(57)【要約】    【課題】  短時間で十分な固定効果を有する、細胞又は組織を固定するため固定液を提供すること。    【解決手段】  （i）ホルムアルデヒド、（ii）エタノール及び（iii）酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を含む、細胞又は組織を固定するための固定液。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ホルムアルデヒド、（ii）エタノール、及び（iii）酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を含む、細胞又は組織を固定するための固定液。
【請求項２】
ホルムアルデヒドを8〜18容量%の割合で含有する請求項1記載の固定液。
【請求項３】
エタノールを15〜25容量%の割合で含有する請求項1又は2に記載の固定液。
【請求項４】
酢酸の濃度と酢酸のアルカリ金属塩の濃度の合計が100〜350mMである請求項1〜3のいずれかに記載の固定液。
【請求項５】
酢酸のアルカリ金属塩が酢酸ナトリウムである請求項4記載の固定液。
【請求項６】
pHが6〜7である請求項1〜5のいずれかに記載の固定液。
【請求項７】
浸透圧が1000〜1100kPaである請求項1〜6のいずれかに記載の固定液。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれかに記載の固定液中に細胞又は組織を浸漬する工程を含む、細胞又は組織の固定方法。
【請求項９】
細胞又は組織を、請求項1〜7に記載の固定液に浸漬することにより固定する工程と、固定した細胞又は組織を染色する工程とを含む、細胞又は組織の染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞又は組織を固定するための固定液に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物組織の固定に用いられるホルムアルデヒドは、組織中の蛋白質のアミノ基やOH基と付加反応を起こしてメチロール基を形成する。そして、このメチロール基同士が縮合反応を起こし、メチレン橋、オキシメチレン橋、ポリメチレン橋を形成し、固定が終了する。
【０００３】
病理組織検査用の汎用固定液として、10倍希釈中性ホルムアルデヒド水（固定液中のホルムアルデヒド濃度は3.7%）が使用されているが、この10倍希釈中性ホルムアルデヒド水では固定に長時間を要するため好ましくない。
【０００４】
現在、固定速度を高める方法として、加温（50℃前後）する方法；マイクロウェーブ（電子レンジ）を用いる方法；ホルムアルデヒド濃度を高くすることにより水溶液のpHを低下させる方法；ホルムアルデヒドと種々の化合物を組み合わせた固定液を用いる方法（例えば、特許文献1〜3参照。）等が知られている。
【０００５】
しかしながら、加温固定及びマイクロウェーブ固定を行った場合には、加熱により未固定蛋白の熱変性が起こりやすいという問題がある。また、ホルムアルデヒドの濃度を高くすることによりpHを低下させた場合には、蛋白質の強い変性により組織が強く収縮し、染色性も低下するという問題がある。さらに、ホルムアルデヒドと種々の化合物を組み合わせた固定液を使用しても、満足のいく固定効果が得られていない。
【特許文献１】特開昭49-126433号公報
【特許文献２】特公平6-8818号公報
【特許文献３】特表平2002-519666公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主な目的は、上記した従来技術の現状に鑑み、短時間で十分な固定効果を有する固定液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、以下の固定液に関する。
【０００８】
１．（i）ホルムアルデヒド、（ii）エタノール、及び（iii）酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を含む、細胞又は組織を固定するための固定液。
【０００９】
２．ホルムアルデヒドを8〜18容量%の割合で含有する上記項1記載の固定液。
【００１０】
３．エタノールを15〜25容量%の割合で含有する上記項1又は2に記載の固定液。
【００１１】
４．酢酸の濃度と酢酸のアルカリ金属塩の濃度の合計が100〜350mMである上記項1〜3のいずれかに記載の固定液。
【００１２】
５．酢酸のアルカリ金属塩が酢酸ナトリウムである上記項4記載の固定液。
【００１３】
６．pHが6〜7である上記項1〜5のいずれかに記載の固定液。
【００１４】
