(57)【要約】【課題】天然試料から高純度かつ高収率で網羅的にリン酸化ペプチドを精製する方法を提供する。【解決手段】リン酸化ペプチドをチタニアに吸着後、種々の溶媒で洗浄して夾雑物を除去後、溶出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化ペプチドの精製法であって、試料をチタニアに吸着後、夾雑物を洗い流した後、リン酸化ペプチドを溶出してリン酸化ペプチドを精製することを特徴とする、チタニアカラム利用天然試料由来のリン酸化ペプチド精製方法。
【請求項２】
夾雑物の洗い出しの方法は、高塩濃度の溶液および疎水性溶液を用いることを特徴とする請求項１に記載の、チタニアカラム利用天然試料由来のリン酸化ペプチド精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、試料ペプチド混合物からリン酸化ペプチドを分離精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、ゲノムから転写・翻訳され、その後にさらに活性調節に重要なリン酸化等の翻訳後修飾を受ける。細胞にとって最も重要な翻訳後修飾であるタンパク質リン酸化による修飾は、細胞の状態によって変化するため、タンパク質のリン酸化状態を網羅的に解析できればその細胞の状態を知ることができ、細胞機能の解析や、細胞の病的状態の把握に役立ち、新薬の開発、病気の診断等に重要な知見を与える。タンパク質は多くの場合複数箇所で複数の酵素によってリン酸化されるためどのタンパク質のどの箇所がリン酸化されたか、つまりタンパク質のリン酸化状態、を知るためにはタンパク質の分解物中のリン酸化ペプチドを精製してリン酸化部位を知ることが重要といえる。
【０００３】
従来、リン酸化ペプチドの精製にはキレート樹脂を用いたＩＭＡＣ法が用いられてきた。ＩＭＡＣ法とは、キレート樹脂に三価の鉄イオンを結合したものを吸着体とし、これをカラムに充填してペプチド混合物を添加し、結合したリン酸化ペプチドを分取する方法である。しかしこの方法は、すべてのリン酸化ペプチドを結合することができず、４０％以上のリン酸化ペプチドはカラムに吸着せずに溶離してしまうためリン酸化ペプチドの網羅的解析には適さない（表１参照）。一方、最近チタニアを充填したカラムがリン酸化ペプチドを結合しこれによってリン酸化ペプチドが精製できると報告された。
【０００４】
しかし、報告されたチタニア法は精製タンパク質由来のリン酸化ペプチドに限られた結果であり、多くの夾雑ペプチドを含む試料の分析に使用可能かは示されていない。実際その方法を一般的な、多くの夾雑ペプチドを含む試料に適用しても不純ペプチドを多く含む画分しか得られず、リン酸化ペプチドの網羅的分析に汎用される質量分析計によるリン酸化ペプチドの同定には使えないものであった（表３でその結果にも言及する）。
【非特許文献１】黒田育磨ほか４名、チタニアをプレカラムとするリン酸化ペプチドの選択的検出のための２次元ＬＣ、Chromatography, 23卷 95-96ページ(2002)
【非特許文献２】T. S. Nuhse他３名  Large-scale analysis of in vivo phosphorylated membrane proteins by immobilized metal ion affinity chromatography and mass spectrometry. Mol. Cell Proteomics 2, 1234-1243 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、天然のタンパク質混合物から８５％以上の高収率で、質量分析計による測定が可能な純度の精製リン酸化ペプチドを得る方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、多くのペプチドの中に含まれる少量のリン酸化ペプチドを８５％以上の回収率で精製するために、まずこのペプチド混合物をチタニアに結合させ、続いてリン酸化ペプチドとともに結合した非リン酸化ペプチドおよび溶媒由来の不純物等を高濃度の塩溶液および疎水性溶液で十分に洗浄して除去後リン酸化ペプチドを溶出し、精製リン酸化ペプチド標品を得る方法により目的を達成する。
【発明の効果】
【０００７】
