(57)【要約】【課題】  精子による動物資源の保存において保存精子が一回限りの使用であることから極めて限定された精子の個体復帰の機会を多数回に改善して、動物資源保存バンクの運用に効果的な保存復帰方法を構築する。【解決手段】  精子の個体復帰に顕微授精法を用いることで、これまでは一回限りの使用で廃棄していた保存精子を、融解時に一部を顕微授精に使用して個体復帰することにあて、残りを希釈分注して再び凍結保存して顕微授精にあてることを繰り返すことで、個体復帰の機会が殆ど制限されることなく、また、液体窒素保存容器に占有するスペースを大きくとることなく保存して個体復帰を運営できることから、動物資源の保存復帰を効率化でき、動物資源バンクの良好な運営を図ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子懸濁液または該精子懸濁液を凍結保存し、融解した精子懸濁液を顕微授精に使用するに際し、再びその一部を採取して凍結保存をして顕微授精に使用することを繰り返して行う動物資源の効率的な保存復帰方法。
【請求項２】
精子懸濁液が、体外受精法または顕微授精法に使用する目的で調製または凍結保存された精子懸濁液である請求項１記載の保存復帰方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生工学的手法を活用した精子を用いる動物資源の保存復帰方法に関する。本発明は、体外受精法または顕微授精法を用いて精子と卵子を授精させることを目的に調製した精子懸濁液または凍結保存した精子懸濁液を顕微授精に使用するに際して、精子懸濁液の一部を再び採取して凍結保存して次回の顕微授精に使用する操作を繰り返して行う保存復帰方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変技術や飽和突然変異プロジェクトにより生み出される多種多様な遺伝子改変動物やミュータント動物を評価するには非常に長い時間を要する。このため、作出された動物の系統維持に際しては、単に動物を繁殖維持することより、胚あるいは配偶子を凍結保存し、これを必要に応じて復帰させて研究に用いる手法が一般的に採用されている。
【０００３】
動物の系統維持を目的に精子を凍結保存することは、雌雄を交配して得た受精卵を保存することに比べて非常に簡便に行えることから、大型家畜のウシから小型実験動物のマウスまで様々な動物種で行われている。大型家畜のウシでは、多量の精子または精液を得ることができるため凍結保存した精液を用いる人工受精法が汎用されている。一方、遺伝子改変動物技術で作成されるマウスやラット、飽和突然変異プロジェクトにより生み出されるミュータントマウスやラットでは、採取できる精子または精液が限られ少量であることから、精子を多量に使用する人工受精法ではなく、少量の精子で受精させることができる体外受精法が採用されている。
【０００４】
特に、採取した新鮮精子や冷蔵或いは凍結保存した精子を体外培養条件下で精子自らが持つ運動能により未受精卵子に受精させる体外受精法は比較的簡便な手法であることから精子を個体へ復帰させる場合の最初に選択される方法である。このため、精子の凍結保存に際しては精子自身の持つ運動性を保持する目的で凍害保護物質が使用されている。しかし、使用する精子の状態、特に運動性に加え、受精に供した未受精卵の状態が受精の成立を大きく左右することから、体外受精法による個体への復帰成績が不良となることをしばしば経験する。この場合には、未受精卵に対して強制的に受精させて個体発生へ導く顕微授精法を用いる個体復帰の操作を改めて行うことがなされている。
【０００５】
上述した体外受精法または顕微授精法の実施に際しては、精子は一回限りの使用であり、その一部を保存し、次回の顕微授精法に使用することは為されず、一部を採取し希釈して小分けして保存することで何度も使用し、しかも、その操作を繰り返すことで、凍結保存した少数のバイアルから多数回使用するという着想は無かった。このため、例えば、マウスでは、通常1匹の雄から採取できる精液量が限られるため、例え、少量ずつに分注して凍結保存し、体外受精法や顕微授精法に使用することで個体復帰させたとしても、その機会は僅か数回から10回程度と大幅に制限されていた。特に、体外受精法に使用するための精子懸濁液の一部を凍結保存して顕微授精法に用いて個体復帰をさせることはなされていなかった。
