(57)【要約】  【課題】複数個のタンパク質などの標的物質を含んだ生体成分中から標的物質の発現状況に基づいて複数個の標的物質を同時に検出することができる同時物質検出方法を提供すること。  【解決手段】基盤上に数多くの抗体などのパートナー物質を固定し、標識マーカーで標識した標識基準試料と検査試料とを、または別々の色素でタンパク質を色素固定した測定用検体と基準用検体とを所定の割合、特に好ましくは７対３の割合で混合した後に、この混合検体を基盤上の抗体と接触させてその中のパートナー物質と結合させて、この結合体を基にして所望の複数の標的物質を同時に定性・定量する。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個の標的物質を同時に測定する同時物質測定方法であって、測定用試料中に存在する前記複数個の標的物質を、前記複数個の標的物質に対するパートナー物質と接触させることによって前記複数個の標的物質を同時に測定することからなる同時物質測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の同時物質測定方法において、前記測定用試料が基準試料と、検査試料とを所定割合で混合してなることからなる同時物質測定方法。
【請求項３】
請求項1または２に記載の同時物質測定方法において、前記所定割合が、基準基準試料１対検査試料９から基準試料９対検査試料１までの割合であることからなる同時物質測定方法。
【請求項４】
請求項1ないし３のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記所定割合が、基準試料２対検査試料８から基準試料８対検査試料２までの割合であることからなる同時物質測定方法。
【請求項５】
請求項1ないし４のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記所定割合が、基準試料３対検査試料７から基準試料７対検査試料３までの割合であることからなる同時物質測定方法。
【請求項６】
請求項1ないし５のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記所定割合が、基準試料４対検査試料６から基準試料６対検査試料４までの割合であることからなる同時物質測定方法。
【請求項７】
請求項1ないし６のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記所定割合が、基準試料５対検査試料５の割合であることからなる同時物質測定方法。
【請求項８】
請求項1ないし７のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記基準試料が標識マーカーで標識されている標識基準試料であり、前記検査試料は標識マーカーで標識されていない非標識検査試料であることからなる同時物質測定方法。
【請求項９】
請求項1ないし７のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記基準試料が標識マーカーで標識されていない非標識基準試料であり、前記検査試料は標識マーカーで標識されている標識検査試料であることからなる同時物質測定方法。
【請求項１０】
請求項1ないし７のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記基準試料が第１標識マーカーで標識されている第１標識基準試料であり、前記検査試料は第２標識マーカーで標識されている第２標識検査試料であることからなる同時物質測定方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記パートナー物質を固相化支持体に固定化することからなる同時物質測定方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記パートナー物質に対して前記測定用試料中に存在する標的物質を接触させてパートナー物質と標的物質との複合体を形成することからなる同時物質測定方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記パートナー物質と標的物質との複合体を検出することからなる同時物質測定方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記複合体に結合する標識マーカーに基づいて所定の標的物質を測定することからなる同時物質測定方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記標的物質と前記パートナー物質との結合を、前記標的物質を標識する標識マーカーもしくは第１標識マーカーと、前記パートナー物質を標識する標識物質との結合を検出することからなる同時物質測定方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１５項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、前記パートナー物質は固相化されていることからなる同時物質測定方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１６項のいずれか１項に記載の同時測定方法において、前記パートナー物質は標識物質によって固相化前に標識されているか、または固相化後に標識することからなる同時物質測定方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１７項のいずれか１項に記載の同時測定方法において、基準試料中に存在する複数個の標的物質を標識マーカーで標識した標識標的物質を測定し、別に検査試料中に存在する複数個の標的物質を標識マーカーで標識した標識標的物質を測定し、それぞれの測定結果を比較して検査試料中に存在する複数個の標的物質を同時に測定することからなる同時物質測定方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１８項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法に使用できる測定用支持体であって、所定種類のパートナー物質が個別に分離された状態で固定化されていることからなる測定用支持体。
【請求項２０】
請求項１ないし１９項のいずれか１項に記載の測定用支持体において、測定目的に適った所定種類のパートナー物質が固定化されていることからなる測定用支持体。
【請求項２１】
請求項１ないし２０項のいずれか１項に記載の測定用支持体において、測定用支持体がシート状、プレート状またはビーズ状であることからなる測定用支持体。
【請求項２２】
請求項１ないし２１項のいずれか１項に記載の測定用支持体において、固定化されたパートナー物質に対して試料中の標的物質が結合して複合体を形成していることからなる測定用支持体。
【請求項２３】
請求項１ないし２３項のいずれか１項に記載の測定用支持体を使用して測定中の複数種類の標的物質を測定することからなる同時物質測定方法。
【請求項２４】
請求項１ないし２３項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、固定化されたパートナー物質に対して測定用試料を接触させることによって該試料中に含まれる複数種類の標的物質との複合体を形成することからなる同時物質測定方法。
【請求項２５】
請求項１または２４項のいずれか１項に記載の同時物質測定方法において、パートナー物質と標的物質との複合体を検出することからなる同時物質測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特に多種多様な生物種由来の試料中に存在する多種類のタンパク質等の生体成分物質などの物質を同時に定性ならびに定量することができる同時物質測定方法およびそれに使用する測定用支持体に関する。この発明に係る同時物質測定方法は、試料中において著しい量的差違がある非常に多種類の物質を同時に測定することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジー技術の進展に伴って、例えば、ヒトゲノムの全塩基配列である６０億塩基対もの完全なゲノム配列が解析された。このゲノム解析に基づくその後の研究結果から、遺伝子の数は２万個強であることが報告されている。
【０００３】
遺伝子は、各生体を特徴づける設計図であり、この遺伝子こそが生物の多様性の基本を決定している。この遺伝子によって描かれている設計図に基づいて、各生体を構成するタンパク質が生成され、このタンパク質が生物の多様性を構成している。また、これらの遺伝子が一体となって成長時期や外部環境に応じてタンパク質の発現様式を様々に変えている。
【０００４】
このように各生体を特徴づける遺伝子の塩基配列が突然変異などの理由により変異すれば、当然その遺伝子は正常な発現をすることができず、その設計図も変化してしまう。その結果、そのような変異した設計図を基に構築されるタンパク質も必然的に変異して正常な機能を果たすことができないことになる。遺伝子変異は様々な障害や疾患などの原因ともなっているので、遺伝子塩基配列の変異を解析することは、かかる変異による様々な障害や疾患などの原因を解明することになる。しかしながら、この遺伝子解析だけでは生体内における実際の病状や病態などの把握は不可能である。生体内における実際の病状や病態などは、遺伝子の発現によって構築されたタンパク質の変異の結果として反映されているからである。遺伝子の塩基配列変異の解析は非常に重要であるが、実際の病状や病態などの把握には生体内における多種多様なタンパク質の状態をできるだけ実際の状態のままで解明することも非常に重要である。そこで、多種多様なタンパク質全体の総合的解析は極めて重要な課題である。
【０００５】
特に遺伝子のＤＮＡやＲＮＡなどの塩基配列についての突然変異を検出する方法は数多く開発されていて、その目的のためにＤＮＡチップやＲＮＡチップなどのマイクロアレイチップが汎用されるようになってきた。遺伝子は、構成成分が４種類の塩基のみからなりかつ構造も１重鎖か２重鎖と比較的単純であり、安定でもある。その上、ＰＣＲなどによる増幅という手段も確定されていることから、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップなどのマイクロアレイチップは比較的作製するのが容易である。このようなマイクロアレイチップは、数千から数万の遺伝子の発現状態を同時に測定可能であるという利点をある（非特許文献１、２；特許文献１、２、３）。これらのチップは、データの再現性・定量性が低いという難点があるが、遺伝子機能の解析には大きな役割を果たしている。
【０００６】
一方、全ての生体を構成しているタンパク質は僅か２０種類のアミノ酸から構成されているが、そのアミノ酸で構成されている生体構成成分の数は膨大で、遺伝子と比較して格段に多くかつ複雑である。また各タンパク質は独自の複雑な立体構造を有していて、この立体構造がタンパク質によって非常に異なっていること、またこのタンパク質の立体構造が生体中におけるタンパク質の安定性に大きく関与していることが、タンパク質の発現様式の研究を困難にしている。これらに加えて、つまり、フォールデイングの問題に加えて、タンパク質の濃度も大きく異なっていて、例えば、血清アルブミンのように約６ｇ／１００ｍｌも存在するものもあれば、他方ホルモン類のように数マイクログラム／１００ｍｌしか存在しないものまであり、なんと数百万倍という濃度差があることも、タンパク質全体の総合的解析を困難にしている問題点の１つとなっている。その上、タンパク質は、水溶性のものもあれば、生体膜構成成分のように水不溶性でありながら可溶化を必要とするものまであり、さらに分子量も１０００以下のペプチドから脱水素酵素のように複合体を形成して全体として数百万という高分子量のものまで存在する。タンパク質はこのような複雑で多様な形態で生体内で存在することから、かかる多種多様で複雑なタンパク質の発現様式を同時に検出することは極めて困難であると考えられる。
【０００７】
このように、タンパク質の発現様式の変化は、様々な障害や疾病などとして反映されることから、タンパク質の発現様式の解明は、障害や疾病などの治療ばかりではなく、診断ならびに予防や予後にとっても極めて重要な役割を果たすことになる。しかしながら、現状では、タンパク質全体の発現様式を同時に解析することは不可能であり、個々のタンパク質毎に解析していく以外に手段がない。
【０００８】
これまでタンパク質の解析方法として数多くの解析技法が利用されていて、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、ＨＰＬＣ、超遠心機、カラムクロマトグラフィー、アフィニテイークロマトフラフィー、電気泳動などの手法を使用した方法などが知られている。
【０００９】
この他にも、タンパク質解析に利用するために、遺伝子チップのように１枚のスライドグラスほどの大きさの中に複数種類のタンパク質を固定化したいわゆるプロテインチップも開発されてきている（非特許文献３、４、５）。また、かかるプロテインチップの１例として、２種類以上の抗原または抗体をスライドグラス基板上に固定化した病態解析チップが報告されている（特許文献４）。このプロテインチップは、血液検査での各検査項目に対して少なくとも１種類の抗原または抗体をスライドグラス基板上に固定化した病態解析チップであって、特に被験者が家庭で自ら採血し全血をこのチップに滴下して病態を解析する目的のものである（特許文献４）。したがって、この病態解析チップは、血液中の生体成分であるタンパク質を総合的に解析するものではない。
【非特許文献１】Fodor, S. P., etal., Science 251:767-773, 1991
【非特許文献２】Schana, M, et al.,Science 270:467-470, 1995
【非特許文献３】小嶋謙一他、化学センサー研究会、１７、１０６、２００１
