(57)【要約】【課題】新規な蛍光試薬を提供することを目的とする。【解決手段】蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬は、二本鎖DNAと接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖DNAの塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖DNAを高感度でかつ選択的に検出することができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、
二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、
蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬。
【請求項２】
蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基が、蛍光試薬であるα−アミノ酸残基からなるペプチド分子において、2から10個のα−アミノ酸残基おきに存在する、請求項１の蛍光試薬。
【請求項３】
蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基が、2個のα−アミノ酸残基おきに存在する、請求項２の蛍光試薬。
【請求項４】
全α−アミノ酸残基数が4から40個である、請求項１から３のいずれかの蛍光試薬。
【請求項５】
全α−アミノ酸残基数が4から25個である、請求項４の蛍光試薬。
【請求項６】
蛍光試薬が、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩である、請求項１から５のいずれかの蛍光試薬。
【化１】
2005291703.tif 000014
（式中、Xは蛍光性インターカレート基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す。但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光性インターカレート基であってもよく、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
【請求項７】
式Ｉにおいて、Yが-A-W-（Aは炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す）である、請求項６の蛍光試薬。
【請求項８】
式Ｉにおいて、Zが-A-W-H（AおよびWは請求項７の定義と同じ）である、請求項６または７の蛍光試薬。
【請求項９】
蛍光性インターカレート基が、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基、置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基または置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基である請求項１から８のいずれかの蛍光試薬。
【請求項１０】
蛍光試薬が、下記式ＩＩで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩である、請求項１から９のいずれかの蛍光試薬。
【化２】
2005291703.tif 000015
【請求項１１】
検体中の二本鎖核酸を検出する方法であって、
二本鎖核酸を含むことが疑われる検体に請求項１から１０のいずれかの蛍光試薬を接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強により、検体中の二本鎖核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光試薬およびそれを用いた二本鎖核酸の検出方法に関する。更に詳細には、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬、並びに該蛍光試薬を用いた二本鎖核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
DNA塩基対間に平行挿入（インターカレート）する化合物は、インターカレーターと呼ばれている。このインターカレート部位を分子内に複数個有するポリインターカレーターは新しい薬剤の開発や優れたDNA蛍光染色剤の観点から研究がなされている（Wakelin,L.P.G., Med. Res. Rev., 1986, 6, 275-340; Glazer,A.N.et al., Nature, 1992, 359, 859-861）。しかしながら、通常、研究はビスインターカレーターに限られており、そのDNAに対する結合定数もそれほど向上されていない（Wakelin,L.P.G., Med. Res. Rev., 1986, 6, 275-340; Wirth,M.et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939）。これは、ビスインターカレーターの二つのインターカレート部位がDNAに立体的に無理がないようにインターカレートされるようにリンカー鎖を配置させるような分子設計が難しいためである。この困難さは、二つ以上のポリインターカレーターにおいてはもっと顕著である（Wirth,M.et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 93-939）。
【０００３】
