(57)【要約】【課題】  一次および再発性のアテローム性動脈硬化症を予防するのに有効な臨床薬を提供すること。【解決手段】アテローム性プラークの一次発達および再発達を治療する方法を提供する。本発明の方法には、薬学上許容される担体と混合した治療有効量のＳＥＲＰ−１を動脈壁の内膜または管腔膜へ投与することを含む。ＳＥＲＰ−１の生物活性類縁体もまた、提供する。【選択図】図３
2005306883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される担体と混合して、配列番号１よって表されるアミノ酸配列であるＳＥＲＰ−１、該ＳＥＲＰ−１に由来し、配列番号１における少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失または付加され、かつ該ＳＥＲＰ−１活性を有するＳＥＲＰ−１の類縁体または生物学的に活性なそのフラグメントの治療的有効量を含有する、ヒトにおけるプラークの一次発達または再発達を治療するための医薬組成物であって、アテローム性部位に直接０．５μｇ〜２００ｍｇ／用量で投与される医薬組成物。
【請求項２】
配列番号１によって表されるアミノ酸配列であるＳＥＲＰ−１を含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号１の２４４位がシステイン以外のアミノ酸であるＳＥＲＰ−１の類縁体を含む請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
該ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１の類縁体または生物学的に活性なそのフラグメントにおいて、配列番号１の２４４位がアラニン残基である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
該ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１の類縁体または生物学的に活性なそのフラグメントにおいて、配列番号１の３１９位がアルギニン以外のアミノ酸である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
該ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１の類縁体または生物学的に活性なそのフラグメントにおいて、配列番号１の３２０位がアスパラギン以外のアミノ酸である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
該ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１の類縁体または生物学的に活性なそのフラグメントにおいて、配列番号１の３１９位がアルギニン以外のアミノ酸であり、および、３２０位がアスパラギン以外のアミノ酸である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
動脈内皮へ送達して、プラークの一次発達または再発達を治療するためのものである、請求項１-７いずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
末梢静脈内または動脈内へ注入することによって投与するためのものである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
バルーン型カテーテルを用いて投与するためのものである、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
動脈再疎通部位へ投与して動脈再疎通施術の後に生じる再狭窄を治療するためのものである、請求項１-７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
動脈再疎通施術がバルーン血管形成術である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
動脈再疎通施術がレーザー血管形成術である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
動脈再疎通施術がステント埋め込みである請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動脈再疎通施術が動脈切除である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１６】
動脈再疎通施術が静脈または動脈移植である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１７】
動脈再疎通施術が冠動脈バイパス手術である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１８】
尿管および／または尿道の管口層へ直接投与して、尿管および／または尿道狭窄を治療するためのものである、請求項１-７いずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
動脈内膜の損傷後の炎症を治療するためのものである、請求項１-７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
セリンプロテアーゼの活性を抑制することによって、動脈脈管内膜損傷後の炎症を治療するためのものである、請求項１９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈再疎通介在方法後の血管動脈内膜過形成および再狭窄の予防におけるウイルスタンパク質、ＳＥＲＰ−１、その類縁体ならびに生物学的に活性なフラグメントの使用に関する。本発明は一次アテローム性プラーク（plaque）形成の予防におけるＳＥＲＰ−１の使用も意図する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症プラーク生長と関連した細胞増殖および結合組織沈着は動脈閉塞、心臓発作、搏動、および末梢閉塞を引き起こす。アテローム性動脈硬化症病変の再発（再狭窄）は、閉塞した動脈を開放するための公知の介在方法（レーザーおよびバルーン血管形成術、アテレクトミー(atherectomy)およびステント内移植）の後に起り、重要な医学的問題となっている。再狭窄は、用いた介在装置に関係なく、６カ月以内に２０〜５０％の場合で発見され、術後１０年以内に静脈移植の５０％が閉塞する。デトレ（Detre）等、１９８９、アム・ジェイ・カルジオール（Am J Cardiol）８０：４２１〜４２８；トポル（Topol）等、１９９３、エヌ・イー・ジェイ・エム（NEJM）３２９：２２１〜２２７；シャッツ（Schatz）等、１９９１ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１７：１５５Ｂ〜１５９Ｂ（抜粋）；エリス（Ellis）等、１９９２ディー・ダブリュー・エム（DWM）ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１９：２７５〜２７７。たいてい術後２週間〜６カ月で起こる再狭窄は、術後すぐに起こる血管の突然の再閉塞（血管痙攣）と区別される。
【０００３】
再発性のアテローム性動脈硬化症に関する正確な起因はまだ知られていないが、介在処置中に起こる局所的な動脈ダメージがその領域での炎症を引き起こすことが証明されている。内皮損傷およびその後の再狭窄の部位においては、炎症応答が過度に発現するようになり、その結果動脈内膜細胞の増殖や過度の繁殖組織の生長が起こる。ドザウ（Dzau）等、１９９３サーキュレーション（Circulation）８７：７０５〜７１９；ロス・アール（Ross, R）、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９；フュスター（Fuster）等、１９９２エヌ・イー・ジェイ・エム（NEJM）３２６：２４２〜２５０、３１０〜３１８；マークス・ジェイ（Marx J.）、１９９０サイエンス２４８：１４９１〜１４９３；ブランケンホルン（Blanckenhorn）等、１９８９サーキュレーション（Circulation）７９：１〜７；シュバルツ（Schwartz）等、１９９２ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）２０：１２８４〜１２９３；リビー（Libby）等、１９９２ジェイ・セル・バイオケム（J Cell Biochem）１６Ａ：２（抜粋）；ウェストリン（Westlin）等、１９９１アム・ジェイ・パソール（Am J Pathol）１４２：１１７〜１２５；ファルキー（Faruqi）等、１９９３、ブル・ハート・ジェイ（Br Heart J）６９：Ｓ１９〜Ｓ２９；ハンソン・ジー・ケイ（Hansson GK）、１９９３ブル・ハート・ジェイ６９：Ｓ３８〜Ｓ４１；エリス（Ellis）等、ディー・ダブリュー・エム（DWM）ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)１９：２７５〜２７７；シュバルツ（Schwartz）等、１９９２ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１９：２６７〜２７４。局所的な動脈内膜の損傷と関連する炎症反応は、多くの場合、新規の（一次）プラーク発達の開始と応答できることも信じられている。
【０００４】
