(57)【要約】【課題】本発明は、オーファンＧＰＣＲのＧタンパク質活性化部位の予測方法を提供すると共に、相互作用するＧタンパク質のサブタイプを予測する方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、オーファンＧＰＣＲの細胞内第３ループのアミノ酸配列を膜貫通領域予測プログラムを用いて予測し、Ｇタンパク質の活性化部位と考えられるアミノ酸配列から構成される部分ペプチドを作製し、該ペプチドと候補Ｇタンパク質の相互作用を検出することにより、前記オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のタイプを予測する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のサブタイプを予測する方法であって、
（ａ）前記オーファンＧＰＣＲの細胞内第３ループのアミノ酸配列を、膜貫通領域予測プログラムを用いて予測する段階、
（ｂ）前記第３ループアミノ酸配列中に、式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列部分を検索する段階、
（ｃ）（ｂ）の段階で検索される前記アミノ酸配列部分を含むペプチドを作製する段階、
（ｄ）（ｃ）の段階で作製したペプチドとＧタンパク質の相互作用を検出する段階、
（ｅ）（ｄ）の段階で検出された検出結果に基づき、前記オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のサブタイプを予測する段階、
から成る方法。
−Ｂ１−Ｂ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｂ３−（Ｂ（１〜６）は塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）（Ｉ）
−Ｂ４−Ｂ５−Ｘ３−Ｂ６−（Ｂ（１〜６）は塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）（ＩＩ）
【請求項２】
前記膜貫通領域予測プログラムが、３つの膜貫通領域予測プログラム、ＳＯＳＵＩ、ＴｏｐＰｒｅｄ、ＴＭＨＭＭから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６が、それぞれ、リジン、アルギニン、ヒスチジンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記（ｄ）の段階の検出が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、または結合アッセイ法により行なわれることを特徴とする請求項１乃至３に記載の方法。
【請求項５】
上記（ｄ）の段階で相互作用が検出された場合、前記オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質は、上記（ｄ）の段階で用いたＧタンパク質と同じサブタイプであると予測することを特徴とする、請求項１乃至４に記載の方法。
【請求項６】
上記（ｄ）の段階のＧタンパク質がＧｉ又はＧｓであることを特徴とする請求項１乃至４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のサブタイプの予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのサイトカイン、ホルモン及び神経伝達物質等の生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的な受容体タンパク質を通じて生体中の機能を発揮している。これらの受容体タンパク質中の多くは、７個の膜貫通領域を有する共通した構造を有しており、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質ともいう）の活性化を通じて、細胞内シグナル伝達を行なうことからＧタンパク質共役型受容体タンパク質といわれる。Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質（以下、ＧＰＣＲと称する）に、生体中に存在するリガンド（例えば、前記生理活性物質）が結合すると、共役するＧタンパク質を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞増殖の活性化や抑制等の様々な生体内反応が惹起される。従って、生体内の各種細胞や臓器における複雑な機能を調節する物質と、その特異的受容体タンパク質（特にはＧタンパク質共役型受容体タンパク質）との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の生理調節機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
ＧＰＣＲを介したシグナルを細胞内に伝達する上で重要な役割を果たしているのがＧタンパク質である。Ｇタンパク質の主なサブタイプとしてＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｏなどが知られているが、これらＧタンパク質はいずれもα、β、γからなるサブユニット構造をとっており、その中でαサブユニットがＧＴＰａｓｅ活性を有している。
Ｇｓタンパク質は、共役するＧＰＣＲとの相互作用を介して、アデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こし、一方、Ｇｉタンパク質は、アデニル酸シクラーゼの活性を逆に抑制することが知られている。両Ｇタンパク質は、作用メカニズムは異なるものの、細胞内メッセンジャーとして機能するｃＡＭＰの存在量を調節することで、細胞内に様々にシグナルを伝えている。
