(57)【要約】      （修正有）【課題】  育苗段階早期に根こぶ病抵抗性を有するナタネ類の個体を安定的、かつ効率的に選抜するため、目的とするＤＮＡマーカーを獲得し、それを用いた根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法を確立する。【解決手段】  特定の塩基配列を含む、根こぶ病抵抗性形質ナタネ類の選抜用マーカー、及び該マーカーを特異的に増幅しうるオリゴヌクレオチドプライマーを取得し、該マーカーとプライマーを利用した根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法を開発した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー。
【請求項２】
配列番号３で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、該配列を増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列をそれぞれ含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア。
【請求項５】
ナタネ類より抽出したRNA又はDNAから、請求項１記載のマーカーを検出することを特徴とする、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法。
【請求項６】
請求項２もしくは３記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４記載のプライマーペアを用いた核酸増幅工程を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法：
１）ナタネ類より抽出したRNA又はDNAを鋳型として、請求項２もしくは３記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項４記載のプライマーペアを用いて核酸増幅反応を行い；
２）得られた核酸増幅産物から、配列番号３で示される塩基配列を含む増幅産物を検出することにより、根こぶ病抵抗性ナタネ類を選抜する。
【請求項８】
検出が電気泳動分析を利用して行われる、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーに関する。より詳しくは、根こぶ病抵抗性形質を有するナタネ類の個体選抜に有用なマーカー、及び該マーカーを特異的に増幅しうるオリゴヌクレオチド、ならびに該マーカーとオリゴヌクレオチドを利用した根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
根こぶ病はアブラナ科植物全般に深刻な打撃を与える土壌病害であり、防除がきわめて困難な病害である。根こぶ病を発病した植物では、根がこぶ状になり、養分を十分に吸収できなくなるため、発育障害をおこす。一部のアブラナ科植物では抵抗性を有する品種が育成されているが、当該病原菌のレース分化により、抵抗性品種であっても罹病化する例も多発している。
【０００３】
現在、根こぶ病多発地域における対策は殺菌剤を用いた防除に頼っているが、この方法では原因となる病原菌の活動を完全に抑止、あるいは死滅させることは困難である。そればかりか、殺菌剤の多量の使用は、残留成分による環境への悪影響が懸念され、市場からは殺菌剤を含む化学薬品の使用を減じた農産物の生産が望まれている。
【０００４】
ナバナはBrassica napus L.（洋種ナタネ）に属する食用ナタネであるが、従来ナタネ類において、根こぶ病抵抗性を有し、かつ青果市場に適する品種は存在しなかった。そのため、当該病害を克服する品種を得るために、根こぶ病抵抗性形質を有する素材との交雑による新品種の育成も試みられている。現在交雑の素材として用いられている飼料用カブ品種ルタバガはBrassica napus L.に属し、当該病害に対してほとんど発病が見られない強度の抵抗性を有する品種であり、その病害抵抗性形質は他科アブラナとは異なっている。しかし、抵抗性素材が飼料用カブであるため、交雑後代は青果市場に適さない形質を受け継ぎやすく、新品種育成までには長期を要することが予測される。
【０００５】
また、現在の抵抗性の検定及び抵抗性個体の選抜は、病原菌接種後、抵抗性を示した個体を選抜する方法によって実施されている。しかし、この判定には播種後５週間程度の栽培期間が必要であり、検定終了後には病原菌を多量に含んだ土壌・根塊が発生する。さらに、温度及び土壌水分が低い場合には発病させることができず、検定精度が低くなるため、検定結果は季節的あるいは年次的な制約を受ける。そのため、検定精度を高めるためには人工気象室等の施設が必要となり、選抜育種の効率化を阻んでいる。このような状況下、育苗段階で根こぶ病抵抗性を有する個体を安定的、かつ効率的に選抜する方法の開発が望まれる。
【０００６】
一方、DNA情報を形質マーカーとする選抜方法もある。この方法は、DNA情報が生物の生涯にわたって変化しない性質を利用した選抜方法であり、植物個体が選抜目的とする形質を発現する前の生育段階における選抜や、環境変動に容易に影響を受けうる形質の選抜を可能にする。すなわち、この方法では従来の病原菌接種による検定方法のように病原菌による汚染土壌が発生せず、また施設的あるいは時間的な制約に束縛されることなく、安定的な形質選抜が可能となる。
