(57)【要約】      （修正有）【課題】新規ヒト腫瘍関連抗原、即ち胎盤から誘導されるアポトーシス因子（ＰＤＡＦ）の核酸配列及びアミノ酸配列、更に免疫や細胞増殖に関連する疾病の治療におけるこれら配列の使用を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むＰＤＡＦ及びこの生物学的機能同等物、この特定のアミノ酸列で表されるポリペプチドをコードする核酸及び縮重配列を提供し、医薬組成物として、特に細胞増殖の治療又は免疫応答の阻害に用いるため、経口、経静脈等の種々の経路に用いられる薬剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこの生物学的機能同等物。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列及びこのバリアントを含むポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこの生物学的機能同等物。
【請求項４】
細胞増殖に対する処置又は免疫反応の抑制に用いるための、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
細胞の生育及び分化の抑制に用いるための、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
細胞増殖に対する処置又は免疫反応の抑制に用いるための、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
癌の治療に用いるための、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
癌の治療に用いるための、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
癌の治療に用いるための、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸及びこの縮重配列。
【請求項１１】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸及びこの縮重配列。
【請求項１２】
請求項３に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸及びこの縮重配列。
【請求項１３】
配列番号４で表される、請求項１０に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号５で表される、請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号６で表される、請求項１２に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
請求項１０に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１２に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１７のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件において請求項１９に記載の宿主細胞を培養する段階と、
ｂ）宿主細胞の培養物からポリペプチドを回収する段階
とを含む製造方法。
【請求項２３】
請求項２に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件において請求項２０に記載の宿主細胞を培養する段階と、
ｂ）宿主細胞の培養物からポリペプチドを回収する段階
とを含む製造方法。
【請求項２４】
請求項３に記載のポリペプチドの製造方法であって、
ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件において請求項２１に記載の宿主細胞を培養する段階と、
ｂ）宿主細胞の培養物からポリペプチドを回収する段階
とを含む製造方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチド及び異種タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項２に記載のポリペプチド及び異種タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項３に記載のポリペプチド及び異種タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項３に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３１】
細胞増殖に対する処置又は免疫反応の抑制に用いるための、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
細胞の生育及び分化の抑制に用いるための、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
細胞増殖に対する処置又は免疫反応の抑制に用いるための、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
配列番号４で表される核酸配列を含む遺伝子断片を導入した形質転換動物。
【請求項３５】
配列番号５で表される核酸配列を含む遺伝子断片を導入した形質転換動物。
【請求項３６】
配列番号６で表される核酸配列を含む遺伝子断片を導入した形質転換動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒト腫瘍関連抗原（胎盤由来アポトーシス因子（ＰＤＡＦ）と称する）、及びその遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
