(57)【要約】【課題】  評価対象に蛍光標識部や放射性物質を導入しなくても、少量であっても、また、試料中に多種類の評価対象が混合された状態で存在する場合であっても、評価可能とすることもでき、さらに、小型化、複合化、集積化された被検体評価装置を実現できる、高感度に評価可能な被検体評価技術を提供する。【解決手段】  担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部４を備えた被検体７と結合することができる担体を備えた被検体評価装置１において、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であるようにする。【選択図】      図９
2005283560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部を備えた被検体と結合することができ、外部からの作用により、当該蛍光標識部との間の距離が変化し得る担体と、
当該蛍光標識部を発光させるための光照射装置と、
当該蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置と
を備え、
光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能である、
被検体評価装置。
【請求項２】
前記担体が電極であり、
前記感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物である、
請求項１に記載の被検体評価装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の被検体評価装置を用い、
被検体を担体と結合せしめ、
外部からの作用により、蛍光標識部と担体との間の距離を変化させ、
光照射装置から光を照射し、
蛍光標識部から発光される蛍光を蛍光検出装置で検出し、
光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整する
被検体評価方法。
【請求項４】
光照射面積と担体の表面積との比、蛍光検出面積と担体の表面積との比の少なくともいずれか一方を調整する、請求項３に記載の被検体評価方法。
【請求項５】
前記媒体中の塩濃度を１Ｍ以下に調整する、請求項３または４に記載の被検体評価方法。
【請求項６】
前記媒体中の塩濃度を１００ｍＭ以下に調整する、請求項３または４に記載の被検体評価方法。
【請求項７】
外部からの作用が、電磁的作用であり、
担体として電極を使用し、対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることにより当該電磁的作用を実現する、
請求項３〜６のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項８】
蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値と、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度および印加電位差からなる群から選択された少なくとも一つの特性値との関係から評価を行う、請求項３〜７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項９】
前記担体が電極であり、
前記感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物であり、
サイン波または矩形波の交流電場を印加することにより、当該ワイヤー状物を担体に近づけたり遠ざけたりして前記被検体を評価する、請求項３〜８のいずれかに記載の被検体評価方法。
【請求項１０】
前記ワイヤー状物またはワイヤー状物に付着させた物質の電荷、その静電容量、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、前記ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整する、請求項９に記載の被検体評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップやＤＮＡチップに代表される、評価対象評価のための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９０年代に入って進められてきたヒトゲノム計画は、各国が分担してヒトの遺伝暗号をすべて解読しようとする試みであり、２０００年夏にドラフト版が完成したことが公表された。今後、機能ゲノム科学や構造ゲノム科学の進展によって、解読されたヒトゲノム配列情報の各々の箇所がどのような機能に係わっているかが明らかにされていくものと予想される。
【０００３】
このヒトゲノム計画は、ライフサイエンスにかかわりを持つ科学技術並びに産業に対して、大きなパラダイムの変化をもたらした。たとえば糖尿病は、血糖値が高くなるという病状に基づいて分類が行われ、発症の原因としては患者の体内でインシュリン産成能がどの程度あるかに基づいてＩ型（体内でインシュリンを産生できない）、ＩＩ型（体内でインシュリン量の調整ができない）のような分類が行われてきた。
【０００４】
ヒトゲノム計画は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの調整に係わっている酵素やレセプターなどの蛋白質のアミノ酸配列構造、ならびにそのような蛋白質の存在量の制御に係わっている遺伝子のＤＮＡ配列の情報をすべて我々に提示している。
【０００５】
このような情報を使うと、血糖値の調整が正常に行われないという現象としての糖尿病は、血糖とインシュリンの検出、合成、分解などの一連の処理に係わるそれぞれの蛋白質のどれが不調なのかによって、サブタイプに分類でき、それによって適切な診断と治療を行うことが可能になるはずである。
【０００６】
特に、ヒトゲノム配列に基づいて特定の蛋白質に対する薬剤を開発するゲノム創薬が精力的に進められており、このような一連の機能的にかかわりのある蛋白質の状態を把握してゲノム創薬薬剤を投与し、症状の緩和や治癒を行う時代がくると予想される。
【０００７】
しかし、このような一連の機能的にかかわりのある蛋白質の存在量を簡便に測定できる技術は、プロテオーム解析技術として発展途上にある。現在確立されている方法として、二次元電気泳動と質量分析機の組み合わせで測定が行われているが、これには比較的大がかりな装置が必要になる。従って、臨床の現場、たとえば病院の検査室やベッドサイドで患者の症状を把握するためにはあらたな技術の開発が必要とされている。
【０００８】
こうした中、ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（μ−ＴＡＳ）やＬａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる研究に関心が集ってきている。これは、数センチメートル角のガラスやシリコンの基板にマイクロメートルサイズの溝（マイクロチャネル）を加工して微細な装置となし、その中で化学分析や反応を行うものである。液体や気体のサンプルを微細な流路（数百μｍ〜数μｍ幅）の中に流すため、試料・廃棄物量の低減、高速処理などの利点をもたらし、更に化学プラントさえも小型化できる可能性があり、この技術のバイオ分野への応用が期待されている。なお、μ−ＴＡＳは、「集積化化学分析システム」、「マイクロ化学・生化学分析システム」等と訳され、センサ、分析装置などを小型化した化学分析システムであり、分析化学実験室で使用される機器の機能をチップ上に集約させたものである。
【０００９】
中でも、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイ）に代表されるバイオチップの技術は、遺伝子解析に有効な手段として注目されている。バイオチップとは、ガラス、シリコン、プラスチックなどからなる基板の表面上に、ＤＮＡ、蛋白質などの生体高分子からなる多数の異なった検体を高密度に整列化してスポットしたもので、臨床診断や薬物治療などの分野で、核酸や蛋白質の試験を簡素化できるのが特徴である（たとえば特許文献１、非特許文献１参照）。
【００１０】
検体としては、たとえばＤＮＡや、ヌクレオチドなどが用いられる。従って、バイオチップはＤＮＡチップと呼ばれることも多い。
【００１１】
このようなＤＮＡチップに、被検体である未知のＤＮＡの断片を流した場合に、ＤＮＡがそれと相補的関係にあるＤＮＡと結合する性質を利用して、検体とハイブリダイゼーションさせることにより、ターゲットであるＤＮＡを捕獲する。未知のＤＮＡに蛍光標識部を予め付加しておけば、捕獲された被検体は、ＤＮＡチップ上の各スポットからの蛍光シグナルとして検出され、これをコンピュータでデータ解析することにより、被検体中の数千から数万のＤＮＡあるいはＲＮＡの状況を一挙に観測することが可能となる。
【００１２】
このような、いわゆるＤＮＡチップにおいては、測定対象であるＤＮＡをあらかじめＰＣＲ反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって増幅（増量）する際に蛍光色素を導入し、アレイ状に配した相補ＤＮＡ鎖と結合した試料中のＤＮＡ量を蛍光強度によって定量しようとするものである。
【特許文献１】特開２００１−２３５４６８号公報（段落番号０００２〜０００９）
【非特許文献１】「ジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｔｙ）」，１９９７年，第１１９巻，ｐ．８９１６−８９２０
【非特許文献２】「アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９８年，第７０巻，ｐ．４６７０−４６７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、蛋白質はＰＣＲ反応に相当する増幅を行うことができない。また、試料中に多種類の蛋白質が混合された状態で存在する場合に、蛍光標識部を一様に導入することは個々の蛋白質と色素との反応性が異なるために用いることができないという問題があった。
【００１４】
本発明は上記の課題を解決し、蛋白質等の評価対象について、高感度に評価可能な新規技術を提供することを目的とする。本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によれば、担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部を備えた被検体と結合することができ、外部からの作用により、蛍光標識部との間の距離が変化し得る担体と、蛍光標識部を発光させるための光照射装置と、蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置とを備え、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能である被検体評価装置が提供される。
【００１６】
本発明により、蛋白質等の評価対象について、高感度に評価可能な被検体評価装置を実現できる。評価対象に蛍光標識部や放射性物質を導入しなくても評価可能とすることもできる。少量であっても評価可能とすることもできる。また、試料中に多種類の評価対象が混合された状態で存在する場合であっても、評価可能とすることもできる。さらに、小型化、複合化、集積化された被検体評価装置を実現できる。
【００１７】
