(57)【要約】【課題】  生体物質の有利な固定化、解析、回収方法と、この方法の利点を活かした表面プラズモン共鳴センサーを提供する。【解決手段】  所定の光固定化材料を用いた担体の表面に生体物質を配置し、これを光照射によって固定化して、その検出、利用、解析又は複合体形成等を行った後、再度の光照射のもとに機械的外力の負荷によって生体物質を脱離させ、生体物質あるいは複合体の活性や機能を維持したままで回収する方法。光固定化担体と、光照射システムと、表面プラズモン測定システムと、穏やかな機械的外力の負荷手段とを備える表面プラズモン共鳴センサー。【選択図】          図２
2005091128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも表層部に下記（Ａ）の光固定化材料を用いた担体の表面に下記（Ｂ）の生体物質を配置したもとで、光照射によって前記生体物質を担体表面に固定化する固定化工程と、固定化した前記生体物質を光照射及び機械的外力の負荷によって前記担体の表面から脱離させ回収する回収工程とを有することを特徴とする生体物質の光固定化・回収方法。
（Ａ）光固定化材料：光照射時に可塑化し、表面に配置された微小物体に対して光変形による固定化能力を示す材料。
（Ｂ）生体物質：ポリペプチド、糖鎖、ポリヌクレオチド、オルガネラ、細胞、細菌、ウイルス又はこれらの集合体。
【請求項２】
前記固定化工程と回収工程との間において、担体の表面に固定化した前記生体物質を検出、利用又は解析する中間工程を行うことを特徴とする請求項１に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項３】
前記中間工程が、前記生体物質に対して単一種類の第２の生体物質を特異的に吸着又は反応させ、又は複数種類の第２の生体物質を順次特異的に吸着又は反応させる複合体形成を含み、かつ、前記回収工程においては、この複合体を担体の表面から脱離させ回収することを特徴とする請求項２に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項４】
前記中間工程が、前記複合体を検出することであることを特徴とする請求項３に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項５】
前記複合体の検出を、該複合体を構成する第２の生体物質に備えさせた検出マーカーによって行うことを特徴とする請求項４に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項６】
前記担体の表層部において前記光固定化材料層の下層に金属薄膜層を設けたもとで、前記複合体の検出を、該複合体の形成による担体表層部の屈折率変化が与える表面プラズモン共鳴位置の変化によって検出することを特徴とする請求項４に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項７】
前記光固定化材料が、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれかに記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項８】
前記化学構造が、アゾ基を有する色素構造であることを特徴とする請求項７に記載の生体物質の光固定化・回収方法。
【請求項９】
前記固定化工程及び／又は回収工程における光照射が、以下の（１）及び／又は（２）に従うことを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれかに記載の生体物質の光固定化・回収方法。
（１）フォトンエネルギーの低い光を用いて光照射を行う。
（２）生体物質周囲の温度上昇が、その生体物質の機能を損なわない温度域に止まるようなパワーの光を用いて光照射を行う。
【請求項１０】
以下の（イ）〜（ニ）の要素を備えることを特徴とする表面プラズモン共鳴センサー。
（イ）光照射時に可塑化し、表面に配置された微小物体に対して光変形による固定化能力を示す光固定化材料層と、その下層の金属薄膜層とを表層部に設けた担体。
（ロ）前記担体の表面に対して光を照射できる構成の光照射システム。
（ハ）前記担体の表面における一定の生体物質の反応による担体表層部の屈折率変化を検出できる構成の表面プラズモン測定システム。
（ニ）前記担体の表面に対する機械的外力の負荷手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の光固定化・回収方法及び表面プラズモン共鳴センサーに関し、更に詳しくは、各種の極めて微小な生体物質を光学的手段を利用して担体上に固定化すると共に、目的に応じて固定化した生体物質やその複合体の検出、利用又は解析等を行った後に、マイルドな操作により生体物質やその複合体を損傷等させることなく担体の表面から脱離させ回収すると言う生体物質の光固定化・回収方法、及び、この方法を応用して構成された、検体を活性又は機能を維持した状態で回収可能な表面プラズモン共鳴センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、材料系、機械系等の多くの技術分野において、極めて微小なスケールで対象物を解析し又は構成するナノテクノロジーが注目され、特にバイオテクノロジーの分野においてはナノテクノロジーと分子生物学を融合した研究成果が種々報告されている。
【０００３】
例えば、分子生物学の著しい発展に伴い、遺伝子等のポリヌクレオチド、遺伝子によって発現する各種のポリペプチド（酵素、抗原−抗体、細胞膜レセプタータンパク質等）、又は糖鎖の機能解析等が注目されている。又、その関係で、オルガネラ、細胞、微生物等を利用した in vitro 解析は非常に重要である。
【０００４】
更に、ポストゲノムの医学分野における中心的な課題の一つとして遺伝子診断又はＤＮＡ診断が挙げられる。即ち、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）又はマイクロサテライト部を含むＤＮＡ断片の解析や、多様な一塩基多型（ＳＮＰｓ）の解析によって、いわゆるゲノム創薬を行ったり、個人の遺伝情報を把握してテーラーメイド医療や法医学鑑定に活用することが考えられる。
