(57)【要約】【課題】  標的細胞に対する特異性を有し、核酸、例えば遺伝子発現性に優れた核酸導入用キャリアー、及び核酸導入用組成物を提供する。【解決手段】  カチオン性の高分子物質と、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体とを共有結合しない状態で含む核酸導入用キャリアー、及び、核酸、カチオン性の高分子物質、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体を、共有結合しない状態で含有する組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性の高分子物質と、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体とを共有結合しない状態で含む核酸導入用キャリアー。
【請求項２】
ヒアルロン酸又はその塩又はその誘導体が負に帯電しており、その分子量が1万以上で
ある請求項１記載の核酸導入用キャリアー。
【請求項３】
カチオン性の高分子物質が、蛋白質、ポリペプチド、デンドリマー、ポリエチレンイミン、キトサン又はデキストランである請求項２記載の核酸導入用キャリアー。
【請求項４】
カチオン性の高分子物質と、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体における各荷電基のモル比が、１：０．０１〜１：２００である請求項２記載の核酸導入用キャリアー。
【請求項５】
カチオン性の高分子物質がキトサンである請求項２記載の核酸導入用キャリアー。
【請求項６】
核酸、カチオン性の高分子物質、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体を、共有結合しない状態で含有する組成物。
【請求項７】
核酸とカチオン性の高分子物質における各荷電基のモル比が１：０．１〜１：５０である請求項６記載の組成物。
【請求項８】
核酸とヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体における各荷電基のモル比が１：０．００１〜１：１０００である請求項６記載の組成物。
【請求項９】
核酸が遺伝子である請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
遺伝子治療用である請求項９記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞に導入するために用いるキャリアー、及び該キャリアーとともに核酸を含有する核酸導入用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、実用化されている遺伝子治療法は大きく分けて２つある。１つは、先天性免疫不全症や先天性代謝異常症等の先天的な遺伝病において、その欠損した遺伝子を外部から導入して補うという治療法であり、もう１つはがん細胞やAIDSなどのような細胞やウイルスをターゲットにして、それらの増殖を抑制したり、それらを死滅させるための遺伝子を導入する治療法である。上記どちらの治療法においても、目的とする遺伝子を細胞内に導入し、発現させることが重要であることが知られている。
【０００３】
しかしながら、ＤＮＡと細胞膜はともにアニオン性を示し、電気的に反発してしまうため、遺伝子(ＤＮＡ)を単独で直接細胞内に導入することは非常に困難である。
【０００４】
そこで、これまでにもＤＮＡキャリアーとして様々な物質が検討されてきたが、安全性や導入効率等の面で問題があり、実用化の妨げとなっている。例えば、代表的なウイルスベクターであるレトロウイルスベクターは、導入効率が高いという利点がある一方で、（１）大きなサイズのDNAを使えない、（２）非分裂細胞に導入できない、（３）発現レベルが低いなどの欠点がある。また、アデノウイルスベクターは、非分裂細胞にも導入可能だが、免疫原性が強く、抗体ができてしまうという欠点があり、ヘルペスウイルスベクターは、神経細胞への導入に優れているが、細胞毒性が強いという欠点がある。その他ウイルスベクター以外のキャリアーとしてカチオン性リポソーム、脂質、ポリマーなどが研究されているが、導入効率や細胞特異性が低くなるという問題があった。
【０００５】
ポリマーを用いる方法としては、特許文献１に、ポリエチレングリコール誘導体及びカチオン性の高分子を含む遺伝子導入用キャリアーが開示されている。このキャリアーは、遺伝子とカチオン性高分子からなる複合体をポリエチレングリコール誘導体で被覆して生体内に投与することにより、高い遺伝子発現を達成した。このポリエチレングリコール誘導体は糖残基含有側鎖をもつが、糖残基の糖としてはオリゴ糖であり任意の組織を特異的に標的するには不十分であった。
【０００６】
標的細胞特異性をもつ遺伝子産物を導入するための組成物として、特許文献２において、リポソーム表面にヒアルロン酸が共有結合したカチオン性リポソーム組成物が開示されている。このカチオン性リポソーム製剤は、標的細胞に対する生体接着性、低い免疫原性、マクロファージ食作用に対する耐性、およびリポソーム表面のカチオン性脂質のマスキングを特徴とすると記載されている。しかし、遺伝子発現効率が低いという問題があった。
