(57)【要約】【課題】ヒトオーロラＡ蛋白質に対する抗体の提供。【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドに対する抗体又はその断片。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドに対する抗体又はその断片。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドとキャリア蛋白質との複合体を免疫原として得られた請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されているハイブリドーマより得られる請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、当該哺乳動物と同種又は異種の動物由来の自己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクローン化することにより得られる、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
ハイブリドーマが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されたものである、請求項４記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項４又は５記載のハイブリドーマを培養し、培養上清から請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラ蛋白質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患治療用医薬組成物。
【請求項８】
前記疾患が、悪性腫瘍（癌）である請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記悪性腫瘍が、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍からなる群から選択されるものである請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラＡ蛋白質の活性化阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラＡ蛋白質のリン酸化阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オーロラ蛋白質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患、特に癌の治療に使用することができるヒトオーロラ蛋白質に対するモノクローナル抗体又はその断片、このモノクローナル抗体又は断片を有効成分として含有する医薬組成物等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）キナーゼファミリーは、酵母からヒトまで保存されている細胞周期依存的なセリン−スレオニンキナーゼである。出芽酵母ではＩｐｌ１ｐ、分裂酵母ではＡｒｋ１のそれぞれ１種類が存在し、ショウジョウバエではａｕｒｏｒａとＩＡＬ、線虫ではＡＩＲ−１とＡＩＲ−２の各２種類が存在することが知られている。一方、哺乳動物では、オーロラＡ（オーロラ２ともいう）、オーロラＢ（オーロラ１ともいう）及びオーロラＣ（オーロラ３ともいう）の少なくとも３種類のアイソフォームが存在する。これら３種類の蛋白質はその細胞内局在が分類の１つの基準になっている。すなわち、哺乳動物細胞内ではオーロラＡは中心体とスピンドル微小管に、オーロラＢは動原体（ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ）とスピンドルミッドゾーン（ｓｐｉｎｄｌｅ  ｍｉｄｚｏｎｅ）に、オーロラＣは分裂後期（ａｎａｐｈａｓｅ）に限定して中心体に局在することが報告されている。
【０００３】
ヒトオーロラＡは、ヒトの乳癌において高頻度に遺伝子増幅が起こっている第２０番染色体の長腕１３の領域に存在する遺伝子として同定された［例えば、非特許文献１参照］。ヒトオーロラＡ遺伝子の増幅とｍＲＮＡの発現上昇は乳癌以外にも大腸癌等の他の細胞株でも確認されている。さらに、繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３やＲａｔ−１においてオーロラＡのｍＲＮＡを過剰発現させるとこれらの細胞が癌細胞としての特徴を示すようにトランスフォームすることから、オーロラＡは癌遺伝子として位置付けられている［例えば、非特許文献２参照］。オーロラＡ蛋白質の発現量を細胞周期の点から見た場合、オーロラＡ蛋白質の発現量はＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に分解される［例えば、非特許文献２参照］。それに伴い、オーロラＡのキナーゼ活性もまたＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に低下する。オーロラＡ蛋白質はそのＮ末端領域にＫＥＮボックスとＣ末端領域に破壊ボックス（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｂｏｘ）の２つのユビキチン依存的な蛋白質分解ドメインを保有していることから、オーロラＡ蛋白質の分解はユビキチン化分解によるものと考えられる。実際、オーロラＡがＧ１期以降にＡＰＣ／Ｆｉｚｚｙ−ｒｅｌａｔｅｄ（Ｃｄｈ１）複合体によりユビキチン化分解を受けることが報告されている［例えば、非特許文献３，４参照］。
【０００４】
ところで、オーロラＡの過剰発現による癌化形質転換能（トランスフォーメーション）にはオーロラＡのキナーゼ活性が必要である［例えば、非特許文献２参照］。したがって、オーロラＡのキナーゼ活性の特異的に阻害剤は、オーロラＡの過剰発現に起因する癌の抗癌剤として有用と考えられるがそのような阻害剤は知られていない。
