(57)【要約】 【課題】  細胞が生着するのに適した生体内の環境を構築して、生着性を向上し、人工臓器を構築した場合に、耐久的に人工臓器としての機能を保持させる人工臓器構成材および人工臓器構成体を製造する。【解決手段】  人工臓器を構成する人工臓器構成材１の製造方法であって、細胞外基質３を産生する細胞Ａを基材２の表面に播種して培養するステップと、基材２表面に接着して細胞外基質３を産生した細胞Ａを死滅させるステップを含む人工臓器構成材１の製造方法を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工臓器を構成する人工臓器構成材の製造方法であって、
細胞外基質を産生する細胞を基材の表面に播種して培養するステップと、
前記基材表面に接着して細胞外基質を産生した細胞を死滅させるステップを含む人工臓器構成材の製造方法。
【請求項２】
前記基材が、マイクロキャリア、ホローファイバーまたは不織布のいずれかにより構成されている請求項１に記載の人工臓器構成材の製造方法。
【請求項３】
前記細胞外基質を産生する細胞が、血管内皮細胞、繊維芽細胞または幹細胞のいずれかである請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の人工臓器構成材の製造方法。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載された製造方法により製造された人工臓器構成材に、臓器構成細胞を播種して培養する人工臓器構成体の製造方法。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載された製造方法により製造された人工臓器構成材を備える人工臓器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、人工臓器、特に人工肝臓等の人工臓器を構成する人工臓器構成材および人工臓器構成体の製造方法および人工臓器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生理活性物質、例えば、ウロキナーゼや組織プラスミノーゲンアクチベーター、β型インターフェロン等は、それらを産生する細胞、例えば、ヒト腎細胞や血管内皮細胞、メラノーマ細胞、ヒト二倍体繊維芽細胞等の付着依存性細胞をマイクロキャリア培養法を用いて大量培養することにより生産される（非特許文献１，２参照）。マイクロキャリアとは、付着性動物細胞を付着・増殖させるための微小粒子をいい、通常、直径約１００〜３００μｍ、表面積約３０００〜６０００ｃｍ２／ｇの球状粒子であり、デキストラン、ゼラチンあるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基が付与されている。
【０００３】
また、人工臓器としては、例えば、非特許文献３，４に示されるような、人工肝臓が提案されている。これらの文献には、血液を流通可能な容器内に、表面に肝細胞を接着させたマイクロキャリアまたは中空糸膜を封入した構造の人工肝臓、あるいは、肝細胞を付着させた不織布によって中空糸を巻いた構造の人工肝臓が開示されている。
【非特許文献１】松谷、「生物化学実験法２９  動物細胞培養入門」、株式会社学会出版センター、１９９３年、ｐ．２１８−２２３
【非特許文献２】大石、「動物細胞培養技術と物質生産」、株式会社シーエムシー出版、１９８６年、ｐ．１８７−１９０
【非特許文献３】石原他２名、「バイオハイブリッド型人工肝臓：肝組織の再構築化とバイオハイブリッド型人工肝臓」、最新医学、最新医学社、第５８巻、２００３年６月増刊号、ｐ．１４７−１５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記各非特許文献１〜４に開示されている技術では、付着させる細胞にとって、生体内での環境が構築されているとは言い難い。すなわち、接着性の細胞を単にマイクロキャリアの表面や不織布の表面に付着させるだけでは、細胞が長期にわたって生着状態に維持されることが困難であり、人工臓器のように生体内の機能を模倣する必要がある用途に応用する場合には、その耐久的な使用に問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞が生着するのに適した生体内の環境を構築して、生着性を向上し、人工臓器を構築した場合に、耐久的に人工臓器としての機能を保持させることが可能な人工臓器構成材および人工臓器構成体の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、人工臓器を構成する人工臓器構成材の製造方法であって、細胞外基質を産生する細胞を基材に播種して培養するステップと、前記基材表面に接着して細胞外基質を産生した細胞を死滅させるステップとを含む人工臓器構成材の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、細胞外基質を産生する細胞を基材に播種して培養するステップにより、細胞が基材の表面に付着して成長する際に細胞外基質を基材表面に産生する。