(57)【要約】【課題】これまで種々の方法でホスホリパーゼDの固定化が行われてきたが、いずれも、グルタルアルデヒドや、食品製造に用いることができないゲルを用いている。また、工業的に目的生産物を安価に且つ効率よく得るという点でこれまで十分に満足するものは得られていない。【解決手段】こんにゃくマンナンを含むゲルすなわち担体に、ホスホリパーゼDを固定化することにより、酵素固定化時の、酵素活性の低下を最小限に抑えることができる。また、本発明の方法によりホスホリパーゼDが強固に固定化され、反応時の酵素の漏出が最小限に抑えられる。さらに、本発明の固定化ホスホリパーゼ用いたリアクターにより工業的にも優れた反応物が提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
こんにゃくマンナンを含有する担体に、ホスフォリパーゼDを固定化することを特徴とするホスフォリパーゼＤ固定化酵素 。
【請求項２】
ホスフォリパーゼＤが、キャベツまたは細菌より得られるものであることを特徴とする請求項１記載の固定化酵素 。
【請求項３】
細菌がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．であることを特徴とする請求項２記載の固定化酵素。
【請求項４】
酵素固定化用担体が、こんにゃく生芋をすりおろしたもの又はこんにゃく精粉に凝固剤を添加したゲル化物である請求項１〜３記載の固定化酵素。
【請求項５】
酵素固定化用担体が、こんにゃく生芋をすりおろしたもの又はこんにゃく精粉に凝固剤を添加してゲル化物であり、添加物として、こんにゃく以外の原料由来のゲル化剤を含む請求項１〜３記載の固定化酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一記載の固定化酵素 を含有していることを特徴とするバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素 の固定化 に関するものであり、更に詳細には脂質の改質に有用な酵素 であるホスホリパーゼＤを繰り返し効率良く利用できるよう、そして該酵素 を工業的使用に適した固定化 担体に固定化 する方法に関するものである。本発明はこの得られたホスホリパーゼＤ固定化 酵素 を利用したりん脂質の製造法、特には、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホファチジルセリンを効率的に得るための製造法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホリパーゼは,その選択性や特異性を利用し,油脂を含む各種脂質の高度改質による高機能化を実現した。リパーゼに関して、1)油糧種子や穀物類に含まれるリパーゼは,基質特異性が高く特定油脂類生成に関与する,2)植物リパーゼは,存在量が僅かなため応用事例が少ないが,カラス麦,ヒマの実,ナタネ,クーミン等のリパーゼ並びにキャベツ起源ホスホリパーゼDによる油脂改質が実験室的に検討されている,3)パパイヤ(CPL)は,プロテアーゼの植物起源であるが処理条件によりリパーゼ活性を発現し,短鎖-長鎖の各種トリグリセリド分解活性やエステル交換に関するデータが報告され,その後油脂改質応用事例も増加している,4)パインアップルやパパインより得られるブロメラインは,食品加工への応用に目処を得つつあるが油脂改質に十分なリパーゼ活性は得られておらず検討中である（非特許文献１）。
【０００３】
種々のホスホリパーゼのうち、ホスホリパーゼDは加水分解だけでなく塩基交換反応を触媒し、新たな化合物の製造に使用できるため注目を集めている。鎌田ら（非特許文献２）はホスフォリパーゼＤを用いてホスファチジルコリン90%とホスファチジルエタノールアミン10%から成る大豆りん脂質からホスファチジルセリン(PS)調製条件を検討した。ホスフォリパーゼＤの変換活性はpH5.6の酢酸緩衝液でホスフォリパーゼＤを1h前処理することで向上し,30分間でPS含有量を52%まで高めることができることを明らかにした。さらに、鎌田らは、ホスホリパーゼD粗酵素(17IU/g)を用いて,大豆りん脂質からホスファチジルグリセリン(PG)を定量的に調製するホスファチジル基変換反応条件を検討した（非特許文献３）。