(57)【要約】【課題】  標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるオリゴ−又はポリヌクレオチド、例えばｓｈＲＮＡ、の提供。【解決手段】  センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列を連続してこの順に含むＲＮＡ干渉用のオリゴ−又はポリヌクレオチドであって、センス配列は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列の一部と相同の配列であり、但し、５´末端塩基はグアニン、３´末端塩基はアデニン、チミン又はウラシルであり、アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、但し、５´末端及び３´末端は、センス配列の対応個所に完全に相補的であり、５´端側の７ヌクレオチド領域は、アデニン、チミン及びウラシルから選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み且つ式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）で表され、そして、前記ヌクレオチドは、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるものの４個以上の連続を含まない。【選択図】  図１９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に含むＲＮＡ干渉用のオリゴ−又はポリヌクレオチドであって、
センス配列は、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｂ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｂ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｃ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｂ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなり、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はアデニン、チミン又はウラシルであり、且つ、センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、アンチセンス配列の５´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、
ここにおいて、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、オリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項２】
センス配列及びアンチセンス配列が、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まない、請求項１に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｙ領域が、互いに相補的ではない６〜２０個のヌクレオチドを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖を形成する際にはループ部分となる、請求項１又は２に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項４】
センス配列及びアンチセンス配列が、それぞれ１３〜２８個のヌクレオチドを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項５】
さらに、アンチセンス配列の３´末端に付加された１〜３個のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を有する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項６】
センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項７】
センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその３´末端のヌクレオチド以外は同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項８】
センス配列及びアンチセンス配列の長さが、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、及び、トリミング配列とアンチセンス配列との間となるような長さである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項９】
３０〜９０個のヌクレオチドを含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１０】
アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列をこの順に含むＲＮＡ干渉用のオリゴ−又はポリヌクレオチドであって、
センス配列は、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｋ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｋ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｌ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｋ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｍ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなり、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン、チミン又はウラシルであり、センス配列の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、
ここにおいて、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、オリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１１】
センス配列及びアンチセンス配列が、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まない、請求項１０に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｙ領域が、互いに相補的ではない６〜２０個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖とセンス鎖とが二本鎖を形成する際にはループ部分となる、請求項１０又は１１に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１３】
センス配列及びアンチセンス配列が、それぞれ１３〜２８個のヌクレオチドを含む、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１４】
さらに、センス配列の３´末端に付加された１〜３個のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を有する、請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１５】
センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１６】
センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその５´末端のヌクレオチド以外は同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１７】
センス配列及びアンチセンス配列の長さが、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、及び、トリミング配列とセンス配列との間となるような長さである、請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１８】
３０〜９０個のヌクレオチドを含む、請求項１０乃至１７のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項１９】
オリゴ−又はポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のＤＮＡと、そのＤＮＡに相補的なＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ。
【請求項２１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターと、その下流に挿入された請求項２０の二本鎖ＤＮＡとを含む、組換えＤＮＡ。
【請求項２２】
遺伝子治療のために使用される、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２３】
疾患の予防に使用される、請求項２１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項２４】
オリゴ−又はポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項２５】
オリゴ−又はポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２４に記載のＲＮＡと、そのＲＮＡに相補的なＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ。
【請求項２７】
請求項２１の組換えＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞。
【請求項２８】
請求項２１の組換えＤＮＡをほ乳類細胞にトランスフェクトすることを含む、ほ乳類細胞中においてＲＮＡ干渉を生じさせる方法。
【請求項２９】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成部と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定部と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定部と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定部と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計部と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計部と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計部と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定部と
を備えるｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理装置。
【請求項３０】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程と
を含むｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させる、プログラム。
【請求項３１】
請求項３０に記載されたプログラムが記録されてなる、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項３２】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成部と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定部と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定部と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定部と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計部と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計部と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計部と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定部と
を備えるｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理装置。
【請求項３３】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程と
を含むｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させる、プログラム。
【請求項３４】
請求項３３に記載されたプログラムが記録されてなる、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターの存在下で発現される、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができるオリゴ−又はポリヌクレオチド、当該オリゴ−又はポリヌクレオチドが挿入されてなる組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞、及び当該組換えＤＮＡを用いるほ乳類細胞中においてＲＮＡ干渉を生じさせる方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、ｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理装置及びプログラムと、当該プログラムが記録されてなる記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡに依存性する転写後遺伝子沈黙化（発現抑制）のプロセスである。ＲＮＡ干渉は、１９９８年に、Ｆｉｒｅ等によって、標的遺伝子と相同のＲＮＡ及びそれと相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡを線虫の細胞にトランスフェクトしたところ、標的遺伝子が転写されなかった現象として、初めて発表された（非特許文献１、特許文献１）。しかし、このような長い二本鎖ＲＮＡの哺乳動物細胞への導入は、しばしば致命的なインターフェロン応答を引き起こすため、哺乳動物細胞における研究には困難が伴った。
【０００４】
その後、１９９９年に、Ｔｕｓｈｌ等が、標的遺伝子の配列の一部と相同の２１ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡをヒト培養細胞にトランスフェクトしたところ、標的遺伝子の特異的発現抑制が観測された、即ちＲＮＡ干渉が生じたと発表した（非特許文献２、特許文献２）。この短い二本鎖ＲＮＡは、ショート・インターフェアレンスＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれた。ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞に導入されてもインターフェロン応答を引き起こし難いことから、この発表の後、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉に関する研究が急速に進んだ。
【０００５】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の研究においては、当初は、化学合成されたｓｉＲＮＡが細胞に直接導入されていた。その後、ＲＮＡポリメラーゼをプロモーターとするプラスミド・ベクターであって、ｓｉＲＮＡのセンス配列及びアンチセンス配列に相当する配列とそれら二つの配列の間に位置する配列（スペーサー、ヘアピン、トリミング等と呼ばれている）とを有するＤＮＡが導入されてなるプラスミド・ベクターを用いる方法が提案された（非特許文献３、特許文献３）。このようなプラスミド・ベクターを用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトすると、センス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖ＲＮＡを形成し、それら二つの鎖の間に位置する部分はループ又はヘアピン部分として保持された、その一部にループ又はヘアピン構造の一本鎖部分を含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が形成される。このｓｈＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって切断されてｓｉＲＮＡとなり、核から細胞質に移動し、ＲＮＡ干渉を引き起こす。
【０００６】
一方、哺乳動物細胞においては、標的遺伝子の配列の一部と相同な配列を含む多数のｓｉＲＮＡ中の限定された一部のみが、非常に効果的なＲＮＡ干渉を引き起こすことが明らかとなりつつある。実際、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こす配列を選択するソフトウエアが開発され、また、ｓｉＲＮＡの設計法に関する発表がなされてきている。
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５１６０６２
【特許文献２】特表２００３−５２９３７４
【特許文献３】国際公開ＷＯ０３／００６４７７
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  Ａ．ら，１９９８年，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ｐ．ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ら，１９９９年，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３，  ｐ．ｐ．３１９１−３１９７
【非特許文献３】Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．ら，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９７，  ｐ．ｐ．２０５６−２０６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の如く、ｓｉＲＮＡの配列設計のために、標的遺伝子のヌクレオチド配列から、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こすことができる部分配列を選択するソフトウエアが開発されている。
【０００９】
しかし、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こすことができるｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列設計は、ｓｉＲＮＡの配列設計のための条件のみでは達成され得ない。
【００１０】
本発明は、上記の事情に鑑みて、ｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列設計を研究した結果としてなされたものであり、効果的にＲＮＡ干渉を引き起こすことができるオリゴ−又はポリヌクレオチド、当該オリゴ−又はポリヌクレオチドが挿入されてなる組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞、及び当該組換えＤＮＡを用いるほ乳類細胞中においてＲＮＡ干渉を生じさせる方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、ｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理装置及びプログラムと、当該プログラムが記録されてなる記録媒体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、効果的にＲＮＡ干渉を生じさせ得るｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列設計について検討を進めた。その結果、有効なｓｈＲＮＡには配列規則性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、以下のとおりである。
【００１４】
［１］  センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に含むＲＮＡ干渉用のオリゴ−又はポリヌクレオチドであって、
センス配列は、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｂ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｂ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｃ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｂ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなり、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はアデニン、チミン又はウラシルであり、且つ、センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、アンチセンス配列の５´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、
ここにおいて、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、オリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００１５】
［１−１］  センス配列及びアンチセンス配列が、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まない、［１］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００１６】
［１−２］  Ｙ領域が、互いに相補的ではない６〜２０個のヌクレオチドを含み、センス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖を形成する際にはループ部分となる、［１］又は［１−１］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００１７】
［１−３］  センス配列及びアンチセンス配列が、それぞれ１３〜２８個のヌクレオチドを含む、［１］、［１−１］又は［１−２］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００１８】
［１−４］  さらに、アンチセンス配列の３´末端に付加された１〜３個のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を有する、［１］又は［１−１］乃至［１−３］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００１９】
［１−５］  センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、［１］又は［１−１］乃至［１−４］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２０】
［１−６］  センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその３´末端のヌクレオチド以外は同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、［１］又は［１−１］乃至［１−４］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２１】
