(57)【要約】【課題】本発明の目的は、体重の調整に使用されうる化合物を同定するための方法を提供することである。【解決手段】本発明は、肥満の予防および治療に有用と思われる化合物を同定するための新規標的に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）表2に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を上方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
遺伝子が配列番号：1である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
遺伝子が配列番号：2である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
遺伝子が配列番号：3である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
遺伝子が配列番号：4である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
遺伝子が配列番号：5である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
遺伝子が配列番号：6である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
a）配列番号：25〜37からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を上方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
a）表3に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドを減少させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
遺伝子が配列番号：7である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子が配列番号：8である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子が配列番号：9である、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子が配列番号：10である、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子が配列番号：11である、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子が配列番号：12である、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
a）配列番号：38〜85からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドを減少させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２２】
a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２３】
a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２４】
a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２５】
a）化合物をポリペプチドと接触させる段階；および
b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階；
を含む、配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２６】
a）化合物をポリペプチドと接触させる段階；および
b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階；
を含む、配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
表2および／または表3に列挙した遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用。
【請求項２８】
配列番号：25〜146からなる群より選択される遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用。
【請求項２９】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用。
【請求項３０】
配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用。
【請求項３１】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項３２】
配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキット。
【請求項３３】
請求項1〜26のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
【請求項３４】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物を、薬学的に許容される担体と混合した状態で含む、体重を調整するための薬学的製剤。
【請求項３５】
配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物を、薬学的に許容される担体と混合した状態で含む、体重を調整するための薬学的製剤。
【請求項３６】
肥満の治療用の薬剤を調製するための、請求項33記載の化合物の使用。
【請求項３７】
悪液質の治療用の薬剤を調製するための、請求項33記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満に関する脂肪組織由来の新規標的に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満などの多因子性疾患は、複数の遺伝子の変異によって引き起こされ、環境要因による寄与の度合いも大きい。メンデル型遺伝病の原因となる遺伝子の同定については目覚ましい成果が得られているが、多因子性疾患にかかわる感受性遺伝子を発見することは現時点では困難である。高脂肪食を摂っていると体重が増加するという遺伝的素因をヒトが遺伝的に受け継いでいることが、科学的証拠によって示唆されている。このため、臨床的および生理学的なパラメーターに基づく組織の収集のために患者試料の採取を最適化することが非常に重要である。
【０００３】
この健康上の問題に対する新規な治療的解決策の医学的需要は明らかに満たされておらず、これは特に、体重減少を促進させる現在の治療行為が一時的なものに過ぎず、体重の過剰分が減少しても1〜5年以内に増加して元に戻るという事実を考慮すれば明らかである。したがって、新たな治療法の開発のための新たな標的を同定することが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、体重の調整（例えば体重障害の治療）に使用されうる化合物を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ法」とも称する）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る方法においては、（１）
a）表2に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を上方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【０００６】
本発明に係る方法においては、（２）遺伝子が配列番号：1である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係る方法においては、（３）遺伝子が配列番号：2である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【０００８】
本発明に係る方法においては、（４）遺伝子が配列番号：3である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る方法においては、（５）遺伝子が配列番号：4である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００１０】
本発明に係る方法においては、（６）遺伝子が配列番号：5である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る方法においては、（７）遺伝子が配列番号：6である、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る方法においては、（８）
a）配列番号：25〜37からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を上方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る方法においては、（９）
a）表3に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドを減少させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る方法においては、（１０）遺伝子が配列番号：7である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る方法においては、（１１）遺伝子が配列番号：8である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る方法においては、（１２）遺伝子が配列番号：9である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る方法においては、（１３）遺伝子が配列番号：10である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る方法においては、（１４）遺伝子が配列番号：11である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る方法においては、（１５）遺伝子が配列番号：12である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係る方法においては、（１６）
a）配列番号：38〜85からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階；および
b）該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階；
を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、該遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドを減少させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る方法においては、（１７）
a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る方法においては、（１８）
a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る方法においては、（１９）
a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る方法においては、（２０）
a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る方法においては、（２１）
a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法であることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る方法においては、（２２）
a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法であることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る方法においては、（２３）
a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法であることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る方法においては、（２４）
a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階；ならびに
b）該ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階；
を含み、該ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、該ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る方法においては、（２５）
a）化合物をポリペプチドと接触させる段階；および
b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階；
を含む、配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る方法においては、（２６）
a）化合物をポリペプチドと接触させる段階；および
b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階；
を含む、配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る使用においては、（２７）表2および／または表3に列挙した遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る使用においては、（２８）配列番号：25〜146からなる群より選択される遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る使用においては、（２９）配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用であることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る使用においては、（３０）配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用であることを特徴とする。
【００３５】
本発明に係るキットにおいては、（３１）配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキットであることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係るキットにおいては、（３２）配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキットであることを特徴とする。
【００３７】
本発明に係る化合物においては、（３３）上記(1)〜(26)のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物であることを特徴とする。
【００３８】
本発明に係る薬学的製剤においては、（３４）配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物を、薬学的に許容される担体と混合した状態で含む、体重を調整するための薬学的製剤であることを特徴とする。
【００３９】
本発明に係る薬学的製剤においては、（３５）配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物を、薬学的に許容される担体と混合した状態で含む、体重を調整するための薬学的製剤であることを特徴とする。
【００４０】
本発明に係る使用においては、（３６）肥満の治療用の薬剤を調製するための、上記(33)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る使用においては、（３７）悪液質の治療用の薬剤を調製するための、上記(33)記載の化合物の使用であることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る方法、化合物、製剤、および使用においては、（３８）実質的には、本明細書中に、特に実施例に関連して記載されているような、方法、化合物、製剤、および使用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４３】