【非特許文献１】Ｓｅｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １４：２１９５−２２００（１９９７）
【非特許文献２】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １７：３０５２−３０６５（１９９８）
【非特許文献３】Ｈｏｎｄａ，  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９：２８１２−２８１９（２０００）
【非特許文献４】Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．，５１９：５９−６５（２００２）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、オーロラ蛋白質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患、特に癌の治療に使用することができるヒトオーロラ蛋白質に対するモノクローナル抗体又はその断片、このモノクローナル抗体又は断片を有効成分として含有する医薬組成物等を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ヒトオーロラＡ蛋白質の部分断片を免疫原として作製したモノクローナル抗体を使用することによって、ヒトオーロラＡ蛋白質活性化の鍵となる２８８番アミノ酸（スレオニン）のリン酸化反応を特異的に阻害することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）である。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドに対する抗体又はその断片。
（２）  配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドとキャリア蛋白質との複合体を免疫原として得られた上記（１）の抗体又はその断片。
（３）  独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されているハイブリドーマより得られる上記（１）又は（２）の抗体又はその断片。
（４）  配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドとキャリア蛋白質との複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、当該哺乳動物と同種又は異種の動物由来の自己増殖能を有する細胞とを融合し、当該融合細胞をクローン化することにより得られる、上記（１）〜（３）のいずれかの抗体を産生するハイブリドーマ。
（５）  ハイブリドーマが、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５又はＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されたものである、上記（４）のハイブリドーマ。
【０００８】
（６）  上記（４）又は（５）のハイブリドーマを培養し、培養上清から上記（１）〜（３）のいずれかのモノクローナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
（７）  上記（１）〜（３）のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラ蛋白質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患治療用医薬組成物。
（８）  前記疾患が、悪性腫瘍（癌）である上記（７）の医薬組成物。
（９）  前記悪性腫瘍が、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍からなる群から選択されるものである上記（８）の医薬組成物。
（１０）  上記（１）〜（３）のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラＡ蛋白質の活性化阻害剤。
（１１）  上記（１）〜（３）のいずれか抗体又はその断片を有効成分として含有する、オーロラＡ蛋白質のリン酸化阻害剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、悪性腫瘍の治療に使用することができるヒトオーロラ蛋白質に対するモノクローナル抗体及びその断片である。以下に、本発明のハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の調製法及びその応用について詳述する。
【００１０】
１．本発明のモノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は以下のようにして調製することができる。まず、本発明で免疫原として使用する抗原ペプチドとしては、オーロラＡ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末から２８８番目のリン酸化されたスレオニンを含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。本抗原ペプチドは、天然由来のオーロラＡ蛋白質を蛋白質分解酵素で分解後、分別精製したものものでもよく、また、化学合成法により製造されたものでもよい。なお、化学合成法としては、公知の文献［ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ２  ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発  続第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１］などに記載されている方法が挙げられる。
