(57)【要約】  【課題】  スクリーニングの時間短縮および作業効率向上のために、コンビナトリアルバイオエンジニアリングを利用したハイスループットスクリーニング系を提供すること。  【解決手段】  本発明は、アゴニストのスクリーニング方法を提供し、該方法は、レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および 発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程、を含む。  【選択図】  図１
2005176605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アゴニストのスクリーニング方法であって、
レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および 
発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記レセプターが、キメラレセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターが、Ｇタンパク質共役型レセプターであり、該レセプターのアゴニスト結合部位が細胞表層に提示され、そして該レセプターが、前記酵母の細胞質内のＧタンパク質と相互作用してシグナル伝達を引き起こす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母に由来する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が哺乳類に由来する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記レセプターが、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；前記酵母が、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせが、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アゴニスト候補物質が、リンカーを介して細胞表層に提示される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法であって、
ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し、アゴニスト結合部位を細胞表層に提示しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞内に提示するレセプターを細胞膜に発現し、そして、アゴニストを細胞表層に提示する酵母を得る工程；および
該アゴニストと該レセプターとの結合によって該レセプターと該細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用が生じた酵母を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項１０】
前記レセプターが、キメラレセプターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記キメラレセプターが、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；前記酵母が、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせが、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し；
アゴニスト結合部位を細胞表層に提示しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞内に提示するレセプターを発現し；そして
アゴニストを細胞表層に提示する；酵母。
【請求項１４】
前記レセプターが、キメラレセプターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キメラレセプターが、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；前記酵母が、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用が検出可能である、請求項１４に記載の酵母。
【請求項１６】
前記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせが、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである、請求項１５に記載の酵母。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レセプター結合性物質、すなわち、アゴニストおよび細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レセプターは、そのほとんどが細胞膜に存在し、外部の刺激を認識して情報を伝達するための構造を有している。言い換えれば、レセプターは、ホルモン、神経伝達物質などの細胞外に存在する物質や物理的または化学的刺激が、何らかの細胞応答を引き起こす場合の、その物質または刺激を特異的に認識するシグナル伝達の入口である。レセプターに結合して細胞応答を引き起こす物質をアゴニストといい、アゴニストまたは刺激がレセプターに作用し、タンパク質間相互作用を介して直接的または第二メッセンジャーを介して間接的に細胞応答を引き起こす。
【０００３】
