(57)【要約】【課題】  本発明は、中枢神経系疾患または末梢神経障害の処置に有用な化合物を提供する。【解決手段】  本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）で示される。【化１】2005075832.tif 000020  ［式中、ｎは１〜４の整数；  Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびメチル基から選ばれ；  Ｒ３は独立して、１〜３個の炭素原子を含有する直鎖、分枝鎖または環式アルキル基（Ｒ３ａ）および単純アミノ基（Ｒ３ｂ）またはニトロ基で置換されたアミノ基（Ｒ３ｃ）から選ばれる］【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2005075832.tif 000010
［式中、ｎは１〜４の整数；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびメチル基から選ばれ；
Ｒ３は独立して、１〜３個の炭素原子を含有する直鎖、分枝鎖または環式アルキル基（Ｒ３ａ）および単純アミノ基（Ｒ３ｂ）またはニトロ基で置換されたアミノ基（Ｒ３ｃ）から選ばれる］
で示される化合物、またはその医薬的に許容しうる塩。
【請求項２】
ｎが２およびＲ１とＲ２が共にメチル基である式（Ｉ）の請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３が１〜３個の炭素原子を含有する直鎖、分枝鎖または環式アルキル基である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメチル基である請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３がアミノ基である請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の、認識能力の衰退または乏しい機能に付随する病的症状、たとえば老人痴呆、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ痴呆症候群、行動障害およびうつ病を処置する医薬品としての使用。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の、脳虚血を処置する医薬品としての使用。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の、機械的または代謝起点の末梢神経障害を処置する医薬品としての使用。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の、慢性関節リウマチなどの変性炎症性徴候を処置する医薬品としての使用。
【請求項１０】
活性物質として、請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の少なくとも１種を含有する医薬製剤。
【請求項１１】
活性物質として、請求項２に記載の化合物またはその医薬的に許容しうる塩の少なくとも１種を含有する医薬製剤。
【請求項１２】
中枢神経系の各種病的症状、たとえば老人痴呆、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ痴呆症候群、行動障害およびうつ病の処置に用いる、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
脳虚血の処置に用いる、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
機械的または代謝起点の末梢神経障害の処置に用いる、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
慢性関節リウマチなどの変性炎症性徴候の処置に用いる、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
ビヒクル、結合剤、フレーバー、甘味剤、崩壊剤、保存剤、湿潤剤およびこれらの混合物からなる群から選ばれる医薬的に許容しうる不活性な成分、または非経口、経皮、経粘膜もしくは直腸吸収を容易にする成分あるいは活性物質の時間にわたる制御放出を可能ならしめる成分をも含有する請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ａが請求項１の記載と同意義である式（Ｉ）の請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
ａ）式（ＩＩ）：
【化２】
2005075832.tif 000011
