(57)【要約】【課題】  天然物由来の血管平滑筋細胞増殖抑制剤ないし同含有物質を開発する。【解決手段】  天然トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ＩＶＹ）又はそれを含有する物質を有効成分とする該増殖抑制剤。ＩＶＹは、ＩＶＹ含有物質である小麦胚芽水解物やその疎水性吸着樹脂、例えばＯＤＳ画分からも分離することができ、また、同じくイワシ等の魚肉の水解物のＯＤＳ画分からも分離することができる。更に、ＩＶＹ又は同含有物質は、医薬のほか飲食品としても使用できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
天然物由来で、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有する物質を有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
天然物として、魚肉又は小麦胚芽を使用することを、特徴とする請求項２に記載の増殖抑制剤。
【請求項４】
該天然物を、脱脂処理、酵素処理、イオン交換樹脂処理、疎水性吸着樹脂処理、クロマトグラフィー処理のうち少なくともひとつの処理を行うこと、を特徴とする請求項３に記載の増殖抑制剤。
【請求項５】
小麦胚芽を脱脂及びα−アミラーゼ処理した後、プロテアーゼ処理して得たペプチドＷＢ−１、又は、このペプチドを更にペプチド吸着性樹脂に吸着せしめた後、これをエタノール水溶液で溶出して得たペプチドＷＢ−２を有効成分とすること、を特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項６】
下記の理化学的性質を有するペプチドＷＢ−１。
（Ａ）融点（黒化点）：１２１．３〜１６０．５℃。
（Ｂ）比旋光度：〔α〕D20＝＋２６９°±５°（測定濃度；２．１１ｍｇ／５ｍｌ−水）
（Ｃ）液性（ｐＨ）：６．８〜８．４（濃度０．０３％）
（Ｄ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル：図１
（Ｆ）紫外線吸収スペクトル：図２
【請求項７】
下記の理化学的性質を有するペプチドＷＢ−２。
（Ａ）融点（黒化点）：１５５．２〜２０５．７℃
（Ｂ）比旋光度：〔α〕D20＝＋２１３°±５°（測定濃度；２．３１ｍｇ／５ｍｌ−水）
（Ｃ）液性（ｐＨ）：６．８〜８．０（濃度０．０５％）
（Ｄ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル：図３
（Ｆ）紫外線吸収スペクトル：図４
【請求項８】
請求項６に記載のペプチドＷＢ−１、又は、請求項７に記載のペプチドＷＢ−２を有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
ペプチド原液をペプチド吸着樹脂に吸着せしめた後、８〜１７Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液で溶出した画分であって、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＹ−２を有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
ペプチドＹ−２が下記の理化学的性質を有するものであること、を特徴とする請求項９に記載の増殖抑制剤。
（ペプチドＹ−２の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８°で着色、分解する。
（Ｃ）比旋光度〔α〕D20＝−４０°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別：中性  ｐＨ５．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）物質の外観：白色〜淡黄色粉末。
（Ｇ）成分：水分２．７２％（常圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．２５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分０．２０％（直接灰化法）
（Ｈ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｉ）赤外線吸収スペクトル：図６
（Ｊ）紫外線吸収スペクトル：図７
【請求項１１】
ペプチド原液をペプチド吸着樹脂による溶出分画処理により得られるペプチド成分であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１３の溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出（１）の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分及び水溶出（２）画分を分取混合してなり、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹを有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
（１）水溶出（１）の後画分：展開液として水を用い、溶出ペプチド画分全体（ペプチドＳＹ）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出（１）の後画分の最終分取点までの画分。
（２）エタノール溶出画分：次に、１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。
（３）水溶出（２）画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となるまでに得られる画分。
【請求項１２】
ペプチドＳＹが下記の理化学的性質を有するものであること、を特徴とする請求項１１に記載の増殖抑制剤。
（ペプチドＳＹの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質８４〜９４Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質０．５％（ソックスレー抽出法）
；灰分４±２％（直接灰化法）
；Ｎａ  １〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図９
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図１０
【請求項１３】
請求項１１の（２）におけるエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分のみを単離分散してなり、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹ−ＭＤを有効成分とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤。
【請求項１４】
ペプチドＳＹ−ＭＤが下記の理化学的性質を有するものであること、を特徴とする請求項１３に記載の増殖抑制剤。
（ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分  ２〜６Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質  ９０〜９８Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
：資質  ０．５Ｗ／Ｗ％（ソックスレー抽出法）
：灰分  ３．０Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
：Ｎａ  ０．１〜０．２Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図１１
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図１２
【請求項１５】
ペプチド原液が、魚肉を熱変性した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理して得たペプチドα−１０００の水溶液であること、を特徴とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載の増殖抑制剤。
【請求項１６】
ペプチドα−１０００が下記の理化学的性質を有するものであること、を特徴とする請求項１５に記載の増殖抑制剤。
（ペプチドα−１０００の理化学的性質）
（ａ）分子量：
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる）
（ｂ）融点：１１９℃で着色（分解点）
（ｃ）比旋光度：
〔α〕D20＝−２２°
（ｄ）溶剤に対する溶解性：
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（ｅ）酸性、中性、塩基性の区別：
中性
（ｆ）外観、成分：
白色粉末：水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（ｇ）特性：
