(57)【要約】      （修正有）【課題】神経細胞のアポトーシスを抑制する、神経細胞の生存に重要な役割を果たす新規遺伝子alivin1、および該遺伝子がコードするタンパク質及びそれらを含む医薬組成物に関する。【解決手段】変異alivin1遺伝子および該遺伝子がコードする変異Alivin1タンパク質に関する。本発明は神経細胞のアポトーシスを抑制するための、本発明の遺伝子およびタンパク質を含む医薬組成物を提供する。【効果】本発明の遺伝子はアルツハイマー病やパーキンソン病の関連遺伝子であることが結論づけられたため、本発明の医薬組成物はこれらの病気にも用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
ラット由来である、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質またはそれと実質的に同じ活性を有するタンパク質をコードする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号５に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターを有する形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換細胞を、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を発現する条件で培養し、培養細胞またはその培地からＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を分離することよりなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の製造方法。
【請求項８】
配列番号４に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
【請求項９】
ラット由来タンパク質である、請求項８記載のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
【請求項１０】
配列番号５に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
【請求項１１】
配列番号６に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質に特異的な抗体。
【請求項１３】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを投与することからなる神経細胞の生存を促進する方法。
【請求項１４】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを投与することからなる神経細胞死の抑制方法。
【請求項１５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、神経細胞死の抑制剤。
【請求項１６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療のための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１８】
神経細胞死の抑制のために用いる、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質を誘導的または構成的に発現する、非ヒトのトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させた、非ヒトのノックアウト動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞の生存に重要な役割を果たす新規遺伝子、および該遺伝子がコードするタンパク質に関する。本発明者らは、この遺伝子の機能およびその遺伝子座から、この遺伝子はアルツハイマー病およびパーキンソン病と関連する遺伝子であると結論づけた。
【０００２】
【従来の技術】
神経活動は、記憶、神経伝達、神経成長、分化、シナプスの発生、神経細胞の生死などの広範囲の機能を制御している。特に、神経活動はアポトーシスを抑制しニューロンの生存を促進することにより神経細胞の数および接合パターンを調節していることが知られている（例えば、非特許文献１を参照）。神経活動が神経細胞の死を抑制してその生存を促進することは、多くのｉｎ  ｖｉｖｏ  およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の系を用いた実験により証明されてきた（例えば、非特許文献２、３、または４を参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の実験系では、高濃度ＫＣｌによる脱分極刺激やグルタミン酸レセプターアゴニストによる神経細胞への刺激が用いられる。これらの刺激はｉｎ  ｖｉｖｏ  における神経活動を模倣すると考えられ、これらの刺激がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  の実験系で多用されてきた。これらの刺激が神経細胞の生存を促進する機構は次のように考えられている。高濃度のＫＣｌまたはグルタミン酸レセプターアゴニストを用いて神経細胞を刺激すると、それぞれの刺激は電位依存性Ｃａ２＋チャネルおよびグルタミン酸レセプターチャネルを介して細胞内へのＣａ２＋の流入をもたらし、それにより細胞内外へのＣａ２＋の代謝回転（細胞内へのＣａ２＋流入と細胞外へのＣａ２＋排出）が昂進する（例えば非特許文献５または６を参照）。このＣａ２＋代謝回転シグナルはＣａ２＋／カルモジュリン−依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）（例えば、非特許文献７を参照）およびＲＡＳ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫのカスケードを活性化し、これらの下流に存在する転写依存性の経路および転写非依存性の経路の両方の経路を介してアポトーシスを抑制しニューロンの生存を促進する（例えば、非特許文献８を参照）。転写に依存する生存促進の経路としては、転写因子であるＣＲＥＢ（Ｃａ２＋／ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やＭＥＦ２Ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ２Ｃ）が介在する経路が報告されている（例えば、非特許文献８、９、または１０を参照）。しかしながら神経活動依存性の生存を仲介すると考えられるこれらの転写因子の下流の標的は未だ十分に解明されていない。ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＡＣＡＰ（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ：  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などのいくつかの分泌タンパク質は神経活動またはＣａ２＋依存的に遺伝子発現され、神経細胞の生存を促進する効果や神経保護効果を有することが報告されている（例えば、非特許文献１１、１２、または１３を参照）。これらのタンパク質は神経細胞から神経活動依存的に分泌され、オートクリンおよび／またはパラクリン的に作用して、神経細胞の生存を促進する。例えば、ＢＤＮＦはＣａ２＋シグナルの下流に存在するＣＲＥＢおよびＣａＲＦ（ｃａｌｃｉｕｍ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）を介する転写によって発現し（例えば、非特許文献１４、１５、または１６を参照）、神経細胞の生存を促進する（例えば、非特許文献１１を参照）ことが多くの研究によって示されている。しかしながら、ＢＤＮＦ単独ではニューロンの生存を十分に支えるには不十分であるので（例えば、非特許文献１７を参照）、ＢＤＮＦ以外のシグナル因子が神経活動依存性の生存に関与していると考えられている（例えば、非特許文献１８を参照）。
【０００３】
神経細胞の生存が神経活動またはＣａ２＋依存的に促進される過程に関与する因子を包括的に突き止めるため、本発明者らはｍＲＮＡディファレンシャルディスプレーを利用して、生存促進（即ち脱分極）条件下で培養した小脳顆粒細胞で特異的に発現される遺伝子をスクリーニングした。この方法により、神経活動依存的な細胞の生存に関与すると思われるいくつかの候補遺伝子を見いだしてきた。例えば、本発明者らは既に、遺伝子の発現パターンと神経活動依存的な生存の間の相関性を比較することにより、既知の因子であるＰＴＨｒＰを突き止めている（例えば、非特許文献１２を参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．；Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，（１９９１），Ｖｏｌ．１４，ｐ．４５３−５０１．
【非特許文献２】
Ｇａｌｌｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，（１９８７），Ｖｏｌ．７，ｐ．２２０３−２２１３．
【非特許文献３】
Ｉｋｏｎｏｍｉｄｏｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），Ｖｏｌ．２８３，ｐ．７０−７４．
【非特許文献４】
Ｍｏｎｔｉ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅｓｔａｂｉｌｅ，Ａ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，（２０００），Ｖｏｌ．１２，ｐ．３１１７−３１２３．
【非特許文献５】
Ｏｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，（１９９７），Ｖｏｌ．２２８，ｐ．１２３−１２６．
【非特許文献６】
Ｋｏｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，（１９９８），Ｖｏｌ．８０９，ｐ．２３１−２３７．
【非特許文献７】
Ｙａｎｏ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８），Ｖｏｌ．３９６，ｐ．５８４−５８７．
【非特許文献８】
Ｂｏｎｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），Ｖｏｌ．２８６，ｐ．１３５８−１３６２．
【非特許文献９】
Ｍａｏ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），Ｖｏｌ．２８６，ｐ．７８５−７９０．
【非特許文献１０】
Ｗａｌｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ  Ｄｒａｇｕｎｏｗ，Ｉ．；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，（２０００），Ｖｏｌ．２３，ｐ．４８−５３．
【非特許文献１１】
Ｇｈｏｓｈ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９４），Ｖｏｌ．２６３，ｐ．１６１８−１６２３．
【非特許文献１２】
Ｏｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），Ｖｏｌ．２７２，ｐ．１４４０４−１４４１１．
【非特許文献１３】
Ｔａｂｕｃｈｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，（２００１），Ｖｏｌ．３９，ｐ．８５−９３．
【非特許文献１４】
Ｓｈｉｅｈ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９８），Ｖｏｌ．２０，ｐ．７２７−７４０．
【非特許文献１５】
Ｔａｏ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｎ，（１９９８），Ｖｏｌ．２０，ｐ．７０９−７２６．
【非特許文献１６】
Ｔａｏ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｕｒｏｎ，（２００２），Ｖｏｌ．３３，ｐ．３８３−３９５．
【非特許文献１７】
Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，（１９９８），Ｖｏｌ．５６，ｐ．２１８−２２６．
【非特許文献１８】
Ｆｒａｎｋｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，（２０００），Ｖｏｌ．１６５，ｐ．１２５−１３５．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ａｌｉｖｉｎ  １  もしくはａｌｉ１  と命名した小脳顆粒細胞の神経活動依存的生存に対して重要な役目を果たす新規遺伝子、該遺伝子を含むベクター、および該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。なお、ａｌｉｖｉｎ  １  は、”ａｌｉｖｅ”  および“ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ−ｒｅｐｅａｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｓｕｒｖｉｖａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ”に因んで命名された。
【０００６】
本発明は上記宿主細胞を培養して、ａｌｉｖｉｎ  １  がコードする新規タンパク質Ａｌｉｖｉｎ  １  （Ａｌｉ１）を製造する方法、および当該方法で製造した新規タンパク質も提供する。
【０００７】
以下の発明は、本発明に包含される：
（１）配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）ラット由来である、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質またはそれと実質的に同じ活性を有するタンパク質をコードする（１）に記載のＤＮＡ。