７．浸透圧が1000〜1100kPaである上記項1〜6のいずれかに記載の固定液。
【００１５】
８．上記項1〜7のいずれかに記載の固定液中に細胞又は組織を浸漬する工程を含む、細胞又は組織の固定方法。
【００１６】
９．細胞又は組織を、上記項1〜7に記載の固定液に浸漬することにより固定する工程と、固定した細胞又は組織を染色する工程とを含む、細胞又は組織の染色方法。
【００１７】
（１）本発明の固定液
本発明の、細胞又は組織を固定するための新規な固定液は、（i）ホルムアルデヒド、（ii）エタノール及び（iii）酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を必須成分とする。このような固定液を使用することにより、細胞又は組織を迅速かつ確実に固定することができる。また、本発明の固定液は、細胞又は組織中の蛋白質に対して過剰な（余分な）変性等の悪影響が少なく、染色性も非常に良好である。
【００１８】
ホルムアルデヒド
本発明の固定液は、ホルムアルデヒドを含む。固定液中のホルムアルデヒドの含有量は、例えば、8.0〜18容量%程度、好ましくは10〜13容量%程度とすればよい。このような従来の固定液で使用されるホルムアルデヒド濃度よりも高めの濃度を用いることにより、短時間で細胞又は組織を固定することができる。
【００１９】
ホルムアルデヒドは、市販されているものをそのまま使用することができる。また、例えば、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等で中性（pH約7.0）に調整したもの、サリチル酸メチル、メントール等のマスク剤を使用してホルムアルデヒド臭を抑制したもの等を使用することができる。
【００２０】
エタノール
本発明の固定液はまた、エタノールを含む。固定液中のエタノールの含有量は、例えば、15〜25容量%程度、好ましくは18〜23容量%程度とすればよい。固定液中にエタノールを含むことにより、高濃度のホルムアルデヒドによる細胞又は組織の急激な収縮を防ぐことができる。また、エタノールは、ホルムアルデヒドの重合を防止する働きがある。
【００２１】
酢酸及びそのアルカリ金属塩
本発明の固定液は、酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を含む。酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩は、固定液のpHを調整、固定液への緩衝性の付与、固定液の浸透圧の調整等のうちの少なくとも一つの働きを有する。
【００２２】
本発明において使用する酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩は、酢酸及び／又はそのアルカリ塩をそのまま使用することもできるし、酢酸−酢酸のアルカリ塩の緩衝液を使用することもできる。
【００２３】
酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩の濃度は、酢酸とそのアルカリ金属塩との合計で、例えば100〜350mM程度、好ましくは150〜350mM程度、より好ましくは180〜250mM程度とすればよい。この範囲において、優れた固定効果を有する固定液が得られる。
【００２４】
また、酢酸の濃度と酢酸のアルカリ金属塩濃度との比率は、所望のpH、所望の浸透圧等のうちの少なくとも一つを固定液に与えることができる限り限定されない。本発明において、酢酸の濃度と酢酸のアルカリ金属塩濃度との比率は、例えば、以下の式1に従って調整することが好ましい。
【００２５】
【数１】
2005211055.tif 000002
【００２６】
〔式中、Caは酢酸濃度（mol/dm3）を示し、Cbは酢酸Na濃度（mol/dm3）を示し、Kaは酢酸解離定数（1.8×10-5）を示す。〕
酢酸のアルカリ金属塩としては、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム等が挙げられる。その中でも酢酸ナトリウムが好ましい。
【００２７】
その他
本発明の固定液の溶媒としては、水を使用すればよい。水の種類も限定されず、例えば、水道水、超純水、蒸留水、イオン交換水等を好適に使用することができる。
【００２８】
本発明の固定液は、この溶媒に上記の成分を添加し、必要に応じて撹拌することにより得ることができる。
【００２９】
本発明の固定液は、例えば、pHを6〜7程度、好ましくは6.2〜6.8程度に調整することにより、より迅速かつ確実な固定効果を示す。pHは、上述したように、上記式1に従って調整すればよい。
【００３０】
