(57)【要約】【課題】  微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、様々な水質の検水に対しても有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができる方法を提供する。【解決手段】  微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、基質濃度を変えたときの前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値の変化を測定することにより基質濃度依存応答特性を求め、あるいは定常の運転状態から所定の基質濃度に変えた際の、前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値が予め定めた値を超えるまでの時間を測定することにより、前記所定の基質濃度における応答速度を求め、前記基質濃度依存応答特性あるいは前記応答速度に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、基質濃度を変えたときの前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値の変化を測定することにより基質濃度依存応答特性を求め、この基質濃度依存応答特性に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質のモニタリング方法。
【請求項２】
前記基質濃度依存応答特性が所定値を超えるときに、前記微生物センサの設定温度を該微生物の至適生育温度よりも高い温度に設定する請求項１記載の環境水中の有害物質のモニタリング方法。
【請求項３】
微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、定常運転状態から所定の基質濃度に変えた際の、前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値が予め定めた値を超えるまでの時間を測定することにより、前記所定の基質濃度における応答速度を求め、この応答速度に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質のモニタリング方法。
【請求項４】
前記応答速度が所定値を超えるときに、前記微生物センサの設定温度を該微生物の至適生育温度よりも高い温度に設定する請求項３記載の環境水中の有害物質のモニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、河川水や湖沼等の環境水、及び上下水道の各プロセスの水等を対象とした微生物センサを用いた水中の有害化学物質のモニタリング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは、試料水中の測定対象化学物質を認識する分子識別素子として、酵素や抗体等の生体機能性材料や微生物、細胞等の生体そのものを利用し、これらの生物材料を多孔性高分子膜に化学的に包括又は共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器等のトランスデューサと組み合せて前記生物材料の分子識別信号を電気信号に変換して試料水中の化学物質の測定を行うセンサである。
【０００３】
バイオセンサは、試料水を上記生体材料の固定化膜に接触させ、これによって生ずる生化学反応により生成又は消費される物質の濃度変化を検出器で電流や電圧等の電気的な出力（本発明において、センサ出力という）の変化に変換して測定する。
【０００４】
通常、微生物を使用したバイオセンサ（本発明においては、微生物センサという）応用水質計測器では、固定化膜内の微生物の酸素の消費状態を溶存酸素電極で測定することにより、検水中の有害物質を検知しているので、固定化膜内の微生物の数や活性（以下、これらを活性度という）をできるだけ長い期間安定に維持するために、微生物の至適温度条件、至適ｐＨ条件を維持し、生育に必要な微量栄養成分を含む緩衝液を用いて測定を行っている。
【０００５】
例えば、下記特許文献１には、ａ．亜硝酸生成細菌を固定した固定化微生物膜を保持しこの固定化微生物膜の各々の面に接する二つの液流路を設けたフローセルと、前記固定化微生物膜の一方の面にガス透過膜を介して接触させた溶存酸素電極とを組み合わせた微生物センサ，ｂ．前記固定化微生物膜の前記一方の面に前記亜硝酸生成細菌の基質となるアンモニア態窒素を所定の濃度で含む緩衝溶液を循環させる循環系統，ｃ．試料水と前記微生物センサ校正用の標準溶液と洗浄水とを切り替え、前記試料水と前記標準溶液との溶存酸素量を飽和させて前記固定化微生物膜の他方の面に送液する送液系統，ｄ．前記微生物センサの出力信号を演算処理し運転を制御する演算・制御回路を備えたことを特徴とする毒物検知装置が開示されている。
