(57)【要約】【課題】  ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡがＡＵＵＵＡ（ＡＵシークエンス又はAU-rich element；ＡＲＥ）ｍＲＮＡと同様の動態を示す点に着目した、新しいタイプのエイズ薬剤の開発に有用なＨＩＶ−１複製抑制剤を提供すること。【解決手段】  ヒト トリステトラプロリン（tristetraprolin；ＴＴＰ）や、トリステトラプロリン遺伝子又はトリステトラプロリン遺伝子を組み込んだ発現ベクターを有効成分とする。本発明によると、抗ＨＩＶ−１薬の開発において盛んに行われているプロテオミクスによる蛋白性因子を標的とした薬剤開発とは異なり、ＨＩＶ−１ｍＲＮＡを標的とする新しい抗ＨＩＶ−１薬の開発が可能となり、ＨＩＶ感染だけではなく、さらに広い範囲の疾患治療を実現可能にすることも期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤。
【請求項５】
ＤＮＡを組換えベクターとして含有することを特徴とする請求項３又は４記載のＨＩＶ−１複製抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のＨＩＶ−１複製抑制剤を含有することを特徴とするエイズ予防・治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス−タイプ１）の複製を抑制する薬剤に関し、詳しくは、トリステトラプロリン（tristetraprolin；ＴＴＰ）やトリステトラプロリン遺伝子を組み込んだ発現ベクターを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤やエイズ予防・治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；エイズ）は、ＲＮＡウィルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染によって引き起こされる重篤な全身性の免疫不全症状によって特徴づけられる極めて高い発症率と致死率をもつ疾患である。ＨＩＶは、ＣＤ４とよばれる細胞膜蛋白を受容体として細胞に感染する性質をもつため、細胞性免疫を統御する中枢細胞であるＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞に感染し、破壊する。そのため細胞性免疫の著しい機能低下が起こり、その結果、全身性の免疫不全状態が引き起こされる。エイズの病因ウイルスであるＨＩＶは、血清学的・遺伝学的に性状の異なるＨＩＶ−１とＨＩＶ−２に大別される。ＨＩＶ−１は現在の世界流行の主体となっているウイルスで全世界に分布している。また、ＨＩＶは変異しやすく多くのウイルス亜株が知られており、それらの全塩基配列が解明されているものも多い。そして、抗ＨＩＶ−１活性を有する多くのペプチド抑制剤が既に報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜６参照）。
【０００３】
他方、トリステトラプロリンは、特有なモチーフのジンク・フィンガーモチーフCys-Cys-Cys-Hisをもつタンパク質であり、このトリステトラプロリン欠損マウスでは種々のサイトカインｍＲＮＡの安定性が大幅に増加し、関節炎等の自己免疫疾患を発症することが知られている（例えば、非特許文献７参照）。また、トリステトラプロリンがマクロファージによるＴＮＦ−α産生を阻害する負の制御をしていることも知られている（例えば、非特許文献８参照）。トリステトラプロリンはＴＮＦ−α等のサイトカインｍＲＮＡの３'非アミノ酸コード領域にあるＡＵＵＵＡ（ＡＵシークエンス又はAU-rich element；ＡＲＥ）を認識して結合し、エキソゾーム（exosome）によるｍＲＮＡの分解を促進するタンパク質として知られている（例えば、非特許文献９参照）。癌遺伝子、サイトカインなど細胞外部からのシグナルによって作用を開始する因子群は、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳、分解等によって多重制御されており、リポポリサッカライド等の刺激によりｍＲＮＡの転写が亢進する一方で、ＡＲＥを認識するトリステトラプロリン等の因子により細胞質、エキソゾームへ誘導され、ｍＲＮＡの分解が促進されている。トリステトラプロリンは通常、細胞内では発現しておらず、サイトカインなどの転写スイッチ・オンと共に発現し、サイトカインｍＲＮＡの分解を促進することによって、転写スイッチでは困難であるサイトカインの俊敏なスイッチ操作を行っていると考えられている（例えば、非特許文献１０参照）。
【特許文献１】特開２００２−３３８６００号公報
【非特許文献１】Cell 89: 263-273, 1997
【非特許文献２】Cell 93: 681-684, 1998
【非特許文献３】Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95: 15613-15617, 1998
【非特許文献４】Cell 99: 103-115, 1999
【非特許文献５】Nat.Med. 4: 1302-1307, 1998
【非特許文献６】J.Virol. 72: 9763-9770, 1998、Cell 99: 243-246, 1999
【非特許文献７】Science 281: 1001-1005, 1998
【非特許文献８】Mol. Cell. Biol. 19: 4311-4323, 1999
【非特許文献９】Mol. Cell. Biol. 23: 3798-3812, 2003
