(57)【要約】【課題】  原相互作用能力が実質的に失われているが、原細菌レセプターの基本構造および安定性は失われていない、改変された相互作用能力を有する、新規人工細菌レセプター構造体の製造方法。【解決手段】  天然細菌レセプターのドメインの表面露出アミノ酸の変異誘発により得ることができる新規タンパク質のレパートリーを具体化するタンパク質ライブラリーから選抜される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する天然細菌レセプターの、少なくとも１個の表面露出アミノ酸残基を他のアミノ酸残基により置換したアミノ酸配列を有し、該天然細菌レセプターの基本構造や安定性は失われておらず、該天然細菌レセプターの相互作用能力を欠失し、および、該天然細菌レセプターが結合しない相互作用パートナーに結合する、人工細菌レセプター構造体を含むタンパク質。
【請求項２】
ファージ−コートタンパク質に融合されており、そして前記細菌レセプターが好ましくはグラム陽性細菌に由来する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記細菌レセプターが黄色ぶどう球菌、化膿連鎖球菌〔グループＡ〕、連鎖球菌グループＣ、Ｇ、Ｌ、ウシグループＧ連鎖球菌、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス〔グループＣ〕、ストレプトコッカス・ズーピデミカスＳ２１２、連鎖球菌グループＡ、連鎖球菌グループＡ、Ｃ、Ｇ、ペプトストレプトコッカス・マグナス、ストレプトコッカス・アガラクティエ〔グループＢ〕より選択される細菌に由来する請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
前記細菌レセプターがぶどう球菌プロテインＡまたは連鎖球菌プロテインＧに由来する、請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
前記細菌レセプターが、Fc〔IgG〕レセプタータイプＩ、タイプII、タイプIII、タイプIV、タイプＶおよびタイプVI、フィブロネクチンレセプター、Ｍプロテイン、プラスミンレセプター、コラーゲンレセプター、フィブリノーゲンレセプターまたはプロテインＬ〔Ｋ軽鎖〕、プロテインＨ〔ヒトIgG〕、プロテインＢ〔ヒトIgA、Ａ１〕、プロテインArp〔ヒトIgA〕より選択されるレセプターに由来する、請求項３または４記載のタンパク質。
【請求項６】
前記レセプターがぶどう球菌プロテインＡのFc〔IgG〕レセプタータイプＩまたは連鎖球菌プロテインＧの血清アルブミンレセプターに由来する、請求項４記載のタンパク質。
【請求項７】
前記レセプターがIgG結合性ドメインＺ、Ｃ１または血清アルブミン結合性ドメインＢ２Ａ３に由来する、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
前記置換に、原細菌レセプターのアミノ酸残基のうち最高で約５０％が関与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記置換に、原細菌レセプターのアミノ酸残基のうち最高で約２５％が関与する、請求項８記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記置換に、原細菌レセプターの相互作用機能に参加するアミノ酸残基のうち最高で実質的に全部が関与する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記置換が部位特異的変異誘発により得られたものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記置換が相互作用相手としてのタンパク質、脂質、炭水化物および無機物質より選択された物質に対する特異的相互作用能を創出するためのものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記物質が相互作用相手としての炭水化物例えば血液型決定因子、および病原体特異的オリゴ糖より選択される、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記物質が相互作用相手としてのIGF−Ｉ、IGF−II、hGH、第VIII因子、インスリンおよびアポリポタンパク質およびそれらのそれぞれの受容体より選択される、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記置換がウイルスコートタンパク質、細菌抗原、ビオチンおよび細胞マーカー例えばCD34、CD４より選択される物質に対する特異的相互作用能を創出するためのものである、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記置換が抗体断片、例えばFv、scFv、FabおよびFcに対する特異的相互作用能を創出するためのものである、請求項12記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記置換が有機リガンドに対する特異的相互作用能を創出するためのものである、請求項１２記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記新規タンパク質のレパートリーを具体化するタンパク質ライブラリーから選抜された、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
次の諸段階、
ａ）請求項１に従って得られた新規レセプター構造体のレパートリーを所望の相互作用機能に基づく選抜手順にかける；そして
ｂ）選抜されたレセプター構造体を単離する
段階より成るが、ただし、該天然細菌レセプターはぶどう球菌プロテインＡ由来ドメインＺではない、人工細菌レセプター構造体の製造方法。
【請求項２０】
次の諸段階、
a1）新規レセプター構造体の前記レパートリーからのものであってファージ−コートタンパク質に融合されたタンパク質をそれぞれの表面に有するファージ粒子を組換えDNA法により調製する；
a2）段階a1)で得られたファージ粒子のプールからパンニングを行って所望の結合特性を示す特定ファージクローンを選抜する；そして
ｂ）前記特定ファージクローンを前記結合特性と関連する相互作用を用いて単離する
段階より成る、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
次の諸段階、
ａ）前記ライブラリーのタンパク質を、特定タンパク質変種とそれをコートするプラスミドとの間に相互作用を生じる特定プラスミド担持オペレーター領域に対する親和性を有するレプレッサータンパク質に融合させることによって組換えDNA法により融合タンパク質を調製する；および
ｂ）前記相互作用を用いて選抜されたタンパク質を単離する
段階より成る、非分泌性のタンパク質に関係したレセプター構造を選抜するための請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
次の諸段階、
a1）新規レセプター構造体の前記レパートリーからのものであって、細菌細胞において機能する細胞壁アンカリングドメインに融合されたタンパク質をそれぞれの表面に有する前記細菌細胞を組換えDNA法により調製する；
a2）段階a1)で得られた細菌細胞のプールからパンニングを行って所望の結合特性を示す特定細菌クローンを選抜する；および
ｂ）前記結合特性と関連する相互作用を用いて前記特定クローンを単離する
段階より成る、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、天然の細胞レセプター構造体を起源とし、そして原相互作用機能に関与するアミノ酸残基を改変することによって原相互作用機能が実質的に阻害されかつ望ましい相互作用相手に向けられた改変相互作用機能により置換されている新規の細菌レセプター構造体に関する。
【従来の技術】
【０００２】
哺乳動物を侵すことが知られているいくつかの細菌は宿主特異的炭水化物およびタンパク質を含む様々な物質に結合できる表面タンパク質を進化させている。グラム陽性細菌病原体からはいくつかのその種のレセプターが単離されまた後述の如く詳細に特性評価されている。最も十分に特性評価されているのは、IgGの不変Fc部への結合能にちなんで命名されたFcレセプターである。様々な哺乳動物給源からのIgGおよびそのサブクラスへの結合実験に基づいて、FcレセプターはＩ−VIの六タイプに分けられている。タイプＩレセプターを規定する黄色ぶどう球菌(S. aureus）のレセプター、プロテインＡ（SPA）は広範に及ぶ研究の主題となっている。
【０００３】
SPAは人間を含む大部分の哺乳動物種からのIgGを結合する。SPAは、ヒトIgGの四サブクラスのうち、IgG１とIgG４には結合するがIgG３には極めて弱い相互作用を示すかまたは全く相互作用を示さない〔Eliasson, M. et al, 1989 J. Biol. Chem. 9：4323-4327〕。この準免疫反応は20年以上にもわたって、診断、研究および治療への応用上、抗体の精製および検出に用いられてきている。SPA遺伝子の規定された断片のクローン化、配列決定および大腸菌（Escherichia coli）発現から五つのIgG結合ドメイン〔E-D-A-B-C〕を有する高度反復構成、細胞壁スパニング（spanning）領域および膜アンカリング（anchoring）配列〔XM〕が明らかにされている〔Unlen, M. et al, 1984 J. Biol. Chem. 259：1695-1702; Moks,T. et al, 1986 Eur. J. Biochem. 156：637-643〕。極めて多数のプラスミドベクターが構築され、各種宿主で融合タンパク質を生産させるための各種遺伝子断片への遺伝子融合が可能となっている〔Nilsson B. and Abrahmsen, L. 1990 Meth. Enz. 185：144-161〕（Fig. 2a）。
【０００４】
ヒトFc〔IgG１〕とSPAの単一ドメイン〔Ｂ〕との間の複合体の構造は2.8Å解像度でＸ線結晶学的方法により決定された〔Deisenhofer,J. et al 1981 Biochemistry 20：2361-2370〕。この構造とNMR実験からの付加的情報とに基づいて、Ｂドメインはループに接続された三つの逆並行α−ヘリックスより成るコンパクトな構造とみることができる。そのFc結合は静電的性質および疎水性を併有するが、それにはヘリックス１および２からの残基の側鎖だけが関与し、第三ヘリックスは結合に関与していない。このドメインＢに基づいて、合成IgG−結合性ドメイン〔Ｚ〕〔Nilsson, B. et al 1987 Prot.Eng. 1：107-113〕が構築されているが、これはIgGアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする組換えタンパク質を生産するための融合相手として適している。このＺドメインの高溶解度および安定構造は、幾多の組換えタンパク質の生産、精製および復元に利用されている〔Josephsson, S. and Bishop, R. TrendsBiotechnol. 6：218-224; Samuelsson, E. et al 1991 Bio.Technol. 9：363-366〕。
