(57)【要約】【課題】精度の高い遺伝子発現プロファイルを作製する方法を提供する。【解決手段】ＨｉＣＥＰ法のＰＣＲ工程において、プライマーの鋳型へのアニーリングをプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃の温度で行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡを得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｃ）で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で回収された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含むＸアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸアダプターが結合している断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で回収された断片を、該Ｘアダプターを切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｇ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｆ）で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片を回収する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で回収された断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
（ｉ）該Ｘアダプターの配列に相補的な配列を含むＸプライマーであって、該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸプライマーと、該Ｙアダプターの配列に相補的な配列を含むＹプライマーであって、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｊ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含み、
工程（ｉ）において、
Ｘプライマー及びＹプライマーのそれぞれＸアダプター及びＹアダプターへのアニーリングを、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃の温度で行うこと
を特徴とする方法。
【請求項２】
工程（ｉ）において、
Ｘプライマー及びＹプライマーのそれぞれＸアダプター及びＹアダプターへのアニーリングをＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋９℃で行う、
請求項１に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法。
【請求項３】
工程（ｉ）において、
プライマーセットとして、１６種類のＸプライマーと１６種類のＹプライマーとの組合せから構成される２５６種類のプライマーセットを用いる、請求項１又は２に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法。
【請求項４】
工程（ｉ）において、
Ｘプライマーが
５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＮ１Ｎ２−３’
（式中、Ｎ１Ｎ２は、ＣＣ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＡ、ＴＣ、ＴＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＴ、ＧＴ、ＧＣ、ＧＡ又はＧＧである）
であり、
Ｙプライマーが
５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＮ３Ｎ４−３’
（式中、Ｎ３Ｎ４は、ＣＣ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＡ、ＴＣ、ＴＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＴ、ＧＴ、ＧＣ、ＧＡ又はＧＧである）
である、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法。
【請求項５】
遺伝子発現頻度を解析する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡを得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｃ）で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で回収された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含むＸアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸアダプターが結合している断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で回収された断片を、該Ｘアダプターを切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｇ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｆ）で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片を回収する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で回収された断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
（ｉ）該Ｘアダプターの配列に相補的な配列を含むＸプライマーであって、該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸプライマーと、該Ｙアダプターの配列に相補的な配列を含むＹプライマーであって、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、
（ｊ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、及び、
（ｋ）前記工程（ａ）〜（ｉ）により得られた２つの遺伝子発現プロファイルを比較することにより被検細胞の遺伝子発現頻度の変化を解析する工程
を含み、
工程（ｉ）において、
Ｘプライマー及びＹプライマーのそれぞれＸアダプター及びＹアダプターへのアニーリングを、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃の温度で行うこと
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子発現プロファイルを作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
西暦２００２年、ヒトゲノム配列がほぼ完全に解読された。得られた塩基データからオーダーメード治療等の開発が期待されているが、その為には生体内でどの遺伝子がどの程度発現しているかの解明、すなわち遺伝子発現ネットワークの解明が非常に重要である。そして、遺伝子発現ネットワークの解明に当たっては、ある時点における生体内でどの遺伝子がどの程度発現しているかを示す遺伝子発現プロファイルを作製する必要がある。
現在、遺伝子発現プロファイル作製方法として、ディファレンシャルディスプレー法、遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）、マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いた方法及び国際公開第０２／４８３５２号パンフレットに開示される高カバー率遺伝子発現プロファイル解析法（ＨｉＣＥＰ）等がある。
これらの遺伝子発現プロファイル作製方法の中で、ＨｉＣＥＰ法は、未知の遺伝子を含む広範囲の遺伝子をカバーする遺伝子発現プロフィールを簡便に作製する方法として優れた方法である。
