(57)【要約】【課題】増幅した試料中の標的核酸を検出する際に、プローブの混入時期を調整することにより、検出作業の迅速化と、より多くの種類の標的核酸検出を可能にする。【解決手段】患者から抽出した試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにした。  これにより特殊技術を要することなく、従来技術より短時間で、しかも、少なくとも５種類以上の異なる核酸配列の増幅結果を、より高い検出感度で同時的に確認することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにした標的核酸の検出方法。
【請求項２】
試料中の核酸がＤＮＡ又はＲＮＡであるところの請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
核酸増幅手段がＰＣＲ法によるものであるところの請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項４】
核酸増幅手段がライトサイクラー又はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  定量システムを用いるものであるところの請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
核酸増幅後に混入するプローブが、蛍光標識プローブであるところの請求項１〜４の何れか１に記載の標的核酸の検出方法。
【請求項６】
標的核酸が、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である塩基配列のものであるところの請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、傷病・病害の予防若しくは治療に際し、患者から採取した試料中に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出して対応するための標的核酸の検出方法に関し、より多くの標的核酸配列を高い効率で同時に増幅するとともに、その産物を定性的に高い感度で同時に検出する標的核酸検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
傷病・病害の予防、または治療において、原因となる有害な細菌やウィルスを迅速に同定し検出することが重要である。  細菌やウィルスの同定には、一般に病徴の観察による方法、電子顕微鏡などを使用した形態的特徴観察による方法、および抗体を用いる簡便な方法などが用いられているが、これらはいずれも厳密性（高い選択性）に欠けるという欠点があるため、最近では検定生物を用いる方法や遺伝子配列解析による方法、あるいはハイブリダイゼーションを利用する方法などが開発されるに至った。
【０００３】
具体的には、第１に、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、２型（ＨＩＶ２）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）、２型（ＨＴＬＶ２）を同時に定量と定性ができる方法、第２に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、  ＨＩＶ１を同時に定性ができる方法、  第３に、ＨＢＶ、ＨＣＶを同時に定量と定性ができる方法などが知られる。  上記した第１〜第３の方法は、何れもタックマンプローブ（Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ）法を原理とした検出法（以下単に「タックマン法」と称する）である。
【０００４】
なおここで、タックマン法とは、まず  ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）の原理を利用したもので  ＦＲＥＴとは接近して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ；Ｒ）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（ｑｕｅｎｃｈｅｒ；Ｑ）に移る現象をいう。  この場合、ｒｅｐｏｒｔｅｒ側の色素の蛍光は生じず、エネルギーの移動によりｑｕｅｎｃｈｅｒ側の色素の蛍光（波長が異なる）が生じる。５｀端および３｀端にｒｅｐｏｒｔｅｒ、ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素が付与したプローブがハイブリダイズし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５｀→３｀エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、接近していた２種類の蛍光物質の距離が離れることにより、色素が蛍光を発するようになるのでこれを検出して測定をおこなうものである。
【０００５】
