(57)【要約】【課題】  軟骨細胞培養に使用できる生分解可能な骨格としてより好適な形態、条件を具備している、新しい加水分解性ポリロタキサンとその製造方法、並びにこれを用いた軟骨細胞の培養方法を提供する。【解決手段】  複数の環状分子の空洞部を貫通した線状分子の両末端に置換基を加水分解性結合させた加水分解性ポリロタキサンにおいて、コレステロール基が導入結合されているポリロタキサンとする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の環状分子の空洞部を貫通した線状分子の両末端に嵩高い置換基を有する生体親和性基を加水分解性結合させた加水分解性ポリロタキサンにおいて、コレステロール基が導入結合されていることを特徴とするポリロタキサン。
【請求項２】
環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、および環状ポリアミンのうちの１種以上であることを特徴とする請求項１のポリロタキサン。
【請求項３】
環状分子がα，βおよびγ−シクロデキストリンのうちの１種以上であることを特徴とする請求項２のポリロタキサン。
【請求項４】
線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体、およびポリアルキルビニルエーテルのうちの１種以上であることを特徴とする請求項１のポリロタキサン。
【請求項５】
環状分子がシクロデキストリンであって、コレステロール基が100unitグルコース当り１〜50の範囲で導入されていることを特徴とする請求項１のポリロタキサン。
【請求項６】
請求項１ないし５のうちのいずれかのポリロタキサンが二官能性水溶性化合物により架橋され、発泡により多孔化されていることを特徴とするポリロタキサンヒドロゲル。
【請求項７】
請求項６のポリロタキサンであることを特徴とする組織再生用基材。
【請求項８】
請求項３のポリロタキサンヒドロゲルを用いて軟骨細胞を培養することを特徴とする軟骨細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、ポリロタキサンとそのヒドロゲル並びに組織再生用基材と軟骨細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
臓器移植に替わる新しい医療として期待されている再生医療分野では、安全性の高くかつ組織再生が可能なマテリアルが切望されているにも関わらず、そのような理想的なマテリアルはほとんど実現されていない。
【０００３】
たとえば軟骨は特徴的なマトリックスを有するため自己修復能が低く、損傷すると治療が困難である。その再生医療に関しては、生体適合性マトリックス上に軟骨細胞を培養し、再生された軟骨組織を体内に移植する軟骨組織工学(cartilage tissue engineering)が試みられている。現在までにポリグルコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、キチン、キトサンなどの生分解性高分子を用いた軟骨再生が検討されている。しかしながら、これらは、生体内分解制御が困難であり、組織再生後に残存する分解産物によって炎症反応を惹起するという問題がある。この問題点は、依然として解決されていない。
【０００４】
このような背景から、この出願の発明者らは、高密度で細胞を播種するためには、高度な開放性孔質性ポリマー基質が必要であり、三次元の基質中で培養する細胞に対しては、栄養と酸素を効率的に供給する必要があるとの観点から、末端にエステル結合を有するＰＥＧ鎖上に連なるα−シクロデキストリン（α−ＣＤｓ）を用いてPoly(ethyleneglycol)bisamine（ＰＥＧ−ＢＡ）を架橋することにより、ポリロタキサンヒドロゲルを調製する方法を提案している（非特許文献１、特許文献１）。この方法によれば、連結されたヒドロゲルの浸食時間は、末端エステル結合を有するα−ＣＤｓの包接複合体により調節される。すなわちこれらのヒドロゲルでは、高い含水量の維持と浸食時間の延長が同時に達成される（非特許文献２）。この特異な知見は、α−ＣＤｓとＰＥＧ鎖の間の機械的連結が有する構造的特徴に起因している（非特許文献３）。
【０００５】
また、最近発明者らが示した事実によれば、連結されたヒドロゲルで調節された分解性を有するものは、軟骨細胞培養に使用する生物分解可能な骨格として大きな可能性を持っている。
【０００６】
