(57)【要約】【課題】  簡単な製法でしかも定量化が可能な球状能動要素の製造方法を得ると共に、体液成分を発色により測定する際の試薬として有用な球状試薬を得る。【解決手段】  能動要素を形成するための出発物質を含む溶液を、超低温寒剤下へ定量的に滴下した後、乾燥してえられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
能動要素を形成するための出発物質を含む溶液を、超低温空間下へ定量的に接触させた後、乾燥して得られる球状能動要素の製造方法。
【請求項２】
前記能動要素が、体液等の被測定溶液と接触することで、発色反応する球状の試薬粒、分離剤、呈色剤、緩衝剤、酵素剤である請求項１に記載の球状能動要素の製造方法。
【請求項３】
支持ポリマー、賦形剤及び試薬成分を含む溶液を、超低温空間下へ、定量的に接触させた後、乾燥して得られる試薬。
【請求項４】
前記賦形剤が、糖類、中性水溶解性高分子、ゼラチン、コラーゲンペプチド、中性水溶解性消泡剤、中性水溶解性分散剤より選ばれた１乃至複数である請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
前記支持ポリマーが、ポリビニルアルコール、コラーゲンペプチド、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルベンゼンスルホン 酸ナトリウム、アガロースより選ばれた１乃至複数である請求項３に記載の試薬。
【請求項６】
支持ポリマー0.1〜20重量％、賦形材  0.1〜20％重量％を含む請求項３に記載の試薬。
【請求項７】
前記超低温空間とは、液体窒素、液体ヘリウム、ドライアイス−有機溶媒などの寒剤及びその周辺空間であって超低温領域である請求項１，３に記載の球状能動要素の製造方法及び試薬。
【請求項８】
出発物質を含む溶液を、断続的な空気圧により管状体から押し出して超低温空間へ滴下する請求項１、３に記載の球状能動要素の製造方法及び試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、球状で、能動的に用いられる粒子の製造方法に関し、更には当該要素を用いた試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
今般、微細加工技術の発達に伴い、微量の液体の成分を測定しようとする試みが提案されており、
特開２００２−３５７６１６号公報には、毛管を利用した微量定量チップを中心と、その利用用途にグルコース測定システム等の診断システムが開示されている。
特開２００２−３５７６１６号公報では、毛管力を利用して微量の液体の輸送、定量を行うことが開示されており、体液の採取を少量とし患者に負担をかけないですむ点で有用ではあるが、試薬も微量となるため、ごく少ない試薬の定量的な取り扱いが必要になってくるものの、その点の記載はされていない。
【０００３】
特開２００１−２６４３２５号公報には、今までのような多孔質材で、血液を展開する展開層をもつ様な多層構造ではなく、試薬粒を、水不透過の、枠体に収容され、直接体液と反応させる手法が開示されている。
この様に、試薬粒そのものと体液の接触による、試薬の発色反応を得る手法は、構成が簡単であり、体液の量も少なくてすむことから、少量の試料の成分計測に向いており、体液を採取される患者の苦痛をより緩和できる。
定量的な試薬の提供については、支持体表面に噴霧して凍結乾燥する手法等が開示されているが、何れもその結果として、粒度等にばらつきが生じ、定量的な製造は困難である。
【特許文献１】特開２００２−３５７６１６号公報
【特許文献２】特開２００１−２６４３２５号公報
【特許文献３】アメリカ特許第５０１９４００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
噴霧凍結乾燥による球状粒子を得る手法としては、アメリカ特許５０１９４００号公報が示される。
当該公報には、スプレー法により、ポリL-乳酸等の生体活性ポリマーと薬物の混合溶液を液体窒素に噴霧滴下して、1〜1000μｍ程度の微粒子を製造する手法が開示されている。
溶液を空中で噴霧して、液体窒素などの超低温空間へ滴下するスプレー法は、多数の球状微粒子を、一度に生成する点で好ましいが、粒径が、広範囲にばらつくため、特定の粒径の粒子を得るためには篩にかける必要があるなど煩雑な作業を必要とし、更に、使用不可能な程度の微粒子（埃）が生成されるため無駄が多い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記に鑑み本発明は、能動要素を形成するための出発物質を含む溶液を、超低温空間下へ定量的に滴下するなどして接触させた後、乾燥して得られる球状能動要素により、より真球に近い球状であって、しかも滴下を定量的に行うことにより、所望の粒径を有する球状能動要素が得ることを実現した。