【０００５】
このような技術状況においては、上記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、オルガネラ、細胞等の各種の微小な生体物質を活性な状態又は生存状態で選択的に固定化して、その複合体等の多様な形態における生体物質の利用又は解析等を行い、好ましくは更に、この生体物質又はその複合体を活性な状態や生存状態を維持したままで回収できるようにする技術が望まれる。
【０００６】
又、このような目的に用いる重要なセンサーの一つとして、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）に基づく表面プラズモン共鳴センサーがある。ＳＰＲ法は、例えば膜厚１００ｎｍ以下の金属の薄膜に向けて全反射条件で光を入射した時に、ある特定の角度で共鳴して金属薄膜の表面波となるＳＰＲ現象を利用する。ＳＰＲが生じる角度は金属周囲の屈折率の変化によって鋭敏に変化し、入射光のエネルギーがＳＰＲを励起するために使われて、反射光の強度が減少する。従って、例えば担体の表面に固定化された機能性タンパク質等が被検査対象物体と特異的に結合すると屈折率変化が起こるが、この屈折率変化を鋭敏に検出することができる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１１６５１５号公報  この特許文献１に係る明細書の「０００５」には、従来技術の記述として、表面プラズモン共鳴センサーを構成するプリズムを抗体により修飾し、この抗体により抗原を捕捉して、そのことを検出した後、ｐＨもしくは塩濃度を変えた緩衝液を流すことにより、生体分子を溶出できる旨の記載がある。
【０００８】
即ちこの従来技術の記載は、一種の担体上に抗原である生体分子を抗原−抗体複合体の形態において固定化し、その後に、この生体分子を抗原−抗体複合体の形態を解除して回収する技術である、と理解することができる。
【０００９】
上記の特許文献１に係る発明では、プローブが形成された微粒子を基板上に固定し、この微粒子に被検体である生体分子を吸着させて、生体分子の相互作用の検出後、生体分子を微粒子ごと回収する技術が開示されている。微粒子を回収する手段としてレーザーパルスを照射する技術も開示されている。
【００１０】
即ち、これらの開示は、基板上の微粒子に生体分子を固定化して生体分子の相互作用を検出した後、その生体分子を微粒子ごと回収する技術と、その回収手段とを開示している、と理解することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の特許文献１に従来技術として記載された技術においては免疫反応を利用することにより、又、特許文献１に係る発明においては例えばＤＮＡのハイブリダイゼーションを利用することにより、それぞれ生体分子たるタンパク質やＤＮＡを固定化及び回収する技術である。しかし、それらの固定化手段が複合体（抗原−抗体複合体又はＤＮＡハイブリッド鎖）の形成であって、複合体を構成する一方の生体分子はあらかじめ固定化されているため、固定化した生体分子又はその複合体の回収において、以下のような幾つかの不具合がある。
【００１２】
即ち、第１に、複合体を構成する一方の生体分子（抗原又はプローブたるＤＮＡ）は、担体たるプリズム又は微粒子から分離・回収し得ない。従って、これらの生体分子が貴重又は高価なものである場合、大きなコスト上のロスを生じる。第２に、担体から分離して回収し得る生体分子、特に抗体については、抗体の活性を維持した状態で回収を行うためには、その回収時の手段又は条件を個々に検討する必要があり、煩雑である。第３に、生体分子（抗体又は相補鎖ＤＮＡ）の回収は複合体（抗原−抗体複合体又はハイブリッド鎖）を構成する生体分子間の解離を条件とするから、複合体そのものを回収して解析等を行う、と言うことが不可能である。
【００１３】
そこで本発明は、各種の極めて微小な生体物質を光学的手段を利用して担体上に固定化すると共に、固定化した生体物質を簡易かつマイルドな回収手段により生体物質を損傷等させることなく担体の表面から回収する方法、更には固定化した生体物質について形成した複合体を同様にして回収する方法を提供すること、及び、この方法を応用して構成された、検体を活性又は機能を維持した状態で回収可能な表面プラズモン共鳴センサーを提供することを、解決すべき技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、少なくとも表層部に下記（Ａ）の光固定化材料を用いた担体の表面に下記（Ｂ）の生体物質を配置したもとで、光照射によって前記生体物質を担体表面に固定化する固定化工程と、固定化した前記生体物質を光照射及び機械的外力の負荷によって前記担体の表面から脱離させ回収する回収工程とを有する、生体物質の光固定化・回収方法である。
（Ａ）光固定化材料：光照射時に可塑化し、表面に配置された微小物体に対して光変形による固定化能力を示す材料。
（Ｂ）生体物質：ポリペプチド、糖鎖、ポリヌクレオチド、オルガネラ、細胞、細菌、ウイルス又はこれらの集合体。
【００１５】
上記の第１発明において、「光変形」とは、通常のマクロな意味での形状変化の他、分子レベルでの運動による生体物質と担体表面との絡み合い等による変形も含む。このような光変形には、光学顕微鏡や電子顕微鏡等により明瞭に観察できるものもあるし、変形量や変形形態の関係で通常の観察手段によっては明瞭に観察することが困難のものもある。
【００１６】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る固定化工程と回収工程との間において、担体の表面に固定化した前記生体物質を検出、利用又は解析する中間工程を行う、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００１７】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第２発明に係る中間工程が、前記生体物質に対して単一種類の第２の生体物質を特異的に吸着又は反応させ、又は複数種類の第２の生体物質を順次特異的に吸着又は反応させる複合体形成を含み、かつ、前記回収工程においては、この複合体を担体の表面から脱離させ回収する、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００１８】
