(57)【要約】    【課題】  ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインを阻害する新規サイトカイン遊離阻害剤を提供すること。    【解決手段】  細胞壁を破砕したクロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）の乾燥粉末を含有してなる、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインの遊離阻害剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるサイトカイン遊離阻害剤。
【請求項２】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＩＬ−１β遊離阻害剤。
【請求項３】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＩＬ−２遊離阻害剤。
【請求項４】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＩＬ−４遊離阻害剤
【請求項５】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＩＬ−６遊離阻害剤。
【請求項６】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＩＦＮ−γ遊離阻害剤。
【請求項７】
クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるＴＮＦ−α遊離阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインを阻害するためのサイトカイン遊離阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１βはアデニール酸シクラーゼを活性化して、ｃＡＭＰレベルの上昇をもたらし、その結果、蛋白質キナーゼＡの活性化を誘発したり、あるいは細胞遺伝子転写活性化因子の役目を果たす核因子を誘発する。ＩＬ−１βは、プロスタグランジンを産生する酵素の合成を誘発する結果、発熱が生じる。低濃度では、ＩＬ−１βは主として免疫調整的に作用する。ＩＬ−１βはポリクローン活性因子と協同で作用し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球増殖のみならず、Ｂリンパ球の成長と分化をも促進する。ＩＬ−１βは多数の細胞を刺激して、免疫または炎症反応エフェクター細胞として作用するとともに、単核食細胞や血管内皮によるＩＬ−６の合成以外に、自らの合成をも誘発する。ＩＬ−１βはその前炎症性特性の点で、腫瘍壊死因子 (TNF)と似ている。
【０００３】
ＩＬ−２は、インターフェロンγやリンパトキシンを含むＴリンパ球によって産生されるその他のサイトカインの形成を促進する。ＩＬ−２合成が不適切な場合、抗原特異性Ｔリンパ球アネルギーにつながる可能性がある。ＩＬ−２によってＮＫ細胞の成長は促進され、リンフォカイン活性化キラー (LAK)細胞の産生を通して、ＮＫ細胞の細胞溶解作用は増強される。ＩＬ−２は、他のサイトカインに対する未成熟骨髄の反応性を促進する。胸腺では、ＩＬ−２は未成熟T細胞の成長を促進する可能性がある。また、ＩＬ−２は、免疫系因子の過剰産生又はそれらの因子に対する過剰反応により発症する自己免疫疾患の一因と考えられる。
【０００４】
ＩＬ−４は、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージの成長と分化に対して促進因子としての役割を果たし、マウスではＩｇＥ合成に対するスイッチ因子となる。そのほか、クローン化ＣＤ４＋Ｔ細胞の成長も促進し、ＭＨＣクラスII分子発現を増強し、Ｂリンパ球肥大を鎮静化する。ネズミとヒトのＩＬ−４はともに、Ｂリンパ球のスイッチングを誘発してＩｇＥを合成する。ヒトＩＬ−４はまた、ヒトにおいてＢリンパ球とマクロファージでのＣＤ２３発現も誘発する。ＩＬ−４は細胞仲介性免疫に何らかの役割を持つ可能性がある。
【０００５】
ＩＬ−６は多くのタイプの細胞に作用すると考えられ、一つの重要な機能として、Ｂリンパ球に作用して、抗体を合成する細胞に分化させる能力を持つ。ＩＬ−６は肝細胞に作用して、フィブリノーゲンを含む急性相蛋白質形成を誘発する。Ｂ細胞分化の晩期における活性化Ｂリンパ球にとって、主たる成長因子となっている。ＩＬ−６はまた、Ｔリンパ球と胸腺細胞の同時刺激因子としての役割も持つ。さらに、初期の骨髄造血性幹細胞の成長を促進する他のサイトカインと共同作用する。ＩＬ−６は、急性相蛋白質の転写レベルをコントロールすることによって、急性相反応誘発分子としても作用する。ＩＬ−６は、ポリクローナルＢ細胞活性化による高ガンマグロブリン血症やＣＲＰ陽性等の発症に関与していると考えられる他、自己免疫様症状を呈する疾患にＩＬ−６の関与が報告されている。またＩＬ−６は、癌の領域において増殖因子として機能している他、敗血症、炎症、外科手術後の回復遅延、骨粗鬆症、Ｉ型糖尿病、アルツハイマー病、アミロイドーシス、高脂血症、血小板増多症、心筋梗塞、川崎病、乾癬、メサンギウム細胞増殖性腎症にも関与しているものと考えられている。
【０００６】