【０００６】
即ち、本発明は、能動要素を形成するための支持ポリマー、試薬、薬剤等の出発物質を含む溶液を、液体窒素レベルの超低温空間下へ管状体から滴下量を調整するなどして定量的に滴下した後、乾燥してえられる球状能動要素の製造方法であり、当該方法で製造された試薬を示す。
当該試薬を成分とする球状能動要素を得る場合は、ポリビニルアルコール等の支持ポリマー0.1重量％〜20％重量％、ゼラチン、糖類等の賦形材0.1重量％〜20重量％、試薬40重量％〜90重量％を有効成分とした溶液を液体窒素下へ滴下する。
滴下は、所定の高さ（例えば  超低温空間より10ｍｍ〜200ｍｍの高さ）又は距離にある管状体（口径  50μｍ〜1ｍｍ）から、超低温空間へ一滴ずつ滴下することで行われ、管状体からの滴下は、例えば、断続的な空気圧により溶液を押し出すことで行われる。
【０００７】
本発明は、所望の粒径の球状粒子を定量的な滴下によって得ることができる球状微粒子であって、より真球であれば、その容積は、算術、目視等で得られることから、一つの定量的な試薬が得られ、その個数で、試薬の調整が可能となるのである。
更にこれらの球状微粒子を複数充填すると、その空隙が、粒径によって、大きくなり、例えば反応時に酸素を必要とする場合など、この隙間に一時的に蓄えることができるようにすることも可能である。
【０００８】
能動要素とは、単に保持するための受け身的な無機担体を意図せず、他の物質と反応したり、あるいは、微生物に対する活性の作用を及ぼしたりする素材、有機担体等々で形成される。
例えば、  ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、フェノール、1-ナフトール-3, 6-ジスルホン酸ニナトリウム、4-アミノアンチピリン、リン酸、ピルビン酸オキシダーゼ、オキサロ酢酸脱炭酸酵素、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルフォプロピル)-m-トルイジンナトリウム、4-アミノアンチピリン、L-アスパラギン酸、α-ケトグルタル酸、チアミンピロリン酸、塩化マグネシウム六水和物、HEPES、リポプロテインリパーゼ、アデノシン-5'-三リン酸二ナトリウム三水和物、グルセロールキナーゼ、グルセロール-3-リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、3, 5-ジメトキシ-N-エチル-N-(2'-ヒドロキシ-3'-スルホプロピル)-アニリンナトリウム、PIPES（緩衝液）リポプロテインリパーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、L-アラニン、DAOS、炭酸緩衝液、水酸化ナトリウム
p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム、F-DAOS、ウリカーゼ、N, N-ヒ゛ス(4-スルホフ゛チル)-3-メチルアニリンニナトリウム(TODB)、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、グッド緩衝液、クレアチニナーゼ、アジ化ナトリウム、3, 5-シ゛ニトロ安息香酸、水酸化リチウム一水和物、コレステロールオキシダーゼ、N, N-ヒ゛ス(4-スルホフ゛チル)-m-トルイシ゛ンニナトリウム(DSBmT)、コレステロールエステラーゼ、界面活性剤、硫酸銅5水塩、酒石酸カリウムナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸銅、グルコアミラーゼ、BES緩衝液、α-グリコシダーゼ、p-ニトロフェニルヘ゛ンシ゛ル-α-マルトヘ゜ンタオシト゛(BG5P)、ヘ゛ンシ゛リテ゛ン-p-ニトロフェニルマルトヘフ゜タオシト゛(BG7-pNP)、モノエタノールアミン緩衝液、メチルキシノールブルー、8-キノリノール、o-クレソ゛ールフタレインコンフ゜レキソン、（試薬の具体名、薬物、免疫物質、等の試薬、薬剤等を示すものであるが、薬剤の新規開発物なども当該方法において使用できることからこれらに限定されるものではない。
【０００９】
本発明は、出発物質を、滴下、投入する等して、超低温空間と接触させ凍結させることを期待するものであり、最終的に球状の粒子であって、好ましくは、出発物質が寒剤により形成される超低温空間への定量的な接触により、定量容易な球形能動要素が得られるようにするものである。
定量接触については、所定量を所定の高さ又は距離から超低温空間へ滴下する行為が、簡単で、しかも確実な球形粒子を形成できる。
