(57)【要約】【課題】HCVが関与する心筋炎または心筋症を検査する簡便で高精度な方法を確立する。【解決手段】ヒトC型肝炎ウイルスが関与する心筋炎または心筋症の検査法であって、下記第一工程および第二工程を含むことを特徴とする検査方法；第一工程：血液を検体として、該検体中の(イ)トロポニンTおよびトロポニンIの少なくとも1種、および／または(ロ)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびN末端プロBNPの少なくとも1種の濃度を調べる工程、および第二工程：心筋組織を検体として、検体中のヒトC型肝炎ウイルス抗体およびヒトC型肝炎ウイルス抗原の少なくとも1種を検出する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトC型肝炎ウイルスが関与する心筋炎または心筋症の検査法であって、下記第一工程および第二工程を含むことを特徴とする検査方法；
第一工程：血液を検体として、該検体中の
(イ)トロポニンTおよびトロポニンIの少なくとも1種、および／または
(ロ)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびN末端プロBNPの少なくとも1種
の濃度を調べる工程、および
第二工程：心筋組織を検体として、検体中のヒトC型肝炎ウイルス抗体およびヒトC型肝炎ウイルス抗原の少なくとも1種を検出する工程。
【請求項２】
第一工程が、血液検体中のトロポニンIの濃度を調べる工程および血液検体中のN末端プロBNPの濃度を調べる工程である請求項1に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋炎ならびに心筋症の検査法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋炎は、感染、アレルギー、中毒などによる炎症性心筋障害をきたす疾患であり、大半がウイルス性であると考えられてきた歴史がある。その原因ウイルスとしては、エンテロウイルス、コクサッキーＢウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーＡウイルス、サイトメガロウイルス、パラインフルエンザウイルスなどの多種のウイルスも報告されてきたが、未だ主原因となるウイルスは確定的ではない。本発明者は、心筋炎の原因ウイルスがヒトC型肝炎ウイルス(human hepatitis C virus：HCVと略す)であることを先に見出し、この知見に係る発明を完成した(特許文献1)。
【０００３】
かかるウイルス性心筋炎は、しばしば心異常を後遺する。即ち、急性期を乗り越えれば約43％は完全治癒するが、約40％は後遺症を残し、3.2％は再発あるいは再燃をきたす(非特許文献2)。更に、その後の追跡調査でも、後遺症をきたした一部が拡張型心筋症様病像を呈することが明らかにされ、急性期後も長期の追跡が必要と考えられている。
【０００４】
拡張型心筋症は、心筋に原発性の変性または機能障害をきたして収縮不全となり、心室が拡大してうっ血性心不全の病態を呈する。その予後は極めて不良で、発症後5年および10年の生存率は、それぞれ54％および36％である(非特許文献3)。このため、欧米では心臓移植適応の最優先疾患の一つとなっており、我国でも病因究明と治療法確立を目指して、厚生省特定疾患として調査研究班が組織されている。
【０００５】
拡張型心筋症に対する治療は、ジギタリス製剤、利尿剤、βブロッカー、ACE阻害薬などによる対症療法が主である。このような内科的治療も、心筋の予備力が残っているうちはその効果が期待できるが、心不全を繰り返すうちに限界となり、最終的には心臓移植の適応となる。また、肥大型心筋症の一部はミオシン重鎖遺伝子異常によると考えられているが、その大部分は原因不明で、ウイルス感染からの移行が無視できず、その治療法も未確立である。しかしながら、HCVに対してはインターフェロンなどの抗ウイルス薬が有効であることが知られており、心筋炎と心筋症においてもHCVが成因のひとつと考えられる症例については、早期に診断して治療を始めることが、良好な予後をもたらすと期待できる。
【０００６】
そのため、心筋炎および心筋症の簡便で確実な診断法の開発が急務の課題となっており、特に現状では有効な治療法が乏しいとされる拡張型心筋症や肥大型心筋症ではその検査法の開発の意義は極めて大きい。
【特許文献１】国際公開第97/07820号パンフレット
【非特許文献１】河村慧四郎他、昭和57年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班報告書、p．16、1983
