(57)【要約】【課題】  粒子径を狭い範囲内に揃えたエマルション粒子とした造影物質を含み、造影化合物の血中滞留性を高め、造影剤の効率的送達および良好なターゲティングを達成する、安全性が高い造影剤を提供すること。【解決手段】  本発明の造影剤は、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとして、水溶性造影化合物を油性造影化合物油膜で被覆した造影物質と製剤助剤とを含有する水性分散物からなるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤である。該水溶性造影化合物は、好ましくは非イオン系ヨウド化合物であり、該油性造影化合物が油溶性ヨウド化合物である。前記の造影化合物が、近赤外蛍光色素であってもよい。本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤の製造方法は、水相中に水溶性造影化合物を含有し、油相中に油性造影化合物を含有するＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して外水相中に圧入分散することを特徴としている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとして、水溶性造影化合物を油性造影化合物油膜で被覆した造影物質と製剤助剤とを含有する水性分散物からなる造影剤。
【請求項２】
前記水溶性造影化合物が、非イオン系ヨウド化合物であり、前記油性造影化合物が油溶性ヨウド化合物であることを特徴とする請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
前記水溶性造影化合物と、前記油性造影化合物との含有比が、1：0.001〜1：0.1であることを特徴とする請求項１または２に記載の造影剤。
【請求項４】
前記油性造影化合物が、ヨウ素化けし油脂肪酸エチルエステルであることを特徴とする請求項１に記載の造影剤。
【請求項５】
前記の造影化合物が、近赤外蛍光色素であることを特徴とする請求項１に記載の造影剤。
【請求項６】
前記近赤外蛍光色素が、シアニン系蛍光色素であることを特徴とする請求項５に記載の造影剤。
【請求項７】
前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子の平均粒径が、0.1〜0.3μｍであることを特徴とする請求項１に記載の造影剤。
【請求項８】
水相中に水溶性造影化合物を含有し、油相中に油性造影化合物を含有するＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して外水相中に圧入分散することを特徴とするＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中油中水相型（Ｗ／Ｏ／Ｗ型）エマルション造影剤に関し、詳しくは水溶性造影化合物を油性造影剤油膜で被覆したエマルション粒子を含むＸ線造影剤または近赤外蛍光造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線を用いる単純撮影やＣＴ撮影法（コンピュータ断層撮影法）は、今日の画像診断の中核を占めている。臓器、管腔などの軟組織間ではＸ線吸収の差が小さいため高いコントラスト像を得ることは困難であり、一般的にはコントラストの高い画像を得るために造影剤が使用される。現在実用化されているＸ線造影剤の大部分は、トリヨードフェニル基を含有し水溶性化した化合物を造影物質とするものである。これらの造影剤は、血管、尿管、輸卵管などの管腔部位に投与され、管腔の形状、狭窄などの診断に使用されている。  しかしながら、これらの化合物は組織や疾患部位と相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されるために、組織や疾患部位、特に癌組織をより詳細に診断する目的には役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位に選択的に集積し、その周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供するＸ線造影剤もまた望まれている。そのようなＸ線検査用造影剤であれば、微細な癌組織であっても精度良く検出することも可能となるからである。
【０００３】
腫瘍発見のための検査方法として、Ｘ線撮影法だけでなく測定原理を異にする他の方法も開発されている。たとえばＭＲＩ（磁気共鳴造影法）では、癌組織、特に微小な癌組織を精度よく撮像するには感度の面から限界があり、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）では、被爆と稼動コストの点で一般的でなく、いずれも大規模な設備と高額の装置を必要としており、今のところ一般的に広く利用される検査法ではない。
【０００４】
一方、薬物投与の最適化を実現する基本的概念として薬物送達システムが導入されている。実用薬物の副作用、毒性を減らす努力も引き続き求められている。これらはＸ線造影剤についても例外ではない。国際公開ＷＯ98/46275、同ＷＯ95/31181、同ＷＯ94/19025、同ＷＯ96/28414、同ＷＯ96/00089、米国特許4873075号、同4567034号などには、疎水性ヨウド化合物を界面活性剤や油脂の存在下で水中に分散させたものを投与して、肝臓、脾像、副腎皮質、腫瘍、動脈硬化巣、血液プール、リンパ系などを造影する方法が開示されている。これらの方法は、造影剤を微粒子化することにより体内での滞留時間を長くして疾患部位を選択的に造影しようとするものである。その目的のために提案された製剤方法は、造影の効率および選択性とも充分でない。さらに使用するヨウド化合物が疎水性であるために、造影後、体外へ排出する速度が遅く、患者への負担が大きいという問題点もあった。
【０００５】
