(57)【要約】【課題】アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物を利用した酸化反応において、酸化反応生成物の収量を増大させる方法を提供する。【解決手段】アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ属細菌など）による基質（例えばスチレンまたはスチレン誘導体など）の酸化方法において、反応系にシクロデキストリン類（例えばαシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体の少なくとも１種または２種以上など）を共存させ、酸化を行わせる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物による基質の酸化方法において、反応系にシクロデキストリン類を共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
微生物が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ属細菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の酸化方法。
【請求項３】
シクロデキストリン類が、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体の少なくとも１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化方法。
【請求項４】
基質が、スチレンまたはスチレン誘導体であることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の酸化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物を利用した酸化反応において、シクロデキストリン類を反応系内に共存させることにより、酸化されるべき基質を包接させ、酸化反応生成物の収量を増大させる酸化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シクロデキストリン類はグルコースがα−１，４結合で環状に連なった化合物であり、６、７、８個環状に結合したものは、それぞれα、β、γシクロデキストリンと呼ばれる。シクロデキストリンは内側が疎水性で、外側が親水性という構造を持つことから、内部に多種多様な疎水性の分子を取り込んで包接化合物を作ることが知られており、これにより不安定物質を安定化できる。産業面では香料、農薬などの安定化剤として幅広く用いられている。さらにα、β、γのシクロデキストリンには物性、機能に限界が有るため、新しいシクロデキストリン誘導体開発のために多くの研究が成されており、合成化学、電気化学、食品、化粧品、建材などその応用分野は多岐にわたると考えられる。
【０００３】
一般に有機化合物を基質とした微生物変換においては、基質の有機化合物が難水溶性である場合には酵素との接触効率が悪い、基質の有機化合物および酵素反応により生成した有機化合物が微生物に対して毒性が有る、あるいは酵素を失活させるといった理由から、基質を高濃度に作用させた状態で比較的収率良く反応を行うことは困難であった。一方、シクロデキストリン類は様々な難水溶性有機化合物を包接することにより、包接化合物としてこれらの有機化合物を水溶液中に可溶化でき、更に基質が揮発性有機化合物であっても包接化合物として水溶液中に沈殿の状態で存在させることが出来るため、これら揮発性有機化合物の揮発を抑え、溶液中の濃度を一定に保つ働きが有ることが知られている。また、一般にシクロデキストリン類自体は本来微生物が産生する物質であり、微生物や酵素自体には無害である。
【０００４】
このようなシクロデキストリンの機能・性質を微生物変換に応用した例としては、ベンズアルデヒドとαシクロデキストリン、バニリンとβシクロデキストリンを用いて、アルデヒドから対応するアルコールへの還元効率を高めた例（例えば非特許文献１参照）、シクロデキストリン誘導体を用いてコレステロールの酸化効率を高めた例（例えば非特許文献２参照）、１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の製造にシクロデキストリン類を添加し反応効率を高めた例（例えば特許文献１参照）等が報告されている。
【０００５】
一方、酸化酵素であるアルケンモノオキシゲナーゼは種々の末端オレフィン及び内部オレフィンを空気中の酸素を用いて酸化し、対応するエポキシ化合物を生成することが知られている。この酵素を有する微生物は比較的限られた属、すなわちＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌とその近縁菌、およびＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属細菌に集中して見出される傾向がある。例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１（例えば非特許文献３参照）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｅ３（例えば非特許文献４参照）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍ１５６（例えば非特許文献５参照）、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  Ｂ−２７６（別名としてＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（例えば非特許文献６参照）、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｐｙ２（例えば非特許文献７参照）などである。特にＮｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  Ｂ−２７６とＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｐｙ２のアルケンモノオキシゲナーゼについては最も酵素学的な解析が進んでおり、いずれも活性中心に鉄を持ち、複数の蛋白質の複合体からなる酵素であることなどが明らかにされている。
【０００６】
