(57)【要約】【課題】  ザクロ果実の果汁及び／又は抽出物を有効成分として含有することを特徴とする炎症性サイトカインの産生抑制剤を提供する。【解決手段】  本発明は、ザクロ果実の果汁及び／又は抽出物を有効成分として含有するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制剤である。本発明に係るザクロの果実及び／又は抽出物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの反応系の下流に作用するＭＭＰ−２等のＭＭＰファミリーの活性阻害に対しても効果を示し、慢性関節リウマチ、変形性関節症、痛風、結核、外傷、がん転移、歯周疾患、糖尿病、胃潰瘍、骨粗鬆症、シワ、老化、火傷等の様々な疾患の改善・予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザクロ果実の果汁及び／又は抽出物を有効成分として含有する炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【請求項２】
ザクロの果実の抽出物が、水及び／又はエチルアルコールによる抽出物である炎症性サイトカインの産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ザクロ果実の果汁及び／又は抽出物を有効成分として含有する炎症性サイトカインの産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージをはじめとする種々の免疫担当細胞が作用しあい、複雑なネットワークを形成している。近年、この免疫担当細胞間の相互作用が、各細胞から分泌されるサイトカインにより制御されていることが明らかにされてきた。
【０００３】
サイトカインは、主に免疫システムの制御に中心的な働きを担う生体内情報伝達物質の総称で、インターロイキン、インタ−フェロン、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、造血幹細胞因子、単球走化活性化因子、トランスフォーミング増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経細胞増殖因子等が存在する。
これらのサイトカインは、生体内で免疫・生体防御、炎症・アレルギー、発生・分化（形態形成）、造血機構、内分泌系、神経系に直接的或いは間接的に関与し、又、その破綻としての各種疾患にも大きく関与している。例えば、慢性関節リウマチ、骨関節炎、ライター症候群、痛風、結核、筋肉変性、感染に起因する熱及び筋肉痛、潰瘍性大腸炎等が挙げられる。
【０００４】
例えば、慢性関節リウマチの関節炎病変局所では、リンパ球等の白血球浸潤、滑膜細胞の異常増殖、血管新生、骨・軟骨の破壊等の多彩な病理組織学的な変化と共に、様々なサイトカインが関与している。活性化されたマクロファージ等から、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）やインターロイキン１（ＩＬ−１）等の炎症性サイトカインが過剰かつ持続的に産生されると、炎症の遅延及び悪化につながる。インターロイキン６（ＩＬ−６）は、他の炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αやＩＬ−１と相互に作用しながら、慢性関節リウマチの病理像を形作る。慢性関節リウマチの羅患関節内において、ＩＬ−６は主にＴＮＦ−αの刺激により滑膜細胞から産生される。ＩＬ−６は、ＩＬ−１と並んでＴ細胞の分化・増殖に不可欠なサイトカインであり、自己免疫反応を増殖し、血管内皮細胞増殖因子の産生誘導を介して血管新生を促す。又、ＩＬ−６は破骨細胞の重要な活性化因子であるだけでなく、ＴＮＦ−αやＩＬ−１と相乗的に作用して、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ＭＭＰ）ファミリーであるＭＭＰ−１やＭＭＰ−３等の細胞外マトリックス分解酵素の産生を誘導し、関節破壊に関わる（非特許文献１）。
【０００５】
ＭＭＰは、外傷、がん転移、歯周疾患、慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症、糖尿病、角膜潰瘍、胃潰瘍、骨粗鬆症、シワ、老化、火傷等の様々な疾患に関わることが知られているので、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制は、これらの疾患にも効果があると示唆される。
【０００６】
例えば、慢性関節リウマチの改善・予防として、ＭＭＰを阻害するものが幾つか提案されている。フラボノイドを含有するマトリックスメタロプロテアーゼ又はその前駆体の産生を阻害するための薬剤（特許文献１）、オキサジアゾール環を有するスルホンアミド誘導体のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用（特許文献２）、特定のポリアザナフタレン化合物又は製薬学的に許容されるその塩を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤（特許文献３）、カチオン基を分子内に有するカチオニックマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（特許文献４）等である。
しかし、慢性関節リウマチは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインがＭＭＰの産生を誘導しているので、反応系の下流に作用するこれらのＭＭＰ阻害剤の効果はいずれも充分なものとは言えなかった。
【０００７】
最近、慢性関節リウマチの特効薬として、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの作用を抑制する薬剤が開発されてきた。代表的なものとして、インフリキシマブ、エンブレル、キネレット、アトリズマブ等が挙げられる（非特許文献２〜４）。しかし、これらは効果が強すぎて副作用がある、医師の処置（皮下注射等）が必要である、どこでも作れるような薬剤ではないので値段が高額である等の欠点がある。
【０００８】
