(57)【要約】【課題】未精製あるいは低純度の生体試料に対して使用可能なプライマーまたはプローブとして有用なキメラオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の増幅及び／又は検出方法を提供すること。【解決手段】抽出操作及び／又は精製操作をしない、あるいはこの操作が不十分である場合の生体試料中の標的核酸を増幅する方法、該標的核酸の検出方法ならびに未精製あるいは低純度の生体試料に対して使用可能なプライマーまたはプローブとして有用なキメラオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の増幅及び／又は検出方法のためのキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び／又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする生体試料中の標的核酸の増幅及び／又は検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患等の遺伝子診断、病原菌あるいはウイルスの検出等の医学分野において有用な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸を増幅、あるいは検出する技術は、遺伝子工学、分子生物学における実験手法としてのみならず、疾病の診断、微生物の検出等、医学、薬学、農林畜産分野においても必要不可欠な技術となっている。
【０００３】
核酸の増幅、検出技術には、その原理を異にする種々の方法が知られているが、これらのいくつかはリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドをプライマーもしくはプローブとして使用するものである。前記方法としては、キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する方法としてバイオメリュー社の方法（例えば、特許文献１参照）やＩＣＡＮ法（例えば、特許文献２〜３参照）が例示される。また、キメラオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する方法としては、サイクリングプローブ反応（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（例えば、特許文献４〜５参照）が例示される。
【０００４】
上記のキメラオリゴヌクレオチドを使用する核酸増幅、検出方法の多くは、増幅、検出反応中にリボヌクレオチド部分が特異的に切断される工程を含んでいる。キメラオリゴヌクレオチドに含有されるリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドに比べて酵素的、化学的に切断を受けやすいことが知られており、前記方法を実施するにあたってはキメラオリゴヌクレオチドの安定性に留意する必要がある。
【０００５】
一方、核酸の増幅、検出に使用される試料中には、核酸の他に種々の生体由来の成分が含まれている場合がある。当該試料より核酸を抽出もしくは精製して反応に用いる場合には前記成分の影響を考慮する必要はないが、試料から核酸を抽出及び／又は精製しない、あるいはこの操作が不十分である場合には反応液中に混在する前記成分が反応の結果に影響を与えることがある。精製されていない試料には核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等）が混在している可能性があり、特にキメラオリゴヌクレオチドを使用する核酸の増幅、検出方法においてはプライマーの分解に起因する偽陰性、プローブの分解に起因する偽陽性の発生が懸念されている。
【０００６】
生体試料中に含まれるもので上記キメラオリゴヌクレオチドに影響を与えるものとしては、特に限定はされないが例えばＤＮａｓｅＩが例示される。当該ＤＮａｓｅＩは、一本鎖ＤＮＡあるいは二本鎖ＤＮＡに作用してオリゴヌクレオチド鎖を生成することが知られている（例えば、非特許文献１）。また、ＲＮａｓｅとしては、特に限定はされないが例えば、ＲＮａｓｅＡが例示される。当該ＲＮａｓｅＡは、ピリミジン特異的ＲＮａｓｅであることが知られている（例えば、非特許文献２）。
しかしながら、上記ＤＮａｓｅＩならびにＲＮａｓｅＡに対して分解されず、その一方で当該キメラオリゴヌクレオチドがＤＮＡ鎖とハイブリッドを形成した時にＲＮａｓｅＨで分解されるようなキメラオリゴヌクレオチドについては知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第５８２４５１７号
【０００８】
【特許文献２】
国際公開第００／５６８７７号パンフレット
【０００９】
【特許文献３】
国際公開第０２／０７１３９号パンフレット
【００１０】
【特許文献４】
米国特許第４８７６１８７号
【００１１】
【特許文献５】
米国特許第５０１１７６９号
【００１２】
【非特許文献１】
日本生化学会編  新生化学実験講座  第２巻、核酸ＩＩＩ、第２３〜２５頁、１９９２年
【００１３】
【非特許文献２】
日本生化学会編  生化学実験講座  第２巻、核酸の化学ＩＩ、第８８〜９７頁、１９７６年
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子検査を実施している現場においては、検査担当者の安全かつ処理時間の短縮等が要望されており、操作が簡便な核酸の増幅、検出系を構築することが求められている。その際には、生体試料を前処理しない、もしくは簡素な前処理にとどめることが好ましい。