数々の癌特異性遺伝マーカー及び腫瘍関連抗原が同定されている。腫瘍関連抗原の大部分は非腫瘍組織の細胞においてではなく、腫瘍細胞において発現する表面分子であることが見出されている。腫瘍関連抗原は、膜タンパク質として、あるいは糖タンパク質や糖脂質の改変炭水化物分子として特徴づけられている。これらの抗原は腫瘍細胞を免疫学的に通常の細胞と区別し、ヒトの癌に対する診断上及び治療上の標的として有用である。
【０００３】
腫瘍関連抗原のいくつかは先行技術の文献に開示されている。例えば腫瘍関連抗原として機能する、ＳｉＳｏ細胞上に発現する受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１）が、（非特許文献１）に記載されている。ＲＣＡＳ１遺伝子は通常の細胞では発現せずに、子宮頚部腺癌、子宮内膜腺癌、卵巣癌、及び子宮頚部扁平上皮癌で発現する（非特許文献２、非特許文献参照）。更に、ＲＣＡＳ１遺伝子は食道扁平上皮癌、胃腺癌、結腸腺癌及び膵臓腺癌においても発現し得る。ＲＣＡＳ１は、２１３個のアミノ酸を含むタンパク質である。このようなタンパク質はＮ末端に膜貫通セグメント（８〜２７アミノ酸）及びＣ末端部分（１７９〜２０６アミノ酸）にコイルドコイル構造を有し、ＲＣＡＳ１がＩＩ型膜タンパク質又は二量体タンパク質の構造を有する分泌タンパク質である可能性を示している。ＲＣＡＳ１はＫ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ヒトＴリンパ芽球）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）等の各種ヒト細胞系及びＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等の通常の末梢リンパ球に存在する推定受容体のリガンドとして作用する。ＲＣＡＳ１は受容体発現細胞の生育を抑制し、アポトーシス性の細胞死を誘導する。腫瘍細胞はＲＣＡＳ１を発現することにより免疫監視から逃れ、ＲＣＡＳ１受容体ポジティブ免疫細胞にアポトーシスを誘導する。ＲＣＡＳ１は腫瘍関連抗原における役割と共に免疫細胞のアポトーシス誘導における役割も果たしている。
【０００４】
腫瘍関連ＲＣＡＳ１抗原に似た新しい腫瘍関連抗原及びこの抗原をコードする核酸が免疫疾患、細胞増殖及び腫瘍（特に癌）の診断、予防及び治療に役立つことが期待されている。
【非特許文献１】ワタナベタケシら、１９９９年、ネイチャーメディスン（Nature Medicine）、第５巻、Ｎｏ．８、９３８〜９４２ページ
【非特許文献２】ワタナベタケシら、１９９６年、アメリカ癌学会（American Cancer Society）、１５０１〜１５０９ページ
【非特許文献３】３ナカノヒトオ、１９９８年、臨床癌研究（Clinical Cancer Research）、第４巻、１５１７〜１５２０ページ
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一目的は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む新規なヒト腫瘍関連抗原（ここでは、胎盤由来アポトーシス因子（ＰＤＡＦ）と称する）及びこの生物学的機能同等物を提供することにある。
【０００６】
本発明の一目的は、配列番号２で表されるアミノ酸配列及びこのバリアントを含むポリペプチドを提供することにある。
【０００７】
本発明の一目的は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＰＤＡＦ断片及びこの生物学的機能同等物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、配列番号１で表されるポリペプチドをコードする配列番号４で表される核酸及びその縮重配列を提供することにある。また、本発明は配列番号２で表されるポリペプチドをコードする配列番号５で表される核酸及びその縮重配列；及び配列番号３で表されるポリペプチドをコードする配列番号６で表される核酸及びその縮重配列を提供する。
【０００９】
本発明の他の目的は、配列番号４で表される核酸を含む発現ベクター、及び配列番号６で表される核酸を含む発現ベクターを提供することにある。更に、本発明は配列番号４で表される核酸を含む宿主細胞、及び配列番号６で表される核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明に係るＰＤＡＦ又はその断片を含む医薬組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の更なる他の目的は、配列番号４で表される核酸配列を含む遺伝子断片、配列番号５で表される核酸配列を含む遺伝子断片又は配列番号６で表される核酸配列を含む遺伝子断片を導入した形質転換動物を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の特徴は、新規な腫瘍関連抗原（以下これをＰＤＡＦと称する）にあり、また、ＲＣＡＳ１との類似性を有することにある。驚くべきことに、本発明のＰＤＡＦは、ＲＣＡＳ１と比べ、腫瘍細胞及び免疫細胞に対してより高いアポトーシス率を示すことが見出されている。
【００１３】
定義