従って、炎症性サイトカインが関与する疾病を改善・予防するには、原因となるＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生を抑制することが有効な手段である。又、副作用や医師の処置等がなく使用できる炎症性サイトカインの産生抑制剤が望まれてきた。
【０００９】
一方、ザクロの健康面に対する効能としては、更年期障害の諸症状の改善、骨粗鬆症の予防、妊娠（不妊）の悩み改善、肌荒れ・乾燥肌・しみ・くすみ等の予防、枝毛・抜け毛・白髪等の改善、二日酔いの緩和、滋養強壮、疲労回復、卵巣・子宮・膣等の女性生殖器の発達促進、豊乳への効果等が知られているが、炎症性サイトカインの産生を抑制するという効果は報告されていない。
【特許文献１】特開２０００―８００３５号公報
【特許文献２】国際公開第００／６３１９４号公報
【特許文献３】国際公開第０１／０３２６５８号公報
【特許文献４】国際公開第０２／００６２２７号公報
【非特許文献１】西本憲弘，最新医学，２００２，５７（４），８９−９４
【非特許文献２】久保田文、増田智子、小崎丈太郎，日経バイオビジネス，２００２，９，４０−５０
【非特許文献３】伊藤勝彦，日経バイオビジネス，２００３，１，１３２−１３４
【非特許文献４】杉田尚久，日薬理誌，２００３，１２１，５７−６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージをはじめとする種々の免疫担当細胞等が分泌する炎症性サイトカインの産生を抑制し、慢性関節リウマチ等の予防・改善効果に優れた炎症性サイトカインの産生抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題について鋭意研究した結果、ザクロの果実の抽出物に炎症性サイトカインの産生抑制効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明に用いられるザクロは、ザクロ科ザクロ属のザクロ（Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ  Ｌ．）である。果実は秋に熟して厚い外果皮が割れ、たくさんの種子が現れる。本発明のザクロ果実とは、係る種子の外皮部分をいう。
【００１３】
本発明に係る果汁とは、ザクロ果実を圧搾して得られた液をいう。抽出物とは、ザクロ果実或いはザクロ果汁に溶媒を接触させて成分を分離したものをいう。抽出溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール等の低級１価アルコール類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素、エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等のエーテル類、及び水等が挙げられる。これらの溶媒は、１種又は２種以上を適宜選択して用いることができる。当該溶媒の中でも、水、エチルアルコール、或いは水とエチルアルコールの混合溶媒を用いるのがより好ましい。
【００１４】
ザクロ果実の果汁及び／又は抽出物は、溶媒を留去して濃縮液或いは乾燥物とすることもできる。乾燥には、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の乾燥手段を用いることができる。
【００１５】
本発明におけるザクロ果実の１日の摂取量は、ストレート果汁として０．００１〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５ｇ／ｋｇである。濃縮果汁を用いる場合は、ストレート果汁に換算した量を摂取する。ザクロ果実の抽出物の場合は、生のザクロ果実に換算して０．００１〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５ｇ／ｋｇを摂取する。
【００１６】
本発明の炎症性サイトカインの産生抑制剤は、経口投与で適用することが好ましく、液剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤等の剤型を用いることができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じてデキストリン、乳糖、コーンスターチ、乳化剤、防腐剤、賦形剤、増量剤、甘味剤、香味剤、着色剤等の添加剤を配合することも可能である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係るザクロの果実及び／又は抽出物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制に対して優れた効果を示し、炎症性サイトカインの産生抑制剤として有益であるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に、本発明を詳細に説明するために代表的な実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。
【実施例１】
【００１９】
液剤
処方                                            配合量（％）
１．ザクロ１０倍濃縮果汁                          １．０
２．コラーゲンペプチド                          １０．０
３．クエン酸                                      ０．７
４．果糖ブドウ糖液糖                              ６．０
５．香料                                          適  量
６．精製水にて全量を１００とする。
［製法］６に１〜５を加え、攪拌溶解してろ過し、加熱殺菌後、３０ｍｌガラス瓶に充填する。本液剤を１日１本摂取することで、ザクロのストレート果汁３ｇ相当量を摂取できる。
【実施例２】
【００２０】
錠剤
処方                                                                  配合量（％）
１．ザクロ果実の乾燥アルコール抽出物（２０倍の生ザクロ果実に相当）      ５．０
