(57)【要約】【課題】  最適な免疫原性を提供するために設計された人工的Tヘルパー細胞エピトープ（Thエピトープ）を含んで成る、LHRHに対する抗体を誘導するための新規の免疫原を提供する。【解決手段】  合成ペプチドB細胞エピトープまたは「ターゲット抗原部位」に結合されたプロミスカス人工的Tヘルパー細胞エピトープ競合免疫原性ペプチド組成物を提供する。免疫原性ペプチドは、人工的Tヘルパー細胞（Th）エピトープおよびB細胞エピトープを含有するターゲット抗原部位および、必要に応じて、一般的免疫刺激配列を含んでなる。免疫原性ペプチド中の人工的Thエピトープの存在は、強いTヘルパー細胞仲介免疫応答を誘導して、「ターゲット抗原部位」に対して向けられた抗体を高いレベルで産生する能力を免疫原性ペプチドに付与する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
（A）n−（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−X
または
（A）n−（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−X
または
（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−（A）n−X
または
（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−（A）n−X
式中、
Aはアミノ酸またはインベーシンドメイン（配列番号27）であり、ここでnは1超であり、個々のAは同一であるか、あるいは異なることができ、
Bはアミノ酸、−NHCH（X）CH2SCH2CO−、−NHCH（X）CH2SCH2CO（ε−N）Lys−、−NHCH（X）CH2S−スクシニミジル（ε−N）Lys−、および−NHCH（X）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択され、
Thは配列番号21〜25またはそれらのアナローグから成る群から選択される人工的ヘルパーT細胞エピトープであり、ここで「それらのアナローグ」とはロトバード配列ルールに従い位置１，４，５，８におけるアミノ酸残基が電荷を保持するように他のアミノ酸残基により置換されたものをいい、
「ターゲット抗原部位」はLHRHであり、
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−COONH2であり、
nは1〜10であり、
mは1〜4であり、そして
oは0〜10である、
により表されるペプチド免疫原。
【請求項２】
BがGly−Gly、Pro−Pro−Xaa−Pro−Xaa−Pro（配列番号26）（式中Xaaは任意のアミノ酸である）、−NHCH（X）CH2SCH2CO−、−NHCH（X）CH2SCH2CO（ε−N）Lys−、−NHCH（X）CH2S−スクシニミジル（ε−N）Lys−、および−NHCH（X）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択される、請求項1に記載のペプチド免疫原。
【請求項３】
BがGly−Glyである、請求項1に記載のペプチド免疫原。
【請求項４】
配列番号31、36、38、40、41、43、46及び49から成る群から選択される、請求項1又は3に記載のペプチド免疫原。
【請求項５】
配列番号36、38、40、41、43、46及び49から成る群から選択される、請求項4に記載のペプチド免疫原。
【請求項６】
配列番号33、35、39、42、45、47及び48から成る群から選択される、請求項1又は3に記載のペプチド免疫原。
【請求項７】
配列番号33、39、42及び45から成る群から選択される、請求項6に記載のペプチド免疫原。
【請求項８】
医薬的に許容される担体を更に含んで成る、免疫学的に有効な量の請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド免疫原を含んで成る医薬組成物。
【請求項９】
医薬的に許容される担体を更に含んで成る、免疫学的に有効な量の請求項4に記載のペプチド免疫原を含んで成る医薬組成物。
【請求項１０】
医薬的に許容される担体を更に含んで成る、免疫学的に有効な量の請求項5に記載のペプチド免疫原を含んで成る医薬組成物。
【請求項１１】
前記ペプチド又はペプチド複合体の免疫学的に有効な量が1回の投与当り体重1kgにつき0.5μg〜1mgである、請求項8記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ペプチド又はペプチド複合体の免疫学的に有効な量が1回の投与当り体重1kgにつき0.5μg〜1mgである、請求項9記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ペプチド又はペプチド複合体の免疫学的に有効な量が1回の投与当り体重1kgにつき0.5μg〜1mgである、請求項10記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、B細胞エピトープを含んでなる所望のターゲット抗原部位および必要に応じて一般的免疫刺激配列に共有結合した新規な人工的Tヘルパー細胞エピトープ（Th）を含んでなるペプチド免疫原に関する。人工的Thエピトープは、強いTヘルパー細胞仲介免疫応答および「ターゲット抗原部位」に対して向けられた抗体の産生を誘導する能力をペプチド免疫原に付与する。本発明は、また、免疫原性を改良するために、担体タンパク質および確立されたペプチド免疫原中の病原体由来Tヘルパー細胞部位を新規な人工的Tヘルパー細胞エピトープで好都合に置換する。
【背景技術】
【０００２】
T細胞エピトープのアミノ酸配列を予測する、多数のルールが開発されてきている。しかしながら、T細胞エピトープとして特定のアミノ酸配列を有効とする方法または因子に関する中心となる統合された理論は存在しないので、ルールは経験的であり、万能に適用可能ではない。これらのルールを知ることによって、それにもかかわらず、実験的研究により、本発明の新規な人工的Tヘルパー細胞エピトープが開発された。
【０００３】
本発明のペプチド免疫原は、免疫化された宿主において、病原性生物から取った部位、およびイムノサイレント自己抗原および腫瘍関連ターゲットから取った部位を包含する、所望のターゲット抗原部位に対して抗体応答を誘発するために有用である。したがって、本発明のペプチドは多様な医学的、獣医学的用途、例えば、下記の用途において有用である：感染症に対する保護免疫を提供するワクチン；正常の生理学的プロセスの機能障害から生ずる疾患を治療する免疫療法；癌を治療する免疫療法；および所望の結果を生成するための正常の生理学的プロセスに介入する因子として。
【０００４】
例えば、本発明の新規な人工的Tヘルパー細胞エピトープは、黄体化ホルモン放出ホルモン（LHRH）に対してターゲッティングされた抗体を誘発し、避妊、ホルモン依存性腫瘍の抑制、雄豚腐敗（boar  taint）の予防、および免疫去勢に有用である。本発明の新規な人工的Thエピトープは、種々の微生物／タンパク質／ペプチドのターゲットB細胞エピトープと組合わせるとき、免疫応答を誘発することが見出された。LHRHに加えて、本発明の人工的Thエピトープは、下記のものを包含する他のターゲット抗原部位に結合させたとき、有効であることが見出された：飼育場の動物における成長を促進するソマトスタチン；アレルギー治療のためのIgE；HIV感染および免疫障害を治療および予防するためのTヘルパー細胞のCD4レセプター及び口蹄疫を予防する口蹄疫ウイルスキャプシドタンパク質。
【０００５】
大部分の抗体免疫応答は細胞仲介であり、抗原提示細胞、B細胞（また、抗原提示細胞として機能する、抗体産生細胞）、およびTヘルパー（Th）細胞の間の相互作用を必要とすることが知られている。結局、有効な抗体応答の誘発は、B細胞が主題の免疫原のターゲット抗原部位（B細胞エピトープ）を認識し、そしてTヘルパー細胞がThエピトープを認識することを必要とする。一般に、主題の免疫原上のTヘルパー細胞エピトープはその1またはそれ以上のB細胞エピトープと異なる（Babbitt他、Nature、1985；317：259−361）。B細胞エピトープは、応答において所望のターゲット部位に対する抗体を産生するB細胞により認識される所望のターゲット上の部位である。ターゲットの自然コンフォメーションは抗体が直接結合する部位を決定することが理解される。しかしながら、タンパク質のTヘルパー細胞の認識は非常にいっそう複雑であり、それほどよく理解されていない。（Cornette他、Methods  in  Enzymology、Vol.  178、Academic  Press、1989、pp.  611−634）。
【０００６】