アテローム発達を開始させると信じられている平滑筋細胞または単球増殖への刺激（シュハット(Schatz)等、１９９１ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)１７:１５５Ｂ〜１５９Ｂ(抜粋)；ロス・アール(Ross R.)等、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９）は様々に、損傷(trauma)（ヘリン(Helin)等、１９７１アテロスクレロシス(Atherosclerosis)１３：３１９〜３３１；ワタナベ・ワイ(Watanabe Y.)等、１９８０アテロスクレロシス（Aterosclerosis)１３：３１９〜３３１）、高脂肪血（ワタナベ・ワイ(Watanabe Y.)１９８０；ゴールドステイン(Goldstein)等、１９７９ネイチャー２７９：６７９〜６８５）、自己免疫反応（例えば、以下の文献を見よ。ロペス−ヴィレラ(Lopes-Virella)等、１９８５ジー・クリン・イムノール・パス(G. Clin. Immunol. Path.)３７：３７７〜３８６；ニトキン（Nitkin)等、１９８５ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)６：２４３〜２４５）およびウイルスまたは細胞自身による（autocrine）良性平滑筋腫瘍の誘導（ミニック(Minick)等、１９７３ジー・イー・アム・ジェイ・パソール(GE Am. J. Pathol)７３：２６５〜３２５；ベンジット(Benditt)等、１９７３ピー・エヌ・エイ・エス(PNAS)７０：１７５３〜１７５６；シモンス(Simons)等、１９９２ネイチャー３５９：６７〜７０）に原因があると考えられている。閉塞した動脈を再開放するのに現在用いられているいずれの介在装置（レーザー、バルーン、アテレクトミー、またはステント）による二次的内皮ダメージによっても、一般に局所的な炎症反応が開始される。この内皮ダメージおよびそれと関連した炎症応答は、細胞増殖および再狭窄への刺激の基本的な原因であると考えられる。局所的な動脈内膜ダメージが起こった後、循環細胞（circulating cells）、例えば、血小板、単球、およびＴ細胞は損傷領域に付着し、活性化する（プルザンスキ(Pruzanski)等、１９９１イムノール・トゥデイ(Immunol Today)１２：１４３〜１４６；ポストン(Poston)等、１９９２アム・ジェイ・パソール(Am. J. Pathol)１４０：６６５〜６７３）。このように、狭窄した動脈を機械的に開放する作業は、炎症および免疫系を伴う一連の事象を産生し、それらはしばしば損傷部位におけるプラークの再生長、すなわち再狭窄を引き起こす。同様の方法は他の炎症に基づく疾病、例えば、尿管または尿道狭窄および膀胱の炎症疾患において細胞増殖を引き起こすと信じられている。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症プラークを産生し、閉塞した動脈へ進行させ得る初期の動脈損傷を伴う他のパラメーター（ウイルス性、自己免疫性、または高脂肪血性のメカニズム）は、介在治療部位でのプラーク再発の基本的な傾向と関係するかもしれない。損傷への局所的な応答を伴う様々な細胞および分子の経路の多くは、再狭窄へと誘導する追発性創傷（exacerbated wound）／修理応答（repair response）の開始時に役割を果たすと信じられている。
【０００６】
プラーク生長はいかにして偶発的な破損、出血および／または裂によって促進するのかということは完全には理解されていない；介在治療後のプラーク再発を伴う正確なメカニズムもうまく説明されていない。しかしながら、小板の活性化が炎症タンパク質および生長因子の開放を引き起こすことが知られている（ロス・アール(Ross R.)、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９；フュースター（Fuster）等、１９９２エヌ・イー・ジェイ・エム(NEJM)３２６：８０１〜８０９；アンブロース(Ambrose)等、１９８８ジェイ・エイ・シー・シー(JACC）１２：５６〜６２；アンブロース（Ambrose)等、１９８６ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)７：４７２〜４７８）。これらの炎症タンパク質は順次作用して、損傷部位における動脈の動脈内膜層へ移動する単球細胞、Ｔ細胞、および平滑筋細胞を引き付ける。閉塞したヒトの頸動脈由来のプラーク験体において血小板由来生長因子（platelet derived growth factor）（ＰＤＧＦ）が存在することも説明されている（レビー(Lebby)等、１９８８エヌ・イー・ジェイ・エム(NEJM)３１８：１４９３〜１４９７）。最近の報告では、動脈損傷後ＰＤＧＦ処置したヌード・マウスはプラーク発達を促進した。これは、ＰＤＧＦレセプターを発現する目的細胞の刺激は再狭窄と関連する過形成の構成要素の１つであることを提言する。ｃＭｙｂおよびＰＤＧＦの阻害が動脈損傷部位での細胞増殖を低減させることが報告されている（シモンス(Simons)等、１９９２ネイチャー３５９：６７〜７０）。さらに、ＴＧＦベータのような他の生長因子は内皮損傷と関連する細胞増殖と関連している（ロス・アール(Ross R.)等、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９）。多数のサイトカイン（炎症および免疫系において細胞メッセージを伴う信号分子(signaling molecules)）はプラーク発達にかかわっている；例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびガンマ・インターフェロン（ｇＩＦ）、インターロイキン１および６、および様々な細胞付着分子を含む（ロス(Ross)等、１９９３；フュースター(Fuster)等、１９９２、リビー(Libby)等、セル・バイオケム(Cell Biochem)１６Ａ：２（抜粋））。
【０００７】
免疫抑制で役割を果たす抗−免疫特性を有するタンパク質は、いくつかの大きなＤＮＡウイルス（the large DNA viruses）によって産生される。（例えば、以下の文献を見よ。グッディング・エル・アール(Gooding L.R.)、１９９２セル(Cell)７１：５〜７、マクファデン・ジー(MacFadden,G.)、ヒューマン・サイトカインズ(Human Cytokines)：ゼアー・ロール・イン・ヘルス・アンド・ディスィース、エズ(Their Role in Health and Disease, eds.)、ビー・ビー・アガーウォール・アンド・アール・ケイ・プリ・ブラックウェル・プレス(BB Agarwall and RK Puri Blackwell Press)［１９９３、イン・プレス(in press)］）。例えば、レポリポクスウイルス（Leporipoxvirus）のメンバーは抗−免疫特性を有する少なくとも４つのかかるタンパク質をコード化する：（１）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびガンマ・インターフェロンについての細胞レセプターと相同な分泌タンパク質、（２）未知の機能を有するタンパク質、Ｍ１１Ｌのようなレセプター、および（３）セリン・プロテアーゼ・インヒビター、宿主の感染に対する炎症応答を妨げる能力が証明されているＳＥＲＰ−１。（例えば、以下の文献を見よ。グッディング・エル・アール(Gooding L.R.)、１９９２セル(Cell)７１：５〜７、マクファデン・ジー(MacFadden,G.)、エンク・オブ・ヴィロロジー(Enc. of Virology)、アール・ジー・ウェブスター(RG Webster)およびエイ・グランホフ(A. Granhoff)、ダブリュー・ビー・サウンダーズ(WB Saunders Co.)、［１９９３、イン・プレス(in press)］；グラヘム(Grahem)等、１９９２ビロール(Virol.)１９１：１１２〜１２４。）これら考えの成功は、１つの上記メンバー、ミクソーマ（Myxoma）ウイルスは、ウサギにおいてほとんどを常に死に至らせる広範な悪性の感染を引き起こすという事実によって証明される。
【０００８】
悪性のウサギ・フィブローマ（fibroma）・ウイルス（ＭＲＶ）およびミクソーマ・ウイルス（ＭＹＸ）は５５kDaセリン・プロテアーゼ・インヒビター（ＳＥＲＰ−１）を産生し、これは有毒なＭＹＸおよびＭＲＶ感染をもたらす。このＳＥＲＰ−１タンパク質は、セルピン族（serpin family）のセリン・プロティナーゼ・インヒビターとの有意なアミノ酸相似性を示す。セリン・プロティナーゼ・インヒビターの阻害特性は主に反応部位のＰ１−Ｐ１'位に存在する残基によって定義される。ロマス(Lomas)等、１９９３ジェイ・バイオロ・ケム(J. Biol. Chem.)、２６８（１）：５１６〜５２１を見よ。Ｐ１−Ｐ１'位で存在するアミノ酸は同種のプロティナーゼについての仮性基質（psuedosubstrate）として作用する。同種のプロティナーゼはセルピンと１：１比で結合し、複合体形成により不活性化する。Ｉｄ
【０００９】
ミクソーマ・ウイルスＳＥＲＰ−１は結合してヒトのプロティナーゼ・プラズミン、ウロキナーゼ（urokinase）、組織プラズミノーゲン・アクチベーター、およびＣ１ｓのタンパク質加水分解活性を阻害することが最近示された（ロマス(Lomas)等１９９３）。ＳＥＲＰ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はともに既知である。アップトン（Upton）等、１９９０ヴィロロジー(Virology)１７９：６１８〜６３１を見よ。翻訳ＳＥＲＰ−１ＯＲＦはＭＲＶおよびＭＹＸ両方において同一である。Ｉｄ
