遺伝子のサブクローニング及びＤＮＡのシーケンシングを行った。３’ＲＡＣＥ ＰＣＲについては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットのプロトコールに従った。まず、キット添付の３’ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマーＡと配列番号：９に示すハスモンヨトウ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ２．５μｇを鋳型とし、ユニバーサルプライマーミックスＡ（ＵＰＭ）及び配列番号：１０のハスモンヨトウ特異的プライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。これにより得られたＤＮＡ断片について、常法に従いサブクローニングを行い、ＤＮＡシーケンシングにより３’側配列を取得した。上記と同様にＣｌｏｎｔｅｃｈ社ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用し、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを実施した。まずキットに添付されているＳＭＡＲＴ IIＡオリゴヌクレオチドと配列番号：１１に示すハスモンヨトウ特異的プライマー３（ＧＳＰ３）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、一本鎖ＣＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ２．５μｇを鋳型とし、ユニバーサルプライマーミックスＡ(ＵＰＭ)及び配列番号：１２に示すハスモンヨトウ特異的プライマー４（ＧＳＰ４）を用いてＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。さらに、得られたＤＮＡ断片を５０倍希釈にし、そのうちの２．５μｇを使用して再度Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。この際キットに添付されているネステッドユニバーサルプライマーＡ（ＮＵＰ）と配列番号：１３のハスモンヨトウ特異的プライマー５（ＧＳＰ５）を使用した。得られたＤＮＡ断片について、常法に従ってサブクローニングを行い、ＤＮＡシーケンシングにより５’側配列を取得した。
【００１４】
（Ｂ）ハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体α２サブユニット遺伝子のプラスミドベクターへのクローニング
トータルＲＮＡ５μｇを鋳型とし、ＱＩＡＧＥＮ社Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用い、プロトコールに従って、配列番号：１４および配列番号：１５のプライマーを用いて、ハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体α２サブユニット全長配列の増幅を行った。得られたＤＮＡをプラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅとライゲーションした。同プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した後、アンピシリン及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート(４０μｇ/ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５μｇ/ｍｌのアンピシリンを含む)上で選択を行った。３７℃で１６時間培養後、白いコロニーのみ数個選び、２ｍｌのＬＢ培地で培養後、常法に従いアルカリ抽出法でプラスミドｐＴ７−ＳＩＧＡＢＡを抽出した。
【００１５】
（Ｃ）発現ベクターの構築
プラスミドベクターｐＵＣ１８をＨｉｎｄIII及びＳｐｈＩで切断し、配列番号：１６（合成ＤＮＡ１）および配列番号：１７（合成ＤＮＡ１７）に示すの混合液とライゲーションした。このベクターで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン及びＸ−Ｇａｌを含むＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養後、白いコロニーを数個選び、２ｍｌのＬＢ培地で培養後、常法に従いアルカリ抽出法でプラスミドＤＮＡを抽出した。さらに、プラスミドＤＮＡをＳｐｈＩ及びＳａｌＩで切断後、プラスミドｐＢｍＡ：ｎｅｏ（インビトロジェン社）を鋳型として配列番号：１８及び配列番号：１９に示すプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させたＤＮＡ断片とライゲーションした。プラスミドＤＮＡは常法に従い、単一のプラスミドＤＮＡに単離した。さらにプラスミドＤＮＡをＳａｌＩ及びＳｍａＩで切断し、配列番号２０および配列番号２１のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させたＤＮＡ断片とライゲーションした。プラスミドＤＮＡは常法に従い単一のプラスミドＤＮＡに単離した。さらに、プラスミドＤＮＡをＢｓｔ１１０７Ｉ及びＥｃｏ０３５Ｉで切断後、プラスミドｐＴ７−ＳＩＧＡＢＡを鋳型とし配列番号２３及び配列番号２４に示すプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させたＤＮＡ断片とライゲーションした。プラスミドＤＮＡは常法に従い単一のプラスミドｐＵＣ−ＧＡＢＡ−ｎｅｏに単離した。インビトロジェン社Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｅｃｔのマニュアルに従い、エントリークローン及びデスチネーションベクターを作成し、最終的にハスモンヨトウＧＡＢＡα２サブユニット発現プラスミドｐＸＩＮｓｅｃｔ−ＳｌＧＡＢＡを構築した。
【００１６】
（Ｄ）昆虫細胞Ｓｆ９を用いたＧＡＢＡ受容体α２サブユニットの発現
昆虫細胞Ｓｆ９にプラスミドｐＸＩＮｓｅｃｔ−ＳｌＧＡＢＡ１μｇを添加しゆっくりと撹拌した後、セルフェクチンを加えた。ゆっくりと撹拌した後室温で１５分静置した。６０ｍｍのディッシュに移液した後、２７℃で４時間反応させた。新鮮な培地に置き換えた後、さらに２７℃で７２時間反応させた。９６穴マイクロプレートに細胞を分注し細胞をプレートの底面に接着させた後、抗生物質Ｇ４１８及びＧｅｎｔａｍｉｃｉｎを含むグレース培地を加え２７℃で培養することで細胞の選択を行った。約１週間培養後、コンフルエントに達したウェルの細胞のみ４８ウェルプレートに移した。このような方法で２４ウェル、６ウェル、２５ｃｍ２フラスコで培養することにより細胞のスケールアップを行い、ＧＡＢＡ受容体α２サブユニットを発現させた。
【００１７】
（Ｅ）パッチクランプ法によるイオンチャンネル機能確認
上記のように構築したハスモンヨトウＧＡＢＡ受容体発現細胞のイオンチャンネル機能をパッチクランプ法により確認した。
【配列表】
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