(57)【要約】【課題】軟骨や骨組織の形成制御及び破壊抑制、並びに変形性関節症、軟骨関節リウマチ、歯槽骨や歯根膜等に係る歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病の的確かつ効果的な治療・予防・診断、更に、これ等の治療薬や診断剤の開発を可能にする。【解決手段】マスピン、マスピン機能ドメイン、マスピンエピトープ、これ等をコードする遺伝子、抗マスピン抗体等を有効成分あるいは反応試薬として用いる、軟骨や骨組織の形成制御剤及び破壊抑制剤、上記疾患に係る治療、診断剤、並びにこれ等の創薬。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬効を奏する量のマスピン、マスピン機能ドメイン、マスピン発現ベクター、又はマスピン機能ドメイン発現ベクターを有効成分として含有する、軟骨又は骨組織の形成制御剤又は破壊抑制剤。
【請求項２】
薬効を奏する量のマスピン、マスピン機能ドメイン、マスピン発現ベクター、又はマスピン機能ドメイン発現ベクターを有効成分として含有する、変形性関節症、関節リウマチ、歯周病、又は自己免疫疾患の治療剤。
【請求項３】
マスピン、マスピンエピトープ、マスピン機能ドメイン、マスピン遺伝子発現、マスピンエピトープ遺伝子発現、又はマスピン機能ドメイン遺伝子発現の定量反応又は定性反応を呈する量の物質を反応試薬として含有する、軟骨疾患、骨組織疾患、変形性関節症、関節リウマチ、歯周病、又は自己免疫疾患の診断剤。
【請求項４】
請求項３に記載の反応試薬を用いる定量反応又は定性反応に基づくスクリーニングにより得られる、軟骨疾患、骨組織疾患、変形性関節症、関節リウマチ、歯周病、又は自己免疫疾患の治療薬。
【請求項５】
反応試薬が、抗マスピンポリクローナル抗体、抗マスピンモノクローナル抗体、マスピン遺伝子ＤＮＡの完全長塩基配列又はその部分配列に基づき構築又は合成されたＤＮＡ又はＲＮＡである請求項３に記載の診断剤、又は請求項４に記載の定量反応又は定性反応に基づくスクリーニングにより得られる治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マスピンとその機能ドメイン、並びにこれ等をコードする遺伝子を用いる、軟骨・骨組織の形成制御・破壊抑制、更に、変形性関節症、関節リウマチ、歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の治療剤、診断剤及びこれ等の開発に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マスピンは１９９４年、Ｚｏｕらにより初めて報告された分子量４２ｋＤａのセリンプロテアーゼインヒビターである。乳腺上皮細胞から分離されたので、その命名にはｍａｍｍａｒｙ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの頭字語、マスピン（ＭＡＳＰＩＮ）が用いられた。マスピンは、多くの正常組織での発現が確認されており、現在までに、乳腺、前立腺、皮膚、膣、甲状腺、精嚢、膀胱、胸腺、小腸、筋上皮細胞、角膜等での発現が報告されている（非特許文献１）。マスピンの生物学的作用として、腫瘍抑制作用（非特許文献２、６、及び特許文献１〜３）、血管新生抑制作用（非特許文献３、及び特許文献４）等が知られている。
【０００３】
上記作用は、セリンプロテアーゼである次の２つのプスミノーゲンアベータ（以下「Ｐ
Ａ」と略記する）、即ち、組織型ＰＡとウロキナーゼ型ＰＡとを、マスピンが阻害する結果、生じることが知られている。尚、ＰＡはプラスミノーゲンをプラスンに変換し、この変換作用はＰＡインヒビター（以下「ＰＡＩ」と略記する）により抑制される。ところで、かかるＰＡ／プラスミン系（ＰＡによるプラスミン生成と、ＰＡＩによるＰＡ阻害→プラスミン抑制）は、上述の組織・細胞と同様に、骨組織においても重要な役割を演じていることが知られている。以下、これにつき詳述する。
【０００４】
骨芽細胞が産生・分泌するトランスフォーミング増殖因子−β（以下「ＴＧＦ−β」と略記する）は、潜在型ＴＧＦ−βとして通常、細胞外基質に蓄積される。この潜在型は、プラスミンなどのセリンプロテアーゼやｐＨ条件により活性化され、活性型ＴＧＦ−βに変換される。そして、この活性型ＴＧＦ−βが、骨芽細胞の増殖や分化を促進し、破骨細胞ではアポトーシスの誘導や、その分化を抑制する（非特許文献４）。そのため、ＴＧＦ−βが骨のリモデリングにおける骨形成や骨吸収の主要なカップリングファクターとして働き、潜在型ＴＧＦ−βと活性型ＴＧＦ−βとの量の均衡が骨のリモデリングを制御すると考えられている（非特許文献５〜６）。従って、骨形成・骨吸収には、ＴＧＦ−βの活性化機構が極めて重要であり、この活性化機構には、骨芽細胞が産生・分泌するＰＡとＰＡＩ、即ち、ＰＡ／プラスミン系が関与していると思量される。