［１−７］  センス配列及びアンチセンス配列の長さが、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、及び、トリミング配列とアンチセンス配列との間となるような長さである、［１］又は［１−１］乃至［１−６］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２２】
［１−８］  ３０〜９０個のヌクレオチドを含む、［１］又は［１−１］乃至［１−７］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２３】
［２］  アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列をこの順に含むＲＮＡ干渉用のオリゴ−又はポリヌクレオチドであって、
センス配列は、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｋ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｋ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｌ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｋ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｍ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなり、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン、チミン又はウラシルであり、センス配列の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、
ここにおいて、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がチミン又はウラシルの４個以上の連続を含まない、オリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２４】
［２−１］  センス配列及びアンチセンス配列が、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まない、［２］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２５】
［２−２］  Ｙ領域が、互いに相補的ではない６〜２０個のヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖とセンス鎖とが二本鎖を形成する際にはループ部分となる、［２又は［２−１］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２６】
［２−３］  センス配列及びアンチセンス配列が、それぞれ１３〜２８個のヌクレオチドを含む、［２］、［２−１］又は［２−２］に記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２７】
［２−４］  さらに、センス配列の３´末端に付加された１〜３個のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を有する、［２］又は［２−１］乃至［２−３］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２８】
［２−５］  センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、［２］又は［２−１］乃至［２−４］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００２９】
［２−６］  センス配列が、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその５´末端のヌクレオチド以外は同一の配列であり、アンチセンス配列が、センス配列に完全に相補的である、［２］又は［２−１］乃至［２−４］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３０】
［２−７］  センス配列及びアンチセンス配列の長さが、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、及び、トリミング配列とセンス配列との間となるような長さである、［２］又は［２−１］乃至［２−６］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３１】
［２−８］  ３０〜９０個のヌクレオチドを含む、［２］又は［２−１］乃至［２−７］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３２】
［３］  オリゴ−又はポリヌクレオチドがＤＮＡである、［１］、［１−１］乃至［１−８］、［２］及び［２−１］乃至［２−８］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３３】
［４］  ［３］に記載のＤＮＡと、そのＤＮＡに相補的なＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ。
【００３４】
［５］  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターと、その下流に挿入された［４］の二本鎖ＤＮＡとを含む、組換えＤＮＡ。
【００３５】
［５−１］  遺伝子治療のために使用される、［５］の組換えＤＮＡ。
【００３６】
［５−２］  疾患の予防に使用される、［５］の組換えＤＮＡ。
【００３７】
［６］  オリゴ−又はポリヌクレオチドがＲＮＡである、［１］、［１−１］乃至［１−８］、［２］及び［２−１］乃至［２−８］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３８】
［７］  オリゴ−又はポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、［１］、［１−１］乃至［１−８］、［２］及び［２−１］乃至［２−８］のいずれかに記載のオリゴ−又はポリヌクレオチド。
【００３９】
［８］  ［６］に記載のＲＮＡと、そのＲＮＡに相補的なＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ。
【００４０】
［９］  ［５］の組換えＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞。
【００４１】
［１０］  ［５］の組換えＤＮＡをほ乳類細胞にトランスフェクトすることを含む、ほ乳類細胞中においてＲＮＡ干渉を生じさせる方法。
【００４２】
［１１］  （１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成手段と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定手段と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定手段と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定手段と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計手段と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計手段と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計手段と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定手段と
を備えるｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理装置。
【００４３】
［１２］  （１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程と
を含むｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させる、プログラム。
【００４４】
［１３］  ［１２］に記載されたプログラムが記録されてなる、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【００４５】
［１４］  （１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成部と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定部と、
（３）作成した部分配列情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドがシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定部と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定部と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計部と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計部と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計部と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定部と
を備えるｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理装置。
【００４６】
［１５］  （１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程と、
（４）作成した部分配列情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程と
を含むｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理方法をコンピュータに実行させる、プログラム。
【００４７】
［１６］  ［１５］に記載されたプログラムが記録されてなる、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の効果】
【００４８】
本発明により、種々の特徴を有するオリゴ−又はポリヌクレオチドが提供されたので、これにより、ｓｈＲＮＡを容易に且つ効率よく製造することが可能となる。ｓｈＲＮＡからトリミング配列部分を除去することにより、ｓｉＲＮＡを得ることができる。この本発明のｓｈＲＮＡに由来するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子に対して高いＲＮＡ干渉効果を示すと共に、標的遺伝子とは関係のない遺伝子について、ＲＮＡ干渉を生じさせる危険性が極めて小さい。即ち、このようなｓｉＲＮＡは、発現を抑制しようとする標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができる。
【００４９】
また、本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドと、それに相補的なオリゴ−又はポリヌクレオチドとからなる二本鎖ＤＮＡは、組換えＤＮＡの調製に使用することができる。
【００５０】
本発明の組換えＤＮＡは、ｓｉＲＮＡを直接細胞に導入する場合と比べて、細胞により小さなダメージしか与えことなく、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができる。したがって、本発明の組換えＤＮＡは、遺伝子治療や遺伝子の機能同定等においてＲＮＡ干渉を行う際に、有効に用いることができる。
【００５１】
本発明のトランスフェクトされた細胞は、標的遺伝子がノックダウンされており、したがって、当該標的遺伝子の示す作用等を研究する上で有用である。
【００５２】
本発明のほ乳類細胞においてＲＮＡ干渉効果を生じさせる方法によると、標的遺伝子を高い確率でノックダウンすることができる。
【００５３】
以上のように、本発明は、ＲＮＡ干渉を利用する試験、治療方法等に好適に利用することができ、哺乳類などの高等動物、特にヒトを対象としてＲＮＡ干渉を行う際に特に有効性を発揮するものである。
【００５４】
本発明のｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理装置を使用すると、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列を設計することができる。
【００５５】
本発明のプログラム又は記録媒体を使用すると、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列を設計することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
初めに、上記本発明の基礎となるｓｈＲＮＡの配列設計方法について説明する。
【００５７】
ｓｈＲＮＡの配列設計方法の第一は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターの存在下で発現される、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができ、且つ、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に含むｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、
センス配列として、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｂ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｂ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｃ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｂ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなる配列（Ａ）を選択し、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はアデニン又はウラシルであり、且つ、センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列として、センス配列に相補的な配列（Ｅ）を選択し、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、アンチセンス配列の５´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列として、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表される配列（Ｆ）を選択することを含み、
ここにおいて、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、ｓｈＲＮＡの配列設計方法である。
【００５８】
この第一のｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、センス配列が配列（Ｂ）のみからなる場合については、次のように規定することもできる。
【００５９】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターの存在下で発現される、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができるｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、
ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列から、下記規則（１）乃至（４）を充足する領域を検索することと
（１）検索された領域の３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルである、
（２）検索された領域の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンである、
（３）検索された領域の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチである、及び
（４）ヌクレオチドの数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に配置することを含み、
ここにおいて、センス配列は、検索された領域の配列と相同であり、但し、センス配列の３´末端のヌクレオチドの塩基はアデニン又はウラシルであり、その５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニンであり、
アンチセンス配列は、センス配列に相補的であり、但し、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、且つ、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、且つ、
センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、ｓｈＲＮＡの配列設計方法。
【００６０】
ｓｈＲＮＡの発現には、プラスミド等のベクターを使用する。本発明では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターを含むベクターを使用する。ここで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターには、Ｕ６プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７クラスＩＩＩプロモーター等がある。また、本発明では、特定条件下でのみ発現を誘導することができるようなプロモーター、例えばＴｅｔ誘導プロモーターも使用することができる。
【００６１】
ｓｈＲＮＡの配列設計方法の第一において設計されるｓｈＲＮＡは、センス配列部分、トリミング配列部分及びアンチセンス配列部分をこの順で有し、トリミング配列部分の少なくとも一部がループ又はヘアピンを形成でき、且つ、センス配列部分とアンチセンス配列部分とが二本鎖を形成できるものである。
【００６２】
センス配列は、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｂ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｂ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｃ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｂ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｄ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなる配列（Ａ）である。ここで、配列（Ｃ）及び配列（Ｄ）が各々０個のヌクレオチドを含む、換言すれば、配列（Ｃ）も配列（Ｄ）もないことが好ましい。
【００６３】
「標的遺伝子」とは、ＲＮＡ干渉を生じさせる対象となる遺伝子のことである。「標的遺伝子の配列（ｂ）」は、一つのコード領域であってもよいし、複数のコード領域に亘っていてもよいし、また、配列が判明したすべてのポリヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
「遺伝子」とは、遺伝情報をコードする媒体のこという。「遺伝子」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの複合体など、遺伝情報をコードする物質により構成される。
【００６５】
標的遺伝子を有する生物（目的生物）は、特に限定されず、大腸菌をはじめとする原核生物、酵母、真菌等の微生物、哺乳類をはじめとする動物、昆虫、植物等のいずれでもよい。
【００６６】
センス配列は、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｂ）であるか、当該配列（Ｂ）の３´末端に１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｃ））が付加されている配列であるか、当該配列（Ｂ）の５´末端に１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｄ））が付加されている配列であるか、又は、当該配列（Ｂ）の３´末端には１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｃ））が付加され且つその５´末端には１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｄ））が付加されている配列である。
【００６７】
「相同な配列」とは、同一の配列であるか、又は、ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲で、配列（ｂ）の一部であって選択された配列に対し、欠失、置換、挿入などの変異をがなされている配列をいう。
【００６８】
標的遺伝子の種類、配列などの条件にもよるが、許容される変異を相同性（ホモロジー）で例示すると、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズム用いて算出された数値同士を比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはＢＬＡＳＴ、ｓｓｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。
【００６９】
上記のように、センス配列においては、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部の配列に対して若干の改変が許容される。しかし、センス配列を構成するヌクレオチドの数は、配列（ｂ）の一部であって選択された配列を構成するヌクレオチドの数と同一とすることが特に好ましい。ヌクレオチドの数を同一とした場合について、改変の許容度を例示すると、改変されてよいのは、構成ヌクレオチドの、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下である。例えば、ヌクレオチド数が１９の場合、好ましくは１６以上、より好ましくは１８以上のヌクレオチドが一致することが好ましい。
【００７０】
センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はアデニン又はウラシルである。したがって、配列（ｂ）の一部であって選択された配列がこれらの条件を充足する場合はそのままでよいが、充足しない場合には、上記の変異を導入して、又は、３´末端及び／又は５´末端に１〜５個のヌクレオチドを付加して、５´末端の塩基はグアニン、３´末端の塩基はアデニン又はウラシルとする。
【００７１】
センス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。この数は、通常は１３〜２８、好ましくは１６〜２２、より好ましくは１８〜２０、特に好ましくは１９である。
【００７２】
アンチセンス配列は、センス配列に相補的な配列（Ｅ）である。ここで、「相補」とは、例えば、センス配列のヌクレオチドの塩基がアデニンの場合には、アンチセンス配列の対応個所のヌクレオチドの塩基はウラシル（ＲＮＡの場合）又はチミン（ＤＮＡの場合）であることをいうが、本明細書において「相補的」といった場合には、全てのヌクレオチドが完全に対応関係にあることのみを示すのではない。ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲で、一部に対応しないヌクレオチドが存在していてもよい。なお、「完全に相補的」という場合は、アデニンに対してはウラシル又はチミンが、グアニンに対してはシトシンが、ウラシル又はチミンに対してはアデニンが、シトシンに対してはグアニンが対応していることをいう。
【００７３】
アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的である。
【００７４】