レセプターとしては、代表的には、以下のような種類が知られている：（１）三量体Ｇタンパク質共役型（７回膜貫通型）：Ｎ末端を細胞外にＣ末端を細胞内に向けて７個の疎水性部が細胞膜を貫通する構造をとり、アセチルコリン、ノルアドレナリンなどの化学物質、光（ロドプシン）などを認識して、Ｇタンパク質を活性化し、種々のエフェクター分子にシグナルを伝達する；（２）レセプター型キナーゼ：１回膜を貫通し、細胞質内のＣ末端側がプロテインキナーゼ活性を有し、アゴニストによって酵素が活性化され、標的タンパク質をリン酸化することによってシグナルを伝達する；（３）サイトカインレセプター型：１回膜を貫通するが、細胞質内Ｃ末端が短く、特定の機能を持たず、共役する他のタンパク質を活性化してシグナルを伝達する；（４）イオンチャンネル型：アゴニストや刺激により、内在するイオンチャンネルの透過性が変化してシグナルを伝達するもので、膜を４回通過するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター、１回貫通するイノシトール１，４，５−トリスリン酸レセプターなどがある；および（５）脂溶性ホルモンレセプター：細胞質内や核内の可溶性のタンパク質レセプターであり、細胞膜を通過したアゴニストが結合して、転写を活性化する。
【０００４】
なかでも、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、生体の基礎的機能において重要であり、ｃＤＮＡクローニングされているものだけでも数百種類が知られており、千種類以上存在すると予想されている。このような生体機能に重要と思われるレセプターに対するアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングすることは、創薬における第１段階であり、そのための方法が、いくつか報告されている（特許文献１〜３参照）。例えば、特許文献３では、異種性ＧＰＣＲを発現する組換え酵母細胞にスクリーニングすべき物質を外的に添加することによって、あるいは該酵母細胞自体がスクリーニングすべき物質を発現して分泌することによって、レセプター結合性物質をスクリーニングしている。
【特許文献１】特表２００２−５４１４３９号公報
【特許文献２】特表平１１−５０７５１８号公報
【特許文献３】特表２００１−５１９１５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
種々のレセプターに対して標的化合物を１つずつスクリーニングするには、非常に時間および費用がかかる。そこで、本発明の目的は、スクリーニングの時間短縮および作業効率向上のために、コンビナトリアルバイオエンジニアリングを利用したアゴニストハイスループットスクリーニング系を提供することである。
【０００６】
ここで、コンビナトリアルバイオエンジニアリングとは、ＤＮＡ情報に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応などを用いて、同時に多数のＤＮＡライブラリーを作成し、生細胞の増殖性を利用することによってこのＤＮＡライブラリーを細胞で発現させて機能性ペプチドを産生させるという、一連の手法のことをいう。この方法によれば、ほぼ無限に近いランダムなペプチドライブラリーを簡単に作成することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アゴニストのスクリーニング方法を提供し、該方法は、
レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および 
発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程；を含む。
【０００８】
好適な実施態様では、上記レセプターは、キメラレセプターである。
【０００９】
好適な実施態様では、上記レセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプターであり、該レセプターのアゴニスト結合部位は細胞表層に提示され、そして該レセプターは、前記酵母の細胞質内のＧタンパク質と相互作用してシグナル伝達を引き起こす。
【００１０】
より好適な実施態様では、上記レセプターにおける細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は酵母に由来するか、あるいは哺乳類に由来する。
【００１１】
さらに好適な実施態様では、上記レセプターは、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；上記酵母は、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用は検出可能である。
【００１２】
より好適な実施態様では、上記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせは、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである。
【００１３】
好適な実施態様では、上記アゴニスト候補物質は、リンカーを介して細胞表層に提示される。
【００１４】
他の好適な実施態様では、上記検出する工程は、蛍光変化、発色反応、発光反応、またはレポーター遺伝子の発現を検出する工程である。
【００１５】
より好適な実施態様では、上記酵母はプロテアーゼ低下株または欠損株である。
【００１６】
本発明はまた、細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法を提供し、該方法は、
ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し、アゴニスト結合部位を細胞表層に提示しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞内に提示するレセプターを細胞膜に発現し、そして、アゴニストを細胞表層に提示する酵母を得る工程；および
該アゴニストと該レセプターとの結合によって該レセプターと該細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用が生じた酵母を検出する工程；を含む。
【００１７】
好適な実施態様では、上記レセプターは、キメラレセプターである。
【００１８】
好適な実施態様では、上記キメラレセプターは、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；上記酵母は、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用は検出可能である。
