(57)【要約】【課題】本発明は、植物における紫外線耐性遺伝子を同定すること、もしくは植物における変異誘起遺伝子を同定することを課題とする。本発明はまた、そのような植物における紫外線耐性あるいは変異誘起遺伝子をモジュレートすることもまた課題とする。【課題手段】本発明の発明者らは、これまでは未知であった、植物細胞中で生じる損傷乗り越え複製に関与する遺伝子を初めて明らかにし、それにより上述した課題を解決した。具体的には、本発明は、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与するタンパク質を提供した。本発明はまた、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製の機能をモジュレートした遺伝子改変植物体を提供した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一な配列を有するタンパク質。
【請求項２】
植物細胞中でＤＮＡポリメラーゼζのＲＥＶ３サブユニットとして機能する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
シロイヌナズナ由来ＲＥＶ３タンパク質である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製の機能がモジュレートされる、遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項５】
植物細胞中でＤＮＡポリメラーゼζのＲＥＶ３サブユニットとして機能するタンパク質の機能がモジュレートされる、請求項４に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項６】
変異原への曝露に対して感受性または耐性である、請求項４または５に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項７】
変異原がＵＶ、変異原性化学物質、放射線である、請求項６に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項８】
突然変異率が改変された、請求項４または５に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項９】
植物細胞中でＤＮＡポリメラーゼζのＲＥＶ３サブユニットとして機能するタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミン酸配列またはこれと実質的に同一な配列を有する、請求項４〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【請求項１０】
ＲＥＶ３がシロイヌナズナ由来ＲＥＶ３である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、植物における紫外線耐性遺伝子あるいは変異誘起遺伝子を同定することに関する。本発明はまた、そのような植物における紫外線耐性遺伝子あるいは変異誘起遺伝子をモジュレートすることに関する。
【０００２】
背景技術
植物は、発芽したその場所でその一生を過ごす：植物は、ストレスの多い環境から容易には逃れられない。光合成に必須である太陽光でさえ、ストレスとなる。強すぎる光は、活性酸素（ＲＯＳ）の過剰産生により葉緑体中の光化学系に損傷を与える。全日射の中のほんの一部に相当する紫外線（ＵＶ）は、植物に対して重大な作用を起こす。ＵＶ光は、ＤＮＡ、膜、光化学系および植物ホルモンを含む様々な細胞性化合物に、ＲＯＳの誘導を介して直接的にまたは間接的に、損傷を与える。さらに、ＤＮＡ損傷すなわちシクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）および６−４光化学反応生成物の生成は、ＤＮＡ複製および転写を妨害し、また突然変異を生じさせるため、植物細胞に対して極めて毒性である。
【０００３】
植物のＵＶ耐性システムは、長い間研究されてきた。最もよく知られたシステムは、ＵＶ光子自身やＵＶ照射により生じたフリーラジカルを吸収する二次代謝産物の合成である。これらの二次代謝産物は、シールドとして機能し、ＤＮＡを損傷から保護する。また別のメカニズムとして、ＵＶ損傷ＤＮＡを酵素的に修復するものが存在する。植物は、光回復酵素（ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ）あるいはフォトリアーゼと呼ばれる一連の強力な修復酵素を持っている。可視光からの光子エネルギーを利用することによって、ＣＰＤフォトリアーゼ  はＣＰＤを修復し、６−４フォトリアーゼは６−４光化学反応生成物を修復する。さらに最近、別の酵素がＵＶ損傷ＤＮＡのヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）に関与していることが、示唆された（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｇａｌｌｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  ２００１）。
【０００４】
一方で、生物の中には、損傷耐性経路と呼ばれるメカニズムを有するものがあり、そのメカニズムにより非修復ＤＮＡ損傷に対する耐性を増大させることが知られている。例えば、酵母においては、非修復ＤＮＡ損傷部分により引き起こされる複製の阻害は、いわゆるＲＡＤ６エピスタシス群に属する遺伝子によりコードされる一連のタンパク質の活性により克服される（Ｈａｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｋｕｎｚ，  １９８１）。
【０００５】
損傷乗り越え複製（ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＴＬＳ）は、損傷耐性経路により行われる活性の一つである。ＴＬＳにおいて、ＤＮＡ損傷が克服され、新生ＤＮＡ鎖が特殊なＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ピリミジン二量体またはその他の損傷の形成が修復されず、複製フォーク上に残った場合、それによりＤＮＡ構造がゆがめられ、そして複製型ポリメラーゼによる娘鎖の合成は阻害される。異常な鋳型ＤＮＡ鋳型の構造に対してより頑強なＴＬＳ型ポリメラーゼは、正常ポリメラーゼに置き換わり、ＤＮＡ損傷部位に対合する位置にヌクレオチドを挿入する。ＴＬＳ活性は、酵母（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６ａ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ（Ｒｅｕｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、およびヒト（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）を含む多くの生物において研究されてきた。いくつかのバイオインフォマティクス解析により高等植物においてもＴＬＳ経路の存在が予想されたが、そのような経路は実験的には未だ見つかっていない。
【０００６】
発明が解決すべき課題
本発明は、植物における紫外線耐性遺伝子あるいは変異誘起遺伝子を同定することを課題とする。本発明はまた、そのような植物における紫外線耐性遺伝子あるいは変異誘起遺伝子をモジュレートすることもまた課題とする。
【０００７】
課題を解決する手段
本発明の発明者らは、これまでは未知であった、植物細胞中で生じる損傷乗り越え複製に関与する遺伝子を初めて明らかにし、それにより上述した課題を解決した。
【０００８】
具体的には、本発明は、植物細胞中でのエラーを起こしがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）損傷乗り越え複製（Ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴＬＳ）に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一な配列を有するタンパク質を提供することにより、上述した課題を解決した。
【０００９】
本発明はまた、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与する、上述したタンパク質の機能をモジュレートすることにより、エラーを起こしがちな損傷乗り越え複製の機能をモジュレートした遺伝子改変植物体を提供することにより、上述した課題を解決した。本発明で提供する遺伝子改変植物体は、ＵＶ、変異原性化学物質、放射線などの変異原への曝露に対して感受性または耐性である、という特徴を有する。また、これとは別に変異誘発率が高いかまたは変異誘発率が低い、遺伝子改変植物体、培養細胞系などの特徴となることもある。
【００１０】
発明を実施するための好ましい態様
本発明者らは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物体に対してイオンビーム変異生成技術を適用することにより、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）から数種類のＵＶ感受性変異植物体を単離した。それらの変異植物体のうちｓｕｖ１と命名した変異株を解析したところ、酵母においてＤＮＡポリメラーゼζの触媒サブユニットを構成するＲＥＶ３や、その他の生物におけるＲＥＶ３に相同性を有するＡｔＲＥＶ３遺伝子が破壊されていること、およびそれにより、エラーを起こしがちな損傷乗り越え複製（Ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴＬＳ）の機能不全が起こっていることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の第一の態様において、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一な配列を有するタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明のタンパク質は、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与することを特徴とする。これまでは、植物に於いては損傷乗り越え複製が生じるかどうかはわかっていなかった。本発明は、上述したＡｔＲＥＶ３タンパク質が、植物においてエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与していることを初めて証明した。