【００１０】
経皮的冠動脈内腔拡張術（ＰＣＴＡ）後の再狭窄の分野での１０年を越える臨床的経験および研究にもかかわらず、薬理学的介在における躍進はあまりなかった。ヘールマン(Herrman)等、１９９３ドラッグズ(Drugs)４６（２）：２４９〜２６２。例えば、アスピリン、ジピリダモールおよびチクロピジン等の抗小板薬の使用は、再狭窄頻度の低下をもたらさなかった。アンダーソン(Anderson)、キタズメ(Kitazume)等、１９８８サーキュレーション(Circulation)７８（ＩＩ）：６３３。ヘパリンおよびコウマジン（coumadin）等の抗凝固薬は、再狭窄を低減させるには効果がないことも示された。食餌添加剤としての魚油（高ω脂肪酸）での臨床試験では、有望ではあるがたいした結果は得られていない。トロンボキサン、プロスタサイクリンおよびセロトニン等のプロスタノイド生成物（prostanoid products）の使用は有効ではなかった。抗凝集薬（antiaggregatory）、抗血管痙攣性プロスタサイクリン−タイプの化合物またはトロンボキサンのインヒビターを使用しても再狭窄頻度は低下しなかった。同様に、アンギオテンシン−転換酵素インヒビターの２つの大きな臨床試験でも、再狭窄を低減させるいかなる利益も証明することはできなかった。カルシウム−チャンネル拮抗剤、β−アドレナリン・レセプター拮抗剤、脂質−降下剤、および抗有糸分裂剤コルチシンも有効でないことが証明された。
【非特許文献１】デトレ（Detre）等、１９８９、アム・ジェイ・カルジオール（Am J Cardiol）８０：４２１〜４２８
【非特許文献２】トポル（Topol）等、１９９３、エヌ・イー・ジェイ・エム（NEJM）３２９：２２１〜２２７
【非特許文献３】シャッツ（Schatz）等、１９９１ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１７：１５５Ｂ〜１５９Ｂ（抜粋）
【非特許文献４】エリス（Ellis）等、１９９２ディー・ダブリュー・エム（DWM）ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１９：２７５〜２７７
【非特許文献５】ドザウ（Dzau）等、１９９３サーキュレーション（Circulation）８７：７０５〜７１９
【非特許文献６】ロス・アール（Ross, R）、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９
【非特許文献７】フュスター（Fuster）等、１９９２エヌ・イー・ジェイ・エム（NEJM）３２６：２４２〜２５０、３１０〜３１８
【非特許文献８】マークス・ジェイ（Marx J.）、１９９０サイエンス２４８：１４９１〜１４９３
【非特許文献９】ブランケンホルン（Blanckenhorn）等、１９８９サーキュレーション（Circulation）７９：１〜７
【非特許文献１０】シュバルツ（Schwartz）等、１９９２ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）２０：１２８４〜１２９３
【非特許文献１１】リビー（Libby）等、１９９２ジェイ・セル・バイオケム（J Cell Biochem）１６Ａ：２（抜粋）
【非特許文献１２】ウェストリン（Westlin）等、１９９１アム・ジェイ・パソール（Am J Pathol）１４２：１１７〜１２５
【非特許文献１３】ファルキー（Faruqi）等、１９９３、ブル・ハート・ジェイ（Br Heart J）６９：Ｓ１９〜Ｓ２９
【非特許文献１４】ハンソン・ジー・ケイ（Hansson GK）、１９９３ブル・ハート・ジェイ６９：Ｓ３８〜Ｓ４１
【非特許文献１５】エリス（Ellis）等、ディー・ダブリュー・エム（DWM）ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)１９：２７５〜２７７
【非特許文献１６】シュバルツ（Schwartz）等、１９９２ジェイ・エイ・シー・シー（JACC）１９：２６７〜２７４
【非特許文献１７】シュハット(Schatz)等、１９９１ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)１７:１５５Ｂ〜１５９Ｂ(抜粋)
【非特許文献１８】ロス・アール(Ross R.)等、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９
【非特許文献１９】ヘリン(Helin)等、１９７１アテロスクレロシス(Atherosclerosis)１３：３１９〜３３１
【非特許文献２０】ワタナベ・ワイ(Watanabe Y.)等、１９８０アテロスクレロシス（Aterosclerosis)１３：３１９〜３３１
【非特許文献２１】ワタナベ・ワイ(Watanabe Y.)１９８０
【非特許文献２２】；ゴールドステイン(Goldstein)等、１９７９ネイチャー２７９：６７９〜６８５
【非特許文献２３】ロペス−ヴィレラ(Lopes-Virella)等、１９８５ジー・クリン・イムノール・パス(G. Clin. Immunol. Path.)３７：３７７〜３８６
【非特許文献２４】ニトキン（Nitkin)等、１９８５ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)６：２４３〜２４５
【非特許文献２５】ミニック(Minick)等、１９７３ジー・イー・アム・ジェイ・パソール(GE Am. J. Pathol)７３：２６５〜３２５
【非特許文献２６】ベンジット(Benditt)等、１９７３ピー・エヌ・エイ・エス(PNAS)７０：１７５３〜１７５６
【非特許文献２７】シモンス(Simons)等、１９９２ネイチャー３５９：６７〜７０
【非特許文献２８】プルザンスキ(Pruzanski)等、１９９１イムノール・トゥデイ(Immunol Today)１２：１４３〜１４６
【非特許文献２９】ポストン(Poston)等、１９９２アム・ジェイ・パソール(Am. J. Pathol)１４０：６６５〜６７３
【非特許文献３０】ロス・アール(Ross R.)、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９
【非特許文献３１】フュースター（Fuster）等、１９９２エヌ・イー・ジェイ・エム(NEJM)３２６：８０１〜８０９
【非特許文献３２】アンブロース(Ambrose)等、１９８８ジェイ・エイ・シー・シー(JACC）１２：５６〜６２
【非特許文献３３】アンブロース（Ambrose)等、１９８６ジェイ・エイ・シー・シー(JACC)７：４７２〜４７８
【非特許文献３４】レビー(Lebby)等、１９８８エヌ・イー・ジェイ・エム(NEJM)３１８：１４９３〜１４９７
【非特許文献３５】シモンス(Simons)等、１９９２ネイチャー３５９：６７〜７０
【非特許文献３６】ロス・アール(Ross R.)等、１９９３ネイチャー３６２：８０１〜８０９
【非特許文献３７】ロス(Ross)等、１９９３
【非特許文献３８】フュースター(Fuster)等、１９９２
【非特許文献３９】リビー(Libby)等、セル・バイオケム(Cell Biochem)１６Ａ：２（抜粋）
【非特許文献４０】グッディング・エル・アール(Gooding L.R.)、１９９２セル(Cell)７１：５〜７
【非特許文献４１】マクファデン・ジー(MacFadden,G.)、ヒューマン・サイトカインズ(Human Cytokines)：ゼアー・ロール・イン・ヘルス・アンド・ディスィース、エズ(Their Role in Health and Disease, eds.)、ビー・ビー・アガーウォール・アンド・アール・ケイ・プリ・ブラックウェル・プレス(BB Agarwall and RK Puri Blackwell Press)［１９９３、イン・プレス(in press)］
【非特許文献４２】グッディング・エル・アール(Gooding L.R.)、１９９２セル(Cell)７１：５〜７
【非特許文献４３】マクファデン・ジー(MacFadden,G.)、エンク・オブ・ヴィロロジー(Enc. of Virology)、アール・ジー・ウェブスター(RG Webster)およびエイ・グランホフ(A. Granhoff)、ダブリュー・ビー・サウンダーズ(WB Saunders Co.)、［１９９３、イン・プレス(in press)］
【非特許文献４４】グラヘム(Grahem)等、１９９２ビロール(Virol.)１９１：１１２〜１２４
【非特許文献４５】ロマス(Lomas)等、１９９３ジェイ・バイオロ・ケム(J. Biol. Chem.)、２６８（１）：５１６〜５２１
【非特許文献４６】ロマス(Lomas)等１９９３
【非特許文献４７】アップトン（Upton）等、１９９０ヴィロロジー(Virology)１７９：６１８〜６３１
【非特許文献４８】ヘールマン(Herrman)等、１９９３ドラッグズ(Drugs)４６（２）：２４９〜２６２
【非特許文献４９】アンダーソン(Anderson)、キタズメ(Kitazume)等、１９８８サーキュレーション(Circulation)７８（ＩＩ）：６３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
