(57)【要約】【課題】ペプチドについて、幅数ナノから数十ナノメートル、長さ数百ナノメートル規模のナノメートルスケールの微細繊維を形成する新規ペプチドの配列、当該配列を成す物質のナノファイバー形成条件の特定、ペプチドで構成されるナノファイバー形状の制御方法について提供する。【解決手段】天然アミノ酸のみを用い、特定のアミノ酸配列のペプチドを、常温常圧の水溶媒中で、特異的条件下で自己組織化させることにより、ナノファイバーを形成させる。また、アミノ酸配列の種類および形成条件を制御することにより、直線状、曲線状、テープ状、シート状などの多様な形態を形成させる。さらに、ナノファイバーに、酵素を結合させることにより、酵素の耐熱性や活性寿命を向上し、酵素を安定的に機能させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）で示されるペプチドから切り出されたペプチド断片のうち、天然アミノ酸フェニルアラニン（Phe）を含み、アミノ酸数３残基以上７残基以下からなるペプチドで構成されるナノファイバー。
【請求項２】
アミノ酸配列がLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）で示されるアミノ酸数７残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項３】
アミノ酸配列がPhe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）で示されるアミノ酸数６残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項４】
アミノ酸配列がPhe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）で示されるアミノ酸数５残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項５】
アミノ酸配列がIle-Val-Ile-Phe（配列番号４）で示されるアミノ酸数４残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項６】
アミノ酸配列がPhe-Ile-Val-Ile（配列番号５）で示されるアミノ酸数４残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項７】
アミノ酸配列がPhe-Ile-Valで示されるアミノ酸数３残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項８】
アミノ酸配列がVal-Ile-Pheで示されるアミノ酸数３残基からなるペプチドで構成されることを特徴とする請求項１記載のナノファイバー。
【請求項９】
アミノ酸配列がLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）で示されるアミノ酸７残基を一部に含むアミノ酸数７７残基以下のペプチドで構成されるナノファイバー。
【請求項１０】
ペプチドを水に溶解し、これをｐＨ２〜１０の範囲内で塩強度が１０〜１０００ミリモル／リットルの範囲内の水溶液と混合して、常温常圧下に静置することにより作製することを特徴とする請求項２，３，５，６，７，または８に記載のいずれかのナノファイバーの製造方法。
【請求項１１】
前記水溶液が、中性付近（ｐＨ７±１）のリン酸緩衝液とアルカリ金属塩との混合液である請求項１０記載のナノファイバーの製造方法。
【請求項１２】
水に難溶のペプチドをクリべージ溶液に溶解し、これを水で希釈した溶液を常温常圧下で静置することにより作製することを特徴とする請求項４または８に記載のいずれかのナノファイバーの製造方法。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２記載のいずれかのナノファイバーの製造方法において、常温常圧下で静置の際に、吸着させた基板を水で洗浄することを特徴とするナノファイバーの製造方法。
【請求項１４】
ナノファイバーを作製させる基板の種類、混合液の攪拌の有無により、微細繊維の形態を制御することを特徴とする請求項１０乃至１２記載のいずれかのナノファイバーの製造方法。
【請求項１５】
繊維形成によって水溶液系から析出するペプチドで構成されるナノファイバーを分離することにより、上澄みの反応水溶液を回収し、ナノファイバーの作製に再利用することを特徴とする請求項１０乃至１２記載のいずれかのナノファイバーの製造方法。
【請求項１６】
ペプチドで構成されたナノファイバーの生成過程において、攪拌しつづけることで、分子間衝突回数を増やし、均一度を上げること及び基板との相互作用により方向性を揃えることにより、ナノメートルサイズのジャンクションを形成することを特徴とする請求項８記載のナノファイバー。
【請求項１７】
請求項１乃至９記載のいずれかのナノファイバーに、酵素を結合させることにより、酵素の耐熱性及び／または活性寿命を向上し、酵素を安定的に機能させることを特徴とする酵素固定化材料。
