(57)【要約】【課題】  十分な量、且つ安定した強度で蛋白質を固相担体表面に固定化する方法を提供すること。【解決手段】  ポリマー及び当該ポリマーを架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（Ｉ）を固相担体表面に接触させる工程、そして当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、ポリマー、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（ＩＩ）を点着する工程を含むことを特徴とする方法。【選択図】  図５
2005283351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー及び当該ポリマーを架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（Ｉ）を固相担体表面に接触させる工程；そして
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、ポリマー、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（ＩＩ）を点着する工程；
を含む、固相担体への蛋白質固定化方法。
【請求項２】
ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（Ｉ’）を、固相担体表面に接触させる工程；そして
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、ポリマー、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（ＩＩ）を点着する工程；
を含む、固相担体表面への蛋白質固定化方法。
【請求項３】
ポリマー及び当該ポリマーを架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（Ｉ）を、固相担体表面に接触させる工程；そして
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（ＩＩ’）を点着させる工程；
を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。
【請求項４】
前記接触工程の前に、前記固相担体表面を、前記架橋試薬と共有結合可能な官能基を有するシランカップリング剤で表面処理する工程を更に含む、請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記のポリマーが、分子内に複数のアミノ基を有するものである、請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記の架橋剤が、前記蛋白質のＮ末端アミノ基及び/又はＣ末端アミノ基とも反応することが可能なものである、請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記の架橋剤が、分子内に２以上のＮＨＳエステルを含むものである、請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーがポリ-Ｌ-リジンであり、前記架橋剤が、ＤＳＳである、請求項１乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか一項に記載の方法により製造された、プロテインチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体表面への蛋白質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の示す種々の反応は、それに関与する生体内分子、特に蛋白質の相互作用によって引き起こされ、且つ制御されている。そのため、生体反応を分子レベルで理解するには、蛋白質の発現、翻訳後修飾（リン酸化、脱リン酸化等）のみならず、生体内分子の相互作用の解明が必要不可欠である。
【０００３】
近年、プロテオーム（ゲノムにより発現された蛋白質の完全なセット）の解析のために蛋白質の性質に関する大規模な研究が行われているが、これらの研究においては、蛋白質の発現量、翻訳後修飾や相互作用を解析して、健康状態及び発病状態において蛋白質発現レベルで発生している現象を明らかにすることが中心課題となっている。
【０００４】