【０００７】
また、特許文献３には、ＤＮＡおよびヒアルロン酸またはその誘導体と医薬的に許容される担体からなる組成物が開示されている。この組成物では、遺伝子を含むウイルスベクターはヒアルロン酸と単純に混合されるかまたはヒアルロン酸に結合されていてもよい。実施例では、ヒアルロン酸がアデノウイルスベクターの標的細胞への取込みを増大させることを示している。しかし、アデノウイルスベクターには免疫原性が強く抗体ができてしまうという欠点があり、高用量の使用または反復投与の妨げになる場合があるという問題があった。
【０００８】
ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸受容体が高レベルで発現している組織を特異的に標的化することが示されている。ヒアルロン酸レベルは腫瘍の侵略度と相関することが示されており、腫瘍細胞の浸潤特性の指標になる可能性がある。組織適合性抗原CD44、ヒアルロン酸媒介運動性(RHAMM)、細胞間接着因子(ICAM)およびCD44ファミリーにおける類似タンパク質の受容体を含むヒアルロン酸特異的細胞表面受容体が同定されている。
【０００９】
カチオン性ポリマーとヒアルロン酸を共有結合させた遺伝子導入用キャリアーは、組織を特異的に標的化することができるが、遺伝子発現効率が低く、細胞内に取り込まれた後の遺伝子発現が妨害される可能性がある。
【００１０】
ヒアルロン酸は多量の水に結合する能力を有し、インビボで粘弾性を有する粘性の含水化合物となるため、標的細胞特異性のために使用されるだけでなく、一般の薬物の担体としても研究されている。例えば、特許文献４には、生体内分解性及び生体適合性を有する高分子及び/又は多価金属イオンとヒアルロン酸により形成されるマトリックス中に薬物
を含有させた医薬組成物が開示されている。この医薬組成物は疾病治療用薬物の放出速度を制御するためのものであって、細胞への遺伝子導入用のキャリアーとしての利用には適合しない。
【特許文献１】特開２００３−２３１７４８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２８１３１号公報
【特許文献３】特表２００３−５０７９１５号公報
【特許文献４】特開平１１−１３０６９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、免疫原性がなく、標的細胞への遺伝子導入効率の優れた核酸導入用キャリアー、及び該キャリアーと核酸を含有する核酸導入用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、核酸、例えば遺伝子とカチオン性の高分子物質からなる複合体を、負に帯電した高分子物質であるヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」という。）又はその塩、あるいは負に帯電したＨＡ誘導体で被覆して生体内に投与することにより、ＨＡ受容体などの細胞表面分子を有する細胞を標的として、優れた遺伝子発現能を達成することを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりのものである。
【００１３】
（１）カチオン性の高分子物質と、ヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体とを共有結合しない状態で含む核酸導入用キャリアー。
（２）ヒアルロン酸又はその塩又はその誘導体が負に帯電しており、その分子量が1万以
上である（１）に記載の核酸導入用キャリアー。
（３）カチオン性の高分子物質が、蛋白質、ポリペプチド、デンドリマー、ポリエチレンイミン、キトサン又はデキストランである（２）に記載の核酸導入用キャリアー。
（４）カチオン性の高分子物質とヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体における各荷電基のモル比が、１：０．０１〜１：２００である（２）に記載の核酸導入用キャリアー。
（５）カチオン性の高分子物質がキトサンである（２）に記載の核酸導入用キャリアー。（６）核酸、カチオン性の高分子物質、及びヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体を、共有結合しない状態で含有する組成物。
（７）核酸とカチオン性の高分子物質における各荷電基のモル比が１：０．１〜１：５０である（６）に記載の組成物。
（８）核酸とヒアルロン酸又はその塩及び／又はその負に荷電した誘導体における各荷電基のモル比が１：０．００１〜１：１０００である（６）に記載の組成物。
（９）核酸が遺伝子である（６）〜（８）のいずれか１に記載の組成物。