本発明により、肥満の予防および治療に有用と思われる化合物をスクリーニングするための、骨格筋由来の新規標的が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
糖尿病／肥満予防プログラム（Diabetes/Obesity Prevention Program）には、ストックホルム予防プログラム（Stockholm Prevention Program）とともに8000例の患者集団が登録されており、多数の臨床的パラメーターおよびバイタルサインに関してモニタリングされている。この大規模な患者プールのうち糖尿病でない肥満患者10例および条件を整合させた対照患者10例から、臨床的に詳細な注釈付けがなされた一連の生検組織を得、遺伝子発現プロファイリングのために分析した。特に以下の臨床的パラメーターおよびバイタルサインは、整合させた上で患者の登録に用いた：BMI（対照平均＝22.2 sd+/-1.3および症例平均＝32.8 sd+/-2.1）、年齢（対照平均＝54.6歳および症例平均＝56.3歳）、性別が男性、VO2比、総脂肪と体幹脂肪との比、ウエスト-ヒップ比、エネルギー消費量、血圧、FA酸化；CHO酸化、OGTT陰性、出生時体重、家族に糖尿病患者がいない、非喫煙者、デスクワーク中心、飲酒習慣がない。
【００４５】
（表１）
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【００４６】
患者の選択に用いたその他のパラメーター：
*糖尿病の家族歴
*出生時体重
*血圧
*薬物療法（あれば）
*食物摂取
*身体活動の教育
*体重の履歴
*慢性疾患
*喫煙および飲酒の習慣
*住宅の状況
*社会経済的要因
【００４７】
本発明によって提供される方法は、配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド、もしくは配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する、および／または配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド、もしくは配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性もしくは発現に対して刺激作用もしくは抑制作用を及ぼす、候補または被験化合物または作用物質（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、またはその他の薬物）を同定する段階と、そして次に、配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド、もしくは配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物、および／または配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド、もしくは配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドの活性もしくは発現に対して刺激作用もしくは抑制作用を及ぼす化合物のうちどどの化合物がインビボアッセイで哺乳動物（例えば、マウスまたはラット）の摂食行動、体重、または代謝速度に対して効果を及ぼすかを決定する段階とを必然的に伴う。
【００４８】
本発明は、a）表2に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階、およびb）前記遺伝子の発現または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階を含み、発現を上方制御する化合物は、前記遺伝子または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【００４９】
本明細書で用いる「発現の上方制御」という用語は、核酸のmRNAレベルでの発現の上昇のこと、またはポリペプチドレベルでの発現の上昇のことを指す。また、この用語を、ポリペプチドの活性および／または機能のために必要な翻訳後修飾（例えば糖部分の付加、リン酸化など）の増大と関連づけることもできる。
【００５０】
以上に述べた方法において、または以下に述べる任意の方法において用いられる細胞は、脂肪細胞、または以下に定義する宿主もしくは宿主細胞であってよい。
【００５１】
好ましくは、遺伝子は配列番号：1である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：2である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：3である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：4である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：5である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：6である。
【００５２】
本発明はさらに、a）配列番号：25〜37からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階、およびb）前記遺伝子の発現または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階を含み、遺伝子発現を上方制御する化合物は、前記遺伝子または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を上昇させる化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００５３】
好ましくは、ポリペプチドは配列番号：13である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：14である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：15である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：16である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：17である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：18である。
【００５４】
本発明はまた、a）表3に列挙した遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階、およびb）前記遺伝子の発現または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、前記遺伝子または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの減少を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法にも関する。
【００５５】
本明細書で用いる「発現の下方制御」という用語は、核酸のmRNAレベルでの発現の低下のこと、またはポリペプチドレベルでの発現の低下のことを指す。この用語を、ポリペプチドの活性および／または機能のために必要な翻訳後修飾（例えば糖部分の付加、リン酸化など）の減少と関連づけることもできる。
【００５６】
好ましくは、遺伝子は配列番号：7である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：8である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：9である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：10である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：11である。別の好ましい態様において、遺伝子は配列番号：12である。
【００５７】
好ましくは、ポリペプチドは配列番号：19である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：20である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：21である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：22である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：23である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：24である。
【００５８】
本発明はさらに、a）配列番号：38〜85からなる群より選択される遺伝子を発現する細胞を化合物と接触させる段階、およびb）前記遺伝子の発現または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現を測定する段階を含み、遺伝子発現を下方制御する化合物は、前記遺伝子または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの減少を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００５９】
本発明は、a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアゴニストとして作用して（agonizing）肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６０】
本発明はまた、a）配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００６１】
好ましくは、ポリペプチドは配列番号：13である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：14である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：15である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：16である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：17である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：18である。
【００６２】
配列番号：1にコードされるポリペプチド、AZGP1に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、AZGP1の脂質分解活性および脂質動員（mobilizing）活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開公報第99/62939号に記載されている。
【００６３】
配列番号：2にコードされるポリペプチド、IRS1に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、例えばリン酸化、好ましくはチロシンリン酸化によるIRS1の修飾、および／または活性化の後の下流エフェクターとの結合、例えばPI3-キナーゼ、SypもしくはGrb2との結合、および／またはIRS1活性化の下流エフェクターのリン酸化もしくは活性化のことを指す。IRS1の活性および／または機能を測定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Ridderstraleら、J. Biol. Chem. 270, 3471, 1995；またはKuhneら、J. Biol. Chem. 268, 11479-81, 1993に記載されている。
【００６４】
配列番号：3にコードされるポリペプチド、ApoAIに関して用いる「活性および／または機能」という用語は、ApoAIおよび／もしくはApoAIを含む脂質小胞と標的細胞との結合、ならびに／またはApoAIおよび／もしくはApoAIを含む脂質小胞が細胞コレステロールおよびリン脂質の流出を誘導する能力のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Hauserら、Biochemistry 1998, 37, 17843-17850；Yanceyら、Biochemistry 1995, 34, 7955-7965に記載されている。
【００６５】
配列番号：4にコードされるポリペプチド、ARNTに関して用いる「活性および／または機能」という用語は、ARNTの転写活性および／またはコアクチベーター活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Whitelawら、Mol. Cell Biol. 12, 1994, 8343-8355；および／またはBrunnbergら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2003, 6517-6522に記載されている。
【００６６】
配列番号：5にコードされるポリペプチド、脳由来クレアチンキナーゼ（CKB）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、CKBのキナーゼ活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、O'Gormanら、Biochem. Biophys. Acta 1276, 1996, 161-170；および／またはDuranyら、Mol. Pathol. 55, 2002, 242-249に記載されている。
【００６７】
配列番号：6にコードされるポリペプチド、6ステロール-c5-不飽和化酵素に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、6ステロール-c5不飽和化酵素がn-3脂肪酸およびn-6脂肪酸を不飽和化する能力のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、de Antuenoら、FEBS Letters 509, 2001, 77-80；de Antuenoら、FEBS Letters 491, 2001, 247-251；Tatonら、Biochemistry 39, 2000, 701-711に記載されている。
【００６８】
本発明はまた、a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法にも関する。
【００６９】
本発明はまた、a）配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の増大を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法にも関する。
【００７０】
本発明は、a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドを発現する細胞を化合物と接触させる段階、ならびにb）前記遺伝子または前記遺伝子にコードされるポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【００７１】
本発明は、a）配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００７２】
好ましくは、ポリペプチドは配列番号：19である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：20である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：21である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：22である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：23である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは配列番号：24である。
【００７３】