【非特許文献４】Kim, T. E., et al., Exp.Mol. Med. 31:152, 2002
【非特許文献５】Christodoulides, N., etal., Anal. Chem. 74:3030, 2002
【特許文献１】ＷＯ２００２/０７０７４７号公報
【特許文献２】ＷＯ２００２/０９２８１３号公報
【特許文献３】特開２００３−３３９３７５号公報
【特許文献４】特開２００４−１９１１２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明者らは、多種類のタンパク質を同時に解析可能なタンパク質解析手段を開発すべく鋭意検討・研究をした結果、ニトロセルロース膜やＰＶＤＦなどの基盤となる膜上に数多くの抗体をスポットして、別々の色素でタンパク質を色素固定した測定用検体と測定基準となる標準検体とを所定の割合で混合した後に基盤上の抗体と接触させて結合した結合タンパク質の相対的タンパク質発現濃度を測定することにより同時に多種類のタンパク質の発現を測定することができることを見出して、発明を完成し、その発明についてはすでに特許出願を行った（特願２００３−４２３３０３、特願２００４−１３１７８８）。
【００１１】
本発明者らは、上記発明を更に発展させて、多種類のタンパク質を同時に解析可能なタンパク質解析の別の手法を開発すべく鋭意検討・研究をした結果、色素以外の標識マーカーを用いて抗原−抗体反応を利用することによって測定用検体中の多種類のタンパク質などの分析物質を検出することを見出して、この発明を完成するに到った。
【００１２】
したがって、この発明は、１つの形態として、複数個の標的物質を同時に測定する同時物質測定方法であって、測定用試料中に存在する複数個の標的物質を、複数個の標的物質に対するパートナー物質と接触させることによって複数個の標的物質を同時に測定することからなる同時物質測定方法を提供することを目的としている。
【００１３】
この発明は、その態様として、測定用試料が、検査試料と基準試料とを所定割合で混合した混合試料であって、基準試料が標識マーカーで標識された標識基準試料であり、検査試料が標識マーカーで標識されていない非標識検査試料である態様と、基準試料が標識マーカーで標識されていない非標識基準試料であり、検査試料が標識マーカーで標識されている標識検査試料である態様と、基準試料が第１標識マーカーで標識された標識基準試料であり、検査試料が第２標識マーカーで標識されている標識検査試料である態様とからなる同時物質測定方法を提供することを目的としている。
【００１４】
この発明は、さらに別の態様として、基準試料と検査試料とがそれぞれ同一標識マーカーで標識されている標識試料であって、両試料をそれぞれ別個に測定することからなる同時物質測定方法を提供することを目的としている。
【００１５】
この発明は、別の形態として、上記測定用試料中に存在する標的物質と複合体などを形成することができるパートナー物質を固定化している測定用支持体を提供することを目的としている。
【００１６】
この発明は、さらに別の態様として、上記測定用支持体を使用して、同時に多量のタンパク質の定性または定量を同時に行うことができる測定方法を提供することを目的としている。
【００１７】
更に、この発明は、上記測定に適用することができる測定用キットおよびそれを用いた測定方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、この発明は、複数個の標的物質を同時に測定する同時物質測定方法であって、測定用試料中に存在する前記複数個の標的物質を、前記複数個の標的物質に対するパートナー物質と接触させることによって前記複数個の標的物質を同時に測定することからなる同時物質測定方法を提供する。
【００１９】
この発明は、その態様として、測定用試料が、検査試料と基準試料とを所定割合で混合した混合試料であって、基準試料が標識マーカーで標識された標識基準試料であり、検査試料が標識マーカーで標識されていない非標識検査試料である同時物質測定方法を提供する。
【００２０】
この発明の別の態様は、測定用試料が、検査試料と基準試料とを所定割合で混合した混合試料であって、基準試料が標識マーカーで標識されていない非標識基準試料であり、検査試料が標識マーカーで標識されている標識検査試料である同時物質測定方法を提供する。
【００２１】
この発明の更に別の態様は、測定用試料が、検査試料と基準試料とを所定割合で混合した混合試料であって、基準試料が第１標識マーカーで標識された標識基準試料であり、検査試料が第２標識マーカーで標識されている標識検査試料である同時物質測定方法を提供する。
【００２２】
この発明は、更に別の態様として、基準試料と検査試料とがそれぞれ同一標識マーカーで標識されている標識試料であって、両試料をそれぞれ別個に測定することからなる同時物質測定方法を提供する。
【００２３】
この発明は、別の形態として、第１標識抗体結合可能物質と第２標識抗体結合可能物質とを所定割合で混合し、前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質との両者と結合する対象抗体を前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質との相対割合に基づいて測定して前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質とを検出することからなる同時物質測方法を提供する。
【００２４】
また、この発明は、別の態様として、第１標識抗体結合可能物質を含む基準用検体と第２標識抗体結合可能物質を含む測定用検体とを所定の割合で混合し、複数種類の抗体に接触させて、対象抗体に結合した前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質との相対割合に基づいて前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質とを検出することからなる検出方法を提供する。
【００２５】
更に、この発明は、別の態様として、第１標識抗体結合可能物質と第２標識抗体結合可能物質とを所定割合で混合した混合検体を測定用支持体上に結合した複数種類の抗体と接触させて対象抗体に結合した前記第１標識抗体結合可能物質と前記第２標識抗体結合可能物質との相対割合を測定することができる測定用支持体を提供する。
【００２６】
この発明は、更に別の態様として、測定用支持体と、基準試料となる第１標識抗体結合可能物質と、から構成されている測定用キットおよびこの測定用キットを使用して、測定用検体に含まれる第２標識抗体結合可能物質を定性または定量することからなる測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
この発明に係る同時物質検出方法は、特に、疾患診断や健康診断などでの血液検査において測定される検体中の複数の疾患関連物質を同時に検出することができるという大きな利点がある。
【００２８】
この発明に係る測定用支持体およびそれを用いた測定方法は、遺伝子チップのような１枚のスライドグラスの大きさの中で一度に数百種類のタンパク質などの生体成分物質を固定化して、その固定化支持体に、例えば全血のような試料にそのまま標識マーカーを添加して標識した試料を添加するだけで、多種類のタンパク質を同時に解析可能にするという極めて大きな効果がある。この発明の測定用支持体およびそれを用いた測定方法はまた極めて単純でかつ極めて簡単に多量のタンパク質などの生体成分物質を同時に検出することができるという効果も有している。
更に、この発明の測定用キットは、その構成が非常に簡単であると共に、その操作方法も非常に簡単であるという大きな効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、この発明を実施態様によって説明するが、この発明は下記実施態様に何ら限定されるものではないことは当然である。また、下記実施態様においては、タンパク質を例にして説明するが、下記実施態様は、この発明の具体的形態をより明確に例示して説明するための目的で記載するものであって、この発明を限定する意図で記載されるものでは一切ないことと理解さるべきである。したがって、この発明は、下記実施態様から派生するあらゆる改良ならびに変法などもこの範囲内に包含するものと解釈すべきである。
【００３０】
この発明に係る同時物質測定方法は、検体としての試料中に存在する複数種類の標的物質を同時に測定することからなっている。特に、健康診断や疾病診断などの血液検査などにおいて、従来では、通常、各検査項目の１項目毎に測定して検査されているのに対して、この発明の方法は、かかる検査項目を複数項目または必要な全検査項目を同時に測定して検査することができる画期的な技法であるといえる。
【００３１】
[試料]
この発明の方法に使用することができる試料は、例えば、人間や家畜、ペット等の動物、植物または細菌などの被験対象由来のものであっても、また工場もしくは家庭などからの工場廃水や生活排水などの試料であっても、この発明が適用できる由来の試料であればいずれの由来の試料であってもよい。かかる試料としては、例えば、脳組織、肺、胃、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管組織（小腸、大腸、直腸、結腸など）、皮膚組織、神経組織、血管組織等の各種臓器や、脳細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋肉細胞、軟骨細胞等の細胞、赤血球、血小板細胞、各種白血球・リンパ球等の血球系細胞等の細胞などの由来の生体由来試料、例えば、血清、血漿、血球成分、髄液、滑液、リンパ液等の体液、唾液、汗、涙液などの分泌物、尿、糞便のような排泄物、喀たん、膿、毛髪、垢や耳垢などの皮膚由来物、精液、胎盤、生理おりもの等の生体由来試料、また、例えば、食品、飲料、水道水、海水、湖沼水、河川水、工場廃液、半導体用洗浄水、医療器具等を洗浄した後の洗浄液等の環境試料などが挙げられる。これらの試料は、不溶性であっても、可溶性であってもいずれでもよく、更に高分子糖類であっても抗体と反応できるものであればいずれでも測定することができ、いずれも、必要に応じて、水や生理食塩水、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液等の通常この分野で用いられている緩衝液等によって可溶化処理などの処理をして使用することができる。
【００３２】
これらの試料は、上記被験対象から当該技術分野で慣用されている技術によって容易に採取することができる。例えば、患者からの検体としての血液採取は注射などの慣用手段で容易に行うことができ、また環境試料などは現場から容器などによって掬ったりなどして採取して行うことができる。
【００３３】
なお、以下、本明細書においては、説明を簡略にするために、例えばヒトを試料由来の例として説明するが、このヒトについての説明はその他の試料にも実質的同様に適用できるものであって、この発明を限定する意味では一切使用していないことをここに明記する。
【００３４】
（検査試料）
この発明の同時物質検出方法に使用する検査試料は、被験対象から採取された試料であって、この発明の方法で検出する標的物質を含有している試料またはかかる標的物質を含有していると思われる試料を意味する。この発明においては、検査試料は、被験対象から採取された状態のままの未精製の状態でも使用することができるが、必要に応じて、成分分離や固形物分離、可溶化処理等の通常の前処理を施すこともできる。例えば、試料が血液の場合、血液を全血のままの状態または全血から血球成分を分離して得られた血清または血漿などの状態で試料として使用することができる。血清を使用する場合は、非動化処理をすると、標的物質が変性してしまい検出できなくなったりまたは検出結果に悪影響を及ぼしたりする恐れがあるので、変性などしないように適正な処理を施すのがよい。
【００３５】
（基準試料）
一方、この発明に使用される基準試料は、標的物質を正常範囲内の値もしくは量を含んでいる標準試料であって、検査試料中の標的物質に対する基準範囲内の標的物質を含有している試料を意味している。例えば、検査試料が血液などの場合には、この「基準試料」は、標的物質が正常値の健常人から採取した血液を意味している。この基準試料は、単独の人からの血液でもよいが、例えば２、３名以上、好ましくは５名以上、より好ましくは２０名以上、更に好ましくは１００名前後の複数人からの血液を混合したものが更に好ましい。また、基準試料には、ある種の標的物質を外部から添加することもできる。この場合には、検査試料にも、同一標的物質を同一量添加するのが好ましい。これにより、両試料中の標的物質の比較が容易に行うことができるようになる。なお、基準試料は、必要に応じて、各標的物質が正常範囲内に含有されるように人工的に調製することも可能である。
【００３６】
この発明で使用する基準試料は、標的物質の測定値の対照として使用される。この基準試料は、単一の状態で測定した測定値を対照値として使用することによって試料中の各標的物質を検出することができる。
【００３７】
（標識マーカー）
この発明の方法においては、検査試料および／または基準試料は、下記のような標識マーカーによって標識されるが、標識マーカーの種類は適用する測定方法によって変えるのがよい。また、検査試料および／または基準試料の標識は、特に特定の標識方法に限定されるものではないが、各試料に標識マーカーを直接添加することによって行うのがよい。これにより試料中に存在する実質的全ての標的物質を標識マーカーで標識することができる。
【００３８】
なお、試料中の標的物質の中には、使用する標識マーカーで標識困難な場合もあるが、この場合には、例えば、精製した標的物質を標識マーカーで標識して各試料に添加することもできる。
【００３９】