【００１９】
より好適な実施態様では、上記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせは、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである。
【００２０】
好適な実施態様では、上記アゴニストは、リンカーを介して細胞表層に提示される。
【００２１】
他の好適な実施態様では、上記検出する工程は、蛍光変化、発色反応、発光反応、またはレポーター遺伝子の発現を検出する工程である。
【００２２】
より好適な実施態様では、上記酵母はプロテアーゼ低下株または欠損株である。
【００２３】
本発明はさらに、ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し；
アゴニスト結合部位を細胞表層に提示しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞内に提示するレセプターを発現し；そして
アゴニストを細胞表層に提示する；酵母を提供する。
【００２４】
好適な実施態様では、上記レセプターは、キメラレセプターである。
【００２５】
好適な実施態様では、上記キメラレセプターは、細胞内で発現される第１のマーカータンパク質をさらに有し；上記酵母は、該第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質と、哺乳類のＧタンパク質との、融合タンパク質を細胞内に発現し；そして、該第１のマーカータンパク質と該第２のマーカータンパク質との相互作用は検出可能である。
【００２６】
より好適な実施態様では、上記第１および第２のマーカータンパク質の組み合わせは、シアン蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質の組み合わせ、あるいはβ−ガラクトシダーゼΔαおよびβ−ガラクトシダーゼΔωの組み合わせである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のアゴニストのスクリーニング方法は、対象となるレセプターと同一細胞の表層上に発現したアゴニスト候補物質のみが該レセプターに結合するため、ランダム化したアゴニスト候補物質を導入した組換え酵母を構築して培養するのみで、スクリーニングが可能である。また、アゴニスト候補物質とレセプターとが細胞内で１対１対応しているため、１細胞ずつに分けてアッセイを行う必要がなく、その同定が確実であるという利点がある。さらに、本発明の細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法においても、構築した組換え酵母では、アゴニストが確実にレセプターに結合されているため、レセプターと細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用（例えば、結合、シグナル伝達など）の有無を容易に検出できるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の第１の局面では、アゴニストのスクリーニング方法が提供され、この方法は、レセプターを発現し、そしてランダム化したアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する酵母を得る工程；および発現した該アゴニスト候補物質が該レセプターに結合している酵母を検出する工程、を含む。
【００２９】
本発明の第２の局面では、細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法が提供され、この方法は、ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を細胞内に発現し、アゴニスト結合部位を細胞表層に提示しかつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を細胞内に提示するレセプターを発現し、そして、アゴニストを細胞表層に提示する酵母を得る工程；および
該アゴニストと該レセプターとの結合によって該レセプターと該細胞内レセプター共役タンパク質との相互作用が生じた酵母を検出する工程、を含む。
【００３０】
本発明において、アゴニスト候補物質がレセプターに結合している酵母、あるいはシグナル伝達中のタンパク質間相互作用が生じた酵母、を検出するためのメカニズムを説明する。いずれの場合も、酵母において発現しているレセプターのアゴニスト結合部位にアゴニストまたはアゴニスト候補物質が結合すると、レセプターの細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位と、細胞内レセプター共役タンパク質または細胞内レセプター共役タンパク質候補物質とが（例えば、リン酸化などを介して）相互作用する。この相互作用によってシグナル伝達が行われる場合もある。本発明においては、この相互作用またはシグナル伝達の発生を検出する。
【００３１】
ここで「細胞内レセプター共役タンパク質」とは、アゴニストが結合しているレセプターと相互作用するタンパク質をいい、特に、細胞内へのシグナル伝達または増幅の役割を果たすタンパク質をいう。細胞内レセプター共役タンパク質も、レセプター結合性物質の一種であり得る。代表的には、Ｇタンパク質が挙げられる。ここで、相互作用とは、結合、会合、コンホメーション変化などが挙げられる。
【００３２】
本発明において、細胞内レセプター共役タンパク質として、（Ａ）酵母由来のタンパク質を用いる場合、および（Ｂ）哺乳類由来のタンパク質を用いる場合があり得る（図１を参照のこと）。
【００３３】