本明細書において用いる「核酸配列」という語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ；ＦＡＳＥＢ誌（The FASEB Journal）、２０００年、１４：（１０４１〜１０６０））やポリヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等）、及び場合によってはリボ核酸（ＲＮＡ）をいう。この用語はまた、その同等物として、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡ又はＤＮＡどちらかの類似体、及び記載されている実施形態に利用可能であるような一本鎖（センス又はアンチセンス）ポリヌクレオチド及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００１４】
本明細書において用いる「アミノ酸配列」という語は、天然のタンパク質分子のアミノ酸配列をいう。「アミノ酸配列」という用語や、「ポリペプチド」、「タンパク質」等の用語はアミノ酸配列を、上記タンパク質分子に関連する、完全なネイティヴアミノ酸配列に限定することを意図するものではない。アミノ酸配列として、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列；それらの断片や一部；並びに天然あるいは合成分子の配列が挙げられる。
【００１５】
本明細書において用いる「バリアント」という語は一以上のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列をいう。このバリアントは、「保存的」変化をしても良く、この場合、置換（例えばロイシンをイソロイシンで置換等）されたアミノ酸は類似の構造又は化学的な性質を有する。また、まれなケースではあろうが、バリアントは、グリシンをトリプトファンで置換する等の「非保存的」変化をしても良い。同様な少数のバリエーションとしてアミノ酸の欠失または挿入又はその両方を挙げることもできる。
【００１６】
本明細書において用いる「欠失」という語は一以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基がそれぞれ欠けたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列における変化をいう。
【００１７】
本明細書において用いる「挿入」又は「付加」という語は天然の分子と比べ、一以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基がそれぞれ付加されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列における変化をいう。
【００１８】
本明細書において用いる「誘導体」という語は、核酸の化学的修飾をいう。このような修飾の例としてはアルキル基、アシル基又はアミノ基による水素の置換が挙げられる。核酸誘導体は天然の分子の本質的な生物学的性質を保持するポリペプチドをコードするであろう。
【００１９】
本明細書において用いる「生物学的機能同等物」という語は、天然の分子が有している構造的、調節的、又は生化学的機能を備えたタンパク質をいう。
【００２０】
本明細書において用いる「融合タンパク質」という語は、標的ポリペプチドをコードする第一のアミノ酸配列と、標的タンパク質のどの領域とも性質が異なり、実質的に相同ではない領域（例えばポリペプチド部分等）を定義する第二のアミノ酸配列との融合をいう。
【００２１】
本明細書において用いる「ベクター」という語は、それが連結している他の核酸の輸送を可能とする核酸分子をいう。好ましいベクターの一タイプはエピソーム、即ち染色体外複製が可能な核酸である。自律複製が可能であり及び／ベクターが連結している核酸の発現が可能なベクターが好ましい。ベクターに有効に連結する遺伝子を発現させることができるベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターはしばしば「プラスミド」の形態である。「プラスミド」は通常二本鎖環状ＤＮＡループを指し、ベクターの形をとるときは染色体に結合していない。
【００２２】
本明細書において用いる「宿主細胞」という語は、プラスミド等のベクターに感染できる宿主の細胞をいう。本発明に適した宿主としては当技術分野において一般に従来用いられている宿主が挙げられる。
【００２３】
本明細書において用いる「形質転換動物」という語は、一以上（好ましくは基本的に全て）の動物細胞に異種の遺伝子が導入されたいずれの動物をもいう。遺伝子は、マイクロインジェクション等による慎重な遺伝子操作によって直接的又は間接的に細胞前駆体に導入したり、組換えベクターの感染により動物細胞に導入する。遺伝子操作という用語は古典的な交雑育種、又は体外受精を含むだけでなく、染色体内に組み込まれたり又は染色体外でＤＮＡを複製している組換えＤＮＡ分子の導入も含まれる。
【００２４】
ポリペプチド
本発明の一目的は配列番号１（図１参照）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下、胎盤由来アポトーシス因子（ＰＤＡＦ）と称する）及びこの生物学的機能同等物を提供することにある。
【００２５】
本ＰＤＡＦは、実質的に精製されたＰＤＡＦのアミノ酸配列をいい、どのような種から得たものでもよく（好ましくはヒト）、また天然、合成、半合成や組換え体のいずれのソースから得たものでも良い。
【００２６】
本発明によれば、ＰＤＡＦは２５８個のアミノ酸を含み、このうちＰＤＡＦの２１３個のアミノ酸はＲＣＡＳ１のアミノ酸と完全に同一である。２１３個のアミノ酸を構成する配列は膜貫通ドメインとコイルドコイル構造と二量体ドメインを含む。本発明のＰＤＡＦは腫瘍細胞及び免疫細胞に対しアポトーシスを誘導することができる。
【００２７】