動脈再疎通介在法後の再狭窄は依然として臨床上の重要な問題である。上述のように、市販の医薬品は再発性のアテローム性プラークの発達を低下させるのに有効でないことがわかった。このため、一次および再発性のアテローム性動脈硬化症を予防するのに有効な臨床薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明において、ウイルスタンパク質のＳＥＲＰ−１、その類縁体およびこれらの生物活性フラグメントが、再狭窄および一次プラーク発達を含むアテローム性動脈硬化症およびプラーク発達の予防、抑制および／または改善に有効であるという驚くべき事実を見いだした。
【００１３】
本発明は、抑制および改善を含むアテローム性動脈硬化症の治療方法を提供する。本発明においては、ウイルスタンパク質ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体およびこれらの生物活性フラグメントを、先にダメージを受けた部位の動脈壁の内膜及び中間膜へ投与する。本発明では従って、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体およびこれらの生物活性フラグメントは再狭窄の治療、抑制および予防方法において用いられる。
【００１４】
本発明はまた、一次（新規の）プラーク発達の治療、予防および抑制方法も提供する。本発明のこの態様において、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを、動脈壁の、すでにアテローム性プラークが発達してきているかあるいは未発達部位に投与することを含む。
【００１５】
本発明においては、様々な病因に起因する尿管または尿道の狭窄および膀胱の慢性炎症性疾患を、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを尿道および／または尿管の管腔層（lumenal layers)へ投与することによって治療する方法も提供する。
【００１６】
本発明の他の態様において、薬学的に許容される単体と混合されたＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを含有する医薬組成物も提供する。
【００１７】
さらに他の態様において、本発明はパッケージ材およびパッケージ材内に含有された薬剤を含み、薬剤がアテローム性プラーク発達の治療に有用であり、パッケージング材へ該薬剤がアテローム性プラーク発達の治療に使用し得ることを示すラベルが付されている製品にも及ぶ。
【００１８】
本願発明の上述の目的およびその他の目的は、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体および生物学的に活性なそのフラグメントを、所望の治療効果が得られるのに十分な量、投与することによって達成される。
【００１９】
本発明において、悪性ウサギ繊維腫ウイルス（ＭＲＶ）およびミクソーマウイルス（ＭＹＸ）により産生されるセリンプロテアーゼインヒビターであるタンパク質ＳＥＲＰ−１、その類縁体およびこれらの生物活性フラグメントは驚くべきことに、アテローム性プラーク発達に起因する生理的影響を抑制、予防および治療するのに有用であり、従って、新規なプラーク発達および再発したアテローム性プラーク発達（再狭窄）の治療に有用であることを見いだした。
【００２０】
より詳しくは、本発明において、治療有効量のＳＥＲＰ−１、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを動脈再疎通施術の際にあるいはその後すぐに内膜の損傷部位に、通常患者が当該手術の後に罹患する再狭窄を避けるために投与する。本発明のこの態様において、ＳＥＲＰ−１、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントは動脈再疎通施術の際にあるいはその後に投与する。この手術は例えばレーザーおよびバルーン血管形成、動脈切除、血管移植、ステント挿入、冠動脈バイパス手術等があるが、投与はこれら従来の動脈再疎通施術に応じて従来の方法によって行えばよい。ＳＥＲＰ−１、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントは動脈内膜の損傷部位へ、例えばボリンスキー（Wolinsky)カテーテルのごとき穴のあるカテーテルを用いて所望の治療効果を得るのに十分な量を届ければよい。
【００２１】
本発明の他の観点においては、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントの治療有効用量を、再疎通術が施されていないアテローム性病変部位へ直接作用させる。この態様においては、ＳＥＲＰ−１タンパク質を徐々に液体を分泌するバルーン型カテーテル、例えばコルディス（Cordis）を用いて到達させてもよい。ＳＥＲＰ−１タンパク質がアテローム部位へゆっくりと漏れ出る他の投与方法を用いてもよい。本明細書において、「アテローム性部位（atheromatous site)」は、動脈血管内においてアテローム（atheroma)に影響を受けているかまたはアテロームが生成している部位をいう。
【００２２】
本発明の他の態様においては、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントの治療有効用量を、再疎通処置がなされていないか、なされない、未だアテローム性プラーク発達の兆候の認められない動脈壁へ投与する。本発明のこの観点において、ＳＥＲＰ−１、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントの投与は治療、すなわち一次（新規な）プラーク発達の予防もしくは抑制を目的とするものである。本発明のこの態様において用いられる投与経路は末梢静脈内注入、好ましくは手の静脈内投与、であってもよい。また、動脈内注入を用いてもよい。またはＳＥＲＰ−１タンパク質、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントは遅延漏洩型カテーテルを介して動脈壁内皮細胞の領域へ到達させてもよい。
【００２３】
尿道狭窄の治療、例えば再発の予防をするために、ＳＥＲＰ−１タンパク質、その類縁体または生物活性フラグメントは尿管および／または尿道の管腔層へと、尿道開口部へ適したカテーテルを用いて到達させてもよい。例えば、尿管および／または尿道の炎症性狭窄および膀胱の慢性炎症性疾患の両方が、ＳＥＲＰ−１による治療によって改善され得る。
【００２４】
本発明において、ＳＥＲＰ−１タンパク質、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントは、最初に単離し、次いで不純物を除く精製を行う。本発明のＳＥＲＰ−１タンパク質、類縁体または生物活性フラグメントを製造する好ましい方法は、ＳＥＲＰ−１タンパク質、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントのコーディング配列を規定する、即ちこれらを発現し得るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはセグメントを用いる方法である。
【００２５】
ミクソーマウイルスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より識別番号ＶＲ−１１５として得ることができる。ＤＮＡはこのミクソーマウイルスから当業者に良く知られた方法にて抽出することができる。ＳＥＲＰ−１のオープンリーディングフレーム全体またはそのフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のごとき良く知られた方法にて増幅することができる。ＳＥＲＰ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を公開し（アップトン（Upton)ら、1990バイロロジー179:618-631）、この配列は図７にも示した。こうしてＳＥＲＰ−１の全ＯＲＦまたはその一部が得られた。
【００２６】
本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ分子はまた、あちこちで説明されている様々なプラスミドから得られる適当な制限フラグメントうまく連結させて得てもよい。例えばアップトンら1990バイロロジー179:618-631;マッセン(Macen)ら、1993バイロロジー195:348-363を参照のこと。本発明は、上記と等価なリボ核酸（ＲＮＡ）もまた、目的の範囲内としている。
【００２７】
従って、ＳＥＲＰ−１タンパク質、その類縁体またはこれらの生物活性フラグメントは、目的のＳＥＲＰ−１タンパク質をコードする配列の複製および／または発現が可能なようにうまく連結させたベクターを含む組換えＤＮＡ分子によって産生してもよい。本明細書において、「ベクター」の語は細胞内で自己複製が可能であり他のＤＮＡセグメントを、該セグメントが複製し得るよう連結し得るＤＮＡ分子をいう。目的とするＤＮＡセグメント由来の遺伝子の発現を制御し得るベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。
【００２８】
本発明の目的とするタンパク質を産生する方法のひとつは、原核生物のレプリコン、即ち自己複製をつかさどる能力、および組換えＤＮＡ分子を、形質転換された細菌宿主細胞のごとき原核生物宿主細胞内において染色体外で維持する能力を有するＤＮＡ配列を有するベクターによるものである。かかるレプリコンは当業者にはよく知られている。さらに、発現ベクターには目的とするＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントの発現（転写および翻訳）を司ることができる原核生物のプロモーターを有する。細菌宿主と共存性のプロモーター配列は典型的には、目的とするＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントをコードするＤＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含有するプラスミドベクター内に提供される。
