(57)【要約】      （修正有）【課題】肺癌患者の５年生存率を判定するために使用される遺伝子発現の各品方法ならびに該方法におけるＤＮＡプローブキットの使用を提供する。【解決手段】肺非小細胞癌患者の生存率の判定に利用される、例えば、ＷＥＥ１（Ｈｓ．２４９４４１）、ＭＹＣ（Ｈｓ．２０２４５３）、ＴＩＴＦ１（Ｈｓ．１９７７６４）、ＦＯＳＬ１（Ｈｓ．２８３５６５）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈｓ．４４６６７６）、ＳＳＢＰ１（Ｈｓ．９２３）、ＳＦＴＰＣ（Ｈｓ．１０７４）、ＴＨＢＤ（Ｈｓ．２０３０）、ＮＩＣＥ−４（Ｈｓ．８１２７）、ＰＴＮ（Ｈｓ．４４）、ＳＮＲＢＰ（Ｈｓ．８３７５３）、ＣＴＮＮＤ１（Ｈｓ．１６６０１１）、ＮＡＰ１Ｌ１（Ｈｓ．４１９７７６）、ＣＣＴ３（Ｈｓ．１７０８）、ＤＳＣ２（Ｈｓ．９５６１２）などから選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を肺非小細胞癌患者から摘出された肺癌組織において確認する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺非小細胞癌患者の生存率の判定に利用される、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＴＩＴＦ１（Ｔ６０１６８）、ＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＰＴＮ（ＡＡ００１４４９）、ＳＮＲＰＢ（ＡＡ５９９１１６）、ＮＡＰ１Ｌ１（Ｒ９３８２９）、ＣＴＮＮＤ１（ＡＡ０２４６５６）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＳＰＲＲ１Ｂ （ＡＡ４４７８３５）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＡＲＣＮ１（ＡＡ５９８４０１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＡＡ４８６２７５）、ＥＳＴ断片（Ｎ７３２０１）、ＡＣＴＲ３（Ｎ３４９７４）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＩＳＬＲ（Ｈ６２３８７）、ＡＮＸＡ１（Ｈ６３０７７）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、 ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）及びＰＳＭＡ５（ＡＡ５９８８１５）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を肺非小細胞癌患者から摘出された肺癌組織において確認する方法。
【請求項２】
肺扁平上皮癌患者の生存率の判定に利用される、ＦＬＪ２０６１９（Ｒ７４４８０）、ＳＰＣ１２（Ｒ１９１８３）、 ＥＳＴ断片（Ｒ９６３５８）、ＫＲＴ５（ＡＡ１６０５０７）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＬＯＣ３３９３２４（Ｗ２３５２２）、ＭＹＳＴ４（ＡＡ０５７３１３）、ＳＰＡＲＣＬ１（ＡＡ４９０６９４）、 ＩＧＪ（Ｔ７００５７）、ＥＩＦ４Ａ２（Ｈ０５９１９）、ＥＳＴ断片（ＡＡ１１５１２１）、ＩＤ２（Ｈ８２７０６）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＭＧＣ１５４７６（Ｗ７２５２５）、 ＺＦＰ（Ｈ５３４９９）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＺＹＧ（ＡＡ４５３２８９）、ＣＡＣＮＡ１Ｉ （Ｎ５２７６５）、ＦＬＪ４６２３（Ｎ７１４７３）、ＣＳＴＢ（Ｈ２２９１９）、ＥＰＢ４１Ｌ１（Ｒ７１６８９）、ＭＧＣ４５４９（ＡＡ４５５２６７）、ＥＳＴ断片（Ｔ６４８７８）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＥＳＴ断片（Ｈ７９００７）、ＥＳＴ断片（Ｗ８４７７６）、ＩＦＩ３０（ＡＡ６３０８００）、ＥＳＴ断片（Ｔ８１１５５）及びＩＬ１ＲＮ（Ｔ７２８７７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を該患者から摘出された肺癌組織において確認する方法。
【請求項３】
肺非扁平上皮癌患者の生存率の判定に利用される、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＷＦＤＣ２（ＡＡ４５１９０４）、ＡＣＴＡ２（ＡＡ６３４００６）、Ｇ２２Ｐ１（ＡＡ４８６３１１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＰＨＢ（Ｒ６０９４６）、ＤＲＰＬＡ（Ｈ０８６４２）、ＳＮＲＢＰ（ＡＡ５９９１１６）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＡＣＴＲ１Ａ（Ｒ４０８５０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＲＡＤ２３Ｂ（ＡＡ４８９６７８）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＬＡＭＰ１（Ｈ２９０７７）、ＩＲＡＫ１（ＡＡ６８３５５０）、ＢＩＲＣ２（Ｒ１９６２８）、ＬＭＡＮ１（Ｈ７３４２０）、ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）、ＴＭＳＢ４Ｘ（ＡＡ６３４１０３）、ＥＥＦ１Ｇ（Ｒ４３９７３）、ＥＳＴ断片（Ｈ０５８２０）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＯＤ１（Ｒ５２５４８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＫＲＴ２５Ａ（Ｗ７３６３４）及びＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を該患者から摘出された肺癌組織において確認する方法。
【請求項４】
ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＴＩＴＦ１（Ｔ６０１６８）、ＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＰＴＮ（ＡＡ００１４４９）、ＳＮＲＰＢ（ＡＡ５９９１１６）、ＮＡＰ１Ｌ１（Ｒ９３８２９）、ＣＴＮＮＤ１（ＡＡ０２４６５６）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＡＲＣＮ１（ＡＡ５９８４０１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＡＡ４８６２７５）、ＥＳＴ断片（Ｎ７３２０１）、ＡＣＴＲ３（Ｎ３４９７４）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＩＳＬＲ（Ｈ６２３８７）、ＡＮＸＡ１（Ｈ６３０７７）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、 ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）及びＰＳＭＡ５（ＡＡ５９８８１５）  よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸配列からなるＤＮＡプローブの、請求項１に記載の方法における使用。
【請求項５】
ＦＬＪ２０６１９（Ｒ７４４８０）、ＳＰＣ１２（Ｒ１９１８３）、 ＥＳＴ断片（Ｒ９６３５８）、ＫＲＴ５（ＡＡ１６０５０７）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＬＯＣ３３９３２４（Ｗ２３５２２）、ＭＹＳＴ４（ＡＡ０５７３１３）、ＳＰＡＲＣＬ１（ＡＡ４９０６９４）、 ＩＧＪ（Ｔ７００５７）、ＥＩＦ４Ａ２（Ｈ０５９１９）、ＥＳＴ断片（ＡＡ１１５１２１）、ＩＤ２（Ｈ８２７０６）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＭＧＣ１５４７６（Ｗ７２５２５）、 ＺＦＰ（Ｈ５３４９９）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＺＹＧ（ＡＡ４５３２８９）、ＣＡＣＮＡ１Ｉ （Ｎ５２７６５）、ＦＬＪ４６２３（Ｎ７１４７３）、ＣＳＴＢ（Ｈ２２９１９）、ＥＰＢ４１Ｌ１（Ｒ７１６８９）、ＭＧＣ４５４９（ＡＡ４５５２６７）、ＥＳＴ断片（Ｔ６４８７８）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＥＳＴ断片（Ｈ７９００７）、ＥＳＴ断片（Ｗ８４７７６）、ＩＦＩ３０（ＡＡ６３０８００）、ＥＳＴ断片（Ｔ８１１５５）及びＩＬ１ＲＮ（Ｔ７２８７７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸配列からなるＤＮＡプローブの、請求項２に記載の方法における使用。
【請求項６】
ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＷＦＤＣ２（ＡＡ４５１９０４）、ＡＣＴＡ２（ＡＡ６３４００６）、Ｇ２２Ｐ１（ＡＡ４８６３１１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＰＨＢ（Ｒ６０９４６）、ＤＲＰＬＡ（Ｈ０８６４２）、ＳＮＲＢＰ（ＡＡ５９９１１６）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＡＣＴＲ１Ａ（Ｒ４０８５０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＲＡＤ２３Ｂ（ＡＡ４８９６７８）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＬＡＭＰ１（Ｈ２９０７７）、ＩＲＡＫ１（ＡＡ６８３５５０）、ＢＩＲＣ２（Ｒ１９６２８）、ＬＭＡＮ１（Ｈ７３４２０）、ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）、ＴＭＳＢ４Ｘ（ＡＡ６３４１０３）、ＥＥＦ１Ｇ（Ｒ４３９７３）、ＥＳＴ断片（Ｈ０５８２０）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＯＤ１（Ｒ５２５４８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＫＲＴ２５Ａ（Ｗ７３６３４）及びＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸配列からなるＤＮＡプローブの、請求項３に記載の方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺がん患者の５年生存率を高い精度で予測する技術に使用するための、肺癌組織における特定の遺伝子の発現を確認する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆるがん（癌）に罹患した患者に種々の治療を施す上で、その治癒の目安として５年生存率という表し方がよく用いられる。すなわち、がんであると診断されあるいは治療を受けた後、５年経過後に生存している確率を用いて、がんの進行度（ステージ）、治療の効果等を表すものである。
【０００３】
従来は、臨床的な方法により腫瘍の大きさ（腫瘍計、Ｔで表す）、リンパ節転移の範囲（Ｎで表す）、遠隔転移の有無（Ｍで表す）の組合せからなるＴＭＮ分類が主に利用されてきた（非特許文献１）。例えば、ＴＮＭ分類でステージＩ判定された患者とは、手術によって腫瘍を摘出すれば６０％強の患者が５年間は生存できる程度の進行度にある患者であり、ステージＩＩＩと判定された患者とは、同条件下でも高々２０％しか生存できない程度の進行度にある患者であるというように判定される。
【０００４】
また、最近では、がん患者あるいはがん組織において特異的に発現している１つまたは２つの遺伝子に着目して、治療効果の高い患者とそうでない患者との間の当該遺伝子の発現の相違を調べることで、治癒効果を予測することもしばしば行われている（非特許文献２）。
【０００５】
【非特許文献１】ロバート・ギンスバーグ（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）ら著、「キャンサー  オブ  ザ  ラング（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ）」（米国）、第５版、リッピンコット−レイブン、１９９７年、ｐ．８５８〜９１０頁
