(57)【要約】【課題】  本発明は、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養用パターニング基板や、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等を提供することを主目的としている。【解決手段】  上記目的を達成するために、本発明は、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層とを有することを特徴とするパターニング用基板を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層とを有することを特徴とするパターニング用基板。
【請求項２】
前記基材上にパターン状に遮光部が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のパターニング用基板。
【請求項３】
前記細胞培養パターニング用層が、バインダを含有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載のパターニング用基板。
【請求項４】
基材と、前記基材上に形成された細胞培養用パターン層とを有する細胞培養基板であって、前記細胞培養用パターン層は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部と、少なくとも光触媒を含有し、前記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板。
【請求項５】
前記基材上に、前記細胞接着部と同じパターン状に遮光部が形成されていることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養用パターニング基板。
【請求項６】
前記細胞培養用パターン層が、バインダを含有することを特徴とする請求項４または請求項５に記載の細胞培養用パターニング基板。
【請求項７】
請求項４から請求項６までのいずれかの請求項に記載の細胞培養用パターニング基板における前記細胞接着部上に細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板。
【請求項８】
少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有することを特徴とするパターニング用基板用コーティング液。
【請求項９】
バインダを含有することを特徴とする請求項８に記載のパターニング用基板用コーティング液。
【請求項１０】
基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部および、少なくとも光触媒を含有し、前記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部を有する細胞培養用パターン層と、前記細胞接着部上に接着した細胞とを有する細胞培養基板の製造方法であって、
前記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、前記細胞非接着部に、エネルギー照射を行うことにより、前記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
【０００３】
一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
【０００４】
一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞非接着性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。
【０００６】
さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。
【０００７】
しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。
【０００８】
さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ  Ｍ，ホワイトサイズ(George M. Whitesides)により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。
【特許文献１】特開平２−２４５１８１号公報
【特許文献２】特開平３−７５７６号公報
【特許文献３】特開平５−１７６７５３号公報
【特許文献４】米国特許第５，５１２，１３１号公報
【特許文献５】米国特許第５，９００，１６０号公報
【特許文献６】特開平９−２４０１２５号公報
【特許文献７】特開平１０−１２５４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養用パターニング基板や、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等の提供が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層とを有することを特徴とするパターニング用基板を提供する。
【００１１】
本発明においては、上記細胞培養パターニング用層が、上記光触媒および上記細胞接着材料を含有していることから、エネルギーを照射することにより、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって細胞接着材料が分解または変性した領域を形成することができる。したがって、本発明によれば、特別な装置や複雑な工程を必要とすることなく、細胞との接着性が良好な細胞接着材料を含有する領域と、細胞接着材料が分解または変性され、細胞との接着性が低い領域とを容易に形成することが可能なパターニング用基板とすることができる。
【００１２】
上記発明においては、上記基材上にパターン状に遮光部が形成されているものとすることができる。この場合、基材側からエネルギーを照射することにより、遮光部が形成されていない領域の細胞培養パターニング用層のみにエネルギーを照射することができ、遮光部が形成されたパターン状に細胞接着材料が残存したパターンが形成可能なパターニング用基板とすることができるからである。
【００１３】
上記発明においてはまた、上記細胞培養パターニング用層が、バインダを含有することが好ましい。これにより、上記細胞培養パターニング用層に強度を付与することや、エネルギー照射された領域の細胞との接着性をより低下させる等の特性を付与することが可能となるからである。
【００１４】
本発明は、基材と、上記基材上に形成された細胞培養用パターン層とを有する細胞培養基板であって、上記細胞培養用パターン層は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部と、少なくとも光触媒を含有し、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部とを有することを特徴とする細胞培養用パターニング基板を提供する。
【００１５】
