(57)【要約】【課題】  GMP-140に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体を提供すること。【解決手段】  GMP-140に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体であって、この糖タンパク質リガンドは、シアリルLex部分を含むフコシル化シアリル化糖タンパク質を含み、そして還元条件下でのSDS-PAGEでの評価により約120,000の見かけの相対分子量を有する。この抗体は、GMP-140に対する糖タンパク質リガンドへのGMP-140の結合を特異的にブロックするのに有効であるもの。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、GMP-140、ELAM-1およびリンパ球ホーミングレセプタ
ーを含むセレクチン類(Selectins)との結合反応をともなう炎症反応の治療法
と予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は米国国立心臓、肺臓および血液研究所(National Heart, Lung and
BloodInstitute)の助成金によるものであるから、米国政府は本発明に権利を
もっている。
【０００３】
血小板とリンパ球の血管表面への付着は炎症反応の重要な要素であり、かつ
補体系、凝血系および免疫系の同時におこる相互に関連する活性化を伴う一連
の複雑な反応の一部である。
【０００４】
トロンビンおよびヒスタミンのような「迅速」活性化因子に暴露された内皮
は２〜10分以内に好中球に対して付着性になるが、一方腫瘍壊死因子およびイ
ンターロイキン−１のようなサイトカイン類に暴露された内皮は、１〜６時間
後に付着性になる。迅速な内皮依存性のリンパ球の付着は、細胞表面での脂質
媒介物血小板活性化因子（PAF）の発現と関連があり、およびおそらくその他
の内皮リンパ球の表面レセプターの出現と関連がある。サイトカインで誘発さ
れる、内皮のリンパ球に対するゆっくりした付着は、少なくとも一部分は、内
皮細胞レセプターのELAM-1で媒介される。このELAM-1は内皮細胞がサイトカイ
ン類に暴露された後に合成され、次いで細胞表面に輸送され、そこで好中球を
補足する。ELAM-1の単離、特性決定およびクローニングについては、Bevilacq
uaらがScience  243巻、1160〜1165頁、1989年で概説している。末梢リンパ節
ホーミングレセプターは、「ネズミMel 14抗原」、「Leu8」、「Leu8抗原」お
よび「LAM-1」とも呼ばれるが、末梢リンパ節において高内皮性小静脈にリン
パ球を結合させる好中球、単球およびリンパ球上の別の構造体である。このタ
ンパク質の特性決定とクローニングについては、Laskyら、Cell 56巻、1045
〜1055頁、1989年（マウス）およびTedderら、J．Exp.Med.170巻、123〜13
3頁、1989年に概説されている。
【０００５】
GMP-140（顆粒膜タンパク質140）はPADGEMとして知られているが、システ
インに富んだ、強くグリコシル化された膜内存在性糖タンパク質であり、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)で測定した
見かけの分子量は140,000である。GMP-140は、McEverとMartinが最初にヒト
血小板から精製した(J.Biol.Chem.259巻、9799〜9804頁、1984年）。このタ
ンパク質は、Stenbergら(1985年）が報告しているように、休止血小板のα顆
粒中に存在しているが血小板を活性化してから迅速に細胞膜に再分布される。
GMP-140が内皮細胞内に存在しこれらの細胞によって生合成されることは、Mc
Everら、Blood70(5)Suppl.1:355a，AbstractNo．1274(1987年)に報告さ
れた。内皮細胞中で、GMP-140は、ワイベルパレイド(Weibel-Palade)体とし
て知られている貯蔵顆粒に見られる。またGMP-140(PADGEMと呼ばれている）は
、活性化された血小板と、好中球および単球との相互作用も媒介すると報告さ
れている(Larsenら、Cell59巻、305〜312頁、1989年10月およびHamburge
rとMcEver、Blood75巻、550〜554頁、1990年)。
【０００６】
そのcDNA由来アミノ酸配列は、Johonstonら、Cell56巻、1033〜1044頁、19
89年3月24日および1989年3月8日出願の米国特許出願第07/320,408号に報告
されたが、独立して折り重なっているようである多数のモジュールドメインを
含有していることを示している。Ｎ末端から始まって、これらのドメインは、
１つの「レクチン」ドメイン、１つの「EGF」ドメイン、補体結合タンパク質
中のものと類似の９つの縦列共通反復構造、トランスメンブランドメイン（分
化スプライシングから得られる可溶性形を除く）および細胞質テールを含有し
ている。
【０００７】
血小板もしくは内皮細胞がトロンビンのような媒介物で活性化されると、貯
蔵顆粒の膜は原形質膜とともに溶解して顆粒性の可溶性内容物が外部環境に放
出され、膜に結合していたGMP-140が、数秒以内に細胞表面に提供される。GM
P-140が活性化された結果血小板および内皮細胞の表面に迅速に再分布すると
いうことは、この糖タンパク質が炎症もしくは血管の破裂の部位で重要な役割
をし得るということを示唆している。
【０００８】
ELAM-1、ホーミングレセプター、およびGMP-140はその構造と機能が関連し
ていることから「セレクチン類」と称されている。
【０００９】
血小板リンパ球の相互作用のインビボでの重要性はまだ綿密には研究されて
いない。しかし血管の損傷に応答して、血小板は、内皮下面に付着して活性化
され凝血を助けることが知られている。また血小板および他の細胞は、微生物
の侵入を防止するためにリンパ球を創傷内に補充するのに重要な役割を果たす
。逆に、リンパ球は、Issekutzら、Lab.Invest.49巻、716頁、1983年に報告
されているように、炎症部位の組織中に血小板を補充する。
【００１０】
凝血と炎症の経路は、組織の損傷に応答して協調方式で調節される。例えば
、活性化された内皮細胞は、リンパ球に対して付着性になるのに加えて、その
細胞表面に組織因子を発現させ、それらの表面がトロンボモジュリンを発現す
るのを減少させて、最終的に、細胞表面で凝血反応を起こり易くする。場合に
よっては、単一のレセプターが、炎症と凝血のプロセスの両者に関与できる。
【００１１】
止血経路と炎症経路に関与するタンパク質は、ヒトの疾患の診断および治療
を行うのに重要である。しかしタンパク質を治療に用いるには多くの問題があ
る。タンパク質は、患者に投与するのに十分であるように大量生産すると、通
常は経費がかかる。更に、タンパク質を患者に複数回投与した後そのタンパク
質に対する反応が起こり得る。従って、対象のタンパク質と同じかまたはより
優れた活性を有し、安価に合成可能で、再現性があり、比較的無害なペプチド
を開発することが望ましい。また、インビトロとインビボの両方で用いて、セ
レクチン類の結合作用を対象のタンパク質分子と同等に有効に調節することが
できて、かつ合成に要する経費が少なく、より再現性が高く、反応を起こすこ
とが少ないと考えられる炭水化物の分子を開発することが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、GMP-140、ELAM-1およびリンパ球ホーミングレセプターを
含むセレクチン類と相互に作用するペプチドを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、GMP-140に対するリンパ球リガンドの構造に基づいた
構造を有し、GMP-140性付着相互作用を阻害する炭水化物べースの薬剤を提供
することである。
【００１４】
それ故に本発明の目的は、ELAM-1のような他のセレクチン類とは全く異なる
セレクチンである、GMP-140に対するレセプターの一部を形成する炭水化物構
造体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いてリン
パ球が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法を提供することである
。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、これらのぺプチドおよび炭水化物構造体を用いて
免疫応答と止血経路を調節する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、GMP-140、ELAM-1およびリンパ球ホーミングレ
セプターに関する診断上のアッセイに用いる炭水化物およびペプチドを提供す
ることである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、GMP-140に特異的な結合を有する糖タンパク質
リガンドに対する抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明によれば、GMP-140への好中球および単球の結合を阻害するGMP-140
のレクチン様ドメイン由来の単離されたペプチドが提供される。
【００２０】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、CQNRYTDLVAIQNKNE、AENWADNEPNNKRN
NED、RKNNKTWTWVGTKKALTNE、KKALTNEAENWAD、ならびにGMP-140への好中球
および単球の結合を阻害するこれらの部分からなる群から選択されるペプチド
を含む。
【００２１】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、CQ.RYTDLVAIQNK.E、RK.N..WTWVGT.K
.LTEE、AENWADGEPNNK.N.ED、C...YT.LVAIQNK.E、RK....W.WVGT.K.LT.E、A.
NW...EPNN....ED、および.K.KT.EA.NW..からなる群から選択され、ここで、
”．”は任意のアミノ酸である。
【００２２】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、レクチンドメインペプチドのアミノ
酸19-34、19-30、23-34、21-30、22-30、23-30、54-72、54-63、73-8
9、73-83、73-85、77-89およびその組合せからなる群より選択されるペプ
チドを含む。
【００２３】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、キャリヤー分子に結合される。
【００２４】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、身体へ移植するために不活性基質に
結合される。
【００２５】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、患者へ投与するために、受容可能な
薬学的キャリヤー中にある。
【００２６】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、蛍光、放射、および酵素標識からな
る群から選択される検出可能な標識をさらに含む。
【００２７】
本発明によれば、α1,3−フコシル化、α2,3−シアル化ラクトサミノグリ
カン構造を含む、セレクチンに結合する単離された炭水化物が提供される。
【００２８】
１つの実施態様では、上記炭水化物は、シアリルLex、ジフコシルシアリル
Lex、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカン(polyactosam
inoglycans）からなる群から選択される。
【００２９】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3
）GlcNAcβ1-Rであり、そしてＲはタンパク質または他の炭水化物構造である
。
【００３０】
別の実施態様では、上記炭水化物は、タンパク質をさらに含む。
【００３１】
別の実施態様では、上記炭水化物は、GMP-140の単球および好中球への結合
を阻害する。
【００３２】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ELAM-1の血小板および内皮細胞へ
の結合を阻害しない。
【００３３】
別の実施態様では、上記炭水化物は、身体へ移植するために不活性基に結合
される。
【００３４】
別の実施態様では、上記炭水化物は、患者へ投与するために受容可能な薬学
的キャリヤー中にある。
【００３５】
別の実施態様では、上記炭水化物は、蛍光、放射および酵素標識からなる群
から選択される検出可能な標識をさらに含む。
【００３６】
本発明によれば、GMP-140の結合を阻害して生物学的機能を変化させるペプ
チド、GMP-140に結合される炭水化物、およびGMP-140のレクチンドメインか
ら単離されたペプチドからなる群から選択される物質の有効な量を投与するこ
とを含む、炎症応答を調節する方法が提供される。
【００３７】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、好中球のGMP-140への結合を阻害す
るGMP-140のレクチン様ドメイン由来のペプチドから選択される。
【００３８】
好ましい実施態様では、上記ペプチドは、CQNRYTDLVAIQNKNE、AENWADNEPNNK
RNNED、RKNNKTWTWVGTKKALTNE、KKALTNEAENWAD、および好中球のGMP-140へ
の結合を阻害するこれらの部分からなる群から選択される。
【００３９】
別の好ましい実施態様では、上記ペプチドは、CQ.RYTDLVAIQNK.E、RK.N..WT
WVGT.K.LTEE、AENWADGEPNNK.N.ED、C...YT.LVAIQNK.E、RK....W.WVGT.K.LT.