【非特許文献２】堀尾（Ｈｏｒｉｏ）ら著、“キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”、１９９３年１月１日、第５４巻、１〜４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＴＮＭ分類は、多くの臨床検査の結果を集積して初めて判定可能となる手法であり、決して簡便であるとは言えず、またその精度も満足できるものではない。また、特定の遺伝子の発現を確認することで治癒効果を予測する方法については、現に肺がん患者における遺伝子発現と５年生存率との相関に関しては未だ報告がない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、特に肺がん患者の生存率の判定を正確に行うことを目的として、肺癌組織における特定の遺伝子の発現を確認するものである。
【０００８】
すなわち本発明は、肺非小細胞癌患者の生存率の判定に利用される、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＴＩＴＦ１（Ｔ６０１６８）、ＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＴＨＢＤ （Ｈ５９８６１）、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＰＴＮ（ＡＡ００１４４９）、ＳＮＲＰＢ（ＡＡ５９９１１６）、ＮＡＰ１Ｌ１（Ｒ９３８２９）、ＣＴＮＮＤ１（ＡＡ０２４６５６）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＡＲＣＮ１（ＡＡ５９８４０１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＡＡ４８６２７５）、ＥＳＴ断片（Ｎ７３２０１）、ＡＣＴＲ３（Ｎ３４９７４）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＩＳＬＲ（Ｈ６２３８７）、ＡＮＸＡ１（Ｈ６３０７７）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、 ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）及びＰＳＭＡ５（ＡＡ５９８８１５）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を肺非小細胞癌患者から摘出された肺癌組織において確認する方法に関する。
【０００９】
また、本発明は肺扁平上皮癌患者の生存率の判定に利用される、ＦＬＪ２０６１９（Ｒ７４４８０）、ＳＰＣ１２（Ｒ１９１８３）、ＥＳＴ断片（Ｒ９６３５８）、ＫＲＴ５（ＡＡ１６０５０７）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＬＯＣ３３９３２４（Ｗ２３５２２）、ＭＹＳＴ４（ＡＡ０５７３１３）、ＳＰＡＲＣＬ１（ＡＡ４９０６９４）、 ＩＧＪ（Ｔ７００５７）、ＥＩＦ４Ａ２（Ｈ０５９１９）、ＥＳＴ断片（ＡＡ１１５１２１）、ＩＤ２（Ｈ８２７０６）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＭＧＣ１５４７６（Ｗ７２５２５）、 ＺＦＰ（Ｈ５３４９９）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＺＹＧ（ＡＡ４５３２８９）、ＣＡＣＮＡ１Ｉ（Ｎ５２７６５）、ＦＬＪ４６２３（Ｎ７１４７３）、ＣＳＴＢ（Ｈ２２９１９）、ＥＰＢ４１Ｌ１（Ｒ７１６８９）、ＭＧＣ４５４９（ＡＡ４５５２６７）、ＥＳＴ断片（Ｔ６４８７８）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＥＳＴ断片（Ｈ７９００７）、ＥＳＴ断片（Ｗ８４７７６）、ＩＦＩ３０（ＡＡ６３０８００）、ＥＳＴ断片（Ｔ８１１５５）及びＩＬ１ＲＮ（Ｔ７２８７７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を該患者から摘出された肺癌組織において確認する方法を提供する。
【００１０】
さらには、本発明は肺非扁平上皮癌患者の生存率の判定に利用される、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＷＦＤＣ２（ＡＡ４５１９０４）、ＡＣＴＡ２（ＡＡ６３４００６）、Ｇ２２Ｐ１（ＡＡ４８６３１１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＰＨＢ（Ｒ６０９４６）、ＤＲＰＬＡ（Ｈ０８６４２）、ＳＮＲＢＰ（ＡＡ５９９１１６）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＡＣＴＲ１Ａ（Ｒ４０８５０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＲＡＤ２３Ｂ（ＡＡ４８９６７８）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＬＡＭＰ１（Ｈ２９０７７）、ＩＲＡＫ１（ＡＡ６８３５５０）、ＢＩＲＣ２（Ｒ１９６２８）、ＬＭＡＮ１（Ｈ７３４２０）、ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）、ＴＭＳＢ４Ｘ（ＡＡ６３４１０３）、ＥＥＦ１Ｇ（Ｒ４３９７３）、ＥＳＴ断片（Ｈ０５８２０）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＯＤ１（Ｒ５２５４８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＫＲＴ２５Ａ（Ｗ７３６３４）及びＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）よりなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子の発現強度を該患者から摘出された肺癌組織において確認する方法を提供する。
【００１１】
本発明の別態様は、上記方法において対象となる少なくとも一つの遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸配列からなるＤＮＡプローブの、上記方法における使用に関する。
【００１２】
