(57)【要約】【課題】  それ自体では多量に生産することが為し得なかったキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼを、他の蛋白質と融合させた蛋白質として従来にくらべて多量に取得する方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質であるヒドロキシラーゼに少なくともひとつのポリペプチドを融合させたポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ、該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された微生物、及び該微生物を培養することを含む該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの製造方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質であるヒドロキシラーゼに少なくともひとつのポリペプチドを融合させたポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ。
【請求項２】
前記ポリペプチドがレダクターゼである、特許請求の範囲の請求項１に記載されたポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ。
【請求項３】
ポリペプチドが、チオレドキシンである、特許請求の範囲の請求項１又は２に記載されたポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質のうちの酸素添加反応を担う構成蛋白質であるヒドロキシラーゼにポリペプチドを融合したことを特徴とするポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ、該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された微生物、及び該微生物を培養することを含む該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
有機化合物の酸化の方法については有機化学的には種々の方法がある。しかし合成の過程で多量のエネルギーを消費する場合や、多量の副生物（塩素等のハロゲン）や廃棄物が生じる場合などがあり、また生じた副生物や廃棄物を再利用する場合にも多くのエネルギーを消費する場合がある。
【０００３】
ノンハロゲン化学プロセスの一端をになう「グリーンケミストリー」のひとつの技術として酸化反応を酵素化学的に行うことが期待されている。
キシレン類のメチル基を酸化する場合にも工業的には、一旦メチル基を塩素化あるいは臭素化する工程が含まれる。
【０００４】
酸化酵素であるキシレンモノオキシゲナーゼはキシレン類やトルエンあるいはそれらの誘導体のベンゼン環に結合したメチル基や、米国特許第５２１７８８４号に記載の芳香族の５員複素環式化合物や６員複素環式化合物などの複素環に結合したメチル基を直接酸化することができる。この酵素の代表的なものにはシュードモナス・プチダｍｔ−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｍｔ−２）のキシレンモノオキシゲナーゼ（特開平２−１１９７７７号公報記載のキシレンオキシゲナーゼ）、シュードモナス・プチダＨＳ１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＨＳ１）のキシレンモノオキシゲナーゼなどがある。シュードモナス・プチダｍｔ−２のキシレンモノオキシゲナーゼは、ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ上の、ｘｙｌＭ遺伝子がコードするヒドロキシラーゼ（ＸｙｌＭ）とｘｙｌＡ遺伝子がコードするＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ（ＸｙｌＡ）とから構成されている。また、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）のアルカン−１−モノオキシゲナーゼや、メタン資化菌の例えばメチロコッカス・カプスラタスＢａｔｈ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ）のメタンモノオキシゲナーゼにもトルエンのメチル基を酸化してベンジルアルコールを生成する酵素活性があることが、それぞれ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、９０４−９１１（１９９４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２６、５５５−５６０（１９９４）に記載されている。いずれのモノオキシゲナーゼも複数のコンポーネントからなる酵素である。
【０００５】
アルカン−１−モノオキシゲナーゼに関し、そのヒドロキシラーゼはヒドロキシラーゼ遺伝子で形質転換した大腸菌から精製されている。またメタンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼに関しては、メタン資化菌自身からの精製方法が知られている。
【０００６】
シュードモナス・プチダのキシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子のふたつの遺伝子を含んだプラスミドで形質転換した大腸菌にはキシレンモノオキシゲナーゼ活性があることが知られ、ＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼについてはその形質転換大腸菌から精製がなされている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９、５１−６１（１９９２））。しかしながら、キシレンモノオキシゲナーゼのもうひとつのコンポーネントであるヒドロキシラーゼについては、シュードモナス・プチダｍｔ−２からの精製が試みられているが、ＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼに比べて生産量が著しく少なく、形質転換した大腸菌から多量に調製された例はない。
【０００７】
生産量の少ない蛋白質を遺伝子工学的な手法を用いて多量に生産する手段として、他の蛋白質と融合させた蛋白質として大腸菌や酵母等の微生物、あるいは昆虫や植物や動物などの生物に生産させる方法が知られている。
細菌類を用いて目的の蛋白質に融合させる蛋白質としては、チオレドキシン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ベータラクタマ−ゼ、リボヌクレアーゼＡ、Ｔ７ファージ主要ｃａｐｓｉｄ蛋白質などの蛋白質や、それらいずれかの蛋白質の一部分を用いる例がある。それらの蛋白質と目的蛋白質を融合した蛋白質の遺伝子を構築するためのプラスミドが商品化されている。
【０００８】
また、特開平１−１４４９７８号公報、特開平１−１４４９８１号公報、特開平２−１３３７５号公報などに記載された方法を参考にして成長ホルモンやその一部の蛋白質を融合させることもできる。
さらには、動物などでは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を融合させて融合蛋白質の検出を容易にさせる方法もあり、その作製のためのプラスミドが商品化されている。
【０００９】
