(57)【要約】  【課題】牛肉の基となっている牛の品種を、特に、黒毛和種か否かについて鑑別できる方法を提供すること。  【解決手段】下記遺伝子多型のうち、１種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子ＤＮＡを検出することにより、当該被験牛が黒毛和種か否か等を鑑別可能であることを見いだした。  １．配列番号２の164〜166番目の塩基；２．.配列番号４の589番目の塩基；３．配列番号６の560〜568番目の塩基；４．配列番号８の445番目の塩基；５．配列番号10の344番目の塩基；６．配列番号12の524番目の塩基；７．配列番号14の734番目の塩基；８．配列番号16の1212番目の塩基；９．配列番号18の1051番目の塩基；10．配列番号20の633番目の塩基；における遺伝子多型； 11．配列番号22の202〜204番目の塩基。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１〜１１で表されるウシの遺伝子の多型のうち、１種または２種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子ＤＮＡを検出することにより、当該被験牛が黒毛和種であるか否かを鑑別する、ウシの品種の鑑別方法。
１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２に示す塩基配列の１６４〜１６６番目の塩基における遺伝子多型。
２．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４に示す塩基配列の５８９番目の塩基における遺伝子多型。
３．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号６に示す塩基配列の５６０〜５６８番目の塩基における遺伝子多型。
４．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列の４４５番目の塩基における遺伝子多型。
５．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０に示す塩基配列の３４４番目の塩基における遺伝子多型。
６．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２に示す塩基配列の５２４番目の塩基における遺伝子多型。
７．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４に示す塩基配列の７３４番目の塩基における遺伝子多型。
８．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型。
９．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１８に示す塩基配列の１０５１番目の塩基における遺伝子多型。
１０．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２０に示す塩基配列の６３３番目の塩基における遺伝子多型。
１１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２２に示す塩基配列の２０２〜２０４番目の塩基における遺伝子多型。
【請求項２】
１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２に示す塩基配列の１６４〜１６６番目における遺伝子多型が、「ＣＴＣ」であるか、または、当該３塩基の欠失であるか、により表現される多型である、請求項１記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項３】
遺伝子多型を、配列番号１および２の１６４〜１６６番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項２記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項４】
２．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４に示す塩基配列の５８９番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ］であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜３のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項５】
遺伝子多型を、配列番号３および４の５８９番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜４のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項６】
３．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号６に示す塩基配列の５６０〜５６８番目の塩基における遺伝子多型が、「ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ」であるか、または、当該９塩基の欠失であるか、により表現される多型である、請求項１〜５のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項７】
遺伝子多型を、配列番号５および６の５６０〜５６８番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜６のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項８】
４．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列の４４５番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜８のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項９】
遺伝子多型を、配列番号７および８の４４５番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜８のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１０】
５．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０に示す塩基配列の３４４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜９のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１１】
遺伝子多型を、配列番号９および１０の３４４番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜１０のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１２】
６．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２に示す塩基配列の５２４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ａ」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型である、請求項１〜１１のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１３】
遺伝子多型を、配列番号１１および１２の５２４番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜１２のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１４】
７．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４に示す塩基配列の７３４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ］であるか、または、「Ｔ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜１３のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１５】
遺伝子多型を、配列番号１３および１４の７３４番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜１４のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１６】
８．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｔ」であるか、または、「Ｃ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜１５のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１７】
遺伝子多型を、配列番号１５および１６の１２１２番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜１６のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１８】
９．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１８に示す塩基配列の１０５１番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜１７のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項１９】
遺伝子多型を、配列番号１７および１８の１０５１番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜１８のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項２０】
