(57)【要約】  【課題】  本発明は、アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインＢをエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法を提供する。  【解決手段】  ａ）エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料に水か又は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかにより抽出し、ｂ）ろ過し、ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発させ、ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合体ゲルのカラムにより精製する工程を順次に行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）エピロビウム・パルビフロラム（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  Ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）の乾燥試料に水か又は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかを添加することにより抽出し、
ｂ）ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発が達成されるまで濃縮を行い、
ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発させ、
ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合体ゲルのカラムにより精製する
工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法。
【請求項２】
エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料にアセトン／水混合物を添加することにより抽出を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン過多症（ｈｙｐｅｒａｎｄｒｏｇｅｎｉｓｍ）と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインＢ（ｏｅｎｏｔｈｅｉｎｅ  Ｂ）をエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピロビウム属（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ）（アカバナ科）にはほぼ２００もの異なった種が存在する。エピロビウム・パルビフロラム（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  Ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）並びにエピロビウムのその他の種は、あらゆる種類の障害、例えば膀胱、腎臓の障害、特に前立腺の障害に有益であるとして慣用医薬品の中に説明されている（Ｈ．ヒアーマン、Ｈ．ジュアン及びＷ．サメツ、Ｊ．Ｅｔｈｎｏ−ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７（１９８６），１６１−１６７；Ｖ．Ｅ．タイラー、Ｐｈａｒｍ．Ｉｎｔ．（１９８６），２０５）。
エピロビウムには多くの成分が含まれていて、それらは複雑な構造を有する。今日までにいくつかの分析が試みられ、各種の化合物の存在が示された。しかし、組成はまだ周知ではない。
【０００３】
しかして、ステロール類（Ａ．ヒアーマン、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８５），３９）、トリテルペン及びフラボノイド類（アグリコン及びグリシドフラボノール類）（Ａ．ヒアーマン及びＫ．メイ、Ｓｃｉ．Ｐｈａｒｍ．５１（１９８３），１５８）の存在がわかった。最近になって、エピロビウム・パルビフロラムからグリコシドフラボノール類が分離されてからケルシトリン、ミリシトリン、イソミリシトリン、没食子酸及びクロロゲン酸の存在が明らかにされた（Ｉ．スラカニン、Ａ．マーストン、Ｋ．ホステットマン、Ｎ．デラベイズ及びＣ．ダーベレイ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５５７（１９９１），３９１−３９８）。
