(57)【要約】【課題】    新規な単離株に由来するＣ型肝炎(HCV)の診断に有用なポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。【解決手段】  HCVの新規な単離株J1またはJ7に由来するポリヌクレオチドのためのプローブおよびプライマー、ならびにJ1またはJ7に対する抗体を検出するためのポリペプチド。このプローブおよびプライマーは、本願開示のJ1またはJ7のポリヌクレオチド配列から得られる、少なくとも８個のヌクレオチドの連続する配列を含み、単離株HCV1のヌクレオチド配列とは相同ではない。上記ポリペプチドは、J1またはJ7に対する抗体によって結合され得る抗原決定基を含有する、少なくとも10個のアミノ酸の連続配列をふくみ、この連続配列は、本願開示のJ1またはJ7のアミノ酸配列から得られるが、HCV1配列の対応するアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載されるか、またはJ7 HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図１４から図１６において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして89、99、111、116、125、129、156、168、171、183、216、219、231、237、240、267、270、273、276、279、297、327、333、362、372、387、393、408、419、420、444、471、501、507、519、520、522、525、546、および552からなる群より選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＣ型肝炎ウイルス分離株、それ由来のポリペプチド、ポリヌ
クレオチドおよび抗体、ならびに、アッセイ(例えば、イムノアッセイ、核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイ)およびウイルスポリペプチドの製造における、
このようなポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非Ａ、非Ｂ型肝炎(NANBH)は、感染性疾患、あるいはウイルスによって起こる
と考えられている疾患のファミリーである。これは、公知の肝炎ウイルス、すな
わちＡ型肝炎ウイルス(HAV)、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)、およびデルタ肝炎ウイル
スによって起こる他の型のウイルス関連の肝臓疾患、ならびにサイトメガロウイ
ルス(CMV)あるいはエプスタインバーウイルス(EBV)によって起こる肝炎とは区別
し得る。NANBHは、最初は輸血された患者に検出された。ヒトからチンパンジー
への感染およびチンパンジーでの連続継代で、NANBHが伝染性の(単数あるいは複
数の)感染因子によることの確証が提供された。疫学的証拠によってNANBHには３
つの型が存在し得ることが示唆されている。すなわち；水媒介性の流行型：血液
あるいは針に関連する型；および散発的に発生する(コミュニティーが罹患する)
型である。しかし、最近までNANBHの原因である感染因子は同定されていなかっ
た。
【０００３】
NANBHの臨床診断および同定は、主に他のウイルスマーカーを除くことによっ
てなされてきた。推定されるNANBHの抗原および抗体を検出するのに用いられる
方法には、寒天ゲル拡散法、カウンターカレント免疫電気泳動法、免疫蛍光顕微
鏡法、免疫電子顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ、およびELISA法がある。しか
し、これらのアッセイはいずれも、NANBHの診断テストとして用いられるには十
分な感度、特異性、ならびに再現性を示さなかった。
【０００４】
最近まで、NANBH因子に関連する抗原抗体系の同定あるいは特異性は明瞭確実
にはされていなかった。NANBHは１つより多い感染因子によることは可能であっ
て、血清学的アッセイによってNANBHを有する患者の血清に何が検出されている
か明かではない。
【０００５】
かつては、NANBH因子であると考えられる多くのものが推測された。例えば、P
rince (1983)Ann.Rev.Microbiol. 37:217；FeinstoneおよびHoofnagle (1984) 
New Eng.J.Med.311:185；Overby (1985)
Curr.Heptol.5:49；Overby (1986) C
urr.Heptol.6:65；Overby (1981)
Curr.Heptol.7:35およびIwarson (1987) Br
itish Med.J.295:946を参照のこと。しかし、これらのいずれにも、NANBHの病
因物質であることを示す証拠はない。
【０００６】
1987年に、Houghtonらは、確実にNANBHに関連するウイルスをクローン化した
。例えば、欧州特許公開第318,216号；Houghtonら、Science 244:359 (1989)を
参照のこと。Houghtonらは、そこで、新しいウイルスクラスであるＣ型肝炎ウイ
ルス(HCV)の分離株のクローニングを開示しており、そのプロトタイプの分離株
を「HCV1」と命名している。HCVは、RNAゲノムを有するフラビ様ウイルスである
。Houghtonらは、診断試薬として有用なHCV配列からの組換えタンパク質の製造
、ならびに、診断用のハイブリダイゼーションアッセイおよび他のHCV分離株の
クローニングに有用なポリヌクレオチドの製造について記載している。
【０００７】
NANBH保持者およびNANBHに汚染した血液あるいは血液製剤のスクリーニングお
よび同定に感度のよい特異的な方法の必要性は重大である。輸血後肝炎(PTH)は
輸血患者の約10％に起こり、NANBHが、これらの最高90％を占める。しばしば慢
性の肝臓障害に進行する(25〜55％)。
【０００８】
患者の治療、ならびに血液および血液製剤による、あるいは個人間の密接な接
触によるNANBH感染の予防には、NANBH関連の核酸、抗原および抗体を検出する確
実な診断手段および予後診断手段が必要とされる。さらに、この疾患を予防およ
び／あるいは処置するための効果的なワクチンおよび免疫治療学的な治療剤の必
要性がある。
【０００９】
前述の必要性をみたす有用な少なくとも１つのHCV分離株の同定がなされたが
、別の分離株、特にゲノムが相違を有する分離株は新規の応用性を有することを
証明し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
新規なHCV分離株の核酸、抗原および抗体を検出する確実な診断手段および予
後診断手段を提供する。さらに、新規なHCV分離株による疾患を予防および／あ
るいは処置するための効果的なワクチンおよび免疫治療学的な治療剤を提供する
。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
NANBH保持者と考えられる日本人の血液提供者からのHCVの新規分離株を特徴付
けた。これらの分離株は、数種のウイルスドメインにおいて、プロトタイプの分
離株であるHCV1とはヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の異質性(heterogenei
ty)を示す。これらの異なる配列が特に診断アッセイおよびワクチンの開発に重
要であると考えられている。
【００１２】
１つの実施態様において、本発明は、グループJ1あるいはJ7から選択される分
離株と実質的に相同であるHCV分離株の少なくとも15bpのヌクレオチド配列を含
有するDNA分子を提供する。このヌクレオチド配列は、HCVの分離株HCV1のヌクレ
オチド配列とは異なる。
【００１３】
他の実施態様では、本発明は、HCV分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列をコー
ドする少なくとも15bpのヌクレオチド配列を含有するDNA分子を提供する。ここ
で、このJ1あるいはJ7のアミノ酸配列は、HCVの分離株HCV1のアミノ酸配列とは
異なる。
【００１４】
さらに本発明の他の実施態様では、グループJ1およびJ7から選択される分離株
と実質的に相同なHCV分離株のアミノ酸配列を含有する精製ポリペプチドを提供
する。ここで、このアミノ酸配列はHCV分離株のHCV1のポリペプチドの配列とは
異なる。
【００１５】
さらに本発明の他の実施態様では、HCVの分離株のJ1あるいはJ7のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドを提供する。ここで、このJ1あるいはJ7のアミノ酸配
列はHCV分離株のHCV1のアミノ酸配列とは異なり、このポリペプチドは固体支持
体に固定される。
【００１６】
さらに本発明の実施態様では、テスト試料中の抗HCV抗体の存在を検出する、
下記の(ａ)および(ｂ)の工程を包含するイムノアッセイを提供する：(ａ)グルー
プJ1およびJ7から選択される分離株と実質的に相同なHCV分離株のアミノ酸配列
であって、HCV分離株HCV1のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含有する免
疫原性ポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体を形成する条件下で、テスト試
料をインキュベートする工程；および(ｂ)この免疫原性ポリペプチドを含有する
抗原−抗体複合体を検出する工程。
【００１７】
本発明はさらに、HCVのエピトープに結合しない抗体を実質的には含有してい
ない、HCVのエピトープに結合する抗HCV抗体を含有する組成物を提供する：ここ
で、(ａ)HCVのエピトープは、グループJ1およびJ7から選択される分離株と実質
的に相同であるHCV分離株のアミノ酸配列を含有し、このアミノ酸配列は、HCV分
離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる；および(ｂ)このJ1あるいはJ7のアミノ酸配
列は、HCV1とは免疫学的に交差反応しない。
【００１８】
本発明のもう１つの実施態様では、下記の(ａ)および(ｂ)の工程を包含する、
テスト試料中のHCVポリペプチドの存在を検出するイムノアッセイを提供する：(
ａ)HCVのエピトープに結合する抗HCV抗体とともに、抗原−抗体複合体を形成す
る条件下でテスト試料をインキュベートする工程：ここで、(ｉ)このHCVのエピ
トープは、HCV分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列を含有する；(ii)このJ1ある
いはJ7のアミノ酸配列はHCV分離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる；および(iii)
このJ1あるいはJ7のアミノ酸配列は免疫学的にHCV1とは交差反応しない；および
(ｂ)抗HCV抗体を含有する抗原−抗体複合体を検出する工程。
【００１９】
さらに本発明によって、哺乳動物に、HCVの分離株HCV1のアミノ酸配列とは異
なる、HCVの分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを投与
し、そしてこの哺乳動物が抗HCV抗体を産生することを包含する、抗HCV抗体を生
産する方法を提供する。
【００２０】
本発明のもう１つの実施態様では、下記の(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の工程を包含
する、テスト試料中のHCVポリペプチドを検出する方法を提供する：(ａ)請求項
１に記載のDNA分子を含有するプローブを提供する工程；(ｂ)テスト試料中に存
在するHCVのポリヌクレオチドではない配列とプローブとのポリヌクレオチド二
重鎖の実質的な形成がなされない、プローブとその相補体間でのポリヌクレオチ
ドの二重鎖を形成させる条件下で、テスト試料とプローブとを接触させる工程；
および(ｃ)このプローブを含有するポリヌクレオチドの二重鎖を検出する工程。
【００２１】
さらに別の本発明の実施態様では、下記の(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の工程を包含
する、HCVアミノ酸配列を含有する組換えポリペプチドを生産する方法を提供す
る：(ａ)HCV分離株J1あるいはJ7のアミノ酸配列をコードするコード配列に作動
可能に結合された宿主細胞の制御配列を含有するDNA構築物によって形質転換さ
れた宿主細胞を提供する工程。ここで、このJ1あるいはJ7のアミノ酸配列はHCV
分離株HCV1のアミノ酸配列とは異なる；(ｂ)このコード配列が組換えポリペプチ
ドに転写および翻訳される条件下で宿主細胞を増殖させる工程；および(ｃ)組換
えポリペプチドを回収する工程。
【００２２】
本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、当分野の通常の技術を有す
る当業者には下記の記載において容易に明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の実施においては、特に断わりのない限り、当分野の技術範囲内である
、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、および免疫学の通常技術を使用する
。このような技術は、文献に詳細に記載されている。例えば、Maniatis, Fitsch
およびSambrookのMOLECULAR
CLONING, ALABORATORY MANUAL (1982): DNA CLONI
NG,VOLUMES IAND II (D.N Glover編集、1985)；OLIGONUCLEOTIDE
SYNTHESIS (M
.J.Gait編集、1984)；NUCLEICACID HYBRIDIZATION (B.D.HamesおよびS.J.Higgi
ns編集、1984)；TRANSCRIPTIONAND TRANSLATION (B.D.HamesおよびS.J.Higgins
編集、1984)；ANIMAL
CELL CULTURE(R.I.Freshney編集、1986); IMMOBILIZED C
ELLS AND ENZYMES(IRL Press, 1986)；B.PerbalのA
PRACTICAL GUIDETO MOLEC
ULAR CLONING(1984); METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)のシリ
ーズ；GENETRANSFER VECTORS
FOR MAMMALIANCELLS (J.H.MillerおよびM.P.Cal
os編集、1987, ColdSpring Harbor Laboratory)、Methods in
Enzymology Vol.
154およびVol.155 (それぞれWuおよびGrossman編集、Wu編集)、MayerおよびWalk
er編集(1987)のIMMUNOCHEMICALMETHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Acad
emic Press,London)、Scopes(1987)のPROTEIN
PURIFICATION:PRINCIPLES AND 
PRACTICE,Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.)、およびHANDBOOK OF EXPE
RIMENTALIMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編集、1986
)、を参照。前出および後出の、本明細書に記載の全ての特許、特許出願および
その他の出版物を、参考文献として援用する。
【００２４】
「Ｃ型肝炎ウイルス」は、以前は未知であった非Ａ非Ｂ肝炎(NANBH)の病因物
質のために、当分野の研究者が用意しておいた用語である。従って本明細書で用
いる「Ｃ型肝炎ウイルス」(HCV)とは、Houghtonらが記載したプロトタイプ分離
株HCV1クラスから、NANBVおよび／あるいはBB-NANBVと以前は呼ばれていたNANBH
の原因物質を指す。例えば、本明細書でその開示を参考文献として援用する、欧
州特許公開第318,216号、および1989年5月19日付の米国特許出願第355,002号(同
じ優先権を有する米国以外の特許出願が入手できる)を参照。HCV1のヌクレオチ
ド配列および推定アミノ酸配列は、図１４〜図１６に示した。本明細書では、用
語HCV、NANBV、およびBB-NANBVは互換可能に用いられる。この用語法の延長とし
て、以前の非Ａ非Ｂ肝炎(NANBH)と呼ばれていた、HCVによる疾患をＣ型肝炎と呼
ぶ。用語、NANBH(非Ａ非Ｂ肝炎)およびＣ型肝炎は、本明細書では互換可能に使
用し得る。本明細書で用いる用語「HCV」は、その病原株がNANBHを引き起こす、
ウイルス種、および弱毒化株あるいはそれらに由来する不完全な干渉粒子を指す
。
【００２５】
HCVは、Flavi様のウイルスである。フラビウイルス粒子の形態および形成は公
知で、Brinton(1986)の、THEVIRUSES: THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Fr
aenkel-ConratおよびWagnerシリーズ編集、SchlesingerおよびShelesinger巻編
集、PlenumPress), p.327〜374に記載されている。形態に関しては、一般にフ
ラビウイルスは、脂質二重層に包まれた中心ヌクレオカプシドを含んでいる。ビ
リオンは球状で、そして約40〜50nmの直径を有している。これらのコアは、約25
〜30nmの直径である。ビリオンエンベロープの外部表面に沿って、直径約２nmの
ノブを末端に有する、約５〜10nmの長さの放射状突起物がある。
【００２６】
HCVゲノムはRNAからなる。RNAを含んだウイルスは、比較的高い自然変異度を
有することが知られている。即ち、取り込まれるヌクレオチド一個当たり10-3か
ら10-4の確率であると報告されている。従って、HCVのクラスあるいは種の中に
、病原性あるいは非病原性の多くの株が存在する。
【００２７】
HCV分離株のゲノムは、HCV1と大きさが似たポリタンパク質をコードし、コー
ドされたポリタンパク質がHCV1と類似の疎水性および抗原性の特徴を有し、そし
て、HCV1で保存されているほぼ連続している(co-linear)ペプチド配列の存在す
る、約9,000ヌクレオチドから約12,000ヌクレオチドの単一のORFからなると考え
られている。加えて、このゲノムは、＋(ポジティブ)鎖RNAであると考えられて
いる。
【００２８】
HCV単離株は、HCV1ゲノム中のエピトープと免疫学的に交差反応するエピトー
プを包含する。他の既知のフラビウイルスと比較したときに、これらの内の少な
くともいくつかのエピトープはHCVに特有なものである。エピトープの特異性は
、抗HCV抗体との免疫学的反応性、および他のフラビウイルス種に対する抗体に
対する反応性の欠如により決定される。免疫学的反応性を調べる方法は、例えば
、ラジオイムノアッセイによる方法、ELISAアッセイによる方法、血球凝集反応
による方法が当分野で公知であり、そしてアッセイ用の適切な技法のいくつかの
実施例が、本明細書で提供される。
【００２９】
さらに、ヌクレオチドレベルでのHCV単離株とHCV1ゲノムとの総体的な相同性
