(57)【要約】【課題】  紫外線照射や乾燥刺激をはじめとする外部刺激により発症する皮膚炎症の抑制・改善のための手段の提供を課題とする。【解決手段】  本発明は、細胞のＡＴＰ受容体にＡＴＰ受容体アンタゴニストを作用させてブロックすることにより、該細胞の炎症性サイトカイン、特にインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び／又はインターロイキン−８（ＩＬ−８）の遊離を阻害することで炎症を改善及びその発症を抑制することを特徴とする方法及び組成物を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のＡＴＰ受容体にＡＴＰ受容体アンタゴニストを作用させて該受容体をブロックし、該細胞の炎症性サイトカインの遊離を阻害することで炎症を抑制することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記炎症性サイトカインがインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び／又はインターロイキン−８（ＩＬ−８）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記炎症が紫外線照射又は乾燥刺激による皮膚炎症である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が表皮角化細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＴＰ受容体アンタゴニストがＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
炎症を抑制するための医薬組成物又は化粧組成物であって、細胞のＡＴＰ受容体に作用して該細胞の炎症性サイトカインの遊離を阻害するのに有効な量のＡＴＰ受容体アンタゴニストを含有することを特徴とする医薬組成物又は化粧組成物。
【請求項７】
前記炎症性サイトカインがＩＬ−６及び／又はＩＬ−８である、請求項６記載の医薬組成物又は化粧組成物。
【請求項８】
前記炎症が紫外線照射又は乾燥刺激による皮膚炎症である、請求項６又は７記載の医薬組成物又は化粧組成物。
【請求項９】
前記細胞が表皮角化細胞である、請求項６〜８のいずれか１項記載の医薬組成物又は化粧組成物。
【請求項１０】
前記ＡＴＰ受容体アンタゴニストがＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２である、請求項５〜９のいずれか１項記載の医薬組成物又は化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のＡＴＰ受容体にＡＴＰ受容体アンタゴニストを作用させてブロックすることにより、該細胞の炎症性サイトカイン、特にインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及び／又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の遊離を阻害することで炎症を改善及びその発症を抑制することを特徴とする方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線照射、乾燥、化学薬剤暴露をはじめとする外部刺激は皮膚にさまざまなダメージを与える。特に紫外線照射による炎症を伴って肌が赤くなる状態（サンバーン）は、痛みやほてりを生じるだけでなく、重度の場合には、やけどと同じような火ぶくれを起こすこともある。
【０００３】
紫外線をはじめとする様々な外部刺激による炎症の原因の一つに、活性酸素やフリーラジカルの産生が挙げられる。活性酸素やフリーラジカルが皮膚で発生すると、細胞にダメージを与え、サンバーンセル（日やけ細胞）が形成されたり、遺伝子が傷ついたりし（ＤＮＡの損傷）、また長期間にわたってＤＮＡの損傷が蓄積されると、皮膚がんを発生させることもある。そのため、抗酸化作用を有する薬剤、生薬などが肌炎症を抑えるのによく利用されている。その他、抗炎症作用を有するステロイドや保湿効果を発揮する各種保湿剤、動物・植物エキスも炎症を鎮めるのに使用されている。
【０００４】
【特許文献１】特表平１１−５１５０２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、紫外線照射をはじめとする外部刺激により発症する皮膚炎症の抑制・改善を、従来の抗炎症メカニズムとは全く異なる新たな切り口から提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
テープストリッピングに代表される機械的刺激や細胞を破壊するなどの外部刺激により傷害を受けた細胞からＡＴＰが放出され、その遊離ＡＴＰがＡＴＰ受容体に結合することで情報伝達が行われていることはよく知られている（Pain 95(2002)41-47, S.P.Cook and E.W.McClesky; M.Denda, K.Inoue, S.Fuziwara, S.Denda, J.Invest.Dermatol. 119(2002)1034-1040）。しかしながら、放出されるＡＴＰと炎症との関係について注目し、解明した研究報告は存在しない。本発明者は驚くべきことに、表皮角化細胞にＡＴＰが作用することにより炎症性サイトカインたるＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ、ＩＬ−１αが遊離されることを見出した。そして、表皮角化細胞のＡＴＰ受容体をブロックすることで、サイトカインの遊離を抑制できることも見出した。ＡＴＰの生体内エネルギー代謝や情報伝達における関与は知られているが、炎症との関与については従来において全く解明されていない点、この事実は驚くべきものである。
【０００７】