【０００７】
従来、根こぶ病抵抗性を識別するためのDNAマーカーとしては、ハクサイを対象としたものが知られている（例えば、特許文献１参照）。しかし、DNAマーカーは、作目毎あるいは同一作目内でも形質ごとに特異的なものであり、同じアブラナ科植物であっても、ハクサイのマーカーを他のアブラナ科野菜（例えば、ナタネ類）に使用することはできない。
【特許文献１】特開平９−１１７２８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、育苗段階早期に根こぶ病抵抗性を有するナタネ類の個体を安定的、かつ効率的に選抜するためのDNAマーカーを獲得し、それを用いた根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題の解決にあたり、発明者らはハクサイのDNAマーカーのナタネ類への使用を試みた。両者は同じアブラナ科植物であり、罹病個体の病徴も類似しているが、ハクサイのDNAマーカーによって、根こぶ病抵抗性ナタネ類の個体選抜はできなかった。これは、当該マーカーが作目毎あるいは同一作目内でも形質ごとに特異的なものだからである。
【００１０】
そこで、本発明者はナタネ類に適用可能なマーカーの開発を行った。まず、任意の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド及び特定のマイクロサテライト領域を増幅するサイクロサテライトプライマーを用いたPCRにより、ナタネ類のDNA多型分析を行い、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜に有効なDNAマーカーを獲得した。さらにこのDNAマーカーを改良し、単一のDNAバンドの増幅が可能な合成オリゴヌクレオチドプライマーを作成した。そして、このプライマーを用いれば、育種過程で根こぶ病抵抗性個体を効率的に選抜できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は配列番号３で示される塩基配列を含むのポリヌクレオチドからなる根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーを提供する。
【００１２】
また、本発明は前記マーカー増幅用プライマーを提供する。該プライマーは配列番号３で示される塩基配列を含むのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、該配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドとして設計される。
【００１３】
前記オリゴヌクレオチドの好適な態様として、配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。該オリゴヌクレオチドは、利用する核酸増幅方法により、片方だけ用いても両方用いてもよい。特に好ましい形態として、配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列をそれぞれ含む２種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを挙げることができる。
【００１４】
本発明はまた、本発明のマーカー及びオリゴヌクレオチドを利用した根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法を提供する。該方法は、ナタネ類より抽出したRNA又はDNAから、前記マーカーを検出することにより行われる。好ましい態様において、前記検出は本発明のオリゴヌクレオチド又はプライマーペアを用いた核酸増幅工程を含む。
【００１５】
例えば、本発明の根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜方法は以下の工程を含む：
１）ナタネ類より抽出したRNA又はDNAを鋳型として、本発明ののオリゴヌクレオチド又はプライマーペアを用いて核酸増幅反応を行い；
２）得られた核酸増幅産物から、配列番号３で示される塩基配列を含む増幅産物を検出することにより、根こぶ病抵抗性ナタネ類を選抜する。
前記方法において、検出は例えば電気泳動分析を利用して行うことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ナタネ類の根こぶ病抵抗性個体を簡便に識別・選抜することができる。本発明は、ナタネ類の根こぶ病抵抗性新品種の育成における、選抜精度を向上させ、これまで必要であった多大な労力の軽減、育成期間の短縮に寄与する。さらに、本発明を応用・発展させれば、新たなDNAマーカーの開発や、早晩性等の農業生産上重要な形質をもった新品種の育成も可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．根こぶ病抵抗性系統の育種
