(57)【要約】【課題】自然界の微生物分離源から微小コロニー形成細菌を分離する微小コロニー形成細菌の単離方法を提供する。【解決手段】自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養し、この微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られた培養液を、平板培地に接種し、平板培養することにより、平板培地上に微小コロニーを形成させ、この微小コロニーを採取することにより微小コロニー形成細菌を単離する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養し、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した後、当該培養液を当該培養液を含む平板培地で培養して平板培地上に生育する微小コロニーを分離・採取することを特徴とする微小コロニー形成細菌の単離方法。
【請求項２】
前記微小コロニー形成細菌が、直径１ｍｍ以上のコロニーを形成することができない微生物であることを特徴とする請求項１に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【請求項３】
前記平板培地から分離・採取した微小コロニーを、さらに平板培養し、直径１ｍｍ以上のコロニーを形成するか否かを確認することによって、単離した微小コロニーが微小コロニー形成細菌であるかを判定する判定工程を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【請求項４】
前記微生物分離源を少なくとも８４時間以上集積培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【請求項５】
前記平板培地は、前記微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られた培養液またはその上清液を１０ｗｔ％以上含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【請求項６】
自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養し、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した後、当該培養液を当該培養液を含む平板培地で培養することにより、平板培地上に微小コロニーを形成させることを特徴とする微小コロニーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、通常の平板培養法では、分離・培養することが困難な微小コロニー形成細菌の単離に適した微小コロニー形成細菌の単離方法および微小コロニーの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、自然界から微生物を分離・取得する方法としては、１８７６年にコッホが発明した平板培養法が良く知られている。この古くから知られている平板培養法は、多種多様な微生物が混在する試料を適当な濃度に希釈後、これを平板培地（プレート）に撒き一定時間培養後、プレート上に形成されるコロニーを単離する方法で、通常単離した微生物（コロニー）の中から目的にかなった微生物が単離される。また、ある特定の目的に対しては、採取した試料を直接平板培地で培養する前に一旦液体培地で培養して特定の目的にかなう微生物を生育させる集積培養（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を行なった後、平板培養法で分離する方法も良く行なわれる。このような平板培養法をベースとして種々な方法が開発され、それらの方法により産業上有用な微生物が数多く分離され利用されている。
【０００３】
ところが、１９７０年代後半に蛍光顕微鏡を用いる分離源中の全菌数を測定する技術が開発され、一方で分離源中の微生物に起因する生物活性を蛍光色素染色方法で検出する方法が開発され、これらの技術により従来の平板培養法では培養できない微生物が自然界に多く存在することが解明されてきた。
【０００４】
例えば、別府らは、絶対好熱共生細菌の研究において、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｒｅｒｉｕｍ属に属する細菌は、その生育に対し、共生する他の微生物の培養上清液中に存在する未知の栄養因子を必要とし、未知の栄養因子を含む平板培地上で微小コロニーを形成することを報告している（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００５】
また、原山らは、流出石油の微生物分解機構の研究において、石油の微生物分解が微小コロニーを形成する細菌によって行なわれることを報告している。更にその報告では、海洋等自然界における石油の微生物分解は石油資化細菌として実験室レベルで容易に分離できる大コロニー形成細菌が関与するのではなく、石油汚染された海洋で速やかに出現するような微小コロニー形成細菌が関与することをＤＮＡレベルで証明している（Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ；  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１，  ４５−５１，  １９９７及びＨａｒａｙａｍａ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ；  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １，  ６３−７０，  １９９９）。