（３）配列番号５に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）配列番号６に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １タンパク質をコードするＤＮＡ、または上記アミノ酸配列において１または複数のアミノ酸に欠失、置換、挿入、付加を有し、且つＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）（１）ないし（４）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを有するベクター。
（６）（５）に記載のベクターを有する形質転換細胞。
（７）（６）に記載の形質転換細胞をＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を発現する条件で培養し、培養細胞またはその培地からＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を分離することよりなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の製造方法。
（８）配列番号４に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
（９）ラット由来タンパク質である、（８）に記載のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
（１０）配列番号５に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
（１１）  配列番号６に示すアミノ酸配列または該アミノ酸配列において１または複数の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加を有する配列からなる、Ａｌｉｖｉｎ  １タンパク質。
（１２）（８）ないし（１１）のいずれか１項目に記載のタンパク質に特異的な抗体。
（１３）（１）ないし（５）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを投与することからなる神経細胞の生存を促進する方法。
（１４）（１）ないし（５）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを投与することからなる神経細胞死の抑制方法。
（１５）（１）ないし（５）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを含む、神経細胞死の抑制剤。
（１６）（１）ないし（５）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを投与することからなるアルツハイマー病およびパーキンソン病の治療方法。
（１７）（１）ないし（５）のいずれか１項目に記載のＤＮＡを含む、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療のための医薬組成物。
（１８）（８）ないし（１１）のいずれか１項目に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
（１９）神経細胞死の抑制のために用いる、（１８）に記載の医薬組成物。
（２０）（８）ないし（１１）のいずれか１項目に記載のタンパク質を誘導的または構成的に発現する、非ヒトのトランスジェニック動物。
（２１）（８）ないし（１１）のいずれか１項目に記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させた、非ヒトのノックアウト動物。
（２２）配列番号１、２または３に示す塩基配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をコードするＤＮＡ。
（２３）配列番号４、５または６に示すアミノ酸配列を有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
ａｌｉｖｉｎ  １  （ａｌｉ１）遺伝子およびタンパク質
本発明の遺伝子ａｌｉｖｉｎ  １  は、小脳顆粒細胞において、神経活動またはＣａ２＋依存的に発現し、転写過程を経て神経細胞の生存を高める。また、当該遺伝子はその機能およびその遺伝子座からアルツハイマー病およびパーキンソン病と関係を有すると本発明者は結論づけた。
【０００９】
ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子のヌクレオチド配列は、ラット、マウスおよびヒト由来のものは、それぞれ配列番号１、２および３に示す。これらのヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列は配列番号４、５および６に示す。
【００１０】
ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子がコードするタンパク質（Ａｌｉｖｉｎ  １）は、７個のロイシンリッチリピート、１個の免疫グロブリンＣ２様ループ、および１個の膜貫通ドメインを有する。ロイシンリッチリピートおよび免疫グロブリンＣ２様ループおよび膜貫通ドメインをもつ領域はＫｅｋ（ｋｅｋｋｏｎ）およびＴｒｋ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ）とホモロジーがある。
【００１１】
本発明のａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏ  では肺において多く観察される。また、小脳顆粒細胞の初代培養系では、その発現は、細胞周囲のＫＣｌおよび／またはＮＭＤＡ  （Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）  濃度に依存して変化する。例えば、培養した小脳顆粒細胞を２５ｍＭのＫＣｌで刺激すると、電位依存性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを通ってＣａ２＋が細胞に流入し、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの転写が昂進する。この昂進は神経細胞の生存を高める。
【００１２】
上記の種々の事実から、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子は神経細胞の生存に重要な役目を有することが明らかになった。さらにその事実は、小脳顆粒細胞の培養液中に、抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体または抗血清を添加すると、神経細胞の生存率が低下すること、また、抗体等の代りにＡｌｉｖｉｎ  １  の細胞外ドメインを添加しても、小脳顆粒細胞の生存率が低下することからも確認された。
【００１３】
ヒトａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子は、１２番染色体上の家族性アルツハイマー病５型およびパーキンソン病８型の原因遺伝子座が存在する領域に一致して存在する。したがって、ａｌｉｖｉｎ  １  の変異または発現の低下がヒトにおけるアルツハイマー病５型の原因であると本発明者らは結論づけた。
【００１４】
各種動物または組織からのａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の単離および変異ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の作製
本発明の遺伝子のｍＲＮＡは、動物の脳、肺を含む器官または組織に分布して発現する。したがって、それらの器官または組織からのゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを材料とし、配列番号１〜３のいずれかのヌクレオチド配列をプローブとして用い、または配列番号１〜３のヌクレオチド配列の適当な部分をプライマーとして用いて、種々の動物からａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子を単離することが可能である。
【００１５】
各アミノ酸をコードするコドンは複数存在する場合があり、したがって配列番号１〜３のヌクレオチド配列以外にも、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は存在する。本発明はそのようなヌクレオチド配列からなるａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子、および、それがコードするタンパク質を包含する。
【００１６】
また、天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の違い等による遺伝子の変異、あるいは１ないし複数個のアミノ酸の変異を有し、且つ変異前のタンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質が存在することも周知である。したがって、天然型のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質についての変異型のタンパク質であって、天然型と同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質およびそれらをコードするＤＮＡは、本願発明の範囲内である。  具体的には、本発明は、配列番号１ないし３のヌクレオチド配列において、１またはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、置換、挿入もしくは付加による変異を含むヌクレオチド配列によってコードされ、かつＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質を含む。また、本発明は、配列番号４ないし６のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加による変異アミノ酸配列からなる、生物学的に活性なＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質も含む。加えて、本発明は、配列番号１ないし３のヌクレオチド配列において、１またはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、置換、挿入もしくは付加による変異を含むヌクレオチド配列を有し、かつＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と実質的に同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。また、本発明は、配列番号４ないし６のアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加による変異アミノ酸配列からなる、生物学的に活性なＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と同じ活性を有するタンパク質またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性をコードするＤＮＡも含む。
【００１７】
本明細書においてＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質というときは、天然型のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質のみならず、変異アミノ酸配列からなるタンパク質であってＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と同じ活性を有するタンパク質をも包含する。その際、特定のヌクレオチド配列における１またはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、置換、挿入もしくは付加による変異とは、例えば、部位特異的変異形成法で修飾できる程度の変異をいう。
【００１８】
また、本明細書において、Ａｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質とは、Ａｌｉｖｉｎ  １  の作用と拮抗することなどによりその阻害活性を発揮して、神経細胞の生存を抑制する活性を有するＡｌｉｖｉｎ  １  の変異タンパク質である。その際、当該変異はＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質のアミノ酸配列において複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を含む。Ａｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有するタンパク質には、たとえば、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞外セグメント、好ましくは、ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５２−４０２）などが含まれる。
【００１９】
さらに、本発明のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質は、本明細書中に記載した特性を有する限り全てのタンパク質を含む。例えば、配列番号１ないし３のアミノ酸配列との類似性が４０％以上（例えば、Ａｌｉｖｉｎ  １  類似体である  Ａｌｉｖｉｎ  ２，  Ａｌｉｖｉｎ  ３）、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるタンパク質、および該タンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質がＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と同じ活性またはＡｌｉｖｉｎ  １  の活性を阻害する活性を有する限り本発明に含まれる。相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２５，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同プログラムの使用説明に詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２０】