（Ａ）細胞内レセプター共役タンパク質として酵母由来のタンパク質を用いる場合、対象とされるレセプターの少なくとも細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位は、酵母で作動可能であればその由来は特に限定されないが、酵母由来であることが好ましい。そのため、新薬開発の点で、アゴニストのスクリーニングの対象とされるレセプターは、酵母内で作動し得る哺乳類のレセプターか、あるいはアゴニスト結合部位が哺乳類由来であり、かつ細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来であるキメラレセプターが好ましい。以下、キメラレセプターを用いる場合についてより詳細に説明する。
【００３４】
細胞内レセプター共役タンパク質がＧタンパク質である場合を例に挙げて、具体的に説明する。図１の（Ａ）に示すように、Ｇタンパク質は、通常３量体の形態で存在しており、Ｓｔｅ２という酵母のＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）に対しては、Ｇｐａ１、Ｓｔｅ４、およびＳｔｅ１８という３つのサブユニットが会合しているＧタンパク質が共役する。酵母ＧＰＣＲのＳｔｅ２にアゴニストが結合すると、Ｇｐａ１がＳｔｅ２の細胞質内部位と相互作用（結合）し、三量体Ｇタンパク質は活性化する。三量体Ｇタンパク質が活性化されると、Ｇｐａ１とＳｔｅ４・Ｓｔｅ１８複合体とに解離し、Ｓｔｅ４・Ｓｔｅ１８複合体（特にＳｔｅ４）が、次のＭＡＰキナーゼカスケード（ＭＡＰＫカスケード）を活性化する。ＭＡＰＫカスケードが活性化されると、Ｓｔｅ１２という転写因子を活性化し、最終的に細胞応答に関与するタンパク質の発現が引き起こされる。このようなタンパク質として、Ｆｕｓ１、Ｆａｒ１などが知られている。例えば、Ｆｕｓ１遺伝子の３’末端側に続いて強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子を組込むと、Ｆｕｓ１タンパク質の発現と同時にＥＧＦＰも発現し得る。したがって、その蛍光を発する酵母を、例えばＦＡＣＳにより蛍光を検出し、ソーティングすることによって、シグナル伝達が行われている酵母をスクリーニングすることができる。そこで、哺乳類由来のレセプターを酵母で発現させる場合は、細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位を酵母由来のものに改変すれば、酵母内でシグナル伝達が行われ得る。
【００３５】
（Ｂ）細胞内レセプター共役タンパク質として哺乳類由来のタンパク質を用いる場合は、対象とされるレセプターは、哺乳類由来レセプターが用いられる。この場合、シグナル伝達を確認するために、レセプターは、好ましくは、第１のマーカータンパク質が細胞内で発現するように融合されているキメラレセプターであり、そして細胞内レセプター共役タンパク質は、この第１のマーカータンパク質と相互作用し得る第２のマーカータンパク質との融合タンパク質である。キメラレセプターとアゴニストとの結合により、このキメラレセプターと細胞内レセプター共役タンパク質とが相互作用する。そのため、第１のマーカータンパク質と第２のマーカータンパク質とが接近するので、これらのマーカータンパク質の蛍光変化などによって検出可能である。
【００３６】
例えば、図１の（Ｂ１）に示すように、第１および第２のマーカータンパク質として、それぞれＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）とＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）とを利用する方法が挙げられる。例えば、ＹＦＰを細胞内レセプター共役タンパク質と融合させた場合、レセプターにはＣＦＰを付加する。アゴニストがレセプターに結合すると、細胞内レセプター共役タンパク質がレセプターと相互作用するので、細胞内レセプター共役タンパク質と融合しているＹＦＰが、レセプターに融合されているＣＦＰに接近し、これらの励起波長が移動する。そのため、蛍光の変化が生じ、この変化を検出することができる。ＣＦＰを細胞内レセプター共役タンパク質と融合させ、レセプターにＹＦＰを付加してもよい。
【００３７】
あるいは、図１の（Ｂ２）に示すように、第１および第２のマーカータンパク質として、β−ガラクトシダーゼのΔω（Ｃ末端欠損変異体）とΔα（Ｎ末端欠損変異体）とを利用する方法も挙げられる。例えば、細胞内レセプター共役タンパク質とβ−ガラクトシダーゼΔωとを融合させた場合、レセプターにβ−ガラクトシダーゼΔαを付加させる。アゴニストがレセプターに結合することにより、細胞内レセプター共役タンパク質がレセプターと相互作用すると、ΔωとΔαとの間で会合が生じ、β−ガラクトシダーゼとして機能し得るようになる（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４巻，２５００−２５０４頁，２００２年）。そこに、当該分野で通常用いられる発色系または発光系の反応試薬を添加することによって、シグナル伝達が行われた酵母を検出することができる。
【００３８】
本発明において「レセプター」とは、上記のように、細胞表面に存在し、細胞外環境と相互作用して、その環境に関する情報を細胞内に伝達または変換する分子をいう。言い換えれば、ホルモン、神経伝達物質などの細胞外の物質や物理的または化学的刺激を特異的に認識し、タンパク質間相互作用を介して直接的または第二メッセンジャーを介して間接的に細胞応答を引き起こす機能を有する分子をいう。本発明においては、好ましくはＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）が対象とされ得る。また、レセプターは、哺乳類由来ＧＰＣＲが好ましく、特に、新薬開発の観点から、ヒト由来ＧＰＣＲであることが最も好ましい。ヒト由来ＧＰＣＲは、上述のようにｃＤＮＡクローニングされているものだけでも数百種類が知られており、本発明においては、これらを酵母で発現させて、アゴニスト／細胞内レセプター共役タンパク質がスクリーニングされ得る。
【００３９】
