(57)【要約】【課題】  免疫学的活性物質を固定化させた担体粒子を用いる免疫学的測定方法において、該担体粒子に固定化した免疫学的活性物質の失活や、該担体粒子に対して測定試料中に共存するタンパク質の非特異吸着がなく、かつ迅速、簡易、高感度で実施し得る方法を提供する。【解決手段】  ポリマーからなる粒子に固定化した免疫学的活性物質Ａと他の免疫学的活性物質Ｂとを、水性液体中で反応させる工程を含む免疫学的活性物質の測定方法において、該粒子として、少なくとも粒子表面部が下記一般式（１）【化１】2005091236.tif 000011（式中、Ａはアルキレン基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子又は水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）で表される基（１）と非イオン性含酸素基を有する芳香族基Ａｒ（２）を側鎖に有するポリマーからなる粒子を用いるとともに、該反応を圧電素子の存在下で行うことを特徴とする免疫学的活性物質の測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーからなる粒子に固定化した免疫学的活性物質Ａと他の免疫学的活性物質Ｂとを、水性液体中で反応させる工程を含む免疫学的活性物質の測定方法において、該粒子として、少なくとも粒子表面部が下記一般式（１）
【化１】
2005091236.tif 000010
（式中、Ａはアルキレン基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子又は水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）
で表される基（１）と非イオン性含酸素基を有する芳香族基Ａｒ（２）を側鎖に有するポリマーからなる粒子を用いるとともに、該反応を圧電素子の存在下で行うことを特徴とする免疫学的活性物質の測定方法。
【請求項２】
該免疫学的活性物質Ａが抗体であり、該免疫学的活性物質Ｂが抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該免疫学的活性物質Ａが抗原であり、該免疫学的活性物質Ｂが抗体である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性液体中に存在する免疫学的活性物質（抗体、抗原）を迅速、簡易かつ高感度で測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
水性液体中に存在する免疫学的活性物質（抗原、抗体等）を測定するために、免疫学的反応（抗原抗体反応）を利用することは広く行われている。このような免疫学的測定方法において、乳化重合法によって作成したポリスチレン粒子等の担体粒子上に、あらかじめ免疫学的活性物質Ａを物理吸着法により固定化させ、この粒子を他の免疫学的活性物質Ｂと反応させて、該免疫学的活性物質Ｂの濃度を検出する方法が知られている。
【０００３】
しかし、免疫学的活性物質を固定化させるために用いられているポリスチレン粒子等の従来の担体粒子の場合、その表面に固定化した抗体等の免疫学的活性物質が変質（失活）を生じやすいという問題や、その担体粒子表面に測定試料中に共存するタンパク質等の非特異吸着が生じる等の問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、免疫学的活性物質を固定化させた担体粒子を用いる免疫学的測定方法において、該担体粒子に固定化した免疫学的活性物質の失活や、該担体粒子に対して測定試料中に共存するタンパク質の非特異吸着がなく、かつ迅速、簡易、高感度で実施し得る方法を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明によれば、以下に示す免疫学的活性物質の測定方法が提供される。
【０００６】
（１）ポリマーからなる粒子に固定化した免疫学的活性物質Ａと他の免疫学的活性物質Ｂとを、水性液体中で反応させる工程を含む免疫学的活性物質の測定方法において、該粒子として、少なくとも粒子表面部が下記一般式（１）
【化２】
2005091236.tif 000002
（式中、Ａはアルキレン基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子又は水酸基を有していてもよいアルキル基を示す）
で表される基（１）と非イオン性含酸素基を有する芳香族基Ａｒ（２）を側鎖に有するポリマーからなる粒子を用いるとともに、該反応を圧電素子の存在下で行うことを特徴とする免疫学的活性物質の測定方法。
（２）該免疫学的活性物質Ａが抗体であり、該免疫学的活性物質Ｂが抗原である前記（１）に記載の方法。