本発明の遺伝子は、配列番号１ないし３のヌクレオチド配列に対して、特定の条件でハイブリダイゼーションするヌクレオチドとして定義することもできる。例えば、本発明は、ストリンジェントな条件下で（例えば、２ｘＳＳＣ中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーション；２ｘＳＳＣ中、５０℃で洗浄）配列番号１ないし３のいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする遺伝子であって、かつ、７つのロイシンリッチリピート、１つの免疫グロブリンＣ２−様ループ、および１個の膜貫通ドメインを有し、細胞表面でのタンパク質間相互作用によって細胞接着および／またはシグナル伝達の役目をするタンパク質をコードする遺伝子も包含する。
【００２１】
さらに、本発明は、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の一部分を持つ部分Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質（例えばＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞外ドメイン、または細胞内ドメインのみを持つタンパク質など）をも含む。部分Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質は、抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体を作成するのに用いたり、Ａｌｉｖｉｎ  １  の機能を評価するなどの用途がある。
【００２２】
Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の製造
本発明は、本発明の遺伝子を組み込んだ発現ベクターを使用し、該ベクターで形質転換した宿主細胞を、遺伝子が発現する条件で培養し、培養物から単離回収して、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を製造する方法にも関する。
【００２３】
発現ベクターは、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を発現させようとする宿主細胞に適するベクターを適宜選択して用いる。大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞などの種々の細胞で使用可能なベクターは、遺伝子工学の分野で良く知られている。ベクターには、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子に加え、プロモーター、ターミネーター、さらに必要に応じて他の発現を制御要素や、遺伝子発現の確認を容易にするためのマーカーを含んでもよい。
【００２４】
宿主細胞の形質転換、培地、培養温度、培養時間等は当業者が適宜設定することができる。完全長のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質は膜貫通ドメインを有し、宿主細胞中で核画分と細胞膜画分に主として存在する。したがって、例えば培養後の細胞からショ糖密度勾配遠心法またはＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により精製してＡｌｉｖｉｎ  １タンパク質を単離することができる。膜貫通ドメイン（配列番号４、６（それぞれラット、ヒト）のアミノ酸配列における３９９番目〜４１９番目の部分、配列番号５（マウス）のアミノ酸配列における３９８番目〜４１８番目の部分）をコードする領域を除外したａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子を用いて、膜貫通ドメインを含まない本発明のタンパク質を製造する場合、適当なリーダー配列を含むタンパク質として発現させ、培養上清中に分泌させることも可能である。
【００２５】
したがって、本発明は、本発明のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をコードするＤＮＡを有するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質発現ベクター、当該発現ベクターを有する形質転換細胞、および当該形質転換細胞を用いて本発明のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を製造するための方法を包含する。
【００２６】
本発明は、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質に対する抗体も提供する。本発明のタンパク質に対する抗血清および／またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の製造は、公知の方法で行うことができる。
【００２７】
治療方法および医薬組成物
本発明の遺伝子を神経細胞に導入すると、当該神経細胞のアポトーシスが抑制され、生存が促進することを本発明者らは見いだした。このことから、本発明のタンパク質は神経細胞のアポトーシスを抑制し、生存を促進をする機能を有する。
【００２８】
本発明のタンパク質は、神経細胞の変性により引き起こされる各種疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病の患者に投与して、神経細胞の生存を昂進し、症状の予防、改善、進行阻止のために用いることが期待できる。本発明のタンパク質および抗体は、神経細胞の変性により引き起こされる各種疾患の、メカニズムの研究の試薬としても有用である。
【００２９】
したがって、本発明は、本発明の遺伝子を神経細胞に投与して、神経細胞の死を抑制し、生存を促進する方法、および当該方法に用いる細胞死抑制剤に関する。
【００３０】
本発明のこの態様においては、本発明の遺伝子をヒトを含む動物に投与して、該動物の神経細胞を活性化し、アポトーシスを抑制し、および／またはアルツハイマー病、パーキンソン病などの疾患を治療する方法、および該治療方法に用いる医薬組成物も包含される。
【００３１】
本発明の遺伝子を含む抑制剤または医薬組成物は、有効成分として、遺伝子治療に使用可能なベクターにａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子を組み込んで含んでなる。例えば、治療対象の動物に対する感染力を残して毒性を除去したウイルス性ベクターとして、アデノウィルスやレトロウィルス等が使用できる。ベクターには、特定の条件下、例えば光、温度等の物理的刺激や、テトラサイクリン等による化学的刺激で本発明の遺伝子を発現させることができるプロモーターを含めておき、ヒトを含む動物に投与後の適当な時期に発現条件に置いて、治療効果を高めることが可能である。さらに、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子を組織特異的プロモーターの下流に組み込み、目的とする組織で特異的に発現させることも可能である。組成物は、ベクターを対象動物の治療を必要とする部位、好ましくは脳神経に選択的にａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子を運ぶための単鎖抗体やペプチドリガンドまたはレセプター、動物体中での組成物の安定性を高めるため、その他薬剤として使用される各種添加物を含んでもよい。
【００３２】
また、本発明は、本発明のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質をヒトを含む動物に投与して、該動物の神経細胞の細胞死を抑制し生存を促進する、および／またはアルツハイマー病、パーキンソン病などの疾患を治療する方法、および該治療方法に用いる医薬組成物にも関する。
【００３３】
本発明のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質を含む医薬組成物は、有効成分として本発明のタンパク質を含むほか、薬学的に使用可能な、種々の医薬的に許容できるキャリアー、希釈剤、賦形剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。医薬組成物は、いかなる形態であってもよく、例えば、錠剤、カプセル剤等であってもよく、また、液剤もしくは使用時に溶解して用いる乾燥製剤とすることもできる。液剤、もしくは溶解して用いる乾燥製剤は、溶液状態では浸透圧やｐＨが投与される患者のそれらと適合するように調整する。
【００３４】
本発明の医薬組成物の投与は、血管内投与、経口投与、局所投与、皮下投与等により行うことが可能である。また、本発明の医薬組成物の投与量は、個々の患者の症状、体重、年齢などによって変化するが、医師が個々の患者に適した量を決定することができ、それらの用量範囲は本発明に含まれる。
【００３５】
アルツハイマー病およびパーキンソン病の動物モデル
本発明により、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の変異または発現異常が、アルツハイマー病およびパーキンソン病の原因の一つであると本発明者らは結論づけた。したがって、ラット、マウス等の実験動物を用いて、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の機能についてのトランスジェニック動物、および／またはノックアウト動物を作成することにより、アルツハイマー病およびパーキンソン病の実験モデルとすることが可能である。
【００３６】
トランスジェニック／ノックアウト動物の作成は、当業者に既知の方法により行うことができる（たとえば、マウスラボマニュアル  第２版−ポストゲノム時代の実験法−、（財）東京都臨床医学総合研究所  実験動物研究部門編、シュプリンガー・フェアラーク東京、（２００３）などを参照）。
【００３７】
このようなモデル動物は、ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子および遺伝子産物のより詳細な生理機能の解明に役立つ。ａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の変異または発現異常がアルツハイマー病およびパーキンソン病の原因であるため、これらの病気のモデル動物として病気の発症のメカニズムの解明、発症の予防法の開発、診断法の開発、治療法の開発のための薬物のスクリーニングなど、病気の早期発見、治療法の開発、進行防止に役立つ。
【００３８】
薬物のスクリーニング
本発明は、本発明のタンパク質に関連する物質のスクリーニング方法にも関する。本発明のタンパク質に関連する物質には、本発明のタンパク質と同様の作用を有するもの、本発明のタンパク質に作用してその活性を促進または阻害して、本発明のタンパク質の活性を制御することができるものなどがある。そのような物質は、作動薬、または、拮抗薬と表現することもできる。ここで、拮抗薬は、競合的拮抗薬および非競合的拮抗薬の両方を意味する。            Ａｌｉｖｉｎ  １  の神経細胞に対する生存促進活性の測定法を用いて、これらの薬物のスクリーニングが可能である。
【００３９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
実施例１  ラットのａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の同定
ラット小脳顆粒細胞の初代培養および細胞生存率の測定
ラット小脳顆粒細胞はＬｅｖｉら（Ｌｅｖｉら、ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ９８％  ｐｕｒｅ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．、”Ａ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ”  （Ａ．  Ｓ，  ｄｅ  Ｖｅｌｌｉｓ  Ｊ，  Ａ．  Ｖ，  Ｂ．  Ｈ，  ｅｄｓ），  ｐ．２１１−２１４，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，  （１９８９）、を参照）の方法を若干修正した方法（Ｏｎｏら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７２，  ｐ．１４４０４−１４４１１，  （１９９７）  を参照）で培養した。細胞生存率はＭｏｓｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．，  Ｖｏｌ．６５，  ｐ．５５−６３，  （１９８３）、を参照）の記載に従って、上記  Ｏｎｏらの論文に記載された方法で測定した。
【００４１】
ＲＮＡの単離およびノーザンブロット
