(57)【要約】【課題】  幹細胞からニューロンを生成する方法に関する。【解決手段】  本発明は、培地中ニューロンを培養し、結果として得られた混合物中幹細胞を培養することを含む、幹細胞からニューロンを生成する方法に関する。本発明はさらに、基礎培地中ニューロンを培養することにより調製される幹細胞を培養するための培地に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞からニューロンを調製する方法であって、培地においてニューロンを培養し、次いで得られた混合物中にて幹細胞を培養することを含む方法。
【請求項２】
ニューロンが脳から得られる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ニューロンが海馬から得られる請求項２記載の方法。
【請求項４】
幹細胞を添加する前に、ニューロンが培地中で３〜６日間培養されている請求項１記載の方法。
【請求項５】
ニューロンが５日間培養されている請求項４記載の方法。
【請求項６】
幹細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性腫瘍（ＥＣ）細胞、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）、骨髄造血細胞、臍帯血細胞および臍間葉細胞からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項７】
幹細胞が骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）または臍間葉細胞である請求項６記載の方法。
【請求項８】
ニューロンの培養に用いられる培地がＦＢＳ−ＤＭＥＭである請求項１記載の方法。
【請求項９】
幹細胞を混合物中にて６ないし１２日間培養する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞培養混合物からニューロンを採取する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ニューロンを培養の第６日から第１２日の期間に採取する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ニューロンを培養の第６日から第９日の期間に採取する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ニューロンを基礎培地中で培養することにより調製される、幹細胞を培養するための培地。
【請求項１４】
基礎培地がＦＢＳ−ＤＭＥＭである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ニューロンが基礎培地から除去されている請求項１３記載の培地。
【請求項１６】
ニューロンが脳から得られる請求項１３記載の培地。
【請求項１７】
ニューロンが海馬から得られる請求項１６記載の培地。
【請求項１８】
ニューロンが基礎培地中にて３ないし６日間培養されている請求項１３記載の培地。
【請求項１９】
ニューロンが基礎培地中にて５日間培養されている請求項１８記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は幹細胞からニューロンを生成する方法および幹細胞を培養するための培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの臨床上一般的な慢性神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューロンの変性および死の結果起こる。ニューロンは、上皮細胞および肝細胞と違って、迅速に再生できない。ＣＮＳ中には実際、通常の条件下またはニューロンが損傷を受けた場合のいずれかに複製し、分化できる幹細胞が存在するが、その複製は非常に遅く、ニューロンの分化の割合は非常に低い。ＣＮＳにおける幹細胞のほとんどは、分化して神経膠細胞になり、従って神経変性疾患を救済できない。
【０００３】
神経変性疾患の治療を行う目的でニューロン移植が取り上げられている。研究者らはインビトロおよびインビボの両方において様々な幹細胞からニューロンを生成しようと試みてきた。幹細胞は、自己再生、多能性、増殖、長命および分化をはじめとするある特徴を有すると考えられる。胎児、臍帯血および骨髄は、臨床的用途のためのヒト幹細胞の一般的供給源である。胎児において、中枢神経系の病的変化の治療に利用できる幹細胞は、主に胚盤胞の胚性幹細胞および神経幹細胞であった（非特許文献１）。研究者らは、脊髄損傷を修復するために胚性幹細胞（非特許文献２）または神経幹細胞（非特許文献３）を移植した後、これらの細胞は主に分化して星状膠細胞および乏希突起神経膠細胞になり、ごくわずかの細胞しかニューロン細胞にならないことを明らかにしている。回復が困難であること、移植後の生存率が低いこと、および神経細胞への変化率が非常に低いことに加え、胎児組織の移植は、人道的、法律および倫理的観点における論議によっても阻まれている。
【０００４】
臍帯血の造血幹細胞を直接移植することにより、損傷を受けた神経細胞を修復することはまだ研究されていない。しかしながら、インビトロモデルは、０．００１％のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中で培養された臍帯血の造血幹細胞を神経細胞の前駆体に変換し、次いでこれらの細胞の１０％をさらに神経細胞および神経膠細胞に分化させることができること示している（非特許文献４および５）。臍帯血幹細胞のニューロン細胞への変換率は比較的低いので、臍帯血の研究および適用は主に血液疾患に絞られていた。
【０００５】
骨髄は、赤血球、血小板、単球、顆粒球、およびリンパ球の原種の継続した供給源を提供する造血幹細胞を含む。さらに、骨髄は非造血組織の幹細胞の基準を満たす細胞も含む。成人骨髄から得られる造血幹細胞は、マウスの脳において小神経膠細胞および大神経膠細胞の両方に分化することができると報告されている（非特許文献６）。骨髄間質から得られる非造血幹細胞は、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）または骨髄間葉細胞と呼ばれる。ＢＭＳＣはインビトロにおいて分化して、骨原性、軟骨原性、脂肪生成、筋原性およびその他の系統になることができる（非特許文献７および８）。最近、ＢＭＳＣ（非特許文献９および１０）はインビボで分化してニューロンになることができると報告されている。
【０００６】
多能性細胞からニューロンを生成する前記の方法は全て１つの共通の問題を有する。すなわち、多能性幹細胞のほとんどは分化してニューロンではなく膠細胞（星状細胞、乏突起神経膠細胞など）になる。ＢＭＳＣのインビトロ培養についてのみ、ＢＭＥが神経分化に対して重大な影響を及ぼすことが観察され、これは培養されたＢＭＳＣの約８０％をニューロンに分化させる（非特許文献１１）。しかしながら、ＢＭＥはタンパク質に対して有毒であり、従って人間の身体における使用に適さない（非特許文献１２）。従って、幹細胞をニューロンに変換する有効な方法が依然として必要とされている。
【０００７】
【非特許文献１】R.L. Rietze et al., 2001, Nature 412: 736-739
【非特許文献２】J.W. McDonald et al., 1999, Nature Medicine 5: 1410-1412
【非特許文献３】Q.L. Cao et al., 2001, Experimental Neurology 167: 48-58
【非特許文献４】J. R. Sanchez-Ramos et al., 2001, Experimental Neurology 171: 109-115
【非特許文献５】Y. Ha et al., 2001, Neuroreport 12(16): 3523-3527
【非特許文献６】M. A. Eglitis et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4080-4085
【非特許文献７】M.F. Pittenger et al., 1999, Science 284: 143-147
【非特許文献８】B. E. Petersen et al., 1999, Science 284: 1168- 1170
【非特許文献９】S. A. Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3908-3913
【非特許文献１０】G. C. Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 10711-10716
【非特許文献１１】D. Woodbury et al., 2000, Journal of Neuroscience Research 61: 364-370
【非特許文献１２】K. White et al., 1973, Journal of Pharmaceutical Sciences 62: 237-241
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は幹細胞からニューロンを生成する方法であって、ニューロンを培地中で培養し、結果として得られる混合物中で幹細胞を培養することを含む方法を提供する。
本発明はさらに、幹細胞を培養するための培地であって、基礎培地中でニューロンを培養することにより調製される培地をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、ニューロンを基礎培養培地にて６〜９日間培養することにより調製される培地において培養された幹細胞は、高い割合で（８７％）機能的有糸核分裂後のニューロンに分化できることが見いだされた。
特定の理論に限定されることを望まないが、何らかの物質が、培養されたニューロンから放出され、それが、幹細胞が分化してニューロンになるための最適の条件を提供するものと考えられる。
本発明において使用される「幹細胞」なる用語は任意の未分化の多能性または多型潜在性哺乳動物細胞を意味し、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性腫瘍（ＥＣ）細胞、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）、骨髄造血細胞、臍帯血細胞および臍間葉細胞を包含するが、これらに限定されない。臍間葉細胞を除く前記幹細胞はすべて、分化してニューロンおよび／または神経膠細胞になれることが報告されている。しかしながら、本発明の培養法により、臍間葉細胞さえも高い割合で機能的ニューロンに分化できる。
【００１０】
従って、任意の哺乳動物幹細胞が本発明の方法における使用に適している。好ましくは、間葉細胞、例えば、ＢＭＳＣまたは臍間葉細胞が用いられる。
本発明の培地を調製するために用いられるニューロンは、哺乳動物の末梢神経系と中枢神経系の両方から得ることができる。好ましくは、ニューロンはＣＮＳ由来のものであり、さらに好ましくは脳由来であり、最も好ましくは海馬由来である。
ニューロンを任意の慣用の培地中で培養して、本発明の培地を得ることができる。本発明の基礎培地として使用するのに好適な培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地を包含するが、これらに限定されない。
本発明において用いられる基礎培地には、細胞培養に一般的に用いられる他の添加物を添加することができる。
【００１１】
本発明では、ニューロンを基礎培地中、通常の方法で３ないし６日間、好ましくは５日間培養する。結果として得られる混合物を、幹細胞を培養するために直接用いることができる。