【０００６】
この様に精子を凍結保存することは比較的簡便な手法で出来ることから、動物資源の保存方法として精子を凍結保存して用いる方法が汎用されているが、その個体復帰の機会は非常に制限されるものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
希少系統の動物に加え、遺伝子改変技術や飽和突然変異プロジェクトにより得られた多種多様な系統の動物資源が精子を用いて保存され、系統維持されているが、上述した様に個体復帰の機会が非常に制限されることから、個体復帰の機会が制限されない効率的な精子の保存復帰方法が切望されていた。このため、個体復帰の機会が制限されない精子の効率的な保存復帰方法を開発することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、この様な状況に鑑み、個体復帰の機会が制限されず、汎用性が高い効率的な精子を用いる保存復帰方法について鋭意研究を重ねた結果、入手或いは作製が比較的容易な既存の体外受精培地や精子の凍結保存培地または胚操作培地などを用いて精子を凍結し、融解して顕微授精に使用する際に、調製した精子懸濁液の一部を採取して再び凍結保存することを繰り返して行う精子の保存復帰方法を検討した。本法では、精子の個体復帰に際しては顕微授精法を用いることで凍結融解を繰り返して行っても安定した個体発生が可能であることを見出し、動物資源を確実に保存できる系統維持に適する効率的な保存復帰方法を構築して本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、精子を繰り返し凍結融解しても安定した個体発生ができる顕微授精法を用いる精子の保存復帰方法の提供に関する。本発明は、（１）精子懸濁液または該精子懸濁液を凍結保存し、融解した精子懸濁液を、顕微授精に使用するに際し、再びその一部を採取して凍結保存をして顕微授精に使用することを繰り返して行う動物資源の効率的な保存復帰方法である。また本発明は（２）精子懸濁液が、体外受精法または顕微授精法に使用する目的で調製または凍結保存された精子懸濁液である前項（１）記載の保存復帰方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、発生工学的手法を用いた精子から個体復帰させる機会を格段に増やすことができる。このため、産子を得る確実な機会を得ることができることから、精子の優れた保存復帰方法を提供する。本発明方法により提供される保存復帰方法は、保存用に調製した精子懸濁液を融解、希釈、凍結を繰り返して行うことができるため、従来は凍結保存した精子懸濁液を使用して行う個体復帰への機会が1回に限られたが、本発明により何度でも個体復帰の機会を繰り返すことができるため、保存した精子から確実に個体へ復帰させることができる。このため、貴重な精子を保存維持する上で極めて有用な保存復帰方法を提供することができる。一度調製した精子懸濁液の一部を採取して再び凍結保存することを繰り返すことで、何度でも凍結保存精子が使用できることから、精子の凍結保存バイアルを大量に調製して巨大な液体窒素容器中に凍結保存する必要がなく、個体復帰の機会も制限を受けない優れた保存復帰方法であり、精子による動物資源バンクなどを運営する上で極めて有用な保存復帰方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で提供される保存復帰方法を動物資源バンクの運営に採用すると、個体復帰に使用するために凍結保存した一本の精子バイアルを融解して調製した精子懸濁液の一部を採取し、希釈分注して再び凍結保存して使用する操作を繰り返して行うことができるため、凍結保存精子を使用して個体復帰させる機会を何十回、何百回と繰り返すことができる。従って、希少系統の実験動物、および遺伝子改変技術や飽和突然変異プロジェクトから得られた多種多様な系統の実験動物の供給依頼を多数の研究者から繰り返して受けた場合でも、発生工学的手法による個体復帰を何度でも行って対応することができる。このように、非常に多数回の動物供給依頼が予測される動物資源バンクの運営に際しても凍結保存した精子を枯渇することなく個体復帰を繰り返して行うことができる効率的な保存復帰方法であり、極めて有用である。