また第４に、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）を同時に定量と定性ができる方法や、第５に、ハイブリプローブ（Ｈｙｂｒｉ−ｐｒｏｂｅ）法を原理としたＨＣＶの５種類の変異型が同定できる測定系の検出法も知られている。  さらに第６に、サイバーグリーン（Ｓｙｂｅｒ−ＧｒｅｅｎＩ）と融解曲線分析を原理とした検出法（以下単に「サイバーグリーン法」という）、すなわちＳｙｂｅｒ−ＧｒｅｅｎＩとはインターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出する（１本鎖  ＤＮＡになると離れて再び変化する）ものであって、これによって単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状庖疹（ＶＺＶ）、エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）を同時に定性するものである。
【０００６】
また第７に、ＨＳＶ，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、ＶＺＶの５種類について同時に定性ができる方法や、第８に、ＨＳＶ、ＶＺＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶの４種類について同時に定性ができる方法、さらにはＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓの６種類について同時に定性できる方法も知られる。  さらに第９に、核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法も知られている（特許公表２０００−５１３２０２）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タックマン法を原理とする前記第１〜第３の方法による場合には使用できる蛍光色素が４色に限られているため最大４種類が限界である。  またハイブリプローブ法は、使用されるＢＫＶ，ＪＣＶあるいはＨＣＶは配列において殆ど同じ塩基配列を有する。  そのために同一あるいは、略同一のプライマーとプローブで判定できるが、通常は、各標的遺伝子ごとに異なる２つのプローブを必要とするので仮に多くの種類のプライマーとプローブを反応液に加えると  ＰＣＲ反応を阻害し、著しく検出感度が悪化する難点がある。
【０００８】
さらにサイバーグリーン法は、融解曲線分析を原理とした検出法であるが、融解曲線分析はその  ＰＣＲ産物の融解温度（Ｔｍ）値によりその目的産物であるか区別する方法である。  一般的には融解曲線分析により４種類の  ＰＣＲ産物を区別するが、ＰＣＲ産物のような１００ｂｐ−５００ｂｐの大きさではＴｍ値が８０℃〜８５℃の範囲に集中し、多くをこの１０℃の範囲内で区別するのは難しく、また非特異的産物の検出（目的の核酸配列でない配列）を否定できない。
【０００９】
さらに既述した第７〜第８は、多いもので６種類の異なる標的核酸を増幅するがどの核酸が増幅されたか否かはアガロースゲル電気泳動法により  ＰＣＲ産物の長さで判定するため、  ＰＣＲ後にさらに多くの操作と時間が必要となるのみならず、増幅産物が実験室内に拡散し、その後の検出において偽陽性の原因となる可能性が高い。  また第９は、ＰＣＲ  で１チューブに一度に増幅できる遺伝子数には限界があり、ハイブリダイゼーションと検出の処理には１日以上の操作時間を必要とする。
【００１０】
また近時においては移植医療、再生医療が盛んとなり、患者に移植や移入する際に、有害な細菌やウィルスの混入は人体に重大な危険を伴う。  また高品質を維持するためにも移植や移入の前に検査する必要がある。  しかし有害な細菌やウィルスには多くの種類が存在し、現在の技術では多量の検査と時間、人手、費用がかかる。  今後、移植医療、再生医療においてこれらの検査が必須になると予想され、高い検出感度の達成と時間、人手、費用の節約をするための効率化が求められる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明は高い厳密性を有する  ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ法などの核酸配列の増幅を用いて１個のチューブ内あるいは１反応液内で同時に多数の種類を検査する方法について開発したものであって、上記で説明した分子生物学的手法の高い厳密性（細菌やウイルス間の高い選択性、検出性）を保持しつつ、かつ従来の技術の欠点を解決し、高感度でしかも高選択的、かつ迅速に細菌やウイルス、検出やＳＮＰｓなどの遺伝子解析をする方法を提供するものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、ハイブリプローブ法を応用してプローブによる増幅核酸の同定をおこなう場合において、従来のように核酸増幅反応液にあらかじめプローブを加えて反応検出をおこなうのではなしに、増幅反応液にプローブを加えずに核酸増幅をおこない、反応終了後にプローブを加え、その後、融解曲線分析により各プローブのＴｍ値の違いから目的とするウイルス等の標的核酸の有無を判定することを特徴とする。
【００１３】
具体的には、患者から抽出した試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにした標的核酸の検出方法に関する。
【００１４】