配列番号：7にコードされるポリペプチド、オステオモジュリン（オステオアドへリン）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、オステオモジュリンが細胞接着および／または付着を仲介する能力のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Wendelら、J. Cell Biol. 141, 1998, 839-847に記載されている。
【００７４】
配列番号：8にコードされるポリペプチド、VLDLR（超低比重リポタンパク質受容体）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、VLDLRの、プロテイナーゼ、アポリポタンパク質、細胞外タンパク質などのリガンドとの結合等の能力を指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Rettenbergerら、J. Biol. Chem. 274, 1999, 8973-8980に記載されており、ここには、セリンプロテイナーゼ-セルピン複合体、プロ酵素型uPA、ApoE含有リポタンパク質、apo(a)、リポタンパク質リパーゼ、およびトロンボスポンジン-1を含むリガンドに対する結合アッセイ法に関する参考文献も列挙している。
【００７５】
配列番号：9にコードされるポリペプチド、11-β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1型（HSD11B1）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、HSD11B1のデヒドロゲナーゼ活性および／またはレダクターゼ活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Bujaiska, I.J.ら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002, 87, 1205-1210に記載されている。
【００７６】
配列番号：10にコードされるポリペプチド、リーリンに関して用いる「活性および／または機能」という用語は、リーリンが受容体、例えばVLDLRもしくはApoER2と結合する能力、または下流シグナル伝達分子、例えばDisabled 1のリン酸化を誘導する能力のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、D'Arcangelo, G.ら、Neuron 1999, 24, 471-479；およびHowell, B.W.ら、Genes Dev. 1999, 13, 643-648に記載されている。
【００７７】
配列番号：11にコードされるポリペプチド、多剤耐性タンパク質7（MRP7、ABCC10）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、ABCC10のトランスポーター活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、例えば、Mol. Pharmacol. 2003, 63, 351-358に記載されている。
【００７８】
配列番号：12にコードされるポリペプチド、シクロフィリン40（CyP40）に関して用いる「活性および／または機能」という用語は、CyP40が他のシャペロン、例えばHsp90と結合する能力、およびそのシャペロン活性のことを指す。これらの活性を決定するためのアッセイ法は当技術分野で周知であり、Ward、B.K.ら、J. Biol. Chem. 2002, 277, 40799-40809；およびFreeman B.C.ら、Science 1996, 274, 1718-1720に記載されている。
【００７９】
本発明は、a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドを化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００８０】
本発明はさらに、a）配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸を発現する細胞を化合物と接触させる段階、ならびにb）前記ポリペプチドの活性および／または機能を決定および／または測定する段階を含み、前記ポリペプチドのアンタゴニストとして作用して肥満を軽減および／または予防する化合物は、前記ポリペプチドの活性および／または機能の低下を引き起こす化合物である、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００８１】
本発明はまた、a）化合物を前記ポリペプチドと接触させる段階、およびb）前記化合物の前記ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階を含む、配列番号：13〜24のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００８２】
本発明は、a）化合物を前記ポリペプチドと接触させる段階、およびb）前記化合物の前記ポリペプチドに対する結合能力を決定する段階を含む、配列番号：86〜146のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドと結合する化合物をスクリーニングする方法も提供する。
【００８３】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドもしくは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドと結合する、および／またはポリペプチドの活性もしくは発現に対して刺激作用もしくは抑制作用を及ぼす、候補化合物または被験化合物または作用物質は、ある型のポリペプチドを発現する細胞（細胞系アッセイ法）または単離されたポリペプチド（無細胞アッセイ法）のいずれかを用いて同定される。さまざまなアッセイ法に、ポリペプチドの種々の型（例えば、完全長ポリペプチド、ポリペプチドの生物学的活性断片、またはポリペプチドの全体もしくは一部分を含む融合タンパク質）を用いることができる。さらに、ポリペプチドは任意の適した哺乳動物種に由来しうる。アッセイ法は、以上に定義したように、被験化合物またはポリペプチドと既知のリガンドまたは受容体との結合を直接的または間接的に測定する結合アッセイ法でありうる。アッセイ法は、ポリペプチドの活性を直接的または間接的に測定する活性アッセイ法であってもよい。アッセイ法は、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドをコードするmRNAまたはポリペプチド）の発現を直接的または間接的に測定する発現アッセイ法であってもよい。さまざまなスクリーニングアッセイ法が、哺乳動物（例えば、マウスまたはラット）の摂食行動、体重、または代謝速度に対する被験化合物の効果を測定するインビボアッセイ法と組み合わせられる。
【００８４】
別の態様において、アッセイ法は、ポリペプチド（例えば、完全長ポリペプチド、ポリペプチドの生物学的活性断片、またはポリペプチドの全体もしくは一部分を含む融合タンパク質）を発現する細胞を被験化合物と接触させる段階、およびポリペプチドの活性を調整する（例えば、刺激または抑制する）被験化合物の能力を決定する段階を含む、細胞系アッセイ法である。ポリペプチドの活性を調整する被験化合物の能力は、ポリペプチドの活性を測定するのに適した任意の方法によって決定することができる。
【００８５】
本発明は無細胞アッセイ法も含む。このようなアッセイ法は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの1つの型（例えば、完全長ポリペプチド、ポリペプチドの生物学的活性断片またはポリペプチドの全体もしくは一部分を含む融合タンパク質）を被験化合物と接触させる段階、およびポリペプチドに対する被験化合物の結合能力を決定する段階を含む。被験化合物とポリペプチドとの結合は、上記のように直接的または間接的に決定することができる。別の態様において、本アッセイ法は、ポリペプチドを、ポリペプチドと結合する既知の化合物と接触させ、アッセイ混合物を形成させる段階、アッセイ混合物を被験化合物と接触させる段階、およびポリペプチドと相互作用する被験化合物の能力を決定する段階を含み、この際、ポリペプチドと相互作用する被験化合物の能力を決定するには、既知の化合物と比較してポリペプチドと選好的に結合する被験化合物の結合能力を決定する段階を含む。
【００８６】
本発明の無細胞アッセイ法は、膜結合型のポリペプチドまたはその可溶性断片のいずれの使用に対しても適用しうる。膜結合型のポリペプチドを含む無細胞アッセイ法の場合には、膜結合型のポリペプチドが溶液中に保たれるように可溶化剤を利用することが望ましいと思われる。このような可溶化剤の例には、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、トリトンX-100、トリトンX-114、テシット（Thesit）、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸（CHAPS）、3-[(3コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸（CHAPSO）またはN-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００８７】
本発明の以上のアッセイ方法のさまざまな態様においては、結合性分子と複合体を形成した型のポリペプチドと複合体を形成していない型のポリペプチドとの分離を容易にするために、さらにはアッセイ法を自動化するために、ポリペプチドを固定化することが望ましいと思われる。被験化合物とポリペプチドとの結合、または候補化合物の存在下および非存在下におけるポリペプチドと結合性分子との相互作用は、反応物を収容するのに適した任意の容器内で行うことができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が含まれる。1つの態様においては、タンパク質の一方または両方をマトリックスに対して結合させることを可能にするドメインを付加した融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical；St. Louis, Mo.）またはグルタチオンにより誘導体化されたマイクロタイタープレートの表面に吸着させ、続いてそれを被験化合物と組み合わせた上で、または被験化合物および未吸着結合タンパク質もしくはポリペプチドのいずれかと組み合わせた上で、複合体の形成を導く条件（例えば、塩およびpHに関する生理的条件）下で混合物をインキュベートすることができる。インキュベーション後に、結合していない成分を除去するためにビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、複合体の形成を直接的または間接的に、例えば上記のようにして測定する。または、複合体をマトリックスから解離させ、前述したポリペプチドの結合または活性のレベルを標準的な技法を用いて決定することもできる。
【００８８】
タンパク質をマトリックス表面に固定化するためのその他の技法を、本発明のスクリーニングアッセイ法に用いることもできる。例えば、前述したポリペプチドまたはその結合性分子を、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。本発明のビオチン化ポリペプチドまたは標的分子は、当技術分野で周知の技法（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals；Rockford, Ill.）を用いてビオチンNHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製した上で、ストレプトアビジンをコーティングした96ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェル内に固定化することができる。または、ポリペプチドまたは結合性分子とは反応するが、本発明のポリペプチドとその結合性分子との結合は妨げない抗体により、プレートのウェルを誘導体化することもできる。結合していない結合タンパク質または本発明のポリペプチドは、抗体結合によってウェルに捕捉される。このような複合体を検出するための方法には、GST固定化複合体に関する上記のものに加えて、前述したポリペプチドまたは結合性分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、さらにはポリペプチドまたは結合性分子に付随する酵素活性の検出に依拠する酵素結合アッセイ法が含まれる。
【００８９】
II．被験化合物
本発明のスクリーニングアッセイ法での使用に適した被験化合物は、任意の適した源、例えば、従来の化合物ライブラリーから入手できる。被験化合物を、生物学的ライブラリー法；空間的アドレス指定が可能な並行した固相または液相ライブラリー法；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法のさまざまなアプローチのうち任意のものを用いて入手することもできる。生物学的ライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4種類のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子の化合物ライブラリーに対して適用しうる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12：145）。
【００９０】
分子ライブラリーの合成法の例は当技術分野で見いだすことができ、例えば、DeWittら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6909；Erbら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422；Zuckermannら(1994) J. Med. Chem. 37：2678；Choら(1993) Science 261：1303；Carrellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2059；Carellら(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2061；およびGallopら(1994) J. Med. Chem. 37：1233に記載されている。
【００９１】
化合物のライブラリーは溶液中に提示されていてもよく（例えば、Houghten (1992) BioTechniques 13：412-421）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354：82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364：555-556）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号；同第5,403,484号；および同第5,223,409号）、プラスミド（Cullら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865-1869）もしくはファージ（ScottおよびSmith (1990) Science 249：386-390；Devlin (1990) Science 249：404-406；Cwirlaら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：6378-6382；およびFelici (1991) J. Mol. Biol. 222：301-310）上に提示されていてもよい。
【００９２】
本発明は、前述の任意の方法によって同定される化合物を提供する。
【００９３】
III．単離された核酸分子
本発明の1つの局面は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチド、配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチド、またはその生物学的活性部分をコードする単離された核酸分子、さらには、配列番号：1〜12からなる群より選択される遺伝子もしくは配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸分子、および、核酸分子の増幅または変異のためのPCRプライマーとして用いるのに適したこのような核酸分子の断片に関する。本明細書で用いる「核酸分子」という用語は、DNA分子（例えばcDNAまたはゲノムDNA）およびRNA分子（例えばmRNA）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNAまたはRNA類似体を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖DNAであることが好ましい。この項では、前述の核酸およびこのような核酸の作製および使用のための方法について述べる。