【０００４】
本願発明者は、エピロビウム・パルビフロラムがこの植物から今日までに単離されることが決してなかった特に有益な別の化合物、即ちイーノセインＢをさらに含有することを発見した。
イーノセインＢは加水分解性のオリゴマータンニンである。それは、イーノセラ・エリスロセパラ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｓｅｐａｌａ  Ｂｏｒｂａｓ）から初めて単離された（Ｔ・ハタノ他、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１（１９９０），２７３５；日本薬学会第１０４回年会、１９８４年３月、仙台；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（８）（１９８９），２２６９−２２７１）。
次いで、イーノセインＢは、種々のアカバナ科（Ｏｎａｇｒｅａｃｅａｅ）、そしてミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）の一員であるウッドホルジア・フルチコサ（Ｗｏｏｄｆｏｒｄｉａ  ｆｒｕｔｉｃｏｓａ）に見出された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８，１２１１（１９９０）。さらに、最近になって、イーノセインＢは、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）の一員であるユーカリプタス・アルバ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ａｌｂａ  ＲＥＩＮＷ）の乾燥果実から単離された（Ｔ．ヨシダ他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０（７），１７５０−１７５４（１９９２）。
【０００５】
最近発見されたが、イーノセインＢはその薬剤として用途を立証する多くの研究の主題となってきた。しかして、イーノセインＢは抗ウイルス剤及び抗腫瘍剤の領域において多くの生物学的及び薬理学的性質を持っている。
抗腫瘍活性
・リードケミカルＣｏ：特開昭６２−１２９２２０（１１／０６／８７）；優先権主張：特願昭６０−２７０４９４（３０／１１／８５）
・日本化薬：特開平３−１２３７９３（２７／０５／９１）；優先権主張：特願平１−２５８７０８（０５／１０／８９）
・ケンイチミヤモト他：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１６（４），３７９−３８７（１９９３）
・Ａ．クラモチ−モギ他：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．４４（１０），１９６１−１９６５（１９９２）
・ヤン−ジュ  ツァイ他：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．ｏｆ  Ｃｈｅｍ．：２６７（２０），１４４３６−１４４４２
・ケンイチミヤモト他：Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８４，９９−１０３（１９９３）
抗ウイルス活性（ヘルペス）
・Ｋ．フクチ他：Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（１９８９），２８５−２９８
抗ウイルス活性（ＨＩＶ）
・リードケミカルＣｏ：ヨーロッパ特許２９７５４７（０４／０１／８９）；優先権主張：特願昭６２−１６１５７２（２９／０６／８７）
【０００６】
エピロビウム・パルビフロラムの煎じ汁からの特定の抽出物（水性画分）がある種の男性ホルモン、特に４，５−α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の生合成における重要な酵素であるテストステロン酵素５−α−レダクターゼの阻害剤として有意に応答することを本願発明者が観察したのはこの抽出物の研究中であった。
この観察によって本願発明者はこの阻害の原因となる分子を同定しようと試みるに至った。これによりこのものがイーノセインＢであることが示された。
要するに、イーノセインＢがエピロビウム・パルビフロラムの活性成分の一つとして単離され同定されたのはこれが最初である。