本発明によれば、上記細胞培養用パターン層が、上記細胞接着部と上記細胞非接着部とを有することから、容易に細胞接着部上にのみ細胞を接着させることができ、例えば細胞培養用パターン層の全面に細胞を塗布した場合であっても、細胞接着部上のみに、高精細に細胞を接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板とすることができる。
【００１６】
上記発明においては、上記基材上に、上記細胞接着部と同じパターン状に遮光部が形成されているものとすることができる。これにより、細胞培養用パターニング基板を形成する際、基材側からエネルギーを照射することによって、遮光部が形成されている領域以外の細胞接着材料を分解または変性させることができ、容易に細胞非接着部が形成されたものとすることができるからである。また、本発明の細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に細胞を接着させて細胞培養基板とした場合に、基材側からエネルギーを照射することによって、細胞非接着部に存在する細胞をエネルギー照射に伴う光触媒の作用により、容易に除去することが可能となり、高精細なパターン状に細胞を保持することが可能となる。
【００１７】
また、上記発明においては、上記細胞培養用パターン層が、バインダを含有することが好ましい。これにより、細胞培養用パターン層の強度を高いものとしたり、上記細胞非接着部上に細胞が接着することをより防止する等の特性を付与することができるからである。
【００１８】
また、本発明は、上述したいずれかの細胞培養用パターニング基板における上記細胞接着部上に細胞が接着していることを特徴とする細胞培養基板を提供する。
【００１９】
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板の細胞非接着部上には細胞が接着せず、細胞接着部上にのみ細胞が接着することから、複雑な工程や、細胞に悪影響を及ぼすような処理液等を用いることなく、容易に高精細なパターン状に細胞が接着された細胞培養基板とすることができる。
【００２０】
またさらに、本発明は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有するパターニング用基板用コーティング液を提供する。
【００２１】
本発明によれば、上記光触媒および細胞接着材料を含有することから、例えば基材上にパターニング用基板用コーティング液を塗布し、エネルギー照射をパターン状に行うことによって、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着材料が分解または変性した領域と、細胞接着材料により細胞との接着性が良好な領域とを容易に形成することが可能なものとすることができる。
【００２２】
上記発明においては、上記パターニング用基板用コーティング液が、バインダを含有することが好ましい。これにより、パターニング用基板用コーティング液を塗布して層を形成する際に、層の形成を容易とすることや、層の強度を高めること等ができるからである。また、層を形成した後、エネルギー照射された領域の細胞との接着性を調整すること等も可能となる。
【００２３】
また、本発明は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部および、少なくとも光触媒を含有し、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部を有する細胞培養用パターン層と、上記細胞接着部上に接着した細胞とを有する細胞培養基板の製造方法であって、
上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞非接着部に、エネルギー照射を行うことにより、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法を提供する。
【００２４】
本発明によれば、上記細胞接着工程により、細胞接着部上に細胞を接着させた後、上記細胞維持工程により、上記細胞培養基板の細胞非接着部にエネルギーを照射することによって、細胞非接着部に接着した細胞等を除去することが可能となり、細胞接着部のみに高精細なパターン状に細胞が接着した細胞培養基板とすることができるからである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、特別な装置や複雑な工程を必要とすることなく、細胞と接着性が良好な細胞接着材料を有する領域と、細胞接着材料が分解または変性され、細胞との接着性が低い領域とを容易に形成することが可能なパターニング用基板とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させることが可能な細胞培養用パターニング基板や、その細胞培養用パターニング基板の形成に用いられるパターニング用基板、そのパターニング用基板を形成するために用いられるパターニング用基板用コーティング液、および細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板等に関するものである。以下、それぞれについてわけて説明する。
【００２７】
Ａ．パターニング用基板用コーティング液
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有するものである。
【００２８】
本発明のパターニング用基板用コーティング液には、上記細胞接着材料が含有されていることから、このパターニング用基板用コーティング液を基材上に塗布して層を形成した場合、上記細胞接着材料により、細胞との接着性が良好なものとすることができる。その一方で、この層にエネルギーを照射することにより、パターニング用基板用コーティング液中に含有される光触媒の作用によって細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性が低下したものとすることができる。したがって、本発明のパターニング用基板用コーティング液を用いて層を形成し、パターン状にエネルギーを照射することにより、細胞接着材料を含有する細胞との接着性が良好な領域と、細胞接着材料が分解または変性されて細胞との接着性が低下した領域とを有するものとすることができる。
以下、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる各材料について説明する。
【００２９】
１．光触媒
まず、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる光触媒について説明する。本発明に用いられる光触媒は、後述する細胞接着材料を、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。
【００３０】
ここで、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本発明においては、このキャリアが後述する細胞接着材料に作用を及ぼすものであると思われる。
【００３１】
本発明に用いられる光触媒として、具体的には、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ３）、酸化タングステン（ＷＯ３）、酸化ビスマス（Ｂｉ２Ｏ３）、および酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００３２】
