(57)【要約】      （修正有）【課題】ｍＲＮＡ合成用の汎用性のあるプラスミドの構築と、ｍＲＮＡの合成及び精製手段を提供する。【解決手段】タンパク質翻訳鋳型分子であるｍＲＮＡの５'末端に特定配列を有する配列、３'末端に少なくとも非翻訳配列を有する配列構造を導入することにより、翻訳効率の高いｍＲＮＡを構築し、本ｍＲＮＡを転写せしめるための鋳型ＤＮＡを含む汎用性のあるプラスミドを構築し、高い翻訳鋳型活性を有する本ｍＲＮＡの合成方法、精製方法、およびこれらを用いた実用的な無細胞タンパク質合成手段として連続式ＲＮＡ合成手段とコムギ胚芽抽出物を利用した連続式無細胞タンパク質合成手段を組み合わせた転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成を構築し、また無細胞タンパク質合成手段を利用した複数のタンパク質を共発現せしめる方法。【選択図】図９
2005247857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程、
（ａ）ｍＲＮＡを、分子篩可能な担体を担持した反応槽において合成し、
（ｂ）該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製の後に捕集し、
（ｃ）タンパク質合成を、該合成され捕集されたｍＲＮＡを含む反応槽において透析条件下で行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２】
以下の工程、
（ａ）ｍＲＮＡを、分子篩可能な担体を担持した反応槽において合成し、
（ｂ）該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製の後に捕集し、
（ｃ）ｍＲＮＡを含む反応槽の反応液温度をタンパク質合成に適当な温度に変化させ、
（ｄ）タンパク質合成を、該合成され捕集されたｍＲＮＡを含む反応槽において透析条件下で行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
以下の工程、
（１）透析膜を担持した反応槽を用い、ｍＲＮＡを透析膜内で合成し、
（２）反応液温度をタンパク質合成反応（翻訳反応）に適当な温度に変化させ、
（３）透析膜内の溶液組成がタンパク質合成用溶液組成に透析により変換されることにより、透析条件下でタンパク質合成を行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
以下の工程、
（１）透析膜内に転写反応液と翻訳反応液の混液を加えた、透析膜を担持した反応槽を用い、透析外液にタンパク質合成反応用溶液を満たし、ｍＲＮＡを透析膜内で合成し、
（２）反応液温度をタンパク質合成反応（翻訳反応）に適当な温度に変化させ、
（３）透析膜内の溶液組成がタンパク質合成用溶液組成に透析により変換されることにより、透析条件下でタンパク質合成を行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
【請求項５】
請求の範囲第１―４項のいずれか１項に記載の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を利用することを特徴とする遺伝子多型と遺伝子機能の関係を検定する方法。
【請求項６】
請求の範囲第１―４項のいずれか１項に記載の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を利用することを特徴とする遺伝子機能のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞や組織から調製した抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系を実用技術に発展させることを目的とした、効率の高い汎用性のある翻訳鋳型分子の設計、ＲＮＡ合成用の汎用性のあるプラスミドの構築、ＲＮＡの合成手段、ＲＮＡの無細胞タンパク質合成系への供給手段、およびこれらの技術を組合せた転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の開発や農業での品種改良などの分野では、多くのタンパク質の生体内での機能を明らかにすることが重要な課題である。特にゲノム計画の完了を間近に控え、解明すべき課題が遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へと急速に展開してきている。遺伝子機能解析の一つの方法として、遺伝子がコードしているタンパク質を作製し、該タンパク質の機能を解析する方法がある。
【０００３】
細胞のタンパク質合成は、ＤＮＡに保存された遺伝情報が先ず翻訳鋳型分子であるｍＲＮＡに転写され、リボソームなどの一群の因子からなる翻訳装置によって、このｍＲＮＡの塩基配列に記載された情報に従ってアミノ酸が結合され、遺伝情報の翻訳産物としてのタンパク質が合成される過程からなる。
【０００４】
遺伝子がコードしているタンパク質を得るために、細胞内で効率良く進行するタンパク質合成反応を生体外で行わせる方法として、例えば細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソームなどを生物体から抽出し、この抽出液に翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、およびその他の有効因子を加えて試験管内でタンパク質を合成する無細胞タンパク質合成法の研究が盛んに行われている（特開平６−９８７９０号公報、特開平６−２２５７８３号公報、特開平７−１９４号公報、特開平９−２９１号公報、特開平７−１４７９９２号公報）。この無細胞タンパク質合成のための反応系、すなわち無細胞タンパク質合成系に用いるタンパク質合成用の、細胞または生体組織の抽出液の調製には、大腸菌、コムギ胚芽、家兎網状赤血球などが用いられてきた。
【０００５】
無細胞タンパク質合成系は、ペプチド合成速度と翻訳反応の正確性においては生細胞に匹敵する性能を保持することから、複雑な化学反応工程や煩雑な細胞培養工程を必要としないため、その実用的なシステムの開発がなされてきた。しかしながら、一般的に生物体の細胞から抽出した細胞抽出液のタンパク質合成能はきわめて不安定であることから、タンパク質合成効率が低く、さらに保存による細胞抽出液の品質低下も著しかったため、無細胞タンパク質合成系で得られる合成産物量は放射性同位体標識などによって検出できる程度の低いレベルでしかなく、実用的なタンパク質の生産手段としては利用できなかった。
【０００６】
本発明者らは先に、従来の無細胞タンパク質合成系の欠点を解決する方法、すなわち、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物製剤および無細胞タンパク質合成手段（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８）を提供した。
【０００７】
しかし、さらにタンパク質合成を効率良く行うためには、上記発明に加えて、翻訳鋳型であるｍＲＮＡの翻訳効率を上げることが重要である。従来の高翻訳効率を有するｍＲＮＡの合成には、７ｍＧｐｐｐＧなどのＣＡＰ構造と呼ばれる特殊な構造体をその５'末端に結合させることが必要であった。しかし、このＣＡＰ分子はそれ自体がタンパク質合成開始反応の強力な阻害活性をもつことから、ｍＲＮＡ合成後には残余分子をｍＲＮＡ画分から完全に除去することが必須であった。また、５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡ量を高濃度にするとタンパク質合成反応が阻害されるために、その濃度を低く抑えねばならず、タンパク質合成の効率も低かった。さらに、ＣＡＰ分子は高価でもあることから、無細胞タンパク質合成手段の実用化には、これらが解決しなければならない問題点として残されていた。
【０００８】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成は、一般的に、基質となる４種類のリボヌクレオシド−５'−３リン酸、ＲＮＡポリメラーゼ、スペルミジン、マグネシウムイオンや適当な緩衝液の存在下に試験管などの閉じた反応系（閉鎖系）で行う。さらに、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの単離および精製には、合成反応液をフェノール処理によって脱タンパク質した後にエタノール沈殿やゲルろ過カラムを用いて、残余リボヌクレオシドや合成反応の副生成物であるピロリン酸（さらに強力な翻訳阻害作用を持つＣＡＰ分子）などをＲＮＡ画分から排除する必要があった。当然ながらこれらの合成および精製過程はＲＮＡ分解酵素非存在下で行われなければならず、この過程は充分な操作経験を必要とし、しかも煩雑であった。また、従来法の閉鎖系におけるＲＮＡ合成反応は、合成反応の進行に伴って、基質濃度が低下し、同時に副生成物であるピロリン酸が蓄積することによって、ＲＮＡ合成反応は比較的すみやかに化学平衡に至り停止することから、ＲＮＡの合成収量は原理的に低かった。このような合成方法では、例えば、反応は約２時間程度で停止し、得られるＲＮＡ量は反応容量１ｍｌ当り約３００μｇ程度であり、非効率的であった。
【０００９】
一方、タンパク質合成の効率化を図るため、転写によるｍＲＮＡ合成と翻訳によるタンパク質合成とを共役させ、同一の系で同時に転写と翻訳とを行わせる転写・翻訳共役無細胞タンパク質合成系が、原核生物である大腸菌の細胞抽出液（Ｓ−３０）を用いた無細胞タンパク質合成系で初めて報告され（Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，（１９７３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，７，２６７−２８７）、その後、真核生物の細胞抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系においても報告され（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７２，１９２２−１９２６、Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８２，１９９−２０９、米国特許第５６６５５６３号、同第５４９２８１７号、同第５３２４６３７号）、商品化もなされている。しかし、転写反応および翻訳反応における、至適イオン濃度や、ＲＮＡ合成の基質であるリボヌクレオシド−５'−３リン酸、特に翻訳のエネルギーとなるアデノシン−５'−３リン酸（ＡＴＰ）とグアノシン−５'−３リン酸（ＧＴＰ）の至適濃度が大きく異なることから、従来の転写・翻訳共役系におけるタンパク質合成効率はきわめて低かった。さらに、このような真核生物の細胞を用いる系では、ＣＡＰ分子それ自体が強力な翻訳阻害作用を持つため、５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡの合成と共役する高効率な翻訳系を構築することは原理的に不可能であった。
【００１０】
また、タンパク質は細胞内において単独で機能しているわけではなく、多種多様なタンパク質、核酸、低分子種、および／または細胞膜成分との相互作用により機能を発揮する。この相互作用を明らかにすることも医薬品開発などの分野では重要な課題である。遺伝子、または遺伝子群の機能を調べる方法としては、培養細胞および生物個体の遺伝子破壊法や、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｆｉｅｌｄ，Ｓ．，（１９９３）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５，１１６−１２４）が知られている。しかしながら、培養細胞および生物個体の遺伝子破壊法は、細胞や個体の生育を観察することにより細胞内で起きている反応を間接的に調べることしかできないという限界をもつ。また、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法は複数のタンパク質を同時に共発現でき、タンパク質間相互作用を解析する上で利用されているが、これも探索的実験手段であって、操作が煩雑で時間がかかる上に、得られる結果はこれもまた間接的なものであった。他方、従来の生細胞を用いる遺伝子工学的手法では２種類程度のタンパク質を共発現させることは可能であるが、多数のタンパク質を効率よく共発現させる技術は開発されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、高効率で且つ汎用性のある翻訳鋳型分子ｍＲＮＡの設計であり、これを簡便に調製せしめるｍＲＮＡ合成用の汎用性のあるプラスミドの構築と、ｍＲＮＡの合成および精製手段を提供することである。
また、本発明の別の課題の一つは、無細胞タンパク質合成系へのｍＲＮＡの効率的供給手段を提供することである。
本発明の別の課題は、上記の要素技術を総合した転写・翻訳非共役連続式高効率無細胞タンパク質合成手段の提供に関するものである。
また、本発明の別の課題は、無細胞タンパク質合成系において複数のタンパク質を共発現させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、汎用性がある高効率の実用的無細胞タンパク質合成手段を開発すべく検討を行った結果、その手段の一つとして、タンパク質翻訳鋳型分子であるｍＲＮＡの５'末端にタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列を有する塩基配列、アルファルファウイルス（ＡＭＶ）のリーダー配列を有する塩基配列、またはこれらから改変して得た３種類の短い塩基配列（配列表の配列番号１、配列番号２、および配列番号３）、さらに３'末端に少なくとも非翻訳配列を有する配列構造を導入することにより、翻訳効率の高いｍＲＮＡを構築し、該構築したｍＲＮＡの転写用鋳型ＤＮＡを含む汎用プラスミドを構築し、高翻訳鋳型活性を有する該構築したｍＲＮＡの合成方法、精製方法、およびこれらを用いた実用的な無細胞タンパク質合成手段としてｍＲＮＡ合成とコムギ胚芽抽出物を利用した連続式無細胞タンパク質合成との転写・翻訳非共役連続式システムを提供することにより、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、
「１．  無細胞タンパク質合成手段に用いうる翻訳鋳型分子の改変手段であって、該翻訳鋳型分子の５'末端の構造に、以下から選ばれる少なくとも１つの塩基配列、