また、ＨｉＣＥＰ法の一工程として用いるＰＣＲ反応において、プライマーの鋳型へのアニーリング温度は、従来、使用するプライマーのＴｍ付近の温度、例えば、ＧＣ含量が５０％の２０ｍｅｒからなるプライマーを用いる場合、５５℃でのアニーリング温度が用いられていた（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）著、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、（米国）、第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１年、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １５、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ、８．８６）。
【特許文献１】
国際公開第０２／４８３５２号パンフレット
【非特許文献１】
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）著、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、（米国）、第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１年、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  １５、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ、８．８６
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子の発現量は、遺伝子の種類及びその発現時期に依存して異なる。したがって、遺伝子発現ネットワークを解明するためには、その前提となる遺伝子発現プロフィール作製方法が発現遺伝子に対して高い検出感度を有していることが望まれる。
そこで、本発明者等は、広範囲の遺伝子をカバーする遺伝子発現プロフィールを簡便に作製することができるＨｉＣＥＰ法について、発現遺伝子の検出感度の更なる向上を課題として鋭意検討を重ねた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
その結果、ＨｉＣＥＰ法のＰＣＲ反応工程において、当該ＰＣＲ反応に用いるプライマーの鋳型へのアニーリング温度を特別の範囲に設定することにより発現遺伝子の検出感度が飛躍的に向上することを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、該二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡを得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｃ）で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で回収された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含むＸアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＸアダプターが結合している断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で回収された断片を、該Ｘアダプターを切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｇ）該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程（ｆ）で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片を回収する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で回収された断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプターを結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
（ｉ）該Ｘアダプターの配列に相補的な配列を含むＸプライマーであって、該Ｘプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸプライマーと、該Ｙアダプターの配列に相補的な配列を含むＹプライマーであって、該Ｙプライマーを基準として３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｊ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含み、
工程（ｉ）において、
Ｘプライマー及びＹプライマーのそれぞれＸアダプター及びＹアダプターへのアニーリングを、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃の温度で行うこと
を特徴とする方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子発現プロファイル作製方法を、一態様としての図１を用いて説明する。上述の工程（ａ）から工程（ｊ）の工程と図１における工程（ａ）から工程（ｊ）とは、それぞれのアルファベット同士で対応する。
図１に示す配列における各アルファベットは塩基配列を構成する塩基を示す。Ａはアデニン（以下、Ａと略す）、Ｇはグアニン（以下、Ｇと略す）、Ｃはシトシン（以下、Ｃと略す）、Ｇはグアニン（以下、Ｇと略す）及びＴはチミン（以下、Ｔと略す）を示す。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３及びＮ４はそれぞれ、同一又は異なっていてもよい、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴからなる群より選ばれる塩基である。
本願明細書において、特に断りのないかぎり、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖（鋳型となるポリ（Ａ）ＲＮＡに相同な配列を有する鎖）の５’末端側を二本鎖ｃＤＮＡの５’末端側とし、当該センス鎖の３’末端側を二本鎖ｃＤＮＡの３’末端側とする。
【０００６】
工程（ａ）
ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程である。
まず、遺伝子発現プロファイルの作製対象となる細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡ１１を抽出する。
抽出したポリ（Ａ）ＲＮＡ１１の３’末端側のポリ（Ａ）テイルに相補的なオリゴｄＴプライマーをタグ物質１２で標識化したものをプライマーとして用いて、ポリ（Ａ）ＲＮＡ１１を鋳型として一本鎖ｃＤＮＡ１３を合成する（図１ではポリ（Ａ）ＲＮＡ１１と共に示されている）。タグ物質１２は一本鎖ｃＤＮＡ１３を基準として５’末端側に付加されている。
工程（ｂ）
工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡ１３を鋳型として二本鎖ｃＤＮＡ１４を合成する。タグ物質１２は二本鎖ｃＤＮＡ１４を基準として３’末端側に付加されている。
工程（ｃ）
工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ１４を第１の制限酵素Ｘで切断する。
工程（ｄ）
タグ物質１２に高親和性を有する物質１５を用いてタグ物質１２を捕捉し、工程（ｃ）で得られた断片からタグ物質１２が付加している断片を回収する。
工程（ｅ）
工程（ｄ）で回収された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＸプライマーに相補的な配列を含むＸアダプター１６を結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ１４を基準として５’末端側にＸアダプター１６が結合している断片を得る。
工程（ｆ）
工程（ｅ）で回収された断片を、第２の制限酵素Ｙで切断する。
工程（ｇ）