「キメラレセプター」は、少なくとも２つの別個のポリペプチドが融合しているレセプターをいう。例えば、レセプターの一部が置換されているレセプター、あるいは別のタンパク質が付加しているレセプターが挙げられる。前者の例としては、哺乳類由来のレセプターにおいて、細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来となるように置換されているキメラレセプターが好ましい。より具体的には、レセプターのアゴニスト結合部位が哺乳類由来、より好ましくはヒト由来であり、そして細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用する部位が酵母由来であるキメラレセプターが好ましい。後者の例としては、シグナル伝達が行われた場合に細胞内で細胞内レセプター共役タンパク質と相互作用して、検出可能なシグナルを発生し得る第１のマーカータンパク質がレセプターに付加されているキメラレセプターが好ましい。具体的には、哺乳類由来のレセプターとＣＦＰとを含み、該ＣＦＰ部分が細胞内で発現されるキメラレセプター；哺乳類由来のレセプターとβ−ガラクトシダーゼΔαとを含み、該Δα部分が細胞内に提示されるキメラレセプターなどが挙げられる。
【００４０】
「アゴニスト」とは、機能的タンパク質（例えば、レセプター）に特異的に結合する物質（「レセプター結合性物質」ともいう）のうち、結合によって細胞応答を引き起こす物質をいう。例えば、上記酵母由来ＧＰＣＲに対するアゴニストは、α−因子である。アゴニストになり得る物質としては、一般的には、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子などが挙げられるが、本発明においては、ペプチドが好ましい。アゴニストをスクリーニングする場合、「アゴニスト候補物質」とは、コンビナトリアルバイオエンジニアリングによって産生されたランダムなペプチドライブラリーに含まれるペプチドをいう。
【００４１】
「アゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する」とは、細胞内で産生されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質が、細胞内から細胞膜を通過して細胞表層に移動するが、細胞外に分泌されずに、細胞表層に固定されていることをいう。アゴニストまたはアゴニスト候補物質は、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示され得るか、あるいは細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示され得る。細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、同一細胞上に発現しているレセプターのアゴニスト結合部位に結合し得る。アゴニストまたはアゴニスト候補物質をアゴニスト結合部位に適切に結合させるために、ＧＰＩアンカーまたは糖鎖結合タンパク質ドメインとアゴニストまたはアゴニスト候補物質との間に、適切な長さのリンカーを有していてもよい。ただし、リンカーが長すぎると、他の細胞のレセプターと結合する可能性が生じるため、好ましくない。また、細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質が細胞表層から切断されて遊離することを避けるために、酵母はプロテアーゼ低下株または欠損株であることが好ましい。
【００４２】
細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示する方法としては、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介してアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示する方法がある。
【００４３】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、ＦＬＯ１タンパク質（ＦＬＯ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、ＦＬＯ４２、ＦＬＯ１０２、ＦＬＯ１４６、ＦＬＯ３１８、ＦＬＯ４２８、ＦＬＯ１３２６など；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６０巻，４６９−４７４頁，２００２年）、ＦＬＯタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず、凝集性を利用するＦＬＯｓｈｏｒｔまたはＦＬＯｌｏｎｇ；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５１７−４５２２頁，２００２年）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
【００４４】
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元部が切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００４５】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール (ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００４６】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
【００４７】
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードするＤＮＡ配列に置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示されたアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
【００４８】
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００４９】
