(57)【要約】      （修正有）【課題】表皮バリヤが混乱し機能不全になっている皮膚及び粘膜の障害の改善。【解決手段】ファルネソイドＸ受容体の活性化剤、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αの活性化剤及びＬＸＲα受容体のオキシステロール活性化剤のいずれかの化合物を局所的に塗布することによって治療され又は予防される。【効果】上記の化合物は、表皮の分化と増殖の障害の治療にも有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乱された分化の症状に悩む患者の表皮の治療剤であって、ファルネサル、メチルファルネシルエーテル、エチルファルネシルエーテル、メチルファルネソエイト、エチルファルネソエイト、７−メチルー９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル２、６−ノナジエン酸メチルエステル、及び７−メチルー９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル‐２，６−ノナジエン酸エチルエステルからなる群から選ばれたメンバーであるファルネソイドＸ応答性受容体の活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、前記分化の症状を正常化するのに有効な濃度で存在する状態にて表皮に局所的に投与される表皮の治療剤。
【請求項２】
過度な増殖の症状に悩む患者の表皮又は粘膜の治療剤であって、ファルネサル、メチルファルネシルエーテル、エチルファルネシルエーテル、メチルファルネソエイト、エチルファルネソエイト、７−メチルー９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル２、６−ノナジエン酸メチルエステル、及び７−メチルー９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル‐２，６−ノナジエン酸エチルエステルからなる群から選ばれたメンバーであるファルネソイドＸ応答性受容体の活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、過度な増殖の症状を正常化するのに有効な濃度で存在する状態にて表皮又は粘膜に局所的に投与される表皮又は粘膜の治療剤。
【請求項３】
前記ファルネソイドＸ応答性受容体の活性化剤が、約１０μＭ‐約２００μＭの濃度で表皮又は粘膜に局所的に投与される７−メチルー９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル２、６−ノナジエン酸メチルエステルである請求項１又は２に記載した表皮又は粘膜の治療剤。
【請求項４】
乱された分化の症状に悩む患者の表皮又は粘膜の治療剤であって、５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸、４−クロロー６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオ酢酸、及びクロロフィブレートからなる群から選ばれたメンバーであるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αの活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、乱された分化の症状を正常化するのに有効な濃度で存在する状態にて表皮又は粘膜に局所的に投与される表皮又は粘膜の治療剤。
【請求項５】
過度な増殖の症状に悩む患者の表皮又は粘膜の治療剤であって、５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸、４−クロロー６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオ酢酸、及びクロロフィブレートからなる群から選ばれたメンバーであるペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αの活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、過度な増殖の症状を正常化するのに有効な濃度で存在する状態にて表皮又は粘膜に局所的に投与される表皮又は粘膜の治療剤。
【請求項６】
前記ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体αの活性化剤が約１００μＭ‐約１０００μＭの濃度で表皮に局所的に投与されるクロロフィブレートである請求項３に記載した表皮の治療剤。
【請求項７】
乱された分化の症状に悩む患者の表皮又は粘膜の治療剤であって、
２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、７α―ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、４β‐ヒドロキシコレステロール、２０，２２−ヒドロキシコレステロール、及び２０（Ｓ）‐ヒドロキシコレステロールからなる群から選ばれたメンバーであるＬＸＲαのオキシステロール活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、乱された分化の症状を正常化に有効な濃度で存在する状態にて表皮又は粘膜に局所的に投与される表皮又は粘膜の治療剤。
【請求項８】
過度な増殖の症状に悩む患者の表皮又は粘膜の治療剤であって、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、７α―ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、４β‐ヒドロキシコレステロール、２０，２２−ヒドロキシコレステロール、及び２０（Ｓ）‐ヒドロキシコレステロールからなる群から選ばれたメンバーであるＬＸＲαのオキシステロール活性化剤を有効成分として含む局所組成物からなり、過度な増殖の症状を正常化するのに有効な濃度で存在する状態にて表皮又は粘膜に局所的に投与される表皮又は粘膜の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、１９９７年１月２４日付けで出願された同時継続中の原出願である米国特許願第０８／７８８，９７３号の一部継続出願である。なおこの特許願は本明細書に援用するものである。
【背景技術】
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所の助成第ＨＤ２９７０６号に基づいて、少なくとも一部が米国連邦政府の援助でなされたものである。したがって、米国連邦政府はこの発明に特定の権利を有している。
【０００３】
この発明は、皮膚に塗布するのに用いる局所用配合物の技術分野に関し、そしてバリヤ機能の混乱を示す皮膚または粘膜の疾患または障害、および表皮の分化と増殖の障害を起こす疾患が診られる患者の治療に関する。
【０００４】
発明の背景
哺乳類の表皮が行う機能の一つは、環境に対して皮膚を通して過大に水を失わないようにバリヤを形成することである。このバリヤは、総合して角質層として知られている表皮の無角層、角化層、最外層によって形成されている。表皮バリヤの局在的または全身的な混乱は、皮膚および粘膜の各種の疾患と症状で起こる。これらの混乱は、皮膚の病変部の形態に重大な影響があるだけではなく、乾癬のケブナー現象および湿疹症の炎症などの特定の皮膚疾患も促進する。また、表皮バリヤが健全であることは、表皮のＤＮＡ合成を調節する重要な要因でもある。したがって、正常な表皮バリヤを維持することは、表皮の過大増殖を抑制する生理的手段である。混乱しているか又は機能不全の表皮バリヤを生じる症状の例は以下のとおりである。
【０００５】
懐胎期間が３３週以下の早産児の体液と電解質の異常、低体温症および皮膚を通じての感染症；口唇炎、荒れた唇、鼻の刺激および外陰膣炎などの粘膜の炎症；
アトピー性および脂漏性の皮膚炎、アレルギー性皮膚炎若しくは刺激物接触皮膚炎、冬季湿疹、光アレルギー皮膚炎、光毒性皮膚炎、植物性光皮膚炎、放射線皮膚炎およびうつ血性皮膚炎などの湿疹皮膚炎；
皮膚または粘膜の外傷、火傷、水疱性障害または乏血から起こる潰瘍とびらん；
各種の形態の魚鱗癬；
表皮水疱症；
乾癬；
肥大した瘢痕とケロイド；
内因性老化と光老化による皮膚の変化；
皮膚の機械的剪断によって生じる摩擦発疱；
および
コルチコステロイド類の局所使用で起こる皮膚萎縮症。
【０００６】
機能性バリヤに必要な表皮の重要要素は、角質層脂質の細胞間のラメラ２層シートである。角質層脂質の合成は、循環系または食事の影響に対して比較的自律的である。その合成応答は、代わりに、浸透性のバリヤ機能の変化によって調節される。その調節は、３種の各重要脂質の律速酵素：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（セラミド類に対する）、ＨＭＧＣｏＡリダクターゼ（コレステロールに対する）およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼと脂肪酸シンターゼの両者（脂肪酸に対する）の活性、リン酸化（活性化）状態、質量およびｍＲＮＡの変化によって起こる。バリヤ機能が変化して起こる別の事象は、細胞外脂質のプロセシングを行う重要酵素の調節である。このような酵素の一つはβ−グルコセレブロシダーゼであり、これは、前駆体のグリコシルセラミド類のセラミド類への転化反応を触媒する。
【０００７】
バリヤが必要とする浸透性に基づいて脂質の合成は調節されるが、バリヤの発育と恒常性の内因性調節剤は知られていない。本発明の発明者らの研究室の細菌の研究によって、核受容体のスーパーファミリーのいくつもの活性化剤とリガンド、例えばグルココルチコイド類、甲状腺ホルモンおよびエストロゲンなどが、げっ歯動物胎仔の皮膚の成熟バリヤの出現を加速することが分かった（Hanley,K.他、「Epidermal barrier ontogenesis:maturation in serum-free media and acceleration by glucocorticoids and thyroid hormonbut not selected growth factors」、J.Invest Dermatol、１０６：４０４〜４１１、１９９６年；Hanley,K.他、「Hormonal basis for the gender difference in epidermal barrier formation in the fetal rat. Acceleration by estrogen and delay by androgen」、J.Invest.Dermatol、９７：２５７６〜２５８４、１９９６年）。対照的に、このファミリーの他のメンバー、例えば、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、および全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸は全く作用がなかった。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
