(57)【要約】【課題】  水産系廃棄物ヒトデの有効利用技術を確立し、特に植物生長促進作用ないし植物生長抑制作用に関与する活性成分を解明し、これを化学合成品に代わる生物資源由来の安全、かつ安心な肥料・農薬もしくはその素材として提供すること。【解決手段】  ヒトデの温水抽出物を水と有機溶剤で２層分配して得た水溶性画分の濃縮・精製画分又はヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た有機層の濃縮・精製画分を含有する植物生育促進剤並びにヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た水層の濃縮・精製画分を含有する植物生育抑制剤、これらを含有する肥料・農薬もしくはその素材。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトデの温水抽出物を水と有機溶剤で２層分配して得た水溶性画分の濃縮・精製画分を含有する植物生育促進剤。
【請求項２】
ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た有機層の濃縮・精製画分を含有する植物生育促進剤。
【請求項３】
ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た水層の濃縮・精製画分を含有する植物生育抑制剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の植物生長促進剤を含有する肥料・農薬もしくはその素材。
【請求項５】
請求項３記載の植物生長抑制剤を含有する肥料・農薬もしくはその素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難処理性水産系廃棄物の一つであるヒトデの有効利用技術に関し、詳しくはヒトデの温水抽出物並びに有機溶剤抽出物の利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
北海道においては、近年ヒトデが大量発生を繰り返し、漁業等の操業や水産資源に深刻な被害を及ぼすことから、ヒトデの駆除が行われている。
駆除され陸揚げされたヒトデは、資源として利用されることなく、廃棄物として処理されている。そのため、陸上回収されたヒトデの有効利用法の開発が望まれている。
【０００３】
ヒトデ（学名Asterias amurensis、別名キヒトデ）はヒトデ綱に属し、日本に生息するヒトデ綱のなかで最も生息度が高い一般的な種で、北海道から瀬戸内に広く分布し、多くの食物資源、特に貝類を好む広食性の水生動物である。
他方、ヒトデは、サポニン、ステロイド、アントラキノン、アルカロイドやリン脂質などの様々な二次代謝産物を含有することが知られている。
【０００４】
ヒトデの代表的な二次代謝産物にアステロ（ヒトデ）サポニンがある。サポニンは主に植物界に存在するが、動物界での存在はヒトデとナマコなどに限られている。ステロイドと複数の糖が結合した構造（ステロイド配糖体）を有しており、駆虫・防虫作用、発泡作用や魚毒作用（非特許文献１参照）のほかに、捕食動物に対する防御作用（非特許文献２参照）や種々の薬効作用（アカヒトデから単離したcertonardosideのHIVやHSVに対する抗ウィルス活性（非特許文献３参照）やガン細胞に対する抗腫瘍活性（非特許文献４参照）など）およびculcitosideやrathbuniosideによる赤血球溶血活性（非特許文献５参照）など多くの生物活性を示す。
【０００５】
また、ヒトデにはサポニンの他にも生物活性を有する様々な成分が知られている。例えば、ステロール類はウニ受精卵の卵割阻害活性（非特許文献６参照）や抗菌活性（非特許文献７参照）などを示す。また、アルカロイドのImbricatineはイソギンチャクの攻撃に対するヒトデの防御物質として知られている（非特許文献８参照）。さらに、イトマキヒトデやムラサキヒトデ由来のスフィンゴ糖脂質ガングリオシドには、ラット胎児の大脳皮質細胞の生存維持作用（非特許文献９参照）やマウス神経細胞の神経突起伸長作用（非特許文献１０参照）がある。