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質とを結合することにより、細胞表層にアゴニストまたはアゴニスト候補物質が提示される。目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させる、（２）Ｃ末端側にアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なるアゴニストまたはアゴニスト候補物質を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質をコードする遺伝子、を作成することにより、細胞表層に目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため、より適切な長さでアゴニストまたはアゴニスト候補物質を細胞表層に提示できる点で、ならびにアゴニストまたはアゴニスト候補物質のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
【００５０】
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的とするアゴニストまたはアゴニスト候補物質を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼが挙げられる。目的のアゴニストまたはアゴニスト候補物質は、これらペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
【００５１】
「ランダム化したアゴニスト候補物質」または「ランダム化した哺乳類ｃＤＮＡライブラリー由来の細胞内レセプター共役タンパク質候補物質」は、上記組換えＤＮＡのアゴニスト部分をコードするＤＮＡまたは得られたｃＤＮＡライブラリー由来のタンパク質をコードするＤＮＡを、コンビナトリアル（バイオエンジニアリング）ＰＣＲを用いて、目的部分をランダム化することによって得られ得る。すなわち、種々のランダムに改変された候補物質をいう。細胞表層に提示されるまたは細胞内で発現されるランダム化した候補物質は、同一酵母において一種であってもよくあるいは複数種であってもよい。
【００５２】
本発明において使用される酵母は、プラスミド発現のためのマーカー遺伝子を有し、アゴニストを細胞表層に提示し、レセプター（好ましくは、キメラレセプター）を発現し得る株であれば、特に限定されない。例えば、S.cerevisiae ＢＹ４７４１、ＡＴＣＣ６０７１５、ＭＴ８−１、Ｗ３０３ａ、ＩＦＯ１０１５０、ＹＰＨ４９９などが挙げられる。シグナル伝達量が多い株が好ましい。
【００５３】
これらの酵母には、対象とするレセプター、細胞表層提示アゴニストまたはアゴニスト候補物質、必要に応じて、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を含む融合タンパク質が組込まれる。したがって、これらの機能と競合または機能阻害する天然のタンパク質の発現が抑制された株としておくことが好ましい。例えば、プロテアーゼ低下株または欠損株が好ましい。
【００５４】
本発明において、酵母は、少なくともレセプター（好ましくは、キメラレセプター）および細胞表層提示アゴニストまたはアゴニスト候補物質が発現するように遺伝子構築物が導入される。必要に応じて、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を含む融合タンパク質も細胞内で発現されるように遺伝子構築物が導入される。遺伝子構築物は、酵母に適切なクローニングベクターおよび発現ベクター中に組込まれる。このような適切なベクターは当該技術分野で公知であり、酵母での発現に必要なエレメントが適宜含まれている。酵母への遺伝子構築物の導入とは、細胞の中に遺伝子構築物を導入し、発現させることを意味する。遺伝子構築物の導入の方法としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなど、当業者に公知の種々の方法があり、具体的には、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。遺伝子構築物が導入された細胞は、選択マーカー（例えばＴＲＰ）で選択され、発現されたタンパク質の活性を測定することにより選択される。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。このようにして、少なくともキメラレセプターおよび細胞表層提示アゴニストまたはアゴニスト候補物質を発現し、必要に応じて、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質を含む融合タンパク質を発現する酵母が得られる。
【００５５】
このようにして得られた酵母においては、単に培養するだけで、結合可能なアゴニスト候補物質がレセプター（好ましくは、キメラレセプター）に結合してシグナル伝達が行われ得るため、アゴニスト候補物質のスクリーニングが可能である。あるいは、レセプター（好ましくは、キメラレセプター）に対するアゴニストが該レセプターに結合し、次いで細胞内レセプター共役タンパク質候補物質と該レセプターとが相互作用してシグナル伝達が行われ得るため、細胞内レセプター共役タンパク質候補物質のスクリーニングも可能である。細胞内レセプター共役タンパク質を介するシグナル伝達の反応様式（例えば、第１および第２のマーカータンパク質の結合など）に応じて、シグナル伝達の有無を確認することができる。例えば、ナノチャンバーアレイのような１細胞ずつアッセイするためのシステムにおいて、チャンバーに酵母を１細胞ずつ分注して、蛍光変化を直接的に検出してもよいし、あるいは各チャンバーに反応試薬を添加することによって、発色反応、発光反応、またはレポーター遺伝子の発現を検出してもよい。２ｃｍ×２ｃｍのナノチャンバーアレイを用いると、１回で１０４〜１０５個の細胞についてアッセイすることができる。あるいは、酵母を分けずにまとめて培養し、その後ＦＡＣＳにより１細胞ずつソーティングして、蛍光変化を検出してもよい。
【００５６】
シグナル伝達が行われたことが確認された酵母について、アゴニスト候補物質または細胞内レセプター共役タンパク質候補物質をコードする遺伝子配列を、当業者が通常用いる手段により同定することによって、アゴニスト／アンタゴニストになり得るペプチドを同定することができる。