は、恐らく約40％あるいはそれ以上であり、恐らく約60％あるいはそれ以上、そ
して約80％から約90％あるいはそれ以上であることがより可能性が高いと考えら
れている。加えて、多くの対応する完全に相同な、少なくとも約13ヌクレオチド
の連続する配列が存在する。新しい分離株からの配列とHCV1配列との間の対応は
、当分野で公知の技術により調べ得る。例えば、新しい分離株からのポリヌクレ
オチドの配列情報とHCV1配列の直接比較により調べ得る。あるいは、相同な領域
で安定な二重鎖を形成するような条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼー
ションし(例えば、S1消化に先立ち使用されるもの)、次いで一本鎖特異的なヌク
レアーゼ(一つあるいは複数)で消化し、次いで消化した断片のサイズ決定により
、相同性を調べ得る。
【００３０】
HCV株間の、あるいはHCV単離株間の進化的関係から、ポリペプチドレベルでの
相同性により、HCVと推定される株あるいは分離株は同定可能である。従って、
新しいHCV分離株はポリヌクレオチドレベルで、約40％より高い相同性が予期さ
れ、恐らくは約70％より高い相同性であり、約80％より高い相同性である可能性
が高い。アミノ酸配列の相同性を調べる方法は当分野での公知である。例えば、
アミノ酸配列を直接配列決定し、そして本明細書で提供される配列と比較し得る
。あるいは、HCVと予測されるゲノム物質のヌクレオチド配列を決定し、それに
コードされているアミノ酸配列を決定し、そして対応する領域を比較し得る。
【００３１】
HCV1のORFを図２９〜図５９に示した。HCV1のポリタンパク質の非構造ドメイ
ン、コアドメイン、およびエンベロープドメインが予測されている(図１２およ
び図１３)。「C」すなわちコアのポリペプチドは、HCV1の５'末端から345ヌクレ
オチドにコードされていると考えられている。HCV1の推測される「E」すなわち
エンベロープドメインは、約346番目のヌクレオチドから約1050番目のヌクレオ
チドにコードされていると考えられている。推測されるNS1すなわち非構造１ド
メインは、約1051番目のヌクレオチドから約1953番目のヌクレオチドにコードさ
れていると考えられている。残りのドメインに関しては、推測されるNS2は約195
4番目のヌクレオチドから約3018番目のヌクレオチドに、推測されるNS3は約3019
番目のヌクレオチドから約4950番目のヌクレオチドに、推測されるNS4は約4951
番目のヌクレオチドから約6297番目のヌクレオチドに、そして推測されるNS5は
ヌクレオチド6298から３'末端にコードされていると、各々考えられている。上
記の境界は、ORFの分析に基づく近似値である。本明細書の開示の観点から当業
者は、正確な境界を同定し得る。
【００３２】
「HCV/J1」あるいは「J1」、および、「HCV/J7」あるいは「J7」は、本明細書
に開示されたヌクレオチド配列により特徴付られる新しいHCVの分離株、および
それと実質的に相同的な；即ち、ヌクレオチドレベルで少なくとも約90％あるい
は約95％相同の、関連した分離株を指す。本明細書に開示されている配列は、日
本および他のアジアおよび／あるいは環太平洋諸国で大勢を占めるHCVのサブク
ラスを特徴付ると考えられている。別のJ1およびJ7分離株は、本明細書および欧
州特許公開第318,216号に開示された観点から得られ得る。特に、本明細書に開
示したJ1およびJ7のヌクレオチド配列、および図２９〜図５９中のHCV1配列は、
J1およびJ7あるいは別の分離株の別のドメインをクローニングするためのプライ
マーあるいはプローブとして使用し得る。
【００３３】
本明細書の指定した配列あるいは材料「からの」ヌクレオチド配列は、指定し
た配列あるいは材料、あるいはそれらの一部分の配列に、相同(即ち、同じ)ある
いは相補である、ヌクレオチド配列を指す。本明細書で提供されるJ1の配列は、
最小で約６ヌクレオチド、好ましくは約８ヌクレオチド、さらに好ましくは約１
５ヌクレオチド、そして最も好ましくは20ヌクレオチドあるいはそれ以上である
。最大長は、完全なウイルスゲノムである。
【００３４】
本発明の幾つかの局面では、ポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、HCV
ゲノム、あるいはJ1およびJ7に特有な配列に、相同であるか、あるいは相補的で
あることが好ましい。ある配列がゲノムに特有であるかどうかは、当業者に公知
の技術で同定し得る。例えば、その配列を、Genebankのようなデータバンク中の
配列と比較し、未感染の宿主中あるいは他の微生物中に存在しているかどうかを
確認し得る。さらにこの配列を、例えばHAV、HBV、およびHDVのような肝炎を引
き起こすことが知られているもの、およびフラビウイルスの他の種を包含する、
他のウイルス物質の既知の配列とも比較し得る。派生した配列が、他の配列と対
応するか、あるいは対応しないかは、適切なストリンジェンシー条件下でハイブ
リダイゼーションすることで同定し得る。核酸配列の相補性を調べるためのハイ
ブリダイゼーション技術は当分野では公知である。例えば、Maniatisら(1982)の
MOLECULARCLONING；A LABORATORY MANUAL
(Cold SpringHarbor Press, Cold S
pring Harbor,N.Y.)をさらに参照。加えて、ハイブリダイゼーションにより形
成された二重鎖ポリヌクレオチドのミスマッチは、たとえば、二重鎖ポリヌクレ
オチドの中の一本鎖部分を特異的に消化するS1のようなヌクレアーゼで消化する
ことを含む、公知の技術で同定し得る。典型的なDNA配列が派生し得る領域には
、これらに限定されないが、特異的エピトープをコードする領域、および非転写
領域および／あるいは非翻訳領域がある。
【００３５】
J1あるいはJ7のポリヌクレオチドは、示したヌクレオチド配列から直接取らな
くても良く、例えば、化学合成、あるいはDNA複製、あるいは逆転写、あるいは
転写、を含む任意の方法で生成し得る。加えて、指定された配列の領域に対応す
る領域の組み合わせは、意図した使用法と矛盾しないように、当分野で公知の方
法で改変し得る。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の標識物を一つあるいはそ
れ以上含み得る。
【００３６】
指定したポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの材料「からの」アミノ酸配
列は、指定したポリペプチドの配列、あるいはその一部分の配列に、相同(即ち
、同じ)である、アミノ酸配列を意味する。指定された核酸配列「からの」アミ
ノ酸配列は、その配列にコードされたポリペプチド、あるいはその一部分と同じ
アミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド中の、J1ある
いはJ7のアミノ酸配列は、その長さが、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましく
は少なくとも約10個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも15個のアミノ酸、
そして最も好ましくは少なくとも約20個のアミノ酸である。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要は
ない；ポリペプチドは、例えば、化学合成、あるいは組換え発現系による発現、
あるいはウイルスからの単離を含む任意の方法で生成し得る。ポリペプチドは、
アミノ酸アナログ、あるいは非天然アミノ酸を、一つあるいはそれ以上含み得る
。配列にアミノ酸アナログを挿入する方法は、当分野で公知である。さらにポリ
ペプチドは、当業者に公知の標識物を一つあるいはそれ以上含み得る。
【００３８】
本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、半合成
、あるいは合成、の起源のポリヌクレオチドであって、その起源あるいは操作の
ために；(１)それが天然で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチ
ドに結合されているもの；あるいは(２)天然には存在しないものを意図している
。
【００３９】
本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのポリマー型のヌ
クレオチドで、リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれか
をも指す。この用語は、分子の一次構造をのみ指す。従ってこの用語は二本鎖お
よび一本鎖のDNA、およびRNAを指す。さらに、以下に示す既知の種類の改変され
たポリヌクレオチドをも改変されない型のポリヌクレオチドと同様に含む。改変
には、例えば、当分野で公知の標識、メチル化、「caps」、アナログによる天然
ヌクレオチド一つあるいはそれ以上の置換、およびヌクレオチド内の改変が含ま
れる。ヌクレオチド内の改変には、例えば、非イオン性の結合による改変(例え
ば、メチルリン酸、リン酸トリエステル、フォスフォアミデート、カルバメート
、等)、およびイオン結合による改変(例えば、フォスフォロチオエート、フォス
フォロジチオエート、等)、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、
抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン、等を含む)のようなペンダント部分を
含んだ改変、インターカレーション剤(例えば、アクリジン、ソラレン、等)によ
る改変、キレート剤(例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化性金属、等)を
含んだ改変、アルキル化剤を含んだ改変、改変された結合による改変(例えば、
αアノメリック核酸、等)、を含む。
【００４０】
「精製されたポリヌクレオチド」は、他の成分を実質的に含まない、特定のポ
リヌクレオチドを含む組成物を指し、そのような組成物は、典型的には少なくと
も約70％の特定のポリヌクレオチドを含み、さらに典型的には少なくとも約80％
、90％あるいはさらに95％から99％の特定のポリヌクレオチドを含む。
【００４１】
「精製されたポリペプチド」は、他の成分を実質的に含まない、特定のポリペ
プチドを含む組成物を指し、この組成物は、典型的には少なくとも約70％の特定
のポリヌクレオチドを含み、さらに典型的には少なくとも約80％、90％あるいは
さらに95％から99％の特定のポリヌクレオチドからなる。
【００４２】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」
、および他のこの様な用語は、単一細胞として培養された、組換えベクターある
いは他の転移DNA用の受容細胞として用いられ得るか、あるいは用いられた微生
物あるいは高等真核細胞株を指し、そして形質転換された元の細胞の子孫を包含
する。一個の親細胞の子孫は、自然の変異、偶然の変異、あるいは意図的な変異
等の理由から、形態、あるいは、ゲノム相補性あるいは総DNA相補性において必
ずしも完全に親細胞と同じである必要はないことは理解される。
【００４３】
「レプリコン」は、例えば、プラスミド、クロモソーム、ウイルス、コスミド
、等であり、細胞内でポリヌクレオチドの複製を行う自律的単位として働く；即
ち、自身の制御下で複製する能力がある、任意の遺伝子エレメントである。
【００４４】
「クローニングベクター」は、選択された宿主細胞を形質転換し得るレプリコ
ンであり、そして付加されたセグメントの複製、および／あるいは発現が引き起
こされるように、他のポリヌクレオチドセグメントが付加されている。典型的な
クローニングベクターには、プラスミド、ウイルス(例えば、バクテリオファー
ジベクター)、およびコスミドが含まれる。
【００４５】
「組み込み用(integrating)ベクター」は、選択された宿主細胞中でレプリコ
ンとしては働かないが、宿主を安定に形質転換するために、選択された宿主中の
レプリコン(典型的には、クロモソーム)に駐留物を組み込む(integrate)能力を
有するベクターである。
【００４６】
「発現ベクター」は、選択された宿主細胞を形質転換し得る構築物で、選択さ
れた宿主中で異種のコード配列を発現させる。発現ベクターは、クローニングベ
クターあるいは組み込み用ベクターの何れでもよい。
【００４７】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、mRNAに転写され
る、および／あるいはポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列である
。コード配列の境界は、５'-末端の翻訳開始コドンおよび３'-末端の翻訳停止コ
ドンによって決定される。コード配列は、mRNA、cDNA、および組換えポリヌクレ
オチド配列を含み得るが、これらに限定はされない。
【００４８】
「制御配列」は、これらがライゲーションされているコード配列を発現させる
のに必要なポリヌクレオチドの調節配列を指す。このような制御配列の特徴は、
宿主生物によって異なる。原核細胞では、制御配列は一般にプロモーター、リポ
ソーム結合部位、および転写終結信号を含む。真核細胞では一般的に、制御配列
はプロモーター、転写終結信号、および時としてエンハンサーを含む。用語「制
御配列」は、発現のためにその存在が必要な全ての構成要素を少なくとも含んで
いることを意図し、そして、別の有用な構成要素も含み得る。
【００４９】
「作動可能に結合された」は、上述の構成要素が意図された様式で機能し得る
ような関係の、近傍にあることを指す。コード配列と「作動可能に結合された」
制御配列は、制御配列と適合した条件下でコード配列の発現がなされるような様
式でつながれている。
【００５０】
「オープンリーディングフレーム」あるいはORFは、ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドの領域である；この領域は、コード配列の一部分、あるいは
コード配列の全体であり得る。
【００５１】
「免疫学的に交差反応性である」は、同じ抗体が結合する、二つあるいはそれ
以上のエピトープ、あるはポリペプチドを指す。交差反応性は、競合アッセイの
ような多くのイムノアッセイ法の何れかにより同定され得る。
【００５２】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、ポリペプチド、あるいは、少
なくとも一つのエピトープを含むポリペプチドの群を指す。「抗原結合部位」は
、(単数あるいは複数の)抗体分子の可変領域の折り畳みで形成されて、抗原のエ
ピトープの特性に相補的な内部表面形および荷電分布を有する三次元的な結合部
位を形成し、これが特異的な結合を可能にして、抗原抗体複合体を形成する。抗
原結合部位は、重鎖および／あるいは軽鎖ドメイン(各々、VHおよびVL)から形成
され得、次いで抗原結合に寄与する超可変ループを形成する。用語「抗体」は、
キメラ抗体、改変抗体、一価抗体、Fabタンパク質、および単一ドメイン抗体を
包含するが、これらに制限はされない。多くの場合、抗体の抗原に対する結合現
象は、他のリガンド／抗リガンド結合と同等である。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「単一ドメイン抗体」(dAb)は、HLドメイ
ンを含む抗体で、指定された抗原と特異的に結合する。dAbは、VLドメインを含
まないが、抗体に存在することが知られている他の抗原結合ドメイン、例えばκ
およびλドメインを含み得る。dAbを調製する方法は当分野で公知である。例え
ば、Wardら、Nature341:544(1989)を参照。
【００５４】
抗体はまた、VHおよびVLドメイン、および他の既知の抗原結合ドメインからな
り得る。これらのタイプの抗体の例、およびこれらの調製方法は当分野で公知で
あり(例えば、本明細書では参考文献として援用する、米国特許第4,816,467号を
参照)、そして以下のものが含まれる。例えば、「脊椎動物抗体」は、四量体あ
るいはその凝集体である、抗体を指し、通常は「Y」型の形態に凝集している、
鎖間に共有結合を有しても有さなくともよい、軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物
抗体では、鎖のアミノ酸配列は、脊椎動物中で産生された抗体に見いだされる配
列と、insituあるいはin vitro(例えば、ハイブリドーマ中で)に関わらず、相
同である。脊椎動物抗体は、例えば、精製されたポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体を含み、これらの調製方法は以下に記載されている。
【００５５】
「ハイブリッド抗体」は、各鎖が各々、哺乳動物抗体の別々の鎖に対して相同
であり、この四量体あるいは凝集体により２つの異なる抗原が沈降するように、
これらを新たな集合物にしたものである。ハイブリッド抗体では、一対の軽鎖お
よび重鎖が、第一の抗原に対して作成された抗体に見いだされるそれと相同であ
り、一方、第二の対の鎖が、第二の抗原に対して作成された抗体に見いだされる
それと相同である。この結果、「二価」の特性がもたらされる、即ち、二つの抗
原に同時に結合することができる。このようなハイブリッドは、以下に示すよう
に、キメラ鎖を用いても形成し得る。
【００５６】
「キメラ抗体」は、重鎖および／あるいは軽鎖が融合タンパク質である抗体を
指す。典型的には、鎖のアミノ酸配列の一部分は、特定の種あるいは特定のクラ
スから由来する抗体の対応する配列に相同で、一方、鎖の残りのセグメントは、
他の種および／クラスから由来する配列に相同である。通常、軽鎖および重鎖の
両方の可変領域は、一種類の脊椎動物から由来する可変領域あるいは抗体によく
似ており、一方、定常部分は、他の種の脊椎動物から由来した抗体の配列に相同
である。しかしながら、この用語の定義は、この特定の例に限定されない。材料
が異なるクラスあるいは異なる種に由来するかどうかにかかわらず、また融点が
可変／定常境界にあるかどうかにかかわらず、重鎖あるいは軽鎖のいずれかある
いは両方が、異なる抗体の配列に似た配列の組み合わせで構成される、任意の抗
体も含まれる。従って、定常あるいは可変領域のいずれも既知の抗体配列に似て
いない抗体を産生することも可能である。従って例えば、可変領域が特定の抗原
に対して高い特異的親和性を有する抗体、あるいは、定常領域が増大した補体結
合作用を示す抗体を構築すること、あるいは、特定の定常領域が有する特性に別
の改善を加えることが可能である。
【００５７】
他の例は「改変抗体」である。これは、脊椎動物の抗体中の天然のアミノ酸配
列が変化した抗体を指す。組換えDNA法を用いて、所望の特性が得られるように
抗体を再設計し得る。可能なバリエーションは多く、一つあるいはそれ以上のア
ミノ酸の変化から、例えば定常領域のような、領域の完全な再設計までを含む。
定常領域の変化は一般に、例えば、補体結合、細胞膜との相互作用、および他の
エフェクター機能、の変化のような所望の細胞性プロセスの特性を得るために行
われる。可変領域の変化は、抗原結合特性を変化させるために行い得る。抗体は
また、特定の細胞あるいは組織の部位への、分子あるいは物質の特異的送達を補
助するように加工し得る。所望の改変は、例えば、組換え技術、部位特異的変異
誘発、等の分子生物学の公知の技術により行い得る。
【００５８】
さらに別の例は、「一価抗体」である。これは、第二の重鎖のFc(即ち、幹)領