酸化酵素に関連した融合蛋白質の例としては、ヘム含有蛋白質であるシトクロムＰ４５０と、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０・レダクターゼとの融合蛋白質が知られている。シトクロムＰ４５０とＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０・レダクターゼが融合した蛋白質と類似の構造をもつ蛋白質はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＰ４５０BM3のように自然界にも存在している。
【００１０】
しかしながら、非ヘム鉄含有蛋白質であるキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼや、そのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼについては融合蛋白質の例は知られていない。
【００１１】
【特許文献１】特開平２−１１９７７７号公報
【００１２】
【非特許文献１】Eur.J.Biochem.209, 51−61（1992）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、それ自体では多量に生産することが為し得なかったキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼを、他の蛋白質と融合させた蛋白質として従来にくらべて多量に取得する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質であるヒドロキシラーゼに少なくともひとつのポリペプチドを融合させたポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ、該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された微生物、及び該微生物を培養することを含む該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの製造方法を提供する。
【００１５】
好適な態様において、該ポリペプチドは、ヒドロキシラーゼと共役して反応するレダクターゼ、より好ましくはキシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼである。
【００１６】
好適な態様において、該ポリペプチドはヒドロキシラーゼのアミノ末端に直接またはリンカーとなるアミノ酸残基を介して連結している、あるいは該ポリペプチドはヒドロキシラーゼのカルボキシル末端に直接またはリンカーとなるアミノ酸残基を介して連結している。
【００１７】
該ポリペプチドはまた、チオレドキシン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ベータラクタマ−ゼ、リボヌクレアーゼＡ、Ｔ７ファージ主要ｃａｐｓｉｄ蛋白質、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、のいずれかの蛋白質またはその一部分であってよい。チオレドキシンはまた、アミノ酸残基の３１残基目と６３残基目のアミノ酸がヒスチジン残基に置換された大腸菌由来の改変チオレドキシンであってもよい。
【００１８】
好適な態様において、該微生物はエシェリヒア属またはシュードモナス属の細菌である。
【００１９】
本発明に係るポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの製造方法は、例えばヒドロキシラーゼをコードする遺伝子と、融合せしめるポリペプチドをコードする遺伝子とを含むプラスミドを適当な微生物宿主細胞に形質転換し、該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼが発現される条件下で該細胞を培養し、しかる後該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼを回収する工程を含むことを特徴とする。
該製造方法のひとつの態様において、該融合ポリペプチドはアミノ酸残基の３１残基目と６３残基目のアミノ酸がヒスチジン残基に置換された大腸菌由来の改変チオレドキシンとし、該プラスミドはｐＴｈｉｏＨｉｓＢ（インビトロジェン社製：His-Patch ThioFusion(商標）Expression System）とする。ｐＴｈｉｏＨｉｓＢは改変チオレドキシンのカルボキシル末端に、エンテロキナーゼ（別名：エンテロペプチダーゼ）の特異的切断部位を含んだペプチドリンカーを連結させた蛋白質をコードする遺伝子を含んだプラスミドである。また、この融合遺伝子にキシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼをコードするＸｙｌＡ遺伝子を融合させてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明で提供されるポリペプチド融合したキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼは、従来報告されているキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼと比べ、その遺伝子で形質転換した微生物を用いることで多量に生産できるという利点を供する。そのことは、その酵素の検出が容易になることでポリペプチド融合ヒドロキシラーゼあるいはその分子内のヒドロキシラーゼ、あるいは融合ポリペプチドを切除したヒドロキシラーゼの機能を改変するための遺伝子組換え技術に貢献するとともに、それらヒドロキシラーゼを用いて行う酸化反応への応用に道を開くものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明を詳細に記述する。
本発明に係るキシレンモノオキシゲナーゼは、その酵素の基質特異性に関してキシレン類あるいはその誘導体のベンゼン環に結合したメチル基を酸化する活性を有していればよい。キシレンモノオキシゲナーゼを構成する本発明に係るヒドロシラーゼは好適な態様において、特開平２−１１９７７７号公報に記載の遺伝子ＸｙｌＭでコードされるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
また本発明で用いるキシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質の遺伝子の生物起源は特に限定されない。さらにはキシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質の遺伝子の塩基を置換して、その結果としてアミノ酸配列が元来とは異なる蛋白質で構成されたキシレンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いてもよい。
【００２３】
キシレンモノオキシゲナーゼの構成蛋白質であるヒドロキシラーゼへのポリペプチドの融合は、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをひとつの遺伝子として含んだプラスミドベクターを構築し、それを用いて微生物を形質転換して、形質転換された微生物にその遺伝子を発現させることにより、微生物にポリペプチド融合ヒドロキシラーゼを生産させることで達せられる。
【００２４】
ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ遺伝子を組込むプラスミドと、それを用いて形質転換する微生物の組合せは、少なくとも融合しようとするポリペプチドの遺伝子あるいはキシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質の遺伝子を発現しうるプラスミドと微生物の組合せであることが望ましい。そのためにはポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドを作製するに先立ち、たとえば、融合しようとするポリペプチドの遺伝子が、形質転換した微生物において発現しうることを確認しておくことが望ましい。微生物に大腸菌を用いる場合のプラスミドとしてはｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＥＴ−１１（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｈｉｏＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが例示できる。大腸菌としてはエシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＭＣ４１００などが例示できる。また微生物にシュードモナスを用いる場合のプラスミドとしてはｐＴＳ１１３７やその接合伝達能を取り除いたプラスミド（たとえば特開２００１−２０４４７３に記載されたｐＴＭ３３）などが例示でき、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０が例示できる。それら以外のシュードモナスでも、その菌が本来もつプラスミドを取得し、そのプラスミドにポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入したのちにそれを用いて、もともとのプラスミドをもつシュードモナスを形質転換させてもよい。さらにはプラスミドと宿主生物の関係が適切であれば上記以外の生物でもかまわない。ただし宿主生物の選択にあたってはキシレンモノオキシゲナーゼが基質から生成した物質を代謝しない生物であることが望ましい。
【００２５】
融合するポリペプチドは、ヒドロキシラーゼと共役して機能する蛋白質（例えばレダクターゼ、好ましくはキシレンモノオキシゲナーゼを構成するＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ）あるいはそれに関連する蛋白質（例えばレダクターゼの一部分、フェレドキシン等）、ヒドロキシラーゼと共役して酸化反応をおこなわない蛋白質、例えばチオレドキシン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ベータラクタマ−ゼ、リボヌクレアーゼＡ、Ｔ７ファージ主要ｃａｐｓｉｄ蛋白質、成長ホルモン、酵母アルファー因子などの蛋白質や、それらいずれかの蛋白質の一部分のポリペプチド等からひとつ以上選択すればよい。キシレンモノオキシゲナーゼを構成するＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼは好適な態様において、特開平２−１１９７７７号公報に記載の遺伝子ＸｙｌＡでコードされるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
ヒドロキシラーゼとそれに融合するポリペプチドとは直接ペプチド結合していても、ペプチドリンカー（例えばＧＧＧＧＳやＧＳＧＳＧなどのようにグリシン残基とセリン残基からなるペプチドや、それら配列を複数回繰り返した配列のペプチド、あるいはＤＤＤＤＫやＩＥＧＲなどのペプチド配列のように特異的プロテアーゼの基質となりうるアミノ酸残基からなるペプチド）で結合していてもよい。また、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子により形質転換した微生物からポリペプチド融合ヒドロキシラーゼを精製するときの一助として、特定のリガンドや抗体に対するアフィニティーを有するアミノ酸配列を含んだポリペプチドを融合しても良い。前者の例としては金属キレート樹脂などにアフィニティーのあるヒスチジンヘキサマー、後者の例としては特異的抗体固定化樹脂で捕捉される特異的抗原に相当するアミノ酸配列があげられる。
【００２７】
ヒドロキシラーゼに融合させるポリペプチドは、ヒドロキシラーゼのアミノ末端側あるいはカルボキシル末端側あるいはその両方を選択し、より多くのポリペプチド融合ヒドロキシラーゼが発現するものを選択すれば良い。
【００２８】
ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの検出方法としては、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が例示できる。ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子により形質転換した微生物を培養して増殖したのちに、ついで必要があればその遺伝子の発現を誘導する処理をしてさらに適宜培養したのちに、その微生物を回収して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と還元剤（例えば２−メルカプトエタノールあるいはジチオトレイトール）を含んだ緩衝液に分散したあと、煮沸することで調製した微生物ライセートにする。そのライセートを、融合しようとするポリペプチドの遺伝子を含んでいないプラスミドで形質転換した微生物のライセートを比較対照として、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）したのち蛋白質を染色して、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼを検出する方法が例示できる。
【００２９】
ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現に誘導が必要な微生物では、誘導の条件（誘導温度、誘導時間、誘導剤の濃度等）を様々に変えてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施すればよい。
【００３０】
また融合しようとするポリペプチドに結合する血清あるいは抗体（のぞましくはモノクローナルな特異的な抗体）あるいはヒドロキシラーゼに結合する血清あるいは抗体（のぞましくはモノクローナルな特異的な抗体）があれば、それを用いたウエスタンブロットを実施して融合したポリペプチドを検出してもよい。
【００３１】
ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子と、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼと共役して酸化反応をつかさどるレダクターゼをコードする遺伝子の両遺伝子を含んだプラスミドを用いて形質転換した微生物、あるいはヒドロキシラーゼと共役して酸化反応をつかさどるレダクターゼを融合したポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミドを用いて形質転換した微生物に関し、該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの酵素活性測定をすることができる。酵素活性測定法としては、形質転換した微生物を培養して増殖したのちに、必要があればその遺伝子の発現を誘導する処理をしてさらに適宜培養したのちに、その微生物を回収して、キシレンモノオキシゲナーゼの基質（たとえばｐ−キシレンやｍ−キシレン）を含んだ培地に移し、振とう培養したのち、培地に含まれる基質を生じた酸化物を定量する方法が例示できる。その酸化物がエーテル等の有機溶媒で抽出可能なら、それをガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析やＧＣ−マススペクトル分析等で分析、定量する方法があり、その酸化物を含んだ反応液を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分析やＬＣ−マススペクトル分析等で分析、定量する方法がある。