本発明では、幹細胞を本発明の培地中、通常の方法で、６ないし１２日間培養し、次いで成熟ニューロンを収穫する。好ましくは、ニューロンは培養の第９日目に収穫される。
培養されたニューロンを除去した後、本発明の培地を等分して、さらに使用するために貯蔵することができる。
【００１２】
次の分析は、本発明の方法により調製されるニューロンを特徴づけるために行われる。
ＮＦ免疫細胞化学
神経フィラメント（ＮＦ）はニューロンにおける主要な細胞骨格であり、これはニューロンの樹状突起の大きさ、外観および直径を調節する。後期発生段階のニューロンまたは成熟ニューロンのみがＮＦを発現する。ＮＦの免疫染色は後期のニューロンを認識するために利用される。
ＮｅｕＮ免疫細胞化学
ニューロン特異性核タンパク質（ＮｅｕＮ）は脊椎動物の中枢神経系においてニューロンの核中に存在する特定のタンパク質である。ＮｅｕＮはインビトロでＤＮＡと結合する。ＮｅｕＮはニューロンの発生中にＮＦよりも早期に出現することが知られている。従って、ＮｅｕＮの免疫染色は、変換の早期段階のニューロンを識別するために利用される。
【００１３】
ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティング
グルタメートは哺乳動物ＣＮＳにおける主な興奮性神経伝達物質である。ほとんどのニューロンは興奮シグナルを受容するためにグルタメートレセプターを有する。主に２種のグルタメートレセプターのグループ：イオノトロピータイプとメタボトロピータイプがある。イオノトロピータイプレセプターは、その異なる選択的作用物質により、さらに：ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）レセプター、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）レセプター、およびＫＡ（カイネート）レセプターに分類できる。ＫＡレセプターはサブユニットＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１およびＫＡ２から形成される。従って、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティングは機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
【００１４】
Ｃａ２＋結合タンパク質免疫細胞化学
Ｃａ２＋は細胞のシグナル変換経路において重要な役割を果たす。しかしながら、たいていのＣａ２＋は細胞において単独で作用せず、Ｃａ２＋結合タンパク質により結合されて作用する。Ｃａ２＋結合タンパク質は、細胞中のＣａ２＋の濃度を緩衝し、さらにＣａ２＋の活性を調節する。ＣＮＳ中には多くのＣａ２＋結合タンパク質が存在し、最も広い分布を有するものは、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）およびカルレチニンである。ＰＶおよびＣＢは両方ともＥＦハンドタイプのＣａ２＋結合タンパク質ファミリーに属する。胚の神経系の発生中、ＰＶおよびＣＢはニューロンにより特異的に発現されるＣａ２＋結合タンパク質と考えられる。従って、ＰＶおよびＣＢの免疫染色は、機能的タンパク質を合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
【００１５】
ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重標識
ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩）は細胞および核膜を自由に横切り、核中のＤＮＡと結合できる蛍光色素であり、通常、細胞の数を定量化するために用いられる。さらに、複製中、細胞は、染色体のさらなる組を合成することを必要とし、チミジンの類似体である添加されたＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）を合成された染色体中に組み入れる。従って、ＢｒｄＵ取り込みの観察は細胞の複製を確認するために利用される。ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重標識はニューロンの複製を確認できる。
【００１６】
ＢｒｄＵおよびＮＦ二重標識
前記のように、ＮＦの免疫染色はニューロンを確認するために利用され、ＢｒｄＵ標識は細胞の複製を確認するために利用される。ＮＦおよびＢｒｄＵ二重標識はニューロンの複製能力を確認できる。
ＧＡＤ免疫細胞化学
神経伝達物質の一つであるＧＡＢＡのグルタミン酸からの合成は、酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）により触媒される。従って、ＧＡＤの免疫染色は神経伝達物質ＧＡＢＡを合成するためのニューロンの能力を確認するために利用される。
本発明の方法から生成されるニューロンは、神経変成疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および筋萎縮性側策硬化症または発作および外傷から誘発されるニューロンの死の治療において用いることができる。
本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、この実施例は本発明の範囲に対する制限と見なすべきではない。
【実施例１】
【００１７】
ヒト臍間葉細胞の調製
分娩を取り扱う診療所、Tsai産科クリニック(72, Sec. 1, Shi Pai Rd., Beitou, Taipei)からヒト臍帯を入手した。無菌操作により臍帯を採取し、ＨＢＳＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌ２０１−１０）中４℃で２４時間以下保存した。
臍帯をまず衛生化のために３０秒間７５％エタノール中に浸漬した。衛生化された臍帯を、無菌層流中、無Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋緩衝液（ＣＭＦ、Ｇｉｂｃｏ１４１８５−０５２）中に入れ、オートクレーブ滅菌された道具で縦に切断し、これから血管および間葉組織（ホウォートンゼリー）を除去した。間葉組織をさいの目に切って約０．５ｃｍ３の立方体にし、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、適当な量の無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１２１００−０４６）を添加し、２５０ｘｇで５分間遠心分離にかけることにより沈殿（間葉組織）を２回洗浄した。間葉組織をコラゲナーゼで３７℃で１４〜１８時間処理し、洗浄し、次いで３７℃で３０分間撹拌下、２．５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ１５０９０−０４６）で処理した。ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３００７１．０３）を間葉組織に添加して、トリプシンの活性を失活させた。この時点で、間葉組織は間葉細胞になった。
間葉細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理して分散させ、計数した。間葉細胞はこれで培養に直接用いることができる。
【実施例２】
【００１８】
ニューロン−培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの調製
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの調製に用いられるニューロンを、７日令のスプラグ・ドーリーラット（the Animal Center of National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan, ROC）の脳から入手した。
２４ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを含有する５０ｍｌの遠心管を、その後の操作の前に３７℃のインキュベーター中に入れた。
ｉ．ｐ．注射により０．３ｍｌの１０％塩化物水和物をラットに投与した。３〜４分後、全身麻酔されたラットの全身を７５％エタノールで消毒した。無菌層流中、ラットの脳を除去し、ＣＭＦ中に入れた。脳を９００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。上清を除去し、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを沈殿（脳組織）に添加した。脳組織を１５回ピペットで移して単一細胞中に分散させた。細胞分散液を前記のようにして調製した５０ｍｌの遠心管に添加し、内部でＦＢＳ−ＤＭＥＭとよく混合した。混合物を２４ウェルプレートのポリ−Ｌ−リシンでコートされたウェル中に添加し、３７℃のインキュベーター中で培養した。次の日、Ａｒａｃを培養物に最終濃度２μＭまで添加した。
培養の第５日に培地を除去して、臍間葉細胞の培養に使用した。
【実施例３】
【００１９】
臍間葉細胞のニューロンへの変換
実施例１において得られた臍間葉細胞を、実施例２において調製されたニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中またはＦＢＳ−ＤＭＥＭ中（対照）、３７℃のインキュベーター中、で培養した。培養された細胞を第３日、６日、９日および１２日に採取した。
図１（Ａ）に示すように、ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間（対照）の臍間葉細胞培養物の形態は紡錘形を示し、増殖のために互いに密接に結合していた。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中６日間培養された臍間葉細胞は、細胞体退縮、プロセス加工、および細胞クラスターを含むニューロン表現型を示した（図１Ｂ）。
【実施例４】
【００２０】
分析
実施例３において採取した細胞を以下の分析に供して、その結果を以下に記載する：
（Ｉ）ＮＦ免疫染色
カバーガラス上で６日間成長する細胞を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ  ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
処置された細胞を次いで第一の抗体（ウサギ抗神経フィラメント２００ポリクローナルＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１９８２）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：１０００希釈、Ｓｉｇｍａ  ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いで３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ  ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
【００２１】
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２）下で観察した。
図２（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理後の様々な時間で、ＮＦを発現する臍間葉細胞の割合を測定した。図３に示すように、５９．４％の臍間葉細胞が処理後第３日にＮＦを発現し、ＮＦを発現する細胞の割合は処理後第６日に最大の８７．４％に達した。この割合は時間とともに増大も、減少もしなかった（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ、続いてＬＳＤ試験；ｐ＜０．０１）。
