(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫調節および増強作用のための新規分子の提供。【解決手段】アミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰを含む単離されたペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体であり、該ペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する特性を有する、ペプチドまたはポリペプチドであって、１つの実施形態において、１１アミノ酸残基と２００アミノ酸残基との間の長さであり、他の実施形態において、１１アミノ酸残基と２０アミノ酸残基との間の長さであり、別の実施形態において、上記アミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む単離されたペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体であって、該ペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する特性を有する、ペプチドまたはポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、免疫増強特性を有するムチンペプチド、このペプチドを含む薬学的組成物、および癌の処置方法または予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景の情報
ＭＵＣ１遺伝子は、正常な上皮、および数種のヒト癌において発現し、乳癌では非常に高レベルで発現する（１）。この遺伝子の主な産物は、大きな、高度にグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および７２個のアミノ酸の細胞質の尾（ｔａｉｌ）から構成される、多型１の膜貫通分子である（２）。この多型は、細胞外ドメインに存在する２０個のアミノ酸縦列の繰り返しのユニット数のバリエーションに、主に由来する。分泌ＭＵＣ１アイソフォーム（ＭＵＣ１／ｓｅｃ）（３）はまた、イントロン２配列を含み、このイントロン内の終止コドンで早期に終結し、そして、それにより、膜貫通ドメインを欠くことが見い出されている。
【０００３】
ＭＵＣ１、ならびにそのフラグメントおよびその誘導体は、抗癌ワクチンおよび癌治療における可能な使用について、広く研究されている。米国特許第６，３４４，２０３号は、癌ワクチンに使用するための、ＭＵＣ１を模倣し、そしてＩＢ４レクチンおよび抗−Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ抗体に結合するペプチドを開示する。これらのペプチドは、Ｔ細胞の援助を刺激するために、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、または酸化ＫＬＨのようなタンパク質を保有するように結合体化される。
【０００４】
米国特許第５，８２７，６６６号は、グルコシル化の不存在下で、ネイティブのコンホメーションを達成し得るＭＵＣ１の少なくとも２つの２０個のアミノ酸縦列の繰り返しを含む、合成ＭＵＣ１ペプチドを開示する。この合成ペプチドは、特に、エピトープに対するアミノ酸配列も含む、ワクチンにおいて有用であることが示される。米国特許第５，９８９，５５２号は、免疫療法に使用するための、ＭＵＣ１ポリペプチドまたはその縦列の繰り返しと酸化マンナンとの結合体を開示する。
【０００５】
米国特許第６，０８０，７２５号は、ワクチン中の腫瘍関連抗原として、ＭＵＣ１およびそのペプチドフラグメントと共に利用され得る、サポニンアナログのアジュバントを開示する。
【０００６】
ＭＵＣ１はまた、例えば、公開された米国特許出願第２００２０００９７５９号、同第２００２００１２９３１号、同第２００２００２２２３５号、および同第２００１００５１３５１号に開示されるように、癌細胞決定基、または癌細胞マーカーとして記載および使用されている。
【０００７】
前述の開示の中で、ＭＵＣ１、ならびにそのフラグメントおよびその模倣物は、ワクチンもしくは免疫原性組成物において使用するための腫瘍関連抗原として利用されるか、腫瘍関連抗原であると考えられるか、または診断テストのマーカーとして利用される。
【０００８】
本発明では、ＭＵＣ１の改変体分泌アイソフォームが、アジュバントの特性を有し、従って、抗原の特性と区別される免疫増強特性を有するという予期しない発見がなされた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（請求項１）アミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む単離されたペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体であって、該ペプチドまたはポリペプチドは、哺乳動物に投与された場合、抗原に対する免疫応答を増強する特性を有する、ペプチドまたはポリペプチド。
（請求項２）１１アミノ酸残基と２００アミノ酸残基との間の長さである、請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチド。
（請求項３）１１アミノ酸残基と２０アミノ酸残基との間の長さである、請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチド。
（請求項４）ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む、請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチド。
（請求項５）タンパク質キャリアに結合体化したアミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む、少なくとも１コピーのペプチドまたはポリペプチドを含む、請求項１に記載の誘導体。
（請求項６）前記キャリアが、キーホールリンペットヘモシアニンである、請求項４に記載の誘導体。
（請求項７）請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸あるいは該核酸と相補的な配列を有する核酸。
（請求項８）請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体と、薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む、薬学的組成物。
（請求項９）抗原をさらに含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
（請求項１０）前記抗原が腫瘍抗原である、請求項９に記載の薬学的組成物。
（請求項１１）前記抗原が、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原およびｐ５３からなる群より選択される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
（請求項１２）前記ペプチドが、ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
（請求項１３）請求項７に記載の核酸を含む、ベクター。
（請求項１４）請求項７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
（請求項１５）ＭＵＣ１／ｓｅｃをコードする核酸を含む、請求項１４に記載の宿主細胞。
（請求項１６）ＤＡ−３細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
