(57)【要約】【課題】  医薬物質、生理活性物質、或いは遺伝子や核酸のような機能性分子を生体内に導入し、その機能を効果的に発現する技術を提供すること【解決手段】  機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーを、生体内に導入し、生体内に導入した機能性分子の機能を発現する機能性分子の生体内導入発現方法において、ナノ粒子を、パルス電磁波（光）を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質から形成し、生体内に導入された該ナノ粒子にパルス電磁波からなるパルス電磁波を照射することにより、該機能性分子の機能を効果的に発現及び／又は発現を促進することができる。パルス光を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質からなるナノ粒子としては、高分子ナノ粒子、色素を含むミセル、半導体ナノ粒子、或いは金属ナノ粒子、及び／又はこれらのナノ粒子の１種類あるいは複数種類の凝集体を挙げることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーを、生体内に導入し、生体内に導入した機能性分子の機能を発現する機能性分子の生体内導入発現方法において、パルス電磁波を照射して機能性分子の機能を発現及び／又は発現を促進することを特徴とする機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２】
パルス電磁波の照射が、エックス線域、紫外域、可視域、又は近赤外域の光であることを特徴とする請求項１記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項３】
パルス電磁波の照射が、可視域から近赤外域の光であり、パルス幅がマイクロ秒からフェムト秒の間であるパルスレーザー光の照射であることを特徴とする請求項１又は２記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項４】
ナノ粒子が、パルス光を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質から形成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項５】
ナノ粒子が、高分子ナノ粒子、色素を含むミセル、半導体ナノ粒子、或いは金属ナノ粒子、及び／又はこれらのナノ粒子の１種類あるいは複数種類の凝集体であることを特徴とする請求項４記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項６】
高分子ナノ粒子が、ポリスチレン、カルボン酸修飾ラテックス、スチレン／ブタジエン共重合体、スチレン／ビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエン、又はビニルトルエン／イソブチレン共重合体からなるナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項７】
高分子ナノ粒子の大きさが、５０ｎｍから１０μｍであることを特徴とする請求項６記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項８】
色素会を含むミセルが、ポルフィリン、フタロシアニン、或いはピレンからなる水に不溶性の色素の会合体を含む界面活性剤のミセル；フェロセンをメチレン鎖に結合させた、疎水的かつ光分解性の部位を分子内に持つ界面活性剤のミセル；ポルフィリン或いはフタロシアニンからなる、フェロセンの光分解を加速する光触媒部位を分子内に持つ界面活性剤のミセル；或いは光触媒部位をもつ界面活性剤と光分解性の部位を持つ界面活性剤の混合ミセルであることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項９】
半導体ナノ粒子が、シリコン、酸化チタン、酸化インジウムからなるバンドギャップを有する半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１０】
半導体ナノ粒子の大きさが、５ｎｍから１μｍであることを特徴とする請求項９記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１１】
金属ナノ粒子が、金、銀、又は銅のナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１２】
金属ナノ粒子の大きさが、２ｎｍから１５０ｎｍであることを特徴とする請求項１１記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１３】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、機能性分子をナノ粒子の表面に直接固定することにより形成されていることを特徴とする請求項１〜１２記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１４】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、機能性分子をナノ粒子の表面修飾物質を介して固定することにより形成されていることを特徴とする請求項１〜１２記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１５】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面を、アミノ基を有するシランカップリン剤、又はスクシニイミドエステル、マレイミド、或いはアジドを用いた架橋剤で処理し、ナノ粒子表面と機能性分子の間を化学的に結合することにより形成されていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１６】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面に、１本鎖ＤＮＡ、又はペプチド核酸を固定し、これに機能性分子である核酸を固定するか、或いはチオール末端の核酸をナノ粒子表面に直接固定するかして形成されていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１７】
機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面に、カチオン性のイオンを固定することにより、アニオン性である機能性分子と静電的な相互作用によって複合体を形成させること特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１８】
カチオンが、カチオン性ポリマー、末端アミンのシランカップリング剤、或いはカチオン性部位をもつチオール化合物を用いて行なわれていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項１９】