【０００６】
この毒物検知装置によれば、有害物質にきわめて弱い微生物である亜硝酸生成細菌を生きたまま固定化して高分子多孔膜で封じ込めた固定化微生物膜と検出器として溶存酸素電極とを組み合わせた微生物センサを構成し、これに亜硝酸生成細菌の基質となるアンモニア性窒素と鉄やマグネシウム等の微量成分を一定濃度含む緩衝溶液と試料水を所定の比率となるように混合して連続的に流すことにより、試料水中に亜硝酸精製細菌の呼吸を阻害するような有害物質が存在した場合、亜硝酸生成細菌の呼吸活性が阻害されて酸素電極出力が増加するので、このセンサ出力の変化から試料水中の有害物質の存在を検知することができる。
【０００７】
しかしながら、上記のような微生物センサ応用水質計測器を用いて、例えば、下排水等が混入し、栄養成分が豊富に含まれている河川水等に含まれる有害物質をモニタリングする場合、固定化微生物膜内の微生物の活性度が短期間で高くなるため、下記に述べるように、有害物質に対する微生物センサの検出感度が低下するという問題があった。
【０００８】
微生物センサの有害物質に対する検出感度の劣化のメカニズムを図７に基づいて説明する。図７には、上記のような微生物センサのシアン（有害物質）溶液への応答例が示されている。
【０００９】
図７において、（１）に示す曲線は、固定化微生物膜を溶存酸素電極に装着した当初、すなわち、固定化微生物膜内の微生物が至適活性度にある場合のセンサ出力の例である。（１）に示す曲線のように、固定化微生物膜内の微生物が至適活性度にある場合、通常、センサ出力はゼロ点校正（図７中I）で５ｍＶ程度、次のセンサ校正（図７中II）で０ｍＶ付近であり、その後に連続監視測定（図７中III）に移る。
【００１０】
このとき、センサ出力は０ｍＶに近い状態で推移する。そして、図７中、IVａ及びIVｂの時点で、人や生物に呼吸阻害作用を示す毒性物質であるシアン溶液を試料水中に混入すると、固定化微生物膜内の微生物の呼吸が阻害されるため、試料水中の溶存酸素の消費量が減り、シアン濃度（IVａでは０．０５ｍｇ／Ｌ、IVｂでは０．２ｍｇ／Ｌ）に応じてセンサ出力も増加する。この結果、有害物質が混入したこととその度合いが検出できる。
【００１１】
しかしながら、この微生物センサを用いて大都市の汚濁河川水を約１週間程度連続測定すると、微生物センサのセンサ出力は、図７の（２）の実線に示すようになり、連続監視測定IIIのセンサ出力は０ｍＶとなる。そして、有害物質の混入については、シアン溶液の濃度０．０５ｍｇ／Ｌ（IVａ）では検出できず、また濃度が高いIVｂの濃度０．２ｍｇ／Ｌでも感度が低下する。これは、固定化微生物膜内の微生物の活性度が高くなった結果、固定化微生物膜内では酸素不足状態になっているが、酸素不足状態でもセンサ出力は０ｍＶ以下にはならないため、見かけ上、センサ出力は０ｍＶとなっている状態である。したがって、例えば、センサ出力の負の値がとれるとすると、有害物質に対する応答は、図７の破線で示すような応答になると考えられる。
【００１２】
これを、有害物質濃度に対する微生物センサの酸素消費率、即ち、作用応答曲線で表現すると図８に示すようになる。ここで、微生物センサの検出可能濃度を、酸素消費率が２０分間で１０％低下するレベルとすると、固定化微生物膜装着当初（図７の（１）の曲線）はシアンに対する検出感度が０．０５ｍｇ／Ｌであったのが、汚濁河川水を約１週間程度連続測定した後（図７の（２）の曲線）は、０．２ｍｇ／Ｌに検出感度が劣化することになる。
【００１３】
上記のような微生物センサの有害物質に対する検出感度の低下を解決するために、下記特許文献２には、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用い、環境水（検水）中の有害物質を検出する方法において、微生物センサの電気的出力の値によって、微生物センサの設定温度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質の検出方法が開示されている。
【００１４】
この方法によれば、センサ出力値に、出力の減少側と増加側とに２つのしきい値を設定し、微生物センサが設置される恒温槽に、至適温度と高温側温度の２つの温度を設定し、センサ出力値がしきい値に達する毎に、恒温槽の温度を変える制御を行い、微生物の増殖あるいは活性を抑制することにより、有害物質に対する検出感度の保持を可能としている。