【００２２】
（ＩＩ）ＮｅｕＮ免疫染色：
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ  ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド）で２０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；次いでブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を第一の抗体（マウス抗ニューロン核モノクローナルＩｇＧ、１：１００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３７７）と４℃で少なくとも３６時間から４２時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ１２４Ｂ）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ  ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２）下で観察した。
図２（Ｂ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＮＦを発現し、このことは、これらがニューロンに変換されたことを示唆する。
【００２３】
（ＩＩＩ）ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２のウェスタンブロッティング
（ａ）細胞膜の調製
異なる時間、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理された臍間葉細胞および７日令ラットの脳から細胞膜を調製した。培養された細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で３分間２回洗浄した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を細胞に４℃で添加し、細胞を培養皿からスクレーパーで削りとった。削り取られた細胞を１５ｍｌテフロンガラスホモジナイザー中に入れ、２０回粉砕して均質化し、次いで３００００ｇで３０分間、４℃で遠心分離にかけた。ほとんど細胞膜である得られたペレットを再び粉砕し、適当な体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、後に使用するために−２０℃の冷蔵庫中に保存した。
（ｂ）タンパク質濃度の決定
ウェスタンブロッティング分析において使用するために、前記で得られた各サンプル中のタンパク質の濃度を、５９５ｎｍでの吸収を測定することにより決定した。タンパク質濃度の測定は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づいて行った（MM. Bradford, 1976, Analytical Biochemistry 72: 248-254.）。
【００２４】
（ｃ）電気泳動
サンプル中のタンパク質を２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲル中の分離されたタンパク質を次いでウェスタンブロッティング分析を行うためにＰＶＤＦ紙（ＮＥＷ、ＮＥＦ１００２）上に移した。
（ｄ）ウェスタンブロッティング
タンパク質を含有するＰＶＤＦ紙をＴＢＳ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０分間２回洗浄した。ＴＢＳ緩衝液中に溶解させた５％スキムミルク粉末を用いて６０分間ブロッキングを行った。次いで、ＰＶＤＦ紙をブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５％正常ヤギ血清および３％ＢＳＡ）中に６０分間浸漬し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、第一の抗体（ウサギ抗ＫＡ２ポリクローナルＩｇＧ、１：１８００希釈、ＵＰＳＴＡＴＥ０６−３１５；ヤギ抗ＧｌｕＲ５ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６１７；ヤギ抗ＧｌｕＲ６ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６１８：ヤギ抗ＧｌｕＲ７ポリクローナルＩｇＧ、１：３０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６２０；およびウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１０８）と４℃で１２〜１８時間反応させた。
【００２５】
反応が完了した後、ＰＶＤＦ紙をＴＴＢＳ（０．０５％ＴＢＳ中Ｔｗｅｅｎ−２０）で３０分間２回洗浄し、ブロッキング溶液中に６０分間浸漬し、次いで第二の抗体（ＧｌｕＲ５／６／７については、ビオチン−抗ヤギ／ヒツジＩｇＧ、１：２００希釈、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−３１４８；およびＫＡＲ２／ＧＡＤについてはビオチン−抗ウサギＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ１８７Ｂ）と室温で１時間反応させた。反応したＰＶＤＦ紙をＴＴＢＳで３０分間２回洗浄し、アビジン−ビオチニル化−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ、再びＴＴＢＳで３０分間２回洗浄し、最後にＤＡＢ（５ｍｇ  ＤＡＢ、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２、ｐＨ７．４）で発色させた。
図４に示されるように、カイニン酸レセプター（ｋａｉｎａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）サブユニットは、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭの処理前の臍間葉細胞において発現されなかった。ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭでの処理の６日目に、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２を包含するカイニン酸レセプターサブユニットは少量で発現され、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２は１２日目に著しく発現された。
【００２６】
（ＩＶ）パルブアルブミン（ＰＶ）およびカルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）免疫染色：
カバーガラス上で６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ  ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次いで第一の抗体（ヤギ抗パルブアルブミンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７４４９；およびヤギ抗カルビンジンポリクローナルＩｇＧ、１：４０希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６９１）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合マウス抗ヤギ／ヒツジモノクローナルＩｇＧ，１：２５０希釈、Ｓｉｇｍａ  Ｂ３１４８）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し、３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ  ＤＡＢ、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
【００２７】
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２）下で観察した。
図５に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で９日間培養された臍間葉細胞は、パルブアルブミン（図５Ａ）およびカルビンジン−Ｄ２８Ｋ（図５Ｂ）の両方を発現し、このことは２つのＣａ２＋結合タンパク質を合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。
【００２８】
（Ｖ）ＧＡＤ免疫染色およびウェスタンブロッティング：
カバーガラス上６日間成長する細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（０．１Ｍ  ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドおよび７．５％ピリン酸）で２０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、非特異性抗体−抗原結合を防止した。
処理された細胞を次に第一の抗体（ウサギ抗グルタメートデカルボキシラーゼポリクローナルＩｇＧ、１：１５００希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１０８）と４℃で少なくとも１２から１８時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（ビオチン−接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：３００希釈、Ｓｉｇｍａ  ｂ−８８９５）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；アビジン−ビオチニル化ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ  ＫＩＴ、Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ  ＰＫ−４０００）と室温で１時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；３，３’−ジアミノベンジジン（５ｍｇ  ＤＡＢ、１０μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中３．５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２）で発色させた。
【００２９】
得られたサンプルを、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％および１００％の濃度が段々に増加するエタノール、ならびにキシレンで脱水した（それぞれ５分間）。カバーガラスをスライド上にパーマウントで密封し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＨ−２）下で観察した。
図６（Ａ）に示すように、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中で６日間培養された臍間葉細胞はＧＡＤを発現し、このことは、これらが神経伝達物質ＧＡＢＡを合成できるニューロンに変換されたことを示唆する。図６（Ｂ）に示すように、臍間葉細胞のＧＡＤを発現する能力は、処理後６日目に誘発され、ＧＡＤ発現レベルは第１２日に著しく増大した。