E、A.NW...EPNN....ED、および.K.KT.EA.NWからなる群から選択され、ここ
で、”．”が任意のアミノ酸である。
【００４０】
別の実施態様では、上記ペプチドは、レクチンドメインペプチドのアミノ酸
19-34、19-30、23-34、21-30、22-30、23-30、54-72、54-63、73-83
、73-89、73-85、77-89およびその組合せからなる群より選択される。
【００４１】
別の実施態様では、上記物質をキャリヤー分子に結合する工程をさらに包含
する。
【００４２】
別の実施態様では、身体へ移植するために不活性基質に上記物質を結合する
工程をさらに包含する。
【００４３】
別の実施態様では、上記物質と、患者に投与するために受容可能な薬学的キ
ャリヤーとを組み合わせる工程をさらに包含する。
【００４４】
別の実施態様では、蛍光、放射および酵素標識の群から選択される検出可能
な標識で、上記物質を標識する工程をさらに包含する。
【００４５】
別の実施態様では、インビボにおける半減期を増大させるために、上記物質
を化学的に改変する工程をさらに包含する。
【００４６】
好ましい実施態様では、上記キャリヤーは、マイクロスフェア、マイクロカ
プセル、およびリポソームからなる群から選択される。
【００４７】
別の実施態様では、上記炭水化物は、α1,3-フコシル化、α2,3-シアル化ラ
クトサミノグリカン構造、糖タンパク質、および炭水化物または糖タンパク質
に対する抗体からなる群から選択され、この方法は、炎症応答を調節する。
【００４８】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、シアリルLex、ジフコシルシアリ
ルLex、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群
から選択される。
【００４９】
より好ましい実施態様では、上記炭水化物は、NeuAcα2,3Ga1β1,4(Fucα
1,3)GlcNAcβ1-Rであり、そしてＲはタンパク質または他の炭水化物構造であ
る。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、GMP-140の単球および好中球
への結合を阻害する。
【００５１】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ELAM-1の血小板および内皮細
胞への結合を阻害しない。
【００５２】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、GMP-140およびELAM-1の結合
を阻害し、GMP-140またはELAM-1の結合を実質的に阻害するのに有効な量の炭
水化物を投与する工程を含む。
【００５３】
別の実施態様では、上記炎症応答は、腫瘍に対するものであり、上記物質は
、該腫瘍の転移を阻害するのに有効な量で投与される。
【００５４】
本発明により、セレクチンに結合する単離された炭水化物に対する抗体であ
って、該炭水化物が、α1,3-フコシル化、α2,3−シアル化ラクトサミノグリ
カン構造を含む、抗体が提供される。
【００５５】
１つの実施態様では、上記炭水化物は、シアリルLex、ジフコシルシアリル
Lex、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群か
ら選択される。
【００５６】
別の実施態様では、上記炭水化物は、NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcN
Acβ1-Rであり、Ｒはタンパク質または他の炭水化物構造である。
【００５７】
本発明により、還元条件下でのSDS-PAGEによる120,000ダルトンの分子量を
有し、O−グリコシル化のための複数の部位を有する、セレクチンに対するリ
ガンドの単離されタンパク質成分が提供される。
【００５８】
１つの実施態様では、上記タンパク質はロイコシアリンである。
【００５９】
本発明により、GMP-140に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対
する抗体が提供される。
（発明の効果）
本発明により、GMP-140、ELAM-1およびリンパ球ホーミングレセプターを含
むセレクチン類と相互に作用するペプチドが提供される。また、本発明により
、GMP-140に対するリンパ球リガンドの構造に基づいた構造を有し、GMP-140
性付着相互作用を阻害する炭水化物ベースの薬剤、GMP-140に対するレセプタ
ーの一部を形成する炭水化物構造体、これらのペプチドおよび炭水化物構造体
を用いてリンパ球が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法も提供さ
れる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
発明の要旨
GMP-140のレクチン結合領域の３つの領域由来のペプチドは、GMP-140、EL
AM-１およびリンパ球ホーミングレセプターを含む「セレクチン類」と選択的
に相互に作用することが見い出されている。この３つの領域は、上記ペプチド
に含有される残基の番号にしたがってアミノ酸番号19〜34、54〜72および66〜
89を含有している。なお残基1は、シグナルペプチドを切断した後の前記成熟
タンパク質のＮ末端と定義する。該ペプチドは、長さが５〜８アミノ酸の短い
ものであり、標準的な技法で容易に調製することができる。
【００６１】
GMP-140と結合する、フコシル化シアル化(Sialyated）ラクトサミン構造体
も発見されている。この構造体は、α(2,3)シアル酸で置換されたラクトサミ
ノグリカン類を含有する受容体を改変できるα(1,3)フコシルトランスフェラ
ーゼ類を発現させることによって生成される。骨髄性細胞には存在するがリン
パ球もしくは赤血球の細胞には存在しない共通の三糖構造体であるLexすなわ
ちGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1-R（式中Ｒはタンパク質もしくは他の炭水
化物構造体）が、上記シアル酸化構造体のコアを形成している。実際の構造体
はシアリルLexすなわちNeuAcα2-3Calβ1-4(Fucα1,3)GlcNAc-Rであっても
よい。他の可能な構造体には、ジフコシルシアリルLex、すなわちより長いポ
リフコシル化ポリアクトサミノグリカン(polyfucosylated polyactosaminogly
can）または類縁の変異体が含まれる。これらの構造体のいくつかは、種々の
アフィニティー度でGMP-140に結合できる。
【００６２】
実施例は、これらのペプチドが好中球に結合してGMP-140が好中球と結合す
るのを阻害し、IC50（好中球が固定されたGMP-140に付着するのを50％まで阻
害するのに必要な投与量）が50から300マイクロモルの範囲内にあることを実
証している。その結合親和性は、EGFドメイン由来配列と、このEGFドメイン
とレクチンドメインの両方に結合する二価のカオチンを用いて調節することが
できる。全セレクチンまたは個々のセレクチン類、特にGMP-140の結合を阻害
するこれらのペプチドの変異体をスクリーニングするのに有用なアッセイも示
してある。
【００６３】
特異的グリコシルトランスフェラーゼでトランスフェクトされたチャイニー
ズハムスター卵巣（CHO）細胞系を用いる実施例によって、GMP-140に対する
オリゴ糖リガンドがシアル化フコシル化構造体であり、そのシアル酸の結合が
Galへのα2,3結合であり、およびフコースの結合はGlcNacへのα1,3結合で
あり、そのGlcNacにCalがβ1,4結合で結合していることが確認されている。
【００６４】
シアリルLex、ジフコシルシアリルLex、またはより長いポリフコシル化ポ
リアクトサミノグリカン変異体（合成で製造するかまたは遺伝子工学で作製し
た細胞内で発現させる）を含む本発明のペプチドもしくは炭水化物の構造体は
、診断用薬として有用であり、かつ適切な医薬用キャリヤーを組合わせて凝血
過程もしくは炎症過程を調節もしくは阻害する臨床の適用に有用である。また
本発明のペプチドと炭水化物は、そのアミノ酸を化学的に改変するかまたはキ
ャリヤー分子もしくは不活性基質に結合させることによって、改変してインビ
ボでの半減期を増大することができる。またこれらの構造体に対する抗体も、
診断用薬として、および凝血もしくは炎症のプロセスの調節に用いる医薬とし
て有用である。
【００６５】
GMP-140の構造と生合成法を詳細に分析した。GMP-140の全アミノ酸配列を
、精製された血小板GMP-140由来のペプチドフラグメントのタンパク質配列決
定の結果を組み合わせ、ヒト内皮細胞のcDNAライブラリーからGMP-140をコー
ドするcDNAをクローニングすることによって決定した。GMP-140は、その構造
と機能の研究に基づいて、好中球に対するレセプターとして作用し、かつ補体
タンパク質C3bおよび抗凝血性補因子のプロテインSと相互に作用する。
【００６６】
GMP-140のcDNAとアミノ酸配列
GMP-140に対する遺伝子のクローニングは、G.I.Johnston、R.G.Cookおよび
R.P.McEverが初めてAbstract1238 Supptment IICirculation 78(4)(1988年10
月)に報告している。オリゴヌクレオチドを、GMP-140のペプチドのN末端ア
ミノ酸の配列決定結果に基づいて調製して、ヒト内皮細胞のcDNAライブラリー
をスクリーニングするのに使用した。727のアミノ酸からなるタンパク質をコ
ードする3.0kbのクローンを単離した。多くのシステイン、リシンおよびチロ
シンを含有する118の残基からなるN末端ドメインは、アシアロ糖タンパク質
のレセプターに類似しているが、このＮ末端ドメインに、EGF型の反復ドメイ
ン構造と、各々62のアミノ酸からなる８つの縦列反復構造（ただし６番目の縦
列反復構造のみ70のアミノ酸で構成されている）とが続いている。これらの反
復構造は、C3bとC4bを調節するタンパク質を含むタンパク質類のファミリー
に見いだされる反復構造と相同であるが、１反復構造当り６つの保存システイ
ンを含有し、これは一般に４つの保存システインを含有しているのと異なる独
特の構造である。これらに対して、24のアミノ酸のトランスメンブラン領域と
35のアミノ酸の細胞質テールが続いている。同じ遺伝子の転写体、可溶性形と
膜または顆粒結合形を選択的にスプライスすることによってもたらされる少な
くとも２つの形のタンパク質、が存在するようである。
【００６７】
内皮細胞GMP-140の予測アミノ酸配列(図１ＡおよびＢに示す)には、６つ
の異なる構造ドメインが存在することを示唆している。これらの領域の１つは
、Ｃ末端の近くにある24残基の疎水性セグメントであり、メンブランスパニン
グドメインの特徴を有する。そのタンパク質の大部分はこのドメインのＮ末端
側に位置し、細胞質外に存在しているようである。すなわち分泌顆粒のルーメ
ンに体面しているが、または細胞が活性化された後、細胞外環境に暴露される
。
【００６８】
Ｎ末端から始まる第１のドメインは41の残基（図１Ａに-41から-1の標識を
つけて示す）を含有し、シグナルペプチドの特徴を有する。これらの残基中に
はいくつかの正の電荷を有するアミノ酸を含有し、次いで疎水性ドメインが続
き、次に極性残基が多い領域が続いている。-3および-1の位置に見られる電荷
をもっていない小さな残基は、シグナルペプチダーゼによって開裂される部位
に見られる一般的な残基である。その上に、血小板GMP-140のＮ末端のアミノ
酸配列は、残基１から27の27個の位置のうち25個が内皮細胞の推定配列に一致
している。
【００６９】
シグナルペプチドに続いて、翻訳されるcDNA配列によって、789の残基で構
成された成熟タンパク質が予測される。血小板GMP-140ペプチドの配列を内皮
細胞の推定配列とを比べると、341の帰属アミノ酸のうち337が一致すること
が分かったが、このことは、両方の細胞型が同じタンパク質を合成することを
示唆している。
【００７０】
共通配列NxS／Tを有する、12の潜在的アスパラギン連結グリコシル化部位
がある。これらはすべて分子の細胞質外の部分に位置しており、かつ血小板GM
P-140の炭水化物の組成に基づいてグリコシル化されているようである。その
成熟タンパク質は、全アミノ酸の８％を占める65のシステインを含有している
。これらの大部分はジスルフィド架橋で組織化されていると予測されるが、そ
の理由は、ヨードアセトアミドで処理した非還元GMP-140の試料中にごく少量
のカルボキシメチルシステインを同定できるからである。
【００７１】
第２のドメインは残基１から始まり、その成熟タンパク質の最初の118のア
ミノ酸が含まれる。この領域は、リシン（12％）、チロシン（10％）、アスパ
ラギン（13％）およびトリプトファン（６％）の残基を豊富に含有している。
GMP-140のこの領域は、このモチーフを有するタンパク質の多くが炭水化物を
結合するので「レクチンドメイン」と称される。
【００７２】
第３のドメインは残基119から始まり、６つのシステインを含有する40のア
ミノ酸の配列を有する。GMP-140のこの領域を、NBRFのデータベースの配列と
比較すると、同じシステインの配列を含有する多数のタンパク質がある。この
モチーフで報告された最初のタンパク質は上皮増殖因子（EGF）前駆物質であ
り、10の相同コピーを含有している（Grayら、Nature303巻、236〜240頁、
1983年;Scottら、Nature221巻、 236〜240頁、1983年)。
【００７３】
第４のドメインは残基159から始まり、各々62のアミノ酸を含有する９つの縦
列共通反復構造で構成され、その上に、８つの残基と４つの残基の延長部分が
それぞれ７番目と９番目の反復構造の末端にみとめられる。このドメインの境
界部は、最初の反復構造の最初のシステインと推定トランスメンブランドメイ
ンの前の最後の残基とともに任意に設定される。共通配列により、９つの反復
構造のうちの少なくとも５つで多数のアミノ酸が生成することが分かる。すべ
て反復構造が６つの保存システイン、３つのグリシン、および１つずつのトリ
プトファン、フェニルアラニン、プロリン、およびロイシンを含有している。
そのシステイン残基は、「EGF」ドメインに見られる６つのシステインとは異
なるモチーフで配列されている。その反復構造は、互いに、アミノ酸レベルで
31％から56％同一であり、ヌクレオチドレベルで42％から62％同一である。反
復構造間の配列を最大にするのにギャップを必要としない。
【００７４】
第５のドメインは残基731から始まる24残基の推定トランスメンブランドメ
インである。この第５ドメインに続いて第６ドメインがあり、この第６ドメイ
ンは、高電荷を有するいくつかの残基で始まりそのタンパク質のＣ末端の残基
789で終わる35残基の推定細胞質セグメントである。セリン、トレオニンおよ
びチロシンの残基、ならびに翻訳後に修飾されるかもしれないシステインには
、ホスホリル化されうる部位がある。
【００７５】
２つの異なる枠内欠失部（in-frame-deletion）が、詳細に試験された４つ
の内皮細胞クローンの配列中に同定される。第１の欠失部は186bpである。こ
の欠失によって、第７の共通反復構造から62のアミノ酸が除かれ、９つの反復
構造の代わりに８つの反復構造を含有するタンパク質が予測される。第２の欠
失部は120bpであり、第９の反復構造の末端の直後の40のアミノ酸を除去され
ている。欠失した領域は、トランスメンブラン領域と、細胞質領域の最初のい