本発明においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本発明ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。
【００３３】
このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。
【００３４】
光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
【００３５】
本発明のパターニング用基板用コーティング液における光触媒の含有量は、５〜９５重量％、好ましくは１０〜６０重量％、さらに好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。これにより、パターニング用基板用コーティング液を塗布して層を形成した際に、エネルギー照射された領域の細胞接着材料を分解または変性することが可能となるからである。
【００３６】
ここで、本発明に用いられる光触媒は、例えば高い親水性を有すること等によって、細胞との接着性が低いものであることが好ましい。これにより、後述する細胞接着材料が分解等されて光触媒が露出した領域を、細胞との接着性が低い領域として用いることが可能となるからである。
【００３７】
２．細胞接着材料
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着材料について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液に用いられる細胞接着材料は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。ここで、細胞と接着性を有するとは、細胞と良好に接着することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞と良好に接着することをいう。
【００３８】
本発明に用いられる細胞接着材料は、このような細胞との接着性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、細胞との接着性を有しなくなるものや、細胞との接着を阻害する細胞接着阻害性を有するものに変化するもの等が用いられる。
【００３９】
ここで、上記のような細胞と接着性を有する材料には、物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料と、生物化学的特性により細胞と接着性を有する材料との２種類がある。
【００４０】
物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料の、細胞との接着性を決定する物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーや、静電相互作用等が挙げられる。例えば細胞との接着性が材料の表面自由エネルギーにより決定される場合には、材料が所定の範囲内の表面自由エネルギーを有すると細胞と材料との接着性が良好となり、その範囲を外れると細胞と材料との接着性が低下することとなる。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては、例えば資料ＣＭＣ出版  バイオマテリアルの最先端  筏  義人（監修）ｐ．１０９下部に示されるような実験結果が知られている。このような因子により細胞との接着性を有する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の表面の官能基が置換等されたり、分解されること等によって、表面自由エネルギーが変化し、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
【００４１】
また、静電相互作用等により細胞と材料との接着性が決定される場合、例えば材料が有する正電荷の量等によって細胞との接着性が決定されることとなる。このような静電相互作用により細胞との接着性を有する材料としては、例えばポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記材料が分解または変性されることによって、例えば表面に存在する正電荷量を変化させることができ、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
【００４２】
また、生物学的特性により細胞と接着性を有する材料としては、特定の細胞と接着性が良好なもの、または多くの細胞と接着性が良好なもの等が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の構造の一部を破壊したり、主鎖を破壊すること等によって、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。
【００４３】
このような細胞接着材料は、上記材料の種類等によって異なるものであるが、パターニング用基板用コーティング液中に通常０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％含有されることが好ましい。これにより、細胞接着材料を含有する領域を細胞との接着性が良好な領域とすることができるからである。
【００４４】
３．パターニング用基板用コーティング液
次に、本発明のパターニング用基板用コーティング液について説明する。本発明のパターニング用基板用コーティング液は、上述した光触媒と、細胞接着材料とを含有するものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じてバインダ等、適宜含有するものであってもよい。
【００４５】
本発明においては、特にバインダを含有していることが好ましい。バインダを含有することにより、パターニング用基板用コーティング液を、例えば基材等の上に形成する際に、塗工を容易とすることや、形成された層に強度や耐性を付与する等、様々な特性を付与することが可能となるからである。以下、本発明に用いられるバインダについて説明する。
【００４６】
（バインダ）
本発明に用いられるバインダは、上記光触媒および細胞接着材料の特性を阻害しないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば塗工性や、層を形成した際の強度や耐性等、パターニング用基板用コーティング液が必要とされる特性に合わせたものを用いることができる。
【００４７】
本発明においては、上記バインダとして、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する材料が用いられることが好ましい。このような材料としては、例えばエネルギー照射される前から上記細胞接着阻害性を有するものであってもよく、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害性を有するものとなるものであってもよい。
【００４８】
本発明においては、特にエネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害性を有するものとなる材料をバインダとして用いることが好ましい。これにより、エネルギー照射される前の領域においては、上記細胞接着材料の細胞との接着性を阻害することがなく、エネルギー照射された領域のみを、細胞との接着性が低いものとすることができるからである。