（請求項１７）請求項１に記載のペプチドまたはポリペプチドあるいはそのアナログまたは誘導体と、抗原と薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとを含む、ワクチン。
（請求項１８）哺乳動物において癌を処置または予防するための方法であって、該方法は、安全かつ有効な量の請求項８または請求項９に記載の薬学的組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（請求項１９）哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導または増強するための方法であって、該方法は、安全かつ有効な量の請求項８または請求項９に記載の薬学的組成物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
（請求項２０）前記抗原もまた、前記哺乳動物に投与される、請求項１９に記載の方法。
（発明の要旨）
アミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含むペプチド、ならびにそのアナログおよびその誘導体は、インビボで免疫調節活性を示す。このようなペプチド、およびそれらをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、当該分野で公知の体液の基準、または細胞の基準によりアッセイされる場合、被験体（動物またはヒト）において免疫応答を刺激するか、またはさもなければ増強するアジュバントとして使用され得る。例えば、抗体産生の増強、その可溶性免疫媒介物（例えば、サイトカイン）の分泌、抗原提示、エフェクター細胞の産生またはエフェクター細胞の機能（例えば、細胞傷害性）、免疫応答の他の公知の方法、またはこれらの組み合わせが、効力を示すのに使用され得る。特に、このペプチドまたは核酸は、ワクチンアジュバントとして使用されて、インビボで免疫応答を増強させ得、インビボおよび／もしくはインビトロでサイトカイン（１つ以上の細胞の亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のマイトジェンとして）産生を誘導し得、または細胞傷害性を増強させ得る。本発明の１つの目的は、免疫調節および増強作用のための新規分子を提供することである。
【００１０】
抗原特異的な免疫応答を刺激するために、さもなければ増強するために、このペプチドが抗原（例えば、腫瘍抗原、またはバクテリア、ウイルス、原生動物、真菌、糸状菌、または酵母のような感染因子由来の抗原）と共にワクチン処方物の中へ組み込まれ得るか、またはこの抗原に結合体化され得る。核酸は、この抗原、および／もしくはこの抗原をコードする発現ベクターと共に、遺伝子ワクチン接種用の処方物の中へ組み込まれ得るか；あるいは、ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列、またはこれらのアナログもしくはこれらの誘導体抗原コード領域に結合するか、または抗原コード領域と区別される発現ベクターの中に含まれ得る。他のアジュバントおよび／またはサイトカインのような、ワクチン処方物の成分はまた、この処方物に含まれ得る。従って、これらの組成物は、細胞ワクチン、無細胞ワクチン、分画したかもしくは精製した組み換えタンパクベースのワクチン、または「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡワクチンの中に組み込まれ得る。
【００１１】
処置され得る腫瘍型は、肉腫および癌腫を含むが、これらに限定されない。例えば、白血病、リンパ腫、または脳腫瘍のような癌は、処置され得る。一般的に、任意の抗体ベースの治療、または任意の他の免疫学的処置は、本発明によって増強され得る。
【００１２】
本発明は、免疫応答を増強させるための、有効でかつより低い毒性の、他のアジュバントに対する代替物を提供し得る。これは、医学的処置または獣医学的処置を意図する、生物学的基準を満足する条件下で生成され得、そして、治療および予防に使用される処方物として、生体適合性である。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、相互交換可能であり、そして各々の用語は、天然に存在するアミノ酸の配列をいう。一般的に、「ペプチド」は、２０個未満のアミノ酸残基の配列、「ポリペプチド」は、２０個以上のアミノ酸残基の配列をいうことを意味し、そして本明細書中で使用される場合、タンパク質も包含することを意味する。好ましくは、本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、１１個と２００個の間のアミノ酸残基を包含し、さらに好ましくは、１１個と１００個の間の残基であり、なおさらに好ましくは、１１個と５０個の間の残基、そして、最も好ましくは１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の残基を含む。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」は、元の環境から取り出された物質
（例えば、自然環境から取り出された天然に存在する物質）をいう。上記のベクター、組成物、または細胞が、この物質の元の環境に存在しない場合、このような物質は、ベクターの部分、または物質組成物の部分であり得るか、もしくは細胞内に含まれ得る。
【００１５】
アミノ酸配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む、単離されたペプチド、単離されたポリペプチド、もしくは単離されたタンパク質、またはそのアナログもしくはその誘導体を提供することが、本発明の１つの目的である。本発明のペプチドは、免疫増強特性を有し、薬学的組成物およびワクチンにおいて使用され得る。
【００１６】
用語「アナログ」は、本明細書中で使用される場合、同一または類似の機能的特徴（すなわち、免疫調節効果を産生する）を有する配列改変体を意味することを意図する。このような改変体は、「親」化合物の免疫調節特性を保持するようなアミノ酸残基の単一またはいくつかの（２〜３）置換（好ましくは、保存的置換）を有し得る。
【００１７】
用語「誘導体」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つのさらなる基の付加によって改変されており、そして親化合物の免疫調節能特性を保持する、配列ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰ（配列番号１）を含む、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を意味することを意図する。好ましい実施形態において、この誘導体は、本発明のペプチドの多数のコピーが結合体化されるＫＬＨ分子を包含する。この誘導体はまた、添付した本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が結合した抗原であり得る。誘導体の他の例としては、ペプチドの多数のコピーに結合体化されるＯＶＡおよびＢＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。このペプチドは、また、その純粋な形態で有用である。本発明のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、化学合成の従来の方法によって、または組み換えＤＮＡ技術によって、生成され得る。例えば、宿主微生物が、このポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントで形質転換され得、そしてこのポリペプチドが培養物から収集され得る。宿主生物は、例えば、バクテリア、酵母、ウイルスベクター、または哺乳動物の細胞であり得、それによって、問題のＤＮＡフラグメントは、宿主生物のゲノムの中に組み込まれるか、または宿主生物の中で複製し得る、適切な発現ベクターの中に挿入される。このＤＮＡフラグメントは、適切な転写シグナルおよび翻訳シグナルを含む領域の制御下に位置する。これらの手段によってポリペプチドを得る方法は、当業者によく知られている。