くつかの残基を含んでいる。Ｃ末端における残りの28の残基は第９の反復構造
の直後に続くと予測される。親水性を示す図(KyteとDoolittle、J.Mol.Biol
. 157巻、105〜132頁、1982年)は、この形態のGMP-140が可溶性であるこ
とを予報している。
【００７６】
GMP-140は、血小板および内皮細胞に存在するレセプターであり、好中球と
単球の表面リガンドに結合して炎症過程を促進することが実証されている。
【００７７】
GMP-140は、リンパ球が活性化された内皮細胞および血小板に付着するため
のレセプターとして働くという結論は、本来次のようないくつかの観察結果に
基づいてなされた。すなわちトロンビンもしくはヒスタミンで刺激された内皮
の表面のGMP-140の迅速な出現が、これらのアゴニストによって刺激された内
皮への好中球の誘発性付着と平行して起こること；GMP-140の細胞表面への再
分布を起こすトロンビンのようなアゴニストで血小板を刺激した後だけ起こり
、ADPのような血小板アゴニストでは起こらない、好中球もしくは単球と血小
板との相互作用；リンパ球が内皮を通過して組織へ移行する前に内皮に結合す
る主要な部位である後毛細管静脈におけるGMP-140の濃度；組織培養マイクロ
タイターウェルにコートしたGMP-140に対する精製された好中球の特異的付着
；ヒスタミンによって刺激された培養ヒト臍静脈内皮細胞への好中球の付着の
60〜90％がGMP-140に対するポリクローナル抗体で阻止されること；GMP-140
のcDNA由来アミノ酸配列が、ELAM-1、好中球に結合することがすでに知られて
いる内皮細胞タンパク質、およびリンパ球ホーミングレセプターのアミノ酸配
列に相似していることである。続く研究によって、Ca2+の存在下、GMP-140は
また刺激された血小板への好中球の付着を媒介するが、刺激されていない血小
板については媒介しないことが実証された。血小板の好中球への結合は、GMP-
140に対するモノクローナル抗体および精製されたGMP-140によって阻害され
た。
【００７８】
他の研究によって、GMP-140が、補体系タンパク質であるC3b、および抗凝
血性補因子夕ンパク質であるプロテインＳに結合することが実証された。GMP-
140は、血漿タンパク質のC4b結合タンパク質（C4bp）と配列相同性を共有し
ており、このC4bpは血漿タンパク質C4bと相互に作用するのみならずプロテイ
ンＳと相互に作用する。
【００７９】
GMP-140由来のペプチドが、診断用薬として有用であり、およびリンパ球が
GMP-140を認識するのを阻止できるペプチドの治療上の有効量を患者に投与し
て患者の止血応答と炎症応答を調節するのに有用であることが発見されたので
ある。
【００８０】
また、他のタンパク質、特にELAM-1およびそのホーミングレセプターのレク
チンドメインと相同性のGMP-140のレクチンドメイン内のペプチド配列は、好
中球が精製されたGMP-140に付着するのを選択的に阻害するので、患者および
これらの分子による結合性の変化を特徴とする疾患の診断上のアッセイ、なら
びにこの結合を変化させる化合物のスクリーニングアッセイに用いることがで
き、および凝血および／または炎症の過程を伴う、リンパ球と、血小板もしく
は内皮細胞との相互作用を抑制もしくは調節するのに臨床上有用に違いないこ
とが発見されたのである。
【００８１】
GMP-140のcDNA由来の一次構造によって、血管系におけるGMP-140の機能に
ついていくつかのことが分かる。最も注目すべき観察結果は、GMP-140が、血
管細胞にみられ最近クローニングされた２つの他のレセプターと構造が著しく
類似していることである。
【００８２】
これらの類似したレセプターの第１のものはELAM-1である。ELAM-1は未刺激
の内皮中には存在しない内皮細胞タンパク質である。しかし、内皮が腫瘍壊死
因子またはインターロイキン−１のようなサイトカイン類に暴露されると、EL
AM-1の遺伝子が転写されてRNAを産生し、次いでそのRNAはタンパク質に翻訳
される。その結果、ELAM-1はタンパク質に翻訳される。その結果、ELAM-1は、
Bevilacquaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA84巻、9238〜9242頁、1987年に記載
されているように、サイトカイン類に暴露されてから１-４時間後に内皮細胞
の表面に発現される(顆粒内に貯蔵されて活性化後数秒以内に細胞表面に現れ
るGMP-140とは異なる）。ELAM-1は、好中球が、サイトカインで処理された内
皮に付着するのを媒介することが判明し、従って、リンパ球をサイトカインで
刺激された内皮を通過させて組織中へ移行させるのに重要であるらしい。ELAM
-1の一次構造は、ELAM-1が「レクチン」ドメイン、EGFドメインおよび補体調
節タンパク質の反復構造に類似の６つの反復構造（GMP-140の９つの反復構造
の代わりに）、トランスメンブランドメイン、および短い細胞質テールを含有
することを示している。GMP-140とELAM-1間には、両方のタンパク質を通じて
広範囲の相同配列が存在するが、その相似性がレクチンドメインとEGFドメイ
ンにおいて特に顕著である。
【００８３】
GMP-140に構造全体が類似している第２分子は、リンパ球に見出されるホー
ミングレセプターである。ホーミングレセプターは、高内皮性細胞もしくは高
内皮性小静脈と呼ばれる、リンパ組織中の特殊な内皮細胞にリンパ球を結合さ
せるリンパ球表面構造体である（YednockおよびRose，Advances in Immunolo
gy 44巻、F．I．Dixon編集、313〜378頁、Academic Press，NewYork，
1989年に概説されている）。この結合によって、リンパ球は内皮を通過してリ
ンパ組織に移行し、そこで処理された抗原に暴露される。そのリンパ球は次に
リンパ系を通じて血液中に再び入る。そのホーミングレセプターは、レクチン
ドメイン、EGFドメイン、２つの補体結合性反復構造、トランスメンブランド
メイン、および短い細胞質テールを含有している。このホーミングレセプター
も、特にレクチンドメインおよびEGFドメインが、GMP-140と広範囲の相同配
列を共有している。
【００８４】
GMP-140，ELAM-1およびこのホーミングレセプター（LEU-8）それぞれのレ
クチンドメイン間の比較を表１に示す、これらの配列相似性に基づいて、好中
球がGMP-140に結合するのを阻害するペプチドであって、ELAM-1、そのホーミ
ングレセプター、および他の相同セレクチン類が炎症過程の成分に結合するの
を阻害するか、または逆にGMP-140の結合だけを阻害するペプチドを選択する
ことが可能なはずである。
【００８５】
GMP-140に結合するフコシル化シアル化ラクトサミン構造体を発見された。
この構造体は、α(2，3）シアル酸置換ラクトサミノグリカンを含有する受容
体を改変することができるα（1,3）フコシルトランスフェラーゼを発現する
ことによって生成することができる。骨髄細胞に存在するがリンパ球もしくは
赤血球細胞には存在しない共通の三糖構造体であるLexすなわちGalβ1,4(Fu
cα1，3）GlcNAcβ1-R（式中、Ｒはタンパク質もしくは他の炭水化物構造
）は、上記のシアル化構造のコアを形成している。実際の構造はシアリルLex
、すなわちNeuAcα2-3Galβ1-4（Fucα1,3）GlcNAc-Rであってもよい。他
の可能な構造には、ジフコシルシアリルLex、より長いポリフコシル化ポリア
クトサミノグリカン、または類縁の変異体が含まれる。これらの構造体のいく
つかは、種々の親和度でGMP-140に結合できる。
【００８６】
そのリガンドの炭水化物の部分は、GMP-140と相互に作用する、骨髄もしく
は他の細胞の１つ以上のタンパク質に保持されていると考えられる。骨髄の糖
タンパク質は単離されていないが、そのいくつかの特徴についての予備情報は
得られている。
【００８７】
この構造は、プロテアーゼおよびノイラミニダーゼによる消化、およびトラ
ンスフェクトされたCOS細胞を用いて推定した。
【００８８】
実施例５に記載したように、好中球をニューカッスル病ウイルス由来のノイ
ラミニダーゼ、これはビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）由来のノイラミニ
ダーゼと同様に、シアル酸のα2,3結合を切断するがα2,6結合を切断しない
、で処理することによって結合が少なくとも部分的に減少するので、リガンド
中の重要な結合の少なくともいくつかにα2,3結合が含まれている。上記両方
の型の酵素はともにα2,8結合を切断するが、骨髄細胞には存在しない。
【００８９】
実施例６に詳細に記載されているトランスフェクトされた細胞系についての
他のデータは、α2,3結合のシアル酸を有するシアル化フコシル化ラクトサミ
ンは充分に認識されることを示している。Lexに対する抗体は、125I［GMP-
140］が好中球に結合するのを阻害しないので、その炭水化物はLexだけでは
ないと考えられる。GMP-140と２種の多価ネオ複合糖質の結合を比較する試験
を、シアリルLexもしくはLexを、ウシ血清アルブミンに約10：１のモル比に
て、高濃度で（6.5μMの複合体、65μMのオリゴ糖）結合させて行ったが、
結合を阻害することができなかった。このことは、LexもシアリルLex自体も
リガンドではないか、またはこれらのオリゴ糖のGMP-140に対する親和性が非
常に低いので、このアッセイでは測定できないことを示唆している。
【００９０】
GMP-140に対する糖タンパク質のリガンドの炭水化物の部分は、ELAM-1に対
する糖タンパク質リガンドの炭水化物の部分と類似しているかまたは同じであ
るとはいえ、阻害物の試験がGMP-140とELAM-1の認識特異性に差があることを
示すことは確かである。これらのことは、各セレクチンによって認識されるオ
リゴ糖の構造のわずかの差、または同じ構造体に結合する親和性の差が原因で
ある。
【００９１】
本願に記載されていないオリゴ糖構造もGMP-140と相互に作用することがで
きる。例えば、α2,6シアル酸結合を有するシアル化フコシル化ラクトサミノ
グリカンは結合するかもしれないが、この構造は真核細胞については報告され
ていない。
【００９２】
シアル化フコシル化ラクトサミン、または多数のシアル化フコシル化ラクト
サミンは多数のシアル化フコシル化ラクトサミンが結合した炭水化物もしくは
タンパク質の分子を用いて、GMP-140のリガンドヘの結合をインビボで操作す
ることが可能である。単一の分子に結合した多数シアル化フコシル化ラクトサ
ミンを使用すれば、天然のリガンド以上に、人工の分子に対してGMP-140の親
和性を増大させることができる。
【実施例】
【００９３】
以下の実施例によって上記の結論をもたらした物質、方法および試験結果を
さらに説明するが本発明を限定するものではない。
実施例１：GMP-140のレクチンドメイン由来のペプチドによる、好中球の固定
化GMP-140への結合の競合阻害の証明。
【００９４】
分子内部に引っ込んでいると予想される２つの疎水性ストレッチを除いて、
レクチンドメインの118個の残基のほとんどすべてにまたがる一連のペプチド
を合成することにより、GMP-140レクチンドメインの役割をテストした。また
、レクチンドメインにつづくEGF様ドメイン（36個の基）を含むペプチドをも
合成した。また対照として、分子の共通反復構造、トランスメンブラン領域、
およびＣ末端（細胞質テール）のうちのひとつから、ペプチドを得た。レクチ
ンドメイン由来の活性ペプチドを表１に示す。表１はまたELAM-1およびホーミ
ングレセプターであるLEU-8のレクチンドメインの関連する配列の配置をも示
す。t-Bocの化学的特性を利用したAppliedBiosystems Model 430A自動ペプ
チド合成機か、または、Fmocの化学的特性を利用したDupont RAMPS手動ペプチ
ド合成機かのいずれかで、ペプチドを調製した。合成が行われた樹脂からの開
裂後、逆相高性能液体クロマトグラフィーにより、すべてのペプチドを精製し
た。
【００９５】
プラスチックウェル上に固定化された精製GMP-140への好中球の付着を阻害
する、ペプチドの能力を調べるために、Gengら、Nature 343、757-760(1990)
に記載のアッセイを用いて、ペプチドをスクリーニングした。
【００９６】
FlowLaboratories製Mono-Poly分離媒体における密度勾配遠心分離法によ
り、ヒト好中球をヘパリン処理した全血から単離する。好中球懸濁液は、98％
より高い純度およびトリパンブルー排除法による95％より高い生存度を有する
。付着アッセイのために、好中球を、5mg/mlヒト血清アルブミン（HBSS/HSA）
と共に1.26mMCa2+および0.81 mM Mg2+（HBSS，Gibco）を含むハンクス平衡
塩類溶液中に、2×106細胞／mlの濃度で懸濁する。付着アッセイを、Cornin
g製96ウェルマイクロタイタープレートにおいて３回行い、様々なタンパク質
溶液50マイクロリットルを用いて４℃で一晩インキュベートする。
【００９７】
以下のように、抗体S12-セファロースTMでのイムノアフィニテイークロマト
グラフィーおよびMono-QTMカラム（FLPC,Pharmacia Fine Chemicals）でのイ
オン交換クロマトグラフィーにより、GMP-140をヒト血小板溶解産物から単離
する。
【００９８】
血液銀行から得て４℃で貯蔵した使用期限の過ぎたヒト血小板パック（100
ユニット）をプールし、pH7.5の5mM EDTAに調整し、１リットルボトル中で30
分間、4,000rpmで遠心分離する。次いで、0.1MNaCl、20mMトリス pH7.5(TBS
)、5mM EDTA、5mMベンズアミジンを含む１リットル溶液で3回洗浄する。
【００９９】
次に、ペレットを最小量の洗浄緩衝液中に再懸濁し、DIFP中で1mMにし、次
いで、-80℃で50mlスクリュートップ管中で冷凍させる。
【０１００】
冷凍ペレットを解凍し、50ml TBS、5mMベンズアミジン、5mM EDTA pH7.5、
100Mロイペプチンを含む溶液中に再懸濁する。懸濁液を、600ml凍結解凍フラ
スコを用いてドライアイス−アセトン浴中で２回冷凍および解凍し、次いで、
ガラス／テフロン（登録商標）乳鉢中で乳棒を用いてホモジナイズし、DIFP中で
１mMにする
。４Ｍ NaClの貯蔵溶液を用いて、NaClの濃度を0.5Mに調整する。懸濁液を４
℃で撹拌した後、４℃で60分間、33,000rpmでポリカーボネート管中で遠心分
離する。上澄み（0.5MNaCl洗浄液）を取り出し貯蔵する。この上澄みは、可
溶形態のGMP-140を含む。上澄みと共にペレットの上部を除去しないように注
意する。次いで、抽出緩衝液（TBS、5mMベンズアミジン、5mM EDTA pH7.5、
100Mロイペプチン、２％トリトンX-100）中でペレットをホモジナイズする。
４℃で25分間、１9,500rpmで遠心分離した後、上澄みを取り出す。この抽出手
順をペレットを用いて反復し、上澄みを最初の上澄みと合せる。メンブラン形
態のGMP-140を含む混合抽出物を、0.5ＭNaClに調整する。
【０１０１】
可溶画分（0.5MNaCl洗浄液）およびメンブラン抽出画分（これもまた0.5M
NaClに調整している）を、前もって４℃で２時間、5mg/mlのAffigel(アフィ
ゲル)(Biorad)にカップリングしておいたモノクローナル抗体S12(ヒトGMP-14
0に対する)の別々のプールを用いて吸収させる。樹脂を沈降させた後、上澄
みを除く。次いで、結合GMP-140を含むS12アフィゲルをカラムに充填し、0.