【請求項１８】
請求項１乃至９記載のナノファイバーのリジン残基またはＮ末端のアミノ基をビオチン化し、また、リジン残基またはＮ末端を有する酵素をビオチン化し、アビジンを介して、ナノファイバーに酵素を結合させることを特徴とする酵素固定化材料。
【請求項１９】
前記酵素がプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）であるキモトリプシンであることを特徴とする請求項１８記載の酵素固定化材料。
【請求項２０】
請求項１乃至９記載のナノファイバーのリジン残基またはＮ末端のアミノ基をビオチン化し、また、リジン残基またはＮ末端を有する酵素や抗体などのタンパク質若しくは核酸をビオチン化し、アビジンを介して、ナノファイバーに結合させることを特徴とする固定化材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドという生体物質から成るバイオ分子で構成されたナノ材料、ナノ素材技術に関するものであり、また、機能物質の配置をナノメートル単位の精度で制御できるナノ加工技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノメートルスケールの材料についての研究が世界的に急速に進展している。また、環境への取り組みが重要視され、地球環境や人間にやさしい装置やシステムを構築すべく、自然界のタンパク質などの生体物質をモデルとした環境調和材料の研究が行われている。
【０００３】
しかし、従来のナノスケール材料は、人工的な合成物であり、天然物で規則的な構造を形成させることは困難であった。天然物で材料を形成させる利点としては、物質自体及びその製法が自然に近く環境負荷が非常に小さいことがあげられる。
また、生体物質から成るバイオ分子の特徴を生かした応用、例えば医療材料としての活用が可能な点などがあげられる。この生体物質から成るバイオ分子により形成される材料として、ごく一部のタンパク質やペプチドが繊維を形成することは知られているが、工業的に形成条件を確立させることまでには至っていない状況である。
【０００４】
また、ペプチドにより構成されるナノファイバーは、担体、吸着材のほか、例えば生体適合材料として医療、薬剤分野に、マイクロ電子部品材料として電子・情報・エレクトロニクス分野に、あるいは乳化剤、安定剤、分散剤、湿潤剤などとして食品工業、農林業、繊維工業などの分野において利用が期待されている。従来、リン脂質の分子集合体として、天然由来のリン脂質から得られる球状の分子集合体、いわゆるリポソームが知られているが、これは、一般に薄膜法、熱分散法、溶液注入法、コール酸法、逆層蒸発法などによって製造されており、熟練した技術を必要とし、得られる分子集合体は、単一膜ベシクル又は球状の多重膜ベシクルであり、長繊維状集合体は得られなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−２６６００７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、天然物で規則的な構造を有するナノスケールの材料、素材を提供することである。また、当該ナノ材料に、さまざまな特性・機能を持たせる酵素などの物質を配置し、特性・機能の向上、さまざまな用途の材料を作製することである。
【０００７】
具体的には、ペプチドについて、幅数ナノから数十ナノメートル、長さ数百ナノメートル規模のナノメートルスケールの微細繊維を形成する新規ペプチドの配列、当該配列を成す物質のナノファイバーの形成条件の特定、ペプチドで構成されるナノファイバーの形状の制御方法について提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ペプチドにより構成されるナノファイバーについて鋭意研究を重ねた結果、天然アミノ酸のみで、アミノ酸数３残基以７７残基以下で構成されるペプチドを、常温常圧の水溶媒中で、特異的条件下で自己組織化させることにより、幅数ナノから数十ナノメートル、長さ数百ナノメートルから数十マイクロメートルに至るナノファイバーが形成できることを知見し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明に係るナノファイバーを形成するペプチドは、繊維形成の報告例のない新規のアミノ酸配列からなるペプチドであり、具体的には、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）で示される７アミノ酸からなるものを基本として、これとこの一部である３〜７アミノ酸からなるペプチド断片またはペプチド断片を含むものである。ペプチド断片としては、Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２），Phe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３），Ile-Val-Ile-Phe（配列番号４），Phe-Ile-Val-Ile（配列番号５），Phe-Ile-Val，Val-Ile-Pheで繊維形成できることを確認した。また、ペプチド断片として、Ile-Val-Ileの３アミノ酸残基は、繊維形成できないことを確認した。これより、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）を基本にして、天然アミノ酸フェニルアラニン（Phe）を含む３残基以上７残基以下のペプチド断片がナノファイバーを形成すると考える。
