(57)【要約】【課題】  生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供する。【解決手段】  エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する
プレニルアルコールの製造方法。
【請求項２】
エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を培地に添加することで、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項３】
上記エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤は、上記細胞の培養途中に培地に添加することを特徴とする請求項２記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項４】
エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項５】
エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項６】
上記細胞は、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ欠損酵母であることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項７】
細胞の培養に際して、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下とすることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項８】
スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項７記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチルCo-Aとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００３】
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。しかしながら、グルコース等の炭素源からの変換率は著しく低く、殆どの炭素源はプレニルアルコールの生合成以外の代謝経路に使用されている。したがって、培地に含まれる炭素源をプレニルアルコールの生合成に効果的に使用できれば、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、現在そのような報告例はない。
【０００４】
例えば、スクアレン合成酵素阻害剤であるスクアレスタチン1を投与したラットでは血中のa11トランスのファルネソール濃度が上昇する(非特許文献１)。また、同様にスクアレン合成酵素阻害剤であるzaragozic acid Bを含む培地で培養したCandida albivcans、スクアレン合成酵素遺伝子が欠損したSaccharomyces cerevisiaeにおいてもa11トランスのファルネソールが生産されることが報告されている(非特許文献２、非特許文献３)。
【０００５】
これらのファルネソール生産量は少ないが、遺伝子組換えによってプレニルアルコール生産を向上させることができる。たとえば、スクアレン合成酵素遺伝子欠損酵母のHMG-COA還元酵素遺伝子を強化することによりファルネソール生産を向上させる方法(特許文献１)、特異的フォスファターゼ遺伝子を強化することによるゲラニルゲラニオール生産向上する方法(特許文献２)、さらにはゲラニルゲラニル二リン酸合成遺伝子とファルネシルニリン酸合成酵素遺伝子との融合遺伝子を用いてゲラニルゲラニオールを生産する方法等が報告されている(特許文献３)。しかしながら、これらの方法ではプレニルアルコール生産はC源のグルコースが消費されてから生産量が上昇するため、培養時間が長期化する問題点があった。
【０００６】
すなわち、プレニルアルコールの生産性を向上させるため、簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコールの製造方法は確立されていない。
【０００７】
【特許文献１】特表2002-519049号
【特許文献２】PCT JPO1/11223
【特許文献３】PCT JPO1/11214
【非特許文献１】Bansa1 VS et.a1, Arch Biochem. Biophys. 1994,315,393-399
【非特許文献２】Jacob M. et．a1,Antuimicrob Agents Chemother. 2003 Jul;47(7)9:2366-9
【非特許文献３】Chambon S. et. al, Curr Genet 1990 Jul;18(1):41-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させた細胞において、プレニルアルコールを高生産することを見出し、本発明を完成するに至った。本来、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼを破壊すると、アルコールデヒドロゲナーゼの発現を抑制することが知られており（Genetics. 1990 Feb;124(2):283-91）、その結果、エタノールの蓄積が増加する。このため、本来、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼを破壊株においては、アセトアルデヒドからエタノールへと進む経路に流れる物質量が増加し、アセトアルデヒドから酢酸へと進む経路に流れる物質量が減少するため、プレニルアルコールの生産は減少するものと考えられる（図１参照）。しかしながら、本発明者は、この本来考え得る予想に反して、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させた細胞において、プレニルアルコールを高生産するといった知見を得るに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収する方法である。
【００１１】
本発明において、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を培地に添加すること、又は、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の発現を低下させること、又は、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼを低下させる条件下で細胞を培養することで、当該細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼは、Saccharomyces cerevisiaeにおいて、炭素異化代謝産物抑制（carbon catabolite repression）を引き起こす遺伝子（CCR4遺伝子）によってコードされている。
