(57)【要約】      （修正有）【課題】マイクロウェルアレイチップを用い、特定のマイクロウェルに導入された生物試料を、他のマイクロウェルに導入された生物試料の混入を回避しつつより簡易にかつ確実に取得する方法を提供する。【解決手段】(1)取得されるべき試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、固定されていない試料をマイクロウェルから除去し、固定した試料をマイクロウェルから取り出す。(2)取得されるべき試料を含むマイクロウェルに隣接するマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、固定されていない取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出す。(3)マイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、固定された取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出す、などの方法による。【選択図】図２
2005261339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記取得されるべき試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定されていない試料をマイクロウェルから除去し、
前記固定した試料をマイクロウェルから取り出す
ことを含む前記方法。
【請求項２】
試料のマイクロウェルへの固定を、
（１）アガロース溶液を取得されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで冷却して、前記アガロース溶液を固化することで行う、または
（２）温度応答ポリマーを取得されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで加熱して、前記温度応答ポリマーを固化することで行う、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記固定した試料を、アガロースまたは温度応答ポリマーとともにマイクロウェルから取り出し、さらにアガロースまたは温度応答ポリマーから試料を取り出すことを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
固定した試料のマイクロウェルからの取り出しを、
（１）固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行う、または
（２）固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行う、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記取得されるべき試料を含むマイクロウェルに隣接するマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定されていない取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出す
ことを含む前記方法。
【請求項６】
取得されるべき試料を含むマイクロウェル以外のマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記マイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定された取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出すことを含む前記方法。
【請求項８】
前記固定した試料を、アガロースまたは温度応答ポリマーとともにマイクロウェルから取り出し、さらにアガロースまたは温度応答ポリマーから試料を取り出すことを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記マイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定された取得されるべき試料をマイクロウェル中でアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出し、次いで取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出すことを含む前記方法。
【請求項１０】
取得されるべき試料のマイクロウェルからの取り出しを、
（１）固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行う、または
（２）固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行う、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料のマイクロウェルへの固定を、
（１）アガロース溶液を固定されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで冷却して、前記アガロース溶液を固化することで行う、または
（２）温度応答ポリマーを固定されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで加熱して、前記温度応答ポリマーを固化することで行う、
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料のマイクロウェルからの取り出しを、マイクロウェルごとに行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料のマイクロウェルからの取り出しを、複数のマイクロウェルについてまとめて行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物試料が、動物細胞、酵母細胞または細菌細胞である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
動物細胞がリンパ球、単球、または顆粒球である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つの生物試料のみが格納される形状及び寸法を有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有する請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップを用い、マイクロウェルに導入された、例えば、リンパ球のような生物試料から特定の試料を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的抗体作製の手法として、抗原特異的抗体遺伝子をクローニングし、クローニングした遺伝子を用いて、遺伝子工学的に抗原特異的抗体を作製する方法がある。しかるに、従来の抗原特異的抗体遺伝子をクローニングする方法は、非常に効率の悪い方法であった。それでも、頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球については、従来の方法でも、相当量の労力を投入すれば、抗原特異的抗体遺伝子をクローニングすることは可能であった。しかし、従来の方法では頻度の低い抗原特異的リンパ球を同定、選別するということは事実上、不可能であった。
【０００３】
そこで本発明者らは、頻度が比較的高い抗原特異的リンパ球は勿論のこと、頻度の低い抗原特異的リンパ球であっても、簡便に特定の抗原に特異的に反応するリンパ球（抗原特異的リンパ球）を選択し、この選択された抗原特異的リンパ球から、抗原特異的抗原受容体遺伝子を効率的にクローニングする方法を提供することを目的として、前記抗原特異的リンパ球を単一のリンパ球として分取できる手法の開発を進めてきた。
【０００４】
まず、従来の抗原特異的リンパ球を分取する方法について説明する。
従来、抗原特異的リンパ球は図３に示すような９６穴プレートを用いて、1穴あたり約200,000個のリンパ球を加えて３日から１週間、抗原の存在下で培養することにより検出していた（非特許文献１及び２）。
検出方法は