【００２９】
ＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントの製造に好ましい発現ベクターとしては、真核生物の細胞と共存性であるもの、より好ましくは哺乳類細胞と共存性であるものである。ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを真核細胞内において発現させることが好ましい。というのはかかる細胞はＳＥＲＰ−１タンパク質を糖タンパク質化することができるからである。真核細胞の発現ベクターは当業者によく知られており、いくつもの業者から購入できる。典型的にはかかるベクターは所望のＤＮＡセグメントを挿入するのに便利な制限部位を有する。市販の発現ベクターの例としては、以下の便利な制限部位を有するものが知られている：
ｒｅ  ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＶ−１ｐＭＬ２ｄ（ＩＢＩ）およびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ識別番号３１２５５番）が挙げられる。
【００３０】
真核細胞と共存性であり、ＳＥＲＰ−１タンパク質の産生のためのＳＥＲＰ−１発現ベクターを構築するために使用される発現ベクターへは、真核細胞において効力を発揮する選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含ませ得る。薬剤耐性のマーカーの例としてはネオマイシン耐性が挙げられる。この耐性はネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現によって獲得することができる。
【００３１】
好ましい真核宿主細胞には酵母および哺乳動物の細胞、好ましくはマウス、ラット、サル、またはヒト繊維芽セルラインのごとき脊椎動物の細胞が挙げられる。真核宿主細胞の例にはチャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）；この細胞はＡＴＣＣよりＣＣＬ６１として得ることができる、およびＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３；この細胞はＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能である、を含む。適当な細胞宿主の本発明の組換えＤＮＡ分子による形質転換は、よく知られた方法であって、典型的には使用するベクターに依存する。原核細胞の形質転換方法はコーエン（Cohen)ら、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー69:2110(1972)に記載されている。脊椎動物細胞の形質転換はサンブルック（Sambrook)ら、1989モレキュラークローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークに記載されている。
【００３２】
うまく形質転換された細胞、即ちＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントをコードする組換えＤＮＡ分子を含む細胞を、よく知られた方法にて同定することができる。例えば、ＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントのコーディング配列を含有するｒＤＮＡベクターの導入により得られる細胞をクローン化し、増幅してモノクローンからなるコロニーを作らせても良い。このコロニーから細胞を収穫し、溶菌し、そしてそのＤＮＡ含有物についてＳＥＲＰ−１のＤＮＡの存在を調べるべく、サザン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー98-503(1975)またはブレント(Brent)ら、バイオテクノロジー3:208(1985)に記載されたごとき方法を用いればよい。
【００３３】
ＳＥＲＰ−１のＤＮＡの存在を直接アッセイするのに代えて、所望の通り形質転換できたか否かにつき、ｒＤＮＡが目的とするタンパク質の発現を支配し得る場合に用いられる、良く知られた免疫学的手法を用いて調べても良い。ＳＥＲＰ−１のコード領域を含有する発現ベクターによる形質転換の成功した細胞は、ＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを産生する。形質転換されたと期待される細胞の試料を収穫し、抗ＳＥＲＰ−１抗体を用いてＳＥＲＰ−１抗原性の存在をアッセイすればよい。
【００３４】
本発明のある態様において、ミクソーマウイルスのＢａｍＨＩ  Ｕ３フラグメント（アップトンら、1990バイロロジー179:618-631)の配列決定のために用いたＭ１３クーンであるＢＶ１２−１０ａ、これは全ＳＥＲＰ−１のオープンリーディングフレーム（配列番号：１）が含まれている、を大腸菌内で増殖させた（図７参照）。方法および操作はアップトンらの用いたものであり、この文献の内容は本願明細書に含まれる。ＣＪ２３６（dut−，ung−；クンケル（Kunkel)ら、1987 メソッズ・エンザイモロジー154:367-382)。オリゴヌクレオチドによる変異誘発を上記に開示したごとく（クンケルら1987）行って、ＢａｍＨＩ部位をＳＥＲＰ−１開始コドン（ＧＧＡＴＣＣＡＴＧ）の５’側すぐのところに挿入した。得られたファージを大腸菌ＪＭ１０３内で増殖させた。全ＳＥＲＰ−１オープンリーディングフレームを含有する１３０１ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをこのファージから得、ｐＭＴＬ２２（チャンバーズ(Chambers)ら、1988ジーン68:139-149)内にサブクローニングした。１３４４ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩフラグメントを次いでワクシニア発現プラスミドｐＭＪ６０１（デイビッドソンら、1990ヌクレイック・アシッズ・リサーチ18:4285-4286)内のＢａｍＨＩ部位へ連結させ、ＳＥＲＰ−１をワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子内の、強い合成後期プロモーターの支配下へ挿入させた。組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をＴＫ−Ｈ１４３細胞上、２５μｇ／ｍｌのＢＵｄＲの存在下で培養し、プラークを精製して選択した。組換えウイルス（ＶＶ−Ｓ１と名付ける）からのＳＥＲＰ−１タンパク質の発現は抗ＳＥＲＰ−１抗血清を用いて免疫学的に確認した。コントロールのウイルス（ＳＥＲＰ−１のオープンリーディングフレームを含有しない）はワクシニアＷＲ株のＴＫ−組み替え体を親のｐＭＨＪ６０１プラスミドを用いて調製することにより用意した．
【００３５】
ＶＶ−Ｓ１により産生されたＳＥＲＰ−１を、サルのＢＧＭＫ細胞をこの細胞１個あたり１ｐｆｕの割合でウイルスに感染させ、２４時間後の培養上清から回収した（マッセンら、1993バイロロジー195:348-363)。操作および方法はマッセンらに因った。この報文の内容は本明細書に含まれる。
【００３６】
分泌された、ＶＶ−Ｓ１内で産生されたＳＥＲＰ−１糖タンパク質を回収し、精製するため、ウイルス分泌タンパク質を含有する増殖培地を回収し、遠心分離して上清を分取し、２５ｍＭのトリスｐＨ８.０緩衝液に対して透析し、そしてタンパク質を、例えばアミコンセントリプレップ−10（Centriprep−10)装置にて濃縮した。透析された試料をＭｏｎｏＱカラム上へロードし、直線状の塩のグラジエント（０〜３０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いてタンパク質を溶出した。このようにして精製されたＳＥＲＰ−１タンパク質を半精製されたものとする。好ましくはＳＥＲＰ−１タンパク質はさらにスーパーデックス−７５カラムクロマトグラフィーにて精製する。こうしてさらなる精製をされたＳＥＲＰ−１タンパク質は、より高度に精製されたものであり、より高い生物活性を示した。
【００３７】
ＳＥＲＰ−１を含有するフラクションをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて調べた。全タンパク質濃度は例えばブラッドフォードアッセイのようなよく知られた方法によって測定し得る。タンパク質濃度はまた、銀染色ゲルの濃度走査やゲルの細菌により発現されたＳＥＲＰ−１タンパク質を標準コントロールとして用いるウエスタンブロッティングにより調節および測定できる。ＳＥＲＰ−１のオープンリーディングフレームを有していないコントロールのワクシニアベクターもまた、同様の方法によってＢＧＭＫ細胞培養上清から回収、精製できる。
【００３８】
半精製物となるまで、またはより精製された状態となるまで精製した後、ＳＥＲＰ−１へ滅菌水および生理的食塩水またはその他の薬学上許容される担体へ混合して濃度を３ｐｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの間、好ましくは３ｐｇ／ｍｌと３００ｎｇ／ｍｌの間となるように希釈する。または、ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらの生物活性フラグメントを凍結乾燥粉末としてまたは凍結保存し、その後に滅菌水または生理的食塩水もしくは他の薬学上許容される担体に溶解させて、上記の濃度としてもよい。
