(57)【要約】【課題】  生理活性を有するニガナ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高く、炎症やアレルギー症状、循環器疾患、又は頭髪の成長阻害や抜毛の調整剤、または化粧品用組成物等に適用することができるリポキシゲナーゼ阻害剤や、かかる疾患を改善し得るリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材を提供する。【解決手段】  ニガナ（Ixeris dentata）及び／又はその処理物を有効成分とし、処理物が、ニガナの発酵処理物であることが好ましい。ニガナの発酵処理物としては、ルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上となるまで発酵させた発酵処理物であり、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌による発酵処理物であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニガナ（Ixeris dentata）及び／又はその処理物を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項２】
処理物が、ニガナの発酵処理物であることを特徴とする請求項１記載のリポキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項３】
ニガナの発酵処理物が、ルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上となるまで発酵させた発酵処理物であることを特徴とする請求項２記載のリポキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項４】
発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌による発酵処理物であることを特徴とする請求項２又は３記載のリポキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載のリポキシゲナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、沖縄に生育するニガナ植物由来の生理活性物質を利用したリポキシゲナーゼ阻害剤、これらを有効成分とするリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、沖縄に自生している植物について生理活性物質を含有する優れた天然資源の開発が行われている。例えば、食材として利用されていない植物繊維を利用した抗酸化性植物繊維やその加工食品（例えば、特許文献１参照）や、ゲットウ 、アカメガシワ、ヒラミレモン、クダモノトケイソウ及びストレリチアからなる群から選ばれた１種類以上の植物の乾燥粉末又は抽出物を有効成分とすることを特徴とするα−アミラーゼ活性を阻害するための物質（例えば、特許文献２参照）等も報告されている。また、ニガナ（Ixeris dentata）はキク科ニガナ属に属する多年草で、葉や茎に苦味のある白い乳液を含み、山地や野原にごく普通に植生し、沖縄でもよく見られる。ニガナは血液中に存在するペプチドのアンジオテイシンＩが酵素の作用によりアンジオテイシンIIへ変換されるのを抑制する機能（ＡＣＥ活性阻害機能）を有する成分を含有し、これにより血圧上昇抑制効果を奏することが報告されている（例えば、特許文献３参照）。
【０００３】
一方、アラキドン酸は生体内においては細胞膜の構成成分として存在する長鎖高度不飽和脂肪酸であり、刺激を受けるとホスホリパーゼの作用でリン脂質から遊離される。遊離したアラキドン酸に、リポキシゲナーゼの作用によって酸素分子が添加され、例えば、１５−リポキシゲナーゼにより１５位の炭素に酸素添加した１５−ヒドロペルオキシ酸（１５−ＨＰＥＴＥ）が、１２−リポキシゲナーゼにより１２位の炭素に酸素添加した１２−ヒドロペルオキシ−５，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）が生成され、同様に５−リポキシゲナーゼにより５位の炭素に酸素添加した５−ヒドロペルオキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）が生成される。これらは、アレルギー性疾患、炎症、喘息に関与するロイコトリエン（ＬＴ）類、血栓の形成等に関与するトロンボキサン（ＴＸ）類等の物質に変換され、動脈硬化等の循環器系疾患、アレルギー性疾患や炎症、更には癌の転位等を誘発する。
【０００４】