また、ホスホリパーゼDにより競争的に起こる加水分解反応の抑制がPGの調製における課題となるため,変換反応に先立ち加水分解反応についても併せて検討した。その結果,加水分解反応においては従来ホスフォリパーゼＤの最適条件とされているpH5.6で定量的にホスファチジン酸が生成したのに対し,変換反応においてはやや酸性側のpH4.8を用いることにより加水分解反応が効果的に抑制でき,ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを定量的にPGに変換できることを報告している。Junejaら（非特許文献４）は、ホスファチジルコリンにグリセリン存在下でホスホリパーゼDを作用させてホスファチジルグリセリンへ変換するときの,ホスファチジン酸の生成を抑制するための解決策として1)ミセル系反応法2)基質のエーテル溶液を水に懸濁して反応させる方法を考え,比較したところ,2)では速度は遅いが水解がほとんど無くて100%変換できることを報告している。Aurichら（非特許文献５）は、ホスホリパーゼDを用いたN-(2-ヒドロキシ-エチル)-N-メチルピペリジンによるオクタデシルホスホコリンのコリンの交換は動力学的に制御され、緩衝液中で最大60%,緩衝液/ヘキサン中で43%,緩衝液/n-ヘキサン/1-オクタノール中で82%の交換が得られることを報告している。Subraminoら（非特許文献６）は、Triton X-100を含むジエチルエーテル中におけるホスホリパーゼDのホスファチジルコリンの分解に及ぼす含水量, ホスホリパーゼD濃度及びホスファチジルコリン濃度の影響を調べた。Ryuら（非特許文献７）は、ホスホリパーゼDの活性が,リゾホスファチジルエタノールアミンおよびリゾホスファチジルイノシトールにより阻害されることを示した。一方、リゾホスファチジルコリン,リゾホスファチジルグリセロール,リゾホスファチジルセリンでは効果がなかった。上記以外の特許文献として、ホスホリパーゼを用いて、コレステロールを低減する技術（例えば特許文献１）が知られている。
【０００４】
以上のように、工業的に有用なホスホリパーゼDを効率的に利用するために、固定化酵素を調製する試みがなされている。JUNEJAら（非特許文献８）は、L-またはD-セリンの存在下、両親媒性ゲルに固定化したホスホリパーゼDによるホスファチジルコリンのホスファチジルセリンへの転換を調べた。2層反応は30±0.5°CでセリンとホスホリパーゼDを含む水層とホスファチジルコリンを含む酢酸エチルで行なった。溶媒として酢酸エチルとジエチルエーテルは十分なトランスホスファチジル化を示した。MASOOMら（非特許文献９）は、ホスホリパーゼDをガラスビーズに固定化たカラムと,アルカリ性ホスファターゼおよびコリンオキシダーゼを固定化したカラムを連結することにより,両カラム共にフローインジェクション系で生成する過酸化水素を電流滴定することによりホスファチジルコリンを定量できることを報告した。JUNEJAら（非特許文献１０）は、ホスホリパーゼDの固定化の方法および固定化酵素を用いたホスファチジルセリンの効率のよい生産方法について検討した。連続処理システムおよびバッチ処理システムにおいてそれぞれ最適な条件を調べた。ホスホリパーゼDの固定化率および活性は100%に達し,反復バッチ処理においてきわめて良好な結果が得られたという。MASOOMら（非特許文献１１）は、ホスホリパーゼDをグルタルアルデヒドにより多孔性ガラスビーズに固定化し,カラムリアクタに充填した。カルシウム,トリトンX-100を含むジエチルバルビトンバッファにホスファチジルコリンを溶解し,上記カラム内を循環させて反応した。PL-Dの反応に脂肪酸特異性はなく、ホスファチジン酸を調製した。
【０００５】
ホスホリパーゼ以外の酵素の固定化技術として、プロテアーゼをキトサンやイオン交換樹脂に固定化する技術（例えば特許文献３）、マルトジェニックα―アミラーゼを多孔質に固定化する技術（例えば特許文献４）、β―ガラクトシダーゼをポリマーやガラスに固定化する技術（例えば特許文献５）が知られている。
【０００６】
【特許文献１】特開平５−４９４１４
【０００７】
【特許文献２】特開平８−２９１１８８
【０００８】
【特許文献３】特開平１１−２２１０４９
【０００９】
【特許文献４】特開２０００−１８９１６１
【００１０】
【特許文献５】特開平６−１４１８２２
【００１１】