また、内軟骨性骨化においては、軟骨原基が形成された後、活発な血管新生、軟骨組織の吸収、骨組織の新生等々、極めてダイナミックな組織の再構築が行われ、この過程では、種々の蛋白質分解酵素の作用を必要とする厳しい条件下で、骨芽細胞は骨基質を産生・分泌していく必要がある。しかしながら、骨のリモデリングにおける骨形成や骨吸収の機構の詳細については、未だ十分には解明されておらず、また、軟骨や骨組織の形成制御及び破壊抑制のための的確かつ有効な手段の確立あるいは実用化は、現在のところ未だ知られていない。
【特許文献１】PCT国際出願公表WO 94/05804号公報
【特許文献２】米国特許第5,905,023号公報
【特許文献３】米国特許第5,801,001号公報
【特許文献４】PCT国際出願公表WO 98/34638号公報
【非特許文献１】Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42, 3135-3141, 2001
【非特許文献２】Cancer Research, 61, 6945-6951, 2001
【非特許文献３】Nature Medicie, 6(2), 196-199, 2000
【非特許文献４】Journal of Biological Chemistry, 277(24), 21352-21360, 2002
【非特許文献５】Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 9(1), 33-44, 1999
【非特許文献６】Proceedings of National Academiy of Science [USA], 100(13), 7847-7852, 2003
【０００５】
以上の技術を背景とし、本発明者は、内軟骨性骨化過程における蛋白質分解酵素、特にセリンプロテアーゼに対するインヒビターとしてのマスピンの占める役割、更に、マスピンが骨形成やリモデリングにおいて生理的役割を演じている可能性に着眼し、骨細胞培養及びラットの内軟骨性骨化過程におけるマスピンの発現につき究明すると共に、その生理的意義に係る細胞生物学的研究を重ねた。その結果、本発明者は、次の（１）〜（３）に記載の驚くべき事実・現象を発見した：（１）マスピン又はマスピン遺伝子の発現が骨細胞外基質への潜在型ＴＧＦ−βの蓄積を促進・増大させる；（２）マスピン又はマスピン遺伝子の発現には潜在型ＴＧＦ−β／活性型ＴＧＦ−β量の平衡を調節し、軟骨や骨組織の形成を制御する作用機能がある；（３）マスピンは関節表面の永久軟骨だけに存在し、関節軟骨の破壊を抑制あるいは防止し、軟骨や骨組織を維持する作用機能がある。この発明は、かかる発見及び知見に基づき完成された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
解決しようとする課題は、軟骨や骨組織の形成制御及び破壊抑制のための確固たる有効手段、更に、軟骨変形性関節症、軟骨関節リウマチ、歯槽骨・歯根膜等の歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の治療、予防、診断、創薬等に係る的確かつ有効な手段が未だ確立されていないことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、上述した課題を解決するため、マスピン、マスピン機能ドメイン、マスピンエピトープ、これ等の遺伝子、抗マスピン抗体等を、有効成分あるいは反応試薬として用いることを主な特徴する。
【発明の効果】
【０００８】
軟骨や骨組織の形成制御及び破壊抑制、更に、軟骨変形性関節症、軟骨関節リウマチ、歯槽骨や歯根膜等の異状に起因する歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等に対する優れて的確かつ効果的な治療あるいは予防、診断、及び創薬を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
この発明は、次の（１）〜（５）に記載のものをそれぞれ提供する：（１）薬効を奏する量のマスピン、マスピン機能ドメイン、マスピン遺伝子発現ベクター、マスピン機能ドメイン遺伝子発現ベクター等を有効成分として含有する、軟骨や骨組織の形成制御剤、形成促進剤、破壊抑制剤あるいは破壊防止剤等；（２）薬効を奏する量のマスピン、マスピン機能ドメイン、マスピン遺伝子発現ベクター、マスピン機能ドメイン遺伝子発現ベクター等を有効成分として含有する、変形性関節症、特に軟骨の変形性関節症、関節リウマチ、特に軟骨の関節リウマチ、歯周病、特に歯槽骨や歯根膜の異状に起因する歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の治療剤；（３）マスピン、マスピンエピトープ、マスピン機能ドメイン、マスピン遺伝子発現、マスピンエピトープ遺伝子発現、マスピン機能ドメイン遺伝子発現等の定量反応又は定性反応を呈する量の物質を反応試薬として含有する、軟骨疾患、骨組織疾患、変形性関節症、特に軟骨の変形性関節症、関節リウマチ、特に軟骨の関節リウマチ、歯周病、特に歯