さらに、イーノセインＢが従来技術において決して予見されなかったテストステロン酵素５−α−レダクターゼの阻害剤として作用することが決定されたのはこれが最初である。
イーノセインＢは５−α−レダクターゼの阻害剤としての特異的な活性を有する。５−α−レダクターゼは、アンドロゲン受容器（ＡＲ）に対してテストステロンよりも大きな親和性を有するジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）にテストステロンを変換させる原因となる酵素である。
【０００７】
このホルモンは、男性においては、外部生殖器官の子宮内発現に対して、次いで青春期からはある種の第二次性徴（顔及び体の毛の系統）の発生に対して必須である。
５−α−レダクターゼは、テストステロンが活性であるようにＤＨＴに変換されなばならない思われる前立腺及び皮膚に主として見出される。
しかし、過剰なＤＨＴはざそう又はアンドロゲン性脱毛症、女性の多毛症の原因となろうし、また前立腺に蓄積すると前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）又は癌の原因となろう。８０才以上の男性の８０％はＢＨＰを有し、７０％は癌性の病巣を有するものと推定される。
スタロイド代謝におけるこの酵素段階の阻害はインビボでのＤＨＴのレベルの低下を伴う。このＤＨＴレベルの低下は、男性の前立腺の大きさを減少させるという効果を有し、従って前立腺の良性肥大、前立腺癌及びある種のアンドロゲン依存性の疾病の治療において有益な効果を有する。
従って、５−α−レダクターゼを阻害する治療は非常に有用であって、受容器をブロックする抗男性ホルモンの欠点を現わさない。
従って、５−α−レダクターゼのこの阻害性は、イーノセインＢをアンドロゲン過多症と関連した障害の治療に、特に前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）、前立腺癌、ざそう、アンドロゲン性脱毛症、脂漏又は女性の多毛症の治療に使用するのを可能ならしめるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤であるイーノセインＢをエピロビウム・パルビフロラムから製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
しかして、本発明の主題は、
ａ）エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料に水か又は水と混和性の溶媒と水との混合物のいずれかを添加することにより抽出し、
ｂ）ろ過し、要すれば減圧下に水と混和性の溶媒の蒸発が達成されるまで濃縮を行い、
ｃ）水性相の凍結乾燥を行うか又は極性溶媒による抽出を行い、その極性溶媒を乾燥抽出物が得られるまで蒸発させ、
ｄ）凍結乾燥物又は乾燥抽出物を逆相ＨＰＬＣ又は重合体ゲルのカラムにより精製する
工程を順次に行うことを特徴とする、エピロビウム・パルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
したがって、本発明の製造方法は、下記のように行われる抽出、次いで精製から本質的になっている。
【００１１】
抽出
エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料に水か又は水と混和性の溶媒、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールのようなアルコール又はアセトンと水との混合物を添加する。乾燥試料は好ましくはエピロビウム・パルビフロラムの葉である。
水と混和性の溶媒の好ましいものはアセトンである。
撹拌し、ろ過した後、要すればろ液を減圧下に水と混和性の溶媒が蒸発されるまで濃縮する。残った水性相を凍結乾燥するか又は当業者に周知の各種の極性溶媒、例えばジエチルエーテル、酢酸エチル又はブタノールによって抽出する。ブタノールを使用するのが好ましい。次いでこれらの画分を集めて５０℃を越えない温度で減圧下に乾燥抽出物が得られるまで蒸発させる。
【００１２】
精製
活性成分の精製は、重合体ゲルのカラムに通すか又は逆相ＨＰＬＣにより行う。
重合体ゲルのカラムによる精製
上記で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、生じた混合物を重合体ゲルのカラム、例えばダイアイオンＨＰ２０、セファデックスＬＨ２０又はトヨパールＨＷ４０型のカラムに注ぎ入れる。
溶出を蒸留水、次いでアルコールの割合を順次に増大させたアルコール／蒸留水混合物により行う。イーノセインＢを含有する画分はＨＰＬＣにより同定し、次いで凍結乾燥する。使用するアルコールは好ましくはメタノールである。