（１０）遺伝子治療用である（９）に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の核酸導入用キャリアーは、負に帯電したＨＡを、共有結合させずに使用することにより、核酸とカチオン性高分子物質の複合体を壊さずに、核酸とカチオン性高分子物質の複合体の分散性を高め、標的細胞に対する特異性を持たせることができるため、従来の遺伝子-カチオン性高分子物質の複合体と比較して、遺伝子発現の活性が高く、また、
ウイルスベクターのような免疫原性がないため安全性が高く、しかも細胞特異的な遺伝子のデリバリーを達成することができる。したがって、本発明の核酸導入用キャリアーとともに核酸を含有する組成物は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、あるいは特定の遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成を効率的に実施することができる点で極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の核酸導入用キャリアーに適合する核酸としては、種々のプラスミドＤＮＡ、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、リボザイム、又はそれらの混合物などの核酸や核酸誘導体を例示することができる。
【００１６】
カチオン性高分子物質とは、正に荷電された、分子量が１０００〜５０万程度の天然由来あるいは合成による高分子物質をいい、例えば、プロタミン、ヒストン、HelΔ１、ゼ
ラチンなどの蛋白質やポリペプチド、ポリＬ−Ｌリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンなどのポリアミノ酸、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリリジンデンドリマーなどのデンドリマー、ポリエチレンイミンなどの合成ポリマー、ジエチルアミノエチル−デキストランなどのデキストラン、キトサンなどの多糖類又はそれらの塩、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
蛋白質やポリペプチドの分子量は好ましくは１０００〜５０万程度であり、蛋白質やポリペプチドの塩として、塩酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
デンドリマーの分子量は好ましくは１０００〜５０万程度であり、デンドリマーの塩として、塩酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
合成ポリマーの一例であるポリエチレンイミンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度であり、ポリエチレンイミンの塩として、塩酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩などを例示することができる。
キトサンの分子量は、好ましくは１０００〜５０万程度であり、より好ましくは５０００〜２０万程度であり、もっとも好ましくは１万〜１０万程度であり、キトサンの塩としては、塩酸塩、酢酸塩などを例示することができる。また、通常、キトサンは原料となるキチンを脱アセチル化して製造され、本発明で用いるキトサンの脱アセチル化度は、好ましくは５〜１００％であり、より好ましくは５０〜１００％であり、もっとも好ましくは７０〜１００％である。ここで、例えば、キトサンの脱アセチル化度が７０％であるということは、実際には、構成単位であるＤ−グルコサミンとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとが７：３のモル比で存在することを意味する。キトサンは甲殻類、真菌類および他の物質を含む多様な供給源から得ることができる。
カチオン性高分子は、通常は正に荷電されていないものであっても、アミノ基などの官能基の導入によって正に荷電されるものであれば使用可能であり、また、必要により抗体などで修飾されていてもよい。
【００１７】
ＨＡ又はその塩又は負に荷電したその誘導体は、分子量１０，０００以上であればよいが、１００，０００以上が好ましく、１０万〜５，０００万がより好ましい。
ＨＡの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを例示することができる。
負に荷電した誘導体とは、例えば、ＨＡにポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体又はその一部などを導入することによって得られるものが挙げられる。
【００１８】
核酸とカチオン性高分子物質の配合比(各荷電基のモル比、負電荷：正電荷比)は標的細胞・核酸・カチオン性高分子物質の種類により異なるが、１：０．１〜１：５０であるとよく、好ましくは１：０．２〜１：２０であり、より好ましくは１：１〜１：１０である。ここでいう核酸とカチオン性高分子物質の配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸のリン酸アニオンによる負電荷：カチオン性の高分子の正電荷比を指す。