１０．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２０に示す塩基配列の６３３番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である、請求項１〜１９のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項２１】
遺伝子多型を、配列番号１９および２０の６３３番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜２０のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項２２】
１１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２２に示す塩基配列の２０２〜２０４番目の塩基における遺伝子多型が、「ＴＧＧ」であるか、または、当該３塩基の欠失であるか、により表現される多型である、請求項１〜２１のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項２３】
遺伝子多型を、配列番号１９および２０の２０２〜２０４番目の塩基部分を、遺伝子増幅法により得られる遺伝子増幅産物により検出する、請求項１〜２２のいずれかに記載のウシの品種の鑑別方法。
【請求項２４】
鑑別方法が、被験牛が黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別することができる方法である、請求項１〜２３のいずれかの請求項に記載の牛の品種の鑑別方法。
【請求項２５】
第１段階として、被験牛における、下記１および／または６の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、
１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２に示す塩基配列の１６４〜１６６番目の塩基における遺伝子多型。
６．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２に示す塩基配列の５２４番目の塩基における遺伝子多型。
上記第１段階において、上記遺伝子多型１および／または６の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、上記の被験牛における下記２、４および５からなる群から選ばれる２種若しくは３種の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項１〜２４のいずれかに記載の牛の品種の鑑別方法。
２．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４に示す塩基配列の５８９番目の塩基における遺伝子多型。
４．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列の４４５番目の塩基における遺伝子多型
５．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０に示す塩基配列の３４４番目の塩基における遺伝子多型。
【請求項２６】
被験牛における、下記７および／または８の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定する、請求項１〜２４のいずれかに記載の牛の品種の鑑別方法。
７．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４に示す塩基配列の７３４番目の塩基における遺伝子多型。
８．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型。
【請求項２７】
第１段階として、被験牛における、下記７および／または８の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、
７．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４に示す塩基配列の７３４番目の塩基における遺伝子多型。
８．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型。
上記第１段階において、上記遺伝子多型７および／または８の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、上記の被験牛における下記１〜６、９〜１１からなる群から選ばれる２種以上の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項１〜２４のいずれかに記載の牛の品種の鑑別方法。
１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２に示す塩基配列の１６４〜１６６番目の塩基における遺伝子多型。
２．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４に示す塩基配列の５８９番目の塩基における遺伝子多型。
３．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号６に示す塩基配列の５６０〜５６８番目の塩基における遺伝子多型。
４．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列の４４５番目の塩基における遺伝子多型。
５．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０に示す塩基配列の３４４番目の塩基における遺伝子多型。
６．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２に示す塩基配列の５２４番目の塩基における遺伝子多型。
９．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１８に示す塩基配列の１０５１番目の塩基における遺伝子多型。
１０．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２０に示す塩基配列の６３３番目の塩基における遺伝子多型。
１１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２２に示す塩基配列の２０２〜２０４番目の塩基における遺伝子多型。
【請求項２８】
上記第１段階において、被験牛の上記遺伝子多型７および／または８の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、上記１および１１の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項２７記載の牛の品種の鑑別方法。
【請求項２９】
上記第１段階において、被験牛の上記遺伝子多型７および／または８の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、上記１および１１、並びに、６および／または９の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する、請求項２７記載の牛の品種の鑑別方法。
【請求項３０】
下記１〜１１に示す群からなる、１種または２種以上のヌクレオチド鎖。
１．配列番号１または２の１６４〜１６６番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１または２に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
２．配列番号３または４の５８９番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３または４に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
３．配列番号５または６の５６０〜５６８番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号５または６に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
４．配列番号７または８の４４５番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号７または８に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
５．配列番号９または１０の３４４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号９または１０に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
６．配列番号１１または１２の５２４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１１または１２に示す塩基配列を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
７．配列番号１３または１４の７３４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１３または１４に示す塩基配列を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
８．配列番号１５または１６の１２１２番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１５または１６に示す塩基配列を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
９．配列番号１７または１８の１０５１番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１７または１８に示す塩基配列を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
１０．配列番号１９または２０の６３３番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１９または２０に示す塩基配列を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
１１．配列番号２１または２２の２０２〜２０４番目の塩基を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２１または２２に示す塩基配列を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の検出による、ウシの品種の鑑別方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