タグ物質１２に高親和性を有する物質１５を用いて、工程（ｆ）で得られた断片から該タグ物質１２が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖ｃＤＮＡ１４を基準として３’末端側に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片を回収する。
工程（ｈ）
工程（ｇ）で回収された断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマーに相補的な配列を含むＹアダプター１７を結合させて、二本鎖ｃＤＮＡ１４を基準として３’末端側にＹアダプター１７が結合している二本鎖配列の断片１８を得る。得られた二本鎖配列の断片１８は、二本鎖ｃＤＮＡ１４を基準として５’末端側にＸアダプター１６を含み、かつ３’末端側にＹアダプター１７を含んでいる。
工程（ｉ）
Ｘアダプター１６の配列に相補的な配列を含むＸプライマー１９であって、該Ｘプライマー１９を基準として３’末端（すなわち、増幅が起こる側）に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣからなる群より選ばれる塩基である）を含み、該Ｘプライマー１９を基準として５’末端に蛍光物質２０を結合したＸプライマー１９と、Ｙアダプター１７の配列に相補的な配列を含むＹプライマー２１であって、該Ｙプライマー２１を基準として３’末端（すなわち、増幅が起こる側）に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹプライマー２１とからなるプライマーセットを用いて、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片１８を鋳型としてＰＣＲ反応を行う。ここで、プライマーセットの鋳型へのアニーリング温度はプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃である。
工程（ｊ）
得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する。
【０００７】
本明細書において「遺伝子発現プロファイル」とは、ある条件下における特定の細胞における遺伝子の発現パターン、公知及び未知遺伝子の発現の有無、発現される全ての遺伝子の発現量等の情報を示すものである。また、当該遺伝子発現プロファイルは、遺伝子の発現を解析するための手段として使用することが可能である。
「ポリ（Ａ）ＲＮＡ」とは、一般的にポリＡとも称される配列を３’末端に含むｍＲＮＡをいう。また、ポリ（Ａ）ＲＮＡに相補的な配列を有する「オリゴｄＴプライマー」によって、当該ポリ（Ａ）ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し得る。ここで使用される「オリゴｄＴプライマー」は、一般的にはオリゴ（ｄＴ）プライマーとも称される。オリゴｄＴプライマーを用いたポリ（Ａ）ＲＮＡからの一本鎖ｃＤＮＡの合成（工程（ａ））は、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。また、一本鎖ｃＤＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの合成（工程（ｂ））も、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を指す。本発明の一態様である実施例１に示す方法では、タグ物質としてビオチンを、タグ物質に高親和性を有する物質としてストレプトアビジンを使用しているが、これに限るものではない。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、ＦＩＴＣとＦＩＴＣ抗体、ＤＩＧとアンタイＤＩＧ及びプロテインＡとマウスＩｇＧ及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のＤＮＡ配列への付加は、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。また、「タグ物質」と「タグ物質に高親和性を有する物質」との間の親和性に基づくＤＮＡ断片の回収（工程（ｄ）及び（ｇ））は、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖ＤＮＡを加水分解し切断する酵素である。本発明においては、適切な断片を得るために２種類の制限酵素Ｘ及びＹを組み合わせて使用する。本発明に使用可能な制限酵素は、発現された遺伝子であるｍＲＮＡから合成された二本鎖ｃＤＮＡを、識別可能な長さを有する断片に切断することが可能な酵素が好ましい。また、得られた当該二本鎖のより多くを、好ましくはほとんど全ての二本鎖を切断するような酵素が好ましい。そのような酵素の例を下記表１に示す。
【０００８】
【表１】
2005006554.tif 000002
【０００９】
表１の酵素からいずれか２つを選択し、組み合わせて使用することが可能である。また、表１に示した酵素は４塩基認識酵素であるが、その他の４塩基認識酵素、又は６塩基認識酵素を使用してもよい。本発明では、４塩基認識酵素の使用が好ましく、ＭｓｐＩとＭｓｅＩとを組み合わせて使用することが特に好ましい。本発明の一態様である実施例１に示す方法では、制限酵素ＸとしてＭｓｐＩを、制限酵素ＹとしてＭｓｅＩを使用しているが、これらに限定されるものではない。制限酵素による二本鎖ＤＮＡの切断（工程（ｃ）及び（ｆ））は、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。
「アダプター」とは、工程（ｉ）におけるＰＣＲ反応の際に用いるプライマーを結合させるために用いるものである。アダプターは、使用する制限酵素及びプライマーに応じて設計される。すなわち、制限酵素Ｘの認識切断部位に結合するためのＸアダプターは、制限酵素Ｘの認識切断部位に相補的な配列を含み、更にＸプライマーに相補的な配列を有する。好ましくは、Ｘアダプターは３０塩基前後で設計され得る。それによって安定したＰＣＲが行える。制限酵素Ｙの認識切断部位に結合するためのＹアダプターは制限酵素Ｙの認識切断部位に相補的な配列を含み、更にＹプライマーに相補的な任意の配列を有する。好ましくは、Ｙアダプターは３０塩基前後で設計され得る。それによって安定したＰＣＲが行うことができる。
本発明の一態様である実施例１の方法では、Ｘアダプターとして制限酵素ＭｓｐＩによる切断部位に相補的な配列を含むもの（配列番号１及び２）を、Ｙアダプターとして制限酵素ＭｓｅＩによる切断部位に相補的な配列を含むもの（配列番号３及び４）を使用しているが、これらに限定されるものではない。アダプターの二本鎖ＤＮＡへの結合（工程（ｅ）及び工程（ｈ））は、一般的に行われるいずれかの条件により達成することが可能である。
【００１０】
工程（ｉ）のＰＣＲ反応で使用するプライマーセットを構成するＸプライマー及びＹプライマーの配列において、各プライマーの３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）以外の部分の配列は、被験対象のＲＮＡ配列と一致しないことが望ましい。しかしながら、如何なる生物においても全ＲＮＡの配列が明らかとなっていない現状では、この条件を完全に満たすことは困難である。そこで、例えばヒトを被験対象とする場合は、ヒトゲノム配列に存在しない又は非常に出現頻度が低い配列を選択することが好ましい。
上述の条件を満たすべく、Ｘプライマー及びＹプライマーの長さは、それぞれ１６塩基以上であることが好ましい。例えば、ヒトゲノム配列の長さは約３０億塩基であるところ、プライマーの長さを１６塩基とした場合、プライマーを構成する４種類の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ）から４の１６乗通り（約４０億通り）のプライマーが可能であるので、その中から選択した任意の１６塩基のプライマーはヒトゲノム配列中に１回以下の確率で出現することになる。そこで、後述するプライマーに求められる一般的条件を考慮して設計した長さ１６塩基以上のプライマーにつき、その配列と公共の塩基配列データベースに登録された配列とを比較することにより、ヒトゲノムに存在する配列と一致しない、あるいは、非常に出現頻度が低い配列を有するプライマーを選択することができる。
また、工程（ｉ）で用いるプライマーは、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件（例えば、「バイオ実験イラストレイテッド  （３）新版  本当にふえるＰＣＲ」、中山広樹  著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載される条件）を満たしている必要がある。