また、本発明の固定液の浸透圧は、例えば1000〜1100kPa程度、好ましくは1010〜1050kPa程度に調整するのがよい。この範囲の浸透圧を用いることにより、より迅速かつ確実な固定効果を示す。浸透圧の調整は、酢酸及び／又はそのアルカリ金属塩を上記の濃度範囲内で更に増減させることにより行うことができる。
【００３１】
本発明の固定液には、本発明の固定液の性質を損なわない限り、その他の添加剤を加えてもよい。
【００３２】
（２）固定方法
本発明の固定液に固定される細胞としては、何ら限定されず、あらゆる細胞を使用することができる。例えば、培養細胞だけでなく、以下に挙げる組織（臓器又は器官）由来の細胞も使用することができる。
【００３３】
当該組織としては、胃、大腸、小腸、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、肺、心臓、角膜、口腔粘膜、副鼻腔粘膜、膀胱、尿道、尿管、前立腺、子宮、腱、卵巣、大脳、小脳、眼球、骨、関節、胸腺、軟部組織（脂肪、体腔膜）、血管等、及びこれらの部分が挙げられる。
【００３４】
固定方法は限定されず、常法により行うことができる。例えば、上記の細胞又は組織を、本発明の固定液に浸漬すればよい。細胞又は組織が固定液に浸漬され、十分に固定されれば、浸漬の条件も限定されない。例えば、細胞や組織の体積の2〜3倍程度の固定液に、当該細胞や組織を浸漬すればよい。また、組織の体積が1000mm3以下の場合は、組織の取り扱いやすさ等の点から、その体積の10倍程度以上の固定液に当該細胞又は組織を浸漬するのが好ましい。
【００３５】
固定する際の固定液の温度も限定されない。本発明の固定液を使用すれば、常温でも十分な固定効果を得ることができる。例えば、20〜40℃程度、好ましくは25〜30℃程度とすることができる。
【００３６】
固定時間も限定されず、固定する細胞や組織の種類、体積、使用する固定液の量等に応じて適宜選択することができる。例えば、0.7〜1.2時間程度、好ましくは0.9〜1.0時間程度とすればよい。
【００３７】
体積が大きな組織を固定する際には、本発明の固定液での固定を繰り返し行うことができる。また、一般に使用されている固定液で固定した後、本発明の固定液を用いて再度固定することもできる。
【００３８】
（３）染色方法
上記のようにして固定された細胞又は組織は、目的に応じて染色することができる。染色に使用する液、染色条件等は限定されない。例えば、使用する細胞又は組織の大きさ、目的とする実験、検査項目等に応じて適宜選択することができる。
【００３９】
例えば、細胞の核、細胞質、細胞間質等を染色するためには、ヘマトキシリン・エオシン染色が利用できる。粘液や多糖類を染色するためには、PAS染色が利用できる。毛細血管や基底膜を染色するためには、PAM染色が利用できる。細網繊維を染色するためには、ゴモリー・渡辺変法が利用できる。抗原性の保持を評価するためには、LCA、EMA等の細胞表面高原及びケラチン、ヴィメンチン等の細胞骨格を免疫染色する方法が利用できる。膠原繊維等を染色するためには、アザン・マロリー染色が利用できる。
【００４０】
本発明の固定液により固定された細胞又は組織は、上記で例示した方法を含むどのような染色方法を用いても、優れた染色効果を示すことができる。従って、正確な検査結果が得られる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の新規な固定液は、細胞だけでなく、大きな体積を有する組織に対しても短時間で十分な固定効果を発揮する。本発明の固定液を使用した場合には、細胞又は組織の蛋白質の過剰な変性等が抑制されており、正確な検査結果や実験結果を得ることができる。また、本発明の固定液を使用することにより、固定時間が短縮されることから、検査や実験等に要する時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、実施例を示し、本発明の特徴を一層明確にする。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１
組織材料（以下、「生検材料」又は「試料」ということがある。）として、手術時に病理組織検査室に写真撮影目的で持ち込まれた手術材料（胃、大腸、腎、肝）で、診断に影響の及ぼさない部位を使用した。胃及び大腸は、直径が2〜3mmの球状になるように採取した。腎及び肝は、縦×横＝7〜9×10〜12mmで厚さが3mm程度の直方体になるように採取した。これらの試料を採取した後、直ちに検討する固定液に浸漬することにより、固定液の固定効果を検討した。
【００４４】