［式中、ｎ，Ｒ１およびＲ２は前記と同意義である］
のアダマンチルアルキルアミンを、無水不活性溶媒、好ましくはテトラヒドロフラン中、第三塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で、式（ＩＩＩＡ）：
【化３】
2005075832.tif 000012
［式中、Ｒ３ａは前記と同意義である］
の塩酸塩形状に塩化したアルキルアセトアミデートと２〜７２時間反応させて、式（ＩＡ）：
【化４】
2005075832.tif 000013
［式中、ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ａは前記と同意義である］
の対応する最終化合物を得；次いで
反応物から式（ＩＡ）の化合物を、未変性形状でまたは医薬的に許容しうる塩で回収し、常法に従って精製する
ことを特徴とする製造法。
【請求項１８】
ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ｂが請求項１の記載と同意義である式（Ｉ）の請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
ａ）式（ＩＩ）：
【化５】
2005075832.tif 000014
［式中、ｎ，Ｒ１およびＲ２は前記と同意義である］
のアダマンチルアルキルアミンを、無水不活性溶媒、好ましくはアセトニトリル中、第三塩基、好ましくはトリエチルアミンの存在下で、式（ＩＩＩＢ）：
【化６】
2005075832.tif 000015
［式中、Ｒ３ｂは前記と同意義である］
の塩酸塩形状に塩化した１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジンと２〜７２時間反応させて、式（ＩＢ）：
【化７】
2005075832.tif 000016
［式中、ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ｂは前記と同意義である］
の対応する最終化合物を得；次いで
反応物から式（ＩＢ）の化合物を、未変性形状でまたは医薬的に許容しうる塩で回収し、常法に従って精製する
ことを特徴とする製造法。
【請求項１９】
ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ｃが請求項１の記載と同意義である式（Ｉ）の請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
ａ）式（ＩＩ）：
【化８】
2005075832.tif 000017
［式中、ｎ，Ｒ１およびＲ２は前記と同意義である］
のアダマンチルアルキルアミンを、無水不活性溶媒、好ましくはエチルエーテル中、やや不足量の式（ＩＩＩＣ）：
【化９】
2005075832.tif 000018
［式中、Ｒ３ｃは前記と同意義である］
のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ’−ニトログアニジン、好ましくはアダマンチルアルキルアミン（ＩＩ）１．３モル当り１モルのＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ’−ニトログアニジン（ＩＩＩＣ）と２〜７２時間反応させて、式（ＩＣ）：
【化１０】
2005075832.tif 000019
［式中、ｎ，Ｒ１，Ｒ２およびＲ３ｃは前記と同意義である］
の対応する最終化合物を得；次いで
反応物から式（ＩＣ）の化合物を未変性形状で回収し、常法に従って精製する
ことを特徴とする製造法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示されるアダマンタンの新規アミジンおよびグアニジン誘導体、およびこれらの医薬的に許容しうる塩に関する。
【化１】
2005075832.tif 000002
【０００２】
上記式中、ｎは１〜４の整数；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびメチル基から選ばれ；
Ｒ３は独立して、１〜３個の炭素原子を含有する直鎖、分枝鎖または環式アルキル基（Ｒ３ａ）および単純アミノ基（Ｒ３ｂ）またはニトロ基で置換されたアミノ基（Ｒ３ｃ）から選ばれる。
【０００３】
本発明の主題である化合物は、ＮＭＤＡレセプタの非競合的レセプタ拮抗薬であって、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、たとえばアルツハイマー病、老人痴呆、脳虚血およびうつ病の処置、または神経障害性末梢形態の処置に有利に使用でき、これらの病状は多分、グルタマター作用性（glutamatergic）系の機能不全と少なくとも部分的に相互関係するだろう。
