(57)【要約】  【課題】    光アフィニティーラベル試薬として有用なジアジリン基を有するホモフェニルアラニン及びその合成法を提供する。  【解決手段】      下式【化１】2005263748.tif 000016（式中、Ｒ１はCF3等を表し、Ｒ２は水素原子やメトキシ基等を表す。）で表される反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（化１）
【化１】
2005263748.tif 000013
（式中、Ｒ１はアルキル基又はフッ素置換アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、アルコキシ基又はアルキレンオキシドを介した置換又は非置換のアルキル基を表す。）で表される反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体。
【請求項２】
液相で下記−般式（化２）
【化２】
2005263748.tif 000014
（式中、Ｒ１はアルキル基又はフッ素置換アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、アルコキシ基又はアルキレンオキシドを介した置換又は非置換のアルキル基を表す。）で表されるジアジリン化合物に、下記一般式（化３）
【化３】
2005263748.tif 000015
(式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれアミノ基及びカルボキシル基の保護基を表し、Ｘはハロゲン原子を表す。)で表されるアスパラギン酸β−酸ハライド化合物を反応させる段階、及びその生成物を還元し、必要に応じて脱保護する段階から成る記載の反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体の製法。
【請求項３】
Ｒ１が−ＣＦ３を表し、Ｒ２が水素原子又はアルコキシ基を表し、Ｒ２が−ＣＮ２ＣＦ３に対してメタ位にある請求項２に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、光反応性ジアジリン基をもつホモフェニルアラニン（炭素鎖の一つ長いフェニルアラニン）化合物及びその合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアジリン基は生理活性低分子化合物と生体高分子（蛋白質、核酸等）との相互作用解析できる光親和性標識（光アフィニティーラベル）試薬としてが注目されている。現在までに、光反応性ジアジリンをもつアミノ酸誘導体としてフェニルアラニン誘導体が報告されている(非特許文献１)。
ホモフェニルアラニンはフェニルアラニンのメチレン１個分鎖長延長した化合物であるが、フェニルアラニンと異なる生理活性を持つことが報告されている(非特許文献２、３)。
ホモフェニルアラニンの合成法の一つとして、芳香族化合物（ベンゼン）とアスパラギン酸無水物によるフリーデルークラフト反応を行い、続いて（アリール）カルボニル基のパラジウム炭素による水素添加によるメチレンへの還元を行う方法が報告されている(非特許文献４)。
【０００３】
【非特許文献１】J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, 7540
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry vol.275, No.19 14659-14666, 2000
【非特許文献３】Archives of Biochemistry and Biophysics 403 (2002) 160-170
【非特許文献４】tetrahedron: assymmetry, 12, 1583-1587 (2001)
【非特許文献５】J. Chem. Soc.,1959, 1308-1309、
【非特許文献６】Heterocycles, 59, 395-398 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ジアジリン基を有するホモフェニルアラニンの合成は今まで成功していない。
ジアジリンを持つホモフェニルアラニン誘導体の従来の合成方法(非特許文献４)には以下の問題があった。即ち、ジアジリン化芳香族化合物は反応性が低く、アスパラギン酸無水物では反応が進行しない。パラジウム炭素による水素添加反応は、ジアジリンの窒素-窒素二重結合へも反応してしまう。
従って、本発明は、これらの問題を解決して、光アフィニティーラベル試薬として有用なジアジリン基を有するホモフェニルアラニンを合成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ジアジリン化芳香族化合物は反応性が低く、アスパラギン酸無水物では反応が進行しない問題については、アスパラギン酸のβ−酸クロライド(非特許文献５)を用いて問題を解決した。