槽骨や歯根膜の異状に起因する歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の診断剤；（４）上記（３）の反応試薬を用いる定量反応又は定性反応に基づくスクリーニングにより得られる、軟骨疾患、骨組織疾患、変形性関節症、特に軟骨の変形性関節症、関節リウマチ、特に軟骨の関節リウマチ、歯周病、特に歯槽骨や歯根膜の異状に起因する歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の治療薬；（５）反応試薬が、抗マスピンポリクローナル抗体、抗マスピンモノクローナル抗体、マスピン遺伝子ＤＮＡ（米国ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ03413、及びＢＣ020713）の完全長塩基配列又はその部分配列に基づき設計・構築又は合成されたＤＮＡ又はＲＮＡである、上記（３）の診断剤、又は上記（４）の定量反応又は定性反応に基づくスクリーニングにより得られる治療薬。これにより、軟骨及び骨組織の的確かつ効果的な形成制御や破壊抑制、また、前述（２）の諸疾患の適切な治療及び診断、並びに合理的かつ能率的な創薬や医薬品開発が実現される。以下、実験例及び参考例を上げ、具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実験例や参考例にだけ限定されるものではない。
（実験例１）
【００１０】
免疫組織化学的試験：生後１週齢雄性F344ラット（日本クレア、東京）の脛骨を採取し、Mildform 10N（和光純薬工業、大阪）にて固定後、10%ギ酸 / 10%クエン酸で脱灰し、厚さ3 μmのパラフィン切片を作製した。脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止するため、3%過酸化水素を含むメタノールで室温、35分間処理した。10%正常ウサギ血清で10分間、室温で処理後、1%牛血清アルブミン（以下BSAと略記する）を含むリン酸緩衝液（Phosphate Buffered Saline:以下PBSと略記する、pH 7.4）で1:500に希釈したヤギ抗ラットマスピン抗体（Santa Cruz Biotechnology、CA、USA）を一次抗体として、室温で2時間反応させた。PBSで洗浄後、Histofine SAB-PO (G) Kit（ニチレイ、東京）とDiaminobenzidine（以下DABと略記する）Substrate Kit（ニチレイ）を用いて発色させた。ヘマトキシリンにて対比染色後、封入した。反応の特異性は、一次抗体の代わりに正常ヤギIgG（Chemicon、Temecula、CA、USA）を用いることにより確認した。
その結果、生後1週齢ラット脛骨におけるマスピンの発現が認められた。即ち、脛骨成長板近傍における一次海綿骨梁部に活発な骨形成、及び新生骨組織表面には活発な骨芽細胞が検出される共に、この新生骨組織表面に存在する活発な骨芽細胞に、マスピンの発現が認められた。
（実験例２）
【００１１】
細胞培養：ラット骨芽細胞株ROS 17/2.8（理研セルバンク、茨城）は10%ウシ胎児血清（以下FBSと略記する、ニチレイ）を含むアルファ変法イーグル培地（以下α−ＭＥＭと略記する、SIGMA、MO、USA）に50 μg/ml L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate（和光純薬工業）、1×GultaMAX （GIBCO BRL、Grand Island、NY、USA）、100 units/ml penicillin、100μg/ml streptomycin（GIBCO）を添加した培地にて、37℃、95% air/5% CO2、絶対湿度100%、の条件下で培養した。
初代ラット骨芽細胞及び軟骨細胞は、生後4週齢雄性F344ラット（日本クレア）の大腿骨を採取し、実体顕微鏡下に骨髄、骨膜などを含めずに小骨片及び小軟骨片を分離し、これを12穴プラスティックカルチャープレート（Nalge Nunc Inc.、Roskile、IL、USA）上に静置し、付着したところで前述の培地を加えた。1週間後、遊走してきた細胞を回収し、これをP-2とした。以後の実験にはp-3〜6を使用した。
（実験例３）
【００１２】
Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏ法（以下「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略記する）：ＲＴ−ＰＣＲ法を用い、マスピンのメッセンジャーRNA（以下mRNAと略記する）の発現について検討した。コンフルエント時およびコンフルエント後１週間の細胞から、TRIzol reagent（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を用いてtotal RNAを回収した。1μｇのRNAにランダムヘキサマープライマー（Invitrogen）を加え、逆転写酵素SuperScript II（Invitrogen）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを得た。各種の遺伝子に特異的なプライマーおよび1.1 x ReddyMix PCR Master Mix (1.5 mM MgCl2) （ABgene、Epsom、Surrey、U.K.）を用いてPCRを行った（表1）。その際、内部標準遺伝子としてglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（以下G3PDHと略記する）を使用した。PCR産物は100 ng/ml ethidium bromideを含む2%アガロースゲルにて電気泳動を行い、UV撮影装置FAS-III（東洋紡績、大阪）を用いて可視化した。
その結果、上記RT-PCR法によりROS 17/2.8におけるマスピンｍＲＮＡの発現が認められた。また、この発現はコンフルエント時に比べてコンフルエント後1週間でやや強い傾向が見られた。更に、免疫細胞化学的試験の結果、細胞質にDAB陽性、FITC陽性を示し、マスピン蛋白質を発現していることが明らかとなった。更に、後述するウエスタンブロット法による検索においても、ROS 17/2.8がマスピン蛋白質を発現していることが確かめられた。これらの知見に基づき、ROS 17/2.8がｍＲＮＡ及び蛋白質レベルでマスピンを発現していると判断できる。
更に、初代ラット骨芽細胞におけるマスピンの発現も併せて次の通り確認された。先ず、
小骨片をプラスティックペトリディッシュに静置して培養を行うと、培養開始後1週間で小骨片周囲に細胞の遊走が確認された。これらの細胞を回収し、ペトリディッシュに1×104 cells/cm2の細胞密度で播種し培養を行うと、培養開始24時間後には、細胞は類円形から多角形を呈し、コンフルエント時には敷石状の形態を示した。コンフルエント時およびコンフルエント後1週間でtotal RNAを回収し、RT-PCR法により骨関連遺伝子のmRNA発現につき検討したところ、アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロ蛋白質などの骨関連遺伝子のｍＲＮＡ発現が確認でき、細胞は骨芽細胞の性格を有していることが確認できた。また、その発現はコンフルエント後1週間でより強くなっていた。更に、ＴＧＦ−β及びマスピンについても測定したところ、その発現が確認できた。後述の免疫細胞化学的解析の結果、細胞質にDAB陽性、FITC陽性を示し、マスピン蛋白質を発現していることが確認された。また、ウエスタンブロット法においても、マスピン蛋白質の発現が確かめられた。これらの結果に基づき、前述した ROS 17/2.8細胞と同様に、培養により分離した初代ラット骨芽細胞もｍＲＮＡ及び蛋白質レベルでマスピンを発現していることが明らかとなった。
【００１３】
【表１】
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（実験例４）
【００１４】
免疫細胞化学的試験：ROS 17/2.8と初代ラット骨芽細胞及びラット軟骨細胞を2-well glass chamber slide（Nunc）に播種し、ほぼコンフルエントに達したときに95%エタノールで細胞を固定した。10%正常ウサギ血清で10分間、室温で処理後、1%牛血清アルブミン（以下BSAと略記する）を含むリン酸緩衝液（Phosphate Buffered Saline:以下PBSと略記する、pH 7.4）で1:500に希釈したヤギ抗ラットマスピン抗体（Santa Cruz Biotechnology）を一次抗体として、室温で2時間反応させた。PBSで洗浄後、Histofine SAB-PO (G) Kit（ニチレイ）と、DAB Substrate Kit（ニチレイ）及びAEC Substrate Kit(ニチレイ)を用いて発色させた。ヘマトキシリンにて対比染色後、封入した。またこれとは別に、一次抗体反応後にPBSで洗浄した後、fluorescein isothiocyanate（以下FITCと略記する）で標識されたウサギ抗ヤギIgG抗体（DAKO Cytomation、Glostrup、Denmark）を1時間、室温で反応させた後再度洗浄し、励起波長490 nmにて蛍光顕微鏡（ニコン、東京）を用いて観察した。双方とも、陰性対照としては、一次抗体と同様に希釈した正常ヤギIgG（Chemicon）を用いた。
（実験例５）
【００１５】
