(57)【要約】      （修正有）【課題】癌の発生、浸潤または転移を診断するための診断剤、および癌の発生、浸潤、転移または増殖を抑制するための治療剤を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列における８６位または２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体またはその免疫反応性断片、およびそれらを有効成分とする癌の発生、浸潤または転移を診断するための診断剤、および癌の発生、浸潤、転移または増殖を抑制するための治療剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体。
【請求項２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体がハイブリドーマKM2853またはKM2891から生産される請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
IgGクラスの抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の免疫反応性断片。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の誘導体。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項９】
ハイブリドーマが受託番号FERM BP-8262で特定される請求項７記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】
ハイブリドーマが受託番号FERM BP-8261で特定される請求項８記載のハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を含有する、癌の治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を含有する、癌の診断剤。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いてβカテニンのチロシンリン酸化を免疫学的測定法によって検出する方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて癌を判別する方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシン残基のリン酸化を阻害する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて癌の治療剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体、およびそれらの利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞間の細胞接着は、アドヘレンスジャンクションを構成するカルシウム依存性細胞接着因子であるＥカドヘリンのホモフィリックな結合により維持されている。βカテニンは、Ｅカドヘリンの細胞内ドメインに結合する蛋白質の一つとして見出された。また、Ｅカドヘリンと結合したβカテニンは、αカテニンを介してアクチン細胞骨格と結合する。即ち、αカテニンおよびβカテニンは、Ｅカドヘリンとアクチン細胞骨格との結合を介在している。また、細胞内ドメインを欠損したＥカドヘリンは、細胞間接着能を喪失することから、αカテニンおよびβカテニンを介したＥカドヘリンとアクチン細胞骨格との結合は、細胞間接着の維持に必須であると考えられている（非特許文献１）。
【０００３】
癌の浸潤および癌の転移の第一段階は、癌胞巣からの癌細胞の遊走である。Ｅカドヘリン細胞間接着機構は、この癌細胞の遊走に関与し、癌の浸潤および癌の転移を抑制する機能を担っていると考えられる。実際、癌細胞では様々な要因によりＥカドヘリン細胞間接着機構が不活性化していることが知られている。例えば、Ｅカドヘリンまたはカテニンの遺伝子の欠失または変異の導入が挙げられる。または、遺伝子のコード領域が正常であってもプロモーター領域のCpGメチル化により引き起こされる、細胞間接着機構に関わる蛋白質の発現低下が挙げられる。
【０００４】
また、細胞間の接着性が乏しいびまん浸潤の組織像を示す低分化型腺癌では、Ｅカドヘリンおよびβカテニンの遺伝子異常または発現異常が、高頻度で認められる。このようなＥカドヘリンおよびβカテニンの遺伝子発現異常による細胞間接着機構の不活性化は、癌の浸潤および転移の引き金の一つになっている。
【０００５】
一方、細胞間接着を維持した組織像を示す高分化型腺癌では、Ｅカドヘリンおよびβカテニンの遺伝子異常または発現異常の頻度は低い。高分化型腺癌では、腫瘍先進部でのみ細胞間の接着性が喪失し、癌細胞は間質増生を伴って浸潤する病理組織学的所見を認める。また、同一症例の肝転移巣では細胞間の接着能は回復しており、高分化型腺癌においては、Ｅカドヘリン細胞間接着機構は可逆的に制御されている。
【０００６】
細胞株を用いたin vitroの実験では、細胞内のリン酸化の亢進により、細胞間接着が解離することが確認された。さらに上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor；以下、EGFと表記する）や肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor；以下、HGFと表記する）などの増殖因子による刺激があると、細胞間接着は解離する。加えて、EGF受容体であるc-erbB-2のリン酸化触媒ドメインが、細胞内でβカテニンと会合していることが見出された。現在では、種々の増殖因子受容体のチロシンリン酸化作用によりβカテニンがリン酸化されることが、Ｅカドヘリン細胞間接着機構が不活性化する一因となっていると考えられている（非特許文献２）。
【０００７】
胃の未分化型腺癌の免疫組織染色において、細胞内のリン酸化チロシン量とリン酸化触媒ドメインを有する角質細胞増殖因子（Keratinocyte Growth Factor；KGF）受容体の発現量が相関（P＜0.001）すること、および細胞内リン酸化チロシン量と、Ｅカドヘリンおよびβカテニンの細胞質内発現量が相関すること（P＜0.05）が報告されている（非特許文献３）。臨床検体の癌部位の抽出物を抗βカテニン抗体で免疫沈降した後、抗リン酸化チロシン抗体で検出したところ、リン酸化されたβカテニンが検出された。即ち、癌組織内にはリン酸化されたβカテニンが著量存在している。一方、癌部位に近接する非癌部位においてはリン酸化されたβカテニンは検出されなかった。従って、臨床においても、βカテニンのリン酸化を伴う細胞間接着機構の不活性化が、癌の浸潤および癌の転移に関与しているものと考えられる。
【０００８】
リン酸化触媒ドメインを有するerbB-2レセプターとは結合できるが、Ｅカドヘリンとは結合できないβカテニンのN末端欠失体をコードする遺伝子を導入したヒト胃癌細胞株TMK-1細胞の形質転換体を、ヌードマウスの腹腔内に移植し、腹膜への転移が検討された。遺伝子導入されていないTMK-1細胞と比較した場合、βカテニンN末端欠失体の形質転換体には腹膜への転移の抑制効果が認められた(非特許文献４)。即ち、βカテニンN末端欠失体の形質転換体では、受容体erbB-2による野生型βカテニンのチロシンリン酸化を、βカテニンN末端の欠失体が競合的に阻害することで、Ｅカドヘリンによる細胞間接着機構を正常化し、癌細胞の転移を抑制していると考えられた。
【０００９】
また、βカテニンはwntシグナルを伝達して核内で転写活性化因子として機能しているとの報告がある（非特許文献５）。βカテニンは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β(以下、GSK-3βと表記する)によるリン酸化、癌抑制遺伝子であるAPC遺伝子の産物やその他の因子との結合、ユビキチン化を経て、分解されることで細胞質内での存在量が低く保たれている。wntとその受容体であるFrizzledの結合により、GSK-3βは不活性化され、βカテニンはリン酸化されずに分解機構から免れて細胞質内に蓄積する。蓄積したβカテニンは、転写因子であるリンパ球エンハンサー結合因子-1（lymphoid enhancer binding factor-1；以下、LEF1と表記する）またはT細胞因子-4（T cell factor-4；以下、TCF4と表記する）などと結合して、核内に移行して、c-myc、Cyclin D、PPARδ（peroxisome proliferator activated receptor δ）等の癌関連遺伝子の転写活性化を行うと考えられている。
【００１０】
また、多くの大腸癌において、βカテニンの分解に関与すると考えられているAPC遺伝子の欠失または変異が見出されており、同様に多くの癌において、βカテニンがGSK-3βによりリン酸化を受ける部位に変異が認められる。即ち、βカテニンの細胞質内での蓄積は、癌の発生や増殖に深く関わっていると考えられる。
【００１１】
さらに、APC遺伝子またはβカテニン遺伝子の変異が原因でβカテニンの分解系が不完全になっているメラノーマ細胞株に、EGF受容体erbB-2の分解を誘導する薬剤であるゲルダナマイシンを作用させると、βカテニンのチロシン残基のリン酸化は抑制され、βカテニンとＥカドヘリンとの結合が亢進されると同時に、核内βカテニン量の低下とβカテニン依存的な転写活性因子の活性低下が認められる（非特許文献６）。即ち、βカテニンの分解系が不全となった癌細胞では、増殖因子受容体のリン酸化触媒ドメインによるβカテニンのチロシンリン酸化は、Ｅカドヘリンの細胞間接着機構を不活性化して癌の浸潤および癌の転移を引き起こすと同時に、wntシグナル伝達系の正の制御を介して、癌の発生および癌の増殖にも関与している可能性が示唆された。
【００１２】
βカテニンのリン酸化によるＥカドヘリン細胞間接着機構不活性化の分子レベルでのメカニズムは未だ明らかにされていないが、いくつかの仮説が提唱されている。リン酸化されたβカテニンは、Ｅカドヘリンに対する親和性が低下し、Ｅカドヘリンとの結合が解離する。in vitroの組換え体蛋白質を用いた実験で、癌原遺伝子であるc-Src遺伝子の産物によるβカテニンのリン酸化部位は、８６位チロシンまたは６５４位チロシンであり、チロシンをフェニルアラニンに置換した変異体を用いた検討から、βカテニンとＥカドヘリンとの親和性の低下には６５４位チロシンのリン酸化が関与していることが明らかとなった（非特許文献７）。
【００１３】
リンパ腫細胞株K562細胞にＥカドヘリン遺伝子を導入して細胞間接着機構が導入された形質転換体に、チロシンフォスファターゼの阻害剤を作用させて細胞内リン酸化を亢進させると、細胞の凝集塊が解離する。その際、Ｅカドヘリンとβカテニンの結合は解離せず、βカテニンとαカテニンの結合が解離する。さらにK562細胞にＥカドヘリンとαカテニンとのキメラ遺伝子を導入した形質転換体は、チロシンフォスファターゼ阻害剤により細胞の凝集塊の解離は認められなかった。従って、Ｅカドヘリンとαカテニンおよびβカテニンの複合体から、αカテニンが離脱することが、細胞間接着機構の不活性化の原因であることが示唆された。（非特許文献８）。
【００１４】
このように、βカテニンのリン酸化は、癌の発生、浸潤、転移、ならびに増殖に深く関わっていると考えられるが、これらの現象において重要なβカテニンのチロシンリン酸化部位はこれまでに特定されていない。
【００１５】
このようなリン酸化アミノ酸残基を特異的に検出する場合には、一般的にリン酸化アミノ酸残基を含むペプチドと特異的に反応する抗体が利用される。これまでに、リン酸化βカテニンと特異的に反応する抗体としては、ウサギ抗リン酸化βカテニンポリクローナル抗体が市販されている。該抗体は４１位のチロシンおよび４５位のセリンがリン酸化されたβカテニン、または３３位、３７位のセリンおよび４１位のチロシンがリン酸化されたβカテニンを認識する。しかしながら、特定のリン酸化部位を認識できる抗βカテニンモノクローナル抗体の報告はない。さらに、ただ一つのリン酸化部位を認識する抗リン酸化βカテニンモノクローナル抗体は知られておらず、特に８６位リン酸化チロシンまたは２５４位リン酸化チロシンを選択的に認識できる抗リン酸化βカテニン抗体は知られていない。
【００１６】
【非特許文献１】EMBO Journal, 7, 3679, 1988
【非特許文献２】Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy, 26, 565, 1999
【非特許文献３】Japanese Journal of Cancer Research, 89, 829, 1998
【非特許文献４】Oncogene, 13, 883, 1996
【非特許文献５】細胞工学, 16, 793，1997