【００１８】
本発明の別の目的は、本発明のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質をコードする核酸、またはそれらの誘導体もしくはそれらのアナログを提供することである。本発明の核酸は、組み換え、合成、または当業者に利用可能な任意の手段によって生成され得、そして、この核酸は、当該分野において公知の技術を使用してクローン化され得る。このことに関して、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター、および本発明の核酸を含む宿主細胞を含む。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、単鎖形態か、または二重鎖形態のいずれかの、１つより多いヌクレオチドのＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含むことを意味し、そして、これらは、互換性をもって使用される。
【００２０】
用語「相補的な」、または用語「その相補体」は、本明細書中で使用される場合、相補的な領域全体にわたって、別の特定したポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ＆Ｃｌｉｃｋ塩基対合を形成し得る、ポリヌクレオチド配列のことをいう。この用語は、それらの配列のみに基づくポリヌクレオチドの対に適用され、そして、この用語は２つのポリヌクレオチドが実際に結合する特定の条件には適用されない。
【００２１】
本発明はまた、本発明のペプチドもしくはポリペプチド、またはそれらのアナログもしくはそれらの誘導体、および薬学的に受容可能な賦形剤、または薬学的に受容可能なキャリアを含む、免疫原性薬学的組成物を包含する。好ましい実施形態において、この薬学的組成物は、少なくとも１つの抗原（好ましくは腫瘍抗原）を含む。腫瘍抗原としては、例えば、以下が挙げられる：自己腫瘍細胞、同種腫瘍細胞、ガングリオシド、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、抗原に関連する黒色腫、およびｐ５３、ならびに当業者に公知の他の腫瘍抗原。本発明で使用され得る他の抗原としては、以下が挙げられる：ウイルス抗原（例えば、乳頭腫ウイルス（ｐａｐｉｌｌｍａｖｉｒｕｓ）由来抗原、Ｂ型肝炎由来抗原およびＣ型肝炎由来抗原、ＨＩＶ由来抗原、ならびにＨＴＬＶ−１由来抗原）、およびバクテリア由来抗原、ならびにＭ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような感染性微生物由来の他の抗原。
【００２２】
本発明はまた、ワクチン、および免疫学的応答を誘導する方法、または増強する方法を含む。好ましい実施形態において、このワクチンは、本発明の免疫調節ペプチドもしくはポリペプチド、またはそのアナログもしくはその誘導体、抗原、および薬学的に受容可能な賦形剤または薬学的に受容可能なキャリアを含む。特に好ましい実施形態において、この抗原は、腫瘍抗原である。
【００２３】
ワクチンの処方は、一般的に当業者に公知であり、そして技術文献（参照、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ．）に広く記載される。
【００２４】
本発明の免疫原性薬学的組成物、またはワクチンはまた、必要に応じて、本発明の免疫調節ペプチド、または免疫調節ポリペプチドに連結され得る、１つ以上のさらなるアジュバント（例えば、ＢＣＧ、ＫＬＨ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、およびｃｙｔｏｘａｎ）を含み得る。１つの好ましい実施形態において、本発明の免疫調節ペプチドは、マレイミド（ｍａｌａｉｍｉｄｅ）活性化ＫＬＨを用いて、ＫＬＨに結合化される。このペプチドが結合化されるアジュバントに依存して使用され得る多くの連結パッケージは、当該分野で公知である。一般的な形態は、Ｒ−ＨＮＣＯ−Ｘ、またはＲ−ＨＣＮＯ−Ｘである（Ｒ＝最適なアジュバント、Ｘ＝ペプチド）。
【００２５】
本発明のワクチンまたは薬学的組成物の安全用量および有効用量を投与することによる、疾患もしくは障害の予防方法または処置方法を提供することもまた、本発明の目的である。本発明の薬学的組成物およびワクチンの安全用量および有効用量は、過度の実験なしで、当業者によって決定され得る。安全用量および有効用量は、当業者によって受け入れがたいと考えられる有害な影響を引き起こすことなしに、被験体の免疫応答に対して有益な効果を生じるように、被験体に投与され得る用量であると考えられる。このような有害な影響のいずれも、本発明の処置の利益、代替利用可能な処置の利点、および当業者によく知られている他の因子に対してバランスをとらなけらばならないことが理解される。好ましい実施形態において、本発明は、腫瘍（特に癌性腫瘍）の予防方法、またはその処置方法を提供する。
（発明の詳細な説明）
規定された腫瘍抗原を使用して、乳癌に対する免疫応答を研究するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス宿主の転移性傷害および死に導く乳癌細胞株であるＤＡ−３細胞を、膜貫通ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ＴＭ）、分泌型（ＤＡ−３／ｓｅｃ）、またはネオマイシンベクター単独（ＤＡ−３／ｎｅｏ）でトランスフェクトした。分泌型ＭＵＣ１でトランスフェクトすることにより、ＤＡ−３細胞は、インタクトなＢＡＬＢ／ｃマウス中で増殖できなくなるが、一方これらはヌードＢＡＬＢ／ｃ動物中では増殖する。ＤＡ―３／ｓｅｃ細胞のワクチン接種は、ＤＡ−３／ＴＭ細胞、またはＤＡ−３／ｎｅ
ｏ細胞を用いるチャレンジに対する保護、およびＢＡＬＢ／ｃマウスとまた同系の２つの関連しない腫瘍に対する保護を与える。分泌ＭＵＣ１アイソフォームに存在する固有の１１個のアミノ酸ペプチドは保護効果に関係し、そして免疫増強分子として作用すると思われる。
【００２６】
（材料および方法）
（マウスおよび腫瘍）
インタクトなＢＡＬＣ／ｃマウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの本発明者らの実験室において、兄弟姉妹交配によって維持した。ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ＋／ｎｕ＋を、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓから購入した。ＤＡ−３腫瘍細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃマウスと同系のインビボのＤ１−ＤＭＢＡ−３マウス乳腺腫瘍から得た（４）。ＤＡ−３細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腫瘍を生成し、肺において転移性病変を引き起こす。この細胞株を、５％  ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、１００Ｕペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０−５Ｍ  ２−βメルカプトエタノール（２−ＢＭＥ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％必須アミノ酸、および１％ピルビン酸ナトリウム（全て、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから購入）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地において増殖させ、そして連続継代によって維持する。これらの細胞は、リムルスアメーバ様細胞溶解物（Ｐｙｒｏｇｅｎｔ（登録商標）ｐｌｕｓ；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いた慣用的アッセイによって確かめられるように、内毒素を有さない。