この状態で、細胞を死滅させるステップにより、基材表面に付着して細胞外基質を産生した細胞が死滅させられる。これにより、死滅した細胞が産生していた細胞外基質が基材表面に付着状態に残された状態の人工臓器構成材が製造されることになる。
【０００８】
このようにして製造された人工臓器構成材によれば、その表面に細胞外基質、その他の産生物質が付着状態に残されているので、臓器構成細胞を播種すると、それらの産生物質の作用によって臓器構成細胞に対して生体内と同様の環境を構築することが可能となり、臓器構成細胞の成長が促進されるとともに、生着性を向上させて、耐久的な使用にも耐え得る人工臓器を構成することが可能となる。
また、生きた細胞は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）が一致しない場合には免疫拒絶反応を生じさせるが、細胞を死滅させた後に残る細胞外基質等の産生物質は免疫拒絶反応を生じさせないので、ドナーとは異なる患者にも容易に移植することができる人工臓器を構成することができる。
【０００９】
上記発明においては、基材として、マイクロキャリア、ホローファイバーまたは不織布のいずれかにより構成することが好ましい。
基材としてマイクロキャリアを用いると、マイクロキャリアは、比重が１．０３〜１．０４と水よりわずかに重いだけであるために、少し攪拌しただけで培養液内において自然浮遊状態とすることができるので、浮遊しながら細胞を表面に付着させ、迅速に細胞を増殖させることが可能となる。
【００１０】
また、基材としてホローファイバーを用いると、内部に酸素や二酸化炭素を流通させ、外部に血漿を通過させるような人工臓器構成材を製造することができる。
さらに、基材として不織布を用いると、広い比表面積を有し、かつ、形態を簡便に調節できる人工臓器構成材を製造することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記細胞外基質を産生する細胞が、血管内皮細胞、繊維芽細胞または幹細胞のいずれかであることが好ましい。
これらの細胞は、ヒトの体内のあらゆる場所に多く存在する細胞であり、入手性が高いので、人工臓器構成材の製造を容易にすることができる。
【００１２】
また、本発明は、上記製造方法により製造された人工臓器構成材に、臓器構成細胞を播種して培養する人工臓器構成体の製造方法を提供する。
本発明によれば、人工臓器構成材の表面に播種された臓器構成細胞は、細胞外基質を含む産生物質の作用によってその成長を促進されるので、迅速に人工臓器構成体を製造することができる。
【００１３】
また、本発明は上記製造方法により製造された人工臓器構成材を備える人工臓器を提供する。
本発明によれば、人工臓器構成材に生着する臓器構成細胞が、細胞外基質を含む産生物質の作用によって長期にわたり生着状態に維持されるので、耐久性を向上することができるという効果を奏する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る人工臓器構成材および人工臓器構成体の製造方法によれば、臓器構成細胞の生着性を高め、臓器構成細胞が耐久的に生着状態に維持される人工臓器を構築可能な人工臓器構成材および人工臓器構成体を製造することができるという効果を奏する。また、この人工臓器構成材を用いた人工臓器によれば、長期にわたり耐久的に使用可能であり、患者にかかる負担を低減することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態に係る人工臓器構成材の製造方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る人工臓器構成材１の製造方法は、図１に示されるように、マイクロキャリア（基材）２の表面に細胞外基質３をコーティングした状態の人工臓器構成材１を製造する方法である。マイクロキャリア２は、付着性動物細胞を付着・増殖させるための微小粒子であって、直径約１００〜３００μｍ、表面積約３０００〜６０００ｃｍ２／ｇの球状粒子であり、デキストラン、ゼラチンあるいはポリスチレン等の素材により構成されている。
【００１６】
