(57)【要約】【課題】  被検者の一定の疾患状態又は生理状態の診断等に有効な、赤血球中ポリアミン量の簡易かつ高精度な測定方法を提供する。【解決手段】  スペルミン及びスペルミジンに対して基質特異性を有するポリアミン酸化酵素、又はスペルミンのみに対して基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を用い、血液より分離精製した赤血球の溶出液に対してこれらの酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量する赤血球中ポリアミンの測定方法。【選択図】          図１  
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量を測定することを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項２】
前記ポリアミン酸化酵素が、少なくとも燕麦を包含する麦科植物群から選ばれた植物に由来する酵素であることを特徴とする請求項１に記載の赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項３】
前記高感度発色試薬が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項４】
血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中のスペルミン量を測定することを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項５】
前記ポリアミン酸化酵素が、少なくとも大麦を包含する麦科植物群から選ばれた植物に由来する酵素であることを特徴とする請求項４に記載の赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項６】
前記高感度発色試薬が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩であることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の赤血球中ポリアミンの測定方法。
【請求項７】
同一検体の同一試料に基づく下記の測定値Ａから下記の測定値Ｂを差し引くことにより、赤血球中のスペルミジン量の算定値Ｃを求めることを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定方法。
測定値Ａ：請求項１〜請求項３のいずれかに記載の赤血球中ポリアミンの測定方法により得られた、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量の測定値。
測定値Ｂ：請求項４〜請求項６のいずれかに記載の赤血球中ポリアミンの測定方法により得られた、赤血球中のスペルミンの測定値。
【請求項８】
請求項７に記載の測定値Ａ、測定値Ｂ、及び算定値Ｃのいずれか１以上の値を指標として、これらの指標との関連が認められる疾患状態又は生理状態について検体の診断を行うことを特徴とする診断方法。
【請求項９】
前記指標として少なくとも算定値Ｃが含まれる場合において、前記診断が臓器切除又は臓器移植の予後の診断であることを特徴とする請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
前記指標として少なくとも測定値Ａが含まれる場合において、前記診断が癌の診断であることを特徴とする請求項８に記載の診断方法。
【請求項１１】
少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量を測定するために用いられるものであることを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定用キット。
【請求項１２】
少なくとも、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミン量を測定するために用いられるものであることを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定用キット。
【請求項１３】
少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミジンを算定するための測定に用いられるものであることを特徴とする赤血球中ポリアミンの測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球中ポリアミンの測定方法、診断方法、及び赤血球中ポリアミンの測定用キットに関する。更に詳しくは、本発明は、研究目的又は臨床目的において赤血球中のスペルミン及び／又はスペルミジン量を選択的に測定できる赤血球中ポリアミンの測定方法と、これらの測定方法の結果を利用して検体の疾患状態又は生理状態を診断できる診断方法と、このような測定方法又は診断方法に利用できる赤血球中ポリアミンの測定用キットとに関する。
【背景技術】
【０００２】
〔生体内ポリアミンの研究〕
ポリアミンとは、本来は一級アミノ基又は二級アミノ基を２個以上有する塩基性の炭化水素化合物を包括的に指すが、生体内に見られるポリアミンとしては、プトレッシン、カダベリン、スペルミン、スペルミジン等が知られている。この内、スペルミンは、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）−１，４−ジアミノブタン：ＮＨ２  （ＣＨ２  ）３  ＮＨ（ＣＨ２  ）４  ＮＨ（ＣＨ２  ）３  ＮＨ２  である。又、スペルミジンは、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，４−ジアミノブタン：ＮＨ２  （ＣＨ２  ）３  ＮＨ（ＣＨ２  ）４  ＮＨ２  である。以下、単に「ポリアミン」と言う時は、これらの生体内に見られるポリアミンを指す。