【００２７】
（ペプチドフラグメントおよび抗体の調製）
Ｈ２３と称されるモノクローナル抗体を使用して、ＭＵＣ１／ＴＭおよびＭＵＣ１／ｓｅｃの両方に共通する縦列反復配列を検出した。抗体１７０９（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ，Ｔｉｇａｒｄ，ＯＲ）を、マレイミド（ｍａｌａｉｍｉｄｅ）活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いてＫＬＨに結合体化されたＭＵＣ１／ｓｅｃ特異的ペプチド（ＶＳＩＧＬＳＦＭＬＰ（配列番号：））を用いてニワトリを免疫することによって、調製した。遊離ペプチド濃度およびＫＬＨ１分子あたり少なくとも１５０のペプチド分子の結合体を、免疫のために使用した。前免疫ＩｇＹ抗体を、免疫前に集められた卵から調製した。
【００２８】
（ＤＡ−３細胞のトランスフェクション）
ＭＵＣ１アイソフォームを発現する安定なトランスフェクト体を、ＭＵＣ１／ＴＭ  ｃＤＮＡ、または分泌型ＭＵＣ１／ｓｅｃ  ｃＤＮＡのいずれかを有し、ネオマイシンプラスミド（ｐＳＶ２  ｎｅｏ）選択マーカーを有する発現プラスミドを、ＤＡ−３マウス乳腺腫瘍細胞へと同時トランスフェクトすることによって生成した。コントロールとして、細胞をまた、空のプラスミドでトランスフェクトし、そしてネオマイシン耐性について選択した。
【００２９】
（インビボでの腫瘍増殖）
親ＤＡ−３細胞、ネオマイシンコントロールおよびＭＵＣ１アイソフォームトランスフェクト細胞を、洗浄し、計数し、そして１０６の細胞を、同系のインタクトなＢＡＬＢ／ｃマウスまたはヌード（ｎｕ＋／ｎｕ＋）ＢＡＬＢ／ｃマウスに、皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍の増殖を、２〜３日毎にモニターし、そしてカリパスを用いて測定された場合に、１０ｍｍより大きい腫瘍を有するマウスを、腫瘍陽性としてスコアした。
【００３０】
（ワクチン接種プロトコル）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２週間の間隔で２回または３回、生理食塩水溶液中の１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞でワクチン接種した。最後のワクチン投与から２週間後、この
動物を、トランスフェクトされないＤＡ−３細胞またはネオマイシンベクター単独でトランスフェクトされたＤＡ−３細胞もしくはＭＵＣ１膜貫通アイソフォームでトランスフェクトされたＤＡ−３細胞を用いて、チャレンジした。いくつかの実験において、チャレンジをするために使用された腫瘍は、腎細胞癌、ＲＥＮＣＡ、または骨肉腫Ｋ７であった。１０６の腫瘍細胞を、１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と混合して、各チャレンジのために使用した。
【００３１】
他の研究において、分泌型ＭＵＣ１アイソフォーム中に存在する、独特の１１アミノ酸ペプチドが、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｉｇａｒｄ，ＯＲ）によって合成され、そのペプチドは、ＫＬＨに結合された。ペプチドのＫＬＨに対する正確な比は、各合成によって異なるので；各投与において、当量のペプチドを送達するために調製物を規格化した。このＫＬＨペプチドを、２週間間隔のワクチンとして使用した。５０μｇのペプチドを、フロイント完全アジュバントと共に、第１のワクチンとして、ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。２週間後、２５μｇのペプチドを、フロイント不完全アジュバントと共に投与した。２週間後、このマウスを、アジュバントを有さない２５μｇのペプチドと混合された１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ細胞またはＤＡ−３／ｎｅｏ細胞を用いて、チャレンジした。
【００３２】
全ての研究において、ワクチン接種されないマウスを、コントロールとして働くための実験群におけるのと同じ腫瘍チャレンジを与えた。腫瘍の増殖を、２日または３日毎にモニターし、そして腫瘍の大きさを、カリパスによって測定した。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
ＤＡ−３乳腺腫瘍細胞を、材料および方法に記載されるように、ヒトＭＵＣ１の膜貫通アイソフォームおよび分泌アイソフォームの両方を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの成功を、ＭＵＣ１縦列反復配列に特異的なＨ２３抗体を使用して、このＭＵＣ１縦列反復の存在について細胞を染色することによって、証明した（５）。この得られた細胞株を、インビトロ実験において使用し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍出現の発生数および時間を決定した。表１に示されるように、ＤＡ−３乳腺腫瘍細胞、ＤＡ−３／ｎｅｏ乳腺腫瘍細胞、およびＤＡ−３／ＴＭ乳腺腫瘍細胞をマウスに移植することによって、７日までにほほ同じサイズの触知可能な腫瘍を生じ、そして１５日までに実質的に全ての動物が、かなり大きな腫瘍を生じた。
【００３４】
（表１．ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍出現の発生数および時間）
【００３５】
【表１】
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驚いたことに、ＭＵＣ１分泌形態（ＤＡ−３／ｓｅｃ）を用いてトランスフェクトされたＤＡ−３細胞は、腫瘍の発達を引き起こさなかった。注目すべきことには、図１で見られるように、これらの動物は、移植の１２ヶ月より後でさえも腫瘍を有さないままであるのに対して、他の３つの型のＤＡ−３細胞を有する動物は、１００日より長くは生存しない。腫瘍の増殖が、１回の接種あたり１×１０７細胞の濃度までのＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞を用いて移植されたマウスで観察されなかったことは指摘されるべきである。
【００３６】
（実施例２）
トランスフェクションの工程によって、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の基本的な増殖能力が選択的に損なわれたということは、この結果についてのありふれた説明であり得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、これら４つの型のＤＡ−３腫瘍細胞のインビトロ増殖特性を調査した。図２に示されるように、親細胞株および全ての種々のトランスフェクト体は、インビトロで類似した速度論で増殖した。実際には、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞は、他の細胞株より良好に増殖するように見え、このことはこれらの細胞のインビトロでの増殖能力が、トランスフェクション操作によって改変されなかったことを示す。
【００３７】
（実施例３）
ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞が、インビボでの全ての腫瘍形成能力を喪失したかどうかを決定するために、４つのＤＡ−３細胞株の全てを、ｎｕ＋／ｎｕ＋ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、そして種々の時点における腫瘍出現の発生率および腫瘍の大きさを評価した。図３は、ＤＡ−３細胞、ＤＡ−３／ｎｅｏ細胞、およびＤＡ−３／ＴＭ細胞が、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、移植後７日までに触知可能な腫瘍を生じ、これらの細胞は、インタクトなＢＡＬＢ／ｃ動物の様式と類似する様式で増殖したことを示す。表１および図１の結果を対照的に、ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞は、全てのヌードマウスにおいて、１４日までに腫瘍を生じ、そして２５日までに、これらの全ての動物が腫瘍を有した。従って、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞を移植されたインタクトなＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腫瘍増殖が生じないことは、免疫学的に制御されるように見える。なぜなら、たとえ出現の時間がより遅くとも、ヌードマウスにおけるこの腫瘍の移植は、１００％の腫瘍の獲得を生じるからである。これらの結果は、ＭＵＣ１の分泌形態を保持する発現プラスミドで別々にトランスフェクトされた他の２つのＤＡ−３腫瘍細胞を使用して、繰り返された。表２に見られるように、ＭＵＣ１−ｓｅｃ遺伝子でトランスフェクトされた３つの別個のＤＡ−３細胞はいずれも、インタクトなＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、増殖し得なかった。
【００３８】
（表２．異なるＤＡ−３／ｓｅｃトランスフェクト体のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍発生率）
【００３９】
【表２】
2005247861.tif 000003
図４は、免疫欠損マウスにおいてこれら３つの異なるＤＡ−３／ｓｅｃ細胞トランスフェクト体（すなわち、ＤＡ−３／ｓｅｃ、ＤＡ−３／ｓｅｃ１１、およびＤＡ−３／ｓｅｃ２２）の増殖速度論がいくらか異なるとはいえ、これらトランスフェクト体全てが、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、インビボで増殖し得ることを示す。興味深いことに、ヌードＢＡＬＢ／ｃ動物で増殖したＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍は、免疫学的にインタクトなＢＡＬＢ／ｃマウスに移植された場合、増殖しなかったが、この腫瘍は、他のヌードＢＡＬＢ／ｃ動物に接種された場合、増殖する（データ示さず）。これらの実験の結果によって、Ｔ細胞（および、より低い度合いで、別の型の非Ｔ細胞エフェクター）が、分泌形態のＭＵＣ１を用いてトランスフェクトされた腫瘍の増殖の制御に関与することが示唆される。
【００４０】
（実施例４）
本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＡ−３／ｓｅｃ細胞での移植が、他のＭＵＣ１腫瘍細胞に対して保護を付与するかどうかを評価した。ムチンを発現しないＤＡ−３細胞（ＤＡ−３／ｎｅｏ）もまた、本研究に含んだ。実験群は、１×１０６細胞のＤＡ−３／ＴＭ細胞またはＤＡ−３／ｎｅｏ細胞を単独またはＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と混合してチャレンジする前に、１週間の間隔で２回または３回の１×１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の注射を受けた。コントロールとして、ワクチン接種されない動物を、ＤＡ−３／ｎｅｏ細胞またはＤＡ−３／ＴＭ細胞のいずれかを用いてチャレンジをした。ＤＡ−３  ｓｅｃ（１０６細胞）を混合されない２回の注射を受ける動物は、ＤＡ−３／ＴＭ細胞単独でチャレンジされた場合、腫瘍の出現のほんの短い遅延（すなわち、コントロール群における１週間での腫瘍を有する１３／１４匹の動物に比べて、２週間で１３／２２匹の腫瘍を有する動物）を引き起こした。チャレンジ前に１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の３回の注射を受けたマウスは、ＤＡ−３／ＴＭ細胞の増殖だけでなくＤＡ−３／ｎｅｏ細胞の増殖も、ワクチン接種されなかったコントロール群に比べて、予想外に遅延した。注目すべきことに、チャレンジのために使用されたＤＡ−３／ＴＭ腫瘍細胞が、移植の時にＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と混合された場合（図５）、コントロール群に比べて腫瘍出現の時間が遅延しただけでなく、ワクチン接種されたマウスの５０％においてＤＡ−３／ＴＭ腫瘍細胞を増殖させない実際の実質的な防御が存在した。さらに、この防御は、ＭＵＣ１分子の認識に起因しないように見えた。なぜなら、同様の効果が、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞でワクチン接種され、かつＤＡ−３／ｎｅｏ乳腺腫瘍細胞およびＤＡ−３／ｓｅｃ乳腺腫瘍細胞の混合物を用いてチャレンジされた動物において見出され得るからである。
【００４１】
（実施例５）
ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞をワクチン接種することが、ＤＡ−３乳腺腫瘍バックグラウンドにおける腫瘍以外の腫瘍の増殖に対する防御を付与し得るかどうかを決定するために、さらなる研究を実施した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに同系である２つの無関係な腫瘍（すなわち、腎細胞癌株（ＲＥＮＣＡ）、および骨肉腫（Ｋ７細胞株））を、使用した。図７は、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞で２回、ＢＡＬＢ／ｃマウスをワクチン接種し、その後ＲＥＮＣＡ細
胞とＤＡ−３／ｓｅｃ細胞との混合物を用いてチャレンジすることによって、ワクチン接種されないコントロールに比べて、腫瘍の増殖が実質的に減少したことを示す。チャレンジ時におけるＤＡ−３／ｓｅｃの添加は、ＤＡ−３／ＴＭ細胞実験およびＤＡ−３／ｎｅｏ細胞実験の場合と同様、必要であった。なぜなら、混合されていないＲＥＮＣＡ細胞の増殖が、損なわれなかったからである。同様の結果を、Ｋ７骨肉腫細胞を使用した実験において得た。図８に見られるように、Ｋ７細胞とＤＡ３／ｓｅｃ細胞との混合物を移植されたワクチン接種されないマウスの８０％は、チャレンジの２１日後までに、腫瘍を出現した。しかし、１０６のＤＡ−３／ｓｅｃ乳腺腫瘍細胞で２回ワクチン接種されたマウスは、腫瘍の出現がチャレンジの４０日後までに遅延し、腫瘍の発達に対する防御を有した。実際、チャレンジの７０日後、５０％未満のワクチン接種されたマウスが、腫瘍を有した。
【００４２】
（実施例６）