【００１９】
核酸とＨＡ（又はその塩及び／又は負に荷電したその誘導体）の配合比(各荷電基のモ
ル比、負電荷：負電荷比)は標的細胞・核酸・カチオン性の高分子の種類により異なるが
、１：０．００１〜１：１０００であるとよく、好ましくは１：０．１〜１：１００であり、より好ましくは１：１〜１：５０である。ここでいう核酸とＨＡの配合比とは、各荷電基のモル比であり、具体的には核酸のリン酸アニオンによる負電荷：ＨＡのカルボン酸アニオンによる負電荷比を指す。
【００２０】
カチオン性の高分子物質とＨＡ（又はその塩、及び／又はその負に荷電した誘導体）の配合比(各荷電基のモル比、正電荷：負電荷比)は、１：０．０１〜１：２００であるとよく、好ましくは１：０．１〜１：５０であり、より好ましくは１：０．１〜１：１０である。
【００２１】
本発明の核酸導入用キャリアーは、カチオン性高分子物質とＨＡを混合することによって製造される。
本発明の核酸導入用組成物は、核酸導入用キャリアーを核酸と混合することによって製造される。又は、核酸をカチオン性高分子物質及びＨＡと任意の順で混合することによっても製造することができる。
得られた核酸導入用組成物は、核酸、カチオン性高分子物質、及びＨＡが、イオン結合によってゆるく結合して複合体を形成するか、あるいは、各成分の配合組成によっては、このような複合体構造をさらにＨＡが被覆する態様を形成する。
【００２２】
本発明の核酸導入用組成物は、ヒトや動物に対する各種の遺伝子治療、あるいは特定の遺伝子を導入した実験動物や細胞の作成に利用することができる。例えば、体外に取り出した標的細胞に本発明の遺伝子（核酸）導入用組成物を用いて遺伝子（核酸）を導入した後、該細胞を生体内に戻して、目的とする遺伝子を発現させるex vivo法、あるいは、in vivo、in situ法などの直接的な遺伝子導入法などが例示される。
直接投与の方法としては、静脈、皮下又は筋肉、腹腔などへの注射、鼻腔、口腔、肺などへの吸入、あるいは、病変部組織ないし近傍の血管内に直接投与や、ゲル状物、スポンジなどの多孔体、不織布などに担持させて留置するなど、遺伝子治療技術の如何なる方法も可能である。
【００２３】
投与に適する剤型とするため、あるいは徐放性製剤とするために、必要に応じて、製薬上普通に使用される各種の添加剤（賦形剤、希釈剤、増粘剤、安定剤、保存剤など）を使用することができる。
【００２４】
核酸、例えば遺伝子とカチオン性の高分子物質は静電的に結合して小さく折りたたまれた複合体を形成していて、通常はエンドサイトシスで細胞に取り込まれるため、遺伝子とカチオン性高分子物質の複合体を遺伝子導入に使用しようとすると、その多くは弱酸性となったエンドソーム内で酵素により分解されてしまう。これに対して、本発明のキャリアーにおいては、マイナスに帯電したヒアルロン酸をさらに複合させているために、弱酸性下で細胞膜破壊機能を持つと考えられる。このようなアニオン性の高分子物質で核酸−カチオン性高分子物質複合体を被覆することにより、核酸が酵素分解される前にエンドソーム膜を壊し、核酸を細胞質に移行させ、遺伝子発現効率を向上させると考えられる。
【００２５】
また、核酸−カチオン性高分子物質複合体は凝集しやすく、この凝集により複合体の細胞への取込みが妨害されるが、該複合体をヒアルロン酸によって被覆することにより、核酸−カチオン性高分子物質複合体の凝集が阻止されるものと考えられる。また、本発明のヒアルロン酸は親水性であることから、血清タンパク質、血球細胞、細胞外マトリックスなどによる凝集等の相互作用から該複合体を保護すると考えられる。
【００２６】
このように、本発明において、核酸、カチオン性高分子物質、及びヒアルロン酸は相互に共有結合することなく、イオン結合によって複合体を形成する。とくに、ヒアルロン酸がカチオン性の高分子物質と共有結合によって強固に結合していないために、細胞内への移行後、カチオン性高分子物質の遺伝子発現効果が損なわれることがなく、遺伝子発現効率を顕著に向上させることができる。
また、本発明による遺伝子導入用キャリアーは、標的細胞に対する接着能を有しているため、ヒアルロン酸と特異的に結合するCD44などの細胞表面分子を有する細胞を標的として用いることができる。
【００２７】
本発明による遺伝子導入用キャリアーは、トランスフェクション効率を改善し、キャリアーの使用量を減らすことを可能にする生体接着性を示す。ヒアルロン酸は、該キャリアーの細胞膜への結合を促進し、細胞への移行を促進する。これは、標的細胞における該キャリアー濃度を高めるだけでなく、標的細胞での滞留時間の改善をもたらす。
【００２８】
本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２９】
プロタミン / プラスミド 複合体 のアルブミンによる凝集のヒアルロン酸(以下「HA」という。)による阻止効果