5M NaCl、20mMトリスpH7.5、0.01％ Lubrol（ルブロール）PXを含む400ml
溶液を用いて４℃で一晩洗浄する。
【０１０２】
80％エチレングリコール、1mMMES pH6.0、0.01％ルブロールPXを含む100m
l溶液を用いて、S12アフィゲルから結合したGMP-140を溶出する。280nmに
おいて吸光度がピークである画分をプールする。溶出液を、0.05％ルブロール
（Lubrol）を含むTBSに対して透析し、次いで、MonoQカラム（Pharmaciaの
FPLC）にかける。濃縮タンパク質を、2MNaCl、20mMトリスpH7.5（およびメ
ンブラン画分用の0.05％ルブロールPX）を含む溶液を用いて段階的に溶出する
。ピーク画分をTBSpH7.5（およびメンブラン画分用の0.05％ルブロールPX）
を含む溶液に透析する。
【０１０３】
GMP-140を、５マイクログラム／mlにプレートし、対照タンパク質、すなわ
ち、ヒト血清アルブミン（Alb）、血小板糖タンパク質IIb/IIIa(IIb)、フォ
ンビルブラント因子（vWF）、フィブリノーゲン（FIB）、トロンボモジュリ
ン（TM）、ゼラチン（GEL）またはヒト血清（HS）を50マイクログラム／mlで
添加する。すべてのウェルを、10mg/ml HSAを含む300マイクロリットルHBSS
を用いて、22℃で２時間ブロックし、次いで、0.1％Tween-20を含むHBSSで３
回洗浄し、HBSSで１回洗浄する。細胞（ウェル毎に２×105個）をウェルに添
加し、22℃で20分間インキュベートした。次いで、ウェルをHBSS／HSAで満た
し、アセテートテープ（Dynatech）で密封し、５分間150gで遠心分離してひっ
くり返した。非付着細胞および上澄みを廃棄した後、各ウェルの含有物を、Si
gma製0.5％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムの50mMリン酸カリウム
溶液pH6.0、200マイクロリットルを用いて可溶化し、Leyら、Blood73, 13
24-1330（1989）に記載のように、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッ
セイする。結合した細胞の数を、ミエロペルオキシダーゼ活性対細胞の数の標
準曲線から導き出した。すべてのアッセイ条件下において、細胞は、全ミエロ
ペルオキシダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの５％未満を放出した。結果を
表１に示す。負の対照としてのＣ末端ペプチド（GMP-140のアミノ酸残基761-
777）の存在下で、100％の付着が見られ、この値は、細胞にペプチドも抗体
も添加されない対照の場合と同じである。５％という値は特異的付着の95％が
阻害されたことを意味するので、阻害を、より低い付着率と解釈する。
【０１０４】
GMP-140のEGFドメイン由来のペプチドは、どれも付着を阻害しなかった。
しかし、レクチンドメインの３つの非隣接領域由来のペプチドは、付着を阻害
した。そのレクチンドメイン由来の３つの領域とは、アミノ酸19から34、アミ
ノ酸54から72、アミノ酸73から89、およびアミノ酸66-78の重複ペプチドであ
る。アミノ酸は、ペプチドに含まれる残基の数に基づいて番号付けられ、残基
１は、シグナルペプチドの開裂後の成熟タンパク質のＮ末端と定義づけられる
。
【０１０５】
現在、活性を有することが知られている、これらの配列に由来する最も短い
ペプチド配列は、それが由来するレクチンドメインの面積にある程度依存して
変化する、８個から13個のアミノ酸の範囲にある。より短いペプチドのいくつ
かは、より長いペプチド配列よりも高い活性を有する。この時点で特徴づけら
れる最も短い活性ペプチドは、レクチンドメインアミノ酸23から30であり、レ
クチンドメインアミノ酸19から34由来のものである。このペプチドは、ELAM-1
中の単一のアミノ酸の違いを除いて、GMP-140、ELAM-1、およびホーミングレ
セプターの間で同一であり、従って、３個のセレクチンすべてによって媒介さ
れた細胞−細胞接触を阻害する。現時点で周知の、レクチンドメインアミノ酸
54から72由来の最も短い活性ペプチドは、アミノ酸54から63である。現時点で
周知の、レクチンドメインアミノ酸78-89由来の最も短い活性ペプチドは、ア
ミノ酸73から83である。さらに、アミノ酸66から78にまたがる重複ペプチドは
、非常に活性が高い。アミノ酸66から83にまたがる領域から、２つの、活性が
あってより短い、非重複ペプチドを設計することが可能であり得る。
【０１０６】
表１に示すように、これらの領域のいくつかは、他の領域よりも、セレクチ
ンの間でより高度に保存されている。その結果、全セレクチンを含む、相互作
用を調節するための高度に保存された領域由来のペプチドを用いること、およ
びGMP-140のみを含む、相互作用を調節するためのセレクチンの間でより低い
程度で保存されている領域からのペプチドを用いることが可能である。例えば
、レクチン領域19-34（残基23-30）の中心コアは、３つの分子の間で非常に
高度に保存されている。対照的に、レクチン領域54から72由来のアミノ酸配列
54から60は、セレクチンの間で多くの違いを有する。
【０１０７】
【表１】
2005255691.tif 000002
ａ．固定化GMP-140に結合した細胞の数を、Gengら、Nature343：757-760(19
90)に記載のように決定した。対照Ｃ末端ペプチド（残基761-777）の存在下
において結合した細胞の数を100％に標準化した。この値は、ペプチドを含ま
ないときに観察されたものと同一であった。ペプチドによる付着の阻害は、10
0％よりも大幅に低い付着値により示される。例えば、５％という値は、対照
において見られる付着が95％阻害されたということを示す。すべてのペプチド
を加えて、1.5mMという最終濃度にした。
【０１０８】
実施例２：GMP-140のレクチンドメイン由来のペプチドによる、固定化GMP-14
0へのモノクローナル抗体の結合の競合阻害の証明。
【０１０９】
実施例１は、GMP-140のレクチンドメインの３つの領域由来のペプチドが、
表面に固定化されたGMP-140に対する好中球の結合を阻害するということを示
す。そのペプチドがまた、固定化GMP-140に対するモノクローナル抗体の結合
をも阻害するかどうかを決定するための研究も行った。
【０１１０】
GMP-140に対する好中球の付着をブロックする３つのモノクローナル抗体（
mAb）を発生させ、G1、G2、およびG3と命名した。精製タンパク質を用いた競
合ELISAに基づいて、G1、G2、およびG3は各々、異なる、または部分的に重複
したエピトープを認識する。1.5mMペプチドを、2.5マイクログラム／mlの濃
度でビオチニル化mAbに添加し、次いで、得られた物質を、実施例１に記載の
ように、GMP-140を含むウェルに添加した。結合を、アビジン検出システムを
用いたELISAにより測定した。
【０１１１】
モノクローナル抗体を、以下のようにビオチニル化した。0.5mlの精製IgG
抗体(PBS中に1mg/ml、pH7.4）に、3.2mMＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオ
チンのジメチルスルホキシド溶液50μlおよび１Ｍ NaHC03 50μlを添加した
。室温で２時間、暗所でインキュベートした後、50μlの１Ｍ NH4Clにより
反応を停止した。次いで、PBS中で平衡させたPD-10カラム上でゲル濾過して
、ビオチニル化抗体を他の成分から分離した。ELISAを以下のように行った。
全工程を室温で行った。
【０１１２】
1.5mMペプチドを有するまたは有さない、ビオチニル化抗体(2.5μg/ml)を
、実施例１に記載のように、GMP-140によりコートしたウェルでインキュベー
トした。２時間インキュベートした後、抗体を除去し、ウェルを洗浄し、そし
て、HBSS/HSA中で１：1,000に希釈した、ホースラディッシュペルオキシダー
ゼと結合したステップアビジン（stepavidin）（Pierce）0.1mlを30分間添加
した。次いで、ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質（Pierce）0.1mlを15
分間添加した。呈色反応を405nmにおいて読み取った。
結果を表２に示す。
【０１１３】
【表２】
2005255691.tif 000003
ａ.固定化GMP-140を含むマイクロタイターウェルに溶液を添加する前に、ペ
プチド（1.5mM）をmAb（2.5マイクログラム／ml）に添加した。
ｂ.固定化GMP-140へのビオチニル化mAbG1、G2、またはG3の結合を、アビジ
ン検出システムを用いたELlSAにより測定した。
ｃ．G1、G2、およびG3は、固定化GMP-140への好中球の付着を防止する、GMP-
140に結合する抗体である。
【０１１４】
実施例３:好中球の固定化GMP-140への結合の、ペプチドによる阻害に対する
、濃度の影響。
【０１１５】
GMP-140のレクチン様ドメイン由来のペプチドを、実施例１に記載のアッセ
イにおいて、固定化GMP-140への好中球の付着を阻害する、前記ペプチドの能
力をアッセイした。テストした濃度は、0.1mMから1.5mMの範囲であった。
【０１１６】
４つのペプチドに関する結果を図２に示す。GMP-140レクチンドメイン、す
なわち、アミノ酸66-78、アミノ酸73-83、アミノ酸54-63、およびアミノ酸
23-30由来のペプチドが、投与量に依存して結合を阻害したということは明白
である。付着を50％阻害するために必要なペプチドの投与量であるIC50は、ペ