アンチセンス配列の５´端側の７ヌクレオチド領域は、アデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチである。ここで、「リッチ」とは、特定のヌクレオチドが現れる頻度が高いことを意味する。より具体的には、７ヌクレオチド領域中に、その塩基がアデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上であるヌクレオチドが、通常は４０％以上、好ましくは５０％以上含まれることを意味する。換言すると、アンチセンス配列の５´端側の７ヌクレオチドの中、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、特に好ましくは５以上が、アデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基を含むヌクレオチドである。
【００７５】
アンチセンス配列のヌクレオチド数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。この数は、通常は１３〜２８、好ましくは１６〜２２、より好ましくは１８〜２０、特に好ましくは１９である。
トリミング配列は、センス配列とアンチセンス配列との間に位置する、塩基特異的ＲＮａｓｅ（細胞中ではＤｉｃｅｒ）で切断される配列である。したがって、使用する塩基特異的ＲＮａｓｅに対応する塩基配列を有する必要がある。また、トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含むが、そのヌクレオチド数は、好ましくは６〜４２個、より好ましくは７〜３２個、特に好ましくは８〜２２個である。
【００７６】
トリミング配列は、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）で表される。即ち、トリミング配列のセンス配列に隣接する末端のヌクレオチドの塩基は、グアニン又はシトシンであり、他方の末端、即ち、アンチセンス配列に隣接する末端は、センス配列に隣接する末端のヌクレオチドに完全に相補するヌクレオチドである。
【００７７】
Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される、０〜１０個の、好ましくは１〜８個の、さらに好ましくは２〜６個の、特に好ましくは３個のヌクレオチドを含む。Ｘ領域とＺ領域とは、それらの領域の間にあるＹ領域で折り返したときに互いに相補的である。
【００７８】
Ｙ領域は、３〜５０個の、好ましくは４〜４０個の、さらに好ましくは５〜３０個の、特に好ましくは６〜２０個の、最も好ましくは１０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない。Ｙ領域を構成するヌクレオチド中、少なくともその両末端のヌクレオチド同士は相補的ではないために、転写産物において、このＹ領域はループ又はヘアピン構造となることができる。Ｙ領域全てがループ又はヘアピン構造であってよい。あるいは、Ｙ領域は、その一部に相補的部分（転写産物において二本鎖となる部分）を有していてもよい（図１９中、ＦＬ６２０−ｍ２１２Ｌ、ＦＬ７７４−ｍ２１２Ｌ及びＦＬ８２６−ｍ２１２Ｌを参照されたい）。
【００７９】
二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、各鎖の３´末端に、通常は標的遺伝子の配列に基づくオーバーハング部（即ち、配列（ｂ）の一部であって選択された配列に隣接する部分）を有する。したがって、トリミング配列中のセンス配列に隣接する末端のヌクレオチド（Ｇ又はＣ）、又は当該ヌクレオチド（Ｇ又はＣ）とそれに続くＸ領域の５´端側の一つ以上のヌクレオチド（好ましくは、当該ヌクレオチド（Ｇ又はＣ）とそれに続くＸ領域の５´末端のヌクレオチドの二つ）は、ｓｉＲＮＡのオーバーハング部分のヌクレオチドに対応するヌクレオチドであることができる。
【００８０】
トリミング配列として、ヒトのｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−２３やｍｉＲ−２１２、のループ相当部分の配列又はそれを若干改変した配列を使用することができる。トリミング配列として、そのトリミング配列を有するｓｈＲＮＡが、核から細胞質へ排出され易く、また、核や細胞質においてＲＮａｓｅによる分解を受け難いものを選択することが好ましい。
【００８１】
センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列は、連続しているが、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含んではいけない。そのようなウラシルを含むヌクレオチドが４個以上連続する部分を含むと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターは、その部分の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間で転写を終了してしまうからである。
【００８２】
上記において、配列（Ａ）、即ちセンス配列と、配列（Ｅ）、即ちアンチセンス配列は、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まないことが好ましい。これにより、ＲＮＡ干渉の効率が、更に高まる。
【００８３】
その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張とは、センス配列やアンチセンス配列を構成するヌクレオチド数の３０％以上の数の、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドが連続する配列をいう。例えば、センス配列を構成するヌクレオチド数が１９である場合、そのようなヌクレオチドが７個以上連続する配列を含まないことが好ましい。
【００８４】
アンチセンス配列の３´末端に、１〜３個（好ましくは２個）のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を付加してもよい。このオーバーハング部分は、通常は標的遺伝子の配列に基づくオーバーハング部（即ち、配列（ｂ）の一部であって選択された配列の５´末端に隣接する部分のアンチセンス配列）である。但し、転写産物であるｓｈＲＮＡにおいては、このオーバーハング部分は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターによる転写の終了を示す、ウラシルを含むヌクレオチド２個である。
【００８５】
センス配列である配列（Ａ）として、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列を選択し、アンチセンス配列である配列（Ｅ）として、センス配列に完全に相補的である配列を選択することができる。
【００８６】
また、センス配列である配列（Ａ）として、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその３´末端の塩基以外は同一の配列を選択し、アンチセンス配列である配列（Ｅ）として、センス配列に完全に相補的である配列を選択することができる。図１６中のＣに示された配列が、この例である。
【００８７】
ｓｈＲＮＡは、細胞中ではＤｉｃｅｒによって切断され、ｓｉＲＮＡとなる。Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、及び、トリミング配列とアンチセンス配列との間となるように、センス配列及びアンチセンス配列の長さを決定することが好ましい。そのためには、センス配列及びアンチセンス配列を構成するヌクレオチドの数は、各々、通常は１３〜２８、好ましくは１６〜２２、より好ましくは１８〜２０、特に好ましくは１９である。
【００８８】
また、アンチセンス配列中、その５´末端から２番目のヌクレオチド、及び／又は、トリミング配列中、その３´末端のヌクレオチド（アンチセンス配列に隣接するヌクレオチド）が、その塩基としてアデニン又はウラシルを含むものであることが好ましい。この場合、アンチセンス配列側におけるＤｉｃｅｒによる切断部位は、アンチセンス配列の５´末端から２番目のヌクレオチドと５´末端のヌクレオチドとの間、アンチセンス配列とトリミング配列との間、又は、トリミング配列の３´末端から２番目のヌクレオチドと３´末端のヌクレオチドとの間となる。これは、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が目的とする位置からずれても、高効率でＲＮＡ干渉を生じさせるための特定の配列を有するｓｉＲＮＡが得られることを意味する。
【００８９】
ｓｈＲＮＡを構成するヌクレオチドの総数は、通常は３０〜９０個、好ましくは４０〜８０個、より好ましくは４５〜７５個である。
【００９０】
第一のｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、センス配列が配列（Ｃ）も配列（Ｄ）も含まない場合については、先ず、ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列から、下記規則（１）乃至（４）を充足する領域を検索する：
（１）検索された領域の３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルである、
（２）検索された領域の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンである、
（３）検索された領域の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチである、及び
（４）ヌクレオチドの数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【００９１】
ここで、標的遺伝子の検索された領域のヌクレオチドは、標的遺伝子のセンス鎖のヌクレオチドに基づいて記載している。
【００９２】
他の条件に関して、第一のｓｈＲＮＡの配列設計方法に関する説明中に記載したとおりである。
【００９３】
ｓｈＲＮＡの配列設計方法の第二は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターの存在下で発現される、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができ、且つ、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列をこの順に含むｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、
センス配列として、（ｉ）ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｋ）と、（ｉｉ）（ｉｉ−１）配列（Ｋ）の３´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｌ）及び（ｉｉ−２）配列（Ｋ）の５´末端に付加され且つ０〜５個のヌクレオチドを含む配列（Ｍ）からなる群から選択される少なくとも一つの配列とからなる配列（Ｊ）を選択し、ここにおいて、センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン又はウラシルであり、センス配列の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであり、且つ、センス配列のヌクレオチドの数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列として、センス配列に相補的な配列（Ｎ）を選択し、ここにおいて、アンチセンス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、且つ、アンチセンス配列のヌクレオチドの数は、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；及び
トリミング配列として、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基アデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表される配列（F）を選択することを含み、ここにおいて、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、ｓｈＲＮＡの配列設計方法である。
【００９４】
この第二のｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、センス配列が配列（Ｋ）のみの場合については、次のように規定することもできる。
【００９５】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターによって発現される、ＲＮＡ干渉を引き起こすことができるｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、
ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列から、下記規則（５）乃至（８）を充足する領域を検索することと
（５）検索された領域の３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルである、
（６）検索された領域の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンである、
（７）検索された領域の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチである、及び
（８）ヌクレオチドの数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列をこの順に配置することを含み、
ここにおいて、アンチセンス配列は、検索された領域の配列と相補的であり、但し、アンチセンス配列の３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン又はグアニンであり、その５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はアデニンであり、
センス配列は、アンチセンス配列に相補的であり、但し、センス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれアンチセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的であり、
トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、且つ、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表され、且つ、
アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列は、連続しており、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない、ｓｈＲＮＡの配列設計方法。
【００９６】
ｓｈＲＮＡの配列設計方法の第二において設計されるｓｈＲＮＡは、アンチセンス配列部分、トリミング配列部分及びセンス配列部分をこの順で有し、トリミング配列部分の少なくとも一部がループ又はヘアピンを形成し、且つ、アンチセンス配列部分とセンス配列部分とが二本鎖を形成しているものである。
【００９７】
センス配列は、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と相同の配列（Ｋ）であるか、当該配列（Ｋ）の３´末端に１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｌ））が付加されている配列であるか、当該配列（Ｋ）の５´末端に１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｍ））が付加されている配列であるか、又は、当該配列（Ｂ）の３´末端には１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｌ））が付加され且つその５´末端には１〜５個のヌクレオチド（配列（Ｍ））が付加されている配列である。センス配列において、配列（Ｌ）及び配列（Ｍ）が各々０個のヌクレオチドを含む、換言すれば、配列（Ｌ）も配列（Ｍ）もないことが好ましい。
【００９８】
相同、相補、配列の改変等については、第一の配列設計方法における説明と同様である。
【００９９】
センス配列の５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシンであり、その３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン又はウラシルである。したがって、配列（ｂ）の一部であって選択された配列がこれらの条件を充足する場合はそのままでよいが、充足しない場合には、変異を導入して、又は、３´末端及び／又は５´末端に１〜５個のヌクレオチドを付加して、５´末端のヌクレオチドの塩基はグアニン又はシトシン、３´末端のヌクレオチドの塩基はシトシン又はウラシルとする。アンチセンス配列は、センス配列に相補的な配列（Ｎ）である。
【０１００】
「アデニン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチ」、「細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数」及び「センス配列の５´末端及び３´末端のヌクレオチドは、それぞれアンチセンス配列の対応するヌクレオチドに完全に相補的である」ことについては、第一の配列設計方法における説明と同様である。
【０１０１】
また、「トリミング配列」も、第一の配列設計方法における説明と同様である。
【０１０２】
アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列は、連続しているが、この連続した配列は、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含んではいけない。
【０１０３】
センス配列中、その５´末端から２番目のヌクレオチド、及び／又は、トリミング配列中、その３´末端のヌクレオチド（センス配列に隣接するヌクレオチド）が、その塩基としてグアニン又はシトシンを含むものであることが好ましい。この場合、センス配列側におけるＤｉｃｅｒによる切断部位は、センス配列の５´末端から２番目のヌクレオチドと５´末端のヌクレオチドとの間、センス配列とトリミング配列との間、又は、トリミング配列の３´末端から２番目のヌクレオチドと３´末端のヌクレオチドとの間となる。これは、Ｄｉｃｅｒによる切断部位が目的とする位置からずれても、高効率でＲＮＡ干渉を生じさせるための特定の配列を有するｓｉＲＮＡが得られることを意味する。
【０１０４】
上記において、配列（Ｊ）、即ちセンス配列と、配列（Ｎ）、即ちアンチセンス配列は、その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張を含まないことが好ましい。これにより、ＲＮＡ干渉の効率が、更に高まる。
【０１０５】
「その塩基がグアニン及び／又はシトシンであるヌクレオチドの長い伸張」は、第一の配列設計方法における説明と同様である。
【０１０６】
センス配列の３´末端に、１〜３個（好ましくは２個）のヌクレオチドからなるオーバーハング部分を付加してもよい。このオーバーハング部分は、通常は標的遺伝子の配列に基づくオーバーハング部（即ち、配列（ｂ）の一部であって選択された配列の３´末端に隣接する部分のセンス配列）である。但し、転写産物であるｓｈＲＮＡにおいては、このオーバーハング部分は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系プロモーターによる転写の終了を示す、その塩基としてウラシルを含むヌクレオチド２個である。
【０１０７】
センス配列である配列（Ｊ）として、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部と同一の配列を選択し、アンチセンス配列である配列（Ｎ）として、センス配列に完全に相補的である配列を選択することができる。
【０１０８】
また、センス配列である配列（Ｊ）として、標的遺伝子の配列（ｂ）の一部とその５´末端の塩基以外は同一の配列を選択し、アンチセンス配列である配列（Ｎ）として、センス配列に完全に相補的である配列を選択することができる。
【０１０９】
ｓｈＲＮＡは、細胞中ではＤｉｃｅｒによって切断され、ｓｉＲＮＡとなる。Ｄｉｃｅｒによる切断部位が、トリミング配列の５´末端から数えて２番目の塩基と３番目の塩基との間、及び、トリミング配列とセンス配列との間となるように、センス配列及びアンチセンス配列の長さを決定することが好ましい。
【０１１０】
ｓｈＲＮＡを構成するヌクレオチドの総数は、通常は３０〜９０個、好ましくは４０〜８０個、より好ましくは４５〜７５個である。
【０１１１】
なお、図１９中、ＦＬ８２６−ｍ２１２Ｌが、第二の配列設計方法によって設計された例である。
【０１１２】
第二のｓｈＲＮＡの配列設計方法であって、センス配列が配列（Ｌ）も配列（Ｍ）も含まない場合については、先ず、ＲＮＡ干渉を生じさせようとしている標的遺伝子の配列から、下記規則（５）乃至（６）を充足する領域を検索する：
（５）検索された領域の３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルである、
（６）検索された領域の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンである、
（７）検索された領域の３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチである、及び
（８）ヌクレオチドの数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である；
ここで、標的遺伝子の検索された領域のヌクレオチドは、標的遺伝子のセンス鎖のヌクレオチドに基づいて記載している。
【０１１３】
他の条件に関して、第二のｓｈＲＮＡの配列設計方法に関する説明中に記載したとおりである。
【０１１４】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドは、先に、第一のｓｈＲＮＡの配列設計方法に関する説明中で言及した、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に含むもの、及び、第二のｓｈＲＮＡの配列設計方法に関する説明中で言及した、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列をこの順に含むものである。なお、センス配列部分とアンチセンス配列部分とが、水素結合によって二本鎖を形成していてもよい。
【０１１５】
このようなオリゴ−又はポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの混成体であることができる。なお、混成体は、キメラ型とも呼称されている。
【０１１６】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、その合成は、例えば、公知の酵素的又は化学的合成法によって行うことができる。
【０１１７】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、その合成は、例えば、化学合成によってもよいし、また、通常のバイオテクノロジー等の手法に従って行うこともできる。バイオテクノロジーの手法によれば、例えば、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製した後、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、二本鎖ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡを二本鎖化するなどの手法により合成することができる。
【０１１８】
なお、分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉ
ｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、
羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９
９）など、多くの標準的な実験マニュアルがある。
【０１１９】