【非特許文献６】Cancer Research, 61, 1671, 2001
【非特許文献７】Journal of Biological Chemistry，274，36734, 1999
【非特許文献８】The Journal of Cell Biology, 127, 1375, 1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、癌を診断するための診断剤、癌の治療剤、ならびに癌の治療剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、以下に示す（１）〜（１６）に関する。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体。
（２）抗体がモノクローナル抗体である（１）記載の抗体。
（３）抗体がハイブリドーマKM2853またはKM2891から生産される（２）記載のモノクローナル抗体。
（４）IgGクラスの抗体である（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体の免疫反応性断片。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体の誘導体。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
（９）ハイブリドーマが受託番号FERM BP-8262で特定される（７）記載のハイブリドーマ。
（１０）ハイブリドーマが受託番号FERM BP-8261で特定される（８）記載のハイブリドーマ。
（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を含有する、癌の治療剤。
（１２）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を含有する、癌の診断剤。
（１３）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いてβカテニンのチロシンリン酸化を免疫学的測定法によって検出する方法。
（１４）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて癌を判別する方法。
（１５）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシン残基のリン酸化を阻害する薬剤をスクリーニングする方法。
（１６）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いて癌の治療剤をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体およびその用途を提供する。また、本発明の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシンリン酸化を特異的に認識することができるため、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシンリン酸化を阻害する物質のスクリーニングにも利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の抗体
本発明の配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体には、配列番号１で表されるβカテニンのアミノ酸配列において、８６位チロシンがリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体（以下、「８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体」と表記する）、および２５４位チロシンがリン酸化されたβカテニンを選択的に認識する抗体（以下、「２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体」と表記する）が含まれる。
【００２１】
８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに特異的に結合できる抗体をいう。２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに特異的に結合できる抗体をいう。
【００２２】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに特異的に結合できる抗体とは、βカテニンのアミノ酸配列中の８６位チロシン残基がリン酸化されていないβカテニンよりも８６位チロシン残基がリン酸化されているβカテニンに対し、より強いアフィニティーをもって特異的に結合する抗体をいう。
【００２３】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも包含されるが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００２４】
ポリクローナル抗体としては、免疫を施された動物の抗血清、および該抗血清から精製されたポリクローナル抗体を挙げることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産された抗体および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００２６】
遺伝子組換え抗体には、ヒト化抗体およびヒト抗体など、遺伝子組換えにより製造される抗体が包含される。遺伝子組換え抗体としては、モノクローナル抗体の有する性質と同等の性質を有し、ヒト体内において抗原性が低下し、血中半減期が延長されたものが好ましく用いられる。モノクローナル抗体の有する性質と同等の性質としては結合活性、中和活性などが挙げられる。
【００２７】
ヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（complementary determining region; 以下、CDRと表記する）移植抗体を包含する。
【００２８】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖（以下、H鎖と表記する）V領域（以下、抗体重鎖可変領域をVHと表記する）および軽鎖（以下、L鎖と表記する）V領域（以下、抗体L鎖可変領域をVLと表記する）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHと表記する）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLと表記する）とからなる抗体をいう。
【００２９】
本発明において、ヒト型キメラ抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基または２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターに挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、これを動物細胞へ導入して発現させることにより製造できる。
【００３０】
本発明のヒト型キメラ抗体のC領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ig）クラスに属するものでもよいが、IgG型、さらにはIgG型に属するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4等のイムノグロブリンのC領域が好ましい。
【００３１】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列で任意のヒト抗体のVH配列およびVL配列をそれぞれ置換したV領域をコードする遺伝子を構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ導入し、発現させることにより製造することができる。
【００３２】
本発明のヒト型CDR移植抗体のC領域の構造としては、いずれのイムノグロブリン（Ig）クラスに属するものでもよいが、IgG型、さらにはIgG型に属するIgG1、IgG2、IgG3、IgG4等のイムノグロブリンのC領域が好ましい。
【００３３】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー、およびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も包含する。
【００３４】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト抗体を産生するヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させて不死化、単一クローン化することにより、該抗体を産生するリンパ球を培養し、培養物中より該抗体を精製して製造することができる。
【００３５】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞などのヒト抗体産生細胞から調製した抗体cDNAをファージベクター中に挿入することにより、Fab、scFv等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーのことをいう。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに遺伝子工学的手法を用いて、2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子に変換することも可能である。
【００３６】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子がゲノム内に組み込まれた動物をいう。具体的には、マウス等のES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞を他のマウス初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を創製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、これを培養して培養物中の該抗体を精製することにより実施できる。
【００３７】
抗体の免疫反応性断片
本発明の抗体の免疫反応性断片は、上記のような本発明の抗体の断片であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに特異的に結合することができる抗体断片をいう。このような免疫反応性断片は、本発明の抗体を適当なペプチダーゼで消化して得られる抗体断片、組換えDNA技術を用いて作製される抗体断片を包含する。本発明の免疫反応性断片には、上記の本発明の抗体のFab（Fragment of antigen binding）、F(ab’)2、Fab’、一本鎖抗体（Single chain Fv; 以下、scFvと称す）［Science, 242, 423, 1988］、２量体化可変領域（以下、Diabodyと称す）［Nature Biotechnol., 15, 629, 1997］、およびジスルフィド安定化V領域断片（disulfide stabilized Fv; 以下、dsFvと称す）［Molecular Immunol., 32, 249, 1995］が包含される。また、本発明の抗体断片には、抗体重鎖V領域（VH）、および抗体軽鎖V領域（VL）のCDRのアミノ酸配列を含むペプチド（以下、CDRを含むペプチドと表記する）［J. Biol. Chem.， 271，2966, 1996］も包含される。
【００３８】
Fabは、IgGのヒンジ領域で2本のH鎖を架橋している2つのジスルフィド結合の上部のペプチド部分を酵素パパインで切断して得られるH鎖のN末端側半分と、L鎖全体で構成される分子量約3万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００３９】
本発明のFabは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を酵素パパインで処理して取得することができる。または、該抗体のFab断片をコードするDNAを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
【００４０】
F(ab’) 2は、IgGのヒンジ領域の２対のジスルフィド結合の下部を酵素トリプシンで処理して得ることができる、２つのFab領域がヒンジ部分で結合した分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４１】