ルシフェラーゼプラスミド(pCMV-Luc)は次のように作製した。pGL3−コントロールベクター(Promega, Madison, WI, USA)のルシフェラーゼcDNAを制限酵素HindIII/Xbalで切り出し、その断片をpcDNA3ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)のマルチクローニングサイトに組み込んだ。このルシフェラーゼプラスミド(pCMV-Luc)を大腸菌DH5alphaにより増殖させ、キアゲン・プラスミド・ギガ・キットにて精製した(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)。
以上のように作製したルシフェラーゼプラスミドを蛍光色素DAPI（4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール ジアセテート、シグマ社製）で標識し、硫酸プロタミン (Wako製、サケ精子由来)を電荷比プラスミド：プロタミン＝1：2（プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：プロタミンのアルギニン側鎖グアニジノ基及びN末端アミノ基カチオンの正電荷のモル比）の割合で加えて複合体を調製した。（ルシフェラーゼプラスミド濃度：6μＭ(核酸塩基濃度にして)、プロタミン濃度：2.32μg/ml）。蛍光顕微鏡で観察すると、小さなグロビュール状の複合体がブラウン運動しているのが見られた。ここにアルブミンを、最終濃度6mg/mlとなるように加えると、複合体は瞬時に凝集し、沈殿した。
一方、ルシフェラーゼプラスミド/プロタミン複合体に予めHAナトリウム塩(ナカライテスク製、微生物由来)を電荷比プロタミン： HA＝2:1（プロタミンのアルギニン側鎖グアニジノ基及びN末端アミノ基カチオンの正電荷： HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)で加えた系（ルシフェラーゼプラスミド濃度：6μＭ(核酸塩基濃度にして)、プロタミン濃度：2.32μg/ml、HA濃度：9.62μg/ml)では、6 mg / mlのアルブミン添加後も複合体は小さなグロビュール状のままブラウン運度を続けた。
以上の観察から、HAはDNA複合体表面をコートし、血清タンパクによる凝集を効果的に阻止する能力があることが認められた。
【実施例２】
【００３０】
HelΔ1 / HA / Plasmid Complex による遺伝子発現
遺伝子(ルシフェラーゼプラスミド)・HelΔ1(両親媒性カチオン性ペプチド)・HAの３成分の複合体を作製し、この複合体をチャイニーズ・ハムスター卵巣由来細胞CHOと相互作用させ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を確認した。
操作手順
(1)  複合体を導入する前日に、24穴マルチプレートに5×10４cells/wellでチャイニーズ・ハムスター卵巣由来CHO細胞をまき、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、旭テクノグラス製)培地を用いて24時間インキュベートした。
(2)  実施例1と同様に調製したルシフェラーゼプラスミド2.5μgを含むDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、旭テクノグラス製)溶液180μlを0.52μg/μlのHelΔ1溶液(HelΔ1は文献にしたがって作製した (T. Niidome, K. Takaji, M. Urakawa, N. Ohmori, A. Wada, T. Hirayama, H.Aoyagi, Chain Length of Cationic a-Helical Peptide Sufficient for Gene Delivery into Cells, Bioconjugate Chem., 10, 773-780 (1999))。)10μlと混合して、電荷比プラスミド：HelΔ1-＝1:2（プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HelΔ1のLys残基の側鎖の一級アミノ基カチオンの正電荷のモル比)とし、５分間室温で放置した。
(3)  HA濃度1.12μg/μlまたは2.43μg/μlのHA溶液 (HAナトリウム塩、ナカライテスク製、微生物由来) を10μl加えて、電荷比プラスミド：HA＝1:4又は1:8 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比) とし、さらに10分間室温で静置した。
(4)  作成した複合体溶液にDMEM 50μlを混合した後、ウェルに加えた。
(5)  3時間、37℃、5％CO2-95% air下でインキュベートした。
(6)  複合体を含んだ培地を除き、PBS（-）(Phosphate Buffered Salts, Dalbecco's Formula (Modified), Without Magnesium and Calcium、 Takara製)で2〜3回細胞表面を洗い、新たな培地を加えた。