【００９４】
「単離された」核酸分子とは、その核酸分子の天然の源に存在するその他の核酸分子から分離されたもののことである。「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物体のゲノムDNA中、自然下ではその核酸に隣接している配列（すなわち、その核酸の5'および3'末端に位置する配列、好ましくはタンパク質をコードする配列）から遊離した状態にあることが好ましい。例えば、さまざまな態様において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムDNA中、自然下ではその核酸と隣接しているヌクレオチド配列の約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満を含みうる。さらに、cDNA分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合にはその他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まないこと、または化学合成された場合には前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない状態とすることが可能である。
【００９５】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学の技法および本明細書に提示した配列情報を用いて単離することができる。配列番号：1〜12からなる群より選択される核酸配列または配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子の全体または一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いることにより、本発明の核酸分子を、標準的なハイブリダイゼーション法およびクローニング法（例えば、Sambrookら編、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されたもの）を用いて単離することができる。
【００９６】
本発明の核酸分子は、標準的なPCR増幅法に従って、鋳型としてのcDNA、mRNAまたはゲノムDNA、および適切なオリヌクレオチドプライマーを用いて増幅できる。このようにして増幅された核酸を適切なベクター中にクローニングして、DNA配列解析によって特徴を明らかにすることができる。さらに、例えば自動DNA合成装置を用いるといった標準的な合成法により、核酸配列の全体または一部に対応するオリゴヌクレオチドを調製することもできる。
【００９７】
さらに、本発明の核酸分子には、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドもしくは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸配列の一部分のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用できる断片、または配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドもしくは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの生物学的活性部分をコードする断片が含まれうる。表2および表3または配列番号：25〜85に列挙したいずれかの遺伝子のクローニングによって決定されたヌクレオチド配列により、表2および表3または配列番号：25〜85に列挙したいずれかの遺伝子の対立遺伝子変種（allelic variant）およびその他の変種を同定および／またはクローニングするために設計されたプローブおよびプライマーを作製することができる。プローブ／プライマーは一般に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは一般に、表2および表3または配列番号：25〜85に列挙した遺伝子またはその天然の変異体もしくは対立遺伝子変種のいずれか1つのセンス配列またはアンチセンス配列における少なくとも約12個、好ましくは約25個、より好ましくは約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350または400個の連続したヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。
【００９８】
本発明の核酸分子の配列に基づくプローブは、選択した核酸分子にコードされるタンパク質分子と同一のタンパク質分子をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いることができる。このプローブは、そこに結合した標識基、例えば放射性同位体、蛍光性化合物、酵素または酵素補因子などを含む。このようなプローブは、例えば、mRNAレベルの検出、またはタンパク質をコードする遺伝子が変異もしくは欠失しているか否かの判定といった、対象由来の細胞試料中のタンパク質をコードする核酸分子のレベルの測定などによって、タンパク質を誤発現（mis-express）する細胞または組織を同定するための診断用キットの一部として用いうる。
【００９９】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの「生物学的活性部分」をコードする核酸断片は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸の一部分を単離し、ポリペプチドタンパク質のコード部分を発現させて（例えば、インビトロでの組換え体の発現による）、ポリペプチドのコード部分の活性を評価することによって調製しうる。
【０１００】
本発明はさらに、配列番号：1〜12からなる群より選択される核酸または配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子のヌクレオチド配列とは遺伝暗号の縮重のために異なるが、コードするタンパク質は前記ヌクレオチド配列と同じである核酸分子も含む。
【０１０１】
配列番号：1〜12のうちいずれか1つのヌクレオチド配列または配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子のヌクレオチド配列のほかに、アミノ酸配列に変化をもたらすDNA配列多型が集団内に存在しうることは当業者には理解されると思われる。このような遺伝的多型は、天然に存在する対立遺伝子の差異のために集団内の個体間にも存在しうる。対立遺伝子とは、所定の遺伝子座に択一的に存在する遺伝子の一群の構成要素のことである。本明細書で用いる「対立遺伝子変種」という語句は、所定の遺伝子座位に存在するヌクレオチド配列のこと、またはそのヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのことを指す。このような天然に存在する対立遺伝子の差異は、一般的には所定の遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％の変化をもたらしうる。代替の対立遺伝子は、多数の異なる個体において目的遺伝子のシークエンシングを行うことによって同定できる。これは、同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブをさまざまな個体に用いることにより、容易に実施しうる。天然に存在する対立遺伝子の差異の結果であって機能的活性を変化させない、このようなヌクレオチドの差異およびその結果生じるアミノ酸の多型または差異の任意のものおよびすべてが、本発明の範囲に含まれる。
【０１０２】
したがって、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、または1200）ヌクレオチドであって、表2および／または表3または配列番号：25〜85に列挙した遺伝子のいずれかのヌクレオチド配列、好ましくはコード配列、を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、遺伝子の対立遺伝子変種または変異体をコードする。
【０１０３】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いの同一性が少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75％）であるヌクレオチド配列が典型的には互いにハイブリダイズした状態にあるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明するためのものである。このようなストリンジェントな条件は当業者に周知であり、「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な一例は、約45℃の6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中でのハイブリダイゼーションに続いて50〜65℃の0.2×SSC、0.1％SDS中で1回または複数回の洗浄を行うというものである。配列番号：1〜12からなる群より選択される配列または配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然の核酸分子に対応することが好ましい。本明細書で用いる「天然の」核酸分子とは、自然界に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然型タンパク質をコードする）RNAまたはDNA分子のことを意味する。
【０１０４】
表2および表3または配列番号：25〜85に列挙したいずれかの遺伝子の天然の対立遺伝子変種のほかに、当業者は、突然変異によって変化を導入し、それにより、タンパク質の機能活性を変化させることなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらしうることをさらに理解すると思われる。例えば、「非必須な」アミノ酸残基の箇所にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を作製することができる。「非必須な」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなく野生型配列からの変更が可能な残基のことであり、これに対して「必須な」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。例えば、さまざまな種の相同体間で保存されていない、または半保存的に過ぎないアミノ酸残基は、活性にとって必須ではなく、このため変更の標的となる可能性が高いと考えられる。また、さまざまな種（例えば、マウスおよびヒト）の相同体間で保存されているアミノ酸残基は、活性にとって必須であり、このため変更の標的とはならないと考えられる。
【０１０５】
したがって、本発明の別の局面は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドであって、活性にとって必須でないアミノ酸残基に変化を含むポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなポリペプチドはアミノ酸配列の点で前記ポリペプチドと異なるが、それでも生物学的活性を保っている。1つの態様において、単離された核酸分子は、配列番号：13〜24または86〜146のいずれかのアミノ酸配列との同一性が少なくとも約85％、95％、96％、97％、98％または99％であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
異型タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コードするタンパク質に1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失が導入されるように、表2および表3または配列番号：25〜85に列挙したいずれかの遺伝子のヌクレオチド配列に1つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作製できる。変異は、部位特異的変異誘発、PCRを介した変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、予想される1つまたは複数の非必須なアミノ酸残基の箇所に作製されることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ残残基によって置換されることをいう。類似のアミノ酸残基を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。または、飽和変異誘発法（saturation mutagenesis）などにより、コード配列の全体または一部にわたってランダムに変異を導入することもでき、その結果得られる変異体を、生物学的活性に関してスクリーニングし、活性を保っている変異体を同定することもできる。変異誘発の後には、コードされたタンパク質を組換え法によって発現させ、そのタンパク質の活性を評価することができる。
【０１０７】
1つの態様においては、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの変種である変異型ポリペプチドは、（1）シグナル伝達経路中のタンパク質とタンパク質-タンパク質相互作用を生じる能力；（2）ポリペプチドのリガンドとの結合能力；または（3）ポリペプチドの細胞内結合タンパク質との結合能力、に関してアッセイすることができる。別の態様においては、変異型ポリペプチドは、摂食行動、体重または代謝に変化をもたらす能力に関してアッセイすることができる。
【０１０８】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードするセンス核酸に対して相補的な分子、例えば二本鎖cDNA分子のコード鎖に対して相補的な、またはmRNA配列に対して相補的な分子を含む。このため、アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合を形成することができる。アンチセンス核酸はコード鎖全体に対して相補的であってもよく、例えばタンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全体または一部といった、コード鎖の一部のみに対して相補的であってもよい。アンチセンス核酸分子は、配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体または一部に対するアンチセンスであってもよい。非コード領域（「5'および3'非翻訳領域」）とは、コード領域に隣接していてアミノ酸には翻訳されない5'および3'配列のことである。
【０１０９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50ヌクレオチド長でありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で知られた化学合成反応および酵素連結反応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、または例えばホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドのように、分子の生物学的安定性を高めるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された種々の修飾を受けたヌクレオチドを用いて、化学合成することができる。アンチセンス核酸を作製するために用いうる修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチンキサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュェオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。または、アンチセンスの向きに核酸がサブクローニングされた（すなわち、以下の細項目でさらに詳細に説明するように、挿入された核酸から転写されたRNAが、目的の標的核酸に対してアンチセンスの向きになると考えられる）発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることもできる。