【００４９】
このようなバインダとして用いられる材料としては、例えば主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような有機置換基を有するものが好ましく、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）撥水牲や撥油性に優れた反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。
【００５０】
上記の（１）の場合、一般式：
ＹｎＳｉＸ（４−ｎ）
（ここで、Ｙはアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基を示し、Ｘはアルコキシ基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）
で示される珪素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。
【００５１】
また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。
【００５２】
【化１】
2005143382.tif 000003
【００５３】
ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ１，Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜１０の置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アリールあるいはシアノアルキル基であり、モル比で全体の４０％以下がビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルである。また、Ｒ１、Ｒ２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端もしくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。上記のような材料を用いることによって、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、エネルギー照射された領域の表面を高い親水性を有するものとすることができる。これにより、細胞との接着が阻害され、エネルギー照射された領域には細胞が接着しないものとすることができるからである。
【００５４】
また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物をバインダに混合してもよい。
また、本発明においては、エネルギーが照射された領域の濡れ性の変化を起こさせること等により、細胞との接着性が低下する、もしくはそのような変化を補助する分解物質等を含有するものであってもよい。
【００５５】
このような分解物質としては、例えばエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解等されて、親水性となること等により、細胞との接着性が低下する界面活性剤等を挙げることができる。具体的には、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ  ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。
【００５６】
また、界面活性剤の他にも、ポリビニルアルコール、不飽和ポリエステル、アクリル樹脂、ポリエチレン、ジアリルフタレート、エチレンプロピレンジエンモノマー、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、メラミン樹脂、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリイミド、スチレンブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ナイロン、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリベンズイミダゾール、ポリアクリルニトリル、エピクロルヒドリン、ポリサルファイド、ポリイソプレン等のオリゴマー、ポリマー等を挙げることができる。
【００５７】
本発明においては、このようなバインダは、パターニング用基板用コーティング液中に５重量％〜９５重量％、中でも４０重量％〜９０重量％、特に６０重量％〜８０重量％の範囲内含有されることが好ましい。
【００５８】
Ｂ．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層とを有するものである。
【００５９】
本発明のパターニング用基板は、例えば図１に示すように、基材１と、その基材上に形成された細胞培養パターニング用層２とを有するものである。本発明によれば、細胞培養パターニング用層が光触媒と、上記細胞接着材料とを含有することから、細胞培養パターニング用層にエネルギーを照射することによって、細胞接着材料を光触媒の作用により、分解または変性させることができ、細胞が接着しないものとすることができる。また、エネルギーが照射されていない領域は、細胞接着材料が残存することから、細胞との接着性が良好なものとすることができる。したがって、特別な装置や複雑な工程を必要とせず、パターン状にエネルギーを照射することにより、細胞と接着性が良好な細胞接着材料を有する領域と、細胞との接着性が低い領域とを容易に形成することが可能となる。
【００６０】
ここで、本発明のパターニング用基板においては、例えば図２に示すように、基材１上に遮光部３が形成されているものであってもよい。上記遮光部が形成されていることにより、基材側からエネルギーを照射した場合、遮光部が形成された領域上の細胞培養パターニング用層にはエネルギーが照射されないものとすることができる。これにより、遮光部が形成されていない領域上の細胞接着材料のみを分解または変性させることができ、フォトマスク等を用いることなく、容易に細胞が接着する領域と、細胞が接着しない領域とを形成することが可能となる。
以下、本発明のパターニング用基板の各構成について説明する。
【００６１】
１．細胞培養パターニング用層
まず、本発明に用いられる細胞培養パターニング用層について説明する。本発明に用いられる細胞培養パターニング用層は、後述する基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有するものであれば、特に限定されるものではない。
【００６２】
上記細胞培養パターニング用層としては、例えば上述したパターニング用基板用コーティング液を用いて、層を形成したもの等とすることができ、特に、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって細胞との接着性が低下するようなバインダが含有されているパターニング用基板用コーティング液を用いて層を形成したものであることが好ましい。これにより、細胞培養パターニング用層にエネルギーが照射された際に、エネルギーが照射された領域の細胞との接着性をより低いものとすることができ、エネルギーが照射されていない領域のみに、高精細なパターンで細胞を接着させることができるからである。