根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの取得にあたり、まずナタネ類の根こぶ病抵抗性系統を作出する。ナタネ類の根こぶ病抵抗性系統は、交雑、選抜、自殖を繰り返して、根こぶ病抵抗性形質を固定化することにより作出される。例えば、根こぶ病抵抗性カブと根こぶ病罹病性のナタネ類を両親として交雑を行い、その後代から抵抗性の系統を選抜する。さらにこの抵抗性の系統を自殖し、抵抗性を固定させることにより、根こぶ病抵抗性のナタネ類を得ることができる。根こぶ病抵抗性カブとしては、例えば、飼料用カブ品種ルタバガを用いることができる。ルタバガはBrassica napus L.に属し、根こぶ病の発病がほとんど見られない強度の抵抗性を有する品種であり、その病害抵抗性形質は他科アブラナとは異なり非常に強力である。
【００１８】
２．  根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー
２．１  多型解析
前項のようにして得られたナタネ類の根こぶ病抵抗性系統より、根こぶ病抵抗性識別マーカーとなりうるDNA配列を探索する。根こぶ病抵抗性識別マーカーとしては、根こぶ病抵抗性系統のDNAにのみ特異的に現れるDNA多型を利用することが好ましい。そのようなDNA多型としては、以下に説明するRAPDとマイクロサテライト多型を挙げることができる。
【００１９】
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)とは、任意の10〜12塩基の配列を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いたPCRによって解析されるDNA多型であり、用いる合成オリゴヌクレオチドの種類を変えることにより、容易に、かつ数多く得ることができる。このDNA多型を示すバンドは、それ自体がDNAマーカーとなり得る場合もある。
【００２０】
生物ゲノム中の短い反復する塩基配列はマイクロサテライトと呼称され、多型性に富むため安定した個体識別マーカーとなりうることが知られている。このような多型を、マイクロサテライト多型という。いくつかの研究機関で作目ごとのマイクロサテライトマーカーや該マーカー用プライマーが開発されており、これを利用することにより、RAPDとほぼ同様の手法でDNA多型を得ることができる。前記マイクロサテライトマーカーに関する情報は、例えば、S.Kresovich  A.K.Szewc-McFadden  S.M.Bliek, USDA-ARS, Theor Appl Gene (1995)91:206-211, “Abundance and characterization of simple-sequence repeats(SSRs) isolated from a size-fractionated genomiclibrary of Brassica napusL.(rapeseed)” や、CALLUM J. BELL AND JOSEPH R.ECKER, Plant Science Institute of Biology, University of Pennsylvania, Genomics 19,137-144(1994), “Assignment of 30 Microsatellite Loci to the Linkage Map of Arabidopsis”より得ることができる。
【００２１】
前記いずれの方法も、対象とする生物より抽出されたDNAを鋳型としたPCRを行い、増幅されたDNAを分析することにより、簡単に種々の生物におけるDNA多型を知ることができる。そのため、遺伝解析や品種・個体の識別、さらにはＦ1種子の純度検定等に用いられている。
【００２２】
しかしRAPD分析の場合、目的とするDNA多型バンド以外にも複数のDNA多型が増幅されることや、結果の再現性が劣る場合があるため、迅速で正確な判定が必要な品種育成の場面には適さない場合もある。そのため得られたDNA多型の断片をクローン化して塩基配列を決定し、この塩基配列情報から目的のDNA多型のみを増幅させうるプライマーを設計して供する（STS化）ことにより、安定した結果を得ることが必要となる。一方、マイクロサテライト多型は再現性が高いため、プライマーの再設計は必要ではない。
【００２３】
なお、RAPD解析においても、マイクロサテライト解析においても、用いられる合成オリゴヌクレオチドプライマーは、市販のDNA合成機を使用して容易に合成することができる。
【００２４】
２．２  根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの選択
根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーとして有効なDNA多型は、RAPD解析あるいはマイクロサテライト解析における抵抗性系統と罹病性ナタネ類の増幅産物を比較し、抵抗性系統にのみ特異的に出現する増幅産物を選択することにより得ることができる。かくして、いくつかのプライマーによる増幅産物（DNAバンド）が、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの候補として選択される。
【００２５】
次いで、選択された候補の中から、さらに根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーとして最適なものを特定する。特定は、数種類の抵抗性系統において、前項と同様のRAPD解析及びマイクロサテライト解析を行い、抵抗性系統に共通して発現するDNA多型を選択することにより行われる。
【００２６】