本発明の目的は、上記課題を解決するため、未精製あるいは低純度の生体試料に対して使用可能なプライマーまたはプローブとして有用なキメラオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを用いた標的核酸の増幅及び／又は検出方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抽出操作及び／又は精製操作をしない、あるいはこの操作が不十分である場合の生体試料中の標的核酸を増幅する技術と、増幅された標的核酸の検出方法を構築し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明を概説すれば本発明の第１の発明は、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び／又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする生体試料中の標的核酸の増幅及び／又は検出方法に関する。
【００１７】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法のためのキットであって、、少なくとも１つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とするキットに関する。
本発明の第１及び２の発明において当該キメラオリゴヌクレオチドは、複数個のプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有していても良い。また、リボヌクレオチド領域は複数であってもよく、該領域は連続的あるいは不連続的に存在していてもよい。さらに、該キメラオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識物質を有していても良い。該標識物質は、複数個であってもよい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本明細書において生体試料とは、特に限定はなく、核酸、もしくは生物を含む可能性のあるあらゆる試料、例えば、細胞、組織（生検試料等）、全血、血清、脳脊髄液、精液、唾液、喀痰、尿、糞便、毛髪、細胞培養物等を使用することができる。上記の検体は、特に限定するものではないが、好ましくは適切な処理によって、例えばＤＮＡポリメラーゼの反応を実施が可能な形態としたうえ、本発明の方法に供することができる。このような処理には細胞の溶解や試料からの核酸の抽出、精製が包含される。
【００１９】
本明細書においてデオキシリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
【００２０】
本明細書においてリボヌクレオチドとは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
【００２１】
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドのことを言う。該オリゴヌクレオチドはヌクレオチドアナログおよび／または修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。
【００２２】
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、キメラオリゴヌクレオチドにおいてそのリボヌクレオチド部分より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてそのリボヌクレオチド部分より５’末端にかけての部分を指す。
【００２３】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の標的核酸の増幅及び／又は検出方法及び該方法に用いるキメラオリゴヌクレオチド
本発明の標的核酸の増幅及び／又は検出方法は、少なくとも１以上のリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを用いる、生体試料中の標的核酸の増幅及び／又は検出方法であって、当該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有することを特徴とする。
【００２４】
本発明の態様の一つとしては、標的核酸の増幅方法において、上記キメラオリゴヌクレオチドは標的核酸増幅用プライマーとして機能し得る。また、本発明の別態様としては、標的核酸の検出方法において、上記キメラオリゴヌクレオチドは標的核酸検出用プローブとして機能し得る。さらに、特に限定はないが例えば、リアルタイム検出の場合のような標的核酸の増幅及び検出方法を組み合わせた場合、上記キメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸増幅及び／又は検出のためのプライマー及び／又はプローブとして機能し得る。
【００２５】
本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブとして使用することができる。特に限定はされないが、プライマーとして使用する場合には、当該オリゴヌクレオチドの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに好ましくは、当該リボヌクレオチドがプリン塩基を有するリボヌクレオチドになるように設計することが好ましい。
【００２６】