【００１３】
通常、損傷を受けたＤＮＡは、除去修復などにより修復された後に複製過程に進み、修復されなかった場合には複製が進行しない。しかしながら、損傷を修復しないまま複製過程に進む場合もある。そのような損傷を修復しないまま行う複製のことを損傷乗り越え複製（Ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴＬＳ）という。
【００１４】
損傷乗り越え複製（Ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴＬＳ）には、エラーを起こしがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）損傷乗り越え複製とエラーのない（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ）損傷乗り越え複製とがあることが知られている。例えばＤＮＡ上に６−４光化学反応生成物やチミジンダイマーに代表されるピリミジンダイマーが形成された際に、この様な損傷部位を修復することなく乗り越えて複製を進行させ、その際に損傷部位の対合部分に任意の塩基を挿入し、そのためしばしば誤った塩基を挿入することとなってしまうような複製の様式のことをエラーを起こしがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）損傷乗り越え複製という。一方、そのような損傷乗り越え複製の際に損傷部位の対合部分に相補的な塩基を挿入する複製の様式のことをエラーのない（ｅｒｒｏｒ−ｆｒｅｅ）損傷乗り越え複製という。本発明のタンパク質は、２種のタイプのうちエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製を生じさせることを特徴とする。
【００１５】
上述したように、本発明において作出されたＵＶ感受性変異植物体を解析したところ、植物細胞ゲノムの特定の部位において変異が生じており、その結果としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のタンパク質をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２のヌクレオチド配列を有する遺伝子が破壊されていることが分かった。
【００１６】
したがって、本発明のタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミノ酸配列またはこれと実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。本発明の文脈において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のアミノ酸配列と「実質的に同一」という場合、１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列によりコードされるアミノ酸配列；３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で示されるアミノ酸配列との間で少なくとも６０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列；４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；５）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示される塩基配列と相補的な塩基配列との間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能な塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；そして６）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で示される塩基配列との間で少なくとも６０％の塩基配列相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；のことをいう。
【００１７】
この分子を解析したところ、アミノ酸配列中に酵母由来のＲＥＶ３タンパク質との間で共通するモチーフ構造を有していることが分かった。この共通するモチーフ構造は、６種のＢ−型ポリメラーゼドメイン、ｚｉｎｃフィンガードメイン、などである。酵母のＲＥＶ３タンパク質は、損傷乗り越え複製を生じさせるＤＮＡポリメラーゼζの触媒サブユニットを構成していることが知られている。したがって、本発明のタンパク質は、そのモチーフ構造の類似性から判断して、ＲＥＶ３タンパク質のシロイヌナズナホモログであることが強く推測される。そこで、本発明においては、このＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １のアミノ酸配列を有するタンパク質をシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来ＲＥＶ３タンパク質を意味するＡｔＲＥＶ３タンパク質と命名し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２のヌクレオチド配列を有する遺伝子をＡｔＲＥＶ３遺伝子と命名した。
【００１８】
ＲＥＶ３タンパク質は、動物や酵母において、損傷トレランス機構に関与することが明らかになっている。通常、損傷を受けたＤＮＡは、除去修復などにより修復された後に複製過程に進み、修復されなかった場合には複製が進行しない。しかしながら、損傷を修復しないまま複製過程に進む場合もある。そのような損傷を修復しないまま複製を行うことができる。このような損傷乗り越え複製を引き起こすポリメラーゼの一つとしてＤＮＡポリメラーゼζが存在するが、ＲＥＶ３タンパク質は、このＤＮＡポリメラーゼζの触媒サブユニットを構成している。しかしながら、植物においてはこれまでＲＥＶ３タンパク質に対応するタンパク質の存在および機能は知られていない。
【００１９】
本発明のＡｔＲＥＶ３タンパク質は、エラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与するタンパク質であり、植物のＤＮＡポリメラーゼζを構成していることが推測される。そして、エラーを起こしがちな損傷乗り越え複製を行う結果、変異を誘起しやすく、植物体の変異率を上昇させる作用を有する。一方で、このタンパク質が欠損すると、植物体の変異率が著しく低下するという特徴を有する。
【００２０】
本発明においては、植物細胞中でのエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製の機能がモジュレートされた遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞もまた、提供する。ここで遺伝子改変植物体あるいは遺伝子改変植物細胞という場合、植物体あるいは植物細胞に本来存在する遺伝子が完全にまたは部分的に発現されないように改変された植物体あるいは植物細胞、植物体あるいは植物細胞に本来存在する遺伝子をさらに追加的に導入するかまたはその発現を増強させるように操作してその発現を増強する様に改変された植物体あるいは植物細胞、もしくは植物体あるいは植物細胞に本来存在する遺伝子ではないがそれに類似する遺伝子を植物体あるいは植物細胞に導入することにより改変された植物体あるいは植物細胞のいずれであってもよい。
【００２１】
本発明の文脈において、機能について言及する場合に「モジュレート」または「モジュレーション」とは、その機能の低下（阻害）または上昇（刺激）のいずれか、を意味する。より具体的には、エラーを起こしがちな損傷乗り越え複製の機能がモジュレートされる、という場合、そのような損傷乗り越え複製の機能が低下する場合または上昇する場合のいずれかをいう。
【００２２】
本発明において、損傷乗り越え複製の機能が低下するという場合、そのような機能が完全にまたは部分的に低下することを意味しており、具体的には本発明のＡｔＲＥＶ３タンパク質の機能が低下することによって生じる。例えば、ＡｔＲＥＶ３遺伝子に変異を導入して、その機能を低下させることにより、損傷乗り越え複製の機能を低下させることができる。ＡｔＲＥＶ３遺伝子に変異を導入した植物個体を作出するためには、従来から植物個体や種子への放射線の照射が主として使用されており、本発明においても従来から使用されてきたそのような方法を用いてもかまわない。放射線を照射する対象は植物個体であっても種子であってもかまわないが、本発明においては種子に対して放射線を照射することが好ましい。
【００２３】
この方法において「放射線」という場合、例えばＸ線、イオンビーム、γ線、電子線、中性子線などを使用することができる。本発明においては、Ｘ線、イオンビームを使用することが好ましく、イオンビームを使用することが最も好ましい。放射線としてイオンビームを使用する場合、線種としてはどのイオンを使用してもよいが、例えば１０〜５０００  ＭｅＶのヘリウムイオン、炭素イオン、ネオンイオン、アルゴンイオンなどを使用することができる。本発明において使用する場合のイオンビームの線量は、放射線を照射する植物の種類によって異なるものの、０．１〜２０００  Ｇｙの線量で照射することが好ましい。例えば、シロイヌナズナ種子の場合には、好ましくは１〜１０００  Ｇｙ、より好ましくは１０〜５００  Ｇｙ、最も好ましくは１０〜２００  Ｇｙの線量で照射する。
【００２４】
変異個体のスクリーニングは、特徴的な形質を指標として、その形質を有するか否かを調べることにより行う。そのような特徴的な形質を指標としたスクリーニングの例としては、根の屈曲分析、植物体の生長量分析などがあるが、これらのものには限定されない。本発明においては根の屈曲分析を使用することが好ましい。
【００２５】
このように作出された損傷乗り越え複製の機能が低下した変異植物体は、変異原への曝露の結果生じたＤＮＡ上の損傷部位で複製が停止するかまたは抑制されるため、変異原への曝露に対して感受性になる。そして、複製の速度が著しく低下し、植物細胞の分裂速度が低下することとなる。