蛍光標識部と担体との間の距離が、被検体と担体との少なくともいずれか一方に備えられた感応部により変化し得ること、外部からの作用が、電磁的作用または化学的作用であること、特に、担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより電磁的作用が実現すること、担体が、被検体と化学的に結合し得ること、担体が表面にＡｕ層を有すること、担体の被検体結合部が、チオール基を介してＡｕ層と結合したものであること、被検体が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの評価対象に対して特異的に結合する性質を有する評価対象結合部を備えていること、特に評価対象が蛋白質であること、感応部がプラスまたはマイナスに帯電し得ること、感応部が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなること、特に、感応部が天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、あるいは、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体よりなること、感応部が抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントよりなること、感応部が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片よりなること、感応部がアプタマーよりなること、光照射面積を担体の表面積以上とし、蛍光検出面積を担体の表面積の８０〜１２０％の範囲とし得ること、光照射面積を担体の表面積以上とし、蛍光検出面積を担体の表面積の１／２以下とし得ること、担体が被検体と結合したものであること、同種または異種の担体を複数配してなること、同種または異種の被検体を複数配してなることが好ましい。
【００１８】
また、担体が電極であり、感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物であること、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であること、ワイヤー状物が電極に、物理吸着または化学吸着により固定されていることが好ましい。
【００１９】
本発明の他の一態様によれば、上記の被検体評価装置を用い、被検体を担体と結合せしめ、外部からの作用により、蛍光標識部と担体との間の距離を変化させ、光照射装置から光を照射し、蛍光標識部から発光される蛍光を蛍光検出装置で検出し、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整する被検体評価方法が提供される。
【００２０】
本発明により、蛋白質等の評価対象について、高感度に評価可能な被検体評価方法が実現できる。評価対象に蛍光標識部や放射性物質を導入せずに評価することもできる。少量であっても評価することもできる。また、試料中に多種類の評価対象が混合された状態で存在する場合であっても、評価することもできる。
【００２１】
光照射面積と担体の表面積との比、蛍光検出面積と担体の表面積との比の少なくともいずれか一方を調整すること、光照射面積を担体の表面積以上とし、蛍光検出面積を担体の表面積の８０〜１２０％の範囲とすること、光照射面積を担体の表面積以上とし、蛍光検出面積を担体の表面積の１／２以下とすること、媒体中の塩濃度を１Ｍ以下に調整すること、媒体中の塩濃度を１００ｍＭ以下に調整すること、被検体の大きさ、長さを考慮し、被検体あるいは被検体と評価対象との結合物が担体上で立体障碍を起こさないように、担体上の被検体の付着密度を調整すること、被検体を担体と結合せしめる前に、被検体を評価対象と結合せしめること、担体として電極を使用し、対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることにより電磁的作用を実現すること、蛍光発生の有無、蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値を測定すること、蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値と、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度および印加電位差からなる群から選択された少なくとも一つの特性値との関係から評価を行うことが好ましい。
【００２２】
また、担体が電極であり、感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物であること、サイン波または矩形波の交流電場を印加することにより、ワイヤー状物を担体に近づけたり遠ざけたりして被検体を評価すること、ワイヤー状物またはワイヤー状物に付着させた物質の電荷、その静電容量、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整すること、交流電圧の中心となる電位を担体電極の零電位に調整すること、交流電場の中心となる電位を段階的にまたは連続的に変化させること、交流電場の中心となる電位を段階的にまたは連続的に変化させた場合に現れる、より強い蛍光信号が得られ始める低電位領域と、蛍光信号が急速に弱まる高電位領域との間の領域で、交流電場の中心となる電位を変化させることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、蛋白質等の評価対象について、高感度に評価可能な被検体評価装置や被検体評価方法が提供される。
【００２４】
評価対象に蛍光標識部や放射性物質を導入しなくても評価可能とすることもできる。少量であっても評価可能とすることもできる。また、試料中に多種類の評価対象が混合された状態で存在する場合であっても、評価可能とすることもできる。さらに、小型化、複合化、集積化された被検体評価装置やその被検体評価装置を使用した優れた被検体評価方法を提供することもできる。
【００２５】
なお、本発明において、被検体とは、被検体評価装置において、最終的に評価対象を評価するために検出、評価される対象物であり、評価対象そのものが被検体である場合も、評価対象が結合した被検体が検出、評価される場合も本発明の範疇に属する。被検体評価装置は、被検体の検出、評価により評価対象を把握する機能を有し、バイオチップやＤＮＡチップに相当する概念である。
【００２６】
ただし、後述するように、被検体を含む場合も含まない場合も本発明に係る被検体評価装置の範疇に属する。また、複数の被検体評価装置を、たとえばアレイ状に高密度に整列したものも本発明に係る被検体評価装置の範疇に属する。さらに、他の機能を有する装置と複合化したものも本発明に係る被検体評価装置の範疇に属する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
特願２００２−２９７９３４，２００２−２９７９４１等において、上記の課題を解決するため蛍光等の標識反応を施すことなく蛋白質を特異的に定量する技術、また、蛋白質を集団として捉えるプロテオームの観点で役立つ情報が得られるアレイチップテクノロジーに適用可能な要素技術が開示されている。
【００２８】
本発明はこのような技術において、評価時の感度を向上させ、要素技術としての適用を容易にすることを目的としている。なお、本発明において、評価とは、評価対象の有無の検出や定量を行うことを意味する。
【００２９】
本発明に係る被検体評価装置は、担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部を備えた被検体と結合することができ、外部からの作用により、蛍光標識部との間の距離が変化し得る担体と、蛍光標識部を発光させるための光照射装置と、蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置とを備える。
【００３０】
この装置において、被検体を担体に結合せしめ、クエンチング効果で蛍光標識部が消光した状態となし、外部からの作用により、蛍光標識部と担体との間の距離を大きくすることにより、蛍光標識部を発光させ、その発光の増大減少挙動を観察することにより、評価対象を評価できる。
【００３１】
蛍光標識部と担体との間の距離は、外部からの作用に感応し、被検体を担体から脱離せしめる機能や伸縮する機能を有する感応部により変化し得るものであることが好ましい。感応部は、被検体と担体とのいずれにあってもその目的を達成することができる。なお、担体との間の距離を大きくすることは、被検体が担体から離脱することや感応部が伸びることによって実現できる。図２−Ａは、被検体７が担体３と吸着により結合した状態を示す模式図、図２−Ｂは、被検体７が担体３から脱離した状態を示す模式図である。また、図３−Ａは、被検体７が担体３と結合し、縮まった状態を示す模式図、図３−Ｂは、被検体７が担体３と結合し、横に倒れた状態を示す模式図、図３−Ｃは、被検体７が担体３から伸長した状態を示す模式図である。被検体が担体から離脱する場合については、感応部が、被検体にあるとも、担体にあるとも、被検体と担体の両方にあるとも考えることができる。
【００３２】
評価対象は、被検体そのものであってもよく、後に説明するように被検体と結合し得るまたは結合した物質であってもよい。評価対象としては、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれたものが好ましい。なお本発明において、上記複合体の例としては、ＤＮＡとマイナスに帯電したポリマーとの結合体等、上記の物質と他の物質との結合体を挙げることができる。評価対象が蛋白質であることが好ましい。
【００３３】
ここで、本発明において「ヌクレオチド体」とは、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドよりなる群のいずれか一つまたはその混合物を意味する。このような物質は、マイナスに帯電していることが多い。１本鎖あるいは２本鎖を用いることができる。ハイブリダイゼーションすることにより被検体と特異的に結合することもできる。なお、蛋白質、ＤＮＡ、ヌクレオチド体が混在していてもよい。また、生体高分子には、生体に由来するものの他、生体に由来するものを加工したもの、合成された分子も含まれる。
【００３４】
ここで、上記「産物」とは、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られるものであり、本発明の趣旨に合致する限り、抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントや抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片、さらにはその誘導体等どのようなものを含めることもできる。
【００３５】
抗体としては、たとえば、モノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧ抗体を使用することができる。また、ＩｇＧ抗体に由来する断片として、たとえばＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを使用することもできる。更に、そのようなＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片などを使用することもできる。蛋白質に対して親和性を有する有機化合物として使用可能な例を挙げると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）等の酵素基質アナログや酵素活性阻害剤、神経伝達阻害剤（アンタゴニスト）などがある。蛋白質に対して親和性を有する生体高分子の例としては、蛋白質の基質または触媒となる蛋白質、分子複合体を構成する要素蛋白質同士等を挙げることができる。
【００３６】
外部からの作用としては、担体と蛍光標識部との間の距離が変化し得る作用であればどのようなものでもよいが、電磁的作用または化学的作用が実際的であり、好ましい。
【００３７】
たとえば、電磁的作用は、担体として電極を使用し、対向電極を設け、これらの電極間に電位差を与えることにより実現することができる。担体と対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることにより電磁的作用を実現することができる。
【００３８】
このような各種の電位差を採用することにより、被検体の伸縮、担体からの脱離、拡散等の状況を種々の条件で評価することができる。また、比較的簡単に担体から脱離するものと脱離しにくいものとを分離して評価することもできる。
【００３９】
化学的作用としては、生じている共有結合、配位結合等の化学結合を切断することや、イオン的、疎水性または極性的相互作用を阻害しまたは付与すること等どのようなものでもよい。