【００１２】
本発明の精子による動物資源の保存復帰方法をより具体的に述べる。例えば、マウスでは雄１匹から1千万個の精子を回収することができることから、見かけ上は無限の生体試料が得られるように見える。しかし、実務的には、これらの採取した精子を少量ずつ分注して凍結保存し、その１つを融解して使用した後は破棄するのが実態であり、精子により動物資源を保存する現行のこの様なバンクシステムでは本数分の試料しか利用できず有限である。このため、保存した精子のバイアル数が少なくなると、改めて精子を採取して保存バイアルを作製しなければなかった。
【００１３】
本発明が提供する保存復帰方法では、凍結保存用に調製した精子バイアルを融解し、一部を使用して残りを希釈分注して凍結保存して次回以降の使用に供することができる。例えば、1本の精子バイアルの半量を顕微授精に使用し、残りの半量を採取して10倍希釈して5本のバイアルに凍結保存することを4回繰り返した後でも、最初に1バイアルに100万個の精子を保存した場合には100個が保存されており、この個数は顕微授精法に充分使用できる精子量である。この間の精子の供給回数は、1+5+25+125+625=781回と試算される。また、体外受精用に凍結保存される精子は通常20万個から30万個が1本のバイアルに保存されるが、上述の方法で希釈を繰り返した場合には、3回反復して使用でき、その間に156回の個体復帰の機会を得ることができる。これらの回数は、動物資源バンク運営における個体復帰の機会の制限を事実上解消できる回数を提供するものである。
【００１４】
この様に、本発明で提供される凍結精子の反復使用を可能とする保存復帰方法は、精子からの個体復帰の機会を殆ど制限されることなく行えるため、動物資源の保存復帰に対する画期的な方法を提供することができる。
【００１５】
尚、個体への復帰に際しては熟練した高度技術が求められる顕微授精法を用いるが、精子を保存することに際しては、そのような手技的制限もなく容易に行えることから、精子の凍結保存は、実際に動物を維持する全国、全世界の研究機関で行うことができる。そして、精子から個体への復帰は一括して実施する機関センターを用意することで足りることから、動物資源バンクの運営を何ら制限するものではない。
【００１６】
本発明で用いる雄のマウスは性成熟に達したもの（8〜12週齢等）を用いることができる。精子の保存はストローあるいはクライオチューブを用いることが好ましい。この場合、30〜100μlのTYH培養液（組成:119.37ｍM NaCl, 4.78mM KCl, 1.71mMCaCl2・2H2O, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4・7H2O, 25.07mM NaHCO3, 1.0mMピルビン酸ナトリウム, 1g/L グルコース, 4g/L BSA, 100IU/mL ペニシリン, 50μg/mLストレプトマイシン）を用いる。TYH培養液は市販のもの、例えばDRO1011（株式会社三菱化学ヤトロン社製）を用いることもできる。凍結保存した精子を2〜171日保管したものを2〜5倍に希釈して、顕微授精法（以下ICSI:intracytoplasmic sperm injectionと言うこともある）に使用できる。さらに再凍結した全ての精子懸濁液は受精にあたり、1〜72日凍結したものを使用できる。精子の凍結保存培地としては、体外受精培地のTYH培養液のほか、R18S3凍結保存培地(組成:18% raffinose,3% skim milk;アーク・リソース株式会社より市販品を購入することもできる)や胚操作培地HTF（Human Tubal Fluid;市販  HTF9528 (抗生物質非含有粉末):アイエスジャパンより市販品を購入して抗生物質を添加して調製することもできる）などがあげられる。これらは市販品を入手することもできることから動物資源を幅広く収集する上でも、動物資源バンクを管理運営する上でも有利な保存復帰方法と判断される。
【００１７】
本発明で示す動物資源の保存復帰方法は、哺乳動物全般に用いることができるが、個体復帰における熟練した高度技術が求められる顕微授精法を採用することの手技的制限や費用を考慮した場合には、研究用の各種系統のマウスやラットがあげられる。特に、BDF1などの交雑系統マウスやC57BLやBALBやC3Hなどの近交系統マウスに適用することが望ましい。