上記により、増幅反応を行う際に反応液に混ざらない状態でキャピラリー中にプローブを加え、あるいは２００μｌマイクロチューブに反応液を加え、ついでミネラルオイルを加えた後オイルより上層にプローブ溶液を加える。  この状態では反応液とプローブ液がミネラルオイルを解して混ざらない状態になる。  増幅反応終了後に遠心操作によりプローブと反応液を混合し、融解曲線分析する。  この方法では増幅反応の際にプローブが反応を阻害しないためプライマーとプローブの複雑な産物を形成せず、これまでのハイブリプローブ法よりも検出感度が高い。
【００１５】
またプローブによる増幅産物の確認ができるため、特異的増幅産物のみを測定できる。  さらに、これまでのサイバーグリーン法よりも判定の際に使用するＴｍ値の範囲が広いため、多くの種類の判定が容易となる。  電気泳動法のような増幅後の操作が不要で操作時間が節約できる。  増幅産物の拡散が無く、繰り返し測定を行っても偽陽性がでる可能性が極めて低い。  また目視でなく光学機器による計測のため微量でも検出、判定できる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的な内容について順次説明するとつぎの通りである。  まず検出したい遺伝子である標的核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である塩基配列のものが含まれる。
【００１７】
ほかに、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、２型（ＨＩＶ２）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）、２型（ＨＴＬＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（  ＨＣＶ）、ピコルナウィルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、カリシウィルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）、オルソミクソウィルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ）などの  ＲＮＡウィルス類、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルス（  ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（  ＨＨＶ６）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状庖疹（ＶＺＶ）、ポックスウイルス（Ｐｐｘｖｉｒｕｓｅｓ）、パルボウィルス（  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）、パポーバウイルス（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）などのＤＮＡウィルス類などがある。
【００１８】
また有害細菌としては、例えば、サルモネラ属（チフス菌、パラチフスＡ菌、パラチフスＢ菌、腸炎菌、ネズミチフス菌、アリゾナ菌等）、シゲラ属（赤痢菌等）、ビブリオ属（腸炎ビブリオ、コレラ菌、ＮＡＧビブリオ、ビブリオ・ミミカス、バルニフィカス、アルギノリチカス等）、エロモナス属（エロモナス・ヒドロフィア、ソブリアキャビエ、サルモニサイダ等）、プレジオモナス属（プレジオモナス・シゲロイデス等）、カンピロバクター属（カンピロバクター・ジェジュニー、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・フィタス等）、クロストリジウム属（ウエルシュ菌、ボツリヌス菌等）、スタフィロコッカス属（黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等）、エシェリキア属（大腸菌、腸管出血性大腸菌（Ｏ１５７等）、毒素原性大腸菌、組織侵入性大腸菌、病原血清型大腸菌、腸管付着性大腸菌属等）、エルシニア属（エルシニア・エンテロコリチカ、偽結核菌、ペスト菌等）、バシラス属（セレウス菌、炭疽菌、枯草菌、バシルス・ステアロサーモフィラス等）、リステリア属（リステリア・モノシトジェンズ等）、ミコバクテリア属（人型結核菌、牛型結核菌、鳥型結核菌等）、さらにＣａｎｄｉｄａ，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，  Ｍｕｃｏｒ，  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｐｎｅｕｍｉｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ，  梅毒菌、淋菌、および応用微生物学（昭和５０年発行、相田浩ら、株式会社朝倉書店  発行）の１３〜７６貢に記載の微生物などが挙げられる。
【００１９】
さらにビタミンＤ受容体遺伝子、アポリポタンパクＥ遺伝子およびエストロゲン受容体遺伝子などの遺伝子多型の  ＳＮＰｓ（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓの略）領域も含まれる。  ＳＮＰｓとは、遺伝暗号である塩基配列は一人一人でかなり多くの部位で異なっている。この違いから同じ診断名や類似の症状の疾患であっても、その背景となる疾患を起こす仕組みが異なる。  ＳＮＰｓの遺伝解析は、違いを考慮にいれた薬剤の使い分けなどの治療を可能にする所謂「オーダーメイド医療」を指す。  さらに疾患の予防、発症の遅延、早期発見、早期治療につながる。