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体を製造するには、まず、配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン、スカシガイヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等のキャリア蛋白質を結合させた複合体を、必要に応じて、完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等のアジュバントとともに適当な温血動物に投与（免疫）する。次いで、当該免疫感作動物由来の脾臓細胞と、当該温血動物と同種又は異種の温血動物の無限増殖可能な細胞とを融合し、この融合細胞をクローン化することにより製造することができる。ここで、使用可能な温血動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるがこれらに限定されない。免疫に際しての免疫原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等のいずれの経路でも投与することができる。
【００１２】
より具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに、免疫原を数日〜数週間おきに数回接種する。接種量は一匹当たり、一回につき１〜１０００μｇの免疫原を使うのが好ましい。次いで、免疫されたマウスより脾臓を摘出し、遠心分離により抗体産生細胞（脾臓細胞）を得る。この細胞は増殖能が無いので、無限増殖能を有する細胞と融合させる。無限増殖能を有する細胞としてはミエローマ細胞等のリンパ球様細胞が特に好ましい。ミエローマ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種の動物のものを用いるのが好ましく、また、抗体を分泌しないものを選択するのが好ましい。かかるミエローマ細胞としては、例えばマウスミエローマ細胞Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）［Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１−５１９（１９７６）］、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）［Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３Ｘ  ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−９）［Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）］などが挙げられる。抗体産生細胞とミエローマ細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれら細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液（又は懸濁液）で処理することにより実施できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数比で約３：１〜１０：１とするのが好ましい。
【００１３】
得られた融合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を増殖させ、各ウェルにおいて産生される抗体を、免疫原固相化プレートを使用するＥＬＩＳＡ法において試験し、その結果から所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択する。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをアルキレンジアルデヒドおよび塩基性ポリペプチド又は塩基性合成ポリマーの存在下に固相化させて、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド特異抗体アッセイプレートを調製する。このアッセイプレートを用い、上記融合細胞の産生する抗体をＥＬＩＳＡ法で試験し、配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。その際、対象として配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されていないペプチドには反応しない抗体であることを確認する。
【００１４】
なお、本発明において得られたオーロラＡ蛋白質の２８８番目のアミノ酸を含む領域に結合し、当該部位のリン酸化を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株（名称：ｐＡ７．２．５）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成１４年１１月１４日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５として寄託されている。同様の活性を有する、ハイブリドーマ株（名称：ｐＡ１２．１．９）は、平成１５年３月５日付で受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されている。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、上記において選択されたハイブリドーマを適当な培地を用いて培養して得られる培養上清から常法（例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、プロティンＡを用いるアフィニティークロマトグラフィー等）により容易に取得することができる。また、上記ハイブリドーマを適当な哺乳動物（例えば、マウス等）の腹腔内に接種し、ハイブリドーマ細胞を増殖させた後、当該哺乳動物の腹水、血清等から所望のモノクローナル抗体を採取することもできる。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、上記以外の方法によっても得ることができる。例えば、本発明分野においてにおいては、組換えＤＮＡ技術を利用する抗体の製造方法が種々提案されており、そのような方法によってもこの発明の抗体は得ることができる。