一方、パラジウム炭素による水素添加反応がジアジリンの窒素-窒素二重結合へも反応してしまう問題については、トリエチルシランとトリフルオロ酢酸による（アリール）カルボニル基のメチレンへの還元法(非特許文献６)を用いることで還元に成功した。
その結果、ジアジリン化ホモフェニルアラニンを初めて合成することに成功した。
【０００６】
即ち、本発明は、下記一般式（化１）
【化１】
2005263748.tif 000002
（式中、Ｒ１はアルキル基又はフッ素置換アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子、アルコキシ基又はアルキレンオキシドを介した置換又は非置換のアルキル基を表す。）で表される反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体である。
【０００７】
また本発明は、液相で下記−般式（化２）
【化２】
2005263748.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記と同様に定義される。）で表されるジアジリン化合物に、下記一般式（化３）
【化３】
2005263748.tif 000004
(式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれアミノ基及びカルボキシル基の保護基を表し、Ｘはハロゲン原子を表す。)で表されるアスパラギン酸β−酸ハライド化合物を反応させる段階、及びその生成物を還元し、必要に応じて脱保護する段階から成る記載の反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体の製法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、既知のホモフェニルアラニン誘導体合成法(非特許文献４．６)を改良することにより、光反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体を合成することに成功した。そのため、光親和性標識（光アフィニティーラベル）試薬として期待されるホモフェニルアラニン誘導体を提供することを可能にした。この化合物を合成できたことにより、ペプチドや蛋白質における芳香族アミノ酸の果たす役割を解明する有効な手段を得たことになり、その価値は高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いるジアジリン化合物は下式（化２）で表される。
【化２】
2005263748.tif 000005
Ｒ１はアルキル基又はフッ素置換アルキル基、好ましくはフッ素置換アルキル、より好ましくは−ＣＦ３を表す。
Ｒ２は水素原子、アルコキシ基又はアルキレンオキシドを介した置換又は非置換のアルキル基、好ましくは水素原子又はアルコキシ基を表し、アルコキシ基の炭素数は１〜３が好ましい。アルキレンオキシドを介した置換又は非置換のアルキル基は好ましくは−（ＣｍＨ２ｍＯ）ｎ−（ＣＨ２）ｏ−Ｒ５で表され、式中、ｍは２又は３、ｎは１〜６、ｏは１〜４を表し、Ｒ５は水素原子、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基、好ましくは水素原子を表す。Ｒ２は−ＣＮ２Ｒ１に対してメタ位にあることが好ましい。
また、ジアジリン化合物中にＲ２は複数あってもよく、その際それぞれは同一であっても異なってもよい。
【００１０】
本発明で用いるアスパラギン酸β−酸ハライド化合物は下式（化３）で表される。
【化３】
2005263748.tif 000006
Ｒ３はアミノ基保護基を表す。アミノ基の保護基として、例えば、Teoc(トリメチルシリルエトキシカルボニル、Me3SiCH2CH2OCO-)、アセチル基、CF3CO-、CH3(CH2)nCO-等のアシル基等が挙げられる。
Ｒ４はカルボキシル基の保護基を表す。カルボキシル基の保護基として、例えば、アルキル基、特にメチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
Ｘはハロゲン原子、好ましくは塩素原子及び臭素原子を表す。
【００１１】
この反応において、溶媒として、ニトロメタン、ニトロベンゼン、エーテル、ニトリル、エステル等の一般的有機溶媒を用いることができる。特にこの溶媒として、ニトロメタンが好ましい。
本発明では触媒として、四塩化チタン、塩化アルミニウム等を使用することができる。
触媒の添加量は、1〜10 mol/l程度である。
溶媒中のジアジリン化合物の濃度は好ましくは0.1〜1 mol/l程度である。
溶媒中のアスパラギン酸β−酸ハライド化合物の濃度は好ましくは0.2〜2 mol/l程度である。
この反応の温度は、好ましくは10〜25℃である。
この反応時間は、2〜12時間程度である。
生成物は抽出、カラムクロマトグラフィー、蒸留、再結晶等の一般的精製法を利用して回収でき、化３で示される立体を保持して合成することができる。
【００１２】
