(57)【要約】      （修正有）【課題】良好な加工性を備えた複数回の測定に使用することのできる明確な透過性を有する膜を提供する。【解決手段】酵素に基づくセンサーに供される拡散膜、拡散膜を備えるセンサー、ならびに物質特に酵素基質(例えば、グルコース)の検出および/または定量を行うための酵素に基づくセンサーの使用に関し、この膜は、少なくとも１種のポリマー材料と、少なくとも１種のポリマー材料中に分散された細孔形成粒子と、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素に基づくセンサーに利用するための拡散膜であって、
(a) 少なくとも１種のポリマー材料、および
(b) 前記少なくとも１種のポリマー材料中に分散された細孔形成粒子
を含む、前記拡散膜。
【請求項２】
前記細孔形成粒子のサイズが0.5〜100μmである、請求項１に記載の拡散膜。
【請求項３】
前記細孔形成粒子が0.5〜70重量%の量で存在する、請求項１または２に記載の拡散膜。
【請求項４】
前記細孔形成粒子が珪藻土を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の拡散膜。
【請求項５】
膜の厚さが0.5〜1000μmである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の拡散膜。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の拡散膜を備える、酵素に基づくセンサー。
【請求項７】
(i) 少なくとも１つの酵素層、
(ii) カバー層、および
(iii) 少なくとも１つの下層
をさらに備える、請求項６に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項８】
前記拡散膜が前記カバー層である、請求項６または７に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項９】
前記拡散膜が下層上に直接コーティングされている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項１０】
前記拡散膜が物理的接着により下層に付着している、請求項６〜９のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項１１】
前記拡散膜が酵素層上に直接コーティングされている、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項１２】
光センサーである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項１３】
電気化学センサーである、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサー。
【請求項１４】
酵素基質および/または共基質の検出および/または定量のための、請求項６〜１３のいずれか１項に記載の酵素に基づくセンサーの使用。
【請求項１５】
前記酵素基質がグルコースである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記定量が血液で行われる、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
複数回の測定が行われる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
酵素に基づくセンサーを製造する方法であって、
(i) (a) 少なくとも1種のポリマー材料、および
(b) 細孔形成粒子
を含む分散体を形成するステップと、
(ii) 前記分散体を下層上に直接キャスティングして拡散膜を形成するステップと、
(iii) 場合により、前記分散体を乾燥させるステップと
を含む、上記方法。
【請求項１９】
前記分散体を物理的接着により前記下層に付着させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分散体を酵素層上に直接キャスティングする、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素に基づくセンサーに供される拡散膜、拡散膜を備えるセンサー、酵素に基づくセンサーの製造方法、ならびに物質、特に酵素基質(例えば、グルコース)の検出および/または定量を行うための酵素に基づくセンサーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素に基づくセンサーは、血液中および他の体液中の対象物質を定量的および定性的に測定するために広く使用されている。酵素に基づくセンサーは、特に、酵素基質を測定するために使用されている。酵素に基づくセンサーでは、いわゆるセンシング反応(当技術分野では、「トランスデューサー反応」と呼ばれることもある)が行われる。この反応では、物質が、少なくとも1種の酵素の関与下で、直接的または間接的に検出することのできる他の物質に変換される。そのようなセンシング反応の例は、グルコースの酵素触媒酸化である。通常、この反応では、電子受容体として酸素が使用される。反応の過程で、グルコースはグルコノラクトンに変換され、酸素は過酸化水素に変換される。センシング反応により、グルコースおよび酸素の消費または過酸化水素もしくはグルコノラクトンの生成のいずれかを測定することが可能である。