ウエスタンブロット法：ROS 17/2.8およびprimaryラット骨芽細胞を60 mmプラスティックペトリディッシュ（Nunc）に播種し、コンフルエント時およびコンフルエント後１週間で細胞を1 mM Phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF）、5 μM leupeptinおよび10 μM aprotininを添加したRIPA buffer（10 mM Tris-HCl / 1% NP-40 / 0.1% SDS / 150 mM NaCl / 1 mM EDTA）で可溶化した。Bradford法を用いて蛋白質量を測定した後、最終濃度が8 mg/mlとなるように蛋白質溶液を調整した。蛋白質量80μgの試料にサンプルバッファーを混和し、加熱後、SureBlot F1 System（藤沢薬品工業、大阪）を用いて電気泳動を行った。蛋白質をImmobilon PVDFメンブレン（Millipore、Bedford、MA、USA）に転写した後、5%スキムミルク- 0.05% Tween-20を含むトリス緩衝液（以下TBS-Tと略記する）にて室温、1時間ブロッキングを行った後、TBS-Tで1:500に希釈したヤギ抗ラットマスピン抗体（SantaCruz）を、室温で3時間反応させた。メンブレンをTBS-Tで十分に洗浄した後に、ビオチン標識された抗ヤギIgG抗体（Amersham Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden）を室温で1時間反応させた。さらにTBS-Tで洗浄後、horseradish-peroxidase標識ストレプトアビジン（Amersham Pharmacia Biotech）を含むTBS-T中で、室温、1時間インキュベートした。TBS-Tにて洗浄後、ECL Western Blotting Detection Reagents（Amersham Pharmacia Biotech）とECL mini-Camera（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてシグナルを可視化した。
（実験例６）
【００１６】
ＴＧＦ−βの定量：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種した後、コンフルエント時を0日目とし、0、3、7、10日目に、１．可溶化バッファーによる細胞全層の可溶化サンプル、２．回収前に4℃の純水で2分30秒間処理することで細胞を破壊し、細胞外マトリックスのみの可溶化サンプル、３．回収日までの培養上清すべてのサンプル、の3種類を回収した。なお、可溶化バッファーには1% NP-40、10% glycerol、1 mM PMSF、10 μg/ml aprotinin、1 μg/ml leupeptinを含むトリス緩衝液を用いた。それぞれのサンプルについてELISA法を用いてＴＧＦ−β量の測定を行った。測定はPromega社のＴＧＦ−β Emax ImmunoAssay System（Promega、Madison、WI、USA）を用いて行った。すなわち、ELISAプレート（IWAKI、千葉）をＴＧＦ−βモノクローナル一次抗体で4℃で一晩コートし、その後、ブロックバッファーで37℃、35分間インキュベートした後、サンプルとスタンダードを各wellに加え、室温で1時間30分インキュベートした。プレートをTBS-Tで洗浄した後、抗ＴＧＦ−β抗体を加えて2時間室温でインキュベートし、洗浄の後、HRP標識抗体を加えて室温で2時間インキュベートした。キットに含まれるTMB One Solutionにて発色させ、1N HClにて発色を停止した後、450 nmの吸光度を測定し、スタンダードカーブからＴＧＦ−β量を算定した。このときのＴＧＦ−β量は活性型ＴＧＦ−βであり、総ＴＧＦ−β量を測定するために、続いて、サンプル50 μlに対してPBSを50 μl加えて総量を100 μlとし、ここに1N HClを10 μl加えた。15分後に1N NaOHを加えて中性化し、これについてもＴＧＦ−β量を前述の方法に従い測定し、総ＴＧＦ−β量とした。ここから活性型ＴＧＦ−β量を差し引いた量を潜在型ＴＧＦ−β量とした。
（実験例７）
【００１７】
ROS 17/2.8通常培養時における骨関連遺伝子ｍＲＮＡの発現とＴＧＦ−β量との相関解
析：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時を0日目とし、70%コンフルエント時（-3日目）、0、3、7、10、14日目にtotal RNAを前述の方法で回収し、骨関連遺伝子、ＴＧＦ−βおよびマスピンのmRNA発現についてRT-PCR法により検討した。また、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、ROS 17/2.8の通常培養時における骨関連遺伝子及びＴＧＦ−βの両発現が共に検出された。即ち、  ROS 17/2.8の通常培養ではアルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロ蛋白質等の骨関連遺伝子のｍＲＮＡは共に、経時的に発現の上昇が見られた。また、ＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現も経時的に上昇し、マスピンｍＲＮＡにも同様の傾向が認められた。更に、ＴＧＦ−β量の変化については、細胞全層では潜在型ＴＧＦ−βに経時的な増加がみられたのに対し、活性型ＴＧＦ−βでは軽度の増加がみられたのみであった。また、細胞外基質中のＴＧＦ−βについては、細胞全層に比べて全体に量が少しずつ少ないものの、傾向としては細胞全層と差はなかった。培養上清中には潜在型ＴＧＦ−βが経時的に増加し、活性型ＴＧＦ−βもわずかではあるが増加傾向を示した。これらの知見に基づき、ROS 17/2.8の通常培養においては、経時的に骨関連遺伝子のmRNA発現が上昇するとと共に、同様にＴＧＦ−β及びマスピンmRNAの発現も上昇すること、また、細胞外基質中には経時的に潜在型TＴＧＦ−βが蓄積されると判断された。