一方、２００３年までにヒトの全遺伝子の塩基配列を解明するヒトゲノム改革も格段に向上した処理能力を有する塩基配列解析システムの出現により、急ピッチで進行している。しかし、ゲノムの機能は塩基配列のみで決定されるわけではなく、蛋白質レベルでの解析も必要である。ゲノムの遺伝子上にコードされているすべての蛋白質が同時に発現しているわけではなく、臓器、組織、薬物投与の影響、時期、加齢や、疾患の種類によって、遺伝子発現の有無及びその量が異なり、これらを理解しなければ生命現象を理解したことにはならない。また、生体内蛋白質には、翻訳後修飾や高次立体構造のような不均一性が存在していて、これらによっても機能的影響を受けることがあることからも、生体内蛋白質の相互作用の研究が必要性である。
【０００５】
プロテオーム解析においては、蛋白質を高感度で分析する質量分析が発達してきている。この質量分析法においては、電気泳動ゲルからスポットを切り出し、還元やトリプシン消化処理を行った後、分解された蛋白質の分子量測定を行い、その結果をもとにデータベース検索を行うことを基礎として、蛋白質を同定している。この質量分析を改良したものとしては、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ  ＭＳ（マトリクス支援イオン化-飛行時間型質量分析計）がある。
【０００６】
ここで、ＭＡＬＤＩとは、試料分子をイオン化する試薬としてマトリクスを使用し、試料が備えられたマトリクス上にレーザ光を照射し、励起状態となったマトリクスからのエネルギーによって試料分子を蒸発させ、気相反応によって試料分子をイオン化する方法のことである。また、ＴＯＦとは、プレート上でイオン化された試料分子が、高真空のフライトチューブ内で自由飛行した後、プレートの反対側に設置された検出器に、低分子量の試料分子から順に到達するという性質を利用して、その到達時間の違いにより分子量を決定する方法のことである。
【０００７】
ＴＯＦ型質量分析計と、プロテインチップとを組み合わせたＳＥＬＤＩ（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization）プロテインチップシステムは、プロテオーム解析のための強力なツールを提供している。ＳＥＬＤＩプロテインチップは、基板表面に化学修飾（陰イオン、陽イオン、疎水性、親水性、金属イオン等）、又は生化学修飾（抗体、レセプタ等）を施したチップであり、これまでに１基板あたり２４スポットを有するものが開発されている。このシステムにおいては、チップ上で蛋白質と、蛋白質、ＤＮＡ、種々の低分子量物質との相互作用を固相で行い、被解析物の蛋白質の分子量をＴＯＦ型質量分析計により測定する。その結果、細胞による蛋白質の発現量の相違や特定の蛋白質と他の物質との相互作用の解析、試料中の極微量物質の定量、翻訳後修飾や酵素活性の測定などを行うことができるものとなっている。斯かる方法においては、試料を標識する必要がなく、試料を１アットモルないし１フェムトモルのレベルで検出することが可能である。
【０００８】
プロテインチップとしては、表面がカルボキシデキストランで被覆された金膜表面に蛋白質を固定化したセンサーチップも存在する。センサーチップを用いる蛋白質-蛋白質相互作用の検出方法（主としてモノクローナル抗体のスクリーニングに利用されている）では、試料をカセット式のマイクロ流路系を介してチップ表面に添加し、蛋白質と試料分子の、二分子間の結合や解離に伴うチップ表面での質量変化を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルとして検出する。この方法においても、試料分子を標識する必要はない。
【０００９】
ＳＥＬＤＩプロテインチップ及びセンサーチップは、一般的にいって、蛋白質と他の物質との相互作用が強い場合、たとえばリガンド-レセプター、抗原-抗体等の場合には有効であるが、弱い相互作用の検出には感度において問題がある。さらにＳＥＬＤＩプロテインチップ及びセンサーチップに関しての現在の技術では、多数の試料を同時に短時間で解析することは困難である。
【００１０】
そのため、蛋白質の相互作用を並列的、且つ大規模に解析するための蛋白質チップの技術開発が進行しつつある。蛋白質チップは、スライドガラス等の固相担体に多数の蛋白質分子を整列させて固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等を同時に解析するのに非常に有用である。しかし、従来の蛋白質固定化技術では、蛋白質分子を担体に１分子づつ固定化する方法がとられているため、検出限界の問題あり、さらに固定化強度の問題もある。したがって、固相担体表面に十分な量で安定に蛋白質を固定化する方法が望まれている。
【特許文献１】特開２００１-２４２１１６号公報
【特許文献２】特表２００２-５２０６１８号公報
【特許文献３】特表２００２-５２０６２０号公報
