(57)【要約】【課題】  無保護のβ−アラニン酸クロライドでＬ−ヒスチジンをアシル化し、高純度のＬ−カルノシンを高収率で得ることができるＬ−カルノシンの合成方法を提供する。【解決手段】  Ｌ−ヒスチジンのアシル化によるＬ−カルノシンの合成法において、アシル化試薬として無保護のβ−アラニンクロライドの酸塩を使用することを特徴とするカルノシンの合成方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ヒスチジンのアシル化によるＬ−カルノシンの合成法において、アシル化試薬として無保護のβ−アラニンクロライドの酸塩を使用することを特徴とするカルノシンの合成方法。
【請求項２】
β−アラニンクロライドと塩を形成する酸は、塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トリフロロ酢酸、またはｐ−トルエンスルホン酸から選ばれる請求項１の方法。
【請求項３】
前記アシル化試薬は、Ｌ−ヒスチジンに対し少なくとも理論の１．５倍使用される請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記アシル化試薬は、Ｌ−ヒスチジンの酸塩の溶液または酸を含むＬ−ヒスチジンの溶液へ固体もしくは粉末として添加される請求項１ないし３のいずれかの方法。
【請求項５】
前記酸は、塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トリフロロ酢酸、またはｐ−トルエンスルホン酸から選ばれる請求項４の方法。
【請求項６】
アシル化反応は、室温以下の温度で実施される請求項１ないし５のいずれかの方法。
【請求項７】
極性溶媒中のＬ−ヒスチジン・ｐ−トルエンスルホン酸塩溶液へ、過剰のβ−アラニンクロライド・ｐ−トルエンスルホン酸塩を固体状で添加し、Ｌ−ヒスチジンをアシル化することを特徴とするＬ−カルノシンの合成方法。
【請求項８】
前記極性溶媒はジメチルアセタミドである請求項７の方法。
【請求項９】
アシル化反応は、不活性ガス雰囲気中−１０℃〜０℃の温度で行われる請求項７または８の方法。
【請求項１０】
β−アラニルクロライド・ｐ−トルエンスルホン酸塩は、Ｌ−ヒスチジンに対し少なくとも理論の１．５倍添加される請求項７ないし９のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−カルノシン、すなわちβ−アラニル−Ｌ−ヒスチジンの新規合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルノシンイは筋肉中に発見される天然ジペプチドであって、筋ＡＴＰアーゼの活性化作用、抗酸化作用を有し、またその亜鉛との錯体は抗潰瘍剤として市販されている。最近では健康食品サプリメントとして欧米において広まっている。
【０００３】
一般にジペプチドの合成法は、アミノ基を保護したＮ末端アミノ酸の反応性誘導体、例えば酸クロライドでＣ末端アミノ酸のアミノ基をアシル化し、アミノ基を脱保護することよりなる。これまで報告されているＬ−カルノシンの合成法の大部分はこの方法に従っており、β−アラニンの保護基としてフタルイミド、ベンシルオキシカルボニルなどが、また反応性誘導体として酸クロライドのほか、酸アジド、スクシンイミジル、エトキシカルボニルなどが用いられている。β−アラニンはキラル炭素原子を持たないため、β−ニトロもしくはヨードプロピオン酸の反応性誘導体でＬ−ヒスチジンをアシル化し、還元またはアンモニアとの反応によってＬ−カルノシンとする方法が報告されている。またβ−アラニンのラクタムまたはチオラクタムをＬ−ヒスチジンのアシル化剤とする方法も報告されている。最近Ｌ−ヒスチジンをシアン酢酸エステルでアシル化し、生成するＮ−シアノアセチル−Ｌ−ヒスチジンを接触還元してＬ−カルノシンを合成する方法が開示された。さらにＬ−ヒスチジンを遊離塩基の状態でアシル化すると副生成物が多く生成し、Ｌ−カルノシンの収率が低くなるため、メチルエステルなどのエステルとし、アシル化後Ｌ−カルノシンエステルを加水分解する方法も報告されている。
【０００４】
従来技術のＬ−カルノシン合成方法は、β−アラニンのアミノ基の保護および脱保護、後でアミノ基へ変換し得る基を有する前駆体を使用する場合はアミノ基への変換、シアノ基の還元などの付加工程を必要とし、工程が長くかつ収率も満足ではなかった。
【０００５】
〔参考文献〕