しかしながら、これまでのところ、このような大きな可能性のあるポリロタキサンヒドロゲルではあるが、細胞培養のための最適な形態、条件についてはその検討は必ずしも充分ではなかった。
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０７４０９９
【非特許文献１】J.Watanabe at el., Chem. Lett. 1031(1998)
【非特許文献２】T. Ichi et al., Biomacromolecules 2, 204(2001)
【非特許文献３】T. Ichi et al., Macromol. Biosci 3, 373(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりのこれまでの背景を踏まえて、その特徴によって軟骨細胞培養に使用できる生分解可能な骨格としてより好適な形態、条件を具備している、新しい加水分解性ポリロタキサンとそのヒドロゲル、並びにこれを用いた組織再生用基材と軟骨細胞の培養方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、複数の環状分子の空洞部を貫通した線状分子の両末端に嵩高い置換基を有する生体親和性基を加水分解性結合させた加水分解性ポリロタキサンにおいて、コレステロール基が導入結合されていることを特徴とするポリロタキサンを提供する。
【０００９】
また、第２には、環状分子が環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、および環状ポリアミンのうちの１種以上であることを特徴とするポリロタキサンを、第３には、環状分子がα，βおよびγ−シクロデキストリンのうちの１種以上であることを特徴とする請求項２のポリロタキサンを、第４には、線状分子がポリアルキレングリコールもしくはその２種以上の共重合体、およびポリアルキルビニルエーテルのうちの１種以上であることを特徴とするポリロタキサンを、第５には、環状分子がシクロデキストリンであって、コレステロール基が100unitグルコース当り１〜50の範囲で導入されていることを特徴とする上記のポリロタキサンを提供する。
【００１０】
そして、この出願の発明は、第６には、上記のポリロタキサンが二官能性水溶性化合物により架橋され、発泡により多孔化されていることを特徴とするポリロタキサンヒドロゲルを提供する。
【００１１】
さらにこの出願の発明は、第７には、上記のポリロタキサンであることを特徴とする組織再生用基材を提供し、第８には、上記のポリロタキサンヒドロゲルを用いて軟骨細胞を培養することを特徴とする軟骨細胞の培養方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
上記のとおりこの出願の発明においては、コレステロール基を加水分解性ポリロタキサンに導入することによって分解時間を任意に制御できると共に軟骨再生を促進することができる。コレステロール導入量が高いほど短期間で分解される。さらに、コレステロール基の存在によって、軟骨増殖および細胞外基質（ＧＡＧ production）が向上される。
【００１３】
この出願の発明のコレステロール導入多孔化ヒドロゲルは、軟骨組織再生と完全分解する点において理想的な組織再生用マテリアルに向けたブレークスルーを可能にしており、再生医療の発展に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１５】
この出願の発明の加水分解性ポリロタキサンは、これまでに発明者らが開発し、提案している複数の環状分子の空洞部を貫通した線状分子の両末端に嵩高い置換基を有する生体親和性基を加水分解性結合された加水分解性ポリロタキサンにおいて、コレステロール基を導入結合したものである。
【００１６】
ここで、上記の加水分解性結合については、エステル結合、シッフ塩基結合、カーバメート結合、ペプチド結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合等の各種の加水分解性の結合であってよい。また、線状分子についてもポリアルキレングリコールをはじめ、これに類似する線状高分子として、アミン基結合やチオエーテル結合等を介してのポリアルキレン線状高分子等が考慮される。なかでも、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、及びポリメチルビニルエーテルからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。