1.細胞の増殖（3H-thymidineの取り込み、生細胞の検出）
2.抗体・サイトカインの産生
を測定することによる。
この方法では、約200,000個というリンパ球集団の中に抗原特異的リンパ球が存在することは確認できた。しかし、リンパ球集団中に存在する個々の抗原特異的リンパ球を同定することはできなかった。
【０００５】
これに対して近年、蛍光色素で標識した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に蛍光標識抗原を結合させ、蛍光標識抗原を結合したリンパ球を、フローサイトメータを用いることにより検出する方法が開発され利用されている（非特許文献３）。この方法では抗原に結合する1個のリンパ球を同定することが可能である。さらに抗原に結合する1個のリンパ球を分取することも可能である。
【０００６】
しかしながら、上記検出方法では、分取するためにはセルソーターという高価で複雑な機器が必要である上に、以下の問題も有る。
（１）分取するための機器の条件設定が難しく、細胞を分取するためには機器操作の熟練を要する。
（２）バックグラウンドが高いため抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出できない。
（３）細胞を分取する効率は低い。
（４）頻度の低い細胞を分取するのに時間がかかる。
（５）抗原が結合することは確認できるが、抗原が結合したリンパ球の反応を解析することは難しい。
【０００７】
別の抗原特異的リンパ球検出法として、磁気ビーズに結合した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に磁気ビーズ結合抗原を結合させ、磁石を用いて抗原特異的リンパ球を分取する方法も開発されている（非特許文献４）。
この方法では、複雑な装置は必要とせず、細胞の分取の時間は短時間であり、抗原が結合することも確認できる。しかし、抗原が結合したリンパ球が抗原に反応(細胞内シグナル伝達、RNA合成、タンパク質合成などの細胞の代謝生理反応)するかを解析することはできなかった。また、抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出できなかった。
【非特許文献１】「リンパ球機能検索法」矢野純一、藤原道夫編著、中外医学社（１９９４年）
【非特許文献２】「免疫実験操作法Ｉ、ＩＩ」右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之編集、南江堂（１９９５年）
【非特許文献３】Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274:94-96, 1996
【非特許文献４】Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, Tesch H, CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of Immunological Methods 125:19-28, 1989.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それに対して本発明者らは、複雑な装置は必要とせず、細胞の分取の時間は短時間であり、抗原が結合することも確認でき、頻度の低い抗原特異的リンパ球(0.001%以上)も検出でき、抗原が結合したリンパ球が抗原に反応するかを解析することができ、しかも抗原特異的リンパ球を分取できる抗原特異的リンパ球検出法を開発した。さらに、上記検出法に使用する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップ（複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップ）、及び上記検出法を利用した抗原特異的リンパ球の製造方法も開発した。
これらについては、既に特許出願済みである。
【０００９】
上記方法では、抗原特異的リンパ球を単一のリンパ球として分取できることが可能となり、この単一の抗原特異的リンパ球を用いて、抗原特異的抗体遺伝子をクローニングし、クローニングした遺伝子を用いて、遺伝子工学的に抗原特異的抗体を作製する方法も開発し、既に特許出願済みである。
【００１０】
上記方法において、単一の抗原特異的リンパ球を採取することは可能である。しかし、上記方法を実用化するにあたっては、他のリンパ球の混入を回避しつつより簡易にかつ確実に、目的とする単一の抗原特異的リンパ球を採取する方法の確立が必要であった。
【００１１】
そこで本発明の目的は、複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップを用い、特定のマイクロウェルに導入された生物試料（例えば、リンパ球）を、他のマイクロウェルに導入された生物試料（リンパ球）の混入を回避しつつより簡易にかつ確実に取得する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するための手段は、以下の通りである。
[請求項１] 複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記取得されるべき試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定されていない試料をマイクロウェルから除去し、
前記固定した試料をマイクロウェルから取り出す
ことを含む前記方法（以下、第１の方法という）。
［請求項２］試料のマイクロウェルへの固定を、
（１）アガロース溶液を取得されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで冷却して、前記アガロース溶液を固化することで行う、または
（２）温度応答ポリマーを取得されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで加熱して、前記温度応答ポリマーを固化することで行う、
請求項1に記載の方法。
［請求項３］前記固定した試料を、アガロースまたは温度応答ポリマーとともにマイクロウェルから取り出し、さらにアガロースまたは温度応答ポリマーから試料を取り出すことを含む請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］固定した試料のマイクロウェルからの取り出しを、
（１）固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行う、または
（２）固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行う、
請求項１または２に記載の方法。
［請求項５］複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記取得されるべき試料を含むマイクロウェルに隣接するマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定されていない取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出す
ことを含む前記方法（以下、第２の方法という）。
［請求項６］取得されるべき試料を含むマイクロウェル以外のマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する請求項５に記載の方法。
［請求項７］複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記マイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定された取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出すことを含む前記方法（以下、第３の方法という）。
［請求項８］前記固定した試料を、アガロースまたは温度応答ポリマーとともにマイクロウェルから取り出し、さらにアガロースまたは温度応答ポリマーから試料を取り出すことを含む請求項７に記載の方法。
［請求項９］複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法であって、
