(57)【要約】【課題】シアノピリジン類をニコチン酸類に変換して、工業化するに十分な活性を有する高純度ニコチン酸類を収率良く製造する方法を提供する。【解決手段】  シアノピリジン類に対し生体触媒であるアシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)及び／または該微生物由来のニトリラーゼ酵素による加水分解反応を行い、生成するニコチン酸類アンモニウム塩からニコチン酸類を取得することによって高純度ニコチン酸類を収率良く製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアノピリジン類の加水分解反応によりニコチン酸類を製造する方法において、微生物であるアシネトバクター・エスピーAK226及びまたは該微生物由来のニトリラーゼ酵素を該加水分解反応の生体触媒として用いることを特徴とするニコチン酸類の製造方法。
【請求項２】
前記シアノピリジン類が２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジンから選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする請求項1記載のニコチン酸類の製造方法。
【請求項３】
シアノピリジン類が３−シアノピリジンであることを特徴とする請求項1記載のニコチン酸の製造方法。
【請求項４】
微生物であるアシネトバクター・エスピーAK226及びまたは該微生物由来のニトリラーゼ酵素を懸濁又は溶解させた水溶液に、シアノピリジン類を液中濃度５重量％以下になるようにコントロールしながら逐次或いは連続添加することを特徴とする請求項１~３のいずれかに記載のニコチン酸類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニコチン酸またはニコチン酸異性体またはニコチン酸誘導体(以下本明細書では「ニコチン酸類」という。)の製造方法に関する。更に詳しくは、シアノピリジンまたはシアノピリジン異性体またはシアノピリジン誘導体(以下本明細書では「シアノピリジン類」という。)の生物学的加水分解反応によって生成するニコチン酸類アンモニウム塩からニコチン酸類を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ニコチン酸類の製造方法としては、アセトアルデヒドとアンモニアによるレッペ反応により得られるアルデヒドコリジンを経由した方法(特許文献１参照)や、β−ピコリンのアンモ酸化により得られる３−シアノピリジンを化学的に加水分解する方法(特許文献２参照)などの化学的合成法が知られている。
【０００３】
しかしながら、これらの方法は副生物の生成や精製工程が複雑になる等の問題があり、さらに新規で工業的に有利な製造方法の開発が望まれていた。
【０００４】
一方、二トリルを加水分解する活性を有する微生物を用いて３−シアノピリジンをニコチン酸に変換する方法として、ロドコッカス族ロドクロス種(非特許文献１参照)、ノカルディア族ロドクロウス種(非特許文献２参照)、アグロバクテリウム族、アシネトバクター族、ミクロバクテリウム族、セルロモナス族、サイトファーガ族、オベサムバクテリウム族またはストレプトマイセス族(特許文献３参照)等の微生物を用いる方法が知られている。
【０００５】
これらの微生物を用いた製法は、化学的製法と比較して温和な条件下で反応でき、反応副生物が少ないことから、より工業的に有利な製法と考えられる。しかしながら、上記参考文献記載の技術は、基礎的な実験がなされているのみであるか、或いは、工業化を目的としたものであると言いながら、充分なニトリル化合物の加水分解活性を有しておらず、とても工業化できるレベルに達しているとは言えないものであった。
【０００６】
【特許文献１】独国特許公開第２，０４６，５５６号明細書
【特許文献２】独国特許第８２８，２４６号明細書
【特許文献３】特許第２９２６３５０号工法
【非特許文献１】Appl.Environ.Microbiol.54  1030-1032(1988)
【非特許文献２】J.Gen.Microbiol.134  1099-1108(1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、シアノピリジン類を加水分解してニコチン酸類を製造する方法において、従来の化学法のような、副生物の生成や精製工程が複雑になる等の問題を有していない、二トリル類を加水分解する活性を有する微生物を用いて温和な条件下でシアノピリジン類をニコチン酸類に変換する方法であって、工業化するに十分な活性を有する、高純度ニコチン酸類を収率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、工業的生産を目的として、さらに有効な活性の高い新規微生物の探索を鋭意行った結果、何と驚くべきことに、アシネトバクター・エスピーAK226（FERM  P-08271）がシアノピリジン類の加水分解反応に対して非常に高い活性を有しており、また高い生産能力(単位乾燥微生物重量当たりのニコチン酸類の総生産量)を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下に記載する通りの構成を有する。