現在の理論によると、Th細胞応答の誘発はTヘルパー細胞レセプターが所望のターゲットを認識することを必要としないが、ターゲットタンパク質のプロセシングされたペプチドフラグメントと、結合したクラスII主要組織適合性複合体（MHC）との間で、抗原提示細胞の膜上に複合体が形成する。こうして、ターゲットタンパク質のペプチドのプロセシングおよび3方認識がTヘルパー細胞の応答に必要とされる。3成分複合体は規定することが特に困難である。なぜなら、決定的なMHCクラスII接触残基は異なるMHC結合ペプチド（Thエピトープ）内の様々な位置に配置されており、そしてこれらのペプチドは異なるアミノ酸配列を有して長さが異なるからである（Rudensky他、Nature、1991；353：622−627）。さらに、MHCクラスII分子はそれら自体宿主の遺伝的構成に依存して高度に多様性である。こうして、特定のThエピトープに対する免疫応答性は、一部分、宿主のMHC遺伝子により決定される。事実、ある種のペプチドは特定のクラスIIのMHCアレルの産物にのみ結合することが示された。こうして、プロミスカスThエピトープ、すなわち、種を横切ってかつ単一種の個体を横切って反応性であるもの、を同定することは困難である。Thエピトープの反応性は集団の個体の間においてさえ異なることが見出された。
【０００７】
T細胞認識の成分工程の各々についての多数の、変化する因子：抗原プロセシング細胞による適当なペプチドのプロセシング、遺伝的に決定されたクラスIIのMHC分子によるペプチドの提示、およびTヘルパー細胞上のレセプターによるMHC分子／ペプチド複合体の認識は、広い応答性を提供するプロミスカスThエピトープについての要件の決定を困難とした（Bianchi他、EP  0427347；Sinigaglia他、chapter  6、Immunological  Recognition  of  Peptides  in  Medicine  and  Biology、Zegers他、編、CRC  Press、1995、pp.  79−87）。
【０００８】
抗体を誘導するために、免疫原はB細胞の決定因子およびTh細胞の1またはそれ以上の決定因子の両方を含まなくてはならないことが明らかである。普通に、ターゲットの免疫原性を増加するために、ターゲットを担体タンパク質にカップリングさせることによって、Th応答が得られる。この技術の多数の欠点が存在する。下記の理由で、よく規定された、安全な、有効なペプチド−担体タンパク質複合体を製造することが困難である：
【０００９】
1.  化学的カップリングは、サイズおよび組成の不均質性を導入するランダム反応である、例えば、グルタルアルデヒドとの複合化（Borras−Cuesta他、Eur.  J.  Immunol.、1987；17：1213−1215）；
2.  担体タンパク質は、望ましくない免疫反応、例えば、アレルギー反応および自己免疫反応についての可能性を導入する（Bixler他、WO89／06974号）；
3.  大きいペプチド−担体タンパク質は、ターゲット部位よりむしろ主として担体タンパク質に対して誤って向けられた無関係の免疫応答を誘発する（Cease他、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、1987；84：4249−4253）；および
4.  担体タンパク質は、また、同一担体タンパク質を含んでなる免疫原で以前に免疫化された宿主において、エピトープの抑制の可能性を導入する。同一担体タンパク質が異なるハプテンにカップリングされている他の免疫原で宿主を引き続いて免疫化するとき、生ずる免疫応答は担体タンパク質について増強されるが、ハプテンについて阻害される（Schutze他、J.  Immunol.、1985；135：2319−2322）。
【００１０】
これらの危険を回避するために、担体タンパク質を置換することが望ましい。T細胞のヘルパーを適切に特性決定されたプロミスカスTh決定因子に共有結合させることによって、それをターゲット抗原ペプチドに供給することができる。既知のプロミスカスThは、効力がある病原性因子、例えば、麻疹ウイルFタンパク質（Greenstein他、J.  Immunol.、1992；148：3970−3977）およびB型肝炎ウイルス表面抗原（Partidos他、J.  Gen.  Virol.、1991；72：1293−1299）に由来する。本発明者らは、多数の既知のプロミスカスThは低い免疫原性のペプチド、例えば、デカペプチドホルモンの黄体化ホルモン放出ホルモン（LHRH）を増強するとき有効であることを示した（米国特許第5,759,551号）。効力がある免疫原を発生する、既知のプロミスカスThエピトープおよび低い免疫原性の合成ペプチドを含んでなる他のキメラペプチドが開発された（Borras−Cuesta他、1987）。適切に設計されたプロミスカスTh／B細胞エピトープキメラペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分のメンバーにおいて、Th応答を誘発してB細胞部位にターゲットされた抗体応答を生ずることができる（米国特許第5,759,551号）。
【００１１】
既知のプロミスカスThエピトープを概観すると、それらはほぼ15〜50アミノ酸残基の大きさの範囲であり（米国特許第5,759,551号）、しばしば普通の構造的特徴を共有し、特異的ランドマーク配列を有する。例えば、普通の特徴は両親媒性らせんである。これらはらせんの1つの面を支配する疎水性アミノ酸残基と、取り囲む面を支配帯電した極性残基とを有するアルファ−らせん構造である（Cease他、1987）。既知のThエピトープは、また、しばしば追加の主要なアミノ酸パターン、例えば、帯電した残基、−Gly−、引き続く2〜3つの疎水性残基、引き続いて帯電したまたは極性の残基を含有する（RothbardおよびTaylor、EMBO  J.、1988；7：93−101）。このパターンを有するエピトープはロトバード（Rothbard）配列と呼ばれる。また、Thエピトープはしばしば1、4、5、8ルールに従い、ここで正に帯電した残基に引き続いて帯電した残基後に疎水性残基が第4、第5および第8位置に存在し、同一面に位置する位置1、4、5、および8を有する両親媒性らせんと一致することが見出された。疎水性および帯電したおよび極性のアミノ酸のこのパターンは単一のThエピトープ内で反復されることがある（Partidos他、J.  Gen.  Virol.、1991；72：1293−99）。既知のプロミスカスT細胞エピトープのすべてではなく、大部分は、前述の周期性の少なくとも1つを含有する。  病原体に由来するプロミスカスThエピトープは下記のものを包含する：B型肝炎表面およびコア抗原ヘルパーT細胞エピトープ（HBsAg  ThおよびHBc  Th）、百日咳トキシンヘルパーT細胞エピトープ（PT  Th）、破傷風トキシンヘルパーT細胞エピトープ（TT  Th）、麻疹ウイルFタンパク質ヘルパーT細胞エピトープ（MVF  Th）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）主要外膜タンパク質ヘルパーT細胞エピトープ（CT  Th）、ジフテリアトキシンヘルパーT細胞エピトープ（DT  Th）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium  falciparum）サーカムスポロゾイトヘルパーT細胞エピトープ（PF  Th）、シストソマ・マンソニ（Schistosoma  mansoni）トリオースホスフェートイソメラーゼヘルパーT細胞エピトープ（SM  Th）、および大腸菌（Escherichia  coli）TratヘルパーT細胞エピトープ（TraT  Th）。これらの病原体由来Thエピトープの配列は下記の文献に記載されている：米国特許第5,759,551号（引用することによって本明細書の一部とされる）の中に配列番号2〜9および42〜52として；Stagg他、Immunology、1993；79：1−9；およびFerrari他、J.  Clin.  Invest.、1991；88：214−222（また、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００１２】
LHRHに適用するペプチドB細胞部位を免疫増強するためにこのような病原体由来部位を使用することは、米国特許第5,759,551号、HIVについてGreenstein他（1992）、マラリアについてEP  0,427,347、レトロウイルスについてBorras−Cuesta他（1987）、および麻疹についてPartidos他（1991）に記載されている。
有用なThエピトープは、また、組合わせThを包含することができる。Wang他（WO95/11998号）において、組合わせのエピトープの特定のクラス、「構造化合成抗原ライブラリー（Structured  Synthetic  Antigen  Library）」（SSAL）が記載された。Th  SSALエピトープは、特定の位置に置換基を有する不変残基の構造的フレームワークの回りに体制化されたアミノ酸配列を有する、多数のThエピトープを含んでなる。比較的不変の残基を保持させると同時に、他の残基を変化させて多様なMHC制限因子の認識を提供することによって、SSALの配列は決定される。これは次のようにして達成することができる。プロミスカスThの一次アミノ酸配列を整列し、骨格フレームワークとして、Thペプチドのユニーク構造の原因となる残基を選択しかつ保持し、そして既知のMHC制限因子に従い残りの残基を変化させる。MHC制限因子の好ましいアミノ酸を有する不変および可変位置のリストを利用して、MHC結合モチーフを得ることができる。（Meister他、Vaccine、1995；13：581−591）。