従って、第一の観点において、本発明は、細胞のＡＴＰ受容体にＡＴＰ受容体アンタゴニストを作用させて該受容体をブロックし、該細胞の炎症性サイトカインの遊離を阻害することで炎症を抑制することを特徴とする方法を提供する。ＡＴＰ受容体は好ましくは細胞膜上にある。
【０００８】
第二の観点において、本発明は、炎症を抑制するための医薬組成物又は化粧組成物であって、細胞のＡＴＰ受容体に作用して該細胞の炎症性サイトカインの遊離を阻害するのに有効な量のＡＴＰ受容体アンタゴニストを含有することを特徴とする医薬組成物又は化粧組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、従来技術には全く新たな手段による、例えば副作用のない、より有効な外部刺激による炎症の治療・改善が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上述のとおり、本発明は、細胞のＡＴＰ受容体にＡＴＰ受容体アンタゴニストを作用させてブロックすることにより、該細胞の炎症性サイトカインの遊離を阻害することで炎症の発症を抑制することを特徴とする方法及び組成物を提供する。ここでいうＡＴＰ受容体とは、哺乳動物細胞、好ましくは角層、表皮、基底膜、真皮等を構成する皮膚細胞、例えば角化細胞の表層において存在する。
ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）は、全ての細胞内のミトコンドリアにおいて合成され、生体反応のエネルギー供給源となっているが、細胞間の情報伝達物質として機能することも明らかになってきている。そのＡＴＰが結合する受容体が１９９３年にクローニングされたが、その特性によりイオンチャネル内蔵型（Ｐ２Ｘｎ）とＧ蛋白共役型（Ｐ２Ｙｎ）に大別される。現在、Ｐ２Ｘｎは７種類のサブタイプ、Ｐ２Ｙｎは９種類のサブタイプに分けられる。ヒト表皮角化細胞に発現するサブタイプは、Ｐ２Ｙ系はＰ２Ｙ１，Ｐ２Ｙ２，Ｐ２Ｙ４，Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｘ系はＰ２Ｘ５，Ｐ２Ｘ７が存在し、マウスではＰ２Ｘ３の発現が報告されている。（参考文献  Greig A V H, Linge C, Terenghi G, McGrouther, Burnstock G.Purinergic receptors are part of a functional signaling system for proliferation and differentiation of human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol 2003: 120: 1007-1015; Dixon C J, Bowler W B, Littlewood-Evans A, Dillon J, Bilbe G, Sharpe G R, Gallagher. Regulation of epidermal homeostasis through P2Y2 receptors. Br J Pharmacol 1991: 127: 1680-1686; Denda M, Inoue K, Fuziwara S, Denda S. P2X purinergic receptor antagonist accelerates skin barrier repair and prevents epidermal hyperplasia induced by skin barrier disruption. J Invest Dermatol 2002: 119: 1034-1040; Burrell H E, Bowler W B, Gallagher J A, Sharpe G R. Human keratinocytes express multiple P2Y-receptors: Evidence for fuctional P2Y1, P2Y2, and P2Y4 receptors. J Invest Dermatol 2003: 120: 440-447.）ここでいう哺乳動物には、ヒトをはじめとして、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギなど様々な種が挙げられる。
【００１１】
ＡＴＰ受容体アンタゴニストとしては様々な天然及び合成化合物、例えばＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ（アントラキノンスルホン酸誘導体）２、スラミン、ＰＰＡＤＳ（ピリドキサルホスフェート−６−アゾフェニル  ２'，４’−ジスルホン酸）、ＴＮＰ−ＡＴＰ（トリニトロフェニル−ＡＴＰ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ，ＩＰ５Ｉなどが挙げられる。本発明において特に有効なＡＴＰ受容体アンタゴニストはＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２である。
【００１２】
本発明の方法及び組成物により細胞からの遊離を抑制すべき炎症性サイトカインは、ＡＴＰが細胞上のＡＴＰ受容体に結合することで該細胞から遊離し、その結果炎症を引き起こすことで知られるサイトカイン、好ましくはインターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）である。その他の炎症性サイトカインとしては、例えばインターロイキン−１α，β、インターロイキン−１８、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が考えられる。
【００１３】
本発明でいう炎症とは、好ましくは外部刺激、例えば紫外線照射刺激、乾燥刺激、熱刺激（加熱及び冷却）、化学薬剤刺激、浸透圧刺激、酸化刺激等のストレスを原因とする皮膚炎症を意味する。より好ましくは、炎症は紫外線照射又は乾燥刺激による皮膚炎症である。
【００１４】