このように構成する環状分子や線状分子として、生体親和性に優れているものを選ぶことにより、合成されたポリロタキサンやポリロタキサンヒドロゲルは生体親和性に優れ、組織再生用移植材料として適している。また、平均分子量は200〜100000、特に400〜5000であることが好ましい。環状分子としては、α，β又はγ−シクロデキストリンであることが好ましいが、これと類似の環状構造を持つものであってもよく、そのような環状構造としては環状ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルアミン、環状ポリアミン等が挙げられる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、α−シクロデキストリンとポリエチレングリコールとの組合せが好ましい。このような線状分子の末端に加水分解性結合を介して結合される生体親和性基も各種であってよく、嵩高い置換基を有するものが用いられる。生体親和性基としては、たとえばアミノ酸、オリゴペプチド、オリゴ糖類又は糖誘導体であることが好ましい。アミノ酸としては、たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミンサン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。また、オリゴペプチドとしては、前出のアミノ酸の複数がペプチド結合して形成されたもの等が挙げられる。また、オリゴ糖類としては、繰り返し単位が１〜５であり、構成多糖としてデキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷんからなるもの等が挙げられる。さらに、糖誘導体としては、オリゴ糖類、多糖又は単糖をアセチル化やイソプロピル化等の化学修飾した化合物等が挙げられる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、たとえばＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等が好ましい。
【００１７】
また、嵩高い置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのような基であってもよいが、たとえば１以上のベンゼン環を有する基又は１以上の第三ブチルを有する基が好ましい。１以上のベンゼン環を有する基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フレオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジルエステル（ＯＢｚ）基等が挙げられ、また、１以上の第三ブチルを有する基としては、第三ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）基、アミノ酸第三ブチルエステル（ＯＢｕ基）等が挙げられるが、このうち、ベンジルオキシカルボニル基が好ましい。
【００１８】
コレステロール基は、次式
【００１９】
【化１】
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【００２０】
の構造のもの、さらにはその骨格にこの出願の発明の目的、効果を促進する各種の置換基を有するものの１種以上が選択されてよい。置換基としては、たとえばアルキル基等の炭化水素基、エーテル基、ヒドロキシル基、エステル基、チオエーテル基、アミノ基、アミド基、カルバメート基、ペプチド基、等の各種のものが考慮される。
【００２１】
このようなコレステロール基については、その導入量は、環状分子がシクロデキストリンの場合、グルコール100unit当り１〜50の範囲、さらには１〜25の範囲とすることが実際上は好適である。
【００２２】
コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲルの調製は、線状分子、たとえばＰＥＧ鎖上に連なるシクロデキストンと二官性水溶性化合物、たとえばＰＥＧ−ＢＡを結合することにより行い、発泡塩として、たとえば炭酸水素カリウムとクエン酸を組み合わせて使用する発泡技術により、マクロ孔質構造を形成することにより実現される。
【００２３】