域に結合した、重鎖／軽鎖二量体からなる、凝集体である。このタイプの抗体は
、抗原変質を免れている。例えば、Glennieら、Nature 295:712(1982)、を参照
。抗体の定義に含まれるものにはさらに、抗体の「Fab」断片がある。「Fab」領
域は、重鎖および軽鎖の分枝部分を含む配列と、概ね同じか、あるいは類似の重
鎖および軽鎖の同部分を指し、そして、特定の抗原に対し免疫学的結合性を示す
が、エフェクターであるFc部分を欠いている。「Fab」は、一つの重鎖および一
つの軽鎖の凝集体(通常、Fab'として知られている)、および2Hおよび2Lの鎖を含
んだ四量体(F(ab)2と呼ぶ)を含み、指定した抗原あるいは抗原ファミリーと選択
的に反応し得る。Fab抗体は、上述の抗体と同じようにサブセットに、即ち、「
脊椎動物Fab」、「ハイブリッドFab」、「キメラFab」、および「改変Fab」、に
分類し得る。抗体のFab断片を製造する方法は、当分野で公知であり、例えば、
タンパク質分解、および組換え技術による合成が含まれる。
【００５９】
「エピトープ」は、抗体結合部位を指し、通常はポリペプチドにより定義され
るが、非アミノ酸のハプテンでも有り得る。エピトープは、エピトープに特有な
空間配置の３個のアミノ酸からなり得、一般にはエピトープは少なくとも５個の
このようなアミノ酸からなり、そしてさらに通常は、少なくとも８〜10個のこの
ようなアミノ酸からなる。
【００６０】
「抗原抗体複合体」は、抗原上のエピトープに特異的に結合した抗体により形
成された複合体を指す。
【００６１】
「免疫原性ポリペプチド」は、単独で、あるいはキャリアーと結合して、アジ
ュバントと共に、あるいはアジュバントなしで、哺乳類動物中に細胞性および／
あるいは液性の免疫応答を引き起こすポリペプチドを指す。
【００６２】
「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指し、分子の長さを特定しない。
従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義
に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、
等のポリペプチドの発現後の修飾を特定も除外もしない。定義に含まれるのは、
例えば、一つあるいはそれ以上のアミノ酸のアナログを含んだポリペプチド(例
えば、非天然のアミノ酸、等を含む)、結合の変化したポリペプチド、および、
天然および非天然の両方の、他の当分野で公知の改変である。
【００６３】
本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、宿主細胞に外来のポリヌ
クレオチドを挿入することを指し、挿入に用いた方法には無関係であり、例えば
、直接の取り込み、トランスダクション、f-接合、あるいはエレクトロポーレー
ションである。外来のポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドのように、組み
込まれないベクターとして保持され得、あるいは宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００６４】
「形質転換された」宿主細胞は、形質転換された当の細胞、および元々は外来
であったポリヌクレオチドを保持しているその子孫の両方を指す。
【００６５】
本明細書の用語「処置」は、予防および／あるいは治療を指す。
【００６６】
「個体」は、脊椎動物、特に哺乳類種のものを指し、そして、家畜、競技用動
物、およびヒトを含む霊長類を含むがこれらに限定されない。
【００６７】
「センス鎖」は、それからのmRNA転写体に相同な二本鎖DNAの一方の鎖を指す
。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列に相補的な配列を含む。
【００６８】
「抗体含有身体成分」は、目的の抗体の原料である、個体の身体の構成物を指
す。抗体含有体成分は当分野で公知であり、全血およびその構成成分、血漿、血
清、脊髄液、リンパ液、呼吸管、消化管、および尿生殖管の外部切片、涙、唾液
、乳汁、白血球、およびミエローマ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
「精製されたHCV」分離株は、ウイルスが通常付随している細胞構成物から、
および感染した組織中に存在し得る他のタイプのウイルスから、単離されたHCV
粒子の調製物を指す。ウイルスを単離する技術は当業者に公知であり、例えば、
遠心分離およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。
【００７０】
HCV「粒子」は、全ビリオン、およびビリオン形成の中間体の粒子である。HCV
粒子は、一般に、HCV核酸に付随する一つあるいはそれ以上のHCVタンパク質を有
する。
【００７１】
「プローブ」は、プローブの少なくとも一つの領域と標的の領域との相補性に
より、標的ポリヌクレオチド中の配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレ
オチドを指す。
【００７２】
「生物学的試料」は、個体から単離された組織あるいは液体の試料を指し、例
えば、全血およびその構成成部、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸管
、消化管、および尿生殖管の外部切片、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官
、およびinvitroの細胞培養構成物の試料(細胞培養培地中で生育した細胞から
得られる馴化培地、ウイルス感染細胞と推測される細胞、組換え細胞、および細
胞構成物を含むが、これらに限定されない)もまた含まれるが、これらに限定さ
れない。
【００７３】
本発明は、HCVの新たに発見された分離株、J1およびJ7、これらのヌクレオチ
ド配列、タンパク配列、および得られるポリヌクレオチド、ポリペプチド、およ
びこれらに由来する抗体の単離および特徴付に関する。分離株J1およびJ7は、ヌ
クレオチド配列およびアミノ酸配列が新規であり、そしてこれらの配列は、日本
および他のアジア諸国からのHCV単離株に特徴的であると考えられている。
【００７４】
HCV/J1およびHCV/J7に由来するヌクレオチド配列は、試料中のウイルスの存在
を診断するための、および、このウイルスの天然変異株を単離するためのプロー
ブとして有用である。さらにこれらのヌクレオチド配列は、J1およびJ7のゲノム
の中にコードされたHCV抗原のポリペプチド配列を得ることも可能とし、そして
、標準物質として、あるいは、診断テストおよび／あるいはワクチンの成分とし
て、有用なポリペプチドの製造を可能とする。さらにこれらのポリペプチド配列
に含まれるHCVのエピトープに対するポリクローナルおよびモノクローナルの両
方の抗体は、診断テスト用に、治療剤として、抗ウイルス剤のスクリーニング用
に、およびNANBHウイルスの単離用に、有用である。加えて、本明細書に開示さ
れた配列に由来するプローブを用いると、J1およびJ7のゲノムの他の部分の単離
および配列決定が可能となり、従って、NANBHの、予防的および治療的の両方の
、診断および／あるいは処置に有用な、別のプローブおよびポリペプチドが得ら
れる。
【００７５】
HCV/J1およびHCV/J7のヌクレオチド配列が得られると、HCV感染によるNANBHの
診断に有用な、そして、供血者および供与された血液および血液製剤の感染をス
クリーニングするのに有用な、ポリヌクレオチドプローブおよびポリペプチドの
構築が可能となる。例えば、この配列から８〜10個のヌクレオチドあるいはもっ
と長いDNAオリゴマーを合成することが可能である。これは例えば、ウイルスを
有すると予測される患者の血清中のHCV RNAの存在を検出するための、あるいは
、ウイルスの存在に関して供与された血液をスクリーニングするためのハイブリ
ダイゼーションプローブとして有用である。このHCV/J1およびHCV/J7配列はまた
、NANBHの期間に生成された抗体の存在を診断する試薬として有用な、HCV特異的
ポリペプチドの設計および製造を可能とする。HCV/J1およびHCV/J7の配列に由来
する精製されたポリペプチドに対する抗体はまた、感染した個体および血液中の
ウイルス抗原を検出するために使用し得る。
【００７６】
これらHCV/J1およびHCV/J7の配列に関する知識はさらに、HCVに対するワクチ
ンとして使用し得、また抗体の産生にも使用し得るポリペプチドの設計および製
造を可能とする。そして、それは病気に対する防御としておよび／あるいはHCV
感染した個体の治療に使用し得る。さらに、開示されたHCV/J1およびHCV/J7の配
列は、HCVゲノムのさらなる特徴付けを可能とする。これらの配列およびHCVゲノ
ムに由来するポリヌクレオチドプローブは、別のウイルスcDNA配列をcDNAライブ
ラリーからスクリーニングするために使用し得、次いでこれを別の重複配列を得
るために使用し得る。例えば、欧州特許公開第318,216号を参照。
【００７７】
HCV/J1およびHCV/J7のポリヌクレオチド配列、それらに由来するポリペプチド
、およびこれらのポリペプチドに対する抗体は、(単数あるいは複数の)BB-NANBV
物質の単離および同定に有用である。例えば、HCV/J1配列に由来するポリペプチ
ドに含まれるHCVのエピトープに対する抗体は、アフィニティークロマトグラフ
ィーに基づくウイルスの単離法で使用し得る。あるいは、この抗体を、他の方法
によって単離されたウイルス粒子の同定に使用し得る。次に、単離されたウイル
ス粒子内のウイルス抗原およびゲノム物質は、さらに特徴付けられ得る。
【００７８】
HCV/J1およびHCV/J7のゲノムのさらなる配列決定から、および、HCV/J1および
HCV/J7の抗原のさらなる特徴付けおよびゲノムの特徴付けから得られる情報によ
り、別のプローブ、およびポリペプチド、および抗体の設計および合成が可能と
なる。この抗体は、HCVにより引き起こされるNANBHの予防および治療のための診
断、および、感染血液および血液関連製剤のスクリーニングのために使用し得る
。
【００７９】
HCV/J1およびHCV/J7のcDNA配列が得られると、いずれかの鎖にコードされたポ
リペプチドの抗原的に活性な領域をコードする発現ベクターの構築が可能となる
。これらの抗原的に活性な領域は、コートあるいはエンベロープ抗原、あるいは
コア抗原、あるいは、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質、(単数あるいは
複数の)ポリヌクレオチドポリメラーゼ、およびウイルス粒子の複製および／あ
るいは組立に必要とされる他のウイルスタンパク質を含む、非構造タンパク質の
抗原に由来し得る。所望のポリペプチドをコードする断片は、通常の制限酵素消
化あるいは合成的方法を用いてｃDNAクローンから誘導し、そして、例えばβ-ガ
ラクトシダーゼあるいはスーパーオキサイドジムスターゼ(SOD)のような融合配
列の部分を含み得る、ベクターにつなぎ入れる。SODの融合配列を含むポリペプ
チドの製造に有用な方法およびベクターは、欧州特許公開第196,056号に記載さ
れている。SODおよびHCVポリペプチドの融合ポリペプチドをコードするベクター
は、欧州特許公開第318,216号に記載されている。いずれかのセンス鎖の、オー
プンリーディングフレームを含んだHCV cDNAのいかなる所望の部分でも、成熟タ
ンパク質あるいは融合タンパク質のような組換えポリペプチドとして得ることが
できる。あるいは、cDNA中にコードされたポリペプチドは、化学合成により提供
し得る。
【００８０】
融合あるいは成熟の形態を問わず、所望のポリペプチドをコードするDNAは、
任意の都合のよい宿主に適した発現ベクターにつなぎ入れ得る。組換えポリペプ
チドの形成には、現在、真核細胞および原核細胞宿主系の両方が使用されており
、そしてより一般的な制御システムおよび宿主細胞のいくつかに関する要約を以
下に記した。このような宿主細胞中で産生されたポリペプチドは、次に溶解され
た細胞から、あるいは培養液から単離され、そして目的の使用法が必要とする状
態まで精製される。精製は、例えば分別抽出、塩分画、イオン交換樹脂でのクロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離等の分野で公知
の方法で行い得る。タンパク質の精製のための種々の方法に関しては、例えば、
Methods inEnzymologyを参照。
【００８１】
このような組換えあるいは合成のHCVポリペプチドは、診断試薬として、ある
いはワクチン中に処方し得る中和抗体を生成させる物質として、使用し得る。こ
れらのポリペプチドに対する抗体はまた、診断試薬、あるいは受動免疫療法剤と
して使用し得る。加えて、これらのポリペプチドに対する抗体は、HCV粒子の単
離および同定に有用である。
【００８２】
HCV抗原はまた、HCVのビリオンから単離し得る。ビリオンは、組織培養中のHC
V感染細胞中、あるいは感染した宿主中で生育し得る。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、実質的に完全なウイルス領域を含むが、多くの適用
で必要とされるのはウイルスの抗原領域あるいは免疫原性領域を含むポリペプチ
ドである。ポリペプチドの抗原的な領域は一般に相対的に小さく、典型的には、
長さが８〜10個のアミノ酸、あるいはそれ以下である。僅か５個のアミノ酸の断
片でも、抗原的領域を特徴付け得る。このような断片は、HCV/J1あるいはHCV/J7
(HCV/J&)のエピトープ領域に対応し得る。従ってHCV/J1およびHCV/J7のcDNAを元
として使用して、HCV/J1およびHCV/J7ポリペプチドの短い断片をコードするDNA
を、融合タンパク質、あるいは分離したポリペプチドとして、組換え技術で発現
させ得る。加えて、短いアミノ酸配列は、化学合成により簡便に得られ得る。
【００８４】
合成されたポリペプチドが、正しいエピトープを提供するべく正しく配置され
てはいるが免疫原としては小さ過ぎる場合には、このポリペプチドを適切なキャ
リアーと結合し得る。このような結合を得るための多くの方法は当分野で公知で
あり、PierceCompany,
Rockford,Illinoisから市販されている、N-スクシンイ
ミジル-3-(2-ピリジル-チオ)プロピオネート(SPDP)およびスクシンイミジル4-(N
-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)を用いたジスル
フィド結合の形成が含まれる(ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システ
イン残基の付加によりスルフヒドリル基が提供される)。これらの試薬は、自身
と一つのタンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合を生
成し、そして、リジンのε-アミノ基、あるいは他方のタンパク質の他のフリー
のアミノ基を介して、アミド結合を生成する。種々のこのようなジスルフィド／
アミノ形成試薬は公知である。例えば、Immun.Rev.(1982)
62:185を参照。他の
二価のカップリング試薬は、ジスルフィド結合でなくチオエーテルを形成する。
これらのチオエーテル形成試薬の多くは市販されており、そして、6-マレイミド
カプロン酸、2-ブロモ酢酸、2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘ
キサン-1-カルボン酸等の反応性エステルが含まれる。カルボキシル基は、スク
シンイミド、あるいは1-ヒドロキシル-2-ニトロ-4-スルフォン酸ナトリウム塩と
組み合わせることにより活性化し得る。抗原を結合する他の方法は、欧州特許公
開第259,149号(本明細書で参考文献として援用する)に記載されたロタウイルス
／「結合ペプチド」システムを採用している。以上のリストは完全なものではな
く、名を挙げた化合物を改変したものも使用し得るのは明白である。
【００８５】
それ自身は宿主に有害な抗体の産生を誘起しない、任意のキャリアーが使用し
得る。典型的な適切なキャリアーは大きく、ゆっくり代謝される巨大分子である
。その例には、タンパク質；ラテックスに加工されたセファロース、アガロース
セルロース、セルロースビーズ等のような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジ
ン等のような、ポリマー性のアミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性なウ
イルス粒子がある。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホール
リンペットヘモシアニン、イムノグロブリン分子、サイログロブリン、オバアル
ブミン、破傷風トキソイド、および当業者に良く知られた他のタンパク質である
。
【００８６】
完全長のウイルスタンパク質に加えて、少なくとも一つのウイルスエピトープ
をコードする、先端切断したHCVアミノ酸配列を含むポリペプチドも、免疫学的
試薬として有用である。例えば、このような先端切断した配列を含むポリペプチ
ドは、イムノアッセイの試薬として使用し得る。これらのポリペプチドはまた、
抗血清の製造あるいはワクチン用の組成物中の、抗原サブユニットの候補でもあ
る。これらの先端切断した配列は、天然のウイルスタンパク質に種々の公知の処
理を行うことで製造し得るが、一般に、HCV配列を含む、合成あるいは組換えポ
リペプチドを作成するのが好ましい。これらの先端切断したHCV配列を含むポリ
ペプチドは、HCV配列からのみ(隣接したあるいは隣接しない、一つのあるいはそ
れ以上のエピトープ)作成し得、あるいはHCV配列および異種の配列を融合タンパ
ク質の形で作成し得る。有用な異種配列には、組換え宿主からの分泌を促す配列
、(単数あるいは複数の)HCVエピトープの免疫学的反応性を増強する配列、ある
いはポリペプチドがイムノアッセイ支持体あるいはワクチンキャリアーヘカップ
リングするのを促進する配列が含まれる。例えば、欧州特許公開第116,201号；
米国特許第4,722,840号；欧州特許公開第259,149号；米国特許第4,629,783号(本
明細書では開示内容を参考文献として援用する)を参照。
【００８７】
先端切断されたHCVを含むポリペプチドの大きさは広く変化し得、最小の大き
さはHCVエピトープを提供するのに充分な大きさの配列であるが最大の大きさは
特に重要ではない。幾つかの例では、最大の大きさは一般に、所望するHCVのエ
ピトープ、および、もし存在するならば、異種の配列の(単数あるいは複数の)機
能を提供するために必要とされるよりも実質的に大きくはない。典型的には、先
端切断されたHCVアミノ酸配列は、約５個から100個のアミノ酸の範囲の長さであ
る。しかし、さらに典型的には、HCV配列は最大約50個のアミノ酸の長さで、好
適には最大約30個のアミノ酸である。一般に、少なくとも約10、12あるいは15個
のアミノ酸、最大約20個あるいは25個のアミノ酸までのHCV配列を選択するのが
望ましい。
【００８８】
エピトープを含む先端切断したHCVアミノ酸配列は、多くの方法で同定し得る
。例えば、全長のウイルスタンパク質配列は、全体で全長のタンパク質配列を包
含する一連の短いペプチドを調製することによりスクリーニングし得る。例えば
、100-merのポリペプチドから始めて、目的の反応性を示す(単数あるいは複数の