全細胞ＲＮＡの単離は、ＣｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．１６２，  ｐ．１５６−１５９，  （１９８７）、を参照）を若干修正した方法で行った。細胞をｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａおよび水飽和フェノールの１：１混合物で溶解した。得られたトータルＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで分離し、Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ  膜（Ｐａｌｌ）に転写した。０．２４−９．５ｋｂ  ＲＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をサイズマーカーとして用いた。ｃＤＮＡプローブをランダム９−ｍｅｒ（Ｔａｋａｒａ）および［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ハイブリダイゼーションは、Ｒａｐｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で６５℃で販売元の指示に従って行った。ハイブリダイゼーション後、膜を０．１％  ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣにて室温で、続いて０．１％  ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣにて５５℃で洗浄した。膜を、マウスのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ（Ｇ６ＰＤＨ）で再プローブして、ＲＮＡサンプルが等量負荷されたことを確認した（Ｉｎｏｋｕｃｈｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  Ｖｏｌ．３８２，  ｐ．４８−５２，  （１９９６）、を参照）。ハイブリダイゼーションシグナルはＦＵＪＩＸ  ＢＡＳ２０００  Ｂｉｏｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  ｆｉｌｍ）を用いて解析した。ｍＲＮＡのレベルはＧ６ＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルで標準化した。
【００４２】
ディファレンシャルディスプレーおよびｃＤＮＡクローニング
ディファレンシャルディスプレーは、文献記載の方法（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７２，  ｐ．１４４０４−１４４１１，  （１９９７）；  マウスラボマニュアル  第２版−ポストゲノム時代の実験法−、（財）東京都臨床医学総合研究所  実験動物研究部門編、シュプリンガー・フェアラーク東京、（２００３）を参照）で行った。用いたプライマー対は、５’−ＡＣＡ  ＣＧＣ  ＴＣＡ  Ｃ−３’（配列番号７）および５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＡ−３’（アンカープライマー、配列番号８；  Ｖ  はＡ，  Ｇ，  またはＣ）であった。生じたＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングした。ノーザンプロッティング分析により陽性クローンを選択し、得られたクローンのＤＮＡの配列をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で決定した。
【００４３】
神経活動依存性遺伝子であるａｌｉｖｉｎ  １  の同定
小脳顆粒細胞は、２５ｍＭ  ＫＣｌまたは１５０μＭ  ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）／１５ｍＭ  ＫＣｌを含む培地で培養すると非常によく生存する（図１、それぞれ、○−○および●−●）。逆に、これらの神経細胞は５ｍＭまたは１５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地中で培養すると、細胞は徐々にアポトーシスで死滅する（Ｇａｌｌｏ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．２２０３−２２１３，  （１９８７）；Ｂａｌａｚｓ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２７，  ｐ．４３７−４５１，  （１９８８）；または、Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７２，  ｐ．１４４０４−１４４１１，  （１９９７）、を参照）。生存率は１５ｍＭ  ＫＣｌを含む培地での培養の方が、５ｍＭ  ＫＣｌを含む培地での培養よりも高い（図１、それぞれ□−□および■−■）。また、１５０μＭ  ＮＭＤＡ／１５ｍＭ  ＫＣｌ培地で３．５ＤＩＶ（ｄａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養後、３００μＭ  ＡＰ−５（（±）−２−ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を培養液中に添加すると、アポトーシスが誘導され、３６時間後までに約半数の細胞が死滅した（図１、▲−▲）。神経細胞の神経活動依存性生存に関連する遺伝子として、脱分極条件またはＮＭＤＡ存在条件により誘導される遺伝子群を同定する目的のために、まずアポトーシスのコミットメント時間を決定した。コミットメント時間は培養開始後３．０ＤＩＶであった（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７２，  ｐ．１４４０４−１４４１１，  （１９９７）、を参照）。それゆえに、本発明者らは生存促進条件（１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地）およびアポトーシス誘導条件（５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地）で培養した細胞群から、３．０ＤＩＶに、それそれＲＮＡを抽出した。これらのＲＮＡサンプルは、ｃＤＮＡに変換した後、ディファレンシャルディスプレイ解析に供した。図２に示すように、生存促進条件下で培養した細胞に由来するＰＣＲ産物をのせたレーンにおいてはバンドが検出されたが（図２、レーンＳ上の矢印）、アポトーシス誘導条件下で培養した細胞由来のＰＣＲ産物をのせたレーンでは、この位置にバンドは検出されなかった（図２、レーンＡ）。レーンＳ上の矢印のバンドをゲルから取り出して、以前に報告した方法で（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７２，  ｐ．１４４０４−１４４１１，  （１９９７）、を参照）再増幅した。ＰＣＲ産物はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）へクローニングし、配列解析を行った。得られたｃＤＮＡはラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡの、３’−非翻訳配列の最も下流側の領域であるヌクレオチド断片（配列番号１の２９５７−３０９５ｂｐに相当する配列）と同定された。
【００４４】
ラットａｌｉｖｉｎ  １  完全長ｃＤＮＡの同定
１５ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０μＭ  ＮＭＤＡを含有する培地中で５．０日間培養したラット小脳顆粒細胞から抽出したＲＮＡから構築したλＺａｐ  ＩＩライブラリーを、クローン化したラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした。その結果、いくつかのオーバーラップする配列を持つクローンが得られた。得られた配列の最も上流領域を用いて、同じライブラリーの再スクリーニングを行い、およそ５００ｂｐ上流の配列を有するいくつかのクローンを得た。その結果、完全長ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡ（配列番号１）を同定した。
【００４５】
実施例２  マウスおよびヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのクローニング
データベース検索
実施例１で得られた完全長ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡについて、データベース検索（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）を行った。その結果、ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡの３’領域についての有意な相同性を持つ複数のマウスおよびヒトＥＳＴクローンが存在することが明らかになった。さらにラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡ配列の全体はヒト染色体ＤＮＡのＢＡＣクローンの一部（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＣ００４０１０）と、かなりの同一性（連続した１６塩基以上のギャップなしで７２％同一性）を示し、これは、ラットａｌｉｖｉｎ  １  のヒトホモログ（ヒトａｌｉｖｉｎ  １）の完全長ｍＲＮＡ配列は単一のエキソンにコードされていることを示している。
【００４６】
マウスａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのクローニング
マウスａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡは、鋳型としてマウス全脳から調整したｃＤＮＡを用い、ＬＡ−Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲでクローニングした。本発明者らは、マウスおよびヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡを同じプライマー対でクローニングできるように、以下の二つのプライマーを設計した。５’−プライマー（５’−ＧＣＴ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＧＴＴ  Ｔ−３’；  ｓｅｎｓｅ：配列番号９）は、ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡ配列およびヒトａｌｉｖｉｎ  １  のゲノム配列の比較を行い、これらの二つの配列の最も上流側の領域のコンセンサス配列に基づいて設計した。また、３’−プライマー（５’−ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＡ  Ｇ−３’；  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：配列番号１０）は、マウスおよびヒトＥＳＴクローンの３’非翻訳配列のコンセンサス配列からこれらのａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡに特徴的なプライマーとして設計した。
ＰＣＲ条件は、９４℃  １分につづいて、９４℃  ３０秒；６６℃  ３０秒；６８℃  ３０秒を３５サイクル繰り返した後、６８℃  ３分で加熱して行った。
上記の５’−プライマーおよび３’−プライマーを用いて、ＰＣＲにより完全長マウスａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡ（配列番号２）を得た。
【００４７】
ヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのクローニング
まず、マウスａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのクローニングで用いたのと同じプライマー対（配列番号９および１０）を用いてヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡをクローニングすることを試みたが、このプライマーでクローニングすることはできなかった。そこで、ヒトａｌｉｖｉｎ  １  のゲノム配列に基づいて、新たに  ５’−ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＴＡＧ  ＧＣ−３  ’（ｓｅｎｓｅ  １−２３）（配列番号１１），  ５’−  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＧＧ−３’（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ７９１−７７２）（配列番号１２），  ５’−ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＣＧ−３’（ｓｅｎｓｅ  ７４６−７８４）（配列番号１３），  および５’−ＧＴＧ  ＴＡＧ  ＴＣＴ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＣＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＧ−３’  （ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  １３８４−１３５５）（配列番号１４）を設計して使用した。
上記２組のプライマー対を用いて、ヒトｃＤＮＡを鋳型として、マウスａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのクローニングのときと同条件でＰＣＲを行った。上記２組のプライマー対を用いて得られた２つのＰＣＲ産物の塩基配列がオーバーラップする部分を重ね合わせて、ヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡの一部分が得られた（配列番号３の７８１−２１６３番目の塩基）。ヒトＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＧ７２４４１３）はこの部分的なヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡとオーバーラップすることが確認できたので、これらの二つの配列を連結して完全長ヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡ（配列番号３）を構築した。当該ＥＳＴクローンは配列番号６の１−２３９番目のアミノ酸配列を含む領域をコードし、一方、ＰＣＲによって得られた部分ヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡは配列番号６の２４０−５２２番目のアミノ酸配列をコードしている。
【００４８】
実施例３  ラット、マウスおよびヒトＡｌｉタンパク質の構造的特徴