【０００６】
また、最近の論文では、タコ、ヒトデからのキタムラサキウニ逃避行動誘起物質（硫酸化ポリヒドロキシステロイド）（非特許文献１１参照）やニチリンヒトデから得られたイトマキヒトデ逃避行動誘起物質（核酸のイノシンとグアノシン）（非特許文献１２参照）などのアレロケミカルスが報告されている。
【０００７】
ヒトデの利用については、ヒトデの植物生長作用、害虫防除作用に着目したものに、魚カス・米糠の発酵物に生薬アルコール抽出液やヒトデ酢酸エタノール抽出液を配合した農作物用活性剤（特許文献１参照）、ヒトデ粉末を原料とした昆虫類等の忌避剤（特許文献２参照）、ヒトデ・食品製造カスを発酵させた発酵肥料（特許文献３参照）がある。
しかしながら、植物成長促進や抑制に関与するヒトデ抽出物に含有される活性画分に関する研究は遅れており、本発明はヒトデ抽出物の該活性画分を明らかにすると共に、該活性画分の利用を図るものである。
【０００８】
【非特許文献１】Toxicon, 27, 179-188 (1990)
【非特許文献２】Comp. Bioche. Physiol., 26, 415-428 (1968)
【非特許文献３】J. Nat. Prod., 65, 1649-1656 (2002)
【非特許文献４】Chem. Pharm. Bull. 51, 435-439 (2003)
【非特許文献５】Comp. Bioche. Physiol., 134, 695-701 (2003)
【非特許文献６】Russ. Chem. Bull., Int. Ed., 51, 535-539 (2002)
【非特許文献７】J. Nat. Prod., 66, 384-391 (2003)
【非特許文献８】J. Am. Chem. Soc., 108, 8288-8289 (1986)
【非特許文献９】Liebigs Ann. Chem., 1-10 (1991)
【非特許文献１０】Liebigs Ann. Chem., 359-366 (1993)
【非特許文献１１】Fisheries Sci., 66, 412-413 (2000)
【非特許文献１２】J. Tokyo Univ. Fisheries 88, 7-13, (2002)
【特許文献１】特開平５−３２００１８号公報
【特許文献２】特開２００３−１８３１０８号公報
【特許文献３】特開平６―３０５８７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は一般廃棄物として年間１万トンが埋め立て処理されている混獲・駆除ヒトデについて、環境に配慮したヒトデの有効利用技術確立を目指し、ヒトデ由来の天然有用生物活性物質を解明し、具体的には植物生長促進作用ないし植物生長抑制作用に関与する活性成分を解明し、これを化学合成品に代わる生物資源由来の安全、かつ安心な肥料・農薬もしくはその素材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ヒトデの有効利用に技術的な決め手を欠く中で、ヒトデを対象に、化学合成品に代わる新規な環境調和型の生物資源活用肥料・農薬を創出すべく研究開発に着手し、その活性物質の探索、機能性の解明について検討を重ねた。その過程で、ヒトデ水抽出物並びに有機溶剤抽出物から得られる数種の画分に、植物生長促進効果または植物生長抑制効果を見出し、本発明に到達した。
【００１１】
請求項１に記載の本発明は、ヒトデの温水抽出物を水と有機溶剤で２層分配して得た水溶性画分の濃縮・精製画分を含有する植物生育促進剤である。
請求項２に記載の本発明は、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た有機層の濃縮・精製画分を含有する植物生育促進剤である。
【００１２】