造影剤をマイクロカプセルに封入することにより、効率的な造影剤の送達を図ることも検討されてきた。具体的には生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性ゆえに安全性が高いとされているリポソーム粒子に造影化合物を内包させる手法が開示されている。たとえば国際公開ＷＯ88/09165、同ＷＯ89/00988、同ＷＯ90/07491、特開平07-316079、特開2003-5596では、イオン性または非イオン性の造影剤を含有するリポソーム粒子が提案されている。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソーム粒子を使用するにもかかわらず、実用化に至っていない（たとえば、特許文献１参照）。製造過程においてリポソーム粒子膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用することから、どうしても残存する溶剤の毒性が懸念されるためである。
【０００６】
他方、徐放制御されたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション製剤であって、油相中にポリオキシエチレン硬化ヒマシ油およびポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルを含有することを特徴とする薬物徐放性乳化製剤、ならびにその製剤を、多孔質ガラス膜を使用して製造する方法が開示された（特許文献２）。
【０００７】
さらに首尾良く造影物質をマイクロカプセルの内部に内包させても、時間経過とともに外部へ漏出する問題、あるいはマイクロカプセル粒子そのものが、加工処理時または保存中に不安定になる事態も考慮されねばならない。さらにマイクロカプセル粒子を生体内へ投与しても、その多くが肝臓、脾臓などの網内系組織で捕捉されるため、所期の効果が得られないことも指摘されている（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。
【特許文献１】特開平7-316079号公報
【特許文献２】特開平10-203962号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、水溶性造影化合物をＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子としてその送達効率を向上させた造影剤を提供することを目的とする。すなわち水溶性ヨウド系化合物などが油膜内に良好に保持されており、造影力にも優れ、かつ、安全性の高い造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。
本発明の造影剤は、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとして、水溶性造影化合物を油性造影化合物油膜で被覆した造影物質と製剤助剤とを含有する水性分散物からなるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤である。
【００１０】
前記水溶性造影化合物は、好ましくは非イオン系ヨウド化合物であり、前記油性造影化合物が油溶性ヨウド化合物である。
前記水溶性造影化合物と前記油性造影化合物との含有比が、1：0.001〜1：0.1であることを特徴としている。
【００１１】
さらに前記水溶性造影化合物は、全造影化合物の50〜100質量％の造影化合物が油性造
影化合物油膜により被覆されていることが望ましい。
前記油性造影化合物は、好ましくはヨウ素化けし油脂肪酸エチルエステルである。
【００１２】
前記の造影化合物が、近赤外蛍光色素であってもよい。
前記近赤外蛍光色素は、好ましくはシアニン系蛍光色素である。
前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子の平均粒径は、0.1〜0.3μｍであることを特徴としている。
【００１３】
本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤の製造方法は、水相中に水溶性造影化合物を含有し、油相中に油性造影化合物を含有するＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して外水相中に圧入分散することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤に含まれるエマルション粒子は、その構造が安定であり、しかも粒子径が揃って実質的に単分散エマルションとなっている。
そのエマルション粒子に内包される水溶性造影化合物に対し、油性造影剤による血管塞栓効果あるいは良好な血中滞留性によるＥＰＲ効果が発揮される。このため目的とする疾
患部位または組織、とりわけ癌組織に選択的に集中し蓄積する。造影後は、該造影化合物の大半が水溶性であるため、体外へ速やかに排泄される。本発明に係る造影剤は、その製造過程において有機溶剤を使用しないため、毒性、副作用が著しく軽減されている。
【００１５】
多孔性ガラス膜を使用する膜乳化法を用いることにより、安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子を含有するエマルション造影剤を工業的規模で製造することができる。
〔発明の具体的説明〕
乳化型造影剤である本発明の造影剤は、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションとして、水溶性造影化合物を、油溶性造影化合物油膜で被覆した造影物質および製剤助剤とを含有する水性分散物である。内水相に水溶性造影化合物を溶解し、油相には油性造影剤、外水相には製剤助剤を含む水性分散液とする構成、すなわち、水中油中水相型乳化物である。これを本明細書中ではＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションとも表記する。なお「内水相」とは、油相によって被覆された水溶性造影化合物を含む水性媒体といい、内水相を被覆している油滴を「Ｗ／Ｏ型エマルション粒子」、または単に「エマルション粒子」と称する。Ｗ／Ｏ型エマルション粒子を分散している水溶性媒体を「Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子」といい、その水性分散媒だけを指す場合は「外水相」という。
