(57)【要約】【課題】本発明は、モノリスシリカ内に修飾したい試薬を浸透させ、官能基間の吸着作用によりシリカ表面を修飾させることを目的とする。【解決手段】ジメチルエチレンジアミンとオクタデシルイソシアネートをトルエン溶媒中で60℃で反応させ、疎水基を持ったジメチルエチレンジアミンを合成した。合成された試薬0.05gを50ｍLメタノール−水（75/25、v/v）に室温にて溶解させた。溶解させた固定相試薬をモノリス型シリカに室温で流速0.05mL/minで15時間以上通液した。【選択図】    図１
2005194155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）モノリス型シリカを準備する工程
（ｂ）官能基を持った固定相試薬を溶媒に溶解させる工程
（ｃ）溶解させた固定相試薬をモノリス型シリカに吸着相互作用により固定させる工程
とからなるモノリス型シリカの表面修飾法。
【請求項２】
工程（ａ）が、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造してなる請求項１記載のモノリス型シリカの表面修飾法。
【請求項３】
官能基がイオン交換基、キラル分離基である請求項１記載のモノリス型シリカの表面修飾法。
【請求項４】
試薬の固定化を通液法またはバッチ法で行うことを特徴とする請求項１記載のモノリス型シリカの表面修飾法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相分離を利用したゾル−ゲル法によって調整される多孔質連続体（モノリス型）シリカの表面修飾に関する。修飾される官能基は、例えばイオン交換基、キラル分離基などであり、その修飾方法は従来の化学結合ではなく、吸着相互作用に限定される。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィーにおいて、通常粒子充填シリカを使用したシステムでは流速が大きくなるにつれてシリカ負荷圧が大きくなり、また分離性能は低下していく。そのため、充填シリカのもつ性能を最大限に発揮するために、最適流速で測定され、検出器、データプロセッサーなどを含むハードシステムに求められる性能も調整されている。
高速液体クロマトグラフィーは広範囲にわたる分野において支持されている分析手段の一つである。現在、クロマトグラフィーにおいて多種にわたる溶質を一度に分離することは困難を要し、また短時間で溶質を分離することも難しいとされ、これらを克服するための研究が数多くなされている。高速液体クロマトグラフィーにおいて溶質分離の媒体となるのはシリカであり、通常無機あるいは有機物質からなる粒子が充填されている。このような粒子充填シリカにおいては、シリカの性能を最大限に発揮できる最適流速が存在するが、高速分離を試み試料流速を大きくすると、シリカ負荷圧が大きくなり、分離性能は低下する。
ここで、高速分離に対応するため、充填に頼らない、いわゆるモノリス型シリカが提案されている（特許文献１）。このシリカは、ゾル−ゲル法多孔質ガラスの製法を用い、マクロな貫通孔と貫通孔の内壁面に形成された細孔とを有する二重構造のシリカである。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−２６５５３４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のモノリス型シリカでは、シリカ表面にイオン交換基、キラル分離基を修飾するには化学結合によっていた。しかし、シリカ表面の官能基と反応させるためには、高温あるいは高圧条件が必要であった。
本発明では、修飾される官能基は、例えばイオン交換基、キラル分離基などであり、その修飾方法は従来の化学結合ではなく、吸着相互作用に限定される。
吸着相互作用とは、化学的変化を起こさない相互作用であり、例えば、疎水性相互作用、水素結合、分散力、双極子相互作用、静電引力などが挙げられる。これらの相互作用は、シリカ表面あるいはシリカ表面に化学結合された官能基と、修飾したい試薬の持つ官能基の間で発揮されるものである。例えば、疎水性相互作用は、シリカ表面に化学結合された疎水基と、修飾試薬の疎水基との間の相互作用であり、具体的には、シリカ表面に化学結合されたオクタデシル基と、イオン交換基であるジメチルエチレンジアミンにオクタデシルイソシタネートを反応させた修飾試薬のオクタデシル基との相互作用により、修飾される。また、水素結合による相互作用の例としては、シラノール基とキラル分離試薬であるR-(-)-N-(3,5-ジニトルベンゾイル)-α-フェニルグリシンのニトロ基との間の相互作用により修飾される。
本発明によると、モノリスシリカ内に修飾したい試薬が浸透すれば、官能基間の吸着相互作用により修飾させるため、室温付近で簡便に行うことができる。さらに本発明によれば、固定相試薬を洗浄し簡単に再生することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、次の工程からなるモノリス型シリカの表面修飾法である。
モノリス型シリカを準備する工程
官能基を持った固定相試薬を溶媒に溶解させる工程
溶解させた固定相試薬をモノリス型シリカに吸着相互作用により固定させる工程
【０００６】
ここで、官能基は、イオン交換基、キラル分離基である。
イオン交換基としては、-ＳＯ3Ｈ、-ＣＯＯＨ、-ＰＯ（ＯＨ）2、-Ｎ（ＣＨ3）3Ｃｌ、-ＮＨ2、-ＮＨＲ、-ＮＲ2などを挙げることができる。