逆相ＨＰＬＣによる精製
上で得た乾燥抽出物又は凍結乾燥物を蒸留水に溶解し、次いでこれを逆相ＨＰＬＣにより精製する。溶出をアセトニトリル／水混合物のような極性親水性溶媒の混合物からなる勾配でもって、トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）のような酸を使用する酸性ｐＨにおいて行う。次いで、イーノセインＢを含有する画分を、保持時間及びダイオードアレイ検出器（２１０−５００ｎｍ）又はＵＶ検出器を使用する分析により得たスペクトルの関数として単離する。場合により二回目の精製の後、所期生成物の凍結乾燥を行う。
【００１３】
本発明のさらに特別の主題は、エピロビウム・パルビフロラムの乾燥試料にアセトン／水混合物を添加することにより抽出を行うことを特徴とする、前記のようなエピロビウム・パルビフロラムからイーノセインＢを製造する方法にある。
【００１４】
上記の製造方法により製造されたイーノセインＢは、アンドロゲン過多症と関連した障害の治療用薬剤として有用である。
この薬剤の薬量は、治療しようとする疾病及び投与経路によって変わる。
従って、それは、例えば成人の場合に経口投与により１日当たり５〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。
【００１５】
従って、イーノセインＢは、これを活性成分として含有する製薬組成物を調製するのに使用することができる。
本発明に従うイーノセインＢは、消化器経路で、非経口的に又は局所的に、例えば経皮的に使用することができる。これは固体でも液体でもよく、人の医薬として慣用されている製剤形状で、例えば無味若しくは糖衣錠剤、カプセル、顆粒、座薬、注射用調合剤、ペッサリー、軟膏、クリーム、ゲル及び貼り薬の形状で提供できる。これらは通常の方法により製造される。
活性成分は、これらの製薬組成物に通常使用される補助剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性若しくは非水性のビヒクル、動物性若しくは植物性の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール類、各種の湿潤、分散若しくは乳化剤、保存剤と配合することができる。
【実施例】
【００１６】
下記の実施例は本発明を例示するものであって、それを何ら制限するものではない。
【００１７】
例１：アセトン／水混合物によるエピロビウム・パルビフロラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製のイーノセインＢの取得
１２７５ｇのエピロビウム・パルビフロラムの乾燥し破砕した葉及び枝を１００リットルの反応器に導入する。２０リットルのアセトン−水混合物（７−３）を添加する。混合物を機械的撹拌機を使用して６０時間撹拌する。混合物をろ過し、葉を４リットルのアセトンによりすすぐ。ろ液を減圧下に３５℃で、アセトンが蒸発するようにして約６リットルの容積まで濃縮する。残った水性相を２×１リットルのジエチルエーテル、２×１リットルの酢酸エチル及び２×０．５リットルのブタノールにより続けて抽出する。これらのうち最初の二つの画分を減圧下に３５℃の温度で蒸発させた後、１００ｇの黒色樹脂状物及び１０ｇの脆い褐色発泡体をそれぞれ得た。また、第三の画分をさらに低い減圧下に５０℃の温度で蒸発させた後、４５ｇの黒色樹脂状物を得た。この最後の画分がイーノセインＢに最も富んでいた。
【００１８】
例２：水によるエピロビウム・パルビフロラムの葉及び枝からの抽出並びに粗製のイーノセインＢの取得
２０ｇのエピロビウム・パルビフロラムの破砕した葉及び枝を６５℃で３５０ｍｌの水により覆う。次いで混合物を周囲温度で２０時間機械的に撹拌し続ける。次いで混合物をろ過し、葉を１００ｍｌの蒸留水によりすすぐ。このようにして、４５０ｍｌの透明な黒色溶液を得た。この溶液の５０ｍｌを凍結乾燥すると、所期の生成物に富む５００ｍｇの淡緑色粉末が得られた。
【００１９】
例３：イーノセインＢの同定及び精製
例２に従って製造した凍結乾燥物を蒸留水に溶解する（蒸留水１ｍｌ当たり２ｍｇ）。１０ｍｌ（２０ｍｇ）をノバパック（ＮＯＶＡＰＡＣＫ：商標）型の分取クロマトグラフィーカラム（Ｃ１８  ６μ  ７．８×３００ｍｍ）に注入する。溶出を下記の条件下で溶媒勾配によって５ｍｌ／ｍｉｎの流量で行う（容量％）。
・０〜２分：試料