パルス光を照射することによる機能性分子の機能の発現及び／又は発現の促進が、機能性分子の複合体からの脱離によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２０】
機能性分子とナノ粒子の複合体とからの機能性分子の脱離が、パルス光の照射によるナノ粒子の断片化、形状変化、及びナノ粒子の融合の１又は２以上の状態変化によって引き起こされることを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２１】
機能性分子とナノ粒子の複合体とからの機能性分子の脱離が、球形ではないナノ粒子の球形粒子或いは非球状粒子への形状変化、及び／又は非球形粒子凝集体の形状変化或いは単一粒子への融合により誘起されることを特徴とする請求項１９又は２０記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２２】
金ナノ粒子の表面プラズモンバンドの光吸収に起因する光反応によって機能性分子の機能の発現及び／又は発現の促進が引き起こされることを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２３】
生体親和性の高い両親媒性化合物によって被覆されたカチオン性金ナノロッドと核酸の相互作用によって形成された金ナノ粒子凝集体と、機能性分子の複合体に、近赤外パルスレーザー光を照射することによって機能性分子の金ナノロッドからの脱離を引き起こすことを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２４】
機能性分子が、医薬物質、生理活性物質、遺伝子又は核酸であることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法に用いられる機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアー。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか記載のナノ粒子に機能性分子を固定することを特徴とする機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法。
【請求項２７】
機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法において、金ナノロッド製造時に共存するカチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を金ナノロッドの分散安定性を損なわずに除去することを特徴とする、機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法。
【請求項２８】
金ナノロッド製造時に共存するカチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を、両親媒性のリン脂質共存下で、水と混和しない極性有機溶媒で抽出、除去することにより、金ナノロッドの分散安定性を損なわずに除去することを特徴とする請求項２７記載の機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に機能性分子を導入し、その機能を発現する方法、及びそのための機能性分子キャリヤー等に関する。すなわち、医薬物質、生理活性物質、又は遺伝子・核酸などの機能性分子を生体の任意の組織（臓器）に輸送し、機能を発現をする技術は、分子生物学あるいは遺伝子治療の基盤技術である。例えば、生体に投与した核酸を任意の臓器・組織で効果的に発現させるためには、核酸の生分解を抑制し、生体中へ機能性分子を導入すると共に、生体の特定部位での発現を助ける遺伝子キャリアーの利用とその発現を図ることが必須である。本発明は、遺伝子の光放出機能を有する高機能な遺伝子キャリアーを提供し、かつ、その機能性分子の機能の発現手段を提供することにより、遺伝子治療、或いはポストゲノムにおけるハイスループットな遺伝子機能解析を可能とするものである。また、本技術を生理活性薬剤にも適用することで新たなドラッグデリバリー技術（ＤＤＳ）としての応用も可能とするものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸（遺伝子）又は薬物など機能性分子を生体の任意の組織（臓器）に輸送する技術は、分子生物学或いは遺伝子治療、更には医薬等の投与のための基盤技術であり、医薬物質、生理活性物質、又は遺伝子・核酸などの機能性分子を生体に導入し、その機能性分子の機能を発現するための技術が種々開発されている。
【０００３】
近年の遺伝子治療の研究の発展に伴い、生体内に導入される機能性分子の代表的な例として、遺伝子・核酸などの機能性分子が挙げられる。遺伝子・核酸などの機能性分子を生体内に導入する技術としては、プラスミドＤＮＡ等を単独で生体内に投与する方法と、遺伝子キャリヤー分子を使用した方法とが挙げられる。プラスミドDNA等を単独で投与する方法としては、プラスミドDNAそのままを投与する方法が、最もシンプルな方法として挙げられる。しかし、この方法は、DNAの細胞内への移行には細胞膜が大きなバリアーとなっているため、何かしらの工夫によって細胞内へ移行させる必要があり、これまでに様々な方法が試みられている。
【０００４】
プラスミドDNA等を単独で投与する方法として、エレクトロポレーションが挙げられる。この方法は、細胞に電気パルスをあてることで細胞膜に一過性の孔を開け、細胞膜の透過性を上昇させることによりDNAの取込を促進させる方法で、投与遺伝子の長期発現が可能であること、理論的にはあらゆる組織に適用可能であるという長所がある。これまでにin vivoへのアプリケーションを目的として、標的組織に応じたDNAの投与量、電解質溶液のイオン強度、電気量などの様々なファクターが最適化され、電極の形状なども改良が重ねられてきている（Mol. Ther.,3:249-255,2001）。
【０００５】
また、プラスミドDNA等を単独で投与する方法として、超音波によりDNA等を細胞内への導入する方法が報告されている（Echocardiography,18:339-347,2001;J. Am．Coll.Cardiol.,37:1975-1980,2001）。この方法では、超音波照射により細胞周辺でキャビテーションが起こり、小さな気泡の生成と崩壊が繰り返され、気泡の崩壊時に発生する液体マイクロジェット流によって細胞膜に一過性の孔が開くことで細胞膜の透過性が上昇し、さらに細胞膜付近に存在するDNAや薬物がマイクロジェット流によって細胞内へ押し込まれるというメカニズムが利用されている。この方法はエレクトロポレーションのように電極を標的部位に挿入する必要がないため、体内の臓器などを標的とする場合においても非侵襲的であり、更に、マイクロバブル（造影剤）を併用することによって低いエネルギーの超音波で効率よくDNAを導入可能であることが見いだされ、今後の発展が注目されている。