（３）該免疫学的活性物質Ａが抗原であり、該免疫学的活性物質Ｂが抗体である前記（１）に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、粒子表面に固定化した免疫学的活性物質の失活の問題や、該粒子表面への試料中に共存するタンパク質の非特異吸着の問題がなく、かつ迅速、簡易、高感度で実施し得る免疫学的活性物質の測定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明においては、その少なくとも表面部が、下記一般式（１）で表される基（１）及び下記一般式（２）で表される基（２）を側鎖に有する非水溶性のポリマー（以下、ポリマーＡと略記する）からなる粒子（以下、粒子Ａとも言う）Ａを、免疫学的活性物質固定化用粒子として用いる。
【化３】
2005091236.tif 000003
前記式中、Ａはアルキレン基を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子又は水酸基を有していてもよいアルキル基を示す。
【化４】
2005091236.tif 000004
前記式中、Ａｒは非イオン性含酸素基を有する芳香族基を示す
【０００９】
前記一般式（１）において、Ａはアルキレン基を示すが、その炭素数は１〜６、好ましくは２〜３である。このようなアルキレン基としては、例えば、エチレン、プロピレン、トリメチレン等が上げられる。Ｒ１〜Ｒ３を示す水酸基を有していてもよいアルキル基において、その炭素数は１〜６、好ましくは１〜４、より好ましくは１〜２である。この場合のアルキル基は、直鎖状、分枝状、又は環状であることができる。メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔーブチル、ｎ−ペンチル、インぺンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、シクロヘキシルヒドロキソメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ−ｎ−プロピル、ヒドロキシ−イソブチル、ヒドロキシ−ｎ−ペンチル、ヒドロキシ−ｎ−ヘキシル、ヒドロキシシクロヘキシル等が挙げられる。
【００１０】
前記一般式（２）において、Ａｒは非イオン性含酸素基を有する芳香族基示すが、この場合の芳香族基には、アリール基及びアリールアルキル基が包含される。アリール基としては、フェニル、ナフチル、トリル、メチルナフチル等が挙げられ、その炭素数は６〜１２、好ましくは６〜１０である。アリールアルキル基としては、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル等が挙げられ、その炭素数は７〜１３、好ましくは７〜１１である。非イオン性含酸素基としては、ニトロ基、水酸基、炭素数約１〜６のアルコキシ基等が挙げられる。
【００１１】
ポリマーＡ中に含まれる前記一般式（１）の基（１）と前記一般式（２）の基（２）との割合は、それらのモル比［１］／［２］で、１９〜４、好ましくは６〜４である。
【００１２】
前記基（１）及び基（２）を側鎖に含有するポリマーには、コポリマーが包含され、このコポリマーとしては、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー等が挙げられる。その分子量は、数平均分子量で、５０００以上、好ましくは１万以上であり、その上限値は特に制約されないが、通常６万程度である。
【００１３】
前記ポリマーＡは、各種の方法で製造可能であるが、通常、下記一般式（３）
【化５】
2005091236.tif 000005
で表されるモノマー（３）と、下記一般式（４）
【化６】
2005091236.tif 000006
で表されるモノマー（４）とを重合反応させることによって製造することができる。このようなポリマーの製造については、例えば特許第２８７０７２７号公報に詳述されている。
【００１４】
前記一般式（３）において、Ａ、Ｒ１〜Ｒ３は前記と同じ意味を有し、Ｂはアルキレン基である。この場合のアルキレン基Ｂにおいて、その炭素数は１〜６、好ましくは２〜３である。
前記一般式（４）において、Ｘはアルキレン基を示し、その炭素数は１〜６、好ましくは２〜３である。Ａｒは前記と同じ意味を有する。
【００１５】
ポリマーＡにおいて、前記一般式（３）のモノマー（３）と前記一般式（４）のモノマー（４）との割合は、モル比［３］／［４］で、１９〜４、好ましくは６〜４である。
【００１６】
本発明においては、モノマーとしては、必要に応じ、前記一般式（３）及び（４）のモノマーに加えて、下記一般式（５）で表されるモノマー（５）を用いることができる。
【化７】
2005091236.tif 000007
前記式中、Ｒは炭化水素基であり、その炭素数は１〜１３である。
該炭化水素基には、アルキル基及び芳香族基が包含される。
アルキル基には、炭素数１〜１２、好ましくは１〜６の鎖状アルキル基及び炭素数３〜１２、好ましくは６〜８の環状アルキル基が包含される。