たとえばより具体的には、コレステロール導入多孔化ヒドロゲルの製造方法は、発明者らが既に提案している方法（特許文献１）に沿って、コレステロール導入ポリロタキサン中のＣＤ水酸基を用いて予めＣＤＩ：Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール等の縮合剤で活性化し、両末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＢＡ）等の二官能性水溶性高分子と、たとえば重量比で10−80％の割合でジメチスルスルホキシド中にて混合し、100ｗｔ％以上の100−500μｍの発泡剤を加えて架橋し、３Ｍクエン酸中に発泡させることによって多孔化する。
【００２４】
この出願の発明の加水分解性ロタキサンヒドロゲルは生理的条件下にて加水分解され、その分解時間は数時間以上数年以下の範囲にあり、コレステロール基の導入量によって制御できる特徴を有している。いずれの分野においてもヒドロゲルに何らかの外力がかかることにより、外力による変形挙動もその材料としての機能、性能を決定する最も重要な物性である。コレステロール基の導入量及び、多孔化によって圧縮力による弾性率（ヤング率）を制御できる特徴を有し、このヒドロゲルのヤング率は数ＫＰａ以下の範囲である。
【００２５】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって発明が限定されることはない。
【実施例】
【００２６】
以下の例においては次の試料を用いている。
材料：  数平均分子量が3300であるPoly(ethylene glycol)（PEG）はSanyo Chemical Co. Ltd., Kyoto, Japanからのものを、また、アミノ終端化Poly(ethylene glycol) ［poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol)-block-poly(ethylene glycol)bis(2-aminopropyl ether)、PEG-BA、Mn=2000］はSuntechno Chemical Co., Tokyo, Japanからのものを用いた。PEG-BAは脱水したのちトルエン中で共沸蒸留を行い、ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過して室温真空中で乾燥させた。以下の化合物は試薬グレードであり、追加精製を行うことなく使用した。a-Cyclodextrin（a-CD）［Bio-Research Corporation of Yokohama, Yokohama, Japan］；benzyloxycarbonyl (Z)-L-phenylalanine（Z-L-Phe）［Kokusan Chemical Works, Tokyo, Japan］；無水コハク酸、エチレンジアミン、N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide（DCC）、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、無水クエン酸［Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan］；N,N'-Carbonyldiimidazole（CDI）［Aldich Chemical Co., Inc., USA］；N-Hydroxysuccinimide［Peptide Institue, Inc., Osaka Japan］；クロロギ酸コレステロール［Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo, Japan］；トリエチルアミン［Sigma Chemical Co., USA］;炭酸水素カリウム［Kanto Chemical Co. Inc., Tokyo, Japan］；0.03%トリメチルシラン含有ジメチルスルホキシド（［D6］DMSO）［Acoss Organics, Geel, Belgium］。ジメチルスルホキシド（DMSO）ならびにジメチルホルムアミド（DMF）はNacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japanからのものを使用前に精製した。
＜実施例１＞
