(57)【要約】【課題】  プラスミドＤＮＡやＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど核酸の血中における滞留性（安定性）を向上させることにより、リガンド修飾による標的部位への選択的デリバリーを可能にし、また、腫瘍組織へのパッシブターゲティングを実現することができる、遺伝子治療のための遺伝子キャリアーとして有用な遺伝子デリバリー治療剤やそれを用いた遺伝子治療方法を提供すること【解決手段】  次式で表されるデンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体からなり、血中における滞留性に優れた遺伝子デリバリー治療剤を静脈投与する。【化１】2005247755.tif 000006【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式で表されるデンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体からなり、血中における滞留性に優れたことを特徴とする静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【化１】
2005247755.tif 000004
【請求項２】
腫瘍組織に目的遺伝子を蓄積させるために用いられることを特徴とする請求項１記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【請求項３】
デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）の誘導体がリガンド修飾物であることを特徴とする請求項１又は２記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【請求項４】
核酸がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【請求項５】
デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）／プラスミドＤＮＡのチャージ比が８〜３２であることを特徴とする請求項４記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【請求項６】
次式で表されるデンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体からなり、血中における滞留性に優れた遺伝子デリバリー治療剤を静脈投与することを特徴とする遺伝子治療方法。
【化２】
2005247755.tif 000005
【請求項７】
腫瘍組織に目的遺伝子を蓄積させることを特徴とする請求項６記載の遺伝子治療方法。
【請求項８】
デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）の誘導体がリガンド修飾物であることを特徴とする請求項６又は７記載の遺伝子治療方法。
【請求項９】
核酸がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の遺伝子治療方法。
【請求項１０】
デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）／プラスミドＤＮＡのチャージ比が８〜３２であることを特徴とする請求項９記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤、詳しくは血中における滞留性に優れたデンドリティックポリリジン／核酸複合体を有効成分とする静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤やそれを用いた遺伝子治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は先天性の遺伝子疾患ばかりでなく、がんやエイズなどの難治疾患の新しい治療法として期待されている。遺伝子治療を目的としたＤＮＡの細胞内へのデリバリー技術は、ウイルスに治療用遺伝子を組み込んで標的細胞に感染させるウイルス法と、人工化合物を遺伝子キャリアーとして用いる非ウイルス法に分類できる。非ウイルス法ではキャリアー分子の物性コントロールによる毒性や抗原性を抑えたキャリアーデザインが可能である。しかし、導入した遺伝子の発現効率は低く、その遺伝子の発現は一過性であるという問題点がある。一方、ウイルス法はウイルスの持つ感染機構を利用しているため遺伝子の発現効率は高く、導入遺伝子の安定発現が期待できるが、ベクターとして用いたウイルスに起因すると思われる免疫性ショック死（1999年、米国）や白血病発症（2002年、フランス）の事例は記憶に新しく、改めて安全性の高い遺伝子デリバリー技術の開発が望まれている。