本発明は、ＤＮＡである本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドとそれに相補的なＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡである本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドと、それに相補的なＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのような二本鎖部分と一本鎖（ループ）部分とを含むものをも提供するものである。一本鎖のＤＮＡやＲＮＡからの、二本鎖のＤＮＡやＲＮＡの合成方法は、公知である。また、本発明に基づき、ＤＮＡである本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドとそれに相補的なＲＮＡ、又は、ＲＮＡである本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドとそれに相補的なＤＮＡとからなる二本鎖も合成することができる。このような二本鎖の核酸は、ハイブリッド構造の二本鎖といわれている。
【０１２０】
本発明の組換えＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系のプロモーターを有するプラスミド等であって、そのプロモーターの下流に、本発明の二本鎖ＤＮＡが挿入されてなるものである。
【０１２１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系のプロモーターは、例えばＵ６遺伝子やＨ１遺伝子中に存在する。その例としては、Ｕ６プロモーター、Ｔ７クラスＩＩＩプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等がある。また、特定の条件下でのみ発現を誘導することができるようなプロモーター、例えばＴｅｔ誘導プロモーターも、本発明において使用することができる。
【０１２２】
本発明の組換えＤＮＡの作製に使用されるプラスミドやベクターは、特に限定されないが、ｐＳｃｉｌｅｎｃｅｒ、ｐｓＨ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＧＥ−１等が挙げられる。
【０１２３】
プラスミドやベクターは、初めからＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系のプロモーターを有するものに限定されない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系のプロモーターを有さない場合には、プラスミドやベクターの適切な位置に、後からＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写系のプロモーターを挿入すればよい。
【０１２４】
本発明の組換えＤＮＡは、上記プラスミド等の適切な位置、例えばマルチプル・クローニング・サイトに、本発明の二本鎖ＤＮＡを挿入することで作製することができる。挿入のために、二本鎖ＤＮＡの５´末端及び３´末端の外側に、クローニング・サイトが有する制限酵素切断部位の配列にマッチする配列を付加しておけばよい。
【０１２５】
本発明の組換えＤＮＡは、遺伝子治療に、また、疾患の予防に使用することができる。その投与方法は、例えば、リポソーム等を使用するドラッグ・デリバリー・システムを使用して、標的細胞に組換えＤＮＡを到達させる。
【０１２６】
本発明の組換えＤＮＡによってトランスフェクトされた細胞は、特定の標的遺伝子がノックアウトされたものである。このような細胞は、本発明の組換えＤＮＡを、公知の適切な条件下で、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする細胞にトランスフェクトさせ、適切な条件下で培養することで得られる。
【０１２７】
本発明のほ乳動物細胞中においてＲＮＡ干渉を生じさせる方法、換言すると、遺伝子の発現抑制方法は、本発明の組換えＤＮＡをほ乳動物細胞にトランスフェクトすることを含む。
【０１２８】
ここで、ほ乳動物細胞は、培養細胞、培養組織、生体のいずれであってもよい。
【０１２９】
なお、ＲＮＡ干渉を生じさせる、即ち、発現抑制をしようとする標的遺伝子（抑制標的遺伝子）を含む細胞は、ｓｈＲＮＡの配列設計において使用した標的遺伝子配列を有する生物種のものに限らずともよいが、配列設計において使用した遺伝子と抑制対象遺伝子の由来が近縁であればあるほど、特異的かつ効果的に特定遺伝子の抑制を行うことができる。
【０１３０】
ほ乳動物細胞に本発明の組換えＤＮＡをトランスフェクトする方法は公知である。
【０１３１】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドの中、センス配列が配列（Ｂ）のみである（配列（Ｃ）も配列（Ｄ）も含まない）場合であって、アンチセンス配列はセンス配列に完全に相補的であるものを選択する場合には、本発明のｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理方法を、コンピュータに実行させることができる。そのプログラム（本発明の第一のプログラム）は、少なくとも、以下の工程（１）乃至（８）を含む。
【０１３２】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程、及び
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程。
【０１３３】
上記工程（１）乃至（８）の中、工程（１）は、最初に行われる工程である。工程（２）、乃至（５）は、一連の工程であるが、これらの工程の中、工程（２）、（３）及び（４）はいずれの順序で行ってもよい。また、工程（６）は、工程（１）又は（５）の後に行う。
【０１３４】
図１に、本発明に係る第一のプログラムの例をダイアグラムで示す。
【０１３５】
工程（１）は、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する工程である。例えば図１４に示すように、標的遺伝子のヌクレオチド配列から、予め定められた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列を、その部分配列の５´末端の位置を予め定められた数ずつ、ずらしながら、順次特定していく。
【０１３６】
ここでは、ヌクレオチド配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成してもよい。
【０１３７】
また、異なる生物に由来する複数のヌクレオチド配列情報（例えば、ヒトのヌクレオチド配列情報およびマウスのヌクレオチド配列情報など）の間で共通する部分を標的遺伝子のヌクレオチド配列情報としてもよい。あるいは、同じ生物種における類似する複数のヌクレオチド配列情報の間で共通する部分を標的遺伝子のヌクレオチド配列情報としてもよい。
【０１３８】
工程（１）において、オーバーハング部位を含む部分配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分ヌクレオチド配列情報を作成してもよい。部分ヌクレオチド配列情報とオーバーハング部位含有情報とを相互に関連付けてもよい。
【０１３９】
なお、上述の予め定めた数は、オーバーハング部位を含まない場合は、通常は１３〜２８、好ましくは１６〜２２、より好ましくは１８〜２０、特に好ましくは１９である。オーバーハング部位を含まない場合が１９である場合、その数は、ヌクレオチド２個のオーバーハング部位を含む場合は２３となる。これにより、哺乳類においても細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせる配列を効率よく選択することができる。
【０１４０】
次いで、工程（１）にて作成された部分配列情報中の個々の部分配列について、工程（２）、（３）及び（４）を行う。これらの工程を行う順序は限定されない。
【０１４１】
工程（２）：部分配列の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるか否かを判定し、グアニンであるものを選択する。
【０１４２】
工程（３）：部分配列の３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるか否かを判定し、アデニン、チミン又はウラシルであるものを選択する。
【０１４３】
工程（４）：部分配列の３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるか否かを判定し、リッチであるものを選択する。「リッチ」の定義は、先に記載したとおりである。
【０１４４】
例えば工程（２）に関し、５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。工程（３）及び（４）も同様である。
【０１４５】
なお、判定対象としてオーバーハング部位を含む部分配列を使用する場合には、工程（２）乃至（４）では、オーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として用いる。
【０１４６】
工程（２）乃至（４）は、例えば、工程（２）で選択された配列についてのみ、工程（３）を行い、工程（３）で選択された配列についてのみ、工程（４）を行ってもよいし、あるいは、工程（１）で得られたすべての部分配列について、工程（２）乃至（４）を個々に行い、得られた情報（選択された配列）から、工程（２）乃至（４）のすべてにおいて選択された配列を選択してもよい。
【０１４７】
また、工程（２）乃至（４）にて選択された部分配列を、他のヌクレオチド配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）などの公的データベースで公開されているヌクレオチド配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索した結果と比較し、両者で重複する配列のみを、工程（５）に供してもよい。
【０１４８】
工程（２）乃至（４）を経て選択された配列に基づいて、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるセンス配列／アンチセンス配列を設計する（工程（５））。
【０１４９】
工程（５）では、選択された部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定する。
【０１５０】
工程（６）では、トリミング配列を決定する。トリミング配列は、５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるものであればよいので、予めこの条件に合致する配列を決定しておいて、そのような配列を一つ又は二つ以上入力してもよい。
【０１５１】
なお、オーバーハング部位を含む部分配列情報が使用された場合には、センス鎖の３´末端側のオーバーハング部位は、トリミング配列の一部（トリミング配列の５´端の部位）を構成することとなる。
【０１５２】
工程（７）では、工程（５）及び（６）で決定された配列を、センス配列、トリミング配列及びアンチセンス配列の順に連続して配置し、ＲＮＡ配列を決定する。
【０１５３】
工程（８）では、（７）で設計された配列の各々について、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含むか含まないか判定し、含まないものを選択する。
【０１５４】
これらの工程を経て、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるｓｈＲＮＡの配列が決定される。
【０１５５】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドの中、センス配列が配列（Ｋ）のみである（配列（Ｌ）も配列（Ｍ）も含まない）場合であって、アンチセンス配列はセンス配列に完全に相補的であるものを選択する場合にも、本発明のｓｈＲＮＡ配列設計のための情報処理方法を、コンピュータに実行させることができる。そのプログラム（本発明の第二のプログラム）は、少なくとも、以下の工程（１）乃至（８）を含む。
【０１５６】
（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列の情報を作成する部分配列作成工程、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定工程、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定工程、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定工程、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計工程、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計工程、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計工程、及び
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、その塩基がチミン及び／又はウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定工程。
【０１５７】
上記工程（１）乃至（８）の中、工程（１）は、最初に行われる工程である。工程（２）乃至（５）は、一連の工程であるが、これらの工程の中、工程（２）、（３）及び（４）はいずれの順序で行ってもよい。また、工程（６）は、工程（１）又は（５）の後に行う。
【０１５８】
この本発明に係る第二のプログラムの例を、図１を参照しながら説明する。
【０１５９】
工程（１）は、本発明の第一のプログラムにおける工程（１）と同様である。
【０１６０】
次いで、工程（１）にて作成された部分配列情報中の個々の部分配列について、工程（２）、（３）及び（４）を行う。これらの工程を行う順序は限定されない。
【０１６１】
工程（２）：部分配列の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する。
【０１６２】
工程（３）：部分配列の３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する。
【０１６３】
（４）部分配列の３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるか否かを判定し、リッチであるものを選択する。「リッチ」の定義は、先に記載したとおりである。
【０１６４】
例えば工程（２）に関し、５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。工程（３）及び（４）も同様である。
【０１６５】
なお、判定対象としてオーバーハング部位を含む部分配列を使用する場合には、工程（２）乃至（４）では、オーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として用いる。
【０１６６】
工程（５）及び（６）は、本発明の第一のプログラムにおける工程（５）及び（６）と同様である。
【０１６７】
工程（７）では、工程（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置し、ＲＮＡ配列を決定する。
【０１６８】
工程（８）は、本発明の第一のプログラムにおける工程（８）と同様である。
【０１６９】
これらの工程を経て、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるｓｈＲＮＡの配列が決定される。
【０１７０】
「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。コンピュータプログラムは、ＲＡＭ等にロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働する。
【０１７１】
なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。
【０１７２】
本発明は、上記プログラムが記録されてなる、コンピュータ読み取り可能な記録媒体にも関する。
【０１７３】
この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、フラッシュディスク等の任意の「可搬用の物理媒体」や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の「固定用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
【０１７４】
次に、本発明の情報処理装置について説明する。ここでは、本発明の情報処理装置を含むシステムの概要の一例を示すブロック図である図２を参照する。
【０１７５】
図２において情報処理装置１００は、概略的に、情報処理装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御部１０２、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続される通信制御インターフェース部１０４、入力装置１１２や出力装置１１４に接続される入出力制御インターフェース部１０８、及び、各種のデータベースやテーブルなどを格納する記憶部１０６を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して相互に通信可能に接続されている。そして、この情報処理装置１００と、遺伝子のヌクレオチド配列情報やタンパク質の構造情報等に関するデータベースやホモロジー検索等のプログラムを提供する外部システム２００とが、ネットワーク３００を介して通信可能に接続されてシステムが構成されている。
【０１７６】
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやテーブル（標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａ〜標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｋ）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。フレキシブル・ディスク、磁気光ディスク等の記憶媒体を介して記憶部１０６にこれらが格納されてもよい。
【０１７７】
これら記憶部１０６の各構成要素のうち、標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を格納する。図３は、標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図である。
【０１７８】
標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａに格納される情報は、図３に示すように、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を一意に識別する配列識別情報（例えば、図３の「ＮＭ＿０００５０７」）と、配列情報（例えば、図３の「ＡＴＧＧＣＴＧＡ・・・ＡＧＴＧＡ」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１７９】
また、部分配列ファイル１０６ｂは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報に由来する、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分配列の情報を格納する。図４は、部分配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図である。
【０１８０】
部分配列ファイル１０６ｂに格納される情報は、図４に示すように、部分配列情報を一意に識別する部分配列識別情報（例えば、図４の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、部分配列情報（例えば、図４の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」）と、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報（例えば、図４の「含有」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１８１】
また、判定結果ファイル（１）１０６ｃは、後述する３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂ、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃ、及び、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄにて判定された結果を格納する。図５は、判定結果ファイル（１）１０６ｃに格納される情報の一例を示す図である。
【０１８２】
判定結果ファイル（１）１０６ｃに格納される情報は、図５に示すように、部分配列識別情報（例えば、図５の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂにて判定された結果である３´末端ヌクレオチド判定結果（例えば、図５の「１」）と、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃにて判定された結果である５´末端ヌクレオチド判定結果（例えば、図５の「１」）と、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄにて判定された結果である特定ヌクレオチド含有判定結果（例えば、図５の「４」）と、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂ、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃ、及び、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄにて判定された結果を総合した結果である総合判定結果（例えば、図５の「４」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１８３】
なお、図５は、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂと、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃのそれぞれにて、「含む」と判定された場合「１」を設定し、「含まない」と判定された場合「０」を設定した場合の一例である。また、図５において、特定ヌクレオチド含有判定結果は、部分配列情報の３´端側の７個のヌクレオチドからなる配列情報に含まれる、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基の数を設定した場合の一例である。さらに、図５において、総合判定結果は、３´末端ヌクレオチド判定結果、５´末端ヌクレオチド判定結果及び特定ヌクレオチド含有判定結果の積を設定した場合の一例である。具体的には、例えば、当該積が３以下の場合は、「０」を設定してもよい。
【０１８４】
センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄは、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分ヌクレオチドを、センス配列とアンチセンス配列とで一組にした配列情報を格納する。図６は、センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図である。
【０１８５】
センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄに格納される情報は、図６に示すように、部分配列識別情報（例えば、図６の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分ヌクレオチド配列情報であるセンス配列／アンチセンス配列情報（例えば、図６の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」及び「ｇｔｇｇｇａ・・・ａｇｔａｃｃ」）であり、これらが相互に関連付けられている。
【０１８６】
また、参照配列データベース１０６ｅは、後述する同一類似塩基配列検索部１０２ｇに
てセンス配列／アンチセンス配列情報と同一又は類似のヌクレオチド配列情報を検索するために参照する配列情報を格納するデータベースである。なお、参照配列データベース１０６ｅは、インターネットを経由してアクセスする外部のヌクレオチド配列情報データベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。図７は、参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図である。
【０１８７】