図３に示すように、ラットマウスおよびヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームはそれぞれ、５２０、５１９、５２２アミノ酸のタンパク質をコードする。それぞれのタンパク質は、ＮＨ２−末端にシグナルペプチド配列（Ｌ）、二つのシステイン−リッチドメイン（ＮＣおよびＣＣ）に囲まれた７つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）、１つの免疫グロブリンＣ２−様ドメイン（ＩＧ）および１つの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を有する。シグナルペプチド切断部位は、Ｎｅｉｌｓｅｎらの方法（Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｖｏｌ．１０，  ｐ．１−６，  （１９９７）、を参照）を用いて、ラット、マウス、ヒトのＡｌｉｖｉｎ  １  について３８から３９残基の間であると予測した。特に、５番目のＬＲＲの後半（ラットおよびマウスについてはそれぞれ配列番号４および５の１６９−１９０番目のアミノ酸配列、ヒトについては配列番号６の１７０−１９１番目のアミノ酸配列）はロイシンジッパー配列のコンセンサス（ＬｘｘｘｘｘｘＬｘｘｘｘｘｘＬｘｘｘｘｘｘＬ；Ｌはロイシン、ｘは任意のＬ体のαアミノ酸を表す：配列番号１５）と１００％一致した。それぞれのタンパク質はＣＯＯＨ−末端領域におよそ１００アミノ酸の細胞内ドメイン（ＩＤ）を含み、このドメインは他の既知のタンパク質と相同性がなかった。
上記構造の特徴から、データベース検索により、ａｌｉｖｉｎファミリーの他の構成要素（ａｌｉｖｉｎ  ２およびａｌｉｖｉｎ  ３）も明らかにした（実施例１１参照）。
【００４９】
実施例４  小脳顆粒細胞の神経活動依存性生存とａｌｉｖｉｎ  １    ｍＲＮＡの発現の関連
ラットａｌｉｖｉｎ  １  発現解析のための競合的ＲＴ−ＰＣＲ
ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現量の評価は、競合的ＲＴ−ＰＣＲにより行った。細胞から抽出した全ＲＮＡ（１μｇ）をＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、メーカーのマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡに変換した。サンプルの一部（１／２０）を用いて、競合的ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。競合相手は、’ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ’（Ｔａｋａｒａ）を用いて構築した。ラットａｌｉｖｉｎ  １  の競合的ＰＣＲ分析には次の配列を用いた：  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （１９９２−２０１４）  ：  ５’−ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＣＧ−３  ’（配列番号１６）およびａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  （２２６６−２２９１）  ：  ５  ’−ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  Ｇ−３’（配列番号１７）、ならびに、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５  ’−ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ−３’（配列番号１８）およびｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５  ’−ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＡ  ＴＧＡ  Ｔ−３’（配列番号１９）。このセンスおよびアンチセンスプライマー対は、３００ｂｐ産物を生じ、一方、競合的プライマー対を用いたＰＣＲは、１９９ｂｐ産物を増幅した。競合的ＰＣＲは、１０４コピーの競合相手およびサンプルより調製した５０ｎｇのｃＤＮＡを用いて行った。
【００５０】
ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現と小脳顆粒細胞の神経活動依存性生存の関連
小脳顆粒細胞の生存とａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現の間の関係を明らかにするために、ノーザンブロッティングにより発現パターンの時間的変化を検討した。ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡのサイズは３．３ｋｂのサイズであり、８．５ｋｂ付近にもマイナーな転写産物が検出された（図４−１Ａ）。ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現は生存促進条件下（すなわち、２５ｍＭ  ＫＣｌ、または、１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地）で培養した細胞に限定して発現し、その発現は経日的に増加した。対照的に、アポトーシス誘導条件下（すなわち、５ｍＭ  ＫＣｌまたは１５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培養培地）で培養した細胞では、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡはほとんど検出されなかった（図４−１Ａ、Ｂ）。ＮＭＤＡ存在下で培養した細胞に、ＮＭＤＡレセプターの特異的なアンタゴニストであるＡＰ−５を終濃度３００μＭで加えたとき、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現は著しく速く下方制御された（ｔ１／２＝１．４ｈ、図４−２ＡおよびＢ）。この下方制御は大多数の小脳顆粒細胞細胞の死滅の前に起こり、ａｌｉｖｉｎ  １  が神経細胞生存において重大な役割を果たすことが明らかになった。下方制御された後、神経細胞は２５ｍＭ  ＫＣｌ、または１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌのいずれかで再度刺激した（図４−３Ａ、Ｂ）。ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡは上方制御されたが、元のレベルに戻るには５〜２４時間かかった。ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの上方制御のメカニズムを調べるために、培養液に様々な阻害剤を加えた後、ＫＣｌ及び／またはＮＭＤＡで刺激を行い、刺激後２４時間の転写物の発現を検定した。
【００５１】
ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現はアクチノマイシンＤによって完全に阻害され、シクロヘキシミドによっては部分的に阻害された（それぞれ２５ｍＭ  ＫＣｌ刺激においては対照レベルの４３％、ＮＭＤＡ刺激においては対照レベルの４９％）。さらに、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの上方制御は、電位依存型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの特異的な阻害剤であるニフェジピンによって阻害された。これらの結果は、ａｌｉｖｉｎ  １  は、電位依存型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを通してのＣａ２＋流入により、転写過程でその発現が制御される初期応答遺伝子であることを示す。
【００５２】
実施例５  ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの神経活動依存性発現
ラット大脳皮質ニューロンの初代培養
ラット大脳皮質ニューロンは小倉らの方法（Ｏｇｕｒａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  Ｖｏｌ．７８，  ｐ．６９−７４  （１９８７）、を参照）で培養した。胎生２０日のウィスターラットから大脳を取り出し、神経細胞分散液（住友ベークライト  Ｂ−Ｘ９９０１）を用いて神経細胞を調整した。分散させた神経細胞は３．５ｃｍ径ディッシュあたり５ｘ１０６個の密度で、ウシ胎児血清および５％ウマ血清を含有する２ｍｌのＤＭＥＭ培地中に播種し培養を行った。
【００５３】
ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの神経活動依存性発現
これまでに報告された多くの論文では、高濃度のＫＣｌを用いた長期の脱分極刺激を神経活動依存性遺伝子の研究に用いていた。例えば、Ｂｒｏｓｅｎｉｔｓｃｈ  と  Ｋａｔｚ（Ｂｒｏｓｅｎｉｔｓｃｈ，  Ｔ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．２５７１−２５７９  （２００１）、を参照）は、長期の脱分極刺激は、生体内で起こる生理的な神経活動とは異なる遺伝子応答を引き起こすことを報告している。また、小倉ら（Ｏｇｕｒａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  Ｖｏｌ．７８，  ｐ．６９−７４，  （１９８７）、を参照）および黒田ら（Ｋｕｒｏｄａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．，  Ｖｏｌ．１３５，  ｐ．２５５−２５８，  （１９９２）、を参照）は、それぞれ、初代培養した海馬ニューロンおよび大脳皮質ニューロンは、神経細胞間で実際に機能するシナプスを形成し、外から刺激を与えなくても、神経細胞が自発的にしかも同調的に興奮することを報告した。彼らは、培養系にテトロドトキシンを加えることにより、ニューロンの自発的な興奮を抑制でき、さらに培養液からテトロドトキシンを除くと神経細胞の自発的な興奮が回復すること報告している。
【００５４】
そこで本発明者らは、大脳皮質ニューロンの初代培養系を用いてａｌｉｖｉｎ  １  の遺伝子発現が、上記の報告のような生理的な神経活動により制御されているか否か、すなわち、神経細胞の電気的な活動により制御されているか否かを検討した。上記のように調製したラット胎児の大脳皮質ニューロンは、ニューロンが成熟しシナプスを形成する期間である２週間培養した。図５に示したように２週間培養した細胞はａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡを発現していた。この細胞にＮａ２＋チャンネルの阻害剤であるテトロドトキシンを加えるとａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現は著しく抑制された。テトロドトキシンを培養液から除くとａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現は、ほぼ元のレベルまで回復した。これらの結果からａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の発現は神経細胞の電気的活動に依存しており、従ってａｌｉｖｉｎ  １  は神経活動依存的に発現制御される遺伝子であることが結論された。
【００５５】
実施例６  ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの組織分布および発生過程における発現制御
ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡは肺において最も豊富に発現していた（図６Ａ）。肺以外では、検定した組織のすべてに低レベルのａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡ発現が観察された。
小脳におけるａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現は発生にともなって発現制御を受けていた。ラットの小脳は生後に発生し、発生形態形成は生後２１日で完了する。生後７日から１４日は、小脳顆粒神経細胞が顆粒層外部から内部へ移動する期間であるが、この間に、小脳のａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡは生後０日のおよそ半分まで下方制御された（図６Ｂ、Ｃ）。このレベルは生後９０日まで維持された。これらのデータはａｌｉｖｉｎ  １は小脳の形態形成において役割を持つことを示唆している。
【００５６】
実施例７  免疫組織分析
ラットＡｌｉｖｉｎ  １  の細菌による発現と抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体の作製
ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡをＰｆｕポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅した。両方のプライマーに適当な制限部位を組み込み、アンチセンスプライマーにはＨｉｓタグ配列を含めた。ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５７−５２０）（本明細書において、「ラットＡｌｉｖｉｎ  １（ｘ−ｙ）」という表記は、配列番号４のｘ番目からｙ番目のアミノ酸配列からなる、ラットＡｌｉｖｉｎ  １  の部分タンパク質であることを示す）に特異的な抗体を製造するためのプライマーは、５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  Ｇ−３’（配列番号２０）および５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  Ｇ−３’（配列番号２１）を用いた。細胞外ドメイン（ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５７−４０２））の増幅のためのプライマーは、５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  Ｇ−３’（配列番号２２）および５’−ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ−３’（配列番号２３）を用いた。得られたＰＣＲ産物は、ｐＥＴ２２ｂベクターに、読み枠を一致させてクローニングした。これを大腸菌にトランスフェクションし、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の発現のため、１ｍＭ  ＩＰＴＧで３時間誘導した後、生じたタンパク質をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（ＱＩＡＧＥＮ）クロマトグラフィーで精製した。精製したラットＡｌｉｖｉｎ  １（５７−５２０）は、ＳＤＳゲル電気泳動でさらに精製し、ウサギに免疫して抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗血清を得た。得られた抗血清をそのまま又は精製して、抗体として用いた。この抗体は、ラット脳の６６Ｋおよび６３ＫのＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質と交差反応することをウエスタンブロットで確認した（図７Ａ）。
