(57)【要約】【課題】本発明は、トランスジェニック植物および植物組織における組換え核酸配列の発現を向上させるための方法、ベクターおよび遺伝子構築物を提供する。【解決手段】本発明によれば、核酸配列が、オスモチンタンパク質をコードする遺伝子の５’および３’非翻訳領域から得られ、かつ／または由来し、ベクターの選択されたコーディング領域のそれぞれの部分に隣接するように加工される。ベクター構築物は、従来の手順により植物および／または植物組織中に導入することができ、それにより、選択されたコーディング領域の発現が向上する。好ましい実施態様において、選択されたコーディング領域は、トランスジェニック植物および／または植物組織に、あるレベルの殺虫活性を賦与することが知られている一または二以上のタンパク質を発現するキメラ遺伝子または遺伝子断片である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群より選択されるＵＴＲの一または二以上に機能的に結合している少なくとも一つの目的の構造遺伝子を含んでなる核酸構築物、およびいずれかの誘導体または機能的等価物。
【請求項２】
少なくとも一つの目的の構造遺伝子が、植物に非天然表現型を与えることができる遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
少なくとも一つの目的の構造遺伝子が、植物に殺虫剤または除草剤抵抗性を与えることができる遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
少なくとも一つの目的の構造遺伝子が、配列番号６、７、８、９および１０からなる群より単離され、またはこれらに由来する昆虫耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
少なくとも一つの目的の構造遺伝子が、配列番号５またはその誘導体を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸構築物で形質転換した植物または植物細胞。
【請求項７】
さらに、少なくとも一つの目的の遺伝子と積み重ねられた別の目的の構造遺伝子を含む、請求項６に記載の植物または植物細胞。
【請求項８】
別の目的の構造遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３からなる群より選択されるＵＴＲおよびいずれかの誘導体または機能的等価物の一または二以上に機能的に結合している、請求項７に記載の植物または植物細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸構築物を含んでなるベクター。
【請求項１０】
オスモチンＵＴＲ因子からなる核酸配列を、目的の構造遺伝子に機能的に結合することを含んでなる、ペプチドまたはタンパク質を組換え的に生成する方法。
【請求項１１】
核酸構築物を作製するために、配列番号１〜３の少なくとも一つを含んでなるオスモチンＵＴＲ因子からなる少なくとも一つの核酸配列を、目的の構造遺伝子に結合し；植物細胞をその核酸構築物で形質転換し；および形質転換細胞を、目的の構造遺伝子が発現される条件下で成長させることを含んでなる、植物細胞中の遺伝子の発現を増加させる方法。
【請求項１２】
目的の遺伝子および、少なくとも、オスモチン遺伝子の５’および３’ＵＴＲからなる群より選択されるＵＴＲを含んでなる組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
非相同性遺伝子に機能的に結合しているオスモチン遺伝子の５’ＵＴＲ、またはその誘導体。
【請求項１４】
非相同性遺伝子に機能的に結合しているオスモチン遺伝子の３’ＵＴＲ、またはその誘導体。
【請求項１５】
オスモチン遺伝子から単離され、またはこれに由来する５’および／または３’ＵＴＲを含んでなり、５’および／または３’ＵＴＲは目的の構造遺伝子に機能的に結合している、組換え核酸構築物。
【請求項１６】
５’および／または３’ＵＴＲが、タバコかのオスモチン遺伝子に由来する、請求項１５に記載の組換え核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物分子生物学および、植物への遺伝子工学技術の適用に関する。より具体的には、本発明は、植物における組換え遺伝子の発現の向上に有用なＤＮＡ配列、構築物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学は、所望のＤＮＡ配列を植物細胞に導入して目的のタンパク質を発現させることを通常的に可能にした。しかしながら、市場的に実行可能な形質転換に関して、重要な作物において所望のレベルの安定で予想可能な発現を得ることは依然として困難である。
【０００３】
作物において所望のレベルで非相同性遺伝子を発現させる一つの方法は、植物において発現を支配する調節機能を操作することである。この調節は、転写時または転写後のものでよく、例えば、ＤＮＡの転写を向上、制限または抑制する機構、並びにｍＲＮＡがつくられた後にその寿命を制限または増加させる機構を含み得る。この調節過程に含まれるＤＮＡ配列は、遺伝子のタンパク質産物をコードする構造ＤＮＡ配列の上流、下流に、またはその内部にさえ配することができる。
【０００４】
トランスジェニック植物における転写を調節するために、種々の型のプロモーターが用いられる。プロモーターは、元々そこに由来する遺伝子の発現パターンに類似の様式でトランスジェニック植物において外来遺伝子の発現を制御するために用いられる。通常、プロモーターは二つのカテゴリーに分類される。「構成的」プロモーターは、殆どの組織において殆どの時間発現している。構成的プロモーターからの発現は、発生の過程を通して、ほぼ定常状態レベルにある。ハウスキーピング機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、しばしば構成的プロモーターにより誘導される。トウモロコシで構成的に発現している遺伝子の例としては、アクチンおよびユビキチンがあげられる。（Wilminkら、Plant Mol.Biol．、第２８巻：９４９〜９５５頁、１９９５年）。「調節された」プロモーターは、典型的に、ある組織型だけで（組織特異的プロモーター）、あるいは発生過程のある時期に（一過性プロモーター）、発現する。
【０００５】
転写のさらなる向上は、プロモーターの上流（５’）に「エンハンサー」配列を置くことにより、トランスジェニック植物において得られた。エンハンサー因子はシス作用性で、エンハンサーの上流位置および方向性に比較的依存せずに、そのプロモーターに近接する遺伝子の転写のレベルを増加させる。そのような配列は、ウイルス、細菌および植物遺伝子を含む種々の材料から単離された。充分に特性がわかっているエンハンサー配列の一例は、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，８３７，８４９号、第５，７１０，２６７号および第５，５７３，９３２号に記載の、Agrobacterium tumefaciensのオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）エンハンサーである。この短い（４０ｂｐ）配列が、トウモロコシを含む双子葉植物および単子葉植物における遺伝子発現レベルを著しく増加させることが示された。このエンハンサーの縦列反復は、トウモロコシにけるＧＵＳ遺伝子の発現を８倍増加させることが示された。これらのエンハンサー配列がどのように機能するかは不明のままである。おそらく、エンハンサーがアクチベータータンパク質を結合し、それによりＴＡＴＡボックスへのＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を容易にすると考えられる。ＷＯ９５／１４０９８は、トランスジェニックタバコカルスにおけるＧＵＳ遺伝子の遺伝子発現を数１００倍増加させることになる、ｏｃｓエンハンサーとｍａｓ（マンノピンシンターゼ）エンハンサーの種々の複合組み合わせの試験について記載している。
【０００６】
しかしながら、一または二以上のエンハンサーを用いるまたは用いないで特定のプロモーターを用いることは、植物における所望のレベルの遺伝子発現を必ずしも保証しない。所望の転写レベルに加えて、不適当なスプライシング、ポリアデニル化および核輸出のような他の因子が、ｍＲＮＡおよび目的のタンパク質の両方の蓄積に影響を与え得る。従って、当該分野において、転写後調節の機構によりＲＮＡ安定性および翻訳効率を増加させる方法が必要とされている。
【０００７】
転写後調節に関して、真核生物ｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が、翻訳効率およびＲＮＡ安定性のそれぞれにおいて主要な役割を果たすことが示された。例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）コートタンパク質のｍＲＮＡの５’および３’ＵＴＲは、タバコ植物において遺伝子発現をそれぞれ５．４倍および３．０倍向上させることができる。（Zeyenko、FEBS Lett.、１１月１４日；第３５４（３）巻：２７１〜３頁（１９９４年））。トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ−１（ａｄｈ１）遺伝子の５’および３’ＵＴＲは、低酸素状態プロトプラストにおける効率的翻訳のために必要とされている。（Bailey-Serresら、Plant Physiol．、１０月；第１１２（２）巻：６８５〜９５頁（１９９６年））。
【０００８】
種々の５’ＵＴＲリーダー配列を用いた実験は、５’ＵＴＲの種々の構造的特徴が翻訳効率レベルと関連付けることができることを示している。ある５’ＵＴＲが、開始部位においてＡＵＧコドンをスキャンする場合に４０Ｓリボソームサブユニットと相互作用し、翻訳速度を低下させるＡＵＧコドンを含むことがわかった（Kozak、Mol.Cell.Biol．、第７巻：３４３８頁（１９８７年）；Kozak、J.Cell Biol．、第１０８巻：２０９頁（１９８９年））。さらに、ｍＲＮＡ上のＡＵＧ開始部位と隣接する５’ＵＴＲヌクレオチド配列が、翻訳効率に影響を与える。隣接５’ＵＴＲの状態が好ましくない場合、４０Ｓリボソームサブユニットは翻訳開始部位を認識することができず、その結果ポリペプチド合成速度が遅くなる（Kozak、J.Biol.Chem．、第２６６巻：１９８６７〜１９８７０頁（１９９１年）；Pain、Eur.J.Biochem．、第２３６巻：７４７〜７７１頁（１９９６年））。５’ＵＴＲの二次構造（例えば、ヘアピン形成）はまた、スキャンニングプロセス中に４０Ｓリボソームサブユニットの動きを妨げ、その結果、翻訳効率に負の影響を与える（Sonenbergら、Nature、第３３４巻：３２０頁（１９８８年）；Kozak、Cell．、第４４巻：２８３〜２９２頁（１９８６年））。５’ＵＴＲ配列の相対的ＧＣ含量は、潜在的二次構造の安定性の指標であり、高レベルのＧＣは不安定性を示すことが示された（Kozak、J.Biol.Chem．、第２６６巻：１９８６７〜１９８７０頁（１９９１年））。より長い５’ＵＴＲは、より多数の阻害的二次構造を示す（Sonenbergら、１９９６年）。すなわち、所定の５’ＵＴＲの翻訳効率はその特定の構造に高度に依存し、リーダー配列の最適化は、向上した翻訳開始効率の直接の結果として遺伝子発現を向上させることが示された。さらに、植物ウイルスまたはヒートショック遺伝子のリーダー配列の付加により、遺伝子発現が著しく増加する（Rajuら、Plant Science、第９４巻：１３９〜１４９頁（１９９３年））。
【０００９】
５’ＵＴＲ配列に加えて、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（トレーラー）配列も、遺伝子発現に含まれる。３’ＵＴＲ（ポリアデニル化因子またはアデニル化制御因子としても知られている）は、核輸出、ポリアデニル化状態、細胞以下のターゲッティングおよび、ＲＮａｓｅからのｍＲＮＡの翻訳およびＲＮａｓｅによるｍＲＮＡの分解の速度を制御することが知られている。特に、３’ＵＴＲは、エキソリボヌクレアーゼへのバリアとして作用するステム−ループ構造に折り畳むことができると共にＲＮＡ安定性を促進することが知られているタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用する一または二以上の逆位反復を含み得る（Barkenら、A Look Beyond Transcription:Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants,American Society of Plant Physiologists,Rockville,MD、１６２〜２１３頁（１９９８年））。しかしながら、３’ＵＴＲ中に見つかる特定の因子は、ＲＮＡを不安定化させ得る。植物中に存在する一つのそのような例が、small auxin up RNA（ＳＡＵＲ）中に見出されるＤＳＴ因子である（Gilら、EMBO J．、第１５巻：１６７８〜１６８６頁（１９９６年））。いくつかの３’ＵＴＲの別の不安定化の特徴は、ＡＵＵＵＡペンタマーの存在である（Ohme−Takagiら、Pro.Nat.Acad.Sci.USA、第９０巻：１１８１１〜１１８１５頁（１９９３年））。
【００１０】
３’ＵＴＲは、幾つかのトウモロコシ遺伝子の遺伝子発現において重要な役割を果たすことが示された。具体的には、２００塩基対の３’配列が、葉肉細胞中のリブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子（ｒｂｃ／ｍ３）のトウモロコシのスモールｍ３サブユニットの光誘導の促成の原因となることが示された（Viretら、Proc Natl Acad Sci.USA、第９１（１８）巻：８５７７〜８１頁（１９９４年））。植物、特にトウモロコシにおいて、この配列はあまり保存されていない。植物の遺伝子工学において頻繁に用いられる一つの３’ＵＴＲは、ノパリンシンターゼ遺伝子（３’ｎｏｓ）に由来するものである（Wyattら、Plant Mol Biol、第２２（５）巻：７３１〜４９頁（１９９３年））。
【００１１】
アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のようなある種の植物ウイルスにおいて、高度に構築された３’ＵＴＲは複製に必須であり、幾つかの高親和性コートタンパク質結合部位を含むステム−ループ構造の直線配列に、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるｔＲＮＡ様部位に折り畳むことができる（Olsthoornら、EMBO J1；．第１８（１７）巻：４８５６〜６４頁（１９９９年）；Zeyenkoら（１９９４年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、本発明までに、トランスジェニック植物中において、組換え核酸の発現を調節するために５’および３’ＵＴＲを使用することは、最適／最適化されたＵＴＲ配列がまだ同定または特性が調べられていないことが主な理由で、広まっていない。従って、最適な／最適化された５’および３’ＵＴＲを用いて遺伝子発現を調節するための新規な方法および組成物が、当該分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要約
