(57)【要約】【課題】コプラナーＰＣＢに対して高感度かつコプラナーＰＣＢ間の類似化合物に対する交差反応性の明確な抗体を作製するためのハプテンおよびコプラナーＰＣＢ抗体、ならびに当該抗体を用いた感度および定量性に優れたコプラナーＰＣＢの免疫学的測定キットおよび免疫学的測定方法を提供する。【解決手段】下記式（１）：【化１】2005247822.tif 000007で表わされる構造を有する化合物、前記化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対するモノクローナル抗体、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体を含んでなるコプラナーＰＣＢの測定キット、および前記抗体または前記キットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2005247822.tif 000006
で表わされる構造を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対する抗体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＰＣＢ８０の測定方法に使用される、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＰＣＢ８０、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９、ＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９からなるコプラナーＰＣＢ群の測定方法に使用される、請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項３〜５いずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
前記ハイブリドーマがＰＫ−４Ｎ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４０）またはＰＫ−０Ｔ２である請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項３〜５いずれかに記載のモノクローナル抗体を含んでなるコプラナーＰＣＢの測定キット。
【請求項９】
さらに固相化抗原を含んでなる請求項８に記載のコプラナーＰＣＢの測定キットであって、前記固相化抗原は請求項１に記載の化合物とは異なる化合物をハプテン部分として含むものである、キット。
【請求項１０】
前記固相化抗原のハプテン部分が４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸、または２，４−ジクロロフェニル酢酸である請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項３〜５いずれかに記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法。
【請求項１２】
請求項８〜１０いずれかに記載のキットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コプラナーＰＣＢハプテン、コプラナーＰＣＢに対する抗体およびそれを用いる免疫学的測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）は、化学的安定性や低い電気伝導性のため絶縁体や潤滑油などの様々な工業製品に利用されてきた。しかし、ＰＣＢは肝臓や甲状腺などへの毒性があり、とりわけノンオルト置換型ＰＣＢはコプラナーＰＣＢと呼ばれ、ダイオキシンと類似した作用を示す。日本におけるＰＣＢの生産は１９７２年に中止されたが、ＰＣＢは廃棄物などから環境に流出しており、人の健康や野生生物に影響を及ぼす恐れがある。
【０００３】
そこで、環境におけるＰＣＢ残留量をモニタリングすることは極めて重要である。一般に、ＰＣＢの測定はガスクロマトグラフィーを用いた機器分析で行われるが、この手法は煩雑で費用がかかる。
【０００４】
一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れているばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法である。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の病態解析法の一つとして大きな役割を担ってきたが、ＰＣＢのような環境負荷化学物質の測定へも適用が進んでいる。近年、コプラナーＰＣＢの中でも特に毒性の高いＰＣＢ１２６やＰＣＢ１６９の測定が試みられている。
【０００５】
抗体には、一般に免疫したウサギやヤギなどから血液を採取後その中に含まれる抗体を分離・精製するいわゆるポリクローナル抗体や、抗体産生能を持つクローン化ハイブリドーマの分泌する抗体を分離・精製するいわゆるモノクローナル抗体がある。これらの抗体は、反応性において十分な性能を持つが、ＰＣＢが水に不溶性であることから限定された条件下で測定しなければならないこと、および類似の構造を有する化学物質間で交差反応が起きる問題点があった。
【０００６】
前記免疫学的測定法を利用したＰＣＢの検出方法としては、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中で検出する方法（特許文献１を参照）、生物または化学発光を測定することによる検出方法（特許文献２を参照）、コプラナーＰＣＢを含むダイオキシン類を異性体レベルで検出する方法（特許文献３を参照）などが知られているが、特許文献１または３に記載の方法では検出感度が低い点、特許文献２に記載の方法では抗体の交差反応性については考慮されていない点などの問題があり、ＰＣＢの検出感度および定量性において未だ満足できるような方法は知られていない。
【特許文献１】特開２０００−１９１６９９号公報
【特許文献２】特開２００１−６６３１１号公報
【特許文献３】特開２００２−２２８６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コプラナーＰＣＢに対して高感度かつコプラナーＰＣＢ間の類似化合物に対する交差反応性の明確な抗体を作製するためのハプテンおよびコプラナーＰＣＢ抗体、ならびに当該抗体を用いた感度および定量性に優れたコプラナーＰＣＢの免疫学的測定キットおよび免疫学的測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コプラナーＰＣＢの中で弱いエストロジェン様活性を示し、ヒトや野生生物への影響が懸念されるＰＣＢ８０をハプテン候補として用いることにより、意外にもＰＣＢ８０のみならず毒性の高いコプラナーＰＣＢも高感度かつ定量的に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記式（１）：