【０１１０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、それらがタンパク質をコードする細胞性mRNAおよび／またはゲノムDNAとハイブリダイズまたは結合し、それにより、例えば転写および／または翻訳を抑制することによってタンパク質の発現を抑制するように、一般的には対象に投与されるかまたはインサイチューで産生される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成させる通常のヌクレオチド相補性によるものであってもよく、または例えば、DNA二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介したものであってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の一例には、組織部位での直接注入が含まれる。または、選択した細胞を標的とするようにアンチセンス核酸分子を改変して全身投与することもできる。例えば、全身投与のためには、例えば細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体とアンチセンス核酸分子とを連結させることにより、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するようにアンチセンス分子を改変することができる。本明細書に記載のベクターを用いて、アンチセンス核酸分子を細胞に送達することも可能である。アンチセンス核酸分子の十分に高い細胞内濃度を得るためには、強力なpol IIプロモーターまたはpol IIIプロモーターの制御下にアンチセンス核酸分子が位置するベクター構築物が好ましい。
【０１１１】
本発明のアンチセンス核酸分子はαアノマー型の核酸分子でありうる。αアノマー型核酸分子は相補的RNAと特異的な二本鎖ハイブリッド体を形成するが、通常のαユニットとは異なり、鎖は互いに平行する（Gaultierら(1987) Nucleic Acids Res. 15：6625-6641）。アンチセンス核酸分子が、2'-o-メチルリボヌクレオチド（Inoueら(1987) Nucleic Acids Res. 15：6131-6148）またはキメラ型RNA-DNA類似体（Inoueら(1987) FEBS Lett. 215：327-330）を含むことも可能である。
【０１１２】
本発明にはリボザイムも含まれる。リボザイムとはリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒性RNA分子のことであり、リボザイムとの相補的領域を有するmRNAなどの一本鎖核酸を切断することができる。このため、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（HaselhoffおよびGerlach (1988) Nature 334：585-591に記載））を用いて、mRNA転写物を触媒作用によって切断し、それによってmRNAの翻訳を抑制することができる。配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるcDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計できる。例えば、活性部位のヌクレオチドが、切断しようとするヌクレオチド配列に対して相補的であるようなテトラヒメナL-19 JVS RNAの誘導体を作製することができる。Cechら、米国特許第4,987,071号；およびCechら、米国特許第5,116,742号。または、表1および表2に列挙した遺伝子のいずれかをコードするmRNAを用いて、RNA分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性RNAを選択することもできる。例えば、BartelおよびSzostak (1993) Science 261：1411-1418を参照されたい。
【０１１３】
本発明は、三重らせん構造を形成する核酸分子も含む。例えば、配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドの発現を、そのポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に対して相補的なヌクレオチド配列に対するターゲティングを行わせて標的細胞における遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成させることにより、抑制することができる。概論については、Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6)：569-84；Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660：27-36；およびMaher (1992) Bioassays 14(12): 807-15を参照されたい。
【０１１４】
いくつかの態様においては、本発明の核酸分子を、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善するために、塩基部分（base moiety）、糖部分、またはリン酸骨格の箇所で改変することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変してペプチド核酸を作製することができる（Hyrupら(1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23を参照）。本明細書で用いる「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、核酸模倣物のこと、例えばデオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド（pseudopeptide）によって置換され、4種の天然の核酸塩基のみが保持されているDNA模倣物などのことを指す。PNAの中性骨格は、低イオン強度条件下でDNAおよびRNAと特異的なハイブリダイゼーションを生じうることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、Hyrupら(1996)、前記；Perry-O'Keefeら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14670-675に記載されたような標準的な固相ペプチド合成手順を用いて行える。PNAは治療的および診断的な用途に用いうる。例えば、PNAを、転写もしくは翻訳の停止の誘導または複製の阻害などによる遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（antigene）物質として用いることができる。また、PNAを、例えば、PNA依存的PCRクランプ法（PNA directed PCR clamping）などによる遺伝子中の単一塩基対変異の解析に；S1ヌクレアーゼなどの他の酵素と組み合わせて用いて人工的制限酵素として（Hyrup (1996)、前記）；またはDNA配列およびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Hyrup (1996)、前記；Perry-O'Keefeら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14670-75）、用いることもできる。
【０１１５】
別の態様では、PNAに親油性もしくは他の補助的な基を結び付けること、PNA-DNAキメラの形成、またはリポソームもしくは当技術分野で知られたその他の薬物送達法を用いることにより、PNAを、例えばその安定性または細胞への取込みを増強させるために改変することができる。例えば、PNAおよびDNAの有利な性質を兼ね備えると思われるPNA-DNAキメラを作製することができる。このようなキメラは、RNaseHおよびDNAポリメラーゼなどのDNA認識酵素がそのDNA部分と相互作用することを可能にする一方で、そのPNA部分は高い結合親和性および特異性をもたらすと考えられる。PNA-DNAキメラの連結は、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数および配向に関して選択された適切な長さのリンカーを用いて行うことができる（Hyrup (1996)、前記）。PNA-DNAキメラの合成は、Hyrup (1996)、前記；およびFinnら(1996) Nucleic Acids Research 24（17）：3357-63に記載されたようにして行うことができる。例えば、標準的なホスホルアミダイト結合化学反応および修飾ヌクレオシド類似体を用いて固体支持体上にDNA鎖を合成することができる。5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシ-チミジンホスホルアミダイトなどの化合物を、PNAとDNA5'末端との間にリンカーとして用いることができる（Magら(1989) Nucleic Acids Res. 17：5973-88）。続いてPNAモノマーを逐次的な様式で結合させて、5'PNAセグメントおよび3'DNAセグメントを有するキメラ分子を形成させる（Finnら(1996) Nucleic Acids Research 24(17)：3357-63）。または、5'DNAセグメントおよび3'PNAセグメントを有するキメラ分子を合成することもできる（Peterserら(1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5：1119-11124）。
【０１１６】
また別の態様において、オリゴヌクレオチドは、ペプチドなどの他の付属基（例えば、インビボでの宿主細胞受容体のターゲティングのためのもの）、または細胞膜（例えば、Letsingerら(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：6553-6556；Lemaitreら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84：648-652；PCT国際公開公報第88/09810号を参照）もしくは血液脳関門（例えば、PCT国際公開公報第89/10134号を参照）を介した輸送を促進する作用物質を含みうる。さらに、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤（例えば、Krolら(1988) Bio/Techniques 6：958-976を参照）またはインターカレート剤（例えば、Zon (1988) Pharm. Res. 5：539-549を参照）を用いてオリゴヌクレオチドを改変することもできる。この目的のために、オリゴヌクレオチドをペプチド、ハイブリダイゼーションにより誘発される架橋剤、輸送因子（transport agent）、ハイブリダイゼーションにより誘発される切断剤、などの別の分子と結合させてもよい。
【０１１７】
本発明は、表2および／または表3または配列番号：25〜85に列挙した遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用を提供する。
【０１１８】
本発明はまた、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドもしくは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用も提供する。
【０１１９】
V．単離されたタンパク質および抗体
本発明の1つの局面は、単離されたタンパク質およびその生物学的活性部分、さらには配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを標的とする抗体を産生させるための免疫原としての使用に適したポリペプチド断片に関する。1つの態様では、標準的なタンパク質精製法を用いた適切な精製方式により、細胞または組織源から天然型のタンパク質を単離することができる。別の態様では、組換えDNA法によって本発明のポリペプチドを産生させる。組換え体の発現の代わりに、標準的なペプチド合成法を用いてポリペプチドを化学合成することもできる。この項では、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のいずれかのポリペプチド、そのポリペプチドを標的とする抗体、ならびにこのようなポリペプチドおよび抗体の作製および使用のための方法について述べる。
【０１２０】
「単離された」または「精製された」タンパク質もしくはその生物学的活性部分は、タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞材料もしくはその他の混入タンパク質を実質的に含まない、または化学合成された場合には前駆化学物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、単離または組換えによる産生に用いる細胞の細胞成分から分離された、タンパク質の調製物が含まれる。このため、細胞材料を実質的に含まないタンパク質には、異種タンパク質（heterologous protein）（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）が（乾燥重量にして）約30％、20％、10％または5％未満のタンパク質が含まれる。タンパク質またはその生物学的活性部分が組換えによって産生される場合には、培地も実質的に含まないこと、すなわち培地がタンパク質調製物の容積の約20％、10％または5％未満であることが好ましい。タンパク質が化学合成によって生産される場合には、前駆化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まないこと、すなわちタンパク質の合成にかかわる前駆化学物質またはその他の化学物質から分離されていることが好ましい。したがって、このようなタンパク質調製物が有する前駆化学物質または非関連化学物質は（乾燥重量にして）約30％、20％、10％、5％未満である。
【０１２１】
配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの生物学的活性部分には、完全長タンパク質よりもアミノ酸の数が少ないタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含んでおり、対応する完全長タンパク質の少なくとも1つの活性を呈する。一般的には、生物学的活性部分は、対応する部分の少なくとも1つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明の生物学的活性部分は、例えば10、25、50、100アミノ酸長またはそれ以上の長さであってよい。さらに、タンパク質の他の領域を除去した別の生物学的活性部分を組換え法によって作製し、天然型のポリペプチドの1つまたは複数の機能的活性に関して評価することもできる。
【０１２２】
有用なポリペプチドとしては、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また別の有用なタンパク質としては、ポリペプチドのいずれかに対して実質的に同一（例えば、同一性が少なくとも約96％、97％、98％、99％または99.5％）であり、対応する天然のタンパク質の機能的活性を保持しているものの、天然の対立遺伝子変異または変異誘発のためにアミノ酸配列には差があるものがある。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性を決定するためには、最適な比較を目的として配列のアラインメントを行う（例えば、第2のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第1のアミノ酸配列または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。続いて、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置にあるものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合には、これらの分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性は、配列によって共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置（例えば、オーバーラップしている位置）の総数（×100）。2つの配列は同じ長さであることが好ましい。
【０１２３】