【非特許文献１０】J. Biol. Chem. 278: 30373-30381, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡがＡＲＥｍＲＮＡと同様の動態を示す点に着目した、新しいタイプのエイズ薬剤の開発に有用なＨＩＶ−１複製抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、一貫してレトロウイルス、ＪＣウイルスの研究を継続しており、特にウイルス脳症の治療法の確立を目指して研究を遂行している。その研究過程の中で、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの安定性が宿主トポイソメラーゼＩによって調節されていること、ウイルス発芽によって安定制御機構が解除され、急速にＲＮＡのＵＡまたはＣＡ間にニック（切れ目）が入ること、ニックが入ったゲノムＲＮＡはトポイソメラーゼＩによって再結合することを見い出した。また、ＡＵＵＵＡの繰り返し配列を含むＲＮＡを合成して切断を調べたところ、タンパク質等の存在下でＵＡ間が急速に切断されることが判明した。さらに、トポイソメラーゼＩによるＲＮＡライゲース活性の役割を調べたところ、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡはＡＲＥｍＲＮＡと同様に、トポイソメラーゼＩによりＲＮＡの切断が阻害されること、すなわち、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡがＡＲＥを有するｍＲＮＡと同様の動態をとることを見い出した。このように、ＡＲＥを含むｍＲＮＡとＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡが同様の制御をうけていることから、トリステトラプロリンのＨＩＶ−１複製に対する作用を調べた結果、トリステトラプロリンはＨＩＶ−１複製を抑制することを確認した。これらの知見に基づいて、本発明は完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤や、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤に関する。
【０００７】
また本発明は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤や、配列番号１で表される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドををコードするＤＮＡを有効成分として含有するＨＩＶ−１複製抑制剤や、これらＤＮＡを組換えベクターとして含有するＨＩＶ−１複製抑制剤に関する。
【０００８】
さらに本発明は、以上のＨＩＶ−１複製抑制剤を含有することを特徴とするエイズ予防・治療薬に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、抗ＨＩＶ−１薬の開発において盛んに行われているプロテオミクスによる蛋白性因子を標的とした薬剤開発とは異なり、ＨＩＶ−１ｍＲＮＡを標的とする新しい抗ＨＩＶ−１薬の開発が可能となり、ＨＩＶ感染だけではなく、さらに広い範囲の疾患治療を実現可能にすることも期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤とは、細胞内でＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの複製を抑制することができるものであって、本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤としては、ポリペプチド又はＤＮＡ（ベクターを含む）を有効成分として含有するものを挙げることができる。
【００１１】
上記ポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒトトリステトラプロリンや、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するとは、ヒトトリステトラプロリンが有するＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用と同程度若しくはそれ以上のＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用をいい、またここで、アミノ酸の「欠失、置換若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチド若しくは蛋白質が、配列番号２で示されるアミノ酸配列のからなるポリペプチド（ヒトトリステトラプロリン）と同効物であれば特に制限されない。
【００１２】
アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。上記ポリペプチドには、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ分解作用を有する全ての改変ペプチドが包含される。アミノ酸の人為的な置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性に基づき行うことができる。例えば、負電荷の酸性アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷の塩基性アミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ、また同様の親水価をもつ無電荷の中性アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【００１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。化学合成法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。上記ポリペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。
【００１４】
上記ポリペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物（1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示することができる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。例えば、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
【００１５】
上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸やペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシンの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばアルギニンのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる上記ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００１６】