固定液の評価判定は次のようにして行った。細胞質と核（クロマチン構造）の染色性及び固定効果は、ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）で確認した。粘液や多糖類の保持性は、PAS染色で確認した。毛細血管等の基底膜の変化は、PAM染色で確認した。細網繊維の染色性は、ゴモリー・渡辺変法で評価した。さらに、抗原性の保持は、LCA、EMA等の細胞表面抗原及びケラチン、ヴィメンチン等の細胞骨格を免疫染色（Envision  Al-P法）することにより確認した。
【００４５】
固定液の評価は、従来の固定液（3.7%ホルムアルデヒド水溶液）を用いて、上記材料を室温下で6時間固定して得られた組織標本を基準とし、評価に用いた染色法での染色性について5段階で行った。基準より良い場合を「5」、やや良い場合を「4」、基準と同程度の場合は「3」、基準より悪い場合を「2」、非常に悪い場合又は染色されなかった場合を「0」とする。基本となるHE染色で評価が「3」以下の固定液については、PAS、PAM、ゴモリー・渡辺変法、免疫染色は行わなかった。
【００４６】
また、37%ホルムアルデヒドは、炭酸カルシウムで中性（pH7.0）にしたものを用いた。酢酸、酢酸ナトリウム、ホルムアルデヒド及びエタノールのうちで、浸透圧に関係するのは酢酸と酢酸ナトリウムだけなので、固定液の浸透圧調整は、酢酸と酢酸ナトリウムの濃度調整により行った。なお、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液のpHは上記の式１に基いて求めた。
【００４７】
ホルムアルデヒド濃度と固定時間の関係
ホルムアルデヒド濃度と固定時間の関係について、下記の固定液を検討した。上記した試料を、室温（25℃）で1、5、10及び24時間固定液に浸漬した後、種々の染色を行い、固定液の評価を行った。ホルムアルデヒドの濃度は容量%で示す。結果を以下の表1.1〜1.4に示す。なお、（e）及び（f）は、固定液C（(a)）で固定した後、マイクロウェーブ又は加温処理を行った。
【００４８】
（a）3.7%中性ホルムアルデヒド水溶液（従来の固定液）        ：C
（b）37%ホルムアルデヒド水溶液（ホルムアルデヒド原液）     ：C37
（c）20%ホルムアルデヒド水溶液                             ：C20
（d）10%ホルムアルデヒド水溶液                             ：C10
（e）固定液Cに浸漬後、マイクロウェーブ（500W  30sec×2） ：CM
（f）固定液Cに浸漬後、加温（50℃で1時間）                ：CT
ここでは、核を染色した場合に、クロマチン構造が粗大すぎるか、またはすりガラス状に見えて構造が不鮮明なものを0として評価した。細胞質を染色した場合には、自己融解を起こしたもの（固定不充分）、細胞の構造を変えるような収縮を起こしたもの、酸性色素（エオジン）との親和性が無いものを0として評価した。
【００４９】
【表１】
2005211055.tif 000003
【００５０】
ホルムアルデヒド濃度が高い固定液C37では、固定後直ちに細胞全体が強く収縮していたので、使用不可能であることがわかる。C10は、迅速な固定も可能であり、24時間という長時間の固定も可能であることがわかる。
【００５１】
実施例２
H+の効果を判定するために、実施例1において、迅速かつ安定した固定効果が得られたC10をベースに下記の固定液を検討した。ホルムアルデヒドの濃度は容量%で示す。かっこ内のmMは、酢酸と酢酸ナトリウムの合計濃度又はリン酸とリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの合計濃度を示す。
【００５２】
（g）10%ホルムアルデヒド酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0；200mM）  ：C105
（h）10%ホルムアルデヒド酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0；200mM）  ：C106
（i）10%ホルムアルデヒド酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0；200mM）   ：C107
（j）10%ホルムアルデヒドりん酸緩衝液（pH7.2；200mM）                 ：C10P7
（k）10%ホルムアルデヒドりん酸緩衝液（pH8.0；200mM）                ：C10P8
実施例1で使用したのと同様の試料を、上記の固定液（g〜k）に浸漬し、1時間後に固定液から取り出し、実施例1と同様に各種染色を行った。各々の固定液の評価を以下の表2に示す。