【００６３】
また、上記パターニング用基板用コーティング液等の塗布は、一般的な塗布方法を用いて行うことができ、例えばスピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法、ロールコート法、ビードコート法等を用いることができる。
【００６４】
ここで、本発明に用いられる細胞培養パターニング用層中に含有される光触媒、細胞接着材料、およびバインダ等については、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
【００６５】
上記細胞培養パターニング用層の膜厚としては、パターニング用基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．０１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．１μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。
【００６６】
２．基材
次に、本発明に用いられる基材について説明する。本発明に用いられる基材は、上記細胞培養パターニング用層を形成可能な層であれば、特に限定されるものではなく、例えば金属、ガラス、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。
【００６７】
ここで、基材の可撓性等はパターニング用基板の種類や用途等によって適宜選択される。また、上記基材の透明性は、パターニング用基板の種類や、上記細胞接着材料を分解または変性させるために照射されるエネルギーの照射方向等によって、適宜選択され、例えば基材が遮光部等を有しており、上記エネルギーの照射が、基材側から行われる場合等には、基材が透明性を有するものとされる。
【００６８】
ここで、本発明の基材には、上述したように、遮光部が形成されていてもよい。本発明に用いることが可能な遮光部としては、パターニング用基板に照射されるエネルギーを遮断することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。
【００６９】
また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このような樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。
【００７０】
なお、上記遮光部は、基材の上記細胞培養パターニング用層が形成される側の面に形成されるものであってもよく、また反対側の面に形成されるものであってもよい。
【００７１】
また、上記遮光部を形成する場合には、上記細胞培養パターニング用層と遮光部との間にプライマー層を形成してもよい。このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、プライマー層を形成することにより、光触媒の作用による細胞培養パターニング用層中の細胞接着材料の分解または変性を阻害する要因となる遮光部および遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着材料を分解または変性させることができ、その結果、高解像度のパターンを得ることが可能となるのである。
【００７２】
なお、本発明においてプライマー層は、遮光部のみならず遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
【００７３】
本発明におけるプライマー層は、上記遮光部と上記細胞培養パターニング用層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
【００７４】
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。
【００７５】
３．パターニング用基板
次に、本発明のパターニング用基板について説明する。本発明のパターニング用基板は、上述した基材上に細胞培養パターニング用層が形成されたものであれば、特に限定されるものではなく、例えば必要に応じて他の層が積層されたもの等であってもよい。
【００７６】
Ｃ．細胞培養用パターニング基板
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板は、基材と、上記基材上に形成された細胞培養用パターン層とを有する細胞培養基板であって、上記細胞培養用パターン層は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部と、少なくとも光触媒を含有し、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部とを有するものである。
【００７７】
本発明の細胞培養用パターニング基板は、例えば図３に示すように、基材１と、その基材１上に形成された細胞培養用パターン層４とを有するものであり、その細胞培養用パターン層４は細胞接着部５と、細胞非接着部６とを有するものである。
【００７８】
本発明によれば、上記細胞培養用パターン層が、上記細胞接着部と上記細胞非接着部とを有することから、容易に細胞接着部上にのみ細胞を接着させることができ、例えば細胞培養用パターン層の全面に細胞を塗布した場合であっても、細胞接着部上のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるのである。
【００７９】
また、本発明によれば、細胞接着部上に細胞を接着させた後、例えば基材側から全面にエネルギーを照射することによって、細胞が接着した細胞接着部の細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性が低いものとすることができる。これにより、細胞接着部上に接着した細胞を剥離することができ、パターン状に形成された細胞を得ることができるのである。なお、この際照射されるエネルギーは細胞に影響を与えない程度のエネルギーとされる。
【００８０】
ここで、本発明においては、例えば図４に示すように、上記細胞培養用パターン層４の細胞接着部５と同じパターン状に、基材１に遮光部７が形成されていてもよい。このような遮光部が形成されていることにより、例えば、上述した「Ｂ．パターニング用基板」で説明したパターニング用基板を形成し、基材側からエネルギーを照射することによって、遮光部が形成されていない領域上のみの細胞接着材料を分解または変性させることができ、上記細胞非接着部が容易に形成されたものとすることができるからである。
【００８１】
また、本発明の細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に細胞を接着した後、基材側からエネルギーを照射することによって、細胞非接着部のみにエネルギーを照射することができる。これにより、細胞非接着部に細胞が付着した場合等であっても、このエネルギーの照射により、細胞非接着部上の細胞を除去することができ、高精細なパターンを保つことが可能となる。
以下、本発明の細胞培養用パターニング基板の各構成について説明する。