【００１４】
本発明において、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼとしては、Saccharomyces cerevisiaeのCCR4遺伝子によりコードされるタンパク質に限定されず、Xenopus laevisのnocturnin遺伝子、Homo sapiensのCCRN4L遺伝子、Mus musculusのCCRN4l遺伝子、Cyanidioschyzon merolaeのCMJO74C遺伝子によってコードされるタンパク質を含む意味である。
【００１５】
また、本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール、プレノール、ゲラニルリナロールを意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
【００１６】
本発明においては、プレニルアルコールを生合成する代謝経路と持つ細胞を対象としている。プレニルアルコールを合成する代謝経路では、図１に示すように、グルコースやエタノール等の炭素源から合成されたアセチルCo-Aからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸が合成される。イソペンテニル二リン酸は、ペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸に異性化される。また、図１に示すように、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸は、イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸を基質として順次合成される。さらに、図１に示すように、プレニルアルコールであるファルネソール、ネロリドール及びゲラニルゲラニオールは、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲラニル二リン酸から合成される。一方、ファルネシル二リン酸からは、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンが生合成される。スクアレンは、ステロールの前駆体物質となり、最終的にエルゴステロールとなる。
【００１７】
なお、図１及び以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol；GGOH）
ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate；GGPP）
ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate；FPP, ）
イソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate；IPP）
ジメチルアリル二リン酸（dimethylallyl diphosphate；DMAPP）
ファルネソール（farnesol；FOH）
ネロリドール（nerolidol；NOH）
【００１８】
本方法においては、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ（以下、単に「ポリ(A)デアデニラーゼ」と称する）活性を低下させる条件下で細胞を培養する。ここでポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させる方法としては、
１．当該ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を培地に添加する
２．当該ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写を抑制する
３．当該ポリ(A)デアデニラーゼの翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
【００１９】
１．ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を培地に添加する方法
ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤としては、例えば、一般的なリボヌクレアーゼ阻害剤であるジエチルピロカーボネート(DEP)などを挙げることができる。
【００２０】
これらポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤は、細胞を培養する培地に単独で添加しても良いし、複数を組み合わせて添加しても良い。ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤としてDEPを使用する場合、添加量は、特に限定されないが、0.1〜10 g/Lが好ましい。
【００２１】
また、本方法では、ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を、細胞を培養する培地に予め添加していても良いし、細胞の培養途中に培地に添加してもよい。特に細胞の種類によっては、ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤によって生育阻害が生ずる場合もあり、この場合には、細胞が十分に生育（増殖）した後、ポリ(A)デアデニラーゼ阻害剤を培地に添加することが好ましい。
【００２２】
また、細胞としては、特に限定されないが、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、大腸菌、枯草菌及び糸状菌等の微生物を思量することができる。また、本方法においては、微生物に限定されず、例えば、ヒト脂肪細胞、ニワトリ脂肪細胞、マウス脂肪細胞等の脂肪酸合成能の高い細胞を使用することができる。
【００２３】
また、本方法においては、これら細胞に対して、プレニルアルコール合成の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、フォスファチジン酸フォスファターゼ等の遺伝子を強化し、プレニルアルコールの生産能を向上させた変異型細胞を使用しても良い。これら遺伝子を強化する方法としては、遺伝子の発現制御領域（プロモーター等のシス領域）を置換したり、遺伝子に変異を導入して酵素活性を増強させたりする方法が挙げられる。
【００２４】
細胞を培養する培地としては、特に限定されず、上述した細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。細胞としてSaccharomyces cerevisiaeを用いる場合、例えば、グルコース及び大豆油を添加したYM培地を使用することができる。
【００２５】