【特許文献１】特公平７−８５０７２号公報
【特許文献２】特開２００１−１６５８９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記特許文献２に開示された方法では、センサ出力から酸素律速の程度、すなわち固定化微生物内の微生物の活性度の増大の程度を正確に把握することは難しく、また、一律の温度制御方法では、固定化微生物内の微生物に対して温度負荷を与えすぎる場合があった。その結果、微生物が過剰なダメージを受けてしまい、センサ出力の急激な出力低下をきたし、温度を至適温度まで下げても回復に時間を要し、誤警報を発信する場合があることが分かった。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、様々な水質の検水に対しても有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、基質濃度を変えたときの前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値の変化を測定することにより基質濃度依存応答特性を求め、この基質濃度依存応答特性に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質のモニタリング方法を提供するものである。
【００１８】
上記発明においては、前記基質濃度依存応答特性が所定値を超えるときに、前記微生物センサの設定温度を該微生物の至適生育温度よりも高い温度に設定することが好ましい。
【００１９】
上記発明によれば、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、基質濃度を変えたときの前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値の変化を測定して基質濃度依存応答特性を求めることにより、固定化した微生物の活性度を正確に把握することができる。そして、この基質濃度依存応答特性に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度に応じてより的確に微生物センサの設定温度を変えることができ、微生物へ過剰なダメージを与えることなく微生物の活性度を制御することができる。その結果、様々な水質の検水に対しても有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができる。
【００２０】
また、本発明のもう一つは、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、定常運転状態から所定の基質濃度に変えた際の、前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値が予め定めた値を超えるまでの時間を測定することにより、前記所定の基質濃度における応答速度を求め、この応答速度に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御することを特徴とする環境水中の有害物質のモニタリング方法を提供するものである。
【００２１】
上記発明においては、前記応答速度が所定値を超えるときに、前記微生物センサの設定温度を該微生物の至適生育温度よりも高い温度に設定することが好ましい。
【００２２】
上記発明によれば、微生物を固定化した膜と溶存酸素電極とから構成される微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、定常運転状態から所定の基質濃度に変えた際の、前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値が予め定めた値を超えるまでの時間を測定し、前記所定の基質濃度における応答速度を求めることにより、固定化した微生物の活性度をより簡便に把握することができる。そして、この応答速度に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度に応じてより的確に微生物センサの設定温度を変えることができ、微生物へ過剰なダメージを与えることなく微生物の活性度を制御することができる。その結果、様々な水質の検水に対しても有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、微生物センサの基質濃度依存応答特性、あるいは所定の基質濃度における応答速度を求めることにより、微生物センサに使用されている微生物の活性度を正確に把握することができる。