アルケンモノオキシゲナーゼはエチレン、塩化エチレン、プロピレンなどの脂肪族アルケンのみならず、芳香族基置換のアルケンに作用して対応するエポキシドを生成する性質があり、スチレン及び各種のスチレン誘導体に対する反応性が調べられている（例えば非特許文献８参照）。ただし一般にアルケンモノオキシゲナーゼ活性を利用して微生物による酸化反応を行わせた場合の生産性は低い。この原因として生成するエポキシドによって酵素が失活する可能性があることが知られており、これを回避するために有機溶媒／水溶液による二相系反応も考案されている。しかしながら、二相系反応を用いた例としてアリルフェニルエーテルのエポキシ化反応においてｎ−ヘキサデカンを用いた場合には生成物であるフェニルグリシジルエーテルの蓄積が１．２ｍＭにとどまるなど（例えば非特許文献９参照）生産性の向上は十分でない。こうした課題を解決するための方策としてシクロデキストリンを用いることはまったく試みられておらず、その有効性について言及した報告もない。
【０００７】
スチレンおよびスチレン誘導体のビニル基の酸化はスチレンモノオキシゲナーゼによっても触媒され、アルケンモノオキシゲナーゼによる反応と同様、対応するエポキシ化合物が生成する。この酵素を有する微生物はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌に多く見出されている。例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＶＬＢ１２０（例えば非特許文献１０参照）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｙ２（例えば非特許文献１１参照）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴ（例えば非特許文献１２参照）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２および同ＣＡ−３（例えば非特許文献１３参照）などである。またＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌など（例えば非特許文献１４参照）からも見出されている。
【０００８】
スチレンモノオキシゲナーゼの酵素学的な解析はアルケンモノオキシゲナーゼほどには進展していないものの、活性中心に鉄を持たないことや、アミノ酸配列、蛋白質複合体の構成などの点でもアルケンモノオキシゲナーゼとはまったく異なる別の酵素であることなどが明らかにされている。スチレンモノオキシゲナーゼの基質域はアルケンモノオキシゲナーゼよりも狭く、ベンゼン環に共役したビニル基にのみ作用する（例えば非特許文献１５参照）。すなわちスチレンおよびスチレン誘導体は両方の酵素でエポキシ化を受けるが、鎖状のオレフィンやベンゼン環と共役していないビニル基をもつ化合物はスチレンモノオキシゲナーゼではエポキシ化され難く、一方アルケンモノオキシゲナーゼではエポキシ化されることがしばしばある。
【０００９】
スチレンモノオキシゲナーゼを有する微生物を用いた酸化反応において有機溶媒を用いる研究例はいくつかあり、こうした水−有機溶媒二相系反応が生産性を向上することが知られている（例えば非特許文献１６参照）。しかしながら有機溶媒を共存させた状態で長時間の培養と反応を行うことは、操作上必ずしも好ましくない。シクロデキストリンは安全性が高く、基本的に水溶性の化合物であることから、有機溶媒の欠点を補う可能性を有している。しかしながらスチレンモノオキシゲナーゼ活性を利用して微生物による酸化反応を行う目的でシクロデキストリンを用いることはまったく試みられておらず、その有効性について言及した報告もない。
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−２９５９９９号公報
【００１１】
【非特許文献１】Ｒａｐｈａｅｌ  Ｂａｒ（１９８９）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３１  ２５−２８
【非特許文献２】Ｊｅｒｉｅｓ  Ｊａｄｏｕｎら（１９９３）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４０  ２３０−２４０
【非特許文献３】Ｓｙｂｅ  Ｈａｒｔｍａｎｓら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１３７，２５５５−２５６０
【非特許文献４】Ｆｒａｎｓ  Ｊ．  Ｗｅｂｅｒら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１７４，３２７５−３２８１
【非特許文献５】Ｍａｒｃ  Ｐ．  Ｗｏｏｄｌａｎｄら（１９９５）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１６３，２３１−２３４
【非特許文献６】Ａｋｉｒａ  ＭｉｕｒａとＨｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ（１９９５）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．５９，８５３−８５９
【非特許文献７】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｊ．  ＳｍａｌｌとＳｃｏｔｔ  Ａ．  Ｅｎｓｉｇｎ（１９９７）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７２，２４９１３−２４９２０
【非特許文献８】Ｓｔｕａｒｔ  Ｒ．  Ｒｉｇｂｙら（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２，５６３−５５６
【非特許文献９】Ｓ．  Ｐｒｉｃｈａｎｏｎｔら（１９９８）Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２２，４７１−４７９
【非特許文献１０】Ｓｖｅｎ  Ｐａｎｋｅら（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６４，２０３２−２０４３
【非特許文献１１】Ａｎａ  Ｖｅｌａｓｃｏら（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８０，１０６３−１０７１
【非特許文献１２】Ａｎｄｒｅａ  Ｍ．  Ｍａｒｃｏｎｉら（１９９６）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６２，１２１−１２７
【非特許文献１３】Ｋｅｖｉｎｅ  Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒら（１９９７）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６３，４２８７−４２９１
【非特許文献１４】Ｎｏｂｕｙａ  Ｉｔｏｈら（１９９７）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．６１，２０５８−２０６２