本発明においてその発現の確認対象となる遺伝子は全て公知の遺伝子であり、それらの塩基配列は、ＮＣＢＩが提供する公的データベースの一つである「ＵｎｉＧｅｎｅ」に、略称及びＡＡ等のアルファベットと数字の組み合わせからなるアクセッション番号が付された上で登録されている。本明細書では、特許請求の範囲の記載も含め、本発明にかかる方法の確認対象となる遺伝子を全て２００３年１１月１９日時点をもって「Ｕｎｉｇｅｎｅ」に登録された略称名とアクセッション番号を用いて表すこととする。この「Ｕｎｉｇｅｎｅ」に登録された略称名とアクセッション番号による遺伝子の特定は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易にその遺伝子ならびにその具体的な塩基配列を「Ｕｎｉｇｅｎｅ」に確認させ、本発明を実施させるものとなるのは言うまでもない。同様に、本発明の方法において使用する各遺伝子に特定的なＤＮＡプローブの核酸配列も、上記データベースに登録されている核酸配列に基き、相同性検索プログラム等を用いて、各遺伝子について複数の候補配列を容易に決定することが出来る。特に本発明のプローブの核酸配列は、対応する遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができるように選択される以外には格別の制限はなく、ある一種類の具体的な核酸配列に制限あるいは限定されるものではない。また、このような操作は、今日においては当業者であれば何ら格別な創意工夫を要することなく行うことができるものである。
【００１３】
本発明者らの研究により、非小細胞肺癌と診断され、あるいは治療を受けた後の５年以内に死亡した患者と５年以上生存した患者とのそれぞれの肺癌組織において、特徴的に発現している遺伝子を探索した結果、５年以内の生存率と遺伝子の発現パターンに特異的な傾向が存在することが見出いだされた。
【００１４】
術後あるいは診断後５年以内に死亡した患者群と生存した患者群それぞれの癌組織において、一方の群で他方の群に対して特異的に発現量が高まりあるいは低くなっている遺伝子に着目して、両群を効率的に区別する予測的遺伝子を、シグナル−ノイズ関数（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｍｅｔｒｉｃｓ、Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２８６，  ｐｐ５３１  ｔｏ５３７，  １９９９））を用いて選択した。要すれば、生存した患者と死亡した患者をｃｌａｓｓ０またはｃｌａｓｓ１とそれぞれ規定した場合、遺伝子ｘに対するシグナル−ノイズ統計値（Ｓｘ）は次式の様に計算される。
【００１５】
Ｓｘ＝（μｃｌａｓｓ０−μｃｌａｓｓ１／δｃｌａｓｓ０＋δｃｌａｓｓ１）
各遺伝子について、μｃｌａｓｓ０はｃｌａｓｓ０（生存患者群）に属する患者の全発現強度データの平均値を示し、δｃｌａｓｓ０はｃｌａｓｓ０（生存患者群）に属する患者の全発現強度データの標準偏差を示す。この様にして算出したＳｘの絶対値を用いて、上位にランクされる、すなわち生存患者群と死亡者群で発現強度の差異が大きい遺伝子を選択した。
各癌種に特異的なマーカー遺伝子の統計的な意義を検定するために、解析に用いた各患者のサンプルレベル（生存または死亡）を遺伝子の発現強度データセットとともにランダムにラベル化した後、各遺伝子について、ランダム化後のラベルに従いシグナル−ノイズ値（Ｓｘ値）を再計算した。この手法を１０，０００回繰り返し、ラベルをランダム化した場合のＳｘ値のほうが、実際のＳｘ値に比べて良好である度合いに基いて、個々の遺伝子にＰ値を割り当てた。
【００１６】
この様にして、各肺癌患者の癌組織で発現している遺伝子の中から、該患者の生存率に有意に関係していると判断される遺伝子、すなわち予測的遺伝子を探索したところ、下記のごとき関係が明らかとなった。
【００１７】
すなわち、非小細胞肺癌と診断されあるいは治療を受けた後に５年以内で死亡した患者の肺癌組織の多くで、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＰＴＮ（ＡＡ００１４４９）、ＳＮＲＰＢ（ＡＡ５９９１１６）、ＮＡＰ１Ｌ１（Ｒ９３８２９）、ＣＴＮＮＤ１（ＡＡ０２４６５６）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＡＲＣＮ１（ＡＡ５９８４０１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＡＡ４８６２７５）、ＡＣＴＲ３（Ｎ３４９７４）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＩＳＬＲ（Ｈ６２３８７）、ＡＮＸＡ１（Ｈ６３０７７）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）及びＰＳＭＡ５（ＡＡ５９８８１５）の発現がいずれも有意に高く、一方、ＴＩＴＦ１（Ｔ６０１６８）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）及びＥＳＴ断片（Ｎ７３２０１）の各遺伝子は有意に発現が低下しているという発現パターンが認められた。以下、上記遺伝子からなる群を遺伝子群１と称する。
【００１８】
従って、非小細胞肺癌と診断された肺癌患者の癌組織から全ＲＮＡを抽出し、遺伝子群１に属する一つまたはそれ以上の遺伝子の発現の強弱を確認することで、その患者の５年生存率、すなわち５年以内に「死亡」するかあるいは５年以上「生存」するかを予測することが可能となる。
【００１９】
例えば、遺伝子としてＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１、ｆａｔａｌ）を選択し、この遺伝子の発現の強弱を確認した結果を基に５年生存率を予測した場合には、６４％の確度を期待することができる。また、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１、ｆａｔａｌ）に加えてＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０、ｆａｔａｌ）あるいはＡＣＴＲ３（Ｎ３４９７４、ｆａｔａｌ）の発現の強弱を確認した結果を基にした場合には、それぞれ６６％、７４％、遺伝子群１を構成する全ての遺伝子についての結果を考慮した場合の確度は８２％となる。これらの結果の信頼性は、従来の方法に比して高いものである。
【００２０】
非小細胞肺癌は、更に扁平上皮癌（ＳＱ）と非扁平上皮癌（ｎｏｎ−ＳＱ）に分類されるが、遺伝子群１は肺癌細胞の種類をより細かく分類せずに５年生存率を判定する際に選択される遺伝子群として有用である。
【００２１】
一方、本発明者らは、扁平上皮癌（ＳＱ）と非扁平上皮癌（ｎｏｎ−ＳＱ）それぞれについて遺伝子の発現の強弱を確認した結果、遺伝子群１とは別の遺伝子群を対象とすることで、より確実に５年生存率の判定が行い得ることを明らかにした。
【００２２】