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Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４８，３９２−３９３（１９８３）；
ＷＯ２００１／０６４６３８（特表２００４−５０９８３４）．
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、無保護でβ−アラニンの酸クロライドとＬ−ヒスチジンを反応させてＬ−カルノシンを合成する方法を考え、アシル化試薬としてβ−アラニンクロライドの酸塩を使用することによってこれが可能であることを発見した。無保護のβ−アラニンを酸クロライドの形に活性化すると、アミノ基の求核性による分子間での自己縮合が考えられるが、求核性を抑制するため無保護のβ−アラニンクロライドを酸塩の形でアミノ基を４級化することにより副反応を抑えることができた。
【０００７】
そこで本発明は、Ｌ−ヒスチジンのアシル化によるＬ−カルノシンの合成法において、アシル化試薬として無保護のβ−アラニンクロライド酸塩を使用することを特徴とするＬ−カルノシンの合成方法を提供する。
【０００８】
好ましい具体例では、Ｌ−ヒスチジンも酸塩の形でアシル化反応に使用される。これにより副生成物の生成およびラセミ化を抑制することができる。代りにＬ−ヒスチジンの溶液へ酸を加えてもよい。
【０００９】
塩を形成する酸は、塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トリフロロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸などであるが、特に塩酸およびｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。アシル化反応は、Ｌ−ヒスチジンの溶液へ粉末または固体の前記アシル化試薬を攪拌下に添加し、Ｌ−ヒスチジンの大部分が消費されるまで攪拌を継続することにより行われる。この際アシル化試薬を過剰、例えば少なくとも理論の１．５倍添加し、室温以下、例えば０℃の温度で行うのが好ましい。反応終了後、例えば反応液を水で希釈し、イオン交換樹脂処理によって不純分を除去した後、メタノール、エタノールのようなアルコールまたは含水アルコールを加えて結晶化することによって化学的および光学的純度の高いＬ−カルノシンを高収率で得ることができる。
【００１０】
ここに記載した本発明によれば、アミノ基の保護および脱保護、その他の付加工程なしで、β−アラニンとＬ−ヒスチジンとから高い純度のＬ−カルノシンを短かい工程で高収率で合成することが可能になる。
【好ましい実施態様】
【００１１】
本発明は、無保護β−アラニンクロライド（３−アミノプロピオン酸クロライド）の酸付加塩をＬ−ヒスチジンのアシル化試薬として使用する。このアシル化試薬はあらかじめ生成したβ−アラニンの酸付加塩に塩化チオニルを反応させて製造することができる。アシル化反応は、Ｌ−ヒスチジンの溶液に固体もしくは粉末状の前記アシル化試薬を添加し、攪拌することによって行われる。この際できるだけ多くのＬ−ヒスチジンがアシル化されるように、アシル化試薬を少なくとも１．５倍、特に２．０倍過剰に添加するのが好ましい。
【００１２】
Ｌ−ヒスチジンもやはり酸塩の形で反応させることが好ましく、これにより副生成物の量を減らすことができる。代って酸をＬ−ヒスチジンの溶液に加えても良い。
【００１３】
好ましい反応溶媒は、水、酢酸、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどであるが、Ｌ−ヒスチジンの酸塩の代りにこれら溶媒に酸を加えても良い。例えば１Ｎ塩酸、リン酸緩衝液（ｐＨ２．８）、トリフルオロ酢酸／ジメチルホルムアミド混液、メタンスルホン酸／ジメチルホルムアミド混液、メタンスルホン酸／ジメチルアセタミド混液、メタンスルホン酸／Ｎ−メチル−２−ピロリドン混液等である。
【００１４】
酸クロライドとアミンとの反応には生成する塩化水素を結合する塩基を使用するのが一般的であるが、本発明のアシル化反応では酸結合塩基の使用を省くことができる。もし使用するならば、３級アミン、例えばトリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンを使用することができる。
【００１５】
