(57)【要約】【課題】増幅した核酸断片を高精度に検出する。【解決課題】  鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む。【選択図】  図１
2005176623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、
その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、
その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程と、
を含む核酸検出方法。
【請求項２】
上記デオキシヌクレオチド及び上記ジデオキシヌクレオチドの濃度比が下記式を満たす反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
0.1<{dNTP濃度／(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
（上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、ａは増幅反応時に伸長する塩基数（１≦ａ）であり、ｂは増幅反応時のサイクル数である。）
【請求項３】
上記式中bは、２０≦ｂ≦２４の範囲を満たすことを特徴とする請求項２記載の核酸検出方法。
【請求項４】
上記一対のプライマーのうちいずれか一方のプライマーを、上記プローブと相補的な塩基配列と近接した領域にアニーリングするように設計することを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項５】
上記一対のプライマーのうち少なくとも一方のプライマー及び/又は上記プローブを、予め標識しておくことを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項６】
上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、少なくとも１の補助的プライマーを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項７】
上記増幅反応ではアニーリング温度を、サイクルが進むたびに低い値となるように設定することを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
【請求項８】
上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、一対の第２プライマーセットを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項１記載の核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅反応によって得られた核酸を検出する、核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムは生物の設計図であり、ヒトにおいては約３０億塩基対のデオキシリボ核酸（DNA）から作られている。このゲノムの塩基配列中には、同種の個体間で異なる部位が複数発見されており、それらを多型と呼ぶ。特に一塩基のみ置き換わった多型のことは一塩基多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphisms）と呼ばれる。SNPが異なることによって病気や薬の効き方に影響する場合もある。このようにSNPは、個人差を説明する要因として注目されている。
【０００３】
ゲノムからはmRNA、rRNA、tRNAが発現され、これらの設計図から具体的なタンパク質等が選択的に作られ、生命活動を支えている。これらRNAの発現の有無やRNA配列を調べることも、生命現象を解明する上で重要である。また生物種によっては、rRNAの配列が部分的に異なることから、その配列を調べることで生物種同定などを行うことも可能である。
【０００４】
いずれにしても目的とする配列を増幅すること、また情報として認識可能にするために増幅産物を標識して検出することが必要である。現在一般的な核酸配列の増幅方法としては、PCR（Polymerase Chain Reaction）が知られている。PCRとは、鋳型となるDNA配列から増幅したい領域を挟むように一対のプライマーセットを設計し、それらプライマーや基質となるdNTP、高温にも耐性なDNA合成酵素等を含む反応溶液を調製し、熱変性、アニーリング、伸長の温度変化を１サイクルとした反応を２０〜３０サイクル繰り返すことで当該領域を増幅する増幅反応のことである。
【０００５】
標識方法としては、PCRで増幅の有無をアガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイド等で二本鎖DNAを染色するといった増幅後に可視化する方法がある。また、配列特異的に相補鎖と結合する原理を用いて検出するには、増幅産物に蛍光物質を取り込ませるなど、直接標識することが必要である。増幅産物に直接標識する方法としては、プライマーにあらかじめ蛍光標識やビオチンなどを結合させて増幅反応を行う方法、基質に放射性同位元素を含むものや蛍光標識化、ビオチン化されたものを用いて増幅反応中に増幅産物へ取り込ませる方法などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