【０００５】
血清学的グループＣおよびＧの連鎖球菌株は、タイプＩレセプターに対してよりも一段と広い結合レパートリーをヒトIgG３を含む哺乳動物IgGに対して示す。グループＧ連鎖球菌からのタイプIIIレセプターに対してはプロテインＧの名称が提案されている。1986年に、Olssonおよび共同研究者は、血清学的グループＧ連鎖球菌からの遺伝子〔Ｇ148〕のクローン化および配列決定について報じている〔Guss, B. et al, 1987 EMBO J. 5：1567-1575；Olsson, A. et al,1987 Eur. J. Biochem. 168：319-324〕。SPAと同様に、SPGはより小さなＤ−領域により隔てられた三つの相同ドメイン〔C1、C2、C3〕のIgG結合性ドメインより成る反復配置分子である（Fig．2A)。SPAに比べ、SPGは様々な生物種からの免疫グロブリンおよびそれらのサブクラスに対して異なる結合スペクトルを示す。現在、プロテインＧのIgG結合性ドメインは免疫学的ツールとして、すなわち、モノクローナル抗体のアフィニティー精製に広く用いられている。DNA技術により構築された亜断片(サブフラグメント）の生産により、個々のＣ領域が十分なIgG結合に十分であることがわかっている。最近になってSPGからのＣ１−ドメインとヒトFcとの複合体の構造がＸ線結晶学的方法により決定された(Fig．2B)。それは、SPGはCH2-CH3界面に結合するがSPAとは異なる部位に結合することを示している。その結合は、SPA-Fc相互作用にみられた疎水力の大きな寄与とは対照的に、主に静電的性質を有している。さらに、Ｃ１の３−Ｄ構造はα−ヘリックスにより接続された二つのβ−シートによって構築されている（ββ−α−ββ）点でＸ構造と異なっている。その構造に従って結合に関与するＣ１の残基はα−ヘリックス、ループおよびそれに続くβ−シートに相当する。
【０００６】
SPGのさらに別の活性は血清アルブミン結合能である。その結合力は生物種依存性があり、そして試験された検体の中では、SPGはラット、ヒトおよびマウスからの血清アルブミンに最も強く結合する。SPGの亜断片の生産および結合試験によって、それら二つの結合活性が構造的に別なものであること、および血清アルブミン結合機能が反復性Ａ−Ｂ領域に位置することがわかった〔Nygren et al1990 Eur. J. Biochem. 193：143-148〕。この領域はいくつかのバイオテクノロジー的諸目的に用いられている。その領域への融合体として組換えタンパク質が生産されており、それによって極めて多くの場合にヒト血清アルブミンが固定リガンドとして用いられるアフィニティークロマトグラフィーによる精製が可能となる。それぞれSPAおよびSPG由来の二つの異なるアフィニティー尾部(テイル)を隣接させた「二重アフィニティー融合物(dual affinity fusions)」として、タンパク質分解的に敏感であることがわかっているタンパク質が生産されている。そのため、完全な標的タンパク質の回収を保証する、Ｎ−およびＣ−末端の両方を用いた精製スキームが可能である〔Hammarberg et al 1989 Proc. Natl. Acad. Sciences USA86：4367-4371〕。血清アルブミンへの強力で特異的な結合も治療用タンパク質の生体内安定化目的に用いられている。
【０００７】
極めて長命の血清アルブミンとの複合体形成を通してレセプターは血清アルブミンそれ自体の半減期に近い半減期で循環にのる（赤毛猿)。HIV／AIDS治療には興味深いものがあるが速やかに清浄化されるＴ細胞レセプターCD４を用いたマウスでの試験は、それが血清アルブミン結合性領域に融合した場合に、未融合コントロールタンパク質に比べ、実質的に安定化することを示した〔Nygren et al1991 Vaccines 91 Cold Spring Harbor Press 363-368〕。清浄化が遅くなることは、おそらく、肝臓による除去および腎臓での排泄をかわす血清アルブミンとの複合体形成によって説明できる。
【０００８】
血清アルブミンへの結合維持に必要な最小長を測定するために、Ａ−Ｂ領域のより小さな断片がいくつか生産され分析されている。血清アルブミン結合活性を有するこれまでの最小断片は、領域Ｂ２およびＳからのそれぞれＢおよび９残基を隣接させた領域Ａ３より成る46残基断片〔「Ｂ２Ａ３」〕である。
【０００９】
その他の部分断片の相同性および結合試験に基づいて、SPGは血清アルブミンへの結合に関し、三価であると考えられる。一価のIgG結合性ドメインであるＺおよびＣ１と同様、Ｂ２Ａ３は比較的小さくまた高い溶解度および安定性を示し、従って改変にふさわしい候補である。
【００１０】
発明の概要
本発明の主な目的は、天然細菌レセプターの原相互作用機能を改変することにより改変相互作用機能を有する新規細菌レセプター構造体を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、様々な条件、例えば高温などに対して安定であってかつより抵抗性のある人工細菌レセプター構造体を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、その相互作用機能が他の望ましい相互作用相手にそれを向けるように改変された人工細菌レセプター構造体を提供することにある。
【００１３】
これらの目的および以下の開示から明らかとなろう他の目的を念頭に置きつつ、本発明は、天然細菌レセプターのドメインの表面露出アミノ酸の変異誘発により得ることができ、そして該天然細菌レセプターの基本構造および安定性を実質的に失うことなく得られる新規タンパク質を提供するものである。前記タンパク質は、好ましくは、前記新規タンパク質のレパートリーを具現化したタンパク質ライブラリーから選択される。かかる新規細菌レセプター構造体において、原細菌レセプターの相互作用機能に関与する少なくとも一つのアミノ酸残基が別のアミノ酸残基による置換を受けることとなり、その結果改変された相互作用能力が生じると共に原相互作用能力が実質的に失われるのであるが、前記置換は原細菌レセプターの基本構造および安定性を実質的に失うことなく行われる。
【００１４】
前記細菌構造体はグラム陽性細菌を起源とするが好ましい。そのような細菌としては、黄色ぶどう球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）〔グループＡ〕、連鎖球菌グループＣ、Ｇ、Ｌ、ウシグループＧ連鎖球菌、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus)〔グループＣ〕、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスＳ212、化膿連鎖球菌〔グループＡ〕、連鎖球菌グループＡ、Ｃ、Ｇ、ペプトストレプトコッカス・マグナス（Streptococcus magnus）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）〔グループＢ〕などが挙げられる。
【００１５】
特に興味深いのは、高温環境中で存続するように進化した好熱性細菌である。例えばバチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillusstearothermophilus)、サーマス・アクアティカス（Thermus aqua-ticus)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）およびパイロコッカス（Pyrococcus）などの生物種からのレセプターは当然ながらとりわけ安定である潜在能力を有し、従って本発明によるタンパク質エンジニアリングのための構造枠組を与えるのにふさわしい。
【００１６】
相互作用機能改変のための出発材料としては、ぶどう球菌プロテインＡまたは連鎖球菌プロテインＧ由来の細菌レセプター構造体を用いるのが特に好ましい。
【００１７】
好ましいレセプターとしては、Fc〔IgG〕レセプター タイプＩ、タイプII、タイプIII、タイプIV、タイプＶおよびタイプVI、フィブロネクチンレセプター、Ｍプロテイン、プラスミンレセプター、コラーゲンレセプター、フィブリノーゲンレセプターまたはプロテインＬ〔Ｋ軽鎖〕、プロテインＨ〔ヒトIgG〕、プロテインＢ〔ヒトIgA、Ａ１〕、プロテインArp〔ヒトIgA〕に由来する細菌レセプターなどが挙げられる。
【００１８】
特に好ましい細菌レセプターは、ぶどう球菌プロテインＡのFc〔IgG〕レセプタータイプＩまたは連鎖球菌プロテインＧの血清アルブミンレセプターに由来するものである。
【００１９】
本発明によれば、原細菌レセプター構造体の安定性および諸性質を維持するために、原細菌レセプターの相互作用機能に参加するアミノ酸残基に関与する置換が原細菌レセプターのアミノ酸残基の約50％を超えて及ばないようにするのが好ましい。原細菌レセプターのアミノ酸残基の約25％を超えない範囲で置換を受けるようにするのが特に好ましい。
【００２０】
それらの相互作用機能の改変に選択される原細菌レセプター構造体については、IgG結合性ドメインＺ、Ｃ１、および血清アルブミン結合性ドメインＢ２Ａ３に由来するレセプターを用いるのが特に好ましい。
【００２１】
本発明による改変を受ける原レセプター構造体の安定性および諸性質をできるだけ維持するために、その置換が原細菌レセプターの相互作用機能に参加するアミノ酸残基の実質的に全部を限度として及ぶようにするのが好ましい。
【００２２】
各種条件に対する安定性および抵抗性に関する好ましい性質を得るには、本発明による細菌レセプターが約100を超えないアミノ酸残基より成るのが好ましい。学術報告書から、比較的小サイズのタンパク質は高温に対し、また低pHおよびある種の化学物質に対してもかなり抵抗性があることが知られている。温度抵抗性に関する詳細についてはBiochemistry 1992, 31, pp.3597-3603にあるAlexanderらの文献を参照されたい。
【００２３】
天然細菌レセプター構造体の改変に関しては、その置換を遺伝子工学、例えば部位特異的変異誘発により行うのが好ましい。
【００２４】
改変された天然細菌レセプターの相互作用相手については、多くの物質、例えばタンパク質、脂質、炭水化物および無機物質などが考えられる。炭水化物の例としては、血液型決定因子および病原体特異的オリゴ糖が挙げられる。
【００２５】
タンパク質について考え得る相手は、相互作用相手としてのIGF−Ｉ、IGF−II、hGH、第VIII因子、インスリンおよびアポリポタンパク質、およびそれらのそれぞれの受容体である。更にまた、様々な折りたたみ形態のタンパク質に対する特異性を有する新規レセプター変種を選択することによって、正しく折りたたまれた分子の単離を容易にするアフィニティー樹脂または分析ツールを生産することができる。更なる例は、ウイルスコートタンパク質、細菌抗原、ビオチンおよび細胞マーカー、例えばCD34およびCD４である。
【００２６】