なお、第３発明の構成を変更した発明として、一旦形成して検出、利用又は解析に供した複合体を、その構成要素たる生体物質単位に解離させ、解離した第２の生体物質をまず回収した後に担体に固定化した生体物質を回収したり、担体に固定化した生体物質のみを回収したりすることもできる。
【００１９】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第３発明に係る中間工程が、前記複合体を検出することである、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００２０】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係る複合体の形成を、該複合体を構成する第２の生体物質に備えさせた検出マーカーによって検出する、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００２１】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第４発明に係る担体の表層部において前記光固定化材料層の下層に金属薄膜層を設けたもとで、前記複合体の形成を、該複合体の形成による担体表層部の屈折率変化が与える表面プラズモン共鳴位置の変化によって検出する、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００２２】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第１発明〜第６発明のいずれかに係る光固定化材料が、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料である、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００２３】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第７発明に係る化学構造がアゾ基を有する色素構造である、生体物質の光固定化・回収方法である。
【００２４】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第１発明〜第８発明のいずれかに係る固定化工程及び／又は回収工程における光照射が、以下の（１）及び／又は（２）に従う、生体物質の光固定化・回収方法である。
（１）フォトンエネルギーの低い光を用いて光照射を行う。
（２）生体物質周囲の温度上昇が、その生体物質の機能を損なわない温度域に止まるようなパワーの光を用いて光照射を行う。
【００２５】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、以下の（イ）〜（ニ）の要素を備える、表面プラズモン共鳴センサーである。
（イ）表面に配置された微小物体に対して、光照射時に可塑化し光変形による固定化能力を示す光固定化材料層と、その下層の金属薄膜層とを表層部に設けた担体。
（ロ）前記担体の表面に対して光を照射できる構成の光照射システム。
（ハ）前記担体の表面における一定の生体物質の反応による担体表層部の屈折率変化を検出できる構成の表面プラズモン測定システム。
（ニ）前記担体の表面に対する機械的外力の負荷手段。
【発明の効果】
【００２６】
（第１発明の効果）
本願発明者は、前記課題の解決手段を研究する過程で、「光照射時に可塑化し、表面に配置された微小物体に対して光変形による固定化能力を示す光固定化材料」の表面に生体物質を配置させて光照射を行うと、光固定化材料の表面に生体物質が強く固定化される、と言う知見を得た。更に、固定化した生体物質に対して再度あるいは繰り返し光照射を行うと、その度に生体物質に対する固定力がある程度弱まり、材料表面に接する液体をある程度の流速で流動させる等の機械的外力の負荷によって、生体物質を材料表面から脱離させることができる、と言う知見も得た。
【００２７】
これらの現象においては、光照射により光固定化材料が可塑化し、生体物質の形状に依存した変形（例えば、生体物質の形状に対応した凹状の変形）を起こして生体物質がある程度の強さで固定化された準固定化状態となり、次に光照射の終了後に光固定化材料が可塑化状態から固化状態に戻ることにより、生体物質が強く固定化された本固定化状態となる、と考えられる。本固定化状態における強い固定力は、光変形した材料表面による生体物質に対する支持効果、材料  表面と生体物質との接触面積の増大によるファンデルワールス力等の付着力の増加効果等によるものと推察される。
【００２８】
次に、固定化した生体物質に対して再度あるいは繰り返し光照射を行うと、その度に光固定化材料が可塑化して、生体物質に対する本固定化状態が準固定化状態に戻り、それに加えて機械的外力（生体物質の活性状態あるいは生存状態を損なわない程度の機械的外力）を負荷すると、生体物質を脱離させることができるのである。
【００２９】
第１発明の生体物質の光固定化・回収方法においては、極めて微小な生体物質であるポリペプチド、糖鎖、ポリヌクレオチド、オルガネラ、細胞、細菌、ウイルス又はこれらの集合体を、容易に光固定化及び回収することができる。
【００３０】
又、光照射及び穏やかな機械的外力の負荷という簡易かつマイルドな手段で生体物質を光固定化及び回収することができるので、発明の実施手段及び実施方法が非常に簡易かつ低コストであり、しかも生体物質を活性状態あるいは生存状態のままで光固定化及び回収できる。例えば、生体物質である酵素の失活や立体形状の変形を防止でき、化学構造的に弱いＤＮＡの破壊を防止でき、細胞又は細菌の生存状態を良好に維持できる。従って任意の目的のために担体に一旦固定化した生体物質をフリーの状態で回収し、かつその機能や活性等を再評価できる。