その他、上記ポリペプチドは、その塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られるポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１７】
本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤の有効成分としてのＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ヒトトリステトラプロリン遺伝子）や、配列番号１で表される塩基配列若しくはその部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡや、これらＤＮＡが発現ベクターに組み込まれた組換えベクターを挙げることができる。
【００１８】
また、上記配列番号１で表される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの分解作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はそれらの配列の一部又は全部をプローブとして、ヒトのＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、ヒトトリステトラプロリンと同効な目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１９】
また、上記組換えベクターの構築におけるＤＮＡが組み込まれる発現ベクターとしては、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス等のウイルス由来のベクターの他、リポソームなどを具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、経口により細胞株を樹立することなく直接的に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能なアデノウイルスベクターが好ましい。これら発現ベクターへの組込みは常法によって行われ、その際プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を適宜利用することもできる。
【００２０】
上述のＨＩＶ−１複製抑制剤や、かかるＨＩＶ−１複製抑制剤を含有する本発明のエイズ予防・治療薬を、ＨＩＶ−１を標的とした医薬用の製剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分の他、Ｓｍａｄタンパク質やそれをコードするＤＮＡ等のトリステトラプロリン誘発剤を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２１】
経口的に投与する製剤の場合、薬理学的に許容される担体としては、慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、デンプン等の賦形剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、懸濁液製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の溶解補助剤、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、レシチン等の懸濁化剤、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の緩衝剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。非経口的に投与する製剤の場合、蒸留水、生理的食塩水等の水溶性溶剤、サリチル酸ナトリウム等の溶解補助剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができる。
【００２２】
また、本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤や、かかるＨＩＶ−１複製抑制剤を含有する本発明のエイズ予防・治療薬の投与量は、疾病の種類、患者の体重や年齢、投与形態、症状等により適宜選定することができるが、例えば成人に投与する場合、有効成分であるＨＩＶ−１を標的としたＨＩＶ−１複製抑制剤を通常１回量として約０．００１〜５００ｍｇ、好ましくは１〜５０ｍｇであり、この量を１日１回〜３回投与するのが望ましい。本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤や、かかるＨＩＶ−１複製抑制剤を含有する本発明のエイズ予防・治療薬を非経口的に投与するには、たとえば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投与、経粘膜投与などを挙げることができるが、静脈内投与や皮下投与が好ましい。
【００２３】
さらに、本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤は養子免疫療法にも用いることができる。すなわち、生体外に取り出したエイズ患者のＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞に本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤導入し、再びエイズ患者の生体内に戻すことにより、養子免疫療法を行うことができる。ヘルパーＴ細胞内に、ポリペプチドを有効成分とする本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤を導入する方法としては、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない試薬を用いることができる。また、ヘルパーＴ細胞内に、組換えベクター等ＤＮＡを有効成分とする本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤を導入する方法としては、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等を挙げることができる。
【００２４】
本発明のＨＩＶ−１複製抑制剤は、サイトカイン等ｍＲＮＡの分解を促進することにより腫瘍、自己免疫疾患、他のＲＮＡウイルス感染症等の治療に応用できる可能性が期待できるが、かかるＨＩＶ−１複製抑制剤を含有する本発明のエイズ予防・治療薬を用いる、宿主因子とウイルスＲＮＡの相互作用を標的としたエイズ治療の場合、ウイルス因子を対象とする場合に比べてエスケープミュータントの出現効率が極めて低く、細胞毒性の低い特異的抗ウイルス剤の開発が可能となる。