（１）シアノピリジン類の加水分解反応によりニコチン酸類を製造する方法において、微生物であるアシネトバクター・エスピーAK226及びまたは該微生物由来のニトリラーゼ酵素を該加水分解反応の生体触媒として用いることを特徴とするニコチン酸類の製造方法。
（２）前記シアノピリジン類が２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジンから選ばれた少なくとも一つである上記（１）のニコチン酸類の製造方法。
（３）シアノピリジン類が３−シアノピリジンである上記（１）のニコチン酸の製造方法。
（４）アシネトバクター・エスピーAK226を懸濁又は溶解させた水溶液に、シアノピリジン類を液中濃度５重量％以下になるようにコントロールしながら逐次或いは連続添加する上記（１）〜（３）のニコチン酸類の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、シアノピリジン類に対し、アシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)及び／または該微生物由来のニトリラーゼ酵素を生体触媒として使用し、加水分解反応を行うことで、ニコチン酸類を高収率、高生産能力で生成でき、高純度のニコチン酸類を工業的に満足できるレベルで生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の微生物、アシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)の菌学的性質は以下の通りである。
【００１２】
【表１】
2005176639.tif 000002
【００１３】
本微生物の培養のために用いられる培地は、本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機イオンさらに必要ならば有機栄養源を含む通常の培地である。炭素源としては、有機酸、アミド類、ニトリル類、植物油、その他が使用できるが、好ましくは有機酸、ニトリル類、植物油がよい。窒素源としては、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、その他が使用できるが、好ましくは、アンモニア、アンモニウム塩がよい。無機イオンとしてはマグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、リン酸イオン、その他が必要に応じて適宜使用できる。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸及びこれらを含有する酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、その他が適宜使用できる。培養は、好気的条件下、ｐＨ＝６〜１２、好ましくは６．５〜１０、より好ましくは７〜９、培養温度１５〜４２℃、好ましくは２０〜３５℃に制御し、培養時間１〜３日で行うことで、高活性の微生物を高収量で取得することができる。
【００１４】
本微生物及び／または該微生物由来のニトリラーゼ酵素を生体触媒として用い、ニトリル類を加水分解反応させる方法としては、例えば上記のように培養して得た微生物の培養液、或いは遠心分離、バッファーによる洗浄等を経て得た微生物懸濁液に、シアノピリジン類を添加する方法、微生物または微生物処理物(例えば微生物破砕物、粗酵素、精製酵素等)を懸濁または溶解させた水溶液に、シアノピリジン類を添加する方法、或いはそれら微生物処理物を一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを用いる方法等がある。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
反応温度は氷点〜５０℃、好ましくは１０℃〜４０℃、より好ましくは２０〜３０℃、ｐＨは５〜１２、好ましくは６〜１０に保ちつつ、暫時撹拌または静置すればよい。シアノピリジン類の濃度は、特に限定するものではないが、１０重量％以下、好ましくは５重量％以下、より好ましくは２重量％以下、最適には１重量％以下であり、シアノピリジン類を固体の状態、或いは水溶液の状態で連続的にまたは間欠的に添加すればよい。
【００１６】
この場合、シアノピリジン類の濃度及び反応温度は、本微生物及び／または該微生物由来のニトリラーゼ酵素の持つ生体触媒能の基質阻害及び／または経時的劣化に大きく影響し、シアノピリジン類の濃度の低い程、また、反応温度の低い程、ニトリラーゼ酵素の基質阻害及び／または失活を軽減でき、生産能力を増加させることができるため、シアノピリジン類の定常濃度を低濃度に、また反応温度を低温にそれぞれ制御することが望ましい。尚、シアノピリジン類の濃度及び反応温度の下限としては、特に制限はないが、現実的には低すぎると反応速度が低下するため、大きなリアクターが必要になる等の不利益を生じる。