エチジウムホモダイマーやアクリジンホモダイマーなどは蛍光染色試薬としてのビスインターカレーターの成功例である（Markovis,J.et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264; Le Pecq,J.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 2915-2919）。DNAに効果的に結合するビス体以上のポリインターカレーターの例としては、アントラキノン部分と二つのアクリジン部位からなるトリスインターカレターなどが知られている（Takenaka,S.et al., Supramol. Chem., 1993, 2, 41-46; Lokey.R.S.,et al., J. Am. Chem. Sic., 1997, 119, 7202-7210）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかながら、これらのポリインターカレーターの場合にも、DNAに対する結合能は十分ではなく、また蛍光染色試薬としての蛍光強度も十分に満足のいくものではない。
通常、ポリインターカレーターは水溶液中では、分子内スタッキング構造を取っており、そのために蛍光が消光される。従って、ポリインターカレーターがDNA二重らせんにポリインターカレートすることにより、分子内消光から解消され蛍光の復帰が起こると期待される。特に、ポリイターカレーターがDNA二重らせんに結合すると蛍光増強を示すものであれば、更に効果的な蛍光増大を示す蛍光染色試薬が得られると期待される。しかしながら、通常、ポリインターカレーターにおける分子内スタッキングは、そのDNA二重らせんへの結合能の低下を引き起こす。従って、ポリインターカレーターの分子内設計が、効果的な蛍光増大を示す蛍光染色試薬を得るためには極めて重要である。
従って、本発明の目的は、蛍光試薬が二本鎖核酸と接触すると該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間に効果的にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度に検出できる、蛍光試薬を提供することにある。
更に本発明の他の目的は、上記蛍光試薬を用いた二本鎖DNAの検出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記した目的を達成することのできる蛍光試薬を得ることを目的として鋭意研究した結果、リジンなどのα−アミノ酸残基からなるペプチドに適当な間隔で蛍光性インターカレート基を置換させたものが、上記目的を極めて有効に達成できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
従って、本発明は、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光性インターカレート基を含有する二本鎖核酸検出用蛍光試薬に関する。
更に本発明の目的は、検体中の二本鎖核酸を検出する方法であって、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体に上記蛍光試薬を接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強により、検体中の二本鎖核酸を検出する方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光試薬は、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基を2個以上含むα−アミノ酸残基からなるペプチドの蛍光試薬であって、二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を検出することのできる、蛍光試薬である。
本発明の蛍光試薬としては、蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸残基が、蛍光試薬であるα−アミノ酸残基からなるペプチド分子において、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに存在するものが好ましい。即ち、蛍光性インターカレート基は、2から10個、更には2から5個、特に2個のα−アミノ酸残基おきに置換されているのが好ましい。この場合には、蛍光性インターカレート基が、二本鎖核酸の塩基対間に効果的にインターカレートして、蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が効果的に解消して蛍光強度が著しく増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で検出することができる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドは、全α−アミノ酸残基数が、4から40個、特に4から25個であるペプチドが好ましい。更には全α−アミノ酸残基数が4から16個、特には4から10個であるペプチドが好ましい。
【０００８】
本発明において、蛍光性インターカレート基としては、蛍光を発することができかつ二本鎖DNAもしくは二本鎖RNAの塩基対の間に平行して挿入し得るものであればいずれの基であってもよい。かかる蛍光性インターカレータ基としては、例えば、置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基、置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基、置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基などが挙げられる。
【０００９】