本発明に係る炎症を改善し・発症を抑制する方法は、ＡＴＰ受容体アンタゴニスト、好ましくはＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２を含有する組成物を炎症患部に適用することにより実施することができる。かかる組成物は医薬組成物として、又は化粧料として、例えば皮膚外用剤として炎症患部に適用してよい。
【００１５】
本発明に係る医薬又は化粧組成物は、通常、上記ＡＴＰ受容体アンタゴニスト、好ましくはＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２を水やエタノール等の水性溶媒に含有させて用いられる。本発明に係るＡＴＰ受容体アンタゴニストの配合量は特に限定されないが、例えば１μＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１００μＭ程度の範囲の濃度の溶液として適用される。尚、本発明に係る薬剤を入浴剤として調製する場合、使用時に通常100〜1000倍程度に希釈されるので、配合はそれを加味した高濃度で処方されるのが好ましい。上記水性溶媒としては、低級アルコールが好ましく、低級アルコールの含有量は、本発明の組成物中に、20〜80質量％、さらに好ましくは40〜60質量％である。
【００１６】
また、本発明に係る医薬又は化粧組成物は、上記必須成分たるＡＴＰアンタゴニスト以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００１７】
その他、組成物の用途に合わせ、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ類なども適宜配合することができる。
【００１８】
本発明に係る医薬又は化粧組成物は、その用途に合わせ、例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等の外用剤、例えば化粧水、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤、軟膏、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス、養毛・育毛剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
【実施例】
【００１９】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【００２０】
材料と方法
（１）正常ヒト皮膚表皮細胞の培養
市販の表皮角化細胞（クラボウ社製）をその操作書に従い、ＫＧＭ−２培地（クラボウ社製）にて培養を行った。細胞は１２穴プレートに１ウェルあたり１．５×１０5個となるように播種した。
【００２１】
（２）培養上清液中のサイトカイン（ＩＬ−６,ＩＬ−８，ＩＬ−１α，ＴＮＦ）の測定
細胞を播種した翌日に１２穴プレートの培地を捨て、新しい培地に溶解した試験液を２ｍｌ入れ、２４時間後に培養上清液を採取した。採取した上清液内のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１α、ＴＮＦは、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００２２】
（３）紫外線照射の条件
培地を捨てた後にＰＢＳ（−）を入れ、ＵＶＢを強度３０又は６０ｍＪ／ｃｍ2となるように照射した。照射後、ＰＢＳ（−）を捨て、培地又は培地に溶解した試験液２ｍｌを入れ、２４時間後に培養上清液を採取した。
【００２３】
（４）ＲＮＡの調整とｃＤＮＡの作製
表皮角化細胞を試験験液で処置し、６時間後の細胞を使用した。細胞の全ＲＮＡは、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を加え、その操作書に従って抽出した。ＲＮＡ１μｇを鋳型としてＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを作製した。
【００２４】
（５）蛍光プローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ法（Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲ法）による遺伝子発現の定量
得られたｃＤＮＡをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、本装置操作書に従い遺伝子発現をＴａｑｍａｎ−ＰＣＲ法により、特開平１１−３２７９９号公報に記載の項１１にして定量的に解析した。得られた結果は内部標準のヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ）の発現量で補正した。
【００２５】
（６）Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲ法のためのプライマー及び蛍光プローブ（Ｔａｑｍａｎ  プローブ）の配列
IL-6     forward primer 5' GAACTCCTTCTCCACAAGCG 3'
IL-6     reverse primer 5' AGATGCCGTCGAGGATGTA 3'
probe                   5' TTCGTTCTGAAGAGGTGAGTGGCTG 3'
IL-8     forward primer 5' TCAGAGACAGCAGAGCACACA 3'
IL-8     reverse primer 5' CTCGGCAGCCTTCCTGATT 3'
probe                   5' AACATGACTTCCAAGCTGGCCA 3'
GAPDH    forward primer 5' GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 3'
GAPDH    reverse primer 5' GAAGATGGTGATGGGATTTC 3'