【０００３】
ポリアミンはウイルスからヒトに至る全ての生物細胞中に多量に存在しており、非常に簡単な構造を有する化合物でありながら、多様な酸性高分子物質と相互作用することによって多岐にわたる生理活性を示すことが知られている。近年、特に細胞の増殖・分化との関係でポリアミンが注目されており、例えば DNA合成、 RNA合成、タンパク質合成等との関係が再生肝等を用いて広範囲に研究されている。そして、臨床レベルで応用することが可能な知見も増大している。
【０００４】
例えば Dykstraらは、下記の「非特許文献１」において、ラット肝臓の部分摘出後、２４時間の間にスペルミジンの濃度が増加するが、スペルミンは増加しないことを報告している。この場合、ポリアミンの蓄積する割合は、再生肝における RNA合成の増加率とほぼ同じであり、又、静脈注射したプトレッシンの取り込みとスペルミジンの合成は肝摘出手術後２時間以内に増加することを報告している。なお、ポリアミンはラット肝臓の抽出液を用いて測定している。
【０００５】
【非特許文献１】William G. Dykstra, Jr.;Edward J. Herbst "Spermidin in Regenerating Liver:Relation to Rapid Synthesis of Ribonucleic Acid" Science, New Series, Vol. 149, No. 3682 (Jul. 23, 1965), 428-429  次に、Russell らは、下記の「非特許文献２」において、種々の癌患者で異常に高い尿中ポリアミン値を認めたことを報告している。この報告を嚆矢として、その後、悪性腫瘍に対する診断方法や化学療法等の効果の指標としての尿、血清あるいは赤血球等のポリアミン分析に関する多くの報告がなされている。
【０００６】
【非特許文献２】Diane Russell, Solomon H. Snyder " Amine Synthesis in Rapidly Growing Tissued: Ornithine Decarboxylase Activity in Regenerating Rat Liver, Chick Embryo, and various Tumors" Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1968;60:1420-1427  〔ポリアミン測定法〕  以上の事情から、生体試料中のポリアミンについて種々の測定法が提案されており、その一部は既に実用化されており、又は実用化に近づいている。その代表的な方法の一つが HPLC 法（高速液体クロマトグラフィー法）であり、血中ポリアミンや尿中ポリアミンの測定に利用されている。しかしこの方法は、周知のようにプロセスが煩雑であり、日常的な臨床検査法としてルーチンに普及することは困難であると考えられる。
【０００７】
一方、久保田らが酵素を利用した尿中ポリアミンの測定法（久保田俊一郎ら、「医学のあゆみ」124(1), 22-24, 1983 等に報告されている）を開発して以来、悪性腫瘍全般の補助診断として、あるいは悪性腫瘍に対する外科的治療、抗癌剤投与、放射線治療等を行った際の治療効果判定の補助手段として、尿中総ポリアミンの測定がルーチン化されるに至り、尿中ポリアミン測定用キットも市販されている。
【０００８】
更に Isobeらは、下記の「非特許文献３」において、酵素法による血中総ポリアミンの測定について報告している。
【０００９】
【非特許文献３】Kimiyasu Isobe, Hideaki Yamada, Yasuko Soejima, Shogo Otsuji, " A Rapid Enzymatic Assay for Total Blood Polyamines" Clin Biochem, Vol. 20, pp. 157-161, 1987  〔酵素法に用いる酵素〕  上記の久保田らの方法や Isobeらの方法ではポリアミン酸化酵素が用いられている。岡田らは、下記の「非特許文献４」において、各種のポリアミン酸化酵素の性質等を詳細にまとめて報告している。その報告によれば、ポリアミン酸化酵素には、モノアミンをも含む広い基質特異性を有するものと、ジアミンを含めたポリアミンに対して特異的に作用するものに大別される。又、ポリアミンに対して特異的に作用する酵素の一例として、スペルミン及びスペルミジンのみに基質特異性を有する燕麦（カラス麦）由来のポリアミン酸化酵素も紹介されている。そして、Smith の下記「非特許文献５」によれば、大麦由来のポリアミン酸化酵素は、一定のｐＨにおいてスペルミジンを特異的に酵素分解することが報告されている。
【００１０】
【非特許文献４】岡田昌人、川島誠一、今堀和友「ポリアミン酸化酵素」  蛋白質  核酸  酵素  Vol. 26, No. 9 (1981)
【非特許文献５】T. A. Smith  "Purification and Properties of the Polyamine Oxidase of Barley Plants" Phytochemistry, 1972, Vol. 11, pp.899 to 910
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、上記した久保田らの酵素法によるポリアミン測定方法は、尿中ポリアミンが抱合型であるため、これを遊離型に加水分解する前処理を要する点で、十分に簡便であるとは言えない。又、尿を用いた場合、水分摂取量や活動状態の違い、あるいは季節の違い等により尿水分排泄量が異なるため、これらの原因による濃度の変動を受け易い。更に、尿の働きとして、体液の恒常性（酸・塩基平衡等）を維持するために適宜に余剰の水分や老廃物を排泄すると言うことがあり、尿中濃度がストレートに体内濃度を示すとは限らない点等から、診断手段としての感度面でも十分ではない。