コレステロール導入化ポリロタキサンの合成：  加水分解可能ポリロタキサンの合成は、発明者が確立した方法により行った（非特許文献２および３）。a-CD連続数が38であるポリロタキサン（１g、24mmol）は40mLのDMSO/DMF（1:1）に溶解した。この溶液にクロロギ酸コレステロール（54.7-1,370mmol）を添加し、60℃、Ｎ2環境で３時間にわたり攪拌した。過剰エーテル中に注ぐことにより粗製品を得た。その結果得られた白色沈殿をエーテルを用いて数回洗浄し、遠心分離して真空乾燥させた。得られた加水分解可能ポリロタキサンとコレステロール導入化ポリロタキサンの特性分析を1H NMR（Varian 500 MHz FT-NMR Gemini300, Palo Alto, CA, USA）により行った。ポリロタキサンの1H NMR（DMSO-d6、ppm）：5.80-5.20（d、a-CDのOH-2, OH-3）、4.79（s、a-CDのH-1）、4.48（b、a-CDのOH-6）、3.80-3.25（m、a-CDのH-3、H-5、H-6）、3.51（s、PEGのCH2）。コレステロール誘導体の1H NMR（DMSO-d6、ppm）：d=5.80-5.20（b、a-CDの12H、OH-2、OH-3/1H、CholのH-6）、4.80（s、1H、a-CDのH-1）、4.65-4.20（b、6H、a-CDのOH-6/2H、CholのH-4、H-4'）、3.80-3.60（m、24H、a-CDのH-3、H-5、H-6、H-6'）、3.51（m、4H、PEGのH-1、H-1'、H-2、H-2'）、3.40-3.20（m、12H、a-CDのH-2、H-4）、1.30-1.17（m、41H、CholのH）。置換度の計算は、Cholの41Hとa-CDのH-1の間を積分して行った。クロロギ酸コレステロールとa-CDの水酸基の添加比率を変えることにより、1-25%の範囲で置換度を変えることが可能であった。コレステロール導入化ポリロタキサンの構造図を図1に示した。
＜実施例２＞
コレステロール導入化加水分解性ポリロタキサンを用いたマクロ孔質骨格の調製と特性分析：  概略としては、コレステロール導入化ポリロタキサン中のa-CDの水酸基を、DMSO中で1,1-carbonyldiimidazole（CDI）により活性化した（非特許文献２を参照）。PEG-BA（MW:2,000）を溶液中に添加し、PEG-BAとa-CDの添加比率（PEG-BA/a-CD）が1.0になるようにした。PEG-BA/a-CD比率が２を超える条件で調製したヒドロゲルは生理学的条件で浸食されないが、これは平均して２分子のPEG-BAが１個のa-CD分子上に導入され、不溶性のネットワークを形成し、末端のエステル結合を加水分解した後でさえもそれが持続するためである。よって、PEG-BA/a-CD比率を１に合わせてコレステロール導入化ポリロタキサン骨格を調製した。
【００２７】
マクロ孔質骨格の調製には、次の２段階の製造工程を実施した。（1）塩抽出過程：直径300-500mmに篩過した600wt% NaClを混合液に添加し、均一に混合した。1.2g塩混合溶液を鋳型に入れ、圧縮して40℃で24時間にわたりインキュベートした。次にペレットの上面と底面をスライスし、大量の蒸留水中に入れて、蒸留水を用いて48時間にわたり数回洗浄した。（2）バブリングまたはガス発泡化過程：直径300-500 mmに篩過した600wt% KHCO3を混合液に添加し、均一に混合した。同様に1.2g塩混合溶液を鋳型に入れ、圧縮して40℃で24時間にわたりインキュベートした。次にペレットの上面と底面をスライスし、大量の3Mクエン酸溶液中に入れて、12時間にわたりバブリング過程を実施し、その後蒸留水を用いて24時間にわたり数回洗浄した。三次元骨格は必須であるが、これは軟骨細胞は単層基質上で培養すると、ほとんどの場合に表現型を変えて、繊維芽細胞に似た細胞となるためである。骨格の小孔の大きさも同様に、細胞増殖のための栄養素を移送するために重要な因子の一つである。軟骨細胞（大きさ、15-20mm）を高濃度で供給すると、小孔が十分な大きさを有しない場合には細胞が小孔を覆ってしまい、細胞死を引き起こすことがある。この細胞は、播種後に10回以上分裂する。そのため長期培養時には、骨格の小孔の大きさが軟骨細胞の大きさの10倍以上でなければならない。よって、この実験では300-500mmで篩過した小孔原料を使用するよう考慮した。塩抽出技術は、細胞の播種と移植のために広く利用されている。この方法で調整した骨格は常に高密度の層となり、これはin vitroでの骨格内ならびにin vivo埋め込み後の成長中組織内部への細胞播種を妨げた。いわゆるバブリングまたはガス発泡化過程と言われる工程を、発泡塩としての炭酸水素カリウムとクエン酸の組み合わせを用いて、高度な多孔性を持つヒドロゲルに対して行う方法を利用することにより、生物分解性骨格の多孔性相互接続性が改良されている。
【００２８】