この発明において標識マーカーとして使用される標識物質は、通常、当該技術分野で標識物質として使用されているものであればいずれも使用でき、特に限定されるものではないが、試料中の検出対象である標的物質の種類や測定方法などによって適宜選択して使用するのがよい。かかる標識マーカーとしては、ビオチンと、これと特異的に結合するアビジンならびにストレプトアビジンの他に、例えば、酵素としてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β-ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、デヒドロゲナーゼまたはルシフェラーゼ等が使用でき、放射性同位元素として131Ｉ、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓまたは99Ｔｃ等が使用でき、また色素、蛍光性物質ならびに発光性物質としてメチレンブルー、ローズベンガル、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、アクリジン、リボフラビン、プロフラビン、アクリフラビン、クレゾールレッド、インドール、ピリドキサルリン酸、フルオレセイン、フルオレセイン・イソシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ローダミン（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダミン・イソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、カルボキシルメチルインドシアニン（Ｃｙ３）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ジメチルアミノナフタレンスルホン酸、ナフチルアミン、ビオチン、オレゴングリーン、テキサスレッド、クーマシーブリリアントブルー、メチルオレンジもしくはこれらの誘導体などが挙げられる。また磁性マーカーとしては、例えば、磁性体微粒子として酸化鉄、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト、純鉄、酸化クロム、ニッケル、コバルト、マンガン、銅、ニッケル、コバルト添加酸化鉄等の強磁性またはフェリ磁性物質、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）微粒子、マグネタイト微粒子などの表面をデキストランなどの糖やプロテインＡなどのタンパク質等の微粒子に結合させたＩｇＧ抗体などの抗体（または抗原）などが使用できる。これらの磁性マーカーに加えて、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレン、ポリアクリルアミドなどの末端に重合性ビニル基を有し親水性で分子量が５００〜１０００のマクロモノマーを磁性微粒子の表面に吸着させ、カルボキシル基を有し親水性のビニル化合物から成るモノマーと架橋剤とを加えて共重合させたＳＱＵＩＤ磁気センサー用磁性マーカーなども使用することができる。これら標識マーカーは、使用する試料や標的物質の種類ならびに適用される測定原理などにより適宜選択するのがよい。
【００４０】
（測定用試料）
この発明の１形態に係る同時物質検出方法において測定に供される試料、つまり、測定用試料は、被験対象から採取された検体としての検査試料と、対照としての基準試料とを後述するように所定割合ずつ混合した混合試料として使用される。このように検査試料を対照としての基準試料と混合することによって、検査試料に含まれる検査すべき標的物質を、基準試料中に含まれる対照量の標的物質との割合として検出することができることになる。
【００４１】
この発明の形態において使用できる測定用試料は、標識マーカーで標識した標識基準試料と標識マーカーで標識しない非標識検査試料とを混合して調製した測定用試料と、標識検査試料と非標識基準試料とを混合して調製した測定用試料と、標識基準試料と標識検査試料とを混合して調製した測定用試料とが使用することができる。なお、標識基準試料と標識検査試料とを混合して調製した測定用試料の場合には、標識基準試料と標識検査試料とにおいて使用する標識マーカーとしては、その種類は変なるが、同一測定方法で測定できるものを使用する。
【００４２】
また、この発明は、標識検査試料と、標識基準試料とを別々に測定して、標識検査試料の測定結果と、対照としての標識基準試料の測定結果とを比較することによって検査試料中の標的物質を検出する別の形態をも包含している。この場合は、両試料を標識する標識マーカーも測定方法も同一である。なお、本明細書においては、上記混合試料について説明するが、この説明はこの別の形態の検出方法にも特段の記載がない限り実質的に同様に適用することができる。
【００４３】
なお、本明細書においては、標識検査試料ならびに標識基準試料やこれらに類似した表現をしている場合があるが、正確には、例えば、検査試料または基準試料中の標的物質が標識マーカーで標識されている試料を意味していると理解できる。他方、非標識検査試料や非標識基準試料などの表現は、かかる試料中に含まれている標的物質は一切標識されていない試料を意味していると理解できる。
【００４４】
また、本明細書で使用する「非標識」という用語ならびにこれに関連する用語は、試料が標識マーカーで完全に標識されていない場合を含めて、必要に応じて、この発明の目的を損なわずかつ試料中の標的物質の検出結果に対して悪影響を及ぼさない程度であれば、標識マーカーで標識されている場合をも包含している意味として使用されているものと理解することができる。
【００４５】
上記のようにして、測定用試料は、検査試料と基準試料とを所定割合ずつ混合することによって調製される。この検査試料と基準試料との混合割合は、特に限定されるものではなく、両試料を検出する場合にコントラストが大きくなり、その比較検討が確実にかつ十分にできるようにするのがよい。この発明においては、検査試料と基準試料とは、例えば、約１：９（検査試料対基準試料。以下同じ）から約９：１までの割合、好ましくは約２：８から約８：２までの割合、より好ましくは約３：７から約７：３までの割合であるのがよい。
【００４６】
この発明に係る同時物質検出方法において検査試料中に存在する標的物質を検出するには、検査試料と標識基準試料とを所定割合で混合することによって、検査試料中の標的物質は、基準試料中の標的物質に対して所定割合で測定用試料中に存在することになる。従って、基準試料中の標的物質は、この測定用試料中に含まれる全ての標的物質に対して上記混合割合と同じ割合で測定用試料中に存在する。そこで、この基準試料中の標的物質の割合を、基準試料だけからなる対照試料の標的物質に対する割合と対比することによって測定することができ、その結果、検査試料中の標的物質を定性・定量することができる。
【００４７】
上記のように、本明細書においては、上記検査試料と基準試料とを混合した測定用試料について説明するが、その説明は各試料を別々に測定する場合にも、特段の場合を除いて、同様に適用できるものと理解することができる。この発明の同時物質検出方法においては、上記検査試料と基準試料とを上記のように混合して調製する測定用試料の他に、各試料を、それぞれ個別に混合することなしに、同様に、同一標識マーカーで標識し、同一測定原理に従って測定して、各測定結果に基づいて各試料中の標的物質を検出・定量することもできる。
【００４８】
（標的物質）
この発明に係る同時物質検出方法によって検出される標的物質は、通常、標的物質によって特異的な認識可能な、例えば、結合能または反応性などを有する物質（以下、「パートナー物質」という）と結合または反応などして結合性複合体などを形成して、この結合性複合体を測定できるものであればいずれでもよい。かかる結合性複合体としては、例えば、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジン、およびその他の結合性複合体を形成する分子が挙げられる。
【００４９】
かかる標的物質としては、例えば、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖質、サイトカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マーカー等を含む疾患関連マーカー、疾患関連マーカーレセプター、核酸、薬物もしくは薬物代謝物またはこれらのレセプター等およびそれらの一部分が挙げられる。上記物質の例としては下記のようなものが例示でき、またこれらの部分とは、少なくともレセプター物質との結合能などを決定する部位を含む１部分であってもよい。また、この発明では、抗原やレセプターを表面に発現する細菌、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、リステリア菌等の病原性細菌、放線菌、酵母、かび、ウイルス等の微生物も検出することができる。なお、本明細書で使用する用語は、厳密な定義によって分類しているのではなく、分類によって重複している場合もあり、単に例示的に使用しているものと理解することができる。
【００５０】
この発明で使用する抗原は、抗体と抗原・抗体反応によって結合し得る物質であればいずれも使用することができ、特に限定されるものではなく、例えば、あらゆるタンパク質の他、タンパク質の抗原決定基を含むフラグメント、細胞表面受容体であるＣＤ抗原、サイトカイン、ホルモン、環境ホルモン、微生物由来タンパクまたはペプチドあるいは糖鎖抗原、リガンド、レセプター、アレルゲン、免疫グロブリン、レクチン、糖鎖、脂質、リポ多糖、抗生物質、毒素、腫瘍マーカー等を含む疾患関連マーカー抗原などを包含している。
【００５１】
この発明で使用する抗体としては、上記抗原に対して抗原・抗体反応によって結合し得るポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそれら抗体の一部分であるフラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、Ｈ鎖モノマーまたはダイマー、Ｌ鎖モノマーまたはダイマー、１個のＨ鎖および１個のＬ鎖からなるダイマー等も挙げられる。
【００５２】
なお、この発明に使用する抗体、例えば、これらのポリクローナル抗体やモノクローナル抗体などは、当該技術分野に属する当業者に周知の方法に従って作製することができる。つまり、生体成分物質などの抗体結合可能物質などを抗原として、抗体を産生することができる動物種、例えば、ヒト、モルモット、ヤギ、ネズミ、ウサギ等の動物に免疫して、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などの抗体を常法に従って作製することができる。
【００５３】
また、ＣＤＲ領域などの抗体の一部分は、抗体をパパイン、トリプシンなどのプロテアーゼで処理および／またはｐＨと、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等の還元剤で処理することによって、または当該技術分野で慣用されている遺伝子工学的手法を用いても作製することもできる。
【００５４】
サイトカインおよびサイトカインレセプターとしては、例えば、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子ならびにそれらのレセプターなどが挙げられる。
【００５５】
ホルモンおよびホルモンレセプターとしては、例えば、下垂体ホルモン（黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質ホルモン（ＡＣＴＨ）、チロトロピン（ＴＳＨ）、プロラクチン等）、甲状腺ホルモン（トリヨードサイロニン（Ｔ３）、サイロキシン（Ｔ４）、サイログロブリン等）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン（ｈＣＧ、エストロゲン、テストステロン、ｈＰＬ等）、膵・消化管ホルモン（インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ガストリン等）、その他のホルモン（レニン、アンジオテンシンＩ、ＩＩ、エンケファリン、エリスロポエチン、ソマトスタチン（ＧＩＨ）等）などおよびそれらのレセプターなどが挙げられる。また、環境ホルモンとしては、例えば、トリブチルスズ、ノニルフェノール、４−オクチルフェノール、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、ベンゾフェノン、オクタクロロスチレン、フタル酸ジ−２−エチルヘキシルなどがあげられる。
【００５６】
微生物由来タンパクまたはペプチドあるいは糖鎖抗原としては、例えば、微生物、例えば結核菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、髄膜炎菌、淋菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス,炎テロウイルス、ポリオウイルス、ＥＢウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等のウイルス、カンジダ、クリプトコッカス等の真菌、レプトスピラ、梅毒トレポネーマ等のスピロヘータ、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物由来のタンパクまたはペプチドあるいは糖鎖抗原等が挙げられる。
【００５７】
リガンドとしては、例えばエストロゲン，ＴＳＨ等などが挙げられ、レセプターとしては、例えば、エストロゲン，ＴＳＨ等に対するレセプターなどが挙げられる。
【００５８】
アレルゲンとしては、例えば、ハウスダストや、コナヒョウダニ，ヤケヒョウダニ等のダニ類、スギ、ヒノキ、スズメノヒエ、ハルガヤ、ライムギ等の花粉、ネコ、イヌ、カニ等の動物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来する気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる吸入性アレルゲンや、米、麦、そば、卵白等の食物アレルゲンなどが挙げられる。