(7)  24時間のインキュベート後、PBS（-）で3回細胞表面を洗った後、PicaGeneの細胞溶解液を200μlずつ各ウェルに加えた。20分ほど放置してから、細胞を剥がし、エッペンに回収した。
(8)  遠心（15000rpm, 1 min）にかけてから、上清を用いてLuciferase Assay を行った。Luciferase Assay は、PicaGene  Luminescence kitの方法に従って行った。
なお、Protein Assay には、この細胞溶解液をそのまま用いた。Protein Assay は、Bio-Rad 社のProtein assay kitを用いて行った。
比較のために、HAを添加しなかったものについても遺伝子発現を調べた。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity 738244.48(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA＝1:4の時では21417306.49(RLU/mg protein)で2900％、電荷比プラスミド：HA＝1:8の時では3339644.80(RLU/mg protein)で450％発現が上がった。
【実施例３】
【００３１】
KG6 / HA / Plasmid Complex による遺伝子発現
実施例２と同様の実験を、HelΔ1の代わりに、KG6(Lysの第６世代デンドリマー、KG6は文献にしたがって作製した(M. Ohsaki, T. Okuda, A. Wada, T. Hirayama, T. Niidome, H. Aoyagi, In Vitro Gene Transfection Using Dendritic Poly(L-Lysine), Bioconjugate Chem., 13, 510-517(2002)。)を用いて同様に行った。ただし、電荷比プラスミド：KG6＝1:4 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：KG6の一番外側の第六世代のLysの一級アミノ基カチオンの正電荷のモル比)とした。したがって、ルシフェラーゼプラスミド・KG6・HAの３成分複合体形成時には、プラスミド濃度は0.0125μg/μl、KG6濃度は0.0191μg/μl、HA濃度は電荷比プラスミド：HA＝1:4 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)の時には0.0608μg/μl、電荷比プラスミド：HA＝1:8の時には0.1215μg/μlとなった。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity 695554636.82(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA＝1:4の時では1976351064.56(RLU/mg protein)で280％、電荷比プラスミド：HA＝1:8の時では2295352964.00(RLU/mg protein)で330％発現が上がった。
【実施例４】
【００３２】
HelΔ1 / HA / Plasmid Complex による血清存在下での遺伝子発現
実施例２と同様の実験を、遺伝子複合体と細胞とのインキュベーションを10％血清（牛胎児血清（Fetal Bovine Serum）、コスモバイオ（株）製）入り培地中にて行った。したがって、ルシフェラーゼプラスミド・KG6・HAの３成分複合体形成時には、プラスミド濃度は0.0125μg/μl、HelΔ1濃度は0.0262μg/μl、HA濃度は電荷比プラスミド：HA＝1:4 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)の時には0.0608μg/μl、電荷比プラスミド：HA＝1:8の時には0.1215μg/μlとなった。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity 47936.02(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA＝1:4の時では167160.27(RLU/mg protein)で350％、電荷比プラスミド：HA＝1:8の時では100815.58(RLU/mg protein)で210％発現が上がった。
【実施例５】
【００３３】
PEI / HA / Plasmid Complex による遺伝子発現
遺伝子(ルシフェラーゼプラスミド)・PEI(ポリエチレンイミン、Linear、分子量約25,000、ポリサイエンス製)・HAの３成分の複合体を作製し、この複合体をチャイニーズ・ハムスター卵巣由来細胞CHOと相互作用させ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を確認した。
操作手順