【非特許文献１】Eur J Lipid Sci Technol Vol.105, No.6, Page308-317 (2003)
【００１２】
【非特許文献２】日本油化学会誌 Vol.47, No.1, Page51-56 (1998)
【００１３】
【非特許文献３】油化学 Vol.42, No.4, Page297-301 (1993)
【００１４】
【非特許文献４】Enzyme Microb Technol Vol.9, No.6, Page350-354 (1987)
【００１５】
【非特許文献５】ULBRICH-HOFMANN R Vol.19, No.9, Page875-879 (1997)
【００１６】
【非特許文献６】ULBRICH-HOFMANN R Vol.18, No.7, Page815-820 (1996)
【００１７】
【非特許文献７】Proc Natl Acad Sci USA Vol.94, No.23, Page12717-12721 (1997)
【００１８】
【非特許文献８】Biochim Biophys Acta Vol.1003, No.3, Page277-283 (1989)
【００１９】
【非特許文献９】Anal Biochem Vol.187, No.2, Page240-245 (1990)
【００２０】
【非特許文献１０】化学工学協会年会研究発表講演要旨集 Vol.53rd, Page27 (1988)
【００２１】
【非特許文献１１】Process Biochem Vol.30, No.8, Page701-704 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
上述のように、ホスホリパーゼDの固定化が行われてきたが、いずれも、グルタルアルデヒドや、食品製造に用いることができないゲルを用いている。また、工業的に目的生産物を安価に且つ効率よく得るという点でこれまで十分に満足するものは得られていない。そこで、本発明は、食品製造に使用可能な固定化ホスホリパーゼＤの製造法と固定化ホスホリパーゼＤを利用したバイオリアクターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
これらの点を克服し、食品の製造に使用でき、工業的に有利な固定化酵素を得るため、鋭意研究を行った。そしてホスホリパーゼを各種ゲル化剤を使用しその固定化を種々検討した結果、こんにゃくマンナンゲルを用いると効率よく固定化 できることを見出した。しかも得られた酵素 を用いて塩基交換反応を行い、その活性を比較したところ活性がほとんど低下せず、むしろ増大するという現象を見出した。また、得られた本固定化 酵素 は、その固定化 は極めて強固であり、高濃度の基質溶液中でも酵素 の漏出がほとんど認められず、充填カラムによる連続的生産に効率的に使用され得ることを見出した。そして、本固定化 ホスホリパーゼを利用すれば工業的にも優れた反応物が提供できることを知見し、結果、本発明を完成したのである。
【００２４】
かくして、本発明は、〔１〕 こんにゃくマンナンを主体とする担体に、ホスフォリパーゼDを固定化 していることを特徴とするホスフォリパーゼD固定化 酵素；
〔２〕ホスフォリパーゼDが、キャベツまたは細菌より得られるものであることを特徴とする〔１〕記載の固定化 酵素 ；
〔３〕 細菌がＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．であることを特徴とする〔２〕記載の固定化 酵素；
〔４〕 酵素 固定化 用担体が、こんにゃく 生芋をすりおろしたもの又はこんにゃく 精粉に凝固剤を添加したゲル化物である〔１〕〜〔３〕記載の固定化酵素；
〔５〕酵素 固定化 用担体が、こんにゃく 生芋をすりおろしたもの又はこんにゃく 精粉に凝固剤を添加してゲル化物であり、添加物として、こんにゃく以外の原料由来のゲル化剤を含む〔１〕〜〔３〕の固定化酵素；
〔６〕 〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載の固定化酵素 を含有していることを特徴とするバイオリアクターである。
【発明の効果】
【００２５】
