(57)【要約】【課題】  各タイプの気管支喘息を発症した喘息モデル動物を提供する。【解決手段】  刺激によって喘息を誘導するメモリー型Ｔｈ細胞を有することによって、メモリー型Ｔｈ１細胞を刺激すればＴｈ１型喘息を発症した喘息モデル動物が、メモリー型Ｔｈ２細胞を刺激すればＴｈ２型喘息を発症した喘息モデル動物となる。また、両細胞共に刺激すれば、混合型喘息を発症した喘息モデル動物となる。これらの喘息モデル動物は、各タイプの喘息の詳細な病態解析、および、各症状に適した有効な喘息の治療法（特に、難治性気管支喘息の治療法）を確立するために有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激によって喘息を誘導するメモリー型Ｔ細胞を有することを特徴とする喘息モデル動物。
【請求項２】
上記メモリー型Ｔ細胞が、上記刺激に対して特異的に作用するＴ細胞であることを特徴とする請求項１に記載の喘息モデル動物。
【請求項３】
上記メモリー型Ｔ細胞が、メモリー型ヘルパーＴ１細胞、または、メモリー型ヘルパーＴ２細胞であることを特徴とする請求項１または２に記載の喘息モデル動物。
【請求項４】
上記刺激は、抗原によるものであることを特徴とする請求項１、２または３に記載の喘息モデル動物。
【請求項５】
上記刺激は、抗原およびインターロイキン−１８によるものであることを特徴とする請求項１、２または３に記載の喘息モデル動物。
【請求項６】
上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子の産生が阻害されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の喘息モデル動物。
【請求項７】
上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子が、ＩｇＥ、または、ケミカルメディエーターであることを特徴とする請求項６に記載の喘息モデル動物。
【請求項８】
上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞が、肥満細胞であることを特徴とする請求項６または７に記載の喘息モデル動物。
【請求項９】
刺激によって、ヘルパーＴ１サイトカインとヘルパーＴ２サイトカインとを産生するメモリー型ヘルパーＴ１細胞を有することを特徴とする喘息モデル動物。
【請求項１０】
Ｔ細胞を、宿主に導入する導入工程と、
宿主に導入したＴ細胞を、メモリー型Ｔ細胞に変換する変換工程と、
メモリー型ヘルパーＴ細胞を刺激して、宿主を喘息に誘導する誘導工程とを含むことを特徴とする喘息モデル動物の作製方法。
【請求項１１】
上記誘導工程における刺激を、吸入によって行うことを特徴とする請求項１０に記載の喘息モデル動物の作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の喘息モデル動物に対して、被験物質を投与し、喘息の改善効果を検定することを特徴とする喘息治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のスクリーニング方法により喘息の改善効果を示すと判定される物質を含有する喘息治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息モデル動物およびその作製方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）は、産生するサイトカインの違いから、２つの機能の異なるサブセットＴｈ１細胞とＴｈ２細胞とに分類される。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞に固有のサイトカインの産生パターンは、非常に厳格なものである。特に、細胞染色体のクロマチン構造を考慮に入れた場合、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生性のＴｈ１細胞が、Ｔｈ２サイトカインを産生しないということが、一般的な考え方であった。従って、免疫学では、一般的に、Ｔｈ１細胞の免疫応答と、Ｔｈ２細胞の免疫応答とは、お互いに抑制的に作用してバランスを平衡に維持していると考えられている。すなわち、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、生体の恒常性を保つために、互いに産生するサイトカインによって、互いを抑制的に制御しているというのが、一般的な考えである。Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞の免疫応答によって発症する疾患（Ｔｈ１型疾患またはＴｈ２型疾患）の多くは、このバランスが崩れることが原因であると考えられている。
【０００３】
例えば、気管支喘息（喘息）も、このバランスが崩れることによって発症すると考えられている。気管支喘息は、肺における、即時型および遅延型の過敏反応の繰り返しによって引き起こされる気道の疾患であり、断続的な可逆性の気道閉塞を発症する。気管支喘息を発症した気道には、好中球，好酸球，脱顆粒した肥満細胞，基底膜の肥厚化，および杯細胞の増殖などの病的変化が存在する。すなわち、気管支喘息は、気道過敏性、好酸球性気道炎症、気道閉塞、粘液過分泌、および高レベルのＩｇＥによって特徴付けられる。
【０００４】
現在では、気管支喘息の本態は、気道の慢性炎症に基づく「気道過敏性（ＡＨＲ）」であると考えられている。「気道過敏症」は、気道炎症によって引き起こされ、炎症細胞浸潤，気道上皮細胞の障害，サイトカインや各種メディエーターの遊離を起こし、様々な作用機序で気道平滑筋の反応性亢進を示す。
【０００５】
これまで、気管支喘息は、アレルゲン，免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ），およびヘルパーＴ２細胞が産生するサイトカイン（Ｔｈ２サイトカイン）の協調作用によって誘導されるＴｈ２型疾患と考えられてきた。すなわち、気管支喘息の症状は、Ｔｈ２細胞の刺激状態によって説明されてきた。実際、ＧＡＴＡ−３の不活性化によるＴｈ２細胞の不活性化は、気道炎症および気道過敏性を著しく低減する。
【０００６】
また、特に、Ｔｈ２サイトカイン（例えば、インターロイキン（以下「ＩＬ」）−４（ＩＬ−４）、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３など）、および、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子）によって、気管支喘息が引き起こされることは、よく知られている。
【０００７】
ここで、ＩＬ−４は、Ｔｈ２サイトカインとして重要な作用を有しており、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を誘導する。ＩＬ−５は、好酸球の分化および活性化を誘導する。ＩＬ−４およびＩＬ−９は、強力な肥満細胞成長因子である。ＩＬ−９およびＩＬ−１３は、杯細胞の異常増殖を引き起こし、粘液産生を誘導する。さらに、ＩＬ−１３は、ＡＨＲ（気道過敏性（気道の応答性亢進））を誘導する必須因子であることが示されている。また、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−４非依存的にＴｈ２細胞の分化を誘導するとともに、好酸球の生存も維持している。
【０００８】
一方、Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ２細胞の活性を抑制するため、気管支喘息に対して防御的であると考えられている。すなわち、Ｔｈ１サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は、Ｔｈ２細胞の免疫応答に拮抗するため、Ｔｈ１細胞（またはＴｈ１サイトカイン）は、喘息に対して防御的であると考えられている。
【０００９】
従来、喘息の病態解析等を行うため、気道過敏性の亢進を伴った喘息モデル動物が、以下の方法で作製されている。以下の方法は、喘息がＴｈ２型疾患であること；ウイルス等の感染により喘息の症状が悪化すること；などに基づく方法である。
【００１０】
例えば、喘息モデル動物を作製する第１の方法として、Ｔｈ２細胞から産生するＩＬ−１３の作用によって喘息を誘導する方法がある。
【００１１】
具体的には、この方法は、ＯＶＡをアジュバンドと共にマウスに免疫して、ＯＶＡ反応性のＴｈ２細胞を生体内に誘導した感作マウスとする。そして、この感作マウスに、ＯＶＡを投与することによって、Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ−１３の作用により誘導される、肺組織内の好酸球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った喘息モデルマウスを作製するものである。
【００１２】
また、上記第１の方法の別の方法として、抗原特異的Ｔｈ２細胞を利用する方法がある。この方法は、抗原特異的Ｔｈ２細胞をマウスに移入し、その直後から抗原を投与することによって、Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ−１３の作用により誘導される、肺組織内の好酸球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った喘息モデルマウスを作製するものである。
【００１３】
また、上記第１の方法の別の方法として、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウィルス；respiratory syncytial virus）を利用する方法がある。この方法は、正常マウスに、ＲＳウイルスを直接吸入させることによって、ＩＬ−１３の産生を誘導し、気道内杯細胞を刺激してムチン産生亢進による気道閉塞を伴った喘息モデルマウスを作製するものである。
【００１４】
また、喘息モデル動物を作製する第２の方法として、リポ多糖体（ＬＰＳ）を利用する方法がある。この方法は、正常マウスにグラム陰性菌の細胞壁の主成分であるＬＰＳを直接投与して炎症性サイトカイン産生を誘導し、肺組織内の好中球の増加と気道過敏性の亢進とを伴った喘息モデルマウスを作製するものである。
【非特許文献１】Hansen, G., G. Berry, R.H. DeKruyff, and D.T. Umetsu. 1999. Allergen-specific Th1 cells fail to counterbalance Th2 cell-induced airway hyperreactivity but cause severe airway inflammation. J. Clin. Invest. 103:175-183.
【非特許文献２】Randolph, D.A., C.J. Carruthers, S.J. Szabo, K.M. Murphy, and D.D. Chaplin. 1999. Modulation of airway inflammation by passive transfer of allergen-specific Th1 and Th2 cells in a mouse model of asthma. J. Immunol. 162:2375-2383.
【非特許文献３】Ford, J.G., D. Rennick, D.D. Donaldson, R. Venkayya, C. McArthur, E. Hansell, V.P. Kurup, M. Warnock, and G. Grunig. 2001. IL-13 and IFN-γ: interactions in lung inflammation. J. Immunol. 167:1769-1777.