本発明のF(ab’) 2は、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、該抗体のF(ab’) 2断片をコードするDNAを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入することにより発現させ、F(ab’) 2を製造することができる。
【００４２】
Fab’は、下記F(ab’)2のヒンジ間のジスルフィド結合を切断して得られる分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４３】
本発明のFab’は、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体のまたは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体のF(ab’)2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab’断片をコードするDNAを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入することにより発現させ、Fab’を製造することができる。
【００４４】
scFvは、一本のVHと一本のVLとが適当なペプチドリンカー（以下、Pと表記する）を用いて連結された、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドとして示される断片をいう。本発明で使用されるscFvに含まれるVHおよびVLとしては、本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体のいずれのものも用いることができる。
【００４５】
本発明のscFvは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体から、VHおよびVLのcDNAを取得してscFv断片をコードするDNAを構築し、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。
【００４６】
Diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なるscFvが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性、または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００４７】
本発明のDiabodyは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体から、VHおよびVLのcDNAを取得してDiabody断片をコードするDNAを構築し、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより製造することができる。
【００４８】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをジスルフィド結合により結合させたものである。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらに示された方法［Protein Engineering, 7, 697, 1994］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００４９】
本発明のdsFvに含まれるVHおよびVLは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体、または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体のいずれのものも用いることができる。
【００５０】
本発明のdsFvは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体から、VHおよびVLのcDNAを取得してdsFv断片をコードするDNAを構築し、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。
【００５１】
CDRを含むペプチドは、VHまたはVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることによって製造することができる。
【００５２】
本発明のCDRを含むペプチドは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体から、VHおよびVLのcDNAを取得してCDRを含むペプチドをコードするDNAを構築し、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法よって製造することもできる。
【００５３】
抗体誘導体
本発明の抗体の誘導体としては、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくはその免疫反応性断片、または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくはその免疫反応性断片に、放射性同位元素、蛋白質または薬剤などを化学的にまたは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体が挙げられる。
【００５４】
本発明の抗体の誘導体は、本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくはその免疫反応性断片、または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくはその免疫反応性断片のH鎖またはL鎖の、N末端側またはC末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基または側鎖、あるいは抗体または抗体断片中の糖鎖に、放射性同位元素、蛋白質または薬剤（好ましくは、低分子薬剤）などを化学的手法［抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館、1994］を用いて結合させることにより製造することができる。
【００５５】
あるいは、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体またはその免疫反応性断片をコードするDNAと、結合させたい蛋白質をコードするDNAとを連結させたDNAを、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入することにより発現させて製造することができる。
【００５６】
放射性同位元素としては、131I、125Iなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
【００５７】
薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、5-フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、1996］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマスチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、1982］などが挙げられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタルアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【００５８】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン12などが挙げられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質と抗体またはその免疫反応性抗体断片とを結合させた融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードするcDNAに蛋白質をコードするcDNAを連結させ、融合抗体をコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００５９】
本発明の抗体またはその免疫反応性断片の、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニンまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニンに対する結合活性は、一般的に使用される免疫学的測定法で測定することができる。免疫学的測定法としては、ELISA［Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］、およびウェスタンブロッティング［Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］などがあげられる。これらの方法により、in vitroにおいて測定することができる。
【００６０】
以下に、本発明を構成する８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体、その免疫反応性断片および誘導体の製造法、それらの用途、ならびにそれらを含む薬剤の用途について説明する。
【００６１】
１．８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体の製造法
(1)抗原とするペプチドの調製
配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシンリン酸化選択的βカテニン抗体、または配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシンリン酸化選択的βカテニン抗体は、βカテニンのアミノ酸配列のうちの、それぞれ配列番号１で表されるアミノ配列における８６位または２５４位のチロシンを含む連続した５残基以上、具体的には６〜３０残基、好ましくは１０〜２５残基のアミノ酸配列からなり、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシンをリン酸化チロシンに置換したペプチドを化学合成し、該ペプチドを抗原として動物に免疫することにより、それぞれ作製することができる。配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシンリン酸化選択的βカテニン抗体を製造するための抗原ペプチドの具体例としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられる。配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシンリン酸化選択的βカテニン抗体を製造するための抗原ペプチドの具体例としては、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられる。すなわち、本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体は、８６位チロシンリン酸化βカテニンにおける上記リン酸化ペプチド部分をエピトープとし、当該リン酸化ペプチド部分に特異的に結合する。２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体も同様に、２５４位チロシンリン酸化βカテニンにおける上記リン酸化ペプチド部分をエピトープとし、当該リン酸化ペプチド部分に特異的に結合する。
【００６２】
必要に応じて該ペプチドのN末端またはC末端には、後述する担体蛋白質との結合に用いるためのシステイン残基を付加する。チロシンがリン酸化されたペプチドは、文献の方法［Helv. Chim. Acta, 74, 1314, 1991、Helv. Chem. Acta, 75, 707, 1992、Tetrahedron Lett., 30, 6229, 1989、Tetrahedron Lett., 29, 3591, 1988］に基づきペプチド合成機等を用いて固相合成を行うことにより化学合成することができる。
【００６３】
(2)ポリクローナル抗体の作製
