(57)【要約】【課題】  物質を目標細胞に注入する際に細胞構造の破壊を最小限に抑える装置および方法を提供すること。【解決手段】  少なくとも１つの物質を選択された１つの細胞（１１４）に対して、物質を細胞に衝突させることができるような態様で送達するための方法および装置（１００）。物質は、電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）から射出され、適当な軌道および速度で移動する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜によって画定された体積を有する個々の細胞に物質を送達する方法であって、
個々の細胞を選択するステップと、
少なくとも１つの電子制御式流体送達装置（１１６，１１８）から前記個々の細胞の体積よりも少ない量の少なくとも１つの物質を射出し、射出した前記物質が少なくとも１つの細胞機能に影響を与えるような態様で前記細胞膜に衝突するだけの十分な速度および軌道で移動するステップと、
からなる方法。
【請求項２】
前記個々の細胞を少なくとも１つの細胞機能の分析に適した環境に維持するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
射出された前記流動物質は、細胞質内の少なくとも１つの位置、および／または、細胞膜表面上の少なくとも１つの位置に注入される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞に対する物質の送達精度を確認するステップ（４０）をさらに含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
選択された前記細胞が細胞集団の要素であり、該細胞集団は、同種または異種の集団である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記物質が衝突した後で前記細胞集団から前記細胞を分離するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの細胞に射出された前記物質の少なくとも１つの作用を観察するステップ（５０）をさらに含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞集団内の少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの化合物を送達する装置（１００）であって、
細胞集団（１１４）を保持するように構成された受け面（１１２）と、
前記受け面に関連付けられ、少なくとも１つの物質の個々の部分を前記細胞（１１４）を目標にして送達する電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）と、
からなる装置。
【請求項９】
前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）からの少なくとも１つの物質の射出をトリガし、前記受け面上の前記細胞に衝突させる機能を有し、液滴のサイズ、液滴の速度、液滴の温度、および液滴の軌道のうちの少なくとも１つに影響を与える信号を生成するアクチュエータ（１３２）をさらに含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記受け面（１１２）が支持装置（１２０）上に配置され、該支持装置は、前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）に対する前記受け面の向きを変更する移動手段（１２２）を有する、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記受け面（１１２）に配置された少なくとも１つの細胞（１１４）が示す少なくとも１つの細胞反応メカニズムを監視するように構成された少なくとも１つのセンサをさらに含む、請求項８〜１０のうちのいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）と電気的に通信し、前記電子制御式流体送達装置の動作を制御する少なくとも１つの信号を送出するように構成されたコントローラ（１２６）をさらに含む、請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）はジェットデバイスであり、前記細胞に送達される物質を過熱する機能を有する過熱手段をさらに有する、請求項８〜１２のうちのいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）は、サーマルジェットデバイスおよび圧電ジェットデバイスのうちの少なくとも一方である、請求項８〜１３のうちのいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）に関連付けられ、前記電子制御式流体送達装置（１１６、１１８）を前記受け面（１１２）に対して可動式に位置合わせする機能を有する目標調節手段をさらに含む、請求項８〜１４のうちのいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記個々の物質が前記細胞に衝突することによって前記細胞に現れる細胞機能の少なくとも１つの変化を検出するように構成された検査装置（１３４）をさらに含む，請求項８〜１５のうちのいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、選択された個々の細胞に物質を送達する方法および装置に関する。