例えば、抵抗性を固定させた系統と罹病性ナタネ類を再び交雑し、その雑種第一代、二代、三代を自殖により得る。交雑第三代を用いた根こぶ病接種検定による抵抗性結果と交雑第二代を用いた増幅産物との関係を解析する。
【００２７】
その結果、発明者らはRAPD法によりオリゴヌクレオチドプライマー（OPH-06：配列番号７）を用いて得られた増幅産物（約650bp）が根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜のマーカーとして最適であることを確認した。この増幅産物に含まれる多型は、根こぶ病抵抗性遺伝子の近傍に位置し、それゆえ根こぶ病抵抗性形質と連鎖して遺伝すると考えられる。後述するように、この増幅断片は配列番号３に示される塩基配列を有することが確認された。したがって、該配列を含むポリヌクレオチドは根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーとして利用できる。すなわち、当該ナタネの遺伝子上において、配列番号３に示される塩基配列を含む連続した６４９〜８００塩基長、特に６４９〜７００塩基長の領域は、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーとして好適に利用できる。
【００２８】
また本発明の根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーは適当な修飾を施されていてもよい。例えば、蛍光色素（FITC、ROC等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、DNP）、ビオチン、DIG（ジゴキシゲニン）等の標識物質による標識塩基や、ペプチド核酸等の修飾塩基の利用が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドには、そのような修飾物も含むものとする。なお、便宜上配列表の塩基配列はDNAとして記載するが、上記マーカーがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。
【００２９】
３．  根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用オリゴヌクレオチド
しかし、RAPD法で得られたDNAマーカーはすでに述べたような再現性等の課題があるため、多型DNAのみ特異的に増幅することが可能なプライマーを再設計することが好ましい。すなわち、特定された根こぶ病抵抗性マーカーをより特異的に増幅しうるプライマーの設計が必要である。
【００３０】
そのためには、OPH-06プライマーによる増幅産物を分画・精製した後、クローン化して、高純度のプラスミドを取得し、DNAシーケンサーを用いてマーカー部分の塩基配列を解読し、該配列に基づいて根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー特異的プライマーの設計を行う必要がある。
【００３１】
かくして、発明者らは根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーが、配列番号３に示される塩基配列を有することを決定し、該配列にハイブリダイズし、これを特異的に増幅しうるプライマーとして、配列番号１及び配列番号２に示される塩基配列を有するプライマー（１組）を設計した。このプライマーによって特異的に増幅されるDNA断片は根こぶ病抵抗性形質の選抜に有効な根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーである。
【００３２】
前記プライマーに限定されず、配列番号１あるいは配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドは根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用プライマーとして使用しうる。前記オリゴヌクレオチドは、使用する核酸増幅反応に応じて、単独で使用しても、１対のプライマーペアとして使用してもよい。また、前記オリゴヌクレオチドの塩基長も、使用する核酸増幅反応に応じて決定される。通常のPCR反応であれば、１５〜３０塩基長、好ましくは２０〜３０塩基長、特に好ましくは２０〜２５塩基長がである。
【００３３】
また本発明のオリゴヌクレオチドは適当な修飾を施されていてもよい。例えば、蛍光色素（FITC、ROC等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、DNP）、ビオチン、DIG（ジゴキシゲニン）等の標識物質による標識塩基や、ペプチド核酸等の修飾塩基の利用が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドには、そのような修飾物も含むものとする。なお、便宜上配列表の塩基配列はDNAとして記載するが、オリゴヌクレオチドがRNAである場合、配列表中の塩基記号「t」は「u」に読み替えるものとする。
【００３４】
４．根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜・識別