前記マイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定し、
固定された取得されるべき試料をマイクロウェル中でアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出し、次いで取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出すことを含む前記方法（以下、第４の方法という）。
［請求項１０］取得されるべき試料のマイクロウェルからの取り出しを、
（１）固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行う、または
（２）固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行う、
請求項９に記載の方法。
［請求項１１］試料のマイクロウェルへの固定を、
（１）アガロース溶液を固定されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで冷却して、前記アガロース溶液を固化することで行う、または
（２）温度応答ポリマーを固定されるべき試料を格納したマイクロウェルに導入し、次いで加熱して、前記温度応答ポリマーを固化することで行う、
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１２］ 前記試料のマイクロウェルからの取り出しを、マイクロウェルごとに行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］前記試料のマイクロウェルからの取り出しを、複数のマイクロウェルについてまとめて行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１４］前記生物試料が、動物細胞、酵母細胞または細菌細胞である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１５］動物細胞がリンパ球、単球、または顆粒球である請求項１４に記載の方法。
［請求項１６］前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つの生物試料のみが格納される形状及び寸法を有する請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１７］前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有する請求項１６に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法では、回収する生体試料をチップに固定するが、その利点としては以下のものを挙げる事ができる。
１）細胞の回収が容易になる：１０ミクロンのウェルが２０〜３０ミクロン程度のピッチで並んでいるマイクロアレイチップの特定のウェルから細胞を回収する場合、機械的な位置精度が高くとも隣接ウェルの細胞も誤って採取してしまう可能性が高い。本発明では、目的のウェル中の細胞をウェル中に固定した後、固定されていない無関係な細胞を除去することができる。無関係な細胞を除去した後、目的の細胞を回収する場合、隣接ウェルにはもはや細胞がない可能性が高く、誤って細胞を回収してしまう可能性が非常に低くなる。
【００１４】
２）回収時の細胞の損傷を防げる：マイクロアレイチップから細胞を１個ずつ回収する際、細胞に損傷を与え、その後の増殖に悪影響を与える可能性がある。ゲルに守られていることで損傷を与えにくい。またゲル化させておけば細胞と違って溶液外へ出すことも可能で回収操作が非常に容易になる。
【００１５】
３）ゲル内で細胞を増殖させられる：回収してから細胞を増殖させる必要のある場合(ハイブリドーマ法の場合など)、ゲル中に封入したまま、ある程度、細胞を増殖させるということも可能である。細胞は細胞数が非常に少ない、あるいは細胞濃度が非常に低い場合には増殖しにくい傾向がある。ゲル中に封入することで低濃度でも細胞が増殖できるようになる場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の生物試料取得方法は、複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップのマイクロウェルに生物試料を導入し、前記生物試料から特定の試料を取得する方法である。
【００１７】
本発明の方法で取得の対象とする生物試料は、特に限定されないが、例えば、リンパ球、単球、顆粒球などの動物細胞、または、酵母もしくは細菌の細胞であることができる。また、動物細胞として、神経細胞、心筋細胞、筋細胞、精子、卵子等を挙げることもできる。
本発明の方法は、１個の抗原特異的リンパ球を選択し、取得する方法として有用であり、特に抗原特異的リンパ球が１個である場合、すなわち、単独の抗原特異的リンパ球を選択し、取得する方法として有用である。以下、生物試料がリンパ球である場合を例に説明する。
【００１８】
［抗原特異的リンパ球の選択］
抗原特異的リンパ球を選択し、取得する場合、複数個のマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに生物試料である被検体リンパ球を格納する。１個の抗原特異的リンパ球を選択し、取得する場合は、各マイクロウェルに１個の被検体リンパ球が含まれるように、マイクロウエルの寸法等を設定する。この点については後述する。次いで、１個の被検体リンパ球が含まれるマイクロウェルを複数有する抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、次いで、抗原に反応したリンパ球を検出する。
【００１９】
検出された抗原特異的リンパ球、即ち、取得されるべき試料は、第１の方法においては、アガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。その後、固定されていないリンパ球をマイクロウェルから除去し、固定したリンパ球（このリンパ球が抗原特異的リンパ球である）をマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。
【００２０】
第２の方法においては、取得されるべき試料である検出された抗原特異的リンパ球を含むマイクロウェルに隣接するマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。次いで、固定されていない抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。
【００２１】
第３の方法においては、取得されるべき試料である検出された抗原特異的リンパ球を含む、全てのマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。次いで、固定された試料の中から、抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）のみをマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。
【００２２】
第４の方法においては、取得されるべき試料である検出された抗原特異的リンパ球を含む、全てのマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。この点は、第３の方法と同様である。次いで、固定された試料の中から、抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェル中でアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出し、次いでフリーになった抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェルから取り出すことにより、１個の抗原特異的リンパ球を得ることができる。
【００２３】
尚、上記方法において、取得されるべき試料（抗原特異的リンパ球）は、１つのアレイチップに１つとは限らず、複数個存在することもあり得る。その場合、これら複数個の取得されるべき試料（抗原特異的リンパ球）のそれぞれについて、上記第１〜第４のいずれかの方法により、マイクロウェルから取り出す。