１．プライマーダイマーの形成が、Ｘプライマー間、Ｙプライマー間、ＸプライマーとＹプライマーとの間で生ずることが予測されないこと。
２．分子内高次構造の形成が、Ｘプライマー内、Ｙプライマー内で生ずることが予想されないこと。
３．５’末端配列の相補性が、Ｘプライマー間、Ｙプライマー間、ＹプライマーとＹプライマーとの間で生ずることが予測されないこと。
【００１１】
プライマーのＴｍ値について、当該Ｔｍ値はアニーリング温度を規定（プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃）するので、プライマーのＴｍ値が高くなるとアニーリング温度も高くなる。したがって、アニーリング温度が、耐熱性ポリメラーゼがＰＣＲ反応の全反応時間にわたって充分に機能しうる温度をこえることのないよう、プライマーのＴｍ値は使用する耐熱性ポリメラーゼがＰＣＲ反応の全反応時間にわたって充分に機能する上限温度より６℃以上低いことが好ましい。そこで、工程（ｉ）で用いるＸ及びＹプライマーのＴｍ値は、それぞれ５９℃〜６９℃、特に６０℃〜６４℃であることが好ましい。Ｘプライマー及びＹプライマーそれぞれのＴｍが６０〜６４℃であると、後述のアニーリング温度（ＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃）を用いてＰＣＲ反応を行ったときに発現遺伝子の極めて高い検出感度が得られる。
Ｘ及びＹプライマーの３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）は、それぞれ、同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である。
Ｘプライマー及びＹプライマーは、一般的なプライマー合成方法、例えば、ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの化学合成法であるＬｅｔｓｉｎｇｅｒ  等の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０，  １８７９−１８８２，  １９９２）及び特開平１１−０８０１８号公報に記載の方法を用いて合成することができる。
また、ＰＣＲ反応の後の検出を容易にするために、当該プライマーのいずれかの末端に蛍光物質を予め結合しておくことが好ましい。好ましくは、Ｘプライマーの５’末端に結合する。本発明で使用することが可能な蛍光物質は、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドバイオシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等が含まれる。
【００１２】
「プライマーセット」とは、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてＰＣＲ反応を行うために使用する１つのＸプライマーと１つのＹプライマーとからなる１組のプライマーのセットをいう。
ここで、プライマーセットを構成するＸ及びＹプライマーとして、各プライマー配列の３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）以外の配列の構成が固定されたプライマー（例えば、Ｘプライマーとして実施例１で用いる配列番号５で示されるＭｓｐＩプライマー、Ｙプライマーとして実施例１で用いる配列番号６で示されるＭｓｅＩプライマー）を用いる場合、当該２塩基配列を構成する塩基の種類に依存して１６種類のＸプライマーと１６種類のＹプライマーが得られ、これらの組合せから２５６種類のプライマーセットが得られる。このような２５６種類のプライマーセットを用いると、ほとんど全ての遺伝子の発現を網羅した遺伝子発現プロファイルを簡便に作成することができるので好ましい。
工程（ｊ）の「電気泳動をし、移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する」手段は、増幅ＰＣＲ産物の分子量（塩基配列長）とその量が測定できる手段であればいずれの手段であってもよい。その中でも、分解能の高さから電気泳動が好ましく、ゲル電気泳動が特に好ましい。ゲル電気泳動を用いる場合、ゲル電気泳動装置と解析ソフトウェアとを組み合わせると、ゲル電気泳動の結果を、分離された増幅ＰＣＲ産物の移動距離及びその量を指標とするピークパターンとして得ることができる。このピークパターンにおいて、増幅ＰＣＲ産物の移動距離は特定の遺伝子を反映し、当該増幅ＰＣＲ産物の量は当該遺伝子の発現量を反映しているので、当該ピークパターンは遺伝子発現プロファイルそのものとなる。
ゲル電気泳動装置としては、例えば、シークエンサと呼ばれるＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００（アプライドバイオシステムズジャパン社）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（アプライドバイオシステムズジャパン社）及びＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００（アマシャムファルマシア社）を使用することができ、解析ソフトウェアとしては、例えばＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）（アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用することができる。
尚、上述の各工程は、国際公開第０２／４８３５２号パンフレットに記載される方法にしたがい行うこともできる。
また、本発明に従い作製した遺伝子発現プロファイル上に現れるピークの大きさは、被検細胞で発現した遺伝子の発現量を反映している。したがって、当該ピークの大きさの変化を観察することにより、遺伝子の発現頻度を解析することができる。例えば、正常細胞と異常細胞との比較、正常細胞と癌細胞との比較、異なる細胞間での比較、及び異なる条件により処理された細胞間での比較等が可能となる。
【００１３】
以下、本発明の特徴となる工程（ｉ）のアニーリング温度について詳述する。
工程（ｉ）のＰＣＲ反応では、プライマーセットの鋳型へアニーリング、すなわち、プライマーセットを構成するＸプライマー及びＹプライマーの、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片のうち対応する鎖へのアニーリングを、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃、好ましくはＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１０℃、特に好ましくはＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋９℃の温度範囲で行う。
ここで、プライマーの「ＴｍＭＡＸ」とは、プライマーセットを構成するＸプライマーのＴｍ値とＹプライマーのＴｍ値のうち大きい方のＴｍ値をいう。
また、プライマーの「Ｔｍ」とは、プライマーとアダプターとが形成する二本鎖がほどける温度のことをいう。Ｔｍは、例えば水島昭二、大島泰郎他、ライフサイエンスの基礎実験、丸善株式会社に記載の方法にしたがい実験的に求めることができる。又、プライマーを構成する塩基数が２０未満である場合は、例えば、最も簡便には、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）著、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、（米国）、第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１年、Ｃｈａｐｔｅｒ  １０．３に記載の以下の計算式：
Ｔｍ（℃）＝２×（Ａ＋Ｔ）＋４×（Ｇ＋Ｃ）  （式１）
（式中、（Ａ＋Ｔ）は、プライマーを構成するアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）残基の合計数であり、（Ｃ＋Ｇ）は、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）残基の合計数である。）にしたがい計算的に求めることもできる。