【非特許文献４】Takaoka, A., Y. Tanaka, T. Tsuji, T. Jinushi, A. Hoshino, Y. Asakura, Y. Mita, K. Watanabe, S. Nakaike, Y. Togashi, T. Koda, K. Matsushima, and T. Nishimura. 2001. A critical role for mouse CXC chemokine(s) in pulmonary neutrophilia during Th type 1-dependent airway inflammation. J. Immunol. 167:2349-2353.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、喘息はＴｈ２型疾患であると考えられてきたため、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γが、Ｔｈ２サイトカインに拮抗して、気管支喘息を抑制すると考えられてきた。
【００１６】
しかしながら、近年、Ｔｈ１細胞は、好中球を遊走・活性化することによって、気管支喘息を誘発するとの報告や、気管支喘息患者の中には、Ｔｈ１細胞優位な免疫応答を示す症例も混在するという報告もされている。このため、気管支喘息の発症メカニズムにおける、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞のバランス説に疑問が投げかけられている。
【００１７】
最近の研究から、気管支喘息の誘導に、Ｔｈ１細胞が関与していることが明らかとなった。例えば、Ｔｈ１細胞の減少に伴い、Ｔｈ２細胞で誘導されたＡＨＲが緩和することを示した研究もある。また、Ｔｈ１細胞は、好中球の遊走および活性化によって、ＡＨＲを誘導するという報告もなされている。
【００１８】
また、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞が、お互いを阻害するのではなく、むしろ、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞が共同して、それぞれの活性を増強し、気管支喘息を誘導することを示しているという研究、すなわち、喘息誘導におけるＴｈ１サイトカインおよびＴｈ２サイトカインの両方の重要性を示した研究もある。具体的には、アレルゲン特異的Ｔｈ１細胞、および、アレルゲン特異的Ｔｈ２細胞の同時移入は、喘息を誘導する。さらに、アレルゲン特異的Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ２細胞を介した気道過敏性に効果を示さなかった。
【００１９】
また、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ−１３（Ｔｈ２サイトカイン）の投与は、最も重篤な気管支喘息を誘導する。さらに、最近の研究では、Ｔｈ１細胞が、好中球を集積および活性化するによって気道過敏性を誘導するという、別の可能性も示されている。すなわち、Ｔｈ１細胞が、ある条件下では、病的状態の細胞となるという可能性も指摘されている。
【００２０】
以上ように、Ｔｈ２型疾患と考えられていた気管支喘息は、現在では３つのタイプ、すなわち、Ｔｈ１細胞誘導型喘息（Ｔｈ１型喘息）Ｔｈ２細胞誘導型喘息（Ｔｈ２型喘息）、および、Ｔｈ１細胞／Ｔｈ２細胞混合誘導型喘息（混合型喘息）に分類できる。なお、Ｔｈ１型喘息は、ケモカインの機能阻害によって制御され、Ｔｈ２型喘息は、ＩＬ−１３の中和によって阻害される。
【００２１】
ところで、現在の喘息治療では、ステロイド（ステロイド吸入），β刺激薬、気管支拡張薬（テオフィリン等），抗コリン薬，抗アレルギー薬，などの投与；減感作療法などが行われている。なお、減感作療法とは、ＩｇＥ抗体が関与する即時型アレルギー反応（Ｉ型アレルギー反応）の原因抗原であるアレルゲン，特に吸入性アレルゲンを生体内に投与し（一般には注射）、アレルゲンに対する過敏反応を軽減させようとする治療法である。
【００２２】
しかしながら、喘息の中には、これらの治療法に対して抵抗性を示す難治性喘息も存在する。また、病原体の感染（感染症）を契機に発症した喘息に対しては、ステロイド吸入法は、症状を悪化させる可能性も指摘されている。
【００２３】
このように、気管支喘息で引き起こされる「気道過敏性」の原因は、未だ不明な点が多く、それを解明することが今後の重要な課題となっている。そのためには、上記各タイプの喘息モデル動物を作製し、各タイプの喘息の詳細な病態解析、および、各症状に適した有効な喘息の治療法（特に、難治性気管支喘息の治療法）を確立すること重要となる。
【００２４】
本発明は、上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、例えば、気管支喘息の病態解析および治療法を確立するために好適に利用できる、各タイプの気管支喘息を発症した喘息モデル動物およびその作製方法並びにその利用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明者等は、Ｔｈ細胞のタイプに応じた喘息モデル動物について鋭意に検討した結果、抗原特異的Ｔｈ細胞を選択的に刺激することによって、Ｔｈ１型喘息，Ｔｈ２型喘息，および混合型喘息を発症させることができることを見出した。さらに、メモリー型Ｔｈ１細胞を、抗原とＩＬ−１８とにより刺激することによって、当該Ｔｈ１細胞が、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとを同時に産生することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２６】
すなわち、本発明にかかる喘息モデル動物（本モデル動物）は、上記の課題を解決するために、刺激によって喘息を誘導するメモリー型Ｔ細胞を有することを特徴としている。
【００２７】
また、本モデル動物は、上記メモリー型Ｔ細胞が、上記刺激に対して特異的に作用するＴ細胞であることを特徴としている。
【００２８】
また、本モデル動物は、上記メモリー型Ｔ細胞が、メモリー型ヘルパーＴ１細胞（メモリー型Ｔｈ１細胞）、または、メモリー型ヘルパーＴ２細胞（メモリー型Ｔｈ２細胞）であることを特徴としている。
【００２９】
また、本モデル動物は、上記刺激が、抗原によるものであることを特徴としている。
【００３０】
また、本モデル動物は、上記刺激が、抗原およびインターロイキン−１８によるものであることを特徴としている。
【００３１】
また、本モデル動物は、上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子の産生が阻害されていることを特徴としている。換言すれば、上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子の産生が誘導されないことを特徴としている。
【００３２】
また、本モデル動物は、上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子が、ＩｇＥ、または、ケミカルメディエーターであることを特徴としている。
【００３３】
また、本モデル動物は、上記メモリー型Ｔ細胞以外の細胞が、肥満細胞であることを特徴としている。
【００３４】
本発明の喘息モデル動物は、上記の課題を解決するために、刺激によって、ヘルパーＴ１サイトカイン（Ｔｈ１サイトカイン）とヘルパーＴ２サイトカイン（Ｔｈ２サイトカイン）とを産生するメモリー型ヘルパーＴ１（メモリー型Ｔｈ１）細胞を有することを特徴としている。
【００３５】
本発明の喘息モデル動物の作製方法（本作製方法）は、上記の課題を解決するために、Ｔ細胞を、宿主に導入する導入工程と、宿主に導入したＴ細胞を、メモリー型Ｔ細胞に変換する変換工程と、メモリー型ヘルパーＴ細胞を刺激して、宿主を喘息に誘導する誘導工程とを含むことを特徴としている。
【００３６】
また、本作製方法は、上記誘導工程における刺激を、吸入によって行うことを特徴としている。
【００３７】
本発明の喘息治療剤のスクリーニング方法は、上記いずれかの喘息モデル動物に対して、被験物質を投与し、喘息の改善効果を検定することを特徴とするものである。また、本喘息治療剤は、前記スクリーニング方法により喘息の改善効果を示すと判定される物質を含有することを特徴とするものである。
【００３８】
上記各構成および方法によれば、メモリー型Ｔ細胞に依存的に喘息を発症させることができ、与える刺激によってタイプの異なる喘息モデル動物を提供できる。従って、各タイプの喘息の詳細な病態をより的確に把握でき、これらの喘息モデル動物を用いた喘息治療剤（抗喘息薬）のスクリーニング方法や、喘息のタイプや症状に適した医薬品（喘息治療剤）をより確実に得ることが可能となるという効果を奏する。さらに、各タイプの喘息の発症機構の解明、それによる新規治療法を確立できるため、従来の治療法では抵抗性を示していた難治性喘息の治療法の開発にも有用である。
【発明の効果】
【００３９】
以上のように、本発明の喘息モデル動物は、刺激によって喘息を誘導するメモリー型Ｔ細胞有することを特徴としている。それゆえ、メモリー型Ｔ細胞に依存的に喘息を発症させることができ、与える刺激によってタイプの異なる喘息モデル動物を提供できる。従って、各タイプの喘息の詳細な病態をより的確に把握でき、これらの喘息モデル動物を用いた抗喘息薬のスクリーニングや、喘息のタイプや症状に適した医薬品をより確実に得ることが可能となるという効果を奏する。
【００４０】
また、本発明の喘息モデル動物は、刺激（例えば、抗原とＩＬ−１８による刺激）によって、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとを産生して喘息を誘発するメモリー型Ｔｈ１細胞を有することを特徴としている。それゆえ、Ｔｈ１細胞からはＴｈ１サイトカインのみが産生されるという従来の考え、および、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとが互いに拮抗するという従来の考えとは異なった新しいサイトカインネットワークを解明し、免疫学の開拓に貢献できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の実施の一形態について説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【００４２】
まず、本発明にかかる喘息モデル動物（本モデル動物）について説明する。
【００４３】
本モデル動物の重要な特徴点は、
（Ａ）喘息を誘導するためにメモリー型Ｔ細胞を有すること；
（Ｂ）メモリー型Ｔｈ１細胞からＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとが産生され、喘息が誘導されること；
（Ｃ）ＩＬ−１８による刺激によって喘息が誘導されること；である。
【００４４】
すなわち、本モデル動物は、メモリー型Ｔ細胞を有しており、このメモリー型Ｔ細胞を刺激することによって、喘息を誘導（発症）するものである。すなわち、本モデル動物は、喘息を発症するためのメモリー型Ｔ細胞を有するものである。
【００４５】
本モデル動物は、少なくとも気道炎症、好ましくは気道炎症と気道過敏性（ＡＨＲ）との症状を示すヒト以外の（非ヒト）モデル動物であればよい。なお、これに加えて、喘息の症状に特徴付けられる他の症状を示すモデル動物であってもよい。すなわち、「喘息を誘導（発症）」とは、メモリー型Ｔ細胞がサイトカインやケモカイン、各種メディエーターを産生することにより、気道炎症（好ましくはさらにＡＨＲ）を示すことを示している。
【００４６】
本モデル動物の「気道過敏性」の程度は、例えば、通常アセチルコリン，メタコリン，ヒスタミンなどの気道収縮作用のある薬剤を、低濃度から順次、宿主に吸入し、気管支が一定の基準以上に収縮した時の薬剤の最低濃度から判定することができる。なお、後述の実施例では、メタコリンを用いて判定している。
【００４７】
本モデル動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、喘息の病態解析、有効な治療法の確立や、その治療方法の開発などに有用である。
【００４８】
また、本モデル動物は、喘息を誘導するためのメモリー型Ｔ細胞を有していればよく、その他の遺伝子を欠損した遺伝子欠損動物（ノックアウト動物）、外来性の遺伝子が導入されたトランスジェニック動物などであってもよい。
【００４９】
ここで、メモリー型Ｔ細胞とは、Ｔ細胞の初回免疫後に形成されるメモリー機能を有するＴ細胞である。通常、Ｔ細胞は、抗体とは異なり、天然型の抗原を認識することができず、ＭＨＣ分子と抗原由来のペプチドの複合体を認識する。このため、ナイーブＴ細胞は、抗原提示細胞を必要とする。メモリー型Ｔ細胞は、ペプチド抗原によっていったん活性化された後生き残ったＴ細胞であるため、同じペプチド抗原に刺激されると、以前に活性化された記憶を有しているため、迅速に免疫応答する点が、ナイーブＴ細胞の免疫応答と異なる。
【００５０】
本モデル動物は、このようなメモリー型Ｔ細胞を、喘息を誘導する因子として有しているため、メモリー型Ｔ細胞を刺激すると免疫応答が速やかに進行して、喘息の症状を呈することが可能である。
【００５１】
本モデル動物において、メモリー型Ｔ細胞のタイプは、刺激によって喘息を誘発するメモリー型Ｔ細胞であれば特に限定されるものではない。前述のように、喘息は、Ｔｈ細胞から産生されるサイトカイン，ケモカイン，メディエーターなどが原因となる。従って、本モデル動物のメモリー型Ｔ細胞は、喘息に関与するとされているメモリー型Ｔｈ細胞であることが好ましい。すなわち、メモリー型Ｔｈ１細胞、または、メモリー型Ｔｈ２細胞であることが好ましい。なお、メモリー型Ｔ細胞は、in vivoまたはin vitroのいずれで培養されたものでってもよい。また、外来性のもの（遺伝的背景の異なる動物由来のもの）を移入したものであってもよい。
【００５２】
前述のように、現在、喘息は、Ｔｈ１型喘息，Ｔｈ２型喘息，混合型喘息の３つのタイプに分類できる。従って、一方のＴｈ細胞、または、両方のＴｈ細胞の刺激によって喘息を誘発すれば、各タイプの喘息を発症したモデル動物となる。これにより、各タイプの喘息の病態解析が可能となる。
【００５３】