これまでのチタニア法は、精製タンパク質由来のリン酸化ペプチドの分離には有効であったが、多くの夾雑ペプチドを含む天然の試料に適用しても不純ペプチドを多く含む画分しか得られず、質量分析計によるリン酸化ペプチドの同定には使えないもので実用的ではなかった。しかし、ペプチド混合物をチタニアに結合させ、本発明に従って高濃度の塩溶液および疎水性溶液で十分に洗浄した後に溶出することにより、質量分析計による分析が可能な精製リン酸化ペプチド標品が得られる。またＩＭＡＣ法では、４３％のリン酸化ペプチドがカラムに吸着されず消失したが、本改良法では９％の消失に留まり、８８％のリン酸化ペプチドが回収された。よって天然試料中のリン酸化タンパク質由来のリン酸化ペプチドの網羅的解析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この出願の発明のリン酸化ペプチドの精製法は、まず細胞抽出液中のタンパク質混合物をトリプシン、キモトリプシン等で加水分解してペプチド混合物とし、これを高速液体クロマト用チタニアカラムに通してリン酸化ペプチドをカラムに吸着させる。その後リン酸化ペプチドをリン酸緩衝液で溶離する。そしてこのリン酸化ペプチドを含む画分を逆相高速液体クロマトグラフィー用カラムに吸着させリン酸塩を洗浄、除去後疎水性溶媒でリン酸化ペプチドを溶離し、これをマトリックス支援レーザー解離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）にてペプチドを同定することができるのである。検出されたピークがリン酸化ペプチドであるかどうかは、試料の一部を脱リン酸化処理してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて分析し、リン酸基の脱離に相当する質量数８０またはその倍数の減少で確認する。
【０００９】
しかしこのような方法にも新たな問題が発生した。つまり通常リン酸化タンパク質の網羅的解析の目的で用いられる試料は、多くの非リン酸化タンパク質を含む試料中のリン酸化タンパク質由来の極微量のリン酸化ペプチドを検出しなければならないこと、並びにリン酸化ペプチドは非リン酸化ペプチドに比べて検出感度が通常１０分の１以下であることである。このためリン酸化ペプチドのシグナルは夾雑ペプチドのシグナルに隠れてしまい検出ができなかった。
【００１０】
発明者らは鋭意研究を進め、ペプチドをチタニアカラムに結合後、高濃度の塩を含む水溶液、例えば１mol/l塩化ナトリウムを含む０．１％トリフロロ酢酸水溶液で洗浄してイオン的に結合している不純物ペプチドを洗浄除去した後にリン酸化ペプチドを溶出することによって、最終的にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳでリン酸化ペプチドが検出可能になることを見出した。また高濃度の塩を含む水溶液による洗浄の後にさらに疎水性溶液、例えば５０％アセトニトリル−０．１％トリフロロ酢酸を含む水溶液で疎水性不純物を洗浄除去することにより、その後のクロマトグラムのベースラインの上昇を抑えて解析を容易にすることができた。
【００１１】
このような、イオン性の結合不純物を洗浄除去するための溶液としては、種々の塩が検討された。発明者らが鋭意検討した結果、アルカリ金属のハロゲン化物、過塩素酸塩等が好ましいことが示された。また疎水性の結合不純物を洗浄除去するための溶液としては、アセトニトリル、低級アルコール類等が好ましい。
【００１２】
チタニアカラム洗浄液は、具体的にはそれぞれ1 M 塩化ナトリウム（Mはmol/lを示す）、1 M 酢酸、1 M 過塩素酸等及び、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等である。
【実施例】
【００１３】
実施例１
本発明の一実施例をフローチャートにして示す。このチャート中、Ｍはmol/lを示す。
（１）天然タンパク質混合液の例としてのカエル卵抽出液（４ｍｇタンパク質相当）
↓
（２）脱リン酸化酵素阻害剤のオカダ酸を添加（終濃度１μＭ）
↓
（３）タンパク質変性剤のドデシル硫酸ナトリウムを加える（終濃度５％）
↓
（４）還元剤のジチオスレイトールを加える（終濃度６０ｍＭ）
↓
（５）１００℃で５分間加熱
↓
（６）ヨード酢酸アミドを加える（終濃度１５０ｍＭ）
↓
（７）室温暗所に１５分間放置
↓
（８）４倍量の−２０℃のアセトンを加えて−８０℃に１時間放置
↓
（９）１万回転／分で１５分間遠心してタンパク質の沈殿を得る。この沈殿をアセトンで２回洗浄する
↓
（１０）アセトンを蒸発後、沈殿を０．７ｍｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液に懸濁して４０μｇのトリプシンを加える
↓
（１１）３７℃で１２時間反応し、さらに４０μｇのトリプシンを加えて１２時間反応しペプチドを得る
↓
（１２）得られたペプチド混合物をトリフロロ酢酸でｐＨを２．５に合わせ生じた沈殿を遠心除去後、０．１％トリフロロ酢酸で平衡化したチタニアカラム（０．４ｘ１ｃｍ）に添加する（流速０．１ｍｌ／分）
↓
（１３）１Ｍ塩化ナトリウム−０．１％トリフロロ酢酸溶液でカラムを洗浄（１ｍｌ／分、２０分間）
↓
（１４）５０％アセトニトリル−０．１％トリフロロ酢酸溶液でカラムを洗浄（１ｍｌ／分、２０分間）
↓
（１５）０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）でリン酸化ペプチドを溶離（０．２ｍｌ／分、３０分間）
↓
（１６）この溶離液を直接、０．１％トリフロロ酢酸水溶液で平衡化した逆相高速液体クロマトグラフィー用のＣ８カラム（０．４ｘ１５ｃｍ）に添加する。または、一旦溶離し、ギ酸でｐＨを３以下にした後に添加する。
↓