【００３２】
同様の方法でポリペプチド融合ヒドロキシラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドを作製するに先立ち、キシレンモノオキシゲナーゼを構成する蛋白質の遺伝子が、形質転換した微生物において発現しうるかどうかを試してもよい。
【００３３】
もしも、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子と、ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼと共役して酸化反応をつかさどるレダクターゼをコードする遺伝子の両遺伝子を含んだプラスミドを用いて形質転換した微生物、あるいは、ヒドロキシラーゼと共役して酸化反応をつかさどるレダクターゼを融合したポリペプチド融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミドを用いて形質転換した微生物が該ポリペプチド融合ヒドロキシラーゼの酵素を有していないことが明らかになった場合は、ポリペプチドの種類、リンカーの長さや種類、複数のポリペプチドを連結する場合にはその順番などを変えたものを、またはプラスミドや宿主を変えたものを新たに作製し、同様にして調べ、同活性を有する微生物を獲得することができる。
【００３４】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼ遺伝子で形質転換された大腸菌の作製
最初にＰＣＲでの遺伝子増幅に鋳型として用いるためにアルカリＳＤＳ法によりシュードモナス・プチダｍｔ−２のプラスミド（ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ）（特開平２−１１９７７７号公報）を調製した。
ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ、プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）を用いてキシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＡ遺伝子を増幅し、ＮｃｏＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、さらにＰｓｔＩで切断した。これを、予めＮｈｅＩで切断しＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化しさらにＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃＭに挿入することにより、ＸｙｌＭの１残基目メチオニン残基から３６８残基目セリン残基までから成る蛋白質の遺伝子にｘｙｌＡ遺伝子が直結した遺伝子を含んだプラスミドｐＴｒｃＭＡｆ（ＸｙｌＭの１残基目メチオニン残基から３６８残基目セリン残基までからなるヒドロキシラーゼのカルボキシル末端に、ＸｙｌＡのアミノ末端が直結されたレダクターゼ融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミド）を得た[XylM1-368-XylA]。
【００３６】
エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＭＣ４１００のそれぞれのコンピテントセルをｐＴｒｃＭＡｆで形質転換してＪＭ１０９ＭＡｆ、Ｃ６００ＭＡｆ、ＭＣ４１００ＭＡｆの３種類を作製した。
【００３７】
それぞれの菌体を回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１０の菌体懸濁液を調製した。栓つき試験管にその容量の１／３２体積あるいは１／１６体積だけ菌体懸濁液を移し、エタノールで３０ｍＭに調製した基質溶液を５体積％加えて密栓し、試験管を横にして３０℃で２８０回／分振とうした。３０分後に氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を、菌体懸濁液の８％体積だけ加えて反応を停止し、菌体懸濁液の約５０質量％の塩化ナトリウムと、０．２ｍＭドデカンのエーテル溶液を菌体懸濁液と同体積加えて、３０℃で２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００３８】
基質にトルエンを用いて反応時間３０分でＪＭ１０９ＭＡｆを活性測定した結果、ベンジルアルコールが０．６ｍＭの濃度で検出された。ベンズアルデヒドは検出されなかった。
【００３９】
基質にトルエンを用いて反応時間７５分で、Ｃ６００ＭＡｆとＭＣ４１００ＭＡｆを活性測定した結果、それぞれにベンジルアルコールが０．９７ｍＭ、０．９１ｍＭの濃度で検出された。またそれぞれにベンズアルデヒドが０．１４ｍＭ、０．０４ｍＭの濃度で検出された。
【００４０】
さらに基質にｐ−キシレンを用いて反応時間７５分で、Ｃ６００ＭＡｆとＭＣ４１００ＭＡｆを活性測定した結果、それぞれにｐ−メチルベンジルアルコールが０．３５ｍＭ、０．４９ｍＭの濃度で検出された。またそれぞれにｐ−メチルベンズアルデヒドが０．４９ｍＭ、０．３７ｍＭの濃度で検出された。
形質転換細胞ＪＭ１０９ＭＡｆ、Ｃ６００ＭＡｆ、ＭＣ４１００ＭＡｆは全てキシレンモノオキシゲナーゼ活性を示すことから、それらはヒドロキシラーゼとＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼの両者を発現することが示された。
【実施例２】
【００４１】
チオレドキシン融合ヒドロキシラーゼとチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼの作製
ｐＴｈｉｏＨｉｓＢはアミノ酸残基の３１残基目と６３残基目のアミノ酸がヒスチジン残基に置換された大腸菌由来のチオレドキシン（以下、「改変チオレドキシン」と称す）のカルボキシル末端に、エンテロキナーゼ（別名：エンテロペプチダーゼ）の特異的切断部位を含んだペプチドリンカーを連結させた蛋白質をコードする遺伝子を含んだプラスミドである。そのプラスミドのエンテロキナーゼの特異的切断部位の塩基配列の下流のクローニング部位に他の蛋白質遺伝子を適切に挿入すれば、そのプラスミドで形質転換された大腸菌に、改変チオレドキシンから挿入した蛋白質までが融合した蛋白質の遺伝子の発現を誘導できると考えられる。尚、誘導にはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）が用いられる。また、３１残基目と６３残基目のアミノ酸がヒスチジン残基に置換された改変チオレドキシンはニッケルキレート樹脂に吸着する性質があることと、ヒスチジンを含んだ緩衝液でニッケルキレート樹脂から遊離することが知られており、ニッケルキレート樹脂がその精製に利用できることが知られている。
