(57)【要約】【課題】  抗炎症活性、抗アレルギー活性を有する新規な化合物を提供すること。【解決手段】  本発明の新規な化合物は式（Ｉ）で表されるクロモン誘導体化合物である。式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ水素原子を表すか、又はＲ1とＲ2が一緒になって結合を表し、又はＲ2とＲ3が一緒になって結合を表す。一般式（Ｉ）の化合物は、ＮＯ産生抑制活性並びにｉＮＯＳ、インターロイキン−１β、インターロイキン−６及び腫瘍壊死因子−αのｍＲＮＡ発現を抑制する活性を有し、抗炎症剤、抗アレルギー剤として有用である。2005247762.tif 000022【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表されるクロモン誘導体化合物：
2005247762.tif 000017
式中、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ水素原子を表すか、又はＲ1とＲ2が一緒になって結合を表し、又はＲ2とＲ3が一緒になって結合を表す。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1とＲ2が一緒になって結合を表し、Ｒ3が水素原子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2とＲ3が一緒になって結合を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式（II）で表される、請求項１に記載のクロモン誘導体化合物：
2005247762.tif 000018
【請求項５】
以下の式（III）で表される、請求項１に記載のクロモン誘導体化合物：
2005247762.tif 000019
【請求項６】
以下の式（IV）で表される、請求項１に記載のクロモン誘導体化合物：
2005247762.tif 000020
【請求項７】
以下の式（V）で表される、請求項１に記載のクロモン誘導体化合物：
2005247762.tif 000021
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の化合物、医薬として受容可能な担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が抗炎症剤である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬組成物が抗アレルギー剤である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤、抗アレルギー剤として有用な新規なクロモン誘導体化合物及びそれを含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
阜康阿魏（学名  Ferula fukanensis K M shen）は、アジアの乾燥地帯に分布するセリ科の多年草であり、その根茎から採取した樹脂は、リウマチ、婦人病、痙攣の治療に使用され、ヒステリー症の鎮静剤として用いられている。
コジマ（Kojima）らは、Ferula ferulioidesの根から分離したプレニルベンゾイルフラノン型のセスキテルペン誘導体及びその生合成の経路を報告しているが、その有用性については述べていない（非特許文献１）。
バオ−ニン ス（Bao-Ning Su）らは、Ferula pallidaの根から抽出したセスキテルペンクマリン及びその誘導体並びにその生合成経路を報告しているが、その有用性につては述べていない（非特許文献２）。
本発明者らは、阜康阿魏の根茎から抽出した化合物のいくつかにＮＯ産生抑制活性があることを見出している（非特許文献３）が、それらはクマリン誘導体又はオキソフラン誘導体であり、本発明の化合物とは骨格を異にする。
【０００３】
【非特許文献１】K. Kojima, et. al., Chem. Pharma. Bull., 47(8), pp. 1145-1147, 1999
【非特許文献２】Bao-Ning Su, et. al., J. Nat. Prod., 2000, 63, pp. 436-440
【非特許文献３】日本生薬学会第５０年会、講演要旨集、P172、173、2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＮＯ産生抑制作用を有する新規なクロモン誘導体化合物及びこれを含む医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の新規なクロモン誘導体化合物は以下の一般式（Ｉ）を有する。
2005247762.tif 000002
式中、
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ水素原子を表すか、又はＲ1とＲ2が一緒になって結合を表し、又はＲ2とＲ3が一緒になって結合を表す。