本発明は様々な天然細菌レセプターに適用可能であるが、以下の本発明のより詳細な説明はIgG結合性ドメインＺ、Ｃ１およびＢ２Ａ３の使用に向けられている。天然細菌レセプターの天然構造体に基づいた人工細菌レセプターの使用にある本発明概念にはいくつかの長所が伴う。すなわち本発明により、強く、安定した、高溶解性の、そして分泌能のあるレセプターを用いることが可能になる。このことは、貯蔵、条件変動例えば温度変動などに関しさほど安定でないポリクローナル体およびモノクローナル体の、例えば診断目的のための、使用に基づく従来技術とは対照的である。更にまた、本発明により、天然細菌レセプターを改変して特定目的に望ましい相互作用能力を獲得することができるようになる。
【００２７】
大きなレパートリー中で、かかる機能的変種を選抜するには、強力な選抜システムを採用しなければならない。この分野における最近の発展は様々な方法の選択肢を提供してくれる。この数年の間に出現したタンパク質エンジニアリングのための最も重要なツールの一つは、タンパク質のファージディスプレイである。組換えDNA法によって、それらの表面にタンパク質をファージコートタンパク質に融合した形で相持する個々のファージ粒子を調製することができる。様々なタンパク質または特異タンパク質の変種を有するファージの大プールからパンニング（panning）することによってある結合特徴を示す特定のファージクローンを選抜することができる〔WinterらへのWO 92／20791〕。ファージ粒子はファージタンパク質成分をコードする詰込みDNAを含んでいるので、ディスプレイされたタンパク質の特定変種と対応する遺伝情報との間のカップリングが得られる。この方法を用いて、典型的には109ファージクローンを同時的に生成させそして所望の特徴の選抜のためのパンニングにかけることができる。ファージディスプレイ法は小タンパク質のほか、より複雑なタンパク質、例えば抗体、レセプターおよびホルモンなどの選抜にも用いることができる。ファージディスプレイの前提要件となる分泌が不可能なタンパク質の選抜には、細胞内システムが開発されていて、その場合、タンパク質のライブラリーが特定プラスミド担持オペレーター領域に対する親和性を有するレプレッサータンパク質に融合される結果、特定タンパク質変種とそれをコードするプラスミドとの間のカップリングが得られる。タンパク質ライブラリーの担持体としてのファージの代替物の一つは、細菌細胞の使用であろう。最近、細胞壁アンカリングドメインへの融合に基づくスタフィロコッカス・キシロサス（Staphylococcus  xylosus)の表面への組換えタンパク質のディスプレイが実証されたが、このことは、特定変種のアフィニティー選抜のためのタンパク質のレパートリーのディスプレイについても可能性を開くものである〔Hansson, M. et al 1992 J. Bacteriology 174：4239-4245〕。更にまた、コンピューターグラフィックシミュレーションを用いて構造モデル化を行うことにより、あるタンパク質の変えられた変種の結合および機能を、該タンパク質をコードする遺伝子を構築する前に理論的に予測できる。
【００２８】
前述のとおり、本発明は、殺菌レセプター由来のドメインの表面露出アミノ酸の変異誘発に基づく新規タンパク質の構築を記述するものである。これらの人工細菌レセプターはファージディスプレイシステムを用いて様々な応用目的のために選抜することができる。細菌レセプターを構造枠組として用いることから来る利点にはいくつかがある。それらは、全体構造を乱すことなく結合機能を発現するように進化している。それらは、当然ながら、易溶性で、非生理学的条件例えばpHおよび熱に対して強く、折りたたみ効率がよく、また加えて分泌能がある。
【００２９】
本発明は、いくつかの様々な分野で有用である。前述の特許明細書WO 92／20791の導入部は抗体およびそれらの構造に関する優れた調査結果を記載している。特にその第１頁が参考となる。
【００３０】
細菌レセプターSPAおよびSPGは、例えばハイブリドーマ上清および腹水液などからの抗体を検出および精製する目的で抗体技術に広く用いられている。しかしながら、生物種およびサブクラスによっては、すべての抗体がこれらのレセプターによって認識されるわけではない。抗体のより小さい亜断片に対しては（Fig.４)、SPAおよびSPGは限られた結合しか示さず、また一般的精製スキームのための効率的ツールが欠如している。しかしながら、SPAおよびSPGを含む変異レセプターのレパートリーからは、抗体およびそれらの亜断片に対するより広い親和性を示す形態のものを可能性として選抜することができる。
【００３１】
抗体の複雑な構造組織は、様々な応用目的に用いる上で、また組換え誘導体を生産する上で多くの重要性を有する。免疫収着剤に用いる場合、ジスルフィド結合により接合されたサブユニットの配置は、遊離重軽鎖のカラムからの漏れを招くことがある。抗原結合部位に寄与する二つのサブユニットをうまくドッキングさせなければならないために、会合度の低い小さな亜断片を細菌内生産させることは困難になる。抗体の折りたたみは、鎖内および鎖間ジスルフィド結合の形成に依存するが、それら結合は細菌細胞の細胞内環境中では形成し得ない。組換え抗体用の高水準細胞内発現系は封入小体形成を招き、そしてその封入小体は生物学的活性の獲得のためには復元されなければならない。これらの制約のために、広範多岐にわたる応用において抗体に代えて、特異的結合可能なタンパク質ドメインとして用いるための代替物を探索することには価値がある。
【００３２】
抗体の抗原結合部を形成するCDR領域は、約800Å2の抗原利用可能総面積を形成し、抗体からの典型的な10〜20残基が結合に関与する。出発点としてSPAの一つのドメインＢとヒトfc〔IgGＩ〕との間のＸ線結晶学的方法により決定された複合体の構造を用いて、この結合に関与する前記ドメインの約15アミノ酸を決定または仮定することができる。約60
0Å2の結合面積は抗体とその抗原との間と同程度の大きさである。これらの位置の任意の試験管内変異誘発により、同時に、改変された機能性質を有するＺ変種の大ライブラリーが得られる。極めて安定したいわゆる三ヘリックス束（three-helixbundle）を構成するＺドメインの領域がその天然型のままに維持されることから、「人工抗体」と考え得る、また期待される易溶性および多数の新リガンドに結合できる優れた折りたたみ特性を有する、様々な範囲のタンパク質が生成する。不変領域へのこれら人工レセプターの融合体を、エフェクター機能、例えば補体結合またはADCC（抗体依存性細胞性細胞傷害作用）のトリガリングといった機能を新規導入するために構築することができる。
【００３３】
このような「人工抗体」または人工細菌レセプターの出発点としてSPA構造〔Ｄ〕を利用することにはいくつかの潜在的長所がある。約10年にわたって、多くのタンパク質がSPAへの融合体として生産されているが、その場合には融合相手の発現、再折りたたみおよび精製上の独特な性質が利用されている。これらの応用例において、Ｚドメインは極めて安定であって、プロテアーゼに対して安定であり、大量に生産しやすく、そして細胞内的にも大腸菌内で正しい構造に折りたたみ可能（システインなし）であることがわかっている。免疫グロブリン（Ig：Ｓ）は、実質的に、抗原結合性ループ（こちらの方は連続ペプチド配列で構成されている）の配向を安定させるいわゆるβ−シート構造から構築されたテトラマーである。これと比較すべきは、三つの密に充填されたα−ヘリックス構造より成るいわゆる三ヘリックス束から構築されるモノマーＺドメインであって、その場合には、Fc結合性アミノ酸は配列中に非連続的に認められるが折りたたまれたタンパク質中では一つの同じ結合表面に位置している。結合表面の形成に寄与する構造要素に関するこの相違は、天然抗体では得ることのできない新しい可能性としてのコンホメーションを可能にするものである。細胞質部位に普通にみられる条件下においても天然構造に折りたたまれるＺの能力は、それらの誘導体の臨床使用の可能性を開くものである。例えばウイルス中和能を有する人工抗体をコードする遺伝子をいわゆる遺伝子療法を通して細胞に分布させて感染を初期段階で阻止することができる。
【００３４】
SPGの一つのIg結合性ドメイン〔Ｃ１〕とヒトFcとの間の複合体の構造データから結合表面を調べることができる。本質的に静電的性質を有するその結合には、α−ヘリックスからの、および後に続くβ−シート〔＃３〕からのアミノ酸からの側鎖が関与する。Ｚドメインと比較した場合のこれらの相違から、人工抗体の結合パターン上の相違が結合表面のトポロジーに関する様々な条件に依存して観察され得るかどうかを調べるためにＣ１変種のライブラリーを作ることも有用となる。従ってこれらの、およびその他のレセプターの構造に基づくレパートリーは、新機能を有する人工形態を創製する上で様々な可能性を提供する。
【００３５】
組換えタンパク質を生産する際に生産物の精製が主な問題となることがしばしばである。標的タンパク質をいわゆるアフィニティーテイルへの融合体として発現することによって、そのハイブリッド生産物を細胞溶解液から、または場合によっては培地から、固定リガンド含有カラムを通して効果的かつ選択的に回収することができる。あるタンパク質とリガンドとの相互作用に基づくいくつかのそのような遺伝子融合系が報告されている。工業的応用の場合は、当局による純度要件を満たすべく作業間にカラムを効果的に清浄化することがしばしば望ましい。タンパク質の性質によるが、しばしば有機または物理的マトリックスに対して、例えばイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などに用いられる比較的過酷な条件（NaOH、酸、熱）は通常用い得ない。ここに細菌レセプター由来の安定構造体に基づく新リガンドを用いることの大きな重要性がある。これに関して、SPAからのＺドメインは優れた例である。なぜなら該ドメインは、pH１あるいは80℃への加熱などといった困難な条件に、非可逆的に変性することなく、付すことができるからである（後記実施例２参照）。例えばＺ変種のライブラリーからは、アフィニティークロマトグラフィー用固相に固定して用いるための興味深いタンパク質生産物を選抜することができる。これらのタンパク質リガンドは効果的精製条件に対して抵抗性があり、またそれ故に大規模に反復使用できる。固定モノクローナル抗体がある生産物の選択的精製に用いられる伝統的免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいては、抗体がシステイン橋により連結された四つのポリペプチド鎖から構成されていることから、そのサブユニット（重および軽鎖）がカラムから漏れるという問題がある。本発明の人工細菌レセプターは一つのポリペプチド鎖だけで構成されているのでこの問題は回避される。興味深い一つの特別の分野は、炭水化物への結合のための選抜である。この大きなそして重要なバイオ分子群に対する天然バインダーであるレクチンは精製しにくくまた安定性に限界があることがわかっている。炭水化物に対する抗体の発生は極めて複雑であることがわかっていることから、新しい人工レクチンの選抜は、研究、診断および治療にとって極めて重要になる。
【００３６】
細菌宿主中で組換えタンパク質を生産すると、遺伝子生産物の沈殿、いわゆる封入小体がしばしば形成される。タンパク質の天然構造体を得るにはこれを試験管内復元にかける必要がある。かかる方法においてしばしば直面する一つの制約は、物質の大部分が手順の中で沈殿してしまうため歩留りが低下することである。短い親水性ペプチドまたは易溶性完全ドメインのいずれかの形の鎖長のタンパク質を生産することにより〔Samuelsson, E.