分泌形態ＭＵＣ１がなぜ防御を与えるかについての可能性のある手掛かりは、ＭＵＣ１膜貫通アイソフォームおよびＭＵＣ１分泌アイソフォームの構造の分析から得られた。ＭＵＣ１／ＴＭアイソフォームおよびＭＵＣ１／ＳＥＣアイソフォーム由来のｃＤＮＡの模式図を、図９に示す。これらのｃＤＮＡを、図の左側でその５’末端から描く。縦列反復アレイを、縦縞領域によって示し、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインをコードする領域は、それぞれＳＰ、ＴＭ、およびＣＹＴによって示され、そして２つの形態において同じ濃淡を有する。ＭＵＣ１／ｓｅｃアイソフォームの末端のアミノ酸配列は、ＶＳＩＧＬＳＦＰＭＬＰである（３）。重要なことには、これら１１アミノ酸の高ストリンジェンシーでのＢＬＡＳＴＰ１．４．１１（６）分析は、任意の公知のタンパク質配列との同一性を有さないヒトＬｙ４９Ｅリガンドと、約５０％の同一性を明らかにした。低ストリンジェンシーでは、２つのＥｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅの推定タンパク質ＭＬＣＢ４．３０および２つの植物種のＥＦハンドタンパク質（ＥＦ  ｈａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して、いくらかの親和性を示した。このペプチドは、その親水性特性に起因して、高度に抗原性でありそうである。分泌型ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトされたＤＡ−３細胞中のこのペプチドの存在を確かめるために、ＫＬＨに結合した独特の１１アミノ酸ペプチドに対するニワトリＩｇＹ抗体を調製した。この試薬を利用する直接的ＥＬＩＳＡを、ＤＡ−３／ｓｅｃ培養物の上清中のこのペプチドを検出するために開発した。簡単には、１ｍｌあたり０．２〜１０．０μｇのタンパク質または無血清培地からの組織培養物上清を含むコーティング緩衝液５０μｌを、４℃で一晩プレートした。ブロッキング緩衝液を３７℃で１時間加え、プレートを３回洗浄し、一次抗体を１時間または一晩インキュベートし；３回洗浄し；二次抗体を（必要な場合１時間）加え、３回洗浄し；可視化溶液を加え；インキュベートし、そして読み取った。既知濃度の精製ペプチドのポジティブコントロールを、全てのアッセイにおいて使用した。試験された全ての培養物は、この分子について陽性であった（データ示さず）。
【００４３】
（実施例７）
このペプチドを用いたワクチン接種の潜在的な有利な効果を評価するための実験を、実施した（図１０）。ＤＡ−３／ＴＭ細胞またはＤＡ−３／ｎｅｏ細胞（１０６細胞）での注射を受けたコントロールマウスは、アジュバント単独の存在下または非存在下に関わらず、１００％の腫瘍増殖を生じた。実験マウスは、アジュバントの存在下でＫＬＨ結合した独特なペプチドでの注射を、８日間隔で２回受けた。第２の注射の８日後、この動物に、ＫＬＨ結合ペプチドと腫瘍細胞との混合物を用いて、チャレンジした。ＤＡ−３／ＴＭ細胞と混合されたペプチドを用いたチャレンジによって、１２匹のマウスのうちたった７匹で腫瘍増殖を生じ、さらなる動物が、４週間で腫瘍を発生した。ＫＬＨ結合ペプチドとＤＡ−３／ｎｅｏ細胞との混合物でワクチン接種されたマウスのチャレンジは、より多くの防御さえももたらし、ほんの４０％の動物が腫瘍を生じ、その上、さらに１匹のマウス
が、１ヶ月遅れて腫瘍増殖を示した。重要なことには、生存動物は、ＤＡ−３／ＴＭ細胞またはＤＡ−３／ｎｅｏ細胞いずれかでの最初のチャレンジの６ヶ月後に、腫瘍の徴候を示さなかった。
【００４４】
（実施例８）
さらなる研究において、ペプチドワクチン接種の効果を、２つの他の腫瘍において評価した。図１１Ａにおいて、このプロトコルが、ＲＥＮＣＡ細胞がＢＡＬＢ／ｃマウスに移植された場合、わずかな防御および腫瘍出現の遅延のみを提供することが見られ得る。重要なことには、ＫＬＨ結合免疫強化ペプチドが、別のマウス株（Ｃ５７／ＢＬ６マウス）でのワクチン接種プロトコルで使用され、非常に侵襲性のＬｅｗｉｓ肺癌腫でチャレンジされた場合、図１１Ｂにみられるように、防御効果がまた、観察された。
【００４５】
（実施例９）
ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と混合されたより少数のチャレンジ細胞が、腫瘍増殖に対する防御を提供するためにＤＡ−３／ｓｅｃ細胞に前もってさらす必要性を取り除くかどうかを決定するために、５×１０５のＤＡ−３／ＴＭ細胞を、同量のＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と混合し、そしてマウスに投与した。図１２に示されるように、この処置によって、いすれのあらかじめのワクチン接種がなくとも、腫瘍発生に対して６０％の防御が提供された。
【００４６】
（実施例１０）
エフェクター細胞がＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞増殖に対して観察された防御に関与するかどうかを決定するために、この細胞を獲得する２週間前に、ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞の接種を受けたマウス由来の脾臓細胞を使用して、５１Ｃｒ標識化細胞に対する細胞傷害性アッセイを実施した。１０×１０６の脾細胞を、２×１０５〜２×１０６のマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の存在下で、５日間培養した。ＤＡ−３／ｓｅｃで感作された脾細胞は、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞に対して強い細胞溶解活性を示した（図１３）。ＤＡ−３／ｓｅｃで感作された脾細胞は、ＤＡ−３／ＴＭ標的、ＤＡ−３／ｎｅｏ標的およびＤＡ−３標的に対して、低いレベルの細胞傷害性を有した。これらの結果は、リンパ球の集団が、ＤＡ−３／ｓｅｃを用いた刺激の際にインビトロで広がることを示唆し、この刺激は、ＤＡ−３／ｓｅｃ標的に対して、強力なエフェクター機能を有する。
【００４７】
（実施例１１）
免疫系の細胞は、多数の殺傷機構を有し、この殺傷機構には、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用（７）およびパーフォリン−グランザイム媒介性殺傷（８）が挙げられる。ＤＡ−３／ｓｅｃ感作脾細胞を、抗Ｆａｓ抗体またはコンカナマイシン（Ｃｏｎｃａｎａｍｙｃｉｎ）Ａ（ＣＭＡ）（パーフォリン媒介性殺傷をブロックするＨ＋  ＡＴＰアーゼのブロックを介する小胞酸性化のインヒビター（９））で処理した。ＣＭＡは、用量依存様式で、ＤＡ−３／ｓｅｃ標的の殺傷を効率的にブロックした（図１４）のに対して、細胞傷害性に対する効果は、抗Ｆａｓ抗体の添加では観察されなかった（図１５）。これらの結果は、Ｆａｓ／ＦａｓＬが、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の細胞傷害性において役割を果たさないが、Ｆａｓ／ＦａｓＬが、パーフォリン−グランザイム経路を介して媒介されることを示す。
【００４８】
（実施例１２）
インビボでのＤＡ−３／ｓｅｃ細胞への曝露によって、ＹＡＣ−１標的細胞（古典的なマウスＮＫ標的細胞）（１０）に対してより高いＮＫ活性を生じるかどうかを決定するために、正常な脾細胞を、溶解を誘導するその能力に関して、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞にインビボで３日間または１０日間曝された脾細胞と比較する実験を実施した。図１６に見られるように、アッセイ３日前にＤＡ−３／ｓｅｃ細胞を注射されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来
の脾臓細胞は、正常なマウス由来の脾臓細胞と比較して、いくらかより高いレベルのＹＡＣ−１細胞に対する溶解活性を有する。この強化されたＮＫ反応性は、試験１０日前にＤＡ−３／ｓｅｃ細胞でワクチン接種されたマウスにおいて、より明白である。
【００４９】
（実施例１３）