【００１２】
次に、上記した Isobeらの酵素法によるポリアミン測定方法は、細菌及び真菌由来の２種類のアミン酸化酵素を用い、２段階の酵素反応を必要とする点で簡便性において改良の余地を残す。
【００１３】
更に、これらのポリアミン測定方法は、尿中又は血中の総ポリアミンを測定するものであって、特定されたポリアミン化合物を特異的に測定しないため、おのずから診断可能な疾患状態又は生理状態について制約があり、又、疾患状態あるいは生理状態の種類によっては診断の精度に問題がある、と考えられる。
【００１４】
そこで本発明は、簡便な酵素法として構成されたポリアミン測定法であって、診断手段としての感度が十分に高く、しかも各種の疾患状態や生理状態との関係において注目されている特定のポリアミン化合物を特異的に測定することができるポリアミン測定方法を提供し、これによって一定の疾患状態や生理状態に対する有利かつ有効な診断を可能とすることを、解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量を測定する、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００１６】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るポリアミン酸化酵素が、少なくとも燕麦を包含する麦科植物群から選ばれた植物に由来する酵素である、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００１７】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る高感度発色試薬が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩である、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００１８】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中のスペルミン量を測定する、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００１９】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係るポリアミン酸化酵素が、少なくとも大麦を包含する麦科植物群から選ばれた植物に由来する酵素である、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００２０】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第４発明又は第５発明に係る高感度発色試薬が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩である、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
【００２１】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、同一検体の同一試料に基づく下記の測定値Ａから下記の測定値Ｂを差し引くことにより、赤血球中のスペルミジン量の算定値Ｃを求める、赤血球中ポリアミンの測定方法である。
測定値Ａ：請求項１〜請求項３のいずれかに記載の赤血球中ポリアミンの測定方法により得られた、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量の測定値。測定値Ｂ：請求項４〜請求項６のいずれかに記載の赤血球中ポリアミンの測定方法により得られた、赤血球中のスペルミンの測定値。
【００２２】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、第７発明に係る測定値Ａ、測定値Ｂ、及び算定値Ｃのいずれか１以上の値を指標として、これらの指標との関連が認められる疾患状態又は生理状態について検体の診断を行う、診断方法である。
【００２３】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第８発明に係る指標として少なくとも算定値Ｃが含まれる場合において、前記診断が臓器切除又は臓器移植の予後の診断である、診断方法である。
【００２４】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第８発明に係る指標として少なくとも測定値Ａが含まれる場合において、前記診断が癌の診断である、診断方法である。
【００２５】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量を測定するために用いられるものである、赤血球中ポリアミンの測定用キットである。
【００２６】
（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、少なくとも、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミン量を測定するために用いられるものである、赤血球中ポリアミンの測定用キットである。
【００２７】
（第１３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成され、かつ、赤血球中のスペルミジンを算定するための測定に用いられるものである、赤血球中ポリアミンの測定用キットである。