結合させる疎水基としては、アルキル基、フェニル基などの炭化水素基を挙げることができる。具体的には、例えばオクタデシルシリル化剤、トリメチルシリル化剤を挙げることができ、オクタデシルシリル化剤としては、例えばオクタデシルジメチル−Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノシラン、トリメチルシリル化剤としては、例えば、1,1,1,3,3,3‐ヘキサメチルジシラザンなどを用いることができる。
キラル分離基を持った試薬としては、例えば、２-アミノ-1-（３クロロフェニル）エタノール、２-クロロマンデル酸、d-トリプトファン、５クロル-２ペンタノ−ル、２-オキシルアニルアセテート、2-オキシルアニルアニソール、1,3-ブタンジオール、1,2-プロパンジオール、４クロロ-３ハイドロキシブタノエート、２クロロ-４ハイドロキシブタノエート、2-ハイドロキシ-4-フェニルブチル酸などを挙げることができるが、これらに限定されない。
固定相試薬を溶解させる溶媒は、試薬を溶解させることができれば特に限定されず、例えば、水、メタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ピリジンなどを用いることができる。
溶媒の濃度は、特に限定されず、例えば、1μmol〜1molが好ましい。
また、溶解温度は、室温、加温いずれでもよい。好ましくは、20〜80℃である。
【０００７】
試薬の固定化は、通液法、バッチ法、いずれでもよく、通液法の場合は、流速0.01〜1mL/min、好ましくは0.05〜0.1mL/minで流通させる。バッチ法の場合は、該当溶液の中に12時間以上浸漬させる。温度は、通液法、バッチ法いずれの場合も、20〜80℃、好ましくは室温付近で行う。
【０００８】
モノリス型シリカは、相分離を利用したゾル―ゲル法によって調製することが好ましく、このシリカは高速・高分離性能を示す。また、モノリス型シリカは高流速での送液を可能にしているため、短時間で化合物の分離を達成できるという利点を持っている。このモノリス型シリカを多次元クロマトグラフィーに用いることによって多種の溶質を短時間に分離することが可能となる。
【０００９】
本発明におけるモノリス型シリカは、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜50nmのメソ孔が存在する。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【００１０】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【００１１】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１２】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１３】
相分離・ゲル化にあたっては、板状部材の溝内に溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１４】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１５】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溝内において、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００１６】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００１７】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００１８】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００１９】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって、溝内において、管壁に密着した乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【００２０】
なお、モノリス型シリカのサイズは、内径２mm〜５mm、長さ２cm〜１５cmが好ましい。
さらに、モノリス型カラムの作成にハイブリッドのゲルを使うことによって、アルカリ性の試薬にも対応できる。
ハイブリッドカラムは、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物と、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解・重合して反応溶液系のゲル化を行った後、ゲル中の不要物質を除去し、加熱することにより作成できる。
ここで、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物の容量が、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物の容量の１／１０以上であることが好ましい。