滴下は、重力を利用した自然落下の他、加速させたりしても良い場合もある。又、上方へ投げて、包絡線を描いて滴下させても良い場合もある。
本発明に於ける超低温空間とは、  液体窒素、液体ヘリウム、ドライアイス−有機溶媒・塩化カルシウム6水和物（CaCL2・6H2O）58.8％と氷41.2％、等の寒剤を直接示すほか、その周辺の空間を示す。  即ち、超低温の寒剤は、その周辺も超低温化される為、その付近を通過した溶液は、球状凍結化するのである。
従って、熱伝導率の良い容器にいれた超低温寒剤の側面を通過させる場合でも球状凍結粒子は形成可能である。
又、本発明により得られる球状粒子の粒径は50μｍ〜3ｍｍで、好ましくは、400μｍ  〜1ｍｍが例示される。これ以下だと測定上の点で適当でなく、これ以上だと  球状粒子崩壊性、コストの点で適当でない。
【００１０】
本発明に於ける接触とは、管状体から、所定の高さで、超低温空間に滴下する他、所定量の溶液を、すくい上げて大気中に投下するといった手法が例示される。管状体とは、例えば注射器の針のようなもの（先端が必ずしも鋭利でなくても良い場合もある。）であって、口径は、50μｍ〜1ｍｍ（好ましくは100〜500μｍ：粘性コントロール、粒径コントロールの点で有利）が例示される。又、管状体は円筒状でなくてもよく三角柱、四角柱等の多角柱状であってもよく、その他の形状でも良い場合もある。
本発明は、超低温空間下で、球状に凍結した能動要素を更に乾燥させる。  乾燥は、  温風による乾燥法、または、真空凍結乾燥が例示され、温風乾燥の場合は試薬の失活しない温度付近（酵素の場合40度以下）で15分以内に乾燥を行う。真空凍結乾燥の場合は、試薬の量・含水率等により乾燥時間は変動するが、5〜15Pa程度で2時間から24時間の乾燥時間を必要とする。  凍結乾燥時には、能動要素を超低温空間より取り出した後、能動要素が常温に戻る前に素早く凍結乾燥機にて減圧する必要がある。  その際、内部の氷の部分が気孔になり、粒子が多孔質状となり、能動要素と試料との迅速な浸透接触、反応に必要な酸素の確保等により有効な形態となる。
【００１１】
更に本発明は、球状の能動要素を支持ポリマー、賦形材及び試薬の組み合わせとすることにより、試料溶液との接触において、速やかな溶解性を得ることを実現した。
即ち本発明は、いわゆるドライケミストリーの分野に於ける試薬粒子として、定量性に優れながら、溶解性が良く、しかも１ｍｍ以上の直径を有する球状試薬粒子を可能とする。
当該、試薬は、体液との接触により発色反応を起こし、発色の程度により体液成分を測定するものであるが、溶解性の良さ、と定量性の良さにより、迅速に且つ正確に成分計測を可能とするものである。
【００１２】
本発明に於ける支持ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリメチルビニルエーテル、これらの共重合体、ポリエル乳酸、                                等が例示され、その添加量は支持ポリマーの水への溶解性に依存し適正濃度は異なるが、たとえばポリビニルアルコールの場合0.1重量％〜5重量％、好ましくは、0.1重量％      〜2.5重量％が試薬粒の水への再溶解性の点で優れている。支持ポリマーの添加量はポリビニルアルコールの場合2.5重量％以上だと、再溶解性が十分に確保できない点で0.1重量％以下だと、能動要素の強度が不十分になる点で都合が悪いが、これも試薬の性状に依存する。
本発明における賦形材は、  例えば  カオリン、果糖、カルメロース、キシリトール、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、D-ソルビトール、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、トウモロコシデンプン、乳糖、白糖、精製白糖、バレイショデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポビドン、 D-マンニトール、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム（以上、日本薬局方収載品）
アルファー化デンプン、クロスポビドン、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、結晶セルロース（粒）、ヒドロキシプロピルスターチ、ブドウ糖水和物、部分アルファー化デンプン、粉末還元麦芽糖水アメが例示され、この中でもD-マンニトールが吸湿性が少ない点で優れている。