【発明の効果】
【００２８】
（第１発明の効果）
本願発明者は、生体内ポリアミンの内、 Spm及び Spdに着目した。前記の非特許文献１や非特許文献２、あるいはその他の多くの研究報告に示されるように、 Spm及び Spdは、その他の生体内ポリアミンに比較して指標物質としての価値が特に高く、この両者の合計量の測定は、患者の各種の疾患状態や生理状態について非常に有効な診断指標を与える。より具体的には、赤血球中の SpmとSpd の合計量は癌の診断指標として有効であり、あるいは悪性腫瘍に対する外科的治療、抗癌剤投与、放射線治療等を行った際の治療効果判定にも有効である。その他にも、赤血球中の SpmとSpd の合計量が有効な診断指標となる具体的な疾患状態や生理状態について、近い将来、多くの報告がなされることはほぼ確実である。
【００２９】
そして本願発明者は、 SpmとSpd に対して基質特異性を有するポリアミン酸化酵素が存在することから、このような酵素を用いる測定法により Spmと Spdの合計量を特異的に測定できるポリアミン測定方法の構築に成功した。その結果、適用範囲が広く、的確な診断を可能とする新たなポリアミン測定方法が提供されることとなった。
【００３０】
次に、本願発明者は赤血球中の Spm及び Spdに着目した。赤血球中のポリアミンは尿中や血漿中よりも高濃度であり、しかも大部分が遊離型の Spm及び Spdである。従って、高感度の測定が可能であり、しかも前記した久保田らの酵素法のような遊離型ポリアミンを得るための前処理が不要である。
【００３１】
更に、一般的に指摘されることであるが、血液またはその特定成分を対象とする測定方法では、患者に対して一定の侵襲的負荷を与える血液採取を伴うため、可及的に血液採取量を低減させることが求められる。そしてこの意味において、測定系も特に高感度に設計することが求められる。第１発明では、酵素反応で生じた過酸化水素量をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で発色させて定量する、と言う測定系を設計することにより、このような目的を達成した。
【００３２】
以上の各種の特徴点に基づき、第１発明の測定方法においては、後述の実施例において示すように、１回の測定当たり僅かに０．５ｍＬ又はそれ以下の充填赤血球を用いて、 Spm及び Spdの合計量を有効に測定することが可能となった。この点は、臨床的に極めて重要な意味を持つ。
【００３３】
なお、第１発明の測定方法は、例えば臓器切除又は臓器移植の予後の診断や、癌の診断等と言った臨床的な各種の診断目的に利用できるだけでなく、例えば細胞の分裂や増殖の研究、 DNA合成、 RNA合成又はタンパク質合成の研究等と言う基礎研究に対しても、有力な研究手段を提供することができる。
【００３４】
（第２発明の効果）
上記の第１発明で用いるポリアミン酸化酵素は、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有する限りにおいて、その種類又は由来を限定されないが、麦科植物に由来するポリアミン酸化酵素、とりわけ燕麦に由来するポリアミン酸化酵素（以下、これを「 OSPO 」とも言う）を好ましく例示することができる。
【００３５】
（第３発明の効果）
上記の第１発明又は第２発明で用いるジフェニルアミン系の高感度発色試薬の種類は必ずしも限定されないが、好ましくは、試料としての０．５ｍＬ又はそれ以下の充填赤血球中のスペルミン及びスペルミジンを、過酸化水素の生成を通じて有効に検出できる程度に高感度な発色試薬、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩を好ましく例示することができる。この金属塩としては、特にアルカリ金属塩、とりわけナトリウム塩を好ましく例示することができる。以下において、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンのナトリウム塩を、「 DA-64」とも呼ぶ。
【００３６】
（第４発明の効果）
生体内ポリアミンの内、スペルミンのみに着目することも重要な意味がある。本願発明者は、現在までのところ、患者の疾患状態や生理状態の診断指標としての赤血球中 Spm量について、必ずしも明確な理解を持っていないが、基礎研究のレベルにおいて報告されている Spmの多様な生理作用から、近い将来、赤血球中の Spm量が有効な診断指標となる疾患状態や生理状態について多くの報告がなされることは、ほぼ確実である。
【００３７】
又、例えば前記の非特許文献１によれば、スペルミジンの濃度が肝臓等の臓器の摘出又は移植の予後の診断指標として有効である。そして、同一検体から採った同一試料について、第１発明の測定方法による測定値と第４発明の測定方法による測定値とが得られれば、その試料におけるスペルミジン濃度を容易に算定することができる。
【００３８】
これらの点から、第４発明においても、前記第１発明の作用・効果と同様に、適用範囲が広く、的確な診断を可能とする新たなポリアミン測定方法が提供されることとなる。又、赤血球中の Spmを対象とするために高感度の測定が可能であり、遊離型ポリアミンを得るための前処理が不要であり、かつ、１回の測定当たり僅かに０．５ｍＬ又はそれ以下の充填赤血球に基づいて測定できると言う利点がある。更に、臨床的な各種の診断目的の他に、基礎研究に対しても有力な研究手段を提供できる点でも、第１発明と同様である。
【００３９】