【００１０】
【化１】
2005247822.tif 000002
で表わされる構造を有する化合物に関する。
【００１１】
本発明は、前記化合物をハプテンとし、当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対する抗体に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１２】
前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０の測定方法に使用されることが好ましい。また、前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９、ＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９からなるコプラナーＰＣＢ群の測定方法に使用されることが好ましく、さらにＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９の測定方法に使用されることが好ましい。
【００１３】
本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、ＰＫ−４Ｎ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４０）またはＰＫ−０Ｔ２であることが好ましい。
【００１４】
本発明は、前記モノクローナル抗体を含んでなるコプラナーＰＣＢの測定キットに関する。前記キットは、さらに固相化抗原を含んでなり、前記固相化抗原は前記式（１）の化合物とは異なる化合物をハプテン部分として含むものであることが好ましい。
【００１５】
前記キットにおいて、前記固相化抗原のハプテン部分が４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸、または２，４−ジクロロフェニル酢酸であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体または前記キットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の化合物は、コプラナーＰＣＢハプテンとして好適に用いられるものである。当該ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、動物においてコプラナーＰＣＢに対する免疫応答を良好に惹起することができ、特異的かつ高感度なコプラナーＰＣＢ抗体を得ることができる。
【００１８】
本発明の抗体は、特異的かつ高感度にコプラナーＰＣＢを検出することができる。当該抗体がモノクローナル抗体の場合、コプラナーＰＣＢ、特にＰＣＢ８０に対して高感度であり、しかも他の類似化合物に対する交差反応性が明確である。前記モノクローナル抗体を交差反応性により単独または組み合わせて用いることにより、ＰＣＢ８０に構造が類似する他のコプラナーＰＣＢをも同時に検出することができるとともに、それらの類似化合物を分別して検出することもできる。
【００１９】
本発明のハイブリドーマは、前記モノクローナル抗体を安定して産生することができ、当該ハイブリドーマを培養することにより、大量のモノクローナル抗体を製造することができる。
【００２０】
本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体を含むことにより、コプラナーＰＣＢの免疫学的測定方法に好適に用いられ、コプラナーＰＣＢを特異的、高感度および簡便に測定することのできる手段を提供することができる。本発明のキットが前記式（１）とは異なる構造を有する化合物を含有する固相化抗原をさらに含む場合、より高感度に測定することができる手段を提供することができる。
【００２１】
本発明のコプラナーＰＣＢの測定方法は、本発明のモノクローナル抗体またはキットを用いることにより感度、特異性および操作の簡便性にすぐれた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、下記式（１）：
【００２３】
【化２】
2005247822.tif 000003
で表わされる構造を有する化合物を提供する。前記化合物は、２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸であり、コプラナーＰＣＢハプテンとして好適に使用される。
【００２４】
前記式（１）において、−Ｏ−（ＣＨ2 ）3 −はＰＣＢ８０（３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル）に導入したスペーサーアームを表わす。前記スペーサーアームは、ＰＣＢ８０と結合対象の高分子化合物との間に適度なスペースを与える。
【００２５】
前記式（１）において、前記スペーサーアームに隣接するカルボキシ基が、後述する高分子化合物と共有結合することにより、複合体を形成する。
【００２６】
前記コプラナーＰＣＢハプテンの製造は、公知の合成方法により行なうことができ、特に限定されるものではないが、例えば下記反応式：
【００２７】
【化３】
2005247822.tif 000004
で示す方法は、各工程において高収率で化合物を得ることから好適に用いられる。前記反応式において、式（２）の化合物、式（４）の化合物および式（６）の化合物は、いずれも入手が容易な化合物である。
【００２８】
前記反応式において、出発原料として２，６−ジクロロフェノール（２）を用い、臭素化反応により２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）を得る（工程（ａ））。
【００２９】
得られた式（３）の化合物を、塩基の存在下、４−ブロモ酪酸エチル（４）と反応させて、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）を得る（工程（ｂ））。
【００３０】
得られた式（５）の化合物を、触媒（例えば、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム）の存在下、３，５−ジクロロフェニルボロニックアシッド（６）と反応させて、２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）を得る（工程（ｃ））。
