(57)【要約】【課題】ロドコッカス属細菌用ベクター、特に、ロドコッカス  ロドクロウス  セルフクローニング用ベクターの構築に有用であるロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、該ベクターを有する形質転換体または形質導入体を提供する。  【解決手段】宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子ＤＮＡ。更に、該遺伝子ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該ベクターを有する形質転換体または形質導入体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（A）及び（B）から選択されるタンパク質であって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質。
（A）配列番号１または配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号１または配列番号３記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来である請求項1記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２記載のタンパク質をコードする遺伝子DNA。
【請求項４】
下記の（a）及び（b）から選択されるＤＮＡであって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子DNA。
（a）配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNA。
（b）配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNAであってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子DNA。
【請求項５】
ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来である請求項３または４に記載の遺伝子DNA。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子DNAを有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれかに記載の遺伝子DNAおよびロドコッカス属細菌で複製増殖可能なDNA領域を有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項６〜７のいずれかに記載の組換えベクターからロドコッカス属細菌由来DNA以外のDNA領域が除かれたセルフクローニング型プラスミド。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のベクターを有する形質転換体または形質導入体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物にトリメトプリム耐性を付与するロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来の遺伝子およびそれを含むプラスミドベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス属に属する微生物はニトリル類を水和または加水分解して対応するアミドまたは酸類を生産するための微生物触媒として知られており（特許文献1〜4参照）、特に、ロドコッカス  ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) 種に属する微生物が極めて高性能なニトリル水和活性を有する（特許文献３参照）。
このような状況下、本発明者らは、先に、ロドコッカス属の宿主ベクター系の開発を行うべく、あるロドコッカス  ロドクロウス種の菌株より潜在性プラスミドを見い出し、複合プラスミドベクターを構築した（特許文献５〜７参照）。セルフクローニング系及びナチュラルオカレンス系プラスミドの構築のために、ロドコッカス属由来のマーカーとなり得る遺伝子が特許文献8、特許文献9および非特許文献1に提案されている。これら文献には、ロドコッカス  ロドクロウス種由来のカナマイシン耐性遺伝子、カドミウム耐性遺伝子および砒酸耐性遺伝子について記載されている。しかしながら、ロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来のトリメトプリム耐性遺伝子についてはこれまで記載がない。
【特許文献１】特公昭４−４８７３号公報
【特許文献２】特開昭６２−９１１８９号公報
【特許文献３】特開平２−４７０号公報
【特許文献４】特開平２−８４１９８号公報
【特許文献５】特開平４−１４８６８５号各公報
【特許文献６】特開平５−６４５８９号各公報
【特許文献７】特開平５−６８５６６号各公報
【特許文献８】特開平８−３８１８４号公報
【特許文献９】ＥＰ １ １２７ ９４３
【非特許文献１】Plasmid ２３、 ２４２−２４７ （１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ロドコッカス属のセルフクローニング系及びナチュラルオカレンス系プラスミドの構築のためには、ロドコッカス属由来のマーカーとなり得る遺伝子の開発が望まれていた。本発明の目的は、ロドコッカス属、特にロドコッカス  ロドクロウス種由来の薬剤耐性遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、該ベクターを有する形質転換体または形質導入体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ある種のロドコッカス属細菌株が高いトリメトプリム耐性を示すことを見いだし、これらの株より新たにトリメトプリム耐性遺伝子を単離することに成功し、さらにこれらを用いてロドコッカス属細菌において利用しうるプラスミドベクターを構築し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
(1)下記の（A）及び（B）から選択されるタンパク質であって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質。
（A）配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（B）配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。（2）ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来である(1)記載のタンパク質。（3）(1)または(2)記載のタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ。（4）下記の(a)及び(b)から選択されるＤＮＡであって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子ＤＮＡ。
(a)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNA。