本実施形態に係る製造方法は、図２に示されるように、培養ステップＳ１と、処理ステップＳ２と、除去ステップＳ３とを含んでいる。
培養ステップＳ１は、例えば、図３（ａ）に示されるように、任意の培養容器４内に貯留した所定の培地５内に、複数のマイクロキャリア２を投入するとともに、繊維芽細胞または血管内皮細胞等の細胞Ａ（以下繊維芽細胞Ａとして説明する。）を投入して、所定の培養条件下に配することにより行われる。
【００１７】
所定の培地５は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、ＦＢＳがなくてもよい。さらに、所定の培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％である。
【００１８】
繊維芽細胞Ａは、培地５内をマイクロキャリア２とともに浮遊する間に、マイクロキャリア２と接触してその表面に付着することにより成長を開始する。マイクロキャリア２の表面に接着して成長する繊維芽細胞Ａは、成長しながら、細胞外基質３その他の産生物質、例えば、ＭＢＰ（Maltose Binding
Protein）等を産生する。これらの産生物質は、マイクロキャリア２の表面全面を被覆して接着状態に配される。
【００１９】
処理ステップＳ２は、図３（ｂ）に示されるように、培養ステップＳ１により、マイクロキャリア２の表面に付着して成長した繊維芽細胞Ａに対して、例えば、１５〜５０Ｇｙのγ線を照射するステップである。γ線を照射することにより、繊維芽細胞Ａがγ線のエネルギによって死滅する。したがって、マイクロキャリア２の表面には免疫拒絶反応を生じさせる生きた繊維芽細胞Ａが存在しなくなり、そのまま、繊維芽細胞Ａを採取したドナーとは異なる患者に供給することが可能となる。
【００２０】
なお、上記実施形態においては、処理ステップＳ２として、γ線を照射する方法を採用したが、これに代えて、γ線以外の他の電子線等の放射線を照射することにしてもよい。
また、放射線を照射する方法に代えて、繊維芽細胞Ａを−２０℃程度に冷却して凍結させる方法を採用してもよい。これによれば、凍結により繊維芽細胞Ａの細胞膜内部の組織液を膨張させて細胞膜を破壊し、同様に繊維芽細胞Ａを死滅させることができる。また、氷塊が生成されることによって細胞膜が損傷しても、繊維芽細胞Ａによって産生された細胞外基質３などの産生物質は変質することがない。そして、凍結後、室温にて徐々に解凍し、あるいは電子レンジにより解凍することにより、人工臓器構成材１が製造されることになる。
【００２１】
また、上記方法に代えて、繊維芽細胞Ａに超音波（例えば、４７ｋＨｚ）を間欠的に照射することにしてもよい。このとき、超音波照射による発熱で、繊維芽細胞Ａ内のタンパク質等が変質することを防止するために、繊維芽細胞Ａを冷却してもよい。これにより、上記と同様に、繊維芽細胞Ａを死滅させることができる。
【００２２】
また、上記方法に代えて、繊維芽細胞Ａを減圧処理することにしてもよい。繊維芽細胞Ａが付着したマイクロキャリア２を真空乾燥装置に収容して、約１２０Ｐａ程度の圧力に減圧する。これにより繊維芽細胞Ａ内への浸透圧が高まり、細胞膜が破壊されて繊維芽細胞Ａが死滅することになる。
【００２３】
また、上記方法に代えて、繊維芽細胞Ａを高温槽に挿入して１分間に１℃程度の温度上昇で６３℃まで昇温した後に、３０分間の保持を行う低温長時間殺菌法（ＬＴＬＴ）処理を行うことにしてもよい。これにより、繊維芽細胞Ａ等を死滅させることができる。なお、７２℃まで昇温した後に、１５秒間保持する高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ）によってもよい。
【００２４】
また、上記方法に代えて、繊維芽細胞Ａに界面活性剤を供給する方法を採用することができる。界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレンアルキルエーテルの内の少なくとも１つあるいはこれらの混合物が適している。具体的には、０．５％濃度のＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業製）を含有するＰＢＳを供給する。これにより繊維芽細胞Ａの細胞膜等が、界面活性剤によって破壊されて繊維芽細胞Ａが死滅する。界面活性剤を非イオン性とすることにより細胞外基質３等の変質を抑制することができる。
なお、界面活性剤として、トリトンＸ−１００（和光純薬工業製）、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業製）を用いてもよい。
【００２５】