【００３１】
（第２発明の効果）
第２発明においては、前記第１発明における固定化工程と回収工程との間に、固定化した生体物質を検出、利用又は解析する中間工程を行う。従って、各種の生体物質をその検出、利用又は解析に適した固定化状態として所望の操作を行い、その後に生体物質を活性状態あるいは生存状態のままで回収することが容易にできる。
（第３発明の効果）
第３発明においては、第２発明に係る中間工程が、生体物質相互の特異的な吸着又は反応に基づく複合体形成を含み、複合体としては、固定化された生体物質と単一種類の第２の生体物質との複合体の他に、複数種類の第２の生体物質を順次特異的に結合させた複合体も含まれ、かつ、その複合体全体を担体の表面から脱離させ回収する。
【００３２】
即ち、従来は例えば抗原―抗体反応のような免疫反応で形成された複合体を、未だ複合体を形成していない抗原や抗体から効率良く高純度に分離・回収することが容易ではなかったが、第３発明では、その回収工程において、複合体のこのような高純度の分離・回収を容易に行うことができる。そして分離・回収した複合体は本来の機能や活性が阻害されていない（例えば、本来の立体的コンフォメーション等を維持している）ので、これを質量分析、ＮＭＲ、ＸＲＤ等の手段により解析することができる。
【００３３】
なお、中間工程において一旦形成した複合体を解離させて、まず第２の生体物質を回収した後に、担体に光固定化した生体物質の回収工程を行うこともできるので、複合体を構成する一方の生体物質を回収できないと言う不具合もなく、その生体物質が貴重又は高価なものである場合のコスト上のロスを生じない。
（第４発明の効果）
第４発明のように、中間工程において複合体の形成とその検出とを行うことで、生体物質の光固定化・回収方法の、バイオリアクター、バイオセンサー、バイオアッセイ用試験片又はプロテオーム解析用プロテインチップ等の多様な用途への展開を図ることができる  。
（第５発明の効果）
上記の第４発明における複合体の検出は、例えば第５発明のように複合体を構成する第２の生体物質に備えさせた検出マーカーによって行うことができる。
（第６発明の効果）
又、上記の第４発明における複合体の検出は、例えば第６発明のように、担体に所定の構成で金属薄膜層を設けたもとで、ＳＰＲ法を利用した原理により行うこともできる。
【００３４】
これは即ち、表面プラズモン共鳴センサーである。表面プラズモン共鳴センサーにおいて、検出用の第２の生体物質あるいは複合体そのものを活性状態あるいは生存状態のままで回収することのメリットは大きい。
（第７発明の効果）
光固定化材料の種類は、第１発明の定義に該当する限りにおいて限定されないが、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料であることが、特に好ましい。このような材料では、シス−トランス光異性化による分子レベルの運動が光固定化材料を可塑化させ、光変形を容易にする。
（第８発明の効果）
上記第７発明における「化学構造」として、第８発明のように、アゾ基を有する色素構造を特に好ましく例示できる。アゾ基を有する色素構造（とりわけ、アゾベンゼン構造）を含む材料は、シス−トランス光異性化による分子レベルの運動に基づき光固定化材料を可塑化させ、光変形を容易にする効果が、とりわけ著しい。
（第９発明の効果）
第９発明のように、固定化工程及び／又は回収工程における光照射は、フォトンエネルギーの低い光（例えば、可視光）を用いることが好ましい。フォトンエネルギーの高い光（例えば、紫外光）を用いると、固定化対象である生体物質を失活させたり、損傷させたりする恐れがある。但し、好ましいフォトンエネルギーの具体的な基準は、固定化対象である生体物質の種類や、光照射の環境等により変動するので、一律に規定することはできない。
【００３５】
又、固定化工程及び／又は回収工程における光照射は、生体物質周囲の温度上昇が、その生体物質の機能を損なわない温度域に止まるようなパワーの光を用いることが好ましい。但し、好ましい光のパワーの具体的な基準は、固定化対象である生体物質の種類や、光照射の環境等により変動するので、一律に規定することはできない。
（第１０発明の効果）
第１０発明に係る表面プラズモン共鳴センサーは、（イ）の担体と、（ロ）の光照射システムと、（ハ）の表面プラズモン測定システムと、（ニ）の負荷手段の各要素を備えるので、検出用の第２の生体物質あるいは複合体そのものを活性状態あるいは生存状態のままで回収することができる。しかも、生体物質の固定化、複合体の形成及び回収に関わる担体、光照射システム及び負荷手段を非常に安価かつ簡易に構成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
次に、本願の第１発明〜第１０発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。
【００３７】
〔生体物質の光固定化・回収方法〕
本発明に係る生体物質の光固定化・回収方法においては、少なくとも表層部に光固定化材料を用いた担体の表面に生体物質を配置したもとで、光照射によって生体物質を担体表面に固定化する固定化工程と、固定化した生体物質を光照射及び機械的外力（主として、穏やかな機械的外力）の負荷によって担体の表面から脱離させ回収する回収工程とを有する。
【００３８】
上記の担体は、光固定化材料からなるものであり、又は無機材料あるいは有機材料を用いた基材の少なくとも表層部に光固定化材料を用いたものである限りにおいて、その形態、材質、用途等を限定されない。担体の形態を幾つか例示すれば、ＤＮＡチップ等のような比較的小さなチップの形態、カラム等に充填するための粒体等の形態、比較的大きな固定的反応床の形態、簡便なイムノアッセイ等に用いる小サイズの試験紙の如き形態、顕微鏡観察に用いられるスライドガラスの如き形態等が挙げられる。又、担体の使用目的によっては、後述のように担体の表層部において光固定化材料層の下層に金属薄膜層を設けるなど、担体において任意の構成要素を追加することができる。
【００３９】