現在、我国で飼育されている肉用牛は、黒毛和種、褐毛和種、無角和種、日本短角種の和牛4品種と、若干の外国種である。和牛4品種の中でも特に黒毛和種の供用頭数は多く、その繁殖雌牛は我国の肉用種繁殖雌牛総頭数において約90％を占めている。一方、我国で飼育されている乳用牛は、そのほぼ全てがホルスタイン種で、この他に若干のジャージー種が存在する。
【０００３】
ホルスタイン種の雄子牛は肥育用素牛として出荷されていた。ホルスタイン種の肉質は黒毛和種に劣るが、その枝肉は安価で、大衆肉として好まれてきたが、牛肉の輸入自由化に伴い、ホルスタイン種牛肉と競合する外国産の安価な牛肉が市場に大量に出回るようになった。そこで、外国産の安価な牛肉に対抗するため、国内では、ホルスタイン種雌牛に黒毛和種雄牛を交配して作った第一代交雑種 からの牛肉生産が盛んになってきた。
【特許文献１】特開２００２−２０９５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところが、近年、牛海綿状脳症 (BSE; Bovine Spongiform Encephalopathy) 感染牛が我国でも確認されるようになり、牛肉の安全性に対する消費者の不安から、一時、牛肉需要が激減した。また、外国産輸入牛肉を国産牛肉と偽称した事例に代表されるような、牛肉などの食品を不当な表示で販売するという不祥事も起きた。この偽称販売は輸入牛肉に対してだけではなく、国産牛肉に対しても行われている可能性を否定できない。例えば、上述の黒毛和種とホルスタイン種との第一代交雑種の毛色は、黒毛和種の毛色と見分けがつきにくいだけではなく、肉質も黒毛和種に近く、この第一代交雑種の中でも、特に肉質の良いものは黒毛和種とほとんど差が認められないこともある。このため、この第一代交雑種牛肉が、黒毛和種高級牛肉として偽称販売される可能性を否定することができない。
このような偽装を防止するため、農林水産省は素牛の誕生から市場までの流れをトレースできるシステム (トレーサビリティー) の構築に努めている。このシステムは、食肉の偽装販売を防ぎ、食肉の品質や安全性を保証する上でも重要な要素になると期待されている。また、このトレーサビリティーを補完する意味で、黒毛和種と第一代交雑種とを正しく鑑別する技術、ひいては牛品種を正しく鑑別する技術の確立が望まれている。しかし、現在に至るまで、科学的な手法に基づく客観的判定基準による品種鑑定技術は、実用化されていない。
【０００５】
そこで、本発明が解決すべき課題は、牛肉の基となっている牛の品種を、実際に売られている牛肉を材料として効率的に鑑別する方法、殊に、生産量が多く、かつ、不当表示などの偽装工作の対象となる可能性が高い第一代交雑種やホルスタイン種の肉が、黒毛和種由来の肉として販売されているような場合、これを非黒毛和種由来の肉であると鑑別できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
生物の進化は、遺伝子の本質であるＤＮＡの塩基配列の突然変異によりもたらされたと考えられる。品種の違いもこのような塩基配列の変化が蓄積した結果と考えられるから、鑑別対象となる品種間で、ゲノムＤＮＡの塩基配列が一塩基でも異なる「多型」が認められれば、この多型を品種鑑別のマーカーとして利用できることになる。
【０００７】
ＤＮＡ塩基配列の多型を、品種鑑別のマーカーとする検査の場合、検査対象とすべきＤＮＡの範囲を絞ることができるため、と畜から日時が経過した、冷凍もしくは冷蔵保存されていた肉であっても、ＤＮＡが抽出できさえすれば検査することが可能と考えられる。それ故、食肉を対象とした遺伝子に関わる検査の場合、遺伝子の多型を検査マーカーとすることが好適である。
【０００８】
近年、遺伝子工学が飛躍的に発展し、DNA分析に基づく遺伝学的な分析が可能となった。DNAの多型は遺伝標識として有用で、それをマーカーとして、家畜では、血統登録、個体識別、親子判定、病原遺伝子のキャリア個体の除去などに利用されている。遺伝子多型の検索方法としては、特に限定されず、通常公知の方法、例えば、マイクロサテライト法、RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)法、Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) 法 (Vos, et al. 1995)等〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（1993）等を参照のこと］等や、これらの遺伝子検索方法の変法等を行うことが可能である。
【０００９】
例えば、AFLP法 は、2種類の制限酵素を用いた多型解析法であり、比較的簡単に多数のゲノム情報を得ることの出来る多型解析法として注目されている。そのため、AFLP法 は、遺伝的類縁関係 (Nijiman, et al. 1999、Moreno, et al. 2002) 、QTL (quantitative trait loci) 解析 (Otsen, et al. 1996) 、連鎖地図作成 (Barendse, et al. 1994、Lee, et al. 2002) 、cDNAを利用した発現遺伝子の解析 (Bracaccia, et al. 2001) などの幅広い研究に応用されており、本発明においても好適な遺伝子多型の検索法として応用することができる。すなわち、AFLP法 自体は、一度にゲノム全体の多型をスクリーニングするため、遺伝子座毎の遺伝子型の判定が不可能であるが、AFLP多型となっている原因（一塩基多型や、塩基の挿入若しくは欠損に基づく多型）を同定することにより、この同定情報を基に、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法やハイブリダイズ法等により、被験牛の遺伝子型の判定を行うことが可能である。かかる遺伝子型の判定結果を集積して解析することにより、遺伝子頻度を推測し、牛の品種間の遺伝的構造の差異が予測することが可能となる。
【００１０】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて、黒毛和種とホルスタイン種間におけるAFLP法を用いた遺伝子の多型解析の結果、牛の品種を鑑別可能な遺伝子の多型マーカーを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
［多型マーカーの検索］
本発明者は、黒毛和種と、ホルスタイン種またはホルスタイン種と黒毛和種の第一代交雑種（以下、Ｆ１ともいう）等とを峻別可能な遺伝子の多型マーカーを見つけだすために、AFLP法により、ホルスタイン種に高頻度で検出されるAFLP多型断片を中心に検索を行った。
【００１２】
まず、黒毛和種とホルスタイン種各10頭ずつで1次スクリーニングを行い、検出されるAFLP断片に偏りがあったプライマーセットについては、黒毛和種を50頭に、ホルスタイン種を51頭に増やして、2次スクリーニングを行った。
【００１３】
（i）牛のゲノムDNA抽出
まず、牛の肝臓組織、リンパ節、血液（白血球）をホモジナイズした残渣を、ザルコシル、EDTAを含むTNE溶液に溶解後、Proteinase Kを加え、37℃で一晩インキュベートした。次に、TE-フェノール抽出、フェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール抽出、ジエチルエーテル抽出、およびエタノール沈殿によりDNAを抽出精製し、かかるDNAを遺伝子試料とした。
【００１４】
(ii)AFLP法によるゲノムスキャンニング
AFLP法における操作は、基本的には、Vosら (1995) の方法に従って行った。まず、500ngのDNAを制限酵素Taq IとEcoRIの組み合わせで切断し、表1に示したTaq IアダプターとEcoRIアダプターを付加し、これをPCRのためのテンプレートとした。PCR反応液は、アダプターを付加した鋳型DNA 溶液5μl、1×Ex Taq buffer、dNTP Mixture (0.2mM each)、TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version (1U)、1つの塩基を付加させたアダプターに特異的に結合する1st PCRプライマー（Taq IプライマーとEcoRIプライマー；表1参照）各75ngを含み、蒸留水で全量を50μlに調整した。1st PCR反応は、94℃ 30秒、56℃1分、72℃ 1分を1サイクルとして20サイクル繰り返した後、72℃ 10分の伸長反応を行った。なお、サーマルサイクラーは、PE BiosystemsのGeneAmp PCR system 9700Gを使用した。1st PCR産物は蒸留水で10倍希釈し−20℃で保存した。
【００１５】
【表１】
2005027655.tif 000002
【００１６】
［表中、アダプターとプライマーの配列番号は、上から順に、23〜30（アダプターの２本鎖は、１本鎖毎にカウント）とする］
【００１７】
次に、蒸留水で10倍希釈した1st PCR産物5μlに、1×Ex Taq buffer、dNTP Mixture（0.2mM each）、TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version（1U）、3つの塩基を付加させたアダプターに特異的に結合する2nd PCRプライマー（Taq IプライマーとEcoRIプライマー；表1参照）を加え、蒸留水で20μlに調整した。加えるプライマーは付加されたアダプターの種類に従った。PCR反応は、94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして13サイクル繰り返した。さらに94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを23サイクル繰り返した。その際に、1サイクルごとに0.7℃ずつ温度を下げるタッチダウンPCRを行った。2nd PCR産物は、スラブ型電気泳動装置を用い、Long Ranger（Takara）ゲルで、0.6×TBE、1,800Vで2.5時間、電気泳動した。電気泳動後、SILVER SEQUENCETM DNA Staining Reagents (Promega)で銀染色し、DNAバンドを観察した。
【００１８】