上述の通り、Ｔｍは実験的及び計算的に求めることができるものでありかつその方法も種々存在するものであるが、同一方法を用いてＸプライマー及びＹプライマーのＴｍを求める限り任意の手法を使用することができる。
複数種類のプライマーセットを同時使用する場合は、使用する各プライマーセットを構成するＸプライマー及びＹプライマーのＴｍ値のうち、最も大きいＴｍ値がプライマーのＴｍＭＡＸとなる。本発明のプライマーセットのアニーリングをプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃の温度範囲内で行うとミスアニーリングが回避され、結果として発現遺伝子の検出感度を向上させることができる。
【００１４】
尚、プライマーの鋳型への正確なアニーリングのみを目的とすれば、アニーリング温度がプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃以上であればその目的を達成することができると考えられる。
しかし、ＰＣＲ反応で使用する耐熱性ポリメラーゼの酵素活性は温度の影響を受け、酵素の変性が起こるような高温下（例えば、Ｔａｑポリメラーゼでは９０℃以上）では耐熱性ポリメラーゼの機能低下が起こりＰＣＲ反応の効率が低下する。したがって、アニーリング温度は耐熱性ポリメラーゼがＰＣＲ反応の全反応時間にわたって充分に機能することができる温度以下（例えば、Ｔａｑポリメラーゼでは７５℃）に設定する必要がある。
以上の点を鑑み、本発明では、工程（ｉ）におけるアニーリング温度を、プライマーの鋳型への正確なアニーリングを達成しつつ、かつ、耐熱性ポリメラーゼが充分に機能しうる温度範囲であり、かつ、発現遺伝子の検出感度の向上が充分に達成できる温度範囲として、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１４℃、好ましくはＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋９℃であるように設定する。
尚、上述のアニーリング温度以外のＰＣＲ反応条件については、一般的に用いられるＰＣＲ反応条件を用いることができる。
本発明の一態様である実施例１では、Ｘプライマーとして制限酵素ＭｓｐＩによる切断部位に相補的な配列を含むＸアダプターに相補的な配列を含むもの（配列番号５）を、Ｙプライマーとして制限酵素ＭｓｅＩによる切断部位に相補的な配列を含むＹアダプターに相補的な配列を含むもの（配列番号６）を使用しているが、この場合における、上述の式（１）に従い計算されるＸ及びＹプライマーのＴｍは６０℃〜６４℃（すなわち、ＴｍＭＡＸは６４℃）であるので、アニーリング温度は７０℃（ＴｍＭＡＸ＋６℃）〜７８℃（ＴｍＭＡＸ＋１４℃）となるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい態様では、工程（ｉ）において、
Ｘアダプターとして配列番号１及び２に記載の配列を有するもの、及び、Ｙプライマーとして配列番号３及び４に記載の配列を有するものを用い、
Ｘプライマーとして配列番号５に記載の配列を有するもの、及び、Ｙプライマーとして配列番号６に記載の配列を有するものから構成される２５６種類のプライマーセットを用い、
プライマーのアニーリング温度を７０℃（ＴｍＭＡＸ＋６℃）〜７３℃（ＴｍＭＡＸ＋９℃）としてＰＣＲ反応を行う。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
発現遺伝子の検出感度の指標として、遺伝子発現プロファイル中の偽ピークの存在を採用した。
遺伝子発現プロファイルにおけるピークとは、本発明の工程（ｉ）のＰＣＲ反応で増幅したＰＣＲ産物（遺伝子転写物）の量に対応するピークのことであり、例えば、Ｘプライマーの５’末端側に結合させた蛍光色素に基づいて検出することができる。
偽ピークとは、プライマーセットを構成するプライマーの３’末端の２塩基（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）が、相補的でない塩基配列へミスアニーリングすることにより生じるピークのことをいう。偽ピークの存在は、本来ある１つの遺伝子転写物は当該遺伝子転写物に相補的な配列を含む唯一の特定プライマーセットにより生ずる唯一のピーク（真正ピーク）によって検出されるべきところ、相補的でない他のプライマーセットによってもピーク（偽ピーク）が生じ、結果として一つの遺伝子転写物について複数のピークが生じている状態を意味する。かかる一つの遺伝子転写物に対する複数のピークの存在は、発現遺伝子の検出感度に影響し、その結果、遺伝子発現プロファイルに基づく遺伝子発現解析処理を煩雑にする。したがって、偽ピークを生じさせない方法又は解析から除外するための偽ピークを見分ける方法が必要となる。本発明の方法は、ＰＣＲ反応に用いるプライマー及び当該プライマーの鋳型へのアニーリング温度を特別の範囲に設定することにより偽ピークの発生を減少させ、発現遺伝子の検出感度を向上させるものである。
【００１６】
ピークの真偽の評価方法
ピークの真偽は、既知の配列を有するプライマーを用いて得られたある遺伝子に対応する増幅ＰＣＲ産物の塩基配列と、既存のデータベースに登録され配列が既知の当該遺伝子の塩基配列とを比較し、両塩基配列におけるプライマーの３’末端の２塩基（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）に対応する部分が一致するか否かで評価した。
具体的には、以下の手順にしたがいピークの真偽を評価した。
１．既知の配列を有するＸ及びＹプライマーからなる特定のプライマーセットを用いてＨｉＣＥＰ法により遺伝子発現プロファイルを作成し、現れたピークに対応する増幅ＰＣＲ産物の配列決定を行った。
２．増幅ＰＣＲ産物の配列の中から、用いたプライマーＸ及びＹの塩基配列に対応する領域を同定し、当該同定された領域を含みかつこれらの領域に挟まれた塩基配列部分のみを取り出し、既存のデータベースに対してコンピューターを用いた塩基配列の相同検索（ＢＬＡＳＴ）を実行し、以下（１）〜（３）の３基準について評価した。
尚、以下の説明で言及する「データベースに登録されている遺伝子の塩基配列」において、「データベースに登録されている遺伝子のセンス鎖」とは、ＰＣＲ反応において鋳型となる工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片のセンス鎖に相同な配列を有する鎖をいい、「データベースに登録されている遺伝子のアンチセンス鎖」とは、ＰＣＲ反応において鋳型となる工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片のアンチセンス鎖に相同な配列を有する鎖をいう。
又、以下の説明で言及する「増幅ＰＣＲ産物」において、「増幅ＰＣＲ産物のセンス鎖」とは、ＰＣＲ反応において鋳型となる工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片のセンス鎖に相同な配列を有する鎖をいい、「増幅ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖」とは、ＰＣＲ反応において鋳型となる工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片のアンチセンス鎖に相同な配列を有する鎖をいう。
【００１７】
（１）相同検索にかけた増幅ＰＣＲ産物のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列（但し、各プライマーに対応する部分を除く）が、それぞれ、データベースに登録されているある遺伝子（全部又は一部）のセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列と１００％一致すること。
（２）増幅ＰＣＲ産物のセンス鎖において、（１）で一致した領域の５’末端側に近接して制限酵素Ｘの認識配列が存在し、かつ、増幅ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖において、（１）で一致した領域の５’末端側に近接して制限酵素Ｙの認識配列が存在すること。