このような作用を有するリポキシゲナーゼの活性を阻害することにより、上記リボキシゲナーゼに誘発される炎症、アレルギー性疾患や、循環器系疾患、癌の転位等の治療、改善又は予防することができるため、種々のリポキシゲナーゼ活性阻害剤が知られている。例えば、過酸化脂質生成抑制作用、リポキシゲナーゼ及びＨＨＴ生成阻害・抑制作用を有するアミノクマラン誘導体を含有する過酸化脂質生成抑制剤（例えば、特許文献４参照）や、キノン誘導体を有効成分とする５−リポキシゲナーゼ阻害剤、トロンボキサン合成酵素阻害剤（例えば、特許文献５参照）や、複素環等を有する特定の置換基を有する二環式エーテル誘導体を含有する５−リボキシゲナーゼ阻害剤（例えば、特許文献６参照）、硫化ジアリルや硫化ジ−（１−プロペニル）等を用いた体毛及び／又は頭髪の成長調整用のリポキシゲナーゼ阻害剤（例えば、特許文献７参照）等が報告されている。また、エゴマ種子のアルコール抽出物に含まれるポリフェノールのルテオリンやクリソエリオールがリポキシゲナーゼ阻害活性を有することから、ルテオリン、クリソエリオール等を含むエゴマ種子のアルコール抽出物を有効成分とするリポキシゲナーゼ阻害剤（例えば、特許文献８参照）も知られている。
【特許文献１】特開２００２−２０４６７４号公報
【特許文献２】特開２００１−３３３７３３号公報
【特許文献３】特開平６−２２５７２３号公報
【特許文献４】特開平５−１４０１４２号公報
【特許文献５】特開平５−７８３２１号公報
【特許文献６】特表平９−５０４７７５号公報
【特許文献７】特開平１０−３６２３５号公報
【特許文献８】特開平１０−２９８０９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、生理活性を有するニガナ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高く、炎症やアレルギー症状、循環器疾患、又は頭髪の成長阻害や抜毛の調整剤、又は化粧品用組成物等に適用することができるリポキシゲナーゼ阻害剤や、かかる疾患を改善し得るリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、沖縄に生育するニガナ植物の有効活用を目的とし、その生理活性について鋭利研究をした結果、ニガナの葉の抽出物が優れたリポキシゲナーゼ阻害活性を有することを見い出し、更に、ニガナを乳酸菌等で発酵させたニガナの発酵処理物は、ルテオリンの含有量が増加し、優れたリポキシゲナーゼ阻害活性を有するとの知見を得、これら知見に基き本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ニガナ（Ixeris dentata）及び／又はその処理物を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害剤に関し、好ましくは、処理物が、ニガナの発酵処理物であることを特徴とする請求項１記載のリポキシゲナーゼ阻害剤（請求項２）や、ニガナの発酵処理物が、ルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上となるまで発酵させた発酵処理物であることを特徴とする請求項２記載のリポキシゲナーゼ阻害剤（請求項３）や、発酵処理物が、乳酸菌、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は乳酸菌と酵母と枯草菌による発酵処理物であることを特徴とする請求項２又は３記載のリポキシゲナーゼ阻害剤（請求項４）に関する。
【０００８】
また、本発明は、請求項１〜４のいずれか記載のリポキシゲナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とするリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の炎症疾患予防・治療剤は、ニガナ植物の有効利用を図り、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し副作用が少なく安全性が高い炎症疾患予防・治療剤を容易に調製することができ、抗炎症疾患の予防・改善用機能性食品又は食品素材を容易に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤は、ニガナ（Ixeris dentata）及び／又はその処理物を有効成分とするものであれば、特に限定されるものではない。本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤に用いるニガナ植物はキク科（Asteraceae）に属する植物であり、使用部位は、根等の地下部や、茎、葉、花、等の地上部であってもよく、また、これらの二種以上の混合物や、全草であってもよい。これらのうちで特に、葉が好ましい。
【００１１】