成熟し完全に分化した角質層の形成と機能的表皮浸透性バリヤは、３つの核受容体、すなわちファルネソイドＸ−応答性受容体（ＦＸＲ）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α（ＰＰＡＲα）及びＬＸＲαとして知られた肝臓ベース受容体のうちのいずれか１つの特定活性化剤を局所的投与することによって促進されることが発見された。これら３つの受容体は核受容体であり、かつ転写因子の核受容体のスーパーファミリーの一部分である。３つの受容体は、上記スーパーファミリーの１つのサブグループに属し、このサブグループの全ての受容体は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成したときにのみ機能するという特徴を共有している。しかしながら、このサブグループの他の多くのメンバーは、成熟した角質層の形成又はバリヤの発育を促進する活性化剤を有せず、そのメンバーには、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸受容体（ＲＡＲα，β，δ）及び９−ｃｉｓ−レチノイン酸（ＲＸＲ）受容体が含まれる。したがって、この結果を達成するＦＸＲ、ＰＰＡＲαおよびＬＸＲαの活性化剤の能力は、このサブグループのメンバーのなかでユニークなものである。
【０００９】
バリヤの発育を促進するＦＸＲの活性化剤の能力は、ファルネソール（卓越したＦＸＲ活性化剤）に構造が類似しているが、それ自体ＦＸＲ活性化剤ではないがその化合物が構造が類似しているにもかかわらずバリヤの発育を促進しないことから、特に驚異的である。また、ＰＰＡＲα受容体の能力も、構造と機能が類似している他のＰＰＡＲ受容体が（それら自体別個の活性化剤をもっている）存在するが、ＰＰＡＲα受容体の活性化剤のみがバリヤの発育を促進することから、特に驚異的である。この発見のさらに驚くべき点は、ＰＰＡＲα活性化に伴うバリヤ発育の促進は、必須脂肪酸と非必須脂肪酸の間の差になんら関係がなく、むしろある共通の構造的特徴に関係するということである。この発見のさらに驚くべき点は、ＬＸＲαの活性化剤ではないオキシステロール類が、ＬＸＲαの活性化剤であるオキシステロール類と構造が非常に似ているということである。ＬＸＲαの活性化剤ではないオキシステロール類は、構造が類似しているにもかかわらず本発明の有益な効果をもたらさない。さらに、本発明の主題である多くの活性化剤が、局所表皮用剤としての用途を有することは過去には全く知られていなかった。
【００１０】
この３つのクラスの活性化剤の新規に発見された活性は、欠陥のある、又は撹乱されたバリヤ機能に悩む哺乳類の皮膚の治療にこれらの薬剤を有用なものとした。本発明は、早産児、特に懐胎期間３３週以下の幼児の治療に対して特に有用である。また、本発明は、表皮の分化と増殖の変調に対して有用である。適用症には、黒色腫と非黒色腫皮膚癌および皮膚前癌；乾癬、アトピー性皮膚炎および関連するバリヤ異常を伴うか又は伴わない種々のタイプの魚鱗癬などの表皮の分化と増殖の障害；ならびにいぼやコンジロームや脂漏性角化症のような良性新生物が含まれる。
【００１１】
本発明の他の特徴と利点は、以下の説明によって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明と好ましい実施態様
ファルネソイドＸ応答性受容体（ＦＸＲ）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α（ＰＰＡＲα）および受容体ＬＸＲαは、それらの標的遺伝子のプロモーターのシス作用領域に結合してホルモン活性化剤またはリガンドに応答して遺伝子発現を調節する約１５０種のタンパク質のスーパーファミリーのメンバーである。これらの受容体の多くのものに対する活性化剤は知られているが、「オーファン受容体」と呼ばれているその外の受容体に対する活性化剤は知られていない。さらに、これら受容体のいくつかは、同じ受容体２分子からなる二量体（ホモ二量体）として、それらの標的遺伝子に結合するが、残りの受容体は、２種の受容体各々１分子ずつからなる二量体（ヘテロ二量体）として結合する。後者の受容体の中で目立つのは、Yu V.C.他、「RXRβ：coregulator that enhances binding of retinoic acid, thyroid hormon, and vitamin D receptors to their cognate response elements」、Cell、６７：１２５１〜１２６６，１９９１年に開示されているレチノイドＸ受容体とヘテロ二量体を形成する必要がある核受容体である。このグループのメンバーとしては、ビタミンＤ受容体、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ3Ｒ）、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ファルネソイドＸ応答性受容体（ＦＸＲ）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）およびＬＸＲαである。
【００１３】
ファルネソイドＸ応答性受容体（ＦＸＲ）は、Formanと共同研究者が初めて報告した（Forman,B.B.「Identification of a nuclear receptor that is activated by farnesol metabolites」、Cell、８１：６７８〜６９３，１９９５年）。この受容体は相対質量（Ｍｒ）が約５４，０００のタンパク質であり、細胞内代謝物によって調節される脊椎動物の転写因子である。この受容体は、特定のフェルネソイド類、すなわち、ファルネソール自体およびファルネソールから誘導されるかおよび／またはファルネソールに構成が類似している化合物によって活性化される。これらフェルネソイド類としては、ファルネソール、ファルネサル、酢酸ファルネシル、ファルネソール酸、ゲラニルゲラニオールおよび幼若ホルモンＩＩＩがある。ファルネソールの化学名は、３，７，１１トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエンオールであり、そして幼若ホルモンＩＩＩの化学名は、７−メチル−９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル−２，６−ノナジエン酸メチルエステルである。ＦＸＲを活性化しないフェルネソイド類と代謝物は、ゲラニオール、スクアレン、メトプレン、メバロネート、スクアレンオキシド、スクアレンジオキシド、ラノステロール、２４，２５−エポキシコレステロール、プレグネナロン、デヒドロエビアンドロステロン、胆汁酸類および２５−ヒドロキシコレステロールである。特に興味深いＦＸＲ活性化剤は、ファルネソール（以後、ｔｒａｎｓ記号を付けてｔｒａｎｓ−ファルネソールと呼ぶ）、ファルネサル、メチルファルネシルエーテル、エチルファルネシルエーテル、メチルファルネソエート、エチルファルネソエート、７−メチル−９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル−２，６−ノナジエン酸メチルエステル、および７−メチル−９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル−２，６−ノナジエン酸エチルエステルである。これらの中で好ましいのは、ファルネソール、ファルネサル、メチルファルネシルエーテル、メチルファルネソエート、および７−メチル−９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル−２，６−ノナジエン酸メチルエステルである。特に好ましいのは、ファルネソールと７−メチル−９−（３，３−ジメチルオキシラニル）−３−メチル−２，６−ノナジエン酸メチルエステル（幼若ホルモンＩＩＩ）である。
【００１４】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）は、総説論文である、Schoonjans,J.、「Role of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in mediating the effects of fibrates and fatty acids on gene expression」,J.Lipid Res.、３７：９０７〜９２５，１９９６年に記載されている。ＰＰＡＲの３種のサブタイプが確認されており、これらサブタイプはα、β（またはδ）およびγと命名されている。そのαサブタイプはアフリカツメガエル（Xenopus）、ヒト、マウスおよびラットからクローン化されており、アフリカツメガエル、ヒトおよびマウスからはβ（またはδ）サブタイプが得られそしてアフリカツメガエル、ヒトおよびハムスターからはγサブタイプが得られる。ＰＰＡＲ類は６個の機能ドメインからなるモジコール構造を有している。ＤＮＡ結合ドメインとして働く一つのドメインは、約６６個のアミノ酸を含有し、２個の亜鉛原子で安定化され、これら亜鉛原子は各々、四つの不変システインの残基に結合している。ＰＰＡＲαの活性化剤としては、フイブレート類（fibrates）、短い連鎖（＜Ｃ10）の脂肪酸以外の脂肪酸、長連鎖のモノ不飽和脂肪酸、およびジカルボン酸特にドデカン二酸がある。フイブレートの低級アルキルエステル好ましくはメチルエステル、および脂肪酸の低級アルキルエステル好ましくはメチルエステルも含まれる。フイブレート類としては以下のものがある。
【００１５】
クロフィブレート：２−（４−クロロフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
クロフィブレート：２−（４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸イソプロピルエステル
クロフィブレート：２−（４−（２，２−ジクロロシクロプロピル）フェノキシ）イソ酪酸
ゲムフィブロジル：２−（２，４−ジメチルフェノキシプロピロ）−２−メチルプロパン酸
ベザフイブレート：２−（４−（４−クロロベンゾイルアミノエチル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸。
【００１６】
これらの脂肪酸の中で、置換された脂肪酸が特に強力な活性化剤である。特に興味深いＰＰＡＲα活性化剤は、リノール酸、オレイン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸、（４−クロロ−６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオ酢酸およびクロフィブレートである。これらのＰＰＡＲα活性化剤と他の例を含むリストは以下の通りである。
【００１７】
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸
２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸
２−フェノキシ−２−２メチルプロパン酸エチルエステル