詳しくは、本開示は、複数の物質および／または複数投与回数分の同じ物質を様々な制御態様で個々の細胞に送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物を選択された個々の細胞に送達すなわち注入するための種々の方法が提案されている。たとえば、マイクロインジェクション技術は、非常に小さな口径の針またはマイクロピペットを用いて物質を細胞の内部に手動で注入する。マイクロインジェクションプロセスは、顕微鏡と精密に制御されたホルダを用いて細胞膜を貫通することを含む。ホルダを使用することで、物質が細胞質内の領域全体に配置される。マイクロピペットを差し込むと、細胞膜が摂動し、細胞内部に物理的変化が生じる。
【０００３】
エレクトロポレーション（電気穿孔法）は、比較的大きな細胞集団に対して一様に薬剤を注入するのに使用され、一時的な電界を用いて細胞膜の構造に穴または弱い部分を作り出し、そこを通して薬剤を注入する。エレクトロインジェクションは、マイクロインジェクションとエレクトロポレーションの組み合わせであり、一時的な電界を用いて細胞膜を弱め、または開口した後、圧力を加えてマイクロインジェクション手順を実施し、所望の物質を選択された細胞の細胞質の中に注入する。いずれの方法も、細胞膜が摂動するので、研究対象または分析対象の薬剤または物質に対する細胞反応は、変化する可能性がある。従って、細胞構造の物理的または電気的な破壊を最小限に抑え、あるいは無くすような態様で、薬剤または化合物を目標の１つの細胞まで、または細胞集団内の個々の細胞まで正確に送達することができる装置および方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の１つの目的は、物質を目標の細胞に注入する際に細胞構造の破壊を最小限に抑える方法および装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
選択された個々の細胞に物質を送達する方法を開示する。この方法では、電子制御式流体送達装置から流動物質を該流動物質が細胞膜に衝突したときに少なくとも１つの細胞機能に影響を与えるのに十分なだけの速度および軌道で射出する。また、少なくとも１つの化合物を送達し、少なくとも１つの細胞に接触させる装置も開示する。この装置は、細胞集団を保持するように構成された受け面と、該受け面に関連する電子制御式流体送達装置とからなり、該電子制御式流体送達装置は、少なくとも１つの物質の各部分を細胞を目標として送達する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書は、物質を個々の細胞に送達する方法を開示する。本開示によれば、この送達方法は、少なくとも１つの個々の細胞を選択し、電子制御式流体送達装置から物質を射出することを含む。細胞としては、細胞膜によって画定された細胞容積を有する細胞が使用される。選択された細胞に注入される物質の体積は、その細胞に関連する細胞容積よりも小さい。射出された物質は、細胞膜に衝突するときに少なくとも１つの細胞機能に影響を与えるのに十分なだけの速度および軌道で移動する。
【０００７】
図１は、本明細書に開示されるような、物質を選択された個々の細胞に送達する方法を示す図である。本明細書で使用される「細胞」という用語は、細胞膜によって画定された容積を有する生物学的単位として定義される。細胞は、原核細胞であっても、真核細胞であってもよく、分離された細胞であってもよいし、大きな細胞集団の一部であってもよい。細胞集団は、試験の性質や、実施または観察したいプロセス、あるいは実施したい手順などに応じて、同種（均質）の細胞集団であってもよいし、異種（混成）の細胞集団であってもよい。
【０００８】
また、細胞は、所与の容積、奥行きおよび座標を有する適当なマイクロカプセルの一部であってもよい。本明細書で使用される「マイクロカプセル」という用語は、適当な時間にわたって細胞を収容し、細胞の生命を維持する機能を有するデバイスまたは構造を指す用語として定義される。マイクロカプセルは、個別の擬似自然環境またはマイクロ流体分析構造の中に、複数の細胞、生体物質および／または他の添加または補助物質および／またはデバイスを収容することができる。
【０００９】
開示する方法によれば、流動物質は、該流動物質が選択された１つの細胞に衝突するのに十分なだけの速度および軌道で移動できるような態様で、電子制御式流体送達装置から射出される。細胞膜に衝突する流動物質の量は、個々の細胞の容積よりも少ない。
【００１０】
本明細書で使用される「流動物質」という用語は、反応を誘発させる化合物または組成物、あるいは反応を誘発させる可能性をもつ化合物または組成物として定義される。反応は一般に、流動物質が注入された細胞から発生する。しかしながら、反応には、目標の細胞（複数の場合もあり）を取り囲む周囲の細胞や、目標の細胞の周囲の環境から読み取られる（すなわち認識される）反応も含まれる。反応には、限定はしないが、細胞形態の変化、色素や色分布の変化、電気化学的反応の変化、細胞質機能の変化、タンパク質合成の変化、または特定の細胞もしくは細胞系統に特有の他の反応も含まれる。流動物質は、興味のある、すなわち重要な１または複数の生物活性薬剤を含む。流動物質は、注入された他の物質を選択された細胞に接触させる担体として機能する場合もある。そのような物質としては、限定はしないが、微細電子部品の類、センサやトレーサとして有用な生体適合性物質などがある。