【００１６】
以下、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤を、造影化合物、エマルション粒子、その製造法、エマルション造影剤について詳細に説明する。
水溶性造影化合物
本発明の造影剤がＸ線造影剤である場合、内水相に溶解した造影化合物として水溶性ヨウド系化合物を用いる。これはイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低く毒性が低いためにより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物として、特にヨウ化フェニル基、たとえば2,4,6−トリヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好ましい。
【００１７】
具体的には、そのような非イオン性ヨウド化合物として、イオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、N,N′−ビス
〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−2,4,6−トリヨード−1,3−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。
【００１８】
また、その他のヨウド系化合物として、ジアトリゾイン酸；ジアトリゾエートナトリウム；メグルミンジアトリゾエート；アセトリゾイン酸およびその可溶性塩；ジプロトリゾ酸；ヨーダミド，ヨージパミドナトリウム、メグルミンヨージパミド、ヨード馬尿酸およびその可溶性塩；ヨードメタム酸；ヨードピラセットヨード−２−ピリドン−Ｎ−酢酸、3,5−ジヨード−４−ピリドン−Ｎ−酢酸（ヨードピラセット）；前記酸のジエチルアン
モニウム塩；イオタラム酸；メトリゾイン酸およびその塩；イオパノ酸、イオセファム酸、イオフェノ酸およびそれらの可溶性塩；チロパノエートナトリウム、イオポダートナトリウムおよび他の同様なヨウ素化された化合物などを挙げることができる。
【００１９】
造影化合物はこれらの化合物に限定されるものではない。造影化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００２０】
本発明のＸ線検査用造影剤に好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールなどが挙げられる。とりわけイオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低い
ために浸透圧をさらに低下させる利点がある。
【００２１】
また内水相に限らず、外水相の水性媒体として水溶性ヨウド化合物の溶液を用いても良い。
本発明に係る造影剤は、近赤外蛍光造影剤であってもよい。ここで近赤外造影剤とは、近赤外領域に蛍光を発する造影剤を意味する。近赤外蛍光造影剤に造影物質として含まれる近赤外蛍光色素は、励起光の照射により近赤外領域、たとえば700〜1300nm、特に700〜900nmで蛍光を放射する化合物であれば特に制限はない。そのモル吸光係数は少なくとも100,000であることが望ましい。たとえば、インドシアニングリーン（ICG）を始めとする
インドシアニングリーン誘導体、従来報告されている種々のシアニン化合物のうち、水溶性シアニン化合物が好適である（ＷＯ９６/１７６２８、ＷＯ９７/１３４９０）。インドシアニングリーンは、従来から肝、循環機能障害検査において使用されてきており、比較的安全である。特に低毒性で充分に水溶性であり、イメージング標的部位に対する選択性が良好な一群のシアニン化合物が提案されている(ＷＯ９７／１３４９０)。
油性造影剤
Ｘ線造影剤の場合、上記内水相に溶解した水溶性造影化合物を被覆する油相としての油膜は、油性造影剤であるヨウ素化ケシ油脂肪酸エチルエステル（商品名「リピオドールＵＦ」ラボラトワール・ゲルベ社）あるいは油脂類に溶解もしくは分散させた油溶性造影ヨウド化合物である。これらのうち1種または２種以上を併用しても良い。油相を構成する
主成分としては、薬理的に許容されるものであれば、特に制限されず、市販のものを使用することができる。大豆油、オリーブ油、ゴマ油、ツバキ油、ナタネ油、ヨード油、強ヨード油、メンジツ油、ラッカセイ油、トウモロコシ油などが挙げられる。好ましくは、加温して流動性を有する液体となり、室温に冷えると固体脂壁材として機能するような油脂である。これは、油性造影剤を含有する脂質キャリヤーとなり得る。
【００２２】
近赤外蛍光造影剤の場合、上記内水相に溶解した水溶性造影化合物を被覆する油相としての油膜は、油性の近赤外蛍光造影剤である。あるいは油脂類に溶解もしくは分散させた油性の近赤外蛍光造影化合物、たとえば親油性シアニン化合物でもよい。油脂類は上記のものが使用される。
エマルション粒子
本発明の造影剤は、上記造影化合物を標的部位へ効率よく送達するためにエマルション粒子とした形態で使用される。優れた腫瘍描出性へ導くＥＰＲ（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進および滞留）効果を生じさせるために、エマルション粒子
構造の安定性、封入物質の内包化の割合および保持性を改善させるとともに、血中安定性、血中滞留性といった特性を有することが造影剤には求められる。そこで本発明の造影剤は、経時安定性ならびに血中安定性が改善されたエマルション粒子を用いることにより血中滞留性を向上させて、効率的な薬物送達ならびにターゲティングの実現を図っている。
【００２３】