２−（４−プロモフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（４−ヨードフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（２−クロロフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（３−クロロフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（４−クロロフェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（４−（４−クロロフェニル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸エチルエステル
２−（４−（４−クロロベンゾイル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸イソプロピルエステル
２−（４−（２，２−ジクロロシクロプロピル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸
２−（４−（４−クロロベンゾイルアミノエチル）フェノキシ）−２−メチルプロパン酸
２−（２，３−ジメチル−４−（１，２，３，４−テトラヒドロメフチ−１−イル）フェノキシ）酢酸
２−（２−メチル−３−エチル−４−（４−クロロベンジル）フェノキシ）酢酸
（４−クロロ−６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオ酢酸
２（（４−クロロ−６−（２，３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオアセトアミド）エタノール
ペルフルオロ−ｎ−デカン酸
ジ−（２−エチルヘキシル）アジペート
ジ−（２−エチルヘキシル）ホスフェート
ジ−（２−エチルヘキシル）セバケート
ゼス−（カルボキシメチルチオ）−１，１０−デカン
エチル４−（４−クロロフェノキシ）ブタノエート
２−（２−ニトロ−５−（２−クロロ−４−トリフルオロメチルフェノキシ）ベンゾイルオキシ）プロパン酸エチルエステル
２−（４−（４−クロロベンゾイル））フェノキシ−２−（２−メチルプロピオンアミド）エチルスルホン酸テトラデシルオキシ酢酸
テトラデシルオキシ酢酸
テトラデシルオキシプロピオン酸
ペルフルオロブタン酸
ペルフルオロオクタン酸
テトラデシルチオ酢酸
テトラデシルチオプロピオン酸
ジ−（２−エチルヘキシル）フタレート
モノ−（２−エチルヘキシル）フタレート
２−エチルヘキサン酸
２−プロピルヘキサン酸。
【００１８】
受容体ＬＸＲαは、Willy,P.J.他、「LXR,a nuclear receptor that defines a distinctretinoid response pathway」,Genes & Development、９：１０３３〜１０４５（Cold Sprong Harbor Laboratory Press）に初めて記載され、この受容体は最初肝臓から分離されかつ肝臓で豊富に発現されるためＬＸＲαと命名された。ＬＸＲαの活性化剤はオキシステロール類のサブセットであり、７α−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロール、２７−ヒドロキシコレステロール、４β−ヒドロキシコレステロール、２４−ヒドロキシコレステロール、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールおよび２０，２２−ジヒドロキシコレステロールが含まれる。ＬＸＲαの活性化剤ではないが構造が類似している化合物としては、コレステロール自体とオキシステロール類の７，２５−ジヒドロキシコレステロール、１７α−ヒドロキシコレステロールおよび２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールのエナンチオマー）が含まれる。置換コレステロール類に用いられる番号付けの方式は以下のとおりである。
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【００１９】
用語「活性化剤」は、本明細書で使用する場合、分子種を局所に投与したとき、その分子種自体が受容体に結合するかまたはその分子種の代謝物が受容体に結合するかのいかんに拘わらず、指定の受容体を活性化する分子種を意味する。したがって、活性化剤は受容体のリガンドでもなく、または代謝されて受容体のリガンドになる活性化剤、すなわち組織中で形成されて実際のリガンドである代謝物でもよい。
【００２０】
本発明を実施する場合、これら活性化剤が、局所投与用に医薬として許容される配合物の有効成分として投与される。これらの配合物は、媒体を含有していてもいなくてもよいが、媒体は使用した方が好ましい。好ましい媒体は非脂質の媒体であり、特に水混和性の液体または液体の混合物である。その例は、メタノールエタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびブチレングリコール、ならびにこれら化合物の２種以上の混合物である。
【００２１】
媒体中の有効成分の濃度は一般に約１０μＭ〜約１０００μＭの範囲内であるが、特定の有効成分の場合その濃度はこの範囲外に変えてもよい。有効成分として、ファルネソールを含有する配合物の場合、好ましい濃度は約１０μＭ〜約１００μＭの範囲内である。有効成分として幼若ホルモンＩＩＩを含有する配合物の場合、好ましい濃度は約１０μＭ〜約２００μＭの範囲内である。有効成分としてクロフィブレートを含有する配合物の場合、好ましい濃度は約１００μＭ〜約１０００μＭの範囲内である。有効成分としてオレイン酸を含有する配合物の場合、好ましい濃度は約１００μＭ〜約１０００μＭの範囲内である。有効成分としてリノール酸を含有する配合物の場合、好ましい濃度は約５μＭ〜約５０μＭの範囲内である。
【００２２】
本発明による、ＦＸＲまたはＰＰＡＲαの活性化剤を含有する局所用配合物は、皮膚および／または粘膜に塗布すると有益な作用がある。これらの活性化剤は、ローション剤、液剤、ゲル剤、クリーム剤、皮膚軟化クリーム剤、軟膏、スプレー剤、または局所塗布を行える他の形態として配合することができる。本発明の配合物は、その疾患領域の上への塗り広げを促進するがそれ以外は生物学的に不活性の薬剤１種以上を含有していてもよい。これら薬剤の例は、界面活性剤、保湿剤、湿潤剤、乳化剤または噴射剤である。
【００２３】
本明細書で、バリヤの発育を高めるのに有効であると称している量とは、繰返し塗布して時間が経過すると、混乱しているかまたは機能不全の表皮の浸透バリヤの症状を実質的に除く量である。与えられる事例の最適量は、当業技術者には容易に分かるであろうし、または日常的な実験で決定できる。
【００２４】
本発明を実施して治療を受けることができる皮膚の症状の例は次のとおりである。
【００２５】
懐胎期間が３３週以下の早産幼児の皮膚；
アトピー性皮膚炎と脂漏性皮膚炎；
口唇炎、荒れた唇、鼻の刺激および外陰膣炎などの粘膜の炎症；
アレルギーおよび刺激物接触で起こる湿疹皮膚炎、冬季湿疹、放射線皮膚炎およびうつ血性皮膚炎；
化学薬剤または火傷、水疱性障害、または静脈、動脈、塞栓性もしくは糖尿病の潰瘍を含む血管の損傷または欠血による潰瘍とびらん；
バリヤの異常を伴うかまたは伴わない魚鱗癬；
表皮水疱症；
乾癬；
肥大した瘢痕とケロイド；
内因性老化およびダーマトヘリオサス（dermatoheliosus）；
機械的摩擦による発疱；
コルチコステロイド萎縮症；および
リグニン黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、紫外線角化症およびウイルス誘発異常増殖（いぼおよび尖形コンジローム）を含む黒色腫と非黒色腫の皮膚癌。
【００２６】
投与の最適の方法と頻度は、当業技術者であれば容易に分かるであろうし、または日常的な実験で決定できる。疾患の領域または望ましい作用を達成することが求められている領域の上に薄い層で局所塗布を行うことによって、ほとんどの症例で有効な結果が達成される。取り上げられる症例、その病気または程度および塗布の理由が治療か予防かということによって、２日もしくは３日毎に１回の塗布〜１日に４回以上の塗布の塗布回数で有効な結果が得られる。  本発明は、一般に、ヒト、家庭ペット、および家畜類などの飼育動物を含む陸生動物の皮膚の治療に適用できる。
【００２７】
以下の実施例は、例示を目的として提供するものであり、本発明を限定または定義するものではない。これら実施例中および本明細書を通じての引用文献はすべて、それによって提供されるすべての法的目的を達成するため本明細書に援用するものである。
実施１〜１１の材料と方法。
【００２８】
Ａ． 期間培養モデルとバリヤ機能の測定
妊娠中のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（プラグデイト（plug date）＝ゼロ日）をSimonsen（米国、カリフォルニア州ギルロイ）から入手して１７日目に早産させた。皮膚経由水損失量（ＴＥＷＬ）は、ラットの胎仔から切り取った側腹部の皮膚（全厚み）について、各種の期間培養した後に測定した。その皮膚の外植片を、培地Ｍ−１９９（血清なし）中、コラーゲン膜挿入体（細孔の大きさ３μ）上に、真皮の面をペトロラタムでシールして、水損失が表皮表面を通じてのみ起こるようにした。外植片の試料の重量を、外界温度（２４±３℃）および湿度（４０±５％）にて、６時間にわたって、Ｃａｈｎ天秤（感度０．００１ｍｇ）を使って１時間毎に測定した。ＴＥＷＬのレベルは、１ｈｒで表皮の表面１ｍｍ２当たりの水損失量のｍｇとして報告した。
【００２９】
これらの実施例で使用した化合物は以下のとおりである。
【００３０】
ファルネソール
2005247854.tif 000003
幼若ホルモンＩＩＩ
2005247854.tif 000004
リノール酸
2005247854.tif 000005
オレイン酸
2005247854.tif 000006
クロフィブレート
2005247854.tif 000007
ＷＹ１４,６４３（pirinixic acid）
2005247854.tif 000008
５,８,１１,１４−エイコサテトライン酸（ＥＴＹＡ）
2005247854.tif 000009
トログリタゾン
2005247854.tif 000010
レチノイン酸
2005247854.tif 000011
9-cisレチノイン酸     
2005247854.tif 000012
１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ
2005247854.tif 000013
プロスタグランジンＪ２
2005247854.tif 000014
ネロリドール
2005247854.tif 000015
ゲラニルゲラニオール
2005247854.tif 000016
cis,trans-ファルネソール
2005247854.tif 000017
コレステロール
2005247854.tif 000018
２５−ヒドロキシコレステロール
2005247854.tif 000019