本発明の根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーは、ナタネ類の根こぶ病抵抗性遺伝子と連鎖しているため、根こぶ病抵抗性形質の検出に利用することができる。すなわち、本発明はナタネ類より抽出したRNA又はDNAから、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーを検出することを特徴とする、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜（あるいは識別）方法を提供する。
【００３５】
ここで、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの検出は、RT-PCR、ドットブロット、遺伝子チップ、マイクロアレイやメンブレンフィルター等の核酸固相化試料を利用した核酸ハイブリダイゼーション、など周知の方法を任意に用いることができる。
【００３６】
通常、ナタネ類より抽出したRNA又はDNA中に含まれるマーカー配列は微量であるため、本発明のプライマーを用いた核酸増幅反応を行ってマーカー領域を増幅することが好ましい。そして、得られた増幅産物から本発明の根こぶ病選抜用マーカーを検出することにより、ナタネ類の根こぶ病抵抗性個体を選抜する。ここで、用いられる核酸増幅反応は特に限定されず、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のほか、SDA法、LCR法、LAMP法、ICAN法、NASBA法等、任意の核酸増幅法を用いることができる。
【００３７】
例えば、ナタネ類より抽出したRNA又はDNAを鋳型として、本発明のオリゴヌクレオチド、又はプライマーペアを用いて核酸増幅反応を行い、次いで得られた核酸増幅産物から、配列番号３で示される塩基配列を含む増幅産物を検出することにより、根こぶ病抵抗性ナタネ類を選抜する。検出方法としては、例えば、電気泳動分析等を用いることができる。
【実施例】
【００３８】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
実施例１：根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用プライマーの確立
１．根こぶ病抵抗性ナタネ類（ナバナ）の育種
根こぶ病抵抗性品種ルタバガ（飼料用カブ）と罹病性ナバナを交雑し、その後代から接種検定により抵抗性の個体を選抜した。この個体を接種検定を重ねながら自殖し、抵抗性を固定させた系統を得た。この抵抗性系統と罹病性ナバナを再度交雑し、雑種第一代を得たのち、自殖により交雑二代、三代を得た。
【００３９】
２．RAPD解析
各世代のナバナ葉よりDNAを常法（セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）法）に従い抽出した。RAPD解析では、このDNA10ngを鋳型として、200μＭ dNTPs、1.5pmol RAPDプライマー及び0.2unit TthDNAポリメラーゼ（東洋紡製）を加え、10μｌの反応液を作製した。なお、RAPDプライマーとしては、10又は12塩基の市販のランダムプライマー792種（和光社、オペロン社製、ベックス社製）を用いた。PCR反応装置はタカラ社製TP-3000を用い、94℃、１秒の前処理の後、熱変性94℃、１秒、アニーリング40℃、２分及び伸長反応72℃、3分の処理を1サイクルとして45サイクル反復し、さらに72℃、7分の温度処理を行った。
【００４０】
３．マイクロサテライト解析
マイクロサテライト解析ではDNA10ngを鋳型として、200μＭ dNTPs、2.5pmol マイクロサテライトプライマー２種[(locus) B.n.6A2, Theor Appl Gene (1995)91:206-211;(locus) nga139, Genomics 19,137-144(1994)]及び0.25unit EX-Taqポリメラーゼ（タカラ製）を加え、10μｌの反応液を作成した。PCR反応装置はタカラ社製TP-3000を用い、94℃，5秒の前処理の後、熱変性94℃、5秒、アニーリング50〜60℃、30秒及び伸長反応72℃、 1分の処理を1サイクルとして40サイクル反復し、さらに72℃，2分の温度処理を行った。
マイクロサテライトプライマー：
B.n.6A2 Forward:5'-CTTTgTgTggACTTTTAgAACTTTA-3' （配列番号４）
B.n.6A2 Reverse:5'-CgCAgCTTTTggCCCACCTg-3' （配列番号５）
nga139 Forward:5'-AgAgCTACCAgATCCgATgg-3'（配列番号６）
nga139 Reverse:5'-ggTTTCgTTTCACTATCCAgg-3'（配列番号７）
【００４１】
PCR増幅産物5ないし10μｌを1μg/mlのエチジウムブロミドを含む1.5％アガロースゲル中で電気泳動、又はエチジウムブロミドを含まない1.5％アガロースゲル中で電気泳動した後、1μg/mlのエチジウムブロミドを含む緩衝液中で染色し、紫外線照射することにより、増幅産物の有無を分析した。
【００４２】
４．根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの選択