そして、この活性度に応じて微生物センサの設定温度を段階的にコントロールすることにより、微生物に対して過大な温度負荷をかけることなく微生物の活性度を制御することができる。その結果、過大な温度負荷によって微生物へダメージを与えることによるセンサ出力の急激な低下を防ぎつつ、微生物センサに使用している微生物の活性度の増大による有害化学物質に対する検出感度の低下を抑制することができる。したがって、様々な水質の検水に対しても有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明において、微生物を固定化した膜（以下、固定化微生物膜という）と溶存酸素電極とから構成される微生物センサとしては、例えば、図１に示すような構成のものを用いることができる。
【００２５】
図１に示すように、微生物センサ１は、流路２０ａを有するフローセル２０と、固定化微生物膜２５と、検水中の溶存酸素量を測定する溶存酸素電極２１とから構成されている。前記固定化微生物膜２５は、前流路２０ａ内を流れる検水と接触できるように前記フローセル２０内に設置されたステンレス製金網２６の上に載置されており、前記溶存酸素電極２１は、前記固定化微生物膜２５の上に密着するように取付けられている。電極液で満たされた前記溶存酸素電極２１内には負極２３が設置されており、正極２２は固定化微生物膜２５の一方の面に隔膜２４を介して接触するように設置されている。また、前記隔膜２４は、溶存酸素電極２１本体にＯリング２７ｃ及びワッシャー２９により固定されている。
【００２６】
本発明において、固定化微生物膜に使用される微生物としては、硝化細菌が好ましく、特にアンモニア酸化細菌が好ましい。アンモニア酸化細菌としては、ニトロソモナス ユーロピア（Nitrosomonas europaea ATCC25978）が例示できる。
【００２７】
固定化微生物膜は、公知の方法にしたがって作製することができ、例えば、硝化細菌をアルギン酸ナトリウム水溶液に懸濁し、この懸濁液を多孔質のセルロース膜上に滴下してからもう１枚のセルロース膜で挟み、塩化カルシウム水溶液でアルギン酸ナトリウムをゲル化させて菌体を固定化することにより作製できる。
【００２８】
本発明の方法の一つは、上記のような構成からなる微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に適用されるものであり、固定化微生物膜内の微生物の餌（以下、基質という）を含む溶液（以下、センサ校正用溶液という）を用い、該基質濃度を変えたときの前記微生物センサのセンサ出力の変化を測定することにより基質濃度依存応答特性を求め、該基質濃度依存応答特性から固定化微生物膜内の微生物の活性の高さを把握し、微生物センサの設定温度を変えて微生物の活性度を制御するものである。
【００２９】
前記基質濃度依存応答特性は、少なくとも２種類以上の異なる基質濃度のセンサ校正用溶液を用いて微生物センサのセンサ出力差をそれぞれ測定して、各基質濃度に対するセンサ出力差をプロットする（横軸：基質濃度、縦軸：センサ出力差）ことにより得られる直線の傾きとして求めることができる。
【００３０】
実施例１に示すように、前記直線の傾きは、固定化微生物膜内の微生物の活性度と相関があり、固定化微生物膜内の微生物の活性度が高い場合は、前記直線の傾きが大きくなり、活性度が低い場合は傾きが小さくなるので、前記直線の傾きが所定値を超える場合、すなわち活性度が高過ぎる場合は、活性度を低減させるために微生物センサの設定温度を微生物の生育阻害温度に調整し、前記直線の傾きが所定値内の場合、すなわち活性度が至適である場合は、設定温度を生育至適温度に調整する。
【００３１】
図６に、微生物の相対活性の温度特性の測定例を示すが、この例においては、生育至適温度は３０℃付近であり、この生育至適温度の低温側及び高温側が生育阻害温度になる。しかし、本発明においては、生育至適温度より低温側では微生物の生育を十分に阻害することができず、最終的に固定化微生物膜内の微生物の活性度を低減させることができないので、生育阻害温度としては生育至適温度より高温側を採用することが好ましい。
【００３２】
例えば、アンモニア酸化細菌を使用した固定化微生物膜を用いた微生物センサの場合は、基質としてアンモニア性窒素が用いられ、少なくとも２種類以上の異なる基質濃度（通常、アンモニア性窒素濃度が０〜１０ｍｇ／Ｌの少なくとも１種類以上と、１０ｍｇ／Ｌ以上の少なくとも１種類以上）のセンサ校正用溶液を用いて、各センサ校正用溶液におけるセンサ出力差を測定し、各基質濃度に対するセンサ出力差をプロットして得られる直線の傾き（基質濃度依存応答特性）を求める。