また、上記方法に代えて、繊維芽細胞Ａを酸溶液、例えば、ｐＨ４〜６程度の酢酸溶液に浸漬することにしてもよい。これにより、酢酸溶液内の非解離型分子が繊維芽細胞Ａの細胞膜を通過して繊維芽細胞Ａ内に侵入するため、繊維芽細胞Ａの代謝によって水素イオンが増加して繊維芽細胞Ａが自ら変質して死滅する。その後、炭酸カルシウム水溶液等のアルカリ溶液によって中和し、あるいは洗浄ステップによって洗浄することにより、酸溶液を含まない人工臓器構成材１を製造することができる。
【００２６】
除去ステップＳ３は、処理ステップＳ２後に、死滅した繊維芽細胞Ａや、マイクロキャリア２の周囲に付着している栄養分の失われた培地５等の不要な成分をＰＢＳ等によって洗浄するステップである。上述したように、繊維芽細胞Ａは死滅しているので、ドナー以外の患者に移植しても免疫拒絶反応を生じさせることがない。したがって、除去ステップＳ３は必須のステップではなく、上記処理ステップＳ２が、界面活性剤あるいは酢酸溶液等を使用する場合には、これを洗い流すために行うことが好ましい場合がある。
これにより、図１および図３（ｃ）に示されるように、マイクロキャリア２の外周面に臓器構成細胞が生着しやすい状態に細胞外基質３をコーティングした人工臓器構成材が製造されることになる。
【００２７】
このように本実施形態に係る人工臓器構成材１の製造方法によれば、マイクロキャリア２の表面に細胞外基質３の膜を構成した人工臓器構成材１を簡易に製造することができる。特に、繊維芽細胞Ａ等の細胞外基質３を産生する細胞を利用することにより、人為的に細胞外基質３をマイクロキャリア２の表面にコーティングする方法よりも、その後に生着させる細胞が生着しやすい状態に細胞外基質３を付着させることができる。
【００２８】
また、生きた繊維芽細胞Ａが存在しないので、比較的長期にわたり保存でき、かつ、患者の体内に移植された状態で免疫拒絶反応を発生させることがない。したがって、繊維芽細胞等の細胞外基質３を産生する細胞Ａを、最終的に人工臓器を移植する患者とは異なるドナーから入手することができ、患者に与える身体的な負担を低減することができる。
【００２９】
なお、本実施形態に係る人工臓器構成材１の製造方法によれば、繊維芽細胞Ａ等を付着させる基材としてマイクロキャリア２を用いたが、これに代えて、多孔質マイクロキャリアや、後述する中空糸のようなホローファイバーや不織布を基材として用いることもできる。
【００３０】
次に、本実施形態に係る人工臓器構成体１０の製造方法について説明する。本実施形態に係る人工臓器構成体１０の製造方法は、図４に示されるように、上記実施形態に係る人工臓器構成材１の製造方法により製造された人工臓器構成材１と、臓器構成細胞Ｂ、例えば、肝細胞Ｂとを所定の培地１１内に投入して、所定の培養条件下に配することにより、臓器構成細胞Ｂを人工臓器構成材１の表面において成長させる。
【００３１】
本実施形態に係る製造方法によれば、人工臓器構成材１の表面にコーティングされた細胞外基質３等の産生物質の作用により、臓器構成細胞Ｂの成長を促進することができる。
その結果、基材として用いたマイクロキャリア２、中空糸あるいは不織布の表面に臓器構成細胞Ｂを効率よく接着させ、かつ接着した臓器構成細胞Ｂを迅速に成長させることができる。
【００３２】
すなわち、臓器構成細胞Ｂの増殖を促進するので、人工臓器の製造に要する時間を短縮することができる。また、臓器構成細胞Ｂの機能発現を向上することができ、大量の生理活性物質を産生させることができる。また、臓器構成細胞Ｂを長期にわたり生着させた状態に維持することができるので、耐久的に生体に近い機能発現が可能な人工臓器を製造することが可能となる。
【００３３】
次に、上記のようにして製造される人工臓器構成体１０を用いて人工臓器を製造する場合について、人工肝臓１２を例に挙げ、図５を参照して説明する。
この人工肝臓１２は、図５および図６に示されるように、円筒状の容器本体１５内に肝細胞を付着させた第１、第２の人工臓器構成体１０ａ，１０ｂを収容することにより構成されている。
【００３４】
この人工肝臓１２を製造するには、まず、上記製造方法により、複数のポリプロピレン製のガス交換用中空糸１３の外面にコーティングされた細胞外基質３の作用により中空糸１３の外面に生着させた肝細胞Ｂを有する第１の人工臓器構成体１０ａと、ポリエステル製の不織布１４の表面に同様に生着させた肝細胞Ｂを有する第２の人工臓器構成体１０ｂとを製造する。
【００３５】