)エピトープの存在に関して各ポリペプチドをテストし、そして次に、確認され
た100-merからより小さい、重複する断片をテストして目的のエピトープの位置
を決めることはルーチンである。イムノアッセイでこのようなペプチドをスクリ
ーニングすることは、当分野の技術範囲内である。タンパク質配列のコンピュー
ター分析を行って、潜在的なエピトープを同定し、そして次に同定された領域を
含むオリゴヌクレオチドをスクリーニングのために調製することも公知である。
抗原性に関するこのようなコンピューター分析が実際に存在するエピトープを常
に同定するわけではなく、タンパク質のある領域をエピトープを含んだ領域とし
て誤って同定することもあり得ることは、当業者も認めている。
【００８９】
HCVの推定されるポリタンパク質とフラビウイルスとの関係の観察によって、H
CVの「非構造」(NS)タンパク質の推定ドメインの予測が可能となった。推定され
るフラビウイルスの前駆体ポリタンパク質中のNSタンパク質の個々の位置は、か
なり良く知られている。さらに、これらはまた、ポリタンパク質の観察された疎
水性プロフィールの総体的変動とも一致する。フラビウイルスのNS5は、ビリオ
ンのポリメラーゼをコードし、そしてNS1は、動物に対して有効なワクチンであ
ることが示された補体結合抗原に相当することが確認された。最近、フラビウイ
ルスのプロテアーゼ機能は、NS3中に在ることが示された。HCVとフラビウイルス
との観察された類似性のため、HCVポリタンパク質中の対応するタンパク質ドメ
インおよび機能の概ねの位置に関する推論が可能である。図２８は、HCVポリタ
ンパク質の推定ドメインの概要を示している。例えば、細菌、酵母、昆虫、およ
び脊椎動物細胞を含む種々の組換え宿主細胞中でのこれらのドメインを含んだポ
リペプチドの発現は、診断、検出、およびワクチンに使用し得る重要な免疫学的
試薬を提供する。
【００９０】
本明細書に記載されたHCV分離株およびフラビウイルスの推定されたポリタン
パク質の非構造タンパク質領域は、全般的に類似であるように見えるが、N-末端
に向かう推定構造領域の間では類似性が低い。この領域では、配列の相違が大き
く、そして加えて、二つの領域の疎水性プロフィールはさらに類似性が低い。こ
の「相違」は、HCV中の推定NS1ドメインのN-末端領域に始まり、推定N-末端まで
延びている。しかしながら、推定されるヌクレオカプシド(N-末端塩基性ドメイ
ン)およびＥ(一般的に疎水性)ドメインのHCVポリタンパク質中でのおおまかな位
置を予測することは、可能である。これらの予測から、有用な免疫学的試薬に対
応し得るHCVポリタンパク質の大まかな領域を同定することは可能で有り得る。
例えば、フラビウイルスのＥおよびNS1タンパク質は、防御的ワクチンとして有
効性を有することが知られている。このような領域、および、例えば推定NS3、C
、およびNS5等の中のHCV1で抗原性であることを示された幾つかの領域もまた、
診断試薬を提供するに違いない。
【００９１】
HCV配列の免疫原性はまた、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原あるいはロタウイルスV
P6抗原のような粒子形成タンパク質と、融合あるいは組み合わされた配列を調製
することで増強され得る。HCVエピトープが粒子形成タンパク質をコードする配
列に直接結合された構築物は、HCVエピトープに関して抗原性であるハイブリッ
ドを産生する。加えて、調製されたベクターの全てはHBVに特異的なエピトープ
を含み、例えば、プレ-Sペプチドのような様々な程度の免疫原性を有する。従っ
て、HCV配列を含む粒子形成タンパク質から構築された粒子は、HCVおよび粒子形
成タンパク質に関して、免疫原性である。例えば、米国特許第4,722,840号；欧
州特許公開第175,261号；欧州特許公開第259,149号；Michelleら(1984)Int.Sym
posium on ViralHepatitis；を参照。
【００９２】
HCV/J1あるいはHCV/J1に由来する一つあるいはそれ以上の免疫原性ポリペプチ
ドから、ワクチンが調製し得る。HCVとフラビウイルスとの間の観察された相同
性は、ワクチンとして最も効果的と思われるポリペプチド、および、これらがコ
ードされているゲノムの領域に関する情報を提供する。フラビウイルスのゲノム
の一般的構造は、THEVIRUSES: THE
TOGAVIRIDAE ANDFLAVIVIRIDAE (シリーズ
編集Fraenkel-ConratおよびWagner、巻編集SchlesingerおよびSchlesinger,Ple
num Press)中でRiceら(1986)により、論議されている。フラビウイルスゲノムRN
Aは、唯一のウイルス特異的mRNA種であると考えられており、これは３つの、即
ちＣ、ＭおよびＥのウイルス構造タンパク質、および２つの大きな非構造タンパ
ク質NV4およびNV5、および、より小さい非構造タンパク質の複合セットに翻訳さ
れる。フラビウイルスの主要な中和エピトープは、Ｅ(エンベロープ)タンパク質
に存在することが知られている。THE VIRUSES:
THE TOGAVIRIDAEAND FLAVIVIRI
DAE (シリーズ編集Fraenkel-ConratおよびWagner、巻編集SchlesingerおよびSch
lesinger,Plenum Press)中のRoehrig (1986)。対応するHCVのＥ遺伝子およびポ
リペプチドをコードする領域は、フラビウイルスに対する相同性に基づき予測し
得る。従ってワクチンは、HCVのＥのエピトープを含む組換えポリペプチドを含
み得る。これらのポリペプチドは、細菌、酵母、あるいは哺乳類細胞中で発現さ
れ得、あるいは、ウイルス調製物から単離され得る。他の構造タンパク質もまた
、防御用の抗HCV抗体を誘起するエピトープを含み得ることもまた予測される。
従って、単独で、あるいは組合せでＥ、Ｃ、およびＭのエピトープを含むポリペ
プチドもまた、HCVワクチンに使用し得る。
【００９３】
上記に加えて、NS1(非構造タンパク質１)での免疫は、黄熱病に対する防御を
もたらすことが示された。Schlesingerら(1986)
J.Virol.60:1153。この免疫は
中和抗体の産生を引き起こさないが、これは事実である。従って、特にこのタン
パク質がフラビウイルス間で高度に保持されていることから、HCVのNS1もまたHC
V感染に対する防御となり得ると考えられる。さらにこのことは、非構造タンパ
ク質が、中和抗体の産生は引き起こさないにも拘らず、ウイルス病原性に対する
防御を与え得ることも示す。
【００９４】
上記の観点から、HCVに対する多価のワクチンは、一つあるいはそれ以上の構
造タンパク質からの一つあるいはそれ以上のエピトープ、および／あるいは一つ
あるいはそれ以上の非構造タンパク質からの一つあるいはそれ以上のエピトープ
を含み得る。これらのワクチンは、例えば、組換えHCVポリペプチドおよび／あ
るいはビリオンから単離されたポリペプチドを含み得る。特に、一つあるいはそ
れ以上の以下のHCVタンパク質：E、NS1、C、NS2、NS3、HS4、およびNS5、あるい
は、それらに由来するサブユニット抗原を含むワクチンが期待されている。特に
好適なのは、Eおよび／あるいはNS1、あるいはそのサブユニットを含むワクチン
である。加えて、不活性化したHCVをワクチンに使用することも可能であり得る
；不活性化は、ウイルス溶解液の調製により、あるいはフラビウイルスの不活性
化を引き起こす、当分野で公知の手段、例えば、有機溶媒あるいは界面活性剤に
よる処理、あるいはホルマリン処理によって行い得る。さらにまた、ワクチンは
、弱毒化されたHCV株から、あるいは当分野で公知の［Brownら、Nature319:549
-550 (1986)］、ワクシニアベクターのようなハイブリッドウイルスから、調製
し得る。
【００９５】
有効成分として(単数あるいは複数の)免疫原性ポリペプチドを含んだワクチン
の調製物は、当業者に公知である。このようなワクチンは典型的には、液体溶液
あるいは懸濁液のいずれかとして注射可能に調製される；また注射に先立ち溶液
中で、溶液として、あるいは懸濁液として調製するのに適した固体の形態でも調
製し得る。この調製物は乳化し得、あるいはリポソーム中にタンパク質をカプセ
ル化し得る。免疫原性の有効成分はしばしば、薬学的に許容可能で有効成分と適
合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキス
トロース、グリセリン、エタノール等、およびそれらの組合せである。加えて、
所望するならばワクチンは、湿潤剤あるいは乳化剤、pH緩衝剤、および／あるい
はワクチンの有効性を増強するアジュバントのような少量の補助物質を含み得る
。有効で有り得るアジュバントの例には、以下のものが含まれるが、これらに制
限はされない：水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イ
ソグルタミン(thr-WDP)、N-アセチル-nor-ムラニル-L-アラニル-D-イソグルタミ
ン(CGP11637、nor-MDPと呼ぶ)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタ
ミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロール-3-ヒドロキシホ
スホリルオキシ)-エチルアミン(CGP19835A、MTP-PEと呼ぶ)、および細菌から抽
出したモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格の３
つの成分(MPL＋TDM＋CWS)を２％のスクアレン／Tween80乳化液中に含むRIBI。
アジュバントの有効性は、このポリペプチドを含み、さらに種々のアジュバント
を含むワクチンの投与により得られる、HCVの抗原性配列を含んだ免疫原性ポリ
ペプチドに対する抗体の量を測定することで決定し得る。
【００９６】
このワクチンは、注射により、通常は皮下あるいは筋肉内のいづれかに非経口
的に従来のように投与される。別の様式の投与に適した別の処方には、座剤およ
び、ときとして経口処方が含まれる。座剤には、例えば、ポリアルキレングリコ
ールあるいはトリグリセリドのような伝統的な結合剤およびキャリアーが含まれ
得る；このような座剤は、有効成分を0.5％〜10％、好ましくは１％〜２％の範
囲で含んだ混合物から形成される。経口処方には、例えば薬剤等級の、マンニト
ール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、
セルロース、炭酸マグネシウム、等のような通常使用される賦形剤が含まれる。
これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方あるいは
粉末の形態を取り、そして10％〜95％の、好ましくは25％〜70％の有効成分を含
む。
【００９７】
タンパク質は、中性あるいは塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に許
容可能な塩には、酸付加塩(ペプチドのフリーのアミノ基と形成した)、および例
えば、塩酸あるいはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、
マレイン酸等のような有機酸と形成した塩が含まれる。フリーのカルボキシル基
と形成した塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アン
モニウム、水酸化カルシウム、あるいは水酸化第二鉄のような無機塩基、および
イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジ
ン、プロカイン、等のような有機塩基から誘導し得る。
【００９８】
ワクチンは、投与処方が適合する様式で、そして、予防的におよび／あるいは
治療的に有効な量で、投与される。投与される量は一般に、投与当り抗原が５μ
gから250μgの範囲であり、処置される対象、対象の抗体を合成する免疫系の能
力、および所望する防御の程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確
な量は、実施者の判断に依存し得、そして個体毎に固有となり得る。
【００９９】
ワクチンは、単回投与のスケジュールで、あるいは好ましくは複数投与スケジ
ュールで与え得る。複数投与スケジュールでは、予防接種の第一過程が１〜10回
の別々の投与であり得、その後、免疫応答を維持あるいは補強するために、必要
な投与をさらに引き続き、期間毎に行い、例えば、１〜４ヶ月に第二の投与を行
い、そして必要ならば、数カ月後に次の(単数あるいは複数の)投与を行う。投薬
法はまた、少なくとも部分的には、個体の必要に応じて決定され、実施者の判断
による。
【０１００】
加えて、(単数あるいは複数の)免疫原性のHCV抗原を含んだワクチンは、例え
ば、免疫グロブリンのような他の免疫調節物質と共に投与し得る。
【０１０１】
上述のようにして調製された免疫原性のポリペプチドは、ポリクローナルおよ
びモノクローナルの両方の抗体の製造に使用される。ポリクローナル抗体が所望
ならば、選択した哺乳類(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、その他)をHCV
の(単数あるいは複数の)エピトープを有する免疫原性のポリペプチドで免疫する
。免疫した動物からの血清を、回収し、そして公知の方法に従って処理する。HC
Vエピトープに対するポリクローナル抗体を含んでいる血清が、他の抗原に対す
る抗体を含んでいる場合、ポリクローナル抗体はイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより精製され得る。ポリクローナルの抗血清の製造および処理の技
術は当分野で公知であり、例えば、MayerおよびWalker編集 (1987) IMMUNOCHEMI
CAL METHODS INCELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Acadenic Press, London)を参照
。
【０１０２】
HCVエピトープに対するモノクローナル抗体もまた、当業者は容易に製造し得
る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作成の一般的方法は良く知られて
いる。永久に継代可能な抗体産生細胞株は、細胞融合、および、ガン遺伝子DNA
でＢリンパ球を直接形質転換したり、あるいはエプスタインバーウイルスによる
トランスフェクションのような他の方法によっても創製し得る。例えば、M.Schr
eierら(1980)HYBRIDOMA TECHNIQUES；Hammerlingら(1981),
MONOCLONALANTIBO
DIES AND T-CELLHYBRIDOMAS；Kennettら(1980)
MONOCLONALANTIBODIES；を参
照。また、米国特許第4,341,761号；第4,399,121号；第4,427,783号；第4,444,8
87号；第4,466,917号；第4,472,500号；第4,491,632号；および、第4,493,890号
も参照。HCVエピトープに対して製造された一連のモノクローナル抗体は、種々
の性質、即ち、アイソタイプ、エピトープ親和性、その他に関してスクリーニン
グし得る。
【０１０３】
HCVエピトープに対する、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体
は、特に診断に有用であり、中和抗体は、受動的免疫療法に有用である。特にモ
ノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体の作成に有用である。
【０１０４】
抗イディオタイプ抗体は、それに対する防御が望まれている感染物質の抗原の
「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を作成
する技術は当分野で公知である。例えば、Grzych
(1985), Nature316:74；MacN
amaraら(1984),Science 226:1325、Uytdehaagら(1985),
J.Immunol.134:1225
、を参照。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、NANBHの治療および／あるい
は診断に、およびHCV抗原の免疫原性領域の解明に、有用で有り得る。
【０１０５】
HCV/J1あるいはHCV/J7のポリヌクレオチド配列を基として用いて、切り出しあ
るいは合成的に、約８ヌクレオチドあるいはそれ以上のオリゴマーを調製し得る
。このヌクレオチドは、HCVゲノムにハイブリダイズし、そして、(単数あるいは
複数の)ウイルス物質の同定に、(単数あるいは複数の)ウイルスゲノムのさらな
る特徴付けに、および病気の個体中の(単数あるいは複数の)ウイルスの検出に、
有用である。HCVポリヌクレオチド(天然あるいは誘導体)用のプローブは、ハイ
ブリダイゼーションにより特有のウイルス配列の検出が可能となる長さである。
６〜８個のヌクレオチドは、実際に使用し得る長さであり得るが、約10〜12個の
ヌクレオチドの配列が好ましく、そして約20個のヌクレオチドが最適のようであ
る。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法を含む、日常的方法を
用いて調製し得る。有用なプローブには、例えば以下に記載する、本明細書に開
示されたクローン、およびcDNAライブラリーをプローブするのに有用な種々のオ
リゴマーがある。HCVゲノムの任意の特有な部分に相補的であれば充分である。
プローブとして使用するためには、断片の長さが増せば不必要となるが、完全な
相補性が望ましい。
【０１０６】
このようなプローブを診断試薬として使用する場合、所望するならば血液ある
いは血清のような分析される生物学的試料を処理して、その中に含まれる核酸を
抽出し得る。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動、あるいは他のサイズ選別
技術にかけ得る；あるいは、サイズ選別せずに核酸試料をドットブロットし得る
。このプローブを次に標識する。適切な標識、およびプローブを標識する方法は
当分野で公知であり、例えば、ニックトランスレーションあるいはカイネーショ
ンによる放射活性標識の組み込み、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プ
ローブが含まれる。試料から抽出された核酸を次に、適切なストリンジェンシー
のハイブリダイゼーション条件下で標識プローブで処理する。偽陽性を妨げるた
めに、通常は高いストリンジェンシーの条件が好ましい。ハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミ
ドの濃度を包含する、ハイブリダイゼーション中および洗浄工程中の多くの因子
によって、決められる。例えば、Maniatis,T.(1982)
MOLECULARCLONING；A LAB
ORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に、
これらの因子の概略が示されている。
【０１０７】
一般的に、HCVゲノム配列は、感染した個体の血清中に相対的に低い濃度で、
即ち、約102〜103チンパンジー感染量(chimp
infectiousdoses)(CID)/mlの濃度
で、存在していると考えられている。このレベルは、ハイブリダイゼーションア