参照配列データベース１０６ｅに格納される情報は、図７に示すように、参照配列識別情報（例えば、図７の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」）と、参照ヌクレオチド配
列情報（例えば、図７の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｇｃａｔｇｇ」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１８８】
また、同一類似度ファイル１０６ｆは、後述する同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇにて検索された同一又は類似のヌクレオチド配列に付された、同一類似の度合いを示す値である同一類似度を格納する。図８は、同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図である。
【０１８９】
同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報は、図８に示すように、部分配列識別情報（例えば、図８の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、参照配列識別情報（例えば、図８の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」及び「ｒｅｆ｜ＮＭ＿００３８３７．１｜」）と、同一類似度（例えば、図８の「０．５２」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１９０】
評価結果ファイル１０６ｇは、後述する無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価した結果を格納する。図９は、評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報の一例を示す図である。
【０１９１】
評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報は、図９に示すように、部分配列識別情報（例えば、図９の「ＮＭ＿０００５０７：３６」及び「ＮＭ＿０００５０７：４４１」）と、後述する総和算出部１０２ｈ１にて算出された総和（例えば、図９の「５．９」及び「１７０．８」）と、評価情報（例えば、図９の「非標的」及び「標的」）であり、これらは相互に関連付けられている。なお、図９において、「非標的」は、センス配列／アンチセンス配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にしないことを意味し、また、「標的」は、センス配列／アンチセンス配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にすることを意味する。
【０１９２】
トリミング配列ファイル１０６ｈに格納される情報は、本発明のトリミング配列の定義に合致するヌクレオチド配列である。ここに格納されたトリミング配列の中から、トリミング配列選択／ＲＮＡファイル設計部１０２ｉにて、種々の条件、例えばオーバーハング部位の配列を考慮して、選択されたセンス配列／アンチセンス配列と組み合わせるに適するトリミング配列を選択する。そして、センス配列、選択されたトリミング配列及びアンチセンス配列をこの順に並べる。
【０１９３】
ＲＮＡ配列ファイル１０６ｉに格納される情報は、トリミング配列選択／ＲＮＡファイル設計部１０２ｉにて設計されたＲＮＡ配列である。ここに格納されたＲＮＡ配列の各々について、特定ヌクレオチド不含有判定部１０２ｊにて、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含むか含まないかを判定する。含まないと判定されたものは、判定結果ファイル（２）１０６ｊに格納される。判定結果ファイル（２）１０６ｊにおいては、その塩基がウラシルであるヌクレオチドの４個以上の連続を含まないと判定されたＲＮＡ配列が、部分配列識別情報と相互に関連付けられて格納されている。
【０１９４】
標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｋは、標的遺伝子に関するアノテーション情報を格納する。なお、標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｋは、インターネットを経由してアクセスする、遺伝子に関するアノテーション情報を格納する外部のアノテーションデータベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。
【０１９５】
標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｋに格納される情報は、標的遺伝子を識
別する標的遺伝子識別情報（例えば標的遺伝子の遺伝子名、アクセッション（Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ）番号など（例えば、図３に記載の「ＮＭ＿０００５０７」）と標的遺伝子に関する簡略的な情報（例えば、「Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １」）であり、これらは相互に関連付けられている。
【０１９６】
図２において、通信制御インターフェース部１０４は、情報処理装置１００とネットワーク３００（又はルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
【０１９７】
また、図２において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力装置１１２や出力装置１１４の制御を行う。ここで、出力装置１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカを用いることができる（なお、以下においては出力装置１１４をモニタとして記載する場合がある）。また、入力装置１１２としては、キーボード、マウス及びマイク等を用いることができる。モニタも、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現する。
【０１９８】
図２において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。
【０１９９】
制御部１０２は、機能概念的に、部分配列作成部１０２ａ、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂ、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃ、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄ、センス配列／アンチセンス配列選択部１０２ｅ、オーバーハング部位付加部１０２ｆ、同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇ、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈ、トリミング配列選択／ＲＮＡ配列設計部１０２ｉ及び特定ヌクレオチド不含有判定部１０２ｊを備えて構成されている。
【０２００】
このうち、部分ヌクレオチド配列作成部１０２ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得して、その中から、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分配列情報を作成する手段である。
【０２０１】
図１０は、本発明が適用されるシステムの部分ヌクレオチド配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図であり、その構成のうち、本発明に関係する部分のみを概念的に示している。ここで、部分配列作成部１０２ａは、例えば図１０に示すように、領域指定ヌクレオチド配列作成部１０２ａ１、共通ヌクレオチド配列作成部１０２ａ２、及びオーバーハング部位含有ヌクレオチド配列作成部１０２ａ３をさらに含んで構成される。
【０２０２】
図１０において、領域指定ヌクレオチド配列作成部１０２ａ１では、ヌクレオチド配列情報の標的遺伝子のコード領域又は転写領域に対応する部位から、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分配列情報を作成する。
【０２０３】
また、共通ヌクレオチド配列作成部１０２ａ２では、異なる生物に由来する複数のヌクレオチド配列情報の間で共通する、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分配列情報を作成する。
【０２０４】
オーバーハング部位含有ヌクレオチド配列作成部１０２ａ３では、オーバーハング部位を含む部分配列情報を作成する。
【０２０５】
再び図２に戻る。３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂは、部分ヌクレオチド配列情報に含まれる各配列の３´末端のヌクレオチドの塩基が、アデニン、チミン又はウラシルであるか否かを判定する。
【０２０６】
また、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃは、部分ヌクレオチド配列情報に含まれる各配列の５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるか否かを判定する。
【０２０７】
特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄは、部分ヌクレオチド配列情報に含まれる各配列の３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるか否かを判定する。
【０２０８】
センス配列／アンチセンス配列設計部１０２ｅは、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂ、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃ及び特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｃにて判定された結果に基づいて、部分配列情報に含まれる配列から、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を選択し、その配列につき、センス配列とアンチセンス配列とを組みにして特定するする。
【０２０９】
オーバーハング部位付加部１０２ｆは、センス配列／アンチセンス配列情報中のセンス配列の５´末端、３´末端、アンチセンス配列の５´末端、３´末端の中の少なくとも一つの末端にオーバーハング部位を付加する。
【０２１０】
また、同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇは、センス配列／アンチセンス配列情報中の配列と同一又は類似のヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列情報から検索する。
【０２１１】
無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、同一又は類似のヌクレオチド配列情報に基づいて
、センス配列／アンチセンス配列情報中の配列が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する。ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、図１１に示すように、総和算出部１０２ｈ１及び総和基準評価部１０２ｈ２をさらに含んで構成される。
【０２１２】
図１１は、本発明が適用されるシステムの無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図であり、その構成のうち、本発明に関係する部分のみを概念的に示し
ている。
【０２１３】
図１１において、総和算出部１０２ｈ１は、同一又は類似のヌクレオチド配列のうち、標的遺伝子とは無関係の遺伝子のヌクレオチド配列の総数、及び、標的遺伝子とは無関係の遺伝子のヌクレオチド配列に付された同一類似の度合いを示す値（同一類似度）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段である。
【０２１４】
また、総和基準評価部１０２ｈ２は、総和算出部１０２ｈ１にて算出された総和に基づいて、センス配列／アンチセンス配列情報中の配列が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する。
【０２１５】
なお、これら各部によって行なわれる処理の詳細については、後述する。
【０２１６】
まず、メイン処理の詳細について、図１２等を参照して説明する。図１２は、上記システムにおける情報処理の主要部分（メイン処理）の一例を示すフローチャートである。
【０２１７】
情報処理装置１００は、部分配列作成部１０２ａにて行われる部分ヌクレオチド配列作成処理によって、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａの所定の記憶領域に格納し、そのヌクレオチド配列情報から、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成し、作成されたその情報を部分配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−１）。
【０２１８】
ステップＳＡ−１において、部分配列作成部１０２ａは、領域指定ヌクレオチド配列作成部１０２ａ１での処理により、ヌクレオチド配列情報の標的遺伝子のコード領域又は転写領域に対応する部位から、予め定められた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成し、作成されたその情報を部分配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２１９】
ステップＳＡ−１において、部分配列作成部１０２ａは、共通ヌクレオチド配列作成部１０２ａ２での処理により、異なる生物種に由来する複数のヌクレオチド配列情報（例えば、ヒトのヌクレオチド配列情報及びマウスのヌクレオチド配列情報など）の間で共通する、予め定めた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成し、作成されたその情報を部分配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。また、同じ生物種における類似する複数のヌクレオチド配列情報の間で共通する、予め定められた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成してもよい。
【０２２０】
ステップＳＡ−１において、部分配列作成部１０２ａは、領域指定ヌクレオチド配列作成部１０２ａ１及び共通ヌクレオチド配列作成部１０２ａ２での処理により、異なる生物種に由来する複数のヌクレオチド配列情報の間で共通する、標的遺伝子のコード領域又は転写領域中の予め定められた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成し、作成されたその情報を部分配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。また、同じ生物種において、類似する複数のヌクレオチド配列情報の間で共通する、標的遺伝子のコード領域又は転写領域中の予め定められた数のヌクレオチドからなる部分ヌクレオチド配列の集合体である部分ヌクレオチド配列情報を作成してもよい。
【０２２１】
さらに、ステップＳＡ−１において、部分配列作成部１０２ａでは、オーバーハング部位含有ヌクレオチド配列作成部１０２ａ３での処理により、オーバーハング部位を含む部分ヌクレオチド配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、部分配列作成部１０２ａでは、オーバーハング部位含有ヌクレオチド配列作成部１０２ａ３での処理により、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分配列情報を作成し、作成された部分配列情報とオーバーハング部位含有情報とを相互に関連付けて、部分配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２２２】
次いで、情報処理装置１００では、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−２）。
【０２２３】
具体的には、例えば、３´末端ヌクレオチド判定部１０２ｂでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、３´末端のヌクレオチドがの塩基アデニン、チミン又はウラシルであるときには「１」を、そうでないときには「０」を、判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２２４】
次いで、情報処理装置１００では、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−３）。
【０２２５】
具体的には、例えば、５´末端ヌクレオチド判定部１０２ｃでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を、判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２２６】
次いで、情報処理装置１００では、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、３´端側の７個のヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−４）。
【０２２７】
具体的には、例えば、特定ヌクレオチド含有判定部１０２ｄでの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の各部分配列について、３´端側の７個のヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基の数を、判定結果ファイル（１）１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２２８】
なお、「リッチ」については、先に説明したとおりである。
【０２２９】
また、ステップＳＡ−２乃至ステップＳＡ−４において、オーバーハング部位を含む部
分ヌクレオチド配列を判定する場合には、オーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象とする。
【０２３０】
次いで、情報処理装置１００では、センス配列／アンチセンス配列選択部１０２ｅでの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３及びステップＳＡ−４にて判定された結果に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報から、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を選択し、そのセンス配列とアンチセンス配列とを一組として、ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−５）。
【０２３１】
具体的には、例えば、センス配列／アンチセンス配列選択部１０２ｅでの処理により、ステップＳＡ−２にて３´末端のヌクレオチドの塩基がアデニン、チミン又はウラシルであると判定され、ステップＳＡ−３にて５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニンであると判定され、且つ、ステップＳＡ−４にて３´端側の７ヌクレオチド領域において、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであると判定された部分配列を選択し、それらの配列につき、センス配列とアンチセンス配列とを一組として、センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する。
【０２３２】
ここで、例えば、情報処理装置１００では、センス配列／アンチセンス配列選択部１０２ｅでの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３及びステップＳＡ−４にて出力される数値の積を算出し、その積の値に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分配列情報中の部分ヌクレオチド配列から、センス配列／アンチセンス配列を選択してもよい。
【０２３３】
情報処理装置１００では、オーバーハング部位付加部１０２ｆでの処理により、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列におけるいずれか一つ以上の末端にオーバーハング部位を付加した後、その付加された配列を、センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納してもよい。
【０２３４】
具体的には、例えば、情報処理装置１００では、オーバーハング部位付加部１０２ｆでの処理により、センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄに記憶されているセンス配列／アンチセンス配列情報を、末端にオーバーハング部位が付加されたセンス配列／アンチセンス配列情報に書き換えてもよい。
【０２３５】
また、情報処理装置１００では、同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇでの処理により、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列と同一又は類似のヌクレオチド配列を、他のヌクレオチド配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理により、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
【０２３６】
具体的には、例えば、同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇでの処理により、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列と同一又は類似のヌクレオチド配列を、他のヌクレオチド配列情報から、既存のホモロジー検索手法を用いて検索する。そして、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈでは、総和算出部１０２ｈ１での処理により、検索された同一又は類似のヌクレオチド配列のうち、標的遺伝子とは無関係の遺伝子のヌクレオチド配列の総数と、標的遺伝子とは無関係の遺伝子のヌクレオチド配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、さらに、総和基準評価部１０２ｈ２での処理により、算出された総和に基づいて、選択されたセンス配列／アンチセンス配列が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
【０２３７】
ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理の詳細について、図１３を参照して説明する。
【０２３８】
図１３は、上記システムにおける無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートである。
【０２３９】
先ず、情報処理装置１００では、同一類似ヌクレオチド配列検索部１０２ｇでの処理により、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列のヌクレオチド配列と同一又は類似のヌクレオチド配列を、他のヌクレオチド配列情報から、既存のホモロ
ジー検索手法を用いて検索し、選択されたセンス配列／アンチセンス配列の識別情報（図８における「部分配列識別情報」）と、検索された同一又は類似の配列の識別情報（図８における「参照配列識別情報」）と、検索された同一又は類似の配列に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びｓｓｅａｒｃｈの場合は「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）（図８における「同一類似度」）とを相互に関連付けて、同一類似度ファイル１０６ｆの所定の記憶領域に格納する。