【０００４】
ＮＭＤＡレセプタは、ＡＭＰＡレセプタおよびカイニン酸塩レセプタといっしょに、グルタミン酸イオン性（ionotropic）レセプタのファミリーに属する。中枢神経系に存在する種々のＮＭＤＡレセプタは、該レセプタを区別するカルシウムチャネルを形成する、たん白サブユニット（ＮＲ１、ＮＲ２Ａ−Ｄ、ＮＲ３）の組成によって分化される。グルタミン酸（作用薬）およびグリシン（補助作用薬）の結合部位は、レセプタの細胞外の部分に存在する。加えて、チャネル外側の少なくとも別の２つのモジュレーター部位（ポリアミンおよび亜鉛）とチャネル内側の２つ（ＭＫ−８０１およびＭｇ２＋）が存在する。
【０００５】
グルタマター作用性のシナプス前の神経単位が、作用潜在性に従って、グルタミン酸分子をシナプスに放出すると、生理学的条件下で、ＮＭＤＡチャネルへのカルシウム流入が起こる。放出したグルタメートは、シナプス後の神経単位のＮＭＤＡレセプタの触媒部位と相互作用し、そして、チャネルがいったん、静止条件下で占有するマグネシウムから解放されると、該グルタメートは細胞外媒体から細胞内媒体へのカルシウム流入を可能ならしめる。
【０００６】
ＮＭＤＡレセプタと関連するカルシウムチャネルが、数ミリセカンド以上の間カルシウム流入に対し開放のままでいると（病的症状）、細胞内反応のカスケードが開始し、神経単位死（細胞消滅）に導く。すなわち、カルシウムイオンの流入をブロックするか、あるいはＮＭＤＡレセプタ結合部位と相互作用することによって、治療介入がなされうる。
【０００７】
本発明に係る化合物の効果について、インビトロおよびインビボ両方の前臨床薬理学で実験した。
インビトロで、これら化合物の幾つかは、ラット海馬のノルアドレナリン作用性神経単位に関して、ＮＭＤＡ−誘発レセプタ活性化をサブミクロモル濃度範囲で抑制することが証明される。
本発明の主題を構成する化合物の幾つかはまた、ラット海馬スライスにおけるノルアドレナリン（ＮＥ）の基礎放出を増加し、かつ線条体におけるドパミンとアセチルコリンの基礎放出の両方を増加することも証明される。それらの幾つかは、虚血発作によって喚起されるアスパルテートの放出をブロックすることが証明される。
【０００８】
また本発明の主題である化合物は、誘発できるＮＯ（酸化窒素）シンセターゼ（ｉＮＯＳ）のインヒビターであることが証明される。この酵素は、多くのプロ炎症性サイトカインの存在下または内毒素によって誘発されるが、各種の細胞、たとえば好中球や大食細胞で発現される。
【０００９】
すなわち、本発明に係る化合物はまた、炎症性疾患、たとえば慢性関節リウマチにも有利に使用しうる。ＮＭＤＡレセプタやｉＮＯＳ酵素に対するそれらの複合拮抗薬活性は、機械的起点（圧搾、挫傷、骨折等）または代謝起点の末梢神経障害の処置に、たとえば真性糖尿病の場合におよび散在性神経単位ロスや、学習および記憶のおよび運動コントロールのメカニズムの両欠陥の特徴である、“ＡＩＤＳ痴呆症候群”として公知の神経学的症候群の処置に使用しうる。
【００１０】
また本発明の主題である化合物の神経保護効果は、虚血性脳病状の処置や予防にも首尾よく使用することができる。
本発明の主題である化合物は、薬物の抗うつ活性を評価するのに有効なモデルとして承認されているマウスの各種実験モデルに従って、抗うつ活性を有することが証明される。
【００１１】
すなわち、上述の化合物は、ＮＭＤＡレセプタ複合のおよびノルアドレナリン作用、ドパミン作用およびコリン作用系の活性化を調節する能力と、ｉＮＯＳ酵素の抑制からなる、それらの個々の作用メカニズムによって、認識能力の衰退または乏しい機能に付随する各種の疾患、たとえば、いずれかの起点のおよび脳虚血における末梢神経障害の処置のため、精神的能力の障害、器官および老人認識衰退、アルツハイマー病、老人痴呆、ＡＩＤＳ痴呆症候群、行動障害およびうつ病の処置および予防に有利に使用しうる。
【００１２】
痴呆一般、特にアルツハイマー病を処置する薬物の調査において、この１０年間で多数の研究が行なわれている。これらの薬物の中で、特別の役割は、アミノ−アダマンチル誘導体のメマンチン（memantine）によって演じられる。この物質はドパミン擬似活性のため、抗パーキンソン症候群薬物として１９８０年代に開発されたが、その後、ドパミンの放出を皮質−線条体レベルで促進するのに必要な濃度よりも１００倍までの低い濃度で、ＮＭＤＡレセプタ−関連チャネルを横切るカルシウムイオンの流れをブロックしうることがわかった。
【００１３】
これらの結果に基づき、memantine は、アルツハイマー病を処置する可能性のある薬物として再考された。しかしながら、memantine は、ＭＫ−８０１のレセプタ結合を抑制し、かつ海馬におけるＮＭＤＡのＮＥ−喚起放出を抑制する、本発明の主題である化合物に匹敵する活性を有するが、海馬でのＮＥの基礎放出における活性が顕著に低く、またちょうど誘発できるｉＮＯＳ酵素の抑制に全く活性がないかの如く、線条体でのＡchの基礎放出に全く不活性である。