【０００３】
（プラスミドＤＮＡを単独で投与する方法）
プラスミドＤＮＡそのままを投与する方法は最もシンプルであり、臨床応用を考慮した場合においても安全面を考慮する対象がプラスミドＤＮＡのみとなるため、その敷居は低い。しかし、静脈からの全身投与を考えた場合、ＤＮＡは血中において速やかに分解される。さらに、ＤＮＡの細胞内への移行には細胞膜が大きなバリアーとなっているため、何かしらの工夫によって細胞内へ移行させる必要があり、これまでにエレクトロポレーション法をはじめ様々な方法が試みられている。
【０００４】
エレクトロポレーションは細胞に電気パルスをあてることで細胞膜に一過性の孔を開け、細胞膜の透過性を上昇させることによりＤＮＡの取込を促進させる方法で、投与遺伝子の長期発現が可能であること、理論的にはあらゆる組織に適用可能であるという長所がある。これまでにインビボへのアプリケーションを目的として、標的組織に応じたＤＮＡの投与量、電解質溶液のイオン強度、電気量などの様々なファクターが最適化され、電極の形状なども改良が重ねられてきている。中でも、処置のしやすさから皮膚や筋肉が最も適したターゲットといえる。ＤＮＡワクチン等の免疫療法を目的としたＤＮＡの投与方法としてエレクトロポレーションが多く利用されており、皮膚や筋肉にエレクトロポレーションでＤＮＡを投与し、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原、あるいは、ＩＬ−１２やＩＦＮ−α等のサイトカインを発現させて治療効果や遠隔部位に存在する腫瘍に対する抗腫瘍効果を得た報告が増えてきている。
【０００５】
超音波によってもＤＮＡの細胞内への導入が可能であることが報告されている。この方法では、超音波照射により細胞周辺でキャビテーションが起こり、小さな気泡の生成と崩壊が繰り返され、気泡の崩壊時に発生する液体マイクロジェット流によって細胞膜に一過性の孔が開くことで細胞膜の透過性が上昇し、さらに細胞膜付近に存在するＤＮＡや薬物がマイクロジェット流によって細胞内へ押し込まれるというメカニズムが提唱されている。この方法はエレクトロポレーションのように電極を標的部位に挿入する必要がないため、体内の臓器などを標的とする場合においても非侵襲的であり、さらにマイクロバブル（造影剤）を併用することによって低いエネルギーの超音波で効率よくＤＮＡを導入可能であることが見いだされ、今後の発展が期待できる。
【０００６】
遺伝子銃は金粒子を核酸でコートし、それを高圧ヘリウムガスで直接細胞に打ち込む方法で、まさに遺伝子を弾丸として用いた銃である。この方法は導入するＤＮＡのサイズに制限がないこと、一度に多くの細胞に確実にＤＮＡを導入できること、複数の種類のＤＮＡを同時に導入できることなど多くの利点があるが、生体への応用を考えた場合標的とする組織の表層部にしか導入できないという欠点もある。
【０００７】
ハイドロダイナミクスインジェクション法は、ほぼ全血量と同量のＤＮＡ溶液をマウスの尾静脈より数秒のうちに投与する方法である。この方法では、最も柔軟性に富む臓器である肝臓に投与したＤＮＡ溶液がいったん集積し、投与の際の圧力によりＤＮＡが肝組織へと押し込まれているものと考えられており、少量のＤＮＡで導入遺伝子の高い発現が特に肝臓で認められる。ヒトの場合で換算すると、数秒間に数リットルもの量を投与されることになり実用的ではないが、部位を限定することで適用は可能であろう。一方で、ある特定遺伝子のマウス肝臓での機能を評価するには便利な手法である。
【０００８】
その他、ＤＮＡを投与した後、標的部位周辺の血流を一時的に止めることにより遺伝子発現レベルを上昇させる方法や、マウス尾静脈よりＤＮＡを投与後、腹部をマッサージし、機械的ストレスを与えることにより肝臓での遺伝子発現が促進されることも報告されている。また、肝臓表面へ直接ＤＮＡ溶液を滴下するだけでも組織内へ浸透し、その部分に遺伝子発現が起こることも見いだされている。これらＤＮＡ単独投与で行う手法は、目的によっては重要な遺伝子デリバリー技術となりうる。しかし、ターゲティング可能な部位や組織に制約が多く、応用範囲が限られてしまう。さらに、ＤＮＡの細胞内への移行メカニズムが解明されていないものもあり、今後の詳細な解析が待たれれている。
【０００９】
（遺伝子キャリアー分子を使った方法）
これまでに脂質やポリマーをベースにした多くの化合物が遺伝子キャリアーとして開発されてきた。一般に遺伝子キャリアーは塩基性の化合物であり、マイナスに帯電したＤＮＡと静電的相互作用によって安定な複合体を形成することでＤＮＡの細胞や組織内外での安定性を向上させるばかりでなく、細胞への取込みも促進する。塩基性脂質を介した遺伝子デリバリーは１９８７年にFelgnerらによって最初に報告され、それ以降、脂質の塩基性ヘッド部分を様々に変化させた脂質が多く開発されてきた。さらに、ＤＯＰＥやコレステロールなどのヘルパー脂質の添加や塩基性脂質との混合割合などが検討され、脂質の種類や利用する条件などの最適化がなされ、主要な遺伝子デリバリー技術になっている。
