(57)【要約】  【課題】テロメア配列結合蛋白質TRF1を認識可能な抗テロメア配列結合蛋白質TRF1モノクローナル抗体を提供する。【課題解決手段】 ヒトテロメア配列結合蛋白質TRF1をリン酸バッファー中で５０度３０分の温和な条件で熱処理を施し、適度に変性させたたものを抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞、とミエローマ細胞とを融合して得たハイブリドーマから、上記特性を有する抗テロメア配列結合蛋白質TRF1モノクローナル抗体を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトテロメア配列結合蛋白質TRF1を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた抗テロメア配列結合蛋白質TRF1抗体であって、テロメア配列結合蛋白質TRF1を特異的に認識することを特徴とする。
【請求項２】
ヒトテロメア配列結合蛋白質TRF1を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗テロメア配列結合蛋白質TRF1抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テロメア配列結合蛋白質TRF1を特異的に認識する抗テロメア配列結合蛋白質TRF1抗体及びその産生ハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメア配列結合蛋白質TRF1は分子量60kDaの核タンパク質で、二量体としてテロメア配列(TTAGGG)nの二重鎖DNAに結合する。TRF1のホモ・ノックアウトマウスは致死になることから正常細胞で重要な生理的活性を持っていると考えられているが、不死化細胞でテロメラーゼ依存的にテロメア配列長を調節するという報告があるだけで、真の生理的意義はいまだ不明のままである。細胞の由来に関わらず、TRF1は正常細胞では発現が低く、細胞の不死化に伴い誘導されてくることから、TRF1はテロメラーゼの抑制と協調して細胞の寿命を制限していると考えられている。
【０００３】
そのため、癌などの増殖性病変において悪性度のマーカーとして使用できる可能性が高いが、これまでのポリクローナル抗体ではバックグラウンドが高く、その結果は研究者によってまちまちであるため、より特異性の高いモノクローナル抗体の開発が待ち望まれていた。
TRF1は他の細胞側因子と複合体を作り細胞の寿命を制御している可能性が高いが、これまでのポリクローナル抗体では複合体形成が阻害されるので、これを用いて免疫沈降法で他の細胞側因子を精製することができない。免疫沈降法を成功させるには、独立のエピトープを認識するモノクローナル抗体が必要である。TRF1を特異的に認識するモノクローナル抗体を利用することにより、TRF1との相互作用をする未知の因子を同定が可能になり、TRF1を介した細胞不死化の調節機構をつかさどる分子群の解明につながることが期待される。
ところが、TRF1は種間のホモロジーが高く構造も類似しているため、マウスを用いて免疫を行なった場合、免疫価が上がらず、ヒトTRF1の抗体作製は成功しなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、TRF1特異的に認識する分子を、モノクローナル抗体として提供することにあり、また、このため、該抗体を容易にかつ多量に生産しうるハイブリドーマを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、抗原であるヒトTRF1をリン酸バッファー中で５０度３０分の温和な条件で熱処理を施し、軽度に変性させたヒトTRF1を用意し、これを抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、TRF1を認識可能な抗TRF1モノクローナル抗体を得ることに始めて成功するとともに、本発明において得られた上記ハイブリドーマが、抗TRF1モノクローナル抗体を極めて高率に産生する能力を有し、かつ増殖性に優れたものであることも併せて確認して、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下（１）及び（２）に係るものである。
（１）   ヒトTRF1を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた抗TRF1モノクローナル抗体。
（２）   ヒトTRF1を抗原として、マウス脾細胞を免疫感作して得られた細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗TRF1モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の効果】
【０００７】
以上説明したように、本発明の抗TRF1モノクローナル抗体は、TRF1の細胞内局在、細胞の不死化の阻害、TRF1結合タンパク質の同定・精製等、極めて広い範囲の用途に適用可能なものである。また、本発明のハイブリドーマは、上記モノクローナル抗体を効率よく生産可能なものであり、本発明は、細胞、遺伝子操作技術等において極めて有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体は、ヒトTRF1を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られたものであるが、この製法についてさらに具体的に説明する。
使用する抗原は、ヒトTRF1遺伝子を細胞sf21に強制発現させ、分離精製したヒトTRF1をリン酸バッファー中で５０度３０分の温和な条件で熱処理を施し、軽度に変性させたものである。
【０００９】
抗体を作製するにあたり、マウスに抗原を腹腔内注入し、免役する方法を用いた。
【００１０】
次いで上記免疫感作されたマウスの脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールにより細胞融合させ、常法により、HAT培地でハイブリドーマを選別し、さらに限界希釈法により得たハイブリドーマの各クローンの培養上澄みを、上記抗原を使用した酵素免疫測定法（ELISA）により測定し陽性のハイブリドーマクローンを得る。さらに得られたクローンについて、TRF1に特異的に陽性反応を示すハイブリドーマクローンを得る。この後、抗体産生能力及び増殖性が良好なクローンをさらにスクリーニングし、本発明の抗TRF1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００１１】
上記ハイブリドーマから得られた本発明の抗TRF1モノクローナル抗体は、TRF1を特異的に認識することができる。
【００１２】