【０００６】
また、共存する他の微生物の代謝産物を利用して初めて生育してくる微生物が存在することも報告されている。例えば、土田らは活性汚泥の遠心分離上清液を平板培地に添加してはじめて生育が認められるような細菌を数株分離している。そしてこの遠心分離上清液中の細菌生育促進因子は活性汚泥中に存在する他の微生物の代謝産物である可能性があると報告している（非特許文献３）。
【０００７】
さらに、Ｋａｅｂｅｒｌｅｉｎらは、従来は培養が困難であった海洋細菌が、ある種の他の細菌を共存させることによりはじめて培養が可能になったことを報告している（非特許文献４）。
【０００８】
上述のように、自然界には従来の平板培養法では分離が困難な微小コロニー形成細菌やコロニーを全く形成できない細菌が数多く存在する。更に、深海などの極端な環境、またはヒト等の高等動物、昆虫、土壌原生動物もしくは海洋生物等の生物体内、活性汚泥等の人工的環境にも微小コロニー形成細菌の存在が推定される。
【０００９】
平板培養法では分離が困難な微生物は、平板培地上では単一細胞のままか又は裸眼では検出されがたいほど微小なコロニーを形成している。このような微生物は、その微生物が採取された自然界の環境下においては生育しているが、極めて生育が遅いため、自然界から取得してきたような複数種の微生物を含む微生物分離源を前処理することなく単に平板培地に直接接種しただけでは他の生育旺盛な微生物のコロニーの発達により、識別し、単離することが困難な微生物である。このような生きてはいるが培養困難な微生物はＶＢＮＣ（Ｖｉａｂｌｅ  Ｂｕｔ  Ｎｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）状微生物として知られるようになった。
【００１０】
【非特許文献１】
バイオサイエンス  バイオテクノロジ  バイオケミストリ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９９年、６３巻、１０８３〜１０９０頁
【非特許文献２】
アプライド  アンド  エンバイヤロンメンタル  マイクロバイオロジ（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、２００１年、６７巻、３７７９〜３７８４頁
【非特許文献３】
プログラム  アンド  アブストラクト  オブ  フィフス  インターナショナルシンポジウム  オン  エンバイロメンタル  バイオテクノロジ（Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｎ  ｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０００年、０５−５
【非特許文献４】
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年、２９６号、１１２７〜１１２９頁
【００１１】
【本発明が解決しようとする課題】
ＶＢＮＣ状微生物を単離すべく、本発明者らは、微生物分離源を適当な濃度に希釈し、これを直接平板培地で培養し、コロニーが形成されていない部分を顕微鏡で検鏡して微小コロニーを分離することにより、微小コロニー形成細菌を単離できるのではないかと考え、検討を行った。
【００１２】
本発明者らはこの考えに基づき、常法に従い平板培養を行い、平板培地上に生育した微小コロニーを多数分離した。しかしながら、これら微小コロニーをＬＢ寒天培地で培養したところ、分離したすべての細菌が可視的な大コロニーを形成した。上記の方法で得られた微小コロニーは４０倍検鏡下で観察される微小コロニーではあるが、容易に培養できることからいわゆるＶＢＮＣ状微生物ではなく、上記の方法では目的とする微小コロニー形成細菌を取得することはできなかった（比較例１参照）。
【００１３】
したがって、真の微小コロニー形成細菌、換言すればＶＢＮＣ状の微小コロニー形成細菌を取得するには新規な技術の開発が必要であると考えられた。
【００１４】
微小コロニー形成細菌はいまだかって平板培養法では単離されたことのない微生物であることから、この中にはいわゆる希少細菌と称されるような微生物、更には新種または新属と分類され得るような新規細菌の存在が想定される。
【００１５】
微小コロニー形成細菌は生きている細胞であるから、その中に存在するＤＮＡ遺伝子についても未だ知られていない機能を有する未知の有用な遺伝子が存在する可能性が高いことが予想される。
【００１６】
新規で有用な微生物又はＤＮＡ遺伝子の必要性は、食品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等において強く望まれている。微小コロニー形成細菌は自然界に多く存在しているにも拘わらず、微小コロニー形成細菌やそのＤＮＡ遺伝子を効率良く取得する方法は知られていないため、微小コロニー形成細菌を新たな微生物資源として利用するのは容易なことではない。
【００１７】
更に、現状では微小コロニー形成細菌を培養する技術も知られていないため、培地の成分や組成、温度、ｐＨ、浸透圧等の物理的条件を種々変えて平板培養法を繰り返し行なわざるをえない。
【００１８】
したがって、本発明は、微小コロニー形成細菌のほかに通常の微生物、換言すれば大コロニー形成細菌が混在する自然界の微生物分離源から微小コロニー形成細菌を効率よく分離・取得するのに適した微小コロニー形成細菌の単離方法を提供することを目的とする。
【００１９】
さらに、本発明は、微小コロニーの製造方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