こんにゃくマンナンを含むゲルすなわち担体に、ホスフォリパーゼDを固定化することにより、酵素固定化時の、酵素活性の低下を最小限に抑えることができる。また、本発明の方法によりホスホリパーゼDが強固に固定化され、反応時の酵素の漏出が最小限に抑えられる。さらに、本発明の固定化ホスホリパーゼ用いたリアクターにより工業的にも優れた反応物が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、こんにゃくマンナンを担体として使用し、その担体に固定化 されたホスホリパーゼに関する。本発明で担体として使用されるこんにゃくマンナンは、グルコマンナンすなわち、こんにゃく生芋をスライスし、乾燥した後、副産物である飛粉を除去した（精粉）である。精粉を精製し、グルコマンナン含量を高めた精製品の使用が好ましい。精製グルコマンナンとしては、一般市販の製品、例えば製品名スーパーマンナン（荻野商店製）やマンナンベース（サンフラワースミヨシ製）を使用できる。こんにゃくマンナンをゲル化する方法には、以下の２方法を採用できる。すなわち、精粉または精製品を水で希釈した後、水酸化カルシウムや炭酸ナトリウムを添加しアルカリ性とするか、加温下で精粉または精製品とこんにゃく以外のゲル化剤を混合した水溶液とし、冷却する方法でゲル化できる。ゲル化剤としては、食品添加物として認められているもの、例えば、カラギーナン、キサンタンガム、ジェランガム、アラビアガム、デンプン等を単独または組み合わせて使用することができる。ゲル中のこんにゃくマンナンまたは／およびゲル化剤の含有量は、０．０２〜２０重量％、好ましくは０．１〜５重量％、より好ましくは１から３重量％とする。ゲル中のこんにゃくマンナンまたは／およびゲル化剤の含有量が０．０２重量％未満では、ゲルの強度が不足し、リアクターに応用することができず、２０重量％より多くなると、ゲル強度が強すぎて、微細な固定化酵素の調製が困難になる。
【００２７】
本発明に使用するこんにゃくマンナンの原料となるこんにゃく芋は、里芋科のAmorphophallus rivieri var. konjacである。コンニャク芋の品種として在来種 （赤茎、白ヅル、平玉、和玉、大玉種など）、支那種 、備中種 （青茎、黒ヅル、長玉、石玉など）があり、育成品種として、はるなくろ（こんにゃく農林１号） 、あかぎおおだま（こんにゃく農林２号） 、みょうぎゆたか（こんにゃく農林３号） 、みやままさり（こんにゃく農林４号）が知られているが、本発明にはいずれの品種のコンニャク芋も使用できる。また、上記の品種のうちの１種類または複数を組み合わせて使用する。こんにゃくマンナンを採取できる部位は、球茎と生子である。また、栽培または天然のコンニャクを適宜組み合わせて用いることができる。
【００２８】
本発明で固定化するホスホリパーゼDは、天然由来のもの、例えば、キャベツ、ピーナッツ、微生物等由来の物を単独または適宜組み合わせて使用することができる。ホスホリパーゼDの原料となる細菌として、バチルス族のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．や放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．を挙げることができる。本発明には、起源を限定せず、ホスホリパーゼDの活性を有するタンパク質を単独または適宜組み合わせて使用することができる。本発明の固定化酵素中の酵素含量は、酵素活性が０．００１〜１０００U／ｍｇになるよう調製する。酵素活性が０．００１U／ｍｇでは、必要な反応生成物を得るために長時間を要すことになり、結果コスト面で不利が生じる。また、酵素活性が１０００U／ｍｇにした場合に、酵素添加量に応じた反応速度の増加が見込めない。
【００２９】
酵素ホスホリパーゼDを担体に固定するには、当該酵素 を極端に失活させることのないような条件下で行われ、例えば、溶液にこんにゃくマンナンおよび／またはゲル化剤を所定量溶解し、最終的な酵素活性が約０．００１〜１０００U／ｍｇとなる量の酵素を添加する。次いで、酵素 の安定範囲、例えば pH 約 3〜10、温度約 0〜80℃の範囲で、約 0.1〜50時間混合し、水酸化カルシウムや炭酸ナトリウムを添加しアルカリ性するか、溶液を冷却することによりゲル化させる。溶液をノズルや押し出し造粒機等を用いて、微細化することにより、表面積を大きくし、効率を高めることができる。また、あらかじめ板状のゲルを作り、次いで、カッター、粉砕機等により微細に切断することにより微細な小手か酵素を調製することが可能である。
【００３０】
