(57)【要約】【課題】  インスリン抵抗性改善剤や肝臓における糖新生阻害剤のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】  被験物質の、KKLF遺伝子もしくはKKLFの発現抑制活性、又はKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とする、インスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の、KKLF遺伝子もしくはKKLFの発現抑制活性、又はKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とする、インスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
被験物質のKKLF遺伝子発現抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、KKLF遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLF遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLF遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【請求項３】
被験物質のKKLF遺伝子発現抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）KKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【請求項４】
被験物質のKKLF発現抑制活性に基づき、KKLF発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、KKLFを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLFの発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞のKKLFの発現量と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLFの発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【請求項５】
被験物質のKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、PEPCK遺伝子及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞と被験物質を接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を測定し、該発現量又は活性を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量又は活性と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【請求項６】
被験物質のKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする請求項１に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子、及びKKLF遺伝子を含む細胞と、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【請求項７】
インスリン抵抗性改善剤が肝糖新生抑制剤である、請求項１〜６のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
肝糖新生抑制剤がPEPCK発現抑制剤である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞が、肝臓由来細胞であることを特徴とする、請求項２〜８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法で選択されるインスリン抵抗性改善物質を有効成分として含有する、糖尿病治療又は予防剤。
【請求項１１】
KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、PEPCK発現抑制剤。
【請求項１２】
KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、肝糖新生抑制剤。
【請求項１３】
KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性改善剤。
【請求項１４】
KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、糖尿病治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン抵抗性や肝臓における糖新生を促進する転写因子、KKLF及びKKLF遺伝子の発現量を指標とした、インスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、生体において最大の臓器であり、腸で吸収された栄養分を運搬する門脈や、心臓から血液を運ぶ肝動脈が集まり、体外から摂取した栄養分をからだが使いやすいように処理する「代謝機能」、からだに不用なものを体外に排出しやすい形に変える「解毒機能」、栄養素を分解して肝臓に蓄える「貯蔵機能」など、生命活動を維持する上でもきわめて重要な働きをしている。肝臓は過剰な単糖類を貯蔵可能なグリコーゲンや脂肪に変える役割を持つ一方で、必要に応じて肝臓内のグリコーゲン、脂肪、タンパク質をグルコースに変える役割も併せ持つ。
【０００３】
肝臓等における糖・脂質代謝の調節で、最も重要な役割を果たしているのはインスリンである。インスリンは糖、脂質、タンパク質の代謝作用の他、細胞増殖、細胞骨格の制御、筋肉、肝臓細胞の分化、転写調節、アポトーシスの抑制と多岐にわたる生理作用を有するホルモンである。
特に糖代謝に関しては、インスリンは肝臓に直接作用し、糖産生を抑制することで糖代謝の恒常性を維持している。また血糖を調節するホルモン類の中で、インスリンは唯一血糖低下作用を示す。
従って、インスリンの作用不全は直接体内の糖代謝の恒常性維持に問題を引き起こす。例えば糖尿病患者の空腹時における血糖上昇は、主に肝臓におけるインスリンの糖放出抑制作用が充分に働かないためであると考えられている（インスリン抵抗性状態）。この様なインスリン抵抗性状態は糖尿病の他にも動脈硬化、高血圧、高脂血症といった症例にも見られることが知られている。
インスリンは、標的細胞上に存在するインスリンレセプターに結合し、レセプターチロシンキナーゼを活性化することにより標的細胞内にシグナルを伝達する。これにより、細胞内で種々の転写因子の発現が誘導され、様々な生理作用が生じると考えられている。
しかし、これまでに知られている転写因子の作用では、上記インスリン抵抗性状態の肝臓における生理作用を十分に説明できない。このことから肝臓においてインスリン抵抗性に関与する新たな転写因子が存在すると考えられていたが、未だ特定されるには至っていなかった。
また、肝臓から血中への糖放出には肝臓に蓄えられたグリコーゲン分解と、筋肉や脂肪などから供給されるラクテート、アラニン及びグリセロールなどを原料とする糖新生の二つが存在する。Consoliらは2型糖尿病患者における肝糖産生の増加の90％は糖新生の増加によること、また、糖新生の増加が空腹時血糖の増加と強く相関していることを報告している（非特許文献1）。
この糖新生過程で律速となり、その制御において重要と考えられている酵素の一つがホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）である。
PEPCKはオキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸を生成する不可逆反応を担う酵素であり、糖新生に必須であるが、PEPCKの発現を制御している転写因子については不明であった。
一方、KKLF（Kruppel-like factor 15;Kidney-enriched Kruppel-like factor(KKLF)とも呼ばれている。）はC末端にCys2／His2  Zinc  finger  motifを3つ持つ転写因子（非特許文献2）である。KLFには16個の遺伝子がヒトで知られており、KLFファミリーを形成している。しかし、KKLFの肝臓における役割、あるいは糖新生に対する効果については全く知られていなかった。
【非特許文献１】Diabetes 38:550-556 (1989)
【非特許文献２】Molecular and Cellular Biology 20:7319-7331 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、肝臓において摂食、再摂食などの生理的刺激やインスリン等のホルモンの刺激により制御され、インスリンの生理作用に関与する転写因子を同定し、該転写因子の発現又は機能を指標として、インスリン抵抗性改善剤、すなわちインスリン抵抗性を伴う疾患を改善／治療する薬剤をスクリーニングする方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、インスリンにより発現調節される遺伝子を同定すべく鋭意検討した結果、肝臓細胞において、インスリンの存在に応答してKKLF遺伝子の発現が抑制されることを見出した。
更に、インスリン拮抗剤であるデキサメサゾンやグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるcAMPで細胞を処理すると、KKLF遺伝子の発現が誘導されることを明らかにした。また、KKLFの強制発現により、PEPCK遺伝子の転写が亢進されることから、KKLFがPEPCK遺伝子の発現を制御することにより、糖新生の調節に関与していることも明らかにした。
上記の知見からKKLF遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質の発現誘導の有無や発現誘導の程度を指標とすることにより、肝臓におけるインスリン抵抗性改善剤、特に糖新生抑制剤をスクリーニングできると考えた。
本発明は上記の知見をもとに完成するに至ったものである。すなわち本発明は、
［１］  被験物質の、KKLF遺伝子もしくはKKLFの発現抑制活性、又はKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とする、インスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法；
［２］  被験物質のKKLF遺伝子発現抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む［１］に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、KKLF遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLF遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLF遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程；
［３］  被験物質のKKLF遺伝子発現抑制活性に基づき、KKLF遺伝子発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする［１］に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）KKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程；
［４］  被験物質のKKLF発現抑制活性に基づき、KKLF発現抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする［１］に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、KKLFを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLFの発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞のKKLFの発現量と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLFの発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程；
［５］    被験物質のKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする［１］に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、PEPCK遺伝子及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞と被験物質を接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を測定し、該発現量又は活性を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量又は活性と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程；
［６］  被験物質のKKLF機能抑制活性に基づき、KKLF機能抑制物質を候補物質として選択することを特徴とするスクリーニング方法であって、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする［１］に記載のインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法：
（ａ）PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子、及びKKLF遺伝子を含む細胞と、被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の前記遺伝子の発現量と比較する工程、及び
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程；
［７］  インスリン抵抗性改善剤が肝糖新生抑制剤である、［１］〜［６］のいずれかに記載のスクリーニング方法；
［８］  肝糖新生抑制剤がPEPCK発現抑制剤である、［７］に記載のスクリーニング方法；
［９］  細胞が、肝臓由来細胞であることを特徴とする、［２］〜［８］のいずれかに記載のスクリーニング方法；
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で選択されるインスリン抵抗性改善物質を有効成分として含有する、糖尿病治療又は予防剤；
［１１］  KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、PEPCK発現抑制剤；
［１２］  KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、肝糖新生抑制剤；
［１３］  KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性改善剤；及び
［１４］  KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質を有効成分として含有する、糖尿病治療又は予防剤；
［１５］  KKLF遺伝子又はKKLFを有効成分として含有する、インスリン抵抗性促進剤；
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、KKLF遺伝子又はKKLFの発現量を指標とすることによって、インスリン抵抗性改善剤、更に詳しくは肝糖新生阻害剤、及びこれらのスクリーニング方法等を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【０００８】
本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。
また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号：1、３、５）で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体(ホモログ)等）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。具体的には、「KKLF遺伝子」は配列番号：１で表されるヒトKKLF遺伝子のみならず、その同族体（ホモログ）や、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1で示される特定塩基配列もしくは前記同族体の塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を包含する。また、「PEPCK遺伝子」はGenBank Accession No. NM_002591,NM_004563のヒトPEPCK遺伝子のみならず、その同族体（ホモログ）やストリンジェントな条件下で、前記のGenBank Accession No. NM_002591,NM_004563で示される特定塩基配列もしくは前記同族体の塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を包含する。
なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１ＸSSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5ＸSSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1ＸSSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０００９】
配列番号１に示すヒトKKLF遺伝子は公知であり（GenBank Accession No.  NM_014079）、その取得方法についても Mol. Cell. Biol. 20 (19), 7319-7331 (2000)  に記載されるように公知である。
ヒトPEPCK遺伝子は公知であり（Genbank Accession No. NM_002591,NM_004563）、その取得方法についても、Ann. Hum. Genet. 56 (Pt 4), 289-293 (1992)、 Genomics 15 (1), 219-221 (1993)、Biochem. J. 315 (Pt 3), 807-814 (1996)  、Biochem. J. 333 (Pt 2), 359-366 (1998)  に記載されるように公知である。