１）アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列を有する塩基配列、
２）タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列を有する塩基配列、
３）アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列と７０％以上の相同性を有し、且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、
４）タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列と７０％以上の相同性を有し、且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、
５）配列表の配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列、
６）配列表の配列番号１〜３に記載の塩基配列から選ばれる配列と７０％以上の相同性を有し、且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、
を導入し、さらに３'末端の構造に、少なくとも非翻訳配列を導入することを含む、翻訳鋳型分子の改変手段。
２．  ５'末端に既知の翻訳開始活性を有する塩基配列を導入することを組合せてなる前記１の翻訳鋳型分子の改変手段。
３．  （１）プロモーター機能を担持した塩基配列と、（２）その下流にあたる領域に少なくともアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列もしくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列と７０％以上の相同性を有し且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、配列表の配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３に記載の塩基配列、または、配列表の配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３に記載の塩基配列と７０％以上の相同性を有し且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、の転写鋳型となる塩基配列と、（３）その下流にあたる領域に複数の制限酵素切断部位と、（４）ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）の終止コドンの下流にあたる領域に少なくとも３'末端非翻訳配列と、が配置された無細胞タンパク質合成手段に用いる翻訳鋳型分子の製造に利用するプラスミド。
４．  プラスミド本体の大きさが３Ｋｂ以上である、前記３のプラスミド。
５．  プラスミドが環状型である、前記３または４のプラスミド。
６．  前記５のプラスミドであって、プロモーター機能を担持した塩基配列の上流に、転写ターミネーター機能を担持した塩基配列が配置されたプラスミド。
７．  プラスミドが直鎖型である、前記３または４のプラスミド。
８．  前記１または２の改変手段を利用したＲＮＡの合成方法。
９．  前記８のＲＮＡの合成方法であって、ＲＮＡを合成するための反応系において、該ＲＮＡの合成に必要な物質を連続的に供給すること、および／または該ＲＮＡの合成を阻害する物質と反応の副生成物とを連続的に除去すること、を特徴とするＲＮＡの合成方法。
１０．  前記３から７のいずれか１のプラスミドを用いる、無細胞タンパク質合成手段に使用するＲＮＡの合成方法。
１１．  前記１０のＲＮＡの合成方法であって、ＲＮＡを合成するための反応系において、該ＲＮＡの合成に必要な物質を連続的に供給すること、および／または該ＲＮＡの合成を阻害する物質を連続的に除去すること、を特徴とするＲＮＡの合成方法。
１２．  前記８から１１のいずれか１のＲＮＡの合成方法により得られたｍＲＮＡを利用した無細胞タンパク質合成手段。
１３．  前記３から７のいずれか１のプラスミドを利用した無細胞タンパク質合成手段。
１４．  前記１２または１３の無細胞タンパク質合成手段がコムギ胚芽抽出物を用いて行う無細胞タンパク質合成手段であり、該コムギ胚芽抽出物が胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているものである無細胞タンパク質合成手段。
１５．  前記１２または１３の無細胞タンパク質合成手段であって、ｍＲＮＡの合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）とが共役せず連続して１つの系で行われることを特徴とする転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
１６．  前記５または６のプラスミドを利用する無細胞タンパク質合成手段であって、ｍＲＮＡの合成（転写）を分子篩担体を担持した反応槽で行い、該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製および捕集し、透析条件下で、このｍＲＮＡのタンパク質合成反応をおこすために、ｍＲＮＡを含む反応槽の反応液温度をタンパク質合成に適当な温度に変化させることを含む、同じ反応槽中でタンパク質合成（翻訳）を行うことが可能な転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
１７．  前記５または６のプラスミドを利用する無細胞タンパク質合成手段であって、透析手段を担持した反応槽を用いて、透析膜内でｍＲＮＡの合成（転写）を行った後、反応液温度をタンパク質合成（翻訳）に適当な温度に変化させ、透析膜内の溶液組成がタンパク質合成用溶液組成に透析により変換されることにより、同じ反応槽中でｍＲＮＡ合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）とを行うことが可能な転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
１８．  以下の工程、
（ａ）ｍＲＮＡを、分子篩可能な担体を担持した反応槽において合成し、
（ｂ）該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製の後に捕集し、
（ｃ）タンパク質合成を、該合成され捕集されたｍＲＮＡを含む反応槽において透析条件下で行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
１９．  以下の工程、
（１）透析膜内に転写反応液と翻訳反応液の混液を加えた、透析膜を担持した反応槽を用い、
（２）透析外液にタンパク質合成反応用溶液を満たし、ｍＲＮＡを透析膜内で製造し、
（３）ついで、反応液温度をタンパク質合成反応（翻訳反応）に適当な温度に変化させ、
（４）透析条件下でタンパク質合成を行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
２０．  前記１５から１９のいずれか１の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段において、少なくともタンパク質合成反応の翻訳鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質、エネルギー源から選ばれた要素について、追加、保存、交換、および排出から選択される処置を導入する転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
２１．  ｍＲＮＡの合成を行う反応槽の反応液が接する面の少なくとも透析手段または分子篩手段に関与する面にタンパク質コーティングを施すことを特徴とする無細胞タンパク質合成手段。
２２．  分子篩手段または分子篩可能な担体として、合成されたｍＲＮＡと基質や副生成物などの低分子物質との分離が可能な孔径のフィルターを使用して行う前記１６、１８、２０、および２１のいずれか１の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
２３．  前記１５から２２のいずれか１の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段において使用される無細胞タンパク質合成系が、コムギ胚芽抽出物を利用する系であり、該コムギ胚芽抽出物が胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているものである転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
２４．  無細胞タンパク質合成手段において翻訳鋳型であるｍＲＮＡを２種以上使用し、各ｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成反応液中で個別に予備保温（プレインキュベーション）後に混合して無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする、無細胞タンパク質合成手段を用いた複数タンパク質の共発現方法。
２５．  前記２４の複数タンパク質の共発現方法において、使用するｍＲＮＡが前記８から１１のいずれか１のＲＮＡ合成方法によって合成したｍＲＮＡである複数タンパク質の共発現方法。
２６．  前記２４または２５の複数タンパク質の共発現方法において、無細胞タンパク質合成手段がコムギ胚芽抽出物を用いて行う無細胞タンパク質合成手段であり、該コムギ胚芽抽出物が胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているものである複数タンパク質の共発現方法。
２７．  白色を呈する小傷部分をもつ胚芽および茶や黒などの色をもつ胚芽を除去した、黄色の胚芽のみからなる無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽原料。
２８．  前記２７のコムギ胚芽原料から製造される小麦胚芽抽出物。
２９．  前記１４の無細胞タンパク質合成手段において胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているコムギ胚芽抽出物が前記２８の小麦胚芽抽出物である無細胞タンパク質合成手段。
３０．  前記２３の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段において胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているコムギ胚芽抽出物が前記２８の小麦胚芽抽出物である転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
３１．  前記２６の複数タンパク質の共発現方法において、胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているコムギ胚芽抽出物が前記２８の小麦胚芽抽出物である複数タンパク質の共発現方法。
３２．  小麦胚芽抽出物を利用する無細胞タンパク質合成系において、無細胞タンパク質合成反応を小麦胚芽抽出物を含む反応溶液を撹拌することなく静置条件下で行うことを特徴とする無細胞タンパク質合成手段。
３３．  前記１４または２９の無細胞タンパク質合成手段であって、無細胞タンパク質合成反応を小麦胚芽抽出物を含む反応溶液を撹拌することなく静置条件下で行うことを特徴とする無細胞タンパク質合成手段。
３４．  前記２３または３０の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段であって、無細胞タンパク質合成反応を小麦胚芽抽出物を含む反応溶液を撹拌することなく静置条件下で行うことを特徴とする転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段。
３５．  前記２６または３１の複数タンパク質の共発現方法であって、無細胞タンパク質合成反応を小麦胚芽抽出物を含む反応溶液を撹拌することなく静置条件下で行うことを特徴とする複数タンパク質の共発現方法。
３６．  前記１２から１４、２９および３３の無細胞タンパク質合成手段、前記１５から２３、３０および３４の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段、前記２４から２６、３１および３５の複数タンパク質の共発現方法から選ばれるいずれか１を利用することを特徴とする遺伝子多型と遺伝子機能の関係を検定する方法。
３７．  前記１２から１４、２９および３３の無細胞タンパク質合成手段、前記１５から２３、３０および３４の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段、前記２４から２６、３１および３５の複数タンパク質の共発現方法から選ばれるいずれか１を利用することを特徴とする遺伝子機能のスクリーニング方法。
３８．  前記１４、２９および３３の無細胞タンパク質合成手段、前記２３、３０および３４の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段、前記２６、３１および３５の複数タンパク質の共発現方から選ばれるいずれか１を用いるタンパク質の合成方法であって、小麦胚芽抽出物を利用することを特徴とする哺乳動物由来遺伝子からタンパク質を合成する方法。」
又は、
「１）
以下の工程、
（ａ）ｍＲＮＡを、分子篩可能な担体を担持した反応槽において合成し、
（ｂ）該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製の後に捕集し、
（ｃ）タンパク質合成を、該合成され捕集されたｍＲＮＡを含む反応槽において透析条件下で行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
２）
以下の工程、
（ａ）ｍＲＮＡを、分子篩可能な担体を担持した反応槽において合成し、
（ｂ）該合成されたｍＲＮＡを分子篩可能な担体によって精製の後に捕集し、
（ｃ）ｍＲＮＡを含む反応槽の反応液温度をタンパク質合成に適当な温度に変化させ、
（ｄ）タンパク質合成を、該合成され捕集されたｍＲＮＡを含む反応槽において透析条件下で行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
