(57)【要約】【課題】改良されたポリリジンの製造方法を提供すること及びその製造方法に用いられる新規な菌株の探索。【解決手段】ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）またはその変異株を液体培地中でＬ−リジンを添加することなく培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）。
【請求項２】
ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）の変異株。
【請求項３】
ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【請求項４】
ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）の変異株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【請求項５】
培地中にＬ−リジンを添加することなく、菌株を培養することを特徴とする請求項３または４に記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた１０数量体から３０数量体程度の重合度のε−ポリ−Ｌ−リジン（以下中重合度ポリリジンと略称する）の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合した高分子化合物である。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。したがってトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。
【０００３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌を液体培地中で培養し、液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）  Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研菌寄第３８３４号）（特許文献１参照）（以下、Ｎｏ．３４６−Ｄ株という。）、Ｎｏ．３４６−Ｄ株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）（特許文献２参照）、
【０００４】
Ｎｏ．３４６−Ｄ株のプラスミド増幅変異株である５０８３３株（微工研条寄第１１１０号）（特許文献３及び４参照）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、１１０１１Ａ−１株の変異株であるＢ２１０２１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５９２６）（特許文献５参照）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）に属する菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−９７９７）（特許文献６参照）ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−７２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１０）（特許文献７参照）、ストレプトマイセスｓｐ．ＳＰ−６６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７２２３）（特許文献８参照）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー  ＳＰ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７８４５）（特許文献９参照）、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスペシーズ  ＳＰ−２５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９９８）（特許文献１０参照）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ  ＵＳＥ−５３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３０５）（特許文献１１参照）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献２】
特公平３−４２０７０号公報
【特許文献３】
特公平３−４２０７５号公報
【特許文献４】
特公平６−７５５０１号公報
【特許文献５】
特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献６】
特開平１−１８７０９０号公報
【特許文献７】
特開２０００−０６９９８８号公報
【特許文献８】
特開２００１−０１７１５９号公報
【特許文献９】
特開２００２−９５４６６号公報
【特許文献１０】
特開２００２−９５４６７号公報
【特許文献１１】
特開２００３−５２３５８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら前述の菌株を用いて発酵法によってε−ポリ−Ｌ−リジンをできるだけ多量得るためには、炭素源、窒素源、無機塩に加え、Ｌ−リジンを０．１〜２％程度加えることが好ましいことが知られている。例えば、Ｎｏ．３４６−Ｄ株では、培地中に添加したＬ−リジンがε−ポリ−Ｌ−リジンに取り込まれ、ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産量が増えることを［１４Ｃ］−Ｌ−リジンを用いて証明されている。（日本農芸化学会誌、５７巻、２２１−２２６頁、１９８３年）また、特開２００２−９５４６７号公報の図２のＳＰ−２５株によるε−ポリ−Ｌ−リジンの生産曲線は０．２％（Ｗ／Ｖ）のＬ−リジンの添加のもとで得られたことが、同公報に開示されている。しかしながら、原料中にＬ−リジンを添加することは原料の種類を増加させることによる生産の煩雑さを増すばかりではなく、この様にして得られたε−ポリ−Ｌ−リジンは、しばしば着色する場合があり、その用途が限られるのが現状である。こうした状況をもとに、本発明は、Ｌ−リジンを培地中に添加しなくともε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することができる新規な製造方法を提供することを目的にしてなされた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は前述の従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた。その結果、ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）およびその変異株であれば、中重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する、新規な菌株ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１および該菌株を用いた発酵法による収率の高い中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法を提供する。
【０００９】
以上の記述から明らかなように、本発明は下記の（１）〜（５）の構成を有する。
（１）  ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）。
【００１０】
（２）  ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）の変異株。
【００１１】
（３）  ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【００１２】
（４）  ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１）の変異株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【００１３】
（５）  培地中にＬ−リジンを添加することなく、菌株を培養することを特徴とする（３）または（４）項に記載のε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明菌株
本発明菌株は、中重合度ポリリジンを生産する性質を有する。中重合度ポリリジンを生産するとは、採取可能な量の中重合度ポリリジンを生産することを意味する。
【００１５】
本発明で云う中重合度ポリリジンとは、前述したように重合度が１０数量体から３０数量体程度であって、数平均分子量が２０００以上であるε−ポリ−Ｌ−リジンである。この様なε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｎｏ．３４６−Ｄ株を生産培地（２．０％グリセロール、２．０％クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ  ４．５）、１．０％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％Ｌ−リジン・ＨＣｌ）を用い、３０℃で培養することにより得られるポリリジンと同程度の重合度である。