本発明者は上記事項を鑑み、プラスミドｐＴｈｉｏＨｉｓＢを用い、チオレドキシン融合ヒドロキシラーゼ及びチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼを作製した。
【００４２】
ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ、プライマー３（配列番号３）、プライマー４（配列番号４）を用いてｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｈｉｏＨｉｓＢに挿入することにより、アミノ末端側から順に、改変チオレドキシン、リンカーペプチド、ＸｙｌＭが連結されたチオレドキシン融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子を含んだ（ただしｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子の間にノンコード領域をもつ）プラスミドｐＴｈＭ１Ａを得た[Mod.ThioRed-XylM-XylA]。
【００４３】
ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ、プライマー５（配列番号５）、プライマー４（配列番号４）を用いてｘｙｌＭ２遺伝子（ＸｙｌＭの２残基目Ｄから３６９残基目Ｉまでをコードする遺伝子）とｘｙｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、ＫｐｎＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＫｐｎＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｈｉｏＨｉｓＢに挿入することにより、アミノ末端側から順に、改変チオレドキシン、リンカーペプチド、ＸｙｌＭ２（ＸｙｌＭの２残基目アスパラギン酸残基から３６９残基目イソロイシン残基までからなるヒドロキシラーゼ）が連結されたチオレドキシン融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子と、ｘｙｌＡ遺伝子を含んだ（ただしＸｙｌＭ２の遺伝子と、ｘｙｌＡ遺伝子の間にノンコード領域をもつ）プラスミドｐＴｈＭ２Ａを得た[Mod.ThioRed-XylM2-369-XylA]。
【００４４】
ｐＴｒｃＭＡｆ、プライマー３（配列番号３）、プライマー４（配列番号４）を用いてＤＮＡを増幅し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｈｉｏＨｉｓＢに挿入することにより、アミノ末端側から順に、改変チオレドキシン、リンカーペプチド、ＸｙｌＭの１残基目メチオニン残基から３６８残基目セリン残基までからなるヒドロキシラーゼ、ＸｙｌＡが連結されたチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＴｈＭ１Ａｆを得た[Mod.ThioRed-XylM1-368-XylA]。
【００４５】
ｐＴｒｃＭＡｆ、プライマー５（配列番号５）、プライマー４（配列番号４）を用いてＤＮＡを増幅し、ＫｐｎＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＫｐｎＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｈｉｏＨｉｓＢに挿入することにより、アミノ末端側から順に改変チオレドキシン、リンカーペプチド、ＸｙｌＭの２残基目アスパラギン酸残基から３６８残基目セリン残基までからなるヒドロキシラーゼ、ＸｙｌＡが連結されたチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミドｐＴｈＭ２Ａｆを得た[Mod.ThioRed-XylM2-368-XylA]。
【００４６】
作製したプラスミドｐＴｈＭ１Ａ、ｐＴｈＭ２Ａ、ｐＴｈＭ１Ａｆ、ｐＴｈＭ２Ａｆのそれぞれでエシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセルとエシェリヒア・コリＣ６００のコンピテントセルの２種類の大腸菌を形質転換して、それぞれ、ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａ、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａｆ、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆの計８種類の形質転換された大腸菌を作製した。それら８種類の形質転換された大腸菌についてｐ−キシレンを基質にして活性測定を行った結果、それぞれｐ−メチルベンジルアルコールが、０．１０５ｍＭ、０．２２４ｍＭ、０．０７９ｍＭ、０．０２９ｍＭ、０．２６３ｍＭ、０．０２３ｍＭ、０．１６２ｍＭ、０．０３０ｍＭの濃度で検出された。
これら形質転換細胞は全てキシレンモノオキシゲナーゼ活性を示すことから、全てヒドロキシラーゼとＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼの両者を発現することが示された。
【実施例３】
【００４７】
チオレドキシン融合ヒドロキシラーゼとチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
上記の形質転換細胞ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａ、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａｆ、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆのそれぞれを１．６％トリプトンペプトン、１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ  ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリンからなる培地で液体培養して増殖させ、菌体密度がＯＤ６００で０．５〜０．９に達したのち、ＩＰＴＧを加えてさらに３．５時間培養した。
【００４８】
それぞれの形質転換体を回収し、５％２−メルカプトエタノール、１％ＳＤＳ、５０％グリセリン、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８（ＳＤＳ試料緩衝液）に分散して、５分間煮沸した。１２．５％のポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量マーカー蛋白質には分子量９７ｋ、６６ｋ、４２ｋ、３０ｋ、２０ｋ、１４ｋの蛋白質を用いた。蛋白質はＣＢＢ Ｒ−２５０で染色して検出した。
【００４９】
図１に示すようにＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ（レーン６）、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ（レーン１〜５）、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａ（レーン１２）、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ（レーン７〜１１）のそれぞれの遺伝子に対応するチオレドキシン融合ヒドロキシラーゼが分子量５１ｋの蛋白質として検出され、また、それぞれにＸｙｌＡが分子量４０ｋの蛋白質として検出された。