ッセイに増幅技術が用いられることを必要とし得る。このような技術は当分野で
公知である。例えば、Enzo Biochemical
Corporationの「Bio-Bridge」システム
は、修飾されていない3'-ポリ-dT-テイルをDNAプローブに付け加えるために、タ
ーミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを使用する。このポリdT-テ
イルを付けたプローブを、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションし、
そして次に、ビオチン修飾したポリ-Aとハイブリダイゼーションする。PCT特許
出願No.84/03520、および欧州特許公開第124,221号にはDNAハイブリダイゼーシ
ョンアッセイが記載され、その中で：(１)被分析物を、酵素標識したオリゴヌク
レオチドに相補的な一本鎖DNAプローブとアニールさせ、そして、(２)得られた
テイルの付いた二重鎖を酵素標識したオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシ
ョンしている。欧州特許公開第204,510号には、被分析物DNAを、ポリ-dTテイル
のようなテイルを有するプローブ、および、ポリ-A配列のようなプローブのテイ
ルとハイブリダイゼーションする配列を有し、そして複数の標識された鎖と結合
し得る、アンプリファイアー鎖と接触させる、DNAハイブリダイゼーションアッ
セイを記載している。
【０１０８】
特に望ましい技術は、先ず、血清中の標的HCV配列を約10,000-倍に、即ち、約
106配列/mlに増幅する工程を含む。例えば、Saikiら(1986)Nature 324:163、Mu
llisらの米国特許第4,683,195号、およびMullisらの米国特許第4,683,202号に記
載されたポリメラーゼチェインリアクション(PCR)法により行える。増幅された(
単数あるいは複数の)配列は次に、係属出願の、欧州特許公開第317-077号、およ
び日本特許出願番号第63-260347号(これらは本明細書の譲受人に譲渡され、本明
細書ではこれらを参考文献として援用する)に記載されたハイブリダイゼーショ
ンアッセイを用いて検出する。106/mlのレベルの配列を検出する必要のあるこれ
らのハイブリダイゼーションアッセイは、一本鎖の被分析物核酸に結合し、さら
に複数の標識一本鎖オリゴヌクレオチドとも結合する、核酸マルチマーを利用し
ている。標識ポリヌクレオチドプローブに使用し得る適切な液相サンドイッチア
ッセイ、およびプローブを調製するための方法は、欧州特許公開第225,807号(本
明細書では参考文献として援用する)に記載されている。
【０１０９】
これらのプローブは、診断キット中に包括し得る。診断キットは、プローブDN
Aを含み、プローブは標識されていても良く；あるいは、DNAプローブは非標識で
、標識用の成分をキット中の別の容器中に含んでいても良い。キットはまた、例
えば、スタンダード用物質、洗浄バッファー、およびテストを行うための指示書
のような、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要とされる、他の適
切に包装された試薬および物を含み得る。
【０１１０】
HCV抗体を含む血清およびHCV/J1およびHCV/J7のポリペプチド中のHCV特異的エ
ピトープに対する抗体と免疫学的に反応する、HCV/J1およびHCV/J7のポリペプチ
ドの両者は、生物学的試料中のHCV抗体の存在を、あるいは、ウイルスおよび／
あるいはウイルス抗原の存在を検出するイムノアッセイに有用である。イムノア
ッセイの設計は非常に多様で、これらの多様性は当分野で公知である。抗HCV抗
体用のイムノアッセイは、一つのウイルスエピトープ、あるいは数個のウイルス
エピトープを利用し得る。複数のエピトープを用いる場合、このエピトープは、
同じあるいは異なるウイルスポリペプチドに由来し得、そして、エピトープは、
別々の、組換えポリペプチドあるいは天然のポリペプチド中に、あるいは同じ組
換えポリペプチド中に一緒に、存在しても良い。
【０１１１】
ウイルス抗原用のイムノアッセイは、例えば、ウイルスエピトープに対するモ
ノクローナル抗体、一つのウイルスポリペプチドのエピトープに対するモノクロ
ーナル抗体の組合せ、異なるウイルスポリペプチドの複数のエピトープに対する
モノクローナル抗体の組合せ、同じウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、
異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体、あるいは、モノクローナルお
よびポリクローナルの抗体の組合せが使用し得る。
【０１１２】
イムノアッセイのプロトコールは、例えば、競合法、あるいは直接反応、ある
いはサンドイッチタイプのアッセイに基づき得る。プロトコールはまた、例えば
固相支持体を使用しても良く、あるいは免疫沈降法であっても良い。殆どのアッ
セイは、標識した抗体あるいはポリペプチドの使用を含む。標識は、例えば、蛍
光、化学発光、放射活性、あるいは色素分子であり得る。プローブからの信号を
増幅するアッセイもまた公知である。その例は、ELISAアッセイのような、ビオ
チンおよびアビジンを利用するアッセイ、および、酵素標識および酵素を介する
イムノアッセイである。
【０１１３】
典型的には、抗HCV抗体用のイムノアッセイは、生物学的試料のようなテスト
試料を選択および調製し、そして次に、それを抗原性(即ち、エピトープを含有
する)HCVポリペプチドと共に、抗原抗体複合体が形成される条件下でインキュベ
ートすることを含む。このような条件は当分野では公知である。不均一系では、
インキュベーション後にポリペプチドから試料を分離するために、ポリペプチド
は固相支持体に結合される。使用し得る固相支持体の例には、メンブレンあるい
はマイクロタイターウェルの形態のニトロセルロース、シートあるいはマイクロ
タイターウェルの形態のポリ塩化ビニル、ビーズあるいはマイクロタイターウェ
ルの形態のポリスチレンラテックス、ImmobulonTMとして知られているポリビニ
リジンフルオライド、ジアゾ化紙、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、および
プロテインＡビーズである。最も好適なのは、DynatechのImmulonTM１マイクロ
タイタープレートあるいは0.25-インチのポリスチレンビーズであり、これはPre
cision PlasticBallでスペック(Spec)仕上げされ、不均一系で使用されている
。固相支持体は、テスト試料から分離された後に一般に典型的に洗浄される。均
一系では、当分野で公知のように、テスト試料は抗原と共に、溶液中で、形成さ
れた如何なる抗原抗体複合体をも沈降させる条件下でインキュベートする。沈降
した複合体を次に、例えば、遠心分離により、テスト試料から分離する。抗HCV
抗体を含む形成された複合体は、次に多くの技術のいずれかにより検出される。
系によってはこの複合体は、標識した抗異種Igにより、あるいは、競合系が用い
られた場合には、結合した標識競合抗体量を測定することにより、検出し得る。
【０１１４】
HCVポリペプチドが被分析物であるイムノアッセイでは、典型的には生物学的
試料であるテスト試料は、抗HCV抗体と共に、抗原抗体複合体の形成が可能な条
件下で同様にインキュベートされる。抗体が固相支持体に結合され、テスト試料
と共にインキュベートされ；洗浄され；被分析物と第二の標識抗体とを共にイン
キュベートされ；そして、支持体を再び洗浄する、「サンドイッチ」アッセイの
ような種々の系を採用し得る。被分析物は第二抗体が支持体に結合したかどうか
を調べることで検出される。不均一系あるいは均一系のいづれでも有り得る競合
系では、テスト試料は通常、抗体および標識された競合する抗原と共に、順番に
あるいは同時に、インキュベートされる。これらおよび他の系は、当分野で良く
知られている。
【０１１５】
HCVのフラビウイルスモデルは、ビリオンの構造タンパク質の診断用エピトー
プの存在しそうな位置に関する予測を可能とする。C、プレ-M、M、およびEドメ
インは全て、ウイルス抗原の検出、および特に診断に役立つ可能性の高いエピト
ープを含んでいると考えられる。同様に、非構造タンパク質のドメインは、重要
な診断用エピトープ(例えば、推定ポリメラーゼをコードするNS5；および、推定
補体結合抗原をコードするNS1)を含むと考えられる。これらの特異的なドメイン
のエピトープを含む、組換えポリペプチドあるいはウイルスポリペプチドは、感
染性血液の供与者および感染患者中のウイルス抗体の検出に有用であり得る。加
えて、Eおよび／あるいはMタンパク質に対する抗体は、HCVにより引き起こされ
たNANBHの患者、および感染性血液の供与者の、ウイルス抗原検出用のイムノア
ッセイに使用し得る。さらに、これらの抗体は、急性期の供血者および患者から
の検出に、非常に有用であり得る。
【０１１６】
推定ポリタンパク質の抗原性領域は、細菌でのポリタンパク質の部分をコード
するHCVのcDNAの発現産物の抗原性をスクリーニングすることにより、位置付け
および同定し得る。HCVの他の抗原性領域は、酵母系、および、昆虫および脊椎
動物由来の細胞系を含む、他の発現系でHCVのcDNAの部分を発現させることによ
り検出し得る。加えて、抗原性指数および疎水性／親水性プロフィールに関する
研究により、領域の抗原性の見込みに関する情報が得られる。有効な検出系は、
一連のエピトープの使用を含み得る。この一連のエピトープは、一つあるいは複
数のポリペプチドに構築し得る。
【０１１７】
免疫診断に適し、そして適切な標識試薬を含んだ適切なキットは、適切な容器
中のHCVエピトープを含んだ本発明のポリペプチドあるいはHCVエピトープに対す
る抗体、そしてアッセイの実施に必要な他の試薬および物質(例えば、洗浄バッ
ファー、標識抗ヒトIgのような検出手段、標識抗HCV、あるいは標識HCV抗原)、
および適当なアッセイ指示書のセットを含む、適切な物質をパッケージに入れる
ことで構築される。
【０１１８】
本明細書に記載したHCV/J1およびHCV/J7のヌクレオチド配列情報は、HCVゲノ
ムの配列に関するさらなる情報を得るために、そしてJ1あるいはJ7に関連した別
のHCV分離株の同定および単離にも、使用し得る。そしてこの情報は、別のポリ
ヌクレオチドプローブ、HCVゲノムから誘導したポリペプチド、およびHCVにより
引き起こされたNANBHの診断およびあるいは処置に有用であろうHCVエピトープに
対する抗体を導き出す。
【０１１９】
本明細書に記載したHCV/J1およびHCV/J7のヌクレオチド配列情報は、それから
J1およびJ7配列が由来する、HCVゲノムの未だ定義されていない領域に由来する
別の配列を単離するためのプローブの設計に有用である。例えば、実施例に開示
されたHCVのcDNA配列の５'末端あるいは３'末端に近い領域に由来する、約８個
のあるいはそれ以上の、そして好ましくは20個のあるいはそれ以上のヌクレオチ
ドの配列を含んだ標識プローブは、HCVのcDNAライブラリーから重複するcDNA配
列を単離するために使用し得る。上記のクローン中のcDNAと重複するが、上記の
クローン中のcDNAが由来しないゲノムの領域から由来する配列をも含む、これら
の配列は次に、以下に記載するcDNAと必ずしも重複しない他の重複断片を単離す
るためのプローブの合成に使用し得る。cDNAライブラリーを構築する方法は当分
野で公知である。例えば、欧州特許公開第318,216号を参照。HCV1抗原に対する
抗体が証明されてNANBHを有すると診断された、日本および他のアジアの患者か
らライブラリーを調製するのが特に好ましい；これらの人々は、HCV/J1、HCV/J7
あるいは関連した分離株の保持者の最も有力な候補であると考えられている。
【０１２０】
HCV粒子は、NANBHの固体の血清から、あるいは細胞培養物から、当分野で公知
の任意の方法で単離し得る。この方法には例えば、沈降あるいは排除法のような
サイズ分別に基づく技術、あるいは密度勾配中での超遠心のような密度に基づく
技術、あるいはポリエチレングリコールのような物質と共に沈澱させる方法、あ
るいはアニオン性あるいはカチオン性の交換物質、および疎水性により結合する
物質のような種々の物質によるクロマトグラフィーが含まれる。
【０１２１】
HCV粒子あるいは抗原を単離するための好ましい方法は、イムノアフィニティ
ーによる方法である。イムノアフィニティーの技術は当分野で公知であり、固相
支持体に抗体を固定し、それらの免疫選択性を保持しておく技術が含まれる。こ
れらの技術は、抗体が支持体に吸着されるもの(例えば、KurstakのENZYME IMMUN
ODIAGNOSIS,p.31〜37を参照)、および抗体を支持体に共有結合するものであり
得る。一般に、この技術は上述の抗原を固相支持体に共有結合するために使用し
たものと類似である。しかし、抗体の抗原結合部位が接近可能に保たれるようス
ペーサーグループが二価のカップリング試薬中に含まれ得る。抗体はモノクロー
ナル、あるいはポリクローナルで良く、イムノアッセイに使用する前に抗体を精
製しておくことが望ましい。
【０１２２】
ウイルスからのゲノムの抽出、cDNAライブラリーの調製およびプロービング、
クローンの配列決定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、ラジオイムノアッ
セイあるいはELISAアッセイのような免疫学的アッセイの実施、培養による細胞
の増殖、等に使用される一般的技術は当分野で公知であり、これらの技術を記載
したラボラトリーマニュアルは入手できるが、一般的指針として、これらの方法
に関する現在得られる情報源、および実施する際に有用な物質を以下に記載する
。
【０１２３】
指定の宿主と適合する適切な制御配列が使用できるなら、望みのコード配列を
発現させるために、原核および真核宿主細胞が使用し得る。原核細胞宿主の中で
はE.coliが最も頻繁に使用されている。原核細胞用の発現制御配列は、プロモー
ターを含み、オペレーター部分、およびリボソーム結合部位を随意に含む。原核
細胞宿主に適合するトランスファーベクターは、通常は、例えば、アンピシリン
およびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含んだプラスミドpBR322、お
よび、抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含んだ種々のpUCベクターから誘
導される。これらのマーカーは、選択によりうまく形質転換体を得るために使用
し得る。通常使用される原核細胞の制御配列には、β-ラクタマーゼ(ペニシリナ
ーゼ)、およびラクトースプロモーターシステム(Changら(1977),
Nature 198:10
56)、トリプトファン(trp)プロモーターシステム(Goeddelら(1980)Nucleic Aci
d Res. 8:4057)、および、λ-由来のＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム
結合部位(Shimatakeら(1981)
Nature 292:128)、およびtrpおよびlacUV5プロモ
ーターの配列に由来するハイブリッドtacプロモーター(De Boerら(1983) Proc.N
atl.Acad.Sci.USA292:128)が含まれる。以上のシステムは特にE.coliに適合し
たものである；所望するならば、BacillusあるいはPseudomonasの株のような他
の原核細胞宿主も対応する制御配列と共に使用し得る。
【０１２４】
真核細胞宿主には、培養システム中の酵母および哺乳類細胞が含まれる。Sacc
haromycescerevisiae、Saccharomyces
carlsbergensis、Klebsielalactisおよ
びPichiapastorisは、最も一般的に使用される酵母宿主であり、便利な真菌宿
主である。酵母に適合したベクターは、栄養素要求性変異株に原栄養菌性を変換
、あるいは、野生株に重金属耐性を付与することによる、首尾良い形質転換体の
選択を可能とするマーカーを有している。酵母に適合したベクターは、２micron
複製開始点(Broachら(1983)
Math Enz.101:307)、CEN3およびARS1の組合せ、あ
るいは、宿主細胞ゲノムに適切な断片の組み込みをもたらす配列のような複製を
保証する他の手段を使用し得る。酵母ベクター用の制御配列は、当分野で公知で
あり、解糖酵素合成のプロモーター(Hessら(1968)
J.Adv.EnzymeEng. 7:149；H
ollandら(1978),J.Biol.Chem. 256:1385)を含み、これには３フォスフォグリセ
レートキナーゼ(Hitzeman(1980),
J.Biol.Chem.255:2073)が含まれる。さらに
、エノラーゼ遺伝子に由来するような転写停止信号(Holland
(1981),J.Biol.Ch
em.256:1385)も含まれ得る。特に有用な制御システムは、グリセルアルデヒド-3
フォスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、あるいはアルコールデ
ヒドロゲナーゼ(ADH)を調節し得るプロモーター、これもGAPDHに由来する転写停
止信号、そして分泌が望ましいならば、酵母α因子からのリーダー配列を含むも
のである。加えて、作動可能に結合された転写調節領域および転写開始領域は、
野生種生物では天然に結合しないような様式であり得る。これらのシステムは、
欧州特許公開第120,551号、欧州特許公開第116,201号、および欧州特許公開第16
4,556号(本明細書ではこれら全てを参考文献として援用する)に詳細に記載され
ている。
【０１２５】
発現用の宿主として入手可能な哺乳類細胞株は、当分野で公知であり、HeLa細
胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、
および多くの他の細胞株を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATC
C)から得られる多くの不死化細胞株が含まれる。哺乳類細胞用の適切なプロモー
ターもまた、当分野で公知であり、Simian
Virus40(SV40)(Fiers (1978), Natu
re 273:113)、ラウスサルコーマウイルス(PSV)、アデノウイルス(ADV)、および
ウシパピローマウイルス(BPV)、からのもののようなウイルスプロモーターが含
まれる。哺乳類細胞はまた、転写停止信号およびポリＡ付加配列を必要とし得る
；発現を増大させるエンハンサー配列もまた含まれ得、そして遺伝子の増幅を引
き起こす配列もまた望ましい。これらの配列は、当分野で公知である。哺乳類細
胞中での複製に適したベクターは、ウイルスレプリコン、あるいは宿主ゲノムへ
のNANBVエピトープをコードする適切な配列の組込みを保証する配列を含み得る
。
【０１２６】
ワクシニアウイルスシステムもまた、哺乳類細胞中で外来DNAを発現させるた
めに使用し得る。異種遺伝子を発現させるために、通常、この外来DNAはワクシ
ニアウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入され、そして次に感染した細胞を
選択し得る。この方法は当分野で公知であり、さらなる情報は以下の文献中に見
いだされる［Mackettら、J.Virol.49：857-864(1984)およびDNA Cloning, Vol.