３）
以下の工程、
（１）透析膜を担持した反応槽を用い、ｍＲＮＡを透析膜内で合成し、
（２）反応液温度をタンパク質合成反応（翻訳反応）に適当な温度に変化させ、
（３）透析膜内の溶液組成がタンパク質合成用溶液組成に透析により変換されることにより、透析条件下でタンパク質合成を行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
４）
以下の工程、
（１）透析膜内に転写反応液と翻訳反応液の混液を加えた、透析膜を担持した反応槽を用い、透析外液にタンパク質合成反応用溶液を満たし、ｍＲＮＡを透析膜内で合成し、
（２）反応液温度をタンパク質合成反応（翻訳反応）に適当な温度に変化させ、
（３）透析膜内の溶液組成がタンパク質合成用溶液組成に透析により変換されることにより、透析条件下でタンパク質合成を行うこと、
を備える転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法。
５）
前記１）―４）項のいずれか１項に記載の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を利用することを特徴とする遺伝子多型と遺伝子機能の関係を検定する方法。
６）
前記１）―４）項のいずれか１項に記載の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を利用することを特徴とする遺伝子機能のスクリーニング方法。」
である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、無細胞タンパク質合成系が不安定となる原因を特定し、これらの知見をもとに安定な且つ合成効率の優れた細胞または組織抽出物の調製および高効率無細胞タンパク質合成手段を開発している（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８）。以下、手段とは目的達成のために使用される方法および／または媒体を意味する。
【００１５】
実用的な無細胞タンパク質合成手段を完成させるために、本発明ではさらに次の技術を確立した。すなわち、どのようなｍＲＮＡ種に対してもその翻訳効率を著しく促進するｍＲＮＡの５'末端および３'末端の非翻訳配列の開発、該非翻訳配列を組み込んだ高翻訳効率を有するｍＲＮＡを合成するための汎用性のあるプラスミド（以下、高効率翻訳カセットプラスミドと呼ぶこともある）の構築、該カセットプラスミドを鋳型とするｍＲＮＡの簡便な大量合成および精製技術の開発、限外ろ過膜を利用する連続式ＲＮＡ合成と透析膜を用いた連続式無細胞タンパク質合成を一体化した転写・翻訳非共役連続式タンパク質合成とを行うための簡便なシステムの開発、さらに、目的のタンパク質遺伝子を組み込んだ高効率翻訳カセットプラスミドを制限酵素で切断することなく環状型プラスミドのまま無細胞タンパク質合成系に添加することによって、安定で且つ翻訳鋳型活性の高いｍＲＮＡを効率良く連続合成し、同一反応容器内で転写とは非共役的に連続式無細胞タンパク質合成を可能とする方法、無細胞タンパク質合成手段を用いた複数タンパク質の共発現方法などを確立した。
【００１６】
以下、本発明において、無細胞タンパク質合成手段に用いる細胞抽出物は、コムギ胚芽、大腸菌、家兎網状赤血球などに由来するものが使用できるが、好ましくはコムギ胚芽抽出物であり、より好ましくは、胚乳成分の夾雑が実質的に排除されているコムギ胚芽抽出物を用いる。該コムギ胚芽抽出物は、その原料として、後述する実施例１に示した方法で得ることのできる、白色を呈する小傷部分をもつ胚芽および茶や黒などの色をもつ胚芽〔図１（Ａ）〕を除去した、黄色の胚芽〔図１（Ｂ）〕のみからなるコムギ胚芽を原料として調製したものが特に好ましい。
【００１７】
また、本発明において、コムギ胚芽抽出物を使用して無細胞タンパク質合成手段を行う場合、タンパク質合成反応は反応液を撹拌することのない静置条件下で行うことが好ましい。
【００１８】
（高翻訳効率を有するｍＲＮＡの５'末端および３'末端構造の構築）
５'末端構造：
本発明の高効率のタンパク質翻訳鋳型分子の構築は、生細胞を用いたタンパク質発現系の検討から得られていた５'末端非翻訳配列に関する知見をもとに、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡの５'末端非翻訳配列に存在するオメガ（Ｏｍｅｇａ；Ω）配列、およびこれらを改変して得た配列表の配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列を（配列表フリーテキスト）５'末端非翻訳領域（５'Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ；５'ＵＴＲ）として用い、無細胞タンパク質合成系に用いるタンパク質翻訳鋳型分子（ｍＲＮＡ）の塩基配列において、目的のｍＲＮＡの５'末端に導入することにより行われる。ＡＭＶリーダー配列およびＴＭＶΩ配列は後述する表１に、これらを改変した３つの塩基配列（配列表の配列番号１〜３）は表２に示す。
【００１９】
導入する塩基配列は、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡの５'末端非翻訳配列に存在するオメガ（Ｏｍｅｇａ；Ω）配列、配列表の配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３に記載の塩基配列、またはこれらの配列と７０％以上の相同性を有し、かつＣＡＰ構造の存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列であればよい。
【００２０】
該塩基配列は、単独もしくは複数で、さらに翻訳開始に関与する塩基配列や構造、例えば公知のＣＡＰ構造などを、組み合わせて導入することが可能である。
【００２１】
３'末端構造：
真核生物ＲＮＡの３'末端には、数十から２００個余りのポリアデニル酸構造〔ポリ（Ａ）〕が存在し、翻訳開始活性の促進とＲＮＡの安定化に関与していることが知られている。発明者らは、ＲＮＡの鋳型ＤＮＡの３'末端に５０〜１５０個の、好ましくは１００個のポリアデニル酸構造を付加してｍＲＮＡを合成し、この分子が高鋳型活性を有することを確認した。
【００２２】
次にこれらの結果を踏まえて、さらなるｍＲＮＡの安定化方法を探るため、翻訳終止コドンの下流に長い非翻訳ＲＮＡ鎖を導入したところ、ｍＲＮＡの安定性が極めて上昇することを見出した。この長鎖非翻訳ＲＮＡの導入方法として、プラスミドを転写反応に先だって制限酵素で切断して直鎖型にすることなしに、環状型のまま鋳型として転写反応に用いた。この場合、用いたプラスミドには特別な転写終結部位を挿入していないので、転写産物であるｍＲＮＡは種々の分子サイズのｍＲＮＡとして合成される。
【００２３】
なお、長鎖非翻訳ＲＮＡである３'末端非翻訳配列は約３００塩基以上好ましくは約５００塩基以上であればよく、その塩基配列は特別のものである必要はない。好ましくは約５００〜約１５００塩基前後であり、最も好ましくは約７００塩基前後である。
本発明では一例として、プラスミドにクローン化した大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｄｈｆｒ）遺伝子（Ｂａｒａｎｏｖ，Ｖ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ，８４，４６３−４６６）を利用して、遺伝子工学的に遺伝子の５'末端および／または３'末端にウイルスＲＮＡ由来の非翻訳配列を導入する方法を採用した。すなわち、その一つとして、その５'末端に、ＡＭＶ  ｍＲＮＡの５'末端非翻訳配列であるＡＭＶリーダー配列やＴＭＶ  ｍＲＮＡの５'末端非翻訳配列のΩ構造や配列表の配列番号１または配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列を複数個直列に組合せて導入したり、３'末端に長い非翻訳配列（ＵＴＲ）および／または１００個のポリアデニル酸構造を導入することによって、ＣＡＰ構造の存在を必要としない高い翻訳開始活性を有するｍＲＮＡの新規な構造を構築した。これらの配列並びに構造は、それぞれ単独でｍＲＮＡに導入しても、該ｍＲＮＡの翻訳活性を増強するが、高い翻訳活性を有するｍＲＮＡの構造は、実施例１の表１に示すように環状型プラスミドを転写鋳型として合成したＡＭＶ−Ω−タンパク質翻訳塩基配列−３'末端非翻訳配列−ポリ（Ａ）−プラスミド由来３'末端非翻訳配列構造、またはＡＭＶ−Ωの代わりに配列表の配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３に記載の塩基配列を同様に導入し構築した場合である（表２および表３）。
【００２４】
以上、ｍＲＮＡに新規な５'末端および３'末端構造を結合させることによって、高鋳型活性を有するｍＲＮＡを設計し合成することに成功し、これがコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系において、高い翻訳効率を示すことを実証した。上記本発明の翻訳鋳型分子の改変手段は、高鋳型活性を有するＲＮＡの合成、および無細胞タンパク質合成手段に利用することができる。
【００２５】
（高翻訳効率ｍＲＮＡ合成用の汎用プラスミドの構築）
上記の知見は、モデルとしてｄｈｆｒ遺伝子を用いた実験結果から得られたものであるが、種々のｍＲＮＡ合成に一般的に利用できるように、複数のクローニング部位を挿入した汎用性の高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成用の新規プラスミドを構築した。むろん、該プラスミドにＯＲＦとして組み込むｍＲＮＡ転写用鋳型ＤＮＡには、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などのタグをコードするＤＮＡを結合しておいてもよい。タグは自体公知のものを使用できるが、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、ＦＬＡＧ、Ｘｐｒｅｓｓ、ヘマグルチニンエピトープ（ＨＡ）、Ｍｙｃエピトープ、Ｔ７エピトープ、ＨＳＶエピトープ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、βガラクトシダーゼ（βｇａｌ、ＬａｃＺ）などの市販されているものを、目的に応じて使用すればよい。該プラスミドは、あらかじめ制限酵素で直鎖型に切断したものはもちろん、切断しないで環状型のままで転写反応の鋳型とすることによって、ｍＲＮＡの３'末端側に長い非翻訳ＲＮＡ鎖を導入したｍＲＮＡの合成が可能となる。この転写産物（ｍＲＮＡ）がコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系において、安定で高い翻訳鋳型機能を有することも確認された。
【００２６】
本発明の汎用性のあるプラスミドは、（１）プロモーター機能を担持した塩基配列と、（２）その下流にあたる領域に少なくともアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）リーダー配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ＲＮＡの５'末端非翻訳配列に存在するオメガ（Ｏｍｅｇａ；Ω）配列、配列表の配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３に記載の塩基配列、またはこれらの配列と７０％以上の相同性を有し、且つＣＡＰ構造が存在するｍＲＮＡの翻訳開始活性に比して約７０％以上の翻訳開始活性を有するｍＲＮＡを与えうる塩基配列、の転写鋳型となる塩基配列と、（３）その下流にあたる領域に複数の制限酵素切断部位と、（４）ＯＲＦの終止コドンの下流にあたる領域に少なくとも３'末端非翻訳配列と、が配置された無細胞タンパク質合成系の鋳型として利用するプラスミドである。本発明のプラスミドを環状型のままで用いる場合、上述したように、該プラスミドには特別な転写終結部位を挿入していないので、転写産物であるｍＲＮＡは種々の分子サイズのｍＲＮＡとして合成される。転写終結部位を規定するターミネーター機能を担持する配列を、プロモーター領域の上流に配置し、転写産物の分子サイズを一定にすることもできる。
ここで利用するプラスミドは、コムギ胚芽、大腸菌、家兎網状赤血球などの細胞抽出物を用いる無細胞タンパク質合成系に利用する、ｍＲＮＡの鋳型となりうるものであれば特に限定されない。但し、プラスミド本体の大きさは、３Ｋｂ以上であることが望ましい。プロモーターも、該無細胞タンパク質合成系において、ｍＲＮＡの合成のために機能発揮できるものであれば特に限定されないが、例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーターが例示される。複数の制限酵素切断部位は、この部位を利用して所望の遺伝子をｍＲＮＡ合成の鋳型としてプラスミドに挿入するための手段である。
かくして得られた本発明のプラスミドは、ＲＮＡの合成、および無細胞タンパク質合成手段などに使用することができる。
【００２７】
（ｍＲＮＡの簡便な大量合成および精製技術の確立）
発明者らは、従来のＲＮＡ合成方法の問題点を解決する以下の連続式ＲＮＡ合成の新技術を発明した。すなわち、反応槽として限外ろ過フィルターを装着したスピンカラムを用意し、同容器内に鋳型ＤＮＡ、４種類の基質リボヌクレオシド−５'−３リン酸、さらに必要に応じてＣＡＰ分子、ＲＮＡポリメラーゼ、スペルミジン、マグネシウムイオンおよび適当な緩衝液などからなる転写反応液を満たす。別に調製した、上記の転写反応液から鋳型ＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼを除いた溶液を透析外液として、ＲＮＡの透析式連続合成を行う。このＲＮＡ合成法では、限外ろ過フィルターを介して、基質の連続供給と副生成物として生ずるピロリン酸などを連続的に反応系から排除することとが可能であり、反応は長時間にわたり化学平衡に到達しないため、ＲＮＡ合成は１２時間以上にわたって持続し、従来の５倍以上のＲＮＡが得られる。
【００２８】
限外ろ過フィルターの分子量カットサイズは合成されたＲＮＡと基質や副生成物などの低分子物質との分離が可能な孔径であれば特に限定されないが、カット分子量が５，０００〜１００，０００のフィルターが好ましい。それらフィルターの孔径は、１０〜５０オングストロームである。