et al 1991 Bio／Technol. 9：363-366〕復元中に沈殿が起きることなく、実質的により高濃度のタンパク質が得られる。例えば、前記ドメインの高溶解度は、タンパク質の増大した溶解度を封入体からの再折りたたみあるいはジスルフィド橋のいわゆるリシャッフリングに用いることを可能にする。人工レセプターのライブラリーからは、組換えタンパク質の再折りたたみを容易にしそして可能にさえもする改良された性質を有する新しい形態を選抜することができる（シス−作用性シャペロン）。
【００３７】
最近、いわゆる膨張床（expanded bed）でのイオン交換クロマトグラフィーに基づく組換えタンパク質精製のための新しい単位操作が報告されている〔Hansson, M. et al 1994
Bio／Technol. inpress〕。これに関し、正荷電イオン交換マトリックスでの選択的濃縮には、標的タンパク質と宿主細胞のタンパク質との間の等電点の差が利用される。酸性Ｚドメイン（pI 4.7）への融合により、イオン交換段階は大部分の汚染物質が融合タンパク質とは反対電荷を有するpHで行うことができる。選択されたアミノ酸が酸性アミノ酸であるアスパルテートおよびグルタメートにより置換されている細菌レセプターのライブラリーを構築することにより、組換えタンパク質生産における融合相手として用いるための、同じく極めて酸性がある溶解度増大ドメインを生産することができる。
【００３８】
前述のとおり、タンパク質リガンドに基づくアフィニティー系はカラムの清浄化に過酷な条件が必要とされることから、工業目的には全面的に適しているわけではない。それ故、簡単で安価な有機リガンドに対して特異的親和性を有する融合相手が必要とされている。かかるリガンドに対する様々な細菌レセプターのファージディスプレイライブラリーのパンニングにより、組換えタンパク質の生産精製のための融合相手として用いるのに適した新しいアフィニティーテイルが提供される。
【００３９】
本発明は新しい機能を有するタンパク質を生産および選抜するための手段を提供する。本発明により、これは細菌レセプターの安定ドメインの規定された残基に広範な変異誘発を行うことによって達成される。本発明の人工細菌レセプターはその新しい機能の故に治療、診断、バイオテクノロジーのための、あるいは研究用の特異的バインダーとして用いることができる。
【００４０】
以下、本発明を添付図面を参照しつつ特定の実施例により詳述する。図面中、
図１．Ａ．シグナルペプチド(S)、五つのIgG結合性領域〔E-D-A-B-C〕、次いで細胞壁アンカリング領域〔X-M〕を示すぶどう球菌プロテインＡの概略図。
Ｂ．Ｘ線結晶学的方法によって決定されたSPAからのドメインＢとヒトFc１との複合体
のコンピューターグラフィック図。本図にはSPAの第三ヘリックスが見られない点に留意。
図２. Ａ．シグナルペプチド(Ss)、領域Ｅ(E)、反復性血清アルブミン結合性Ａ−Ｂ領域、スペーサー領域(S)、次いでＤ領域により隔てられたIgG結合性ドメインC1〜C3、そして最後に細胞壁アンカリング領域Ｗ−Ｍを示す、Ｇ148株からの連鎖球菌プロテインＧの概略図。
Ｂ．Ｘ線結晶学的方法により決定された、SPGのドメインC１とヒトFc１との複合体のコンピューターグラフィック図。
図３．58残基SPAアナローグＺの三ヘリックス束構造の概略図。ヘリックス−ヘリックス詰込みを安定化させるＦ30を除いてFcへの結合に関与するとされている側鎖の一部が示されている。
図４．各種亜断片であるFab、Fd、Fcおよび、短い(約15aaの）リンカーにより接続されたVHとVLとで構成されるscFvを示す、IgG抗体構造。
図５．Ａ．Ｚ遺伝子ライブラリーの作成に用いられる遺伝子組立て手法の一般的考え方。酸性Ｚ誘導体のライブラリーを構築するには、縮退オリゴヌクレオチドであるACID-1、ACID-2を用いて残基９、11、14、32および35だけを変える。組立て後のライブラリーの増幅に用いられるPCRプライマーはZLIB-3（PCRプライマー5′）およびZLIB-5（PCRプライマー3′）とした。
Ｂ．Ｚ−ドメインの58残基のうち46個をコードする組立て後のライブラリーを増幅して得られるPCR生産物は、Ｚの残りのＣ−末端部を取り込んだファージミドDNA中にクローン化することができる。この遺伝子はＭ13ファミリーの大腸菌バクテリオファージのプロテインIII遺伝子とフレームをあわせて融合される。これによって酸性Ｚ変種のレパートリーをファージ表面にディスプレイすることができる。
図６．Ｚライブラリーの構築に用いられるオリゴヌクレオチド。実施例２に記載の酸性Ｚ−変種のライブラリーにはオリゴヌクレオチドZLIB-1、2、3、4、5、LONGBRIDGE、ACID-1およびACID-2だけを用いた。
図７．酸性Ｚタンパク質ライブラリーに由来するクローンのDNA配列。肉太数字はＺ−ドメインにおけるアミノ酸位置を示している。明確にするために、制限部位AccＩおよびNhe１の位置が示されている。
図８．pH2.9における一つのＺドメインの温度安定性の分析結果。検体中のα−ヘリックス含量は、温度スキャン中、s222nmにおいて楕円率を測定することにより監視した。
図９．ファージミドベクターpKN１。斑入り(variegated）ヘリックス１および２をコードするライブラリーPCR生産物(酸性および広範(extensive）ライブラリーの両方）を、野生型Ｚドメインの残基44−58（本質的にヘリックス３）の遺伝子とその後に続く、Ｍ13ファージコートタンパク質３遺伝子の端部切除体とフレームをあわせて連結されたぶどう球菌プロテインＧに由来する46残基血清アルブミン結合性領域（ABP）の遺伝子にサブクローン化した。このファージミドはプラスミドpBR322に由来する複製開始点およびファージ粒子への詰込みに必要な遺伝子間領域（fl ori）を含有する。
図10．SDS-PAGE。それぞれのファージミドベクターからコードされたABP融合タンパク質として野生型Ｚドメインおよび二つの異なる酸性Ｚ−変種を産生する大腸菌細胞のペリプラズムから得られたHSA−アフィニティー精製タンパク質をSDS／PAGEにより分析した。Ｍ、分子量マーカー；レーン１、野生型Ｚドメイン；レーン２、クローン10；レーン３、クローン12。
図11．CD−データ。Ｚ−タンパク質ライブラリーの野生型Ｚドメインと二つの変種について得られたCDスペクトルの重ね合わせプロット。タンパク質の信号は、分析中に共存するABPテイルのCD信号寄与を差し引いた後に得られた。
図12．イオン交換クロマトグラフィー。二つの酸性Ｚ−変種タンパク質No.10およびNo.12、および野生型Ｚ−ドメイン(ABP融合タンパク質として生産）を各々陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを用い、pH5.5で分析にかけた。カラムからのタンパク質溶出はNaCｌ勾配によって得た。上位：酸性Ｚ変種No.12；中位、酸性Ｚ変種No.10；下位、Ｚ（野生型)。野生型Ｚ−タンパク質はこのpHにおいてカラムで遅延しなかった点に留意。
図13．Ｚ−ドメイン構造。天然Ｚ−ドメイン構造モデルの主鎖トレース図。ヘリックス１および２の構造はSPAのドメインＢとFcとの間の共結晶構造からのものである（Deisenhofer,(1981) Biochemistry, 20, 2361-2370）。第三ヘリックスはNMR分光法からの二次的構造帰属に基づいて作成された（Gouda et al., (1992) Biochemistry, 31, 9665-9672）。組合せライブラリー（combinatorial library）構築の際に変異された残基の側鎖の非水素原子が玉−棒モデルとして表示されている。このディスプレイはプログラムMOLSCRIPTによって作成された（Kraulis (1991) J. Appl. Cryst., 24, 946-950）。
図14．アミノ酸配列。ライブラリーから無作為抽出された31個のＺ−変種のDNA配列決定結果。変異誘発を受けた残基は枠で囲んである。水平線は最上位に掲げた野生型Ｚ配列と同じヌクレオチドであることを示している。示されているのはABP−テイルへの融合タンパク質として発現され特性評価されたクローンである。
図15．アミノ酸分布。変異位置における推定アミノ酸の統計的解析結果。全部で、31クローンからの13残基(403コドン）を計算に含めた。20個すべてのアミノ酸のほか、NNG／Ｔ縮退プロフィールに含められた単なる停止信号(TAG）についても実測頻度と予測頻度の割合が示されている。
図16．SDS−PAGE分析。それぞれのファージミドベクターからコードされたABP融合タンパク質として野生型Ｚドメインと四つの異なるＺ−変種を産生する大腸菌細胞のペリプラズムから得られたHSA−アフィニティー精製タンパク質をSDS／PAGEにより分析した。レーン１−５：還元条件。レーン６および７：非還元条件。レーン１、野生型Ｚドメイン；レーン２、クローン16、レーン３、クローン21；レーン４、クローン22；レーン５、クローン24；Ｍ、分子量マーカー；レーン６、クローン16およびレーン７、クローン22。
図17．CD−データ。α−ヘリックスタンパク質表面ライブラリーの野生型Ｚドメインと四つの変種について得られたCDスペクトルの重ね合わせプロット。それら変種の信号は分析中に共存するABPテイルのCD信号寄与を差し引いた後に得られた。
