(57)【要約】      （修正有）【課題】硝酸イオン濃度に応じて下流遺伝子の発現を調節することが可能な硝酸イオン誘導性プロモーターを提供すること。【解決手段】特定の塩基配列からなる群より選択される何れか一の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択されるプロモーター：
ａ）配列番号７に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｂ）配列番号８に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｃ）配列番号９に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｅ）配列番号１１に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；および
ｆ）配列番号１２に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロモーター遺伝子に関する。より詳しくは、プロモーターの下流に連結された外来タンパク質等の発現誘導を外部刺激によって調節可能なプロモーターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物にとって窒素は重要な栄養素であり、多くの植物は好硝酸性の性質を有し、植物培養細胞の増殖および植物体の成長は、硝酸態窒素の有無、あるいはその濃度によって大きく影響を受けることが知られている。植物が根から硝酸イオンを吸収し、吸収した硝酸イオンを植物体内で細胞間輸送する際に働く一群のタンパク質は、硝酸トランスポータータンパク質と称され公知である。
【０００３】
硝酸トランスポータータンパク質は、硝酸イオン濃度が高い（即ち、０．５ｍＭ以上）ときに働く低親和性硝酸トランスポーターと硝酸イオン濃度が低い（即ち、０．５ｍＭ以下）ときに働く高親和性硝酸トランスポーターが知られており、それぞれの硝酸トランスポーターをコードする遺伝子（以下、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子、高親和性硝酸トランスポーター遺伝子ともいう）が報告されている（化学と生物，  Ｖｏｌ．３８，  ｐ１９６−２０３，  ２０００（非特許文献１））。これまでに遺伝子レベルでの研究が進み、植物由来の低親和性硝酸トランスポーター遺伝子として、シロイヌナズナ由来のＣＨＬ１（ＡｔＮＲＴ１）（Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．７２，  ｐ７０５−７１３，  １９９３，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．８，  ｐ２１８３−２１９１，  １９９６（非特許文献２））、ＮＴＬ１（ＡｔＮＲＴ１：２）（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ１３８１−１３９２，  １９９９（非特許文献３））、イネ由来のＯｓＮＲＴ１（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１２２，  ｐ３７９−３８８，  ２０００（非特許文献４））、アブラナ由来のＢｎＮＲＴ１：２（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７３，  ｐ１２０１，  １９９８（非特許文献５））、トマト由来のＬｅＮＲＴ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐ８１３９−８１４４，  １９９６（非特許文献６））などの報告がある。なお、ＣＨＬ１については低親和性、高親和性両方の機能を併せ持っているとの報告もある（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ８６５−８７４，  １９９９（非特許文献７））。これらの遺伝子のうち、硝酸イオン輸送活性が実験的に確認されているものは、ＣＨＬ１、ＮＴＬ１およびＯｓＮＲＴ１である。この他にも遺伝子レベルで相同性のある遺伝子が多数単離されているが、それらの硝酸イオン輸送活性は測定されておらず、硝酸トランスポーター遺伝子であるという明確な確認はなされていないのが現状である。
【０００４】
以上、硝酸トランスポーターについては、それらの遺伝子とタンパク質の機能についてこれまでにも研究が行われており、数多くの報告があるが、硝酸トランスポーター遺伝子のプロモーターに関しての報告はない。
【０００５】
一般に、遺伝子の発現調節領域であるプロモーターは、その下流に存在する遺伝子の発現を調節可能であるため、外来遺伝子を発現させる際に用いるプロモーターの選択は重要な意味を有している。すなわち、プロモーターは、遺伝子工学的に導入された外来遺伝子を発現させる際、外来遺伝子の発現時期、発現組織、発現強度を制御できるため、形質転換植物の作製においてその選択は重要な意味を有している。植物細胞で外来遺伝子を発現させる際に最もよく用いられる方法として、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターまたはノパリン合成酵素遺伝子プロモーター（Ｓａｎｄｅｒ  Ｐ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＲＥＳ，  １５  （１９８７）  １５４３−１５５８（非特許文献８））等の下流に外来遺伝子を連結して、植物細胞に導入する方法が挙げられる。