(57)【要約】【課題】ＧＡＢＡ抑制性神経系機能に関連する新たなてんかん発症機構と発症因子を提示し、該新規機構に立脚した新規創薬を行うための手段を提供する。【課題を解決するための手段】分泌性抗接着因子Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＳＰＡＲＣ）、海馬放線層領域のＧＡＢＡ抑制性神経において発現亢進することによっててんかん症状を引き起こすことを見いだし、この分泌性抗接着因子を用いててんかんモデル動物を作出するとともに、該転換モデル動物を用いて、てんかん症に対する新規医薬品や予防法の開発を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳内におけるＳＰＡＲＣ蛋白質量が過剰量存在していることを特徴とする、てんかんモデル動物。
【請求項２】
ＳＰＡＲＣ蛋白質が脳内投与されたものである、請求項１に記載のてんかんモデル動物。
【請求項３】
脳内におけるＳＰＡＲＣ蛋白質の存在量が、ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子の脳内発現量の増大により、増大せしめられていることを特徴とする、請求項１に記載のてんかんモデル動物。
【請求項４】
ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子が脳内に導入されていることを特徴とする、請求項３に記載のてんかんモデル動物。
【請求項５】
ＳＰＡＲＣ蛋白質からなる、てんかんモデル動物を作出するための材料。
【請求項６】
ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子からなる、てんかんモデル動物を作出するための材料
【請求項７】
ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子が保持されたベクターからなる、てんかんモデル動物を作出するための材料。
【請求項８】
ＳＰＡＲＣ蛋白質を脳内投与することを特徴とする、てんかんモデル動物を作出する方法
【請求項９】
ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子を脳内に導入することを特徴とする、てんかんモデル動物を作出する方法
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のてんかんモデル動物に被験薬剤およびカイニン酸を投与し、該被験薬剤の、カイニン酸投与により生ずるてんかん症状の抑制を指標にして、該被験薬剤の抗てんかん作用を検定することを特徴とする抗てんかん薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗てんかん薬剤の探索あるいはてんかん発症機構の解明に有効なてんかんモデル動物、その作出方法、及び該動物を作出するための材料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
てんかん発作を繰り返して起こすような慢性脳障害（てんかん性障害）を獲得した脳は、非発作時に於いても容易に過興奮状態へ移行する性質（けいれん準備性）を獲得している。また、てんかん発作発症には、抑制性（ＧＡＢＡ）ならびに興奮性（グルタミン酸）神経伝達系のバランスが不均衡となることが重要な要因であると考えられている。てんかん発症機構の解明を目指すためには、このような「けいれん準備性」を獲得しているモデル動物を解析する必要があり、従来、下記のような動物モデルが知られている。
【０００３】
（１）電撃けいれん（キンドリング）モデル
ー定の脳部位を反復電気刺激し、後発射を繰り返すことによって発作が次第増強し、二次性全般化発作が出現するようになる動物モデルを指す。難治性のヒト側頭稟てんかんの二次性全般化発作モデルと考えられており、けいれん準備性の維持が半永続的である特徴を有する。
（２）けいれん誘発動物（Ｅｌマウスなど）
Ｅｌマウスは、ｄｄＹマウスの突然変異体から見いだされたてんかんモデルマウスであり、遺伝的素因と後天的要因（発作履歴）が関与する最もヒトてんかんに近いモデルである。ＧＡＢＡ抑制系機構における異常と複数の遺伝子の変異が発作に関与することが明らかにされている。
【０００４】
（３）原因遺伝子改変マウス
アストロサイトに存在する‘グリア型グルタミン酸トランスポーター・  ＧＬＴ−１ノックアウトマウスは、ＮＭＤＡを皮下注射したときに観察されるてんかん発作と酷似した致死性のてんかん発作を引き起こす。これはシナプス間隙におけるグルタミン酸の取り込みが阻害されることが原因であることが知られている。
【０００５】
（４）カイニン酸モデル
代表的なイオンチヤネル型グルタミン酸受容体作動薬の一つであるカイニン酸は、皮下注射や静脈内注射などの全身投与によって激しい１ｉｍｂｉｃ  ｍｏｔｏｒ  ｓｅｉｚｕｒｅｓを誘発し、大脳皮質、海馬ＣＡ１、扁桃核などに選択的神経細胞死を引き起こす。カイニン酸による痙攣は、特徴的で強烈であり、側頭てんかんのモデルといわれている。脳の解剖学的解析により、１）てんかん発作に伴う神経細胞の脱落に由来したグリア細胞の増殖の結果生じる「海馬硬化」２）苔状線維の異常発芽による海馬神経回路のパターンの変化、３）遺伝子発現変化などが報告されている。
【０００６】
てんかん発症の主要因は、ＧＡＢＡ抑制性神経機構と興奮性アミノ酸神経系の不均衡状態であると推定されている。現在、臨床上使用されている抗てんかん薬は、これら神経系のいずれかあるいは双方に作用点を有する薬物が用いられている。抗てんかん薬をてんかん発作発現機序の観点から類型化すると、１）抑制性ＧＡＢＡ神経系の強化薬、２）興奮性アミノ酸神経系の阻害薬、３）イオンチャンネル系に作用する禅経細胞膜興奮性の安定化薬に分類される。第１群の抗てんかん薬は、ＧＡＢＡ神経作動系を増強させるもので、フェントバルビタールなどのバルビタール系薬物や、ジアゼパムなどのペンゾジアゼピン系薬物が代表的であり、ＧＡＢＡ受容体やシナプス間隙のＧＡＢＡ取り込み系あるいは分解系が作用点である。
【０００７】