図18．バイオセンサーアッセイ。ABPテイルに融合された四つの異なる変種(No.16、21、22、24；図14）と野生型ＺドメインのBIA-coreTM分析から得られたセンサーグラムの重ね合わせプロット。それら各種タンパク質のIgG結合活性は、約5000RUヒトポリクローナルIgGで被覆されたセンサーチップを用いそして各種タンパク質の1500nM溶液を２μｌ／分で45μｌパルス注入して分析した。変種No.16、21、22および24を注入中の信号のプラトー値の相違は、駆動緩衝液中への希釈度が様々であることによる点に留意。
【００４１】
すべての試薬およびDNA構築物はスエーデン国ストックホルムの王立技術研究所、生化学・生命工学部（The department forBiochemistry and Biochemistry, Royal Institute
of Technology，Stockholm, Sweden）で入手可能である。
【００４２】
材料
オリゴヌクレオチド(図６)をスカンジナビアン・ジーン・シンセシス(Scandinavian Gene Synthesis)(スエーデン）から購入し、そして指示されている場合には〔Maniatis et al (1988) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press〕に従ってリン酸化した。ZLIB-1は5′−末端でビオチン化され、ダイナール(Dynal）Ａ／Ｓ(ノルウェイ)から購入した常磁性ビーズM-280ストレプトアビジンへの固定化が可能となる。洗浄／結合緩衝液は１Ｍ NaCｌ、10mM Tris-HCｌ、pH7.5、１mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸)とした。アニーリング／連結緩衝液は30mM Tris-HCｌ、pH7.5、10mM MgCｌ2、0.2mM ATP、１mM 1.4ジチオトレイトール(DTT)とした。DNAリガーゼはベーリンガー・マンハイム（BoehringerMannheim）（ドイツ）から入手した。10×PCR緩衝液は20mM MgCｌ2、２mM dNTP、100mM Tris-HCｌ、pH8.3、50mM KCｌ、１％Tween 20を含有した。Taq DNAポリメラーゼはシータス社（Cetus Inc.）（米国）から入手した。サーマルサイクラーはパーキン−エルマー(Perkin-Elmer）9600とした。温度／安定性スキャニングにはJ-720分光偏光計(JASCO、日本）を用いた。適格性（competence）を有するように調製された〔Maniatis et al (1988) Molecular cloning. Alaboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press〕大腸菌株RR1△M15〔Ruether, U. (1982) Nucl. Acids Res. 10: 5765-5772〕を形質転換用宿主として用いた。寒天プレートは100μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有した。
【実施例】
【００４３】
実施例１
酸性Ｚ−ライブラリーの構築
イオン交換クロマトグラフィーによって精製すべき組換えタンパク質のための融合相手を生産するために、合成58残基SPAアナローグＺ〔Nilsson et al, Prot. Eng〕を変異誘発アプローチにかけてpIが変化した新変種を構築した。SPAのＢ−ドメインとヒトFc１との複合体の結晶構造に基づいて〔Deisenhofer, J. et al 1981,Biochemistry 20: 2361-2370〕、結合に参加するＢ−ドメインからの５残基を変異誘発の標的として選択した。ヘリックス１および２に位置するＺ−残基No. ９、11、14、27および35に対応するこれら五つのコドンを、縮退オリゴヌクレオチドを用いて同時的に変えると、これらの位置におけるトリプレット配列G(C/A)(C/A）はアミノ酸であるアラニンのコドン（50％）、アスパラギン酸のコドン（25％）およびグルタミン酸のコドン（25％）をそれぞれ生じる。固相遺伝子組立て手法〔Stahl et al, Biotechniques 14: 424-434〕を用いて、合成IgG結合性Ｚ−ドメインの35(243)の酸性変種をコードする遺伝子のライブラリーを創製した（図５）。20μｌ（200μｇ）の常磁性ストレプトアビシン−被覆ビーズを洗浄／結合緩衝液で洗浄し、そして15pmoleのプレハイブリダイズされたZLIB-１（ビオチン化されている）およびZLIB-2と共に、洗浄／結合緩衝液の最終容量を40μｌとしてRTで15分間インキュベートした。連結および洗浄の後、各々約15pmoleのオリゴヌクレオチドACID-1（縮退）、LONGBRIDGEおよびACID-2（縮退）およびプレアニールされたリンカー対ZLIB-4／ZLIB-5を、Stahl et al〔Biotechniques 14: 424-434〕に従って洗浄段階をはさみながら、くり返し添加した。組立て完了後、様々な断片を37℃で15分間連結した。ビーズ上に依然として同定されているＺ(酸性）−ライブラリーをコードするDNA量を増幅するために、一部を抜出してPCRにかけた。そのPCR混合物(50μｌ）は各々１pmoleのPCRプライマーZLIB-3およびZLIB-5、各々５μｌの連結混合物、10×PCR緩衝液および10×CHASE、１単位のTaqポリメラーゼおよび全量を50μｌにするだけの滅菌水を含有した。温度循環プログラムは次のとおりとした：96℃、１分、60℃、１分および72℃、２分を35サイクル反復した。１％アガロースゲル電気泳動による分析は179bpという予測されたバンドを示し、前述の組立ての考え方が実施可能であることがわかる。Ｚ（酸性）−ライブラリーのPCRからの179bpバンドをゲルから切り出し、そして粗製(GenecleanTM、Bio 101、Inc. 米国)後に固相DNA配列決定〔Hultmanet al, 1988〕に適したプラスミドベクター（TA-cloningTMキット、Invitrogen, Inc. 米国)に挿入した。形質転換を行い、そしてアンピシリン含有寒天プレートに塗布した後得られた配列の分析のために二つのコロニーを選択した。その結果（図６）は、所望の位置に予測された縮退がみられることを示している。
【００４４】
実施例２
Ｚコンホメーションの温度安定性の測定
Ｚコンホメーションの温度安定性は、温度スキャンを通して円二色性(CD）分光法により222nmでの楕円率を追跡することによって測定した。この波長はＺのα−ヘリックス度の存在を監視するために用いられる〔Cedergren et al. 1993, Prot. Eng. 6: 441-448〕。分子を不安定化するためにどちらかというと低いpH(約2.9）で実験が行われた。何故なら、温度変性の中間点（Tm）は中性pHにあっては〜95℃であり（データは示していない）、これは正常大気圧下においてトランジションを通過する完全なスキャンにより測定できる範囲の外にあるからである。この実験は、Ｚドメインの（温度スキャンの変曲点により規定される)TmがpH2.9において71℃もの高さであることを示している（図８）。このことはＺ分子のα−ヘリックスの温度安定性が極めて高いことを実証している。
【００４５】
実験はJ-720分光偏光計（JASCO、日本）で行われ、そして温度は、NESLAB水浴からキュベットホルダーを通して水を循環することにより調節した。温度はキュベット中でマイクロセンサーデバイス(JASCO、日本)を通して監視した。緩衝液は50mM酢酸、pH2.9とした。タンパク質はドメインＺ〔Cedergren et al, 1993, Prot. Eng. 6:441-448〕を50μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で用い、そしてキュベットセル通路長は１ｃｍとした。実験における温度スキャン速度は50℃／時とした。
【００４６】
実施例３
酸性Ｚ−ライブラリー由来タンパク質の特性評価
酸性Ｚ−ライブラリーに由来する二つのタンパク質変種を大腸菌で発現させ、精製しそしてSDS-PAGE、円二色性およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて特性評価した。固相遺伝子組立てで得られたPCR生産物（実施例１参照）を、200μｌの緩衝液（33mM Tris−アセテート、pH7.9、10mM酢酸マグネシウム、66mM酢酸カリウム、0.5mM DTTおよび0.1ｍｇ／ｍｌ BSA）中で45Ｕ Esp3I(Labassco AB、スエーデン）および50Ｕ Nhe Ｉ（Pharmacia・スエーデン）を用いて制限した。この混合物に鉱油を重層しそして37℃で一夜インキュベートした。制限断片（約５μｇ）をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出に続いてクロロホルムを用いた付加的洗浄を行うことにより精製し、次いでエタノール沈殿させてからMlu I-Nhe I切断pKN１ベクター(１μｇ)(後記参照）に13.5Weiss単位のT4DNAリガーゼを用いて15℃で一夜連結させた。その連結混合物を70℃で20分間熱処理し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した後クロロホルムで洗浄し、エタノール沈殿させそして20μｌの滅菌水に再溶解した。
