(57)【要約】 【課題】  糖尿病で併発する神経障害を予防または治療するアルドースリダクターゼ阻害剤等を提供する。【解決手段】  菌類、特に万年茸の子実体を粉砕して水やエタノールでエキスを抽出することで、簡単にまた、人体にとって安全性の高いアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができる。アルドースリダクターゼ阻害剤を抽出するには、抽出液として水、低級アルコール、酢酸エチルなどの有機溶剤などを使用することができるが、特に、水および／またはエタノールを使用することが好ましい。水とエタノールは人体に対する安全性が高いからである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
茸類の子実体を由来成分とすることを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項２】
前記茸類は万年茸であることを特徴とする請求項１記載のアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項３】
アルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの濃度が５０μｇ／ｍｌ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤。
【請求項４】
茸類の子実体から有効成分を抽出する抽出工程と、
前記有効成分からアルドースリダクターゼ阻害剤を得る阻害剤形成工程と、
を含むことを特徴とするアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
前記有効成分をエタノール及び／または水で抽出することを特徴とする請求項４に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項６】
前記有効成分をエタノール濃度が３０％以上の含水エタノールで抽出することを特徴とする請求項５に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項７】
前記有効成分を１〜３０℃で抽出することを特徴とする請求項５または６に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項８】
前記茸類は万年茸であることを特徴とする請求項４から７のいずれかに記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【請求項９】
前記万年茸の子実体を粉砕する粉砕工程を経た後、粉砕された前記子実体から前記抽出工程にて前記有効成分を抽出し、前記阻害剤形成工程では、前記有効成分を粉末化してエキス粉末を得た後、前記エキス粉末を用いて前記アルドースリダクターゼ阻害剤を形成することを特徴とする請求項８に記載のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、万年茸をはじめとする茸類から得ることができるアルドースリダクターゼ阻害剤、アルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法、健康食品および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、糖尿病の合併症として発症する、糖尿病性の神経障害の治療について様々な研究がなされている。糖尿病による高血糖の状態においては、細胞内のグルコース濃度が高くなった際、通常の解糖系（主経路）で代謝しきれない過剰のグルコースは、アルドースリダクターゼと呼ばれる酵素によりソルビトールへ変換される。ソルビトールは代謝される速度が遅いため、多量に生成されると細胞内に蓄積されてしまう。その結果、細胞内の浸透圧が高まり、細胞の膨化と細胞膜変異を引き起こし、神経障害の原因となりうると考えられている。
【０００３】
そこで、アルドースリダクターゼを阻害することによりソルビトールの生成を抑制することができる「アルドースリダクターゼ阻害剤」について研究がなされている。例えば、合成化合物のアルドースリダクターゼ剤としてエパルレスタット（商品名：キネダック錠）が開発された。
【０００４】
また、アルドースリダクターゼ剤として天然物由来の化合物も知られており、例えばフクギ抽出成分（特許文献１）、褐藻類抽出成分（特許文献２）、ビテキシンを有効成分とするトケイ草抽出成分（特許文献３）、アルファバッカ抽出物（特許文献４），ネムノキ属植物由来成分（特許文献５）、シポー・エスカーダ抽出成分（特許文献６）、ハマゴウ属植物抽出成分（特許文献７）、フトモモ抽出成分（特許文献８）、シャペウ・デ・コウロ抽出成分（特許文献９）、ストロベリーリーフ、セージ、西河柳、仙鶴草、ミサキノハナの葉、チャービルの葉、チャイブスの葉、大黄の抽出物を一種類以上配合したもの（特許文献１０）、メドゥスイートの地上部、マテ茶、アルニカの花または茎、チャーブルの地上部、オールスパイス、テン茶、グアバの葉、オオハナサルスベリの地上部、タンジーの花または茎の抽出物を一種類以上配合したもの（特許文献１１）、Myrcia multiflora DC.の葉からの抽出成分（特許文献１２）等がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１１２９３８号公報（請求項１等）