(1)  複合体を導入する前日に、24穴マルチプレートに5×10４cells/wellでチャイニーズ・ハムスター卵巣由来細胞CHOをまき、Ｆ12培地（Ham's F12、GibcoBRL製）中で24時間インキュベートした。
(2)  実施例1と同様に調製したルシフェラーゼプラスミド 2.5 μgを含む水溶液12.5 μlを、HA濃度4.86μg/μlの水溶液 (HAナトリウム塩、ナカライテスク製、微生物由来) 25μlと混合し、電荷比プラスミド：HA＝1:40 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)とした。
(3)  プラスミドに対して電荷比プラスミド：PEI＝1:5 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：PEIの主鎖中の二級アミノ基カチオンの正電荷のモル比)となる量のPEI 1.6μgを含む水溶液12.5μlを加えた。
(4)  作成した複合体溶液に２倍濃度のPBS(-)(Phosphate Buffered Salts, Dalbecco's Formula (Modified), Without Magnesium and Calcium.  Takara製) 50μlを混合した。
(5)  Ｆ12培地（Ham's F12、GibcoBRL製）1 ml とともに細胞に加え、3時間、37℃、5％CO2-95% air下でインキュベートした。
(6)  複合体を含んだ培地を除き、新たな培地を加えた。
(7)  40時間のインキュベート後、PBS(-)で3回細胞表面を洗った後、PicaGeneの細胞溶解液を200μlずつ各ウェルに加えた。20分ほど放置してから、細胞を剥がし、エッペンに回収した。
(8)  遠心（15000rpm, 1 min）にかけてから、上清を用いてLuciferase Assay を行った
。Luciferase Assay は、PicaGene  Luminescence kitの方法に従って行った。
なお、Protein Assay には、この細胞溶解液をそのまま用いた。Protein Assay は、Bio-Rad 社のProtein assay kitを用いて行った。
比較のために、HAを添加しなかったものについても遺伝子発現を調べた。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity 342273243.33(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA＝1:40の時では2360467027.23(RLU/mg protein)で690％発現が上がった。
【実施例６】
【００３４】
プロタミン / HA / Plasmid Complex による血清存在下での遺伝子発現
実施例５と同様の実験を、PEIの代わりに、プロタミン(硫酸プロタミン、Wako製、サケ精子由来)を用いて、また遺伝子複合体と細胞とのインキュベーションを10％血清（牛胎児血清（Fetal Bovine Serum）、コスモバイオ（株）製）入り培地中にて行った。
ただし、電荷比プラスミド：プロタミン＝1：2 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：プロタミンのアルギニン側鎖グアニジノ基及びN末端アミノ基カチオンの正電荷のモル比)とした。したがって、ルシフェラーゼプラスミド・KG6・HAの３成分複合体形成時には、プラスミド濃度は0.05μg/μl、プロタミン濃度は0.0585μg/μl、HA濃度は電荷比プラスミド：HA＝1：2 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)の時には0.1215μg/μl、電荷比プラスミド：HA＝1：16の時には0.9721μg/μlとなった。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity 1100288.94(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA＝1：2の時では9768359.70(RLU/mg protein)で890％、電荷比プラスミド：HA＝1：16の時では6019322.32(RLU/mg protein)で550％発現が上がった。
【実施例７】
【００３５】
キトサン / HA(微生物由来) / plasmid Complexによる血清存在下での遺伝子発現
遺伝子(ルシフェラーゼプラスミド)・キトサン(キトサン塩酸塩、分子量約40,000、脱アセチル化度８０％、焼津水産化学工業(株)製)・HAの3成分の複合体を作製し、この複合体をチャイニーズハムスター卵巣由来CHO細胞と相互作用させ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を確認した。
操作手順