上記問題に鑑み、鋭意研究の結果、本発明者らは、自然界における微生物の相変化、即ち、自然界に有機化合物が新たに供給された後におこる微生物の相変化に着目し、相変化が進むに従い微小コロニー形成細菌の比率が増加するものと考え、自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で微生物の相変化が認められなくなるまで好気的条件下で集積培養した後、この培養液を平板培養することにより、平板培地上に微小コロニーを形成できることを見出し、本発明に想到した。
【００２１】
本発明の微小コロニー形成細菌の単離方法によって、複数種の微生物を含む微生物分離源を単に平板培地に直接接種し培養しただけでは単離することが困難であった微生物、特にＶＢＮＣ状の微小コロニー形成細菌を効率的に単離することが可能となる。
【００２２】
また、本発明者らは、微小コロニー形成細菌の培養条件について検討を重ねた結果、上述した微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られる培養液に微小コロニー形成細菌の生育を促進する効果があることを見出した。
【００２３】
すなわち、本発明に係る微小コロニー形成細菌の単離方法および微小コロニーの製造方法は、以下の通りである。
【００２４】
〔１〕  自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養し、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した後、当該培養液を当該培養液を含む平板培地で培養して平板培地上に生育する微小コロニーを分離・採取することを特徴とする微小コロニー形成細菌の単離方法。
【００２５】
〔２〕  前記微小コロニー形成細菌が、直径１ｍｍ以上のコロニーを形成することができない微生物であることを特徴とする〔１〕に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【００２６】
〔３〕  前記平板培地から分離・採取した微小コロニーを、さらに平板培養し、直径１ｍｍ以上のコロニーを形成するか否かを確認することによって、単離した微小コロニーが微小コロニー形成細菌であるかを判定する判定工程を含むことを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【００２７】
〔４〕  前記微生物分離源を少なくとも８４時間以上集積培養することを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【００２８】
〔５〕  前記平板培地は、前記微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られた培養液またはその上清液を１０ｗｔ％以上含有することを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の微小コロニー形成細菌の単離方法。
【００２９】
〔６〕  自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養し、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した後、当該培養液を当該培養液を含む平板培地で培養することにより、平板培地上に微小コロニーを形成させることを特徴とする微小コロニーの製造方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明に係る微小コロニー形成細菌の単離方法は、自然界から採取した微生物分離源を微生物の相変化が認められなくなるまで好気的条件下で集積培養し、得られた培養液を平板培地に接種して平板培養し、平板培地上に微小コロニー形成細菌の微小コロニーを形成させることにより微小コロニー形成細菌を単離することを特徴とする。
【００３１】
本明細書において、「微小コロニー形成細菌」とは、極めて生育が遅いことなどが原因となり、培養して形成されるコロニーが微小な状態に留まる傾向が強い細菌のことをいう。微小コロニー形成細菌であることの一つの指標として、平板培養法で培養した場合、培地や培養条件を種々変化させて生育させても、直径１ｍｍ以上のコロニーを形成することができない微生物であることを挙げることができる。微小コロニー形成細菌は、直径０．５ｍｍ以上のコロニーを形成することができない微生物であることが好ましい。自然界には前述したように微小コロニーを形成する細菌であっても、培地や培養条件を変化させることにより可視的な大コロニーを形成する細菌群が存在するが、このような細菌群は本発明でいう微小コロニー形成細菌とは区別される。
【００３２】
このような微小コロニー形成細菌は、自然界においては生きているが、極めて生育が遅いため、自然界から取得してきたような複数種の微生物を含む微生物分離源を前処理することなく単に平板培地に直接接種しただけでは他の生育旺盛な微生物のコロニーの発達により、識別し、単離することが困難な微生物である。すなわち、微小コロニー形成細菌は、生育が早い他の微生物との共存条件下にある平板培地で培養しても単離することが困難であった。
【００３３】
本発明の微小コロニー形成細菌の単離方法の特徴は、集積培養工程において、自然界における微生物の相変化を人工的に再現することにより、大コロニー形成細菌を排除し、微小コロニー形成細菌の存在比を高めた状態で平板培地に接種するため、従来の平板培養法では単離することが困難であった微小コロニー形成細菌を効率よく単離できる点にある。
【００３４】
以下、本発明に係る微小コロニー形成細菌の単離方法の各工程について詳述する。
【００３５】
〔Ａ〕微生物分離源の取得
「微生物分離源」は、微小コロニー形成細菌を含む多種の微生物と、これら微生物が生育している環境を構成する成分とが混在する混合物である。
【００３６】
