(57)【要約】【課題】本発明は、腎細胞癌の手術除去後の転移若しくは再発を予測する方法を提供することを課題とする。【解決手段】腎細胞癌患者の腫瘍細胞におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量を正常細胞のそれと比較することによる腎細胞癌の予測方法を提供することにより課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎細胞癌患者から摘出した腎細胞癌腫瘍組織におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量と当該腎細胞癌患者から摘出した正常腎組織におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量とを比較することによる、腎細胞癌摘出後の転移若しくは再発の可能性の予測方法。
【請求項２】
インターフェロンα受容体遺伝子がインターフェロンα受容体タイプ２遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
インターフェロンα受容体遺伝子の一部又は全部のＤＮＡを増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる腎細胞癌摘出後の患者の転移若しくは再発の可能性の予測用キット。
【請求項４】
インターフェロンα受容体遺伝子がインターフェロンα受容体タイプ２遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載の予測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌の転移若しくは再発の可能性を予測する方法並びにそれを行うためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌の治療としては、腫瘍部分の外科的な手術による切除が一般的な方法であるが、患者によっては、切除後数年で、腎臓での再発、又は、肺などの他の臓器への転移が認められる場合が多い。通常、浸潤やリンパ節への転移の程度が激しく悪性度が高いと診断された腎細胞癌は、癌の転移や再発が起こりやすく、摘出手術後に、インターフェロンαなどのサイトカインや抗癌剤を投与して、手術により除去できなかった癌細胞を死滅させる治療が行われている。しかしながら、サイトカインや抗癌剤の投与は、患者への副作用が大きいことから、投与の決定に際して、癌転移や再発の可能性を予測することができる診断方法は有用である。
【０００３】
従来、癌の診断は、腫瘍の大きさや形状、組織への浸潤、リンパ節への転移の程度などで評価してランク付けして悪性度を示すことによって行われてきた。しかしながら、上記のようにランク付けする評価方法は、手術時に医師の目視により行われるため、曖昧な評価となり、また、手術後の癌の転移若しくは再発の予測が正確に行うことができるとはいえない。そこで、近年、癌患者のインターフェロンα受容体タイプ１遺伝子の発現量に着目して癌の悪性度を診断することが検討されており、その診断方法としては、例えば、腎細胞癌患者の血清中の遊離受容体を免疫学的な手法により測定する方法（非特許文献１）、肝臓癌をＲＴ−ＰＣＲによりインターフェロンα受容体タイプ１遺伝子の発現量を調べる方法（非特許文献２）がある。しかしながら、これらの方法は、腎細胞癌の手術後の転移若しくは再発の可能性を予測するものではない。
【０００４】
【非特許文献１】「腎細胞癌患者における血清可溶性ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ値の臨床的意義の検討」、伊勢田徳広、横山政好、金山博臣、大本安一、香川征、日泌尿会誌、９１巻、５号、２０００年
【非特許文献２】「インターフェロンα  レセプター  ｍＲＮＡ  エクスプレッション  イン  ア  ユナイテッド  ステイツ  サンプル  ウィッズ  プレドミナントリー  ジェノタイプ  １ａ／Ｉ  クロニック  ヘパタイティス  Ｃ  リバー  バイオプシーズ  コリレーツ  ウイッズ  レスポンス  トゥ  ＩＦＮ  セラピー（ＩＦＮ−α  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｓａｍｐｌｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ａ／Ｉ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｂｉｏｐｓｉｅｓ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＦＮ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ジェイ・マサイ（Ｊ  Ｍａｔｈａｉ）、ケイ・シモダ（Ｋ  Ｓｈｉｍｏｄａ）、ビー・エフ・バナー（Ｂ  Ｆ  Ｂａｎｎｅｒ）、エム・モリ（Ｍ  Ｍｏｒｉ）、エイチ・エル・ボンコフスキー（Ｈ  Ｌ  Ｂｏｎｋｏｖｓｋｙ）、ジー・エフ・バーナード（Ｇ  Ｆ  Ｂａｒｎａｒｄ）、ジャーナル  オブ  インターフェロン  アンド  サイトカインリサーチ、（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１９巻、１０１１乃至１０１８頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腎細胞癌の手術摘出後の患者の転移若しくは再発の可能性を予測する方法を提供することを第一の課題とする。