SSALのメンバーは、単一の固相ペプチド合成において、ターゲッテッドB細胞エピトープおよび他の配列と縦列で同時に産生することができる。Thライブラリー配列は、プロミスカスThエピトープの構造モチーフを維持し、同時に、より広い範囲のハプロタイプに対する反応性を収容するように設計される。例えば、縮重Thエピトープ「SSAL1  TH1」（WO95/11998号）に「SSAL1TH1」は、プロミスカスエピトープを麻疹ウイルのFタンパク質から取った後、モデル化された（Partidos他、1991）。SSAL1  TH1は、ターゲット抗原、LHRHと縦列で使用するように設計された。それが由来する麻疹エピトープと同様に、SSAL1  TH1はロトバード（Rothbard）配列および1、4、5、8ルールに従うように設計され、そして4つのペプチドの混合物である：
【化１】
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帯電した残基GluまたはAspを位置1に付加して、Thの疎水性面を取り囲む電荷を増加させる。次いで両親媒性らせんの疎水性面は2、5、8、9、10、13および16における疎水性残基により維持され、2、5、8、9、10、および13における位置を変化させて、広い範囲のMHC制限因子に対する結合能力を有する正面を提供する。SSALの特徴の正味の効果は、人工的Thの免疫応答性の範囲を拡大することである（WO95/11998号）。
【００１３】
既知のプロミスカスThエピトープの性質および特徴のすべての組込んだ「理想化された」人工的Thエピトープを設計する、他の試みがなされてきている。SSALの形態のものを包含する、これらの人工的プロミスカスThエピトープを含んでなる、いくつかのペプチド免疫原がまた構築された。人工的Th部位を自己抗原および外来抗原から取ったペプチド配列と組合わせて、高度に有効であると記載された部位特異的ターゲットに対する抗体応答が増強された（WO95/11998号；Alecander他、Immunity、1994、1:751；Del  Guerio他、Vaccine、1997、15：441）。このようなペプチド免疫原は、有効かつ安全な抗体応答を提供し、かつ記載する理想化プロミスカスTh部位により付与された広く反応応答性から生ずる、それらの免疫効力を提供するために好ましい。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、合成ペプチドB細胞エピトープまたは「ターゲット抗原部位」に結合されたプロミスカス人工的Tヘルパー細胞エピトープ競合免疫原性ペプチド組成物を提供する。免疫原性ペプチドは、人工的Tヘルパー細胞（Th）エピトープおよびB細胞エピトープを含有するターゲット抗原部位および、必要に応じて、一般的免疫刺激配列を含んでなる。免疫原性ペプチド中の人工的Thエピトープの存在は、強いTヘルパー細胞仲介免疫応答を誘導して、「ターゲット抗原部位」に対して向けられた抗体を高いレベルで産生する能力を免疫原性ペプチドに付与する。本発明は、さらに、確立されたペプチド免疫原において、担体タンパク質および病原体由来Tヘルパー細胞部位を、ペプチド免疫原の免疫原性を改良するように特別に設計された人工的Tヘルパー細胞エピトープと好都合に置換する。本発明の人工的Thエピトープを有する、新規な短いペプチド免疫原は、避妊、ホルモン依存的腫瘍の抑制、雄豚腐敗の防止、および免疫去勢に有用な黄体化ホルモン放出ホルモン（LHRH）に対してターゲットされた抗体を高いレベルで誘発する。
【００１５】
人工的Thエピトープは、プロミスカスT細胞エピトープを予測する既知のルールを念頭に置いて、実験的に開発された。Thエピトープのメカニズムを説明する統合する理論の非存在下において、これらの「予測的」ルールは有効な人工的Thエピトープを設計するためのガイドラインとして単に働くだけである。本発明の人工的Thエピトープは、ターゲット抗原部位および必要に応じて免疫刺激配列と結合するとき、有用であることが見出された。本発明の免疫原性ペプチドは、下記式により表される：
（A）n−（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−X
または
（A）n−（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−X
または
（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−（A）n−X
または
（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−（A）n−X
式中、
各Aはアミノ酸または一般的免疫刺激性配列、例えば、インベーシンドメイン（Inv）（配列番号27）であり、ここでnは1超であり、個々のAは同一であるか、あるいは異なることができ、
各Bはアミノ酸、−NHCH（X）CH2SCH2CO−、−NHCH（X）CH2SCH2CO（ε−N）Lys−、−NHCH（X）CH2S−スクシニミジル（ε−N）Lys−、および−NHCH（X）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択され、
Thは配列番号3〜16、21〜25またはそれらのアナローグまたはセグメントから成る群から選択される人工的ヘルパーT細胞エピトープであり、
「ターゲット抗原部位」は、B細胞エピトープ、ペプチドハプテン、またはそれらの免疫学的反応性アナローグであり、
Xはアミノ酸のα−COOH、α−COONH2であり、
nは1〜約10であり、
mは1〜約4であり、そして
oは0〜約10である。
【００１６】
ターゲット抗原部位としてペプチドハプテンの例はLHRH（配列番号28）である。
本発明の組成物は、免疫化された宿主において、所望のターゲット抗原部位に対する抗体応答を誘発することができるペプチドを含んでなる。ターゲット抗原部位は病原性生物、通常イムノサイレント自己抗原および腫瘍関連ターゲット、例えば、LHRHに由来することができる。
【００１７】
したがって、本発明の組成物は多数の多様な医学および獣医学の用途において有用である。これらは下記の用途を包含する：感染症に対する保護免疫を提供するワクチン；正常の生理学的プロセスの機能障害から生ずる疾患を治療する免疫療法；癌を治療する免疫療法；および正常の生理学的プロセスに介入し、変更する因子として。
【００１８】
LHRHの他に、他の有用なターゲット抗原には下記のものを包含する：避妊、ホルモン依存的腫瘍の抑制および免疫去勢のためのLHRH；飼育場の動物における成長を促進するソマトスタチン；HIV感染および免疫障害を治療および予防するためのTヘルパー細胞のCD4レセプター並びに口蹄疫を予防するワクチンとしての口蹄疫ウイルスキャプシドタンパク質。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
理想化された人工的Thエピトープが提供された。これらは2つの既知の自然ThエピトープおよびSSALペプチドプロトタイプ（WO95/11998号に開示されている）に基づいてモデル化された。SSALSは、遺伝的に多様な集団のメンバーの間で広い免疫応答を誘発することを意図して、組合わせのMHC分子結合モチーフ（Meister他、1995）を組込んでいる。SSALペプチドプロトトロフは、麻疹ウイルスおよびB型肝炎ウイルスの抗原をベースとして設計され、多重MHC結合モチーフの導入により修飾された。他のThエピトープの設計は、他の既知のThエピトープ後に、多重MHC結合モチーフを簡素化し、付加し、および／または修飾して、1系列の新規な人工的Thエピトープを産生することによって、モデル化された。新しく採用されたプロミスカス人工的Th部位は、種々のターゲット抗原部位を担持する合成ペプチドの中に組込まれた。生ずるキメラペプチドは、ターゲット抗原部位に対する有効な抗体応答を刺激することができた。
【００２０】
表1a中に「SSAL1  TH1」、すなわち、4つのペプチドの混合物（配列番号1）として示すプロトタイプ人工的ヘルパーT細胞（Th）エピトープは、麻疹ウイルのFタンパク質のプロミスカスThエピトープからモデル化された、理想化Thエピトープである（Partidos他、1991）。表1a中に「MVF  Th」として示すモデルのThエピトープ（配列番号2）は、麻疹ウイルスFタンパク質の残基288〜302に対応する。MVF  Th（配列番号2）を次のようにしてSSAL1  Th1プロトタイプ（配列番号1）に修飾した：「ロトバード（Rothbard）ルール」に従い、位置1に帯電した残基Glu／Aspを付加してエピトープの疎水性面を取り囲む電荷を増加する；位置4、6、12および14において帯電した残基またはGlyを付加または保持する；そして位置7および11において帯電した残基またはGlyを付加または保持する。Thエピトープの疎水性面は、位置2、5、8、910、13および16における残基を含んでなる。普通にプロミスカスエピトープと結合する疎水性残基をこれらの位置において置換して、コンビナトリアルTh  SSALエピトープ、SSAL1  Th1（配列番号1）を生成した。ロトバード（Rothbard）配列ルールに順応する疎水性残基はボールドフェースで示されている（表1a、配列番号1）。1、4、5、8ルールに従う配列中の位置には下線が引かれている。プロトタイプSSAL1  Th1（配列番号1）の他の有意な特徴は、位置1および4が位置9の各側においてパリンドロームとして不完全に反復してMHC結合モチーフを模擬していることである。SSAL1  Th1のこの「1、4、9」パリンドロームパターンを配列番号3（表1a）においてさらに修飾して、もとのMVFモデルTh（配列番号2）の配列をいっそう密接に反映させた。また、可変位置1、12、および14にメチオニン残基を付加することによって、SSAL1  Th1プロトタイプ（配列番号1）の疎水性を配列番号3において調節した。実験データが示すように、ターゲット抗原部位にカップリングした配列番号3は、免疫化された動物において、ターゲット抗原部位に対する抗体応答を増強した。