【０２４０】
次いで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈでは、総和算出部１０２ｈ１での処理により、検索された同一又は類似の配列のうち、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の配列の総数と、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、センス配列／アンチセンス配列情報の識別情報（図９における「部分配列識別情報」）と算出された総和（図９における「総和」）とを相互に関連付けて、評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−１）。
【０２４１】
次いで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈでは、総和基準評価部１０２ｈ２での処理により、ステップＳＢ−１にて算出された総和に基づいて（例えば、ステップＳＢ−１にて算出された総和の大小などに基づいて）、選択されたセンス配列／アンチセンス配列が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価し、評価結果（図９における「非標的」及び「標的」）を評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−２）。
【０２４２】
本発明のオリゴ−又はポリヌクレオチドは、センス配列、アンチセンス配列に加えてトリミング配列を有する。よって、トリミング配列選択／ＲＮＡ配列設計部１０２ｉにて、トリミング配列ファイル１０６ｈから、トリミング配列を選択するか、又は、本発明におけるトリミング配列の諸条件を充足するトリミング配列を設計し（ステップＳＡ−５）、次に、ステップＳＡ−５にて選択されたセンス配列／アンチセンス配列の各組について、センス配列、トリミング配列、アンチセンス配列の順に並べてＲＮＡ配列とする（ＲＮＡ配列の設計、ステップＳＡ−７）。一組のセンス配列／アンチセンス配列について、２種以上のトリミング配列の各々を組合わせ、２種以上のＲＮＡ配列を設計してもよい。このようにして設計されたＲＮＡ配列は、情報処理装置のＲＮＡ配列ファイル１０６ｉの記憶領域に格納される。
【０２４３】
なお、センス配列の３´末端やアンチセンス配列の５´末端の外側にオーバーハング部位がある場合には、それらのオーバーハング部位は、トリミング配列の一部となる。
【０２４４】
最後に、ＲＮＡ配列ファイル１０６ｉに格納された配列それぞれについて、その塩基がウラシルであるヌクレオチドが４個以上連続する領域があるか否かを判定し、その結果を判定結果ファイル（２）１０６ｊの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−８）。判定結果ファイル（２）には、そのような領域がないＲＮＡ配列のみを格納してもよいし、判定したすべての配列を、判定結果（そのような領域が「ない」、「ある」）と共に格納してもよい。
【０２４５】
これにて、メイン処理が終了する。
【０２４６】
これまで、本発明に係る情報処理装置の一例について説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されない。
【０２４７】
上においては、主として情報処理装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合について説明したが、システムとして処理を行う形態、例えば、情報処理装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果をクライアント端末に返却するような構成であってもよい。具体的には、例えば、クライアント端末はＲＮＡ干渉の標的遺伝子の名称（例えば遺伝子名、アクセッション番号など）又は標的遺伝子に係るヌクレオチド配列情報を情報処理装置１００に送信し、情報処理装置１００は、その名称に対応するヌクレオチド配列情報又はクライアント端末より送信されたヌクレオチド配列情報に対して制御部１０２で行われる上述した各処理を行い、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ配列を選択し、その情報をクライアント端末に送信してもよい。この場合、例えば、クエリーの遺伝子に対して公共データベースから配列情報を取得してＲＮＡ配列を選択してもよい。
【０２４８】
また、情報処理装置１００に、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対するセンス配列／アンチセンス配列の特異性を確認させてもよい。これにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ配列情報を選出することができる。
【０２４９】
クライアント端末と情報処理装置１００とで構成されるシステムの場合には、例えば、Ｗｅｂページの利用者から、ｓｈＲＮＡのＲＮＡ干渉効果の結果をＷｅｂ上でフィードバックしてもらい、利用者からフィードバックされた実験例を情報処理装置１００に蓄積して上述したＲＮＡ干渉に有効なｓｈＲＮＡの配列規則性を改善するための、インターフェース機能を導入してもよい。
【０２５０】
また、情報処理装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理端末にプリンタやモニタやイメージスキャナ等の周辺装置を接続し、その情報処理端末に本発明のプログラムを走らせるソフトウェアを実装することにより実現してもよい。
【０２５１】
ネットワーク３００は、情報処理装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有する。そのようなネットワーク３００として、例えば、インターネット、イントラネット、ＬＡＮ（有線／無線の双方を含む）、ＶＡＮ、パソコン通信網、公衆電話網（アナログ／デジタルの双方を含む）、専用回線網（アナログ／デジタルの双方を含む）、ＣＡＴＶ網、ＩＭＴ２０００方式、ＧＳＭ方式又はＰＤＣ／ＰＤＣ−Ｐ方式等の携帯回線交換網／携帯パケット交換網、無線呼出網、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ等の局所無線網、ＰＨＳ網、ＣＳ、ＢＳ又はＩＳＤＢ等の衛星通信網等のうちいずれかを含んでもよい。
【０２５２】
本発明の第二の情報処理装置、即ち、（１）ＲＮＡ干渉の標的遺伝子のヌクレオチド配列情報を取得し、この配列情報から、予め定めた数の連続するヌクレオチドからなる部分配列情報を作成する部分配列作成部と、
（２）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その５´末端のヌクレオチドの塩基がグアニン又はシトシンであるものを選択する５´末端ヌクレオチド判定部と、
（３）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、その３´末端のヌクレオチドの塩基がシトシン、チミン又はウラシルであるものを選択する３´末端ヌクレオチド判定部と、
（４）作成した部分配列の情報中に含まれる部分配列から、３´端側の７ヌクレオチド中に、アデニン、チミン及びウラシルからなる群より選ばれる１種以上の塩基がリッチであるものを選択する特定ヌクレオチド含有判定部と、
（５）上記（２）、（３）及び（４）の全てで選択された部分配列の各々について、その部分配列と同一のセンス配列と、そのセンス配列に完全に相補するアンチセンス配列とを決定するセンス配列／アンチセンス配列設計部と、
（６）５〜５２個のヌクレオチドを含み、式：（Ｇ又はＣ）−Ｘ−Ｙ−Ｚ−（Ｃ又はＧ）［式中、両末端のヌクレオチドは互いに完全に相補的であり、Ｘ領域とＺ領域は、それぞれ、その塩基がアデニン、チミン、ウラシル、グアニン及びシトシンからなる群から選択される０〜１０個のヌクレオチドを含み、且つ、トリミング配列をＹ領域で折り返したときに互いに相補的であり、Ｙ領域は、３〜５０個のヌクレオチドを含み、且つ、少なくともＹ領域の両末端のヌクレオチド同士は相補的ではない］で表されるトリミング配列を決定するトリミング配列設計部と、
（７）（５）及び（６）で決定された配列を、アンチセンス配列、トリミング配列及びセンス配列の順に連続して配置するＲＮＡ配列設計部と、
（８）（７）で設計されたＲＮＡ配列の中から、チミン又はウラシルの４個以上の連続を含まない配列を選択する特定ヌクレオチド不含有判定部と
を備えるｓｈＲＮＡの配列設計のための情報処理装置については、詳細な説明は省略する。
【０２５３】
この第二の情報処理装置は、判定に使用されるヌクレオチドの種類や、ＲＮＡ配列設計において、アンチセンス配列、トリミング配列、センス配列がこの順で並べられることを除いては、上記第一の情報処理装置に関する説明がそのまま当てはまる。
【実施例】
【０２５４】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【０２５５】
＜材料及び方法＞
１．細胞培養
ショウジョウバエＳ２細胞を、２５℃にて、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で培養した。チャイニーズ・ハムスターＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）及びヒトＨｅｌａ細胞を、３７℃にて、ダルベッコの修飾Ｅａｇｌｅ'ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で培養した。両培地共に、１０％熱不活化胎児牛血清（ＦＢＳ；三菱化学）及び抗生物質（１０単位／ｍｌのペニシリン（明治）及び５０μｇ／ｍｌのストレプトナイシン（明治））を補った。Ｅ１４ＴＧ２ａ（マウス胚性幹）細胞を、２０％熱不活化胎児牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍMの２−メルカプトエタノール（和光）、８μｇ／ｍｌのアデノシン、８．５μｇ／ｍｌのグアノシン、７．３μｇ／ｍｌのシチジン、７．３μｇ／ｍｌのウリジン、２．４μｇ／ｍｌのチミジン、各々０．１ｍＭの非必須アミノ酸及び１，０００単位／ｍｌの白血病阻害剤因子（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を補ったＤＭＥＭ中で培養した。
【０２５６】
２．ｓｉＲＮＡの調製
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Ｐｒｏｌｉｇｏによって合成した。二本鎖ｓｉＲＮＡは、Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４７９，ｐ．ｐ．７９−８２（２０００年）に記載の方法で調製した。ｓｉＲＮＡの濃度は、アンチセンス鎖の濃度に基づいて示した。必要な場合には、標的ｍＲＮＡのコード領域内の、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖３´末端に対応するヌクレオチド位置に基づいてｓｉＲＮＡに番号を振った。
【０２５７】
３．ｌｕｃＲＮＡ干渉アッセイ
Ｓ２（１×１０６細胞／ｍｌ）、ＣＨＯ−Ｋ１（３×１０５細胞／ｍｌ）、Ｈｅｌａ（１×１０５細胞／ｍｌ）又はＥ１４ＴＧ２ａ（２×１０５細胞／ｍｌ）の細胞懸濁液１ｍｌを、トランスフェクトの２４時間前に１．５ｃｍウェルに植付けた。細胞に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をコードしているｐＧＬ３−コントロールＤＮＡ（１μｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と、いずれも海椎茸ルシフェラーゼ遺伝子をコードしているｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡ（０．１−１μｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）又はｐＲＬ−ＳＶ４０（０．１−１μｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）とを、ｓｉＲＮＡと共に又はｓｉＲＮＡを伴わずにトランスフェクトした。Ｓ２、Ｈｅｌａ又はＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクトには、リン酸カルシウム沈澱法を使用した。一方、Ｅ１４ＴＧ２ａのトランスフェクトには、ＤＭＲＩＥ  Ｃ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。トランスフェクト後２４時間で細胞を取り出し、デュアル−ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２５８】
図１５中、Ａには、１６種のルシフェラーゼｓｉＲＮＡの分類を示した。
【０２５９】
図１４に示された１６種のｓｉＲＮＡａ−ｐを５０ｎＭ使用し、３種のほ乳類（ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｅｌａ及びＥ１４ＴＧ２ａ）細胞及びショウジョウバエ（Ｓ２）細胞において、ホタル・ルシフェラーゼ活性のｓｉＲＮＡ依存性低減を試験した。その結果の詳細は後記するが、三つのグループに分類された。
【０２６０】
図１５中、Ｂには、我々の配列嗜好性規則を使用して設計されたｓｉＲＮＡによって引き起こされたＲＮＡ干渉活性を示した。その規則を使用して、１５種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ及び５種のクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡを設計し、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｅｌａ、Ｅ１４ＴＧ２ａ及びＳ２細胞においてＲＮＡ干渉をもたらす能力を試験した。
【０２６１】
ｓｉＲＮＡの番号は、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の３´末端に対応する、ルシフェラーゼのコード領域内におけるヌクレオチドの位置を示す。
【０２６２】
ｓｉＲＮＡの濃度は５０ｎＭで、ＲＮＡ干渉効果は、トランスフェクションの２４時間後に観察した。
【０２６３】
４．ビメンチンＲＮＡ干渉及び免疫染色
Ｈｅｌａ細胞懸濁液（１×１０５細胞／ｍｌ）１ｍｌを、トランスフェクトの２４時間前に１．５ｃｍウェルに植付けた。細胞を、５０ｎＭのビメンチンｓｉＲＮＡを用い、２４時間のインターバルで行った３サイクルのトランスフェクションで処理した。トランスフェクションには、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。推定されるトランスフェクション効率は、９５％超であった。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３．７％のホルムアルデヒドで固定し、最後のトランスフェクション後２４時間、浸透性のある状態においた（permeabilized）。ＰＢＳにて洗浄後、抗ブタビメンチン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ｃｙ３−接合第二抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及び抗ヒトＹｅｓ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と、ｃｙ５−接合第二抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とで、細胞を二重染色した。
【０２６４】
５．Ｏｃｔ４ＲＮＡ干渉アッセイ
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞（２×１０５細胞／ｍｌ）に、図１６中、Ｂに示す５０ｎＭのＯｃｔ４ｓｉＲＮＡと、ＥＧＦＰ及びピューロマイシン抵抗性遺伝子とをコードしているｐＣＡＧＩＰｕｒｏ−ＥＧＦＰ（０．５μｇ／ｍｌ）とをコ・トタンスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培地にピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を添加し、形態の変化を、トランスフェクションの後３日目に、位相対比顕微鏡下で観察した。ＲＮＡも、トランスフェクションの後３日目にＲＮｅａｓｙ（ＱＵＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、ＲＮＡ  ＬＡ−ＰＣＲキット（タカラ）を用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。殆ど全ての細胞が、トランスフェクションの後３日目に、ＥＧＦＰを発現していることが見出された。ＲＴ−ＰＣＲのために、次のプライマーを用い、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇａｐｄ）及びＯｃｔ４ｍＲＮＡの濃度を測定した。
【０２６５】
Ｇａｐｄ：  ５´−ＧＣＣＴＣＡＴＣＣＧＧＴＡＧＡＣＡＡＡＡ（配列番号１）
及び  ５´−ＡＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣ（配列番号２）；
Ｏｃｔ−４：  ５´−ＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号３）
及び  ５´−ＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＴＧ（配列番号４）。
【０２６６】
６．ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ及びＤｓＲｅｄのＲＮＡ干渉アッセイ
ＥＧＦＰに対するＲＮＡ干渉を測定するために、Ｈｅｌａ細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）に、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ（０．２５μｇ／ウェル）、ｐＣＡＧＧＳ−ＤｓＲｅｄ（０．２５μｇ／ウェル）及びｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）をトランスフェクトした。ＥＣＦＰに対するＲＮＡ干渉のためには、Ｈｅｌａ細胞へのトランスフェクションは、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（０．２５μｇ／ウェル；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＣＡＧＧＳ−ＤｓＲｅｄ（０．２５μｇ／ウェル）及びｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を用いて行った。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。ＲＮＡ干渉活性は、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下で、ＤｓＲｅｄポジティブ細胞中のＥＧＦＰ−又はＥＣＦＰ−ポジティブ細胞を数えることによって評価した。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥＧＦＰフラグメントをｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩサイトに挿入することによって構築した。
【０２６７】
７．Ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション
地方の農場から入手した多産のニワトリの卵を、３７℃にて２日間孵卵した。卵に窓を取り付け、０．０１％のルキソール（luxol）・ファスト・ブルーと、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ（０．１μｇμｌ）、ｐＣＡＧＧＳ−ＤｓＲｅｄ（０．１μｇμｌ）及びｓｉＲＮＡ（５μｇμｌ）を含むＰＢＳ０．１−０．５μｌを、先端の直径が５０−１００μｍのガラス毛細管を使用して、翼の高さで脊髄の中心管に注入した。エレクトロポレーションには、４ｍｍ離れた一対の白金電極（Ｎｅｐａｇｅｎｅ）を使用した。トランスフェクションは、神経管のもっぱら右側半分で生じた。２０ｍVにおいて、５０ミリ秒継続するパルスを５回使用した。胚を３７℃にて２日間インキュベートし、殺した。トランスフェクションの４日後に、蛍光顕微鏡下で、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの発現が観察された。
【０２６８】
８．ＤＮＡに基づくＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ発現プラスミドの構築
その長さが約８０ヌクレオチドであり、順に（１）２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡセンス鎖（この２１ヌクレオチドの中、３´末端側の２つは、本発明におけるトリミング配列の一部を構成するものである）；（２）ヒトｍｉＲＮＡループ；及び（３）同じｓｉＲＮＡの１９塩基アンチセンス鎖（マイナス３´オーバーハング）をコードしている一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、対応する相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニールさせた。結果として得られた二本鎖ＤＮＡを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．０−Ｈ１（Ａｍｂｉｏｎ）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ＦＬｘ−ｍ２３Ｌ又はＦＬｘ−ｍ２１２Ｌプラスミド（ここで、ｘは、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子における対応する標的配列の位置を示す）を生成させた。ＦＬ８２６−ｍ２１２Ｌにおいては、センス鎖とアンチセンス鎖との順番を反対とした。ヒトｍｉＲＮＡループとして、各々ｍｉＲ−２３及びｍｉＲ−２１２に由来するｍ２３Ｌ及びｍ２１２Ｌを使用した。大腸菌ＸＬ１−青色コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を、結果として得られたプラスミドで形質転換した。プラスミドＤＮＡを、市販のＤＮＡ精製キット（ＱＵＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。Ｈｅｌａ細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）に、ｐＧＬ３−コントロール（１μｇ）及びｐＲＬ−ＳＶ４０（０．１μｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、１５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。コントロールとして、インサートのないｐＳｉｌｅｎｃｅｒを使用した。デュアル・ルシフェラーゼ・レポーター・アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、トランスフェクションに続く３日間、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２６９】
９．自由エネルギーの計算
五量体連続配列の安定性を反映する標準Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーを、Ｆｒｅｉｅｒらによって記載されたニアレスト・ネイバー（nearest neighbor）法に従って、５´アンチセンス鎖末端（位置１）を含むｓｉＲＮＡ二重末端から計算した。位置１６−１９からの値は、五量体連続配列がなかったために、計算しなかった。
【０２７０】
＜結果＞
１．ほ乳類ＲＮＡ干渉における強いｓｉＲＮＡ配列嗜好性
ほ乳類細胞中でのＲＮＡ干渉は、ｓｉＲＮＡ配列にかなり依存して変動するということが、以前から注目されている。この点をより詳細に検討するため、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）を標的とする１６種のｓｉＲＮＡを調製し（図１４）、ヒト（Ｈｅｌａ）、チャイニーズ・ハムスター（ＣＨＯ−Ｋ１）、マウスＥＳ（Ｅ１４ＴＧ２ａ）及びショウジョウバエ（Ｓ２）において、ＲＮＡ干渉を生ずる能力を、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイによって評価した。
【０２７１】