かかるニガナの処理物における処理としては、粉砕処理、切断処理、乾燥処理、抽出処理、焙煎処理、超音波ホモゲナイズ処理、凍結処理、加熱処理、酵素処理、発酵処理等を挙げることができ、これら処理を二以上組み合わせて行ってもよい。上記ニガナの粉砕処理としては、例えば、粒径３ｍｍ以下、好ましくは０．５〜１．０ｍｍの粒径まで粉砕する処理が好ましい。３ｍｍ以下の粒径とすることにより、有効成分を容易に抽出することができ、０．５〜１．０ｍｍの範囲の粒径であれば、かかる効果がより顕著に得られる。また、植物の生体をそのまま粉砕してもよいが、あらかじめ切断処理、乾燥処理、凍結処理等を施した処理物に粉砕処理を行ってもよい。また反対に、植物を粉砕処理した粉砕処理物に、常温で風乾処理、４０〜６０℃前後での加熱乾燥処理、天日乾燥処理等の乾燥処理を施すこともできる。さらに、粉砕処理後の乾燥処理物や乾燥処理後の粉砕物に対して抽出処理を施すこともできる。本発明の処理物としては、かかる抽出処理によって得られた生葉又は乾燥葉の粉砕処理物の抽出処理物をそのまま、あるいは溶媒を除去した後凍結乾燥した凍結乾燥処理物を有利に使用することができ、また、必要に応じてこれらの抽出物を複数種混合したり、溶媒と混合し混合液としたものも使用することができる。
【００１２】
かかる抽出処理に使用する溶媒としては、例えば、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコールや、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコールや、ヘキサン等の非極性溶媒の一種又は二種以上を用いることができる。好ましい抽出方法としては、例えば、水濃度０〜１００容量％のメチルアルコール、エチルアルコール等を用い、０〜８０℃で３０分〜５日等、好ましくはエチルアルコール水溶液を用い、室温で２４時間抽出した後濾過する方法等を挙げることができる。
【００１３】
更に、ニガナの処理物における処理としては、発酵処理を好ましい処理として挙げることができる。発酵処理としては、ルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上となるまで発酵させた発酵処理であることが好ましい。かかる発酵処理には、基質として、生体又は乾燥処理物に上記粉砕処理を施した粉砕処理物を用いることが、発酵菌との接触面積を十分に確保することができ、発酵を効果的に進行させることができるため、好ましい。
【００１４】
上記発酵処理に使用する微生物としては、乳酸菌、酵母、枯草菌を使用することができ、これらを単独又は２種以上を適宜組み合わせることもできるが、乳酸菌単独、乳酸菌と酵母、乳酸菌と枯草菌、又は、乳酸菌と酵母と枯草菌の組み合わせが好ましい。
【００１５】
上記発酵処理に使用される乳酸菌としては、ストレプトコッカス属（Storeptococcus）、ラクトバシルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）又はテトラジェノコッカス属（Tetragenococcus）のいずれかに属する菌が好ましく、特にラクトバシルス属が好ましい。上記ストレプトコッカス属に属する菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）であることが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルスＩＦＯ１３９５７菌株を具体的に例示することができる。また、ラクトバシリルス属に属する菌としては、ラクトバシルス・プランタリム（L. plantrum）、ラクトバシルス・デルブリッキ（L. delbruckii）、ラクトバシルス・ペントサス（L. pentosus）又はラクトバシルス・カセイ（L. casei）のいずれかに属する菌であることが好ましく、これらの菌のうち、特にラクトバシルス・プランタリムが好ましい。かかるラクトバシルス・プランタリムとしてＩＦＯ１４７１２菌株やＩＦＯ１４７１３菌株を、ラクトバシルス・デルブリッキとしてＩＦＯ１３９５３菌株を、ラクトバシルス・ペントサスとしてＩＦＯ１２０１１菌株を、ラクトバシルス・カセイとしてＩＦＯ１５８８３菌株を、それぞれ具体的に例示することができる。また、テトラジェノコッカス属に属する菌としては、テトラジェノ・ハロフィルス（T. halophilus）であることが好ましく、テトラジェノ・ハロフィルスＩＦＯ１２１７２菌株を具体的に例示することができる。これら乳酸菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０3〜１０7個、特に１０6〜１０7個用いることが好ましい。
【００１６】
また、上記発酵処理に用いられる酵母は、主として香りの改善のために添加され、かかる酵母としては、カンジダ属（Candida）又はサッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する菌が好ましい。かかるカンジダ属に属する菌として、カンジダ・ビルサチルス（Candida versatilis）であることが好ましく、カンジダ・ビルサチルスとしてＩＦＯ１００３８菌株を具体的に例示することができる。サッカロマイセス属に属する菌として、サッカロマイセス・セレビシアエ（S. cerevisiae）であることが好ましく、サッカロマイセス・セレビシアエとしてＩＦＯ０５５５菌株を具体的に例示することができる。これら酵母菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０3〜１０7個、特に１０6〜１０7個用いることが好ましい。
