(57)【要約】【目的】  受粉防止物質に対する耐性形質を有する成熟花粉を選択的に柱頭に受粉させることによって、培養操作等による選択工程を省略して簡便かつ確実に作出する方法を提供する。【構成】  候補植物の花粉を、受粉防止物質を処理した柱頭に接触させるステップ；および受粉した胚から発芽させるステップ、を含むことを特徴とする選択的受粉法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(a)候補植物の花粉を、受粉防止物質を処理した柱頭に接触させるステップ；および
(b)受粉した胚から発芽させるステップ、
を含むことを特徴とする選択的受粉法。
【請求項２】
候補植物の花粉が、外来遺伝子と受粉防止物質に対する抵抗性遺伝子を導入した形質転換花粉である請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、植物の選択的受粉法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、化学物質耐性や有用な外来形質を有する植物を簡便かつ効率よく選択し、個体発生させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
土壌の変化（例えば汚染等）に対応して植物を良好に生育させること、あるいは有用植物個体やその果実等の生産量を高めることを目的として、所望の遺伝形質を有する植物個体の選択が行われている。
【０００３】
しかしながら、自然界に生育する膨大な植物から所望の形質を有する個体を探索する方法や、交配によって所望の遺伝形質を植物個体に導入する方法は非効率的であり、多大な時間や労力にも係わらず、必ずしも成功を収めるとは限らない。
【０００４】
一方、遺伝子組換え法によって有用な遺伝子（外来遺伝子）を植物個体に導入する方法が確立されつつあり、比較的簡便かつ確実に様々な遺伝形質を有する植物（遺伝的改変植物）の作出が可能となっている。このような形質転換（遺伝子組換え）植物の作成における遺伝子導入方法としては、主に二つの手法が用いられている。その一つは「アグロバクテリウム法」であり、土壌細菌Agrobacterium tumefaciensまたはA. rhizogenesが植物に感染し、アグロバクテリウム細胞内のプラスミドの一部を植物ゲノムDNAに組込み、ホルモン異常を起こさせる現象を利用したものである。もう一つが「パーティクルガン法」であり、DNAを金属粒子（直径1μm程度）にコーティングし、音速以上に加速して植物細胞に打ち込み、細胞壁および細胞膜を貫通させて細胞内に組込むことにより植物を形質転換する方法である。
【０００５】
ただしこれらの方法の場合には、導入したい遺伝子が必ずしも全ての細胞に入るとは限らないため、大量の細胞に対して遺伝子導入操作を行い、目的の遺伝子が導入されたものだけを選択する必要がある。また、対象の細胞種によっても異なるが、例えばパーティクルガン法による花粉への遺伝子導入効率は約0.4％程度であり、その後の操作の効率化のためには、遺伝子が確実に導入された花粉を選択する必要がある。
【０００６】
このような遺伝子導入した植物細胞の選択方法として特許文献１が知られている。これは、抗生物質ハイグロマイシンを添加した培地で遺伝子導入細胞を培養することによって、ハイグロマイシン耐性を持たない植物細胞の増殖を妨げ、結果としてハイグロマイシン耐性またはこの耐性と連鎖した目的遺伝形質をもつ細胞を選択する方法である。また非特許文献１の方法は、アグロバクテリウム法で既に外来遺伝子を導入した組換え植物の未熟花粉の成熟を阻害する物質（例えばハイグロマイシンB）に対する耐性遺伝子と目的遺伝子を持った未熟花粉を、成熟阻害物質を添加した培地で培養し、この培地で成熟する花粉（すなわち遺伝子導入花粉）を選択する方法である。
【特許文献１】日本特許第2815837号
【非特許文献１】Tourave A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:12165-12169, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１や非特許文献１の方法の場合には、細胞や花粉の培養操作を必須とするが、この培養の操作は極めて煩雑である。また、非特許文献１の方法では選択した遺伝子導入花粉を受粉させることによって植物個体を簡便に発生させることができるが、選択の対象が未熟花粉であるため、それを成熟花粉に発達させる必要がある。
【０００８】