【００３９】
本発明のＳＥＲＰ−１はヒト患者へ、好ましくは医薬組成物として治療に有効な量を投与し得る。本発明の医薬組成物には、治療に有効な用量のＳＥＲＰ−１タンパク質、当該タンパク質と同等または類縁のタンパク質、もしくはＳＥＲＰ−１タンパク質、これと同等または類縁のタンパク質の生物活性フラグメントを、薬学上許容される担体と共に含有する。「治療に有効な量」という言葉はアテローム性プラークの一次発達または再発達を有効に治療するのに必要な用量を意味する。本発明の目的において、「治療する」あるいは「治療」という語には、治療する症状の発症の予防、抑制、減少および／または当該症状に起因する生理的な影響の軽減を含む。
【００４０】
本明細書において「類縁体」という語はＳＥＲＰ−１タンパク質のアミノ酸配列中に置換または変換を含むものをいい、ここで置換または変換（すなわち付加および欠失）が、該タンパク質を動脈壁の外表面もしくは内膜表面へ投与した場合に示される抗アテローム性を失わないようなものである。本発明の目的において、「類縁体」には、アミノ末端および／またはカルボキシ末端へ、および配列内へ１または複数のアミノ酸を融合あるいは挿入させるごとく、ＳＥＲＰ−１へアミノ酸を挿入した誘導体を含む。アミノ酸配列挿入変異体は、１または複数のアミノ酸残基がタンパク質のあらかじめ定められた部位に導入されたものである。ランダムな挿入もまた可能であり、適当なスクリーニングによって生成物が得られる。欠失変異体は１またはそれ以上のアミノ酸を配列から削除することに特徴付けられる。アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１の残基が除去されて、当該位置に異なる残基が挿入されるものをいう。アミノ酸置換によって誘導されたタンパク質においては、アミノ酸は一般に同等の物理化学的性質、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、かさ高な側鎖等、を有する他のアミノ酸と置換される。
【００４１】
本明細書において、「類縁体」という語にはまた、ＳＥＲＰ−１と同等なもの、すなわち他のＳＥＲＰ−１由来の対応するアミノ酸配列であり、同じあるいは実質的に同じ抗アテローム性質を有するタンパク質も含有する。
【００４２】
ＳＥＲＰ−１アミノ酸変異体は、当業者によく知られている、固相ペプチド合成法（メリフィールド・シンセシス（Merrifield synthesis））などのごときペプチド合成法、または当業者によく知られている組換えＤＮＡ法を用いて容易に調製し得る。ＤＮＡ内の予め定めた部位における置換を行う操作法としては、例えばＭ１３変異誘発法がある。ＤＮＡ配列の置換、挿入または欠失変異体を調製するためのＤＮＡ配列の取り扱いは様々な文献に開示されており、例えばサムブルックらの１９８９モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークに記載されている。
【００４３】
本発明の目的のために、ＳＥＲＰ−１の類縁体には、炭化水素、脂質および／または他のプロテイナーゼ性部分のごとき、天然にまたは人工的にＳＥＲＰ−１に関与するいかなる成分の単一または複数の置換、欠失および／または付加を含んでいてもよい。これらすべての分子は「ＳＥＲＰ−１類縁体」の語の範囲内である。
【００４４】
本発明のひとつの態様において、調製されたＳＥＲＰ−１タンパク質の特異活性を増加させるため、２４４位のシステイン残基を他のアミノ酸残基、例えばアラニンと置換してもよい。このような置換によってＳＥＲＰ−１タンパク質の生物活性がより高まる、というのはＣｙｓ２４４はジスルフィド結合を介したＳＥＲＰ−１ダイマー形成部位であると考えられるからである。Ｃｙｓ２４４はＳＥＲＰ−１タンパク質の活性中心に非常に近接しているため、ＳＥＲＰ−１のダイマーは妨げられた、不明確な活性中心を有しており、そのため生物的に不活性となっていると考えられている（ローマス（Lomas)ら、1993ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー268(1):516-521。２４４位の変異により、組換えＤＮＡ法によってＳＥＲＰ−１を産生する際のＳＥＲＰ−１ダイマーの生成が防止される。試料中におけるＳＥＲＰ−１ダイマーの存在率が低下することにより、単離したタンパク質の特異活性が増加し、したがって医薬組成物中に必要となるタンパク質量が減少する。
【００４５】
セルピン類（serpins）の抑制活性は、セルピンの活性領域にあるＰ１とＰ１'領域の間の切断の後、セリンプロテアーゼからのセルピンのゆっくりとした解離の際に生じると考えられている。アップトンら、1990バイロロジー179:618-631。最近では、アミノ酸配列Ａｒｇ／ＡｓｐがＳＥＲＰ−１のＰ１−Ｐ１’部位とされている部分（アミノ酸残基３１９および３２０位）にあり、そしてこれがセリンプロテアーゼによって切断される部位であると考えられている。これら２つのアミノ酸の一方または両方の置換によって生物活性が変化したＳＥＲＰ−１類縁体が得られ、これは本発明の実施に有用である。
【００４６】
医薬組成物の処方は、当業者に一般的に知られているが、参考文献としてはレミントンのファーマシューティカル・サイエンス第１７版、マック・パブリッシング社、ペンシルバニア州イーストンが挙げられる。本発明において用いるＳＥＲＰ−１タンパク質、類縁体またはこれらのフラグメントは、製造および貯蔵の条件において安定でなくてはならず、細菌や黴などの微生物の汚染のないよう保護されていなくてはならない。微生物汚染は様々な抗生物質および抗黴剤を添加することによって防止し得る。
【００４７】
ＳＥＲＰ−１の注入に適当な医薬剤形には滅菌水溶液または分散液および即座に注射し得る滅菌溶液または分散液を調製し得る滅菌粉末を含む。すべての場合において、薬剤は滅菌されていなくてはならず、また容易に注射し得る液体でなくてはならない。典型的な担体には溶液もしくは分散液の媒体を含み、例えば水、水性緩衝液（例えば生物適合性緩衝液）、エタノール、ポリオール類、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、これらの適当な混合物等、界面活性剤または植物油が挙げられる。滅菌方法としては当業者に知られた方法で行えばよく、濾過または抗生物質もしくは抗かび剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ダイズ酸またはチメロサル、の添加を含むが、これらに限定されるわけではない。さらに、糖または塩化ナトリウムのごとき等張剤を目的の組成物へ加えてもよい。
【００４８】
本発明のペプチドを含有する滅菌注射剤を製造するには、これらの化合物の必要量を適当な溶剤内へ、必要に応じて上記に列挙した様々な成分とともに含有させ、次いで滅菌、好ましくは濾過滅菌すればよい。滅菌粉末を得るためには、必要に応じて上記溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。
【００４９】
目的とするＳＥＲＰ−１タンパク質または類縁体およびこれらのフラグメントは従って、薬剤として有効な量を適当な薬学上許容される担体と共に治療に有効な用量で容易にそして有効に投与することができる。
【００５０】
本明細書において、「薬学上許容される担体および／または希釈剤」という語にはすべての溶剤、分散媒、抗生物質および抗かび剤、等張剤および吸収遅延剤等であって、活性成分（ＳＥＲＰ−１、ＳＥＲＰ−１類縁体およびこれらのフラグメント）と適合性があるもののうち、いずれのものも含まれる。かかる媒体および剤を薬理活性物質のために使用することは当業者によく知られている。その他の活性成分もまた、本発明の組成物中に含有させ、本発明の方法に用いてもよい。
【００５１】
本発明の方法によってヒトに投与されるＳＥＲＰ−１タンパク質、類縁体またはそれらのフラグメントの正確な治療有効量は、個々の年齢、体重、アテローム性プラーク発達の程度および患者の症状によって異なるため一概に定めることはできない。しかしながら、一般的に本発明のＳＥＲＰ−１医薬組成物は好ましくは、１注入用量につき少なくとも３０ｐｇ、より好ましくは１注入用量につき約３００μｇを投与すべきである。
【００５２】
非経口組成物を、一定の用量で投与するのに容易な用量単位の製剤とすれば特に有利である。本明細書で用いる用量単位製剤という語は、物理的に別個の単位であって治療すべき哺乳動物に対する単一の用量に適合するものをいう；各ユニットは所望の治療効果を産生するよう計算された、予め定められた量の活性物質を、必要な医薬担体と共に含有している。本発明の新規用量単位製剤の詳細は、（ａ）活性物質（すなわちＳＥＲＰ−１タンパク質、ＳＥＲＰ−１類縁体またはこれらのフラグメント）、（ｂ）ここで詳しく説明した、アテローム性のプラーク発達の治療のための活性物質を処方する分野において固有の制限事項、によって説明され、またこれらに直接依存している。
【００５３】
主活性成分は有効量の有効な投与を容易に行うために、適当な薬学上に許容される担体と共に上述のごとき用量単位製剤として製剤する。１の用量単位製剤には、例えばこの主活性物質を０.５μｇから約２００ｍｇ含有する。他の活性成分を含有する組成物の場合、その用量は通常の用量および該成分の投与方法を参照して定められる。
【００５４】
ＳＥＲＰ−１活性成分を含有させるのに用いるパッケージ材としては、該パッケージ材が組成物に含まれる成分のいずれとも反応しないものであれば、ガラス、プラスチック、金属またはその他のいずれの適当な不活性物質であってもよい。