【０００６】
更に、プラスミドDNA等を単独で投与する方法として、遺伝子銃を用いる方法が報告されている。この方法は、金粒子を核酸でコートし、それを高圧ヘリウムガスで直接細胞に打ち込む方法で、まさに遺伝子を弾丸として用いた銃である（Int. J. Dermatol.,39:161-170,2000;Gene Ther.,7:1132-1136）。この方法は導入するDNAのサイズに制限がないこと、一度に多くの細胞に確実にDNAを導入できること、複数の種類のDNAを同時に導入できることなど多くの利点があるが、生体への応用を考えた場合標的とする組織の表層部にしか導入できないという欠点もある。
【０００７】
また、プラスミドDNA等を単独で投与する方法として、ハイドロダイナミクスインジェクション法が報告されている。この方法は、ほぼ全血量と同量のDNA溶液を、例えばマウスの尾静脈より数秒のうちに投与する方法である（Hum. Gene Ther.,10:1735-1737;Gene Ther.6:1258-1266）。この方法は、ヒトの場合で換算すると、数秒間に数リットルもの量を投与されることになり実用的ではないが、部位を限定することで適用は可能であると考えられている。
【０００８】
一方で、遺伝子・核酸などの機能性分子を生体内に導入する技術として、キャリヤーを使用した方法が開発されている。キャリヤーを使用した遺伝子・核酸の細胞内へのデリバリー技術は、ウイルスに治療用遺伝子を組み込んで標的細胞に感染させるウイルス法と、人工化合物を遺伝子キャリアーとして用いる非ウイルス法である遺伝子キャリヤー法に分類できる。非ウイルスの遺伝子キャリヤー法では、キャリアー分子の物性コントロールによる毒性や抗原性を抑えたキャリアーデザインが可能である。しかし、導入した遺伝子の発現効率は低く、その遺伝子の発現は一過性であるという問題点がある。一方、ウイルス法はウイルスの持つ感染機構を利用しているため遺伝子の発現効率は高く、導入遺伝子の安定発現が期待できるが、ベクターとして用いたウイルスに起因すると思われる免疫性等の問題が報告されている。
【０００９】
機能性分子キャリアーの代表的な例として挙げられる遺伝子キャリアー法の非ウイルス性遺伝子キャリアーには、従来、塩基性脂質や塩基性ポリマーが主に用いられてきた。しかし、動物体内あるいは細胞内でのキャリアーの安定性や臓器選択性などの挙動とキャリアーの分子構造との相関が不明な点が多く、キャリアーとしての制御性に欠けることが指摘されている（Gene Ther. 9:1647-1652,2002）。一方、無機材料からなるナノ粒子を遺伝子キャリアーとして用いる方法も報告されている。たとえば、シリカ表面をアミン修飾したナノ粒子はプラスミドＤＮＡと複合体を形成し、更に、培養細胞へ添加すると、そのプラスミドＤＮＡからの遺伝子発現が認識されたことが報告されている（Bioconjugate Chem.11:926-932,2000）。
【００１０】
無機材料によるキャリアーの一種として、金ナノ粒子の利用も試みられている。チオコリン（ＨＳ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）で表面修飾した金ナノ粒子のＤＮＡとの結合が確認されている（Chem.Lett. 2002,1172-1173）。更に、金ナノ粒子を長鎖アルキル鎖の先に４級アミンをもつチオール化合物で作製し、そのＤＮＡ結合能を確認し、その複合体を培養細胞に添加することによって、遺伝子発現が起こることが明らかにされている。
【００１１】
最近、医薬や遺伝子・核酸の生体内への導入方法として、金コロイド、銀コロイド、銅コロイドのようなナノ粒子を用いたデリバリー手段が注目され、これらの技術について多くの開示がなされている（特開平１０−１１７７９８号公報、特開平１１−９２４０６号公報、特開２００１−２１３８０７号公報、特開２００２−３１６９５０号公報、特開２００３−２０２３３９号公報、特開２００４−６８０２０号公報、特表２００１−５１０３２７号公報、特表２００２−５３１８３０号公報）。
【００１２】
このように遺伝子キャリアーを用いた遺伝子・核酸等の生体内への導入方法については、多くの技術が開示されているが、これまでの遺伝子キャリアーは核酸等を特定の動物組織或いは細胞まで運搬することに視点が向けられており、動物組織や細胞まで運搬するは可能であるが、運搬された場所での機能性分子の発現については考慮がなされていない。すなわち、キャリアーからの核酸の脱離は機能としては織り込まれてはいない。キャリアーから脱離しない核酸は発現しないために、核酸の脱離効率は遺伝子の発現に大きな影響を与える。従来法による遺伝子デリバリー効率の低さはキャリアーからの核酸の脱離効率が低いことも原因のひとつとなっている。
【特許文献１】特開平１０−１１７７９８号公報。
【特許文献２】特開平１１−９２４０６号公報。
【特許文献３】特開２００１−２１３８０７号公報。
【特許文献４】特開２００２−３１６９５０号公報。
【特許文献５】特開２００３−２０２３３９号公報。
【特許文献６】特開２００４−６８０２０号公報。
【特許文献７】特表２００１−５１０３２７号公報。
【特許文献８】特表２００２−５３１８３０号公報。
【非特許文献１】Mol. Ther. ,3:249-255,2001。
【非特許文献２】Echocardiography,18:339-347,2001。
【非特許文献３】J. Am．Coll.Cardiol.,37:1975-1980,2001。
【非特許文献４】Int. J. Dermatol.,39:161-170,2000。
【非特許文献５】Gene Ther.,7:1132-1136。
【非特許文献６】Hum. Gene Ther.,10:1735-1737。
【非特許文献７】Gene Ther.6:1258-1266。
【非特許文献８】Gene Ther. 9:1647-1652,2002。
【非特許文献９】Bioconjugate Chem.11:926-932,2000。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、医薬物質、生理活性物質、或いは遺伝子や核酸のような機能性分子を生体内に導入し、その機能を効果的に発現する技術を提供すること、特に、機能性分子キャリヤーにナノ粒子を用い、該粒子に、医薬物質、生理活性物質、又は遺伝子や核酸などの機能性分子を固定して、生体の任意の組織（臓器）に輸送し、機能性分子の機能を効果的に発現をする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究する中で、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーを、生体内に導入し、生体内に導入した機能性分子の機能を発現する機能性分子の生体内導入発現方法において、
