(57)【要約】【課題】  新規なヘムオキシゲナーゼ誘導または誘導促進剤を提供すること。【解決手段】  式（１）で示されるベンゾフロキサンはヘムオキシゲナーゼの誘導または誘導促進剤として有用であることを見出した。2005075806.tif 000005【選択図】  図２
2005075806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示されるベンゾフロキサンを有効成分として含有する、ヘムオキシゲナーゼの誘導または誘導促進剤。
2005075806.tif 000004
【請求項２】
ベンゾフロキサンを有効成分とする急性肺傷害（ALI, ARDS）治療剤。
【請求項３】
ベンゾフロキサンを有効成分とする慢性閉塞性肺疾患（COPD）治療剤。
【請求項４】
ベンゾフロキサンを有効成分とする喘息治療剤。
【請求項５】
ベンゾフロキサンを有効成分とする移植臓器の保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾフロキサンを有効成分とするヘムオキシゲナーゼの誘導または誘導促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘムオキシゲナーゼ（以下 HOと略す）は、ヘムの分解代謝における第一段階で働く律速酵素であり、細胞内遊離へムを一酸化炭素、鉄、ビリベルジンに分解する。ビリベルジンはさらにビリベルジン還元酵素によりビリルビンに変換される。HOにはHO-1、HO-2及びHO-3の３つのアイソザイムが知られている。HO-1は誘導型の酵素であり、酸化ストレス、熱ショック、サイトカイン、金属ポルフィリン、重金属、生体異物、ホルモンなどの広範囲な化合物や病的状態により誘導され、細胞内ヘムの恒常性、ヘム蛋白の維持および鉄の再利用に重要な役割を果たしていると考えられている。また、HO-1は哺乳類の組織に広く存在するが、炎症や虚血再還流時に酸化的ストレス部位で誘導されることも知られている。さらに種々の炎症モデルでの検討から、HO-1の誘導は細胞障害に対する内因性の防御機構の一部と考えられている。HOにより生じたビリベルジン、ビリルビンは抗酸化、抗補体作用を有し、一酸化炭素は細胞内伝達物質として、鉄は遺伝子調節因子としての機能を有することから、これらが防御作用に関与していることが考えられている。
HO-2は非誘導型の酵素であり、特に脳、精巣に多く存在し、グルココルチコイド以外には誘導されることがないとされている。
【０００３】
HO-3は構造的にHO-2と関連するが、詳細については明らかにされていない。触媒としての活性は比較的弱く、ヘム同士の結合に関与すると考えられている。
【０００４】
HO-1の誘導と病態との関連性については、幾つかの報告がされている。HO-1誘導剤であるヘミンによりHO-1を誘導しておくと、カラゲニンによる胸膜炎モデルでは胸水量、胸水中の炎症細胞数増加が抑制される。これに対しHO阻害薬であるスズ(IV)プロトポルフィリンIXジクロライド(以下Snppと略す)はカラゲニンによる炎症反応を増悪することが報告されている（非特許文献１）。オゾン暴露による気道炎症マウスモデルにおいてHO-1の過剰発現は気道への好中球浸潤を抑制し、気道過敏症を改善させることが報告されている（非特許文献２）。また、遺伝的にHO-1の発現能が低いヒトが慢性閉塞性肺疾患(以下COPDと略す)になりやすいという疫学調査結果が報告されている（非特許文献３）。マウスの喘息モデルではHO-1の誘導により、好酸球数の増加が抑制されることも報告されている（非特許文献４）。更に、高酸素負荷時（非特許文献５）や心臓移植（非特許文献６）、脳血管攣縮時（非特許文献７）においてもHO-1の発現は組織防御的に作用していることが報告されている。
【０００５】
また、近年ヒトでの世界初症例となる先天的HO-1欠損症の報告がなされた（非特許文献８）。患者は２歳ごろより持続する発熱、肝肥大、関節痛、発疹、溶血性貧血、凝固線溶系の異常など多彩な臨床症状を示し、６歳時に高血圧と頭蓋内出血を合併して死亡したと報告されている。一方、PossらはHO-1ノックアウトマウスを作製し解析を行った（非特許文献９）。HO-1ノックアウトマウスでは鉄の再利用障害による貧血、組織への鉄の沈着、成長障害などが認められた。また、このマウスでは胎児死亡率が極めて高く、感染ストレスに対する抵抗性も著明に低下していると考えられた。これらの情報よりHO-1は生体防御に重要な役割を演じており、この欠損は酸化ストレスのみならず生体の防御機構不全を引き起こし、種々の合併症を生じるものと想定されている。