また、Ｇｑタンパク質は、ホスホリパーゼＣを活性化してホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）を分解し、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産生する。産生されたＩＰ３は小胞体からＣａ２＋を細胞質内へ遊離させ、この遊離Ｃａ２＋がＤＡＧとホスファチジルセリンと協同してプロテインキナーゼＣを活性化させる。
【０００４】
このように、ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質はそのサブタイプによって、全く異なるシグナルを伝達していることから、機能未知であるオーファンＧＰＣＲの作用機序を解明する上では、どのタイプのＧタンパク質と共役しているかを明らかにすることが非常に重要なこととなってくる。
また、医薬品の多くは、ＧＰＣＲをターゲットにしており、その機能解明は創薬に重要であるといえる。オーファンＧＰＣＲのリガンドスクリーニング研究にはターゲットとなる受容体にＧ１６を融合させ、カルシウム濃度を測定するなどの手法が行われているが、レセプターのもう一つの機能であるシグナル伝達機構を知ることはできない。つまり、ＧＰＣＲに特異的なリガンドが不明のままでカルシウム濃度の測定等を行なったとしても、ＧＰＣＲが細胞内にもたらすシグナルのタイプを判別することが不可能であるため、シグナル伝達の詳細を明らかにすることはできない。従って、受容体が本来相互作用するＧタンパク質を特定することもオーファンＧＰＣＲの研究を行う上で、非常に重要なことであり、さらにはリガンドスクリーニングにおいても有益であると考えられる。
【０００５】
ＧＰＣＲのＧタンパク質を活性化する部位に関しては、Ｇタンパク質活性化作用を持つアドレナリンレセプターなどの細胞内第３ループの部分ペプチドが直接Ｇタンパク質を活性化することが既に見出されている（例えば、非特許文献１、２、３を参照のこと）。しかしながら、機能未知であり、リガンドも未だ同定されていないオーファンＧＰＣＲにおいては、相互作用するＧタンパク質のサブタイプを予測する方法が現在のところ無いため、細胞内に伝達するシグナルの特定を困難な状態となっている。
【非特許文献１】Ｏｋｕｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９１：１２９７−１３０１  ２００２
【非特許文献２】Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ  ６２：７０９−７１７  １９９０
【非特許文献３】Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ  ６７：７２３−７３０  １９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、リガンドが同定されておらず、その機能も未だに解明されていないオーファンＧＰＣＲのＧタンパク質活性化部位の予測方法を提供すると共に、相互作用するＧタンパク質のサブタイプ（例えば、Ｇｓ、Ｇｑ、Ｇｏなど）を予測しオーファンＧＰＣＲの細胞内情報伝達機構を解明する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記事情に鑑み、オーファンＧＰＣＲにおけるＧタンパク質活性化部位を同定すべく、鋭意研究を行った結果、オーファンＧＰＣＲの第３ループの特定のアミノ酸配列を有する部分ペプチドを用いることにより、活性化するＧタンパク質のサブタイプを予測することが可能であることを見出した。
【０００８】
すなわち、上記課題は以下の（１）〜（６）によって解決される。
（１）オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のサブタイプを予測する方法であって、
（ａ）前記オーファンＧＰＣＲの細胞内第３ループのアミノ酸配列を、膜貫通領域予測プログラムを用いて予測する段階、
（ｂ）前記第３ループアミノ酸配列中に、式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列部分を検索する段階、
（ｃ）（ｂ）の段階で検索される前記アミノ酸配列部分を含むペプチドを作製する段階、
（ｄ）（ｃ）の段階で作製したペプチドとＧタンパク質の相互作用を検出する段階、
（ｅ）（ｄ）の段階で検出された検出結果に基づき、前記オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質のサブタイプを予測する段階、
から成る方法。
−Ｂ１−Ｂ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｂ３−（Ｂ（１〜６）は塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）（Ｉ）
−Ｂ４−Ｂ５−Ｘ３−Ｂ６−（Ｂ（１〜６）は塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）（ＩＩ）
ここで、「ＧＰＣＲの細胞内第３ループ」とは、ＧＰＣＲのアミノ酸配列においてＮ末端側から３番目の細胞内ループのことである（図１を参照のこと）。また、「膜貫通領域予測プログラム」は、当業者において選択可能なプログラムであれば如何なるものも使用可能であり、例えば、ＳＯＳＵＩ、ＴｏｐＰｒｅｄ、ＴＭＨＭＭなどが使用可能である。
上記（ｄ）に記載の「相互作用を検出する」方法は、当業者における通常の知識及び技術常識に基づいて選択可能な方法であれば、如何なる方法であっても使用可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＧＴＰγＳを用いて結合アッセイなどが使用可能である。