【００５３】
【表２】
2005211055.tif 000004
【００５４】
これらの結果より、固定液のpHを酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液により6〜7程度に調整する場合には、より優れた固定効果を示すことがわる。
【００５５】
実施例３
実施例2で最も固定効果が高かったC106をベースにして、下記の固定液を検討した。下記（l〜o）に示す種々の溶媒にC106と同様の溶質を溶解させた。
【００５６】
（l）溶媒として水：エタノール＝9：1（容量比）を用いたもの（エタノールの最終濃度は、10容量%）   ：C106E9
（m）溶媒として水：エタノール＝8：2（容量比）を用いたもの（エタノールの最終濃度は、20容量%）   ：C106E8
（n）溶媒として水：メタノール＝9：1（容量比）を用いたもの（メタノールの最終濃度は、10容量%）   ：C106M9
（o）溶媒として水：メタノール＝8：2（容量比）を用いたもの（メタノールの最終濃度は、20容量%）   ：C106M8
実施例1で用いたのと同様の試料を上記の固定液（l〜o）に浸漬し、1時間後に固定液から取り出し、実施例1と同様に各種染色を行った。結果を表3に示す。また、固定液中に試料を浸漬してから1ヵ月後の固定液の変化を観察した。この結果もあわせて表3に示す（対照として、アルコールを加えなかったC106を用いた）。
【００５７】
【表３】
2005211055.tif 000005
【００５８】
この結果から、本発明の固定液にエタノールを添加した場合には、細胞中の蛋白質の過剰な変性を抑制することができるので、より優れた染色効果が得られることがわかる。また、エタノールを使用した場合もメタノールを使用した場合も、1ヵ月後の固定液中にパラホルムアルデヒドの白色の沈殿物（ホルムアルデヒドは酸性下では重合しやすいために生じる）は認められなかった。
【００５９】
実施例４
実施例3において、最も固定効果が良く、1ヵ月たってもパラホルムアルデヒドを生じなかったC106E8をベースにし、下記の固定液（p〜s）のように浸透圧を変化させて、固定効果を検討した。ただし、ホルムアルデヒドとアルコールは、浸透圧に関与しないものとした。
【００６０】
（p）正常浸透圧の1/2（37℃で385KPa）に酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液濃度で調整（75mM）：C106E8L
（q）正常浸透圧（37℃で775KPa）に酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液濃度で調整（150mM）：C105E8E
（r）正常浸透圧より高く（137℃で031KPa）酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液濃度で調整 （200mM）：C106E8H
（s）C106E8LにNaClを加えて正常浸透圧（37℃で775KPa）に調整（150mM＝酢酸−酢酸ナトリウム（75mM）とNaCl（75mM）を合わせた濃度）：C106E8ES
実施例1で使用したのと同様の試料を上記の固定液（p〜s）に浸漬し、1時間後に固定液から取り出し、実施例1と同様に各種染色を行った。結果を以下の表4に示す。
【００６１】
【表４】
2005211055.tif 000006
【００６２】
この結果から、固定液の浸透圧を上昇させることにより、固定効果をさらに向上することができることがわかる。また、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液により浸透圧を調整した固定液は、塩化ナトリウム（NaCl）で浸透圧を調整した固定液よりも固定効果が高いこともわかる。
【００６３】
実施例５
実施例4において最も固定効果の優れていたC106E8Hをベースにして、種々のpH（6.2、6.4、6.6、6.8）を有する固定液の効果について検討した。結果を表5に示す。
【００６４】
【表５】
2005211055.tif 000007
【００６５】
以上の実施例1〜5の結果より、ホルムアルデヒドを10容量%の濃度で含み、浸透圧を高く調整した固定液の中でも、pHが6.2〜6.6の固定液が、より優れた固定効果を示すことがわかる。
【００６６】
実施例６
次に、大きな試料（手術材料）の再固定（例えば、一度、通常の固定液Cで15時間以上固定された試料をさらに固定する）に用いる固定液について検討した。
【００６７】
ここで、ホルムアルデヒドの動物組織への浸透速度は1mm/hであるとされている。この速度は、濃度と固定反応速度に比例して高くはなるが、2mm/h以上にすることは不可能である。従って、最初から迅速固定液に浸漬して固定しようとしても、臓器深部まで充分には固定できない。