【０００６】
さらに本発明は、腎細胞癌の手術摘出後の患者の転移若しくは再発の可能性の予測を容易に実施することを可能とするキットを提供することを第ニの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明者等は、腎細胞癌患者から摘出された腎細胞癌腫瘍組織におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により算出し、それを当該患者の正常腎組織におけるそれと比較した。さらに、手術後数年に渡り、肺転移若しくは再発の有無を調べた。その結果、インターフェロンα受容体、とりわけ、インターフェロンα受容体タイプ２遺伝子の発現量が正常腎組織に比べて高くなるほど、腎細胞癌の手術後の転移若しくは再発が起こる可能性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、腎細胞癌腫瘍組織におけるインターフェロンα受容体遺伝子、とりわけ、インターフェロンα受容体タイプ２（ＩＦＮＡＲ２）遺伝子の発現量と正常腎組織のそれとを比較することによって、腎細胞癌の転移若しくは再発の可能性を予測することにより第一の課題を解決するものである。
【０００９】
さらに、本発明は、腎細胞癌の転移若しくは再発の可能性の予測を、インターフェロンα受容体遺伝子のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなるキットを提供することにより、第二の課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１０】
この発明によれば、腎細胞癌の転移若しくは再発の可能性を予測することができる。したがって、本発明は、腎細胞癌の手術後のサイトカインや抗癌剤投与の判断基準になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でいうインターフェロンα受容体とは、インターフェロンα又はインターフェロンβなどに特異的な受容体であり、タイプ１（ＧＥＮＢＡＮＫ  ＭＮ＿０００６２９）（以下、「ＩＦＮＡＲ１」と記載することがある。）及びタイプ２（ＧＥＮＢＡＮＫ  ＭＮ＿０００８７４）（以下、「ＩＦＮＡＲ２」と記載することがある。）の２種類の受容体が知られている。本発明においては、それら両方を用いることがができるが、ＩＦＮＡＲ２遺伝子の方が正確に予測可能なので有利に選択される。
【００１２】
インターフェロンα受容体遺伝子の発現量を調べる方法としては、通常、組織又は細胞内で発現しているインターフェロンα受容体のｍＲＮＡを抽出し、必要に応じて精製、増幅した後、適宜の公知の方法により定量することによって行われる。例えば、逆転写酵素法、ノーザンブロッティング法、サザンブロッテイング法、ハイブリダイゼーション法、マグネットビーズ法、電気泳動法、ＰＣＲ法、ＤＮＡシークエンシング法などを単独で、若しくは適宜組み合わせて行うことができる。前記定量方法としては、ＰＣＲ法、とりわけ後述するリアルタイムＰＣＲ法は、処理速度、定量精度が共に優れていることから本発明においては最も有利に用いられる。
【００１３】
インターフェロンα遺伝子の発現量を比較する方法として、通常、腎細胞癌患者から摘出された腫瘍部分を含む腎臓組織から、腎細胞癌腫瘍組織と正常腎組織を分取した後、それぞれの組織のインターフェロンα受容体遺伝子の発現量を測定し、下記の数式により、腎細胞癌腫瘍組織におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量と正常腎組織におけるそれとを比較して、インターフェロンα受容体遺伝子の発現比率（以下、「Ｔ／Ｓ値」と略記することがある）を算出する方法が挙げられる。なお、発現量の比較において、ＲＮＡ量、ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、細胞数などを単位量に設定して調整する必要がある。また、正常腎組織部分の入手が困難な場合、腎細胞癌腫瘍組織におけるグリセロアルデヒドリン酸脱水素酵素などの解糖系の酵素、又は、βアクチンなどの細胞骨格タンパク質などの発現量を内部標準にして、インターフェロンα受容体遺伝子の相対発現量を算出する方法を採用することもできる。
【００１４】
【数１】
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【００１５】
得られたＴ／Ｓ値と、手術による腎細胞癌の摘出後、２乃至４年の転移の有無を比較し、インターフェロンα受容体遺伝子の発現量と転移若しくは再発の有無を、適宜の統計的手法、例えば、マン・ホイットニーのＵ検定によって、所望の有意差水準において有意差が存在するか否かに基づいて検証した結果、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値と転移との間には相関性があることが判明した。
【００１６】
本発明でいう腎細胞癌とは、腎細胞組織に発生した悪性腫瘍を意味し、腎臓組織を原発巣とするもの及び他の組織から腎臓に転移した癌であってもよい。
【００１７】