例えば、まず上記のようにして温血動物を免疫感作し、当該免疫感作動物から脾臓細胞を調製するか又はハイブリドーマを調製したり、常法によりヒトを含む温血動物から選ばれるいずれかの動物から採取したリンパ球を生体外で抗原刺激することにより、この発明の抗体の産生能を有する細胞を得る。次に、斯かる抗体産生細胞からＲＮＡを採取し、そのＲＮＡを鋳型として用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法に準じて、この発明の抗体における相補性決定領域を含む部分をコードするＤＮＡをクローン化する［例えば、エス・タラン・ジョーンズら、「バイオテクノロジー」、第９巻、８８−８９頁（１９９１年）参照］。かかるＤＮＡのクローン化は、発現ライブラリー（ファージ・ディスプレー・ライブラリー）の検索によることもできる。クローン化されるＤＮＡを、適宜の免疫グロブリンの定常領域をコードする慣用のＤＮＡと連結すれば、この発明の抗体をコードするＤＮＡが得られる。得られたＤＮＡを用いて、オーロラＡ蛋白質の２８８番目のアミノ酸を含む領域に対する結合特異性を実質的に消失させない範囲でその一次構造を改変するように蛋白質工学的手法を実施することもできる。前記ＤＮＡを当該技術分野において周知の発現系を用いて形質転換細胞により発現させ、発現された抗体を精製すれば、組換えＤＮＡ技術による本発明の抗体が得られる。以上のような組換えＤＮＡ技術を適宜組み合わせて実施することにより、本来ヒト以外の温血動物のリンパ球が産生する抗体と実質的に同等の構造・機能の抗体のほか、ヒトのリンパ球が産生する抗体における定常領域を含む、いわゆる、「ヒト化抗体」及び「キメラ抗体」、さらには、ヒトのリンパ球が産生する抗体と実質的に同等の構造・機能を有する、いわゆる、「ヒト抗体」を得ることもできる。なお、トリスタン・ジェイ・ボーンら、「ネイチャー・バイオテクノロジー」、第１６巻、５３５〜５３９頁（１９９８年）には、ヒト化抗体、キメラ抗体及びヒト抗体に関する手法が概説されている。ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体としてのこの発明による抗体は、後述するように、ヒトへの投与を前提とする医薬用途にとりわけ有利に用いることができる。
【００１７】
得られたモノクローナル抗体は、そのまま使用することもできるが、活性フラグメントとして断片化して使用することもできる。活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の各種フラグメントで、オーロラＡ蛋白質の２８８番目のアミノ酸を含む領域に結合し、リン酸化阻害活性が失われていないものであればよい。これら活性フラグメントの調製は、精製モノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することで行うことができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参照）。
【００１８】
２．薬学的応用
本発明のモノクローナル抗体は、オーロラＡ蛋白質のＮ末から２８８番目のリン酸化スレオニンに結合し、オーロラＡ蛋白質の活性化を阻害することができる。従って、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、オーロラＡ蛋白質の発現又は過剰発現により特徴付けられる疾患においてその治療等に有用であると考えられる。特に、上記のヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体としての本発明の抗体は、ヒト以外の動物起源の抗体に比べて、ヒトに投与した際に抗原性を示し難いので、ヒトへの投与を前提とするこれらの医薬用途にとりわけ有用である。ここで、疾患としては、悪性腫瘍（癌）、例えば、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍等が挙げられる。
【００１９】
ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体としての本発明の抗体は、上記の通りヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内で免疫原性を示さず、その効果が長期間にわたり持続することが期待される。本発明のヒト化抗体は単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【００２０】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
【００２１】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【００２２】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
【００２３】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００２４】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  本発明のモノクローナル抗体の作製