その添加量は0.1〜20重量％、好ましくは、１〜10重量％が再溶解性の点で優れている  。賦形材の添加量は  10重量％以上だと能動要素の強度が不十分になると考えられ1重量％以下だと、賦形剤としての性能が期待できない点で都合が悪い。
【００１３】
本発明の試薬としては、酵素、脂質、無機イオン、蛋白質、各種グロブリン、免疫抗原、免疫抗体、腫瘍マーカー、核酸類、ホルモン、などを定量する際に使用する場合、定量をするために電気泳動などで分離する際の分離促進剤、分離の条件としてｐHに対する緩衝性をもたせるための緩衝剤、発色によって定量を測定する際の呈色剤などに使用されるが、本発明の記載に限定されるものではない。              
尚、試薬等能動的に作用する物質と、その他支持ポリマー賦形材は互いに選択的に使用されればよく、本発明の記載に限定されるものではない。
【００１４】
図１は、定量滴下装置の概略的な一例である。
１１は、加圧空気形成部であり、加圧ポンプ等で構成され、加圧量、加圧時間を適宜調整可能とする。
１２は、溶液加圧部であり、加圧空気形成部１１と同様の構成により後段の溶液貯留部の溶液を加圧するためのもので
１３は、溶液貯留部であり、出発物質を含む溶液が貯留されている。溶液の質によって保温、不活性ガスの供給等が可能な構成となっている。
１４は、弁駆動部であり、駆動弁１５が、電磁弁であれば電気パルスを出力するパルス発振回路等で構成されている。又駆動弁１６に対しても、駆動弁１５とは異なったタイミングでの開閉のためのパルスを出力する。
１５及び１６は、駆動弁であり、外部信号により開閉動作を行わせるためのものであり、電磁弁、その他空気圧弁等が適用可能である。
１７は、管状体であり、内径  100μｍ〜４ｍｍで形成され、ステンレス、              真鍮、鉄などの金属  フッ素樹脂など耐薬品性樹脂  等で形成されている。内面は、試薬との反応性がほとんどないことが求められることに加え、粘度、表面張力などの影響が試薬ごとにおこらないようにする為、親水処理、疎水処理、フッ素加工やシリコン加工が適時施されている場合もある。
１８は、超低温の寒剤であり、図中、上部が開放された容器を示すが、少なくとも超低温空間が形成されれば良く、この様に、寒剤に直接接触する様な構成でなくても良い。
【００１５】
図１で示す滴下凍結構成について、動作を説明する。
加圧空気形成部１１において、一時的に空気圧を蓄積するような場所に加圧空気が形成される。この空気圧に対し弁駆動部１４は、駆動弁１５の開閉を行うためのパルスを出力する。
他方、溶液加圧部１２は、溶液貯留部１３に対し、所定の圧力で溶液を管状体１５方向に押し出すための圧力を加える。駆動弁１６は、弁駆動部１４からの信号により開く、駆動弁１６は、開いたままの状態とする。
溶液は、駆動弁１６を介して管状体１５に侵出するその際、駆動弁１５が開くと且つ空気形成部１１の加圧空気が、弁駆動部１４の駆動パルスのパルス幅に対応する状態で管状体１５を伝達し、侵出した溶液を外部へ押し出して溶液滴Ｔ１を形成する。
溶液滴Ｔ１は、滴下中、表面張力により球形となり、超低温の寒剤１８の付近で、凍結する。落下過程での球径を確保するために好ましい高さは、10ｍｍ〜200ｍｍ程度であり、あまり低温溶媒と管状体15の距離が近すぎると、管状体15内で溶液が凍結してしまい、不都合が生じる場合がある。しかし、溶液の表面張力などにより、上記好ましい高さを確保できない場合は、管状体にヒーター機構を設けるなどして凍結防止策を講じることもできる。また、200ｍｍ以上の高さになると低温の寒剤への滴下精度が滴下している環境に応じて悪くなるが、寒剤中の凍結中の溶液は、寒剤液体表面上に浮遊しており、そこへ新たな滴下工程を経た溶液が重なり、粒の形状に影響を与え歩留まりを悪くすることが観察されたため、滴下距離は溶液の融点に応じて微調整されうるべきものであり、その融点は調整された各溶液により、個々に異なる。滴下の際の粒子の重なりを取り除くために、寒剤に流れを設けたり、管状体を移動させながら滴下する方法が、適時とられるが、限定されるものではない。
滴下量は、管状体１５内を断続的に通過する加圧空気の間隔によってきまる。
例えば、加圧空気塊の間隔（休止期間）で、溶液の侵出量が調整される。間隔が長ければ滴下量が多く、球径が大きくなり、間隔が短ければ、滴下量が小さくなり、球径が小さい球状能動要素ができるのである。
【００１６】