【非特許文献１】コスターら（Koster H. et al.）、「ネイチャー・バイオテクノロジー」（”Nature Biotechnol.”）、１９９６年、１４巻、ｐｐ.１１２３-１１２８
【非特許文献２】グリフィンら（Griffin T.J. et al.）、「ネイチャー・バイオテクノロジー」（”Nature Biotechnol.”）、１９９７年、１５巻、ｐｐ.１３６８-１３７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は斯かる問題に鑑みてなされたものであり、本発明者は上記課題に鑑み鋭意研究を進めたところ、固定化する蛋白質分子を固相担体表面上で３次元的な配置をとらせることにより、斯かる問題が克服されることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の蛋白質固定化方法は、ポリマー及び当該ポリマーを架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（Ｉ）を固相担体表面に接触させる工程、そして当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、ポリマー、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（ＩＩ）を点着する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
また本発明の蛋白質固定化方法は、ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（Ｉ’）を、固相担体表面に接触させる工程、そして当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、ポリマー、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（ＩＩ）を点着する工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
更に本発明のポリマー及び当該ポリマーを架橋する架橋試薬を媒体中に溶解又は分散した溶液（Ｉ）を、固相担体表面に接触させる工程、そして当該工程を経た固相担体表面に、固定化用蛋白質、並びに当該固定化用蛋白質及び当該ポリマーの両方を架橋する架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（ＩＩ’）を点着させる工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の蛋白質固定化方法においては、前記接触工程の前に、前記固相担体表面を、前記架橋試薬と共有結合可能な官能基を有するシランカップリング剤で表面処理する工程を更に含むことが好ましい。
【００１６】
また本発明の蛋白質固定化方法においては、好ましくは前記のポリマーを、分子内に複数のアミノ基を有する。
【００１７】
本発明の蛋白質固定化方法においてはまた、前記の架橋剤が、前記蛋白質のＮ末端アミノ基及び/又はＣ末端アミノ基とも反応することが可能なものであることが好ましく、更により好ましくは、分子内に２以上のＮＨＳエステルを含むものである。
本発明の蛋白質固定化方法においては、前記ポリマーがポリ-Ｌ-リジンであり、前記架橋剤が、ＤＳＳ（Disuccinimidyl Suberate）であることが好ましい。
【００１８】
本発明は更に、本発明の蛋白質固定化方法により蛋白質が固定化されたプロテインチップを提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の蛋白質固定化方法によれば、被固定化蛋白質を固相担体表面上で高次の構造をとらせることによって、十分な量で安定に蛋白質を固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１乃至図５は、本発明の一の形態を示すものである。これらの図においては、ポリマーと、当該ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、予備処理を施しておいた蛋白質固定用の固相担体表面に接触させ、次に、固定化する蛋白質、ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液（II）を、前記工程により溶液（I）と接触させておいた固相担体表面に接触させることによって、固相担体表面に３次元的（網目状）に蛋白質を固定化する方法が示されている。
【００２１】
（固相担体とその予備処理）