本発明者らの実験室における他の予備的な研究によって、ヒトＭＵＣ１分泌形態によってトランスフェクトされたＤＡ−３細胞が、インビボおよびインビトロの両方で、エフェクター細胞をＤＡ−３／ｓｅｃ細胞に対して応答するように刺激するが、膜貫通形態は刺激しないことが示唆された。上に挙げられたように、ＭＵＣ１／ｓｅｃタンパク質のＣ末端上には、独特な１１アミノ酸ペプチドが存在するが、ＭＵＣ１／ＴＭタンパク質上には存在しない。このペプチド（「免疫強化ペプチド」、すなわちＩＥＰと称される）に対応する合成ペプチドが作製され、このペプチドは、それがワクチン接種プロトコルで使用される場合、ＤＡ３、ＤＡ−３／ｎｅｏ、ＤＡ３−ＴＭ、Ｋ７骨肉種、ＲＥＮＣＡ、およびＬｅｗｉｓ肺癌腫細胞に対する防御効果を有することが見出された。本発明者らは、細胞傷害性に対するこのペプチドの潜在的な効果を調査した。本発明者らは、このペプチドを、なお別の腫瘍モデル（すなわち、Ｄ１−ＤＭＢＡ−３乳腺腫瘍保有マウス）で試験した。このＤＡ−３細胞株は、もともとこの腫瘍から得られ、本発明者らの実験室で同系のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてインビボで、慣用的に経代される。図１７において、正常なマウスまたはＤ１−ＤＭＢＡ−３腫瘍保有マウスのいずれかから得た脾細胞へのインビトロでのＭＵＣ１／ｓｅｃの独特なペプチドの５日間の添加によって、ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍標的に対する有意なレベルの細胞傷害性が生じたことが見られ得る。重要なことには、上記のプロトコルに類似するワクチン接種プロトコルは、Ｄ１−ＤＭＢＡ−３腫瘍の増殖に対する有意な防御を与えた。このＮＫ細胞アッセイにおいて、このペプチドが免疫細胞を刺激する能力を、試験した。このアッセイは、ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍がヌードマウス中での増殖の初期段階の間に抑制されるという観察に基づいて選択され、この観察は、生得的な免疫成分が、ＤＡ−３／ｓｅｃに対する即座の反応に関与し得ることを示唆した。従って、免疫強化ペプチド（ＩＥＰ）の免疫調節活性を試験するために、ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を、１０μｇのＩＥＰを用いて、３０〜４５分間前処理し、その後クロム標識ＹＡＣ−１標的またはクロム標識ＥＬ−４標的を、以前に記載される（１１）ように４時間のアッセイに添加した。図１８に見られるように、ペプチド添加によって、古典的なマウスＮＫ標的細胞（ＹＡＣ−１）に対する正常な脾細胞からの、細胞傷害性レベルの上昇を生じた。さらに、ＥＬ−４標的細胞（これは、正常な脾臓細胞によるＮＫ型の細胞傷害性に対して感受性ではない）は、免疫強化ペプチドに前もって曝露された場合、これらのエフェクターによって容易に溶解可能であった。他の実験において、本発明者らは、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７  ＢＬ／６（Ｂ６）マウス由来の脾臓エフェクター細胞を活性化して、ＭＵＣ１／ｓｅｃ独特ペプチドへの前もっての曝露によって、ＤＡ−３／ｓｅｃ標的細胞を殺傷し得た（図１９）。
【００５０】
（実施例１４）
観察された細胞傷害性が、この独特の１１アミノ酸ペプチドの腫瘍細胞に対する直接の毒性効果に起因することを議論し得る。この可能性を試験するために、本発明者らは、高レベルのＩＥＰを、いくつかの腫瘍標的にインビトロで加え、４日後の培養物中での細胞生存性を決定した。表３に見られるように、細胞がインビボで曝されるペプチドレベル、すなわちエフェクター細胞媒介性細胞傷害性アッセイにおけるペプチドレベルよりもずっと高いペプチドレベルでのそのような処置によって、腫瘍細胞に対する増殖の阻害も細胞殺傷活性も引き起こされなかった。
【００５１】
（表３．インビトロでの腫瘍増殖に対するＳｅｃペプチドの効果）
【００５２】
【表３】
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１ウェル当たり５０μｇ
２４日後の培養物中の総細胞
（結論）
本明細書中に開示されるデータによって、ＭＵＣ１遺伝子の新規分泌型アイソフォーム（ＭＵＣ１／ｓｅｃ）のトランスフェクションが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、侵襲性の免疫原性を確立された腫瘍細胞株の増殖が防止することが示される。ワクチン接種プロトコルで使用される場合、このＭＵＣ１／ｓｅｃは、非特異的な様式で、同系腫瘍に対する防御を提供し得る。ＭＵＣ１／ｓｅｃ分子に存在する独特の１１アミノ酸ペプチドは、この防御効果に関与し、そしてワクチン接種プロトコルで使用される場合、このペプチドは、種々の腫瘍細胞株に対して効果的に作用し得る。このデータはまた、生来の免疫系および／または適応性免疫系のエフェクター細胞による細胞傷害性が、この観察された結果に関与することを示唆する。このペプチドの効果は、所定の型の腫瘍またはマウス株に限定されないので、このペプチドは、単独での使用および／または種々の広範な腫瘍に対する他の免疫調節分子と組合わせての使用が可能であるはずである。このペプチドを注射された動物において、毒性は検出されなかった。このＩＥＰの広い範囲の作用によって、腫瘍に対してだけでなく、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎のようなウイルス性または細菌性の疾患、ならびに他の微生物感染（例えば、結核）に対してのこの薬剤の使用もまた可能になり得、ここで免疫応答の強化は、曝露された個体において陽性の効果を有し得る、
本発明の好ましい実施形態を記載することにおいて、特定の用語を明瞭さのために使用する。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図しない。各特定の要素が、全ての技術的等価物を含み、類似する目的を達成するために同様の様式で影響を作用することが理解されるべきである。
【００５３】
本明細書中で示されかつ議論された実施形態は、当業者に、本発明を作製しそして使用するための本発明者らに既知である最良の方法を教示することのみのために意図され、本発明の範囲を限定するとみなされるべきではない。本発明の例示された実施形態は、上記教示の観点から当業者に理解されるように、本発明から逸脱することなく、改変または変更され得、そして要素を添加または削除され得る。従って、特許請求の範囲の範囲およびこれらに等価な範囲内で、本発明が、具体的に記載される範囲とは異なるように実施され得ることが理解されるべきである。
【００５４】
本明細書中に引用される全ての特許、公開特許刊行物および他の刊行された参考文献は、参考として本明細書中に援用される。参考文献を、便宜上以下に列挙する。
【００５５】
（参考文献）
【００５６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１  トランスフェクトされていないＤＡ−３乳癌細胞（１０６）移植後のインタクトなＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率、またはネオマイシンベクターのみでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｎｅｏ）、または膜貫通ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ＴＭ）もしくは分泌ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｓｅｃ）。
【図２】図２  トランスフェクトされていないＤＡ−３乳癌細胞もしくはネオマイシンベクターのみでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞（ＤＡ−３／ｎｅｏ）のインビトロにおける成長反応速度、または膜貫通ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ＴＭ）、または分泌ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｓｅｃ）。
