(57)【要約】      （修正有）【課題】β−グルクロニダーゼ阻害活性を有する生薬及び化合物を探索し、天然物であるため副作用の少ないβ−グルクロニダーゼ阻害剤、引いては、膀胱癌や大腸癌の発生を低減させうる薬剤を提供する。【解決手段】木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2005162756.tif 000005
［式中、Ｒは、水素原子又は式（ＩＩ）
【化２】
2005162756.tif 000006
を示す。］で示される化合物。
【請求項２】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物を含有することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物を含有することを特徴とする膀胱癌予防薬。
【請求項４】
請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物を含有することを特徴とする大腸癌予防薬。
【請求項５】
木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害剤。
【請求項６】
木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とする膀胱癌予防薬。
【請求項７】
木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とする大腸癌予防薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、β−グルクロニダーゼ阻害活性を有する生薬及び化合物に関し、該生薬又は該化合物を用いた膀胱癌及び大腸癌の予防薬に関する。医薬品、医薬部外品、食品で利用される。
【背景技術】
【０００２】  体外より摂取され、あるいは代謝されてできた発癌性物質は、肝臓においてグルクロン酸抱合体化されることにより不活化され、尿中に排泄される。しかしながら、腸内細菌もしくは膀胱粘膜由来のβ−グルクロニダーゼにより加水分解されて再び活性型に変換され、発癌作用や腸管粘膜障害を呈することがあった（非特許文献１参照）。【０００３】
【非特許文献１】Ｂｏｙｌａｎｄ，Ｅ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｃ：Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｕｌｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｒｉｎｅ，ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ．：Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．９，６２−７９，１９５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の目的は、β−グルクロニダーゼ阻害活性を有する生薬及び化合物を探索し、天然物であるため副作用の少ないβ−グルクロニダーゼ阻害剤、引いては、膀胱癌や大腸癌の発生を低減させうる薬剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明者らは前記課題を解決するために多くの生薬のβ−グルクロニダーゼ阻害活性を探索した結果、木通をはじめとする数種の生薬がβ−グルクロニダーゼ阻害活性を有することを見出し、また、木通より抽出されるグルクロン酸誘導体が、β−グルクロニダーゼ阻害活性を示す化合物であることを見出した。【０００６】  すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）
【化３】
2005162756.tif 000002
［式中、Ｒは、水素原子又は式（ＩＩ）
【化４】
2005162756.tif 000003
を示す。］で示される化合物を提供する。【０００７】  本発明の他の態様は、式（Ｉ）で示される化合物を含有することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害剤である。
本発明の他の態様は、式（Ｉ）で示される化合物を含有することを特徴とする膀胱癌予防薬又は大腸癌予防薬である。【０００８】  また、本発明の他の態様は、木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とするβ−グルクロニダーゼ阻害剤である。
本発明の他の態様は、木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン及び黄連のうち少なくとも１種を含有することを特徴とする膀胱癌予防薬又は大腸癌予防薬である。
【発明の効果】
【０００９】  本発明により、生薬由来の副作用の少ないβ−グルクロニダーゼ阻害剤を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明において前記した各化合物は、生薬から水、極性溶媒（アルコール類など）を用いて抽出した抽出物を、従来知られているカラムクロマトグラフィー等の精製単離操作を行い、得ることができる。
式（Ｉ）で示される化合物の有効投与量はおおよそ成人１人に対して１日当たり１．５〜３．０ｇであり、好ましくは２．０〜３．０ｇである。【００１１】  本発明において各生薬は、原末のみならず、エキス等の抽出物であってもよく、その形態には特に限定はない。その有効投与量（原生薬換算量）は、おおよそ成人１人に対して１日当たり０．５〜５．０ｇであり、好ましくは１．５〜４．０ｇである。