本発明の固定化酵素が触媒する反応は、加水分解と塩基交換である。反応基質としてホスファチジルコリンとセリンを用いた反応系では、反応物として、加水分解物すなわちホスファチジン酸と塩基交換反応物すなわちホスファチジルセリンが得られ、セリンの代わりにグリセリンを用いた反応系では、ホスファチジルセリンの代わりに、ホスファチジルグリセロールが得られる。反応液中のホスファチジルコリン、セリン、グリセロールは化学合成品、天然物を問わず、両者を単独または適宜組み合わせて使用できる。反応の溶媒としては、セリン、グリセリンを水層、ホスファチジルコリンを有機溶媒、すなわち、エーテル、クロロホルム、トルエン等に溶解し、両者を攪拌により混合して、反応を行う方法、または、セリン、グリセリン等を含む水溶液に、ホスファチジルコリン等の油溶性物質を乳化して反応を行う方法を採用することができる。
【００３１】
本発明の固定化 酵素 と、反応液とは、回分法、あるいは連続法で接触せしめて加水分解または塩基交換反応させることができ、工業的に実施するに適した方法を適宜選択して行うことができる。反応液中の成分濃度は、ホスファチジルコリン等の油溶性成分が、約 ５〜５０w/v% 、そしてセリン、グリセリンなどの水溶性成分の濃度が、約 ５〜３０重量％とする。基質溶液に約１〜１０重量％のカルシウム塩、例えば、塩化カルシウムを共存させることにより反応速度を高めることができる。反応条件としては、固定化酵素中の酵素が安定で、しかも充分に作用し得る条件、例えば pH 約 3〜10、より好ましくは pH 約 5〜10、温度約 20 〜80℃、より好ましくは約４０〜６０℃の範囲で選ばれる。反応液中の油溶成分または水溶成分の濃度が５重量％未満では、十分な反応速度が得られない。また、反応液中の油溶成分または水溶成分の濃度がそれぞれ５０または３０重量％より多くなると、粘度が高くなり連続した反応を行うことが困難になる。
【００３２】
本発明のバイオリアクターは、酵素 担持された担体が反応させるべき流体と接触できるようにする装置を有しているものである。有利には、該装置は、撹拌型リアクター、バスケット型リアクター、流動床式リアクター、バックベッド式リアクター、フィルター式リアクターなどから選ばれたものである。ごく一般的な固定化 酵素 の使用形式としては、充填カラムによる連続式のものでも、あるいは固定化 酵素 の回収が容易なバッチ式でもよい。バイオリアクターは、同様にして、１本のカラムあるいは有利には複数のカラムを有する装置で構成されていてよい。処理されるべき反応液は、好ましくは、カラムの中を重力の働く方向に流れるものである。バイオリアクターの別の有利な実施態様としては、該装置に加えて、処理すべき基質の入った槽、バイオリアクターからの流出物を後処理するための後処理槽、及び生成物の貯蔵用槽を含むものである。
【００３３】
次に、本発明を実施例にてさらに詳しく説明する。
【００３４】
１．キャベツホスフォリパーゼ（粗酵素）の調製
原料として、群馬県吾妻郡田代の群馬県園芸試験場高冷地分場で栽培したキャベツ（つまみどり）を用いた。内側の明るい緑色の葉（200g）に300mlの水を加え、5minホモジナイズした。 粉砕した試料は絹を通して圧搾した。ろ液を13000×gで30min遠心分離し、クリアな上清が380mlを得た。上清を55℃、3min熱処理した。迅速に急冷し、不溶成分は4℃、15000×ｇ、30min遠心で分離除去した。クリアな上清に0.4倍量エタノールを加え、-15℃で20min以上冷却した。15min、-15℃中で攪拌した。沈殿物を3000×ｇ、5min遠心除去した。沈殿物を水に再び溶かし、15000×ｇ、5min遠心分離した。再懸濁と遠心を、上清に酵素活性が検出できなくなるまで繰り返した。Amicon  X100膜（日本ミリポア製）を通して限外濾過した。凍結乾燥し、粗酵素とした。
２．ホスホリパーゼの精製