また、喘息は、種々のサイトカインやケモカイン、各種メディエーター（ヒスタミン、ロイコトリエンなど）が複雑に関与して発症する（以下、これらのサイトカイン、ケモカイン、メディエーターを併せて、単にサイトカイン等と示す）。このため、本モデル動物を用いて喘息の病態解析を行う場合、メモリー型Ｔ細胞に与える刺激のみによって、喘息を誘導することが好ましい。すなわち、メモリー型Ｔ細胞が、刺激に対して特異的に作用することが好ましい。これにより、与えた刺激は、メモリー型Ｔ細胞以外には作用しない。従って、その刺激が他の細胞等に作用して、サイトカイン等を産生することはない。その結果、その刺激によって誘導した喘息の正確な病態解析が可能となる。
【００５４】
このような、メモリー型Ｔ細胞に与える刺激のみによって喘息を誘導する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、当該刺激が抗原である場合には、抗原特異的メモリー型Ｔ細胞とすればよい。後述の実施例では、ＯＶＡ（卵白アルブミン）特異的Ｔｈ細胞を用いているが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、メモリー型Ｔ細胞のみによって喘息を誘導するように、メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から産生される喘息を誘導する因子（例えば、サイトカイン，ケモカイン，メディエーター（ケミカルメディエーター），ＩｇＥなど）の産生が阻害（好ましくは欠損）するようにしてもよいし、薬剤を投与することによって、そのような因子の機能（その因子の産生）を阻害（好ましくは欠損）するようにしてもよい。
【００５６】
例えば、遺伝子工学的手法によって、そのような因子を阻害（好ましくは欠損）したり、喘息を誘導するＩｇＥ産生を阻害する坑ＩｇＥ抗体の投与、活性化肥満細胞の不活性化によるサイトカイン等の産生を阻害してもよい。
【００５７】
また、前述のように、ＩＬ−１３は、ＡＨＲを誘導する必須因子である。従って、メモリー型Ｔ細胞のみに依存する喘息モデル動物を作製する場合には、ＩＬ−１３が機能しないように、ＩＬ−１３を阻害することが好ましい。これにより、ＩＬ−１３によるＡＨＲを排除し、メモリー型Ｔ細胞の刺激のみにより誘導される喘息モデル動物を作製できる。
【００５８】
このように、本モデル動物は、換言すれば、メモリー型Ｔ細胞以外の細胞から、喘息を誘導する因子の産生が誘導されないようにしてもよい。なお、メモリー型Ｔ細胞以外の細胞としては、炎症反応やアレルギー反応を引き起こすケミカルメディエーターを放出する細胞、例えば、肥満細胞などが挙げられる。
【００５９】
本モデル動物のメモリー型Ｔ細胞に与える刺激は、喘息を誘導するものであれば特に限定されるものではない。この刺激としては、抗原（例えば、卵白アルブミン、チトクロームＣ、リゾチームなど），ＩＬ−１８などが例示される。
これらのうち、抗原特異的メモリー型Ｔｈ２細胞（抗原（刺激）に対して特異的に作用するメモリー型Ｔｈ２細胞）を有する場合、抗原により、メモリー型Ｔｈ２細胞を選択的に刺激して、喘息を誘発できる。すなわち、抗原のみの刺激により、喘息を誘導（発症）できる。従って、メモリー型Ｔ細胞が抗原特異的メモリー型Ｔｈ２細胞である場合、上記刺激は、抗原であることが好ましい。
【００６０】
また、後述の実施例にも示すように、メモリー型Ｔｈ１細胞に与える刺激は、抗原とＩＬ−１８とによるものであってもよい。後述の実施例に示すように、メモリー型Ｔｈ１またはＴｈ２細胞を、ＩＬ−１８のみで刺激しても喘息を発症しない。また、上記Ｔｈ１細胞を抗原のみで刺激すると、軽度の喘息（気道の炎症のみ）を発症し、抗原とＩＬ−１８とによって刺激すると、重度の喘息（気道の炎症・ＡＨＲ）を発症した。一方、上記Ｔｈ２細胞を抗原、または、抗原とＩＬ−１８とによって刺激すると、何れの場合も、重度の喘息を発症した（抗原とＩＬ−１８による刺激の方が重度の喘息を発症した）。
【００６１】
特に、メモリー型Ｔｈ１細胞を、抗原とＩＬ−１８とによって刺激した場合、重度の喘息を発症するだけでなく、このＴｈ１細胞から、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとが産生されるという、興味深い結果が得られている。
【００６２】
このように、本モデル動物には、刺激によって、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとを産生するメモリー型Ｔｈ１細胞を有することを特徴とする喘息モデル動物も含まれる。このモデル動物は、メモリー型Ｔｈ１細胞が刺激を受けると、このＴｈ１細胞から、Ｔｈ１サイトカインのみならず、Ｔｈ２サイトカインも産生する。しかも、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインは、互いに拮抗して喘息の症状を緩和するのではなく、増強することも重要な特徴である。
【００６３】
このように、Ｔｈ１細胞から、Ｔｈ１サイトカインと、Ｔｈ２サイトカインとが同時に産生した場合には、互いに拮抗的に作用せず、それぞれ単独の場合よりも、強力に気管支喘息を誘導するという、これまでの常識とは相反する症状は、Ｔｈ２サイトカインの阻害する薬剤によって、喘息の緩和を図っても、その症状が改善されない場合に類似している。すなわち、従来の治療法に対して抵抗性を示す難治性喘息の症状に似ている。
【００６４】
本モデル動物は、Ｔｈ１型喘息の発症メカニズムの解明、気管支喘息に有効な新規治療薬・治療方法の開発などにも有効である。
【００６５】
従って、このモデル動物は、難治性喘息や、ＩＬ−１８が関与する喘息などの病態解析に特に有用であり、それによって、そのような喘息の治療薬の開発や、治療方法の確立に、極めて重要な役割を果たす。
【００６６】
ここで、後述の実施例でも刺激として用いたＩＬ−１８について説明する。
【００６７】
ＩＬ−１８は、マクロファージや樹状細胞内で前駆体として産生され、Toll-like Receptor（ＴＬＲ）のリガンド刺激を受けることによってカスパーゼ−１（caspase-1）によって活性型となって分泌されるサイトカインである。ＩＬ−１８は、当初、抗ＣＤ３およびＩＬ−１２存在下、Ｔｈ１細胞からＩＦＮ−γ産生を促進する因子として認識されていた。すなわち、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２存在下で、Ｔｈ１やＮＫ細胞に作用して、ＩＦＮ−γの産生を強力に誘導する。また、Ｔｈ１やＮＫ細胞上に、Ｆａｓリガンド（アポトーシスを誘導する生体内のタンパク質）の発現を誘導する。このため、生体内でＩＬ−１２とＩＬ−１８とが過剰に産生すると、例えば、腸や肝臓で重篤な臓器障害が惹起され、いわゆるＴｈ１型疾患の原因となる。
【００６８】
ところが、ＩＬ−１８がＩＬ−１２ではなくＩＬ−２の存在下で、Ｔ細胞に作用すると、ＣＤ４０リガンドの発現と、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生とが誘導される。このため、ＩＬ−１８で刺激されたＴ細胞はＢ細胞に作用して、このＢ細胞活性化し、ＩｇＥ抗体産生を誘導する。
【００６９】
さらに、本発明者等によって、ＩＬ−１８が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球および肥満細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を促進することが明らかとなった。すなわち、ＩＬ−１８は、好塩基球や肥満細胞を直接刺激して、ＩｇＥ非依存的に、これらの細胞から、ヒスタミン，ＩＬ−４，ＩＬ−１４などの産生を誘導する。このため、例えば、皮膚ケラチノサイト特異的カスパーゼ−１トランスジェニックマウスでは、高ＩＬ−１８血症，高ＩｇＥ血症，さらに顕著なアトピー性皮膚炎の症状が認められる。従って、ＩＬ−１２の産生を伴わないＩＬ−１８の過剰産生は、いわゆるＴｈ２型疾患の原因ともなる。
【００７０】
このように、ＩＬ−１８は、肝炎や炎症性腸疾患などのようなＴｈ１型疾患の発症ばかりか、喘息やアトピー性皮膚炎などのようなＴｈ２型疾患の発症にも関与している。
【００７１】
また、ＩＬ−１８は、種々の器官の上皮細胞に大量に蓄積されているため（Cameron, L.A., R.A. Taha, A. Tsicopoulos, M. Kurimoto, R. Olivenstein, B. Wallaert, E.M. Minshall, and Q.A. Hamid. 1999. Airway epithelium expresses interleukin-18. Eur. Respir. J. 14:553-559.）、病原菌によっては、気管支の上皮細胞を刺激し、ＩＬ−１８を産生する可能性がある。
【００７２】
従って、気管支喘息におけるＩＬ−１８の生物学的な関連性を決定することは、非常に重要である。すなわち、ＩＬ−１８のさらなる解析によって、その機能を分子レベルで明らかにすることは、ＩＬ−１８の関与する疾患の病態の解明、および、有効な治療法を確立するために、極めて重要になる。
【００７３】
ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）は、α鎖とβ鎖とからなる２量体構造を有するヘテロダイマー複合体である。ＩＬ−１８Ｒの発現は、ＩＬ−１２の作用により誘導され、ＩＬ−４の作用による抑制される。また、ＩＬ−１８Ｒにおいて、α鎖（ＩＬ−１８Ｒα）がＩＬ−１８の結合分子であり、β鎖（ＩＬ−１８Ｒβ）がシグナル伝達分子である。このシグナルは、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ−６などのシグナル伝達分子を介して、転写因子ＮＦκＢとＡＰ−１とを活性化することによって、核内に伝達される。
【００７４】
Ｔｈ細胞（Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞）は、ナイーブＴ細胞（Ｔｈ０細胞、または、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞とも称される）が、抗原と、ＩＬ−１２またはＩＬ−４とによる刺激によって、分化して形成される。
【００７５】
本発明者等は、すでに、ＩＬ−１２が、Ｔ細胞にＩＬ−１８Ｒαの発現を誘導するために、Ｔｈ１細胞のみが、ＩＬ−１８の主な標的細胞となり、抗原およびＩＬ−１８で刺激されると、多量のＩＮＦ−γを産生することを見出している。すなわち、ＩＬ−１８とＩＬ−１２とが協同して、抗原または抗ＣＤ３抗体により活性化されたＴｈ１細胞のＩＦＮ−γ産生を強く誘導する。このように、Ｔｈ２細胞ではなく、Ｔｈ１細胞が、ＩＬ−１８Ｒαを発現しており、Ｔｈ１細胞が、ＩＬ−１８に対する主な標的細胞である。
【００７６】
なお、ＩＬ−１８は、非免疫系細胞でも広く検出され、この非免疫系細胞が種々の刺激を受けることによっても産生されることが明らかとなった。例えば、気道上皮細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）の刺激によってＩＬ−１８を産生するが、生理的意義は不明である。
【００７７】
このように、ＩＬ−１８は、当初、Ｔｈ１型サイトカインを誘導すると考えられていた。一般的に、ＩＦＮ−Ｎγ産生に有利に働く因子は、アレルギー性疾患を緩和すると考えられている。このため、ＩＬ−１８も、アレルギー疾患の治療に有効であると予想される。
【００７８】
そこで、本願発明者等は、メモリー型Ｔ細胞をＩＬ−１８によって刺激し、気管支喘息を調節するＩＬ−１８の役割を検討した。すなわち、抗原およびＩＬ−１８を暴露した、メモリー型Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞を投与されたモデル動物の応答性を比較した。具体的には、宿主由来のＴ細胞のバックグラウンド反応を避けるために、メモリー型Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞を、非感作マウスに投与し、気管支喘息誘導時のＩＬ−１８の役割を検討した。
【００７９】
その結果、以下のことが明らかとなった。
（１）メモリー型Ｔｈ２細胞を投与されたマウスに、抗原を投与（鼻腔内投与）すると、気道炎症およびＡＨＲが誘導される。
（２）メモリー型Ｔｈ１細胞を投与されたマウスに、同じ処置を施すと、軽度の気道炎症のみ誘導し、ＡＨＲは誘導されない。
（３）（１）（２）のマウスに、抗原とＩＬ−１８とを同時に投与（鼻腔内投与）した場合、顕著な気道炎症とＡＨＲが現れた。
（４）さらに、分極化したＴｈ１細胞から選択したＩＦＮ−γ発現（ＩＦＮ−γ＋）Ｔｈ１細胞を投与されたマウスは、抗原およびＩＬ−１８の鼻腔内投与後に、重度の気道炎症およびＡＨＲを発現した。
（５）メモリー型Ｔｈ１細胞またはメモリー型Ｔｈ２細胞を投与されたマウスに、ＩＬ−１８のみを投与（鼻腔内投与）すると、喘息の症状は見られない。
【００８０】
このように、Ｔｈ１細胞が、抗原およびＩＬ−１８で刺激された場合に、特に害を及ぼす。新たに分極化した、Ｔｈ１細胞、および、ＩＦＮ−γ発現Ｔｈ１細胞（共に、ＩＬ−１８Ｒα鎖を強く発現する）は、in vitroで、抗原、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって、ＩＦＮ−γ（インターフェロン−γ）、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＲＡＮＴＥＳ（ケモカインの一種）およびＭＩＰ−１α（マクロファージ由来炎症性タンパク質−１α；ケモカインの一種）を産生する。従って、抗原およびＩＬ−１８は、メモリー型Ｔｈ１細胞を刺激し、非感作宿主に重度の気道炎症およびＡＨＲを誘導する。
【００８１】