上述の方法により、黒毛和種およびホルスタイン種各10頭ずつのゲノムDNAにおいて、合計500組のプライマーセットでスキャンニングした結果、黒毛和種に高頻度に検出された多型バンドが4本、ホルスタイン種に高頻度に検出された多型バンドが29本得られた（図1参照）。これらのバンドが得られたプライマーセットを用い、黒毛和種50頭、ホルスタイン種51頭に供試頭数を増やし2次スクリーニングを行ったところ、6種類のAFLP多型バンドの検出頻度が極端に偏っていた。よって、これら6種類の多型断片をBIMA(Breed Identified Markers derived from AFLP)1〜6とし、以降の解析を行った。
【００１９】
また、上述のAFLPゲノムスキャニングとは別個に、合計約１０００組のプライマーセットを用いて、AFLPゲノムスキャニングを行った。その結果、さらに高精度の検出を可能とする５種類の新たな識別マーカー（BIMA７〜11）を得た。
【００２０】
(iii)AFLP多型断片のクローニングと塩基配列の解析
次に、銀染色法により検出されたAFLP多型バンド（BIMA1〜11）をポリアクリルアミドゲルから切り出し、TE 20μlに浸してDNAを溶出させた。このDNA溶液をテンプレートとして2nd PCRと同じ条件でPCR反応を行い、1.5％アガロースゲルで20分間電気泳動した。UV照射下でゲルからバンドを切り出し、Ultra CleanTM 15 DNA Purification Kit (MO BIO) でDNAを抽出した。
【００２１】
抽出したAFLP多型断片は、pGEM-T Vector （pGEM-T Easy Vector System II；Promega）に挿入後、コンピテント大腸菌 (JM109)に導入し、抗生物質アンピシリン添加LB-アガープレート上で、37℃で一晩培養した。プレートに生育した上記プラスミドで形質転換されたアンピシリン耐性の大腸菌のコロニーを滅菌爪楊枝で拾い上げ、少量を保存用プレートに殖菌した後、残りを0.2mg/ml Proteinase K、0.45% NP40、0.45％ Tween20を含む溶液でDNAを溶出させ、2nd PCRと同じ条件でPCR反応を行い、目的の断片がクローニングされているか電気泳動により確認した。
【００２２】
目的の断片がクローニングされているコロニーを、加熱滅菌した白金耳で保存用プレートから拾い、50μg/mlアンピシリン添加LB培地3mlに移し、37℃で一晩振盪培養した。プラスミドはアルカリ法で抽出し、RNase Aで混入しているRNAを分解後、フェノール/クロロフォルム/イソアミルおよびジエチルエーテルで抽出後、エタノール沈殿したDNAを50μl 蒸留水に溶かした。
【００２３】
クローニングされたAFLP断片の塩基配列は、Sequi Therm EXCELTM II DNA sequencing Kits-LC (EPICENTRE Technologies)により解析した。IRD800で標識されたM13 Forward、M13 Reverseの2種類のプライマーを用い、添付プロトコールに従い、95℃ 5分加熱後、95℃ 30秒、50℃ 15秒、70℃ 1分を1サイクルとして30サイクル繰り返した後、70℃ 7分間の伸長反応を行い、ラベリングした。シークエンスにはLong Ranger Gelを用い、LI-COR社DNAシーケンサーにて、0.8×TBE、2,000V、5時間以上通電し、解析した。
【００２４】
(iv)フランキングサイトの塩基配列決定
多型部位は、EcoRI、Taq Iの制限酵素認識部位である可能性があるため、AFLP多型断片の両端を含むフランキングサイトの塩基配列を、Universal GenomeWalkerTM Kit (BD Biosciences)を用いたPCR Walking法（Devic, et al. 1997）で決定した。無作為に選んだ黒毛和種1個体のDNAを、添付マニュアルに従い、Dra I、EcoRV、Pvu II、Stu Iの4種類の制限酵素で切断し、それぞれにGenome-Walker Adaptor（表2）をライゲーションし、ライブラリーを作成した。
【００２５】
【表２】
2005027655.tif 000003
【００２６】
［表中、アダプターとプライマーの配列番号は、上から順に、31〜34（アダプターの２本鎖は、１本鎖毎にカウント）とする］
【００２７】
【表３】
2005027655.tif 000004
【００２８】
［表中、プライマーの配列番号は、左上から左下、次いで、右上から右下に向かって、順に、35〜58とする］
【００２９】
アダプターを付加した4種類のゲノムライブラリーをテンプレートとして、プライマリーPCRを行った。反応液は、1μlテンプレートDNA溶液、1×TthPCR Reaction Buffer、dNTP（0.2mM each）、1.1mM Mg(OAc)2、0.2μM Adaptor primer 1（表2）、0.2μM 1st PCRプライマー（表3）、1×Advantage Genomic Polymerase Mixを含み、蒸留水で全量50μlとし、94℃ 2秒、72℃ 3分を1サイクルとして7サイクル反応させた。この際、タッチダウンPCRにより67℃まで伸長反応の温度を下げた。その後、94℃ 2秒、67℃ 3分を1サイクルとして32サイクル反応させ、67℃で4分維持した。
【００３０】
次に、蒸留水で50倍に希釈したプライマリーPCR産物 1μl、1×Tth PCR Reaction Buffer、dNTP（0.2mM each）、1.1mM Mg(OAc)2、0.2μM Adaptor primer 2（表2）、0.2μM 2nd PCRプライマー（表3）、1×Advantage Genomic Polymerase Mixを含み、蒸留水で全量50μlとしたセカンダリーPCR反応液を調整した。PCR反応条件は94℃ 2秒、72℃ 3分を1サイクルとして5サイクル行った。この際、タッチダウンPCRにより67℃まで伸長反応の温度を下げた。その後、94℃ 2秒、67℃ 3分を1サイクルとして20サイクル行い、67℃で4分維持した。それでも伸長反応がうまく行かない場合は、step down PCRを行った (Zhang, et al. 2000)。
【００３１】
PCR Walkingにより得られたPCR産物は、アガロースゲルから回収し、(iii)AFLP多型断片のクローニングと塩基配列の解析で用いられたクローニングおよびシークエンス方法と同様に、クローニング後、塩基配列を決定した。ただし、サブクローニングの確認は、PCR Walking法のセカンダリーPCRで使用したプライマーを用いた。
BIMA７〜11に対しても、同様の方法でフランキングサイトの塩基配列の決定を行った。
【００３２】
(v)品種間の変異の特定
フランキングサイトの塩基配列に基づいて、制限酵素部位を挟みこめるプライマーセットを設計した。このプライマーセットを用いて黒毛和種とホルスタイン種のゲノムDNAでPCR反応を行った。反応条件は94℃ 2分間熱変性後、94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル反応させた後、72℃ 7分、伸長反応した。得られた産物はアガロースゲルから回収し、SILVER SEQUENCETM DNA Sequencing Reagentsを用い、添付プロトコールに従ってシーケンス反応を行い、銀染色法でバンドを検出した。シークエンス解析の結果から黒毛和種とホルスタイン種の塩基配列を比較し、BIMA1〜11の多型断片において多型の原因となっている変異を特定したところ、制限酵素認識部位の変異が原因であったものが８種類 (EcoRIが３種類、Taq Iが５種類)、欠失によるものが３種類であった。
【００３３】
このようにして配列が決定されたBIMA1〜11の多型断片を、黒毛和種型とホルスタイン種型に分けて開示する。
【００３４】
図２は、BIMA1の多型断片を示した図面である。図２（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA1a：配列番号１）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA1b：配列番号２）である。図２により、BIMA1の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２に示す塩基配列の１６４〜１６６番目における遺伝子多型が、「ＣＴＣ」であるか、または、当該３塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００３５】
図３は、BIMA2の多型断片を示した図面である。図３（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA2a：配列番号３）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA2b：配列番号４）である。図３により、BIMA2の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４に示す塩基配列の５８９番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ］であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００３６】
図４は、BIMA3の多型断片を示した図面である。図４（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA3a：配列番号５）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA3b：配列番号６）である。図４により、BIMA3の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号６に示す塩基配列の５６０〜５６８番目の塩基における遺伝子多型が、「ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ」であるか、または、当該９塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００３７】