本発明では、微生物分離源として、自然界から取得された試料を用いることが好ましい。本発明でいう「自然界」とは、いろいろな微生物種が生息する自然環境であって、例えば土壌、泥、湖水、河水、沼水、温泉、植物および動物等の温和な自然環境、又は深海、深地下、高温多湿地、極寒地、火山地、強酸性地、強アルカリ性地、高塩地又は乾燥地等極端な天然環境を意味する。又、病院、食品工場における空気および活性汚泥、風味付け汁、果汁等の食品加工産業原料および腐敗物など、更に金属表面等の人工的環境も自然界に含める。
【００３７】
微生物分離源の採取は通常の採取方法に従って行なえばよく、これら自然界から採取した試料を微生物分離源として利用できる。
【００３８】
〔Ｂ〕集積培養工程
本発明においては、自然界の微生物分離源を、有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養することにより、自然界に有機化合物が新たに供給された後におこる微生物の相変化を人工的に再現する。
【００３９】
ここで、「微生物相」とは、培養液中における微生物の種類、量および混合比を意味する。また、「微生物の相変化が認められなくなる」とは、微生物相の変化が実質的に観測されなくなることを意味し、具体的には、培養液中の溶存酸素レベルを観察することにより、微生物の相変化が生じなくなったかどうかを判断することができる。
【００４０】
図１を参照しながら、微生物の相変化について説明する。自然界においては、動物や植物起源の多種多様な有機物が絶え間なく供給されている。そしてこれらの有機物を利用してある種の微生物群が生育をし、種々の有機化合物（代謝産物）を生産する。自然界から取得した微生物分離源を集積培養すると、最初の微生物群、いわゆる第一相（フェーズ）の微生物群の生育・増殖が終わるとこれらの微生物は衰え死滅して分解され新たな有機物が自然界に供給されることになる。すると、次にこれら有機化合物を利用できる微生物が第二相（フェーズ）の微生物として生育し、以下同様に第三相、第四相の微生物群が生育してくるものと考えられている。
【００４１】
最初に生育してくる微生物は、従来の平板培養方法によりコロニー形成細菌として分離されるものと考えられる。これに対し、第二相（フェーズ）以降の微生物群は培養が困難な微生物が多く平板培地上では微小コロニーを形成するか又は全く生育が認められない場合が多いものと考えられる。
【００４２】
自然界から取得した微生物分離源は、微小コロニー形成細菌以外にも多種多様の微生物を含むため、この微生物分離源をそのまま平板培養した場合、平板培地上で単離可能な大きさのコロニーを形成するのは通常の微生物、換言すれば、大コロニー形成細菌のみであり、微小コロニー形成細菌は微小コロニーを形成するか又は全く生育が認めらない。
【００４３】
これに対し、本発明の微小コロニー形成細菌の単離方法では、平板培養する前の工程で、自然界から取得した微生物分離源を、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養することを特徴とする。集積培養の過程で、培養液中では、第一相（フェーズ）の微生物群が生育した後、衰え死滅して分解されるとともに、次に第一相（フェーズ）の微生物群が分解して得られる有機化合物を利用できる第二相（フェーズ）以降の微生物が生育し、これもまた死滅し、以下同様にして第三相以降の微生物群が順次生育、死滅していくものと考えられる。このため、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した後の培養液中の微生物相は、培養開始時点の微生物相と比較して、培養液中に存在する微生物全体に対する微小コロニー形成細菌の菌体数が高められた状態となっていると推察される。
【００４４】
本発明においては、上述の微生物の相変化、すなわち、自然界に有機化合物が新たに供給された後におこる微生物の相変化を人工的に再現するため、微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養する。
【００４５】
本明細書において、栄養培地とは、微生物や高等生物の細胞、組織、器官などを生育、増殖させるための栄養成分と支持体のことをいう。栄養培地はその支持体の状態によって、固形培地、半固形培地、液体培地などに分類され、単に栄養培地というときは、特に支持体の状態には限定されないが、本発明の集積培養工程においては、栄養培地として有機窒素源を含む液体培地を用いる。
【００４６】
集積培養工程で使用する栄養培地は、微生物分離法で一般的に使用される有機窒素源を含む栄養培地であればよい。有機窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等、或いはこれらの混合物など、通常の微生物培養に使用される有機窒素化合物を用いることができる。
【００４７】
例えば、温和な環境から採取された微生物分離源を集積培養する場合は、ＬＢ培地（カゼイン加水分解物１％、酵母エキス０．５％、食塩０．５％（ｐＨ７．０））や、ＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ  （ＤＩＦＣＯ社）等の完全培地を適当な濃度に希釈して使用することができる。ＬＢ培地を使用する場合には１／１０程度に希釈して使用することが望ましい。
【００４８】
また、極端な環境から採取した微生物分離源を培養する場合には、採取した微生物分離源の存在する環境を考慮し、その環境にあった培地を使用することが望ましい。例えば活性汚泥から採取した試料の場合には活性汚泥を培地の構成成分として加えたり、海洋微生物を分離する際には、海水又は人工海水を培地成分として使用する等、培地についての配慮することが好ましい。
【００４９】