【００１８】
以下の参考例、実施例、試験例をもって本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
本発明のマウスの保存復帰方法における動物、培地、卵子の回収方法の一例を参考例として次に示す。
動物：本実施例で使用した雌雄のC57BL/6Jマウス（以後、B6マウスと略す）は日本クレア社から購入した。雌マウスは４または５週齢（3〜5週齢の若齢期又は8〜10週齢の繁殖適期の使用が望ましい）を、雄マウスは性成熟に達した12週齢（8〜12週齢等の繁殖適期の使用が望ましい）を用いた。マウスはSPF（Specific Pathogen Free）条件下にて、12時間間隔（明期：05:00-17:00）の明暗周期、23±2 ℃及び55±5%の温湿度で飼育し、給餌は市販の飼料（EF；オリエンタル酵母工業株式会社製）を自由摂取させた。
【００２０】
培地：卵子の卵管からの回収および精子注入には、牛血清アルブミン（以下、BSAと略す）の代わりに0.1mg/ml ポリビニルアルコール (以下、PVAと略す, 30〜50 kD: Water soluble; シグマ社製)を添加したHEPES-buffered CZB （HEPES-CZB）培養液（組成：81.62mM NaCl, 4.83mM KCl, 1.70mM CaCl2・2H20, 1.18mM KH2PO4, 1.18mM MgSO4・7H2O, 5.0mM NaHCO3, 20mM HEPES-Na, 23.80mM 乳酸ナトリウム, 0.27mM ピルビン酸ナトリウム, 1.0mM L-グルタミン, 0.1mg/L PVA, 100IU/mL ペニシリン, 50μg/mL ストレプトマイシン, 0.11mM EDTA-2Na）を使用した。顕微授精操作後の一時的培養および仮腹に移植するための培地は、M2培養液（組成: 94.70mM NaCl, 4.78mM KCl, 1.71mM CaCl2・2H20, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4・7H2O, 4.0mM NaHCO3, 21.0mM HEPES, 23.3mM 乳酸ナトリウム, 0.33mM ピルビン酸ナトリウム, 1g/L グルコース, 4g/L BSA、100IU/mL ペニシリン, 50μg/mL ストレプトマイシン）を用いた。
【００２１】
ICSI操作直前までの精子保存培地は、12%ポリビニルピロリドン (以下、PVPと略す, 360kDa; 和光純薬工業株式会社製)を添加したHEPES-CZB培養液を用いた。ICSI操作後の胚の体外培養用培地は、100μM EDTA( EDTA-2Na)を添加したM16培養液（組成：94.59mM NaCl, 4.78mM KCl, 1.71mM CaCl2・2H20, 1.19mM KH2PO4, 1.19mM MgSO4・7H2O, 25.07mM NaHCO3, 23.28mM 乳酸ナトリウム, 0.33mM ピルビン酸ナトリウム, 1g/L グルコース, 4g/L BSA, 100IU/mL ペニシリン, 50μg/mL ストレプトマイシン）を用いた。精巣上体マウス精子の凍結保存用培地は、マウス精子の凍結保存用培地のR18S3 （アーク・リソース株式会社製）、および体外受精用培地のTYH培養液を用いた。
【００２２】
卵子の回収：卵子は、５単位のウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（PMSゼンヤク:日本全薬工業株式会社製）を腹腔内投与し、その４８時間後に５単位のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（プベローゲン: 三共エール薬品株式会社製）を腹腔内に投与して過剰排卵を誘起した４週齢の幼若雌マウスから得た卵子を使用した。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与後18時間目に卵丘卵子複合体を0.1%ヒアルロニダーゼ（シグマ社製） を含むM2培養液を用い卵管から回収した。卵丘細胞を除去した卵子はM2培養液で洗浄し、37℃-5% CO2の環境下で2時間までM16培地で維持した。
