(57)【要約】【解決手段】醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＡＷＡ１遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法又はＬＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動し、その電気泳動パターンの違いにより酵母を同定する。【効果】上記の方法により、醸造用酵母の正確な分類・同定が、迅速且つ容易に可能となる。本同定方法は、再現性が高く、しかもきわめて短期間に結果を得ることができ、特に清酒酵母の同定に有効であって、例えば清酒酵母協会７号と同９号といった清酒醸造という同一用途の酵母菌株の同定を可能とするだけでなく、清酒酵母とワイン酵母といった異なった用途の酵母の同定・判別も可能とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その塩基配列を配列番号１に示すＡＷＡ１遺伝子のヌクレオチド配列と相同性を示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして清酒酵母のＤＮＡを増幅し、増幅断片の大きさに基づき清酒酵母の同定を行うことを特徴とする清酒酵母の同定法。
【請求項２】
プライマーとして配列番号３及び配列番号４の塩基配列で示されるプライマーＳ１及びＳ２を用いて清酒酵母のＤＮＡを増幅し、増幅断片の大きさに基づき清酒酵母の同定を行うこと、を特徴とする請求項１に記載の同定法。
【請求項３】
増幅をＰＣＲ法又はＬＣＲ法によって行うこと、を特徴とする請求項１又は２に記載の同定法。
【請求項４】
増幅させた遺伝子断片は、これを直接アガロース電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いによってあるいはその塩基配列を比較することによって酵母を同定すること、を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の同定法。
【請求項５】
配列番号３の塩基配列で示される清酒酵母同定用プライマーＳ１のＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号４の塩基配列で示される清酒酵母同定用プライマーＳ２のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５〜６のいずれか１項に記載のプライマーＤＮＡあるいは該プライマーを用いたＰＣＲ法又はＬＣＲ増幅産物を含んでなること、を特徴とする清酒酵母同定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の同定に関するものであり、更に詳細には、醸造用酵母、特に清酒酵母のＡＷＡ１遺伝子を指標とした清酒酵母の同定、検出、判別、分類法に関するものである。本発明は、清酒酵母の同定、検出、判別、分類の少なくともひとつに有用であり、また、モニタリングを必要とする清酒醸造産業に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来酵母の同定には、培養による糖の資化性検査などの生化学的検査に主に依存してきた。これらの検査は時間がかかり、また検査項目が非常に多岐にわたり煩雑である。また、培養条件の影響などにより、検査結果は必ずしも信頼に値するものではない。
【０００３】
一方、清酒酵母としては、清酒酵母協会１〜１５号等各種菌株が知られている。
しかしながら、これらの清酒醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類されるものであって、同一種に属し、同じ清酒醸造に使用されるため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間に且つ正確にそれぞれ区別することはきわめて困難である。
【０００４】
上述した生化学的検査では、清酒酵母の菌株を同定することは不可能であって、したがって、現在のところ、酵母を小仕込試験するなどして、その醸造特性から判別したり、薬剤や培養条件を変えることで酵母を判別したりする方法で酵母の判別を行わざるを得ないのが実情である。しかしながら、これらの同定、判別方法は、酵母を実際に培養したり、実際に仕込みを行ってその醸造特性を確認したりする必要があるため、判別に相当の時間を要したり熟練を要したりすることは不可避であり、当業界においてその改善が求められている。
【０００５】
わずかに、清酒酵母協会７号は、高温でパントテン酸を要求することが知られているが（例えば、非特許文献１参照）、この方法は清酒酵母協会７号のみにしか応用することができず、きわめて限定された菌株同定方法であって、汎用性を欠くものである。また、培養後の菌体を染色して清酒酵母の菌株を同定する方法も提唱されているが（例えば、非特許文献２参照）、染色後の色調で判断するために、検査結果には個人差が伴い、信頼性のある結果を得るには熟練が必要である。近年では従来の菌株同定の欠点を補うものとしてゲノムＤＮＡの多型を検出する方法が使用されるようになってきたが、清酒酵母間は類縁性が高いため同定が困難であることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、現時点においては、遺伝子、特にＡＷＡ１遺伝子に着目した同定に成功した例は未だ報告されていない。
【０００６】
【非特許文献１】
菅間誠之助ほか４名、「日本醸造協会誌」、６０巻、ｐ．４５３〜４５６、１９６５年
【０００７】
【非特許文献２】
村上英也ほか４名、「日本醸造協会誌」、７７巻、ｐ．１８１〜１８４、１９８２年
【０００８】
【非特許文献３】