【特許文献２】特開２０００−２２６３３３号公報（請求項１等）
【特許文献３】特開平６−２９３６５７号公報（請求項１等）
【特許文献４】特開平９−５９１６８号公報（請求項１等）
【特許文献５】特開２０００−１２８７９８号公報（請求項１等）
【特許文献６】特開平１０−１５８１８５号公報（請求項１等）
【特許文献７】特開２０００−１２８７９９号公報（請求項１等）
【特許文献８】特開２０００−１４３５２５号公報（請求項１等）
【特許文献９】特開平６−９４１６号公報（請求項１等）
【特許文献１０】特開２００３−１２８６５７号公報（請求項１等）
【特許文献１１】特開２００２−２５５８３７号公報（請求項１等）
【特許文献１２】特開２０００−１４３５号公報（請求項１等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、アルドースリダクターゼ阻害剤としては様々な物質から得られたものが存在するが、人体に対する安全性が必ずしも保障されているとは限らない。また、これらのアルドースリダクターゼ阻害剤は、生成や抽出にかなり手間がかかるものも多い。例えば、高温で抽出する必要があったり、人体にとって有毒である物質、例えばメチルアルコール等を用いて抽出され、最終的に人体に対して安全性が高いものとするための精製に手間がかかるものがある。
【０００７】
本発明は、茸類、特に万年茸から比較的手間をかけずに得ることができるアルドースリダクターゼ阻害剤、その製造方法、アルドースリダクターゼ阻害剤を含有する健康食品、および医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような技術的課題を鑑み、本発明者らが鋭意研究を行ったところ、本発明者らは、食品として食されていた歴史が長い茸類に着目し、茸類、特に万年茸にアルドースリダクターゼ阻害剤が含有されていることを発見するに至った。
そこでなされた本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤は、茸類の子実体を由来成分とすることを特徴とするものである。特に、茸類は万年茸であることが好ましい。
また、このようなアルドースリダクターゼ阻害剤は、アルドースリダクターゼ阻害率が５０％のときの濃度（以下、ＩＣ５０濃度）を５０μｇ／ｍｌ以下とすることができる。さらに、製造の際のエキス（有効成分）抽出を、エタノールを用いて行うことで、ＩＣ５０濃度を１０μｇ／ｍｌ以下とすることもできる。
【０００９】
また本発明のアルドースリダクターゼ阻害剤の製造方法は、茸類の子実体から有効成分を抽出する抽出工程と、有効成分からアルドースリダクターゼ阻害剤を得る阻害剤形成工程と、を含むことを特徴とする方法である。本発明の製造方法では、有効成分をエタノール及び／または水で抽出することができる。特に、ＩＣ５０濃度を１０μｇ／ｍｌ以下といったものとするには、有効成分をエタノール濃度が３０％以上の含水エタノールで抽出するのが良い。また、有効成分抽出は、加熱しながら行うこともできるが、１〜３０℃のような室温であっても良好に抽出できる。なお、茸類は万年茸であることが好ましい。
また、万年茸の子実体を粉砕する粉砕工程を経た後、粉砕された子実体から抽出工程にて有効成分を抽出し、阻害剤形成工程では、有効成分を粉末化してエキス粉末を得た後、このエキス粉末を用いてアルドースリダクターゼ阻害剤を形成することもできる。
【００１０】
さらに、本発明の健康食品は、茸類の子実体から得られるアルドースリダクターゼ阻害剤を含有することを特徴とするものである。この茸類は万年茸であることが好ましい。
【００１１】
その他、本発明の医薬品は、茸類の子実体から得られるアルドースリダクターゼ阻害剤を含有し、糖尿病性の神経障害を予防及び／または改善することを特徴とするものである。この場合、医薬品の剤型は、例えば経口剤、貼布剤、点眼剤、または注射剤を挙げることができる。なお、茸類は万年茸であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、アルドースリダクターゼを阻害することにより、高血糖時にポリオール代謝系が亢進されることで蓄積するソルビトールの生成を抑制でき、糖尿病合併症である糖尿病性白内障、網膜症、腎不全、神経障害、動脈硬化などの予防及び治療に有効であるアルドースリダクターゼ阻害剤を、茸類、特に万年茸の子実体から比較的手間をかけずに簡単に得ることができる。茸類は古くから人類が食品として食してきたものであり、その安全性を考慮する経験は長い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明では、アルドースリダクターゼ阻害剤を茸類の子実体から得る。本発明の茸類は、人類が食品として食することができるものが好ましく、その中でも特に万年茸が好ましい。万年茸とはサイワイタケとも称される茸類であり、中国名では霊芝（れいし）とも称される。