・２〜７分：０．１％ｖ／ｖのトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）を含む１００％の  水
・７〜５７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセトニトリルの０から１０％ｖ  ／ｖまでの線形勾配
・５７〜７７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセトニトリルの１０から２５  ％ｖ／ｖまでの線形勾配
・７７〜９７分：０．１％ｖ／ｖのＴＦＡを含むアセトニトリルの２５から９０  ％ｖ／ｖまでの線形勾配
検出は、２１０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の波長でダイオードアレイを使用して行う。
集められた４３個の画分のうち１個だけが５−α−レダクターゼに対して活性を有し、保持時間は３６〜３８分の間であった。
純度を検査した後、この画分を凍結乾燥する。所期の物質をＮＭＲ及び質量分析計によりただちに分析する（この画分のＮＭＲ及び質量分析値は、文献：Ｔ．ハタノ他、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１（１９９０），２７３５−２７４３に記載のものと比較できる）。
【００２０】
ＮＭＲ
２５０ＭＨｚ
溶媒：アセトン−ｄ6 、４５℃、参照物質ＳｉＭｅ4 、ｐｐｍ、Ｊ（Ｈｚ）
α−グルコース
Ｈ−１；６．２０ｄ；Ｊ＝３．５
Ｈ−２；５．８７ｄｄ；Ｊ＝３．５−１０．５
Ｈ−３；６．１１ｄｄ；Ｊ＝１０．５
Ｈ−４；５．５９ｔ；Ｊ＝１０．５
Ｈ−５；４．５７ｄｄ；Ｊ＝６−１０
Ｈ−６；５．２４ｄｄ；Ｊ＝６−１３
３．６３ｄ；Ｊ＝１３
β−グルコース
Ｈ−１；４．４２ｄ；Ｊ＝８
Ｈ−２；５．１６ｄｄ；Ｊ＝８−９．５
Ｈ−３；５．４５ｔ；Ｊ＝９．５
Ｈ−４；４．９０ｔ；Ｊ＝９．５
Ｈ−５；４．１３ｄｄ；Ｊ＝５−９．５
Ｈ−６；５．０１ｄｄ；Ｊ＝５−１３
３．８４ｄ；Ｊ＝１３
例４の式を参照
質量スペクトル
ｍ／ｚＭＡＬＤＩ（マトリックスアシストレーザー脱着イオン化）
１５６９［（Ｍ＋Ｈ）］+ 
１５９１［（Ｍ＋Ｎａ）］+ 
１６０７［（Ｍ＋Ｋ）］+
【００２１】
例４：イーノセインＢの精製
ミクロボンダパック分取クロマトグラフィーカラム（Ｃ１８  １０μ、長さ５０ｃｍ、直径２ｃｍ（１インチ））を使用する。例２に従って製造した１ｇの凍結乾燥物を５０ｍｌの水に溶解してなるものを注入する。溶出を０．１％のトリフルオル酢酸を含有する水−アセトニトリル溶離剤混合物によって行う。アセトニトリルの濃度勾配は、３０分毎に１５％ｖ／ｖづつ増大させる。生成物をＵＶ検出器（波長３０５ｎｍ）により検出する。所期の物質は２７分の保持時間で現れた。画分を凍結乾燥した後、約３５ｍｇの純粋な所期物質がベージュ色粉末として回収された。
【００２２】
ＵＶ
ＭｅＯＨ／ＨＣｌ  ０．１Ｎ
２１８ｎＭ（＝１２００００）及び２６６ｎＭ（＝５５０００）
ＭｅＯＨ
２１８ｎＭ（ｌｏｇ＝５．０９）及び２６５ｎＭ（ｌｏｇ＝４．７７）
ＭｅＯＨ／ＮａＯＨ  ０．１Ｎ
２８５ｎＭ（＝３３０００）及びｉｎｆｌ．３１５及び４７３ｎＭ
不可逆的変化
円二色性
ＭｅＯＨ／ＨＣｌ  ０．１Ｎ
Ｍａｘ．２１９（ｎＭ）；（０）＝＋３．８  １０５
Ｉｎｆｌ．２３６（ｎＭ）；（０）＝＋１．７  １０５
Ｍａｘ．２５９（ｎＭ）；（０）＝−４．５  １０４
Ｉｎｆｌ．２８２（ｎＭ）；（０）＝＋９．５  １０４
【００２３】
ＮＭＲ
４００  Ｃ１３  ＭＨｚ
溶媒：Ｄ2 Ｏ
温度：プロトンについて２９７Ｋ
炭素１３について３１８Ｋ
参照：ＴＳＰ、０ｐｐｍ
略号：ｐｐｍ：ｐｐｍで表わした化学シフト
Ｊ（Ｈｚ）：Ｈｚで表わしたカップリング定数
多重線
ｓ：シングレット
ｗｓ：広いシングレット
ｄ：ダブレット
ｄｄ：ダブレットのダブレット
ｔ：トリプレット
【００２４】
イーノセインＢの構造を以下に示す。
【化１】
2005255693.tif 000002
【００２５】
イーノセインＢのＮＭＲデータを以下の表に示す。
【００２６】
【表１】
2005255693.tif 000003
【００２７】
【表２】
2005255693.tif 000004
【００２８】
【表３】
2005255693.tif 000005
【００２９】
上記の表において
ａ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る
ｂ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る
ｃ：属性がそれらの間で反転する場合があり得る