なお、本願発明の作用・効果と直接の関係はないが、農業分野でも Spm量の測定は重要な意味を持っている。例えば、タバコモザイクウイルスに感染したタバコの葉は健全なタバコの葉に比較して２０倍量以上の Spmを蓄積し、このような葉からは感染が植物全体に拡がらないことが認められている。 Spmの一般的な機能としては、シグナル伝達に関与するタンパク質のリン酸化に Spmが関係すると言われているが、いずれにせよ、タバコの葉において、 Spmが感染特異的タンパク質群の誘導を通じて病原体抵抗性を誘導すると言われている。従って Spm量の測定は、ウイルス病原体に対する抵抗性植物の作出等において重要な知見を与えることが予想される。
【００４０】
（第５発明の効果）
上記の第４発明で用いるポリアミン酸化酵素は、スペルミンに基質特異性を有する限りにおいて、その種類又は由来を限定されないが、麦科植物に由来するポリアミン酸化酵素、とりわけ大麦に由来するポリアミン酸化酵素（以下、これを「 BSPO 」とも言う）を好ましく例示することができる。
【００４１】
（第６発明の効果）
上記の第４発明又は第５発明で用いるジフェニルアミン系の高感度発色試薬の種類は必ずしも限定されないが、前記第３発明の場合と同様に、好ましくは、試料としての０．５ｍＬ又はそれ以下の充填赤血球中のスペルミンを、過酸化水素の生成を通じて有効に検出できる程度に高感度なジフェニルアミン系の発色試薬、例えば、 DA-64や、これと類似の各種金属塩を例示することができる。
【００４２】
（第７発明の効果）
第７発明においては、同一検体の同一試料について、赤血球中の Spm＋Spd の合計量の測定値Ａから赤血球中の Spm量の測定値Ｂを差し引くので、赤血球中の Spd量の算定値Ｃを簡単に求めることができる。
【００４３】
この測定値Ｃは、肝臓等の臓器の摘出又は移植の予後の診断指標として有効であり、その他にも、近い将来、赤血球中の Spd量が有効な診断指標となる具体的な疾患状態や生理状態について多くの報告がなされることはほぼ確実である。
【００４４】
（第８発明の効果）
第８発明のように、赤血球中の Spm＋Spd の合計量である測定値Ａ、赤血球中の Spm量である測定値Ｂ、赤血球中の Spd量である算定値Ｃのいずれか１の値を指標として、各種の疾患状態又は生理状態について、簡便にかつ精度良く検体の診断を行うことができる。検体は必ずしもヒトに限られず、例えば、ヒト以外の各種の哺乳動物であり得る。
【００４５】
測定値Ａ／測定値Ｂ／算定値Ｃの個別の診断指標としての価値は前記した通りであるが、近い将来、測定値Ａ／測定値Ｂ／算定値Ｃの内の任意の２項目の組み合わせ、あるいは全ての項目の組み合わせにより有効に診断され得る具体的な疾患状態や生理状態について多くの報告がなされることは、ほぼ確実である。
【００４６】
（第９発明の効果）
上記した第８発明において、診断の指標として少なくとも算定値Ｃが含まれる場合には、臓器切除又は臓器移植の予後の診断を行うことが特に好ましい。
【００４７】
（第１０発明の効果）
上記した第８発明において、診断の指標として少なくとも測定値Ａが含まれる場合には、癌の診断を行うことが特に好ましい。
【００４８】
（第１１発明〜第１３発明の効果）
第１１発明〜第１３発明のいずれかに係る赤血球中ポリアミンの測定用キットを用いることにより、赤血球中の Spm量及び／又は Spd量の測定を、精度良く、かつ簡単に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
次に、本願の第１発明〜第１３発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。
【００５０】
〔赤血球中ポリアミンの測定方法〕
（方法の概要）
本発明に係る赤血球中ポリアミンの測定方法には、第１〜第３の三つの測定方法がある。
【００５１】
第１の測定方法は、血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、 Spm及び Spdに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中の Spm及び Spdの合計量を測定する、と言う方法である。第１の測定方法において、溶出液にポリアミン酸化酵素を作用させる際の条件は、要するにポリアミン酸化酵素の作用に好適な条件であれば良い。例えばポリアミン酸化酵素が燕麦由来のポリアミン酸化酵素（OSPO）の場合には、ｐＨを６〜７程度、とりわけ６．５程度とし、温度を３０〜４０°Ｃ程度、とりわけ３７°Ｃ程度に設定することが好ましい。
【００５２】
なお、第１の測定方法及び下記の第２の測定方法において、酵素反応系に適当なペルオキシダーゼを共存させることが好ましく、あるいは必要である。
【００５３】
第２の測定方法は、血液より分離精製した赤血球の溶出液に対して、 Spmに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素を作用させ、生じた過酸化水素をジフェニルアミン系の高感度発色試薬で定量することにより、赤血球中の Spm量を測定すると言う方法である。
【００５４】
第２の測定方法において、溶出液にポリアミン酸化酵素を作用させる際の条件は、酵素に対する一般的な意味での好適な条件だけでなく、酵素の Spmに対する基質特異性（とりわけ Spd等の他の生体内ポリアミンと比較しての基質特異性）が最も顕著に現れる条件を選択することが好ましい。例えばポリアミン酸化酵素が大麦由来のポリアミン酸化酵素（BSPO）の場合には、ｐＨを４〜５程度、とりわけ４．５程度に設定することが好ましい。温度は、３０〜４０°Ｃ程度、とりわけ３７°Ｃ程度に設定することが好ましい。
【００５５】
第３の測定方法は、同一検体の同一試料に基づく測定値Ａ（第１の測定方法により得られた、赤血球中の Spm及び Spdの合計量の測定値）から測定値Ｂ（第２の測定方法により得られた、赤血球中の Spm量の測定値）を差し引くことにより、赤血球中の Spd量の算定値Ｃを求める、と言う方法である。