本発明の方法により得られるホモフェニルアラニン誘導体は下式（化１）で表される。
【化１】
2005263748.tif 000007
(式中、Ｒ１及びＲ２は上記と同様に定義される。)
【００１３】
このような化合物は、例えば、自動ペプチド合成機もしくは一般的なペプチド合成反応により生理活性ペプチド内に導入することができ、光アフィニティーラベルを実施し、当該生理活性ペプチド受容体の同定に利用することができる。
【００１４】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
製造例１
ジアジリン化合物a5を、既報（J.Org.Chem., 59,383-387, 1994；heterocycles,49, 465-468, 1998）に従い合成した。
【化４】
2005263748.tif 000008
【００１５】
化合物a1(50.0 g, 0.267 mol,特級、和光純薬)と金属マグネシウム(6.52 g, 0.268 mol、特級、和光純薬)をテトロヒドロフラン(200 m、無水、和光純薬)中で還流した。金属マグネシウムが溶解した後、-15℃に冷却しトリフルオロアセチルピペリジン(無水トリフルオロ酢酸とピペリジンから調製、38.6 g, 0.213 mol)を加えて室温で8時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水を加えて生じた沈澱をろ過、酢酸エチル（特級、和光純薬）で洗浄後、ろ液を硫酸マグネシウム（特級、和光純薬）で、乾燥した。ろ過後溶媒留去し、残った残渣を蒸留により精製し、化合物a2を得た（収率80％）。
【００１６】
化合物a2と塩酸ヒドロキシルアミン(11.7 g, 0.168 mol、特級、和光純薬)をエタノール(30 ml、特級、和光純薬)とピリジン (100 ml、特級、和光純薬)の混合溶媒に溶解し２時間還流した。濃縮後、残渣を水−酢酸エチルで分配し酢酸エチル層を1N HClで洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後溶媒留去後塩化メチレン−メタノール＝20：1によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し化合物（オキシム体）a3を得た（収率96％）。
【００１７】
化合物a3、4-ジメチルアミノピリジン(1.52 g, 0.012 mol、特級、和光純薬)を塩化メチレン(100 ml、特級、和光純薬)とトリエチルアミン(70 ml、特級、和光純薬)に溶解し、0℃で塩化p-トルエンスルホニル(75.0 g, 0.393 mol、特級、和光純薬)を加えた。室温で２時間撹拌後水を加えた。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥しろ過し、濃縮した残渣を塩化メチレン（80 ml）に溶解した。-78℃で液体アンモニア（16 ml、ホクサン製、99％）を加え密封し、室温で18時間撹拌した。濃縮後、残渣を水−塩化メチレンで分配し塩化メチレン層を硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後溶媒留去しエーテルによるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し化合物a4を得た（収率52％）。
【００１８】
化合物a4(37.2 g, 0.171 mol)をトリエチルアミン(50 ml、特級、和光純薬)とメタノール(300 ml) に溶かし0℃でヨウ素(30.0 g、特級、和光純薬)を加え、１時間撹拌した。濃縮後残渣を水−エーテルで分配しエーテル層を1N HCl、１N硫酸水素ナトリウム（特級、和光純薬）、飽和食塩水で順次洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後溶媒留去後塩化メチレン−ヘキサン＝1：2によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し化合物a5を得た（収率51％）。
【００１９】
製造例２
下記化合物b2（4-chlorocarbonyl-2-(2,2,2-trifluoro-acetylamino)-butyric acid methyl ester）を、既報(J. Chem. Soc.,1959, 1308-1309）に従い合成した。
【化５】
2005263748.tif 000009
N-Trifluoroacetyl-L-aspartic anhydride (化合物b1, Aldrich社、0.2590 g, 1.227 mmol)をメタノール中 (和光純薬特級、6 ml) 3時間還流した。溶媒を留去後、残渣に酢酸エチルを加え不溶性物質をろ過した。ろ液を濃縮し、thionyl chloride (和光純薬特級、0.5 ml)を加えベンゼン（和光純薬特級、10 ml）中で30分還流した。濃縮後、少量のベンゼンから再結晶することで無色固体（化合物b2）を得た(0.2053 g, 0.785 mmol, 64%)。