【０００３】
酵素に基づくセンサーは、通常、いくつかの層、特に、酵素層と、カバー膜または外層とを備える。このカバー膜は、サンプルに直接接触し、センシング反応に必要な物質、特に酵素基質または共基質の拡散を制限する。
【０００４】
酵素に基づくセンサーは、電気化学センサーとして、または光センサー(オプトード)として提供することができる。グルコースオプトードの構成および機能については、例えば、特許文献１に記載されている。電気化学グルコースセンサーの構成および機能については、例えば、特許文献２に記載されている。
【０００５】
特に、グルコース、ラクテート、またはクレアチニンを測定するために使用される酵素に基づくセンサーは、好ましくは、オキシドレダクターゼを用いて構成され、検出は、酸素の消費量に基づく。この場合、カバー膜は、酵素基質と酸素の両方の透過を制御するポーラスな高分子膜または少なくとも透過性の高分子膜でなければならないという要件が、センサーに課せられる。
【０００６】
酵素に基づくセンサーに利用するための現在入手可能な拡散膜には、種々の欠点がある。当技術分野で公知の一方法によれば、酵素に基づくセンサーに利用するためのカバー膜は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、およびポリエステルのような非水和性ポリマーから得られるマイクロポーラス構造からなる予備成形された膜である。そのような膜のポロシティーは、物理的手段により、例えば、中性子またはアルゴントラックエッチングにより提供される。グルコースおよび酸素は、主に、血液また他の体液で満たされたこれらの細孔の中を通ってそのような膜を通過する。1つの主要な欠点は、そのような膜が予備成形されたものであり、キャスタブルではないという点である。予備成形膜を酵素層に付着させなければならない。ほとんどの場合、膜は、機械的に酵素層に付着される。そのような機械的付着は高価であり、技術的に複雑である。気泡を生成させることなく下層に+膜を適用することが容易に行えるようにならないかぎり、さらなる問題を生じる。例えば、下層に膜を接着剤で接着するときにも、同じような問題を生じる。
【０００７】
当技術分野で公知の他の方法では、カバー膜はキャスタブルである。そのようなカバー膜は、一般的には、ポリマーの溶液を酵素層に塗布して溶媒を蒸発させることにより形成される。そのような膜は、親水性領域と疎水性領域とを有するポリマー構造からなる。水に暴露されると、膜の親水性領域は、水を吸収するので、膨潤構造をとって、例えば、グルコースに対する透過経路を提供する。しかしながら、それらの膜は、明確なポロシティーを提供しない。この方法では、ポリマー自身が透過性を提供しなければならないので、すべてのポリマーが適しているとは限らず、したがって、ポリマーの選択に限界がある。
【０００８】
1つの欠点は、キャスタブル膜の使用に好適であるポリマーが、多くの場合、刺激性または毒性の溶媒にのみ可溶であるという点である。この例としては、DMSOおよびアセトンに可溶であるセルロースアセテートならびにテトラヒドロフランおよびシクロヘキサノンに可溶であるPVCが挙げられる。こうした状況は、安全上の理由だけではなく、酵素層中に存在する酵素がこれらの溶媒により破壊されるおそれがあるという点とも関連する。さらに、そのような膜の有効性は、疎水性マトリックス内の親水性ドメインの分散に依存する。膜の製造プロセス全体にわたり均一な分散を達成することは難しいので、結果として、親水性ドメインの不均一な分布を生じる。このため、例えば、再現性が不十分になる。
【０００９】
Offenbacherら（特許文献３）は、より良好なコーティング再現性を有するカバー膜について記載している。この膜は、親水性コポリマー成分を存在させることにより透過性の調節をきわめて満足に行いうるPVCコポリマーで作製される。しかしながら、センサーの酸素リザーバーの再生が非常に遅いので、酸素の消費に基づくセンサーに使用する場合、そのようなPVCカバー膜は複数回の測定には、限界がある。
【特許文献１】米国特許第6,107,083号明細書
【特許文献２】国際公開第99/30152号パンフレット