ナノ粒子を、パルス電磁波（パルス光）を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質から形成し、生体内に導入された該ナノ粒子にパルス電磁波を照射することにより、該機能性分子の機能を効果的に発現及び／又は発現を促進することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、機能性分子をナノ粒子を用いた機能性分子キャリアーの形で、安定的に生体内に導入し、パルス電磁波を照射して、ナノ粒子の構造変化を招来し、該構造の変化により特定部位での能動的な遺伝子や核酸或いは薬物等の機能性分子のキャリアーからの脱離を引き起こして、機能性分子の機能を効果的に発現及び／又は発現を促進することよりなるものである。
【００１５】
本発明の特定部位での能動的な遺伝子や核酸或いは薬物等の機能性分子のキャリアーからの脱離を可能とする能動的キャリアーは、機能性分子のの導入効率及び発現効率を劇的に改善する新しい機能の薬物や遺伝子のような機能性分子の導入法である。本発明において、パルス電磁波を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質からなるナノ粒子としては、高分子ナノ粒子、色素を含むミセル、半導体ナノ粒子、或いは金属ナノ粒子、及び／又はこれらのナノ粒子の１種類あるいは複数種類の凝集体を挙げることができる。また、本発明で用いられるパルス光としては、エックス線域、紫外域、可視域、又は近赤外域の光等のパルス電磁波を挙げることができる。
【００１６】
本発明の機能性分子の生体内導入発現手段について詳述すると、本発明では光（電磁波）、たとえばパルスレーザー光照射を照射することで、核酸や薬剤などの遺伝情報または薬物の機能発現を実現する。孤立ナノ粒子と機能性分子の複合体を用いる場合は、機能発現はナノ粒子の光断片化によって誘起される。すなわち、粒子の断片化（粒径の減少）に伴う機能性分子のキャリアーからの放出やナノ粒子への結合状態の変化によって機能発現が可能になる。一方、機能性分子がナノ粒子の凝集体と複合体を形成している場合は、光の照射に伴ってナノ粒子凝集体の融合が進行し、粒子の融合に伴う表面積の減少によって機能性分子の脱離が誘起される（図１）。
【００１７】
利用可能なナノ粒子は光を吸収して、断片化や凝集体の融合を起こすものであり、ポリスチレンなどの高分子ナノ粒子、水に不溶な色素会合体を含むミセル、半導体ナノ粒子、さらには貴金属ナノ粒子が利用可能である。なかでも好ましくは、吸光度の大きなＳＰ吸収を持つ金・銀・銅などの貴金属ナノ粒子が有用であり、更に好ましくは生体に対して毒性が少なく、かつ表面修飾が容易な金のナノ粒子が有用である。特に、棒状の金ナノ粒子（金ナノロッド）の凝集体と核酸との複合体は、光融合に伴う表面積の減少が大きいために機能性分子の光脱離に適している。光融合による機能性分子の脱離は、光断片化による脱離と比較すると温和な環境で反応が進行するため、機能性分子へのダメージが少なく、生体への機能性分子導入に適した方法である。
【００１８】
ナノ粒子にエックス線域・紫外域・可視域・近赤外域のパルス電磁波を照射することで、物質変化（凝集体形成・断片化・形状変化・融合）を引き起こすことが可能である。例えば、金ナノ粒子の場合は表面プラズモン（SurfacePlasmon,SP）バンドと呼ばれる大きな吸光度を持つ。ＳＰバンドに吸収された紫外光、可視光、あるいは近赤外光はすみやかに熱に交換される。このため、比較的高強度のパルスレーザー光を照射した場合は、多数の光子が１個の金ナノ粒子に吸収され、粒子の溶融や断片化を引き起こすことが報告されている（J. Phys. Chem. B,103,1226,1999;J. Appl. Phys.,35,L781,1996）。また、金ナノ粒子の凝集体にパルスレーザー光を照射すると、金ナノ粒子の融合に伴う粒径の増大が起こることも知られている（J. Phys. Chem. B,103,2589,1999;Nano. Lett.,1,365,2001）。
【００１９】
金ナノロッドは可視域と近赤外域に２つのＳＰバンドを示す。金ナノロッドの近赤外域のＳＰ吸収は非常に吸光度が大きいため、金ナノロッドは近赤外パルス電磁波による物性変化を特に引き起こしやすいナノ粒子である。近赤外域のパルス電磁波は有機物に吸収されにくく、生体への影響を最小限に押さえることができる光であるため、ナノ粒子の物性変化に伴う機能性分子の機能発現に適している。したがって、金ナノロッドは機能性分子の近赤外による機能発現により好ましいナノ粒子である。
【００２０】
パルス光源にはマイクロ秒からフェムト秒のパルスレーザー光が利用可能である。例えばＮｄ−ＹＡＧレーザー（ナノ秒、ピコ秒）の基本波（１０６４ｎｍ）、２倍波（５３２ｎｍ）、３倍波（３５５ｎｍ）、４倍波（２６６ｎｍ）およびエキシマレーザー（ナノ秒）、窒素レーザー（ナノ秒、ピコ秒）、さらにこれらのレーザー光を用いて発信させる色素レーザーまたはＯＰＯレーザーのパルス光を利用可能である。また、チタンサファイアレーザーのフェムト秒パルス、およびそのパルス光を用いたＯＰＯレーザーのフェムト秒パルス光も利用可能である。フェムト秒レーザーはナノ秒レーザーに比較して高価ではあるが、ナノ粒子の光反応を制御するという意味では有効であり、機能性分子にダメージを与えないキャリアーからの脱離を実現できる。
【００２１】
金ナノ粒子（金ナノロッド）凝集体と核酸との複合体を作成するには、核酸塩基間の水素結合を利用する（例えば、金ナノ粒子に１本鎖ＤＮＡを固定し、これに別の１本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせる）方法、さらに静電的相互作用を利用する（例えば、カチオン性高分子やカチオン性界面活性剤、あるいはカチオン性チオール化合物で金ナノ粒子を修飾し、これと核酸とを結合させ凝集体を作成する）方法を用いることができる。なかでも静電的相互作用を用いる場合は核酸を化学的に修飾する必要が無く、プラスミドそのものに適用可能であるため汎用性が高い。金ナノ粒子の凝集体と核酸が複合体を形成している場合は、光照射による融合が起こるために、粒子の表面積が減少し、効率のよい機能性分子の脱離を実現できる。
【００２２】
金ナノロッドの凝集体の場合は、凝集体を形成している複数の棒状ナノ粒子が一つの球状粒子に融合することで大きな表面積減少率が得られるため、より優れた光脱離機能を有する。ナノ粒子と核酸の混合比率を適切に設定することで、凝集体形成を制御することが可能である。また、粒子間を結合させる化合物（例えば、金ナノ粒子の場合は両末端にチオール基をもつ化合物）を用いることでも、核酸と結合した粒子凝集体を形成することが可能である。
【００２３】
金ナノロッドは合成の段階でカチオン性界面活性剤（Hexadecy trimethylammonium bromide：ＣＴＡＢ）が共存する。ＣＡＴＢは核酸への吸着性が高く、しかもＣＴＡＢが吸着した核酸は構造変化を起こすため遺伝子として機能を失う。したがって、ＣＴＡＢを金ナノロッド溶液中から取り除くことが、遺伝子キャリアーとして金ナノロッドを用いる上では必須の条件である。しかしながら、ＣＴＡＢを単純に溶液から取り除くと金ナノロッドは容易に沈殿してしまう。従来、金ナノロッド溶液から金ナノロッドの分散安定性を損ねずにＣＴＡＢを取り除く方法は知られていない。本発明では、金ナノロッド溶液中のＣＴＡＢを水と混合しない極性有機溶媒に抽出することで、ＣＴＡＢを取り除く方法を開発した。