【００４０】
上記の種々の評価条件に呼応して、被検体評価方法としては、蛍光発生の有無、蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値を測定することが有用である。
【００４１】
これらの評価により、たとえば、上記の、蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数等の物性値と、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度および印加電位差等の特性値との関係から、被検体の結合の有無および／または結合した被検体の種類および／または結合した被検体の量を検出できる。また、評価対象結合部に対する生体高分子の結合の有無および／または結合した生体高分子の種類および／または結合した生体高分子量を検出できる。
【００４２】
蛍光を発光または消光する蛍光標識部は、場合によっては評価対象の一部として共有結合により付加されていてもよいが、評価対象と結合する前の被検体の一部として共有結合により付加されていてもよく、あるいは、隣接する相補的結合の間に挿入（インタカレーション）されている例のようにヌクレオチド体等の中に含有されていてもよく、あるいはヌクレオチド体等の一部に置換により組み込まれていてもよい。蛍光標識部は、被検体の先端の近傍に存在するようにされるのが好ましい。
【００４３】
蛍光標識部は、光の作用で励起されて蛍光を発生する物質から選ばれる。本発
明で蛍光標識部として好適に使用できるものの例を挙げると、インドカルボシアニン３（商標Ｃｙ３）などである。
【００４４】
被検体は、担体と結合し得るものであれば、本発明の趣旨に反しない限り、どのようなものでもよいが、担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部を、評価対象との結合前に備えたものであることが好ましい。
【００４５】
被検体は、評価対象と特異的に結合する性質を有する評価対象結合部を有することが好ましい。この評価対象結合部を介して、蛍光等の標識反応を施すことなく、蛋白質等の評価対象を被検体に結合させ、評価することが可能となるからである。
【００４６】
このような評価対象結合部としては、上記した評価対象に対して特異的に結合する性質を有することが好ましい。結合の種類および結合箇所については特に制限はないが、結合力が特に弱い結合は避けた方がよいであろう。
【００４７】
感応部は、外部からの作用により、蛍光標識部と担体との間の距離が変化し得る機能を有する。蛍光標識部と担体との間の距離の変化は、先述のごとく、感応部の伸縮によっても、被検体が担体から脱離することによっても起こすことができる。電磁的作用によって、蛍光標識部と担体との間の距離の変化を生ぜしめるためには、感応部がプラスまたはマイナスに帯電し得ることが好ましい。
【００４８】
このような感応部は、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなることが好ましい。伸縮や担体からの脱離を行い易い場合や、評価対象結合部としても作用して、評価対象と特異的に結合し易い場合が多いからである。プラスまたはマイナスに帯電した感応部としては、主鎖にグアニジド結合を用いてプラスに帯電させたＤＮＡ（グアニジンＤＮＡ）やマイナスに帯電した天然のヌクレオチド体を例示できる。
【００４９】
ここで、上記「産物」とは、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られるものであり、本発明の趣旨に合致する限り、抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントや抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片、さらにはその誘導体等どのようなものを含めることもできる。
【００５０】
抗体としては、たとえば、モノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧ抗体を使用することができる。また、ＩｇＧ抗体に由来する断片として、たとえばＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを使用することもできる。更に、そのようなＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片などを使用することもできる。蛋白質に対して親和性を有する有機化合物として使用可能な例を挙げると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）等の酵素基質アナログや酵素活性阻害剤、神経伝達阻害剤（アンタゴニスト）などがある。蛋白質に対して親和性を有する生体高分子の例としては、蛋白質の基質または触媒となる蛋白質、分子複合体を構成する要素蛋白質同士等を挙げることができる。
【００５１】
感応部として、天然のヌクレオチド体や人工のヌクレオチド体を使用することができる。人工のヌクレオチド体には、完全に人工のものも、天然のヌクレオチド体から誘導されるものも含まれる。人工のヌクレオチド体を使用すれば、検出の感度を上げたり、安定性を向上させたりすることができるため有利な場合がある。
【００５２】
また、１本鎖ヌクレオチド体でも、互いに相補的な関係にある１本鎖ヌクレオチド体の対である２本鎖ヌクレオチド体でもよい。なお、伸長や収縮のし易さからすると１本鎖ヌクレオチド体が好ましく、担体上で横たえたり、立ち上げたりするには２本鎖ヌクレオチド体が好ましい場合が多い。電極毎に異なるヌクレオチド体を使用することもできる。ヌクレオチド体鎖の長さは１残基以上あればよい。すなわち、モノヌクレオチド鎖でもよい。
【００５３】
感応部は、また、モノクローナル抗体や蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物を使用することもできる。抗原抗体反応に類する反応によって生じる結合を利用でき、評価対象結合部としても機能するので有用である。
【００５４】
感応部としては、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメント、もしくはモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片を使用することも好ましい。なお、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片とは、モノクローナル抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを細分化した断片やその誘導体を意味する。
【００５５】
さらに、感応部として、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメント、ＩｇＧ抗体もしくはＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片を使用することがより好ましい。なお、ＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片とは、ＩｇＧ抗体Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントを細分化した断片やその誘導体を意味する。アプタマーであることも好ましい。一般的に分子量の小さいものの方が検出感度がよいのでこれらが好まれる理由である。
【００５６】
なお、本発明において、蛍光標識部や評価対象結合部や感応部や被検体は明確に区分される場合の他、それぞれの一部や全部が他の一部や全部と重複している場合も含まれる。感応部が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなる場合には、その一部が評価対象結合部としての機能を有している場合が多い。
【００５７】
本発明に係る担体は、被検体と結合することができ、外部からの作用により、蛍光標識部との間の距離が変化し得れば、本発明の趣旨に反しない限りどのようなものでもよく、その形状にも特別な制限はない。この場合の結合には、共有結合、配位結合のような化学的結合の他、生物学的結合、静電気的結合、物理吸着、化学吸着等、本発明の趣旨に反しない限りどのような結合を使用することもできる。
【００５８】
例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、金属等を使用したり、その表面に被検体と結合し得る構造部分（被検体結合部）を設けることで本発明の担体とすることができる。担体は単層であっても多層であってもよく、層状以外の構造を有していてもよい。
【００５９】
担体の材質は目的に応じて任意に定めることができるが、Ａｕが特に好ましい。生体高分子を被検体として使用する場合に、担体への固定が容易に行えるからである。
【００６０】
外部からの作用として電磁的作用を利用する場合、担体の全部または一部を電極として使用するのが合理的である。導電性の物質そのものを担体とする場合やガラス、セラミックス、プラスチック、金属等の表面に導電性の物質の層を設けることが考えられる。このような導電性の物質としては、単金属、合金、それらの積層体等どのようなものでもよい。Ａｕに代表される貴金属は化学的に安定であり、好ましく使用できる。
【００６１】
特に被検体結合部を設けなくても被検体と結合し得る場合は、表面に被検体結合部を設ける必要はない。被検体がヌクレオチド体よりなり、そのチオール基を介して、Ａｕ層と直接結合できる場合を例示すると、ポリッシュしたＡｕ電極と室温で２４時間反応させて、図１に示すように、サファイア基板２上に設けたＡｕ電極（担体３）に、蛍光標識部４と天然の１本鎖オリゴヌクレオチド構造を持つ感応部５と評価対象結合部６とを持つ被検体７が結合した状態の被検体評価装置１を挙げることができる。１本鎖オリゴヌクレオチド構造の下部にあるＳは、被検体７がチオール基を介して、Ａｕ電極２と直接結合していることを表している。なお、チオール基と結合する電極表面としてＡｕ以外の公知の金属を使用することもできる。図１では、オリゴヌクレオチド鎖の末端にモノクローナルな免疫グロブリンＩｇＧのＦａｂフラグメントを、評価対象に対して特異的に結合する性質を有する評価対象結合部６として固定してある。
【００６２】
図１の左側は被検体が伸長した状態、右側は被検体が縮まった状態を表す。縮まった状態の被検体７は、Ａｕ電極３と対向電極８との間に外部電場印加装置９により所定の電位差を印加することにより、伸長した状態とすることができる。この例では、被検体が単体から脱離して、蛍光標識部との間の距離が変化するのではなく、被検体の一部である感応部の伸縮により蛍光標識部との間の距離が変化する。この場合、被検体は担体上に固定されたままであり、脱離現象を利用する評価に比べ、連続的に評価できる点や、何度も評価できるといった利点がある。
【００６３】
このとき、光照射装置１０から光１１を照射すると蛍光１２が得られる。図１では、評価対象１３は、評価対象結合部６と結合している。被検体そのものを評価対象とする場合には、図８に示すように、被検体に評価対象を結合させずに蛍光の発光や消光を評価する。この場合、評価対象結合部はなくともよい。
【００６４】
図１において、チオール基と蛍光標識部は予め１本鎖オリゴヌクレオチドに導入しておいた。チオール基と蛍光標識部とは、１本鎖の末端に導入することが望ましく、チオール基を５’末端に導入した場合は蛍光標識部を３’末端に導入することが好ましく、またこの反対でもよい。この例では、オリゴヌクレオチド鎖は、直径１ｍｍの円形状のＡｕ電極上に固定した。
【００６５】
担体の一部として被検体結合部を設ける場合、その材料としては、被検体と結合できる限り、どのようなものでもよく、例えば、被検体と化学結合または分子間力により結合できる分子を挙げることができる。被検体結合部が伸縮し、あるいは被検体を脱離し得るものであれば、感応部として機能させることもできる。この場合、被検体との脱離は、必ずしも、被検体結合部と被検体とが結合した部位である必要はなく、例えば、被検体結合部が、チオール基を介してＡｕ層と結合したものである好ましい態様において、そのチオール基での脱離であってもよい。このように担体と被検体との脱離の部位が、担体と被検体との結合の部位と異なる場合も、一般的に本発明の範疇に属することはいうまでもない。