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［ヒトトリステトラプロリンｃＤＮＡのクローニングとシークエンス、発現ベクターの作製］
ヒト細胞株HeLaからSV total kit（Promega）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Omniscript kit（Qiagen）を用いて１５ｎｔのｐｏｌｙ（ｄＴ）をプライマーとしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＲＴ−ＰＣＲによってヒトトリステトラプロリンをクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲには、ＴＴＰＦ（５'−ＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＣＴ−３'；配列番号３）と、ＴＴＰＲ（５'−ＧＡＣＣＧＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＴ−３'；配列番号４）をそれぞれプライマーとして用いた（EcoRIとNotIサイトをそれぞれ下線で示した。）。ヒトトリステトラプロリンｃＤＮＡのシークエンスを確認した後、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−Ｃ（Invitrogen Life Technologies）のEcoRI、NotIサイトへ挿入しｐｃｈＴＴＰｗｔとした。
【実施例２】
【００２７】
［発現ベクターによる感染性ウイルス粒子の作製］
ＨＩＶ−１は１本鎖直鎖状ＲＮＡウイルスで染色体上のプロウイルスとしては９，７０９ｂｐの長さを有する。ＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを含むベクターｐＮＬ４３（１９８６年にＡｄａｃｈｉ等が発表）を哺乳類細胞へ導入することによりＨＩＶ−１蛋白群が転写、翻訳され、感染性を有する粒子が培養細胞上清に放出される。
【実施例３】
【００２８】
［ウイルス発現ベクター及びヒトトリステトラプロリン発現ベクターの細胞内への導入］
実施例２記載のＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを含むベクターｐＮＬ４３を０．２μｇと、実施例１で得られたヒトトリステトラプロリン発現ベクターｐｃｈＴＴＰｗｔを０．０２μｇ、０．２μｇ又は空の哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ−Ｃを０．２μｇとを、同時にヒト由来の２９３Ｔ細胞へ哺乳細胞遺伝子導入試薬Ｆｕｇｅｎｅ６（Rosche）を用いて導入し、１ｍｌの培養液で培養した。
【実施例４】
【００２９】
［ウイルスの定量］
遺伝子導入から４８時間後、上清のＨＩＶ−１抗原（Ｐ２４）を抗原ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）(ZeptoMetrix, Buffalo, NewYork)によって定量した。ヒトトリステトラプロリンを発現したヒト２９３Ｔ細胞から得られたウイルス量を空の発現ベクターを導入した細胞由来のウイルス量と比較した結果を図１に示す。図１から、ヒトトリステトラプロリンの発現により、ウイルス産生量は５．２分の１となることがわかる。また、感染価は１２分の１になった。トリステトラプロリンの発現量に依存してＨＩＶ−１ウイルス産生と感染価が減少しているこれらの結果は、ヒトトリステトラプロリンによりＨＩＶ−１ ＲＮＡの分解が細胞内で促進され、ウイルス産生量が低下したことを示している。
【実施例５】
【００３０】
［ウイルスＲＮＡの定量］
上清からからSV total kit（Promega）を用いてＲＮＡを抽出し、Omniscript kit（Qiagen）を用いて１５ｎｔのｐｏｌｙ（ｄＴ）をプライマーとしてｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡはreal-time, 5'-exonuclease PCR-based assay （TaqMan）によって定量解析された。QuantiTect Probe PCR kit (Qiagen)を用い、ＰＣＲの条件は、９５℃１５分、９５℃１５秒、６０℃１分を１サイクルとして４５サイクルとした。ＰＣＲには、１４５９Ｆ（５'−ＧＧＴＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＴＣＣＧＧＴＴＡＴＧ−３'；配列番号５）と、１５３５Ｒ（５'−ＴＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡ−３'；配列番号６）をプライマーとして使用した。また、プローブとしては、１４９１Ｐ（５'−ＦＡＭ−ＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３'；配列番号７）を用いた。なお、１４９１Ｐにおいて、ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセイン（6-carboxyfluorescein）を、ＴＡＭＲＡはＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine）を表す。結果を図２に示す。その結果、上清のウイルスＲＮＡ量は１０分の１以下になった。トリステトラプロリンの発現により上精のウイルスＲＮＡ量が減少しているこれらの結果は、ヒトトリステトラプロリンによりＨＩＶ−１ ＲＮＡの複製が細胞内で阻害され、ウイルス産生量が低下し、ウイルスＲＮＡ量が低下したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヒトトリステトラプロリン発現ベクターを導入したヒト由来２９３Ｔ細胞の培養上清におけるＨＩＶ−１抗原（Ｐ２４）を抗原ＥＬＩＳＡにより定量した結果を示す図である。
【図２】ヒトトリステトラプロリン発現ベクターを導入したヒト由来２９３Ｔ細胞の培養上清におけるウイルスＲＮＡの定量解析の結果を示す図である。
【図１】
2005247763.tif 000002
【図２】
2005247763.tif 000003
【配列表】
2005247763000001.app