ここで言う置換基としては、例えば、塩素、フッ素、臭素などのハロゲン原子；メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基; メトキシ、エトキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどの炭素原子数1から6のアルコキシ基；ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；アセチルオキシ、ブタノイルオキシ、ペンタノイルオキシ、ヘキサノイルオキシなどの炭素原子数2から7のアシルオキシ基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアルキル基が1つもしくは2つ置換されていてもよい炭素原子数1から6のアミノアルキル基などが挙げられる。これらの置換基は、アクリジン骨格、エチジウム骨格、チアゾールオレンジ骨格またはオキサゾールイエロー骨格のいずれの位置に置換されていてもよく、また2つ以上の複数の置換基がこれらの骨格に置換されていてもよい。また、アクリジン骨格、エチジウム骨格、チアゾールオレンジ骨格またはオキサゾールイエロー骨格には、本発明の蛍光試薬であるペプチドを構成するα−アミノ酸残基に結合するための官能基を有していてもよく、このような官能基としては、例えば、-CO-、-NH-、-SO2-、-PO2-、-S-、-N(NH)NH-、これらの官能基が炭素原子数1から6のアルキレン基の末端もしくは側鎖に結合した基などが挙げられる。
【００１０】
上記した置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基、置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基、置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基、置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基の具体的な例として以下のものが挙げられる。
【００１１】
置換基を有していてもよいアクリジン骨格を有する基
【化３】
2005291703.tif 000002
置換基を有していてもよいエチジウム骨格を有する基
【化４】
2005291703.tif 000003
置換基を有していてもよいチアゾールオレンジ骨格を有する基
【化５】
2005291703.tif 000004
置換基を有していてもよいオキサゾールイエロー骨格を有する基
【化６】
2005291703.tif 000005
【００１２】
より具体的には、本発明の蛍光試薬は、下記式Ｉで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が好ましい。
【化７】
2005291703.tif 000006
（式中、Xは蛍光性インターカレート基を表し、Yはα-アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zはα-アミノ酸を構成する1価の基を表し、ｎは1から8の整数を表す但し、式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるもしくは同じ蛍光性インターカレート基であってもよく、式IにおけるそれぞれのYおよびZも、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい）。
【００１３】
式Ｉにおいて、Xは上記した蛍光性インターカレート基を表す。式IにおけるそれぞれのXは、お互いに異なるインターカレート基であっても同じインターカレート基であってもよい。Yはα-アミノ酸を構成する2価の基（結合手を2つ持つ）を表し、Zはα−アミノ酸を構成する1価の基（結合手を1つ持つ）を表す。即ち、Yはα−アミノ酸から-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成する2価の基を表し、Zは１価の基を表す。具体的には、Yは-A-W-で表わされる基であり、ここで、Aはメチレン、エチレン、プロピレン、メチルメチレンなどの炭素原子数1から6の直鎖もしくは分岐アルキレン基を表し、Wは単結合、NH、CO、CONH、NHCO、O、SまたはHNC(NH)NHを表す。ZはA-W-Hで表される基である。これらのYおよびZは、α−アミノ酸である、例えばアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどから-CH(NH2)COOHを除いた残りの該α−アミノ酸を構成するそれぞれ2価の基あるいは1価の基を表す。式IにおけるそれぞれのYおよびZは、お互いに異なるものであっても同じものであってもよい。式Ｉのペプチドにおいて、ｎは1から8の整数を表す。好ましくはnは1から5、特に好ましくは、nは1から3の整数である。
【００１４】
本発明の蛍光試薬であるペプチド並びに式Ｉのペプチドは、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩であってもよい。N末端が置換された誘導体としては、例えば、ホルミル、アセチル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルなどの炭素原子数1から7のアシル基；メトキシカルボニル、ブトキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルなどの炭素原子数2から7のアルコキシカルボニル基等がN末端のアミノ基に置換された誘導体などが挙げられる。