【００１４】
万年茸は現在人工的に栽培して収穫することが可能であり、例えば、おが屑や米ぬか、ふすま等を混ぜたもの（これを培地と称する）を培養袋や広口ビン等の容器に充填した後、この培地に菌を植え付け、これを一定期間培養させる。すると、菌（菌糸）が容器内の培地に蔓延し、いわゆる菌床が得られる。この菌床を、所定範囲内の湿度・温度・照度環境に維持することで菌床から鹿角状の万年茸の子実体が生えてくるので、この環境を一定期間維持して所望の大きさに生育させる。そして、生育した子実体を収穫する。
【００１５】
茸類、特に万年茸からアルドースリダクターゼ阻害剤を得るには、万年茸を粉砕し、エキスを抽出することにより得ることができる。まず、収穫した万年茸は、乾燥工程にて乾燥され、乾燥子実体を得る。この乾燥子実体を粉砕工程で粉砕する。このとき、例えば回転刃の付いた破砕装置等で粗粉砕した後、乾式ジェットミル等の粉砕手段によって微粉砕する。なお、微粉砕することで得られる微粉砕物の大きさを嵩密度が０．２［ｇ／ｃｍ３］以上となるようにすると、水溶性多糖類等のアルドースリダクターゼ阻害剤以外の人体にとって有効な成分を多く含んだエキスを得ることができるので好ましい。
【００１６】
続けて、抽出工程により微粉砕物からアルドースリダクターゼ阻害剤を含んだエキスを抽出する。アルドースリダクターゼ阻害剤を抽出するには、抽出液として水、低級アルコール、酢酸エチルなどの有機溶剤などを使用することができるが、特に、水および／またはエタノールを使用することが好ましい。水とエタノールは人体に対する安全性が高く、万が一抽出されたエキスに残っていても安全性に対する問題はない。また、水および／またはエタノールを用いて抽出すると、阻害率に優れたアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができる。水とエタノールを混合した含水エタノールを抽出液として使用する場合、その含水率（混合比率）はどのようなものであってもよい。さらに、抽出工程の抽出時における水および／またはエタノールの温度は例えば８０℃など、温度が高い場合において若干阻害率が高くなる傾向がみられるが、加熱せずに例えば１〜３０℃程度のいわゆる室温や１５〜２５℃のいわゆる常温であっても抽出したアルドースリダクターゼ阻害剤の阻害率は優れたものとなる。
【００１７】
このように本実施の形態においては、人体にとって安全な茸類から、人体にとって安全な水やエタノールを用いてアルドースリダクターゼ阻害剤を抽出することができる。さらに、抽出においては水とアルコールの混合比率や、温度などの細かい条件を気にすることなく、優れた阻害率を有するアルドースリダクターゼ阻害剤を抽出することができる。したがって、抽出時に加熱することなく、室温下で抽出することもでき、抽出にかかる手間やエネルギーコストを抑えることができる。
【００１８】
なお、抽出工程の後、得られたアルドースリダクターゼ阻害剤を含有するエキスを濃縮する濃縮工程を設けることができる。濃縮工程では、例えば水やエタノールなどの抽出液を常圧あるいは減圧雰囲気下で蒸発させることで、エキスに含まれるアルドースリダクターゼ阻害剤の濃度を高めることができる。
【００１９】
また、抽出工程や濃縮工程の後には、アルドースリダクターゼ阻害剤のエキスを健康食品や医薬品として形成する形成工程を設けることもできる。この工程では、抽出工程や濃縮工程で得られたエキスを粉末化工程においてスプレードライヤ等で粉末化した後、得られたエキス粉末をカプセルに充填したり、バインダ等を混合して所定形状に成形してタブレットの打錠を行ったりすることで、所定の形態の製品を得る。また、粉末化する際に所定粒度の微粉末あるいは顆粒状としたり、これを液体に混合してドリンク剤とすること等も可能である。なおアルドースリダクターゼ阻害剤のエキスは−２０℃で溶液のまま保存することもでき、また凍結乾燥や減圧濃縮した後に固形物として保存することができる。このような保存したものを形成工程で使用することもできる。
【００２０】