【００３１】
得られた式（７）の化合物をアルカリまたは酸により加水分解して、前記目的化合物（１）を得る（工程（ｄ））。
【００３２】
前記各工程における詳細な合成方法は、実施例１に記載している。
【００３３】
このようにして得られたコプラナーＰＣＢハプテンは、牛血清アルブミン（BSA)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン(OVA) 、スカシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いる。
【００３４】
複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記コプラナーＰＣＢハプテンのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。
【００３５】
本発明は、前記ハプテンと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより得られるコプラナーＰＣＢに対する抗体を提供する。
【００３６】
本明細書におけるコプラナーＰＣＢとは、ポリ塩化ビフェニルの塩素の置換位置がノンオルト型またはモノオルト型であって各原子が同一平面上に位置する構造を有するＰＣＢをいう。コプラナーＰＣＢの具体例は、ＩＵＰＡＣ＃で例示すると、ＰＣＢ７７、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９、ＰＣＢ１０５、ＰＣＢ１１１、ＰＣＢ１１４、ＰＣＢ１１８、ＰＣＢ１２３、ＰＣＢ１５６、ＰＣＢ１５７、ＰＣＢ１６７、ＰＣＢ１８９があげられる。本発明においては、ＰＣＢ７７、ＰＣＢ８０、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１１１、ＰＣＢ１８９、ＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９が好ましく、その抗体が得られていないＰＣＢ８０、ＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９ならびに毒性等価係数（ＴＥＦ）が高いＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９がより好ましい。
【００３７】
本発明の抗体は、コプラナーＰＣＢ、特にＰＣＢ８０に対する特異性を有する抗体である。
【００３８】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が包含され、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）2 フラグメントなどのように抗原結合性を有する抗体の一部も包含される。これら抗体の中でも、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３９】
前記モノクローナル抗体は、ＰＣＢ８０に対する特異性と他のコプラナーＰＣＢに対する交差反応性とを明確にするため、下記のようなＩＣ50値を有することが好ましい。ここでＩＣ50値とは、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡにより標準阻害曲線を求めて、５０％阻害を示す検体の濃度をいう。
【００４０】
すなわち、本抗体は、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ８０に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００４１】
本抗体は、ＰＣＢ１２６を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１２６に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００４２】
本抗体は、ＰＣＢ１６９を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１６９に対するＩＣ50が３．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００４３】
本抗体は、ＰＣＢ１１１を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１１１に対するＩＣ50が２５ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００４４】
本抗体は、ＰＣＢ１８９を測定対象とする場合、間接競合ＥＬＩＳＡによるＰＣＢ１８９に対するＩＣ50が５．０ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、３．０ｎｇ／ｍｌ以下がより好ましい。
【００４５】
前記抗体の製造方法は、公知であり、本発明の抗体も常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000) ）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って前記コプラナーＰＣＢハプテンと高分子化合物との複合体を形成させた後、当該複合体を家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、前記複合体を常法に従ってマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。
【００４６】
抗体の調製は、限外ろ過、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィーなどの濃縮・精製法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００４７】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。以下、マウスでのハイブリドーマの作製方法についてより詳細に説明する。
【００４８】