C末端が置換された誘導体としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、トリフルオロメチルなどのハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数1から6のアルキル基；アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、メチルアミノメチル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノプロピル、ジメチルアミノブチルなどの炭素原子数1から6のアミノアルキル基；アミノ基等がC末端のカルボニル基に置換された誘導体などが挙げられる。本発明の蛍光試薬であるペプチドの塩並びに式Ｉのペプチドの塩あるいはそれらのペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体の塩としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの有機酸；塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸等との酸付加塩が挙げられる。また、本発明の蛍光試薬であるペプチドカルボキシル基並びに式Ｉのペプチドのカルボキシル基とのナトリウム塩、カリウム塩なども挙げられる。
【００１５】
本発明の式Ｉのペプチドの特に好ましい例としては、以下の式ＩＩで表されるペプチド、そのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩が挙げられる。
【化８】
2005291703.tif 000007
【００１６】
本発明の蛍光試薬であるペプチドの合成は、α−アミノ酸および蛍光性インターカレート基が置換されたα−アミノ酸の両者のアミノ基保護誘導体もしくはカルボキシ保護誘導体を、合成しようとするペプチドに対応させて、順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。これらの合成法はそれ自体周知であり、周知の合成法を利用できる。あるいはα−アミノ酸の保護誘導体を反応させてペプチドを合成した後に、蛍光性インターカレート基を導入する反応を行って、本発明の蛍光試薬であるペプチドを合成することもできる。これらの合成に用いるアミノ基もしくはカルボキシ基の保護基としては、上記したペプチドのN末端もしくはC末端が置換された誘導体について例示した官能基が挙げられる。
【００１７】
本発明の式Iのペプチドは、下記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体と下記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体とを用いて、周知のペプチド合成反応を行うことによって合成することができる。
【００１８】
【化９】
2005291703.tif 000008
ペプチド合成は、上記したと同様に、両者の保護誘導体を順次ペプチド結合により連結して行うこともでき、また周知の固相法もしくは液相法により合成することもでき、ペプチド合成機により合成することもできる。上記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸および上記式IVのα-アミノ酸のアミノ基もしくはカルボニル基保護誘導体としては、上記した保護基で保護されたものが挙げられる。上記式IIIの蛍光性インターカレート基置換α-アミノ酸は、下記式Vで表されるα-アミノ酸と下記式VIで表される蛍光性インターカレーター誘導体(式VIにおいてDは、ハロゲン原子などの反応性基を表す)とを反応させることにより得ることができる。
【００１９】
【化１０】
2005291703.tif 000009
式IVまたはVのα-アミノ酸としては、上記したアラニン、リシン、ノルリシン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、システインなどが挙げられる。
かくして式Iのペプチドを得ることができる。式IのペプチドのN末端もしくはC末端が置換されたその誘導体またはそれらの塩は、式Iのペプチドの合成の段階で得ることもでき、また式Iのペプチドを合成した後に、それ自体周知の方法で得ることもできる。
式Iで表されるペプチド以外の本発明の蛍光試薬であるペプチドも、式Iのペプチドと同様に合成することができる。
【００２０】
本発明の蛍光試薬は、二本鎖DNA、二本鎖RNAなどの二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で選択的に検出することができる。
本発明の蛍光試薬を用いて、二本鎖核酸を含むことが疑われる検体中の二本鎖核酸を検出するには、該蛍光試薬を検体と接触させて、該蛍光試薬の蛍光強度の増強度を測定することにより検出できる。蛍光試薬と検体を接触させる際の具体的条件、蛍光強度の具体的方法等は、それ自体周知の方法を採用することができる。本発明の蛍光試薬は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイでのDNA検索に適用できる。即ち、サンプルDNAをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに固定されたプローブNDAに反応させて、二本鎖DNA形成させ、この二本鎖DNAを本発明の蛍光試薬で高感度でかつ選択的に検出することができる。従って、本発明の蛍光試薬によれば、従来必要とされたサンプルDNAごとにラベル化試薬でラベル化する必要がなくなり、ラベル化剤の導入による二本鎖DNA形成能の低下が引き起こされたり、遺伝子の変異や多型の診断に誤った結果を導くこともない。
【００２１】
【実施例】
以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
テトラキスアクリジニルペプチドの合成
以下に示す、メトキシ基と塩素原子が置換されたアクリジン骨格がインターカレータ基として置換されたリシン残基を含むテトラキスアクリジニルペプチド(TAP)を固相合成法により合成した。