β−アラニンクロライドまたはＬ−ヒスチジンと塩を形成する酸には多数の無機および有機酸が含まれるが、実用上塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、およびｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸が最も好ましい。アシル化試薬およびＬ−ヒスチジンと塩を形成する酸と溶媒の最も好ましい組合わせは、β−アラニンクロラドのｐ−トルエンスルホン酸塩とＬ−ヒスチジンのｐ−トルエンスルホン酸塩をジメチルアセトアミドに溶解にして縮合させる方法である。無保護の反応では生成物の一部がラセミ化し、光学純度が低下する傾向があり、またはβ−アラニル−アラニル−ヒスチジンが主であるトリペプチド副生成物を生成する傾向があるが、上の組合わせによりラセミ化および副生成物の生成を最小に抑えるこができる。
【００１６】
好ましい反応温度は室温以下、最も好ましくは−１０℃〜０℃である。反応を不活性ガス、例えばアルゴン雰囲気中で実施することも好ましい。反応時間はＬ−ヒスチジンの少なくとも大部分、例えば９０％以上が反応に消費される時間である。これには例えば反応温度０℃附近の場合、少なくとも６時間を要するであろう。
【００１７】
反応終了後、常法に従って反応液からＬ−カルノシンを回収することができる。例えば反応液を水で希釈し、強酸性イオン交換樹脂に吸着後、アンモニア水で溶出させ、溶出液を濃縮して弱酸性イオン交換樹脂に通液し、濃縮後エタノールを加えてＬ−カルノシンを結晶化する。
【００１８】
以下実施例によって本発明を例証する。実施例中に使用した略号の意味は次のとおりである。
β−Ａｌａ：β−アラニン
β−ＡｌａＣｌ：β−アラニンクロライド
Ａｃ：アセチル
ＡｃＯＨ：酢酸
ＣＡＳ：Ｌ−カルノシン
ＤＭＡ：ジメチルアセタミド
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン
ＭｓＯＨ：メタンスルホン酸
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ｐ−ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸
【００１９】
〔参考例１〕β−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌの合成
β−Ａｌａ５０ｇ（０．５６ｍｏｌ）をトルエン４９０ｇと水２．８ｇの混液に懸濁させ、激しく攪拌しながら塩化水素ガスを８時間かけて吹き込み、β−Ａｌａ・ＨＣｌを生成させる。その後反応液に室温で塩化チオニル２４５ｍｌ（３．３７ｍｏｌ）を滴下し、１時間攪拌する。その後内温を５０℃に上げ、３８時間激しく攪拌する。反応後反応液をすばやく濾過し、得られた結晶をトルエン２００ｍｌで洗浄し、洗浄した結晶をトルエン２００ｍｌに懸濁させ、エバポレーターで濃縮し、褐色パウダー状のβ−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌ  ７３．３６ｇ（９０．８％）を得た。ＩＲ（ヌジョール）：１７９４ｃｍ-1（Ｃ＝０）
【００２０】
〔参考例２〕β−ＡｌａＣｌ・ｐ−ＴｓＯＨの合成
β−Ａｌａ５０ｇ（０．５６ｍｏｌ）を水１００ｍｌに溶かし、これにｐ−ＴｓＯＨ・Ｈ2 Ｏ  １０６．８ｇ（０．５６ｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌する。その後溶媒を留去し、トルエン１００ｍｌを加え、再び溶媒を留去すると定量的にβ−Ａｌａ・ｐ−ＴｓＯＨが得られる。次いでこれに室温でトルエン中チオニルクロライド２４５ｍｌ（３．３７ｍｏｌ）を滴下し、１時間攪拌する。その後温度を５０℃に上げ、３８時間激しく攪拌し、溶媒を減圧留去し、トルエンを加え、再び溶媒を留去し、パウダー状のβ−ＡｌａＣｌ・ｐ−ＴｓＯＨ  １５５．９ｇ（９９．３％）を得た。ＩＲ（ヌジョール）：１７９０ｃｍ-1（Ｃ＝０）
【００２１】
〔参考例３〕Ｈｉｓ・２ｐ−ＴｓＯＨの合成
Ｈｉｓ  １５５．１５ｇ（１．０ｍｏｌ）を水２５０ｍｌに溶かし、室温でｐ−ＴｓＯＨ・Ｈ2 Ｏ  ３８０．４２ｇ（２．０ｍｏｌ）を加えて３０分攪拌する。その後反応液を濃縮し、トルエン２００ｍｌ×２を加えて濃縮すると、Ｈｉｓ・２ｐ−ＴｓＯＨ  ４９５．２ｇ（９８．９％）が得られる。ＩＲ（ＫＢｒ）：１７３０ｃｍ-1（Ｃ＝０），１６２９ｃｍ-1（ａｒｏｍａｔｉｃ）
【００２２】
〔実施例１〕β−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌの使用