一般式（Ｉ）の化合物は、ＮＯ産生抑制活性並びにｉＮＯＳ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現を抑制する活性を有し、抗炎症剤、抗アレルギー剤として使用することができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の化合物はＮＯ産生抑制活性並びにｉＮＯＳ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現を抑制する活性を有する新規なクロモン誘導体化合物であり、抗炎症剤、抗アレルギー剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ水素原子を表すか、又はＲ1とＲ2が一緒になって結合を表し、又はＲ2とＲ3が一緒になって結合を表す。
例えば一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ1とＲ2が一緒になって結合を表し、Ｒ3が水素原子である以下の化合物：
2005247762.tif 000003
及び一般式（Ｉ）の化合物において、Ｒ2とＲ3が一緒になって結合を表し、Ｒ1が水素原子である以下の化合物を挙げることができる。
2005247762.tif 000004
【０００８】
本発明の望ましい化合物として、以下の式（II）で表される化合物１、式（III）表される化合物２、式（IV）で表される化合物３及び式（V）で表される化合物４を挙げることができる。
2005247762.tif 000005
2005247762.tif 000006
2005247762.tif 000007
2005247762.tif 000008
【０００９】
本発明の化合物１ないし４は、阜康阿魏の根茎をそのまま又は乾燥し、好ましくは粉砕し、有機溶媒（例えばメタノール、クロロホルム、酢酸エチル）を用いて室温で抽出して得ることができ、得られた抽出物を自体公知の方法で処理し、精製することにより製造することができる。
これらの化合物を出発原料として本発明の一般式（Ｉ）で表される他の化合物を製造することができる。
【実施例】
【００１０】
製造例１
阜康阿魏（学名  Ferula fukanensis K M shen）の根茎５．９kgを粉砕し、これを８０％メタノール（メタノール：水＝８：２容量）により３８リットルの溶液とし、室温で１２０時間温浸した。温浸を同一条件で繰り返し、得られた浸出液を合わせて減圧下に４０℃で濃縮して７１１gのエキスを得た。
このエキスの４５０gを水１．５リットルに溶解し、クロロホルム、酢酸エチルの各１．５リットルで、順次それぞれ３回ずつ抽出した。これらの抽出液をそれぞれ減圧下に４０℃で濃縮し、クロロホルム画分から２７０g、酢酸エチル画分から１４０gの濃縮エキスを得た。
クロロホルム画分から得られた濃縮エキス７０gをシリカゲルカラム（Wako gel C-200、和光純薬社製、６φ×１７cm）にのせ、ヘキサン：酢酸エチル系の展開溶媒を使用し、酢酸エチル濃度０％、２％、５％、１０％、２０％、４０％、６０％及び１００％の溶媒をそれぞれ３リットル順次使用して展開し、２００mlずつ分取して第１〜第１１の１１画分に分画した。
得られた第６画分（４０％の酢酸エチルを含むヘキサン溶媒によって溶出した画分）の減圧濃縮物を、シリカゲルカラム（ワコーゲル C-300、和光純薬株式会社社製、４×２３cm）にのせ、ヘキサン：酢酸エチル系の展開溶媒を使用し、酢酸エチル濃度を０％、２％、５％、１０％、２０％、４０％、６０％及び１００％とした溶媒をそれぞれ１．５リットル順次使用して展開し、１００mlずつ分取して第１’〜第１１’の１１画分に分画した。
得られた第８’画分（５０％の酢酸エチルを含むヘキサン溶媒によって溶出した画分）と第９’画分（６０％の酢酸エチルを含むヘキサン溶媒によって溶出した画分）を合わせて減圧下に濃縮し、この濃縮物をシリカゲルカラム（ワコーゲル C-300、和光純薬株式会社社製、３φ×２０cm）にのせ、ヘキサン：酢酸エチル系の展開溶媒を使用し、酢酸エチル濃度を０％、２％、５％、１０％、２０％、４０％、６０％及び１００％とした溶媒をそれぞれ３リットル順次使用して展開し、２００mlずつ分取して第１”〜第１０”の１０画分に分画した。第６”画分を逆相ＨＰＬＣ（YMC-PAK Pro C18、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として５６％アセトニトリル（アセトニトリル：水＝５６：４４）を用い、流速９．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２１０nm）で監視しつつ、保持時間１１分５４秒、１３分４２秒、１４分５７秒、１５分２０秒及び１６分５４秒にピークを示す溶出液を分取した。このうち１３分４２秒にピークを示す画分を順相ＨＰＬＣ（YMC-PAK SIL-06、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として４８％ヘキサン（ヘキサン：酢酸エチル＝４８：５２）を用い、流速３．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２５４nm）で監視しつつ、保持時間１５分２４秒にピークを示す溶出液を分取した。この溶出液を減圧下に濃縮して化合物１を得た。
【００１１】
製造例２
製造例１において、第６”画分を逆相ＨＰＬＣにより分離した画分のうち、１４分５７秒にピークを示す画分を順相ＨＰＬＣ（YMC-PAK SIL-06、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として４７％ヘキサン（ヘキサン：酢酸エチル＝４７：５３）を用い、流速３．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２５４nm）で監視しつつ、保持時間１５分２４秒にピークを示す溶出液を分取した。この溶出液を減圧下に濃縮して化合物３を得た。