（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の結果は、本発明の方法により誘導されるニューロンは機能的であり、ニューロンに特徴的なタンパク質および神経伝達物質を合成できることを証明する。
【００３０】
（ＶＩ）ＤＡＰＩ染色
処理後、細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液で２回、それぞれ５分間洗浄し、次いで５０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで３０分間染色した。細胞を次いでＴｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ＝７．３）でよく洗浄し、マウンティング培地（Ｔｒｉｓ：グリセロール＝１：１）で取り付け、蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、計数した。
図７（Ａ）は、細胞密度を示す顕微鏡写真である。処理後０、第３日、６日および９日の細胞数を測定するためにＤＡＰＩ標識（青）を行った。図７（Ｂ）はニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭ中での処理の様々な時間の後の臍間葉細胞の細胞密度を示す。様々な処理後の時点で、細胞密度における変化を測定するためにＤＡＰＩ染色を行った。結果は、処理後第９日の細胞密度は第３日よりも著しく高いことを示した（ｎ＝３、ワンウェイＡＮＯＶＡ続いてＬＳＤ試験；Ｐ＜０．０１）。
（ＶＩＩ）ＢｒｄＵおよびＤＡＰＩ二重染色
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
【００３１】
処理された細胞を次いで第一の抗体（マウス抗ＢｒｄＵモノクローナルＩｇＧ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３２２２、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中０．６６ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭβ−メルカプトエタノールで１：１００希釈）と４℃で少なくとも３６〜４２時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（フルオレセイン接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ１２４Ｆ）および１ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ９５４２）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄した。カバーガラスをスライド上にマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｈ−１０００）で取り付け、マニキュア液で密封し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０）下で観察した。単位面積内の合計細胞数およびＢｒｄＵ標識された細胞数を計数する。
【００３２】
（ＶＩＩＩ）ＢｒｄＵおよびＮＦ二重染色
カバーガラス上で成長する細胞により、最終濃度５０μＭのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５００２、５０ｍＭストック溶液として調製）が得られ、２４時間さらに成長させた。細胞を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５分間２回洗浄し；定着液（５０ｍＭグリシン緩衝液中７０％エタノール、ｐＨ２．０）で−２０℃で３０分間固定し；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；ブロッキング溶液（０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％正常ヤギ血清および３％ウシ血清アルブミン）で３０分間処理して、特異性抗体−抗原結合を防止した。
【００３３】
処理された細胞を次いで第一の抗体（マウス抗ＢｒｄＵモノクローナルＩｇＧ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３２２２、６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中０．６６ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭβ−メルカプトエタノールで１：１００希釈）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；もう一つの第一の抗体（ウサギ抗神経フィラメントポリクローナルＩｇＧ、１：２５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１９８２）と４℃で少なくとも１２〜１８時間反応させ；０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄し；第二の抗体（フルオレセイン接合ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ１２４Ｆ；およびローダミン接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ、１：５０希釈、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ１３２Ｒ）と室温で１時間反応させ；再び０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間３回洗浄した。カバーガラスをスライド上にマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｈ−１０００）で取り付け、マニキュア液で密封し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０）下で観察した。
【００３４】
図８は、ニューロン培養１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで３日間処理された臍間葉細胞の増殖分析の結果を示す（Ａ〜Ｆ）。ＤＡＰＩで標識された細胞のほとんど（Ａにおいて青色）はＢｒｄＵ陽性であった（Ｂにおいて緑色）。（Ｃ）は（Ｃ）と（Ｄ）の結果を合わせたものである。処理後第３日に、これらの細胞は、ＮＦを発現する細胞（Ｄにおいて赤色）にすでに分化しているが、依然としてＢｒｄＵで標識された（Ｅにおいて緑色）。（Ｆ）は（Ｄ）と（Ｅ）の結果を合わせたものである。ニューロン培養１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで処理した後第９日の細胞はその増殖能力を失った（Ｇ〜Ｌ）。ＤＡＰＩで標識された細胞はすべて（Ｇにおいて青色）ＢｒｄＵ陰性であった（Ｈにおいて緑色）。（Ｉ）は（Ｇ）と（Ｈ）の結果を合わせたものである。処理後第９日に、ＮＦを発現する細胞（Ｊにおいて赤色）に分化したこれらの細胞は、ほとんどＢｒｄＵで標識されなかった（Ｋにおいて緑色）。（Ｌ）は（Ｊ）および（Ｋ）の結果を合わせたものである。要約すると、細胞のほとんどはニューロンに変換され、第９日に増殖を停止し、このことは第９日のニューロンは有糸核分裂後の段階に入ったことを示唆する。
（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）の結果は、ニューロン培養ＦＢＳ−ＤＭＥＭと共に培養された臍間葉細胞は増殖し、分化して、ニューロンになることができることを示す。
【００３５】
前記載事項から、当業者らは、本発明の本質的特徴を容易に理解することができ、その精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々に変更および修飾し、様々な用途および条件に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】（Ａ）ＦＢＳ−ＤＭＥＭ（対照）および（Ｂ）ニューロン培養培地において６日間培養した臍間葉細胞の形態を示す。
【図２】ニューロン培養培地において６日間培養した臍間葉細胞の（Ａ）ＮＦおよび（Ｂ）ＮｅｕＮ免疫染色を示す。
【図３】ニューロン培養培地での処理後様々な時間における、ＮＦを発現する臍間葉細胞の割合を示す。
【図４】ニューロン培養培地中にて培養した臍間葉細胞の、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７およびＫＡ２についてのウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図５】ニューロン培養培地中で９日間培養した臍間葉細胞の（Ａ）パルブアルブミン（ＰＶ）および（Ｂ）カルビンジン−Ｄ２８Ｋ（ＣＢ）についての免疫染色を示す。
【図６】ニューロン培養培地において６日間培養された臍間葉細胞のＧＡＤについての（Ａ）免疫染色および（Ｂ）ウェスタンブロッティングを示す。
【図７】図７（Ａ）は、処理後０、３、６、および９日にニューロン培養培地により誘発された臍間葉細胞の変更された細胞密度を示し（スケールバー：１００μｍ）；図７（Ｂ）は、ＤＡＰＩ染色を用いて、ニューロン培養培地で処理された臍間葉細胞の定量的細胞密度を示す。
【図８】ニューロン培養培地中で３日（３Ｄ）および９日（９Ｄ）間培養された臍間葉細胞のＤＡＰＩ＋ＢｒｄＵ二重染色およびＮＦ＋ＢｒｄＵ二重染色を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
METHOD OF GENERATING NEURONS FROM STEM CELLS AND MEDIUM FOR CULTURING STEM CELLS
Field of the Invention
The present invention relates to a method of generating neurons from stem cells and a medium for culturing stem cells.
Background of the Invention
Many clinically common chronic neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis, are resulted from the degeneration and death of neurons in the central nervous system (CNS). Neurons, unlike epithelial and liver cells, cannot regenerate quickly.  Although there are indeed stem cells present in the CNS, which can replicate and differentiate either under normal conditions or when neurons are damaged, their replication is quite slow and the proportion of neuronal differentiation is very low.  Most of the stem cells in the CNS differentiate into glial cells and thus cannot rescue the neurodegenerative diseases.