（３）増幅ＰＣＲ産物のセンス鎖における（２）で評価した制限酵素Ｘの認識配列のすぐ３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーのＮ１Ｎ２の塩基配列に対応）と、データベースに登録されている遺伝子のセンス鎖における制限酵素Ｘの認識配列のすぐ３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーのＮ１Ｎ２の塩基配列に対応）とが一致し、かつ、増幅ＰＣＲ産物のアンチセンス鎖における（２）で評価した制限酵素Ｙの認識配列のすぐ３’末端側の２塩基配列（ＹプライマーのＮ３Ｎ４の塩基配列に対応）と、データベースに登録されている遺伝子のアンチセンス鎖における制限酵素Ｙの認識配列のすぐ３’末端側の２塩基配列（ＹプライマーのＮ３Ｎ４の塩基配列に対応）とが一致すること。
３．あるピークを構成する増幅ＰＣＲ産物が上記３条件を全て満たしている場合、当該ピークはプライマーの正確なアニーリングに基づき得られたものであるとして、そのピークは真正ピークであると判断した。
他方、上記（１）及び（２）の条件は満たすが（３）の条件を満たさないＰＣＲ産物からなるピークが存在する。正確なアニーリングに基づき増幅反応が行われる場合、「増幅ＰＣＲ産物」と「データベースに登録されている遺伝子」とは、各プライマーの３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）に該当する部分においても同一の配列を有するはずである。一方、ミスアニーリングに基づき増幅反応が行われた場合、次サイクルの増幅反応ではミスアニーリングを起こしたプライマーを鋳型として更なる増幅反応が進行するので、最終的に得られる「増幅ＰＣＲ産物」と「データベースに登録されている遺伝子」とは、各プライマーの３’末端側の２塩基配列に該当する部分において異なる配列を有することになる。したがって、プライマーの３’末端側の２塩基配列に該当する部分において「データベースに登録されている遺伝子」と異なる配列を有する「増幅ＰＣＲ産物」（すなわち、（３）の条件を満たさないＰＣＲ産物）はプライマーのミスアニーリングに基づき得られたＰＣＲ産物であるとして、かかるＰＣＲ産物からなるピークを偽ピークであると判断した。
【００１８】
実施例１
マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について、以下の手順により遺伝子発現プロファイルを作成した。
（ａ）タグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡの合成
Ｃ３Ｈ系統のマウスから調製した胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）１０７個からキアゲン社、ＲＮＡｅａｓｙ  ＭｉｎｉＫｉｔを用いてトータルＲＮＡを抽出し、更にマイクロファーストトラックキット（インビトロゲン社）を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した。抽出したポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として、タグ物質としてのビオチンで５’末端を修飾したオリゴｄＴプライマー（インビトロゲン社によるカスタム合成オリゴヌクレオチド）を用い、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（インビトロゲン社）を用いて、該一本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端にビオチンが付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（ｂ）二本鎖ｃＤＮＡの合成
工程（ａ）で合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＩ、セカンドストランドバッファー及びＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（共にインビトロゲン社）を用い、インビトロゲン社推奨の二本鎖ｃＤＮＡ合成方法にしたがい、該二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にビオチンが付加された二本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（ｃ）制限酵素Ｘによる切断
工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを、第１の制限酵素ＸとしてのＭｓｐＩ（ＴａｋａＲａ社）を３７℃、４時間で用いて二本鎖ｃＤＮＡを切断した。
（ｄ）タグ物質が付加している断片の回収
工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から、ビオチンに高親和性を有する物質としてのストレプトアビジンが固定された磁性ビーズ（ＤＹＮＡＬ社）を用いＤＹＮＡＬ社推奨の条件にしたがいビオチンが付加している断片を回収した。
（ｅ）Ｘアダプターの結合
工程（ｄ）で回収された二本鎖ｃＤＮＡ断片の制限酵素ＭｓｐＩによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列を含むＸアダプターとしてのＭｓｐＩアダプター（インビトロゲン社によるカスタムオリゴ合成）：
ＭｓｐＩアダプターの塩基配列
５’−ＡＡＣＡＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴ    −３’（二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖側）（配列番号１）
５’−ＣＧＡＡＣＣＧＡＧＴＧＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＡＴＴＣＧＴＧＴＴ−３’（二本鎖ｃＤＮＡのアンチセンス鎖側）（配列番号２）
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））用い、１６℃で１６時間以上かけて結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として５’末端側にＭｓｐＩアダプターが結合している断片を得た。
【００１９】
（ｆ）第２の制限酵素Ｙによる切断
工程（ｅ）で回収された二本鎖ｃＤＮＡ断片を、第２の制限酵素ＹとしてのＭｓｅＩ（ＮＥＢ社）を、３７℃で４時間用いて二本鎖ｃＤＮＡを切断した。
（ｇ）第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片の回収
工程（ｆ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から、ストレプトアビジンが固定された磁性ビーズ（ＤＹＮＡＬ社）を用い、ＤＹＮＡＬ社推奨の方法にしたがいビオチンが付加している断片を除去し、第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む断片を回収した。得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片は、その５’末端にＭｓｐＩアダプターを、３’末端に制限酵素ＭｓｅＩによる切断部位を含んでいた。
（ｈ）Ｙアダプターの結合
工程（ｇ）で回収された二本鎖ｃＤＮＡ断片の制限酵素ＭｓｅＩによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列を含むＹアダプターとしてのＭｓｅＩアダプター（インビトロゲン社によるカスタムオリゴ合成）：
ＭｓｅＩアダプターの塩基配列
５’−ＡＧＴＣＡＣＧＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣ−３’（二本鎖ｃＤＮＡのアンチセンス鎖側）（配列番号３）
５’−ＴＡＧＧＡＣＧＣＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＣＴＣＧＴＧＡＣＴ−３’（二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖側）（配列番号４）
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用い、２５℃で１６時間以上かけてで結合させて、二本鎖ｃＤＮＡを基準として３’末端側にＭｓｅＩアダプターが結合している断片を得た。エタノール沈殿により過剰のアダプターを除去した。
【００２０】
