(57)【要約】      （修正有）【課題】  ＤＮＡを位置特異的に、しかも効率よく切断する方法の提供。【解決手段】ＤＮＡの切断方法は、標的ＤＮＡを、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることを含んでなる方法であって、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されることを特徴とする方法である。またこの方法の実施に使用できるキットも提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的となるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断する方法において、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とするＤＮＡの切断方法。
【請求項２】
該相補鎖Ａがハイブリダイズする標的ＤＮＡの５’末端領域と相補鎖Ｂがハイブリダイズする標的ＤＮＡの３’末端領域との間にギャップが存在し、かつ所望の切断点がギャップ中に存在することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡの切断方法。
【請求項３】
セリウム（ＩＶ）錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸の錯体であることを特徴とする、請求項１−２記載のＤＮＡ切断方法。
【請求項４】
該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３記載のＤＮＡ切断方法。
【請求項５】
該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする、請求項１〜３記載のＤＮＡ切断方法。
【請求項６】
標的となるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断する方法において、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【産業上の分野】
【０００１】  本発明は、ＤＮＡの特異的な切断方法およびキットに関し、更に詳細には人工的に作出された化学構造においてＤＮＡを特異的に切断する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】  ＤＮＡ鎖を任意の位置で切断する簡便な方法は、医学、分子生物学等、遺伝子を取り扱う諸分野において大きな役割を果たすことが期待されている。現在は、ＤＮＡを切断するのに制限酵素が広く使用されているが、制限酵素は塩基配列の特異性が低く、巨大なＤＮＡを特定の位置で選択的に切断することができない。また天然酵素を使用しないＤＮＡ切断法としては、これまでにも、ＤＮＡを金属イオンや金属イオン錯体で切断する試みがなされてきた。しかし、たとえばセリウム（ＩＶ）イオンがＤＮＡ切断能を持つことは知られているものの、塩基配列特異性はほとんどない。すなわち、巨大なＤＮＡを特定の位置で切断する方法はいまだ開発されていない。
【本発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明はＤＮＡを特定の位置で、しかも効率よく切断する方法の提供をその目的とする。本発明はまた、ＤＮＡを特異的に、しかも効率よく切断するキットの提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明の課題は、
（１）標的となるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断する方法において、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とするＤＮＡの切断方法。
（２）該相補鎖Ａがハイブリダイズする標的ＤＮＡの５’末端領域と相補鎖Ｂがハイブリダイズする標的ＤＮＡの３’末端領域との間にギャップが存在し、かつ所望の切断点がギャップ中に存在することを特徴とする（１）記載のＤＮＡの切断方法。
（３）セリウム（ＩＶ）錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸の錯体であることを特徴とする、（１）〜（２）記載のＤＮＡ切断方法。
（４）該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがＤＮＡであることを特徴とする、（１）〜（３）記載のＤＮＡ切断方法。
（５）該相補鎖Ａおよび該相補鎖Ｂの両方あるいはどちらかがペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする、（１）〜（３）記載のＤＮＡ切断方法。
（６）標的となるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることで標的ＤＮＡを切断する方法において、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されていることを特徴とするキットによって達成された。（１）項における核酸複合体の構造を図１および図２に示す。
【０００５】図１
【０００６】図２
【発明の詳細な説明】
【０００７】  本発明による第一の態様によれば、  標的となるＤＮＡ（標的ＤＮＡ）を、標的ＤＮＡの標的部分の５’末端領域に相補的な配列を持つ相補鎖Ａおよび標的ＤＮＡの標的部分の３’末端領域に相補的な相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることを含む標的ＤＮＡを切断する方法であって、相補鎖Ａの５’末端および／または相補鎖Ｂの３’端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入されることを特徴とする方法が提供される。
【０００８】  ここに相補鎖ＡおよびＢとは、ＤＮＡ，ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ、およびその誘導体であり、合成や取り扱いの容易さから好ましくはＤＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ここで、ＰＮＡは、アミド結合を主鎖に、核酸塩基を側鎖に持つ高分子であり、例えば、「生命化学のニューセントラルドグマ」（化学同人、平成１４年発行）の第６６ページに記載されているものを利用することができる。
【０００９】  相補鎖Ａの５’末端および相補鎖Ｂの３’末端にリン酸基またはこれを含有する誘導体が導入する際には、導入部分の構造は例えば図３のいずれかであることができる。
【００１０】図３
【００１１】  図３で、Ｘは酸素原子またはＣＨ２基を表す。また、ｍは１〜２０、好ましくは６−１２の整数、ｎは１〜１０、好ましくは３または４の整数、ｑおよびｒは０−５の整数であって最も好ましくは０である。