【００１４】
上述の如く、memantine そのもの以外に各種のアダマンタンアミノ誘導体の、治療活性に関係する豊富な特許文献があり、たとえば、１９７１年のＤＥ１９  ４３  ４０４のクレームに、抗うつ活性を有する化合物が記載され；ＵＳ２００２／０２８８３６に、“カリウム−チャネルオープナー”としての活性を有する誘導体が言及され；ＷＯ９９／４２４５８のクレームに、ヒスタミンＨ３レセプタに対し高い親和性を有する化合物が記載され；ＷＯ９９／２０５９９に、神経変性障害を処置するアダマンチル誘導体が記載され；ＷＯ９１／１８８６８に、新規シグマレセプタ・リガンドが記載され；ＷＯ０３／０２４４０１に、新規ケモケミカルレセプタ・モジュレーターが言及され；ＵＳ５０６１７０３（１９９１年）のクレームに、虚血を予防し、処置するアミノ−アダマンチル誘導体が記載されている。
【００１５】
しかしながら、引用された特許のいずれにも、アミジンまたはグアニジン基で置換されたアダマンタン誘導体はクレーム化されておらず、またｉＮＯＳ酵素の抑制およびＮＥ、アセチルコリンおよびドパミン媒介物質の基礎放出の増加と共に、同時にＮＭＤＡレセプタ複合の過剰活性化を調節する可能性を付与する、これらの基の挿入が適当であるとする記載もない。
式Ｉで示される本発明の主題である化合物（誘導体）を製造する方法は、以下に示す操作で構成され、要約すると以下の通りである。すなわち、公知文献の手順［たとえば、Ｎovakov  Ｉ．Ａ．らの「Ｋhim．−Ｆarm．Ｚh．」（２１（４）、４５４−４５８、１９８７年）参照］によって得られる、一般式（ＩＩ）（ここで、Ｒ１，Ｒ２およびｎは前記と同意義である）の適切に置換したアダマンチルアルキルアミン（一般合成の反応式参照）を、一連の試薬と反応させることから成る。
【００１６】
上記試薬としては、
ａ）式（ＩＩＩＡ）（ここで、Ｒ３ａは前記と同意義である）の塩酸塩形状に塩化したアルキルアセトアミデートを用い；上記アダマンチルアルキルアミン（ＩＩ）に対し過剰のアルキルアセトアミデート（ＩＩＩＡ）（好ましくは（ＩＩ）１モルに対し（ＩＩＩＡ）２モル）およびアルキルアセトアミデート（ＩＩＩＡ）に対し理論量の第三塩基、好ましくはトリエチルアミンを存在させて、無水不活性溶媒、たとえばテトラヒドロフラン中、４℃〜溶媒の沸点の温度で２〜７２時間反応を行なって、対応する式（ＩＡ）（ここで、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３ａおよびｎは前記と同意義である）の最終誘導体を得る（下記一般合成の反応式の工程ａ参照）。
【００１７】
ｂ）式（ＩＩＩＢ）（ここで、Ｒ３ｂは前記と同意義である）の、上記アダマンチルアルキルアミン（ＩＩ）に対し理論量の塩酸塩形状に塩化した１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジンを用い；不活性溶媒、たとえばアセトニトリル中、第三塩基の存在下１０℃〜溶媒の沸点の温度で２〜７２時間反応を行なって、対応する式（ＩＢ）（ここで、Ｒ１，Ｒ２およびｎは前記と同意義、およびＲ３ｂはアミノ基である）の最終誘導体を得る（下記一般合成の反応式の工程ｂ参照）。
【００１８】
ｃ）式（ＩＩＩＣ）（ここで、Ｒ３ｃは前記と同意義である）のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ'−ニトログアニジンを用い；上記アダマンチルアルキルアミン（ＩＩ）に対し不足量のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ'−ニトログアニジン（好ましくは（ＩＩ）１.３モルに対し（ＩＩＩＣ）１モル）を存在させて、不活性溶媒、たとえばエチルエーテル中、５℃〜溶媒の沸点の温度で２〜７２時間反応を行なって、対応する式（ＩＣ）（ここで、Ｒ１，Ｒ２およびｎは前記と同意義、およびＲ３ｃはニトロアミン基である）の最終誘導体を得る（下記一般合成の反応式の工程Ｃ参照）。
【００１９】
一般合成の反応式（反応式１）：
【化２】
2005075832.tif 000003
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。
実施例１
Ｎ−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］アセタミジン（下記表１の化合物２）の製造：