【特許文献３】米国特許第6,214,185号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、酵素に基づくセンサーに利用するための膜に関連した上記の欠点を少なくとも部分的に克服することである。特に、良好な加工性を備えたキャスタブル膜を提供することが目的である。さらなる目的は、複数回の測定に使用することのできる明確な透過性を有する膜を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、酵素に基づくセンサーに利用するための拡散膜に関する。この膜は、(a)少なくとも1種のポリマー材料と、(b)該少なくとも1種のポリマー材料中に分散された細孔形成粒子(pore maker particles)と、を含む。
【００１２】
本発明に係る膜は、1種以上のポリマー材料中に分散された細孔形成粒子を含む。膜のポロシティーは、細孔形成粒子により提供される。したがって、透過性またはポロシティーの観点からみて、ポリマーを選択するうえでの制限はない。
【００１３】
本発明の拡散膜に使用されるポリマー材料は、一般的には、いかなるキャスタブルポリマー材料またはポリマー材料の混合物であってもよい。例えば、意図した用途に合せて、無毒の材料または容易に適用可能な材料を使用することができる。
【００１４】
好ましいポリマー材料は、非水溶性ポリマーよりなる群から選択され、好ましくは、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルエステル、およびコポリマー（例えば、ブタジエンとスチレンとのコポリマー）から選択される。
【００１５】
ポリマー材料に関してさまざまな選択の可能性があるので、再現性よく直接コーティングしうるキャスタブル拡散膜を容易に提供することができる。拡散膜は、例えば、下層上に、好ましくは、酵素層上にコーティングすることができる。酵素層上に拡散膜を直接コーティングしても関連する酵素活性が変化しないことは、本発明の拡散膜の利点である。さらに、血液などのような体液に不溶の拡散膜を容易に提供することができる。
【００１６】
本発明に係る拡散膜は、層形成ポリマー材料中に分散された細孔形成粒子を含む。細孔形成粒子は、膜のポロシティーつまり透過性を提供する。細孔形成体(pore-maker)として使用される粒子は、好ましくは、固有の明確なポロシティーを有する安定な粒子またそのような粒子の混合物である。細孔形成粒子のサイズは、好ましくは約0.5〜100μm、特に約1〜50μmである。
【００１７】
膜は、本発明に従って細孔形成粒子により形成された細孔により提供される確実なポロシティーを有する。膜の用途に応じて、細孔のサイズを変化させることができる。細孔のサイズは、好ましくは、細孔形成粒子のサイズの範囲内にある。
【００１８】
本発明に係る拡散膜は、乾燥膜の全重量を基準にして、好ましくは約0.5〜70重量%、より好ましくは約0.7〜50重量%、最も好ましくは約1〜40重量%の量の細孔形成粒子を含む。細孔形成粒子の割合が特定の限度を超えると、膜は機械的に不安定になり、細孔形成粒子の添加量が少なすぎると、膜は不透過性になる可能性がある。
【００１９】
膜中の細孔形成粒子として使用する場合、固有の明確なポロシティーを有する本質的にすべての安定な粒子およびそのような粒子の混合物が有用である。所望の用途および/または細孔サイズに応じて、好適な粒子を選択することができる。好適な細孔形成粒子の例としては、キーゼルグール(Kieselguhr)、シリカゲル、セルロース、沈澱石膏、カオリン、ガラスなどから作製された無機もしくは有機の粒子が挙げられる。特に好ましい粒子は、二酸化ケイ素に基づく粒子であり、なかでも特に珪藻土に基づく粒子である。特に好ましい珪藻土は、商品名Celatom(登録商標)として販売されているものである。
【００２０】
本発明に係る拡散膜は、光を遮断するためのカーボンブラック、膜の規約反射率(remission)特性を改良するための二酸化チタンのような顔料、または湿潤剤などのような他の成分をさらに含有しうる。
【００２１】
本発明に係る拡散膜の厚さは、所望の用途および/または透過速度に応じて柔軟に選択することができる。好適な厚さは、約0.5〜1000μm、好ましくは約3〜500μm、最も好ましくは5〜100μmの範囲内である。
【００２２】
したがって、コーティングの厚さおよび/または細孔形成粒子の濃度を変化させることにより、拡散膜の透過を容易に調節することができる。
【００２３】
本発明に係る拡散膜の一実施形態では、細孔形成粒子のサイズは、少なくとも拡散膜の層の厚さに対応し、粒子サイズと層の厚さとの関係は、約1:1または≧1:1である。この実施形態では、細孔形成粒子のサイズは、単一粒子または単一粒子のクラスターがセンサーの表面から酵素層まで連続した細孔を形成するように選択される。したがって、物質の拡散がもたらされる。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、先に述べたような拡散膜を備える酵素に基づくセンサーである。本発明に係るセンサーはいくつかの層を備え、そのうちの少なくとも1層は酵素層である。本発明に係る酵素に基づくセンサーは、カバー層および少なくとも1つの下層をさらに備える。センサーのタイプに依存して、さらなる層は、例えば、干渉防止層、光遮断層、導電層、インジケーター層、またはベース電極であってもよい。
