(57)【要約】【課題】  血清の存在下においても優れた遺伝子導入効率及び生体適合性を有する非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして有用な新規のリン脂質誘導体を提供する。【解決手段】    下記の化１又は化２で示されるリン脂質誘導体。    【化１】2005247750.tif 000008    【化２】2005247750.tif 000009  （化１及び化２において、  Ｒ１，Ｒ２：炭素数１２〜１８の直鎖脂肪族炭化水素基  Ａ１，Ａ２：スペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、スペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、トリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基又は数平均分子量１０００〜２００００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基）【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化１又は化２で示されるリン脂質誘導体。
【化１】
2005247750.tif 000006
【化２】
2005247750.tif 000007
（化１及び化２において、
Ｒ１，Ｒ２：炭素数１２〜１８の直鎖脂肪族炭化水素基
Ａ１，Ａ２：スペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、スペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、トリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基又は数平均分子量１０００〜２００００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基）
【請求項２】
化１で示されるリン脂質誘導体であって且つ化１中のＲ１がヘキサデシル基である場合のものである請求項１記載のリン脂質誘導体。
【請求項３】
化２で示されるリン脂質誘導体であって且つ化２中のＲ２がヘキサデカノイル基である場合のものである請求項１記載のリン脂質誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つの項記載のリン脂質誘導体から成る遺伝子導入キャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のリン脂質誘導体及び該リン脂質誘導体から成る遺伝子導入キャリアに関する。疾病の治療に際しては、薬剤や生理活性物質等の有用物質を標的組織の細胞内に導入するための運搬体すなわちキャリアが必要となる。近年、遺伝子治療やアンチセンス医薬等の技術の進歩に伴って、特定の遺伝子を標的組織の細胞内に効率良く導入するための遺伝子導入キャリアの開発が盛んに行われており、なかでも非ウイルス系の遺伝子導入キャリアが安全性の点から注目されている。本発明はかかる非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして有用な新規のリン脂質誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして、１）２，５−ビス（３−アミノプロピルアミノ）ペンチル（ジオクタデシルカルバモイルメトキシ）アセテート等のリポポリアミン類（例えば特許文献１参照）、２）Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド等の第４級アンモニウム塩とリン脂質とを組み合わせたもの（例えば特許文献２参照）、３）Ｎ−［３−［２−（１，３−ジオレオイルオキシ）プロポキシカルボニル］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムヨード等の第４級アンモニウム塩とリン脂質とを組み合わせたもの（例えば特許文献３参照）等が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特表平１０−５０９９５８号公報
【特許文献２】再公表特許ＷＯ９８／４５４６３号公報
【特許文献３】特開平９−２７８７２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、血清の存在下においても優れた遺伝子導入効率及び生体適合性を有する非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして有用な新規のリン脂質誘導体を提供する処にある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記の課題を解決する本発明は、下記の化１又は化２で示されるリン脂質誘導体に係る。
【０００６】
【化１】
2005247750.tif 000002
【０００７】
【化２】
2005247750.tif 000003
【０００８】
化１及び化２において、
Ｒ１，Ｒ２：炭素数１２〜１８の直鎖脂肪族炭化水素基
Ａ１，Ａ２：スペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、スペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、トリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基又は数平均分子量１０００〜２００００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基
【０００９】
また本発明は、前記のようなリン脂質誘導体から成る遺伝子導入キャリアに係る。
【００１０】
化１で示されるリン脂質誘導体において、化１中のＲ１としては、１）ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基（セチル基）、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基、オクタデカトリエニル基等の炭素数１２〜１８の直鎖脂肪族炭化水素基が挙げられるが、なかでもヘキサデシル基（セチル基）が好ましい。
【００１１】
また化２で示されるリン脂質誘導体において、化２中のＲ２としては、ドデカデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、ヘキサデセノイル基、オクタデセノイル基、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基等の炭素数１２〜１８の直鎖脂肪族アシル基が挙げられるが、なかでもヘキサデカノイル基（パルミトイル基）が好ましい。