【００８２】
１．細胞培養用パターン層
まず、本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる細胞培養用パターン層について説明する。本発明に用いられる細胞培養用パターン層は、後述する基材上に形成されるものであり、細胞接着部と、細胞非接着部とを有するものであれば、特に限定されるものではないが、特に細胞培養用パターン層にバインダが含有されていることが好ましい。これにより、細胞培養用パターン層に強度や耐性等、様々な特性を付与することが可能となるからである。
【００８３】
本発明においては、上記バインダとして特に、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、濡れ性等が変化し、細胞との接着性が低下するバインダが含有されていることが好ましい。これにより、上記細胞非接着部を細胞との接着性をより低いものとすることができ、細胞接着部上にのみ高精細なパターンで細胞を接着させることが可能な細胞培養用パターン層とすることができるからである。
【００８４】
上記細胞接着部とは、光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する領域であり、目的とする細胞との接着性が良好な領域である。ここで、細胞との接着性を有するとは、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」の項で説明したような物理化学的細胞接着性や生物学的細胞接着性を有することとする。
【００８５】
一方、細胞非接着部とは、少なくとも光触媒を含有し、上記細胞接着材料が分解または変性されており、細胞との接着性が低い領域である。ここで、上記細胞接着材料が分解または変性されているとは、上記細胞接着材料が含有されていない、もしくは上記細胞接着部に含有される細胞接着材料の量と比較して、細胞接着材料が少ない量含有されていることをいう。例えば上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞非接着部中にはその細胞接着材料が含有されていない、または細胞接着材料の分解物等が含有されていることとなる。また、上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞非接着部中にはその変性物等が含有されていることとなる。
【００８６】
ここで、上記細胞非接着部中には、上述したように、細胞との接着性が低いバインダが含有されていることが好ましい。これにより、細胞非接着部上に細胞が接着することをより防止することができるからである。
【００８７】
なお、上記細胞接着材料、光触媒、およびバインダについては、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略し、以下、上述したような細胞接着部および細胞非接着部を有する細胞培養用パターン層の形成方法について説明する。
【００８８】
まず、上述した「Ａ．パターニング用基板用コーティング液」で説明したパターニング用基板用コーティング液等を用いて、例えば図５に示すように、少なくとも光触媒および細胞接着材料を含有する細胞培養パターニング用層２を基材１上に形成する（図５（ａ））。次にこの細胞培養パターニング用層２に、細胞非接着部を形成するパターン状に、例えばフォトマスク８等を用いてエネルギー９を照射する（図５（ｂ））。これにより、細胞培養パターニング用層２中に含有される光触媒の作用によって、エネルギー照射された領域の細胞接着材料が分解または変性され、エネルギーが照射された領域が細胞非接着部６、エネルギーが照射されていない領域が細胞接着部５となった細胞培養用パターン層４が形成されるのである（図５（ｃ））。なお、上記細胞培養パターニング用層の形成方法等については、上記「Ｂ．パターニング用基板」で説明した方法と同様であるので、ここでの説明は省略する。また、上述したように、光触媒および細胞接着材料とともに、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞との接着性が低下するようなバインダが含有されている場合には、上記エネルギー照射によって、バインダの細胞との接着性も低下し、細胞非接着部の細胞との接着性をより低いものとすることができるのである。
【００８９】
ここで、本発明でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、可視光の照射に限定されるものではない。
【００９０】
通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒として用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
【００９１】
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。
【００９２】
上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。また、上述したように、基材が細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、基材側からエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。この場合、フォトマスク等が必要なく、位置あわせ等の工程が必要ない、という利点を有する。
【００９３】
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒の作用によって細胞接着材料が分解または変性されるのに必要な照射量とする。
【００９４】
この際、光触媒が含有される層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的に細胞接着材料を分解または変性させることができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。
【００９５】
本発明におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および細胞培養用パターン層を形成する側のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、細胞培養用パターン層を形成する側からエネルギー照射を行う必要がある。
【００９６】
２．基材
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板に用いられる基材は、上述した細胞培養用パターン層を形成することが可能であれば、特に限定されるものではなく、例えば上述したように遮光部等が形成されているものであってもよい。
【００９７】
なお、本発明に用いられる基材や遮光部等については、上述した「Ｂ．パターニング用基板」で説明したものと同様のものを用いることが可能であるので、ここでの説明は省略する。
【００９８】
３．細胞培養用パターニング基板
次に、本発明の細胞培養用パターニング基板について説明する。本発明の細胞培養用パターニング基板は、上記基材上に、上記細胞培養用パターン層が形成されているものであれば、特に限定されるものではなく、必要に応じて適宜他の層が形成されているもの等であってもよい。