また、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノール  LG-109 (旭電化製)、アデカノールLG-294(旭電化製)、アデカノールLG-295S (旭電化製)、アデカノールLG-297 (旭電化製)、アデカノールB-3009A (旭電化製)、アデカプロニックL-61 (旭電化製)
【００２６】
油脂濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)であり、界面活性剤濃度は0.005〜1%(w/v)、好ましくは0.05〜0.5%(w/v)であり、テルペノイド濃度は0.01%(w/v)以上、好ましくは1〜3%(w/v)である。
【００２７】
２．ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法
ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる細胞におけるポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型細胞を調製し、当該変化型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、GAL1遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
【００２８】
また、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、細胞におけるポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型細胞を調製し、当該細胞を培養しても良い。
【００２９】
さらに、RNAデコイをコードする核酸を細胞内に導入することによって、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の発現を転写レベルで抑制することができる。当該RNAデコイとは、転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するRNAを指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものをいう。
【００３０】
３．ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスRNAを用いる方法が挙げられる。すなわち、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、細胞ゲノムに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。アンチセンスRNAに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳類（マウス）、昆虫（ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Mizuno et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 1966-1970; Aiba et al. (1987) J. Bacteriol, 169, 3007-3012; Green et al. (1986) Annu. Rev. Biochem., 55, 569-597; Harland et al. (1985) J. Cell. Biol., 101, 1094-1099; Coleman et al. (1984) Cell, 37, 429-36; Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 4313-4317; Hackett et al. (2000) Plant Physiol., 124, 1079-86）。
【００３１】
なお、アンチセンスRNAの代わりに、アンチセンスDNAを使用することによって、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の発現を転写レベルで抑制することもできる。何れの場合であってもアンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意の核酸物質を使用することができる。例えば、DNA、RNA、又は任意の核酸擬似物が挙げられる。従って、発現を抑制させようとするポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンス核酸（オリゴヌクレオチド）配列を設計すればよい。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体も使用することができる。分子類似体は、高安定性、分布特異性などを有するものである。分子類似体には、化学的に反応性である基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものが挙げられる。
【００３２】
さらにまた、リボザイムを使用することによって、上述した遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制することができる。リボザイムとは、特定のタンパク質のmRNAを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、FEBS Letter, 228; 228-230(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のmRNAを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。
【００３３】
ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子のmRNAを選択的に分解する方法としては、RNA干渉を利用する方法を挙げることができる。RNA干渉とは、二本鎖を形成しているRNA（以下、「二本鎖RNA」又は「dsRNA」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのRNAの塩基配列に相同的な内在性のmRNAが分解される結果、当該mRNAからの遺伝子発現が特異的に抑制される現象である。RNA干渉は、RNAインターフェアランス、RNAiとも称される。RNA干渉の原理を利用するための遺伝子としては、ヘアピン型dsRNA等の宿主内で二本鎖RNAを形成するように、発現を抑制したいポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計される。
【００３４】
また、上記１〜３の方法に限定されず、例えば遺伝子組換え技術を用いてポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子に変異を導入し、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることも本発明に含まれる。ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子の遺伝子破壊によって、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることも可能である。
