(57)【要約】【課題】  安全で安価で、しかも作物発芽抑制効果に優れ、簡単に製造でき、安定して供給できる作物発芽抑制剤を提供する。【解決手段】  ニンニク由来のアホエンを有効成分とする植物の発芽抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アホエン（Z-ajoene）を有効成分とする植物の発芽抑制剤
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
ニンニクは青森県の主農産物であり、年間を通して全国に出荷されている。ニンニクには休眠性があるが、その休眠期間は収穫終了の7月下旬から9月までと非常に短い。このためニンニクを栽培する農家は、通年で安定に出荷する目的で，萌芽（発芽）抑制剤（CMH剤）を用いてきた。CMH剤は数十年前から用いられている化学合成物で、マレイン酸ヒドラジッドとコリン酸の塩が活性の主体となる農薬で、穀類・野菜・果物などの発芽抑制剤として広く用いられ、「エルノー」として知られてきた。
【０００２】
【非特許文献１】Nishio H., Nishio A., Takayasu J., Iwashima A.,Itakura Y., Kodera Y., Matsuura H., and Fuwa T. : Antitumor-promoting activity of allixin, a stress compound produced by garlic, Cancer J ., 3, 20-21, 1990.
【非特許文献２】高橋英明：ニンニクの救形成と休眠に関する研究, 山形大学紀要（農学）8, (2)別冊, 507-599, 1979.
【非特許文献３】Ibrahim I. El-Oksh, Adel S. Abdel-Kader, Yussuf A.Wally, and Ahmed F. El-Kholly3 : J.Am.Soc.Hort.Sci. 96, (5), 637-640, 1971.
【非特許文献４】W. W. Lee, Agr. Coll. Kyungpook Nat. Uni., 1, 4-8, 1971.
【非特許文献５】L. K. Mann and D. A. Lewis : Rest and Dormancy in garlic, J. Ag. Sci, 26, (3), 161-189, 1956.
【非特許文献６】小口伴二, 大谷英夫,  牛流清志：ニンニクの休眠および貯蔵に関する研究, 長野県農業試験報告, 38, 239-247, 1974.
【非特許文献７】Cavllito C. J. and Bailey J. H. : Allicin, the antibacterial principle of Allium sativum. I. Isolation, physical properties and antibacterial action, J. Am. Chem. Soc., 66, 1950-1951, 1944.
【非特許文献８】植物ホルモンハンドブック（上）, 高橋信孝・増田芳雄  共編,  培風館, p.1 , p.13〜p.14, 1994.
【非特許文献９】今井崇仁：「コムギの“ふ”と“胚”に含まれる発芽抑制物質の探索と発芽抑制機構に関する研究 」, 東京理科大学, 卒業論文, p.4, 2001.
【０００３】
しかし一昨年、発癌性を有することが明らかとなり、使用禁止となった。発癌性は，マレイン酸ヒドラジッドが分解してヒドラジンが生成するためで、ヒドラジンの分離・精製が困難なためにこのような問題が起こった。
【０００４】
青森県にとってニンニクは主要な農産物であり、生産農家にとっては年間を通じて出荷する事が困難となったために，大きな社会問題となった。また東京都ではスギ花粉症の対策として従来からスギにCMH剤が使用されており、東京都でも大きな問題となっている。
【０００５】
現在，青森県において，ニンニクの貯蔵・保は温度制御で対処している。しかしー２℃で温度管理をしており、氷結のギリギリの温度のために，一般農家にとって困難さが付きまとっている。そこで、従来の合成品ではない「食に安全」でしかも操作が簡便で確実な新たな発芽抑制剤が求められた。
【０００６】
これまで、ニンニクの休眠に関する植物生理学分野の研究は、いくつか報告されている１）、２）３）、４）、５）、６)。これらの文献では，ニンニクに休眠期間があることが報告されている。このことから、休眠あるいは発芽抑制物質が存在していると考え、新たな発芽抑制物質をニンニク自身から探索し、人に安全な発芽抑制剤の開発を目的に研究を行った。
【０００７】
ニンニクの有機溶媒抽出物の分離・分画とその活性試験の繰り返しを行った。しかしニンニクの個体は大きく、活性試験に必要な画分の量も大量となる。そこで活性試験にはシロイヌナズナの種子を用いた。
【０００８】
シロイヌナズナの発芽に及ぼすニンニク抽出物の影響を検討した。抽出は、図１のフローにしたがっておこない、ニンニク鱗片の酢酸エチル抽出物（Fr-1：ニンニク鱗片、Fr-2：ニンニク鱗片以外（皮・盤珪・茎））と水抽出物（Fr-3：ニンニク鱗片、Fr-4：ニンニク鱗片以外（皮・盤珪・茎））を得た。各画分のシロイヌナズナに対する発芽抑制試験を行なった。
【０００９】
各画分をDMSO(dimethyl sulfoxide)に溶かし、各々を滅菌フィルターで滅菌処理した。それらを寒天培地 (MS寒天培地)に加え、希釈した。各抽出物の濃度を、Fr-1：347ppm、Fr-2：202ppm、Fr-1：540ppm、Fr-1：56.5ppmにした。また、コントロールの寒天培地にはDMSOだけを加えた。各寒天培地をシャーレに移し固めたのち、シロイヌナズナの種子を各30個植え、インキュベーターで1週間発育させた。以後同様の操作を繰り返した。その結果を表１に示した。表１には、種子30個当り出芽した個数を示した。発芽率は各画分の平均発芽数とコントロールの平均発芽数から計算した。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