【００１２】
製造例３
製造例１において、第６”画分を逆相ＨＰＬＣにより分離した画分のうち、１６分５４秒にピークを示す画分を順相ＨＰＬＣ（YMC-PAK SIL-06、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として４７％ヘキサン（ヘキサン：酢酸エチル＝４７：５３）を用い、流速３．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２５４nm）で監視しつつ、保持時間１６分５４秒にピークを示す溶出液を分取した。この溶出液を減圧下に濃縮して化合物４を得た。
【００１３】
製造例４
製造例１において、第２回目のシリカゲルカラムによる分離から得られた第１”〜１０”画分のうちの第７”画分を、順相ＨＰＬＣ（YMC-PAK SIL-06、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として４５％ヘキサン（ヘキサン：酢酸エチル＝４５：５５）を用い、流速８．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２５４nm）で監視しつつ、保持時間１９分００秒にピークを示す溶出液を分取した。この溶出液の減圧濃縮物をさらに逆相ＨＰＬＣ（YMC-PAK Pro C18、株式会社ＹＭＣ社製）により分離した。移動相として５５％アセトニトリル（アセトニトリル：水＝５５：４５）を用い、流速３．０ml／min（室温）で溶出させ、溶出液をＵＶ（２１０nm）で監視しつつ、保持時間１１分２３秒にピークを示す溶出液を分取した。この溶出液を減圧下に濃縮して化合物２を得た。
【００１４】
以下に、得られた化合物の1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲのデータを示す。なお、溶媒はすべてCDCl3である。
表１  化合物１及び２のＮＭＲスペクトル
2005247762.tif 000009
【００１５】
表２  化合物３のNMRスペクトル
2005247762.tif 000010
【００１６】
表３  化合物４のNMRスペクトル
2005247762.tif 000011
【００１７】
これらのデータから化合物１ないし４はそれぞれ下記の式（II）及び（V）の構造を有することが確認された。
2005247762.tif 000012
2005247762.tif 000013
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【００１８】
本発明の化合物の活性を、以下の各種試験により評価した。
〔一酸化窒素産生抑制試験〕
生体内の一酸化窒素（ＮＯ）はＬ−アルギニンを前駆体とする。アルギニンのグアニジノ基に分子酸素が添加し、Ｌ−シトルリンへ変換され、同時にＮＯが産生される。この反応を触媒するのがＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）であり、神経型ＮＯＳ、内皮型ＮＯＳとｉＮＯＳの３種類のアイソフォームが存在する。
ｉＮＯＳは通常発現しておらず、マクロファージ、白血球、血管平滑筋、内皮細胞、腎メンサギウム細胞、心筋細胞など多くの細胞で、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αなどのサイトカインやリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の刺激により誘導される。
炎症巣において、好中球やマクロファージはＮＯと同時に活性酸素の一種であるＯ2-を産生する。ＮＯは速やかにＯ2-と反応し、ＮＯより反応性の高いＯＮＯＯ-を生成する。この結果、慢性的な炎症やアレルギー、糖尿病、動脈硬化などが引き起こされる。
【００１９】
マクロファージとしてアベルソン ロイケミア（Abelson leukemia）ウィルスで形質転換したマウス腹腔より得られたマクロファージ様株化細胞RAW264.7細胞（ATCCより購入）を使用した。この細胞を、ウシ胎児血清を１０％含むHam's培地中に１〜５×１０5個／mlの濃度に調製し、９６穴プレート（住友ベークライト製、8096R）に２００μlずつ分注し、１時間、ＣＯ2インキュベーターで細胞を接着させた。各種濃度の試験化合物と共にマウスＩＦＮ−γ（ジェンザイム（Genzyme）製）及びＬＰＳ（シグマ（Sigma）製、055:B5）を加えた。最終濃度がＩＦＮ−γは０．３３ng／ml、ＬＰＳは１００ng／mlとなるように調整した。試験化合物はＤＭＳＯに溶解し、培地に対する含量が０．２％となるように調整した。
３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで１６時間培養後、培養上清を採取し、グリース法（L. J. Ignarro, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1987, pp. 9265-9269）により培地中のＮＯ2-を定量した。得られたＮＯ2-量から、抑制率を次式により算出した。
抑制率（％）＝｛１−（Ｘ−Ｙ）／（Ｚ−Ｙ）｝×１００
Ｘ：試験化合物の存在下でＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2-の量