１.７gの１−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］アミン（８.２０ミリモル）を、５０mLのテトラヒドロフランに懸濁する。室温で撹拌しながら、２.３mLのトリエチルアミン（１６.４ミリモル）および１.７３gのメチルアセトアミデート塩酸塩（１６.４ミリモル）を加える（懸濁液のpＨは約９である）。２４時間後（pＨは７に低下）、固体を濾別し、少量のテトラヒドロフランおよびエチルエーテルで洗う。残渣を水に溶かし、これを４Ｎ水酸化ナトリウム溶液でpＨ１１に塩基性化し、１時間撹拌し、次いで濾別し、水およびエチルエーテルで洗い、五酸化リン上で減圧乾燥する。
【００２１】
得られる固体をイソプロピルエーテルに懸濁し、ＨＣl／イソプロピルエーテルの８Ｍ溶液で酸性化して、塩酸塩（２.１g）を得、次いでこれを濾別し、イソプロピルエーテルで洗い、アセトニトリルより再結晶する。１.９gを得る。
式：Ｃ１６Ｈ２９ＣlＮ２（ＭＷ２８４.８７）、収率８０％
ＴＬＣ：（ブタノール／酢酸／水＝５：２：２），Ｒf０.７８、m.p．１６９℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），ppm：０.８５（ｓ，６Ｈ）、１.０５−１.５０（ｍ、１５Ｈ）、２.１８（ｓ、３Ｈ）、３.２０（ｍ、２Ｈ）、９.０８（bs、３Ｈ）
式ＩＡの全ての誘導体（反応式１参照）は、適当なアルキルアセトアミデートを用い同様な方法で製造される。
【００２２】
実施例２
Ｎ−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］グアニジン（下記表１の化合物４）の製造：
１.７gの１−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］アミン（８.２０ミリモル）を、５０mLのアセトニトリルに懸濁する。室温で撹拌しながら、１.１４mLのトリエチルアミン（８.２０ミリモル）および１.２gの１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジニウム塩酸塩（８.２０ミリモル）［Ｂernatowicz  Ｍ．Ｓ．らの「Ｊ．Ｏrg．Ｃhem．」（５７、２４９７−２５０２、１９９２年）参照］を加える。懸濁液を７０℃で６時間加熱し、室温で２４時間放置し、次いで０℃に冷却する。
【００２３】
析出した固体を濾別し、アセトニトリルで洗い、イソプロピルエーテルに懸濁し、ＨＣl／イソプロピルエーテルの８Ｍ溶液で酸性化して、塩酸塩を得、次いでこれを濾別し、イソプロピルエーテルで洗い、アセトニトリルより再結晶する。１.５gを得る。
式：Ｃ１５Ｈ２８ＣlＮ３（ＭＷ２８５.８５）、収率６５％
ＴＬＣ：（ブタノール／酢酸／水＝５：２：２），Ｒf０.８３、m.p．１８１℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），ppm：０.８２（ｓ，６Ｈ）、１.０５−１.４５（ｍ、１５Ｈ）、３.１０（ｍ、２Ｈ）、７.２５（bs、４Ｈ）、７.８０（bs、１Ｈ）
Ｒ３がアミノ基である式ＩＢの全ての誘導体は、同様な方法で製造される。
【００２４】
実施例３
Ｎ−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］ニトログアニジン（下記表１の化合物６）の製造：
１.４gの１−［２−（３,５−ジメチル−１−アダマンチル）エチル］アミン（６.８７ミリモル）を、エチルエーテル／水（３：１）混合物１６mLに溶解し、撹拌しながら、０.８gのＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎ'−ニトログアニジン（５.２８ミリモル）［Ｍckay  Ａ．Ｆ．の「Ｊ．Ａm．Ｃhem．Ｓoc．」（７１、１９６８−１９７０、１９４９年）参照］を滴下し、その間温度を２２℃以下に保持する。ガスの発生と沈殿物の形成が見られる。室温で３０分後、固体を濾別し、エチルエーテルで洗い、９５％エタノール（５０mL／g）より再結晶する。１.５gを得る。
【００２５】
式：Ｃ１５Ｈ２６Ｎ４Ｏ２（ＭＷ２９４.３９）、収率９６.５％
ＴＬＣ：（クロロホルム／メタノール／水／水性アンモニア＝８５：２５：２：１），Ｒf０.７５、m.p．２０５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６），ppm：０.７５（ｓ，６Ｈ）、０.９８−１.４５（ｍ、１５Ｈ）、３.０５（ｍ、２Ｈ）、７.８０（bs、３Ｈ）
Ｒ３がニトロアミン基である式ＩＣの全ての誘導体は、同様な方法で製造される。
【００２６】
本発明に従って得られる幾つかの誘導体を、その同定した幾らかの物理化学特性と共に下記表１に示す。
表１：下記式の化合物（誘導体）
【化３】
2005075832.tif 000004
【００２７】