【実施例】
【００５７】
（実施例１：酵母由来Ｓｔｅ２への細胞表層提示α−因子の結合の確認）
（１−１：欠損酵母株の構築）
酵母S. cerevisiae ＢＹ４７４１株（MATa ura3 leu2 his3 met15）をＡＴＣＣより入手した。ＢＡＲ１（プロテアーゼ遺伝子）については、ＬＥＵ２マーカーの両端がゲノム相同領域となるようにＰＣＲを行った後、酢酸リチウムＰＣＲによる１ｓｔｅｐ遺伝子破壊株作製法（蛋白質核酸酵素，４６巻，２７６頁，２００１年）によってノックアウトした。また、ＦＡＲ１（シグナル伝達により細胞周期阻止を引き起こす遺伝子）については、マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を用いる酢酸リチウムＰＣＲによる１ｓｔｅｐ遺伝子破壊株作製法（ＲｅｓＧｅｎから購入）によってノックアウトした。次いで、ＦＵＳ１（シグナル伝達により転写が開始される遺伝子）のＣ末端にＥＧＦＰをコードするＤＮＡを融合した遺伝子を、マーカーとしてＨＩＳ３を用いるＰＣＲによる２ｓｔｅｐ遺伝子破壊法によりＢＹ４７４１株に組込み、欠損酵母ＢＹ４７４１株（MATa ura3 leu2 his3 met15 Δbar1::LEU2 Δfar1::kanMX4 Δfus1::FOS1-EGFP-HIS3）を得た。
【００５８】
（１−２：α−因子表層提示型プラスミドの構築）
本実施例に使用したプラスミドを、表１に列挙する。
【００５９】
【表１】
2005176605.tif 000003
【００６０】
以下、これらのプラスミドの作成について説明する。
【００６１】
アグルチニンを利用したα−因子表層提示型プラスミドを、以下のように構築した。まず、プレプロ領域を含むα−因子をコードする遺伝子を、High Fidelity PCR Master（Roche）にて、配列番号１および２に示すプライマーを用いて、S.cerevisiae ＢＹ４７４２株のゲノムから増幅した。ここで、配列番号１のプライマーはBamHI部位、および配列番号２のプライマーはXhoI部位をそれぞれ有する。増幅したフラグメントを制限酵素BamHIおよびXhoIで消化し、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Stratagene）に挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα（ＡＧ）を得た。α−アグルチニンの3'-Half領域をコードする遺伝子を、High Fidelity PCR Masterにて、配列番号３および４に示すプライマーを用いて、ｐＩＣＡＳ１（Ｍｕｒａｉら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：４８５７−４８６１，１９９８）から増幅した。ここで、配列番号３のプライマーはXhoI部位、および配列番号４のプライマーはNheI部位をそれぞれ有する。増幅したフラグメントをXhoIおよびNheIで消化し、ｐＵＥＳＣα（ＡＧ）に挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＡＧを得た。
【００６２】
グリシンおよびセリンからなる１８アミノ酸単位（ＧＳリンカー）をコードするＤＮＡフラグメントを、配列番号５および６に示すプライマーを用いて調製した。調製したフラグメント（両端はXhoIおよびSalI）をｐＵＥＳＣα−ＡＧのXhoI部位に挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＡＧを得た。さらにこのＧＳリンカーのフラグメントを、得られたｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＡＧのXhoI部位に挿入し、ＧＳリンカーを２つ有するプラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ２−ＡＧを得た。以下同様にして、リンカーの長さが異なるプラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ３−ＡＧ、ｐＵＥＳＣα−ＧＳ４−ＡＧ、およびｐＵＥＳＣα−ＧＳ５−ＡＧを得た（図２を参照のこと）。
【００６３】
次に、ＦＬＯを利用したα−因子表層提示プラスミドを、以下のように構築した。まず、プレプロ領域を含むα−因子をコードする遺伝子を、High Fidelity PCR Master（Roche）にて、配列番号１および７に示すプライマーを用いて、S.cerevisiae ＢＹ４７４２株のゲノムから増幅した。ここで、配列番号１のプライマーはBamHI部位、および配列番号７のプライマーはXhoI部位をそれぞれ有する。増幅したフラグメントを制限酵素BamHIおよびXhoIで消化し、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Stratagene）に挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαを得た。長さを様々に変えたＦｌｏ１ｐをコードする４つの遺伝子を、High Fidelity PCR Masterにて、以下のプライマー対：配列番号８と配列番号９；配列番号１０と配列番号９；配列番号１１と配列番号９；ならびに配列番号１２と配列番号９を用いて、S.cerevisiae ＢＹ４７４１株の染色体ＤＮＡから増幅した。ここで、配列番号８、１０、１１、および１２のプライマーはXhoI部位、ならびに配列番号９のプライマーはNheI部位をそれぞれ有する。それぞれＦｌｏ１ｐの４２アミノ酸、１０２アミノ酸、１４６アミノ酸、および３１８アミノ酸に相当する増幅したフラグメントを、それぞれXhoIおよびNheIで消化し、上記のように構築したプラスミドｐＵＥＳＣαに挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ４２、ｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ１０２、ｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ１４６、およびｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ３１８を得た。