従って、特許文献１や非特許文献１の方法における問題点を解消し、好ましい状態の遺伝子導入細胞を確実に選択し、かつ簡便に遺伝子導入植物個体を再生する方法が望まれていた。
【０００９】
さらにまた、好ましい特定の形質を有する植物を得るという本来的な目的達成の観点からは、遺伝子導入に頼らず、内在的に特定の形質を保有している植物を選択する方法が望まれてもいた。
【００１０】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、植物が有する形質（外来遺伝子の導入による獲得形質を含む）を簡便かつ正確に特定することを可能とする新しい方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、以下のステップ：
(a)候補植物の花粉を、受粉防止物質を処理した柱頭に接触させるステップ；および
(b)受粉した胚から発芽させるステップ、
を含むことを特徴とする選択的受粉法を提供する。
【００１２】
この発明においては、候補植物の花粉が、外来遺伝子と受粉防止物質に対する抵抗性遺伝子を導入した形質転換花粉であることを好ましい態様としている。
【００１３】
なお、この発明において「植物」とはその受粉器官として柱頭を有する被子植物であり、さらには産業上有用な農作物、果樹、樹木等である。「外来遺伝子」とは、宿主植物が本来は有してはいないが、その形質を有することが好ましいと考えられる形質（例えば、耐害虫性、耐塩性、アルカリまたは酸性耐性、低または高温耐性、高生産性、耐病害性、除草剤耐性、耐重金属性等）である。
【００１４】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【発明の効果】
【００１５】
この発明によれば、受粉防止物質に対する耐性形質を有する植物の花粉を選択的に受粉させることによって、受粉防止物質に対する耐性形質とその形質と強く連鎖する有用な形質を有する植物個体を効率的に得ることが可能となる。
【００１６】
また外来遺伝子の導入によって耐性形質および所望の外来遺伝子形質を導入した形質転換花粉を選択的に受粉させることによって、目的の外来遺伝形質を有する遺伝子導入植物個体を効率よく得ることが可能となる。
【００１７】
以下、発明の実施形態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
この発明の方法は、以下のステップによって実施する。
ステップ(a)：候補植物の花粉を、受粉防止物質を処理した柱頭に接触させるステップ
「受粉防止物質」とは花粉の柱頭への受粉を選択的に防止させる物質であり、例えばハイグロマイシンB、カナマイシン、アンピシリン、ビアラフォス剤等が例示される。
【００１９】
特にハイグロマイシンBは、花粉の柱頭への受粉を阻害することが確認されており（下記「参考例」参照）、特にこの発明に使用する物質として好ましい。またこのハイグロマイシンBは、その細胞毒性によって受精胚の培養選抜にも使用することができる。
【００２０】
受粉防止物質は、例えば10〜500mg/ml程度の濃度の溶液を、柱頭表面に塗布、噴霧等によって処理することができる。また候補植物の花粉を柱頭に接触させる方法は、一般的に受粉方法に準じて行うことができる。
ステップ(c)：受粉した胚から発芽させるステップ
受粉した胚から発芽させ、受粉防止物質に耐性を有する植物個体を生育させるステップである。この発明の方法では、前記のステップ(a)において受粉防止物質耐性を有する花粉のみが受粉されるのであるから、受粉胚は原理的には受粉防止物質耐性胚である。従って、この受粉胚を公知の方法に従って発芽させれば、目的の形質（受粉防止物質耐性）を有する植物個体を生育させることが可能である。また、さらに選別の精度を向上させるためには、ステップ(a)で使用した受粉防止物質（例えばハイグロマイシンB）を添加した培地で発芽・生育を行うことも好ましい。
【００２１】
以上の方法によって、特定の受粉防止物質に対する植物を簡便かつ確実に選択し、植物個体として生育させることが可能となる。そして、このようにして得られた植物個体は、特定の受粉防止物質に対する耐性形質のほか、その耐性形質に強く関連した有用な遺伝形質を有する植物個体である。そのような有用遺伝形質としては、例えばハイグロマイシンBに関連する耐害虫性遺伝形質、カナマイシンに関連する耐塩性形質等が挙げられる。
【００２２】