（１７）０．１％トリフロロ酢酸で洗浄（１ｍｌ／分、４５分間）
↓
（１８）０から４５％アセトニトリル／０．１％トリフロロ酢酸の濃度勾配溶離（９０分間）でリン酸化ペプチドを溶離（１．０ｍｌ／分）し、１分ごとに分画する
↓
（１９）各画分の溶媒を減圧化に留去する
↓
（２０）得られたリン酸化ペプチドを２分して一方は直接、他方は５０％フッ化水素酸で室温１．５時間処理して脱リン酸化後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳでリン酸化ペプチドを検出する
【００１４】
表１は、ＩＭＡＣ法とチタニア法を用いた天然タンパク質試料由来のリン酸化ペプチドの回収率の比較を示したものである。
【００１５】
アフリカツメガエル卵抽出液可溶性画分と[γ−３２P]-アデノシン三リン酸を反応させリン酸基を放射能ラベルした後トリプシンで分解し、この分解物をIMACカラムまたはチタニアカラムに通してカラムに結合しないで溶離してくる「カラム非結合画分」と結合後溶離された「カラム結合画分」を得てそれぞれの画分について液体シンチレーションカウンターで計測してリン酸化ペプチドの回収率を求めた。標準偏差は三回の独立した実験の結果より求めた。ＩＭＡＣ法は、キレート樹脂に三価の鉄イオンを結合し、チタニアカラムと同じ０．４ｘ１ｃｍのカラムに充填して標準的な方法で用いた。
【００１６】
この結果は、ＩＭＡＣ法では約４割のリン酸化ペプチドがカラムに結合しないことを示し、リン酸化ペプチドの網羅的解析には不向きであることがわかった（カラム非結合画分は再度カラムに添加してもカラムに結合しないことを確かめている）。それに対してチタニア法では結合しない画分は１０％以下で良好な成績が得られた。
【００１７】
これらのことからチタニアカラムは、天然のタンパク質試料を酵素消化して得られる不純ペプチドを多く含む試料からもほぼ定量的にリン酸化ペプチドを回収できることが示された。
【００１８】
表２は、チタニアカラムに非特異的に結合する非リン酸化ペプチドの洗浄除去のための条件検討の結果を示したものである。この表の中でＭはmol/lを示し、また、NaClは塩化ナトリウムを示す。
【００１９】
チタニアカラムに非特異的に結合することを見出しているエメリンタンパク質由来のアミノ酸１５残基からなる非リン酸化ペプチド（GYNDDYYEESYFTTR：アミノ酸は一文字表記した）を結合し、下に示した種々の条件で洗浄後リン酸緩衝液で溶離し洗浄後の残存量を調べた（チタニアカラム：０．４ｘ１ｃｍ；平衡化緩衝液：０．１％トリフロロ酢酸）
【００２０】
この結果から、1 M 塩化ナトリウム−０．１％トリフロロ酢酸で流速０．５ｍｌ／分で１５分以上の洗浄が最も有効であることが示された。この条件で洗浄することにより非特異的吸着のペプチドの８０％以上が除去でき、この洗浄法の有効性が示された。またこのような洗浄でリン酸化ペプチドが失われることがないことは[γ−３２P]-アデノシン三リン酸でラベルしたアフリカツメガエル卵タンパク質由来のリン酸化ペプチドを用いて確認している。
【００２１】
表３は、天然試料由来のリン酸化ペプチドの分析結果を示したものである。
【００２２】
アフリカツメガエル卵抽出液可溶性画分のトリプシン分解物をチタニアカラムに通してリン酸化ペプチドを結合後、表２の実験例６の条件で洗浄してから0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)でリン酸化ペプチドを溶離した。これをＣ８カラムに添加し塩を洗い去った後アセトニトリルの濃度勾配で溶出した。得られた画分を２等分し一方はそのまま、一方はフッ化水素酸で脱リン酸化後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで分析した。その結果得られたリン酸化ペプチドを下に示した。なお、従来法に相当する表２の実験例１の条件「洗浄なし」で溶離した画分についてもまったく同様の実験を行った。その結果、従来のチタニアカラム法で得た画分には多くのペプチドが検出されたがリン酸化ペプチド（脱リン酸化処理で質量数が８０またはその倍数減少するペプチド）は一つも検出することができなかった。不純ペプチドの干渉で検出できなかったものと考えられる。それに対してチタニアカラムを洗浄後にペプチドを溶出する上記の改良法を用いた場合は、表に示したように、全体の1/7の画分について分析したところ７つのリン酸化ペプチドが検出された。全体では約４９本のペプチドが検出できることが期待される。
【００２３】
これらの結果は、本改良法による洗浄を行うことによって初めて、チタニアカラムにより天然試料由来のリン酸化ペプチドを精製し、質量分析計で分析することができるようになったことを示している。よって本法は、天然のリン酸化タンパク質の網羅的解析に道を開くものである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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