これらの薬物は、シナプス間隙のＧＡＢＡを増加させることで抑制性ＧＡＢＡ神経系を強化し、抗てんかん効果を発揮するものと考えられている。第２群の抗てんかん薬は、興奮性アミノ酸神経系伝達を抑制あるいは阻止することにより抗てんかん効果を発揮する薬物であり、シナプス前終末の電位依存性Ｎａ＋チャンネルを阻害することでグルタミン酸放出抑制効果を示すフェニトインやラモトリギンが代表的薬物である。第３群の抗てんかん薬は、細胞膜上に存在するイオンチャンネルに作用して細胞膜興奮性の安定化を誘導する薬物であり、電位依存性Ｎａ＋チャンネル桔抗薬ゾニサマイドやＴ型Ｃａ  ２＋チャンネル括抗薬ラモトリギンなどが代表的薬物である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、難治性てんかん症に対しては、上記３群の薬物は有効ではなく、依然発症機構に関しても不明な点が多い。したがって、神経伝達物質受容体、神経伝達物質取り込み・分解、各種イオンチャンネル作用薬とは異なる作用機序を有する新規薬物の開発が求められており、新たなてんかん発症機構の解明とその機構に立脚した創薬が必要不可欠である。また、ＧＡＢＡ抑制性神経系異常によるてんかん発症機構は、新規薬物開発の上でも重要な研究課題である。本発明は、ＧＡＢＡ抑制性神経系機能に関連する新たなてんかん発症機構と発症因子を提示しようとするものであり、同時に新規機構に立脚した新規創薬の可能性を拓くものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は鋭意研究の結果、カイニン酸モデルにおいて、てんかん発症因子として新規に同定された分泌性抗接着因子Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＳＰＡＲＣ）が、海馬放線層領域のＧＡＢＡ抑制性神経において発現亢進することによっててんかん症状を引き起こすことを見いだした。本発明は、この知見に基づき、１）異常ＧＡＢＡ抑制性機構解明のための新規動物モデル創製、２）特に難治性てんかん症に対する新規医薬品や予防法の開発、３）新規薬物開発の基盤となるＳＰＡＲＣ標的因子の同定と分子生理機能の解明、を行うための基盤技術を提示するものである。すなわち、本発明は、以下の構成を伴う。
【００１０】
（１）  脳内におけるＳＰＡＲＣ蛋白質量が過剰量存在していることを特徴とする、てんかんモデル動物。
（２）  ＳＰＡＲＣ蛋白質が脳内投与されたものである、上記（１）に記載のてんかんモデル動物。
（３）  脳内におけるＳＰＡＲＣ蛋白質の存在量が、ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子の脳内発現量の増大により、増大せしめられていることを特徴とする、上記（１）に記載のてんかんモデル動物。
（４）  ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子が脳内に導入されていることを特徴とする、上記（３）に記載のてんかんモデル動物。
（５）  ＳＰＡＲＣ蛋白質からなる、てんかんモデル動物を作出するための材料。
（６）  ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子からなる、てんかんモデル動物を作出するための材料
（７）  ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子が保持されたベクターからなる、てんかんモデル動物を作出するための材料。
（８）      ＳＰＡＲＣ蛋白質を脳内投与することを特徴とする、てんかんモデル動物を作出する方法
（９）  ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子を脳内に導入することを特徴とする、てんかんモデル動物を作出する方法
（１０）請求項１〜４のいずれかに記載のてんかんモデル動物に被験薬剤およびカイニン酸を投与し、該被験薬剤の、カイニン酸投与により生ずるてんかん症状の抑制を指標にして、該被験薬剤の抗てんかん作用を検定することを特徴とする抗てんかん薬剤のスクリーニング方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のてんかんモデル動物は、ＳＰＡＲＣ蛋白質、ＳＰＡＲＣ蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質、あるいはその遺伝子を用いて作出される。
このＳＰＡＲＣ蛋白質  （ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ；「酸性およびシステインに富む分泌タンパク質」）  は、骨中に存在する主要な非コラーゲン性タンパク質であるオステオネクチン（Ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）として最初に報告され（Ｔｅｒｍｉｎｅ，Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２６  ：  ９９−１０５，  １９８１）、コラーゲンやハイドロキシアパタイトへの強い結合性を有し、Ｃａ２＋結合能を持つことから機能性骨特異タンパク質として注目された。このＳＰＡＲＣは、接着性培養細胞の増殖に伴い細胞外に分泌される分子量４３ｋＤ蛋白として報告されていたものより遺伝子配列が決定されているものである（Ｓａｇｅ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２５９，  ３９９３−４００７，  １９８４）。
このＳＰＡＲＣ蛋白質のアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列をそれぞれ、配列表の配列番号１及び２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ：  Ｘ０４０１７）として示す。
【００１２】
ＳＰＡＲＣはその後、種々の培養細胞からの分泌が観察され、特に正常線維芽細胞や血管内皮細胞からの分泌が顕著である（Ｌａｎｅ．Ｔ．Ｆ．＆  Ｓａｇｅ，  Ｅ．Ｈ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ８  ：  １６３−１７３，  １９９４）。また、ＳＰＡＲＣの機能としては、ＳＰＡＲＣの細胞培養系への添加によって細胞外マトリックス分子への細胞接着が濃度依存的に阻害されることが知られている。
【００１３】
一方、本発明者等は、モルヒネの慢性投与時に扁桃体において特異的に上昇する遺伝子群中にＳＰＡＲＣ遺伝子を見いだし、チオレドキシン遺伝子含有ベクターの該遺伝子下流側にＳＰＡＲＣ遺伝子を組み込み、これを大腸菌で発現させ、チオレドキシン−ＳＰＡＲＣ融合蛋白質（以下、ＳＰＡＲＣ融合蛋白質という。）を得るとともに、神経細胞に対して抗細胞接着活性及び球形化活性を発揮することを見いだしている。さらに、本発明者は、このＳＰＡＲＣ融合蛋白質を扁桃体外側基底核に脳内微量投与を施したマウスでは、モルヒネの単回投与によってモルヒネ自発運動量の増強が引き起こされること、すなわち神経シナプスに変化をもたらすとともに、さらに、上記ＳＰＡＲＣ蛋白質が脳内において神経可塑性因子として機能することを見いだしている（特許第３０１２９３０号公報、特許第３０１２９３１号公報）。
上記ＳＰＡＲＣ融合蛋白質のアミノ酸配列及びその遺伝子の塩基配列を配列番号３、４にそれぞれ示す。
【００１４】
本発明において、てんかんモデル動物を作出するための材料としては、上記した配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＰＡＲＣ蛋白質、配列番号３のアミノ酸配列を有するチオレドキシン（Ｔｒｘ）−ＳＰＡＲＣ融合蛋白質、あるいは配列番号１又は３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＳＰＡＲＣ蛋白質の生理学的活性を有するものが挙げられる。
