(57)【要約】【課題】  コモチクダホコリ（Tubiferadimorphotheca）由来の新規化合物であるツビフェラールＡおよびツビフェラールＢを提供する。【解決手段】  下記（１）式で示されるツビフェラールＡ及び下記（２）式で示されるツビフェラールＢ。【化１】2005306838.tif 000011【化２】2005306838.tif 000012【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）式で示されることを特徴とするツビフェラールＡ。
【化１】
2005306838.tif 000009
【請求項２】
下記（２）式で示されることを特徴とするツビフェラールＢ。
【化２】
2005306838.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物であるツビフェラールＡおよびツビフェラールＢに関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀となった現在でも、地球上の人口の６割以上の人は、ふだんの病気や怪我の治療に、身近な自然の中にある植物や菌類（キノコなど）あるいはそれ由来の生薬を用いていると言われている。また、一方では、現在病院や家庭で使われている医薬品の中には、もともと天然の動植物、微生物などの体の中に含まれる化学成分として見つけ出されたもの（以下、「天然物」と言う）が沢山ある。また、天然の化学成分を原形として化学構造に改良を加えることにより、元の天然物よりも更に有効で安全な合成化合物も数多く開発されている。このように新しい有用な天然物を探すという研究（以下、「ものとり」と言う）は、薬を創り出す出発点とも言うべき大変重要なことと位置づけることができる。
【０００３】
しかしながら、地球上の全ての生物種の中で、これまでに有効成分を探すための材料として研究されたものは未だ１０％にも満たないと言われている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上述した事情に鑑み、天然の動植物、微生物などに含まれる新規の化学成分を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、人間と地球環境との共存・保全の立場を十分尊重しつつ、未利用資源の開発と有効成分の探索研究に力を注いで、野外採取した変形菌の子実体であるコモチクダホコリ（Tubifera dimorphotheca）の成分研究を行い、新規化合物を見出した。なお、今までに野外採取した変形菌の子実体であるコモチクダホコリの成分研究はなされていなかった。
【０００６】
かかる本発明の第１の態様は、下記（１）式で示されることを特徴とするツビフェラールＡにある。
【０００７】
【化１】
2005306838.tif 000002
【０００８】
本発明の第２の態様は、下記（２）式で示されることを特徴とするツビフェラールＢにある。
【０００９】
【化２】
2005306838.tif 000003
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、コモチクダホコリ（Tubifera
dimorphotheca）由来の新規化合物であるツビフェラールＡおよびツビフェラールＢを提供することができる。この新規化合物は有用な生物活性が期待でき、大いに有用な医薬品となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の新規化合物は、上記（１）式で表されるツビフェラールＡ（Ｔｕｂｉｆｅｒａｌ  Ａ：以下「ＴＤ−１」とも略称する）および上記（２）式で表されるツビフェラールＢ（Ｔｕｂｉｆｅｒａｌ  Ｂ：以下「ＴＤ−２」とも略称する）である。このツビフェラールＡおよびツビフェラールＢは、コモチクダホコリから単離することにより製造することができる。例えば、野外採取した変形菌の子実体であるコモチクダホコリから９０％メタノールおよび９０％アセトンを溶媒として成分を抽出し、分画することにより得ることができ、その方法は限定されない。また、合成してもよい。
【００１３】
本発明のツビフェラールＡおよびツビフェラールＢは、細胞毒性物質として利用できる。テルペノイド系天然物は、ヒト子宮頸がんＨｅＬａ細胞やマウス白血病細胞Ｐ３８８等の腫瘍細胞に対する細胞毒性を示すものが多く、特にツビフェラールＡの場合分子内にラクトン構造をもつテルペノイドであり、しかも従来前例のない新規化学構造を有するため、新規細胞毒性物質としての有用性が期待される。
【００１４】
以下、本発明について実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００１５】
（実施例）
野外採取したコモチクダホコリ（３．７ｇ）を、９０％メタノール（１００ｍＬ）で２回、続いて９０％アセトン（１００ｍＬ）で１回、ホモジナイザーで粉砕しながら、室温で約１０分ずつ抽出し、溶媒を留去して、抽出物３０５．０ｍｇを得た。この抽出物を２０％メタノール（約１０ｍＬ）に溶解し、下記の条件でカラムクロマトグラフィーにかけ、各成分を分取した。なお、展開溶媒は（ａ）〜（ｆ）の順に流した。
【００１６】
＜ＯＤＳ  ｆｌａｓｈ  ｃ．ｃ．＞
分離用担体：ＯＤＳ（オクタデシルシラン）、直径２０ｍｍ×長さ２００ｍｍ
展開溶媒
（ａ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／４