【００２４】
これらの方法について、より具体的に説明する。
【００２５】
（マイクロウェルアレイチップ）
マイクロウェルアレイチップとしては、複数のマイクロウェルを有し、かつ各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことができるものを使用することができる。各マイクロウェルが被検体リンパ球を１個含むことで、抗原特異的リンパ球を細胞レベルで特定することが可能になる。即ち、このマイクロウェルアレイチップを用いると、マイクロウェルに含まれる被検体リンパ球が１個であることから、抗原に反応する被検体リンパ球を１個の細胞として特定でき、結果として、抗原特異的リンパ球を１個の細胞として検出できる。そして、検出された１個の抗原特異的リンパ球のみを、前記第１〜第４のいずれかの方法により、マイクロウェルから取り出し、この遺伝子をクローニングすることができる。
【００２６】
上記遺伝子のクローニングは、例えば、マイクロウェルから取り出した固定した抗原特異的リンパ球を、固定材料であるアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出した後に行うことができる。この点については後述する。
【００２７】
但し、同一のマイクロウェルには、リンパ球以外の細胞が被検体リンパ球とともに含まれていても良い。リンパ球以外の細胞であれば、抗原に反応せず、検出されることもないからである。
【００２８】
本発明で使用するマイクロウェルアレイチップは、複数個のマイクロウェルを有し、前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有することが好ましい。
【００２９】
マイクロウェルの形状や寸法には特に制限はないが、マイクロウェルの形状は、例えば、円筒形であることができ、円筒形以外に、直方体、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であることもでき、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体の場合は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
【００３０】
マイクロウェルの形状や寸法は、マイクロウェルに格納されるべきリンパ球の種類（リンパ球の形状や寸法等）を考慮して、１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるように、適宜決定される。
１つのマイクロウェルに１つのリンパ球が格納されるようにするためには、例えば、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。
また、マイクロウェルの深さは、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球の直径の1〜2倍の範囲、好ましくは1.1〜1.9倍の範囲、より好ましくは1.2〜1.8倍の範囲であることが適当である。
【００３１】
マイクロウェルが円筒形の場合、その寸法は、例えば、直径0.1〜100μｍであることができ、好ましくは、5〜100μｍである。尚、生物試料がリンパ球であり、中でもＢリンパ球の場合、マイクロウェルの直径は5〜15μｍであることが好ましい。また、深さは、例えば、0.1〜100μｍであることができ、好ましくは、5〜100μｍである。尚、生物試料がリンパ球であり、リンパ球がＢリンパ球の場合、マイクロウェルの深さは5〜40μｍであることが好ましい。但し、マイクロウェルの寸法は、上述のように、マイクロウェルに格納しようとするリンパ球等の試料の直径とのマイクロウェルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
【００３２】
1つのマイクロウェルアレイチップが有するマイクロウェルの数は、特に制限はないが、抗原特異的リンパ球の頻度が105個に1個から多い場合には約500個であるという観点から、1cm2当たり、例えば、2,000〜1,000,000個の範囲であることができる。
【００３３】
マイクロウェルには、被検体リンパ球は培養液とともに格納されている。培養液としては、例えば、以下のいずれかのものを挙げることができる。
1. 137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1mg/mlグルコース, 1mg/ml BSA, 20mM HEPES (pH7.4)
2. 10% FCS(牛胎仔血清)含有RPMI1640培地
3. 1mg/ml BSA含有RPMI1640培地
4. 10% FCS(牛胎仔血清)含有Dulbecco's MEM培地
5. 1mg/ml BSA含有Dulbecco's MEM培地
【００３４】
被検体リンパ球は血液由来であることができ、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球であることができる。それ以外に扁桃腺(リンパ節)、脾臓等のリンパ組織由来リンパ球、がん浸潤リンパ球などの病変部位浸潤リンパ球等を挙げることができる。
【００３５】
（抗原特異的リンパ球の検出方法）
抗原特異的リンパ球の検出方法は、上記マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、細胞を刺激し、抗原に反応する細胞を検出することを含む。
【００３６】
各マイクロウェルへの抗原の添加は、以下のように行うことができる。
1. ピペットを用いてマイクロウェルアレイチップ全面を覆うように抗原液を添加する。
2. 1ウェルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。
【００３７】
この方法により検出される抗原には、特に制限はないが、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、糖鎖または有機化合物等であることができる。また、抗原は、細菌、ウィルス、自己抗原、がん抗原またはアレルゲン等であることができる。
【００３８】
細胞の培養は、例えば、リンパ球を培養液に懸濁させ、ウェルに分注後、室温あるいは37℃にて、空気中あるいはＣＯ2インキュベータ内にて培養することで行うことができる。
【００３９】
抗原に反応する細胞の検出は、以下のように行うことができる。
例えば、Ｂリンパ球の抗原受容体（免疫グロブリン）に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、それに続いて細胞増殖、抗体産生が起こる。従って、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。あるいは、例えば、Tリンパ球の抗原受容体に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、それに続いて細胞増殖、サイトカイン産生が起こる。従って、細胞内シグナル伝達、細胞増殖、サイトカイン産生を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。
【００４０】
細胞内シグナル伝達を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞内Ｃａイオンの濃度変化をＣａイオン依存性の蛍光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内Ｃａイオン濃度変化は、蛍光色素としてＦｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−３あるいはＦｌｕｏ−４を用い、検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いる。
【００４１】
具体的には、図１に示すように、Ｂリンパ球にＣａイオン依存性蛍光色素であるＦｕｒａ−２あるいはＦｌｕｏ−３を導入する。次いで抗原でＢリンパ球を刺激すると、細胞内Ｃａイオン濃度が上昇する。その結果、ＣａイオンがＣａイオン依存性蛍光色素に結合し、蛍光強度が増強される。Ｃａイオン濃度が低いと青っぽい色、高いと赤っぽい色で示されている。この方法では、抗原で刺激されることにより細胞内Ｃａイオンが上昇したＢリンパ球（抗原特異的）を、マイクロウェルアレイチップを用いて検出できる。