【００６６】
なお、一般的に担体と被検体との結合は定量的であることが理想的であるが、結合によっては、かなり大きな解離定数を有するものもあり得る。この解離定数があまり大きいと、たとえは緩衝液での洗浄の際に、結合が徐々に減少することになる。この意味で、一般的に、担体と被検体との結合における解離定数が１０-5以下であることが好ましい。
【００６７】
このような担体を媒体である水溶液に浸漬し、水溶液中に配した対向電極との間に例えば直流電場を印加すると、被検体結合部が伸長し、電場を切ると自発的に凝集するようにすることができる。
【００６８】
あるいは、対向電極がない場合でも、担体（電極）に負電場を印加した場合、マイナスに帯電している被検体結合部がクーロン反発により、伸長するようにすることができる。
【００６９】
従って、被検体結合部を本発明に係る感応部と考えれば、被検体結合部に結合した被検体にある蛍光標識部を発光、消光せしめることができる。その結果、電極近傍にあるため消光していた蛍光が、電極表面から十分に離れるため、発光し始める。
【００７０】
蛍光分子等の蛍光標識部を発光させるための光照射装置や蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置としては公知のどのようなものを採用してもよいが、微小な領域に適用することになるので、１本または２本以上の光ファイバーを使用することが有利である場合が多い。光ファイバーの内径（直径）としては１μｍ〜１０ｍｍ程度のものを使用することができる。
【００７１】
次に、担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより電磁的作用を実現させて、担体に結合した被検体を担体から離脱させ、この離脱に伴い発光する蛍光を検出する場合について、図９，１０を使用して説明する。
【００７２】
図９は、担体から離脱していく被検体に光を照射して蛍光を生じさせ、この蛍光を検出する様子を示す模式図である。図９において、本発明に係る被検体評価装置１は、蛍光標識部４と感応部５とを有する被検体７を結合させた電極３と媒体である水溶液中に配した対向電極８、外部電場印加装置９、光ファイバーよりなる光照射装置１０、光ファイバーよりなる蛍光検出装置１４からなる。
【００７３】
図９に示すように、外部電場印加装置９により電極３と対向電極８との間に電位差を印加することにより、電極３に結合した被検体７は電極３から離脱していく。この時の蛍光の増大減少を蛍光検出装置１４で検出するのである。
【００７４】
なお、図９は、被検体７そのものが評価対象である場合を示しており、評価対象結合部や評価対象結合部と結合した評価対象は描かれていない。これに対し、図１０は、被検体７の一部である評価対象結合部６が評価対象１３と結合している場合を表している。
【００７５】
本発明に係る被検体評価装置では、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であり、これらの因子を調整して、評価対象を評価することができる。図９において符号αが光照射角度を、符号１５が光照射面積を、符号βが蛍光検出角度を、符号１６が蛍光検出面積を、符号１７が担体の表面積を、それぞれ断面成分として示したものである。
【００７６】
上記の因子が調整可能であると、蛍光の増大減少や最大値等の挙動を変えることができ、また、外部からの作用の大きさや与え方を変えることにより、それらの挙動をさらに変えることもでき、このような挙動の変化を通じて評価対象の評価をより正確に、迅速に行うことができるようになる。なお、この調整は、本発明に係る被検体評価装置の使用前や使用中に行えることが好ましい。
【００７７】
被検体の評価方法としては、照射面積と担体の表面積との比、蛍光検出面積と担体の表面積との比の少なくともいずれか一方を調整することを好ましい例として挙げることができる。
【００７８】
調整の効果を例示すると、たとえば、図９では、光照射面積を担体の表面積以上とし、蛍光検出面積を担体の表面積と同程度としたものである。蛍光検出面積は、担体の表面積の８０〜１２０％の範囲であることが好ましく、８０〜１００％の範囲であることがより好ましい。
【００７９】
この場合、適切な極性の電場を印加することによって、被検体は静電反発により担体から伸長または離脱する。この伸長または離脱に伴い、クエンチング効果で消光していた蛍光標識部４が蛍光を発し、蛍光検出装置１４により観察される。
【００８０】
さらに時間が経過すると、被検体が伸長している場合には媒体中のカウンターイオンの補償効果により、元の状態に収縮し、また、離脱している場合には、水溶液媒体内での拡散により被検体７が図９では四角形で示されている光検出エリア１８の外に移動し、蛍光が急速に減少し、やがて観察されなくなる。被検体７ａは光検出エリア１８の内部にある被検体を、被検体７ｂは光検出エリア１８の外にある被検体を例示している。このとき、担体の大きさと蛍光検出装置の大きさとの関係によっては、蛍光の強度や強度変化が水溶液媒体中に拡散する被検体の量や拡散速度に比例することが実験的に観測された。
【００８１】
光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度等の因子の調整は、被検体が担体から離脱し得る場合に特に有用である。離脱により、蛍光標識部を発光させ、被検体を光検出エリアから拡散させることにより消光させることが容易にできるため、より多くの情報を得ることが可能となるからである。
【００８２】
このような場合、光照射装置１０の光照射角度を選んで、入射光が電極３の全面にあたるようにセットすることにより、担体全面からの被検体の蛍光を観察でき、蛍光強度を大きくすることができる。また、蛍光検出装置１４の蛍光検出面積を電極３の表面積と同程度の大きさにすることにより、光検出エリア以外には実質的に被検体が存在しない状態から観察を開始することになることから、拡散で光検出エリアに入ってくる被検体が実質的に存在しない状態を実現することができる。従って、光検出エリアから被検体が拡散していく様子を容易に観察することができる。
【００８３】
担体から離れる被検体の脱離の時定数をτrとし、光検出エリアから外に拡散していく時の拡散の時定数をτdとし、担体から脱離した被検体の量をＮ、受光エリアで観察できる被検体の量をＭとすると、以下の近似的関係（１），（２）が考えられる。
【００８４】
【数１】
2005283560.tif 000003
【００８５】
【数２】
2005283560.tif 000004
これらの式をＭについて解くと、下式（３）になる。
【００８６】
【数３】
2005283560.tif 000005
ここで、Ｎ0は最初に担体に結合していた被検体の量である。
【００８７】
なお、式（３）は非常に簡単な近似式であるが、消光や溶媒極性の影響が大きくない限り、Ｍと蛍光強度との間には比例関係が存在すると考えられることから、式（３）を蛍光強度挙動と直接比較することが可能である。
【００８８】
蛍光強度挙動との比較結果では、図１１に示すように、実験値（折線）と計算値（太い実線）が非常に良い一致を示した。このことから、本発明に係る被検体評価装置が、被検体の挙動や被検体と結合した評価対象の挙動を正確に、高感度で、容易に評価できることが理解される。
【００８９】
また、図１２のように、光照射面積１５を担体の表面積１７以上とし、蛍光検出面積１６を担体の表面積１７の１／２以下とすることも有用である。
【００９０】
このようにすると、入射光が電極３の全面にあたるように光照射装置１０をセットすることにより、担体全面からの被検体の蛍光を観察でき、蛍光強度を大きくすることができると共に、蛍光検出面積１６が電極３の表面積１７より十分小さいため、光検出エリア以外にも被検体が存在することになり、拡散で光検出エリア１８に入ってくる被検体が、拡散で光検出エリア１８から出ていく被検体と同程度の数だけ存在する状態を実現することができる。
【００９１】
従って、見かけ上拡散が進まず、蛍光強度が飽和した状態を長く保つことができ、かなりの時間の経過後、蛍光が減少し始める挙動を示すことになる。
【００９２】
このような場合には、たとえば一旦静電反発した被検体が、十分な時間が経過した後に光検出エリア外に拡散で広がっていくため、静電反発による脱離過程と、外部への拡散過程を別々に検討することが可能となる。また、飽和した状態の蛍光強度からバックグラウンドを差し引いた値（正規化した蛍光強度）は、脱離した被検体の量に比例するので、その値を比較することにより、脱離した被検体の量を比較することができる。
【００９３】
このようなときには、式（３）を適用せずに、式（４），（５）をそれぞれ独立に適用することができる。
【００９４】
【数４】
2005283560.tif 000006
【００９５】
【数５】
2005283560.tif 000007
図１３に脱離の時定数τrと拡散の時定数τdとを別々に評価した結果を示す。折線で示した実験結果と太い実線の近似が非常に良い一致を示している。すなわち、本装置は、脱離の時定数や拡散の時定数を独立で扱い、蛋白質を検出評価する場合に非常に適した蛋白質検出デバイスとなり得る。
【００９６】
なお、蛍光検出面積を担体の表面積の１／２以下とするには、図１４に示すように、光照射装置１０と蛍光検出装置１４を並列させる配置、図１５に示すように両者を複合化したもの等どのような配置を採用してもよい。なお、図１５は、複数の光ファイバー１５１を束ねて使用した例である。
【００９７】
上記は、光照射面積と蛍光検出面積とを適宜選択する例であるが、本発明に係る被検体評価装置を使用して評価対象を評価する場合には、そのほかにも種々の条件が複合的に存在する。このような条件に対して本発明に係る被検体評価装置を適切に使用するためには、光照射面積や蛍光検出面積のみならず、光照射角度、光照射強度、蛍光検出角度、担体の形状、担体の表面積を調整因子として使用することが好ましい。
【００９８】
本発明に係る蛍光の検出では、被検体や被検体と結合させる評価対象の環境（媒体）である水溶液の塩濃度も調整因子として有用である。塩は、評価対象の凝集を防止するために添加される。塩としては無機塩、有機塩等を適宜使用できる。無機塩としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等を例示できる。
【００９９】
図１８，１９は、図１に示すような担体３に、蛍光標識部４と天然の１本鎖オリゴヌクレオチド構造を持つ感応部５と評価対象結合部６とを持つ被検体７が結合した状態の本発明に係る被検体評価装置１について、塩濃度の影響を説明する図である。図１８はステップ状に印加した電位の経時的変化を、図１９は、そのときに観察される蛍光強度の時間変化を示す。図１９中のデータは、符号１９１，１９２，１９３，１９４と上に向かう順で、塩濃度を増大させた条件を示す。
【０１００】
図１８，１９より、塩濃度が低いところでは、図１９中のポイントａに示すように、低電位差で比較的大きな蛍光強度の変化が観察される。また、塩濃度を上げて行くと、図１９中のポイントｂに示すように、特定の塩濃度、特定の電位差で蛍光強度を高感度で観察することができる。従って、塩濃度と電位差とを適当に変化させて蛍光の挙動を観察することにより、被検体の種類や被検体と結合した評価対象の種類を判定することが可能である。また、塩濃度を適当な濃度に設定することにより、比較的低電位差での検出を可能にしたり、検出感度を増加させたりすることが可能となる。
【０１０１】
なお、図中のポイントｂのピークは塩濃度の上昇と共に、一旦大きくなるもののその後は小さくなる傾向を示す。このような条件を避け、蛍光が小さくならず、被検体の担体からの伸長や離脱を高効率に保ったり、挙動を高感度に観察できるようにするためには、水溶液媒体の塩濃度を１Ｍ（モル／Ｌ）以下に調整することが好ましい場合が多い。１００ｍＭ（ミリモル／Ｌ）以下であることが、比較的低電位差での高感度の検出が可能となり、水溶液媒体の電気分解や、被検体、評価対象の電気的ダメージを抑えられるため、より好ましい。