本発明の腎細胞癌の予測方法の利用方法について一例を述べると、まず、腎細胞癌患者から腎細胞癌腫瘍組織を含む腎臓組織を摘出手術により摘出するか、あるいは少量を診断用サンプルとして摘出し、摘出した組織から腎細胞癌腫瘍組織と正常腎組織を分離し、それぞれからＲＮＡを採取する。これを鋳型にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製した後、インターフェロンα受容体遺伝子の一部又は全部を特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（配列表における配列番号１乃至４で表される塩基配列）や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを含有するＰＣＲ反応液中でインターフェロンα受容体遺伝子の一部分を増幅し、増幅ＤＮＡ量を定量してインターフェロンα受容体遺伝子の発現量を算出する。このとき、正常腎組織から調製したＲＮＡを鋳型にして逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製し、腎細胞癌腫瘍組織の場合と等量のｃＤＮＡ量を用いて、インターフェロンα受容体遺伝子の発現量を測定し、それらの測定値を前記数式に当てはめることにより、インターフェロンα受容体遺伝子の発現比率（Ｔ／Ｓ値）を求める。Ｔ／Ｓ値が高い患者ほど腎癌の転移若しくは再発する確率が高いので、腎細胞癌の転移若しくは再発を防止するためにインターフェロンαなどのサイトカインや抗癌剤を投与することが効果的であると予測できる。腎細胞癌患者の症状、手術後の状況などにより異なるが、腎細胞癌摘出手術後でのサイトカインや抗癌剤の投与を決定する目安としては、通常ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値が３以上の場合、転移若しくは再発の危険領域であると判断してサイトカインや抗癌剤の投与を決定することができる。また、Ｔ／Ｓ値が０．８乃至３の範囲内は、中間領域であり、患者の状況、他の予測結果と合わせてサイトカインや抗癌剤の投与を検討すればよい。Ｔ／Ｓ値が０．８以下、より厳密には０．４以下の場合は、ほぼ転移若しくは再発の危険性がない安全領域であると判断することができる。
【００１８】
上記のＰＣＲによる検出を簡便におこなうべく、鋳型ＤＮＡ以外の成分、すなわち、インターフェロンα受容体遺伝子を増幅するプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質のデオキシヌクレオチド三リン酸などをあらかじめ混合したＰＣＲ反応用プレミックス液を作製しておくこともできる。
【００１９】
以下、実験例をもとに、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
＜実験：腎細胞癌患者のインターフェロンα受容体遺伝子のＴ／Ｓ値と手術後の経過についての相関関係＞
腎細胞癌患者から摘出した組織から、腎細胞癌腫瘍組織と正常腎組織を各約５０ｍｇ分取し、市販のＲＮＡ調製キット（キアゲン社販売、商品名『ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ』）を使用して、常法にしたがってＲＮＡを調製した。このＲＮＡ１μｇを、別途調製した１００ｎｇのランダムヘキサマー、１００単位のマウス乳癌ウイルス逆転写酵素を含む１００μｌの反応溶液と、２５℃１０分間、４２℃３０分間反応させたのち、７０℃で１０分間処理して、反応を停止させ、ｃＤＮＡを得た。次に、ＤＮＡデータベースＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＩＦＮＡＲ１遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ  ＭＮ＿０００６２９）又はＩＦＮＡＲ２遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ  ＭＮ＿０００８７４）に開示される塩基配列を基に、ＰＣＲで特異的に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー（配列表における配列番号１乃至４で表される塩基配列を有する）を常法により作製した。さらに、常法にしたがって、リアルタイムＰＣＲ法を市販の装置（アプライドバイオシステムズ社販売、商品名『ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ７７００  シークエンス・ディテクション・システム』）を用いて行った。すなわち、２０ｎｇのｃＤＮＡ、各１００ｎＭのプライマー（ＩＦＮＡＲ１遺伝子用に配列表における配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマー、あるいは、ＩＦＮＡＲ２遺伝子用に配列表における配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマー）を水に溶解し１２．５μｌとし、それに１２．５μｌの『ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス』（アプライドバイオシステムズ社販売）を添加して反応溶液を調製した。これを、９０℃１５秒、６０℃１分を１サイクルとして、４５サイクルのＰＣＲを行った。腎細胞癌腫瘍組織と正常腎組織におけるインターフェロンα遺伝子の増幅断片の量を定量し、前記数式を適用してＴ／Ｓ値を算出した。次に、各患者の手術後２４乃至４８ヶ月までにおける、胸部Ｘ線撮影による肺への癌転移及び生存を調べた。これらの結果を表１に示す。さらに、転移の有無によりグループ分けした後、平均値及び標準偏差を算出した後、マン・ホイットニーのＵ検定を行い、有意水準ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１で有意差があるかどうか調べた。この結果を図１及び図２に示す。図中、棒状で示された値が平均値であり、線状で示された値が標準偏差である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