本発明は、トランスジェニック植物および植物組織における組換え核酸配列の発現を向上させるための方法、ベクターおよび遺伝子構築物を提供する。本発明によれば、核酸配列はオスモチンタンパク質をコードする遺伝子の５’および３’非翻訳領域から得られ、および／または誘導され、そして処理されてベクターの選択されたコーディング領域の隣接部分になる。ベクター構築物は、従来の手順により植物および／または植物組織に導入され、選択されたコーディング領域の発現の向上をもたらす。好ましい実施態様において、選択されたコーディング領域は、トランスジェニック植物および／または植物組織にあるレベルの殺虫活性を賦与することが知られている一または二以上のタンパク質を発現するキメラ遺伝子または遺伝子断片である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、タバコオスモチン遺伝子から単離された、またはそれに由来する５’および／または３’ＵＴＲ領域を用いて細胞、組織または生物を遺伝的に改変するための組成物および方法を提供する。本発明の５’および／または３’ＵＴＲ領域は、目的の構造核酸に隣接する場合、トランスジェニック植物において、目的の構造遺伝子のｍＲＮＡ安定性を向上させるおよび／または翻訳効率を上昇させる。すなわち、本発明は、経済的または研究的価値のある表現型を発現させるための植物の遺伝子加工を容易にする。
【００１５】
オスモチンは、タバコ（Nicotiana tabacum）細胞の浸透圧ストレスへの適応の際に、高度に蓄積される小さな（２４ｋＤａ）、塩基性の病因関連タンパク質であり、全可溶性タンパク質の約１２％を占める。タバコにおいて、二つのオスモチンが記載され、オスモチン−Ｉは水溶性で、オスモチン−ＩＩは界面活性剤に可溶性で、それぞれ比較的プロテアーゼに耐性である。タバコの両オスモチンは、約２４ｋＤの分子量を有し、タバコの２４ｋＤオスモチン様タンパク質（Lycopersicon esculentum）並びに、Thaumatococcus denielliiのタウマチン、タバコの病因関連タンパク質Ｓ（ＰＲ−Ｓ）、およびトウモロコシの二機能性トリプシン／α−アミラーゼ阻害因子を含む他のタンパク質に対し、大きなアミノ酸配列同一性および類似性を示す。
【００１６】
オスモチン遺伝子の発現は、水不足、塩度、ウイルス感染および傷害から生じるような種々のストレス関連シグナルにより誘導される。（Ｓｉｎｇｈら、Plant Physiol、第８５巻：５２９〜５３６頁（１９８７年）；Ｓｉｎｇｈら、Plant Physiol、第９０巻：１０９６〜１１０１頁（１９８９年）；Ｓｉｎｇｈら、NATO ASI Series、Ｇ１９、６７〜８７頁「Environmental Stress in Plants」、Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｒｒｙ編、（１９８９年）；ＬａＲｏｓａら、Plant Physiol、第９１巻：８５５〜８６１頁（１９８９年）；Ｍｅｅｋｓ−Ｗａｇｎｅｒら、Plant Cell、第１巻：２５〜３５頁（１９８９年）；Ｇｒｏｓｓｅｔら、Plant Physiol、第９２巻：５２０〜５２７頁（１９９０年）；Ｎｅａｌｅら、Plant Cell、第２巻：６７３〜６８４頁（１９９０年）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、J.Gen.Microbiol、第１３６巻：１７７１〜１７７８頁（１９９０年）；Ｓｔｉｎｔｚｉら、Physiol.Mol.Plant Pathol、第３８巻：１３７〜１４６頁（１９９１年）；Ｗｏｌｏｓｈｕｋら、Plant Cell、第３巻：６１９〜６２８頁（１９９１年）；Ｓｉｎｇｈら、Plant Physiol、第７９巻：１２６〜１３７頁（１９８５年）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら、Nature、第３２７巻：４３２〜４３４頁（１９８７年）；Ｂｏｌ  Temporal and Spatial Regulation of Plant Genes，Ｄ．Ｐ．Ｓ．ＶｅｒｍａおよびＲ．Ｂ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）編（New York:Springer-Verlag）２０１〜２２１頁（１９８８年）；Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅら、Mol.Biol.、第１７巻：１１１７〜１１２５頁（１９９１年）；Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ，Crit.Rev.Plant Sci.、第１０巻：１２３〜１５０頁（１９９１年）；ＬａＲｏｓａら、Plant Physiol、第７９巻：１３８〜１４２頁（１９８５年）；ＬａＲｏｓａら、Plant Physiol、第８５巻：１７４〜１８５頁（１９８７年）；Ｓｉｎｇｈら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第８４巻：７３９〜７４３頁（１９８７年）；を参照）。
【００１７】
オスモチンｍＲＮＡおよびオスモチンタンパク質はともに極めて安定である。本発明に関しては、タバコオスモチン遺伝子の５’および３’ＵＴＲの構造的特性はオスモチンｍＲＮＡおよびタンパク質の高度な安定性に一致しており、１）その５’ＵＴＲは高度にＡＴを多く含み、それにより４０Ｓリボソームサブユニットが翻訳開始のために、容易にその開始コドンをスキャンし（図６Ａを参照）、および２）その３’ＵＴＲは、ＲＮａｓｅによる分解を効果的に阻害する、強度のステム−ループ二次構造を形成することができる（図６Ｂ）。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様によれば、オスモチン遺伝子から単離され、またはそれに由来する５’および３’ＵＴＲ領域の一方または両方が、植物、植物細胞または植物組織において組換え技術により発現されるタンパク質をコードする目的の構造遺伝子に隣接するように遺伝学的に加工される。好ましくは、オスモチン遺伝子は、タバコオスモチン遺伝子から単離され、または由来する。
【００１９】
ここで明細書および請求の範囲における特定の用語の目的、範囲および用法を明確にするために以下の定義を提供する。
【００２０】
ここで用いられる「キメラ遺伝子構築物」という用語は、二種以上の生物の遺伝子またはその部分を含む組換え核酸を意味する。
【００２１】
ここで用いられる「欠失」という用語は、一または二以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ存在しないアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
【００２２】
本発明の５’および３’オスモチンＵＴＲは、５’および３’オスモチンＵＴＲが目的の構造核酸配列の翻訳産物のｍＲＮＡ安定性、翻訳効率に影響を与えるようにこれらの因子が他の因子と相対的に位置するなら、目的の構造核酸配列に「機能的に結合する」と言われている。
【００２３】
ここで用いられる「非相同性遺伝子」という用語は、その正確なアミノ酸配列が宿主細胞において通常見出されないが、標準的遺伝子転移技術により導入されるタンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡまたはいずれかの部分をコードする遺伝子を意味する。
【００２４】
ここで用いられる「相同性」という用語は、相補性の程度を意味する。部分的相同性または完全相同性（すなわち、同一性）がある。部分的相補的配列は、同一の配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同な」という機能的用語を用いることになる。完全相補性配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低緊縮条件下のハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて試験される。実質的に相同な配列またはプローブは、低緊縮条件下で完全相同性配列またはプローブが標的配列に結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）することに競合または阻害する。これは、低緊縮条件が、非特異的結合が許容されるものであることを意味せず；低緊縮条件は、二つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえない第２の標的配列を用いることにより試験され；非特異的結合がない場合、プローブは第２の非相補性標的配列にハイブリダイズしない。
【００２５】
ここで用いられ当該分野で知られている「同一性」および「類似性」という用語は、配列を比較することにより決定される、二つのポリペプチド配列または二つのポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該分野において、同一性はまた、そのような配列の二本鎖の間のマッチの度合いにより決められる、二つのポリペプチドまたは二つのポリヌクレオチド間の配列関係の程度も意味する。同一性と類似性の両方が容易に計算することができる（Computational Molecular Biology,Lesk，Ａ．Ｍ．編、Oxford University Press.New York（１９８８年）；Biocomputing:Informatics and Genome Projects，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Academic Pewss,New York（１９９３年）；Computer Analysis of Sequence Data，第１部，グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ，Ｇ，編、Humana Press,New Jersey（１９９４年）；Sequence Analysis in Molecular Biology，Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Academic Press（１９８７年）；およびSequence Analysis Primer，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、M Stockton Press,New York（１９９１年））。二つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般的に用いられる方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，SIAM J.Applied Math.，第４８巻：１０７３頁（１９８８年）に開示の方法があるが、これに限定されない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する二つの配列間に最大のマッチが得られるようにデザインされる。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムで体系化される。二つの配列間の同一性および類似性を決定するための典型的なコンピュータープログラム法として、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Nucleic Acids Research第１２（１）巻：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、J.Mol.Biol．第２１５巻：４０３頁（１９９０年））があげられる。
【００２６】
ここで用いられる「挿入」または「付加」という用語は、天然に存在する分子と比較して、一または二以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基のそれぞれが付加されることになる、アミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
【００２７】
ここで用いられる「改変された発現」という用語は、１）天然の植物または２）目的の構造遺伝子を含むがその隣接領域としての５’および３’オスモチンＵＴＲの一方または両方を含まないトランスジェニック植物と比べて、目的の構造遺伝子のｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたは酵素の比活性が変化している目的の非相同性構造遺伝子のそれぞれの領域に隣接している本発明の５’および３’オスモチンＵＴＲの一方または両方を有するように遺伝学的に操作されたトランスジェニック植物における発現を意味する。
【００２８】
ここで用いられる「非天然の表現型」という用語は、植物における組換えＤＮＡの発現を起こすまたはそれにより影響を受ける特性を意味する。
【００２９】
ここで用いられる「組換え核酸」という用語は、任意の材料に由来し、またはそこから単離され、続いて化学的に改変され、その後、トランスジェニック植物に導入される核酸を意味する。材料に「由来する」組換え核酸の例は、所定の生物で有用な断片として同定され、次に本質的に純粋な状態で化学的に合成されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。材料から「単離される」そのようなＤＮＡの例は、化学的手段、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用により前記材料から切り出され、または除去され、そして遺伝子工学の方法により、本発明で用いるためにさらに操作、例えば増幅される有用なＤＮＡ配列である。
【００３０】
「緊縮」という用語は、ここで、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度および、有機溶媒のような他の化合物の存在の条件を示すために用いられる。当業者は、「緊縮」条件を、前述のパラメーターを個々にまたは組み合わせて変化させることにより変えることができることを認識している。「高緊縮」条件では、核酸塩基対は、相補性塩基配列を高頻度で有する核酸断片間にしか生じない（例えば、「高緊縮」条件下でのハイブリダイゼーションは、同一性が約８５〜１００％、好ましくは約７０〜１００％である相同体間に起こる）。中程度の緊縮条件では、核酸塩基対は、相補性塩基配列の頻度が中程度である核酸間に起こる（例えば、「中程度緊縮」条件下のハイブリダイゼーションは、同一性が約５０〜７０％であるホモローグ間に起こる）。すなわち、「弱い」または「低い」緊縮の条件は、相補的配列の頻度が低いために、遺伝的に多様な生物に由来する核酸で必要とされることが多い。
【００３１】
ここで用いられる「目的の構造核酸配列」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ヌクレオチドの配列を意味する。「目的の構造核酸」という用語は、ここで、「目的の構造遺伝子」という用語と互換的に用いられる。
【００３２】
本出願で用いられる「実質的配列相同性」という用語は、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡの場合）またはアミノ酸配列（タンパク質またはポリペプチドの場合）が、別のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対して実質的に機能的または構造的等価性を示すことを示すために用いられる。実質的配列相同性を有する配列間の機能的または構造的相違は少ない；すなわち、本出願において示されるように機能する配列の性能に影響を与えない。ここに開示の配列と実質的に配列相同性を有する配列は、通常、突然変異のような開示された配列の変異であるが、合成配列であってもよい。