【００１２】
化１又は化２中のＡ１，Ａ２は、スペルミジン［Ｎ−（３−アミノプロピル）−４−アミノブチルアミン］の１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、スペルミン［Ｎ−（Ｎ’−（３−アミノプロピル）−４−アミノブチル）−３−アミノプロピルアミン］の１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基、トリスペルミン［Ｎ−（３―アミノープロピル）−Ｎ’−｛３−［３−（３―｛４−［３―（３−｛３−［４―（３−アミノープロピルアミノ）―ブチルアミノ］―プロピルアミノ｝―プロピルアミノ）―プロピルアミノ］−ブチルアミノ｝−プロピルアミノ）−プロピルアミノ］−プロピル｝−ブタンー１，４−ジアミン］（スペルミンの３量体）の１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基又は数平均分子量１０００〜２００００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である。
【００１３】
以上説明した化１で示されるリン脂質誘導体は以下の方法で合成できる。ポリアミンと無水ピリジンを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、そこへジアルキルフォスフェート無水物を無水ピリジンに溶解したものを加え、反応容器内を窒素置換して、室温で撹拌しつつ反応させて反応物を得る。得られた反応物から溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画し、溶離液を留去して、目的のリン脂質誘導体を得る。
【００１４】
また以上説明した化２で示されるリン脂質誘導体は以下の方法で合成できる。ポリアミンと無水ピリジンを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、そこへ１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステルを無水ピリジンに溶解したものを加え、反応容器内を窒素置換して、室温で撹拌しつつ反応させて反応物を得る。得られた反応物から溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画し、溶離液を留去して、目的のリン脂質誘導体を得る。
【００１５】
以上説明した本発明の化１又は化２で示されるリン脂質誘導体は、特定の遺伝子を標的組織の細胞内に効率良く導入するための、安全性の高い非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして有用である。
【００１６】
化１又は化２で示されるリン脂質誘導体から成る本発明の遺伝子導入キャリアに適用される遺伝子は特に制限されず、かかる遺伝子としてはオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられるが、なかでも形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子である遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。また前記の遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１７】
本発明の遺伝子導入キャリアを遺伝子に適用する方法それ自体は公知の方法を適用できる。例えば本発明の遺伝子導入キャリアをβ−ガラクトシターゼをコードしたプラスミドＤＮＡとの複合体の水性懸濁液として適用する場合、該水性懸濁液は、β−ガラクトシターゼをコードしたプラスミドＤＮＡの希釈液に本発明の遺伝子導入キャリアの水性懸濁液を加え、攪拌して作製する。本発明の遺伝子導入キャリアの使用量は特に制限されず、遺伝子を細胞内に導入するに充分な量であればよいが、かかる使用量としては、遺伝子１重量部に対し、０．１〜１００重量部とするのが好ましく、０．５〜５０重量部とするのがより好ましい。遺伝子としてのβ−ガラクトシターゼをコードしたプラスミドＤＮＡに適用する場合、該プラスミドＤＮＡ１重量部に対して本発明の遺伝子導入キャリアを１〜１０重量部とするのが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のリン脂質誘導体は血清の存在下においても優れた遺伝子導入効率及び生体適合性を有する非ウイルス系の遺伝子導入キャリアとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のリン脂質誘導体及び遺伝子導入キャリアの実施形態としては、次の１）〜７）が挙げられる。
１）化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がスペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−１）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−１）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２０】
２）化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−２）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−２）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２１】
３）化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がトリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−３）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−３）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２２】
４）化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１が数平均分子量１８００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−４）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−４）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２３】