Ｙ：試験化合物、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳがない状態で誘導されるＮＯ2-の量
Ｚ：ＩＦＮ−γとＬＰＳにより誘導されるＮＯ2-の量
試験化合物のＩＣ50、すなわち抑制率が５０％となる式（II）で表される化合物の濃度を表４に示す。
表４  一酸化窒素産生抑制作用
2005247762.tif 000016
【００２０】
〔ｉＮＯＳ及びＩＬ−６等のサイトカインのｍＲＮＡ発現抑制試験〕
RAW264.7細胞(1.2×106細胞/mL)を試験化合物、ＩＮＦ−γ (10 U/mL)及びＬＰＳ（100 ng/mL）共存下、6時間培養した。RNA isolationキット（QIAGEN社製）を用いて、total RNAを抽出した。RNA量を260 nmの吸収により定量し、250 ngのRNAをオリゴ(dT)12-18プライマーを用いて、逆転写させcDNAを作製した。このcDNAを鋳型としてPCR反応を行った。反応は、50 mM KCl、5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.6 unit Ampli Taq gold（Applied Biosstems）、0.4 mMmolセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む30 μlの反応溶液中で行った。ｉＮＯＳのプライマーに5’-ACCTACTTCCTGGACATTACGACCC-3’ [s]、5’-AAGGGAGCAATGCCCGTACCAGGCC-3' [a]を、またＧＡＰＤＨのプライマーに5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ [s]、 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' [a]、ＩＬ−１βのプライマーに、5'-TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3’ [s]、5’-TGTCCATTGAGGAGAGCTTTCAGC-3’ [a]、ＩＬ−６のプライマーに、5'-TGCAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG3' [s]、5'-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3’ [a]、ＴＮＦ−αのプライマーに、5’-AGGCGCCACCACGCTCTTCT-3’ [s]、5’-GGCAGCCTTGGCCCTTGAA-5’ [a]を用いた。PCR反応は94℃、1分間 (denaturation)、60℃、1分間（annealing）、72℃、1.5分間を1サイクルとし25サイクル行った。PCR産物を2 %アガロースにて電気泳動し、エチジウムブロイマイドで染色し検出した。化合物４についての結果を図１に示す。図１から明らかなように、化合物４はｉＮＯＳ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現を化合物の濃度に依存して抑制する。
【００２１】
このように、本発明の化合物はＮＯの産生を抑制し、ｉＮＯＳ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現を抑制するので、抗アレルギー剤、抗炎症剤として有用である。
本発明の化合物を経口、非経口又は経皮投与することができる。その投与量は患者の年齢、疾病の状況等によって変化するが、成人１日１人当たり１mg／kg〜１００mg／kgである。
本発明の化合物を種々の剤形で投与することができ、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤、パップ剤等の形態で投与することができる。本発明の化合物をこれらの剤形に形成する場合、これらの製剤化に通常使用する担体や添加物、例えば溶剤、基剤、希釈剤、充填剤などの賦形剤、溶解補助剤、乳化剤、分散剤、崩壊剤、可溶化剤、増粘剤、滑沢剤等の補助剤、抗酸化剤、保存剤、芳香剤、甘味剤等の添加剤を常法に従って使用し、製剤化することができる。
【００２２】
製剤例
５５０mgの化合物１、１０５５０mgの乳糖、４５００mgのデンプンを均一に混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース液０．１５mlを添加し、練合して軟塊を製造し、顆粒機を通して顆粒を製造し、乾燥する。乾燥後の顆粒に３００mgのステアリン酸マグネシウムを加え、均一に混合した後、打錠機によって錠剤とする。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の化合物はＮＯの産生を抑制し、ｉＮＯＳ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現を抑制する作用を有する新規なクロマン誘導体化合物であり、抗アレルギー剤、抗炎症剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】化合物４によるｉＮＯＳ、インターロイキン−１β、インターロイキン−６及び腫瘍壊死因子−αのｍＲＮＡ発現抑制を示す電気泳動の写真である。
【図１】
2005247762.tif 000023