【００５０】
また図２に示すようにＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ（レーン６）、Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ（レーン１〜５）、ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａ（レーン１２）、Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ（レーン７〜１１）のそれぞれの遺伝子に対応するチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼが分子量９１ｋの蛋白質として検出された。
従って、これら形質転換細胞は全てヒドロキシラーゼをＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ及び改変チオレドキシンに融合した形態で発現し、またキシレンモノオキシゲナーゼ活性を示すことから、その融合体はヒドロキシラーゼ活性及びＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ活性の両者を発揮することが示された。
【実施例４】
【００５１】
チオレドキシン融合ヒドロキシラーゼとチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼの分画
上記形質転換細胞ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆのそれぞれをトリプトンペプトン培地で液体培養して増殖させ、菌体密度がＯＤ６００で０．５〜０．７に達したのち、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えてさらに４時間培養した。
【００５２】
それぞれに菌体を回収し、１％ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄後、菌体密度がＯＤ６００で１４になるように１ｍＭ ＰＭＳＦ、２．５％エタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液１ｍｌに懸濁したのち、菌体を超音波破砕した。
【００５３】
超音波破砕物（２０μｌ）をそれぞれにマイクロ遠心チューブにとり、５０００ｒｐｍ、１０分間（４℃）遠心分離して上清画分（Ｓ１画分）と沈澱画分に分けた。沈澱画分は０．５ｍＭ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液５００μｌに懸濁後、再度遠心分離して、沈澱画分を０．５ｍＭ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液２０μｌに再懸濁し、それをＰ１画分とした。
【００５４】
同様にして超音波破砕物（２０μｌ）をそれぞれにマイクロ遠心チューブにとり、５０００ｒｐｍ、１０分間（４℃）遠心分離して上清画分と沈澱画分に分けた。各上清画分１５μｌをそれぞれ別のマイクロ遠心チューブにとり、１５０００ｒｐｍ、１０分間（４℃）遠心分離して上清画分（Ｓ２画分）と沈澱画分に分けた。沈澱画分は０．５ｍＭ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液５００μｌに懸濁後、再度遠心分離して、沈澱画分を０．５ｍＭ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液２０μｌに再懸濁し、それをＰ２画分とした。
【００５５】
それぞれの菌体破砕物から得られたＳ１画分、Ｐ１画分、Ｓ２画分、Ｐ２画分  を等体積のＳＤＳ試料緩衝液と混合して、５分間煮沸した。それぞれを室温に戻したのち、１０％のポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ついでＰＶＤＦ膜（商標イモビロン−Ｐ；ミリポア社製）に転写したあとウエスタンブロットを実施した。ウエスタンブロットでは１次抗体に抗チオレドキシン抗体を用い、検出にはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ウエスタンブロットのビオチン標識分子量マーカー蛋白質には分子量２００ｋ、１１６ｋ、９７ｋ、６６ｋ、４５ｋの蛋白質を用いた。
【００５６】
図３に示したようにＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆには、Ｓ１画分（レーン２）、Ｐ１画分（レーン４）、Ｐ２画分（レーン８）にもチオレドキシン・レダクターゼ融合ヒドロキシラーゼが分子量９１ｋの蛋白質として顕著な量で検出されたが、Ｓ２画分（レーン６）には検出されなかった。
【００５７】
ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａにおいては図３に示したように、Ｓ１画分（レーン１）、Ｐ１画分（レーン３）、Ｓ２画分（レーン５）、Ｐ２画分（レーン７）のすべてにチオレドキシン融合ヒドロキシラーゼが分子量５１ｋの蛋白質として顕著な量で存在していた。
【実施例５】
【００５８】
チオレドキシン融合ヒドロキシラーゼのアフィニティークロマトグラフィー
ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａをトリプトンペプトン培地で液体培養して増殖させ、菌体密度がＯＤ６００で０．６７に達したのち、１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えてさらに３．５時間培養した。
【００５９】
その培養物（５００ｍｌ）を遠心分離して菌体を回収し、１％ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄後、菌体密度がＯＤ６００で１０になるように１ｍＭ ＰＭＳＦ、２．５％エタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液１ｍｌに懸濁したのち、菌体を超音波破砕した。
【００６０】
その菌体破砕物を１３０００ｒｐｍ、１０分間（４℃）で遠心分離して沈澱物を得た。その沈澱物を５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）３０ｍｌに懸濁し、再度遠心分離して沈澱物を同緩衝液１０ｍｌに懸濁したのち、予め６０℃に加温した９Ｍ尿素溶液を８０ｍｌ加えた。それを６０℃で４０分間加温して沈澱物を溶解したのち、５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を１０ｍｌ加えて６０℃で２０分間加温した。その溶液１００ｍｌを、尿素７６．９ｇ、酸化型グルタチオン０．２４５ｇ、還元型グルタチオン１．２２９ｇ、ＥＤＴＡ・３ナトリウム０．８２４ｇを含んだ５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）１．９リットルに室温で１２時間透析した。ついで１Ｍ尿素、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ８０、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２リットルに室温で６時間透析した。
【００６１】