図１は、表面処理を施した固相担体表面１００が示されている。この表面処理は、その固相担体の表面の特性に応じて行われる何れかの表面処理方法により行うことができる。本発明の実施に当たって好ましい、疎水性又は親水性に乏しい固定担体の例としては、透明なガラス、シリコン、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのポリマー類を挙げることができるが、固相担体としてはガラス及びシリコンが特に好ましい。これは表面処理の容易さや、蛍光スキャニング装置による解析の容易さのためである。更に、シリカ表面層を有するガラスも好適に利用することができる。
【００２２】
固相担体の大きさは、分析器に収容することのできる大きさであれば特に限定されることはないが、通常は０．５〜１０ｃｍ  Ｘ  ０．５〜１０ｃｍの範囲である。また、厚さに関しては、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
固相担体の形状は、通常のアッセイ系においては板状であるが、アッセイ系の設計によっては、板状以外の形状、例えばビーズ状、管状や、棒状のものなどとすることも可能である。
【００２３】
固相担体がガラスである場合には、例えばシランカップリング剤１０１等を、当業者に知られる条件で使用してガラス表面の処理を行うことができる。より具体的には、固相担体を、シランカップリング剤に浸漬し、固相担体表面に当該シランカップリング剤を結合させ、適宜、固相担体を加熱して当該結合をより強固なものとする。表面処理は、このような操作により固相担体表面への蛋白質の固定化前に予め施しておくことによってもできるが、表面処理がすでになされている固相担体が入手できる場合は、それを利用することもできる。
【００２４】
表面処理を行うためのシランカップリング剤１０１中の官能基１０２は、後の工程で使用される溶液又は分散液（I）又は（I’）、及び溶液又は分散液（II）又は（II’）、特に溶液又は分散液（I）又は（I’）中に含まれるポリマー及び/又は架橋試薬と反応するものであることが好ましい。シランカップリング剤１０１中の官能基１０２の種類としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基を挙げることができるが、使用するポリマー及び架橋試薬に存在する官能基と共有結合可能なものであれば、これらに限定されず、当業者が目的に応じて適宜選択できるものである。
【００２５】
（第一工程）
図１に示されるように予備処理を施した固相担体表面１００に対しては次に、ポリマー１０３と、当該ポリマー１０３を架橋する架橋試薬１０７とを媒体に溶解又は分散した溶液（I）を接触させる（図４参照）。ポリマー１０３と架橋試薬１０７とは、媒体に溶解又は分散させると反応して架橋する。この架橋反応は迅速に開始するものであることが望ましいが、製造工程によっては、触媒を添加するか、又は加熱処理や紫外線暴露によって反応を促進するようなものとすることも可能である。予備処理を施してある固相担体表面１００に対して、ポリマー１０３と架橋試薬１０７を溶解又は分散した溶液（I）を接触させると、固相担体表面１００に存在するシランカップリング剤中の官能基１０２（図４においては図示せず）と、架橋試薬１０７中の未反応の官能基との間で反応が生じ、３次元（網目状）構造をとった複合体１１０が形成される。なお、溶液（I）の固相担体表面１００への接触は、当該技術分野で知られるスポッター装置などを利用して行うことができる。
【００２６】
（ポリマー）
本発明において使用するポリマー１０３は、その分子内において、固定化用蛋白質分子中の官能基と反応して共有結合する官能基１０４と、架橋試薬１０７中の官能基１０８と共有結合する官能基１０５とをそれぞれ２個以上有することが好ましい（図２及び図３参照）。これらが２個以上同一分子内に存在すると、一つのポリマーに対して複数の蛋白質を固定化することが可能となり、更に蛋白質が固定化されたポリマー同士が網目状等の３次元的な高次構造物を形成し、これによって本発明のプロテインチップの反応性が高まる。官能基１０４は、固定化用蛋白質１０６の側鎖、N末端アミノ基、C末端カルボキシル基と結合することができるものであり、尚且つ固定化蛋白質が自身と相互作用する物質（蛋白質、核酸等）との結合を阻害する等、悪影響を与えないものである必要がある。また、この条件を満たす限り、官能基１０５は、官能基１０４と同一種類のものとすることが可能である。
【００２７】
また、ポリマー１０３は、加熱処理や紫外線暴露により固定化用蛋白質分子と共有結合するように、分子内にアルキル基１０９を有するものとすることができる（図２参照）。
【００２８】
本発明において使用することが可能なポリマー１０３の具体例としては、分子量が１０3乃至１０6の範囲のものであることが好ましい。この範囲を越えるものは、粘性が増大するために固定化用蛋白質分子の結合へ悪影響を及ぼすために好ましくない。より具体的には、親水性のポリマー、例えばポリ-Ｌ-リジン、ポリ-Ｌ-グルタミン酸等を挙げることができる。