【００３３】
そして、前記直線の傾きが大きい場合（固定化微生物膜内の微生物の活性度が高い場合）、具体的には前記直線の傾きが６以上の場合は、微生物センサの設定温度をアンモニア酸化細菌の生育阻害温度である３５〜４５℃、好ましくは、生育至適温度（２８〜３０℃）から＋５〜１０℃の範囲内に調整する。なお、温度調整は、例えば、前記直線の傾きが６〜６．５の場合は３７℃、６．５を超える場合は４０℃に調整するというように、前記直線の傾きに応じて段階的行うことが好ましい。また、前記直線の傾きが小さい場合（固定化微生物膜内の微生物の活性度が至適である場合）、具体的には前記直線の傾きが６未満の場合は、微生物センサの設定温度をアンモニア酸化細菌の生育至適温度である２８〜３０℃に調整すればよい。
【００３４】
この方法によれば、固定化微生物膜内の微生物の活性度を正確に把握することができ、この活性度に応じて細かな温度調整ができるので、微生物に対して過大な温度負荷をかけることなく微生物の活性度を制御することができる。
【００３５】
また、本発明のもう一つの方法は、上記のような構成からなる微生物センサを用いて環境水中の有害物質を検出する際に、定常運転状態から所定の基質濃度に変えた際の、前記微生物センサの出力電流値又は出力電圧値が予め定めた値を超えるまでの時間を測定することにより、前記所定の基質濃度における応答速度を求め、この応答速度に応じて該微生物センサの設定温度を変えることにより、微生物の活性度を制御するものである。
【００３６】
この方法では、基質濃度とセンサ出力の関係が直線関係にある所定の基質濃度の一つのセンサ校正用溶液を用いて、このセンサ校正用溶液に対するセンサ出力が予め定めた値を超えるまでの時間（応答速度）を測定し、この応答速度が所定値を超える場合、すなわち固定化微生物膜内の微生物の活性度が高い場合は、活性度を低減させるために微生物センサの設定温度を上記度同様に微生物の生育阻害温度に調整し、前記応答速度が所定値内の場合、すなわち活性度が至適である場合は、設定温度を生育至適温度に調整する。
【００３７】
例えば、アンモニア酸化細菌を使用した固定化微生物膜を用いた微生物センサの場合は、基質としてアンモニア性窒素が用いられ、アンモニア性窒素濃度とセンサ出力が直線関係にある濃度範囲のセンサ校正用溶液（通常アンモニア性窒素濃度１〜５ｍｇ／Ｌ）を一つ用意し、定常の運転状態からこのセンサ校正用溶液を流し始めた際に、センサ出力が予め定めた値（例えば、９０％応答出力相当の値）を超える時間（応答速度）を測定する。そして、前記センサ校正用溶液に対する応答速度が速い場合（固定化微生物膜内の微生物の活性度が高い場合）、具体的には応答速度が１５分以内の場合は、微生物センサの設定温度をアンモニア酸化細菌の生育阻害温度である３５〜４５℃、好ましくは、生育至適温度（２８〜３０℃）から＋５〜１０℃の範囲内に調整する。なお、温度調整は、前記直線の傾きに応じて段階的に調整することが好ましい。また、速度が遅い場合（固定化微生物膜内の微生物の活性度が至適である場合）、具体的には応答速度が１５分以上の場合は、微生物センサの設定温度をアンモニア酸化細菌の生育至適温度である２８〜３０℃に調整すればよい。なお、定常の運転状態における基質濃度は、例えばアンモニア性窒素濃度１０ｍｇ／Ｌに設定されている。
【００３８】
この方法では、１種類のセンサ校正用溶液で固定化微生物膜内の微生物の活性度を測定することができるので、先に説明した方法に比べてより簡便に活性度を把握することができる。
【００３９】
本発明の方法における固定化微生物膜内の微生物の活性度の測定は、モニタリング期間中、少なくとも１日１回以上（通常１日１回程度）行い、その活性度の状態に応じて適宜微生物センサの設定温度を調整することが好ましい。
【００４０】
図２には、本発明の方法を実施するための微生物センサ応用水質計測器の一例を示すフロー図が示されており、以下、図２に基づいて本発明の方法を説明する。
【００４１】
この微生物センサ応用水質計測器は、所定の温度（通常、微生物センサの微生物の生育至適温度）に調整された恒温槽２の中に、図１に示すように設置された微生物センサ１を有する測定部５、センサ出力の表示部６、制御部７、記録計８、及び検水やセンサ校正用溶液を送液するための送液部１４とからなり、更に、エアポンプ１２及び圧力センサ１３を備え、検水にエアレーションを行うことができるようになっている。
【００４２】
送液ポンプ１１ａにより送液された検水は、エアレーションされた後、熱交換器３により所定の温度に調整されてから微生物センサ１と接触し、排水されるようになっている。