すなわち、扁平上皮癌と診断されあるいは治療を受けた後に５年以内で死亡した患者の肺癌組織の多くで、ＫＲＴ５（ＡＡ１６０５０７）、ＰＴＰ４Ａ３（ＡＡ０３９８５１）、ＳＰＲＲ１Ｂ（ＡＡ４４７８３５）、ＭＹＳＴ４（ＡＡ０５７３１３）、ＳＰＡＲＣＬ１（ＡＡ４９０６９４）、 ＩＧＪ（Ｔ７００５７）、ＥＳＴ断片（ＡＡ１１５１２１）、ＩＤ２（Ｈ８２７０６）、ＴＨＢＤ（Ｈ５９８６１）、ＭＧＣ１５４７６（Ｗ７２５２５）、ＣＯＰＢ（ＡＡ５９８８６８）、ＺＹＧ（ＡＡ４５３２８９）、ＣＡＣＮＡ１Ｉ （Ｎ５２７６５）、ＣＳＴＢ（Ｈ２２９１９）、ＥＰＢ４１Ｌ１（Ｒ７１６８９）、ＭＧＣ４５４９（ＡＡ４５５２６７）、ＤＳＣ２（ＡＡ０７４６７７）、ＩＦＩ３０（ＡＡ６３０８００）、ＥＳＴ断片（Ｔ８１１５５）及びＩＬ１ＲＮ（Ｔ７２８７７）の発現がいずれも有意に高く、一方、ＦＬＪ２０６１９（Ｒ７４４８０）、ＳＰＣ１２（Ｒ１９１８３）、 ＥＳＴ断片（Ｒ９６３５８）、ＬＯＣ３３９３２４（Ｗ２３５２２）、ＥＩＦ４Ａ２（Ｈ０５９１９）、ＺＦＰ（Ｈ５３４９９）、ＦＬＪ４６２３（Ｎ７１４７３）、ＥＳＴ断片（Ｔ６４８７８）、ＥＳＴ断片（Ｈ７９００７）及びＥＳＴ断片（Ｗ８４７７６）の各遺伝子は有意に発現が低下しているという発現パターンが認められた。以下、上記遺伝子からなる群を遺伝子群２と称する。
【００２３】
従って、扁平上皮癌と診断された肺癌患者の癌組織から全ＲＮＡを抽出し、遺伝子群２に属する一つまたはそれ以上の遺伝子の発現の強弱を確認することで、その患者の５年生存率、すなわち５年以内に「死亡」するかあるいは５年以上「生存」するかを予測することが可能となる。
【００２４】
例えば、遺伝子としてＣＡＣＮＡ１Ｉ（Ｎ５２７６５、ｆａｔａｌ）を選択し、この遺伝子の発現の強弱を確認した結果を基に５年生存率を予測した場合には、８１％の確度を期待することができる。また、ＣＡＣＮＡ１Ｉ（Ｎ５２７６５、ｆａｔａｌ）に加えてＦＬＪ２０６１９（Ｒ７４４８０、ｆａｖｏｒａｂｌｅ）の発現の強弱を確認した結果を基にした場合は、それぞれ７５％、８１％、遺伝子群２を構成する全ての遺伝子についての結果を考慮した場合の確度は１００％となる。
【００２５】
また、非扁平上皮癌と診断されあるいは治療を受けた後に５年以内で死亡した患者の肺癌組織の多くで、ＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４）、ＷＥＥ１（ＡＡ０３９６４０）、ＳＳＢＰ１（Ｒ０５６９３）、Ｇ２２Ｐ１（ＡＡ４８６３１１）、ＭＳＴ１（Ｔ４７８１３）、ＰＨＢ（Ｒ６０９４６）、ＤＲＰＬＡ（Ｈ０８６４２）、ＳＮＲＢＰ（ＡＡ５９９１１６）、ＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３）、ＡＣＴＲ１Ａ（Ｒ４０８５０）、ＭＹＣ（ＡＡ４６４６００）、ＲＡＤ２３Ｂ（ＡＡ４８９６７８）、ＣＣＴ３（Ｒ６０９３３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（Ｎ７５７１９）、ＢＩＲＣ２（Ｒ１９６２８）、ＬＭＡＮ１（Ｈ７３４２０）、ＨＳＰＥ１（ＡＡ４４８３９６）、ＥＥＦ１Ｇ（Ｒ４３９７３）、ＥＳＴ断片（Ｈ０５８２０）、ＬＹＰＬＡ１（Ｈ００８１７）、ＳＯＤ１（Ｒ５２５４８）、ＡＲＧ１（ＡＡ４５３６７３）、ＫＲＴ２５Ａ（Ｗ７３６３４）及びＦＯＳＬ１（Ｔ８２８１７）の発現がいずれも有意に高く、一方、ＷＦＤＣ２（ＡＡ４５１９０４）、ＡＣＴＡ２（ＡＡ６３４００６）、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１）、ＬＡＭＰ１（Ｈ２９０７７）、ＩＲＡＫ１（ＡＡ６８３５５０）及びＴＭＳＢ４Ｘ（ＡＡ６３４１０３）の各遺伝子は有意に発現が低下しているという発現パターンが認められた。以下、上記遺伝子からなる群を遺伝子群３と称する。
【００２６】
従って、非扁平上皮癌と診断された肺癌患者の癌組織から全ＲＮＡを抽出し、遺伝子群３に属する一つまたはそれ以上の遺伝子の発現の強弱を確認することで、その患者の５年生存率、すなわち５年以内に「死亡」するかあるいは５年以上「生存」するかを予測することが可能となる。
【００２７】
例えば、遺伝子としてＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１、ｆａｖｏｒａｂｌｅ）を選択し、この遺伝子の発現の強弱を確認した結果を基に５年生存率を予測した場合には、５６％の確度を期待することができる。また、ＳＦＴＰＣ（ＡＡ４８７５７１、ｆａｖｏｒａｂｌｅ）に加えてＮＩＣＥ−４（ＡＡ０５４９５４、ｆａｔａｌ）あるいはＧＪＡ１（ＡＡ４８７６２３、ｆａｔａｌ）の発現の強弱を確認した結果を同時に考慮した場合には、それぞれ７９％、７６％、遺伝子群３を構成する全ての遺伝子についての結果を考慮した場合の確度は９１％となる。
【００２８】
この様に、本発明では各遺伝子群よりひとつの遺伝子を任意に選んで使用することが可能であるが、好ましくは２またはそれ以上、更に好ましくは各遺伝子群に属する遺伝子をそれぞれ全て対象として行うことが好ましい。
【００２９】
さらに本発明は、ある新規の患者の癌組織から得られる試料γについて、上記の相関関係に基いて、その患者の生存あるいは死亡を判定するための情報を提供するものである。
【００３０】
新たな肺癌患者（テスト資料γ）について、５年後の生死を判定するためには、予測的遺伝子セットに含まれる各遺伝子ｘの発現強度をＧｘγとして、予測的遺伝子セットに含まれる各遺伝子について、Ｖｘ＝Ｓｘ（Ｇｘγ−ｂｘ）を計算すればよい（ここで、Ｓｘは前述のシグナル−ノイズ統計値、ｂｘはｂｘ＝（μｃｌａｓｓ０＋μｃｌａｓｓ１）／２で算出される）。予測遺伝子セットに含まれる遺伝子について、Ｖｘの総和（ΣＶｘ）を算出したときに値がプラス（＋）であれば「生存」、マイナス（−）であれば死亡として判断する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の方法を使用することで、肺癌患者の５年生存率を精度よく予測することができる。従って、本発明によれば、各型の肺癌患者の癌組織で特定の遺伝子群が発現しているかを確認することで、その肺癌患者がさらに５年以上生存することができるかを、高い確度をもって予見することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明において特定された遺伝子群に属する各遺伝子の発現強度は、それぞれの塩基配列毎に特定のプローブを用意し、ＰＣＲあるいはハイブリダイゼーションを行うことで確認することができる。各遺伝子の塩基配列は、データベースである「Ｕｎｉｇｅｎｅ」から容易に確認することが出来、またそれぞれに特異的にハイブリダイズするプローブの設計、合成、ハイブリダイゼーションの諸条件等は、当業者により適当に定めることができ、特別の創意工夫を要しない。