５）化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２がスペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−５）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−５）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２４】
６）化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２がスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−６）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−６）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２５】
７）化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２が数平均分子量１８００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体（Ｐ−７）。そしてこのリン脂質誘導体（Ｐ−７）から成る遺伝子導入キャリア。
【００２６】
以下、本発明の構成及び効果をより具体的にするため、実施例等を挙げるが、本発明がこれらの実施例に限定されるというものではない。尚、以下の実施例及び比較例において、部は重量部を、また％は重量％を意味する。
【実施例】
【００２７】
試験区分１（予備合成）
・ジセチルフォスフェート無水物の合成
ジセチルフォスフェート５０mg（９０μｍｏｌ）と無水ピリジン１mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に固体状の１，３，５−トリイソプロピルベンゼンスルフォニルクロライド２７７mg（０．９１ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で数時間撹拌して、ジセチルフォスフェートの無水化反応を行った後、溶媒を減圧留去して反応生成物を得た。この反応生成物をクロロフォルムを溶離液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離してジセチルフォスフェート無水物４４．３mg（４１μｍｏｌ）を得た。収率は９０％であった。ここで、ジセチルフォスフェートからジセチルフォスフェート無水物への変換は、固定相シリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより、モリブデンブルーによる呈色反応で確認した。ジセチルフォスフェート無水物の分析値は以下の通りであった。
【００２８】
・ジセチルフォスフェート無水物の分析値
元素分析（Ｃ６４Ｈ１３２Ｏ７Ｐ２）：
理論値；Ｃ７１．４６，Ｈ１２．３７
実測値；Ｃ７１．４９，Ｈ１２．３２
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，１２Ｈ），１．２５（ｂｒｏａｄｓ，９６Ｈ），１．３７（ｍ，８Ｈ），１．７０（ｍ，８Ｈ），４．０−４．２（ｍ，８Ｈ）
３１Ｐ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：−１２．２７，−０．１３
１３Ｃ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：１４．０１，２２．６８，
２５．３６，２５．４５，２９．１６，２９．３６，２９．５４，２９．６０，２９．６６，２９．７１，３０．３１，３１．９２，６７．６７，６９．１２
（Ｃ６４Ｈ１３３Ｏ７Ｐ２）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；１０７５．９
実測値；１０７５．４
【００２９】
・１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステルの合成
ジパルミトイルホスファチジン酸１５mg（２２μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に２−ブロモエタノール１０μＬ（１２７μｍｏｌ）と固体状の１，３，５−トリイソプロピルベンゼンスルフォニルクロライド３０mg（１００μｍｏｌ）を加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で５時間撹拌した後、水０．１５mlを加えて反応を停止し、溶媒を減圧留去して反応生成物を得た。この反応生成物を固定相シリカゲルの薄層クロマトグラフィー｛メルク社製のシリカゲル６０Ｆ２５４、２０cm×２０cm、厚み０．２５mm、展開液クロロホルム／メタノール＝３／１（容量比）の混合液｝に供し、Ｒｆ値０．５〜０．６の区分を単離して、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル１３mg（１７．６μｍｏｌ）を得た。収率は８０％であった。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステルの分析値は以下の通りであった。
【００３０】
・１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステルの分析値
元素分析（Ｃ３７Ｈ７１ＢｒＮａＯ８Ｐ）：
理論値；Ｃ５７．１３，Ｈ９．２０
実測値；Ｃ５７．１８，Ｈ９．１８
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８９（ｔ，６Ｈ），１．２６（ｓ，４８Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），２．２８（ｍ，４Ｈ），３．５０（ｍ，２Ｈ），３．８−４．５（ｂｍ，６Ｈ），５．２５（ｍ，１Ｈ）
（Ｃ３７Ｈ７１Ｏ８ＰＢｒ７９Ｎａ２）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；７９９．４
実測値；７９９．３
【００３１】
試験区分２（リン脂質誘導体の合成）
・実施例１｛リン脂質誘導体（Ｐ−１）の合成｝