【０００６】
ところで、ベンゾフロキサンはキノキサリン誘導体の合成原料（特許文献１）として知られており、市販されている化合物である。しかし、ベンゾフロキサンがHO-1を誘導するとの報告はなされていない。
【０００７】
HO-1の誘導を示す化合物としてはレミノプラゾール（特許文献２）、ニコチンアミド誘導体（特許文献３）及びプロスタグランジンAやそのアゴニスト、ビタミンB12、ヘミンやそのフラグメントとアナログ（特許文献４）が特許として、ピリジン誘導体及びイミダゾール誘導体が文献として報告されている（非特許文献１０）が、何れもベンゾフロキサンとは構造が異なる。
【０００８】
また、ベンゾフロキサン誘導体として、心臓血管性疾患治療剤（特許文献５）や狭心症治療（特許文献６）の報告があるが、何れもHO誘導または誘導促進に関する記述はされていない。
【０００９】
【特許文献１】WO 95/09159  パンフレット
【特許文献２】特開２０００−１１９１８２号
【特許文献３】WO 01/68094  パンフレット
【特許文献４】WO 96/09038  パンフレット
【特許文献５】特表２００２−５１６３１７号
【特許文献６】特表２００２−５１６２７５号
【非特許文献１】Nature Medicine 2, 87-90(1996)．
【非特許文献２】Eur. J. Pharmacol., 399, 229-234(2000)．
【非特許文献３】Am. J. Hum. Genet., 66, 187-195(2000)．
【非特許文献４】呼吸, 19巻, 2号, S37-S38(2000)．
【非特許文献５】J. Clin. Invest., 103, 1047-1054(1999)．
【非特許文献６】Lab. Invest., 82, 61-70(2002)．
【非特許文献７】日薬理誌  114, Suppl1, 55-59(1999)．
【非特許文献８】J. Clin. Invest., 103, 129-135(1999)．
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10919-10924(1997)．
【非特許文献１０】Jpn. J. Toxicol. Environ. Health. 42, 468-478(1996)．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は生体の防御反応を亢進させ、病態の緩和を促進することができる新規HO誘導または誘導促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、HOの誘導または誘導促進作用を有する化合物を探索した結果、ベンゾフロキサンに優れたHO誘導作用を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、
１）式（１）で示されるベンゾフロキサンを有効成分として含有する、HOの誘導または誘導促進剤、
2005075806.tif 000003
２）ベンゾフロキサンを有効成分とする急性肺傷害（ALI, ARDS）治療剤、
３）ベンゾフロキサンを有効成分とする慢性閉塞性肺疾患（COPD）治療剤、
４）ベンゾフロキサンを有効成分とする喘息治療剤、
５）ベンゾフロキサンを有効成分とする移植臓器の保護剤、
に関するものである。
【発明の効果】
【００１３】
ベンゾフロキサンを有効成分として含有するHOの誘導または誘導促進剤は医薬として有用である。とりわけ、急性肺障害治療剤、COPD治療剤、喘息治療剤または移植臓器の保護剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ベンゾフロキサンは試薬、合成原料として市販されていて、容易に入手できる。