請求項３に記載の本発明は、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た水層の濃縮・精製画分を含有する植物生育抑制剤である。
【００１３】
請求項４に記載の本発明は、請求項１又は２記載の植物生長促進剤を含有する肥料・農薬もしくはその素材である。
【００１４】
請求項５に記載の本発明は、請求項３記載の植物生長抑制剤を含有する肥料・農薬もしくはその素材である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ヒトデの有効利用技術が確立され、ヒトデ由来の温水抽出物あるいは有機溶剤抽出物からの濃縮・精製される活性画分を含有する植物生長促進剤もしくは植物生長抑制剤が提供される。
【００１６】
本発明の活性画分は、水生動物であるヒトデに由来するものであり、取り扱いが平易である上に、安全性が高く環境への副作用の心配がない。
【００１７】
本発明の植物生長促進剤並びに植物生長抑制剤は、かかる天然生物資源に由来し、合成された肥料や農薬に代わる環境調和型の生物資源肥料・農薬等として、広く園芸・農業分野で利用できる。
したがって、安全、かつ安心な農産物生産に寄与するとともに、水産廃棄物ヒトデの有効利用として漁業振興に資することが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
請求項１に記載する植物生長促進剤に用いられる成分は、ヒトデの温水抽出物を濃縮・精製して得た活性画分である。詳しくは、ヒトデの温水抽出物を水と有機溶剤で２層分配して得た水溶性画分の濃縮・精製画分を有効成分とする。
請求項２に記載する植物生長抑制剤に用いられる成分は、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮・精製した活性画分である。詳しくは、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た有機層の濃縮・精製画分を有効成分とする。
請求項３に記載する植物生長抑制剤に用いられる成分は、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮・精製した活性画分である。詳しくは、ヒトデの有機溶剤抽出物を濃縮し、該濃縮物を水と有機溶剤で２層分配して得た水層の濃縮・精製画分を有効成分とする。
本発明においては、当該活性画分のほか、使用目的などに応じて、当該成分を所望の純度とした濃縮液として用いられる他、凍結乾燥等により粉末化して使用できる。
ヒトデは、厳密にはヒトデ綱（学名Asteroidea）に属する棘皮動物の総称、またはその１種を指すが、一般には、「ヒトデ」はその生息数の多さからヒトデ（学名Asterias amurensis、別名キヒトデ）を指し、本発明でも同様とする。
【００１９】
請求項１に記載する植物生長促進剤の活性画分含有量は、通常ヒトデ重量の約３〜５％である。また、請求項２に記載する活性画分は２種類あり、それぞれのヒトデにおける含有量は、ヒトデ重量の約３．００×１０-4％〜５．００×１０-4％と約１．００×１０-3％〜３．００×１０-3％である。さらに、請求項３に記載する活性画分の含有量は、ヒトデ重量の約０．５０×１０-2％〜２．００×１０-2％であり、何れもそれぞれ比較的多量に含有されているので、工業的利用に適している。
【００２０】
ヒトデ温水抽出物の製造の１例を示すと、例えばヒトデ湿重２ｋｇを粗粉砕した後に，適当な磨破機でスラリー化し、これに常温の水を１．５〜３．０ｋｇ、好ましくは試料と同量の２ｋｇ程度を加水した後、抽出（例えば、旋回噴流攪拌装置で５０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃で加温しながら攪拌処理抽出）する。抽出時間については、目的とする成分が効率よく回収できるまでであり、通常は１５分〜２時間、好ましくは２０分〜１時間である。