【００２４】
すなわち具体的には本発明は、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーを、生体内に導入し、生体内に導入した機能性分子の機能を発現する機能性分子の生体内導入発現方法において、パルス電磁波を照射して機能性分子の機能を発現及び／又は発現を促進することを特徴とする機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１）や、パルス電磁波の照射が、エックス線域、紫外域、可視域、又は近赤外域の光であることを特徴とする請求項１記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２）や、パルス電磁波の照射が、可視域から近赤外域の光であり、パルス幅がマイクロ秒からフェムト秒の間であるパルスレーザー光の照射であることを特徴とする請求項１又は２記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項３）や、ナノ粒子が、パルス光を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質から形成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項４）や、ナノ粒子が、高分子ナノ粒子、色素を含むミセル、半導体ナノ粒子、或いは金属ナノ粒子、及び／又はこれらのナノ粒子の１種類あるいは複数種類の凝集体であることを特徴とする請求項４記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項５）や、高分子ナノ粒子が、ポリスチレン、カルボン酸修飾ラテックス、スチレン／ブタジエン共重合体、スチレン／ビニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエン、又はビニルトルエン／イソブチレン共重合体からなるナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項６）や、高分子ナノ粒子の大きさが、５０ｎｍから１０μｍであることを特徴とする請求項６記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項７）や、色素会を含むミセルが、ポルフィリン、フタロシアニン、或いはピレンからなる水に不溶性の色素の会合体を含む界面活性剤のミセル；フェロセンをメチレン鎖に結合させた、疎水的かつ光分解性の部位を分子内に持つ界面活性剤のミセル；ポルフィリン或いはフタロシアニンからなる、フェロセンの光分解を加速する光触媒部位を分子内に持つ界面活性剤のミセル；或いは光触媒部位をもつ界面活性剤と光分解性の部位を持つ界面活性剤の混合ミセルであることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項８）や、半導体ナノ粒子が、シリコン、酸化チタン、酸化インジウムからなるバンドギャップを有する半導体ナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項９）や、半導体ナノ粒子の大きさが、５ｎｍから１μｍであることを特徴とする請求項９記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１０）や、金属ナノ粒子が、金、銀、又は銅のナノ粒子であることを特徴とする請求項４又は５記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１１）や、金属ナノ粒子の大きさが、２ｎｍから１５０ｎｍであることを特徴とする請求項１１記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１２）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、機能性分子をナノ粒子の表面に直接固定することにより形成されていることを特徴とする請求項１〜１２記載の機能��分子の生体内導入発現方法（請求項１３）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、機能性分子をナノ粒子の表面修飾物質を介して固定することにより形成されていることを特徴とする請求項１〜１２記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１４）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面を、アミノ基を有するシランカップリン剤、又はスクシニイミドエステル、マレイミド、或いはアジドを用いた架橋剤で処理し、ナノ粒子表面と機能性分子の間を化学的に結合することにより形成されていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１５）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面に、１本鎖ＤＮＡ、又はペプチド核酸を固定し、これに機能性分子である核酸を固定するか、或いはチオール末端の核酸をナノ粒子表面に直接固定するかして形成されていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１６）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーが、ナノ粒子の表面に、カチオン性のイオンを固定することにより、アニオン性である機能性分子と静電的な相互作用によって複合体を形成させること特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１７）や、カチオンが、カチオン性ポリマー、末端アミンのシランカップリング剤、或いはカチオン性部位をもつチオール化合物を用いて行なわれていることを特徴とする請求項１４記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１８）や、パルス光を照射することによる機能性分子の機能の発現及び／又は発現の促進が、機能性分子の複合体からの脱離によって引き起こされることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項１９）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とからの機能性分子の脱離が、パルス光の照射によるナノ粒子の断片化、形状変化、及びナノ粒子の融合の１又は２以上の状態変化によって引き起こされることを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