【００１２】  セリウム（ＩＶ）イオンは、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、硫酸セリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、硫酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物、過塩素酸セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物など、Ｃｅ（ＩＶ）イオンを含む水溶液であれば、いずれの形態で反応系に導入してもよいが、好ましくは硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）である。ＤＮＡ切断能を有するセリウム錯体は、例えばセリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸を水中で接触することにより得られる。ポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸としては、「金属キレート、Ｉ−ＩＶ」（南江堂、昭和４２年発行）に記載するものを利用することができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸、１，３−ジアミノプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１，４−ジアミノブタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−六酢酸、などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００１３】  核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることにより、標的ＤＮＡは切断される。得られた断片は、必要によりポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、またはＨＰＬＣにより精製できる。また、標的ＤＮＡにハイブリダイズしたアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸は慣用方法により分離してもよい。
【発明の具体的な説明】
【００１４】  以下に本発明の好ましい使用形態を示す。
（１）標的ＤＮＡを、５’末端にリン酸基を含有する相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることを含む標的ＤＮＡを切断する方法。
（２）標的ＤＮＡを、相補鎖Ａおよび３’末端にリン酸基を含有する相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることを含む標的ＤＮＡを切断する方法。
（３）標的ＤＮＡを、５’末端にリン酸基を含有する相補鎖Ａおよび３’末端にリン酸基を含有する相補鎖Ｂとハイブリダイズさせて核酸複合体を得、次いで核酸複合体をセリウム（ＩＶ）イオンまたはセリウム（ＩＶ）錯体と接触させることを含む標的ＤＮＡを切断する方法。
（４）相補鎖Ａがハイブリダイズする標的ＤＮＡの５’末端領域と相補鎖Ｂがハイブリダイズする標的ＤＮＡの３’末端領域との間にギャップが存在し、かつ所望の切断点がギャップ中に存在することを特徴とする方法。
（５）該セリウム（ＩＶ）が、硫酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）水溶液、塩化セリウム（ＩＩＩ）水溶液の酸化物であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの切断方法。
（６）該セリウム錯体が、セリウム（ＩＶ）とポリアミン−Ｎ−ポリカルボン酸との錯体であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの切断方法。
（７）相補鎖Ａがハイブリダイズする標的ＤＮＡの５’末端領域と、相補鎖Ｂがハイブリダイズする標的ＤＮＡの３’末端領域との間の距離、すなわちギャップの大きさは典型的には０〜１０塩基対、好ましくは２〜５塩基対、より好ましくは２および３塩基対であることを特徴とするＤＮＡの切断方法。
（８）相補鎖ＡおよびＢが少なくとも６塩基対、好ましくは少なくとも９塩基対である（１）〜（７）のＤＮＡの切断方法。
【００１５】  以下のようにＤＮＡ切断試験を実施したが、本発明は下記例に限定されるものではない。
【実施例】  修飾ＤＮＡの合成
リン酸修飾ＤＮＡの合成
市販試薬（グレンリサーチ社）を用いてＤＮＡ自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成した。５’−末端側のリン酸修飾は、化学リン酸化アミダイトモノマーを用いて行った。また、３’−末端側へのリン酸の導入は、リン酸化ＣＰＧを固定担体として用いることによって実施した。なお、非修飾ＤＮＡはシグマジェノシス社に合成を委託した。【００１６】ＤＮＡ切断反応
５’−末端を３２Ｐで標識した基質ＤＮＡ（ＤＮＡはシグマジェノシス社に合成を委託した）の１μＭ溶液（ＮａＣｌ  １００ｍＭ，ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ８．７５ｍＭ，ｐＨ７）に２本のリン酸修飾ＤＮＡ水溶液をそれぞれ終濃度２μＭとなるように加えた。９０℃で１分加熱し、室温まで徐冷して二本鎖を形成させた。ここに、Ｃｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡ水溶液を終濃度５００μＭとなるよう加え、３７℃で２〜９５時間反応させた。分析は、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で基質の切断を確認した。【００１７】結果
実験に用いた修飾ＤＮＡ配列（２０ｍｅｒ）およびＤＮＡ配列（５０〜４３ｍｅｒ）は図４に示す通りであった。【００１８】図４【００１９】ＤＮＡ切断試験（１）
下記のＤＮＡを準備し、「ＩＩ  ＤＮＡ切断反応」に記載された条件に従ってＤＮＡ（Ｄ５０）と反応させた（但し反応時間は１５時間であった）。結果は図５に示される通りであった。【００２０】図５【００２１】  レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ、レーン５：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０Ｒ、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０Ｒ、レーン７：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン８：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ。
２本のリン酸修飾ＤＮＡを用いた場合には、ギャップ部分で効率よく切断された（レーン８）（Ｍのレーンは、合成ＤＮＡの５’−末端を３２Ｐで標識した標準物のレーンであり、ギャップの部分はＭ２０とＭ３０の間の部分に相当）。
この切断のバンドを富士フィルム社製イメージングアナライザーＦｕｊｉｘＦＬＡ−３０００Ｇにて読み取りを行い、解析ソフトでバンドの濃さを計算した。その結果、ギャップでの切断効率は、約１０％であった。
また、１本のリン酸修飾ＤＮＡと１本を非修飾のＤＮＡを用いた場合においても（レーン６およびレーン７）、２本のリン酸修飾ＤＮＡを用いた場合とほぼ同じ強さの切断が観測された。
非修飾ＤＮＡを用いた場合（レーン５）では、ギャップ部分での選択的切断は見られるものの、その切断効率は非常に低いものであった。
以上のように、リン酸修飾ＤＮＡを用いて、基質ＤＮＡのギャップの両端にリン酸を導入することにより、ギャップ部位での切断の特異性が著しく向上する。
以下の理論に拘束されるわけではないが、リン酸部位で効率よくＣｅ（ＩＶ）／ＥＤＴＡを結合するために、ギャップ部位での切断が実現するものと思われる。【００２２】ＤＮＡ切断実験（２）
下記のＤＮＡを準備し、「ＩＩ  ＤＮＡ切断反応」に記載された条件に従ってＤＮＡ（Ｄ４５）と反応させた（但し反応時間は９５時間であった）。結果は図６に示される通りであった。【００２３】図６【００２４】  レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０Ｌ＋Ｄ２０Ｒ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ、レーン５：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０ＲＳ３、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３。