【００２６】
一方、損傷乗り越え複製の機能が上昇するという場合、そのような機能が変異導入前と比較して少なくとも１０％、上昇することを意味しており、具体的には本発明のＡｔＲＥＶ３タンパク質の機能が上昇することによって生じる。例えば、ＡｔＲＥＶ３遺伝子を植物細胞中に導入し、ＡｔＲＥＶ３タンパク質の発現を亢進することにより、損傷乗り越え複製の機能を上昇させることができる。ＡｔＲＥＶ３遺伝子を植物細胞中に導入するためには、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などの従来から使用されているいずれかの方法を使用することができる。
【００２７】
遺伝子導入個体のスクリーニングは、ノーザンブロットなどの導入遺伝子の発現解析の他、特徴的な形質を指標として、その形質を有するか否かを調べることにより行う。本発明においては、ＡｔＲＥＶ３タンパク質が損傷乗り越え複製の機能を上昇させる活性を有することから、ゲノム中に蓄積する変異を解析することが好ましい。
【００２８】
このように作出された損傷乗り越え複製の機能が上昇した植物体は、変異原への曝露の結果ＤＮＡ上の損傷部位が生じても複製が停止することがないので、変異原への曝露に対して耐性になる。そして、複製の速度が上昇し、植物細胞の分裂速度も上昇することとなる。
【００２９】
本発明において「変異原」という場合、植物細胞中のＤＮＡに対して変異を生じさせる能力を有するもの全てを指し、例えば紫外線（ＵＶ）、ガンマ線、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）やメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）などの変異原性化学物質、活性酸素、放射線などが含まれるが、これらのものには限定されない。
【００３０】
本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に記載のＡｔＲＥＶ３タンパク質は、シロイヌナズナから得られたものであるが、ＲＥＶ３タンパク質は種を越えて相同性が高いことから、他の植物由来のＲＥＶ３タンパク質であっても同様の効果を有することが予想される。
【００３１】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００３２】
【実施例】
実施例１：変異株の作出
本発明においては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＣｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ）株を、野生型植物として使用した。ｒｅｖ３−１株（ＳＡＬＫ＃０２９２３７）およびＦ８Ａ５．６−破壊株（ＳＡＬＫ ０６０９２０）については、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＩＧｎＡＬ）から提供を受けた。植物を、２３°Ｃにて、育成チャンバー（ＬＨ２００ＲＤ，  ＮＫ−Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）中でガラスプレートを介してフィルターをかけた蛍光灯（ＦＬ４０ＳＳ−Ｗ／３７，  Ｔｏｓｈｉｂａ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ；およそ４０μＥｍ−２ｓ−１）による連続白色光のもとで、２３℃で育成された。
【００３３】
変異株の単離は、以下の様に行った。すなわち、Ｃｏｌ株種子を、ＡＶＦサイクロトロンで発生させた１５０  Ｇｙの線量を有する２２０  ＭｅＶの炭素イオンで照射した。およそ７５０個のＭ１種子を生長させ、そして自家受粉させた。得られた種子（Ｍ２）を育成し、それぞれの種子を個体ごとに採取し、３０００種のＭ２系統を作成した。全てのＭ２系統のＵＶ−Ｂ感受性を、根の屈曲分析により調べた。
【００３４】
根の屈曲分析は、以前に報告された方法（Ｂｒｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）を改良して行った。具体的には、幼苗を、垂直に立てた栄養寒天プレート（２％スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）市販栄養物  、Ｈｙｐｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）上で、連続白色光のもと、３日間生長させた。変異体を単離の際には、幼苗を４  ｋＪｍ−２ｍ−１の線量率で０．５  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂに対して曝露し、そしてその後、さらに３日間、暗条件下にてインキュベートした。ＵＶ−Ｂ感受性の解析の際には、幼苗を０．２〜０．８  ｋＪｍ−２（暗条件のとき）または２〜４  ｋＪｍ−２（明条件のとき）のＵＶ−Ｂに曝露し、そしてその後、暗条件下でまたは連続白色光（およそ４０μＥｍ−２ｓ−１）条件下で、３日間インキュベートした。ＵＶ−Ｂ照射後の根生長の長さを、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｖｅｒ．  １．６２により測定し、そして非照射の野生型植物の根の長さの平均を１００パーセントとして相対値で表した。
【００３５】
ＵＶ−Ｂ光源として、２８０  ｎｍ以上の波長（３１２  ｎｍにピークを有する）（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ，  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅにより製造され測定された）を持つＵＶランプ（ＣＳＬ−１５Ｂ，  ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を利用した。ＵＶ−Ｂ線量は、３１３  ｎｍにピークを有するＵＶ−Ｂ放射を透過するフィルターつきＵＶ−Ｂラジオメーター（ＣＳＶ−３１２，  ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ）により測定した。
【００３６】
本発明の発明者らは、上述した約３，０００種のＭ２株を、暗条件下でのＵＶ−Ｂ感受性を指標としてスクリーニングした。ＵＶ−Ｂ照射により生長が阻害された１３系統のＭ２株を、ＵＶ−Ｂ感受性変異体に関する一次候補として選択した。概略的なマッピングと相補性試験の結果に基づき、これらの候補株を６群の独立したグループに分類した。これらの新規なＵＶ−Ｂ感受性変異体を、ｓｕｖ（ＵＶ感受性）１〜ｓｕｖ  ６と命名した。本発明の以下においては、これらのうちｓｕｖ１変異体について実験を行った。
【００３７】
実施例２：ｓｕｖ１株の特徴分析
本実施例においては、実施例１で作出したｓｕｖ１変異体の特徴をさらに明らかにするため、幼苗を様々な線量のＵＶ−Ｂで照射し、それらに対する反応を根の屈曲分析により解析した。根の屈曲分析は、実施例１において記載したように行った。
【００３８】
結果を、図１において示す。図１Ａは、明条件下での野生型幼苗およびｓｕｖ１幼苗の根の生長を示す。この実験では、３日齢の幼苗を、３  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂに曝露し、その後連続白色光条件下にて３日間インキュベートした。図１Ｂは、暗条件下での野生型幼苗およびｓｕｖ１幼苗の根の生長を示す。この実験では、幼苗を、０．６  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂに曝露し、その後暗条件下にて３日間インキュベートした。図１Ｃおよび１Ｄは、明条件下（図１Ｃ）および暗条件下（図１Ｄ）での野生型（白丸）およびｓｕｖ１（黒丸）の根の生長に基づくＵＶ線量応答性曲線。照射後の根の生長を、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅにより測定した。それぞれの値は、１８〜２６回の測定の平均を示す。エラーバーは、ＳＤを示す。
【００３９】
野生型幼苗の根生長は、明条件下では１  ｋＪｍ−２の線量ではほとんど阻害されたなかったが、ＵＶ−Ｂ線量を増大させると、阻害が見られた（図１Ａおよび１Ｃ）。暗条件下では、野生型植物の根生長は、わずかながら阻害された（図１Ｂおよび１Ｄ）。対照的に、ｓｕｖ１変異体の根は、暗条件下でも（図１Ｂおよび１Ｄ）、光回復酵素が活性化されているはずの明条件下でも（図１Ａおよび１Ｃ）、ＵＶ−Ｂ線量依存的に生長が阻害された。
【００４０】
一方、ｓｕｖ１変異体の特徴をさらに明らかにするため、長期のＵＶ−Ｂ照射に対するｓｕｖ１変異体の応答も調べた。長期間のＵＶ−Ｂ照射は、以下の様にして行う。すなわち、植物を、培養土（Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ  ３５０，  Ｓｃｏｔｔｓ  Ｓｉｅｒｒａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ，  ＯＨ）を入れた植木鉢を用い、光チャンバー（ＢＩＯＴＲＯＮ，  ＮＫ−Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）中で１６時間明期の条件下、生長させた。１０日齢幼苗になったところで、７．６〜１４  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂを１日７時間照射した。ＵＶ−Ｂ線量は、ＵＶ−Ｂランプから植物までの距離を変化させることにより調整した。ＵＶ−Ｂ処置の１４日後、それぞれの植物の生重量を測定した。それぞれの試験区について、２０個体以上の植物を使用した。結果を表１にまとめた。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
ｓｕｖ１変異体の生重量は、ＵＶ−Ｂ照射を行っていない野生型植物のものよりも若干少なかった。２週間にわたるＵＶ−Ｂ照射の後、ｓｕｖ１変異体は、野生型植物生重量よりも大幅に生重量が減少したことが示された。ｓｕｖ１変異体の生重量は、ＵＶ−Ｂ線量依存的に、５０％まで減少した。まとめると、これらの結果から、ｓｕｖ１変異体は野生型植物よりもＵＶ−Ｂに対して有意に感受性が高いことがわかった。