【００１０】
塩基性ポリマーをベースとした代表的な遺伝子キャリアーとしては、１９９５年Behrらにより報告された直鎖状のポリエチレンイミンが知られている。直鎖状ポリエチレンイミンは分子量およそ２２〜２５ｋＤａほどの大きさのものが遺伝子キャリアーとして最も適していると言われている。また、ＤＮＡ／遺伝子キャリアー複合体がエンドサイトーシス経路で細胞内へ取り込まれた後、エンドソームから細胞質へエスケープするメカニズムとして現在ではよく知られている“プロトンスポンジ効果”という考え方はこの化合物から生まれたものである。多くの分岐を持つ樹状高分子、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーもまたポリマーベースの遺伝子キャリアーを代表する化合物の一つである。ＰＡＭＡＭデンドリマーが様々な培養細胞に対する遺伝子キャリアーとして利用可能であることは、１９９３年にSzokaらによって報告された。しかし、その後、厳密に合成されたＰＡＭＡＭデンドリマーは完全な球状の構造をしており、その遺伝子発現効率は低いことがわかった。そこで、部分的に加水分解して柔軟性を与え、多分散なものにすることで遺伝子導入能が向上することが報告されている。
【００１１】
合成ペプチドを利用した遺伝子デリバリー技術も報告されている。遺伝子キャリアーとして利用される合成ペプチドは両親媒性の構造を持ち、分子内にＤＮＡとの結合のためにリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸残基を含んでいる。そして、そのロイシンから構成されている疎水性領域がリン脂質膜との親和性を高め、エンドサイトーシスで取り込まれた後のエンドソームから細胞質への移行にも関わっている。また、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン由来のＫＡＬＡペプチドも、ＤＮＡとの結合能を持ち、エンドソーム膜の不安定化を引き起こすことが報告されている。
【００１２】
一方で、遺伝子治療においても副作用を抑え、より効率的に治療効果を引き出すためには薬剤の服用や投与と同様、個体内における標的となる部位、組織に特異的にデリバリーする遺伝子のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が必要となってくる。このＤＤＳの確立はプラスミドＤＮＡを単独で使用した場合では難しく、そこで、遺伝子キャリアー分子にこの機能を盛り込み、それを達成することが試みられている。ＤＤＳを目指した遺伝子キャリアーの機能化例として、細胞表面に特異的に存在するレセプターを標的とし、このレセプターに対する種々のリガンド分子を遺伝子キャリアーに修飾することが一般的に行われている。肝細胞表面に特異的に存在するアシアログリコプロテインレセプターに対するリガンドであるガラクトース残基やアシアロオルソムコイドなどを遺伝子キャリアーに導入する方法が古くから行われている。最近では腫瘍組織内において血管新生が活発に起こっていることに注目し、血管新生が盛んに起こっている部位の内皮細胞表面にとりわけ多く発現しているＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）レセプターに対するＶＥＧＦを遺伝子キャリアーに修飾することも行われている。
【００１３】
標的とする部位や組織に到達後も多くのバリアーが待ちかまえている。そこで、より効率的に導入遺伝子の発現を達成させるために、細胞内でのトラフィックコントロールの試みも盛んになされている。一般に、ＤＮＡ−遺伝子キャリアー複合体（コンプレックス）はエンドサイトーシス経路で細胞に取り込まれ、多くはリソソームで分解を受けてしまうことより、いかにしてエンドソームから細胞質へのエスケープを促進するかが第一のポイントとなる。そのために先に述べたような膜融合能を持つペプチドやリソソーム内のｐＨ条件に相当する弱酸性領域において膜破壊能を持つようなペプチドなどがよく用いられている。また、“プロトンスポンジ効果”によるエンドソームからのエスケープをねらい、多くのヒスチジン残基を導入することにより弱酸性条件下でバッファー能を持つようにデザインしたブロックコポリマーなども知られている。第二のポイントとして、エンドソームから細胞質へと移行したＤＮＡ／遺伝子キャリアー複合体からのＤＮＡのリリースが挙げられる。この点に関して、キャリアー分子内にジスルフィド結合を導入し、細胞内の還元的雰囲気を利用してリリースを促進させる、あるいは、外部から与える温度変化によりリリースをコントロールする目的で温度感受性ポリマーを利用することが行われている。さらに、第三のポイントが遺伝子の機能発現の場である核への移行ステップである。核移行の制御には核への指向性を持たせるため核局在化シグナルによる修飾などが行われている。その他、非ウイルス法の欠点でもある一過性の発現を克服するため、生分解性ポリマーにＤＮＡを内包させてＤＮＡを徐放させることにより長期発現を実現させる試みも行われている。