また、例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http: // www. ncbi. nlm. nih. Gov / HomoloGene/）により同定することができる。当該遺伝子（ホモログ）は、具体的には、例えば下記のようにして取得することができる：特定のヒト遺伝子の塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http: // www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜する。
具体的には、配列番号３で表されるマウスKKLF遺伝子（Genbank  Acc.No.：NM_023184）や、配列番号５で表されるラットKKLF遺伝子（Genbank  Acc.No.：  NM_053536）を挙げることができる。これらの取得方法についてもJ. Biol. Chem. 277 (37), 34322-34328 (2002)  に記載されるように公知である。
また、Genbank  Acc.No. NM_011044、NM_028994で表されるマウスPEPCK遺伝子や、Genbank  Acc.No.AH007109で表されるラットPEPCK遺伝子を挙げることができる。これらの取得方法についてもMol. Cell. Endocrinol. 148 (1-2), 67-77 (1999)、Nature 409 (6821), 685-690 (2001)、J. Biol. Chem. 260 (19), 10748-10760 (1985)  に記載されるように公知である。
【００１０】
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１１】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、および変異体が包含される。具体的には、上記KKLF遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「KKLF」とも言う）は、配列番号2に示すタンパク質のみならず、その相同物、すなわち同族体（ホモログ）や前記変異体をも包含する。
またPEPCK遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「PEPCK」とも言う）は、Genbank Accession No. NP_002582.2、NP_004554.1に示すタンパク質のみならず、その相同物、すなわち同族体（ホモログ）や前記変異体をも包含する。
KKLFとしては配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。すなわち、配列番号1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができ、その取得方法についてもBiochemical Journal. Vol367 p413-22 (2002)に記載されるように公知である。
PEPCKとしてはヒトPEPCK遺伝子によってコードされるタンパク質を挙げることができる。すなわち、Genbank Accession No. NM_002591,NM_004563に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としてはGenbank Accession No. NP_002582.2、NP_004554.1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができ、公知である。
【００１２】
また、ヒト由来のタンパク質の同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。具体的には、配列番号：４で表されるマウスKKLFや、配列番号：６で表されるラットKKLFを挙げることができる。
また変異体とはヒト由来のタンパク質もしくはその同族体の変異体をあらわし、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。
【００１３】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がKKLFの生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１４】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１５】
本明細書においてインスリン抵抗性とは、血中にインスリンが充分量存在するにもかかわらず血糖値が低下しない状態を示し、その原因としては細胞においてインスリンに対する応答性が失われるためと考えられている。すなわち、インスリンが細胞に提供されているにもかかわらず、インスリンシグナルにより生ずる転写因子の発現変動を伴うインスリン由来の生理作用が正常に機能しない状態を表す。肝臓におけるインスリン由来の生理作用として、具体的には、糖新生（肝糖新生）抑制や、脂肪酸合成促進活性又はそれらに関わる一連のシグナル伝達作用等が挙げられる。本明細書において特に言及しない限り、「インスリン抵抗性」とは特に肝臓におけるインスリンによる糖新生（肝糖新生）の抑制が不十分となった状態を示す。
これには、インスリンの分泌に応答して生体内での発現が抑制される、KKLF遺伝子を特異的に認識し結合することのできるヌクレオチド（オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる）、または該遺伝子がコードするタンパク質（KKLF）を特異的に認識し結合することのできる抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００１６】
本明細書において、KKLF発現抑制物質とは、KKLF（タンパク質）の発現を抑制する物質を表す。KKLF遺伝子発現抑制物質とは、KKLFをコードするmRNAの発現を抑制する物質を表す。
また、KKLF機能抑制物質とは、KKLFの機能を抑制する物質を表す。
KKLFの機能とは、KKLFの肝臓細胞における転写因子としての機能を表し、具体的にはPEPCKの発現促進活性を挙げることができる。PEPCKの発現促進活性を測定する方法としては、PEPCK遺伝子もしくはPEPCKの発現量を測定する方法、PEPCKの発現制御領域を用いたレポータージーンアッセイを行う方法、及びPEPCKの酵素活性を測定する方法が挙げられる。
【００１７】
以下、KKLF遺伝子、並びにその発現産物（KKLF）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００１８】
（１）KKLFの発現抑制活性を指標とするインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法
本発明の第一の態様は、KKLFの発現抑制活性を指標とするインスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。以下詳細に説明する。
(1-1) KKLF遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、KKLF遺伝子の発現レベルを指標として、KKLF遺伝子の発現抑制物質(発現量を減少させる物質）をインスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤として選択することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
又、実施例に示すように、肝臓細胞では、インスリンの存在下においてKKLF遺伝子の発現が抑制され、インスリン拮抗剤であるデキサメサゾン等の存在下においてはKKLF遺伝子の発現が誘導される。更に発明者らは、KKLF遺伝子の強制発現により、PEPCK遺伝子の転写が亢進されることから、KKLFがPEPCK遺伝子の発現を亢進し、糖新生を促進することを見出した。この知見は、KKLF遺伝子の発現がインスリン抵抗性に関与していることを示唆しており、KKLF遺伝子の発現を抑制することによってインスリン抵抗性が改善される。また、本発明のスクリーニング方法は、インスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法であると同時に、肝糖新生抑制剤やPEPCK発現抑制剤のスクリーニング方法である。
よって、本発明のスクリーニング方法で得られるKKLF遺伝子の発現抑制物質は、PEPCKの機能を抑制することによって糖新生を抑制する、すなわちインスリン抵抗性を改善させる。該物質はインスリン抵抗性を伴うインスリン抵抗性糖尿病等疾患の改善作用を示す。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、インスリン抵抗性を伴う疾患の予防／改善／治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）  被験物質と、KKLF遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLF遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLF遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【００２１】
KKLF遺伝子の発現抑制物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞におけるKKLF遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることをもって、行うことができる。
かかるスクリーニングに用いられるKKLF遺伝子は、使用する細胞の内在性のKKLF遺伝子が好ましい。ここで内在性のKKLF遺伝子には、KKLF遺伝子を外来遺伝子として細胞に遺伝子導入する場合も含まれる。あるいはKKLF遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子を外来遺伝子として遺伝子導入することもできる［後述する(1-2)を参照］。外来遺伝子として導入する場合、KKLF遺伝子は用いられる細胞の由来動物種のKKLF遺伝子であることが好ましい。
【００２２】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、KKLF遺伝子を発現する肝臓由来細胞であれば特に限定は無いが、例えば肝臓組織から調製した肝臓細胞を挙げることができる。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。
例えば、ラット肝臓細胞は当業者に公知のコラゲナーゼ潅流法を用いて単離することができる（J Cell Biol., 43:506-520, 1969）。
あるいは、肝臓由来の培養細胞を用いることもできる。例えばヒト肝ガン細胞HepG2やマウスH35細胞、ラットHIIC細胞などを用いることもできる。
【００２３】
KKLF遺伝子を外来遺伝子として細胞に遺伝子導入する場合、KKLF遺伝子は通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス又はラット等の組織、細胞やこれらに由来する培養細胞などからＲＮＡを調製する。例えば、ラット肝臓を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の強力なタンパク質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販の試薬としては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）等がある。
【００２４】
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素を作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつKKLF遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５に記載の塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、KKLF遺伝子を増幅し、取得することができる。
また、上記の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようにして得られるｃＤＮＡライブラリーや市販のｃＤＮＡライブラリーから、KKLF遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、KKLF遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、KKLF遺伝子を取得することもできる。
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、約15bpから約50bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が約40%から約60%程度の塩基配列を、上記のような本タンパク質をコードする既知の塩基配列から選択し、該塩基配列に基いてオリゴヌクレオチドを設計し、合成するとよい。
得られたKKLF遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載の方法)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載の方法）により確認することができる。
【００２５】
上記のようにして得られたKKLF遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
ベクターとしては、具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えばプラスミドpUC119(宝酒造（株）製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2(Clontech社製)などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRC/RSV、pRC/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)、EBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができる。昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
KKLF遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、KKLF遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、KKLF遺伝子が宿主細胞に導入された際に、宿主細胞においてプロモーターの制御下に発現されるように、当該プロモーターとKKLF遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーター（尚、ADH1プロモーターは、例えばADH1プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5 〔Washington Research Fundation から入手可能、Ammerer ら、Method in Enzymology、101 part（p.192-201）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）などをあげることができる。
一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターとKKLF遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターとKKLF遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流にKKLF遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位にKKLF遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、KKLF遺伝子を発現させることができる。また、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流にKKLF遺伝子を挿入すれば、KKLF遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で発現させることが可能な発現ベクターが構築できる。マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、KKLF遺伝子が導入された形質転換体を当該マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、KKLF遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
KKLF遺伝子が組み込まれたベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、「モレキュラー・クローニング」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることにより本ベクターを宿主細胞へ導入することができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に本ベクターを導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
本ベクターが導入された形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時に下記のようなマーカー遺伝子を宿主細胞に導入し、導入されたマーカー遺伝子の性質に応じた方法で本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。例えば、当該マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性付与遺伝子）である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、当該マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