本発明はキメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本明細書で用いる「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」には、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの全体または一部（例えば、生物学的活性断片）が、異種ポリペプチド（すなわち、同じ本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）と機能的に結合したものが含まれる。融合タンパク質の範囲における「機能的に結合した」という用語は、本発明のポリペプチドおよび異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことを意図している。異種ポリペプチドはポリペプチドのN末端またはC末端のいずれと融合させてもよい。
【０１２４】
有用な融合タンパク質の1つは、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの全体または一部がGST配列のC末端と融合した、GST融合タンパク質である。この種の融合タンパク質により、組換えポリペプチドの精製が容易となりうる。また別の有用な融合タンパク質には、FLAGTM、lacZ部分、GST、カルモジュリン結合ペプチド、His6、またはHAとのとの融合物が含まれる。このような融合タンパク質を作製するためのベクターは、クロンテック（Clontech, Inc.、Palo Alto, Calif.）およびストラタジーン（Stratagene, Inc.、La Jolla, Calif.）から市販されている。
【０１２５】
別の態様において、融合タンパク質は異種シグナル配列をN末端に含む。例えば、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドの天然のシグナル配列を除去し、別のタンパク質由来のシグナル配列によって置換することができる。例えば、バキュロウイルス外被タンパク質のgp67分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（「分子生物学における最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1992）。真核生物異種シグナル配列のその他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が含まれる（Stratagene；La Jolla, Calif.）。さらに別の例として、有用な原核生物異種シグナル配列には、phoA分泌シグナル（Sambrookら、前記）およびプロテインA分泌シグナル（Pharmacia Biotech；Piscataway, N.J.）が含まれる。
【０１２６】
さらに別の態様において、融合タンパク質は、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドの配列の全体または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーの一員に由来する配列と融合した、免疫グロブリン融合タンパク質である。リガンド（可溶性または膜結合性）と細胞表面にあるタンパク質（受容体）との間の相互作用を阻害し、それによってインビボでのシグナル伝達を抑制するために、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を薬学的組成物に組み入れて対象に投与することが可能である。免疫グロブリン融合タンパク質を用いて、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドの同族リガンドの生物学的利用能に影響を与えることもできる。リガンド／受容体の相互作用の阻害は、摂食行動、体重、または代謝速度を治療的に調整するのに有用な可能性がある。さらに、本発明の免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として用いて、ポリペプチドに対する抗体を対象に産生させること、リガンドを精製することができ、さらには受容体とリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法を行うこともできる。
【０１２７】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は標準的な組換えDNA法によって作製できる。別の態様においては、自動DNA合成装置を含む従来の技法によって融合遺伝子を合成することができる。または、2つの連続した遺伝子断片の間に相補的突出部を生じさせたアンカープライマーを用いて遺伝子断片のPCR増幅を行い、引き続いてアニーリングおよび再増幅を行ってキメラ型遺伝子配列を作製することもできる（例えば、Ausubelら、前記を参照）。さらに、融合部分（例えばGSJポリペプチド）をすでにコードしている発現ベクターも数多く市販されている。融合部分が本発明のタンパク質とインフレームに結合するように、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドのいずれかをコードする核酸をこのような発現ベクター中にクローニングしてもよい。
【０１２８】
本発明はまた、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドのいずれかの変種にも関する。このような変種は、アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能しうる変化したアミノ酸配列を有する。変種は、離散的点変異（discrete point mutation）または切断といった変異誘発によって作製することができる。アゴニストは、天然型のタンパク質と実質的に同じ生物学的活性またはそのサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞内シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーと競合的に結合することにより、天然型タンパク質の活性の1つまたは複数を阻害しうる。このため、機能が制限された変種を用いて処置することにより、特定の生物学的効果を誘発させることができる。天然型のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変種による対象の処置は、天然型のタンパク質による処置に比べて、対象における副作用が少ない可能性がある。
【０１２９】
アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能する本発明のタンパク質の変種は、本発明のタンパク質の変異体、例えば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定しうる。1つの態様においては、変種の多様化ライブラリー（variegated library）が、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、多様化遺伝子ライブラリーによってコードされる。変種の多様化ライブラリーは、タンパク質配列候補の縮重集合が個々のポリペプチドとして、またはさらに長い融合タンパク質の集合（例えばファージディスプレイのため）として発現可能なように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結させて遺伝子配列を形成させることによって作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチドの変種の候補のライブラリーを作製するために使用できる方法にはさまざまなものがある。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39：3；Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53：323；Itakuraら(1984) Science 198：1056；Ikeら(1983) Nucleic Acids Res. 11：477を参照されたい）。
【０１３０】
さらに、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの断片のライブラリーを用いて、変種のスクリーニングおよびその後の選択のための、ポリペプチドの多様化集団（variegated population）を作製することもできる。例えば、コード配列の断片のライブラリーは、目的のコード配列の二本鎖PCR断片をニッキングが1分子当たり1回しか起こらない条件下でヌクレオチドによって処理し、二本鎖PCR断片を変性させ、DNAを再生させて、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖DNAを形成させ、再形成された二本鎖からS1ヌクレアーゼ処理によって一本鎖部分を除去し、その結果得られた断片ライブラリーを発現ベクター中に連結することによって作製しうる。この方法により、目的のタンパク質のN末端および種々のサイズの内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１３１】
点変異または切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのため、および選択した性質を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための技法は、いくつかのものが当技術分野で知られている。ハイスループット解析に適しており、大規模な遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も広く用いられている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、その結果得られたベクターのライブラリーを用いて適切な細胞の形質転換を行った上で、産物の検出される遺伝子をコードするベクターが所望の活性を検出することによって容易に単離される条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。
【０１３２】
ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技法である再帰的集合変異誘発法（Recursive ensemble mutagenesis）（REM）を、本発明のタンパク質の変種を同定するために、スクリーニングアッセイ法と組み合わせて用いることもできる（ArkinおよびYouvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7811-7815；Delgraveら(1993) Protein Engineering 6(3)：327-331）。
【０１３３】
VI．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチド（またはその一部分）をコードする核酸を含むベクター（例えば、発現ベクター）に関する。本明細書で用いる場合、「ベクター」とは、結合させた別の核酸を輸送する能力を持つ核酸分子のことを指す。ベクターの1つのタイプには「プラスミド」があり、これは内部に付加的なDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループのことを指す。別のタイプのベクターにはウイルスベクターがあり、これはウイルスゲノム中に付加的なDNAセグメントを連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞内で自律複製を行いうる（例えば、細菌由来の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。また別のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、このため宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ベクターの一種である発現ベクターは、機能的に結合させた遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組換えDNA法において有用な発現ベクターはしばしばプラスミド（ベクター）の形態にある。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、その他の形態の発現ベクターも含むことを意図している。この項では、配列番号：1〜12からなる群より選択される核酸、配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子、およびその変種、を保有するベクターおよび宿主細胞、ならびにその作製および使用のための方法について述べる。
【０１３４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態にある本発明の核酸を含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現させようとする核酸配列と機能的に結合した、発現に用いる宿主細胞に基づいて選択された1つまたは複数の調節配列を含んでいることを意味する。組換え発現ベクターの範囲における「機能的に結合した」とは、目的のヌクレオチドが、そのヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞内に導入された場合には宿主細胞における）が可能な様式で調節配列に結合していることを意味するものとする。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれるものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel, 「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、および、特定の宿主細胞のみでヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的な調節配列）が含まれる。発現ベクターが、形質転換を行う細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依拠して設計されることは当業者には理解されると考えられる。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより、本明細書に記載の核酸にコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０１３５】
本発明の組換え発現ベクターは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞などの原核細胞または真核細胞において、表2または表3または配列番号：25〜85に列挙した遺伝子の発現のために設計することができる。適した宿主細胞は、Goeddel（前記）によって詳細に考察されている。または、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで組換え発現ベクターの転写および翻訳を行うこともできる。
【０１３６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌で行うことが最も多い。融合ベクターは、その内部にコードされているタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは一般には3つの目的がある：1）組換えタンパク質の発現を上昇させる；2）組換えタンパク質の溶解性を高める；および3）アフィニティ精製の際にリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助ける。融合タンパク質の精製後、融合部分から組換えタンパク質を分離できるように、融合発現ベクターには、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解性切断部位が導入されることが多い。このような酵素およびそれらの同族認識配列には、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターにはpGEX（Pharmacia Biotech Inc；SmithおよびJohnson (1988) Gene 67：31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）およびpRIT5（Pharmacia, Piscataway, NJ）が含まれ、これらはそれぞれグルタチオン5-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質またはタンパク質Aを標的組換えタンパク質と融合させる。
【０１３７】