本発明の造影剤では、造影化合物を内包するエマルション粒子の粒子径を適切に設計することによりターゲティング機能を実現することができる。受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティングいずれも考慮される。受動的ターゲティングでは、エマルション粒子の粒子径、構成などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。エマルション粒子の粒子径を狭い範囲に揃える調整は、後述する方法に基づき容易に行われる。さらにエマルション粒子の設計において、後述するように造影剤、油脂類の種類と組成、共存物質を変えることにより、内包物質の保持効率の向上、エマルション粒子の安定化という要件をも満たすことができる。
【００２４】
さらに造影剤のより高度な選択性と集積性とを可能とする能動的ターゲティングの採用ならびに造影剤の安全性もまた検討されるべきである。本発明のエマルション造影剤は、油性造影剤油膜の親油性または血管塞栓効果に基づいて標的部位までの誘導過程を制御す
ることができる。血管塞栓効果は、非腫瘍部に比べ組織形成の未発達な腫瘍血管に沈着する油剤（油性造影剤）の性質によりもたらされる。たとえば油性造影剤として用いるヨウ素化ケシ油脂肪酸エチルエステル（「リピオドール」）は、肝臓ガンの組織に対し選択的に沈着する性質を有することで注目されている油である。その油滴の大きさおよび充填密度は沈着性に影響する。リピオドールで被覆されたエマルション粒子は、非腫瘍部に到達しても正常な肝細胞から排除されてしまう。これまで油性ヨウド造影剤は、リンパ造影、唾液腺造影に用いられてきたが、本発明のエマルション造影剤は、これらの組織、子宮卵管などにも指向性が認められる。
【００２５】
癌組織、疾患部位などに到達しなかった造影剤は、正常部位に集積することなく、副作用が発現する前にエマルション粒子が分解されて体外に排泄される。このことはエマルションを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能となる。本発明のエマルション造影剤は、エマルション粒子が均一であるため、非腫瘍肝組織からの流出は速い。また造影物質として、その大半が水溶性ヨウド系化合物であるため、腎臓を経由して速やかに尿中に排泄される。内水相を被覆する油性造影剤油膜に含まれる油性造影剤はこれより排泄が遅れるが、もともと少量しか使用しないために、したがって徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。
【００２６】
本発明によるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子の粒子径分布は、平均粒径の75％から150
％の粒子径を有するＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子が、全粒子の50容積％以上であることが好ましい。すなわち実質的に単分散であることが望ましい。
エマルション粒子の製造法
本発明によるＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション造影剤の製造方法は、水相中に水溶性造影化合物を含有し、油相中に油溶性造影化合物を含有するＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して外水相中に圧入分散することを特徴としている。
【００２７】
具体的には、水溶性造影化合物を溶解した水溶液からなる水相を、油性造影化合物を溶解させた油相または液状油性造影化合物の油相に対して分散させることにより、Ｗ／Ｏ型エマルションを調製し、次いでこのＷ／Ｏ型エマルションを、多孔質ガラス膜を介して外水相に圧入することにより、本発明のエマルション造影剤を作製することができる。上記油相に分散させる方法は、一般的に用いられている乳化方法を使用すればよく、特に限定されない。たとえば断続振とう法、プロペラ型撹拌機等による混合、ホモジナイザー、超音波乳化機などの公知技術を挙げられる。本発明の造影剤の製造方法においては、多孔質ガラス膜を介する膜乳化法で行うことがさらに望ましい。
【００２８】
膜乳化法は、従来の分散相の破壊に基づく乳化法ではなく、膜の界面化学的性質を利用した静的乳化法であり、従来の乳化技術では得にくい単分散エマルションを容易に得られるという特徴を有する。膜乳化法を用いると、0.05〜10μｍ程度の微小水相粒子が得られ、かつこの範囲で粒子の粒径を自由に調整することができる。本発明の造影剤におけるエマルション粒子は分散性、通針性を満足させる範囲であればよい。この方法によると、粒子の粒設計は具体的には、多孔質ガラス膜の細孔を変えることにより容易に行うことができる。しかも生成するエマルション粒子は極めて均一で、実質的に単分散のエマルションを得ることができる。機械的方法による方法と異なり、乳化する際に局部的に熱が発生することもないため、熱による分解または副生物もない。
【００２９】
実際には、２段膜乳化によりＷ／Ｏ型エマルションを経て、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションを作製してもよい。まず第1段乳化で、疎水性の多孔質ガラス膜を用いて、水溶性造影化
合物などを溶解した水溶液を、油性造影化合物で被覆する、またはその油相中に分散させることにより、単分散W／Oエマルションを調製する。単分散Ｗ／Ｏ型エマルションが確実に得られるという点でこの方法の方が望ましい。いずれの方法を用いてＷ／Ｏ型エマルシ
ョンを調製する場合にも、水相の浸透圧は、特に制限されないが、一般には0.01〜7.0  
ＭＰａ程度の範囲に調整すればよい。
【００３０】
このエマルションを第２段乳化において、第1段階のガラス膜よりも孔径が大きく、か
つ親水性のガラス膜に通過させることによりＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションが得られる。上記のようにして作製されたＷ／Ｏ型エマルションは、製剤助剤を必要に応じて含む水性分散媒中に加えて（Ｗ／Ｏ）／Ｗ型の３相乳化物を形成させる。外水相の浸透圧は、特に制限されないが、一般には0.1〜0. 7  ＭＰａ程度の範囲に調整すればよい。