【００２９】
本発明のＲＮＡ合成方法には、上記本発明の翻訳鋳型分子の改変手段を利用することができるし、また上記本発明のプラスミドを用いることができる。
また本発明では、ｍＲＮＡの合成を行う反応槽の反応液が接する面の少なくとも透析手段または分子篩手段に関与する面、例えば透析膜または限外ろ過フィルターなどにタンパク質コーティングを施すことの優位性を、無細胞タンパク質合成手段におけるｍＲＮＡの合成方法において初めて見出した。すなわち、タンパク質を用いたコーティング処理により、ｍＲＮＡ転写効率を上昇させることができ、またｍＲＮＡの分解を防止できる。コーティングに用いるタンパク質は、アルブミンが例示されるが必ずしもこれに限定されない。また、コーティングに用いるタンパク質は、透析手段または分子篩手段に関与する面に格別に固定しておく必要はなく、タンパク質含有溶液で数回洗浄することでも効果が得られるが、これに限定されるものではない。タンパク質含有溶液で数回洗浄する方法が、簡便であり好ましい。タンパク質含有溶液の濃度は、格別限定されないが、溶解飽和濃度であれば十分であり、それ以下でもよい。
【００３０】
さらに、本発明のＲＮＡ合成法が従来法に比べて優れている点は、合成したＲＮＡの精製が簡便なことである。すなわち、本方法では、ＲＮＡ合成後に反応容器をそのまま低速遠心することによって、低分子物質は限外ろ過フィルター細孔から排除され、ＲＮＡ分子は容器内の限外ろ過フィルター上に補集される。水など適当な溶液の添加とこれに続く遠心を数回繰り返すことによって、極めて純度の高いＲＮＡを、フェノール処理などの操作を行うことなく容易に単離し回収することができる。
【００３１】
以上のように、本発明の鋳型分子の改変手段、または本発明のプラスミドを利用し、本発明の連続式ＲＮＡ合成法を使用することにより、従来に比べて効率的にＲＮＡを製造することができる。また、本方法は、ｍＲＮＡの合成、およびそれ以外のＲＮＡの合成に一般的に利用できる。
【００３２】
本発明のＲＮＡの合成方法により得られたｍＲＮＡは、無細胞タンパク質合成手段に利用できる。
【００３３】
（無細胞タンパク質合成手段）
本発明は、上記本発明の翻訳鋳型分子の改変方法を利用する、または、上記本発明のプラスミドを利用する無細胞タンパク質合成手段をも含むものである。本発明の無細胞タンパク質合成手段は、本発明の高い翻訳効率を有するｍＲＮＡまたは本発明のプラスミドを用いるので、従来法より高いタンパク質合成効率を示す。また、本発明の無細胞タンパク質合成手段は、後述する本発明の転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段に利用することができる。
【００３４】
（連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成の一体化システム）
さらに、無細胞タンパク質合成手段において、高い合成効率を確保し且つ操作を簡便にするために、無細胞タンパク質合成反応を行う場合に、目的のタンパク質遺伝子を含むプラスミドを反応系に添加することによって充分量のタンパク質の合成を可能とする、ｍＲＮＡ合成とタンパク質合成とを一体化した以下の２つの実用的なシステムを構築した。この２つの本システムはいずれも、まずｍＲＮＡ合成を行いその後引き続いてタンパク質の合成を同一の反応容器内でおこなう連続式システムであり、転写・翻訳非共役システムである。このシステムは、全自動無細胞タンパク質合成装置の開発にとっても有用なものである。
【００３５】
（透析膜を利用するシステム）
本発明の、透析膜を利用した連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成とを一体化した転写・翻訳非共役連続式無細胞合成手段の模式図を図７（Ｂ）に示した。
【００３６】
まず、上記した翻訳活性の高い、５'末端および３'末端非翻訳配列を含むｍＲＮＡ合成用プラスミドに目的の遺伝子を組み込み、これを環状型のままで、転写反応液に添加し、摂氏２３〜３７度、好ましくは摂氏３０度で、５分程度、好ましくは１０分間の予備反応を行う。この予備反応段階は所望により省略することも可能であるが、この予備反応段階で鋳型ＤＮＡのプロモーター領域にＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写開始反応が効率的に進行するため、次の保温段階におけるｍＲＮＡ合成量が上昇することによって、翻訳反応段階におけるタンパク質の合成量が増加するので好適には行った方がよい。次に、この転写反応液と翻訳反応液を混合する。この混液を透析膜チューブに移した後、これをあらかじめ準備しておいたタンパク質合成用透析外液を満たした容器に浸す。反応を摂氏３０度で約３時間静置条件下で行うことによって、まず主にｍＲＮＡが合成される。
【００３７】
次の段階として、反応温度を摂氏２３度に低下させ、透析下で反応を静置条件下で持続させる。この過程で、透析膜内の低分子、特にｍＲＮＡ合成の至適濃度に合わせて高濃度に設定しておいたＡＴＰ、ＧＴＰやマグネシウムイオンの濃度が透析の進行とともに低下し、タンパク質合成用溶液からなる透析外液濃度に近づき、やがて透析膜内はタンパク質合成用溶液組成に変換される。
【００３８】
これに伴ってタンパク質合成反応が促進され、その反応速度が最大となり、主としてタンパク質が合成される。この無細胞タンパク質合成反応は６０時間以上にわたって持続し、ｄｈｆｒ合成の場合では、反応容量１ｍｌ当り４ｍｇ程度のタンパク質を得ることができる。
【００３９】
透析膜を利用するシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができる。しかし、合成収量とコストを考慮して、環状型プラスミドを用いることが好ましい。またＣＡＰ存在下、非存在下のいずれの条件下でも、本システムは実施可能であるが、ｍＲＮＡ合成に使用するＣＡＰ自身がタンパク質合成に必要な因子に強く結合してこれを阻害しタンパク質合成の効率が低くなるため、ＣＡＰ非存在下で行うことが望ましい。
【００４０】
（限外ろ過膜を利用するシステム）
本発明の、限外ろ過膜を利用した連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成とを一体化した転写・翻訳非共役連続式無細胞合成手段の模式図を図７の（Ａ）図に示した。
【００４１】
上記の翻訳活性の高い５'末端および３'末端非翻訳配列を含むプラスミドを鋳型として、ｍＲＮＡを、限外ろ過膜を備えたスピンカラムを用いた透析法で合成する。この場合、ＲＮＡ合成の鋳型となるプラスミドは環状型のままで用いるのが好ましい。摂氏３０〜３７度で保温し必要なＲＮＡ合成量に応じて反応時間を決定するが、通常の場合はおおよそ３〜５時間でよい。また、ここで用いる限外ろ過膜を備えたスピンカラムは、上記、本発明のＲＮＡの合成方法において用いたものと同様である。
【００４２】
反応後は、反応容器であるスピンカラムを遠心し洗浄することによって、純化されたｍＲＮＡをフィルター上に補集する。次に、コムギ胚芽抽出物などの細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成用溶液を同スピンカラムに添加し、翻訳反応用透析外液を満たした容器に浸し摂氏２３度で無細胞タンパク質合成反応を開始し、細胞抽出液としてコムギ胚芽抽出物を用いた場合は静置条件下で反応させる。
【００４３】
本方法により得られるタンパク質合成収率は、透析チューブを用いる上記の方法による収量とほぼ同程度である。また、スピンカラムのフィルター上のｍＲＮＡをフィルターのまま、上記透析膜を利用するシステムにおいて透析チューブに投入することによってもタンパク質合成が可能である。さらに本手段を用いることにより、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡについても全く同様にその合成および精製に続いて効率的な翻訳反応を行うことができる。
【００４４】
限外ろ過膜を利用するシステムには、環状型、直鎖型のいずれのプラスミドも用いることができ、またＣＡＰ存在下、非存在下のいずれの条件下でも、本システムは実施可能である。５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを用いる方がタンパク質合成収量は高いが、直鎖型プラスミドから合成した５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡと環状型プラスミドからＣＡＰ非存在下に合成したｍＲＮＡとの両者の合成収量に大きな差はなく、コストを考慮して、ＣＡＰ非存在下に環状型プラスミドを用いることが好ましい。
【００４５】
上記２つの本システムでは、少なくともタンパク質合成反応の翻訳鋳型となるｍＲＮＡ、エネルギー再生系酵素、基質、エネルギー源から選ばれた１種または２種以上の要素について、反応開始後、要時または継続的に、追加して添加する手段を導入してもよい。これらは、極少量を継続的に添加してもよいし、一定時間ごとに添加してもよい。また、本システムでは、上記の無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を、該合成反応の効率を維持するために、該合成反応の開始後、反応途中で交換する処置を導入してもよい。例えば、無細胞タンパク質合成用溶液からなる透析外液の所望の量を、継続的または断続的に交換する手段を導入できる。さらに、本システムは、上記の無細胞タンパク質合成反応に必要な物質を追加添加または交換するために、これらを保存しておく手段を備えていてもよい。さらにまた、本発明は、無細胞タンパク質合成反応の副生成物を、該合成反応から除くための排出手段を備えていてもよい。これらの追加、保存、交換、および／または排出のための手段は１種または２種以上を選択し、組み合わせて導入することが可能である。
【００４６】
また、上記本システムにおいて、合成を行う反応槽の反応液が接する面の少なくとも透析手段または分子篩手段に関与する面、例えば透析膜または限外ろ過膜にタンパク質コーティングを予め施せば、タンパク質合成の効率がさらに向上する。すなわち、タンパク質を用いたコーティング処理により、ｍＲＮＡ転写の効率およびそれに続いて起こるタンパク質翻訳の効率を上昇させることができる。コーティングに用いるタンパク質は、アルブミンが例示されるが必ずしもこれに限定されない。また、コーティングに用いるタンパク質は、透析手段または分子篩手段に関与する面に格別に固定しておく必要はなく、タンパク質含有溶液で数回洗浄することでも効果が得られ簡便であり好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、透析膜をアルブミンでコーティングする場合、内液として水とアルブミンの混合溶液を用い、外液として水を使用して数時間透析を行えばよい。むろん、内液と外液の組成が逆であってもよい。タンパク質含有溶液の濃度は、格別限定されないが、溶解飽和濃度であれば十分であり、それ以下でもよい。
【００４７】
（無細胞タンパク質合成系を利用した複数タンパク質の共発現方法）
本発明はさらに、無細胞タンパク質合成系を利用した、複数タンパク質の共発現方法を提供する。本発明の複数タンパク質の共発現方法は、まず、目的とする複数のタンパク質のｍＲＮＡを、それぞれ個別に無細胞タンパク質合成用反応液中で予備保温（プレインキュベーション）し、その後これらを混合して、さらに無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする。ここで、用いるｍＲＮＡは上記本発明のＲＮＡ合成方法により合成したｍＲＮＡでありうる。予備保温（プレインキュベーション）の時間は、５分〜１２時間が適当であり、好ましくは３０分〜３時間、特に好ましくは、３時間である。予備保温（プレインキュベーション）が５分より短いと複数タンパク質の共発現が見られず、１３時間以上であると生産物の部分的な不溶化が起こるので好ましくない。また予備保温（プレインキュベーション）後の無細胞タンパク質合成は、従来の無細胞タンパク質合成法で行えばよいが、好ましくは上記本発明の無細胞タンパク質合成手段、または転写・翻訳非共役無細胞タンパク質合成手段により行う。無細胞タンパク質合成に用いる細胞抽出物は大腸菌、家兎網状赤血球やコムギ胚芽に由来するものが使用できるが、好ましくはコムギ胚芽抽出物を使用する。小麦胚芽抽出物を用いた場合は、静置条件下で撹拌することなく反応させることが好ましい。実施例では５種類のタンパク質のｍＲＮＡを用いて共発現を行い、いずれのタンパク質も同時に効率よく合成できることを確認した。
【００４８】
本発明の複数タンパク質の共発現方法は、翻訳と共役した複数タンパク質の高次構造体形成機構（コフォールディング）の解析、タンパク質因子複合体の構造と機能との関係を解析するための試料の調製、遺伝子変異と病因との関係を解明するための試料の調製、医薬品としての標的タンパク質の同定、および医薬品デザインのための試料調製などに使用することができ有用である。
【００４９】
上記の本発明の無細胞タンパク質合成手段、転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段、複数タンパク質の共発現手段を用いることにより、従来の大腸菌や昆虫細胞などを用いたタンパク質発現方法では得ることが困難であった、生体特に哺乳動物由来で機能を保持したタンパク質の合成を、簡便且つ効率的に行うことができる。
【００５０】
また、ここに記載した原理を組合せることによって、プラスミドにクローン化した多種類の目的遺伝子からそれらの翻訳産物であるタンパク質を一度に且つ効率良く調製できるシステムである全自動無細胞タンパク質合成装置を構築することができる。
【００５１】
さらに、本発明の手段を用いることにより、多種のタンパク質試料の合成などが効率よく簡便に行うことができるようになるため、遺伝子機能の同定すなわち翻訳産物の機能や構造の解析、遺伝子多型と遺伝子機能の関係の解析、遺伝子機能のスクリーニング方法の構築、検査薬や治療薬剤の標的タンパク質のスクリーニングと同定、標的タンパク質を用いた薬剤の分子設計と有効性の検討など行うことができるようになる。
【００５２】
以下、本発明をコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系におけるｄｈｆｒタンパク質の合成を例に挙げて説明するが、下記の実施例は本発明についての具体例を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