（２）  前記膜貫通領域予測プログラムが、３つの膜貫通領域予測プログラム、ＳＯＳＵＩ、ＴｏｐＰｒｅｄ、ＴＭＨＭＭから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）請求項１に記載の式中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６が、それぞれ、リジン、アルギニン、ヒスチジンから成るグループから選択されることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）上記（ｄ）の段階の検出が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、または結合アッセイ法により行なわれることを特徴とする上記（１）乃至（３）に記載の方法。
（５）上記（ｄ）の段階で相互作用が検出された場合、前記オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質は、上記（ｄ）の段階で用いたＧタンパク質と同じタイプであると予測することを特徴とする、上記（１）乃至（４）に記載の方法。
（６）上記（ｄ）の段階のＧタンパク質がＧｉ又はＧｓであることを特徴とする請求項１乃至４に記載の方法。
ここで、「Ｇタンパク質」とは、ＧＰＣＲと共役し、ＧＰＣＲのリガンドからの刺激に応答して機能するタンパク質のことである。ＧＴＰ−ＧＤＰ交換反応によりＧＴＰが結合した状態が活性型（活性型Ｇタンパク質）であり、結合したＧＴＰを水解した後、ＧＤＰ結合型（不活性型Ｇタンパク質）に変わる。活性型Ｇタンパク質はアデニレートシクラーゼなどのエフェクタータンパク質を活性化する。Ｇタンパク質にはエフェクターに対する機能より、幾つかのサブタイプが知られているが、本発明における「Ｇタンパク質」は、ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質であれば、如何なるものも使用可能であり、例えば、Ｇｓ、Ｇｉ（Ｇｉ１、Ｇｉ２などを含む）、Ｇｏ、Ｇｔ、Ｇｑ、ＧＫ、ＧＸ、Ｇ１６、などが使用可能である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、オーファンＧＰＣＲのＧタンパク質活性化部位の予測が可能となり、その結果、相互作用するＧタンパク質のサブタイプの予測も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
１．Ｇタンパク質を活性化する部分ペプチド
（１）活性化部位の絞込み
オーファンＧＰＣＲの細胞内第３ループのアミノ酸配列を予測するために、膜貫通領域予測プログラム（例えば、ＳＯＳＵＩ、ＴｏｐＰｒｅｄ、ＴＭＨＭＭなど）を使用して解析を行うことができる。これらのプログラムは、膜貫通領域を構成するアミノ酸の疎水性、両親媒性、電荷などに基づいて予測を行なうものである。
第３ループを構成するアミノ酸配列の予測を行なったのち、−Ｂ−Ｂ−Ｘ−Ｘ−Ｂ−又は−Ｂ−Ｂ−Ｘ−Ｂ−（Ｂは塩基性アミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）の特徴を持つアミノ酸配列を指標にしてさらに、活性化部位の絞込みを行なった。
【００１１】
（２）部分ペプチドの合成
上記のようにして予測された活性化部位のアミノ酸配列を持つ部分ペプチドを合成した。
本発明の部分ペプチドは、公知のペプチド合成法によって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。すなわち、アミノ酸同士を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる（例えば、Bodanszkyら, 1996；Schroederら, 1965を参照のこと）。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。
部分ペプチドの合成方法としては、当業者により選択可能な方法であれば如何なる方法でもよいが、例えば、Ｆ−ｍｏｃ固相法などが好適に利用可能である。
【００１２】
２．本発明の部分ペプチドの生物材料を用いた合成法
（１）本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの取得
本発明の部分ペプチドは生物材料（例えば、大腸菌、酵母など）を用いて、組換体の形態で製造してもよい。まず、該部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドをｃＤＮＡライブラリーなどから入手したのち、該部分ペプチドをコードする核酸領域を適切な制限酵素などで切断することにより得ることができる（Sambrookら, 1989）。
【００１３】
（２）組換えベクターの作製
本発明の部分ペプチドを製造するための組換えベクターは、適当なベクターに本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを連結することにより得ることができる。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入するためのベクターは、クローニング用に供される場合には、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、本発明の部分ペプチドを発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該ポリペプチド又はその部分をコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターを有するものが使用可能である。
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１４】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００１５】
本発明で使用される組換えベクターには部分ペプチドのコード配列、プロモーター以外にも、エンハンサー、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，  Ｇ４１８）などが利用可能である。