以上のようにして得られるアルドースリダクターゼ阻害剤は、医薬品または食品の形態で提供することができ、糖尿病に合併して発症する神経障害において、その障害の予防及び／または改善を期待することができる。なお、健康食品や医薬品として用いられる場合は、経口剤、貼布剤、点眼剤、注射剤等どのような剤型であっても良い。例えば、経口剤としては、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、液剤などを挙げることができる。医薬品として用いて投与する場合には、経口投与、非経口投与、吸入、経直腸投与、局所投与などの各種投与形態を採用することができる。このうち、非経口投与には、皮下注射、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与または注入などが含まれる。用量は、一般に１回当たり約０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり、通常１日に１〜５回投与される。ただし、正確な用量は、患者の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して、前記範囲内から決められる。また食品として用いられる場合には、ガム、キャンディ、ゼリー、錠菓、飲料などの形で提供することもできる。これらの健康食品や医薬品は、必要に応じて安定剤、賦形剤、増量剤等を含むことができる。
【実施例１】
【００２１】
（熱水抽出エキスのアルドースリダクターゼ阻害活性効果）
万年茸（鹿角霊芝原体）４ｇに蒸留水１００ｍｌを加え、均一になるようによく攪拌し、６０℃で１時間抽出した（熱水抽出）。残渣を９０メッシュで篩い分け、更に５Ｃろ紙で吸引ろ過し、エキスを得た。得られたエキスを最終エキス濃度が３０〜４００μｇ／ｍｌとなるように希釈し、次に述べるアルドースリダクターゼ阻害活性（以下、ＡＲ阻害活性）として阻害率を測定した。
【００２２】
ＡＲ阻害活性測定では、ヒト筋肉細胞由来のアルドースリダクターゼの全コーディング領域を含むｃ−ＤＮＡをバキュロウイルス−昆虫細胞系で発現したアルドースリダクターゼ（分子量：約３６０００、酵素活性：１ｕｎｉｔ／ｍｌ）を酵素液に用いた。なお、このアルドースリダクターゼはヒト筋肉及び網膜組織から抽出精製した酵素と同等の機能を有する。反応液の調整方法は次のとおりである。
（１）リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）
（２）ＮＡＤＰＨ溶液
（３）グリセルアルデヒド水溶液
（１）−（３）を用いて表１に示す組成に従って混合し、ＡＲ反応液を用意した。ブランクは酵素液の代わりに蒸留水を用いた。なお、以下の（１）以外の試薬は使用量に合わせて、都度調製したものを用いた。
【００２３】
【表１】
2005263658.tif 000002
【００２４】
測定では、測定する反応液を２５℃に予備加熱した後、酵素液を５μl加え、２５℃に保ち、約１分後の３４０ｎｍにおける吸光度変化を５分程度にわたり記録した。１分間あたりの吸光度変化量をΔＡ／ｍｉｎとし、以下の計算式に従って、ＡＲ阻害活性と阻害率を算出した。
ＡＲ阻害活性Ｘは、
Ｘ（ｕｎｉｔ／ｍｌ）＝（ΔＡ＿ｔｅｓｔ／ｍｉｎ−ΔＡ＿ｂｌａｎｋ／ｍｉｎ）×１／６．２／０．００５
１        ：反応液の全量（ｍｌ）
６．２    ：ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおけるマイクロモル吸光係数
０．００５：反応に使用した酵素液量（ｍｌ）
という計算式で求められる。阻害率Ｙは、
Ｙ（％）＝｛１−（ＸＳａｍｐｌｅ／ＸＣｏｎｔｒｏｌ）｝×１００
という計算式で求められる。ここで、ＸＳａｍｐｌｅは、エキスを添加した場合のＡＲ阻害活性（表１の“Ｓａｍｐｌｅ”）であり、ＸＣｏｎｔｒｏｌは、エキスの代わりに蒸留水を添加した場合のＡＲ阻害活性（表１の“Ｃｏｎｔｒｏｌ”）である。
【００２５】
結果を表２に示す。また、表２に基づく阻害率とエキス濃度の関係を図１に示す。
【００２６】
【表２】
2005263658.tif 000003
【００２７】
図１からわかるように、エキス濃度に依存して阻害率は増加した（相関係数０.８２）。図１の近似曲線からＩＣ５０（阻害率５０％となるエキス濃度）を算出したところ、７５μｇ／ｍｌとなった。ただし、阻害率に±５〜１０％のばらつきがあることを考慮すると、ＩＣ５０濃度を確実に得るためには、エキス濃度の調整において５０〜１００μｇ／ｍｌ程度の幅を考慮する必要があると思われた。
【実施例２】
【００２８】
（含水エタノール抽出エキスのＡＲ阻害活性効果）
実施例１と同様にしてエキスを抽出し、ＡＲ阻害活性を測定し、阻害率を得た。ただし、抽出液として熱水以外に、１０〜９０％含水エタノール、１００％エタノールを用い、抽出温度は６０℃とした。得られたエキス濃度と阻害率とＩＣ５０を含水エタノールのエタノール含有率（エタノール濃度）毎に表３に示す。また、抽出液のエタノール含有率が０〜５０％を用いた場合の阻害率とエキス濃度の関係のグラフを図２に示し、抽出液のエタノール含有率が６０〜１００％を用いた場合の阻害率とエキス濃度の関係のグラフを図３に示す。さらに表３のエタノール含有量とそれぞれのＩＣ５０濃度の関係のグラフを図４に示す。