結果的に得られた骨格の表面ならびに断面形態を図2に示した。ＳＥＭ像として、塩抽出によるもの：(a)上部表面、(b)断面、ならびにガス発泡化によるもの：(c)上部表面、(d)断面を示している。
【００２９】
最終的に得られた骨格の表面は高度な多孔性構造を有しており、塩抽出法により調製された骨格にしばしば見受けられる高密度の表面薄層は比較的少ない。骨格表面と内部領域にある小孔は均一にマクロ孔質となっており、その大きさの範囲は200-400mmであった。小孔は骨格基質全体にわたり十分に相互結合していた。バブリング処理を行う場合に、クエン酸濃度の及ぼす影響を考察することは興味深いので、クエン酸濃度を1、2、3Mならびに飽和濃度（約3.5M）まで変化させた。コレステロール誘導性ポリロタキサンに対する炭酸水素カリウムの重量比が600%に設定されている状態では、クエン酸濃度を増加させると、SEM測定で観察されるような多孔性の緩やかな増加が生じた（データ示さず）。この結果から、クエン酸と炭酸水素カリウムの間の酸-塩基反応の程度を調節することによって、実際に骨格の多孔性が調節可能であることが示唆される。クエン酸濃度を増加させると、バブリング処置途中のガス放出が活発になるのが視覚的にも観察された。
【００３０】
骨格のヤング係数は圧縮モードで、断面19.65mm2について、また高さ４mmの骨格周囲について、熱機械分析（TMA/SS150アナライザ、SII Seiko Instruments, Japan）を用いて測定し、SSC/5200Hコンピュータ上で37℃で演算した。骨格の表面ならびに断面構造は、走査電子顕微鏡（JSM-5510, JEOL, Japan）により25kV電子ビーム条件で拡大倍率100で観察した。脱水したヒドロゲルはカミソリ刃で切断し、JFC-1600 Auto Fine Coater（JEOL, Japan）を用いて30mAの電場にて30秒間にわたり真空中でプラチナ（Pt）による飛沫コートを行った後に観察した。
【００３１】
図3に示すのは、非小孔性ヒドロゲル（対照、図3a）、コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲルで塩抽出により調製したもの（図3b）、ならびにガス発泡化技術により調製したもの（図3c）のヤング係数である。誤差棒は標準偏差、ｎ＝３を示し、ＣＨとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を示す。非小孔性ヒドロゲルまたは塩抽出調製骨格においては、コレステロール置換度が増加するに従いヤング係数は減少した。コレステロール置換度が大きくなると、架橋領域のクラスタリングが生じるために分子間疎水会合が生じ、その結果としてあまり架橋されていない領域の衝撃耐性が低下するためだと思われる。圧縮力は、主にあまり架橋されていない弱い領域に影響を及ぼしている。一方、ガス発泡化技術により調製した骨格は、置換度を増加させた場合であっても、ヤング係数の変化がはっきりしない結果となった。この結果から、小孔性ヒドロゲルの小孔が相互結合した場合には、相互結合した小孔性ヒドロゲルの全領域にわたり、くまなく自然な圧縮力を受けるため、その弾性係数は置換度に影響されないことが示される。
＜実施例３＞
コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲルのin vitro分解挙動：  膨潤したコレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲルを0.1M NaOH aq.中に浸して、加速分解時間を測定することにより、実際の分解時間を予測した。また37℃条件で0.02重量%アジ化ナトリウムを静菌剤として含む0.1Mリン酸塩緩衝液（pH7.4）中に膨潤した骨格を浸し、万能振とう器SHK-U4（Iwaki Asahi Techno Glass, Japan）を用いて130rpmで振とうすることによっても浸食挙動が観察された。浸食過程の評価は、ヒドロゲルの残余重量を測定して行った。いずれの実験も三重反復で実施した。ゲル重量（%）は次のように計算した。
【００３２】
ゲル重量（%）=（Wt/Wo）x100
但しWtは時間tにおけるヒドロゲルの湿重量であり、
Woは分解前のヒドロゲルの湿重量
図４は、(a)非小孔性コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲル、(b)塩抽出（ＮａＣｌ）ならびに(c)ガス発泡化（ＫＨＣＯ3）により調製した小孔性コレステロール導入化ポリロタキサン骨格について、0.1Ｍ  ＮａＯＨ中で観察される分解が完了するまでの時間を示している。誤差棒は標準偏差、ｎ＝３を示す。ＣＨとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表している。