【００３１】
膜乳化装置として、各種の装置（たとえば清本鐵工株式会社製）が市販されており使用することができる。
上記多孔質ガラス膜としては、公知のものが使用でき、たとえばシラス、ホウ酸、石灰を添加して形成されたガラスのミクロ相分離により製造されたガラス膜が示される。CaO-B2O3-SiO2-Al2O3系多孔質ガラス（特許第1504002号）、特許第1518989号および米国特許
第4657875号に開示されたCaO-B2O3-SiO2-Al2O3‐NaO2系多孔質ガラス、CaO-B2O3-SiO2-Al2O3‐MgO系多孔質ガラス、CaO-B2O3-SiO2-Al2O3‐ZrO2系多孔質ガラスなどが挙げられる
。
【００３２】
これら多孔質ガラスの細孔のサイズは、熱処理の条件を設定することにより、極めて均一に、しかも広範囲に調整できる。膜乳化法に使用する際には、上記多孔質ガラスの中でも、とりわけ相対累積細孔分布曲線において、細孔容積が全体の10%を占めるときの細孔
径を、細孔容積が全体の90%を占める場合の細孔径で割った値が、実質的に１〜1.5の範囲内にあるミクロ多孔膜体を使用することが好ましい。かかる膜は、特に細孔が均一であるためである。
【００３３】
圧入する際の圧力は、水相、油相の組成などに基づいて選択されるが、通常は、Pc >２γcosθ/r  (ただし、Pcは圧力、γは界面張力、θは接触角、rは多孔膜体細孔半径を示
す。)となる圧力を定めるのがよい。
【００３４】
膜乳化操作における温度は特に制限されないが、通常は０〜40℃とすればよい。その際、好ましくは多孔質ガラス膜の細孔が、油性造影剤の析出物または油相の凝固による閉塞などを起こさない間に膜乳化操作を終了する。好ましくは、恒温状態に保持する温度調節を行うのがよい。たとえばエマルション容器、多孔質ガラス膜モジュール、分散相容器などで構成される膜乳化装置全体を恒温とするか、ジャケット式の装置などを使用して所定の温度に制御する。
【００３５】
この工程は従来用いられてきた水中乾燥法なども利用できる。しかしながら、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションは、他のエマルションより構造が複雑なため、安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルション粒子を調製することが難しく、これが実用化の障害となっていた。膜乳化法を使用すれば、安定なＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションが生成し、しかもその生成率がほぼ１００％である。
【００３６】
引き続きエマルション粒子を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により未保持の薬剤を除去して精製してもよい。濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明の造影剤が調製される。
【００３７】
本発明の造影剤エマルション粒子の平均粒径は、通常0.05〜0.3μｍ、好ましくは0.05
〜0.2μｍ、より好ましくは0.05〜0.13μｍである。Ｘ線撮像の目的に応じて、粒径を適
切に設定することができる。たとえば腫瘍部分の選択的撮像目的の場合には、特に0.11〜
0.13μｍが好ましい。エマルション粒子の粒径を0.1〜0.2μｍ、より好ましくは0.11〜0.13μｍの範囲に揃えることにより癌組織へ選択的にＸ線造影剤を集中させることが可能となる（「ＥＰＲ効果」）。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、0.03〜0.08μｍ未満に比べて異常に大きく、約0.1μｍ〜約0.2μｍの大きさの分子でも血管壁から漏れ出る。ＥＰＲ効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものであるため、血中滞留性の向上が図られねばならない。本発明のＸ線造影剤は、特に大きい粒子を含まないため、細網系内皮細胞による捕獲の対象になりにくい。またエマルション粒子がいわば赤血球類似の姿と挙動をしていて腎臓を経由して速やかに排出されることはなく、さらにステルス（隠蔽）化されている場合には細網系内皮細胞に貪食されることもなく、血流中に比較的長くとどまる。
【００３８】
本発明の造影剤における水溶性造影化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。造影剤のコントラスト性能を規定する標的臓器へのヨウ素または近赤外蛍光化合物の必要な送達量は明らかにされている（たとえば特許２６１９０３７号公報）。X線造影剤を使用
した場合、ヨウド含有量として、通常、想定される10〜300mlの製剤溶液の投与量では、100〜500mgI／mlであり、好ましくは、150〜300mgI／mlである。近赤外蛍光造影剤の投与
量は、最終的に診断する部位を検出できる量であれば特に限定されず、使用する近赤外蛍光を発するシアニン系化合物の種類よって適宜増減できる。通常、想定される10〜300ml
の製剤溶液の投与量で、シアニン系化合物が0.1〜100ミリグラム／kg（体重）、好ましくは0.5〜20ｍｇ／kg（体重）となる範囲で投与できるよう調製される。
【００３９】
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおける水溶性造影化合物と前記油性造影化合物との含有質量比は、通常1：0.001〜1：0.2、好ましくは1：0.01〜1：0.1、より好ましくは1：0.01〜1：0.05である。内水相と外水相との体積比は、通常1:100〜1:0.1程度、好ましくは1:10
〜1:1の範囲である。内水相と油相との体積比は、通常1:0.001〜1:0.1程度、好ましくは1:0.01〜1:0.1の範囲である。これらの体積比は、水相、油相の種類などに応じて適宜設定できる。さらに前記水溶性造影化合物は、全造影化合物の50〜100質量％、好ましくは70