【化１１】
2005291703.tif 000010
【００２３】
1. Fmoc-Lys(Acr)-OHの合成
【化１２】
2005291703.tif 000011
a)方法
50mlのビーカーにフェノール30gを入れ80℃まで加熱溶解させた。これに6-クロロ-2-メトキシ-9-フェノキシアクリジン4.54g(13.5mmol)を加え完全に溶解させた。その後、55〜65℃で、Fmoc-Lys-OH 4.42g(12.0mmol)を加えて2時間攪拌した。それからしばらく放冷し、300mlのエーテルを攪拌しながら注いだ。得られた沈殿物を吸引濾過し、減圧乾燥させた。
【００２４】
b)結果
性状：黄色固体
収量：7.57g(収率：92%)
1H-NMR、MALDI TOF MASS（質量分析）により同定した結果、目的化合物の分子量610.11に相当するピークが610.80に検出された。
【００２５】
2.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-樹脂の合成（TAPの伸長反応）
a)方法
リアクションベッセルにFmoc-NH SAL 樹脂 200mgを入れ、カートリッジ1、4、7、10にFmoc-Lys(Acr)-OH 0.33gを入れ、カートリッジ2、3、5、6、8、9にFmoc-Lys(Boc)-OHを入れた。後は、PE Applied Biosystems社の431Aペプチドシンセサイザーにて合成を行った。Fmoc法でN末端はアセチル化した。
b)結果
性状：黄色固体
収量：0.5003g
【００２６】
3.Ac-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-(Lys(Boc))2-Lys(Acr)-樹脂のレジンからの切り出し及び側鎖の脱保護
a)方法
50mlのナス型フラスコに上記の2の実験操作で合成したレジン0.50gを入れ、これにm-クレゾール0.10ml、チオアニソール0.60ml、トリフルオロ酢酸4.3mlを加えて室温で1時間攪拌した。その後、TFAを減圧留去し、氷浴下でエーテル20mlを加えた。超音波照射後、しばらく放置し上澄み液を取り除いた。それから酢酸エチル20mlを加えて超音波照射後、しばらく放置した。吸引ろ過しエーテルで洗浄した。その後、減圧乾燥させた。
b)結果
性状：黄色固体であり、極めて高い水溶性を示した。
収量：0.3181g
【００２７】
4.HPLCによる純度チェック及び精製
TAPの純度チェックを以下の条件下で行った。
検出波長：210nmカラム：Inertsil ODS
試料注入溶媒：超純水  流速：1ml/min
溶離液A:0.1%TFA水溶液
溶離液B:70%アセトニトリル/0.1%TFA溶液
グラジエント条件
【表１】
2005291703.tif 000012
TAPのHPLCチャートを図１に示した。同定はTOF MASSにより行った。得られたTOF MASSのデータを図２に示した。TOF MASSの結果、目的化合物の分子量2307.51に相当するピークが2309.03に検出された。
【００２８】
参考例１
モノマー体の合成
下記反応スキームで表される方法に従って、モノマー体であるAc-Lys(Acr)-OCH3 を合成した。
【化１３】
2005291703.tif 000013
a)方法
20mlのビーカー中で、フェノール5.03gを80℃まで加熱し、これにフェノキシアクリジン0.7567g(2.25mmol)を加え完全に溶解させた。これを60℃まで冷却し、これに少量ずつAc-Lys-OH 0.3766g(2.00mmol)を40分かけて完全に溶解させた。それから1時間55〜60℃で攪拌した。しばらく放冷した後、エーテル50mlを攪拌しながら注いだ。得られた黄色沈殿物を吸引ろ過し、減圧乾燥させた。その粗生成物0.8757gを200mlのナス型フラスコに入れ、これに無水メタノール100mlを加えた。この懸濁溶液を攪拌しながら、乾燥塩化水素ガスを吹き込んだ。溶液が透明になった時点で、氷浴中で冷却し、さらに飽和するまで塩化水素ガスを吹き込んだ。その後、室温で4時間攪拌した。それから、溶媒をエバポレーターで減圧留去し、真空ポンプで減圧乾燥させた。その後、無水メタノール-無水エーテルで、再結晶した。得られた黄色沈殿物は、吸引ろ過し減圧乾燥させた。
【００２９】
b)結果
性状：黄色沈殿物
収量：0.6329g（収量：74%）
【００３０】
実施例２
テトラキスアクリジニルペプチドの物性測定
a) 実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドの吸収スペクトルは、参考例１で合成されたそのモノマー体よりも16％の淡色効果を示し、蛍光がほとんど見られないことから分子内のアクリジン同士がスタッキングしているものと考えられた。また、テトラキスアクリジニルペプチドとモノマー体の円二色性（CD）スペクトルを以下の条件で測定した。
テトラキスアクリジニルペプチド＝モノマー体＝ 6.5μM
緩衝液：10mM MES、1mM EDTA(pH6.25)、0.2M NaCl、25℃
得られたCDスペクトルを図３に示した。モノマー体のCDスペクトルは何もシグナルを示さなかったのに対し、テトラキスアクリジニルペプチドは、260nmと290 nmにそれぞれに負と正の大きなコットン効果を示した。この領域は、9−アミノアクリジンの長軸方向の電子遷移に対応することを考えれば、テトラキスアクリジニルペプチドに存在する4つのアクリジン基同士がスタッキングすることによりらせん状構造を有しているものと考えられた。このときのらせん構造を図４に模式的に示した。
【００３１】
b) テトラキスアクリジニルペプチドに各種量の[poly(dA-dT)]2を添加して、吸収スペクトルを測定した。測定条件は以下の通りであった。