PCRにおいて、原理的にごく微量の鋳型のDNA配列を大量に増幅することが可能であるが、実際には増幅反応が起きないことや、間違えた領域を増幅してしまうことがある。とくにゲノムの一部領域を増幅する場合などは、全DNA量における増幅すべき鋳型のDNA量が非常に少ないため、プライマーの非特異結合等により増幅反応が起きないことや、間違えた領域を増幅してしまうことが多く、目的とした増幅産物を得ることは難しい。
【０００７】
また増幅されたDNAは、目的の情報を得るために何らかの方法で標識する必要がある。PCRの後に標識する方法は、余計な時間や手間、酵素などの高価な試薬等を必要とするため、PCRにおける増幅反応中に標識する方法に比べコストがかかる。とくに大量の検体数を処理しなくてはならない場合などは、このコストが問題となる。しかしPCRの増幅反応中に標識することと、ゲノムなどから安定して増幅産物を得ることを同時に行うことは、現実的に容易ではない。
【０００８】
標識された増幅産物を、その相補鎖となるプローブを用意し、配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、その結合の有無を検出する場合、増幅産物はもともと二本鎖であり、分子数としても過剰量存在するため、プローブとは結合し続けずに、最終的に増幅産物の相補鎖と安定した二本鎖を形成してしまう。つまり単純に標識物質を増幅産物に取り込ませるだけでは、検出感度は非常に低くなってしまう。
【０００９】
増幅産物に偏りを作り一本鎖DNAを調製することで問題が解決すると考え、増幅反応に用いる一対のプライマー比を、等量から異なる量にする非対称PCR法（参考文献；「遺伝子増幅ＰＣＲ法  基礎と新しい展開」（1990年12月10日）、藤永編、加藤郁之進著、共立出版（株）発行、７頁〜26頁）が考案された。しかしながら、非対称PCR法では、実際にはゲノムなどから安定して増幅産物を得ることが容易ではなく、またプライマーが等量ではなくとも過剰量あれば、普通のPCRと同じような増幅反応が起きるため、問題解決には至らなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、増幅した核酸断片を高精度に検出することを可能とする全く新規な核酸標識方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
(1)  鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む核酸検出方法。
【００１２】
(2)  上記デオキシヌクレオチド及び上記ジデオキシヌクレオチドの濃度比が下記式を満たす反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
0.1<{dNTP濃度／(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
（上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、ａは増幅反応時に伸長する塩基数（１≦ａ）であり、ｂは増幅反応時のサイクル数である。）
【００１３】
(3)  上記式中bは、２０≦ｂ≦２４の範囲を満たすことを特徴とする(2)記載の核酸検出方法。
(4)  上記一対のプライマーのうちいずれか一方のプライマーを、上記プローブと相補的な塩基配列と近接した領域にアニーリングするように設計することを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
【００１４】
(5)  上記一対のプライマーのうち少なくとも一方のプライマー及び/又は上記プローブを、予め標識しておくことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
(6)  上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、少なくとも１の補助的プライマーを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
【００１５】
(7)  上記増幅反応ではアニーリング温度を、サイクルが進むたびに低い値となるように設定することを特徴とする(1)記載の核酸増幅方法。
(8)  上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、一対の第２プライマーセットを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、増幅反応後の反応溶液に、鋳型核酸における検出対象の領域に相補的な一本鎖核酸を含むため、当該検出対象の領域を高感度で検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明に係る核酸標識方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、本発明の技術的範囲は以下の説明及び実施例に限定されるものではない。すなわち、以下の説明及び実施例にて直接的に開示されてなくとも、当業者であれば容易に変更できる構成であれば、本発明の技術的範囲に属する。例えば、以下の説明においては、ビオチン化プライマーを用いることで増幅産物を標識する方法を例示して説明するが、その他蛍光物質等で標識されたプライマーを用いる方法、及び増幅反応時に放射性同位元素や蛍光物質で修飾された基質を取り込む方法等であっても、本発明の技術的範囲に属する。また、以下の説明においては、PCRの際に使用する一対のプライマーのうち、片方のプライマーのみがビオチン化され、その結果として増幅産物の片鎖のみを標識する例を説明するが、両方のプライマーをビオチン化して両鎖とも標識する方法であっても、本発明の技術的範囲に属する。