本発明の他の目的は４５個のアミノ酸（配列番号２）及びそのバリアントから成るポリペプチドを提供することにある。この４５個のアミノ酸はＰＤＡＦの１７５番目〜２１９番目の位置にある（図１参照）。ＲＣＡＳ１の配列と比べ、４５個のアミノ酸（配列番号２）はＲＣＡＳ１の１７４番目と１７５番目の間に挿入されている。４５個のアミノ酸のこのような配列はＲＣＡＳ１のコイルドコイル機能的構造と二量体ドメインの前に疎水性領域を形成している。よって、疎水性領域は全タンパク質の構造に影響を与えるため、本ＰＤＡＦの効果はＲＣＡＳ１より更に向上している。更に、配列番号２の２１０番目から２１７番目の位置にあるアミノ酸はＲａｓタンパク質のＡＴＰ−ＧＴＰ結合サイトモチーフの配列に類似していることが見出されている。プロトオンコジーン（原腫瘍形成遺伝子）ｒａｓは様々なタイプの細胞の生育及び分化に重要な遺伝子である。ｒａｓはＧＴＰ加水分解により情報伝達を制御するＧＴＰ結合タンパク質である。ｒａｓ遺伝子のＧＴＰ結合モチーフにあるシグナルポイント変異は全てのｒａｓ変異の９０％を越える割合を占め、全固形腫瘍の２０％以上に存在する。そのため、ｒａｓ変異体は癌治療における潜在的な標的となる（免疫治療ジャーナル（Journal of Immunotherapy）、１９９９年、２２（２）：１５５〜１６５及び泌尿器科ジャーナル（The Journal of Urology）、１９９９年、１６２：１５１９〜１５２６参照）。以上より、ＧＴＰ−ＡＴＰ結合モチーフを包含する配列番号２もまた細胞の生育と分化において重要であり病気の治療及び診断に用いることができることを当然予期できる。。
【００２８】
本発明によれば、配列番号２の好ましいバリアントは、配列番号２に対するアミノ酸配列類似性が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％のものである。配列番号２の最も好ましいバリアントは、配列番号２に対するアミノ酸配列類似性が少なくとも９５％のものである。
【００２９】
本発明の一目的は、ＰＤＡＦ（配列番号３）の１７５番目〜２５８番目の位置のアミノ酸及びそのバリアントからなるポリペプチド配列を提供することである。配列番号３は、主に、免疫細胞や腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する機能的断片である。好ましいバリアントは、配列番号３に対するアミノ酸配列類似性が少なくとも８０％のものであり、より好ましくは少なくとも９０％のものである。最も好ましいＰＤＡＦバリアントは、配列番号３に対するアミノ酸配列類似性が少なくとも９５％のものである。
【００３０】
本発明のＰＤＡＦには、ＰＤＡＦの改変配列やＰＤＡＦの機能的同等物が含まれる。これらは、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換により修飾されていてもよい。
【００３１】
核酸
本発明の別の目的は、図１に示すように、ＰＤＡＦ（配列番号１）をコードする、単離された核酸配列（配列番号４）及びこれを改変した配列を提供することである。ＰＤＡＦ遺伝子は７７７個のＤＮＡに相当する長さのＲＣＡＳ１遺伝子と類似している。ＰＤＡＦ遺伝子は、ヒト胎盤細胞系や横紋筋腫腫瘍ＲＤ細胞系からクローニングすることにより得られる。
【００３２】
本発明はまた、配列番号２に示す４５個のアミノ酸をコードする、１３５個のＤＮＡからなる単離された核酸配列（配列番号５）及びこれを改変した配列を提供する。この１３５個からなるＤＮＡ配列は、ＲＣＡＳ１配列の５２２番目と５２３番目の位置の間に挿入される。この配列番号５に含まれるヌクレオチドの数は３の倍数であり、この領域には転写停止コドンは存在しない。従って、この領域は、これに続くアミノ酸配列の翻訳や配列の長さに対して影響を及ぼさない。
【００３３】
本発明はまた、配列番号３のポリペプチドをコードする、ＰＤＡＦのＤＮＡの５２３番目から７７４番目の核酸からなる単離された核酸配列（配列番号６）及びこれを改変した配列を提供する。この配列は、ＰＤＡＦの機能的断片であることができる。
【００３４】
本発明によれば、配列番号１、２、３をコードするＤＮＡ配列又はその断片、及びそれらの誘導体の製造は、当技術分野においてよく知られている化学的な方法を用いて行うことができる。あるいは、これらを化学的方法により製造することができる。例えば、ペプチド合成は各種固相技法を用いて行うことができ、自動合成はＡＢＩ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ等のペプチド合成器により行うことができる。
【００３５】
本発明の実施形態を実施するために、当技術分野においてよく知られ広く使用されているＤＮＡ配列決定法を用いることができる。この方法においては、ＤＮＡポリメラーゼＩやＴａｑポリメラーゼやＴ７ポリメラーゼのクレノウ（Klenow）フラグメント等の酵素、ＥＬＯＮＧＡＳＥ等のプルーフリーディングエキソヌクレアーゼと組換えポリメラーゼとの組合せ、あるいは市販のキットを用いることができる。好ましくは、このプロセスは、ハミルトン・ミクロ・ラボ２２００（Hamilton Micro Lab2200、ハミルトン、レノ、ネバダ州）、ペルチェ熱サイクラー（Peltier Thermal Cycler、ＰＴＣ２００；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォータータウン、マサチューセッツ州）、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（パーキン・エルマー）等の機器で自動化される。
【００３６】