また本発明で使用するキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合には、当該オリゴヌクレオチドの５’末端あるいは３’末端以外の部位にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに好ましくは、該オリゴヌクレオチドの中央部周辺にリボヌクレオチドを配置することが好ましい。さらに、当該リボヌクレオチドがプリン塩基を有するリボヌクレオチドになるように設計することが好ましい。また、本発明で用いるキメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸との特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１５ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。
【００２７】
本発明の方法に用いる生体試料には、上記キメラオリゴヌクレオチドを不安定化あるいは分解するような夾雑物質、特に限定はされないがＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅが混在していることがある。さらに上記生体試料には、標的核酸の増幅を阻害するような夾雑物質が含まれていることがある。本発明の方法においては、このような夾雑物質の影響を受けることなく、標的核酸を増幅及び／又は検出することができる。
【００２８】
すなわち、本発明で使用されるキメラオリゴヌクレオチドとしては、キメラオリゴヌクレオチドを不安定化あるいは分解するような生体試料中の夾雑物質、特に限定はされないがＤＮａｓｅＩ及び／又はＲＮａｓｅＡの影響を受けないものが好適に使用できる。また、本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、使用される増幅法及び／又は検出法の特徴に応じて、特定のエンドヌクレアーゼ、特に限定はされないがＲＮａｓｅＨ等によってキメラオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチド部分が選択的に切断されるものが好適に使用できる。
【００２９】
本発明の方法において使用するキメラオリゴヌクレオチドは、１個あるいは複数個のプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有していても良い。特に限定はされないが、例えば、１個あるいは複数個のアデニンヌクレオチド及び／又はグアニンヌクレオチドを含有するものが好適に使用できる。好適にはキメラオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドの半数以上、特に好適にはリボヌクレオチドのすべてがプリン塩基を有するリボヌクレオチドである。すなわち、好適にはリボヌクレオチドがピリミジン塩基を有するリボヌクレオチドを含有しないものが例示される。また、上記１個あるいは複数個のリボヌクレオチドで構成されたリボヌクレオチド領域は、１箇所あるいは複数箇所であってもよい。該領域は、不連続的に存在していてもよい。さらに、本発明の方法で該キメラオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識物質を有していても良い。該標識物質は、複数個であってもよい。
【００３０】
本発明に利用できる標的核酸の増幅方法としては、鋳型核酸に相補的な配列を有するプライマーが使用される種々の方法が使用できる。例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号）、鎖置換型増幅法（ＳＤＡ；Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、特公平７−１１４７１８号）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ、国際公開第００／５６８７７号或いは国際公開第０２／０７１３９号パンフレット）等の核酸増幅方法を使用することができる。これらの方法を前記キメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして実施することができ、あるいはこれらの方法で増幅された核酸を本発明の方法で検出することができる。
【００３１】
本発明の一つの態様としてキメラオリゴヌクレオチドをプライマーに用いる核酸増幅方法が挙げられる。例えば、上記のキメラオリゴヌクレオチド（プライマー）は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、前記プライマーからのプライマー伸長物におけるプライマー部分に存在するリボヌクレオチドを切断しうるヌクレアーゼと組み合わせることにより、等温条件下に鋳型となる核酸を増幅することが可能である。この核酸増幅方法はＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法と称されており、その詳細は国際公開第００／５６８７７号パンフレット、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに開示されている。プライマーの設計や反応条件の設定はこれらのパンフレットの開示をもとに、目的に応じて適宜決定すればよい。上記方法において２種のキメラオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した場合には、これらのプライマーにはさまれた領域が特異的に増幅される。
【００３２】
本発明の標的核酸の増幅方法に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定するものではないが、鎖置換活性を有するものが好適に使用できる。また、ヌクレアーゼにも特に限定はないが、キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分を切断する観点からはリボヌクレアーゼＨが本発明に好適である。