【表１】
2005075832.tif 000005
＊）結晶化溶剤：Ａ（アセトニトリル）、Ｂ（９５％エタノール）
＊＊）溶離剤：（Ｉ）ブタノール／酢酸／水（５：２：２）（ｖ／ｖ）、（ＩＩ）クロ  ロホルム／メタノール／水／水性アンモニア（８５：２５：２：１）（ｖ／ｖ）
【００２８】
また実施例１と同様な方法で、以下の化合物も合成した。
Ｎ−［１−（１−アダマンチル）メチル］アセトアミジン
Ｎ−［４−（１−アダマンチル）ブチル］アセトアミジン
Ｎ−［２−（３−メチル−１−アダマンチル）エチル］アセトアミジン
Ｎ−［３−（１−アダマンチル）プロピル］アセトアミジン
一方、実施例２と同様な方法で、以下の化合物を合成した。
Ｎ−［２−（３−メチル−１−アダマンチル）エチル］グアニジン
Ｎ−［３−（１−アダマンチル）プロピル］グアニジン
【００２９】
インビトロの薬理学的活性
ラット皮質のシナプトソーム膜へり結合実験：
本発明に係る化合物のＮＭＤＡレセプタに対する親和性について、抗痙れん活性があると考えられる化合物であって、効力ある選択的および非競合的ＮＭＤＡ拮抗薬として作用するＭＫ−８０１化合物を、トレーサとして用いる結合実験によって評価した。
【００３０】
ラットのシナプトソーム膜プレパラートを用い、Ｆosterらの「Ｂr．Ｊ．Ｐharmacol．」（９１、４０３−４０９、１９８７年）に記載の方法に少し変化を加えた。簡単に、皮質膜をＨ３−ＭＫ−８０１トレーサおよび試験化合物といっしょに、２３℃で４５分間培養した。ガラス繊維フィルターでの濾過により、遊離の放射リガンドから結合放射リガンドを分離して反応を終わらせ、次いで該フィルターを洗ってから、液体シンチレータ（β−カウンター）と接触するように配置し、ペレットに結合した放射能を測定した。冷１０−４ＭのＭＫ−８０１の非存在および存在間の差異として、比結合を測定する。
【００３１】
このようにして得られる結果は、ＩＣ５０、すなわち、レセプタから５０％のリガンド（ＭＫ−８０１）を置換しうる、拮抗薬の濃度（μモル／リットル単位）で表示する。得られるデータから、本発明の主題である化合物の幾つかは、ラット皮質膜レセプタへのＭＫ−８０１の結合に対してかなりの抑制活性を示すことが推察できる。
【００３２】
たとえば、化合物２および化合物４は、約４０μＭの置換能力を示した。
Ｍemantine は、比較の非競合的拮抗薬ＮＭＤＡ薬物であって、同じ実験条件下で活性が少し低かった（ＩＣ５０＝８０μＭ）。
【００３３】
ラット脳スライスの灌流実験：
ａ）ラット脳スライスからの、トリチウム化神経伝達物質の基礎放出に関する実験
ラットを犠牲にし、頭蓋から速やかに脳を取出し、直ちにこれを、酸素９５％および二酸化炭素５％からなるガス混合物で曝気した、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）の中へ４℃で移した。次いで脳を４℃の温度で切断し、関心のある脳領域（海馬および線条体）を取出し、上記の溶液に浸漬させた。
【００３４】
次にＭcＩllwain“チョッパー”を用い、４００μm厚の脳スライスを準備した。３７℃の温度、２０分間にて、海馬スライスを０.０８μＭの［３Ｈ］ノルアドレナリンと共に、線条スライスを０.０１μＭの［３Ｈ］ドパミンおよび／または０.０９μＭの［３Ｈ］コリンと共に培養した。［３Ｈ］ノルアドレナリンで標識付けしたスライスは、セロトニン作用性およびドパミン作用性のシナプス末端（軸索終末）の可能な間違った標識付けを防止するため、それぞれセロトニンおよびドパミンの摂取の選択的インヒビターである、０.１μＭの６−ニトロキパジン（quipazine）および０.１μＭのＧＢＲ１２９０９の存在下で培養した。
【００３５】
同じ理由から、［３Ｈ］ドパミンで標識付けしたスライスは、それぞれセロトニンおよびノルアドレナリン摂取の選択的インヒビターである、０.１μＭの６−ニトロキパジンおよび０.１μＭのニソキセチン（nisoxetine）の存在下で培養した。２０分の培養後、各スライスをトレーサの存在下、ａＣＳＦで洗い、平行した灌流室の中に、１室当り１つのスライスの割合で移し、次いで３７℃の一定温度にて、１mL／分のスピードで灌流した。
【００３６】
４５分の灌流で系を平衡させた後、それぞれ５分の９画分を集めた。画分の収集の開始から１０分後に、灌流液に試験化合物を加えた。スライスから、薬物非存在で集めた最初の２つの画分に放出されたトリチウム化神経伝達物質のパーセンテージを、各スライスの内部制御（対照）とみなした。
【００３７】
実験の終わりに、液体サンプル用のシンチレータを用い、集めたサンプルと灌流したスライス（トルエンに溶解）について、各画分およびスライスに存在する放射能のカウントを行った。トリチウム化神経伝達物質の放出率（fractional release）は、各画分に存在する放射能の量を該画分が収集されたときのスライスに存在するトータル放射能で割って計算した。