【００５９】
免疫グロブリンとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、これらの分解産物などが挙げられる。
【００６０】
レクチンおよびレクチン結合性糖質としては、例えば、コンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等、コンカナバリンＡ−グリコーゲン、デキストラン、酵母マンナン等、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）−キチンオリゴ糖等、インゲンマメ由来フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン含有糖質などが挙げられる。
【００６１】
糖鎖としては、例えば、ＡＢＯ抗原などが挙げられ、脂質としては、例えば、コレステロール等の脂質、カルジオリピン、ホスファチジルコリン等のリン脂質、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質、リポタンパク質などが挙げられ、またリポ多糖としては、例えばエンドトキシン等などが挙げられる。
【００６２】
核酸は、それと特異的に結合し得る物質が得られるのに十分な長さを有するものであれば特に制限はなく、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡなどの天然または合成の配列、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等のウイルス遺伝子の転写産物、各種疾患マーカー遺伝子の転写産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００６３】
薬物もしくは薬物代謝物は、治療目的で投与された薬物、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗てんかん薬、ジゴキシン、キニジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質等ならびにその代謝物などを包含している。
【００６４】
疾患関連マーカーとしては、疾患の診断やスクリーニングの指標として使用できる物質であればいずれも使用することができ、特に限定されるものではない。かかる物質としては、特に血液検査での検査項目、例えば生化学検査(例えば、血清タンパク質、アミノ酸・窒素化合物、血清酵素、血清ビリルビン、脂質、電解質・金属等)、内分泌学的検査(例えば、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎髄質・交感神経、副腎皮質、性腺・胎盤、糖代謝、消化管ホルモン、生理活性等)、血液・凝固・線溶系検査(例えば、凝固・線溶系検査等)、免疫血清検査(例えば、補体、免疫グロブリン、自己抗体等)、感染症検査(例えば、抗酸菌、真菌、一般細菌、微生物産生物・代謝産物、肝炎ウイルス等)、腫瘍・線維化マーカー(例えば、腫瘍マーカー、線維化マーカー)、尿・糞便検査、薬物・毒物などによって検査される物質などが挙げられる。これらの検査項目の検査結果から、疾患(例えば、呼吸器疾患、循環器疾患、消化器疾患、肝・胆・膵疾患、代謝・栄養疾患、内分泌疾患、血液・造血器疾患、腎・尿路疾患、神経疾患、感染症等、リウマチ性疾患、アレルギー性疾患・免疫不全症等)や各臓器の機能などの検査が行われる。
【００６５】
この発明により検出できる腫瘍マーカーは、癌の診断やスクリーニングの指標として使用することができる生体物質であれば特に制限はなく、例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ細胞、メラノーママーカー（ＮＫＩ／Ｃ３）、メラノーママーカー（ＰＡＬ／Ｍ１）、メラノーママーカー（Ｓ−１００α、β）、神経芽腫（ＣＥ７）、神経芽腫（ＡＤ２）、マリグニン、ペプシノーゲン、膵癌胎児性抗原（ＰＯＡ）、塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、胎児性プレアルブミン（ＥＰＡ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）、フェリチン、ポリアミン、免疫グロブリンκ鎖・λ鎖、β２−ミクログロブリン、トリプシンインヒビター、癌抗原（ＫＭＯ−１）、膵癌関連抗原（シアリルＳＳＥＡ−１）、ＳＣＣ抗原、膵癌関連抗原（ＤＵ−ＰＡＮ−２）、膵癌関連抗原（ＳＰａｎ−１）、癌抗原（ＣＳＬＥＸ−１）、糖鎖抗原（ＣＡ１９−９）、膵癌関連抗原（ＣＡ５０）、炭水化物抗原（シアリルＴｎ）、糖鎖抗原（ＣＡ７２−４）、糖鎖抗原（ＣＡ７２−４）、糖鎖抗原（ＣＡ１５−３）、糖鎖抗原（ＣＡ１２５）、偏平細胞癌（ＳＣＣ）、癌抗原（ＮＣＣ−ＳＴ−４３９）、前立腺特異抗原（ＰＡ）、リポヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、可溶性ＩＣＡＭ−１（ｓＩＣＡＭ−１）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、アルドラーゼ、アルカリフォスファターゼ、酒石酸抵抗性酸フォオスファターゼ（破骨細胞抗原）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、腫瘍関連抗原（ＣＹＦＲＡ−２１−１）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、５’−ヌクレオチドフォスフォジエステラーゼアイソザイムＶ、異常プロトロンビン、サーファクタントプロテインなどの他、例えば、ＮＫ細胞関連抗原（ＣＤ２、ＣＤ７#、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ５７）、未熟リンパ球・顆粒球抗原（ＣＤ１０）、汎Ｔリンパ球抗原（ＣＤ２#、ＣＤ３、ＣＤ５）、Ｔリンパ球サブセット抗原（ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ#）、汎Ｂリンパ球抗原（ＣＤ１９#、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ）、Ｂリンパ球抗原（ｂｃｌ−２）、Ｂリンパ球サブセット抗原（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等）、胸腺Ｔリンパ球抗原（ＴｄＴ）、胸腺Ｔリンパ球抗原（ＣＤ１ａ）、単球抗原（ＣＤ１４#）、顆粒球・単球抗原（ＣＤ１５）、幹細胞関連／顆粒球抗原（ＣＤ３４# 、ＣＤ３３#、ＣＤ１３#、ミエロペルオキシダーゼ、好中球エラスターゼ）、組織球抗原（ＣＤ６８、Ｓ−１００、ライソザイム）、樹状細胞関連抗原（ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＤＲＣ−１、Ｋｉ−Ｍ４、Ｓ−１００）、増殖抗原関連（ＣＤ７１#、Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ）などが挙げられる。
【００６６】
更に詳細には、上記腫瘍マーカーや線維化マーカーに加えて、この発明に使用する標的物質は、例えば、一般的な健康診断で測定される検査項目において検査される各種物質をも包含している。かかる検査物質としては、例えば、総タンパク、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、アルブミン／グロブリン比、総ビリルビン量、直接ビリルビン量、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＬＤＨアイソザイム１〜５、コリンエステラーゼ（ＣＨＥ）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）、クレアチニン、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬ−コレステロール、β−リポ蛋白、ＬＤＬ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、尿酸、血清アミラーゼ、Ｐアミラーゼ、リウマトイド因子（ＲＡ）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、抗ストレプトリジンＯ価（ＡＳＬＯ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヘパプラスチン、可溶性ＩＬ−２受容体、可溶性ＣＤ−４受容体、可溶性ＣＤ−８受容体、可溶性Ｆａｓ（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、可溶性ＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ハプテン（ジゴキシン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、コルチゾール等）、サイトカイン類（例えば、免疫担当細胞由来サイトカインとしてＴｈ−１サイトカイン（ＩＦＮα、ＩＬ−２等）；Ｔｈ−２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３等）；Ｔｈ−３サイトカイン（ＴＧＦβ等）、炎症サイトカインとしてＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−８等）、造血関連サイトカインとしてＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等）、組織細胞成長因子としてＦＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ等）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、クリオグロブリン、非特異的ＩｇＥ、ＣＨ５０、Ｃ３、Ｃ４、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体、リュウマトイド因子、アデノシンデアミラーゼ、グアナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、トリプシン（αＩＡＴ−Ｔ）、膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）、エラスターゼ、膵ホスホリパーゼＡ２、ペプシノーゲン、補体、心室筋ミオシン軽鎖（Ｌｃ）、心室筋トロポミオシン、ＩＩＩ型プロコラーゲンアミノペプチド、ＩＶ型コラーゲン（７Ｓドメイン）、インスリン様成長因子−１（ソマトメジンＣ）、インスリン様結合蛋白３型（ＩＧＦＢＰ−３）、甲状腺刺激ホルモン、アルギニンパソプレシン、血漿レニン、グリコアルブミン、インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、ソルビトール脱水素酵素、抗ＧＡＤ抗体、心房性ナトリウム利尿ペプチド、などが挙げられる。また、感染症検査項目やウイルス検査項目として、例えば、Ａ群連鎖球菌抗原、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス等のウイルスならびにＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＣＶ抗体、ＨＩＶ抗体、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、エイズウイルス抗原等のウイルス関連抗体や抗原などが挙げられる。
【００６７】
（パートナー物質）
他方、この発明の方法において使用されるパートナー物質は、通常、標的物質に対して例えば結合能または反応性などを有し、標的物質と結合または反応などして結合性複合体などを形成し、その複合体を測定原理に基づいて測定することによって検出することができる。かかるパートナー物質としては、例えば、標的物質と結合または反応などして複合体などを形成でき、かつ、標的物質を分解や変性などしてその検出に悪影響を及ぼさない限り、いずれの物質であっても使用することができ、特に限定されるものではない。またパートナー物質は、検出する標的物質の種類によって適宜変えることができる。かかるパートナー物質として、例えば、抗原、抗体、ホルモン、ホルモンレセプター、レクチン、レクチン結合性糖質、サイトカイン、サイトカインレセプター、腫瘍マーカー等を含む疾患関連マーカー、疾患関連マーカーレセプター、薬物もしくは薬物代謝物または薬物もしくは薬物代謝物レセプター、核酸、およびそれらの部分などが好ましい。なお、上記物質の部分とは、少なくとも標的物質との結合能などを決定する部位を含む１部分であってもよい。
【００６８】