【００４３】
根の屈曲分析の結果から、ｓｕｖ１植物は、暗条件下および明条件下の両方で、ＵＶ−Ｂ照射に対して感受性であることが示された（図１）。この表現型は、暗修復機構を欠損するその他のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）変異体の表現型（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）と類似する。
【００４４】
実施例３：ｓｕｖ１のＤＮＡ損傷修復活性
本実施例においては、ｓｕｖ１変異体が他のｕｖｈ（ＵＶ感受性）変異体と同様に暗修復機構を欠損するかどうかを調べるため、ｓｕｖ１変異体におけるＵＶ−Ｂ処理後のＣＰＤおよび６−４光化学反応生成物の減少を、ＥＬＩＳＡ法によって定量した。
【００４５】
ＥＬＩＳＡ法は、以下の様に行った。まず、寒天プレート上で生長させた５日齢幼苗を、ＵＶ−Ｂで照射し、その後、暗条件下またはガラスプレートを介してフィルタをかけた蛍光灯（ＦＬ４０ＳＳ−Ｗ／３７，  Ｔｏｓｈｉｂａ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ；  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  ４０μＥｍ−２ｓ−１）下にて、生育させた。植物を様々な時間の後にで採取し、ＤＮＡをＰｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。ＣＰＤおよび６−４光化学反応生成物の量を、特異的抗体を使用してＥＬＩＳＡ法により決定した。値は、野生型植物におけるＵＶ−Ｂ処置の直後のＤＮＡ損傷の量のに対する相対値（％）として表した。
【００４６】
結果を図２に示す。この実験では、５日齢の幼苗を、３  ｋＪｍ−２（明条件）または１  ｋＪｍ−２（暗条件）のＵＶ−Ｂにより照射し、その後白色光条件下（図２Ａ）または暗条件下（図２Ｂ）にて維持した。記載された時間が経過した後に回収し、ＤＮＡを抽出した。ＣＰＤまたは６−４光生成物の量は、特異的抗体を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。それぞれの値は、少なくとも２回の独立した測定の平均として示す。エラーバーは、ＳＥを示す。
【００４７】
ＵＶ−Ｂ照射（１〜３  ｋＪｍ−２）直後には、野生型植物およびｓｕｖ１  植物におけるＤＮＡ損傷の量は同様であった（データは示さない）。ＵＶ−Ｂ処理植物を、暗条件下または明条件下でインキュベートし、残存するＤＮＡ損傷を数時間ごとに定量した。その結果、暗条件下または明条件下の両方で、ＣＰＤおよび６−４光化学反応生成物は、ｓｕｖ１植物において、野生型植物の場合とほとんど同じくらい早く減少した。（図２）。すなわち、ＣＰＤおよび６−４光化学反応生成物は、明条件下で迅速に除去され、これはおそらくは、光回復酵素の活性によるものと思われる（図２Ａ）。一方野生型植物および変異体植物の両方において、暗条件下ではゆっくりと除去された（図２Ｂ）。これらの結果から、暗条件下および明条件下の両方において、ｓｕｖ１は正常な修復活性を有することが示された。
【００４８】
実施例４：ｓｕｖ１変異体の遺伝的解析
本実施例においては、ｓｕｖ１変異体の遺伝的形質を解析した。ｓｕｖ１変異体を親株Ｃｏｌｕｍｂｉａと戻し交配し、この交配の結果得られた９８株のＦ２個体を土の上に蒔き、育成して自家受粉させ、得られた種子をＦ２系統としてプールした。これらのＦ２株を、根の屈曲分析により調べ、全てのＦ３幼苗がＵＶ感受性を示した株を、ＵＶ感受性株として同定した。これらのＦ２のうち、２４個体のＦ３幼苗が、根の屈曲分析によりＵＶ感受性表現型を示した。全系統数に対するＵＶ感受性株の数を、χ２試験により調べた。このことは、分離比がほぼ３：１であることを示しており（ｐ＜０．０５）、ｓｕｖ１が単一劣性遺伝子変異体であることが示唆される。
【００４９】
本実施例においては次に、ｓｕｖ１変異体の原因となるｓｕｖ１遺伝子を同定するため、マッピング解析を行った。マッピング解析は、以下の様にして行った。
【００５０】
ｓｕｖ１株を、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｒ）生態型と交配させた。この交配から得られたＦ２植物を生長させ、それぞれの植物から１枚の葉を採取し、ＤＮＡ調製用に保存した。その後、植物を自家受粉させて、Ｆ２系統を調製した。約６４０系統のＦ２を、ＵＶ−Ｂ感受性について根の屈曲分析によりスクリーニングした。ＤＮＡをＵＶ−Ｂ感受性株の葉のストックから抽出し、ＳＳＬＰ法（Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒ，  １９９４）またはＣＡＰＳ法（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  １９９３）により多型を解析した。ＰＣＲ−ベースマーカーの配列は、ＴＡＩＲデータベース中（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に列挙されている。
【００５１】
解析の結果、ｓｕｖ１変異は、染色体１の下部と緊密に連鎖することが示された。調べた５８本の染色体のうち、６本がｎｇａ１１１（１１５．５５  ｃＭ）マーカーにおいて組換えを起こしており、一方でｎｇａ２８０（８３．８３  ｃＭ）マーカーにおいて組換えを起こしたものはなかった。第１染色体上でほとんど組換えを起こしていない場所を見つけるため、本発明の発明者らは、ｎｇａ２８０とｎｇａ１１１との間に位置するさらに５種類のＰＣＲマーカー（Ｆ１９Ｋ２３、ｇ４０２６、ｍ３０５ａ、ｇ１１４４７およびｎＦ５Ｉ１４）を選択し、そしてそれらの位置における組換えを１６６種の染色体において調べた。しかしながら、これらのマーカーのどれも、何の組換えの証拠も示さなかった。ついで、１２種の新規なＣＡＰＳマーカー、Ｔ１８Ｉ２４、Ｔ３０Ｅ１６−１、Ｔ３０Ｅ１６−２、Ｆ２３Ｈ１１、Ｔ１３Ｄ８、Ｔ１Ｆ９、Ｆ１０１９、Ｆ１Ｎ２１、Ｆ１２Ａ２１、Ｔ２３Ｋ２３、Ｆ２４Ｊ５、Ｆ２４Ｊ１３を、１２種のＢＡＣ配列に基づいて設計した（図３）。これらのＤＮＡマーカーおよびＢＡＣ配列は、ＴＡＩＲホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に列挙されている既知のものであり、インターネット上で入手可能である。
【００５２】
これらの１２種の新規なＣＡＰＳマーカーは、まずそれぞれのマーカーに特異的なプライマー対を用いたＰＣＲによりマーカーのヌクレオチド配列を増幅し、ついでそれをマーカーに対して個別に指定した制限酵素で切断することにより、識別することができる。それぞれのマーカーに対して使用するプライマー対および制限酵素は、以下の通りである：
Ｔ１８Ｉ２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３および４；およびＸｂａ  Ｉ）；
Ｔ３０Ｅ１６−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５および６；およびＡｆｌ  ＩＩＩ）；
Ｔ３０Ｅ１６−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７および８；およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ）；
Ｆ２３Ｈ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９および１０；およびＲｓａ  Ｉ）；
Ｔ１３Ｄ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１および１２；およびＡｃｃ  Ｉ）；
Ｔ１Ｆ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３および１４；およびＳｐｅ  Ｉ）；
Ｆ１０１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５および１６；およびＳｃａ  Ｉ）；
Ｆ１Ｎ２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７および１８；およびＳｔｙ  Ｉ）；
Ｆ１２Ａ２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９および２０；およびＢａｍＨ  Ｉ）；
Ｔ２３Ｋ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１および２２；およびＳａｕ３Ａ  Ｉ）；
Ｆ２４Ｊ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３および２４；およびＤｒａ  Ｉ）；および
Ｆ２４Ｊ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５および２６；およびＸｂａ  Ｉ）。
【００５３】
ｓｕｖ１とＬｅｒとの交配に由来するＦ２植物における、組換え率から得られる第１染色体の下部の部分的染色体地図を、図３に示す。それぞれのマーカー位置での組換え価は、カッコ内で示されている。組換えは、第１染色体の下部で最も低く、Ｔ１３Ｄ８とＦ１Ｎ２１との間に位置するマーカーでは、組換えは検出されなかった。黒の槍型は、ゲノムＤＮＡブロッティングにおいてプローブとして使用したＢＡＣの位置と方向を示す。白の槍型は、本文中に記載したＦ８Ａ５  ＢＡＣを示す。
【００５４】
解析した２６８種の染色体のうち、Ｔ１３Ｄ８〜Ｆ１Ｎ２１の間で組換えを示したものは存在しなかった（図３）。これらの結果から、ｓｕｖ１変異体の第１染色体の構造には、何らかの異常が存在することが示唆される。
【００５５】
実施例５：ｓｕｖ１変異体における染色体再配列の解析
イオンビーム照射がしばしば植物細胞中での大規模な染色体再配列を誘導すると仮定すると、ｓｕｖ１中での組換えの異常な分布が、イオンビーム照射により誘導される染色体逆位によるものである可能性がある。本実施例においては、この可能性を試験し、そしてｓｕｖ１表現型の原因となる変異を同定するため、本発明の発明者らは、逆位領域の末端を検索した。
【００５６】