【００１７】
更に、上記発酵処理において用いられる枯草菌としては、バシルス・ズブチルス（B. subtilis）ＩＦＯ３０１３菌株を具体的に例示することができる。これら枯草菌は、ニガナ植物の乾物１ｇあたり、通常１０3〜１０7個、特に１０6〜１０7個用いることが好ましい。
【００１８】
上記発酵処理において、好ましく用いられる微生物群としては、乳酸菌、酵母及び枯草菌を含む微生物群が好ましく、これら微生物群の中でも、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌であることが好ましく、これらはニガナ植物の乾物に対し、菌数として同数を使用することが好ましい。このような菌数の組合せにおいて菌を使用することにより、発酵時間の短縮を図り、ひいては雑菌の繁殖を抑制することができる。
【００１９】
上記発酵処理は、ニガナの粉砕処理物に、発酵の進行を促進するため、乾物１重量部に対し、２〜１０重量部、特に５重量部程度の水分を添加することが好ましい。かかる粉砕処理物に、上述の菌又は菌群を添加する。菌群は各々菌を培養後、培地へ添加する前に予め混合し、乾燥体である場合の植物の重量に対して、１〜１０重量％添加することが好ましい。発酵は、温度２０〜５０℃、好ましくは４０℃であり、発酵時間は、発酵によりニガナ中のルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上、好ましくは１５０×１０-5ｗｔ％以上となるように、ｐHや、菌数等の条件による発酵の進行状況や、嗜好により適宜選択することができ、例えば、ｐＨ４〜５、菌数１０6以上であれば、約７２時間等とすることができる。発酵処理時、必要に応じてエアレーションや脱酸素処理を行なうことができるが、脱酸素処理後に静置培養において発酵させることができる。発酵形式は、液体培養でなく固体培養が好ましい。
【００２０】
かかる発酵処理において、発酵菌の資化剤として炭水化物や蛋白質を添加することができる。資化剤としての炭水化物は市販のブドウ糖、蔗糖、廃糖蜜等の糖が好ましく、これらの添加量としては培地当たり１〜１０重量％が好ましく、特に３重量％前後が適当である。資化剤としての蛋白質は米糠、ふすま等が好ましく、これらの添加量としては培地当たり１〜５重量％が好ましい。これらの資化剤は１種を単独で、又は２種以上を混合して用いてもよい。
【００２１】
発酵終了後、乾燥機により水分値が１０重量％以下となるように乾燥することが好ましく、乾燥方法としては、加熱乾燥や凍結乾燥によることができ、加熱乾燥の場合は、品温が１００℃以下で行われることが、生理活性成分の失活を防止することができるため好ましい。乾燥後、必要に応じて加熱等公知の方法により滅菌処理を行ない、リポキシゲナーゼ活性阻害剤に好適に使用することができるニガナの発酵処理物が得られる。
【００２２】
上記発酵処理によって得られるニガナの発酵処理物は、ルテオリン含量が１００×１０-5ｗｔ％以上、好ましくは１５０×１０-5ｗｔ％以上であり、図１に示すように、発酵処理を施さないニガナにおいてルテオリン含量が、粉砕した乾燥ニガナのメタノール抽出物を高速液体クロマトグラフィーで測定した値が７．２×１０-5ｗｔ％前後であるのに対し、発酵処理、例えば、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌を、０．５〜１．０ｍｍに粉砕したニガナの葉１ｇに対し、０．１ｇと、水３ｇを加え、４０℃、７２時間の発酵処理により得られたニガナの発酵処理物のルテオリン含量が１７３．４０×１０-5ｗｔ％前後と、顕著に増加する。これは発酵処理を施さないニガナに含有されるルテオリン配糖体が発酵菌により加水分解を受けることにより顕著に増加するためである。ルテオリンはアグリコンの一種であり顕著な抗酸化活性作用を有するため、ニガナの発酵処理物においては、ルテオリンに起因する抗酸化活性が増大し、リポキシゲナーゼ阻害活性が上昇する。
【００２３】
上記ニガナ及び／又はその処理物を有効成分とする本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤は、１２−リポキシゲナーゼや５−リポキシゲナーゼ等のリポシキゲナーゼがアラキドン酸から１２−ヒドロペルオキシ−５，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）や、５−ヒドロペルオキシ−６，８，１０，１４−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）等のアラキドン酸代謝物を生成するのを阻害する。かかる本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤は、リポキシゲナーゼにより生成されるアラキドン酸代謝物に起因する疾患の治療、改善、予防に対して有効であり、例えば、炎症やアレルギー症状、循環器疾患、又は頭髪の成長阻害や抜毛の調整剤等の医薬品、医薬部外品や、また、化粧品用組成物、機能性食品又は食品素材等に適用することができる。