該芳香族基には、炭素数６〜１２、好ましくは６〜１０のアリール基及び炭素数７〜１３、好ましくは７〜１１のアリールアルキル基が包含される。
【００１７】
該モノマー（５）の使用割合は、全モノマーに対して、通常、７０モル％以下、好ましくは６０モル％以下、より好ましくは４０〜５５モル％である。
【００１８】
該モノマー（３）とモノマー（４）と必要に応じてのモノマー（５）との重合反応は、有機溶媒中で重合開始剤の存在下で反応させることにより得られる。有機溶媒は、モノマーが溶解するものであればよく、このようなものとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルム等が挙げられる。重合開始剤としては、２，２’アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスマレノニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ララロイル等が挙げられる。反応温度は４０〜８０℃好ましくは５０〜７０℃である。
【００１９】
本発明で用いる免疫学的活性物質の固定化用担体として用いる粒子は、その少なくとも表面部がポリマーＡからなる粒子Ａであり、該粒子Ａは、乳化法等の各種の方法で製造することができる。
粒子Ａを好ましく製造するには、先ず、ポリマーＡの水溶液を作り、この溶液に芯物質を含む油性液体を加え、超音波を照射して乳化する。これにより、芯物質の表面がポリマーＡで被覆された粒子Ａが得られる。
該芯物質としては、該油性液体に溶解するポリマーや、該液体に溶解しない微粒子（ポリマー、無機物質等）が用いられる。
前記粒子Ａを製造する方法において、芯物質を用いない場合には、粒子全体がポリマーＡからなる粒子Ａを得ることができる。
【００２０】
本発明で用いるポリマーＡからなる粒子Ａにおいて、その平均粒径は、５０〜６００ｎｍ、好ましくは１００〜３００ｎｍである。その粒子Ａの表面電位は、ゼロに近い負の値（マイナス０．３〜５ミリボルト）を示す。
【００２１】
本発明では、反応生成物濃度の測定手段として水晶振動子等の圧電素子を用いるが、この圧電素子としては、従来公知の各種のものを用いることができる。一般的には、その発振周波数が１〜１０，０００ＭＨｚ／秒、好ましくは５〜１５５ＭＨｚ／秒のものが好ましく使用される。この圧電素子、例えば水晶振動子において、その厚さは０．２〜０．００１ｍｍ、好ましくは０．２５〜０．０１ｍｍであり、その寸法は、その電極表面積で表わして、０．２〜０．０００２ｃｍ２、好ましくは０．３〜０．０２ｃｍ２である。圧電素子の電極表面に用いる金属の材質には、クロムやチタンを下地に、金、銀、白金、ＩＴＯ、銅、ニッケル等をもちいることが出来るが、特に含塩溶液に接した際に安定性の高い金及び白金が好ましく、特に、金が経済的にも加工上でも最も好ましい。
圧電素子は、上記の特性を満たしていれば自作できるが、各種のものが市販されているので、本発明ではこのような市販品を用いることができる。
【００２２】
本発明では、これらの圧電素子の圧電効果を利用して免疫学的反応によって生成した反応生成物の濃度を測定するが、圧電素子としては、特に水晶振動子が好ましい。例えば、この水晶振動子の動作原理については、J. W. Grate, S. J. Martin, R. M. White, Anal. Chem., 65, 21 (1993) 940A-948A. の総説に記載されている。使用する水晶振動子では、１〜１，０００ＭＨｚの水晶振動子の基本周波数やその各自の倍音での発振周波数測定法及び共振周波数測定法が利用できる。
【００２３】
本発明においては、該水晶振動子等の圧電素子は、免疫学的反応を行う水性液体中に存在させるが、この場合、該圧電素子は、該素子表面を垂直にして配置されるか又は水平ないし傾斜して配置される。好ましくは該素子表面を垂直にして配置するのがよい。また、圧電素子の表面に付設されている２つの電極のうち一方は、水性液体と接触しないように、疎水性ないし撥水性物質により封止するのがよい。これにより、電極間でのショートが防止され、水性液体中の反応生成物濃度の測定を高精度に行うことができる。
該疎水性ないし撥水性物質としては、シリコーン樹脂や、含フッ素樹脂、ポリオレフィン樹脂等が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、該粒子Ａの表面には、あらかじめ免疫学的活性物質（抗体又は抗原等）を固定化させる。この場合の固定化方法としては、従来公知の各種の方法、例えば、物理的吸着法や共有結合法等を用いることができる。本発明では共有結合法が好ましい。共有結合法により免疫学的活性物質を粒子Ａに固定化させるには、必要に応じ、該ポリマーＡ中に反応性基、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、イソシアネート基、アルデヒド基、メルカプト基等をあらかじめ導入しておき、この反応性基に対して、所定の免疫学的活性物質を反応させればよい。