【００１１】
流動物質は、極性物質であっても無極性物質であってもよく、その性質は有機質であっても水溶性であってもよい。本発明で使用される電子制御式流体送達装置は、使用される流動物質の正確かつ個別の送達が容易になるような態様で流動物質を移動させるように構成される。
【００１２】
本明細書では、流動物質を選択された細胞に結合させるのに使用される種々の仕組みを説明するために、「細胞膜に対する衝突」を利用する。衝突には、細胞膜の外側の面を射出された流動物質に接触させ、その流動物質の少なくとも一部を細胞膜と相互作用させることが含まれる。相互作用には、限定はしないが、細胞膜と射出された流動物質との間の相互作用によって生じる抗原反応や免疫反応が含まれる。衝突には、射出された流動物質を１ステップまたは複数ステップの処理によって細胞膜構造の中に組み込むことが含まれる。また、衝突には、細胞膜を貫通して流動物質を内部の細胞質の中にまで移動すなわち輸送することも含まれる。移動および／または輸送には、流動物質を細胞膜の内側にある細胞内構造へ絶えず輸送し続けることも含まれる。衝突は、細胞のマクロ機能が維持されるような態様で、細胞膜と射出された流動物質とを接触させることによって行なわれる。したがって、射出および注入の際の衝撃や剪断力に起因する細胞膜の摂動を最小限に抑えることができ、相互作用による細胞機能反応、すなわち、流動物質だけが存在するときの細胞機能反応をより容易に確認し、それを利用することが可能になる。
【００１３】
選択される１または複数の細胞は、分離された細胞であってもよいし、所与の細胞集団の要素として存在するものであってもよい。細胞集団は、実施または観察したい分析またはプロセスに応じて、同種の細胞集団であってもよいし、異種の細胞集団であってもよい。細胞集団（または個々の細胞）は、開示するターゲッティング法を実施する前に、任意の適当な方法で用意、分離、および／または配置される。したがって、細胞集団は、任意の適当な培地から収集したものであってもよいし、限定はしないが、フローサイトメトリのような適当な分離技術によって抽出したものであってもよい。
【００１４】
細胞集団内の選択された１または複数の細胞をターゲッティングすることにより、細胞内機能だけでなく、細胞間機能を分析または利用する機会も得られる。細胞間機能プロセスの例としては、限定はしないが、接種を受けた目標の細胞の変化に応答して生じる接種を受けていない細胞の反応および相互作用などがある。したがって、細胞機能およびプロセスに関する情報は、目標の細胞を直接分析および観察することによって得ることもできるし、細胞集団内にある目標細胞に関連する細胞の相互作用および反応から推測することもできる。
【００１５】
次に、図１を参照する。本明細書に開示する方法では、符号１０で示すように、細胞（１または複数）を少なくとも１つの細胞機能を分析するのに適した環境に保持する。細胞（１または複数）を保持する環境は、少なくとも１つの細胞機能を維持するのに必要な物質を含む。通常、この環境は、最低でも細胞機能を維持し、射出物質の注入により細胞機能の変化を分析することができるくらいの細胞機能を維持できるものにする。広い意味では、細胞（１または複数）および関連基板の配置に使用される位置決め手段やターゲッティング手段を補助し、選択された細胞（１または複数）を電子制御式流体送達装置の目標位置に配置する働きをする補助的装置も、この分析環境に含まれる。補助的装置としては、限定はしないが、適当な超小型可動子、ならびに他のマイクロポジショニングデバイスおよび機構などがある。
【００１６】
開示の方法では、符号２０に示すように、分析環境内に保持された細胞（１または複数）の目標座標を測定し、確認する。目標座標は、ｘ座標、ｙ座標、およびｚ座標を含み、顕微鏡、走査型電子顕微鏡、その他の視覚的アナログ分析手段などを含む任意の適当な視覚的または分析的方法によって確認することができる。
【００１７】
符号３０に示すように、電子制御式流体送達装置（１または複数）を位置決めして配置する。電子制御式流体送達装置（１または複数）の位置決めには、限定はしないが、電子制御式流体送達装置（１または複数）の位置および向きを調節し、所望の細胞（１つあるいは複数）を目標位置に配置することが含まれる。また、射出する流動物質の軌道を変更して、射出物質の送達を管理すなわち制御することも考慮する。軌道、したがって目標設定の確度および精度は、液滴の幾何学的形状、温度および速度に影響を受ける場合がある。使用されるデジタル制御式流体送達装置は、液滴の幾何学的形状、温度および／または速度のような要素を制御するように構成される。それらの要素は、多数の様々な手段により調節することができる。例えば、デジタル制御式流体送達装置は、インクジェットデバイスと同じように構成することができ、その場合、出口オリフィスのサイズ、および／または射出器の幾何学的形状を制御すなわち変更する手段およびデバイスを有することができる。軌道および目標設定に影響を与える可能性がある電子制御式流体送達装置の発射室内の他の条件としては、液滴の温度や速度などを制御する条件が含まれる。
【００１８】