図５は、BIMA4の多型断片を示した図面である。図５（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA4a：配列番号７）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA4b：配列番号８）である。図５により、BIMA4の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８に示す塩基配列の４４５番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００３８】
図６は、BIMA5の多型断片を示した図面である。図６（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA5a：配列番号９）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA5b：配列番号10）である。図６により、BIMA5の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０に示す塩基配列の３４４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００３９】
図７は、BIMA6の多型断片を示した図面である。図７（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA6a：配列番号11）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA6b：配列番号12）である。図７により、BIMA6の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２に示す塩基配列の５２４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ａ」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４０】
図８は、BIMA７の多型断片を示した図面である。図８（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA7a：配列番号13）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA7b：配列番号14）である。図８により、BIMA７の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４に示す塩基配列の７３４番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｔ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４１】
図９は、BIMA８の多型断片を示した図面である。図９（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA8a：配列番号15）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA8b：配列番号16）である。図９により、BIMA８の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｔ」であるか、または、「Ｃ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４２】
図１０は、BIMA９の多型断片を示した図面である。図１０（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA9a：配列番号17）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA9b：配列番号18）である。図１０により、BIMA９の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１８に示す塩基配列の１０５１番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４３】
図１１は、BIMA10の多型断片を示した図面である。図１１（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA10a：配列番号19）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA10b：配列番号20）である。図１１により、BIMA10の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２０に示す塩基配列の６３３番目の塩基における遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４４】
図１２は、BIMA11の多型断片を示した図面である。図１２（１）は、ホルスタイン種型の断片（BIMA11a：配列番号21）であり、（２）は、黒毛和種型の断片（BIMA11b：配列番号22）である。図１２により、BIMA11の多型断片における多型は、黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２２に示す塩基配列の２０２〜２０４番目の塩基における遺伝子多型が、「ＴＧＧ」の３塩基であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型であることがわかる。
【００４５】
なお、本明細書における核酸塩基の表示は、通常の例に則り、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）である。
【００４６】
さらに、配列番号１〜１２に示す塩基配列は、すべて、ウシのゲノムＤＮＡの一部を構成するポリヌクレオチドであり、特定の制限酵素でウシのゲノムＤＮＡを処理することにより得られる、特定のポリヌクレオチド鎖である（詳細については後述する）。そして、これらの配列番号１〜２２のうち、配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、および、２１と２２は、本鑑別方法を行う上での指標となる遺伝子多型を示すポリヌクレオチド鎖の組であるが、これらのポリヌクレオチド鎖を表示する塩基の番号は、別添の配列表の表示とそれ以外の部分とでは異なる場合がある。すなわち、遺伝子多型が、一塩基置換等のポリヌクレオチド鎖の塩基数の変動を伴わない多型であれば、別添の配列表の表示とそれ以外の部分の表示は一致するが、例えば、特定の塩基の欠落等のポリヌクレオチド鎖の塩基数の変動を伴う多型の場合においては、両者が一致しない場合がある。
【００４７】
例えば、配列番号１と２は、配列番号２における第１６４〜１６６番目の３塩基「ＣＴＧ」が、配列番号１においては欠落している遺伝子多型を示している。つまり、配列番号２の全塩基数は７６２であるのに対して、配列番号１の全塩基数は、それよりも３塩基少ない７５９である。この場合、別添の配列表では、「配列番号１の全塩基数は７５９であり、かつ、配列番号２の第１６４〜１６６番目に該当する部分は無視して表示する」が、それ以外の部分では、この塩基の欠落がかかわる遺伝子多型の形態を明示するために、「配列番号１の全塩基数は７６２であり、かつ、配列番号２の第１６４〜１６６番目に該当する部分を欠落部分としてカウントして表示する」こととする。
【００４８】
配列番号５と６、および、２１と２２の組においても、これと同様の表示を行っている。
【００４９】
［本鑑別方法］
本発明は、下記１〜１１で表されるウシの遺伝子の多型のうち、１種または２種以上の多型を指標として、被験牛の遺伝子ＤＮＡを検出することにより、当該被験牛が黒毛和種であるか否かを鑑別する、ウシの品種の鑑別方法（以下、本鑑別方法ともいう）を提供する発明である。
【００５０】
１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２（BIMA1b）に示す塩基配列の１６４〜１６６番目の塩基「ＣＴＣ」における遺伝子多型（以下、多型１ともいう）である。
【００５１】
多型１は、典型的には、当該遺伝子多型が、「ＣＴＣ」であるか、または、当該３塩基の欠失であるか、により表現される多型である。
【００５２】
２．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号４（BIMA２b）に示す塩基配列の５８９番目の塩基「Ｇ」における遺伝子多型（以下、多型２ともいう）である。
多型２は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である。
【００５３】
３．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号６（BIMA3b）に示す塩基配列の５６０〜５６８番目の塩基「ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ」における遺伝子多型（以下、多型３ともいう）である。
【００５４】
多型３は、典型的には、当該遺伝子多型が、「ＡＣＣＣＴＣＡＧＧ」であるか、または、当該９塩基の欠失であるか、により表現される多型である。
４．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号８（BIMA4b）に示す塩基配列の４４５番目の塩基「Ｃ」における遺伝子多型（以下、多型４ともいう）である。
【００５５】
多型４は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型である。
【００５６】
５．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１０（BIMA５b）に示す塩基配列の３４４番目の塩基「Ｃ」における遺伝子多型（以下、多型５ともいう）である。
【００５７】
多型５は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｇ」であるか、により表現される多型である。
【００５８】
６．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１２（BIMA6b）に示す塩基配列の５２４番目の塩基「Ａ」における遺伝子多型（以下、多型６ともいう）である。
【００５９】
多型６は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ａ」であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型である。
【００６０】
７．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１４（BIMA7b）に示す塩基配列の７３４番目の塩基「Ｃ」における遺伝子多型（以下、多型７ともいう）である。