【００４３】
そして、微生物センサの固定化微生物膜内の微生物の活性度を測定する際には、以下のように操作を行う。
【００４４】
まず最初に、固定化微生物膜内の微生物は基質を与えないと活動できず、溶存酸素が消費されないという点を利用して、電磁弁９ａを閉じて検水の送液を止めてから、電磁弁９ｂと電磁弁９ｄを開けて、有害物質及び基質を含まない緩衝溶液Ａと純水とを、それぞれポンプ１１ｂ及びポンプ１１ａにより送液し、微生物センサ１の安定化したセンサ出力を装置に記憶してゼロ点校正を行う。この場合のセンサ出力は水中の溶存酸素濃度に対応した値である。
【００４５】
次に、固定化微生物膜内の微生物に有害物質を含まない既知の濃度の基質を与えて、微生物が正常に活動した場合の溶存酸素濃度の測定を行う。本発明においては、基質濃度の異なる少なくとも２種類以上のセンサ校正用溶液を流し、各基質濃度におけるセンサ出力を装置に記憶する。具体的には、電磁弁９ｄを閉し、電磁弁９ｅを開けて、所定の濃度の基質を含むセンサ校正用溶液（緩衝液Ｂ）と純水とを送液し、微生物センサ１の出力安定化後のセンサ出力を装置に記憶する。
【００４６】
更にその後、電磁弁９ｅを閉じ、電磁弁９ｆを開けて、前記センサ校正用溶液（緩衝液Ｂ）とは異なる基質濃度のセンサ校正用溶液（緩衝液Ｃ）と純水とを送液し、微生物センサ１の出力安定化後のセンサ出力を装置に記憶する。これらの場合のセンサ出力は、微生物センサの微生物の活動によって消費され、残った溶存酸素濃度に対応した値である。なお、前記緩衝溶液Ａ〜Ｃとしては、微生物センサの微生物が安定して機能するｐＨ付近に緩衝能を有する緩衝液が用いられ、例えば、アンモニア酸化細菌を使用した微生物センサの場合は、ｐＨ８〜９付近に緩衝能を有するリン酸緩衝溶液等を用いることができる。
【００４７】
そして、前記各測定結果から、各基質濃度におけるセンサ出力差をプロットして得られる直線の傾き（基質濃度依存応答特性）を求め、上記の基準により、微生物センサの微生物の活性度を判断してその活性度に応じて恒温槽２の温度を調整する。なお、通常の状態では、恒温槽２は、微生物センサの微生物の生育至適温度に調整されており、活性度が高過ぎる場合には、前記生育至適温度よりも高い温度（好ましくは＋５〜１０℃の範囲内）に段階的に調整すればよい。これにより、微生物センサの微生物に過大な温度負荷を与えることなく、その活性度を好ましい状態に維持することができる。
【００４８】
なお、上記の方法においては、基質濃度の異なるセンサ校正用溶液を少なくとも２種類以上（前記緩衝液Ｂ又は緩衝液Ｃ）用いて固定化微生物膜内の微生物の活性度の測定を行っているが、基質濃度とセンサ出力の関係が直線関係にある所定の基質濃度のセンサ校正用溶液を一つ用い、このセンサ校正用溶液に対する応答速度を測定することにより行うこともできる。
【００４９】
そして、恒温槽２の温度調整を行った後、電磁弁９ｆ及び電磁弁９ｂを閉じ、電磁弁９ａを開けて検水を送液し、モニタリングを開始すればよい。
【実施例１】
【００５０】
図２に示す構成の微生物センサ応用水質計測器を用いて以下の実験を行った。なお、微生物センサ１の固定化微生物膜には、ニトロソモナス ユーロピア（Nitrosomonas europaea ATCC25978）を固定化した固定化微生物膜を用いた。
【００５１】
図２において、電磁弁９ｄ及び電磁弁９ｂを開け、最初にゼロ点校正（第１の校正）のため、アンモニア性窒素を含まないリン酸緩衝溶液（ｐＨ８〜９）（緩衝溶液Ａ）と純水とを流し、微生物センサ１の安定化した電流値を記憶した。
【００５２】
次に、電磁弁９ｄを閉じ、電磁弁９ｅを開けて、アンモニア性窒素を０〜１０ｍｇ／Ｌ含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ８〜９）（緩衝溶液Ｂ）と純水とを流し、センサ出力安定化後の電流値を記憶した。
【００５３】
更に、電磁弁９ｅを閉じ、電磁弁９ｆを開けて、アンモニア性窒素を１０ｍｇ／Ｌ以上濃度含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ８〜９）（緩衝溶液Ｃ）と純水とを流し、センサ出力安定化後の電圧値を記憶した。
【００５４】
なお、上記のような測定を、微生物の活性度の異なる固定化微生物膜Ａ〜Ｄ（活性度の高さ：Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ）について行い、固定化微生物膜Ａ〜Ｄの各基質濃度におけるセンサ出力差を測定し、各アンモニア濃度におけるセンサ出力差をプロットした。その結果を図３に示す。図３から、アンモニア濃度とセンサ出力との関係は、あるアンモニア濃度の範囲で直線関係が認められることが分かる。