また、この発明の方法においては、候補植物の花粉が、外来遺伝子と受粉防止物質に対する抵抗性遺伝子を導入した形質転換花粉であることを別の態様としてもいる。すなわち、受粉防止物質を処理した柱頭に形質転換花粉を接触させれば、受粉防止物質耐性遺伝子の導入された（すなわち同時に外来遺伝子が導入されている）花粉のみが選択的に受粉する。従って、前記の特許文献１や非特許文献１のように培養操作を行うことなく、目的の遺伝子導入植物を効率よく作出することができる。
【００２３】
受粉防止物質に対する「抵抗性遺伝子」としては、例えばハイグロマイシンBに対してはハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシンに対してはNPTII遺伝子、ビアラフォス剤に対してはbar遺伝子等を例示することができる。またこれらの遺伝子はそれぞれ公知のクローニングベクター等から公知の方法により単離して使用することができる。例えばハイグロマイシン耐性遺伝子はpUC-HY（GenBank AF025747）、pIRES1hyg（GenBank U89672）等から得ることができる。
【００２４】
抵抗性遺伝子と外来遺伝子は、それぞれの発現制御配列（プロモーター等）を連結した発現カセットとし、同一の植物用発現ベクターに組み込んで「遺伝子導入ベクター」を構築する。
【００２５】
遺伝子導入ベクターを成熟花粉に導入するには、公知の遺伝子導入法を採用することができるが、花粉の特性等を考慮し、パーティクルガン法が特に好ましい。パーティクルガン法による成熟花粉への遺伝子導入は、例えば公知の方法（Nishihara, M. et al., Plant Physiol. 102:357-361, 1993等）に準じて行うことができる。
【００２６】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
図1に模式的に示した工程に従って、イネ・キチナーゼ遺伝子を導入したユリ個体を作出した。
(1)  方法
(1-1)導入遺伝子
ハイグロマイシン耐性遺伝子（HPT）とイネ・キチナーゼ遺伝子（RCC2またはRCG3）を導入したプラスミドベクターpEN4-RCC2およびpEN4-RCG3（農業生物資源研究所遺伝子設計研究室・西澤洋子博士より分譲）を用いた。その構成図を図2に示す。なお、RCC2およびRCG3の遺伝子（cDNA）配列は公知である（それぞれGenBank X56787およびGenBank D16223）。
(1-2)遺伝子導入
パーティクルガン法によってユリ成熟花粉に遺伝子導入ベクターを導入した。具体的な手続は以下のとおりである。
(a)花粉の調製
開花直前のユリ蕾より無菌的に葯を採取し、修正White培地中で約5分間攪拌し、培地中に花粉を放出させた後、葯を取り除いた。血球計算盤で花粉密度を調整して、直径27 mmのメンブレンフィルター上に、花粉密度がフィルター当たり２×104個以上となるように均一に置床し、このフィルターを固形の修正White培地上に置いた。
(b)導入遺伝子の調製
プラスミドベクターpEN4-RCC2およびpEN4-RCG3を水に溶かし、金粒子とよく混合し、エタノール沈殿によりベクターと金粒子の混合物を形成した。混合物をエタノールに拡散させてエタノール混合液とし、その一定量をパーティクルガン用の金属板に載せ、乾燥させ、金属板に付着させた。
(c)パーティクルガンによる遺伝子導入
以下の条件で行った。
・装置：日本医化器械製作所製パーティクルガン（PIGG−X）
・パーティクルガンから花粉までの距離：3.5 cm
・ヘリウムガス圧：14 kgf/cm2
・パーティクルガンチャンバー内部圧力：60 mmHg
・同一花粉への発射回数：3回
(1-3)受粉処理
ハイグロマイシンBを（H0）および100mg/ml（H100）塗布したユリの柱頭に、遺伝子導入花粉（約20,000個）を受粉させた。試験規模はそれぞれ、７子房、3反復である。
(1-4)胚形成の確認
受粉から約60日後、受精胚を摘出し、計測した。
(1-5)発芽・生育の確認
ハイグロマイシンB（100mg/ml）を添加したMS培地に受精胚を播種し、90日間培養して発芽・生育した胚数を確認した。
(1-6)PCR法による導入遺伝子の確認
ハイグロマイシンB添加培地で生育した胚を、ハイグロマイシンB無添加培地で継代させてユリを成長させた後、ユリの葉（約50mg）から文献（Edwards, K. et al. Nucleic Acids Res. 19:1349, 1991）の記載に従ってDNAを抽出した。PCRによる遺伝子確認の手続は以下のとおりである。
・装置：TP-3000（TaKaRa社製）
・反応量：25μg
・酵素：r-Taq（TaKaRa社製）  １U/チューブ