【００２１】
配列番号3を配列番号4および5（表1a）に簡素化して、それ以上の免疫原性SSAL  Thエピトープを形成した。配列番号3をさらに配列番号6〜9（表1a）に簡素化して、1系列の単一配列エピトープを形成した。ターゲット抗原部位にカップリングされた、SSAL  Th配列番号4および5および単一配列Thエピトープ配列番号6〜9は、また、増強された免疫原性を提供した。
【００２２】
配列番号3の免疫原性は、N−末端を非極性および極性の非帯電アミノ酸、例えば、IleおよびSerで延長し、そしてC末端を帯電したおよび疎水性アミノ酸、例えば、LysおよびPheで延長することによって、改良できることが見出された。これは表1a中に配列番号10として示されており、それらから簡素化されたSSAL  Thエピトープ配列番号11および12を誘導した。配列番号10、11又は12から選択されるターゲット抗原部位およびThエピトープを含んでなるペプチド免疫原は、増強された免疫原性を表示した。単一配列ペプチド、例えば、配列番号13〜16をまた合成し、動物において免疫原性について試験した。これらもまた有効なThエピトープであることが見出された。
【００２３】
表1b中に「SSAL2  Th2」（配列番号17）として示すSSAL人工的ヘルパーエピトープを、プロミスカスエピトープの後において、B型肝炎表面抗原（HBsAg）の残基19〜33に対応するB型肝炎ウイルス表面抗原配列番号18からモデル化した（Greenstein他、1992）。3つのリシンを付加して水溶性を改良することによって、病原体由来モデルThを配列番号19に修飾した；C末端のAspを配列番号20において欠失させて、Gly−Glyがスペーサーとして導入されたキメラペプチドの合成を促進した。位置1、2、3および5におけるその中の正に帯電した残基を変化させて、らせん構造の疎水性面を取り囲む電荷を変化させることによって、SSAL2  Th2（配列番号17）を配列番号19からさらに修飾した。可変位置3における帯電したアミノ酸は、また、1、4、5、8ルールに従う理想化Thエピトープ、SSAL2  Th2（配列番号17）を発生させるために必要な残基を与えた（下線が引かれている残基）。両親媒性らせんの疎水性面は、配列番号17の位置4、6、7、10、11、13、15および17における疎水性残基から成る。ロトバード配列の残基はプロトタイプSSAL2  Th2（配列番号17）についてボールドフェースで示されている。
【００２４】
前述したように、配列番号21〜25を理想化SSAL2  Th2プロトタイプ（配列番号17）から簡素化した。例えば、可変疎水性残基を単一アミノ酸、例えば、IleまたはMetで置換した（配列番号21〜25）。位置4における疎水性Pheを配列番号24の特徴として組込んが、3つのリシンを欠失させた。C末端のAspの欠失を配列番号22、24、および25の特徴として組込んだ。それ以上の修飾は、普通のMHC結合モチーフAxTxILによるC末端の置換を含んだ（Meister他、1995）。
【００２５】
新規な人工的Thエピトープ、配列番号3〜16及び21〜25の各々を種々のターゲット抗原部位にカップリングして、ペプチド免疫原を形成した。ターゲット抗原部位は、ペプチドホルモン、LHRHおよびソマトスタチン、免疫グロブリンIgEからのB細胞エピトープ、T細胞CD4レセプター、口蹄疫ウイルスのVP1キャプシドタンパク質を包含する。これらの結果が示すように、多様なグループの自己抗原および外来抗原と交差反応性である有効な抗ターゲット部位抗体が産生された。最も重要なことには、抗体応答はターゲット抗原部位に対して向けられ、新規なThエピトープに対して向けられなかった。LHRHについて新規なペプチド免疫原についての結果は表2および3に示されている。また、免疫原性の結果が示すように、産生された抗体はLHRHに対して有効であるが、Thエピトープそれら自体に対して有効ではなかった。LHRHはT細胞エピトープを欠くターゲット抗原部位であることを強調すべきである（Sad他、Immunology、1992；76：599−603および米国特許第5,759,551号）。こうして、本発明の新規な人工的ThエピトープはプロミスカスThエピトープの新しいクラスを表す。
【００２６】
本発明の人工的Thエピトープは、クラスII  MHC分子結合部位を含んでなるアミノ酸（自然または非自然アミノ酸）の連続配列である。それらはターゲット抗原部位に対する抗体応答を増強または刺激する。Thエピトープは連続的または不連続的アミノ酸セグメントから成ることができるので、Thエピトープのすべてのアミノ酸が必然的にMHC認識に関係するわけではない。本発明のThエピトープは、免疫学的に機能的な相同体をさらに包含する。Th相同体は、免疫増強相同体、交差反応性相同体およびこれらのThエピトープの任意のセグメントを包含する。機能的Th相同体は、1〜約10アミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失および挿入をさらに含み、ThエピトープのTh刺激機能を提供する。
【００２７】
本発明のプロミスカスThエピトープはターゲット抗原部位のN−末端またはC−末端に共有結合して、キメラTh／B細胞部位ペプチド免疫原を産生する。用語「ペプチド免疫原」は、本明細書において使用するとき、単一のより長いペプチドを形成するように慣用のペプチド結合によるか、あるいは共有結合、例えば、チオエステルの他の形態の結合によるかにかかわらず、ターゲット抗原部位に共有結合したThエピトープを含んでなる分子を意味する。したがって、Thエピトープ（例えば、配列番号3〜16及び21〜25）は、化学的カップリングまたは直接的合成を介して、ターゲット抗原部位（例えば、配列番号28）に共有結合されている。Thエピトープはターゲット部位に直接結合するか、あるいはスペーサー、例えば、Gly−Glyを通して結合することができる。ThエピトープをB細胞エピトープ（例えば、配列番号31〜54、57、59〜61、63、65〜68、69、70）から物理的に分離することに加えて、スペーサーはThエピトープの結合によりつくられた人工的二次構造またはターゲット抗原部位を有する機能的相同体を崩壊し、これによりThおよび／またはB細胞の応答に対する妨害を排除することができる。ThおよびIgEドメインの分離を増強する柔軟性ヒンジスペーサーは、また、有用である。柔軟性ヒンジスペーサーはしばしばプロリンに富んでいる。1つの特定の有用な柔軟性ヒンジは、免疫グロブリン重鎖の中に見出される柔軟性ヒンジ領域からモデル化された配列Pro−Pro−Xaa−Pro−Xaa−Pro（配列番号26）により提供される。その中のXaaは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。スペーサー（配列番号55および56）により提供されるコンフォメーション的分離は、提示されたペプチド免疫原と適当なTh細胞およびB細胞との間のいっそう効率よい相互作用を可能とする。こうして、Thエピトープに対する免疫応答は増強されて、改良された免疫反応性を提供する。
【００２８】
本発明のペプチド複合体免疫原は、また、必要に応じて一般的免疫刺激ペプチド配列を含むことができる。例えば、細菌エルシニア（Yersinia）種からのインベーシンタンパク質（Inv）のドメイン（Brett他、Eur.  J.  Immunol.、1993、23：1608−1614）。Thエピトープ免疫刺激特性は、T細胞、特に活性化された免疫または記憶T細胞上に存在するβ1インテグリン分子と相互作用するThエピトープインベーシンドメインの能力から生ずる。プロミスカスThエピトープに結合するために好ましいインベーシンドメイン（Inv）の態様は以前に米国特許第5,759,551号に記載され、引用することによって本明細書の一部とされる。前記Invドメインは配列：Thr−Ala−Lys−Ser−Lys−Lys−Phe−Pro−Ser−Tyr−Thr−Ala−Thr−Tyr−Gln−Phe（配列番号27）であるか、あるいは他のエルシニア（Yersinia）種インベーシンタンパク質中の対応する領域からのその免疫刺激相同体である。こうして、このような相同体は、相同体が免疫刺激特性を保持するかぎり、系統毎の変動を収容するアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を含有することができる。一般的免疫刺激配列を必要に応じてスペーサーでThエピトープに結合することができる。