【００３５】
以上のように、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下した条件下で細胞を培養する際には、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件で、細胞を培養することが好ましい。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。
【００３６】
スクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、SQAD（特表平8-508245）、BMS-187745(Taxi. Appl. Pharm., 145, 91-98(1987)), ER-27856(J. lipid. Res. 44, 128-135(2002))などの合成品の他、カビの生産するzaragozic acid(Nat, Prod, Rep., 11, 279-302(1994))などを挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを使用した場合、SQADの添加量は、細胞を培養する培地中に5〜200mg/Lとすることが好ましい。
【００３７】
また、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、WO 02/053747に開示されている方法を、細胞に適用することができる。
【００３８】
本方法においては、細胞を、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を阻害する条件下で培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３９】
本方法においては、プレニルアルコールを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００４０】
酵母においてポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子を欠損させると、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ADH2遺伝子）の発現を抑制することが知られており（Genetics. 1990 Feb;124(2):283-91）、その結果、エタノールの蓄積が増加する。このため、本来、ポリ(A)デアデニラーゼの破壊株においては、アセトアルデヒドからエタノールへと進む経路に流れる物質量が増加し、アセトアルデヒドから酢酸へと進む経路に流れる物質量が減少するため、プレニルアルコールの生産は減少するものと考えられる（図１参照）。しかしながら、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させた細胞において、プレニルアルコールを高生産することは当業者の予測に反した事実である。
【００４１】
さらに、酵母においてポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子（CCR4遺伝子）は、炭素異化代謝抑制を引き起こす機能、すなわち、細胞にとって資化しやすいグルコースが存在すると、他にグルコースの資化速度を最大にするように他の代謝系を抑制する機能を有している。したがって、ポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させることによって、グルコースが存在する培養初期の段階においても、プレニルアルコールの合成を促進することができる。
【００４２】
また、本方法においては、ポリ(A)デアデニラーゼとともにスクアレン合成酵素活性を阻害する条件下で、細胞を培養することによって、プレニルアルコールの生産性をより向上させることができる。これは、図１に示す生合成経路において、スクアレン合成反応が抑制される結果、プレニルアルコールの合成反応が亢進するためであると考えられる。
【００４３】
スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてSQADを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、1〜100mg/Lとすることが好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明に係るプレニルアルコールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
本例では、細胞としてSaccharomyces cerevisiae ATCC 4030387株、及びその野生株であるSaccharomyces cerevisiae ATCC 201390株を使用した。これらの株は、ATCCから購入した。Saccharomyces cerevisiae ATCC 4030387株は、ポリ(A)デアデニラーゼ遺伝子であるCCR4遺伝子を破壊した菌株である。
【００４６】
上記菌株の培地は下記組成のYPDO6-1-SSI培地を使用した。
YPDO6-1-SSI培地組成
グルコース                      60g
Bactopepton                     20g
Bacto Yeast Extract             10g
大豆油                          10ml
アデカノールLG109               1ml
エルゴステロール溶液（10mg/ml）  2ml
【００４７】
上記組成を１Ｌの脱イオン水に加えてオートクレーブ滅菌した。なお、上記組成中、エルゴステロール溶液は、タージトールとエタノールを重量比で１：１で含む溶液である。培地が十分に冷えた後、乾熱滅菌した試験管に3mlずつ分注した。また、培地には、フィルター滅菌したスクアレン合成酵素阻害剤であるSQAD（特表平8-508245号）の水溶液（2.5mg/ml）を24μlずつ添加した。
【００４８】
上記細胞株の前培養は、バッフル付き100ml三角フラスコに培地20mlを入れ、スラントより一白金耳植菌し、30℃、130rpmで3日間回転培養する条件とした。次に、滅菌した培地2mlを入れた18φmm×125mmの試験管に前培養液40μlを入れ、種々の温度で振とう培養した。
【００４９】
培養終了後、培養液2mlに対して1.25mlのメタノールと2mlのペンタンを加え、十分にボルテックスした後、試験管ごと遠心分離（1500rpm、5分、室温）した。遠心分離後、ペンタン層を注意深くピペットマン或いはパスツールピペットを用いて、GC/MS用のバイアル瓶に移した。