【００１４】
ところで、既存の遺伝子キャリアー分子（塩基性脂質やポリマー）の場合は、キャリアーと核酸の複合体を静脈投与すると、まず、血清成分との非特異的な相互作用が起こり、さらに、最初の毛細血管である肺、あるいは、肝臓の細網内皮系に取り込まれることが知られている。これらの遺伝子キャリアー分子−ＤＮＡ複合体はその表面チャージがカチオニックであるため、血清成分との非特異的相互作用を起こし、大きな複合体へ成長し、結果的に上記臓器の細網内皮系細胞にとりこまれると考えられている（例えば、非特許文献１参照）。現時点でのインビボでの遺伝子デリバリーにおいて、全身投与での標的部位への選択的ターゲティング法は未解決であり、細胞あるいは組織選択的遺伝子デリバリーの手法が要求されている現在、血中での滞留性の向上とリガンド修飾などによる標的部位へのデリバリー法は実用的な遺伝子導入技術を実現する上で重要な技術である（例えば、非特許文献２参照）。
【００１５】
１９９３年にデンドリマーを遺伝子キャリアーとして用いる手法が報告された（例えば、非特許文献３、特許文献１参照）。この手法は培養細胞を対象にしたもので、遺伝子発現効率は高いものの、細胞毒性が高い。また、この分子をさらに加熱分解して、枝分かれ構造を粗にして、柔軟性を上げた結果、再現性よく高い遺伝子発現が認められている（例えば、非特許文献４参照）。しかし、熱分解することによる分子構造の不均一化や分解の度合いの調節が困難で、ロット間のばらつきが大きくなるほど、新たな問題も出てきた。また、動物個体へ投与した場合の結果は示されておらず、その有効性は明らかにされていない。動物個体内での遺伝子デリバリーは投与後の血液成分との非特異的な相互作用や分解、そして、目的部位への蓄積、細胞内への取り込みなどと、多くのバリアーが想定され、それは、培養細胞を対象にした遺伝子デリバリーのノウハウは通用しないことが殆どであり、多く研究者が動物個体へ直接投与することによる、遺伝子デリバリー技術の再構築を試みている。
【００１６】
一方、これまで本発明者らはデンドリティックポリリジンを遺伝子キャリアーとして用いる手法について開発してきた。このリジンを枝分かれ単位としてもつデンドリマーは単一な分子で構成されており、詳細な構造−活性相関に関する研究を行いやすくし、さらなる改良の可能性をもっている。また、多くの培養細胞に対して、低毒性で高いトランスフェクション効率を示す高性能の遺伝子キャリアーである（例えば、非特許文献５参照）。
【００１７】
【特許文献１】特表平９−５００１３６号公報
【非特許文献１】Nonviral Vectors for Gene Therapy, L. Huang, Academic Press
【非特許文献２】T. Niidome, L. Huang, Gene Ther.９，1647−1652（2002）
【非特許文献３】J. Haensler and F. C. Szoka, Bioconjugate Chem.４，372−379（1993）
【非特許文献４】M. X. Tang and F. C. Szoka, Gene Ther.４，823−832（1997）
【非特許文献５】M. Ohsaki et al., Bioconjugate Chem.,１３，510−517(2002）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
核酸（遺伝子）デリバリーの技術は遺伝子治療を現実的なものにするカギである。本発明の課題は、プラスミドＤＮＡやＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど核酸の血中における滞留性（安定性）を向上させることにより、リガンド修飾による標的部位への選択的デリバリーを可能にし、また、腫瘍組織での血管内皮の未発達による血中成分の漏れによる浸潤の効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）による、腫瘍組織へのパッシブターゲティングを実現することができる、遺伝子治療のための遺伝子キャリアーとして有用な遺伝子デリバリー治療剤やそれを用いた遺伝子治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究し、遺伝子キャリア化合物の機能として、核酸との安定な複合体の形成、核酸の加水分解酵素からの保護、複合体のゼータポテンシャルの上昇を防ぐといった点を考慮して本発明者らが合成したデンドリティックポリリジン第６世代（以下「ＫＧ６」という）と、プラスミドＤＮＡとの複合体を動物個体へ静脈より投与すると、その血液成分との低い親和性のため、他の遺伝子キャリアー分子と比較して、長時間、血中にとどまり、循環させることが可能になることを見い出した。また、このＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体を腫瘍にもつ動物に投与すると、その浸潤性の増している腫瘍血管からこの複合体が組織中へ浸潤し、結果的に腫瘍中に存在させることができることを見い出した。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００２０】