【００３３】
ここで用いられる「置換」という用語は、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる一または二以上のアミノ酸またはヌクレオチドの置き換えを意味する。
【００３４】
ここで定義される「形質転換」は、それにより外来性ＤＮＡがレシピエント細胞に入り変化させるプロセスを意味する。これは、天然または当該分野において良く知れらている種々の方法を用いる天然または人工的条件下で生じる。形質転換は、原核または真核生物宿主細胞中への外来核酸配列の挿入のための任意の方法に依存する。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェクション、および粒子衝撃を含むが、これらに限定されない。そのような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてまたは宿主染色体の一部として複製することができる安定形質転換細胞を含む。これらはまた、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを、限定された時間、一過的に発現する細胞を含む。
【００３５】
ここで用いられる「核酸配列」は、一つのヌクレオチド糖の３’位置が、ホスホジエステル架橋により次の５’位に結合しているヌクレオチドのポリマーを意味する。線状核酸鎖において、一方の端部は典型的に遊離５’リン酸基を有し、もう一方の端は遊離３’ヒドロキシル基を有する。核酸配列は、ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片また一部を意味し、および一本鎖または二本鎖であり、センスまたはアンチセンス鎖を表すゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを意味するために用いられる。
【００３６】
プロモーター核酸配列は、目的の構造核酸配列の転写にプロモーター核酸配列が影響を与えるように二つを配する場合に、目的の構造核酸配列に「作用的に結合」するといわれている。例えば、構造核酸配列がタンパク質の生成をコードする場合、プロモーター核酸配列が構造核酸配列からのタンパク質産物の発現に影響を与えるならば、プロモーター核酸配列は構造核酸配列に作用的に結合する。
【００３７】
ここで用いられる「トランスジェニック植物」という用語は、核ゲノムまたはオルガネラゲノムのいずれかに挿入された外来ヌクレオチド配列を含む植物を意味する。
【００３８】
ここで用いられる「誘導体」という用語は、５’および３’ＵＴＲタバコオスモチンＵＴＲの天然の核酸配列の改変を意味する。３’タバコオスモチンＵＴＲに関するそのような改変の例は、ＲＮａｓｅ分解に対して３’ＵＴＲの一または二以上のステム−ループ構造の保護的機能を保存、僅かに改変または増加させる３’タバコオスモチンＵＴＲの核酸配列に関する一または二以上の塩基の置換、挿入および／または欠失である。そのような誘導体は、例えば、逆位反復を決めるための配列情報を用いると共に、その例がここで説明される最善および次善二次構造を予想および最適化するためのコンピューターモデリング技術を用いて、当業者が容易に決めることができる。５’タバコオスモチンＵＴＲの誘導体は、例えば、ａ）ＡＴ（またはＡＵ）含量を増加させる、ｂ）目的の遺伝子の５’端ＡＵＧコドン周辺の最適化ヌクレオチド構造を提供し、および／またはｃ）４０Ｓリボソームサブユニットのスキャンニングプロセスを阻害する二次構造を加えない、タバコオスモチン５’ＵＴＲの核酸配列に関する一または二以上の塩基の置換、挿入および／または欠失を含む。すなわち「誘導体」という用語はまた、具体的に開示された調節配列と実質的に配列相同性を有する核酸配列を含み、その結果、開示した発現への効果を有することができる。
【００３９】
本発明の５’および３’ＵＴＲ誘導体を予想／評価する際に用いるためのコンピューターモデリング技術は、限定はされないが、次のものを含む：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから得られるＭＦｏｌｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（Ｚｕｃｋｅｒら、Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Strcture Prediction:A Practical Guide.RNA Biochemistry and Biotechnology，１１〜４３頁，Ｊ．ＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＢ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ編、NATO ASI Series,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL，（１９９９年）；Ｚｕｃｋｅｒら、Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Stucture.J.Mol.Biol．第２８８巻：９１１〜９４０頁（１９９９年）；Ｚｕｃｋｅｒら、RNA Secondary Stucture Prediction.Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry  Ｓ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｄ．Ｅ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｇ．Ｄ．ＧｌｉｃｋおよびＲ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１．２．１〜１１．２．１０（２０００年）参照）、これはソースコードとして無料で配布され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｅｄｄｙ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／にアクセスすることによりダウンロードすることができるＣＯＶＥ（共変化モデルを用いるＲＮＡ構造分析（stochastic context free grammar methods）ｖ．２．４．２（Ｅｄｄｙ  ＆  Ｄｕｒｂｉｎ，Nucl.Acids Res．１９９４年、第２２巻：２０７９〜２０８８頁）；および無料で配布され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ａｕ．ｄｋ／ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ／でダウンロードして得ることができるＦＯＬＤＡＬＩＧＮ（Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences，Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ，Ｌ．Ｊ．ＨｅｙｅｒおよびＧ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ，Nucleic Acids Research，第２５巻，１８号、３７２４〜３７３２頁、１９９７年；Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences．Ｊ．Ｇｏｒｏｄｋｉｎ，Ｌ．Ｊ．ＨｅｙｅｒおよびＧ．Ｄ．Ｓｔｏｒｍｏ．ＩＳＭＢ  ５巻；１２０〜１２３頁，１９９７年）。
【００４０】
５’タバコオスモチンＵＴＲの天然の、最適化された断片化した、または他の改変がなされたものは、構築物中の目的の一または二以上の構造遺伝子の５’領域に隣接させるために用いられる。５’タバコオスモチンＵＴＲの天然配列は以下のようである：
ｔａｔｃｃａａｃａａｃｃｃａａｃｔｔｇｔｔａａａａａａａａｔｇｔｃｃａａｃａａｃ（配列番号１）。（Ｎｅｌｓｏｎら、Analysis of structure and transcriptional activity of an osmotin gene. Plant Mol. Bio.第１９巻：５７７〜５８８頁（１９９２年））。
【００４１】
当業者は、使用可能な天然配列の誘導体を容易に確認することができる。一つの好ましい実施態様において、ここで、単一の「ａｔｇ」コドンが「ａｔｔ」に改変され、それにより、４０Ｓリボソームサブユニットが５’ＵＴＲ中の開始コドンの類似配列により阻害されない。この具体例によれば、天然５’タバコオスモチンＵＴＲの核酸配列が次のものに修飾される：
ｔａｔｃｃａａｃａａｃｃｃａａｃｔｔｇｔｔａａａａａａａａｔｔｔｃｃａａｃａａｃ（配列番号２）。ここで、単一塩基変化をアンダーラインで示す。
【００４２】
３’タバコオスモチンＵＴＲの天然の、最適化された断片化した、または他の改変がなされたものを用いて、構築物中の目的の一または二以上の構造遺伝子の３’領域に隣接させるために用いられる。３’タバコオスモチンＵＴＲの公開された天然配列は以下のようである：
ａｇｔｇｇｃｔａｔｔｔｃｔｇｔａａｔａａｇａｔｃｃａｃｃｔｔｔｔｇｇｔｃａａａｔｔａｔｔｃｔａｔｃｇａｃａｃｇｔｔａｇｔａａｇａｃａａｔｃｔａｔｔｔｇａｃｔｃｇｔｔｔｔｔａｔａｇｔｔａｃｇｔａｃｔｔｔｇｔｔｔｇａａｇｔｇａｔｃａａｇｔｃａｔｇａｔｃｔｔｔｇｃｔｇｔａａｔａａａｃｃｔａａｇａｃｃｔｇａａｔａａｇａｇｔｃａｃａｔａｔｇｔａｔｔｔｔｔｇｔｃｔｔｇａｔｇｔｔａｔａｔａｇａｔｃａａｔａａｔｇｃａｔｔｔｇｇａｔｔａｔｃｇｔｔｔｔｔａｔａｔｔｇｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｇａａｇｔｔｔｔａｇｔａａａｇｔｃｔｔａａｇｃｔｔ（配列番号３）。（Ｎｅｌｓｏｎら、（１９９２年）
【００４３】
大部分の場合、ここに特に開示された５’および３’タバコオスモチンＵＴＲ配列に９５％相同性を有する配列は、等価物として機能し、多くの場合、相同性がかなり低く、例えば７５％または８０％である場合は、許容可能である。重要でないこれらの配列の一部を配置するのは時間がかかるが、おきまりの作業であり当該分野の技術範囲である。
【００４４】
本発明の技術により対象５’および３’ＵＴＲ配列を修飾するための技術の例には、ポリヌクレオチド介した部位特異的突然変異導入のための技術、制限酵素を用いるための良く知られた技術、ＰＣＲ増幅および、存在する核酸分子を改変および／または結合するためのリガーゼがある。（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら、ＤＮＡ、第３巻：４７９〜４８８頁（１９８４年）；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Nucl.Acids Res.、第１６巻：７３５１〜７３６７頁（１９８８年）；Ｈｏら、Gene、第７７巻：５１〜５９頁（１９８９年）；Ｈｏｒｔｏｎら、Gene、第７７巻：６１頁（１９８９年）；PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification，（編）Ｅｒｌｉｃｈ（１９８９年）；およびＭｅｔｚらの第ＵＳ６，２７１，３６０号、Single-stranded oligodeoxynucleotide mutational vectors（２００１年８月７日発行）参照）。本発明の好ましい態様において、一または二以上のステム−ループ構造が配列番号２に付加されて、ｍＲＮＡ分解に対してさらに保護が提供される。本発明の一つの態様において、さらなるステムループ構造は、配列番号３の全体または一部のＰＣＲ増幅により誘導される。ステムループ構造はまた、配列番号３と独立して合成される。本発明の別の実施態様において、配列番号３中の一または二以上の存在するステムループ構造が、例えば、当業者に知られている部位特異的制限酵素の使用により欠失される。
【００４５】
好ましくは、本発明の５’および３’タバコオスモチンＵＴＲは、目的の一または二以上の構造遺伝子の適当な領域への隣接に関して互いに組み合わせて用いられる。しかしながら、本発明はそのように限定されない。すなわち、本発明の５’および３’タバコオスモチンＵＴＲの一方または両方は、例えば、目的の構造遺伝子に天然で、目的の構造遺伝子およびタバコオスモチン遺伝子に非相同性であるＵＴＲと組み合わせて、またはそのような天然または非相同性ＵＴＲに加えて用いることができる。
【００４６】
本発明で用いるための５’および３’オスモチンＵＴＲは、タバコ組織または細胞から、当該分野で知られている核酸ハイブリダイゼーション技術により、例えば、ここに開示の核酸配列またはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、単離される。そのようなプローブは、ここで同定された５’および３’ＵＴＲを含むオスモチン遺伝子全体またはその一部からなる。対象のオスモチン５’および３’ＵＴＲは、合成であってもよく、上記の配列および当該分野で知られている核酸合成技術を用いて得ることができる。さらに、オスモチンをコードするヌクレオチド配列は、Ｓｉｎｇｈら、Plant Physiol．第９０巻：１０９６〜１１０１頁（１９８９年）により記載されるようにｐＯＣ  ｃＤＮＡクローンから得られる。
【００４７】
オスモチン遺伝子が単離される他の植物は、特に、Ｓｉｎｇｈら（１９８７年）および  Ｋｉｎｇら、Plant.Mol.Biol.第１０巻，４０１〜４１２頁（１９８８年）に記載の雑穀、ダイズ、綿、トマトおよびジャガイモである。さらに、トウモロコシのような上記のもの以外の植物のオスモチン様タンパク質をコードする遺伝子のＵＴＲを、タバコからのオスモチンＵＴＲに同様の相同性を有することが合理的に予想され得るように、本発明にしたがって用いられると考えられる。
【００４８】
目的の構造核酸配列は、既知のクローニング技術によりオスモチン遺伝子から単離され、またはそこに由来の５’および／または３’ＵＴＲに作用的に結合している。目的の構造核酸配列は、レシピエント植物、植物細胞または植物組織において天然に存在する遺伝子に非相同性または相同性であり得る。いずれの場合にも、本発明の５’および３’オスモチンＵＴＲは、目的の核酸配列の翻訳効率を調節して：転写されたｍＲＮＡの半減期を伸ばす；および／または、目的の構造核酸配列によりコードされるタンパク質を、本発明の５’および３’オスモチンＵＴＲを使用しないで発現される場合よりも多くの量で、植物組織中に発現するのに有用である。ここで、特に、目的の構造核酸配列によりコードされるタンパク質が根、葉または茎のような植物の特定の好ましい組織においてのみ発現され種子においては発現されないように加工された遺伝子構築物において本発明が用いられることが考えられる。
【００４９】