【００６１】
多型７は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｃ」であるか、または、「Ｔ」であるか、により表現される多型である。
【００６２】
８．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１６（BIMA8b）に示す塩基配列の１２１２番目の塩基における遺伝子多型（以下、多型８ともいう）である。
【００６３】
多型８は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｔ」であるか、または、「Ｃ」であるか、により表現される多型である。
９．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号１８（BIMA9b）に示す塩基配列の１０５１番目の塩基における遺伝子多型（以下、多型９ともいう）である。
【００６４】
多型９は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である。
【００６５】
１０．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２０（BIMA10b）に示す塩基配列の６３３番目の塩基における遺伝子多型（以下、多型１０ともいう）である。
【００６６】
多型１０は、典型的には、当該遺伝子多型が、「Ｇ」であるか、または、「Ａ」であるか、により表現される多型である。
【００６７】
１１．黒毛和種のウシの遺伝子ＤＮＡにおける、配列番号２２（BIMA11b）に示す塩基配列の２０２〜２０４番目の塩基における遺伝子多型（以下、多型１１ともいう）である。
【００６８】
多型１１は、典型的には、当該遺伝子多型が、「ＴＧＧ」の３塩基であるか、または、当該塩基の欠失であるか、により表現される多型である。
本鑑別方法は、特に、被験牛が黒毛和種牛であるか、または、ホルスタイン種牛、若しくは、ホルスタイン種牛と黒毛和種牛の第一代交雑種であるか、を鑑別することができる方法として用いることが有用である。
【００６９】
本鑑別方法は、被験牛の遺伝子試料におけるアリルタイプを判別し、そのアリルタイプから、被験牛の品種を鑑別する方法である。
【００７０】
ここで、遺伝子試料とは、好適には、牛の体細胞の遺伝子（具体的には、ＤＮＡ）、または、これを主成分として含む試料をいう。好適な遺伝子試料を牛の体細胞の遺伝子としたのは、生殖細胞の遺伝子では、一生殖細胞において、父方または母方のいずれか一方のアリルタイプしか判別できず、迅速・的確な個体のアリルタイプの判別が困難であるからである。遺伝子試料の採取部位は、特に限定されず、例えば、筋肉組織、皮下組織、末梢血白血球、毛根細胞などから採取することができる。また、採取対象は、生きている牛のみならず、市場に出回っている精肉であってもよい。本鑑別方法の主要な実施形態が、市販の精肉の品種の鑑別であることを鑑みると、本鑑別方法における遺伝子試料の採取対象が精肉でも可能であることは、極めて重要なことである。遺伝子試料の採取対象からの遺伝子試料の調製は、通常公知のＤＮＡの抽出・精製方法に従って行うことが可能である。また、市販のＤＮＡの抽出・精製キットを用いて、遺伝子試料の調製を行うことも可能である〔採取対象として精肉を用いる場合、筋肉組織等からＤＮＡを抽出するキット（QIAGEN社のQIAamp DNA Mini Kit 等）を用いることも可能である〕。
【００７１】
遺伝子試料からの特定の遺伝子多型である多型１〜６を検出する方法は、特に限定されず、例えば、インベーダー・アッセイ法〔Third Wave Technologies 社（米国）〕、ＳＳＣＰ法、各種のＲＦＬＰ法、ＨＥＴ(hetero duplex analysis)法、ＤＧＧＥ法(denaturing gradient gel electrophoresis) 法、ＤＳ(direct sequence) 法、ＣＣＭ(chemical cleavage mismatch)法、ＣＤＩ(carbodiimid modification)法、ＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法を行うことができる〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(single-stranded conformation polymorphism) 法〕、ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（1993）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ/ ＧＣ−clamp 法については、Myers,R.M.,Shefield,V.,and Cox,D.R.(1988) in Genomic Analysis:A Practical Approach.K.Davies,ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139 等を参照のこと〕。
【００７２】
また、本鑑別方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本鑑別方法を行うための要素が備わっている、遺伝子検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本鑑別方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型部位における塩基の相違を検出可能な反応を行い、かかる検出反応により、所望する遺伝子多型部位における塩基の相違を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、遺伝子の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
【００７３】
本鑑別方法は、上述したように、BIMA1〜11という異なる遺伝子座に、それぞれ遺伝子の多型に基づく異なるアリルタイプを見出して完成された発明であり、被験牛の品種を的確、かつ、多様な観点から鑑別することが可能である。
本鑑別方法により、以下の観点から、被験牛の品種を鑑別することができる。
【００７４】
（１）被験牛が、黒毛和種であるか否かを鑑別することができる。
【００７５】
上記の遺伝子の多型は、黒毛和種とホルスタイン種の間において見出されたものであり、特に、黒毛和種においては、特徴的なアリルパターンをBIMA1〜11において示すことが明らかとなった。ブランド黒毛和種の精肉は、市場において高級品として認識されており、ホルスタイン種との第一代雑種やホルスタイン種そのものの精肉と消費者において混同されることが懸念されている。そのため、精肉が、第一代交雑種やホルスタイン種の肉にもかかわらず、黒毛和種の肉として、偽証・販売されていないかどうかを明確に鑑別可能であることは、非常に有益なことである。
【００７６】
具体的に開示すると、下記のように、特性の異なる２種類のマーカー群を用いて、２段階のスクリーニングを行うことにより、高検出率かつ低危険率で、被験牛の鑑定を行うことが可能である（詳細については、後述する）。
【００７７】
１）BIMA1〜6を用いた態様（図１３）
（第１段階）
被験牛における、多型１および/または６を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定し、
（第２段階）
第１段階において、多型１および／または６の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、多型２、４および５からなる群から選ばれる２若しくは３種の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する。
【００７８】
２）BIMA1〜11を用いた態様
（第１段階）
被験牛における、多型７および/または８を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示す場合には、当該被験牛を非黒毛和種と判定する工程である。
【００７９】
この工程により、非黒毛和種を高頻度で検出することができるので、初期のスクリーニング検査として、この第１段階を独立した鑑定態様とすることも可能である。
【００８０】
（第２段階）
第１段階において、多型７および／または８の遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、第２段階として、多型１〜６、および、多型９〜１１からからなる群から選ばれる２種以上の遺伝子多型を検出し、当該遺伝子多型が非黒毛和種型を示さない場合には、当該被験牛を黒毛和種と判定する工程である。
【００８１】
この第２段階で用いる９種類の多型のうち、特に、多型１及び１１を検出対象とすることが、検出精度を効率的に高めることが可能であり、好適である。また、これらの多型１及び１１に加えて、多型６および／または９を検出対象とすると、いっそう検出精度を向上させることが可能となる。
【００８２】
このようにして、「黒毛和種にもかかわらず、黒毛和種と判定されない」という危険を、最大限排除しつつ、「黒毛和種」として偽装した、ホルスタイン種や、ホルスタイン種と黒毛和種の第一代雑種等を鑑別することが可能となる。
【００８３】
（２）他の態様の鑑別をすることも可能である。
本発明において見出されたBIMA1〜11における多型と、他の遺伝子の多型に対する情報を組み合わせることによって、さらに多様な牛の品種の鑑別を行うことが可能である。
【００８４】
このようにして、本鑑別方法により、被験牛の品種、好適には、被験牛が黒毛和種か否かを、精肉の段階においても鑑別することが可能である。
【００８５】
本鑑別方法により、小売りされている精肉から、その基になっている牛の品種を鑑別することにより、不等表示等の不正行為を抑止し、健全な流通を維持し、その結果、消費者の保護を図ることが可能となる。また、本鑑別方法は、輸入牛肉、外国産の牛肉、ホルスタイン種と黒毛和種の第一代交雑種以外の交雑種等を識別する手段の一つとして、技術的な応用価値がある。
【００８６】
本検出用キット
さらに、本発明は、本鑑別方法を行うための検出用キット（以下、本検出用キットともいう）を提供する発明である。
【００８７】