2gの凍結乾燥した粗酵素を20ml 30mM Pipes buffer (pH6.2) ,50mM CaCl2に懸濁した。12000×ｇ、5min遠心分離した。酵素活性を含む黄色い上清を Octyl-Sepharose CL-4B column (2.5cm×20cm；アムシャム製)にチャージした。充填材は30mM Pipes buffer (pH6.2),50mM CaCl2、flow rate : 24ml/hであらかじめ平衡化した。黄色の物質が洗い流されるまで同様のバッファーで少なくとも60mlリンスした。活性画分は10mM Pipes Buffer (pH6.2),30mM CaCl2で溶出した。最終的に10mM Pipes Buffer (pH6.2),0.1mM EDTAで溶出した。5mlの活性フラクションをプールした。20mM Tris-HCl (pH7.5)中で透析した。透析した酵素溶液をMono-Q HR 5/5 column(trimethylammonium, Pharmacia)にチャージした。リニアグラジエントで溶出（20mM Tris-HCl (pH7.5) 90ml中の0〜0.5M NaCl  flow rate : 1ml/min pressure: 1.0と2.0Mpaの間を維持（FPLC,Pharmacia））した。活性フラクションをプールした。PM30膜を用いたAmicon cellにおける限外濾過で10倍に濃縮した。精製酵素を分注し、30%のグリセロールを加えて-80℃で保存した。
３．酵素活性測定法
第一反応試薬混合液は、0.1M  Tris-HCl  buffer  pH8.0  1.6ml、0.1M  CaCl2  0.4ml、H2O  1.2ml、25ｍM  基質溶液（シグマ社製  ジオレオイルホスファチジルコリン88.5mgを5%（W/V）TritonX-100溶液4.5mlで溶解後4℃、10min超音波乳化）0.8mlの混合液とした。第二反応試薬混合液は、15mM  4-アミノアンチピリン（4-AA）溶液  0.8ml、0.2％（W/V）フェノール液  0.8ml、60mM  EDTA溶液  pH8.0  0.8ml、50mM  Tris-HCl  buffer  16ml、90U/ml  ペルオキシダーゼ（POD）溶液｛POD（旭化成製） 900Uを精製水10mlで溶解したもの｝0.8ml、30U/ml  コリンオキシダーゼ（COD）溶液｛COD（旭化成製） 300Uを10mM Tris-HCl buffer pH8.0  10mlで溶解したもの｝  0.8mlの混合液とした。酵素溶解希釈溶液は、0.05％（W/V）BSA（シグマ社製）と0.1％（W/V）TritonX-100を含む10mM Tris-HCl buffer pH8.0とした。酵素試料液は、    検品約20mgを精密に量り、酵素溶解希釈溶液で全容20mlとした。その液を酵素溶解希釈溶液で適宜希釈した。小試験管に第一反応試薬混合液40ml を正確に分注し、37℃で予備加温した。5分経過後、酵素試料液4mlを正確に加えて混和し、37℃で第一反応を開始した。10分経過後、第二反応試薬混合液200ml を加えて混和し、37℃で第二反応を開始した。盲検はこの時点で酵素試料液4mlを加えた。20分経過後、500nmにおける吸光度を測定した。
４．ホスファチジルセリンの定量法
塩基交換反応中に経時的にサンプリングを行い、油脂中のＰＳ含有量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により測定した。すなわち、有機溶媒相を0.5ml採取し、水5ml、ヘキサン5mlを加え攪拌した後、遠心分離（2500rpm、10分間）に供し、上清を1ml回収した。さらに、溶媒を乾燥させ、乾燥物を試料とした。試料10mgに対して内部標準溶液1mlを加えHPLCに供した。分析はDEVELOSIL  60-5（4.6×250mm、野村化学製）をWaters製HPLC  LC Module-I型に装着し、カラム温度は45℃、移動相としてアセトニトリル：メタノール：リン酸＝780：50：9(V/V/V)を用い、流速を1.5ml/minとした。検出はＵＶ検出器を用い、202nmの波長で検出した。
【実施例１】
【００３５】
酵素の固定化
こんにゃくマンナン（スーパーマンナン；荻野商店製）２５０ｍｇとカラギーナン（シグマ社製）２５０ｍｇを１００ｇの蒸留水に添加し、８０℃で３０分間攪拌して溶解した。５０℃まで冷却後に実施例で得たキャベツホスホリパーゼを１０ｇ添加しさらに３０分攪拌した。ペリスターポンプ（２ｍｌ／分）で５℃に冷却した油脂（パナセート８１０；日本油脂製）に滴下して３０分保持することによりゲル化した。ゲル化した固定化酵素をメッシュで受けて中鎖脂肪酸トリグリセリドを除去した後、１Lのエタノールで洗浄して完全に油分を除去した。酵素活性の測定結果は、１．５U／ｍｇであった。