（ｉ）Ｘ及びＹプライマーを用いたＰＣＲ反応
（１）Ｘ及びＹプライマーの合成
Ｘプライマーとして２０塩基からなるＭｓｐＩプライマー：
ＭｓｅＩプライマーの塩基配列
５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＮ１Ｎ２−３’
（式中、Ｎ１Ｎ２は、ＣＣ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＡ、ＴＣ、ＴＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＴ、ＧＴ、ＧＣ、ＧＡ又はＧＧである）（配列番号５）
を、インビトロゲン社によるカスタムオリゴ合成により、Ｎ１Ｎ２の種類に依存して１６種類合成した。
ＭｓｐＩプライマーと同様の方法にしたがい、Ｙプライマーとして２０塩基からなるＭｓｅＩプライマー：
ＭｓｅＩプライマーの塩基配列
５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＮ３Ｎ４−３’
（式中、Ｎ３Ｎ４は、ＣＣ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＡ、ＴＣ、ＴＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＡＣ、ＡＡ、ＡＧ、ＡＴ、ＧＴ、ＧＣ、ＧＡ又はＧＧである）（配列番号６）
を、Ｎ３Ｎ４の種類に依存して１６種類合成した。
尚、ＭｓｐＩプライマーはインビトロゲン社カスタムオリゴ合成により、蛍光標識名ＦＡＭ、ＮＥＤ又はＨＥＸで標識した。
得られたＭｓｅＩプライマー（１６種類）及びＭｓｐＩプライマー（１６種類）を組み合わせて全２５６種類（１６×１６）のプライマーのペア（プライマーセット）を作成した。
全２５６種類（１６×１６）（ＭｓｅＩプライマー（１６種類）及びＭｓｐＩプライマー（１６種類））のプライマーセットを構成する各プライマーのＴｍについて、前述の計算式（１）によると、３’末端側の２塩基配列（ＸプライマーではＮ１Ｎ２、ＹプライマーではＮ３Ｎ４）によって異なったが６０℃〜６４℃であった。したがって、ＴｍＭＡＸを６４℃とした。
【００２１】
（２）ＰＣＲ反応
得られた２５６種類のプライマーセットを用い、工程（ｈ）で得られた二本鎖配列の断片を鋳型として、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック社）を用い、下記の条件でＰＣＲ反応を行った。使用したポリメラーゼの至適温度範囲は７２℃〜７４℃であった。アニーリング温度は、７０℃（ＴｍＭＡＸ＋６℃）であった。
９５℃で１分
（９８℃で２０秒、７０℃で３０秒、７２℃で１分）×２８回
６０℃で３０分
（ｊ）遺伝子発現プロファイルの作製
工程（ｈ）で得られたＰＣＲ産物を、ＰＲＩＳＭ  ３１００キャピラリー電気泳動装置（アプライドバイオシステムズ社）を用い、ＰＯＰ４推奨のプロトコールにしたがい電気泳動に付し、移動距離及びピークを検出した。電気泳動の結果に基づき、ソフトウェアＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）（アプライドバイオシステムズジャパン社）を用いて、横軸に分子量を指標とした移動距離、縦軸に蛍光強度を指標とした発現量を示す遺伝子発現プロファイルを作製した。
下記のＭｓｐＩプライマー（Ｘプライマー）及びＭｓｅＩプライマー（Ｙプライマー）：
ＭｓｐＩプライマー：５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’（配列番号７）
ＭｓｅＩプライマー：５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡ−３’（配列番号８）
からなるプライマーセットについて得られた遺伝子発現プロファイルを図２に示す。図２において、縦軸は増幅ＰＣＲ産物を表すピークの蛍光強度を示し、これは増幅ＰＣＲ産物の最終量と相関する。横軸は増幅ＰＣＲ産物の移動距離を示し、これは各ピークの増幅ＰＣＲ産物（遺伝子に対応する）を構成するヌクレオチド残基の数と相関する。すなわち、プロファイル中に表れたピークの大きさは、当該ピークに対応する増幅ＰＣＲ産物の量、すなわち当該増幅ＰＣＲ産物に対応する遺伝子の発現量を示している。したがって、特定のピークの大きさの変化を観察することにより、対応する遺伝子の発現頻度を解析することができる。
【００２２】
実施例２
下記に示すＸ及びＹプライマーからなるプライマーセットを用い、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を７０℃〜７６℃（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例１と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
ＸプライマーとしてのＭｓｐＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＡ−３’（配列番号９）
ＹプライマーとしてのＭｓｅＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号１０）
前述の計算式（１）によると、ＭｓｐＩプライマーのＴｍは６０℃であり、ＭｓｅＩプライマーのＴｍは６４℃であったので、プライマーのＴｍＭＡＸを６４℃とした。したがって、実施例２で用いたアニーリング温度７０℃〜７６℃は、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１２℃に対応していた。
【００２３】
比較例１
実施例２と同様のプライマーを用いたが、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を６７℃（ＴｍＭＡＸ＋３℃）〜６９℃（ＴｍＭＡＸ＋５℃）（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例２と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
【００２４】
試験例１
実施例２及び比較例１で得られた遺伝子発現プロファイルの中から無作為抽出した６つのピーク（但し、各ピークは、実施例２及び比較例１において同一の遺伝子の発現に対応している）について、アニーリング温度とピークの蛍光強度との関係を図示した（図３Ａ）。図中、横軸はアニーリング温度、縦軸は増幅ＰＣＲ産物のピークの蛍光強度（増幅ＰＣＲ産物の量、ひいては遺伝子発現量に対応する）を示す。
６つのピークは、大別して２つの群：アニーリング温度７０℃以上でも高い蛍光強度（高い検出感度）を維持したイ群（図中の凡例：■、●及び▲。尚、凡例の横の数字は、各ピークに対応する増幅ＰＣＲ産物の泳動度（増幅ＰＣＲ産物サンプルと同時に電気泳動に付したサイズ標準マーカーによる補正で得られた値であり、当該ＰＣＲ産物に対応する遺伝子フラグメントの長さにおおよそ相当する値である。）を示す。）と、アニーリング温度７０℃で蛍光強度が検出限界（バックグラウンドとの区別が可能な蛍光強度値）以下（蛍光強度５０以下）に低下したロ群（図中の凡例：◇、□及び○）とに分類された。
ここで、各ピークの真偽を評価するために、各ピークに対応するＰＣＲ産物について、ＰＲＩＳＭ３１００自動シーケンス装置を用いて配列決定を行った。得られた塩基配列に基づき、前述したピークの真偽の評価方法にしたがい各ピークの真偽を評価した。尚、評価において利用した既存のデータベースは公共のマウスＥＳＴデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ）であった。
その結果、イ群のピークは、前述のピーク真偽評価方法の（１）〜（３）の条件を全て満たす増幅ＰＣＲ産物からなる真正ピークであり、ロ群のピークはピーク真偽評価方法の（１）〜（２）の条件は満たすが、（３）の条件を満たさない増幅ＰＣＲ産物からなる偽ピークであることが判明した。
この結果は、ＰＣＲ反応におけるプライマーの鋳型へのアニーリングをプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）よりも高い温度で行うと、偽ピークを減少させることが可能になり、特に、ＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）〜ＴｍＭＡＸ＋９℃（６４℃＋９℃＝７３℃）の温度範囲内で行うと、真正ピークの検出感度を充分に維持しつつ偽ピークを減少させることが可能になり、結果としてＨｉＣＥＰ法の検出感度をより向上させることができることを示している。