更に詳細には、パートナー物質としては、例えば、アルブミンに対しては抗アルブミン抗体、グロブリンに対しては抗グロブリン抗体、総ビリルビンに対しては抗ビリルビン抗体、直接ビリルビンに対しては抗ビリルビン抗体、ＧＯＴに対しては抗γ−ＧＯＴ抗体、ＧＯＰに対しては抗ＧＯＰ抗体、γ−ＧＴＰに対しては抗γＧＴＰ抗体、ＧＰＴに対しては抗ＧＰＴ抗体、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）に対しては抗アルカリフォスファターゼ抗体、コリンエステラーゼに対しては抗コリンエステラーゼ抗体、アンジオテンシン変換酵素に対しては抗アンジオテンシン変換酵素抗体、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）に対しては抗ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）抗体、インスリンに対しては抗インスリン抗体、アルドラーゼに対しては抗アルドラーゼ抗体、クレアチニンキナーゼに対しては抗クレアチンキナーゼ抗体、総コレステロールに対しては抗コレステロール抗体、ＬＣＡＴに対しては抗ＬＣＡＴ抗体、中性脂肪に対しては抗中性脂肪抗体、尿酸に対しては抗尿酸抗体、Ｃ−反応性タンパク質に対してはＣ−反応性タンパク質抗体の他、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）に対しては抗アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）抗体、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に対しては抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）抗体、乳酸脱水素酵素に対しては抗乳酸脱水素酵素抗体、ＣＫ−ＭＢに対しては抗ＣＫ−ＭＢ抗体、梅毒定性に対しては抗梅毒菌抗体、トロポニンＴに対しては抗トロポニンＴ抗体、Ｄダイマー定性に対しては抗Ｄダイマー抗体、血液型に対しては抗血液型抗原抗体、ヘモグロビンに対しては抗ヘモグロビン抗体、フィラデルフィア染色体に対しては抗フィラデルフィア染色体抗体、ビタミンＢ１２に対しては抗ビタミンＢ１２抗体、ミオシン軽鎖に対しては抗ミオシン軽鎖抗体、アルドステロン濃度に対しては抗アルドステロン抗体、ガストリンに対しては抗ガストリン抗体、アミラーゼに対しては抗アミラーゼ抗体、ＩｇＥに対しては抗ＩｇＥ抗体、ハプトグロビンに対しては抗ハプトグロビン抗体、心筋ミオシン軽鎖に対しては抗心筋ミオシン軽鎖抗体、トロポニンＴ抗体に対しては抗トロポニンＴ抗体、間質性肺炎マーカー抗体に対しては抗間質性肺炎マーカー抗体、肝細胞増殖因子抗体に対しては抗肝細胞増殖因子抗体、補体抗体に対しては抗補体抗体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体に対しては抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体、リユウマトイドに対しては抗リユウマトイド因子抗体、サイトカインに対しては抗サイトカイン抗体（抗インターロイキン１〜１３抗体、抗ＭＩＰ−１α抗体、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体、抗ＬＩＦ抗体、抗ＳＣＦ抗体、抗ＴＧＦーβ１抗体、抗ＴＧＦ−β２、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＴＮＦーβ抗体、抗インターフェロンα抗体、抗インターフェロンβ抗体、抗インターフェロンγ抗体等）、リユウマトイド因子に対しては抗リユウマトイド因子抗体、レニン活性に対しては抗レニン抗体、Ａ群連鎖球菌に対してはＡ群連鎖球菌抗原、風疹に対しては風疹抗原、抗ＨＢｓ抗原に対しては抗ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原に対しては抗ＨＢｅ抗体、ＨＣＶ抗体に対してはＨＣＶ抗原、��ＩＶ抗体に対してはＨＩＶ抗原、ＨｂＡｌｃに対しては抗ＨｂＡ１ｃ抗体、抗凝固因子ＩないしＸなどが挙げられる。
【００６９】
この他、αフェトプロテイン、フェリチン、ＣＥＡ、ＴＰＡ、ＣＡ１９−９、ＳＣＣ、ＰＳＡ、ＮＳＥ、ＣＡ７２−４、ＳＬＸ、ＢＣＡ２２５等の上記腫瘍マーカーに対する抗原または抗体も使用することができる。例えば、抗腫瘍マーカータンパク質抗体として、抗αーフェトプロテイン抗体、抗ＰＩＶＫＡ抗体、抗ガン胎児性抗原抗体、抗ＣＡ１５−３抗体、抗ＢＦＰ抗体、抗βーＣＦ抗体、抗ＩＡＰ抗体、抗ＩＣＴＰ抗体、抗ＣＹＦＲＹ抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗トリプシンインヒビター抗体などに加えて、上記腫瘍マーカーに対する抗体ならびに抗原が挙げられる。
【００７０】
ここで、この発明における標的物質とパートナー物質との結合関係の例について説明すると、次の通りとなる。
例えば、検出する標的物質が抗原である場合には、その標的物質に対するパートナー物質としては、その抗原に対する抗体、ペプチド、レクチンなどの組み合わせが使用できる。他方、検出する標的物質が抗体である場合には、その標的物質に対するパートナー物質としては、その抗体と結合し得る抗原、ペプチド、レクチンなどの組み合わせが使用できる。
【００７１】
また、例えば、この発明の方法で検出する標的物質がホルモン、レクチン、サイトカインまたは腫瘍マーカーなどである場合には、パートナー物質としては、標的物質と結合能などを有する物質であって、それぞれに対して特異的なホルモンレセプター、レクチン結合性糖質、サイトカインレセプターまたは腫瘍マーカーレセプターなどを組み合わせて使用するのがよい。また、標的物質がそれぞれのレセプターである場合、キャプチャー物質は、標的物質と結合能を有する物質であって、各レセプターを認識する物質、例えば、ホルモン、レクチン、サイトカイン、腫瘍マーカーなどが使用できる。
【００７２】
例えば、この発明の方法で検出する標的物質が核酸の場合には、標的物質と結合能を有するパートナー物質は、上記した標的物質が抗原の場合に例示された物質の組み合わせに加えて、標的物質に対して相補的な核酸もしくは核酸結合蛋白質または標的物質に対して親和性を有する抗体、ペプチド、レクチン等の組み合わせなどが使用できる。
【００７３】
このようにして形成される結合性複合体は、例えば、抗体−抗原、ビオチン−アビジンやストレプトアビジン、ホルモンーレセプター、レセプターリガンド、タンパク質−ペプチド鎖、酵素−基質、レクチン−糖鎖、核酸−核酸、ＩｇＧ−プロテインＡなどとして形成され、かかる複合体を、例えば標識マーカーを指標として適正な測定手段で測定することによって、標的物質を測定することができる。
【００７４】
（固相化支持体）
この発明において標的物質を測定するためには、標的物質またはその標的物質と結合性複合体などを形成するパートナー物質のいずれかを固相化支持体に当該技術分野で慣用されている方法によって固定化または固相化などするのがよい。
【００７５】
固相化支持体としては、血液などの試料を保持することが可能である限り、固相化支持体の材質、形状等は特に制限されない。かかる固相化支持体の材質としては、公知の天然の物質ならびに合成の高分子等が使用でき、例えば、ガラス、シリカゲル、シリコンなど各種セラミックスや、磁性粒子、フェライト、鉄、ニッケル、コバルト等を主成分とした合金といった無機系の担体や、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン系誘導体、無水マレイン酸系重合体、ポリオレフィン、ポリウレタン、セルロースアセテート、ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ナイロン、ポリアクリロニトリルなどの有機合成ポリマーなど有機系の担体などが挙げられる。固相化支持体の形状は、粒子状、板状、棒状、膜状、ディスク状、ビーズ状などのいずれの形状であってもよく、特に限定されるものではないが、例えば、マイクロタイタープレートなどのマイクロアレイなどが好ましい。
【００７６】
この発明に使用するパートナー物質を基盤となる固相化支持体上に固定化する方法としては、当該技術分野で常用されている方法であれば、いずれも使用することができ、特に限定されるものではないが、膜状やシート状の固相化支持体を使用する場合には、その支持体上にスポットして固相化したり、またはマイクロアレイプレートなどの固相化支持体を使用する場合には、そのウエル中に固定化または固相化などするのがよい。固相化支持体上にスポット固定するスポットの数は、光学的手段による限度として、スポット間の干渉が起きない程度の密度に設定するのがよいが、使用目的に適った数のスポットを作成するのがよい。具体的には、例えば、スライドグラスほどの大きさ当たり数十個から数百個のスポットを固定することが可能である。更に、各スポットに別の抗体を固定してもよいし、またはいくつかを重複して同一の抗体をスポットすることも可能である。一方、マイクロアレイプレートなどの固相化支持体の場合には、使用目的に適ったウエルを有するものを適宜選択するのがよい。またマイクロアレイプレートのウエルにはそれぞれ１種類のパートナー物質を固定化するのがよく、そのパートナー物質としては、その種類は同一であっても、異なっていてもよいが、同一種類のパートナー物質を固定化する場合は、その濃度などを変えて固定化するのがよい。
【００７７】
更に、固相化支持体としてビーズ状の支持体を使用する場合には、各ビーズにそれぞれ１種類のパートナー物質を固定化するのがよく、パートナー物質の種類や濃度などに応じてビーズの数を増減することができる。
【００７８】
（測定方法）
この発明の方法において使用する標識マーカーは、当該技術分野における当業者によって通常用いられている各種染色測定法、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ハイブリダイゼーション法等や、磁性マーカーを利用するレーザ磁気免疫測定法等の免疫測定法などによって認識することができる。また、フローサイトメトリー法を利用することもできる。上記標識マーカーは、適用する上記染色測定法などに応じて、この発明の方法で検出する標的物質の種類を適宜選択するのがよい。
【００７９】
この発明に使用される測定方法を更に具体的に例示して説明する。例えば、標的物質を標識マーカーとして酵素を用いて標識する手法である酵素抗体法を使用する場合、使用可能な酵素抗体法としては、直接法、間接法、アビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法と、非標識抗体法としてのペルオキシダーゼ・抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）法などが挙げられ、これらはいずれもこの発明の方法に容易に適用することができる。かかる標識酵素としては、検出する標的物質とそれに対する結合物質であるパートナー物質との結合反応などを阻害せず、かつ、この酵素反応により生成されるシグナルの検出に支障がないものである限り、特に限定されないが、通常、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が用いられる。ＦＩＴＣやＨＲＰ等で標識したアビジンや、ストレプトアビジンなどを用いることができる。この手法では、酵素の基質としては、例えば、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）等が利用可能であり、またアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を使用する場合には、ｐ−ニトロフェニル燐酸等が利用可能である。
【００８０】
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）や放射免疫測定法（ＲＩＡ）などの測定法は、いずれも免疫学的特異性に基づく反応を利用して抗原・抗体または免疫・複合物を検出する免疫学的測定方法である。例えば、酵素免疫測定法や放射免疫測定法などの免疫学的測定法によって腫瘍マーカーなどの抗原物質を検出・定量する場合、例えば、いわゆる競合法がより好ましい。この発明における競合法は、例えば、検出すべき抗原物質などの標的物質と特異的に反応する抗体などのパートナー物質を固相化支持体に固相化し、この固相化抗体（パートナー物質）と特異的に結合または反応する抗原または抗体などの標識標的物質と非標識標的物質とが混在する試料を固相化抗体に対して接触させて競合反応させて免疫複合体を形成させ、その形成した免疫複合体の標識物質を測定することによって試料中の標的物質を検出して定量する。この方法においては、標的物質は、酵素免疫測定法では標識酵素の酵素活性、例えば発色剤とされる酵素基質と酵素との反応による発光強度などを示す吸光度などにより、また放射免疫測定法では標識放射性物質の放射活性、つまり放射線量により測定することによっての検出・定量することができる。
【００８１】
この発明の方法にはサンドイッチ法も適用することができる。この発明に適用できるサンドイッチ法の一般的な例を、標的物質が抗原である場合を例として説明すると、パートナー側抗体としての固相化抗体（パートナー物質）に対して、患者血清などの検査試料を添加してその中に存在する標的物質を免疫結合させた後、放射性物質、着色粒子または酵素などの標識マーカーで標識された検出側抗体を含む基準試料を添加してパートナー側抗体−標的物質−検出側抗体複合体などを生成させ、この複合体を検出することからなっている。この検出は、上記同様に行うことができ、検出側抗体を標識した標識マーカーの性質に依存し、標識マーカーの標識量を測定することによって抗原量を検出することができる。放射性標識であれば放射線量を、着色粒子標識であれば発色量や吸光度を、また酵素標識であれば吸光度を常法に従って検出して行うことができる。
【００８２】
また、磁性マーカーを利用するレーザ磁気免疫測定法を使用する場合は、上記測定法において、標識マーカーとして磁性マーカーを使用して、実質的に同様に検出・定量することができる。この場合、試料中の標的物質の検出は、公知の測定装置、例えば超電導定量干渉装置（ＳＱＵＩＤ）を用いて、磁性マーカーの磁化の残留磁気を磁場センサーにより測定することによって行うことができる。
【００８３】
更に、例えば、標的物質に特異的に結合するパートナー物質を予め蛍光物質などの発色物質で標識する手法を用いる場合には、対応する標的分析物質との結合反応のみによって標的物質を検出することが可能であり有利である。この手法に使用できる蛍光物質は、標的物質とそれに対するパートナー物質との結合反応を阻害せず、かつ、シグナル検出に支障がないものである限りに、特に限定されないが、上記標識マーカーのうちでも、ＦＩＴＣ、ＴＭＲＩＴＣ、Ｃｙ３、ＰＥ等の蛍光色素が好適に使用することができる。