電子制御式流体送達装置は、物質を選択された細胞へ送達するための送達手段として、単独で使用してもよいし、必要に応じて他の装置または付属品と組み合わせて使用してもよい。流体送達装置をデジタル制御することにより、物質注入のタイミングを薬物反応の観察および検出が容易になるように修正、制御、および変更することができる。
【００１９】
開示の方法では、符号４０に示すように、電子制御式流体送達装置（１または複数）から流動物質（１または複数）を射出する。細胞膜に衝突させる流動物質の体積は、選択された細胞（１または複数）に物質を注入して接触させるのに十分なだけの量にする。射出から衝突までの間に生じる体積減少も考慮する。体積減少は、蒸発その他の現象が原因で発生する。したがって、実際に射出する体積は、移動中の体積減少を許容するように調節される場合がある。
【００２０】
選択された細胞へ送達する流動物質の最大体積は、その細胞の容積よりも小さくする。体積の調節は、流体送達装置（１または複数）から射出される液滴のサイズを調節することにより実施される。液滴のサイズ／体積の調節は、様々なジェットデバイス等のような電子制御式流体送達装置の駆動および動作に通常関連する様々な制御パラメータによって行なうことができ、開示する目標設定動作の一部として実施してもよいし、目標設定動作に付随する動作として実施してもよい。
【００２１】
開示の方法に使用される電子制御式流体送達装置（１または複数）は、液滴を生成し、生成した液滴を制御しつつ目標を定めて再現可能な態様で所与の距離にわたって送達することができる装置である。先に述べたように、インクジェット技術で一般に使用されるものと同様の仕組みおよび構成を有する装置を使用して、液滴の生成および射出を行なうことができる。適当な電子制御式ジェットデバイスは、電子制御可能なノズル部材を有するように構成される。電子制御式ジェットデバイスには、限定はしないが、圧電ジェットデバイスやサーマルジェットデバイスなどがある。
【００２２】
開示の方法は、符号５０に示すように、目標細胞（１または複数）に対する射出物質（１または複数）の少なくとも１つの作用の観察も考慮する。この観察の目的は、研究でああっても、さらなる分析であっても、目標設定精度の検証であってもよい。目標設定精度の検証は、視覚的観察によって行なうことができ、射出する流動物質に視認性を向上させる少なくとも１つの化合物を混ぜることによって、その視認性を向上させることができる。
【００２３】
目標細胞（１または複数）に対する射出物質（１または複数）の作用には、限定はしないが、プロテオミクス反応パターン、細胞内の合成プロセス（１または複数）の変化、膜浸透性の変化、並びに、細胞膜、細胞質、および細胞器官などに生じる電気化学的変化（１または複数）などがある。変更、誘導、または開始される細胞反応機構は、使用する物質の性質や、目標細胞上の送達部位の位置などの要因によって異なる場合がある。
【００２４】
開示した本発明に従って処理された目標の細胞は、様々な他の事後処理ステップおよびプロセスによって更に処理を施してもよい。そうした事後処理としては、観察や分析の継続、同じ薬剤または他の薬剤を用いる更なる目標設定および処理、および／または、適当な分離技術による目標細胞の分離などが挙げられる。その目的で、目標細胞へ送達する流動物質は、分離処理を補助または容易にする適当なマーカを含んでもよい。適当な分離技術（１または複数）としては、限定はしないが、珍しい標識の細胞を分離するのに使用されるフローサイトメトリのような技術がある。
【００２５】
開示の方法は、複数の目標設定動作を含み、適当な電子制御式流体送達装置から射出された同じ物質または異なる物質を、細胞集団内の同じ細胞または異なる細胞に接種する場合がある。したがって、開示の方法は、１または複数の物質を選択された細胞（１または複数）に複数のステップで段階的に送達することも考慮する。
【００２６】
本明細書に開示する方法は、送達精度を確認するステップをさらに含んでもよい。選択された細胞（１または複数）に対する流動物質の送達精度の確認は、任意の様々な方法で行なうことができる。一実施形態では、目標細胞（１または複数）に対する射出物質の作用を観察することによって、目標設定精度が確認されるる。このように、目標設定精度の指標としては、細胞膜、輸送特性、および色素などの変化、あるいは他の物理的、物理化学的、化学的または生化学的変化などが使用される。また、射出する流動物質は、視認性を向上させる少なくとも１つ化合物を含んでもよい。視認性を向上させる化合物には、適当な装置すなわち検出器によって視覚化することができる任意の物質、化合物、マーカなどがある。限定はしないが、そのような視認性向上化合物の一例は、フルオロフォアである。
【００２７】
開示した方法は、１または複数の流動物質を、所与の目標設定確度および精度で、選択された細胞に規定された複数の位置、すなわち選択された細胞上の複数の位置に送達することも考慮する。したがって、開示した方法は、選択された細胞（１または複数）に対する物質の送達だけでなく、所与の１または複数の細胞上の１または複数の特定の場所に対する物質の送達も含む場合がある。所与の１または複数の細胞上の特定の位置を目標として流動物質を送達する機能により、所与の物質および刺激に対する局部的反応を観察し、利用することが可能になる。そのような局部的反応は、細胞形態の変化等として現れ、データクラスタリング分析その他の分析方法に適している。
【００２８】