ことを示す。
【００３０】
質量スペクトル
実験の部
この研究に使用した装置は、トリプルセクター−ダブルフォーカス“ＶＧオートスペックＥ”質量分析計（フィソン・インスツルメント社製）であった。
試料の分子質量はＬＳＩＭＳ（液体二次イオン化質量分析計）による正帯電及び負帯電モードでのイオン化の下で決定する。試料は予め“マジックバレット／ＴＦＡ”と称するマトリックスに溶解してからＣｓ+ガンからの一次イオンビームにより衝撃させる。このビームは３０ＫＶの電圧の下で加速し、２〜３μＡｍｐの能力を有する。
二次イオン（試料）を８ＫＶの電圧の下で加速する。
フラグメント化の研究は、Ｂ／Ｅ＝一定の方法に従ってリンクされたスキャンにより行う。このために、“ペアレント”イオンを場の第一自由領域（１ＦＦＲ）に位置させたセルにおいて衝突によりフラグメント化させる。このセルに導入される衝突ガスは空気であって、その圧力は“ペアレント”イオンの初期強度を半分だけ低下させるのに必要なものである。
この研究は次に二つの段階、
ａ）準分子イオン（ＭＨ+ ）のフラグメント化
ｂ）前に得られたイオンのそれぞれについての連続フラグメント化
で行った。
【００３１】
結果
Ａ）正帯電モードでのＬＳＩＭＳ
ＭＨ+ ＝１５６９Ｄａ
Ｂ）負帯電モードでのＬＳＩＭＳ
（Ｍ−Ｈ）- ＝１５６７Ｄａ
Ｃ）ＭＨ+ イオン＝１５６９Ｄａのフラグメント化
このスペクトルで観察された主なイオンは１３９９+ −１２３７+ −７６７+ −４５３+ であった。
Ｄ）１２３７+ イオンのフラグメント化
このスペクトルで観察された主なイオンは１０８５+ −７６７+ −４５３+ であった。
Ｅ）７６７+ イオンのフラグメント化
このスペクトルで観察された主なイオンは７４９+ −６１５+ −４７１+ −４５３+ −３１５+ −１５２+ であった。
Ｆ）４５３+ イオンのフラグメント化
特に４３５Ｄａイオン（脱水）を生じる特徴的でないスペクトル。
【００３２】
例５：イーノセインＢの精製
例１に従って得た７１０ｍｇの黒色樹脂状物を５ｍｌの蒸留水に溶解し、ダイアイオンＨＰ２０樹脂カラム（２０ｃｍ／２ｃｍ）に注ぎ入れる。
溶出を２００ｍｌの蒸留水で、次いで２００ｍｌの蒸留水−メタノール混合物（８０−２０）で行う。この第二画分を凍結乾燥して５８ｍｇのイーノセインＢを粉末状のベイジュ色固体のとして得た。
ＮＭＲ、ＵＶ、ＣＤ及び質量分析計による分析は例４に記載したものと同等であった。
【００３３】
イーノセインＢの薬理学的研究
酵素とその基質（テストステロン）をインキュベーションし、形成された５−α−還元代謝産物（ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）及び５−α−アンドロスタンジオール）の量をＨＰＬＣにより測定することによって５−α−レダクターゼ活性を測定するための試験をインビトロで行う。
前立腺の良性肥大（ＢＨＰ）のために前立腺切除術を行って得たヒト前立腺のホモジネートを使用する。
【００３４】
方法
ホモジネートの調製
前立腺を一連の手術室を出た直後に集め、ドライアイスを満たした容器内に置いたアルミニウムペイパーで包装する。実験室では、ホモジネートが直ちに調製できない場合には、前立腺は−８０℃に貯蔵することができる。
前立腺を氷の上で非常に薄い切片に切断し、次いでポリトロン、次いでポッターガラスにおいて媒質Ａ（２０ｍＭの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；０．３２Ｍのサッカロース；１ｍＭのジチオトレイット（ＤＴＴ）；５０μＭのトリホスホピリジンヌクレオチドの水和ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ））内で粉砕する。１４０，０００Ｇで４℃で６０分間遠心処理した後、生成物を１０〜２０ｍｌの媒質Ｂ（２０ｍＭの燐酸カリウム、ｐＨ６．５；２０％のグリセリン；１ｍＭのジチオトレイット）に再懸濁させる。生成物をナンクチューブに分け、−８０℃に貯蔵する。
ホモジネートの少量についてこれを試験において将来使用するためにたんぱく質の量を定量し、これによりホモジネート１ｍｌ当たり少なくとも１０ｍｇのたんぱく質を有するようにする。
【００３５】
５−α−レダクターゼ活性の測定
試験管１本当たり１ｍｌの媒質の割合でｐＨ５．５でくえん酸塩（前立腺の標準媒質）の存在下にインキュベーションを行う。
１）基質（Ｓ）、即ち、くえん酸三ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中の１００の同位体希釈度を持つ“未標識”テストステロンと“トリチウム化”テストステロンとの混合物の調製