【００２９】
本発明のペプチド複合体、すなわち、記載した人工的Thエピトープを含んでなるペプチド免疫原は、下記式により表すことができる：
（A）n−（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−X
または
（A）n−（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−X
または
（ターゲット抗原部位）−（B）o−（Th）m−（A）n−X
または
（Th）m−（B）o−（ターゲット抗原部位）−（A）n−X
式中、
各Aは任意であり、アミノ酸または一般的免疫刺激性配列であり、ここでnは＞1であり、各Aは同一であるか、あるいは異なることができ、
各Bはアミノ酸、−NHCH（X）CH2SCH2CO−、−NHCH（X）CH2SCH2CO（ε−N）Lys−、−NHCH（X）CH2S−スクシニミジル（ε−N）Lys−、および−NHCH（X）CH2S−（スクシニミジル）−から成る群から選択され、
Thは人工的ヘルパーT細胞エピトープ（配列番号6、12〜19、105、20〜22および31〜35）またはその免疫増強相同体またはセグメントであり、
「ターゲット抗原部位」は、所望のB細胞エピトープまたはペプチドハプテン、またはそれらのアナローグであり）、
Xはアミノ酸のα−COOHまたはα−COONH2であり、
nは1〜約10であり、
mは1〜約4であり、そして
oは0〜約10である。
【００３０】
本発明のペプチド免疫原は、約25〜約100アミノ酸残基、好ましくは約25〜約80アミノ酸残基を含んでなる。
【００３１】
Aがアミノ酸であるとき、それは任意の天然に存在しないか、あるいは任意の天然に存在するアミノ酸であることができる。天然に存在しないアミノ酸は下記のものを包含するが、これらに限定されない：D−アミノ酸、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびその他。天然に存在するアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを包含する。そのうえ、nが1より大きく、かつ2またはそれ以上のA基がアミノ酸であるとき、各アミノ酸は独立して同一であるか、あるいは異なることができる。
【００３２】
Aがインベーシンドメイン配列であるとき、それは好ましくは本明細書において配列番号27として記載するエルシニア（Yersinia）種のインベーシンタンパク質からの免疫刺激エピトープである。
【００３３】
nが3である態様において、各Aは引き続いてインベーシン配列（Inv）、グリシンまたはグリシンである。
【００３４】
Bは任意であり、そして1またはそれ以上の天然に存在するか、あるいは天然に存在しないアミノ酸を含んでなるスペーサーである。（B）0において、o＞1である場合、各Bは同一であるか、あるいは異なることができる。BはGly−GlyまたはPro−Pro−Xaa−Pro−Xaa−Pro（配列番号26）または（ε−N）Lysまたは−NHCH（X）CH2SCH2CO−、−NHCH（X）CH2SCH2CO（ε−N）Lys−、−NHCH（X）CH2S−スクシニミジル（ε−N）Lys−、および−NHCH（X）CH2S−（スクシニミジル）−であることができる。
【００３５】
Thは配列番号3〜16及び21〜25およびそれらの相同体から成る群から選択されるプロミスカスTヘルパー細胞エピトープである。  本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学的方法により作ることができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Fields他、Chapter  3，Synthetic  Peptides：A  User's  Guide、Grant、編、W.  H.  Freeman  &  Co.，New  York、NY、1992、p.  77。ペプチドは、自動化メリフィールド（Merrifield）固相ペプチド合成法に従いα−NH2または側鎖アミノ酸を保護するためにt−BocまたはFmocを使用して合成することができる。ペプチド合成の装置は商業的に入手可能である。1つの例はアプライド・バイオシステムス（Applied  Biosystems）ペプチド合成装置430Aまたは431型である。
【００３６】
所望のペプチド免疫原の組立てが完結した後、標準的手順に従い樹脂を処理して樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を脱ブロックする。遊離ペプチドをHPLCにより精製し、例えば、アミノ酸分析、配列決定、または質量分析により、生化学的に特性決定する。ペプチドを精製し、特性決定する方法はこの分野においてよく知られている。
【００３７】
本発明のThエピトープを含んでなるペプチド免疫原を発生させる他の化学的手段は、「チオエーテル」結合の形成によるハロアセチル化およびシステイン化ペプチドの結合を包含する。例えば、システインをTh含有ペプチドのC−末端に付加し、そしてシステインのチオール基を使用して求電子性基、例えば、リシン残基のNクロロアセチル修飾またはマレイミド誘導ε−またはε−NH2基に対する共有結合を形成することができ、引き続いてこれをターゲット抗原部位のペプチドのN−末端に結合する。この方法において、エピトープ／B細胞部位の複合体を得ることができる。
【００３８】
主題の免疫原をまた重合することができる。重合は、日常的方法に従い、例えば、グルタルアルデヒドとリシン残基の−NH2基との反応により達成することができる。他の方法により、線状構築物のN−末端に付加した追加のシステインを利用することによって、線状Th／B細胞部位の免疫原を重合または共重合することができる。N−末端のシステインのチオール基を使用してハロアセチル修飾アミノ酸との「チオエーテル」結合を形成するか、あるいはリシン残基のマレイミド誘導ε−またはε−NH2基を形成し、これを分枝鎖状ポリ−リシイルコア分子（例えば、K2K、K4K2KまたはK8K4K2K）のN−末端に結合する。主題の免疫原は、また、分枝鎖状ポリ−リシイルコア樹脂上に直接的に所望のペプチド構築物を合成することによって、分枝鎖状構造として重合することができる（Wang他、Science、1991；254：285−288）。
【００３９】
別法として、よく知られている核酸クローニング技術により、より長い合成ペプチド複合体を合成することができる。分子クローニング技術についての標準的マニュアルは、組換えDNAおよびRNAの発現により、本発明のThエピトープを含んでなるペプチドを産生する詳細なプロトコルを提供する。本発明のTh／ターゲット抗原部位のペプチド（例えば、配列番号29〜57）を発現する遺伝子を構築するために、好ましくは遺伝子を発現する生物について最適化されたコドンを使用して、アミノ酸配列を核酸配列に逆転写する。次に、典型的にはペプチドをコードするオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよび必要な調節因子を合成することによって、ペプチドをコードする遺伝子を作る。合成遺伝子を組立て、所望の発現ベクターの中に挿入する。本発明に包含される合成核酸配列は、本発明のThエピトープおよびそれらのThエピトープを含んでなるペプチドをコードする配列、それらの免疫学的に機能的な相同体、およびそれによりコードされるペプチドまたはThエピトープの免疫原特性を変更しない非コーディング配列の変化により特徴づけられる核酸構築物を包含する。合成遺伝子を適当なクローニングベクターの中に挿入し、組換え体を獲得し、特性決定する。次いで選択した発現系および宿主のための適当なの条件下に、ThエピトープおよびThエピトープを含んでなるペプチドを発現させる。Thエピトープまたはペプチドを標準的方法により精製し、特性決定する。
【００４０】
本発明のペプチド免疫原を単独でまたは組合わせで使用して、黄体化ホルモン放出ホルモンに対する抗体応答を誘発することができる。黄体化ホルモン放出ホルモン（LHRH）またはゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）は、雄および雌の両方における有性生殖の調節のためのマスターホルモンである。LHRHはLHおよびFSHの放出を調節し、これらは引き続いて精子形成、排卵および発情、性的発達をコントロールする。LHRHは究極的に男性ホルモンのアンドロゲンおよびテストステロンの分泌、および女性ホルモン、エストロゲンおよびプロゲスチンの分泌をコントロールし、ここでエストロゲンおよびプロゲスチンは、それぞれ、男性および女性における生殖能のための必須である。（Basic  and  Clinical  Endocrinology、FS  GrenspanおよびJD  Baxter編、Appleton  &  Lnage、コネチカット州ノーウォーク、1994）。
【００４１】