2の第７章、IRL Press］。
【０１２７】
加えて、ウイルス抗原は、バキュロウイルスシステムにより昆虫細胞中で発現
し得る。SummerおよびSmithによるバキュロウイルスの発現に関する概説ガイド
ブックは、AManual of Methods
for BaculovirusVectors and Insect Cell Cu
ltureProcedures (Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No.1555
)である。異種遺伝子をバキュロウイルスゲノムに組込むために、先ず遺伝子を
、バキュロウイルス配列を幾つか含むトランスファーベクターにクローニングす
る。このトランスファーベクターを、昆虫細胞へ野生型ウイルスと共に同時にト
ランスフェクトすると、野生型ウイルスとの組換えが起こる。通常トランスファ
ーベクターは、異種遺伝子が野生型バキュロウイルスの多面体遺伝子を崩壊させ
るように作成されている。この組換えウイルスに感染した細胞は、野生型ウイル
スに感染した細胞とは表現形が異なっているので、この崩壊により組換えウイル
スの選択が容易となる。精製された組換えウイルスは、細胞を感染させ、異種遺
伝子を発現させるために使用し得る。もしシグナルペプチドを異種遺伝子のフレ
ームに結合してあれば、外来タンパク質は培地中に分泌され得る；そうでない場
合には、タンパク質は細胞の溶解物に結合している。さらなる情報は、Smithら
のMol.&Cell.Biol.3：2156-2165
(1983)、あるいはLuckowおよびSummersのViro
logy 17:31-39(1989)を参照。
【０１２８】
形質転換は、例えば、ウイルス中にポリヌクレオチドをパッケージングしそし
て宿主をウイルスで変換する、およびポリヌクレオチドの直接の取り込みを含む
、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の方法によって行い得る
。使用される形質転換法は、形質転換される宿主に依存する。直接の取り込みに
よる細菌の形質転換は一般に、塩化カルシウムあるいは塩化ルビジウムでの処理
を用いている(Cohen(1972),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2110；Maniatisら(19
82), MOLECULARCLONING；A LABORATORY MANUAL
(Cold SpringHarbor Press, C
old SpringHarbor. N.Y.))。直接の取り込みによる酵母の形質転換は、Hinnen
ら(1978)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929の方法により行い得る。直接の取り
込みによる哺乳類細胞の形質転換は、GrahamおよびVan der Eb (1978), Virolog
y 52:546のリン酸カルシウム沈降法を、あるいはそれの公知の種々の変法を用い
て行い得る。
【０１２９】
ベクターの構築は、当分野で公知の方法を用いて行う。部位特異的なDNAの開
裂を、適切な制限酵素で、これらの市販されている酵素の製造者により通常は特
定された条件下で、処理することにより行われる。開裂された断片は、Methods 
in Enzymology(1980) 65:499-560に見いだされる一般的方法に従って、ポリア
クリルアミドあるいはアガロースのゲル電気泳動法を用いて分離し得る。非平滑
末端の開裂断片は、E.coliDNAポリメラーゼＩ(クレナウ断片)を用い、混合物中
の適切なデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の存在下で、平滑末端化し得る。
S1ヌクレアーゼでの処理もまた使用し得、如何なる一本鎖DNA部分も加水分解さ
れる。
【０１３０】
ライゲーションは、標準的なバッファーおよび温度条件を用い、T4 DNAリガー
ゼおよびATPを用いて行われる；非平滑末端のライゲーションは、平滑末端のラ
イゲーションに比べ、ATPおよびリガーゼが少なくて済む。ベクター断片がライ
ゲーション混合物の一部分として用いられた場合、５'-リン酸を除去し、そして
その結果ベクターの再ライゲーションを妨害する目的でしばしば、ベクター断片
を細菌アルカリフォスファターゼ(BAP)あるいは仔ウシ腸アルカリフォスファタ
ーゼで処理する；あるいは、ライゲーションを妨害するために不要な断片の制限
酵素消化が使用され得る。ライゲーション混合物は、E.coliのような適切なクロ
ーニング宿主に形質転換され、成功した形質転換体は、例えば抗生物質耐性によ
り選択され、そして正しい構築に関してスクリーニングされる。
【０１３１】
合成オリゴヌクレオチドは、Warner (1984)，DNA
3:401に記載されているよう
に、自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製し得る。所望するならば、32
P-ATPの存在下で、反応の標準的条件を用いて、ポリヌクレオチドキナーゼで処
理することで、合成鎖を32Pで標識し得る。cDNAライブラリーから単離されたも
のを含む、DNA配列は、例えば、Zoller(1982), Nucleic Acids Res.10:6487に
記載された部位特異的変異誘発を含む、既知の方法で改変し得る。
【０１３２】
DNAライブラリーは、GrunsteinおよびHogness(1975), Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 73:3961の方法を用いてプローブし得る。簡単に説明すると、この方法では、
プローブされるDNAはニトロセルロースフィルターに固定され、変性され、そし
てバッファーでプレハイブリダイゼーションされる。バッファー中のホルムアミ
ドの％、および、プレハイブリダイゼーションおよび引さ続くハイブリダイゼー
ション工程の時間および温度条件は、必要とされるストリンジェンシーに依存す
る。低いストリンジェンシー条件を要求するオリゴマープローブは一般に、低い
ホルムアミド濃度、低い温度、および長いハイブリダイゼーション時間で用いら
れる。cDNAあるいはゲノム配列から由来するもののように、30個あるいは40個よ
り多いヌクレオチド以上を含んだプローブには、一般に、より高い温度、例えば
約40〜42℃、そして高い％の、例えば50％のホルムアミドを用いる。プレハイブ
リダイゼーションの後、５'-32P-標識オリゴヌクレオチドプローブをバッファー
に加え、そしてフィルターをハイブリダイゼーション条件下でこの混合物とイン
キュベートする。洗浄後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにか
け、ハイブリダイゼーションしたプローブの位置を表示させる；元のアガープレ
ート上の対応する位置のDNAを、所望のDNAの材料として使用する。
【０１３３】
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、抗原あるいは抗体の濃度の測定に使用
し得る。この方法は、抗原あるいは抗体のいずれかに結合させた酵素に依存し、
そして、結合した酵素活性を定量的標識として用いる。抗体を測定するために、
既知の抗原を固相(例えば、マイクロプレートあるいはプラスチックカップ)に固
定し、試験する希釈血清とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識した抗イムノ
グロブリンとインキュベートし、そして再び洗浄する。標識に適した酵素は、当
分野で公知であり、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。固相に結合し
た酵素活性を特異的基質の添加、そして生成物形成あるいは基質の利用を比色的
に測定により測定する。結合した酵素活性は、結合した抗体量の直接機能である
。
【０１３４】
抗原を測定するには、既知の特異的抗体を固相に固定し、抗原を含む試験材料
を添加し、インキュベーションの後、固相を洗浄し、そして第二の酵素標識した
抗体を加える。洗浄後、基質を添加し、そして酵素活性を比色的に測定し、そし
て抗原濃度に関連させる。
【実施例】
【０１３５】
（実施例１）
この実施例には、HCV/J1およびHCV/J7のヌクレオチド配列のクローニングが記
載されている。
【０１３６】
両方のHCVビリオン源として用いられた血液試料は、抗HCV抗体アッセイで陽性
であった。これらの試料からのHCV分離株を、HCV/J1およびHCV/J7と命名した。J
1分離株を含有する血液試料の感染力は、受血者の将来的な輸血後の経過の研究
によって確認された。National Tokyo
Chest Hospitalの外科のTohruKatayama
博士は、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の患者から採血した。さらに彼は、これらの患者へ
の各々の血液供与者からの血液試料も集めた。次に、これらの試料を、C100-3 H
CV1抗原(欧州特許公開第318,216号)に対する抗体についてアッセイしたところ、
供与者の１人からの血液が陽性であった。
【０１３７】
血液試料からのRNAの単離は、超遠心分離による血液試料中のビリオンをペレ
ット化することから始めた［Bradley,D.W.,
McCaustland,K.A.,Cook E.H., Sch
able,C.A.,Ebert,J.W.およびMaynard,J.E.(1985)
Gastroenterology88, 773-7
79］。次に、RNAを、塩化グアニジニウム／塩化セシウム法によってペレットか
ら抽出し［ManiatisT.,
Fritsch,E.P.,およびSambrookJ.(1982) "Molecular C
loning: ALaboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring
Harbor］、そして、さらに尿素存在下に、フェノール／クロロホルム抽出によ
って精製した［Berk,A.J.Lee,F.,
Harrison,T.,Williams,J.およびSharp,P.A.(
1979) Cell 17,935-944］。
【０１３８】
HCV1のヌクレオチド配列のC/E、Ｅ、E/NS1、NS3およびNS5ドメインから、合成
オリゴヌクレオチドプライマーの５組のぺアーを設計して、J1およびJ7のゲノム
から断片を単離した。プライマーの第１番目の組は、コアドメインおよびいくつ
かのエンベロープドメインの配列を単離して分析するためのものであった。プラ
イマーの第２番目の組は、エンベロープドメイン中の配列の単離のためのもので
あった。プライマーの第３番目の組は、推定エンベロープドメインおよび非構造
ドメイン１、すなわちNS1の領域が重なったドメインの断片を単離するためのも
のであった。プライマーの第４および第５番目の組は、非構造ドメイン３および
５、すなわちNS3およびNS5の断片を単離するために用いた。種々のプライマーの
配列を以下に示す：
C/E領域のプライマーの配列は、
21S    5'  CGTGCCCCCGCAAGACTGCT     3'
J80A  
5'  CCGTCCTCCAGAACCCGGAC     3'
である。
Ｅ領域のプライマーの配列は、
71S    5'  GCCGACCTCATGGGGTACAT     3'
J132A  5'  
AACTGCGACACCACTAAGGC    3'
である。
E/NS1の領域のプライマーの配列は、
127S  
5'  TGGCATGGGATATGATGATG     3'
166A  
5'  TTGAACTTGTGGTGATAGAA     3'
である。
NS3領域のプライマーの配列は、
464S  
5'  GGCTATACCGGCGACTTCGA     3'
526A  
5'  GACATGCATGTCATGATGTA     3'
である。
NS5領域のプライマーの配列は、
870S  
5'   GCTGGAAAGAGGGTCTACTA    3'
917A  
5'  GTTCTTACTGCCCAGTTGAA     3'
である。
【０１３９】
アンチセンスプライマー166A、526Aあるいは911Aの１μgを10ユニットの逆転
写酵素(Biorad)に加えて、単離されたRNAを鋳型としてからcDNA断片を合成した
。次に、適切なセンスプライマー21S、71S、127S、464Sあるいは870Sの１μgを
加えた後、cDNA断片を標準的なポリメラーゼチェーンリアクションによって増幅
した［Saiki,R.K.,Scharf,S.,
Faloona,F.,Mullis,K.B., Horn G.T., Erlich,
H.A.およびArnheim,N.(1985)Science 230, 1350-1354］。
【０１４０】
PCR法によって増幅されたcDNA断片をゲル単離し、pUC119のSmaI部位[Vieira,J
.およびMessijng,J.(1987)Methods in Enzymology 153, 3-11］、あるいはクロ
ーニングベクターcharomid9-42［Saito,I.およびStark,G.(1986) Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA83:8664-8668］の誘導体であるcharomid SBのSnaBI部位に平滑末端
結合してクローン化した。５個のウイルスドメインの断片を含有するクローンを
首尾よく構築した。
（実施例２）
日本の分離株J1およびJ7のPCR反応から、C/E、E、E/NS1、NS3およびNS5のそれ
ぞれの領域の、３つの個々のクローンを、ジデオキシチェインターミネーション
法によって配列決定した。
【０１４１】
C/E以外の全領域の配列は、J1分離株から単離した。C/E領域の配列のみ、J7分
離株から単離した。意外にも、両方の分離株から単離された断片は、HCV1ゲノム
から推測されるよりも長くも短くもなかった。しかし、同じ領域の配列を含有す
るクローン間には異質性が存在する。従って、コンセンサス配列は、図１〜図１
３にそれぞれ示されているように、C/E、E、E/NS1、NS3およびNS5のそれぞれの
ドメインについて構築した。これらの相違は、PCRでの増幅中に無作為に生じた
人工なものとして説明され得る［Saiki,R.K.,
Scharf,S.,Faloona,F., Mullis,
K.B., HornG.T., Erlich,H.A.およびArnheim,N.(1985)
Science 230,1350-135
4］。他の説明は、１人の健康な保持者の血漿に１つ以上のウイルスゲノムが存
在していて、これらのゲノムがヌクレオチドレベルでは異質であるというもので
ある。
【０１４２】
この点を明確にするために、何個のヌクレオチドの相違がアミノ酸の変化を導
くのか、例としてJ1分離株のNS3ドメインの配列を用いて決定した。５個のヌク
レオチドの相違のうち、３個がアミノ酸コドンの３番目の位置であって、アミノ
酸配列を変化させない。残りの２個のヌクレオチドの相違の両方とも、アミノ酸
コドンの１番目の位置であって、スレオニンからアラニンへの変化、およびプロ
リンからアラニンへのアミノ酸の変化を生じた。これら全ては、小さな中性アミ
ノ酸残基である。同様に、他のドメインでのヌクレオチドの相違が分析されると
きも、多くのサイレントな保持された変異が認められる。これらの結果は、１人
の健康な供与者の血漿中のHCVゲノムのヌクレオチド配列が、ヌクレオチドレベ
ルで異質であることを示唆している。
【０１４３】
さらに、各々の断片に対するコンセンサス配列がまとめられると、各々の配列
を、図１４〜図２７に記載されているHCV1分離株と比較した。図１４〜図１６で
は、J7分離株のC/E領域の断片が、HCV1分離株に対して、512/552で92.8％のヌク
レオチド相同性および150/154で97.4％のアミノ酸相同性を有することが示され
ている。図１７〜図１９では、J1のEドメインの断片は、HCV1に対して僅かに低
いヌクレオチド相同性およびアミノ酸相同性を、それぞれ76.2％および82.9％有
することが示されている。エンベロープドメインおよび非構造ドメイン１個に重
なっているJ1分離株の断片は、図２０および図２１に示されているように、HCV1
に対して最も低い相同を有する。そこでは、J1分離株は、HCV1に対して71.5％ヌ
クレオチド相同性および73.5％アミノ酸相同性を有する。図２２〜図２４では、
J1のNS3ドメインの断片とHCV1との比較が示されている。ヌクレオチド配列間の
相同性は79.8％であって、一方、分離株間のアミノ酸相同性は、アミノ酸で179/
194、あるいは92.2％と大変高い。図２５〜図２７では、J1のNS5配列とHCV1と間
の相同性が示されている。この配列は、84.3％のヌクレオチド相同性および88.7
％のアミノ酸相同性を有する。
【０１４４】
上記実施例に記載されているベクターは、Patent
MicroorganismDepository,
FermentationInstitute, Agency of Industrial Science and Technology at
1-3, Higashi1-chome Tsukuba-chi, Ibaragi-ken 305, Japanに寄託されていて
、ブダペスト条約のもとに維持されている。受託番号および寄託日は表１に示さ
れている。
（実施例３）
HCV/J1クローンであるJ1-1519は、本質的には上記記載の方法によって単離し
た。しかし、単離に用いたプライマーは、J159Sおよび199Aであった。オリゴマ
ーのプライマーJ159Sおよび199Aの配列は、以下に示すものであって、これらはJ
1-1216およびHCV1中の配列に基づいている。      
【０１４５】
J159S  
5'   ACT GCC CTGAAC TGC AAT GA     3'
199A    5'  AAT CCA GTT GAG TTC ATC CA     3'
クローンJ1-1519は、367ヌクレオチドのHCVcDNA配列を含有する。これはNS1
領域の５'側のほとんど半分に広がっていて、そしてＥ領域のクローンJ1-1216と
31個のヌクレオチドが重なっている。この領域に広がっている３つのそれぞれの
クローンは配列決定され、３つのクローンから得たこの領域の配列は、同一であ
った。J1-1216(図中ではJ1として示されている)のHCVcDNAの配列およびここに(
上記に示されているヌクレオチド配列)コードされるアミノ酸配列が図６０〜図
６２に示されている。さらに、図６０〜図６２には、J1-1216とプロトタイプHCV
1 cDNAの比較し得る領域との配列の相違(図中ではPTで示されている)、およびそ
れによって得られるコードされたアミノ酸の変化が示されている。J1-1216とHCV
1 cDNAとの間の相同性は、ヌクレオチドレベルで約70％、そしてアミノ酸レベル
で約75％である。
【０１４６】
J1分離株の推定されるコアからNS1領域にかけての配列組成は、図６３〜図６
８に示されていて、さらに、図中にはJ1配列コードされたアミノ酸が示されてい
る。HCV1プロトタイプ配列からの変化は、J1のヌクレオチド配列の下の行に示し
ている。そして破線は相同の配列を示している。HCV1プロトタイプ配列中にコー
ドされた相同でないアミノ酸は、HCV1のヌクレオチド配列の下に示されている。
【０１４７】
J1/1519HCV cDNAを含有するクローン化されたもの(pS1-1519)は、DH5αに維
持されていてPatentMicroorganism
Depositoryに寄託されている。
（実施例４）
HSV1(欧州特許公開第318,216号を参照)の5-1-1ポリペプチドをコードする領域
を取り囲む、推定のNS3−NS4領域、および推定NS1−E領域からのC200−C100領域
を含む、J1分離株の数個の領域をPCR法によって増幅した。このC200−C100領域
は、プロトタイプHCV1の3799から5321のヌクレオチドを含む。抽出を、プロティ
ナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(Maniatis(1982)、前述)の存在下
でグアニジニウムチオシアネートで行った以外は、上記のようにRNAを抽出した
。各々のプライマー１μM、40ユニットのRNアーゼインヒビター(RNASIN)、５ユ
ニットのAMV逆転写酵素、および反応に必要な塩および緩衝液を含む25μl反応液
中でインキュベートして、RNAをHCV
cDNAへ転写した。指定された領域からのHCV
cDNAのセグメントの増幅は、合成オリゴマーの16-merプライマーのぺアーを用
いて行った。PCR増幅を３回(PCRＩ、PCRII、およびPCRIII)行って完成した。PCR
増幅の２回目および３回目(PCRII)には、異なったPCRプライマーの組を用いた。
１回目のPCR反応物を10倍に希釈し、そして新しいプライマーを用いて複数回のP
CR増幅を行ったので、最終的に最高で50％の１回目のPCR反応(PCRＩ)の生成物が
さらに増幅された。領域の増幅に用いたプライマーは、下記に示した。J1分離株
の配列由来のJ1C200-3を除いて、これらのプライマーは、プロトタイプHCV1配列
由来であった。
【０１４８】
NS3−NS4の「5-1-1」領域の増幅用のプライマー
PCRＩ
511/16A (センス、HCV1の1528番から始まるヌクレオチド由来)
5'  AAC AGG CTG CGT GGT
C     3'
511/16B (アンチセンス、HCV1の5260で終わるヌクレオチド由来)
5'  AGT TGG TCT GGA CAG
C     3'
PCR II
511/35A (センス、HSV1の5057番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限酵
素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCTCG
TCT TGT CCG GGAAGC CGG CAA TC     3'
511/35B (アンチセンス、HSV1の5233番で終わるヌクレオチド由来のHCV部分タン
パク質；制限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCCCT
CTG CCT GAC GGGACG CGG TCT GC     3'
PCR III
511/35A (前述参照)
VSNrc7 (アンチセンス、HSV1の5804番で終わるヌクレオチド由来である)
5'  GTA GTG CGT GGG GGA
AAC AT     3'
「NS1/E」領域の増幅用のプライマー
PCRＩ
J1(E2)3 (センス、HSV1の953番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限酵
素部位には下線が引いてある)
5'   CTTAGAATTC
TGG CAT GGG ATATGA TGA TG     3'