しかし、本発明者等は、ＮＫＴ細胞が、ＴＣＲの関与なしに、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激された場合、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８に応答して大量のＩＦＮ−γを産生する可能性を有するにもかかわらず、高レベルのＩＬ−１８Ｒαを恒常的に発現し、Ｔｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３など）を産生することを、見出している（Yoshimoto, T., B. Min, T. Sugimoto, N. Hayashi, Y. Ishikawa, Y. Sasaki, H. Hata, K. Takeda, K. Okumura, K.L. Van, W.E. Paul, and K. Nakanishi. 2003. Nonredundant roles for CD1d-restricted natural killer T cells and conventional CD4+ T cells in the induction of Immunoglobulin E antibodies in response to Interleukin 18 treatment of mice. J. Exp. Med. 197:997-1005）。
【００８２】
従って、ＩＬ−１８Ｒα発現Ｔｈ１細胞も、サイトカイン環境(milieu)に依存して、ＩＬ−１８に応答し、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインを産生するかどうかを検討することが重要である。
【００８３】
養子移入されたメモリー型Ｔｈ１細胞が、肺で抗原に刺激されると、ＡＨＲは認められず、軽度の気道炎症のみを誘導する。一方、メモリーＴｈ１細胞が、抗原およびＩＬ−１８に刺激されると、重度の気道炎症およびＡＨＲを共に誘導する。驚くべきことに、活性化肥満細胞が産生した場合のように、抗原およびＩＬ−１８に刺激されたＴｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αを産生し、このＴｈ細胞が気管支喘息の誘導に関係することを示している。
【００８４】
上記の説明では、鼻腔内投与した抗原とＩＬ−１８とによる気管支喘息の発症について述べた。しかし、実際は、気管支喘息患者が病原体に感染すると、その病原体成分がＴＬＲを介して気道上皮細胞を刺激することによって内因性ＩＬ−１８が誘導され、気管支喘息の発症、あるいは症状の悪化を誘導していると考えられる。従って、本モデル動物のうち、特に、メモリー型Ｔｈ１細胞によって喘息が誘導される喘息モデル動物は、Ｔｈ１型喘息の発症機構の解明、新規喘息（気管支喘息）治療薬の開発に極めて有用である。
【００８５】
次に、前述した本モデル動物の作製方法の一例について説明する。
【００８６】
本発明にかかる喘息モデル動物の作製方法は、Ｔ細胞を、宿主に導入する導入工程と、宿主に導入したＴ細胞を、メモリー型Ｔ細胞に変換する変換工程と、メモリー型Ｔ細胞を刺激して、宿主を喘息に誘導する誘導工程とを少なくとも含んでいる。
【００８７】
導入工程において、宿主は、前述の本モデル動物において例示した動物が例示されるが、特に限定されるものではない。なお、宿主に導入するＴ細胞は、同一固体のものでも、異なる個体のものでもよい。また、Ｔ細胞を導入する宿主は、非感作性動物（ナイーブ動物）であることが好ましい。
【００８８】
また、導入工程において、宿主に導入するＴ細胞は、本モデル動物で説明したように、抗原特異的Ｔ細胞（刺激に対して、特異的に作用するＴ細胞）であることが好ましい。これにより、後続する変換工程において、このＴ細胞の抗原（刺激）特異性を維持したメモリー型Ｔ細胞（抗原特異的メモリー型Ｔ細胞）に変換できる。その結果、最終的に、選択的にメモリー型Ｔ細胞を、刺激することができるモデル動物を作製できる。
【００８９】
続いて、変換工程では、導入工程で、宿主に導入したＴ細胞にメモリー機能を与える。後述の実施例では、導入したＴ細胞を、所定期間無刺激状態とすることにより、メモリー型Ｔ細胞に変換することが可能である。より具体的には、例えば、抗原特異的Ｔｈ１細胞をナイーブマウスに移入した後、３０日間無刺激状態で導入したＴ細胞を存続させることによって、宿主内でそのＴ細胞を、静止期メモリー型Ｔｈ１細胞に変換できる。なお、無刺激状態とする期間は、宿主にメモリー機能を与えることができればよく、特に限定されるものではない。
【００９０】
次に、誘導工程では、メモリー型Ｔ細胞を刺激して、宿主を喘息に誘導する。例えば、喘息を誘導する刺激（前述した刺激）を、吸入によって行うことが好ましい。これにより、刺激（薬剤等）が、効率的に肺に達するため、容易に喘息を誘導できる。
【００９１】
なお、本モデル動物の作製方法における各工程は、作製するモデル動物の種類、喘息のタイプおよび症状等にあわせて、Ｔ細胞の種類、刺激の種類や程度等を設定すればよい。また、各工程で用いる試料や試薬の種類や量についても特に限定されるものではない。
【００９２】
以上のように、本発明によれば、メモリー型Ｔ細胞の刺激によって、喘息を誘導する喘息モデル動物を提供できる。
【００９３】
また、本発明によって、抗原とＩＬ−１８とにより刺激を受けたＴｈ１細胞が、ＩＦＮ産生のみならず、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−９，ＩＬ−１３など）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ（Regulated upon Activation, Normal T cellExpressed and Secreted），ＭＩＰ−１など）も産生することが明らかとなった。さらに、抗原特異的Ｔｈ１細胞を、ナイーブマウスに移入した後、３０日間無刺激状態でＴ細胞を存続させることによって、宿主内でそのＴ細胞を、Ｔｈ１型静止期メモリー型Ｔ細胞に変換できることが明らかとなった。
【００９４】
また、このようなメモリー型Ｔ細胞を有する喘息モデル動物に、抗原とＩＬ−１８とを投与することによって、気管支喘息を発症させられることが明らかとなった。
【００９５】
このように、本願発明者等は、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとが、同時に産生されると、各サイトカインは拮抗的に作用せず、むしろ単独の作用よりも強力な作用を示すことを明らかにした。
【００９６】
また、本発明によって、抗原の鼻腔内投与によって、メモリー型Ｔｈ１細胞を移入したマウスが、気道過敏性（ＡＨＲ）なしに気道炎症を誘導することが明らかとなった。このように、ＡＨＲを発症しなかった原因としては、Ｔｈ１細胞が、遅延型過敏症（ＤＴＨ）を誘導するために、抗原に誘導されるＤＴＨは、生理反応であり、ＡＨＲのような病的症状を誘導するのに関与していないことが考えられる。
【００９７】
一方、メモリー型Ｔｈ１細胞に、抗原およびＩＬ−１８の鼻腔内投与すると、ＡＨＲを伴う重度の気道炎症を誘導した。従って、Ｔｈ１細胞は、抗原およびＩＬ−１８で刺激された場合、病的なＤＴＨを誘導する、非常に有害な細胞となる。
【００９８】
また、本発明（後述する実施例）によって、以下のことが明らかとなった。
【００９９】
すなわち、非感作マウス体内で、メモリー型Ｔｈ１またはＴｈ２細胞が確立された結果、全く異なる様式の気管支喘息を誘導した（図１および図２）。具体的には、Ｔｈ１細胞を投与したマウスは、気管支喘息を発症するのに、抗原およびＩｌ−１８の両方の暴露を必要としたのに対して、Ｔｈ２細胞を投与したマウスは、抗原のみを必要とした。
【０１００】
in vitroの研究では、抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８の刺激により、Ｔｈ１細胞が、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＩＰ−１αを産生することが示された（図３Ａ）。従って、抗原およびＩＬ−１８により刺激したＴｈ１細胞は、活性化肥満細胞によって産生されるサイトカインおよびケモカインに類似したスペクトル(spectrum)の、サイトカインおよびケモカインを産生した。Ｔｈ１細胞を投与したマウスに、重度のＡＨＲが現れたにもかかわらず、血清中には、抗原特異的ＩｇＥが検出されなかった（データを示さず）。すなわち、ＩｇＥ非依存的に、ＡＨＲを誘導する場合には、投与されたメモリー型Ｔｈ１細胞が、重要な役割を果たすことを示している。
【０１０１】
ここで、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、抗原およびＩＬ−１８によるＴｈ１細胞の活性化により、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αが産生されるという、特有の気管支喘息が誘導された。
【０１０２】
また、メモリー型Ｔｈ２細胞の移入によっても、Ｔｈ２型喘息が誘導された（図１および図２）。ＩＬ−１３の中和は、このようなＴｈ２細胞誘導型ＡＨＲを阻害した。ＩＬ−１３がＴｈ２誘導気管支喘息に寄与することは、すでに報告されている。
【０１０３】
一方、ＩＬ−１３の中和は、Ｔｈ１細胞誘導型気管支喘息において、肺の好酸球浸潤を著しく減少したにもかかわらず、ＡＨＲに対しては影響を及ぼさなかった（図５）。Ｔｈ１細胞を、in vivoで抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８で刺激すると、Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびケモカインを産生するため、メモリー型Ｔｈ１細胞の投与によって、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の活性化によって達成できる混合型の喘息応答に似た症状を呈する可能性を示すことは、重要である。
【０１０４】
好酸球は、喘息および喘息性ＡＨＲにおいて、主なエフェクター細胞として関与している。ＩＬ−１３の中和によって、初めメモリー型Ｔｈ１を移入し、その後、抗原およびＩＬ−１８に暴露したマウスの肺に、好酸球数が著しく減少した。それにもかかわらず、上記マウスでは、コントロールマウスに現れたＡＨＲに匹敵するレベルのＡＨＲが現れた。すなわち、これは、Ｔｈ１細胞を移入したマウスでは、ＩＬ−１３よりむしろ他のサイトカインまたはケモカインが、ＡＨＲの発症に関与していることを示している。すなわち、抗原およびＩＬ−１８で刺激されたＴｈ１細胞は、ＩＬ−１３非依存的に、気管支喘息を誘導する。
【０１０５】
Ｔｈ２細胞からのＩＬ−１３産生が、好酸球の集積および活性化を誘導し、好酸球特異的塩基性タンパク質（メジャー塩基性タンパク質、好酸球カチオン性タンパク質、好酸球ペルオキシダーゼ）、好酸球由来神経毒、および、脂質メディエーターを産生し、気管支喘息の症状を引き起こすと考えられることは、興味深い。抗原およびＩＬ−１８により刺激されたＴｈ１細胞は、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの両方を産生するため（図６Ａ）、ＩＦＮ−γは、ＩＬ−１３の作用を阻害し、ＡＨＲを誘導する可能性がある。しかし、この作用に加え、ＩＦＮ−γは、集積された好中球を直接活性化して、ケミカルメディエーターおよび活性酸素中間体を産生し、これらの組み合わせによって、重度の気管支喘息が誘導される可能性がある。このような仮定が正しければ、なぜ、単に好酸球が減少するだけでは、ヒトの研究で、気管支喘息を緩和できないのかを理解することができる。
【０１０６】
また、気管支喘息を軽減するのために、好中球の減少が必要となる可能性もある。実際、ケモカイン（特にＣＸＣケモカイン）を含む、他の因子の中和は、Ｔｈ１細胞誘導喘息において、ＡＨＲを軽減する場合もある。実際、ＢＡＬＦを洗浄液で希釈したにもかかわらず、Ｔｈ１細胞を養子移入した後、ＯＶＡおよびＩＬ−１８で試したマウスから得られたＢＡＬＦでは、大量のＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αが検出された（データを示さず）。
【０１０７】
一方、ＯＶＡのみで試したマウスのＢＡＬＦでは、ＲＡＮＴＥＳもＭＩＰ−１αも検出されなかった（データを示さず）。従って、ＩＦＮ−γで刺激された好中球が、気管支喘息の誘導に寄与しているという、この仮定を実証するため研究がさらに必要である。
【０１０８】
抗原およびＩＬ−１８刺激されたＴｈ１細胞は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３に加えて、ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αを含む、種々のサイトカインを産生した（図３Ａ）。また、肥満細胞が、細胞表面のＩｇＥ分子に架橋を形成するアレルゲンによって活性化された場合、種々のタイプのサイトカイン、ケモカインおよびケミカルメディエーターを産生する。しかし、本発明者は、ＩＬ−１８が、肥満細胞および好塩基球を直接刺激し、Ｔｈ２サイトカインおよびケミカルメディエーターを産生することを見出している（Yoshimoto, T., H. Tsutsui, K. Tominaga, K. Hoshino, H. Okamura, S. Akira, W.E. Paul, and K. Nakanishi. 1999. IL-18, although antiallergic when administered with IL-12, stimulates IL-4 and histamine release by basophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96:13962-13966.）。
【０１０９】
しかし、正常なマウスでは、単にＩＬ−１８を投与するだけでは、気道炎症（図１）および気管支喘息を誘導しなかった。このため、ＩＬ−１８依存的に肥満細胞を活性する代わりに、抗原とＩＬ−１８とによりＴｈ１細胞を活性化することによって、メモリー型Ｔｈ１を備え、抗原特異的ＩｇＥ抗体および活性化肥満細胞を欠損したナイーブ動物に、喘息を誘導することは極めて重要である。活性化肥満細胞と同様に、抗原およびＩＬ−１８刺激されたＴｈ１細胞は、Ｔｈ１サイトカイン、Ｔｈ２サイトカインおよびケモカインを産生することが見出された。ＩＬ−１８は、様々な器官の上皮細胞に大量に貯蔵されているため、ある病原菌によって、気管支上皮細胞からのＩＬ−１８産生が誘導されると考えられる。その後、その病原菌からの抗原、および、上皮細胞からのＩＬ−１８が、前の感染によって誘導されたメモリー型Ｔｈ１細胞を刺激し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αを含むサイトカインを産生する。従って、Ｔｈ１細胞は、ある感染条件下で、気管支喘息の誘導に関与した役割を果たす可能性がある。