LHRHに対する活性免疫化は、男性において、血清および下垂体LHおよびFSHの減少、血清テストステロンの減少、精子形成の抑制および生殖腺および補助的性的器官の可逆的萎縮を包含する多数の作用を発揮することが長い間知られてきている。（例えば、下記の文献を参照のこと：Fraser他、J.  Endocrinol.、1974；63：399−405；Giri他、Exp.  Molec.  Pathol.、1991；54：255−264；Ladd他、J.  Repro.  Immunol.、1989；15：85−101；およびその中に引用されている参考文献）。LHRHに対する免疫化は男性における避妊薬として有効であることが証明され、前立腺癌の治療薬として効力のある（Thau、Scand.  J.  Immunol.，1992；26  Suppl.  11：127−130；および米国特許第5,759,551号）。
【００４２】
また、女性における性ホルモンを阻害するために、LHRHに対する活性免疫化による視床下部−脳下垂体生殖線系に対する免疫関与を使用することができる。LHRHは前下垂体によるFSHの産生を調節し、これは引き続いて卵巣によるエストロゲンの産生を調節し、LHRHの作用のブロッキングは女性における性ホルモン依存的疾患の療法である。例えば、異所性発育および子宮筋系の外側の子宮内膜組織の維持はエストロゲンにより仲介される。したがって、LHRHの作用のブロッキングは子宮内膜炎の治療として有効である。さらに、前立腺炎癌と同様に、乳房のエストロゲン推進腫瘍もまたLHRH免疫治療に対して応答性であろう。事実、抗LH誘導ワクチンは女性においてLHおよびFSHの血清レベルを効果的に減少することが示され、これは避妊およびホルモン依存的障害の治療を行うこの方法の可能性の例示である（Gual他、Fertility  and  Sterility、1997；67：404−407）。
【００４３】
男性および女性の両方における多数の重要な疾患および可逆的不妊の治療を提供することに加えて、LHRHをベースとする免疫療法は雄および雌の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマおよびウサギ）における可逆的避妊の手段ならびに望ましくないアンドロゲン誘導行動、例えば、発情、なわばりおよび攻撃を緩和する手段を提供する。
【００４４】
最後に、免疫学的去勢（LHRH作用の抗体をベースとする阻害）は家畜産業において用途を有する。雄動物からの食用獣肉は、雄豚腐敗（boar  taint）として知られている、不快な芳香および味覚のために、極上の肉片に加工されない。雄豚腐敗は機械的去勢により普通に排除される；しかしながら、雄の食用動物の去勢は人情的であると考えられない。そのうえ、去勢しない雄に比較して、機械的去勢は低い成長性能および体の部分の病変を生じ、また、死体の特徴（carcass  traits）と呼ばれる。これに対して、免疫去勢した動物の成長性能および死体特徴は去勢した動物のそれらよりも影響を受けていない（Bonneau他、J.  Anim.  Sci.、1994；72：14−20および米国特許第5,573,767号）。したがって、免疫学的去勢は機械的去勢よりも好ましい。
【００４５】
LHRH（またはGnRH）は、抗LHRH抗体を発生させるために、Th成分に結合しなくてはならない（Sad他、Immunology、1992；1992；76：599−603）。LHRHのいくつかのこのような免疫原性形態が試験された。例えば、LHRH免疫原は担体タンパク質に対して複合化させるか、あるいは病原性生物に由来する効力があるTh部位に結合させることによって製造されてきている（WO94/07530号、米国特許第5,759,551号、Sad他、1992）。LHRHおよび人工的Thエピトープを含んでなる改良されたLHペプチド免疫原は、実施例1〜3において例示されている。
【００４６】
本発明は、また、ペプチド免疫原を投与するための薬学上許容される送出系を含んでなる組成物を提供する。組成物は免疫学的に有効量の1またはそれ以上の本発明のペプチド免疫原を含んでなる。そのように処方されるとき、ターゲット抗原部位としてLHRHまたはその相同体を含んでなる本発明の組成物は、雄豚腐敗（boar  taint）の予防、動物の免疫去勢、子宮内膜炎、乳癌および生殖腺ステロイドホルモンにより影響を受ける婦人科学的癌の治療、および男性および女性の避妊のために使用される。LHRH以外のターゲット抗原部位を有する本発明のペプチドの実用性は、ターゲット抗原部位の特異性に従い変化するであろう。
【００４７】
本発明のペプチド免疫原は、アジュバント、乳化剤、薬学上許容される担体またはワクチン組成物において日常的に提供される他の成分を使用して免疫原性組成物として処方することができる。本発明において使用できるアジュバントまたは乳化剤は、明礬、不完全フロインドアジュバント（IFA）、リポシン、サポニン、スクアレン、L121、エマルシゲン、モノホスホリル脂質A（MPL）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（DDA）、SQ21、およびISA720、ISA51、ISA35またはISA206ならびに他の有効なアジュバントおよび乳化剤を包含する。このような処方物は当業者により容易に決定され、また、即時放出および／または持続放出について処方物を包含する。本発明のワクチンは、任意の好都合な経路、例えば、皮下、経口、筋肉内、腹腔内、または他の非経口または腸内経路により投与することができる。同様に、免疫原は単一投与量または多投与量で投与することができる。当業者は免疫化スケジュールを容易に決定する。
【００４８】
本発明の組成物は有効量の1またはそれ以上の本発明のペプチド免疫原と、薬学上許容される担体とを含有する。このような組成物は、適当な投与単位形態において、約0.5μg〜約1mgのペプチド免疫原／kg体重を含有する。多投与量で送出すとき、それは好都合には適当な量／投与に分割することができる。例えば、投与量、例えば、0.2〜2.5mg、好ましくは1mgは注射、好ましくは筋肉内注射により投与することができる。次いで反復（ブースター）投与することができる。ワクチンおよび療法の分野においてよく知られているように、投与は被検体の年齢、体重および一般的健康に依存するであろう。
【００４９】
本発明のペプチド免疫原の混合物、特にMVF  Th、すなわち、配列番号3〜16およびHBsAg  Th、すなわち、配列番号21〜25の両方から誘導されるTh部位を含んでなる混合物を含んでなるワクチンは、より広い集団において免疫効能を増強することができ、こうしてLHRHまたは他のターゲット抗原部位に対する免疫応答を改良することができる。
【００５０】
Thエピトープ／LHRHペプチド複合体または他のTh／ターゲット抗原部位複合体に対する免疫応答は、O'Hagan他（Vaccine、1991；9：768）が記載する型の生物分解性微小粒子中にまたはそれらの上に捕捉させて送出すことによって改良することができる。免疫原はアジュバントを使用するか、または使用しないでカプセル化することができ、そしてこのような微小粒子は免疫刺激性アジュバントを有することができる。微小粒子は、また、ペプチド免疫原とともに同時投与して免疫応答を増強することができる。
【００５１】
特定の例として、本発明は、哺乳動物において不妊状態を産生する時間の間および条件下に、Th／LHRHペプチド免疫原を含んでなる医薬組成物を哺乳動物に投与することによって、抗LHRH抗体を誘導する方法を提供する。本明細書において使用するとき、不妊状態は妊娠を防止する状態である。不妊はこの分野において知られている方法、例えば、精子形成または排卵の評価により、または実験動物のデータの統計学的モデル化により測定することができる。男性における不妊の他の指示は、血清テステステロンの去勢レベルへの減少および精巣の衰退を包含する。組成物の適当な投与量は、約0.5μg〜約1mgの各ペプチド／kg体重である。多投与量で送出すとき、この投与量は適当な量／投与に分割することができる。
【００５２】
同様に、本発明のLHRH態様は、癌腫のそれ以上の増殖を防止する時間の間および条件下に、本発明のペプチド組成物を哺乳動物に投与することによって、アンドロゲン依存性癌腫を治療する方法に関する。適当な単位投与量は、約0.5μg〜約1mgの各ペプチド／kg体重である。多投与量で送出すとき、この投与量は適当な量／投与に分割することができる。
【００５３】
さらに、LHRH態様は、雄の家畜からの食用獣肉の感覚器官を刺激する品質およびもろさ（tnederness）を改良すると同時に、無傷の雄の好都合な成長性能を維持する方法に関する。無傷の雄のアンドロゲンステロイドホルモンは速い成長に寄与するが、それらの存在は食用獣肉に不快な味覚および芳香を付与する非アンドロゲンステロイド（例えば、5αアンドロステノン）およびスカトール（トリプトファンの微生物代謝産物）を伴う。この状態は、ブタの場合において雄豚腐敗（boar  taint）として知られており、食用獣肉の品質を低下させる。しかしながら、屠殺の数週直前に免疫去勢を行うスケジュールで、本発明のLHRHペプチドを含んでなる組成物で若い雄を活性免疫化することによって、非去勢雄の成長の利点の多数を保持すると同時に、改良された香味およびもろさを有する食用獣肉を提供することができる。
【００５４】
ターゲット抗原部位、LHRHを含んでなる本発明のペプチド組成物の効能は、実施例1〜3に記載する手順により試験することができる。
【００５５】