組換え領域と非組換え領域の境界付近に位置する７種のＢＡＣの配列をプローブとして使用して、ｓｕｖ１  ＤＮＡの制限酵素消化パターンを検出した。７種のＢＡＣの配列をプローブは、Ｔ２Ｋ１０、Ｆ２３Ｈ１１、Ｔ１３Ｄ８、Ｔ１Ｆ１５、Ｆ１２Ｂ７、Ｆ１２Ａ２１、およびＦ１Ｎ２１であった。これらのＤＮＡマーカーは、ＴＡＩＲホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に列挙されている既知のものであり、インターネット上で入手可能である。結果として、Ｔ２Ｋ１０、Ｆ１２Ｂ７およびＴ１Ｆ１５のＢＡＣから調製されたプローブは、ｓｕｖ１  ＤＮＡとハイブリダイズさせた場合に変化したバンドパターンを示した。Ｆ１２Ｂ７およびＴ１Ｆ１５に対応する９．２  ｋｂのＤＮＡフラグメントおよびＴ２Ｋ１０に対応する６．６  ｋｂ  ＤＮＡフラグメントが、ｓｕｖ１  ＤＮＡのパターンからは失われていた。
【００５７】
可能性のある変異ＤＮＡ領域を狭めるため、９．２−ｋｂ領域（右）および６．６ｋｂ領域（左）を、ＰＣＲで調べた。９．２  ｋｂ領域を増幅するためには、
Ｆ１２Ｂ７−１ＦとＦ１２Ｂ７−１Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７および２８）；
Ｆ１２Ｂ７−２ＦとＦ１２Ｂ７−２Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９および３０）；
Ｆ１２Ｂ７−３ＦとＦ１２Ｂ７−３Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１および３２）；
Ｆ１２Ｂ７−４ＦとＦ１２Ｂ７−４Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３３および３４）；および
Ｆ１２Ｂ７−５ＦとＦ１２Ｂ７−５Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５および３６）；
の５組のプライマー対を使用した。一方、６．６  ｋｂを増幅するためには、
Ｔ２Ｋ１０−１ＦとＴ２Ｋ１０−１Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７および３８）；
Ｔ２Ｋ１０−２ＦとＴ２Ｋ１０−２Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９および４０）；
Ｔ２Ｋ１０−３ＦとＴ２Ｋ１０−３Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１および４２）；
Ｔ２Ｋ１０−４ＦとＴ２Ｋ１０−４Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３および４４）；
Ｔ２Ｋ１０−５ＦとＴ２Ｋ１０−５Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５および４６）；
Ｔ２Ｋ１０−６ＦとＴ２Ｋ１０−６Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４７および４８）；
Ｔ２Ｋ１０−７ＦとＴ２Ｋ１０−７Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４９および５０）；
Ｔ２Ｋ１０−８ＦとＴ２Ｋ１０−８Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１および５２）；
Ｔ２Ｋ１０−８Ｆ−１とＴ２Ｋ１０−８Ｒ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５３および５４）；および
Ｔ２Ｋ１０−９ＦとＴ２Ｋ１０−９Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５５および５６）；
の１０組のプライマー対を使用した。
【００５８】
その結果、９．２ｋｂ領域中の１．６ｋｂサブフラグメントおよび６．６−ｋｂ領域中の０．８ｋｂサブフラグメントは増幅されなかった。これらのサブフラグメントが増幅されなかったのは、その中で再編成が起こった可能性が考えられた。ｓｕｖ１染色体における再編成を明らかにするため、Ｌｉｕら（Ｌｉｕ，  Ｙ−Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ８，  ４５７−４６３）により記載されている配列に基づいて作製された、３種の任意（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ；ＡＤ）プライマー（ＡＤ１：  ５’−ｇｔｎ  ｃｇａ  ｓｗｃ  ａｎａ  ｗｇｔ  ｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５７）；ＡＤ２：  ：  ５’−ｎｇｔ  ｃｇａ  ｓｗｇ  ａｎａ  ｗｇａ  ａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５８）；ＡＤ３：  ５’−ｗｇｔ  ｇｎａ  ｇｗａ  ｎｃａ  ｎａｇ  ａ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５９））と、１．６ｋｂサブフラグメントの上流領域および０．８ｋｂサブフラグメントの下流領域について設計された特異的（ＳＰ）プライマーとを用いて、ＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。１．６ｋｂ上流領域に対するＳＰプライマーは、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ１、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ２、およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ３（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６０〜６２）の３つの配列およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ４、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ５、およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ６（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６３〜６５）の３つの配列をそれぞれ１セットとして、一方向に使用し、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ７、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ８、およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ９（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６６〜６８）の３つの配列およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ１０、Ｆ１２Ｂ７−Ｓｐ１１、およびＦ１２Ｂ７−Ｓｐ１２（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６９〜７１）の３つの配列をそれぞれ１セットとして、逆方向に使用した。０．８ｋｂの下流領域に対するＳＰプライマーは、Ｔ２Ｋ１０−Ｓｐ１、Ｔ２Ｋ１０−Ｓｐ２、およびＴ２Ｋ１０−Ｓｐ３（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７２〜７４）の３つの配列を、それぞれ１セットとして、一方向のみ使用した。ＴＡＩＬ−ＰＣＲのサイクル条件、試薬などはＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ−ＰＣＲ）（Ｌｉｕ，  Ｙ．−Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔｉｅｒ，  Ｒ．Ｆ．（１９９５）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２５，  ６７４−６８１）に従って行った。
【００５９】
ＴＡＩＬ−ＰＣＲ生成物のシークエンシングから、Ｔ１Ｆ１５の配列が破壊され、Ｔ２Ｋ１０の配列に再結合していることが示された。しかしながら、Ｔ２Ｋ１０のもう半分は、Ｔ１Ｆ１５以外のＤＮＡフラグメントと再結合されていた。
【００６０】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＮＡデータベース上で相同配列を検索した結果、このフラグメントはＦ８Ａ５に対応しており、Ｔ２Ｋ１０の約２００  ｋｂ下流に位置することが示された（図３）。これらの結果から、第１染色体中には少なくとも３つの切断点が存在することが示唆される。なお、Ｆ８Ａ５マーカーも、ＴＡＩＲホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に列挙されている既知のものであり、インターネット上で入手可能である。
【００６１】
本実施例においては次に、３つの切断点およびそれらの再結合部位を明らかにするため、Ｆ８Ａ５における破壊点の上流配列および下流配列から設計したＳＰプライマーセットを用いてＴＡＩＬ−ＰＣＲを行い、そしてこれらのＰＣＲ生成物をシークエンシングし、解析を行った。上流については、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ１、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ２、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ３（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７５〜７７）を、下流については、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ４、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ５、Ｆ８Ａ５−Ｓｐ６（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７８〜８０）のＳＰプライマーセットを、それぞれ用いた。ＴＡＩＬ−ＰＣＲを行う際の条件は、上述した条件と同一である。