上記の生体物質の「配置」とは、生体物質を担体の表面に対して接触した状態に置き、あるいは接触可能な状態に置くことを言う。そのためには、例えば光固定化材料と生体物質との親和性を利用して生体物質を担体の表面に安定的に接触させたり、生体物質を含む水や緩衝液等に担体を浸漬して光照射を行ったり、あるいは生体物質を含む少量の水や緩衝液等を担体の表面に滴下して光照射を行ったりすることができる。光固定化材料が本来的に親水性の不足し勝ちな高分子材料である場合、その高分子に親水性基を持たせて生体物質との親和性を高めると、担体の表面に生体物質を安定的に配置し易くなる。
【００４０】
上記の「穏やかな機械的外力の負荷」としては、担体表面に接する液体をある程度の流速で流動又は揺動させたり、撹拌したりすることが、好ましく例示される。担体及び／又はその表面に接する液体に対する加振（例えば、機械的振動又は超音波振動の負荷）も例示される。
【００４１】
又、本発明に係る生体物質の光固定化・回収方法においては、固定化工程と回収工程との間において、担体の表面に固定化した生体物質を検出、利用又は解析する中間工程を行うこともできる。そして更に、この中間工程が、生体物質に対して単一種類の第２の生体物質を特異的に吸着又は反応させ、又は複数種類の第２の生体物質を順次特異的に吸着又は反応させる複合体形成を含み、かつ、前記回収工程においては、この複合体を担体の表面から脱離させ回収する、と言う内容とすることもできる。又、この回収工程では、一旦形成して検出、利用又は解析に供した複合体を、その構成要素たる生体物質単位に解離させ、解離した第２の生体物質をまず回収した後に担体に固定化した生体物質を回収し、又は担体に固定化した生体物質のみを回収することもできる。
【００４２】
更に、上記の中間工程においては前記複合体の形成及び検出を行うこともできる。即ち、第２の生体物質群の中に、固定化した生体物質に特異的に吸着され又は反応する生体物質が含まれるか否かを検出することを目的として、複合体の形成を行うこともできる。この場合、第２の生体物質群には検出マーカーを備えさせることができる。検出マーカーとしては、生体物質に対するいわゆる蛍光標識が好ましいが、放射性元素での標識等のその他の検出マーカーも利用できる。更に高感度で検出するために、酵素免疫測定法を利用できる。検出法として、蛍光、ＲＩ以外に化学発光、電気化学発光、吸収スペクトル等も利用できる。更に、この場合、担体の表層部において光固定化材料層の下層に金属（例えば金）の薄膜層を設けたもとで、複合体の形成を、該複合体の形成による担体表層部の屈折率変化が与える表面プラズモン共鳴位置の変化によって検出することも可能である。
【００４３】
上記の複合体とは、担体に光固定化した生体物質と、これに対して特異的に吸着され又は反応する第２の生体物質とが結合したもの、あるいは更に、この第２の生体物質に対して他の１種又は２種以上の第２の生体物質が順次特異的に結合したものを言う。複合体を構成する任意の生体物質には、上記の検出マーカーを備えさせることができる。
【００４４】
複合体の具体的な内容は限定されないが、幾つかの例として、担体に光固定化した生体物質がポリヌクレオチドである場合のハイブリッド鎖、担体に光固定化した生体物質が抗原（又は抗体）である場合の抗原―抗体複合体、担体に光固定化した生体物質がレセプタータンパク質である場合のレセプター―リガンド複合体、担体に光固定化した生体物質が細胞又は細菌である場合のその膜タンパク質に対するシグナル伝達物質の結合、等が挙げられる。担体に光固定化した生体物質に対して複数種類の第２の生体物質が結合した複合体の例として、上記のように形成した抗原―抗体複合体における一方の生体物質に対して、更に検出マーカーとして機能する基質分解酵素等を特異的に結合させる場合等が挙げられる。
【００４５】
〔光固定化材料〕
本発明において、光固定化材料とは、光照射時に可塑化し、表面に配置された微小物体（生体物質）に対して光変形による固定化能力を示す材料を言う。そして光変形とは前記した定義の通りの意味である。
【００４６】
光固定化材料としては、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料が特に好ましく、そのような化学構造がアゾ基を有する色素構造であるものがとりわけ好ましい。アゾ基を有する色素構造として、アゾベンゼンやその誘導体の化学構造が好ましく例示される。
【００４７】
光固定化材料の好ましい例示の一つとして、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む成分（以下、このような成分を光反応性成分とも言う）を、マトリクスである材料中に含有する光固定化材料を挙げることができる。光反応性成分はマトリクス中において単に分散していても良いし、マトリクス材料の構成分子と化学結合や水素結合等により結合していても良いが、後者の含有形態が特に好ましい。マトリクス材料としては、通常の高分子材料等の有機材料や、ガラス等の無機材料を用いることができるが、とりわけ高分子材料が好ましい。
【００４８】
高分子材料の種類は限定されないが、高分子の繰り返し単位の中にウレタン基、ウレア基又はアミド基を含むものが、耐熱性の点で好ましい。なぜなら、本発明の光固定化材料は、意図された光照射によっては可塑化するが、自然光や通常の室内照明光のようなフォトンエネルギー、パワー共に小さい光の現実的に不可避の照射によっては可塑化しないことが好ましく、更にそのような特性の経時的な安定性も求められるので、それらの点からは、ガラス転移温度が１００°Ｃ以上であることが好ましいと考えられるからである。勿論、ガラス転移温度が１００°Ｃ未満である光固定化材料も使用可能である。
【００４９】
光反応性成分を含む高分子材料の好適な例を、以下の「化１」ないし「化４」に示す。「化１」ないし「化４」において、−Ｘはニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アルデヒド基又はカルボキシル基を、―Ｙ―は―Ｎ＝Ｎ―、―ＣＨ＝Ｎ―又は―ＣＨ＝ＣＨ―を、―Ｒ―はフェニレン基、オリゴメチレン基、ポリメチレン基又はシクロヘキサン基を、それぞれ示す。