次いで、複数の第１の人工臓器構成体１０ａを第２の人工臓器構成体１０ｂ上に並列に並べて、図６に示されるように、第１の人工臓器構成体１０ａを第２の人工臓器構成体１０ｂによって巻き込んだものを円筒状の容器本体１５内に挿入する。第１の人工臓器構成体１０ａの基材となった中空糸１３の両端を束ねて、図５に示されるように、容器本体１５の両端を閉塞するフランジ１５ａから容器本体１５外部に引き出して、ガス入口１６およびガス出口１７を設けることにより、中空糸１３の内部に酸素および二酸化炭素を流通させることを可能とする。また、容器本体１５の側面１５ｂには、長手方向の一端に血漿入口１８を、他端に血漿出口１９を設ける。
【００３６】
このようにして構成された人工肝臓１２の作用について以下に説明する。
第１の人工臓器構成体１０ａの一端に設けたガス入口１６から他端に設けたガス出口１７に向けて、酸素および二酸化炭素を第１の人工臓器構成体１０ａの内部に流通させた状態で、血漿入口１８から容器本体１５内部に血漿を導入する。血漿は、容器本体１５内部を満たすとともに第２の人工臓器構成体１０ｂを構成する不織布１４の隙間を通過して浸透する。
【００３７】
第１の人工臓器構成体１０ａの外面および第２の人工臓器構成体１０ｂの表面には肝細胞Ｂが生着させられているので、血漿は容器本体１５内部を流通させられる間に、肝細胞Ｂの作用によって血漿内に含まれる毒素を除去されて清浄化された状態で血漿出口１９から放出される。第１の人工臓器構成体１０ａの内部には、肝細胞Ｂの生存に必要な酸素および二酸化炭素が流通し、第１の人工臓器構成体１０ａの基材である中空糸１３を透過して肝細胞Ｂに供給されるので、肝細胞Ｂが健全な生着状態に維持される。また、肝細胞Ｂは、中空糸１３および不織布１４の表面をコーティングしている細胞外基質３の作用によって、生理活性物質を大量に産生し、活発な増殖状態を維持している。その結果、肝細胞Ｂを、長期間にわたり、健全な生着状態に維持して機能発現を向上することにより、耐久的に人工肝臓１２として機能させることができる。
【００３８】
また、第１の人工臓器構成体１０ａの基材である中空糸１３、および第２の人工臓器構成体１０ｂの基材である不織布１４は、その表面を細胞外基質３でコーティングされ、かつ肝細胞Ｂが健全な生着状態に維持されているので、基材１３，１４の表面が直接血漿に接触することが防止され、血栓の発生を未然に防止することができる。
【００３９】
なお、上記説明においては、人工臓器として人工肝臓１２を例に挙げて説明したが、これに限定されるものではなく、人工膵臓や人工血管等、他の任意の人工臓器にも応用することができる。
【００４０】
例えば、人工血管２０に応用する場合には、ホローファイバー２１の内面に繊維芽細胞Ａを付着させた状態で培養することにより、図７（ａ）に示されるように、細胞外基質３等の産生物質を産生させた後に、一旦繊維芽細胞Ａを死滅させて、図７（ｂ）に示されるような人工血管構成材２２を製造する。そして、この後に、再度、血管内皮細胞Ｂを播種して培養することにより、図７（ｃ）に示されるように人工血管２０が製造される。このようにすることで、ホローファイバー２１の内面に、血管内皮細胞Ｂを全面にわたって長期に接着状態に生着させることが可能となり、内部に血液を流通させても血栓の発生を効果的に防止し得る人工血管２０を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の一実施形態に係る製造方法により製造される人工臓器構成材の一例を示す模式図である。
【図２】図１に示された本発明の一実施形態に係る人工臓器構成材の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】図２のフローチャートを説明する工程図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る人工臓器構成体の製造方法を説明する工程図である。
【図５】図４の製造方法により製造された人工臓器構成体を用いて製造された人工肝臓の一例を示す斜視図である。
【図６】図５の人工肝臓を示す横断面図である。
【図７】本発明の製造方法により製造される人工臓器構成材を用いて人工血管を製造する方法を説明する工程図である。
【符号の説明】
【００４２】
Ａ  細胞（血管内皮細胞、繊維芽細胞、幹細胞）
Ｂ  肝細胞（臓器構成細胞）
Ｓ１  培養ステップ（培養するステップ）
Ｓ２  処理ステップ（死滅させるステップ）
１，２２  人工臓器構成材
２  マイクロキャリア（基材）
３  細胞外基質
１０，１０ａ，１０ｂ  人工臓器構成体
２１  ホローファイバー（基材）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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