【００４７】
前記ファージミドベクターpKN１(図９）をいくつかの段階を踏んで次のようにして構築した。Ｚ−ドメインの不変残基44-58をコードする二本鎖リンカーをオリゴヌクレオチドZLIB-6およびZLIB-7から形成しそしてファージミドpKP 986（Dr. Lars Abrahmsen, Phar-macia Bioscience Center, スエーデンの好意による寄贈品）中のMlu I-Xho I断片としてクローン化し、その結果pKNを得た。プラスミドPkp 986は大腸菌OmpＡリーダーペプチド、それに続くfd繊維状ファージコートタンパク質３(Lowman et al. (1991) Biochomistry,30, 10832-10844)の残基249-406をlacプロモーターのコンロール下にコードしている。連鎖球菌プロテインＧに由来する一価血清アルブミン結合性領域をコードする遺伝子断片を、プライマーABP-1およびABP-2（それぞれXhoＩおよびSalＩ認識部位を含有）を用いてプラスミドpB2T(Eliasson et al, Molecular Immunol., 28, 1055-1061)からPCRにより増幅し、そしてXho制限プラスミドpKNにクローン化し、pKN１を得た。従ってそのファージミドベクターは、OmpＡシグナルペプチド、野生型Ｚドメインの第三ヘリックス、それに続くfdファージタンパク質IIIの残基249-406に連結された46残基アルブミン結合性タンパク質(ABP）をコードしており、またＺドメインの斑入りヘリックス１および２をコードするEsp 3I／NheＩ−消化PCR生産物の挿入に適合している。
【００４８】
凍結応答性の大腸菌RR1△M15(supE44 lacY1 lacZ ara-14 galK2xyl-5 mil 1 leuB6 proA2△(mrcC-mrr)recA+ rpsL20 thi-1 lambda-F〔lac/q lacZ△M15〕)(Ruether, (1982) Nucleic Acids Research, 10,5766-5772）細胞をManiatisおよび共同研究者（Maniatis et al,(1982) Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)に従って連結混合物で形質転換し、そして100μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma、米国）および１％グルコースを含む寒天プートに塗布した。無作為に採取したコロニーからの少量の細胞を、20mM TAPS(pH9.3)、２mM MgCｌ2、50mM KCｌ、0.1％ Tween 20、0.02mMデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート(dNTP）および1.0ＵのTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer）中の５pmoleのプライマーRIT-27およびNOKA-2（ビオチン化されている）を用いて、Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer、米国）での２−段階PCR増幅（30サイクル：96℃、15秒間；72℃２分間）に別々に付した。PCR生産物の固相DNA配列決定は、ロボットワークステーション（BiomekTM 1000，Beckman Instruments,Fullerton, CA）とのFITC標識配列決定用プライマー NOKA-3（固定化らせん用）およびABP-2（溶出らせん用）およびAutomated Laser Fluoreseent（A.L.F.）DNA SequencerTM (Pharmacia Biotech, スエーデン）を用いてHultmanおよび共同研究者（Hultman et al.,(1989) Nucleic acids Research, 17, 4937-4946）の記載の如く行った。
【００４９】
表１のようにＺ−ドメインの９、11、14、27および35位に様々なコードされた酸性アミノ酸置換を有する二つのクローンを更なる分析のために選抜した。野生型Ｚドメインと二つの異なる酸性Ｚ−変種タンパク質(クローンNo.10および12）をそれぞれのファージミドベクターから血清アルブミン結合性テイル(ABP）への融合体として発現させそしてヒト血清アルブミン−アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００５０】
【表１】
2005263810.tif 000002
【００５１】
対応するファージミドベクターを取込んだ大腸菌RR1△M15細胞を用いてアンピシリン（100μｇ／ｍｌ）を補った100ｍｌのTryptic Soy Broth(Difco）に接種した。それら培養物を37℃でOD600nm＝１となるまで増殖させた後、最終濃度１mMのIPTGで誘導しそして30℃で一夜インキュベートした。約5000ｇで10分間の遠心分離により細胞収集しそしてペリプラズム内タンパク質を浸透圧ショック法により遊離させた。細菌からのペリプラズム成分をNygrenおよび共同研究者(Nygren et al., (1988) J. Mol. Recognit., 1, 69-74）の記載するところに従ってアフィニティークロマトグラフィーにかけ、そして均質12％スラブゲル(BioRad Inc., 米国)でのSDS／PAGE（その染色はCoomassie Brilliant Blue R-250を用いて行った）により分析した。すべてのタンパク質について、1.5〜2.5ｍｇ／ｌ培養液を回収することができたが、このことは変種および野生型ドメインについて産生および分泌効率が同様であることを示している。更に、精製タンパク質のSDS-PAFE分析（図10）結果は分析された維持Ｚ変種が大腸菌内で安定的発現されることを示唆している。
【００５２】
表面変異誘発後に誘導体の二次構造成分が保存されているかどうかを調べるために、差し引き円二色性分析を行った。IgG−またはHSA−アフィニティークロマトグラフィー精製タンパク質Ｚ、Z-ABP、ABPテイルに融合された酸性誘導体No.10および12およびABP−テイルそれ自体を、J-720分光偏光計装置（JASCO、日本）を用いて室温で250〜184nm（遠紫外）円二色性分析にかけた。スキャン速度は10nm／分とした。セル通路長は１mmとした。各種タンパク質の溶液（約0.1ｍｇ／ｍｌ）を0.05％Tween 20（Kebo AB、スエーデン）を補った20mMリン酸緩衝液pH6.5中で調製した。正確なタンパク質濃度はSystem Goldデータ処理システムを備えた。Beckman 6300アミノ酸分析機でのアミノ酸分析により測定した。誘導体のCD信号は、タンパク質濃度差を調整し次いでアミノ酸含量について規格化した後、ABPテイルについて得られる信号を差し引くことによって得られた。
【００５３】
ABP−テイルに融合した野生型Ｚドメインおよび酸性変種について250〜184nmより得られる信号の比較をそのABP−テイルそれ自体よりの寄与を差し引いた後に行った。この結果は、それら二つの酸性Ｚ−誘導体について、208nmに特徴的極小値および222nmに変曲点(Johnson、1990）を持つ野生型Ｚドメインと同様のスペクトルが得られたことを示している（図11）。このことは三ヘリックス束の枠組がこれらの変異体においても保存されていることを示唆している。
【００５４】
前記の二つのＺ−変種、No.10および12は天然Ｚ−ドメインと比較するとそれぞれ四つおよび三つの導入酸性アミノ酸を含有している。その導入された酸性が等電点の差に反映されているかどうかを調べるためにそれらを陰イオン交換カラムからの勾配溶出に付した。(すべてABP融合タンパク質として生産された）タンパク質Ｚ（野生型）および酸性変種No.10および12を各々（５μｇずつ）300μｌの20mM Piperazine緩衝液（pH5.5）に溶解しそして別々にMonoQ、PC1.6／５カラム（Phamacia、スエーデン）に100μｌ／分でかけた。タンパク質の溶出は20分間で０〜50％NaCｌという範囲に及ぶPiperazine緩衝液（pH5.5）（Sigma、米国）中のNaCｌ勾配をかけることによって行った。この分析からの結果（図12）は、それら二つの酸性Ｚ−変種タンパク質が異なるNaCｌ濃度で溶出され、等電点の明らかな相違を示唆しているを示している。これに対し、実験中に選択されたpHでは、野生型Ｚ−ドメインは前記樹脂と相互作用せず、従ってフロースルー中に見られた。
【００５５】
すなわち、前記二つの酸性Ｚ−変種タンパク質について行われた一連の実験は、それら変種の発現挙動、タンパク分解安定性および二次構造成分が天然Ｚ−ドメインと比較した場合に変化しなかったことを示している。更に、それら二つのＺ−変種には表面所在位置を酸性アミノ酸で置換することにより新しい機能が導入された。それら二つの酸性変種は、例えば、低pHでのイオン交換クロマトグラィーによる組換えタンパク質の精製を容易にするために融合相手として用いることができる。すなわち、酸性Ｚ−ライブラリーのメンバーの中から新しい機能を持つ変種を単離できることが示される。