ベンゾフロキサンがHOの誘導または誘導促進作用を有することはヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた実験で明らかにすることができる。即ち、HOの誘導効果はベンゾフロキサンによるHO-1のmRNA上昇作用、ベンゾフロキサンによるHO-1 蛋白の濃度依存的な誘導作用あるいはベンゾフロキサンによるHO活性の上昇作用を測定することによって証明することができる。さらに、マウスリポポリサッカライド(以下LPSと略す)吸入による肺傷害モデルによって気管支肺胞洗浄液中の好中球数に対する効果を測定することができる。好中球は一般的に肺傷害時に多く浸潤し、傷害の程度を見る指標として使用されており、さらに、COPDとの関連も報告されている炎症細胞である。この好中球数の増加を抑制することはCOPDをはじめとする炎症性疾患への有用性を示唆しているものである。更に、この好中球数増加に対する抑制作用はHO阻害剤であるSnppの併用により消失することから、誘導されたHOが好中球数増加に対する抑制作用に関与していることを裏付けることができる。
【００１５】
上記のような実験によって、ベンゾフロキサンはHO-1 mRNA、HO-1 蛋白の誘導を介してHO活性を上昇させていることが明らかになった。肺傷害モデルでは気管支肺胞洗浄液中の好中球数の増加を抑制した。従ってベンゾフロキサンはHOの誘導または誘導促進剤として有用であり、様々な疾患の治療剤として、例えば急性肺傷害治療剤、COPD治療剤、喘息治療剤、移植臓器の保護剤等、様々な酸化的ストレスに対する生体防御剤としての有用性が期待される。
【００１６】
ベンゾフロキサンを有効成分として含有する、HOの誘導または誘導促進剤は、それ自体あるいは薬理学的に許容される賦形剤等と混合し、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等のような経口剤として用いることができる。また、注射剤、吸入剤もしくは坐剤等の非経口的な薬剤としても用いることができる。
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【００１８】
＜ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下HUVECと略す）におけるHO-1 mRNAの測定＞
HUVECは、2% ウシ胎児血清(以下FCSと略す)を含むEB-2培地にて継代培養し、6-9代のものを実験に使用した。HUVEC (1×105 cell/mL)   1.5mLを、コラーゲンタイプIコート6ウエル プレートに播種した。ベンゾフロキサンをジメチルスルフォキシド(以下DMSOと略す)に溶解し、培地にて100倍希釈し、HUVECに添加した。12時間培養した後にRNイージーミニキットを用いてRNAを調製した。cDNAはHUVECから抽出したRNA 約1μgとプライマーにランダムヘキサマー 100pmol、逆転写酵素にスーパースクリプトIIを用い、50℃で50分反応させ合成した。PCRは酵素にEx.Taq polymerase、検出のためにCyberGreen、リアルタイムPCR装置としてスマートサイクラーを用いて定量的に行った。また、今回測定したHO-1 mRNAレベルはβ-アクチン mRNA値で補正した。
（結果）
ベンゾフロキサン(10μM)はHUVECのHO-1 mRNAを増加した。この作用は薬物添加６時間後が最大であった。この作用はHO-1誘導作用が知られているヘミン 15μMと同程度であった。
【実施例２】
【００１９】
＜HUVECにおけるHO-1 蛋白の測定＞
HUVECは、2% FCS を含むEB-2にて継代培養し、6-9代のものを実験に使用した。HUVEC(1×105 cell/mL)   1.5mLを、コラーゲンタイプIコート6ウエル プレートに播種した。ベンゾフロキサンをDMSOに溶解し、培地にて100倍希釈し、HUVECに添加した。24時間培養後、セルリフターを用いて細胞をかきとり、蛋白定量を行い、サンプルとした。ウエスタンブロットはCarraway MSらの方法（Am.J.Physiol. 275, L583-L592, 1998）に準じて行った。サンプル20μgを電気泳動した後、ポリビニリデンフルオライド膜へ転写し、一次抗体として抗ラットHO-1ポリクローナル抗体（Stress Gen）、二次抗体として抗ウサギIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼを結合させた。シグナルはECLTM(アマシャム社)によってバイオマックスフィルムに検出した。
（結果）
ベンゾフロキサン(10-30μM)は濃度依存的にHUVECのHO-1 蛋白を増大させた。ベンゾフロキサン30μMの作用はHO-1誘導作用が知られているヘミン50μMの作用と同程度であった。
【実施例３】
【００２０】
＜HUVECにおけるHO活性の測定＞