【００３３】
また、本発明の別の態様は、標的核酸にハイブリダイズすることができるキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる標的核酸の検出方法を提供する。
ここで標的核酸は、増幅されたものであってもよいし、増幅されていないもののいずれであっても良い。特に好適な本発明の一態様において、標的核酸とハイブリダイズしたキメラオリゴヌクレオチドは、反応液中に添加されたエンドヌクレアーゼ、特に限定はされないがＲＮａｓｅＨにより切断される。切断されたキメラオリゴヌクレオチドが標的核酸とはもはやハイブリダイズできないように反応条件、当該オリゴヌクレオチドの鎖長を設定することにより、切断されたキメラオリゴヌクレオチドの断片は標的核酸から遊離し、次いで新たなキメラオリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズして同様に切断される。このような工程が繰り返され、反応物中には切断された断片が蓄積してゆく。
以上のように、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドは、試料に由来する夾雑物質による不安定化あるいは分解は抑制されているが、標的核酸の増幅及び／又は検出反応において各方法の原理に従って切断されることができる。
【００３４】
前記の態様において、本発明のキメラオリゴヌクレオチドを切断するヌクレアーゼには特に限定はないが、例えば、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットに記載の方法で調製されたリボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。当該リボヌクレアーゼＨとしては、例えばバチルス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、アルカエオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、メタノコッカス・ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｈｉ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のリボヌクレアーゼＨ等を使用することができる。
【００３５】
また、本発明の標的核酸の増幅ならびに検出方法における反応の条件にも特に限定はなく、使用されるＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼが所望の活性を保持する条件を適宜選択すればよい。インキュベーションの温度も使用される酵素やプライマー、プローブの鎖長などを考慮して決定すればよい。特に、耐熱性の酵素を使用し、高温（例えば５０℃〜６５℃）で反応を行う態様が好適である。上記反応温度は、プローブとして使用するキメラオリゴヌクレオチドのＴｍ値等によって調整することができる。特に限定はされないが、例えば、７０℃以下、好ましくは６５℃以下である。
【００３６】
本発明の方法において標的核酸を検出する手段には特に限定はなく、公知の核酸分析手法を利用することができる。例えば、電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー法により、プローブの鎖長の変化から切断を検出することができる。
【００３７】
特に好適な態様としては、例えばキメラオリゴヌクレオチドを蛍光物質と該蛍光物質の発する蛍光を消光する作用を有する物質（クエンチング物質）の両者で、適当な間隔をとって標識したものが包含される。このようなキメラオリゴヌクレオチドはインタクトな状態ではほとんど蛍光を発することはないが、切断されて蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合には蛍光を発するようになる。このようなキメラオリゴヌクレオチドを使用することにより、反応中の反応液を直接観察することによって標的核酸の有無を知ることができる。特に限定はされないが、上記蛍光物質とクエンチング物質の組み合わせとしては、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対あるいは非蛍光共鳴エネルギー転移（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ）対のいずれもが好適に使用できる。また、上記の態様においてはスマート  サイクラー（タカラバイオ社製）のような反応チューブ中の増幅された核酸をチューブを閉じたままで検出できる装置を用いることによりリアルタイムで検出・定量することができる。
【００３８】
本発明の方法に使用される標的核酸としては一本鎖、二本鎖の核酸、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡを使用することができる。使用するヌクレアーゼによってはＲＮＡを標的核酸とすることが困難な場合もあるが、その場合には当該ＲＮＡを鋳型として調製したｃＤＮＡを標的核酸として使用することにより、ＲＮＡ上の塩基置換を検出することが可能である。
【００３９】
（２）本発明の標的核酸の増幅及び／又は検出方法に使用されるキット
本発明は、上記（１）に記載の方法のためのキットを提供する。すなわち該キットは本発明の標的核酸の増幅及び／又は検出方法のための形態を有し、上記（１）記載のキメラオリゴヌクレオチドを含有することを特徴とする。該キメラオリゴヌクレオチドは、プライマー及び／又はプローブとして機能し得る。