プチドによって、約50μMから約300μMの範囲内で変化する。これらの範囲
は、例えば、Ruoslaghtiらの米国特許第4,792,525号に記載のように、細胞付
着および食作用を変更するためにインビボで用いられるRGD含有ペプチドとの
比較に基づくと、ペプチドをインビボで投与する際の効果的な濃度に十分属す
る。
【０１１７】
実施例４：ペプチドの改変およびGMP-140への付着力の比較
いくつかの場合においては、インビボで分子の半減期を増大させるために、
アミノ酸自身の変更、またはキャリヤー分子への付着により、ペプチドを改変
することが必要である。
【０１１８】
PierceChemicalsから市販されているImjectキットのような標準的な手順を
用いて、レクチンペプチド19-34を、そのＮ末端システインにより、キャリヤ
ータンパク質キーホールリンペットヘモシアニンに結合した。次いで、このペ
プチド−KLH複合体を実施例１に記載のアッセイでテストし、結合した細胞の
数を決定した。
【０１１９】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、（１）ペプチドをコートしていない、（２）
KHLに
結合したレクチンドメインペプチド19-34をコートした、または（３）KLHに
結合した対照カルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基761-777）をコートした
、マイクロタイターウェルに対して行われ、液相競合体の存在下において、各
ウェルに２×105個の好中球を添加する前に、ヒト血清アルブミンを含むハン
クス平衡塩類溶液によりブロックした、好中球の特異的付着を比較したもので
ある。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は、皆無（対照）、精
製血小板糖タンパク質IIb-IIIａ（対照）、または、精製GMP-140（パネルａ
）；あるいは、皆無（対照）、1.5mM Ｃ末端ペプチド761-777（対照）、1.5m
Mレクチンドメインペプチド19-34（パネルｂ）であった。
【０１２０】
グラフより、レクチンペプチド−KHL結合体は、プラスチック上に固定化さ
れた場合は、天然のGMP-140ほど効果的ではないが、好中球の付着を直接支持
するということが明白である。比較のために、ウェルに200,000個の好中球を
添加した時、レクチンペプチド19-34は40,000個を結合し、GMP-140は120,00
0個を結合した。単にプラスチックヘのペプチドのコートを促進するために、
ペプチドをKLHにカップリングする。液相精製GMP-140およびレクチンペプチ
ド19-34を用いるが、他のタンパク質またはペプチドを用いない、付着に関す
る競合能力は、付着が特異的であるということを示す。他の研究においては、
レクチンドメインの他の領域、EGFドメイン、およびGMP-140の散在した他の
領域の多くのペプチドは、固定化GMP-140に対する好中球の付着を阻害しない
。
【０１２１】
実施例５：酵素消化によるGMP-140に対する「リガンド」または「カウンター
レセプター」の特性付け
レクチン19-34ペプチドは、GMP-140の白血球との相互作用をブロックする
３つのモノクローナル抗体すべてがGMP-140と結合するのを妨げる。これによ
り、白血球の認識におけるレクチンドメインの重要性がさらに証明される。こ
のデータから、レクチンドメインのコンフォメーションがEGFドメインと相互
作用することにより調節され、これらの相互作用は次に、レクチンドメインお
よびEGFドメインの両方に結合し得る二価カチオンにより調節されることが仮
定される。この結果、好中球および単球上のレセプターに結合する親和性およ
び特異性を付与する３次元コンフォメーションのレクチンドメインが得られる
。
【０１２２】
好中球を単離し、Ca2+／Mg2+がないHBSSに1mg／mlのHSAおよび1mMのCa2+
を補充した（HBSS／HSA／Ca）に4×106/mlとなるように懸濁し、使用する
まで４℃で保存した。
【０１２３】
好中球をトリプシンまたはエラスターゼのいずれかのプロテアーゼで処理し
て、このレセプターがプロテアーゼ感受性タンパク質成分を含有しているかど
うかを決定した。HBSS／10mMMOPS、pH7.5（HBSS/MOPS)中に懸濁した好中球
を、2mMのジイソプロピルフルオロホスフェート(DFP)で22℃で10分間、2回
処理して、内因性血清プロテアーゼを不活性化した。次に細胞をHBSS/MOPSで
洗浄し、８分の１容量の8％パラホルムアルデヒドで22℃で30分間、固定して
、次に、８分の１容量の0.5Mグリシン／0.25Mトリス、pH7.5を加えた。固定
したHBSS/MOPS中の好中球（7.5×106／ml）をTPCK−トリプシン（0.77μM
、41U／ml）と一緒に10分間、またはエラスターゼ（40μＭ、７.8U／ml）と
一緒に30分間、37℃でインキュベートした。コントロール細胞をDFPまたは緩
衝液のみで予め不活性化した同一濃度の酵素と一緒に同一の条件下でインキュ
ベートした。インキュベーション期間の後、DFPを加えて２mMとし、細胞を、
400gで５分間ペレット化した。細胞をHBSS/MOPSで再懸濁し、さらにDFPを加
えて2mMとした。400gで５分間遠心分離した後、細胞ペレットをHBSS/ヒト血
清アルブミン（HSA)／Ca中に４×106/mlとなるように再懸濁し、［125I］
GMP-140の特異的結合を決定した。0.15ＭNaCl、50mMアセテート、pH6.0、
10mg/ml HSA、９mMCaCl2、0.05％アジ化ナトリウム（消化緩衝液）中にDF
P処理して固定した好中球（1.6×107／ml）を、ノイラミニダーゼ、エンド
−β−ガラクトシダーゼ、または緩衝液と一緒に、20μMロイペプチン、30μ
Mアンチパイン、0.64mMベンザミジン、および100KlU／mlアプロチニンの存在
下で、37℃で時間を変えてインキュべートした。いくつかのインキュべーショ
ンでは、消化緩衝液に溶解した0.5から20mMのノイラミニダーゼインヒビター
Neu2en5Acを加えてインキュベーションした。このような濃度では、インヒビ
ターによる反応混合物のpHへの影響はなかった。酵素による処理の後、細胞を
冷たいHBSS/HSA/Caで２回洗浄し、HBSS/HSA/Ca中に４×106／mlとなるよう
に再懸濁して、その後、［125Ｉ］GMP-140の結合を測定した。使用したNDV
ノイラミニダーゼはウィルス粒子の懸濁液であった。これら粒子の各々は約10
3個のノイラミニダーゼ分子を含有し、一方、V.cholerae酵素は溶液中に存在
する。
【０１２４】
[125Ｉ］GMP-140の好中球への結合はプロテアーゼによって４から５％に
減少したが、ジイソプロピルフルオロホスフェートで不活性化されたエラスタ
ーゼまたはトリプシンによっては減少しなかった。これにより、GMP-140に対
する白血球カウンターレセプターの少なくとも実質的なフラクションは、プロ
テアーゼ感受性タンパク質成分を含有、またはこれに結合することが示される
。
【０１２５】
Vibrio cholera（Boehringer-MannheimBiochemicals, Indianapolis, IN）
またはニューカッスル病ウィルス（NDV)(Paulson,Ｊ.C.,ら、J.Biol.Chem. 2
54:2120-2124(1979)に記載のように単離)のいずれかから得られるノイラミニ
ダーゼ、およびBacteroidesfragilis(Boehringer-Mannheim)から得られるエ
ンド−β−ガラクトシダーゼにより、好中球を処理した。V.choleraから得ら
れるノイラミニダーゼはα2-3-、α2-6-、α2-8-結合したシアル酸を開裂させ
る。NDVノイラミニダーゼは、α2-3-およびα2-8-結合したシアル酸のみを開
裂させる。
【０１２６】
好中球をVibriocholeraから精製したノイラミニダーゼで処理すると、125
［GMP-140］のヒト好中球への結合、および好中球の固定化GMP-140への付着
の両方が著しく減少した。これにより、シアル酸残基がGMP-140に対する白血
球のカウンターレセプターの実質的な成分を構成することがわかる。0.1から
O.2U/mlのV.choleraまたはNDVノイラミニダーゼと一緒に10から30分間イン
キュベートすると、GMP-140の特異的な結合は、偽処理されたコントロールと
比較すると各々28±９および52±９％（平均値±標準偏差、ｎ＝７）に減少し
た。この効果はノイラミニダーゼ調整物中の内因性好中球プロテアーゼまたは
プロテアーゼの混入のいずれかによるものであるという可能性を最小限にする
ために、好中球を固定化する前にDFPで処理し、内因性血清プロテアーゼを不
活性化した。そして、10mg／ml HSAおよびいくつかのプロテアーゼインヒビタ
ーの存在下でノイラミニダーゼをインキュベーションした。ノイラミニダーゼ
効果の特異性はさらに、ノイラミニダーゼの競合インヒビターNeu2en5Acが、
GMP-140の好中球への結合がノイラミニダーゼにより減少するのを阻止し得る
ことにより示された。Neu2en5Acは、用量依存的にノイラミニダーゼの効果を
阻害し、IC50は2.5mMであった。
【０１２７】
これらの結果により、GMP-140に対する白血球上のカウンターレセプター、
またはリガンドは糖タンパク質であり、ここでは、レセプター機能のためには
シアル酸が必要であることが示される。好中球はα2-3-およびα2-6-結合した
シアル酸を共に含有するが、α2-8-結合は検出されていない。NDVノイラミニ
ダーゼで処理した後、GMP-140の結合が一部失われることから、レセプター中
のシアル酸結合の少なくともいくつかはα2-3-型であることが示唆される。V.