２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール
2005247854.tif 000020
２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール
2005247854.tif 000021
スクアレン
2005247854.tif 000022
メバロネート
2005247854.tif 000023
【００３１】
プロスタグランジンＪ２はCayman Chemical Company（米国ミシガン州アン・アーバー）から入手した。トログリタゾンはParke-Davis Laboratories（米国ミシガン州デトロイト）から入手した。化合物（４−クロロ−６−（２,３−キシリジノ）−２−ピリミジニル）チオ酢酸（pirinixic acidおよびＷＹ１４,６４３として知られている）はWyeth Laboratories（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア）から入手した。化合物のciｓ-ファルネソール、ネロリドールおよびゲラニルゲラニオールはカリフォルニア大学（米国カリフォルニア州ロスアンゼルス）から入手した。その外の化合物はすべてSigma Chemical Company（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【００３２】
脂肪酸類とクロフィブレート（ｐ−クロロフェノキシイソ酪酸）は、０．５％（重量／容積）ウシ血清アルブシン（ＢＳＡ）に結合させて培地に加えた。イソププレノイド類とオキシステロール類はエタノール（≦０．１％）に入れて加え、幼若ホルモンＩＩＩはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（≦０．１％）として加えた。対照の外植片は、適当な媒体（≦０．１％のＤＭＳＯもしくはエタノール、および／または≦０．５％のＢＳＡ）の存在下でインキュベートした。
【００３３】
Ｂ.光学顕微鏡検査および電子顕微鏡検査
光学顕微鏡検査用試料は改変カーノブスキー溶液（modified
karnovsky's solution）で固定し、プラスチックに埋包し、次いで０．５μＭの切片をトルイジンで染色した。電子顕微鏡検査用試料はつぶして１ｍｍ3の大きさの断片にし、改変カーノブスキー固定液で固定し、切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、四酸化ルテニウムで後固定を行い、次いでＺｅｉｓｓ  １０Ａ電子顕微鏡で測定した。
【００３４】
Ｃ.酵素検査用組織の調製
Ｃａ++イオンとＭｇ++を含有していないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４（１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有）中で、３７℃にて３０〜４０分間インキュベートした後表皮を真皮から分離した。その組織をつぶし、次いで０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（β−グルコセレブロシダーゼの場合）中、または０．１５Ｍスクロースおよび２ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（ステロイドスルファターゼの場合）中で、氷上にてホモジナイズした（Polytronホヒジナイザーを使って３回１５秒間ずつホモジナイズし、続いて、３５％パワーで２回１０秒間ずつ超音波処理を行った）。β−グルコセレブロシダーゼの活性を、４℃で１５分間、１０，０００×ｇにて遠心分離して得た上澄み液で測定した。ステロイドスルファターゼの活性は、１０，０００×ｇによる遠心分離（１０分間、４℃）、続いて４℃で６０分間の１００，０００×ｇによる超遠心分離を行って得たミクロソームの画分で測定した。タンパク質の含有量は通常の方法で測定した。
【００３５】
Ｄ.β−グルコセレブロシダーゼとステロイドスルファターゼの活性  β−グルコセレブロシダーゼの活性は、合成基質の４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄグルコシド（４−ＭＵＧ）を使用して検定した。その検定は、５ｍＭのタウロコール酸ナトリウムを含有するクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中で０．５ｍＭ４−ＭＵＧを使い、３７℃で６０分間、最終検定容積１００μＬにてそしてタンパク質濃度１〜２ｍｇ／ｍＬで実施した。反応は、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．５）２ｍＬで停止させた。次に蛍光を３６０λ（励起）と４５０λ（発光）で測定し、標準の４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）曲線と比較した。
【００３６】
ステロイドスルファターゼの活性は、５．６ｍＭグルコース（ｐＨ７．４）を含有する０．１ＭＴｒｉｓ中１００μｇのミクロソームタンパク質を、１５μＭの（3Ｈ）ジヒドロエピアンドロステロンサルフェート（ＤＨＥＡＳ）（１５μＣｉ）と共に、最終容積１．１ｍＬでインキュベートして測定した。生成物の（3Ｈ）ＤＨＥＡをベンゼンで抽出し、その一部分を取って、シンチレーションスクトロホトメトリーで計数した。
【００３７】
Ｅ.統計的解析
統計的評価はスチューデント検定法を用いて実施した
実施例１
この実施例にて報告された試験は、すべてのＲＸＲヘテロ二量体の活性化剤がバリヤの発育を加速するとは限らないことを実証している。レチノイド受容体、ビタミンＤ受容体およびペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（ＰＰＡＲγ）の三つの特定受容体の活性化剤が使用され、否定的な結果が実証された。
【００３８】
従来の研究によれば、妊娠１７日のラット由来の全厚皮膚は、２日培養した後、顆粒細胞中に層板状体（lamellay body）を示し、かつ角質層間隙に層板状物質が分泌されるが、胎内の妊娠１９日のラットの皮膚と同様に、表皮が成熟層板状膜構造とコンペテントバリヤ（competent barrier）を欠いていることが示された。（Hanley,K.他、「Epidermal barrier ontogenesis:maturation in serum-
free media and accelaration by glucocorticoids and thyroid
hormon but not selected growth factors」J. Invest, Dermatol.１０６：４０４−４１１、１９９６年）。反対に、成熟表皮に観察されるのと同等のバリヤ機能をもつ角質層が胎内における２１日に相当する４日の培養によって通常形成される。（Hanley他、１９９６年の報告）。
【００３９】
各種の活性化剤又は媒体（vehicle）のいずれかの存在下にて妊娠１７日のラット由来の皮膚の外植片をインキュベートし、二日後に表皮経由水分損失量を測定した。この測定に用いた活性化剤とその濃度は次のとおりであった。
【００４０】
９−ciｓ-レチノイン酸；レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の活性化剤；濃度１μＭ
全−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）の受容体；濃度１μＭ
１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３：ビタミンＤ受容体の活性化剤；濃度１μＭ
プロスタグランジンＪ２：ＰＰＡＲγの活性化剤；濃度１０μＭ
表皮経由水分損失量（ＴＥＷＬ）の試験結果を図１の棒グラフにて上方四本のバーにより示したが、対照（図の底部に示したバー）と比較したとき、上記四つの活性化剤はＴＥＷＬを減じてバリヤの発育を促進するのに有意な効果がなかったことを示している。
【００４１】
更なるテストにおいて、図１にはその結果を示さなかったが、最初の三つの活性化剤を、バリヤの発育速度に対するこれらの効果について１ｎＭ〜１μＭの濃度でテストした。この範囲でテストした濃度では効果が全く見られなかった。
【００４２】
これらのデータはレチノイド受容体、ビタミンＤ受容体およびＰＰＡＲγの活性化剤は胎仔のバリヤの発育を促進しないことを実証している。
【００４３】
実施例２
この実施例にて報告された試験は、ＰＰＡＲαの活性化剤がバリヤの発育を促進し、一方他のＰＰＡＲサブタイプの活性化剤はバリヤの発育を促進しないことを実証している。
【００４４】
リノール酸がＰＰＡＲαの活性化剤の一例であり、図１には３００μＭ濃度のリノール酸中にて２日間インキュベートした外植片のＴＥＷＬ値が示されている。実施例１にて検討した四つの無効な活性化剤および対照（これらすべて図１に示してある）とは反対に、リノール酸はＴＥＷＬを著しく減少させた（ｐ＜０．００５，ｎ＝８）。
【００４５】
現在知られている三つのＰＰＡＲサブタイプは、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδとＰＰＡＲγである。これらのサブタイプは薬理学的に異種のものであって各種の因子によって特異的に活性化される。（Yu,V.C.他、「RXRβ：coregulator that enhances binding of
retinoic acid,thynoid hormon,and vitamin D receptors to 
their cognate response elements」Cell、６７：１２５１−１２６６、１９９１年）。
【００４６】
バリヤの発育促進がＰＰＡＲαに特異的に起因しているか否かを判定するために、各種のＰＰＡＲの活性化剤を次のようにテストした。
【００４７】
オレイン酸：ＰＰＡＲαの活性化剤（ＰＰＡＲδの活性化剤と推測される）を３００μＭの濃度でテストした。
ＥＴＹＡ：ＰＰＡＲαの活性化剤（ＰＰＡＲδの活性化剤と推測される）を１００μＭの濃度でテストした。
ＷＹ１４，６４３：ＰＰＡＲαのみの活性化剤を１００μＭの濃度でテストした。
クロフィブレート：ＰＰＡＲαのみの活性化剤を３００μＭの濃度でテストした。
トログリタゾン：ＰＰＡＲαのみの活性化剤を１０μＭの濃度でテストした。
【００４８】
この研究に関連して、プロスタグランジンＪ２、すなわちＰＰＡＲγの活性化剤のテスト結果のみが図１に示されている。
【００４９】
上記の五つの活性化剤の結果が、図２にて棒グラフで示されている。図２には二つの対照が含まれている。ＰＰＡＲαのみを活性化するとして知られているものを含むＰＰＡＲαのすべての活性化剤は有意な正の効果を実証した。これに反して、ＰＰＡＲγ活性化剤のトログリタゾン（troglitazone）は、（図１に示したＰＰＡＲγの活性化剤であるプロスタグランジンＪ２と同様に）効果がなかった。これらの結果は、ＰＰＡＲαの活性化剤はバリヤの発育を促進するのに反して、ＰＰＡＲγのみを活性化する活性化剤はバリヤの発育を促進しないことを示している。
【００５０】
実施例３