図１及び図２の結果が示すとおり、インターフェロンα受容体遺伝子のＴ／Ｓ値は、転移が認められた群において高い値を示した。特にＩＦＮＡＲ２遺伝子において、統計的に有為に高い（ｐ＜０．０１）Ｔ／Ｓ値を示した。したがって、インターフェロンα受容体遺伝子は、腎細胞癌の手術摘出後の転移を予測する指標とすることが可能であることが判明した。
【００２３】
また、表１において、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値が３以上の場合、転移の起こる確率は９１％（１０／１１）であり、一方、０．８以下の場合、転移が起こる確率は０％（０／２２）であった。したがって、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値が３以上の際は、インターフェロンαなどのサイトカインや抗癌剤などの投与が必要であると判断される危険領域であり、０．８以下、より厳密には０．４以下の場合は摘出手術後の処置が不要であると判断される安全領域であると考えられた。また、０．８乃至３の範囲内は、転移の起こる確率は約５０％程度であり、摘出手術後の処理は医師の判断に委ねられる中間領域であると考えられた。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
さらに、表１において、Ｔ／Ｓ値が平均値（ＩＦＮＡＲ１遺伝子では３．７１、ＩＦＮＡＲ２遺伝子では２．９０）よりも高いグループと低いグループに分けて、カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法により累積生存率を求めた。結果を図３及び図４に示す。なお、図中、「▲」はＴ／Ｓ値が低いグループ、「●」はＴ／Ｓ値が高いグループを示す。この結果、図４に示すとおり、ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値が高い場合、患者の生存率は極めて低下することが判明した。なお、生存率の低下は、腎細胞癌の転移若しくは再発によるものである。
【００２６】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
腎細胞癌患者５名（患者Ａ乃至Ｅ）から摘出した腎細胞癌腫瘍組織を含む腎臓組織から、腎細胞癌腫瘍組織と正常腎組織を５０ｍｇずつ分取し、常法にしたがって、それぞれＲＮＡを採取し、これらを鋳型にしてマウス乳癌ウイルス逆転写酵素によりｃＤＮＡを調製し、２０ｎｇ／１２．５μｌのｃＤＮＡ溶液とした。一方、ＩＦＮＡＲ２ｍＲＮＡ検出用のプライマー（配列表における配列番号３及び４）各１００ｎＭと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどを含有する『ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス』（アプライドバイオシステムズ社販売）とを混合したプレミックス反応液１２．５μｌを、上記ｃＤＮＡ溶液に添加して合計２５μｌのＰＣＲ反応溶液を調製した。これらを、リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社販売、商品名『ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ７７００  シークエンス・ディテクション・システム』）により、９０℃１５秒、６０℃１分を１サイクルとして４５サイクルのＰＣＲを行い、蛍光強度を測定し、前記数式を適用して、正常細胞に対する腫瘍細胞のＴ／Ｓ値を算出した。その結果、それぞれの腎細胞癌患者のＴ／Ｓ値については、患者Ａが０．３、患者Ｂが０．７、患者Ｃが１．５、患者Ｄが４．７、患者Ｅが９．３であった。そこで、患者Ｄ及びＥに対しては、転移の可能性が高い危険領域であると認められたので、常法に従い、３００万ＩＵ／日のインターフェロンαを１週間投与した。一方、患者Ａ及びＢに対しては転移の可能性が低い安全領域であると認められたのでインターフェロンαの投与は行わなかった。患者Ｃに対しては、中間領域と認められたが、副作用による患者への影響の方を重くみて、インターフェロンαの投与を行わなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
叙述のとおり、本発明によれば、腎細胞癌におけるインターフェロンα受容体遺伝子の発現量を調べることで、手術により腎細胞癌腫瘍組織を摘出した後の、腎細胞癌の転移若しくは再発を予測することができる。したがって、本発明を手術後における転移若しくは再発を阻止するために、インターフェロンαなどのサイトカインや抗癌剤による治療を無駄なく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＩＦＮＡＲ１遺伝子のＴ／Ｓ値の平均値と標準偏差を示す図である。
【図２】ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値の平均値と標準偏差を示す図である。
【図３】ＩＦＮＡＲ１遺伝子のＴ／Ｓ値が高いグループ（●）と低いグループ（▲）において累積生存率を示す図である。
【図４】ＩＦＮＡＲ２遺伝子のＴ／Ｓ値が高いグループ（●）と低いグループ（▲）において累積生存率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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