ａ）４０ｍＭのくえん酸三ナトリウム緩衝液：１１．７６ｇのくえん酸３Ｎａ・２Ｈ2 Ｏ（Ｍｅｒｋ  ｒｅｆ．Ａｒｔ  ６４４８）を秤量し、これを１リットルの蒸留水（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを５．０に調節する。
ｂ）１００の同位体希釈度を持つ“未標識”テストステロンと“トリチウム化”テストステロンとの混合物：テストステロンの１ｍＭ溶液を得るために、２．８８ｍｇの“未標識”テストステロンを秤量し、これを１０ｍｌのエタノールに溶解する。この溶液を１０ｍｌのくえん酸塩緩衝液中で０．９９／１０００、即ち９．９μｌまで希釈する（＝１０-6Ｍ溶液）。上記の溶液の１０ｍｌに９μｌのテストステロン−3Ｈ（ＮＥＴ−３７０）を添加する（＝１００の同位体希釈度）。基質（Ｓ）は使用できる状態にある。
２）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物の調製
ａ）燐酸カリウム緩衝液、４０ｍＭ、ｐＨ６．５：５．４４ｇのＫＨ2ＰＯ4（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ  ｒｅｆ．３０４０７）を秤量し、これを１リットルの蒸留水Ｂに（ミリキュウ−Ｑ社製）に溶解し、ｐＨを６．５に調節する。
ｂ）ＤＴＴ、１ｍＭ（シグマ社製）：３．１ｍｇのＤＴＴを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝液に溶解する。
ｃ）ＮＡＤＰＨ、５００μＭ（シグマ社製）：８．３３ｍｇのＮＡＤＰＨを秤量し、これを１ｍｌの燐酸塩緩衝液に溶解する。
ｄ）酵素＋ＤＴＴ＋ＮＡＤＰＨ混合物（Ｅ）：０．５ｍｇの前立腺ホモジネートのたんぱく質、５０μｌのＤＴＴ及び５０μｌのＮＡＤＰＨを各試験のために４℃で混合する。この混合物を燐酸塩緩衝液により５００μｌにする。
３）インキュベーション
試験の数と同じ数の試験管を準備する。５００μｌの基質（Ｓ）及び１０μｌの阻害剤を所望の濃度で（又は対照例についてはエタノール）を各試験管に入れる。
予備インキュベーションすべき混合物（Ｓ）を入れた試験管及び混合物（Ｅ）を入れた小びんを水浴で３〜５分間加熱する。
反応を開始させるために、混合物（Ｓ）と阻害剤を入れた各試験管に５００μｌの混合物（Ｅ）を素早く移し、３７℃でゆっくりと撹拌しながら３０分間インキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに試験管に氷を入れて反応を停止させる。
４）抽出
反応を停止させたならば直に各試験管に２ｍｌの酢酸エチルを添加し、マルチチューブ渦巻発生器により１分間撹拌する。試験管を１０分間デカンテーションし、次いで抽出物（＝８０％）の（上部）有機相の１．６ｍｌを別の試験管に回収する。酢酸エチルを全部蒸発させた後、ＨＰＬＣにおいて使用する８００μｌの易動相を各試験管に添加する。
５）ＨＰＬＣクロマトグラフィー
形成された化合物を逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離することによりインキュベーション中に生成した代謝産物の量を測定した。ＯＤＳ−ハイパーシルカラム（粒子直径＝５μｍ）及び４５／１５／４０の比率のＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ2 Ｏからなる易動相を使用する。抽出後に集めた抽出物をＨＰＬＣ系に自動的に注入し、線形放射能測定系（ベルソルド社製）によって放射性代謝産物のみ、従って基質により標識されたテストステロンから形成された代謝産物のみを評価した。この測定は非常に敏感であり、存在し得る内生的生成物の全てを除去する。
【００３６】
結果の表示及び計算方法
形成された代謝産物の量を、ＨＰＬＣのＭＴ２ソフトウェアに入力した参照曲線と比較して計算する。ＭＴ２のレベルでは、これらは注入量１μｌ当たりのｐモル数で現れる。テストステロン、ＤＨＴ及びアンドロスタンジオール、テストステロンの２種の５−α−還元代謝産物について参照曲線が存在する。
量はホモジネートたんぱく質１ｍｇ当たりの生成物のモル数で表わされ（各試験は２回行う）、対照例試験と比較した残留５−α−レダクターゼ活性の割合（％）は次式により計算される。
【数１】
2005255693.tif 000006
結果
イーノセインＢについて、対照例の５−α−レダクターゼ活性を阻害するＩＣ50は２．２×１０-5Ｍであった。