すなわち本発明は、次式で表されるデンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体からなり、血中における滞留性に優れたことを特徴とする静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤
【００２１】
【化１】
2005247755.tif 000002
（請求項１）や、腫瘍組織に目的遺伝子を蓄積させるために用いられることを特徴とする請求項１記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤（請求項２）や、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）の誘導体がリガンド修飾物であることを特徴とする請求項１又は２記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤（請求項３）や、核酸がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤（請求項４）や、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）／プラスミドＤＮＡのチャージ比が８〜３２であることを特徴とする請求項４記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤（請求項５）や、次式で表されるデンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体からなり、血中における滞留性に優れた遺伝子デリバリー治療剤を静脈投与することを特徴とする遺伝子治療方法
【化２】
2005247755.tif 000003
（請求項６）や、腫瘍組織に目的遺伝子を蓄積させることを特徴とする請求項６記載の遺伝子治療方法（請求項７）や、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）の誘導体がリガンド修飾物であることを特徴とする請求項６又は７記載の遺伝子治療方法（請求項７）や、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）の誘導体がリガンド修飾物であることを特徴とする請求項６又は７記載の遺伝子治療方法（請求項８）や、核酸がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか記載の遺伝子治療方法（請求項９）や、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）／プラスミドＤＮＡのチャージ比が８〜３２であることを特徴とする請求項９記載の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤（請求項１０）に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によると、対象動物への静脈投与後の核酸の体内滞留性を飛躍的に向上させることができ、また、腫瘍を持つ動物へ静脈投与後、腫瘍部位に核酸を蓄積させることができる。さらに、血中滞留性が向上することは、それを標的部位に選択的に認識されるようなリガンド修飾することにより、そこへの選択的な遺伝子デリバリーが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤としては、血中における滞留性に優れた、デンドリティックポリリジン（ＫＧ６）又はその誘導体と核酸との複合体であれば特に制限されるものではなく、ＫＧ６の誘導体としては、リガンド、エンドソーム膜破壊ペプチド、酸化還元応答性官能基、核局在化ペプチド等を挙げることができるが、中でも各種臓器又は細胞特異的に発現するレセプターのリガンド修飾物を好適に例示することができる。本発明の静脈投与用遺伝子デリバリー治療剤は血中滞留性に優れているので、リガンド修飾することにより標的部位を選択的に認識して目的とする遺伝子を各種臓器又は細胞にデリバリーすることができる。