【００１５】
なお、ＳＰＡＲＣ蛋白質はシステインに富んだ分泌性の抗接着活性を有する蛋白質であり、その生理活性を発現させるためには、分子内Ｓ−Ｓ結合を正確に再構成させることが必要である。遺伝子工学的手法を用いてチオレドキシン（Ｔｒｘ）との融合蛋白質を得る手法は、大腸菌等の細菌を宿主として動物の生理活性蛋白質を製造させる場合において、得られる生理活性蛋白質の分子内Ｓ−Ｓ結合を正確に再構成させることによって立体構造を保持させ、本来の生理活性を得るために用いられているものである。しかし、動物細胞を宿主として使用する場合においては、融合蛋白質でなくても用いることができる。
【００１６】
これら蛋白質は、哺乳動物の脳内、例えば、海馬、歯状回、扁桃体、大脳皮質等に投与され、これによりてんかんモデル動物を得ることができる。これら蛋白質の脳内投与量は、カイニン酸等の薬物の投与量や個々の動物の個体差にもよるが、数〜数十  ｐｍｏｌｅｓ程度である。海馬（放線層）へのチオレドキシン（Ｔｒｘ）−ＳＰＡＲＣ融合蛋白質の脳内投与実施例では、５  〜１０  ｐｍｏｌｅｓのＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ融合蛋白質の脳内微量投与によりカイニン酸に対する顕著な感受性の増強が誘導されることが判明している。
【００１７】
また、本発明においては、上記した配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＰＡＲＣ蛋白質あるいは配列番号３のアミノ酸配列を有するＳＰＡＲＣ融合蛋白質をコードする遺伝子、また、配列番号１又は３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＳＰＡＲＣ蛋白質の生理学的活性な蛋白質をコードする遺伝子を、脳内組織、例えば、海馬、扁桃体、大脳皮質、線条体等に導入し、脳内において上記蛋白質を発現させてもよい。また、これら遺伝子をさらに具体的に挙げれば、配列番号２又は４の塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００１８】
これらＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子は、各種ウイルスに該遺伝子を組み込み、脳内に導入することにより、該遺伝子を脳内においてＳＰＡＲＣ蛋白質を発現させ、てんかんモデル動物を作出することができる。使用するウイルスとしては、例えば、シンドビスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等を挙げることができる。また、該遺伝子を組み込む代表的なウイルスベクターとしては、各々ｐＳｉｎｒｅｐ５  （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）、ＨＳＶ−ＰｒｐＵＣ、ｐＡｘＣＡｗｔ，（宝酒造社）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５  （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等が存在する。
【００１９】
ウイルスベクター中に存在するマルチクローニング部位に、ＳＰＡＲＣ蛋白質をコードするｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで挿入し、組み換えウイルスＤＮＡを作製する。この組み換えＤＮＡ  （あるいは組み換えウイルスＤＮＡより逆転写して作製した組み換えウイルスＲＮＡ）を宿主細胞（ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）へトランスフェクションし、宿主細胞中で増殖して培地中に放出された組み換えウイルスを回収・精製することにより高力価ＳＰＡＲＣ遺伝子挿入組み換えウイルスを調製する。
これらウイルスあるいはリポソームに保持されたＳＰＡＲＣ蛋白質をコードする遺伝子を脳内組織に導入するには、電気穿孔法、直接注射法、脳内投与法等の周知の方法を適用すればよい。
【００２０】
また、ＳＰＡＲＣ蛋白質を脳内で発現させるための別の方法としては、ＳＰＡＲＣ蛋白質を分泌する細胞、組織を脳内に移植しても良い。移植される細胞の種類としては、海馬、歯状回、扁桃体、大脳皮質等の初代神経培養細胞、神経細胞やグリア細胞等を由来として株化された各種神経培養細胞（ＮＧ１０８−１５，  Ｎ１８ＴＧ−２、Ｃ６Ｂｕ−１、ＰＣ１２等）、神経幹細胞等の細胞群が挙げられる。また、移植される組織としては、脳組織の一部（海馬、歯状回、扁桃体、大脳皮質等）が挙げられる。
【００２１】
また、ウイルス発現系や遺伝子改変動物等を利用し、ＳＰＡＲＣ蛋白質を過剰発現させるように人為的に構築された上記細胞・組織を脳内に移植しても良い。
上記ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内投与、該蛋白質の遺伝子の脳内導入あるいは該蛋白質分泌細胞、組織の脳内移植による該蛋白質の発現量の増大は、ＧＡＢＡ抑制性神経の異常亢進を引き起こし、作出された動物は、カイニン酸をはじめとする痙攣誘発剤の投与、電気刺激、ストレス（放り投げ刺激）等により、たやすくけいれん等の発作を起こし、てんかん症状を呈する。すなわち、  本発明におけるてんかんモデル動物は、「けいれん準備」の状態にあり、いわゆる「てんかん持ち」に対応する状態にある。
【００２２】
上記したように難治性てんかん症は、上記３群の薬物では効果がなく、これら薬物が作用する異常とは異なる異常が脳内に生じている可能性が強く、上記ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内発現量の増大に基づくＧＡＢＡ抑制性神経の異常亢進は、難治性てんかん症の原因と考えられる。
したがって、本発明によれば、例えば、以下のようにてんかんモデル動物に対する被験薬剤投与あるいはＳＰＡＲＣ蛋白質に対する拮抗性等を利用して、てんかん症の予防、治療薬、特に難治性てんかん症の予防、治療薬のスクリーニングあるいは設計することが可能となる。
【００２３】
（１）行動薬理学的評価に基づく新規抗てんかん薬剤のスクリーニング
被験薬剤（天然抽出物、蛋白質、ベプチド、核酸、その他の無機および有機化合物を含む）を上記てんかんモデル動物に対して投与（腹空投与、静動脈投与、経口投与、脳内投与など）し、カイニン酸投与による痙攣回数、痙攣程度などを行動薬理学的に観察し、カイニン酸投与による発症するてんかん症状の抑制、例えば、痙攣閥値の抑制の有無を検定することにより、てんかん症状の予防、あるいは抑制、軽減する薬剤をスクリーニングする。
【００２４】