【００１８】
先ず、本発明に係る核酸検出方法は、鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、その後、反応溶液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む。ハイブリダイゼーションを検出する工程によって、鋳型となる核酸におけるプローブと相補的な配列の存否を検出することができる。以下、工程順に説明する。
【００１９】
先ず、増幅反応を行う工程とは、鋳型となる核酸の所定の領域を増幅する工程であって、一本鎖核酸を含む増幅産物を合成する工程である。例えば、SNPを検出する場合には、対象となるSNPを含む領域を増幅する。また、ある遺伝子の存在の有無を検出する場合には、当該遺伝子を含む領域を増幅する。ここで、鋳型となる核酸は、ゲノムDNA、プラスミドDNA、mRNAを逆転写することで合成されるcDNA等のDNA分子、mRNA、tRNA及びrRNA等のRNA分子のいずれでもよい。
【００２０】
反応溶液に含まれる一対のプライマーは、上述した増幅対象の領域を挟み込むように設計される。特に、検出対象をSNPとする場合や遺伝子の特定の領域とする場合には、一方のプライマーを当該SNPの位置或いは当該特定の領域に近接するように設計することが好ましい。また、一対のプライマーのうちいずれか一方のプライマー或いは両方のプライマーに対して標識を付すことが好ましい。なお、詳細を後述するが、プローブに標識を付した場合には、一対のプライマーのいずれにも標識を付さなくてもよい。
【００２１】
標識としては、従来公知のいずれの標識物質を使用することができる。例えば、標識としては、ビオチン、蛍光色素、ジゴキシゲニン等を使用することができる。
【００２２】
また、反応溶液は、鋳型の核酸に対する相補鎖を合成するための核酸合成酵素を含む。核酸合成酵素としては、一般に使用されている核酸合成酵素であれば特に限定されず、例えば、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素、RNAポリメラーゼ等を挙げることができる。また、核酸合成酵素としては、耐熱性細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼや、高忠実度DNAポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００２３】
本工程においては、反応溶液に含まれる核酸合成酵素の基質となるデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む。すなわち、核酸合成酵素は、鋳型の核酸に対して相補的な配列を合成する際に基質としてデオキシヌクレオチドを使用する。一方、ジデオキシヌクレオチドは、核酸合成酵素によって伸長鎖に取り込まれると、それ以上の伸長反応を停止させる。言い換えると、DNAポリメラーゼは、鋳型の核酸に対して相補的な配列を合成する際に、ジデオキシヌクレオチドを取り込むとそれ以上の伸長反応を行うことができない。なお、ここで、デオキシヌクレオチドとは、デオキシアデニン（dATP）、デオキシグアニン（dGTP）、デオキシチミン（dTTP）及びデオキシシトシン（dCTP）を意味する。ジデオキシヌクレオチドとは、ジデオキシアデニン（ddATP）、ジデオキシグアニン（ddGTP）、ジデオキシチミン（ddTTP）及びジデオキシシトシン（ddCTP）を意味する。
【００２４】
すなわち、本工程によれば、図１に模式的に示すように、上述した反応溶液を用いてPCRを実施することによって、増幅産物として、標識された二本鎖核酸及び標識された一本鎖核酸を取得することができる。ここで、標識された一本鎖核酸は、予め標識されたプライマーからの伸長反応によって増幅され、伸長鎖にジデオキシヌクレオチドが取り込まれることによって伸長反応が停止し、安定な二本鎖構造を取り得なくなった増幅産物である。なお、標識された二本鎖核酸は、伸長反応の途中にジデオキシヌクレオチドが取り込まれず、安定した二本鎖構造を取ることができる増幅産物である。
【００２５】
上述した増幅反応を行う工程の後、増幅産物を含む反応溶液及び別途準備したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。ここで、プローブとしては、本発明に係る核酸検出方法を適用する場面によって適宜設計された核酸を含む核酸構築物を意味する。例えばSNPを検出する場合、プローブは、当該SNPとして取りうる塩基配列のうち何れかの塩基配列からなる核酸断片を有し、当該核酸断片がビーズやディッシュ底面等に結合した構成とされる。また、例えば特定の遺伝子の存否を検出する場合、当該遺伝子が特異的に有する塩基配列からなる核酸断片を有し、当該核酸断片がビーズやディッシュ底面等に結合した構成とされる。
【００２６】