スペルミジン６．７４mg（４６μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得たジセチルフォスフェート無水物１０mg（９．３μｍｏｌ）を無水ピリジン０．１mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で５時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．１（容量比）の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．０２（容量比）の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−１）を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体（Ｐ−１）４．９mgを得た。収率は７８％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−１）は、下記の分析値から、化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がスペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体であった。
【００３２】
・リン脂質誘導体（Ｐ−１）の分析値
元素分析（Ｃ３９Ｈ８４Ｎ３Ｏ３Ｐ）：
理論値；Ｃ６９．４９，Ｈ１２．５６，Ｎ６．２３
実測値；Ｃ６９．４５，Ｈ１２．５９，Ｎ６．２７
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３３９４，３２４４，２９５５，２９１７，２８５０，１６４７，１５５８，１４６７，１２１０，１０１２
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．２６（ｓ，５２Ｈ），１．５６（ｍ，４Ｈ），１．７０（ｍ，６Ｈ），２．６１−３．１２（ｂｍ，１２Ｈ），３．９８（ｂｍ，４Ｈ）
（Ｃ３９Ｈ８５Ｎ３Ｏ３Ｐ）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；６７４．６
実測値；６７４．８
【００３３】
・実施例２｛リン脂質誘導体（Ｐ−２）の合成｝
スペルミン１０mg（４９μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得たジセチルフォスフェート無水物１０mg（９．３μｍｏｌ）を無水ピリジン０．１mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で５時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．１（容量比）の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．０２（容量比）の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−２）を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体（Ｐ−２）４．５mgを得た。収率は６６％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−２）は、下記の分析値から、化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体であった。
【００３４】
・リン脂質誘導体（Ｐ−２）の分析値
元素分析（Ｃ４２Ｈ９１Ｎ４Ｏ３Ｐ）：
理論値；Ｃ６８．９９，Ｈ１２．５４，Ｎ７．６６
実測値；Ｃ６９．０２，Ｈ１２．５９，Ｎ７．６３
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３４２６，３２３５，２９５５，２９１７，２８５０，１６４６，１５５８，１４６７，１２０８，１０１２
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．２６（ｓ，５２Ｈ），１．４２（ｂｍ，８Ｈ），１．５５（ｂｍ，４Ｈ），２．１５（ｂｒ，５Ｈ），３．１７（ｂｍ，８Ｈ），３．６３（ｂｍ，４Ｈ），３．９７（ｍ，４Ｈ）
３１Ｐ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：９．７６
（Ｃ４２Ｈ９２Ｎ４Ｏ３Ｐ）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；７３１．７
実測値；７３１．５
【００３５】
・実施例３｛リン脂質誘導体（Ｐ−３）の合成｝
トリスペルミン６mg（８．７μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得たジセチルフォスフェート無水物４mg（３．７μｍｏｌ）を無水ピリジン０．１mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で２４時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、蒸留水及びリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０，１０ｍＭ）で洗浄した。洗浄した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミノ化シリカゲル１ｇ）に供して、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．１（容量比）の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−３）を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体（Ｐ−３）４．８mgを得た。収率は８５％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−３）は、下記の分析値から、化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ａ１がトリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体であった。
【００３６】
・リン脂質誘導体（Ｐ−３）の分析値
元素分析（Ｃ６８Ｈ１５１Ｎ１２Ｏ３Ｐ）：
理論値；Ｃ６７．１７，Ｈ１２．５２，Ｎ１３．８２
実測値；Ｃ６７．１０，Ｈ１２．５９，Ｎ１３．７５
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３４４０，３２３７，２９５６，２９１７，２８５０，１６３７，１５５８，１４６７，１２０８，１０１２
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．２６（ｓ，５２Ｈ），１．４５（ｍ，４Ｈ），１．６９（ｂｍ，１６Ｈ），１．９１（ｂｒ，５７Ｈ），２．７８（ｂｍ，１２Ｈ），３．９９（ｂｍ，４Ｈ）