適した誘導性非融合型大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amannら(1988) Gene 69：301-315）およびpET lid（Studierら、「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-9）が含まれる。pTrcベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッド型trp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼ転写に依存する。pET lidベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現されるウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）を介したT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、宿主株BL21（DE3）またはHM5174（DE3）により、lacUV 5プロモーターによる転写制御下にあるT7 gn1遺伝子を含む常在性プロファージから供給される。
【０１３８】
大腸菌における組換えタンパク質の発現を最大限に増加させるための戦略の1つは、組換えタンパク質のタンパク質分解による切断能力に障害のある宿主細菌内でタンパク質を発現させることである（Gottesman, 「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128）。もう1つの戦略は、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌で選好的に用いられるように、発現ベクター中に挿入しようとする核酸の核酸配列を変更することである（Wadaら(1992) Nucleic Acids Res. 20：2111-2118）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なDNA合成法によって行うことができる。
【０１３９】
別の態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。出芽酵母（S. cerivisae）における発現のためのベクターの例には、pYepSec1（Baldariら(1987) mEMBO J. 6：229-234）、pMFa（KurjanおよびHerskowitz, (1982) Cell 30：933-943）、pJRY88（Schultzら(1987) Gene 54：113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）およびpPicZ（InVitrogen Corp, San Diego, 15 Calif.）が含まれる。
【０１４０】
または、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現に使用できるバキュロウイルスベクターには、pAcシリーズ（Smithら(1983) Mol. Cell Biol. 3：2156-2165）およびpVLシリーズ（LucklowおよびSummers (1989) Virology 170：31-39）が含まれる。
【０１４１】
さらに別の態様において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞内で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、pCDM8（Seed (1987) Nature 329：840）およびpMT2PC（Kaufmanら(1987) EMBO J. 6：187-195）が含まれる。哺乳動物細胞内で用いた場合には、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス性調節エレメントによって与えられる。例えば、よく用いられるプロモーターは、ポリオーマ、2型アデノウイルス、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞の両方に関するその他の適した発現系については、Sambrookら、前記の16章および17章を参照されたい。
【０１４２】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種で選好的に核酸の発現を導くことができる（例えば、核酸を発現させるために組織特異的調節エレメントが用いられる）。組織特異的調節エレメントは当技術分野で周知である。適した組織特異的プロモーターの非制限的な例には、アルブミンプロモーター（肝特異的；Pinkertら(1987) Genes Dev. 1：268-277）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton (1988) Adv. Immunol. 43：235-275）、特にT細胞受容体（WinotoおよびBaltimore (1989) EMBO J. 8：729-733）および免疫グロブリン（Banerjiら(1983) Cell 33：729-740；QueenおよびBaltimore (1983) Cell 33：741-748）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：5473-5477）、膵特異的プロモーター（Edlundら(1985) Science 230：912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願公報第264,166号）が含まれる。発生調節性プロモーター、例えばマウスhoxプロモーター（KesselおよびGruss (1990) Science 249：374-379）およびα-フェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman (1989) Genes Dev. 3：537-546）なども含まれる。
【０１４３】
本発明はさらに、発現ベクター中にアンチセンスの向きにクローニングされた本発明のDNA分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このDNA分子は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードするmRNAに対するアンチセンスであるRNA分子の発現（DNA分子の転写による）が可能な様式で、調節配列と機能的に結合している。さまざまな細胞種でアンチセンスRNA分子の連続的発現を導く、例えばウイルス性プロモーターおよび／もしくはエンハンサーなどの、アンチセンスの向きにクローニングされて核酸と機能的に結合した調節配列を選択することもでき、または構成的で組織特異的もしくは細胞種特異的なアンチセンスRNAの発現を導く調節配列を選択することもできる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節領域の制御下で産生され、ベクターが導入される細胞種によってその活性が決定されうる、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態をとりうる。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の考察については、Weintraubら、Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１４４】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。この用語が、特定の対象細胞のみではなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も意味することは認識されている。変異または環境的影響のためにその後の世代で何らかの変化が生じる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で用いるこの用語の範囲には含まれる。
【０１４５】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞でありうる（例えば、大腸菌、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞）。ベクターDNAは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入しうる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、DEAEデキストランを介したトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を含む、外来核酸を宿主細胞に導入するための当技術分野で知られた種々の技法を指すものとする。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのために適した方法は、Sambrookら（前記）およびその他の実験マニュアルに記載されている。
【０１４６】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションに関しては、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション法にもよるが、外来DNAがゲノム中に組み込まれる細胞の割合はごくわずかであることが知られている。これらの組み込み体（integrant）の同定および選択のためには、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般に、目的の遺伝子とともに宿主細胞内に導入される。有用な選択マーカーには、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対し耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸による安定的なトランスフェクションを受けた細胞は、薬剤選択によって同定できる（例えば、選択マーカーを組み込んだ細胞は生存し、他の細胞は死滅すると考えられる）。
【０１４７】
培養下にある原核宿主細胞または真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを産生させるために用いることができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを産生させるための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、ポリペプチドが産生されるように、適した培地中で本発明の宿主細胞（配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されたもの）を培養する段階を含む。別の態様において、本方法はさらに、培地または宿主細胞からポリペプチドを単離する段階を含む。
【０１４８】
VII．治療の方法
本発明は、例えば摂食行動または代謝速度を変化させることによる、体重を調整するための予防的および治療的方法の両方を提供する。
【０１４９】
1つの局面において、本発明は、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のポリペプチドのいずれか1つの活性を調整する作用物質を投与することによって体重を調整するための方法を提供する。このような方法は、前記ポリペプチドの発現もしくは活性が異常な患者、または前記ポリペプチドの活性を調整する作用物質の投与によって利益を受けると考えられるその他の患者のいずれにおいても、体重を調整するために有用である。患者の必要性に応じて、ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを対象の治療のために用いることができる。
【０１５０】
配列番号：13〜18もしくは配列番号：86〜146のポリペプチドのいずれか1つの活性に関するアゴニスト、または前記ポリペプチドの発現を上昇させる化合物は、体重を減少させるために用いうることから、高体重、例えば肥満の治療に有用である。同様に、前記ポリペプチドのシグナル伝達経路中のタンパク質の活性または発現を高める化合物は、高体重の治療に有用である。逆に、前記ポリペプチドの活性に対するアンタゴニスト、または前記ポリペプチドの発現もしくは活性を低下させる化合物は、体重を増加させるために用いうることから、低体重、例えば悪液質（cachexia）の治療に有用である。配列番号：13〜18または配列番号：86〜146のいずれかのポリペプチドのシグナル伝達経路中のタンパク質の活性または発現を低下させる化合物は、低体重の治療に有用である。
【０１５１】
配列番号：19〜24または配列番号：99〜146のポリペプチドのいずれかの活性に対するアンタゴニスト、または前記ポリペプチドの発現を低下させる化合物は、体重を減少させるために用いうることから、高体重、例えば肥満の治療に有用である。同様に、前記ポリペプチドのシグナル伝達経路中のタンパク質の活性または発現を低下させる化合物は、高体重の治療に有用である。逆に、前記ポリペプチドの活性に関するアゴニスト、または前記ポリペプチドの発現もしくは活性を上昇させる化合物は、体重を増加させるために用いうることから、低体重、例えば悪液質の治療に有用である。配列番号：19〜24または配列番号：99〜146のいずれか1つのポリペプチドのシグナル伝達経路中のタンパク質の活性または発現を上昇させる化合物は、低体重の治療に有用である。
【０１５２】
本発明はまた、配列番号：13〜18からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜98からなる群より選択されるポリペプチドのアゴニスト、またはその発現を上昇させる化合物の、肥満治療用の薬剤の調製のための使用も提供する。さらに、本発明は、配列番号：19〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：99〜146からなる群より選択されるポリペプチドに対するアンタゴニスト、またはその発現を低下させる化合物の、肥満治療用の薬剤の調製のための使用も提供する。
【０１５３】
VIII．薬学的組成物
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイ法によって同定された新規作用物質、および本明細書に記載した治療のためのその使用にも関する。本発明の核酸分子、ポリペプチド、および抗体（本明細書では「活性化合物」とも称する）は、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。このような組成物は一般に、核酸分子、タンパク質または抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語は、製剤投与との適合性がある任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれることを意図する。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野では周知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補足的な活性化合物を組成物に組み入れることもできる。
【０１５４】
本発明は、配列番号：13〜24または配列番号：86〜146のいずれかのポリペプチドの発現または活性に対する調整物質（modulator）（および／または前記ポリペプチドのシグナル伝達経路中のタンパク質の活性または発現に対する調整物質）を含む薬学的組成物、さらには1つまたは複数のこのような調整物質と薬学的に許容される担体とを配合することによってこのような組成物を調製するための方法を含む。本発明のスクリーニングアッセイ法を用いて同定された調整物質を含む薬学的組成物が、使用のための指示書とともにパッケージ化されたものも本発明に含まれる。配列番号：13〜24もしくは86〜146のポリペプチドのいずれか1つの活性に対するアンタゴニストであるか、または前記ポリペプチドの発現を低下させる調整物質の場合には、低体重の治療（例えば、体重の増加）のための薬学的組成物の用法が指示書に明記されると考えられる。前記ポリペプチドの活性に対するアゴニストであるか、または前記ポリペプチドの発現を上昇させる調整物質の場合には、高体重の治療（すなわち、体重の減少）のための薬学的組成物の用法が指示書に明記されると考えられる。
【０１５５】
本発明は、配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物が、薬学的に許容される担体と混合されたものを含む、体重の調整のための薬学的製剤も提供する。
【０１５６】