より具体的に、図２に示すように、C又はTを取りうる多型部位を含む塩基配列からなる核酸断片がビーズに固定化された一対のプローブを準備する。なお、ここでは、多型部位がCである第１のプローブと、多型部位がTである第２のプローブとを準備する。これら第１のプローブ及び第２のプローブと標識された増幅産物とのハイブリダイゼーションを実施すると、増幅産物に含まれる多型に応じて、当該増幅産物と第１のプローブ及び第２のプローブの何れか一方とがハイブリダイズする。
【００２７】
ハイブリダイゼーションの条件としては、特異的な二本鎖が形成され、且つ非特異的な二本鎖が形成されない条件であれば、特に限定されない。例えば、ハイブリダイゼーションの条件としては、3MのTMAC（Tetramethylammonium chloride）、0.1％のSarkosyl、50mMのTris-HCl（pH8.0）及び4mMのEDTA（pH8.0）からなる溶液で、５５℃（５０〜６０℃）で３０分（１０分〜１２０分）といった条件を挙げることができる。なお、ハイブリダイズ後の洗浄は、上記と同様な組成の溶液を使用することができる。
【００２８】
次に、プローブと増幅産物とのハイブリダイズの有無を、増幅断片の標識に基づいて検出する。図２に示した例では、ビオチンで標識された増幅産物は、多型部位がAであるため、第２のプローブ（多型部位がTであるプローブ）とハイブリダイズする。したがって、この例では、第２のプローブを固定化したビーズからビオチンに基づくシグナルを検出することができる。すなわち、この工程では、第１のプローブ及び第２のプローブの何れか一方から、標識を検出することによって、増幅産物の多型を判別することができる。
【００２９】
特に、本方法においては、上述したように、増幅産物として標識された一本鎖核酸を反応溶液に含んでいる。これら一本鎖核酸は、プローブとの間に安定した二本鎖構造を形成することができる。これに対して、増幅産物である二本鎖核酸は、熱変性によって一本鎖核酸とされた後、プローブとの間で二本鎖構造を形成する場合、元々の相補鎖との間で二本鎖構造を形成する方が安定となり、プローブとの間で安定して二本鎖構造を形成しない。すなわち、二本鎖核酸が熱変性して得られた一方の一本鎖核酸は、プローブと他方の一本鎖核酸との競合のもとに、二本鎖を形成することとなる。この場合、検出感度が大幅に低下してしまい、所望の核酸を検出して、例えばSNPにおける遺伝子型、特定の遺伝子の存否を判別することができないおそれがある。
【００３０】
これに対して、本発明に係る核酸の検出方法によれば、増幅反応を行う工程によって他の核酸と安定な二本鎖構造を形成することがない一本鎖核酸を反応溶液に含むこととなる。したがって、本方法によれば、増幅反応で得られた一本鎖核酸とプローブとのハイブリダイズによって高感度に核酸を検出することができる。
【００３１】
本方法においては、反応溶液において、ジデオキシヌクレオチドの存在比が高いと増幅反応が対数的に進まないため、増幅産物が得られず検出できない。一方、ジデオキシヌクレオチドの存在比が低いと、増幅産物である一本鎖核酸の混在比率も低く、検出感度を高めることができない。そこで、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドの濃度比を下記式を満たすように反応溶液を調製し、上述した増幅反応を行うことが好ましい。
0.1<{dNTP濃度／(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
（上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、ａは増幅反応時に伸長する塩基数（１≦ａ）であり、ｂは増幅反応時のサイクル数である。）
【００３２】
上記式を満たす反応溶液によれば、一本鎖核酸を確実に増幅することができ、優れた検出感度を達成することができる。上記式における下限未満の反応溶液においては、増幅反応後の反応溶液に含まれる二本鎖核酸の割合が多くなり、検出感度が低くなるおそれがある。また、上記式における上限を超える反応溶液では、一対のプライマーから増幅反応が早期に停止する確率が高くなり、検出に十分量の一本鎖核酸を増幅できないおそれがある。
【００３３】
例えば、反応溶液におけるジデオキシヌクレオチドの割合が1/1000、5/10000のとき、サイクル数や伸長する鎖長の変化と予想される増幅率の変化との相関をそれぞれ表１と表２に示す。
【００３４】
【表１】
2005176623.tif 000003
【００３５】
【表２】
2005176623.tif 000004
【００３６】
なお、上記表１及び表２において、増幅率はジデオキシヌクレオチドを含まない反応溶液で増幅反応を行って得られるであろう増幅産物の量を１として算出している。伸長する鎖長が長くなるほど急激に増幅率が下がることがこれらの表より推測できる。
【００３７】
また、上記式において、２０≦ｂ≦２４の範囲を満たすことが好ましい。すなわち、増幅反応のサイクル数がこの範囲である場合には、核酸合成酵素の失活等に起因する増幅反応の律速を防止することができ、最適な検出感度を達成することができる。例えば、通常のPCRではサイクル数が２０回以上（２５〜３０回）であるが、サイクル数が２０回を超えると耐熱性DNAポリメラーゼの失活などより増幅反応は極端に遅くなる。そこでサイクル数は２０〜２４回とすることが好ましい。伸長反応を１回行ったときの増幅率が0.9、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99の場合に予想される増幅率を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2005176623.tif 000005