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体は上記用途のほかにも様々な用途に使用できる。これらについて以下に例示する。
（ａ）TRF1結合蛋白質の同定・精製
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体を用いた免疫沈降法により、TRF1結合蛋白質の同定・精製を行うことができる。
【００１３】
（ｂ）TRF1による細胞の不死化の阻害
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体を不死化細胞の核に注入することにより、不死化の阻害を行ない、細胞寿命の決定因子の同定を行なう。
【００１４】
（ｃ）本発明の抗TRF1モノクローナル抗体の改変によるテロメア配列結合タンパク質に対する抗体の作成
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体の遺伝子を単離し、抗原決定部位の遺伝配列を決定し、その部分に変異を導入することにより、抗体の抗原特異性を改変し、TRF1以外のテロメア配列結合タンパク質の同定を行なう。
（ｄ）本発明の抗TRF1モノクローナル抗体による癌細胞のマーカーの開発
本発明の抗TRF1モノクローナル抗体を用いて、癌などの増殖性病変において悪性度のマーカーとして使用できる可能性がある。
【実施例】
【００１５】
(1)抗原の調製
ヒトテロメア結合タンパク質TRF1の全長439アミノ酸残基配列とヒスチジン６残基に相当する遺伝子をクローン化されたTRF1のcDNAからPCRにより増幅し、昆虫細胞発現ベクターpBacPac8にクローニングした。このベクターをpBacPac6プラスミドと共に昆虫由来Sf21細胞に導入して組換えバキュウロウイルスを作成した。クローニングしたDNAの塩基及びアミノ酸配列を末尾の配列表に示す。
Grace昆虫用培地を含む100mmの培養ディッシュ20枚でSf21細胞を培養し、上記で得られたTRF1発現バキュウロウイルスをMOI
= 5 で感染させた。40時間後に細胞を回収し、5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH = 7.9に懸濁した後、ホモジェナイザーによって破砕し、Beckman
SW41ローターにより30,000 rpm 30分の遠心で上清を回収した。次にこの上清を、ニッケル・アフィニティーカラムに結合させ、imidazoleの濃度を5
mM から500 mM まで変化させながら溶出する直線グラジエント溶出法により精製した。このTRF1をリン酸バッファー中で５０度３０分の温和な条件で熱処理を施し、軽度に変性させたものを抗原として用いた。
【００１６】
(2)細胞融合及びクローニング
８週齡雌マウスに、先に調製した抗原を腹腔内注射して、免疫感作を行った。75日間免疫感作の後、脾細胞を取り出した。2 x 108個の脾細胞と2 x 107個の8-アザグアニン耐性マウスミエローマ細胞であるP3U1
(P3-X63-Ag8-U1)とを混合し、遠心後の沈査に50%ポリエチレングリコール（平均分子量4000）を添加し、２分間穏やかに反応させることにより細胞融合を行った。得られたハイブリドーマ含有液を96ウェルマイクロカルチャープレートに植え込み、HAT培地を用いて２週間培養を行った。増殖の認められたウェルの培養上清を採取して酵素免疫測定法(ELISA)によりスクリーニングを行い、抗原として用いたヒトTRF1に陽性を示したウェルの細胞についてクローニングを行った。ELISA陽性ウェル中の細胞を96ウェルマイクロカルチャープレートに平均１ウェル当り0.1-1個を植え込んだ。培養開始後２週間でコロニーの形成が認められ、こうして得られたコロニーについて上記と同様にスクリーニング及びクローニングを行い、所期の反応性を示す抗体を産生しているハイブリドーマ（クローン）を得た。
【００１７】
(3)スクリーニング
上記（２）で得たハイブリドーマのうち、抗TRF1抗体を産生する所期のクローンを得るためのスクリーニングは、ウェスタン・トランスファー法を利用して行った。即ち、抗原に用いたTRF1、および細胞懸濁液をＳＤＳ電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。それぞれ（10μg/mlの濃度で10μl）を泳動・転写させた後に、ニトロセルロース膜をBSAでブロッキング後、培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出した。
【００１８】
(4)抗TRF-1抗体産生ハイブリドーマの作製及び該抗TRF-1抗体の取得
上記（２）により、抗TRF1抗体の産生能を有するハイブリドーマを10クローン樹立することができたが、さらに、上記（３）のスクリーニングを行うことにより、上記TRF1に対して陽性の抗TRF1抗体産生ハイブリドーマは３クローン樹立された。このうちハイブリドーマ増殖性及び抗体産生能におけるバランスの面から最も優れていると考えられるクローンに係るハイブリドーマを血清無添加培地中もしくはプリスタン投与マウスの腹腔内において増殖させその培養上清もしくは腹水を回収した。これらを硫安塩析後、プロテインGカラムクロマトグラフィーにより精製回収し、本発明の抗TRF1モノクローナル抗体を得た。上記最終的に得られたハイブリドーマクローンは受託番号FERM
P-１９７５３として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００１９】
（５）抗TRF1モノクローナル抗体の特性
（ａ）抗TRF1モノクローナル抗体の基質特異性
抗TRF1モノクローナル抗体の基質特異性は、ウェスタン・トランスファー法を利用して決定した。即ち、抗原に用いたTRF1、およびHeLa細胞懸濁液をＳＤＳ電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。それぞれ（10μg/mlの濃度で10μl）を泳動・転写させた後に、ニトロセルロース膜をBSAでブロッキング後、培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでp-ニトロフェニルリン酸を基質とした発色系で検出した。結果を第１図に示す。図示されるように、本抗TRF-1モノクローナル抗体はTRF-1のみを認識することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の抗テロメア配列結合蛋白質TRF1抗体の認識性をウェスタンブロッティング法により、試験した結果を示す写真である。
【図１】
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【配列表】
2005306811000001.app