（２）ＳＰＡＲＣ蛋白質による抗接着活性評価に基づく新規抗てんかん薬剤のスクリーニング
上記したようにＳＰＡＲＣ蛋白質は、神経細胞をはじめ各々の細胞に対し抗細胞接着活性を有し、この機能はＳＰＡＲＣ蛋白質の基本的機能であり、上記球形化活性は、抗細胞接着活性によりもたらされる。したがって、これら活性を阻害する物質はＳＰＡＲＣ蛋白質の機能を阻害する物質とみなすことができ、この活性阻害を示す物質は、抗てんかん薬剤である可能性がある。したがって、種々の神経培養細胞もしくは海馬をはじめとする各種初代神経培養細胞に対して、被験薬剤（天然抽出物、蛋白質、ヘプチド、核酸、その他の無機および有機化合物を含む）を添加し、該培養細胞から分泌されるＳＰＡＲＣ蛋白質の抗接着活性を括抗するか否かを細胞形態の球形化度を指標として新規抗てんかん薬剤をスクリーニングすることができる。
【００２５】
（３）トランスクリプトーム解析法及び／又はプロテオーム解析法を用いた新規抗てんかん薬剤の設計
上記新規てんかんモデル動物と正常動物間でのトランスクリプトーム解析あるいはプロテオーム解析等の包括的解析法により、例えば、発現遺伝子プロファイル及び発現蛋白質等における差異等を検出して、創薬ターゲットとなる「てんかん関連因子」の解明、その生理機能、分子機能等に関する知見を得、これらに基づき、新規抗てんかん薬剤を探索、設計することが可能となる。
さらに、本発明は、新規てんかん動物モデルの解析により、てんかん発症機構の解明あるいはＧＡＢＡ袖経系の制御機構などの解明にも寄与することはいうまでもない。
【００２６】
以下に、実施例を示すが、該実施例において用いたＳＰＡＲＣ融合蛋白質は、本発明者等が開発した方法（特許第３０１２９３１号）に従った。該方法を参考例として以下に示す。
【００２７】
〔参考例〕
（１）ＳＰＡＲＣ融合蛋白質（リコンビナントＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ）キメラ蛋白質の調製
ａ．  ＳＰＡＲＣ  融合タンパク質発現用プラスミドベクターの作製
Ｔベクターの作製はＤ．  Ｍａｒｃｈｕｋらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９  ：  １１５４，  １９９０）に準じた。すなわち、プラスミド  Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）  （１０μｇ／μｌ）  （ＳＴＡＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）  １．０μｌ、１０×緩衝液Ｈ  （宝酒造社製）２．０μｌ、ＥｃｏＲＶ  （１０  Ｕ／μｌ）  ２．０μｌ、滅菌水１５．０μｌを混合して総量を２０．０μｌに調製し、３７℃で２時間反応させてプラスミドを完全に切断した。エタノール沈殿で生成した沈殿に、１０×ＰＣＲ緩衝液  （ＰＥアプライドシステムズ社製）  ４．０μｌ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ  ８．０μｌ、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （５Ｕ／μｌ）（ＰＥアプライドシステムズ社製）  ２．０μｌ、滅菌水２４．０μｌを加えて総量を４０．０μｌに調製し、７０℃で２時間反応させた。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿による精製濃縮後、生成した沈殿に滅菌水２０μｌに溶解させてＴベクター溶液を得た。尚、Ｔベクターは４℃下で保存した。
【００２８】
ｂ．  マウス大脳皮質からの全ＲＮＡの抽出
Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １６２  ：  １５６−１５９，  １９８７）に準じて全ＲＮＡ  を抽出した。すなわち、マウス大脳皮質を摘出後に液体窒素で凍結し、ハンマーで破砕して粉末状にした。この粉末７５ｍｇをグアニジン溶液  （４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．０、０．５％サルコシルナトリウム、０．１Ｍメルカプトエタノール）  ５００μｌに溶解させ、これに２Ｍ酢酸ナトリウム溶液  （ｐＨ４．０）  ５０μｌ、ＤＥＰＣ水飽和フェノール（ｐＨ４．０）  ５０μｌ  、クロロホルム  １００μｌ  を加えて撹拌した後、４℃で１５分間放置した。１０，０００×ｇ  で２０分間の遠心分離後に水層を回収し、これに同容量の冷却したイソプロパノール６００μｌとグリコーゲン（２０μｇ／ｍｌ）  ２μｌ  を加えて−２０℃で１時間放置した。１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離により生成した沈殿は、グアニジン溶液  ５００μｌに完全に溶解させて上記の過程を再度繰り返した。イソプロパノール沈殿で生成した沈殿にＤＥＰＣ水５０μｌ  を加えて溶解させ全ＲＮＡ  溶液を得た。最終的にマウス大脳皮質  ０．３ｇから２５４μｇの全ＲＮＡが得られた。
【００２９】
ｃ．  ＲＴ−ＰＣＲ法によるマウスＳＰＡＲＣ遺伝子のクローニング
〔ｃＤＮＡ  の合成〕
上記ｂ．工程において得られた全ＲＮＡ（２．５  μｇ／μｌ）  １．２μｌ  にランダムプライマー（１００ｎｇ／μｌ）  １．０μｌ、ＤＥＰＣ処理滅菌水２．８μｌを加えて総量を５．０μｌに調製し、７０℃で１０分間の熱変性処理をした。この溶液に５×緩衝液  （ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）２．０μｌ、０．１Ｍジチオスレイトール  ２．０μｌ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８．０μｌ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （２００Ｕ／  μｌ）  １．０μｌを加えて総量を２０．０μｌに調製し、４２℃で２時間反応させた。さらに、７０℃で１５分間の加熱処理により逆転写酵素を完全に失活させて一本鎖ｃＤＮＡ溶液を得た。
【００３０】
〔ＰＣＲ反応〕