開示したようなターゲット送達方法は、様々な他の生合成プロセス、および／または、生化学的操作プロセスと組み合わせて使用することができる。本ターゲッティング送達方法を用いると、培地幅ごとに通常使用される種々の標準的な組換え培地技術を実施することができる。数百以上もの細胞を有する細胞培地の処理を必要とした従来の手順とは異なり、本明細書に開示した方法によれば、組換え培地技術を細胞毎に実施することが可能になる。したがって、遺伝子治療のために、組換えＤＮＡのような物質を細胞に正確に送達することが可能になる。開示した方法は、適当なフローサイトメトリ技術と組み合わせて使用することもできる。フローサイトメトリ処理によって分離された珍しい細胞株を、分類にしたがって物質に注入すなわち衝突させることができ、連続的またはほぼ連続的なプロセスを形成することができる。開示した方法は、種々のプロテオミクス技術に適合させることもできる。
【００２９】
開示したような送達方法は、基板−送達装置間の距離の正確な調節を含む場合がある。そのような調節は、スペーサのような任意の適当な手段によって行なうことができる。距離の調節は、単独で実施してもよいし、電子制御式流体送達装置から射出されたときに射出液滴に残留する運動エネルギーと組み合わせて実施してもよく、液滴の速度に影響を与える。このように、液滴が細胞膜に衝突するように、隙間および運動エネルギーのうちの少なくとも一方を変更することによって、液滴の速度が決まる。
【００３０】
また、基質−送達装置間の距離は、衝突時の液滴の温度が最適になるような距離に決められる。何らかの理論に結び付けるまでもなく、本明細書で使用される「衝突」という用語は、液滴の軌道、液滴の速度、液滴のサイズ、液滴の幾何学的形状、および衝突時の液滴の温度などの複数の要素の関数であると思われる。一実施形態では、衝突時の温度の微妙な変化によって、液滴を細胞膜の中に取り入れたり、細胞膜を貫通して液滴を移動させる場合がある。液滴の温度は通常、目標の細胞の温度とほぼ同じにし、その上限および下限は目標の細胞（１または複数）の機能に悪影響を与えたり破壊したりすることがない大きさに制限する。
【００３１】
開示した方法では、液滴の温度を任意の適当な方法で制御し、調節してよい。１つの適当な手段は、電子制御式流体送達装置に設けられる。好ましい電子制御式流体送達装置は、射出室内の物質に直接的または間接的に熱を与え、その温度を調節する加熱デバイスを備えることができる。そのような加熱デバイスとしては、たとえば、サーマルジェットデバイスで使用されるような抵抗体がある。基板とジェットデバイスとの間の厳密な距離の調節は、必要に応じて、細胞または細胞膜に受け取られる物質をその作用を最大にする温度で細胞に送達するためにも使用される。
【００３２】
細胞膜構造は、ある程度の多孔性および浸透性を有する。正確な微小投与量で投与され、特定の速度および調節された温度で送達される物質は、細胞膜の浸透率と同じ浸透率にして細胞膜上に滞在させることもできるし、細胞膜を通過させて細胞内の所望の位置へ移動させることもできると考えられる。また、そのような浸透率は、均一であってもよいし、細胞膜の部位に固有のものであってもよい。したがって、物質を特定の部位に注入する際の精度の制御は、細胞膜を摂動させたり、細胞機能をむやみに損ねたりすることなく、所望の物質を注入するためにも使用される。
【００３３】
本明細書に開示する方法は、電子制御式流体送達装置を目標領域から離れた位置に配置し、射出された物質が衝突するまでに特別な領域を通って移動するようにすることも考慮する。適当な気体などから成る特別な領域により、サンプルの滲みや拡散を最小限に抑えることができる。液体以外の物質を液体に接触させるとき、それらが極性物質と無極性物質の接触である場合、非混和性の要素によって物質の滲みを防止し、あるいは最小限に抑え、接触状態にすることができる。
【００３４】
本明細書に開示する方法は、大量生産または大量処理のために、流動物質を選択された細胞からなる大きなアレイに向けて射出し、注入できるようにすることも考慮する。したがって、処理速度の速い細胞検査、スクリーニング、および分析が実現される。
【００３５】
また、本方法は、複数の物質を選択された細胞（１または複数）へ送達できるようにすることも考慮する。複数の物質は、選択された細胞へ同時に送達してもよいし、順番に送達してもよい。選択される個々の細胞は、細胞集団内の同じ細胞であってもよいし、異なる細胞であってもよい。したがって、複数の物質を同じ細胞に送達する場合、物質を細胞膜上の近い部位や遠い部位に送達することも、本方法の範囲内にある。細胞集団内の異なる細胞に物質を送達する方法を用いると、種々の相互作用を観察することが可能になる。
【００３６】
物質（１つあるいは複数）は同時に送達することもできる。すなわち、物質は、概ね同時であると見なされる時間内に複数の制御可能な流体送達デバイスから送達することができる。また、実施する分析や処理が容易になるような任意の態様で、異なる物質を順番に送達することもできる。物質を集団集団内の異なる細胞に送達する場合、適当な識別または識別階層を用いて、ターゲット送達の際に異なる細胞を識別できるようにしてもよい。そのような識別階層としては、細胞形態識別、並びに、種々の形式のタンパク質分析、マーカ識別などがある。識別ルーチンとしては、適当な自動形態認識アルゴリズムまたはプロトコル、並びに、放射線マーカおよび／または免疫マーカ、トレーサ集積法などがある。
【００３７】