集積培養工程においては、微生物分離源を、上記栄養培地（液体培地）に添加して集積培養液を調整し、好気的条件下で集積培養する。この際、自然界から採取した試料を微生物分離源として直接栄養培地に添加してもよいし、自然界から採取した試料の希釈液や、この希釈液を遠心分離して得られる上清を微生物分離源として栄養培地に添加してもよい。
【００５０】
好気的条件とは、発酵槽を使用する場合は通気攪拌培養法を、フラスコや試験管を使用する場合には振とう培養法をいう。
【００５１】
集積培養中の溶存酸素レベルは、ゼロ（０）以上（酸素電極で測定）に維持されることが望ましい。微生物の生育時には、酸素消費量が高まるため、溶存酸素レベルをゼロ（０）以上に維持するためには通気攪拌の場合攪拌速度を高く維持する必要がある。
【００５２】
培養温度と培養ｐＨは、採取した試料の環境を考慮して設定することが望ましく、通常の自然環境から採取した試料を培養する場合には、通常の微生物が生育できる範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは４〜８、更に好ましくは５〜７の範囲で調節される。特殊な環境から採取した試料の場合には、その特殊な環境に合わせて温度やｐＨを設定することが望ましい。
【００５３】
本発明においては、微生物の相変化を進行させるために集積培養液中の栄養分が微生物によって消費され栄養が欠乏した状態を作ることが重要であるため、集積培養の途中で、新たな栄養成分を培養液中に追加しないことが好ましい。
【００５４】
微生物の相変化を観察するためには分光光度計を用いて培養液の濁度（吸光度）を測定して吸光度の変化を観察する方法や酸素電極を用いて溶存酸素の変化を測定して観察する方法等がある。ガラス製の発酵槽や培養器具を用いる場合、微生物の相変化は培養液中の溶存酸素の推移で観察すればよく、集積培養液中の溶存酸素レベルが極小となるまで培養を行う。
【００５５】
培養液中の微生物が生育を開始し、増殖を始めると微生物の呼吸により酸素が消費され、培養液中の溶存酸素レベルが低下する。酸素電極を用いて溶存酸素の変化を測定する方法は、微生物の呼吸量を測定し、もって微生物の生育量を観察する方法であり継続的に観察できるので便利である。
【００５６】
微生物の相変化が生じなくなったことを厳密に定義するのは難しいが、微生物の相変化が生じなくなったことを示す指標の一例として、集積培養を継続しても溶存酸素の変化が以後実質的に観察されなくなった時点を例示することができる。
【００５７】
本発明においては、微生物の相変化が実質的に観察されなくなった時点の培養液を次工程における平板培養に用いることもできるが、当該時点からさらに培養を継続することにより得られる培養液を用いる方が好ましい。好ましくは、微生物の相変化が実質的に観察されなくなった時点から１２時間以上、より好ましくは１日以上、さらに好ましくは３日以上、特に好ましくは１週間以上培養を継続することによって得られた培養液を用いることが好ましい。
【００５８】
上記の観点から、集積培養の培養期間は、培養条件等にもよるが、８４時間以上であることが好ましく、１週間以上であることがより好ましく、場合によっては１〜２ヶ月の長時間の培養が必要な場合もある。要は、微生物の相変化を観察し、微生物相の変化が認められなくなるまで培養することが必要である。
【００５９】
〔Ｃ〕平板培養工程
微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られた培養液を平板培地に接種し、平板培養することにより、平板培地上に微小コロニーを形成させることができる。
【００６０】
本明細書において、「微小コロニー」とは、直径１ｍｍ以下のコロニー、好ましくは直径０．５ｍｍ以下のコロニーを意味し、平板上に裸眼では観察できず４０倍〜１００倍の検鏡下ではじめて微小コロニーとして観察されるコロニーである。
【００６１】
平板培地とは、平板形状を有する固形状の栄養培地のことをいう。微小コロニー形成細菌を培養するための平板培地としては、微小コロニー形成細菌を培養できる栄養分を含む培地であれば特に限定なく使用することができる。具体的には、ＬＢ培地、ＮＢ培地、Ｓｈａｅｆｆｅｒ培地、Ａｌｂｕｍｉｎ培地、ＹＳ培地、Ｒ培地等の通常の培地を使用することができるが、特に好ましい平板培地としては、上記〔Ｂ〕で説明した集積培養工程で、微生物の相変化が認められなくなるまで培養して得られた培養液を培地成分として含有する培地（以下ＣＬ培地と称する）が挙げられる。
【００６２】
ＣＬ培地は、微生物の相変化が認められなくなるまで培養した培養液またはその上清液を１０ｗｔ％以上、特に３０ｗｔ％以上含有することが好ましい。好ましいＣＬ培地の組成の具体例としては、１Ｌｉｔｅｒ中に集積培養液又はその遠心分離上清液を５００ｍｌ含有し、ｐＨ７．０に調節し、寒天を１〜１．５％含有する平板培地を挙げることができる。
【００６３】
ＬＢ培地等の通常の栄養培地も使用できるが、ＣＬ培地を用いたほうが出現する微小コロニーの数が多く、より多様な形態と色調を有する微小コロニーが分離できる。これは、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養した培養液中に、微小コロニー形成細菌の生育を促進させる因子が含まれるためと推察される。
【００６４】
ＬＢ培地等の通常の栄養培地を使用する場合、微小コロニー形成細菌の生育には多くの栄養素を必要としないため、培地の濃度は通常の濃度より希薄な培地、例えば１／１０程度に希釈して使用することが望ましい。
【００６５】
微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られる培養液を採取し、これを直接又は遠心分離法で濃縮した後、平板培養法で培養すると平板培地上には培養後数日〜数十日、およその目安としては、８〜３９日で、微小コロニーが多く出現する。