以下、Ｂａｌｂ／ｃマウスを例にして説明する。前記のように調製した抗原（免疫原）を２ｍｇ／ｍｌ程度になるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内に投与する。その後、約２週間毎に追加免疫する。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなった前記マウスの脾臓を摘出し、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）を入れたシャーレ内で前記脾臓から細胞を取り出す。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させ、脾臓細胞が浮遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を低速で遠心分離して細胞を集め、脾臓細胞を調製する。マウスのミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾臓細胞）になるように混合し、低速で遠心分離して細胞を集める。沈殿細胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１，５００）溶液１ｍｌをゆっくり加え細胞融合を行う。細胞融合後、ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、さらに含牛胎児血清ＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加する。遠心分離によって集めた細胞に、細胞数が５×１０5 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えて懸濁し、細胞懸濁液を９６穴プラスチックプレートに２５０μｌ／ウェルの量で分注して、３７℃、５％炭酸ガス、加湿条件下のインキュベーター中で培養する。１週間後、ウェル中の培地の半量をＨＡＴ培地で置換して、１０日から１４日間培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、抗コプラナーＰＣＢ抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【００４９】
本発明では、前記方法によりハイブリドーマを作製し、ＰＫ−０Ｔ２、ＰＫ−４Ｎ２等のハイブリドーマ株を樹立した。このうち、ＰＫ−４Ｎ２について、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６４０の下、２００４年１月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（郵便番号３０５−００４６、茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。
【００５０】
本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに上述のように精製・濃縮することができる。
【００５１】
また、本発明は、前記抗体を含むコプラナーＰＣＢの測定キットに関する。本発明の測定キットは、コプラナーＰＣＢ、好ましくはＰＣＢ８０に特異的に結合する抗体を含むことにより、コプラナーＰＣＢを簡便に測定することができ、後述のコプラナーＰＣＢの測定方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、測定法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたコプラナーＰＣＢハプテン（抗原）、緩衝液、検出試薬および／またはコプラナーＰＣＢ標準溶液等を含む。
【００５２】
好ましいキットは、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法または直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いられうるものである。直接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、本発明のモノクローナル抗体を固相化した担体をさらに含むことが好ましい。この場合、下記直接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。
【００５３】
間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、本キットは、さらに固相化抗原を含むものが好ましく、当該固相化抗原を固相化した担体を含むことが好ましい。この場合、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法の工程（１）を省略することができる。
【００５４】
前記固相化抗原は、本発明の抗体を製造するために用いるハプテンとは異なるハプテンを含むものである。前記固相化抗原のハプテン部分は、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシプロピオン酸、または２，４−ジクロロフェニル酢酸であることが好ましい。
【００５５】
また、前記固相化抗原は、前記固相化抗原用ハプテンと、牛血清アルブミン（BSA)、ウサギ血清アルブミン(RSA) 、オボアルブミン(OVA) 、スカシ貝ヘモシアニン(KLH) 、チログロブリン(TG)、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成することにより得られる。
【００５６】
前記固相化抗原用のハプテンは、公知の方法により合成することができ、市販品を利用することもできる。複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記固相化抗原用ハプテンのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。
【００５７】
固相化抗原用のハプテンとして抗体製造用ハプテンと異なるものを選択することにより、抗体製造用ハプテンと同じものを固相化抗原用のハプテンとして用いてコプラナーＰＣＢを測定した場合と比較して、感度が１〜１５倍上昇する。
【００５８】
本発明のキットは、下記間接競合ＥＬＩＳＡ法に用いる場合、前記固相化抗原、固相化抗原を保持する担体、コプラナーＰＣＢ抗体、酵素標識された二次抗体および検出試薬などを含む。
【００５９】
さらに、本発明は、前記抗体またはキットを用いることを特徴とするコプラナーＰＣＢの測定方法に関する。測定方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989)) が挙げられるが、感度や簡便性等の点からＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡに用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。
【００６０】