【００１０】
また、特異的条件とは、分子間力を制御するため、特別に最適化されたｐＨや塩強度に制御することである。但し、水に難溶のペプチド断片であるPhe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）とVal-Ile-Pheについては、有機溶媒に溶解後に精製水で希釈してファイバーを形成させる製法を発明した。
【００１１】
また、前記ペプチド断片による微細繊維の製造方法において、微細繊維を作製させる基板の種類、基板の洗浄の有無、混合液の攪拌の有無により、微細繊維の形態を制御できることを見出した。また、繊維形成によって水溶液系から析出するペプチドで構成されるナノファイバーを遠心分離することにより、上澄みの反応水溶液を回収でき、これを再利用できることを見出した。上澄みの反応水溶液をほぼ１００％近く回収でき、そのままナノファイバー作製に再利用できるため、量産を容易とし、かつ、廃棄物を出さない製造工程が実現できる。
【００１２】
さらに、鋭意研究の結果、ペプチドにより構成されるナノファイバーに、酵素を結合させることにより、酵素の耐熱性や活性寿命を向上し、酵素を安定的に機能させることを可能とする酵素固定化材料として本発明にかかるナノファイバーを利用できることを見出した。
具体的には、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）の７残基からなるナノファイバーに、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）であるキモトリプシンのリジン残基をビオチン化し、アビジンを介して結合させたものについて、プロテアーゼが自己分解(autolysis)を起こして時間とともに活性が減少するという状態を抑制できることを見出し、ナノファイバーを、酵素を安定化させるための酵素固定化材料として利用する方法を発明した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るナノファイバーを形成するペプチドは、アミノ酸配列の種類および形成条件を制御することにより、直線状や曲線状などの多様な形態をもったナノファイバーを形成させることができ、また、前記ナノファイバーが寄り集まることにより、ナノメートルスケールでのテープ状あるいはシート状のより大きな構造体を形成させることができるという効果を有する。
これらのナノファイバー，ナノテープおよびナノシートは、天然アミノ酸のみで構成され、ペプチドの自己組織化を利用して作製するため、エネルギーや人工合成物の添加は不要であり、また、ナノファイバーの作製過程において使用する溶液は、完全に再利用可能であり、作製プロセスにおいて廃棄物を生成しないことから、環境負荷が少ないという効果を有する。
また、本発明に係るナノファイバーを形成するペプチドのうち、特に、アミノ酸７残基であるLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）からなるナノファイバーに酵素を結合させることで、耐熱性と安定性に優れた酵素とする固定化材料として利用できるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明ナノファイバーを形成するペプチドを作製方法および酵素固定化方法などについて最良の形態を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１５】
先ず、ペプチドによるナノファイバー作製手順フローについて図１に基づいて説明する。アミノ酸配列が、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）で示されるペプチドを精製水に溶かすことにより３ミリモル／リットルの濃度となるペプチドストック溶液を作製する。また、リン酸緩衝溶液のストック溶液（ｐＨ７．０付近）と食塩水のストック溶液（ｐＨ７．０付近）を混合して、塩強度が１０〜１０００ミリモル／リットルの範囲のもの、望ましくは５００ミリモル／リットルの塩強度を有する溶液を準備する。これを用いて、前記ペプチドストック溶液を１／１０に希釈し、攪拌する。これから、３００マイクロモル／リットルのペプチド溶液（２５ミリモル／リットルのリン酸緩衝液，ｐＨ７．０，５００ミリモル／リットル以下の食塩を含む）を、室温（２５度）で１週間程度静置させることにより、ナノファイバーを作製する。