【実施例２】
【００２３】
本発明の精子の凍結、再凍結をする方法を以下の実施例で示す。
精巣上体精子の回収および凍結
精巣上体精子は8〜12週齢のB6雄マウスから採取した。精巣上体尾部をマウスの体内から取り出し、ピンセットで圧搾しニードルを用いて回収し、凍結保存溶液内で室温放置した。R18S3凍結保存培地を精子凍結保存溶液として使用し、Nakagata法（文献：Nakagata N.  Cryopreservation of mouse spermatozoa.  Mamm Genome (2000) 11,572-576.マウス個体の精巣上体尾部から精子を採取し、ラフィノースとスキムミルクを含むR18S3凍結保存培地の中に精子を懸濁してストロー中にいれて、冷却フロートに入れた液体窒素中にて凍結する方法）に準じて精子を凍結保存した。融解は液体窒素タンクから取り出した凍結精子懸濁液が融解するまで37℃のウォーターバス中で維持した。内容物をストローからペトリディッシュに取り出し、ICSIおよび再凍結保存のために60μlのTYH培養液を加えた。
【００２４】
上記のR18S3凍結保存培地に代わり、TYH培養液を凍結保存溶液とした。TYH培養液内で攪拌した精子懸濁液を1.0ml Nuncクライオチューブ(cat. No. 343958; ナルジュヌンクインターナショナル社製) の底に各20μlずつ分注した。その後、液体窒素タンク内で凍結保存した。全ての実験サンプルは使用するまで2日間を超える期間(2〜171日)保管した。TYH培養液を用いて凍結した精子を使用する場合、そのチューブを液体窒素タンクから取り出し、すみやかに37℃のウォーターバス内で融解した。融解された精子をペトリディッシュに移し、37℃で温めておいたTYH培養液で３倍に希釈した。
【００２５】
得られたR18S3凍結保存培地又はTYH培養液を用いた精子懸濁液の半量をミネラルオイルで覆われたTYH培養液内に移してICSIに使用した。残る半量は再凍結に使用するため氷上に静置した。
【００２６】
融解した精巣上体精子の再凍結処理：精子の凍結保存チューブを融解した後に、上述の様にして得たその懸濁液の約半分量を、TYH培養液を用いて３倍希釈し、5本の1.0ml Nuncクライオチューブに分注し（15μl/本）、TYH培養液で凍結した精子と同様の工程で再凍結した。再凍結した全ての精子懸濁液は使用するまで1日（1〜72日）凍結した。融解はTYH培養液で上述した凍結精子の融解および再凍結の工程と同様の工程で行ない、1回目の凍結融解と同様に2回目の再凍結融解を行った。
【００２７】
顕微授精（ICSI）：ICSIはピエゾマイクロマニプレーターを使用し、Kimura及びYanagimachiによって示された方法（文献：Kimura Y and Yanagimachi R.,  Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.  Biol. Reprod.(1995) 52:709-20）である毛細管プラーで細い状態のピペットを作成し、先端内径が約７μMとなるようにマイクロフォージを用いてカットした後に2.5％フッ化水素でインジェクションピペットの先端のガラス壁を薄くする方法に準拠し、インジェクションションピペットの先端はマイクロフォージを用いて加工した。少量の精子懸濁液（1μl）を融解した精子懸濁液より取り出し、12％PVPを含むHEPES-CZB培養液（2μl）を加えて混合した。精子を卵子内に注入する操作は室温で行った。1個の精子を注入ピペット内へ尾部より吸い込み、頭部中片部接合部を注入ピペットの開口部まで移動し、1回以上のピエゾパルスで中片部及び尾部を切り離した。そして、分離された精子頭部を注入ピペット内へ吸い込み、速やかに卵子内に注入した。精子の注入は、融解後2.5時間以内の精子を用いてHEPES-CZB培養液中で行った。
【００２８】
着床前の培養：ICSI後、精子を注入した卵子は、すみやかに17〜20℃で維持されたM2培養液中に移し、15分以上氷上放置した。その後、その胚をプラスチック製カルチャーディッシュ (Falcon社製, cat. No. 351007 or 351008)の上に作製したM16培養液ドロップ中に移した。ICSI処理した卵子の生存を培養開始から6時間目まで観察し、2細胞期胚数は培養24時間目に観察した。2細胞期まで発生した受精卵は胚盤胞期胚の発生を評価するために96時間目まで続けて培養した。