ＥＬＩＳＡによる測定法は、間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡなどがあげられる。例えば、間接競合ＥＬＩＳＡは、以下のような手順により行うことができる。
【００６１】
（１）固相化抗原を担体に固相化する
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００６２】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする
ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００６３】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面に各種濃度のコプラナーＰＣＢを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびコプラナーＰＣＢに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびコプラナーＰＣＢ−抗体複合体を生成させる
反応は、通常４〜３７℃で１〜２時間程度で行うことができる。
【００６４】
コプラナーＰＣＢは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、コプラナーＰＣＢを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、ジメチルスルホキシドなどがあげられ、含有量は、５〜５０重量％程度である。
【００６５】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のコプラナーＰＣＢの量を決定することができる
固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（コプラナーＰＣＢ抗体を認識する抗体）を添加して測定することができる。例えばコプラナーＰＣＢ抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したコプラナーＰＣＢ抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００６６】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からコプラナーＰＣＢの量を算出することができる
二次抗体に結合する酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に測定することが望ましい。
【００６７】
二次抗体に結合する酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法があげられる。
【００６８】
コプラナーＰＣＢを添加しない反応溶液の吸光度に対して、コプラナーＰＣＢを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のコプラナーＰＣＢを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のコプラナーＰＣＢの濃度を算出することができる。
【００６９】
別の態様として、コプラナーＰＣＢの測定は、例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合ＥＬＩＳＡによって行うこともできる。
【００７０】
（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する
用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００７１】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする
ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００７２】
（３）各種濃度のコプラナーＰＣＢを含む試料に、コプラナーＰＣＢハプテンと酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する
酵素結合ハプテンの調製は、コプラナーＰＣＢハプテンを酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
【００７３】
（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる
コプラナーＰＣＢと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。
【００７４】
固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のコプラナーＰＣＢの量を決定する。
【００７５】
本工程において酵素結合ハプテンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線からコプラナーＰＣＢの量を算出することができる。
【００７６】
前記本発明の測定方法においては、測定対象物に応じた前処理をして試料とした後、前記間接競合ＥＬＩＳＡまたは直接競合ＥＬＩＳＡの工程（３）に供せられる。
【００７７】
測定対象物が土壌または食品の場合、コプラナーＰＣＢが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノールに転溶させて緩衝液で希釈後、測定試料にする。簡便法として、メタノールで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。具体的には、例えば試料５ｇに、メタノール５ｍｌを加えて２０分間振とうする。室温で３０分間静置した後、抽出物の上層２ｍｌを２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を蒸留水で１：４に希釈し、これを前記工程（３）に供する。
【００７８】
測定対象物が環境水の場合、抽出工程を必要とせず、直接測定試料とすることが可能である。
【００７９】
本発明のモノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２を用いて、以下のようなコプラナーＰＣＢ群の測定方法を実施することができる。ＰＫ−０Ｔ２は、ＰＣＢ８０に対してＩＣ50値が２. ６ｎｇ／ｍｌと高感度に反応するのに対して、他のＰＣＢ、例えばＰＣＢ７７、ＰＣＢ８１、ＰＣＢ１２６、ＰＣＢ１６９およびＰＣＢ１８９とは全く反応しないことから、本抗体を用いることによって今までイムノアッセイによる測定法のなかったＰＣＢ８０の特異的かつ高感度測定を実施することができる。