２．粉糖                                                              ５０．０
３．クエン酸                                                            ４．０
４．乳糖にて全量を１００とする。
５．色素                                                                適  量
６．香料                                                                適  量
７．ショ糖脂肪酸エステル                                                ３．０
［製法］１〜５の混合物に８０％エタノールを適量加えて造粒を行った後、乾燥する。それに６及び７を加えて打錠成型し、３００ｍｇの錠剤を得る。本錠剤を１日３錠摂取することで、生ザクロ果実０．９ｇ相当量を摂取できる。
【実施例３】
【００２１】
顆粒剤
処方                                                          配合量（％）
１．ザクロ果実の乾燥水抽出物（１０倍の生ザクロ果実に相当）      ２０．０
２．粉糖                                                        ５０．０
３．クエン酸                                                      ２．５
４．ビタミンＣ                                                    １．０
５．香料                                                          適  量
６．乳糖にて全量を１００とする。
［製法］１〜６の混合物に８０％エタノールを適量加え、押出し造粒を行った後、乾燥する。本顆粒剤を１日２ｇ摂取することで、生ザクロ果実４ｇ相当量を摂取できる。
【実施例４】
【００２２】
散剤
処方                                                          配合量（％）
１．ザクロ果実の乾燥水抽出物（１０倍の生ザクロ果実に相当）      １０．０
２．粉糖                                                        ５０．０
３．クエン酸                                                      ２．５
４．ビタミンＣ                                                    １．０
５．香料                                                          適  量
６．乳糖にて全量を１００とする。
［製法］１〜６の混合物に８０％エタノールを適量加え、よく混和し、乾燥後粉砕して細末とする。本散剤を１日１ｇ摂取することで、生ザクロ果実１．０ｇ相当量を摂取できる。
【実施例５】
【００２３】
カプセル剤
処方                                                                  配合量（％）
１．ザクロ果実の乾燥アルコール抽出物（２０倍の生ザクロ果実に相当）      ５．０
２．微結晶セルロース                                                    ３．５
３．コーンスターチ                                                      ２．０
４．ポリビニルピロリドン                                                ０．３
５．乳糖にて全量を１００とする。
［製法］１〜３及び５を混和し、４を結合剤として加えて常法により顆粒化した後、ゼラチン硬カプセルに２５０ｍｇ充填する。本カプセルを１日４粒摂取することで、生ザクロ果実１．０ｇ相当量を摂取できる。
【実施例６】
【００２４】
シロップ剤
処方                                            配合量（％）
１．ザクロ１０倍濃縮果汁                        １０．０
２．カルボキシメチルセルロース                    ２．０
３．単シロップにて全量を１００とする。
［製法］１〜３を混和し、均等の粘稠液とする。本シロップ剤を１日１０ｇ摂取することで、ザクロのストレート果実１０ｇ相当量を摂取できる。
【００２５】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【実施例７】
【００２６】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の炎症性サイトカイン産生抑制試験
ザクロ１０倍濃縮果汁のＴＮＦ−α及びＩＬ−６の炎症性サイトカイン産生抑制を、ａｄｊｕｖａｎｔ関節炎ラットを用いて調べた。すなわち、ネンブタール３５．０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．麻酔下、ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ液（ＳＩＧＭＡ）に懸濁したｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＤＩＦＣＯ）（以下、ａｄｊｕｖａｎｔ液）０．６ｍｇ／０．０５ｍｌを右後肢足蹠に皮内注射してａｄｊｕｖａｎｔ関節炎を惹起した。コントロールとして、健常ラット群にはｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ液０．０５ｍｌを同様に皮内注射した。
ザクロ１０倍濃縮果汁は２．０ｇ／１０．０ｍｌになるようにｄ−Ｈ２０に懸濁し、１０．０ｍｌ／ｋｇ，Ｂ．Ｗ．をａｄｊｕｖａｎｔ液の皮内注射を行った日から１日１回２週間経口投与した。試験は以下の３群で行い、１群はｎ＝３とした。