培養液中の中重合度ポリリジン量は、後記実施例１（１）（ｃ）に記載した方法により測定することができる。
【００１６】
本発明菌株のうち、中重合度ポリリジンを生産するストレプトマイセス・スペシーズ  ＵＳＥ−１３株（以下、ＵＳＥ−１３株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによってポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。
【００１７】
ＵＳＥ−１３株の菌学的性質は以下の通りである。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ＩＳＰ．  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）上で２８℃、１〜２週間生育したＵＳＥ−１３株の気菌糸および基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。▲１▼胞子形成菌糸の分枝法および形態：らせん（ｓｐ．ｉｒａｌ）。
▲２▼胞子のつながりと表面形状：いくつもの細長い胞子がチェーン状をなしている（ＳＰ型）。
【００１８】
（２）各種培地における生育状態
下記表１に示す各種培地における２８℃で２週間培養後の観察結果である。また、いずれの培地においても溶解、拡散性色素の産出は見られない。
【００１９】
【表１】
2005006562.tif 000002
【００２０】
2005006562.tif 000003
【００２１】
2005006562.tif 000004
【００２２】
2005006562.tif 000005
【００２３】
（３）生理的性質
▲１▼細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック（Ｓｔａｎｅｃｋ）らの方法（アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２８巻第２２６頁（１９７４年）参照）により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
▲２▼各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上）を表２に示す。
【００２４】
【表２】
2005006562.tif 000006
注）＋：同化する、−：同化しない。
【００２５】
▲３▼メラニンの生成：
チロシン寒天培地：なし、ペプトン・イースト鉄培地：なし。
【００２６】
2005006562.tif 000007
【００２７】
2005006562.tif 000008
【００２８】
（４）酸の生産性
炭素源として下記表３の炭水化物を用いた場合の酸生産の有無をＮｏ．３４６−Ｄ株の結果と合わせて示す。
【００２９】
【表３】
2005006562.tif 000009
注）＋：生産する、−：生産しない
【００３０】
ＵＳＥ−１３株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、配列を調べたところ、これまでに知られているストレプトマイセス属のいずれのタイプ株と比べても、相同性は同定のためにある程度信頼できる数値である９９．５％を下回っている。その上、ストレプトマイセス属の場合は、他の多くの細菌と異なり、この方法だけでは同定できないことは良く知られているところである。
【００３１】
上記の菌学的性質、特に形態学的性質および細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、ＵＳＥ−１３株はストレプトマイセス属に属すると判定される。Ｅ．キュスター（Ｅ．Ｋｕｓｔｅｒ）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第２２巻第１３９頁−１４８頁（１９７２年）並びにＰ．ケムファー（Ｐ．Ｋａｍｐｈｅｒ）らのジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）第１３７巻第１８３１頁−第１８９１頁（１９９１年）を参照して類縁菌種を検索し、更にバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２４７６頁並びにＥ．Ｂ．シーリング（Ｅ．  Ｂ．  Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）及びＤ．ゴットリーブ（Ｄ．  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｊ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第２２巻第２７１頁−第２７３頁（１９７２年）を参照して類縁菌種を検索したところ、本発明菌株はストレプトマイセス・アルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｉｓ  ）の新しいサブスペシーズ（ｓｕｂｓｐ．ｅｃｉｅｓ：通常ｓｕｂｓｐ．と略記する。）ないしはストレプトマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）の新しい種［スペシーズ（ｓｐｅｃｉｅｓ，  ｓｐ．と略記する。）］と同定し、ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株と命名した。このストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株は、独立行政法人  産業技術総合研究所に２００１年１０月１１日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１が付与されている。
【００３２】
また、本発明菌株には、ＵＳＥ−１３株と同等以上に中重合度ポリリジンを生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の性質）を有する限り、ＵＳＥ−１３株の変異株も包含される。ＵＳＥ−１３株の変異株とは、ＵＳＥ−１３株に変異処理をして誘導することのできるポリリジン生産性変異株またはＵＳＥ−１３株の自然突然変異株を意味する。
【００３３】
ＵＳＥ−１３株の変異株は、ＵＳＥ−１３株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やＵＳＥ−１３株の自然突然変異株を、ポリリジンを生産する性質などを指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質などを指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。
【００３４】
＜２＞本発明製造方法
本発明製造方法は、本発明菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積したポリリジンを採取することを特徴とする。本発明菌株は、好ましくは、ＵＳＥ−１３株である。
【００３５】
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセロールを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。
【００３６】
培養は、好気的条件下で振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜９が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを特に液体培地に添加する必要はない。０．５％（Ｗ／Ｖ）以上添加すると生産量である。このような培養により、培養液中に中重合度ポリリジンが生成蓄積する。
【００３７】
培養液中に生成蓄積した中重合度ポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法により中重合度ポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、さらにカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより中重合度ポリリジンが得られる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
実施例１  中重合度ポリリジン生産菌の取得
（１）  中重合度ポリリジン生産菌のスクリーニング
（ａ）  土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（１０ｍｌ）に懸濁し、３０℃で振とう（２００ｒｐｍで１０分間）、静置（３０分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。これを２８℃で２週間程度培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
【００３９】
（ｂ）  中重合度ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（３０℃、３５時間）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、３０℃で２０時間振とう培養した。