【００１６】
（３） 形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現ベクターを、目的の部分ペプチドを発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の部分ペプチド発現に使用できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００１７】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法（Cohenら, 1972）、エレクトロポレーション法（Shigekawa及びDower, 1988）等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法（Beckerら, 1990）、スフェロプラスト法（Hinnenら, 1978）、酢酸リチウム法（Itohら,
1983）等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama,
1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。
【００１８】
（４）本発明の部分ペプチドの製造
本発明の部分ペプチドは、上記において得られる形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００１９】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。
例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
酵母培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。  
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞膜等に本発明の部分ペプチドを生成させることができる。上記培養物から本発明の部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００２０】
本発明の部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれる部分ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２１】
３．部分ペプチドとＧタンパク質の相互作用の検出方法
本発明の部分ペプチドとＧタンパク質の相互作用を検出する方法としては、当業者が選択可能な方法であれば如何なる方法も使用可能である。限定はしないが、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、又はＧＴＰγＳを用いた結合アッセイなどが使用可能である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、金属薄膜にｐ偏光の光を入射したとき、ある特定の角度
（共鳴角）でその反射光強度が減少することを利用した手法である。近年、生物学分野での応用や生体の特異的反応を利用したセンサーへの応用が多数行われている。本方法は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ１０００  ｓｙｓｔｅｍ（BIACORE社）などを利用して実施可能である。
また、ＧＴＰγＳを用いた結合アッセイは、Ｇタンパク質に取り込まれた［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射能係数を測定する方法で、定法に従い適宜行い得る方法である。
【００２２】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
ＡＰＧ１におけるＧタンパク質活性化部位の予測
ＡＰＧ１は機能未知のオーファンＧＰＣＲであり、ショウジョウバエで発見されたｍｔｈ遺伝子と相同性を持つ。ｍｔｈ遺伝子はノックアウトすると寿命が延びることが知られており、老化機構に関与している可能性が示唆されている。
Ｇタンパク質を活性化させると考えられている細胞内第３ループのアミノ酸配列を予測するため膜貫通領域予測プログラム、ＳＯＳＵＩ、ＴｏｐＰｒｅｄ、  ＴＭＨＭＭでの解析を行った（図１及び２、配列番号１〜３）。
ＳＯＳＵＩは疎水性指標、両親媒性指標、電荷指標を元に膜貫通領域を予測、ＴｏｐＰｒｅｄはアミノ酸の疎水性を元に膜貫通領域を予測、ＴＭＨＭＭは膜貫通部位の配列情報から法則を抽出しモデル化したものから膜貫通領域を予測するプログラムである。
Ｇタンパク質活性化作用を持つアドレナリン受容体等の細胞内第３ループのアミノ酸配列をもつペプチドを合成すると、それ自体がＧタンパク質を活性化し、またヘリカル構造をとることが知られている（非特許文献１乃至３を参照のこと）。そのとき作る塩基性アミノ酸のクラスターがＧタンパク質活性化に関与しているとも言われている。ＡＰＧ１の細胞内第３ループにおいてもアドレナリン受容体Ｇタンパク質活性化部位と同様な塩基性アミノ酸の配列が存在した（図２）。この配列が、ヘリカル構造をとり、塩基性アミノ酸のクラスターを形成すると仮定してＲＮＧＫＲＳＮＲＴＬＲＥＥ（配列番号４）をＧタンパク質活性化部位と考え、この配列から成るペプチドを合成した。
【実施例２】
【００２４】
ＡＰＧ１受容体ペプチドとＧタンパク質との分子間相互作用の測定
（１）試料調製
ＡＰＧ１受容体ペプチド（配列番号４）はＦ−ｍｏｃ固相法により合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、マススペクトルにより分子量を確認した。Ｇ蛋白質はＧｉ，Ｇｓともにラットの組換体αサブユニットを用いた。
（２）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による分子間相互作用の測定