【００５７】
ラットＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の免疫組織分析
成熟したラットの脳の凍結切片（厚さ１５μｍ）を１００％メタノールで−２０℃にて１０分間固定した。切片を、５％ウシ血清アルブミンおよび５％ヤギ血清を含むダルベッコのリン酸緩衝食塩でブロックした。次に切片を上述したウサギ抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体と、次いでフルオレセインイソチオシアネートに結合した抗ウサギＩｇＧと反応させた。陰性対照の染色には、非免疫ウサギ抗体を使用した。
【００５８】
ラット脳におけるＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の免疫組織化学的局在
ラット脳におけるＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の分布を評価するため、上述したウサギ抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体を用い、ラット脳の免疫組織化学を行った（図７Ｂ、Ｃ）。ラット小脳において、Ａｌｉｖｉｎ  １  免疫反応性の大部分が小脳顆粒神経細胞およびプルキンエ細胞の細胞体に局在した、一方ラット海馬においてＡｌｉｖｉｎ  １  免疫反応性は、ＣＡ１領域とＣＡ３領域（ＣＡは、Ｃｏｒｎｕ  Ａｍｍｏｎｉｓ（アンモン角）の略）の間における錐体細胞の体および歯状回における顆粒細胞の細胞体に局在した。陰性対照標本においては染色されなかった（データは示さない）。
【００５９】
実施例８  Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞内局在
ラット脳の細胞分画
１０週齢の雄ラットから脳を摘出し、細胞内顆粒をＧｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ，  Ｐ．  Ｒ．，  （１９８７）  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ，  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．  ”Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”  （Ｔｕｒｎｅｒ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｂａｃｈｅｌａｒｄ，  Ｈ．  Ｓ．，  ｅｄｓ），  ｐｐ  １−２６．  Ｏｘｆｏｒｄ：  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、を参照）の方法で分画した。細胞膜画分、シナプトソーム画分およびミトコンドリア画分を、同じくＧｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓの方法で、Ｆｉｃｏｌｌ濃度勾配遠心で得た。細胞膜のマーカー酵素である５’−ヌクレオチダーゼをＧｒａｈａｍら（Ｇｒａｈａｍ，  Ｊ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  Ｖｏｌ．１５０，  ｐ．３０３−３０５，  （１９６８）、を参照）の方法でアッセイした。
【００６０】
ウェスタンブロット分析
細胞抽出物は１０％  ＳＤＳゲルで電気泳動した。泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、３０００倍希釈の抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体を用いてＥＣＬまたはＥＣＬ−プラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でＡｌｉｖｉｎ  １  の免疫反応性を検出した。
【００６１】
ラット脳におけるＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞内局在
ラット脳の全体を、上述したように密度勾配遠心分離によって、様々な細胞内顆粒画分に分画した。個々の画分を抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体でのウェスタンブロッティング解析に供した。Ａｌｉｖｉｎ  １  の免疫反応性の大部分は細胞核画分（図８、レーン２）および細胞膜画分（図８、レーン６）に局在した。後者の画分は細胞膜のマーカー酵素である５’−ヌクレオチダーゼ活性を最も高く示した（データは示していない）。これらの実験結果から、Ａｌｉｖｉｎ  １  は核と細胞膜に局在することが判明した。
【００６２】
細胞膜に局在すると考えられていたシグナル伝達受容体が実際には細胞核に存在していた例が、ＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、増殖因子レセプター、ｃ−ｅｒｂ−４／ＨＥＲ−４増殖因子レセプター（Ｌｏｂｉｅ，  Ｐ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２６９，  ｐ．３１７３５−３１７４６，  （１９９４）；Ｘｉｅ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｈｕｎｇ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  Ｖｏｌ．２０３，  ｐ．１５８９−１５９８，  （１９９４）；Ｍａｈｅｒ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１３４，  ｐ．５２９−５３６，  （１９９６）；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．６０，  ｐ．１４８３−１４８７，  （２０００）；Ｌｉｎ，  Ｓ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．８０２−８０８，  （２００１）；または、Ｍａｒｔｉ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｙｒｏｉｄ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ．１３７−１４５，  （２００１）、を参照）について報告されている。ＥＧＦレセプターについては、それ自身がトランスアクチベーター活性を示し、転写因子として働きうることが報告されている（Ｌｉｎ，  Ｓ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．８０２−８０８，  （２００１）、を参照）。核にＡｌｉｖｉｎ  １  が局在している事実により、細胞表面での機能に加えて、細胞核においてもＡｌｉｖｉｎ  １  がなんらかの役割を担っていると考えられる。
【００６３】
実施例９  Ａｌｉｖｉｎ  １  による小脳顆粒細胞の脱分極依存性生存の促進
Ａｌｉｖｉｎ  １  発現ベクターの初代培養小脳顆粒細胞への導入
ＰＣＲを用いてＦｌａｇエピトープをコードするヌクレオチドをラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのコード領域の３’−側に融合させた。合成したｃＤＮＡはｐＴｒｉＥｘ−１．１  ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローングした。発現ベクターは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞播種時（培養０日）に小脳顆粒細胞へ導入した。Ａｌｉｖｉｎ  １  発現ベクターまたは対照ベクター（ｐＴｒｉＥｘ−１．１  ベクター）をＥＧＦＰ発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ３；  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と４：１に混合し、これをＢＭＥ培地と混合した。発現ベクターと等量のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００をＢＭＥ培地で希釈し、室温で５分間保温した。この希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００溶液をＤＮＡ／ＢＭＥ溶液と混合し、室温で２０分間保温し、Ｌｉｏｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＤＮＡ複合体を形成させた。１０％ウシ胎児血清を含むＢＭＥ培地に分散させた小脳顆粒細胞とＬｉｏｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ／ＤＮＡ複合体を４：１の割合で混合した。この混合液を０．５ｍｌ／ウェルの割合で、ポリエチレンイミンでコートしたカバーグラスを含む１２ウェル・プレート上に播種し、培養を開始した。培養１ウェルには２．５ｘ１０６個の細胞と１．２５μｇのＤＮＡが含まれるようにした。培養開始後５時間に培養液を新しいものと交換した。２４時間後に３０μＭ  ＡＰ−５と１００μＭ  ＡｒａＣを加えた。３．０ＤＩＶに細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２；  Ｓｉｇｍａ）で免疫染色した。細胞の核はＳｅｅらの方法（Ｓｅｅ，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆａｓｅｂ．  Ｊ．，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１３４−１４４，  （２００１）、を参照）により、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色してアポトーシスで死んだ細胞を同定した。
【００６４】
Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質による小脳顆粒細胞の脱分極依存性生存の促進
Ａｌｉｖｉｎ  １−Ｆｌａｇ融合タンパク質発現ベクターとＥＧＦＰ発現ベクターを初代培養小脳顆粒細胞へ同時にトランスフェクションし、ａｌｉｖｉｎ  １  の細胞生存率に対する効果を検討した。生存率に対する効果はトランスフェクションした細胞群（Ｆｌａｇ陽性かつＥＧＦＰ陽性）中のアポトーシスを起こして死んだ細胞の割合を測定することにより検討した。対照実験群へは対照ベクターとＥＧＦＰ発現ベクターを同時にトランスフェクションし、ＥＧＦＰの蛍光によりベクターが導入されている細胞を同定した。図９ＡおよびＢに示すようにＡｌｉｖｉｎ  １−Ｆｌａｇ発現ベクターをトランスフェクションし、５ｍＭ  ＫＣｌ／３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液中で培養した細胞では、トランスフェクションした細胞の内、４７％の細胞がアポトーシスを生じたのに対し、対照群では７５％の細胞がアポトーシスを生じた。これらの結果により、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質が小脳顆粒細胞のアポトーシスを抑制し、生存を促進することが確認された。
【００６５】