【００６２】
この結果、ｓｕｖ１変異体は、逆位および転座を含む大規模な染色体再編成を起こしていることが示唆された（図４）。まとめると、染色体１は、少なくとも３つの点で破壊されており、それらはＴ２Ｋ１０、Ｆ８Ａ５およびＴ１Ｆ１５に存在した。第１の破壊点（Ｔ２Ｋ１０上）から第２の破壊点（Ｆ８Ａ５上）までの１つのＤＮＡフラグメント（フラグメント１）は転座し、そして第３の破壊点（Ｔ１Ｆ１５上）の右側に再結合していた。第２の破壊点から第３の破壊点までの約２  Ｍｂの別のフラグメント（フラグメント２）は逆位を起こしており、そして第１の破壊点の左側および転座フラグメントに再結合していた。
【００６３】
上述した染色体再編成のため、少なくとも３つの破壊が生じ、それにより、２種の推定遺伝子がｓｕｖ１変異体中では破壊されているようである（図４）。１つの遺伝子（Ｆ８Ａ５．６）は、大型ＧＴＰ−結合タンパク質群の１つと相同なタンパク質をコードしており、もう一つの遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼζの触媒サブユニット（ＡｔＲＥＶ３）をコードしていた。
【００６４】
３つの破壊点に隣接するヌクレオチド配列を解析した結果、ＡｔＲＥＶ３遺伝子の第１２エクソンが、Ｆ８Ａ５．６遺伝子の第１イントロンと逆向きに再結合したことがわかった。この再編成により、ＡｔＲＥＶ３遺伝子のＯＲＦおよびＦ８Ａ５．６遺伝子のＯＲＦが両方とも破壊された（図４）。ＡｔＲＥＶ３遺伝子の３’部分は、遺伝子が何も存在しないＴ２Ｋ１０の破壊末端の一方に再結合された。同様に、Ｆ８Ａ５．６遺伝子の３’−部分は、Ｔ２Ｋ１０のもう一方の破壊末端に再結合されていた。
【００６５】
再結合部位に隣接するヌクレオチド配列を、野生型の対応する配列と比較することにより、第１、第２、および第３の破壊点が、それぞれ２０、２８および１７  ｂｐ欠失していることが示された。さらに、第１の破壊点および第２の破壊点での数ヌクレオチドのＴまたはＧＴＡが、両方の再結合部位に存在したことから、これらの短い相同性配列を使用して、末端を再結合したことが示唆された。しかしながら、第３の破壊点においては、再結合部位に相同性の配列は見いだされなかった。これらの知見から、再結合は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）により生じることが示された。
【００６６】
以上の結果を図４にまとめる。上の図は、ｓｕｖ１における染色体再配列の概観、すなわち、ｓｕｖ１変異体において破壊された２つの遺伝子の、もとの構造と位置を示す。野生型植物において、６個のエクソン（灰色の四角）からなるＦ８Ａ５．６遺伝子は、Ｆ８Ａ５上に位置する。２２個のエクソン（黒四角）からなるＡｔＲＥＶ３遺伝子は、Ｔ１Ｆ１５上に位置する。中央の図は、イオンビーム照射による、予想される染色体再編成を示す。この図にも示すように、染色体は、３つの点（鉛直方向矢印）で破壊されており、フラグメント２は逆位を起こし、フラグメント１は転座している。そして下の図は、ｓｕｖ１変異体における染色体および遺伝子構造を示す。ＡｔＲＥＶ３遺伝子の１２番目エクソンが、Ｆ８Ａ５．６遺伝子の第１のイントロンに逆向きで再結合されている。ＡｔＲＥＶ３遺伝子の３’部分は、Ｔ２Ｋ１０中の非コード領域に再結合され、そしてＦ８Ａ５．６遺伝子の３’部分はＴ２Ｋ１０中の他の切断末端に再結合される。
【００６７】
実施例６：ｓｕｖ１変異体表現型
ｓｕｖ１変異体においては２種の遺伝子が破壊されているため、これらの変異の一方または両方が、変異体のＵＶ−感受性の原因となっている可能性がある。そのため、本実施例においては、はじめに、Ｆ８Ａ５．６遺伝子に注目した。しかしながら、この遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲにより転写物が何も検出されない（データは示さない）ため、野生型植物中では転写されていないようだった。したがって、本発明の発明者らは、この遺伝子は偽遺伝子であり、ｓｕｖ１変異体表現型の原因とはなり得ないと推測した。
【００６８】
この推測を確認するため、本発明の発明者らは、Ｔ−ＤＮＡ挿入Ｆ８Ａ５．６破壊株を解析し、そしてそのＵＶ感受性が、両方のＦ８Ａ５．６が破壊された場合であっても野生型植物中で観察されたものと同一のものであることを見いだした（データは示さない）。まとめると、これらの結果から、Ｆ８Ａ５．６遺伝子ではなくＡｔＲＥＶ３遺伝子が、ｓｕｖ１変異体の表現型の原因である、という仮説が導かれる。
【００６９】
この仮説を試験するため、ｒｅｖ３−１変異体株を解析した。ｒｅｖ３−１変異体は、ＡｔＲＥＶ３遺伝子がＴ−ＤＮＡ挿入により破壊されたが（図５Ａ）Ｆ８Ａ５．６遺伝子は無傷であるという特徴を有する。結果を図５に示す。図５Ａは、Ｔ−ＤＮＡ挿入によるＡｔＲＥＶ３遺伝子の破壊を示す。この図において黒四角は、ＡｔＲＥＶ３遺伝子の２２エクソンを示す。Ｔ−ＤＮＡは、１３番目エクソン中に挿入されている。図５Ｂは、ｓｕｖ１、ｒｅｖ３−１およびｓｕｖ１／ｒｅｖ３−１幼苗のＵＶ感受性を示す。この図において、幼苗を、２  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂに曝露し、その後連続白色光条件下にて３日間インキュベートした。根の生長を、非照射根の平均の長さに対する相対値（％）として表し、ＳＥとともに示した。
【００７０】
ＵＶ照射がない場合には、野生型、ｓｕｖ１、ｒｅｖ３−１、およびｓｕｖ１／ｒｅｖ３−１植物の根の長さは、ほぼ同一であった（対照値、それぞれの値を１００％と設定）。
【００７１】
２  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂを照射し、そして明条件下でインキュベートした場合、野生型幼苗の根生長は、若干減少した（対照値の８８．３±２．５％）のに対して、ｒｅｖ３−１幼苗の根生長は、ＵＶ−処理しなかった対照ｒｅｖ３−１幼苗の根生長のわずか５０．４±３．２％となった（図５Ｂ）。ｒｅｖ３−１幼苗の根生長のこの阻害は、ｓｕｖ１植物の根生長とほとんど同一であった（対照の根生長の５７．０±３．２％）。
【００７２】
同様に、０．６  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂを照射し、そして暗条件下でインキュベートした場合、ｒｅｖ３−１幼苗の根の長さは対照の４５．８±１．８％であったのに対して、野生型幼苗の根生長は対照の７６．９±２．０％であり、そしてｓｕｖ１幼苗の生長は、対照の４４．９±１．６％であった。
【００７３】
ｓｕｖ１およびｒｅｖ３−１が同一遺伝子座上の変異であるか否かを調べるため、ｒｅｖ３−１をｓｕｖ１と交配し、得られたＦ２幼苗を根の屈曲分析により調べた。その結果、ｓｕｖ１／ｒｅｖ３植物の根生長は、明条件下において対照の５６．６±３．７％であり（図５Ｂ）、そして暗条件下において対照の５５．５±２．３％であった。
【００７４】
ｒｅｖ３−１変異体は、ゲノム中に１つ以上のＴ−ＤＮＡ挿入を含有していた（データは示さない）が、ｒｅｖ３−１／＋植物の子孫は、１（ＵＶ感受性）：３（ＵＶ耐性）の比に分離した（Ｐ＜０．０５、ｎ＝２７６）ことから、単一劣性遺伝子形質であることが示唆される。さらに、調べたＵＶ−感受性子孫の全て（ｎ＝６６）が、Ｔ−ＤＮＡ−挿入を含有したが、無傷のＡｔＲＥＶ３遺伝子は含有しなかった（データは示さない）。まとめると、これらの結果全てから、ｓｕｖ１変異体のＵＶ−感受性はＡｔＲＥＶ３遺伝子の破壊により引き起こされることが示唆される。
【００７５】
実施例７：ＡｔＲＥＶ３タンパク質の配列分析
本実施例においては、シロイヌナズナＲＥＶ３タンパク質の配列を分析するため、まず様々な種のＲＥＶ３タンパク質との間でのマルチプルアラインメントを行った。酵母、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヒト、マウス、およびハエのＲＥＶ３配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手した。これらの配列のアクセッション番号は、以下の通りである：Ｐ１４２８４（酵母ＲＥＶ３）、ＢＡＢ８３６２７（アカパンカビＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＲＥＶ３）、Ｏ６０６７３（ヒトＲＥＶ３）、ＸＰ １２５５３３（マウスＲＥＶ３）、ＡＰ００３９８２（ハエＲＥＶ３）。ＲＥＶ３に相同なタンパク質をコードするイネＢＡＣ配列は、ＴＩＧＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）のイネゲノムデータベースをＢＬＡＳＴ法で検索することにより得た。このイネＢＡＣ配列のアクセッション番号は、ＡＡＧ３０２２４（イネＲＥＶ３−様遺伝子を含むＢＡＣ）である。
【００７６】
データベース中ではじめに予想されたＯＲＦは、本発明の発明者らがゲノム配列中に見いだしたエクソンを含んでいなかったため、ＡｔＲＥＶ３配列との最適なアラインメントを作成するにあたって欠失した配列も含めた配列とした。すべてのＲＥＶ３タンパク質のアミノ酸配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）によりアラインメントされた。ＡｔＲＥＶ３とＯｓＲＥＶ３とのアミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ２プログラム（ＮＣＢＩ）により計算した。
【００７７】
この結果を図６に示す。ＡｔＲＥＶ３遺伝子は、２２個のエクソンからなり、５，６８５  ｂｐのオープンリーディングフレームを含有し（ＢＡＣ  Ｔ１Ｆ１５のアクセッション番号、Ａｃ００４３９２；遺伝子ＩＤ、Ａｔ１ｇ６７５００）、１，８９４アミノ酸のタンパク質をコードしている（アクセッション番号ＡＡＣ１８７８５）。図６Ａにおいて、ショウジョウバエ（ＤＭ）、ヒト（ＨＳ）、マウス（ＭＭ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ；ＡＴ）、イネ（ＯＳ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（ＮＣ）、酵母（ＳＣ）由来のＲＥＶ３タンパク質における、保存されたＣ末端領域のアラインメントを示す。それぞれのタンパク質におけるアミノ酸の位置は、左側および右側に示される。全ての配列中で保存された残基は、白黒逆転で示されている。４種以上の配列で保存された残基を灰色で示す。配列上のアスタリスクは、６個の保存されたポリメラーゼドメインを示す。配列下の＠マークは、他のＢ−型ポリメラーゼ中で活性中心を形成することが示された残基を示す。この図において示されるように、ＡｔＲＥＶ３は、一見して他の生物のＲＥＶ３と相同性が高い。特に、このタンパク質のＣ末端側半分は、Ｂ型ＤＮＡポリメラーゼ群中で保存されている６種のポリメラーゼドメインの全てを含有する（図６Ａ）。