【００４２】
細胞増殖を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞数を、生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによっても行うことができる。この方法は、具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ2インキュベータ内にて37℃、3日間培養すると、細胞が増殖する。細胞が増殖後、培養液中にフルオレッセイン・ジアセテート(Fluorescein diacetate(FDA))あるいはカルボキシ・フルオレッセイン・ジアセテート・スクシンイミジル・エステル(Carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester(CFSE))溶液を加える。これらの試薬は生細胞の膜を透過し、細胞内でエステラーゼによって分解され、膜不透過性の蛍光色素を生成する。この蛍光色素の発光は細胞数に比例するためウェル内の生細胞が発光する蛍光強度の和を蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて計測することにより生細胞数を測定する。
【００４３】
抗体産生を計測することによっても、抗原に反応する細胞の検出を行うことができる。抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することにより検出できる。
具体的には、抗原でＢリンパ球を刺激しＣＯ2インキュベータ内にて37℃、1週間培養すると、抗体が培養液中に分泌される。培養液中に分泌された抗原特異的抗体をELISA法(酵素標識免疫吸着法)により検出する。
尚、この検出方法では、マイトゲン、レクチン、抗体、サイトカイン、ＰＭＡ、Ｃａイオノフォアを用いても、シグナル伝達、細胞増殖、抗体産生を検出することができる。
【００４４】
以下に、蛍光色素を用いる方法におけるマイクロウェルアレイチップへの細胞の分注、抗原刺激、取り出しまでについて図２に基づいて説明する。
（１）細胞の分注
ウェル１つずつに細胞を入れる。
ウェルに入れる細胞は、末梢血からリンパ球画分を分離後、Ｂリンパ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、Ｆｌｕｏ３/ＡＭ(2μM)溶液に細胞を懸濁させ、室温に30分置き、さらに緩衝液で細胞を洗浄し、細胞内に負荷されなかった色素を除去する。
色素を除去した細胞をマイクロウェルに分注する。
マイクロウェルアレイチップの両側にシールを貼り、その上にカバーグラスを乗せ、緩衝液を満たすことで、乾燥を防ぐ。
【００４５】
（２）蛍光測定
まず、未刺激の細胞の蛍光を測定する。その際の蛍光強度(Ａ)を測定する。
次いで抗原溶液をスライドグラスとカバーグラスの隙間に流し入れ緩衝液と交換し、抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。刺激後１〜２分後の蛍光強度(Ｂ)を測定する。
【００４６】
（３）抗原刺激に反応した細胞の選別
抗原刺激により反応した細胞は、未刺激の細胞の蛍光強度と抗原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比(Ｂ/Ａ)により選別（検出）する。
【００４７】
（抗原特異的リンパ球の取り出し）
上記方法で検出された抗原特異的リンパ球は、本発明の第１〜第４のいずれかの方法により、マイクロウェルから、他のリンパ球の混入を回避しながら取り出される。
第１の方法では、抗原に反応したリンパ球を検出し、検出された抗原特異的リンパ球は、アガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定される。
アガロースでの固定は、例えば、アガロース溶液を検出された抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）を格納したマイクロウェルに導入し、次いで冷却して、前記アガロース溶液を固化することで行うことができる。
具体的には、アガロースとして、ゲル化温度が２０〜４５℃の範囲であるアガロースを用いることが、固定化対象が生物試料であり、その耐熱性を考慮すると好ましい。ゲル化温度が上記範囲であるアガロースは、市販品として入手可能である。但し、固定化対象である生物試料が高い耐熱性を有する場合には、上記アガロースとして、上記範囲を超えるゲル化温度のものを使用することはできる。
【００４８】
【表１】
2005261339.tif 000003
【００４９】
このアガロースを含むアガロース溶液を４０〜５０℃に加温し、検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェルに加注する。アガロース溶液のマイクロウェルへの加注は、例えば、検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェル中のリンパ球を固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しないよう行う。そのため、アガロース溶液のマイクロウェルへの加注量は、マイクロウェルの寸法、容量やマイクロウェル間の間隔にもよるが、例えば、１ピコリットル〜１マイクロリットルの範囲とすることが適当である。但し、この範囲内であっても、１つのマイクロウェル中のリンパ球を固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しない量を選択する。また、上記範囲は例示であり、上記範囲から外れても、１つのマイクロウェル中のリンパ球のみを固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しない量であれば、選択可能である。
【００５０】
検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェルへアガロース溶液を加注した後に、ゲル化温度以下にすることで、アガロース溶液は固化し、リンパ球は固定される。アガロース溶液は通常常温を超える範囲の温度にゲル化温度を有するので、マイクロウェルへアガロース溶液を加注した後に、室温に放置することで、アガロース溶液を固化させることができる。
【００５１】
温度応答ポリマーでの固定は、例えば、温度応答ポリマーを検出された抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）を格納したマイクロウェルに導入し、次いで加熱して、前記温度応答ポリマーを固化することで行うことができる。
【００５２】
温度応答ポリマーは、温度応答性を有するポリマー、即ち、温度に応答性を有するポリマーであれば制限はない。温度応答ポリマーは、例えば、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）であることができる。N-イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）は３２℃である。N-イソプロピルアクリルアミド以外に温度応答ポリマーとして利用できるポリマーとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
【００５３】
【表２】
2005261339.tif 000004
【００５４】
本発明においては、使用用途に応じて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の異なる温度応答ポリマーを選択し、細胞の固定化及び回収をすることができる。また、ＬＣＳＴの異なる温度応答ポリマーを複数組み合わせて、ＬＣＳＴを調整することもできる。
【００５５】