本検出用キットには、本鑑別方法を行うために必要な要素が含有されている。例えば、遺伝子検出用の試薬（ヌクレオチド鎖を含む）、希釈液、検出用のプレート（いわゆるDNAチップを含む）等を挙げることができるが、その中でも、PCR法（その変法を含む）等の遺伝子増幅法に、遺伝子増幅用プライマーとして用いるヌクレオチド鎖（本ヌクレオチド鎖）は重要である。
このように、本発明は、本鑑別方法を行うために、遺伝子増幅用プライマー等として用いることができる、特定のヌクレオチド鎖（以下、本ヌクレオチド鎖ともいう）を提供する発明である。
【００８８】
本ヌクレオチド鎖は、下記の態様を例示することができる。
【００８９】
１．配列番号１または２の１６４〜１６６番目の塩基（多型１）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１または２に示す塩基配列（ＢＩＭＡ1）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９０】
２．配列番号３または４の５８９番目の塩基（多型２）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号３または４に示す塩基配列（ＢＩＭＡ２）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９１】
３．配列番号５または６の５６０〜５６８番目の塩基（多型３）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号５または６に示す塩基配列（ＢＩＭＡ３）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９２】
４．配列番号７または８の４４５番目の塩基（多型４）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号７または８に示す塩基配列（ＢＩＭＡ４）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９３】
５．配列番号９または１０の３４４番目の塩基（多型５）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号９または１０に示す塩基配列（ＢＩＭＡ５）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９４】
６．配列番号１１または１２の５２４番目の塩基（多型６）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１１または１２に示す塩基配列（ＢＩＭＡ６）を基とした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９５】
７．配列番号１３または１４の７３４番目の塩基（多型７）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１３または１４に示す塩基配列（ＢＩＭＡ７）を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９６】
８．配列番号１５または１６の１２１２番目の塩基（多型８）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１５または１６に示す塩基配列（ＢＩＭＡ８）を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９７】
９．配列番号１７または１８の１０５１番目の塩基（多型９）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１７または１８に示す塩基配列（ＢＩＭＡ９）を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９８】
１０．配列番号１９または２０の６３３番目の塩基（多型１０）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号１９または２０に示す塩基配列（ＢＩＭＡ１０）を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【００９９】
１１．配列番号２１または２２の２０２〜２０４番目の塩基（多型１１）を検出可能な遺伝子増幅産物を与える、配列番号２１または２２に示す塩基配列（ＢＩＭＡ１１）を基にした増幅用プライマーとして用いることができるヌクレオチド鎖。
【０１００】
これらの態様の本ヌクレオチド鎖は、選択する検出法によって異なる態様となり得る。すなわち、例えば、ＳＳＣＰ(Single-strand conformation polymorphism) 法、ＲＦＬＰ(restriction fragment length polymorphism)法、インベーダー法等の多型塩基の相違により、直接的に異なる遺伝子増幅産物を得て、これにより多型を検出する場合には、好適な態様として、ＢＩＭＡ１〜１１の多型塩基を含むヌクレオチド鎖とハイブリダイズが可能であり、かつ、その３’末端に多型塩基に対応する塩基を保有する、塩基数が１０〜４５、好ましくは１５〜４０のヌクレオチド鎖が挙げられる（この態様のヌクレオチド鎖を、遺伝子増幅用プライマーの対の一方として用いて、被験牛の遺伝子を増幅して得られる遺伝子増幅産物を、所望するアリルタイプの判別情報として用いることができる）。
【０１０１】
また、両方の多型塩基を含む遺伝子領域を増幅させて、得られた増幅産物の分子量を比較することにより、多型塩基の内容を検出する方法（この方法は、多型１、３、１１のように、多型部分において塩基の欠失や挿入が認められる場合が有用である）を選択する場合や、得られた遺伝子増幅産物に多型部分に対して感受性が認められる制限酵素を作用させて、その消化産物の分子量の相違を検出する方法（この方法は、多型２，４〜１０のように、多型塩基が置換している場合が有用である）を行う場合には、ＢＩＭＡ１〜１１の多型塩基を含むヌクレオチド鎖とハイブリダイズが可能であり、かつ、多型塩基に対応する部分を含まずに、プライマーとしてのハイブリダイズに多型塩基を挟み込んで、多型塩基を含む増幅産物を得ることができる、塩基数が１０〜４５、好ましくは１５〜４０のヌクレオチド鎖であることが好適である。
【発明の効果】
【０１０２】
本発明により、牛肉の基となっている品種を効率的に鑑別する方法、すなわち、ホルスタイン種、黒毛和種、およびこれらの第一代交雑種を鑑別する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０３】
［SNPsマーカーを用いた遺伝子型判別］
次に、多型部分の変異の種類に応じて、PCRやミスマッチPCR-RFLPなどによる大量試料について簡便に遺伝子型判別を解析できる方法を構築した（表4、図１４）。
【０１０４】
（１）BIMA1〜6 
反応液は、ゲノムDNA 50ng、1×PCR buffer、dNTP mixture (0.2mM each)、各プライマー 10pmol、DNA polymerase 1U (TaKaRa Ex TaqTM Hot Start Version) を含み、蒸留水で全量20μlとした。基本的なPCRの条件は、94℃ 2分熱変性後、94℃ 30秒、65（or 55）℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル反応後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、増幅しにくいプライマーについては、65℃のアニーリング温度を62℃に下げて行った。PCR-RFLPを行うマーカーについては、以下の反応を行った。反応液は、PCR産物 10μl、制限酵素バッファー 3μl、制限酵素EcoRIまたはTaqI 5unitを含み蒸留水で全量30μlとし、EcoRIで切断するものは37℃、TaqIで切断するものは65℃でそれぞれ12時間以上インキュベートした。BIMA2、4、5、6の反応液は、3%アガロースゲルで100V、30分間、電気泳動後、エチジウムブロマイド染色によりバンドを検出した。BIMA1と3のPCR産物は、5%ポリアクリルアミドゲルで、1,800V、2時間、電気泳動後、銀染色（Silver sequence DNA staining reagents：Promega社）によりバンドを検出した。なお、ミスマッチPCR-RFLPとは、PCRプライマーセットの一方に、作為的に一塩基の置換を入れたプライマーを用いることで（表4参照）、RFLPで使用する制限酵素で認識される塩基配列をプライマー領域に持つPCR産物を作り出し、多型部分が制限酵素で切断されないアリルを鋳型としたPCR産物であっても、この部分が必ず切断される方法である（図１４）。これは、PCR反応および制限酵素処理が正常に起きていることを裏付ける内部指標となる。
【０１０５】
（２）BIMA7〜11
ゲノムDNA(10ng/μl)5μl、10×PCR buffer(100mM Tris-HCl, 15mM MgCl, 500mM KCl ; pH8.6) 2.0μl、dNTP Mixture(2.5mM each)1.6μl、TaKaRa Ex TaqTMHot Start Version(5unit/μl)0.08μl、Forwardプライマー 10ngとReverseプライマー10ngをそれぞれ加え、超純水で全量を20μlとして反応を行った。PCRの条件は基本的には以下のように設定した。94℃ 2分後、94℃30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル繰り返した後、72℃ 7分の伸長反応を行った。ただし、PCR増幅がしにくいプライマーについては、65℃のアニーリング温度を下げて行った。
【０１０６】
PCR産物10μl、10×制限酵素buffer(各制限酵素に対応するもの)3μl、制限酵素(10unit/μl)0.5μlをそれぞれ加え、超純水で全量を30μlとして各制限酵素の活性温度でインキュベートした。
【０１０７】
40％グリセロール液 (40％グリセロール, 0.25％ Bromophenol Blue, 0.25% Xylene Cyanol FF) を加えて1.5％アガロースゲル (アガロース S 60mg, 1×TBE buffer 40ml, エチジウムブロマイド溶液 (10mg/ml in water) 2.0μl) で電気泳動した。
【０１０８】
銀染色法にはSILVER SEQUENCETMDNA Staining Reagents (Promega) を用いた。方法はプロトコールに従った。
【０１０９】