上記のペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清は、文献 ［Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. 1988］（以下、Antibodies: A Laboratory Manualと略記する）等に記載の一般的な方法により、マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの動物の皮下、静脈内または腹腔内に、適当なアジュバントとともに上記抗原を10日から4週間おきに数回投与して免疫を行うことにより調製することができる。免疫は、８６位リン酸化チロシンを含む上記ペプチド抗原および２５４位リン酸化チロシンを含む上記ペプチド抗原の片方で行ってもよく、または双方を含む混合物を用いて行ってもよい。混合物を用いて免疫を行った場合は、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体と２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を含むポリクローナル抗体が得られる。
【００６４】
（1）で調製したペプチドだけでは抗原として抗体を惹起する力が弱い場合、ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン(Keyhole Limpet Hemocyanine；以下、KLHと表記する)、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、破傷風毒素などの担体蛋白質に結合させたものを抗原とし、例えばウサギでは200〜1000μg、マウスで10〜100μgを1回あたり投与する。ペプチドと担体蛋白質との結合はm-マレインイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド(MBS)、グルタルアルデヒドを用いて行うことができる。アジュバンドとしては、フロインドの完全アジュバント(Complete Freund's Adjuvant)または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどが挙げられる。各投与後3〜10日目に免疫動物の眼底静脈叢または尾静脈より採血し、抗原に用いたリン酸化ペプチドに対する反応性について、酵素免疫測定法で確認し、その血清が十分な抗体価を示した動物から採取した血清を抗血清とする。酵素免疫測定法は、抗原に用いたリン酸化ペプチドをプレートにコートし、サンプルである血清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射性同位体等で標識した抗イムノグロブリン抗体(免疫に用いた動物のイムノグロブリンに対する抗体)を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、抗原ペプチドを認識して結合する抗体を検出および定量する方法である[酵素免疫測定法(ELISA法): 医学書院刊, 1976]。
【００６５】
(1)で調製した抗原用のペプチドを、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(N-hydroxysuccinimide、NHS)により活性化したセファロース-4B（Amersham Pharmacia Biotech 社製）やその充填済カラムであるハイトラップNHS-活性化カラム（HiTrap NHS-activated column、Amersham Pharmacia Biotech 社製）等に固定化して作製したアフィニティーカラムを用いて、上記の抗血清に対してアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、抗原ペプチドと結合するポリクローナル抗体を精製することができる。ペプチドの固定化やアフィニティークロマトグラフィーはメーカーの添付書類に従って行うことができる。
【００６６】
このようにして精製したポリクローナル抗体には、抗原としたペプチドのアミノ酸配列中のリン酸化チロシン以外の部分をエピトープとするために、抗原としたペプチドまたは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位もしくは２５４位のチロシン残基がリン酸化されたβカテニン以外の、８６位または２５４位がリン酸化されていないβカテニンとも結合できる抗体も含まれている。そこで、(1)で調製した抗原用のペプチドと同一のアミノ酸配列において、チロシンがリン酸化されていないペプチドを上記方法を用いて固定化したアフィニティーカラムに、上記で精製したポリクローナル抗体を通塔して、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位がリン酸化されていないβカテニンを認識する抗体をカラムに結合させて除くことにより、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンポリクローナル抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンポリクローナル抗体を精製することができる。
【００６７】
(3)モノクローナル抗体の作製
(2)と同様にして3〜20週令のマウスまたはラットを免疫し、血清中に十分な抗体価を示した動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。例えば脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。
【００６８】
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞として、一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。骨髄腫細胞としては、例えば、マウスから得られた株化細胞である８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1）［Kohler G. et al., Europ. J. Immunol., 6, 511, 1976］、SP2/0-Ag14（SP-2/0）［Shulmanet M. et al., Nature, 276, 269, 1978］、P3-X63Ag8653（653）［Kearney JF et al., J. Immunol., 123，1548, 1979］、P3-X63Ag8（X63）［Kohler G. et al., Nature, 256, 495, 1975］など、イン・ビトロ（in vitro）で増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法［Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988］に従い、細胞融合時までに2×107個以上の細胞数を確保する。
【００６９】
抗体産生細胞と骨髄腫細胞を、最小培地（minimal essential medium；以下、MEMと表記する）またはリン酸緩衝化生理食塩水（Phosphate Buffered Saline；以下、PBSと表記する）で洗浄したのち、ポリエチレングリコール−1000などの細胞凝集性媒体を加え、細胞融合させる。融合細胞をHAT培地［正常培地（RPMI-1640培地に1.5mmol/Lグルタミン、5×10-5mol/L  2-メルカプトエタノール、10μg/mLジェンタマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）を加えた培地）に10-4mol/L ヒポキサンチン、1.5×10-5mol/L チミジンおよび4×10-7mol/L アミノプテリンを加えた培地］に懸濁させ、96ウェルプレートに分注して培養する。
【００７０】
培養後、各ウェルの培養上清の一部をとり酵素免疫測定法により、抗原としたリン酸化ペプチドに、抗原のペプチドと同一の配列を有する非リン酸化ペプチドと比較してより強い反応性を示すものを選択する。選択したウェル内の細胞から、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［1回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものを８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００７１】
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、モノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質量は、ローリー法または波長280nmでの吸光度より算出することができる。
【００７２】
精製モノクローナル抗体の取得法としては、プリスタン（Pristane、2、6、10、14-テトラメチルペンタデカン）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、上記で得られた８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体産生ハイブリドーマ細胞または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体産生ハイブリドーマ細胞5×106〜2×107細胞／匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、40〜50％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインＡカラムまたはセルロファインGSL2000（生化学工業）のカラムなどを用いて、IgGまたはIgM画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
【００７３】
なお、本発明のハイブリドーマの具体例としては、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体産生ハイブリドーマKM2891、および２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体産生ハイブリドーマKM2853などが挙げられる。ハイブリドーマKM2853は、平成１４年１２月１９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第３）にFERM BP-8261として寄託されている。また、ハイブリドーマKM2891は、平成１４年１２月１９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第３）にFERM BP-8262として寄託されている。
【００７４】
２．８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体、または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体、その免疫反応性断片および誘導体の用途
本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体は、βカテニンのリン酸化された８６位のチロシンまたは２５４位のチロシンにそれぞれ特異的に結合することができる。このような性質を有する本発明の抗体は以下の用途に使用することができる。
【００７５】
(1)本発明の抗体を用いるβカテニンのリン酸化を検出する方法、癌の診断剤および癌を判別する方法
細胞内のβカテニンのリン酸化は、上記１で得られた抗体を用いて、免疫学的方法により検出することができる。
【００７６】
また、βカテニンの細胞内での上昇は癌に関与しているとされることから、上述の免疫学的方法でβカテニンの定量を行うことにより、癌の発生、癌増殖、癌浸潤および癌転移の状態を判別することができる。したがって、本発明の抗体は癌の診断剤として用いることができる。
【００７７】
具体的には、本発明の抗体を、細胞抽出物または被験試料と接触させて、本発明の抗体とβカテニンの結合を定性的または定量的に測定する。以上のことにより、細胞抽出物または被験試料内のβカテニンのリン酸化を定量することにより、癌の発生、癌増殖、癌浸潤および癌転移の状態を予測することができる。
【００７８】
被験試料としては、特に限定されないが、例えば生体試料、具体的には、癌化の疑われる病変組織など、それらの抽出物等が挙げられ、生検試料、手術摘出組織などを使用するのが好ましい。
【００７９】
本発明のβカテニンのリン酸化の度合いを調べる方法としては、免疫学的測定法が挙げられる。免疫学的測定方法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法等の抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくは、酵素免疫学的測定法（ELISA法）、イムノブロッティング法、免疫組織染色法等が用いられる。
【００８０】