【００２０】
また、病原菌等標的核酸を含む可能性のある試料（検体）としては、例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。  これらのＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含有した試料は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。  この場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮＡ又はＲＮＡを顕在化させる目的で行われるものである。
【００２１】
さらに試料中の核酸増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法）やリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ法あるいはｇａｐ−ＬＣＲ法）、もしくはライゲーション増幅反応（ＡＳＰＣＲ法）、あるいはＡＲＭＳ法、ＩＣＡＮ法、Ｌａｍｐ法、または特定の核酸配列を濃縮する他の方法の使用を示している。  なかでもＰＣＲ法は、一般にポリメラーゼ鎖反応法と呼ばれる方法であって、２本鎖の試料ＤＮＡを加熱して、１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温してＤＮＡポリメラーゼにより該プライマーからｄＮＴＰｓを合成し、伸張させる。
【００２２】
上記により得られた２本鎖を１本鎖に分離して、上記反応を繰り返すことにより、効率的に目標領域を有する  ＤＮＡを増幅することができる。  一般に反応条件は９２〜９５℃で１秒間〜１分間、５０〜６５℃を５秒〜１分間、７０〜７５℃を５秒から５分間を、２０〜４０回繰り返す。  ５０〜６５℃の部分で上記アニールがおこり、反応を成功させるためのアニール温度は、主にプライマーの組成によって規定される。  ７０〜７５℃の部分で伸張がおこり、反応を成功させるための伸張時間は増幅する目標領域の長さによって規定される。  また標的核酸としてＲＮＡとＤＮＡとがあるがＲＮＡの場合、逆転写してｃＤＮＡに変換して増幅する場合とＲＮＡをそのまま増幅する場合がある。
【００２３】
本発明によるＤＮＡ又はＲＮＡの増幅は、上記したＰＣＲ法などによるほかに、ライトサイクラー又はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  定量システムなどを用いておこなうこともできる。  また核酸増幅に際しては特異的プライマー、ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｐＨ調整剤、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩基、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの添加剤が添加される。  さらに核酸増幅後に混入するプローブとは蛍光標識プローブなどであり、前記標的核酸と塩基配列が相補であるＲＮＡ又は１本鎖ＤＮＡをいう。  このようなプローブは、ＰＣＲ法、化学合成法などにより作製することができる。  プローブの長さは、通常のハイブリダイゼーション条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限り、制限されないが、Ｔｍ値を設定から１５〜４０塩基が望ましい。
【００２４】
標的核酸の検出は、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより複数の標的核酸を同時的に同定検出する。  標識物質の種類は限定されないが、例えば使用する標識物質が蛍光標識である場合、蛍光顕微鏡、蛍光強度測定装置およびレーザ・スキャニング・サイトメータ（以下、ＬＳＣと略す）等の使用が可能である。  しかし、検出機器は特に上記のものに限定されない。
【００２５】
使用する標識物質が蛍光標識である場合、検出方法の例を以下に示すとＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）の原理を利用して検出する。  ＦＲＥＴとは、近接して蛍光色素が存在するところに励起光を照射した場合、片方の蛍光色素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ；Ｒ）に吸収されたエネルギーがもう一方の蛍光色素（ｑｕｅｎｃｈｅｒ；Ｑ）に移る現象を言う。
【００２６】
検出プローブの種類としては以下のものが例示される
Ａ．ハイブリプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）
これは２種類のプローブが増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、２種類の蛍光色素が接近し、ｑｕｅｎｃｈｅｒ側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである
Ｂ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