Ｈｉｓ  ０．５ｇをＡｃＯＨ  １０ｍｌまたは２０ｍｌに溶かし、室温でβ−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌ  ２当量を加えて３０分間攪拌する。反応液中の未反応Ｈｉｓ，生成したＣＡＳおよび副生したＡｃＨｉｓをそれぞれ定量し、出発Ｈｉｓに対する％を算出した。
【００２３】
ＡｃＯＨ 反応時間 ＨＩＳ ＣＡＳ ＡｃＨｉｓ
１０ｍｌ      ３０ｍｉｎ      ３０．５％      ６８．０％      １．６％
２０ｍｌ      ３０ｍｉｎ      ３４．６％      ６４．７％      ０．７％
【００２４】
〔実施例２〕β−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌの使用
Ｈｉｓ  ０．７８ｇを下表の溶媒に溶かして１０ｍｌとし、これにアルゴン雰囲気下、５℃でβ−ＡｌａＣｌ・ＨＣｌ  ２当量を添加し、室温で４時間まで攪拌する。反応時間２時間後および４時間後、反応液の未反応Ｈｉｓ，ＣＡＳおよび副生したＡｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓを定量し、出発Ｈｉｓに対する％を算出した。またエタノールで析出させた粗ＣＡＳについて光学純度（％ｅｅ）を測定した。
【００２５】
実験Ｎｏ．    溶媒      時間      Ｈｉｓ      ＣＡＳ      ％ｅｅ      副生成物
ｈ        ％          ％                            
─────  ─────  ───  ─────  ─────  ─────  ─────
１          １．０Ｍ    ２      ４．１      ８０．２    ９１．２      ９．７
MsOH/DMA    ４      １．４      ７９．４    ８６．６    １１．８
───────────────────────────────────────
２          ２．０Ｍ    ２      ７．０      ７９．７    ８６．３      ７．７
MsOH/DMA    ４      ２．２      ７９．７    ８１．６      ９．７
───────────────────────────────────────
３          ２．０Ｍ    ２    １１．０      ７５．２    ９２．６    １１．３
MsOH/DMA    ４      ４．２      ７８．５    ８５．８    １１．３
───────────────────────────────────────
【００２６】
〔実施例３〕β−ＡｌａＣｌ・ｐＴｓＯＨおよびＨｉｓ・２ｐＴｓＯＨの使用
Ｈｉｓ・２ｐＴｓＯＨ  １００ｇ（０．２ｍｏｌ）をＤＭＡ  ４００ｍｌに溶解し、アルゴン雰囲気下−１０℃でβ−ＡｌａＣｌ・ｐＴｓＯＨ  １１２ｇ（０．４ｍｏｌ）を１時間かけて添加し、０℃まで徐々に昇温し、攪拌する。反応終了後水を加えて残存するβ−ＡｌａＣｌを加水分解する。その後反応液を水で希釈し、強酸性イオン交換樹脂（ＳＫ−１Ｂ）に吸着後、２Ｎアンモニア水で溶出させ、溶出液を濃縮し、弱酸性イオン交換樹脂（ＷＫ−１１）に通液して濃縮し、８０％エタノールを加えて結晶化させ、乾燥してＣＡＳ２９．３ｇ（６４．７％）を得た。
化学純度９９．２％（ＵＬＴＲＯＮ  ＶＸ−ＯＤＳ，Ｓｈｉｎｗａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．使用），光学純度９９．３％ｅｅ（ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００，住友化学工業（株）使用）
1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2 Ｏ，２００ＭＨｚ）：δ２．６２−２．６９（２Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ2 ）；２．６９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ2 ＣＨＣＯＯＨ）；２．９８（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨ2 ＣＨＣＯＯＨ）；３．２３（２Ｈ，ｔ，ＮＣＨ2 ）；４．４９（１Ｈ，ｄｄ，ＣＨＣＯＯＨ）；６．９６（１Ｈ，ｄ，ＮＨＣＨ）；７．７１（１Ｈ，ｄ，ＮＣＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ）：１６４７ｃｍ-1，１５８５ｃｍ-1