温度応答ポリマーとしてN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）を用いる細胞の固定化方法について説明する。32℃前後で膨潤収縮する温度応答性N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーを、32℃以下に保ちながら検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェルに加注する。ポリマーのマイクロウェルへの加注は、例えば、検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェル中のリンパ球を固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しないよう行う。そのため、ポリマーのマイクロウェルへの加注量は、マイクロウェルの寸法、容量やマイクロウエル間の間隔にもよるが、例えば、１ピコリットル〜１マイクロリットルの範囲とすることが適当である。但し、この範囲内であっても、１つのマイクロウェル中のリンパ球を固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しない量を選択する。また、上記範囲は例示であり、上記範囲から外れても、１つのマイクロウェル中のリンパ球のみを固定し、周囲のマイクロウェルに含まれるリンパ球は固定しない量であれば、選択可能である。
【００５６】
検出された抗原特異的リンパ球が格納されたマイクロウェルへ温度応答ポリマーを加注した後に、下限臨界溶解温度以上の温度にすることで、温度応答ポリマーは固化し、リンパ球は固定される。温度応答ポリマーは、上記表に示すように通常常温を超える範囲の温度に下限臨界溶解温度を有するので、マイクロウェルへ温度応答ポリマーを加注した後に、マイクロウェルまたはマイクロウェルアレイチップ全体を、ヒーターなどを用いて加温することで、温度応答ポリマーを固化させることができる。
【００５７】
本発明の第１の方法では、検出された１個または複数個の抗原特異的リンパ球を上記のようにマイクロウェルへ固定し、次いでそれ以外のリンパ球をマイクロウェルから除去する。リンパ球のマイクロウェルからの除去は、例えば、マイクロウェルアレイチップ全体を洗浄することで行うことができる。マイクロウェルアレイチップ全体の洗浄は、例えば、以下のように行うことができる。
【００５８】
すなわち、
1.  チップ上の余分なバッファーをピペット等を用いて除く。
2.  PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4)を1/10に希釈した液（1/10 PBS）をチップ上に添加し、細胞懸濁液を低張にすることにより固定されていない細胞を破砕する。
3.  1/10 PBSをチップから除去する。
4.  代わりにPBSをチップに添加し、細胞懸濁液を等張にする。
【００５９】
固定した抗原特異的リンパ球以外の細胞をマイクロウェルから除去した後に固定した抗原特異的リンパ球を取り出す。固定されていないリンパ球をマイクロウェルから除去し、固定したリンパ球（このリンパ球が抗原特異的リンパ球である）をマイクロウェルから取り出すことにより、抗原特異的リンパ球を選択的に得ることができる。抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うことで、１個の抗原特異的リンパ球を回収することができる。また、複数の抗原特異的リンパ球が検出された場合、上記のように抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うこともできるが、複数のマイクロウェルについてまとめて行うこともできる。チップ上の全ての検出された抗原特異的リンパ球について、一度にマイクロウェルから取り出して回収することもできる。
【００６０】
抗原特異的リンパ球が格納された周囲のマイクロウェルに格納されたリンパ球が固定されていない状態で抗原特異的リンパ球を採取しようとすると、マイクロウェルアレイチップ上の各マイクロウェルが近接している場合、隣接するマイクロウェル中のリンパ球も抗原特異的リンパ球と一緒に採取されてしまう場合がある。しかし、本発明のように、抗原特異的リンパ球のみを固定化し、周囲のマイクロウェルに格納されたリンパ球を除去した後に抗原特異的リンパ球を採取することで、１個１個の抗原特異的リンパ球を確実に選択的に得ることができる。逆に抗原特異的リンパ球以外のリンパ球をマイクロウェルに固定し、固定されていない抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから回収することにより、抗原特異的リンパ球を選択的に回収することもできる。
【００６１】
抗原特異的リンパ球の取り出しは、固定化にアガロースを用いた場合には、固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行うことができる。固化したアガロースが溶液化する温度とは、具体的には、アガロースの融点を超える温度であり、使用したアガロースに応じて適宜選択することができる。アガロース分解酵素は、例えば、アガラーゼ（EC 3.2.1.81）であることができる。アガラーゼ（EC 3.2.1.81）としては、例えば、シグマ社製Ａ８６８８、コスモバイオ社製ＥＯ ０４６１、ＮＥＢ製ＭＯ３９２Ｓを用いることができる。アガロース分解酵素を用いてのアガロースの分解は、例えば、以下のように行うことができる。
【００６２】
すなわち、
1.  チップ上の余分なバッファーをピペット等を用いて除く。
2.  10単位のβアガラーゼI (ニューイングランド・バイオラボ(New England BioLabs)、バーベリー(Berverly)、MA)をPBSで希釈したものを約100μLチップに添加し、室温あるいは37℃で約10分インキュベーションすることによりアガロースが分解できる。
【００６３】
また、固定化に温度応答ポリマーを用いた場合には、固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行うことができる。固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度とは、下限臨界溶解温度以下の温度であり、使用した温度応答ポリマーに応じて適宜選択できる。
【００６４】
固定した抗原特異的リンパ球の固定化材料からの取り出しは、固定した抗原特異的リンパ球を固定化材料とともに、例えば、別の容器に取り出した後に行うことができる。そして、固定化材料から取り出された抗原特異的リンパ球は、マイクロウェルから取り出すことなく、そのままマイクロウェル中で、次の遺伝子増幅に供することもできる。遺伝子のクローニングは、好ましくはマイクロウェルから取り出した固定した抗原特異的リンパ球を固定材料であるアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出した後に行う。
【００６５】
あるいは、固定した抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行うことができる。この場合、抗原特異的リンパ球のみがマイクロウェルから取り出される。また、固定した抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行うこともできる。この場合も、抗原特異的リンパ球のみがマイクロウェルから取り出される。マイクロウェルから取り出された抗原特異的リンパ球は、その遺伝子をクローニングすることができる。
【００６６】
あるいは、マイクロウェルから取り出された抗原特異的リンパ球を用いて抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを作製することもできる。ハイブリドーマを作製する場合、１個の抗原特異的リンパ球をマイクロウェルから取り出して、それを用いることもできるが、複数のマイクロウェルについてまとめて抗原特異的リンパ球を取り出して、この複数の抗原特異的リンパ球を用いてハイブリドーマを作製することもできる。この場合、異なる種類の抗原特異的抗体を産生する複数のハイブリドーマが作成される。各々のハイブリドーマが産生する抗体の性質（親和性、エピトープ、クラス、サブクラス）はハイブリドーマが産生する抗体を用いて解析することができる。
【００６７】
また、固定した抗原特異的リンパ球を固定化材料とともに、遺伝子のクローニングに供することもできる。その場合、以下のように行うことができる。
【００６８】
すなわち、