本発明は、通常、単子葉植物および双子葉植物の両方において、目的の構造遺伝子の発現に適用することができる。すなわち、本発明は、限定はされないがトウモロコシ、米、大麦、麦、小麦、サトウモロコシ、ライ麦、サトウキビ、パイナップル、ヤムイモ、タマネギ、バナナ、ココヤシの実およびナツメヤシの実を含む単子葉類植物のいずれのものにも適している。本発明の好ましい適用は、トランスジェニックトウモロコシ植物の産生である。本発明で用いるための双子葉植物には、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、テンサイ、ジャガイモ、レタス、メロン、大豆およびカノーラ（ナタネ）があるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の構築物で用いられる目的の構造核酸配列は、得られるトランスジェニック植物の有益な特徴を提供または向上させる任意の核酸配列である。特に有用な核酸配列は、向上した栄養価、高収率、除草剤、昆虫または病気への耐性、等を促進するための、タンパク質またはアンチセンスＲＮＡ転写物をコードするものである。より好ましくは、核酸配列は、遺伝子を物理的、化学的または酵素的分解をより受け易くすることが知られているその比較的大きなサイズ（少なくとも、長さが４〜５ｋｂ）故に生来不安定である有用な遺伝子である。そのサイズゆえに生来不安定な遺伝子には、Xenorhabdus（米国特許第６，０４８，８３８号を参照）およびPhotorabdus（例えば、ここに記載のような毒素Ａ）からの殺虫遺伝子がある。
【００５１】
本発明の一つの好ましい実施態様において、目的の一または二以上の構造核酸が、特定の作物種において互いに「積み重ね」られた本発明の一または二以上のオスモチンＵＴＲにより隣接されている。「積み重ね」という用語を用いる場合、ここで、各々の構造遺伝子が好ましくは市場で望ましい特性を賦与する目的の複数の構造遺伝子が、単一の作物種（近交系または雑種）中に遺伝子導入されたことが示される。例えば、積み重ねられた遺伝子を有するトウモロコシ雑種は、昆虫耐性のための遺伝子（例えば、Ｃｒｙ１Ｆ  Ｂ．ｔ．遺伝子）および除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホセート耐性遺伝子）を含み得る。
【００５２】
もう一つの好ましい実施態様において、本発明のオスモチンＵＴＲの一または二以上が、フォトラブダスからの毒素Ａに機能的に結合され、次に、単一の作物種において一または二以上の殺虫剤および／または除草剤耐性遺伝子が積み重ねされる。好ましくは、必然ではないが、殺虫剤遺伝子は、Bacillus thuringiensisまたはXenorhabdus種からのものであり、除草剤遺伝子は、グルホシネート、グリホセート、イミダゾリノンまたは２．４−Ｄもしくはスルホニル尿素抵抗遺伝子の一または二以上である。もちろん、「積み重ね」られた殺虫剤または除草剤遺伝子にいずれかを、本発明のオスモチンＵＴＲに機構的に結合することができる。
【００５３】
目的の構造核酸配列を、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核ゲノム、ミトコンドリアまたはプラスチドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルス核酸、化学的に合成された核酸の全体または一部に由来するものである。目的の構造核酸配列は、発現産物の生物学的活性または化学的構造、発現の割合、または発現制御方法に影響を与え得るいずれかのコーディング領域に一または二以上の改変を含むことができると考えられる。そのような改変は、一または二以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、再編成および置換を含むが、これらに限定されない。目的の構造核酸配列は、中断しないコーディング配列を構成する、または、これは適当な植物機能的スプライス結合部に結合された一または二以上のイントロンを含むことができる。目的の構造核酸配列は、天然に存在するまたは合成の複数の材料に由来するセグメントの複合体であり得る。目的の構造核酸配列は、実験操作がコーディング配列の結合において機能性を維持する限り、融合タンパク質もコードすることができる。
【００５４】
本発明の実施において、その後に所望の宿主細胞中に導入するために、目的の構造遺伝子に隣接する５’および／または３’オスモチンＵＴＲを含むベクターを得るように、クローニング技術が用いられる。すなわち、５’および３’オスモチンＵＴＲ、目的の構造核酸配列および、任意の所望のプロモーター、エンハンサー、選択マーカー等が単離され、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press （第２版、１９８９年）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９年） Current Protocols in Molecular Biology，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（いずれもここで参考のために取り込まれる）に記載のような当該分野における標準的クローニング手順を用いて、ベクター中にクローニングすることができる。
【００５５】
種々のクローニングベクターが入手できるまたは調製することができ、クローニングベクターは所望の植物種において機能的な遺伝子構築物を含む。ベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４、Bluescriptシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等がある。すなわち、そのようなベクターは植物細胞の形質転換のために市販されているまたは、容易に調製することができる。通常、プラスミドまたはウイルスベクターは、所定の宿主における非相同性ＤＮＡ配列の維持と発現の両方のために必要な核酸配列を含む。任意の特定の種における発現を最適化するための適当な因子の選択は、この開示の教示を利用する当該分野の通常の技術である。適当なＤＮＡ成分、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子、エンハンサー、イントロン等が、Ｋ．Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ann.Rev.Genetics，第２２巻，４２１頁（１９８８年）に記載されている。
【００５６】
典型的には、目的の構造核酸配列および５’および３’タバコオスモチンＵＴＲは、適当な制限部位における適当なクローニングベクター中に挿入され、それにより、目的の構造遺伝子が所望のプロモーターに実施可能となるように結合し、５’および／または３’タバコオスモチンＵＴＲが、目的の構造核酸配列に作用的に結合する。本発明の遺伝子構築物の調製において、適当な配向でおよび、適切な場合には、正しい読み取り枠において核酸配列を提供するように、種々の核酸断片を操作することができる。もちろん、核酸断片を結合するためにアダプターまたはリンカーを用いることができる、または、都合の良い制限部位、過剰ＤＮＡの除去、制限部位の除去等を提供するために他の操作が含まれ得る。
【００５７】
本発明において用いられる構造遺伝子の発現は、任意の数のプロモーターにより行われる。ここで、目的の構造遺伝子の内在性プロモーターを遺伝子の転写的調節のために利用することができるが、好ましくは、プロモーターは外来調節配列である。植物発現ベクターで、適当なウイルスプロモーターとしては、Cassava Vein Mosaic Virus promoter（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、Plant Mol.Biol．第３１（６）巻，１１２９〜３９頁（１９９６年）；Cauliflower Mosaic Virusの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（ＣａＭＶ）（Ｂｒｉｓｓｏｎら、Nature第３１０巻，５１１頁（１９８４年）；Ｏｄｅｌｌら、Nature第３１３巻：８１０頁（１９８５年）；向上したおよび二倍向上したＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｋａｙら、Science第２３６巻：１２９９〜１３０２頁（１９８７年））；Ｆｉｇｗｏｒｔ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓからの全長転写プロモーター（ＦＭＶ）（Ｇｏｗｄａら、J.Cell Biochem.，１３Ｄ：３０１頁（１９８９年））およびＴＭＶからのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、EMBO J．第６巻：３０７頁（１９８７年）がある。他の有用なプロモーターには、スモールサブユニットリブロースである１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）（Ｃｏｒｕｚｚｉら、EMBO J．第３巻：１６７１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Science第２２４巻：８３８頁（１９８４年））；米アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙら、Plant Cell．第２（２）巻：１６３〜７１頁（１９９０年）；Ａｄｈ１プロモーター（Ｄｅｎｎｉｓら、Nucleic Acids Res．第１２（９）巻：３９８３〜４０００頁（１９８４年））；マンノピンシンターゼプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎら、EMBO J．第３巻：２７２３頁（１９８４年））；ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウムツメファシエンス）またはヒートショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら、Mol.Cell.Biol．第６巻：５５９頁（１９８６年）；Ｓｅｖｅｒｉｎら、Plant Mol.Biol．第１５巻：８２７頁（１９９０年））がある。
【００５８】
クローニング工程の分析は、典型的に行われ、配列分析、制限分析、電気泳動等を含む。各操作後に、最終的構築物で用いるべきＤＮＡ配列が限定され、次の配列に結合され、部分的構築物の各々は、同じまたは異なるプラスド中にクローニングされる。
【００５９】
クローニング工程が一旦完了すると、導入、植物再生、安定組み込みおよび、植物細胞中の目的の非相同性遺伝子を含む外来組換えベクターの発現を可能にする種々の技術が存在する。そのような技術の一つに、遺伝材料でコートされた微粒子の植物細胞への直接導入の促進が含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌの米国特許第４，９４５，０５０号；ＤｏｗＥｌａｎｃｏの米国特許第５，１４１，１３１号；および米国特許第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号，いずれもＤｅｋａｌｂのもの）。この技術は、通常、「微粒子衝撃」または「バイオリスティクス」と呼ばれる。植物はまた、アグロバクテリウム技術を用いて形質転換される（トレド大学の米国特許第５，１７７，０１０号、Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍの米国特許第５，１９４，３１０号、欧州特許出願０１３１６２４Ｂ１、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの欧州特許出願１２０５１６、１５９４１８Ｂ１および１７６，１１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの米国特許第５，１４９，６４５号、５，４６９，９７６号、５，４６４，７６３号および４，９４０，８３８号および４，６９３，９７６号、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋの欧州特許出願１１６７１８、２９０７９９、３２０５００、日本たばこ産業の欧州特許出願６０４６６２、６２７７５２および米国特許第５，５９１，６１６号、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙの欧州特許出願０２６７１５９および０２９２４３５および米国特許第５，２３１，０１９号、Ｃａｌｇｅｎｅの米国特許第５，４６３，１７４号および４，７６２，７８５号、およびＡｇｒａｃｅｔｕｓの米国特許第５，００４，８６３号および５，１５９，１３５号）。別の形質転換法は、トウモロコシ細胞懸濁培地を形質転換するための伸長針状マイクロファイバーまたは「ウィスカー」の使用である（米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号，いずれもＺｅｎｅｃａのもの）。さらに、生殖力のある植物が得られる植物細胞を形質転換するために電気穿孔技術が用いられた（Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＯ８７／０６６１４；Ｄｅｋａｌｂの米国特許第５，４７２，８６９号および第５，３８４，２５３号；Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓの米国特許第５，６７９，５５８号、第５，６４１，６６４号、ＷＯ９２０９６９６およびＷＯ９３２１３３５）。
【００６０】
植物細胞の形質転換のためのさらに別の技術には、直接的なＤＮＡ取り込み機構（Ｍａｎｄｅｌおよび  Ｈｉｇａ，J.Mol.Biol．第５３巻：１５９〜１６２頁（１９７２年）；Ｄｉｔｙａｔｋｉｎら、Biochimica et Biophysica Acta，第２８１巻：３１９〜３２３頁（１９７２年）；Ｗｉｇｌｅｒら、Cell，第１６巻：７７頁（１９７９年）；およびＵｃｈｉｍｉｙａら，Proc.5th Intl.Cong.Plant Tissue and Cell Culture，Ａ．Ｆｕｊｉｗａｒａ編、Jap.Assoc.for Plant Tissue Culture，Ｔｏｋｙｏ，５０７〜５０８頁（１９８２年）；融合機構（Ｕｃｈｉｄａｚら，Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells，Ｂａｓｅｒｇａら（編），Wistar Symposium Series，第１巻：１６９〜１８５頁（１９８０年）参照）；部位特異的組換え（ＷＯ／９１０９９５７参照）および種々の感染剤（Ｆｒａｌｅｙら、CRC Crit.Rev.Plant Sci．第４巻：１〜４６頁（１９８６年）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Science，第２２６巻：４０１〜４０９頁（１９８４年）参照）がある。
【００６１】
選択された植物細胞を形質転換するための適切な手順は、用いられる植物細胞に従って選択される。これまでの経験に基づくと、一旦細胞中に挿入されると、形質転換方法それ自身に起因する遺伝子発現の相違は殆ど無いようである。むしろ、植物細胞中に挿入された外来遺伝子の活性は、挿入部に隣接している内在性植物ＤＮＡの影響に依存する。通常、非相同性遺伝子の挿入は、任意の形質転換技術を用いてランダムであると思われるが、近年、植物細胞中へのＤＮＡの部位特異的組換えを用いた植物を産生するための技術が存在する（ＷＯ９１／０９９５７参照）。
【００６２】
そのような植物細胞を形質転換するために用いられる特定の方法は本発明に重要でなく、そのような植物細胞の再生のような必要な場合のその後の工程においても重要でない。対象の一または二以上の５’および／または３’ＵＴＲの調節制御下に所望の配列を発現させる方法または方法の組み合わせが許容される。
【００６３】