【００７８】
さらに図６Ｂにおいて、真核細胞ＲＥＶ３タンパク質の一次構造を示す。黒四角は、Ｂ−型ポリメラーゼドメイン（Ｉ〜ＩＶ）、およびｚｉｎｃフィンガードメイン（ＺＦ）を示す。斜線四角は、Ｎ末端のｓ相同領域を示す（Ｎ）。他のＢ型ポリメラーゼで鋳型ＤＮＡと相互作用することが知られている３つのアミノ酸残基は、ＡｔＲＥＶ３およびその他のＲＥＶ３のアミノ酸配列中にも見いだされる。加えて、ＡｔＲＥＶ３は、Ｎ末端相同領域およびほとんど全てのＲＥＶ３において保存されているｚｉｎｃフィンガードメインを有する（図６Ｂ）。
【００７９】
これらの事実により、ＡｔＲＥＶ３は、ＤＮＡ合成に関与することが強く示唆される。ＡｔＲＥＶ３と相同な配列についての検索の結果、ＴＩＧＲ（ＢＡＣのアクセッション番号、ＡＡＧ３０２２４）中に示されるイネゲノム中にイネのＲＥＶ３ホモログと思われる配列が見出された（４３％同一性）。このことからＲＥＶ３タンパク質は、単子葉植物にも双子葉植物にも両方とも存在することが示唆された。
【００８０】
実施例８：ＡｔＲＥＶ３遺伝子の発現分析
本実施例においては、ＡｔＲＥＶ３遺伝子の発現をＲＮＡブロッティング解析により解析した。ＲＮＡブロッティング解析は、１週齢野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）幼苗に対して、２  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂで照射したもの（レーン２、４）および未照射の対照区（レーン１、３）を用いて行った。これらの幼苗を６−時間のインキュベーションの後、ＲＮＡを幼苗から抽出した。ＲＮＡはまた、野生型（レーン５）、ｓｕｖ１（レーン６）またはｒｅｖ３−１（レーン７）の２−週齢植物から、そして４−週齢の野生型植物（レーン８−１０）の異なる組織から抽出した。１０μｇの全ＲＮＡをメンブレン上にブロットし、そしてＡｔＲＥＶ３  ｃＤＮＡから調製したプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８１）で検出した。
【００８１】
ＲＮＡブロッティング解析の結果から、ＡｔＲＥＶ３転写物がサイズにしてほぼ６  ｋｂであり、予想されるＯＲＦサイズの５，６８２  ｂｐと一致することが示された。野生型植物におけるＡｔＲＥＶ３転写物は、２週齢植物においては、１週齢幼苗においてよりも、より多量であり（図７、レーン３および５）、そして４−週齢植物の葉、根、および花などの様々な組織において、発現している（レーン８〜１０）。しかしながら、転写物は、ｓｕｖ１およびｒｅｖ３−１変異体においては検出されなかった（レーン６および７）。
【００８２】
ＡｔＲＥＶ３遺伝子が野生型植物におけるＵＶ感受性に関与しており、ｓｕｖ１またはｒｅｖ３−１変異体がＵＶ感受性になるのであれば、ＡｔＲＥＶ３転写物は、ＵＶ処理に依存して誘導されることが予想される。しかしながら、幼苗に３  ｋＪ／ｍ−２のＵＶ−Ｂを照射した後、６時間経過した時点では、発現レベルは変化しなかった（図７、レーン１および２）。ＵＶによるＡｔＲＥＶ３の誘導が見られないことは、酵母のＲＥＶ３遺伝子の弱いＵＶ誘導性をもつこと（Ｓｉｎｇｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）と一致している。
【００８３】
実施例９：ＡｔＲＥＶ３遺伝子の損傷乗り越え複製（ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＴＬＳ）に対する関与
ＡｔＲＥＶ３遺伝子が、酵母および動物細胞における事例（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）と同様に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）においてＴＬＳに関与するならば、ＲＥＶ３の欠失は、ＤＮＡ損傷後のＤＮＡ複製を阻害させるかもしれない。予備的な観察において、ＵＶ−Ｂにより処理したｓｕｖ１植物は、根の形態が異常を示し、表皮細胞の並びがひどく乱されていた（データは示さない）。本発明の発明者らは、この現象が不均一な細胞分裂によるものであると推測した：根の細胞において、ＵＶ誘導性のＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ複製を阻害し、根における細胞分裂パターンに影響を与える可能性があった。もしこれが正しいならば、ＤＮＡ合成はＵＶ−Ｂにより処理されたｓｕｖ１植物において減少しまたは乱されるはずである。本実施例においては、この仮説を試験するため、チミジンアナログであるＢｒｄＵの、ｓｕｖ１の根への取り込み効率を観察した。
【００８４】
根におけるＤＮＡ合成は、ＢｒｄＵ標識および検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）により検出した。３日齢幼苗に対して、２  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂで照射するか（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）もしくは未照射（Ａ、Ｃ、Ｅ  、Ｇ）に分類し、照射後約３６時間の幼苗の根組織を、１０μＭのＢｒｄＵおよび１μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＩＣＮ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）を含有する標識溶液中で、室温にて２４時間、インキュベートした。４％パラホルムアルデヒド−リン酸バッファー（Ｗａｋｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）により固定した後、組織を脱水し、Ｔｅｃｈｎｏｂｉｔ  ７１００樹脂（Ｈｅｒａｅｕ  Ｋｕｌｚｅｒ，  Ｗｅｈｒｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に包埋した。ＢｒｄＵの取り込みの検出は、製造者の指示書にしたがって、抗ＢｒｄＵ抗体で検出した（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）。また同一の切片を、ＤＡＰＩにより染色した（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）。蛍光イメージは蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ，  Ｚｅｉｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）により得た。
【００８５】
結果を図８に示す。ＵＶ−Ｂ処置を行っていない野生型の根およびｓｕｖ１の根の組織は、抗ＢｒｄＵ抗体によりよく染色された（図８Ａおよび８Ｅ）ことから、活発に増殖している根冠細胞がＢｒｄＵを取り込んだことが示唆される。
【００８６】
２  ｋＪｍ−２のＵＶ−Ｂで処理された野生型の根は、非処理の根とほとんど同様であった（図８Ｂ）。しかしながら、ＵＶ−Ｂ−処置したｓｕｖ１の根において、免疫染色された細胞の数は、大幅に減少した（図８Ｈ）ことから、ｓｕｖ１の根におけるＤＮＡ複製がＵＶ−Ｂ照射により阻害されたことが示唆される。ＵＶ−Ｂ−処理したｓｕｖ１の根の中には、多量のＢｒｄＵ取り込んだ細胞も幾つか見られた（データは示さない）。しかしながら、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞は数が少なく、非処置の根または野生型の根において観察されたものと比較して、揃っていなかった。この非同調性ＤＮＡ複製は、ＵＶ−処置ｓｕｖ１の根における不規則な細胞分裂を引き起こしたと思われる（図８Ｆ、８Ｈ）。これらの結果は、ＡｔＲＥＶ３がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＴＬＳに関与し、そしてＡｔＲＥＶ３活性の欠失がｓｕｖ１変異体におけるＵＶ感受性表現型を引き起こすという概念と一致している。
【００８７】
実施例１０：植物のγ線、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）およびマイトマイシン（ＭＭＣ）に対する感受性の測定
他の生物において、ＲＥＶ３タンパク質は、ＵＶ損傷ＤＮＡの複製だけでなく、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）部位などのその他のタイプのＤＮＡ損傷の複製にも関与することが報告される（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ＡｔＲＥＶ３が、いくつかの種のＤＮＡ損傷のＴＬＳにも関与しているならば、ＤＮＡ損傷を受けたｓｕｖ１植物は、ＵＶ処置により引き起こされる根の生長阻害と同様の阻害を示すはずである。本実施例においては、この予想が正しいかどうかを調べるため、野生型、ｓｕｖ１およびｒｅｖ３−１幼苗を、様々なタイプのＤＮＡ損傷を引き起こすいくつかの薬剤で処理した。
【００８８】