次いで、得られた抽出物に１〜２ｋｇ、好ましくは約１．６〜１．７ｋｇの水を加水し、固−液分離装置、例えば遠心分離機で１０〜３０分間、好ましくは１５分間処理したのち、例えば吸引濾過機で吸引濾過して残さを分離して、目的の活性画分を含有する濃縮液を得ることができる。
この濃縮液を、必要に応じて凍結乾燥機などを用いてで凍結乾燥させることにより、粗抽出物を得る。この抽出物の収量は、約１６０〜１８０ｇ（収率約８〜９％）である。
【００２１】
次に、上述の粗抽出物を水と有機溶媒（例えば酢酸エチルなど）に分配し、さらに水溶性画分を水と１−ブタノール等の有機溶媒で２層分配することにより、請求項１記載の濃縮・精製水溶性画分（H-W）を、ヒトデ試料２ｋｇに対して収量約６０〜１００ｇ（収率約３〜５％）で製造することができる。
【００２２】
請求項２及び３に記載のヒトデ有機溶剤抽出物の製造は、洗浄・細裁断したヒトデ０.９〜１．１ｋｇを０．８〜２．０Ｌの含水有機溶剤（例えばメタノール溶液）と共にホモジナイズしたものを遠心分離処理するが、必要に応じて、ホモジナイズした後に、２〜４Ｌの含水有機溶剤（例えばメタノール溶液）に室温で２４〜４８時間浸漬、抽出してもよい。
得られた抽出液を遠心分離機などの固−液分離装置で１０分間処理し、回収した上澄み液を吸引ろ過し、残さを分離し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固して、濃縮液を得ることができる。
【００２３】
次いで、上述の濃縮液について、有機溶媒（例えば酢酸エチル）と水で分配して脂溶性の有機層（Me-EA）と水溶性の水層（Me-H）に分配する。
【００２４】
有機層（Me-EA）を溶離液にクロロホルム−メタノール−水系（例えばクロロホルム８０：メタノール２０：水１）を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出した画分（Me-EA-Ｅ）を収量６５〜８５ｍｇ（収率６．５×１０-3％〜８．５×１０-3％）で得ることができる。
【００２５】
上述の溶出画分について、展開溶媒に有機溶媒（例えばトルエン３：エタノール１）を用いた薄層クロマトグラフィーに供し、請求項２記載の濃縮・精製脂溶性画分（Me-EA-E-b）を収量３．０〜５．０ｍｇ（収率３×１０-4％〜５×１０-4％）で、また濃縮・精製画分（Me-EA-E-c）を収量１０〜３０ｍｇ（収率１．０×１０-3％〜３．０×１０-3％）で、それぞれ製造することができる。
なお、得られる溶出画分を所望により、さらに濃縮することにより、純度の高い、高度に精製された抽出物を得ることができる。また、所望により、任意の純度のものを凍結乾燥などにより粉末化して用いることもできる。
【００２６】
一方、水層（Me-H）を溶離液に水−メタノール系（例えば７５％メタノール）を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、溶出した画分（Me-H-D）について、溶離液に水−メタノール系（例えば７５％メタノール）を用いたODS カラムクロマトグラフィーで分離し、請求項３記載の濃縮・精製水溶性画分（Me-H-D-c）を収量８０〜２００ｍｇ（収率０.８×１０-2％〜２．０×１０-2％）で製造することができる。
【００２７】
本発明の植物生育促進剤及び植物生長抑制剤は、廃棄物ヒトデの有効利用技術として化学合成品に代わる生物資源由来の安全、かつ安心な肥料・農薬もしくはその素材の提供に寄与し、園芸・農業生産部門で広く利用することができる。例えば、後記のようにコマツナで代表されるアブラナ科植物で植物生育促進ないし抑制効果を得ており、このことから、例えばマメ類、葉菜類、花卉類、果物類などにおいても同様の効果が期待できる。
本発明に用いた水生動物ヒトデの組成は、１００ｇあたり水分７３．０ｇ、粗蛋白質９．６ｇ、粗脂肪１．３ｇ、粗灰分１５．１ｇなどで、無機質として微量の亜鉛、銅などを含む。ヒトデの抽出物から精製・濃縮される植物生育促進剤或いは植物生長抑制剤は、前記した活性画分とヒトデ由来組成物を主要成分とする生物資源濃縮物として提供され、使用にあたっては、用途に応じて、１，０００〜１０，０００倍に希釈して用いることができる。また、他の肥料・農薬と併用してもよい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