【００２４】
本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤は、公知の医薬用担体と組合せ内服用製剤や、外用製剤とすることができる。かかる内服用製剤における医薬用担体としては、本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤のニガナ及び／又はその処理物を有効成分として薬学的に許容できる液状又は固体状の担体を適用することができ、また、本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤剤には必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤の製剤とすることができる。またこれら製剤は、経口又は非経口に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができるほか、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。また、投与量は、疾病の種類、患者の体重、投与形態等により適宜選定することができる。かかる製剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当り１０μｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。尚、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤はそのまま経口投与するほか、後述する食品、食品素材として任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また、本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤を外用製剤とする場合は、エタノール等と乳剤、ニガナ抽出物をワセリン等と混練し軟膏剤とすることができる。
【００２５】
本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤の調製方法としては、上記ニガナや、その発酵処理物等の処理物や、熱水やエタノール等による抽出物を凍結乾燥した凍結乾燥物等を、ミキサー等で粉末とし、得られた粉末を常法により顆粒化、カプセル化、錠剤化したり、溶剤に溶解、縣濁、分散等させて液剤を調製する方法、あるいは、抽出液をそのまま適用する等具体例に例示することができる。
【００２６】
本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤を化粧品組成物や医薬部外品に適用する場合は、いずれの形態であってもよく、上記調整方法により得られた調製物を、化粧水、ローション、液体クリーム、クリーム、乳液、パック、オイル、石鹸（薬用石鹸も含む）、先願料、浴用剤、シャンプー、リンス、スプレー、軟膏、絆創膏、衛生綿類、ウェットティシュ等いずれの形態のもの選択することができる。
【００２７】
ニガナ及び／又はその処理物を有効成分とする本発明のリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材は、ニガナ及び／又はその処理物から選ばれた一種又は二種以上を飲食品原料の一部として用いたり、あるいは製造工程又は製造後に添加・配合することにより得ることができる。上記のようにリポキシゲナーゼの作用を阻害することにより、アラキドン酸がヒドロペルオキシアラキドン酸に変化するのを抑制するには、毎日、適度のリポキシゲナーゼ阻害効果を有する物質を摂取することが望ましく、その方法として飲食品から摂取するのが望ましく、本発明のリポキシゲナーゼ阻害剤を含有するリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材はその点で極めて有用である。本発明のリポキシゲナーゼ阻害用機能性食品又は食品素材の形態は、何れのものであってもよく、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、食用油、マーガリン、ラード、バター、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合して食品として使用することができる。配合量は、特に限定されるものではなく、食品によって適宜選択することができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［発酵ニガナの調製］