【図３】図３  トランスフェクトされていないＤＡ−３乳癌細胞（１０６）を移植されたＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ＋／ｎｕ＋）マウスにおける腫瘍の成長、またはネオマイシンベクターのみでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｎｅｏ）、または膜貫通ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ＴＭ）もしくは分泌ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｓｅｃ）。
【図４】図４  トランスフェクトされていないＤＡ−３乳癌細胞（１０６）もしくはネオマイシンベクターのみでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞（ＤＡ−３／ｎｅｏ）接種後のヌードＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍の成長、または膜貫通ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ＴＭ）もしくは分泌ＭＵＣ１アイソフォームの３つの別個のトランスフェクタントでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いた場合（ＤＡ−３／ｓｅｃ）。
【図５】図５  膜貫通ＭＵＣ１アイソフォームでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞（ＤＡ−３／ＴＭ）およびＤＡ−３  ｓｅｃ細胞の混合物のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける成長に対する、分泌ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ｓｅｃ）細胞でトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いるワクチン接種の効果。
【図６】図６  ネオマイシンベクターのみでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞（ＤＡ−３／ｎｅｏ）およびＤＡ−３  ｓｅｃ細胞の混合物のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける成長に対する、分泌ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞）でトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いるワクチン接種の効果。
【図７】図７  ＲＥＮＣＡ腎細胞癌およびＤＡ−３／ｓｅｃ細胞の混合物のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける成長に対する、分泌ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞）でトランスフェクトしたＤＡ−３乳癌細胞を用いるワクチン接種の効果。
【図８】図８  Ｋ７骨肉腫細胞およびＤＡ−３／ｓｅｃ乳癌細胞の混合物のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける成長に対する、分泌ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞）でトランスフェクトしたＤＡ−３乳癌細胞を用いるワクチン接種の効果。
【図９】図９  ヒト膜貫通ＭＵＣ１アイソフォーム（ＭＵＣ１／ＴＭ）およびヒト分泌ＭＵＣ１（ＭＵＣ１／ｓｅｃ）アイソフォームのｃＤＮＡ配列の図示。
【図１０】図１０  ペプチドワクチン接種。ネオマイシンベクター単独（ＤＡ−３／ｎｅｏ）か、または膜貫通ＭＵＣ１アイソフォーム（ＤＡ−３／ＴＭ）のいずれかでトランスフェクトしたＤＡ−３細胞を用いる、ＫＬＨ結合固有ペプチドの混合物の成長に対する、分泌ヒトＭＵＣ１アイソフォームのＫＬＨに結合した固有の１１個のアミノ酸ペプチドを用いるワクチン接種の効果。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂ  ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＥＮＣＡ腫瘍細胞（１１Ａ）か、またはＣ５７／ＢＬ６マウスのＬｅｗｉｓ肺癌（１１Ｂ）のいずれかを用いる、ＫＬＨ結合固有ペプチドの混合物の成長に対する、分泌ヒトＭＵＣ１アイソフォーム由来のＫＬＨ結合固有アミノ酸ペプチドの効果。これらの図面は、ＭＵＣ１／ｓｅｃペプチドワクチン接種の有効性が、系によって制限されないことを示す。
【図１２】図１２  腫瘍成長に対する、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞と共により少ない数のチャレンジ細胞（ＤＡ−３／ＴＭ）を含む混合物の投与の効果。この図は、より少ない数のチャレンジ細胞がワクチン接種無しに、効果的な防御を可能にすることを示す。
【図１３】図１３  ＤＡ−３腫瘍細胞標的に対する、ＤＡ−３／ｓｅｃを注射したマウス由来の脾（ｓｐｅｎｉｃ）細胞の細胞傷害性活性。
【図１４】図１４  ＤＡ−３／ｓｅｃ脾細胞の細胞傷害性に対する、パーフォリンインヒビターのコンカナマイシンＡの効果。図面は、パーフォリンが、活性化された脾細胞によるＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞の溶解を媒介することを示す。
【図１５】図１５  ＤＡ−３／ｓｅｃ標的およびポジティブコントロールに対するＤＡ―３／ｓｅｃで活性化された脾細胞の細胞傷害性に対する抗Ｆａｓ抗体の効果。図面は、Ｆａｓ／ＦａｓＬが、ＤＡ−３／ｓｅｃ細胞傷害性において役割を果たさないことを示す。
【図１６】図１６  ＹＡＣ−１標的に対する古典的ＮＫ活性に対する、インビボでのＤＡ−３／ｓｅｃ曝露の効果。図面は、インビボでのＤＡ−３／ｓｅｃ曝露で、より高い古典的ＮＫ活性対ＹＡＣ−１標的を生じることを示す。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂ  インビトロ（１７Ａ）、およびインビボ（１７Ｂ）におけるＤ１−ＤＭＢＡ−３腫瘍保有者（ｂｅａｒｅｒ）の免疫応答に対するＭＵＣ１／ｓｅｃペプチドの効果。図面は、ＭＵＣ１／ｓｅｃペプチドが、Ｄ１−ＤＭＢＡ−３腫瘍保有者の免疫応答を刺激することを示す。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂ  ＹＡＣ−１（１８Ａ）およびＥＬ―４（１８Ｂ）標的細胞の溶解に対するＭＵＣ１／ｓｅｃペプチド有りおよび無しでの、正常ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞の効果。図面は、ＭＵＣ１／ｓｅｃペプチドが、正常ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を活性化して、複数の標的を殺傷することを示す。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂ  ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞の溶解に対する、ＭＵＣ１／ｓｅｃペプチド有りおよび無しでの、異なるマウス系由来の正常脾細胞の効果。図面は、正常脾細胞が、ＭＵＣ１／ｓｅｃペプチド存在下で、ＤＡ−３／ｓｅｃ腫瘍細胞を殺傷することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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