【００８０】
一方、ＰＫ−４Ｎ２を用いることによって、ＰＣＢ８０に対してＩＣ50値が０. ４６ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１２６に対してＩＣ50値が２. ３ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１６９に対してＩＣ50値が０. ６３ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１１１に対してＩＣ50値が２. ２ｎｇ／ｍｌ、ＰＣＢ１８９に対してＩＣ50値が１．９ｎｇ／ｍｌと、５種類のコプラナーＰＣＢのグループ特異的かつ高感度測定を実施することができる。また、ＰＫ−０Ｔ２とＰＫ−４Ｎ２とを適宜組み合わせて、感度と特異性の相違に基づいて分別することが可能である。
【００８１】
［実施例］
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８２】
実施例１
（ａ）２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）の合成
２，６−ジクロロフェノール（２）３．２６ｇ（２０ミリモル）を酢酸２０ｍ lに溶解し、室温攪拌下に臭素３．３６ｇ（２１ミリモル）を滴下した。得られた混合物を９０℃で５時間加熱攪拌した後、反応混合物を減圧下に濃縮した。得られた残渣を水中に注ぎ込み、酢酸エチル７０ｍｌで抽出した。酢酸エチル抽出液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗結晶をｎ−へキサンから再結晶して、標記目的化合物４．０７ｇ（収率８４％）を得た。
【００８３】
（ｂ）２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）の合成  
２００ｍｌのナスフラスコに、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノール（３）２．４２ｇ（１０ミリモル）、４−ブロモ酪酸エチル（４）１．９５ｇ（１０ミリモル）、炭酸カリウム１．３８ｇ（１０ミリモル）およびアセトニトリル５０ｍｌを加え、５時間還流した。反応混合物を減圧下に濃縮した。得られた残渣を水中に注ぎ込み、酢酸エチル７０ｍｌで抽出した。酢酸エチル抽出液を水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−へキサン／酢酸エチル＝２０／１〜１５／１）で精製することにより、標記目的化合物２．６４ｇ（収率７４％）を得た。
【００８４】
（ｃ）２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）の合成
１００ｍｌのナスフラスコに、２，６−ジクロロ−４−ブロモフェノキシ酪酸エチル（５）１．７８ｇ（５ミリモル）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．２ｇ（O ．１７３ミリモル）、炭酸ナトリウム１．０６ｇ（１０ミリモル）を水５ｍｌに溶解した液およびベンゼン１０ｍｌを加えた。この混合物に、３，５−ジクロロフェニルボロニックアシッド（６）０．９５ｇ（５ミリモル）をメタノール５ｍｌに溶解した液を加え、１５時間還流した。反応混合物に飽和食塩水３０ｍ１を加え、ジエチルエーテル３０ｍｌで２回抽出した。エーテル抽出液を合わせ、これを無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を留去した。留去後に得られた粕生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−へキサン／酢酸エチル＝１５／１〜１０／１）で精製することにより、標記目的化合物１−８６ｇ（収率８８％）を得た。
【００８５】
（ｄ）２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸（１）の合成
２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸エチル（７）０．８４ｇ（２ミリモル）をエタノール７ｍｌに溶解した液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液８ｇ（４ミリモル）を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ込み、１Ｎ−塩酸を用いて酸性（ｐＨ１）とした後、酢酸エチル３０ｍ lで２回抽出した。酢酸エチル抽出液を合わせ、これを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下に溶媒を留去した。留去後に得られた粗結晶を酢酸エチル／ｎ−へキサンから再結晶して、標記目的化合物０．４９ｇ（収率６２％）を得た。
【００８６】
実施例２（免疫原の調製）
免疫原としてスカシ貝へモシアニン（ＫＬＨ）と本発明ＰＣＢハプテンとの結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
【００８７】
実施例１で製造した２，６−ジクロロ−４−（３，５−ジクロロフェニル）フェノキシ酪酸（ＰＣＢハプテン）９．４５ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．８８ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロビル）−カルボジイミド塩酸塩４．７９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．５ｍｌに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に一晩放置した。
【００８８】
別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）２ｍｌにKLH を１５０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＫＬＨ溶液としておいた。
【００８９】
このＫＬＨ溶液に、先に調製したＰＣＢハプテン溶液を徐々に滴下し、４℃で３時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に対して透析した後、−３０℃で貯蔵した。上記のようにして得られたＰＣＢハプテンとＫＬＨとの結合体を免疫原として使用した。
【００９０】
実施例３（固相化抗原の調製）