cholera酵素を使用してさらに大きな阻害が観察されたことは、α2-6-結合が
またレセプター機能のためにも必要であることを意味し得、または、これらの
結果は、無傷ウィルスの成分であるNDV酵素によって本質的な結合のすべてに
接近し得ないためであり得る。
【０１２８】
赤血球細胞およびリンパ球細胞とは対照的に、骨髄細胞は、α2-3-またはα
2-6-結合シアル酸を末端とし得るポリラクトサミノグリカンが豊富である。こ
れらラクトサミノグリカンの多くはフコシル化されている。これらの構造は好
中球の糖タンパク質および糖脂質の両方に存在する。GMP-140の認識における
これらグリカンの可能な役割を調べるために、細胞を、糖タンパク質の分枝し
ていないポリラクトサミニル側鎖のガラクトースとＮ−アセチルグルコサミン
（Galβ1-4GlcNAc）との間のβ１−４結合を加水分解するエンド−β−ガラ
クトシダーゼで処理した。固定した好中球をO.2U／mlまでのE.freundiiエンド
−β−ガラクトシダーゼで30分間、または0.4U／mlまでのB.fragilisエンド−
β−ガラクトシダーゼで60分間、前処理してもGMP-140の特異的結合に対する
影響はなかった。これらの酵素が結合に影響を与えないことは、GMP-140を認
識する構造がポリラクトサミン側鎖上には存在しないことと一致する。別の可
能性として、および恐らくより高い可能性として、関連する側鎖はこれらの条
件下では酵素による加水分解に対して非感受性であり得る。分枝したポリラク
トサミノグリカンは好中球には存在しないが、高度にフコシル化したおよび／
または分枝したポリラクトサミノグリカンはこの酵素による加水分解に耐性で
ある。さらに、Ｎ−またはＯ−結合構造のコアに直接結合する単一のラクトサ
ミノグリカンは酵素に耐性であり得る。
【０１２９】
実施例６：シアル化したフコシル化構造がGMP-140に結合するための必要条件
以下の研究は、ジョージア大学のRichard Cummingsによりチャイニーズハム
スターの卵巣細胞、すなわちCHO細胞を使用して行われた。使用した細胞系に
は、Ade-C細胞および特異的グリコシルトランスフェラーゼで永久にトランス
フェクトされたAde-C細胞が含まれる。Ade-C細胞は、これらが非常に低レベ
ルの内因性α（１，３）フコシルトランスフェラーゼを含有するために選択さ
れた。これらの細胞は以下に述べる研究では野生型細胞と呼ばれる。トランス
フェトされた細胞は、野生型細胞上には存在しない特定の型のオリゴ糖を発現
する。Lec8CHOと呼ばれる、使用する別のCHO細胞系にはUDPGalに対するトラ
ンスポーターを欠く。この結果、細胞にはガラクトシル化およびシアル化した
複合糖質がない（DeutscherおよびHirschberg、J.Biol.Chem.261:96-100,19
86)。これらのいくつかの細胞に存在するオリゴ糖構造およびその細胞の型を
表３に示す。関連する細胞としては、野生型細胞(CHO)、ネオルイス(Neo Lew
)、ネオルイス関連細胞(NeoLew(rel))、およびLec8 CHO細胞(Lec8)がある。
【０１３０】
【表３】
2005255691.tif 000004
以下の方法を用いて細胞を培養およびトランスフェクトした。
【０１３１】
CHO系のAde-C（0atesおよびPatterson、Som.Cell Genet. 3:561-577(1
977);Van Keurenら、Am.J.Hum.Genet．38：793-804(1986))を、10％のウシ胎
児血清を補充したα−改変イーグル培地で増殖させた。トランスフェクトされ
たCHO細胞を、400μｇ／mlのG418（GIBC0）（活性薬剤）を補充した培地で
増殖させた。
【０１３２】
前述のように、Ade-CCHO細胞をα(1,3/1,4)フコシルトランスフェラーゼ
をコードするDNAで安定にトランスフェクトすることにより、NewLew CH0細
胞を調製した（Loweら、Cell63：475-484,1990、この文献ではこの細胞をCH
0-FTと呼んだ）。野生型CHO細胞を、GDPフコースが非シアル化ラクトサミノ
グリカンのみに転移するのを触媒するα（１，３）フコシルトランスフェラー
ゼをコードするDNAで同様の方法により安定にトランスフェクトすることによ
り、NeoLew(re1)(re1）関連細胞を調製した。このトランスフェラーゼは、Lo
weら、Cell63：475-484、1990に記載されている。これらトランスフェクト
された細胞系は共にミシガン大学のDr.John Loweから贈与されたものである。
【０１３３】
GMP-140を含有するセレクチンが結合する炭水化物に関する結果および結論
野生型CHO細胞およびトランスフェクトされたCHO細胞により生成される構
造を表３に示す。野生型CHO細胞はGalβ1,4 GlcNAcβ1,3二糖類の単位を繰
り返し発現し、これらのうちのいくつかはα２，３結合する末端シアル酸（Ne
uAc)を有する。これらはα2，6結合するシアル酸結合を有せず、またフコー
ス結合を有しない。さらに、これらはII型構造(3Galβ1,4GlcNAcβ1)を合成
するが、Ｉ型構造(3Ga1β1,3GlcNAcβ1)は合成しない。NeoLewis細胞はα1,
3(4)フコシルトランスフェラーゼをコードするcDNAでトランスフェクトされ、
これはドナーとしてCDPフコースを使用し、そしてフコースがGalβ1,4GlcNA
c-Rに付加するのを触媒してGalβ1,4（Fucα1,3)GlcNAc-Rを生成させる。
これはLex構造である（時には、SSEA-1抗原としても知られている）。同じ酵
素は、フコースをシアル化基質NeuAcα2，3Ga1β1,4GlcNAc-Rに転移して、
NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAc-Rを生成する。これはシアリルLex構
造である。他の２つの関連する構造、VIM-2およびジフコシルLexもまた、表
に示すように、NeoLewis細胞および他の多種類のシアル化したポリフコシル化
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型構造により生成される。NeoLewis関連細胞
を、異なるフコシルトランスフェラーゼである、α1,3フコシルトランスフェ
ラーゼでトランスフェクトした。これは、GDPフコースがGa1β1,4GlcNAc-R
の非シアル化基質のみに転移するのを触媒する。これは、Lex構造を生成する
(表３参照)。
【０１３４】
これらの細胞のGMP-140と相互作用する能力を試験するために、好中球およ
びHL60細胞に対して使用される付着アッセイ（J.-G．Gengら、Nature343：75
7−760，1990）を僅かに改変した方法を、精製されたGMP-140およびGMP-14
0に対するモノクローナル抗体と共に使用した。GMP-140を濃度を高めながら
プラスチックのウェルに固定し、次にウェルをアルブミンを含有する緩衝液で
ブロックした。［35S］メチオニンで代謝的に標識されたCHO細胞またはHL-6
0細胞を、Ca2+の存在下または非存在下でウェルに加えて、結合した細胞を可
溶化し、そして放射能を定量することにより付着力を測定した。
【０１３５】
結合アッセイの結果を図４Ａ（CHOのGMP-140への結合）；図４Ｂ（Lec 8
CHOのGMP-140への結合）；図４Ｃ（NeoLewisCHOのGMP-140への結合）；お
よび図４Ｄ（HL60細胞のGMP-140への結合）に示す。
【０１３６】
Gengら、Nature343：757-760（1990）に記載のように、HL-60細胞は、Ca
2+に依存的にGMP-140でコートしたウェルに特異的に結合した。野生型CHO細
胞、Lec 8CHO細胞、およびNeoLewis関連CHO細胞は結合しなかった。しかし
、HL-60細胞のように、NeoLewisCHO細胞は、Ca2+に依存的に固定したGMP-14
0に強く結合した。付着は特異的であった。これは、図５に示すように、GMP-
140に対するブロッキングモノクローナル抗体であるG1により阻害されるが、
非ブロッキング抗体であるS12によっては阻害されなかったためである。付着
性は決定的にシアル酸に依存した。これは、NeoLewis CH0細胞をVibrio chole
raから得られるノイラミニラーゼで処理することにより、結合が破壊されたた
めである。NeoLewisCH0細胞をトリプシンで予め処理することにより結合が60
％減少した。これにより、細胞上のGMP-140に対するオリゴ糖リガンドの少な
くとも実質的なフラクションがタンパク質により運ばれることが示唆される。
【０１３７】
これらのデータにより、GMP-140に対するオリゴ糖リガンドはシアル化した
フコシル化構造であることが確認される。シアル酸結合は、CHO細胞がα2,6
結合を有しないため、Galにα2,3結合し得る。フコース結合はGlcNAcにα1,
3結合し、GlcNAcにはβ1,4結合によりGalが結合している。可能な構造とし
ては、シアリルLex自体、ジフコシルシアリルLex、シアリルLexのより長い
ポリフコシル化ポリラクトサミノグリカン変異株、または上記成分の要素を含
有する分枝構造がある。Lex自体は結合に対する必要な親和性または特異性を
提供しない。末端シアル酸に最も近いGlcNAcに結合するFucがないシアル化構
造を有するVlM-2は、この構造はGMP-140に結合しないNeoLewis関連細胞上に
存在するため、GMP-140に対して親和性を有し得る。しかし、NeoLewis関連細
胞上に存在するVIM-2の数量は知られていない。数量が少ない場合は、VIM-2
がGMP-140に対していくらか親和性がある場合でも、細胞は十分には結合しな
い。
【０１３８】
別の研究により、高濃度のLexは付着を阻害することが示されているが、Le
x三糖類を含むLNFIIIは、300μMまでの濃度では、精製され固定化されたGM
P-140への好中球の結合には全く影響を及ぼさない。
【０１３９】
実施例７：GMP-140およびELAM-1によるリガンドの結合における相違の証明
ELAM-1およびGMP-140に対するリガンドが同一または非常に類似しているこ
とを示すデータにもかかわらず、そうではないことを示す２つの証拠がある。
【０１４０】
まず第１に、GMP-140またはELAM-1をコードするcDNAでトランスフェクトさ
れたCOS細胞への好中球の付着は、両タイプのトランスフェクトされた細胞に
対して特異的な付着を示す。Gengら、Nature（1990）に記載されているように
、GMP-140でトランスフェクトされた細胞への付着を、GMP-140に対するモノ
クローナル抗体G1によりブロックし、ELAM-1でトランスフェクトされた細胞へ
の付着を、ELAM-1に対するモノクローナル抗体H18/7によりブロックした。し
かし液相GMP-140は、GMP-140でトランスフェクトされた細胞への付着をブロ
ックしたが、ELAM-1でトランスフェクトされた細胞への付着には影響を与えな
かった（図６）。
【０１４１】
第２に、豊富な量のシアリルLexを含むヒトがん腫細胞系HT-29は、ELAM-1
でトランスフェクトされた細胞に結合するが、GMP-140でトランスフェクトさ
れた細胞には結合しない（図７）。
【０１４２】
図６および図７のデータは、GMP-140およびELAM-1が、若干異なる構造のリ
ガンドを認識し、そして／または同じリガンドを認識する親和性の点で異なる
ことを示している。GMP-140およびELAM-1はそれぞれ、親和性の程度が異なる
関連したオリゴ糖構造の範囲に結合し得る。
【０１４３】
ELAM-1およびGMP-140による結合を比較研究するために使用される方法およ
び物質は、以下のものであった：
細胞の単離および培養物
Mooreら、J.CellBiol. 112、491-499（1991）に記載されているように、
モノポリ分離媒体を用いて、正常なボランティアからヒト好中球を単離した。
ヒトHL-60前骨髄細胞およびHT-29ヒト結腸がん腫細胞を、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（Rockville，MD）から得た。HL-60細胞を、RPMI-1
640/10％ウシ胎児血清中に保存した。HT-29細胞を、10％ウシ胎児血清（fcs
）を補充したMcCoyの5a培地の培養物中に保存した。COS-7細胞を、10％ウシ
血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（HG-DMEM）中に保存した。
【０１４４】
COS7細胞トランスフェクションおよび好中球ロゼッティングアッセイ
GMP-140またはELAM-1をコードする全長cDNAを、Gengら、Nature(1990)に
より記載されているように、CDM8に挿入した。COS7細胞を、10％ウシ血清を補
充した高グルコースDMEM(Gibco)(HG-DMEM/10％CS)を含む10cmペトリ皿におい
て、約80％コンフルエンスになるまで増殖させた。50μlのトランスフェクチ
ンTM試薬(BRL Life Technologies,Inc.)を、50μlの水中20μgのcDNAまたは
水のみと混合し、室温で15分間放置した。COS細胞を3mlの0ptiMEMTMI還元
血清血清培地（BRLLife Technogies,Inc.)で２回洗浄した後、cDNA-リポフ
ェクチン試薬混合物を加え、５％のC02雰囲気中37℃で一昼夜インキュベート
した。６mlのHG-DMEM/10％CSを加え、細胞をさらに24時間インキュベートし
た。次いで、Ca+2およびMg+2を含まないHBSSで単層を１回洗浄し、0.02％のED
TAを用いて細胞を分離し、遠心分離によりペレット化し、次いで12mlのHG-DME
M/10％ CS中で再懸濁した。２mlの細胞懸濁液を、３mlのHG-DMEM/10％CSを
含む６-ウェルの組織培養物（Corning）を含む各ウェルにプレートし、さら
に24時間増殖した。付着アッセイの前に、ウェルをHBSSで２回洗浄した。ウェ
ルを、30μg/mlのG1F(ab')2、H18/7 F(ab')2または緩衝液のみを含む0.5m
lのHBSSと一緒に22℃で30分間インキュベートし、これを２回繰り返した。次
いで、30μg/mlのGMP-140または希釈液の存在下で30分間インキュベートして
新たに単離したヒト好中球（HBSS中２×106／ml）１mlを単層に加え、22℃で
20分間インキュベートした。
【０１４５】
新たに単離したヒト好中球または35S−メチオニンで標識したHT-29細胞(H
BSS中2×106/1％HSA)を1ml加え、22℃で20分間インキュベートした。いく
つかの実験において、付着アッセイの前に、好中球を、精製されたGMP-140（
最終濃度10μg／ml）と一緒に22℃で30分間、インキュベートした。
【０１４６】
細胞付着をアッセイするために、５mlのHBSS／１％ HSAで５回洗浄した後、
付着した好中球を、50mMのリン酸カリウム中0.5％のヘキサデシルトリメチル