ELISA法としては、サンドイッチELISAや競合ELISAが挙げられるが、サンドイッチELISAが望ましい。サンドイッチELISA法に用いる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などの抗体およびそれらの免疫反応性断片のうちいずれを用いてもよい。ELISA法で用いる2種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などの抗体およびそれらの免疫反応性断片のうちいずれを用いても良いが、高感度のサンドイッチELISAを行うためには、異なる抗原結合活性を有する２種類のモノクローナル抗体の組み合わせが好ましい。
【００８１】
また、リン酸化βカテニンを特異的に検出する場合、一方の抗体にはβカテニン特異的な抗体を、一方の抗体には本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を用いるのが好ましい。
【００８２】
非リン酸化βカテニンを特異的に検出する場合には、使用する２種類の抗体が同一のエピトープを認識しておらず、互いにβカテニンへの結合を阻害しない抗体であれば、いかなるβカテニン結合抗体も利用することができる。
【００８３】
固相に結合させる抗体および標識する抗体は、上記の抗体のいずれでもよい。抗体の標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光、発光などで標識する方法が挙げられるが、酵素での標識が好ましい。
【００８４】
ELISA法を利用したβカテニンのリン酸化の度合いを調べる方法としては、以下の方法が挙げられる。
【００８５】
第一に、上記のサンドイッチELISAにおいて、固相に結合させる抗体および標識抗体として、リン酸化されていないβカテニンに結合する抗体を使用し、被験試料中に含まれるリン酸化されていないβカテニンを検出する。
【００８６】
第二に、固相に結合させる抗体または標識抗体のいずれか一方に、本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を使用して、被験試料中に含まれる配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシンがリン酸化されたβカテニンのみを特異的に検出する。
【００８７】
このようにして検出された非リン酸化βカテニン量とリン酸化βカテニン量を比較することにより、被験試料中のβカテニン量およびβカテニンのリン酸化の度合いを測定することができる。
【００８８】
イムノブロッティング法を利用したβカテニンのリン酸化の度合いを調べる方法としては、具体的には、メンブレン上に固定した細胞抽出物または被験物質と、第一の抗体とを反応させた後、標識した第二の抗体を反応させる方法を用いることができる。
【００８９】
イムノブロッティング法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、上述したFab、Fab’、F(ab’)2などの免疫反応性断片を用いてもよい。
【００９０】
第一の抗体としては、例えば、本発明の８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体もしくは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体、それらの免疫反応性断片、または非リン酸化βカテニンモノクローナル抗体もしくはその免疫反応性断片を使用することができる。
【００９１】
第二の抗体としては、第一の抗体に反応できる抗体であればいかなる抗体を用いてもよく、例えば、抗マウスイムノグロブリン抗体が用いられる。
【００９２】
標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光、発光などによる標識が挙げられるが、酵素での標識が好ましい。
【００９３】
免疫組織染色法を利用してβカテニンリン酸化の度合いを調べる方法は、イムノブロッティング法と同様に行うことができる。具体的には、プレパラート上に固定した臨床組織材料と第一の抗体とを反応させた後、標識した第二の抗体を反応させる。臨床組織としては、癌化が疑われる組織およびその抽出物等が挙げられ、生検試料および手術摘出組織を使用することが好ましい。
【００９４】
免疫組織染色法において染色された組織の部位は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位チロシンがリン酸化されていることを示す。そして、リン酸化の度合いの高い組織を有する患者は、癌患者として判別することができる。
【００９５】
また、癌患者の腫瘍組織を上記と同様の方法で経時的に染色することにより、βカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化の度合いを測定して、癌の増殖または浸潤を判別することができる。
【００９６】
さらに、癌患者の腫瘍組織と腫瘍組織近傍の組織を上記と同様の方法で染色し、βカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化の度合いを比較することにより、癌の転移について判別することができる。
【００９７】
なお、イムノブロッティング法、ならびに免疫組織染色はAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988等の実験書に記載する方法で行うことができる。
【００９８】
(2)本発明の抗体、その免疫反応性断片または誘導体を用いた癌の治療剤
本発明の抗体、その免疫反応性断片または誘導体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位のチロシンまたは２５４位のチロシンがリン酸化されたβカテニンを選択的に認識し、リン酸化βカテニンの８６位または２５４位のリン酸化チロシンに特異的に結合することができる。従って、リン酸化されたβカテニンが関連する癌関連遺伝子の転写活性化を抑制することにより、癌の治療剤として用いることができる。
【００９９】
上述した薬剤は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【０１００】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与を挙げることができる。
【０１０１】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【０１０２】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。
【０１０３】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０１０４】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１０５】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、坐剤、噴霧剤等が挙げられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０１０６】
また、噴霧剤は該化合物または抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物または抗体を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。
【０１０７】
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物または抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１０８】
本医薬組成物の投与量は、患者の年齢、症状等によって異なるが、ヒトを含む哺乳動物に対し、各化合物または抗体として0.1〜20mg/kg/日投与する。投与は、各化合物または抗体を同時に投与する場合は、1日1回 (単回投与または連日投与) または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回、別々に投与する場合は、各々の化合物または抗体を、適宜時間をおいて、1日1回(単回投与または連日投与) または間歇的に1週間に1〜3回、2、3週間に1回静脈注射により行う。
【０１０９】
(3)βカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質をスクリーニングする方法
上記1で得られた抗体、その免疫反応性断片または誘導体とβカテニンを発現する細胞を用いて、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【０１１０】
具体的には、βカテニンを発現していると思われる細胞または該細胞の抽出物およびβカテニンをリン酸化できる物質と被験試料とを接触させた後、上記２の(1)に記載のβカテニンのリン酸化量を測定する方法を用いてβカテニンのリン酸化量を測定し、被験試料中に含まれる配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシンのリン酸化を阻害する物質を選択することができる。
【０１１１】
被験物質としては、βカテニンと溶液状態で混合できるものであれば特に限定されず、例えば、低分子化合物、高分子化合物、有機化合物、無機化合物、蛋白質、遺伝子、ウイルス、細胞などが挙げられる。遺伝子を除く被験物質は、反応液中に直接添加すればよい。
【０１１２】
遺伝子を効率的に培養系に導入する方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクターに乗せて培養系に添加する方法、またはリポソームなどの人工的なべジクル構造に封入して培養系に添加する方法などが挙げられる。その具体例としては、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子解析に関する報告 ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6733, 1995、Nucleic Acids Res., 18, 3587, 1990、Nucleic Acids Res., 23, 3816, 1995］を挙げることができる。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法としては、免疫学的測定法を利用したスクリーニング方法が挙げられる。免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法が挙げられる。免疫学的測定法としては、例えば、競合法、サンドイッチ法 [免疫学イラストレイテッド 第5版 (南江堂)]が挙げられるが、サンドイッチ法が好ましい。
【０１１４】
サンドイッチ法を利用したスクリーニング法とは、具体的には、固相に第一の抗体を結合させた後、被験試料と、EGF（epidermal growth factor）やHGF（hepatocyte growth factor）などの増殖因子含有培地で培養したβカテニンが発現していると思われる細胞または細胞の抽出物とを反応させた後、標識した第二の抗体を反応させる方法である。
【０１１５】
サンドイッチ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、上述したFab、Fab’、F(ab’)2、などの免疫反応性断片を用いてもよい。
【０１１６】
サンドイッチ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などの抗体およびそれらの免疫反応性断片のうちいずれを用いてもよいが、高感度のサンドイッチELISAを行うためには、異なる抗原結合活性を有する２種類のモノクローナル抗体の組み合わせが好ましい。
【０１１７】
例えば、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体とは別のエピトープを認識する抗βカテニン抗体またはその抗体断片と、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体もしくは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体またはその免疫反応性断片との組み合わせが挙げられる。固相に結合させる抗体および標識する抗体は、２つの抗体のいずれでもよい。
【０１１８】
標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光、発光などによる標識が挙げられるが、酵素での標識が好ましい。
【０１１９】
以下に本発明のスクリーニング方法の一態様を具体的に説明する。