この実施例にて報告された試験は、ファルネソールＸ応答性受容体（ＦＸＲ）はバリヤの発育を促進するが、ファルネソール、ファルネソールの代謝産物、ファルネソールの代謝前駆体又はファルネソールの代謝前駆体の代謝産物と構造が類似している他の化合物はバリヤの発育を促進しないことを実証している。
【００５１】
再び図１を参照すると、ファルネソールがその棒グラフに含まれており、５０μＭのファルネソール中で２日間インキュベートした外植片のＴＥＷＬ値が列挙されている。実施例１にて検討した四つの無効な活性化剤と対照とは反対に、ファルネソールはＴＥＷＬをリノール酸が果たしたと同様な度合まで顕著に減少させた（ｐ＜０．００５，ｎ＝８）。
【００５２】
ファルネソールによるバリヤ発育の効果がＦＸＲによって仲介されるか否かを確認するため、活性化されるＦＸＲについて述べられているように、または活性化されるＦＸＲについて同様に知られていることによって、ファルネソールに類縁の数種の他の化合物をＴＥＷＬについてテストした。ファルネソールはアセチル補酵素Ａから多段階の代謝合成によって産生され、重要中間体の一つはメバロネートである。経路の一部として、メバロネートは律速段階でイソペンテニルピロホスフェートに転化され、そのイソペンテニルピロホスフェートは、一連の反応を通じてファルネシルピロホスフェートに転化される。ファルネシルピロホスフェートはファルネソールに直接変換されるが、コレステロール、ユビキノン、ドリコール、カロチノイド類、ビタミンＤ、胆汁酸類及びステロイドホルモン類のような化合物の合成を行う別の経路を取ることもできる。このファルネソール経路は次に、ファルネサル、ファルネソール酸（farnesoic acid）、メチルファルネソエート及び幼若ホルモンＩＩＩのようなファルネソイド代謝産物に至る。
【００５３】
従って、この一連の試験は、メバロネート（２００μＭにてテストした）、幼若ホルモンＩＩＩ（１００μＭ）及び２５−ヒドロキシコレステロール（５０μＭ）についてのテスト、ならびにネロリドール（１００μＭ）、ゲラニルゲラニオール（５０μＭ）、ciｓ-ファルネソール（５０μＭ）およびスクアレン（５０μＭ）についての試験が含まれている（後者の四つの化合物とファルネソールとは構造が類似している）。
【００５４】
これらのテスト結果が図３の棒グラフに示されている。この棒グラフは幼若ホルモンＩＩＩが１００μＭにて有意にバリヤ形成を促進したことを示している（ｐ＜０．００５，ｎ＝６）。これと対照的に、２００μＭにてのメバロネート、５０μＭにての２５−ヒドロキシコレステロール、５０μＭにてのスクアレン、５０μＭにてのゲラニルゲラニオール、５０μＭにてのciｓ-ファルネソールまたは１００μＭにてのネロリドールはいずれもバリヤ機能に有意な影響をしなかった。これらの結果は、ファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩによるバリヤ発育の促進がＦＸＲにより仲介されることを示している。        
【００５５】
実施例４
この実施例にて報告された試験は、先の実施例においてテストしたＰＰＡＲαおよびＦＸＲの各種活性化剤の投与量反応を探究している。クロフィブレート、オレイン酸、リノール酸、ファルネソールおよび幼若ホルモンＩＩＩを各々ある範囲の濃度にわたって使用して、ＴＥＷＬの試験を先に述べたようにして実施した。その結果が図４ａ（クロフィブレートとオレイン酸）、図４ｂ（リノール酸）および４ｃ（ファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩ）に表示されている。クロフィブレートとオレイン酸の両者については、バリヤ発育に対する最大の効果が約５００μＭの濃度にて生じ、最大効果の半分の効果が約２５０μＭの濃度で生じている。リノール酸については、バリヤ発育に対する最大効果が約３０μＭの濃度にて生じ、最大効果の半分効果が１２．５μＭの濃度にて生じる。ファルネソールは約５０μＭの濃度にて最大効果を示し約２０μＭの濃度にて最大効果の半分の効果を示した。
【００５６】
実施例５
ＲＸＲとＦＸＲの両者またはＲＸＲとＦＸＲの両者の活性化が、相乗効果または加成効果で、ＦＸＲまたはＰＰＡＲα単独の活性化より、大きくバリヤを発育させるかどうかを確認するため、一連の試験が行われた。
【００５７】
外植片が、９−ciｓ-レチノイン酸中にて最初にクロフィブレートと次いでファルネソールと更に両者と組合せて、続いてＴＥＷＬが測定された。９−ciｓ-レチノイン酸は１μＭの濃度でテストされ、一方クロフィブレートとファルネソールは共に上記実施例４にて定めたような最適下限の濃度、すなわち、クロフィブレートは１００μＭ、ファルネソールは１０μＭにてテストされた。いずれの組み合わせによっても機能または表皮形態学的な成熟に対する効果は見られなかった。
【００５８】
次いで、ＰＰＡＲα活性化剤とＦＸＲ活性化剤の組み合わせが相乗効果または加成効果を生じるかどうかを測定するための試験がなされた。最初の試験は、これら二つの活性化剤の最適下限の濃度（クロフィブレート１００μＭとファルネソール１０μＭ）を用いて行われた。その結果が図５ａの棒グラフに（活性化剤が存在しない）対照と比較して表示されている。「Ｃｌｏ」と標識したバーによって表示したクロフィブレートのＴＥＷＬ値は同一濃度で図４ａに示したデータ点と同じであり、一方図５ａにおいて「Ｆａｒｎ」と標識したバーによって表示したファルネソールのＴＥＷＬ値は同一濃度で図４ｃに示したデータ点と同じである。上記二つの活性化剤の組み合わせについてのＴＥＷＬ値は図５ａにおいて「Ｃｌｏ＋Ｆａｒｎ」と標識下バーによって表示され、バリヤの発育が顕著に促進されたことを示し、クロフィブレートとファルネソールの加成効果を示している。
【００５９】
図５ｂにおいてその結果が示されている第２の試験においては、ファルネソールとクロフィブレートが図４ａと４ｃにて確認されたそれらの最大濃度にて用いられた。クロフィブレートのＴＥＷＬ値は、図５において「Ｃｌｏ」と標識したバーにより表示されおり図４ａにおける効果が最大の濃度での値と同じである。一方、ファルネソールのＴＥＷＬ値は図５において「Ｆａｒｎ」を標識したバーによって表示されており図４ｃにおける効果が最大の濃度での値と同じである。効果が最大の濃度での上記二つの活性化剤の組み合わせのＴＥＷＬ値は図５ｂにおいて「Ｃｌｏ＋Ｆａｒｎ」と標識したバーによって表示され、バリヤの発育が上記二つの活性化剤のみの値と較べてそれ以上促進されなかったことを示している。
【００６０】
最適下限の投与量のクロフィブレートとファルネソールに加成効果があることはバリヤの発育に向かう類似の活性化経路を示唆している。このことは、効果が最大の濃度にて同じ二つの活性化剤を組み合わせた場合に相乗効果が欠除していることでも示唆される。９−ciｓ-レチノイン酸とクロフィブレートまたはファルネソールとの間の相乗効果が欠除しているのは、バリヤの発育に向かう経路がＲＸＲの活性化とは独立していること、すなわち充分な内因性のＲＸＲ活性化剤が存在していたことを示唆している。
【００６１】
実施例６
この実施例は、ＰＰＡＲαおよびＦＸＲの活性化剤の効果を表皮成熟の間に、光学顕微鏡のレベルと電子顕微鏡レベルで関係があるかどうかを判定することを目的としている。
【００６２】
各種の培地中にてインキュベートした外植片が光学顕微鏡によって検査された。インキュベーション培地には、対照培地（活性化剤を含まない）、ならびに、個別に、３００μＭのクロフィブレート、１００μＭの幼若ホルモンＩＩＩ、３００μＭのオレイン酸、３０μＭのリノール酸、５０μＭのファルネソール、各種濃度の９−ciｓ-レチノイン酸、全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含有する培地が含まれている。対照の外植片中の表皮の光学顕微鏡検査は、対照の外植片が明確な顆粒層と明確な角質層の両者を欠除していることを示した。これと対比して、クロフィブレート含有培地中、幼若ホルモンＩＩＩ含有培地中、オレイン酸含有培地中、リノール酸含有培地中、およびファルネソール含有培地中にてそれぞれ４８時間インキュベートした外植片はすべて多層の顆粒層と角質層の両者を有していた。レチノイン酸含有培地（９−ciｓと全−ｔｒａｎｓの両者）中にてインキュベートした外植片と、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３含有培地中にてインキュベートした外植片は明確な角質層を示さず形態学的に対照と区別できなかった。
【００６３】
各種の培地でインキュベートし次いで四酸化ルテニウムで後固定した外植片中の外表皮の超微細構造の成熟について観察した。レチノイン酸含有培地と１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３含有培地を除いて、上記パラグラフで用いたのと同じ培地を使用した。ＦＸＲとＰＰＡＲαの活性化剤を含有するすべての培地で処理した外植片は、角質層の細胞外ドメインを埋める、成熟したラメラ膜単位構造（mature lamellar membrane unit structure）の多重アレイ（multiple array）を示した。対照、ビタミンＤ３、全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸または９−ciｓ-レチノイン酸の培養物には、いずれも単一層状角質層中に、成熟ラメラ膜単位構造まで器質化された細胞がラメラはなかった。
【００６４】
これらの結果は、バリヤの機能の発育が刺激されると、これに付随して、表皮の層化と分化が加速されかつ成熟ラメラ膜単位構造が角質層中に迅速に出現することを示している。
【００６５】
実施例７
この実施例は、バリヤの形成にその活性が増大する酵素の発現に対するＰＰＡＲαとＦＸＲの活性化剤の効果を精査している。表皮のβ−グルコセレブロシダーゼ活性が体内と生体外のラットの角質層とバリヤの発育中に増大すること、この酵素の阻害が正常なバリヤの形成を妨げること、およびこの酵素がバリヤのホメオスタシス（成人の生体内でのバリヤ機能）に必要とされることが当業技術分野で知られている。表皮バリヤの形成を加速するホルモン類が、胎児の皮膚の外植片のβ−グルコセレブロシダーゼ活性を増大することも分かっている。また、ステロイドスルファターゼの活性がバリヤの形成中に増大することも知られており、この活性はバリヤ形成を促進するホルモンによって刺激される。よって、β−グルコセレブロシダーゼとステロイドスルファターゼが二の研究のための酵素として選ばれた。
【００６６】
１７日胎仔ラット由来の皮膚外植片がクロフィブレート（３００μＭ）と幼若ホルモンＩＩＩ（１００μＭ）を個々に含有している培地と対照培地中に２４時間又は４８時間インキュベートされた。かくして、酵素の活性が測定され、その結果が表１に五つの測定値の平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）として表示されている。ｐ値はすべて、同じ期間の対照と比べて≦０．００５である。
【００６７】
【表１】
2005247854.tif 000024
【００６８】