【００５０】
本例では、分離されたペンタン層に含まれるプレニルアルコールを、ヒューレットパッカード社製HP6890/5973 GC/MSシステムを用いて分析した。
インレット温度：250℃
ディテクター温度：260℃
MSゾーン温度
MS Quad：150℃
MS Source：230℃
スキャンパラメーター
Low Mass：35
High Mass：200
Threshold：40
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：2μl
洗浄回数：メタノールで3回、ヘキサンで2回
スプリット比：1：20
カラム：ヒューレットパッカード社製HP-5MS(O.25mm×30M、フィルム厚O.25μm)
キャリアーガス：1ヘリウム1.0ml/min
ソルベントディレイ：2min
オ一ブン昇温条件：l15℃、1.5分保持→70/分で250℃まで昇温、2分保持→70/分で300℃まで昇温、7分保持
ポストタイム：O
内部標準：1-ウンデカノール/エタノール溶液(1μl/ml)を各バイアルに10μ1添加
注入口ライナー：スプリット/スプリットレス ライナー
解析：TICを取り込んだ後、69マスをセレクションし1ウンデカノール(RT=3.39min)、ネロリドール(RT=3.86min)、ファルネソール(RT=4.23min)、ゲラニルゲラニオ一ル(RT=5.78min)のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
【００５１】
各菌株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。なお、表１において、「Cont a/a」はATCC 201390株であり、「CCR4 a/a」はATCC 4030387株である。
【００５２】
【表１】
2005348643.tif 000002
【００５３】
表１から判るように、培地中にグルコースが残存している培養初期（例えば培養日数二日目）においても、CCR4遺伝子欠損株では、野生株と比較してプレノール生産量が向上している。また、CCR4遺伝子欠損株では、酢酸の蓄積量が野生株と比較して減少していることから、アセトアルデヒドから酢酸へと進む経路に流れる物質量が減少していると考えられる。CCR4遺伝子欠損株において酢酸の蓄積量が減少していることからすると、本来、プレニルアルコールの生産は減少するものと考えられる（図１参照）。しかしながら、本実施例によれば、この本来考え得る予想に反して、CCR4遺伝子欠損株においてプレニルアルコールを高生産していることが実証された。
【００５４】
以上の結果より、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させた細胞において、プレニルアルコールを高生産することが明らかとなった。
【００５５】
〔比較例〕
上述した実施例と比較するため、プレニルアルコールの製造過程に関与する遺伝子であって破壊することによってプレニルアルコールを高生産できると考えられる遺伝子の破壊株について、実施例１と同様にしてプレニルアルコールの生産性を検討した。
【００５６】
本比較例で検討対象とした遺伝子は、ＡＣＨ１遺伝子（acetyl-CoA hydrase）、ＡＤＨ１遺伝子（alcohol dehydrogenase）、ＩＣＬ１遺伝子（isocitrate lyase）、ＧＤＨ１遺伝子（glutamate dehydrogenase）、ＧＬＴ１遺伝子（glutamate synthase）及びＣＯＱ１遺伝子（hexaprenyl diphosphate synthase）である。
【００５７】
結果を表２に示す。なお、ＡＣＨ１遺伝子欠損株はATCC4033041を、ＡＤＨ１遺伝子欠損株はATCC4036236を、ＩＣＬ１遺伝子欠損株はATCC4030202を、ＧＤＨ１遺伝子欠損株はATCC4031672を、ＧＬＴ１遺伝子欠損株はATCC4033869を、ＣＯＱ１遺伝子欠損株はATCC4033138を、ATCCより購入した。
【００５８】
【表２】
2005348643.tif 000003
【００５９】
ＡＣＨ１遺伝子は、アセチルＣｏＡを酢酸に分解する酵素であるため、ＡＣＨ１遺伝子破壊株においては酢酸が減少しＦＯＨ量が上昇すると予想した。しかしながら、表２に示すように、ＡＣＨ１遺伝子破壊株においてはプレニルアルコールの生産性を向上させる効果は見られなかった。
【００６０】
ＡＤＨ１遺伝子は、アセトアルデヒドをエタノールにする酵素であり、エタノール合成に関係している。したがってＡＤＨ１遺伝子破壊株においては、エタノール合成が減少しＦＯＨ生産が上昇すると予想された。しかしながら、表２に示すように、ＡＤＨ１遺伝子破壊株においては、プレニルアルコールの生産性が低下しており、また、生育も悪くなっていた。
【００６１】
ＩＣＬ１遺伝子は、グリオキシル酸経路に関与している酵素で、エタノールより酢酸を経由して合成されたアセチルＣｏＡより糖新生を行なう過程で関与している酵素である。したがって、ＩＣＬ１遺伝子破壊株においては、糖新生が抑えられＦＯＨ生産が上昇すると予測された。しかしながら、表２に示すように、ＩＣＬ１遺伝子破壊株においてはプレニルアルコールの生産性を向上させる効果は見られなかった。
【００６２】
ＧＤＨ１遺伝子及びＧＬＴ１遺伝子は、それぞれαケトグルタル酸よりＮＡＤＰＨを消費してグルタミン酸を合成する酵素である。ＦＯＨ及びＧＧＯＨ合成には多くのＮＡＤＰＨを必要とすることから、これらの遺伝子を破壊すればＮＡＤＰＨ量が上昇し、ＦＯＨ、ＧＧＯＨ生産が上昇すると予測された。しかしながら、表２に示すように、ＧＤＨ１遺伝子破壊株及びＧＬＴ１遺伝子破壊株においては、プレニルアルコールの生産性を向上させる効果は見られないばかりかＧＬＴ１遺伝子破壊株においてはプレニルアルコールの生産性が低下していた。
【００６３】
Ｃｏｑ１遺伝子は、ＦＯＨの原料であるファルネシル二リン酸よりヘキサプレニル二リン酸を合成する酵素である。したがって、Ｃｏｑ１遺伝子を破壊することによって、ファルネシル二リン酸が増え、ＦＯＨ生産が上昇すると予測された。しかしながら、表２に示すように、Ｃｏｑ１遺伝子破壊株においては、プレニルアルコールの生産性が低下していた。
【００６４】
以上の結果から、プレニルアルコールの生合成経路に関与する遺伝子を破壊することによって、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みは、当業者が予測できるものではないことが判明した。この比較例の結果を考慮すると、上述した実施例において、エンドヌクレアーゼIIIファミリーに属するポリ(A)デアデニラーゼ活性を低下させた細胞を培養することで、プレニルアルコールを高生産できることを実証したことは、当業者の予測できるものでなく、また顕著な効果を奏するものとして評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。
【図１】
2005348643.tif 000004