次いで、得られた一本鎖ｃＤＮＡ溶液  ５．０μｌに  １０×ＰＣＲ緩衝液  （ＰＥアプライドシステムズ社製）  ２．５μｌ、Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （５Ｕ／μｌ  ）  （ＰＥアプライドシステムズ社製）０．２５μｌ、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ８．０μｌ、６０ｎｇ／μｌ  プライマー１（５’−ＣＣＧＡＧＡＧＴＴＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡＴ−３’）；  ２０ｍｅｒ、およびプライマー２（５’−ＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴ−３’  ）；  ２０ｍｅｒ  を各々２．５μｌ、滅菌水４．２５μｌを加えて総量を２５．０μｌに調製して反応液とした。次に、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ＰＪ２０００  Ｍｏｄｅｌ  ４８０  （ＰＥアプライドシステムズ社）を用いてＰＣＲ（変性反応；９４℃、３０秒、アニーリング反応；５０℃、４５秒、合成反応  ；  ７２℃、９０秒；３５サイクル）、続いて７２℃で１０分間伸長反応を行った。約１７５０ｂｐのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動により分離精製し、ウルトラフリー  ＭＣ  フィルター（ミリポア社製）を用いてゲルより回収した。回収したＰＣＲ産物は  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて上記Ｔベクターにサブクローニングした。尚、プライマーはマウスＳＰＡＲＣ  ｃＤＮＡ塩基配列（Ｊ．Ｈ．  ＭｃＶｅｙ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３  ，  １１１１１−１１１１６，  １９８８）の一部に対応するオリゴヌクレオチド配列を化学合成することにより作製した。プライマー１および  ２は各々ＳＰＡＲＣ  ｃＤＮＡ塩基配列の７２−９１ならびに１８０１−１８２０に対応するオリゴヌクレオチド配列である。
【００３１】
〔ＰＣＲ産物のｃＤＮＡ塩基配列の決定〕
上記ＰＣＲ産物をサブクローニングしたＴベクター（ｐＢＳＫ−ＳＰＡＲＣベクター）はサイクルシークエンス法によりｃＤＮＡ塩基配列を決定した。すなわち、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｋｉｔ  （フナコシ社製）により精製した上記Ｔベクター１．５μｇ  を鋳型として使用し、ＰＲＩＳＭ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＰＥアプライドシステムズ社製）を用いてシークエンス試料を作製した。尚、ＰＣＲはＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ  ＰＪ２０００  Ｍｏｄｅｌ  ４８０  （ＰＥアプライドシステムズ社）を用い、変性反応；９６℃、３０秒、アニーリング反応；５０℃、１５秒、合成反応  ；  ６０℃、２４０秒；２５サイクルの条件下で行った。ＰＣＲ産物は、エタノール沈殿によって未反応物を除去後、変性溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ブルーデキストラン、８．３ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、８３．３％ホルムアミド）４．０μｌに溶解させて９０℃で２分間の熱変性処理を行った。その後直ちにＡＢＩ  ３７３Ｓシーケンサー（ＰＥアプライドシステムズ社製）を用いてｃＤＮＡ塩基配列の解析を行い、ＰＣＲ産物がマウスＳＰＡＲＣ  ｃＤＮＡ塩基配列  （７２−１８２０）を有することを確認した。
【００３２】
ｄ．  ｐＧＥＸ  ４Ｔ−１ベクターへのサブクローニング
上記  ｐＢＳＫ−ＳＰＡＲＣ  ベクター（６．２５μｇ／μｌ）  １０μｌ  に１０×緩衝液４（ＮＥＢ社製）  １０μｌ、ＢａｍＨＩ  ２μｌ、ＸｈｏＩ  （１２  Ｕ／μｌ）  ２μｌ、滅菌水  ７６μｌ  を加えて総量を１００μｌにし、３７℃で２時間反応させた。約１８００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ挿入断片は、１％アガロースゲル電気泳動により分離精製後にＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ（フナコシ社製）  を用いてゲルから回収してＴＥ溶液  （Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）  ４８μｌ  に溶解させた。次に、このＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ挿入断片溶液  ４２μｌに１０×緩衝液４（ＮＥＢ社製）  １０μｌ、ＢｓｐＨＩ  （１０  Ｕ／μｌ）  ２μｌ、ＳｍａＩ  （１０  Ｕ／  μｌ）  ２μｌ  、滅菌水４４μｌ  を加えて総量を１００μｌにし、３７℃で２時間反応させた。約１５００ｂｐのＢｓｐＨＩ−ＳｍａＩ挿入断片は、１％アガロースゲル電気泳動により分離精製後にＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮＩＩ  ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてゲルから回収しＴＥ溶液  ４８μｌ  に溶解させた。このＢｓｐＨＩ−ＳｍａＩ挿入断片（９６０ｎｇ）  はＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、ＴＥ溶液１０μｌに溶解させて平滑末端化挿入断片溶液を得た。
【００３３】
一方、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター  （５００ｎｇ／μｌ）  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）  ２μｌ  に１０×緩衝液４（ＮＥＢ社製）  ２μｌ、ＳｍａＩ  （１０  Ｕ／μｌ）  １μｌ  、滅菌水  １５μｌ  を加えて総量を２０μｌにし、３７℃で２時間反応させた。フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿による精製濃縮後、生成した沈殿に１０×脱リン酸化緩衝液  （宝酒造社製）５μｌ  、子牛小腸由来アルカリフォスファターゼ  （１０  Ｕ／μｌ）  １μｌ  、滅菌水  ４４μｌ  を加えて総量を５０μｌにし、３７℃で１５分間反応させて脱リン酸化処理を施した。５２℃で１５分間の熱処理を行って脱リン酸化酵素を失活させた後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿による精製濃縮を行った。生成した沈殿はＴＥ溶液  ２０μｌ  に溶解させて脱リン酸化処理ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター溶液を得た。
【００３４】