【００３３】
このプローブは、各遺伝子についてＰＣＲ反応が可能となるような一組のプローブすなわちＰＣＲプライマーとして合成することができ、当該プライマーを用いたＰＣＲ反応により、発現強度を確認しても良い。
【００３４】
本発明の実施にあたっては、いわゆるマイクロアレイを用いた発現遺伝子の確認法の利用が好ましい。マイクロアレイには、ガラス基板上にプローブＤＮＡがスポットされたもの、メンブレン上にプローブＤＮＡがスポットされたもの。ビーズ表面にプローブＤＮＡがスポットされたもの、あるいはガラス基板上で直接プローブを合成したものなどが開発されている。メンブレンアレイの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されているメンブレンマイクロアレイ（商品名Ｇｅｎｅｆｉｌｔｅｒｓ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、カタログＮｏ．ＧＦ２００またはＧＦ２０１）が挙げられる。このメンブレンマイクロアレイは、８６４４の独立した遺伝子に相当する全１１１６８ものプローブＤＮＡのスポットを含んでおり、それぞれのプローブの配列は、各配列に近似した遺伝子が存在しても、その発現を誤って検出するといういわゆるクロスハイブリダイゼーションが起きないことを、Ｂｌａｓｔサーチによって確認されたものである。
【００３５】
本発明で利用可能なマイクロアレイとしては、上記のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されているメンブレンマイクロアレイの他にＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社、Ａｇｉｌｅｎｔ社などから販売されるｃＤＮＡあるいはオリゴアレイを挙げることができる。
【００３６】
本発明では、肺癌患者から開胸手術の際あるいは内視鏡等の利用によるバイオプシーにより摘出した癌組織を直ちに凍結して切片化し、当該切片の中で癌細胞が豊富な部分を小さくくり抜いて得た組織切片から常法に従ってＲＮＡを抽出し、このＲＮＡに対して逆転写酵素を作用させることで該組織中に発現しているｍＲＮＡを全てｃＤＮＡに変換させて使用することが望ましい。この場合、目的とする遺伝子群は、逆転写酵素反応によるｃＤＮＡの調製の際に３３Ｐなどの適当な放射性同位元素やＣｙ３またはＣｙ５などの蛍光色素を利用して、ｃＤＮＡにラベルを加えることができる。
【００３７】
本発明は、各遺伝子群に含まれる遺伝子の塩基配列情報に基いて各遺伝子に特異的なオリゴＤＮＡを利用して、ハイブリダイゼーションあるいはリアルタイムＰＣＲ反応などにより、検出対象となる遺伝子の発現の強度を確認し実施することができる。逆転写酵素と適当なラベル物質とを用いて調製したｃＤＮＡとマイクロアレイとを組み合わせることで、より簡便に検出対象の遺伝子群の発現を確認することが好ましい。
【００３８】
ラベルを付したｃＤＮＡとマイクロアレイとを適当な条件下でハイブリダイズさせ、後にラベルを指標として遺伝子の発現及びその発現量を確認することで、本発明が対象とする遺伝子群の発現強度を簡便に確認することができる。発現強度の確認は、ラベル物質によるシグナル強度を適当な方法で定量化することを通じて行う。
【００３９】
例えば放射性ラベルを利用した場合には、富士写真フイルム社イメージングプレートに対して露光させたのち、同社製バイオイメージングアナライザーＢＡＳ５０００を用いて走査及び画像化するとともに、ハイブリしたアレイの画像を同社製Ｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓで加工、同社製解析ソフトＡｒｒａｙ  Ｇａｕｇｅを用いることで、シグナル強度を定量化することができる。その他、放射性ラベル強度の定量化はアマシャム社製フォフフォイメジャーを用いることも出来、また蛍光ラベルの場合にはアジレント社製マイクロアレイリーダーなども利用することができる。
【００４０】
この様にして得られたラベル強度のデータを、例えばＴｓｅｎｇらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  ２９，  ｐｐ．２５４９  ｔｏ  ２５５７）により、個々のハイブリダイゼーション強度に関するデータへと変換する。その後、標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）ならびに個々の遺伝子に関する散布図（ｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔｓ）の作成等を経て発現の再現性を評価した上で、目的とする遺伝子の発現量が有意に増加あるいは減少しているかを評価すればよい。
【００４１】
以下、非限定的な実施例を挙げて本発明を更に詳述する。
【実施例】
【００４２】
＜実施例１＞
以下の実施例において、特に明記しない限り、市販のキットを用いた操作は全てキットの推奨する条件の下で行った。
【００４３】
１）肺癌組織からの全ＲＮＡの抽出
３０名の腺癌、１６名の扁平肺癌及び４名の大細胞癌からなる全５０名の非小細胞肺癌患者（女性１５名、男性３５名、年齢幅４３〜７６歳、平均年齢６３歳、ステージＩ２３名、ステージＩＩ１１名、ステージＩＩＩ１６名）から摘出した癌組織（平均０．５ｇ）を、ＯＣＴ化合物に埋包して−８０℃で凍結した。５０枚の７μｍの厚みからなる凍結標品を調製した。さらに癌細胞の集中した部分を注意深く取り、平均して含有細胞の７５．４％が癌細胞である部位からＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて切片から全ＲＮＡ（平均１２μｇ）を抽出し、ＲＮＡ６００ナノアッセイキット及び２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて純度を確認した。
【００４４】
２）マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
１）で調製した全ＲＮＡ５μｇを、オリゴ−ｄＴプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１００μＣｉの［３２Ｐ］ｄＣＴＰを加えてｃＤＮＡへと変換した。０．５μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ−ｄＡ及び０．５μｇ／ｍｌのＣｏｔ−１ＤＮＡ（ともにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む１０ｍｌのＡｌｋＰｈｏｓＤＩＲＥＣＴ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）で、５１℃２時間ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をプレハイブリし、さらに変性させた放射性標識プローブｃＤＮＡで１７時間ハイブリダイズした。