【００２９】
（架橋試薬）
本発明において使用する架橋試薬１０７は、表面処理された固相担体表面１００において、ポリマー１０３同士の３次元（網目状）構造体を構築するため、更にポリマー１０３及び固定化用蛋白質１０６との間にも同様に３次元（網目状）構造体を構築するために使用されるものであり、図３に示されるように主鎖１０９から分子表面に突出した官能基１０８を少なくとも２つ有するものとなっている。
【００３０】
架橋試薬１０７中の官能基１０８の具体例としては、上述の条件を満たすものであれば特に限定されるものではないが、NHSエステル基、イミドエステル基、マレイミド基、を有するものを挙げることができる。架橋試薬の具体例としては、DSS（Disuccinimidyl Suberate）、SMCC（Succinimidyl 4-[M-maleimido methyl]-cyclohexane-1-carboxylate）等を挙げることができる。ポリマー１０３がポリ-L-リジンである場合には、架橋試薬１０７としてはDSS、SMCC等を使用することが好ましい。この場合、ポリ-L-リジン中のアミノ基がDSS中のNHSエステル基と反応して共有結合を生じる。
【００３１】
（ポリマーと架橋試薬との混合比）
溶液又は分散液（I）中におけるポリマー１０３と架橋試薬１０７との混合比は、これらの反応後においても、未反応の官能基が当該架橋試薬中に残存しているような比率とすることが望ましい。より具体的には、親水性ポリマーと架橋試薬の各官能基総数の比率は、１：２〜１：１０００の範囲内であることが好ましい。（混合比の一般的な範囲と、本願発明において使用している「ポリLリジン-DSS」の組み合わせの場合の好ましい混合比率を記載することをお勧めいたします。親水性ポリマー一分子当たりの官能基数の違いによっても混合比率が変わってくると思いますので、一分子当たり官能基の数によって分類することが必要と思います）
【００３２】
溶液（I）においてポリマー１０３と架橋試薬１０７とを溶解又は分散させるのに使用する媒体としては、水、アルコール、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの中から選択した２種類以上のものの混合物等を挙げることができる。何れの媒体を使用するかは、当業者が目的に応じて容易に選択できるものである。
【００３３】
（第二工程）
上記第一工程の後、固定化用蛋白質分子１０６、ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を、固相担体表面１００に点着させる工程を行う。この工程では、固定化用蛋白質分子１０６、ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７を媒体中に溶解又は分散させると、上記の第一工程におけるように、これらは互いに反応して、ポリマー１０３、架橋試薬１０７、固定化用蛋白質分子１０６からなる３次元（網目）構造の複合体１１１が形成される（図５）。この反応は、第一工程と同様に、触媒等を介在させて行ったり、加熱したり、更にポリマーや架橋試薬中にアルキル鎖が存在する場合には、紫外線による処理を行って、架橋を更に行うことも可能である。このような、架橋を促進させるための加熱処理などは、溶液又は分散液（II）を固相担体表面に点着した後に行う。これらの操作の後、適宜、固相担体表面の洗浄を行い、結合しなかったポリマーや蛋白質分子等を除去する。洗浄には、溶液又は分散液の調製に使用した媒体と同じものを使用することが出来る。
【００３４】
図５の上部は、溶液又は分散液（II）中における蛋白質分子１０６、ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７の構造的関係を示すものである。この図においては、蛋白質分子１０６がポリマー１０３と共有結合している構造体同士が、架橋試薬１０７により更に高次の構造体（複合体１１１）が形成されている。このようにして形成された複合体１１１（黒丸）は、溶液又は分散液（I）中の構成要素により形成された複合体１１０（白丸）と、溶液又は分散液（II）中の架橋試薬１０７の未反応の官能基を介し、超高次構造体を形成する（図５下部）。この超高次構造体は、溶液（I）の構成要素から構成される１の高次構造体につき、溶液又は分散液（II）の構成要素から構成される１又はｎ個（ｎは２以上）の高次構造体と結合している。
【００３５】
溶液又は分散液（II）に含まれる架橋試薬１０７の、溶液又は分散液中の割合（モル比）を調整することにより、複合体１１０の一つあたりの複合体１１１の量比に影響を与えることができる。