臭化アンモニウム（pH6.0）200μlで可溶性にした。Gengら、Nature343，
757-760（1990）により記載されているように、付着した好中球をミエロペル
オキシダーゼで２回繰り返しアッセイした。HT-29細胞付着をアッセイするた
めに、付着細胞を１％のトリトンX100で可溶性にし、液体シンチレーションカ
ウンティングにより定量した。界面活性剤を加える前に、単層を位相差顕微鏡
検査により検査し、単層が十分に洗浄され、COS細胞単層が無傷であることを
確認した。
【０１４７】
結果
GMP-140は、GMP-140をコードするcDNAでトランスフェクトされたCOS7細胞
への好中球の付着を阻害するが、ELAM-1をコードするcDNAでトランスフェクト
された細胞への付着は阻害しない。COS7細胞を、GMP-140またはELAM-1をコー
ドするcDNAで偽トランスフェクトまたはトランスフェクトした。精製されたGM
P-140、G1 F(ab')2またはH18/7F(ab')2（最終濃度はすべて10μg/ml）が
、トランスフェクトされたCOS7細胞に好中球がロゼッティングするのを阻害す
る能力を、図６に示す。データは、２つの独立したトランスフェクション実験
からの結果である。各トランスフェクションにおいて、GMP-140およびG1 F(a
b')2またはH18/7F（ab')2の存在下または非存在下で、付着アッセイを単
層上で２回繰り返し行った。結果を、結合した好中球の数（平均±SD）として
表す。
【０１４８】
この結果は、好中球が、ELAM-1またはGMP-140をコードするcDNAでトランス
フェクトされたCOS細胞に結合し、その結合が適切なモノクローナル抗体によ
り阻害されることを明確に示している。すなわち、抗ELAM-1抗体(H18/7)は、
ELAM-1でトランスフェクトされた細胞への好中球の結合をブロックし、抗GMP-
140抗体(G1)は、GMP-140でトランスフェクトされたCOS細胞への好中球の結
合をブロックする。しかし、液相GMP-140は、GMP-140でトランスフェクトさ
れたCOS細胞への好中球の付着を完全にブロックするが、ELAM-1でトランスフ
ェクトされたCOS細胞への好中球の付着には影響を与えない。
【０１４９】
次いで、大量のシアリルLex構造を含むHT-29細胞の結合における相違を調
べるために、トランスフェクトされたCOS細胞を用いた。図７に示す結果は、
HT-29細胞がELAM-1でトランスフェクトされた細胞に強く結合するが、GMP-14
0でトランスフェクトされた細胞には全く結合しないことを示している。従っ
て、GMP-140およびELAM-1は両方とも、α（2,3）シアル化α（1,3）フコシ
ル化ラクトサミノグリカンを含むオリゴ糖構造を認識するが、HT-29細胞と、
GMP-140およびELAM-1でトランスフェクトされたCOS細胞との相互作用は、同
一ではない。
【０１５０】
実施例８：好中球におけるGMP-140リガンドのタンパク質成分の特性付け
トリプシンによる好中球の処理により、特異的なGMP-140の結合が破壊され
た。このことは、好中球におけるGMP-140に対する優勢なリガンドがグリコス
ピンゴリピドではなく表面糖タンパク質であることを示している。図８に示す
ように、HL-60細胞およびNeoLewisCHO細胞のトリプシン処理もまた、GMP-14
0へのそれらの付着を著しく減少させた。このことは、糖タンパク質成分は、
これらの細胞におけるGMP-140に対する主要なリガンドでもあることを示して
いる。CHO細胞により合成された単一糖脂質は、トランスフェクトされたフコ
シルトランスフェラーゼの基質ではないため、糖脂質リガンドは、NeoLewis C
HO細胞上では期待されない。GMP-140により認識されるオリゴ糖構造を有する
表面タンパク質は、ヒト骨髄細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞にお
いては同一ではないようである。このことは、リガンドへのGMP-140の強い親
和性結合は、タンパク質間の相互作用を必要としないことを示唆している。
【０１５１】
トリプシン処理については、HEPES緩衝液Ａ中で懸濁したNeoLewis CH0細胞
を、0.1％のDPCC−トリプシンと一緒に37℃で10分間インキュベートした。コ
ントロール細胞を、DFPで不可逆的に不活性化したDPCC−トリプシンと一緒に
、同一条件下でインキュベートした。トリプシン処理後、細胞を氷上で冷凍し
、最終濃度が2mMになるようにDFPを加えて酵素を不活性化した。トリプシン
で処理した後、アッセイする前に、細胞を氷で冷却したHEPES緩衝液Ａで２回
洗浄した。
【０１５２】
好中球の場合、還元条件下でSDS-PAGEにより分析すると、GMP-140で認識さ
れた主要な糖タンパク質の、見かけ上のMrは約120,000であることが証明され
ている。ヒト好中球の原形質膜フラクションを調製し、その調製物を「リガン
ドブロッティング」で分析した。この調製物をSDS-PAGEで分画し、イモビロン
膜に移し換え、［125I］GMP-140でプローブした。還元条件下では、標識さ
れたGMP-140は120-kDバンドに一貫して結合しているのが観察された。この結
合は特異的である。なぜなら、Ca2+依存性であり、抗体G1によりブロックされ
るが、S12によってはブロックされず、ノイラミニダーゼによる膜の前処理に
より除去されるからである。このタンパク質は、小麦胚芽凝集素アフィニティ
ーカラム上に定量的に結合し、このことは、シアル化されたオリゴ糖を広く含
むことを示している。
【０１５３】
このタンパク質は、AffigelTMに結合したGMP-140のアフィニティーカラム
に結合し、カラムから溶出され得る。部分的に精製されたタンパク質は、銀お
よびクーマシーブルーではあまり染色されない。このタンパク質は、同様の見
かけ上のMrを有し、SDSポリアクリルアミドゲル上に染色パターンを有するロ
イコシアリンとして公知の、強く０−グリコシル化されたタンパク質を示し得
る。さらに、低用量のノイラミニダーゼでこのタンパク質を処理すると、タン
パク質からはすべてのシアル酸が除去されるわけではないが、結果としてゲル
上の移動度はゆるやかになり、特定の強く０−グリコシル化されたタンパク質
が部分的に脱シアル酸化されたパターンと一致する。
【０１５４】
GMP-140に対するオリゴ糖リガンドを有する骨髄細胞には、他のタンパク質
が存在し得る。リガンドブロッティングにより決定されるように、120-kDa糖
タンパク質は、GMP-140に最も強い親和性で結合する最も豊富なリガンドおよ
び／またはその構造を示し得る。
【０１５５】
GMP-140のレクチンドメインまたはGMP-140と相互作用する炭水化物由来のペ
プチドからの診断試薬および治療薬の調製
上記のペプチドおよび炭水化物は、診断試薬として様々に応用され、特に、
多くの炎症性疾患の治療に適用される。
【０１５６】
診断試薬
GMP-140に結合するペプチドおよび抗体または炭水化物に対する他のプロー
ブはまた、GMP-140のリガンドを欠くヒトの疾患の検出に使用され得る。この
ような疾患は、白血球が活性化された血小板または内皮に結合し得ない感染症
に感染しやすい患者に多く見られる。テストされる細胞、通常白血球を、医学
的に容認されている標準技術で集めてスクリーニングする。検出システムには
、ELlSA法、放射標識された抗体の固定化された活性化細胞への結合、フロー
サイトメトリー、または当業者に公知の他の方法が含まれる。
【０１５７】
レクチンドメインペプチドの存在下および非存在下での結合の阻害は、セレ
クチン結合における欠陥または改変を検出するのに使用され得る。このような
疾患は、GMP-140に対する白血球のリガンドがないために、白血球が血小板お
よび内皮に対して結合しない感染症に感染しやすい患者に多く見られる。GMP-
140ペプチドを、蛍光タッグで放射的に、酵素的に、または電子顕微鏡の金の
ような高電子密度物質で標識する。検査される細胞、通常白血球は、標識され
たGMP-140ペプチドと一緒にインキュベートされ、結合は、GMP-140に対する
抗体を用いて上記の方法により評価されるか、または当業者に公知の他の方法
により評価される。GMP-140に対するリガンドが血漿中にも見いだされると、
それらはまた、検出試薬として抗体の代わりに標識されたGMP-140ペプチドを
用いて、標準ELlSA法またはラジオイムノアッセイ法により測定され得る。
【０１５８】
同様のアプローチは、GMP-140の定性的または定量的な疾患を決定するのに
も使用され得る。炭水化物を標識し、GMP-140に欠陥があると思われる疾患を
有する患者からの活性化血小板におけるGMP-140への炭水化物の結合能力をテ
ストする。
【０１５９】
臨床上の応用
GMP-140は、白血球付着、炎症および凝血に関連したいくつかの機能を有す
るため、GMP-140ならびに／あるいは、ELAM-1およびLEU-8を含む、GMP-140
ペプチドまたは炭水化物のような他のセレクチン結合に相互作用する臨床上の
化合物は、これらの応答を調節するために使用され得る。
【０１６０】
例えば、GMP-140ペプチドまたは炭水化物は、活性化された血小板または内
皮細胞の表面にあるGMP-140のレセプターへ競合的に結合することにより、白
血球の付着を競合的に阻害するのに使用され得る。この種の治療法は、白血球
により媒介される炎症の阻害が望ましい急性の状況下において特に有用であり
得、効果的であるが一時的である。GMP-140ペプチドまたは炭水化物の注入に
よる慢性治療法もまた、いくつかの状況では可能である。
【０１６１】
炎症応答は、もし再チェックされなければ、宿主を損傷し得る。なぜなら、
白血球は、正常な組織を損傷し得る有毒な分子を多く放出するためである。こ
れらの分子には、タンパク質分解酵素およびフリーラジカルが含まれる。白血
球が組織に損傷を与え得る病理的状態の例としては、虚血および再灌流からの
傷害、細菌性敗血症、血管内凝固症候群、成人呼吸性困難症候群、腫瘍転移、
慢性関節リウマチ、およびアテローム硬化症が挙げられる。
【０１６２】
灌流傷害は、臨床心臓学において主要な問題である。虚血性心筋層における
白血球付着を減少させる治療剤は、血栓崩壊性剤の治療的効能を著しく引き上
げ得る。組織プラスミノゲン活性剤またはストレプトキナーゼのような物質に
よる血栓崩壊性療法は、可逆的な心筋細胞死の前の深刻な心筋虚血を有する多
くの患者における環状動脈閉塞を和らげ得る。しかし、このような患者の多く
は、血流の回復にもかかわらず心筋神経症を煩っている。この「再灌流傷害」
は、心筋領域における血管内皮への白血球の付着と関連していることが知られ
ている。これは、一部には、白血球に対して付着性とする、トロンビンおよび
サイトカインによる血小板および内皮の活性化のためであろう（Romsonら、Ci
rculation 67：1016-1023,1983)。これらの付着白血球は、内皮を通じて拡散
し、血流の回復により救済されるように心筋虚血を破壊し得る。
【０１６３】
心筋および再灌流により、発作、腸間膜および末梢血管、臓器移植、および
循環器系統のショック（この場合、多くの臓器は血流の回復により傷害を与え
られる）を含む、血管表面への白血球の付着による臓器傷害が引き起こされる
、多数の他の通常の臨床上の疾患がある。
【０１６４】
細菌性敗血症および血管内凝固症候群はしばしば重症の患者には同時に発生
する。これらは、トロンビン、サイトキンおよび他の炎症性媒介物、血小板お
よび内皮の活性化、白血球の付着、ならびに血管系全体における血小板の凝集
と関連している。白血球に依存する臓器傷害は、これらの症状の重要な特徴で
ある。
【０１６５】
成人呼吸性困難症候群は、敗血症または肺循環における白血球の広範囲な付
着および凝集と関連する以下の外傷を有する患者において発生する荒廃する肺
疾患である。これにより、大量の血漿が肺に溢血し、肺組織が破壊される。大
抵、これらは両方とも白血球産物により媒介される。
【０１６６】
しばしば致命的な２つの関連した肺疾患は、同種間の骨髄移植を受ける免疫
抑制患者、およびインターロイキン−２で処理されたLAK細胞(リンフォカイ
ン活性リンパ球)を用いた治療により生じる血管漏れに起因する合併症を煩う
がん患者において見られる。LAK細胞は、血管壁に付着し、内皮に毒性と思わ
れる産物を放出することが公知である。LAK細胞が内皮に付着するメカニズム
は知られていないが、このような細胞は、内皮を活性化する分子を潜在的に放
出し、次いで好中球において作用するメカニズムと同様のメカニズムにより内
皮に付着する。
【０１６７】
多くの悪性腫瘍（がん腫、リンパ腫および肉腫）からの腫瘍細胞は、血管系
を通じて遠位部位に転移し得る。腫瘍細胞が内皮に付着するメカニズムおよび
それに続く移行は、あまりよく理解されていないが、少なくともいくつかの点
で、白血球のメカニズムと同様であり得る。血小板と転移腫瘍細胞との結合に
ついては詳しく記載されており、いくつかのがんの蔓延における血小板の役割
を示唆している。
【０１６８】
血小板−白血球の相互作用は、アテローム硬化症において重要であると考え
られる。血小板は、単球がアテローム硬化プラークに補充される際の役割を果
たし得る。単球の蓄積は、アテローム発生中の最も初期に検出可能な症状の１
つであることが知られている。完全に発達したプラークが破裂すると、血小板
の沈着、活性化、血栓形成の促進、ならびに虚血領域への好中球の初期補充が
引き起こされ得る。
【０１６９】
他の領域における可能な応用は、慢性関節リウマチの治療である。
【０１７０】
これらの臨床上の応用では、適切な薬学的キャリヤー中のペプチドまたは炭
水化物またはその混合物は、迅速な緩和を必要とする場所に静脈注射により投
与されるのが好ましい。ペプチドもしくは炭水化物はまた、キャリヤー分子に
結合したペプチドもしくは炭水化物として、筋肉内、腹膜内、皮下、経口によ
り、または薬物送達装置によっても投与され得る。ペプチドまたは炭水化物は
、インビボにおける半減期を増加させるために、さらに化学的に改変され得る
。
【０１７１】
ペプチドは、GMP-140のタンパク質分解的開裂、または好ましくは実施例
１においてペプチドを調製するために使用したような合成手段により調製され
得る。これらの方法は、当業者により公知である。例としては、米国特許第4,
792,525号において使用され、米国特許第4,244,946号において記載されてい
る、J.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85,2149(1964）により記載の固相合成が
挙げられる。この合成では、保護されたαアミノ酸は、適切な樹脂に結合され
、Ｃ末端から開始するペプチドの合成を開始する。他の合成方法については、
米国特許第4,305,872号および第4,316,891号に記載されている。これらの方
法は、GMP-140と同一の配列を有するペプチド、またはアミノ酸の置換物また
は付加物を合成するのに使用され得、これらは、実施例１および２に記載され
ているように、その活性を調べるためにスクリーニングされ得る。
【０１７２】