【００５５】
ＳＥＲＰ−１タンパク質、類縁体またはこれらのフラグメントは用量製剤と適合するような方法で、および治療効果が得られるであろう量にて投与すればよい。  本発明は以下の実施例によりさらに詳細に説明される。以下の実施例は本発明の限定をするものではない。
【実施例１】
【００５６】
ワクシニアベクターからのミクソーマＳＥＲＰ−１タンパク質の精製
ミクソーマＳＥＲＰ−１を分泌糖タンパク質として過度に発現するワクシニアベクター（ＶＶ−Ｓ１）はどこか（マッセン(Macen)等１９９３ヴィロロジー(Virology)１９５：３４８〜３６３）で開示されており、マッセン等の用いた手段および方法論をここで参考文献として引用する。発現した分泌タンパク質を精製するために、２４個のローラー・ボトル（roller bottles）（１ボトルにつき細胞３×１０８個）のＢＧＭＫ細胞を、ＶＶ−Ｓ１またはＳＥＲＰ−１を発現しないコントロールウイルス（ＶＶ−６０１）で１〜３pfu/細胞にて感染させ、血清なしのドゥルベッコの改良イーグル培地（Dulbecco's modified Eagles medium）に吸着させた。３７Ｃにて２４時間後、デカントした培地を遠心分離により清澄し、分泌タンパク質を２５mMトリス（Tris）、ｐＨ８に対して透析し、アミコン・セントリプレップ（Amicon Centriprep）−１０装置で濃縮した。その後、ＶＶ−Ｓ１およびＶＶ−６０１感染細胞由来のタンパク質を、ＦＰＬＣ、最初にモノ(Mono)−Ｑ交換カラム・クロマトグラフィー（ファーマシア(Pharmacia）)、次いでスーパーデックス(Superdex)−７５カラム・クロマトグラフィー（ファーマシア(Pharmacia)）により分留した。その結果得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ゲルの銀染色により、このタンパク質を可視化した。図１、レーン３。
【００５７】
図１のレーン１はワクシニアベクターコントロールタンパク質である（モノ−Ｑカラム後）。レーン２は半精製ＳＥＲＰ−１である（モノ−Ｑカラム後）。レーン３は精製ＳＥＲＰ−１である（スーパーデックス・カラム後）。
【実施例２】
【００５８】
血管形成術誘導内皮裸化部位におけるＳＥＲＰ−１の注入
介在前２週間およびその後１週間あたり４日間、ニュージーランド白ウサギに１０％ピーナッツオイル中の２％コレステロールを与えた。筋肉内麻酔薬（準備投薬：４０mg/kgケタレーン(ketalean)、麻酔薬：８mg/kgキシラゼン(xylazene）、および０.５mg/kgアセプロマジン(Acepromazine)）で麻酔をかけたウサギの大腿の切り口から３〜３.５mmの血管形成術バルーン・カテーテルを挿入し、透視診断コントロール下で遠位の腹大動脈まで進めた。
【００５９】
血管形成術中、バルーンを最終圧力８バールまで２分間膨らませ、これを用いて大動脈全体の内皮層を剥がし、その後しぼませた。バルーンが損傷を誘導した直後に、バルーンが介在した動脈内膜ダメージ位置の遠位の腹大動脈のみへ生理的食塩水で希釈した増加濃度のＳＥＲＰ−１を１０ml注入した。注入は、ボリンスキー・パーフュージョン（Wolinxsky perfusion）・バルーン・カテーテル、動脈内膜および動脈壁の内側の層へ薬剤を局所的に注入する多孔質カテーテルで行った（スタディアス(Stadius)等、アム・ハート・ジェイ(Am Heart J）１２６：４７〜５６）。
【００６０】
この実験において１４匹のウサギを用いた。第１の実験群では３匹のウサギそれぞれに３００pgの半精製ＳＥＲＰ−１を投与し、一方で第２の実験群では３匹のウサギそれぞれに３０pgの半精製ＳＥＲＰ−１を投与した。第３の実験群では３匹のウサギそれぞれに３ngのＳＥＲＰ−１を投与した。別の５匹のコントロール群では同様に精製したワクシニアベクタータンパク質も先のバルーン媒介動脈内膜ダメージ部位に注入した。コントロール実験で用いたベクターコントロールタンパク質の投与量は半精製ＳＥＲＰ−１実験におけるワクシニアタンパク質に対して当量であった。
【実施例３】
【００６１】
ＳＥＲＰ−１処置およびコントロール処置した大動脈の対比血管造影法による分析
血管形成術および半精製ＳＥＲＰ−１またはワクシニアコントロールタンパク質いずれかの注入４週間後、動脈内膜増殖およびアテローム性動脈硬化症プラーク発達について対比血管造影法によりウサギを試験した。対比血管造影法は標準対比剤（例えば、イソブ(Isovue)）の動脈内への注入により行った。血管形成術の前後と術後４週間、死亡する直前に血管造影を記録した。図２は、血管形成術４週間後に撮影した２つの脈管影像を示す。図２のパネルＢではＳＥＲＰ−１の注入部位において狭窄が低減していることが明らかである。
【００６２】
対比血管造影法において、半精製ＳＥＲＰ−１注入後の腹大動脈の口径には実質的に変化はないことが証明された。腹大動脈の直径は電子測定器により測定した。腹大動脈の基線口径は４.０５mmであった。血管形成術およびＳＥＲＰ−１注入４週間後、口径を測定したところ４.０３mm、ｐ＝０.９１６９、ＮＳであった。これに対して、ワクシニアベクターコントロールタンパク質注入４週間後の対比血管造影法では腹大動脈管腔径において測定可能な低下があった。ワクシニアベクターコントロール動物において、腹大動脈管腔の基線直径は４.２８mmであった。４週間後ではその大動脈管腔の直径は３.４９６mm、ｐ＜０.０９５３であった。この差は、ＳＥＲＰ−１注入後にアテローム性動物硬化症プラーク発達が低減したという組織学的研究結果と一致する。バルーン血管形成術およびＳＥＲＰ−１注入直後ではその口径において検出可能な増加はなかった。ＳＥＲＰ−１注入またはコントロール注入間における明らかに関連した合併症、すなわち離断、血栓、出血、伝染性アレルギーまたは免疫反応および痙縮の頻度においては差はなかった。
【実施例４】
【００６３】
半精製ＳＥＲＰ−１処置およびコントロール処置した大動脈の直接的目視試験および組織学的分析
半精製ＳＥＲＰ−１またはコントロール注入４週間後、ウサギを安楽死のための注入により殺した。全ての外科的手段およびウサギの殺傷方法はアニマル・ウェルフェア・コミッティー（Animal Welfare Committee）、ユニバーシティー・オブ・アルベルタ（University of Alberta）のガイドラインおよびカナディアン・ナショナル・ガイドラインに従った。殺した後すぐに、動脈内膜表面の目視検査および組織学的分析のために腹および胸大動脈を取り出した。
【００６４】
図３で見られるように、アテローム性ビルドアップは大動脈中容易に目視できる。半精製ＳＥＲＰ−１注入領域において、盛り上がったプラークの顕著な低減も目視できる（図３）。これに対して、半精製ＳＥＲＰ−１注入部位上流の胸大動脈および注入部位下流の腸骨分岐では盛り上がった脂肪質プラーク領域が目視できる（図３）。
【００６５】
実験動物から取り出した大動脈をコントロール動物から取り出したそれと比較することにより、半精製ＳＥＲＰ−１注入後においては腹大動脈における先の動脈内膜ダメージ部位でのプラーク発達が有意に低減しているが、生理的食塩水またはワクシニアベクター注入後ではそうではないことが明らかになった。プラーク発達は他の大動脈領域では変わらなかった；半精製ＳＥＲＰ−１注入またはコントロール注入いずれかの後、注入部位上流の胸大動脈および注入部位下流の腸骨動脈において目視実験で観察されたプラーク量は同じであった。
【００６６】
組織学的分析のために、実験およびコントロール動物両方において、バルーン血管形成術部位上流の胸大動脈、血管形成術部位下流の腸骨分岐、および血管形成術部位の腹大動脈より切片を取り出した。大動脈の験体を中性の緩衝孔（neutral buffered foramen）に固定し、以下のようにしてヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。験体をパラフィンで包埋し、３〜４ミクロン切片にカットした。この切片をある等級のアルコールおよびキシレム洗浄剤（xylem washes）で処理し、その後ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【００６７】
プラーク厚および面積を、ジャンデル・サイエンティフィック・ドロウイング・チューブ（Jandell scientific drawing tube）および前述（２１〜２２ PreII）のＭＡＣ−ＯＭＡソフトウェアを用いる計測学的分析により測定した。ニコン・ラボフォトＩＩ顕微鏡でのドロウイング・チューブ付属品を用いた後の測定のため、動脈内膜領域を抜き出した。顕微鏡に取り付けた測微接眼レンズにより動脈内膜厚も測定した。半精製ＳＥＲＰ−１注入後におけるプラーク発達の非常に明らかな低減が組織学的試験により確認された（図４ａ）。
【００６８】
腹大動脈において半精製ＳＥＲＰ−１注入後、プラーク面積における１４倍の減少およびプラーク厚における２８倍の減少が確認された（図５および表１）。腹大動脈におけるバルーン血管形成術部位で測定したアテローム性動脈硬化症プラークの平均厚は、半精製ＳＥＲＰ−１注入後では９４±３３ミクロン、ワクシニアベクターコントロール注入後では４３６±１００ミクロンであった（ｐ＜０.００１７）。腹大動脈におけるプラーク面積の平均値は、ＳＥＲＰ−１注入後では０.０３７±０.０１６mm２、ワクシニアコントロール注入後では０.５１６±０.１６３mm２であった（ｐ＜０.００１７）。
【００６９】