Neuron transplantation has provided a direction for treating neurodegenerative diseases.  Researchers have been trying to generate neurons from various stem cells both in vitro and in vivo.  Stem cells are believed to possess certain characteristics, including self-renewal, pluripotency, proliferation, longevity and differentiation.  Fetuses, umbilical cord blood and bone marrow are the most common sources of human stem cells for clinical applications.  In fetuses, stem cells applicable in treating pathological changes of the central nervous system were mainly embryonic stem cells of blastocyst and neural stem cells (R.L. Rietze et al., 2001, Nature 412: 736-739).  Researches have shown that after transplantation of embryonic stem cells (J.W. McDonald et al., 1999, Nature Medicine 5: 1410-1412) or neural stem cells (Q.L. Cao et al., 2001, Experimental Neurology 167: 48-58) for repairing a spinal trauma, these cells mainly differentiated into astrocytes and oligodendrocytes and only extremely few cells turned into neuronal cells.  Apart from the difficulty in retrieving, the low survival rate after transplantation, and the extremely low rate for turning into neural cells, transplantation of fetus tissues is also hindered by disputes in the aspects of religion, law and ethic and therefore is not available to all.
The repair of damaged neural cells by direct implantation of haematopoietic stem cells of umbilical cord blood has yet to be studied.  However, in vitro model showed that haematopoietic stem cells of umbilical cord blood cultured in 0.001% of β-mercaptoethanol (BME) could be transformed into precursors of neural cells, and then 10% of these cells could be further induced to differentiate into neural cells and glial cells (J. R. Sanchez-Ramos et al., 2001, Experimental Neurology 171: 109-115; and Y. Ha et al., 2001, Neuroreport 12(16): 3523-3527).  Since the conversion rate of umbilical cord blood stem cells into neuronal cells was relatively low, the research and application of umbilical cord blood mainly focused on haematological diseases.
Bone marrow contains hematopoietic stem cells that provide a continuous source for progenitors of red cells, platelets, monocytes, granulocytes, and lymphocytes. Moreover, bone marrow also contains cells that meet the criteria for stem cells of nonhematopoietic tissues.  Hematopoietic stem cells from adult bone marrow have been reported to be able to differentiate into both microglia and macroglia in the brains of mice (M. A. Eglitis et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4080-4085).  Nonhematopoietic stem cells from bone marrow stroma have been referred to as bone marrow stromal cells (BMSCs) or bone marrow mesenchymal cells.  BMSCs are capable of differentiating into osteogenic, chondrogenic, adipogenic, myogenic and other lineages in vitro (M.F. Pittenger et al., 1999, Science 284: 143-147 and B. E. Petersen et al., 1999, Science 284: 1168- 1170).  Recently, BMSCs (S. A. Azizi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3908-3913; and G. C. Kopen et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 10711-10716) have been reported to be able to differentiate into neurons in vivo.
All the above methods of generating neurons from multipotent cells have one common problem: most of the multipotent stem cells differentiate into glial cells (astrocytes, oligodendrocytes etc.) instead of neurons.  Only for in vitro culture of BMSCs, it has been observed that BME has a significant effect on neuronal differentiation, which induces about 80% of the cultured BMSCs to differentiate into neurons (D. Woodbury et al., 2000, Journal of Neuroscience Research 61: 364-370).  However, BME is toxic for proteins and thus unsuitable for use in human bodies (K. White et al., 1973, Journal of Pharmaceutical Sciences 62: 237-241).  Therefore, there is still a need for an efficient method to transform stem cells into neurons.
Summary of the Invention
The present invention provides a method of generating neurons from stem cells which comprises culturing neurons in a medium and culturing the stem cells in the resultant mixture.
The present invention also provides a medium for culturing stem cells which is prepared by culturing neurons in a base culture medium.
Brief Description of the Drawings
Figure 1 shows the morphology of umbilical mesenchymal cells cultured for 6 days in (A) FBS-DMEM (Control) and (B) neuron-cultured medium.
Figure 2 shows (A) NF and (B) NeuN immunostaining of umbilical mesenchymal cells cultured in neuron-cultured medium for 6 days.
Figure 3 shows the ratios of umbilical mesenchymal cells expressing NF after various times of treatment with neuron-cultured medium.
Figure 4 shows the results of western blotting for GluR5, GluR6, GluR7 and KA2 of umbilical mesenchymal cells cultured in neuron-cultured medium.
Figure 5 shows immunostaining for (A) parvalbumin (PV) and (B) calbindin-D28K (CB) of umbilical mesenchymal cells cultured in neuron-cultured medium for 9 days.
Figure 6 shows (A) immunostaining and (B) western blotting for GAD of umbilical mesenchymal cells cultured in neuron-cultured medium for 6 days.
Figure 7 (A) shows the altered cell density of umbilical mesenchymal cells induced by neuron-cultured medium on the 0, 3rd, 6th and 9th day post-treatment (Scale bar: 100 μm); and
(B) shows quantitative cell density of umbilical mesenchymal cells treated with neuron-cultured medium using DAPI staining. 
Figure 8 shows DAPI+BrdU double staining and NF+BrdU double staining for umbilical mesenchymal cells cultured in neuron-cultured medium for 3 days (3D) and 9 days (9D).
Detailed Description of the Invention
It is surprisingly found that stem cells cultured with a medium prepared by culturing neurons in a basic culture medium for 6-9 days can differentiate into a high proportion (87%) of functional postmitotic neurons.
Not wishing to be bound by theory, it is believed that a composition of matters is released by the cultured neurons, which provides the optimal condition for stem cells to differentiate into neurons.
When used herein, the term "stem cells" refers to any undifferentiated, pluripotent or multipotent mammalian cells including, but not limited to, embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic carcinoma (EC) cells, bone marrow stromal cells, bone marrow hematopoietic cells, umbilical cord blood cells and umbilical mesenchymal cells.  All of the above stem cells have been reported to be able to differentiate into neurons and/or glial cells, except for umbilical mesenchymal cells.  However, through the culturing method of the present invention, even umbilical mesenchymal cells can differentiate into a high proportion of functional neurons.  
Accordingly, any mammalian stem cells are suitable for use in the method of the invention.  Preferably, mesenchymal cells such as BMSC or umbilical mesenchymal cells are used.
The neurons used to prepare the medium of the present invention can be derived from both the peripheral nervous system and the central nervous system (CNS) of mammals. Preferably, neurons are derived form the CNS, more preferably from the brain, and most preferably from the hippocampus.
The neurons can be cultured in any conventional culture medium to obtain the medium of the invention.  Culture media suitable for use as the base medium according to the present invention include, but are not limited to, Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with fetal bovine serum (FBS-DMEM).
It should be acknowledged that the base medium used in the present invention may be supplemented with other additives commonly used for cell culture.
According to the present invention, neurons are cultured in the base medium in a conventional way for 3 to 6 days, preferably 5 days.  The resultant mixture can be directly used for culturing stem cells.  
According to the invention, stem cells are cultured in the medium of the invention in a conventional way for 6 to 12 days before the mature neurons are harvested.  Preferably, neurons are harvested on the ninth day of culturing.
After the cultured neurons have been removed, the medium of the invention can be divided into aliquots and stored for further use.
The following assays are conducted to characterize the neurons produced by the method of the present invention.
NF Immunocytochemistry
Neurofilament (NF) is the major cytoskeleton in neurons, which is responsible for adjusting the size, appearance and diameter of dendrites of neurons.  Only neurons at the late developmental stage or mature neurons express NF.  Immunostaining for NF is utilized to recognize neurons at the late stage.