（Ｃ６８Ｈ１５１Ｎ１２Ｏ３ＰＮａ）＋に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析：
理論値；１２３８．２
実測値；１２４０．１
【００３７】
・実施例４｛リン脂質誘導体（Ｐ−４）の合成｝
数平均分子量１８００のポリエチレンイミン１６．７mg（９．３μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得たジセチルフォスフェート無水物１０mg（９．３μｍｏｌ）を無水ピリジン０．１mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で５時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．１（容量比）の混合物からなる溶離液で副生成物を溶出させ、更にクロロホルム／メタノール／トリエチルアミン＝１０／１／０．０２（容量比）の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−４）を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥して白色粉末状のリン脂質誘導体（Ｐ−４）３．５mgを得た。収率は２０．７％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−４）は、下記の分析値から、化１中のＲ１がヘキサデシル基（セチル基）、Ｒ３が数平均分子量１８００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化１で示されるリン脂質誘導体であった。
【００３８】
・リン脂質誘導体（Ｐ−４）の分析値
元素分析（Ｃ１１６Ｈ２７６Ｎ４２Ｏ３Ｐ）：
理論値；Ｃ５９．６０，Ｈ１１．９０，Ｎ２５．１７
実測値；Ｃ５９．５５，Ｈ１１．９６，Ｎ２５．１０
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３３４７，３２７３，２９５０，２９１７，２８５０，１６３３，１５６０，１４６７，１２１１，１０１２
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．１−１．６（ｂｒ，８３Ｈ），１．６５（ｂｍ，４Ｈ），２．５−３．１（ｂｍ，１７９Ｈ），４．１（ｍ，４Ｈ）
【００３９】
・実施例５｛リン脂質誘導体（Ｐ−５）の合成｝
スペルミジン８．５mg（５８．５μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得た１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル１６．４mg（２１．１μｍｏｌ）を無水ピリジン０．５mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で２４時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルム／メタノール＝３／１（容量比）の混合物からなる溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−５）を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体（Ｐ−５）１．３mgを得た。収率は７．５％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−５）は、下記の分析値から、化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２がスペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体であった。
【００４０】
・リン脂質誘導体（Ｐ−５）の分析値
元素分析（Ｃ４４Ｈ９０Ｎ３Ｏ８Ｐ）：
理論値；Ｃ６４．４３，Ｈ１１．０６，Ｎ５．１２
実測値；Ｃ６４．３８，Ｈ１１．１０，Ｎ５．０８
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３２９９，２９５６，２９１８，２８５１，１７２９，１６３７，１５５８，１４６６，１２１７，１０７０
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．２５（ｓ，４８Ｈ），１．５−１．９（ｂｒ，１４Ｈ），２．３０（ｂｍ，４Ｈ），２．５−３．０（ｂｍ，１０Ｈ），３．６９（ｂｒ，２Ｈ），３．９９（ｂｒ，２Ｈ），４．４１（ｍ，２Ｈ），５．２５（ｂｒ，１Ｈ）
（Ｃ４４Ｈ９１Ｎ３Ｏ８Ｐ）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；８２０．６
実測値；８２０．６
【００４１】
・実施例６｛リン脂質誘導体（Ｐ−６）の合成｝
スペルミン１０．３mg（５１μｍｏｌ）と無水ピリジン０．２５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得た１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル１６．４mg（２１．１μｍｏｌ）を無水ピリジン０．７５mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で２４時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、リン脂質誘導体（Ｐ−５）の場合と同様に、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、リン脂質誘導体（Ｐ−６）を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体（Ｐ−６）９．４mgを得た。収率は５１％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−６）は、下記の分析値から、化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２がスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体であった。
【００４２】
・リン脂質誘導体（Ｐ−６）の分析値
元素分析（Ｃ４７Ｈ９７Ｎ４Ｏ８Ｐ）：
理論値；Ｃ６４．３５，Ｈ１１．１４，Ｎ６．３９
実測値；Ｃ６４．３２，Ｈ１１．１９，Ｎ６．４２
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３４００，３３０８，２９４７，２９１８，２８５０，１７３７，１６４０，１５６３，１４６８，１２１９，１０６３