【００４５】
ハイブリ後、２Ｍ  尿素、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．２％  ＡｌｋＰｈｏｓＤＩＲＥＣＴ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を含む溶液で２回洗浄し、さらに２ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液で２回、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び１５ｍＭ  ＮａＣｌを含む溶液で２回、それぞれ洗浄した。マイクロアレイをイメージングプレート（富士写真フイルム社）に対して２時間露光させたのち、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ５０００（富士写真フイルム社製）を用いて２５μｍの解像度でイメージングプレートを走査及び画像化し、ハイブリしたアレイの画像をＬ  Ｐｒｏｃｅｓｓ（富士写真フイルム社製）で加工し、解析ソフトＡｒｒａｙ  Ｇａｕｇｅ（富士写真フイルム社製）を用いてシグナル強度を定量化した。
【００４６】
３）データ処理
２）で得たシグナル強度に関するデータを個々のハイブリダイゼーション強度に関するデータへと変換した。まず、非線形曲線の設定（ｆｉｔｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）に使用される遺伝子を選択するためのＴｓｅｎｇらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  ２９，  ｐｐ．２５４９  ｔｏ  ２５５７）を採用した。標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）後、個々の遺伝子に関する５０組の複製データの散布図を作成し、複製ペアー間の発現の再現性を評価し、０．８５以上のピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を示す遺伝子を選択した。一回目のハイブリダイゼーションと二回目のハイブリダイゼーションの平均を更なる分析に使用した。加えて、少なくとも発現レベルで倍あるいは１／２倍の変化が見られない遺伝子を排除した。メジアン強度（ｍｅｄｉａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が０．３未満である遺伝子を以下に続く分析から排除した。
【００４７】
４）５年生存に関する遺伝子の抽出
術後あるいは診断後５年以内に死亡した患者（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ−ｆａｔａｌ）と生存した患者（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ−ｆａｖｏｒａｂｌｅ）とを最も効率的に区別する予測的遺伝子（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ）を、シグナル−ノイズ関数（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｍｅｔｒｉｃｓ、Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．２８６，  ｐｐ５３１  ｔｏ５３７，  １９９９））を用いて選択した。要すれば、生存した患者と死亡した患者をｃｌａｓｓ０またはｃｌａｓｓ１とそれぞれ規定した場合、シグナル−ノイズ統計値（Ｓｘ）は次式の様に計算される。
【００４８】
Ｓｘ＝（μｃｌａｓｓ０−μｃｌａｓｓ１／δｃｌａｓｓ０＋δｃｌａｓｓ１）
各遺伝子について、μｃｌａｓｓ０はｃｌａｓｓ０（生存患者群）に属する患者の全発現強度データの平均値を示し、δｃｌａｓｓ０はｃｌａｓｓ０（生存患者群）に属する患者の全発現強度データの標準偏差を示す。
【００４９】
Ｓｘの絶対値に基いて上位にランクされる遺伝子を選択した。前述の様に選択された遺伝子を用いて結果を予測するために重み付け得票分類アルゴリズム（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ−ｖｏｔｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を採用し、得られた結果識別子（ｏｕｔｃｏｍｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ）を１個抜き交差検定法（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）という手段によってテストした。このスキームにおいて、アルゴリズムは、Ｓｘを計算することの他に、個々の遺伝子に関してクラス平均：ｂｘ＝（μｃｌａｓｓ０＋μｃｌａｓｓ１）／２間のｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓを見出すために使用することもできる。
【００５０】
５）確率化検定（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）
各癌種に特異的なマーカー遺伝子の統計的な意義を検定するために、解析に用いた各患者のサンプルレベル（生存または死亡）を遺伝子の発現強度データセットとともにランダムにラベル化した後、各遺伝子について、ランダム化後のラベルに従いシグナル−ノイズ値（Ｓｘ値）を再計算した。この手法を１０，０００回繰り返し、ラベルをランダム化した場合のＳｘ値のほうが、実際のＳｘ値に比べて良好である度合いに基いて、個々の遺伝子にＰ値を割り当てた。
【００５１】
６）非小細胞癌患者に対する生存率予測モデルの構築