【００５６】
実施例４
Ｚ−変種の組合せライブラリーの構築および特性評価
固相遺伝子組立て手法を用いてＺ−変種のライブラリーを構築した（実施例１参照）。Fcへの結合に参加するものと示唆されている(Deisenhofer, (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370）アミノ酸残基の大部分は分子表面にある（Q9、Q10、N11、F13、Y14、L17、N28、Q32およびK35）ことが認められ、従って変異誘導に含まれる。加えて、それらの表面局在に基づき、他の残基（H18、E24、E25およびR27)も含まれるものと決定された。このように全部でＺ骨格中の13残基が同等的かつ無作為変異誘発に選択された。Ｚと記される58−残基一価IgG−結合性ドメインの表面変異体のライブラリーを構築するために一組のオリゴヌクレオチド（図６）を合成した。このライブラリーにおいて、Ｚ−ドメインの第一α−ヘリックスに位置するQ9、Q10、N11、F13、Y14、L17およびH18のコドンと第二α−ヘリックスにあるE24、E25、R27、N28、Q32およびK35のコドン（図13）を、構築用の一本鎖縮退オリゴヌクレオチドを用いた固相法により縮退NNK（Ｋ＝ＧまたはＴ）コドンで置換した。選択されたNNK縮退はTAG(アンバー）停止信号を含む全20個のアミノ酸をカバーする32コドンを含む。
【００５７】
遺伝子組立て中の固体支持体として用いられるストレプトアビジン−被覆常磁性ビーズへの強いアンカリングを可能にする5′ビオチン基を有するオリゴヌクレオチドZLIB-1を合成した。このZLIB-1オリゴヌクレオチドはその相補配列（ZLIB-2）と共に、Ｚ−ドメインの残基１−８、およびそれに先行するＺ変種の大腸菌分泌を容易にするために含められたプロティンＡの領域Ｅの最初の６残基（Abrahmsen et al., (1986) EMBO J., 4, 3901-3906）をコードしている。オリゴヌクレオチドDEGEN-1およびDEGEN-2（図６）は、通常Fc−結合に関与するＺドメインの二つの変異ヘリックスをコードする。理論的には、前記の13個の選定位置で完全かつ同時にNNK縮退があれば、3.7・1019の異なるDNA配列によりコードされた約8・1016タンパク質変種の組合せライブラリーが得られることになる。しかし、ここではライブラリー構築は約15pmoleのプレハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドZLIB-1およびZLIB-2（図６）の固定化から開始されており、そのためにＺ−ライブラリーの理論的サイズは、約2・1010Ｚ変種をコードする約0.9・1013の各種DNA配列に制限される。この組立てに続いて、架橋オリゴヌクレオチドBRIDGE（図６）により容易化された等モル量のオリゴヌクレオチドDEGEN-1およびDEGEN-2の連結により得られる前形成構築物の添加および連結を行った。
【００５８】
この組立てを完了させるために、プレハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドZLIB-4およびZLIB-5より成る断片を連結目的でビーズに添加した。この断片はＺドメインの第２ループと不変第三ヘリックスの最初の６残基をコードする。組立て完了後、それぞれエン
ドヌクレアーゼEsp 3およびNhe Iの認識配列を含むヌクレオチドZLIB-3およびZLIB-5をビーズ−固定化ssDNAの10分の１を鋳型(理論的に2・109タンパク質変種に相当する)として用いた組立て構築物のPCR増幅のためのプライマーとして用いた。増幅中の望ましくない干渉を避けるために、オリゴヌクレオチドZLIB-2、BRIDGEおよびZLIB-5をアルカリでまず溶出させた。得られたPCR生成物をアガロースゲル電気泳動により分析したところ均質でありかつ予測された179bpサイズであることが判明した。
【００５９】
そのPCR生産物を、ファージミド形質転換大腸菌細胞のヘルパーファージ重感染でファージ粒子上に表面ディスプレイされるために、fdファージコートタンパク質３遺伝子の端部切除体とフレームを合わせて野生型Ｚドメインの残基44-58の遺伝子を含有するpKN１ファージミドベクター中にサブクローン化した(Lowman et al., (1991)Biochemistry, 30, 10832-10844)（図９）。更に、そのファージミドベクターは連鎖球菌プロテインＧ（Nygren et al., (1988) J.Mol. Recognit., 1, 69-74；Nilsson et al., (1994) Eur. J.Biochem., 224, 103-108）に由来する５kDa(46aa）血清アルブミン結合性領域(ABPと記す）をコードするフレームを合わせて介在させたカセットを含有するが、これは天然Fc−結合性を欠く生成Ｚ変種の効率的アフィニティー精製を可能にする。更にまた、その血清アルブミン結合活性は潜在的に、新しい結合機能を有するＺ変種を求めてパンニングする前に組換え分子を有するファージ粒子を予め選抜して非特異的に結合した非組換ファージ粒子に由来するバックグラウンドを減少させるために用いることができる。
【００６０】
形質転換後、25クローンを（オリゴヌクレオチドRIT-27およびNOKA-2を用いて)PCRスクリーニングをしたところ、それらクローンの95％以上（24／25）が予測長を有する挿入物を含有することが示されたが、このことは前記遺伝子組立て手順が高効率で行われたことを示唆している。そのライブラリーの品質と不均質性を更に分析するために、45個の形質転換体を無作為に選択しそして直接固相DNA配列決定(実施例３参照）にかけた。それらクローンの約69％が正しいものであり、予測された位置に野生型および縮退コドンを含有した。残りのクローンには偽りの不一致を有したが、これは部分的にはPCR中に導入されたエラーまたはオリゴヌクレオチド合成によるものとすることができる。それら正確なクローン(31クローン)（図14）を13個の縮退位置におけるコドン表現について更に分析した。NKK縮退プロフィールに含まれる32コドンから得られる全部で403個の推定アミノ酸の分布は、これら未だ選抜されていないクローンについての予測された頻度と密接な相関を示している（図15）。Ｚ−変種の発現および安定性を調べるために、様々な置換度を有する四つのクローン(No.16、21、22、24；図14）および野生型ＺドメインをそれぞれのファージミドベクターからコードされたABP融合体として生産した。IPTG−誘導培養物のペリプラズムからの可溶性タンパク質を一般的および効率的回収のためにABP−テイルを用いたHSA−アフィニティークロマトグラフィーにかけた（Nygren etal.，(1988) J. Mol. Recognit., 1, 69-74)。すべてのタンパク質について約1.5〜2.5ｍｇ／ｌ培養液を回収できたが、このことは前記変種および野生型ドメインについて同様の生産および分泌効率であることを示している。精製タンパク質のSDS-PAGE分析結果（図16）は分析された四つのＺ変種が大腸菌内で安定的に発現されることを示している。異なる強度をもってみられるHSA−結合活性を有するより小さなバンドは、Ｚ変種とABP−テイルとの間のタンパク質分解的切断から得られるABP−テイルそれ自体（５kDa）に相当する確率が極めて高い。興味深いことに、導入システイン残基を有するいずれのＺ−変種(No.16および22）もダイマーを形成したが、これはSDS−PAGE中に非還元性条件下で認められた(図16；レーン６および７)。
【００６１】
広範な表面変異誘導後に誘導体の二次構造成分が保存されているかどうかを調べるために差し引き円二色性分析を行った（実施例３参照)。ABP−テイルに融合させた野生型Ｚドメインおよび四つの変種についての250〜184nmより得られた信号の比較をABP−テイルそれ自体からの寄与を差し引いた後行った。その結果は、四つのうち三つの誘導体について
、208nmに特徴的極小値および222nmに変曲点を有する野生型Ｚドメインに類似したスペクトルが得られたことを示した（Johnson, (1990) Prot. Struct. Funct. Genet., 7, 205-224）(図17）。このことは三ヘリックス束枠組がこれらの変異体中でおそらく保存されていることを示唆している。しかしながら第四の誘導体(No.24）についてはランダムコイルに見られるスペクトルに類似するスペクトルが得られたが、このことは二次構造要素の含量が低いことを示唆している(Johnson, 1990）。この誘導体はヘリックス２の32位においてグルタミンからプロリンへの置換を含んでおり、脱安定化が生じてヘリックス束枠組の崩壊を招いたことが示唆される。
【００６２】