本発明の薬学的組成物は、意図する投与経路と適合しうるように製剤化される。投与経路の例には、静脈内、皮内、皮下などの非経口的投与、経口的（吸入など）、経皮的（局所外用）、経粘膜的および直腸内投与が含まれる。非経口的、皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含みうる：注射用の水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸鉛、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースといった張性の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整しうる。非経口的製剤は、アンプル、ディスポーザルシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の多回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１５７】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液の要時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適した担体には、生理食塩水、滅菌精製水、クレモフォア（Cremophor）ELTM（BASF；Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が含まれる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動的である必要がある。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物による汚染から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適した混合物などを含む、溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持しうる。微生物による影響からは、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって保護することができる。多くの場合には、糖類、多価アルコ−ル、例えばマンニトール、ソルビトールなど、塩化ナトリウムといった等張剤を組成物に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって持続させることができる。
【０１５８】
滅菌注射液は、適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を、必要に応じて上記に列挙した成分を1つまたは組み合わせて組み入れ、その後に濾過滅菌を行うことによって調製できる。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を含めることによって調製される。滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、活性成分に加えて、あらかじめ滅菌濾過した溶液からの任意の所望の付加的成分が粉末として得られる、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１５９】
経口用組成物は一般に、不活性希釈液または可食担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入すること、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療的投与の目的には、活性化合物を賦形剤とともに組み入れ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で用いることができる。液体担体中の化合物が経口的に適用されて咀嚼および喀出または嚥下されるような口内洗浄剤として用いるために、液体担体を用いて経口用組成物を調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤および／または添加材料を組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは以下の成分、または同様の性状をもつ化合物のうち任意のものを含みうる：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Primogel）もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテス（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素などの流動促進剤（glidant）；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料などの着香料。
【０１６０】
吸入による投与のためには、化合物は、適した噴霧剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１６１】
全身投与が経粘膜的または経皮的な手段によるものであってもよい。経粘膜的または経皮的投与のためには、透過させようとする障壁に適した浸透剤が製剤中に用いられる。このような浸透剤は当技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜的投与用としては、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は鼻スプレーまたは坐薬の使用によって行いうる。経皮的投与用としては、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム剤中に配合される。
【０１６２】
また、化合物を、直腸内送達のための坐薬（例えば、カカオ脂およびその他のグリセリド類などの従来の坐薬用基材）または停留浣腸の形態として調製することもできる。
【０１６３】
1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御放出型製剤などの、化合物が身体から迅速に排出されないよう保護すると思われる担体とともに調製される。エチレンビニルアセテート、重合無水物（polyanhydride）、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体を用いることもできる。このような製剤の調製のための方法は当業者には明らかであると考えられる。材料をアルザ社（Alza Corporation）およびノバ ファーマシューティカルズ（Nova Pharmaceuticals, Inc.）から購入することもできる。リポソーム懸濁液（感染細胞を標的とするリポソームをウイルス抗原に対するモノクローナル抗体とともに含む）を薬学的に許容される担体として用いることも可能である。これらは、例えば米国特許第4,522,811号に記載されたような当業者に周知の方法に従って調製しうる。
【０１６４】
投与の簡便性および投与量の均一性のためには、経口用または非経口用の組成物を単位用量剤形（unit dosage form）として製剤化することが特に有利である。本明細書で用いる単位用量剤形とは、治療しようとする対象に対する単位用量として適した物理的に離散的な単位のことを指す；各単位は必要な薬学的担体とともに望ましい治療効果を生じるように計算された規定量の活性化合物を含む。本発明の単位用量剤形のための規格は、活性化合物に特有な特徴および達成しようとする特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこのような活性化合物を調合する際の技術分野に内在する制限によって規定されるとともに、それらに直接依存する。
【０１６５】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入して遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号を参照）または定位的注射（例えば、Chenら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：3054-3057を参照）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的製剤は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでいてもよく、または遺伝子送達媒体を包埋する徐放性基質を含んでいてもよい。または、例えばレトロウイルスベクターのように、組換え細胞から完全な遺伝子送達用ベクターを無傷の状態で作製しうる場合には、薬学的製剤は遺伝子送達システムを生成する1つまたは複数の細胞を含みうる。
【０１６６】
薬学的組成物は、投与のための指示書とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１６７】
本発明は、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドの活性を調整する化合物が、薬学的に許容される担体と混合されたものを含む、体重の調整のための薬学的製剤を提供する。
【０１６８】
本発明はまた、前述の薬学的製剤、および体重を調整する目的で薬学的製剤を投与するための指示書を含むパッケージにも言及する。
【０１６９】
本発明は、a）被験化合物を、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階、b）被験化合物が、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドに結合するか否かを判定する段階、およびc）配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドまたは配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドに結合する被験化合物を薬学的に許容される担体と組み合わせて、体重を調整するために有用な薬学的組成物を作製する段階を含む、体重の調整に有用な薬学的組成物を調製するための方法に関する。
【０１７０】
本発明は、a）配列番号：13〜24からなる群または配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドのリガンドを、被験化合物の存在下および非存在下、配列番号：13〜24からなる群または配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドに接触させる段階、b）配列番号：13〜24からなる群または配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドのリガンドと、配列番号：13〜24からなる群または配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドとの結合を、被験化合物が変化させるか否かを判定する段階、およびc）前記リガンドと前記ポリペプチドとの結合を変化させる化合物を、薬学的に許容される担体と組み合わせて、体重を調整するために有用な薬学的組成物を作製する段階を含む、体重の調整に有用な薬学的組成物を調製するための方法を提供する。
【０１７１】
本発明はまた、配列番号：1〜12からなる群より選択される遺伝子もしくは配列番号：25〜85からなる群より選択される遺伝子、または配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用も提供する。
【０１７２】
本発明はさらに、配列番号：25〜146からなる群より選択される遺伝子またはその遺伝子にコードされるポリペプチドの、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用を提供する。
【０１７３】
これに加えて、本発明はまた、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用にも関する。
【０１７４】
さらに、本発明は、配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸、またはその変異体もしくは断片の、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするための標的としての使用を提供する。
【０１７５】
本発明はまた、配列番号：13〜24からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。
【０１７６】
本発明はさらに、配列番号：86〜146からなる群より選択されるポリペプチドを含む、肥満を軽減および／または予防する化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。
【実施例】
【０１７７】
実施例1．RNAの調製
トリゾール（TriZol）試薬（Life Technologies）およびファストRNAグリーン（Fast RNA green）（BIO101）キットを製造者のプロトコールに従って用いて、皮下脂肪組織500mgから全RNAを単離した。RNeasyキット（Qiagen）により全DNAを混入DNAから精製した。
【０１７８】
実施例2．DNAチップによる遺伝子発現の測定
第一鎖cDNAおよび第二鎖cDNAの合成は、SuperScriptチョイス ジーンチップ キット（SuperScript Choice Gene Chip Kit）（Life Technologies）およびギブコ（Gibco）の試薬を用いて行った。T7 RNAポリメラーゼ結合部位が組み込まれた二本鎖cDNAを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合物（Life Technologies）を用いた抽出によって精製した。有機相および水相をフェーズロックゲル（Phase Lock Gel）（Eppendorf）によって分離し、二本鎖cDNAを製造者のプロトコールに従って沈降させて回収した後、水中に再懸濁した。
【０１７９】
この二本鎖cDNAを、T7キット（Ambion）およびビオチン含有リボヌクレオチド（Enzo-LOXO GmbH）を用いたインビトロ転写（IVT）によってビオチン標識cRNAに変換した。このIVT材料を、RNeasyスピンカラム（Qiagen）を用いて、取り込まれなかったリボヌクレオチドから精製した。洗浄の後に、一本鎖ビオチン標識cRNAを、95℃の500mM酢酸カルシウム、150mM酢酸マグネシウム、pH 8.1中で35分間、化学的に加水分解して小さな断片にした。反応は、試料を氷上で冷却することによって停止させた。
【０１８０】
プローブを、〜12,000遺伝子に相当する特徴（feature）を含むU95Aジーンチップ マイクロアレイ（GeneChip Microarray）（Affymetrix）に対してハイブリダイズさせた。洗浄、ハイブリダイゼーション、検出およびシグナル増幅の工程はすべてジーンチップ フルイディクス ステーション（GeneChip Fluidics Station）（Affymetrix）を用いて行った。ハイブリダイズさせたジーンアレイ（GeneArray）からの蛍光強度データをジーンアレイ スキャナー（Affymetrix）を用いて収集した。蛍光強度情報を含む生ファイルを、アフィメトリクス マイクロアレイ スイート（Affymetrix Microarray Suite）（MAS）ソフトウエアを用いてデータファイルに変換した。差異を伴って発現される遺伝子を、ロシュ アフィメトリクス チップ（Roche Affymetrix Chip）実験解析（RACE-A）ソフトウエアを用いて同定した。対照患者（n＝10）と肥満患者（n＝10）との間の差を、数種類の統計学的フィルターにより、変化要因と対照との比較として評価した。
【０１８１】
（表２）肥満例の脂肪組織で下方制御される遺伝子
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【０１８２】
（表３）肥満例の脂肪組織で上方制御される遺伝子
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【０１８３】
（表４）肥満例の脂肪組織で下方制御される遺伝子
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【０１８４】
（表５）肥満例の脂肪組織で上方制御される遺伝子
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【配列表】
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