本発明において前記各生薬及び各化合物は単独で配合するのみならず、数種を組み合わせて配合してもよい。【００１２】  本発明における「β−グルクロニダーゼ阻害剤」は、例えば、上記生薬をそのまま、あるいはエキス、または上記２種の化合物を、必要に応じて他の公知の添加剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、懸濁化剤、溶解補助剤、緩衝剤、水溶性基剤、乳化剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、消泡剤、粘稠剤、コーティング剤、着色剤、界面活性剤、可塑剤、香料などを用いて、一般的な製剤化方法により、液剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、ドライシロップ剤などの製剤とすることができ、１日１乃至数回患者に投与することができる。
【実施例】
【００１３】［生薬熱水抽出液の調製］
１３種の各生薬（木通、山梔子、大黄、連翹、竹茹、厚朴、ボクソク、牛蒡子、釣藤鉤、桂皮、荊芥、黄ゴン、黄連）１００ｇを８００ｍＬの水で４０分間煎じ、シルクの布で濾過した。その生薬に再び４００ｍＬの水を加え４０分間煎じ、濾過した後凍結乾燥させた。【００１４】［β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性の測定］
ＢＳＡ（３ｍｇ／ｍＬ）又は水、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭｐＨ６．８）、上記の各凍結乾燥エキスを水に溶解し、終濃度が２００μｇ／ｍＬとなるよう調製したサンプルを含む溶液に酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ由来β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（８．６ｕｎｉｔｓ；ＳｉｇｍａＧ−７３９６）を加え、３７℃、３０分でインキュベートした。次に、基質としてＰＮＰ−β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ  Ｎ−１６２７）を加え、３７℃、３０分でインキュベートした。その後、Ｎａ２ＣＯ３（４００ｍＭ）を加え、反応によって生成するＰＮＰ量を分光光度計を用いて、吸収波長４００ｎｍにて測定した。また吸光度は、測定値より各生薬のブランク値を引いて算出した。
その結果、各生薬は反応終濃度２００μｇ／ｍＬにおいて、５０％以上の阻害作用がみられた。特に阻害率の高かった生薬は、木通８９．０％、山梔子７８．７％、大黄７６．９％であった。それらの結果を図１に示す（図１参照）。【００１５】（２）各生薬のＩＣ５０値
阻害作用を示した１３種の生薬の、阻害活性ＩＣ５０値を測定した。中でも強い阻害活性を示した生薬は、木通、竹茹、大黄であって、それぞれのＩＣ５０値は３９．１μｇ／ｍＬ、４１．２μｇ／ｍＬ、５１．０μｇ／ｍＬであった（表１参照）。【００１６】
【表１】
2005162756.tif 000004
【００１７】  以上の結果は、生薬１３種が強いβ−グルクロニダーゼ阻害活性を有することを示す。【００１８】［β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害物質の単離・精製］
（１）木通からβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害物質の単離・精製
木通（Ａｋｅｂｉａｅ  Ｃａｕｌｉｓ）の細末１ｋｇ（乾燥重量）を熱水で１時間抽出をおこなった。得られた熱水エキスを冷却後、沈殿物をセライトで濾過した。濾液を合成吸着カラムＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０にアプライし１００％ＭｅＯＨで溶出される画分を減圧濃縮した。得られたアメ状の混合物を酢酸エチルで分配し、得られた酢酸エチル層をＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０にアプライし、１分画が８ｍＬとなるように５０％ＭｅＯＨで溶出し、４０−６０分画をＩ画分６１−１３０分画をＩＩ画分、１３１−１６０分画をＩＩＩ画分、１６１−２３０分画をＩＶ画分に分画した。それぞれ減圧下で濃縮し、Ｉ画分から１７６ｍｇ、ＩＩ画分から２．４ｇ、ＩＩＩ画分から４４４ｍｇ、ＩＶ画分から４８０ｍｇのアメ状の化合物を得た。各画分をＳｃｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０にアプライし、１分画が５ｍＬとなるように１００％ＭｅＯＨで溶出し精製をおこなった。その結果、ＩＩ画分から単一の活性化合物Ａを、ＩＩＩ画分から単一の活性化合物Ｂを得た。なお、Ｉ画分およびＩＶ画分からも強い阻害活性を示す画分が得られたが、単一の化合物を得るまでには至らなかった。それぞれのβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅに対する阻害活性（ＩＣ５０）を測定したところ、Ｉ画分から得られた混合画分は１１５．４μｇ／ｍＬ、ＩＩ画分から得られた化合物Ａは１５．２μｇ／ｍＬ．ＩＩＩ画分から得られた化合物Ｂは５．１μｇ／ｍＬ、ＩＶ画分から得られた混合画分は３．９μｇ／ｍＬであった。【００１９】（２）β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害物質の構造決定