【非特許文献２】河合忠一ら、昭和57年度厚生省特定疾患特発性心筋症調査研究班研究報告書、p．63、1983
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、HCVが関与する心筋炎および心筋症を検査することができる簡便で且つ高精度な検査方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成するために研究を行った結果、HCVが関与する心筋炎および心筋症の診断には、心機能の異常とそのマーカーの検出と共にHCVの同定が必要であるとの知見を得た。また、これらの検出、同定は、できるだけ患者への負担が少なく、簡便で、更に精度も高いことが求められることを考慮して、更に、鋭意検討の結果、下記要旨の本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、HCVが関与する心筋炎または心筋症の検査法であって、下記第一工程および第二工程を含むことを特徴とする検査方法である。
第一工程：血液を検体として、該検体中の
(イ)トロポニンTおよびトロポニンIの少なくとも1種、および／または
(ロ)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびN末端プロBNPの少なくとも1種
の濃度を調べる工程、および
第二工程：心筋組織を検体として、該検体中のHCV抗体およびHCV抗原の少なくとも1種を検出する工程。
【００１０】
また、本発明は上記第一工程が、血液検体中のトロポニンTまたはトロポニンI、好ましくはトロポニンI、の濃度を調べる工程、および血液検体中のN末端プロBNPの濃度を調べる工程の組み合わせである上記検査方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明検査法によれば、HCVが関与する心筋炎および心筋症を、いずれも高精度で診断することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、HCVが関与する心筋炎または心筋症を、高精度で診断できる検査法を提供するものである。本発明検査方法は、第一工程として、血液検体中の(イ)トロポニンTおよびトロポニンIの少なくとも1種の濃度を調べる工程、および／または(ロ)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)およびN末端プロBNPの少なくとも1種の濃度を調べる工程を採用することが重要である。本発明方法では、次いで、第二工程として、心筋組織検体中のHCV抗体およびHCV抗原の少なくとも1種を検出する工程を採用することを必須の要件とする。
【００１３】
特に好ましい本発明検査方法は、前記第一工程が、血液検体中のトロポニンTまたはトロポニンIの濃度を調べる工程、より好ましくは血液検体中のトロポニンIの濃度を調べる工程、および血液検体中のN末端プロBNPの濃度を調べる工程の組み合わせである。
【００１４】
通常、心機能異常は、健康診断の場合や不整脈等の異常を患者が訴えた場合に、心電図や心エコー図、胸部Ｘ線写真を測定して見つけられる。本発明が対象とする、HCVが関与する心筋炎または心筋症は、これらに続いて、さらに本発明検査法によって診断される。
【００１５】
生化学的検査の検体である血液で心筋障害を診断するためのマーカーとしては、クレアチニンキナーゼ(CK)、CKのアイソザイムであるCK-MB、ミオグロビン、心臓型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)、ミオシン軽鎖(MLC)、心筋トロポニンT(TnT)、心筋トロポニンI(TnI)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)などがある。本発明者は、これらのうちで、心筋トロポニン(Tn)複合体と、BNPおよび後述するN末端プロBNPとが、HCVが関与する心筋炎または心筋症の診断に有効であることを見出した。
【００１６】
Tn複合体は、骨格筋と心筋の両者において、横紋筋のアクチンとミオシンの間のカルシウムを介した筋収縮の調節を行っている。Tn複合体は、TnTとTnIとに分かれ、TnT(分子量37kD)はトロポミオシンに結合し、TnIはアクトミオシンのATPase活性部位を抑制することにより、アクチンとミオシンの結合を抑制している。TnTとTnIはいずれも筋肉の構成成分であり、心筋、骨格筋の遅筋および速筋の3つのアイソフォームが存在する。TnTとTnIの心筋アイソフォームは、ともに成人の骨格筋には存在しないため、心筋特異性が極めて高く、外傷や運動などの急性骨格筋障害により偽陽性(心筋傷害が存在しなくても異常高値を示すこと)を生じない。従って、これらの血中濃度が少しでも上昇すれば、心筋傷害が存在すると考えることができる。