（高翻訳効率を有するｍＲＮＡの５'末端および３'末端構造の構築、および該末端構造を含むプラスミドの構築）
大腸菌由来のｄｈｆｒ遺伝子（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）を、ＳＰ６プロモーター領域につないだプラスミドｐＰＳＰ６５に常法を用いてクローン化し、ｍＲＮＡの５'末端および３'末端非翻訳配列コード部位を改変した種々のプラスミドを構築した（表１および表３）。表１左列上段の「−ｄｈｆｒ−３'ＵＴＲ」はその転写産物を示し、左側の「−」はｄｈｆｒ遺伝子由来の５'ＵＴＲ（３６塩基）を、右側の「−３'ＵＴＲ」は５３９塩基からなる３'ＵＴＲを示す。これらを環状型プラスミドＤＮＡのまま、あるいは制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩによって切断し開環して得た直鎖型プラスミドＤＮＡを鋳型として種々の非翻訳配列を有するそれぞれのｍＲＮＡを合成した後に、それぞれの翻訳鋳型活性を測定し、その結果を表１に示した。表３には、配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列（表２の配列−１、配列−２または配列−３に相当する）をΩ配列の代わりに５'−ＵＴＲに導入したＤＮＡを鋳型にして、ｍＲＮＡを合成した後に、それぞれの翻訳鋳型活性を測定し、その結果を示した。
【００５４】
ｍＲＮＡの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は常法（Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，Ｖ．Ｖ．，（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２７５，３８３−３９７）により行った。
【００５５】
この転写反応の条件は、次のとおりである；すなわち、反応溶液｛８０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１６ｍＭ  酢酸マグネシウム、２ｍＭ  スペルミジン、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２．５ｍＭの各ヌクレオシド−５'−３リン酸〔ＮＴＰ；ＡＴＰ、ＧＴＰ、ウリジン−５'−３リン酸（ＵＴＰ）、シチジン−５'−３リン酸（ＣＴＰ）〕、リボヌクレアーゼ阻害剤（１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（３，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、なお、５'末端にＣＡＰ構造を有するＲＮＡを合成する場合は、この溶液に５ｍＭの７ｍＧｐｐｐＧを追加した｝を摂氏３７度で２時間保温することによって、ｍＲＮＡを合成し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行った後に、必要に応じて、鋳型ＤＮＡをＤＮＡ分解酵素処理によって消化した。エタノール沈殿物を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６に溶解した後、本画分に残存する４種のＮＴＰ、７ｍＧｐｐｐＧ、ＤＮＡの分解産物やイオンをゲルろ過カラムにより除去した。ｍＲＮＡは、紫外部吸収法（４５μｇ／１ＯＤ  ｕｎｉｔ）によって定量した。
【００５６】
これら合成されたＲＮＡの翻訳鋳型活性をバッチ式のコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系を用いて調べた。この場合、コムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成は既報告（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）、（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，（２０００），９７，５５９〜５６４）およびＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８に記載の方法に準じて行った。但し、コムギ胚芽の選別は、これに記載されたシクロヘキサンや四塩化炭素を用いる浮選法ではなく、肉眼もしくは顕鏡下に優良胚芽を色によって選別する方法でおこなった。図１に、選別基準とするコムギ胚芽の状態を図示した。図１（Ｂ）に示すような黄色の胚芽を原則として採取し、図１（Ａ）に示すような白色を呈する小傷部分をもつ胚芽、および茶、黒などの色をもつ胚芽を廃棄した。この方法でも、十分に翻訳活性の高いコムギ胚芽抽出物を調製することが可能であり、かつシクロヘキサンや四塩化炭素のような有害な有機溶剤を使用する必要がない。
【００５７】
詳しくは、無細胞タンパク質合成系に使用したコムギ胚芽を、Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの方法（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１）を改良した方法で得た。まず、北海道産のチホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製Ｒｏｔｏｒ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｌｌ  ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ  １４型）に添加し、回転数８，０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。これを再度６，０００ｒｐｍで破砕し、篩で粗胚芽画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を得た後、胚芽画分に混在する種皮などの不純物をポリエチレン板などの静電気帯電体を用いて吸着除去した。
【００５８】
さらに胚芽粒子を篩と静電気帯電体を用いて、小粒（０．７１ｍｍ〜０．８５ｍｍ）、中粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍ）、軽粒（０．８５ｍｍ〜１ｍｍで且つ軽量）の３画分に分別し、最後に肉眼による分別を行い、黄色の胚芽を採取した。小粒画分が最も高いタンパク質合成活性を示した。軽粒は、種子破砕時に胚芽に生じた小傷胚芽が浮選操作中に破壊が進行したものであると推察される。次に、この試料からコムギ胚乳成分を除去するため、ガーゼにコムギ胚芽を入れ、冷却しながら冷蒸留水（ＤＤＷ）で洗浄し、非イオン性界面活性剤であるＮＰ−４０の０．５％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄を繰り返した。蒸留水の存在下に再度１回の超音波洗浄後、吸引ろ過によってコムギ胚芽を収集し、それを冷蒸留水（ＤＤＷ）で何度も洗浄し、コムギ胚芽を純化した。かくして純化されたコムギ胚芽は、実質的にコムギ胚芽に夾雑する内因性のタンパク質合成阻害因子、トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼなどが除去され、胚乳成分の夾雑が無いものであった。
【００５９】
コムギ胚芽からの抽出物の調製は常法（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ   Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０）に準じた。以下の操作は摂氏４度で行う。液体窒素で凍結した純化コムギ胚芽を乳鉢中で粉砕し、得た粉体１ｇ当たり、１ｍｌのＰａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した抽出溶液（８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、２００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  酢酸マグネシウム、４ｍＭ  塩化カルシウム、８ｍＭ  ジチオスレイトール、各０．６ｍＭ  Ｌ型アミノ酸２０種類、各１μＭのタンパク質分解酵素阻害剤であるＦＵＴ、Ｅ−６４、ＰＭＳＦを含む）を加えて、泡が発生しないように注意しながら攪拌した。３０，０００ｇ、１５分間の遠心によって得られる上清を胚芽抽出物として回収し、あらかじめ溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、４ｍＭ  ジチオスレイトール）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラム（Ｃｏａｒｓｅ）でゲルろ過を行った。試料の濃度を、１７０〜２５０Ａ２６０ｎｍ（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）に調整した。
【００６０】
ｄｈｆｒタンパク質合成反応条件は以下のとおりである；反応溶液は、容量の２４％の小麦胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．０５％  ＮＰ−４０の他、２μＣｉ（ｍｌ反応容量当たり）の［Ｕ−１４Ｃ］ロイシン（１６６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）と、０．２μＭのｍＲＮＡを含む。反応は摂氏２６度で静置反応条件下で行い、タンパク質合成活性を、５'末端にＣＡＰ構造（７ｍＧｐｐｐＧ）を導入したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ（直鎖型プラスミドから転写した塩基数１１６７、表１中に＊で示した）を鋳型とした場合のｄｈｆｒタンパク質に取り込まれた［Ｕ−１４Ｃ］ロイシンの放射活性（２８２１ｄｐｍ／５μｌ）を１００％としてそれに対する割合（％）で表示した。
【００６１】
【表１】
2005247857.tif 000003
【表２】
2005247857.tif 000004
【表３】
2005247857.tif 000005
【００６２】
表１に示した実験結果から明らかなように、５'末端非翻訳配列としては、アルファルファモザイクウイルスｍＲＮＡ（ＡＭＶ−ｍＲＮＡ）の５'末端リーダー構造（ＡＭＶ  ｌｅａｄｅｒ配列）とタバコモザイクウイルスｍＲＮＡ（ＴＭＶ−ｍＲＮＡ）の５'末端Ω配列とを直列に結合したＡＭＶ−Ω配列が最も高い翻訳鋳型活性を示した。しかし、５'末端にΩ−ＡＭＶ配列を有するｍＲＮＡにおいても、有意に高い翻訳鋳型活性が保持されている。一方、いずれのｍＲＮＡも５'末端にＣＡＰを結合させたものは、ほぼ同一の活性を保持していることがわかる。
【００６３】
また、表３には、配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列で示される３種類の５'−ＵＴＲの構造を持つｄｈｆｒ  ｍＲＮＡのバッチ反応系における翻訳鋳型活性を示したが、いずれもΩ配列を持つものに比べて遜色のない翻訳鋳型活性を保持していた。
【００６４】
３'末端非翻訳配列の末端ポリアデニル酸付加は翻訳鋳型活性の増強に対して効果的であるが、付加する鎖長については、６０、８０、１００個間で差は認められなかった。さらにここで最も注目すべき結果は、このポリアデニル酸の下流に本プラスミドにコードされる塩基配列から転写されるＲＮＡ鎖を結合したｍＲＮＡ（環状型プラスミドを鋳型として転写したｍＲＮＡ）が極めて安定で高い翻訳活性を保持していることが見出されたことである。本発明の改変手段により作成されたｍＲＮＡ（ＣＡＰなし）の翻訳効率は、５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡの翻訳効率に匹敵する。
【００６５】
以上、翻訳鋳型活性の高いｍＲＮＡを得るためには、５'末端非翻訳配列にＡＭＶリーダー配列、ＴＭＶ  Ω配列、配列表の配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載の塩基配列などを１つまたは２つ以上組み合わせて直列に結合し、加えて、３'末端にはポリアデニル酸を含む、長鎖ＲＮＡを結合させることが有効であることが明らかとなった。これらの成果を踏まえて、汎用性の高い高効率翻訳鋳型機能を備えた無細胞タンパク質合成用鋳型分子合成専用プラスミド、ｐＥＵ１（図２）を作製した。
【００６６】
ｐＥＵ１は、プラスミドｐＰＳＰ６５を基にして、ＳＰ６プロモーターまたはＴ７プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼの結合する塩基配列を挿入し、その下流にｍＲＮＡの翻訳開始反応に重要な機能を持つＡＭＶ−Ω配列の転写鋳型となる塩基配列と、さらに、この下流に目的遺伝子を導入するための複数の制限酵素部位と、ポリ（Ａ）コ−ド配列を含む３'末端非翻訳配列とを挿入したプラスミドである。さらに、ＡＭＶ−Ω配列の代わりに、配列表の配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の塩基配列の転写鋳型となる塩基配列を挿入したプラスミドを作製した。
【００６７】
また、本発明の直鎖型プラスミドとは、本プラスミドのポリ（Ａ）配列下流に導入した制限酵素部位（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位）をＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断したものである（図２）。なお、以下の実施例に用いたｍＲＮＡの３'末端ポリアデニル酸の残基数は１００個（ポリ（Ａ）１００）であり、直鎖型プラスミドを鋳型として転写したｍＲＮＡ長は１．３Ｋ塩基長（１，２８０塩基）である。また、翻訳効率の高い環状型プラスミドを鋳型として転写したｍＲＮＡは、鎖長が２．７Ｋ、７．４Ｋ、および１０．４Ｋ塩基長の分子の混合物であった〔図３（Ｂ）〕。ＣＡＰ構造を有するＡＭＶ−Ω−ｍＲＮＡにおいても、長鎖ＲＮＡを３'末端に結合させたｍＲＮＡの翻訳鋳型活性が高くなることから（表１）、この長鎖ＲＮＡが、ｍＲＮＡの安定化に関わっていることを示している。
【実施例２】
【００６８】
（長鎖３'末端非翻訳配列の導入によるｍＲＮＡの安定化手段）