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドであって、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有する。
【請求項１７】
天然物由来で、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有する物質を有効成分とすること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制用ないし予防用食品。
【請求項１８】
請求項６に記載のペプチドＷＢ−１、請求項７に記載のペプチドＷＢ−２、請求項９又は１０に記載のペプチドＹ−２、請求項１１又は１２に記載のペプチドＳＹ、請求項１３又は１４に記載のペプチドＳＹ−ＭＤから選ばれる少なくともひとつのペプチド自体からなること、あるいは、これらのペプチドから選ばれる少なくともひとつのペプチドを含有してなること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制用ないし予防用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管平滑筋細胞増殖抑制剤に関するものであり、更に詳細には、特定の天然トリペプチド及び／又はその含有物を有効成分とする新規にして有用な血管平滑筋細胞増殖抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
先に、本発明者らは、魚肉を熱変性処理し、自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理することによってＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ：アンジオテンシンＩ変換酵素）阻害活性を有する新規ペプチドα−１０００を開発するのに成功し、既に特許権を得ている（特許文献１参照）。
【０００３】
一方、本発明は、天然ペプチド、特に天然由来の特定のトリペプチド（Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）が血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有することをはじめて見出し、この有用新知見に基づいてなされたものであるが、本トリペプチドがこのようなすぐれた生理作用を有することは従来全く知られていない。
【特許文献１】特許第３１１７７７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特に安全性の観点から、天然物由来の薬剤、機能性食品の開発を目的としてなされたものであって、先に本発明者らが開発するのに成功した魚肉由来ペプチドα−１０００のすぐれた生理作用に再度着目し、すぐれた生理作用を有する新規ペプチドを新たに開発する目的でなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するために各方面から検討の結果、小麦胚芽に着目し、その加水分解物を精製、分画し、各種の分画画分について、その生理作用を詳細に研究した結果、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（イソロイシル−バリル−チロシン、以下ＩＶＹということもある）が血管平滑筋細胞の増殖を抑制する作用を有することをはじめて見出した。
【０００６】
また、単離したＩＶＹだけでなく、ＩＶＹを含有する物質のスクリーニング、ＩＶＹ高含有成分の分離、取得法についても検討を行い、小麦胚芽のほか魚肉ペプチドの水解物からもＩＶＹが得られることもはじめて見出し、これらの有用新知見に基づいて各種研究の結果、遂に本発明の完成に至ったものである。
【０００７】
すなわち本発明は、トリペプチドＩＶＹについて血管平滑筋細胞増殖抑制作用という新しい生理作用をはじめて発見したことに基づくものであって、ＩＶＹ及び／又はその含有物を有効成分とする血管平滑筋細胞増殖抑制ないし予防用の薬剤あるいは同食品に関するものである。
【０００８】
本発明においては、有効成分としてトリペプチドＩＶＹを使用するものであるが、ＩＶＹとしては、精製、単離したものが使用できるほか、ＩＶＹを含有する物質、特に天然物由来物質も各種使用することができる。該物質としては、本発明者らの研究の結果、例えば小麦胚芽処理物や魚肉処理物が好適であることが見出された。
【０００９】
ここに処理物とは、アミノ酸、ペプチド、蛋白質等天然物の分離、精製に常用される各種処理の１種又は２種以上によって得られたものをいい、処理としては下記の処理が例示される：透析、酵素加水分解、酸加水分解、脱脂、イオン交換樹脂、疎水性吸着樹脂、クロマトグラフィーその他。
【００１０】
本発明においては、有効成分として天然物由来のＩＶＹ含有物質も使用することができ、例えば該物質としては小麦胚芽処理物や魚肉処理物が挙げられ、小麦胚芽由来のペプチドＷＢ−１、ＷＢ−２や魚肉由来のペプチドＹ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等が有利に使用される。そして所望する場合にはクロマトグラフィー処理等の分離精製手段をくり返したり適宜組み合わせたりして、ＩＶＹ濃度を高めたり、ＩＶＹ画分を分画したりすることも可能である。先ずはじめに、小麦胚芽の処理について詳述する。
【００１１】
小麦胚芽は、脱脂した後に又は脱脂することなくそのまま脱イオン水に溶解してホモゲナイズした後、α−アミラーゼ処理した後に又は該処理を行うことなく酵素で加水分解する。脱脂は、常法にしたがえばよく、例えばｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル等の溶媒を用いて、５０〜９０℃、１〜１０時間程度処理すればよい。
【００１２】
α−アミラーゼ処理は、小麦胚芽ホモゲネートとα−アミラーゼを混合してインキュベートすればよく、例えば、α−アミラーゼの添加量は、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、通常は１〜３重量％程度とし、３５〜３９℃、１０分〜２４時間、好ましくは１〜１０時間、通常は３〜５時間処理すればよい。
【００１３】
酵素加水分解としては、各種のプロテアーゼを０．１〜５％、好ましくは０．３〜２％用い、それぞれに適したｐＨ及び温度で１〜１０時間、好ましくは３〜７時間程度処理すればよい。プロテアーゼとしては次のものが例示される（カッコ内は、処理ｐＨ及び温度を示す）：ペプシン、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ（ヤクルト社商品名）（ｐＨ２〜４、通常３程度；３０〜５０℃、通常４０℃前後）；キモトリプシン、トリプシン（ｐＨ７〜９、通常８程度；３０〜５０℃、通常４０℃前後）；アルカリプロテアーゼ（ｐＨ８〜１０、通常９程度；４０〜６０℃、通常５０℃前後）。プロテアーゼとしては、市販品も適宜使用可能である。
【００１４】
酵素加水分解終了後、ｐＨを６〜８に調整した後、１０〜２０分程度沸とう加熱処理した後、遠心分離し（７，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０〜２０分）、得られた上清を濾過する。
【００１５】
上記において、脱脂した小麦胚芽をα−アミラーゼ処理した後、アルカリプロテアーゼ処理して得た小麦胚芽水解物（ペプチドＷＢ−１）は、ＩＶＹ量が高く、原料の小麦胚芽が天然物であるために多少のバラつきは認められたが２０ｍｇ／１００ｇ以上であって、３０ｍｇ／１００ｇ以上のものも充分に期待される。事実、小麦胚芽を脱脂した後、３％α−アミラーゼで３時間処理し、次いで０．５％アルカリプロテアーゼで８時間処理して得たペプチドＷＢ−１（すなわち小麦胚芽水解物であるペプチドＷＢ−１）には、ＩＶＹが２１．６±３．３ｍｇ／１００ｇ含有されていることが確認された。
【００１６】
上記によって得た小麦胚芽水解物（ペプチドＷＢ−１）の遠沈上清濾液に活性炭を添加した後、疎水性吸着樹脂（例えばＯＤＳ樹脂）にアプライし、次いで５〜２０％、好ましくは７〜１５％エタノール水溶液で溶出し、得られる溶出画分をＩＶＹ高含有物質（ペプチドＷＢ−２）とする。そのＩＶＹ含量は、１２０ｍｇ／１００ｇ以上であって、原料の小麦胚芽によっては１６０ｍｇ／１００ｇ以上のものも充分に期待される。事実、小麦胚芽を３％α−アミラーゼで３時間処理して脱脂した後、０．５％アルカリプロテアーゼで８時間処理して得た水解物（ペプチドＷＢ−１）をＯＤＳカラムに供し、１０％エタノールで溶出した画分であるペプチドＷＢ−２（すなわち、小麦胚芽水解物ＯＤＳ画分：ペプチドＷＢ−２）には、ＩＶＹが１４３±１６．７ｍｇ／１００ｇ含有されていることが確認された。なお、疎水性吸着樹脂としてはＯＤＳ樹脂、例えばＹＭＣ、ＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０（ＹＭＣ社商品名）のほか、例えばＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学（株）製商品名）等も使用可能である。