鱗片の酢酸エチル抽出物（Fr-1）にシロイヌナズナの発芽抑制効果が見られたことから、酢酸エチル抽出物を分画し、発芽抑制物質を探索することとした。
【００１２】
図２のフローにしたがい、酢酸エチル抽出物の分画をおこなった。ニンニクの鱗片をミキサーにかけて粉砕し、酢酸エチル抽出を行い、エバポレーターで溶媒を留去し、真空ポンプで乾燥し、酢酸エチル抽出物を得た。酢酸エチル抽出物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル30g、カラム30cm×2.3cmφ）で分画した。展開溶媒を（１）n-ヘキサン、（２）n-へキサン：酢酸エチル＝5：1、（３）n-ヘキサン：酢酸エチル＝1：1、（４）n-ヘキサン：酢酸エチル＝1：5、（５）酢酸エチル、（６）メタノールで順次展開して、Fr-I〜Fr-VIIを得た。
【００１３】
分画したFr-I〜Fr-VIIについて、シロイヌナズナの発芽抑制活性試験をおこなった。各画分をDMSO(dimethyl sulfoxide)で溶かし寒天培地に加え、各濃度を333 ppmにした。各シャーレにシロイヌナズナの種子を30個ずつ植え、インキュベーターで1週間発育させた。その結果を 表２に掲げた。
【００１４】
【表２】
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【００１５】
活性試験の結果、Fr-IVとFr-Vは発芽したシロイヌナズナの数は０であった。従って、Fr-IVとFr-Vにシロイヌナズナの発芽を抑制する物質の存在が示唆された。TLCの分析で、Fr-Vはほぼ１スポットであったのでFr-Vの分離・分画を行い、シロイヌナズナに対する発芽抑制物質の単離を検討することとした。
【００１６】
Fr-Vを多量に得るために、鱗片の量を20倍に増やし、図３のフローにしたがい、酢酸エチル抽出物の分画をおこなった。酢酸エチル抽出物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、カラム50cm×3.7cmφ）で分画した。展開溶媒を（１）n-ヘキサン：酢酸エチル＝3：1、（２）n-へキサン：酢酸エチル＝1：1、（３）n-ヘキサン：酢酸エチル＝1：3、（４）メタノールで順次展開して、Fr-Vを得た。さらに、フラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル,カラム24cm×1.8cmφ)で分画した。展開溶媒を（１）ジクロルメタン：エチルエーテル＝5：1、（２）ジクロルメタン：エチルエーテル＝1：1、（３）ジクロルメタン：エチルエーテル＝1：5、（４）メタノールで順時展開、Fr-V-1〜Fr-V-4を得た。
【００１７】
画分Fr-V-1〜Fr-V-4のシロイヌナズナの発芽試験を行なった。各画分をDMSOに溶かして、寒天培地に加え各濃度を333 ppmにした。活性試験は、サンプルの量が少なかった(最低10.8 mg)ために、１つのシャーレのシロイヌナズナの種子数を8個とした。その結果を表３に示す。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
Fr-V-1の薄層クロマトグラフィー(TLC)分析でははほぼ１スポットだったので、構造決定のため、核磁器共鳴スペクトル及びマススペクトルを測定した。マススペクトルの値からこの画分の分子量は234であった。Fr-V-1の核磁器共鳴スペクトルのデータはZ-Ajoeneの値と良く一致していた７）。このことからニンニクに含まれるシロイヌナズナの発芽抑制物質の化学構造はZ-Ajoeneと決定した。
【００２０】
Fr-V-1の画分は、Z-Ajoeneが圧倒的な主成分であった。しかし質量分析からごく微量の成分が含まれていることがわかった。そこで、ニンニクの鱗片の量を更に増やし、図４のフローにしたがい、再度抽出・精製を行った。TLCでAjoeneを含む画分を2回分離分画した。Ajoeneを含む画分のTLC分析したところ、単離に成功していたので、シロイヌナズナの発芽抑制試験を行なった。
【００２１】
活性試験では、サンプルの量(1 mg)に合わせてシロイヌナズナの種子を8個とした。AjoeneをDMSO(100μl)溶かし、さらにDMSOを100μlまで加えて希釈し、50 ppm、 25 ppm、12.5 ppm、 6.25 ppm、3.12 ppm の５つの濃度に設定した。また活性物質の効果を計るために、発育期間を1ヶ月に延ばした。その結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
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【００２３】
表４から単離した物質は25ppmの濃度までシロイヌナズナ種子の発芽を抑制した。発芽抑制の活性を持つことで知られるAbscisic acidはシロイヌナズナ種子８）に対して1〜2μM、またタバコの種子９）に対して1-10μMの濃度で活性を示す。またコムギから得られたコムギ穂発芽抑制物質であるTALは，コムギ種子に対して125 ppm濃度まで活性を示した。これらと比較すると、今回ニンニクから見出したシロイヌナズナ種子の発芽抑制物質は25ppmで活性を示しており、充分に高活性物質と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ニンニクからの抽出を示す図である。
【図２】ニンニク鱗片の酢酸エチル抽出物の分画を示す図である。
【図３】Fr-Ｖの分離・精製を示す図である。
【図４】アホエンの分離精製を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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