表１に示したように、ｍＲＮＡの３'末端非翻訳配列の下流に長鎖ＲＮＡを導入することによって、ｍＲＮＡの鋳型活性が数倍に高まる。この原因を探るため、コムギ胚芽抽出物を使用した無細胞タンパク質合成系に［３２Ｐ］標識したｍＲＮＡを添加し、その放射活性を指標として翻訳反応中におけるｍＲＮＡの安定性を調べた。詳しくは、５'末端にＡＭＶ−Ω配列をもつｍＲＮＡの３'末端非翻訳配列の下流に、塩基長の異なる長鎖ＲＮＡを結合させたｍＲＮＡを設計して合成し、これら鋳型分子のコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成反応における安定性を調べた。転写鋳型としては、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した直鎖型プラスミドまたは未処理の環状型プラスミドを用い、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ存在下に、実施例１と同様の方法でそれぞれＣＡＰ構造有り、無しのｍＲＮＡの合成および精製を行った。この標識ｍＲＮＡ（０．２μＭ）を用い、無細胞タンパク質合成反応を実施例１に記載した方法で行った。ｍＲＮＡの安定性は反応０、１５、３０、６０、１２０分後にＲＮＡをフェノール法で抽出、エタノール沈殿による精製後、１％アガロースを用いたゲル電気泳動でＲＮＡを分離し、ＢＡＳ２０００（フジフィルムＫＫ）を用いてオートラジオグラフィーを行った。ｍＲＮＡの分子サイズマーカーは、プロモーター領域にＳＰ６またはＴ７プロモーター配列を導入したプラスミドを構築し、各々をＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断して得た直鎖型プラスミドを転写鋳型として合成したＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡと同一ゲルで泳動した。
【００６９】
図３に示した実験結果から、３'末端非翻訳配列に導入した長鎖ＲＮＡがｍＲＮＡ分子の無細胞タンパク質合成系における安定化に直接的に関わっていることが明らかになった。図３から明らかなように、５'末端にＣＡＰ構造を導入したｍＲＮＡは、直鎖型〔図３（Ａ）〕または環状型プラスミド〔図３（Ｂ）〕から転写したｍＲＮＡ種とも、比較的その安定性が高いが、５'末端にＣＡＰ構造を持たないｍＲＮＡ〔図３（Ａ）、右側の５'ＡＭＶ−Ω、１．３Ｋ塩基長〕は極めて不安定で、タンパク質合成反応１時間以降ではほとんど分解されている。しかし、環状プラスミドから転写したＣＡＰ構造を持たないｍＲＮＡ分子種のうち、２．７Ｋ、７．４Ｋ、および１０．４Ｋ塩記長のｍＲＮＡ〔図３（Ｂ）、右側の５'ＡＭＶ−Ω〕は明らかに１．３Ｋ塩基長のｍＲＮＡよりも安定性が高く、７．４Ｋ、および１０．４Ｋ塩基長の分子の安定性はＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡの安定性に匹敵する。すなわち、ｍＲＮＡの３'末端非翻訳配列の下流に長鎖ＲＮＡを導入するという本発明の原理の一つが、ｍＲＮＡの安定化に起因するｍＲＮＡの鋳型活性の上昇に寄与することが証明された。
【００７０】
さらに、この５'ＡＭＶ−Ω−ｄｈｆｒ−長鎖３'末端非翻訳配列構造をもつｍＲＮＡの翻訳効率の高い原因は、翻訳反応中において、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡがその分解によって翻訳開始反応を強く阻害するＣＡＰを含む分解産物を生ずるのに対して、本発明のｍＲＮＡでは翻訳を阻害する分解産物を生じないことに起因する。ｍＲＮＡの３'末端に結合させたＲＮＡの非翻訳配列は、特に選択した塩基配列ではないことから、ｍＲＮＡの翻訳効率化効果は、その塩基配列自体ではなく、３'末端に結合させたＲＮＡの長い鎖長が効果を示すことが判明した。この高鋳型活性を持つｍＲＮＡの設計原理は、他のｍＲＮＡ種の鋳型活性を効率化するためにも応用できる。図３（Ｂ）の分子量マーカーとして示した図（左端の図）からわかるように、このプラスミドは、Ｔ７プロモーターとＴ７ポリメラーゼを用いても、ＳＰ６系のプロモーターとポリメラーゼを用いても同様にｍＲＮＡ合成が可能である。図２に無細胞タンパク質合成のための高翻訳鋳型活性を有するｍＲＮＡ転写用プラスミドの構造を示したが、このプラスミドに目的遺伝子を任意の制限酵素部位に導入し、大腸菌菌体内などでプラスミドを増幅させた後、菌体から調製したプラスミドを鋳型として、制限酵素によるＤＮＡ切断操作無しに簡便に、高翻訳鋳型活性を有するｍＲＮＡを調製することができる。
【実施例３】
【００７１】
（ｍＲＮＡの簡便な大量合成および精製技術の開発）
反応容器は、容器底部が透析フィルターからなるミクロスピンカラム（アミコン社製ＹＭ−１０）を利用し、転写鋳型として、５'末端にＡＭＶ−Ω配列、３'末端に大腸菌ｄｈｆｒ遺伝子由来の３'ＵＴＲとポリ（Ａ）１００とを付加したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ合成用プラスミドを制限酵素で切断した直鎖型ＤＮＡを用いた。ＲＮＡ合成反応溶液の組成および反応温度は、実施例１と同一である。
【００７２】
２００μｌの反応溶液を水で洗浄した反応容器に移し、従来どおりのバッチ式で反応させ〔図４（Ａ）〕、または同容器の反応溶液をＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼを含まない２ｍｌの転写溶液に対して透析しながら、反応させ〔図４（Ｂ）〕、あるいは同様な透析式反応を、水洗後にあらかじめ１０ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンでコーティング処理した反応容器を用いて行った〔図４（Ｃ）〕。
【００７３】
図４の下図に示すように、従来のバッチ式反応〔図４（Ａ）〕では、反応は２時間でほぼ停止し、反応容量１ｍｌ当り０．２３ｍｇのｍＲＮＡが合成された。この収率は、反応容器として通常の試験管を用いた場合と同じであった。一方、透析法では、合成反応が長時間にわたって持続し、８時間後には反応容量１ｍｌ当り０．８ｍｇにまでその収量が上昇した。しかし、電気泳動図（図４の上図）からわかるように、時間の経過とともにｍＲＮＡの分解が生ずることがわかる〔図４（Ｂ）〕。一方、牛血清アルブミンでコーティング処理したＹＭ−１０を用いて透析転写を行うと、反応は少なくとも１６時間にわたって進行し、１．８ｍｇのｍＲＮＡを合成することができた。このタンパク質コーティング法は、転写効率の上昇とｍＲＮＡ分解の防止に有効である〔図４（Ｃ）〕。
【００７４】
合成されたｍＲＮＡの精製は従来のフェノールによる脱タンパク質と、エチルアルコールなどによるｍＲＮＡの水層からの沈殿法によっても可能であるが、以下の方法で簡便にこれを行うことができる。
【００７５】
すなわち、反応終了後にこの反応容器（ミクロスピンカラム）のまま遠心することによって、溶液中のヌクレオシド３リン酸やＣＡＰなどの基質や、副生成物のピロリン酸、イオン、緩衝液などの低分子はフィルター孔を通して除去され、合成されたｍＲＮＡなどの高分子はフィルター上に留まる。容器に水を加え、この操作を数回繰り返すことによって、合成されたｍＲＮＡはフィルター上に捕集され、この合成されたｍＲＮＡ画分からピロリン酸などの低分子のタンパク質合成阻害物質を除くことが可能となる。
【００７６】
下記のように、ｍＲＮＡが捕集されたフィルターを、フィルターのまま無細胞タンパク質合成系に添加することによって、タンパク質合成を行うことも可能であるが、フィルターからｍＲＮＡを水溶液として回収して用いてもよい。本方法は、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡ合成にも同様に利用できる。
【実施例４】
【００７７】
（環状型プラスミドを鋳型とする翻訳鋳型活性の高いｍＲＮＡ合成法）
実施例１で示した、５'末端非翻訳配列としてＡＭＶとΩ配列の組み合わせ構造を直列に結合し、加えて、３'末端に非翻訳配列とポリアデニル酸とを結合させたｄｈｆｒ  ｍＲＮＡの高翻訳効率をさらに確認するため、実施例３で述べた透析によるＲＮＡ合成方法で、５'末端にＡＭＶ−Ω配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ合成用の環状型プラスミド、または、直鎖型プラスミドを用いてｍＲＮＡを合成した。さらに５'−ＣＡＰ−ｄｈｆｒ−３'末端にポリ（Ａ）１００を付加したｍＲＮＡをも同様に透析法で合成した。遠心法で精製後、適当容量の水を添加し、ｍＲＮＡをフィルターから水溶液として回収した。
【００７８】
これらのｍＲＮＡの翻訳鋳型活性を、バッチ式のコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系（鋳型プラスミドからｍＲＮＡを転写合成し、精製した後に、反応液に翻訳鋳型として添加して反応させる）（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）、（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（２０００），９７，５５９〜５６４）を用いて実施例１および３と同様の方法で調べた（図５）。縦軸は直線的にタンパク質合成反応が進行する開始後３時間までに合成されたタンパク質に取り込まれた放射活性（ｄｐｍ／５μｌ）を、横軸は反応溶液中のｍＲＮＡ濃度を示す。その結果、０．６μＭのｍＲＮＡ濃度において３'末端に長鎖のＲＮＡを結合した環状型プラスミドから転写したｍＲＮＡ〔図３（Ｂ）に示した鎖長が、２．７Ｋ、７．４Ｋ、および１０．４Ｋ塩基長のｍＲＮＡの混合物〕、の方（★−★）が直鎖型プラスミドのそれ（☆−☆）よりも２倍程度の高い鋳型活性を保持していることが判明した。この時の翻訳活性は、最大活性を示すＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡ（●−●）の８７％であった。すなわち、５'末端非翻訳配列にＡＭＶとΩ配列の組み合わせ構造を直列に結合し、加えて、３'末端にはポリアデニル酸を含む長鎖ＲＮＡを結合させたｍＲＮＡは、高い翻訳鋳型活性を示した。また、このようなｍＲＮＡは環状型プラスミドを転写鋳型とし、透析による合成および精製法によって簡便に調製できることが証明できた。
【００７９】
さらに、図５から明らかなように、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡは０．５μＭの至適濃度を過ぎると急激なタンパク質合成の阻害を起こすが、環状型プラスミドを鋳型として合成したＣＡＰ構造を持たないｍＲＮＡでは１．８μＭに至っても強い阻害作用は示さない。これらのことから、ＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡに見られるこの翻訳阻害現象は、ＣＡＰ分子を含むｍＲＮＡの分解産物がタンパク質合成開始反応因子に競合的に結合することによる拮抗阻害剤効果に起因するものと理解できる。すなわち、３'末端に長鎖のＲＮＡを結合した環状型プラスミドから転写したＣＡＰ構造を持たない５'ＡＭＶ−Ω  ｍＲＮＡにおいては、この拮抗阻害がないので、無細胞タンパク質合成系における至適鋳型濃度の範囲がはるかに広く、タンパク質合成反応の条件設定が簡便である。すなわち、ここに示したｍＲＮＡは、翻訳開始活性の高い５'末端非翻訳配列と、安定性に関与する３'末端の長鎖構造を併せ持つことによって、翻訳鋳型としての高い効率を保持するに至ったと考えられた。さらに、この環状型プラスミドを鋳型とする転写方法では、制限酵素切断を行わないので、目的とする遺伝子の翻訳塩基配列（ＯＲＦ）内の、制限酵素認識塩基配列の存在に無関係となり、どのようなｍＲＮＡ種をも翻訳効率の高い完全長の分子として合成することができる。
【実施例５】
【００８０】
（環状型プラスミドから転写した５'末端にＡＭＶ−Ω配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡを用いた連続式無細胞タンパク質合成）
次に、この連続転写で合成したｍＲＮＡの連続式無細胞タンパク質合成系における性能について調べた。実施例３に記載の透析法で直鎖型と環状型プラスミドとを鋳型としてｍＲＮＡを合成した、５'ＡＭＶ−Ω構造を持つｍＲＮＡ分子種を用いて、透析膜を用いた連続式無細胞タンパク質合成を行い、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によってタンパク質を分離後、クマシーブルー染色をおこなった。各ｍＲＮＡは反応開始時にのみ添加した。その濃度は各２μＭである。その結果を図６に示した。図６（Ａ）および図６（Ｂ）はそれぞれ、環状型プラスミドおよび直鎖型プラスミドを鋳型として合成したｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いた結果である。ゲル上の矢印は翻訳産物であるｄｈｆｒタンパク質を、星印は反応溶液中のクレアチンキナーゼをそれぞれ示している。
【００８１】
図６から明らかなように、環状型プラスミドから転写したｍＲＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系では翻訳反応が４０時間以上にわたって持続する〔図６（Ａ）〕が、直鎖型プラスミドから合成したｍＲＮＡでは反応開始１０時間後には停止することが翻訳産物であるｄｈｆｒタンパク質の染色強度からわかる〔図６（Ｂ）〕。合成されたｄｈｆｒタンパク質量を、未反応無細胞タンパク質合成液に既知の量のｄｈｆｒタンパク質を添加して同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した染色バンドの強度を標準とし、デンシトメーターによって定量した結果、環状型プラスミドを用いて合成したｍＲＮＡが、５'末端にＣＡＰ構造を有するＡＭＶ−Ω−ｄｈｆｒ−３'末端ポリ（Ａ）１００付加ｄｈｆｒ  ｍＲＮＡを鋳型とした場合とほぼ同等の高い収率を示すことがわかった。一方、直鎖型プラスミドから転写したｍＲＮＡの翻訳鋳型活性は、環状型の効率の半分以下であった。すなわち、環状型プラスミドから転写した５'末端にＡＭＶ−Ω配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加した長鎖のｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ（環状型プラスミドを鋳型として合成）は、連続式無細胞タンパク質合成系においても安定で高い鋳型活性を保持しており、その有効性が確認できた。
【００８２】