（実験例８）
【００１８】
マスピン遺伝子過剰発現細胞における骨関連遺伝子ｍＲＮＡの発現とＴＧＦ−β量との
相関解析：ROS 17/2.8を60 mmプラスティックペトリディッシュに播種し、95%コンフルエントに達したところで、pTARGET vectorのマルチクローニングサイトに、ラットマスピンmRNAの-36から+1187までの1233 bpを組み込んだマスピン遺伝子発現vectorとempty vectorをそれぞれ、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。前述の培地に750 μg/ml G418（SIGMA）を添加しセレクションを行い、クローニングシリンダーによりG418耐性クローンを選択した。選択した細胞は培地に100 μg/ml G418を添加して維持した。なお、マスピン遺伝子発現ベクターは名古屋市立大学大学院医学研究科病態病理学講座実験病態病理学朝元誠人先生より供与された。得られたマスピン遺伝子導入細胞およびempty vector導入細胞におけるマスピン遺伝子の発現は前述のウエスタンブロット法により確認した。
これらの細胞を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時より0、3、7、10日目にtotal RNAを前述の方法で回収し、骨関連遺伝子、ＴＧＦ−βおよびマスピンのｍＲＮＡ発現についてRT-PCR法により検討した。また、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、継代後24時間では両細胞とも紡錘形を示していたが、コンフルエント時には、empty vector導入細胞は紡錘形を示すのに対し、マスピン遺伝子導入細胞では敷石状の形態を示した。これらの細胞を用いて、コンフルエント時に細胞を可溶化しウエスタンブロット法によりマスピン蛋白質の発現を検索したところ、マスピン遺伝子導入細胞により強いマスピン蛋白質の発現が認められた。また、これらの細胞でRT-PCR法により骨関連遺伝子およびＴＧＦ−β及びマスピンmRNAの発現を確認したところ、マスピン遺伝子導入細胞では早期からマスピンmRNAの強い発現が認められ、オステオカルシン、骨シアロ蛋白質のmRNAの発現の促進が見られた。更に、これ等の細胞でＴＧＦ−β量の変化を測定したところ、細胞全層および細胞外基質において、マスピン遺伝子導入細胞で早期に潜在型ＴＧＦ−β量が増加し、それに同調して活性型ＴＧＦ−β量が減少する傾向が見られた。ところが、総ＴＧＦ−β量にはほとんど差が見られなかった。
（実験例９）
【００１９】
ROS 17/2.8のＴＧＦ−β量に対するアプロチニン添加の影響に係る測定：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時より培地に5 μg/mlアプロチニン（SIGMA）またはコントロールとしてvehicleを添加し、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、ROS 17/2.8にコンフルエント後アプロチニンを加えて培養すると、マスピン遺伝子導入細胞とほぼ同程度に、細胞外基質中により多くの潜在型ＴＧＦ−β量が蓄積される傾向が見られた。
（実験例１０）
【００２０】
ROS 17/2.8の骨関連遺伝子発現およびＴＧＦ−β量に対する、抗マスピン抗体添加の影
響に係る測定：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時より培地に2 μg/ml抗マスピン抗体（SantaCruz）またはコントロールとして正常ヤギIgGを添加し、0、3、7、10日目にtotal RNAを前述の方法で回収し、骨関連遺伝子、ＴＧＦ−βおよびマスピンのｍＲＮＡ発現についてRT-PCR法により検討した。また、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果に基づき、RT-PCR法により骨関連遺伝子、ＴＧＦ−β及びマスピンのmRNA発現を比較検討したところ、抗マスピン抗体添加、コントロールの両者において通常培養時とmRNA発現に変化は認められなかった。また、ＴＧＦ−β量の変化については、抗マスピン抗体添加群においては細胞外基質中への潜在型ＴＧＦ−βの蓄積が著明に減少していた。一方、活性型ＴＧＦ−βはコントロール群に比べて増加傾向にあった。また培養上清中に放出される活性型ＴＧＦ−βの量の増加も認められた。