一旦植物組織中に導入されると、構造遺伝子の発現は、一過性発現システムにおいて検定され、または、植物ゲノム中の安定組み込みを選択した後、決定される。
【００６４】
形質転換された細胞株を回復するために任意の数の選択システムが用いられる。これらは、限定はされないが、ｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞でそれぞれ用いることができる単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Cell第１１巻：２２３頁（１９７７年））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Cell第２２巻：８１７頁（１９８０年））遺伝子を含む。また、例えば、メトトレキセートに抵抗力を付与するｄｈｒｆ（Ｗｉｇｌｅｒら、Proc.Natl.Acad.Sci．第７７巻：３５６７頁（１９８０年））；アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に抵抗力を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、J.Mol.Biol．第１５０巻：１頁）（１９８１年））；およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに抵抗力を付与するＡＬＳ（Ｂｅｄｂｒｏｏｋの米国特許第５，３７８，８２４号）またはＰＡＴ（Ｗｅｈｒｍａｎｎら、Nat Biotechnol第１４（１０）巻：１２７４〜８頁（１９９６年））をそれぞれ選択するための基礎として代謝拮抗物質、抗生物質または耐除草剤薬を用いることもできる。また別の選択可能な遺伝子、例えば、細胞がトリプロファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢまたは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤが記載されている（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Proc.Natl.Acad.Sci．第８５巻：８０４７頁（１９８８年））。より近年、可視性マーカーの利用が人気を得、ＧＦＰ、アントシアニン、α−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換株を同定するのみならず、特定のベクター系に起因する一過性または安定タンパク質発現の量を定量するためにも広く用いられる（Ｒｈｏｄｅｓら、Methods Mol.Biol．第５５巻：１２１頁（１９９５年））。
【００６５】
マーカー遺伝子発現の有無は、目的の遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在および発現を確認する必要がある。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列中に挿入されると、ポリペプチドをコードする配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能がなくなることにより同定される。また、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの制御下に、ポリペプチドをコードする配列とタンデムに配することができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、同様にタンデムな遺伝子の発現を示す。
【００６６】
また、目的のポリペプチド（例えば、本発明の核酸によりコードされるポリペプチド）をコードする核酸配列を含み、ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られている種々の手順により同定される。これらの手順は、限定はされないが、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のためのメンブラン、溶液またはチップに基づく技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイ技術を含む。
【００６７】
目的のポリペプチド（例えば、本発明の核酸によりコードされるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または断片を用いるＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。核酸の増幅に基づくアッセイとして、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体を検出するためにポリペプチドをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用があげられる。ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」という用語は、プローブまたは増幅剤として用いることができる、少なくとも約１０個のヌクレオチド、および／あるいは約６０個のヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５個のヌクレオチドを有する核酸配列を意味する。
【００６８】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いてポリペプチド（例えば、本発明の核酸によりコードされるポリペプチド）の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは当該分野において知られている。その例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）が含まれる。ポリペプチド上の二つの非干渉性エピトープに反応性のモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いることができる。これらおよび他のアッセイが、特に、Ｈａｍｐｔｏｎら、Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul,Minn．（１９９０年）、およびＭａｄｄｏｘら、J.Exp.Med．第１５８巻：１２１１頁（１９８３年）に記載されている。
【００６９】
種々の標識および結合技術が、当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて用いることができる。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製する手段は、オリゴヌクレオチドラベリング、ニックトランスレーション、エンドラベリングまたは、標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。また、ポリペプチドまたはその任意の部分をコードする配列を、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクター中にクローニングすることができる。そのようなベクターは当該分野において知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６および標識ヌクレオチドのような適当なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドを添加することにより試験管内でのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの手順は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ），Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の種々の市販キットを用いて行うことができる。用いられる適当なレポーター分子または標識として、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光または発色剤並びに基質、コファクター、阻害因子、磁気粒子等があげられる。
【００７０】
植物組織の試験管内培養のためおよび、多くの場合、全植物体への再生のための技術が知られている。成熟トランスジェニック植物を産生するための適当な手順を、用いられる植物種に従って選択することができる。再生は、植物の種によって変化する。効率的な再生は、培地、遺伝子型および、培養履歴に依存する。ひとたび全植物体が得られると、これらは、子孫の細胞中に配列の少なくとも一つのコピーが存在するような様式で、有性生殖または無性生殖により再生される。再生植物の種子を将来の使用のために集めることができ、この種子から植物が成長する。最初に形質転換した植物の導入遺伝子を市場で有用な栽培変種に移す手順は当業者に知られている。
【００７１】
本発明の特別の実施態様を、実施例においてさらに例示する。しかしながら、当業者は、詳説する特定の実施例が、添付の請求の範囲により完全に説明する本発明の例にすぎないものであることを容易に理解できるであろう。
【００７２】
本発明で用いるための目的の好ましい遺伝子は、Photorabadus luminescens（以下、「Photorabadus」または「P. luminescens」と記載する）の毒素Ａ遺伝子である。
【実施例】
【００７３】
実験計画
Photorabadus luminescensは、Heterorhabditis種土壌線虫との昆虫病因性共生を形成するグラム陰性細菌である（ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら、Cell Mol Life Sci第５７（５）巻：８２８〜３３頁（２０００年）；ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら、Curr Opin Microbiol．第２（３）巻：２８４〜８頁（１９９９年）。この細菌を有する線虫は、昆虫蔓延の生物学的制御剤として長らく用いられてきた。線虫が昆虫宿主に侵入した後、細菌が昆虫血腔内に放出され、それらは毒素およびプロテアーゼを産生し、これらが昆虫宿主を殺し、宿主の死体を、細菌および線虫両方の成長のための栄養源として提供される。
【００７４】
幾つかの群の毒素複合体が、P. luminescensから精製され、それらの対応する遺伝子がクローニングされている（Ｂｏｗｅｎら、Science第２８０巻：２１２９〜３２頁（１９９８年）；Ｍｅｒｌｏら、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８８４８３（１９９９年））。先に行われた実験において、P. luminescens  Ｗ−１４株の発酵培養液が、少なくとも二つの潜在的タンパク質毒素Ａおよび毒素Ｂを含み、これらは独立的に、サザンコーンルートワーム（ＳＣＲ；Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ）およびタバコホルンワーム（ＴＨＷ；Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）に対する殺虫活性をもたらす（Ｇｏｕら、J.Biol.Chem．第２７４（１４）巻：９８３６〜４２頁（１９９９年））。これら二つのタンパク質の活性は、トップローディッド人工食餌アッセイ（ｔｏｐｌｏａｄｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｉｅｔ  ａｓｓａｙ）において劇的に異なる。ＳＣＲに対するＬＤ５０値（５０％の昆虫に対する致死投与量）は、毒素Ａおよび毒素Ｂについてそれぞれ５ｎｇ／ｃｍ２食餌および８７ｎｇ／ｃｍ２食餌である。
【００７５】
P. luminescens  Ｗ−１４株の２８３ｋＤ毒素Ａタンパク質（配列番号４）（ここでＡ０タンパク質と表す）は、７５４８ｂｐの単一のオープンリーディングフレーム（ｔｃｄＡと表す）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８８４８３；Ｇｏｕ，１９９９年）により暗号化される。細菌発酵培養液において、天然の毒素Ａは、ホモ四量体とサイズが一致する大きな複合体（８６０ｋＤ超）として存在する（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、Plant Mol.Biol．第３１（６）巻：１１２９〜３９頁（１９９６年））。毒素Ａ複合体を含むタンパク質の単離および特徴付け（Ｎ−末端配列決定およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＱＴＯＦ分析）は、Ａ０一次遺伝子産物のＮ−末端の８８アミノ酸が除去され、残りのペプチドが、ここでＡ１（５．８ｋｂ）およびＡ２（１．７ｋｂ）と表される二つの大きなポリペプチドに分解されることを示した。この工程中、別の８８個の内部アミノ酸が失われる（図１参照）。これらの分解工程の順番および、毒素活性に対するＮ−末端および内部の欠失の重要性は、この開示の時点において当該分野において知られていなかったと考えられる。Ａ１ポリペプチド単独で毒素Ａの殺虫活性の原因となるか否かについても以前は不明であった。
【００７６】
種々の形態の毒素Ａ遺伝子の害虫駆除のための使用可能性を評価するために、その殺虫活性を、以下のようにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物において試験した。
【００７７】
Ｃａｓｓａｖａ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓの構成的プロモーター（ＣｓＶＭＶ）の制御下に毒素Ａ遺伝子の種々の形態を含む６つの植物形質転換ベクター（ｐＤＡＢ７０３１〜ｐＤＡＢ７０３６）を構築した（図２参照）。これらの毒素Ａ遺伝子断片は：１）構築物ｐＤＡＢ７０３１中の全長Ａ０遺伝子（Ａ０、７．５ｋｂ）（配列番号５）、２）構築物ｐＤＡＢ７０３２中のＮ−末端がトランケートされたＡ０遺伝子（Ａ０／ΔＮ、７．３ｋｂ）（配列番号６）、３）構築物ｐＤＡＢ７０３３中の全長Ａ１遺伝子（Ａ１、５．８ｋｂ）（配列番号７）、４）構築物ｐＤＡＢ７０３４中のＣ−末端切頭を有するＡ１遺伝子（Ａ１／ΔＣ、５．６ｋｂ）（配列番号８）、５）構築物ｐＤＡＢ７０３５中のＮ−およびＣ−末端の両方がトランケートされたＡ１遺伝子（Ａ１／ΔＮ＋ΔＣ、５．４）（配列番号９）および６）構築物ｐＤＡＢ７０３６中の全長Ａ２遺伝子（Ａ２、１．７ｋｂ）（配列番号１０）を含む。これらの６つの構築物を、アグロバクテリウム媒介形質転換によりシロイヌナズナ植物中に形質転換した。トランスジェニック植物を、カナマイシン耐性の表現型に基づいて選択した。
【００７８】
植物細胞中での毒素Ａの発現を向上させるための手段として、さらに遺伝子構築物がプロセスされ、その結果、毒素Ａ遺伝子断片のうち三つＡ０（配列番号５）、Ａ１／ΔＣ（配列番号８）およびＡ２（配列番号１０）が、タバコオスモチン遺伝子から単離された５’および３’ＵＴＲ配列（それぞれ配列番号２および３）により、それぞれの端部に隣接されるように加工された。得られる構築物を、それぞれｐＤＡＢ７０２６、ｐＤＡＢ７０２７、ｐＤＡＢ７０２８と表す（図７参照）。次に、ｐＤＡＢ７０２６、ｐＤＡＢ７０２７およびｐＤＡＢ７０２８（以降、「オスモチンＵＴＲ−毒素Ａ構築物」）のタンパク質発現レベルを、オスモチンＵＴＲＳ−ｐＤＡＢ７０３１〜ｐＤＡＢ７０３６を含まない毒素Ａ構築物（図２参照）（以降、「非オスモチンＵＴＲ−毒素Ａ構築物」）と比較した。