【００５０】
【化１】
2005091128.tif 000003
【００５１】
【化２】
2005091128.tif 000004
【００５２】
【化３】
2005091128.tif 000005
【００５３】
【化４】
2005091128.tif 000006
〔生体物質〕
本発明において、生体物質とは、ポリペプチド、糖鎖、ポリヌクレオチド、オルガネラ、細胞、細菌、ウイルス又はこれらの集合体を言う。
【００５４】
ポリペプチドとしては、酵素、抗原、抗体、細胞膜レセプタータンパク質その他の生物細胞において発現する各種のタンパク質が例示される。糖鎖としては、Ｎ−グルコシド型糖鎖、Ｏ−グルコシド型糖鎖が例示される。ポリヌクレオチドとしては、１本鎖又は２本鎖以上のＤＮＡ及び／又はＲＮＡが挙げられる。より具体的には、一塩基多型部を含むＤＮＡ断片、制限酵素断片又はマイクロサテライト部を含むＤＮＡ断片ｍＲＮＡやその断片、ｃＤＮＡやその断片、ゲノムＤＮＡ断片等が例示される。
【００５５】
生体物質は、例えばレーザートラッピング等を利用して担体表面の特定の部位に配置したもとで光固定化しても良いし、照射光の照射領域あるいは照射強度に一定の分布を与えることにより、多数の生体物質を特定の分布パターンに従って担体表面に光固定化しても良い。担体の表面には、ランダムに又は特定の分布パターンに従って１種類の生体物質のみを光固定化しても良く、ランダムに又はそれぞれ特定の分布パターンに従って２種類以上の生体物質を光固定化しても良い。
【００５６】
〔光照射〕
照射光としては、伝播光、近接場光又はエバネッセント光等の任意の光を利用できる。光源は特に限定されるものではなく、キセノンランプ、ＬＥＤあるいはレーザー等から任意に選択される。レーザーを用いた場合は、その偏光特性を利用することができる。照射光としては、可視光等のフォトンエネルギーの低い光を用いて光照射を行うことが好ましく、あるいは、生体物質周囲の温度上昇が、その生体物質の機能を損なわない温度域に止まるようなパワーの光を用いて光照射を行うことが好ましい。
【００５７】
光照射の方法として、上記のように照射光の照射領域あるいは照射強度に一定のパターンに従う分布を与えることも好ましいが、そのための手段として、例えばフォトマスクを利用したり、細く絞った集光ビームを特定のパターンに従って照射することができる。
【００５８】
〔表面プラズモン共鳴センサー〕
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサーは、少なくとも、表層部に光固定化材料層とその下層の金属薄膜層とを備える前記担体と、担体の表面に対して上記のような光照射を行うことができる光照射システムと、担体の表面に固定化した生体物質の複合体形成による担体表層部の屈折率変化を検出できる表面プラズモン測定システムと、担体の表面に対する前記したような穏やかな機械的外力の負荷手段とを備える。
【００５９】
本発明に係る表面プラズモン共鳴センサーは、後述の実施例において説明するように、上記した各要素が一体的な複合装置として構成されても良いし、機械的な意味では要素又は要素群ごとに独立して構成されながら、全体として表面プラズモン共鳴センサーのシステムを形成するように構成されても良い。
【実施例】
【００６０】
｛実施例１〜４：生体物質の光固定化、複合体形成及び回収｝
（実施例１：光固定化材料の合成）
高分子光固定化材料の合成を常法に従い行った。まず、公知のジアゾカップリング法を用いて下記の「化５」に示す化合物を合成した。次に、公知の酸クロリド反応により、下記の「化６」に示す化合物を合成した。これらの化合物においては、アゾベンゼン構造部分が光反応性成分を構成している。
【００６１】
【化５】
2005091128.tif 000007
【００６２】
【化６】
2005091128.tif 000008
市販のメタクリル酸メチル（ＭＭＡ：和光純薬製）を入手し、減圧蒸留により重合禁止剤を取り除いておいた。そして、「化６」に示す化合物０．３６２ｇ（０．００１モル）と、ＭＭＡ０．６００ｇ（０．００６モル）とを共重合させた高分子光固定化材料を合成した。
【００６３】
１００ｍＬ容のなすフラスコに上記の各モノマーを上記の割合で投入・混合した後、ジメチルホルムアミド５０ｍＬと２，２−アゾイソブチロニトリル８２ｍｇを加えた。なすフラスコにゴム栓をした後、窒素を１時間バブリングして系内の酸素を取り除いた。次に窒素をバブリングしたままでなすフラスコを６０°Ｃで２時間加熱した。その後、なすフラスコから反応溶液を取り出し、メタノールを用いて再沈殿させた。このような再沈殿を３回繰り返した後に減圧蒸留させ、実施例１に係る２元共重合の高分子光固定化材料を得た。
【００６４】
（実施例２：高分子光固定化材料フィルムの作製）
実施例１に係る高分子光固定化材料の１２．５ｍｇをピリジン２ｍＬに溶解し、ポア径０．２μｍのフィルターでろ過した。このろ液をＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス社製）表面に滴下し、このスライドガラスを回転数４０００ｒ．ｐ．ｍ．でスピンキャストして、スライドガラスの表面に高分子光固定化材料フィルムを作製した。この高分子光固定化材料フィルムは、約２０ｎｍの均一な膜厚であることを吸光度測定により確認した。
【００６５】
（実施例３：光固定化担体への抗原の固定化と抗原抗体反応）
実施例２に係る光固定化材料フィルムを形成したスライドガラスを１ｃｍ平方の大きさにカットして、光固定化担体を作製した。この光固定化担体における光固定化材料フィルムの表面に、第１の生体物質としてインドジカルボサイアニン系の蛍光物質Ｃｙ３で標識したウサギＩｇＧを０．０１ｍｇ／ｍＬ含有するリン酸緩衝液を１μＬ滴下した。そして水が自然乾燥した後に、波長４７０ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２  の光をフィルムの表面側より３０分間照射した。その後直ちにリン酸緩衝液を用いて光固定化担体を洗浄し、光固定化材料フィルムに固定化されなかったＩｇＧを洗い流した。蛍光顕微鏡を用いてＩｇＧの固定化領域面を観察したところ、Ｃｙ３に由来する直径約２ｍｍの円形状のスポットを確認した。