２０）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とからの機能性分子の脱離が、球形ではないナノ粒子の球形粒子或いは非球状粒子への形状変化、及び／又は非球形粒子凝集体の形状変化或いは単一粒子への融合により誘起されることを特徴とする請求項１９又は２０記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２１）や、金ナノ粒子の表面プラズモンバンドの光吸収に起因する光反応によって機能性分子の機能の発現及び／又は発現の促進が引き起こされることを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２２）や、生体親和性の高い両親媒性化合物によって被覆されたカチオン性金ナノロッドと核酸の相互作用によって形成された金ナノ粒子凝集体と、機能性分子の複合体に、近赤外パルスレーザー光を照射することによって機能性分子の金ナノロッドからの脱離を引き起こすことを特徴とする請求項１９記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２３）や、機能性分子が、医薬物質、生理活性物質、遺伝子又は核��であることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法（請求項２４）からなる。
【００２５】
また本発明は、請求項１〜２４のいずれか記載の機能性分子の生体内導入発現方法に用いられる機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアー（請求項２５）や、請求項１〜２４のいずれか記載のナノ粒子に機能性分子を固定することを特徴とする機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法（請求項２６）や、機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法において、金ナノロッド製造時に共存するカチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を金ナノロッドの分散安定性を損なわずに除去することを特徴とする、機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法（請求項２７）や、金ナノロッド製造時に共存するカチオン性界面活性剤セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を、両親媒性のリン脂質共存下で、水と混和しない極性有機溶媒で抽出、除去することにより、金ナノロッドの分散安定性を損なわずに除去することを特徴とする請求項２７記載の機能性分子とナノ粒子の複合体とからなる機能性分子キャリアーの製造方法（請求項２８）からなる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、医薬物質、生理活性物質、或いは遺伝子や核酸のような機能性分子を安定的に生体内に導入し、その機能を効果的に発現する技術を提供する。したがって、本発明の方法は、薬物等を生体内に導入し、その機能を発現させるドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）として、或いは遺伝子や核酸を生体内に導入し、遺伝子治療を行うための遺伝子や核酸の導入方法として、その利用が期待できるものである。また、本発明においては、ナノ粒子を用いた機能性分子キャリヤー法において、キャリヤーとして最も好ましいナノ粒子として挙げられる金ナノロッドの製造に際して問題となっていた、金ナノロッドの水溶液に共存するカチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ）を取り除く手段も開発し、該手段により、極めて好ましいナノ粒子キャリヤーの提供を可能とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、機能性分子とナノ粒子の複合体とから形成される機能性分子キャリアーを、生体内に導入し、生体内に導入した機能性分子の機能を発現する機能性分子の生体内導入発現方法において、ナノ粒子として、パルス電磁波を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こす物質を用い、パルス電磁波を照射して機能性分子の機能を発現及び／又は発現を促進することよりなる。該パルス電磁波を吸収して、粒子の断片化又は凝集体の融合を起こすキャリヤー物質からなるナノ粒子としては、高分子ナノ粒子、色素を含むミセル、半導体ナノ粒子、或いは金属ナノ粒子、及び／又はこれらのナノ粒子の１種類あるいは複数種類の凝集体が挙げられる。また、パルス電磁波としては、エックス線域、紫外域、可視域、又は近赤外域の光等のパルス電磁波の照射が用いられる。
【００２８】
本発明で用いる高分子ナノ粒子キャリアーは、ポリスチレン、カルボン酸修飾ラテックス、スチレン／ブタジエン共重合体、スチレン／ジベニルベンゼン共重合体、ポリビニルトルエン、あるいはビニルトルエン／イソブチルスチレン強重合体で構成される。粒子の大きさは５０ｎｍから１０μｍであり、好ましくは５００ｎｍから１μｍである。高分子ナノ粒子の物性変化に用いるパルス電磁波は紫外または可視域のパルスレーザー光が好ましい。パルス電磁波照射によって高分子ナノ粒子は断片化し、高分子ナノ粒子表面に吸着した機能性分子の脱離が誘起される。
【００２９】
利用可能な色素会合体ミセルはポルフィリン、フタロシアニン、またはピレンなどの水に不溶性の色素の会合体を含む、界面活性剤（たとえば、リン脂質（ホスファチジルコリンなど）、あるいはポリエチレングリコール鎖を親水部とする界面活性剤）のミセルあるいはベクシルであり、色素の光反応により分子集合構造が大幅に変化するものである。あるいは、疎水的かつ光分解性の部位を分子内に持つ界面活性剤、たとえばフェロセンをメチレン鎖に結合させた界面活性剤、さらにフェロセンの光分解を加速する光触媒部位を持つ界面活性剤の混合ミセルが利用可能である。色素会合体ミセルの物性変化に用いる光は、紫外、可視、あるいは近赤外域のパルス電磁波である。光照射に伴う疎水性色素の断片化、あるいは分解性色素の光分解に伴ってミセル構造が崩壊し、ミセルに吸着した機能性分子の脱離が誘起される。
【００３０】
利用可能な半導体ナノ粒子は、たとえばシリコン、酸化チタン、酸化インジウムなどのバンドギャップを有する半導体ナノ粒子であり、好ましくは光触媒性が低く、生体への影響の少ない、シリコンまたは酸化インジウムである。いずれの場合も、好ましいサイズは５ｎｍから１μｍである。半導体ナノ粒子の物性変化に用いる光は、紫外、可視、近赤外域のパルス電磁波である。高強度エックス線も利用可能である。半導体の光吸収とその後の熱的な緩和により、粒子が断片化することで、機能性分子の脱離が誘起される。
【００３１】