この環状型プラスミドから転写したｍＲＮＡの方が直鎖型プラスミドから合成したｍＲＮＡよりも翻訳鋳型としての効率が優れているという事実は、単にこのことに留まるだけでなく、別のより大きな有用性を示したことになる。すなわち、従来のように直鎖型プラスミドを転写鋳型とする場合は、転写反応に先だって挿入遺伝子の３'下流の制限酵素部位でプラスミドを切断するが、この場合、目的とする遺伝子の翻訳塩基配列（ＯＲＦ）内にこの制限酵素認識構造が存在しないことを確認する必要があり、これが存在する場合には、３'下流にそれとは別の制限酵素部位を持つプラスミドを構築する必要がある。
【００８３】
しかし、たとえ６塩基認識の制限酵素を用いるにしても、４０９６塩基長に１回の頻度で制限酵素部位と同一の塩基配列が出現する計算となるため、直鎖型プラスミドは多種類の転写用遺伝子のクローン化には利用できない。たとえば、ヒトの約１０万種類の遺伝子には、それら遺伝子の平均ヌクレオチド数を１２００個と仮定すると、およそ２万〜３万ヶ所の制限酵素部位と同一の塩基配列がＯＲＦ内に存在する計算となるため、現在知られている制限酵素の性質からいって、ｍＲＮＡの転写用の直鎖型プラスミドを構築することは原理的に不可能である。
【００８４】
ここに示した環状型プラスミドでは、たとえば、これまでに示した新規無細胞タンパク質合成用のプラスミド（ｍＲＮＡの５'末端にＡＭＶ−Ω配列と３'末端にポリ（Ａ）１００との付加を可能としたカセットプラスミド）にクローン化しさえすれば転写反応に先立って制限酵素によるプラスミドを切断する必要がないので、１種類のカセットプラスミドですべての目的遺伝子からのｍＲＮＡの転写が可能となる。すなわち、それら遺伝子のコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系で合成することが可能となる。
【実施例６】
【００８５】
（フィルターに補集したｍＲＮＡをそのまま利用する連続式無細胞タンパク質合成法）
実施例３で説明したｍＲＮＡの簡便な大量合成および精製法でｍＲＮＡを合成し、フェノール抽出処理を行うことなく、反応容器を遠心することによりフィルターに補集した精製ｍＲＮＡをフィルターのままスピンカラムから取りだし、このフィルターをタンパク質合成反応液を満たした透析膜内に投入し、連続式無細胞タンパク質合成を行った。ｍＲＮＡを補集したフィルターは反応開始時にのみ添加した。そのフィルター上のｍＲＮＡ量と反応容量から計算したｍＲＮＡの濃度は約２μＭである。
【００８６】
図６（Ｃ）に示すように、環状型プラスミドから転写した、５'末端にＡＭＶ−Ω配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡを補集したフィルターを添加した連続式無細胞タンパク質合成系が長時間にわたって安定したタンパク質合成能を発揮し、最も高い翻訳鋳型活性を保持していることが判明した。さらに、ｍＲＮＡをフィルターに補集した状態で長期間にわたって保存できることも確認できた。
【実施例７】
【００８７】
（連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成の一体化システム−透析膜を利用する転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法−）
５'末端に配列表の配列番号１に記載の塩基配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加した長鎖ｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ合成用の環状型プラスミドを転写反応液（実施例１を参照）に添加し摂氏３０℃５分の予備保温を行う。この目的は、以降のＲＮＡポリメラーゼによる転写反応の効率化にある。この予備保温の後に転写反応液とタンパク質合成液（実施例１を参照）を混合し、これを、透析膜内に移す。本例では、転写反応溶液容量：翻訳反応溶液容量＝２：１で混合したので、マグネシウムイオンや４種のリボヌクレオシド−５'−３リン酸の反応開始時における濃度はそれぞれ、ＵＴＰは１１．７ｍＭ、ＣＴＰは１．６７ｍＭ、ＡＴＰは２．０７ｍＭ、ＧＴＰは１．７６ｍＭなどである。透析外液には連続式無細胞タンパク質合成反応用溶液（実施例１および１１を参照）（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９７，５５９〜５６４）（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８）を用いて、摂氏３０度で２時間の保温によってｍＲＮＡの大量合成の後、反応系の温度を摂氏２３度に低下させ、図７（Ｂ）にしめすように透析膜連続方式タンパク質合成を行った。分析は、実施例５と同様にＳＤＳ−ゲル電気泳動法でおこなった。図中、矢印は翻訳産物であるｄｈｆｒタンパク質を、星印は反応溶液中のクレアチンキナーゼをそれぞれ示している。
【００８８】
本反応条件では、反応溶液組成が転写反応に適した組成である反応初期にはｍＲＮＡ合成が進行し、透析膜を介した透析の進行とともに透析膜内の溶液組成が翻訳反応組成に換わることに伴って、タンパク質合成反応が開始され進行する。図８（Ａ）にその結果を示したが、１ｍｌの反応液容量当たり、４ｍｇのｄｈｆｒタンパク質を静置反応条件下で合成することができた。なお、このタンパク質合成方法が成立するのは、用いるコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成溶液が極めて安定であるからである。本原理および手段は、既に発明され市販もされている転写・翻訳反応共役系（米国特許第５６６５５６３号、同第 ５４９２８１７号、同第 ５３２４６３７号）とは原理を異にするものである。図８（Ａ）から明らかなように、本システムが長時間にわたって安定したタンパク質合成能を発揮することから、本システムが簡便で効率的なタンパク質合成手段であることがわかる。本手段は、原理および操作が簡単なことから、多種遺伝子からのタンパク質の自動合成を可能とする全自動無細胞タンパク質合成装置の構築に応用できる。
【実施例８】
【００８９】
（連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成の一体化システム−フィルターに補集した精製ｍＲＮＡを鋳型とする転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法−）
実施例３に記載した方法でｍＲＮＡを合成し、フェノール抽出処理を行うことなく、遠心によってｍＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡをフィルターに捕集した状態のスピンカラムに無細胞タンパク質合成溶液を添加し、〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕、〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（２０００），９７，５５９〜５６４〕、ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４０８８、ならびに実施例１および１１の方法に準じて連続式無細胞タンパク質合成を行った〔図７（Ａ）〕。分析は、実施例５と同様にＳＤＳ−ゲル電気泳動法でおこなった。図中、矢印は翻訳産物であるｄｈｆｒタンパク質を、星印は反応溶液中のクレアチンキナーゼをそれぞれ示している。
【００９０】
図８（Ｂ）に示したように、環状型プラスミドから転写した５'末端に配列表の配列番号２に記載の塩基配列と３'末端にポリ（Ａ）１００とを付加した長鎖ｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ（環状型プラスミドを鋳型として合成したｍＲＮＡ）を捕集したフィルターカラムを用いた連続式無細胞タンパク質合成系が長時間にわたって安定したタンパク質合成能を発揮し、高い翻訳鋳型活性を保持していることが判明した。本方法によるｄｈｆｒの合成収量は、１ｍｌの反応液容量当たり３ｍｇであった。この方法は、転写・翻訳が共役していない連続式無細胞タンパク質合成法であり、５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを鋳型とするタンパク質合成にも同様に応用できる。さらに、フィルター付きカラムを多数集積したマルチ型スピンカラムを準備することによって、多種類の遺伝子からのタンパク質合成が一度に可能となり、原理および操作が簡単なことから、自動送液および遠心装置を組み込んだ全自動無細胞タンパク質合成装置の構築が可能である。
【実施例９】
【００９１】
（オステオポンチンの生産）
オステオポンチン（ＯＰＮ）とＧＳＴとの融合タンパク質（ＧＳＴ−ＯＰＮ）を調製するために、実施例1および２に順じて、図９（Ａ）と図９（Ｂ）に示すプラスミドを設計した。ＧＳＴは、ＧＳＴ−ＯＰＮ合成後にグルタチオンカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーで容易にこれを精製するために、ＯＰＮに融合させた。オステオポンチンは、骨のマトリックスに含まれる接着タンパク質の一種で、分泌性リン酸タンパク１と呼ばれ、分子量は約６万９０００であり、ラットのｃＤＮＡが１９８５年にクローン化されている。能勢眞人（愛媛大学医学部）らは、この物質をコードする遺伝子座が糸球体腎炎の候補遺伝子であることを見出している。ＯＰＮの遺伝子多型（ポリモルフィズム：ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）３２，４４７−４４８）と糸球体腎炎の発症との関連を探るために、膠原病モデルマウスであり糸球体腎炎を発症するＭＲＬ／ｌｐｒマウス（Ｆａｓの欠損変異遺伝子ｌｐｒを有する）由来のＯＰＮ遺伝子と正常対照であるＣ３Ｈ／ｌｐｒマウス由来のＯＰＮ遺伝子とを、各マウスの脾細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作成して、常法により実施例２に順じて、図９（Ａ）および（Ｂ）に示すｐＥＵ−ＧＳＴ−Ｃ３ＨとｐＥＵ−ＧＳＴ−ＭＲＬを設計し構築した。いずれも、ＳＰ６ポリメラーゼ用の転写プロモーター（Ｐｒｏ）、５'ＵＴＲとしてＡＭＶ−Ω配列の転写鋳型となる塩基配列、ＯＲＦとしてＧＳＴ−ＯＰＮ、および３'末端にポリＡ（１００）コード配列を有する構造である。図中ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭとはファルマシア製のプロテアーゼ切断部位である。成熟型のＣ３Ｈ型ＯＰＮ（ＯＰＮ／Ｃ３Ｈ）の分子量は、３１，１１８ダルトン、成熟型のＭＲＬ型ＯＰＮ（ＯＰＮ／ＭＲＬ）は、３０，９８７ダルトンである。デザインされた融合タンパク質の分子量は、前者が５７，７４６ダルトン（ＧＳＴ−ＯＰＮ／Ｃ３Ｈ）、後者が５７，５５３ダルトン（ＧＳＴ−ＯＰＮ／ＭＲＬ）である。
【００９２】
（バッチ式無細胞タンパク合成系によるＧＳＴ−ＯＰＮの合成）
上記構築した環状プラスミドを鋳型にしてｍＲＮＡを転写合成し、該ｍＲＮＡを精製してこれを翻訳鋳型とし、実施例３に順じてバッチ式で、実施例１に順じたコムギ胚芽抽出液を用い、ＧＳＴとの融合型ＯＰＮの合成を静置条件下でおこなった。該ｍＲＮＡは、タンパク質合成用反応液２５μｌあたり４μｇ添加した。図１０は実施例１と同様にタンパク質合成量をトリクロル酢酸分画への放射活性の取込み量として表したものであり、縦軸は反応液５μｌ当たりの取込み量をｄｐｍ値で示している。ＭＲＬ／ｌｐｒ由来、Ｃ３Ｈ／ｌｐｒ由来の両融合タンパク質とも、２時間までほぼ直線的に合成される。なお、ｄｈｆｒは、反応系が正常に機能していることを確認する対照実験である。
【００９３】
（合成融合ＯＰＮのオートラジオグラフィー）
図１１は、上記で２時間目までに合成された融合タンパク質の分子量の確認をおこなったもので、得られたタンパク質が設計したタンパク質であることが確認された。ＧＳＴ−ＯＰＮ／Ｃ３Ｈの移動度がＧＳＴ−ＯＰＮ／ＭＲＬに比べて大きいのは、両者のアミノ酸配列の違い（多型）に起因するＳＤＳ存在下における立体構造の違いを反映する。
【００９４】
（ＯＰＮ／Ｃ３ＨとＯＰＮ／ＭＲＬの調製）
図１２は、ｍＲＮＡからの転写とタンパク質の翻訳合成を連続的に行う透析法（実施例３を参照）による大量合成の結果をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で調べた結果である。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）の染色パターンから、ＧＳＴ−ＯＰＮ／Ｃ３Ｈ（レーンＴ）とＧＳＴ−ＯＰＮ／ＭＲＬ（レーンＴ）の合成を確認でき、前者は１ｍｌ反応容量当たり１．２ｍｇ、後者は同１．４ｍｇであった。ファルマシア製のキットを用いて各ＯＰＮを精製し、融合タンパク質（各レーンＥ）、および、ＯＰＮ／Ｃ３ＨとＯＰＮ／ＭＲＬ（各レーンＤ）が、設計どおりの分子量を示すことが分析結果から確認できた。図には示していないが、精製用のタグとしてＧＳＴではなくヒスチジンオリゴマー（ＨＩＳ−ｔａｇ）を用いて融合タンパク質として合成したＨＩＳ−ＯＰＮ／Ｃ３ＨおよびＨＩＳ−ＯＰＮ／ＭＲＬを、ニッケルをリガンドとするニッケルアフィニティークロマトグラフィーで純度高く精製することもできた。
【００９５】
（合成ＯＰＮを用いたバイオアッセイ）
脾細胞を８週齢のＭＲＬ／＋マウスおよびＣ３Ｈ／＋マウスより採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させた。ここに、上記合成した各ＯＰＮを１０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、２４時間または４８時間短期培養した。培養後の細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ＩｇＧ３、ＩＬ−２、ＩＬ−１０それぞれに特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、その発現を定量的に解析した。その結果、ＭＲＬ型合成ＯＰＮ（ＯＰＮ／ＭＲＬ）は、脾細胞にＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３の産生を誘導し、その効果はＣ３Ｈ型ＯＰＮ（ＯＰＮ／Ｃ３Ｈ）に比べて高かった。このことは、ＯＰＮ構造遺伝子の多型による構造タンパクおよびその機能の差異が、抗体産生の亢進を介してＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおける糸球体腎炎発症に関与している可能性を示唆した。また、本発明の無細胞タンパク質合成系により、生体内で機能しうる、機能を保持したタンパク質を哺乳動物由来の遺伝子から合成できることが確認された。これにより、コムギ胚芽を利用した無細胞タンパク質合成システムは、遺伝子多型と疾患の関係を遺伝子−タンパク質発現のレベルで検定する手段として使用できることを見出した。