〜98質量％の造影化合物が油性造影化合物油膜により被覆されていることが望ましい。
【００４０】
Ｗ／Ｏ型エマルションにおける水相の浸透圧を、外水相となる水相の浸透圧以上の値とし、しかも得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションにおける内水相および外水相の浸透圧を、生理食塩水の浸透圧を超える値とすることが望ましい。これにより沈着性などに優れたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションの造影剤を得ることができる。得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションの内水相および外水相の浸透圧は、生理食塩水の浸透圧の通常1.1〜５倍（３７℃で0.75〜3.5ＭＰａ）とすることが望ましい。
【００４１】
本発明のＸ線検査用造影剤は、上記のようにエマルション粒子自体の安定性が向上しているために、製剤化工程における処理時、貯蔵・保管期間にもエマルション粒子内に造影物質が安定的に保持される。さらに造影剤の血中安定性も上記エマルション粒子内への内包により図られている。
エマルション造影剤
本発明の造影剤において内水相および外水相を構成する水性媒体には、蒸留水、局方注射用水、純水などの水のほか、生理食塩水、各種緩衝液、塩類などを含む水溶液などが好適に用いられる。製剤化に際し、必要に応じてさらに製剤助剤を内水相および／または外水相に含めてもよい。「製剤助剤」とは、製剤化に際し、造影物質とともに添加されるものであり、これまでの薬剤製造技術に基づいて各種の物質が適宜使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、キレート化剤、さらに必要に応じて、浸透圧調節剤、安定化剤、粘度調節剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、パラオキシ安息香酸メチ
ルといった保存剤、界面活性剤などが挙げられる。
【００４２】
Ｘ線検査用造影剤に残存する遊離ヨウ素イオンなどのトラップ剤として機能するキレート化剤を加えることが好ましい。そのようなキレート剤として製剤学的に使用が認められるEDTA、ＥＤＴＡNa2−Ca（エデト酸二ナトリウムカルシウム）、ＥＤＴＡNa2、ヘキサメタリン酸などが挙げられる。
【００４３】
本発明のＸ線検査用造影剤は、体内の浸透圧に対し、等張の溶液または懸濁液の形で調製される。そうした溶液もしくは懸濁液の媒質として、水、各種の緩衝液、たとえば水溶性アミン系緩衝剤、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸塩緩衝剤、酢酸系緩衝剤などを使用することができる。
【００４４】
上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。造影剤が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有する緩
衝液である。水溶性アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、具体的には、トリス、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエチルアミン、モルホリンなどが例示される。特に好ましくはトリス（TRIS）である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中の造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。したがって、注射用無菌造影剤を製造するためにオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。しかしオートクレーブ滅菌を適用できない場合には、ろ過滅菌を行なうのがよい。
【００４５】
等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。たとえば造影剤化合物の溶解性が低いために造影剤が単独では等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、たとえば塩化ナトリウムのごとき塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。
【００４６】
従来技術におけるマイクロカプセルの製造は、油相の溶剤として有機溶剤を使用している。すなわち親油性高分子、脂質、リン脂質、ステロール、レシチンといった脂質成分をほとんど例外なく、まず溶媒、たとえばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなどとともに容器中で、溶解、混合するこ
とにより調製されている。最終的には水中乾燥法により有機溶媒が除去される。このような調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。残存するこれらの有機溶媒を除去するために、多段階の工程および長時間の処理を要しているのが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒は、完全に除去することが困難であり、生体に及ぼす悪影響、具体的には副作用が懸念される。
【００４７】
本発明の方法においては、水溶性造影化合物を被覆するために油性造影剤の油膜を用いるか、あるいは油性造影化合物を溶解する溶媒として薬理的に許容される脂質類を使用し、そのまま油膜として利用する膜乳化法を用いているため、そうした残存する有機溶剤の問題はない。
【００４８】
本発明の造影剤において、必要に応じてその水相または油相に、薬理的に許容される水性または油性の界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤として人体に実質的に無害なものである限り、特に制限されない。これにはたとえば、市販の胆汁酸、レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが例示される。