【０１０２】
図１６は印加電位差を固定し、塩濃度をより詳細に変化させた場合の正規化した蛍光強度の実験結果の一例を示す。この図は、図１７に示すような、ある塩濃度での電位差印加後の蛍光強度の時間的変化を用い、飽和した状態の蛍光強度のピークからバックグラウンドを差し引いて、電極から離脱した被検体の量に比例した正規化した蛍光強度をプロットしたものである。
【０１０３】
図１６より明らかなように、特定の塩濃度（図１６では７０〜１００ｍＭ近辺）以上では被検体の脱離が抑制される傾向にある。従って、被検体を用いた検出デバイスの感度を高く保つには、１００ｍＭ以下の比較的低濃度の水溶液媒体中を用いることが有用であることが理解される。
【０１０４】
被検体が評価対象と特異的に結合している場合には、当然、評価対象の質量や電荷により、被検体の脱離や拡散が異なってくる。それに伴い、蛍光強度の変化も大きく異なることになる。そこでこのような変化を利用すれば、本発明に係る被検体評価装置で、高感度に蛋白質等の評価対象の検出が可能となる。
【０１０５】
なお、本発明に係る被検体評価装置について、これまでは担体が被検体と結合し得る状態のものであって未だ結合していないものについて主に説明したが、本発明に係る被検体評価装置はこれにとどまらず、担体がすでに被検体と結合したものも本発明の範疇に属する。
【０１０６】
また、担体の数や種類は一つにとどまらない。同種または異種の担体を複数配してなる被検体評価装置も本発明の範疇に属する。
【０１０７】
同様に、同種または異種の被検体を複数配してなる被検体評価装置も本発明の範疇に属する。
【０１０８】
本発明のある態様に係る被検体評価装置では、担体が電極であり、感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物である。すなわち、以下の態様では、被検体が担体から離脱する場合ではなく、感応部が伸縮する場合について説明する。なお、この場合についても、本発明の趣旨に反しない限り、これまでに説明した種々の態様を本態様にも適用し得ることは言うまでもない。
【０１０９】
直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物（以下、ナノワイヤーとも言う）としては、直径が１００ｎｍ以下であれば、上述の感応部に使用される材料から任意に選択することができるが、その他のものであっても、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状の物であれば、どのようなものからでも選択することができる。この場合の直径とは、円形断面を有しない場合にはその円相当直径を使用してもよい。
【０１１０】
より具体的には、原子１つ１つが直列に結合したものから、上述のＤＮＡや高分子のように複雑な分子を結合して、ワイヤー状にしたものまでを挙げることができる。原子が１つずつ直列に結合している場合は０．１ｎｍ、ＤＮＡ２本鎖の場合は２ｎｍ程度を直径として例示することができる。なお、修飾基が付いている場合は、その主鎖についでだけ判断すれば充分である。
【０１１１】
ワイヤー状であるという要件は、長さ対直径のアスペクト比で２：１以上であれば、充分であり、形状は問わない。チューブ状、短冊状、コイル状、層状等、種々の形状のものを使用し得る。この場合にアスペクト比は、長さ方向に伸びきった状態の値として考えることができる。
【０１１２】
簡単に入手できるナノワイヤーとしては、−ＣＨ2−を複数個つなげたものがある。例えば２０個つなげると、Ｃ−Ｃ結合の長さが０．１３４ｎｍ程度であるので、−ＣＨ2−が伸びた状態では２．６８ｎｍのナノワイヤーとなる。この場合の直径はＣの原子直径の３倍から４倍になるので０．３〜０．５ｎｍと考えられる。
【０１１３】
ナノワイヤーがプラスまたはマイナスに帯電し得るようにするには、たとえば、荷電基（ＣＯＯ-やＮＨ3+）を結合させたイオン性ポリマーでもよいが、他のどのよう方法によってもよい。ＤＮＡのような最初から電荷を持った分子をワイヤー状につなげて使用する場合には、このような荷電基の結合は不要である。後述する１本鎖の１２量体ＤＮＡの場合は、最大に引き伸ばした場合、直径が約１．１ｎｍ、長さが約５ｎｍのナノワイヤーとなる。
【０１１４】
ナノワイヤーが伸縮可能かどうかは、本発明に係る被検体の評価が可能かどうかで定めることができるので、実際に伸縮していることを確認する必要はない。一般的には伸縮運動の範疇には含まれない、倒れたり、立ち上がったりして担体との位置関係が変化する動作の場合、あるいは、ワイヤーの全体または一部が折れたり曲がったりして担体との位置関係が変化する動作の場合でも、本発明に係る被検体の評価が可能であれば、本発明に係る「伸縮可能」の範疇に含めることができる。たとえはカーボンナノチューブの場合である。
【０１１５】
ナノワイヤーの電極への固定には、どのような方法を採用してもよい。物理吸着または化学吸着により固定されているものを挙げることができる。
【０１１６】
ナノワイヤーを使用する被検体評価装置では、以下に説明する評価を可能とするため、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能であることが好ましい。
【０１１７】
上記の被検体評価装置を使用する場合、サイン波または矩形波の交流電場を印加することにより、ワイヤー状物を担体に近づけたり遠ざけたりして被検体を評価することが好ましい。
【０１１８】
この場合、ワイヤー状物またはワイヤー状物に付着させた物質の電荷、その静電容量、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整すると、被検体の分子量や性質に基づいて、種々の情報を得ることが可能である。この場合のワイヤー状物に付着させた物質とは、上述の評価対象そのものでもよいが、被検体から得られる情報に変化を与えるものであるならばどのようなものでも構わない。
【０１１９】
たとえば、ナノワイヤーに付着させた物質の電荷が外部電場印加装置により担体に印加された交流電場により、静電反発力や静電引力をうけると、ナノワイヤーが伸縮する。この現象を利用して、ワイヤー状物またはワイヤー状物に付着させた物質の電荷、その静電容量、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位等を変化させて評価すると、種々の情報が得られ、これにより、評価対象の有無の検出や定量をより正確に行うことができる。
【０１２０】
評価に蛍光標識を用いた本形態の被検体評価装置には、たとえば図１に示した装置を使用することができる。この場合、感応部５が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物（ナノワイヤー）である。
【０１２１】
この場合の、一連の蛍光強度の変化の一例を図２０に示す。図２０の上部に示す矩形の交流電場を印加したときに観察される蛍光強度の時間変化を下部に示す。右にある模式図部分は、ナノワイヤーが伸縮する様子を示したものである。
【０１２２】
蛍光強度の大きいＡの状態は、ナノワイヤー１９が静電反発力により電極３から離れた状態を、蛍光強度の小さいＢの状態は、静電引力により電極３に近づいた状態を示す。この状態ＡとＢの間の差に相当する蛍光強度の変化、蛍光強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数、この変化の立ち上がり、立下りの時定数等により、ナノワイヤー１９の評価が可能である。
【０１２３】
図中左の挿入図は、交流電場による蛍光強度を積算し、蛍光強度の立ち下がり部分を一次の指数関数で近似したものである。この近似曲線より、実験に用いたナノワイヤー１９の水溶液中の時定数の評価が可能である。なお、蛍光強度の変化率は、蛍光強度の最大値から最小値を引いた値を中間の蛍光強度（最大値と最小値を足して２で割った値）で割った値を意味する。ただしノイズは除外される。
【０１２４】
また、ナノワイヤー１９に特異的に結合する評価対象がある場合には、評価対象の結合前後の蛍光強度の変化を観察することにより、評価対象の有無、存在量を評価することも可能である。
【０１２５】
図中中央の挿入図は交流電場を１０時間に及ぶ長時間において印加し続けた場合であるが、信号の劣化は見られず、再現性良いデータを長時間取得することが可能である。１回の交流電場を１測定とすれば、交流電場の周波数を調整して、１００Ｈｚで測定した場合、１秒間に同じ測定が１００回できることになるが、このような測定の仕方で評価する装置や方法は、他に例がない。分子等を用いたナノワイヤーでは、蛍光標識部やナノワイヤーの劣化が起こると考えられており、このような高い回数の測定に耐えられほど強い結合が得られることは、これまで全く知られていない知見である。後述するように、１０時間以上の交流電場の印加（７２００回以上の測定）に耐えられる実験条件が見出された。その結果、繰り返しの測定が可能となった。使用する交流電場の周波数としては、０．２Ｈｚ以下の小さいものから、１０００Ｈｚ程度以上のものまで可能である。
【０１２６】
図２１は、交流電場として、微弱なＡＣバイアスを、段階的に増加させたＤＣバイアスに乗せたものを使用した場合の蛍光強度の変化と、蛍光強度の変化率の変化を示したものである。サイン波または矩形波の交流電場を印加することができる。
【０１２７】
この図より、各ＤＣバイアスでの蛍光強度の違いが観察できる。特に、最下段の図に示すように、電極を零電位にするとＡＣバイアスの効果が最大になることから、蛍光強度の変化率が最大となるＤＣバイアスを電極の零電位にすることができる。なお、電極の零電位とは、ナノワイヤーを固定している電極の電位が、被検体の媒体である溶液中にある対向電極に対し、電位差がゼロである状態を意味する。通常、ナノワイヤーを固定している電極は、被検体の媒体である溶液中にある対向電極に対し、プラスまたはマイナスの電位を有している。電極を零電位にするとは、この電位差を消す電位をナノワイヤーを固定している電極に与えることを意味する。たとえば、電極電位が溶液に対して−１Ｖに帯電している場合、０Ｖを中心とする±０．２Ｖの交流電場を電極に印加したとすると、電極の電位は実際には−０．８Ｖと−１．２Ｖの交流電場となり、いずれにしても負電場を印加していることになる。この場合に、電極電位に＋１Ｖのオフセット電位を与えると、交流電圧の中心となる電位が調整され、０Ｖを中心とする±０．２Ｖの交流電場を電極に印加した場合に、電極の電位も実際に０Ｖを中心とする±０．２Ｖの交流電場となるのである。
【０１２８】
図中、Ｃの電位が電極の零電位であり、この電位を中心にＡＣバイアスを設定することにより、最も効率よくＡＣバイアスをナノワイヤーに印加することができ、高感度の評価が可能であることが判明した。
【０１２９】
また、図中Ｄ以上の電位では、蛍光信号が急速に減少し、やがて観察されなくなる。これは、蛍光標識部やナノワイヤーの劣化によるものと推察される。さらに、図中Ｅ以下の電位では、ナノワイヤーの担体からの脱離によるものと思われる強い蛍光信号が観察される。この挙動はＡＣバイアスによる継続的な評価には向いていない。従って、このＤ〜Ｅの範囲、すなわち、交流電場の中心となる電位を段階的にまたは連続的に変化させた場合に現れる、より強い蛍光信号が得られ始める低電位領域と、蛍光信号が急速に弱まる高電位領域との間の領域に電位を設定することが、劣化のほとんど無い、信頼性の高い評価をする上で重要であると考えられる。
【０１３０】
図２２は、媒体中の塩濃度を変化させて、蛍光強度の変化率を観察したものである。比較的塩濃度の高い範囲では、荷電性ナノワイヤーの電荷が塩に補償され、交流電場の影響を受けにくくなっている。また、図中、電荷量の異なる２種類のワイヤーを用いているが、電荷量が２倍のワイヤーの方が交流電場の影響を強く受け、変化率が大きくなっている。図より、塩濃度を低く保ち、電荷量を多く調整したワイヤーを用いると、感度の高い評価が可能であることが理解できる。電荷量の多いワイヤーはたとえば、荷電数の大きいイオン性ポリマーや２本鎖のヌクレオチドを使用することで実現できる。
【０１３１】