【００７９】
プラスミドの構築
特記しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press（第２版、１９８９年））およびＡｕｓｕｂｅｌら、Current Protocols in Molecular Biology（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）（１９８７年）に記載のように、ＤＮＡの精製、制限酵素による消化、アガロースゲル分析、ＤＮＡ断片の単離、ライゲーションおよび形質転換の標準的方法が用いられる。
【００８０】
この実験で用いられる天然の毒素Ａ遺伝子ＯＲＦの７４５８ｂｐＤＮＡは、P. luminescens  Ｗ−１４株からこの実験室でクローニングした遺伝子を用いて決定された（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８８４８３）。開始コドンに及ぶＮｃｏ  Ｉ確認部位を提供するために、アラニンコドンをＯＲＦの第２の位置に付加された。本質的に同じタンパク質をコードする得られた核酸配列が、Ａｄａｎｇら、Plant Mol.Biol．第２１巻（１９９３年）に概説されたパラメーターに従って設計された。遺伝子断片の合成および、完全なコーディング領域への組み込みは、オペロンテクノロジーズ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により行われた。毒素Ａ遺伝子の再構築によって、推定ＲＮＡ不安定配列（ＡＴＴＴＡＡ）、潜在的イントロンスプライスシグナルおよび潜在的ポリアデニル化シグナル配列が除去され、単子葉植物と双子葉植物種の両方における発現が行われるようにコドンユーセージが調節された（「最適化された植物」）（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／１１０２９、ここでその全体を参考のために取り込む）。唯一のＮｃｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉ部位を、コーディング領域の５’および３’末端に丁寧に付加した。対応するＮｃｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉ部位を有する種々の遺伝子誘導体が、ＰＣＲ法を用いて塩基性ｔｃｄＡのコーディング領域から作られた：Ａ０／ΔＮ遺伝子（配列番号６）、Ａ１遺伝子（配列番号７）、Ａ１／ΔＣ遺伝子（配列番号８）、Ａ１／ΔＮ＋ΔＣ遺伝子（配列番号９）およびＡ２遺伝子（配列番号１０）。すなわち、全ての毒素Ａ遺伝子断片が、ＣｓＶＭＶプロモーターおよびＴｉプラスミドｐＴｉ−１５９５５（Ｂａｒｋｅｒら、Plant Mol.Biol．第２巻、３３５頁（１９８３年））のＯＲＦｓ２５／２６の間の遺伝子間領域に由来する３’ＵＴＲ／ポリアデニル化シグナル配列の発現制御下に置かれた。各毒素Ａ遺伝子発現カセットが切り出され（Ａｓｃ  ＩおよびＰｍｅ  Ｉ）、植物形質転換用の選択性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む二元ベクターｐＤＡＢ１５４２（図１２）上のＴ−ＤＮＡ境界間にクローニングされた。得られた構築物（ｐＤＡＢ７０３１〜ｐＤＡＢ７０３６）をここでさらに説明し、図２に図示する。
【００８１】
ＣｓＶＭＶ−ＧＵＳ−ＯＲＦ２５発現カセット（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Plant Molec.Biol.Rep．第５巻、３８７頁（１９８７年））を含む制御植物形質転換ベクター（ｐＤＡＢ７０２９）が、同じ手段を用いて構築された。ＧＵＳ遺伝子は、最初に、Ｎｃｏ  ＩおよびＳａｃ  Ｉ酵素によりプラスミドｐＫＡ８８２（図１３）から切り出され、プラスミドｐＤＡＢ７０１３中のＰＡＴ遺伝子の位置に挿入された（図１４）。次に、ＣｓＶＭＶ−ＧＵＳ−ＯＲＦ２５カセットを、酵素Ａｓｃ  ＩおよびＰｍｅ  Ｉを用いて、二元ベクター（ｐＤＡＢ１５４２）に挿入された（図１２）。
【００８２】
オスモチン−毒素Ａ遺伝子構築物を作るために、タバコオスモチン遺伝子の４０ｂｐ５’ＵＴＲ配列（配列番号１）をコードする一対の相補オリゴヌクレオチドを、５’ＵＴＲ配列から推定開始コドンを除去するように単一の「ａｔｇ」コドンを「ａｔｔ」に変化させる（配列番号２になる）修飾を除いて、公開された配列（Ｎｅｌｓｏｎら、１９９２年）に従って化学的に合成した。合成中、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＮｃｏ  Ｉ部位が、５’および３’末端に付加された。次に、得られる５’ＵＴＲ配列が、ＣｓＶＭＶプロモーターとベクターｐＤＡＢ７０１３中のＰＡＴ遺伝子との間の同じ部位に挿入され（図１４）、プラスミドｐＤＡＢ７０２０を得た（図１５）。同じタバコオスモチン遺伝子（配列番号３）の３’ＵＴＲが、オスモチンｃＤＮＡクローン（Ｌｉｕら、Proc.Natl.Acad.Sci．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９１巻、１８８８〜１８９２頁（１９９４年）；Ｄｒ．Ｒａｙ  Ｂｒｅｓｓａｎ，Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから頂いた）からＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ増幅中、５’および３’末端にそれぞれＳａｃ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位が付加された。次に、増幅されたオスモチン３’ＵＴＲ配列（配列番号３）が、ｐＤＡＢ６００１上のＯＲＦ２５／２６  ３’配列を置換するために用いられ（図１６）、プラスミドｐＤＡＢ７００２を得た（図１７）。ＰＡＴ遺伝子およびオスモチン３’ＵＴＲを、Ｎｃｏ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉを用いてｐＤＡＢ７００２から切り出し、ｐＤＡＢ７０２０上のＧＵＳ遺伝子と置換されるように用いて、プラスミドｐＤＡＢ７０２１を得（図１８）、これはＣｓＶＭＶ−ＯＳＭ（オスモチン）５’ＵＴＲ／ＰＡＴ／ＯＳＭ  ３’ＵＴＲ−ＯＲＦ２５／２６発現カセットを含んでいた。次に、三つの毒素Ａ遺伝子断片のコーディング領域Ａ０（配列番号５）、Ａ１／ΔＣ（配列番号５）、Ａ１／ΔＣ（配列番号８）およびＡ２（配列番号１０）が、ｐＤＡＢ７０２１上のＰＡＴ遺伝子を置換するために用いられた（図１８）。最後に、ＣｘＶＭＶプロモーターおよびＯＲＦ２５／２６  ３’ＵＴＲの制御下に修飾されたコーディング領域断片を含む発現カセットを、別々に、二元ベクターｐＤＡＢ１５４２中にクローニングされた（図１２）。
【００８３】
オスモチン５’および３’ＵＴＲ（ｐＤＡＢ７０２６）を有する全長Ａ０遺伝子を含む植物形質転換ベクターのマップを図１９に示す。同様の方法を用いて、ＣｓＶＭＶ−ＯＳＭ  ５’ＵＴＲ／ＧＵＳ／ＯＳＭ  ３’ＵＴＲ−ＯＲＦ２５／２６を含む制御植物形質転換ベクターも構築された。
【００８４】
上述のベクター実施態様に加えて、当業者は、任意の目的の遺伝子を本発明の５’および３’タバコオスモチンＵＴＲに隣接してクローニングさせる一般的なベクターを容易に作ることができることを理解しているであろう。非限定的な例として、植物発現ベクターｐＢｌ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターにより駆動され、ＮＯＳターミネーター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Nature第３４２巻：８３７〜８３８頁（１９８９年）により終結するＧＵＳレポーター遺伝子の発現カセットを含む。ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＧＵＳレポーター遺伝子との間に、三つの制限部位Ｘｂａ  Ｉ、ＢａｍＨ  ＩおよびＳｍａ  Ｉがある。ベクターｐＢｌ１２１はまた、ＧＵＳ遺伝子とＮＯＳターミネーター配列との間にＳｓｔ  Ｉ部位を有する。本発明の５’オスモチンＵＴＲ配列は、標準的技術を用いて、その５’および３’にＸｂａ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位を用いて化学的に合成され、次に、ｐＢｌ１２１のＸｂａ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位に容易に挿入される。オスモチン３’ＵＴＲ配列をベクターｐＢｌ１２１に挿入するために、その５’および３’末端にＳｍａ  ＩおよびＳｓｔ  Ｉ部位を付加してオスモチンｃＤＮＡコーンからオスモチン３’ＵＴＲを単離するためにＰＣＲ増幅法が用いられる。次に、このオスモチン  ３’ＵＴＲ配列は、ｐＢｌ１２１のＳｍａ  ＩおよびＳｓｔ  Ｉ部位に挿入され、これによりＧＵＳコーディング領域が置換される。このクローニング工程により、得られるプラスミド上にＣａＭＶ  ３５Ｓ−ＯＳＭ  ５’ＵＴＲ／ＯＳＭ  ３’ＵＴＲ−ＮＯＳの発現カセットが形成される。この発現カセットにおいて、オスモチン５’ＵＴＲと３’ＵＴＲ配列との間に二つの制限部位Ｂａｍ  ＨＩおよびＳｍａ  Ｉが存在する。それゆえ、目的の遺伝子上のＢａｍＨ  ＩおよびＳｍａ  Ｉ制限酸素および、適当な制限部位を用いて、目的の遺伝子はトランスジェニック植物での発現のためのｐＢＩ１１２１にクローニングされる。
【００８５】
植物の生育および形質転換
１６時間の照明と８時間の暗黒の照明サイクルを用いて、シロイヌナズナ植物（コロンビア生態型）を２２℃で生育させた。全ての植物形質転換構築物は、電気穿孔（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら、Efficient transformation of Agrobacterium spp.by electroporation.Nucleic Acids Research第１７（１６）巻、６７４７頁（１９８９年）；Ｍｅｒｓｅｒｅａｕら、Efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens by electroporation.Gene（９０）巻、１４９〜１５１頁（１９９０年））または凍結−溶解法（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Storage of competent cells for Agobacterium transformation.Nucleic Acids Research，第１６巻、９８７７頁（１９９８年））を用いてアグロバクテリウムＣ５８（Ｚ７０７）株（ＡＴＣＣ３３９７０）中に形質転換した。植物の形質転換は、真空浸潤法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、Mol.Biol.Genet．第３１６巻、１１９４〜１１９９頁（１９９３年））を用いて行った。トランスジェニック植物は、カナマイシン耐性の表現型に基づいて選択された。
【００８６】
ノーザンハイブリダイゼーション
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｎｔ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて１５０ｍｇの成熟葉組織から抽出された。ＲＮＡブロット分析のために、全ＲＮＡ５ｕｇを、ホルムアルデヒドを含む１．５％アガロースゲルにのせ、ノーザン分析のためにプロセスした。ハイブリダイゼーションは、ＵＬＴＲＡｈｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中、４２℃で４時間行われた。ハイブリダイゼーション後、メンブランを２×ＳＳＰＥ，０．５％ＳＤＳで１５分間２回洗い、次に０．１×ＳＳＰＥ，０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。最初の３回の洗浄は室温で行い、最終洗浄は４２℃で行った。
【００８７】
ＴＨＷに対するトランスジェニック植物のバイオアッセイ
タバコホルンワーム（ＴＨＷ，Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）の卵を、ノースカロライナ州立大学昆虫館から受領した。卵を、照明チャンバー（Ｐｅｒｃｉｖａｌ，Ｂｏｏｎｅ，ＩＡ）内において９０ｍｍペトリ皿で寒天溶液と共に２２℃または２８℃で２〜３日間インキュベートした。バイオアッセイの朝、一晩で孵った幼虫をプレートから除去し、新しい幼虫のみをバイオアッセイで用いた（好ましくは、６時間齢未満）。２％寒天溶液０．５ｍｌを各々のウエルに入れて、１２８ウエルＣＤインターナショナル（Ｐｉｔｍａｎ，ＮＪ）バイオアッセイトレイを調製した。５週齢植物からシロイヌナズナ葉を採取した。各植物において、葉組織を８つのウエルに均一に分散した。単一の新生ホルンワーム幼虫を各ウエルに入れた。ウエルを、穿孔された粘着性蓋で覆い、昆虫を、チャンバー中２８℃で１６：８の照明：暗黒サイクルで３日間（７２時間）食餌を与えた。７２時間後、昆虫の致死率および重量スコアを記録した。致死率は、所定の植物について合計数のうちの死んだ幼虫の数から決定した。毒素Ａ遺伝子構築物を有する１６のトランスジェニック植物ごとに二つの対照（ＧＵＳ）植物が用いられた。実験植物と対照植物について昆虫致死率の％を比較することにより、昆虫致死率スコアについてデータ分析を行った。致死率スコアを変換し、ｚ−試験を用いた。「中ないし高」毒素Ａタンパク質レベルを示し対照（ｐ＝０．０５）よりかなり高い致死率を示す植物を「活性」と考える。毒素Ａタンパク質レベルが低いが致死率が高い（通常＞５０％）場合、植物を再試験した（通常、次の世代において、しかし最初の植物を再サンプリングしてもよい）。潜在的生育阻害効果を示すために、個々の昆虫の重量を、ＡＮＯＶＡにより分析し、形質転換植物と対照植物を比較した。
【００８８】
実験結果
非オスモチンＵＴＲ−毒素Ａ構築物
ノーザンハイブリダイゼーション実験は、試験Ｔ０植物の６７％（６４のうち４３）が予想されるサイズの単一の毒素Ａ  ＲＮＡ種を示したことを示している（図２）。我々が気づく限り、全長ｔｃｄＡ転写物は、これまでに植物中で産生された最も大きいトランスジェニックＲＮＡである。ＲＮＡ発現レベルは、株から株に変化した（データは示さず）。各構築物について植物中のタンパク質発現パターンを試験するために、イムノブロット（ウエスタン）分析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に三つのバンド（Ａ０、Ａ１／ΔＣ、およびＡ２タンパク）を示した組換え大腸菌株から生成された精製毒素Ａタンパク質を、陽性標品として用いられた。ＣｓＶＭＶ−ＧＵＳ−ＯＲＦ２５構築物（ｐＤＡＢ７０２９）で形質転換した植物は、陰性対照として用いた。結果（図３Ａおよび３Ｂ）は、構築物ｐＤＡＢ７０３１（全長ｔｃｄＡ）（図２０）を有する植物が、陽性対象と並べられた三つのタンパク質バンドを生成した（図３Ａ）ことを示した。ｐＤＡＢ７０３６植物において、単一のタンパク質バンドのみが観察され、その分子量は、Ｎ−末端８８個のアミノ酸がトランケートしているために、全長Ａ０タンパク質より僅かに小さかった（図３Ｂ）。検出可能なＡ１／ΔＣおよびＡ２タンパク質がないことは、Ａ０タンパク質のＮ−末端の８８アミノ酸が二つの大きなサブユニット間の内部プロセシングのためのコントロールシグナルとして作用することを示している。三つのＡ１遺伝子構築物を有する植物から、予想される分子サイズの単一のＡ１タンパク質バンドが見つかった（図３Ｃ）。ｐＤＡＢ７０３５植物におけるＡ１タンパク質は、標準と同じサイズを有し（図３Ａ）、ｐＤＡＢ７０３３およびｐＤＡＢ７０３４植物からのＡ１タンパク質は、Ｃ−末端または両端部におけるトランケートのために、僅かに小さいサイズを有していた（図５Ｂおよび５Ｃ）。これに対して、Ａ２  ＲＮＡが適正に生成されても（図２）、構築物ｐＤＡＢ７０３２で形質転換した３２の実験植物においてＡ２タンパク質は検出されなかった（データは示さず）。これらの結果は、Ａ２  ＲＮＡの翻訳効率が極めて低い、Ａ２タンパク質が植物において非常に不安定である、あるいはＡ２タンパク質が用いた方法により抽出されないことを示唆している。