また、本発明のペプチド免疫原において使用された他のターゲット抗原部位は、実施例4〜9に記載されている。ペプチド免疫原組成物は、哺乳動物において特定のターゲット抗原に対して免疫応答を誘導するために有用であり、そして疾患の予防または治療、または正常の生理学的状態を有効に改変する関与を提供する。
【実施例】
【００５６】
実施例1
LHRHを含有するペプチド免疫原を使用するラットの免疫化
後述するように、表2aおよび表2bに列挙するペプチドを合成し、試験した。
A.  ペプチドの合成
メリフィールド固相技術によりアプライド・バイオシステムス自動化ペプチド合成装置（430、431および433A）を使用してFmoc化学に従い、表2aおよび表2bに列挙するペプチドを合成した。構造化合成抗原ライブラリー（SSAL）、例えば、配列番号3と表示する人工的Th部位を含んでなるペプチド複合体の製造は、所定の位置のために選択された所望のアミノ酸混合物を形成することによって達成される。所望のペプチドまたは組合わせのペプチドが完全に組立てられた後、標準的手順に従いトリフルオロ酢酸を使用して樹脂を処理してペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖上の保護基を脱ブロックした。
【００５７】
切断し、抽出し、洗浄したペプチドをHPLCにより精製し、質量分析および逆相HPLCにより特性決定した。
【００５８】
表2aおよび表2bに列挙するように表示したThエピトープの各々と縦列でLHRHターゲット抗原ペプチド（配列番号28）を有するように、ペプチドを合成した。Thエピトープは表1aおよび表1bに示すもの（配列番号3〜16及び21〜25）であった。比較の目的で、モデルTh部位（配列番号29および71）、およびプロトタイプTh部位（配列番号30および72）を含んでなる先行技術ペプチド免疫原およびペプチド／担体タンパク質複合体、KLH−LHRH（表2b）をまた合成し、試験した。ターゲット抗原部位とThエピトープとの間にスペーサーとしてgly−glyを使用し、そしてThエピトープとInv免疫刺激配列との間にgly−glyを使用するか、または使用しないで、Th／LHRHおよびInv／Th／LHRHペプチド複合体を合成した。さらに、Th部位とターゲット抗原部位との間にスペーサーとして配列番号26を使用して、配列番号55及び56（表2a及び2b）を合成した。ペプチド免疫原配列番号55及び56についての結果はまだ入手可能ではない。
【００５９】
B.  免疫化プロトコル
下に概説する実験的免疫化プロトコルおよび血清試料についての免疫原性を測定する血清学的アッセイにより特定したように、5〜10匹のラットのグループについて、表2aおよび表2bに示すLHRHペプチド免疫原を評価した：
動物：            SDラット、雄
グループの大きさ：5〜10匹のラット／グループ
免疫原：    個々のペプチド免疫原
投与量：    0.5mの特定した量（μg）
アジュバント：（1）フロインド不完全アジュバント（IFA）または
（2）明礬（水酸化アルミニウム）
1つのアジュバント／免疫原／グループ
投与スケジュール：特定したように0、3、および6週、または0、3週
経路：            筋肉内
血液を収集し、血清にプロセシングし、血清テストステロン値を測定するELISAおよびラジオイムノアッセイ（RIA）前に貯蔵した。
【００６０】
C.  免疫原性を測定する方法
免疫吸着剤としてLHRHペプチド（配列番号28）で被覆した96ウェルの平底マイクロタイタープレートを使用するELISA（酵素結合イムノアッセイ）により、抗体活性を測定した。5μg／mlの濃度のペプチド免疫原溶液のアリコート（100μl）を37℃において1時間インキュベートした。プレートを3％のゼラチン／PBS溶液と37℃においてさらに1時間インキュベートすることによって、プレートをブロックした。次いでブロックしたプレートを乾燥し、アッセイのために使用した。被験免疫血清のアリコート（100μl）をまず試料希釈緩衝液中で1：100に希釈し、その後10倍に連続希釈し、ペプチド被覆したプレートに添加した。プレートを37℃において1時間インキュベートした。
【００６１】
プレートをPBS中の0.05％のTWEENR（登録商標）で6回洗浄した。100μlのセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ラットIgG抗体を、複合体希釈緩衝液（0.5MのNaCl、および正常ヤギ血清を含有するリン酸塩緩衝液）中で適当な希釈で添加した。前述したように、プレート37℃において1時間インキュベートし、次いで洗浄した。次いでo−フェニレンジアミン基質溶液を添加した。色を5〜15分間発生させた後、50μlの2N  H2SO4の添加により、酵素の色反応を停止させた。各ウェルの内容物のA492nmをプレートリーダーで読んだ。0.5に設定したカットオフA492nmで、吸収の線形回帰分析に基づいて、ELISA力価を計算した。各アッセイで実験した希釈した正常対照試料についての値は0.15より低かったので、このカットオフ値は厳格であった。
D.  免疫原の効能の測定
RIAにより、免疫原を血清テストステロン値について評価した。ダイアグノスチック・プロダクツ（Diagnostic  Products）（カリフォルニア州ロサンジェルス）からのRIAキットを製造業者のインストラクションに従い使用して、血清テストステロンレベルを測定した。テストステロンの検出下限は0.01〜0.03nmol／lの範囲であった。各試料を二重反復実験で分析した。テストステロンレベルが検出限界より低いとき、去勢レベルであるとて、そして＜0.1nmol／lであるとき「ほぼ去勢」であるとして、血清試料にスコアをつけた。機械的に去勢したラットからの血清中のテストステロンレベルとの比較により、結果を確認した。
【００６２】
E.  結果
第10週または第12週に収集した血清試料からの結果を表2aおよび表2bに示す。（表のペプチドは、表1aおよび表1bにおけるように、それらのThエピトープの誘導順序で配列されている）。列挙した免疫原のすべてによる免疫化はすべての動物において抗体応答を生ずることを、ELISAデータ(示されていない)は証明した。抗ペプチド抗体の応答の効能は、自然LHRHに対する交差反応性の結果であり、血清テストステロンレベルの測定により確立された。去勢レベルの血清テストステロンを有する動物の数／グループ中の全動物として、これらの結果は表2aおよび表2bの右欄に要約されている。
【００６３】
これらの結果が示すように、本発明のペプチドは、強いアジュバントのIFAを使用し、高い投与量で3回投与したか、あるいは弱いアジュバントの明礬を使用し、低い投与量で2回投与したかどうかにかかわらず、免疫去勢の生成において有効なであった。Th部位配列番号4および13の免疫原性は、Invドメイン配列の添加により改良された。配列番号32と33及び配列番号44と45とを比較参照せよ。しかしながら、Invドメイン配列の添加は、例えば、配列番号38および39、配列番号46および47、並びに配列番号53および57を比較すると、常に免疫原性を改良するわけではなかった。本発明の2つのペプチド（配列番号37および54）をわずかに低い投与量で弱いアジュバントを使用して試験し、それらは免疫去勢を引き起こすことができなかったが、他のペプチド、例えば、配列番号52を使用した結果が示すように、それらはより高い投与量において強いアジュバントを使用したとき有効であった。本発明のLHRHペプチド免疫原の多数は、KLH／LHRHペプチド担体タンパク質複合体またはHBsAg  Th（配列番号71および72）を有するペプチド免疫原よりも、免疫去勢の誘導において有意にいっそう有効であった。表2b参照。
【００６４】
また、本発明のペプチド免疫原は、ペプチド／担体タンパク質複合体タンパク質または先行技術のいっそう複雑なプロトタイプThエピトープ（配列番号1または17）を有するペプチド免疫原よりも、容易に合成された。しかも、本発明の人工的Thエピトープを含んでなるペプチド免疫原を使用すると、より少ない回数およびより低い投与量で、同等であるか、あるいは改良された免疫原性が得られた。
【００６５】
本発明のLHRHペプチドを投与されたラットの抗体応答の血清学的分析において、ペプチドに対する抗体応答はターゲット抗原部位に対して特異的に向けられ、新規な人工的Th部位に対して向けられないことが証明された。これは従来のペプチド／担体タンパク質複合体を越えたこれらのペプチド免疫原の明確な利点である。表3に示すペプチド免疫原で、明礬を使用して25μgの投与において、第0週および第3週に免疫化したラットからの血清試料を、反応性について、LHRHターゲット部位およびThエピトープに対して、ペプチドをベースとするELISAにおける固相基質としてELISAによりLHRHエピトープ（配列番号28）および適当なThエピトープ（配列番号11、21又は24）を使用して比較した。これらのELISAについての結果を表3に示す。この表3が示すように、Th／LHRHペプチド複合体のLHRH部分に対する高い力価の応答性にかかわらず、人工的Th部位についての反応性はバックグラウンドレベルであった。
【００６６】
実施例2
ラットにおける広い免疫去勢を誘導するLHRHペプチド混合物