probe                   5' AGGCTGAGAACGGGAAGCTTG 3'
【００２６】
（７）紫外線照射後のＡＴＰ遊離測定
紫外線は、光源としてＵＶＢを用い、１０〜２００ｍＪ／ｃｍ2の強度を照射した。細胞培養した１２穴プレートの培地を捨てた後にＰＢＳ（−）を入れ、ＵＶＢを強度３０又は６０ｍＪ／ｃｍ2と成るように照射した。照射後、直ちに細胞上清液１００μｌを採取し、ＡＴＰ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）を用い、操作書に従って溶液中のＡＴＰを発光測定により定量した。
【００２７】
（８）Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２による炎症抑制効果確認試験
ＨＲ−１マウスを乾燥環境下（＜１０％ＲＨ）で４８時間飼育した後、背部皮膚をアセトン処理することによって皮膚バリアー機能を破壊し、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １ｍＭを塗布した。対照動物は水を塗布した。さらに４８時間後に両動物の背部皮膚を採取した。皮膚組織はホルムアルデヒドにより固定しヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を行い光学顕微鏡にて観察を行った。
【００２８】
実験１
（１）ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−６遊離量測定
培養液に溶解したＡＴＰ（１０μＭ〜１ｍＭ）を試験液として表皮角化細胞に適用し、２４時間後の培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットにより炎症性サイトカインＩＬ−６の測定を行った。その結果を図１に示す。
図１に示すように、ＡＴＰの添加により濃度に比例してＩＬ−６が有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞をＡＴＰ処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるRｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２（ＡＬＥＸＩＳ社製  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃ．Ａ．ＵＳＡ）３０μＭ〜１００μＭにより予め前処置してからＡＴＰを添加すると、ＡＴＰによるＩＬ−６増加が有意に抑制された。その結果も図１に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−６遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＩＬ−６遊離増加は、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体を介することが明らかとなった。
【００２９】
実験２
（２）ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−８遊離量測定
培養液に溶解したＡＴＰ（１０μＭ〜１ｍＭ）を試験液として表皮角化細胞に適用し、２４時間後の培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットにより炎症性サイトカインＩＬ−８の測定を行った。その結果を図２に示す。
図２に示すように、ＡＴＰの添加により濃度に比例してＩＬ−８が有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞をＡＴＰ処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  ３０μＭ〜１００μＭにより予め前処置してからＡＴＰを添加すると、ＡＴＰによるＩＬ−８増加が有意に抑制された。その結果も図２に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−８遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＩＬ−８遊離増加は、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体を介することが明らかとなった。
【００３０】
実験３
（３）ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−１α遊離量測定
培養液に溶解したＡＴＰ（１０μＭ〜１ｍＭ）を試験液として表皮角化細胞に適用し、２４時間後の培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットにより炎症性サイトカインＩＬ−１αの測定を行った。その結果を図３に示す。
図３に示すように、ＡＴＰの添加により濃度に比例してＩＬ−１αが有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞をＡＴＰ処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるRｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １００μＭにより予め前処置してからＡＴＰを添加すると、ＡＴＰによるＩＬ−１α増加が有意に抑制された。その結果も図３に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−１α遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＩＬ−１α遊離増加は、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体を介することが明らかとなった。
【００３１】