上述のようにして得られた本ベクターが導入された形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）を培養することによりKKLF遺伝子を発現させることができる。
【００２６】
KKLF遺伝子をコードする核酸は、前述の如く調製すればよいが、例えば、当該核酸を含有する組換えベクター又は組換えウイルス等の形態で使用されることもある。このような形態では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターをあげることができる。さらに、アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ  Ｋｉｔを用い、KKLF遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、KKLF遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。
また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。KKLF遺伝子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いてKKLF遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は極めて有益である。体外に取り出された細胞に発現ベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。
【００２７】
以上に挙げたような細胞の他、細胞の集合体である組織（例えば肝臓組織片）も、本発明のスクリーニングに用いられる「細胞」の範疇に含まれる。
【００２８】
候補物質となりえるものとしては、特に制限されないが、核酸（KKLF遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（KKLFに対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などが挙げられる。スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る物質を被験物質として含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００２９】
上記の工程（ａ）において、KKLF遺伝子を発現可能な細胞と接触させる被験物質の濃度は、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、約１μＭ〜約５０μＭが好ましく、約１μＭ〜約１０μＭがより好ましい。当該細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常、約１時間以上５日程度であり、数時間から４日程度が好ましい。好ましくは、１８時間以上６０時間程度であり、より好ましくは２４時間から４０時間程度が挙げられる。
当該細胞と被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えばよい。例えば、哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合、適宜ウシ胎児血清等の哺乳動物由来の血清を添加したＤ−ＭＥＭ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）等の市販の培地中で培養できる。培養は、通常約３０℃〜約４０℃、約２％（Ｖ／Ｖ）〜１０％（Ｖ／Ｖ）二酸化炭素存在下で実施すればよく、約３５℃〜約３７℃、約４％（Ｖ／Ｖ）〜約６％（Ｖ／Ｖ）二酸化炭素存在下で実施するのがより好ましい。
被験物質と接触させる際の当該細胞の細胞数は、例えば２４ウェルプレートを用いる場合、通常約１Ｘ１０5個／ウェル〜約１Ｘ１０6個／ウェルであればよく、約５Ｘ１０5個／ウェル〜約８Ｘ１０5個／ウェルが好ましい。
【００３０】
「対照細胞」とは、前記工程（ａ）で用いられるKKLF遺伝子を発現可能な細胞において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、KKLF遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００３１】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【００３２】
このような遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。
【００３３】
ノーザンブロット法を利用する場合は、具体的には、KKLF遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、RNA中のKKLF遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、KKLF遺伝子の全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、前述のとおりである。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００３４】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、KKLF遺伝子の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００３５】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態でプライマーもしくはプローブとして使用されても、また二本鎖の形態で使用されてもよい。
【００３６】
前記プライマーもしくはプローブは、具体的にはヒトKKLF遺伝子の塩基配列に関する配列番号１に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、マウスKKLF遺伝子の塩基配列に関する配列番号３に記載される塩基配列（全長配列）もしくはラットKKLF遺伝子の塩基配列に関する配列番号５に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。更に、前記各配列番号で示されるKKLF遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３７】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法を用いた場合は、KKLF遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法を用いた場合は、KKLF遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００３８】
そのようなプローブもしくはプライマーは、配列番号1、配列番号３、又は配列番号５で示される塩基配列等のKKLF遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００３９】
具体的にはKKLF遺伝子をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００４０】
本発明で用いるプローブもしくはプライマーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００４１】
上記プライマーは、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００４２】
上記のプローブもしくはプライマーは、KKLF遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００４３】
具体的には、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００４４】
RT-PCR法を利用する場合は、KKLF遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーとして用いことによって、RNA中のKKLF遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のKKLF遺伝子の領域が増幅できるように、KKLF遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００４５】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、KKLF遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、前記プローブから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、KKLF遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Rat Genome U34 A, B，Cを挙げることができる。
【００４６】
上記のように検出・定量したKKLF遺伝子の発現レベルに基づき、KKLF発現抑制物質を選択することができる。すなわち、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるKKLF遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被験物質は発現抑制物質として選択することができる。
【００４７】
（1-2)KKLFの発現制御領域を用いるレポーター遺伝子アッセイ
またKKLF遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、これらの遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のKKLF遺伝子の発現抑制物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含される。
即ち、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）KKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程、
を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法である。
【００４８】
KKLF遺伝子の発現制御領域を含むＤＮＡとしては、例えば、配列番号19の塩基番号１番から３１９５番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号１番から３４６３番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号１７３７番から３４６３番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号３０４０番から３４６３番で示される塩基配列からなるＤＮＡ等のＤＮＡや、前記のいずれかのＤＮＡの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなりかつ配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有するKKLFをコードする遺伝子の転写を制御する能力を有するＤＮＡ、前記のいずれかのＤＮＡの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズしかつ配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有するKKLFをコードする遺伝子の転写を制御する能力を有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００４９】
KKLF遺伝子の発現制御領域の調製方法としては、例えば、化学合成法、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。
化学合成法を用いて調製する場合、ＤＮＡ自動合成機、例えばDNA合成機モデ
ル380A  （ABI社製）等を用いることができる。
次に、ＰＣＲを用いてKKLF遺伝子の発現制御領域を調製する方法について説明する。鋳型とするゲノムライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載されている方法に準じてヒト、マウス等の哺乳動物の組織から調製することができる。また、ヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック製）等の市販のゲノムＤＮＡや、ヒトゲノムウォーカーキット（クローンテック製）等の市販ゲノムライブラリーを用いることができる。次いで、増幅させるプロモーターに対応したプライマー、例えば配列番号19で示される塩基配列からなるＤＮＡを含むKKLF遺伝子の発現制御領域を調製する場合であれば、例えば配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号18で示される塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲを行う。前記のようにして増幅されたＤＮＡは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法などにより分析することができる。
【００５０】
次に、ハイブリダイゼーション法を用いてKKLF遺伝子の発現制御領域を調製する方法について説明する。
まず、プローブに用いるＤＮＡを標識する。プローブに用いるＤＮＡとしては、調製しようとするプロモーターの塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡ、例えば、配列番号19の塩基番号１番から３１９５番で示される塩基配列もしくはその連続した一部の塩基配列からなるＤＮＡであってその鎖長が２０塩基以上１６０塩基以下であるＤＮＡ、前記ＤＮＡの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ等を挙げることができる。
具体的には、配列番号19の塩基番号３００１番から３１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号19の塩基番号２５０１番から２６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号19の塩基番号２００１番から２１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号３００１番から３１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号２５０１番から２６００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号22の塩基番号２００１番から２１００番で示される塩基配列からなるＤＮＡ等を挙げることができる。
プローブに用いる前記ＤＮＡは、例えば、化学合成法、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法等、「KKLF遺伝子の発現制御領域の調製方法」として前述した通常のＤＮＡの調製方法によって得ることができる。
なお、プローブに用いる前記ＤＮＡは、それ自身が配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するKKLFをコードする遺伝子の転写を制御する能力を有していても良い。
プローブに用いる前記ＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー製、宝酒造製のＲａｎｄｏｍ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等を用いることができ、通常のＰＣＲ反応組成中のｄＣＴＰを［α−32Ｐ］ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いる前記ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等を用いることができる。プローブをハイブリダイズさせるＤＮＡライブラリーとしては、例えば、ラットなどのげっ歯類等の動物由来のゲノムＤＮＡライブラリー等を使用することができる。当該ＤＮＡライブラリーには、市販のゲノムＤＮＡライブラリーを用いることもできるし、また「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓや「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常のライブラリー作製法に従い、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のλ  ＦＩＸ  ＩＩ、λ  ＥＭＢＬ３、λ  ＥＭＢＬ４、λ  ＤＡＳＨ  ＩＩ等のλベクターを用い、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）等をｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングに用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、これを用いることもできる。
【００５１】
ハイブリダイゼーション方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。例えば、使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築されたライブラリーである場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換細胞を取得し、得られた形質転換細胞を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで３７℃で培養を行う。また、使用されるライブラリーがファージベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上にまく。その後プラークが現れるまで３７℃で培養を行う。より具体的には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）２．６０から２．６５等に記載されている方法に準じて、ＮＺＹ寒天培地に寒天培地１ｍｍ2当り０．１〜１．０ｐｆｕの密度で、約９．０Ｘ１０5ｐｆｕのファージライブラリーを広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。