図２３は、荷電性ナノワイヤーの電極への付着率（すなわち、担体上への付着率）を変化させて、蛍光強度の変化率を観察したものである。担体上への付着率が高い範囲では、ワイヤー同士が相互に干渉する立体障害が起こり、蛍光強度の変化率は高くない。図中、長さの異なる２種類のワイヤーを用いているが、長さが長いほど立体障害が、低い付着率の範囲まで起こっている。図より、比較的短いワイヤーを低付着率で用いると、感度の高い評価が可能である。比較的短いワイヤーとは５ｎｍ程度の長さのワイヤーである。なお、付着率は公知のどのような方法によって求めてもよい。代表的なものとして、付着した分子にのみ含まれる元素をＸＰＳ（Ｘ−ｒａｙ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）で測定し、比較する方法や、付着させる分子に放射性元素（３２Ｐなど）をラベルして、あるいは、付着させる分子の一部を放射性同位元素で置換して、放射線を測定することにより、付着率を求める方法、ナノワイヤーの持つ電荷を正電荷を持つ酸化還元マーカーで補償し、この酸化還元マーカーの還元電流の実測から補償に必要な電荷を推算し、表面に付着している分子の付着率を算出する方法（たとえば、非特許文献２参照。）等を挙げることができる。
【０１３２】
本発明により、評価対象に蛍光標識部や放射性物質を導入しなくても評価可能とすることもできる。少量であっても評価可能とすることもできる。高感度の評価も可能である。また、試料中に多種類の評価対象が混合された状態で存在する場合であっても、評価可能とすることもできる。さらに、小型化、複合化、集積化された被検体評価装置やその被検体評価装置を使用した優れた被検体評価方法を実現できる。
【０１３３】
本発明によって実現される被検体評価装置は、たとえば糖尿病において肝細胞がインシュリンの受容状態に応じて細胞内グリコーゲン代謝を切り換える場合などに、インシュリン受容体からグリコーゲン分解酵素に至る一連の蛋白質相互作用ネットワークの一部が低下または昂進していることを捉える蛋白質検出デバイスとして使用できる。
【０１３４】
このような、蛋白質検出デバイスを利用することによって、リン酸化や糖鎖付加などのいわゆる翻訳後修飾も含めて、蛋白質のポピュレーションを捉えることが可能になる。
【０１３５】
また、従来のように症状として現れた現象を大括りにして糖尿病と捉えるのではなく、たとえば、相互作用ネットワークに係わるある特定の蛋白質の機能低下が糖代謝の不全を起こしていることを把握できるようになり、機能不全の原因に対応した、適切な診断と治療ならびに治療結果の検証が可能になる。同様の手法は、糖尿病に限らず、高血圧症、高脂血症、癌（細胞増殖制御不全）その他の多因子性疾患全般に対しても適用が可能である。
【実施例】
【０１３６】
以下、実施例を参照して本発明を更に説明する。
【０１３７】
［実施例１］
５’末端に蛍光色素標識を導入した１本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、ポリッシュしたＡｕ電極と室温で２４時間反応させて、Ａｕ電極に１本鎖オリゴヌクレオチドを、図９に示すように結合した。蛍光色素標識は１本鎖の両端に導入してもよく、鎖の３’末端に導入してもよい。オリゴヌクレオチド鎖は、直径１ｍｍの円形状のＡｕ電極上に保持した。この蛍光色素は、光により活性化され、金属表面に十分近い状態では消光し、十分に離れると発光した。
【０１３８】
光照射装置は、Ａｕ電極に対し、４５°の角度に配し、電極全面に入射光を入射できるようにした。また、受光ファイバー（蛍光検出装置）は電極径と同等の大きさ（内径１ｍｍ）のものを用いた。
【０１３９】
以上の構成を用い、オリゴヌクレオチド鎖を結合した電極を水溶液に浸し、二電極法によりオリゴヌクレオチド鎖に、パルスなどのモジュレーションをかけたものを含む直流電場を印加し、紫外線ランプによりオリゴヌクレオチド鎖上の蛍光色素が励起されて蛍光を発し、蛍光強度が変動する様子を測定した。水溶液は、純水にトリス緩衝剤（２−ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ）１０ｍＭ、塩として食塩を２８０ｍＭ加えたものを使用した。なお、二電極法に代えて三電極法を採用してもよい。
【０１４０】
電極に−０．８Ｖの負電場を印加した際の蛍光強度の変化を図４に示す。発光は、負イオンであるオリゴヌクレオチドがクーロン反発によって電極から乖離し、オリゴヌクレオチドに結合させてある蛍光分子が電極から離れ、その結果電極近傍にあるため消光していた蛍光が発光し始めたためと解される。
【０１４１】
電極の大きさ（担体の表面積）と受光ファイバー内径（直径）で決まる蛍光検出面積とが同等の大きさであることから、電極を離れたオリゴヌクレオチドは拡散によりすみやかに光検出エリアを出て行くため、蛍光の減衰が観察された。図４中白丸印は、本実施例で観察された蛍光強度のデータ例を示す。また、図４中実線は前記（３）式を用いて求めた計算結果である。実験結果と非常によい一致を示し、このときの脱離の時定数τr1、拡散の時定数τd1、電極に結合していた最初のオリゴヌクレオチドの相対量Ｎ0はそれぞれ、９．４±０．７秒，３８．３±２．４秒，８０３±２８（任意単位）となった。
【０１４２】
［実施例２］
上記実施例１において、Ａｕ電極径を、図１２に示すように、受光ファイバーの内径に比べ十分に大きい径である、直径２ｍｍと倍の値にした場合の同様の測定結果を図５に示す。
【０１４３】
この場合、オリゴヌクレオチドの脱離は電場の印加とともに同様に起こり、蛍光強度の増加が観測された。その後、Ａｕ電極径が受光ファイバーよりも十分に大きいため、受光ファイバーの周囲で拡散が進まず、蛍光強度が飽和する時間ｔsが発生し、その後時間の経過とともに、オリゴヌクレオチドが周囲に拡散し、蛍光強度の減衰が観察された。
【０１４４】
一旦静電反発したオリゴヌクレオチドが十分な時間が経過した後に、光検出エリア外に拡散で広がっていくため、静電反発による脱離過程と、外部への拡散過程を別々に検討することが可能となった。図５中白丸印は、本実施例で観察された蛍光強度のデータ例を示す。また、図５中実線は、脱離の時定数と拡散の時定数を別々に評価した結果である。実験結果と近似が非常に良い一致を示し、この場合の、脱離の時定数τr2や拡散の時定数τd2はそれぞれ、０．６７±０．０５秒，２３．７±０．６秒となった。
【０１４５】
［実施例３］
電極に印加する電場と塩濃度以外は、上記実施例１と同様の構成を用い、蛍光強度が変動する様子を測定した。
【０１４６】
電極に各種の直流負電場（−２００ｍＶ，−４００ｍＶ，−６００ｍＶ，−８００ｍＶ，−１０００ｍＶ）を印加し、トリス緩衝剤１０ｍＭ一定の下、食塩（ＮａＣｌ）を変化（０ｍＭ，７０ｍＭ，２８０ｍＭ，９９０ｍＭ）させた際の蛍光強度の変化を図６に示す。トータルの塩濃度は、１０ｍＭ，８０ｍＭ，２９０ｍＭ，１０００ｍＭであった。
【０１４７】
塩濃度１０ｍＭ，８０ｍＭでは、比較的低電場の−６００ｍＶから比較的大きな蛍光強度が観察された。また、塩濃度２９０ｍＭでの負電場−８００ｍＶの点において、最大の蛍光強度が観察された。
【０１４８】
このことから、塩濃度を１０ｍＭや８０ｍＭに調整することにより、比較的低電場から蛍光を観察することが可能となり、電場の影響を最小限に抑えた測定が可能となることが理解できる。また、塩濃度を２９０ｍＭ、負電場を−８００ｍＶに設定することにより、比較的高感度で蛍光の観測が可能となることが理解できる。
【０１４９】
また、上記実施例２と同様の構成を用い、電極に印加する負電場を−８００ｍＶに固定し、塩濃度を詳細に変化させた（３ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ，４０ｍＭ，７０ｍＭ，７００ｍＭ，１６００ｍＭ）場合の正規化した蛍光強度（図５で蛍光強度のピーク値からバックグラウンドを差し引いたもの）と塩濃度との関係を図７に示す。なお、３ｍＭ，１０ｍＭはトリス緩衝剤のみ、残りはトリス緩衝剤１０ｍＭ一定の下、食塩を規定量添加した。
【０１５０】
図７より明らかなように、特定の塩濃度以下、より具体的には１００ｍＭ以下では蛍光強度のピークが高い値をとり、この範囲に塩濃度を調整することにより、被検体を用いたデバイスの検出感度を十分にとることができる。
【０１５１】
実施例１，２，３では評価対象と被検体との結合による信号の変化については検討しなかったが、電極からの脱離や拡散は、電極に結合した物質の電荷や質量に大きく依存することから、実施例に用いたオリゴヌクレオチドの一端あるいは両端に特定の蛋白質（評価対象）と特異的に親和性を持つ例えば抗体等（評価対象結合部）を結合させ、特定の蛋白質とこの抗体とが特異的に結合した場合には、蛋白質の電荷、質量に依存する脱離、拡散特性の変化が現れ、蛋白質の検出が可能であるものと考えられる。
【０１５２】
［実施例４］
５’末端に蛍光色素標識を、３’末端にチオール（ＳＨ）基を導入した１本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、ポリッシュした金電極とチオール基とを室温で２４時間反応させて金電極に１本鎖オリゴヌクレオチドをナノワイヤーとして結合した。１本鎖オリゴヌクレオチドの長さは１残基以上あればよい。また、蛍光色素標識は１本鎖の途中や３’末端に導入してもよく、３’末端に導入する場合はチオール基を５’末端に導入することができる。オリゴヌクレオチド鎖は、２ｍｍの円形状のＡｕ電極上に保持した。
【０１５３】
蛍光色素は、光により活性化され、金属表面に十分近い状態ではクエンチング効果により消光あるいは減光され、十分に離れると発光を強める性質を有していた。入射光ファイバーは、Ａｕ電極に対し、４５°の角度に配し、電極全面に入射光を入射できるようにした。また、受光ファイバーは電極径と同等の大きさのものを用いた。
【０１５４】
以上の構成を用い、オリゴヌクレオチド鎖を固定した電極を電解質の水溶液に浸漬し、二電極法でオリゴヌクレオチド鎖に矩形波の交流電場を印加し、紫外線ランプによりオリゴヌクレオチド鎖上の蛍光色素が励起されて蛍光を発し、蛍光強度が変動する様子を測定した。
【０１５５】
電極に２００ｍＶを基準に±２００ｍＶ（０ｍＶ〜４００ｍＶ）の矩形の交流電圧を印加し、蛍光強度が変動する様子を観察した結果を図２４に示す。図の右部分に示すように、マイナスの電荷を持つヌクレオチドは、電極電位が相対的にマイナス電位の場合には、静電反発力により電極から離れ、ヌクレオチドに結合させてある蛍光色素が電極から離れる。その結果、電極近傍にあるため消光あるいは減光していた蛍光色素からの蛍光が発光を強める。プラス電位の場合には静電引力により電極に引き寄せられ、蛍光色素が、クエンチング効果によって、消光あるいは減光する。
【０１５６】
この交流電圧による蛍光強度の変化率（以下、モジュレーションともいう）は水溶液中のヌクレオチドの運動現象に強く依存しており、モジュレーションの時定数やモジュレーション幅、周波数特性、カットオフ周波数を解析することにより、水溶液中のヌクレオチドの挙動を評価することが可能である。
【０１５７】
図２５の下図部分は、モジュレーションを積算し、蛍光強度の減衰曲線に指数関数をあてはめたものの一例である。減衰時定数として０．３５８±０．０３２７秒が得られた。また、図２５の上二つの図部分は、１０時間以上交流電圧を印加し続けた時の測定結果である。１０時間以上の測定時間においても、劣化無くこの現象が観察され、信頼性の高い測定が可能であることが判明した。
【０１５８】
図２６は、水溶液中の塩濃度（ＮａＣｌ）を変化させて、モジュレーションの変化を観察したものである。比較的塩濃度の高い領域では、カウンターイオン（ここではＮａ+）の補償効果が大きく、交流電圧の影響を受けにくく、モジュレーションは小さい。また、図中、１本鎖ヌクレオチドの相補鎖を用いて２本鎖を形成した２本鎖ヌクレオチドのモジュレーションの変化も併せて示してある。電荷量が２倍の２本鎖ヌクレオチドのほうが、交流電場の影響を強く受け、モジュレーションが大きくなっている。図より、塩濃度を低く保ち、電荷量の多いヌクレオチドを用いると、感度の高い評価が可能であることが理解できる。
【０１５９】