Ｍ．Ａｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｙｅａｓｔ」、Ｖｏｌ．１８、ｐ．１１４５〜１１５４、２００１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
清酒の醸造において清酒酵母は、アルコール発酵を行うのみならず、様々な香味成分を生成する。清酒酵母の菌株によって生成される清酒の品質に特徴があるので、清酒酵母の菌株を分類・同定することは適切な醸造管理を行う上で欠かせない技術である。このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来より重要な課題である。本発明は、このような技術の現状に鑑み、例えば清酒酵母協会６号、７号、９号、１０号といった清酒醸造という同一用途の酵母間において、それを短期間で正確且つ簡易に同定、判別及び／又は分類できるシステムを新たに開発する目的でなされたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために各方面から検討の結果、先の報告（非特許文献３）のように清酒酵母の同定には不適とされて研究対象から外されている観もあったゲノムＤＮＡにあえて着目し、ＰＣＲなどの遺伝子増幅法は、適切なプライマーを開発することができれば、菌株の同定に有効であるとの観点にたち、清酒酵母の菌株間で多型を示す遺伝子増幅産物を得るようなプライマーを新たに設定し、清酒酵母の同定及び検出を可能にする手段を新たに提供することとした。
【００１１】
しかしながら、一般に、同種の菌株間ではゲノムの多型が少なく、適切なプライマーを設定することは容易なことではなく、きわめて困難である。ましてや、例えば清酒酵母協会６号、同７号、同９号、同１０号等といった清酒醸造という同一用途に用いる酵母菌株間ではゲノムの多型が更に少なく、困難性は更に倍加している。換言すれば、清酒酵母に属する各酵母菌株間での同定、つまり、同一用途間での同定は容易なことではなく、困難を極める。
【００１２】
このようにきわめて困難な技術の現状において、本発明者らは、清酒酵母協会７号から酵母細胞に高泡形成能及び細胞表層の疎水性を与える遺伝子ＡＷＡ１を取得した（Ｈ．Ｓｈｉｍｏｉ，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｏｋｕｄａ，Ｒ．Ａｔｔｈｉ，Ｋ．Ｉｗａｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，１９３２−１９７３，２００２）。本遺伝子について研究を行っている過程で、本遺伝子は実験室酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ  株：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （株）より購入）の相同遺伝子ＹＯＬ１５５ＣとＯＲＦの大きさが異なることを見出した。さらに研究を進めた結果、ＡＷＡ１遺伝子には清酒酵母菌株間にも遺伝子の大きさに多様性が存在し、これを利用することで清酒酵母菌株間の分類・同定が可能であることがわかった。以上の知見に基づき本発明は完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明は、ＡＷＡ１遺伝子とホモロジーを持ち実質的なプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドを、少なくとも一方のＰＣＲプライマーとして清酒酵母のＤＮＡを増幅し、増幅断片長に基づき清酒酵母の同定を行うことを特徴とする清酒酵母の同定法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、清酒酵母のＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部をＰＣＲなどの遺伝子増幅法により特異的に増幅し、その増幅断片の大きさ（長さ）及び／又は数に基づき、清酒酵母の同定、検出、判定、分類の少なくともひとつを行うものである。ＡＷＡ１遺伝子は、上記したように、本発明者らによって既に明らかにされているが、その塩基配列を配列番号１に示し（図１〜図９の上段）、それに対応するアミノ酸配列を配列番号２（図１〜図９の下段）に示す。
【００１５】
プライマーとしては、ＡＷＡ１遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と相同性を有し実質的なプライマーとしての機能を有するオリゴヌクレオチドであればすべてのものが使用可能である。好適なプライマーとしては、その塩基配列を、それぞれ、配列番号３（図１０）、及び、配列番号（図１１）に示すプライマーＳ１、及び、プライマーＳ２が例示される。
【００１６】
本発明にしたがって清酒酵母の分類・同定を行うには、例えば次の工程を実施すればよい。
先ずはじめに、清酒酵母を含むサンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＷＡ１遺伝子の一部と相同性を持つプライマーを用いてＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部を既知の遺伝子増幅法によって増幅する。増幅されたヌクレオチド配列の長さの比較測定は電気泳動ゲル上でのそれらの移動度の分析（既知の分子量マーカーと比較することによる）によって行うことができる。遺伝子増幅法はＰＣＲ（米国特許４９６５１８８）、ＬＣＲ（Ｌａｎｄｇｒｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２４１、ｐｐ．１０７７−１０８０（１９８８））などを用いることが可能である。場合によっては、遺伝子増幅産物の塩基配列を相互に比較することも可能である。
【００１７】