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８８（ｔ，６Ｈ），１．２５（ｓ，４８Ｈ），１．４−１．９（ｍ，１６Ｈ），２．３０（ｂｍ，４Ｈ），２．５−３．０（ｂｍ，１６Ｈ），３．９５（ｂｒ，２Ｈ），４．１５（ｂｒ，２Ｈ），４．４５（ｍ，２Ｈ），５．２５（ｂｓ，１Ｈ）
（Ｃ４７Ｈ９８Ｎ４Ｏ８Ｐ）＋に対するＳＩＭＳ質量分析：
理論値；８７７．７
実測値；８７７．７
【００４３】
・実施例７｛リン脂質誘導体（Ｐ−７）の合成｝
数平均分子量１８００のポリエチレンイミン１１．６mg（６．４μｍｏｌ）と無水ピリジン０．５mlを反応容器に仕込み、均一に溶解した後、更に試験区分１で得た１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−リン酸ブロモエチルエステル５mg（６．４μｍｏｌ）を無水ピリジン３mlに溶解したものを加えた。反応容器内を窒素置換し、室温で２４時間撹拌して反応させ、溶媒を留去した後、中性アルミナカラムクロマトグラフィーに供して、クロロホルムの溶離液でリン脂質誘導体（Ｐ−７）を含む区分を溶出させた。溶出物から溶離液を減圧留去した後、真空乾燥してリン脂質誘導体（Ｐ−７）５．３mgを得た。収率は３２％であった。このリン脂質誘導体（Ｐ−７）は、下記の分析値から、化２中のＲ２がヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、Ａ２が数平均分子量１８００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基である場合の化２で示されるリン脂質誘導体であった。
【００４４】
・リン脂質誘導体（Ｐ−７）の分析値
元素分析（Ｃ１２２Ｈ２８４Ｎ４２Ｏ８Ｐ）：
理論値；Ｃ５８．６４，Ｈ１１．４６，Ｎ２３．５５
実測値；Ｃ５８．６０，Ｈ１１．５０，Ｎ２３．５０
ＩＲの主なピーク（単位cm−１）：３４０７，３３０６，２９５０，２９２３，２８５０，１７３７，１６４０，１５６２，１４６８，１２１９，１０６３
１Ｈ−ＮＭＲによるケミカルシフト（単位はｐｐｍ）：０．８６（ｔ，６Ｈ），１．２４（ｓ，４８Ｈ），１．６０（ｍ，４Ｈ），２．３２（ｂｒ，４Ｈ），２．３−３．１（ｂｍ，１８４Ｈ），３．２５−４．５８（ｂｍ，３７Ｈ），５．１９（ｂｒ，１Ｈ）
【００４５】
試験区分３（リン脂質誘導体の評価）
試験区分２で合成したリン脂質誘導体の遺伝子導入キャリアとしての評価を下記の通り行った。遺伝子導入効率は蛍光強度の大きさで評価した。蛍光強度が大きいほど遺伝子導入効率が高いことを意味する。
【００４６】
・細胞培養
１次血管平滑筋細胞は、ウイスターラットの胸腹神経大動脈から取りだすことにより得た。内皮細胞と外膜細胞を分離し、平均的な血管平滑筋細胞を、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水［２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），ペニシリン２００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ，ストレプトマイシン２００mg／mlを含有する溶液］中にて３７℃で５％二酸化炭素存在下に保存した。コンフルエント時には０．２５mg／mlトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で細胞をはがした。
【００４７】
・トランスフェクションの評価
トランスフェクションの２４時間前に９６個のくぼみを持つプレート中に前記で培養した細胞を入れた。β−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ)を血清を含有していない培養液で２０mg／mlにまで希釈した。遺伝子導入キャリアをダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水に１mg／mlの濃度で懸濁させた懸濁液を、該懸濁液と同体積のβ−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ溶液で希釈して、遺伝子導入キャリア／β−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ＝１／３（重量比）からなる複合体とした。この複合体を１５分間室温でインキュベーションした後、細胞培地に添加して、血清非存在下のトランスフェクション評価試験を実施した。血清存在下のトランスフェクション評価試験は、２０％ＦＢＳを含む細胞培地に添加する以外は血清非存在下のトランスフェクション評価試験と同様に行った。トランスフェクション試験開始後２４時間において、内因性の酵素活性を失活させるための加熱（５０℃で４５分間）を加えるように改良されたマイクロプレート蛍光アッセイを用い、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を次の手順で測定した。プレートのそれぞれくぼみから培養液を取り除き、細胞をＰＢＳ溶液で一度洗い、１００mlの溶解用緩衝溶液［硫酸マグネシウム０．１ｍＭと塩化カリウム１ｍＭと４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル―エタンスルホン酸１００ｍＭ（ｐＨ７．８）に溶かした０．０３％トリトンＸ−１００溶液］を加えることにより細胞を溶解した。このプレートを５０℃で４５分間保ち、その後室温まで放冷した。プレートのそれぞれのくぼみに１０mlのフルオレセインジβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ，１００ｍＭ）を加えた。３７℃で一晩インキュベーションし、マイクロプレート蛍光光度計（Ｍｏｄｅｌ  ７６２０，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）で蛍光強度を測定した。結果を表１及び表２に示した。
【００４８】
【表１】
2005247750.tif 000004
【００４９】
【表２】
2005247750.tif 000005
【００５０】
表１及び表２において、
Ａ−１：スペルミジンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基
Ａ−２：スペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基
Ａ−３：トリスペルミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基
Ａ−４：数平均分子量１８００のポリエチレンイミンの１個の第１級アミノ基から１個の水素原子を除いた残基