また、図２７は、電極上に固定するオリゴヌクレオチドの電極表面密度（担体上への付着率）を変化させて、モジュレーションの変化を観察したものである。担体上への付着率が高い範囲では、ヌクレオチド同士が相互に干渉する立体障害が起こり、モジュレーションが小さくなっている。図中、長さの異なる２種類の１本鎖オリゴヌクレオチド（１２量体と２４量体）をナノワイヤーとして用いているが、長さが長いほど立体障害が低表面付着率の範囲まで起こっていることが理解される。図より、比較的短いワイヤーを低表面付着率で用いると、感度の高い評価が可能であることが理解できる。
【０１６０】
また、図２８は、交流電圧として、±５０ｍＶのＡＣバイアスを、段階的に増加させたＤＣバイアスに乗せたものを使用し、そのときの蛍光強度の変化と、モジュレーションの変化とを測定したものである。
【０１６１】
この図より、各ＤＣバイアスでのモジュレーションの違いが観察できる。特に、電極の零電位でＡＣバイアスの効果が最大になることから、この電位を中心にＡＣバイアスを設定することにより、最も効率よくＡＣバイアスをヌクレオチドに印加することができ、高感度での評価が可能であることが理解される。
【０１６２】
また、図中Ｄ以上の電圧では、蛍光強度が急速に減少し、やがて観察されなくなった。この領域では、蛍光標識部やヌクレオチドの劣化が起こるものと考えられる。さらに、図中Ｅ以下の電位では、ナノワイヤーの担体からの脱離によると思われる強い信号が観察された。従ってこの領域は、ＡＣバイアスによる継続的な評価には向いていない。電極に印加する電圧をＤ〜Ｅの範囲に設定することが、劣化の無い、信頼性の高い評価をする上で必要であると考えることができる。
【０１６３】
本実施例では、電極へのヌクレオチドの固定にチオール基による化学吸着を用いているが、電極へ固定できるものであれば何を用いても良く、また、物理吸着等のヌクレオチド自身の吸着作用を用いても同様の効果が得られる。
【０１６４】
さらに、本実施例では、電極へ固定した荷電性ナノワイヤーとして、ヌクレオチドを評価対象としているが、他の電荷を持つ物質を固定させたナノワイヤーを評価対象としても良く、また、評価対象をナノワイヤーと特異的に結合する性質を有する物質（例えば、蛋白質）や、ナノワイヤーに付着させた物質（例えば、抗体）と特異的に結合する性質を有する物質（例えば、蛋白質）とした場合も全く同様に評価可能である。この場合、本実施例のように、交流電圧の印加による評価対象の連続的な評価を観察しても良く、また、ナノワイヤーとナノワイヤーに付着させる物質との組み合わせの場合には、結合前後の変化をモニターし、評価対象の結合の有無、結合量等を評価することも可能である。
【０１６５】
［実施例５］
５’末端に蛍光色素標識を、３’末端にチオール（ＳＨ）基を導入した１本鎖オリゴヌクレオチドと、３’末端にビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）を導入した相補鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、ポリッシュした金電極とチオール基とを室温で１時間反応させて金電極に２本鎖オリゴヌクレオチドをナノワイヤーとして結合した。１本鎖オリゴヌクレオチドの長さは１残基以上あればよい。また、蛍光色素標識は１本鎖の途中や３’末端に導入してもよく、３’末端に導入する場合はチオール基を５’末端に導入することができる。その場合には、相補鎖のビオチンを５’末端に導入すればよい。オリゴヌクレオチド鎖は、２ｍｍの円形状のＡｕ電極上に保持した。
【０１６６】
測定系は実施例４と全く同じものを用い、矩形の交流電圧の代わりに、周波数を任意に変更可能なサイン波の交流電源を用い、そのときのモジュレーションの変化のみをロック・イン・アンプで観察し、測定可能な周波数の評価を行った結果を図２９に示す。図２９より、１０００Ｈｚ程度以上の高周波までモジュレーションの感度が落ちずに測定が可能であり、測定の高速化に寄与できることがわかる。
【０１６７】
図３１は同様の付着条件で金電極に付着させた１本鎖オリゴヌクレオチドに相補鎖オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたときのハイブリダイズ前後の周波数特性である。たとえば１０〜１，０００Ｈｚといった、測定周波数の広い範囲でモジュレーションの変化率が４．９倍に増加し、広範囲でハイブリダイゼーションを検出できることがわかる。このことから、蛍光強度の変化率の周波数特性、たとえば印加する電圧の周波数を種々変えた場合における蛍光強度の変化率挙動、から、種々の評価が可能であることが分かる。
【０１６８】
図３２は図３１を最大値で規格化した図である。ハイブリダイズすることによって、カットオフ周波数（ここでは最大値の１／２に減少する点と規定）が１７７０Ｈｚから２３５０Ｈｚに変化していることがわかる。このことから、測定対象のカットオフ周波数に注目することによっても、高感度の測定が可能になることが明らかである。
【０１６９】
さらに、図３０には、相補鎖に導入したビオチンと特異的に結合するストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を少量（１００ｎＭ）水溶液中に添加した際のモジュレーションの変化を観察したものである。測定周波数は３７Ｈｚ固定で、ストレプトアビジンの添加前、添加後の信号変化をリアルタイムで測定してある。図３０より、ビオチンとストレプトアビジンの特異的結合を、モジュレーションの信号変化としてはっきりと検出していることがわかる。また、秒単位の変化を捉えることによるリアルタイムの検出が可能になっている。図３３はビオチン−ストレプトアビジン混合物の有無による周波数特性の変化を最大値で規格化したものである。ビオチン−ストレプトアビジン混合物の付着により、カットオフ周波数が３７５０Ｈｚから２１２０Ｈｚにシフトしていることがわかる。混合物の付着は全体の分子質量を増加させ、高い周波数まで分子全体の運動が追従できなくなっていると推定される。このことから全体の質量の変化がカットオフ周波数に影響を与え、カットオフ周波数に注目することによりナノワイヤーへの吸着物の有無を検出できることが明らかである。
【０１７０】
本実施例では、オリゴヌクレオチドのハイブリダイズやビオチン−ストレプトアビジンの特異的結合を検出対象としているが、その他、抗原抗体反応や、あらゆる物質の特異的結合、また、一塩基多型(ＳＮＰｓ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ)の相補鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせるような部分的な特異的結合の測定が可能であることは言うまでも無い。
【０１７１】
なお、上記に開示した内容から、下記の付記に示した発明が導き出せる。
【０１７２】
（付記１）  担体との間の距離が離れると受光により蛍光を発し得る蛍光標識部を備えた被検体と結合することができ、外部からの作用により、当該蛍光標識部との間の距離が変化し得る担体と、
当該蛍光標識部を発光させるための光照射装置と、
当該蛍光標識部から発光される蛍光を検出するための蛍光検出装置と
を備え、
光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能である、
被検体評価装置。
【０１７３】
（付記２）  前記蛍光標識部と前記担体との間の距離が、被検体と担体との少なくともいずれか一方に備えられた感応部により変化し得る、付記１に記載の被検体評価装置。
【０１７４】
（付記３）  前記外部からの作用が、電磁的作用または化学的作用である、付記１または２に記載の被検体評価装置。
【０１７５】
（付記４）  前記担体が電極であり、対向電極との間に電位差を与えることにより前記電磁的作用が実現する、付記３に記載の被検体評価装置。
【０１７６】
（付記５）  前記担体が、被検体と化学的に結合し得る、付記１〜４のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１７７】
（付記６）  前記担体が表面にＡｕ層を有する、付記１〜５のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１７８】
（付記７）  担体の被検体結合部が、チオール基を介してＡｕ層と結合したものである、付記６に記載の被検体評価装置。
【０１７９】
（付記８）  前記被検体が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの評価対象に対して特異的に結合する性質を有する評価対象結合部を備えている、付記１〜７のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１８０】
（付記９）  前記評価対象が蛋白質である、付記８に記載の被検体評価装置。
【０１８１】
（付記１０）  前記感応部がプラスまたはマイナスに帯電し得る、付記１〜９のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１８２】
（付記１１）  前記感応部が、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体、アプタマー、抗体を蛋白質分解酵素で限定分解して得られる産物、蛋白質に対して親和性を有する有機化合物、蛋白質に対して親和性を有する生体高分子、これらの複合体、プラスまたはマイナスに帯電したイオン性ポリマーおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選ばれた少なくとも一つの物質よりなる、付記１〜１０のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１８３】
（付記１２）  前記感応部が天然または人工の１本鎖のヌクレオチド体、あるいは、天然または人工の２本鎖のヌクレオチド体よりなる、付記１１に記載の被検体評価装置。
【０１８４】
（付記１３）  前記感応部が抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントよりなる、付記１１に記載の被検体評価装置。
【０１８５】
（付記１４）  前記感応部が、ＩｇＧ抗体またはＩｇＧ抗体のＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）2フラグメントに由来する断片よりなる、付記１１に記載の被検体評価装置。
【０１８６】
（付記１５）  前記感応部がアプタマーよりなる、付記１１に記載の被検体評価装置。
【０１８７】
（付記１６）  前記光照射面積を前記担体の表面積以上とし、
前記蛍光検出面積を前記担体の表面積の８０〜１２０％の範囲とし得る、
付記１〜１５のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１８８】
（付記１７）  前記光照射面積を前記担体の表面積以上とし、
前記蛍光検出面積を前記担体の表面積の１／２以下とし得る、
付記１〜１５のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１８９】
（付記１８）  前記担体が前記被検体と結合したものである、付記１〜１７のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１９０】
（付記１９）  同種または異種の担体を複数配してなる、付記１〜１８のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１９１】
（付記２０）  同種または異種の被検体を複数配してなる、付記１〜１９のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１９２】
（付記２１）
前記担体が電極であり、
前記感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物である、
付記４〜２０のいずれかに記載の被検体評価装置。
【０１９３】
（付記２２）
印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、前記ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子が調整可能である、付記２１に記載の被検体評価装置。