【００５６】
（試料の調製）
上記の第１の測定方法及び第２の測定方法において、検体、例えば患者としてのヒトから採取した血液より赤血球を分離精製する方法、及び、その赤血球より内容物（原形質）を溶出させる方法は限定されず、後述の実施例で行った方法も含めて、公知の任意の方法を採用することができる。
【００５７】
（ポリアミン酸化酵素）
第１の測定方法で言う「ポリアミン酸化酵素」とは、実質的に Spmと Spdのみに特異的に作用してこれらを酸化し過酸化水素を生成させる酵素を言うのであって、その種類又は由来は限定されず、このような基質特異性が認められる任意のポリアミン酸化酵素を使用することができる。その好ましい一例として燕麦（カラス麦：oat seedling）由来のポリアミン酸化酵素を挙げることができる。燕麦以外の麦科植物からも、あるいはそれ以外の任意の生物種からも、このようなポリアミン酸化酵素が見出される可能性がある。
【００５８】
後述の実施例で用いた燕麦由来のポリアミン酸化酵素は、構成上のタイプとしては FADを有する酵素であり、反応機構面からは２級アミノ基を特異的に切断する酵素である。この酵素は、信頼できる市販品があればそれを用いることもできるし、後述の実施例のような方法でカラス麦実生から作製することもできる。
【００５９】
下記の「化１」において、燕麦由来のポリアミン酸化酵素（OSPO）をスペルミジン（Spermidine）に作用させた場合と、スペルミン（Spermine）に作用させた場合との反応式を示す。
【００６０】
【化１】
2005348630.tif 000003
第２の測定方法で言う「ポリアミン酸化酵素」とは、実質的に Spmのみに特異的に作用してこれを酸化し、過酸化水素を生成させる酵素を言うのであって、その種類又は由来は限定されず、このような基質特異性が認められる公知の任意のポリアミン酸化酵素を使用することができる。このような酵素の好ましい一例として、大麦（ barley seedling）由来のポリアミン酸化酵素（BSPO）を挙げることができる。燕麦以外の麦科植物からも、あるいはそれ以外の任意の生物種からも、このようなポリアミン酸化酵素が見出される可能性がある。
【００６１】
後述の実施例で用いた大麦由来のポリアミン酸化酵素は、前記の OSPO と同様、構成上のタイプとしては FADを有する酵素であり、反応機構面からは２級アミノ基を特異的に切断する酵素である。この酵素は、信頼できる市販品があればそれを用いることもできるし、後述の実施例のような方法で大麦実生から作製することもできる。
【００６２】
BSPOをスペルミンに作用させた場合の反応式は、前記「化１」中の OSPO をスペルミンに作用させた場合と同様である。
【００６３】
（高感度発色試薬）
第１の測定方法及び第２の測定方法において、ジフェニルアミン系の高感度発色試薬とは、基本骨格としてジフェニルアミンの構造を持ち、過酸化水素と鋭敏に反応して特定の色彩に発色する化学物質を言う。その発色の度合いを、色彩に対応する所定の波長域における吸光度測定等で測定することにより、過酸化水素の定量を通じて試料中の Spmと Spdの合計量（又は Spm量）を正確に測定することができる。
【００６４】
高感度発色試薬として特に好ましいものが、Ｎ−（カルボキシメチルアミノ−カルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンの金属塩、特にそのアルカリ金属塩、とりわけナトリウム塩（ DA-64）である。
【００６５】
下記の「化２」において、ペルオキシダーゼ（ POD）の存在下における DA-64と過酸化水素との反応スキームを示す。「化２」中、「Bindschedler's Green」とあるのは、 DA-64から生成する緑色の色素であって、極大吸収が７２７ｎｍにある。反応スキームの下部には、 DA-64と Bindschedler's Green との化学構造を併せ示している。
【００６６】
【化２】
2005348630.tif 000004
〔診断方法〕
本発明に係る診断方法は、上記第１の測定方法により得られた測定値Ａ、上記第２の測定方法により得られた測定値Ｂ、及び「Ａ−Ｂ」の演算により得られた算定値Ｃのいずれか１以上の値を指標として、これらの指標との関連が認められる疾患状態又は生理状態について検体の診断を行う、と言う診断方法である。
【００６７】
上記の「疾患状態又は生理状態」は、上記の指標との関連が一定以上の信頼性を持って認められる限りにおいて限定されないが、例えば、少なくとも算定値Ｃが含まれる指標については、臓器切除又は臓器移植の予後の疾患状態又は生理状態が該当する。又、少なくとも測定値Ａが含まれる指標については、各種の悪性腫瘍に係る癌患者の疾患状態又は生理状態が該当する。
【００６８】
その他に、現時点では、感染症、肝硬変症、糖尿病（Ｉ型）、アルツハイマー病等の疾患状態でポリアミン濃度の上昇が報告されているため、これらの疾患状態が本発明に係る診断方法の対象となる可能性がある。
【００６９】
〔赤血球中ポリアミンの測定用キット〕
本発明に係る赤血球中ポリアミンの測定用キットには、以下の第１の測定用キット〜第３の測定用キットの３種類がある。
【００７０】
第１の測定用キットは、少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成されるものであり、赤血球中のスペルミン及びスペルミジンの合計量を測定するために用いられる。
【００７１】
第２の測定用キットは、少なくとも、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成されるものであり、赤血球中のスペルミン量を測定するために用いられる。
【００７２】