【００２５】
本発明の方法は、水性液体中で、該圧電素子の存在下で、該粒子Ａにあらかじめ固定化した免疫学的活性物質Ａと、該免疫学的活性物質Ａと反応する他の免疫学的活性物質Ｂとを反応させる免疫学的反応工程を包含する。
該免疫学的活性物質には各種のものが包含され、特に限定されるものではないが、例えば、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、アルブミン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、トランスフェリン、ハプトグロビン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＯ）等があげられる。
なお、固定化される抗体に対する抗原、または固定化される抗原に対する抗体が、測定対象の免疫学的活性物質（被検物質）として使用できる。
【００２６】
該免疫学的活性物質を含む水性液体としては、例えば、血清、血漿、リンパ、ずい液等の各種の水性液（水又は水溶液）が挙げられる。
【００２７】
本発明は、免疫凝集反応による抗原濃度測定や、サンドイッチ反応による抗原濃度測定等の各種の免疫学的活性物質の濃度測定法として有利に適用される。
【実施例】
【００２８】
次に、本発明を実施によりさらに詳細に説明する。なお、これらの実施例は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２９】
参考例１
前記一般式（３）で表されるモノマー（３）（但し、Ａ、Ｂはエチレン基、Ｒ１〜Ｒ３はメチル基）（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）４０モル％と、前記一般式（４）で表されるモノマー（４）（但し、Ｘはエチレン基、Ａｒはパラニトロフェニル基）１０モル％とモノマー（５）（ｎ−ブチルメタクリレート）５０モル％との混合物を、溶媒としてのエタノール中で、慣用のラジカル重合法で重合処理して、ポリマーＡのエタノール溶液を得た。
この場合、ポリマーＡは水溶性で、その数平均分子量は、４万であった。
次に、このポリマーＡの水溶液に、ジクロロメタン中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度でポリ乳酸を溶解した溶液を加え、超音波を照射して乳化して、ポリマーＡからなる粒子を含有する乳化液を得た。
次に、この乳化液から、それに含まれる溶媒を減圧下で蒸発除去してポリマーＡからなる粒子Ｉを得た。この粒子Ｉの平均粒径は２０２ｎｍであった。その表面電位は、マイナス５ｍＶであった。
【００３０】
参考例２
参考例１において、乳化条件を変更した以外は同様にして、粒子II（平均粒径２６３ｎｍ）及び粒子III（平均粒径６５４ｎｍ）を得た。
【００３１】
参考例３
参考例１、２で得たナノ粒子Ｉ、II、IIIに対して抗ＣＲＰモノクローナル抗体を以下のようにして固定化した。
抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体（コスモバイオ製）の１．１ｍｇを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬと、粒子を１％（ｗ／ｖ）含むように懸濁させた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬとを混合し、４℃で１０時間反応させた。その後、遠心分離により分離した抗体固定化ナノ粒子を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の１０ｍＬで洗浄し、当該の抗体固定化ナノ粒子濃度を０．２％（ｗ／ｖ）となるように調整した。得られた懸濁液を、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体固定化ナノ粒子液とした。
表１に粒子上に固定化された抗ＣＲＰモノクローナル抗体量を示す。
【００３２】
【表１】
2005091236.tif 000008
【００３３】
参考例４
参考例３で得た抗ＣＲＰモノクローナル固定化粒子上の未反応の活性エステル基を常法によりグリシン処理（ブロッキング処理）した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2005091236.tif 000009
【００３５】
比較参考例１
比較測定に使用するポリスチレンラテックス粒子への抗体の固定化を以下のように行った。
抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体（コスモバイオ製）の１．１ｍｇを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬと、ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．１２μｍ、積水化学工業（株）製）を１％（ｗ／ｖ）含むように懸濁させた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬとを混合し、４℃で１０時間反応させた。その後、遠心分離により分離した抗体固定化ポリスチレンラテックスを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の１０ｍＬで洗浄し、当該の抗体固定化ポリスチレンラテックスを粒子濃度が０．２％（ｗ／ｖ）となるように調整した。得られた懸濁液を、抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体固定化ポリスチレンラテックス液とした。
【００３６】
実施例１
（ポリマーナノ粒子Ａの免疫凝集反応によるＣＲＰ応答性の評価）
水晶振動子によるポリマーナノ粒子Ｉの免疫凝集反応測定を、文献の方法（Ｈ．Ａｉｚａｗａ，Ｓ．Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｋ．Ｏｇａｗａ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊ．Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｔｅｘ  Ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，７６（２００１）１７３−１７６．）に従って行った。
水晶振動子としては、円板状の市販品（日本電波工業（株）製、基本発振周波数：９ＭＨｚ／秒、厚さ：０．１８５ｍｍ、水晶板直径：８ｍｍ、水晶電極直径：５ｍｍ）を用いた。この水晶振動子片面にシリコーン樹脂で水晶板を貼り付け、片面の電極のみが溶液に接するようにした。この水晶振動子を１．２ｍＬの抗ＣＲＰ抗体固定化ナノ粒子Ｉを含む液体（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２）中に入れ、発振周波数が安定したところで２０μＬの各濃度のＣＲＰ溶液を添加した。ＣＲＰ溶液を添加すると、水晶振動子の発振周波数は時間の経過と共に減少する。
比較のために、比較参考例１の高分子ラテックス粒子を用いた結果では、周波数変化はポリマーナノ粒子Ｉに比べて小さいが、同様なＣＲＰ濃度応答性を示した。本現象は抗原抗体反応により、ＣＲＰ（抗原）を介して架橋結合した抗ＣＲＰ抗体固定化ナノ粒子Ｉが水晶振動子上に吸着することによって発振周波数が減少すると考えられる。
図１には、ポリマーナノ粒子Ｉと高分子ラテックス粒子により各ＣＲＰ濃度の測定を行った結果を示す。水晶振動子の発振周波数変化は添加したＣＲＰ濃度に比例し、臨床検査で陽性と判定するのに必要な濃度範囲（１ｍｇ／ｄＬ程度のＣＲＰ濃度）が上記の文献と同様に１０分程度で迅速に測定できる。
【００３７】
実施例２
（抗体固定化ポリマーナノ粒子Ａによる血清中のＣＲＰ濃度測定）
血清中のＣＲＰ濃度測定を、実施例１と同様にして行った。
水晶振動子片面にシリコーン樹脂で水晶板を貼り付け、片面の電極のみが溶液に接するようにした。この水晶振動子を１．２ｍＬの抗ＣＲＰ抗体固定化ナノ粒子Ｉを含む試料液（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．２）中に入れ、発振周波数が安定したところで２０μＬの各濃度のＣＲＰ溶液を添加した。ＣＲＰ溶液を添加すると、水晶振動子の発振周波数は時間の経過と共に減少する。
比較のために、比較参考例１の高分子ラテックス粒子を用いた結果では、周波数変化はポリマーナノ粒子Ｉに比べて小さいが同様なＣＲＰ濃度応答性を示した。本現象は抗原抗体反応により、ＣＲＰ（抗原）を介して架橋結合した抗ＣＲＰ抗体固定化ナノ粒子Ｉが水晶振動子上に吸着することによって発振周波数が減少すると考えられる。
図２には、ポリマーナノ粒子Ｉと高分子ラテックス粒子により各ＣＲＰ濃度の測定を行った結果を示す。水晶振動子の発振周波数変化は添加したＣＲＰ濃度に比例し、臨床検査で陽性と判定するのに必要な濃度範囲（１ｍｇ／ｄＬ程度のＣＲＰ濃度）が上記の文献と同様に１０分程度で迅速に測定できる。
【００３８】
実施例３
（ポリマーナノ粒子Ａのサンドイッチ反応によるＣＲＰ濃度の測定）