HUVECは、2% FCS を含むEB-2培地にて継代培養し、6〜9代のものを実験に使用した。HUVEC (1×105 cell/mL)  4.5mLを、コラーゲンタイプIコート6cmディッシュに播種した。ベンゾフロキサンをDMSOに溶解し、培地にて100倍希釈し、HUVECに添加した。37℃ CO2インキュベーターにて3、8および24時間培養した後、細胞を回収した。凍結融解により細胞を破壊し、蛋白定量を行い、60〜100μgをサンプルとした。
HO活性の測定はTaylor,JLらの方法（Am.J.Physiol. 274, L582-L590, 1998）に準じて行った。サンプルにラット肝上澄蛋白を2 mg、20 μM ヘミン、2mM グルコース6-ホスフェート、0.016 U/μL グルコース6-ホスフェート デハイドロゲナーゼ、0.8 mM ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド ホスフェート(以下NADPHと略す)を含む反応液450μLを加え、攪拌した後、1時間反応させた。クロロホルムを700μL加え、良く攪拌した後、9000rpm、4℃にて5分間遠心し、下層（クロロホルム層）の吸光度（453nmおよび530nm）を測定した。453nmと530nmの吸光度差より、生成したビリルビン量を算出し、HO活性とした。
（結果）
ベンゾフロキサン(10μM)はHUVECのHO活性を増大させた。この作用は薬物添加8時間後がピークでコントロール3.64倍であった。この作用はHO誘導作用が知られているヘミン 15μMと同程度であった。
【実施例４】
【００２１】
＜マウスLPS吸入による肺傷害に対する影響＞
プラスチックケースに雄性BALB/cマウスを入れ、超音波式吸入器で10分間LPS（1mg/ml 生理食塩液）をマウスに噴霧した。LPS吸入24時間後、マウスをペントバルビタールナトリウム( 30mg/kg,i.p. )で麻酔し、腹部大動脈より脱血して致死させた。気管にカニューレを挿入し、1.0mlの0.4% クエン酸ナトリウムを含む0.85% NaCl 溶液で気管支肺洗浄を３回行い、気管支肺胞洗浄液( 以下BALFと略す )を得た。BALFを4℃、15分、×200gで遠心し、白血球を含むペレットを0.1% ウシ血清アルブミンを含む生理食塩液に懸濁した。懸濁液中の白血球数をカウントして1×105cells/mlに調製し、サイトスピン3 を用いて室温、5分、400rpmの条件でスライドガラス上に固定、ディフ・クイックで染色した後、好中球数を測定した。
ベンゾフロキサンは、0.01%Tween80/生理食塩液で懸濁し、LPS吸入2および24時間前に投与した。
（結果）
ベンゾフロキサン(10mg/kg,i.p.)はLPS吸入によるBALF中の好中球数の増加を抑制した。この作用はHO阻害剤であるSnppとの併用により消失した。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
以上のことからベンゾフロキサンは生体防御的に作用するHOの発現を誘導または促進することが確認された。従って、ベンゾフロキサンは生体の防御反応を亢進させ、病態の緩和を促進することができる。このようにしてベンゾフロキサンを有効成分として含有するHOの誘導または誘導促進剤は医薬として有用であり、とりわけ、急性肺障害治療剤、COPD治療剤、喘息治療剤または移臓器の保護剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】HUVECにおけるベンゾフロキサンのHO-1 mRNA誘導作用を示す図である。
【図２】HUVECにおけるベンゾフロキサンのHO-1 蛋白誘導作用を示す図である。
【図３】HUVECにおけるベンゾフロキサンのHO活性上昇作用の経時変化を示す図である。
【図４】マウスにおけるLPS吸入後のBALF中への好中球浸潤に対するベンゾフロキサンの影響を示す図である。
【図５】ベンゾフロキサンの好中球浸潤抑制作用に対するSnppの影響を示す図である。
【図１】
2005075806.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005075806.tif 000009
【図５】
2005075806.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月23日(2004.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