【００２４】
ＫＧ６と複合体を形成する核酸としては、ＲＮＡ又はＤＮＡを挙げることができ、遺伝子ＤＮＡが好ましく、なかでも遺伝子ＤＮＡが組み込まれたプラスミドＤＮＡが好ましい。核酸としてプラスミドＤＮＡを用いる場合、プラスミドの大きさにもよるが、ＫＧ６／プラスミドＤＮＡのチャージ比を８〜３２とすると、プラスミドＤＮＡが血液中でより安定に存在するので好ましい。
【００２５】
ＫＧ６と核酸との複合体を形成する方法は特に制限されず、ＰＢＳ中での混合や、培養細胞培地中での混合等を挙げることができるが、５％グルコース溶液中でＫＧ６と核酸とを混合し、反応させる方法を好適に例示することができる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１．ＫＧ６の調製
デンドリティックポリリジン第６世代（ＫＧ６）は文献（M. Ohsaki et al., Bioconjugate Chem.,１３，510−517(2002）)にしたがって合成した。すなわち、図１に示すように、初発コアとしてヘキサメチレンジアミンから合成した。デンドリティックポリリジン第１世代は、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法（Fields.CM.G. et al.,Pept.Res. 4, 95-101, 1991）により、ヘキサメチレンジアミンにＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ−ＤＣＡＨをカップリングすることにより合成した。第２世代から第６世代は、ＴＦＡで脱保護した後に繰り返しＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨをカップリングすることにより得ることができた。各カップリングステップで遊離アミノ酸残基を検出するカイザーテスト（Kaiser Test）を実施した。
【００２８】
２．プラスミドＤＮＡの構築
ｐＧＬ３−コントロールベクター（Promega, Madison, WI, USA）のルシフェラーゼｃＤＮＡを制限酵素HindIII／XbaIで切り出し、その断片をｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。このプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）は大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａにより増殖させ、キアゲン・プラスミド・ギガ・キット（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）にて精製した。
【００２９】
３．ＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体の静脈投与
上記１で合成したＫＧ６を上記２で構築したプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）２５μｇのＤＮＡとチャージ比を８として、２００μＬ５％グルコース溶液中に混合し、室温で反応させてＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体を作製した。このＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体をマウスの尾静脈に注射した。静脈投与後３０分で麻酔下各臓器を摘出し、全ＤＮＡをＤＮｅａｓｙキット（キアゲン社）により抽出後、含まれているプラスミドＤＮＡ量をサザンブロッティング法により評価した。比較対照として、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（N-[1-(2.3-Dioleoyloxyl)propy1]-N,N,N-trimethyl-ammonium salts）、またカチオン性ポリマーのＰＥＩ（polyethyleneimine）とＤＮＡの複合体も同様に投与し、体内分布を評価した。結果を図２に示す（図２の１レーンはＫＧ６−ｐＤＮＡ、２レーンはＤＯＴＡＰ−ｐＤＮＡ、３レーンはＰＥＩ−ｐＤＮＡ、４レーンはｐＤＮＡ単独を示す。）。その結果、血中において、ＫＧ６が他の非ウイルス性キャリアーに比べ、ＤＮＡの血液中での滞留性を促進させていることが分かった。肝臓ではＫＧ６がＰＥＩと同等にＤＮＡを蓄積させており、肺ではＤＯＴＡＰが大量に蓄積されている。またＫＧ６はＤＯＴＡＰ、ＰＥＩとは異なり、脾臓、腎臓にもＤＮＡが存在しており、全身の主要な臓器に遺伝子をデリバリーしている。一方、ＤＮＡのみを投与すると、そのすべてが分解されていることが観察された。
【００３０】
４．ＫＧ６によるＤＮＡの体内分布