【００２９】
胚移植：精子を注入した後に正常な受精をした胚から発生する2細胞期胚を無作為に選択し、偽妊娠一日目の仮腹雌マウスの卵管に移植した。仮腹雌マウスには、日本チャールスリバー社から購入したCD-1を使用した。それらの雌は前夜中に精管結紮したCD-1の雄と交配して準備した。着床痕あるいは胎児の数は出産日前日に帝王切開して調べた。
【試験例１】
【００３０】
実施例１と同様の方法で得られたR18S3凍結保存培地で凍結保存した精子及びTYH培養液で凍結保存した精子の受精能および胚発生能を調べた。ICSI法により産出した胚を体外受精したところ、R18S3凍結保存培地あるいはTYH培養液で凍結した精子のいずれを用いた場合でも、ほとんど全ての胚（卵子）は生存し(95% および 98%:表１)、生存した胚の殆どが2細胞期まで発生した(100% および 91%:表２)。また、2細胞期胚が胚盤胞期胚まで発生する割合も、R18S3凍結保存培地あるいはTYH培養液のいずれで凍結した精子を用いても高い値を示した(80% および 87%:表３)。
【００３１】
【表１】
2005255650.tif 000002
【００３２】
【表２】
2005255650.tif 000003
【００３３】
【表３】
2005255650.tif 000004
【試験例２】
【００３４】
次に、実施例１と同様の方法で得られたR18S3凍結保存培地で凍結保存した精子及びTYH培養液で凍結保存した精子を用いた場合の産子の作出効率を調べた。上述の結果と同じくICSIにより作出した受精卵は、精子を凍結保存した培養液の種類に関わらず同様に2細胞期胚まで発生した（R18S3とTYHそれぞれで、ICSI処理後生存胚の96%と96%:表４)。次に、２細胞期胚の一部を無作為に選抜して移植した。その結果、産子（出生日前日の胎児数）の作出効率は、TYH培養液で凍結した精子を用いた方が高値を示した(移植胚数に対する産子の割合は、R18S3とTYHの49%と64%:表４)。
【００３５】
【表４】
2005255650.tif 000005
【試験例３】
【００３６】
実施例１と同様の方法により得られたR18S3凍結保存培地あるいはTYH培養液で凍結保存した精子を融解した後TYH培養液で再度凍結保存した精子、またさらに再々凍結保存した精子が持つ胚発生能を調べた。ICSI法により作出した受精卵を体外培養して、ICSI操作後の胚盤胞期胚の発生率及び産子の作出効率を調べた。これらの結果を表５、表６に示した。2細胞期胚から胚盤胞期胚に発生する割合は、一度R18S3凍結保存培地で凍結し融解後にTYH培養液で再凍結した精子、またさらに再々凍結保存した精子を用いた場合は、再々凍結により低下する傾向が見られたが、TYH培養液で凍結保存し融解後にTYH培養液で再凍結した精子、またさらに再々凍結保存した精子を用いた場合は、再々凍結による低下を認めなかった（表５）。しかし、再々凍結による低下を認めたR18S3凍結保存培地で凍結融解して再度TYH培養液で凍結し、さらに再々凍結保存した精子を用いた場合の産子の作出効率は、再々凍結しても低下を認めなかったことから（表６）、TYH培養液で再凍結した精子を用いても産子の作出効率が低下しないことが示された。
【００３７】
【表５】
2005255650.tif 000006
【００３８】
【表６】
2005255650.tif 000007
これらの結果から、精子を希釈して再凍結して再び顕微授精法(ICSI)に使用することが実用面で有効であることが分かった。この様に、動物資源バンクの運営等において、本発明は極めて有用な保存復帰方法を提供することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明により、凍結保存した精子を個体に復帰させる機会を大幅に増やし、確実で効率的な動物資源の保存復帰方法が提供される。本発明により提供される方法は、希少動物や遺伝子改変動物、飽和突然変異プロジェクトで作成されるミュータント動物などを保存し、復帰する機会を大幅に増やすことで保存復帰を確実にし、動物資源バンクの運用を効率化することができるため、極めて有用である。