利用可能な金属ナノ粒子は生体に対する毒性の低い金属で構成されるものであり、好ましくはＳＰバンドを示す金、銀、または銅のナノ粒子である。いずれの場合も、好ましい粒子サイズは２ｎｍから１５０ｎｍである。金ナノ粒子の物性変化に用いる光は、紫外、可視、近赤外域のパルス光である。貴金属はエックス線の吸収効率も高いため、比較的高強度のエックス線照射も物性変化を引き起こす要因として利用可能である。金ナノ粒子の断片化、あるいは金ナノ粒子凝集体の光融合に伴う粒子表面積の減少によって機能性分子の脱離、あるいは結合様式の変化による機能発現が誘起される。
【００３２】
金ナノ粒子の断片化によって機能性分子の脱離を実現する場合に有効な照射エネルギーは、ナノ秒Ｎｄ−ＹＡＧレーザーの２倍波の場合は５００ｍＪ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2以下であり、好ましくは１０  ｍＪ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2から１５０  ｍＪ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2である。基本波の場合は２  Ｊ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2以下であり、好ましくは１００ｍＪ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2から４００ｍＪ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2である。ピコ秒の場合、２倍波では５０  Ｊ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2以下、基本波では２００  Ｊ／ｐｕｌｓｅ以下である。フェムト秒の場合は１  Ｊ／ｐｕｌｓｅ  ｃｍ2以下が適切である。いずれの場合も生体に深刻なダメージを与えない程度の強度に照射条件を設定する。金ナノ粒子凝集体の光融合体によって機能性分子の機能発現を誘起する場合は、断片化の場合の概ね１／３から３／４の強度のレーザー光強度の光を照射する。
【００３３】
キャリアーナノ粒子表面と機能性分子の間を化学的に結合し、様々な機能性分子デリバリーを実現する。たとえば、アミノ基を有するシランカップリン剤の利用やスクシニイミドエステル、マレイミド、アジドを用いた架橋が想定される。また、核酸の場合にはナノ粒子表面に１本鎖ＤＮＡを固定し、これに別の１本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることで可能である。あるいはペプチド核酸のように核酸と３本鎖を形成する分子を用いてナノ粒子表面に核酸を固定することも可能である。高分子ナノ粒子、色素含有ミセル、半導体ナノ粒子一方、貴金属ナノ粒子の場合、特に金ナノ粒子の場合はチオール末端の核酸をナノ粒子表面に直接固定することが可能である。
【００３４】
また、ナノ粒子表面にカチオン性のイオンを固定することにより、アニオン性である核酸と静電的な相互作用によって複合体を形成させることが可能である。粒子表面に固定するカチオンには、ポリエチレンイミンのようなカチオン性ポリマー、末端アミンのシランカップリング剤などが利用可能である。金ナノ粒子を用いる場合は、チオコリン（Chem. Lett. ,2002，1172-1173）のようなカチオン性部位をもつチオール化合物も有用である。
【００３５】
カチオン性ナノ粒子と核酸を混合する際にナノ粒子を過剰に加えるとナノ粒子凝集体と核酸の複合体が形成する。チオコリン修飾金ナノ粒子の場合は、金ナノ粒子：核酸の重量比率が１：５から５：１の範囲、好ましくは１：２から３：１の範囲で金ナノ粒子凝集体／核酸複合体が形成される。一方、金ナノロッドの場合は金ナノロッド：核酸の重量比率が１：５から４：１の範囲、好ましくは１：２から２：１の範囲で金ナノ粒子凝集体／核酸複合体が形成される。
【００３６】
本発明においては、ナノ粒子を用いた機能性分子キャリヤー法において、キャリヤーとして用いられる金ナノロッドの製造に際して問題となっていた、金ナノロッドの水溶液に共存するカチオン性界面活性剤（ＣＴＡＢ）を取り除く手段も同時に開発した。
金ナノロッド合成の際に共存するＣＴＡＢを除去するために、水と混和しない極性有機溶媒、好ましくはクロロホルムや塩化メチレンなどのハロゲン系溶媒を用いて、有機溶媒へのＣＴＡＢの抽出を行った。この際に、有機相と水相の両方に共存できる生体親和性の高い界面活性剤、たとえばホスファチジルコリンに代表されるリン脂質、あるいはポリエチエングリコール鎖を親水部とする界面活性剤を共存させることで、金ナノロッドの分散安定性を損なわずに金ナノロッド溶液に共存するＣＴＡＢを除去することに成功した。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
[アミノエタンチオ−ル修飾金ナノ粒子／核酸複合体の作製と光脱離]
（金ナノ粒子（Ａｕ−ＣＹＳ／ＰＥＧ粒子）の作製）
塩化金酸（１．４２ｍＭ）２０ｍｌに２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｌ（ＣＹＳ，２１３ｍＭ）１８０μｌとｍＰＥＧ−ＯＰＳＳ（Searwater Polymers社、ＰＥＧ、２ｍＭ）１０００μｌを加え、５、６分攪拌した。その後ＮａＢＨ４（２６．４ｍＭ）を５００μｌを入れて還元し、更に３０分ほど攪拌した。
【００３９】
（金ナノ粒子／核酸複合体の作製）
作成されたＡｕ−ＣＹＳ／ＰＥＧ粒子とｐＤＮＡ（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を表１の割合で順番に混ぜ、Ａｕ−ＣＹＳ／ＰＥＧ／ｐＤＮＡ複合体を作成した。複合体形成に伴う吸収スペクトルを図２に示す。Ａｕ−ＣＹＳ／ＰＥＧ粒子にｐＤＮＡを混ぜることによって、金ナノ粒子のＳＰバンドが長波長シフトするとともにバンド幅が広くなった。このことは金ナノ粒子が凝集体を形成した状態でｐＤＮＡと複合体を形成したことを意味している。１時間ほどおいた後、ＴＢＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｘ５を５μｌを加えた。電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液に３０分浸して紫外線下での泳動パターン（図３）を観察した。その結果、金ナノ粒子の存在箇所にＤＮＡの蛍光が観察された。Ａｕ−ＣＹＧ／ＰＥＧ／ｐＤＮＡ複合体が実際にできており、金ナノ粒子と金ナノ粒子の結合は電気泳動ではかい離しない強固なものであることがわかった。
【００４０】
【表１】
2005255582.tif 000002
（光照射による核酸の脱離）
前述のサンプル５の凝集体を作成し、１０４６ｎｍパルスレーザーを４種類の強度（１９９，２２４，２５１，２９３ｍＪ／ｐｕｌｓｅ）で３分間照射した。ｐＤＮＡのサンプル（ｃｏｎ１）、レーザーを照射していないサンプル（ｃｏｎ２）とともに電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液に３０分浸して、紫