【００４０】
（ｃ）  中重合度ポリリジンの検出・測定
分離・取得株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で４日間程度培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ε−ポリ−Ｌ−リジンの検出・測定を行った。ポリリジンの検出はイツアキ（Ｉｔｚｈａｋｉ）（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第５０巻第５６９頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液０．５  ｍｌと１ｍＭメチルオレンジ及び５０  ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．０）の水溶液２ｍｌとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（４７０ｎｍ）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジンを求めた。
【００４１】
上記培地１〜４の組成を下記に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。培地１  放線菌分離用培地（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ｃｚａｐｅｋ培地）
グリセロール  ０．３％
ＮａＮＯ３    ０．２％
Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７．０）    ０．１％
ＫＣｌ  ０．０５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１％
寒天  １．５％
シクロヘキシミド  ５０μｇ／ｍｌ
ナイスタチン  ５０μｇ／ｍｌ
【００４２】
培地２  酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ＩＳＰ．  ２）
酵母エキス  ０．４％
麦芽エキス  １．０％
グルコース  ０．４％
寒天  １．５％
ｐＨ  ７．２
【００４３】
培地３  生育培地
グリセロール  ２．０％
酵母エキス  ０．５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％
ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ６．８）  １／５０Ｍ
【００４４】
培地４  生産培地
グリセロール  ２．０％
クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ  ４．５）  ２．０％
（ＮＨ４）２ＳＯ４                １．０％
Ｌ−リジン・ＨＣｌ  ０．２％
【００４５】
上記の検出方法によりポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、和歌山県新宮市の丘陵の土壌より、ポリリジンを著量生産するポリリジン生産菌を分離・取得した。
【００４６】
（２）取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態および生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。また、類縁菌種を検索したところ本発明菌株はストレプトマイセス・アルブラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ）の新しいサブスペシーズ（ｓｕｂｓｐ．）ないしはストレプトマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）の新しい種［スペシーズ（ｓｐｅｃｉｅｓ，  ｓｐ．と略記する。）］と同定した。本菌株は、ストレプトマイセス・スペシーズ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）  ＵＳＥ−１３株と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所に２００１年１０月１１日に寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６１が付与されている。
【００４７】
（３）ＵＳＥ−１３株の生産物の確認
ＵＳＥ−１３株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で１週間程度培養後、培養ろ液をメタノールで沈殿させ回収した（４０〜６０％画分）。次に回収したメタノール沈殿画分をゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を６Ｍ塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってＤＡＢＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ−）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
【００４８】
アミノ酸分析の結果、ＵＳＥ−１３株の生産物はリジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
また、ＵＳＥ−１３株の生産するポリリジンの重合度を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ）を用いて、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定した。その結果、１０数量体から３０数量体程度の中重合度ポリリジンを共に著量に含む中重合度ポリリジンであった。結果をＮｏ．３４６−Ｄ株の生産するポリリジンの結果をあわせて図１に示す。
【００４９】
さらに、ＵＳＥ−１３株の生産する中重合度ポリリジンは、Ｎｏ．３４６−Ｄ株由来ε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解するタンパク質分解酵素（Ａｓｐ．ｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解された。一方、α−ポリアミド結合したα−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。
【００５０】
ＵＳＥ−１３株の生産する中重合度ポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（ＩＦＯ  ３３３１）及びグラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２（ＩＦＯ  ３３０１）に対してＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｌｕｓ  Ｎｏ．３４６−Ｄ株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。
【００５１】
実施例２  ＵＳＥ−１３株のポリリジン生産性
ＵＳＥ−１３株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（１００  ｍｌ培地／５００  ｍｌ容）を用いて３０℃で３５時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４および培地４よりＬ−リジン・ＨＣｌ  ０．２％（Ｗ／Ｖ）を除いた培地）に移し、坂口フラスコ（１００  ｍｌ培地／５００  ｍｌ容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液の中重合度ポリリジン濃度を前記の方法により測定した。
結果を図２に示す。４日間の培養では、ＵＳＥ−１３株はＬ−リジン・ＨＣｌ  ０．２％（Ｗ／Ｖ）の添加の有無にかかわらず３ｇ／ｌの生産性を示した。
【００５２】
なお本菌株はポリリジンの生産性が高く、炭素源のグリセロールが早く消費されてしまい、５日目以降培地のｐＨが上昇し、同時に生産されたポリリジン分解酵素によってポリリジンは分解されてしまうが、グリセロールが消費されてしまう前に新たにグリセロールを添加すると培地のｐＨが上昇せず、ポリリジンは分解されずに蓄積されることが確認された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の菌株は、中重合度ポリリジンを著量に生産する。該菌株を用いた本発明の製造方法では、培地中にＬ−リジンを添加することなく、菌株の培養を行っても、高い収率で中重合度ポリリジンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＵＳＥ−１３株による中重合度ポリリジンのイオン会合クロマトグラムを示す図面である。
【図２】ＵＳＥ−１３株による中重合度ポリリジンの生産曲線を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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