これは、ハイブリダイゼーションプローブは遊離の状態ではヘアピン構造をとるため、２種類の蛍光色素（正確には、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎの場合はｑｕｅｎｃｈｅｒは蛍光物質でなく、ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  作用のある物質）は近接している。  増幅された核酸とハイブリダイズすることにより、互いの距離が離れ、ｒｅｐｏｒｔｅｒ側の色素が蛍光を発するようになるので、これを検出するものである。
【００２７】
上記いずれのものを使用する場合においても、それぞれの核酸配列固有のプローブの区別は融解曲線分析により判定される。  融解曲線分析は、増幅された核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドを初めは低温（４０℃）から通常０．２℃／ｓｅｃの速度で７５℃まで温度を上げていくとそれぞれの増幅された核酸やプローブが持つ固有のＴｍ値に従い核酸やプローブと増幅された核酸のハイブリッドが融解し、この場合、増幅された核酸はＳｙｂｅｒ−ＧｒｅｅｎＩが、またプローブと増幅された核酸のハイブリッドはＦＲＥＴの蛍光強度が急激に落ちる。  そしてその温度に対する急激に落ちた蛍光強度変化を微分してピーク化したものを分析する方法による。
【００２８】
なお、上記したＳｙｂｅｒ−ＧｒｅｅｎＩとは、インターカレート試薬とも呼ばれ、２本鎖遺伝子の中に入り込むことによって、その蛍光強度や蛍光波長が著しく変化するものがあり、その性質を利用して２本鎖遺伝子を検出するものである。  １本鎖  ＤＮＡになると離れて再び変化する。
【００２９】
【実施例】
〔ＤＮＡの抽出〕
ウィルス性疾患の疑いのある患者から採血した血液から試料として  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ抽出をした。  ＤＮＡ  の抽出は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  を用い、以下の操作方法により抽出した。  すなわち  １．５μｌ  ｔｕｂｅにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ２０μｌを入れ、そのＴｕｂｅ内に血液または血清を２００μｌ＋Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬ２００μｌ加え、これをＶｏｒｔｅｘ  １５ｓｅｃした後、５６Ｃ  １０ｍｉｎ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅをスピンしてサンプルを集めた。
【００３０】
これに１００％  Ｅｔｈａｎｏｌ  ２００μｌを加え、Ｖｏｒｔｅｘ  １５ｓｅｃ  し、さらにスピンした後に  ２ｍｌ  遠心Ｔｕｂｅにセットしたスピンカラムにサンプルを移す。  ８０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ  遠心後、２ｍｌ  の遠心ｔｕｂｅ内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットする。  このスピンカラムにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１  ５００μｌを加えて再び８０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ  遠心する。
【００３１】
新しい  ２ｍｌ  遠心ｔｕｂｅに交換してスピンカラム内にＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２    ５００μｌを加え、これを再び  １４０００ｒｐｍ  ３ｍｉｎ  遠心する。  ２ｍｌ  の遠心ｔｕｂｅ内の溶液を捨て、再びスピンカラムにセットし、１４０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ  遠心する。  １．５ｍｌ  遠心ｔｕｂｅ内にスピンカラムを移し、Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＥ  ５０μｌ  を加え、室温で１ｍｉｎ放置した後、８０００ｒｐｍ  １ｍｉｎ  遠心してＤＮＡを回収する。
【００３２】
〔核酸の増幅〕
ＤＮＡ  ウィルスについては、Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ１（ＨＳＶ１）、  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ２（ＨＳＶ２）、  Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＶＺＶ）、  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＨＣＭＶ）、  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  ７（ＨＨＶ７）、  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  ８（ＨＨＶ８）、  ｐａｒｖｏＢ１９、  ＢＫ  Ｖｉｒｕｓ  （ＢＫＶ）、  ＪＣ  Ｖｉｒｕｓ  （ＪＣＶ）    などの各ウィルスを同時定性する。