96ウェルプレートに８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体を分注し、4℃で一晩放置して吸着させる。洗浄後、1％牛血清アルブミンを含むPBSを加えて、室温で1時間静置して非特異的吸着をブロックする。PBSで洗浄後、EGF（epidermal growth factor）やHGF（hepatocyte growth factor）等の増殖因子を含まない培地で培養したβカテニンを発現している細胞の細胞抽出液を分注した後に、EGFやHGF等の増殖因子および試験物質を添加してβカテニンを活性化し反応させる。洗浄後に８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体に結合したβカテニンの量を、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体とは別のエピトープを認識する抗βカテニン抗体を用いて酵素免疫測定法により測定する。
【０１２０】
またはウェルに結合したβカテニンに結合しうるアダプター分子の結合量を、アダプター分子の標識体またはアダプター分子に対する抗体を用いて酵素免疫測定法により測定する。試験物質を添加しない場合のβカテニンの結合量またはβカテニンと結合したアダプター分子の結合量と、試験物質を添加した場合の結合量とを比較することにより、配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位のチロシンのリン酸化を阻害する物質、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位のチロシンがリン酸化されたβカテニンとアダプター分子の結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【０１２１】
アダプター分子としては、Ｅカドヘリン、αカテニン、転写因子であるLEF1、またはTCF-4などが挙げられる。
【０１２２】
(4)ドラックデザインによるβカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質の取得方法
βカテニンの細胞内領域およびチロシンキナーゼドメインの構造を、X線結晶解析またはNMR解析などの構造解析により得られた数値をもとに、計算機上のシミュレーションを行ってβカテニンと情報伝達分子との結合領域を推定し、かつそれらの分子間結合を阻害することが可能な化合物を既存のデータベースまたはコンピューターソフトを用いてデザインして該化合物を合成することにより、βカテニンのリン酸化の阻害剤を取得することができる。
【０１２３】
チロシンキナーゼドメインとしては、βカテニンと相互作用して、βカテニンをリン酸化できる酵素蛋白質であれば、いかなる酵素蛋白質でもよく、例えば、EGF受容体やHGF受容体などの増殖因子受容体のチロシンキナーゼドメイン、またはwntシグナルを伝達するGSK-3βのチロシンキナーゼドメインが挙げられる。
【０１２４】
また、βカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化を特異的に阻害する物質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位または２５４位をリン酸化するチロシンキナーゼドメインの構造を、X線結晶解析またはNMR解析などによる構造解析により得られた数値をもとに計算機上のシミュレーションにより、推定して新規化合物を既存のデータベースから選択するか、またはコンピューターソフトを用いてデザインすることにより、βカテニンのリン酸化を特異的に阻害する物質を設計することができる。
【０１２５】
コンピューターソフトとしては、蛋白質の立体構造予測からドラッグデザインに一般的に用いられているコンピューターソフトであれば、いかなるソフトを使用することもできる。具体的には、(1) 構造未知のタンパク質の立体構造を構造が既知の類似蛋白質の立体構造から自動構築する場合には、例えば、Insight II/Modeler (Accelrys) が用いられる。(2) タンパク質の立体構造からリガンド結合部位を予測する場合には、例えば、Cerius2/LigandFit(Accelrys) が用いられる。(3) タンパク質の立体構造がわかっていて、リガンド結合部位がだいたい（領域として）わかっているときに、リガンドの結合様式を予測する場合、または任意の化合物が結合（阻害）するかどうか予測する場合には、例えば、Insight II/Affinity (Accelrys)、GOLD(CCDC)、FlexX (Tripos)、DOCK (Prof. Kuntz) が用いられる。(4) リガンド結合部位から、結合（阻害）すると予想される化合物をデザインする場合には、例えば、Insight II/Ludi (Accelrys) が用いられる。
【０１２６】
上記でデザインした化合物を製造し、前記２の(3)のスクリーニング方法で示したアッセイ方法に供することにより、阻害活性を有しているか否かを確認することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２７】
略号について
本発明において使用したアミノ酸およびその保護基に関する略号は、生化学命名に関するIUPAC-IUB委員会（IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）の勧告［European Journal of Biochemistry, 138, 9, 1984］に従った。
【０１２８】
以下の略号は、特に断わらない限り対応する下記のアミノ酸を表す。
Ala: L-アラニン
Asp: L-アスパラギン酸
Asx: L-アスパラギン酸またはL-アスパラギン
Arg: L-アルギニン
Cys: L-システイン
Gln: L-グルタミン
Glx: L-グルタミン酸またはL-グルタミン
Gly: グリシン
Ile: L-イソロイシン
Leu: L-ロイシン
Met: L-メチオニン
Phe: L-フェニルアラニン
Ser: L-セリン
Thr: L-スレオニン
Tyr: L-チロシン
pTyr: L-ホスホチロシン
Met: L-メチオニン
Val: L-バリン
【０１２９】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基および側鎖保護アミノ酸を表す。
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
tBu: ｔ-ブチル
Bzl: ベンジル
Trt: トリチル
Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルフォニル
Fmoc-Arg(Pmc)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Ng-2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル-L-アルギニン
Fmoc-Asp(OtBu)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-L-アスパラギン酸-β-t-ブチルエステル
Fmoc-Cys(Trt)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン
Fmoc-Gln(Trt)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Nε-トリチル-L-グルタミン
Fmoc-Ser(tBu)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-セリン
Fmoc-Thr(tBu)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-スレオニン
Fmoc-Tyr(tBu)-OH:Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-t-ブチル-L-チロシン
Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH)-OH: Nα-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル-O-ベンジル-L-ホスホチロシン
【０１３０】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
HBTU: 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
TFA: トリフルオロ酢酸
【０１３１】
以下の実施例において、化合物の理化学的性質は以下の方法により測定した。
質量分析は、日本電子JMS-HX110Aを用いFAB-MS法により、もしくはブルカー社質量分析装置REFLEXを用いMALDI-TOFMS法により行った。アミノ酸分析は、コーエンらの方法［Analytical Biochemistry, 222, 19, 1994］により行った。加水分解は塩酸蒸気中110℃で20時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はウォーターズ・アキュ・タグ（Waters AccQ-Tag）アミノ酸分析計（Waters社製）を用い分析した。
【０１３２】
実施例１．８６位または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニン抗体の作製
(1)抗原ペプチドの調製
配列番号１に示したβカテニン蛋白質のアミノ酸配列を解析し、親水性の高い部分、N末端、C末端、二次構造上ターン構造、ランダムコイル構造を有する部分の中から、抗原として適当と考えられる配列番号２および配列番号４で示される部分アミノ酸配列を２つ選択し、アミノ酸配列に基づきペプチド化合物を作製した（化合物１および３）。さらにそれぞれの部分配列の中でリン酸化部位であると考えられるチロシン残基を特定し、配列番号３および配列番号５で示される２つの部分配列でチロシン残基がリン酸化されたペプチドおよびリン酸化していないペプチド（化合物２および４）を以下のように作製した。
【０１３３】
(1)-1  化合物１(bCAT-86Y)（配列番号２）
（H-Cys-Asp-Ile-Asp-Gly-Gln-Tyr-Ala-Met-Thr-Arg-Ala-NH2）の合成
Fmoc-NH、27.5μmolが結合した担体樹脂（Rink amide MBHA resin樹脂、ノバビオケム社製）50mgを自動合成機（島津製作所製）の反応容器に入れ、600μlのDMFを加えて3分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従って、以下の操作を行った。
(a) 30%ピペリジン-DMF溶液500μlを加えて混合物を4分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をさらに1回繰り返した。
(b) 担体樹脂を600μlのDMFで1分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を5回繰り返した。
(c) Fmoc-Ala-OH(275μmol)、HBTU(275μmol)、HOBt 1水和物(275μmol)およびDIEA(550μmol)をDMF(1.10ml)中で3分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を60分間攪拌し、溶液を排出した。
【０１３４】
担体樹脂を600μlのDMFで1分間洗浄後溶液を排出し、これを5回繰り返した。このようにして、Fmoc-Ala-NHを担体上に合成した。
【０１３５】
次に、(a) (b)の工程の後、(c)の工程でFmoc-Arg(Pmc)-OHを用いて縮合反応を行い、(d)の洗浄工程を経て、Fmoc-Arg(Pmc)-Ala-NHが担体上に合成された。
以下、工程(c)において、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次用いて、(a)〜(d)を繰り返した後、(a)(b)の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下12時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液1mlを加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして41.5mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物１を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、11.4mgの以下の物理化学的性質を有する化合物１を得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 1342.5 (M+H+)