【００３８】
すなわち、各スライスにおいて、所定の灌流時の放出率と、最初に集めた画分の放出率の割合を算出した。化合物の効果は、薬物非存在で灌流した対照スライスに対し、実験に供した神経伝達物質の放出増加のパーセンテージで表示した（下記表２）。データは、神経伝達物質の基礎放出を１００％まで増加しうる化合物のミクロモル濃度を示す。
【００３９】
表２：ラット脳スライスからのトリチウム化神経伝達物質の基礎放出実験
化合物２      化合物４      Ｍemantine
（μＭ）     （μＭ）     （μＭ）  
海馬スライスの［３Ｈ］ＮＥの            ６          １５            １３０
基礎放出
線条スライスの［３Ｈ］ＤＡの            ２            ８            不活性
基礎放出                                                        （３０μＭ）
線条スライスの［３Ｈ］Ａchの          不活性        ２０            不活性
基礎放出                          （３０μＭ）                （１００μＭ）
【００４０】
表２のデータから、本発明の主題である化合物の幾つか、たとえば化合物２および４は、ミクロモル濃度でＮＥおよびドパミンの基礎放出を増加しうることが認められる。これに対し、memantine はその活性がほとんどもしくは全くなく、また同じくＡchの放出についても不活性である。これに対し、化合物４は後者神経伝達物質の線条体への放出を増加するのにも非常に活性である。
【００４１】
ｂ）ラット海馬スライスにおけるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）によって刺激された［３Ｈ］ノルアドレナリンの放出に関する実験
各スライスのプレパラートは、前記のものに類似する。スライスは、Ｍg２＋イオンが欠けているａＣＳＦと共に［３Ｈ］ノルアドレナリンの存在下で灌流した。４５分の灌流で系を平衡させた後、それぞれ５分の７画分を集めた。画分の収集の開始の１０分前に、灌流液に試験化合物を加え、同時に収集開始の４秒後から、画分４のみに１００μＭ−ＮＭＤＡを加えた。
【００４２】
実験の終わりに、存在する放射能を前記と同様にカウントした。各サンプルにおいて、ＮＭＤＡ存在下の画分４の放出率と、最初に集めた画分の放出率のパーセンテージ割合を測定した。試験薬物の活性は、拮抗薬非存在のＮＭＤＡ−刺激対照室への［３Ｈ］ノルアドレナリンの放出のパーセンテージ増加に対し、行った実験回数の平均パーセンテージ値で表示した。
【００４３】
本発明の主題である化合物の幾つか、たとえば化合物２および４は、１００μＭのＮＭＤＡの作用を拮抗する強力な能力を示した。それらのＩＣ５０値は、０.８および０.５μＭであった。memantine はこの試験で、類似のもしくは少し劣る活性を示し、ＩＣ５０値は１.６μＭであった。
【００４４】
神経保護活性
ラット頭頂後頭スライスにおける低血糖条件下の３０mＭ−ＫＣlによって喚起される［３Ｈ］Ｄ−アスパルテートの放出実験：
このインビトロ実験モデルは、神経単位痛の症状をまねるように設計したもので、Ｚablocka  Ｂ．およびＤomanska−Ｊanik  Ｋ．の「ＮeuroＲeport」（６、８５−８８、１９９４年）で報告されたモデルの変形である。
ラット頭頂後頭皮質を取出し、４００μm冠状スライスに切断する。皮質スライスを［３Ｈ］Ｄ−アスパルテートと共に３７℃で３０分間培養し、次いで４５分間洗ってから、高浸透圧カリウム溶液（３０mＭ）で５分間刺激する。
【００４５】
いったん基礎条件に回復すると、スライスを無グルコース媒体と共に２０分間灌流する。この時点で、グルコース含有の標準媒体に試験化合物を加え、実験の終りまで灌流する。低血糖期間の終わりから１０分に、さらに高浸透圧刺激で神経単位膜を脱分極して、制御（control）条件下で喚起した［３Ｈ］Ｄ−アスパルテートの放出の約７５％増加を引き起こす。
【００４６】
化合物２および４、また比較薬物として用いたmemantine は、［３Ｈ］Ｄ−アスパルテートの放出の低血糖−誘発増加を完全に拮抗することができた。化合物４の活性程度は、memantine に比しより効力ある大きさ（ＩＣ５０：７.５μＭに対し０.８μＭ）であり、一方、化合物２はその中間の効力を示した（ＩＣ５０＝２.５μＭ）。
【００４７】
ＮＯ−シンセターゼ（ＮＯＳ）拮抗薬活性