【００９９】
Ｄ．細胞培養基板
次に、本発明の細胞培養基板について説明する。本発明の細胞培養基板は、上述した細胞培養用パターニング基板における細胞接着部上に、細胞が接着したものである。
【０１００】
本発明の細胞培養基板は、例えば図６に示すように、上記細胞培養用パターン層４の細胞接着部５上にのみ細胞７が接着し、細胞非接着部６上には、細胞７が接着していないものである。
【０１０１】
本発明によれば、上記細胞培養用パターニング基板上には、細胞との接着性が良好な細胞接着部と、細胞との接着性を有しない細胞非接着部とが形成されていることから、例えば細胞を細胞培養用パターニング基板の全面に塗布した場合であっても、細胞接着部のみに細胞を接着させて、細胞非接着部上の細胞を容易に除去することができる。これにより、複雑な工程や細胞に悪影響を及ぼす処理液等を用いることなく、容易に形成されたものとすることができるのである。
【０１０２】
また、本発明によれば、上記細胞培養基板の全面にエネルギーを照射することによって、細胞が接着した細胞接着部の細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞との接着性を低いものとすることができる。これにより、細胞接着部上に接着した細胞等を容易に剥離することができ、パターン状に形成された細胞のみを得ることができるのである。なお、この際照射されるエネルギーは細胞に影響を与えない程度のエネルギーとされる。
【０１０３】
また、上述したように、細胞接着部と同じパターン状に基材上に遮光部が形成されている場合には、必要に応じて基材側から全面にエネルギーを照射することにより、細胞非接着部上に付着した細胞を除去することが可能となり、細胞が細胞接着部に接着したパターンを高精細に保つことができるのである。
【０１０４】
なお、上記遮光部が形成されていない場合には、細胞非接着部と同じパターン状に開口部が形成されたフォトマスク等を用いてエネルギーを照射することにより、高精細なパタ
ーンを保つことができる。
【０１０５】
以下、本発明の細胞培養基板に用いられる細胞について説明する。ここで、細胞培養用パターニング基板については、上記「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」で説明したものであるので、ここでの説明は省略する。
【０１０６】
（細胞）
本発明の細胞培養基板に用いられる細胞としては、上記細胞培養用パターニング基板の細胞接着部上に接着するものであり、細胞非接着部上には接着しないものであれば特に限定されるものではない。
【０１０７】
本発明に用いられる細胞としては例えば、神経組織、肝臓、腎臓、膵臓、血管、脳、軟骨等、血球系等の非接着性細胞以外なら、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞とすることができる。また一般的に非接着性の細胞についても、近年、接着固定を行う為に細胞膜を修飾する技術が考案されており、必要に応じてこのような技術を用いる事で本発明に用いることが可能である。
ここで、上述したような各組織は種々の機能をもつ細胞により形成されていることから、所望する細胞を選択し、使用する必要がある。例えば肝臓の場合、肝実質細胞以外にも上皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、脂肪摂取細胞等から形成されることとなる。なおこの場合、細胞の種類により細胞接着材料に対する接着性が異なる為、細胞種に応じて、上記細胞接着部に用いられる細胞接着材料やその組成比の選択が必要となる。
【０１０８】
また、細胞を細胞接着部に接着させる方法としては、上記細胞接着部と細胞非接着部とを有する上記細胞培養用パターニング基板の上記細胞接着部のみに細胞を接着させることが可能な方法であれば特に限定されるものではない。例えばインクジェットプリンタやマニピュレータ等で細胞を接着させる方法等であってもよいが、細胞懸濁液を播種して上記細胞接着部に細胞を接着させた後、不要となった細胞非接着部上の細胞をリン酸バッファで洗浄し、細胞を除去する方法が一般的に用いられる。このような方法としては、例えば参考文献”Spatial distribution of mammalian cells dicated by material surface chemistry”,Kevin E.Healy 他,Biotech.Bioeng．(1994) p.792等に記載されている方法を用いること等ができる。
【０１０９】
Ｅ．細胞培養基板の製造方法
次に、本発明の細胞培養基板の製造方法について説明する。本発明の細胞培養基板の製造方法は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着部および、少なくとも光触媒を含有し、上記細胞接着材料が分解または変性された細胞非接着部を有する細胞培養用パターン層と、上記細胞接着部上に接着した細胞とを有する細胞培養基板の製造方法であって、
上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞非接着部に、エネルギー照射を行うことにより、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる細胞維持工程を有するものである。
【０１１０】
本発明の細胞培養基板の製造方法は、例えば図７に示すように、基材１と、その基材１上に形成され、細胞接着部５および細胞非接着部６を有する細胞培養用パターン層４と、上記細胞接着部５上に形成された細胞７とを有する細胞培養基板の製造方法である。本発明においては、上記細胞接着部５上に細胞７を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞非接着部６に、例えばフォトマスク８等を用いてエネルギー９を照射することにより、細胞接着部５上に接着した細胞７のパターンを維持する細胞維持工程を行う。これにより、細胞が細胞非接着部上に付着した場合であっても、細胞非接着部中に含有される光触媒の作用により、細胞非接着部上のたんぱく質、有機物、細胞等を除去することが可能となり、細胞接着部上にのみ高精細に細胞が接着された細胞培養基板とすることができるのである。
以下、本発明の細胞培養基板の製造方法における細胞維持工程について説明する。
【０１１１】
（細胞維持工程）
本発明の細胞培養基板の製造方法における細胞維持工程は、上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程を行った後、上記細胞非接着部に、エネルギー照射を行うことにより、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを維持させる工程であり、細胞非接着部にエネルギーを照射を行い、細胞接着部上の細胞のパターンを維持することが可能であれば、そのエネルギーの照射方法等は特に限定されるものではない。
【０１１２】
本発明においては、例えば図７に示すように、細胞非接着部のパターン状に開口部を有するフォトマスク８等を用いてエネルギー９を照射する方法等が挙げられる。また、例えば図８に示すように、基材１上に遮光部３が、細胞接着部５と同じパターン状に形成されている場合には、基材１側から全面にエネルギーを照射することにより、細胞非接着部６のみにエネルギー９を照射する方法等とすることができる。