【００１７】
このようにして溶出した小麦胚芽水解物のクロマトグラフィー画分（ＷＢ−２）でも充分にＩＶＹ高含有組成物として利用可能であるが、更にＩＶＹ含量を高めることができる。その非限定例を下記する。
【００１８】
上記によって得たＯＤＳフラクション等クロマトグラフィーフラクション（乾燥物）に脱イオン水を加え、これをカチオン交換樹脂（例えばＡＧ５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ+）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社商品名））充填カラムにアプライした後、水洗し、次いで０．１〜５Ｍ、好ましくは０．５〜２Ｍアンモニア水で溶出して、溶出画分（ＡＧ５０Ｗペプチド）を得る。
【００１９】
この画分（ＡＧ５０Ｗペプチド）のＩＶＹ含量は、２４０ｍｇ／１００ｇ以上と大幅に上昇していることが確認されたが、更に２８０ｍｇ／１００ｇ以上とすることも充分に可能である。また、この方法によれば、例えば１ｋ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ遠心濃縮（米国、Ｆｉｌｔｒｏｎ社）よりも収率が２〜３倍も上昇する。この画分は凍結乾燥して保存することも可能である。
【００２０】
この画分は、ＩＶＹ含量が高く、本発明に係る医薬の有効成分として使用するのに更に好適であるが、クロマトグラフィー処理（以下、クロマト処理ということもある）等既知の精製処理によって更に精製することも可能である。
【００２１】
例えば、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＬ、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５  Ｐｈ（ナカライ  テスク社商品名）カラムを適宜組み合わせてＡＧ５０ＷフラクションをＨＰＬＣ処理することによって、精製し、各ペプチドに単離し、ＩＶＹを単離することもできる。
【００２２】
本発明のペプチドＷＢ−１の理化学的性質は、次に示される。
（ペプチドＷＢ−１の理化学的性質）
（Ａ）融点（黒化点）：１２１．３〜１６０．５℃
（Ｂ）比旋光度：〔α〕D20＝＋２６９°±５°（測定濃度；２．１１ｍｇ／５ｍｌ−水）
（Ｃ）液性（ｐＨ）：６．８〜８．４（濃度０．０３％）
（Ｄ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル：図１
（Ｆ）紫外線吸収スペクトル：図２
【００２３】
本発明のペプチドＷＢ−２の理化学的性質は、次に示される。
（ペプチドＷＢ−２の理化学的性質）
（Ａ）融点（黒化点）：１５５．２〜２０５．７℃
（Ｂ）比旋光度：〔α〕D20＝＋２１３°±５°（測定濃度；２．３１ｍｇ／５ｍｌ−水）
（Ｃ）液性（ｐＨ）：６．８〜８．０（濃度０．０５％）
（Ｄ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル：図３
（Ｆ）紫外線吸収スペクトル：図４
【００２４】
次に、ＩＶＹ含有物質の他の１例として、魚肉処理物について詳述する。本発明者らは、先に述べたように、小麦胚芽にトリペプチドＩＶＹが含有されており、これを各種処理することによってＩＶＹ濃度を高めることにはじめて成功したが、これに満足することなく更に研究を続けた結果、先に本発明者らが開発した魚肉由来ペプチドα−１０００を疎水性吸着樹脂ＯＤＳカラムに供した後、１０％エタノール水溶液で溶出した画分にＩＶＹが高濃度に含まれていることをはじめて見出し、鋭意研究の結果、ＩＶＹ含量の高い魚肉処理物（ペプチドＹ−２）を開発するのに成功し、また、別の処理による魚肉処理物（ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等）にもＩＶＹが高濃度に含まれていることも確認し、魚肉由来ペプチドの面からの発明を完成するのにも成功した。
【００２５】
はじめに、ペプチドＹ−２は次のようにして製造することができる。ペプチド原液つまりペプチドＹ−２の原料としては、魚肉由来ペプチドを用い、これを疎水性吸着樹脂に供した後、５〜２０、好ましくは８〜１７、更に好ましくは約１５Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液で溶出することにより、ペプチドＹ−２が得られる。また、エタノール水溶液で溶出する前に水で溶出し次にエタノール水溶液で溶出してもよい。このようにして得られた溶出画分にはＩＶＹが含まれており、この画分（ペプチドＹ−２）は、本発明における有効成分として有利に使用することができる。
【００２６】
ペプチドＹ−２のほかＳＹやＳＹ−ＭＤの原料ないし起源、つまりペプチド原液としては、例えばペプチドα−１０００の水溶液が使用できる。
ペプチドα−１０００は、魚肉を熱変性した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水分解し、次いで加熱等常法にしたがって酵素を失活せしめた後、分離処理して製造することができる。その詳細を以下に述べる。
【００２７】
ペプチドα−１０００は、魚介類を原料として製造するものであって、例えば特許第３１１７７７９号にしたがって製造することができ、先ず、魚介類を採肉機、デボーナー等によって処理して魚肉質を分離する。原料は出来る限り新鮮なものが好ましい。分離した魚肉は、１０ｋｇ程度のすり身に分割し、このまま次の処理に使用してもよいが、−２０〜−５０℃、例えば−３０℃程度の冷気を吹き付けて急速凍結し、−２０〜−２５℃に保存しておき、必要に応じてこれを適宜使用することにしてもよい。
【００２８】
魚介類としては、イワシ、アジ、マグロ、カツオ、サンマ、サバ等赤身魚；ヒラメ、タイ、キス、コノシロ、タラ、ニシン、ブリ等白身魚；サメ、エイ等軟骨魚；ワカサギ、コイ、イワナ、ヤマメ等淡水魚；アイザメ、アンコウ等深海魚のほか、エビ、カニ、タコ、アミ類等も適宜使用できる。
【００２９】
採肉した後、粉砕機等によって魚介類を粉砕し、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、加熱処理し、もって、自己消化酵素を失活させ、且つ細菌を死滅させるとともに、タンパク質を熱変性させて後に行う酵素反応効率を上昇せしめる。加熱条件としては、このような作用が奏される条件であればすべての条件が利用できるが、例えば６５℃以上、２〜６０分、好ましくは８０℃以上、５〜３０分とするのがよい。
【００３０】
次いで、アンモニア水か、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、（例えばアルカリプロテアーゼの場合は、ｐＨ７．５以上、好ましくは８以上）、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、アルカリプロテアーゼの場合は３５〜６０℃、好ましくは４０〜５５℃）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（アルカリプロテアーゼの場合は３０分〜２５時間、好ましくは１〜１７時間）処理する。
【００３１】
蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物に求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメレインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でもよい。
【００３２】
次いで必要あれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、バイブスクリーン等によって粗分離し、必要によりジエクター処理した後、超遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。
【００３３】
次に、ケイソウ土等濾過助剤（例えばセライト）を用いて濾過し、濾液を活性炭処理（０．０５〜２０Ｗ／Ｖ％、好ましくは０．１〜１０Ｗ／Ｖ％使用、２０〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、１５分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間）して、脱臭、脱色、精製する。
【００３４】
これを減圧濃縮（０〜５０℃）その他常法にしたがって濃縮（３０Ｂｘ程度にまで）した後、必要あれば再度（超）遠心分離又は濾過してペプチド原液を得る。このようにして得たペプチド原液は、殺菌（ＵＨＴＳＴその他常法による）した後、容器に充填した製品（α−１０００（液体））とする。また、希望するのであれば、更に濃縮したりあるいは逆に希釈したり、また、噴霧乾燥、凍結乾燥等の常法によって６０メッシュ程度に粉末化し、これを袋等の容器に充填して製品（α−１０００（粉末））とすることもできる。これらの製品は、液体は冷蔵ないし冷凍保管、粉末は乾燥冷暗所保管する。
【００３５】
このようにして得た、液状、ペースト状ないし粉末状のペプチドがα−１０００である。
【００３６】
ペプチドα−１０００（スプレードライ粉末）の物理化学的性質は、下記に示すとおりである。