【００６６】
次に、この光固定化担体における光固定化材料フィルムの表面に、第２の生体物質としてインドジカルボサイアニン系の蛍光物質Ｃｙ５で標識したヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を０．０１ｍｇ／ｍＬ含有するリン酸緩衝液を２μＬ滴下した。そしてその光固定化担体を温度３７°C 、湿度８５％ＲＨの恒湿槽に３０分間保持した。次に、リン酸緩衝液を用いて光固定化担体を３回洗浄した。蛍光顕微鏡を用いてヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体の固定化領域面を観察したところ、上記した直径約２ｍｍの円形状の同一のスポットから、Ｃｙ３に由来する蛍光とＣｙ５に由来する蛍光とを同時に発していることを確認した。即ち、光固定化担体に固定化した第１の生体物質たるウサギＩｇＧに対する第２の生体物質たるヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体の吸着を確認することができた。
【００６７】
（実施例４：生体物質の回収と複合体形成の確認）
実施例３のように抗原と抗体とが固定化された状態の光固定化担体を２個用意し、それぞれ内径約１．２ｃｍの透明プラスチックチューブに入れて、これらのチューブにリン酸緩衝液を各１ｍＬ滴下した。そのうちの１本の透明プラスチックチューブの側面には青色ＬＥＤを配置し、チューブ内の光固定化担体にＬＥＤからの光を照射しながら、そのままローテータを用いて撹拌した（実施例４）。他１本の透明プラスチックチューブは、光が当たらないようにアルミ箔で完全に被覆した状態で、ローテータを用いて撹拌した（比較例４）。
【００６８】
これらの撹拌を開始した後２４時間を経過した時点で撹拌を終了し、それぞれの透明プラスチックチューブからリン酸緩衝液を回収して、各リン酸緩衝液の蛍光を分光蛍光光度計により検出した。その結果、実施例４に係るリン酸緩衝液ではＣｙ３とＣｙ５との蛍光スペクトルを確認した。比較例４に係るリン酸緩衝液ではＣｙ３とＣｙ５との蛍光スペクトルを確認できなかった。
【００６９】
又、実施例４に係るリン酸緩衝液におけるＣｙ５由来の蛍光の励起スペクトルを測定すると、Ｃｙ５の吸収ピークに帰属される約６３０ｎｍ付近のピークと、Ｃｙ３の吸収ピークに帰属される約５３０ｎｍ付近のピークとを確認することができた。この結果は、Ｃｙ３からＣｙ５への励起エネルギー移動が生じていることを示唆している。励起エネルギー移動機構を表すフェルスターの式から考えると、系内でのＣｙ３とＣｙ５との距離が約１００ｎｍ以内であることが分かるので、Ｃｙ３を含むウサギＩｇＧと、Ｃｙ５を含むヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体とが結合して抗原―抗体複合体を形成していることが示唆される結果である。
【００７０】
｛実施例５〜６：光固定化担体チップを用いたＳＰＲ角度変化検出｝
（実施例５：金膜表面への高分子光固定化材料フィルムの形成）
所定の大きさのガラス基板の表面に金を蒸着して膜厚５０ｎｍの金薄膜を形成した。次に、実施例１で得た高分子光固定化材料６ｍｇをピリジン２ｍＬに溶解し、ポア径０．２μｍのフィルターでろ過した。このろ液を上記の金薄膜の表面に５０μＬ滴下し、回転数４０００ｒ．ｐ．ｍ．でスピンキャストして、ガラス基板の金薄膜の表面に高分子光固定化材料フィルムを形成してなるＳＰＲセンサーチップを得た。ＳＰＲセンサーチップにおける高分子光固定化材料フィルムの膜厚は５ｎｍであることを、反射吸光度測定により確認した。
【００７１】
ＳＰＲセンサーチップの表面に、第１の生体物質としてヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を０．０１ｍｇ／ｍＬ含有するリン酸緩衝液を１μＬ滴下した。そして水が自然乾燥した後に、波長４７０ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２  の光をＳＰＲセンサーチップの表面側より３０分間照射した。その後直ちに、リン酸緩衝液を用いてＳＰＲセンサーチップを洗浄して、ＳＰＲセンサーチップに固定化されなかったヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を洗い流した。
【００７２】
（実施例６：ＳＰＲ角度変化の検出）
上記のヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化したＳＰＲセンサーチップを、チップの表面における一定の生体物質の反応によるチップ表層部の屈折率変化を検出できる構成の表面プラズモン測定システムを備えたＳＰＲ測定装置に取り付けた。そして第２の生体物質としてのウサギＩｇＧを２０μｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液：Phosphate Buffered Saline ）溶液１００μＬを５０μＬ／ｍｉｎ．の流速でＳＰＲセンサーチップ上に流した。すると、このＰＢＳ溶液を流す前後でＳＰＲ角度が０．０２°変化した。このことは、ウサギＩｇＧが免疫反応によりＳＰＲセンサーチップの表面に結合したことを示している。
【００７３】
（実施例７：生体物質回収装置による抗体、抗原の回収）
上記のようにＳＰＲ角度を測定した後のＳＰＲセンサーチップをＳＰＲ測定装置から取り外し、図１に示し後述する生体物質回収装置に取り付けた。そして、ＳＰＲセンサーチップの表面に波長４７０ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２  の光を照射しながら、その表面にＰＢＳを流速５０μＬ／ｍｉｎ．で流して回収した。回収したＰＢＳを分析したところ、ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体とウサギＩｇＧとが合計で１ｎｇ含まれていた。