したがって、開示したような方法は、細胞膜によって画定される内部容積を有する個々の選択された細胞に１または複数の物質を送達することも考慮する。
【００３８】
本明細書に開示する方法は概して、電子制御式ジェットデバイスのような電子制御式流体送達装置から可変量の少なくとも第１の流動物質および第２の流動物質を射出するステップをさらに含む場合がある。これらの物質の組成、機能その他の適当な特性すなわち性質は、互いに異なるものにすることができる。射出された各流動物質は、目標の細胞の細胞膜に衝突したときに少なくとも１つの細胞機能に作用するような速度および軌道で移動する。本方法は第１および第２の流動物質に関して説明されているが、流動物質の数は任意の数であってよい。
【００３９】
第１および第２の流動物質の量は、自由に調節できるようにしてもよい。この可変性は、１または複数の流動物質を選択された細胞に時間をかけて複数回注入することによって実現される。また、射出液滴のサイズ／体積を変更することによって、量を変更することもできる。最大液滴サイズは、物質を送達する細胞の体積よりも小さくすることが望ましい。複数の液滴を１つの細胞に注入して接触させる場合、注入する物質の総体積は、細胞機能の有用性がむやみに損なわれない量にする。
【００４０】
この可変性は、ユーザが所望の観察用アレイを作成するために開発した適当な制御コマンドによって管理することができる。また、可変性は、射出液滴のタイミング、速度、軌道、温度および他の物理的性質を変更または管理する計算によって管理することもできる。さらに可変性は、上記の考慮事項のうちのいずれか、または全ての関数にしてもよい。
【００４１】
射出された少なくとも１つの流動物質は、細胞のマクロ機能を維持するような態様で、細胞質内の目標位置に注入される。流動物質のうちの少なくとも１つは、細胞質内の細胞小器官のような場所に注入される場合がある。送達および導入は、目標の細胞の破壊を最小限に抑えるような態様で実施される。「細胞のマクロ機能」は、細胞機能を維持するために行われる一般的な細胞プロセスとして定義される。１または複数の流動物質の注入により、細胞機能に何らかの変化が生じる。この変化は、場合によっては細胞を死なせることがある。しかしながら、本送達方法によれば、送達時の衝突に起因する摂動を最小限に抑え、細胞組織と注入物質との間の相互作用の観察および研究の妨げになる可能性を低減することができる。
【００４２】
また、射出した少なくとも１つの流動物質は、細胞膜表面の目標位置に結合させることもできる。したがって、流動物質は、親和性、すなわち細胞膜に対する親和性を有し、細胞膜の構造や機能に変化を生じさせるような物質であってもよい。したがって、複数の物質を使用する場合、細胞膜に結合され、細胞膜の局部的領域を変化させて、細胞質等に対するその後の流動物質の注入が容易になるような物質を使用する場合がある。
【００４３】
また、少なくとも１つの流動物質を細胞質内の指定位置まで送達するのに適した速度および軌道で射出できるようにすることも考慮する。上で述べたように、速度および軌道の制御は、電子制御式ジェットデバイスと目標細胞との間の間隔や、射出運動などの関数にすることができる。
【００４４】
また、本方法は、流動物質の送達精度を確認するための追加ステップも考慮する。送達精度は、視覚的な観察および／またはセンサの変化、ならびに薬剤反応の観察などのような任意の直接的または間接的な方法によって確認することができる。送達精度の確認を容易にするために、流動物質は、視認性を向上させる少なくとも１つの化合物を含んでもよい。そのように視認性を向上させる化合物として、適当な検出手段または検出方法を用いて検出することが可能な、放射線マーカや化学的マーカを使用することができる。送達精度の判定には、物質が所与の細胞に接触しているか否かの判定と、細胞膜上または細胞体積内における物質の位置的精度の確認との両方が含まれる。要望または必要に応じて、流動物質は、その流動物質が選択された細胞内または細胞上の位置に正確に送達されたか否かを判定するのに役立つ適当な親和性マーカなどを含んでもよい。
【００４５】
開示した方法は、少なくとも１つの流動物質を衝突させた後、細胞集団から細胞を分離するための追加ステップを含むことができる。この分離は、フローサイトメトリなどの任意の適当な手段によって実施される。分離は、流動物質のうちの１または複数が衝突した後に実施することができる。したがって本方法は、１または複数の流動物質を細胞集団内の細胞に衝突させた後、分離方法を実施し、要望または必要に応じて更に流動物質を衝突させるという、複数ステップからなるプロセスにしてもよい。
【００４６】
また、少なくとも１つの化合物を細胞集団内の少なくとも１つの細胞に送達するための装置１００も開示する。図２は、そのような装置を概略的に示す図である。この装置は、細胞または細胞集団１１４を保持するように構成された受け面１１２と、少なくとも１つの物質の各部分を受け面１１２上に配置された細胞１１４を目標にして送達する電子制御式流体送達装置１１６、１１８とを有する。要望または必要に応じて、受け面１１２は、細胞または細胞集団１１４を生存可能な状態に、すなわち分析や処理に適した適当な状態に維持するように構成される。したがって、受け面１１２は、細胞を生存可能状態に維持するための適当な栄養分および支持手段を有する場合がある。
【００４７】