【００３７】
ペプチドα−１０００（粉末）の物理化学的性質
（Ａ）分子量；
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点；１１９℃で着色（分解点）
（Ｃ）比旋光度
〔α〕D20＝−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性；
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別；
中性  ｐＨ６．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）外観、成分；
白色粉末；水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（Ｇ）特  性；
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。
（Ｈ）アミノ酸組成；
下記に示すとおり。
【００３８】
（表１）
ペプチドα−１０００（粉末）のアミノ酸組成
―――――――――――――――――
分析試験項目      結果（％）
―――――――――――――――――
全アミノ酸
アルギニン          ３．３４
リジン              ６．８６
ヒスチジン          ３．３４
フェニルアラニン    ２．３３
チロシン            ２．０１
ロイシン            ６．３５
イソロイシン        ３．２７
メチオニン          ２．２６
バリン              ４．１６
アラニン            ５．１７
グリシン            ３．５９
プロリン            ２．１５
グルタミン酸      １２．３５
セリン              ３．３０
スレオニン          ３．７０
アスパラギン酸      ８．３６
トリプトファン      ０．３２
シスチン            ０．４７
全量              ７３．３３
―――――――――――――――――
分析方法：アミノ酸自動分析法による（但し、シスチンは、過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解し測定した。トリプトファンは、高速液体クロマトグラフ法を用いた。）
【００３９】
このようにして調製したペプチドα−１０００は、液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した後、これをＯＤＳ樹脂その他疎水性吸着性樹脂に通し、水などで洗浄した後、ペプチド原液を負荷し、水で溶出した後、ひき続き、５〜２０％、好ましくは１１〜１９％、更に好ましくは１３〜１８％エタノール水溶液を加えてエタノール水溶液での溶出を行い、ペプチドＹ−２を得る。なお、樹脂としては、疎水性吸着性樹脂であればすべての樹脂が使用可能であり、既述した市販の樹脂も適宜使用可能である。
【００４０】
このようにして得た魚肉精製ペプチドのＹ−２画分（つまり、ペプチドＹ−２）には、ＩＶＹが１００μｇ／１００ｇ以上含有されており、１５０μｇ／１００ｇ以上のものの存在も充分に期待される。事実、イワシ魚肉を０．７％アルカラーゼで１７．５時間処理して得た水解物をＯＤＳカラムに供し、水溶出画分の後半部分と１５％エタノール溶出画分を合わせたＹ−２画分（すなわち、イワシ肉由来酵素分解精製物であるサーデンペプチドＹ−２）には、アミノ酸シーケンサーによる解析の結果、ＩＶＹが１２０μｇ／１００ｇ含有されていることが確認された。
【００４１】
本発明において有効成分として使用するペプチドＹ−２の理化学的性質は、次に示される。
（ペプチドＹ−２の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）（図５）
（Ｂ）融点：１３８℃で着色、分解する。
（Ｃ）比旋光度〔α〕D20＝−４０°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別：中性  ｐＨ５．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）物質の外観：白色〜淡黄色粉末。
（Ｇ）成分：水分２．７２％（常圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．２５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分０．２０％（直接灰化法）
（Ｈ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｉ）赤外線吸収スペクトル：図６
（Ｊ）紫外線吸収スペクトル：図７
（Ｋ）アミノ酸組成：下記の表２に示すとおり。分析方法はアミノ酸自動分析法（島津ＬＣ−６Ａシステム）による。
【００４２】
（表２）
ペプチドＹ−２のアミノ酸組成
―――――――――――――――――
アミノ酸          分析値（％）
―――――――――――――――――
アスパラギン酸      １０．９７
スレオニン            ４．１０
セリン                ２．９０
グルタミン酸        １２．５２
グリシン              ４．９１
アラニン              ５．０６
バリン                ６．２０
メチオニン            ２．５５
イソロイシン          ５．５５
ロイシン              ９．４７
チロシン              ２．９６
フェニルアラニン      ４．７５
ヒスチジン            ２．８３
リジン              １０．０７
アルギニン            ７．５０
―――――――――――――――――
【００４３】
そして更に、本発明者らは、上記したペプチドＹ−２の有用性に改めて着目し、魚肉を蛋白分解酵素で処理して得たペプチド（例えば、ペプチドα−１０００）について研究を行い、この魚肉由来ペプチドを疎水性吸着樹脂（例えば、ＯＤＳ樹脂）処理し、水溶出、エタノール水溶出、水溶出の三段階溶出を行ったところ、最初の水溶出の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分に、魚肉ペプチド中のＩＶＹが多量に回収されているという有用新知見を得た。
このように、最初の水溶出の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分の混合物はＩＶＹ含量が高いだけでなく、苦味が少なく、呈味性にすぐれ、安定性にもすぐれており、全く新規な機能性ペプチドであることを確認し、これを新規ペプチドと同定して、ここに、ベプチドＳＹと命名した。
更に、本発明において、上記の１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液溶出画分のみを単離して調べたところ、Ｎａ含量が０．１〜０．２％程度（ペプチドＳＹでは、Ｎａは１〜３％程度）と極めてＮａ含量の少ない新たなペプチドが得られたので、この画分をペプチドＳＹ−ＭＤと命名した。
【００４４】
本発明においては、ペプチドα−１０００を原料として、できるだけ多くのＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含むペプチドを連続的に回収することを目的に研究を行った。
その結果、α−１０００をＯＤＳ樹脂処理した後、水を加えて水で溶出する画分の一部（後の方の画分）を得た後、ひき続き、連続してエタノール水溶液を加えてエタノール水溶液で溶出する画分を得るのであるが、その際、水溶出（１）に使用した水が一部残っているために、エタノール濃度は１１〜１８Ｖ／Ｖ％、好ましくは１４〜１６Ｖ／Ｖ％程度が好適であることをつきとめた。
【００４５】
そして更に、ペプチドＳＹを取得するに当り、目的とする水溶出（１）の後画分を分取する際の分取開始点の設定、その終了点（即ち、エタノール溶出の開始点）、その終了点（水溶出（２）の開始点）、その終了点について、分画時間、塩分濃度、Ｂｘ、波長２８０ｎｍのＵＶ吸収の測定、モニタリングによってそれぞれ特定ないし判断して、一種の連続システムによるペプチドＳＹの製造法も確立し、これらの有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に本発明の完成に至ったものである。
【００４６】
すなわち本発明は、トリペプチドＩＶＹを含有してなるペプチドＳＹ又はＳＹ−ＭＤを有効成分としてなること、を特徴とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤に関するものであって、その理化学的性質は次のとおりである。
【００４７】
（ペプチドＳＹの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫ  ＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）；図８