【００３３】
明らかに加速分解時間はコレステロール置換度に依存している。この結果から、ヒドロゲルの疎水性が増加するに従って分解速度が速くなることが示唆される。この理由には2つの可能性が考えられる。一つはコレステロール基の立体障害による架橋効率の減少であり、もう一つはコレステロール基の疎水会合であるが、これらの結果としてa-CDsが移動して他の領域に集合し、末端のエステル結合を水性媒体に曝露することになる。高密度ヒドロゲル（図4a）、塩抽出小孔性ヒドロゲル（図4b）、バブリング小孔性ヒドロゲル（図4c）の分解速度の違いは、次のように推察される。高密度ヒドロゲルと塩抽出小孔性ヒドロゲルは同様な架橋効率を示した。高度なコレステロール置換（CH25）状態にあるヒドロゲルのみが形成されなかった。これは疎水性相互作用によるコレステロール導入化ポリロタキサンの凝集に起因する架橋効率の低下であろうと考えられる。コレステロール導入化ポリロタキサンの分解速度は、水が末端のエステル結合に接触する機会に関係する筈である。塩抽出小孔性ヒドロゲルと比べて、高密度ヒドロゲルは小孔性ヒドロゲルと比べて水に接触する機会が少なく、その結果分解が完了するまでの時間が延長する。塩抽出小孔性ヒドロゲルとバブリング小孔性ヒドロゲルの間の大きさの程度の分解時間差は、架橋途中の塩の分布状態に起因すると考えられる。実験から観察すると、KHCO3はNaClと比較して良い充填と配向性を示した。明確な配向構造が存在する場合には、高度な疎水性置換におけるa-CDsの解離を助け、ヒドロゲルの規則的なネットワーク構造を形成する効率を増加させるだけでなく、末端のエステル結合が水に対して加水分解される機会を減らす可能性もある。この現象のため、KHCO3を発泡塩として用いて調製した場合の小孔性コレステロール導入化ポリロタキサンの分解速度は、NaCl（塩抽出）と高密度ヒドロゲルを用いた場合と比べて遅くなる可能性がある。図5に示すのは、塩抽出工程により調製した小孔性コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲルの分解挙動を、PB溶液中で試験した結果である。初期段階では、ヒドロゲル重量は最大値に達するまで増加し、続いてゲル重量が徐々に失われることにより、完全な大量分解が生じることが観察された。この現象は、初期段階では膨張したゲルの最大値に達するまで水分吸収が生じ、続いて末端エステル結合の加水分解が生じることが原因である。図４と５を基に、0.1M NaOH溶液において実施された加速分解条件を利用して、pH7.4のリン酸塩緩衝液という生理学的条件下におけるヒドロゲルの分解時間を予測し、これを図6に示す検量曲線にまとめることが可能である。この検量曲線は原点を通らない。これはおそらく0.1M NaOH溶液中では約６分、生理学的PB溶液中では約18-20日にあたるゲル膨張の初期段階に相当するのであろう。この検量曲線をもとにして、表１にまとめるように高密度ヒドロゲル、塩抽出小孔性ヒドロゲル、ならびにバブリング小孔性ヒドロゲルの分解時間を予測することが可能である。
【００３４】
【表１】
2005143920.tif 000004
【００３５】
＜実施例４＞
軟骨細胞培養ならびにGAG産生の測定：  軟骨細胞はニホンシロウサギ（同種モデル）より単離した。マクロ孔質骨格は4部分に分割し、４回にわたり蒸留水中で洗浄ならびに攪拌し、次に70%エタノール中に30分にわたり浸して滅菌した。その後、マクロ孔質骨格を24ウェルプレートに入れた。１×107細胞/mLを含む10mL細胞懸濁液を骨格上に供し、30分間放置した。軟骨細胞の培養は、37℃、５% CO2、95%湿度条件下で、14日間と28日間にわたり実施した。培養培地（DMEM、10% FBS、50mg/mLアスコルビン酸）は、３日または４日毎に交換した。生細胞の計数は比色微量滴定（MTTアッセイ、Dojindo, Japan）により実施した。このアッセイでは微量滴定プレートを用い、生細胞がテトラゾリウム塩（MTT）を不溶性形態であるホルマザン塩に還元する能力を測定する。グリコサミノグリカン（GAG）産生の測定は、ラピッドアッセイキット（Hokudo Co. Ltd., JAPAN）を用いたGAGのラピッドアッセイにより行ったが、これはstain-allにより酸性GAGを特異的に染色することができた。