固相化抗原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸（２，４−ＤＢ）との結合体を、活性エステル法を用いて作製した。
【００９１】
２，４−ＤＢ６．２７ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．８８ｍｇおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩４．７９ｍｇを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．５ｍｌに溶解し、この溶液を２５℃の暗所に一晩放置した。別途、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）２ｍｌにＢＳＡを５０ｍｇ加え、一晩攪拌することにより、ＢＳＡ溶液としておいた。
【００９２】
このＢＳＡ溶液に、先に調製した２，４−ＤＢ溶液を徐々に滴下し、４℃で３時間攪拌した。反応終了後、４℃で一晩生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ．ｐＨ７，０）に対して透析した後、−３０℃で貯蔵した。このようにして得られた２，４−ＤＢとＢＳＡとの結合体を固相化抗原として使用した。
【００９３】
実施例４（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫原を２ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量のアジュバント（商品名：Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ  ＣｙｔＲｘ  Ｃｏ製）を混合した。この混合物１００μ１を、４〜５週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与した。その後、上記と同様の手順で、アジュバント（商品名：Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ  ＣｙｔＲｘ  Ｃｏ製）と等量混合した０．５ｍｇ／ｍｌの免疫原１００μｌを２週間毎に追加免疫した。尾血管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を入れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミで傷をつけ、注射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を取り出した。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降させるために５分間静置した。脾細胞が浮遊している上清を静かに取り、単細胞の懸濁液を１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を集め、脾細胞を調製した。
【００９４】
マウスのミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を細胞数の比で５：１（ミエローマ細胞：脾細胞）になるように脾細胞と混合し、３００×ｇで５分間遠心分離して細胞を集めた。上清を除去し、遠心管をはじいて沈殿した細胞をほぐした後、３７℃に温めておいた５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液１ｍｌを６０秒かけてゆっくり加え、細胞融合を行った。次いで、ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、更にウシ胎児血清を１０％含むＤＭＥＭ培地４０ｍｌを添加した。遠心分離によって集められた細胞を、細胞数が５×１０5 個／ｍｌになるようにＨＡＴ培地を加えた。細胞懸濁液を９６穴細胞培養プレートに２５０μｌ／ウェルの量を分注して、３７℃にて５％二酸化炭素の気相中でインキュベーションした。
【００９５】
１週間後、ウェル中の培地の半量を新鮮なＨＡＴ培地で置換して、１２日間培養した。培養上清中の抗体の活性をＥＬＩＳＡ法で調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、９６穴細胞培養プレートで、１０％ウシ胎児血清と８μｇ／ｍｌのインシュリンを含むＨＡＴ培地を用い、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを２度行った。クローニングした結果、最終的に抗ＰＣＢ抗体を産生する安定なハイブリドーマ２株を得た。このうち１つの株をＰＫ−０Ｔ２と名付け、他の１つの株をＰＫ−４Ｎ２と名付けた。
【００９６】
実施例５（モノクローナル抗体の作製）
実施例４で得られたハイブリドーマ２株（ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２）を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養した。培養上清をモノクローナル抗体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液」、「モノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液」とした。調製したモノクローナル抗体溶液は、間接競合ＥＬＩＳＡ法の一次抗体として用い、３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）との反応性を調べた。
【００９７】
実施例６（間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定）
（１）９６穴マイクロプレートに２，４−ＤＢとＢＳＡとの結合体（３μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルとなるように加え、４℃で一晩インキュベーションしてプレートに吸着させた。ＰＢＳで４回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ、大日本製薬（株）製）溶液を２５０μ１／ウェルとなるように加え、４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄した。
【００９８】
（２）モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液またはモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液をＰＢＳ（ｐＨ８．０）で２倍希釈した溶液とＰＣＢ８０標準溶液の各々５０μｌをウェルに加え、ＰＫ−０Ｔ２は２５℃で１時間、ＰＫ−４Ｎ２は４℃で２時間インキュベーションした後、プレートを洗浄した。