最後に、脱リン酸化処理ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター溶液  ２０μｌと平滑末端化挿入断片溶液１０μｌを混合後にエタノール沈殿による濃縮を行い、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）によりｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターのＳｍａＩ部位にＢｓｐＨＩ−ＳｍａＩ平滑末端化挿入断片を連結させてｐＧＥＸ−４Ｔ−ＳＰＡＲＣ  ベクターを得た。尚、ＢｓｐＨＩ−ＳｍａＩ平滑末端化挿入断片がｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターに予定どうり組み込まれていることは、ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＳＰＡＲＣ  ベクターのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）  ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）  のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にサブクローニングしてｃＤＮＡ塩基配列解析を行うことにより確認した。
【００３５】
ｅ．  ｐＥＴ３２ａ（＋）−ＳＰＡＲＣベクターの作製
上記ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＳＰＡＲＣ  ベクター  （０．２５μｇ／μｌ）  ４０μｌ  に１０×緩衝液Ｋ（宝酒造社製）１０μｌ、ＢａｍＨＩ  （１０  Ｕ／μｌ）  ２μｌ、ＸｈｏＩ  （１２  Ｕ／μｌ）  ２μｌ、滅菌水４６μｌ  を加えて総量を１００μｌにし、３７℃で２時間反応させた。ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ挿入断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離精製し、ＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ（フナコシ社製）を用いてゲルよりＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ挿入断片を回収し、ＴＥ溶液  ４８μｌ  に溶解させた。ｐＥＴ３２ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位へサブクローニングした。最終的に得られたｐＥＴ３２ａ（＋）−ＳＰＡＲＣベクターはｃＤＮＡ塩基配列解析を行って遺伝子読み枠が合っていることを確認した。尚、ｐＥＴ３２ａ（＋）−ＳＰＡＲＣベクターの全ｃＤＮＡ塩基配列は配列番号４に、このベクターにより生産されるＳＰＡＲＣ融合タンパク質の全アミノ酸配列は配列番号３及び図１に示す。また、以上のｐＥＴ３２ａ（＋）−ＳＰＡＲＣベクターの構築の概略を図２に示す。
【００３６】
ｆ．  ＳＰＡＲＣ融合タンパク質の生産
上記ｐＥＴ３２ａ（＋）−ＳＰＡＲＣベクターにて大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）を形質転換した。この大腸菌をＯＤ５６０＝０．６  まで３７℃で３時間、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ溶液にて培養後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ存在下、２０℃で６時間振盪培養を行った。菌体は、遠心分離（６，０００×ｇ，  ３０  分）  により回収し、緩衝液Ａ（５ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．９）２０ｍｌに懸濁させて超音波処理を行い、遠心分離（３０，０００×ｇ，  ３０  分）  により可溶性画分を回収した。この可溶性画分をＨｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎカラム（Ｎｏｖａｇｎｅｎ社）  に添加後、緩衝液Ｂ（１Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．９）  にて吸着画分を溶出させた。溶出液は約１ｍｌに濃縮後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．４，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％  ＮＰ−４０）  で一晩透析し、ゲル濾過カラム［Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社製）］に添加した。緩衝液Ｄ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）を流速１ｍｌ／ｍｉｎ  で展開して５ｍｌごとに分画を行い、保持時間４０分の単一ピーク（画分８−１０）  を回収し、緩衝液Ｂで一晩透析した。この試料を１０％ＳＤＳ−ｐＡＧＥ  で分離後にＣＢＢ  染色を行い、精製試料が２５ｋＤａ  の単一バンドで９８％  以上の純度を有することを確認した（図３）。尚、収率はＬＢ培養液１Ｌ当たり約１ｍｇであった。
【００３７】
【実施例】
【実施例１】
（１）脳内微量投与
既報（池本、瀧田  日本薬理学雑誌１１８、２７７−２８２、２００１）に準拠した。ｄｄＹマウス（雄、７週齢）に、塩化ペントバルビタール８０ｍｇ／ｋｇを腹腔投与し、全身麻酔をかけた。手を叩いた音にマウスが反応しないことを確認後、マウスを脳固定装置（成茂科学株式会社）に固定し、眼科用はさみで、頭頂部から眼部付近まで正中線に沿ってマウスの皮膚を切開した。頭蓋全体を露出後、頭部を綿棒でこすって結合組繊を除去し、縫合交点を明瞭にさせた。脳固定装置の脳座標軸原点を縫合交点に合わせた後、頭蓋骨にインナーカニユーラ（ステンレスパイプ０．２¢、インターメディカル株式会社）の挿入口を設ける目的で、Ｂｒｅｇｍａ  −１．８０ｍｍ、Ｌａｔｅｒａｌ±１．５Ｏ  ｍｍの位置に歯科用電気ドリルを用いて直径１ｍｍ程度の穴を２箇所開け、大脳皮質を傷つけないように硬膜に切れ目を入れた。インナーカニユーラを、両側の海馬ＣＡｌ琴域の放線層（ｓｔｒｉａｔｕｍ  ｒａｄｉａｔｕｍ）（Ｂｒｅｇｍａ  −１．８０ｍｍ、Ｌａｔ６ｒａｌ±１・５Ｏｍｍ、Ｖｅｎｔｒａｌ＋１．２０ｍｍ）に一定の速度で慎重に挿入した。０．０４％ＮＰ−４０を含む生理食塩水に溶解させたＴｒｘ−ＳＰＡＲＣキメラ蛋白質溶液を０．１μ１／ｍｉｎの速度で５分間、総量にして２．５〜１０ｐｍｏｌｅｓを脳内微量投与した。
【００３８】