化合物Ａは、［α］Ｄ−１２．９（ＭｅＯＨ）を示す無色アメ状物質として得られた。また、ナフトレゾルシン−硫酸反応に陽性であり、β−ｇｌｕｃｏｄｉｄａｓｅにより加水分解すると、アグリコン（ｍｐ７０−７１℃、Ｃ９Ｈ１２Ｏ３）と糖部を与えた。アグリコンは、標品との直接比較により、３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｅｔｈｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌと決定した。また、糖部はＧＣ−ＭＳ分析によりＤ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄを確認した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおけるアノメリック炭素（１０２．８７ｐｐｍ）を含む６個分の糖部分のケミカルシフトから、化合物Ａはβ−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが１モル結合していると考えられた。これらのことから化合物Ａ｀を２−（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ−１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅと決定した。【００２０】  化合物Ｂは、［α］Ｄ−３１．２（ＭｅＯＨ）を示す無色アメ状物質として得られた。化合物Ｂを０．５Ｎ  ＫＯＨでアルカリ加水分解すると、化合物Ａとｔｒａｎｓ−フェルラ酸を与えることから、化合物Ｂは、化合物Ａのｍｏｎｏ−ｆｅｒｕｌａｔｅと推察された。フェルラ酸の結合位置は、化合物Ａと化合物Ｂの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの比較において、フェネチルアルコール部分のシグナルパターンは両者とよく一致するが、グルクロン酸の５位ならびに３位が共に高磁場シフトし、４位が低磁場シフトしているアシレーションシフトが認められたことから、化合物Ｂは、２−（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ−１−Ｏ−β−Ｄ−（４−Ｏ−ｆｅｒｕｌｏｙｌ）−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅと決定した。【００２１】（化合物Ａ）
［α］Ｄ−１２．９（ＭｅＯＨ）．ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３５［Ｍ＋Ｈ］；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）２．７０（２Ｈ，ｍ，β−Ｈ），２．９２−３．４９（ｍ，ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｙ），３．５５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．６，９．２Ｈｚ，α−Ｈ），３．７１（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ３），３．８７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．０，９．２Ｈｚ，α−Ｈ），４．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ａｎｏｍｅｒｉｃ  Ｈ  ｏｆ  ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ  ａｃｄ  ｕｎｉｔ），６．６９（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，６−Ｈ），６．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２−Ｈ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−Ｈ），８．４３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，３−ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ／ｐｐｍ＝３５．１（β），５５．７（４−ＯＭｅ），６９．８（α），７１．４（Ｃ４’），７２．９（Ｃ２’），７５．２（Ｃ３’），７５．９（Ｃ５’），１０２．８（Ｃ１’），１１２．９（Ｃ５），１１６．３（Ｃ２），１１９．３（Ｃ６），１３１．３（Ｃ１），１４６．１（Ｃ４），１４６．４（Ｃ３），１７０．４（６’）【００２２】（化合物Ｂ）
［α］Ｄ−３１．２（ＭｅＯＨ）；ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２１［Ｍ＋Ｈ］；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．７４（２Ｈ，ｍ，β−Ｈ），３．３５−３．４８（ｍ，ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｙ），３．６２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．０，９．６Ｈｚ，α−Ｈ），３．７３（３Ｈ，ｓ，４−ＯＣＨ３），３．８２（３Ｈ，ｓ，３’−ＯＣＨ３），３．９１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．３，９．６Ｈｚ，α−Ｈ），４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，ａｎｏｍｅｒｉｃ  Ｈ  ｏｆ  ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ  ａｃｄ  ｕｎｉｔ），４．