(b)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNAであってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子ＤＮＡ。（5）ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌由来である(3)または(4)に記載の遺伝子ＤＮＡ。（6）(3)〜(5)のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡを有する組換えベクター。（7）(3)〜(5)のいずれかに記載の遺伝子ＤＮＡおよびロドコッカス属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域を有する組換えベクター。（8）(6)〜(7)のいずれかに記載の組換えベクターからロドコッカス属細菌由来DNA以外のDNA領域が除かれたセルフクローニング型プラスミド。（9）(6)〜(8)のいずれかに記載のベクターを有する形質転換体または形質導入体。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ロドコッカス属細菌用ベクター、特に、ロドコッカス  ロドクロウス  セルフクローニング用ベクターの構築に有用であるロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体または形質導入体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を具体的に説明する。
トリメトプリムは葉酸のアナログであり、細菌のジヒドロ葉酸還元酵素の拮抗阻害剤として知られている。ロドコッカス属細菌においては、トリメトプリム耐性に関する知見はなく、様々なロドコッカス属細菌を探索した結果、ある種のロドコッカス属細菌に高いトリメトプリム耐性を示すものがあることを見いだした。
【０００８】
本発明で用いられるトリメトプリム耐性が付与された菌を選別するための培地中のトリメトプリム塩酸塩の濃度としては、トリメトプリム耐性が付与された菌を選別できる濃度であれば特に制限はないが、好ましくは、100〜1000μg/ml、特に好ましくは、150〜400μg/mlである。
【０００９】
本発明のトリメトプリム耐性を付与する遺伝子DNAを有するロドコッカス属細菌として、具体的には、ロドコッカス  ロドクロウス ATCC 14348 株、ロドコッカス  ロドクロウスJ-1株、ロドコッカス  ロドクロウスATCC19140株、ロドコッカス  ロドクロウスATCC14349株、ロドコッカス  ロドクロウスATCC15906株、ロドコッカス  ロドクロウスATCC33025株を挙げることができる。これらのATCC株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手できる。J-1株は  独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6）にFERM  BP-1478として寄託されている。    
【００１０】
本発明で用いられる宿主微生物としては、大腸菌 ではJM109株、JM105株、HB101株、BL21株、DH5α株、CJ236株、 MV1184株、 TH2株等のK-12株由来の株やB株が挙げられる。好ましくはJM109株が挙げられる。また、ロドコッカス属細菌では 、ロドコッカス  ロドクロウスATCC999株、ATCC12674株、ATCC17895株、ATCC15998株、ATCC33275株、ATCC         184、ATCC4001株、ATCC4273株、ATCC4276株、ATCC9356株、ATCC12483株、ATCC14341株、ATCC14347株、ATCC14350株、ATCC15905株、ATCC15998株、ATCC17041株、ATCC19149株、ATCC19150株、ATCC21243株、 ATCC29670株、ATCC29672株、ATCC29675株、ATCC33258株、ATCC13808株、ATCC17043株、ATCC19067株、ATCC21999株、ATCC21291株、ATCC21785株、ATCC21924株、 IFO14894株、IFO3338株、NCIMB11215株、NCIMB11216株、JCM3202株、  ロドコッカス グロベルルス（Rhodococcus globerulus）IFO14531株、ロドコッカス ・ルテウス（Rhodococcus luteus）JCM6162株、JCM6164株、ロドコッカス ・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO12538株、IFO12320株、ロドコッカス エクイ（Rhodococcus equi）IFO3730株、JCM1313が挙げられる。好ましくは、トリメトプリムに比較的感受性のあるロドコッカス ロドクロウス ATCC 12674株、ATCC17895株、ATCC15998株等が、特に好ましくはロドコッカス ロドクロウス ATCC 12674株が挙げられる。特に、これらに限定されるものではなく、トリメトプリムに感受性を有する他の宿主微生物を用いることもできる。
【００１１】
本発明で用いられるプラスミドベクターとしては、宿主において安定に存在するものであれば特に制限はないが、大腸菌ではpBR322、pSC101、pACYC184、pACYC177、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 、pHSG298、pHSG299等が挙げられる。好ましくは pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298、pHSG299等のpUC系ベクター誘導体が挙げられる。 またファージベクター（例えば、λgt11、M13mp18、M13mp19等）も使用することができる。ロドコッカス属細菌用のプラスミドベクターとしては、ロドコッカス属細菌で複製増殖可能なDNA領域を含むプラスミドであれば特に制限はないが、例えばロドコッカス属細菌で複製増殖可能なDNA領域としては、プラスミドpAN12、pNC903、pFAJ2600、pRC10、pRC20、pRC001、pRC002、pRC003またはpRC004に含まれるものが挙げられる。好ましくはプラスミドpRC001、pRC002、pRC003またはpRC004等に含まれるものが挙げられる。プラスミド pRC001 、pRC002、pRC003、pRC004は、それぞれ、ロドコッカス  ロドクロウス ATCC 4276、ATCC 14349、ATCC 14348、IFO 3338由来であり、前記特許文献４〜７号公報に記載されている。
【００１２】
本発明において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子ＤＮＡ」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、または、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．（ｅｄ．  ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｓｅｌ  Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ２００１、以後  「モレキュラークローニング第３版」  と略称することがある。）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、配列番号2または4記載の塩基配列で表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、特に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
【実施例】
【００１３】
次に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１４】
[実施例１]
ATCC19140 株由来トリメトプリム耐性遺伝子のクローニング
(1) ATCC19140 株染色体ＤＮＡの調製とDNAライブラリーの作製