製造例１［ヒトデ温水抽出物の濃縮・精製画分の製造］
ヒトデ湿重２．０ｋｇをミートチョッパーで粗粉砕し、次に磨破機でスラリー化し、これに常温の水を２．０ｋｇ加える。
次に、この加水したスラリー状物を旋回噴流攪拌装置内で６０℃に加温し、高速で攪拌処理し、さらに攪拌槽に常温の水１．６２４ｋｇを加えて６０℃に加温し、高速で撹拌しながら固−液分離し、抽出物５．６２４ｋｇを得た。
この抽出物を遠心分離機で１０，０００ｒｐｍ、１５分間、温度５℃の条件で遠心分離した後、吸引濾過機で吸引濾過し、抽出物４．６７６ｋｇと含水残渣６３４．０ｇを得た。
この抽出物４．６７６ｋｇを凍結乾燥機で凍結乾燥させ、茶色の乾燥物１７１．７ｇ（収率８．５９％）を製造した。
【００３０】
得られた温水抽出物を、水と酢酸エチルで２層に分配した。さらに、水溶性画分を水と１−ブタノールで２層分配し、目的の水溶性画分（H-W）７５．８ｇ（収率３．７９％）を得た。
【００３１】
製造例２［ヒトデ有機溶剤抽出物の濃縮・精製画分の製造（１）］
ヒトデ湿重９５０ｇの表面についた付着物を水道水で洗い流した後、ハサミで細かくカットした。その後、１Ｌのメタノール（特級  関東化学株式会社製）と共にホモジナイズ（「エースホモジナイザー AM-10」、日本精機製）した。
ホモジナイズしたヒトデを３Ｌのメタノール（特級  関東化学株式会社製）に浸漬して抽出（４８時間、室温）を行った。
得られた抽出液を遠心分離機（マルチパーパス高速冷却遠心機、「KUBOTA6700」、久保田製作所製）で８０００ｒｐｍ、１０分間、５℃の条件で遠心分離にかけた後、回収した上澄み液を吸引ろ過（ろ紙：［Whatman 42 Ashless］、１１０ｍｍ、あるいは［ADVANTEC TOYO 1］、１１０ｍｍ）した。
得られた抽出液をロータリーエバポレーター（「BUCHI RE111 Rotavapor」、柴田科学株式会社製）で濃縮乾固して、メタノール抽出物（３１．０ｇ、収率：３．２６％）を得た。
【００３２】
次に、得られた抽出物を酢酸エチルと水で分配してと有機層（Me-EA）と水層（Me-H）を得た。
【００３３】
製造例３［ヒトデ有機溶剤抽出物の濃縮・精製画分の製造（２）］
製造例２で得た有機層（Me-EA）は、溶離液としてクロロホルム−メタノール−水系を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、溶剤混合比により６つの画分（Me-EA-A〜F）に分画した。
次いで、上記６画分のうちクロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で溶出した画分（Me-EA-E）の７０．０ｍｇ（収率７．３７×１０-3％）について、さらに展開溶媒にトルエン：エタノール（３：１）を使用して薄層クロマトグラフィーで分取を行い、５つの画分（Me-EA-E-a〜e）を得た。
上記５画分のうち、画分Me-EA-E-b（収量３．７ｍｇ、収率３．８９×10-4％）及び画分Me-EA-E-c（収量１７．０ｍｇ、収率１．７９×10-3％）の２画分を取得した。これらの画分を、後述の植物成長・抑制効果試験に供した。
【００３４】
製造例４［ヒトデ有機溶剤抽出物の濃縮・精製画分の製造（３）］
製造例２で得た水層（Me-H）は、溶離液として水−メタノール系を用いてAmberlite XAD-2 カラムクロマトグラフィーで分離し、溶剤濃度比による５つの画分（Me-H-A〜E）に分画した。
次いで、上記５画分のうち７５％メタノールで溶出した画分Me-H-D（収量２３０．０ｍｇ、収率２．４２×１０-2％）を、溶離液に水−メタノール系を用いてODS カラムクロマトグラフィーで分離し、溶剤濃度比により４つの画分（Me-H-D-a〜d）を得た。