【００３６】
（固定化用蛋白質分子）
溶液又は分散液（II）に溶解又は分散させる固定化用蛋白質分子は、他の分子との相互作用を解析しようとするものであり、固定化蛋白質分子の固相担体表面への固定化は、１０2乃至１０5種類/ｃｍ2の範囲にあることが望ましい。１スポット当たりの固定化蛋白質分子の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあり、重量としては数μｇ以下であることが好ましい。固相担体表面におけるスポットの間隔は、スポットする溶液が水性ベースである場合には１.５ｍｍ以下であることが好ましく、より具体的には３００μｍ未満の範囲にあることが好ましい。スポットする各ドットの大きさは、直径が３００μｍ未満の範囲であればよく、スポットする溶液の量は、１００ｐL乃至１μLの範囲にあることが好ましく、特に１乃至１００ｎLの範囲にあることが好ましい。
【００３７】
上記においては、本発明の一の態様である、ポリマーと、当該ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、予備処理を施しておいた蛋白質固定用固相担体表面に接触し、次に、固定化する蛋白質分子、ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を、前記工程により溶液又は分散液（I）と接触しておいた固相担体表面に接触させることによって、固相担体表面に３次元的（網目状）に蛋白質分子を固定化する方法を用いて本発明の実施の形態について説明したが、本発明の他の実施形態のものの実施に関しては、本質的に上記の説明を参酌すれば行うことができる。適宜、溶液又は分散液（I）や（II）よりポリマー又はポリマーを除去することにより行うことが出来る。
【００３８】
例えば、上記した方法における溶液又は分散液（II）の代わりに、固定化用蛋白質分子と、ポリマー又は架橋試薬のいずれか一方とを溶解又は分散した溶液又は分散液（II’）を使用する場合には、溶液又は分散液（II’）の調製時に、ポリマー又は架橋試薬の何れかを溶解又は分散させる以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
また、上記溶液又は分散液（I）の代わりに、ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（I’）使用する場合には、溶液又は分散液（I’）の調製時に、ポリマーを溶解又は分散するのみで、架橋試薬を導入しないこと以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
更に、上記溶液又は分散液（I）、及び上記溶液又は分散液（II）の代わりに、溶液又は分散液（I’）及び溶液又は分散液（II’）を使用する場合には、溶液又は分散液（I’）の調製時に、ポリマーを溶解又は分散するのみで、架橋試薬を導入せず、更に溶液又は分散液（II’）の調製時に、ポリマー又は架橋試薬の何れかを溶解又は分散させる以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
【００３９】
本発明は更に、本発明の蛋白質分子固定化方法により製造された固相担体、即ちプロテインチップをも提供する。
【実施例】
【００４０】
（担体の調製）
担体として顕微鏡用スライドガラス（マツナミ社製）をアミノプロピルエトキシシラン（チッソ社製）に浸漬、加熱してアミノシラン化を施した。次に１ｍMのDSSリンカー（Pierce社製）のみ、又は１ｍMのDSSリンカーと０．１％ポリ-L-リジン（Sigma社製）との混合物に、前記アミノシラン化したスライドガラスを浸漬し、それぞれをスライドガラスに共有結合させた。以下においてはDSSリンカーのみが結合しているスライドをＡスライドと呼び、DSSリンカー及びポリ-L-リジンからなる複合体が結合しているスライドをＢスライドと呼ぶことにする。
【００４１】
（溶液の調製）
ＰＢＳに５ｍｇ/ｍｌの濃度で溶解したストレプトアビジン（Sigma社製）に１ｍMのDSSリンカーのみ、又は１ｍMDSSリンカーと０．１％ポリ-L-リジンとの混合物を含む蛋白質溶液を調製し、DSSリンカーのみ、又はDSSリンカー及びポリ-L-リジンからなる複合体をストレプトアビジンに共有結合させた。以下においては、DSSリンカーのみが結合しているストレプトアビジンの溶液をＡ蛋白質溶液と呼び、DSSリンカー及びポリ-L-リジンが結合しているストレプトアビジンの溶液をＢ蛋白質溶液と呼ぶ。
【００４２】
（蛋白質アレイの調製）