半精製ＳＥＲＰ−１注入部位の上流および下流のプラーク発達において有意な減少はなく、ＳＥＲＰ−１効果は局所的な効果のみであることが示された。半精製ＳＥＲＰ−１はその後のプラーク生長において減少をもたらすが、それは注入部位に制限される。胸大動脈切片において、プラーク厚の平均値はＳＥＲＰ−１注入後では１４６±５４ミクロン、生理的食塩水コントロール注入後では６０６±１３１ミクロンであった（ｐ＝０.１３９２、ＮＳ）；プラーク面積についてはＳＥＲＰ−１注入後では０.６９５±０.１９９mm２、生理的食塩水コントロール注入後では１.２６５±０.３９１mm２であった（ｐ＝０.１３９２、ＮＳ）。腸骨動脈の計測学的分析により同様の値が記録され、再びＳＥＲＰ−１効果は、注入されたＳＥＲＰ−１タンパク質は、末端流失も認められず、かなり局存化していることが証明された。
【００７０】
半精製ＳＥＲＰ−１処置ウサギにおいて注入部位で検出可能なアテローム性動脈硬化症プラークは一般に薄層の脂肪質動脈内膜過形成であった（図４ａ）。対比すると、生理的食塩水またはワクシニアベクターコントロールの注入後検出可能なプラーク（図４ｂ）はしばしば、脂肪および線維細胞の増殖とともに動脈内膜の広範囲にわたって拡張する複合体であった。なかには線維キャップ（fibrous cap）が目視できる場合があった（図４ｃ）。注入の上流および下流の部位において、またはワクシニアベクターコントロールまたは生理的食塩水を注入したコントロールウサギにおいては、しばしば多量の脂肪質および線維プラーク、適度な複合体が存在する。
【００７１】
最も優れた抗−再狭窄効果は３００pg〜３ngの半精製ＳＥＲＰ−１の注入で見られた。投与濃度３０pgの半精製ＳＥＲＰ−１では、動脈内膜増殖およびアテローム性動脈硬化症プラーク発達についての著しい阻害はほとんど提供されなかった。
【００７２】
【表１】
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【実施例５】
【００７３】
十分に精製したＳＥＲＰ−１タンパク質は十分な生物学的活性を有する
図６ａ、６ｂ、６ｃおよび６ｄでは、十分に精製したＳＥＲＰ−１または実施例２〜４で記載のコントロール生理的食塩水で処置した１２匹のウサギについてのデータが示されている。精製ＳＥＲＰ−１の一次注入部位でのプラーク面積についてのデータ（図６ａ）およびプラーク厚についてのデータ（図６ｂ）は、半精製ＳＥＲＰ−１を用いた場合よりその効果は非常に優れていることを示している。
【００７４】
試験した両方のＳＥＲＰ−１濃度について、生理的食塩水コントロールに対してプラーク面積では７３倍の減少、プラーク厚では８倍の減少が観察された。腹大動脈におけるバルーン血管形成術部位で測定したプラークの平均厚は、精製ＳＥＲＰ−１注入後では１３４±７９ミクロン、コントロール生理的食塩水注入後では１,０３５±１０７ミクロンであった（ｐ＜.０００１）。腹大動脈におけるプラーク面積の平均値は、ＳＥＲＰ−１注入後では０.０１９±０.０１１mm２、生理的食塩水注入後では１.３９±.３０８mm２であった（ｐ＜.００４）。
【００７５】
第二次未注入部位の場合では（図６ｃおよび６ｄ）、精製ＳＥＲＰ−１の３００pgレベルにおいて、統計学的には有意でないが適度な減少が示された。バルーン血管形成術後の再狭窄減少にあたっては、精製ＳＥＲＰ−１（図１、レーン３を見よ）はモル基準においても半精製（図１、レーン２）より効果的であった。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１はＳＥＲＰ−１タンパク質およびワクシニアベクターコントロールの、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳動による移動パターンを銀染色したものの写真である。第１レーンはＭｏｎｏ−Ｑで精製したＶＶ−６０１（コントロールベクター）のパターンを示す。第２レーンはＶＶ−Ｓ１からＭｏｎｏ−Ｑで精製したＳＥＲＰ−１タンパク質の電気泳動パターンを示す。第３レーンはさらにセファデックス７５で精製したＳＥＲＰ−１の電気泳動パターンを示す。「半精製」ＳＥＲＰ−１は第２レーンの試料に該当する。半精製ＳＥＲＰ−１の投与を含む実験では、第１レーンと同様にして精製したワクシニアベクタータンパク質をコントロールとして用いた。「精製」ＳＥＲＰ−１は第３レーンの試料に該当する。精製ＳＥＲＰ−１の投与を含む実験においては、生理的食塩水をコントロールにおいた。
【図２−ａ】図２は血管形成術４週間後に撮影した、２つの脈管撮影像である。パネルＡはワクシニアベクターコントロールを注入した動物の、血管形成術部分の脈管撮影像である。パネルＢは半精製ＳＥＲＰ−１を注入した動物の血管形成術部分の脈管撮影像である。
【図２−ｂ】図２は血管形成術４週間後に撮影した、２つの脈管撮影像である。パネルＡはワクシニアベクターコントロールを注入した動物の、血管形成術部分の脈管撮影像である。パネルＢは半精製ＳＥＲＰ−１を注入した動物の血管形成術部分の脈管撮影像である。
【図３】図３は３００ｐｇの半精製ＳＥＲＰ−１を投与したウサギ大動脈の全体像の写真であるが、この大動脈はウサギを殺した後すぐに分離したものである。バルーンによる内膜損傷領域およびＳＥＲＰ−１注入領域を示した。
【図４−ａ】図４ａはヘマトキシリンおよびエオジンで染色した、半精製ＳＥＲＰ−１で処置したウサギの腹大動脈の切片を示す。
【図４−ｂ】図４ｂはヘマトキシリンおよびエオジンで染色した、ワクシニアベクターコントロールタンパク質で処置したウサギの腹大動脈の切片を示す。
【図４−ｃ】図４ｃはヘマトキシリンおよびエオジンで染色した、生理的食塩水コントロールで処置したウサギの腹大動脈の一部を示す。
【図５−ａ】図５ａは半精製ＳＥＲＰ−１およびワクシニアベクターコントロールタンパク質の注入の後の胸部大動脈内膜の厚さを示す。
【図５−ｂ】図５ｂは先に血管形成術を施した箇所へ、半精製ＳＥＲＰ−１およびワクシニアベクターコントロールタンパク質を注入したウサギの腹大動脈のプラークの厚みを示す。
【図５−ｃ】図５ｃは半精製ＳＥＲＰ−１およびワクシニアベクターコントロールタンパク質の注入後の胸部大動脈プラークの面積を示す。
【図５−ｄ】図５ｄは血管形成術から４週間後の腹部大動脈のプラークの面積を示す。
【図６−ａ】図６ａは精製したＳＥＲＰ−１または生理的食塩水コントロールで処置したウサギの、一次注入部位（腹大動脈）におけるプラーク面積を示す。
【図６−ｂ】図６ｂは精製したＳＥＲＰ−１または生理的食塩水コントロールで処置したウサギの、一次注入部位（腹部大動脈）のプラークの厚みを示す。
【図６−ｃ】図６ｃは精製ＳＥＲＰ−１または生理的食塩水（コントロール）で処置したウサギの２次非注入部位（腸骨動脈）のプラークの厚みを示す。
【図６−ｄ】図６ｄは精製ＳＥＲＰ−１または生理的食塩水にて処置した２次非注入部位（腸骨動脈）のプラークの厚みを示す。
【図７−ａ】図７はミクソーマ(Myxoma)ウイルス(ＭＹＸ)のＳＥＲＰ−１オープンリーディングフレーム（ＯＲＰ）のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。
【図７−ｂ】図７はミクソーマ(Myxoma)ウイルス(ＭＹＸ)のＳＥＲＰ−１オープンリーディングフレーム（ＯＲＰ）のヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。
【図１】
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【図２−ａ】
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【図２−ｂ】
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【図３】
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【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
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【図４−ｃ】
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【図５−ａ】
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【図５−ｂ】
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【図５−ｃ】
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【図５−ｄ】
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【図６−ａ】
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【図６−ｂ】
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【図６−ｃ】
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【図６−ｄ】
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【図７−ａ】
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【図７−ｂ】
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【配列表】
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