図１４に、６ヌクレオチドずつ離れているｓｉＲＮＡのａ乃至ｉに対応する９種のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子標的配列を示す。また、残りの３種（ｓｉＲＮＡのｎ乃至ｐに対応する）は、１ヌクレオチドずつのみ離れている。細胞に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（標的）をコードするプラスミドＤＮＡ、海椎茸ルシフェラーゼ遺伝子（対照）をコードするプラスミドＤＮＡ及び５０ｎＭの同じ起源のｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を、その２４時間後に測定した（図１５中、Ａ）。
【０２７２】
図１５中、Ａにおいては、ｓｉＲＮＡ配列と結果として得られるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子活性の低減との間の関係をある程度明らかにするため、ｓｉＲＮＡ配列を、３種のほ乳類細胞における平均ＲＮＡ干渉活性の順で一覧とした。
【０２７３】
ほ乳類細胞においては、ＲＮＡ干渉活性は、用いたｓｉＲＮＡにかなり依存して変動する。５種の非常に有効なｓｉＲＮＡ（ａ、ｌ、ｋ、ｆ及びｏ）を使用すると、相対的なホタル・ルシフェラーゼ活性において７０〜９５％の低減がもたらされ、一方、４種の明らかに有効ではないｓｉＲＮＡ（ｈ、ｍ、ｂ及びｃ）を使用すると、２０％未満の低減しかもたらされなかった。標的配列の１塩基の変化でさえ、ほ乳類細胞におけるＲＮＡ干渉活性に著しい影響を与えた（ｓｉＲＮＡ−ｎとｓｉＲＮＡ−ｏとのＲＮＡ干渉効果を比較せよ）。
【０２７４】
対照的に、ホタル・ルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡ−ｃ以外のいずれのｓｉＲＮＡを用いてショウジョウバエ細胞にトランスフェクトしても、常に８５％超で喪失された。従って、全てではないとしても大部分のｓｉＲＮＡは、少なくとも与えられた条件下では、ショウジョウバエ細胞において非常に有効なＲＮＡ干渉を生じることができるに違いない。ほ乳類細胞において最も高いレベルのＲＮＡ干渉を引き起こす４種のｓｉＲＮＡ中の３種（ａ、ｌ及びｋ）は、ショウジョウバエ細胞において最も高いレベルのＲＮＡ干渉をもたらすことにも注目されたい。
【０２７５】
２．ほ乳類細胞における、非常に有効な及び有効ではないＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ配列要求性
図１５中、Ａにおいて、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｈｅｌａ及びＥ１４ＴＧ２ａ細胞における相対的なホタル・ルシフェラーゼ活性の低減の値は、実質的に同じであるように理解され得る。これは、ほ乳類細胞におけるｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉が、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性に関して同じ規則に基づいていることを示唆している。図の上の余白に示されているように、５´アンチセンス鎖末端及び５´センス鎖末端を有するｓｉＲＮＡ末端は、以下において、それぞれＡＳ末端及びＳＳ末端と呼称される。
【０２７６】
ｓｉＲＮＡ配列の三つの直接的に明らかな特徴は、おそらく、有効ではないｓｉＲＮＡから非常に有効なｓｉＲＮＡを区別するのに役立ち得る。
【０２７７】
第一に、非常に有効なｓｉＲＮＡの５´ＡＳ末端（アンチセンス鎖の５´末端）は、常にＡ又はＵであることができ、有効ではないｓｉＲＮＡの対応個所は、Ｇ又はＣである。Ａ／Ｕ及びＧ／Ｃ残基は、それぞれ、五つの非常に有効なｓｉＲＮＡのすべて及び四つの有効ではないｓｉＲＮＡのすべての５´ＡＳ末端に存在することが見出されている。
【０２７８】
第二に、非常に有効なｓｉＲＮＡの５´ＳＳ末端は、おそらくＧ又はＣであり、有効ではないｓｉＲＮＡの対応個所は、Ａ又はＵである。
【０２７９】
第三に、非常に有効なｓｉＲＮＡのケースにおいては、アンチセンス鎖５´末端側における７ヌクレオチド中の少なくとも四つがＡ又はＵであり、一方、有効ではないｓｉＲＮＡの対応する領域は、Ｇ−Ｃリッチである。
【０２８０】
混じり合った特徴に関係する、仮に全てではないとしても大部分のｓｉＲＮＡは、中間のＲＮＡ干渉活性を示すｓｉＲＮＡクラスに属するように見える。ｓｉＲＮＡ−ａの有効性のため可能な分子の基本原理は、以下で論ずる。
【０２８１】
ｓｉＲＮＡは、末端塩基配列の組合せに基づいて、クラスＩ乃至ＩＩＩにグループ化され得る。クラスＩは、５´ＡＳ末端にＡ／Ｕを、５´ＳＳ末端にＧ／Ｃを、そしてアンチセンス鎖の５´末端側の７ヌクレオチド長の中に少なくとも４個のＡ／Ｕヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡからなる。一方、これとは反対の特徴を有するものは、クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡである。全ての他のｓｉＲＮＡは、クラスＩＩに属すると考えられる。クラスＩのｓｉＲＮＡは、二つのクラス、Ｉａ及びＩｂに細分され得る。アンチセンス鎖の５´末端側の７ヌクレオチド長中に５個乃至７個のＡ／Ｕ残基を有するクラスＩのｓｉＲＮＡは、クラスＩａのｓｉＲＮＡに属すると考えられ、残りはクラスＩｂに属すると考えられる。
【０２８２】
ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子コーディング配列に基づいて、１６３１種の異なるｓｉＲＮＡを作製することが可能である。クラスＩのｓｉＲＮＡの数は、２７５（全体の１７％）であると計算され、クラスＩａのｓｉＲＮＡの数は、１５４（９％）であると計算された。ｓｉＲＮＡ配列嗜好性の為の上記規則の妥当性を試験するために、３種のほ乳類細胞及びショウジョウバエＳ２細胞を用い、異なる１５種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ及び５種のクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡについて、ＲＮＡ干渉をもたらす能力について判定を行った（図１５中、Ｂ）。
【０２８３】
クラスＩａのｓｉＲＮＡの全てが、ショウジョウバエ細胞と同様に３種のほ乳類細胞全てにおいて、非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらした。一方、ほ乳類細胞において、クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを通じて、有効なＲＮＡ干渉は、ほとんど無いか又は全く生じなかった。従って、我々は、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性のためにここに明記された規則は、少なくとも外来のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の場合では、ほ乳類のＲＮＡ干渉のために非常に有効なｓｉＲＮＡの配列と有効ではないｓｉＲＮＡの配列を予言するものであると結論付ける。
【０２８４】
３．ｓｉＲＮＡをトランスフェクトすることによるほ乳類外来遺伝子の抑制化
ｓｉＲＮＡ配列嗜好性の規則が、ほ乳類外来遺伝子のＲＮＡ干渉に非常に有効なｓｉＲＮＡと有効ではないｓｉＲＮＡを設計するために適用できるか否かを決定するために、試験を行った。
【０２８５】
図１６中、Ａ及びＢの右側の余白には、ほ乳類細胞（Ｈｅｌａ及びＥ１４ＴＧ２ａ）におけるビメンチン及びＯｃｔ４の、非常に有効なＲＮＡ干渉及び有効ではないＲＮＡ干渉の各々のために設計されたクラスＩａ及びクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡが示されている。
【０２８６】
標的以外のいずれかの遺伝子の活性が細胞に導入されたｓｉＲＮＡによって影響を受けることがないように、今回の規則によって設計された候補のｓｉＲＮＡを、更に、ｂｌａｓｔ検索によって選択した。ビメンチン及びＯｃｔ４のそれぞれに特有のクラスＩａのｓｉＲＮＡが、ビメンチン及びＯｃｔ４の遺伝子配列に基づいて推定された全ての可能性あるｓｉＲＮＡのそれぞれ５％（ｎ＝６４）及び３％（ｎ＝３７）に相当することが見出された。
【０２８７】
ビメンチン遺伝子は、中間系フィラメント・タンパク質をコードする。同起源のｓｉＲＮＡのトランスフェクションによるビメンチン遺伝子の活性の低減は困難であることが報告されている。従って、Ｈｅｌａ細胞において、ビメンチン及びＹｅｓ（コントロール）のための、これらに対する抗体を用いた免疫染色の前に、ｓｉＲＮＡの３サイクルのトランスフェクション（一回のトランスフェクション／日）を行った。
【０２８８】
ビメンチンに対する１０種のクラスＩａのｓｉＲＮＡのすべてが、ビメンチンタンパク質の発現を著しく低下させるが、Ｙｅｓ信号は低下させないことが見出された（図１６中、Ａ）。ＲＮＡ干渉のためのクラスＩＩＩのビメンチンｓｉＲＮＡを用いた場合には、ビメンチン信号もＹｅｓ信号も、殆ど又はまったく低減が検出され得なかった。
【０２８９】
ＲＴ−ＰＣＲの結果（公開されていないデータ）は、ビメンチンのクラスＩａのｓｉＲＮＡによって、ビメンチンｍＲＮＡの７０〜９５％の減少を示し、一方、クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡによっては、ビメンチンｍＲＮＡの解裂は殆ど生じなかったことを示した。
【０２９０】
Ｏｃｔ４は、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４）遺伝子によってコードされるＰＯＵ転写因子であり、ＥＳ細胞の多分化能の調節因子であると考えられている。Ｏｃｔ４の発現において、５０〜１００％の増加は、万能性あるＥＳ細胞の、原始内胚葉及び原始中胚葉への分化を引き起こし得、一方、Ｏｃｔ４の発現の減少は、万能性の喪失を誘導し、ＥＳ細胞を栄養外胚葉に分化させる（これは、平坦な形態及びＨａｎｄ１とＰｓｘの発現が誘導されたことで特徴付けられる）。
【０２９１】
Ｏｃｔ４のＲＮＡ干渉のために、３種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（Ｏｃｔ−６７０、Ｏｃｔ−７９７及びＯｃｔ−８２１）と２種のクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡ（Ｏｃｔ−１６１及びＯｃｔ−５６６）とを調製し、細胞の形態における変化と遺伝子発現における変化とを、５０ｎＭの同起源のｓｉＲＮＡのトランスフェクションの後３日間にわたって試験した。
【０２９２】
図１６中、Ｂにその一部が示されているように、同起源のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（即ち、Ｏｃｔ−６７０、Ｏｃｔ−７９７及びＯｃｔ−８２１）で処理された万能性のＥＳ細胞は、多くの場合、大きくなった核を有して、培地表面全体にわたって平らになっていた。Ｏｃｔ４の発現は、殆どなくなっていた（図１６中、Ｂ）が、栄養外胚葉マーカー（即ち、Ｈａｎｄ１及びＰｓｘ）の発現は、誘導された（公開されていないデータ）。対照的に、クラスＩＩＩのＯｃｔ４のｓｉＲＮＡ（即ち、Ｏｃｔ−１６１及びＯｃｔ−５６６）によってもたらされる形態及び遺伝子発現における明らかな変化は、見出され得なかった（図１６中、Ｂ）。このように、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性に関する我々の規則は、ほ乳類の内在性遺伝子の遺伝子干渉に非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡを確認するためにも、まったくよく役割を果たしている。
【０２９３】
ホタル・ルシフェラーゼ、ビメンチン及びＯｃｔ４のためのクラスＩａのｓｉＲＮＡ３２種を試験し、その中の３１種（９７％）が、ヒト、チャイニーズ・ハムスター及びマウス細胞において非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらし得ることが見出された。このように、試験したクラスＩａのｓｉＲＮＡのほぼすべてが、ほ乳類細胞のための非常に有効なＲＮＡ干渉試薬であることが示された。従って、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性に関する我々の規則は、ほ乳類細胞の外来遺伝子及び内在性遺伝子の両者のＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの設計のために、非常に有用であり得ると結論付けられる。
【０２９４】
図１６中、Ａ：  ヒト内生遺伝子であるビメンチンの、クラスＩａ及びクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡによる抑制。１０種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（ＶＩＭ−２７０，―３６８、―５９６、―８１２、―８５７、―１０９７、―１１２８、−１１４８、―１２３５及び−１２９８）と３種のクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡ（ＶＩＭ−３５、―１５５及びー４９１）を設計し、それらのＲＮＡ干渉活性を、Ｈｅｌａ細胞内で、３サイクルの５０ｎＭのｓｉＲＮＡトランスフェクションに供して試験した。３日目に、細胞を、ビメンチン（標的）及びＹｅｓ（対照）について染色した。
【０２９５】
図１６中、Ｂ：  マウスの内生遺伝子であるＯｃｔ４の発現におけるｓｉＲＮＡのトランスフェクションの影響。Ｅ１４ＴＧ２ａ（マウスＥＳ）細胞に、クラスＩａ（Ｏｃｔ−６７０，−７９７及び―８２１）又はクラスＩＩＩ（Ｏｃｔ−１６１及び−５６６）をトランスフェクトした。コントロールとしてＧａｐｄを使用した。
【０２９６】
図１６中、Ｃ：  起源の異なるＥＧＦＰのｓｉＲＮＡによって引き起こされたＥＣＦＰのＲＮＡ干渉。ＥＧＦＰ―４４１は、クラスＩａのＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡであるが、５´ＡＳ末端にＧを有するクラスＩＩのＥＣＦＰ  ｓｉＲＮＡＥＣＦＰ―４４１と配列が同じではない。
【０２９７】
図１６中、Ｄ：ヒヨコ胚におけるｉｎ  ｏｖｏのＲＮＡ干渉。ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ発現プラスミドを、クラスＩａのｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ−４１６、―４４１及びＤｓＲｅｄ―３９９）又はクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡ（ＥＧＣＦＰ−６６６、ＤｓＲｅｄ―３８３）と共に、ヒヨコ脊髄索に同時エレクトロポレーションを行った。
【０２９８】
４．Ｇ／Ｃ残基の長い伸張を有するｓｉＲＮＡは、ほ乳類細胞とショウジョウバエ細胞の両者において、高レベルのＲＮＡ干渉をもたらすことが出来ない
ｓｉＲＮＡ−ｎは、我々が評価した他のものとは異なり、５０ｎＭ濃度でトランスフェクションを行ったときに、ほ乳類細胞中で高レベルのＲＮＡ干渉をもたらし得なかった（図１５中、Ａ）という点で、クラスＩａのｓｉＲＮＡの例外的なメンバーであり得る。
【０２９９】
そこで、図１５中、Ａ（図１７中、Ａ）に示す１６種のｓｉＲＮＡを用い、ＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＳ２細胞において、ｓｉＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ濃度及びＲＮＡ干渉活性の間の関係をより詳細に明らかにするために、試験が必要とされた。
【０３００】
５０ｎＭでのトランスフェクションの後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＳ２細胞において有効なＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡの大部分のグラフ上の点は、０．００５〜５ｎＭでｓｉＲＮＡを用いた場合と重なり、あるいは、０．５及び５における水平軸と０．０５及び０．５における相対ルシフェラーゼ活性の５０％の線と、それぞれに交わっている二つの線で結合された陰を付けてある領域の近くに位置していた。
【０３０１】
図１７中、Ａにおける垂直のバーは、５０ｎＭでのトランスフェクションの後に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞又はＳ２細胞において有効なＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡの、相対的なルシフェラーゼ又はＲＮＡ干渉活性レンジを示す。従って、５０ｎＭでのトランスフェクションで非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらすｓｉＲＮＡには、１０倍を超えるＲＮＡ干渉を引き起こす能力を有する異種のメンバーが含まれることが明らかであろう。
【０３０２】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＳ２細胞において、個々のｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の比較は、図１７中、Ｂにおける１１の写真のそれぞれに示されている。この写真は、ｓｉＲＮＡ分類に従って、そしてＲＮＡ干渉活性の順で配列されている。
【０３０３】
ＲＮＡ干渉の最大のレベルは、クラスＩａのｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−ｌのＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＳ２細胞の両者へのトランスフェクションによってもたらされた。Ｓ２細胞におけるｓｉＲＮＡ−ｌによる抑制は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるものとほぼ同じであったことに気づきなさい。我々は、この発見を、細胞に入れられたほぼ全てのｓｉＲＮＡ−ｌ分子が、ショジョウバエとほ乳類の両者において、十分に機能を果たせるようになっていること示唆するものであると理解している。
【０３０４】
クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−ｃのＳ２細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクションによっては、ＲＮＡ干渉は殆ど生じなかった。従って、ほ乳類細胞及びショウジョウバエ細胞は、ｓｉＲＮＡが媒介するＲＮＡ干渉誘導に関し、ほぼ同じ能力を有するように見え、その能力の最大限度及び最小限度は、それぞれ、ｓｉＲＮＡ−ｌ及びｓｉＲＮＡ−ｃのトランスフェクションによって決定される。各クラス内で、Ｓ２細胞中でのｓｉＲＮＡ依存性ＲＮＡ干渉活性は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＲＮＡ干渉活性が増加するに従って増加するにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性に関する我々の規則は、Ｓ２細胞中において、ＲＮＡ干渉のために非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡを予測するのに使用することが出来ないかもしれない。
【０３０５】
Ｓ２細胞中において、ＲＮＡ干渉を誘導する能力は、２種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（ｏ及びｎ）と２種のクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡ（ｂ及びｈ）では、ほぼ同じであった。Ｓ２細胞中においては、３種のクラスＩＩのｓｉＲＮＡ（ａ、ｉ及びｇ）は、２種のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（ｏ及びｎ）と比べて、はるかに効果的であるように見えた。
【０３０６】
我々は、最も有効性の低いクラスＩａのｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−ｎが、センス鎖の５´末端から伸びる長いＧＣ伸張を有しており、且つ、Ｓ２細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞において、クラスＩａのｓｉＲＮＡに依存するＲＮＡ干渉活性は、センス鎖の５´末端から伸びるＧＣ伸張の長さに反対に関連付けられていることに気づいた。ＲＮＡ干渉における長いＧＣ伸張の、同様の反対の効果は、また、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＳ２細胞において、クラスＩＩに依存するＲＮＡ干渉又はクラスＩＩＩに依存するＲＮＡ干渉に明らかであった。
【０３０７】
対照的に、５´ＳＳ末端に隣接する１１塩基対の長い領域における平均ＧＣ含有率は、３１種の非常に有効なクラスＩａのｓｉＲＮＡの場合、およそ５０％であった（図１８）。従って、このことは、ｓｉＲＮＡ配列における長いＧＣ伸張が、その程度はその伸張の長さに依存して、ＲＮＡ干渉の抑制剤としての役割を果たすことを支持し得る。
【０３０８】
５．ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５´末端の可能性ある二重の機能
ＥＧＦＰ（増強された緑色蛍光タンパク質）及びＥＣＦＰ（ＥＧＦＰの誘導体）のＲＮＡ干渉の間に、ＥＧＦＰ−４４１（配列がＥＧＦＰに相同であるが、ＥＣＦＰ遺伝子に対しては完全に相同ではないｓｉＲＮＡ）が、ＥＣＦＰを効果的に不活性化出来ることに気づいた。
【０３０９】
Ｈｅｌａ細胞に、ＤｓＲｅｄプラスミドＤＮＡ（コントロール）とＥＧＦＰ又はＥＣＦＰプラスミドＤＮＡ（標的）及びｓｉＲＮＡを同時にトランスフェクトさせ、標的遺伝子発現細胞の相対的な数を、様々な時に数えた。図１６中、Ｃに示すように、同起源のクラスＩａのｓｉＲＮＡであるＥＧＦＰ−４４１をトランスフェクトした場合、トランスフェクションの２４時間後に、ＥＧＦＰ発現細胞からのＥＧＦＰ信号のほぼ全てが無くなっていた。一方、配列がＥＧＦＰ遺伝子及びＥＣＦＰ遺伝子に完全に相同であるクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡであるＥＧＣＦＰ−６６６は、トランスフェクションの２日後に、少しのＥＧＦＰ信号を低減することが出来ただけであった。ＥＧＦＰ−４４１は、５´ＡＳ末端に対応する位置（図１６中、Ｃの右側の余白を見よ）以外は、配列がＥＣＦＰのｍＲＮＡに相同である。図１６中、Ｃは、ＥＧＦＰ−４４１が、配列が標的（ＥＣＦＰのｍＲＮＡ）に完全に同一であるクラスＩＩのｓｉＲＮＡであるＥＣＦＰ−４４１よりも、ＥＣＦＰのＲＮＡ干渉をより有効にもたらすことができることを示している。
【０３１０】
ＥＧＦＰ−４４１は、トランスフェクションの２４時間後に、ＥＣＦＰ信号のほぼ７０％を無効にし、その残りは、トランスフェクションの後２日でほぼ完全に消去された。同起源のｓｉＲＮＡであるＥＣＦＰ−４４１（クラスＩＩ）によるＥＣＦＰへの試みでは、トランスフェクションの２日後においても、ＥＣＦＰ信号の大部分が未だ検出され得た。
【０３１１】
従って、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５´末端におけるＡ／Ｕの存在は、ｍＲＮＡの認識を除くいくつかのＲＮＡ干渉プロセスのために必須であるようにみえる。ＥＧＦＰ−４４１にとって、ＥＧＦＰのｍＲＮＡがＥＣＦＰよりもよい標的であることは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５´末端が、標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡアンチセンス鎖との間の水素結合に携わってもいることを示す。従って、アンチセンス鎖の５´末端は、二つの別々のＲＮＡ干渉プロセス、即ち、ＲＩＳＣの形成（これは、ｓｉＲＮＡの巻き戻しを含む）とｍＲＮＡの認識、に携わっているらしい。
【０３１２】
いくつかの非常に有効なＥＧＦＰ又はＥＣＦＰのｓｉＲＮＡを用いて生じたＲＮＡ干渉は、少なくとも２日目から始まって７日間、７０％超の効果が残るという状況で、標的遺伝子活性の滅失を示した。対照的に、有効ではないクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡを用いて、ＲＮＡ干渉効果はほとんど無いか又はまったくないことが明らかであった（データは示さない）。
【０３１３】