【０１１０】
このように、本発明によって、Ｔｈ１細胞が、気管過敏性および組織学的変化の誘導に密接に関与していることが示された。Ｔｈ１細胞は、in vitroで、抗原、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激された場合に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αを産生する特別な能力を有している（図３Ａ、図６Ｃ）。
【０１１１】
さらに、正常マウスに、Ｔｈ１細胞を受動移入して、そのマウスに、抗原およびＩＬ−１８を鼻から暴露すると、重度の気道炎症およびＡＨＲを発症させることができる（図１および図２）。
【０１１２】
従って、メモリー型Ｔｈ１細胞が、in vivoで、抗原およびＩＬ−１８で刺激されると、病的細胞となる。抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８刺激されたＴｈ１細胞からの産物に、喘息に関連するサイトカインが含まれているが、本発明の気管支喘息モデル動物を用いて、明確な原因となるエフェクター細胞、または、原因因子を同定することが必要となる。
【０１１３】
しかしながら、本発明において重要なことは、ＩＬ−１８が、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの上流のサイトカインであることが明らかとなり、アレルギー疾患の治療法を確立することが可能な、治療標的分子を提供することである。例えば、抗原とＩＬ−１８とによって刺激されたＴｈ１細胞が産生するＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとによって誘導される喘息の場合、その上流に位置するＩＬ−１８を制御することは、喘息治療に有用である。
【０１１４】
また、従来、喘息は、Ｔｈ２型疾患であると考えられていたため、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ２サイトカイン、ＩｇＥを標的として、気管支喘息の治療が行われていた。しかしながら、抗ＩＬ−５抗体治療が無効の場合もある。これは、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとが同時に産生されている場合、一方のサイトカインを抑制（あるいは阻止）しても、不十分であるためであると考えられる。
【０１１５】
そこで、混合型喘息モデル動物（Ｔｈ１型喘息とＴｈ２型喘息の両方を発症したモデル動物）を作製して、混合型喘息の病態を解析すれば、有効な治療法や、治療薬の開発を行うことができる。
【０１１６】
このように、本モデル動物では、メモリー型Ｔｈ１細胞を刺激すればＴｈ１型喘息を発症した喘息モデル動物が、メモリー型Ｔｈ２細胞を刺激すればＴｈ２型喘息を発症した喘息モデル動物となる。また、両細胞共に刺激すれば、混合型喘息を発症した喘息モデル動物となる。これらの喘息モデル動物は、各タイプの喘息の詳細な病態解析、および、各症状に適した有効な喘息の治療法（特に、難治性気管支喘息の治療法）を確立するために有用である。
【０１１７】
なお、図１〜図７簡単に説明すると、図１は、ＩＬ−１８が、メモリー型Ｔｈ１細胞を移入したマウスに対して、気道炎症およびＡＨＲを誘導した結果を示す図である。すなわち、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスに、静注で、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞（図１ｅ−ｊ）、ＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞（図１ｋ−ｏ）を養子移入、または、移入せず（図１ａ−ｄ）して３０日目後、各動物に、ＰＢＳのみ、あるいは、１μｇＯＶＡ／５０μｌ ＰＢＳおよび／または０．５μｇＩＬ−１８／５０μｌ ＰＢＳを、３日間、毎日鼻に暴露した。そして、最後の抗原の暴露から２４時間後に、アレルギー表現型を評価した。右心室を介して、１０ｍｌのＰＢＳを、動物に注ぎ、肺組織を準備し、次いで、この肺組織を、ホルマリンに固定し、３μｍの断片とし、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。図１は、染色した組織の断片を示す図である。
【０１１８】
図２は、ＩＬ−１８が、メモリー型Ｔｈ１細胞移入マウスの、ＡＨＲおよび好酸球増加症を誘導した結果を示す図であり、図２Ａは、吸入したβ−メタコリン濃度の増加に応じたＡＨＲの全身プレチスモグラフの測定結果である。図２Ｂは、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞、または、ＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞を移入し、３日間連続して、ＰＢＳ、または、ＯＶＡおよび／またはＩＬ−１８の鼻からの投与を、毎日処理したマウスからのＢＡＬＦの炎症細胞である。そして、構成細胞の割合を、サイトスピンプレパラートの光学顕微鏡評価によって決定した。上記のデータは、細胞の絶対値として示し、５匹の動物の代表的な結果を示す。
【０１１９】
図３は、ＩＬ−１８が、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生を誘導した結果を示す図である。図３Ａは、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５／ｍｌ）を、７日間、合計３ｍｌ容量の６ｍｌウェルプレート中で、ＩＬ−２（１００ｐＭ），ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）、および、放射線照射によるＴ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（１×１０６／ｍｌ）と共に培養し、その後、Ｔｈ１細胞に分化するため、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した；Ｔｈ２細胞に分化するため、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮ−γ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。各々の条件下で抗原刺激を２回行った。初回の抗原刺激後、細胞を洗浄し、種々の濃度のＩＬ−１８（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）および、放射線照射Ｔ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（１×１０５／０．２ｍｌ）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで、再び細胞を培養した。培養４８時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＧＭ−ＣＳＦ含有量を検討した。図中の結果は、相乗平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。図３Ｂは、フローサイトメトリーによる、細胞表面に発現したＩＬ−１８Ｒα鎖を示す図である。図中の百分率は、ＣＤ４＋細胞のうちの、ＩＬ−１８Ｒα鎖陽性細胞の割合である。図３Ｃは、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）および放射線照射Ｔ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（１×１０５／０．２ｍｌ）の存在下、培地のみ、あるいは、種々の濃度のＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで、分極化したＴｈ１細胞を培養した結果を示す図である。培養して４８時間後に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ含有量を検討した結果である。図中の結果は、相乗平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１２０】
図４は、ＩＬ−１８が、抗原特異的Ｔｈ１クローンからＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦの産生を誘導した結果を示す図である。図４Ａは、Ｔｈ１クローン（クローン９−１６）（ＫＬＨ特異的、Ｉ−Ａｋ制限）、および、Ｔｈ２クローン（クローンＤ１０．４Ｇ．１）（コンアルブミン特異的、Ｉ−Ａｋ制限）を、種々の濃度のＩＬ−１８（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、固定化抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体（各５μ／ｍｌ）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで培養した。培養４８時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３含有量を検討した。図中の結果は、相乗平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。図４Ｂは、細胞表面に発現したＩＬ−１８Ｒα鎖を示す図である。図中の百分率は、ＣＤ４＋細胞のうちの、ＩＬ−１８Ｒα鎖陽性細胞の割合である。
【０１２１】
図５は、メモリー型Ｔｈ１細胞移入マウスにおいて、ＩＬ−１３阻害剤によるＩＬ−１８によって誘導された、ＡＨＲおよび好酸球増多に対するＩＬ−１３阻害効果を示す図である。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞またはＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞（１匹のマウス当たり１０７細胞）を養子移入して３０日後に、動物に、ＰＢＳ、１μｇＯＶＡのみ、または、ＯＶＡおよび０．５μｇＩＬ−１８／５０μｌＰＢＳを、３日間毎日、鼻腔内へ暴露した。in vivoでのＩＬ−１３阻害のため、２０μｇｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ、または、コントロールとして２０μｇヒトＩｇＧを、ＯＶＡおよびＩＬ−１８との混合して、３日間毎日、鼻腔内へ投与した。最後の抗原の暴露から２４時間後、吸入されたβ−メタコリンの増加する濃度に対するＡＨＲ（図５Ａ）、およびＢＡＬＦの炎症細胞の構成（図５Ｂ）を、図２と同様にして検討した。なお、４匹の動物の代表的な結果を示した。
【０１２２】
図６は、ＩＬ−１８が、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞から、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ産生を誘導した結果を示す図である。図６Ａは、図３に記載のように、分極化したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）の有無で、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）およびＡＰＣ（１×１０６／ｍｌ）で、１６時間刺激した。細胞内のＩＬ−１３およびＩＦＮ−γを染色し、前述のように分析した。図中の数字は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ＋および／またはＩＬ−１３＋細胞の百分率を示している。図６Ｂは、分極化したＴｈ１細胞（１×１０６／ｍｌ）を、合計３ｍｌ容量の６ウェルプレートで、ＯＶＡペプチド、および、ＡＰＣ（１×１０６／ｍｌ）で培養した。８時間後、細胞を回収し、抗ＣＤ４５／抗ＩＦＮ−γ二重特異性抗体と共に、氷上で５分間インキュベートした。得られた細胞をインキュベートし、次いで、前述のように洗浄し、このＩＦＮ−γを、ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ抗体で検出した。次いで、このＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、セルソーティングによって単離した。図中の数字は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ＋の百分率を示す。図６Ｃは、ＩＦＮ−γ＋細胞を洗浄し、種々の濃度のＩＬ−１８（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）および放射線照射ＡＰＣ（１×１０５／０．２）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで再び培養した。培養から４８時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ含有量を検討した。図中の結果は、相乗平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１２３】
図７は、ＩＬ−１８が、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を移入したマウスに対して気道炎症を誘導した結果を示す図である。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に、ＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ＋細胞（１匹のマウス当たり１０７細胞）を養子移入してから２０日後に、動物に、ＰＢＳのみ、または、１μｇＯＶＡおよび０．５μｇＩＬ−１８／５０μｌＰＢＳを、３日間毎日、鼻腔内へ暴露した。最後の抗原の暴露から２４時間後、肺をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。図７Ａは、染色した組織の断片を示す図である。