インターフェロン-γ (ＩＦＮ−γ) には、抗細胞増殖、抗ウイルス特性がある。ＩＦＮ−γは強力な単核食細胞活性因子であり、細胞内微生物や腫瘍細胞に対するそれら食細胞の破壊能力を高める。ＩＦＮ−γ によって多くのタイプの細胞でＭＨＣクラスII分子の発現が誘発され、I 型の発現も多くなる。ＩＦＮ−γ は、Ｂリンパ球とＴリンパ球両者の分化を促進する。ＩＦＮ−γはＮＫ細胞の強力な活性因子であり、好中球や血管内皮細胞をも活性化する。ＩＦＮ−γは、慢性リンパ球性白血病、リンパ腫、ＩｇＡ欠乏のほか、風疹、Epstein-Barrウイルス、サイトメガロウイルスなどに感染した患者では減少する。組替えＩＦＮ−γはこれまでに慢性リンパ球性白血病、粘膜真菌症、ホジキン病、その他様々な疾患の治療に使用されてきた。ＩＦＮ−γはまた、線維芽細胞によるコラーゲン合成に対する減少作用もあり、結合組織障害の治療への応用が期待される。
【０００７】
ＴＮＦ−α (腫瘍壊死因子-a) は殺細胞性モノカインであり、細菌性エンドトキシンによって刺激されたマクロファージによって産生される。ＴＮＦ−αは炎症、外傷の治癒、組織の再形成に加わる。ＴＮＦ−αはカケクチンの名前でも知られており、敗血性ショックや悪液質を誘発することがある。ＴＮＦ−αは白血球補充を促進し、血管形成を誘発し、線維芽細胞の増殖を促進する。ＴＮＦ−αは特定の腫瘍細胞上の受容器と結合し、細胞融解をもたらす。ＴＮＦ−αは天然のネズミ殺細胞性 (ＮＣ) 細胞の抗腫瘍作用に関与しており、その作用はナチュラルキラー (ＮＫ)細胞や細胞障害性Ｔ細胞のそれとは機能的に異なる。ＴＮＦ−αがカケクチンとも呼ばれるのは、実験動物に長期投与すると、体力消耗と貧血を誘発することができるためである。
【０００８】
以上のような反応は、生理学的過程を調整するのに必要である。しかしながら、そうしたサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２等）の濃度がスーパー抗原又は感染中に突然上昇すると、大規模な全身反応が生じ、それは別名"サイトカイン発作"とも呼ばれて、宿主の全身性ショックをもたらす。ＩＬ−４を過度に活性化すると、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎につながることもある。いくつかのタイプの癌は、高レベルのＩＬ−６産生との関連性が指摘されている。さらに、炎症が動脈硬化につながることもあり、より多くのヒトでの病変と密接に相関しているものと考えられる。従って、前記のようなサイトカインの合成が抑制され又はそれらの活性が調整されることは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６についてはそれらの濃度増大による全身性ショック及び悪液質を防ぎ、ＩＬ−４についてはアレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎を防ぎ、ＩＬ−６については癌及び動脈硬化を防ぐ効果をもたらすものと考えられる。また、これらのサイトカインは、低濃度で免疫調節作用を有していることから、それらの阻害により、免疫調節異常による各種疾患の予防・治療に有用と考えられる。
【０００９】
サイトカイン阻害作用を有する化合物としては、特許文献１記載の置換イミダゾール化合物のほか、特許文献２記載の１，３−ジヒドロ−２ Ｈ−イミダゾール−２−オン誘導体、及び特許文献３記載のヒドロキシアルキルアンモニウム−ピリミジン等が知られているが、多様な局面で、サイトカインを阻害する上で、更なるＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインを阻害するサイトカイン遊離阻害剤に対する要望は強い。
【特許文献１】特表２０００−５０３３０３号公報
【特許文献２】特表平１１−５０４００３号公報
【特許文献３】特表平１０−５０９４１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来技術に存した上記のような課題に鑑み行われたものであって、その目的とするところは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインを阻害する新規サイトカイン遊離阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等のサイトカインの遊離を阻害する上で有用な物質について研究を行った結果、本発明を完成したものである。
【００１２】
すなわち、本発明のサイトカイン遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してサイトカインの遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１３】
また本発明のＩＬ−１β遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＩＬ−１βの遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１４】
また本発明のＩＬ−２遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＩＬ−２の遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１５】