（ｂ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／１
（ｃ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝４／１
（ｄ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／０
（ｅ）ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝１／１及び１／０
（ｆ）ＣＨＣｌ３／Ａｃｅｔｏｎｅ＝１／１及び０／１
【００１７】
各展開溶媒で分取された成分１Ａ〜１Ｆについて、ＯＤＳ  ＴＬＣ，９０％ＭｅＯＨを用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。ＴＬＣ結果から判断して新規化合物が含まれている可能性のあった成分１Ｃ（（ｃ）の溶離液で分取された成分）２０．９ｍｇのうち１６．５ｍｇをメタノールに溶解し、さらに下記の条件でＨＰＬＣにかけた。
【００１８】
＜Ｐｒｅｐ．  ＯＤＳ−ＨＰＬＣ＞
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（野村化学社製、直径２０ｍｍ×長さ２５００ｍｍ）
移動層：７５％ＭｅＯＨ
流速：８．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ
【００１９】
これにより、４番目の成分（保持時間Ｒｔ３２．０分：図１中３Ｄと記載）としてＴＤ−１（ツビフェラールＡ）を０．８ｍｇ得た。また、分取した１番目の成分（保持時間Ｒｔ７．０〜１１．０分：図１中３Ａと記載）９．９ｍｇをメタノールに溶解し、さらに下記条件でＨＰＬＣにかけた。
【００２０】
＜Ｐｒｅｐ．  ＯＤＳ−ＨＰＬＣ＞
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（野村化学社製、直径１０ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）
移動層：６５％ＭｅＯＨ
流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出波長：２５４ｎｍ
【００２１】
これにより、２番目の成分（保持時間Ｒｔ１３．０分：図１中４Ｂと記載）としてＴＤ−２（ツビフェラールＢ）を１．２ｍｇ得た。図１に分画フロー及び各分取成分の収量を示す。なお図１において、分取した成分を分取した順に左から記載し、１Ａ〜１Ｆ、３Ａ〜３Ｆ、４Ａ〜４Ｄという番号を付した。
【００２２】
得られたＴＤ−１およびＴＤ−２について、ＴＬＣのＲｆ値を測定した。なお測定には、ＯＤＳ  ＴＬＣ，９０％ＭｅＯＨを用いた。その結果Ｒｆ値は、ツビフェラールＡが０．３９で、ツビフェラールＢが０．６４であった。この結果から、ツビフェラールＢはツビフェラールＡよりも極性が高い化合物であることがわかった。
【００２３】
また、得られたＴＤ−１およびＴＤ−２について、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ、比旋光度、メタノール中でのＵＶ吸収スペクトル、ＩＲを測定した。各結果を外観とともに表１に、ＴＤ−１のメタノール中でのＵＶ吸収スペクトル（測定溶液の濃度：１．２４×１０―５ｍｏｌ／Ｌ）を図２に、ＴＤ−２のメタノール中でのＵＶ吸収スペクトル（測定溶液の濃度：２．０×１０―５ｍｏｌ／Ｌ）を図３に示す。
【００２４】
【表１】
2005306838.tif 000004
【００２５】
次に、ツビフェラールＡの構造解析を行った。具体的には、１Ｈ  ＮＭＲ，１３Ｃ  ＮＭＲ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣスペクトル、およびＨＭＢＣスペクトルを測定することにより、図５に示した平面構造を決定した。表２に、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの化学シフト値を、図４に１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。なお、表２のＮｏ．は、（１）式に付した番号に対応する。また、図５に、平面構造、二次元ＮＭＲスペクトルの手法である１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルおよびＨＭＢＣスペクトルにおいて観測された相関データを示す。
【００２６】
【表２】
2005306838.tif 000005
【００２７】
また、二次元ＮＭＲスペクトルの手法の一つであるＮＯＥＳＹスペクトルを測定した。図６に、ＮＯＥＳＹスペクトルにおいて観測された相関データを示す。
【００２８】
上記のデータから、相対立体配置を含めたツビフェラールＡの化学構造を下記（１）式のように決定した。この結果、９，１０−ｓｅｃｏ−ｃｙｃｌｏａｒｔａｎｅ骨格を有する化合物であることが明らかとなった。
【００２９】
【化３】
2005306838.tif 000006
【００３０】
次に、ツビフェラールＢの構造解析を行った。具体的には、１Ｈ  ＮＭＲ，１３Ｃ  ＮＭＲ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ，  ＨＭＱＣスペクトル、およびＨＭＢＣスペクトルの測定をした。表２に、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの化学シフト値を、図７に１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。なお、表２のＮｏ．は、（２）式に付した番号に対応する。