【００５５】
また、各固定化微生物膜の基質濃度依存応答性（図３における直線の傾き）と有害物質に対する感度（阻害（％））の関係を図４に示す。
【００５６】
なお、図４における阻害（％）とは、有害物質としてシアンを０．０５ｍｇ／Ｌ（ＫＣＮのＣＮ―として）添加した水を検水として流し、下記（１）式によって計算した呼吸阻害率を意味する。
呼吸阻害率（％）＝｛（ＶＭ−Ｖ２）／（Ｖ１−Ｖ２）｝×１００…（１）
Ｖ１：ゼロ校正のセンサ出力
Ｖ２：フィード液のセンサ出力
ＶＭ：検水のセンサ出力
なお、フィード液としては、Ｖ１測定用としては緩衝液、Ｖ２測定用としては緩衝液にアンモニア性窒素が５〜１０ｍｇ／Ｌとなるように添加した液、更に、ＶＭ測定用としては、アンモニア性窒素１〜５ｍｇ／Ｌとなるように添加したものを用いた。
【００５７】
図４から、前記直線の傾き（固定化微生物膜内の微生物の活性度）が大きいほど、有害物質による阻害（％）の値が小さくなっており、結果的に微生物センサの感度が低くなっていることが分かる。なお、図４において、呼吸阻害率（％）が１０％以上であれば、検出可能レベルであると判断される。
【実施例２】
【００５８】
実施例１と同様の微生物センサ応用水質計測器（恒温槽２の温度は、最初３０℃に調整）を用いて、大都市の汚濁河川水に有害物質としてシアンを添加した試料水を用いて、シアンに対する検出感度（呼吸阻害率（％））の経時変化を約１ヶ月間測定した。なお、呼吸阻害率（％）は、実施例１の前記（１）式により計算した。
【００５９】
具体的には、河川水に有害物質としてシアンを０．０５ｍｇ／Ｌ、又は０．２ｍｇ／Ｌ添加した水を検水として流し、１日１回、実施例１と同様の方法で微生物センサの基質濃度依存特性を測定して、固定化微生物膜内の微生物の活性度を把握し、前記直線の傾きが６未満の場合は、恒温槽２の設定温度を３０℃のまま、６〜６．５の場合は、３７℃、６．５を超える場合は４０℃に段階的に変え、微生物の活性度の制御を行いながら、モニタリングを行った。その結果を図５に示す。図５から、大都市の栄養豊富な河川水を検水としてもシアン０．０５ｍｇ／Ｌに対する感度を１ヶ月以上保持することができていることが分かる。なお、呼吸阻害率（％）が１０％以上であれば、検出可能レベルとあると判断される。
【００６０】
したがって、本発明の方法によれば、過大な温度負荷によって微生物センサの微生物へダメージを与えることによるセンサ出力の急激な低下を防ぎつつ、有害物質に対する検出感度を低下させることなく、長期にわたって安定して有害物質をモニタリングすることができることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の方法は、検水の水質によらず微生物センサの有害物質に対する検出感度を高感度に維持することができるので、例えば、微生物センサに使用している微生物の活性度が増大して、短期間で有害化学物質に対する検出感度の低下が起こりやすい大都市の汚濁河川水等の栄養成分が豊富な水を対象とした有害物質のモニタリングに好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】微生物センサの構成の一例を示す模式図である。
【図２】微生物センサ応用水質計測器の構成の一例を示すフロー図である。
【図３】微生物センサの基質（アンモニア）濃度依存性を説明する図である。
【図４】濃度依存特性（直線近似）の傾きの値（活性度）と有害物質に対する感度の関係を説明する図である。
【図５】本発明の実施例２の結果を示す図である。
【図６】微生物の増殖温度特性を説明する図である。
【図７】有害物質に対する検出感度の低下を示す図である。
【図８】図７における有害物質濃度に対する微生物センサの酸素消費率の関係を示す図である。
【符号の説明】
【００６３】
１．微生物センサ
２．恒温槽
３．熱交換器
４．二方切換三方弁
５．測定部
６．表示部
７．制御部
８．記録計
９ａ〜９ｈ．電磁弁
１０．ローラークランプ
１１ａ〜１１ｂ．ポンプ
１２．エアポンプ
１３．圧力センサ
２０．フローセル
２０ａ．試料流路
２１．溶存酸素電極
２２．正極
２３．負極
２４．隔膜
２５．固定化微生物膜
２６．ステンレス製金網
２７ａ〜２７ｃ．Ｏリング
２８ａ〜２８ｂ．リード線
２９．ワッシャー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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