前記の四つのＺ−変種を更に調べるために、ABP−テイルに融合された野生型Ｚおよび四つの異なるＺ変種クローン(No.16、21、22、24；図14）についてのポリクローナルヒトIgG（hIgG）(Pharmacia AB)との相互作用をバイオセンサー技術（BIAcoreTM, PharmaciaBiosensor AB, スエーデン）を用いて比較した。CM-5センサーチップのカルボキシ化デキストラン層を製造元の推めるところに従ってＮ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS）およびＮ−エチル−N′−〔３−ジエチルアミノプロピル〕−カルボジイミド(EDC）化学を用いて活性化した。hIgGを固定化するために、50mMアセテート中の500nM hIgG溶液20μｌを活性化表面上に５μｌ／分の流速で注入した結果約5000共鳴単位（RU）が固定化された。NaCｌ／Hepes（10mM Hepes、pH7.4、150mM NaCｌ、3.4mM FDTA、0.5％界面活性剤P-20)中1500nMの近似濃度となるように溶解した前記五つの融合タンパク質の45μｌ検体を別々の実験として２μｌ／分の流速で注入した。各検体注入後、hIgG表面を20mM HCｌで再生させた。予測されたとおり、野生型Ｚ−ドメインだけがなにがしかの検出可能なFc−結合活性を示した（図18）。
【００６３】
結論として、それらの結果は、α−ヘリックスに位置する13残基で構成される置換表面を有するSPA変種のライブラリーを構築できることを示している。天然Ｚ−ドメインの全体的枠組が高度に保存されるということは、安定性ある可溶性骨格にグラフトされた新機能を有する誘導体を、生化学、免疫学およびバイオテクノロジーにおいて人工抗体として用いるために単離し得たことを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ａはシグナルペプチド(S)、五つのIgG結合性領域〔E-D-A-B-C〕、次いで細胞壁アンカリング領域〔X-M〕を示すぶどう球菌プロテインＡの概略図であり、ＢはＸ線結晶学的方法によって決定されたSPAからのドメインＢとヒトFc１との複合体のコンピューターグラフィック図である。本図にはSPAの第三ヘリックスが見られない点に留意。
【図２】Ａはシグナルペプチド(Ss)、領域Ｅ(E)、反復性血清アルブミン結合性Ａ−Ｂ領域、スペーサー領域(S)、次いでＤ領域により隔てられたIgG結合性ドメインC1〜C3、そして最後に細胞壁アンカリング領域Ｗ−Ｍを示す、Ｇ148株からの連鎖球菌プロテインＧの概略図であり、ＢはＸ線結晶学的方法により決定された、SPGのドメインC１とヒトFc１との複合体のコンピューターグラフィック図である。
【図３】58残基SPAアナローグＺの三ヘリックス束構造の概略図である。ヘリックス−ヘリックス詰込みを安定化させるＦ30を除いてFcへの結合に関与するとされている側鎖の一部が示されている。
【図４】各種亜断片であるFab、Fd、Fcおよび、短い(約15aaの）リンカーにより接続されたVHとVLとで構成されるscFvを示す、IgG抗体構造である。
【図５】ＡはＺ遺伝子ライブラリーの作成に用いられる遺伝子組立て手法の一般的考え方であり、酸性Ｚ誘導体のライブラリーを構築するには、縮退オリゴヌクレオチドであるACID-1、ACID-2を用いて残基９、11、14、32および35だけを変え、組立て後のライブラリーの増幅に用いられるPCRプライマーはZLIB-3（PCRプライマー5′）およびZLIB-5（PCRプライマー3′）としてあり、ＢではＺ−ドメインの58残基のうち46個をコードする組立て後のライブラリーを増幅して得られるPCR生産物は、Ｚの残りのＣ−末端部を取り込んだファージミドDNA中にクローン化することができ、この遺伝子はＭ13ファミリーの大腸菌バクテリオファージのプロテインIII遺伝子とフレームをあわせて融合され、これによって酸性Ｚ変種のレパートリーをファージ表面にディスプレイすることができる。
【図６】Ｚライブラリーの構築に用いられるオリゴヌクレオチドである。実施例２に記載の酸性Ｚ−変種のライブラリーにはオリゴヌクレオチドZLIB-1、2、3、4、5、LONGBRIDGE、ACID-1およびACID-2だけを用いた。
【図７】酸性Ｚタンパク質ライブラリーに由来するクローンのDNA配列である。肉太数字はＺ−ドメインにおけるアミノ酸位置を示している。明確にするために、制限部位AccＩおよびNhe１の位置が示されている。
【図８】pH2.9における一つのＺドメインの温度安定性の分析結果である。検体中のα−ヘリックス含量は、温度スキャン中、s222nmにおいて楕円率を測定することにより監視した。
【図９】ファージミドベクターpKN１である。斑入り(variegated）ヘリックス１および２をコードするライブラリーPCR生産物(酸性および広範(extensive）ライブラリーの両方）を、野生型Ｚドメインの残基44−58（本質的にヘリックス３）の遺伝子とその後に続く、Ｍ13ファージコートタンパク質３遺伝子の端部切除体とフレームをあわせて連結されたぶどう球菌プロテインＧに由来する46残基血清アルブミン結合性領域（ABP）の遺伝子にサブクローン化した。このファージミドはプラスミドpBR322に由来する複製開始点およびファージ粒子への詰込みに必要な遺伝子間領域（fl ori）を含有する。
【図１０】SDS-PAGEである。それぞれのファージミドベクターからコードされたABP融合タンパク質として野生型Ｚドメインおよび二つの異なる酸性Ｚ−変種を産生する大腸菌細胞のペリプラズムから得られたHSA−アフィニティー精製タンパク質をSDS／PAGEにより分析した。Ｍ、分子量マーカー；レーン１、野生型Ｚドメイン；レーン２、クローン10；レーン３、クローン12。
【図１１】CD−データである。Ｚ−タンパク質ライブラリーの野生型Ｚドメインと二つの変種について得られたCDスペクトルの重ね合わせプロット。タンパク質の信号は、分析中に共存するABPテイルのCD信号寄与を差し引いた後に得られた。
【図１２】イオン交換クロマトグラフィーである。二つの酸性Ｚ−変種タンパク質No.10およびNo.12、および野生型Ｚ−ドメイン(ABP融合タンパク質として生産）を各々陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを用い、pH5.5で分析にかけた。カラムからのタンパク質溶出はNaCｌ勾配によって得た。上位：酸性Ｚ変種No.12；中位、酸性Ｚ変種No.10；下位、Ｚ（野生型)。野生型Ｚ−タンパク質はこのpHにおいてカラムで遅延しなかった点に留意。
【図１３】Ｚ−ドメイン構造である。天然Ｚ−ドメイン構造モデルの主鎖トレース図。ヘリックス１および２の構造はSPAのドメインＢとFcとの間の共結晶構造からのものである（Deisenhofer,(1981) Biochemistry, 20, 2361-2370）。第三ヘリックスはNMR分光法からの二次的構造帰属に基づいて作成された（Gouda et al., (1992) Biochemistry, 31, 9665-9672）。組合せライブラリー（combinatorial library）構築の際に変異された残基の側鎖の非水素原子が玉−棒モデルとして表示されている。このディスプレイはプログラムMOLSCRIPTによって作成された（Kraulis (1991) J. Appl. Cryst., 24, 946-950）。
【図１４】アミノ酸配列である。ライブラリーから無作為抽出された31個のＺ−変種のDNA配列決定結果。変異誘発を受けた残基は枠で囲んである。水平線は最上位に掲げた野生型Ｚ配列と同じヌクレオチドであることを示している。示されているのはABP−テイルへの融合タンパク質として発現され特性評価されたクローンである。
【図１５】アミノ酸分布である。変異位置における推定アミノ酸の統計的解析結果。全部で、31クローンからの13残基(403コドン）を計算に含めた。20個すべてのアミノ酸のほか、NNG／Ｔ縮退プロフィールに含められた単なる停止信号(TAG）についても実測頻度と予測頻度の割合が示されている。
【図１６】SDS−PAGE分析である。それぞれのファージミドベクターからコードされたABP融合タンパク質として野生型Ｚドメインと四つの異なるＺ−変種を産生する大腸菌細胞のペリプラズムから得られたHSA−アフィニティー精製タンパク質をSDS／PAGEにより分析した。レーン１−５：還元条件。レーン６および７：非還元条件。レーン１、野生型Ｚドメイン；レーン２、クローン16、レーン３、クローン21；レーン４、クローン22；レーン５、クローン24；Ｍ、分子量マーカー；レーン６、クローン16およびレーン７、クローン22。
【図１７】CD−データである。α−ヘリックスタンパク質表面ライブラリーの野生型Ｚドメインと四つの変種について得られたCDスペクトルの重ね合わせプロット。それら変種の信号は分析中に共存するABPテイルのCD信号寄与を差し引いた後に得られた。
【図１８】バイオセンサーアッセイである。ABPテイルに融合された四つの異なる変種(No.16、21、22、24；図14）と野生型ＺドメインのBIA-coreTM分析から得られたセンサーグラムの重ね合わせプロット。それら各種タンパク質のIgG結合活性は、約5000RUヒトポリクローナルIgGで被覆されたセンサーチップを用いそして各種タンパク質の1500nM溶液を２μｌ／分で45μｌパルス注入して分析した。変種No.16、21、22および24を注入中の信号のプラトー値の相違は、駆動緩衝液中への希釈度が様々であることによる点に留意。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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