【非特許文献１５】Ｓｉｌｖａｎａ  Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉら（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．４１，９１５７−９１６１
【非特許文献１６】Ｓｖｅｎ  Ｐａｎｋｅら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．６９，９１−１００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物を利用した酸化反応において、酸化反応生成物の収量を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物による基質の酸化方法において、反応系にシクロデキストリン類を共存させることを特徴とする方法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１４】
本発明に用いられる微生物としては、アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼを産生するものであれば特に限定はないが、高い酵素活性を維持できる微生物が好ましい。こうしたものとして例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉａ属細菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属細菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌をあげることができ、中でも好ましくは前述したＮｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  Ｂ−２７６、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｐｙ２、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＶＬＢ１２０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２などを例示することができる。
【００１５】
酸化反応に用いられる基質としてはアルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼが酸化作用を有する基質であれば特に限定されないが、シクロデキストリン類との相互作用が可能な構造を有するものについてより有効な作用が期待できる。特に両酵素に共通する基質であるスチレンおよびスチレン誘導体は分子の大きさ、形状、疎水性から、シクロデキストリンと相互作用することが期待できる。
【００１６】
反応系に共存させるシクロデキストリン類としては、アルケンモノオキシゲナーゼまたはスチレンモノオキシゲナーゼが作用する基質と包接化合物を形成するものであれば良く、特に限定されない。例えば、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体を１種又は２種以上、任意の比率で用いる事ができる。シクロデキストリン誘導体としては、例えばシクロデキストリンの水酸基が１個または複数個、置換基で置換されているもの、マルトース単位が分岐鎖状に導入されたもの、シクロデキストリンが重合したものなどがあげられる。
【００１７】
また、シクロデキストリン類を反応系に共存させる方法については特に限定されず、あらかじめシクロデキストリン類と酸化すべき基質を混合し包接化合物を生じせしめてから菌体の懸濁液を添加する方法、菌体の懸濁液にシクロデキストリン類を加えておき次に酸化すべき基質を添加する方法、菌体の懸濁液にシクロデキストリン類と酸化すべき基質を同時に添加する方法等、いずれの方法でも可能である。シクロデキストリン類の共存量としては特に限定されないが、好ましくは１〜５００ｍＭ、更に好ましくは１０〜３００ｍＭである。
【発明の効果】
【００１８】
シクロデキストリン類を反応系に共存させる効果については、以下の２点が重要である。まず１点は、酸化反応の基質として用いられるスチレンまたはスチレン誘導体、およびその基質から酸化反応により生成されるエポキシ化合物を、シクロデキストリン類がその疎水性空洞に内包するため、有機化合物が一般に有する微生物に対する毒性や酸化酵素に対する阻害作用を緩和することができることである。もう１点は酸化反応に用いられる基質の水への溶解度を高め、酵素との接触効率即ち反応効率を高めることができることである。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  シクロデキストリンを利用したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１によるスチレンのエポキシ化反応
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１の培養を以下の条件で行った。すなわち密閉可能容器に下記の完全無機培地を入れ、容器内の空間体積に対して１５％のエチレンを加えて、３週間静置培養を行った。完全無機培地の組成は表１の通りであった。
【００２１】
【表１】
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こうして増殖させた菌体を回収し、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌密度がＯＤ６００で３５．６の懸濁液を調製した。
【００２２】
また、６４ｍｌ容栓付き試験管中に以下の組成の懸濁液１）、２）を用意し、栓付き試験管の蓋を密閉し、水平に寝かせた状態で２４０回／分振盪し、シクロデキストリン−スチレン包接化合物を含む懸濁液をそれぞれ調製した。
１）βシクロデキストリン−スチレン包接化合物を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム
含有５０ｍＭリン酸緩衝液懸濁液の組成
２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍｌ
βシクロデキストリン：１．１３５ｇ（仕込み量２０ｍＭ）
スチレン：６９．０１μｌ（仕込み量１２ｍＭ）
２）γシクロデキストリン−スチレン包接化合物を含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム
含有５０ｍＭリン酸緩衝液懸濁液の組成
２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：５０ｍｌ
γシクロデキストリン：１．２９７ｇ（仕込み量２０ｍＭ）
スチレン：６９．０１μｌ（仕込み量１２ｍＭ）。