【００５２】
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーション法を用いた場合も、前述の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転換細胞やファージを当該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルターをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、ＤＮＡを当該フィルターに固定する処理を行う。より具体的には例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）等に記載の通常の方法に準じて、前記寒天培地の上にニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルター等、例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンフィルターに吸着させる。次に、当該フィルターをアルカリ溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージＤＮＡをフィルター上に溶出させた後、中和溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５）に約５分間浸す処理を行う。当該フィルターを洗浄溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭトリス塩酸）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間ベーキングすることによりファージＤＮＡをフィルターに固定する。このように調製されたフィルターと、前記プローブとを用いてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編「ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５）  ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−１８−７、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）、または、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）等の記載の方法に準じて行うことができる。例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液を、前記のようにして作製したフィルター１ｃｍ2当り５０〜２００μＬの割合で準備し、当該溶液に前記フィルターを浸して４２〜６８℃で１〜４時間、好ましくは、４５℃で２時間保温する。次いで、例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）��濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（フィルター１ｃｍ2当り１．０Ｘ１０4〜２．０Ｘ１０6ｃｐｍ相当量）
とを混合した溶液をフィルター１ｃｍ2当り５０〜２００μＬの割合で準備し、
当該溶液にフィルターを浸し４２〜６８℃で４〜２０時間、好ましくは、４５℃で１６時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。当該ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５〜３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ等を含む４２〜６８℃の洗浄溶液等、好ましくは、３００ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む５５℃の洗浄溶液で、１０〜６０分間のフィルター洗浄を１〜４回、好ましくは１５分間の洗浄を２回行う。さらに、フィルターを２ＸＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、および３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）で軽くすすいだのち乾燥させる。このフィルターを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのフィルター上の位置を検出する。検出されたＤＮＡのフィルター上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離することができる。具体的には例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フィルム）に４時間露光させ、次いで当該プレートをＢＡＳ２０００（富士フィルム）を用いて解析し、シグナルを検出する。フィルターの作製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約５ｍｍ角にくり抜き、これを約５００μＬのＳＭバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム、７ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンを含む。）に２〜１６時間、好ましくは３時間浸してファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出液をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージＤＮＡをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、シグナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ、前述の方法と同様にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行う。このようなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを含むファージクローンが得られる。前述のようなハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより得られたクローンの保有するＤＮＡは、ＤＮＡ調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ＋、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ−  等にサブクローニングして、プラスミドＤＮＡを調製し、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅ��ｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分析に用いる試料の調製は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１３．１５等に記載されているプライマーエクステンション法に準じて行うことができる。また、ファージクローンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５等に記載の方法に準じてＮＺＹＭ液体培地で増幅し、ファージ液を調製して、これから例えば、Ｌａｍｂｄａ−ＴＲＡＰＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を用いてファージクローンＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを鋳型として、例えば、前述のプライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分析することもできる。このようにして得られるＤＮＡの、配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するKKLFをコードする遺伝子の転写を制御する能力を後述のようにして確認することもできる。尚、本願において「転写を制御する能力」とは、例えば、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写を開始させる活性等を意味する（以下、プロモーター活性と記すこともある。）。
【００５３】
KKLF遺伝子の発現制御領域は、配列番号19の塩基番号１番から３１９５番で示される塩基配列からなるＤＮＡを含むプロモーター等に変異を導入することによって作製しても良い。具体的には、例えば、Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ｍ．Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（１９９４）７，３２−３４等に記載される方法を用いてランダムに変異を導入することによって取得することができ、、Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２，９４４１もしくはＷ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３５０等に記載のギャップド・デュープレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、またはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．  ｏｆ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２，４８８もしくはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３６７等に記載のクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法を用いて部位特異的に変異を導入することによって取得することができる。あるいは、配列番号19の塩基番号１番から３１９５番で示される塩基配列からなるＤＮＡを含むプロモーター等のうち１ヶ所ないし数カ所の部分塩基配列を、他のプロモーターのＤＮＡの一部と入れ換えたキメラＤＮＡを作製することによって取得することができ、例えば、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８４）２８，３５１、Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３，１０３等に記載された方法を用いることができる。
【００５４】
前記の種々の方法で調製されるKKLF遺伝子の発現制御領域を、通常の方法、例えば、「田村隆明著（羊土社刊）、新転写制御のメカニズム（２０００年）」３３〜４０頁、「野村慎太郎、渡辺俊樹監修著（秀潤社刊）、脱アイソトープ実験プロトコール（1998年）」等に記載された方法に準じて、プロモーター活性を維持したまま、その一部分の塩基を欠失させて得られる（即ち、適当な制限酵素を用いて切り出すことにより調製される）ＤＮＡもKKLF遺伝子の発現制御領域として使用することができる。得られたＤＮＡの、配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列を有するKKLFをコードする遺伝子の転写を制御する能力は後述する方法により確認することができる。
【００５５】
KKLF遺伝子の発現制御領域を挿入するためのプラスミドとしては、所望の細胞内で機能可能なプラスミドであれば良く、当該プラスミドが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、前記プラスミドにおいて、KKLF遺伝子の発現制御領域および所望の遺伝子がプラスミド上で機能可能な形で連結されるような位置、例えば当該プロモーターを挿入する部位の下流に遺伝子挿入部位がさらに有ると、所望の遺伝子を細胞内で発現させるためのプラスミドの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、KKLF遺伝子の発現制御領域を有するプラスミド上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。当該プラスミドとして具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９（宝酒造製）など］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）、ｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）等が挙げられる。
KKLF遺伝子の発現制御領域の前記プラスミドへの挿入は、通常の方法、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される方法に準じて行うことができる。
【００５６】
前記のKKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含む形質転換細胞の調製方法について以下に説明する。
【００５７】
まずKKLF遺伝子の発現制御領域を、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光タンパク質（GFP）等のレポーター遺伝子（その発現を解析することができる遺伝子）に機能可能な形で連結することにより、KKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を調製する。ここで「機能可能な形で連結する」とは、ある遺伝子と一つまたはそれ以上の調節配列とが、適した外来性のシグナル又は因子が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連結することを意味する。次に、KKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入することにより、プラスミドを作製する。当該プラスミドの調製には、レポーター遺伝子を含む市販のプラスミドを使用することができる。レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、例えば、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（東洋インキ製）等のプラスミドが例示される。
具体的には、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ等の遺伝子挿入部位に通常の方法によりKKLF遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で挿入することにより、KKLF遺伝子の発現制御領域の制御下にレポーター遺伝子を含むプラスミドを作製することができる。
次いで、前記プラスミドを細胞へ導入する。KKLF遺伝子の発現制御領域を導入する宿主細胞としては、大腸菌、酵母、植物細胞、動物細胞等の細胞を挙げることができ、KKLF遺伝子の発現制御領域が細胞内で増幅可能な形態を保てる細胞であればよい。好ましくは動物細胞、特に好ましくは肝臓組織から調製した肝臓細胞を挙げることができる。KKLF遺伝子の発現制御領域の宿主細胞への導入法としては、細胞に応じた導入方法を適用することができ、例えば、リン酸カルシウム法、電気導入法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル形成法等を挙げることができる。リン酸カルシウム法としてはGrimm, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10923-10927等に記載される方法、電気導入法及びＤＥＡＥデキストラン法としてはTing, A. T. et al., EMBO J., 15, 6189-6196等に記載される方法、ミセル形成法としてはHawkins, C. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13786-13790等に記載される方法を挙げることができる。ミセル形成法を用いる場合には、リポフェクトアミン（ギブコ製）やフュージーン（ベーリンガー製）等の市販の試薬を利用するとよい。
【００５８】
前記プラスミドの導入処理を施した細胞を、例えば、当該ベクターに予め含まれる選抜マーカー遺伝子を利用し、当該選択マーカー遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を選抜することができる。
【００５９】
被験物質は、前記（1-1）に記載されたものを用いることができる。また、上記の工程（ａ）における、被験物質の濃度は、前記（1-1）に記載された「ＫＫＬＦ遺伝子を発現可能な細胞と接触させる被験物質の濃度」と同様である。
当該細胞と被験物質との接触の条件についても前記（1-1)に記載された条件を用いることができる。
また、「対照細胞」も、前記（1-1)と同義である。
【００６０】
上記のスクリーニング方法において、「レポーター遺伝子の発現量を測定する」方法としては、前記形質転換細胞中におけるレポーター遺伝子の発現量を時間経過に沿って連続的に又は不連続に測定できる方法であればどのような方法であってもよい。例えば、レポーター遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合には当該酵素の活性測定を利用し、またレポーター遺伝子の発現産物、即ち当該遺伝子に対応するｍＲＮＡもしくは当該遺伝子に対応するタンパク質を検出する方法（具体的にはノザンブロッティング、ウェスタンブロッティング等）等を利用すればよい。
【００６１】
レポーター遺伝子として酵素遺伝子を用いる場合における当該酵素の活性測定を利用する方法において、使用され得るレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等、発現生成したタンパク質の活性の測定が容易であるものを好ましくあげることができる。レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には次のようにすればよい。（１）例えばKKLF遺伝子の発現制御領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む本発明プラスミドを導入された本発明形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得る。（２）当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出できる。この際、ピッカジーンデュアルキット（東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