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質８４〜９４Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
；脂質０．５Ｗ／Ｗ％以下（ソックスレー抽出法）
；灰分４±２Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
；Ｎａ  １〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図９
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図１０
（Ｊ）比旋光度：〔α〕D20＝−４０°〜−５１°
【００４８】
（Ｋ）主要なアミノ酸組成：下記表３のとおり、分析方法はアミノ酸自動分析法（島津ＬＣ−６Ａシステム）による。
【００４９】
（表３）
ペプチドＳＹのアミノ酸組成
――――――――――――――――――――
アミノ酸          分析値（％）
――――――――――――――――――――
アスパラギン酸      ８．０〜９．２
グルタミン酸        ９．５〜１２．０
バリン              ４．５〜５．５
メチオニン          ２．５〜３．８
イソロイシン        ４．５〜５．２
ロイシン            ７．３〜８．５
チロシン            ３．４〜４．８
フェニルアラニン    ４．５〜５．５
ヒスチジン          ３．０〜３．８
リジン              ６．５〜７．８
アルギニン          ５．０〜６．０
――――――――――――――――――――
【００５０】
（ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分  ２〜６Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質  ９０〜９８Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
：資質  ０．５Ｗ／Ｗ％（ソックスレー抽出法）
：灰分  ３．０Ｗ／Ｗ％以下（直接灰化法）
：Ｎａ  ０．１〜０．２Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有し、血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図１１
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図１２
【００５１】
ペプチドＳＹは次のようにして製造することができる。すなわち、ペプチド原液、つまりペプチドＳＹの原料となる魚肉の酵素処理物（例えば、ペプチドα−１０００）を、液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した後、ＯＤＳ樹脂その他疎水性吸着性樹脂に通し、図１３の「原液負荷」を行い、製造プロセスを開始する。
【００５２】
即ち、ペプチド原液を疎水性吸着樹脂による溶出分画処理により得られるペプチド成分であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１３で例示する溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出（１）の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分（図１３では１５％エタノールでの溶出を示す）及び水溶出（２）画分を分取混合してペプチドＳＹは製造される。
（１）水溶出（１）の後画分：展開液として水を用い、水溶出（１）のペプチド（ペプチドＳＹ）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出（１）の後画分の最終分取点までの画分。
（２）１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分：次に、１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。（この画分のみを単離したものをペプチドＳＹ−ＭＤとした。）
（３）水溶出（２）画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となる迄に得られる画分。
【００５３】
そして上記したように、（２）において、エタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分のみを単離分取することにより、トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを含有してなるペプチドＳＹ−ＭＤを得ることができ、また、上記（２）、又は、上記（２）及び（１）からペプチドＹ−２を得ることもできる。
【００５４】
これらのペプチドの製法を、図１３を参照しながら、以下に詳述する。すなわち、ペプチドＳＹは、上記した溶出画分から分取、製造することができる。各種溶出液の溶出パターンの１例を図１３に示す。
本発明に係るペプチドＳＹは、図１３に示す如く、疎水性吸着樹脂に、例えばα−１０００を加え（原液負荷）、次いで水で溶出し（水溶出（１））、その水溶出（１）の後画分、と、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶液で溶出する１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分、と、更に水で溶出する水溶出（２）画分を混合することにより製造することができる。ペプチドＳＹ画分の分取スタート時点の設定、溶出液の切り変え時期の設定等は、Ｂｘ、塩分、ＵＶ（２８０ｎｍ吸収）、Ｎａの少なくともひとつの測定値に基づき、あるいは分画時間に基づいて適宜決定すればよく、これらの項目をリアルタイム等適宜モニターして、コンピュータによって実施することも可能である。
【００５５】
例えば、図１３の溶出パターンにおいてペプチドＳＹの水溶出（２）の後画分の分画スタート時点は、塩分値を測定し、次のようにしてこれを決定することができる。
ｉ）水溶出開始後０分時点から取ると、Ｎａ含量が４ｇ／１００ｇ以上となってしまうので、高Ｎａ素材となり血圧を上昇させる場合があるため、好ましくない。
ii）分取時間を水溶出開始後２０分後の時は、Ｎａ含量として１〜３ｇ／１００ｇで許容範囲である。
iii）これ以降の分取開始とすると、更にＮａ含量は少なくなるが、今度は塩分含量が少なすぎるため濃縮時にペプチドＳＹに含まれるグアニンが析出しやすくなりオリが発生することがあって好ましくない。
iv）したがって分取開始時間を水溶出開始後２０分とし、Ｎａ量を１〜３ｇ／１００ｇ付近とした。
また、水溶出（１）画分の最終分取点はＮａ量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる点とした。
【００５６】
次に、この点から水にかえて１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液が添加され、ペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するところでエタノール水溶液の添加を止め、ここに得られる画分を１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分とした。（この１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分のみを単離したものがＮａをほとんど含まないペプチドＳＹ−ＭＤとなる。）
【００５７】
１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール水溶液の添加を停止し、水の添加に切り換える時期は、水溶出（２）のスタート時点でもあるが、全ペプチド量を示す波長２８０ｎｍのＵＶ吸収値が急激に低下しはじめ、ピークの半分程度になった時期とし、エンドポイントは、ＵＶ吸収値がゼロになって定常状態に入った時期とすればよい。ここに得られた画分を水溶出（２）画分とした。
【００５８】
ここに得られる（１）水溶出（１）の後画分、（２）１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分、（３）水溶出（２）画分を、各別に又は連続して分取混合したものが本発明のペプチドＳＹである。
このようにして、水溶出（１）画分の途中からの後画分から、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分を経て、水溶出（２）画分までの画分を、本発明に係るペプチドＳＹとして得ることができる（図１３においては、サーデンペプチドＳＹと表示）。
また、図１３において「１５％エタノール溶出」としたところが、ペプチドＳＹ−ＭＤに」相当する。
【００５９】
ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤ、Ｙ−２は、本発明者らによって血管平滑筋細胞増殖抑制ペプチドの本体のひとつとしてはじめて確認されたトリペプチド（イソロイシル−バリル−チロシン：Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ又はＩＶＹ）を高濃度に含有しており、特にペプチドＳＹ−ＭＤは、水溶出（１）の後画分を含まないので少し苦みは残るが呈味性が大幅に改良されているだけでなく、Ｎａをほとんど含まないので、Ｎａ摂取不可の人にとっては非常に有用である。
【００６０】
すなわち、「原液負荷」部分は呈味性は強いが、原料由来の魚臭も幾分含まれており、Ｎａ含量も多い。これに対して、水溶出（１）の後画分は原料由来の魚臭が少なく、味も非常に良好である。
従って水溶出（１）の後画分を組み入れることによって、ペプチドＳＹ−ＭＤより、ＩＶＹを多量に回収でき、かつ呈味性と安定性に優れたペプチド素材「ペプチドＳＹ」が得られることになるのである。
【００６１】
本発明に係るペプチドＷＢ−１、ＷＢ−２、Ｙ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤは、いずれもトリペプチドＩＶＹを含有する天然物由来物質であって、すぐれた血管平滑筋細胞増殖抑制作用を示し、しかも安全性についても問題はないので、血管平滑筋細胞増殖抑制剤ないし該増殖抑制を目的として特定保健用食品向けペプチドとしても使用することができる。したがって本ペプチドは、調味料、栄養強化用食品といった食品ないしは動物飼料添加剤として使用されるほか、上記した独特の生理活性の故に、血管性疾病の予防、ある場合には治療のために、医薬として、または輸液、健康食品、臨床栄養食品等としても巾広く使用することができる。
【００６２】
食品として使用する場合には、ペプチドをそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医薬として使用する場合には、経口又は非経口投与することができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤とすることができ、又、非経口投与の揚合には、例えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することができる。もちろん、精製したトリペプチドＩＶＹについても上記と同様に、医薬、食品（本発明においては飲料も包含する）とすることができることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００６３】
ＩＶＹが正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞の増殖を抑制することがはじめて確認され、ＩＶＹを有効成分とする血管平滑筋細胞増殖抑制剤が開発され、更にまた、ＩＶＹを含有する物質（例えば小麦胚芽由来のペプチドＷＢ−１、ＷＢ−２、あるいは、魚肉由来のペプチドＹ−２、ＳＹ、ＳＹ−ＭＤ等）も有効であることも確認され、これらのペプチドを有効成分とする同増殖抑制剤も開発された。
【００６４】
ＩＶＹ、及びそれを含有する物質（例えば上記した各種ペプチド）は、いずれも安全性には問題がなく（現に、ラットに対して５００ｍｇ／日を強制的に経口投与したけれども、１０日間経過後において急性毒性は認められなかった。）、薬効はもとより呈味性にもすぐれているので、同増殖抑制剤のほか、同増殖抑制を目的とした特定保健用食品向けペプチド等食品としても使用することができる。
【００６５】
また、ＩＶＹ、それを含有する物質は、すぐれた血管平滑筋細胞増殖抑制作用を有するので、動脈硬化症、糖尿病性血管障害、血管形成術や動脈バイパス手術後の血管の肥厚、血管再建術の施術後に起こる疾病（血管再狭窄、動脈硬化性疾患、膜増殖性腎炎、糖尿病、末梢性動脈閉塞など）、臓器移植や血管損傷に起因する細胞増殖性血管炎症など各種疾病の予防及び／又は治療用の薬剤や飲食品としての利用も充分に期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
（１）小麦胚芽の酵素加水分解
小麦胚芽をｎ−ヘキサンで８０℃、５時間処理して脱脂した後、その１０ｇを脱イオン水１００ｍｌに溶解し、ホモゲナイズした後、α−アミラーゼを１．０Ｗ／Ｗ％添加し、３７℃で５時間処理した。次いで、プロテアーゼを１．０Ｗ／Ｗ％加えて下記するｐＨ及び温度で５時間処理し、それぞれ下記に示す蛋白収量を得た。
【００６８】
（表４）
小麦胚芽の酵素加水分解
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
酵素                    ｐＨ      温度（℃）          収  率
（ｍｇ  protein  ｍｌ-1）
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
ペプシン                ３．０      ４０              ２７．３
プロテアーゼＹＰ−ＳＳ  ３．０      ４０              ２０．９
キモトリプシン          ８．０      ４０              ２６．３
トリプシン              ８．０      ４０              ３６．２
アルカリプロテアーゼ    ９．０      ５０              ２９．２
――――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００６９】
上記において、小麦胚芽を脱脂した後、３％α−アミラーゼで３時間処理し、０．５％アルカリプロテアーゼで８時間処理して得た小麦胚芽水解物をペプチドＷＢ−１と命名した。ペプチドＷＢ−１にはＩＶＹが２１．６±３．３ｍｇ／１００ｇ含有されていた。
【００７０】
プロテアーゼ加水分解物のｐＨを７．０に調整した後、１５分間沸とう加熱して酵素を失活させ、遠心分離した後（１０，０００ｒｐｍ、１５分）、得られた上清を濾紙にて濾過した。
【００７１】
（２）小麦胚芽水解物のＯＤＳ分離
得られた濾液１００ｍｌに活性炭を５ｇ添加した後、これを疎水性吸着性樹脂ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ  １２０−Ｓ５０クロマトカラム（３．５×１３ｃｍ）にアプライし、各種濃度のエタノール水溶液（０、１０、２５、５０、９９．５％エタノール水溶液）５００ｍｌで順次溶出し、それぞれ溶出フラクションＦ−１、Ｆ−２、Ｆ−３、Ｆ−４、Ｆ−５を分画し、乾燥した。
【００７２】
上記によって得たＦ−２画分（すなわちペプチドＷＢ−１をＯＤＳカラムに供し、１０％エタノール水で溶出した画分）をペプチドＷＢ−２と命名した。ペプチドＷＢ−２にはＩＶＹが１４３±１６．７ｍｇ／１００ｇ含有されていた。
【００７３】
（３）小麦胚芽水解物のＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８分離
上記によって得たＯＤＳフラクション（Ｆ−２：ペプチドＷＢ−２）２０ｍｇ（乾燥物）を６ｍｌ脱イオン水にとかしこれをカチオン交換樹脂ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ+）カラムにアプライした後、１０ｍｌの水で洗滌した。そして、１．０ＭのＮＨ4ＯＨ水溶液１０ｍｌで溶出した後、これを凍結乾燥した。得られたＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８フラクションにはＩＶＹが２５８±１５．１ｍｇ／１００ｇ含有されており、小麦胚芽水解物の活性はＯＤＳ及びＡＧ５０Ｗによる精製で更に高くなったことが確認された。
【００７４】
（４）ＨＰＬＣによる精製、単離
上記によって得た小麦胚芽水解物のＡＧ５０Ｗ−Ｘ８の１．０Ｍ  ＮＨ4ＯＨ溶出フラクションについて、４ステップのＨＰＬＣ（島津ＬＣ−９Ａ）を行って、ＩＶＹの精製、単離を行った。
【００７５】
第１ステップ：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５  Ｐｈカラムを用い、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）濃度を５〜３５％にリニアグラジエントに高めながらＨＰＬＣを行い（流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ）、その結果、２つのピークＩ、IIを得た。
【００７６】
第２ステップ：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＬカラムを用い、アセトニトリル（５〜３５％液）を用いて溶出を行い、ピークＩから８ピーク、ピークIIから６ピークを得た。
【００７７】
第３ステップ：第２ステップの逆相カラム処理を行った。溶出液も第２ステップと同じとした。
【００７８】
第４ステップ：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５  Ｐｈを用い、アセトニトリル（５〜３５％液）を用いて溶出を行い、この最終ＨＰＬＣの保持時間によって、ピークＩからは１０ピーク、ピークIIからは６ピークに単離し、各ペプチドを単離した。ＩＶＹは、ピークIIの保持時間４３．７分のピークであることが同定された。