上記画分のうち、７５％メタノールで溶出した水溶性画分Me-H-D-c（収量１３１．４ｍｇ、収率１．３８×１０-2％）について、植物成長促進・抑制効果試験に供した。
【００３５】
試験例１
製造例１のヒトデ温水抽出物の濃縮・精製水溶性画分（H-W）並びに製造例３のヒトデ有機溶剤抽出物の濃縮・精製脂溶性画分（Me-EA-E-b）と濃縮・精製脂溶性画分（Me-EA-E-c）の２画分及び製造例４のヒトデ有機溶剤の濃縮・精製水溶性画分（Me-H-D-c）について、以下の植物生長促進・抑制効果試験を実施した。
【００３６】
植物生長促進・抑制効果試験はコマツナ発芽・初期生育試験として実施した。各画分溶液は２ｍＬ、コントロールは水道水２ｍＬをそれぞれ含ませた濾紙上にコマツナ種子を播種後、２５℃、１２L／１２Dの明暗サイクル条件下で７２時間インキュベートし、コマツナの生育状況を観察した。
生育状況は、直接測定法を使用して、コマツナの茎長（ＴＯＰ）と根長（ＲＯＯＴ）と全長（ＴＯＴＡＬ）を測定し、各画分の活性の強弱を判断した。
【００３７】
製造例２で得られた画分（H-W）５０個体を実験した結果について、平均値と標準偏差で表１に示す。
表に示したように、画分（H-W）は、平均値でコマツナの発芽および初期生育を顕著に促進させた。
この画分について1H-NMRを用いて分析を行ったところ、糖類などを含有することが推定された。
【００３８】
【表１】
2005247699.tif 000002
【００３９】
製造例３で得られた画分（Me-EA-E-b）１２個体を実験した結果について、平均値と標準偏差で表２に示す。
表２から明らかなように、画分（Me-H-D-ｂ）は、コマツナ種子の発芽・初期生育を顕著に促進した。
この画分について1H-NMRを用いて分析を行ったところ、グリセロ糖脂質を含有することが推定された。
【００４０】
【表２】
2005247699.tif 000003
【００４１】
製造例３で得られた画分（Me-EA-E-ｃ）１２個体を実験した結果について、平均値と標準偏差で表３に示す。
表３から、画分（Me-EA-E-ｃ）は、コマツナの発芽・初期生育を顕著に促進したことが分かる。
この画分について1H-NMRを用いて分析を行ったところ、グリセロ糖脂質を含有することが推定された。
【００４２】
【表３】
2005247699.tif 000004
【００４３】
製造例４で得られた画分（Me-H-D-c）１２個体を実験した結果について、平均値と標準偏差で表４に示す。
この表から、画分（Me-H-D-c）は、コマツナ種子の発芽・初期生育を顕著に阻害したことが分かる。
この画分について1H-NMRを用いて分析を行ったところ、サポニンを含有することが推定された。
【００４４】
【表４】
2005247699.tif 000005
【００４５】
以上の結果から、ヒトデ温水抽出物の濃縮・精製水溶性画分（H-W）並びにヒトデ有機溶剤抽出物の濃縮・精製脂溶性画分（Me-EA-E-b）と濃縮・精製脂溶性画分（Me-EA-E-c）は、植物生長について顕著に促進するこが明らかとなった。
また、ヒトデ有機溶剤の濃縮・精製水溶性画分（Me-H-D-c）は、植物生長について顕著に抑制することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、ヒトデの有効利用技術が確立され、ヒトデ由来の温水抽出物あるいは有機溶剤抽出物から濃縮・精製される活性画分を含有する植物生長促進剤ないし植物生長抑制剤が提供される。
本発明に係る活性画分は、水生動物であるヒトデに由来するものであり、取り扱いが平易で、しかも安全性が高く、環境への副作用の心配がない。
本発明の植物生長促進剤並びに植物生長抑制剤は、かかる天然生物資源に由来し、合成された肥料や農薬に代わる環境調和型の生物資源肥料・農薬あるいはその素材として、広く園芸・農業分野で利用できる。
したがって、本発明は安全、かつ安心な農産物生産に寄与するとともに、水産廃棄物ヒトデの有効利用として漁業振興に資することが期待できる。