【００３３】
これに添加するプライマーとしてウィルス特異的配列を有する核酸配列（例えば、
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ，２００２，６８，ｐ．３９９−４０３，
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｃ，２００１，ｐ．４３５７−４３６１．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｄｅｃ，２００１，ｐ．４４１３−４４１９．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｎｏｖ，２０００，ｐ．４００６−４００９．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｓｅｐｔ，２０００，ｐ．３１８７−３１８９．
ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，  ２，ｐ．１２−２２
に記載されている核酸配列のもの）、
またＨＨＶ７に特異的な増幅プライマー対：ｇａａａａａｔｃｃｇ  ｃｃａｔａａｔａｇｃ  配列番号１，ａｔｇｇａａｃａｃｃ  ｔａｔｔａａｃｇｇ  ｃ  配列番号２．  １０μＭを０．２μｌ  ずつ合計２．８μｌ、  合成酵素として〔  Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）〕０．２５μｌ、調整剤として  １０＊Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ  １μｌ、これに抽出した  ＤＮＡ  ５μｌと、Ｎｕｃｒｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  １．９５μｌとを加えて合計  １０μｌとし、これを  Ｍｉｘし、図１に示したライトサイクラーキャピラリー１の透明ガラス製の細長い容器２内に注入（図１Ａのａ参照）する。  なお核酸の増幅手段としては、この場合ＰＣＲ法を用いた。
【００３４】
〔プローブの混入〕
ついでその上部に、蛍光色素（ＬＣＲｅｄ６４０，ＬＣＲｅｄ７０５，ＦＩＴＣ）が付着したウィルス特異的ハイブリダイゼーションプローブミックス（例えば、
ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，  ２，ｐ．１２−２２
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ，２００２，６８，ｐ．３９９−４０３，
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｃ，２００１，ｐ．４３５７−４３６１．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｄｅｃ，２００１，ｐ．４４１３−４４１９．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｎｏｖ，２０００，ｐ．４００６−４００９．
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ，Ｓｅｐｔ，２０００，ｐ．３１８７−３１８９．
に記載されている核酸配列のもの、ＨＨＶ７に特異的なプローブ：  ｔｔｇｔｇａａａｔｇ  ｔｇｔｔｇｃｇａｔａ  ｇｇｇｃ  核酸配列３、ｇｃｃａｔａａｇａａ  ａｃａｇｇｔａｃａｇ  ａｃａｔｔｇｔｃａ  核酸配列４、およびＨＣＭＶに特異的なプローブ：ａｃａｃｃａｃｔｔａ  ｔｃｔｇ  核酸配列５、ＶＺＶに特異的なプローブ：  ａａｇｔｔｃｇｃｇｇ  ｔａｔａａｔｔｇｔ  核酸配列６を記載されているものの代わりに用いる。以上のプローブ混合液をつくり４μｌ  入れ（図１Ａのｂ参照）てプラスチック製の蓋３で栓をした。  この状態ではＰＣＲ溶液ａとハイブリイゼーションプローブミックスｂとは分離された状態にある。
【００３５】
キャピラリーを刺したカローセルをライトサイクラーにセットしてＰＣＲをおこなった。  ＰＣＲ条件は９５℃で２分、次に９５℃で１秒、５７℃で１５秒、７２℃で１５秒の温度サイクルを４０サイクルおこない、最後に４０℃で３０秒間の冷却をして終了した。
【００３６】
上記すべてのＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｒａｔｅは２０Ｃ／ｓｅｃでおこなった。  次にカローセルをカローセル遠心機にて遠心（３０００ｒｐｍ  ３秒）し、ＰＣＲ反応液１０μｌとハイブリダイゼーションプローブミックス４μｌ  を混合（図１Ｂのｃ参照）して１分間放置した後、再びライトサイクラーにカローセルをセットして、融解曲線分析をおこなった。  分析条件は、９５℃  １分、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ２０Ｃ／ｓｅｃ、４０℃  １５秒  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ２０℃／ｓｅｃ、７５℃０秒  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ０．６℃／ｓｅｃ    Ａｃｑｕｉｓｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅ  ＣＯＮＴ、４０℃  ３０秒である。