この様に、加圧空気形成部１１の押し出す空気の量を断続的に調整する他、駆動弁１５の開閉を一定間隔として、駆動弁１６の駆動間隔を調整することによって、管状体１５への溶液の侵出量を調整しても良い場合もある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、簡単な手法で、真球に近い球状の能動要素の製造を実現すると共に、当該製法に基づいて製造される試薬球においては、支持ポリマーと賦形材及び試薬よりなる溶液を超低温空間へ滴下することで、真球に近い球状試薬が得られ、この形状が真球に近いことにより、粒子径を規定すれば、内部に保持されている試薬の含有量を定量的に規定する系が構築できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、出発物質を含む溶液（スラリー）の滴下量を調整しながら、液体窒素等の寒剤による超低温空間へ滴下等の接触を行う。この滴下により、定量化された又は、外形からより簡単に定量化可能な球状粒子を形成することを可能とする。
又、支持ポリマー0.1〜5重量％  、賦形材0.1〜20  重量％、による出発物質の滴下により、試料に対する可溶性の優れ、ハンドリングのよい、試薬含有量の定量性に優れた試薬球を得ることができる。
【実施例】
【００１９】
実施例１
トリグリセライド（TG）の調製
試薬・含浸ビーズ作製用のTG発色試薬の調製を以下の方法で行った。
はじめに、トリグリセライド（TG）Eテストワコー（GPO-DAOS法）キット試薬を入手し、発色剤として：
・リポプロテインリパーゼ（シュードモナス属）        ９９単位／ｍL
・アデノシン５‘三リン酸（ATP）（バクテリウム属）      １．７ｍM,
・グリセロールキナーゼ（セルロモナス属）            ３０単位／ｍL,
・グリセロール−３リン酸オキシダーゼ（GOD）          １単位／ｍL,
・ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（西洋ワサビ）          ５．５単位／ｍL,
・３，５−ジメトキシ−N−エチル−Ｎ−（２‘−ヒドロキシ−３’−
スルホプロピル（DAOS）                            ５．４ｍM,
・４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）                    １１ｍM,
・アスコルビン酸オキシダーゼ（キュウリ）            ４．５単位／ｍL,    
のキット試薬をビーズ作製のために濃縮倍率２００倍に５０ｍMグッド緩衝液（ｐH６．５）にて調製し、更に、４−ＡＡとＤＡＯＳを１．５倍まで濃くした条件で発色剤の最終試薬調製を行った。
次に、腑形剤として5.0％コラーゲンペプチドと２．５％マン二トールを先の、最終試薬調製をした発色剤に含有させて、均一にした溶液にしてＴＧの試薬・含浸ビーズの製造に供した。
【００２０】
（ビーズの製法例）
その際、試料0.268ｍｌを、内径0.2ｍｍの管状体から高さ15mmで、液体窒素下に滴下した。図１に示す装置を利用した。
結果を図２に示す。図２によれば、直径が800μｍの真球に近い球状試薬が形成できた。
【００２１】
（発色試験）
この球状試薬を用いて以下のトリグリセライドの（ＴＧ）の発色試験を行った。
上述した球状試薬  1  個上に試料（血清  5μｌ）を投与した。  投与後、速やかに溶解し(10秒以内)、発色反応が行われ、  ２分後測定可能となった。反応温度は37℃±３℃のインキュベーションを行った。
この発色反応部位に対し、可視光領域の光を照射し、1ｍｍの光路長に対する透過光を検出して、測色を行い検量線を得たところ、図３のような検量線が引かれた。この際測定器としてオーシャンフォトニクス社製  の分光機器を使用し、光線幅として直径200μｍの光ファイバーを通した光を使用した。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、定量容易な能動要素を提案するものであり、一粒の選択使用において、精度の良い分析を可能とする。これは、例えば、体液を採取してこの成分を測定する場合、使用される試薬の量を、粒の数によって得ることができると共に、試薬領域の画定が容易に行われ、今般発展が著しいマイクロ流路を利用したチップによる検査用試薬等の能動要素として、有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施例を説明する図。
【図２】本発明の実施例を説明する図。
【図３】本発明の実施例を説明する図。
【符号の説明】
【００２４】
１１    加圧空気形成部
１２    溶液加圧部  
１３    溶液貯留部
１４    弁駆動部
１５    駆動弁
１６    駆動弁
１７    管状体
１８    寒剤
【図１】
2005043304.tif 000003
【図２】
2005043304.tif 000004
【図３】
2005043304.tif 000005