【００２９】
【表３】
2005263658.tif 000004
【００３０】
なお、表３に示すＩＣ５０は、図２および図３から直接読み取れる場合（エタノール含有量が２０〜９０％）は読み取り、それ以外（エタノール含有量が０,１０および１００％）は後方補外して予測した値をＩＣ５０濃度とした。
【００３１】
図２および図３に示すように、阻害率はおおむねエキス濃度に依存して増加した。また、図４からわかるように、熱水および低含水エタノールを用いて抽出したエキスのＩＣ５０濃度は高く、抽出液のエタノール含有率が高くなるほどＩＣ５０濃度は低くなる傾向となった。ただし、阻害率にばらつきがあることを考慮すると、読み取ったＩＣ５０濃度に±４μｇ／ｍｌ程度の誤差が想定される。したがって、エタノール含有率が３０％以上の場合には、ＩＣ５０濃度は１０μｇ／ｍｌ付近で一定であると想定された。
【実施例３】
【００３２】
（抽出温度の異なるエキスのＡＲ阻害活性効果）
実施例１と同様にしてエキスを抽出し、ＡＲ阻害活性を測定し、阻害率を得た。ただし、抽出液として７０％含水エタノールを用い、抽出温度を室温である２５℃〜９０℃に設定して抽出を行った。どのエキスも抽出時には抽出液の蒸発を防ぐように容器のキャップを固く閉じた。ただし、８０℃〜９０℃の条件下では、抽出液自体が設定温度にまで達しないことから、設定温度で湯煎して抽出を行った。得られたエキス濃度と阻害率とＩＣ５０を抽出温度毎に表４に示す。各抽出温度におけるエキス濃度と阻害率のグラフを図５に示す。
【００３３】
【表４】
2005263658.tif 000005
【００３４】
図５に示すように、どのエキスも同程度の阻害率を示し、近似曲線もほぼ重なった。エキス毎のＩＣ５０濃度を読み取ったが、それらはばらつきの範囲内に収まり、明らかな温度依存性は見られなかった。このことより、ＡＲ阻害活性に対する抽出温度の影響は殆どなく、どの温度で抽出しても、例えば処置が比較的簡単な室温で抽出しても優れたＡＲ阻害活性を有するアルドースリダクターゼ阻害剤を得ることができることがわかる。
【比較例】
【００３５】
比較例としてアルドースリダクターゼ阻害剤を含有するカテキンとケルセチンについてＡＲ阻害活性を取得し、ＩＣ５０濃度を本発明の万年茸のエキスと比較した。
まず、カテキンでは、反応液濃度が５０〜５００μｇ／ｍｌとなるよう適宜希釈した（＋）−カテキン水溶液をエキスの代わりに用いて実施例と同様に阻害活性を測定し、測定値と公知の技術（特開平１１−１３０６７１号公報）に記載の値からＩＣ５０濃度を算出すると、１２７μｇ／ｍｌであった。また、ケルセチンの公知の技術（特開２００３−３００８９４号公報）の阻害活性からＩＣ５０濃度を算出すると、１３．２μｇ／ｍｌであった。表５に、カテキン、ケルセチン、万年茸（熱水抽出と含水エタノール抽出）のＩＣ５０濃度を示す。なお、含水エタノール抽出の万年茸のＩＣ５０濃度は実施例２のＩＣ５０濃度の平均値である。
【００３６】
【表５】
2005263658.tif 000006
【００３７】
表５からわかるように、アルドースリダクターゼ阻害作用としては、万年茸の熱水抽出エキスではカテキンの１．５倍前後、含水エタノール抽出エキスでは、カテキンの１４倍前後、ケルセチンとは１．４倍程度の効果がある。
【００３８】
なお、本発明においては、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で示した構成に対し、構成の変更、削除、追加等を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例１における熱水抽出エキスのＡＲ阻害効果における阻害率とエキス濃度の関係を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるエタノール含有量が０〜５０％の蒸留水または含水エタノールを抽出に用いた場合の阻害率とエキス濃度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例２におけるエタノール含有量が６０〜１００％の含水エタノールまたはエタノールを抽出に用いた場合の阻害率とエキス濃度の関係を示すグラフである。
【図４】実施例２における表３のエタノール含有量とＩＣ５０濃度の関係を示すグラフである。
【図５】実施例３における各抽出温度のエキス濃度と阻害率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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