【００４９】
本発明のＸ線造影剤を注射剤または点滴注入剤として、非経口的に、具体的には血管（
静脈、動脈）内投与、好ましくは静脈内投与により被験者に投与されＸ線照射により撮像される。近赤外蛍光造影剤は、血管内、経口内、腹腔内、皮下、皮内、膀胱内、気管（支）内などへ注射、注入、噴霧もしくは塗布などの手段により生体内に投与することができる。その用量は、従来のヨウド系造影剤または近赤外蛍光造影剤に準じる。油膜で被覆されたヨウドもしくは近赤外蛍光色素の総量、またはそれ以外のヨウドもしくは近赤外蛍光色素の総量の和が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。実際の診断的検査においては、本発明の造影剤を、コンピュータ断層撮影装置（CT）と組み合わせたＸ線撮影装置または近赤外蛍光撮影装置に使用することにより、その造影剤性能をさらに有効に発揮することも期待される。
〔実施例〕
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
＜試料１＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL、添加物として、トロメタモール1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液2gを内水相とした。油溶性造影剤リピオドールＵＦ0.2ｇを油相
とし、この油相に上記内水相を平均細孔径0.05μｍの多孔質ガラス膜を介して圧入分散し、25℃において膜乳化を行い、Ｗ／Ｏ型エマルションを得た。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、油性界面活性剤ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ（株）製）0.7ｇおよび生理食
塩水7ｇを外水相とし、平均細孔径0.1μｍの多孔質ガラス膜を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料１とした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.129μｍであった。
＜試料２＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL、添加物として、トロメタモール1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液2gを内水相とした。一方、乳化助剤としてグリコール脂質、SUNBRIGHT DSPE-020CN （日本油脂（株）製）0.06g、グリセロール脂質、コートソーム  MG-6060LS （日本油脂（株）製）0.04gを油溶性造影剤リピオドールＵＦ0.12ｇに分散混合し
たものを油相とし、この油相に上記内水相を少しずつホモジナイザーで激しく撹拌しながら加え、内水相が均一に油相に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得た。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL、添加物として、トロメタモール1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液7gを外水相とし、平均細孔径0.2μｍの多孔質ガラス膜
を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料２とした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.183μｍであった。
＜試料3＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
イオパミドール306.2mg/mL（ヨウド含有率150mg/mL、添加物として、トロメタモール1mg/mL、エデト酸カルシウム２ナトリウム0.1mg/mL、塩酸および水酸化ナトリウム（ｐＨ調整剤）適量を含有）溶液2gを内水相とした。一方、油性界面活性剤ＴＧＣＲ0.1ｇ、ＨＣ
Ｏ−４０  0.1ｇを油溶性造影剤リピオドールＵＦ0.2ｇに分散混合したものを油相とし、
この油相に上記内水相を少しずつホモジナイザーで激しく撹拌しながら加え、内水相が均一に油相に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得た。なお「ＴＧＣＲ」は、テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（「ＣＲ−３１０」阪本薬品工業(株)製）、「ＨＣＯ−４０」はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油「ＨＣＯ−４０」（日光ケミカルズ（株）製）をそれぞれ示す。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、油性界面活性剤ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ（株）製）0.7ｇおよび生理食
塩水7ｇを外水相とし、平均細孔径0.2μｍの多孔質ガラス膜を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料３とした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.281μｍであった。
【実施例２】
【００５１】
Ｘ線画像試験
家兎の皮下にＶＸ２カルシノーマの細胞浮遊液を移植した。移植２週間後に、実施例１で得た試料１〜３を家兎に静脈内注射し、注射後にＸ線画像で観察した。比較は、イオパミドール306.2mg/mLを注射したものを用いた。その結果、本発明の試料１〜３を用いた場合には、比較に対していずれも、家兎の移植部分の造影レベルが高く、造影レベルの低下速度は緩やかであった。