【００３１】
また、ツビフェラールＢの測定結果をツビフェラールＡと比較すると次の知見が得られた。
（ｉ）ＵＶスペクトルパターンおよび一次元ＮＭＲスペクトルがツビフェラールＡのものと類似していたことから、ツビフェラールＢはツビフェラールＡの類縁体であることが考えられた。
（ｉｉ）ツビフェラールＢの分子式がツビフェラールＡよりもＨ２Ｏが１分子増えたことと、ツビフェラールＡよりもツビフェラールＢの極性が高くなっていることから、ツビフェラールＡのラクトン部分が開環し、カルボン酸と水酸基になったのではないかと推測された。
【００３２】
この知見及び各種ＮＭＲスペクトルの解析によって導き出された部分構造より、ツビフェラールＢの平面構造を図８および下記式（２）のように推定した。なお、図８は、ツビフェラールＢの平面構造、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルおよびＨＭＢＣスペクトルにおいて観測された相関データを示す図である。
【００３３】
【化４】
2005306838.tif 000007
【００３４】
また上記の知見を確かめるべく、ツビフェラールＡを２ＮのＫＯＨにて室温（２５℃）で終夜（約１２時間）撹拌し、ＴＬＣ分析を行ったところ、ツビフェラールＢの生成を確認でき、上記の知見の信頼性が極めて高いことを確認した。なおＴＬＣ分析の条件は、各展開溶媒で分取された成分１Ａ〜１Ｆについて行った条件と同じくＯＤＳ  ＴＬＣ，９０％ＭｅＯＨとした。
【００３５】
また、上記ツビフェラールＡ及びＢの効果を確かめるべく、これらのヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性試験を行った。
細胞毒性試験は、細胞を培養した後細胞生存率をＭＭＴ法によって決定した。なおここにおいて細胞の培養は、９６穴プレート１ウェルあたり細胞１９５μｌを播採し、これをＣＯ２インキュベータ内で５％ＣＯ２−９５％空気の雰囲気下、３７℃で２４時間培養し、サンプル溶液５μｌ加え、ＣＯ２インキュベータ内で更に３７℃で７２時間培養することにより行った。
またこの試験において用いた腫瘍細胞はビンクリスチン耐性のヒト上皮癌細胞ＫＢ／ＶＪ−３００、ヒト前立腺癌細胞ＬＮＣａＰであり、かつそれらはいずれも１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地中で維持されているものを用いた。なお上記９６穴プレートに播採した細胞の濃度は、ＫＢ／ＶＪ−３００細胞の場合１．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、ＣＮＣａＰ細胞の場合２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。また本試験は、ＫＢ／ＶＪ−３００細胞に対しては、１００ｎｇ／ｍｌのビンクリスチン存在下（ＶＣＲ（＋））及び非存在下（ＶＣＲ（−））で行っている。本実験の陽性対照としてベラパミル、シスプラチンを用いた。この結果を表３に示す。
【表３】
2005306838.tif 000008
上記の結果から、ツビフェラールＡは、ビンクリスチン耐性のＫＢ／ＶＪ−３００に対し、ビンクリスチン存在下においてＩＣ５０値２．７ｍｌで細胞毒性を示した。
以上、この結果によりツビフェラールＡがビンクリスチン耐性克服作用を持つことを示すことが確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例の分画フロー及び各分取成分の収量を示す図である。
【図２】ツビフェラールＡのメタノール中でのＵＶ吸収スペクトルの測定結果である。
【図３】ツビフェラールＢのメタノール中でのＵＶ吸収スペクトルの測定結果である。
【図４】ツビフェラールＡの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果である。
【図５】ツビフェラールＡの平面構造、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル及びＨＭＢＣスペクトルにおいて観測された相関データを示す図である。
【図６】ツビフェラールＡのＮＯＥＳＹスペクトルにおいて観測された相関データを示す図である。
【図７】ツビフェラールＢの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの測定結果である。
【図８】ツビフェラールＢの平面構造、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルおよびＨＭＢＣスペクトルにおいて観測された相関データを示す図である。
【図１】
2005306838.tif 000013
【図２】
2005306838.tif 000014
【図３】
2005306838.tif 000015
【図４】
2005306838.tif 000016
【図５】
2005306838.tif 000017
【図６】
2005306838.tif 000018
【図７】
2005306838.tif 000019
【図８】
2005306838.tif 000020