【実施例２】
【００３６】
こんにゃく芋精粉（荻野商店製）３０ｇと蒸留水９００を加温攪拌してこんにゃく糊とした。水酸化カルシウム２ｇと放線菌由来ホスフォリパーゼD（旭化成製）１ｇを添加して攪拌後、３０分放置し、６０℃で２時間加温してゲル化した。ゲルをミートチョッパーを用いて切断し、粒径１mm程度の固定化酵素を得た。固定化酵素の活性は１０U／ｍｇであった。
【実施例３】
【００３７】
蒸留水１００ｍｌにグリセリン１０ｇと塩化カルシウム０．２ｇを添加して水層とした。ジエチルエーテル１００ｍｌにホスファチジルコリン（ＳＬＰ−ＰＣ７０；ツルーレシチン製）１０ｇを溶解し有機溶媒層とした。水層と有機溶媒層と実施例１の固定化酵素１０ｇを４０℃を保って８時間攪拌した。反応液開始時の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールの含量はそれぞれ５６重量％、３重量％、０．５重量％であったが、反応開始８時間後の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールの含量は２０重量％、１１重量％、２８．５％であった。反応収量後にメッシュにより固定化酵素を回収した。回収した固定化酵素の活性は１．３U／ｍｇであった。
【実施例４】
【００３８】
蒸留水１０ｋｇにホスファチジルコリン（含有率９５％；日清製油製）２００ｇ、Ｌ−セリン２００ｇ、塩化カルシウム０．５ｇを添加して、ポリトロン（キネマチカ製）で２０分間乳化した。カラム（直径 1.8 cm 、長さ 18 cm）に実施例２の固定化酵素を１０ｇ充填し、上記の乳化物をペリスターポンプで２０ｍｌ／分の速度で３時間循環させた。カラムは５０℃の恒温槽中に入れ、反応を５０℃近傍で行った。反応開始時の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンの含量はそれぞれ９５重量％、０重量％、０．５重量％であったが、反応開始８時間後の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンの含量は３２重量％、５重量％、５８．５％であった。反応終了後の固定化酵素の活性は、９Ｕ／ｍｇであった。
（比較例１）
酵素の固定化
寒天１．５ｇを１００ｇの蒸留水に添加し、８０℃で３０分間攪拌して溶解した。５０℃まで冷却後に実施例で得たキャベツホスホリパーゼを１０ｇ添加しさらに３０分攪拌した。ペリスターポンプ（２ｍｌ／分）で５℃に冷却した油脂（パナセート８１０；日本油脂製）に滴下して３０分保持することによりゲル化した。ゲル化した固定化酵素をメッシュで受けて中鎖脂肪酸トリグリセリドを除去した後、１Lのエタノールで洗浄して完全に油分を除去した。酵素活性の測定結果は、０．５U／ｍｇであった。
（比較例２）
アルギン酸ナトリウム（新進科研製）２０ｇと蒸留水４８０ｍｌを加温攪拌して溶解した後、放線菌由来ホスフォリパーゼD（旭化成製）１ｇを添加して攪拌後、４重量％の塩化カルシウム溶液５００ｍｌを添加し攪拌後３０分放置してゲル化した。ゲルをミートチョッパーを用いて切断したが、粒子状にならず、糊状になった。酵素の活性は２U／ｍｇであった。
（比較例３）
実施例１の固定化酵素の代わりに比較例１の酵素を用いた以外は実施例３と同様の方法で、反応を行った。反応液開始時の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールの含量はそれぞれ５６重量％、３重量％、０．５重量％であったが、反応開始８時間後の総脂質中のホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールの含量は４３重量％、５重量％、１１．５％であった。反応収量後にメッシュにより固定化酵素を回収した。回収した固定化酵素の活性は０．２U／ｍｇであった。
（比較例４）
実施例２の固定化酵素の代わりに比較例２の酵素を用いた以外は実施例４の同様の方法で反応を行った。反応開始後１０分で、カラムの出口で目詰まりを起こし、反応液を循環することができなくなった。ゲルを回収して酵素活性を測定した結果、酵素が流出したため、活性が認められなかった。
【００３９】
以上の実施例、比較例から、本発明の固定化酵素が固定化時の酵素のロスが少なく、反応時の酵素の保持に優れているのことが分かる。