乾燥したニガナの葉３０ｇを０．１〜３ｍｍの粒径に粉砕し容器に入れた。ニガナを入れた容器に水１５０ｇ、糖蜜０．９ｇ、米ぬか０．９ｇを添加した。かかる粉砕ニガナを収納した容器に、ラクトバシルス・プランタリム（ＩＦＯ１４７１２菌株、ＩＦＯ１４７１３菌株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（ＩＦＯ１３９５７菌株）、バシルス・ズブチルス（ＩＦＯ３０１３菌株）の各々の菌を培養後、菌数１：１：１の割合で混合し、ニガナの重量に対し、１０重量％を添加し、容器を密閉し、静置培養により発酵を行った。発酵温度は４０℃、発酵時間は７２時間とした。その後、乾燥機により水分値が１０重量％以下になるまで、６０℃で乾燥した後、滅菌処理（１３０℃蒸気、５〜１５秒）を行い、発酵ニガナ３１ｇを得た。
【実施例２】
【００３０】
［サンプルの調製］
(i) ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ、各１ｇあたり８０％エタノール１０ｍｌを添加し、静置で１２時間抽出しろ過後、残渣に８０％エタノールを１０ｍｌ添加して同様に抽出した。その後ろ過した液を２０ｍｇ／ｍｌにジメチルスルホキシド溶媒で調製し、それぞれの８０％エタノール抽出物を得た。
(ii) ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナ１ｇに８０℃の熱水２５ｍｌを添加し、２０分間静置抽出してろ過した後、残渣に同様の熱水を添加して抽出した。これらのろ液を５０ｍｌに定容し、それぞれの熱水抽出物を得た。
【実施例３】
【００３１】
［ルテオリンの含有量の測定］
ニガナの０．１〜３ｍｍ粉砕乾燥葉、及び実施例１で得られた発酵ニガナについて、それぞれルテオリンの含有量を測定した。サンプル２ｇにメタノール１００ｍｌを加え、１時間の還流抽出を２回行い、抽出液をメタノールで２５０ｍｌに定容したものを試料液とし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（SHIMADZU社製）で測定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）について、カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ．ＡＭ−３１２（ＯＤＳ）、メタノール：水＝５０：５０（トリフルオロ酢酸でｐＨ２．５に調製）し、流速１ｍｌ／ｍｉｎ．３６５ｎｍで測定した。
【００３２】
結果から、発酵前においては７．２×１０-5ｗｔ％の含有量が、発酵ニガナにおいては１７３．４×１０-5ｗｔ％と上昇し、発酵によりルテオリンの含有量が著しく増加することが分かった。
【実施例４】
【００３３】
［リポキシゲナーゼ阻害活性の評価］
蒸留水５０μｌ、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、１０ｍＭＣａ+、ＡＴＰ含む）２０μｌ、ホスファチジルコリン（Sigma社製）１０μｌに、実施例２で得られたサンプル１０μｌを添加後、２５０ｕｎｉｔヒト５−リポキシゲナーゼ（CAYMAN社製）１０μｌを加えると同時に混合し、３０℃で５分間加温した。その後氷中で５０ｍＭアラキドン酸（Sigma社製）２μｌ添加した後、３０℃で１０分間加温した。−２０℃氷冷メタノール３００μｌを添加し反応を停止後、１Ｍ酢酸溶液を１μl添加した。これを４℃で１０，０００ｒｐｍの遠心分離１０分行ない、上澄み中に存在する生成した５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）の量を高速液体クロマトグラフ（島津社製）を用いて、以下に記載する条件で測定した。測定値を表１に示す。サンプル無添加のコントロールにおける５−ＨＰＥＴＥ生成量を１００とした場合のサンプルにおける５−ＨＰＥＴＥ生成率を求めた。結果を表１及び図２に示す。
条件  カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−６０−５（４．６口径×１５０）
移動相：メタノール：水：酢酸＝８０：２０：０．０１
流速：０．８ｍｌ／分
カラム温度：室温
ＵＶ波長：２３３ｎｍ（Range  ０．０４×、A＋＋．１６×）
【００３４】
【表１】
2005089385.tif 000002
【００３５】
結果から、ニガナ、ニガナの発酵処理物の存在によりアラキドン酸代謝生成物の５−ＨＰＥＴＥの生成が抑制され、ニガナも、ニガナの発酵処理物も、共に５−リポキシゲナーゼの作用を抑制し、５−リポキシゲナーゼ阻害活性を有することが明かである。特に、ニガナの発酵処理物は顕著な５−リポキシゲナーゼ阻害活性を有することが明かである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ニガナ、発酵ニガナ中のルテオリン含有量を示す図である。
【図２】ニガナ、発酵ニガナ存在下における５−ＨＰＥＴＥ生成率を示す図である。
【図１】
2005089385.tif 000003
【図２】
2005089385.tif 000004