1.  細胞を含むアガロース断片をチューブに加え、それに直接細胞溶解液〔25μLに希釈された時の最終濃度：1x ファースト・ストランド・バッファー(1st strand buffer) (GIBCO-BRL, スーパースクリプト(SuperScript)IIに添付されている), 0.2 mM dNTP, 0.25% NP-40, 0.1 mg/mL BSA, 10 mM DTT, 0.05 μM ランダム・プライマー(Random Primer), 1 U/μL RNasin (プロメガ(Promega), マディソン(Madison), WI)〕を加え、そこへ逆転写酵素スーパースクリプト(SuperScript)II (GIBCO-BRL, ロックヴィル(Rockville), MD)を（4.85μL, 50 U）添加し37 oC、1時間反応させmRNAよりcDNAを合成する。
2.  調製したcDNAを用いて抗体遺伝子をPCRにより増幅する。増幅法は、具体的には、例えば、免疫グロブリン遺伝子用のプライマーミックスを用いて２回ＰＣＲすることにより、所望の抗原特異的免疫グロブリン遺伝子を増幅（クローニング）することができる。
【００６９】
本発明の第２の方法では、抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）を含むマイクロウェルに隣接するマイクロウェル中のリンパ球をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。より具体的には、検出された抗原特異的リンパ球以外の全てのリンパ球を含むマイクロウェル以外のマイクロウェル中の試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定することができる。アガロースまたは温度応答ポリマーを用いる固定方法は、第１の方法と同様である。
次いで、固定されていない抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェルから取り出す。第１の方法と同様に、抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うことで、１個の抗原特異的リンパ球を回収することができる。さらに、この抗原特異的リンパ球は、例えば、培養液中に存在するため（固定化材料を伴わないため）、そのまま次の遺伝子クローニングに付すことができる。また、複数の抗原特異的リンパ球が検出された場合、上記のように抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うこともできるが、複数のマイクロウェルについてまとめて行うこともできる。チップ上の全ての検出された抗原特異的リンパ球について、一度にマイクロウェルから取り出して回収することもできる。そして、回収された抗原特異的リンパ球は、ハイブリドーマの作製に使用することもできる。
【００７０】
本発明の第３の方法では、マイクロウェル中の全てのリンパ球（試料）をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。アガロースまたは温度応答ポリマーを用いる固定方法は、第１の方法と同様である。
次いで、固定された試料の中から、抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェルから取り出す。この場合、固定した抗原特異的リンパ球は、アガロースまたは温度応答ポリマーとともにマイクロウェルから取り出し、次いで、アガロースまたは温度応答ポリマーから試料を取り出すことができる。
【００７１】
第１の方法と同様に、抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うことで、１個の抗原特異的リンパ球を回収することができる。また、複数の抗原特異的リンパ球が検出された場合、上記のように抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うこともできるが、複数のマイクロウェルについてまとめて行うこともできる。チップ上の全ての検出された抗原特異的リンパ球について、一度にマイクロウェルから取り出して回収することもできる。
【００７２】
本発明の第４の方法では、第３の方法と同様にマイクロウェル中の全ての試料をアガロースまたは温度応答ポリマーを用いてマイクロウェルに固定する。次いで固定された抗原特異的リンパ球（取得されるべき試料）をマイクロウェル中でアガロースまたは温度応答ポリマーから取り出し、次いで取得されるべき試料をマイクロウェルから取り出すことができる。より具体的には、取得されるべき試料のマイクロウェルからの取り出しを、（１）固化したアガロースが溶液化する温度にアガロースを加熱した後、若しくはアガロース分解酵素を用いて固化したアガロースを分解した後に行うか、または（２）固化した温度応答ポリマーが溶液化する温度に前記ポリマーを冷却した後に行うことができる。
【００７３】
第１の方法と同様に、抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うことで、１個の抗原特異的リンパ球を回収することができる。また、複数の抗原特異的リンパ球が検出された場合、上記のように抗原特異的リンパ球のマイクロウェルからの取り出しは、マイクロウェルごとに行うこともできるが、複数のマイクロウェルについてまとめて行うこともできる。チップ上の全ての検出された抗原特異的リンパ球について、一度にマイクロウェルから取り出して回収することもできる。
【００７４】
上記のようにして、本発明では、ある抗原に特異的に反応するリンパ球（抗原特異的リンパ球）を１個取得し、この１個の抗原特異的リンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングすることができる。このクローニング方法によれば、抗原特異的リンパ球の頻度が０．１％以下である場合にも、抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングすることができる。しかし、頻度が０．１％を超える場合にも適用できることは勿論である。
【００７５】
あるいは、本発明では、ある抗原に特異的に反応するリンパ球（抗原特異的リンパ球）を１個または複数個取得し、この抗原特異的リンパ球を用いてハイブリドーマを作製することもできる。
【００７６】
抗原特異的リンパ球は、例えば、Ｂリンパ球またはＴリンパ球であることができる。さらに、抗原特異的抗原受容体遺伝子は、抗原特異的リンパ球がＢリンパ球である場合には免疫グロブリン遺伝子であり、Ｔリンパ球である場合にはＴ細胞受容体遺伝子である。血液中のリンパ球は1個1個がそれぞれ別々の抗原に反応する。そこで、本発明を利用することで、例えば、抗原に特異的に反応したＢリンパ球を１つ単位で検出し、かつ他の細胞の混入を防止しつつ取得（採取）でき、その結果、このＢリンパ球から、抗原（病原体）に反応する免疫グロブリン（抗体）遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。同様に、抗原に特異的に反応したＴリンパ球を検出し、このＴリンパ球から、抗原（病原体）に反応するＴ細胞受容体遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
アガロースを用いたマイクロウェル内の細胞の固定および回収（図３参照）
（１）Ca依存性蛍光色素を用いて標識したBリンパ球をマイクロウェルアレイチップに1個のマイクロウェルに1個の細胞が入るように播種した。（図３A）
（２）抗原液をチップに添加し、抗原に反応し細胞内Ca濃度が上昇したBリンパ球を細胞内のCa依存性蛍光色素の蛍光強度の増加をマイクロアレイスキャナー（日立ソフトウェア、神奈川）で測定することにより同定した。（図３B）
（３）マイクロアレイスキャナーに付随の解析ソフトにより抗原に反応したBリンパ球が入ったウェルの位置座標を取得した。
（４）マイクロアレイスキャナーでの検出座標データを、ピコスポッタ（スギノマシン、富山）に転送してスポット位置座標データに変換した。