上記実施例1に示す種々の人工的Thエピトープ／LHRH構築物の相対的効能を確立して、増強された免疫原性のペプチド混合物に組立てるための最も有効な構築物を選択できるようにした。Th／LHRHペプチド免疫原の混合物は、混合物内の個々のペプチドよりも高い効能を有する（米国特許第5,759,551号）。そのうえ、MVF  Th（配列番号2）およびHBsAg  Th（配列番号18〜20）から誘導されたプロミスカスThエピトープを有する個々の構築物の混合物は、ただ1つのプロミスカスThエピトープから誘導されたThエピトープを有するペプチド組成物よりも、遺伝的に多様な集団において、いっそう広い応答を提供する。したがって、MVF  ThおよびHBsAg  Thから誘導された本発明のペプチドの混合物を含んでなるペプチド組成物を組立て、そしてこの混合物の効能を試験し、混合物の個々のペプチドを含んでなる組成物と比較した。
【００６７】
表4に示すペプチド組成物の25μgの投与量（全投与量）で、6または8匹の雄ラットのグループを免疫化した。混合物中のペプチドを等モル比率で組合わせた。ペプチドを0.4％の明礬で処方し、第0週および第3週に筋肉内投与した。血清テストステロンレベルを22週間追跡し、結果を去勢レベルのテストステロンを有する動物の数／グループ中の動物の総数として記録した。これらの結果を表4に示す。これらの結果が証明するように、低い投与量のペプチド組成物は、比較的無効のアジュバントを使用すると、第5週までに去勢レベルのテストステロンに達成し、そしてこの応答は22週を通して維持された。そのうえ、ペプチド混合物は個々のペプチドを含んでなるペプチド組成物の1つよりも有意にすぐれた性能を有した。混合物は他の個々のペプチド組成物を超えた改良された免疫原性を示し、真の集団より大きい、それをいっそう象徴する実験動物の数を有したと仮定することができる。
【００６８】
実施例３
ブタの免疫去勢のためのLHRHペプチド混合物および処方物
1グループの被験動物は、単一ペプチド免疫原を含有する組成物に対してよりも、異なるThエピトープを有するペプチド免疫原の混合物に対して、いっそう広く応答性であることが示された。しかしながら、ブタにおける雄豚腐敗（boar  taint）の予防について、免疫増強LHRHペプチド免疫原は、大部分の動物において所望の応答を誘発すると同時に食用動物において使用するために十分に、効力があることを必要とする。成長速度に対して悪い即時作用が存在せず、かつペプチド免疫原またはアジュバントの残留物が食用獣肉中に残らないか、あるいは死体の市販可能な部分において病変を引き起こしてはならないことが重要である。
【００６９】
本発明のLHRHペプチドの混合物の有効な免疫原性を評価するために、混合物をブタに3つの処方物で0.4％の明礬、IFA、またはISA206／DDAで投与した。ISA206／DDAは水中油型エマルジョンであり、ここで臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（DDA）がMONTANIDE（登録商標）ISA206中に30mg／mlで分散されている（MONTANIDE（登録商標）ISA206はSEPPIC  Inc.、ニュージャージイ州フェアーフィールド、により供給される油性代謝可能な溶液である）。次いで0.5mlの最終調製物においてペプチドの所望の投与量を提供するようにペプチド濃度を調節した水性ペプチド溶液中に、油分散液を1：1容量比で乳化した。
【００７０】
免疫化プロトコルは次の通りであった：
動物：            ヨークシャイアー・ハンプシャイアー・クロス・スワイン                    （Yorkshire  Hampshire  Cross  Swine）、雄
3〜4週齢の非去勢
グループの大きさ：2〜3匹の動物／グループ
免疫原：          配列番号42〜50および57の等モル混合物
投与量：          0.5ml中の400μgの1またはそれ以上のペプチド
アジュバント：    （1) 0.4％の明礬、
（2) IFA、
（3) ISA206／DDA
スケジュール：    第0、4、および13週または第0、4週
経路：            筋肉内
【００７１】
研究を通じて収集したブタ血清試料をアッセイすることによって、ペプチド免疫原処方物の効能をモニターし、結果を第1図〜第3図にグラフで表示する。これらのアッセイは後述する溶液中の自然LHRHに対して交差反応性の抗体の存在を決定するRIA、および実施例1に記載するテストステロンについてのRIAを包含した。さらに、キャリパーを使用するパルピテイション（palpitation）により、平均精巣断面積を測定した。
【００７２】
抗LHRH  RIAのための抗血清を1％のウシ血清アルブミン（BSA）、pH7.4中で1：100に希釈した。等しい体積の希釈血清を100μlの[125I]−LHRH（New  England  Nuclear  Company、マサチュセッツ州ボストン）に添加し、5.25pgのLHRHについてほぼ15,000cpmを含有するように1％のBSA中で希釈した。この溶液を室温において一夜インキュベートし、そして400μlの0.01Mのリン酸塩緩衝液（PBS）、pH7.6中の25％のポリエチレングリコール（分子量8,000）、および200μlのPBS中の5mg／mlのウシガンマグロブリンで抗体結合LHRHを沈降させた。抗LHRH抗体濃度をnmolの結合したヨウ素化LHRH／リットルの血清として表す（Ladd他、1988、Am.  J.  Reprod.  Immunol.、17：121−127）。
【００７３】
3種類のアッセイについての結果を第1図〜第3図にグラフで描写する。免疫原の投与間隔はグラフの下部において矢印で示されている。各図面における個々の実験動物についての測定値を、黒塗り円形、三角形、および正方形で表す。抗LHRH抗体の存在およびテストステロンの付随的抑制により示されるように、ブタはすべての3種類の処方物に対して免疫学的に応答した。
【００７４】
明礬調製物（第1図）は有効性が最低であり、より低いレベルの抗体応答を生成した。このグループの1匹の動物は第11週までテストステロンの去勢レベルを達成せず、このグループの両方の動物は精巣の完全な衰退を発現しなかった。明礬グループの動物は第13週に免疫化されず、処置の効果は逆転した。
【００７５】
IFAグループの動物（第2図）は高いレベルの抗体応答を表示し、3匹のうちの2匹は第6週までにテストステロンの去勢レベルに到達し、そのレベルを保持した。しかしながら、第13週にブースター投与すると、3匹のうちで応答が最低のブタは応答することができず、テストステロンの正常レベルおよび非衰退精巣に戻った。このグループの2匹の応答性動物は第23週までに精巣の完全な衰退を達成した。
【００７６】
ISA206／DDAグループの両方のブタ（第3図）は、高くかつ比較的均一なレベルの抗体応答を提供した。このグループにおけるテストステロンの免疫去勢レベルは第9週までに達成され、第12週を通して安定に維持された。両方の動物は第13週におけるブースター投与に対して応答性であり、テストステロンの去勢レベルを維持した。両方の動物の精巣は第23週までに検出不可能であった。
【００７７】
得られた結果から、ISA206／DDA処方物は、こうして、雄豚腐敗（boar  taint）の予防のために最も好ましい。ISA206／DDA処方物を使用して、2匹の動物について高くかつ均一な効果が達成される。そのうえ、明らかにIFA処方物が容易に代謝されないために、病変を引き起こしたIFA処方物に比較して、この処方物はブタにおいていっそう許容される。
【００７８】
これは、本発明の人工ThエピトープのLHRHに対する有効な抗体応答の刺激の効能を証明する。
【００７９】
【表１】
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【００８０】
【表２】
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【００８１】
【表３】
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【００８２】
【表４】
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【００８３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
図面において、免疫原の投与間隔を各グラフの下に矢印で示す。図面の個々の実験データーは黒丸、三角形及び四角形で示す。
【図１】みょうばん中で処方したTh／LHRHペプチド（配列番号42、50及び57）の混合物を投与したブタのRIAによる抗LHRH血清抗体レベル、RIAによる血清テストステロン濃度、断面積による平均睾丸サイズをグラフ図示する。
【図２】IFA（不完全フロインドアジュバント）内で処方した同混合物の結果を示す。
【図３】ISA206／DDA（ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド）内で処方した同混合物の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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