また、外部刺激による誘導によって、植物細胞に導入した外来遺伝子の発現を制御する方法として、α−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｃｈａｎ  Ｍ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９  （１９９４）  １７６３５−１７６４１（非特許文献９））、リン酸トランスポーター遺伝子のプロモーター（Ｎ．  Ｍｉｔｓｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４  （１９９７）  ７０９８−７１０２（非特許文献１０））、あるいは傷害誘導性プロモーター（Ｔ．Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９４）  ９１７−９２６（非特許文献１１））、化学的誘導プロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２  （１９９３）  ３６１−３６６（非特許文献１２））、光誘導プロモーター（Ｆｌｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３２  （１９８６）  １１０６−１１１２（非特許文献１３））を利用する方法が報告されている。しかし、硝酸イオン刺激により下流遺伝子の発現を誘導するプロモーターの存在については報告されたことがない。
【０００６】
【非特許文献１】
化学と生物，  Ｖｏｌ．３８，  ｐ１９６−２０３，  ２０００
【非特許文献２】
Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．７２，  ｐ７０５−７１３，  １９９３，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．８，  ｐ２１８３−２１９１，  １９９６
【非特許文献３】
Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ１３８１−１３９２，  １９９９
【非特許文献４】
Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．１２２，  ｐ３７９−３８８，  ２０００
【非特許文献５】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２７３，  ｐ１２０１，  １９９８
【非特許文献６】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．９３，  ｐ８１３９−８１４４，  １９９６
【非特許文献７】
Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ８６５−８７４，  １９９９
【非特許文献８】
Ｓａｎｄｅｒ  Ｐ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＲＥＳ，  １５  （１９８７）  １５４３−１５５８
【非特許文献９】
Ｃｈａｎ  Ｍ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９  （１９９４）  １７６３５−１７６４１
【非特許文献１０】
Ｎ．  Ｍｉｔｓｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４  （１９９７）  ７０９８−７１０２
【非特許文献１１】
Ｔ．Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９４）  ９１７−９２６
【非特許文献１２】
Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２  （１９９３）  ３６１−３６６
【非特許文献１３】
Ｆｌｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３２  （１９８６）  １１０６−１１１２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、硝酸イオンの存在により下流遺伝子の発現を調節することが可能な硝酸イオン誘導性プロモーターを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下のａ）〜ｆ）からなる群より選択されるプロモーターを提供する。
ａ）配列番号７に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｂ）配列番号８に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｃ）配列番号９に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｄ）配列番号１０に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；
ｅ）配列番号１１に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター；および
ｆ）配列番号１２に記載の塩基配列を含むプロモーターであって、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能なプロモーター。
【０００９】
更に、本発明は、以下の手段を提供する。
（１）本発明のプロモーターを含む発現ベクター。
（２）本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞。
（３）本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞を含む形質転換体。