【０１２４】
なお、本発明には、前述した本発明の喘息モデル動物に対して、被験物質を投与し気管支喘息の改善効果を検定する喘息治療剤のスクリーニング方法も含まれる。上記方法によれば、本モデル動物を用いたことによって、投与した被験物質における、喘息の改善効果を、より定量的に検定することができる。
【０１２５】
また、本発明には、上記のスクリーニング方法により喘息の改善効果を有すると判定される物質を含有する喘息治療剤も含まれる。上記構成によれば、本モデル動物を用いたスクリーニング方法によって、投与した被験物質における、喘息の改善効果の検定をより正確にできることから、喘息の発症メカニズムに応じた、より的確な医薬品を得ることが可能となる。
【０１２６】
なお、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１２７】
〔実施例〕
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２８】
〔動物および試薬〕
Jackson Laboratoryから特定病原体未感染（ＳＰＦ）雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。Dr.D.Loh（Washington University,St.Louis,MO）から、ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡの３２３〜３３９番目のアミノ酸からなるポリペプチド）を認識するαβＴＣＲのトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（ＤＯ１１．１０；遺伝的背景ＢＡＬＢ／ｃ）を入手した。全ての実験には、導入遺伝子に対してヘテロ接合性のものを用いた。また、兵庫医科大学（西宮、日本）の動物施設で、全てのマウスをＳＰＦ条件下で飼育し、６〜１０週齢のものを使用した。組み換えバキュロウイルス（ＡｃＭＮＰＶ．ＩＬ−４）から取得した組み換えマウスＩＬ−４は、アフィニティークロマトグラフィーによって精製したものを使用した。組み換えマウスＩＬ−１２、ＩＬ−１８および抗マウスＩＬ−１８Ｒα鎖ｍＡｂ（Ｙ３８）（４７）は、林原生物化学研究所（岡山、日本）から入手した。ＤＯ１１．１０マウス由来のＴＣＲを認識するＰＥ−ＫＪ１−２６（CALTAG  Laboratories, Burlingame，CA）を、養子移入したＤＯ１１．１０ＴＣＲトランジェニック細胞を、特異株として使用した。また、精製抗体［抗マウスＣＤ２８（３７．５１）、抗マウスＣＤ３（２Ｃ１１）、抗マウスＩＬ−４（１１Ｂ１１）、抗マウスＩＬ−１２ｐ４０（Ｃ１７．８）および抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２））を、調製した。ＰＥ（Phycoerythrin;フィコエリスリン）−抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）アロフィコシアニン（allophycocyanin;ＡＰＣ）−抗マウスＣＤ４、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）−抗ラットＩｇＧ１（ＲＧ１１／３９．４）、ＦＩＴＣ−抗マウスＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）は、PharMingen（San Diego,CA）から購入した。
【０１２９】
〔Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の産生、並びにＩＦＮ−γ＋細胞（ＩＦＮ−γを産生する細胞）の単離〕
１０％ ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、５０μＭ ２−ＭＥ（ＭＥ：メルカプトエタノール）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを充填したＲＰＭＩ１６４０を、全量３ｍｌの６ウェルプレート中に加え、７日間、ＤＯ１１．１０Ｔｇマウス由来のナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ６２発現Ｔ細胞；１×１０５／ｍｌ）を、抗原提示細胞（ＡＰＣ；放射線照射によるＴ細胞を除去したＢＡＬＢ／ｃの脾細胞）存在下（１×１０６／ｍｌ）、ＩＬ−２（１００ｐＭ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）によって刺激した。また、このＴ細胞を、Ｔｈ１細胞に誘導するため、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１１Ｂ１１；１０μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。また、Ｔｈ２細胞に誘導するため、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１２ｐ４０（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮ−γ（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。このような抗原刺激を２回行った。
【０１３０】
ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を単離するために、７日間Ｔｈ１誘導条件下で培養したＴ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を、全量３ｍｌ容量の６ウェルプレートで、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３２９（１μＭ）およびＡＰＣ（１×１０６細胞／ｍｌ）と共に再び培養した。８時間後、付着細胞のみを回収し、抗ＣＤ４５／抗ＩＦＮ−γ二重特異性抗体（Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany）と共に、５分間氷上でインキュベートした。得られた細胞を５０ｍｌ円錐管に移し、２０ｍｌの温めた培養液中で５×１０４細胞／ｍｌの濃度で培養し、３７℃の水浴に設置した。３０分後、冷却した０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）リン酸緩衝液溶液で、細胞を洗浄した。Ｔｈ１細胞から産生されたＩＦＮ−γを細胞表面に結合させた抗ＩＦＮ−γで捕らえ、このＩＦＮ−γを、ＰＥ−抗ＩＦＮ−γ抗体用いて検出した。ＩＦＮ−γ＋細胞を、セルソーター（Elite；Coulter Electronics,Miami,FL）によって、単離した。
【０１３１】
〔Ｔｈクローン〕
３つのマウスＣＤ４＋Ｔｈクローン、すなわち、クローン９−１６（Asano, Y. and R.J. Hodes. 1985. T cell regulation of B cell activation. Lyt-1+, 2- T cells modify the MHC-restricted function of heterogeneous and cloned T suppressor cells. J. Exp. Med. 162:413-426.）、クローン３５−９Ｄ（Tamura, T. and H. Nariuchi.  1992.  T cell activation trough TCR/-CD3 complex.  IL-2 production of T cell clones stimulated with anti-CD3 without cross-linkage.  J. Immunol. 148:2370-2377）および、クローンＤ１０．Ｇ４．１（Kaye, J., S. Porcelli, J. Tite, B. Jones, and C.J. Janeway. 1983. Both a monoclonal antibody and antisera specific for determinants unique to individual cloned helper T cell lines can substitute for antigen and antigen-presenting cells in the activation of T cells. J Exp Med. 158:836-856.）が、それぞれ浅野（愛媛大学、日本）、善本（東京医科大学、日本）および小野（大阪大学、日本）から提供された。クローン９−１６は、キーホールヘモシアニン（ＫＬＨ）特異的Ｉ−Ａｋ制限Ｔｈ１クローンである。クローン３５−９Ｄは、ＯＶＡ特異的Ｉ−Ａｂ制限Ｔｈ１クローンである。クローンＤ１０．Ｇ４．１は、コンアルブミン特異的Ｉ−Ａｋ制限Ｔｈ２クローンである。なお、Ｉ−Ａｋ，Ｉ−Ａｂは主要組織適合抗原の種類である。
【０１３２】
〔in vitro培養〕
種々の濃度のＩＬ−１８（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）およびＡＰＣ（１×１０５／０．２ｍｌ）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで、分極化したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞、ならびにＴｈ１細胞から選択したＩＦＮ−γ＋細胞を再び培養した。種々の濃度のＩＬ−１８（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、固定化抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８（それぞれ５μｇ／ｍｌ）と共に、１×１０５／０．２ｍｌ／ウェルで、Ｔｈ１クローン（クローン９−１６）およびＴｈ２クローン（クローンＤ１０．４Ｇ．１）を培養した。培養４８時間後、上清みを回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＧＭ−ＣＳＦ含有量を検討した。
【０１３３】
〔フローサイトメトリー〕
細胞内サイトカインを染色するために、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）およびＡＰＣ（１×１０６／ｍｌ）、そしてＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）の有り、または無しの条件下、分極化したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞（１×１０６／ｍｌ）を、１６時間再び刺激し、最後の４時間は、サイトカイン分泌を阻害するために１μｇ／ｍｌのBrefeldin Aを添加した。このような細胞を初めにＰＥ−抗ＣＤ４で染色し、その後、４％（wt/vol）パラホルムアルデヒドリン酸緩衝溶液で固定化し、１％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）および０．１％サポニンを含有する氷冷したリン酸緩衝液で細胞膜を透過処理した。得られた細胞を、１０μｇ／ｍｌ抗−ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ（２４Ｇ２）で３０分間処理し、その後、染色緩衝液（リン酸緩衝液、１％ＦＣＳ）中、４℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌビオチン化ヤギ抗マウスＩＬ−１３、または、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（R＆D  Systems  Inc.,Minneapolis,Mn）で処理した。続いて、処理した細胞を２回洗浄し、ＡＰＣ−標識ストレプトアビジン、および、ＦＩＴＣ−ラット抗マウスＩＦＮ−γ、または、アイソタイプ対応コントロールｍＡｂ（Pharmingen）で３０分間染色した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD  Bioscience,San  Jose,CA）により、各サンプルのＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞質内ＩＦＮ−γ＋および／またはＩＬ−１３＋細胞の割合を、分析した。
【０１３４】
Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞上のＩＬ−１８Ｒα鎖の発現量を測定するために、抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩで、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）をブロッキングした後、細胞を４℃で３０分間、抗マウスＩＬ−１８Ｒα鎖モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、または、コントロールラットＩｇＧ１ｍＡｂ（Ｒ３−３４）でインキュベートした後、４℃、３０分間、染色緩衝液中で、ＦＩＴＣ−抗ラットＩｇＧ１抗体、および、ＰＥ−抗マウスＣＤ４でインキュベートした。そして、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒでサンプルを分析した。
【０１３５】
〔細胞移入・ＯＶＡおよびＩＬ−１８の投与〕