【００６２】
前記のようにして、ＫＫＬＦ遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞において測定されるレポーター遺伝子の発現量を、被験物質を接触させない当該細胞（対照細胞）における前記レポーター遺伝子の発現量と比較することにより、レポーター遺伝子の発現量が対照細胞における発現量よりも減少する被験物質を、インスリン抵抗性改善剤の候補物質として選択することができる。
【００６３】
より具体的には、例えば、被験物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、被験物質非存在下における発現量と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被験物質はＫＫＬＦ遺伝子の発現抑制物質であり、インスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤として選択することができる。
【００６４】
(1-3)  KKLF（タンパク質）の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、KKLFの発現レベルを指標として、KKLFの発現抑制物質(発現量を減少させる物質）をインスリン抵抗性改善剤として選択することを特徴とするスクリーニングする方法を提供する。
【００６５】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）  被験物質と、KKLFを発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、KKLFの発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞のKKLFの発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、KKLFの発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【００６６】
本発明スクリーニング方法に用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、KKLFを有する肝臓由来の培養細胞全般を挙げることができる。具体的には上記（1-1)項に記載された細胞を挙げることができる。
KKLFの発現は、KKLF遺伝子発現産物であるタンパク質を検出することにより、容易に確認することができる。
【００６７】
本発明のスクリーニング方法にかかるKKLFの発現量は、KKLFを認識する抗体(以下本発明の抗体と称する場合がある）を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。
ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明の抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００６８】
抗体は、その形態に特に制限はなく、前記KKLFを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該KKLFを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。本発明の抗体として、例えばヒトKKLFタンパク質またはそのホモログを認識する抗体を例示することができる。
【００６９】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したKKLFを用いて、あるいは常法に従って当該いずれかのKKLFの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したKKLF、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００７０】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、後記配列表に記載する遺伝子の配列情報（配列番号1、３、５）等に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作等、通常の遺伝子工学的方法により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法［例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press；DM. Gloverら著、DNA クローニング（ IRL プレス発行、1985）等に記載されている方法］などに準じて行うことができる。具体的にはKKLFをコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらKKLFは、後記配列表に記載するアミノ酸配列の情報（配列番号2、4、6）等に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００７１】
また本発明の抗体は、KKLFの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、KKLFと同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、KKLFのアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
なお、ここで「KKLFと同様な免疫原特性を有するオリゴペプチド」とは、免疫学的活性においてKKLFと同等の活性を有するオリゴペプチドを表し、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつKKLFに対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００７２】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００７３】
本発明の抗体はKKLFに特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記KKLFを特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるKKLFのタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
【００７４】
候補物質となりえるものとしては、前記（１-1）と同じものが挙げられる。また、インスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤の選択についても、前記（１-1)と同様に行うことができる。また、「対照細胞」は前記（1-1)と同義である。
【００７５】
（２）KKLFの機能抑制活性を指標とするインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法
本発明の第二の態様は、KKLFの機能抑制活性を指標とするインスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。KKLFの機能として、具体的には、PEPCKの発現量を制御する機能が挙げられる。従って、PEPCKの発現誘導活性を指標として、KKLFの機能抑制物質をインスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤として選択することを特徴とするスクリーニング方法も又本発明のスクリーニング方法の範疇に含まれる。以下詳細に説明する。
【００７６】
(2-1)PEPCK遺伝子又はPEPCKの発現量又は活性を測定する方法
KKLFの機能（活性）の検出及び定量は、KKLFにより発現が制御されているPEPCKの発現量又は活性を指標として行うことができる。具体的にはKKLFの存在下に、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの酵素活性を測定することにより、スクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明のKKLFの機能抑制抑制活性を指標とするスクリーニング方法は次の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする：
（ａ）  被験物質と、PEPCK遺伝子及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞と被験物質を接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を測定し、該発現量又は活性を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量又は活性と比較する工程、及び
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又は活性を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程。
【００７７】
前記工程（ａ）において用いられるPEPCK遺伝子及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞としては、それぞれ発現可能な状態でプロモーターに連結されたPEPCK遺伝子及びKKLF遺伝子を含むプラスミドを導入して形質転換された細胞、又は発現可能な状態でプロモーターに連結されたPEPCK遺伝子を含むプラスミドと発現可能な状態でプロモーターに連結されたKKLF遺伝子を含むプラスミドを共導入することにより形質転換された細胞が挙げられる。当該細胞の調製は、前述の(1-1)に記載の方法を用いることができる。
前記工程（ｂ）において、PEPCK遺伝子もしくはPEPCK（タンパク質）の発現量を測定する方法としては、当業者に公知の方法、又は前述の（１−１）又は（１−３）に記載された、KKLF遺伝子の発現量を測定する方法又はKKLF（タンパク質）の発現量を測定する方法が挙げられる。
前記工程（ｂ）において、PEPCKの活性としてはPEPCKのオキサロ酢酸をホスホエノールピルビン酸へと変換する酵素活性が挙げられ、その測定方法はBiochemistry 17巻 5321〜5329頁に記載されているとおり公知である。
【００７８】
測定したPEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの活性を、被験物質を接触させない当該細胞（対照細胞）におけるこれらの値と比較することにより、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの活性が対照細胞におけるこれらの値よりも減少する被験物質を、インスリン抵抗性改善剤の候補物質として選択することができる（工程（ｃ））。
より具体的には、例えば、被験物質の存在下におけるPEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの活性が、被験物質非存在下におけるこれらの値と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、インスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤として選択することができる。
また、選択された被験物質を、PEPCK遺伝子を含み、かつKKLF遺伝子を含まない細胞に接触させ、PEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの活性を測定し、前記工程（ａ）及び（ｂ）で測定したKKLF遺伝子を発現可能な細胞を用いた場合のこれらの値と比較することにより、ＫＫＬＦ遺伝子の存在下で有意にPEPCK遺伝子の発現量、PEPCKの発現量又はPEPCKの活性を減少させる物質、すなわちＫＫＬＦの機能抑制物質であることを確認できる。
【００７９】
（2-2)PEPCKの発現制御領域を用いるレポーター遺伝子アッセイ
またKKLFの機能（活性）の検出及び定量は、KKLFにより発現が制御されている遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。KKLFにより発現が制御されている遺伝子としては、PEPCK遺伝子が挙げられる。
即ち、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子、及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞と被験物質を接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞における、レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）（ｂ）の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン抵抗性改善剤として選択する工程、
を有することを特徴とするインスリン抵抗性改善剤のスクリーニング方法である。
【００８０】
ここで用いられるPEPCK遺伝子の発現制御領域を含むＤＮＡとしては、例えば、  Molecular Endocrinology 4，1302−1310 (1990)、J. Biol. Chem. 260 (19), 10748-10760 (1985)を挙げることができる。
【００８１】
PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子の調製は、前記KKLF遺伝子の発現制御領域の調製方法に準じればよい。
【００８２】
KKLF遺伝子は、プロモーターに機能可能な形で連結されたKKLF遺伝子を含むプラスミドを、PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含むプラスミドとともに、共導入することができる。あるいは、プロモータに機能可能な形で連結されたKKLF遺伝子が、PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含むプラスミド中に含まれていてもよい。
これらのプラスミドを含む形質転換細胞は、前記（1-2)に記載された方法や本明細書実施例に記載された方法に準じて製造することができる。
上記のスクリーニング方法において、「レポーター遺伝子の発現量を測定する」方法についても、前記（1-2)に記載されている方法を用いればよい。
【００８３】
前記のようにして、PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子及びKKLF遺伝子を発現可能な細胞において測定されるレポーター遺伝子の発現量を、被験物質を接触させない当該細胞（対照細胞）における前記レポーター遺伝子の発現量と比較することにより、レポーター遺伝子の発現量が対照細胞における発現量よりも減少する被験物質を、インスリン抵抗性改善剤の候補物質として選択することができる。
【００８４】
より具体的には、例えば、被験物質の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が、被験物質非存在下における発現量と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被験物質はＫＫＬＦ遺伝子の発現抑制物質であり、インスリン抵抗性改善剤、肝糖新生抑制剤又はPEPCK発現抑制剤として選択することができる。
また、PEPCK遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含み、かつKKLF遺伝子を含まない細胞に被験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定し、工程（ａ）及び（ｂ）で測定したKKLF遺伝子を発現可能な細胞を用いた場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することにより、ＫＫＬＦ遺伝子の存在下でのみレポーター遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択することが可能である。
【００８５】
前述の（2-1)及び(2-2)において、被験物質は、前記（1-1)に記載されたものを用いることができる。また、上記の工程（ａ）における被験物質の濃度は、前記（1-1)に記載された「ＫＫＬＦ遺伝子を発現可能な細胞と接触させる被験物質の濃度」と同様である。
当該細胞と被験物質との接触の条件についても前記（1-1)に記載された条件を用いることができる。また、「対照細胞」は前記（1-1)と同義である。
【００８６】
前述の（1-1）〜（1-3）及び(2-1）〜(2-2)の方法における細胞には、哺乳類非ヒト動物も含まれる。具体的には、マウス、ラットもしくはモルモット等のげっ歯類動物、ウサギ、イヌ又はサルなどが挙げられる。
すなわち、前記糖尿病又はインスリン抵抗性モデル動物を用いる任意の評価試験に、本発明のスクリーニング方法を用いることができる。すなわち、前記モデル動物の肝臓又は肝臓由来細胞におけるKKLFの発現又は機能を上記（1-1）〜（1-3）及び(2-1）〜(2-2)に記載のスクリーニング方法を用いて調べることができる。この場合、被験物質は前記モデル動物に経口もしくは非経口で投与される。
また上記と同様に、非ヒト動物を用いた一般薬理試験において、インスリン抵抗性肝糖新生もしくはPEPCK発現等の所見を評価するために、上記（1-1）〜（1-3）及び(2-1）〜(2-2)の方法を用いることもできる。
【００８７】
上記スクリーニング方法によって選別されるKKLF発現抑制物質の中から、さらにインスリン抵抗性糖尿病等のインスリン抵抗性異常の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を選別する方法としては、従来公知である如何なる選別方法をも用いることができる。代表的な方法として、例えばインスリン負荷試験、ブドウ糖負荷試験を挙げることができる。
（３）インスリン抵抗性改善剤
本発明の第三の態様は、インスリン抵抗性を伴う疾患の改善又は治療剤に関する。