J1(E)4 (センス、HSV1の1087番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限酵
素部位には下線が引いてある)
5'   CTTAGAATTC
TCC ATG GTG GGGAAC TGG GC     3'
J1rc12 (アンチセンス、HSV1の1995番で終わるヌクレオチド由来であるHCV部分
；制限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCC
TAA CGG GCT GAGCTC GGA     3'
J1rc13 (アンチセンス、HSV1の1941番で終わるヌクレオチド由来であるHCV部分
；制限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTAGAATTC
CGT CCA GTT GCAGGC AGC TTC     3'
PCR II
J1rc13 (前記参照)
J1IZ-1 (センス、HCV部分はHCV1の1641番から始まるヌクレオチド由来；制限酵
素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCCAA
CTG GTT CGG CTGTAC A     3'
J1IZ-2 (センス、HCV部分はHCV1の1596番から始まるヌクレオチド由来；制限酵
素部位には下線が引いてある)
5'  TGA GAC GGA CGT GCT
GCT CCT     3'
「NS3−NS4」領域のC200−C100領域用のプライマー
PCRＩ
J1C200-1 (センス、HCV1の3478番から始まるヌクレオチド由来である)
5'  TCC TAC TTG AAA GGC
TC     3'
J1C200-3 (アンチセンス、HCV1の4402番で終わるヌクレオチド由来である)
5'  GGA TCC AAG CTG AAA
TCG AC     3'
J1rc52 (アンチセンス、HCV1の5853番で終わるヌクレオチド由来のHCV部分；制
限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTAGAATTC
GAG GCT GCT GAGATA GGC AGT     3'
511/16A (前記参照)
PCR II
J1C200-2 (センス、HCV1の3557番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限
酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCCCC
GTG GAG TGG CTAAGG CGG TGG ACT     3'
J1C200-4 (アンチセンス、HCV1の4346番で終わるヌクレオチド由来のHCV部分；
制限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCTCG
AAG TCG CCG GTATAG CCG GTC ATG     3'
511/35A (前記参照)
J1rc51 (アンチセンス、HCV1の5826番で終わるヌクレオチド由来のHCV部分；制
限酵素部位には下線が引いてある)
5'   CTTAGAATTC
GGC AGC TGC ATCCTC CGG CAC     3'
増幅されたHCVcDNAは、クローニングしないで直接に、および／またはクロー
ニングして、配列決定した。配列決定は、本質的にはShyamalaおよびAmes,J.Bac
teriology171:162 (1989)に記載されているように、アシンメトリックPCR法に
よって行った。この方法では、cDNAの増幅は、１つの鎖の増幅が優先して行われ
るように、プライマーの１つの濃度を制限(通常、約１：50の割合)して行う。次
に、優先的に増幅された鎖は、ジデオキシチェインターミネーション法によって
配列決定される。
【０１４９】
PCR法によるアシンメトリック配列決定に用いるプライマーを下記に示す。NS1
領域用：J1lZ-1およびJ1rc13(両方とも配列決定されている)；J1lZ-2、J1rc13(
両方の鎖で確認されている)。C200-C100のＮ末端領域、C200-C100のＣ末端領域
、および5-1-1領域を含有するNS3−NS4領域用：J1C200-2およびJ1C200-7(C200-C
100のＮ未端領域に対する)およびJ1C200-4およびJ1C200-6(C200-C100のＣ末端領
域に対する)；および511/35Aおよびhep4(5-1-1領域に対する)。J1C200-2、J1C2
00-4、および511/35Aの配列は、前記に示されている；hep4、J1C200-6、および
J1C200-7の配列は、以下に示す。          
hep 4 (HCV1の5415番から始まるヌクレオチド由来である)
5'   TTGGC TAG TGG TTA
GTG GGC TGG TGACAG     3'
J1C200-6 (HCV1の3875番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限酵素部位
には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCCGT
ACT CCA CCT ACGGCA AGT TCC TT     3'
J1C200-7 (HCV1の3946番から始まるヌクレオチド由来のHCV部分；制限酵素部位
には下線が引いてある)
5'   CTTGAATTCGTG
GCA TCC GTG GAGTGG CAC TCG TC     3'
「NS1」領域、C200-C100領域および5-1-1領域のアシンメトリック配列決定に
よって得られた配列は、それぞれ図６９および図７０、ならびに図７１〜図７６
に示されている。図中、J1配列にコードされるアミノ酸は、J1のヌクレオチド配
列の上に示されている。J1配列とHCV1のプロトタイプヌクレオチド配列との差は
、J1配列の下に示されている(棒線は、両方の配列の相同なヌクレオチドを示し
ている)。HCV1のプロトタイプ配列の異なるコードされるアミノ酸配列は、HCV1
のヌクレオチド配列の下に示されている。
【０１５０】
NS1領域、C200-C100領域、および5-1-1領域のHCVcDNAをクローン化した。推
定NS1領域の300bpおよび230bpの断片を、宿主HB101中で、商業的に入手可能なベ
クターの誘導体pGEM-3Zにクローン化して、そしてAW-300bpとしてATCCに寄託し
た。誘導体ベクターは、元来のpCEM-3Zポリリンカー、完全なAmpr遺伝子、およ
びE.coliでの複製に必要な遺伝子を維持している。HCVcDNA断片は、SacIおよび
XbaIで取り出し得る。C200のＮ末端断片770bpを含有するHCVcDNAを、HB101でpM
1Eにクローン化して12クローンをプールし、AW-770bp-NとしてATCCに寄託した。
HCV cDNAは、HaeIIによってベクターから取り出し得る。得られたHaeII断片は、
５'末端および３'末端にそれぞれ300bpおよび250bpのベクターDNAを含有する。
また700bpのC200のＣ末端断片(AW-700bp-C)を含有するHCVcDNAを、M13mp10にク
ローン化して宿主DH5α-F'に維持した；クローニングはベクターのポリリンカー
部位に行った。得られたファージをプールして、AW-700bp-NあるいはAW-700bp-C
として1990年9月11日にATCCに寄託した。HCV1の5-1-1領域に等しいJ1からのHCV
cDNAを、mp191 R1部位にクローン化し、そしてDH5α-F'中に維持した。このクロ
ーニングからのいくつかのm13ファージ上清をプールして、J1 5-1-1としてATCC
に1990年9月11日に寄託した。HCVcDNAはファージをEcoRI処理して得られ得る。
J1 5-1-1およびAW-700bp-NあるいはAW-700bp-Cの受託番号は、ATCCの(301)881-2
600に電話で問い合わせれば得られる。
【０１５１】
上記のクローン化されたものは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(A
TCC)に寄託されている。
（実施例５）
J1分離株の予想される「NS1」領域の配列を含有するHCVcDNAライブラリーは
、λ-gt22に直接クローニングすることによって得られた。「NS1」領域は、HCV1
のプロトタイプ核酸配列の番号系の、ヌクレオチド約1460番からヌクレオチド約
2730番に拡がっている。ここで、ヌクレオチドの１番目は、推定されるポリタン
パク質の開始メチオニンコドンの最初のヌクレオチドである。HCV cDNAの１番目
および２番目の鎖の合成用のプライマーは、それぞれJHC67およびJHC68であって
、RNA源はJ1血漿であったこと以外は、クローニングは、本質的には、Hanおよび
RutterのGENETICENGINEERING, Vol.10 (J.K.Setlow編, Plenum publishing
Co.
,1988)に記載されている方法によってなされた。この方法では、RNAは低温にお
いてグアニジウムチオシアネートで抽出する。次に、全長のcDNAに変換し、これ
をλファージに、lacZプロモーターの特定の方向にクローン化する。この方法に
よって、J1RNAに対するHCV cDNAを、λ-gt22のNotI部位に挿入した。ライブラ
リー中に「NS1」配列が存在することは、Alx54プローブを用いて検出した。
【０１５２】
図６３〜図６８に示されている領域と約20ヌクレオチドが重なって、この領域
から下流の「NS1」領域の配列は、PCR増幅用のプライマーとしてAlx61およびAlx
62に変えて、上記のアシンメトリック配列決定法によって決定した。得られた配
列は、図７７および図７８に示されている。(PCR増幅は、ヌクレオチドの約1930
番からヌクレオチドの約2340番の領域であって、この領域は、図６９および図７
０に示されている配列にも含まれることに注意。)λ-gt22のHCV
cDNAライブラリ
ーを得るため、および「NS1」領域の部分の配列を決定するために用いたプライ
マーおよびプローブの配列は、以下に示した。            
JHC 67
5'  GACGC GGCCG CCTCC
GTGTC CAGCG CGT    3'
JHC 68
5'  CGTGC GGCCG CAAGA
CTGCT AGCCGAGGT     3'
ALX 61
5'  ACCTG CCACT GTGTA
GTGGT CAGCAGTAAC     3'
ALX 62
5'  ACGGA CGTCT TCGTC
CTTAACAATACCAGG     3'
ALX 54
5'  GAACT TTGCG ATCTG
GAAGACAGGGACAGG     3'
配列決定された領域由来のJ1 HCV cDNAの400bpの断片を、pGEM3zにクローン化
してHB101に維持した。HCVcDNAは、SacIおよびXbaIによってベクターから取り
出し得る。ベクター(JH-400bp)で形質転換された宿主細胞は、ATCCに寄託されて
いる。
【０１５３】
プールされた。DNAライブラリーは、J1血清からつくった。プールされたライ
ブラリーはJ1ゲノムを全般にわたって含み、HCV-J1λ gt22として同定される。
プールされたcDNAライブラリーは、11個の別々のcDNAライブラリーの一部をプー
ルしてつくった。このライブラリーは、そのゲノムを全般にわたって含んだHCV 
cDNAを得るために設計されたプライマーからライブラリーをつくること以外は、
上記の直接(directional)クローニング法によって調製した。このプライマーは
、HCV1の配列由来であって、JHC67およびJHC68を含んでいた。HCVcDNAを、λ-g
t22のNotI部位に挿入した。プールされたcDNAライブラリーHCV-J1λ gt22は、A
TCCに寄託されている。
（実施例６）
図６３〜図６８に示されている配列の上流のポリヌクレオチドの領域の配列を
決定した。この領域は、HCV-1(図２９〜図５９参照)のヌクレオチドの-267位か
ら始まり、560個のヌクレオチドに広がる。J1血清から抽出したRNAからHCVcDNA
を調製し、そしてPCR法によってHCVcDNAを増幅して配列決定がなされた。
【０１５４】
RANは、プロティナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理した後、
血清100μlから抽出した。試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、RNAをエ
タノールで沈澱させた。
【０１５５】
J1分離株由来のHCVcDNAを、沈澱させたRNAを0.01MのMeHgOHで変性させて調製
した；10分間室温で放置した後、2-メルカプトエタノールを水銀イオンを離すた
めにsequesterに加えた。直ちに、cDNA合成の第一番目の鎖用の混合物を加えて
、37℃で１時間インキュベートを続けた。アンチセンス鎖の合成の条件を、以下
に示した：50mMTris HCl、pH8.3、75mM
KCl、3mM MgCl2、10mMジチオスレイト
ール、500μMの各々のデオキシヌクレオチド３リン酸、250pmolの特定のアンチ
センスcDNAプライマーr25、250ユニットのMMLV逆転写酵素。第２の鎖(センス)を
合成するために、合成反応成分を加えて14℃で１時間インキュベートした。第２
の鎖の反応成分を以下に示した：14mM Tris
HCl、pH8.3、68mMKCl、7.5mM硫酸
アンモニウム、3.5mMMgCl2、2.8mMジチオスレイトール、25ユニットのDNAポリ
メラーゼＩおよび１ユニットのRNアーゼＨ。反応は、試料を95℃で10分間加熱し
て停止した。その後、氷上で冷却した。
【０１５６】
HCV cDNAを、PCRを２回行って増幅した。１回目は、20μlのcDNA混合物を用い
て行った。PCR反応条件を以下に示した：10mMTris HCl、pH8.3、50mM KCl、1.5
mM MgCl2、0.002％ゼラチン、各々のデオキシヌクレオチド３リン酸200mM、およ
び2.5ユニットのAmplitaq。PCRの温度サイクルは、以下に示すとおりであった：
94℃１分間、50℃１分間、72℃１分間、40回繰り返した後、72℃７分間。PCRの
第２回目は、PCR産物の特異性を増すために、組み合わされたプライマー(すなわ
ち、PCR増幅の第１回目の産物の内部領域に結合されたプライマー)を用いて行わ
れた。第１回目のPCR反応物の１パーセントを、プライマーを取り替え、そしてP
CR反応の第２工程を、50℃を60℃に変えて行った以外は、本質的には第１回目の
ように増幅した。PCRの第１回目に用いたプライマーは、ALX90およびr14であっ
た。PCRの第２回目に用いたプライマーは、r14およびp14であった。
【０１５７】
HCV cDNAの合成用およびPCR法用のプライマーの配列を以下に示した：
r25
5'  ACC TTA CCC AAA TTG
CGC GAC CTA    3'
ALX90
5'  CCA TGA ATC ACT CCC
CTG TGA GGA ACTA     3'
r14
5'  GGG CCC CCAG CTA GGC
CGA GA     3'
p14
5' AACTAC TGT CTT CAC
GCA GAA AGC    3'
PCR産物をゲル精製し、約615bpの位置に移動したものを単離し、そして標識に
32P-ATPを用いて、Sangerのジデオキシチェーンターミネーション法の変法によ
って配列決定した。この変法では、配列の複製はプライマーとしてP32およびR31
を用いて開始した；２本鎖のDNAを複製の前に、３分間95℃で分離し、標識され
たジデオキシによって停止するポリヌクレオチドの合成は、業者の指針に従って
、Bstポリメラーゼ(BioRadCorp.より入手した)で触媒した。配列決定は、シー
ケンシング反応当りPCR産物500ngから１μgを用いて行った。
【０１５８】
プライマーP32(センス)およびR31(アンチセンス)は、それぞれに、HCV1配列の
ヌクレオチド-137から-115およびヌクレオチド192から173由来であった。プライ
マーの配列を以下に示す。                   
P32プライマー
5'  AAC CCG CTC AAT GCC
TGG AGA TT   3'
R31プライマー
5'  GGC CGX CGA GCC TTG
GGG AT   3'
ここでX＝AあるいはG
５'非翻訳領域および推定「コア」領域の一部を含むJ1分離株中の領域の配列
は、図７９および図８０に示す。図中、J1配列中にコードされるアミノ酸はヌク
レオチド配列の上に示している。プロトタイプHCV1の配列は、J1配列の下に示し
ている。棒線は、J1と相同な配列を示す。HCV1配列中にコードされる異なるアミ
ノ酸は、HCV1配列の下に示されている。
【０１５９】
上記の600bp(TC600bp)のJ1配列を代表するHCV cDNA断片を、pGEM3Zにクロー
ン化して、宿主HB101に維持した。HCVcDNA断片はSacIおよびXbaIで取り出し得
る。これは、ATCCに寄託されている。
【０１６０】
ブダペスト条約に基づいてPatent
MicroorganismDepositoryに寄託されてい
るもの。
【０１６１】
【表１】
2005143512.tif 000002
【０１６２】
実施例に記載されている以下のベクターはアメリカンタイプカルチャーコレク
ション(ATCC)，12301
Parklawn Dr.,Rockville, Maryland 20852に寄託されて
いて、以下の受託番号が付けられた。寄託物はブダペスト条約に基づいている。
【０１６３】
【表２】
2005143512.tif 000003
【０１６４】
これらの寄託物は当業者の利用に提供される。これらの寄託物は、これらの寄
託物が本発明を実施するために必要であることを認めるものでもなければ、本発
明の開示に関する同等の実施態様が当業者の範囲内に属さないことを認めるもの
でもない。これらの寄託物の公衆への入手可能性は、本特許および他の特許のも
とに、寄託物の製造、使用、あるいは販売のライセンスを与えるものではない。
寄託物の塩基配列は、本発明の開示に引例として引用され、本発明に記載された
全ての配列に関して争いを生じた場合にこれを規制する。
【０１６５】
（発明の要旨）
本発明は、以下を提供する。
【０１６６】
（１）  J7HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図１４から図１６において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして89、99、111、116、125、129、156、168、171、183、216、219、231、237、240、267、270、273、276、279、297、327、333、362、372、387、393、408、419、420、444、471、501、507、519、520、522、525、546、および552からなる群より選択される。
【０１６７】
（２）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図１７から図１９において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして１、19、20、22、25、46、52、67、94、95、97、100、124、125、130、136、139、142、148、149、151、154、160、163、166、167、179、180、181、182、184、188、190、196、202、205、208、212、214、220、223、232、241、244、246、247、251、256、259、262、271、274、283、287、288、292、293、298、299、301、304、310、314、316、319、322、326、328、331、332、338、342、345、346、347、353、355、359、361、362、364、370、374、379、380、385、388、393、394、397、398、400、401、406、409、412、413、415、427、430、436、442、445、448、449、452、453、457、472、475、476、478、481、484、485、486、490、491、492、493、496、498、499、505、511、526、527、530、532、535、538、547、571、574、578、および580からなる群より選択される。
【０１６８】
（３）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、そして該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図２０および図２１において同定されるヌクレオチド位置に対応し、９、12、16、18、21、24、27、28、31、33、37、39、57、58、61、70、72、75、78、81、96、103、105、108、111、113、114、135、141、142、145、147、151、156、159、171、176、178、180、185、189、192、198-204、211-216、220、221、223、225-230、235、237-239、243、246、249-252、258、259、261、267、268、270、279、291、292、297、300、303、321-323、328、330、333、336、338-340、342、345、347、および351からなる群より選択される。
【０１６９】
（４）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図２２から図２４において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして４、10、16、19、22、31、37、50、52、55、58、70、76、78、79、82、83、85、91、97、100、103、109、112、115、118、121、136、138、140、141、151、154、161、163、166、169、172、175、181、183、184、193、196、199、205、214、223、253、259、260、262、269、271、274、277、281、283、286、289、292、296、298、304、319、321、324、332、340、352、355、361、370、371、373、382、389、390、391、394、397、401、403、406、418、430、439、446、448、451、454、457、469、472、485、487、490、493、496、502、505、508、511、520、529、532、535、538、541、544、547、556、557、565、568、574、575、および577からなる群より選択される。