このように、本発明によれば、酵母のゲノムＤＮＡをＡＷＡ１遺伝子の全部又は一部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を直接アガロースゲル電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので、作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子（この場合、ＡＷＡ１遺伝子の一部又は全部）を増幅させるプライマーを用いることで、ＰＣＲ法での増幅が得られるＤＮＡ断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【００１８】
すなわち、このようにして増幅して得た遺伝子断片は、これを直接アガロースゲル電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また、所望するのであれば、ＰＣＲにて増幅された遺伝子断片を制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で切断し、これを電気泳動してその泳動パターンを観察することによっても、酵母の判別を簡便且つ明確に行うことができる。
【００１９】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の清酒醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは逆に、特定の清酒醸造用酵母を判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよく、目的の酵母に適合した各種設計が可能である。
【００２０】
このようにして本発明によれば、清酒醸造用酵母の判別、同定、分類の少なくともひとつが可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーＳ１及びＳ２を用いて、あるいは、これらのプライマーのＰＣＲ産物を用いて、例えば、特に清酒酵母協会７号といった特定の酵母の同定、分類、判別用キットを組むことができる。
【００２１】
以上、清酒酵母の同定・分類について述べたが、本発明においては、酵母としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母が使用可能である。例えば、本発明は、清酒酵母（清酒酵母協会１号〜１５号酵母等）の実用酵母に適用できるほか、ワイン酵母（協会ブドウ酒１号酵母、協会ブドウ酒３号酵母、協会ブドウ酒４号酵母等）、焼酎酵母（鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ、協会焼酎酵母ＳＨ−４、泡盛酵母１号等）にも適用できる。
【００２２】
なお、本発明を清酒酵母菌株での同定を例にとって説明したが、本発明は、清酒酵母とワイン酵母の判別、ワイン酵母と焼酎酵母の判別といった異なった用途の酵母間の判別が可能であるだけでなく、清酒酵母の場合と同様に、同じワイン酵母であって、協会ブドウ酒１号酵母と同３号酵母、同３号酵母と同４号酵母の判別といった同一用途の酵母間の判別も可能であるという著効も奏するものである。特に後者については、判別自体が困難であって非常にデリケートな要件が必要とされ、従来、簡便にして正確な方法で満足できる方法は報告されていなかったのである。
【００２３】
以下に、本発明の実施例について述べる。
【００２４】
【実施例１】
配列番号３（図１０）及び配列番号４（図１１）に記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドをプライマーＳ１及びＳ２とし、ＡＷＡ１遺伝子を含むプラスミド、実験室酵母Ｘ２１８０（ＡＴＣＣ２６１０９）、清酒酵母協会７号（日本醸造協会）、清酒酵母協会７０１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会９号（日本醸造協会）、清酒酵母協会９０１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１００１号（日本醸造協会）由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図１２に示すような結果が得られ、増幅されたＤＮＡ断片の大きさから各清酒酵母を同定することが可能であつた。
【００２５】
ＰＣＲ増幅条件：９４℃１分、６０℃１分、７２℃５分、３０サイクル、プライマー濃度各１μＭ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ＜１μｇ／１００μＬ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｖｅｒｓｉｏｎ添付のＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ及びデオキシリボヌクレオチドを使用（タカラバイオ）。
【００２６】
図中、各レーンは、それぞれ次のことを示す。
番号  試料                                              断片長（塩基）
１  マーカー（λ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、φＸ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩ）
２  配列番号１を含むプラスミド                        ５１４２
３  実験室酵母Ｘ２１８０（ＡＴＣＣ２６１０９）        ３０００
４  清酒酵母協会７号（日本醸造協会）                  ６５００
５  清酒酵母協会７０１号（日本醸造協会）              ６３００
６  清酒酵母協会９号（日本醸造協会）                  ４０００