【００３９】
サイクル数が２０〜２４回に注目すると、おおよその増幅率が0.1から0.8の間にあることから、下記式を導いた。
0.9<{dNTP濃度／(dNTP濃度+ddNTP濃度)}a<0.99
（上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、ａは増幅反応時に伸長する塩基数（１≦ａ）である。）
【００４０】
また、伸長反応を１回行ったときの増幅率が0.95〜0.96のとき、計算上では増幅産物中の1.5％が一本鎖ＤＮＡとなり最高値であることから下記式を導いた。伸長する鎖長が決まれば、下記式を満たすようなddNTPの存在比でPCR反応を行うことが望ましい。
0.95<{dNTP濃度／(dNTP濃度+ddNTP濃度)}a<0.96
（上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、ａは増幅反応時に伸長する塩基数（１≦ａ）である。）
【００４１】
ところで、本方法では、増幅反応を行う工程において伸長反応が停止する位置が未知であるため、多型部位等の検出対象の塩基配列領域を含まずプローブと相補的な配列を持たない増幅産物が精製される可能性がある。また長鎖になるほど伸長反応が止まる確率が高いため、短鎖の一本鎖核酸の存在比が高いこととなる。したがって、増幅反応を行う工程によって、より感度の高い増幅産物を得るためには、増幅反応に使用する一対のプライマーのうち少なくとも一方の標識されたプライマーを、検出対象の塩基配列領域の近傍にアニーリングするように設計することが望ましい。
【００４２】
より具体的には、検出対象をSNPとする場合には、当該SNPから５〜１２８塩基、好ましくは当該SNPから５〜６４塩基、より好ましくは当該SNPから５〜２０塩基離間した位置にプライマーの3’末端が位置するように標識されたプライマーを設計する。標識されたプライマーをこのように設計することによって、より感度の高い増幅産物を得ることができ、本発明に係る核酸検出方法の感度をより向上させることができる。
【００４３】
一方、本発明に係る核酸検出方法は、上述したように、一対のプライマーを用いて増幅反応するような形態に限定されず、例えば、以下のように一対のプライマーに加えて補助的プライマーを用いて増幅反応するような形態であっても適用することができる。補助的プライマーは、増幅産物中に複数の検出対象の塩基配列領域が存在する場合に、各塩基配列領域に近接してアニーリングするように設計される。具体的には、図３に示すように、鋳型となる核酸に検出対象として多型部位A及び多型部位Bが存在する場合、一対のプライマーとして図３中“プライマー”及び“ビオチン化プライマーA”を準備する。また、この場合、補助的プライマーとしてビオチン化プライマーBを準備する。このとき、ビオチン化プライマーBは、そのTm値がビオチン化プライマーAのTm値と比較して低くなるように設計される。
【００４４】
本方法では、このように設計した一対のプライマー及び補助的プライマーを含む反応溶液を調製し、上述したように増幅反応を行う。このとき、本方法では、増幅反応時においてアニーリングの温度設定をサイクルが進むたびに徐々に下げる、もしくは段階的に下げるように設定する。これによって、サイクルの初段階では一対のプライマー間の増幅反応が優先的に進行し、サイクルの後段階では補助的プライマーからの伸長反応も進行する事となる。このような設定で増幅反応を行うことによって、増幅産物中に複数の検出対象の塩基配列領域が存在する場合であっても、全ての検出対象の塩基配列領域を含む増幅産物を効率よく得ることができる。
【００４５】
一方、本発明に係る核酸検出方法は、上述したように、一対のプライマーを用いて増幅反応するような形態に限定されず、例えば、以下のように複数対のプライマーを用いて増幅反応するような形態であっても適用することができる。例えば、複数対のプライマーを用いて増幅反応する形態としては、図４に示すように、第１のプライマー対として“プライマーA”及び“ビオチン化プライマーA”、並びに第２のプライマー対として“プライマーB”及び“ビオチン化プライマーB”を準備する。このとき、第２のプライマー対は、そのTm値が第１のプライマー対のTm値よりも低くなるように設計される。
【００４６】
本方法では、このように設計した二対のプライマーを含む反応溶液を調製し、上述したように増幅反応を行う。このとき、本方法では、増幅反応時においてアニーリングの温度設定をサイクルが進むたびに徐々に下げる、もしくは段階的に下げるように設定する。これによって、サイクルの初段階では第１のプライマー対の間で増幅反応が優先的に進行し、サイクルの後段階では第２のプライマー対の間における増幅反応も進行する事となる。このような設定で増幅反応を行うことによって、非特異増幅反応を防ぐことができる。また、サイクルの後段階で温度を下げて増幅反応を起こせるので、増幅産物の量を増やすことが可能となる。また内側に設計された第２のプライマー間でも増幅されるということは、二対のプライマーで増幅されたことになるため、より配列特異的な増幅反応が起きていることになる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
１．目的