アミンカップリング法により、Ｇ蛋白質（Ｇｉ；０．４ｎｇ／ｍｍ２、Ｇｓ；０．３ｎｇ／ｍｍ２）を共有結合させたデキストランを基盤としたセンサーチップ(ＣＭ５)を作成した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）のバッファーにＡＰＧ１受容体ペプチドを溶解させた試料溶液を用意し、２５℃、流速５μｌ／ｍｉｎでＧタンパク質に対して過剰な量（１０μＭ，２６０μＬ）を用い、ＡＰＧ受容体ペプチドをセンサーチップ上のＧタンパク質と相互作用させた。Ｂｉａｃｏｒｅ１０００  ｓｙｓｔｅｍ（BIACORE社）を使用してセンサーチップ上のＧタンパク質の質量変化を測定することにより、Ｇタンパク質にＡＰＧ１受容体ペプチドが相互作用し、複合体を形成するかどうかを検討した。Ｇｉのポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてマストパラン（ナカライテスクより購入）、ＧＡＢＡＢ細胞内第２ループペプチドを用い、Ｇｓにはプロスタグランジン細胞内第３ループペプチド（ＥＰ３α）、ＧＡＢＡＢ細胞内第２ループペプチドを用いた。
【００２５】
（３）結合アッセイ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（１μＭ）、Ｇタンパク質（０．１μＭ）を含む試料溶液にＡＰＧ１受容体ペプチド（１μＭ，１０μＭ、１００μＭ）を加え、３０℃で３０分間インキュベートした。反応終了後、その試料溶液をニトロセルロースフィルターで濾過し、そのフィルターを乾燥させた後、Ｇたんぱく質に取り込まれた［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの放射能係数を液体シンチレーションカウンターで測定した。ＡＰＧ１受容体ペプチドを加えない試料溶液の測定値をコントロールとして計数比を求め、ＡＰＧ１受容体ペプチドによるＧタンパク質の活性化を検討した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールにはＳＰＲ実験と同じものを用いた。
【００２６】
結果
（１）表面プラズモン共鳴法による結果
ＡＰＧ１受容体ペプチドはＧｓとの間に相互作用を示さなかったが（図４Ｂ）、Ｇｉを用いた場合には３９１．４ＲＵ上昇が認められた（図４Ａ）。この結果からＡＰＧ１受容体ペプチドがセンサーチップ上のＧｉと結合し、なんらかの複合体を形成していると考えられる。一方、Ｇｓを用いた場合ＲＵ値は上昇を示さなかった。このことから、ＡＰＧ１受容体ペプチドの結合はＧｉ選択的であることがわかった。同様の実験を上述のコントロールを用いて行った結果、ポジティブコントロールでのＲＵ値の上昇はＧｉ、Ｇｓで、各々、３８７及び２６２であり、ネガティブコントロールの値は、各々、−７６．５及び−１１７．０であった。
【００２７】
（２）結合アッセイによる結果
ＡＰＧ１受容体ペプチドのＧｉに対する活性化能は０．８６（１μＭ）、１．９４（１０μＭ）、１．５９（１００μＭ）でありＡＰＧ１受容体ペプチドの濃度が、１０μＭのとき最大であった。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの活性化能は、各々２．３９、１．０３であった（図５）。
また、ＡＰＧ１受容体ペプチドのＧｓに対する活性化能は、１μＭ、１０μＭ、１００μＭで、各々、０．９３、１．０１、１．２６であり、いずれの濃度でも活性化能を示さなかった。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの活性化能は、各々２．０４、１．１８であった（図６）。
【００２８】
結合アッセイの結果より、Ｇタンパク質の活性化に対してＡＰＧ１受容体ペプチドはＧｉ選択的に作用しているものと思われる。またＡＰＧ１受容体ペプチドの全アミノ酸数に対する塩基性アミノ酸の割合は５／１３（３８．５％）でありＧＡＢＡＢ細胞内第２ループペプチドは７／２１（３３．３％）でほぼ同じである。このことから単に塩基性アミノ酸の含有量の多さだけでは、そのペプチドがＧ蛋白質を活性化するかどうかの判別はできない。おそらく、何らかの立体構造的な要因が必要と思われる。
【００２９】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００３０】
現在、オーファンレセプターのリガンドスクリーニングには、Ｇ１６を用いた融合蛋白質を作成しカルシウム濃度の変化によりリガンドの結合を判定する方法などが用いられている。本発明の方法を用いることにより、オーファンＧＰＣＲと共役するＧタンパク質を予め予測することができれば、従来のカルシウム濃度の変動を指標にする方法等とは異なるリガンドスクリーニングアッセイ系を構築できる可能性がある。これにより、創薬候補の迅速な特定が可能となり、医薬品開発の分野において、多大なる技術進歩をもたらすことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＧＰＣＲの構造の一般的な模式図を示す。
【図２】図２は、膜貫通領域予測プログラム（ＳＯＳＵＩ，ＴｏｐＰｒｅｄ，ＴＭＨＭＭ）で予測された第３ループのアミノ酸配列を示す。
【図３】図４は、ＳＰＲの結果を示す。Ｇｉ，Ｇｓを固定化したセンサーチップにＡＰＧ１受容体ペプチドを流したときのセンサーグラムである。
【図４】図３に示すインジェクト終了後のＲＵ値の上昇から、バックグランドとしてＧタンパク質を結合させないセンサーチップに同様の作業を行った測定値を引いた値をグラフ化したものが図４である。
【図５】図５は、Ｇｉの結合アッセイの結果を示す。
【図６】図６は、Ｇｓの結合アッセイの結果を示す。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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