【実施例１０】
【００９６】
（複数タンパク質の共発現）
コムギ胚芽を利用した無細胞タンパク質合成システムを利用して、多数の翻訳鋳型の共存下に、対応する多種タンパク質を同時に合成した。共発現を行ったタンパク質は、ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｄｈｆｒ、１８ｋＤａ）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ、２８ｋＤａ）、ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ、２７ｋＤａ）、ＧＳＴ−ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ融合タンパク質（Ｇ−ＯＰＮ、６７ｋＤａ）、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＬＵＣ、６１ｋＤａ）の５種類である。
【００９７】
まず、実施例２に準じて、ＳＰ６プロモーター、５'ＵＴＲとしてＡＭＶ−Ω配列の転写鋳型となる塩基配列、各タンパク質をコードするＯＲＦ、３'ＵＴＲとしてポリ（Ａ）１００コード配列を含む、各タンパク質のｍＲＮＡ合成用のプラスミドをそれぞれ構築した。このプラスミドを用いて転写合成し精製した各ｍＲＮＡを、コムギ胚芽抽出物を利用した透析式無細胞タンパク質合成システム（実施例１１を参照）に、別々に１種類づつ添加した後、１２０時間のタンパク質合成反応を静置条件下で行い、それら単独の合成結果を図１３（Ａ）に示した。結果は、ＳＤＳ―ＰＡＧＥで分離したタンパク質のＣＢＢによる染色結果で表している。図１３（Ａ）に示すように、各タンパク質は、単独で合成すると、高効率で合成された。しかし、５種類のｍＲＮＡを同時に添加して同一のコムギ胚芽抽出物を利用した透析式無細胞タンパク質合成システムで合成すると、微量のＧＦＰが合成されるのみであり、他のタンパク質の合成はなされなかった〔図１３（Ａ）のレーンＭＩＸ〕。この原因として、翻訳開始効率には、５'−および３'−ＵＴＲ構造のみでなく、アミノ酸配列をコードするＯＲＦの塩基配列および塩基数が影響を及ぼすものと考えた。そこで、５種類のｍＲＮＡを別々のタンパク質翻訳反応チューブに添加し、まずそれらを３時間予備保温（プレインキュベーション）することによって、個々のｍＲＮＡを個別的に効率的に翻訳開始せしめ、その後にこれらを混合し、透析反応を同様に行った。図１３（Ｂ）に示したように、この方法では、５種類のタンパク質とも効率よく合成できることが明らかとなった。Ｇ−ＯＰＮについては６７ｋＤａの分子量を示すものの、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上では移動度が低く、コムギ胚芽の内因性タンパク質のバンドと分離されていない。
【実施例１１】
【００９８】
（コムギ胚芽抽出物を利用した透析法による連続式無細胞タンパク質合成）
コムギ胚芽抽出物を利用した連続式無細胞タンパク質合成の方法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）に準じておこない、精製コムギ胚芽の反応溶液をディスポダイアライザー（Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＣＥ  ，ＭＷＣＯ：２５ｋ，ｖｏｌｕｍｅ：０．５ｍｌ）に入れ、反応液の１０倍容量の透析外液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．６、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、４ｍＭ  ジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８ｍＭ  スペルミジン、Ｌ型アミノ酸２０種類（各０．３ｍＭ）、０．００５％ＮａＮ３、０．０５％ＮＰ−４０、Ｅ−６４、ＰＭＳＦ各１ｍＭ）に対しての透析系で、反応は摂氏２０度で静置条件下で行った。この方法で、分子量５，０００〜１３０，０００の種々のタンパク質を効率良く合成することができ、合成効率は反応容量１ｍｌ当たり０．３〜１．８ｍｇであった。また、合成反応を１００〜１４０ｒｐｍのスタラーによる撹拌条件下でおこなったところ、タンパク合成効率が静置条件下で行った場合と比較して低かった。図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）に、合成タンパク質として、ＧＦＰを合成した場合の電気泳動図を示す。図１４（Ａ）は無撹拌静置条件下であり、図１４（Ｂ）は１２０ｒｐｍでスタラ−により撹拌した場合である。矢印で示した電気泳動図のバンドの濃淡によって示されるＧＦＰ合成量の差異によって明白なように、撹拌条件下では、４８時間反応を継続しても合成量の増加はおこらなかった。かくして、小麦胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成系では、反応は静置条件下で行うことが必須であることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、効率的な無細胞タンパク質合成用翻訳鋳型ｍＲＮＡの５'末端および３'末端非翻訳配列の構築、ｍＲＮＡ転写用の汎用性のあるプラスミドの構築、高い翻訳鋳型活性を有するｍＲＮＡの合成方法、精製方法、および、これらを用いた実用的な無細胞タンパク質合成への応用例として連続式ｍＲＮＡ合成とコムギ胚芽抽出物を利用した連続式無細胞タンパク質合成との転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成手段、ならびに無細胞タンパク質合成手段を利用した複数タンパク質の共発現方法を開示した。本発明は、安価で容易且つ効率的なＲＮＡ合成を達成し、ひいては安価で容易且つ効率的な無細胞タンパク質合成手段の提供を達成した。本発明によれば、従来の大腸菌や昆虫細胞などを用いたタンパク質発現方法では得ることが困難であった、生体における機能を保持したタンパク質の合成を、簡便、且つ効率的に行うことができる。従って、本発明は、遺伝子機能の同定すなわち翻訳産物の機能や構造の解析、遺伝子多型と遺伝子機能の関係の解析、遺伝子機能のスクリーニング方法の構築、検査薬や治療薬剤の標的タンパク質のスクリーニングと同定、標的タンパク質を用いた薬剤の分子設計と有効性の検討などに利用することができ、医薬分野において寄与の高い極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調製に用いるコムギ胚芽を選別するための色と形状による選別基準を説明する図である。図１において、図（Ａ）は除去すべき白色を呈する小傷部分をもつ胚芽および茶や黒などの色をもつ胚芽を示し、図（Ｂ）は黄色の胚芽のみからなる無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽原料を示す。
【図２】汎用性および高効率翻訳鋳型機能を備えた無細胞タンパク質合成用鋳型分子合成プラスミド（ｐＥＵ１）の模式図である。
【図３】５'末端にＡＭＶ−Ω配列をもつｍＲＮＡに、３'末端非翻訳配列を結合させたｍＲＮＡを設計して合成し、これら鋳型分子のコムギ胚芽抽出物を利用した無細胞タンパク質合成反応における安定性を説明する図である。図３（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、直鎖型プラスミド、環状型プラスミドを用いて合成したｍＲＮＡの安定性を示す。
【図４】転写反応の合成効率を、従来のバッチ反応法（試験管内反応法）と透析膜を利用した新規連続反応法とで比較した結果を説明する図である。上図は反応経過に伴う転写産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、臭化エチジウム染色したものである。下図は合成されたｍＲＮＡ量を精製後の吸光度Ａ２６０ｎｍ値と、ゲル上のｍＲＮＡの蛍光強度と鋳型ＤＮＡの蛍光強度を内部標準とした蛍光強度比から求め、その経時変化を示した図である。また図中、（Ａ）は試験管内反応法を、（Ｂ）は血清アルブミンコーティングを施さない透析膜を、また（Ｃ）は血清アルブミンでコーティングした透析膜を用いた結果を示す。
【図５】透析法で合成した各種ｍＲＮＡの鋳型活性をバッチ式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で比較した図である。図中、★−★は環状型プラスミド（制限酵素未切断）から合成した５'末端にＡＭＶ−Ω配列、および３'末端に大腸菌ｄｈｆｒ遺伝子由来の３'ＵＴＲとポリ（Ａ）１００とを付加したｄｈｆｒ  ｍＲＮＡ、☆−☆は直鎖型プラスミド（制限酵素切断）から合成した同ｍＲＮＡ、また●−●は、直鎖型プラスミドを鋳型に合成した５'末端にＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを示す。縦軸はタンパク質に取り込まれた放射活性（ｄｐｍ／５μｌ）を、横軸は反応溶液中のｍＲＮＡの濃度を示す。
【図６】直鎖型と環状型プラスミドとを鋳型として合成した、５'ＡＭＶ−Ω構造を持つｍＲＮＡ分子種を用いて、透析膜を用いた連続式無細胞タンパク質合成を行った結果を示す図である。図６（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ環状型プラスミド、直鎖型プラスミドを鋳型として合成したｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いた場合のタンパク質合成の結果を示す。図６（Ｃ）は環状型プラスミドを鋳型としてｍＲＮＡをミクロスピンカラム中で合成した後、同反応容器を利用して遠心精製し、ミクロスピンカラムからこのｍＲＮＡを補集したフィルターを取りだして、このフィルターをタンパク質合成反応液を満たした透析膜内に添加した場合のタンパク質合成の結果を示す。図中、矢印は翻訳産物であるｄｈｆｒタンパク質を、星印は反応溶液中のクレアチンキナーゼをそれぞれ示している。
【図７】連続式ｍＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成の転写・翻訳非共役連続式一体化システムを説明する図である。図７（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、フィルターに補集した精製ｍＲＮＡを鋳型とする無細胞タンパク質合成方法と、透析膜を利用する転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を説明する。
【図８】連続式ＲＮＡ合成と連続式無細胞タンパク質合成の転写・翻訳非共役連続式一体化システムによるタンパク質合成の結果を説明する図である。図８（Ａ）は透析膜を利用する転写・翻訳非共役連続式無細胞タンパク質合成方法を用いた結果を、図８（Ｂ）はフィルターに補集した精製ｍＲＮＡを鋳型とする方法を用いた結果を示す。図中、矢印は翻訳産物であるｄｈｆｒを、星印は反応溶液中のクレアチンキナーゼをそれぞれ示している。
【図９】ＧＳＴとの融合型オステオポンチンの無細胞タンパク質合成用プラスミドの構造を示す模式図である。図９（Ａ）はＧＳＴと融合させたＣ３Ｈマウス由来のオステオポンチンをコードするＯＲＦを含むプラスミドであるｐＥＵ−ＧＳＴ−Ｃ３Ｈを、図９（Ｂ）はＧＳＴと融合させたＭＲＬマウス由来のオステオポンチンをコードするＯＲＦを含むプラスミドであるｐＥＵ−ＧＳＴ−ＭＲＬを示す。
【図１０】コムギ胚芽抽出物を使ったバッチ式無細胞タンパク質合成による、融合型オステオポンチンの合成結果を示す図である。
【図１１】合成された融合型オステオポンチンの分子量を確認したオートラジオグラムの図である。図中、Ｍは分子量マーカーである。
【図１２】コムギ胚芽抽出物を使った透析法での連続無細胞タンパク質合成により得られた融合型オステオポンチンをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後にクマシーブルー染色によって確認した図である。図中、Ｍは分子量マーカーである。レーンＴは合成された融合タンパク質（ＧＳＴ−ＯＰＮ）を含む総タンパク質の分離染色パターン、レーンＥは該合成された融合タンパク質を精製したもの、レーンＤは成熟型ＯＰＮタンパク質である。
【図１３】無細胞タンパク質合成により、５種類のタンパク質を共発現させた結果を示す図である。図１３（Ａ）は各タンパク質を別々に合成した結果と、各タンパク質のｍＲＮＡを混合して無細胞タンパク質合成した結果を示している。図中、ｄｈｆｒはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＧＦＰはグリーン蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｇ−ＯＰＮはＧＳＴ−オステオポンチン（ＧＳＴ−ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）融合タンパク質、ＬＵＣはルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を表す。また、−ｍＲＮＡはｍＲＮＡを使用せずに無細胞タンパク質合成反応を行った結果である。ＭＩＸは従来通りの方法であって、各ｍＲＮＡを混合して無細胞タンパク質合成を行った結果である。星印は、合成された各タンパク質を示している。図１３（Ｂ）は上記５種類のｍＲＮＡを個別にインキュベーション後に混合して無細胞タンパク質合成を行った結果を示す。Ｍは分子量マーカーである。
【図１４】無撹拌静置条件下で行った無細胞タンパク質合成反応〔図１４（Ａ）〕が、撹拌しながら行ったもの〔図１４（Ｂ）〕より合成効率が良いことを示した図である。図中、矢印は合成されたＧＦＰを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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