＜ヒト臍帯静脈内皮細胞（以下HUVECと略す）におけるHO-1 mRNAの測定＞
HUVECは、2% ウシ胎児血清(以下FCSと略す)を含むEB-2培地にて継代培養し、6-9代のものを実験に使用した。HUVEC (1×105 cell/mL)   1.5mLを、コラーゲンタイプIコート6ウエル プレートに播種した。ベンゾフロキサンをジメチルスルフォキシド(以下DMSOと略す)に溶解し、培地にて100倍希釈し、HUVECに添加した。12時間培養した後にRNイージーミニキットを用いてRNAを調製した。cDNAはHUVECから抽出したRNA 約1μgとプライマーにランダムヘキサマー 100pmol、逆転写酵素にスーパースクリプトIIを用い、50℃で50分反応させ合成した。PCRは酵素にEx.Taq polymerase、検出のためにCyberGreen、リアルタイムPCR装置としてスマートサイクラーを用いて定量的に行った。また、今回測定したHO-1 mRNAレベルはβ-アクチン mRNA値で補正した。
（結果）
ベンゾフロキサン(10μM)はHUVECのHO-1 mRNAを増加させた。この作用は薬物添加６時間後が最大であった。この作用はHO-1誘導作用が知られているヘミン 15μMと同程度であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
＜HUVECにおけるHO活性の測定＞
HUVECは、2% FCS を含むEB-2培地にて継代培養し、6〜9代のものを実験に使用した。HUVEC (1×105 cell/mL)  4.5mLを、コラーゲンタイプIコート6cmディッシュに播種した。ベンゾフロキサンをDMSOに溶解し、培地にて100倍希釈し、HUVECに添加した。37℃ CO2インキュベーターにて3、8および24時間培養した後、細胞を回収した。凍結融解により細胞を破壊し、蛋白定量を行い、60〜100μgをサンプルとした。
HO活性の測定はTaylor,JLらの方法（Am.J.Physiol. 274, L582-L590, 1998）に準じて行った。サンプルにラット肝上澄蛋白を2 mg、20 μM ヘミン、2mM グルコース6-ホスフェート、0.016 U/μL グルコース6-ホスフェート デハイドロゲナーゼ、0.8 mM ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド ホスフェート(以下NADPHと略す)を含む反応液450μLを加え、攪拌した後、1時間反応させた。クロロホルムを700μL加え、良く攪拌した後、9000rpm、4℃にて5分間遠心し、下層（クロロホルム層）の吸光度（453nmおよび530nm）を測定した。453nmと530nmの吸光度差より、生成したビリルビン量を算出し、HO活性とした。
（結果）
ベンゾフロキサン(10μM)はHUVECのHO活性を増大させた。この作用は薬物添加8時間後がピークでコントロールの3.64倍であった。この作用はHO誘導作用が知られているヘミン 15μMと同程度であった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
＜マウスLPS吸入による肺傷害に対する影響＞
プラスチックケースに雄性BALB/cマウスを入れ、超音波式吸入器で10分間LPS（1mg/ml 生理食塩液）をマウスに噴霧した。LPS吸入24時間後、マウスをペントバルビタールナトリウム( 30mg/kg,i.p. )で麻酔し、腹部大動脈より脱血して致死させた。気管にカニューレを挿入し、1.0mlの0.4% クエン酸ナトリウムを含む0.85% NaCl 溶液で気管支肺洗浄を３回行い、気管支肺胞洗浄液( 以下BALFと略す )を得た。BALFを4℃、15分、200×gで遠心し、白血球を含むペレットを0.1% ウシ血清アルブミンを含む生理食塩液に懸濁した。懸濁液中の白血球数をカウントして1×105cells/mlに調製し、サイトスピン3 を用いて室温、5分、400rpmの条件でスライドガラス上に固定、ディフ・クイックで染色した後、好中球数を測定した。
ベンゾフロキサンは、0.01%Tween80/生理食塩液で懸濁し、LPS吸入2および24時間前に投与した。
（結果）
ベンゾフロキサン(10mg/kg,i.p.)はLPS吸入によるBALF中の好中球数の増加を抑制した。この作用はHO阻害剤であるSnppとの併用により消失した。