ペプチドはまた、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸
およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコー
ル酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸および
フマル酸のような有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニ
ウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキル
およびアリルアミンのような有機塩基、および置換エタノールアミンとの反応
により形成される薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として投与され得る
。
【０１７３】
シクロプロピルアミノ酸、または同様に誘導されるアミノ酸を含むペプチド
もまた使用され得る。これらのペプチドは、その最初の活性を保持するが、イ
ンビボにおいて半減期を増加した。アミノ酸を改変することが知られている方
法、およびその使用については、例えば、Stammerの米国特許第4,629,784号
に記載されているように、当業者に公知である。
【０１７４】
炭水化物は、天然に、またはトランスフェクトされたCos細胞の例において
記載されているような遺伝子工学の結果、または好ましくは合成手段により、
炭水化物を発現する細胞から単離され得る。これらの方法は、当業者に公知で
ある。さらに、多数のグリコシルトランスフェラーゼがクローニングされてい
る(J.C.PaulsonおよびK.J.Colley,J.Biol.Chem. 264:17615−17618,1989)。
従って、当業者は、調合薬または診断試薬を調製するために、合成化学および
酵素的合成を組み合わせて使用することができる。
【０１７５】
生物学的に活性なペプチドおよび炭水化物は、GMP-140への好中球および単
球の結合を阻害するもの、またはELAM-1および／またはホーミングレセプター
の媒介による白血球の内皮への付着を阻害するものである。
【０１７６】
患者への投与に適切な薬学ビヒクルは、当業者に公知である。非経口投与で
は、ペプチドまたは炭水化物は、通常、滅菌水または生理食塩水中で溶解また
は懸濁され得る。腸内投与では、ペプチドまたは炭水化物は、錠剤、液体また
はカプセル形態で不活性キャリヤーに導入され得る。適切なキャリヤーは、デ
ンプンまたは砂糖であり、潤滑剤、香料、結合剤および同じ特性を有する他の
物質が含まれる。GMP-140ペプチドまたは炭水化物はまた、創傷部または炎症
部位に、特異的には溶液またはクリームで塗布して局部投与され得る。
【０１７７】
あるいは、ペプチドまたは炭水化物は、リポソームまたはマイクロスフェア
（または微量粒子）で投与され得る。患者へ投与するためのリポソームおよび
マイクロスフェアを調製するための方法は、当業者に公知である。米国特許第
4，789,734号は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化する方法につい
て記載している。実質的に、物質は、水溶液に溶解され、必要に応じて、界面
活性剤と共に適切なリン脂質および脂質が添加され、物質は、必要に応じて透
析または超音波処理される。公知の方法は、G.Gregoriadis,14章、"Liposomes
"，DrugCarriers in Biology and Medicine pp．287-341(Academic Press，
1979）により詳しく記載されており、その教示は本願で参考のために援用して
いる。ポリマーまたはタンパク質により形成されるマイクロスフェアは、当業
者に公知であり、胃腸管を通じて血流に直接送達されるように設計され得る。
あるいは、ペプチドまたは炭水化物が導入され、マイクロスフェアまたはマイ
クロスフェアの複合体が数日から数カ月の期間に渡ってゆっくりと放出される
ように移植され得る。例えば、米国特許第4,906,474号、第4,925,673号およ
び第3,625,214号を参照。
【０１７８】
主題のペプチドは、一般に、体重１ｋｇ当り約１μｇより多い量で非経口投
与されると活性となる。大抵の炎症性疾患の治療には、投与量は、体重１ｋｇ
当り0.1から30mgの間である。実施例で特徴づけられるペプチドの中には、70
mg/kgの投与量が必要なものもある。この投与量は、一部には、１つ以上のペ
プチドが投与されるか否かに依存し得る。レクチンドメインの３つの領域の結
合に関して記載されているように、相乗効果は、レクチンドメインの異なるま
たは重複する領域からのペプチドの組合せ、またはGMP-140のEGFドメイン由
来のペプチドとの組合せにより見られる。
【０１７９】
炭水化物は、非経口または他の手段により投与されるときに、活性とならな
ければならない。必要な量は、インビトロアッセイにおけるGMP-140の骨髄性
細胞への結合の阻害に必要な濃度、および注入された炭水化物のクリアランス
速度に基づく。この投与量は、一部には、１つまたはそれ以上の炭水化物が投
与されるか否かに依存し得る。相乗効果は、炭水化物の組合せ、または多価形
態の天然のリガンドもしくはGMP-140に対する親和性および／または親和力を
増加させるために設計されたリガンドの誘導体により見られる。
【０１８０】
ペプチドまたは炭水化物はまた、白血球の血小板または内皮への付着を防止
するために、身体に注入される補てつ物として使用されるために、基質にコー
ティングされ得る。
【０１８１】
GMP-140、そのペプチドまたは炭水化物の抗体を用いた治療理学療法に対す
る応答を評価するための基準は、特定の条件により左右され、通常、標準的な
医学的実践に従う。例えば、心筋梗塞の拡張を防止するために有効な投与量の
基準は、心電図、生存徴候および臨床応答をモニターして、血漿中の心筋懐死
のマーカー酵素を観察することにより、当業者により決定され得る。急性呼吸
性困難症候群の治療では、動脈酸素および肺浸潤物の分解における改善、なら
びに呼吸困難および頻呼吸の減少により測定される臨床上の改善が調べられる
。ショックを起こした（低血圧）の患者の治療では、有効な投与量は、臨床上
の応答、および血圧回復後の、肝臓および腎臓のような生体臓器の機能の特異
的な測定に基づく。神経機能は、発作を起こした患者においてモニターされる
。移植された臓器の機能をモニターするために、特異的なテストが使用され、
例えば、腎臓移植を受けた患者の血清、尿流、および血清電解質がモニターさ
れる。
【０１８２】
本発明の変更および改変、GMP-140由来のペプチドを用いたGMP-140を含む
結合反応を調節する方法、またはGMP-140リガンドの部分を形成する方法は、
上記の詳細な記載より当業者に自明である。このような変更および改変は、添
付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０１８３】
GMP-140のレクチン結合領域の３つの領域由来のペプチドは、GMP-140、EL
AM-1およびリンパ球ホーミングレセプターを含む、「セレクチン類」と選択的
に相互作用することが発見された。３つの領域には、アミノ酸19-34、54-72
および66-89が含まれる。この番号は、シグナルペプチドを開裂した後の成熟
タンパク質のＮ末端を残基１と定義した、ペプチド中の残基の番号に基づく。
GMP-140に結合するフコシル化シアル化ラクトサミン構造もまた発見された。
この構造は、α(2,3)シアル酸で置換したラクトサミノグリカン類を含む受容
体を改変し得るα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ類の発現により形成され
る。LexGalβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1-R（ここで、Ｒはタンパク質または
他の炭水化物構造である）は、このシアル化構造のコアを形成する。ペプチド
および炭水化物構造は、診断薬、および凝血過程または炎症過程の調節または
阻害への臨床上の応用において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１Ａ】図１は内皮細胞GMP-140のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列である。読取り枠の翻訳アミノ酸配列は、一文字コードで示してある。終止コドンは星印で示している。細い下線は、血小板GMP-140のＮ末端を含むＮ末端から26のペプチドから決定したアミノ酸配列の一致している位置を示す。シグナルペプチドは-41から-1の位置に相当する。推定トランスメンブランドメインには太い下線をつけてある。システイン残基は丸で囲み、アスパラギンが連結した潜在的なグリコシル化部位(NXS/T）は黒丸で示してある。３’未翻訳領域における２つの潜在的なポリアデニル化シグナルには上側と下側に線をつけてある。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【図２】図２は、GMP-140のレクチンドメインである、アミノ酸66-78（三角印）、アミノ酸73-83（四角印）、アミノ酸54-63（丸印）およびアミノ酸23-30（黒丸印）が、ペプチドによって結合が阻害されるのを、ペプチドのmMの値に対して結合した細胞の数を比較して実証したグラフである。
【図３】図３（ａ）および（ｂ）は、次のようなマイクロタイターウェルヘの好中球の特異的付着性を比較した図であり、すなわち、(1)ペプチドをコートしていないウェル；（2）KHLに結合されたレクチンドメインペプチド19-34をコートしたウェル；または(3)KLHに結合された対照のカルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基761〜777）をコートしたウェル；をヒト血清アルブミンを含有するハンクスの平衡塩類溶液で遮断したのちに、各ウェル毎に液相競合体の存在下２×105の好中球を添加して比較した。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は次の通りである。図３（ａ）；含有せず（黒バー印）、精製血小板の糖タンパク質IIｂ-IIIａ（斜線バー印）、または精製GMP-140（点彩バー印）；ならびに図３（ｂ）；含有せず（黒バー印）、1.5mM Ｃ末端ペプチド761-777（斜線バー印）および1.5mMレクチンドメインペプチド19-34（点彩バー印）である。
【図４Ａ】図４Ａは、トランスフェクトされた野生型のCHO細胞と、HL60細胞に対するGMP-140の結合性を、ウェルをコートするのに使用したGMP-140の濃度（ugGMP-140/ml）、Ca2+の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてCPM 51Crとして測定した結果を示すグラフである。図４Ａは、CHOのGMP-140に対する結合性を示す［CH0+Ca2+（四角印）、CH0-Ca2+（黒ひし形印）］。
【図４Ｂ】図４Ｂは、トランスフェクトされた野生型のCHO細胞と、HL60細胞に対するGMP-140の結合性を、ウェルをコートするのに使用したGMP-140の濃度（ugGMP-140/ml）、Ca2+の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてCPM 51Crとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｂは、Lec8CH0のGMP-140に対する結合性を示す［Lec8+Ca2+（四角印）、Lec8-LecCa2+（黒ひし形印）］。
【図４Ｃ】図４Ｃは、トランスフェクトされた野生型のCHO細胞と、HL60細胞に対するGMP-140の結合性を、ウェルをコートするのに使用したGMP-140の濃度（ugGMP-140/ml）、Ca2+の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてCPM 51Crとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｃはネオルイス（NeoLewis）CH0のGMP-140に対する結合性を示す［ネオルイス＋Ca2+（四角印）、ネオルイス、ノイラミニダーゼ（黒ひし形）、およびネオルイス、EDTA（黒四角印）］。
【図４Ｄ】図４Ｄは、トランスフェクトされた野生型のCHO細胞と、HL60細胞に対するGMP-140の結合性を、ウェルをコートするのに使用したGMP-140の濃度（ugGMP-140/ml）、Ca2+の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてCPM 51Crとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｄは、HL60細胞のGMP-140に対する結合性を示す［HL60＋Ca2+（四角印）、HL60、ノイラミニダーゼ（黒ひし形印）およびHL60，EDTA（黒四角印）］。
【図５】図５は、ネオルイスCHO細胞の固定化GMP-140への結合性に対するモノクローナル抗体の作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合％を対照として、G1抗体(///印）、S12抗体(++++印）およびEDTA(///印）それぞれの存在下での結合性を％で示したグラフである。
【図６】図６は、可溶性のELAM-１もしくはGMP-140によって結合される、トランスフェクトされたCOS細胞を示すグラフである［対照および以下の阻害剤の存在下：ELAM-１なし、GMP-140、およびH18/7（ELAM-1の結合を阻害するがGMP-140の結合を阻害しない）；ならびにGMP-140なし、GMP、およびG1の場合について示す。］
【図７】図７は、トランスフェクトされたCOS細胞が結合したPMS細胞とHT-29細胞（これらの細胞はシアリルLexを発現する）を示す（×10-4）グラフである。すなわち対照；ELAM-１のみの場合と、さらにELAM-1による結合を阻害するがGMP-140による結合を阻害しないH18/7抗体が存在する場合；およびGMP-140のみの場合と、さらにGMP-140による結合を阻害するがELAM-1による結合を阻害しないG1抗体が存在する場合について示す。
【図８】図８は、ネオルイスCHO細胞の固定化GMP-140への結合性に対するトリプシンの作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合性を100％とした場合の、トリプシンによる処理時(///印）およびEDTAの存在下（細いバー印）での結合性を％で示したグラフである。
【図１Ａ】
2005255691.tif 000005
【図１Ｂ】
2005255691.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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