【００６６】
〔Ｄ〕微小コロニー形成細菌の単離
平板培地上に生育した微小コロニーを４０〜１００倍の顕微鏡を用いて観察すると、微小コロニーの中には大きさが０．０１ｍｍ〜０．５ｍｍで、４０倍程度の顕微鏡で観察される比較的生育の良いグループが多く観察されるほか、少数ではあるが１００倍程度の顕微鏡ではじめて観察される生育の極めて遅い、微小コロニーの大きさが０．１ｍｍ以下の極微小なグループが観察される。
【００６７】
平板培地上に生育した微小コロニーを分離することにより微小コロニー形成細菌を採取することができる。この際、平板培地上に生育した微小コロニーを４０〜１００倍（実体顕微鏡）を用い、検鏡下で微小コロニーを分離することが好ましい。
【００６８】
平板培地上に生育した微小コロニーには、微小コロニー形成細菌によって形成されたコロニーの他、培地や培養条件を変化させることによっては可視的な大コロニーを形成し得る細菌群によって形成された微小コロニーも含まれる。
【００６９】
単離した微小コロニーが、微小コロニー形成細菌のコロニーであるかどうかは、平板培地から分離した微小コロニーをＬＢ寒天平板培地等の通常の平板培地に接種して平板培養し、可視的な大コロニーを形成するかどうかで判断することができる。
【００７０】
目的とする微小コロニー形成細菌は、培地や培養条件を種々変化させて生育を観察しても、依然として生育は極めて遅く１０日間程度平板培養してもコロニーの大きさは直径０．５ｍｍ程度にしか生育しない性質のものである。微小コロニー形成細菌は、いわゆる希少細菌の範疇に属し、未だかって分離されたことのない微生物である可能性が期待される微生物群と考えられる。
【００７１】
単離された微小コロニー形成細菌を平板培養する場合、微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養して得られた培養液またはその上清液にその微小コロニー形成細菌の生育を促進させる因子が含まれる場合があるため、培地にこの培養液またはその上清液を添加することも好ましい。
【００７２】
これら微小コロニー形成細菌は、依然培養が困難な微生物であり、直接産業上の利用性を検討できるものではないが、従来の平板培養法では単離されたことのない微生物であることから、これを新たな微生物資源や微生物遺伝子資源として利用することができる。
【００７３】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７４】
＜実施例１＞
実施例１では、培養液中の溶存酸素の変化を酸素電極を用いて測定し、培養液中の土壌微生物の微生物相（フローラ）を動的に観察した集積培養例を説明する。
【００７５】
集積培養の培地としてＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｂｒｏｔｈ、ＤＩＦＣＯ社製）培地を調製した。ＬＢ培地の組成はカゼイン加水分解物  １．０％、酵母エキス０．５％、食塩０．５％（ｐＨ７．０）である。調製したＬＢ培地を水で１／１０に希釈し、６００ｍｌ容のガラス製発酵槽に４００ｍｌ張り込んだ。１２０℃で２０分間滅菌後、土壌サンプル０．１ｇを摂取し、２５℃、回転数１５０ｒｐｍの条件で通気攪拌培養を開始した。７時間のラグタイム（ｌａｇ  ｔｉｍｅ）の後に微生物の生育に伴って微生物の呼吸が始まり同時に溶存酸素レベルは顕著に減少した。微生物の高い呼吸活性に対応しかつ溶存酸素レベルをゼロ以上に保持するため攪拌速度を１，５００〜１，８５０ｒｐｍに高めた。
【００７６】
培養２０時間後に溶存酸素レベルが急激に高くなり最初のレベルに戻った。これは培養液中の栄養分が消費され栄養が欠乏してきたため微生物の呼吸活性が低下したことを意味する。培養開始後７〜２０時間を微生物生育の第一相とし、この相では試料中の微生物がＬＢ培地中の栄養素を資化して急速に増殖する時期と言える。
【００７７】
第一相の終わりにはＬＢ培地中の栄養素が消費されてしまうが、第一相微生物細胞よりなる新しい栄養素や第一相微生物の代謝産物などが新しい栄養素として培養液中に供給されるものと考えられる。次に第二相の微生物として、これらの新しい有機化合物を資化し利用できる微生物群の生育が予想される。そこで攪拌速度を１５０ｒｐｍに戻したところ、予期したように溶存酸素の急激な減少が始まり第二相微生物の生育が認められた。１〜２時間後には溶存酸素レベルは再び低下した。これ以降は、溶存酸素レベルを、培養開始時の溶存酸素レベルを１００として約２５〜３０％に維持し以後に起こることが予想される溶存酸素レベルの上昇に備えた。
【００７８】
更に培養を続け、培養２５時間目に第三相、７６時間目に第四相と培養８４時間の間に第四相まで４つの微生物相の変化が観察された。８４時間培養した後の培養液は透明となり微生物のフロックが観察された。実施例１は、自然界の微生物分離源を有機窒素源を含む栄養培地で好気的条件下で集積培養することにより、自然界における微生物の相変化が人工的に再現されることを示している。
【００７９】
＜実施例２＞
集積培養の培地としてＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｂｒｏｔｈ、ＤＩＦＣＯ社製）培地を調製した。ＬＢ培地の組成はカゼイン加水分解物  １．０％、酵母エキス０．５％、食塩０．５％（ｐＨ７．０）である。ＬＢ培地を水で１／１０に希釈し、その１００ｍｌを滅菌処理した５００ｍｌ容の振盪フラスコに張り込み、１２０℃、１０分間加熱殺菌を行なった。これに長野県上伊那郡南蓑輪村から採取したの土壌サンプルを０．０５ｇ加え、２５℃で振盪培養を開始した。
【００８０】