外線下での泳動パターン（図４）を観察した。その結果、金ナノ粒子から放出されたｐＤＮＡ（図の矢印の箇所）を確認することができた。
【実施例２】
【００４１】
[ポリエチレンイミン修飾ナノ粒子／核酸複合体の作製と光脱離]
（金ナノ粒子（ＰＥＩ−Ａｕ）の作製）
２０ｍｇの塩化金酸と０．１４ｇのＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｉｍｉｎｅ）（ＰＥＩ）を９５ｍｌの超純水に溶解し、１０ｍｇのＮａＢＨ4５ｍｌによって還元した。一晩攪拌後、ＰＥＩ修飾金ナノ粒子（ＰＥＩ−Ａｕ）を得た。
【００４２】
（金ナノ粒子／核酸凝集体の作製と光照射による核酸の脱離）
ＰＥＩ−Ａｕ４ｍｌと１０ｍＭのシスタミン２０ｍｌを含む溶液をエバポレーションした。この溶液を水＋エタノール（１：１）の溶液に分散させ、５０００Ｇ×２０分遠心分離し、上清を除去した。沈殿物に０．２５ｍｇ／ｍｌのｐＤＮＡを２００ｌ加えた。溶液を１時間放置した後、遠心分離を数回行い、複合体を形成していないＤＮＡを除去した。複合体を０．５ｍｌのＴＢＥバッファーに分散させ、溶液に１０６４ｎｍパルスレーザーを８０ｍＪ／ｐｕｌｓｅで３０分間照射した。照射後の溶液を遠心分離し、照射前後の上清溶液にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを添加した。溶液の蛍光強度を比較した結果、複合体からＤＮＡが脱離したことが分かった。
【実施例３】
【００４３】
[金ナノロッド／核酸複合体の作製と光脱離]
（ホスファチジルコリン（ＰＣ）で修飾した金ナノロッドの作製）
ホスファチジルコリン（ＰＣ）が溶解したクロロホルム溶液（ＰＣ溶液）を調製した。金ナノロッド２ｍｌをＰＣ溶液１ｍｌに加えた。金ナノロッドは文献１に記載の方法によって三菱マテリアル株式会社によって合成されたものを使用した。溶液を攪拌して均一にした後、二相に分離するまで放置した。水相のみを取り出し、新たにＰＣ溶液１ｍｌに得られた溶液を加えた。この操作を２回繰り返し行って、溶液中とロッド表面に存在した余分なＣＴＡＢを除去した。得られたロッド溶液は遠心分離（５０００Ｇ×１０分）し、上清液を取り除いてから、超純水１００μＬに分散させた。溶液の吸収スペクトルは、ロッド特有の吸収ピークを示しており（図６）、ＣＴＡＢを取り除きＰＣで修飾した金ナノロッド（ＰＣＮＲ）が得られた。
【００４４】
（金ナノロッド／核酸複合体の作製）
作製金ナノロッド（ＰＣＮＲ）のｐＤＮＡに対する比率を変化（表２）させ、総量１０μＬになるように調製した。この溶液に５倍濃度のＴＢＥｂｕｆｆｅｒを４μＬ加え、グリセリンと水を１：１で調製したグリセリン溶液を６μＬ加えて、サンプルの総量を２０μＬにした。ロッド溶液にｐＤＮＡを添加すると、溶液は赤紫色から青紫色に変化した。この変化は、ＰＣＮＲが凝集体を形成し、ｐＤＮＡと複合体を形成したことを意味する。電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液に３０分浸して、紫外線下での泳動パターン（図７）を観察した。その結果、複合体が実際にできており、ＰＣＮＲとｐＤＮＡの結合は電気泳動ではかい離しない強固なものであることがわかった。ＰＣＮＲの量を多くするにしたがい、泳動しないｐＤＮＡの量が増加し、サンプル２以上の比率ではすべてのｐＤＮＡが泳動しなくなっている。このことからも、作製したＰＣＮＲとｐＤＮＡとの複合体（ＰＣＮＲ／ｐＤＮＡ複合体）の形成が確認できた。
【００４５】
【表２】
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（光照射による核酸の脱離）
前述のサンプル２のＰＣＮＲ／ｐＤＮＡ複合体を作成し、１０６４ｎｍパルスレーザーを５種類の強度（１００，１５０，２００，２５０，３００ｍＪ／ｐｕｌｓｅ）で１５秒間照射した。ｐＤＮＡのサンプル（ｒｅｆ）、レーザーを照射していないサンプル（０）とともに電気泳動を行い、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ溶液に３０分浸して、紫外線下での泳動パターン（図８）を観察した。その結果、２００ｍＪ／ｐｕｌｓｅ以上の強度において、金ナノロッドから放出されたｐＤＮＡを確認することができた。
【実施例４】
【００４６】
[金ナノロッド／核酸複合体からの光脱離と遺伝子発現]
ＰＣＮＲ／ｐＤＮＡ複合体を作成し、これを培養細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞（ＨｅＬａ細胞））の倍地中（ダルベッコ改変イーグル培地）に添加した（ＰＣＮＲ：１６０μＬ，ｐＤＮＡ：０．０５μｇ／μＬ    ４０  μＬ，１０倍ＰＢＳバッファー３０μＬ，培地：７０μＬ）。約１時間後、Ｎｄ−ＹＡＧレーザーの基本波（１０６４ｎｍ，１０ｎｓ，１０Ｈｚ，２ｍｉｎ，９０ｍＪ／ｐｕｌｓｅ）を照射し、その後、培地を交換した。照射後約４８時間インキュベートした後、細胞内に取り込まれたｐＤＮＡからの遺伝子（ルシフェラーゼ）発現を、ルミノメーターを用いて評価した。その結果、光照射していない場合と比較して、約１０倍の遺伝子発現が認められた。これは高効率なトランスフェクション試薬として知られているデンドリティックポリリジン第６世代（ＫＧ６：参考文献２）と比べても遜色のないものだった。また、このとき、光照射の有無での細胞由来のタンパク質量に大きな変化がなかったことから、この手法は細胞毒性も低いものであることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のナノ粒子／機能性分子複合体から光による機能性分子の脱離と機能発現の様子を示す模式図である。
【図２】本発明の実施例において、Au-CYS/PEG/pDNA複合体形成に伴う吸収スペクトル変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、Au-CYS/PEG/pDNA複合体形成と電気泳動パターンを示す図である。
【図４】本発明の実施例において、Au-CYS/PEG/pDNA複合体からのＤＮＡ光放出と電気泳動パターンを示す図である。
【図５】本発明の実施例において、レーザー照射によるＤＮＡ脱離に伴う蛍光強度の増加を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、作成した金ナノロッド（ＰＣＮＲ）の吸収スペクトルを示す図である。
【図７】本発明の実施例において、PCNR／ｐDNA複合体形成と電気泳動パターンを示す図である。
【図８】本発明の実施例において、PCNR／ｐDNA複合体からのＤＮＡ光放出と電気泳動パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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