ａ）ＮＯの形成について、ＮＯ２−（亜硝酸塩）で測定する抑制活性の実験を、サイトカインＩＬ−１β（１ng／mL）で４８時間刺激したラビット関節の軟骨細胞の培地にて、インビトロで行った。軟骨細胞のプレパラートの場合、Ｂerenbaum らの「ＦＥＢＳ  Ｌetters」（３４０、５１−５５、１９９４年）の記載方法に従った。簡単に、ラビットの肩、足根関節および膝からの殺菌した軟骨のフラグメントを、微細に切り刻み、ヒアルロニダーゼ、トリプシンおよびコラーゲナーゼの溶液と共に、３７℃で消化せしめ、次いで滅菌ガーゼで濾過し、６００xgで遠心分離し、ＤＭＥＭ−ＦＣＳ  １０％で適切に希釈した後、約１×１０５細胞／ウエル（well）の濃度を得る。
【００４８】
細胞をこれらの条件下で、合流点まで維持し（約１５日）、培地を３日毎に変えた。この時点で、培地に溶解した試験生成物を各検体に加え、２０分後に、３５０μＬのＩＬ−１βを加え、最終濃度１ng／mLとした。刺激を３７℃で４８時間持続した（空気−７％ＣＯ２下で培養）。次に、Ｇreenらの「Ａnal．Ｂiochem．」（１２６、１３１−１３８、１９８２年）に記載の方法に従って、細胞上層液の亜硝酸塩のアッセイを行った。
【００４９】
得られる結果を下記表３に示す。表３において、本発明の主題である化合物の幾つかを、非選択的ＮＯＳインヒビターの、memantine およびＬ−ＮＡＭＥと比較したＩＣ５０値、すなわち、対照群としてＩＬ−１βで刺激するが拮抗薬を加えない細胞に対して亜硝酸塩の形成を５０％抑制しうる拮抗薬の濃度（ミクロモル）を記載する。
【００５０】
表３：下式の化合物
【化４】
2005075832.tif 000006
【表２】
2005075832.tif 000007
注）信頼限界を括弧内に示す。
【００５１】
表３のデータから、本発明の主題である試験化合物の幾つかは、亜硝酸塩の生成に関し、ミクロモルレベル量で効力ある抑制効果を示すことが推察される。最も活性な化合物は、化合物２および４、すなわち、Ｒ１およびＲ２がメチル、ｎが２、およびＲ３がそれぞれアミノ基またはメチル基である化合物である。参考インヒビター化合物Ｌ−ＮＡＭＥは、活性が約１０倍低く、一方、memantine は、最大試験濃度（３×１０−４Ｍ）以下で全くの不活性である。
【００５２】
インビボの薬理学的活性
抗うつ活性の評価：
これらの生成物によって示される、別の有利な側面の薬理学的活性は、うつ病の状態を実験的に誘発させる実験モデルで証明されるそれらの幾つかの効力ある抗うつ活性である。
【００５３】
ａ）ポーソルト（Ｐorsolt）法
プロセス：手順はＰorsoltらの「Ａrch．Ｉnt．Ｐharmacodyn．」（２２９、３２７−３３６頁、１９７７年）に記載のものに類似する。
特定の投薬をうけたことがない（無条件反応の）マウスを、２０cm水位のガラス製シリンダーの中で２５℃の温度にて、強制的に１５分間泳がせる。２０秒から１０秒（両端を含めて）の不動期間と、１０秒から４秒の絶対不動に達する時間を測定した。絶対不動とは、動物が少なくとも３０秒間不動のままでいるのに必要な潜伏時間で規定される。
【００５４】
化合物は、試験の６０分前に経口投与した。化合物４は効力ある抗うつ活性を示し、不動期間を縮小し、かつ１mg／kgおよびそれ以上の用量で不動に対する潜伏時間を増加した。
１および１０mg／kgの用量の場合、これらの効果は統計的に有意であり（Ｐ＜０.０５＞）；ＮＥ再摂取のインヒビターであるアミトリプチリンの活性が低かったが、それは３０mg／kgの用量でしか、不動に対する潜伏時間を有意的に増加しなかったからである（Ｐ＜０.０１）。得られる結果を、下記表４に示す。
【００５５】
表４：マウスの遊泳試験（Ｐorsolt）における化合物４とアミトリプチリンの効果
【表３】
2005075832.tif 000008
＊Ｐ＜０.０５対（対照）、＊＊Ｐ＜０.０１対（対照）
【００５６】
ｂ）マウスの“尾部はさみ”試験
プロセス：手順はＳteruらの「Ｐsychopharmacol．」（８５、３６７頁〜、１９８５年）に記載のものに類似する。マウスをベンチ表面の７５cm上に尾部で吊り下げる。５分間にわたり不動の期間を測定し；マウスが不動のままで、完全に動かないでつるされているときのみ、マウスは不動であるとみなす。試験の３０分前に、化合物を経口投与した。得られる結果を下記表５に示す。
【００５７】
表５：マウスの“尾部はさみ”試験における化合物２とmemantine の効果
【表４】
2005075832.tif 000009
【００５８】
化合物２は高い抗うつ活性を示し、５分の実験にわたり、０.３〜１０mg／kg範囲の用量に依存してマウスの不動時間を縮小した。計算したＥＤ５０は６mg／kgであった。memantine は活性が低く、そのＥＤ５０は２４.９mg／kgである。