（５）マイクロアレイスキャナーからの位置座標データに基づいて、標的細胞のあるウェルにアガロース液1% シープラーク(SeaPlaqu) GTG アガロース(agarose)〔タカラバイオ（株）、ゲル化温度  26〜30 oC、再融解温度 ≦65 oC〕 in ハンクス平衡塩溶液(HANKS' balanced salt solution)（HBSS、HBSSの代わりにPBSでも可）をスポットした。この時、内径15μｍの極細スポッティングノズルを用い、ノズル内は44 ℃に、ピコスポッタ装置内雰囲気温度あるいはチップ自体を室温（約20℃）に保持しておく。これによってアガロース液の移送時は液体状態を維持し、スポット後は硬化してゲル化状態とすることができた。（図３C）
【００７８】
（６）標的細胞のあるウェル全てにアガロース液をスポットし終えたら、チップ全体を1/10 PBS（4 ℃〜室温）を用いて洗浄した。すなわち、（1）チップ上の余分なバッファーをピペット等を用いて除いた。（2）1/10 PBSをチップ上に添加し、細胞懸濁液を低張にすることにより固定されていない細胞を破砕した。（3）1/10 PBSをチップから除去した。（4）代わりにPBSをチップに添加し、細胞懸濁液を等張にした。これによって、アガロースゲルにより保護された標的細胞以外の不要な細胞を破砕し洗い流すことができ、多数の細胞の中から標的細胞だけを選別することができた。（図３D）
【００７９】
（７）選別された標的細胞をアガロースから回収した。すなわち、（1）チップ上の余分なバッファーをピペット等を用いて除いた。（2）10単位のβアガラーゼI (ニューイングランド・バイオラボ(New England BioLabs), バーベリー(Berverly), MA)をPBSで希釈したものを約100μLチップに添加し、室温あるいは37℃で約10分インキュベーションすることによりアガロースが分解できた。（図３E）
【００８０】
実施例２
温度応答ポリマーを用いたマイクロウェル内の細胞の固定および回収（図４〜７参照）
本実施例では、図４に示すように細胞をばらまいて蛍光観察をおこなったチップ上で、蛍光反応のあるウェルに温度応答ポリマー（ポリNイソプロピルアクリルアミドなど）をスポットすることにより、ターゲット細胞をウェル内に固定する。なお温度応答ポリマーは、下限臨界溶解温度(LCST)を境界線として、その温度以下では液体状態、その温度以上では固体状態となる高分子体を使用する。ウェルの寸法は、Φ10μmの細胞を収めるため、ウェルの平面形状が四角形の場合は10〜30μm×10〜30μmであり、ウェルの平面形状が円形の場合はΦ10〜30μmである。蛍光スキャナで反応を検出したウェルに、温度応答ポリマーを滴下して封止する。封止後、チップを洗浄して不要な細胞を除去する。
【００８１】
この方法でターゲット細胞を固定するための手順を、以下に説明する。
1) 蛍光反応の検出
蛍光反応を見るために前処理をした細胞をばらまいたウェル付チップについて、まず蛍光スキャナで読み取りを行ない、蛍光反応のあるウェルの位置座標を取得した。（図５参照）  蛍光スキャナでの検出座標データを、ピコスポッタに転送してスポット位置座標データに変換した。
【００８２】
2) 温度応答ポリマーをスポット
蛍光スキャナからの位置座標データに基づいて、ターゲット細胞のあるウェルに温度応答ポリマーをスポットした。（図６参照）ノズル内を32℃以下に、ピコスポッタ装置内雰囲気温度あるいはチップ自体を37℃以上に保持しておく。これによって温度応答ポリマーの移送時は液体状態を維持し、スポット後は硬化して固体状態とすることができた。
【００８３】
より具体的には、室温を30℃以下に設定し、ピコスポッターのマイクロウェルアレイチップ設置ベースのみを温度制御装置により３７〜40℃に設定した。蛍光マイクロアレイスキャナーで得られた、回収すべき細胞の位置座標データに基づき、標的細胞のあるウェルに、室温で液体状態の温度応答ポリマーを、内径15μｍの極細スポッティングノズルを用いて、１ピコリットルずつ滴下した。細胞の入ったマイクロウェルアレイチップは37〜40℃に設定してあるので滴下した温度応答ポリマーはただちに硬化した。
【００８４】
尚、32℃以下の環境でターゲット細胞のあるウェル全てに温度応答ポリマーをスポットした後で、チップの温度を上げる方法も考えられる。最終的には、ウェルにフタをする形で温度応答ポリマーが硬化することが望ましい。
【００８５】
3) 不要な細胞の除去
ターゲット細胞のあるウェル全てに温度応答ポリマーをスポットし終えたら、チップを37℃以上に保持しつつ、チップ全体を温水で洗浄した。これによって、温度応答ポリマーで保護されたターゲット細胞以外の不要な細胞を洗い流すことができ、多数の細胞の中からターゲット細胞だけを選別することができた。（図７参照）
【００８６】
具体的には、スポッティングが終了した後、チップを取り出し、約40℃の温生理食塩水で洗浄し、ポリマーがスポットされていないウェル中の細胞をチップから除去した。洗浄が終わったら4℃の冷生理食塩緩衝液（ｐＨ７）をマイクロピペットで滴下することでポリマーを液体化させ、細胞を回収した。これにより90％以上の回収率で目的の細胞のみを回収できた。
【００８７】
本発明では、抗原特異的リンパ球以外の抗原に特異的でないリンパ球を、アガロースまたは温度応答ポリマーを用いて固定し、固定されていない抗原特異的リンパ球を回収することもできる。この場合、固定されているリンパ球は回収の操作で誤って回収されることはないので、特異的リンパ球の回収がより確実になる。
【００８８】
実施例３
アガロースを用いた例
(1)Ca依存性蛍光色素を用いて標識したＢリンパ球をマイクロウェルアレイチップに１個のマイクロウェルに１個の細胞が入るように播種した。（図８A）
(2)抗原液をチップに添加し、抗原に反応し細胞内Ca濃度が上昇したＢリンパ球を細胞内のCa依存性蛍光色素の蛍光強度の増加をマイクロアレイスキャナー（日立ソフトウェア）で測定することにより同定した。（図８Ｂ）
(3)マイクロアレイスキャナーに付随の解析ソフトにより抗原に反応したBリンパ球および抗原に反応しなかったリンパ球が入ったウェルの位置座標を取得した。
(4)マイクロアレイスキャナーでの検出座標データを、ピコスポッタ（スギノマシン）に転送してスポット位置座標データに変換した。
(5)マイクロアレイスキャナーからの位置座標データに基づいて、抗原に反応しなかった細胞が入っているウェルにアガロース液〔１％シープラークGTGアガロース（タカラバイオ）in ハンクス平衡塩溶液〕をスポットした。
(6)抗原に反応しなかった細胞が入っている全てのウェルにアガロース液をスポットし終えたら、マイクロマニピュレータを用いて抗原に反応した細胞を回収し、別のチューブに移した。
【００８９】
実施例４
温度応答ポリマー（ポリNイソプロピルアクリルアミド）を用いた例
(1)〜(4)までは実施例３と同様に操作した。さらに、実施例３におけるアガロース液を室温で液体状態の温度応答ポリマーに代え、実施例２と同様にスポットした。次いで、抗原に反応しなかった細胞が入っている全てのウェルに温度応答ポリマーをスポットし終えたら、マイクロマニピュレータを用いて抗原に反応した細胞を回収し、別のチューブに移した。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の方法によりマイクロウェルアレイチップのウェルから特定の細胞を回収する操作が容易になり、マイクロウェルアレイチップを用いた抗原特異的Bリンパ球の同定および抗原特異的抗体遺伝子の作製等の操作がハイスループット化できる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Ｆｌｕｏ３色素の細胞への導入と抗原特異的リンパ球の検出の説明図。
【図２】Ｆｌｕｏ３色素を導入した細胞のマイクロウェルへの分注の説明図。
【図３】実施例1におけるアガロースを用いたマイクロウェル内の細胞の固定および回収の概略説明図。
【図４】実施例２におけるターゲット細胞の固定の説明図。
【図５】チップの蛍光観察の説明図。
【図６】温度応答ポリマーをスポットする際の説明図。
【図７】チップ洗浄の説明図。
【図８】実施例３におけるアガロースを用いたマイクロウェル内の細胞の固定および回収の概略説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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