【００９９】
（３）西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧヤギ抗体（二次抗体）をＰＢＳで２０００倍に希釈し、該希釈液１００μｌをウェルに加え、２５℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄した。
【０１００】
（４）０．２％のｏ−フェニレンジアミン発色溶液（１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、０．００３％過酸化水素水）１００μｌをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、４Ｎ硫酸５０μｌをウェルに加えて酵素反応を止め、４９２ｎｍおよび６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１０１】
好適には、上記の（２）に記載の工程において、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液の１０００倍希釈溶液またはモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液の５００倍希釈溶液と、メタノールに溶解したＰＣＢ８０標準溶液を５０ｎｇ／ｍｌから２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含む蒸留水で段階的に希釈した溶液をウェルに加え、二次抗体を２０００倍希釈したものを用いて、吸光度を測定した。Ｂ／Ｂｏ（％）を次式により算出した。
Ｂ／Ｂｏ（％）＝（ＰＣＢ８０標準溶液の吸光度）／（コントロールの吸光度）×100 
モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図１に示す。モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定可能な範囲は０．７ｎｇ／ｍｌ〜７．０ｎｇ／ｍｌであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ50値）は２．６ｎｇ／ｍｌであった。また、モノクロ−ナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＣＢ８０の測定可能な範囲は０．１５ｎｇ／ｍｌ〜１．５ｎｇ／ｍｌであり、５０％阻害を示す値（ＩＣ50値）は０．４６ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０２】
実施例７（抗体のメタノールに対する耐性）
ＰＣＢ８０希釈液におけるメタノール濃度に対するモノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液の耐性を調べた。
【０１０３】
ＰＣＢ８０標準溶液を１０％〜１００％のメタノールを含む蒸留水で希釈したものを用い、上記実施例６と同様にしてＰＣＢ８０の標準阻害曲線を作成した。
【０１０４】
モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図２に、モノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液についてのＰＣＢ８０の標準阻害曲線を図３に示す。
【０１０５】
図２および図３から明らかなように、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液およびモノクローナル抗体ＰＫ−４Ｎ２溶液は、１０％〜３０％のメタノールでは反応性に変化がなく、メタノールに対して耐性を有していることが明らかになつた。また、モノクローナル抗体ＰＫ−０Ｔ２溶液は、４０％のメタノールでも反応性に変化がなく、メタノールに対する耐性に優れていた。
【０１０６】
以上の結果から、本発明のコプラナーＰＣＢハプテンを用いて得られるモノクローナル抗体を使用する間接競合ＥＬＩＳＡ法により、コプラナーＰＣＢ分析の大幅な簡略化および測定時間の短縮が可能となり、多数の検体を迅速、簡便且つ低コストで測定できることがわかる。
【０１０７】
実施例８（抗体のコプラナーＰＣＢ構造類似化合物に対する交差反応性）
ＰＣＢ８０と化学構造が類似している化合物について抗体ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２の交差反応性を調べた。交差反応性は、実施例６に記載の方法と同様にして試験化合物のIC50値を求め、次式により計算した。
【０１０８】
交差反応率（％）＝（ＰＣＢ８０のIC50値/ 試験化合物のIC50値）×100 
上記式を用いて交差反応率を算出した結果を表１に示す。
【０１０９】
【表１】
2005247822.tif 000005
表１より、抗体ＰＫ−０Ｔ２およびＰＫ−４Ｎ２は、ノンオルソＰＣＢであるＰＣＢ７７およびＰＣＢ８１ならびにジオルソＰＣＢであるＰＣＢ１３３およびＰＣＢ１８０とは殆ど反応しなかった。抗体ＰＫ−４Ｎ２は、ノンオルソＰＣＢであるＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９、ならびにモノオルソＰＣＢであるＰＣＢ１１１およびＰＣＢ１８９と交差反応性を示した。抗体ＰＫ−０Ｔ２は、ＰＣＢ１２６およびＰＣＢ１６９とも殆ど反応せず、ＰＣＢ１１１に対する感度がＰＣＢ８０に対する感度の約０．１倍であり、ＰＣＢ８０に対する特異性が高いことがわかる。抗体ＰＫ−０Ｔ２とＰＫ−４Ｎ２を組み合わせて用いることにより、ＰＣＢ８０と前記その他のコプラナーＰＣＢとを分別して検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】抗体ＰＫ−０Ｔ２または抗体ＰＫ−４Ｎ２を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法におけるＰＣＢ８０に対する標準曲線を示す。
【図２】抗体ＰＫ−０Ｔ２を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法において、メタノールの影響を示す反応曲線である。
【図３】抗体ＰＫ−４Ｎ２を用いた間接競合ＥＬＩＳＡ法において、メタノールの影響を示す反応曲線である。
【図１】
2005247822.tif 000008
【図２】
2005247822.tif 000009
【図３】
2005247822.tif 000010