【００７４】
（実施例８：ＳＰＲ測定―回収複合装置と、抗体のみの回収）
図２に示し後述するＳＰＲ測定―回収複合装置を構成した。上記の実施例６と同様にしてヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化したＳＰＲセンサーチップ上にウサギＩｇＧを結合させた後、１０ｍＭの塩酸１００μＬを５０μＬ／ｍｉｎ．の流速でＳＰＲセンサーチップ上に流してウサギＩｇＧをＳＰＲセンサーチップの表面から除去した。続いてＰＢＳを５０μＬ／ｍｉｎ．の流速でＳＰＲセンサーチップ上に５分間流してｐＨを調整した。その後、照射光を切り替え、波長４７０ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２  の光を照射しながら、その表面にＰＢＳを流速５０μＬ／ｍｉｎ．で流した。回収したＰＢＳを４０μＬを分析したところ、ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体が１ｎｇ含まれていたが、ウサギＩｇＧは含まれていなかった。
【００７５】
（実施例９：生体物質回収装置）
図１に示す生体物質回収装置は、上部が開口した受け皿状の支持部材１と、その上端開口部に密着できるように構成された回収用部材２を備える。回収用部材２は、例えばガラスや透明プラスチックのような適宜な透明材料からなり、その中央底部には、ゴムや軟質のプラスチック等の軟質のシール材３で包囲された回収スペース４を開口している。回収スペース４は流路５によって上部の１対の送液管６に連絡されている。又、この回収スペース４は、支持部材１と回収用部材２を上記のように組み付けたとき、支持部材１の上端開口部に通じる。回収用部材２の上方には光照射器７が設置されている。
【００７６】
図１に示す生体物質回収装置の使用に当たり、上記のようにヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体やその抗原との複合体等の生体物質を固定化したＳＰＲセンサーチップ８（金属薄膜を有しない生体物質光固定化担体でも良い）を、その生体物質固定化面を上側にして受け皿状の支持部材１にはめ込み、その上に回収用部材２を密着させる。この時、生体物質の固定化領域は回収スペース４に面して位置する。そして、光照射器７より光照射を行いつつ、１対の送液管６を通じて図示省略の送液アクチュエータにより緩衝液等の回収液を一定の流速で１方向へ送液すると、ＳＰＲセンサーチップ８に固定化されていた生体物質が脱離して、回収液中に回収されるのである。
【００７７】
（実施例１０：ＳＰＲ測定―回収複合装置）
図２に示すＳＰＲ測定―回収複合装置は、ガラスや透明プラスチックのような適宜な透明材料からなる基板部材９の中央表面部（図の上側面部）に、ゴムや軟質のプラスチック等の軟質のシール材１０で包囲された回収スペース１１を開口している。回収スペース１１は流路１２によって図示省略の送液管に連絡されている。基板部材９の下方には生体物質の光固定化及び回収に用いる光照射器１３が設置され、基板部材９の上方にはＳＰＲ測定用の光照射器１４及び受光器１５がそれぞれ光の反射角度に沿う位置に設置されている  。
【００７８】
図２に示すＳＰＲ測定―回収複合装置の使用に当たり、まず基板部材９の中央表面部（回収スペース１１の開口部）にＳＰＲセンサーチップ８を、その生体物質固定化面を下側にして、かつ、生体物質の固定化領域が回収スペース１１の開口部に面して位置するように、載置する。そして、ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を含む溶液を流路１２によってＳＰＲセンサーチップ８の表面（下面）に流しつつ、下方より光照射器１３による光照射を行って、ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化する。次に、ウサギＩｇＧを含む溶液を流路１２によってＳＰＲセンサーチップ８の表面（下面）に流して、固定化されたヤギ由来抗ウサギＩｇＧ抗体の抗原―抗体複合体を形成させる。
【００７９】
その後、基板部材９の上面に所定形状のプリズム１６を密着状態に設置し（プリズム１６は予め設置しておいても良い）、ＳＰＲ測定用の光照射器１４から光照射することにより、プリズム１６と基板部材９との界面におけるその反射光を受光器１５で受けて、ＳＰＲ測定を行う。
【００８０】
そしてＳＰＲ測定の完了後、光照射器１３より再度の光照射を行いつつ、ＳＰＲセンサーチップ８の表面（下面）に対して緩衝液等の回収液を流路１２によって一定の流速で送液することにより、ＳＰＲセンサーチップ８に固定化されていた抗原―抗体複合体が脱離して、回収液中に回収されるのである。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明は、各種の極めて微小な生体物質を担体上に固定化して解析等を行い、複合体を形成し、かつこれらを損傷等させることなく回収する方法や、この方法の応用たる検体を活性又は機能を維持した状態で回収可能な表面プラズモン共鳴センサーを提供するので、生体物質の解析等に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例に係る生体物質回収装置を簡略化して示す図である。
【図２】実施例に係るＳＰＲ測定―回収複合装置を簡略化して示す図である。
【符号の説明】
【００８３】
１          支持部材
２          回収用部材
３          シール材
４          回収スペース
５          流路
６          送液管
７          光照射器
８          ＳＰＲセンサーチップ
９          基板部材
１０        シール材
１１        回収スペース
１２        流路
１３        光照射器
１４        光照射器
１５        受光器
１６        プリズム
【図１】
2005091128.tif 000009
【図２】
2005091128.tif 000010