透析後の試料溶液のおよそ９割（総蛋白質量６４．５ｍｇ）を、予めニッケルをキレートさせた後に平衡化緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含んだ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））で平衡化したＡＦキレート・トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社製）のカラム（ゲル体積７５ｍｌ）に流速３ｍｌ／分でロードしたのち、２０ｍＭイミダゾールを含んだ平衡化緩衝液で非吸着画分を溶出させた。つぎに２０ｍＭイミダゾールを含んだ平衡化緩衝液から５００ｍＭイミダゾールを含んだ平衡化緩衝液へのリニア濃度勾配（４８分間）で吸着画分を分取した。
【００６２】
分取した画分は、ウシ血清アルブミンを標準蛋白質に用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法により蛋白質定量したのち、蛋白質濃度の高いフラクション近傍をプールした。１２．５％のポリアクリルアミドゲルで、クロマト前の試料、イミダゾールリニア濃度勾配で溶出する前に溶出した非吸着画分、プールした画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量マーカー蛋白質には分子量９７ｋ、６６ｋ、４２ｋ、３０ｋ、２０ｋ、１４ｋの蛋白質を用いた。蛋白質はＣＢＢ Ｒ−２５０で染色して検出した。
【００６３】
その結果、図４に示したようにＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａから精製されたチオレドキシン融合ヒドロキシラーゼが５１ｋの蛋白質としてプールした画分に顕著な量で検出された。プールしたフラクションの総蛋白質量は５ｍｇであった。
【００６４】
比較例１
キシレンモノオキシゲナーゼの非融合型コンポーネントの作製
ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯを鋳型に用いてプラスミド３種類（ｐＴｒｃＭ、ｐＴｒｃＭＡ、ｐＴｒｃＡ）を以下の方法で作製した。
【００６５】
プライマー３（配列番号３）とプライマー６（配列番号６）を用いてキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ遺伝子（ｘｙｌＭ遺伝子）を増幅し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩの制限酵素で切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより、プラスミドｐＴｒｃＭを得た。
【００６６】
プライマー３（配列番号３）とプライマー２（配列番号２）を用いてキシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭ遺伝子とキシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ遺伝子（ｘｙｌＡ遺伝子）を含むＤＮＡを増幅し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより、ｘｙｌＭ遺伝子 とｘｙｌＡ遺伝子の間にノンコード領域をもつプラスミドｐＴｒｃＭＡを得た。
【００６７】
プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）を用いてｘｙｌＡ遺伝子を増幅し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより、プラスミドｐＴｒｃＡを得た。
【００６８】
形質転換体の作製
エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテントセルを、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｒｃＭ、ｐＴｒｃＭＡ、ｐＴｒｃＡのそれぞれで形質転換してＪＭ１０９Ｖ、ＪＭ１０９Ｍ、ＪＭ１０９ＭＡ、ＪＭ１０９Ａを作製した。
【００６９】
形質転換体は１％トリプトンペプトン 、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ  ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、２％Ｂａｃｔｏアガーからなる培地で平板培養して得られたコロニーを１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ  ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリンからなる培地（トリプトンペプトン培地）で液体培養して増殖させ、その菌から調製したプラスミドのサイズおよびそのプラスミドの制限酵素消化断片のサイズから選別した。
【００７０】
活性測定
ＪＭ１０９ＭＡ、ＪＭ１０９Ｍ、ＪＭ１０９Ａ、ＪＭ１０９Ｖのそれぞれをトリプトンペプトン培地で液体培養して増殖させたのち、ＩＰＴＧを濃度１ｍＭになるように加えて４時間培養した。
【００７１】
それぞれの菌体を回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１０の菌体懸濁液を調製した。栓つき試験管にその容量の１／３２体積あるいは１／１６体積だけ菌体懸濁液を移し、エタノールで３０ｍＭに調製した基質溶液を５体積％加えて密栓し、試験管を横にして３０℃で２８０回／分振とうした。３０分後に氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を、菌体懸濁液の８％体積だけ加えて反応を停止し、菌体懸濁液の約５０質量％の塩化ナトリウムと、０．２ｍＭドデカンのエーテル溶液を菌体懸濁液と同体積加えて、３０℃で２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００７２】
ＪＭ１０９ＭＡを用いて活性測定した結果、基質がトルエンのときにはベンジルアルコールが０．２９ｍＭ、基質がｍ−キシレンのときにはｍ−メチルベンジルアルコールが０．８６ｍＭ、基質がｐ−キシレンのときにはｐ−メチルベンジルアルコールが０．７ｍＭのそれぞれの濃度で菌体懸濁液中に検出された。またそれぞれの基質に対応するアルデヒドは検出されなかった。ＸｙｌＭ遺伝子 とＸｙｌＡ遺伝子をもつプラスミドｐＴｒｃＭＡで形質転換されたＪＭ１０９ＭＡはキシレンモノオキシゲナーゼ活性を有することから、ヒドロキシラーゼとＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼの両者を発現することが示された。
ＪＭ１０９Ｍ、ＪＭ１０９Ａ、ＪＭ１０９Ｖはいずれも基質に作用しなかった。
【００７３】
比較例２
ＪＭ１０９Ｖ、ＪＭ１０９Ｍ、ＪＭ１０９ＭＡ及びＪＭ１０９Ａのそれぞれを０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含んだＬＢ培地で液体培養して増殖させたのち、ＩＰＴＧを濃度１ｍＭになるように加えて４時間培養した。
【００７４】
それぞれの形質転換体を回収し、５％２−メルカプトエタノール、１％ＳＤＳ、５０％グリセリン、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８（ＳＤＳ試料緩衝液）に分散して、５分間煮沸した。それぞれを室温に戻したのち、１２．５％のポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。蛋白質はＣＢＢ Ｒ−２５０で染色して検出した。