図８の結果は一部のＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質が細胞膜上に存在することを示しているので、次に細胞膜上に存在するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質が細胞の生存に関係しているか否かを検討した。本発明者らは神経細胞の表面でのＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の機能を阻害するために、抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体を培養液に加えた。図９Ｃに示したように、２５ｍＭ  ＫＣｌを含む培養液で培養した細胞の培養液中に抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体を添加すると用量依存的に小脳顆粒細胞の生存を阻害した。一方、５ｍＭ  ＫＣｌを含む培養液で培養した小脳顆粒細胞の生存は抗体添加により影響されなかった。これらの結果から、細胞表面に存在するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質が小脳顆粒細胞の脱分極依存性の生存に関与していることが判明した。細胞膜上に存在するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質が脱分極依存性の生存に関与していることをさらに確認するために、大腸菌で発現させたＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞外セグメントを用いて検討を行った。Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞外セグメントはタンパク質間相互作用に働くドメイン（ＬＲＲとｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎドメイン）を持っており、これらのドメインはＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質のリガンドに結合すると考えられることから、細胞外セグメントはＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質に対して競合的阻害剤として働くと考えられる。同様な実験はＴＧＦβ受容体とＴｒｋＡで報告されており、これらのタンパク質の可溶性細胞外ドメインがこれら受容体の機能を阻害することが既に報告されている。図９Ｄに示したように、２５ｍＭ  ＫＣｌ／３０μＭＡＰ−５を含む培養液にＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の細胞外セグメント（ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５２−４０２））を添加して培養を行ったところ、用量依存的に小脳顆粒細胞の生存が６５％に抑制された。以上の結果から細胞表面に存在するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質は脱分極依存性の生存に関与していることが明らかになった。尚、これらの結果は核に存在するＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質の脱分極依存性生存への関与を否定するものではない。これらの結果から、抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体が小脳顆粒細胞の生存を阻害し、細胞の表面でのＡｌｉｖｉｎ  １  への結合およびＡｌｉｖｉｎ  １  とその特異的なリガンド（類）の間の相互作用を妨害していることが示された。また、Ａｌｉｖｉｎ  １  の細胞外ドメインの可溶型は初代培養小脳顆粒神経細胞の生存を阻害することから、添加したＡｌｉｖｉｎ  １  の細胞外ドメインは競合的にＡｌｉｖｉｎ  １  リガンド（類）に結合して、Ａｌｉｖｉｎ  １  とＡｌｉｖｉｎ  １  リガンド（類）の相互作用を妨害することにより生存シグナルを阻害することが明らかとなった。
【００６６】
実施例１０  マウスａｌｉｖｉｎ  １  の染色体遺伝子座の
ラディエーションハイブリッド（ＲＨ）によるマッピングとヒトａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子座
マウスａｌｉｖｉｎ  １  の染色体上の位置をＰＣＲ分析で決定し、Ｔ３１  ラディエーションハイブリッド（ＲＨ）パネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭｃＣａｒｔｈｙ，  Ｌ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  Ｖｏｌ．７，  ｐ．１１５３−１１６１  （１９９７）、を参照）からの９４  ＤＮＡサンプル  （基準細胞ライン１２、２５、６１、６２、９９および１００は除く）  に対して、二連でタイプ分析した。このＰＣＲ反応は全量１５μｌ中で、２０ｎｇゲノムＤＮＡ、０．５５μＭの各プライマー、０．１５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｘ  Ｇｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒを含む全量１５μｌ中で行った。サイクル条件は次の通りとした：９５℃  ５分（酵素活性化）、９４℃  ３０秒；５５℃  ４０秒；７２℃  １２分のサイクルを４０サイクル。ＰＣＲ産物は、ＴＡＥバッファー中で４％アガロースゲル（３％  ＮｕＳｉｅｒｖｅ  ａｇａｒｏｓｅおよび１％  ＳｅａＫｅｍ  ＭＥ  ａｇａｒｏｓｅ）により電気泳動し、エチジウムブロミドで染色して可視化した。データはゲルのイメージから、特別のスコアシステム（０＝ネガティブ、  １＝ポジティブ、および２＝試験しないラインまたは再現性なし）  により記録した。得られたデータを用いて、ラディエーション・ハイブリッド・フレームワーク・マップを確定した。座位のマッピングに続き、ＲＨパネルの細胞ラインを用いて、隣接マーカーを再度タイプ分析した。Ｍａｐ  Ｍａｎａｇｅｒ  ＱＴ（Ｍａｎｌｙ，  Ｋ．  Ｆ．  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｏｌ．１０，  ｐ．３２７−３３４，  （１９９９））中のＲＨマッピングデータの分析により、ｃＲ３０００中の距離を決定した。
【００６７】
マウスａｌｉｖｉｎ  １  の染色体マッピング
マウス染色体におけるａｌｉｖｉｎ  １  の染色体上の局在を決定するために、われわれは放射線雑種（ＲＨ）マッピングを行った（図１０）。得られたデータをマウスゲノムデータベース（ＭＧＤ２００２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇ／ｍｇｉｈｏｍｅ／））と比較した結果、マウスａｌｉｖｉｎ  １  の遺伝子座は、１５番染色体のセントロメアからおよそ５５．３ｃＭの位置にマッピングされた。この領域はヒト１２番染色体とシンテニー（遺伝子相同性）がある。データベースによると、ヒトａｌｉｖｉｎ  １  は１２ｑ１３．１１にマッピングされている（アクセッション番号ＡＣ００４０１０）。この領域に一致して、家族性アルツハイマー病５型（ＡＤ５：ＯＭＩＭ  ６０２０９６、１２ｐ１１．２３−ｑ１３．１２）およびパーキンソン病８型（ＰＡＲＫ８：  ＯＭＩＭ  ６０７０６０、１２ｐ１１．２３−ｑ１３．１１）の原因遺伝子が存在するが、ＡＤ５とＰＡＲＫ８の原因遺伝子は特定されていない。ＡＤ５は６０歳以上で発症する遅発性（少なくとも６０歳）のアルツハイマー病であり、これまでに報告されているＡＰＰ、プレセネリン１／２、アポリポプロテインＥの変異が原因ではない。また、ＰＡＲＫ８はこれまでに報告されているパーキンソン病の原因遺伝子であるα−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ｐａｒｋｉｎ、ＤＪ１、ＵＣＨ−Ｌ１とは異なる遺伝子座を持つ。さらに、ＡＤ５およびＰＡＲＫ８がマッピングされている領域には細胞の生存と死に関連する遺伝子はこれまで報告されていない。従ってａｌｉｖｉｎ  １  はこれらの原因遺伝子と本発明者は結論づけた。
【００６８】
実施例１１  Ａｌｉｖｉｎ  ファミリータンパク質の構造
Ａｌｉｖｉｎ  １  は、ＬＲＲおよび免疫グロブリンスーパーファミリーの新しいメンバーである。データベースの検索によりａｌｉｖｉｎ  遺伝子ファミリーに属する他の遺伝子も明らかとなった：すなわち、マウスａｌｉｖｉｎ  ２（アクセッション番号ＢＣ０１０５９８）、ヒトａｌｉｖｉｎ  ２（アクセッション番号ＬＯＣ１２７００１、ＡＢ０３２９８９）、およびヒトａｌｉｖｉｎ  ３（アクセッション番号ＡＢ０５８７５４）である。図３および図１１−１に示したように、ａｌｉｖｉｎ  遺伝子ファミリーがコードするタンパク質の間に著しい配列の相同性が見られた。Ａｌｉｖｉｎ  相同分子種（オルソログ）における類似性は９２％から９５％の間であり、一方Ａｌｉｖｉｎ  パラログの間の類似性は４６％から５６％の間である。ヒトＡｌｉｖｉｎ  パラログのドメイン構造の間の相同性は、膜貫通ドメインが最も高く、次いでＮ末端隣接システイン−リッチおよびＬＲＲドメイン著しい相同性が認められた（図１１−２）。さらに、Ａｌｉｖｉｎ  タンパク質全体のドメイン構造はＡｌｉｖｉｎ  パラログ間で著しく保存されていた。それぞれのＡｌｉｖｉｎ  パラログは、ＮＨ２−末端にシグナルペプチド配列、ＮＨ２−末端側およびＣＯＯＨ−末端側のシステイン−リッチ配列に囲まれた７つのＬＲＲｓ、一個の免疫グロブリンＣ２−様ドメイン、一個の膜貫通ドメイン、およびおよそ１００アミノ酸の細胞内ドメインから構成されている。Ａｌｉｖｉｎ  ファミリータンパク質のＬＲＲドメインの相同配列は、ＬｘｘＬｘｘＬｘＬｘｘＮｘａｘｘａｘｘｘａ（配列番号２４）であり、これは典型的な動物細胞の細胞外ＬＲＲ配列として報告されている配列に一致する（Ｋｏｂｅ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｊ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．１９，  ｐ．４１５−４２１，  （１９９４）；または、Ｋａｊａｖａ，  Ａ．  Ｖ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．２７７，  ｐ．５１９−５２７，  （１９９８）、を参照）。
【００６９】
現在までのところ、多くのＬＲＲファミリーの構成要素が同定されてきた（Ｋｏｂｅ，  Ｂ．  ａｎｄ  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｊ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．１９，  ｐ．４１５−４２１，  （１９９４）、を参照）。しかしながら、ＬＲＲｓおよび免疫グロブリン様ドメインの両方を持つタンパク質はほんの数例しか報告されていない。これらのタンパク質はＫｅｋ  １／２（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１７８，  ｐ．６３−７６，  （１９９６）；または、Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．９６，  ｐ．８４７−８５６，  （１９９９）、を参照）、Ｔｒｋ  Ａ／Ｂ／Ｃ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．６，  ｐ．１８０７−１８１１，  （１９９１）、を参照）、ＩＳＬＲ（Ｎａｇａｓａｗａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｖｏｌ．４４，  ｐ．２７３−  ２７９，  （１９９７）、を参照）、ＮＬＲＲ  １／２／３（Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．３５，  ｐ．３１−４０，  （１９９６）；または、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．３６，  ｐ．４５−５２，  （１９９６）、を参照）、Ｐａｌ（Ｇｏｍｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  Ｖｏｌ．２０，  ｐ．３２０６−３２１３，  （２０００）、を参照）、ＬＩＧ−１（Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７１，  ｐ．２２５２２−２２５２７，  （１９９６）、を参照）およびペルオキシダシン（Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｒ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｍｂｏ  Ｊ．，  Ｖｏｌ．１３，  ｐ．３４３８−３４４７，  （１９９４）、を参照）である。ＬＲＲｓおよび免疫グロブリン様ドメインに加えて、ＮＬＲＲ  １／２／３およびＰａｌはフィブロネクチン  タイプ３  ドメインを有する。また、ペルオキシダシンはペルオキシダーゼおよびスロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）／プロコラーゲン  ドメインを有する。ＬＲＲｓおよび免疫グロブリン様ドメイン（類）の両方を有するタンパク質においては、Ａｌｉファミリーの細胞外ドメインは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＫｅｋ１およびＫｅｋ２のそれらと有意の類似性を示し、前者のそれはキイロショウジョウバエの胚におけるＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）に結合して、腹側化シグナルを制限することにより背腹のパターニングを制御するＧｒｋ／ＥＦＧＲ経路を阻害する（Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．９６，  ｐ．８４７−８５６，  （１９９９）、を参照）。ＫｅｋおよびＡｌｉｖｉｎ  ファミリーの間で一次構造の構成は高く保存されている（図１１−３）。Ｋｅｋファミリーは、システイン−リッチ配列に隣接した１個の不完全なＬＲＲ，および６つの完全なＬＲＲｓ、１つの免疫グロブリンＣ２様ループ、ならびに一個の一回貫通型膜貫通ドメイン（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，  Ｎ．，  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１７８，  ｐ．６３−７６，  （１９９６）、を参照）を有する。膜貫通ドメインおよびＬＲＲドメインにおいて、Ａｌｉｖｉｎ  ファミリーおよびＫｅｋファミリーの間に最も高い相同性が観察されたが、細胞内ドメインでは相同性は観察されなかった。さらにＡｌｉｖｉｎ  ファミリーの細胞外ドメインは、Ｔｒｋファミリーのそれと相同であった。Ｔｒｋタンパク質は、シグナルペプチド配列、システイン−リッチ配列に隣接した３つのＬＲＲｓ、二つの免疫グロブリンＣ２様ループ、一回膜貫通型膜貫通ドメイン、および細胞内チロシン−キナーゼドメインを含んでいる神経栄養因子受容体である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  Ｖｏｌ．６，  ｐ．１８０７−１８１１，  （１９９１）、を参照）。ヒトＴｒｋ  Ｃの細胞外ドメインはヒトＡｌｉｖｉｎ  １  のそれについて２１％のアミノ酸同一性と３７％の類似性を示し、ヒトＡｌｉｖｉｎ  １  と最も高い相同性を示した。