更に、本発明のＩＬ−４遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＩＬ−４の遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１６】
また本発明のＩＬ−６遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＩＬ−６の遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１７】
また更に本発明のＩＦＮ−γ遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＩＦＮ−γの遊離を阻害する方法を提供するものである。
【００１８】
また本発明のＴＮＦ−α遊離阻害剤は、クロレラの細胞壁破砕物を含有してなるものである。また本発明は、細胞壁破砕クロレラを使用してＴＮＦ−αの遊離を阻害する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のサイトカイン遊離阻害剤は、低濃度で免疫調節作用を果している各サイトカインの遊離を阻害するため、免疫調節異常による各種疾患の予防・治療に有用と考えられ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、IL−２についてはそれらの濃度増大による全身性ショック及び悪液質を防ぎ、ＩＬ−４についてはアレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎を防ぎ、ＩＬ−６については癌及び動脈硬化を防ぐ効果をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明におけるクロレラとは、クロレラ属(Chlorella) に属する単細胞緑藻類であって、例えば、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella ellipsoidea 、Chlorella vulgaris 、Chlorella regularis 等を挙げることができる。本発明に最も適しているのは、クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）である。
【００２１】
本発明のサイトカイン遊離阻害剤（ＩＬ−１β遊離阻害剤、ＩＬ−２遊離阻害剤、ＩＬ−４遊離阻害剤、ＩＬ−６遊離阻害剤、ＩＦＮ−γ遊離阻害剤、及びＴＮＦ−α遊離阻害剤を含む。以下同じ。）におけるクロレラの細胞壁破砕物は、例えば次のようにして得ることができる。すなわち、先ずクロレラ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ粉体・水懸濁液を１０℃以下に調整する。次にこの懸濁液を、下記のような連続湿式微粉砕機に送入し、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕する。次いで、このようにして得られたクロレラスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却することにより、細胞壁が破砕されたクロレラを、品質劣化を生じさせることなく得ることができる。
【００２２】
上記連続湿式微粉砕機は、冷却外套を持つ密閉シリンダー中に多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されたものである。そのグラスビーズ容量は密閉シリンダー容量の８０乃至８５％であり、グラスビーズを流入液体と混和・回転することにより、流入液体中の物質を摩砕するものである。
【００２３】
このようにして細胞壁が破砕されたクロレラは、そのまま用いることもできるが、例えば、真空乾燥後粉砕を行う等の適宜の処理を施した後に使用してもよい。
【００２４】
本発明のサイトカイン遊離阻害剤は、経口適用が望ましい。経口適用の形態に特に限定はないが、好ましくは、栄養食品、栄養補助食品、粉末、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、又は飲料用液体の形態である。
【００２５】
また種々の形態を形成する上で、各種賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、可塑剤等を適宜用いることができる。
【００２６】
賦形剤の例としては、糖類（乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール），デンプン（バレイショ，コムギ，トウモロコシ），無機物（炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，塩化ナトリウム），結晶セルロース，植物末（カンゾウ末，ゲンチアナ末）等を挙げることができる。
【００２７】
結合剤の例としては、デンプンのり液，アラビアゴム，ゼラチン，アルギン酸ナトリウム，メチ／レセルロース（ＭＣ），エチルセルロース（ＥＣ），ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），ポリビニルアルコール（ＰＶＡ），ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ），カルポキシメチルセルロース（ＣＭＣ）等を挙げることができる。
【００２８】