【００１６】
また、このナノファイバーを量産する方法を以下に説明する。上述の作製手順フローに従い作製したナノファイバーは、繊維形成によって水溶液系から析出するため、遠心分離など行うことにより、水溶液からナノファイバーのみ取り出すことが可能である。このナノファイバーは収率１００％近くで沈殿することが確認できている。これは、作製反応に用いた水溶液系は、そのまま次のナノファイバーの作製に再利用できることを意味する。従って、本発明に係るナノファイバーの量産については、水溶液系に目的のペプチドを投入、沈殿、分離抽出の繰返し工程にて実現できることとなる。反応に伴う水溶液系は完全に再利用可能であるため、量産プロセスにおいて廃棄物を出さず、かつ、単純な量産プロセスとできる。
【００１７】
上述の作製手順フロー（ｐＨ７．０，１００ミリモル／リットルの食塩の条件において）により作製したナノファイバーの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を図２に、電子顕微鏡（ＥＭ）画像を図３に示す。また、図４〜６には、作製されたナノファイバーが、直径５ナノメートル程度で、長さ数マイクロ〜十数マイクロメートルのものであることが示されている。
【実施例２】
【００１８】
また、次に、塩強度を変化させることにより、ナノファイバーの形状（太さ）を制御できることについて説明する。図７および図８は、上述のペプチドLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）からナノファイバーを作製する手順において、塩強度を強くし、実施例１の場合の塩強度を１００ミリモル／リットルから７００ミリモル／リットルとしたものである。図７および図８は、塩強度を調整することによりナノファイバーの直径を約５ナノメートルから約２２ナノメートルに変化させることができることを示している。
【実施例３】
【００１９】
同様に、ペプチド断片として、Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）の６残基が繊維形成できることを示した画像を図９に、Phe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）の５残基が繊維形成できることを示した画像を図１０〜図１２に、Ile-Val-Ile-Phe（配列番号４）の４残基が繊維形成できることを示した画像を図１３に、Phe-Ile-Val-Ile（配列番号５）の４残基が繊維形成できることを示した画像を図１４に、Phe-Ile-Valの３残基が繊維形成できることを示した画像を図１５に、Val-Ile-Pheの３残基が繊維形成できることを示した画像を図１６および図１７にそれぞれ示す。
ここで、Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２），Ile-Val-Ile-Phe（配列番号４），Phe-Ile-Val-Ile（配列番号５），Phe-Ile-Val，Val-Ile-Pheについては、実施例１と同様に、図１に示すナノファイバー作製手順フローにて作製したものである。
【００２０】
また、水に難溶のペプチドである、Phe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）またはVal-Ile-Pheの場合は、クリベージ溶液に溶解し、これを水で約１０倍に希釈した溶液を常温常圧下で静置することにより作製するナノファイバーの製造方法を開発した。
尚、Val-Ile-Pheの場合は、水に難溶であるが、水溶液からでもナノファイバーの生成が可能であることを確認しており、水溶液に溶解するか、有機溶媒に溶かして希釈するか、いずれかの作製フローによりナノファイバーの作製が可能である。
ここで、クリベージ溶液は、以下のＡ〜Ｃの３種類のいずれかのものを用いる。
Ａ：9.5mlＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）＋0.5ml精製水
Ｂ：0.75g結晶フェノール＋0.25mlＥＤＴ（エタンジチオール）＋0.5mlチオアニソール＋0.5ml精製水＋8.25mlＴＦＡ
Ｃ：0.25mlＥＤＴ＋0.25ml精製水＋9.5mlＴＦＡ
【実施例４】
【００２１】
次の実施例として、アミノ酸配列が、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）であるアミノ酸７残基を一部に含むペプチドが、ナノファイバーを形成する例を説明する。図１９および図２０は、アミノ酸配列が、Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys-Asn-Asp（配列番号６）であるアミノ酸１２残基からなるペプチドが、ナノファイバーを形成できることを示した画像である。アミノ酸配列が、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）であるアミノ酸７残基を一部に含むペプチドについて、N末端方向もしくはC末端方向にアミノ酸を付加して、アミノ酸数を増やしていった場合において、アミノ酸数７７残基のペプチドで、ナノファイバーを形成できることを確認している。