（実験例１１）
【００２１】
ROS 17/2.8における骨関連遺伝子発現とＴＧＦ−β量に対する、合成siRNAを用いたマ
スピンRNA干渉の影響の検討：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時およびコンフルエント後5日目に合成siRNAまたはnegative controlをLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。合成siRNAはGC含有率42%、GC密集度3.8となるラットマスピンmRNAの+671からの19 mer（5'-GCAUCUCAGUAUGCUCAUU-3'）を選択し、3'側に2塩基のオーバーハングを持つdsRNAを合成し（B-Bridge、Sunnyvale、CA、USA）用いた。Negative controlには同様のGC含有率のnon-specific controlを用いた。コンフルエント後10日目に細胞を可溶化し、前述のウエスタンブロット法にてマスピン蛋白質の発現を検討した。また、コンフルエント時より0、3、7、10日目にtotal RNAを前述の方法で回収し、骨関連遺伝子、ＴＧＦ−βおよびマスピンのmRNA発現についてRT-PCR法により検討した。さらに、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、合成siRNAおよびnon-specific control siRNA導入の両群において、コンフルエント後10日目に細胞を可溶化し、ウエスタンブロット法によりマスピン蛋白質の発現を検討したところ、マスピンRNA干渉細胞ではマスピン蛋白質の発現の消失が見られた。両導入細胞においてRT-PCR法により骨関連遺伝子、ＴＧＦ−β、及びマスピンの各mRNA発現を比較したところ、両群において骨関連遺伝子のmRNAの発現にほとんど差は見られなかった。但し、通常培養時と比較すると骨関連遺伝子のうちオステオカルシンと骨シアロ蛋白質のmRNAの発現に遅延傾向が認められた。また、マスピンmRNAの発現はマスピンRNA干渉細胞では3日目よりその発現が消失した。ＴＧＦ−β量の変化についてはマスピンRNA干渉細胞では細胞外基質中への潜在型ＴＧＦ−βの蓄積が著明に減少していた。また、両者とも通常培養時に比べると総ＴＧＦ−β量の減少が見られた。
（実験例１２）
【００２２】
アンチセンスRNA法によるマスピン遺伝子発現抑制による、ROS 17/2.8における骨関連
遺伝子発現とＴＧＦ−β量の変化との相関解析：ROS 17/2.8を60 mmプラスティックペトリディッシュに播種し、95%コンフルエントに達したところで、pTARGET vectorのマルチクローニングサイトにラットマスピンmRNAの-36から+1187までの1233 bpを逆向きに組み込んだvector（以後マスピンreverseとする）とempty vectorをそれぞれ、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。前述の培地に750 μg/ml G418（SIGMA）を添加しセレクションを行い、クローニングシリンダーによりG418耐性クローンを選択した。選択した細胞は培地に100 μg/ml G418を添加して維持した。また得られたマスピンreverse導入細胞およびempty vector導入細胞は前述のウエスタンブロット法によりマスピン蛋白質の発現につき検討した。また、上記の細胞を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時より0、3、7、10日目にtotal RNAを前述の方法で回収し、骨関連遺伝子、ＴＧＦ−βおよびマスピンのmRNA発現についてRT-PCR法により検討した。また、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、継代後24時間では両細胞とも紡錘形を示していたが、コンフルエント時には、empty vector導入細胞は紡錘形を示すのに対し、マスピンreverse導入細胞では敷石状の形態を呈する像が認められた。これらの細胞を用いて、コンフルエント時に細胞を可溶化しウエスタンブロット法によりマスピン蛋白質の発現を測定したところ、マスピンreverse導入細胞ではマスピン蛋白質の発現の消失が認められた。また、これらの細胞でRT-PCR法により骨関連遺伝子およびＴＧＦ−β及びマスピン各mRNAの発現を確認したところ、マスピンreverse導入細胞では骨関連遺伝子のうち、オステオカルシン、骨シアロ蛋白質のmRNA発現がempty vector導入細胞に比べてやや低い傾向が認められた。マスピンreverse導入細胞ではマスピンmRNAの発現が認められなかった。更に、これ等の細胞でＴＧＦ−β量の変化を検討したところ、マスピンreverse導入細胞では細胞外基質中への潜在型ＴＧＦ−βの蓄積の著明な減少が認められると共に、培養上清中へ遊離するＴＧＦ−β量の増加が見られた。一方、総ＴＧＦ−β量には変化が見られなかった。