崩壊剤の例としては、デンプン，寒天，ゼラチン末，結晶セルロース，ＣＭＣ・Ｎａ，ＣＭＣ・Ｃａ，炭酸カルシウム，炭酸水素ナトリウム，アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２９】
滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム，タルク，水素添加植物油，マクロゴール，シリコーン油等を挙げることができる。
【００３０】
コーティング剤の例としては、糖衣（白糖，ＨＰＣ，セラック），膠衣（ゼラチン，グリセリン，ソルビトール），フイルムコーティング〔ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ），ＥＣ，ＨＰＣ，ＰＶＰ〕，腸溶性コーティング〔ヒドロキシプロビルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ），セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）〕等を挙げることができる。
【００３１】
着色剤の例としては、水溶性食用色素，レーキ色素）等を挙げることができる。矯味剤の例としては、乳糖，白糖，ブドウ糖，マンニトール）等を挙げることができる。矯臭剤の例としては、芳香性精油類），光線遮断剤（酸化チタン）等を挙げることができる。可塑剤の例としては、フタル酸エステル類，植物油，ポリエチレングリコール）等を挙げることができる。
【実施例】
【００３２】
クロレラ・ピレノイドサ（Chlorella pyrenoidosa）乾燥粉末の製造
冷却外套を持つ密閉シリンダー中にその密閉シリンダー容量の８０乃至８５％の容量の多数の直径０．５乃至１．５mmのグラスビーズが封入されており、そのグラスビーズを流入液体と混和・回転することにより流入液体中の物質を摩砕する連続湿式微粉砕機（商品名：ダイノーミル［KD型］  WAB, Inc.製）に、１０℃以下に調整されたクロレラ・ピレノイドサ濃度１０乃至２５重量％のクロレラ・ピレノイドサ粉体・水懸濁液を送入して、破砕直後のスラリーが４０℃以下になるよう微粉砕し、次いで、このようにして得られたクロレラ・ピレノイドサスラリーを、直ちに１０℃以下に冷却し、真空乾燥後、粉砕することにより、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末（株式会社サン・クロレラ製の細胞壁破砕クロレラ粉末）が得られた。
【００３３】
ヒト末梢血液単核細胞内のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α放出阻害の測定
細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒を、２５ｎｇ／ｍｌ（ナノグラム／ミリリットル）のリポ多糖 (LPS)-刺激ヒト末梢血単核白血球（リポ多糖：Ｓｉｇｍａ［米国］から入手。ヒト末梢血単核細胞[PBML]：中国血液サービス財団［台湾］から入手。）と共に、培地ｐＨ７．４内で、３７℃にて一夜インキュベートした。
【００３４】
その後、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［米国］から入手）を用いて、コンディションドメディウム内のサイトカインレベルを定量したところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）による５０％阻害濃度は、ＩＬ−１βが４４．９μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ミリリットル）、ＩＬ−６が３４．７μｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αが１１μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサはＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αの阻害作用を有していた。
【００３５】
ヒト末梢血液単核細胞内のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４放出阻害の測定
細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ乾燥粉末および／または溶媒を、２０ｎｇ／ｍｌのコンカバナリンＡ(Concanavalin A)-刺激ヒト末梢血単核白血球（コンカバナリンＡ：Ｓｉｇｍａ［米国］から入手。ヒト末梢血単核細胞[PBML]：中国血液サービス財団［台湾］から入手）と共に、培地ｐＨ７．４内で、３７℃にて一夜インキュベートした。
【００３６】
その後、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ［米国］から入手）を用いて、コンディションドメディウム内のサイトカインレベルを定量したところ、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサ（乾燥粉末）による５０％阻害濃度は、ＩＦＮ−γが３１．６μｇ／ｍｌ、ＩＬ−２が１４．８μｇ／ｍｌ、ＩＬ−４が４９．２μｇ／ｍｌであった。すなわち、細胞壁破砕クロレラ・ピレノイドサはＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＩＬ−４の阻害作用を有していた。