さらに、受け面１１２は、支持装置１２０に取り付け、または接続することができる。支持装置１２０は、電子制御式流体送達装置１１６、１１８と協動して、目標細胞１１４および電子制御式流体送達装置１１６、１１８の位置決めを行い、射出された１または複数の物質を正確に送達できるようにする。協動には、支持装置１２０に接続された受け面１１２の可動位置決め、支持装置１２０に対する受け面１１２および細胞（１または複数）１１４の配置および相互作用の分析なども含まれる。下側の支持装置１２０は、符号１２２に示すような適当なモータや位置変更装置などを備えるように構成された適当な高精度の精密位置決め装置であってよい。そのような高精度の精密位置決め装置の例としては、限定はしないが、目標細胞に対する位置決めに適した段階的な動作をするステップモータ、エンコーダ、リニア誘導モータなどを備えた仕組みがある。
【００４８】
下側の支持装置１２０は、任意の適当な調節コントローラ１２４と通信して、支持面１１２の位置を調節することができる。支持面１１２を電子制御式流体送達装置１１６、１１８に対して移動させ、走査できるようにするために、位置の調節は通常、ｘ平面およびｙ平面で実施される。しかしながら、電子制御式流体送達装置と細胞１１４との間の距離を調節すなわち変更するために、支持面１１２の位置は、電子制御式流体送達装置１１６、１１８に対する空間的位置関係を調節するようにしてもよい。
【００４９】
下側の支持装置１２０によって行なわれる支持面１１２の適当な調節は、支持面制御手段１２４によって制御することができる。支持面制御手段１２４は、そのような電子制御を実施するのに適した電子制御手段を有するのが望ましい。また、支持面制御手段１２４は、電子制御式流体送達装置１１６、１１８の動作に関する種々の機能を制御するように構成された中央射出制御装置１２６と電気的に通信できるように構成してもよい。
【００５０】
支持面１１２は、細胞機能を維持するために必要とされる任意の適当な１または複数の物質から構成される。支持面１１２は、細胞（１または複数）１１４が有する少なくとも１つの細胞機能を監視することができる接点およびリード１２８を備えてもよい。リード１２８は、少なくとも１つの細胞機能または反応を監視することができる適当なセンサ手段またはセンサアレイ１３０に接続することができる。センサ手段１３０は、細胞集団内の１または複数の細胞に直接接続することができるリードやプローブなどを備えてもよい。また、センサ手段１３０は、環境検査などによって細胞反応を間接的に監視するように構成してもよい。要望または必要に応じて、センサ手段１３０は、コントローラ１２６と電気的に通信するように配置してもよい。センサ手段１３０は、１以上の物理的反応および／または化学的反応あるいは他の反応を検出することができるセンサデバイスのアレイを備えてもよい。センサデバイスのアレイは、対象の様々な反応を検出および／または定量化するために、必要に応じて同一、類似、または異なるデバイスを有するものであってよい。
【００５１】
装置１００は、ジェットデバイスのような電子制御式流体送達装置１１６、１１８からの少なくとも１つの物質の射出をトリガとして、受け面１１２にある目標の細胞１１４に衝突させる機能を有する適当なアクチュエータ１３２をさらに備えてもよい。図２に示すように、アクチュエータ１３２は、コントローラ１２６と電気的に通信して、電子制御式流体送達装置１１６、１１８の動作を制御することができる。アクチュエータ１３２は、外部ソースおよび／またはオペレータとの対話を可能にする適当なインターフェースアレイの中に配置してもよい。
【００５２】
コントローラ１２６は、支持面コントローラ１２４、センサ１３０、およびアクチュエータ１３２のような種々の構成要素と双方向に電気的に通信することができる。また、支持面コントローラ１２４または他の適当なデバイスによって電子制御式流体送達装置の動作を制御する少なくとも１つの信号を生成し、射出液滴のサイズ、液滴速度、液滴温度、および液滴軌道のうちの少なくとも１つを制御するようにしてもよい。
【００５３】
また、電子制御式流体送達装置１１６、１１８は、細胞に送達する物質を加熱することができる適当な加熱手段を備えてもよい。種々の加熱デバイスを用いることができるが、例えば、加熱は、サーマルジェットデバイスのような電子制御式ジェットデバイスの発射室内に組み込まれた抵抗体によって実施することができる。
【００５４】
電子制御式流体送達装置１１６、１１８は、物質の個々の液滴をそれぞれ目標の細胞１１４の体積よりも小さい体積で射出できるように構成された装置であれば、任意の適当な装置であってよい。適当な装置としては、圧電駆動式ジェットデバイスおよび熱駆動式ジェットデバイスと一般に呼ばれるジェットデバイスがある。
【００５５】
また、装置１００は、電子制御式流体送達装置１１６、１１８に接続された目標調節手段をさらに備えてもよい。図２に示すように、この目標調節手段には、コントローラ１２６によって制御され、電子制御式流体送達装置１１６、１１８を受け面１１２に対して動かして位置決めすることができる電子制御システムを用いることができる。このようにして、電子制御式流体送達装置１１６、１１８は、受け面１１２およびその上に配置された細胞１１４に対して位置決めされる。特定の流体送達装置から射出された物質を確実に適切に衝突させるために、細胞１１４の細胞膜表面と電子制御式流体送達装置１１６、１１８との間の距離すなわち空間は変更してもよい。
【００５６】