本発明は、インスリン抵抗性を改善する物質（インスリン抵抗性改善剤）を提供する。すなわち、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質は、インスリン抵抗性改善剤として、インスリン抵抗性糖尿病等のインスリン抵抗性を伴う疾患の予防・改善・治療剤の有効成分として用いることができる。また、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質は、PEPCKの発現を抑制することにより、肝臓における糖新生を抑制する。従って、KKLF遺伝子発現抑制物質、KKLF発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質は糖新生抑制剤やPEPCK発現抑制剤として用いることができる。
【００８８】
当該有効成分となるKKLF遺伝子もしくはKKLFの発現抑制物質又はKKLF機能抑制物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
【００８９】
KKLF遺伝子もしくはKKLFの発現抑制物質、又はKKLF機能抑制物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数百ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【００９０】
また、上記の物質がDNAによりコードされるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００９１】
（４）インスリン抵抗性促進剤
本発明の第四の態様は、KKLF遺伝子もしくはKKLFを有効成分として含有するインスリン抵抗性促進剤に関する。すなわち、KKLF遺伝子又はKKLFは、哺乳動物細胞をインスリン抵抗性状態に導くために用いることができる。ここで用いられる哺乳動物細胞としては、前記（1-1)に記載の「スクリーニングに用いられる細胞」が挙げられる。具体的には、哺乳動物由来細胞をインスリン抵抗性状態に導くためには、当該哺乳動物由来細胞に、KKLF遺伝子をコードする外来遺伝子を、当該外来遺伝子が前記細胞で発現可能なように導入すればよい。具体的には前記（1-1)に記載された方法に準じて遺伝子導入を行うことができる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００９２】
（ラット由来の腹腔内脂肪細胞培養液の調製）
国際公開公報第00／44754号パンフレット記載の方法で調製されたラット腹腔内脂肪細胞を6ウエルプレート（住友ベークライト社製）に1ウエル当たり3.0Ｘ105細胞になるように添加した。各ウェルに、10％ウシ胎児血清（Gibco-BRL社製。以下、10％FBSと記す。）及び200μMアスコルビン酸（和光純薬工業社製）が添加されたD-MEM培地（高グルコース、Gibco-BRL社製）（以下、FBS含有培地と記す。）を添加した後、この状態で当該細胞を37℃、5％二酸化炭素下で２日間培養した。
【実施例２】
【００９３】
（totalRNAの調製）
実施例1で得られた細胞培養液を含む各ウエルから培地を除いた後、各ウエルにTRIZOL Reagent(Gibco-BRL社製)を１ウェル当たり0.5mL加えて細胞を溶解した。得られた細胞溶解液を15mL遠心チューブ（IWAKI社製）に集め、これに0.6mLクロロホルム（関東化学社製）を添加した。この混合溶液を15秒間上下に激しく攪拌した後、 5分間室温で静置した。次いで、当該混合溶液を4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を新しい15mL遠心チューブに回収した。回収された水層に、3mL 2-プロパノール（関東化学社製）を添加した後、この混合溶液を混和した。その後、室温で10分間静置した。次いで当該混合溶液を4℃、8,000rpm、10分間遠心分離後、上清を除去しペレットを得た。得られたペレットを、0.1mLのDEPC処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解した。得られた溶解液に、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)添付の350μL RLT buffer (10μL β−メルカプトエタノール/mL RLT buffer) を添加し、この混合溶液を混和した。更に、当該混合溶液に250μL エタノール(関東化学社製)を添加し、これを混和した。当該混和液をRNeasy Mini Kit添付のRNeasy Spin Columnにアプライし、当該カラムを室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、当該カラムからの溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、当該カラムを室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、当該カラムからの溶出液を捨て、次いで当該カラムにエタノールで4倍希釈したRNeasy Mini Kit添付のRPE bufferを500μLアプライし、当該カラムを室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、当該カラムからの溶出液を捨て、再度当該カラムにエタノールで希釈したRPE bufferを500μLアプライし、当該カラムを室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。その後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Mini Kit添付の蒸留水を50μL添加し、これを1分間室温で静置した。静置後、当該チューブを室温、10,000rpm、1分間遠心分離によってカラムからＲＮＡを溶出させることにより、total RNAを得た。
【実施例３】
【００９４】
（cDNAの調製）
実施例２で調製されたtotal RNA 10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液に、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5ＸFirst Strand cDNA Buffer 4μL、該キットに含まれる0.1M DTT 2μL及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、この混合液を42℃、2分間加熱した。更に、当該混合液に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、この混合液を42℃、1時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液にDEPC処理滅菌蒸留水91μL、当該キットに含まれる5ＸSecond Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、当該キットに含まれるE. coli  DNA Ligase 1μL(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、この混合液を16℃、2時間反応させた。次いで、当該混合液に当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、この混合液を16℃、5分間反応させた後、当該混合液に0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、この混合液にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、これを室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。遠心分離後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに回収した。回収された水層に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL及びエタノール362.5μLを加え混合した後、この混合液を4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得た。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを再び得た。得られたDNAペレットに再度80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットを乾燥させた後、DEPC処理滅菌蒸留水12μLに溶解することにより、ｃDNA溶液を得た。
【実施例４】
【００９５】
（ラット由来のKKLF遺伝子のクローニング）
ＰＣＲを行なう実施例３で得られたcDNA溶液1μL、配列番号１１で示された塩基配列からなるプライマー1 20pmol、配列番号１２で示される塩基配列からなるプライマー2 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたＰＣＲ産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ラット由来のKKLF遺伝子（rKKLF）を含むプラスミドを得た。
【実施例５】
【００９６】
（ラット由来のKKLF遺伝子（rKKLF）の塩基配列の決定）
実施例４で得られたPCR産物（約1.2kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号５で示される塩基配列からなるラット由来のKKLF遺伝子の塩基配列を決定した。
【実施例６】
【００９７】
（ヒト由来のKKLF遺伝子のクローニング）
Human Adipocyte Marathon-Ready cDNA (CLONTECH社)1μL、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー5 20pmol、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー6 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ヒト由来のKKLF遺伝子（hKKLF）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例７】
【００９８】
（ヒト由来のKKLF遺伝子（hKKLF）の塩基配列の決定）
実施例６で得られたPCR産物（約1.2kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号１で示される塩基配列からなるヒト由来のKKLF遺伝子の塩基配列を決定した。
【実施例８】
【００９９】
（マウス由来のKKLF遺伝子のクローニング）
Mouse Normal Adipose cDNA (BioChain社)1μL、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー7 20pmol、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー8 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μL及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μLを含む50μLの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、マウス由来のKKLF遺伝子（mKKLF）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例９】
【０１００】
（マウス由来のKKLF遺伝子の塩基配列の決定）
実施例１１で得られたPCR産物（約1.2kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号３で示される塩基配列からなるマウス由来のKKLF遺伝子（mKKLF）の塩基配列を決定した。
【実施例１０】
【０１０１】
（ノザンブロット）
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、マウス肝組織、及びラット初代培養系肝細胞からtotal RNAを抽出した。抽出したRNAサンプルは、１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法にて泳動した後、Hybond-N+メンブレン（Amersham）に転写した。メンブレンのプレハイブリダイゼーションは、Rapid-hyb buffer(Amersham)を用いて65℃で2時間行った。その後、α−32P標識プローブを加えてハイブリダイゼーションを65℃で16時間行った。プローブは、Bca Best Labeling Kit(Takara)を用いて、マウス由来mKKLF cDNAからランダムプライム法により作製した。プローブの標識には、1.85MBqの[α−32P]dCTP（Amersham）を用いた。メンブレンの洗いは、SSC with 0.1％ SDSにより行った。SSCの濃度は、2Ｘ、1Ｘ、0.1Ｘの順で洗いを繰り返す毎にその濃度を下げていった。メンブレンのオートラジオグラフィーには、BAS2000 image analyzer(Fuji)を用いた。
【実施例１１】
【０１０２】
（RT−PCRのためのcDNAの調製）
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、マウス肝組織、及びラット初代培養系肝細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA 10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液に、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5ＸFirst Strand cDNA Buffer 4uLμl、該キットに含まれる0.1M DTT 2μL及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、この混合液を42℃、2分間加熱した。更に、当該混合液に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、この混合液を42℃、1時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液にDEPC処理滅菌蒸留水91μL、当該キットに含まれる5ＸSecond Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、当該キットに含まれるE. coli  DNA Ligase 1μL(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、この混合液を16℃、2時間反応させた。次いで、当該混合液に当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、この混合液を16℃、5分間反応させた後、当該混合液に0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、この混合液にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、これを室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。遠心分離後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに回収した。回収された水層に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL及びエタノール362.5μLを加え混合した後、この混合液を4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得た。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを再び得た。得られたDNAペレットに再度80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットを乾燥させた後、DEPC処理滅菌蒸留水12μLに溶解することにより、ｃDNA溶液を得た。
【実施例１２】
【０１０３】
（RT−PCR）
RT-PCR法を利用する場合は、肝臓組織あるいは肝臓細胞から調製したRNAを、あるいは得られたRNAを鋳型として調製したcDNAを鋳型としてKKLFをコードする塩基配列領域が特異的に増幅できるように、一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）を設計し、通常の方法で合成する。マウスKKLFを定量する際には配列番号１３と１４の配列を有するプライマーを用いた。ラットKKLFを定量する際には配列番号１５と１６の配列を有するプライマーを用いた。合成したプライマーを用いてSYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)を用いてプロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出、定量した。
【実施例１３】
【０１０４】
（ウエスタンブロット）
ラット初代培養系肝細胞をRIPA buffer[50mM NaCl, 1%(vol/vol) nonidet P-40, 0.5%(vol/vol) deoxycholate, 0.1%(vol/vol) SDS, 50mM Tris-Cl ph8.0, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM DTT, 10mM NaF, 30mM NaPPi, 15μｇ/ml Aprotinin, 10μｇ/ml Leupeptin]にて溶解し、遠心上清をタンパク抽出サンプルとした。あるいは核タンパク抽出キット（Nuclear / Cytosol Fractionation Kit, Bio Vision #K266-100）で抽出したタンパク質サンプルを用いた。抽出したタンパク質サンプルは、10％ SDS-ポリアクリルアミドゲル・電気泳動法にて泳動した後、ニトロセルロースメンブレン（Advantec）に転写した。1次抗体にはラットのKKLFのカルボキシル末端のペプチド（CHRFPRSSRAVRAIN：配列番号２４）を合成し、keyhole limpet hemocyaninタンパク質とマレイミド法で結合したものを抗原としてウサギより調製した抗体を用いた。抗-ポリクローナルラビット抗体（Molecular & Cellular Biology. 20(19):7319-31, 2000 Oct.）、2次抗体に抗-ラビットIgG HRP標識ヤギ抗体（Santa cruz）を用いた。抗原抗体反応は、ECL Western Blotting Detection Reagents(Amersham)を用いてHyperfilm ECL(amersham)上に検出した。