【実施例５】
【００２２】
次の実施例として、ナノファイバーを作製させる基板の種類を変化させることにより、微細繊維の形態を制御する方法について説明する。図１１と図１２は、アミノ酸配列がPhe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）で示されるペプチドからナノファイバーを作製する際、雲母上で形成するか、ガラス上で形成するかをにより、形成されるナノファイバーの形状が異なる様子を示している。雲母上で形成されたものは、シート状（ほぼ均一の大きさの繊維が一面に配した形状）に形成できる一方、ガラス上で形成されたものは、テープ状（繊維が平面的に束ねられた形状）に形成できる。このことは、形成基板の種類によってナノファイバーの形態制御が可能であることを示している。
【実施例６】
【００２３】
次の実施例として、前記ナノファイバーの作成手順において、ペプチドを常温常圧下で基板上に静置する際に、ペプチドを吸着させた基板を水で洗浄することにより、ナノファイバーの形態制御が可能であることを説明する。
アミノ酸配列がPhe-Ile-Val-Ile-Phe（配列番号３）で構成されるペプチドを雲母基板上に静置する際に、基板の洗浄を実施しなかった場合のものを図１０に、基板の洗浄を実施した場合のものを図１１に示す。図１０の場合は、ナノファイバーが網目状に形成されているのに対して、図１１の場合は、ナノファイバーがある方向性をもってシート状に形成されている。
これは、吸着する基板を水で洗浄するか否かの条件にて、ナノファイバーの形態制御を行えることを示している。
ここで、基板の洗浄方法は、ペプチドの溶液を基板上に５マイクロリットル滴下し、室温にて完全に乾燥させた後、マイクロピペットで１ミリリットルの精製水を傾けた基板の上端から約２０マイクロリットルずつ滴下することにより行うものである。
【実施例７】
【００２４】
次の実施例として、ナノファイバーを作製させる際、混合液の攪拌の有無により、微細繊維の形態を制御する方法について説明する。図１７と図１８は、アミノ酸配列がVal-Ile-Pheで示されるペプチドからナノファイバーを作製する際、攪拌の有無により、形成されるナノファイバーの形状が異なる様子を示した画像である。
【００２５】
ここで、図１８に示すナノファイバーの画像は、ナノファイバーの生成過程において、攪拌しつづけることで、分子間衝突回数を増やし、均一度を上げ、雲母基板との相互作用により方向性を揃える（雲母の結晶格子方向に揃える）ことを可能としたことにより、ナノメートルサイズのジャンクションを形成できたことを示している。図１８の画像は、０．５マイクロメートル程度の長さの３本のナノファイバーが、１２０度の角度間隔でつながり、ジャンクションの形態をしている様子を示している。
【実施例８】
【００２６】
次に、本発明に係るペプチドにより形成されたナノファイバーに酵素を結合させることにより、酵素の耐熱性及び／または活性寿命を向上し、酵素を安定的に機能させることを可能とする酵素固定化材料と成りうることを詳述する。実施例として、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）の７残基からなるナノファイバーに、酵素としてプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）であるキモトリプシンのリジン残基やＮ末端のアミノ基をビオチン化し、アビジンを介して結合させたものについて、酵素（プロテアーゼ）が自己分解(autolysis)を起こして時間とともに活性が減少するという状態を抑制できることを説明する。言い換えると、本発明にかかるナノファイバーを、酵素を安定化させるための酵素固定化材料できることを説明するものである。ここで、酵素固定化の概念図を図２１に示すこととする。
【００２７】
先ず、アミノ酸配列Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号１）について、ナノファイバー形成後、α-キモトリプシンについてはそのまま溶液中で、ビオチン化試薬（Biotin-(AC5)2-Sulfo-OSu）を用いてリジン残基（の一部）をビオチン化する。モル当りビオチン化率は、ナノファイバーで約35%キモトリプシンで約47%であることを測定により確認した。
【００２８】
また、酵素活性は、合成基質（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA）の吸光度の変化をモニターすることで得る。活性の比較は、同条件とすべく、ビオチン化したナノファイバーと酵素の混合物に、アビジンを入れた場合（ファイバーと酵素が結合）と入れない場合（ファイバーと酵素が遊離）とで比較する。測定温度は、２５度、ｐＨ７で、分解速度をもって活性としている。