第３の測定用キットは、少なくとも、スペルミン及びスペルミジンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、スペルミンに基質特異性を有するポリアミン酸化酵素剤と、過酸化水素定量用のジフェニルアミン系高感度発色試薬とを含んで構成されるものであり、赤血球中のスペルミジンを算定するための測定に用いられる。
【００７３】
上記の各測定用キットにおいては、好ましくは更に適宜な種類のペルオキシダーゼ酵素剤を含むことができる。ポリアミン酸化酵素剤やペルオキシダーゼ酵素剤は、例えば安定な凍結乾燥品として、別容器に封入された適宜な溶解液（適正なｐＨの緩衝液等）と共に提供することができる。更にこれらの測定用キットは、例えば後述の実施例で示すような、適宜なイオン交換樹脂カラム等の装置類を含むことができる。更にこれらの測定用キットは、この種の測定用キットの通常の構成要素である緩衝液、中和液、標準液等の必要又は有益な要素を含むことができる。
【実施例】
【００７４】
〔実施例１：第１の測定方法〕
（ OSPO の作製）
暗室で２１日間発芽させたカラス麦実生を冷精製水にて絞り出し、その搾汁をクエン酸でｐＨ４に調整することにより沈殿を生じさせた。次にこの沈殿物を遠心分離して、１ｍｏｌ濃度の塩化ナトリウムを含んだｐＨ６のクエン酸緩衝液に溶解させ、これに−１５°Ｃのアセトンを等量加えて沈殿を生じさせた。
【００７５】
経験的に、このアセトン沈殿分画による粗精製酵素でも OSPO の酵素剤として十分に利用できることは分かっているが、本実施例では、このアセトン沈殿分画をセファデックスＧ−１００（ SephadexG-100）を用いて常法に従い精製した。その結果、カラス麦実生３７８ｇから OSPO の精製物１２００単位を得た。
【００７６】
OSPO （及び、後述の BSPO やその他の酵素）の「１単位」とは、３５°Ｃにおいて毎分１．０ｎｍｏｌの過酸化水素を生成させるだけの酵素反応を起こす酵素量を言う。
【００７７】
（検体試料の調製）
年齢が１９〜５２才にわたる男女各１５名の健常者と、年齢が２３〜６２才にわたる種々の固形癌を持つ未処置入院患者４６名とを被検者とした。女性被検者として、ポリアミン濃度の変動が知られている月経前の者は除外した。
【００７８】
これらの被検者のヘパリン血より得られた充填赤血球それぞれ０．５ｍＬに対して、１０％トリクロル酢酸溶液０．５ｍＬを加え、攪拌した後に３０００rpm
で１０分間遠心分離を行い、除蛋白した。次に、その上清液０．５ｍＬに対して１．０ｍｏｌ／Ｌのトリス溶液〔ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン〕を加えてｐＨを８とした後、弱酸性カチオン交換樹脂（米国 Bio-Rad Laboratories 社製の Bio-Rex 70 ）に添加し、精製水２．０ｍＬにて洗浄した後、１．０ｍＬの１０％トリクロル酢酸溶液にて赤血球の内容物を溶出した。そしてこの溶出液に１．０ｍｏｌ／Ｌのトリス溶液を加えてｐＨを６．５に調整し、測定用試料液とした。
【００７９】
（酵素反応）
ポリアミン酸化酵素液は、０．１ｍｏｌ／Ｌの PIPES緩衝液〔ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）：ｐＨ６．５〕１０ｍＬに対して、１８単位のペルオキシダーゼ（セイヨウワサビ由来のタイプＸのペルオキシダーゼ）、０．１８９ｍｇのDA-64 （和光純薬製）、及び上記により調製した５０単位の OSPO を加えて用時調製した。そして、このポリアミン酸化酵素液２．０ｍＬを上記の測定用試料液１．０ｍＬに加えて３７°Ｃで１５分間反応させた後、生じた緑色色素を、その極大吸収波長である７２７ｎｍで吸光度測定し、その結果から赤血球中の Spmと Spdの合計量を計算した。
【００８０】
なお、盲検としては、充填赤血球の代わりに精製水０．５ｍＬを用い、上記と同様に操作した。
【００８１】
（測定結果）
以上の測定の結果、充填赤血球サンプル中の Spmと Spdの合計量は、３０名の健常な被検者においては２５．０９±４．６１μｍｏｌ／Ｌ（mean±S.D.）の範囲内に分布し、４６名の固形癌を持つ未処置入院患者においては３５．５６±８．９５μｍｏｌ／Ｌ（mean±S.D.）の範囲内に分布した。
【００８２】
詳細なデータの提示は控えるが、検量線は Spm、 Spdともに１μｍｏｌ／Ｌ〜２００μｍｏｌ／Ｌで良好な直線を示した。酵素反応経過時間で見るとほぼ５分でプラトーに達し、反応は終了していた。同時再現性は C.V. ５％以内を示し、精密度は良好であった。回収率も９０〜１０４％と良好であった。
【００８３】
以上の結果から、第１の測定方法の結果は癌と言う疾患状態を明瞭に反映しており、癌の診断手段、あるいは少なくとも補助診断の手段として有効であることが分かる。
【００８４】
（公知の測定方法との対比）
上記の３０名の健常な被検者に対し、前記と同一の充填赤血球サンプルを用い、煩雑ではあるが従来から一般的な測定法として行われている HPLC 法によってサンプル中の Spmと Spdの合計量を測定した。
【００８５】
この HPLC 法の概略を述べると、次の通りである。即ち、まず充填赤血球をとり、１，６−ジアミノヘキサン溶液（内部標準）及びトリトンＸ−１００を１滴加えて溶血させる。その後１０％トリクロル酢酸を加えて混和し、遠心分離器にて遠心分離し、上清を採る。上清はロータリーエバポレーターで蒸発乾固させ、残留物を蒸留水で溶解した後、水層を HPLC に注入して分析する。 HPLC 中のポリアミンはオルトフタルアルデヒド試薬による蛍光反応で検出する。
【００８６】