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，４”−Ｈ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，α’−Ｈ），６．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．１Ｈｚ，６−Ｈ），６．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２−Ｈ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５’−Ｈ），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−Ｈ），７．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．１Ｈｚ，６’−Ｈ），７．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２’−Ｈ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．７８（１Ｈ，ｓ，３−ＯＨ），９．５８（１Ｈ，ｓ，４’−ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ／ｐｐｍ＝３５．０（β），５５．７（３−ＯＭｅ’），５５．７（４−ＯＭｅ），７０．０（α），７２．４（Ｃ３’），７２．６（Ｃ４’），７３．０（Ｃ２’），７３．８（Ｃ５’），１０２．８（Ｃ１’），１１１．１（Ｃ２”），１１２．３（Ｃ５），１１４．５（α”），１１５．５（Ｃ５”），１１６．３（Ｃ２），１１９．４（Ｃ６），１２３．２（Ｃ６”），１２５．６（Ｃ１”），１３１．１（Ｃ１），１４５．３（β”），１４６．１（Ｃ４），１４６．３（Ｃ３），１４７．９（Ｃ３”），１４９．４（Ｃ４”），１７０．４（Ｃ６’）【００２３】（３）β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害活性の測定
１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有０．２Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝６．８）６５０μＬおよび大腸菌由来β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（８．６ｕｎｉｔｓ；ＳｉｇｍａＧ−７３９６）を含む反応溶液に化合物ＡおよびＢを水に溶解し調製したサンプルを加え３７℃でプレインキュベーションした。３０分後基質として０．２ｍＭ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−１６２７）を加え、３０分インキュベーションした。Ｎａ２ＣＯ３を２ｍＬ加えることにより反応を停止させ、反応により生成したＰＮＰ量を吸光波長４００ｎｍで測定した。各サンプルのβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害率はコントロールと比較することにより算出した。
その結果、化合物Ａの阻害活性（ＩＣ５０）は１５．２ｍｇ／ｍＬであった。また、化合物Ｂの阻害活性（ＩＣ５０）は５．１ｍｇ／ｍＬであった。【００２４】
【産業上の利用可能性】  本発明により、腸内細菌もしくは膀胱粘膜由来のβ−グルクロニダーゼによって加水分解され、再活性化された発癌性物質に基因する大腸癌や膀胱癌の発生を低減する医薬品・医薬部外品・食品の開発が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】１３種の生薬のβ−グルクロニダーゼ阻害率を示すグラフである。
【図１】
2005162756.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月28日(2005.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】（３）β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害活性の測定
１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  含有  ０．２Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ＝６．８）６５０μＬおよび大腸菌由来β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（８．６ｕｎｉｔｓ；ＳｉｇｍａＧ−７３９６）を含む反応溶液に化合物ＡおよびＢを水に溶解し調製したサンプルを加え３７℃でプレインキュベーションした。３０分後基質として０．２ｍＭ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−１６２７）を加え、３０分インキュベーションした。Ｎａ２ＣＯ３を２ｍＬ加えることにより反応を停止させ、反応により生成したＰＮＰ量を吸光波長４００ｎｍで測定した。各サンプルのβ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ阻害率はコントロールと比較することにより算出した。
その結果、化合物Ａの阻害活性（ＩＣ５０）は１５．２μｇ／ｍＬであった。
また、化合物Ｂの阻害活性（ＩＣ５０）は５．１μｇ／ｍＬであった。