実験４
（４）ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＴＮＦα遊離量測定
培養液に溶解したＡＴＰ（１０μＭ〜１ｍＭ）を試験液として表皮角化細胞に適用し、２４時間後の培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットにより炎症性サイトカインＴＮＦαの測定を行った。その結果を図４に示す。
図４に示すように、ＡＴＰの添加により濃度に比例してＴＮＦαが有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞をＡＴＰ処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるRｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １００μＭにより予め前処置してからＡＴＰを添加すると、ＡＴＰによるＴＮＦα増加が有意に抑制された。その結果も図４に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＴＮＦα遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＴＮＦα遊離増加は、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体を介することが明らかとなった。
【００３２】
実験５
（５）ＡＴＰによるＩＬ−６の遺伝子発現とＡＴＰ受容体アンタゴニストの効果
実験（１）のＡＴＰを作用させた表皮角化細胞についてＲＴ−ＰＣＲ法（Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲ法：特開平１１−３２７９９号公報）によりＩＬ−６遺伝子発現の定量をしたところ、図５に示すとおり、未刺激細胞（コントロール）と比較し、ＡＴＰ（３０〜１０００μＭ）により濃度依存式にＩＬ−６の発現が有意に増加することが確認された。そして、図６に示すとおり、ＡＴＰによるＩＬ−６遺伝子発現の増加が、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２（１００μＭ）により有意に抑制されることもＰＣＲ法により確認された。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−６遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＩＬ−６遊離増加は、Ｐ２Ｙ受容体を介することが確認された。
【００３３】
実験６
（６）ＡＴＰによるＩＬ−８の遺伝子発現とＡＴＰ受容体アンタゴニストの効果
実験（２）のＡＴＰを作用させた表皮角化細胞についてＲＴ−ＰＣＲ法（Ｔａｑｍａｎ−ＰＣＲ法）によりＩＬ−８遺伝子発現の定量をしたところ、図７に示すとおり、未刺激細胞（コントロール）と比較し、ＡＴＰ（３０〜１０００μＭ）により濃度依存式にＩＬ−８の発現が有意に増加することが確認された。そして、図８に示すとおり、ＡＴＰによるＩＬ−８遺伝子発現の増加が、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２（１００μＭ）により有意に抑制されることもＰＣＲ法により確認された。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−８遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、ＡＴＰ適用によるＩＬ−８遊離増加は、Ｐ２Ｙ受容体を介することが確認された。
【００３４】
実験７
（７）紫外線照射後のＡＴＰ遊離測定
紫外線刺激により表皮角化細胞からＡＴＰが培地中に遊離することを確認すべく、紫外線照射強度を変えて調べたところ、図９に示すように紫外線強度６０ｍＪ／ｃｍ2をピークにして、ＡＴＰの遊離が認められた。従って、細胞に紫外線刺激を与えることで、ＡＴＰが遊離することが確認できた。
【００３５】
実験８
（８）紫外線照射後のサイトカインＩＬ−６の遊離に対するＡＴＰアンタゴニストの効果
紫外線照射して２４時間経過後の表皮角化細胞培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットによりＩＬ−６の測定を行った。その結果を図１０に示す。図１０からわかるとおり、紫外線照射強度に比例してＩＬ−６が有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞を紫外線照射処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １００μＭにより予め前処置してから紫外線照射すると、紫外線照射によるＩＬ−６増加が有意に抑制された。その結果も図１０に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−６遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、紫外線照射によるＩＬ−６遊離増加に対し、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体アンタゴニストは有効であることが明らかとなった。
【００３６】
実験９
（９）紫外線照射後のサイトカインＩＬ−８の遊離に対するＡＴＰアンタゴニストの効果