【００８４】
上記態様を更に説明するために、測定用試料が標識基準試料と標識検査試料との混合試料からなる例について記載する。この態様においては、標識基準試料と標識検査試料とにおいては異なる標識マーカーを使用する。なお、この発明の態様は、上記態様、つまり基準試料と検査試料とのいずれかが標識マーカーで標識されている態様と実質的に同様であるので、以下の説明では、説明を簡略にするために、実質的に同様な説明は省略する場合があるが、かかる省略した部分も包含しているものとして理解することができる。
【００８５】
以下の説明では、例えば、標識基準試料を標識する標識マーカーを第１標識マーカーとし、標識検査試料を標識する標識マーカーを第２標識マーカーとした場合を例として説明する。ここにおいて、前述したように、第１標識マーカーと第２標識マーカーとは、標識マーカーの種類は異なるが、いずれも例えば発色色素からなり、同一手段で測定できるものを使用する。この場合、標識基準試料と標識検査試料とを所定割合で混合して第１標識マーカーと第２標識マーカーとを発色させると、その発色の程度は、理論的には、第１標識マーカーの発色と第２標識マーカーの発色との混合割合に応じた混合色になる。つまり、例えば、赤色に発色する第１標識マーカーで標識された標識検査試料と、青色に発色する第２標識マーカーで標識された標識基準試料とを同量ずつ混合した場合、この測定用試料は両標識マーカーの中間色の紫色に発色することになる。したがって、赤色の第１標識マーカーで標識した標識検査試料の割合が青色の第２標識マーカーで標識した標識基準試料の割合より多くなればなるほど紫色の発色色調は赤色を帯びてくるのに対し、青色の第２標識マーカーで標識した標識基準試料の割合が多くなればなる発色色調は青色を帯びてくることになる。この紫色の発色の程度を計測することによって、第１標識マーカーと第２標識マーカーとの混合割合を算出でき、この結果から検査試料中の標的物質を検出することができる。そこで、標識検査試料と標識基準試料を標識する標識マーカーは、混合した場合に明瞭なコントラストが出るような組み合わせになるように選択することが好ましい。
【００８６】
かかる標識マーカーをタンパク質などの生体成分物質などの標的物質に標識する方法としては、当該技術分野に属する当業者に公知の方法であればいずれも使用することができる。標識に際しては、例えば、試料中の標識標的物質がタンパク質の場合には、構成する同一のアミノ酸、例えばヒスチジンなどと結合することができる色素などの標識マーカーを選択するのが好ましい。
【００８７】
ところで、使用する測定用試料には、血清などの生体成分が含有されていることから、無色透明ではなく、僅かでも色彩を帯びていると考えられる。そこで、測定に当たっては、かかる色彩の影響を考慮することが好ましい。そのためには、例えば、基準試料中の血清タンパク質を青色色素で標識し、検査試料中の患者血清を赤色色素で標識する場合を例に取ると、基準血清タンパク質についても、別に患者血清と同じ赤色色素を固定したものを用意し、色素の違いに基づく影響を除くためのブランクとして用いるのがよい。この場合には、理論上は、中間色である紫色になり、正常値は中間色の紫色で示されると考えられる。しかし、実際には色素の違いに基づいて中間色から若干のずれが生じると考えられる。従って、上記のブランクを取ることによって、この若干のズレを補正することができる。このようにして異常値を示すタンパク質成分はブランクの色からのズレを測定することによって特定することができる。
【００８８】
この発明の別の形態である両試料を混合しないで別個に測定する場合には、標識検査試料と、標識基準試料とを同一条件で測定して得られた測定値の差に基づいて費用的物質を検出することができる。この場合、検査試料と基準試料とは別々に同一標識マーカーで標識され同一条件で測定される。この測定により、検査試料中に存在する標的物質の量と基準試料中に存在する標的物質の量とが検出されるので、この両試料中の標的物質量により所望の標的物質を検出することができる。
【００８９】
この発明の方法における標的物質、例えば、抗原または抗体、ホルモンまたはホルモンレセプター、核酸等の物質の測定は、通常、測定用試料を、固相化支持体に固定化したその標的物質に特異的な親和性を有する物質、つまりパートナー物質と反応させ、形成される複合体あるいは複合体を形成しなかった該特異的親和性を有する物質を、酵素、蛍光、放射性同位元素等の標識を用いた慣用方法によって計測することにより行うことができる。
【００９０】
かかる慣用方法として１具体例として、例えば、抗原（または抗体）を測定する標識化免疫測定法が挙げられ、この免疫測定法は当該技術分野で慣用されている手法であり、常用されている条件下で容易に実施することができる。この発明において使用する標識化免疫測定法の典型的な例としては、標的物質としての抗原または抗体と特異的に結合し得るパートナー物質である抗体または抗原をビオチンなどの標識マーカーで標識して、マイクロプレートウェル等の固定相である固相化支持体に固定化し、この固定相に測定用試料を添加して、測定用試料中の標的物質である抗原または抗体と結合性複合体を形成して固定相上に捕捉した後に、この固定相にアビジンもしくはストレプトアビジンなどの別の標識マーカーを添加したり、もしくはかかる標識マーカーで標識した抗体もしくは抗原または二次抗体を含む溶液を添加して固定相上の複合体を標識し、この標識化抗体もしくは抗原または二次抗体を当該技術分野で慣用されている免疫学的測定法によって測定することによって固定相上の標識量を算出することができるようになっている。
【００９１】
以下、この発明に係る同時物質検出方法の検出手順について、図面を参照しながら説明するが、この発明は何ら以下の検出手順に限定されるものではない。なお、説明を簡略にするとともに説明を具体的にするために、試料としてはヒトの血液を例にして説明する。
図１は、この発明に係る同時物質検出方法の検出手順の１例を示すフローチャートである。
【００９２】
図１に示すように、この発明で使用する基準試料としては、例えば、一人、好ましくは複数の健常人から採血した血液等をそのまままたは混合して未精製試料（Ａ−ａ）を使用することができるし、必要に応じて、その未精製試料から、例えば血液成分を分離した血清または血漿等の分離試料(Ａ−ｂ)を使用することもできる。特に、この発明において血液を試料として使用する場合は、血漿試料が好ましい。また、血清試料も使用することができるが、血清を非動化すると、タンパク質成分が失われる可能性があるので、血清試料を使用する場合にはタンパク質成分が失われないようにするのがよい。
このようにして調製した未精製試料（Ａ−ａ）または分離試料（Ａ−ｂ）には、まず、ビオチンなどの標識マーカー（Ａ−ｃ）を添加し、例えば室温で所定時間、例えば３時間以上培養を続けて、試料中に存在する標的物質、例えば抗原等のタンパク質などを標識マーカーで標識する。この培養時間は、特に制限されないが、検出する標的物質や標識マーカーなどに応じて適宜選択して決めるのがよい。なお、培養温度は、室温が好ましいが、検出する標的物質や標識マーカーならびに培養時間などに応じて適宜変えることができる。上記試料を所定温度で所定時間培養を行って培養が終結すると、グリシンなどの反応停止剤（Ａ−ｄ）を添加して、反応を停止させると標識基準試料（Ａ−ｅ）が得られる。
なお、インスリン等の低分子物質は、ビオチンなどの標識物質などで標識されなかったりもしくは標識され難い場合があれば、精製インスリンなどを標識物質で標識してまたは非標識の状態で試料に追加して添加することもできる。
【００９３】
反応停止後の標識基準試料（Ａ−ｅ）中には、その試料中の標的物質の標識に使用されなかった未反応の標識マーカー（Ａ−ｃ）が存在している可能性がある。この未使用の標識マーカーが試料中に残存すると、後の処理において、例えば、測定用試料中に存在する非標識標的物質と反応もしくは結合するなどの不都合を生じて、悪影響を及ぼす恐れがあり、標的物質の正確な検出・定量ができなくなる恐れが生じる。したがって、未使用の標識マーカーは完全にもしくは実質的に完全に除外する必要がある。
この標識基準試料（Ａ−ｅ）中に存在する未反応の標識マーカー（Ａ−ｃ）を除去するには、当該技術分野で慣用されている手法、例えば透析等の手段に従って行うことができる。透析に使用する透析液としては、例えば、塩化ナトリウムのリン酸緩衝液等の当該技術分野で使用されている溶液などを使用することができる。この透析は、所定量の透析液を添加した後、所定量の透析液を除去し、また所定量の透析液を追加して添加する。つまり、このような透析液の交換操作を、通常、２回以上、好ましくは数回、例えば４回、５回もしくは６回以上繰り返すことができる。
【００９４】
一方、検査試料としては、図１に示すように、例えば、患者などの被験者から採血した血液検体のような未精製検体（Ｂ−ａ）をそのまま使用することができる。また、必要に応じて、基準試料の場合同様に、分離操作を施して処理した血清や血漿等の検体(Ｂ−ｂ)を検査試料として使用することもできる。また、検査試料を標識する場合は、基準試料の場合同様に、未精製検体（Ｂ−ａ）に標識マーカー（Ａ−ｃ）を添加するか、または未精製検体（Ｂ−ａ）を分離操作に付して調製した検体試料（Ｂ−ｂ）に標識マーカー（Ａ−ｃ）を添加して、試料中に存在する標的物質を標識することもできる。
【００９５】
上記のように調製した標識血漿試料等の標識基準試料（Ａ−ｅ）と、検体試料（Ｂ−ａまたはＢ−ｂ）とは、上記に定めたように所定割合、例えば７：３の割合に混合されて測定用試料（Ｃ−ａ）に調製される。各試料の所定混合割合は、試料の種類、測定手段などにより適宜変更するのがよい。このように標識基準試料と検体試料とを所定割合で混合して測定用試料を調製することにより、検体試料中に存在する標的物質の割合は、標識基準試料中だけに存在する標的物質の割合と測定試料中に存在する標的物質の割合とから算出することができる。
【００９６】
次に、上記のように混合して調製された測定用試料（Ｃ−ａ）は、例えば、マイクロアレイプレート等の固相化支持体（Ｄ−ａ）上に添加される。この添加により、試料中に存在する標的物質は、固相化支持体（Ｄ−ａ）上に固定化した、標的物質と特異的に結合する抗原物質などの各種パートナー物質（Ｄ−ｂ）と結合することになる。
【００９７】
この発明において、固相化支持体（Ｄ−ａ）上に各種パートナー物質（Ｄ−ｂ）を固相化する方法は、当該技術分野で通常使用されている方法であればいずれも使用することができる。各種パートナー物質（Ｄ−ｂ）は、検出する標的物質に応じてそれぞれ選択され、例えば、それぞれ通常の緩衝液、リン酸緩衝液などで約２００倍ないし約１０、０００倍程度に希釈した溶液の状態で、常法に従って固相化支持体上に固相化することができる。つまり、所定量のパートナー物質（Ｄ−ｂ）を固相化支持体（Ｄ−ａ）上に添加して、例えば、室温で所定時間、例えば約１５分間以上放置することによって固相化することができる。固相化反応後、固定されていないパートナー物質（Ｄ−ｂ）を洗浄液で複数回、好ましくは少なくとも３回以上洗浄して除去し、固相化抗体上にパートナー物質が実質的に残存しないように洗浄操作を十分に行う。使用する洗浄剤は当該技術分野で通常使用されているものであればいずれも使用することができ、特に限定されるものではない。かかる洗浄剤の組成としては、例えば、塩化ナトリウムと界面活性剤、例えばツイーン（登録商標）とを含むリン酸緩衝液などが挙げられる。
【００９８】
次に、パートナー物質（Ｄ−ｂ）以外の非特異的結合をブロッキング剤（Ｄ−ｃ）を使用してブロッキング処理する。ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルクなどが使用することができ、その濃度は約１０％程度が好ましい。ブロッキング処理操作は、ブロッキング剤を添加後、所定時間、例えば１０分以上、好ましくは３０分間以上室温で放置することによって行うことができる。ブロッキング処理操作完了後、上記洗浄液で例えば複数回、好ましくは３回以上洗浄して固相化支持体（Ｄ−ｄ）を得ることができる。
【００９９】
上記のように、標識血漿試料等の標識基準試料（Ａ−ｅ）と、非標識検体試料（Ｂ−ａまたはＢ−ｂ）とを所定割合に混合して調製した測定用試料（Ｃ−ａ）を固相化支持体（Ｄ−ｄ）に添加することにより、試料中の標的物質は、固相化支持体上に固相化したパートナー物質と結合して結合性複合体などを形成する。この結合性複合体は、非標識検査試料中の非標識標的物質とパートナー物質との複合体と、標識基準試料（Ａ−ｆ）中の標識（例えば、ビオチン標識）標的物質とパートナー物質との複合体とが、各試料の混合割合に応じて混在していることになる。この複合体が固相化している固相化支持体に、試料中の標識標的物質の標識マーカーと結合または反応などして複合体などを形成し得る結合性物質などを添加する。この結合性物質に、例えばアビジンやストレプトアビジンなどの別の標識物質を添加して、基質として西洋ワサビペルオキシダーゼなどを使用して形成される複合体（例えば、ビオチン・アビジン・ペルオキシダーゼ複合体）を、例えばテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などの発色剤で発光させることによって、この結合性物質が結合している検査試料の標的物質を上記混合割合に基づいて検出・定量することができる。
【０１００】
さらに、この発明の別の１形態を固相化支持体としてタンパク質チップを例にして更に詳細に説明する。ただし、この発明は、下記説明に一切限定されるものではないことは当然である。