【０１１３】
この際、照射するエネルギーは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞非接着部上に接着した細胞を除去することが可能なエネルギーであれば特に限定されるものではなく、具体的には、「Ｃ．細胞培養用パターニング基板」の細胞培養用パターン層の項で説明したものと同様のものとすることができるので、ここでの説明は省略する。
【０１１４】
また、本工程を行う時期としては、細胞接着部上に細胞を接着した細胞接着工程直後に行われるものであってもよく、また細胞接着部上の細胞を所定の期間培養した場合に、細胞非接着部上に細胞が付着し、パターンが太くなる等といった不具合がないように、細胞の種類や状態に合わせて適宜行われるものであってもよい。また、本工程は繰り返し行われるものであってもよい。
なお、上記細胞接着部上に細胞を接着させる細胞接着工程については、上述した「Ｄ．細胞培養基板」の項で説明した細胞の接着方法と同様であるので、ここでの説明は省略する。
【０１１５】
（その他）
本発明の細胞培養基板の製造方法においては、上記エネルギー照射工程および細胞接着工程以外に、例えば光触媒および細胞接着材料を含有するパターニング用基板用コーティング液を基材上に塗布して細胞培養パターニング用層を形成する工程や、その細胞培養パターニング用層にパターン状にエネルギーを照射して、細胞接着部と細胞非接着部とを有する細胞培養用パターン層を形成する工程等、必要に応じた工程を有するものであってもよい。
【０１１６】
ここで、本発明の細胞培養基板の製造方法に用いられる光触媒、細胞接着材料、基材、および細胞等や、上記細胞培養用パターン層の形成方法等については、上述した「Ｄ．細胞培養基板」の項で説明したものと同様であるので、ここでの説明は省略する。
【０１１７】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。
【実施例】
【０１１８】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【０１１９】
[実施例１]
（細胞培養用パターニング基板の作製）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランTSL8114（東芝シリコーン社製）０．４ｇ、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（Huels America社製）０．０４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業社製）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した石英ガラス基板に塗布し、その基板を温度１５０℃で１０分間乾燥させて、加水分解および重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強度に固定された膜厚０．２μｍの光触媒含有細胞接着材料膜基板を得た。
【０１２０】
この基板にフォトマスクを用いて水銀ランプ（波長３６５ｎｍ）により３００ｍＷ／ｃｍ２の照度で９００秒間紫外線露光を行い、未露光部が細胞接着部、露光部が細胞非接着部となる細胞培養基板を得た。
【０１２１】
（細胞接着工程）
細胞培養の手順等については、例えば“組織培養の技術  第三版  基礎編”日本組織培養学会編、朝倉書店等に記載されている方法に基づき、以下の工程を行った。
ラットより摘出した肝臓をシャーレに移してメスで５ｍｍ大に細分し、２０ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えてピペットで軽く懸濁した後、細胞ろ過器でろ過した。得られた粗分細胞分散浮遊液を５００〜６００ｒｐｍで９０秒間遠心処理し、上清を吸引して除去した。残留した細胞に新たにＤＭＥＭ培地を加えて再び遠心処理をした。この操作を３回繰り返し、ほぼ均一な肝実質細胞を得た。得られた肝実質細胞に、ＤＭＥＭ培地を２０ｍｌ加えて懸濁し、肝実質細胞懸濁液を調整した。
【０１２２】
次にWaymouth MB752/1培地（Ｌ-グルタミン含有、ＮａＨＣＯ３非含有）（ギブコ社製）１４．１２ｇに蒸留水９００ｍｌを添加した。これにＮａＨＣＯ３２．２４ｇ、アンホテリシンＢ液（ＩＣＮ）１０ｍｌ、およびペニシリンストレプトマイシン液（ギブコ社製）１０ｍｌ加えて攪拌した。これをｐＨ７．４に調整した後、全量を１０００ｍｌとし、０．２２μｍのメンブレンフィルターでろ過減菌したものをWaymouth MB752/1培地液とした。
先に作製した肝実質細胞懸濁液を、同じく作製したWaymouth MB752/1培地液に懸濁した上で、細胞接着部と細胞非接着部とを有する、上述した細胞培養用パターニング基板上に播種した。この基板を３７℃、５％ＣＯ２付与したインキュベータ内に２４時間静置し、基板全面に肝実質細胞を接着させた。この基板をＰＢＳで２回洗浄することにより、非接着細胞や死細胞を除去した後、新しい培地液と交換した。
【０１２３】
培地液を交換しながら４８時間まで細胞の培養を続け、光学顕微鏡で細胞を観察したところ、細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿って接着していることを確認した。
【０１２４】
[実施例２]
実施例１で使用した石英基板の代わりに、遮光部８０μｍ、スペース部３００μｍのストライプ状遮光層を設けた石英基板を用い、フォトマスク等を用いずに、基板の裏面側から紫外線を照射した以外は、実施例１と同様に細胞培養用パターニング基板を作製し、細胞を培養した。
【０１２５】
この場合についても、光学顕微鏡で細胞を観察したところ、細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に沿って接着していることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】本発明のパターニング用基板の一例を示す概略断面図である。
【図２】本発明のパターニング用基板の他の例を示す概略断面図である。
【図３】本発明の細胞培養用パターニング基板の一例を示す概略断面図である。
【図４】本発明の細胞培養用パターニング基板の他の例を示す概略断面図である。
【図５】本発明の細胞培養用パターニング基板における細胞培養用パターン層の形成方法の一例を示す工程図である。
【図６】本発明の細胞培養基板の一例を示す概略断面図である。
【図７】本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の一例を示す概略断面図である。
【図８】本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の他の例を示す概略断面図である。
【符号の説明】
【０１２７】
１…基板
２…細胞培養パターニング用層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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