紫外線照射して２４時間経過後の表皮角化細胞培養上清液を採取し、ＥＬＩＳＡキットによりＩＬ−８の測定を行った。その結果を図１１に示す。図１１からわかるとおり、紫外線照射強度に比例してＩＬ−８が有意に増加した。さらに、上記表皮角化細胞を紫外線照射処理する１０分前にＡＴＰ受容体のサブタイプのＰ２Ｙ受容体アンタゴニストであるＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １００μＭにより予め前処置してから紫外線照射すると、紫外線照射によるＩＬ−８増加が有意に抑制された。その結果も図１１に示す。尚、ＡＴＰ受容体アンタゴニストで知られるスラミンによりＲｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２と同様に細胞を前処置しても、ＡＴＰ適用によるＩＬ−８遊離の増加は同様に抑制された（データーは示さない）。これにより、表皮角化細胞において、紫外線照射によるＩＬ−８遊離増加に対し、ＡＴＰ受容体サブタイプＰ２Ｙ受容体アンタゴニストは有効であることが明らかとなった。
【００３７】
実験１０
（１０）Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２の炎症抑制効果
乾燥環境下（＜１０％ＲＨ）アセトン処理によるバリヤー破壊により、図１２図上段に示すようにＨＥ染色像から表皮の増殖性異常が亢進しているのが観察された。下段はバリアー破壊後にｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｌｕｅ  ２  １ｍＭを塗布することにより、増殖性異常が抑制されているのが認められた。紫外線刺激だけでなく乾燥環境下によるバリアー破壊刺激にもＰ２Ｙ受容体アンタゴニストは有効であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＥＬＩＳＡによる、ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−６遊離量の測定及びＲｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２によるＩＬ−６の遊離に対する阻害効果の検討結果。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸は培養上清液中のＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡによる、ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−８遊離量の測定及びＲｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２によるＩＬ−８の遊離に対する阻害効果の検討結果。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸は培養上清液中のＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡによる、ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＩＬ−１α遊離量の測定及びＲｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２によるＩＬ−１αの遊離に対する阻害効果の検討結果。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸は培養上清液中のＩＬ−１αの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図４】ＥＬＩＳＡによる、ＡＴＰによる表皮角化細胞からのＴＮＦα遊離量の測定及びＲｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２によるＴＮＦαの遊離に対する阻害効果の検討結果。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸は培養上清液中のＴＮＦαの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図５】ＰＣＲ法による、ＡＴＰの添加が細胞のＩＬ−６遺伝子発現に及ぼす効果の検討結果。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子発現量で補正した培養上清液中のＩＬ−６遺伝子発現量を示す。
【図６】ＰＣＲ法による、ＡＴＰ受容体アンタゴニスト処理がＩＬ−６遺伝子発現に及ぼす効果の検討。縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子発現量で補正した培養上清液中のＩＬ−６遺伝子発現量を示す。
【図７】ＰＣＲ法による、ＡＴＰの添加が細胞のＩＬ−８遺伝子発現に及ぼす効果の検討。横軸はＡＴＰ濃度（μＭ）、縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子発現量で補正した培養上清液中のＩＬ−８遺伝子発現量を示す。
【図８】ＰＣＲ法による、ＡＴＰ受容体アンタゴニスト処理がＩＬ−８遺伝子発現に及ぼす効果の検討。縦軸はＧＡＰＤＨ遺伝子発現量で補正した培養上清液中のＩＬ−８遺伝子発現量を示す。
【図９】紫外線刺激による表皮角化細胞からのＡＴＰの遊離の確認実験の結果。横軸は紫外線（ＵＶＢ）強度（ｍＪ／ｃｍ2）、縦軸は培養上清液中のＡＴＰの濃度（ｎＭ）を示す。
【図１０】紫外線照射後のサイトカインＩＬ−６の遊離に対するＡＴＰアンタゴニストの効果の検討。縦軸は培養上清液中のＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図１１】紫外線照射後のサイトカインＩＬ−８の遊離に対するＡＴＰアンタゴニストの効果の検討。縦軸は培養上清液中のＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図１２】乾燥環境下（＜１０％ＲＨ）、アセトン処理ＨＲ−１マウスにおける水塗布（上段）及びＲｅａｃｔｉｖｅ ｂｌｕｅ ２  １ｍＭ塗布（下段）のＨＥ染色による皮膚組織像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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