in vivo でのメモリー型Ｔｈ１細胞およびメモリー型Ｔｈ２細胞の調製は、文献に従い行った（５１Hayashi, N., D. Liu, B. Min, S.S. Ben, and W.E. Paul. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99:6187-6191.）。同量（１×１０７）のＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、または選別したＩＦＮ−γ＋細胞を、正常ＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループあたり１０〜１５匹のマウス）に、静注した。養子移入の後、種々の時間で、末梢血液細胞を採取し、ＡＰＣ−抗ＣＤ４およびＰＥ−ＫＪ１−２６で染色し、ＤＯ１１．１０ＴＣＲ−Ｔｇ細胞が、宿主マウスに存在しているか確認した。続いて、細胞の移入から３０日経過後、３日間、連日、動物に、ＰＢＳまたは、１μｇＯＶＡ／５０μｌＰＢＳ、および／または、０．５μｇＩＬ−１８／５０μｌＰＢＳを、鼻腔内から暴露した。コントロールマウスには、ＰＢＳを暴露した。最後に抗原を暴露して２４時間後のマウスを分析した。in vivoでは、ＩＬ−１３を遮断（阻害）するため、２０μｇのｓＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ、または、２０μｇのコントロールヒトＩｇＧ（Genetics Institute Inc.,Cambridge,ＭＡ）を、ＯＶＡおよびＩＬ−１８との混合物として、３日間、毎日、鼻腔内に暴露した。
【０１３６】
〔ＡＨＲの測定〕
Ｐｕｌｍｏｓ−Ｉ（ＭＩＰＳ、大阪、日本）のハードウェアおよびソフトウェアを用いて、マウスのβ−メタコリン（Ｍｃｈ）吸入に対するＡＨＲを測定した。チャンバーにマウスを置き、最初に、生理食塩水のエアロゾル（ベースライン）に暴露し、次いで、濃度を増加したメタコリン（５、１０、１５および２０ｍｇ／ｍｌ）に暴露した。それぞれ、２分間の暴露後、増強された圧力波形状および呼吸時間の振幅の変化を反映する指数を３分間測定した。
【０１３７】
〔気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）〕
１匹のマウス当たり、０．５ｍＬＰＢＳを３回に分けて、ＢＡＬを行い、全細胞数を数えた。ＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）を遠心後、Ｄｉｆ−Ｑｕｉｋ（Baxter Healthcare Corp,Miami,FL）で染色し、形態学および染色特性に基づいて区別した。
【０１３８】
〔組織学〕
右心室を介して、１０ｍｌのＰＢＳを、動物に注入した肺組織を準備し、次いで、この肺組織を、１０％緩衝化ホルマリンに固定し、３μｍの断片とし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【実施例１】
【０１３９】
〔ＯＶＡおよびＩＬ−１８の同時投与によって、ＯＶＡ特異的メモリー型Ｔｈ１細胞を受けたマウスは、気道炎症およびＡＨＲを誘導する。〕
ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニック（Ｔｇ）ＢＡＬＢ／ｃ（ＤＯ１１．１０）から分離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下、以下の（ａ）または（ｂ）のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する刺激を７日間を２回（計２週間）行い、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞を得た。
（ａ）ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡぺプチド）、ＩＬ−１２、および、抗ＩＬ−４抗体（Ｔｈ１細胞誘導用の刺激）
（ｂ）ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡぺプチド）、ＩＬ−４、および、抗ＩＬ−１２抗体および抗ＩＦＮ−γ抗体（Ｔｈ２細胞誘導用の刺激）
次いで、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、上記の新しく分極化したＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞を静注移入（１匹のマウス当たり１０７細胞）し、これらの細胞が、in vivoで静止期メモリー表現型を獲得するようにした（Hayashi, N., D. Liu, B. Min, S.S. Ben, and W.E. Paul. 2002. Antigen challenge leads to in vivo activation and elimination of highly polarized TH1 memory T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99:6187-6191.）。細胞の受動移入から３０日後、レシピエントに、３日間、ＯＶＡおよび／またはＩＬ−１８を、毎日、鼻腔内投与した。すなわち、この実験システムでは、ナイーブマウスに、気管支喘息を誘導することが可能な、メモリー型Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞を樹立したことになる。
【０１４０】
各グループのマウスについて、気道の組織病理学的分析を、気管支周囲と血管周囲で行ったところ、Ｔｈ２細胞移入マウスは、正常マウスに比べて、ＯＶＡの鼻腔投与後、気管支周囲(peribronchial)に好酸球およびリンパ球が、顕著に浸潤した（図１ｃ、ｍ、ｏ）。さらに、これらのマウスは、Ｍｃｈ試験（メタコリンを用いた気道過敏性の試験）に対して、投与量依存的に、気道過敏性（ＡＨＲ）を示した（図２Ａ）。
【０１４１】
一方、３０日前に、Ｔｈ１細胞を移入したマウスは、ＯＶＡ投与後、主にリンパ球および好中球から構成される、顕著な細胞浸潤を示したが（図１ｇ、ｈ）、Ｍｃｈ試験によるＡＨＲの上昇は認められなかった（図２Ａ）。
【０１４２】
しかし、Ｔｈ１細胞移入マウスは、抗原およびＩＬ−１８の両方を鼻腔投与された場合、著名な細胞浸潤（図１ｉ、ｊ）およびＡＨＲの亢進（図２Ａ）という、病理学的変化を特徴としている。すなわち、抗原およびＩＬ−１８が、Ｔｈ１細胞を刺激し、好酸球、リンパ球、および好中球による浸潤を、誘導または促進するサイトカインやケモカインを産生することを示している（図１ｊ）。
【０１４３】
一方、３０日前に、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞を移入したマウスは、ＰＢＳまたはＩＬ−１８を鼻腔内投与した場合、肺の炎症（図１ｅ、ｆ、ｋ、ｌ）も、ＡＨＲ（図２Ａ）も示さなかった。すなわち、気管支喘息を誘導するには、メモリー型Ｔｈ２細胞は抗原のみで、メモリー型Ｔｈ１細胞は抗原とＩＬ−１８との刺激によって、それぞれ活性化させなければいけない。このため、メモリー型Ｔｈ１細胞の抗原刺激は、ＡＨＲなしに、気道炎症を誘導するが、抗原とＩＬ−１８との刺激は、気道炎症およびＡＨＲの両方を誘導する。
【０１４４】
Ｔｈ１細胞移入マウスに、気管支喘息を誘導するために、なぜＩＬ−１８の投与が必要であるかを理解することが重要である。そこで、３日間、Ｔｈ１細胞移入マウスに、ＰＢＳ、抗原、ＩＬ−１８、または、抗原およびＩＬ−１８を、毎日暴露した後、浸潤した肺組織の炎症細胞の数を比較した（図２Ｂ）。ＢＡＬＦの分析では、ＯＶＡおよびＩＬ−１８処理後、Ｔｈ１細胞移入マウスの肺に、好酸球集団による浸潤が著しく増加した。すなわち、抗原およびＩＬ−１８が、Ｔｈ１細胞に作用し、好酸球による浸潤を誘導する可溶性メディエーターを産生したことを示している（図２Ｂ，図２Ｃ）。
【０１４５】
また、抗原およびＩＬ−１８の投与によって、リンパ球、好中球、および単球の数が増加した（図２Ｂ，図２Ｃ）。ＯＶＡ、または、ＯＶＡおよびＩＬ−１８を吸入したＴｈ２細胞移入マウスのＢＡＬＦにおける各細胞集団の増加の程度は類似していた（図２Ｂ，図２Ｃ）。この結果は、Ｔｈ１細胞移入マウスの場合、ＯＶＡに加えて、ＩＬ−１８による刺激によって、肺の炎症細胞の組成が定量的にかつ定性的に変化するという、図１の結果をさらに実証している。従って、抗原のみの刺激では、肺に軽度の遅延型過敏症（ＤＴＨ）しか誘導されないが、抗原およびＩＬ−１８の刺激では、非常に重度のＤＴＨが誘導され、気管支喘息の誘導につながる。
【実施例２】
【０１４６】
〔ＩＬ−１８はＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞を刺激し、in vitroで、ＩＦＮ−γ、Ｔｈ２型サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、およびケモカインを産生する。〕
次に、どのようにして抗原およびＩＬ−１８が、気管の炎症およびＡＨＲを誘導するかというメカニズムを理解するため、in vitroで、抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８により刺激されたＴｈ１細胞が産生するサイトカインまたはケモカインのタイプを検討した。
【０１４７】
Ｔｈ１細胞の培養上清の、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＭＩＰ−１α、およびＩＦＮ−γの濃度を測定した。なぜなら、これらの因子は、気管支喘息に深く関与していることが報告されているからである（Busse, W.W., and R.J. Lemanske. 2001. Asthma. N. Engl. J. Med. 344:350-362.など）。特に、ケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、およびエオタキシンは、気道に好酸球を遊走する因子の中心となる（Luster, A.D. 1998. Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation. N. Engl. J. Med. 12: 436-445.）。
【０１４８】
ＯＶＡ特異的ＴＣＲＴｇマウス由来のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を準備し、in vitroで、Ｔｈ１またはＴｈ２を誘導する条件下、７日間の刺激を連続して２回行った。すでに報告されているように、ＯＶＡペプチドおよびＩＬ−２を用いた実験では、Ｔｈ２細胞は、大量のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を産生したが、ＩＦＮ−γを産生しなかった。また、Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γを産生したが、Ｔｈ２サイトカインを産生しなかった（図３Ａ）。
【０１４９】
抗原およびＩＬ−２で刺激したＴｈ１細胞を、ＩＬ−１８でさらに刺激すると、用量依存的にＩＦＮ−γを誘導した（Yoshimoto, T., K. Takeda, T. Tanaka, K. Ohkusu, S. Kashiwamura, H. Okamura, S. Akira, and K. Nakanishi. 1998. IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1 cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-g production. J. Immunol. 161:3400-3407.）（図３Ａ）。驚くべきことに、この処理は、Ｔｈ１細胞において、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α（データを示さず）、およびＧＭ−ＣＳＦを同時に誘導した（図３Ａ）。
【０１５０】
エオタキシンは、Ｔｈ１細胞の培養上清には、検出されなかった。Ｔｈ１およびＴｈ２のＩＬ−１８に対する応答性の違いの原因となるメカニズムは、主として、Ｔｈ１細胞のＩＬ−１８受容体α鎖（ＩＬ−１８Ｒα）の優位な発現によって説明できる（４４）。この予想通り、Ｔｈ１細胞は、高レベルのＩＬ−１８Ｒを発現するのに対して、Ｔｈ２細胞は、少量しか発現しない（図３Ｂ）。さらに、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、大量のケモカインを同時に産生する（図３Ａ）。
【０１５１】
このように、ＩＬ−１８Ｒ発現Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−１８の標的細胞となり、ＩＬ−１８に応答して、ＩＦＮ−γの産生を増大させるだけでなく、いくつかのＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−９、ＩＬ−１３など）、ＴＮＦ−α（データを示さず）、ＧＭ−ＣＳＦ、および、ケモカインも産生した。
【０１５２】
ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、in vivoおよびin vitroにおいて、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導するが、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−４およびＩＬ−１３産生を阻害することが知られているため（Okamura, H., H. Tsutsi, T. Komatsu, M. Yutsudo, A. Hakura, T. Tanimoto, K. Torigoe, T. Okura, Y. Nukada, K. Hattori, et. 1995. Cloning of a new cytokine that induces IFN-g production by T cells. Nature. 378:88-91.など）、Ｔｈ１細胞からのＩＬ−１３産生を誘導するＩＬ−１８の能力に対する、ＩＬ−１２の影響を検討することは重要である。ＩＬ−１２は、ＯＶＡの存在下、ＩＬ−１８のみ、あるいは、ＩＬ−１８およびＩＬ−２で刺激したＴｈ１細胞からのＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ産生を、わずかに減少させた（図３Ｃ）。
【０１５３】