【００２３】
１）、２）の懸濁液１３ｍｌを１２５ｍｌ容バイアル瓶へそれぞれ分注し、前述の菌体密度がＯＤ６００で３５．６の懸濁液を２ｍｌ添加し、シクロデキストリン仕込み量１７．３ｍＭ、スチレン仕込み量１０．４ｍＭとしてテフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタム及びアルミシールで密栓した後、これらのバイアル瓶を水平に寝かせた状態にして３０℃で２４０回／分振盪した。またシクロデキストリンを添加しないコントロールサンプルとして、１２５ｍｌ容バイアル瓶に２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液１３ｍｌを入れ、そこへスチレン２０．７０μｌ、１０．３５μｌ、４．１４μｌ、２．０７μｌをそれぞれに加え、さらに前述の菌体濃度がＯＤ６００で３５．６の懸濁液を２ｍｌずつ分注し、スチレン仕込み量をそれぞれ１０．４ｍＭ、５．２ｍＭ、２．１ｍＭ、１．１ｍＭとしてテフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタム及びアルミシールで密栓した後、同様に３０℃で２４０回／分振盪した。
【００２４】
振盪開始後１時間、２時間、３時間、５時間、１９時間経過したところで針付きガスタイトシリンジを用いてブチルゴムセプタムを通して、反応液１ｍｌをそれぞれから採取した。採取した溶液を、０．５ｇの塩化ナトリウムと１．５ｍＭオクタンを含む酢酸エチル溶液１ｍｌを入れた栓付き試験管に加え密栓した。これらの試験管を水平に寝かせた状態にして３０℃で２８０回／分で１５分間振盪して塩化ナトリウムを飽和させた後、遠心分離して酢酸エチル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２５】
生成したスチレンオキシド濃度の経時変化を図１に示す。シクロデキストリン無添加のコントロールサンプルでは、１０．４ｍＭ（図中、−）、５．２ｍＭ（図中、×）の濃度で基質を仕込んだ場合にはスチレンオキシドの生成量が確認されず、２．１ｍＭ（図中、＊）では反応５時間目以降は減少し、１．１ｍＭ（図中、＋）ではかろうじて生成量が増加していることから、２．１ｍＭ以上の濃度のスチレンが菌体や酵素に悪影響を及ぼし、酸化反応を阻害していることがわかった。一方、シクロデキストリンを添加した場合、即ちβデキストリンを用いた場合（図中、黒四角）やγシクロデキストリンを用いた場合（図中、黒三角）は、スチレンを１０．４ｍＭ仕込んだにもかかわらず、モル等量以上のシクロデキストリンを共存させることにより、スチレンオキシドの生成量が振盪開始後１９時間目まで増加傾向を示した。この結果から本実施例で用いたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１に毒性を及ぼすような高濃度のスチレンを基質として作用させた場合でも、シクロデキストリンを当モル以上添加することで菌体内の酵素による酸化反応の活性を維持し、生成物の収量を増大させることが示された。
【００２６】
実施例２  シクロデキストリンを利用したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１による３−クロロスチレンのエポキシ化反応
実施例１に記載したのと同様にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１を培養し、菌体を回収して、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄後、同緩衝液で懸濁し、ＯＤ６００の２２．５の懸濁液を調製した。
【００２７】
一方、以下の組成のβシクロデキストリン含有緩衝液を調製した。
１）βシクロデキストリン溶液
２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：３０ｍｌ
βシクロデキストリン０．６８１ｇ（仕込み量２０ｍＭ）。
【００２８】
この溶液１）から８ｍｌを１２５ｍｌ容バイアル瓶へ分注し、前述の菌体密度がＯＤ６００で２２．５の懸濁液を２ｍｌ添加し、シクロデキストリン仕込み量１６ｍＭとした。それぞれの懸濁液へ３−クロロスチレンを１２．７μｌ添加し、仕込み量を１０ｍＭとした後、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタムで栓をし、アルミシールをした後、これらのバイアル瓶を水平方向に寝かせた状態にして３０℃で２４０回／分振盪した。またシクロデキストリンを添加しないコントロールサンプルとして１２５ｍｌ容バイアル瓶に２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液１８ｍｌを入れ、そこへ前述の菌体密度がＯＤ６００で２２．５の懸濁液を２ｍｌ添加し、さらに３−クロロスチレンを１５．３μｌ添加し、仕込み濃度１０ｍＭとして、テフロン（登録商標）コートブチルゴムセプタム及びアルミシールで密栓した後、同様に３０℃で２４０回／分振盪した。
【００２９】
振盪開始後２４時間経過したところで、針付きガスタイトシリンジを用いてブチルゴムセプタムを通して反応液１ｍｌを採取した。採取した溶液を、０．５ｇの塩化ナトリウムと１．５ｍＭオクタンを含む酢酸エチル溶液１ｍｌを入れた栓付き試験管に加え密栓した。この試験管を水平に寝かせた状態にして３０℃で２８０回／分で１５分間振盪して塩化ナトリウムを飽和させた後、遠心分離して酢酸エチル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００３０】
生成した３−クロロスチレンオキシド濃度を図２に示す。シクロデキストリン無添加のコントロールサンプル（図２の左側）では３−クロロスチレンオキシドは０．０４ｍＭであるのに対し、βシクロデキストリンを添加した場合（図２の右側）には１．１ｍＭの濃度の３−クロロスチレンオキシドが生成した。実施例１でスチレンを反応させた場合と同様に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒｕｍ  Ｌ１に毒性を及ぼす濃度で３−クロロスチレンを基質として作用させた場合でも、シクロデキストリンを添加することで菌体内の酵素による酸化反応の活性を維持し、生成物の収率を増大させることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１におけるスチレンオキシド濃度の経時変化を示した図である。
【図２】実施例２における３−クロロスチレンオキシドの生成量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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