Ａスライド及びＢスライドのそれぞれにＡ蛋白質溶液又はＢ蛋白質溶液を、ＳＰバイオスポッター装置（日立ソフト社製）で９スポット点着した。この後、各スライドグラスを湿潤箱内に１時間静置して、ＤＳＳリンカーとストレプトアビジンの結合反応を生じさせた。次に、０．２％のＴｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ社製）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０）に、各スライドを２回浸漬することにより、未固定化のストレプトアビジンを洗浄し、５０ｍＭヒドロキシアミン演歌水素と、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩化水素、ｐＨ９．０からなる溶液で、各スライドグラスを室温で３０分間ブロッキングした。
【００４３】
（固定化蛋白質の検出）
蛍光色素Ａｌｅｘａ５４６が結合したビオチシンである、Ａｌｅｘａ５４６ビオチシン（Molecular Probes社製）を０．１μｇ/ｍｌの濃度でＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０に溶解し、その中に各スライドグラスを室温で３０分間浸漬した。次に各スライドグラスをＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０に２回浸漬することにより、未反応のＡｌｅｘａ５４６ビオチシンを洗浄した。次いで、各スライドグラスを風乾させた後、ＧＥＮＥＰＩＸ４００（ＡＸＯＮ社製）で各スライドグラス上をスキャンさせて、各スポットの蛍光強度を測定した。測定条件は、レーザーパワーが１００％、フォロマルチプライヤーゲイン４００とした。蛋白質固定化量を比較するため、上記のスキャン画像を加増解析ソフトＱｕａｎｔａｒｒｙ（Ｐａｃｋａｒｅｄ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐ社製）にて蛍光強度数値を求めた。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2005283351.tif 000003
【００４５】
表１からは、Ｂスライドグラスと、Ｂ蛋白質溶液の組み合わせにおいて最も蛍光強度が強いことがわかる。尚、この表中の数値は、DSSリンカーのみ（即ちポリ-L-リジンなし）でスライドガラスを処理し、蛋白質点着溶液に、DSSリンカーのみ（即ちポリ-L-リジンなし）を含めたもので点着した時の蛍光強度を１として、これに対する相対的強度を表したものである。この表から、スライドガラスの処理には、架橋試薬のみよりも、ポリマーと架橋試薬の組み合わせがより好ましく、更に蛋白質点着溶液も、架橋試薬のみよりも、ポリマーと架橋試薬の組み合わせがより好ましいことがわかる。この結果は、架橋試薬とポリマーとにより生じる高次構造、及び架橋試薬、ポリマー、及び被固定化蛋白質により生じる高次構造によって、担体の単位表面面積あたりに固定化される蛋白質の量が多くなっていることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の蛋白質固定化方法によれば、被固定化蛋白質を固相担体表面上で高次の構造をとらせることによって、十分な量で安定に蛋白質を固定化することができ、蛋白質の相互作用の並列的、且つ大規模な解析に資する蛋白質チップを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】この図は、表面処理工程を経た固相担体表面の状態を模式的に示したものである。
【図２】この図は、ポリマーの構造、及びポリマーと核酸分子との関係の一態様を模式的に示したものである。
【図３】この図は、架橋試薬の構造を模式的に示したものである。
【図４】この図は、ポリマー及び架橋試薬を溶解又は分散させた溶液又は分散液により、固相担体表面を処理した後の固相担体表面の状態を模式的に示したものである。
【図５】この図は、本発明の一の態様により、固相担体表面に蛋白質を固定化した状態を模式的に示したものである。
【符号の説明】
【００４８】
１００・・・固相担体、１０１・・・シランカップリング剤、１０２・・・シランカップリング剤中の官能基、１０３・・・ポリマー、１０４・・・ポリマー中の官能基（１）、１０５・・・ポリマー中の官能基（２）、１０６・・・蛋白質分子、１０７・・・架橋試薬、１０８・・・架橋試薬中の官能基、１０９・・・アルキル鎖、１１０・・・複合体（蛋白質分子非含有）、１１１・・・複合体（蛋白質分子含有）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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