NeuN Immunocytochemistry
Neuron-specific nuclear protein (NeuN) is a specific protein existing in the nucleus of neurons in the central nervous system of vertebrates.  NeuN binds to DNA in vitro.  It is known that NeuN appears earlier than NF during the development of neurons.  Therefore, immunostaining for NeuN is utilized to identify neurons at the early stage of transformation.
Western Blotting for GluR5, GluR6, GluR7 and KA2
Glutamate is the major excitatory neurotransmitter in the mammalian CNS.  Most neurons have glutamate receptors to receive excitatory signals.  There are mainly two groups of glutamate receptors: the ionotropic type and metabotropic type.  Ionotropic type receptors can be further divided by their different selective agonists into: NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptors, AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid) receptors, and KA (kainate) receptors.  KA receptors are formed by subunits GluR5, GluR6, GluR7, KA1 and KA2.  Therefore, western blotting for GluR5, GluR6, GluR7 and KA2 is utilized to confirm the ability of neurons to synthesize functional proteins.
Ca2+-binding Protein Immunocytochemistry
Ca2+ plays an important role in the signal transduction pathway of cells.  However, most Ca2+s do not act alone in the cell, but are bound by Ca2+-binding proteins.  Ca2+-binding proteins can buffer the concentration of Ca2+ in the cell and further regulate the activities of Ca2+.  There are many Ca2+-binding proteins present in the CNS, and those with the widest distribution are parvalbumin (PV), calbindin-D28K (CB) and calretinin.  Both PV and CB belong to the EF-hand type Ca2+-binding protein family.  During the development of the nervous system of embryo, PV and CB are considered as the Ca2+-binding proteins specifically expressed by neurons. Therefore, immunostaining for PV and CB is utilized to confirm the ability of neurons to synthesize functional proteins.
BrdU and DAPI Double Labeling
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) is a fluorescent dye able to cross freely through the cell and nuclear membranes and bind to the DNAs in the nucleus, and is usually used to quantify the number of cells.  Moreover, during replication, cells need to synthesize an additional set of chromosomes, and will incorporate the added BrdU (bromodeoxyuridine), which is an analog of thymidine, into the synthesized chromosomes. Thus, the observation of BrdU incorporation is utilized to confirm the replication of cells. BrdU and DAPI double labeling can confirm the replication of neurons.
BrdU and NF Double Labeling
As described above, Immunostaining for NF is utilized to confirm the identity of neurons, and BrdU labeling is utilized to confirm the replication of cells.  NF and BrdU double labeling can identify the replication ability of neurons.
GAD Immunocytochemistry
The synthesis of GABA, one of the neurotransmitters, from glutamic acid is catalyzed by the enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD).  Therefore, immunostaining for GAD is utilized to confirm the ability of neurons to synthesize the neurotransmitter GABA.
The neurons generated from the method of the present invention can be used in the treatment of neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, and amyotrophic lateral sclerosis or neuronal death induced from stroke and trauma.
The present invention is further illustrated by the following examples, which should not be taken as limitations to the scope of the present invention.
Example 1  Preparation of Human Umbilical Mesenchymal Cells
Human umbilical cords were obtained from a clinic with child delivery service, Tsai's Obstetrical Clinic (72, Sec. 1, Shi Pai Rd., Beitou, Taipei).  The umbilical cords were collected by aseptic manipulation and stored in HBSS (Biochrom L201-10) under 4℃ for no more than 24 hours.
The umbilical cord was first soaked in 75% ethanol for 30 seconds for sanitization.  The sanitized umbilical cord was placed in Ca2+/Mg2+ free buffer (CMF, Gibco 14185-052) in a germ-free laminar flow, cut lengthwise with an autoclaved tool, and from which the blood vessels and mesenchymal tissue (Wharton's jelly) were removed.  The mesenchymal tissue was diced into cubes of about 0.5 cm3 and centrifuged at 250 xg for 5 minutes.  The supernatant was removed, and the precipitate (mesenchymal tissue) was washed twice by adding a proper amount of serum-free DMEM (Gibco 12100-046) and centrifuging at 250x g for 5 minutes. The mesenchymal tissue was treated with Collagase at 37℃ for 14 to 18 hours, washed, and then treated with 2.5% trypsin (Gibco 15090-046) under agitation at 37℃ for 30 minutes.  FBS (Hyclone SH30071.03) was added to the mesenchymal tissue to quench the activity of trypsin.  At this time, the mesenchymal tissue has become mesenchymal cells.
The mesenchymal cells were treated with 10% FBS-DMEM to be dispersed and counted.  The mesenchymal cells can now be directly used for culturing.
Example 2  Preparation of Neuron-Cultured FBS-DMEM
The neurons used for preparing the neuron-cultured FBS-DMEM were obtained from the brain of Sprague-Dawley rats aged 7 days (the Animal Center of National Yang-Ming University, Taipei, Taiwan, ROC).
A 50-ml centrifugation tube containing 24 ml 10% FBS-DMEM was placed in a 37℃ incubator before the subsequent operation.
The rat was given 0.3 ml 10% chloride hydrate by i.p. injection.  After 3 to 4 minutes, the whole body of the totally anesthetized rat was sanitized with 75% ethanol.  In a germ-free laminar flow, the brain of the rat was removed and placed in CMF.  The brain was centrifuged at 900 rpm for 5 minutes.  The supernatant was removed, and 10% FBS-DMEM was added to the precipitate (brain tissue).  The brain tissue was pipetted 15 times to be dispersed into single cells.  The cell dispersion was added to the 50-ml centrifugation tube prepared above, and mixed thoroughly with the FBS-DMEM inside.  The mixture was added into the poly-L-lysine coated wells of a 24-well plate and cultured in the 37℃ incubator.  On the next day, Arac was added to the culture to a final concentration of 2 μM.
On the fifth day of culturing, the culture medium was removed to be used for culturing umbilical mesenchymal cells.
Example 3  Transformation of Umbilical Mesenchymal Cells into Neurons
Umbilical mesenchymal cells obtained in Example 1 were cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM prepared in Example 2 or in FBS-DMEM (Control) in a 37℃ incubator.  Cultured cells were collected on the 3rd, 6th, 9th and 12th days.  
As shown in Fig. 1(A), the morphology of umbilical mesenchymal cells culture in FBS-DMEM for 6 days (control) presented a spindle morphology and were closely attached to each other due to proliferation. Umbilical mesenchymal cells cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM for 6 days exhibited neuronal phenotype, including cell body retraction, process elaboration, and cell cluster (Fig. 1B). 
Example 4  Assays
The cells collected in Example 3 were subjected to the following assays and their results are described below:
(I)            NF Immunostaining:
Cells growing on the cover glass for 6 days were washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS) for 20 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and then treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with primary antibodies (rabbit anti-neurofilament 200 polyclonal IgG, 1:250 diluted, Chemicon AB1982) at 4℃ for at least 12 to 18 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Biotin-conjugated goat anti-rabbit-IgG, 1:1000 diluted, Sigma b-8895) at room temperature for 1 hour; washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 hour; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and then developed with 3,3'-diaminobenzidine (5 mg DAB, 3.5 μl 30% H2O2 in 10 ml 50 mM Tris Buffer).  
The obtained sample was dehydrated with ethanol of progressively increasing concentrations of 50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%, as well as xylene, each for 5 minutes. The cover glass was sealed onto a slide with permount, and observed under an optical microscope (Olympus BH-2).