(1)  ルシフェラーゼプラスミドは次のように作製した。pGL3−コントロールベクター(Promega, Madison, WI, USA)を大腸菌(competent ceLL DH5, TOYOBO, Lot. 116600)により増殖させ、キアゲン・プラスミド・ギガ・キットにて精製した(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)。
(2)  複合体を導入する前日に、24穴マルチプレートに5×10４cells/wellでチャイニーズ・ハムスター卵巣由来細胞CHOをまき、10％血清(牛胎児血清(Fetal Bovine Serum)、JRH BOPSCIENCES製)、１万単位/ mgペニシリン(明治製菓(株)製)、1 mg / mlストレプトマイシン(明治製菓(株)製)を含むハムF12培地(日水製薬(株)製)中で24時間インキュベートした。
(3)  滅菌水に溶解させた1mg／ml ルシフェラーゼプラスミド溶液1.25μlを、予め1N HClでpH 6.5に調製した10mM MOPS(Morpholinepropanesulfonic acid、Sigma社製(St. Louis, MO))入りの無血清ハムF12培地(日水製薬(株)製)に溶解させて25μg/mlとし、30分間インキュベートした。
(4)  予め1N HClでpH 6.5に調製したPBS(-)に溶解させた4.87μg/μl HA溶液 (HAナトリウム塩、ナカライテスク製、微生物由来) 1.25μlを加えて、電荷比プラスミド：HA＝1：4 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)とし、15分間インキュベートした。
(5)  PBS(-)(pH 6.5)に溶解させた3.16μg/μl キトサン溶液1.25μlをハムF12培地(10mM MOPS、pH 6.5、無血清)48.75μlと混合して30分間インキュベートした溶液を加えて、電荷比プラスミド：キトサン＝1：5 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：キトサンのアミノ基カチオンの正電荷のモル比)とし、15分間インキュベートした。
(6)  作製した複合体溶液を10％血清入りハムF12培地(10mM MOPS、pH 6.5) 398.75μlとともに細胞に加えて各ウェルの体積を500μｌとし、3時間、37℃、5％CO２-95% air下でインキュベートした。
(7)  複合体を含んだ培地を除き、新たな10％血清入りハムF12培地1mlを加えた。
(8)  40時間のインキュベート後、PBS(-)で3回細胞表面を洗った後、Cell Culture Lysis Reagent(Promega)を100μlずつ各ウェルに加えて細胞を溶解させ、エッペンに回収した。
(9)  遠心（4℃, 12000rpm, 15秒間）にかけてから、上清を用いてLuciferase Assay を行った。Luciferase Assay は、上清20μlとルシフェリン(Promega)100μlを専用チューブ(Promega)の中に入れ、軽く振り混ぜてからルミノメーター(TD-20/20 Luminometer, TURNER DESIGNS)で吸光度を測定した。測定時間は30秒とした。
なお、Protein Assay には、この細胞溶解液をそのまま用いた。Protein Assay は、Bio-Rad 社のProtein assay kitを用いて行った。
比較のために、HAを添加しなかったものについても遺伝子発現を調べた。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity  174570(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA=1：4の時では302867(RLU/mg protein)で170％発現が上がった。
【実施例８】
【００３６】
キトサン / HA(トサカ由来) / plasmid Complexによる血清存在下での遺伝子発現
実施例7と同様の実験を、微生物由来のHAの代わりに、トサカ由来のHA (HAナトリウム塩、WAKO製)を用いて、同様に行った。ただし、電荷比プラスミド：キトサン＝1：5 (プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：キトサンのアミノ基カチオンの正電荷のモル比)とした。したがって、ルシフェラーゼプラスミド・キトサン・HAの３成分複合体を細胞に加えた時には、プラスミド濃度は2.5μg/ml、キトサン濃度は7.9μg/ml、HA濃度は電荷比プラスミド：HA=1：4(プラスミドのリン酸アニオンの負電荷：HAのカルボン酸アニオンの負電荷のモル比)の時には12.175μg/mlとなった。
結果
発現活性は、HAを加えていない場合(Luciferase Activity  174570(RLU/mg protein))と比較して、電荷比プラスミド：HA=1：4の時では486480(RLU/mg protein)で280％発現が上がった。