アミノ酸分析; Asx 2.1 (2), Glx 1.1 (1), Gly 1.1 (1), Arg 1.1 (1), Thr 1.0 (1), Ala 2.1 (2), Tyr 0.9 (1), Met 0.6 (1), Ile 1.0 (1), Cys 1.4 (1)
【０１３６】
(1)-2  化合物２(bCAT-86pY)（配列番号３）
（H-Cys-Asp-Ile-Asp-Gly-Gln-pTyr-Ala-Met-Thr-Arg-Ala-NH2）の合成
Fmoc-NH、27.5μmol が結合した担体樹脂（Rink amide MBHA resin樹脂、ノバビオケム社製）50mgを出発物質として、上記(1)-1と同様に、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（82.5%）、チオアニソール（5%）、水（5%）、エチルメチルスルフィド（3%）、1,2-エタンジチオール（2.5%）およびチオフェノール（2%）からなる混合溶液1mlを加えて室温で8時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして38.7mgを取得した。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物２を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、14.1mgの以下の物理化学的性質を有する化合物２を得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 1422.6 (M+H+)
アミノ酸分析; Asx 2.1 (2), Glx 1.1 (1), Gly 1.0 (1), Arg 1.0 (1), Thr 1.0 (1), Ala 2.0 (2), Tyr 0.9 (1), Met 1.0 (1), Ile 0.9 (1), Cys 1.4 (1)
但し、アミノ酸分析においてホスホチロシンは加水分解によりチロシンとして検出された。
【０１３７】
(1)-3  化合物３(bCAT-254Y)（配列番号４）
（H-Cys-Asp-Ser-Val-Leu-Phe-Tyr-Ala-Ile-Thr-Thr-Leu-NH2）の合成
Fmoc-NH、27.5μmolが結合した担体樹脂（Rink Amide MBHA resin樹脂、ノバビオケム社製）50mgを出発物質として、上記(1)-1と同様に、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（90%）、チオアニソール（5%）および1,2-エタンジチオール（5%）からなる混合溶液1mlを加えて室温で2時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして30.4mgを取得した。この粗生成物全量をジチオスレイトールおよびDMFからなる混合溶液に溶解し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物３を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、2.9mgの以下の物理化学的性質を有する化合物３を得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 1936.0 (M+H+)
アミノ酸分析; Asx 1.1 (1), Gly 0.9 (1), Thr 2.1 (2), Ala 1.2 (1), Tyr 1.0 (1), Val 0.7 (1), Ile 1.1 (1), Leu 1.9 (2), Phe 1.0 (1), Cys 1.3 (1)
【０１３８】
(1)-4  化合物４(bCAT-254pY)（配列番号５）
（H-Cys-Asp-Ser-Val-Leu-Phe-pTyr-Ala-Ile-Thr-Thr-Leu-NH2）の合成
Fmoc-NH、27.5μmolが結合した担体樹脂（NovaSyn TGR resin樹脂、ノバビオケム社製）50mgを出発物質として、上記(1)-1と同様に、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OHを順次縮合した後に、Fmoc基除去、洗浄、乾燥を経て、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得た。これに、TFA（90%）、チオアニソール（5%）および1,2-エタンジチオール（2.5%）からなる混合溶液1mlを加えて室温で2時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出した。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテル約10mlを加え、生成した沈澱を遠心分離およびデカンテーションにより回収し、粗ペプチドとして34.1mgを取得した。この粗生成物全量をジチオスレイトールおよびジメチルスルホキシドからなる混合溶液に溶解し、逆相カラム（資生堂製、CAPCELL PAK C18 30mmI.D. X 250mm）を用いたHPLCで精製した。0.1% TFA水溶液に、TFA 0.1%を含む90%アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、220nmで検出し、化合物４を含む画分を得た。この画分を凍結乾燥して、2.9mgの以下の物理化学的性質を有する化合物４を得た。
質量分析［TOFMS］; m/z = 1424.6 (M+H+)
アミノ酸分析; Asx 1.1 (1), Gly 1.0 (1), Thr 2.0 (2), Ala 1.0 (1), Tyr 0.9 (1), Val 0.9 (1), Ile 1.0 (1), Leu 2.0 (2), Phe 1.0 (1), Cys 1.3 (1)
但し、アミノ酸分析においてホスホチロシンは加水分解によりチロシンとして検出された。
【０１３９】
(2)免疫原の調製
実施例１(1)で得られた化合物１〜４で示したペプチドのうち、化合物２（bCAT-86pY）および化合物４（bCAT-254pY）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でKLH（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、KLHをPBSに溶解して10m/mLに調製し、1/10容量の25m/mL MBS[N-（m-Maleimidobenzoyloxy）succinimide;ナカライテスク社製]を滴下して30分間撹拌反応させた。あらかじめPBSで平衡化したセファデックスG-25カラムなどのゲルろ過カラムで未反応のMBSを除いて得られたKLH-MBS 2.5mgを0.1Mりん酸ナトリウムバッファー（pH7.0）に溶解したペプチド1mgと混合し、室温で3時間、攪拌反応させた。反応後、PBSで透析したものを免疫原として用いた。
【０１４０】
(3)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（2）で調製した化合物２および化合物４のKLHコンジュゲート100μgをそれぞれ水酸化アルミニウムアジュバント［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 99, 1988］2 mgおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）1×109細胞とともに6週令雌BDF1マウス各３匹に投与した。投与2週間後より、各KLHコンジュゲート100μgを1週間に1回、計4回投与した。該マウスの眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
【０１４１】
脾臓をMEM（Minimum Essential Medium）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（280×g、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.6）を添加し、1〜2分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をMEM培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
【０１４２】
(4)マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1（P3-U1：ATCCより購入）を正常培地（10％ウシ胎児血清添加RPMI培地）で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【０１４３】
(5)ハイブリドーマの作製
実施例１(3)で得られたマウス脾細胞と実施例１(４)で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（280×g、5分間）した。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1000（PEG-1000）2g、MEM培地2mLおよびジメチルスルホキシド0.7mLの混液を108個のマウス脾細胞あたり0.5mL加え、該懸濁液に１〜２分間毎にMEM培地１mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。
【０１４４】
該懸濁液を遠心分離（170×g、5分間）し、得られた沈澱画分の細胞をゆるやかにほぐした後、該細胞を、メスピペットによる吸込み吸出しでゆるやかにHAT培地〔10％ウシ胎児血清添加RPMI培地にHAT 培地添加物（GIBCO BRL社製）を加えた培地〕100mL中に懸濁した。該懸濁液を96ウェル培養用プレートに200μL／ウェルずつ分注し、5％CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。
【０１４５】
培養後、培養上清を実施例１(6)に記載した酵素免疫測定法を用いて、抗原ペプチドとして用いた化合物２および化合物４に対して、同じアミノ酸配列であるがリン酸化されていないコントロールペプチドとして用いた化合物１および化合物３と比較して、強い反応性を示すウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを2回繰り返し、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマまたは２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。化合物２を抗原ペプチドとして用いてKM2890およびKM2891、化合物４を抗原ペプチドとして用いてKM2850〜KM2858、KM2972〜KM2974の計14クローンを取得した。
【０１４６】
(6)酵素免疫測定法（バインディングELISA）
アッセイ用の抗原には実施例１（1）で得られた化合物１〜４をサイログロブリン（以下、THYと表記する）とコンジュゲートしたものを用いた。作製方法は実施例１(2)に記した通りであるが、架橋剤にはMBSの代わりにSMCC [4-(N-Maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimido ester；シグマ社製]を用いた。化合物２については化合物２と同一配列を有する非リン酸化ペプチドである化合物１（bCAT-86Y）を、化合物４については同様に化合物３（bCAT-254Y）をそれぞれの陰性対照ペプチドとして、同様にTHYとコンジュゲートして用いた。96ウェルのELISA用プレート（グライナー社製）に、上記のように調製したコンジュゲートを5μg/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。該プレートを洗浄後、1％牛血清アルブミン（以下、BSAと表記する）を含むダルベッコリン酸バッファー（Phosphate buffered saline：PBS）（以下、１％BSA/PBSと表記する）を100μL/ウェル加え、室温で1時間放置し、残存している活性基をブロックした。1％ BSA/PBSを捨て、該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマの培養上清もしくは精製モノクローナル抗体を50μL/ウェルで分注し、２時間放置した。該プレートを0.05%ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート[（ICI社商標Tween 20相当品：和光純薬社製）]/PBS（以下Tween-PBSと表記する）で洗浄後、2次抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社製）を50μL/ウェルで加えて室温、1時間放置した。該プレートをTween-PBSで洗浄後、ABTS基質液〔2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）、1mmol/L / 0.1mol/Lクエン酸バッファー（pH4.2）〕を50μL/ウェルで添加して発色させ、OD415nmの吸光度をプレートリーダー（Emax；Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１４７】