（４）本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞内において、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を調節する方法。
（５）本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞を含む形質転換体において、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を調節する方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は本発明を説明するためのものであって本発明を限定するためのものではない。なお以下の説明において、ＤＮＡの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ＰＣＲ等の一般の遺伝子組換えは、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものを参照して行うことができる。
【００１１】
１．本発明の硝酸イオン誘導性プロモーター
（１）プロモーターの単離方法
本発明のプロモーターは、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能である。そのため、本発明のプロモーターは、硝酸イオン誘導性プロモーターともいう。
【００１２】
本発明者らは、このような硝酸イオン誘導性プロモーターを単離するために、硝酸イオン吸収と深く係わり合いを有するタンパク質をコードする遺伝子の上流域を単離することを想定した。そこで、まず、硝酸イオン吸収と深く係わり合いを有するタンパク質をコードする硝酸トランスポーター遺伝子を複数種類単離した（後述の実施例１参照）。単離された４種類の硝酸トランスポーター遺伝子を、ｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂと称し、これらの配列を、それぞれ配列番号１３、１５、１７、及び１９に示す。次いで、単離された硝酸トランスポーター遺伝子それぞれの上流域を単離した（後述の実施例２参照）。
【００１３】
硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の単離の仕方について以下説明する。単離された硝酸トランスポーター遺伝子（配列番号１３、１５、１７および１９）の共通塩基配列に基づいて作製した一対のオリゴヌクレオチド（配列番号２５、２６）をプライマーとして用いた逆ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ）法により、植物の染色体ＤＮＡから硝酸トランスポーター遺伝子の上流域を単離することができる。すなわち、Ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法については、植物の染色体ＤＮＡを制限酵素で完全消化、セルフライゲーションしたものを鋳型として、硝酸トランスポーター遺伝子配列から作製したプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲを行い、その上流域を単離することができる。単離された上流域について塩基配列解析を行うことにより、硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の配列を決定することができる。
【００１４】
（２）プロモーターの特徴
得られた複数種類の硝酸トランスポーター遺伝子の共通配列を利用して当該遺伝子の上流域を単離し、その配列を決定した。決定された上流域の配列を配列番号１〜６に示す。硝酸トランスポーター遺伝子ｎｒｔ１．１Ａおよびｎｒｔ１．１Ｂの上流域に相当する配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。硝酸トランスポーター遺伝子ｎｒｔ１．２Ａまたはｎｒｔ１．２Ｂの上流域に相当する配列を、配列番号３〜６に示す。本来、ｎｒｔ１．２Ａの上流域とｎｒｔ１．２Ｂの上流域は、それぞれ一つずつしか単離されないはずであるが、後述の実施例において４種類の上流域の塩基配列が得られている。これは、硝酸トランスポーター遺伝子が、ｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂ以外にも存在し、その上流域も単離されたためであると考えられる。また、後述の実施例で得られたｎｒｔ１．２Ａの上流域またはｎｒｔ１．２Ｂの上流域の何れかに相当する可能性がある配列（配列番号３〜６）は、ｎｒｔ１．２Ａの上流域に相当する配列であるのか、ｎｒｔ１．２Ｂの上流域に相当する配列であるのか、後述の実施例では確定されていない。
【００１５】
本発明において、硝酸トランスポーター遺伝子ｎｒｔ１．１群（ｎｒｔ１．１Ａおよびｎｒｔ１．１Ｂ）およびｎｒｔ１．２群（ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂ）の発現を調べることにより、これら遺伝子のプロモーター領域の硝酸イオン感受性を検討した。これにより、本発明のプロモーターの特徴付けを行った（後述の実施例３および４参照）。より具体的には、硝酸トランスポーター遺伝子ｎｒｔ１．１群およびｎｒｔ１．２群の発現がどの組織で起こっているか（実施例３）、硝酸イオン濃度に応じてどのように変化するか（実施例４）を調べた。
【００１６】
ｎｒｔ１．１群は、タバコ植物の器官全体において発現し、ｎｒｔ１．２群は、組織特異的に（主に根で、その他茎、花で）発現した（図１）。また、ｎｒｔ１．１群は、硝酸イオンの存在の有無に関わらず、その発現は構成的に維持されたが、硝酸イオンの添加によりその発現は増大した（図２Ａ）。一方、ｎｒｔ１．２群は、硝酸イオンの存在しない条件下ではほとんど発現せず、硝酸イオンの添加によりその発現は誘導された（図２Ｂ）。