【実施例２】
【００７９】
（ペプチドα−１０００の製造）
新鮮イワシをデボーナーで処理して採肉した。採肉した魚肉質を１０ｋｇのすり身に分割し、これを−３０℃以下で急速凍結した後、粉砕機で粉砕した後等量の水を加え、これをタンクに送り、１００℃で１０分間加熱して自己消化酵素を失活させ、熱変性させた。次いでアンモニア水を加えてｐＨを９．５に調整した。
これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の０．１％液を加え、５０℃に１７．５時間保持して酵素分解を行った。次いで１５分間煮沸して酵素を失活せしめた。
これをバイブスクリーン（１５０メッシュ）に通し５０００ｒｐｍでジェクター処理した後、シャープレス遠心分離機で処理し（１５０００ｒｐｍ）、ケイソウ土を濾過助剤として用い、濾過処理したものをペプチド原液とした。
【００８０】
上記で得たペプチド原液に活性炭を１Ｗ／Ｖ％加え、３０℃で６０分間攪拌した後濾過して濾液を得た。これを常法にしたがって減圧濃縮（２０℃）した後、常法にしたがってＵＨＴＳＴ殺菌を行って、α−１０００（液体）製品を得、これを更に常法にしたがって噴霧乾燥して粒径６０メッシュのα−１０００（粉末）製品を得、それぞれこれらの製品は冷凍保管した。
【実施例３】
【００８１】
（ペプチドＹ−２の製造１）
イワシ肉を０．７％アルカラーゼで１７．５時間分解処理し、得られた水解物をＯＤＳカラムに供し、水溶出画分の後半部分と次に行った１５％エタノール溶出画分とを合し、この画分をペプチドＹ−２とした。ペプチドＹ−２にはＩＶＹが１２０μｇ／１００ｇ含有されていた。
【００８２】
（ペプチドＹ−２の製造２）
実施例２で製造したイワシペプチドα−１０００（液体）８００ｍｌ（Ｂｒｉｘ４５、たんぱく質含量２９．６％）に２６．２Ｌの脱イオン水を加え、これをＯＤＳ樹脂（ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０）カラム（１．５×５０ｃｍ）に流してペプチドを吸着させ、脱イオン水で洗滌し、次に、０％、１０％、２５％、５０％、９９．５％のエタノール水溶液２７Ｌを用いて順次溶出してそれぞれＹ−１、Ｙ−２、Ｙ−３、Ｙ−４、Ｙ−５の画分を得た。このうちＹ−２画分を、４０℃で濃縮してエタノールを除去し、凍結乾燥してイワシ精製ペプチド（Ｙ−２）を得た。このＹ−２画分にはＩＶＹがα−１０００の約２〜３倍含有されていた。
【実施例４】
【００８３】
（イワシからのＩＶＹ抽出）
実施例３の（ペプチドＹ−２の製造１）で製造したサーデンペプチドＹ−２を２４．４ｍｇ秤取し３ｍｌの超純水に溶解し、その溶解液５０μｌをＨＰＬＣ条件１に供して得られたクロマトグラムが図１４である。ここで、５３５μｇＩＶＹ＋０．５６ｍｇＹ−２／ｍｌの溶液１００μｌをＨＰＬＣ条件１に供して得られたクロマトグラムから本ＨＰＬＣ条件下ではＩＶＹが３２分前後に溶出されてくることがわかった。
【００８４】
さらに分離分画をすすめるために、Ｙ−２溶解液０．８ｍｌをＨＰＬＣ条件１に供し、ＩＶＹを含むと考えられる３１〜３３分に溶出された画分を分取した。乾固後１ｍｌの超純水に溶解し、その全てをＨＰＬＣ条件２に供して得たクロマトグラムが図１５である。ＩＶＹとＹ−２の混合液をＨＰＬＣ条件２に供して得たクロマトグラムのＩＶＹのピーク位置から、図１５（▼）がＩＶＹのピークであり、サーデンペプチドＹ−２中にＩＶＹがα−１０００の約３倍存在していることがわかった。
【００８５】
（条件１）
１ｍｉｎ  ２％ＣＨ3ＣＮ
４３ｍｉｎ  ３５％ＣＨ3ＣＮ
４８ｍｉｎ  ３５％ＣＨ3ＣＮ
５３ｍｉｎ  ２％ＣＨ3ＣＮ
流速  ０．４ｍｌ／ｍｉｎ
波長  ２２０ｎｍ
カラム  ５Ｃ１８−ＡＲＩＬ（Ｗａｔｅｒｓ）
【００８６】
（条件２）
１０ｍｉｎ  １６．１％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
４８ｍｉｎ  ３５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
５３ｍｉｎ  ３５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
５８ｍｉｎ  １６．１％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡのリニアグラジエント分析
流速、波長、カラムは条件１に同じ
【実施例５】
【００８７】
（ペプチドＳＹの製造）
実施例２で製造したイワシペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、次に、図１３の溶出パターンにしたがい、水、１５％エタノール水溶液、次いで水、各５００ｍｌを加えて、図１３におけるサーデンペプチドＳＹの全画分、即ち、水溶出（１）の後画分、１５％エタノール溶出画分、水溶出（２）画分を分取混合し、凍結乾燥し、ペプチドＳＹ（粉末）２．１ｇを得た。ペプチドＳＹのＮａ含量は１．４５Ｗ／Ｗ％であった。（原子吸光光度法による）
【実施例６】
【００８８】
（ペプチドＳＹ−ＭＤの製造）
実施例２で得られたペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、図１３の溶出パターンに示されたサーデンペプチドＳＹの全画分のうち、１５％エタノール溶出画分のみを単離分取し、これを凍結乾燥し、ペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）１．７ｇを得た。ペプチドＳＹ−ＭＤのＮａ含量は０．１２４Ｗ／Ｗ％であった。（原子吸光光度法による）
【実施例７】
【００８９】
（ドリンクの製造）
―――――――――――――――――――――――
１００ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖        ４．５ｇ
糖アルコール            １ｇ
酸味料                  ０．２ｇ
香料                    ０．１３ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０３ｇ
カラメル色素            ０．０２ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例５で得た）
精製水              全量を１００ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
５０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖      １０ｇ
香料                    ０．３ｇ
酸味料                  ０．１６ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例５で得た）
精製水              全量を５０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
３０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖        ５ｇ
香料                    ０．２５ｇ
酸味料                  ０．１ｇ
甘味料（ステビア）      ０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）    ０．５ｇ
（実施例５で得た）
精製水              全量を３０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
【００９０】
上記配合を６０℃で混合溶解した後、１２８℃、１０秒のプレート殺菌とした。次いでこれを充分に洗浄した１００ｍｌ、５０ｍｌ、３０ｍｌの各容量褐色ビンに９０℃で充填し、室温で放冷後、流水水槽中で急冷し、ドリンクを製造した。
【実施例８】
【００９１】
（錠剤の製造）
次の配合により錠剤を製造した。
実施例５で得たペプチドＳＹ（粉末）５００ｇ、還元麦芽糖水飴３５６ｇ、結晶セルロース１００ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４０ｇ、甘味料（ステビア）４ｇを混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して素錠（２５０ｍｇ×４０００個）を作製した。この素錠に、１錠当たり７．５ｍｇのセラック溶液をコーティングし、４錠当たりペプチドＳＹ（粉末）を５００ｍｇ含有する錠剤４０００個を製造した。
【００９２】
上記と同様にして、実施例１で得たペプチドＷＢ−１、ＷＢ−２、実施例３で得たペプチドＹ−２、実施例６で得たペプチドＳＹ−ＭＤを用い、ドリンク及び錠剤を製造した。
【実施例９】
【００９３】
（血管平滑筋細胞増殖抑制試験）
小麦胚芽や魚肉タンパク質から見出された天然トリペプチドＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ＩＶＹ）について、血管平滑筋細胞に対する作用を検討し、ＩＶＹがその増殖を抑制する作用を有することを確認した。