２ヶ月間培養を行うことにより徐々に微小コロニー形成細菌の存在比率を高めた。２ヶ月間集積培養して得られた培養液の濁度を直接肉眼で観察したところ、透明に近かった。この培養液を目的とする微小コロニー形成細菌の分離源および、分離用平板培地調製に使用した。
【００８１】
微小コロニー形成細菌の分離用平板培地として、表２に示す組成のＣＬ寒天平板培地、ＬＢ寒天平板培地及び１／１０希釈ＬＢ寒天平板培地を調製した。この平板培地に２ヶ月間培養後の集積培養液を微生物分離源として播菌し、２５℃で培養した。
【００８２】
培養開始後、８日から３９日にかけて４０倍の検鏡下で平板培地上に生育した微小コロニーを分離・採取した。その結果を表１に示す。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
表１に示すようにＣＬ寒天平板培地を用いた場合、得られる微小コロニーは数が多く、且つその形態や色調も他の培地の場合と比較して多様性を示した。
【００８５】
ＣＬ寒天平板培地から分離した１４８株の微小コロニーについて更にこれらを表２に示す組成のＬＢ寒天平板培地で平板培養を行なった。その結果、１４８株中１４４株は大きなコロニーを形成した。このＬＢ寒天平板培地での培養１週間後でもコロニーの直径が０．５ｍｍ以下の微小コロニーを形成した４株を分離した。
【００８６】
これら４株に共通する培養上の性質として、ＬＢ寒天平板培地上で培養したときにコロニーの大きさが培養１週間後でも０．５ｍｍ以下の微小コロニーを形成する。これらの４菌株をＳｈｉｎｓｈｕ−ａｈ１、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ３及びＳｈｉｎｓｈｕ−ａｈ４株と命名した。
【００８７】
これら４株についてＬＢ培地の他にＣＬ培地、ＮＢ培地、Ｓｈａｅｆｆｅｒ培地、Ａｌｂｕｍｉｎ培地、ＹＳ培地、Ｒ培地、１／１０希釈ＬＢ培地、および１／１００希釈ＬＢ培地を用いて平板培養し生育の状況を観察したが、いずれの平板培地でもコロニーの大きさは変わらず生育の極めて遅い菌株であることが確認された。ここで、使用した培地の組成を表２に示す。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
培養が遅い原因として酸素毒の可能性が考えられるので、嫌気培養キット”ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｐａｃｋ”（三菱ガス化学社製）を使用して低酸素条件で平板培養を試みたが、低酸素条件下ではいずれの菌株とも逆にコロニー形成速度は抑制された。
【００９０】
Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ１，ａｈ２及びａｈ４について、平板培養のほかにＬＢ培地を用いて液体培養を行い生育度（５７０ｎｍにおける吸光度）を測定した。Ｅ．ｃｏｌｉと比較すると、３株とも生育が遅いが、培養時間を長くすればＥ．ｃｏｌｉの１／３程度の生育度を示した。
【００９１】
次に、これら４菌株の菌学的性質を調べた。表３にコロニーの形態学的特徴を示す。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ１、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ４に共通な性質として、生育至適温度は２５〜３０℃であり、３７℃では生育が抑制され、カタラーゼ活性はＥ．ｃｏｌｉ等に比較して著しく弱かった。
【００９４】
４菌株の１６ＳｒＤＮＡの約７００から１，４５０塩基について塩基解析を行ない、系統学的解析を行なった。なお、ここでの相同性は、市販のソフトウェア（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ」：プログラム集「Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌから入手可能）に含まれている。Ｔｏｍｐｓｏｎ，  Ｄ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２，  ４６７３−４６８０  （１９９４）参照）を用いて算出した値である。その結果を表４に示す。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
表４に示す結果から、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ１、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２、及びＳｈｉｎｓｈｕ−ａｈ４株は、夫々の近縁種に対して９７％以下の塩基相同性を示すことから、系統学的に新規な微生物であると判断される。一方、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ３はＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  Ｆ１８（Ｄ３２２３３）に対する相同性が９９％であることから、これとほぼ同一であることが分かった。
【００９７】
分子生物学に基づく微生物分類の概念から、夫々の近縁種との塩基相同性を比較するとＳｈｉｎｓｈｕ−ａｈ１はＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｐｐ３ａ−１０と９７％の塩基相同性を示し、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ４はＡｇｒｏｍｙｃｅｓ  ｒａｍｏｓｕｍ  ＤＳＭ  ４３０４５と９５％の塩基相同性を示すことから新種と判断され、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２はＲａｓｂｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｐｈａ    ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ３４６１９、Ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇｅｎｏｓｐ．Ｐと９１％の塩基相同性を示すことから新属の微生物に属すると判断される。