表１のデータは、β−グルコセレブロシダーゼの活性が、２４時間インキュベーションおよび４８時間インキュベーション後に処理された外植片にて対照におけるよりも約２倍高くなったこと、およびステロイドスルファターゼの活性が、２４時間インキュベーション後においては対照の１．６倍に増大され、４８時間インキュベーション後においては２．５倍に増大されたことを示している。これらのデータは、クロフィブレートと幼若ホルモンＩＩＩの両者が共にコンプテントバリヤの形成に関連する二つの脂質代謝酵素の活性の発育増大を加速することを実証している。
【００６９】
実施例８
この実施例は、ＰＰＡＲαの活性化剤が角質細胞の分化を誘発し、この分化が成熟表皮バリヤを発育させる過程の一部であることを示す。インボルクリンとトランスグルタミナーゼ（およびそれらのｍＲＮＡ）が分化の指標として測定された。これら二つのタンパク質は角質層角質細胞の表面骨格の成分である。テストしたＰＰＡＲαの活性化剤はクロフィブレートであった。
【００７０】
ヒトの角質細胞が０．０３ｍＭＣａ++の濃度（低すぎて分化を誘発できないレベル）にてカルシウムを含有する培養物中にてインキュベートされた。また、この培養地中には４００μＭのクロフィブレートまたは１０μＭと２０μＭのＥＴＹＡが含まれ、一方別の細胞培養物がクロフィブレートまたはＥＴＹＡを含有しない対照として維持された。インボルクリンとトランスグルタミナーゼの両者に対するｍＲＮＡの産生が４８時間にわたって時間間隔（０，６，１２，２４および４８時間をとって）ノーザンブロット分析によって測定された。図６ａにはインボルクリンについての結果が示され、図６ｂにはトランスグルタミナーゼについての結果が示されている。いずれの場合においても、明るいバーが対照細胞を示し、暗いバーがクロフィブレート含有培地中にてインキュベートした細胞を示している。発生したｍＲＮＡの度合が、ゼロ時間における対照に対する百分率で示されている。上記の図におけるデータは、クロフィブレートで処理された細胞が、６時間でインボルクリンのレベルを有意に増大し始め、かつ１２時間でグルタミナーゼのレベルを有意に増大し始めたことを示している。同様な結果がＥＴＹＡについても得られた。
【００７１】
次いで、上記の試験を、培地中１．２ｍＭＣａ++の濃度（それ自体によって分化を誘発させるのに充分高い濃度）にてカルシウムを用いて繰り返した。図７ａにはインボルクリンについての結果が示され、図７ｂにはトランスグルタミナーゼについての結果が示されている。同様にこれらの図においても、明るいバーが対照細胞を示し、暗いバーがクロフィブレート含有培地中にインキュベートされた細胞を示し、発生したｍＲＮＡの度合が、ゼロ時間における対照に対する百分率として示されている。対照細胞においては、インボルクリンｍＲＮＡのレベルは２４時間にて最大値まで増大し、次いで４８時間まで低下し、一方トランスグルタミナーゼｍＲＮＡは最初の２４時間上昇し、次いで横ばい状態になるかまたは緩やかに上昇し続ける。クロフィブレート処理細胞は、対照と比べてすべての時点にて、インボルクリンとトランスグルタミナーゼの両者のｍＲＮＡが増大した。同様な結果がＥＴＹＡについても得られた。
【００７２】
上記二つのｍＲＮＡのレベルのクロフィブレートの投与量に対する依存性が、０（媒体のみ）から４００μＭ間での範囲で変化する濃度のクロフィブレートを、０．０３ｍＭまたは１．２ｍＭＣａ++存在下で含有する培地を用いて２４時間にわたる一連のインキュベーションによって確認された。インボルクリンとトランスグルタミナーゼのｍＲＮＡのレベルについての結果が図８に示されている。この図において、発生するｍＲＮＡの度合はゼロ時間にて実施されたそれぞれの測定値のパーセントとして表示されている。各タンパク質についてのｍＲＮＡレベルはこの範囲内にて投与量が増加するにつれて増大することを示している。
【００７３】
インボルクリン蛋白それ自体のレベルの測定が培地中にてウエスターンブロットにより行われた。この場合、各種のインキュベーションがクロフィブレートを０（媒体のみ）から４００μＭまでの範囲の濃度にて含有しカルシウムイオンを０．０３ｍＭと１．２ｍＭにて含有する培地中にて行われた。図９ａにおいては、０．０３ｍＭにてカルシウムイオンを含有する場合のテスト結果が示され、図９ｂにおいては、１．２ｍＭにてカルシウムイオンを含有する場合のテスト結果が示されている。これらの図において、これらタンパク質の含有量は、クロフィブレートの存在しない状態で同じ時間インキュベートした培地で得たそれぞれの測定値のパーセントとして表されている。
【００７４】
両カルシウムレベルにてクロフィブレートの濃度が上記の範囲内で増大するにつれてタンパク質の含有量が実質的に増加することが観察された。それと共に、これらのデータはＰＰＡＲαの活性化剤が表皮分化のタンパクマーカーの発現に深い効果を有することを実証している。
【００７５】
実施例９
この実施例は、ＦＸＲの活性化剤に角質細胞の分化が増大することを実証している。これは、表皮分化の主要なタンパクマーカーの発現の増大が指標である。用いた活性化剤はファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩであった。
【００７６】
実施例８の処理がなされ、次に０．０３ｍＭと１．２ｍＭのカルシウムイオンを含有する培地中にて０（媒体のみ）から１５μＭの範囲内の各種濃度のファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩで２４時間インキュベートした細胞からのインボルクリン蛋白のレベルの測定がなされた。図１０には０．０３ｍＭＣａ++におけるファルネソールについての結果が示され、図１１には０．０３ｍＭＣａ++における幼若ホルモンＩＩＩについての結果が示されている。これらの図は、ファルネソールの濃度が上記の範囲内にて増大するにつれてインボルクリン蛋白の含有量がタンパク質を実質的に増加することを示し、同様なことが幼若ホルモンＩＩＩについても起こることを示している。これらのデータは、ＦＸＲの活性化剤が表皮分化の主要なタンパクマーカーの発現を増大させることを示している。
【００７７】
実施例１０
この実施例は、クロフィブレート、ファルネソールおよび幼若ホルモンＩＩＩの角化エンベロープの生成率に対する効果を示している。その効果は洗浄剤と還元剤不溶性タンパク中への35Ｓ取り込みによって測定された。
【００７８】
正常なヒトの角質細胞が０．０７μＭＣａ++を含有するＫＧＭ中にて８０％コンフリーエンス（confluence）まで培養された。８０％コンフリーエンスで、上記細胞を、０．０３μＭＣａ++または１．２μＭのＣａ++を含有し、かつクロフィブレートの濃度を０〜４００μＭの範囲で変えたＫＧＭに移した。次いで、細胞が35Ｓ−メチオニン／システインを含むこれら溶液中にて４８時間インキュベートされた。イオノマイシン、５μＭが４６時間の時点、すなわち角化エンベロープを検定する２時間前に添加された。かくして、細胞がリン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ）によりすすがれて、２％のドデシル硫酸ナトリウム溶液に溶解され、その一部と煮沸水中の４％ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム／４０ｍＭジチオトレイトール中に３０分間おかれた。ドデシル硫酸ナトリウムに不溶性のペレットが０．１％ドデシル硫酸ナトリウム／０．１％ジチオトレイトールで洗浄され、洗浄剤−不溶性角化エンベロープ中に取り込まれた放射能がシンチレーション計数によって測定された。35Ｓ−期間中に合成された全タンパク質を測定するために、煮沸前の細胞溶解産物の一部が１０％三塩化酢酸によって３０分間氷上で沈降され、５％三塩化酢酸により洗浄され、シンチレーション計数によって定量された。角化エンベロープの割合がパーセンテージｃｐｍ／全タンパク質ｃｐｍ×１００として算出された。
【００７９】
上記の結果が表２に示されている。この表において、試験結果は、０．０３ｍＭＣａ++を含有する対照を表す値のパーセントとして表示され、各記入数値は、二つの独立した試験地の平均値±ＳＥＭを示している。０．０３ｍＭＣａ++と２００μＭおよび４００μＭのクロフィブレートにてのデータと１．２ｍＭＣａ++と４００μＭにてのデータについては、ｐの値が対応する媒体のみの対照に比べて０．０１小さい。
【００８０】
【表２】
2005247854.tif 000025
【００８１】
表２におけるデータは、クロフィブレートが高いＣａ++の培地および低いＣａ++の培地中にて角化エンベロープの生成を増大させたことを示している。
【００８２】
同様なテストがそれぞれ低カルシウム濃度（０．０３ｍＭ）の別々の培地中で１０μＭのファルネソールと１５μＭの幼若ホルモンＩＩＩを用いて行われた。４８時間の結果が図１２に示されている。この結果は、ファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩが角化エンベロープ生成速度を実質的に増大させたことを示している。
【００８３】
実施例１１
この実施例は、角質細胞の成長に対するクロフィブレート、ファルネソールおよび幼若ホルモンＩＩＩの効果を示す。その結果は、ＰＰＡＲαとＦＸＲの活性化剤が細胞の成長と増殖を抑制することを示している。
【００８４】
プレコンフリューエント（preconfluent）角質細胞を、低濃度（０．０３ｍＭ）のカルシウムおよび高濃度（１．２ｍＭ）のカルシウムの存在下、濃度をゼロ（媒体のみ）〜４００μＭの範囲内で変えたクロフィブレートとともに４８ｈｒ処理した。処理された角質細胞を収穫し次いで超音波処理を行い。次に、得られたホモジネートを、１μＬ／ｍＬのビス−ベンゾイミダゾールとともに、２時間暗所でインキュベートした。試料を、分光蛍光光度計で読み取ってＤＮＡ含有量を定量した。測定結果を表３に示す。表中の各数値は３試料の平均値である。
【００８５】
【表３】
2005247854.tif 000026
【００８６】
１０μＭのファルネソールおよび１５μＭの幼若ホルモンＩＩＩを使用し、両者ともに０．０３ｍＭＣａ++の存在下で４８時間インキュベートして類似の試験を実施した。試験結果を図１３に示す。表２と図１３は、ＰＰＡＲαとＦＸＲ両者の活性化剤が細胞の成長を抑制することを総合的に示している。
【００８７】
実施例１２〜１３では、この発明で取込む用途におけるＬＸＲαのオキシステロール活性化剤の活性について述べる。
【００８８】
実施例１２〜１７の材料と方法：
Ａ．細胞培養
ヒトの表皮を新生児の包皮から切り取り、次いで通常の方法を使って、角質細胞を血清なしの角質細胞増殖培地（「ＫＧＭ」、Clonetics,米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）にプレートした。細胞を、媒体中の試験化合物でまたは媒体のみ（＜０．１％エタノール）で、２４時間または４８時間処理した。試験化合物はSigma Chemical Co.（米国シズーリ州セントルイス）から入手し、１５ｍＭの原液として−２０℃で貯蔵した。メバロネートは減菌水で可溶化した。
【００８９】
Ｂ．ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティングおよびＤＮＡプローブ
全ＤＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（Sigma Chemical Co.）を使用し、製造メーカーのプロトコルにしたがって単離した。エタノールで沈降させたＲＮＡのペレットを、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理した減菌水中に懸濁させ、次いでＲＮＡを、純度の指数として２６０／２８０ｎｍの比率を使用して２６０ｎｍの吸光度によって定量した。２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルによって、ＲＮＡ（１５μｇ／試料）のサイズ分画を行った。ＲＮＡの完全性（integrity）を、電気泳動法で得たゲルをアクリジンオレンジで染色して視覚化した。そのＲＮＡをナイロン膜に移し、続いて、８０℃で２ｈｒベークした。ブロットを、６５℃で一夜かけて、32Ｐで標識したプローブとハイブリッドを形成させた。０．１％のＳＳＣと０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する溶液で、室温にて２０分間洗浄し、次いで６５℃で２０分間洗浄した。オートラジオグラフィーを−７０℃で実施した。ブロットをβ−アクチンでプローブして等しいローディング（loading）を確認した。適当なバンドをデンシトメトリーで定量した。
【００９０】
Ｃ．インボルクリン蛋白質とトランスグルタミナーゼ蛋白質のレベル
タンパク質の濃度は、タンパク質電気泳動法とウエスターンブロット法で検定した。細胞を２％ＳＤＳに溶解し、その溶解物を超音波処理した。タンパク質の測定は、Bicin-choninic acid タンパク質検定法（Pierce Chemical Company、米国イリノイ州ロックフォード）を用いて行った。タンパク質を測定した後、等しい量のタンパク質（５０μＭ）を７．５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分離し、次いでポリ二フッ化ビニリデンの膜（０．２−μ、Bio-Rad Laboratories、米国カリフォルニア州ハーキュレス所在から入手）上にエレクトロブロットした。インボルクリン蛋白質は、ポリクローナルウサギ抗ヒトボルクリン抗体（１：１０００希釈率）とともに、一夜、４℃でインキュベートすることによって検出した。オートラジオグラム上のインボルクリン特異的バンドをデンシトメトリーで定量した。トランスグルタミナーゼ蛋白質の発現は、スタッキング（stacking）、試料および４Ｍの尿素を含有する流動緩衝液を使用して類似の方法で測定し、次いで電気泳動法で得たゲルを、４Ｍ尿素、２５ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、７．５ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２ｍＭエチレンジアミン四酢酸で９０分間洗浄し、次いでエレクトロブロッティングを行い、抗体でトランスグルタミナーゼを検出した。オートラジオグラム上の特異的バンドをデンシトメトリーで定量した。
【００９１】
Ｄ．角化エンベロープの生成
角化エンベロープの生成率を測定するため、細胞を、４８ｈｒかけて、35Ｓ−メチオニン／システイン（２μＣｉ／ｍＬ；ｔｒａｎｓ35Ｓ標識、ICN Biomedical, Inc.、米国カリフォルニア州アービン）で標識し、この４８ｈｒのうち最後の２ｈｒは５μＭのイオノマイシンとともにインキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＢＰＳ）で洗浄し、次いで、２％ＳＤＳ１．１ｍＬ中に収穫した。得られたものを小分けしてタンパク質測定用に保管した。残りの細胞溶解物（１ｍＬ）を短時間（１０秒間）超音波処理した。次に、４％ＳＤＳ／４ｍＭＤＴＴ１ｍＬを添加し、得られた混合物を、＞９５℃に３０分間で加熱した。得られた混合物を放冷し、ＳＤＳ／ＤＴＴに不溶性の物質をフィルターディスク上に集め、０．５％ＳＤＳ／０．５％ＤＴＴで洗浄し、次いで、シンチレーションスクトロホトメトリーで定量した。35Ｓの標識を付けていた４８ｈｒ中に合成された全タンパク質を測定するため、保管中の小分けした細胞溶解物（加熱する前に採取）を、同容積の２％ウシ血清アルブシン（ＢＳＡ）および１ｍＬの１０％（重量／容積）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用い、氷上で３０分間沈降させ、次に沈降した35Ｓ標識化タンパク質をフィルター（細孔の大きさＰ８、Fisher Scientific、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）上に集め、５％ＴＣＡで洗浄し、次いでシンチレーションスペクトロスコピーで定量した。全タンパク質は通常の方法で測定した。
【００９２】
Ｅ．ＤＮＡの合成
培地１ｍＬ当たり２μＣｉの3Ｈ−チシジン（１１０Ｃｉ／ｍｍｏｌのメチル−１’，２’−3Ｈ−チミジン（Amersham Laboratories,米国イリノイ州アーリントンハイツ））とともに１６時間インキュベートした後、細胞ＤＮＡ中に取り込まれた3Ｈ−チミジンの量を測定することによって、ＤＮＡの合成率を求めた。次に、これらの細胞を１Ｎ  ＮａＯＨで可溶化し、ついで、洗浄されたＴＣＡ沈降物の放射能を、シンチレーションスペクトロスコピーによって定量した。
【００９３】
Ｆ．トランスフェクション
角質細胞を次のようにしてトランスフェクトした。すなわち、初代（primary）角質細胞を、６ウェルの多重ウェルプレートを通過させ、１〜２日後にトランスフェクトして、そのトランスフェクトした日に２０〜４０％のコンフリーエンス（confluence）を得た。インボルクリンプロモーター構造体（construct）（１μｇ）、０．１μｇのＲＳＶ−β−ｇａｌおよび７．５μｇのポリブリン（ジヘキサブロミド、Aldrich Chemistry Company,Inc.、米国ウィスコンシン州シルウォーキー）を、培地（０．０３ｍＭＣａ++を含有するＫＧＭ）に、最終容積０．３５ｍＬで添加し、次いで角質細胞を、５ｈｒ、各ｈｒ緩やかに振盪しながら３７℃でインキュベートした。次に、細胞を、ＣＭＦＰＢＳですすぎ、次に、培地に１０％グリセリンを入れて、３分間室温でインキュベートした。ＣＭＦＰＢＳで２回すすいだ後、角質細胞を、０．０３ｍＭＣａ++を含有するＫＧＭ２ｍＬとともに一夜インキュベートした。次に日に、角質細胞質を、媒体（エタノール）の試験化合物１０ｍＭを含有する新しい培地（０．０３ｍＭまたは１．２ｍＭのＣａ++）で処理した。細胞を２５０μＬの細胞溶解緩衝液ですすいで収穫した。その溶解物を、１０，０００×ｇ（４℃）で２分間、遠心分離し、次に、上澄液２０μＬを、ルシフェラーゼの基質とβ−ガラクトシダーゼの基質で検定した。β−ガラクトシダーゼの活性を利用してデータを正規化して、トランスフェクトの無効（transfection inefficiency）について修正した。
【００９４】
実施例１２
この実施例は、ＬＸＲαのオキシステロール活性化剤が、インボルクリンｍＲＮＡとトランスグルタミナーゼｍＲＮＡのレベルで示される角質細胞の分化を刺激するが、コレステロール、メバロネートおよび２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールは有意な効果を示さなかったことを実証する。
【００９５】
低カルシウム（０．０３ｍＭ）中に維持し、次いで、媒体のみ（＜０．１％エタノール）、または２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）、コレステロール（１０μＭ）もしくはメバロネート（５００μＭ）を（個々に）含有する媒体の存在下、２４ｈｒインキュベートした角質細胞について、ノーザンブロット分析を実施した。インボルクリン（「ＩＮＶ」）とトランスグルタミナーゼ（「ＴＧアーゼ」）のｍＲＮＡレベルを図１４ａの棒グラフに示す。なお、ＩＮＶが白い棒で示しそしてＴＧアーゼは影付き棒グラフで示し両方に誤差限界を示してある。図１４ａは、２５−ヒドロキシコレステロール（「２５−ＯＨ」）と２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（「２２Ｒ−ＯＨ」）が、媒体のみの場合と比べて、ｍＲＮＡのレベルが約２倍であったことを示している。対照的に、コレステロール（「ｃｈｏｌ」）もメバロネート（「ｍｅｖ」）も全く効果がなかった。
【００９６】
別の比較として、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールと２２（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（「２２Ｓ−ＯＨ」）を同じ条件下で試験して、その結果を、図１４ａと同じ棒の表示を用いて、図１４ｂの棒グラフに示してある。２２Ｓ−ＯＨのデータには、ＩＮＶまたはＴＧアーゼのｍＲＮＡに対する効果が全く観察されなかったが、２２Ｒ−ＯＨのデータには、図１４ａで観察されたデータが繰り返された。
【００９７】
次に、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールの投与量依存性を、０．０１μＭ、１．０μＭ、１０．０μＭおよび１５．０μＭの投与量を使用して測定した。その結果を、図１４ａと１４ｂと同じ、ＩＮＶとＴＧアーゼのｍＲＮＡのバーの指標を用いて、図１５の棒グラフに示してある。このプロットは、最大効果が１０〜１５μＭの投与量で見られ、そして最大効果の１／２の効果が約５μＭに見られたことを示している。
【００９８】
実施例１３
１．２ｍＭの細胞外カルシウム濃度が角質細胞の分化を刺激することは周知である。この実施例は、高濃度のカルシウムの存在下、ＬＸＲαのオキシステロール活性剤が角質細胞の分化を、一層、刺激することを実証する。
【００９９】
カルシウム濃度を１．２ｍＭまで上げ、ならびに媒体のみ、媒体プラス２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）またはコレステロール（１０μＭ）で試験したこと除いて、実施例１２の実験を繰り返した。試験結果を、上記の諸図と同じバーの指標を使って図１６の棒グラフに示す。図１６の棒グラフは、２５−ヒドロキシコレステロールと２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールの両者が、ＩＮＶとＴＧアーゼの両者のｍＲＮＡのレベルを、ＩＮＶについては対照の約２．３〜２．４倍まで、そしてＴＧアーゼについては対照の約２．５〜２．９倍まで誘発したが、コレステロールはどちらにも効果が全くなかったことを示している。β−アクチンｍＲＮＡのレベルの測定を行ったが、その結果（図示していない）は、そのレベルが、低カルシウム（０．０３ｍＭ）または高カルシウム（１．２ｍＭ）の条件下でのオキシステロールによる処理で影響を受けなかったことを示した。
【０１００】
実施例１４
この実施例は、ＬＸＲのオキシステロール活性剤がインボルクソンとトランスグルタミナーゼのタンパク質のレベルを刺激するが、コレステロールは刺激しないことを実証する。
【０１０１】