【００７０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、小脳顆粒細胞の脱分極依存性およびＮＭＤＡ依存性生存を示すグラフである。小脳顆粒細胞を、５ｍＭ  ＫＣｌおよび３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液（■−■）、１５ｍＭ  ＫＣｌおよび３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液（□−□）、２５ｍＭ  ＫＣｌおよび３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液（○−○）、ならびに、１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌを含む培養液（●−●）中で培養した。さらに、１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌを含む培養液中で培養した細胞については、３．５日間培養を行った後、３００μＭ  ＡＰ−５を加えてＮＭＤＡ受容体をブロックし、アポトーシスを誘導した（▲−▲）。細胞の生存率はＭＴＴ法で測定し、２５ｍＭ  ＫＣｌおよび３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液中で培養した細胞の細胞生存に対する相対的生存率をプロットした。
【図２】図２は、ディファレンシャルディスプレイの結果を示すゲル電気泳動の写真である。レーンＡは、５ｍＭ  ＫＣｌの存在下で３．０ＤＩＶ培養した小脳顆粒細胞のトータルＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物である。レーンＳは、１５０μＭ  ＮＭＤＡ、１５ｍＭ  ＫＣｌ存在下で３．０ＤＩＶ培養した小脳顆粒神経細胞のトータルＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物である。６％シークエンシングゲルで分析した。
【図３】図３は、Ａｌｉｖｉｎ  １  タンパク質のドメインを示す模式図である。ラットマウスおよびヒトａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームはそれぞれ、５２０、５１９、５２２アミノ酸のタンパク質をコードする。ＬはＮＨ２−末端のシグナルペプチド配列を、ＮＣおよびＣＣはシステイン−リッチドメインを、ＬＲＲはロイシンリッチリピートを、ＩＧは免疫グロブリンＣ２−様ドメインを、ＴＭは膜貫通ドメインを、ならびに、ＩＤはＣＯＯＨ−末端領域のおよそ１００アミノ酸の細胞内ドメインを表す。
【図４−１】図４−１Ａは、神経顆粒細胞におけるａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロッティングの結果を示す写真である。５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、または、１５０μＭ  ＮＭＤＡおよび１５ｍＭ  ＫＣｌの両方、のいずれかの存在下で培養した顆粒神経細胞から抽出した全ＲＮＡサンプル（１０μｇ）をノーザンブロッティングに供した。ディファレンシャルディスプレイ解析で得られたｃＤＮＡ（ラットａｌｉｖｉｎ  １  ｃＤＮＡの３’−非翻訳領域に対応する）をプローブとして用いた。下の枠はＧ６ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。
図４−１Ｂは、図４−Ａの結果を定量した値を示すグラフである。神経顆粒細胞は５ｍＭ  ＫＣｌ（△−△）；１５ｍＭ  ＫＣｌ（○−○）；２５ｍＭ  ＫＣｌ（▲−▲）；または、１５ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０μＭ  ＮＭＤＡの両方（●−●）；のいずれかの存在下で培養した。
【図４−２】図４−２Ａは、ＡＰ−５でのＮＭＤＡレセプターのブロッキングによるａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡ発現の早い下方制御を示すノーザンブロッティングの写真である。神経顆粒細胞は１５ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０μＭ  ＮＭＤＡを含有する培地中で４．５日培養し、ＮＭＤＡレセプターは最終濃度３００μＭのＡＰ−５の添加によってブロックした。３．３ｋｂのバンドはａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡに対応するバンドである。下の枠はＧ６ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。
図４−２Ｂは、図４−２Ａの結果を定量化した値を示すグラフである。
【図４−３】図４−３Ａは、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡ発現についての様々な阻害剤の効果を示すゲル電気泳動の写真である。小脳の顆粒神経細胞は、２５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地中で４日間培養した。培地は５ｍＭ  ＫＣｌを含有するものに交換し、さらに２４時間培養を続け、その後その細胞は５ｍＭ  ＫＣｌ（５）；１５ｍＭ  ＫＣｌ（１５）；２５ｍＭ  ＫＣｌ（２５）；または、１５  ｍＭ  ＫＣｌおよび１５０μＭ  ＮＭＤＡの両方（Ｎ）；で刺激した。阻害剤はＫＣｌおよび／またはＮＭＤＡによる刺激の３０分前に培養培地に加えた。刺激の後（２４時間）、全ＲＮＡを抽出し、競合ＰＣＲ解析に供した。使用した阻害剤は３５μＭ  シクロヘキシイミド（ＣＨＸ）、４．０μＭ  アクチノマイシンＤ（ＡｃＤ）または０．２μＭ  ニフェジピン（ＮＦＤ）を含む。ニフェジピンのビヒクルとしてエタノールを用いた。
図４−３Ｂは、図４−３Ａに示したデータを定量化したグラフである。
【図５】図５は、テトロドトキシン存在下および非存在下でのａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現量を評価したグラフである。ラットの大脳皮質神経細胞を１４日間培養した（ｃｏｎｔｒｏｌ）。テトロドトキシン（１μＭ）を培養液に加え、さらに３０時間培養を行った（＋ＴＴＸ）。その後、培養液を新しいものと取り替え、さらに３０時間培養した（−ＴＴＸ）。それぞれのサンプルからＲＮＡを抽出し、競合的ＰＣＲによりａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発現量を評価した。
【図６】図６Ａは、ａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの組織分布をノーザンブロッティングにより評価した結果の写真である。全ＲＮＡ（１０μｇ）を成体ラットの様々な組織から抽出し、ノーザンブロッティングに供した。下の枠は２８Ｓ  ｒＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を示す。
図６Ｂは、ラット小脳におけるａｌｉｖｉｎ  １  ｍＲＮＡの発生期の発現をノーザンブロッティングで評価した際の写真である。全ＲＮＡは生後の特定の日の小脳から抽出し、１０μｇ  ＲＮＡをノーザンブロッティング解析に供した。下の枠は２８Ｓ  ｒＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を示す。
図６Ｃは、図６Ｂの結果を定量化したデータを示すグラフである。
【図７】図７Ａは、ラットの全脳抽出物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗ラットＡｌｉｖｉｎ  １  抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す写真である。
図７Ｂは、ラット小脳におけるＡｌｉｖｉｎ  １  の免疫組織化学上の局在を示す写真である。ＭＬは分子層、ＰＬはプルキンエ細胞層、ＧＬは顆粒細胞層をそれぞれ表す。
図７Ｃは、ラット海馬におけるＡｌｉｖｉｎ  １  の免疫組織化学上の局在を示す写真である。図中、ＣＡ、ＣＡ１およびＣＡ２における“ＣＡ”は、Ｃｏｒｎｕ  Ａｍｍｏｎｉｓ（アンモン角）の略であり、“ＤＧ”はｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ（歯状回）の略である。
【図８】図８は、脳におけるＡｌｉｖｉｎ  １  の細胞下の分布を評価したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。１０週齢のラットの全脳を様々な細胞成分画分に分離した。タンパク質（１００μｇ）を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
【図９】図９Ａは、初代培養小脳顆粒細胞へＡｌｉｖｉｎ  １  タンパク質発現ベクターを導入した細胞の写真を示す。発現ベクターを培養０日目に小脳顆粒細胞に導入し、５ｍＭ  ＫＣｌおよび３０μＭ  ＡＰ−５を含む培養液で培養した。培養３．０日に４％パラホルムアルデヒドで固定し、抗Ｆｌａｇ抗体およびヘキスト色素による染色を行った。トランスフェクションした細胞は抗Ｆｌａｇ抗体による免疫染色およびＥＧＦＰによる蛍光により同定した。アポトーシスを起こしている細胞はヘキスト色素による染色により、収縮した、あるいは断片化した核を持つ細胞として検出した。（ａ−ｄ）Ａｌｉｖｉｎ  １−Ｆｌａｇ融合タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした細胞、（ｅ−ｈ）対照ベクターをトランスフェクションした細胞、（ａおよびｅ）ＥＧＦＰの蛍光、（ｂおよびｆ）抗Ｆｌａｇ抗体およびアレキサ５９４フロアー結合二次抗体による免疫染色、（ｃおよびｇ）ヘキスト色素による染色、（ｄおよびｈ）ＥＧＦＰ蛍光像、抗Ｆｌａｇ抗体免疫染色像、ヘキスト染色色素のオーバーレイ。矢印は、遺伝子導入された細胞を示す。
図９Ｂは、Ａｌｉｖｉｎ  １  発現ベクター、または、対照ベクターを小脳顆粒細胞へトランスフェクションした後、５ｍＭ  ＫＣｌ／３０μＭ  ＡＰ−５の存在下での培養でアポトーシスする細胞の割合を示すグラフである。
図９Ｃは、小脳の顆粒神経細胞生存における抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体の効果を示すグラフである。抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体はＢＭＥ培地に対してよく透析し、０．２２μｍメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過することにより滅菌した。顆粒神経細胞は２５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地中で培養した。抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体または非免疫抗体を培養液に１．０ＤＩＶで加え、５．０ＤＩＶにおいて生存を解析した。２回のの独立した実験の典型的な結果を示した。それぞれの値は二つの解析の平均±Ｓ．Ｄ．である。抗Ａｌｉｖｉｎ  １  抗体（●−●）、非免疫抗体（□−□）。図９Ｄは、ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５７−４０２）の小脳の顆粒神経細胞の生存における効果を示すグラフである。ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５２−４０２）をＢＭＥ培地に対してよく透析し、０．２２μｍメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じて濾過することにより滅菌した。小脳顆粒神経細胞は、２５ｍＭ  ＫＣｌを含有する培地中で培養した。ラットＡｌｉｖｉｎ  １（５７−４０２）を培養液に２．０ＤＩＶで加え、そして神経細胞の生存は６．０ＤＩＶで検定した。２回の独立した実験の典型的な結果を示した。それぞれの値は二つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１０】図１０は、マウスａｌｉｖｉｎ  １  遺伝子の染色体上の局在のマッピングを示す模式図である。マーカーの間の隔たりをｃｅｎｔｉＲａｙｓ（ｃＲ）として示したマウス染色体１５の高分解能ＲＨマップ。マウスａｌｉｖｉｎ  １  の遺伝子座は染色体１５のセントロメアからおよそ５５．３ｃＭに位置する。Ｍｉｔマーカーの相対的な位置はマウスゲノムデータベース（ＭＧＤ２００２）から取得した。
【図１１−１】図１１−１は、Ａｌｉファミリーの構成要素のそれぞれの間の相同性を示す概略図である。かっこの外側の数字は同一性％を示し、一方かっこの中の数字は類似性％を示す。
【図１１−２】図１１−２は、ヒトＡｌｉファミリーの構成要素のドメインの構成を示す模式図である。かっこの外側の数字は同一性％を示し、一方かっこの中の数字は類似性％を示す。Ｌ：シグナルペプチド配列を含むリーダー配列、ＮＣ：ＮＨ２−末端隣接システイン−リッチドメイン、ＬＲＲ：ロイシン−リッチリピート、ＣＣ：ＣＯＯＨ−末端隣接システイン−リッチドメイン、ＩＧ：免疫グロブリンＣ２−様ループ、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＩＤ：細胞内ドメイン。
【図１１−３】図１１−３は、ヒトＡｌｉｖｉｎ  １  のドメイン構成およびキイロショウジョウバエＫｅｋファミリーのドメインの構成を示す模式図である。かっこの外側の数字は同一性％を示し、一方かっこの中の数字は類似性％を示す。Ｌ：シグナルペプチド配列を含むリーダー配列、ＮＣ：ＮＨ２−末端隣接システイン−リッチドメイン、ＬＲＲ：ロイシン−リッチリピート、ＣＣ：ＣＯＯＨ−末端隣接システイン−リッチドメイン、ＩＧ：免疫グロブリンＣ２−様ループ、ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＩＤ：細胞内ドメイン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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