（１）  免疫原の調製  オーロラＡ蛋白質のアミノ酸配列のＮ末から２８８番目のスレオニンを含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の６番目のスレオニンがリン酸化されたペプチドを化学合成後、システイン残基にキャリア蛋白質としてＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）を結合させることにより、免疫原を調製した。すなわち、合成樹脂Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｅｌｏａｄｅｄ  Ｒｅｓｉｎ（０．５２  ｍｍｏｌ／ｇ，  ０．１００  ｍｍｏｌ，  ５．０  ｍＬ）を用いた。この樹脂１９２ｍｇを用いて合成を開始し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ  、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ  、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ  、Ｆｍｏｃ−ＰＴＨＲ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次カップリングさせた。カップリングの後、ペプチド樹脂にＲｅａｇｅｎｔＫ（５％フェノール，５％チオアニソール，５％Ｈ２Ｏ，２．５％エタンジチオール／ＴＦＡ溶液）２ｍｌを加え、室温で２．５時間反応させた。氷冷下反応液にジエチルエーテル１０ｍｌを加えて１０分攪拌し、濾過しジエチルエーテル１０ｍｌで洗浄した。濾上物に酢酸水１０ｍｌを加えて３０分間攪拌後、樹脂を濾別し、酢酸水４ｍｌで洗浄した。濾洗液を凍結乾燥後、得られた粗ペプチドを酢酸水に溶解し、予め０．１％ＴＦＡ水で平衡化させた逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３６３−５（３０φ×２５０ｍｍ）に注入し、カラムを０．１％ＴＦＡ水で洗浄後、アセトニトリル濃度を２００分で３２％まで増加させ、流速７ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。溶出液をＡ２２０ｎｍでモニターし、目的物を含む画分を集め、凍結乾燥し、目的の配列を有するペプチド９４．７ｍｇを得た。得られたＳｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ（配列番号１）は、逆相系充填剤ＹＭＣ−ＰＡＣＫ  ＯＤＳ−ＡＭ  ＡＭ−３０３（４．６φ×２５０ｍｍ）を用いた、０％から６０％までの０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時間６．４３分を示し、そのアミノ酸分析値および質量分析値は理論値と一致した。
【００２５】
ペプチドを抗原として用いる場合には、ペプチドの免疫性を上げるために該ペプチドをキャリア蛋白質に結合させたものを、実際の免疫には使用するのが好ましい。キャリア蛋白質としては、当業者が選択可能なあらゆる蛋白質を使用することができるが、例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、ＫＬＨ  （キーホールリンペットへモシアニン）などが使用可能であるが、ＫＬＨが最も好ましい。ペプチドをキャリア蛋白質に結合する方法としては、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、マレイミドベンゾイルオキシスクシンイミド（ＭＢＳ）法などが利用可能であるが、ＭＢＳ法が最も好ましい。この方法は、免疫原として用いるペプチドのＣ末端部分にあらかじめＣｙｓを結合させておき、ＫＬＨのアミノ基とペプチドに結合させたＣｙｓのＳＨ基とを連結させる方法である。
【００２６】
（２）マウスの免疫
上記（１）で調製した免疫原１００μｇにアジュバント（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ社）１００μｌを加え、室温で５分間ｖｏｒｔｅｘし、エマルジョンを形成させた。これを８週齢ＣＤＦ１マウス（♀）の皮下に注入し、２週間毎に免疫を行った。数回の免疫後、抗体価が好ましい値になった時点で、免疫したマウスから脾臓を取り出し、定法に従って、ミエローマ細胞ＮＳ−１と融合させ，ハイブリドーマを作成することにした。
【００２７】
（３）本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製
まず、以下のようにしてハイブリドーマの生存・増殖を助けるためのフィーダー細胞を調製した（細胞融合処理の１〜２日前に準備）。すなわち、まず９６ウエル平底プレートには一枚あたり７ｍｌ弱（１ウエル当たり一滴）入るので、７×１２ｍｌの１×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地を準備した。一方、高週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）を６〜８匹用意した。ＰＢＳをシリンジに取り、腹腔内に６ｍｌ注入した。針を刺したまま丹念に腹部をｔａｐｐｉｎｇし、腹腔中のリンパ球を十分にＰＢＳ中に浸出させた。次いで、脂肪を吸ったり、腸管を傷つけたりしないように注意してＰＢＳを回収した。回収したＰＢＳを５０ｍｌ遠心チューブに集め、１，５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。３０ｍｌのＰＢＳで一度、細胞を洗浄した。洗浄後、残ったペレットをｔａｐｐｉｎｇした後、１×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地に懸濁した。得られた懸濁液を９６穴プレートのウエルに一滴ずつ分注することによりフィーダー細胞調製プレートを得た。
【００２８】
一方、ミエローマ細胞ＮＳ−１を以下のようにして調製した。ＮＳ−１細胞は、予め１０〜２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン存在下の１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地で培養することにより、復帰変異によるＨＧＰＲＴ活性の獲得を防いだ。融合処理当日に対数増殖期になるように、１０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ培地中で培養した。培養器中の細胞をはがし、５０ｍｌ遠心チューブに集めた。１，５００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。細胞を、一度ｗａｓｈｉｎｇした後、５ｍｌのＲＰＭＩに懸濁し、０．１〜１×１０８個／ｍｌの細胞数であることを確認し、このようにして得たミエローマ細胞ＮＳ−１を細胞融合に使用した。
【００２９】