本発明の方法を用いることで、ゲノム等から安定して増幅産物を得ることを阻害することなく標識された一本鎖ＤＮＡを調整し、最終的には検出感度を上げる効果を証明する。
【００４８】
２．原理
本実施例は、ゲノムDNAを鋳型としてPCR（Polymerase Chain Reaction）法により遺伝子増幅を行い、その増幅産物と担体に固相化されたプローブをハイブリダイゼーションさせ、その有無により変異を検出するrSSO（reverse Sequence Specific Oligonucleotide）法を用いて測定を行った。
【００４９】
３．材料
本実施例では、鋳型DNAとしてアルデヒド脱水素酵素遺伝子を使用した。また、目的の変異部位としては、当該鋳型DNAアルデヒド脱水素酵素遺伝子（Accession No. BC002967）における１５５６番目の一塩基とした。本例では、この変異部位を含む64merのゲノム配列を挟むように一対のプライマーを設計した。具体的にはプライマーＡ（塩基配列；3'-AGC CCA GTC ACC CTT TGG TG -5'；配列番号1）とビオチン化プライマーＢ（塩基配列；3'-CTT TGA CTG TGA CAG TTT TC -5'；配列番号2）を使用した。
【００５０】
また、プローブとしては、上記変異部位を含むDNAとハイブリダイズできる核酸断片１（塩基配列；3'-AGG CAT ACA CTg AAG TGA AA-5'；配列番号3）及び核酸断片２（塩基配列；3'- AGG CAT ACA CTa AAG TGA AA -5'；配列番号4）を使用した。プローブを結合させる担体として、Luminexカルボキシルコートビーズ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を使用した。また、核酸合成酵素としては、Taq DNAポリメラーゼ（QIAGEN社製）を使用した。PCR法で用いる基質として、dNTP及びddNTP（Invitrogen社製）を使用した。蛍光物質としてStreptavidin Phycoerythrin (SA-PE)（Molecular Probes社製）を使用した。
【００５１】
４．測定システム
本実施例において、Luminexシステム（日立ソフトウェアエンジニアリング社）を用いて測定することにした。Luminexシステムでは、特殊なビーズを担体として用いるため、複数項目の同時測定が可能である。特殊なビーズとは、ポリスチレンから作られ、直径は約5.6μm、複数の蛍光物質を用いて染色され、それら蛍光物質の含有量を変えることで同じ溶液中に混在していても、その発色の違いから識別が可能である。それらのビーズにそれぞれ異なる抗体や核酸など生体高分子を結合させることで、それらの生体高分子と相互作用する生体高分子の存在の有無などを測定できる。つまり少量サンプルでも高感度に多項目の測定が可能であることを特徴とするシステムである。
【００５２】
５．方法
１）ゲノム配列の増幅
ゲノムDNAを鋳型として、プライマーＡとビオチン化プライマーＢを使用し増幅を行う。本実施例では、PCR増幅を行う際に基質としてdNTP及びddNTPを使用し、その含有率を変えることでddNTPを用いる意味を評価した。実際には、全体の基質量と比べddNTPが、0/10000、1/10000、2/10000、3/10000、4/10000、5/10000、6/10000、7/10000、8/10000、9/10000、10/10000、15/10000、20/10000で評価を行う。他の条件は全て同じにして、94℃30秒→65℃30秒→72℃30秒を１サイクルとする反応を３０サイクル行い、増幅反応を行った。
【００５３】
２）増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーション
得られた増幅産物とLuminexビーズに固相化されているプローブを、94℃2分→50℃30分で熱変性およびハイブリダイゼーションを行う。
【００５４】
３）Lminex測定装置による蛍光値測定
ハイブリダイゼーションしていない増幅産物やビオチン化プライマーＢを洗浄などで除去した後、SA-PEでハイブリダイゼーションしている増幅産物を蛍光標識し、Luminex測定装置でその蛍光量を測定する。
【００５５】
６．結果
図５は、本実施例で得られた結果をまとめたものであり、ddNTPを用いなかった時の蛍光値を１として棒グラフに示したものである。ddNTPの含有量を工夫することで、約４倍の蛍光値を得られることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係る核酸検出方法における増幅反応を行う工程を、模式的に説明する図である。
【図２】本発明に係る核酸検出方法におけるハイブリダイゼーションを行う工程を、模式的に説明する図である。
【図３】本発明に係る核酸検出方法における他の形態として補助的プライマーを使用して増幅反応を行う工程を、模式的に説明する図である。
【図４】本発明に係る核酸検出方法における他の形態として複数対のプライマーを使用して増幅反応を行う工程を、模式的に説明する図である。
【図５】実施例の結果として、ジデオキシヌクレオチドの含有率と相対蛍光値との関係を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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