その結果、いくつかの合成ヌクレオチドによる増幅産物（DNAバンド）が、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜に有効である可能性が示唆された。そこで、次に交雑第三代を用いた根こぶ病接種検定による抵抗性と第二代を用いた増幅産物との関係を解析した。PCR増幅産物のうち抵抗性親ルタバガに特異的なものを検索し、さらにその中で後代の抵抗性系統に特異的なものを検索した。交雑第三代における抵抗性の分離と、これら検索されたPCR増幅産物の有無の分離を連鎖及び量的形質解析により検討した。なお、連鎖及び量的形質解析は、MAPL（植物育種情報研究所 http://www.asahi-net.or.jp/~fh6y-uki/mapqtl.html；鵜飼保雄ら(1995) DNA多型連鎖地図作成とQTL解析のためのコンピュータ・プログラムMAPL，育種学雑誌 45:139-142参照）を利用して行った。その結果、以下に示すプライマーOPH-06による増幅産物、約650bpのバンドが、抵抗性ナタネ類の選抜に有効であることが判明した。
OPH-06プライマー
OPH-06： 5'-ACGCATCGCA-3’ （配列番号８）
【００４３】
５．プライマーの最適化
次に、OPH-06をプライマーとして、前項２と同様の条件でPCRを行って当該DNA断片を増幅し、これを分画・精製した後、クローン化し、高純度のプラスミドを抽出した。シーケンサー（ABI PRISM 310 Genetic  Analyzer(PE Biosystems)）において塩基配列の解読を行った。その結果、根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー配列として、配列番号３の配列を有するDNA断片が同定された。そこで、この断片の特異的増幅に適したプライマーの設計を行い、以下の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチド１組を確定した。
根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用プライマー：
Forward: 5'-CAGTCAAACCGAAGAAGAAG-3'（配列番号１）
Reverse: 5'-ATGTTCAGTTTGTGCGATGC-3'（配列番号２）
【００４４】
実施例２：根こぶ病抵抗性系統の選抜
根こぶ病抵抗性品種ルタバガ（飼料用カブ）と罹病性ナタネ類（ナバナ）を交雑し、その後代から抵抗性の系統を数系統を得た。これを自殖し、抵抗性形質を固定させた６系統（系統9、系統12、系統15、系統17、系統19、系統22）から、実施例１と同様にしてDNAを抽出した。抽出したDNA10ngを鋳型として200μM dNTPs、実施例１で確定された選抜用プライマー（配列番号１及び２）4pmol及び0.5unit EX-Taqポリメラーゼ（タカラ製）を加え、10μlの反応液を作成した。PCR反応装置はタカラ社製TP-3000を用い、94℃、3秒の前処理の後、熱変性94℃、1秒、アニーリング60℃、1分及び伸長反応72℃、2分の処理を1サイクルとして35サイクル反復した。得られた増幅産物について、実施例１にしたがって電気泳動分析を行った。
【００４５】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、強抵抗性系統15、17、19において本発明の根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカーの特異的増幅が確認できた。ことから本発明のマーカー及びプライマーの有効性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー及び該マーカー用プライマーを用いれば、根こぶ病抵抗性を有するナタネ類の個体を簡便に識別することができる。したがって、本発明は育苗段階早期における根こぶ病抵抗性ナタネ類の個体選抜や根こぶ病抵抗性ナタネ類の品種育成に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号１：人工配列の説明−根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用プライマー（Forward primer）
配列番号２：人工配列の説明−根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用プライマー（Reverse primer）
配列番号３：人工配列の説明−根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜用マーカー
配列番号４：人工配列の説明−マイクロサテライト用プライマー（B.n.6A2 Forward primer）
配列番号５：人工配列の説明−マイクロサテライト用プライマー（B.n.6A2 Reverse）
配列番号６：人工配列の説明−マイクロサテライト用プライマー（nga139 Forward）
配列番号７：人工配列の説明−マイクロサテライト用プライマー（nga139 Reverse）
配列番号８：人工配列の説明−OPH-06プライマー
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、実施例２における根こぶ病抵抗性ナタネ類（ナバナ）系統のPCR増幅産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図１】
2005176619.tif 000002
【配列表】
2005176619000001.app