【００１７】
BNPは、環状構造を有する32個のアミノ酸残基から構成され、先に発見されたANPに引き続いて第二の利尿ペプチドとして豚の脳から単離同定された。主として心室から分泌され、血管拡張作用、利尿作用をもち、体液量や血圧の調整に重要な役割を果たしている。健常人における血漿中BNP濃度は極めて低いが、慢性および急性心不全患者では重症度に応じて著明に増加し、BNPの測定は心不全の病態の把握に重要な意義を持っているといわれている。該BNPは、その前駆体であるプロBNP(108個のアミノ酸残基からなる)のN末端側1-76残基がプロセッシングされたものであり、活性型BNP(77-108残基=32アミノ酸残基からなる)である。
【００１８】
最近、上記前駆体からプロセッシングされたN末端側1-76断片(N末端プロBMP)が、心疾患の診断マーカーとして有用であることが報告された(Seino, Y., et al., The European Journal of Heart Failure, 2004年, 第6巻, pp.295-300)。しかしながら、先に心筋障害の診断マーカーとしてその有効性が報告されたBNPと、このN末端プロBNPのどちらの方が、HCVが関与する心筋炎または心筋症の診断により特異的であるか、より有用であるかに関する報告は、現在尚なされていない。
【００１９】
本発明検査法においては、これらBNPおよびN末端プロBNPのいずれをも利用することができるが、これらの内では、N末端プロBNPの方がより好ましい検査結果を与える。また、BNPを利用する検査においては、検体として新鮮な血漿が必要であるのに対して、N末端プロBNPを利用する場合は、検体として新鮮血清は勿論のこと、保存血清も同様に利用することができる。従って、N末端プロBNPは、臨床検査時の操作の面でも、その汎用性が高く好ましいものである。
【００２０】
これら2つの因子群(イ)および(ロ)の測定は、それぞれ特異的な抗体を用いた免疫抗体検出法によって行われる。例えば、TnTは、“トロップTセンシティブ”、“カーディアック・リーダー”(ロシュ・ダイアグノティクス社)等を用い、それらに記載のマニュアルに従って測定することができる。TnIは、“アドヴィア・ケンタウルス-トロポニンI”(バイエル・メディカル社)、"アボットAXSYM-トロポニンI"(アボット社)等を用い、それらに記載のマニュアルに従って測定することができる。BNPは、“シオノリアBNP”、“デタミナーBNP”(協和メディクス社)などを用い、それらに記載のマニュアルに従って測定することができる。N末端プロBNPは、電気蛍光測定システム“Elecsys 2010”(ロシュ・ダイアグノティクス社)などを用い、それらに記載のマニュアルに従って測定することができる。
【００２１】
これらの臨床検査は、心電図や心エコーなどの検査を行っていない場合でも、TnT、TnI、BNP、N末端プロBNPの少なくとも1つの測定値に異常が認められる場合に、心筋炎や心筋症を疑い、更に、心電図、心エコー、タリウムシンチグラムなどの心機能検査で異常を見出し、本発明の第二工程につなぐこともできる。
【００２２】
本発明方法では、第二工程として、心筋組織検体、例えばバイオプシーにより採取した心筋標本について、該検体中のHCV抗体およびHCV抗原の少なくとも1種を検出する。HCV感染の検出法としての、上記HCV抗体の検出およびHCV抗原の検出は、それぞれ、この種抗原および抗体の免疫検出法において知られている各種の方法に従って実施することができる。例えば、HCV抗体の検出は、好ましくは、特異的な抗体を用いた免疫抗体検出法に従い実施できる。HCV抗原の検出は、好ましくは、核酸同定・定量検査であるdDNA法、RT (reverse TranscrIpTase) -PCR法等に従うことができる。
【００２３】
簡便性および迅速性、患者への検査の負担の軽減等を考慮すると、前述した本発明第一工程の血清学的検査でHCV関連心筋炎または心筋症を疑い、直ちに治療適応することもできるが、より好ましくは、この第二工程を実施することによって、HCV関連心筋炎または心筋症を確定診断する。かくして、本発明によって、HCVが関与する心筋炎または心筋症を、確定的に高精度にて診断することができる。
実施例