種子を栄養性寒天プレート上に置き、連続白色光条件下にて３日間、鉛直方向に生長させた。３日齢の幼苗を、γ線で照射（Ａ）またはメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）含有寒天プレート（Ｂ）またはマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）−含有寒天プレートに移植し（Ｃ）、そしてさらに３日間インキュベートした。γ線感受性を試験するためには、幼苗を６０Ｃｏ照射設備（ＪＡＥＲＩ，  Ｔａｋａｓａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）によるγ線で照射した。ＭＭＳまたはＭＭＣ感受性を試験するためには、３日齢の幼苗を２５〜１００  ｐｐｍ  ＭＭＳまたは０．５〜８  ｍｇＬ−１  ＭＭＣを添加した栄養性寒天プレートの表面に移植した。その後、プレートを回転させて静置し、新しい根の生長がそれよりも前の生長方向に対して９０°になるようにした。連続白色光条件下にて３日間のインキュベーションした後、処置後の根生長は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅにより測定した。それぞれの値は、１６〜２５回の測定の平均を示す。エラーバーは、１  ＳＤを示す。
【００８９】
幼苗をγ線に曝露した場合、ｓｕｖ１およびｒｅｖ３−１幼苗は感受性になった。すなわち、根の生長が野生型の根生長と比較して明らかに阻害された（図９Ａ）。幼苗を塩基修飾を誘発するアルキル化剤であるメチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）を２０〜１００  ｐｐｍ添加した寒天プレートに植え換えた場合、ｓｕｖ１植物の根生長は野生型の根生長よりもほんのわずか短かくなった（図９Ｂ）。一方、ｓｕｖ１幼苗の生長は、二本鎖核酸ＤＮＡ上での鎖内架橋または鎖間架橋を引き起こすと考えられているＭＭＣを２〜８  ｍｇＬ−１添加したプレート上では大きく阻害された。
【００９０】
このことから、ＡｔＲＥＶ３は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）においては多様な機能を果たしていることが示唆される。まとめると、これらの結果から、ＡｔＲＥＶ３はＴＬＳに関与し、そしてｓｕｖ１変異体中のＡｔＲＥＶ３遺伝子を破壊すると、根冠細胞でのＤＮＡ複製の阻害が引き起こされ、ｓｕｖ１幼苗の根において細胞分裂停止を引き起こされることが強く示唆された。
【００９１】
実施例１１：シロイヌナズナ中でのＡｔＲＥＶ３の突然変異率に対する作用
ｓｕｖ１株で欠損しているＡｔＲＥＶ３遺伝子は、酵母のＲＥＶ３遺伝子のホモログであると予想される。ＲＥＶ３遺伝子は、動物や酵母では損傷乗り越え複製に関わるＤＮＡポリメラーゼζの触媒サブユニットをコードしており、紫外線照射によって生じたＤＮＡ損傷部を乗り越えて複製を進行させる機能を持つ一方で、高頻度の複製エラーを引き起こすことが知られている。ＡｔＲＥＶ３が、シロイヌナズナ中でＲＥＶ３遺伝子と同様に損傷乗り越え複製を行っているならば、植物でも酵母の場合と同様に突然変異の誘発に関与している可能性が考えられたことから、本実施例においては、あらかじめＧＵＳ遺伝子に点突然変異が導入されて正常なＧＵＳ発現が見られないが、復帰突然変異によってＧＵＳ発現が回復することによって突然変異率を検出できる系統をｓｕｖ１株に導入し、ＡｔＲＥＶ３遺伝子の有無で突然変異率が変化するかどうかを試験した。
【００９２】
本実施例においては、点突然変異が導入されたＧＵＳ遺伝子をもつシロイヌナズナ系統、＃７４７及び＃６９９を用いた（カナダのＩｇｏｒ  Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ氏より分与）。＃７４７及び＃６９９は、それぞれＫｏｖａｌｃｈｕｋ，  Ｉ．らの論文（（２０００）  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  １９，  ４４３１−４４３８）に記載の系統１１６のうち、塩基ＧがＴとなった変異系統（系統１６６Ｇ→Ｔ）および系統１１２のうち、塩基ＧがＴとなった変異系統（系統１１２Ｇ→Ｔ）である。
【００９３】
次に、＃７４７及び＃６９９をｓｕｖ１と交配し、得られたＦ２種子を用いて実施例１に記載したように根の屈曲分析を行い、紫外線感受性の植物（Ｆ２）を選抜した。さらに、この植物の種子（Ｆ３）を２０μｇ／ｍｌのＢＡＳＴＡを含むジェランガム培地上にまき、ＧＵＳ遺伝子及びＢＡＳＴＡ抵抗性遺伝子をホモにもつＦ２系統をスクリーニングし、＃７４７及び＃６９９でそれぞれ１系統のホモ系統を得て、これらをそれぞれ＃７４７×ｓｕｖ１−３及び＃６９９×ｓｕｖ１−４と命名した。
【００９４】
＃７４７×ｓｕｖ１−３及び＃６９９×ｓｕｖ１−４よりＤＮＡを抽出し、親株（＃６９９、＃７４７）との間で、ＧＵＳ遺伝子のコピー数および挿入位置をサザンブロッティング解析により調べた。結果を図１０に示す。この実験において、１レーンあたり１０μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで切断し、ＧＵＳ領域をプローブとして検出した。その結果、＃７４７と＃７４７×ｓｕｖ１−３は、サザンブロッティングで同じパターンが得られた。一方、＃６９９と＃６９９×ｓｕｖ１−４ではパターンが異なるため、存在様式が変化している可能性があるものの、どちらともにＧＵＳ遺伝子の存在が確認された（図１０）。
【００９５】
＃７４７と＃７４７×ｓｕｖ１−３、または＃６９９と＃６９９×ｓｕｖ１−４の種子各５００粒を滅菌ロックウール上に蒔き、１０００倍希釈のＨｙｐｏｎｅｘを与えながら１６時間明期（〜３４００  ｌｕｘ）、２１℃の条件で１４日間育成した（本葉４〜６枚程度展開）。１４日目にＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ社ＣＳＬ３０Ｃを用いてＵＶ−Ｃを１  ｋＪ／ｍ２照射し、再び同じ条件で１０日間育成した。１０日目に地上部を回収し、生重量を量った後、一部をＤＮＡ抽出用に保存し、残りをＧＵＳ染色に用いた。染色の方法は、１１７  ｍｇ／２００  ｍｌ  Ｘ−ｇｌｕｃシクロヘキシルアンモニウム塩、０．０５％アジ化ナトリウム、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５  ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．５  ｍＭ  Ｆ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含む０．１  Ｍ  リン酸ナトリウムバッファーに組織を浸し、減圧浸透処理（＜０．０１  ＭＰａ、１０  ｍｉｎ×２）を行った後、３７℃で４８時間インキュベートした。染色後、組織を７０％エタノールで脱色し、実体顕微鏡でＧＵＳのスポットを観察した。結果を図１１に示す。
【００９６】
それぞれの系統におけるＧＵＳのスポットの数をカウントした（表２）。その結果、＃７４７×ｓｕｖ１−３は＃７４７に比べて４．４％の、＃６９９×ｓｕｖ１−４は＃６９９の２１．３％の復帰突然変異しか起こっていないことがわかった。このことは、ｓｕｖ１変異の導入によって、突然変異誘発率が大幅に低下することを意味する。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
これらの結果から、ＳＵＶ１遺伝子の機能を抑制することで、突然変異率を低下することができること；シロイヌナズナで発見された遺伝子の機能は、他の高等植物で共通に存在すると考えられること；ＳＵＶ１遺伝子は、植物が生きのびるために必須の遺伝子であること；がわかった。この遺伝子が働くことにより、紫外線などによって誘発された突然変異によるＤＮＡ複製障害を乗り越えて、ＤＮＡ複製の継続、引いては細胞の分裂、植物の生長を行うことができる。
【００９９】
【発明の効果】
本発明のタンパク質は、植物細胞中でエラーを起こしがちな損傷乗り越え複製に関与する。したがって、本発明のタンパク質またはそれと相同な配列を植物細胞中で破壊することにより、その植物細胞中での変異の蓄積を抑制することができる。一方で、本発明のタンパク質またはそれと相同な配列を植物細胞中に導入することにより、その植物細胞中での損傷乗り越え複製を促進することができ、結果として細胞の分裂速度を上昇させ、植物体の生長を促進することができる。
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、明条件下または暗条件下での野生型幼苗およびｓｕｖ１幼苗のＵＶ−Ｂ感受性を示す：
【図２】図２は、野生型およびｓｕｖ１変異体における２種類の主要なタイプのＵＶ損傷の修復活性を示す。
【図３】図３は、ｓｕｖ１とＬｅｒとの交配に由来するＦ２植物における、組換え率から得られる第１染色体の下部の部分的染色体地図を示す。
【図４】図４は、ｓｕｖ１における染色体再配列の概観（上）；イオンビーム照射による、予想される染色体再編成（中央）；ｓｕｖ１変異体における染色体および遺伝子構造（下）をそれぞれ示す。
【図５】図５は、Ｔ−ＤＮＡ挿入により得られたｒｅｖ３−１変異体のＵＶ−Ｂ感受性を示す。
【図６】図６は、ＲＥＶ３タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図７】図７は、ＡｔＲＥＶ３遺伝子の発現パターンを示す。
【図８】図８は、野生型（Ａ−Ｄ）およびｓｕｖ１（Ｅ−Ｈ）の根冠細胞におけるＢｒｄＵ取り込みを示す。
【図９】図９は、野生型、ｓｕｖ１およびｒｅｖ３−１幼苗のＤＮＡ損傷性薬剤に対する反応性を示す。
【図１０】図１０は、親株（＃６９９、＃７４７）および＃７４７×ｓｕｖ１−３及び＃６９９×ｓｕｖ１−４に導入されたＧＵＳ遺伝子のコピー数および挿入位置のサザンブロッティング解析を示す。
【図１１】図１１は、ＧＵＳ遺伝子の復帰突然変異による青いスポットの検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月25日(2003.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005006548.tif 000064
【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
2005006548.tif 000067
【図８】
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【図９】
2005006548.tif 000069
【図１０】
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【図１１】
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