As shown in Fig. 2(A), umbilical mesenchymal cells cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM for 6 days expressed NF, suggesting that they have been transformed into neurons.
The ratio of umbilical mesenchymal cells expressing NF after various times of treatment with neuron-cultured FBS-DMEM was determined. As shown in Fig. 3, 59.4% of the umbilical mesenchymal cells expressed NF on the 3rd day post treatment, and the ratio of cells expressing NF reached maximum, 87.4%, on the 6th day post treatment.  This ratio neither increased nor decreased along with the elongation of time (n=3, one way ANOVA followed by LSD test; P<0.01).
(II)          NeuN Immunostaining:
Cells growing on the cover glass for 6 days were washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS) for 20 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and then treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with primary antibodies (mouse anti-neuronal nuclei monoclonal IgG, 1:100 diluted, Chemicon MAB377) at 4℃ for at least 36 to 42 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG, 1:250 diluted, Chemicon AP124B) at room temperature for 1 hour; washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 hour; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and developed with 3,3'-diaminobenzidine (5 mg DAB, 3.5 μl 30% H2O2 in 10 ml 50 mM Tris Buffer).  
The obtained sample was dehydrated with ethanol of progressively increasing concentrations of 50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%, as well as xylene, each for 5 minutes. The cover glass was sealed onto a slide with permount, and observed under an optical microscope (Olympus BH-2).
As shown in Fig. 2(B), umbilical mesenchymal cells cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM for 6 days expressed NeuN, suggesting that they have been transformed into neurons. 
(III)        Western Blotting for GluR5, GluR6, GluR7 and KA2:
(a) Preparation of Cell Membrane
Cell Membrane was prepared from umbilical mesenchymal cells treated with neuron-cultured FBS-DMEM for different times and the brain of a 7-day aged rat.  Cultured cells were washed with 0.1 M phosphate buffer for 3 minutes twice.  Tris-HCl buffer (50mM, pH 7.4) was added to the cells at 4℃, and the cells were scraped off from the culture plate with a scraper.  The scraped cells were put in a 15 ml Teflon-glass homogenizer, grinded twenty times to behomogenized, and then centrifuged at 30,000 g for 30 minutes at 4℃.  The obtained pellet, which was mostly cell membrane, was grinded again and dissolved in a suitable volume of Tris-HCl buffer, and stored in a -20℃ refrigerator for later use.
(b) Determination of Protein Concentration
In order to be used in the western blotting assay, the concentration of proteins in each sample obtained above was determined by measuring the absorption at 595 nm.  The measurement of protein concentration was conducted based on the Bradford method (MM. Bradford, 1976, Analytical Biochemistry 72: 248-254.).
(c) Electrophoresis
The proteins in the samples were separated by 20% SDS-PAGE.  The separated proteins in the gel were then transferred onto a PVDF paper (NEW, NEF1002) for conducting the western blotting assay.
(d) Western Blotting
The PVDF paper containing the proteins was washed with TBS solution (0.9% NaCl in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) for 30 minutes twice.  Blocking was conducted with 5% skimmed milk powder dissolved in TBS buffer for 60 minutes.  Then the PVDF paper was immersed in the blocking solution (0.05% Triton-X 100, 5% normal goat serum and 3% BSA) for 60 minutes, washed with TBS buffer, and reacted with primary antibodies (rabbit anti-KA2 polyclonal IgG, 1:1800 diluted, UPSTATE 06-315; goat anti-GluR5 polyclonal IgG, 1:30 diluted, Santa Cruz sc-7617; goat anti-GluR6 polyclonal IgG, 1:30 diluted, Santa Cruz sc-7618; goat anti-GluR7 polyclonal IgG, 1:30 diluted, Santa Cruz sc-7620; and rabbit anti-glutamate decarboxylase polyclonal IgG, 1:1500 diluted, Chemicon AB108) at 4℃ for 12 to 18 hours.
After the reaction was completed, the PVDF paper was washed with TTBS (0.05% Tween-20 in TBS) for 30 minutes twice, immersed in the blocking solution for 60 minutes, and then reacted with secondary antibodies (Biotin-anti-goat/sheep IgG for GluR5/6/7, 1:200 diluted, Sigma B-3148; and Biotin-anti-rabbit IgG for KAR2/GAD, 1:250 diluted, Chemicon AP187B) at room temperature for 1 hour.  The reacted PVDF paper was washed with TTBS for 30 minutes twice, reacted with avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 hour, washed again with TTBS for 30 minutes twice, and finally developed with DAB (5 mg DAB, 3.5 μl 30% H2O2 in 10 ml Tris-HCl, pH7.4).
As shown in Fig. 4, kainate receptor subunits were not expressed in umbilical mesenchymal cells before the treatment of neuron-cultured FBS-DMEM. On the 6th day of treatment with neuron-cultured FBS-DMEM, kainate receptor subunits, including GluR6, GluR7 and KA2, were expressed at a small quantity and GluR5, GluR6, GluR7 and KA2 were expressed significantly on the 12th day.
(IV)          Parvalbumin (PV) and Calbindin-D28K (CB) Immunostaining:
Cells growing on the cover glass for 6 days were washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (2% paraformaldehyde and 7.5% piric acid in 0.1 M PBS) for 20 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with primary antibodies (goat anti-parvalbumin polyclonal IgG, 1:40 diluted, Santa Cruz sc-7449; and goat anti-calbindin polyclonal IgG, 1:40 diluted, Santa Cruz sc-7691) at 4℃ for at least 12 to 18 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Biotin-conjugated mouse anti-goat/sheep monoclonal IgG, 1:250 diluted, Sigma B3148) at room temperature for 1 hour; washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 hour; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and developed with 3,3'-diaminobenzidine (5 mg DAB, 3.5 μl 30% H2O2 in 10 ml 50 mM Tris Buffer).  
The obtained sample was dehydrated with ethanol of progressively increasing concentrations of 50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%, as well as xylene, each for 5 minutes.  The cover glass was sealed onto a slide with permount, and observed under an optical microscope (Olympus BH-2).
As shown in Fig. 5, umbilical mesenchymal cells cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM for 9 days expressed both parvalbumin (Fig. 5A) and calbindin-D28K (Fig. 5B), suggesting that they have been transformed into neurons capable of synthesizing the two Ca2+-binding proteins.
(V)            GAD Immunostaining and western blotting:
Cells growing on the cover glass for 6 days were washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (2% paraformaldehyde and 7.5% piric acid in 0.1 M PBS) for 20 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with primary antibodies (rabbit anti-glutamate decarboxylase polyclonal IgG, 1:1500 diluted, Chemicon AB108) at 4℃ for at least 12 to 18 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Biotin-conjugated goat anti-rabbit-IgG, 1:300 diluted, Sigma b-8895) at room temperature for 1 hour; washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with avidin-biotinylated-horseradish peroxidase complex (ABC KIT, Vectorlabs PK-4000) at room temperature for 1 hour; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and developed with 3,3'-diaminobenzidine (5 mg DAB, 3.5 μl 30% H2O2 in 10 ml 50 mM Tris Buffer).  
The obtained sample was dehydrated with ethanol of progressively increasing concentrations of 50%, 70%, 80%, 90%, 95% and 100%, as well as xylene, each for 5 minutes.  The cover glass was sealed onto a slide with permount, and observed under an optical microscope (Olympus BH-2).