本発明の核酸配列を、当技術分野において広く知られている方法を用いて処理してＰＤＡＦのコード配列を改変し、遺伝子産物のクローニング、処理及び／又は発現を変更する各種改変物を得ることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドの例としては、ストリンジェントな条件下でこの核酸配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズしたポリヌクレオチドが挙げられる。ストリンジェントな条件は特に限定されない。例えば、ハイブリダイゼーションを上に述べた条件下で、即ち０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６０℃で、あるいは０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中６０℃で実施することができる。
【００３８】
発現ベクター及び宿主系
本発明の別の目的は、配列番号４又は６に示す核酸配列を含む発現ベクターを提供することである。生物学的に活性なＰＤＡＦを発現させるために、ＰＤＡＦ又は生物学的機能同等物をコードする核酸配列を適切な発現ベクターに挿入することができる。この適切な発現ベクターとは、挿入されたコード配列の転写や翻訳に必要な要素を含むベクターである。本発明によれば、ＰＤＡＦと適切な転写調節要素及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築するために、当業者によく知られている方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技法、合成技法、インビボでの遺伝子組換え等が挙げられる。
【００３９】
本発明の別の目的は、配列番号４又は６に示す核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。本発明によれば、宿主にＰＤＡＦをコードする配列を含ませこれを発現させるために、種々の宿主系を利用することができる。例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌等の微生物；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；ウィルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系；ウィルス発現ベクター又は細菌発現ベクターにより形質転換された植物細胞系；動物細胞系等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
有用性
本発明によると、驚くべきことに、ＰＤＡＦは次の特徴を有することがわかる。
（１）末梢血リンパ球、ネイティブＢ細胞、活性化Ｔ細胞、及び赤白血病細胞系（ジャーカット、ＴＦ−１等）に対しては、ＰＤＡＦが誘導するアポトーシスの速度はＲＣＡＳ１に比べ速い。従って、ＰＤＡＦは、白血病治療のための細胞障害剤として及び／又は免疫応答を阻害する必要がある疾病（移植片対宿主病、自己免疫疾患等）のためや移植中に用いられる免疫抑制剤として使用できる。
（２）また、胎盤組織においては、ＰＤＡＦの発現レベルはＲＣＡＳ１よりも高い。更に、ＰＤＡＦは免疫細胞のアポトーシスも誘導できる。デービッド・エイ・クラーク（David A. Clark）、１９９１、免疫学におけるクリティカルレビュー（Critical Reviews in Immunology）、１１（３，４）：２１５〜２４７によれば、精子に対する拒絶に起因する生殖不能や胎児組織に対する拒絶に起因する流産を減らすためにＰＤＡＦを使用できると考えても妥当であろう。
（３）ＰＤＡＦは、腫瘍細胞に発現できる。従って、抗ＰＤＡＦ抗体を用いて、ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦを発現させている腫瘍細胞を殺すことができると期待できる。
（４）或る種の腫瘍細胞においては、ＰＤＡＦの発現レベルはＲＣＡＳ１よりも低い。従って、ＰＤＡＦの発現の組織特異性はＲＣＡＳ１よりも高い。よって、ＰＤＡＦは癌の診断に使用できることを期待できる。
（５）免疫抑制剤は肝炎の治療に使用できることが本技術分野において知られている（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１１（３−４）：２１５−２４７参照）。従って、本発明のＰＤＡＦを肝炎の治療に使用できると予想しても妥当であろう。
【００４１】
上述のとおり、本発明のＰＤＡＦは、細胞増殖や免疫応答に関連する疾病の治療や診断に用いることができる。
【００４２】
医薬組成物
本発明はまた、特に細胞増殖の治療又は免疫応答の阻害に用いるための、配列番号１又は３に示すポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。この組成物は、医薬として許容される適当な担体を含むことができ、また任意に賦形剤や補助剤を含むことができる。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において知られている方法、例えば、混合、溶解、顆粒化、製剤化、粉状化（levigating）、乳化、カプセル化、取込み（entrapping）及び／又は凍結乾燥の各段階を包含する従来の方法により製造できる。
【００４４】
本発明の医薬組成物の投与は、例えば、経口、経静脈、経筋肉、経動脈、経髄、経鞘、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は直腸等の種々の経路により行うことができるが、投与経路はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
形質転換動物