ゲル溶液の作成は、尿素 35g、10×TBE (1L中にTris 108g, Boric Acid 55g, Na3EDTA・２H2O 9.3g) 8.4ml、Long Ranger(R) Gel Solution 8.4ml、これに超純水を加えてよく撹拌し、尿素が完全に溶けた後、超純水を加えて全量を70mlにした。この溶液を0.45μmのフィルターで濾過し、10分間脱気した。これに10％APS 350μl、TEMED 35μlを加え、ゲル板にゆっくり流し込み、上部にコームを差し込み2時間以上放置した。電気泳動は、スラブ型電気泳動装置を用いた。bufferには0.6×TBEを使用し、1,800Vで行った。
【０１１０】
電気泳動後、ゲル板をはがし染色した。染色には、10%酢酸溶液 2L (停止液)、2g AgNO3・37% Formaldehyde 2L (染色液)、6g NaCO3 2L (現像液)を用いた。また現像液は氷上に保存し、使用する直前に37% Formaldehyde 3mlとSodium Thiosulfate 400μlを加えた。
【０１１１】
ゲル板をトレイに入れ、停止液 1Lを加え、20分間振とうした。その後、超純水で3回洗浄し、染色液にゲル板を浸し、30分間振とうした。染色が終わったゲル板は、銀が落ちすぎない程度に超純水に軽く浸し、すばやく現像液に浸し、バンドが現れるまで振とうした。その後、適度なところで停止液を加えて反応を止めた後、超純水で再び洗浄し、DNAバンドを観察した。
【０１１２】
【表４】
2005027655.tif 000005
【０１１３】
［表中、プライマーの配列番号は、表の上から下に向かって、順に、59〜80とする］
【０１１４】
（１）BIMA1〜6 
この方法を用いて、黒毛和種100頭、ホルスタイン種100頭およびF1 90頭について、各マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた（表5）。黒毛和種やホルスタイン種から検出されたBIMAマーカーの遺伝子頻度は、F1においてほぼ半分の値を示した。この事から、各BIMAマーカーは、黒毛和種とホルスタイン種の集団において、ここで示された遺伝子頻度と同等の頻度で分布していることが示唆された。
【０１１５】
【表５】
2005027655.tif 000006
【０１１６】
（２）BIMA1〜11
また、同様の方法を用いて、（１）とは別個に黒毛和種２９６頭、ホルスタイン種１００頭およびF1９６頭について、各マーカーでの遺伝子型頻度と遺伝子頻度を調べた（表6）。
【０１１７】
【表６】
2005027655.tif 000007
【０１１８】
［複数のSNPsマーカーを用いた遺伝子型頻度からの鑑定確率計算］
（１）BIMA1〜6 
まず、黒毛和種においてアリルaの遺伝子頻度が小さいマーカーであるBIMA1と6をタイプIマーカー、ホルスタイン種においてBIMA1と6以外でアリルaの遺伝子頻度が高いマーカーであるBIMA2、4、5をタイプIIマーカーとした。これらのマーカーを組み合わせたときのF1の検出率と黒毛和種を誤ってF1と判定してしまう危険率を、表5の結果を用いてそれぞれ計算したところ、タイプIマーカー群では検出率73.01%、危険率1.00%（表7）、タイプIIマーカー群では検出率56.27%、危険率1.98%（表8）であった。
【０１１９】
【表７】
2005027655.tif 000008
【０１２０】
【表８】
2005027655.tif 000009
【０１２１】
ここで、タイプIマーカーでホルスタイン種アリルaが検出されたものはF1（またはホルスタイン種）として扱い、タイプIマーカーでアリルaが検出されなかったものは、タイプIIマーカーで鑑定し、2マーカー以上でアリルaが検出されたものをF1（またはホルスタイン種）として判定すると定義し、この2段階鑑定による検出率と危険率を求めた。
【０１２２】
F1でありながらタイプIマーカーでアリルaが検出できない個体は、
式：1−0.7301＝0.2699
で表され、これに対して検出率56.27%のタイプIIマーカーを適用すると、新たに検出されるF1は、
式：0.2699×0.5627＝0.1519
で表される。これは、タイプIマーカーで検出された個体以外に、新たに検出されるF1全体に対する割合なので、全体の検出率は、
式：0.7301＋0.1519＝0.8820
で表され、F1全体の88.20%でアリルaが検出される、すなわち、検出率88.20%となる。
【０１２３】
次に危険率だが、これは黒毛和種をF1として間違って判定してしまう、すなわちアリルaが検出される確率を意味する。BIMA1は黒毛和種において遺伝子型aaおよびabは検出されないため（表5参照）、危険率は0、BIMA6は遺伝子型abが1個体存在するので危険率1%、したがってタイプIマーカー群での危険率は1%である。一方、タイプIIマーカー群では、上述の定義より、3マーカーのうちいずれか２個で検出される黒毛和種の割合と3マーカー全てで検出される割合を加えたものが危険率となる。すなわち、2マーカーで検出される組み合わせである、BIMA2×4、BIMA4×5、BIMA5×2の危険率から、3マーカー全てで検出されるBIMA2×4×5の危険率が重複する分を差し引いたものであるから、
式：0.088×0.107＋0.107×0.0591＋0.0591×0.088−2×0.088×0.107×0.0591＝0.0198
で計算される。これを信頼度で表現する場合は、
式：1−0.0198＝0.9802
で与えられ、98.02%となる。
【０１２４】
よって、これら全てを統合した結果から、2段階判定法では、88.20%の検出率と98.02%の信頼度で鑑定可能と評価された。ただし、危険率は検出されたマーカー数および種類により変動するため、あくまで信頼度が低くなる場合の組み合わせにおける値として示した。
【０１２５】
（２）BIMA1〜11
上記（１）の方法に準じて、BIMA1〜11の鑑定能についての検討を行った。その結果、これらのマーカーを用いた場合の最高の品種鑑定能を得るマーカーの組み合わせは、BIMA1、BIMA7、BIMA8、BIMA11を用いた場合であることが明らかとなった。その精度は、F1の検出率91.7％、誤判別率0.7% (信頼度99.3%)であった。F1の検出率が向上すると共に、信頼度も98％から、99.3％に向上した。
【０１２６】
つまり、これらマーカーを用いて判別を行った場合、黒毛和種をF1として誤判別してしまうことが、例えば1000頭中20頭から7頭にまで減少可能となった。検査対象となる個体のほとんどが黒毛和種であることを考えると、この誤判別率を減少できたことは重要である。
【０１２７】
またF1の検出率を上昇させるためには、これら4つのマーカーに加えて、BIMA6とBIMA9を加えることが有効である。この場合、F1の検出率96.7％、誤判別率2.4% (信頼度97.6%)であった。
【０１２８】
なお、黒毛和種とホルスタイン種の鑑定確率について、もっとも有効な品種鑑定能を得るマーカーの組み合わせは、F1識別と同様、BIMA1、BIMA7、BIMA8、BIMA11を用いた場合であることが明らかとなった。その精度は、ホルスタイン種の検出率99.3％、誤判別率0.7% (信頼度99.3%)であった。また2種類のみのマーカーを用いた場合(BIMA7,8)では、検出率81.1％、誤判別率0% (信頼度100%)であった。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】AFLP法による多型解析例を示した図面である。
【図２】BIMA1にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図３】BIMA２にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図４】BIMA３にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図５】BIMA４にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図６】BIMA５にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図７】BIMA６にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図８】BIMA７にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図９（１）】BIMA８aにかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図９（２）】BIMA８bにかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図１０（１）】BIMA９aにかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図１０（２）】BIMA９bにかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図１１】BIMA10にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図１２】BIMA11にかかわる遺伝子領域の塩基配列を示した図面である。
【図１３】BIMAマーカー5種類を用いた2段階判定による品種鑑定例を示した図面である。
【図１４】各マーカーにおける多型検出方法と検出断片サイズを示した図面である。
【図１】
2005027655.tif 000010
【図２】
2005027655.tif 000011
【図３】
2005027655.tif 000012
【図４】
2005027655.tif 000013
【図５】
2005027655.tif 000014
【図６】
2005027655.tif 000015
【図７】
2005027655.tif 000016
【図８】
2005027655.tif 000017
【図９（１）】
2005027655.tif 000018
【図９（２）】
2005027655.tif 000019
【図１０（１）】
2005027655.tif 000020
【図１０（２）】
2005027655.tif 000021
【図１１】
2005027655.tif 000022
【図１２】
2005027655.tif 000023
【図１３】
2005027655.tif 000024
【図１４】
2005027655.tif 000025
【配列表】
2005027655000001.app