【００３７】
なおプローブの混合には上記した図１のライトサイクラーキャピラリー１に代えて図２にあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）４を用いることもできる。  これはポリプロピレン等の透明な容器５と折り曲げ自在のヒンジを介して施蓋可能な蓋６とからなるもので、図２Ａはプローブを混合する前段階をあらわし、ＰＣＲ  反応液ａ，プローブ溶液ｂ，ミネラルオイルｃが順次積層状に充填された状態をあらわしている。  また図２ＢはＰＣＲ後に３０００ｒｐｍ３秒間遠心してプローブ溶液を混合した状態をあらわしている。
【００３８】
〔融解曲線分析の解析〕
融解曲線分析結果を解析するための操作方法について説明すると、Ｓｅｌｅｃｔ  ａ  Ｐｒｏｇｒａｍにおいてプログラムをｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ  ｐｒｏｇｒａｍに選択し、またＣａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ＭｅｔｈｏｄをＰｏｌｙｎｏｍｉｎａｌに選択した。  Ｅｘｔｒａ  Ｍａｎｕａｌ  Ｔｍ  を選択して各サンプルのＴｍ値を測定したところ、各ウィルスのハイブリダイゼーションプローブ融解ピーク（Ｔｍ値）は図３に示す通りであった。
【００３９】
融解Ｔｍ値が同じか、あるいは近いものは、蛍光色素「ＬＣＲｅｄ６４０（Ｆ２／Ｆ１），  ＬＣＲｅｄ７０５（Ｆ３／Ｆ１）の２色」を換えて異なる波長で検出するようにした。  この操作によりウィルスが存在すれば、増幅されたＰＣＲ産物にウィルス種特異的プローブがハイブリダイゼーションする。  そして除々に温度を上げていくとそのハイブリダイゼーションプローブ固有のＴｍ値のところでプローブが解離して蛍光強度が急激に落ちる。  縦軸を温度、横軸を温度にして急激に下がった温度変化を微分してピークとする。  その解離ピークのＴｍ値よりウィルス種を判定する。
【００４０】
測定の結果、Ｆ２／Ｆ１チャンネルでＴｍ値５９℃にピークが現れ、ＨＨＶ６において陽性となった。このサンプルをウィルス定量系にてウィルス定量したところＨＨＶ６においては２５コピー／μｇＤＮＡ検出され、他のウィルスは検出されなかった。  このことから定性系と定量系との一致が見られた。  なおこの場合に予め反応液等を用意しておけば、血液から  ＤＮＡ，ＲＮＡ抽出に３０分、核酸増幅に３０分、検出に１５分、数にもよるが操作の合計が３０分と、合計１時間４５分で検査作業が完了する。
【００４１】
なおＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブミックスの組成・蛍光色素・添加量などの概要を図４に示す。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本願の発明は患者から抽出した試料中の核酸に対し、プローブを含まない添加剤を添加して核酸増幅した後、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した複数の標識プローブを混入し、混入後のプローブに含まれる蛍光標識を融解曲線分析することにより、複数の標的核酸を同時的に同定検出するようにしたものであるために、特殊技術を要することなく、従来技術より短時間で、しかも、少なくとも５種類以上の異なる核酸配列の増幅結果を、より高い検出感度で同時的に確認することができる。
【００４３】
その結果、傷病・病害の予防、または治療において、患者の体内に原因となる有害細菌やウイルスが存在するか否かを迅速に同定検出することができ、また近時盛んとなった移植医療、再生医療の分野において、患者に移植や移入する際の有害細菌・ウィルスの混入を事前に避けることができ、迅速かつ安全でしかも高品質の移植医療、再生医療の実現に寄与するところが大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いるプローブ混合手段の一例をあらわしたライトサイクラーキャピラリーの縦断面図。
【図２】本発明において用いるプローブ混合手段の別の例をあらわしたマイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）の縦断面図。
【図３】本発明におけるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの融解ピークをあらわした実験結果表。
【図４】本発明において用いるＤＮＡウイルスハイブリダイゼーションプローブの内容をあらわした一覧表。
【符号の説明】
１        ライトサイクラーキャピラリー
２        容器
３        蓋
４        マイクロチューブ（ＰＣＲチューブ）
５        容器
６        蓋
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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