【００２５】
拡散膜の透過性を所望に応じて調節することができるので、この拡散膜を用いれば、センサーの再生を迅速に行うことができる。例えば、酸素の消費に基づくセンシング反応の場合、センサーの再生（例えば、酸素リザーバーの再生）が非常に速くなるように、酸素の透過を調節することができる。したがって、本発明のセンサーはまた、複数回の測定に使用することができる。
【００２６】
酵素に基づくセンサーの酵素層は、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、またはラクテートオキシダーゼなどのような酸化酵素を含有しうる。酵素層はまた、クレアチンなどのような、直接検出することのできないアナライトの検出を可能にする酵素カスケードなどのような酵素混合物を含有しうる。クレアチンは、単純酵素により酵素的に酸化させることはできないが、酵素ステップをいくつか行えば、光学的手段または電流測定手段により検出可能であるアナライト誘導体を生成させることができる。クレアチニンの検出および/または定量に好適な酵素カスケードシステムは、例えば、クレアチニンアミドヒドラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、およびサルコシンオキシダーゼを含む。
【００２７】
本発明に係るセンサーでは、拡散膜は、好ましくは、カバー層として付着させる。この場合、分散体の溶媒蒸発後、安定なカバー層が形成される。拡散膜は、さらに好ましくは、下層上、好ましくは酵素層上に直接コーティングされる。膜を直接コーティングすることにより、有利には、機械的な固定および/または接着剤の使用をせずに膜層が物理的接着により下層に付着される。
【００２８】
拡散膜をカバー層として使用した場合、拡散膜は、試験サンプルに直接接触し、センシング反応に必要な物質（好ましくは、基質または共基質）の拡散を調節する。したがって、本発明に係る拡散膜により、制御された透過性を有するセンサーが提供される。
【００２９】
本発明に係る酵素に基づくセンサーは、基本的には、任意の種類のバイオセンサーを構成しうる。好適なバイオセンサーの例は、例えば、光センサーである。好ましい光センサーでは、酸素に対して感受性をもつ適切な染料(例えば、酸素により消光可能な発光染料)を用いて、酵素反応に基づく酸素の消費を検出することができる。さらに、電気化学センサーも、本発明で使用するに好適である。
【００３０】
特に、アナライトの定量手段として酸素消費を用いるセンサーに取り付けて本発明に係る膜を用いれば、大きな利点が得られる。細孔形成粒子により形成された細孔は、膜を通るアナライト分子(例えば、グルコース)の拡散の調節を可能にし、ポリマーの選択は、酸素の透過性に影響を及ぼす。膜を通る酸素透過は、ある程度、細孔形成粒子により形成された細孔を介して行われうるが、特に、ポリマー層が高い酸素透過性を有する場合、本質的には、ポリマー層による影響を受ける。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、物質（好ましくは、酵素基質）を検出または定量するための、先に記載した酵素に基づくセンサーの使用である。
【００３２】
医療の分野では、例えば、生理学的パラメーターの測定に使用可能である。測定および/または検出は、任意の液体中で、例えば、血液、血清、血漿、尿などのような種々の体液中で行うことができる。センサーの好ましい使用は、血液中のアナライトの検出および/または測定である。
【００３３】
本発明に係るセンサーの可能性のある用途としては、例えば、糖尿病を患っている患者の血中グルコースの定量が挙げられる。本発明に係る酵素に基づくセンサーを用いて定量しうる他の代謝産物は、例えば、コレステロールまたは尿素である。
【００３４】
本発明に係るセンサーの可能性のある別の用途は、環境分析の分野、バイオテクノロジーにおけるプロセス制御および食事コントロールでの用途である。
【００３５】
酵素に基づくセンサーを本発明に従って使用すれば、酵素基質および/または共基質などの多種多様な物質を定量および/または検出することができる。好適な酵素基質は、例えば、コレステロール、スクロース、グルタメート、エタノール、アスコルビン酸、フルクトース、ピルベート、アンモニウム、亜硝酸塩、硝酸塩、フェノール、NADH、グルコース、ラクテート、またはクレアチニンである。好ましくは、グルコース、ラクテート、またはクレアチニンの定量および/または検出を行う。検出および/または定量の対象となる特に好ましい物質は、グルコースである。