すなわち、標的核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくとも１つのプリン塩基を有するリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドを少なくとも１種類、含有するキットが例示される。
【００４０】
上記キメラオリゴヌクレオチドは検出のための標識を付されていてもよい。
さらに上記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの基質であるｄＮＴＰｓや反応液の調製等に使用されるその他の成分を含有していてもよい。
【００４１】
上記のように、本発明の標的核酸の増幅及び／又は検出方法は、生体試料中に存在する夾雑物質の存在の有無にかかわらず、標的核酸を効率よく特異的に増幅及び／又は検出することができる。また、本発明の方法を用いることにより、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、実際の現場で従事している者のバイオハザードに対する危険を回避することができる。また、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、結果を得るための所要時間を大幅に短縮することができる。また、生体試料の前処理が簡略化あるいは省略できるため、フェノールあるいはクロロフォルムのような有毒物質を使用、廃棄する必要がなくなり、作業環境・自然環境に及ぼす影響を小さくすることができる。さらに、本発明により生体試料から標的核酸の検出までを自動化することが容易になり、小型でハイスループットな自動化装置を作製することができる。
【００４２】
【実施例】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００４３】
参考例１
実施例における耐熱性ＲＮａｓｅＨのｕｎｉｔ数は、以下の方法により算出した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム  ファルマシア  バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに任意に希釈した酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２×（１１０／１００）×希釈率
【００４４】
実施例１
本発明の方法で用いるキメラオリゴヌクレオチドを構築するための塩基配列のデザインについて検討した。
（１）ＲＮａｓｅの分解に耐性を有するキメラオリゴヌクレオチドの検討
まず、配列表の配列番号１〜１０に記載の塩基配列を有する１０種類のキメラオリゴヌクレオチドのＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｃ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ８Ｃ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、並びにＩＡＰＰオリゴ９Ｇを合成した。当該オリゴヌクレオチドの構造について表１に示す。
【００４５】
【表１】
2005006587.tif 000002
【００４６】
また、上記キメラオリゴヌクレオチドは、５’末端にＦＡＭ標識及び３’末端にＴＡＭＲＡ標識をそれぞれ付加させた。これらの標識キメラオリゴヌクレオチドについてＲＮａｓｅによる影響を調べた。ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅＡ（シグマ社製）を用いた。
反応は以下のとおり行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、５ｐｍｏｌあるいは１０ｐｍｏｌ上記各種キメラオリゴヌクレオチド、１０μｇのＲＮａｓｅＡの添加と無添加の反応組成溶液を調製し、それぞれ滅菌水で最終容量を２５μｌにした。該反応液は、スマートサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、５５℃、２０分間保持した。ＲＮａｓｅＡによる上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、ＦＡＭ標識の蛍光シグナルをモニタリングすることによって確認した。その結果、ＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、並びにＩＡＰＰオリゴ９Ｇのキメラオリゴヌクレオチドの場合、ＲＮａｓｅＡ添加と無添加の時に得られるＦＡＭ蛍光シグナル差は、ほとんど確認できなかった。すなわち、ＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、並びにＩＡＰＰオリゴ９ＧのキメラオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＡの分解に対して耐性を有することが確認できた。
【００４７】
（２）ＤＮａｓｅの分解に耐性を有するキメラオリゴヌクレオチドの検討
次に、表１記載のＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｃ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ８Ｃ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、ならびにＩＡＰＰオリゴ９ＧについてＤＮａｓｅによる影響を調べた。ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を用いた。