この溶液を、例えば５５度で３０分放置したのち、２５度に戻して活性測定を行うと、アビジンなしでは活性が19.7%に低下（約五分の一）したが、アビジン入りでは49.7%（約二分の一）であった。これは、酵素のナノファイバーへの固定化によって酵素が安定化し、この時点で活性が約2.5倍（49.7/19.7）となっていることを示している。図２２に、α−キモトリプシンの残存活性を示したグラフを示す。これは、安定で高機能（高耐熱性）な酵素を作成するための材料として、ナノファイバーが有用であることを示すデータである。
【００２９】
ここで、ビオチン化率の測定方法について、以下に詳細に説明する。先ず、4-Hydrooxyazobenzene-2-carboxylic  acid（HABA）を秤量し、10mMHABAになるように10mMNaOH水溶液を加える（HABA溶液の調製）。さらに、アビジンを秤量し、phosphate  buffered saline (PBS)と先に調整したHABA溶液を加えて、アビジンの最終濃度が約7μM、HABAの最終濃度が約300μMになるように調製する（HABA-アビジン溶液の調製）。180μlのHABA-アビジン溶液を、ミクロセル（光路長1cm）に入れ、紫外分光光度計（HITACHI  U-3210 spectrophotometer）で500nmの吸光度を測定する。これを３回繰り返し、３回の平均値をその値とする（これをAbsAとする）。次に180μlのHABA-アビジン溶液に２０μlのビオチン化したナノファイバーを加え、５分間以上静置した後、同様に５００nmの吸光度を測定する（これをAbsBとする）。AbsAとAbsBの値より、下記の数式１を用いて、ファイバーに固定化されたビオチン濃度［A（mol/l）］を算出している。
【００３０】
【数１】
2005146462.tif 000003
【００３１】
また、ビオチン化されたペプチド濃度をB（mol/l）とすると、下記の数式２により、ペプチド1分子をラベル化したビオチンの数を計算することができる。
【００３２】
【数２】
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【００３３】
さらに、ビオチン化キモトリプシンのビオチン化率も同様に測定し、算出する。
【００３４】
また、キモトリプシンのナノファイバーへの固定化はビオチン化ファイバーとビオチン化酵素を、それぞれアビジンを介して結合させることで行うことができる。アビジンは４つのビオチン結合部位をもっており、これを固定化に利用する。まず初めにHABA法で見積もったナノファイバーに固定化されたビオチン濃度をもとに、等量になるようにアビジン溶液を添加して５分間結合反応を行う。その後、さらにナノファイバーに固定化されたビオチン濃度と等量になるようにビオチン化キモトリプシン溶液を添加することで、固定化を行う。
【００３５】
次に、酵素活性の吸光度変化のモニタ測定方法について説明する。ナノファイバーに固定化されたキモトリプシンの基質分解活性を評価するために、５５℃で３０分間温置した後の２５℃での残存活性を測定する。また同様にアビジンが存在しなかった場合の残存活性についても測定を行う。初めにキモトリプシンの基質として合成基質N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide（AAPF）を用い、それを２５mMリン酸緩衝溶液（７５０mM NaCl、pH7.0）に５００μMになるように溶かす。さらにファイバーに固定化されたキモトリプシンの濃度が3μMになるように、試料を25mMリン酸緩衝溶液（７５０mM NaCl、pH7.0）で希釈した後、3 μMに調製した試料をブロックインキュベーター（KOKEN RIKA）を用いて、55℃で30分間温置する。その後（A）55℃で温置しなかった試料と（B）55℃で温置した試料を同時に活性測定し、基質AAPFの分解初速度の比（Ｂ/Ａ）を求め、残存活性（％）を求める。
【００３６】
活性測定は、紫外分光プレートリーダー（Molecular Devices）を使用し、測定または解析ソフトとしては、SOFT  max PRO ver.3.1（Molecular Devices）を用いた。本実験では、キモトリプシンによるAAPFの分解から生成した p-nitroanilineの405nmにおける吸収を追跡した。まず96  well  plate （clear flat bottom） （SUMILON）に20 μlの試料（最終濃度0.6 μM）を入れ、次に80μlの AAPF（最終濃度400μM）を加えて酵素反応を開始させた。 その後96 well plateを速やかにプレートリーダーにセットし、10秒間攪拌を行った後、吸光度測定を開始した。測定時間は10分間で、10秒毎に吸光度を測定（測定毎に2秒間攪拌）した。その結果、反応時間（sec）に対してそれぞれの吸光度（OD）をプロットすることにより比例関係が得られ、測定開始から5分間の吸光度の変化量を反応の初速度（mOD/sec）とした。この測定で得られたそれぞれの初速度をもとに、残存活性を計算した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明に係るナノファイバーを形成するペプチドは、ファイバーそのものをナノ材料やナノ素材として利用できる。具体的には、フィルターやクロマトグラフィー担体など繊維製品としての利用が考えられる。