本発明はまた、形質転換動物を提供する。この形質転換動物には、配列番号４の核酸配列を含む遺伝子断片、配列番号５の核酸配列を含む遺伝子断片、又は配列番号６の核酸配列を含む遺伝子断片が導入されている。本発明によれば、形質転換動物は、入手し易い動物とすることができる。例えば、実験室の試験手続において使用されるマウスやラット等の齧歯動物や、移植用の器官や組織を作るために用いられるブタやウマ等、ヒト以外の哺乳類等が挙げられる。本発明の形質転換動物は、マイクロインジェクションや組換えベクターによる感染等の従来の簡便な遺伝子操作技法を用いて動物に本発明遺伝子を導入することにより簡便に得られる。遺伝子の導入は、細胞の前駆体に導入することにより、直接的に又は間接的に動物の細胞一個又は全細胞に導入することができる。遺伝子操作技法としては、例えば、古典的な異種交配、インビトロでの受精、組換えＤＮＡ分子の導入が挙げられる。この組換えＤＮＡ分子は、染色体内に組込まれても、染色体外でＤＮＡを複製するものでもよい。本発明の遺伝子は、核酸配列番号４、５、６のいずれかを含む遺伝子断片を含む。
【００４６】
本発明によれば、形質転換動物は、本発明遺伝子が導入されるため、非特異的な免疫抑制作用を有する。従って、本発明の形質転換動物は、ヒトにとってより受け入れやすい移植用の器官源や組織源として用いることができる。
【００４７】
以下に示す実施例は例示のためのものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：ＰＤＡＦの製造
ヒトＰＤＡＦ遺伝子のクローンニング
ガラスグラインダー（フィートン（Wheaton））を用いて、胎盤組織をＲＮＡｚｏｌ（登録商標）Ｂ溶液中で破砕・混合した。得られた溶液にクロロホルム（０．１ｍＬ）を加え、５分間氷上に載置した。この溶液を４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離に付した。上部の水層から０．５ｍＬを採取し、採取した層にイソプロパノール（０．５ｍＬ）を添加した。完全に混合し、得られた溶液を１５分間氷上に載置し、その後４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離してＲＮＡを沈殿させた。７５％アルコール（１ｍＬ）を沈殿物に添加して、ＲＮＡ沈殿物中の塩を除去した。このＲＮＡ沈殿物を空気中で自然乾燥し、適量の滅菌水に溶解した。ＲＮＡの定量のためにＯＤ260を測定した。
【００４９】
胎盤の全ＲＮＡとオリゴ−ｄ（Ｔ）12-18プライマーを用いて逆転写反応を行った。得られた第一鎖のｃＤＮＡを相補的ＲＮＡに結合させて核酸分子を生成した。この核酸分子をＲＮａｓｅＨで処理して、第二鎖のｃＤＮＡを合成するためのプライマーを得た。第二鎖のｃＤＮＡは、このプライマーとポリメラーゼを用いて合成した。この第二鎖のｃＤＮＡをｐＣＲ３．１．プラスミドに連結した。続いて、宿主細胞である大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）ＤＨ５αをｐＣＲ３．１．プラスミドで形質転換した。この形質転換宿主細胞をニトロセルロース膜へ移し、強塩基及びＳＤＳを含むバッファーで溶解することにより、プラスミドＤＮＡを放出させた。このプラスミドＤＮＡをＵＶ処理して、このＤＮＡをニトロセルロース膜へ固定した。ＡＴＰ−ＧＴＰ結合サイトのペプチド配列ＧＸＸＸＸＧＫＳの縮重配列をＤＮＡプローブとして用いて、ハイブリダイゼーション反応により宿主細胞の所望のプラスミドＤＮＡを選択した。選択された宿主細胞を培養し、その宿主細胞からプラスミドを抽出した。種々の制限酵素を用いる制限酵素地図アッセイ、あるいはプライマーＴ７及びｐＣＲ３．１．逆プライマーを用いる二本鎖ＤＮＡの自動配列決定によって、ＤＮＡの配列を決定した。
【００５０】
この配列決定されたＤＮＡを、ソフトウエアＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃｖ２．０を用いて解析した。ジーンバンクの配列と比較したが、本発明のＰＤＡＦの配列と同様な遺伝子配列は見出せなかった。しかし、新規ＰＤＡＦ遺伝子のタンパク質翻訳領域が、ＲＣＡＳ１のそれと類似していることは見出されている。図１に示すように、ＰＤＡＦ遺伝子のタンパク質翻訳領域は７７７個の核酸相当の長さを有する（配列番号４）。更に、ＰＤＡＦ及びＲＣＡＳ１の制限酵素地図（図２参照）は、ＰＤＡＦ遺伝子がＲＣＡＳ１と実際に異なったものであることを示している。
【００５１】
新規ＰＤＡＦ遺伝子のタンパク質翻訳領域は、１３５個の付加的な核酸を有している（配列番号５）。ＰＤＡＦの残りの６４２個の核酸はＲＣＡＳ１と完全に同一である。更に、前記１３５個の核酸と同じ配列はジーンバンクには見出せなかった。この１３５個の核酸からなる配列は、ＲＣＡＳ１の配列の５２２番目と５２３番目の位置の間に挿入されている。
【００５２】
１３５個の核酸からなる配列は、４５個のアミノ酸からなる配列（配列番号２）をコードする。ジーンバンクで調査した結果、これと同様な配列は見出されていない。小胞体（ＥＲ）中の相補性クラスＢのホスファチジルイノシトールグリコン（ＰＩＧ−Ｂ）の２５６番目から２８４番目のアミノ酸配列のみが、４５個のアミノ酸からなる配列に対して低度の類似性を有している（図３参照）。従って、該４５個のアミノ酸からなる配列は新規の配列である。ソフトウエアＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃｖ２．０による解析によると、４５個のアミノ酸からなる配列は非常に疎水性のペプチドであることがわかる（図４参照）。このペプチドの２１０番目から２１７番目のアミノ酸（ＧＱＷＳＹＧＫＳ）は、Ｒａｓタンパク質のＡＴＰ−ＧＴＰ結合サイトモチーフの配列（（Ａ／Ｇ）ＸＸＸＸＧＫ（Ｓ／Ｔ））に非常に類似している。
【００５３】
腫瘍細胞系におけるＰＤＡＦの発現