【実施例１４】
【０１０５】
（絶食再摂食時マウスの肝臓遺伝子発現解析）
7〜8週齢の雄性C57BL/6マウス(日本クレア)を用いた。飼育室の照明時間は、6時〜18時までを明期、18時〜6時までを暗期とした。飼育飼料としてＣE−2型固形飼料(日本クレア)、飲料水として水道水を与え飼育した。
24時間絶食の後、高炭水化物食（70％ シュクロース、20％ カゼイン）(オリエンタル酵母工業)を用いて再摂食を12時間行なった。随時摂食、絶食24時間後、絶食後再摂食6時間後と12時間後のマウスの肝臓を摘出した。摘出した肝組織は、液体窒素にて早急に凍結し、RNAのRNaseによる分解を防いだ。摘出した肝臓よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
絶食時のmRNAの発現は随時摂食時と比較して約1.4倍に上昇した。再摂食時の発現は絶食時と比較して6時間後及び12時間後で約０．３倍の低下が見られ、随時摂食時よりも低い発現が見られた。（図１参照）
【実施例１５】
【０１０６】
（Streptozotocin 糖尿病マウスにおけるインスリン投与時の肝臓遺伝子発現解析）
7〜8週齢の雄性C57BL/6マウス(日本クレア)を用いた。飼育室の照明時間は、6時〜18時までを明期、18時〜6時までを暗期とした。飼育飼料としてＣE−2型固形飼料(日本クレア)、飲料水として水道水を与え飼育した。
0.05M Sodium Citrate ph4.5に溶かした(Wako)をマウス体重あたり0.2 mg/gにて腹腔内投与した。Streptozotocin投与48時間後に血糖値が300mg/dl以上のマウスを糖尿病発症マウスとし、さらに12時間後に絶食を12時間・行なった。絶食の後、中間型インスリン（Novo Nordisk,ノボリンN注40）をマウス体重あたり5mU/gにて皮下投与し、投与1時間後と3時間後に肝を摘出した。摘出した肝組織は、液体窒素にて早急に凍結し、RNAのRNaseによる分解を防いだ。対照群としてPBSを皮下投与して3時間後の肝を同様に摘出した。摘出した肝臓よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行なった。
インスリン投与後1時間後及び3時間後のKKLFのmRNAの発現は約0.9倍に減少していた。（図２参照）
【実施例１６】
【０１０７】
（デキサメサゾン、cAMP処理ラット初代培養肝細胞での肝細胞遺伝子発現解析）
体重150〜250gの雄性Wisterラット(日本クレア)を用い、コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した得られた肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6Ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin]にて14〜16時間培養し、500nM デキサメサゾン（dexamethasone）, 100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphateの処理を行った。
薬剤処理後9時間後よりRNAを調製し、ノザンブロットを行なった。インスリン拮抗ホルモンであるデキサメサゾンとグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるcAMPで細胞を処理すると、KKLFの発現は3.3倍まで誘導された。このときPEPCKの発現の発現誘導は2.7倍であった。
【実施例１７】
【０１０８】
（インスリン処理ラット初代培養肝細胞の遺伝子発現解析）
体重150〜250gの雄性Wisterラット(日本クレア)を用い、コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6Ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]にて14〜16時間培養し、500nM dexamethasoneあるいは100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphate、10-7Ｍ insulinによる刺激を行った。
処理後、6時間後に培養肝臓細胞からRNAを抽出し、Northern  blottingを行なった。KLFの発現はdexamethasoneあるいは8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphateにより、それぞれ5．4倍、4．2倍に誘導され、この発現はインスリンにより0．54倍、0.67倍に抑制された。
【実施例１８】
【０１０９】
（KKLFアデノウイルスベクターの構築）
アデノウイルスベクターの構築にはAdenovirus Expresion Kit (TaKaRa #6150)を使用した。実施例８で調製されたマウスKKLF遺伝子（pT7Blueベクター）のセンス鎖をコスミドベクターpAxCAwt（宝酒造社）のSwaI部位に挿入し、pAxCAwt-ｍKKLFSを得た。得られたpAxCAwt-ｍKKLFSをλパッケージングキットGigapack III XL Packaging Extract（Stratagene社）を用いてインビトロパッケージングを行い大腸菌DH5αに感染させた。感染させた大腸菌を、50ml  50μg/mlアンピシリン含有LB培地で培養し、Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN社)によりコスミドDNAを大量調製した。
293細胞（宝酒造社）をD-MEM培地（日水製薬株式会社）[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 4mM L-glutamine]で37℃、5%二酸化炭素下で培養した。前述のようにして調製されたpAxCAwt-ｍKKLFS  8μｇと制限酵素処理済みDNA-TPC（宝酒造）5μlとを混合し、当該混合物を用いてリン酸カルシウム法(CellPhect Transfection Kit Sterile, Pharmacia Biotech)にて293細胞にコトランスフェクションを行った。当該細胞をそのまま18時間培養後、培地を10%FCS添加D-MEM培地（前述の培地）と交換し、さらに12時間培養した。培養終了後、細胞をディッシュから剥がし、10%FCS添加D-MEM培地を加えてx１希釈、x１０希釈、x100希釈の細胞懸濁液を作成した。希釈された細胞懸濁液に293細胞を混ぜて細胞数をあわせてから96well collagen plateにて培養した（限界培養）。3日毎に10%FCS添加D-MEM培地の交換を行いながら10〜16日間培養した。単一のウイルス感染により293細胞が完全に死滅したウェルより培養液ごと細胞を回収し、ドライアイスにて急凍した。凍結融解6回後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を1次組換えアデノウイルス液（AxCAwt-ｍKKLFS）として保存した。
24well collagen plateに培養された293細胞（宝酒造社）に前述方法で調製された1次組換えウイルス液を１０μl加え、これに5%FCS添加D-MEM培地を加えた後、当該混合物を37℃、5%二酸化炭素下で1時間培養した。さらに当該混合物に5%FCS添加D-MEM培地を加えた後、これを37℃、5%二酸化炭素下で培養した。3日間培養後、ウィルス感染させた293細胞（宝酒造社）の培養液を回収し、これに超音波破砕を10分間行った後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を２次組換えアデノウイルス液として保存した。一方、前記操作により同時に得られた沈殿（細胞）も回収し、ドライアイスにて急凍した。回収された細胞よりタンパク抽出液を調整し、SDS-PAGEウェスタンブロット法にてKKLFの発現を確認した。KKLFの発現が確認できた２次組換えアデノウイルス液50〜100ulを10cm collagenn dishに培養された293細胞（宝酒造社）に感染させ、前述の繰り返すことにより高力価組換えウィルス液を作製した。力価の測定は既存の方法（特開平7-298877）により測定した。
【実施例１９】
【０１１０】
（ラット初代培養肝細胞へのKKLFアデノウイルス感染によるPEPCKの発現誘導）
コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した得られた肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6Ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始8〜12時間後にアデノウイルスの感染を行なった。実施例１８で作製したKKLFの強制発現をさせるアデノウイルスAxKKLFとコントロールとするウイルスAxβ−galを用いて感染させた。感染後２４時間後に細胞を回収し、mRNAを抽出し、ノザンブロットを行なった。比較対照として、実施例16と同様に500nM デキサメサゾン（dexamethasone）, 100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphateの処理も行った。AxKKLFの感染に伴いPEPCKの発現が誘導された（図３参照）。
【実施例２０】
【０１１１】
（CATアッセイ）
PEPCKプロモーター領域（-2100〜+69）の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を組み込んだプラスミド を導入したrat hepatoma H4IIE cell（HL1C cell, Mol. Endocrinol. 1990 4:  1302-1310）を用いてPEPCKプロモーターの活性を解析した。
培養液は、Dulbecco's Modified Eagle Medium（日本製薬株式会社、#05919）[100units/ml  penicillin, 100μg/ml streptomycin, 5%(vol/vol) fetal bovine serum, 4mM  l-glutamine, 0.14% sodium bicarbonate]を使用した。
アデノウイルスの感染は、コンフルエント状態にある6cmの培養皿の培養液を2mlに交換したところにおこなった。感染後、24〜36時間後に細胞の回収をおこなった。
薬剤刺激によるPEPCKプロモーターの活性化は、コンフルエント状態にある6cmの培養皿の培養液を2mlの無血清培養液に交換し、16時間後に500nM  dexamethasone, 100uM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic  monophosphate、10-7M insulinを添加して6時間後に細胞を回収した。
アデノウイルスに感染、または薬剤処理をおこなった6cmの培養皿上の細胞を4℃のPBS  bufferで洗い、1.5mlエッペンドルフチューブに回収した。1サンプルあたり0.25M Tris buffer  pH8.0を150ulを加えて、超音波破砕を10分間おこない、遠心上清を80ulとった。回収した遠心上清に反応液（4mM acetyl  coenzyme, 0.25M Tris buffer pH8.0, 0.4μCi  D-threo-[dichloroacetyl-1-14C]chloramphenicol）を100μl加えて、37℃で1時間反応し、氷水にて 反応を停止した。そこにetyl  acetateを1ml加えてボルテックスにて混合した後、遠心上清を900μl回収した。真空乾燥の後、30μlのetyl  acetateで再溶解して、TLCプレート（MERCK, #1.05735.）上に展開して移動度の異なるスポットの放射活性をBAS2000  image analyzer（Fuji）にて測定した。KKLFアデノウイルスの感染に応じて、KKLFの発現が認められ、その発現に伴い、CAT活性も確認された。コントロールのウイルスでは活性は認められなかった（図4）。
【実施例２１】
【０１１２】
（動物へのKKLFアデノウイルスベクターの投与）
8〜10週齢のオスC57BL/6マウスに対して、アデノウイルス投与量1x109（1群10匹）の割合になるように、実施例１８により作製された組換えアデノウィルスを生理食塩水で希釈することにより調製された水溶剤を、マウス1匹当たり0.2mlずつシリンジを用いて尾静脈より投与する。
投与後、例えば3日から7日後、あるいは４週間後に被験動物であるBALB／cマウスに対しインスリン負荷試験を行なうことにより、インスリンに対する感受性の評価を行なうことができる。
【実施例２２】
【０１１３】
（ヒトKKLF遺伝子プロモーターのクローニング）
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号18で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ（宝酒造社）１μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で３０秒間、次いで６５℃で３０秒間、更に７２℃で３分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約３ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅ（宝酒造社）とを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１（宝酒造社）を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）とを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離した。
【実施例２３】
【０１１４】
（本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列の決定）
実施例２２で精製・単離された、本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、サンガーの方法  〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），  ７４，  ５４６３−５４６７〕により、本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号19に示す。
【実施例２４】
【０１１５】
（本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーター及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドの構築）
実施例２４で精製・単離された、本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクター５μｇを、ＳａｃＩ及びＮａｅＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。一方、ｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）  ５μｇをＳａｃＩ及びＳｍａＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。両者の消化反応液をそれぞれ別々にアガロースゲル電気泳動に供することにより、ＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸII  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をそれぞれ水２０μＬに溶解し、この溶解液各１μＬとライゲーションキットｖｅｒ．１に含まれるＡ液１６μＬとＢ液２μＬとを混合した。当該混合物を１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｐｈＫＫＬＦｐと記す。）を精製・単離した。
【実施例２５】
【０１１６】
（本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターが有する転写開始能力の測定）
ヒト肝ガン細胞HepG2（大日本製薬社）を２４ウエルプレート（住友ベークライト社）に１ウエル当たり1〜2Ｘ１０5細胞ずつまき込む。このHepG2細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社。以下、ＦＢＳと記す。）及び、１％ Penicillin-Streptomycin, liquid（Gibco-BRL社）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で一晩培養する。次いで、ｐｈＫＫＬＦｐ  １μｇと、シーパンジールシフェラーゼ遺伝子を含むベクターｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．２μｇとを混合し、これにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）９７μＬ及びフュージーン３μＬを添加、混合し、これを２４ウエルプレート１ウエル当たりのトランスフェクション用ＤＮＡ液とする。このトランスフェクション用ＤＮＡ液を前記のHepG2細胞に添加し、これをさらに二晩培養した。培養されたHepG2細胞を回収し、これをＤ−ＰＢＳで１回洗浄した後、ピッカジーンデュアルキット付属の５倍濃細胞溶解剤が水で５倍希釈された液を、２４ウエルプレートに１ウエル当たり１００μＬずつ添加する。これを室温で１５分間放置することにより細胞溶解液を得る。当該細胞溶解液をピペットを用いてエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１分間、室温）することにより上澄み液を得る。得られる上澄み液のうち２０μＬを、上記キット付属のホタルルシフェラーゼ用発光基質液１００μＬに添加し、３０秒間の発光量をルミノメーター（ＴＵＲＮＥＲ社、ＴＤ−２０ｅ）で定量した。測定された値をホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とする。次いで、前記の上澄み液とホタルルシフェラーゼ発光基質液との混合液に前記キット付属のシーパンジールシフェラーゼ用発光基質液１００μＬを添加し、３０秒間の発光量をルミノメーターで定量する。測定された値をシーパンジールシフェラーゼ活性測定値（測定値Ｂ）とする。上記の測定値Ａを上記の測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各HepG2細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各HepG2細胞における相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出する。尚、ここで「対照」とは、組換えプラスミドｐｈＫＫＬＦｐ１の代わりにｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒのみを同様な方法によりトランスフェクションして得られた対照HepG2細胞を意味する。