個人毎の結果予測識別子（ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を開発するために、最初に、死亡患者から生存患者（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｆａｖｏｒａｂｌｅ）をもっとも明確に区別する遺伝子を選択するためにシグナル−ノイズ関数（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を使用した。９８のユニークな遺伝子に相当するトップ１００のスポットを用いた非監督階層クラスタリングアルゴリズムの結果、生存患者及び死亡患者を表す２つの主要なブランチ（ｂｒａｎｃｈ）を得た。非小細胞癌患者２１名のうちの１９名（左枠）すなわち良好ブランチは術後５年間生存し、一方、同患者２９名中１５人（右枠）すなわち死亡ブランチは術後５年以内に死亡している。それらのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線は統計学的に有意な差異を示している。
【００５２】
最終的な目標は患者レベルでの結果予測識別子を開発することであることから、次に教師付き学習法を採用することにした。このため、重み付け得票結果識別子（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ−ｖｏｔｉｎｇ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を、シグナル−ノイズ関数を用いて予め選択した予測的遺伝子を基に構築した。用いる予測的遺伝子の数を増加させた各モデルに対する学習エラーは１個抜き交差確認法によって計算した。非小細胞癌に対する結果識別子を構成する３０の遺伝子(表１)のうち、上位２５個の予測的遺伝子を用いた重み付け得票モデルが、個々の患者に対する結果の予測において、５０患者中４１人（８２％）という最も高い正確性を示した（図１）。
【００５３】
【表１】
2005261201.tif 000002
【００５４】
この識別子について、実際に術後５年以上にわたって生存した２７患者／３３患者（８２％）のケースは、「生存」と判断され、一方、術後５年以内に死亡した１４患者／１７患者中（８２％）は、実際に「死亡」と判定される。「生存」あるいは「死亡」という予測についての患者の生存曲線を図２に示す。この図はグループ間の差異を表している（Ｐ＝６．０×１０−６）。
【００５５】
上述の遺伝子数の増加を利用して、Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅ及びｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓを含む別の教師付き学習アルゴリズムを採用した。これらのモデルの正確性は重み付け得票結果識別子のそれと比較し得るものではあるが、後者が最も高い正確性を示した。
【００５６】
新たな肺癌患者（テスト資料γ）について、５年後の生死を判定するためには、予測的遺伝子セットに含まれる各遺伝子ｘの発現強度をＧｘγとして、予測的遺伝子セットに含まれる各遺伝子について、Ｖｘ＝Ｓｘ（Ｇｘγ−ｂｘ）を計算すればよい（ここで、Ｓｘは前述のシグナル−ノイズ統計値、ｂｘはｂｘ＝（μｃｌａｓｓ０＋μｃｌａｓｓ１）／２で算出される）。予測遺伝子セットに含まれる遺伝子について、Ｖｘの総和（ΣＶｘ）を算出したときに値がプラス（＋）であれば「生存」、マイナス（−）であれば死亡として判断する。
【００５７】
上述の遺伝子数の増加を利用して、Ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｃｈｉｎｅ及びｋ−ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓを含む別の監督下学習アルゴリズムを採用した。これらのモデルの正確性は重み付け得票結果識別子のそれと比較し得るものではあるが、後者が最も高い正確性を示した。
【００５８】
７）扁平上皮癌非扁平上皮癌それぞれに対する特異的な生存率予測モデルの構築
扁平上皮癌と非扁平上皮癌とは臨床病理学的に明確に区別される疾患として認識されている。そこで、重み付け得票アルゴリズム（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ−ｖｏｔｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）及びシグナル−ノイズ関数によって選択された各サブタイプに関する予測的遺伝子を用いて、個々の癌についての結果予測識別子（ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を構築した。
【００５９】
それぞれの癌についての結果識別子を構成する各３０の遺伝子(表２、表３)のうち、高位にランクされる予測的遺伝子の数の増加を伴う識別子の１個抜き交差確認法（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）により、非扁平上皮癌について１２（表２）ならびに扁平上皮癌について１９（表３）の遺伝子が最も高い確度を示した。
【００６０】
【表２】
2005261201.tif 000003
【００６１】
【表３】
2005261201.tif 000004
【００６２】
この結果は、３４の非扁平上皮癌患者の３１人（９１％）の術後５年の生存率が正確に予言されたことを示している（図３）。すなわち、２５人中２３人（９２％）が「生存」と判定され実際に術後５年生存し、「死亡」と判断された９人中わずか１人だけが５年生存した。「生存」と判定された２５人の生存曲線と「死亡」と判定された９人の生存曲線との相違は非常に高い有意差のあるものであった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、２５個の予測的遺伝子を用いた非小細胞肺癌患者における重み付け得票モデルを用いた予測の結果を表す。
【図２】図２は、非小細胞肺癌患者の「生存」あるいは「死亡」という予測についての生存曲線を示す。
【図３】図３は、１２個の予測的遺伝子を用いた非扁平肺癌患者における重み付け得票モデルを用いた予測の結果を表す。
【図４】図４は、１９個の予測的遺伝子を用いた扁平肺癌患者における重み付け得票モデルを用いた予測の結果を表す。
【図５】図５は、非扁平肺癌患者の「生存」あるいは「死亡」という予測についての生存曲線を示す。
【図６】図６は、扁平肺癌患者の「生存」あるいは「死亡」という予測についての生存曲線を示す。
【図１】
2005261201.tif 000005
【図２】
2005261201.tif 000006
【図３】
2005261201.tif 000007
【図４】
2005261201.tif 000008
【図５】
2005261201.tif 000009
【図６】
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