【００３６】
混合KHCO3塩より調製した骨格は、混合NaCl塩より調製した骨格と比べて良好な相互結合性を示したため、KHCO3塩を混合したヒドロゲルを基質として利用して軟骨細胞培養を行い、コレステロール基が軟骨細胞の増殖に対して与える影響を明らかにした。ウサギ軟骨細胞のコレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲル中における細胞増殖とGAG産生の結果を、図７と８にそれぞれ示した。GAG産生は軟骨様組織形成に特異的な表現型として知られている。28日間にわたり、軟骨細胞の細胞数は全てのヒドロゲル中で増加しており、コレステロール基が細胞毒性作用を有しないことが示された。コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲル中における培養軟骨細胞の細胞増殖とGAG産生は（CH5とCH10）、いずれも対照（PRx）より増加していた。これらの結果から、適当量のコレステロールは軟骨細胞膜との間に誘引性の相互作用を生じさせ、続いて起こる軟骨様組織の形成の一因になっていることが示唆される。
＜実施例５＞
組織学的分析：  組織学的標本は10%ホルムアルデヒド中性緩衝液中で固定し、パラフィン埋め込み処理を行った。標本塊は自動ミクロトームを用いて薄片に切断し、ガラススライド上に置いた。スライドはアルシアンブルーで染色し、光学顕微鏡（TE300、倒立顕微鏡、Nikon Co., Japan）により、細胞や細胞外マトリクスなどの組織成分を可視的に観察できるようにした。
【００３７】
組織化学的分析によれば、同様な結果が細胞増殖とGAG産生について示されており、これは軟骨細胞は軟骨骨格中で増殖し、図９に示すようにアルシアンブルー染色により検出されるグリコサミノグリカンを含む、細胞外マトリクスを析出するというものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】コレステロール導入化ポリロタキサンの構造図。
【図２】調製した骨格の走査電子顕微鏡写真。塩抽出（NaCl）によるもの：（a)上部表面、（b)断面、ならびにガス発泡化（KHCO3）によるもの：（c)上部表面、（d)断面。
【図３】（a)非小孔性コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲル、（b)塩抽出（NaCl）ならびに（c)ガス発泡化（KHCO3）により調製した小孔性コレステロール導入化ポリロタキサン骨格の弾性係数。誤差棒は標準偏差、n=3を示す。CHとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表す。
【図４】（a)非小孔性コレステロール導入化ポリロタキサンヒドロゲル、（b)塩抽出（NaCl）ならびに（c)ガス発泡化（KHCO3）により調製した小孔性コレステロール導入化ポリロタキサン骨格について、0.1M NaOH中で観察される分解が完了するまでの時間。誤差棒は標準偏差、n=3を示す。CHとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表す。
【図５】0.1Mリン酸塩緩衝液、pH7.4中でインキュベートしたコレステロール導入化ポリロタキサン骨格の重量変化。
【図６】0.1M NaOH中での完全分解時間をもとにしてPB溶液中の実際の完全分解時間を見積もるための検量曲線。
【図７】コレステロール導入化ポリロタキサン骨格中におけるウサギ軟骨細胞の増殖。CHとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表す。
【図８】コレステロール導入化ポリロタキサン骨格中で14日ならびに28日にわたり培養したウサギ軟骨細胞からのGAG産生。誤差棒は標準偏差、n=３を示す。CHとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表す。
【図９】各種コレステロール導入化ポリロタキサン骨格中での培養28日後における軟骨細胞の、アルシアンブルー染色を行った組織化学的切片。(a)ポリロタキサン（対照）、(b)CH5、(c)CH10、(d)CH15、(e)CH25。CHとその後の数字は、コレステロール導入化ポリロタキサンとその置換度を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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