(7)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス（BALB/c）に実施例１(5)で得られたハイブリドーマ株を5×106〜2×107細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取した。
【０１４８】
該腹水を遠心分離（1200×g、5分間）し固形分を除去した。精製IgGモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］により精製することにより取得した。ハイブリドーマKM2850〜KM2858、KM2890、KM2891およびKM2972〜KM2974が生産するモノクローナル抗体のサブクラスは、サブクラスタイピングキットを用いたELISA法により表１に示すように決定された。
【０１４９】
【表１】
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【０１５０】
実施例２．モノクローナル抗体の反応性の検討
(1)抗原固相系における抗原ペプチドとの反応性（バインディングELISA）
実施例１(6)に示した方法に従って行った。1次抗体には実施例１(5)で得られたハイブリドーマの培養上清を5倍希釈で6段階に希釈したものを用いた。結果を図１に示す。すべてのモノクローナル抗体が、陰性対照の非リン酸化ペプチド（化合物１または３）と比較して、リン酸化抗原ペプチド（化合物２または４）に強い反応性を示した。
【０１５１】
(2)抗原液相系における抗原ペプチドに対する反応性（インヒビションELISA）
実施例１(6)で化合物２を抗原ペプチドに用いて作製された８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体の、化合物１〜４に示される各種ペプチドに対する反応性を、インヒビションELISAで調べた。実施例１(6)と同様に抗原を固相化したプレートを準備し、10μg/mLから10倍希釈で段階的に希釈した化合物を50μL/ウェルで分注後、ハイブリドーマKM2890またはKM2891の培養上清を2000倍に希釈して50μL/ウェルで分注し、ウェル内で混合して室温で2時間反応させた。ウェルをTween−PBSで洗浄後、希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社製）を50μL/ウェルで加えて室温、1時間反応させ、Tween-PBSで洗浄後ABTS基質液［2.2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を50μL/ウェルで添加して発色させ、OD415nmの吸光度をプレートリーダー（Emax;和光純薬社製）にて測定した。
【０１５２】
図２に示すように、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2890由来（１）およびKM2891由来（２））はいずれも液相系においてアミノ酸配列の異なる化合物３および４には反応しなかった。また、同一アミノ酸配列ではあるがリン酸化されていない陰性対照である化合物１と比較して、リン酸化ペプチドである化合物２とは10〜100倍強く反応した。
【０１５３】
(3)ウエスタンブロッティング
ヒト偏平上皮癌細胞株A431（ATCC No. CRL-1555）とヒト胃癌細胞株TMK-1［Jpn. J. Cancer Rec., 76, 1064-1071, 1985］を血清無添加のRPMI培地で48時間培養後、50ng/mLになるように上皮増殖因子EGFを添加し、0時間と0.5時間後にEDTA溶液を用いて回収して以下のように細胞溶解液を調製した。また、比較対照として無血清培養、上皮増殖因子EGF処理をせず10%FCS添加したRPMI培地で培養した細胞からも細胞溶解液を調製した。
【０１５４】
回収した細胞をPBSで洗浄した後、細胞溶解用緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.2，1% TritonX，50mM NaCl，2mM MgCl2，2mM CaCl2，0.1% NaN3，50mM ヨードアセトアミド，50mM N-エチルマレイミド，1mg/ml ロイペプチン，0.1mM ジチオスレイトール)を5×107細胞に１mL添加し、4℃、0.5時間放置後、遠心分離して得られた上清画分を細胞溶解液として用いた。得られた細胞溶解液にSDS-PAGE用サンプルバッファーを加え100℃、5分加熱し、1×105細胞分/レーンでSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(5%濃縮ゲル、7.5%分離ゲル、200V、45分間)［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］にて分画後、セミドライ型ブロッティング装置にてPVDF膜にブロッティング（25V、30分間または60分間）した。5% Skimmilk，1% BSA，0.1% Tween-PBSで2時間ブロッキング後、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体ハイブリドーマ（KM2891）または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体ハイブリドーマ（KM2853）の培養上清を4℃で一晩反応させた。0.1% Tween-20，1mM Orthovanadate-PBSでよく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体〔ザイメット社製〕を１時間反応させた。0.1% Tween，1mM Orthovanadate- PBSでよく洗浄した後、検出はECL detection kit（Amersham-Pharmacia社製）を用いて行い、X線フィルム上に感光させた。
【０１５５】
図３に、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2891由来）でのウェスタンブロッティングの結果を示した。無血清培養後、上皮増殖因子EGFを添加して0.5時間経過したTMK-1細胞では、上皮増殖因子EGF添加直後のTMK-1細胞と比較して、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2891由来）で検出されるバンドのシグナルは明らかに増強していた。従って、８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2891由来）は、上皮増殖因子EGF刺激で配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに、非リン酸化βカテニンと比較してより強く結合し、ウェスタンブロッティングにより配列番号１で表されるアミノ酸配列における８６位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを検出できることが示された。
【０１５６】
図４に２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2853由来）でのウェスタンブロッティングの結果を示した。無血清培養後、上皮増殖因子EGFを添加して0.5時間経過したA431細胞では、上皮増殖因子EGF添加直後のA431細胞と比較して、２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2853由来）で検出されるバンドのシグナルは明らかに増強していた。従って、２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2853由来）は、上皮増殖因子EGF刺激で配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンに非リン酸化βカテニンと比較してより強く結合し、ウェスタンブロッティングにより配列番号１で表されるアミノ酸配列における２５４位チロシン残基がリン酸化されたβカテニンを検出できることが示された。
【０１５７】
(4)免疫組織染色（ABC法）
検体としてホルマリン固定後、パラフィン包埋処理を施したヒト舌癌（扁平上皮癌）切片を用いた。切片はキシレン-エタノール系列にて脱パラフィン、親水化を行い、流水水洗後、0.3%過酸化水素-メタノール溶液にて内因性のペルオキシダーゼを失活させた。抗原賦活処理として1mM Orthovanadate-0.01Mクエン酸バッファー（PH6.0）中でマイクロウエーブ処理（95℃、20分間）を行った。流水および0.1％ Tween-PBSにて洗浄後、5% Skimmilk-1% BSA-1mM Orthovanadate-0.1％ Tween-PBSにて40分間ブロッキングした。2% NSS-1mM Orthovanadate-PBSにて処理（3分間）した後、一次抗体として８６位または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体のハイブリドーマ培養上清を4℃で一晩反応させた。0.1％ Tween-PBSにて洗浄後2% NSS-1mM Orthovanadate-PBSにて処理（3分間）した後、二次抗体としてビオチン化抗マウスイムノグロブリン（VECTOR社製）を室温で45分間反応させた。0.1％ Tween-PBSにて洗浄後、2% NSS-1mM Orthovanadate-PBSにて処理（3分間）した後、sABC試薬（ダコ社製）を室温で40分間反応させた。0.1％ Tween-PBSにて洗浄後ジアミノベンチジン水溶液を3〜20分間反応させて発色させた。流水水洗後ヘマトキシリンにて核染色し、流水水洗後、エタノール-キシレン系列にて脱水、透徹を行った後、封入、検鏡した。
【０１５８】
８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2891由来）または２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2853由来）を一次抗体に用いた染色の結果、癌細胞の細胞膜部分が特異的に染色された。したがって、これらの抗体は、免疫組織染色において癌組織における配列番号１のアミノ酸配列で表されるβカテニンの８６位または２５４位チロシンのリン酸化亢進をそれぞれ検出できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】モノクローナル抗体のバインディングELISAにおける抗原ペプチド選択的な反応性を示す。横軸は、ELISAに用いた各抗体産生ハイブリドーマの培養上清の希釈倍率を、縦軸は吸光度を示す。
【図２】モノクローナル抗体の、インヒビションELISAにおける抗原ペプチド選択的な反応性を示す。横軸は、反応系に添加したペプチドである化合物１〜４の濃度を、縦軸は吸光度を示す。
【図３】８６位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2891由来）のウェスタンブロッティングにおける反応性を示す。図中SFMは無血清培養、FBS Mは血清添加培養を示す。レーンは用いた細胞毎に左から、無血清培養後にEGFを添加した直後、0.5時間後、さらに血清添加培養時の細胞を示す。矢印はβカテニンのバンドを示す。
【図４】２５４位チロシンリン酸化選択的抗βカテニンモノクローナル抗体（KM2853由来）のウェスタンブロッティングにおける反応性を示す。A431細胞を用いた各レーンは用いた細胞毎に左から、無血清培養後にEGFを添加した直後、0.5時間後、さらに血清添加培養時の細胞を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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