【００３６】
酵素に基づくセンサーの再生は、透過を調節することにより影響を受け得るので、再生は、複数回の測定を行うのに十分に速い。センサーの好ましい使用では、複数回の測定を行う。さらに、酵素に基づくセンサーは、当技術分野で公知のあらゆるセンサー用途で利用することができる。例えば、使い捨て用途のセンサーまたは複数回使用用途の耐久センサーとして利用することができる。
【００３７】
本発明のさらなる主題は、先に記載した酵素に基づくセンサーの製造方法である。この方法は、
(i) (a)少なくとも1種のポリマー材料、および
(b) 細孔形成粒子
を含む分散体(dispersion)を形成するステップと、
(ii) 分散体を下層上に直接キャスティングして拡散膜を形成するステップと、
(iii) 場合により、分散体を乾燥させるステップと、
を含む。
【００３８】
本発明に係る方法によれば、ポリマー材料を広範にわたり選択できるので、膜を直接キャスティングすることが可能である。所望により、さらに、適切なポリマー材料を用いることで、溶媒なしで作業することも可能である。さらに、分散体の加熱が必要にならないように、材料を選択することもできる。したがって、本発明に係る方法を用いれば、取扱いが容易になる。
【００３９】
本方法によれば、下層(例えば、酵素層)に損傷を与えることなく、膜を適用することができる。例えば、酵素に影響を及ぼすことなく、酵素層上に膜を直接適用することができる。好ましい実施形態では、酵素層上に分散体を直接キャスティングすることができる。
【００４０】
本発明に係る方法では、好ましくは、物理的接着により分散体を下層に付着させる。したがって、膜を付着させるうえで、上述した欠点を含む機械的付着は必要でない。
【００４１】
所望により、下層上への適用後、分散体を乾燥させることができる。本質的には、当技術分野で公知のあらゆる乾燥方法を使用することができる。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例1および2により、本発明について具体的に説明する。
【００４３】
実施例1
液体サンプル中のグルコース濃度を定量するための膜
膜分散体を調製するために、下記の成分を混合した。
【表１】
2005031086.tif 000002
【００４４】
OptiCCA 使い捨てグルコースセンサー(Roche Diagnostics Corp.)の酵素層の上に厚さ20μmの層として混合物を塗布した。室温で乾燥させた後、本発明に係る膜でオーバーコーティングされたセンサースポット(直径4mm)をセンサーフォイルから切り出し、フロースルーセル中に配置した。そのチャネルに適切な緩衝液を満たしてから、サンプルを注入した。
【００４５】
次に、酸素感受性層中に含まれる発光染料のルミネセンス消光により生じた素強度を測定した。以下の反応速度測定値(蛍光強度変化: ΔI/秒)は、蒸気圧計で測定して150トルの酸素分圧になるようにした3つの異なるグルコース対照溶液を用いて得たものである。
【表２】
2005031086.tif 000003
【００４６】
実施例2
実施例2は、センサーの再生が迅速に行われることおよび複数回の測定が可能であることを示すものである(356mg/dLのグルコースを含有する対照溶液および150トルの酸素分圧を用いて測定を3回行った)。実施例2で使用したセンサーは、実施例1に従って作製したものであるが、膜を手塗りしたので、実施例1のセンサーと完全に同一というわけではなかった。
【表３】
2005031086.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素に基づくセンサーに利用するための拡散膜であって、
(a) 少なくとも１種のポリマー材料、および
(b) 前記少なくとも１種のポリマー材料中に分散された細孔形成粒子
を含む、前記拡散膜。
【請求項２】
前記細孔形成粒子のサイズが0.5〜100μmである、請求項１に記載の拡散膜。
【請求項３】
前記細孔形成粒子が0.5〜70重量%の量で存在する、請求項１または２に記載の拡散膜。
【請求項４】
前記細孔形成粒子が珪藻土を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の拡散膜。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の拡散膜を備える、酵素に基づくセンサー。
【請求項６】
酵素に基づくセンサーを製造する方法であって、
(i) (a) 少なくとも1種のポリマー材料、および
(b) 細孔形成粒子
を含む分散体を形成するステップと、
(ii) 前記分散体を下層上に直接キャスティングして拡散膜を形成するステップと、
(iii) 場合により、前記分散体を乾燥させるステップと
を含む、上記方法。
【外国語明細書】
2005031086000001.pdf