【００１７】
かくして得られるニコチン酸類は、通常、アンモニウム塩水溶液となっているため、目的のニコチン酸類を純度よく固体で回収する工程が必要となる。反応液からのニコチン酸類の回収は、常法により行うことができる。以下に、その方法を例示する。
【００１８】
(1)有機酸及びまたは無機酸で処理し、ニコチン酸類アンモニウム塩をニコチン酸類に変換せしめ、抽出或いは晶析等の操作で回収、精製する方法。
(2)水酸化ナトリウム等の強アルカリで処理し、アンモニアをガスとして回収、除去した後、得られるニコチン酸類ナトリウム塩を硫酸等の強酸で処理し、ニコチン酸類ナトリウム塩をニコチン酸類に変換せしめ、引き続き抽出或いは晶析等の操作で回収、精製する方法。
(3)ホルマリンで処理し、アンモニアをヘキサメチレンテトラミンに変換せしめ、得られたニコチン酸類を抽出或いは晶析等の操作で回収、精製する方法。
(4)反応液を直接スプレー乾燥することでニコチン酸類を得る方法（特開平１１−２１７３７３参照）。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。尚、本発明は、これらの実施例により必ずしも限定されるもので無く、その要旨を超えない限り、様々な変更、修飾等が可能である。
【００２０】
固定化していない微生物または微生物処理物液中の乾燥微生物重量の測定法は、以下のごとく実施した。
まず、適当な濃度の微生物または微生物処理懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、微生物または微生物処理懸濁液の濃度を算出した。既知濃度となった微生物または微生物処理懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、濁度計にて濁度を測定し、該濁度計の検量線を作成し、ファクターを算出した。該濁度計の濁度指示値から任意の微生物または微生物処理懸濁液の乾燥微生物濃度を算出した。
【００２１】
微生物または微生物処理物を固定化したものを生体触媒とする場合は、固定化する前の微生物または微生物処理物の乾燥微生物濃度を測定し、固定化担体と微生物または微生物処理物の混合比に基づき、固定化触媒中の固定化担体を差し引いた生体由来成分の乾燥重量を算出した。
【００２２】
反応液の分析については、生成物であるニコチン酸類アンモニウム塩中のアンモニウムイオンをホルマリン処理でヘキサメチレンテトラミンとしてトラップした後、中和滴定により得られるニコチン酸類濃度を基に、生成ニコチン酸アンモニウム量を定量した。
【００２３】
［実施例１〜5及び比較例1］
１ｗｔ％シアノピリジン類水溶液３０ｇをガラス容器に入れ、各設定温度の恒温槽に漬けてスターラー撹拌をしながら定温に保った。そこに微生物濃度が０．０６５ｗｔ％となるようにアシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)微生物懸濁液を添加し、反応をスタートしたところ、反応時間３０分の間に高活性で反応が進行した。また、比較例として同様な方法でアシネトバクター  カルコアセチカム(IFO  12552)についても反応を行った。結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
［実施例６］
スターラー撹拌下、微生物濃度が、０．０２ｗｔ％となるように、アシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)微生物懸濁液を水に添加して作成した懸濁液５００ｇに、反応温度３０℃において、３−シアノピリジンを１０ｗｔ％濃度以下になるように、固体状態で逐次添加したところ、３１時間後に、ニコチン酸アンモニウム濃度１４ｗｔ％、生産能力６００［ｇ−ニコチン酸アンモニウム／ｇ−乾燥微生物］、１０１時間後に、ニコチン酸アンモニウム濃度１８ｗｔ％、生産能力７６０［ｇ−ニコチン酸アンモニウム／ｇ−乾燥微生物］を得た。
【００２６】
［実施例７〜９］
スターラー撹拌下、微生物濃度が、１．４ｗｔ％となるように、アシネトバクター・エスピーAK226(FERM  P-08271)微生物懸濁液を水に添加して作成した懸濁液３０ｇに、各設定温度において、３−シアノピリジンを固体状態で逐次添加したところ、高活性で反応は進行した。結果を表３に示す。
【００２７】
【表３】
2005176639.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の方法によって得られたニコチン酸は生体内において補酵素として働いていることが知られており、食品、飼料等の用途に用いることができる。また、本発明の方法によって得られたニコチン酸誘導体は農医薬品等に用いることができる。