【００９４】
（１）試験
細胞としては、正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ、Ｃｙｒｏ  ＡＯＳＭＣ；三光純薬（株））継代数６〜１１を使用し、ＩＶＹとしては、化学合成したトリペプチドＩＶＹを使用し、細胞増殖を測定し、また、細胞毒性試験及びアンジオテンシンII刺激に対する応答性も測定した。
【００９５】
細胞増殖測定：５％ＦＢＳを含むＳｍＧＭ血清培地にてコンフルエントまで培養したＶＳＭＣを１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度となるように２４ウェルプレートに１．５ｍｌ播種した。血清培地に対して１ｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒを１０、５０、１００μＭ濃度となるように添加し、ＣＯ2インキュベータ内、３７℃で５日間培養した。細胞数はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅによる染色後、血球計測盤にて生細胞数を計測した。なお、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒの代わりに滅菌水を添加したものをコントロールとした。
【００９６】
細胞毒性試験及びアンジオテンシンII刺激に対する応答性：５％ＦＢＳを含むＳｍＧＭ血清培地にてコンフルエントまで培養したＶＳＭＣを１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度となるように無血清培地で希釈し、９６ウェルプレートに０．１ｍｌ播種した。ＣＯ2インキュベータ内、３７℃で２４時間前培養したのち、１０μｌの１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ溶液を添加し、さらに４８時間インキュベートした。なお、同量の滅菌水を添加したものをコントロールとした。次いで、テトラゾリウム塩であるＷＳＴ−８（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を含む溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、同人化学（株））１０μｌを培地に添加したのち、ＣＯ2インキュベータ内、３７℃で３時間の呈色反応により生じた水溶性ホルマザン量（４５０ｎｍ）から細胞毒性を評価した。また、前培養後１μＭアンジオテンシンII存在下でのＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（１０、１００、１０００μＭ）添加に伴う細胞数の変化（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８）を求めることによりＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒの細胞増殖抑制機構を評価した。
【００９７】
（２）結果
細胞増殖抑制作用
図１６に５日間の血清培養によるＶＳＭＣ増殖に対するＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒの添加効果を示した。その結果、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−ＴｙｒはＶＳＭＣの増殖を濃度依存的に抑制し、１００μＭの添加によって約３３％の増殖抑制効果（Ｐ＜０．０５）が認められた。ペプチドによるＶＳＭＣの増殖抑制効果の発現に関する報告例は皆無であり、またこの結果は大動脈血管の収縮による血圧上昇に対してＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒが予防的に作用することを初めて明示するものであった。
【００９８】
細胞毒性及び細胞増殖抑制機構
図１７は１ｍＭ  Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ存在下でのＷＳＴ−８の細胞内取り込み量を検討したものである。その結果、コントロールと比べて有意な取り込み量の減少が認められなかったことから、ＩＩｅ−Ｖａｌ−ＴｙｒはＶＳＭＣ細胞に対して何ら毒性作用を有さないこと、すなわち細胞増殖抑制作用の発現は細胞毒性によるものではないことが判明した。一方、昇圧代謝系であるレニン−アンジオテンシン系において強い血管収縮作用を示すアンジオテンシンIIを無血清培地に対して添加した結果、ＶＳＭＣの増殖が明らかに促進されたことから、アンジオテンシンIIは大動脈血管の収縮に関わっていることが改めて示された。
【００９９】
そこで、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ共存下でのアンジオテンシンII刺激によるＷＳＴ−８の細胞内取り込み量を検討したところ、全くその影響は認められなかった（図１８）。このことは、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−ＴｙｒのＶＳＭＣ細胞増殖抑制効果（図１６）がアンジオテンシンIIレセプターに対するアンタゴニスト作用により発現しているのではないことを示唆するものであった。
【０１００】
（３）結論
１）Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒは生体内においてヒト大動脈血管平滑筋の収縮を阻害する作用があることが認められた。
２）Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒによる血管弛緩作用の発現はアンジオテンシンIIのアンタゴニスト作用によるものではないことが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ペプチドＷＢ−１の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図２】ペプチドＷＢ−１の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図３】ペプチドＷＢ−２の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図４】ペプチドＷＢ−２の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図５】ペプチドＹ−２のゲル濾過による分子量分布を示す。
【図６】ペプチドＹ−２の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図７】ペプチドＹ−２の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図８】ペプチドＳＹの分子量を示す。
【図９】ペプチドＳＹの赤外線吸収スペクトルを示す。
【図１０】ペプチドＳＹの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図１１】ペプチドＳＹ−ＭＤの赤外線吸収スペクトルを示す。
【図１２】ペプチドＳＹ−ＭＤの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図１３】ペプチドＳＹ、ＳＹ−ＭＤの溶出パターンのグラフである。
【図１４】ペプチドＹ−２のＨＰＬＣ（条件１）のクロマトグラムである。
【図１５】ペプチドＹ−２のＨＰＬＣ（条件２）のクロマトグラムである。
【図１６】５％ＦＢＳ培地で５日間生育したＶＳＭＣに及ぼすＩＶＹの影響について示す。
【図１７】ＶＳＭＣに対するＩＶＹの細胞毒性について示す。細胞は、無血清（Ｂａｓａｌ）、又は、無血清＋１ｍＭ  ＩＶＹで４８時間処理したものであり、毒性評価には、細胞内へのＷＳＴ−８の相対取り込み率を用いた。
【図１８】アンジオテンシンIIに対する応答におけるＷＳＴ−８のＶＳＭＣ内取り込みに及ぼすＩＶＹの影響について示す。１μＭアンジオテンシンIIの存在又は不存在下において、細胞は、無血清（Ｂａｓａｌ）、無血清＋１ｍＭ  ＩＶＹで４８時間処理したものである。
【図１】
2005247765.tif 000002
【図２】
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【図３】
2005247765.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005247765.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2005247765.tif 000014
【図１４】
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【図１５】
2005247765.tif 000016
【図１６】
2005247765.tif 000017
【図１７】
2005247765.tif 000018
【図１８】
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