【００７５】
その結果、キシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ（ＸｙｌＡ）は、ＪＭ１０９ＭＡとＪＭ１０９Ａのそれぞれには分子量４０ｋＤの位置に検出され、ＪＭ１０９ＶとＪＭ１０９Ｍには検出されなかった。キシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ（ＸｙｌＭ）は、ＪＭ１０９ＭＡ、ＪＭ１０９Ｍ、ＪＭ１０９Ａ、ＪＭ１０９Ｖのいずれにも検出できなかった。従って、比較例１でキシレンモノオキシゲナーゼ活性が検出されたＪＭ１０９ＭＡであっても、それが生産するキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼ（ＸｙｌＭ）の量は非常に少ないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明で提供されるポリペプチド融合したキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼは、従来報告されているキシレンモノオキシゲナーゼのヒドロキシラーゼに比べ、その遺伝子で形質転換した微生物を用いることで多量に生産できる。そのことはその酵素の検出が容易になることでポリペプチド融合ヒドロキシラーゼあるいはその分子内のヒドロキシラーゼ、あるいは融合したポリペプチドを切除したヒドロキシラーゼの、機能を改変するための遺伝子組換え技術に貢献するとともにそれらヒドロキシラーゼを用いて行う酸化反応への応用に道を開くものである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】形質転換された大腸菌のライセートを、大腸菌と誘導に使用したＩＰＴＧ濃度の条件をそれぞれ（１）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、０ｍＭ、（２）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、０．１ｍＭ、（３）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、０．５ｍＭ、（４）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、１ｍＭ、（５）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａ、１０ｍＭ、（６）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、１ｍＭ、（７）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、０ｍＭ、（８）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、０．１ｍＭ、（９）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、０．５ｍＭ、（１０）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、１ｍＭ、（１１）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａ、１０ｍＭ、（１２）ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａ、１ｍＭにして実施例３に示す方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥをした結果を示す図である。（Ｍ）は分子量マーカー蛋白質のレーンである。
【図２】形質転換された大腸菌のライセートを、大腸菌と誘導に使用したＩＰＴＧ濃度の条件をそれぞれ（１）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、０ｍＭ、（２）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、０．１ｍＭ、（３）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、０．５ｍＭ、（４）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、１ｍＭ、（５）Ｃ６００ＴｈＭ１Ａｆ、１０ｍＭ、（６）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、１ｍＭ、（７）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆ、０ｍＭ、（８）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆ、０．１ｍＭ、（９）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆ、０．５ｍＭ、（１０）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆ、１ｍＭ、（１１）Ｃ６００ＴｈＭ２Ａｆ、１０ｍＭ、（１２）ＪＭ１０９ＴｈＭ２Ａｆ、１ｍＭにして実施例３に示す方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥをした結果を示す図である。（Ｍ）は分子量マーカー蛋白質のレーンである。
【図３】形質転換された大腸菌の超音波破砕物を、大腸菌と分画の条件をそれぞれ（１）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｓ１画分、（２）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｓ１画分、（３）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｐ１画分、（４）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｐ１画分、（５）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｓ２画分、（６）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｓ２画分、（７）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａ、Ｐ２画分、（８）ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａｆ、Ｐ２画分にして実施例４に示す方法でウエスタンブロットをした結果を示す図である。
【図４】ＪＭ１０９ＴｈＭ１Ａから調製した透析物を、ニッケルをキレートしたＡＦキレートトヨパール６５０Ｍでそれぞれ（１）クロマト前の試料、（２）イミダゾールリニア濃度勾配で溶出する前に溶出した非吸着画分、（３）プールした画分を実施例５に示す方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥをした結果を示す図である。（Ｍ）は分子量マーカー蛋白質のレーンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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