【００９８】
図２は、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２の１６ＳｒＤＮＡ塩基解析に基づく分子系統学的解析結果から得られたＳｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２株及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。系統学的解析は、市販のソフトウェア（「ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ」：プログラム集「Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ」）で計算された多重アラインメント及び進化距離（相同性）を、ＰＨＬＹＰフォーマットデータで出力し、これを系統樹作成ソフト「ＴｒｅｅＶｉｅｗ」（Ｔｒｅｅ  ｄｒａｗｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｅ  Ｍａｃｈｉｎｔｏｓｈ：  ｂｙ  Ｒｏｄｅｒｉｃ  Ｄ．，  Ｐａｇｅ  １９９５，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｌａｓｇｏｗ，  ＵＫ）に読み込ませることによって行った。ＰＨＬＹＰ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ．  （１９９５）  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｃｋａｇｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５．７．，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｓｅａｔｌｅ  ＷＡ，  ＵＳＡ）は、上記Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｐｒｏｇｒａｍｓに含まれている。図２において、縦棒は各微生物種の系統樹上の位置関係を示す。横棒は、各微生物種間の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性を示す。目盛り（０．０１）は、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性について１００個の塩基中１個が相違した時の横棒の長さ（１．０ｃｍ）を示す。また、数字［１０００］は、相同性が同一とでた計算結果が１０００回の内、１０００回でたことを示す。
【００９９】
図２に示すように、Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２は窒素固定細菌であるＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓａｈｅｌｉに近縁な新属の微生物と考えられる。
【０１００】
＜比較例１＞
比較例１では、微生物分離源を適当な濃度に希釈し、これを平板培地で培養し、コロニーが形成されていない部分を顕微鏡で検鏡して微小コロニーを分離できるか検討した。
【０１０１】
まず、微小コロニー分離用の培地としてＬＢ寒天培地を準備した。ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ）培地の組成は、カゼイン加水分解物１．０％、酵母エキス０．５％、食塩０．５％、（ｐＨ７．０）である。これに土壌を希釈して塗布し常法に従い平板培養を行った。次いで、４０倍検鏡下で平板培地上に生育した微小コロニーを多数分離した。これらの微小コロニーは本発明者らが目的とする微小コロニー形成細菌であろうと期待した。しかしながら、これら微小コロニーをＬＢ寒天培地で培養したところ分離したすべての細菌が可視的な大コロニーを形成し、目的とする微小コロニー形成細菌を取得することは出来なかった。
【０１０２】
【発明の効果】
以上説明した通り、本発明の微小コロニー形成細菌の単離方法は、平板培養工程の前に、自然界の微生物分離源を微生物の相変化が認められなくなるまで集積培養することにより、大コロニー形成細菌を排除し、微小コロニー形成細菌の存在比を高めた状態で平板培地に接種するので、平板培地上に微小コロニー形成細菌だけ選択的にコロニー形成させることができる。
【０１０３】
本発明の微小コロニー形成細菌の単離方法によって、従来の平板培養法では単離されたことのない微生物を取得することが可能となり、この微生物は新規なＤＮＡ遺伝子取得源として、食品産業、医薬品産業、水質等の環境保全、医療等の幅広い分野への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物相の経時変化を示すグラフである。
【図２】微小コロニー形成細菌Ｓｈｉｎｓｈｕ−ａｈ２株の及びその近縁微生物の発生系統樹を示す図である。
【図１】
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【図２】
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