As shown in Fig. 6(A), umbilical mesenchymal cells cultured in the neuron-cultured FBS-DMEM for 6 days expressed GAD, suggesting that they have been transformed into neurons capable of synthesizing the neurotransmitter GABA.  As shown in Fig. 6(B), the capability of umbilical mesenchymal cells to express GAD was induced on the 6th day post-treatment and the GAD expression level was significantly increased on the 12th day.
The results in (III), (IV) and (V) prove that the neurons derived by the method of the present invention are functional and capable of synthesizing neuron-characteristic proteins and neurotransmitters.
(VI) DAPI staining 
After treatment, the cells were washed twice with 0.1M phosphate buffer for 5 minutes each and then stained with 50 μg/ml DAPI for 30 minutes. The cells were then washed thoroughly with Tris buffer (Tris-HCl 50 mM pH=7.3) and mounted with mounting medium (Tris:glycerol = 1:1) to observe and count cells under fluorescence microscope.
Fig. 7(A) shows photomicrographs showing the cell density. DAPI labeling (blue) was performed to determine the cell number on the 0, 3rd, 6th and 9th day post-treatment.  Fig. 7(B) shows the cell density of umbilical mesenchymal cells after various periods of treatment in neuron-cultured FBS-DMEM.  At various post treatment time points, DAPI staining was performed to determine the alternation in the cell density.  The results indicated that the cell density on the 9th day post-treatment was significantly higher than that on the 3rd day (n=3, one way ANOVA followed by LSD test; P<0.01).
(VII)        BrdU and DAPI Double Staining:
Cells growing on the cover glass were given BrdU (Sigma B-5002, prepared as a 50 mM stock solution) of a final concentration of 50 μM and allowed to grow for 24 more hours.  The cells were washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (70% ethanol in 50 mM glycine buffer, pH 2.0) at 20℃ for 30 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with primary antibodies (mouse anti-BrdU monoclonal IgG, Chemicon MAB3222, 1:100 diluted with 0.66 mM CaCl2 and 1 mM β-mercaptoethanol in 66 mM Tris buffer) at 4℃ for at least 36 to 42 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Fluorescein-conjugated goat anti-mouse-IgG, 1:50 diluted, Chemicon AP124F) and 1 mg/ml DAPI (Sigma D9542) at room temperature for 1 hour; and washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times.  The cover glass was attached onto a slide with mounting medium (Vector H-1000), sealed with nail-enamel and observed under a fluorescence microscope (Olympus BX50).  The total cell number and BrdU-labeled cell number within unit area were counted.
(VIII)        BrdU and NF Double Staining:
Cells growing on the cover glass were given BrdU (Sigma B-5002, prepared as a 50 mM stock solution) of a final concentration of 50 μM and allowed to grow for 24 more hours.  The cells washed with 0.1 M phosphate buffer (0.1 M PBS, pH 7.4) for 5 minutes twice; fixed with the fixing solution (70% ethanol in 50 mM glycine buffer, pH 2.0) at 20℃ for 30 minutes; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; and treated with the blocking solution (0.05% Triton X-100, 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin) for 30 minutes to prevent non-specific antibody-antigen binding.  
The treated cells were then reacted with a primary antibody (mouse anti-BrdU monoclonal IgG, Chemicon MAB3222, 1:100 diluted with 0.66 mM CaCl2 and 1 mM β-mercaptoethanol in 66 mM Tris buffer) at 4℃ for at least 12 to 18 hours; reacted with another primary antibody (rabbit anti-neurofilament polyclonal IgG, 1:250 diluted, Chemicon AB1982) at 4℃ for at least 12 to 18 hours; washed with 0.1 M PBS for 5 minutes three times; reacted with secondary antibodies (Fluorescein-conjugated goat anti-mouse-IgG, 1:50 diluted, Chemicon AP124F; and Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit-IgG, 1:50 diluted, Chemicon AP132R) at room temperature for 1 hour; and washed again with 0.1 M PBS for 5 minutes three times.  The cover glass was attached onto a slide with mounting medium (Vector H-1000), sealed with nail-enamel and observed under a fluorescence microscope (Olympus BX50). 
Fig 8 shows the results of the proliferation assay of umbilical mesenchymal cells treated with neuron-cultured 10%FBS-DMEM for 3 days (A-F).  The majority of the cells labeled with DAPI (blue in A) were BrdU-positive (green in B).  (C) is the merged result of (C) and (D).  On the 3rd day post treatment, these cells, although have already differentiated into cells expressing NF (red in D), were still labeled with BrdU (green in E).  (F) is the merged result of (D) and (E).  The cells on the 9th day post treatment with neuron-cultured 10%FBS-DMEM lost their proliferation capability (G-L).  All the cells labeled with DAPI (blue in G) were BrdU-negative (green in H).  (I) is the merged result of (G) and (H).  On the 9th day post-treatment, these cells, which have differentiated into cells expressing NF (red in J), were almost not labeled with BrdU (green in K).  (L) is the merged result of (J) and (K).  In summary, most of the cells have been transformed into neurons and stopped proliferating on the 9th day, suggesting that the neurons on the 9th day have entered the postmitotic stage. 
The results in (VII) and (VIII) demonstrate that the umbilical mesenchymal cells cultured with the neuron-cultured FBS-DMEM can proliferate and differentiate into neurons.  
From the above descriptions, persons skilled in the art can easily acknowledge the essential characteristics of the present invention and, without departing from the spirit and scope thereof, can make various changes and modifications of the invention to adapt it to various usages and conditions.
CLAIMS:
1.  A method of generating neurons from stem cells which comprises culturing neurons in a culture medium and culturing the stem cells in the resultant mixture.
2.  The method of Claim 1, wherein the neurons are obtained from the brain.
3.  The method of Claim 2, wherein the neurons are obtained from the hippocampus.
4.  The method of Claim 1, wherein the neurons are cultured in the medium for 3 to 6 days before the stem cells are added.
5.  The method of Claim 4, wherein the neurons are cultured for 5 days.
6.  The method of Claim 1, wherein the stem cells are selected from the group consisting of embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, embryonic carcinoma (EC) cells, bone marrow stromal cells (BMSC), bone marrow hematopoietic cells, umbilical cord blood cells and umbilical mesenchymal cells.
7.  The method of Claim 6, wherein the stem cells are bone marrow stromal cells (BMSC) or umbilical mesenchymal cells.
8.  The method of Claim 1, wherein the medium used for culturing neurons is FBS-DMEM.
9.  The method of Claim 1, wherein the stem cells are cultured in the mixture for 6 to 12 days.
10. The method of Claim 1, further comprising the step of collecting neurons from the stem cell cultured mixture. 
11. The method of Clam 10, wherein the neurons are collected during the period of 6th to 12th days of culturing.
12. The method of Clam 10, wherein the neurons are collected during the period of 6th to 9th days of culturing.
13. A medium for culturing stem cells, which is prepared by culturing neurons in a base culture medium.
14. The medium of Claim 13 wherein the base medium is FBS-DMEM.
15. The medium of Claim 13, wherein the neurons have been removed from the base culture medium.
16. The medium of Claim 13, wherein the neurons are obtained from the brain.
17. The medium of Claim 16, wherein the neurons are obtained from the hippocampus.
18. The medium of Claim 13, wherein the neurons are cultured in the base culture medium for 3 to 6 days.
19. The medium of Claim 18, wherein the neurons are cultured in the base culture medium for 5 days.
【要約】
ABSTRACT:
The present invention relates to a method of generating neurons from stem cells which comprises culturing neurons in a medium and culturing the stem cells in the resultant mixture. The present invention also relates to a medium for culturing stem cells prepared by culturing neurons in a base culture medium.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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