また、Ｂ細胞を以下のようにして調製した。抗体産生能を高めるために融合処理の３〜４日前に、上記（２）において得られた感作マウスの静脈洞もしくは腹腔に可溶性免疫原蛋白質を１５０μｇ注射した。免疫したマウスより脾臓を取り出し、ＲＰＭＩを５ｍｌ入れた６ｃｍ  ｄｉｓｈに移した。ｄｉｓｈ内で脾臓を２本の注射針でできるだけ細かくほぐした。上清だけを１５ｍｌ遠心チューブに回収した。ＲＰＭＩ（ｐｌａｉｎ）を５ｍｌ加えて、残りの細胞を同様に回収した。１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引した後、ペレットをｔａｐｐｉｎｇした。ＲＰＭＩで１回洗浄後、ＲＰＭＩ５ｍｌに懸濁した。得られた懸濁液１０μｌに対し、４０μｌのＲＰＭＩを加え（５倍希釈）、細胞数が１×１０８個／ｍｌ以上存在することを確認した。
【００３０】
次いで、以下のようにして細胞融合処理を行った。予め０．５ｍｌの５０％ＰＥＧ／ＰＢＳ、１  ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ、９ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩをそれぞれ１５ｍｌ容チューブに取り３７℃で温めておいた。ＮＳ−１細胞：Ｂ細胞＝１：１０になるようにＮＳ−１細胞を取り、Ｂ細胞の入っているチューブに入れた。ｕｐ／ｄｏｗｎしてよく混ぜた後、チューブ一杯までＲＰＭＩを加え洗浄した。０．５ｍｌの５０％ＰＥＧ／ＰＢＳを先の長いパスチュアパイペットに取り、９０秒掛けてゆっくり添加した。このとき、ペレットが十分ほぐれるように混ぜ合わせた。１ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを６０秒掛けて同様に添加した。９ｍｌの２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを４分掛けてゆっくり加えた。洗浄後、２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩに懸濁した。得られた懸濁液を、フィーダー細胞を撒いたプレートに一滴ずつたらした。３〜４日後に２×ＨＡＴ・２０％ＦＣＳ−ＲＰＭＩを一滴ずつ添加した。融合処理１〜２週後にコロニーを形成しているウエルの細胞上清を採取し、数回にわたりＥＬＩＳＡを試行した。その結果、ここできわめて強い陽性の結果が得られたＮｏ．７．２．５（ｐＡ７．２．５と命名）およびＮｏ．１２．１．９（ｐＡ１２．１．９と命名）を選択した。
【００３１】
〔実施例２〕  本発明のモノクローナル抗体のリン酸化オーロラＡに対する特異性
本発明のモノクローナル抗体のリン酸化オーロラＡに対する特異性を以下のようにして調べた。すなわち、本発明のモノクローナル抗体が細胞内に存在する２８８番スレオニンがリン酸化されたオーロラＡ蛋白質を特異的に免疫沈降させることができるかどうか検討を行った。
【００３２】
プロテインＧアガロース（１：１  懸濁液２０μｌ）に本発明のモノクローナル抗体（２μｌ）を添加し、４℃で７５分間インキュベートして、プロテインＧアガロースに本発明のモノクローナル抗体を結合させる。
【００３３】
未処理およびノコダゾール処理したＨｅＬａ細胞の抽出液は、適量の細胞ペレットに対し、適量のＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１  ％  ＳＤＳ，  ０．５  ％  ＤＯＣ，  １  ％  ＮＰ−４０，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）を添加し、ホモジナイズ（必要な場合は超音波処理又はヌクレアーゼ処理によりＤＮＡを切断する）後、１００，０００  ｇで６０分間遠心することで上清に回収した。プロテインＧアガロースと本発明のモノクローナル抗体の複合体に、ＨｅＬａ細胞の抽出液を添加し、４℃で７５分間インキュベートした後、遠心（１，２００  ｇで１分間）により、免疫沈降産物を沈殿に回収した。定法に従って、免疫沈降物をサンプル処理したのち、ＳＤＳ添加のポリアクリルアミドゲル（濃度１０％）にて電気泳動を行った。コントロールとして抗オーロラ抗体（？  ｐａｎ−Ａｕｒｏｒａ）を用いて、免疫沈降を行った。
【００３４】
電気泳動終了後、泳動された蛋白質をナイロン膜に転写し、抗オーロラ抗体（？  ｐａｎ−Ａｕｒｏｒａ）を用いてイムノブロッティングを行った。その結果、本発明のモノクローナル抗体で免疫沈降を行わせた場合のみ（図１、レーン６）移動度の遅いオーロラＡのみが沈殿に回収された（図１、矢印）。従って、本発明のモノクローナル抗体では細胞に内在する２８８番スレオニンがリン酸化されたオーロラＡ蛋白質を特異的に認識し、かつ、免疫沈降法にも利用可能であることが明らかとなった。以上より、本発明のモノクローナル抗体は、非リン酸化オーロラＡには結合せず、リン酸化オーロラＡに特異的な抗体であることが判明した。
【００３５】
〔実施例３〕  本発明のモノクローナル抗体のオーロラＡに対する特異性
本発明のモノクローナル抗体のリン酸化オーロラＡに対する特異性を以下のようにして調べた。すなわち、本発明のモノクローナル抗体が細胞内に存在する２８８番スレオニンがリン酸化されたオーロラＡ蛋白質を特異的に免疫沈降させることができるかどうか検討を行った。ｇｌｕ−ｔａｇの付いたオーロラＡ遺伝子，オーロラＢ遺伝子およびオーロラＣ遺伝子をそれぞれ導入後ノコダゾール処理したＣＯＳ細胞の抽出液は、適量の細胞ペレットに対し、適量のＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１  ％  ＳＤＳ，  ０．５  ％  ＤＯＣ，  １  ％  ＮＰ−４０，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）を添加し、ホモジナイズ（必要な場合は超音波処理又はヌクレアーゼ処理によりＤＮＡを切断する）後、１００，０００  ｇで６０分間遠心することで上清に回収した。
【００３６】