低カルシウム（０．０３ｍＭ）の存在下でインキュベートし、そして試験化合物で２４ｈｒ処理した角質細胞中の、インボルクソンとトランスグルタミナーゼのタンパク質のレベルを測定した。試験結果を図１７ａの棒グラフに示す。図１７ａで、試験化合物を、図１４〜１６と同じバーの指標を用いて、媒体のみ（対照）およびコレステロールを比較した。プロットは、２５−ヒドロキシコレステロールが、対照と比べて、約１．７倍のレベルのＩＮＶを誘発しかつ約１．６倍のＴＧアーゼタンパク質を誘発し、そして２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールが、対照と比べて、約３．２倍のレベルのＩＮＶを誘発しかつ約２．８倍のＴＧアーゼ蛋白質を誘発したことを示している。コレステロールは全く効果がなかった。
【０１０２】
高カルシウム条件（１．２ｍＭ）で実施した結果を、図１７ｂ（２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールのみの場合、３種の投与量レベル）および図１７ｃ（２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２５−ヒドロキシコレステロールおよびコレステロールの場合、投与量はすべて１５μＭ）に示す。２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールは、５μＭという低い濃度で、ＴＧアーゼ蛋白質のレベルが２．１倍に増大したことを示した（図１７ｂ）。ＩＮＶタンパク質レベルは、２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールの場合、濃度１５μＭで２．８倍に増大し、そして２５−ヒドロキシコレステロールの場合、やはり濃度１５μＭで３．２倍に増大し、一方コレステロールの場合、ほとんど増加しなかった（図１７ｃ）。
【０１０３】
実施例１５
角質細胞の分化のその外の尺度は、角化エンベロープの生成率である。上記材料と方法の章で述べた手順を使用して、低カルシウム（０．０３ｍＭ）および高カルシウム（１．２ｍＭ）の両条件下４８ｈｒ処理し、２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）と２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）を、コレステロール（１０μＭ）および媒体のみ（対照）と比較した。試験結果を、図１８ａ（低カルシウム）および図１８ｂ（高カルシウム）の棒グラフに示す。低カルシウムの試験結果（図１８ａ）は、角化エンベロープ（ＣＥ）の生成が、２５−ヒドロキシコレステロールで処理した場合、１．６倍に増大し、そして２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールで処理した場合、１．３倍に増大したことを示した。高カルシウムの試験結果（図１８ｂ）は、ＣＥの生成が、２５−ヒドロキシコレステロールで処理した場合、１．７５倍に増大し、そして２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールで処理した場合、２．１倍に増大したことを示した。コレステロール自体は、低カルシウム条件または高カルシウム条件のいずれかの場合もＣＥは全く増大しなかった。
【０１０４】
実施例１６
この実施例は、ＬＸＲαのオキシステロール活性剤が、角質細胞内のＤＮＡ合成率で示される角質細胞の増殖を抑制することを実証する。オキシステロール類が、胸腺細胞やリンパ球のような他の細胞型の細胞増殖の強力な阻害剤であることは知られている。
【０１０５】
前記材料と方法の項に記載の手順を使用して、低カルシウム（０．０３ｍＭ）条件下２４ｈｒ処理して、２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）と２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）を、コレステロール（１０μＭ）と媒体のみ（対照）と比較した。その試験結果は図１９の棒グラフに示してある。その棒グラフは、ＤＮＡの合成を測定した１６ｈｒ中に、２５−ヒドロキシコレステロールが、ＤＮＡの合成率を対照の５０％まで低下させ、そして２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールが対照の４２％まで低下させたことを示している。対照的に、コレステロールは、ＤＮＡの合成をわずかであるが、有意に増大させた（対照の１１７％）。
【０１０６】
実施例１７
この実施例は、オキシステロール類がＩＮＶおよびＴＧアーゼのｍＲＮＡのレベルを増大させることが、これらオキシステロール類がコレステロール合成反応の律速酵素でありかつイソプレノイド類のレベルを減少させる酵素ＨＭＧＣｏＡリダクターゼを阻害するという事実と関連があるのかどうかについて探求する。この問題に答えるため、上記実施例１２に記載したのと類似の試験を、ＨＭＧＣｏＡリダクターゼの最も早期の産物であるメバロネートの存在下および非存在下で実施した。
【０１０７】
これらの試験では、２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）単独またはメバロネート（μＭ）の存在下２５−ヒドロキシコレステロール（１０μＭ）で、およびメバロネート単独（１０μＭ）で、それぞれ２４ｈｒ処理した角質細胞のＩＮＶとＴＧアーゼのｍＲＮＡのレベルを測定した。メバロネート単独で処理した場合は、ＩＮＶとＴＧアーゼのｍＲＮＡのレベルに対し全く効果がなかった。２５−ヒドロキシコレステロール単独で、およびメバロネートの存在下２５−ヒドロキシコレステロールで処理した場合、ＩＮＶとＴＧアーゼのｍＲＮＡのレベルは２倍に増大した。結論は、ＨＭＧＣｏＡリダクターゼの阻害が、オキシステロール類によって起こるＩＮＶとＴＧアーゼのｍＲＮＡのレベルの増大の根拠ではないということである。
【０１０８】
以上実施例は、本来、例示を目的として提供している。この明細書に記載されているプロトコルの濃度、操作条件、材料、手順のステップなどのパラメータは本発明の精神と範囲を逸脱することなく、各種の方式で、さらに改変または置換できることは、当業技術者には容易にわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】６種の化合物の皮膚経由水損失（ＴＥＷＬ）の試験結果を示す棒グラフである。これら化合物のうち２種類は本発明の範囲内に入っている。
【図２】５種の追加の化合物のＴＥＷＬの試験結果を示す棒グラフである。なお、これら化合物のうち３種類は本発明の範囲内に入っている。
【図３】７種の追加の化合物のＴＥＷＬの試験結果を示す棒グラフである。なお、これら化合物のうち１種類は本発明の範囲内に入っている。
【図４ａ】本発明の範囲内に入る２種の化合物についてのＴＥＷＬ対有効成分の濃度のグラフである。
【図４ｂ】本発明の範囲内に入る第三のの化合物についてのＴＥＷＬ対有効成分の濃度のグラフである。
【図４ｃ】本発明の範囲内に入る第四と第五の化合物についてのＴＥＷＬ対有効成分の濃度のグラフである。
【図５ａ】本発明の範囲内に入っている２種の化合物を、最適下限のレベル（suboptimal level）で、個々におよび組み合わせて用いた場合のＴＥＷＬ試験結果を示す棒グラフである。
【図５ｂ】図５ａと同じ２種の化合物を、ただし最適のレベルで、個々におよび組み合わせて用いた場合のＴＥＷＬ試験結果を示す棒グラフである。
【図６ａ】クロフィブレートで処理した細胞培養物中のインボルクリンｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図６ｂ】クロフィブレートで処理した細胞培養物中のトランスグルタミナーゼｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図７ａ】クロフィブレートで処理した細胞培養物中のインボルクリンｍＲＮＡのレベルを示す別の棒グラフである。
【図７ｂ】クロフィブレートで処理した細胞培養物中のトランスグルタミナーゼｍＲＮＡのレベルを示す別の棒グラフである。図７ａと７ｂに示す培地中のカルシウムイオンのレベルは、図６ａと６ｂの場合より高い。
【図８】異なる投与量のクロフィブレートで処理した細胞培養物中のインボルクリンｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図９ａ】異なる投与量のクロフィブレートで処理した細胞培養物中のインボルクリンタンパク質のレベルを示す棒グラフである。
【図９ｂ】カルシウム含有量が一層高い培地から得た類似のデータを示す別の棒グラフである。
【図１０】異なる投与量のファルネソールで処理した細胞培養物中のインボルクリンタンパク質のレベルを示す棒グラフである。
【図１１】異なる投与量の幼若ホルモンＩＩＩで処理した細胞培養物中のインボルクリンタンパク質のレベルを示す棒グラフである。
【図１２】異なる投与量のファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩで処理した細胞培養物中の角化エンベロープ生成率の増大のレベルを示す棒グラフである。
【図１３】異なる投与量のファルネソールと幼若ホルモンＩＩＩで処理した細胞培養物中のＤＮＡ含有量の減少する程度を示す棒グラフである。
【図１４ａ】２種のＬＸＲα活性化剤および２種の類縁化合物で処理した（比較のための）細胞培養物中のインボルクリンｍＲＮＡおよびトランスグルタミナーゼｍＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図１４ｂ】他の類縁化合物に対する類似のデータおよび比較を示す棒グラフである。
【図１５】インボルクリンｍＲＮＡとトランスグルタミナーゼｍＲＮＡのレベルのＬＸＲα活性化剤投与量に対する依存性を示す棒グラフである。
【図１６】カルシウム含有量が一層高い細胞培養物を使用することを除いて、図１４ａと１４ｂの場合と類似の試験結果を示す棒グラフである。
【図１７ａ】２種のＬＸＲα活性化剤で処理した細胞培養物および比較のためコレステロールで処理した一つの細胞培養物中のインボルクリンタンパク質とトランスグルタミナーゼタンパク質のレベルを示す棒グラフである。
【図１７ｂ】トランスグルタミナーゼタンパク質のレベルの、高カルシウム濃度での上記ＬＸＲα活性化剤の１種の投与量に対する依存性を示す棒グラフである。
【図１７ｃ】２種のＬＸＲα活性化剤で処理した細胞培養物、および高カルシウム濃度にてコレステロールで処理した細胞培養物中のインボルクリンタンパク質のレベルを示す棒グラフである。
【図１８ａ】２種のＬＸＲα活性化剤で処理した低カルシウム細胞培養物および比較のためコレステロールで処理した低カルシウム細胞培養物中の角化エンベロープ生成を示す棒グラフである。
【図１８ｂ】高カルシウム細胞培養物を用いた類似試験の結果を示す棒グラフである。
【図１９】２種のＬＸＲα活性化剤で処理した低カルシウム細胞培養物および比較のためコレステロールで処理した低カルシウム細胞培養物におけるＤＮＡ合成速度を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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