【実施例３】
【００５２】
近赤外蛍光造影剤の調製
以下の近赤外造影用蛍光色素、３種類を用意し、それぞれの濃度が0.5mg/mlとなるように各色素、50mgにリン酸緩衝液（PBS、ｐＨ7.4）を加えて100mlとした。得られた近赤外
造影剤溶液をＡ〜Ｃとした。
Ａ：インドシアニングリーン
Ｂ：化合物１（特開2000-95758号の実施例に使用されたNo.29の色素）
【００５３】
【化１】
2005263647.tif 000002
【００５４】
Ｃ：化合物２（特開2003-261464号の実施例に使用されたNo.7の色素）
【００５５】
【化２】
2005263647.tif 000003
【００５６】
なお、使用したリン酸緩衝液（PBS）は、以下の組成を有する（注射用水により最終1リットル（L）に仕上げた。）。
NaCl:8ｇ、  Na2HPO4・12H2O:2.9ｇ、  KCl：0.2ｇ、  KH2PO4：0.2ｇ
＜試料Ａ＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
近赤外造影剤溶液Ａ、2gを内水相とした。油溶性造影剤リピオドールＵＦ0.2ｇを油相
とし、この油相に上記内水相を平均細孔径0.05μｍの多孔質ガラス膜を介して圧入分散し、25℃において膜乳化を行い、Ｗ／Ｏ型エマルションを得た。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、油性界面活性剤ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ（株）製）0.7ｇおよび生理食
塩水7ｇを外水相とし、平均細孔径0.1μｍの多孔質ガラス膜を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料Ａとした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.132μｍであった。
＜試料Ｂ＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
近赤外造影剤溶液Ｂ、2gを内水相とした。一方、乳化助剤としてグリコール脂質、SUNBRIGHT DSPE-020CN （日本油脂（株）製）0.06g、グリセロール脂質、コートソーム  MG-6060LS （日本油脂（株）製）0.04gを油溶性造影剤リピオドール0.12ｇに分散混合したも
のを油相とし、この油相に上記内水相を少しずつホモジナイザーで激しく撹拌しながら加え、内水相が均一に油相に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得た。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、近赤外造影剤溶液Ｂ、7gを外水相とし、平均細孔径0.2μｍの多孔質ガラス膜
を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料Ｂとした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.177μｍであった。
＜試料Ｃ＞
Ｗ／Ｏ型エマルション
近赤外造影剤溶液Ｃ、2gを内水相とした。一方、油性界面活性剤ＴＧＣＲ0.1ｇ、ＨＣ
Ｏ−４０  0.1ｇを油溶性造影剤リピオドール0.2ｇに分散混合したものを油相とし、この油相に上記内水相を少しずつホモジナイザーで激しく撹拌しながら加え、内水相が均一に油相に分散したＷ／Ｏ型エマルションを得た。なお「ＴＧＣＲ」は、テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル（「ＣＲ−３１０」阪本薬品工業(株)製）、「ＨＣＯ−４０」はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油「ＨＣＯ−４０」（日光ケミカルズ（株）製）をそれぞれ示す。
Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション
次いで、油性界面活性剤ＨＣＯ−６０（日光ケミカルズ（株）製）0.7ｇおよび生理食
塩水7ｇを外水相とし、平均細孔径0.2μｍの多孔質ガラス膜を介して前記であらかじめ調製したＷ／Ｏ型エマルションを圧入分散し、25℃において膜乳化を行った。その結果、得られたＷ／Ｏ／Ｗ型エマルションを試料Ｃとした。凍結破砕法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察によって評価したエマルションの平均粒径は0.265μｍであった。
【実施例４】
【００５７】
蛍光造影試験
蛍光励起光源としてチタン・サファイアレーザーを使用した。照射の分散が２％以内になるようにリングタイプの光ガイド（住田光学グラス社）を用いて、試験用家兎にレーザー光を均一に照射した。照射出力は家兎の皮膚表面付近で約36μW/cm2になるように調整
した。蛍光は各化合物の最大励起波長で励起させ、家兎からの蛍光放射をＣＣＤカメラ（
Ｃ４８８０，浜松フォトニクス社）を用いて、短波長カットフィルターを通して検出および造影した。カットフィルターは、化合物の励起波長（800〜900nm）に適合するように選択した。また、照射時間は各化合物の蛍光強度によって調整した。近赤外造影剤溶液の投与後に、家兎をジエチルエーテルで麻酔し、家兎全身の蛍光イメージを造影した。センサーは蛍光光度計（日本分光FP-750）のフォトダイオード（波長範囲220〜730nm）を使用した。
【００５８】
家兎の皮下にＶＸ２カルシノーマの細胞浮遊液を移植した。移植２週間後に、実施例３で得た試料Ａ〜Ｃを家兎に静脈内注射し、注射後に上記蛍光造影試験で画像を観察した。比較は、インドシアニングリーンを用いた。その結果、本発明の試料Ａ〜Ｃを用いた場合には、比較に対していずれも、家兎の移植部分の造影レベルが高く、造影レベルの低下速度は緩やかであった。