テトラキスアクリジニルペプチド＝0.7μM
モノマー体＝ 0〜3.68μM
緩衝液：10mM MES、1mM EDTA(pH6.25)、0.2M NaCl、25℃
得られた吸収スペクトルを図５に示した。図５から分かるように、[poly(dA-dT)]2添加に伴って大きな淡色効果と若干のレッドシフトが見られた。この変化は等吸収点をもって変化したので、単一様式によりテトラキスアクリジニルペプチドは、DNA二重らせんに結合していると考えられた。
【００３２】
c) そこで、この変化を利用してScatchard解析を行なって結合定数（K）と座位数（n）を算出した。仔牛胸腺DNAに対して0.2M NaCl 存在下においてさえK=2.0×108 M-1 (n=5)とモノマー体に比べ1000倍の結合能を有していた。また、 [poly(dG-dC)]2に対してもテトラキスアクリジニルペプチドの結合定数を算出すると[poly(dA-dT)]2と同程度の極めて強い結合能を有していた。各配列に対するテトラキスアクリジニルペプチドの結合能の違いは見られなかった。テトラキスアクリジニルペプチドの結合定数は、従来のDNA高感度検出試薬であるエチジウムホモダイマー（EthD）（Markovis,J.et al., Anal. Biochem., 1979, 94, 259-264）やアクリジンホモダイマー（AcrD）（Le Pecq,J-B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1975,72,2915-2919）よりもそれぞれ10倍、20倍強いものであった。プラスミドDNA溶液の粘度に与えるテトラキスアクリジニルペプチドの添加効果から既知の手法に従ってテトラキスアクリジニルペプチドの結合によるDNA二重らせんの巻き戻し角を算出した。その結果、64゜とモノマー体の4倍の値となった。これらのことはテトラキスアクリジニルペプチドが効果的にテトラインターカレートしていることを示している。
このようなテトラキスアクリジニルペプチドの効率の良いDNA二重らせんへのテトラインターカレートは、溶液中で見られたテトラキスアクリジニルペプチドのらせん構造が、DNA二重らせんにうまくフィットしていることと、テトラキスアクリジニルペプチドの2つのアクリジン基間に存在する2つのリジン側鎖が、DNA溝の両側に存在するリン酸とうまく相互作用しているためと予想された。
【００３３】
d) テトラキスアクリジニルペプチド（1）の溶液に、[poly(dA-dT)]2（二本鎖DNA）またはpolydT（一本鎖DNA）を加えたときの蛍光変化を調べた。対照としてアクリジンホモダイマー（AcrD）についても調べた。測定条件は以下の通りであった。
テトラキスアクリジニルペプチド＝1.6μM、
AcrD＝1.6μM
緩衝液：10mM MES, 1mM EDTA(pH6.25), 0.2M NaCl, 25℃
得られた結果を図６に示す。図６から分かるように、二本鎖DNA（poly[d(A-T)]2）添加に伴って最終的には蛍光強度が1600倍と従来にない蛍光増強が見られた。このような極めて大きな蛍光増加はこれまでに例を見ない。同条件下、AcrDは、数十倍の蛍光増加であった。また、一本鎖DNA（polydT）を加えた場合は、ほとんど蛍光変化は見られなかった。この結果からもテトラキスアクリジニルペプチドが二本鎖DNAを選択的に検出する蛍光試薬として有用であることが示された。
【００３４】
【発明の効果】
以上に説明した通り、本発明の蛍光試薬は、二本鎖DNA、二本鎖RNAなどの二本鎖核酸と接触することにより該蛍光試薬分子中の蛍光性インターカレート基が二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートして、該蛍光試薬分子中における蛍光性インターカレート基同士のスタッキングによる消光が解消して蛍光強度が増強し、それによって二本鎖核酸を高感度で選択的に検出することができる。
本発明の蛍光試薬は、DNAチップまたはDNAマイクロアレイでのDNA検索に適用できる。即ち、サンプルDNAをDNAチップまたはDNAマイクロアレイに固定されたプローブNDAに反応させて、二本鎖DNA形成させ、この二本鎖DNAを本発明の蛍光試薬で高感度でかつ選択的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドのHPLCチャートを示す。
【図２】図２は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドのTOF MASS のデータを示す。
【図３】図３は、実施例１で合成したテトラキスアクリジニルペプチドと参考例１で合成したモノマー体の円二色性（CD）スペクトルを示す。
【図４】図４は、本発明の蛍光試薬の代表例であるテトラキスアクリジニルペプチドに存在する4つの蛍光性インターカレート基であるアクリジン基同士がスタッキングすることによりらせん状構造を有しており、更にこれが二本鎖DNAと反応すると、アクリジン基がインターカレートする様子を示す模式図である。
【図５】図５は、テトラキスアクリジニルペプチドに各種量の[poly(dA-dT)]2を添加して測定した吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、テトラキスアクリジニルペプチド（1）の溶液に[poly(dA-dT)]2またはpolydT、あるいは対照としのアクリジンホモダイマー（AcrD）を添加したときの蛍光強度の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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