プロテインＧアガロースと本発明のモノクローナル抗体の複合体に、ＣＯＳ細胞の抽出液を添加し、４℃で７５分間インキュベートした後、遠心（  １，２００  ｇで１分間）により、免疫沈降産物を沈殿に回収した。定法に従って、免疫沈降物をサンプル処理したのち、ＳＤＳ添加のポリアクリルアミドゲル（濃度１０％）にて電気泳動を行った。常法に従って、免疫沈降物をサンプル処理したのち、ＳＤＳ添加のポリアクリルアミドゲル（濃度１０％）にて電気泳動を行った。電気泳動終了後、泳動された蛋白質をナイロン膜に転写し、抗ｇｌｕ抗体（？  ｇｌｕ）を用いてイムノブロッティングを行った。
【００３７】
その結果、移動度の遅いオーロラＡのみが沈殿に回収された（図２、矢印）。従って、本発明のモノクローナル抗体では細胞に内在する２８８番スレオニンがリン酸化されたオーロラＡ蛋白質を特異的に認識することが明らかとなった。リン酸化酵素としての活性を持たないオーロラＡ（ＫＮ）（図２，レーン８）に対して、本発明のモノクローナル抗体が反応した。しかし、この反応はＣＯＳ細胞内にオーロラＡをリン酸化する上流キナーゼが存在することを示唆するものであって，  本発明のモノクローナル抗体の本質的な抗原特異性に影響を与えるものではない。以上より、本発明のモノクローナル抗体は、リン酸化オーロラＢ及びリン酸化オーロラＣには結合せず、リン酸化オーロラＡに特異的な抗体であることが判明した。
【００３８】
〔実施例４〕  本発明のモノクローナル抗体によるオーロラＡの活性化阻害
実施例１において得られた抗体によるを用いて、オーロラＡの活性化の阻害を調べた。すなわち、本発明のモノクローナル抗体の存在下または非存在下で，ＧＳＴを融合させたヒストンＨ３の部分ペプチド（ＧＳＴ−Ｈ３（５−１５））を基質とし、ＡＴＰをリン酸基のドナー、ｈｉｓ−オーロラＡ（オーロラＡの全長ポリペプチドとｈｉｓとの融合体）をリン酸化酵素として用い、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５），  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．５  ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，  ０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡからなる反応液３０μｌ中で、３０℃、２０分間、ヒストンＨ３のＳｅｒ１０のリン酸化反応を行った（Ｓｕｇｉｙａｍａ等，  ２００２．）。オーロラＡの活性化を判定するために，Ｈ３−Ｓ１０に対するポリクローナル抗体（ＵＢＩ社）を用いたイムノブロット法によるリン酸化の有無を検討した（図３）。コントロールであるマウスＩｇＧはオーロラＡ蛋白質の活性化を阻害しないが，本発明のモノクローナル抗体は，著明にオーロラＡ蛋白質の活性化を阻害した。上記の結果より、本発明のモノクローナル抗体はオーロラＡ蛋白質の２８８番スレオニンのリン酸化による活性化を阻害できることが判明した。
【００３９】
〔実施例５〕  免疫蛍光染色
本発明のモノクローナル抗体により、２８８番スレオニンがリン酸化されたオーロラＡ蛋白質の細胞内における局在を免疫蛍光染色法によって観察した。ＨｅＬａ細胞を、−２０℃保存の１００％メタノールで、１５秒間処理して固定を行い、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２分間処理して細胞膜及び核膜の透過性処理を行った。ＰＢＳで１０００倍に希釈した本発明のモノクローナル抗体を、細胞上に重層し、細胞の乾燥を防ぎながら３７℃で、６０分間、反応させた。次に、抗体の反応後、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、２５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識化抗マウス−ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を、反応させた細胞上に重層し、細胞の乾燥を防ぎながら３７℃で、４５分間反応させた。反応後、細胞をＰＢＳで４回洗浄した後、ＤＡＰＩを含む蛍光保存剤を用いてマウント後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
【００４０】
顕微鏡観察の結果、本発明のモノクローナル抗体では、２個に分裂した中心体および紡錘体極が染色された（図４）。分裂中期にその染色強度は最高となり，それ以降染色強度は急速に減衰した。上記の結果より、本発明のモノクローナル抗体はオーロラＡ蛋白質の活性化を可視化できることが判明した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明は、悪性腫瘍の治療に使用することができるヒトオーロラ蛋白質に対するモノクローナル抗体及びその断片である。本発明のモノクローナル抗体及びその断片を有効成分として含む薬学的組成物は、癌治療薬として有用である。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】未処理およびノコダゾール処理したＨｅＬａ細胞の抽出液から本発明のモノクローナル抗体によって，リン酸化されたオーロラＡが特異的に免疫沈降されることを示す図である。
【図２】ｇｌｕ−ｔａｇの付いたオーロラＡ遺伝子，オーロラＢ遺伝子およびオーロラＣ遺伝子をそれぞれ導入後ノコダゾール処理したＣＯＳ細胞の抽出液から本発明のモノクローナル抗体によって，リン酸化されたオーロラＡが特異的に免疫沈降されることを示す図である。
【図３】本発明のモノクローナル抗体によって，オーロラＡ蛋白質の活性化を阻害することを，Ｈ３−Ｓ１０に対するポリクローナル抗体を用いたイムノブロッティングによって検討した結果を示した図である。
【図４】本発明のモノクローナル抗体を用い、免疫蛍光染色を行って結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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