抗ＣＲＰ抗体を固定化するため、実施例１で示した基本周波数９ＭＨｚの水晶振動子の金表面を文献（Ｊ．−Ｗ．  Ｐａｒｋ，  Ｓ．  Ｋｕｒｏｓａｗａ，  Ｈ．  Ａｉｚａｗａ，  Ｄ．−Ｓ．  Ｈａｎ，  Ｍ．  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｃ．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｊ．  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｓ．−Ｍ．  Ｃｈａｎｇ，  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，４−Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ  ｕｓｉｎｇ  Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ＵＦＦＣ，  ５０，  ２，  ｐ１９３−１９５  （２００３）．；  Ｊ．−Ｗ．  Ｐａｒｋ，  Ｓ．  Ｋｕｒｏｓａｗａ，  Ｈ．  Ａｉｚａｗａ，  Ｓ．Ｗａｋｉｄａ，  Ｓ．  Ｙａｍａｄａ，  Ｋ．  Ｉｓｈｉｈａｒａ，  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，  ９１，  １５６−１６２  （２００３）．）のシステアミンとグルタルアルデヒドによる方法で化学的に活性化させた。その後、５０μｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体溶液を添加し、抗体を固定化した。その後、グリシンやＢＳＡでブロキングしてそれぞれの濃度のＣＲＰ標準品を用いて抗原抗体反応による周波数変化によってＣＲＰ濃度に対する検量線を取った。その後、抗ＣＲＰ抗体を固定化した各種濃度のポリマーナノ粒子Ｉを含む液を添加し、水晶振動子上に結合されているＣＲＰとのサンドイッチ反応によって周波数変化を増幅させた。第１段階目の抗原抗体反応による検量線と抗ＣＲＰ抗体を固定化したポリマーナノ粒子Ｉを応答の増幅手段として利用した第２段階目の抗原抗体反応によって増幅した周波数変化の検量線を比較して、周波数変化応答量の増幅を検討した結果を図３に示す。
血清試料中での非特異吸着の影響を検討するため、ＣＲＰが含まれている血清試料中でポリマーナノ粒子Ｉやポリスチレン粒子を用いて第２段階の抗原抗体反応を行った結果を比較した結果を図４に示す。
【００３９】
実施例４
（ポリマーナノ粒子Ａに結合した抗ＣＲＰ抗体の貯蔵安定性の評価）
ポリマーナノ粒子Ａに結合した抗ＣＲＰ抗体の貯蔵安定性については、抗ＣＲＰ抗体ポリマーナノ粒子Ｉの保存温度を５５℃まで高めて、２時間保存させた後、ＣＲＰ標準品を用いて第二抗原との抗体結合を行った。ナノ粒子Ｉ上に固定化した抗体の失活問題を検討するため、粒子Ｉの保存温度を５５℃に設定した温度促進試験を実施した後、その粒子Ｉを用いて抗原（ＣＲＰ）に対する反応性を２５℃での標準反応性と比較した。
実験の参照として従来の手段との比較をするため、抗ＣＲＰ抗体を固定化した同じ粒子直径のポリスチレン粒子を用いて同じ実験を行ってポリマーナノ粒子Ｉの結果と比較した。その結果を図５に示す。
【００４０】
以上のように、水晶振動子の発振周波数変化によりポリマーナノ粒子Ａの免疫応答性について評価を行った。その結果、抗ＣＲＰ抗体固定化ポリマーナノ粒子Ａを用いた免疫凝集反応及びサンドイッチ反応では、いずれも従来のナノ粒子で問題であった血清試料を用いた場合に生じる共存タンパクの非特異吸着の問題もなく、ＣＲＰ抗原濃度の測定が可能である。また、温度促進試験後でも、抗原に対する反応性が促進試験無しに比べ約８０％の反応性を示し、ポリマーナノ粒子上に固定化された抗体が失活してなかった事が明らかとなり、本発明の著しい効果が明らかとなった。すなわち、本発明では、高分子ナノ粒子であるポリマーナノ粒子Ａを抗体等の生体由来分子認識分子固定化用粒子として用いることによって、医療診断や環境分野において、免疫学的活性物質を、迅速、高精度、高感度、高安定化、かつ簡便に測定する方法を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】水晶振動子を用いたポリマーナノ粒子Ａの免疫凝集反応によるＣＲＰ濃度測定結果を示す。
【図２】水晶振動子を用いたポリマーナノ粒子Ａの免疫凝集反応によるＣＲＰ濃度測定結果を示す。
【図３】抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体固定化ポリマーナノ粒子Ａでの周波数変化量のサンドイッチ反応による測定結果を示す。
【図４】抗ヒトＣＲＰモノクローナル抗体固定化ポリマーナノ粒子Ａでのヒト血清試料中のＣＲＰ濃度に対する周波数応答量のサンドイッチ反応による測定結果を示す。
【図５】ポリマーナノ粒子Ａに結合した抗ＣＲＰ抗体の貯蔵安定性を示す。
【図１】
2005091236.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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