（実験例１３）
【００２３】
ROS 17/2.8のＴＧＦ−β量に対するプラスミン添加の影響の測定：ROS 17/2.8を24穴プラスティックカルチャープレートに播種し、コンフルエント時より培地に0.1 U/mlプラスミン（Calbiochem、CA、USA）またはコントロールとしてvehicleを添加し、0、3、7、10日目に前述の方法でサンプルを回収し、ＴＧＦ−β量を測定した。
その結果、ROS 17/2.8培養時においてコンフルエント後0.1 U/mlプラスミンを加えて培養すると、細胞外基質中への潜在型ＴＧＦ−βの蓄積の著明な減少とともに、培養上清中へのＴＧＦ−βの遊離の増加が認められた。また、その程度は、マスピン発現抑制時とほぼ同程度であった。
（実験例１４）
【００２４】
ROS 17/2.8でのマスピン遺伝子過剰発現または発現抑制時の、セリンプロテアーゼ活性の測定：前述したempty vector、マスピン遺伝子、マスピンreverseそれぞれの導入細胞を60 mmプラスティックペトリディッシュに播種し、コンフルエント時に細胞をプロテアーゼインヒビターを含まないRIPAバッファーで可溶化した。このサンプルについて、Kunitzの方法に準じて以下の方法でサンプルのセリンプロテアーゼ活性を検討した。すなわち、それぞれのサンプル100 μlおよびコントロールとして純水100 μlを1%カゼイン溶液1 mlに加えて攪拌し、37℃で60分間反応させた。これを氷水中に浸し、5%トリクロロ酢酸溶液を3 ml加え攪拌し、60分室温に放置した後、10分間氷水中に放置した。これを3000 x gで15分間遠心分離し、上清を分取後さらに10000 x gで10分間遠心した。この上清につき、分光光度計で280 nmの吸光度を測定し、サンプルの吸光度からコントロールの吸光度を差し引いた値をセリンプロテアーゼ活性とした。Empty vector導入細胞を100%活性とし、それぞれのサンプルの活性を百分率で表した。
その結果、empty vector導入細胞に比べて、マスピン遺伝子導入細胞でのセリンプロテアーゼ活性は78.9%、マスピンreverse導入細胞では166.7%であった。
（実験例１５）
【００２５】
１５．統計学的分析
実験結果はすべて平均値±標準偏差で示した。統計学的処理はANOVAにより実施し、P<0.05にて有意とした。
（実験例１６）
【００２６】
抗ラットマスピン抗体のラット膝関節腔内投与：生後４週齢雄Ｆ３４４ラットの膝関節腔内に、４週齢を０日目とし、７日目（５週齢時）に各２μｇの抗ラットマスピン抗体を投与した。１４日目（６週齢時）にラットを灌流固定し、ギ酸−クエン酸にて脱灰・パラフィン包埋の後、厚さ３μmm切片を作製し、ＨＥ染色を行った。
その結果、軟骨細胞あるいは関節表面の永久軟骨だけにマスピンの存在することが確認された。抗ラットマスピン抗体を投与しない比較対照（コントロール）では関節軟骨の破壊が見られず、抗ラットマスピン抗体を投与したラットでは関節軟骨が破壊され繊維性組織に置換された。かかる知見に基づき、マスピンには、軟骨破壊を抑制ないしは防止し、軟骨を維持する機能・作用があると判断された。
（参考例１）
【００２７】
マスピンとその断片：この発明では、米国NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）GenBankアクセッション番号：U03413、及びBC020713に記載の２つのアミノ酸配列の各完全長配列（ヒト由来マスピン）、その部分配列（マスピン断片）等を用いることができる。尚、ここでいう部分配列とは、上記の完全長アミノ酸配列から、マスピンの活性中心（マスピンの機能を発揮する領域、即ち、マスピン機能ドメイン）、マスピンエピトープ等を含むよう切り出された部分配列（マスピン断片）を意味する。
（参考例２）
【００２８】
マスピン遺伝子：この発明では、上述（参考例１）したGenBankアクセッション番号：U03413、及びBC020713に記載の２つの塩基配列の各完全長配列（ヒト由来のマスピン
遺伝子）、その部分配列、これ等の配列に基づき設計・構築あるいは合成されるＤＮＡやＲＮＡ等を用いることができる。かかるＤＮＡやＲＮＡは、例えば、発現ベクターにマスピン機能ドメインＣＤＲを組み込んだり、また、ＰＣＲ用プライマー（実験例３及び表1を参照）、ハイブリダイゼーション用プローブ、ｓｉＲＮＡ（実験例１１を参照）等として用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
軟骨や骨組織の形成制御剤及び破壊抑制剤、また、軟骨変形性関節症、軟骨関節リウマチ、歯槽骨や歯根膜等に係る歯周病、自己免疫疾患ないしは膠原病等の治療剤、予防剤、診断剤、更に、軟骨や骨組織に係る疾患の診断や治療薬の開発に適用できる。