ヒト乳腺腺癌ＭＣＦ−７、ヒト直腸結腸腺癌ＨＴ２９、ヒトメラノーマＡ３７５、ヒト胚横紋筋腫ＲＤ及びヒト胎盤細胞を用いて、ＰＤＡＦの発現を確認した。ＲＮＡを抽出して、オリゴ−ｄ（Ｔ）12-18をプライマーとして用いて逆転写反応を行った。続いて反応性生成物を、ＰＤＡＦ遺伝子のタンパク質翻訳領域の両末端の配列をプライマーとして用いたＰＣＲ反応に付した。この反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分析した。図５に示すように、これらの腫瘍細胞系は主にＲＣＡＳ１を発現し、ＲＤ細胞系だけが少量のＰＤＡＦを発現する。しかしながら、胎盤細胞系は主にＰＤＡＦを発現する。これに対して胎盤細胞系においては少量のＰＤＡＦが発現された。
【００５４】
融合タンパク質の発現と精製
ｐＣＲ３．１．プラスミドに含まれるＲＣＡＳ１遺伝子フラグメント又はＰＤＡＦ遺伝子フラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて切断し、１％アガロースゲルで単離した。単離されたＤＮＡフラグメントをジーンクリーンＩＩＩ（Gene Clean III）キットを用いて精製した。精製ＤＮＡは、ｐＧＥＸ−３Ｘベクター（アマーシャムファルマシア（Amersham Pharmacia））に連結し、その連結ベクターにより大腸菌を形質転換した。細胞中に含まれるプラスミドを抽出して、プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ／ＲＣＡＳ１及びｐＧＥＸ−３Ｘ／ＰＤＡＦを得た。これら二種のプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換して、融合タンパク質を発現させた。
【００５５】
これら二種のプラスミドを含む大腸菌細胞を３７℃で一夜震盪培養した。培養液を新鮮なＡＰ／ＬＢ培地に接種して３７℃で４時間震盪培養した。ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を培養物に添加した後、２５℃で４時間震盪下でインキュベートして、融合タンパク質を発現させた。細胞を４℃、８，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞を回収した。この細胞を１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳバッファー（２０ｍＬ）中に懸濁させ、ソニケータにより破壊した。不溶性の沈殿物を４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより除去した。融合タンパク質を含む上清を、グルタチオンセファロース４Ｂ（アマーシャムファルマシア（Amersham Pharmacia））を用いたアフィニティーカラムに付した。ＧＳＴ融合タンパク質は、還元グルタチオン（２０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１２０ｍＭ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）を含むバッファー（ｐＨ０．８）で溶離した。溶離液をＰＢＳバッファー（４℃）で透析し、アミコン（Amicon）（登録商標）８０１０を用いて濃縮した。得られた各タンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ピアース（Pierce））を用いて決定した。
【００５６】
ＲＣＡＳ１及びＰＤＡＦの細胞外タンパク質領域から設計したプライマーを用いてＰＣＲを行って、ＲＣＡＳ１及びＰＤＡＦの細胞外タンパク質領域をコードする遺伝子フラグメントを主に得た。この遺伝子フラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、予めＢａｍＨＩで処理したベクターｐＥＴ３２ａ（＋）（インビトローゲン（Invitrogen））へ連結させた。その後、このベクターを用いて大腸菌細胞を形質転換した。ＰＣＲ、プラスミド抽出、制限酵素地図アッセイを行うことにより、プラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）／ＲＣＡＳ１．ＥＣＤ及びｐＥＴ３２ａ（＋）／ＰＤＡＦ．ＥＣＤが得られ、前述の二種のプラスミドを用いてＥ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プロメガ（Promega））を形質転換した。
【００５７】
プラスミドｐＥＴ３２ａ（＋）／ＲＣＡＳ１．ＥＣＤ及びｐＥＴ３２ａ（＋）／ＰＤＡＦ．ＥＣＤを含む大腸菌細胞を３７℃で一夜震盪培養した。培養液を新鮮なＡＰ／ＬＢ培地に接種して３７℃で３時間震盪培養した。ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を該培地に添加して、融合タンパク質を大量に発現させた。この培養物を４℃、８，０００×ｇで１５分間遠心分離して、細胞を回収した。この細胞を、リン酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）及び塩化ナトリウム（３００ｍＭ）を含むバッファーに懸濁させ、ソニケーションにより破壊した。不溶性の沈殿物を４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより除去した。融合タンパク質を含む上清を、Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ni-NTA Superflow）（キューアイエイジーエヌイー（QIAGNE））からなるアフィニティーカラムに付した。ｐＥＴ融合タンパク質は、グリセロール（１０％）及びイミダゾール（０〜５００ｍＭ）を濃度勾配を付けて含むバッファー（ｐＨ８．０）で溶離した。融合タンパク質ｐＥＴ−ＲＣＡＳ１、ｐＥＴ−ＰＤＡＦ、ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１及びＧＳＴ−ＰＤＡＦのプロファイルを図６に示す。溶離液をＰＢＳバッファー（４℃）で透析し、アミコン（Amicon）（登録商標）８０１０を用いて濃縮した。得られた各タンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ピアース（Pierce））を用いて決定した。