１．健常ラット（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ液注射）＋ｄ−Ｈ２０経口投与
→以下、ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ群
２．ａｄｊｕｖａｎｔ関節炎ラット（ａｄｊｕｖａｎｔ液注射）＋ｄ−Ｈ２０経口投与
→以下、ａｄｊｕｖａｎｔ群
３．ａｄｊｕｖａｎｔ関節炎ラット（ａｄｊｕｖａｎｔ液注射）＋ザクロ１０倍濃縮果汁経口投与
→以下、ａｄｊｕｖａｎｔ＋ザクロ１０倍濃縮果汁群
その後、２週間経口投与したａｄｊｕｖａｎｔ関節炎ラットから脾臓を摘出し、重量を測定した（表１）。乾熱したスライドガラスを用いて脾臓から細胞を取り出し、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２．０ｍＭ（Ｌ）−グルタミン及び１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）培地に浮遊させ、軽く遠心して余分なものを除いた。そして、２．０μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０５５：Ｂ５，ＳＩＧＭＡ）を含んだ培地に１．３×１０６／ｍｌの脾臓細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で６４時間培養した。その後、細胞培養液を軽く遠心し、脾臓細胞培養上清を得た。
上記で得られた脾臓細胞培養上清を用いて、Ｒａｔ  ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のキット（いずれもＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて測定した（表２及び表３）。
【００２７】
ａｄｊｕｖａｎｔ関節炎ラットの脾臓重量パーセントであるが、表１に示すように、健常なｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ群と比較すると、関節炎を起こしたａｄｊｕｖａｎｔ群では脾臓重量パーセントが増加した。一方、ザクロ１０倍濃縮果汁を投与したａｄｊｕｖａｎｔ＋ザクロ１０倍濃縮果汁群では、ａｄｊｕｖａｎｔ群で増加した脾臓重量パーセントを抑制する作用を示した。
【００２８】
【表１】
2005089304.tif 000002
【００２９】
ＴＮＦ−αの産生であるが、表２に示すように、健常なｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ群と比較すると、関節炎を起こしたａｄｊｕｖａｎｔ群ではＴＮＦ−αの産生が増加した。一方、ザクロ１０倍濃縮果汁を投与したａｄｊｕｖａｎｔ＋ザクロ１０倍濃縮果汁群では、ａｄｊｕｖａｎｔ群で増加したＴＮＦ−αの産生を抑制する作用を示した。
【００３０】
【表２】
2005089304.tif 000003
【００３１】
ＩＬ−６の産生であるが、表３に示すように、健常なｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ群と比較すると、関節炎を起こしたａｄｊｕｖａｎｔ群ではＩＬ−６の産生が増加した。一方、ザクロ１０倍濃縮果汁を投与したａｄｊｕｖａｎｔ＋ザクロ１０倍濃縮果汁群では、ａｄｊｕｖａｎｔ群で増加したＩＬ−６の産生を有意に抑制する作用を示した。
【００３２】
【表３】
2005089304.tif 000004
【実施例８】
【００３３】
ＭＭＰ−２活性阻害試験
ザクロ１０倍濃縮果汁のＭＭＰ−２活性阻害作用を、ゼラチンザイモグラフィーにより調べた。すなわち、６００μｇ／ｍｌのゼラチンを含む１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１ｍｍ厚）を作製し、ヒト皮膚線維芽細胞の培養上清をマトリックスメタロプロテアーゼ粗酵素として、非還元条件下にて電気泳動を行った。次いで、ゲルを２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液にて室温で３０分間２回洗浄してＳＤＳを除去し、２００ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％ｂｒｉｊ−３５（ＳＩＧＭＡ）を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にて３７℃で２４時間インキュベートした。この際、最終濃度（１ｍｇ／ｍｌ及び３ｍｇ／ｍｌ）の１００倍となるように緩衝液に溶解したザクロ１０倍濃縮果汁を、ゲルを浸した緩衝液中に１／１００量添加した。反応終了後、ゲルを０．２％クマシーブリリアントブルーＲ溶液にて染色し、５％メタノール−７．５％酢酸溶液にて脱色した。青色のゲル上で染色されないバンドとして検出されるゼラチナーゼ活性をデンシトメーター（アトーデンシトグラフ、ＡＥ−６９０５）にて定量化し、阻害率を算出した。
【００３４】
ＭＭＰ−２活性であるが、表４に示すように、ザクロ１０倍濃縮果汁はヒト皮膚線維芽細胞の産生するゼラチナーゼに対して阻害活性を示した。特に、終濃度３ｍｇ／ｍｌにおいて１００％の高い阻害率を示し、ＭＭＰ−２活性阻害の観点から特に優れた物質であることが示された。
【００３５】
【表４】
2005089304.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明に係るザクロの果実及び／又は抽出物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの産生抑制に対して優れた効果を示し、炎症性サイトカインの産生抑制剤として有用である。
本発明に係るザクロの果実及び／又は抽出物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインの反応系の下流に作用するＭＭＰ−２等のＭＭＰファミリーの活性阻害に対しても優れた効果を示し、慢性関節リウマチ、変形性関節症、痛風、結核、外傷、がん転移、歯周疾患、糖尿病、胃潰瘍、骨粗鬆症、シワ、老化、火傷等の様々な疾患の改善・予防に有用である。