７  清酒酵母協会９０１号（日本醸造協会）              ４０００
８  清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）                ５５００
９  清酒酵母協会１００１号（日本醸造協会）            ５０００
１０  マーカー（λ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、φＸ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩ）
【００２７】
【実施例２】
配列番号３（図１０）及び配列番号４（図１１）に記載の塩基配列により表されるオリゴヌクレオチドをプライマーＳ１及びＳ２とし、清酒酵母協会１号（ＩＦＯ  ２１６４）、清酒酵母協会２号（ＩＦＯ  ２３４２）、清酒酵母協会３号（ＩＦＯ  ２３４３）、清酒酵母協会４号（ＩＦＯ  ２３４４）、清酒酵母協会５号（ＩＦＯ  ２３４５）、清酒酵母協会６号（日本醸造協会）、清酒酵母協会７号（日本醸造協会）、清酒酵母協会８号（ＩＦＯ  ２３７６）、清酒酵母協会９号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１１号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１２号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１３号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１４号（日本醸造協会）、清酒酵母協会１５号（日本醸造協会）から由来のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図１３に示すような結果が得られ、増幅されたＤＮＡ断片の大きさから各清酒酵母を分類・同定することが可能であった。
【００２８】
ＰＣＲ増幅条件：９４℃１分、６０℃１分、７２℃５分、３０サイクル、プライマー濃度各１μＭ、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ＜１μｇ／１００μＬ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｖｅｒｓｉｏｎ添付のＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ及びデオキシリボヌクレオチドを使用（タカラバイオ）。
【００２９】
図中、各レーンは、それぞれ次のことを示す。
番号  試料
１    マーカー（λ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ）
２    清酒酵母協会１号（ＩＦＯ  ２１６４）
３    清酒酵母協会２号（ＩＦＯ  ２３４２）
４    清酒酵母協会３号（ＩＦＯ  ２３４３）
５    清酒酵母協会４号（ＩＦＯ  ２３４４）
６    清酒酵母協会５号（ＩＦＯ  ２３４５）
７    清酒酵母協会６号（日本醸造協会）
８    清酒酵母協会７号（日本醸造協会）
９    清酒酵母協会８号（ＩＦＯ  ２３７６）
１０    清酒酵母協会９号（日本醸造協会）
１１    清酒酵母協会１０号（日本醸造協会）
１２    清酒酵母協会１１号（日本醸造協会）
１３    清酒酵母協会１２号（日本醸造協会）
１４    清酒酵母協会１３号（日本醸造協会）
１５    清酒酵母協会１４号（日本醸造協会）
１６    清酒酵母協会１５号（日本醸造協会）
１７  マーカー（λ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、φＸ１７４／Ｈａｅ  ＩＩＩ）
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、酵母の分類、同定、あるいは判別を迅速且つ高精度に行うことを可能にするのである。本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００３１】
更に本発明によれば、清酒酵母とブドウ酒酵母といった異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えば清酒酵母協会７号と９号といった同じ清酒酵母間の菌株の判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【００３２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＷＡ１遺伝子の塩基配列（配列番号１）を上段に示し、それに対応するアミノ酸配列（配列番号２）を下段に示す。
【図２】同上続きを示す。
【図３】同上続きを示す。
【図４】同上続きを示す。
【図５】同上続きを示す。
【図６】同上続きを示す。
【図７】同上続きを示す。
【図８】同上続きを示す。
【図９】同上続きを示す。
【図１０】プライマーＳ１（配列番号１の１番目から３０番目に相当）を示す。
【図１１】プライマーＳ２（配列番号１の５１１３番目から５１４２番目までの配列の相補鎖に相当）を示す。
【図１２】各種清酒酵母の同定・判別を示すＡＷＡ１遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図１３】各種清酒酵母の同定・判別を示すＡＷＡ１遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンの写真である（図面代用写真）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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