【０１９４】
（付記２３）
前記ワイヤー状物が電極に、物理吸着または化学吸着により固定されている、付記２１または２２に記載の被検体評価装置。
【０１９５】
（付記２４）  付記１〜２３のいずれかに記載の被検体評価装置を用い、
被検体を担体と結合せしめ、
外部からの作用により、蛍光標識部と担体との間の距離を変化させ、
光照射装置から光を照射し、
蛍光標識部から発光される蛍光を蛍光検出装置で検出し、
光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積および使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整する
被検体評価方法。
【０１９６】
（付記２５）  光照射面積と担体の表面積との比、蛍光検出面積と担体の表面積との比の少なくともいずれか一方を調整する、付記２４に記載の被検体評価方法。
【０１９７】
（付記２６）  前記光照射面積を前記担体の表面積以上とし、
前記蛍光検出面積を前記担体の表面積の８０〜１２０％の範囲とする、
付記２４または２５に記載の被検体評価方法。
【０１９８】
（付記２７）  前記光照射面積を前記担体の表面積以上とし、
前記蛍光検出面積を前記担体の表面積の１／２以下とする、
付記２４または２５に記載の被検体評価方法。
【０１９９】
（付記２８）  前記媒体中の塩濃度を１Ｍ以下に調整する、付記２４〜２７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２００】
（付記２９）  前記媒体中の塩濃度を１００ｍＭ以下に調整する、付記２４〜２７のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０１】
（付記３０）  被検体を担体と結合せしめる前に、被検体を評価対象と結合せしめる、付記２４〜２９のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０２】
（付記３１）  担体として電極を使用し、対向電極との間に、一定値、パルス値、階段状に変化する値、周期的に変化する値の内のいずれかまたはその組み合わせの値を有する電位差を与えることにより電磁的作用を実現する、付記２４〜３０のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０３】
（付記３２）  蛍光発生の有無、蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値を測定する、付記２４〜３１のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０４】
（付記３３）  蛍光強度増大率、蛍光強度減衰率、蛍光ピーク強度、蛍光ピーク強度の変化率、蛍光強度の変化率の周波数特性、蛍光強度の変化率のカットオフ周波数からなる群から選択された少なくとも一つの物性値と、光照射角度、光照射強度、光照射面積、蛍光検出角度、蛍光検出面積、担体の形状、担体の表面積、使用される媒体中の塩濃度、担体上の被検体の付着密度および印加電位差からなる群から選択された少なくとも一つの特性値との関係から評価を行う、付記２４〜３２のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０５】
（付記３４）
前記担体が電極であり、
前記感応部が、プラスまたはマイナスに帯電し得、伸縮可能で、当該電極に固定された、直径が１００ｎｍ以下のワイヤー状物である、
付記２４〜３３のいずれかに記載の被検体評価方法。
【０２０６】
（付記３５）
サイン波または矩形波の交流電場を印加することにより、前記ワイヤー状物を担体に近づけたり遠ざけたりして前記被検体を評価する、付記３４に記載の被検体評価方法。
【０２０７】
（付記３６）
前記ワイヤー状物またはワイヤー状物に付着させた物質の電荷、その静電容量、印加する直流電圧、交流電圧、その周波数、交流電圧の中心となる電位、前記ワイヤー状物の長さおよびその担体上への付着率からなる群の内の少なくとも一つの因子を調整する、付記３４または３５に記載の被検体評価方法。
【０２０８】
（付記３７）
前記交流電圧の中心となる電位を担体電極の零電位に調整する、付記３６に記載の被検体評価方法。
【０２０９】
（付記３８）
前記交流電場の中心となる電位を段階的にまたは連続的に変化させる、付記３６または３７に記載の被検体評価方法。
【０２１０】
（付記３９）
前記交流電場の中心となる電位を段階的にまたは連続的に変化させた場合に現れる、より強い蛍光信号が得られる低電位領域と、蛍光信号が急速に弱まる高電位領域との間の領域で、前記交流電場の中心となる電位を変化させる、付記３８に記載の被検体評価方法。
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明によって実現される被検体評価装置や被検体評価方法は、狭義には現在非常に注目を集めている生体高分子の検出に利用することができる。また、本発明によって、最適化されたデバイス構造を用いることにより、生体高分子の検出のみならず、生体高分子や人工ナノ構造体の電気的特性、拡散特性などを捉えることができ、医療分野への応用が考えられる。今後、ヒトゲノム計画により得られる生体物質の機能が解明されるにつれ、応用範囲が広がるものと期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】担体上に結合した状態の被検体が伸縮し、蛍光を発光または消光する様子を示す模式図である。
【図２−Ａ】被検体が担体と結合した状態を示す模式図である。
【図２−Ｂ】被検体が担体から脱離した状態を示す模式図である。
【図３−Ａ】被検体が担体と結合し、縮まった状態を示す模式図である。
【図３−Ｂ】被検体が担体と結合し、横に倒れた状態を示す模式図である。
【図３−Ｃ】被検体が担体から伸長した状態を示す模式図である。
【図４】蛍光強度の経時的変化を示す図である。
【図５】蛍光強度の経時的変化を示す他の図である。
【図６】本発明に係る被検体評価装置について、塩濃度の影響を説明する図である。
【図７】蛍光強度ピーク値と塩濃度との関係を説明する図である。
【図８】担体上に結合した状態の被検体が伸縮し、蛍光を発光または消光する様子を示す模式図である。
【図９】本発明に係る被検体評価装置において、担体から離脱していく被検体に光を照射して蛍光を生じさせ、この蛍光を検出する様子を示す模式図である。
【図１０】本発明に係る被検体評価装置において、担体から離脱していく被検体に光を照射して蛍光を生じさせ、この蛍光を検出する様子を示す他の模式図である。
【図１１】蛍光強度の時間的変化を示す図である。
【図１２】本発明に係る被検体評価装置において、担体から離脱していく被検体に光を照射して蛍光を生じさせ、この蛍光を検出する様子を示す他の模式図である。
【図１３】蛍光強度の時間的変化を示す他の図である。
【図１４】本発明に係る被検体評価装置の配置の一例である。
【図１５】本発明に係る被検体評価装置の配置の他の一例である。
【図１６】塩濃度を詳細に変化させた場合の正規化した蛍光強度の様子を示す図である。
【図１７】ある塩濃度での電位差印加後の蛍光強度の時間的変化を示す図である。
【図１８】本発明に係る被検体評価装置について、経時的にステップ状の電位差を印加した様子を示す図である。
【図１９】本発明に係る被検体評価装置について、塩濃度の影響を説明する図である。
【図２０】一連の蛍光強度の変化の一例を示す図である。
【図２１】交流電場として、微弱なＡＣバイアスを段階的に増加させたＤＣバイアスに乗せた場合の蛍光強度の変化等を示す図である。
【図２２】蛍光強度の変化率に対する媒体中の塩濃度の影響を示す図である。
【図２３】蛍光強度の変化率に対するナノワイヤーの電極への表面付着率の影響を示す図である。
【図２４】電極に２００ｍＶを基準に±２００ｍＶ（０ｍＶ〜４００ｍＶ）の矩形の交流電圧を印加し、蛍光強度が変動する様子を観察した図である。
【図２５】長時間交流電圧を印加し続けた時の測定結果を示す図である。
【図２６】蛍光強度の変化率に対する媒体中の塩濃度の影響を示す図である。
【図２７】蛍光強度の変化率に対するナノワイヤーの電極への表面付着率の影響を示す図である。
【図２８】交流電場として、微弱なＡＣバイアスを段階的に増加させたＤＣバイアスに乗せた場合の蛍光強度の変化等を示す図である。
【図２９】交流電場として、サイン波のＡＣバイアスを使用した場合の蛍光強度の変化率の周波数依存性を示す図である。
【図３０】相補鎖に導入したビオチンと特異的に結合するストレプトアビジンを少量水溶液中に添加した際の蛍光強度の変化率の変化を示す図である。
【図３１】交流電場として、サイン波のＡＣバイアスを使用した場合のハイブリダイズ前後の蛍光強度の変化率の周波数依存性を示す図である。
【図３２】交流電場として、サイン波のＡＣバイアスを使用した場合のハイブリダイズ前後の蛍光強度の変化率の規格化した周波数依存性（カットオフ周波数）の変化を示す図である。
【図３３】ビオチン−ストレプトアビジン混合物の有無による蛍光強度の変化率の規格化した周波数特性（カットオフ周波数）の変化を示す図である。
【符号の説明】
【０２１３】
１    本発明に係る被検体評価装置
２    基板
３    担体（電極）
４    蛍光標識部
５    感応部
６    評価対象結合部
７    被検体
８    対向電極
９    外部電場印加装置
１０  光照射装置
１１  光
１２  蛍光
１３  評価対象
１４  蛍光検出装置
１５  光照射面積
１６  蛍光検出面積
１７  担体の表面積
１８  光検出エリア
１９  ナノワイヤー
１５１  光ファイバー                                       
【図１】
2005283560.tif 000008
【図２−Ａ】
2005283560.tif 000009
【図２−Ｂ】
2005283560.tif 000010
【図３−Ａ】
2005283560.tif 000011
【図３−Ｂ】
2005283560.tif 000012
【図３−Ｃ】
2005283560.tif 000013
【図４】
2005283560.tif 000014
【図５】
2005283560.tif 000015
【図６】
2005283560.tif 000016
【図７】
2005283560.tif 000017
【図８】
2005283560.tif 000018
【図９】
2005283560.tif 000019
【図１０】
2005283560.tif 000020
【図１１】
2005283560.tif 000021
【図１２】
2005283560.tif 000022
【図１３】
2005283560.tif 000023
【図１４】
2005283560.tif 000024
【図１５】
2005283560.tif 000025
【図１６】
2005283560.tif 000026
【図１７】
2005283560.tif 000027
【図１８】
2005283560.tif 000028
【図１９】
2005283560.tif 000029
【図２０】
2005283560.tif 000030
【図２１】
2005283560.tif 000031
【図２２】
2005283560.tif 000032
【図２３】
2005283560.tif 000033
【図２４】
2005283560.tif 000034
【図２５】
2005283560.tif 000035
【図２６】
2005283560.tif 000036
【図２７】
2005283560.tif 000037
【図２８】
2005283560.tif 000038
【図２９】
2005283560.tif 000039
【図３０】
2005283560.tif 000040
【図３１】
2005283560.tif 000041
【図３２】
2005283560.tif 000042
【図３３】
2005283560.tif 000043