【００６４】
ＧＳリンカーをコードするＤＮＡフラグメントを、配列番号１３および１４に示すプライマーを用いて調製した。これらのプライマーは、いずれもXhoIおよびSalI部位を有する。調製したフラグメントをXhoIおよびSalIで消化し、ｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ４２、ｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ１０２、ｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ１４６、およびｐＵＥＳＣα−ＦＬＯ３１８のXhoI部位にそれぞれ挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＦＬＯ４２、ｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＦＬＯ１０２、ｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＦＬＯ１４６、およびｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＦＬＯ３１８を得た。そして、上記ＧＳリンカーのフラグメントを、得られたｐＵＥＳＣα−ＧＳ１−ＦＬＯ４２（１０２、１４６、または３１８）のXhoI部位にそれぞれ挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ２−ＦＬＯ４２（１０２、１４６、または３１８）を得た。以下同様にして、プラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ３−ＦＬＯ４２（１０２、１４６、または３１８）、ｐＵＥＳＣα−ＧＳ４−ＦＬＯ４２（１０２、１４６、または３１８）、およびｐＵＥＳＣα−ＧＳ５−ＦＬＯ４２（１０２、１４６、または３１８）を得た。
【００６５】
α−因子分泌型プラスミドは、プレプロ領域を含むα−因子をコードする遺伝子を、High Fidelity PCR Master（Roche）にて、配列番号１および１５に示すプライマーを用いて、S.cerevisiae ＢＹ４７４２株のゲノムから増幅した。ここで、配列番号１のプライマーはBamHI部位、および配列番号１５のプライマーはXhoI部位をそれぞれ有する。増幅したフラグメントを制限酵素BamHIおよびXhoIで消化し、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ（Stratagene）に挿入し、プラスミドｐＵＥＳＣαｓを得た。
【００６６】
（１−３：組換え酵母の作製および蛍光の確認）
上記１−１で得た欠損酵母ＢＹ４７４１株に、上記１−２のようにして得た各プラスミドを、酢酸リチウム法によって導入し、α−因子を表層に提示する酵母を得た。この酵母をウラシルを含まないＳＲＣＡ培地（ＹＮＢ（Becton Dickinson and Company製）０．６７％、ラフィノース５水和物（シグマ製）２％、カザミノ酸（ＢＤ製）２％）１００ｍＬ中でＯＤ６００＝１．０まで培養した。さらに、２％ガラクトースを加えて２４時間培養した後にサンプリングし、ＦＡＣＳにてソーティングし、ＦＬ１フィルターで蛍光を検出した。なお、陽性コントロールとして、上記１−１で得た欠損酵母株にα−因子を分泌型として発現し得るプラスミド（ｐＵＥＳＣα）を導入した実験、および陰性コントロールとして、形質転換していない欠損酵母株をα−因子を添加せずに培養するのみの実験も行った。
【００６７】
ｐＵＥＳＣα−ＧＳ５−ＡＧを導入したα−因子表層提示酵母における結果を図３に示す。陰性コントロールと比較して、α−因子表層提示酵母の方が、蛍光を発する細胞が多かった。α−因子表層提示酵母の蛍光を発する細胞数は、α−因子分泌型酵母とほぼ同等であった。さらに、α−因子を表層提示するために、ＧＳリンカーを含まないα−アグルチニンまたは種々のＦＬＯを用いた場合の結果を、図４（ａ）〜（ｄ）に示す。いずれも、陰性コントロールよりも、蛍光を発する細胞が多かった。
【００６８】
これらのことから、細胞表層に提示されたα−因子が、酵母のＧＰＣＲに結合し、シグナル伝達が行われて蛍光を発することを確認できた。特に、ＦＬＯ４２およびＦＬＯ１０２を用いると、より蛍光強度が強い細胞が多くなることもわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の方法によれば、生体機能に重要と思われるレセプターに対するアゴニストを、高効率でスクリーニングすることができる。そのため、本発明の方法は、新薬の開発に利用することができ、時間およびコストの削減が可能である。さらに、本発明の方法によれば、細胞内レセプター共役タンパク質の高効率スクリーニングも可能であり、このスクリーニングによって、生体機能の解明が促進され、このことは、治療薬または治療法の開発を促進し得る。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】アゴニストおよび細胞内レセプター共役タンパク質のスクリーニング方法のメカニズムを示す模式図である。
【図２】α−因子表層提示型プラスミドｐＵＥＳＣα−ＧＳ５−ＡＧの模式図である。（実施例１）
【図３】ｐＵＥＳＣα−ＧＳ５−ＡＧを含む組換え酵母における蛍光検出結果を示すグラフである。（実施例１）
【図４】種々の組換え酵母における蛍光検出結果を示すグラフである。（実施例１）
【図１】
2005176605.tif 000004
【図２】
2005176605.tif 000005
【図３】
2005176605.tif 000006
【図４】
2005176605.tif 000007
【配列表】
2005176605000001.app