装置１００は、細胞１１４の細胞膜表面と、電子制御式流体送達装置１１６、１１８の出口オリフィスとの間の空間的距離を正確に調節し、射出された物質が細胞膜に確実に衝突するようにするための、センサおよび制御装置を備えてもよい。
【００５７】
装置１００は、細胞１１４を観察したり、射出物質が衝突した後の細胞機能の何らかの変化を観察および／または記録したりするのに適した、適当な分析ツールおよび／または観察ツールをさらに備えてもよい。本明細書に開示する装置は、種々の検査装置を利用することができる。図２に示す１つのそのようなデバイスは、光学式スキャナ１３４である。図２に示すように、光学式スキャナ１３４は、データ収集インターフェース１３６を介してコントローラ１２６と電気的に通信する。光学式スキャナ１３４その他の適当な検査装置は、電子制御式流体送達装置１１６、１１８から所定量の流動物質を細胞１１４に注入することによって現れる、細胞機能の少なくとも１つの変化を検出するように構成される。光学式スキャナその他の適当な検査装置は、そのようにして引き起こされた細胞機能の変化を観察および／または分析できるものであれば、任意の適当な装置であってよい。
【００５８】
光学式スキャナ１３４のような検査装置は、送達装置１００に対して永久的に接続されるように構成することができる。選択された細胞１１４の性質や実施する分析のタイプによっては、光学式スキャナ１３４のような検査装置は、送達装置１００に対して着脱可能に接続できるように構成され、種々の異なる検査装置を利用できるようにすることもできる。
【００５９】
電子制御式流体送達装置１１６、１１８は、任意の適当な物質源または物質に接続することができる。物質源すなわち容器は、送達装置１００から離れたところに配置してもよい。適当な貯蔵容器（１または複数）１３８、１４０を電子制御式流体送達装置１１６、１１８の近くに配置してもよい。１または複数の容器１３８、１４０に格納する物質としては、種々の生物活性薬剤が挙げられる。そうした薬剤としては、細胞１１４と接触したときに細胞反応を引き起こすことができる化学薬品、化合物、または組成物を用いることができる。電子制御式流体送達装置１１６、１１８は、要望または必要に応じて、送達装置１００に永久的に接続することができる。
【００６０】
電子制御式流体送達装置１１６、１１８および貯蔵容器１３８、１４０は、装置１００に対して着脱可能に取り付けることができるカートリッジ２００として構成することもできる。図２および図３に示すようなカートリッジ２００は、物質を格納するための容器と、該容器に連通する電子制御式の液滴射出デバイスとを有する。電子制御式液滴射出デバイスは、ハウジング２１２に配置されたプリントヘッド２１０として構成することができる。このカートリッジは、容器に収容された生物活性物質に関する情報を格納するための適当なメモリデバイス２１４をさらに備えてもよい。メモリデバイス２１４は、コントローラ１２６のような外部ソースと電気的に通信することができるように構成することができる。
【００６１】
装置１００は、１または複数の個々の細胞の反応を確認する方法に使用される。そのような反応確認方法は、所定量の少なくとも１つの生物活性物質を受け面に配置された少なくとも１つの細胞に送達し、該生物活性物質を少なくとも１つの電子制御式流体送達装置によって分配供給するステップを含むのが望ましい。本明細書で使用される「生物活性物質」という用語は、１または複数の細胞に検出可能な影響を与える物質、およびそのような影響を与える可能性がある物質を含む。所定量の生物活性物質を送達した後、現れた細胞反応を観察し、記録することができる。生物活性物質は、所定量の生物活性物質が細胞の細胞膜に衝突するだけの十分な軌道および速度で送達される。衝突には、細胞膜表面に対する結合だけでなく、細胞膜を貫通して細胞質や細胞質内の細胞小器まで移動することも含まれる。目標の細胞に送達する１または複数の物質は、細胞反応の視認、および／または目標精度の確認に役立つ種々の物質を含んでもよい。生物活性物質の所定量は、細胞の体積全体よりも小さいことが望ましい。さらに、生物活性物質は、細胞内または細胞上に規定された複数の場所に送達してもよい。そのような送達は、実施したい観察の性質に応じて、同時に実施してもよいし、順番に実施してもよい。
【００６２】
本発明の説明は、現時点で最も実際的かつ好ましい実施形態に関するものになっているが、その説明は発明を開示した実施形態に限定するためのものではなく、種々の変形形態や均等構成を特許請求の範囲に記載した発明の思想および範囲内に収めるためのものである。したがって、その範囲は、法に従って、それらの種々の変形形態や均等構成も含むものとして、最も広い解釈をしなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】物質を送達する方法を示すプロセス図である。
【図２】物質を１つの細胞に送達する装置を示す概略図である。
【図３】図２の送達装置に使用されるカートリッジを示す斜視図である。
【符号の説明】
【００６４】
１００  流体送達装置
１１２  受け面
１１４  細胞
１１６、１１８  電子制御式流体送達装置
１２０  支持装置
１２２  精密位置決め装置
１２６  コントローラ
１３４  検査装置
【図１】
2005143507.tif 000003
【図２】
2005143507.tif 000004
【図３】
2005143507.tif 000005