【００６８】
現行では、大きな組織材料に割を入れてから固定液Cが満たされているタンクに浸漬し、最低5時間程度初期固定を行った後、組織標本用に切り出を行い、再びCで5時間以上再固定してから以後の操作を行っている。このため、再固定用の材料は、組織（蛋白質等）変性を有するので、このような組織を固定するための再固定液を作成する必要があると考え、以下の固定液を作製した。
【００６９】
浸透圧を1031Kpaに調整し、ホルムアルデヒド濃度を少し高めにし（15%及び20%）、細胞の収縮を抑えるためにpHを6.6〜7.0の範囲に調整した固定液について検討した。ここでは、エタノールの濃度を23容量%に設定した。
【００７０】
固定に用いる試料として、子宮筋腫、大腸がん、腎がんの手術材料を使用した。具体的には、子宮筋腫の手術材料として、およそ0.15m×0.15m×0.18mの大きさの子宮に径が0.13mの球状の筋腫が存在した材料；腎癌の手術材料として、おおよそ高さ0.18mで最大径が0.08mのそら豆状の腎臓に径が0.03m球状の腎がんが存在した材料；大腸がんの手術材料として、およそ0.1m×0.3mで厚さが0.015m程度の直方体の大腸に径が0.04m程度のカリフラワー状のがん組織が付着したような材料を用いた。
【００７１】
このような試料を、固定液Cを満たしたタンク（500mm×1m、深さ500mm）に試料全体が漬かるようにして約16〜20時間浸漬した。その結果、固定液に浸漬した試料の表面は固定され、固定液が到達していない試料の中心部が未固定なものを再固定に使用した。
【００７２】
再固定は、従来の固定液Cで再び固定した組織の染色結果を基準として、下記の固定液で1時間固定したときの固定効果を評価した。また、生検材料の固定に好成績を示したC106.2E8Hも、再固定の固定液として検討した。
【００７３】
結果を以下の表5に示す。今回は、PAM染色の代わりに、手術材料の組織標本によく用いられるアザン・マロリー染色法（膠原繊維を染色するのに使用される）を評価に加えた。
【００７４】
（t） ホルムアルデヒド濃度が15%でpH6.6    ： C156.6E7.7H
（u） ホルムアルデヒド濃度が15%でpH6.8    ：C156.8E7.7H
（v） ホルムアルデヒド濃度が15%でpH7.0    ：C157.0E7.7H
（w） ホルムアルデヒド濃度が20%でpH6.8    ：C206.8E7.7H 
（x） ホルムアルデヒド濃度が20%でpH7.0    ：C207.0E7.7H
（y） 生検用迅速固定液                      ：C106.2E8H
【００７５】
【表６】
2005211055.tif 000008
【００７６】
この結果から、通常の固定液Cでは1時間の（短時間での）再固定は不可能であることがわかる。固定液C156.6E7.7Hは、体積の大きな組織に対して非常に良い評価を得た。
【００７７】
この固定液はホルムアルデヒド濃度が高いので、この固定液に長時間浸漬した場合には、細胞収縮が起こる可能性があると考えられる。従って、再固定時間をそれぞれ12、24、48、72時間にしたときの、試料の細胞収縮の有無も検討した。
【００７８】
その結果、ホルムアルデヒドの濃度が15%の固定液を用いた場合は、再固定時間が72時間の試料においても、組織診断に悪影響を与える程の細胞収縮は認められなかった。これに対し、ホルムアルデヒドの濃度が20%の固定液を用いた場合は、再固定時間が6時間以上になると、強い細胞収縮が認められた。
【００７９】
実施例７
固定液C106.2E8H及び固定液C156.6E7.7Hの最短固定時間を検討するために、固定開始後30、40、50分後の固定効果を評価した。その結果を以下の表7及び8に示す。固定液C106.2E8Hを用いた場合には、実施例1と同様の（未固定の）試料を使用し、実施例1と同様に評価した。また、固定液としてC156.6E7.7Hを用いた場合には、実施例6と同様の（一度固定した）試料を使用し、実施例6と同様に評価した。なお、固定温度は室温（25℃）で行った。また、評価の基準標本は、固定液Cで同一材料を従来の固定時間で作成した標本を用いた。
【００８０】
【表７】
2005211055.tif 000009
【００８１】
【表８】
2005211055.tif 000010
【００８２】
これらの結果より、固定液C106.4E8Hでは40分程度で（表7）十分な固定効果を示すことがわかる。また、固定液C156.6E7.7Hでは50分程度で（表8）十分に再固定効果を発揮することがわかる。