脳内微量投与終了後、直ちに、インナーカニユーラを掃引し、手術部位にゼラチンパウダーを盛って止血処置を施した。  更に、義歯床リベース用樹脂トクリーリベースファースト（株式会社トクソー）を用いてカニユーラ挿入部位を閉塞後、アロンアルファーゼリー状瞬間接着剤（東亜合成化学株式会社）を用いて切開した皮膚を接着した。皮膚が完全に接着後、マウスを脳固定装置より取りはずし、飼育ケージに戻して回復処置を施した。術後２日日（４８時間経過後）に、カイニン酸一水和物（和光純薬工業株式会社）を単回で２０ｍｇ／ｋｇを腹腔に投与後、動物行動測定を行った。動物行動測定は、９０分間にわたって、３０分毎に痙攣回数とｊｕｍｐｉｎｇ回数、よだれの回数、Ｗｅｔ  ｄｏｇ  ｓｈａｋｅの回数を測定した。動物行動の評価の指標には、１）痙攣回数、２）痙攣スコア、３）痙攣程度（症状）を用い、解析データーは、統計学的処理を行って有意差検定を行った。
【００３９】
痙攣回数は、測定時間内に持続痙攣に移行した場合には、カウントに含めなかった。また、痙攣程度は、カイニン酸投与後から４時間以上にわたり観察を行い、スコア化と症状の判定を行った。  持続性の痙攣については、痙攣が３時間以上に持続した場合のみを「持続痙攣」、痙攣が３時間未満に終息した場合については「一過性痙攣」と定義した。さらに、痙攣スコアおよび痙攣程度（症状）は、以下に示すように分類した。
【００４０】
＜痙攣スコア＞
１）スコア０          無症状
２）スコア１      一過性痙攣（よだれ、Ｗｅｔ  ｄｏｇ  ｓｈａｋｅを含む）
３）スコア２          一過性痙攣（３時間未満の持続性痙攣、ｊｕｍｐｉｎｇを含む）
４）スコア３          持続性痙攣（３時間以上の持続性痙攣のみ）
５）スコア４          死亡
以上５段階
＜痙攣程度（症状）＞
１）Ｎｏｎｅ    （無症状）
２）ｐｈａｓｉｃ（一過性痙攣）
３）ｓｔａｔｕｓ（持続性痙攣）
４）死亡
以上４段階
【００４１】
（２）  Ｔｒｘ−ＳＰＡＲ蛋白質脳内投与により誘導されるカイニン酸感受性の亢進
１）ＳＰＡＲＣキメラ蛋白質脳内投与後からの経過時間とカイニン酸感受性
ｄｄＹマウス（雄、７週齢）の海馬放線層にＴｒｘ−ＳＰＡＲＣキメラ蛋白質１０ｐｍｏｌｅｓを脳内微量投与してからの経過時間が、急性カイニン酸投与（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔投与）により誘導される痙攣発作に及ぼす影響を検討した。痙攣回数は、脳内微量投与後２日目のＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群においてのみ統計的に有意に増加し、その効果は脳内微量投与後３日日以降には全く認められなかった（図４）。痙攣スコアは、脳内微量投与後２日日のＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群のみで統計的に有意に増加した（図５）。以上の結果は、カイニン酸に対する薬物感受性がＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与後２日日に著しく亢進していることを示している。
【００４２】
２）ＳＰＡＲＣキメラ蛋白質の脳内微量投与時間
痙攣回数は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群のみで顆著に増加した（図６）。
また、この効果はＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の熱処理により消失した（図６）。
痙攣回数の経時変化曲線は、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群およびＴｒｘ−ｔａｇ蛋白質投与群では、６０分を最高に右下がりの曲線となったが、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群のみが６０分以後も右上がりの曲線となった（図７）。特に９０分後における痙攣回数は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群において顕著な増加が認められた（図７）。
痙攣スコアもＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群のみで顆著に増加した（図８）。
【００４３】
また、この効果は、熱処理したＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質脳内投与群では消失し、Ｖｅｈｉｃｌｅ脳内投与群およびＴｒｘ−ｔａｇ蛋白質脳内投与群と同程度の痙攣スコアおよび痙攣症状しか認められなかった（図８，９）。
以上の結果は、カイニン酸に対する薬物感受性の亢進がＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与により特異的に誘導されることを示している。
【００４４】
３）Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質用量依存性
痙攣回数は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与量に依存して増加し、７．５ｐｍｏｌｅｓ以上のＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与で飽和に達した（図１０）。痙攣回数の経時変化曲線は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与量に依存的に上方に移動し、６０−９０分後に於いて、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内投与量依存的な鋲著な差異が認められた（図１１）。一方、痙攣スコアも同様に、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与量に依存して増加し、７．５  ｐｍｏｌｅｓ以上のＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与により飽和に達した（図１２，１３）。以上の結果は、カイニン酸に対する薬物感受性はＴｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与量に依存して亢進することを示している。
【００４５】
４）カイニン酸用量依存性
痙攣回数は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質投与群では、カイニン酸投与量に依存してに増加し、いずれの用量においてもｖｅｈｉｃｌｅ脳内微量投与群ならびにＴｒｘ−ｔａｇ脳内微量投与群と比較して統計的に顕著な有意な増加を示した（図１４）。痙攣回数の経時変化曲線は、カイニン酸投与量に依存的に上方に移動し、６０−９０分後に於いてカイニン酸投与量に依存的な頼著な差異が認められた（図１５）。痙攣スコアは、２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量のカイニン酸投与時には、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質脳内微量投与量群のみで統計的有意差を認めたが、２５ｍｇ／ｋｇのカイニン酸投与時には、統計的有意差を認めなかった（図１６，１７）。以上の結果は、Ｔｒｘ−ＳＰＡＲＣ蛋白質の脳内微量投与により惹起されるカイニン酸に対する薬物感受性は、２０ｍｇ／ｋｇ以下の用量を投与した場合には、カイニン酸投与量に依存して亢進することを示している。