さらに、ＩＬ−１２は、固定化抗ＣＤ３抗体、および、抗ＣＤ２８抗体で刺激したＴｈ１細胞からのＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ産生に影響を及ぼさなかった（データを示さず）。従って、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞の誘導に不可欠であるが、Ｔｈ１細胞からのサイトカイン産生の誘導にはあまり関与していない。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−１８刺激によって、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３の産生をわずかに増加させたが、ＩＬ−４産生の増加は認められなかった（図３Ａ）。
【０１５４】
これらの結果は、重度の気道炎症およびＡＨＲの両方の誘導には、Ｔｈ１細胞からのサイトカイン、特にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦおよびいくつかのケモカインが関与する可能性を示している。
【実施例３】
【０１５５】
〔ＩＬ−１８は、抗原特異的クローン化Ｔｈ１細胞を刺激し、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦを産生する。〕
前記実施例１および２の結果では、他の混在する細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞）が、ＩＬ−２およびＩＬ−１８に応答し、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦを産生した可能性がある。そこで、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）およびコンアルブミン(conalubumin)のぞれぞれに特異的な、クローン化Ｔｈ１細胞（クローン９−１６）（Asano, Y. and R.J. Hodes. 1985. T cell regulation of B cell activation. Lyt-1+, 2- T cells modify the MHC-restricted function of heterogeneous and cloned T suppressor cells. J. Exp. Med. 162:413-426.）およびクローン化Ｔｈ２細胞（クローンＤ１０．４Ｇ．１）（Kaye, J., S. Porcelli, J. Tite, B. Jones, and C.J. Janeway. 1983. Both a monoclonal antibody and antisera specific for determinants unique to individual cloned helper T cell lines can substitute for antigen and antigen-presenting cells in the activation of T cells. J Exp Med. 158:836-856.）を使用した。種々の用量のＩＬ−１８存在下、固定化抗ＣＤ３抗体、および、固定化抗ＣＤ２８抗体で、上記の細胞を刺激した。上記クローン化Ｔｈ２細胞は、大量のＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生したが、ＩＦＮ−γを産生したかった。また、上記クローン化Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを産生したが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−１３）を産生しなかった（図４Ａ）。ＤＯ１１．１０マウスからの新しく樹立されたＴｈ１細胞のように、安定したクローン化Ｔｈ１細胞の大部分は、高レベルのＩＬ−１８Ｒα鎖を発現し、刺激に用いたＩＬ−１８の用量依存的に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３を産生した（図４Ａ，図４Ｂ）。
【０１５６】
一方、Ｔｈ２細胞は軽度のＩＬ−１８Ｒα鎖を発現するが、クローン化Ｔｈ２細胞は、固定化抗ＣＤ３抗体＋抗ＣＤ２８抗体、およびＩＬ−１８で刺激されても、ＩＦＮ−γを産生しなかった（図４Ａ，図４Ｂ）。
【０１５７】
別のＯＶＡ特異的Ｔｈ１クローン（クローン３５−９Ｄ）についても実験した（４９）。このクローンは、大量のＩＦＮ−γを産生したが、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生しなかった。しかし、上記９−１６Ｔｈ１クローンのように、クローン３５−９ＤＴｈ１細胞は、高レベルのＩＬ−１８Ｒα鎖を発現し（８０．０％；図示せず）、刺激に用いたＩＬ−１８の用量依存的にＩＬ−１３産生を増加した（データを示さず）。
【０１５８】
上記の結果は、安定したクローン化Ｔｈ１細胞でさえ、抗原およびＩＬ−１８で刺激されると、Ｔｈ２サイトカイン、および、ＧＭ−ＣＳＦを産生する能力を獲得することを強く示している。すなわち、Ｔｈ１細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を誘導するＩＬ−１８の重要性を示している。
【実施例４】
【０１５９】
〔Ｔｈ１細胞移入マウスでは、ＩＬ−１３アンタゴニストの投与によって、ＢＡＬＦの好酸球の数を減少するが、抗原およびＩＬ−１８により誘導されるＡＨＲを抑制しない〕
ＩＬ−１３が気道炎症およびＡＨＲに関与することが報告されているため（Wills-Karp, M., J. Luyimbazi, X. Xu, B. Schofield, T.Y. Neben, C.L. Karp, and D.D.）、Ｔｈ１細胞移入マウスに、ＩＬ−１３アンタゴニストを投与することによって、このサイトカインの機能を阻害した（図５）。具体的には、ＩＬ−４には結合せず、ＩＬ−１３に選択的に結合し中和する可溶性ＩＬ−１３Ｒα２−ヒトＦｃ融合タンパク質（ＩＬ−１３Ｒ−Ｆｃ）（Yoshimoto, T., H. Mizutani, H. Tsutsui, T.N. Noben, K. Yamanaka, M. Tanaka, S. Izumi, H. Okamura, W.E. Paul, and K. Nakanishi. 2000. IL-18 induction of IgE: dependence on CD4+ T cells, IL-4 and STAT6. Nat. Immunol. 1:132-137）を、上記のマウスに投与し、コントロールタンパク質を投与したマウスと比較した。これらの処理によって、ＢＡＬＦの好酸球の数が著しく減少したが（図５Ｂ）、Ｍｃｈ試験によるＡＨＲでは、ほとんど効果は見られなかった（図５Ａ）。
【０１６０】
一方、上記のように、ＩＬ−１３アンタゴニストの投与によって、Ｔｈ２細胞を移入されＯＶＡ刺激されたマウスのＡＨＲ、および、ＢＡＬＦの好酸球数の両方が減少した（図５Ｂ）。従って、Ｔｈ１細胞移入マウスにおいて、ＩＬ−１３が、ＡＨＲを誘導するのに関与している可能性は除外された。すなわち、ＩＬ−１３の中和によって、好酸球数が著しく減少したため、この炎症細胞は、この実験的喘息モデルのＡＨＲに関与していない。
【実施例５】
【０１６１】
〔ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を刺激し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＳＣＦを産生する。〕
抗原およびＩＬ−２刺激されたＴｈ１細胞は、さらなるＩＬ−１８刺激の用量依存的に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３の両方の産生を誘導したが（図３Ａ）、混在した可能性のあるＴｈ０細胞が、ＩＬ−１３を産生した可能性を排除する必要がある。
【０１６２】
そこで、この可能性を排除するため、１６時間、抗原、ＩＬ−２、および、ＩＬ−１８で刺激したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞における、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１３を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を検討した（図６Ａ）。その結果、ＩＬ−１８刺激によって、ＩＬ−１３のみ、またはＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３の両方を産生するＴｈ１細胞の割合が、著しく増加した。予想通り、Ｔｈ２細胞は、ＩＦＮ−γではなくＩＬ−１３を産生し、さらなるＩＬ−１３刺激にほとんど応答しなかった。これらの結果は、Ｔｈ１細胞が、抗原，ＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激された場合、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３の両方を産生することを強く示している。
【０１６３】
最後に、in vitroで、抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８に応答して、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−９，およびＩＬ−１３を産生する、高度に精製したＴｈ１細胞の能力を検討した（図６Ｃ）。このため、細胞表面結合抗ＩＦＮ−γ抗体によって、分泌されたＩＦＮ−γを細胞表面で捕らえ、ＩＦＮ−γ発現Ｔｈ１細胞を精製した。図６Ｂに示すように、８時間、ＡＰＣの存在下、ＯＶＡペプチドで刺激されたＴｈ１細胞を、生細胞としてＩＦＮ−γを産生している細胞を検出可能なアフィニティーマトリックス技術によって検討した結果、Ｔｈ１細胞の６．３％は、細胞表面に、ＩＦＮ−γを発現した。
【０１６４】
次に、蛍光セルソータ(cell sorter)によってＩＦＮ−γを産生する、生きたＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を精製した（９８．７％）。ＡＰＣ存在下、ＯＶＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−１８と共に、精製したＩＦＮ−γおよびＴｈ１細胞を培養すると、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦの産生は増加したが、ＩＬ−４産生は増加しなかった（図６Ｃ）。
【０１６５】
従って、抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞を刺激し、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−９およびＩＬ−１３を産生することが正式に結論付けられた。
【０１６６】
また、Ｔｈ１細胞の病理学的関連性を明らかにするため、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分離分析装置; fluorescence‐activated cell sorter）により分別したＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに移入して、これらのマウスを、静止期メモリー表現型を獲得できるようにした。細胞移入して３０日後、これらのマウスに、３日間、ＯＶＡおよびＩＬ−１８を鼻腔から暴露した。病理学的に分析すると、これらの動物は、気管支周囲および小静脈周囲に、好酸球およびリンパ球浸潤が進展しており（図７）、Ｍｃｈ試験によるＡＨＲが著しく増加した（データを示さず）。
【０１６７】
以上のように、生きたＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を、in vivoで、抗原およびＩＬ−１８で刺激すると、非感作宿主マウスに、気道炎症および気管支喘息を誘導できる。しかし、ＩＬ−１３の阻害によって、肺細胞の好酸球は減少したにもかかわらず（データを示さず）、気道炎症およびＡＨＲは抑制されなかった。すなわち、抗原およびＩＬ−１８刺激されたＴｈ１細胞は、気管支喘息の誘導に寄与している。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
以上のように、本発明の喘息モデル動物は、メモリー型Ｔ細胞を有する新たな喘息モデル動物を提供することができるので、喘息発症時の各種物質の体内動態解析、気道に対する組織特異性の確認試験、喘息診断用の医薬品、喘息の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニング試験などに好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】ＩＬ−１８が、メモリー型Ｔｈ１細胞を移入したマウスに対して、気道炎症およびＡＨＲを誘導した結果を示す図である。
【図２】Ａ〜Ｂは、ＩＬ−１８が、メモリー型Ｔｈ１細胞移入マウスの、ＡＨＲおよび好酸球増加症を誘導した結果を示す図である。
【図３】図３は、ＩＬ−１８が、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α産生を誘導した結果を示す図である。
【図４】Ａ〜Ｂは、ＩＬ−１８が、抗原特異的Ｔｈ１クローンからＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦの産生を誘導した結果を示す図である。
【図５】Ａ〜Ｂは、メモリー型Ｔｈ１細胞移入マウスにおいて、ＩＬ−１３阻害剤によるＩＬ−１８によって誘導された、ＡＨＲおよび好酸球増多に対するＩＬ−１３阻害効果を示す図である。
【図６】Ａ〜Ｃは、ＩＬ−１８が、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞から、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ産生を誘導した結果を示す図である。
【図７】ＩＬ−１８が、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を移入したマウスに対して気道炎症を誘導した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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