【００８９】
タンパク質の蓄積レベルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて各一次形質転換体についてさらに定量した（図２８−表１）。構築物ｐＤＡＢ７０３１については（図２０）、７０３１−４３系および７０３１−２５系を除く全ての陽性系が、２００ｐｐｍを下回るレベルで毒素Ａタンパク質を含んでいた（百万当たりの数；ここにおいて、１０００ｐｐｍは、全抽出可能タンパク質の０．１％に等しい）。
【００９０】
三つのｐＤＡＢ７０３１系（７０３１−０４３、０２５および０４１）からの自己Ｔ１子孫が、毒素Ａタンパク質蓄積および、ＴＨＷ給餌への耐性について試験された。この実験で分析した全ての子孫を、導入遺伝子の存在を裏付けるためにカナマイシン含有培地において選択した。これら三つの系の親は、Ｔ０世代において、それぞれ、１０５６、３４９および１３４ｐｐｍの毒素Ａタンパク質のレベルを示した。しかしながら、系７０３１−０２５および７０３１〜０４１からの子孫は毒素Ａタンパク質を産生した。系７０３１−０４３については、３２のうち９の子孫が非常に低い毒素Ａタンパク質レベルを示し（＜８０ｐｐｍ）；他のものは検出可能な毒素Ａを示さなかった。明らかに、毒素Ａ遺伝子の発現は、これらの子孫植物において見られなくなった。その結果、これらの植物のいずれもＴＨＷへの耐性を示さなかった（データは示さず）。
【００９１】
これらのデータは、殺虫活性および毒素Ａ増大レベルについての一次形質転換体（Ｔ０植物）の大規模試験を促した。このために、構築物ｐＤＡＢ７０３１（図２０）を用いて、さらに２８０のトランスジェニック系を産生した。これら２８０の形質転換体のうち、一つの系（７０３１−２４０）のみが、著しく高い殺虫活性（１００％昆虫致死率）を示した（図２９〜表２）。この植物は７８８ｐｐｍの毒素Ａタンパク質レベルを有し、これら２８０の系のうち最も高い発現体であった。毒素Ａタンパク質生成および、そのＴ１子孫３２の昆虫活性を決定した。結果は、１１の子孫が検出不可能なレベルの毒素Ａタンパク質および殺虫活性を有しており、他の２１の植物が、毒素Ａタンパク質生成の高い乃至非常に高いレベル（７３９〜７０２３ｐｐｍ）を保持し、１００％昆虫致死率を示すことを示した。構築物ＣｓＶＭＶ−ＧＵＳ−ＯＲＦ２５で形質転換した対照植物についての昆虫致死率は１８．７％であった。
【００９２】
上記の結果は、毒素Ａの蓄積が植物において閾値レベル（約７００ｐｐｍ）に達したときに、ＴＨＷへの完全な耐性を与えることができることを示した。しかしながら、昆虫耐性系を回復する頻度は非常に低い（３４０のうち１、すなわち０．３％）ことが分かった。これは、おそらく、強度の構成的プロモーターが用いられたとしても、形質転換ベクターｐＤＡＢ７０３１（図２０）の大きな毒素Ａ遺伝子の発現が全体として低いことによる。
【００９３】
オスモチンＵＴＲ−毒素Ａ構築物
植物における毒素Ａ遺伝子の発現を向上させるために、タバコオスモチン遺伝子の５’および３’ＵＴＲ配列（配列番号２および３）を、ここに記載のように、毒素Ａコーディング領域の対応する端部に付加することにより、新規構築物を産生した。これらのオスモチンＵＴＲ構築物因子が毒素Ａ遺伝子発現レベルを向上させるか決定するために、それらの効果が、三つの毒素Ａ遺伝子構築物：ｐＤＡＢ７０２６（全長Ａ０遺伝子）（配列番号５）、ｐＤＡＢ７０２７（Ａ１／ΔＣ遺伝子）（配列番号８）、およびｐＤＡＢ７０２８（Ａ２遺伝子）（配列番号１０）において試験された（図７参照）。
【００９４】
ＲＮＡ発現パターンは、これらの三つのオスモチン−毒素Ａ遺伝子構築物で形質転換したトランスジェニック植物において試験された。ノーザンブロット分析は、三つの構築物の全てを含む３０の実験植物のうち２０が、予想された分子サイズの単一の毒素Ａ  ＲＮＡを示すことを示した（データは示さず）。従って、これらの結果は、類似の非オスモチンＵＴＲ−毒素Ａ構築物で観察される結果と同じであった。これらのオスモチン−毒素Ａ構築物のタンパク質レベルを、それらの非オスモチン−毒素Ａ対照物と比較した（図２９−表２）。全部で３４０のｐＤＡＢ７０３１植物のうち、僅かに２３％が毒素Ａタンパク質の検出可能なレベルを有しており、発現植物の平均毒素Ａ蓄積レベルは６７ｐｐｍであった。２７３のｐＤＡＢ７０２６トランスジェニック植物について、３９％が毒素Ａタンパク質を含んでおり、発現植物の平均レベルは３９０ｐｐｍであった。従って、これらの二つの構築物の間に約６倍の相違があった。全ての実験植物が、統計的分析（すなわち、発現体および非発現体）に含まれる場合、平均毒素Ａ生成レベルは、ｐＤＡＢ７０３１植物について１５ｐｐｍであり、ｐＤＡＢ７０２６植物について１５０ｐｐｍであった（１０倍の相違）。全毒素Ａ生成および毒素Ａ蓄積の増加に加えて、各構築物について高い発現体（毒素Ａタンパク質＞７００ｐｐｍ）の数も異なっていた。ｐＤＡＢ７０３１植物のうち、２つの高い発現体（０．６％）があり、ｐＤＡＢ７０２６植物群においては、１３の高い発現体（４．７％）があった。構築物ｐＤＡＢ７０２６（＞２，０００ｐｐｍ）についての高い発現体について、植物細胞中の毒素Ａタンパク質の蓄積は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて容易に観察することができた（図８Ｂ）。
【００９５】
構築物ｐＤＡＢ７０３３を有する植物について、５８％がトランケートされたＡ１タンパク質を生成し、発現タンパク質の平均Ａ１タンパク質レベルは２５１ｐｐｍであった。ｐＤＡＢ７０２８トランスジェニック植物について、試験タンパク質の９０％がＡ１タンパク質を示し、蓄積の平均レベルは１１３１ｐｐｍ（４．５倍増加）であった。オスモチン隣接配列の効果も、Ａ２タンパク質を生成するように設計された構築物を有するトランスジェニック植物において見られた。試験した３２のｐＤＡＢ７０３２植物のいずれにおいてもＡ２タンパク質は検出されなかった（表１）。しかしながら、構築物ｐＤＡＢ７０２８を有する２５の植物において、４０％（１０の植物）が、Ａ２タンパク質の単一バンドを産生した（図２９−表２および図８Ａ）が、全体の発現レベルは高く無かった。これらのデータは、タバコオスモチンＵＴＲ配列が、トランスジェニックシロイヌナズナ植物における毒素Ａ遺伝子発現を大きく向上させ得ることを明らかに示している。
【００９６】
毒素Ａタンパク質の全蓄積の増加も、昆虫耐性系を回復するチャンスを増加させた。２５９の一次ｐＤＡＢ７０２６形質転換体に、バイオアッセイを直接行った。これらのＴ０植物のうち、９の系（７０２６−０１１系を含まない、以下参照）が１００％昆虫致死率を示した（図３０−表３）。７０２６−１２７系を除いて、これらの全ての系は、１０００ｐｐｍより高い毒素Ａレベルを有していた。毒素Ａタンパク質の生物活性および高レベルの蓄積は、次世代に同様に伝播された。これら９の系の各々および７０２６−０１１系（図３０−表３）について、少なくとも３２の子孫が試験された。バイオアッセイは７０２６−０１１系のＴ０植物については行われなかったが、そのＴ１子孫は、Ｔ０植物が高レベルの毒素Ａタンパク質を有していたので、この研究に含まれた。７０２６−０１１系について、７１のＴ１子孫の一つを除く全てが１００％昆虫致死率を示した。残りの植物は致死率８７．５％（８のうち１の昆虫が生き残った）であり、これはそれにも拘わらず対照致死率（１９％）より著しく高かった（表６）。これに対して、７０２６−１９５については、３２のＴ１子孫のどれも、毒素Ａ蓄積または殺虫活性を示さなかった。他の系については、子孫の％は毒素Ａタンパク質の高レベルを示し、殺虫活性は９０％〜１８％に及んでいた（図３０−表３）。合計で、これら１０系の合計３３３のＴ１子孫を分析し、２１４は高レベルの毒素Ａタンパク質を維持していることが分かった。これらのＴ１高発現のうち、２１１（９８％）が、対照群と比較してかなり高い殺虫活性を有していた（図３０−表３）。図３１−表４は、各系のＴ１子孫のうちの、高発現体および低または非発現体の平均的昆虫致死率を示す。これらの結果は、さらに、毒素Ａタンパク質の高レベルの蓄積が、ＴＨＷに対する植物の殺虫活性の原因となることを確認した。
【００９７】
Ｔ０ｐＤＡＢ７０２６植物のうちの昆虫耐性系についてのスクリーニング中、非常に低い毒素Ａ蓄積または蓄積の無い四つの系が見出されたが、なお、かなり高い殺虫活性を示した。これらの四つの系の各々から１６のＴ１子孫が試験された。これらの植物のどれも、毒素Ａタンパク質または昆虫活性を示さず（データを示さず）、これら四つの系が昆虫バイオアッセイにおいて偽陽性であることが示された。Ｔ０植物についての初期バイオアッセイは、おそらく、試験昆虫生存力による、または形質転換プロセスから生じる未決定の人工産物によると思われた。
【００９８】
これに対して、我々はまた、毒素Ａタンパク質の高レベル蓄積を示すが、著しい昆虫致死率は示さない四つの形質転換を同定した。これらが偽陰性結果であるか決定するために、これらの系の各々からの３２の子孫が分析された。どの子孫も毒素Ａタンパク質または昆虫活性を示さない系７０２６〜１０１を除いて、合計１１子孫の他の三つの系は、毒素Ａ遺伝子の高レベル発現を示した（図３２−表５）。これらＴ１高発現体により示される平均昆虫致死率は９８．２％であり、対照群では１４．０％であった。これらの結果は、Ｔ０世代におけるこれらの系について観察された強くない活性は現在のバイオアッセイ手順から逸脱するものであることを確認した。これらの異常な結果は、遺伝子機能の検査において、Ｔ０植物のみでなく、トランスジェニック子孫を試験する必要性を強調している。
【００９９】
要約すれば、Ｔ１世代で分析した２７４のｐＤＡＢ７０２６トランスジェニック系のうち、１２の系（４．４％）において、遺伝される度合いが３％（７０２６−１０１系）から１００％（７０２６−０１１系）に変化しても、遺伝可能な高レベルの毒素Ａ生成および昆虫活性が同定された（図２９−表２）。これらの結果は、オスモチンＵＴＲ配列による毒素Ａタンパク質の向上した蓄積が、昆虫耐性系の回復頻度を０．３％から４．４％に増加させたことを示している（図２９−表２）。
【０１００】
７０２６−１０１系および７０２６−０５７系では、毒素Ａ遺伝子発現と関連する殺虫活性の安定性を決めるために、さらに第５世代（Ｔ４植物）を続けた。７０２６−０１１系について、毒素Ａおよび殺虫活性の過剰発現が、第５世代の全ての子孫において安定に維持された（図３３−表６）。しかしながら、７０２６−０５７系についての遺伝性パターンはより複雑であった（図９）。３８のＴ１子孫が試験され、導入遺伝子についてホモ接合の全部で１５のＴ１植物が、毒素タンパク質産生および昆虫活性を失った。残りの２３のヘミ接合の子孫のうち７のみが、毒素Ａの高レベルの蓄積と１００％昆虫致死率の両方を保持した（図２９−表２）。Ｔ２世代を、７の昆虫活性ヘミ接合Ｔ１植物のうち６から誘導された（図９）。各Ｔ２ファミリーについての活性植物の％は０％〜３５％であった。
【０１０１】
Ｔ４子孫の試験により一つのＴ３ファミリーが同定され、そのファミリーのうちの６０％が高発現体であり昆虫活性であった。一つの興味深い問題は、このファミリーについて、Ｔ４世代における活性植物の平均％が、Ｔ３世代を超えて増加するか決めることであった。明らかに、これはそうではなかった。単一のＴ２ファミリーに由来する５のＴ３ファミリーの子孫についても同様の結果が見られ、３５．８％のファミリーを構成する植物が活性植物であった。
【０１０２】
毒素Ａ複合体の構造モデル（図１）に従うと、これらのトランスジェニック材料により生じる問題は、Ａ２ポリペプチドが複合体の活性の必須の部分であるかどうかということであった。比較的高レベルでＡ１タンパク質しか生成しない構築物ｐＤＡＢ７０３３、７０３４および７０３５を含むトランスジェニック植物を、さらに研究した。１４６のＴ１子孫のスクリーニングから、三つ全てのＡ１構築物に及ぶ１２の高発現体が同定された。バイオアッセイの結果は、これらの植物のどれも、対照植物と比べて著しく高い昆虫致死率を示さない（データを示さず）ことを示した。これは、シロイヌナズナにおいてＡ１タンパク質のみでは、ＴＨＷに対する殺虫活性について充分でないことを示している。
【０１０３】
ディスカッション
この実験において、我々は、まず、トランスジェニックシロイヌナズナ植物における植物最適化P. luminescens  Ｗ−１４株のｔｃｄＡ遺伝子の発現を分析した。結果は、植物における毒素Ａタンパク質の挙動について次の重要な洞察を提供した：１）全長ｔｃｄＡ遺伝子が、毒素Ａタンパク質を生成することができ、その最終生成物は天然P. luminescens  Ｗ−１４株および組換え大腸菌株から観察されるものに似ている。すなわち、毒素Ａタンパク質は、植物細胞中で適切に加工される；２）Ａ０タンパク質のＮ−末端の８８アミノ酸は、タンパク質分解についてのシグナルペプチドとして作用すると思われる。これは、これらのアミノ酸の欠失が、ＴｃｄＡタンパク質のＡ１およびＡ２ポリペプチドへの分解を防止するからである；３）Ａ１タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端は、植物細胞中でさらに加工されなかった、あるいは、三つの異なるＡ１遺伝子構築物によりコードされたＡ１タンパク質が同じ分子量を有する。
【０１０４】
構築物ｐＤＡＢ７０３１（図２０）を用いるこの実験の初期段階において、トランスジェニック植物における毒素Ａタンパク質の全蓄積が非常に低いことが観察された。全体として低い発現はまた、昆虫耐性系の低い回復頻度をもたらした（トランスジェニックの０．３％）。構築物ｐＤＡＢ７０３２の特定の場合、Ａ２  ｍＲＮＡが容易に検出されても、トランスジェニック植物においてＡ２タンパク質が観察されなかった。植物における低いトランスジェニック発現は、特に非相同性材料からの遺伝子を用いる場合、多くの因子に起因し得る。強力なプロモーターの使用は、必ずしも、高レベルの遺伝子発現を保証しない。組み込み位置の効果による低い転写活性に加えて、不適当なスプライシング、不完全なポリアデニル化、不十分な核輸出、ｍＲＮＡ不安定性、および低い翻訳効率のような特徴により、全ての場合、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の蓄積レベルが低くなり得る。これらの潜在的落とし穴の除去が、植物最適化毒素Ａコーディング領域の完全な再設計および合成により試みられた。さらに、毒素Ａ遺伝子発現を、タバコオスモチン遺伝子からの５’および３’ＵＴＲ隣接配列を毒素Ａ遺伝子に付加することにより向上した。オスモチンｍＲＮＡ５’および３’ＵＴＲの構造的特徴は、安定で、高度に発現された植物ｍＲＮＡの基準に一致しており；ｉ）５’ＵＴＲ配列が、高度にＡＴを含み、それによりリボソームを開始コドンに容易にスキャンニングして翻訳を開始することができる、およびｉｉ）３’ＵＴＲ配列が、ＲＮａｓｅからの分解を効果的に阻害し得る強力なステム−ループ二次構築物を形成することができる（Ｋｏｚｉｅ、１９９６年）。実際、オスモチン５’および３’ＵＴＲ配列を毒素Ａ遺伝子の対応末端に付加した後、Ａ１およびＡ０タンパク質の全生成は５〜１０倍増加した。その結果、ｔｃｄＡ遺伝子で形質転換した昆虫耐性系の回復頻度は、０．３％から４．４％に増加した。また、初めて、Ａ２遺伝子のみで形質転換した試験植物の４０％において、Ａ２タンパク質の蓄積を検出することができた。