【００５８】
実施例２：ＰＩ染色及びフローサイトメトリーアッセイ
ヒト末梢血単核細胞（１０8個）を、１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ培地で３７℃で１〜２時間インキュベートした。懸濁細胞を回収し、ウサギ抗ヒトイムノグロブリンＩｇＭ抗体（ＣＡＰＰＥＬ）でコートした２４穴培養皿に添加した。結合反応のために、培養皿は室温で１時間放置した。ウサギ抗ヒトイムノグロブリンＩｇＭ抗体に結合したリンパ球はネイティヴのＢ細胞であった。懸濁細胞を回収し、１０6細胞／ｍＬ／穴を、マウス抗ヒトＣＤ３モノクロナール抗体（ＯＫＴ３；３μｇ／ｍＬ；１ｍＬ／穴）でコートした２４穴培養皿に添加した。培養皿中のリンパ球は主に活性Ｔ細胞であった。前述のように調製した融合タンパク質を、上述のＢ細胞及びＴ細胞を含む２４穴培養皿に添加し、この培養皿をインキュベーター中に置き、５％ＣＯ2下、３７℃で６４〜６８時間インキュベートした。得られた細胞を、２，４００ｒｐｍで５分間遠心分離に付した。上清を除き、低張ＤＮＡ染色バッファー（クエン酸ナトリウム（３．５ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．３％）、ｐＨ６．８）を細胞に添加した。更に、低張ＤＮＡ染色バッファー（８００μＬ）、ＲＮａｓｅＡ（３０μｇ）及びヨウ化プロピジウム（５μｇ）を加えた。反応は３０分間行った。染色の結果はフローサイトメトリーで定量した。図７に示すように、ＧＳＴ−ＰＤＡＦで処理したＰＢＭＣのアポトーシス率は、ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１で処理したＰＢＭＣのそれより高率である。
【００５９】
図８及び９は、ナイーヴＢ細胞及び活性化Ｔ細胞においてＧＳＴ−ＰＤＡＦが、ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１よりも高いアポトーシス率をもたらすことを示している。
【００６０】
ヒト白血病細胞系（ジャーカット細胞（Ｔリンパ芽球））及びヒト赤白血病細胞系（ＴＦ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ−２００３））のＰＩ染色及びフローサイトメトリーを、前述のように行った。図１０に示すように、ＰＢＳバッファーで処理したジャーカット細胞及びＧＳＴタンパク質で処理したジャーカット細胞（対照）のアポトーシス率はそれぞれ３．９５％、５．２２％であった。ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１で処理したジャーカット細胞のアポトーシス率は７．９％で、ＧＳＴタンパク質で処理したジャーカット細胞のアポトーシス率よりやや高い。しかし、ＧＳＴ−ＰＤＡＦで処理したジャーカット細胞のアポトーシス率は、ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１又はＧＳＴで処理したジャーカット細胞のアポトーシス率よりはるかに高い。以上のように、本発明のＰＤＡＦは、ＲＣＡＳ１に比べより高いアポトーシス率をジャーカット細胞に誘導することができる。
【００６１】
赤白血病細胞系ＴＦ−１は低分化の造血細胞系である。図１１に示すように本発明のＰＤＡＦは、ＲＣＡＳ１に比べより高いアポトーシス率をＴＦ−１細胞に誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＰＤＡＦのアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列を示す。
【図２】ＲＣＡＳ１及びＰＤＡＦの制限酵素地図を示す。
【図３】ＰＤＡＦの１８５番目から２１３番目のアミノ酸とＰＩＧ−Ｂの２５６番目から２８４番目のアミノ酸との類似性を示す。
【図４】ＰＤＡＦのヒドロパシー分析を示す。
【図５】種々のヒト腫瘍細胞系におけるＲＣＡＳ１及びＰＤＡＦの発現を示す。
【図６】組み換え融合タンパク質ＧＳＴ−ＲＣＡＳ１、ＧＳＴ−ＰＤＡＦ、ｐＥＴ−ＰＤＡＦ及びｐＥＴ−ＲＣＡＳ１を示す。
【図７】ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦで処理した後のＰＢＭＣ細胞系のアポトーシス率を示す。
【図８】ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦで処理した後のナイーヴＢ細胞系のアポトーシス率を示す。
【図９】ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦで処理した後のＴ細胞系のアポトーシス率を示す。
【図１０】ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦで処理した後のジャーカット細胞系のアポトーシス率を示す。
【図１１】ＲＣＡＳ１又はＰＤＡＦで処理した後のＴＦ−１細胞系のアポトーシス率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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