末端リン酸とＤＮＡとの間にリンカーを持つリン酸修飾ＤＮＡを２本用いてギャップを形成させた場合には、ギャップ部分で効率よく切断された（レーン６）
この切断のバンドを富士フィルム社製イメージングアナライザー  ＦｕｊｉｘＦＬＡ−３０００Ｇにて読み取りを行い、解析ソフトでバンドの濃さを計算した。その結果、ギャップでの切断効率は、約２５％であった。
また、１本のリン酸修飾ＤＮＡと１本を非修飾のＤＮＡを用いた場合においても（レーン４およびレーン５）、ギャップ選択的切断が観測され、その切断効率は１５〜２０％であった。
一方、非修飾ＤＮＡを用いた場合（レーン３）では、ギャップ部分での選択的切断は見られるものの、その切断効率は低く、効率は約５％であった。
以上のように、リンカーの先にリン酸の先にリン酸を導入しても、効率的な切断が実現する。【００２５】ＤＮＡ切断実験（３）
下記のＤＮＡを準備し、「ＩＩ  ＤＮＡ切断反応」に記載された条件に従ってＤＮＡ（Ｄ４５）と反応させた（但し反応時間は４８時間であった）。結果は図７に示される通りであった。【００２６】図７【００２７】  レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン５：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１。レーン７：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０Ｌ  Ｓ２＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ２、レーン８：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ２＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ２。レーン９：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１、レーン１０：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１。レーン１１：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３、レーン１２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３。レーン１３：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０Ｌ  Ｓ４＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ４、レーン１４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ４＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ４。
様々なリンカーを用いた場合においても、ギャップ部位での効率的切断が実現した。この切断のバンドを富士フィルム社製イメージングアナライザーＦｕｊｉｘ  ＦＬＡ−３０００Ｇにて読み取りを行い、解析ソフトでバンドの濃さを計算した。
その結果、ギャップでの切断効率は、約１０〜１５％であり、いずれのリンカーを用いても同程度の切断効率であった。
以上のように、様々な長さのリンカーの先にリン酸の先にリン酸を導入しても、効率的な切断が実現する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第一の態様において形成される核酸複合体を示す。
【図２】本発明の第一の態様において形成される核酸複合体であって、標的ＤＮＡの５’末端から３’末端までの部分が標的部分であるものを示す。
【図３】リン酸基またはその誘導体を相補鎖Ａおよび相補鎖Ｂに結合する形態。
【図４】実施例で使用した反応基質ＤＮＡ、ならびに相補鎖ＡおよびＢの構造。
【図５】ＤＮＡ切断試験（１）の結果を示す。レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ、レーン５：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０Ｒ、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０Ｒ、レーン７：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン８：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ。
【図６】ＤＮＡ切断試験（２）の結果を示す。レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０Ｌ＋Ｄ２０Ｒ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ、レーン５：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ＋Ｄ２０ＲＳ３、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３。
【図７】ＤＮＡ切断試験（３）の結果を示す。レーン１：未処理、レーン２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体のみ、レーン３、Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＰ＋Ｄ２０ＲＰ、レーン５：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１、レーン６：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１。レーン７：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ２＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ２、レーン８：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ２＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ２。レーン９：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１、レーン１０：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ１＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ１。レーン１１：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３、レーン１２：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０ＬＳ３＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ３。レーン１３：ＥＤＴＡ錯体の不在のもとでのＤ２０Ｌ  Ｓ４＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ４、レーン１４：Ｃｅ（ＩＶ）・ＥＤＴＡ錯体とＤ２０Ｌ  Ｓ４＋Ｄ２０Ｒ  Ｓ４。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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