【実施例１】
【００２０】
本実施例では、反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体を合成した。
まず下式で示す反応により化合物３を合成した。
【化６】
2005263748.tif 000010
製造例１で得た化合物１(化合物a5)(0.0554 g, 0.256 mmol)及び製造例２で得た化合物２(化合物b2)(0.1372 g, 0.524 mmol)をニトロメタン(Aldrich社、0.5 ml)に溶かし、四塩化チタン(和光純薬特級、0.5 ml, 4.560 mmol)を0℃で加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し、氷−酢酸エチル中に注ぎ込んだ。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウンムで乾燥させた。ろ過後。濃縮し シリカカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:hexane = 2.5:1)にて精製し化合物３を無色油状物質として得た。 (19.7 mg, 0.045 micromol, 17%). 1H-NMR (CDCl3)δ: 7.846 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.466 (1H, m, NH), 6.854 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.692 (1H, s), 4.893 (1H, dt, J = 3.95, 4.30 Hz), 3.954 (3H, s), 3.834 (1H, d, J = 4.3 Hz), 3.778 (3H, s), 3.593 (1H, d, J = 3.96 Hz), [α]D = +42.5 (c 6.2 CHCl3), FAB-MS m/z 442 (MH+), HR-FAB-MS calcd for C16H14O5N3F6 442.0837 found 442.0854
【００２１】
次に、得られた化合物３を還元し、化合物４を合成した。
【化７】
2005263748.tif 000011
上記で得た化合物３(9.7 mg, 0.022 mmol)をトリフルオロ酢酸 (和光純薬特級、0.7 ml) にとかし、室温でトリエチルシラン(和光純薬特級、0.1 ml, 0.626 mmol)を加えた。室温で１時間撹拌した後、濃縮し、シリカカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:hexane = 2:1)にて精製し化合物４を無色油状物質として得た(3.0 mg, 0.007 mmol, 32%)。 1H-NMR (CDCl3)δ: 7.123 (1H, d, J=7.6 Hz), 6.985 (1H, m, NH), 6.748 (1H, d, J=7.6 Hz), 6.580 (1H, s), 4.642 (1H, dt, J = 5.94, 13.2 Hz), 3.822 (3H, s), 3.686 (3H, s), 2.644 (2H, t, J = 7.26 Hz), 2.231 (1H, m), 2.087 (1H, m), [α]D = +50.3 (c 1.5 CHCl3), FABMS m/z 428 (MH+), HR-FABMS calcd for C16H16F6N3O4 428.1045 found 428.1031
【００２２】
次に、得られた化合物４を脱保護して反応性ジアジリン基を有するホモフェニルアラニン誘導体を合成した。
【化８】
2005263748.tif 000012
上記で得た化合物４(1.8 mg, 0.004 mmol)をメタノール(和光純薬特級、0.2 ml)に溶かし、１Nの水酸化ナトリウム(0.2 ml)を加え室温で10時間撹拌した。濃縮後シリカカラムクロマトグラフィー(CH3CN:CH3OH:H2O = 4:1:1)にて精製し無色固体を得た(1.3 mg, 0.004 mmol, 100%)。1H-NMR (CD3OD) δ: 7.27 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.81 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.69 (1H, s), 3.84 (3H, d, J = 3.4 Hz), 3.53 (1H, t, J = 6.3 Hz), 2.78-2.74 (4H, m), 2.11-2.03 (4H, m), [α]D = -21.5 (c 0.65 CH3OH), FABMS m/z 318 (MH+), HR-FABMS calcd for C13H15F3N3O3 318.1066 found 318.0975