反応は、以下のようにして行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、５ｐｍｏｌあるいは１０ｐｍｏｌ上記各種キメラオリゴヌクレオチド、７０ＵのＤＮａｓｅＩの添加・無添加の反応組成溶液を調製し、滅菌水で最終容量を２５μｌにした。該反応液は、スマートサイクラー（タカラバイオ）にセットし、５５℃、２０分間保持した。ＤＮａｓｅＩによる上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、ＦＡＭ標識の蛍光シグナルをモニタリングすることによって確認した。その結果、ＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴ８Ｃ、ＩＡＰＰオリゴＡｇ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｇのプローブについては、ＤＮａｓｅＩ無添加時のＦＡＭ蛍光シグナル値と添加時の蛍光シグナル値に顕著な差がみとめられなかった。すなわち、ＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１Ｕ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴ８Ｃ、ＩＡＰＰオリゴＡｇ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、ＩＡＰＰオリゴ９ＧのキメラオリゴヌクレオチドがＤＮａｓｅの分解に対して耐性を有することが確認できた。
【００４８】
以上のことから、表１記載のＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ並びにＩＡＰＰオリゴ９Ｇのプローブは、ＲＮａｓｅＡとＤＮａｓｅＩの両方の分解に耐性を示すことが確認できた。これらのキメラオリゴヌクレオチドの特徴は、ＲＮＡ部分がプリン骨格をもつ塩基から構成されていることである。
【００４９】
（３）キメラオリゴヌクレオチドのプライマー及び／又はプローブとしての利用についての検討
上記（２）でＲＮａｓｅＡおよびＤＮａｓｅＩの分解に耐性を示したＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、並びにＩＡＰＰオリゴ９Ｇキメラオリゴヌクレオチドについて、プライマー及び／又はプローブとしての利用可能性を検討するためにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨＩＩによる影響を調べた。まず、上記キメラオリゴヌクレオチドのＩＡＰＰオリゴ１５Ａ、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、並びにＩＡＰＰオリゴ９Ａに相補的な塩基配列を有する配列表の配列番号１１記載のＴｅｍｐｌａｔｅＡとＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｇに相補的な塩基配列を有する配列表の配列番号１２記載のＴｅｍｐｌａｔｅ  ｇに記載されている３８塩基のＤＮＡを合成した。
反応は以下のようにして行った。すなわち、最終濃度３２ｍＭ  ヘペスー水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｐｍｏｌの上記キメラオリゴヌクレオチド、２５ｐｍｏｌのＴｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（ＴｅｍｐｌａｔｅＡあるいはＴｅｍｐｌａｔｅ  ｇ）、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットに記載の方法で調製したＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨ  ５Ｕを添加あるいは無添加の反応溶液を調製し、滅菌水で２５μｌにした。反応液は、スマートサイクラーにセットし、５５℃、２０分間保持した。その結果、いずれのキメラオリゴヌクレオチドの場合においても、ＲＮａｓｅＨ無添加時のＦＡＭ蛍光シグナル値と添加時の蛍光シグナル値に顕著な差が認められた。
なお、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットに記載のＴｌｉ由来ＲＮａｓｅＨを発現する、プラスミドｐＴＬＩ２０４で形質転換された大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）／ｐＴＬＩ２０４と命名、表示され、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２２３として平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、平成１３年８月２日（移管日）より受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６９３として寄託されている。
以上のことから上記キメラオリゴヌクレオチドは、ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡの分解に耐性であるが、Ｔｌｉ由来ＲＮａｓｅＨにより分解されることが確認できた。すなわち、キメラオリゴヌクレオチド中にプリン骨格の塩基のＲＮＡ部分を有するようにデザインすることによりＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡの分解に耐性であるが、ＲＮａｓｅＨにより分解されるキメラオリゴヌクレオチドを構築できることを確認した。
【００５０】
実施例２
（１）生体試料中の夾雑物質の影響