また、本発明に係るペプチドは、天然のアミノ酸から成るので、環境調和材料として利用できる。
また、たんぱく質や核酸などの他の生体物質、または、有機物，無機物を問わず、特異的に相互作用する一般的な物質と結合させることで、機能材料、生体材料、医療材料として利用できる。
この例として、本発明に係るナノファイバーを形成するペプチドに酵素の修飾を行うことにより、安定で高機能（高耐久性）な酵素を作成するための酵素固定化材料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ペプチドによるナノファイバー作製手順フロー図
【図２】配列番号１で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像
【図３】配列番号１で構成されるペプチドの電子顕微鏡（ＥＭ）画像
【図４】配列番号１で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像にてナノファイバーの直径サイズを示すもの（但し、形成条件は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）
【図５】図４に示す画像における水平方向ＡＢ間における高さを示すグラフ図
【図６】図４に示す画像における水平方向ＣＤ間における高さを示すグラフ図
【図７】配列番号１で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像にてナノファイバーの直径サイズを示すもの（但し、形成条件は、７００ｍＭ  ＮａＣｌ）
【図８】図７に示す画像における水平方向ＡＢ間における高さを示すグラフ図
【図９】配列番号２で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像
【図１０】配列番号３で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（雲母基板上，基板の洗浄無し）
【図１１】配列番号３で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（雲母基板上，基板の洗浄あり）
【図１２】配列番号３で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（ガラス基板上，基板の洗浄あり）
【図１３】配列番号４で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像
【図１４】配列番号５で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像
【図１５】Phe-Ile-Valで構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像
【図１６】Val-Ile-Pheで構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（クリベージ溶液に溶解後、精製水で希釈した溶液）
【図１７】Val-Ile-Pheで構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（静置したもの、攪拌しない）
【図１８】Val-Ile-Pheで構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（攪拌したもの）
【図１９】Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys-Asn-Asp（配列番号６）で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（１００ｍＭのＮａＣｌ）
【図２０】Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys-Asn-Asp（配列番号６）で構成されるペプチドの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像（５００ｍＭのＮａＣｌ）
【図２１】酵素固定化の概念図
【図２２】α−キモトリプシンの残存活性を示したグラフ図
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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