【実施例２６】
【０１１７】
（本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターのクローニング）
Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μＬ、配列番号20で示される塩基配列からなるプライマー２０ｐｍｏｌ、配列番号21で示される塩基配列からなるプライマー  ２０ｐｍｏｌ、Ｅｘ−ｔａｑ  １μＬ、Ｅｘ−ｔａｑ添付のバッファー  ５μＬ及びｄＮＴＰ  ４μＬを含む５０μＬの反応液を調製し、ＰＣＲを行った。当該ＰＣＲでは、まず９４℃で３０秒間、次いで６５℃で３０秒間、更に７２℃で３分間からなる保温サイクルが４０回繰り返された。ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動することにより、約３ｋｂｐの大きさのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡを水２０μＬに溶解し、そのうち１μＬとｐＴ７−Ｂｌｕｅとを混合し当該混合物をライゲーションキットｖｅｒ．１を用いて１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを精製・単離した。
【実施例２７】
【０１１８】
（本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列の決定）
実施例２７で精製・単離された、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＩＩダイ・ターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）及びＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列読み取り装置（PE Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号22に示す。
【実施例２８】
【０１１９】
（本発明マウスKKLF遺伝子プロモーター及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドの構築）
実施例２７で精製・単離された、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクター５μｇを、ＥｃｏＲＶ及びＡｖｉＩＩ各５Ｕを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。一方、ｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Promega社）  ５μｇをＳｍａＩを用いて７０μＬの反応液中で３７℃で１時間消化した。両者の消化反応液をそれぞれ別々にアガロースゲル電気泳動に供することにより、ＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸII  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片をそれぞれ水２０μＬに溶解し、この溶解液各１μＬとライゲーションキットｖｅｒ．１に含まれるＡ液１６μＬとＢ液２μＬとを混合した。当該混合物を１６℃で１時間のライゲーション反応に供した。このようにして得られたライゲーション反応液２０μＬとＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセルとを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９形質転換細胞を得た。当該形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ培地１００ｍＬで培養して得られた培養菌体からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを用いて配列番号22で示される塩基配列における塩基番号１から塩基番号３４６３までの塩基配列からなる本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｐｍＫＫＬＦｐ１と記す。）を精製・単離した。
また、実施例２７で精製・単離された、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターがＳａｃＩ及びＡｖｉＩＩで切断されることにより得られたＤＮＡ断片をｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒのＳａｃＩ及びＳｍａＩサイトに導入すること以外は上記と同様な方法に準じて、配列番号22で示される塩基配列における塩基番号１７３７から塩基番号３４６３までの塩基配列からなる本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｐｍＫＫＬＦｐ２と記す。）を取得した。
さらにまた、実施例２７で精製・単離された、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの塩基配列を含む組換えベクターがＫｐｎＩ及びＡｖｉＩＩで切断されることにより得られたＤＮＡ断片をｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒのＫｐｎＩ及びＳｍａＩサイトに導入すること以外は上記と同様な方法に準じて、配列番号22で示される塩基配列における塩基番号３０４０から塩基番号３４６３までの塩基配列からなる本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターの下流（３’側）にルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む組換え発現ベクター（以下、ｐｍＫＫＬＦｐ３と記す。）を取得した。
【実施例２９】
【０１２０】
（本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターが有する転写開始能力の測定）
２９３細胞(宝酒造社)を２４ウエルプレート（住友ベークライト社）に１ウエル当たり７．５Ｘ１０４細胞ずつまき込んだ。この細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社。以下、ＦＣＳと記す。）が添加されたＤ−ＭＥＭ培地（高グルコース、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用い、３７℃、５％二酸化炭素下で一晩培養した。翌日、Ｄ−ＭＥＭ培地に培地交換を行った。続いて、ｐｍＫＫＬＦｐ１  ０．５μｇと、シーパンジールシフェラーゼ遺伝子を含むベクターｐＲＬ−ＴＫ  ０．１μｇとを混合し、これにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）  １００μＬ及びリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）４μＬを添加、混合した後、この混合物を３０分間室温で放置した。これを２４ウエルプレート１ウエル当たりのトランスフェクション用ＤＮＡ液とする。このトランスフェクション用ＤＮＡ液を前記の細胞に添加し、これをさらに６時間培養した。６時間後培地を１０％ＦＣＳを含む新鮮なＤ−ＭＥＭ培地に交換し、更に２日間培養した。２日後、培養された細胞を回収し、これをＤ−ＰＢＳで１回洗浄した後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）付属の細胞溶解剤を、２４ウエルプレートに１ウエル当たり１００μＬずつ添加した。これを室温で１５分間放置することにより細胞溶解液を得た。当該細胞溶解液をピペットを用いてエッペンドルフチューブに移し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１分間、室温）することにより上澄み液を得た。得られた上澄み液を、上記キット付属のホタルルシフェラーゼ用発光基質液１００μＬに添加し、１秒間の発光量を１２５１ルミノメーター（サーモラボシステムズ社）で定量した。測定された値をホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とする。次いで、前記の上澄み液とホタルルシフェラーゼ発光基質液との混合液に前記キット付属のシーパンジールシフェラーゼ用発光基質液１００μＬを添加し、１秒間の発光量をルミノメーターで定量する。測定された値をシーパンジールシフェラーゼ活性測定値（測定値Ｂ）とする。上記の測定値Ａを上記の測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各細胞における相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出した。尚、ここで「対照」とは、組換えプラスミドｐｍＫＫＬＦｐ１の代わりにｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒを同様な方法によりトランスフェクションして得られた対照細胞を意味する。
次いでｐｍＫＫＬＦｐ２、ｐｍＫＫＬＦｐ３の転写開始能力も上記と同様な方法により測定した。得られた結果を図５に示す。図５から、前記３種類の本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターが転写開始能力を有することが確認された。
【実施例３０】
【０１２１】
（マウスＫＫＬＦの転写開始点の決定：プライマーのラベル化）
配列番号23で示されるプライマー  １００ｐｍｏｌ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）  ３μＬ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社）  １μＬ及び当該酵素付属のバッファー  １μＬを含む１０μＬの反応液を調製した。調製された反応液を３７℃で１０分間保温した後、９０℃で２分間加熱した。続いて、当該反応液に９０μＬの蒸留水を加えた後、これを１０ｍＭトリス塩酸及び１ｍＭＥＤＴＡで平衡化されたＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供し、遠心分離（室温、１，２００ｒｐｍ、１分）することにより、ラベル化プライマーを溶出させた。得られた溶出液の放射活性をシンチレーターで測定した。
（プライマー伸長法）
３Ｔ３−Ｌ１細胞より調製されたｔＲＮＡ  １０μｇと上記の方法で得られた３０，０００ｃｐｍの放射活性を有するラベル化プライマー溶液を混合した後、これをエタノール沈殿した。風乾後、得られた沈殿物を３０μＬのハイブリダイゼーション溶液（６６％脱イオン化ホルムアミド、２０ｍＭトリス塩酸  ｐＨ８．０、４００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解した。次いで得られた溶解液を８５℃、１０分間加熱した後、５５℃で一晩保温した。翌日、これをエタノール沈殿した後、得られた沈殿物に蒸留水  ８μＬ及びＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）添付のバッファー  １μＬ、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １μＬを加えた。この混合液を、４２℃、１時間保温した。当該混合液をフェノール抽出、エタノール沈殿した後、得られた沈殿物を６％アクリルアミドゲル電気泳動で２時間分析した。同時に、分子量マーカーとしてプライマーのラベル化と同様な方法でラベル化されたφＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  ｄｉｇｅｓｔ（ニッポンジーン社）も電気泳動した。アクリルアミドゲルを乾燥した後、これをイメージングプレート（富士フィルム社）に露光し、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社）で画像解析した。解析画像（図６）からマウスＫＫＬＦの転写開始点は配列番号22の塩基番号３３３８番目であることが確認された。
【実施例３１】
【０１２２】
（本発明ヒトKKLF遺伝子プロモーターのプロモーター活性を制御する物質の選抜）
実施例２６に記載される方法を用いて、ｐｈＫＫＬＦｐがトランスフェクションされたHepG2細胞を９６ウエルプレートに１ウエル当たり2〜4Ｘ１０４細胞ずつまき込む。次いで、被験物質の１μＭ  ＤＭＳＯ溶液をウエルプレートに１ウエル当たり０．５μＬずつ添加し、これを一晩培養する。同時に、対照として、被験物質の１μＭ  ＤＭＳＯ溶液の代わりにＤＭＳＯ  ０．５μＬを添加し、これを同様に培養する。実施例３０に記載される方法を用いてホタルルシフェラーゼ活性測定値（測定値Ａ）とシーパンジールシフェラーゼ活性測定値（測定値Ｂ）との測定を行う。次いで、測定値Ａを測定値Ｂで割った値（Ａ／Ｂ値）を算出した後、各HepG2細胞におけるＡ／Ｂ値を対照におけるＡ／Ｂ値で割って、各細胞の相対ルシフェラーゼ活性（相対値）を算出する。この相対ルシフェラーゼ活性（相対値）が１より大きい場合の被験物質を、正の転写調節能力を有する物質として選抜する。逆に、この相対ルシフェラーゼ活性（相対値）が１より小さい場合の被験物質を、負の転写調節能力を有する物質として選抜する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】絶食再摂食時マウスの肝臓遺伝子発現解析  実施例14での結果を示した。発現量をRT‐PCRで定量し、随時摂食時の値を1として相対値で示した。
【図２】Streptozotocin 糖尿病マウスにおけるインスリン投与時の肝臓遺伝子発現解析  実施例15での結果を示した。発現量をRT‐PCRで定量し、コントロールのPBSでの値を1として相対値で示した。
【図３】実施例19での結果を示した。Stはアデノウイルス感染しないサンプル、DCはDexamethasone、cAMPでの刺激でのPEPCKの誘導を示す。Ax−KKLFはKKLFアデノウイルスAxCAwt-ｍKLF15Sを、Axβ-galはコントロールのβ-galアデノウイルスを示し、図の上の三角は感染アデノウイルス量の増加を示す。
【図４】上の図は各条件下におけるKKLF蛋白質の量を抗KKLF抗体を用いたウエスタンブロットで検討した結果を示し、下の図はCATアッセイの結果を示す。DC  Dexamethasone、cAMP処理、DCIはDexamethasone、cAMP、insulin処理を示す。Ax−KKLFはKKLFアデノウイルスAxCAwt-ｍKLF15Sを、Axβ-galはコントロールのβ-galアデノウイルスを示し、図の上の三角は感染アデノウイルス量の増加を示す。
【図５】図５は、本発明マウスKKLF遺伝子プロモーターが有する転写開始能力を測定した結果を示す図である。横軸は使用された本発明プロモーター、縦軸は転写開始能力の指標となる相対ルシフェラーゼ活性（倍）値である。尚、対照はｐＧＬ３−ｐｒｏｍｏｔｅｒである。
【図６】図６は、マウスＫＫＬＦ遺伝子の転写開始点をプライマー伸長法により決定する際に得られた解析画像を示す図である。横軸はＲＮＡ量を表し、縦軸はＤＮＡ分子量サイズを表す。右欄に記載される矢印は配列番号２２で示されるプライマーを用いて逆転写反応を行った時の逆転写産物を表しており、当該産物の分子量サイズが１６７ｂｐであるという結果からマウスＫＫＬＦ遺伝子の転写開始点は配列番号２２の塩基番号３３３８番目であることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号7：PCRのために設計されたプライマー
配列番号8：PCRのために設計されたプライマー
配列番号9  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号10  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号11  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号12  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号13  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号14  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号15  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号16  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号17  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号18  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号20  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号21  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号23  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号24  ：PCRのために設計されたプライマー
配列番号25  ：合成ペプチド
【図１】
2005143468.tif 000002
【図２】
2005143468.tif 000003
【図３】
2005143468.tif 000004
【図４】
2005143468.tif 000005
【図５】
2005143468.tif 000006
【図６】
2005143468.tif 000007
【配列表】
2005143468000001.app