実施例１で構築したキメラオリゴヌクレオチドが、生体試料中の夾雑物質の影響を受けるかどうかについて検討した。生体試料としては、インフォームドコンセントの得られた健常人の尿を用いた。反応は以下のようにして行った。すなわち、健常人の尿を滅菌蒸留水で１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍に希釈したものをサンプルとして使用した。反応系として、スマートサイクラー（タカラバイオ社）専用反応チューブに、氷上にて最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、実施例１の表１記載のＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、またはＩＡＰＰオリゴ９Ｇの５’ＦＡＭ標識及び３’ＴＡＭＲＡ標識のキメラオリゴヌクレオチドを５ｐｍｏｌあるいは１０ｐｍｏｌを含む反応液を調製し、ここに上記希釈尿サンプル、あるいは対照として滅菌蒸留水を１０μｌ加え、全量を２５μｌとした。この反応チューブをスマートサイクラーにセットし、６０℃で１時間保持した。生体試料中の夾雑物質による上記キメラオリゴヌクレオチドの分解の有無は、ＦＡＭ標識の蛍光シグナルをモニターリングし、対照の滅菌蒸留水の場合と比較して確認した。６０℃  １時間経過した後の対照である滅菌蒸留水での（ＦＡＭ）蛍光シグナル強度と、尿サンプルを加えた場合の蛍光シグナル強度を比較した。その結果、いずれのキメラオリゴヌクレオチドにおいても、尿サンプルの希釈濃度にかかわらず分解されなかった。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドが生体試料中の夾雑物質の影響を受けないことが確認できた。
【００５１】
実施例３
標的核酸の検出方法において、本発明のキメラオリゴヌクレオチドをプローブとして用いた場合について検討した。本実施例においては、国際公開第００／５６８７７号パンフレット或いは国際公開第０２／０７１３９号パンフレット記載のＩＣＡＮ法と組み合わせて検討した。生体試料としては、実施例２で調製した尿検体を使用した。
反応は以下のようにして行った。すなわち、スマートサイクラー専用反応チューブに、氷上にて最終濃度３２ｍＭ  ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ  酢酸マグネシウム、配列表の配列番号１３及び１４に示す各５０ｐｍｏｌのＩＡＰＰプライマーＦ２、ＩＡＰＰプライマーＲ１、１００ＵのＴｌｉ  ＲＮａｓｅＨＩＩ、２ＵのＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、０．０４％プロピレンジアミン、実施例１で調製したＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、またはＩＡＰＰオリゴ９Ｇの５’末端ＦＡＭ標識及び３’末端ＴＡＭＲＡ標識のキメラオリゴヌクレオチドを５ｐｍｏｌあるいは１０ｐｍｏｌ含む反応液を調製し、ここに鋳型となるＩＡＰＰ陽性コントロール１０６コピーと、滅菌蒸留水で１０倍、１００倍、５００倍及び１０００倍に希釈した健常人の尿サンプル、あるいは対照として滅菌蒸留水を５μｌ加え、全量を２５μｌとした。この反応チューブをスマートサイクラーにセットし、６０℃で７５分保持した。上記キメラオリゴヌクレオチドによるＩＣＡＮ産物の検出は、反応により得られてくる増幅産物に上記キメラオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし、その際のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドがＲＮａｓｅＨにより切断されることによるＦＡＭ標識の蛍光シグナルが上昇することをモニターすることで行った。各反応直後の蛍光シグナル値を０とし、反応終了後のシグナル値の変化を求めて算出した。
その結果、ＩＡＰＰオリゴ１０Ｇ、ＩＡＰＰオリゴＡＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ａ、ＩＡＰＰオリゴＧＧ、ＩＡＰＰオリゴ９Ｇは、対照の滅菌蒸留水の場合も、尿サンプルを加えた場合もどちらも尿サンプルの希釈倍率にかかわらず検出シグナルの変化が確認され、リアルタイム検出のプローブとして使用することができることが確認できた。すなわち、これらのキメラオリゴヌクレオチドは、生体試料中の夾雑物質による分解に対して耐性を有しているが、ＩＣＡＮ反応物検出の際のＲＮａｓｅＨによるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡの切断は行われていることが示唆される。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により生体試料中の夾雑物質に影響されない標的核酸の増幅及び／又は検出方法が提供される。また、本発明は、プライマーの分解に起因する偽陰性及び／又はプローブの分解に起因する偽陽性を抑制することができるため、正確な標的核酸の正確な検出を行うことができる。
【００５３】
2005006587.tif 000003
2005006587.tif 000004
【００５４】
【配列表】
2005006587.tif 000005
【００５５】
2005006587.tif 000006
2005006587.tif 000007
【００５６】
2005006587.tif 000008
【００５７】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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