【００４６】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、ＳＰＡＲＣ蛋白質はＧＡＢＡ抑制性神経系異常によるてんかん発症機構に関連し、該タンパク質を過剰量脳内に存在せしめた本発明の新規てんかんモデル動物は、従来のてんかんモデル動物にはみられない発症機構を有するものであり、本発明は、特に難治性のてんかん症に対する新規医薬品や予防法の開発、あるいは新規薬物開発の基盤となるてんかん発症機構を解明するための基盤技術として極めて有用なものである。
【００４７】
【配列表】
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2005006563.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質の全アミノ酸配列を示す図である。
【図２】ｐＥＴ３２（＋）−ＳＰＡＲＣベクターの構築を示す図である。
【図３】参考例のＳＰＡＲＣ融合タンパク質の生産工程において得られた精製試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、生理的食塩水およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）をそれぞれ脳内投与後、カイニン酸−一水和物を投与した場合における、痙攣回数の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図５】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、生理的食塩水およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）をそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合における、痙攣スコアの経時変化を測定した結果グラフである。
【図６】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、熱処理ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、チオレドキシン（Ｔｒｘ−Ｔａｇ）およびベヒクルのみそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物を投与後９０分間の各合計痙攣回数を示すグラフである。
【図７】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、熱処理ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、チオレドキシン（Ｔｒｘ−Ｔａｇ）およびベヒクルのみそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、痙攣回数の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図８】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、熱処理ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、チオレドキシン（Ｔｒｘ−Ｔａｇ）およびベヒクルのみそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物を投与後９０分間の各合計痙攣スコアを示すグラフである。
【図９】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、熱処理ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、オレドキシン（Ｔｒｘ−Ｔａｇ）およびベヒクルのみそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物を投与後９０分間に呈した各痙攣程度の割合を示すグラフである。
【図１０】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合における、ＳＰＡＲＣ融合タンパク質の投与量とカイニン酸一水和物を投与後９０分間に呈した痙攣回数との関係を示すグラフである。
【図１１】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合において、ＳＰＡＲＣ融合タンパク質の各投与量毎に痙攣回数の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合における、ＳＰＡＲＣ融合タンパク質の投与量とカイニン酸一水和物投与後９０分間に呈した痙攣スコアの関係を示すグラフである。
【図１３】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物を投与後９０分間に呈した各痙攣程度の割合をＳＰＡＲＣ融合タンパク質の投与量毎に測定したグラフである。
【図１４】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質、チオレドキシン（Ｔｒｘ−Ｔａｇ）およびベヒクルをそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物の投与量と痙攣回数の関係を示すグラフである。
【図１５】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合において、カイニン酸一水和物の各投与量毎に痙攣回数の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図１６】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質をそれぞれ脳内投与後、カイニン酸一水和物をそれぞれ投与した場合における、カイニン酸一水和物の投与量と痙攣スコアの関係を示すグラフである。
【図１７】ＳＰＡＲＣ融合タンパク質を脳内投与後、カイニン酸一水和物を投与した場合における、カイニン酸一水和物を投与後９０分間に呈した各痙攣程度の割合をカイニン酸一水和物の投与量毎に測定したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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