６．ＤＮＡベクターに基づくＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ配列要求性
ほ乳類のｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉における標的配列嗜好性が、ＲＮＡ干渉機構に本質的なものであるか否かを決定するために、標的配列嗜好性のための同様の規則が、ＤＮＡに基づくほ乳類ＲＮＡ干渉において保持されているか否かを明らかにするための研究を行った。
【０３１４】
ここで、ｓｉＲＮＡは、はじめに転写されたヘアピン型のＲＮＡの解裂を通じて生成され、その後、核から輸送される。ｐＳｃｉｌｅｎｃｅｒとホタル・ルシフェラーゼを、それぞれ、ベクター遺伝子及び標的遺伝子として使用した。ＤＮＡに誘導されたＲＮＡ干渉におけるＲＮＡ干渉活性の変化のプロフィールは、ｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉と基本的に同じであることが、図１９から理解され得る。即ち、ヘアピン型のクラスＩａのｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードしているＤＮＡインサートを有するｐＳｃｉｌｅｎｃｅｒの全てが、ほ乳類細胞において、トランスフェクション後３日間で、非常に有効なＲＮＡ干渉を誘導した。対照的に、クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡ（ＦＬ１４−ｍ２３Ｌ）のヘアピンをコードしているＤＮＡインサートを有するｐＳｃｉｌｅｎｃｅｒのトランスフェクションにより、ＲＮＡ干渉は殆ど又は全くを誘導されなかった。従って、ほ乳類のｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉におけるｓｉＲＮＡ配列嗜好性は、ほ乳類細胞におけるＤＮＡに基づくＲＮＡ干渉でも保持されると結論付けられ得、つまり、ＲＮＡ干渉の本質的な特徴の反映であるに違いない。
【０３１５】
７．ヒヨコ胚におけるＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ配列要求性
ここで提供されたｓｉＲＮＡ配列嗜好性の規則が、ほ乳類以外の脊椎動物におけるＲＮＡ干渉に適用でき得ること、そして、個体における遺伝子抑制のためのｓｉＲＮＡの設計に有用であることを証明できる。これらの可能性を確かめるために、ここでの規則によって設計されたｓｉＲＮＡを、ｉｎ  ｏｖｏエレクトロポレーションによってヒヨコの２日目胚の脊髄の右側半分に導入し、４日目胚で標的遺伝子活性の変化を試験した（図１６中、Ｄ）。
【０３１６】
トランスフェクトされたｓｉＲＮＡによってもたらされたＲＮＡ干渉効果を判断するための基準として、ＥＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの発現を用いた。ヒヨコ胚の脊髄において、すべてクラスＩａのｓｉＲＮＡであるＥＧＦＰ−４４１、ＥＧＦＰ−４１６、ＤｓＲｅｄ―３９９（図１６中、Ｄ）及びＤｓＲｅｄ−２３１（データは示さず）は、非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらすことができることが、明らかに示された。すべてクラスＩＩＩに属するＥＧＣＦＰ―６６６、ＤｓＲｅｄ−１４０（図１６中、Ｄ）及びＤｓＲｅｄ−３８３（データは示さず）は、この点において有効ではないことが分かった。従って、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性のための我々の規則が、ヒヨコ胚において、有効なｓｉＲＮＡの設計に全く有用であることが、確かに明らかであろう。
【０３１７】
８．ｓｉＲＮＡのための自由エネルギーの計算
５´アンチセンス鎖末端を含むｓｉＲＮＡ末端における高い頻度と、二本鎖（特に領域９−１４）を横切る低い内部エネルギーが、最近、ｓｉＲＮＡ機能と関連して、強く示されている。従って、ニアレスト−ネイバー（nearest neighbor）法により、次の５量体の安定性を反映する内部安定性を、図１５中、Ａに示す１６種のルシフェラーゼｓｉＲＮＡの各々において推測した。
【０３１８】
５種の非常に有効なｓｉＲＮＡの位置１におけるΔG０は、−３．６乃至−７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌで変動した（図２０中、Ｂ）が、中間のレベルのＲＮＡ干渉を生じる７種のｓｉＲＮＡでは、−４．５乃至−１０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｃ）であり、全く有効ではないｓｉＲＮＡについては、その値は−９．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（Ｄ）を超えていた。これらの値は、非常に有効なｓｉＲＮＡの５´アンチセンス鎖末端を含む二本鎖末端は、熱安定性にかなり劣るという考えを支持するであろう。
【０３１９】
しかし、我々のデータは、領域９−１４におけるΔG０の絶対値において、明らかな低減が無いことを示した。この点を更に試験するために、図１５及び図１６に示す３２種の非常に有効なｓｉＲＮＡを用いて、二本鎖を横切る値の分布を研究した。しかし、再び、二本鎖を横切る明らかな低い内部エネルギーは無かった（図２０中、Ａ）。従って、Ｋｈｖｏｒｏｖａらによって提供された考えは、我々の研究によって部分的に支持された。
【０３２０】
図２０中、Ｂ及びＣにおける実験結果は、ほ乳類細胞において中間レベルのＲＮＡ干渉を引き起こす３種のｓｉＲＮＡ（ｐ、ｎ及びｄ）の位置１におけるΔG０が、５種の非常に有効なｓｉＲＮＡ（ａ、ｆ、ｋ、ｌ及びｏ）のΔG０の範囲内であることを示している。従って、熱力学的安定性の計算に基づいて、ランダムなｓｉＲＮＡのセットから非常に有効なｓｉＲＮＡを選択することは、多分できるかもしれないが、わずか６０％の確率においてであろう。
【０３２１】
＜議論＞
ｓｉＲＮＡ配列と、ほ乳類細胞においてそのＲＮＡ干渉をもたらす能力との間の関係が、ここで鋭意検討された。その結果の基づいて、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性の規則が確立され、それは図２１中、Ａに示されている。
【０３２２】
その規則、即ち、本明細書に記載した条件を充足する配列を有するｓｉＲＮＡは、ほ乳類細胞において、そしておそらくはヒヨコ胚においても、非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらすであろう。中でも、５´ＡＳ末端がＡ／Ｕ；５´ＳＳ末端がＧ／Ｃ；アンチセンス鎖の５´端側１／３における少なくとも５つのＡ／Ｕ残基の存在；及び長さが９ヌクレオチドを超えるＧＣ伸張がないことは、ＲＮＡ干渉を生じさせるために非常に有効である。
【０３２３】
はじめの三つの条件に関連する特徴とは反対の特徴を有するｓｉＲＮＡは、遺伝子抑制を殆ど又はまったくもたらさない。
【０３２４】
これらの規則に基づいて、今日までに、４種の外来の及び２３種の内生の遺伝子のために、合計で５７の非常に有効なｓｉＲＮＡ候補と１６の有効ではないｓｉＲＮＡ候補を設計し（この研究及び我々の公開していないデータ）、それらすべてが、ほ乳類細胞及びヒヨコ胚において、予測されたＲＮＡ干渉活性を奏することが見出された。
【０３２５】
近年、Ｈｏｌｅｎらは、ほ乳類細胞におけるｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉が、標的配列に依存してかなり多様であると指摘した。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２年）３０，ｐ．ｐ．１７５７−１７６６（Ｈｏｌｅｎ  Ｔ．ら）の図１Ｃに示された彼らの実験データは、我々の規則に基づいて明瞭に説明される。彼らは、試験した１１種のｓｉＲＮＡ中、非常に有効なクラスであるクラスＩａ又はＩｂに属する４種のみが、Ｈｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｃｏｓ−１細胞及びＨａＣａｔ細胞において、有効なＲＮＡ干渉をもたらすことが出来たことを示した。従って、ここにおける規則は、ほ乳類及びヒヨコ遺伝子の抑制のための非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡを設計するために、非常に有用であると結論付けられ得る。
【０３２６】
非常に有効な遺伝子抑制のために、上記４条件はほぼ完全に十分であるけれども、いくつかは、他の機能的に過剰な条件によって置換され得るかもしれない。
【０３２７】
標的ＲＮＡの二次構造が、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ認識に重要であると示されている。しかし、これらの条件が矛盾しているとき、我々の結果は、ｓｉＲＮＡによる標的の認識のために、二次構造よりも標的配列がずっと本質的であるということを示している。
【０３２８】
標的の特別な二次構造は、我々の規則からは推定され得ない。おそらく、重要な二次構造が発生する頻度は、ここで標的として使用されたｍＲＮＡのタンパク質コード領域においては、まったく低いのであろう。
【０３２９】
ＥＧＦＰ／ＥＣＦＲのＲＮＡ干渉実験（図１６中、Ｃを見よ）は、５´ＡＳ末端におけるＡ／Ｕの存在は、標的認識のためのみならず、ＲＩＳＣ形成のため（これは、ｓｉＲＮＡがほどけることを含む）にもおそらくは必要とされることを示した。ＵｖｒＤ  ＤＮＡヘリカーゼのためのほどきの工程サイズは５塩基対であり、従って、推定上のｓｉＲＮＡヘリカーゼの一段モーター機能は、ＲＩＳＣ形成の最も初期において、二つのｓｉＲＮＡ末端の一方から数塩基対をほどくことができるであろう。非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡの７塩基対長さのＡＳ末端の二本鎖領域は、それぞれＡ／Ｕリッチ、Ｇ／Ｃリッチであり、且つ、非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡの５´ＡＳ末端は、それぞれＡ／Ｕ、Ｇ／Ｃである。したがって、推定されるｓｉＲＮＡヘリカーゼは、好ましくは、その５´自由端におけるＡ／Ｕを用いて、ＡＵリッチの末端領域でＲＮＡ二本鎖の巻き戻しを開始し、一方、その５´自由端におけるＧ／Ｃを用いてのＧＣリッチの末端領域からのＲＮＡ二本鎖の巻き戻しは、ブロックされるということになるのであろう。我々の公開していない試験は、クラスＩＩＩのビメンチンｓｉＲＮＡであるＶＩＭ−３５によって、事実上、センス標的ＲＮＡ（ビメンチンｍＲＮＡ）の崩壊はもたらされないけれども、アンチセンス標的ＲＮＡの約８０％は、同じｓｉＲＮＡ（これは、アンチセンス標的抑制のためにクラスＩｂのｓｉＲＮＡとしての役割を果たす）によって解裂されることを示している。これらの考察は、ショウジョウバエ胚抽出物中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ干渉のために最近Ｓｃｈｗａｒｚらによって提案された、非対称のＲＩＳＣ形成モデルと一致するようにみえる。このモデルは、ｓｉＲＮＡの巻き戻しは、好ましくは、その５´末端位置においてＡ：Ｕ、Ｇ：Ｃ又はペアとなっていない塩基を有し、且つ熱力学的により安定ではない、より容易な二本鎖末端で生じることと、５´末端を有する鎖は、ＲＩＳＣになるように組み立てられる一本鎖ガイドＲＮＡとしての役割を果たすこととを予言している。ＨＨＥＫ２９７細胞におけるｓｉＲＮＡ巻き戻しのために、ＡＳ末端又はその近くにおける熱力学的に不安定又は柔軟な塩基対が重要であることは、Ｋｈｖｏｒｏｖａらによって既に指摘されてもいる。したがって、ショウジョウバエのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系のために提案されたものと類似のＲＩＳＣ形成機構が、ほ乳類及びヒヨコにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＲＮＡ干渉にも適用出来るはずである（図２１中、Ａを見よ）。
【０３３０】
ここで確立された規則に従って、非常に有効なｓｉＲＮＡの５´ＡＳ末端及び５´ＳＳ末端は、それぞれ、Ａ／Ｕ、Ｇ／Ｃであるに違いない。そして、その反対に有効ではないｓｉＲＮＡでは、それぞれＧ／Ｃ、Ａ／Ｕであるに違いない（図２１中、Ｂを見よ）。この末端ヌクレオチドの構成上の非対称が、ｓｉＲＮＡ巻き戻しの方向を決定するのに重要であり得る。
【０３３１】
図２１より、ｓｉＲＮＡの巻き戻しは、クラスＩａのｓｉＲＮＡの場合、長いＧＣ伸張を欠いて、ＡＵリッチＡＳ末端から効果的に開始されるかもしれない。一方、ｓｉＲＮＡ二本鎖の巻き戻しは、ＧＣリッチのクラスＩＩＩのＡＳ末端から抑制され得るのかもしれない。クラスＩａのｓｉＲＮＡの５´ＳＳ末端におけるＧ／Ｃ及びクラスＩＩＩのｓｉＲＮＡの５´ＡＳ末端におけるＧ／Ｃは、同定されていない、おそらくはｓｉＲＮＡ巻き戻しを抑制するタンパク質の結合のための位置を提供するのかもしれない。一方、クラスＩＩＩのｓｉＲＮＡの５´ＳＳ末端におけるＡ／Ｕ及びクラスＩａのｓｉＲＮＡの５´ＡＳ末端におけるＡ／Ｕは、ヘリカーゼ以外の推定される巻き戻し刺激因子の結合位置としての役割を果たすのかもしれない。ｓｉＲＮＡ−ｎで見出されているような長いＧＣ伸張は、ＡＳ末端からのｓｉＲＮＡ二本鎖変性の引き延ばしを防止するのかもしれない。
【０３３２】
最近、二つのショウジョウバエＰＩＷＩタンパク質が、５塩基対の一本鎖ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ二本鎖に結合できることが示された。我々は、ヒトのＰＩＷＩ蛋白質であるｅＩＦ２Ｃ１のＰＡＺドメインが、２ヌクレオチド長の３´オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡと結合するが、平滑又は５´オーバーハング末端とは結合しないことを見出した（公開していないデータである）。トンバスウイルスに感染した植物細胞において、ｐ１９はｓｉＲＮＡ末端に結合し得、転写後遺伝子抑制を阻害し得る。したがって、おそらくはヘリカーゼに関係しないが、ｓｉＲＮＡ末端のＧ／Ｃ又はＡ／Ｕに優先的に結合できる蛋白質又は蛋白複合体は、ｓｉＲＮＡの早期の鎖分離に包含され得、その結果ｓｉＲＮＡ二本鎖の巻き戻しを抑制又は刺激する。
【０３３３】
非常に有効性の低いｓｉＲＮＡにおいて、ヘリカーゼ機能は、５´ＡＳ末端位置におけるＧ／Ｃと、それに隣接するＧＣリッチ配列によって二重に抑制されるのかもしれない。一方、ヘリカーゼ機能は、５´ＳＳ末端位置における単一のＧ／Ｃペアによってのみブロックされるように見える（図２１）。このことは、５´ＳＳ末端位置における単一のＧ／Ｃペアと、５´ＳＳ末端近くのＧＣリッチ配列が、互いに機能的に余分である、つまり、後者は前者の代替えとしての役割を果たしているのかもしれない。我々は、このことが、ｓｉＲＮＡ−ａ（クラスＩＩのｓｉＲＮＡ）が非常に有効なｓｉＲＮＡとして活動し得ることの理由であるかもしれないと考える（図１５中、Ａ及び図１７中、Ｂを参照されたい）。
【０３３４】
図１５中、Ａの結果は、ＳＳ末端から伸びる１０塩基対長のＧ／Ｃ伸張を有するｓｉＲＮＡ−ｎが、クラスＩａに属するにもかかわらず、ほ乳類細胞において非常に有効なＲＮＡ干渉をもたらすことが出来ないことを示している。ｓｉＲＮＡの完全な鎖の分離は、活性なＲＩＳＣの形成に要求されるように見え、その結果、ＳＳ末端から伸びる長いＧ／Ｃ伸張は、Ｇ／Ｃ伸張の長さに依存する方法で、ＳＳ末端からのみならずＡＳ末端からも、ヘリカーゼの巻き戻しを防御できる（図２１中、Ｃ）。
【０３３５】
ショウジョウバエにおけるｉｎ  ｖｉｒｏＲＮＡ干渉とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのショウジョウバエのＲＮＡ干渉は、ｓｉＲＮＡ配列にそれ程敏感ではなく（図１５を参照されたい）、Ｓ２細胞において、５０ｎＭで使用したときに、事実上すべてのｓｉＲＮＡが有効なＲＮＡ干渉をもたらした。ほ乳類のＲＮＡ干渉データに基づいて確立された我々のｓｉＲＮＡ配列嗜好性規則は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのショウジョウバエに直接的には適用され得ないことが見出された（図１５を参照されたい）。ほ乳類細胞とは異なり、ショウジョウバエ細胞は、ＲＩＳＣ形成に必要とされるより多くのタンパク質成分を産するのかもしれない。したがって、あまり有効ではないｓｉＲＮＡ鎖を用いても、かなりの量のＲＩＳＣを蓄積することができるのかもしれない。即ち、非対称のＲＩＳＣ形成は、おそらく、ショウジョウバエ細胞でのＲＮＡ干渉において、律速段階ではないのかもしれない。
【０３３６】
図１７もまた、非常に有効なクラスＩａのｓｉＲＮＡが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＳ２細胞に対するｓｉＲＮＡ−ｌのトランスフェクションによって誘導される最大の遺伝子抑制活性と１０倍を超えるＲＮＡ干渉をもたらすための能力とを有する異種のメンバーからなることを示す。
【０３３７】
Ｓｃｈｗａｒｚらは、ショウジョウバエのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、ｓｉＲＮＡの遺伝子抑制活性が、５´ＡＳ末端位置にＵ：Ｇ対又は対にならない塩基を導入することによって改良されたことを示した。したがって、末端塩基のペアリングの変更を通じて、殆どすべてのクラスＩａのｓｉＲＮＡを、ほ乳類細胞において、ｓｉＲＮＡ−ｌによってもたらされた最大レベルのＲＮＡ干渉又は最大のＲＮＡ干渉レベルを誘導できるｓｉＲＮＡに変える可能性があるかもしれない。
【０３３８】
別の研究において、ＮＣＢＩ参照配列データベースに登録された１９，９８６種のヒトの配列及び１６，２５６種のマウスの配列を、ここで確立されたｓｉＲＮＡ配列嗜好性規則を用いて試験した。そして、ヒトの配列の９２％、マウスの配列の９９％が、クラスＩａのｓｉＲＮＡのための、長いＧ／Ｃ伸張のない少なくとも一つの独特の潜在的な標的を有することが分かった（公開していないデータ）。したがって、我々の規則は、広い範囲で、体系的な機能ゲノム解析を含むほ乳類のＲＮＡ干渉に非常に有効なｓｉＲＮＡの設計へ適用出来ることが見出された。
【０３３９】
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【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】本発明のプログラムを説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の情報処理装置を含む情報処理システムの一例を示すブロック図である。
【図３】標的遺伝子ヌクレオチド配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図である。
【図４】部分配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図である。
【図５】判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報の一例を示す図である。
【図６】センス配列／アンチセンス配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図である。
【図７】参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図である。
【図８】同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図である。
【図９】評価結果ファイル（１）１０６ｇに格納される情報の一例を示す図である。
【図１０】部分配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図である。
【図１１】無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図である。
【図１２】本発明の情報処理装置を使用したメイン処理の一例を示すフローチャートである。
【図１３】無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートである。
【図１４】ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の抑制のためのｓｉＲＮＡの配置である。
【図１５】ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ配列と、誘導されたルシフェラーゼ遺伝子抑制（ＲＮＡ干渉）活性との間の関係を示す図である。後者は、２〜４回の実験で得られたデータを平均化して棒グラフで示した。棒グラフ中の細い縦の線は、３種のほ乳類細胞の平均を示す。また、前者については、５´アンチセンス鎖末端を含む７ヌクレオチドの末端領域が取囲まれている。
【図１６】クラスＩａのｓｉＲＮＡによる内生遺伝子の非常に有効な抑制（Ａ，Ｂ）、起源が異なるｓｉＲＮＡによって引き起こされたＲＮＡ干渉（Ｃ）、及びヒヨコ胚におけるクラスＩａのｓｉＲＮＡ依存性ＲＮＡ干渉（Ｄ）を示す図である。ここで試験したｓｉＲＮＡの配列は、右の欄外に記載した。図１６Ｃの欄外において、矢印は、ＥＧＦＰとＥＣＦＰのｍＲＮＡが、ＥＧＦＰ−４４１又はＥＣＦＰ―４４１の５´アンチセンス鎖末端に対応する位置において、塩基置換を有することを示している。図１６Ｄにおいて、ドット線は、脊髄索の左（Ｌ）及び右（Ｒ）の部分を示す。
【図１７】ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＳ２細胞におけるＲＮＡ干渉効果の量依存性を示すグラフである。陰を付けた場所は、それぞれ、０．５及び５において水平軸と、０．０５及び０．５においてルシフェラーゼ活性の５０％の線と交差している二つの線によって結ばれた領域である。各パネルの右側の太い縦棒は、ルシフェラーゼ活性が７７％を超えて低減された領域を示す。図１７Ａは、ＣＨＯ−Ｋ１（左）及びＳ２（右）細胞において、０．００５−５０ｎＭの範囲のｓｉＲＮＡを用いた場合のｓｉＲＮＡルシフェラーゼ遺伝子抑制活性の変化を示す。ｓｉＲＮＡａ−ｐが、クラスＩ（白抜き円）、ＩＩ（白抜き三角）及びＩＩＩ（黒円）に分けられている。図１７Ｂは、Ｓ２細胞（白抜き円）及びＣＨＯ−Ｋ１細胞（黒円）におけるＲＮＡ干渉活性曲線を直接比較できるグラフである。対応する又は類似のｓｉＲＮＡの配列を、下の欄外に図式化して示した。黒円はＧ／Ｃ、白抜き円はＡ／Ｕを示す。５´ＡＳ末端を含む７ヌクレオチドの領域が取囲まれている。
【図１８】非常に有効なクラスＩａのｓｉＲＮＡのＧＣ含有率分散を示すグラフである。このグラフは、図１５及び図１６に示した３１種の非常に有効なクラスＩａのｓｉＲＮＡのＧＣ含有率の分散を提供している。位置１は、５´アンチセンス鎖末端を含むｓｉＲＮＡ二本鎖末端に対応する。領域２−７におけるＧＣ含有率の平均は、１９％であり、領域８−１８におけるＧＣ含有率の平均は５２％であった。
【図１９】Ｈｅｌａ細胞におけるｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉及びＤＮＡに基づくＲＮＡ干渉の比較結果を示すグラフである。  ヘアピン型の転写産物の予測された配列を左に示した。一方、誘導されたＲＮＡ干渉活性（相対ルシフェラーゼ活性の低減）は、右側の白抜きの棒グラフによって示した。ドット付きの棒グラフは、Ｈｅｌａ細胞における、同起源のｓｉＲＮＡによる相対ルシフェラーゼ活性の低減を示している。左において、予測されるアンチセンス鎖は陰を付けている。なお、グラフには、２−４回の実験によって得られたデータの平均値を示した。
【図２０】ｓｉＲＮＡの内部安定性プロフィールを示すグラフである。Ａは、非常に有効な３２種のｓｉＲＮＡの熱力学プロフィールを示す。縦棒は、３２種の非常に有効なｓｉＲＮＡの標準偏差を示す。Ｂ、Ｃ及びＤは、図１４に示された１６種のルシフェラーゼｓｉＲＮＡ中、ほ乳類細胞において、それぞれ、非常に有効な、中位の及び有効ではないＲＮＡ干渉をもたらす三つの群の熱力学プロフィールを示す。太い黒の縦棒及び白抜きの縦棒は、それぞれ、非常に有効な及び有効ではないｓｉＲＮＡの位置１における自由エネルギー変化範囲を示す。
【図２１】ほ乳類細胞における、ｓｉＲＮＡに基づくＲＮＡ干渉の可能性あるモデルを示す。Ａは、ｓｉＲＮＡ配列嗜好性の規則を図式化して示すものである。５´ＡＳ末端及びＳＳ末端におけるＡ／Ｕと、それぞれセンス鎖及びアンチセンス鎖におけるそれらの相補は、ハッチのついた円で示した。Ｇ又はＣは、黒円で示した。末端ＡＵリッチ又はＧＣリッチ領域は取囲んだ。白抜き矢印は、仮想的なｓｉＲＮＡヘリカーゼによるｓｉＲＮＡの巻き戻しの方向を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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