ＫＧ６によるＤＮＡの体内分布を詳細に見るため、血液と肝臓、肺での５、３０、６０、１８０分の体内分布を評価した。ＫＧ６を２５μｇのＤＮＡとチャージ比を８として、２００μＬ５％グルコース溶液中に混合し、複合体を形成させ、尾静脈から投与し、上記３と同様にＤＮＡの各臓器への分布を評価した。結果を図３に示す。このとき６０分まで血液中に分解されていないＤＮＡが検出され、マウス全身を安定に循環していることが分かり、血清成分との非特異的な相互作用が低減され、血中滞留性が向上したためであると考えられる。また、肝臓と肺には１８０分まで分解されていないＤＮＡが存在していた。
【００３１】
５．ＤＯＴＡＰとの比較
ＫＧ６と同様にＤＯＴＡＰを比較対照としてＤＮＡとチャージ比を１１．６として複合体を形成させマウスの尾静脈より投与し、血液、肝臓、肺でのＤＮＡ分布を評価した。結果を図４に示す。その結果、血液中において、５分まで分解されていないＤＮＡが存在しているが、大部分のＤＮＡは肺に蓄積していることが分かる。これは比較的大きな凝集体を形成するＤＯＴＡＰ−ＤＮＡ複合体が静脈投与後、最初の毛細血管である肺の細網内皮系の細胞に取り込まれたと考えられる。
【００３２】
６．プラスミドＤＮＡ単独との比較
ＫＧ６やＤＯＴＡＰなどの化学的な遺伝子キャリアーを使わず、ｐＤＮＡのみをマウスの尾静脈より投与し、血液、肝臓、肺でのＤＮＡ分布を評価した。結果を図５に示す。その結果、５分間で大部分のＤＮＡが血液中で分解し、肝臓や肺においても存在していないことが観察された。
【００３３】
７．ＫＧ６とＤＮＡの複合体形成における混合比
ＫＧ６とＤＮＡの複合体形成における混合比の体内分布に対する影響を調べた。ＫＧ６／ｐＤＮＡのチャージ比を０、２、４、８、１６、３２になるように混合しマウスの尾静脈より投与し、その３０分後、血液中よりＤＮＡを検出した。結果を図６に示す。その結果、ＫＧ６のチャージ比を８、１６、３２にするとＤＮＡは血液中で安定に存在し、チャージ比が２、４ではそれらと比較して分解をうけている。これはチャージ比、８から３２のＫＧ６／ＤＮＡコンプレックスが血清成分との非特異的相互作用が他のチャ−ジ比より著しく減少したためだと考えられる。
【００３４】
８．腫瘍組織へのデリバリー効果
次に担がんマウスにおける腫瘍組織へのデリバリー効果を評価した。まず、ｄｄＹマウス皮下よりＢ−１６メラノーマ細胞（１ｘ１０6 ｃｅｌｌｓ）を移植した。２、３週間後、腫瘍が１２、１５ｍｍの大きさになった時点でＫＧ６−ｐＤＮＡ複合体を尾静脈より投与した。結果を図７Ａに示す。その結果、腫瘍組織中では６０分までＤＮＡが蓄積していることが観察された。これはＫＧ６がＤＮＡの体内滞留性が向上し、血中での循環を促進させているからだと思われる。また、比較としてＤＯＴＡＰを用いた場合では腫瘍へのＤＮＡの蓄積は認められなかった（図７Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明に用いられるデンドリティックポリリジン第６世代（ＫＧ６）の構造を示す図である。
【図２】ＫＧ６，ＤＯＴＡＰ，ＰＥＩの各プラスミドＤＮＡ複合体の静脈投与後３０分での体内分布をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図３】ＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体の静脈投与後５〜１８０分での体内動態をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図４】ＤＯＴＡＰ−プラスミドＤＮＡ複合体の静脈投与後５〜１８０分での体内動態をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図５】プラスミドＤＮＡ単独の静脈投与後５〜１８０分での体内動態をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図６】ＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体のＫＧ６／ｐＤＮＡのチャージ比が０、２、４、８、１６、３２になるように混合し静脈投与した後３０分での体内分布をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図７】ＫＧ６−プラスミドＤＮＡ複合体の静脈投与後５〜１８０分での腫瘍へのＤＮＡ分布をサザンブロッティング法により調べた結果を示す図である。
【図１】
2005247755.tif 000007
【図２】
2005247755.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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