この発明に係るタンパク質チップは、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ガラス、アルミニウム、プラスチックなどの基盤となる膜上に数多くの上記抗体、例えば、数百種類のヒト血清成分向け抗体（アンチアルブミン、アンチガンマグロブリン、アンチアルファ１アンチトリプシン、アンチインシュリン等）を数マイクロリットルずつスポットして固定することによって作製することができる。このスポット固定法は、当該技術分野で慣用されている方法であればいずれも使用することができる。なお、通常のウエスタンブロットの手技に則って非特異的タンパク質の吸着防止操作を行うのがよい。
【０１０１】
血清以外の他の生物成分を測定用検体とする場合には、目的とする処理を行う前の基底状態の生物成分由来で、測定用検体と同一方法で採取した検体を基準検体として用意する。基準検体の８割程度をタンパク質色素などで通常用いられている方法で染色固定する。染色固定後、遊離の色素はゲル濾過や透析またはクロマトグラフィーなどで分離して除去することができる。
なお、基準用検体の残りの一部は、測定時には測定用色素で同様に処理するためにブランク用として保存するのがよい。
【０１０２】
続いて、基準用検体と測定用検体とは別の色の色素などの標識剤でそれぞれ固定する。色素固定後、固定反応を停止させるか、または色素固定基準検体タンパク質と測定用検体タンパク質とが混合時に新たな色素固定反応が起きないような条件に設定するのがよい。
更に、保存しておいて基準検体の残りの一部を測定用色素で同様にブランク用として処理する。
【０１０３】
次に、上記のように別々の色素などの標識剤で標識して調製した測定用タンパク質検体と基準用タンパク質検体とを所定の割合で、特に好ましくは５０％ずつ混合して混合検体を調製する。両検体を同量ずつ混合することによって、別々の色素などの標識剤で標識した検体の中間色を測定するのが容易になるが、場合に応じてその混合割合を変えることも可能である。
【０１０４】
このようにして得られた混合検体を上記タンパク質チップに接触させて、混合検体に含まれる第１標識抗体結合可能物質である基準タンパク質と第２標識抗体結合可能物質である測定タンパク質とを結合対象抗体に結合させ、非結合タンパク質などは洗浄除去する。このように基準タンパク質と測定タンパク質とを含む混合検体を支持体に固定した数多くの抗体と接触させて反応させることによって、かかるタンパク質と反応結合する結合対象抗体がその抗体中に含まれている場合には、そのタンパク質とその結合対象抗体とが反応結合することになる。
【０１０５】
基準タンパク質と測定タンパク質が抗体と結合した後は、ウエスタンブロットで通常行われている方法で洗浄し結果を観察する。
もし測定タンパク質が正常であって何ら異常がなければ、つまり、測定タンパク質が基準タンパク質と同一であれば、同一結合対象抗体に結合している標識タンパク質は正常の数値、つまり色素で標識した場合には正常な中間色を示すはずである。反対に、測定タンパク質が異常な発現様式を示している場合には、同一結合対象抗体に結合している標識タンパク質は異常の数値、例えば、中間色から若干ずれた色を示すはずである。この若干のずれを測定することによって、測定タンパク質を定性または定量することができることになる。
【０１０６】
つまり、この発明に係るタンパク質チップによって、測定用タンパク質検体と同一の色素で基準タンパク質検体と前記のように色素固定した基準タンパク質検体とを５０％づつ混合した混合検体と、同様に抗体と反応させて洗浄処理したスポットとを比較することによって、相対的タンパク質発現濃度を一度に大量に測定することができる。
【０１０７】
例えば、ヒト患者血清の異常を診断するときには、ヒト正常血清と、調べようとするヒト患者血清とをそれぞれ別の色素で染色して５０％ずつ混合し、数百のヒト血清成分向け抗体（アンチアルブミン、アンチガンマグロブリン、アンチアルファ１アンチトリプシン、アンチインシュリン等）をスポットした支持体上に混合血清を流して血清中のタンパク質と基盤上の抗体とを反応させる。非特異的な結合を洗浄して除去する。この後、これを上記と同様に処理することによって、相対的タンパク質発現濃度を測定することができる。
【０１０８】
基準タンパク質検体はあらかじめ多量の色素で固定して、使用時まで分注して保存可能である。色素固定後の遊離色素の除去は、ゲル濾過による除去、酸アルカリによる反応停止、透析による除去などのさまざまな公知の方法を使用することができる。
【０１０９】
測定用タンパク質検体の色素固定は、使用時調整となるのでできるだけ簡便な方法を採用するのがよい。例えば、基準タンパク質検体の色素結合部位と測定タンパク質検体の色素結合部位として、例えばヒスチジンなどの同一アミノ酸残基を選ぶことによって、色素固定した基準タンパク質検体に、遊離色素の混じった測定用タンパク質検体を混合しても、遊離の色素が基準検体タンパク質に固定されないようにするのがよい。
【０１１０】
この発明において、基準タンパク質検体と測定用タンパク質検体との混合検体を複数種類の抗体を固定した支持体に接触させた操作終了後の測定は、目視、光学的手段、蛍光的手段による測定等いずれも使用可能であるが、当然のことであるが、正確に定性・定量を行なうためには、光学的手段や蛍光的手段などによる機器計測測定を行なうのがよい。
【０１１１】
結果の判断は、患者の検体と同じ色素で同一の方法で処理した基準用検体と、色素固定基準用検体をそれぞれ５０％ずつ混合して処理したものをブランクとして各スポット毎にブランクよりも色が基準検体の色素の色に近いか、または患者検体の色素の色に近いかどうかを目視などによって比較することによって、基準用検体と比較した相対的タンパク質発現濃度を測定して行なうことができる。
【０１１２】
例えば、赤色と黄色の色素を使った場合には、基準用検体と測定用検体とが正常であれば、赤色と黄色の中間色であるオレンジ色になるはずであるが、もしそのスポットが赤色や黄色もしくは中間色のオレンジ色からずれた色彩をしていれば、測定用検体に含まれるタンパク質は異常ではないかと判断することができる。したがって、このようなシステムを臨床試験に用いたときには、数百のスポットの大多数は中間色のオレンジ色になると考えられるが、いくつかのスポットは異常な黄色もしくは赤色またはそれらの色に近い色を示す容易に見いだすことができることになる。このような場合には、タンパク質に何らかの異常があるかも知れないとの判断を行なうことができる。また、かかる異常の程度は、光学的手法などの計測技術を用いることによって濃度比などを求めることによって正確に測定することも可能である。
【実施例１】
【０１１３】
標準色素標識検体は次のようにして調製した。正常ウサギ血清を５６℃で３０分間処理した後、０．４５マイクロメーターのフィルターで濾過した。この血清２ｍｌに、ヒトＣ−反応性タンパク質（ヒトＣＲＰ；１ｍｇ／ｍｌ）およびヒトインスリン（１μｇ／ｍｌ）を添加した（下表１参照）。各検体を室温で２０分間攪拌した後、１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を添加してｐＨ８．５に調整した後、この検体に１Ｍグリシン１００μｌを添加して反応停止させた。続いて、この血清検体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ：０．１５Ｍ炭酸ナトリウム；ｐＨ７．２）を用いて４℃で透析を行った。次に、このように透析をした検体にビオチンを各１５ｍｇずつ加えて室温（２５℃）で３時間間攪拌してビオチン標識を行った後、各検体に上記緩衝液を添加してその容量を２ｍｌにした。各検体中の各物質の最終濃度は下表２に示すようになるよう調製した。
【０１１４】
【表１】
2005338052.tif 000002
【０１１５】
【表２】
2005338052.tif 000003
【０１１６】
マイクロプレート（Maxi-Sorp：ヌンク社製）に対して、抗ヒトＣＲＰヤギＩｇＧ抗体ならびに抗ヒトインスリンマウスＩｇＧ抗体の０．１Ｍ炭酸緩衝液（ＣＢ：ｐＨ８．５；１０μｇ/ｍｌ）を各ウエル当たり１００μｌの割合でそれぞれ添加して、プレートを２５℃で２時間放置した後、１０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝液/０．１５Ｍ ＣＢ；ｐＨ７．２）・０．０２％ツイーン２０（登録商標）からなる洗浄液で３回洗浄した。このように調製したプレートに対して、２５％ブロックエース（登録商標）/１０ｍＭ ＰＢＳと０．０５％ナトリウムアジドを各ウエルに２５０μｌずつ添加した後、プレートを２５℃で２時間放置し、次いで上記洗浄液で３回洗浄した。
一方、上記で作製したビオチン標識検体（検体番号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）をそれぞれ８段階（１０ｍ＝０、１、２、...６、７）に１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、上記プレートの各ウエルに１００μｌずつ添加した後、プレートを２５℃で２時間放置し、上記洗浄液で３回洗浄した。次に、このように調製したプレートの各ウエルに対して、アビジン・西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５０００倍希釈したものを１００μｌずつ添加し、プレートを２５℃で３０分間放置し、上記洗浄液で３回洗浄した。続いて、発色剤としてテトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を各ウエル当たり１００μｌずつ添加した後、プレートを２５℃で２０分間放置した後、１Ｍ塩酸を各ウエル当たり１００μｌずつ添加して反応を停止し、次に波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。インスリンとＣＲＰについてそれぞれ得られた結果を表３と表４に示す。またこれらの結果を図示するとそれぞれ図４および図５に示される。
【０１１７】
【表３】
2005338052.tif 000004
【０１１８】
【表４】
2005338052.tif 000005
【実施例２】
【０１１９】
正常ウサギ血清を採取し、５６℃で３０分間処理した後、０．４５マイクロメーターのフィルターで濾過した。このウサギ血清２ｍｌに、ヒトＣ−反応性タンパク質（ヒトＣＲＰ；１ｍｇ／ｍｌ）を濃度が３μｌになるように添加した後、室温で（２５℃）で２０分間攪拌し、１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）でｐＨ８．５に調整した。この血清試料にビオチンを１５ｍｇ加えて室温（２５℃）で３時間間攪拌してビオチン標識を行った後、１Ｍグリシン１００μｌを添加して反応停止させた。得られた反応溶液を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２；リン酸緩衝液＋０．１５Ｍ炭酸ナトリウム）で透析チューブを用いて４℃で透析した。
【０１２０】
一方、精製ヒトインスリン（１μｌ）を室温で（２５℃）で２０分間攪拌し、１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）でｐＨ８．５に調整した。この血清試料にビオチンを１５ｍｇ加えて室温（２５℃）で３時間間攪拌してビオチン標識を行った後、１Ｍグリシン１００μｌを添加して反応停止させた。得られた反応溶液を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２；リン酸緩衝液＋０．１５Ｍ炭酸ナトリウム）で透析チューブを用いて４℃で透析した。
【０１２１】
上記のようにして調製したビオチン標識ＣＲＰ検体とビオチン標識インスリン検体とを表５で示す濃度になるように混合して検体（各２ｍｌ；検体番号１、２、３，４，５）を調製した。
【０１２２】
【表５】
2005338052.tif 000006
【０１２３】
これらの検体は実施例１と同様に吸光度（４５０−６２０ｎｍ）を測定して、ＣＲＰについての結果を表６と表７に、またインスリンについての結果を表８および表９に示す。
【０１２４】
【表６】
2005338052.tif 000007
【０１２５】
【表７】
2005338052.tif 000008
【０１２６】
【表８】
2005338052.tif 000009
【０１２７】
【表９】
2005338052.tif 000010
【０１２８】
上記の結果から検量線を求めた結果を図６に示す。この結果は、ヒトＣＲＰもインスリンも容量依存的にカーブを描くことができることを示していることから、この発明の方法は、血液試料中の他の多くのタンパク質成分などの標的物質も同時に検出・定量できることを示唆している。
【実施例３】
【０１２９】
成人男子２名および成人女子１名から各２０ｍｌずつ採血した血液試料にそれぞれ１００ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａの１／２０容量（ｖ／ｖ）を添加した後、３０００ｒｐｍ／分で１０分間低速遠心して得られた上清を血漿として採取した。この血漿をそれぞれ０．９ｍｌずつ混合して１ＭＮａＨＣＯ３の０．５４ｍｌを添加してｐＨ８．５に調整した。この血漿試料にビオチン（5ｍｇ／0.1ml DMSO）２０ｍｇを添加してゆっくり振とうして反応させた。３時間後、１Ｍグリシン１３５μｌ／２．７ｍｌを添加して反応を停止させた。透析チューブを用いて透析液（１０ｍＭリン酸緩衝液＋０．８８％ＮａＣｌ溶液）５００ｍｌで透析した。透析液は数時間毎に合計６回交換して、ビオチン標識ヒト血漿試料を得た。
【０１３０】
ビオチン標識ヒト血漿試料による各血漿タンパク質成分の容量依存的結合実験について説明する。
６０穴テラサキプレートを５枚用意し(プレート番号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ)、そのテラサキプレートの各穴に抗体（抗アルブミン抗体、抗プラスミノーゲン抗体、抗α−フェトプロテイン抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ヒトＩＬー６抗体の６種類）を、次のように希釈した各抗体を添加して固相化した(Ｆｉｇ．Ｂ−１ｔｏＢ−５)。