【００２５】
実施例３
下記に示すＸ及びＹプライマーからなるプライマーセットを用い、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を７０℃〜７６℃（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例１と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
ＸプライマーとしてのＭｓｐＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＣＧ−３’（配列番号１１）
ＹプライマーとしてのＭｓｅＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＴＡ−３’（配列番号１２）
前述の計算式（１）によると、ＭｓｐＩプライマーのＴｍは６４℃であり、ＭｓｅＩプライマーのＴｍは６０℃であったので、プライマーのＴｍＭＡＸを６４℃とした。したがって、実施例３で用いたアニーリング温度７０℃〜７６℃は、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１２℃に対応していた。
【００２６】
比較例２
実施例３と同様のプライマーを用いたが、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を６５℃（ＴｍＭＡＸ＋１℃）〜６９℃（ＴｍＭＡＸ＋５℃）（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例３と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
【００２７】
試験例２
得られた遺伝子発現プロファイルの中から無作為抽出した７つのピークについて、図３Ａと同様にアニーリング温度とピークの蛍光強度との関係を図示した（図３Ｂ）。
７つのピークは、大別して２つの群：アニーリング温度７０℃以上でも高い蛍光強度（高い検出感度）を維持したイ群（図中の凡例：■、●、▲及び◆）と、アニーリング温度７０℃で蛍光強度が検出限界以下（蛍光強度５０以下）に低下したロ群（図中の凡例：□、○及び△）とに分類された。
各ピークについて、試験例１と同様にしてピークの真偽を評価した。その結果、イ群のピークは、前述のピーク真偽評価方法の（１）〜（３）の条件を全て満たす増幅ＰＣＲ産物からなる真正ピークであり、ロ群のピークはピーク真偽評価方法の（１）〜（２）の条件は満たすが、（３）の条件を満たさない増幅ＰＣＲ産物からなる偽ピークであることが判明した。
この結果は、ＰＣＲ反応におけるプライマーの鋳型へのアニーリングをプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）よりも高い温度で行うと、偽ピークを減少させることが可能になり、特に、ＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）〜ＴｍＭＡＸ＋９℃（６４℃＋９℃＝７３℃）の温度範囲内で行うと、真正ピークの検出感度を充分に維持しつつ偽ピークを減少させることが可能になり、結果としてＨｉＣＥＰ法の検出感度をより向上させることができることを示している。
【００２８】
実施例４
下記に示すＸ及びＹプライマーからなるプライマーセットを用い、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を７０℃〜７６℃（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例１と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
ＸプライマーとしてのＭｓｐＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＣＡＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＧ−３’（配列番号１３）
ＹプライマーとしてのＭｓｅＩプライマー（２０塩基）：
５’−ＡＴＡＣＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）
前述の計算式（１）によると、ＭｓｐＩプライマーのＴｍは６２℃であり、ＭｓｅＩプライマーのＴｍは６４℃であったので、プライマーのＴｍＭＡＸを６４℃とした。したがって、実施例４で用いたアニーリング温度７０℃〜７６℃は、プライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃〜ＴｍＭＡＸ＋１２℃に対応していた。
【００２９】
比較例３
実施例４と同様のプライマーを用いたが、プライマーの鋳型へのアニーリング温度を６７℃（ＴｍＭＡＸ＋３℃）〜６９℃（ＴｍＭＡＸ＋５℃）（１℃刻み）に変化させたことを除き、実施例４と同様の工程にしたがい、マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦ）について遺伝子発現プロファイルを作製した。
【００３０】
試験例３
得られた遺伝子発現プロファイルの中から無作為抽出した５つのピークについて、図３Ａと同様にアニーリング温度とピークの蛍光強度との関係を図示した（図３Ｃ）。
５つのピークは、大別して２つの群：アニーリング温度７０℃以上でも高い蛍光強度（高い検出感度）を維持したイ群（図中の凡例：■及び●）と、アニーリング温度７０℃で蛍光強度が検出限界以下（蛍光強度５０以下）に低下したロ群（図中の凡例：○、△及び□）とに分類された。
各ピークについて、試験例１と同様にしてピークの真偽を評価した。その結果、イ群のピークは、前述のピーク真偽評価方法の（１）〜（３）の条件を全て満たす増幅ＰＣＲ産物からなる真正ピークであり、ロ群のピークはピーク真偽評価方法の（１）〜（２）の条件は満たすが、（３）の条件を満たさない増幅ＰＣＲ産物からなる偽ピークであることが判明した。
この結果は、ＰＣＲ反応におけるプライマーの鋳型へのアニーリングをプライマーのＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）よりも高い温度で行うと、偽ピークを減少させることが可能になり、特に、ＴｍＭＡＸ＋６℃（６４℃＋６℃＝７０℃）〜ＴｍＭＡＸ＋９℃（６４℃＋９℃＝７３℃）の温度範囲内で行うと、真正ピークの検出感度を充分に維持しつつ偽ピークを減少させることが可能になり、結果としてＨｉＣＥＰ法の検出感度をより向上させることができることを示している。
【００３１】
【発明の効果】
本発明に従うと、遺伝子発現プロファイル作製過程におけるプライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させることができるので、発現遺伝子の検出感度が向上し、精度の高い遺伝子発現プロフィールを得ることができる。
本発明に従い作製した遺伝子発現プロファイル上に現れるピークの大きさは、被検細胞で発現した遺伝子の発現量を反映している。したがって、当該ピークの大きさの変化を観察することにより、遺伝子の発現頻度を解析することができる。例えば、正常細胞と異常細胞との比較、正常細胞と癌細胞との比較、異なる細胞間での比較、及び異なる条件により処理された細胞間での比較等が可能となる。
【００３２】
【配列表】
2005006554.tif 000003
2005006554.tif 000004
2005006554.tif 000005
2005006554.tif 000006
2005006554.tif 000007
2005006554.tif 000008
2005006554.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の一態様である遺伝子発現プロファイル作製方法を示すスキームである。
【図２】図２は、本発明にしたがい作製した遺伝子発現プロファイルを示す図である。
【図３】図３は、アニーリング温度とピークの蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１】
2005006554.tif 000010
【図２】
2005006554.tif 000011
【図３】
2005006554.tif 000012