以下、HCV感染者におけるBNPとN末端プロBNPの測定試験を実施例1として挙げ、本発明に従うHCV関連の心筋症の診断検査例を実施例2として挙げ、次いで、HCV感染者と健康成人におけるTnTとTnIの測定および本発明検査試験を実施例3として挙げる。これらの実施例は本発明を更に具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
HCV感染者におけるBNPとN末端プロBNPの測定
HCVに感染し、心エコーで異常が認められ、心筋症が疑われた患者56名について、血漿BNP濃度をシオノリアBNPキット(協和メディクス社)を用いた免疫放射測定法(RIA法)により測定し(20pg/mL以上を陽性とした)、また血清N末端プロBNPを電気蛍光測定システム“Elecsys 2010”(ロシュ・ダイアグノティクス社)で測定した(50pg/mL以上を陽性とした)。
【００２５】
その結果、BNP陽性者は11名(19.6％)、N末端プロBNP陽性者は31名(55.4％)であり、N末端プロBNPの陽性率の方が統計学的に有意に高く(p<0.01)、心筋症との関連性の高いことが示唆された。
【実施例２】
【００２６】
HCV関連の心筋症の診断検査
不整脈が出現し、心エコーで異常が認められ、心筋症が疑われた患者21名の血中TnTを調べた。TnTは“トロップTセンシティブ”(ロシュ・ダイアグノティクス社)を用いて測定し、0.01 ng/mL以上を陽性と判定した。その結果、陽性者は8名であった。
【００２７】
また、同患者の血清N末端プロBNPを電気蛍光測定システム“Elecsys 2010”(ロシュ・ダイアグノティクス社)で測定し、50pg/mL以上を陽性とした。その結果、TnT陽性者のうち、血清N末端プロBNP検査陽性者は5名であった。
【００２８】
更に、血清N末端プロBNP検査陽性者5名について、心生検サンプルでHCVの検索を行った。すなわち、各患者からインフォームド・コンセント取得の上、心筋生検鉗子を用いて心カテーテル挿入時に右心室内壁から採取した。各部位から5検体を採取し、うち2検体をウイルス検査試料としてすぐに液体窒素中にて検査時まで保存した。検査時には、凍結試料を200μLの4Mグアニジン・チオシアネート/25mMクエン酸(pH7.0 )/5％サルコシル(sarcosyl)/0.1Mメルカプトエタノールに溶解し、RNAを既法(T-L. Fongら，J. Clin. Invest., 88, 1058, 1991)に従って抽出した。PCRはマウス白血病逆転写酵素(murine leukemia reverse Transcriptase)で一本鎖cDNAを合成した後、Tagポリメラーゼによって行った。
【００２９】
増幅反応は、92℃で5分、55℃で2分、72℃で3分を1サイクルした後、95℃で1分、55℃で1分、72℃で2分を35サイクル行った。二次増幅も同様に35サイクル行った。プライマーとしてはHCVのよく保存された5'-noncoding regionの20〜25merの4種類(センス・ヌクレオチドNo.29-53とNo.54-73, アンチセンス・ヌクレオチドNo.310-334とNo.179-198)を用いた。PCR産物はエチジウムブロミド(1μg/mL)含有の3％アガロース・ゲル電気泳動により検出した。
【００３０】
この結果、5名の血清N末端プロBNP陽性患者のうち2名が、RT-PCR陽性であった。最終的には、心筋炎あるいは心筋症が疑われた患者のうち10％がHCV関連心筋症と診断された。
【実施例３】
【００３１】
HCV感染者と健康成人におけるTnTとTnIの測定と本発明検査
HCV感染患者50名と健康成人50名について、血中のTnTを“トロップTセンシティブ”や“カーディアック・リーダー”(ロシュ・ダイアグノティクス社、0.01ng/mL以上を陽性とした)で測定し、TnIを“アボットAXSYM-トロポニンI”(アボット社、0.1ng/mL以上を陽性とした)で測定した。
【００３２】
その結果、下記表1のとおり、TnIの方がTnTに比べて統計学的に有意(*p<0.05)に高く、HCV感染患者と健康成人の間の変動をよく捕らえることがわかり、心筋症との関連性の診断に有用性が高いことが示唆された。
【００３３】
【表１】
2005291899.tif 000002
【００３４】
表1のHCV感染者でTnI陽性者23名は、心筋症が疑われたため、更に、心エコーとタリウムシンチグラムとで検査したところ、その内の8名で心機能異常が認められた。これらの患者について、実施例2に記載の方法に従って、それぞれ心生検サンプルでHCVの検索を行った。
【００３５】
その結果、3名がRT-PCR陽性であり、最終的にHCV関連心筋症と診断された。
【００３６】
このように、事前の理学的検査の有無に拘わらず、本発明方法によれば、HCV関連心筋症が精度よく診断できることが明らかである。