抗アルブミン抗体は試薬原液の４００倍希釈、１２００倍希釈、３６００倍および１０８００倍希釈溶液の１０μｌを各プレートの穴(１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ)にそれぞれ添加した。抗プラスミノーゲン抗体は試薬原液の２００倍希釈、６００倍希釈、１８００倍希釈および５４００倍希釈溶液の１０μｌを各プレートの穴(２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ)にそれぞれ添加した。また抗α−フェトプロテイン抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ＣＲＰ抗体および抗ヒトＩＬー６抗体は試薬原液の５０倍希釈、１５０倍希釈、４５０倍希釈および１３５０倍希釈溶液の１０μｌをそれぞれ同様に添加した(抗α−フェトプロテイン抗体は各プレートの穴(３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）；抗ヒト成長ホルモン抗体は各プレートの穴(４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ)；抗ＣＲＰ抗体は各プレートの穴(５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄ)；および抗ヒトＩＬー６抗体は各プレートの穴(６Ａ、６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄ)；コントロールは穴（７Ａおよび７Ｂ）にそれぞれ添加した)。このように調製した各プレートは、３０分間以上室温で放置した後、洗浄液（１０ｍＭリン酸緩衝液/０．８８％ＮａＣｌ−０．１％ツイーン２０（登録商標）溶液）を用いて各穴毎に３回洗浄した（１０から１５μｌ洗浄液／穴）。その後プレート全体（７〜１５ｍｌ／プレート）を同洗浄液で１回洗浄した。
【０１３１】
非特異的結合をブロックするため、１０％ブロックエース（登録商標）/１０ｍＭリン酸緩衝液＋０．８８％ＮａＣｌ溶液をプレート毎に添加して室温で３０分間以上放置した後、上記洗浄液でプレートを３回以上（７〜１５ｍｌ／プレート）洗浄した。
ビオチン標識ヒト血漿試料を下記の濃度（表１０）になるように添加したＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液＋０．８８％ＮａＣｌ溶液）１０ｍｌをテラサキプレートにそれぞれ投入し、室温で１時間以上ゆっくり振とうした。その後、上記洗浄液で各プレートを３回以上（７から１５ｍｌ／プレート）洗浄した。
【０１３２】
表１０：プレートのウエル中のビオチン標識ヒト血漿濃度
プレート番号 ビオチン標識ヒト血漿濃度（μl）
ａ              １０
ｂ               ３
ｃ               １
d               ０．３
ｅ               ０ 
【０１３３】
上記各プレートに対して、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン（１０ｍＭリン酸緩衝液０．８８％ＮａＣｌ溶液）を２μl/１０ｍｌを添加して室温で３０分間放置した後、上記洗浄液で３回洗浄して、各穴中の水分を抗体・抗原・ペルオキシダーゼ複合体に影響しないように細心の注意もして丁寧に除去した。続いて、発色色素ＴＭＢ１０μｌを各穴毎に添加して正確に２０分後に１Ｍ硫酸５μｌを添加して反応を停止した。このように調製したプレートを実施例１と同様に吸光度を測定した。
それらの結果から、アルブミン、プラスミノーゲンおよびＣＲＰは、対照と比較してこの順序に強く発色して測定できた。成長ホルモンおよびＩＬ−６は対照よりもわずかに強く発色し検出された。しかし、αーフェトプロテインは対照と同程度の発色で目視では検出が困難であった。更に、血漿中のタンパク質成分は０．３μｌ／プレートでも検出された。それらの結果のうち、図７は、プレート番号ａおよびｂにおける各抗体の発色状態を模式的に図示したものである。
【実施例４】
【０１３４】
実施例３と同様に、６０穴テラサキプレートを５枚（プレート番号１、２、３、４および５）用意し、各プレートの穴に抗体（抗アルブミン抗体、抗プラスミノーゲン抗体、抗α−フェトプロテイン抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ヒトＩＬー６抗体の６種類）を次のように添加した。抗アルブミン抗体は、その試薬原液の４００倍希釈溶液、８００倍希釈溶液および１６００倍希釈溶液１０μｌをテラサキプレートの各穴に２個ずつそれぞれ添加した（４００倍希釈溶液を、各プレートの１Ａおよび１Ｂの穴に、８００倍希釈溶液は１Ｃおよび１Ｄの穴に；そして１６００倍希釈溶液を１Ｅおよび１Ｆの穴に、そして１６００倍希釈溶液を１Ｅおよび１Ｆの穴にそれぞれ添加した）。同様に、抗プラスミノーゲン抗体は、その試薬原液の２００倍希釈溶液、４００倍希釈溶液および８００倍希釈溶液１０μｌを、各プレートの穴(２Ａおよび２Ｂ)、穴（２Ｃおよび２Ｄ）および穴（２Ｅおよび２Ｆ）にそれぞれ添加した。抗ＣＲＰ抗体は、その試薬原液の２００倍希釈溶液、４００倍希釈溶液および８００倍希釈溶液１０μｌを、各プレートの穴(３Ａおよび３Ｂ)、穴（３Ｃおよび３Ｄ）および穴（３Ｅおよび３Ｆ）にそれぞれ添加した。抗ヒト成長ホルモン抗体は、その試薬原液の２００倍希釈溶液、４００倍希釈溶液および８００倍希釈溶液１０μｌを、各プレートの穴(４Ａおよび４Ｂ)、穴（４Ｃおよび４Ｄ）および穴（４Ｅおよび４Ｆ）にそれぞれ添加した。そして、抗ヒトＩＬー６抗体は、その試薬原液の２００倍希釈溶液、４００倍希釈溶液および８００倍希釈溶液１０μｌを、各プレートの穴(５Ａおよび５Ｂ)、穴（５Ｃおよび５Ｄ）および穴（５Ｅおよび５Ｆ）にそれぞれ添加した。同様に、コントロールを各プレートの穴(６Ａ〜６Ｆ)にそれぞれ添加した。このように調製したプレートを３０分以上室温で放置した後、上記洗浄液を用いて各穴毎に３回洗浄して（１０から１５μｌ洗浄液／穴）、続いてプレート全体（７〜１５ｍｌ／プレート）を上記洗浄液で１回洗浄した。
洗浄後、非特異的結合をブロックするため１０％ブロックエース（登録商標）（１０ｍＭリン酸緩衝液＋０．８８％ＮａＣｌ溶液）をプレート毎に添加して室温で３０分間以上放置して、各プレートを上記洗浄液で３回以上（７〜１５ｍｌ/プレート）洗浄した。
次いで、下表１１に示す容量のビオチン処理血漿および正常血漿を１０ｍＭリン酸緩衝液/０．８８％ＮａＣｌ溶液１００ｍｌを添加した。別に、プラスチック容器に上記溶液を数１００ｍｌ入れて、このプラスチック容器中にテラサキプレートをそれぞれ入れて、室温で１時間以上ゆっくり振とうしながら放置した。
【０１３５】
表１１：
プレート番号 ビオチン処理血漿 正常新鮮血漿
１                0                   0
２               50μl                0
３               50μl               50μl
４               50μｌ              150μl
５               50μl              450μl
【０１３６】
その後、プレートを上記洗浄液で３回以上（７から１５ｍｌ/プレート）洗浄した。洗浄した各プレートにアビジン・西洋ワサビペルオキシダーゼ結合０．２μｌ/１０ｍＭリン酸緩衝液/０．８８％ＮａＣｌ溶液１０ｍｌ/プレートずつ添加して室温で３０分間放置した。次に、各プレートを上記洗浄液で３回洗浄し、各穴中の水分を抗体・抗原・ペルオキシダーゼ複合体に影響しないように細心の注意を払って丁寧に洗浄液を除去した。その後、各穴に発色色素テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）１０μｌを添加して２０分後に１Ｍ硫酸５μｌを添加して反応を停止した。
このように発色させた各プレートの発色の程度は上記と実質的に同様であった。それらの結果のうち、図８は、プレート番号１および２における各抗体の発色状態を模式的に図示したものである。
【実施例５】
【０１３７】
スライドガラス程の大きさのニトロセルロース膜を調製し、ヒト血清成分に対する抗体として、抗ＧＯＴ、抗ＧＰＴ、抗γグロブリン、抗アルブミンおよび抗凝固因子Ｉを５μｌずつニトロセルロース膜上にスポットして、スキムミルクでブロッキングして固定した。
正常患者血清の５名（各１０ｍｌ）を用意して混合して、その４０ｍｌをメチレンブルーで染色した。染色後、Ｇ−２５によるゲル濾過で遊離の色素を分離した。メチレンブルー色素固定正常者血清は５ｍｌずつ分注して凍結保存した。
凍結保存したメチレンブルー色素固定正常者血清の一部を使用時融解して基準試料を調製した。
残りの正常者血清は、色素固定せずに５ｍｌずつ分注して、使用時に患者血清と同じ色素で同一条件に色素固定して、患者血清に対するブランク血清として使用するために凍結保存した。
次に、活動期のＡ型肝炎患者の血清５ｍｌを用意し、ローズベンガル（赤色色素）で染色して患者検体とした。
このように調製した患者検体５ｍｌと基準検体５ｍｌとを５０％ずつ混合して混合検体を調製した。この混合検体は淡紫色を呈していた。
その後、この混合検体を抗体がスポット固定された支持体上に注入して抗体と結合させるためにこの状態で３０分間放置した。その後、通常行われているウエスタンブロット法で非特異的結合を洗浄して除去した。
一方、ブランク（前述のようにローズベンガル色素固定基準検体とメチレンブルー色素固定基準検体との５０％混合物と抗体スポットとを反応させたもの）を対照として、結果を観察した。
その結果、抗ＧＯＴおよび抗ＧＰＴが赤色を帯びた色に染色されたのに対し、他の抗体は紫色を帯びた中間色に染色されていた。このことから、Ａ型肝炎患者の血清中に存在する血清タンパク質が異常値を示していていることが診断できた。
それらの結果のうち、図９ないし図１１は、それぞれプレート番号１ないし５における各抗体についての発色状態を模式的に図示したものである。
【実施例６】
【０１３８】
直径３〜３０μｍ、好ましくは４〜１０μｍのプラスチック樹脂製ビーズを用意し、ビーズ表面にカルボキシル基またはアビジン基をコーテングした。これらのビーズ表面に１０段階の濃淡をもった蛍光色素ローズベンガルと蛍光色素メチレンブルーをそれぞれ結合させて１００種類のビーズを作成した。このように色素を結合した１００種類のビーズ表面には、それぞれのビーズ種毎に抗ＣＲＰ抗体または抗インスリン抗体を結合した。
一方、３名の正常者から採血した血液から分離した血清（標準血清）の一部にそのまま上記蛍光色素を添加して標識を行った。この場合、インスリンは、血清そのものでは蛍光色素標識ができなかったので、精製インスリンを蛍光色素標識して添加して蛍光色素標識標準血清（基準試料）を作成した。
この蛍光色素標識標準血清に検体血清（検査試料）を一定の割合、つまり３：７（前者：後者）で混合した。この混合血清に上記抗体結合ビーズを投入してよく反応させた。洗浄後、レーザー光を利用してビーズの種類とビーズ毎の抗原・抗体結合量を測定した。測定は、上記標準血清の残りを上記と同様に処理して基準値を求めた。この基準値からの増減によって、検体血清中の各成分の定量を行ったところ、上記実施例と同様の結果が得られた。
したがって、この方法を使用すれば、各ウエル毎に一人の患者の血清・血漿を用いて約１００種類の臨床検査の同時実施が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
この発明は、タンパク質発現様式を一度に大量にかつ安価に、更に簡単・迅速に測定可能となるので、タンパク質の機能ばかりではなく、遺伝子の機能をも解析するのに有用であり、その上疾病の診断や予防ばかりではなく、疾病の治療などにも役立てることができる。
また、この発明に係るタンパク質チップによる測定の目的も、疾病の治療や予防・診断をはじめ、遺伝子の機能解析等の研究用から遺伝子操作後の発現遺伝子の安全性確認など非常に幅広い分野において利用することができる。更に、この発明は、医薬品や機能性食品などの効果効能や安全性などの確認や評価にも迅速にかつ安価で的確に対応することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】この発明に係る同時物質検出方法の１具体的形態を示すフローチャート。
【図２】試料の希釈率毎のインスリンおよびＣＲＰのそれぞれの吸光度を示すグラフ。
【図３】試料の別の希釈率毎のインスリンおよびＣＲＰのそれぞれの吸光度を示すグラフ。
【図４】希釈率の違いによるＣＲＰの吸光度を示すグラフ。
【図５】希釈率の違いによるインスリンの吸光度を示すグラフ。
【図６】インスリンとＣＲＰとの検量線を示すグラフ。
【図７】実施例３によるプレート番号ａ（上図）およびｂ（下図）の発色状態を示す模式図。
【図８】実施例４によるプレート番号１（上図）および２（下図）の発色状態を示す模式図を示す模式図。
【図９】実施例５によるプレート番号１（上図）および２（下図）の発色状態を示す模式図を示す模式図。
【図１０】実施例５によるプレート番号３（上図）および４（下図）の発色状態を示す模式図を示す模式図。
【図１１】実施例５によるプレート番号５の発色状態を示す模式図を示す模式図。
【図１】
2005338052.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005338052.tif 000017
【図８】
2005338052.tif 000018
【図９】
2005338052.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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