【０１７０】
（５）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図２５から図２７において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして16、19-21、28、32、34、52、70、88、96、100、106、107、115、124、133、136、142-144、146、152、158、159、163、166、173、175、181、187、188、190、205、214、217、226、234、235、241、244、256、259、277、295、298、310、311、321、324、337、348、349、358、365、367、370、381、385、389、392、393、397、400、406、411、および412からなる群より選択される。
【０１７１】
（６）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図６０から図６２において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして１-３、10、13、16、18-20、22、25、27、31、37-40、53、55、58、61、64、67、71、73、74、76、85、88、89、92、95、96、98、100、103、112、118、121、126、127、133、134、136-141、143、144、146、148、155、157、160、163、176、178、181-183、186、187、190、196、199、206、207、209、210、211、217、223、226、238、241、247、250、253、259、268、269、271、273、274、280、283、286、289、291、298、301、307、316、317、319、320、325、331、334、335、340、345、346、352、および361からなる群より選択される。
【０１７２】
（７）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図６３から図６８において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして１、19、20、22、25、46、52、67、94、95、97、100、124、125、136、139、142、148、149、151、154、160、163、166、167、179、180、181、182、184、188、190、196、202、205、208、212、214、220、223、232、241、244、246、247、251、256、257、259、262、271、274、283、287、288、292、293、298、299、301、304、310、314、316、319、322、326、328、331、332、338、342、345-347、353、355、359、360、361、362、364、370、374、379、380、385、388、393、394、397、398、400、401、406、409、412、413、415、427、430、436、442、445、448、449、452、453、457、472、475、476、478、481、484-486、490-493、496、498、499、505、511、526、527、530、532、535、538、547、571、574、578、580、583、586、589、590、593、595、599、601、619、620、623、632、634、637、640、643、658、665、667、670、673、675、676、697、703、704、707、709、713、718、721、733、738、740、742、747、751、754、760-766、773-778、782-785、787-792、797、799-801、805、808、811-815、820、821、823、829、830、832、841、853、854、859、862、865、883-885、890、892、895、898、900-902、904、907、909、913、919-923、935、937、940、943、946、949、953、955、956、958、967、970、971、974、977、978、980、982、985、994、1000、1003、1008、1009、1015-1026、1028、1030、1037、1039、1042、1045、1058、1060、1063-1065、1068、1069、1072、1078、1081、1088、1089、1091-1093、1099、1105、1108、1120、1123、1129、1132、1135、1141、1151、1153、1155、1156、1162、1165、1168、1171、1173、1180、1183、1189、1198、1199、1201、1202、1207、1213、1216、1217、1222、1227-1228、1234、および1243からなる群より選択される。
【０１７３】
（８）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図６９および図７０において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして８、17、23、32-35、41、50-52、61、62、65、68、72、73、80、85、86、99、102、103、113、116、125、129-131、135-137、143、147、149-152、155、158、161、164、167、171、173、179、186、191、200、203、209、215、218、221、224、227、228、235、236、242、245、248、249、251、260、266、269、272、および275からなる群より選択される。
【０１７４】
（９）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図７１から図７６において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして3799、3801、3813、3819、3821、3825、3828、3837、3840、3846、3849、3852、3855、3861、3864-3866、3873、3888、3889、3909、3912、3918、3927、3936、4134-4137、4144、4149、4151、4152、4164、4167、4182、4188、4200、4206、4222-4224、4227、4228、4230、4233、4234、4248、4251、4266、4278、4281、4284、4290、4293、4296、4299、4311、4314、5134、5136-5139、5143、5145、5148、5157、5160、5163、5167、5168、5181、5196、5202、5203、5205、5211、5214、5217、5218、5221-5223、5226、5229、5234、5236-5238、5241、5244-5246、5249-5253、5255-5257、および5260-5265からなる群より選択される。
【０１７５】
（１０）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図７７および図７８において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして２、23、39、47、87、101、106、118、160、175、178、194、202、223、229、230、242、244、247、251、277、291、295、316、322、および331からなる群より選択される。
【０１７６】
（１１）  J1HCVゲノムまたはその相補体の少なくとも８個の連続するヌクレオチドからなるオリゴマーを含む、実質的に単離された形態のプライマーまたはプローブであって、該連続するヌクレオチド配列が、Ｘ位のヌクレオチドを包含する、プライマーまたはプローブ、ここで、Ｘは図７９および図８０において同定されるヌクレオチド位置に対応し、そして169、266、276、293、299、318、345、348、373、390、393、396、414、417、444、447、450、453、456、474、476、490、531、538、539、540、および549からなる群より選択される。
【０１７７】
（１２）  少なくとも15個のヌクレオチドを含む、項目１〜１１のいずれかに記載のプライマーまたはプローブ。
【０１７８】
（１３）  少なくとも20個のヌクレオチドを含む、項目１２に記載のプライマーまたはプローブ。
【０１７９】
（１４）  テスト試料中のHCVポリヌクレオチドを検出する方法であ
って、
(ａ)項目１〜１３のいずれかに記載のプローブを提供する工程、
(ｂ)該プローブとその相補体との間でポリヌクレオチド二重鎖を形成させ、該テスト試料中に存在する非HCVポリヌクレオチド配列と該プローブとの間で実質的なポリヌクレオチド二重鎖の形成が無い条件下で、該テスト試料と該プローブとを接触させる工程、および
(ｃ)該プローブを含有するいかなるポリヌクレオチド二重鎖をも検出する工程、
を包含する、方法。
【０１８０】
（１５）  受託番号FERM BP-2593、FERMBP-2594、FERM BP-2595、FERM BP-2637、FERM BP-2638、FERMBP-3081、ATCCNo.68392、ATCC No.68393、ATCC No.68394、ATCC No.68395、ATCC No.40884で寄託されている材料からなる群由来のHCV由来の材料を含有する生物学的材料。
【０１８１】
（１６）  少なくとも10個のアミノ酸の連続配列を含有する、精製されたポリペプチドであって、該連続配列が、
(ａ)図１４から図１６、図１７から図１９、図２０および図２１、図２２から図２４、図２５から図２７、図６０から図６２、図６３から図６８、図６９および図７０、図７１から図７６、図７７および図７８、または、図７９および図８０に示されるJ1またはJ7アミノ酸配列から得られ、
(ｂ)HCV-J1またはHCV-J7に対する抗体によって結合され得る抗原性決定基を含有し、そして
(ｃ)図２９から図５９に示されるHCV-1配列の対応する部分によりコードされるアミノ酸と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ポリペプチド。
【０１８２】
（１７）  前記連続する配列が少なくとも15個のアミノ酸からなる、項目１６に記載のポリペプチド。
【０１８３】
（１８）  前記連続する配列が少なくとも20個のアミノ酸からなる、項目１６に記載のポリペプチド。
【０１８４】
（１９）  化学的に合成される、項目１６に記載のポリペプチド。
【０１８５】
（２０）  固体支持体上に固定されている、項目１６〜１９のいずれかに記載のポリペプチド。
【０１８６】
（２１）  テスト試料中の抗HCV抗体の存在を検出するための方法であって、
(ａ) 項目１６〜２０のいずれかに記載のポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体を形成する条件下で、該テスト試料をインキュベートする工程であって、ここで、該ポリペプチドが、HCV-1に対する抗体と免疫学的に交差反応しない、工程、および
(ｂ)形成したいかなる抗原−抗体複合体をも検出する工程、を包含する、方法。
【０１８７】
（２２）  前記テスト試料がヒト血液またはその画分を含む、項目２１に記載の方法。
【０１８８】
本発明が、当該分野の当業者のために特定の実施例によって記述したが、本発
明の範囲はこれに制限されない。なぜならば、本発明の開示からさらに別の実施
態様が、当業者には明らかだからである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】J7 C/Eドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所とともに示す。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】J1 Eドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所とともに示す。
【図５】図４の続きである。
【図６】図５の続きである。
【図７】J1 E/NS1ドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所とともに示す。
【図８】図７の続きである。
【図９】J1 NS3ドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所とともに示す。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】図１０の続きである。
【図１２】J1 NS5ドメインの断片のコード鎖のコンセンサス配列を、異なる箇所とともに示す。
【図１３】図１２の続きである。
【図１４】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列とのJ7C/Eのコンセンサス配列の相同性を示す。
【図１５】図１４の続きである。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】J1 Eのコンセンサス配列の、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列との相同性を示す。
【図１８】図１７の続きである。
【図１９】図１８の続きである。
【図２０】J1 E/NS1のコンセンサス配列の、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列との相同性を示す。
【図２１】図２０の続きである。
【図２２】J1 NS3のコンセンサス配列の、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列との相同性を示す。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】J1 NS5のコンセンサス配列の、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列との相同性を示す。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】HCV1ゲノムの推定ゲノム構造を示す。
【図２９】HCV1のORFヌクレオチド配列を示す。図では、ヌクレオチド番号１は、大きいORFの推定開始メチオニンの最初のＡである。このヌクレオチドの上流のヌクレオチドはマイナスの番号が賦されている。
【図３０】図２９の続きである。
【図３１】図３０の続きである。
【図３２】図３１の続きである。
【図３３】図３２の続きである。
【図３４】図３３の続きである。
【図３５】図３４の続きである。
【図３６】図３５の続きである。
【図３７】図３６の続きである。
【図３８】図３７の続きである。
【図３９】図３８の続きである。
【図４０】図３９の続きである。
【図４１】図４０の続きである。
【図４２】図４１の続きである。
【図４３】図４２の続きである。
【図４４】図４３の続きである。
【図４５】図４４の続きである。
【図４６】図４５の続きである。
【図４７】図４６の続きである。
【図４８】図４７の続きである。
【図４９】図４８の続きである。
【図５０】図４９の続きである。
【図５１】図５０の続きである。
【図５２】図５１の続きである。
【図５３】図５２の続きである。
【図５４】図５３の続きである。
【図５５】図５４の続きである。
【図５６】図５５の続きである。
【図５７】図５６の続きである。
【図５８】図５７の続きである。
【図５９】図５８の続きである。
【図６０】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列と比べた、J1NS1のドメイン(J1 1519)の断片のコード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、そこにコードされるアミノ酸も示す。
【図６１】図６０の続きである。
【図６２】図６１の続きである。
【図６３】HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列と比べた、J1のコアからNS1ドメインのコンセンサス配列を示す。さらに、そこにコードされるアミノ酸も示す。
【図６４】図６３の続きである。
【図６５】図６４の続きである。
【図６６】図６５の続きである。
【図６７】図６６の続きである。
【図６８】図６７の続きである。
【図６９】実施例４で決定されたJ1のNS1ドメインのコード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列およびHCV1およびJ1配列にコードされるアミノ酸を示す。
【図７０】図６９の続きである。
【図７１】J1のNS3-NS4ドメインのC200領域のコード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列を示す。さらに、配列中にコードされるアミノ酸も示す。
【図７２】図７１の続きである。
【図７３】図７２の続きである。
【図７４】図７３の続きである。
【図７５】図７４の続きである。
【図７６】図７５の続きである。
【図７７】実施例５で決定されたJ1のNS1ドメインのコード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列を示す。さらに、配列中にコードされるアミノ酸も示す。
【図７８】図７７の続きである。
【図７９】J1の非翻訳ドメインおよびコアドメインのコード鎖のコンセンサス配列を示す。さらに、HCV1の同じドメインのヌクレオチド配列、および配列中にコードされるアミノ酸も示す。
【図８０】図７９の続きである。
【図１】
2005143512.tif 000004
【図２】
2005143512.tif 000005
【図３】
2005143512.tif 000006
【図４】
2005143512.tif 000007
【図５】
2005143512.tif 000008
【図６】
2005143512.tif 000009
【図７】
2005143512.tif 000010
【図８】
2005143512.tif 000011
【図９】
2005143512.tif 000012
【図１０】
2005143512.tif 000013
【図１１】
2005143512.tif 000014
【図１２】
2005143512.tif 000015
【図１３】
2005143512.tif 000016
【図１４】
2005143512.tif 000017
【図１５】
2005143512.tif 000018
【図１６】
2005143512.tif 000019
【図１７】
2005143512.tif 000020
【図１８】
2005143512.tif 000021
【図１９】
2005143512.tif 000022
【図２０】
2005143512.tif 000023
【図２１】
2005143512.tif 000024
【図２２】
2005143512.tif 000025
【図２３】
2005143512.tif 000026
【図２４】
2005143512.tif 000027
【図２５】
2005143512.tif 000028
【図２６】
2005143512.tif 000029
【図２７】
2005143512.tif 000030
【図２８】
2005143512.tif 000031
【図２９】
2005143512.tif 000032
【図３０】
2005143512.tif 000033
【図３１】
2005143512.tif 000034
【図３２】
2005143512.tif 000035
【図３３】
2005143512.tif 000036
【図３４】
2005143512.tif 000037
【図３５】
2005143512.tif 000038
【図３６】
2005143512.tif 000039
【図３７】
2005143512.tif 000040
【図３８】
2005143512.tif 000041
【図３９】
2005143512.tif 000042
【図４０】
2005143512.tif 000043
【図４１】
2005143512.tif 000044
【図４２】
2005143512.tif 000045
【図４３】
2005143512.tif 000046
【図４４】
2005143512.tif 000047
【図４５】
2005143512.tif 000048
【図４６】
2005143512.tif 000049
【図４７】
2005143512.tif 000050
【図４８】
2005143512.tif 000051
【図４９】
2005143512.tif 000052
【図５０】
2005143512.tif 000053
【図５１】
2005143512.tif 000054
【図５２】
2005143512.tif 000055
【図５３】
2005143512.tif 000056
【図５４】
2005143512.tif 000057
【図５５】
2005143512.tif 000058
【図５６】
2005143512.tif 000059
【図５７】
2005143512.tif 000060
【図５８】
2005143512.tif 000061
【図５９】
2005143512.tif 000062
【図６０】
2005143512.tif 000063
【図６１】
2005143512.tif 000064
【図６２】
2005143512.tif 000065
【図６３】
2005143512.tif 000066
【図６４】
2005143512.tif 000067
【図６５】
2005143512.tif 000068
【図６６】
2005143512.tif 000069
【図６７】
2005143512.tif 000070
【図６８】
2005143512.tif 000071
【図６９】
2005143512.tif 000072
【図７０】
2005143512.tif 000073
【図７１】
2005143512.tif 000074
【図７２】
2005143512.tif 000075
【図７３】
2005143512.tif 000076
【図７４】
2005143512.tif 000077
【図７５】
2005143512.tif 000078
【図７６】
2005143512.tif 000079
【図７７】
2005143512.tif 000080
【図７８】
2005143512.tif 000081
【図７９】
2005143512.tif 000082
【図８０】
2005143512.tif 000083