また、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物として、例えばメチルトリメトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、γーグリキシドキシプロピルトリメトキシシラン、γーグリキシドキシプロピルトリエトキシシラン、βー（３，４エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、Nーβ（アミノエチル）γーアミノプロピルトリメトキシシラン、Nーβ（アミノエチル）γーアミノプロピルトリエトキシシラン、γーメタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γーアミノプロピルトリエトキシシラン、γーアミノプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランを用いることができる。
【００２１】
例えば、試薬の固定化を疎水性相互作用で行う場合、モノリス型シリカ表面上に疎水基を化学結合しておき、固定化したい試薬にも疎水基を結合し、両者の疎水性を利用してシリカ表面上の疎水基に疎水性相互作用により結合させることができる。結合させる疎水基としては、アルキル基、フェニル基などの炭化水素基を挙げることができる。具体的には、例えばオクタデシルシリル化剤、トリメチルシリル化剤を挙げることができ、オクタデシルシリル化剤としては、例えばオクタデシルジメチル−Ｎ,Ｎ−ジエチルアミノシラン、トリメチルシリル化剤としては、例えば、1,1,1,3,3,3‐ヘキサメチルジシラザンなどを用いることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、低圧・高分離能というモノリス型シリカの特徴を損なわず、さまざまな表面修飾が可能である。通液法による固定化の場合には、操作が簡単である。
また、疎水基を持った固定相試薬であれば、さまざまな分離能を持った試薬に適応可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
実験例1（疎水性相互作用の例1）
モノリス型シリカに化学結合によって疎水基が修飾された表面へのイオン交換基の修飾方法を次に説明する。
（1）モノリス型シリカの作製
０．０１モル濃度酢酸水溶液１０ｍｌに、ポリエチレングリコール０．７ｇ、尿素０．５ｇを溶解し、これにテトラメトキシシラン５ｍｌを撹拌下で加えて加水分解・重縮合反応を行った。得られた均一溶液を密閉容器中40℃で静置してゲル化させた。こののち密閉状態のまま120℃で２時間熟成し、続いて60℃で乾燥、最終的に600℃で2時間熱処理することにより、マイクロメートル領域に狭い細孔径分布を示すモノリス型シリカを得た。
モノリス型シリカ表面への疎水基の結合は、オクタデシルジエチルアミンとシリカ表面のシラノール基を、トルエン溶媒中で60℃で反応させ、シラノール基にオクタデシル基を化学結合させた。
（２）固定相試薬の準備
ジメチルエチレンジアミンとオクタデシルイソシアネートをトルエン溶媒中で60℃で反応させ、疎水基を持ったジメチルエチレンジアミンを合成した。合成された試薬0.05gを50ｍLメタノール−水（75/25、v/v）に室温にて溶解させた。
（３）通液
溶解させた固定相試薬をモノリス型シリカに室温で流速0.05mL/minで15時間以上通液した。通液後、AMPおよびATPを分析したクロマトグラムを図1に示す。なお、分析条件は次の通りである。
移動相：100mM KH2PO4
カラム長さ：100mm×4.6mmID
検出器：紫外可視吸光度計（UV260nm）
図1(a)は本発明のカラムによる分析結果、図1(b)はODSカラムによる分析結果である。
【００２４】
実験例2（疎水性相互作用の例2）
モノリスシリカに化学結合によって疎水基が修飾された表面へのキラル分離基の修飾方法を示す。
モノリス型シリカは実験例１と同様のものを用いた。
（１）固定相試薬の準備
N,S-ジオクチル-(D)-ペニシルアミン0.05gをメタノール-水（50/50、v/v）50mLに室温で溶解した。
（２）通液
溶解させた固定相試薬をモノリス型シリカに室温で流速0.05mL/minで15時間以上通液した。通液後、D,L-フェニルアラニン、D,L-ロイシンを分析したクロマトグラムを図２に示す。なお、分析条件は次の通りである。
移動相：2mM硫酸銅-水-メタノール(70:30)
カラム長さ：370mm×0.2mmID
検出器：紫外可視吸光度計（UV254nm）
図2(a)はD,L-フェニルアラニンの分析結果、図2(b)はD,L-ロイシンの分析結果、図2(c)は線速度を早くしたときのD,L-ロイシンの分析結果である。
【００２５】
実験例３（水素結合の例）
モノリスシリカのシラノールへのキラル分離試薬の修飾方法を示す。
（１）固定相試薬の準備
R-(-)-N-(3,5-ジニトルベンゾイル)-α-フェニルグリシン1gをテトラヒドロフラン20mLに室温で溶解した。
（２）通液
溶解させた固定相試薬をモノリス型カラムに室温で流速0.05mL/minで15時間以上通液した。通液後、2,2,2-トリフルオロ-1-(9-アントリル)エタノールを分離した。
移動相：ヘキサン-イソプロピルアルコール（98:2）
カラム長さ：100mm×4.6mmID
検出器：紫外可視吸光度計（UV254nm）
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の方法により作製されたカラムは、液体クロマトグラフカラムなどに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のカラム（疎水性相互作用の例１）による分析結果を示す図
【図２】本発明のカラム（疎水性相互作用の例２）による分析結果を示す図
【図１】
2005194155.tif 000003
【図２】
2005194155.tif 000004