ATCC19140 株を 100mlのＭＹ培地(0.5％ポリペプトン、 0.3％バクトイーストエキス、 0.3％バクトモルトエキス)中、30℃にて振盪培養し、Saito and Miura の方法〔Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963) 〕により染色体ＤＮＡを分離した。この一部を制限酵素EcoRIで分解後、ベクター pUC119の EcoRI部位に挿入し、大腸菌JM109株に導入することによりＤＮＡライブラリーを作製した。DNAの大腸菌JM109株への導入は塩化カルシウム法により行った。
【００１５】
(2)トリメトプリム耐性形質転換体の選別
工程(1) で調製したライブラリーより、トリメトプリム耐性を示すようになった大腸菌JM109株形質転換体を選別した。選別は以下のようにして行った。
トリメトプリム塩酸塩（200μg/ml）とＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）（1mM）を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地（0.6％  Na2HPO4、0.3％  KH2PO4、0.05％  NaCl、0.01％  NH4Cl、0.01％  MgSO4・7H2O、0.4％  グルコース、２μg/ml  チアミン、カザミノ酸1.5％寒天）に作製した形質転換体を塗布し、37℃にて一晩培養を行った。出現したコロニーを取り、同寒天培地にストリークし、生育することを確認した。
こうして得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡをFlexiPrep  Kit(アマシャム・ファルマシア社)で調製し、これをpFY605と名付けた（図1）。pFY605は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6） に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM  AP-20063である。プラスミドpFY605により形質転換された大腸菌JM109株はIPTG非存在下ではトリメトプリム耐性を示さず、IPTG存在下で耐性を示した。pFY605はATCC19140株由来の約３KbのEcoRI断片を含んでいた。
【００１６】
(３) 配列の決定
工程(２) で得られたプラスミドpFY605中のATCC19140株由来約3 KbのDNA断片の塩基配列をABI  PRISM  3100を用いて決定した。本断片中に含まれるOpen Reading Frame(ORF)のアミノ酸配列（配列番号1）をGenBankに対してホモロジー検索を行った結果、Mycobacterium tuberculosis由来ジヒドロ葉酸還元酵素と51％一致することがわかった。本断片中に含まれるORFの塩基配列を配列番号２に示す。
【００１７】
[実施例２]
ATCC14348 株由来トリメトプリム耐性遺伝子のクローニング
(1) ATCC14348 株染色体ＤＮＡの調製とＤＮＡライブラリーの作製
実施例１と同様にして、染色体DNAを調製後、染色体DNAを制限酵素SacIで部分分解し、ベクター pUC119の SacI部位に挿入し、大腸菌JM109株に導入することによりＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１８】
(2)トリメトプリム耐性形質転換体の選別
実施例１と同様にして、形質転換体を選別し、それから得られたプラスミドをpTP013と名付けた（図２）。pTP013は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6） に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM  AP-20064である。プラスミドpTP013により形質転換された大腸菌JM109株はIPTG非存在下ではトリメトプリム耐性を示さず、ＩＰＴＧ存在下で耐性を示した。pTP013はATCC14348株由来の約3.4 KbのSacI断片を含んでいた。
【００１９】
(３) 配列の決定
工程(２) で得られたプラスミドpTP013中のATCC14348株由来約３KbのDNA断片の塩基配列をABI  PRISM  3100を用いて決定した。本断片中に含まれるORFのアミノ酸配列（配列番号3）をGenBankに対してホモロジー検索を行った結果、Neisseria  gonorrhoeae由来ジヒドロ葉酸還元酵素と56％一致することがわかった。本断片中に含まれるORFの塩基配列を配列番号４に示す。
【００２０】
[実施例３]
ロドコッカス  ロドクロウス由来トリメトプリム耐性遺伝子を用いた大腸菌−ロドコッカス属複合プラスミドベクターの作製
本発明者らが先に作製した複合プラスミドベクター pK4〔JM109/pK4は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6）にFERM BP-3731として寄託：ロドコッカス属プラスミドpRC004と大腸菌ベクターpHSG299 を連結したもの（特開平5-64589 号および同5-68566 号公報参）〕からpRC004領域の全部とpHSG299 の一部を含む3.1kb HindIII 断片を得、これをpPT013のHindIII部位に連結したプラスミドを作製しpTP014、pTP015と命名した（図３）。pTP014は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6） に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM  AP-20065である。pTP015は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1中央第6） に平成16年5月31日付で受領されており、その受領番号はFERM  AP-20069である。
これらのプラスミドはロドコッカス属および大腸菌において機能する二つの複製開始点を有する。これらのプラスミドを用いロドコッカス  ロドクロウス  ATCC 12674を電気パルス法により形質転換したところ、トリメトプリム（200μg/ml）を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地で生育可能な形質転換体が得られた。形質転換体よりプラスミドを調製したところ、導入したものと同様のプラスミドが得られた。ロドコッカス属細菌を宿主とした場合には、トリメトプリム耐性の発現にＩＰＴＧを必要としなかった。
【００２１】
[実施例４]
セルフクローニング型プラスミドの作製
pTP015を制限酵素EcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって約6 Kbのバンドをゲルから回収した。ゲルから回収したDNAにセルフライゲーション反応を行い、ロドコッカスロドクロウスATCC12674に電気パルス法により導入したところ、トリメトプリム（200μg/ml）を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地で生育可能な形質転換体が得られた。形質転換体よりプラスミドを調製したところ、pTP015から大腸菌由来ベクター部分が存在しないセルフクローニング型プラスミドが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】プラスミドpFY605の制限酵素地図である。
【００２３】
【図２】プラスミドpTP013の制限酵素地図である。
【００２４】
【図３】プラスミドpTP014およびpTP015の構築図および制限酵素地図である。
【図１】
2005348674.tif 000002
【図２】
2005348674.tif 000003
【図３】
2005348674.tif 000004
【配列表】
2005348674000001.app