４６名の固形癌の患者におけるサンプル中の Spmと Spdの合計量の測定値について、 HPLC 法による測定の場合と、前記第１の測定法による測定の場合との結果を図１に示す。図１の「黒丸」のプロットは個々の被験者の測定値を示し、プロットの縦軸方向の位置が HPLC 法による測定値を、横軸方向の位置が第１の測定法による測定値を示す。
【００８７】
図１から明らかなように、第１の測定法による測定結果は、 HPLC 法との相関において、相関係数ｒ＝０．９４４と良好であった。
【００８８】
（評価）
以上の結果から、第１の測定方法の結果は癌と言う疾患状態を明瞭に反映しており、癌の診断手段、あるいは少なくとも補助診断の手段として有効であることが分かる。
【００８９】
〔実施例２：第２の測定方法〕
第２の測定方法に関しては、今のところ、第１の測定方法についての上記実施例１のように、健常者と特定の疾患状態又は生理状態にある者との比較臨床データを得るような段階には至っていない。しかしながら、大麦由来のポリアミン酸化酵素 BSPO について、以下に示すように、その基質特異性を含めた各種特性を十分に確認できるデータを得ており、従って実施例１と同様の臨床レベルの測定を行った場合、実施例１と同等の有効な測定結果を得ることは確実である。
【００９０】
以下の実施例２は、異なる旨が明記されている事項を除き、基本的には実施例１と同様のプロセス及び手段により行っている。
【００９１】
（ BSPO の作製）
対象とした大麦の種類は、六条大麦（Hordeum vulgare L.）の内、異なる２品種（べんけい麦、シュンライ）を用いた。そして、暗室で栽培・発芽させたそれぞれの種類の大麦の実生より BSPO を作製した。
【００９２】
その作製方法はSmith の方法を改良したものであって、概要を述べると、大麦実生を冷却下でホモジナイズし、アセトン沈殿を行った後に、セルロースホスフェート樹脂を用いた吸着を行い、吸着した酵素をクエン酸緩衝液（塩化ナトリウムを含む）にて溶出させた後に硫酸アンモニウムで沈殿させ、透析によって抽出・粗精製を行う方法である。
【００９３】
（ BSPO の酵素反応の至適条件と基質特異性）
基質として Spm及び Spdを用い、上記２種類の大麦から作製した BSPO の至適ｐＨ・酵素濃度・反応時間を求めた。
【００９４】
その結果、要点だけを述べると、 BSPO の酵素反応至適ｐＨに関しては、基質に Spmを用いた場合は、ｐＨ４〜５において強い活性が見られた。一方、基質に Spdを用いた場合は、ｐＨ６〜７において活性の上昇が見られた。しかも、ｐＨ４〜５における Spmに対する活性値はｐＨ６〜７における Spdに対する活性値の約２５倍と言う高い値を示した。従って BSPO は、ｐＨ４〜５と言う液性条件下において Spmに対して高い基質特異性を有することを確認した。
【００９５】
なお、ヒスタミン、カダベリン及びプトレッシンについても BSPO の基質特異性を検討したが、ｐＨ６〜７及びｐＨ４〜５の条件下において、ヒスタミン、カダベリン及びプトレッシンは BSPO に対して基質特異性を有していないことを確認した。
【００９６】
（ BSPO の相互比較）
上記の六条大麦（シュンライ）の一定量の実生から作製した粗精製 BSPO と、べんけい麦の同量の実生から作製した粗精製の BSPO との酵素活性を比較したところ、両者は同等の活性が見られた。
【００９７】
（ BSPO の酵素反応時間）
基質として Spm１００μｍｏｌ／１００ｍＬを用い、酵素活性６０〜１００単位／μＬを有する BSPO で酵素反応させたところ、ほぼ３０分以内に酵素反応は終了していた。
【００９８】
（検量線）
BSPO の酵素活性について、基質として Spmを用いて検討したところ、１０μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌで直線の検量線が得られた。
【００９９】
（ BSPO を用いた赤血球中ポリアミンの測定）
任意の健常な被験者から採取したヘパリン血を用い、前記の実施例１と同様の測定用試料液を調製した。次に、実施例１と同様の手法により、べんけい麦由来の BSPO を含むポリアミン酸化酵素液と、シュンライ由来の BSPO を含むポリアミン酸化酵素液とを調製した。
【０１００】
そして、クエン酸緩衝液で酵素反応時のｐＨを４．５に調整した点を除いては実施例１と同様にして、測定用試料液に上記それぞれのポリアミン酸化酵素液を加えて酵素反応させ、生じた緑色色素を７２７ｎｍで吸光度測定した。又、これとは別に、上記と同一のサンプルを用い、 HPLC 法によってサンプル中の Spm量を測定した。
【０１０１】
その結果、２種類の BSPO を用いた第２の測定法による Spm量の測定結果は、それぞれ、 HPLC 法による Spm量の測定結果との相関において、実施例１の場合とほぼ同等の良好な相関係数であった。
【０１０２】
（評価）
以上の結果から、第２の測定方法は、前記実施例１の結果とも考え併せると、赤血球中の Spm量が指標となる特定の疾患状態又は生理状態について、有効な診断手段あるいは少なくとも有効な補助診断の手段を提供できることが分かる。
【０１０３】
更に、同一検体の同一試料に基づく限りにおいて、第１の測定方法による測定値から第２の測定方法による測定値を差し引くことにより、十分に信頼できる赤血球中Spd 量の値を算定できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明により、赤血球中ポリアミン量が指標となる多様な疾患状態又は生理状態、例えば癌や臓器切除又は臓器移植の予後判定について、簡易かつ信頼性のある診断手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】実施例における測定結果を示すグラフ図である。
【図１】
2005348630.tif 000005