・プライマー：
RCC2増幅用：
フォワード：5'-agaggccgttcaacagcggctcgtcggttgggt-3'（SEQ ID No.1）
リバース：5'-gtataattgcgggactctaatc（SEQ ID No.2）
RCG3増幅用：
フォワード：5'-aggccctacccgccttcctagttg（SEQ ID No.3）
リバース：5'-gtataattgcgggactctaatc（SEQ ID No.2）
・テンプレート量：0.03〜0.2μg／チューブ
・温度条件：94℃/2分−［94℃/1分−56℃/2分−72℃/3分］×35−72℃/5分
・電気泳動：AGE寒天濃度1.5％、100V
(2)  結果
選択的受粉の効果は表1に示したとおりである。ハイグロマイシンBの処理濃度に比例して受精胚の形成数(a)が減少した。これによって、少ない遺伝子導入種子を対象として発芽・生育操作を行うことが可能となる（省力化）。またPCR解析の結果（図３）、遺伝子導入個体を約２倍の効率で得た（効率化の実現）。
【００２８】
【表１】
2005143447.tif 000003
（参考例１）
【００２９】
化学物質の種類とユリ花粉の発芽率の関係を試験した。
(1)  方法
材料：テッポウユリ（品種：ひのもと）の成熟花粉
花粉の調製：ユリの開花直前の蕾より花粉を採取し、発芽培地上のメンブレンフィルター（27 mmφ、孔径3μm）に5×104個／plateを置床した。
発芽培地：ホウ酸100 mg/L、硝酸カルシウム300 mg/L、ショ糖10％、寒天1％
培養条件：25℃、暗黒
試験区：(a)化学物質をそれぞれ(b)濃度で発芽培地に添加
(a)  ビアラフォス剤（Bar）、カナマイシン（Kｍ）、アンピシリン（Amp）、
ハイグロマイシンB（Hyg）
(b)  ０（コントロール）、10、100、500（Hygは250）mg/L
調査：12、30時間後に500個以上の花粉をプロピオン酸オルセインで染色し、発芽を検鏡した。
(2)結果
表２は、各化学物質添加の発芽率（％）である。この表2に示したとおり、テッポウユリの花粉発芽はハイグロマイシンB、カナマイシン、アンピシリンで抑制され、特にハイグロマイシンBの効果が最も高かった。またビアラフォス剤の効果は少なかった。
【００３０】
【表２】
2005143447.tif 000004
（参考例２）
【００３１】
ハイグロマイシンBの濃度とユリ花粉の発芽率との関係を調べた。
(1)  方法
材料：シンテッポウユリ（品種：ホワイトランサー、白龍、雷山１、２、３号）、テッポウユリ（品種：ひのもと）の成熟花粉を参考例１と同一の方法で調製した。
試験区：ハイグロマイシンBを、０、５、10、25、50、100、250 mg/Lの各濃度で参考例１と同一の発芽培地に添加し、参考例１と同一条件で培養した。
調査：12時間後に1000個以上の花粉の発芽数を調査した（各試験区とも、調査は3回繰り返した）。
(2)結果
結果は表３に示したとおりであり、ハイグロマイシンBは、容量依存的にユリ花粉の発芽を抑制し、特に100 mg/L以上の濃度では発芽はほぼ完全に抑制された。
【００３２】
【表３】
2005143447.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００３３】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、特定の遺伝形質（例えば、外来遺伝子による形質など）を有する植物個体を効率的に得ることが可能となり、特定の環境等において良好に生育する品種の改良や、遺伝子改変植物の作出効率を向上させること可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例に例示したイネ・キチナーゼ遺伝子を導入したユリ個体の作出の工程図である。
【図２】実施例で例示した遺伝子導入ベクターの構成図である。矢印の範囲はPCR解析時の増幅範囲を示す。RCC2遺伝子は約300bp、RCG3遺伝子は約250bpである。
【図３】遺伝子RCC2導入ユリ個体のPCR解析（電気泳動像）の結果である。左端レーンおよび右端レーンはサイズマーカー、左から第2レーンはpEN4-RCC2プラスミド、右から第2レーンはpENプラスミドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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