【０１０５】
重要なことに、トランスジェニックシロイヌナズナ植物中のｔｃｄＡの過剰発現が、植物を給餌ＴＨＷに完全に毒性にすることができることが示された。大きなＡ１サブユニットのみを含む植物が不活性化されたので、Ａ２サブユニットの存在が、毒素Ａの殺虫活性に関係していることが初めて明らかに示された。２５００の個々の植物についての我々の分析において、殺虫活性は、常に、毒素Ａタンパク質の高レベルの蓄積と関係していた。これらの結果は、毒素ＡがＳＣＲに対する強度の活性も有するので、毒素Ａ遺伝子が、農業における作物保護用の優れた候補であることを示している。毒素Ａ遺伝子および他のP. luminescens毒素遺伝子が、農業における害虫駆除のための新しい経路を開くかも知れない。今まで、トランスジェニック作物昆虫制御はＢｔ毒素遺伝子の使用に強く依存しており、P. luminescens毒素遺伝子が、Ｂｔ植物への害虫耐性の発現の問題の低下を助けることができる。既にＢｔ遺伝子を含む植物中への毒素Ａ遺伝子の積み重ねも、効果および害虫の範囲について昆虫毒性の効果を増すこともできる。
【０１０６】
要約
トランスジェニックシロイヌナズナ植物中の三つの毒素Ａコーディング領域のタンパク質発現の分析を表１に供する。オスモチンＵＴＲ隣接物を有さないＡ０遺伝子構築物を含む植物において、３４０の試験植物の２３％しか、検出可能なタンパク質発現を示さなかった。発現植物の毒素Ａタンパク質の平均レベルは、６７ＰＰＭであった（百万当たりの数、可溶性タンパク質１ｍｇ当たりのｎｇ数）。しかしながら、オスモチンＵＴＲ−Ａ０遺伝子構築物を有する２７３の試験トランスジェニック植物について、３９％がタンパク質発現を示し、発現している植物における平均毒素Ａタンパク質レベルは３９０ＰＰＭであった。従って、オスモチンＵＴＲ−Ａ０遺伝子構築物は、非オスモチンＡ０構築物と比べて約６倍高く発現される。全ての試験植物が統計的分析に含まれる場合、Ａ０構築物についての平均毒素Ａ発現レベルは１５ｐｐｍであり、オスモチンＵＴＲ−Ａ０植物についての平均毒素Ａ発現レベルは１５０ＰＰＭであった。すなわち、これらの二つの構築物間の平均毒素Ａ生成は約１０倍である。各構築物についての高発現体の数も計算した（毒素Ａタンパク質＞７００ＰＰＭ）。Ａ０タンパク質のうち、二つの高い発現体があり（０．６％）、オスモチンＵＴＲ−Ａ０植物群においては、１３の高い発現体があった（４．７％）。
【０１０７】
Ａ１／ΔＣ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物について、５８％がトランケートしたＡ１タンパク質を発現し、発現植物の平均Ａ１タンパク質発現レベルは２５１ｐｐｍであった。オスモチンＵＴＲ−Ａ１／ΔＣ構築物を有するトランスジェニック植物について、試験植物の９０％がＡ１タンパク質発現を示し、発現の平均レベルは１１３１ＰＰＭであった（４．５倍増加）。Ａ２遺伝子を有するトランスジェニック植物については、Ａ２タンパク質発現を、３２の試験植物のいずれにおいても検出することができなかった。しかしながら、２５のオスモチン−Ａ２植物において、Ａ２タンパク質を発現する１０の植物（４０％）が見られ、平均発現レベルは３１ｐｐであった。これらのデータは、タバコオスモチンＵＴＲ配列が、三つの異なる遺伝子構築物を有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物における外来遺伝子発現を大幅に向上させ得ることを明らかに示している。
【０１０８】
全長毒素Ａ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物の殺虫活性もまた評価された。非オスモチン／Ａ０植物について、一つの系（０．３％）のみが、Ｔ０世代におけるタバコホルンワーム（ＴＨＷ）に対して完全な耐性（１００％致死率）を示し、その活性を次の世代で確認した。オスモチンＵＴＲ−Ａ０遺伝子を有する植物群については、ＴＨＷに対する遺伝性の耐性を有する１０の系（３．６％）が見出された。
【０１０９】
本発明の好ましい実施態様をこのように詳細に説明したが、種々の記載実施態様は、単なる本発明の例であり、本発明の範囲の精神から離れることなくその多くの明らかな変化が可能であると理解すべきである。従って、当業者は、本発明が、ここに記載の特定の実施態様に限定されないことを容易に理解する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】毒素Ａタンパク質の推定加工経路およびその提案された構造モデルを示す図である。未加工Ａ０タンパク質および分解されたＡ１およびＡ２ポリペプチドの分子量を示す。（  ）：Ｎ−末端の８７アミノ酸；（  ）：Ａ１ポリペプチドのＣ−末端の８８アミノ酸。
【図２】植物形質転換に用いられる毒素Ａ遺伝子構築物を示す図である。六つの異なる毒素Ａ遺伝子断片を、それぞれ、Ｃａｓｓｓａｖａ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  （ＣｓＶＭＶ）プロモーターとＴｉ１５９５５プラスミドＯＲＦ２５  ３’配列との間に挿入した。ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡ右境界；ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ左境界；ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子；（  ）：Ｎ−末端の８７アミノ酸；（  ）：Ａ１ポリペプチドのＣ−末端の８８アミノ酸。各毒素Ａ遺伝子断片の表示を図に示す。
【図３】六つの異なる毒素Ａ構築物を有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物のＲＮＡ発現パターンを示すノーザンブロット分析を示す図である。各レーンの上部に、トランスジェニック植物が持つ毒素Ａ遺伝子断片の名称を示す。各構築物についての試験植物の数に対する予想されるＲＮＡ発現パターンの数（このブロットに示す）を以下においてｎ／Ｎとあらわす。ＭＷ：分子量。リボソームＲＮＡへのプローブの非特異的結合が起こる位置を矢印で示す。
【図４】トランスジェニックシロイヌナズナ植物における毒素Ａ発現のウエスタンブロット分析を示す図である。（Ａ）：レーン１：組換え大腸菌株；レーン２：ＣｓＶＭＶ−ＧＵＳ−ＯＲＦ２５遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物；レーン３〜１０：構築物ｐＤＡＢ７０３１を有するトランスジェニック植物。（Ｂ）：レーン１：組換え大腸菌株；レーン２〜６：構築物ｐＤＡＢ７０３６を有するトランスジェニック植物。Ａ２タンパク質の下のバンドは、シロイヌナズナ植物の抗体交差反応のバックグラウンドである。
【図５】トランスジェニックシロイヌナズナ植物におけるＡ１タンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す図である。（Ａ）：レーン１：組換え大腸菌株；レーン２〜６：構築物ｐＤＡＢ７０３５を有するトランスジェニック植物；レーン７：ＧＵＳ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物。（Ｂ）：レーン１：組換え大腸菌株；レーン２〜６：構築物ｐＤＡＢ７０３３を有するトランスジェニック植物；レーン７：ＧＵＳ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物。（Ｃ）：レーン１：組換え大腸菌株；レーン２〜６：構築物ｐＤＡＢ７０３４を有するトランスジェニック植物；レーン７：ＧＵＳ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物。Ａ２タンパク質の下のバンドは、シロイヌナズナ植物の抗体交差反応のバックグラウンドである。
【図６】タバコオスモチン遺伝子の５’および３’ＵＴＲの配列および構造特徴を示す図である。（Ａ）：オスモチン５’ＵＴＲ（配列番号１）のＤＮＡ配列およびそのＡ／Ｔ含量；（Ｂ）：オスモチン３’ＵＴＲ配列のコンピューター予想ＲＮＡ二次構造。
【図７】植物形質転換に用いられる改変毒素Ａ遺伝子構築物を示す図である。タバコオスモチン遺伝子（  ）の５’および３’ＵＴＲ配列を、構築物ｐＤＡＢ７０３１、ｐＤＡＢ７０３３およびｐＤＡＢ７０３２における毒素Ａの両端に付加した（図２）。得られる構築物を、右側に示すようにｐＤＡＢ７０２６、ｐＤＡＢ７０２７およびｐＤＡＢ７０２８と表す。ＣｓＶＭＶ：Ｃａｓｓｓａｖａ  Ｖｅｉｎ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓプロモーター；ＯＲＦ２５：Ｔｉ１５９５５プラスミドのＯＲＦ２５  ３’配列；ＲＢ：Ｔ−ＤＮＡ右側境界；ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡ左側境界；ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子；（  ）：Ｎ−末端の８７アミノ酸；（  ）：Ａ１ポリペプチドのＣ−末端の８８アミノ酸。各毒素Ａ遺伝子断片の表示を図に示す。各構築物の名前を右側に示す。
【図８】トランスジェニックシロイヌナズナ植物の毒素Ａ発現の分析を示す図である。構築物ｐＤＡＢ７０２８を有するトランスジェニック植物中のＡ２タンパク質発現のウエスタンブロット分析。レーン１〜４およびレーン６〜８：トランスジェニック植物；レーン５：組換え大腸菌株。（Ｂ）構築物ｐＤＡＢ７０２６を有するトランスジェニック植物中の毒素Ａ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析。レーン１：毒素Ａ遺伝子の高発現体；レーン２〜４：毒素Ａ遺伝子の三つの低発現体；レーン５：ＧＵＳ遺伝子構築物を有するトランスジェニック植物。Ａ０およびＡ１タンパク質の位置を矢印で示す。全葉におけるタンパク質の１０ｕｇを各レーンに負荷した。
【図９】トランスジェニック７０２６−０５７系中の昆虫耐性の複数世代分析を示す図である。各所定の子孫ファミリー中の活性植物の数をｎ／Ｎ（活性植物／合計試験植物）として示し、合計試験植物の％（括弧内に示す）として示す。ここで示す全ての活性植物は高発現体であり、１００％昆虫致死率を示した。各子孫ファミリーについての発生数を左側に示す。
【図１０】７０２６−１９０系のＴ１子孫の高発現体と低発現体との間の毒素Ａ  ＲＮＡ発現の比較分析を示す図である。（Ａ）：毒素Ａ  ＲＮＡ発現のノーザン分析。レーン１〜４：低毒素Ａ発現レベル（＜５０ｐｐｍ）を有する四つのＴ１植物。レーン５〜８：高毒素Ａ発現レベル（＞１４００ｐｐｍ）を有する四つのＴ１植物。（Ｂ）：ＲＮＡゲルのエチジウムブロミド染色。
【図１１】異なる年齢のＴＨＷに対する毒素Ａ発現トランスジェニック植物の活性を示す図である。各虫齢において１６の幼虫を用いて、毒素Ａ発現植物の活性を試験した。ＧＵＳ構築物で形質転換した植物を、陰性対照として用いた。上に示すデータは、二つの複製実験の平均である。
【図１２】プラスミドｐＤＡＢ１５４２のマップを示す図である。
【図１３】プラスミドｐＫＡ８８２のマップを示す図である。
【図１４】プラスミドｐＤＡＢ７０１３のマップを示す図である。
【図１５】プラスミドｐＤＡＢ７０２０のマップを示す図である。
【図１６】プラスミドｐＤＡＢ６００１のマップを示す図である。
【図１７】プラスミドｐＤＡＢ７００２のマップを示す図である。
【図１８】プラスミドｐＤＡＢ７０２１のマップを示す図である。
【図１９】プラスミドｐＤＡＢ７０２６のマップを示す図である。
【図２０】プラスミドｐＤＡＢ７０３１のマップを示す図である。
【図２１Ａ】全長Ａ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である（その１）。
【図２１Ｂ】全長Ａ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である（その２）。
【図２１Ｃ】全長Ａ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である（その３）。
【図２２Ａ】Ｎ−末端トランケーションを有するＡ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である（その１）。
【図２２Ｂ】Ｎ−末端トランケーションを有するＡ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である（その２）。
【図２３Ａ】Ｃ−末端トランケーションを有するＡ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である（その１）。
【図２３Ｂ】Ｃ−末端トランケーションを有するＡ０オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である（その２）。
【図２４Ａ】全長Ａ１オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である（その１）。
【図２４Ｂ】全長Ａ１オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である（その２）。
【図２５Ａ】Ｎ−末端およびＣ−末端にトランケーションを有するＡ１オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す図である（その１）。
【図２５Ｂ】Ｎ−末端およびＣ−末端にトランケーションを有するＡ１オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す図である（その２）。
【図２６】Ａ２オスモチン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す図である。
【図２７】フォトラブダス毒素Ａのタンパク質配列（配列番号４）を示す図である。
【図２８】種々の毒素Ａ構築物を有するトランスジェニック植物のタンパク質発現の定量的分析を要約する図（表１）である。
【図２９】毒素Ａを有するトランスジェニック植物とオスモチン毒素Ａ構築物との間の殺虫活性およびタンパク質発現を比較する図（表２）である。
【図３０】構築物ｐＤＡＢ７０２６で形質転換した２７４のトランスジェニックシロイヌナズナ系のバイオアッセイ結果を要約する図（表３）である。
【図３１】構築物ｐＤＡＢ７０２６で形質転換したＴ１トランスジェニック植物の高発現および低発現の平均昆虫致死率に関するデータを示す図（表４）である。
【図３２】高い毒素Ａ発現を示すがＴ０世代において低い活性を示す、構築物ｐＤＡＢ７０２６で形質転換したトランスジェニック系のＴ１子孫の昆虫抵抗性およびタンパク質発現の分析を示す図（表５）である。
【図３３】トランスジェニック系７０２６〜００１により示される昆虫耐性の複世代分析を示す図（表６）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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