【００１７】
よって、ｎｒｔ１．１群の上流域に存在するプロモーターは、植物の全器官において、下流遺伝子の構成的発現を可能にするが、硝酸イオンの存在により発現を増大させる性質を有する。一方、ｎｒｔ１．２群の上流域に存在するプロモーターは、下流遺伝子の発現を硝酸イオンの存在により初めて、とりわけ根で組織特異的に引き起こす性質を有する。
【００１８】
また、配列番号１〜６に記載の上流域の塩基配列が、硝酸イオン誘導性プロモーターとして機能し得ることは、これら上流域の配列の下流にレポーター遺伝子を連結し、レポーター遺伝子の発現をみることにより証明された（後述の実施例５および６参照）。
【００１９】
配列番号１〜６に示されるこれら上流域の配列は、転写開始反応に必要なＤＮＡエレメントであるＴＡＴＡボックスを含む。具体的には、配列番号１に示される塩基配列の６１７〜６２３位、配列番号２に示される塩基配列の８２１〜８２７位、配列番号３に示される塩基配列の９４１〜９４７位、配列番号４に示される塩基配列の７０４〜７１０位、配列番号５に示される塩基配列の８１０〜８１６位、配列番号６に示される塩基配列の１００９〜１０１５位がＴＡＴＡボックスに相当する。これらＴＡＴＡボックスがプロモーター活性に必須の配列であることは、硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の配列を種々の長さで切断した欠失プロモーターのプロモーター活性を調べることにより確認された（後述の実施例６参照）。
【００２０】
従って、本発明の硝酸イオン誘導性プロモーターは、ＴＡＴＡボックスから硝酸トランスポーター遺伝子の開始コドンまでの配列（ＴＡＴＡボックスは含むが開始コドンは含まない）を少なくとも含み、プロモーター活性を有するものと定義することができる。配列番号１〜６に示される上流域の配列について、ＴＡＴＡボックスから硝酸トランスポーター遺伝子の開始コドンまでの配列（ＴＡＴＡボックスは含むが開始コドンは含まない）を、それぞれ配列番号７〜１２に示す。本発明の硝酸イオン誘導性プロモーターは、配列番号７〜１２の何れかの塩基配列を含み、当該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を硝酸イオンの存在下で誘導可能であれば、その他任意の配列を含んでいてもよい。また、本発明の硝酸イオン誘導性プロモーターは、プロモーター活性を保持し得る限り、その塩基配列において一ないし数個の塩基が置換、欠失、付加されていてもよいし、化学的な修飾がなされていてもよい。このように一部改変されたプロモーターも本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明において「プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導する」とは、以下の場合を含む。すなわち、硝酸イオンの存在しない条件下で発現していなかった下流遺伝子の発現が、硝酸イオンの存在により初めて誘導される場合、および硝酸イオンの存在しない条件下で発現していた下流遺伝子の発現量が、硝酸イオンの存在により増大される場合を含む。ここで、硝酸イオンの存在とは、例えば０．１〜１０ｍＭの濃度をいい、好ましくは０．２〜５ｍＭの硝酸イオンの濃度をいう。ただし、下流遺伝子の発現を誘導するのに必要な硝酸イオンの濃度は、上記硝酸イオン濃度に限定されず、各プロモーターの硝酸イオン感受性を検討した上で設定することが好ましい。
【００２２】
本発明の硝酸イオン誘導性プロモーターには、例えば、後述の実施例６において作製された欠失プロモーターのうち、プロモーター活性を有するものが含まれる。
【００２３】
なお、下記配列表の配列番号１〜６の配列（硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の配列）および配列番号７〜１２の配列（プロモーターに必須の配列）において、５’側の非翻訳領域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ；ＵＴＲ）を５’ＵＴＲとしてその位置を記す。
【００２４】
２．本発明のプロモーターを含む発現ベクター
更に本発明は、上述の「本発明の硝酸イオン誘導性プロモーター」と、該プロモーターの下流に位置する目的タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の転写を終結させるための配列ターミネーターとを含む発現ベクターを、公知の手法に従って提供することができる。このような発現ベクターは、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を、硝酸イオンの存在下で誘導することが可能である。ここで目的タンパク質をコードする遺伝子は、硝酸トランスポーター遺伝子であってもよいし、その他、硝酸イオンの存在に依存して発現調節したい任意の遺伝子が考えられる。
【００２５】
本発明の発現ベクターは、更に、形質転換体の選抜のためのマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子）を含んでいてもよい。また、本発明の発現ベクターをアグロバクテリウム感染法で使用する場合、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド由来のバイナリーベクターを基に作製することが好ましい。
【００２６】
３．本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞
更に本発明は、上述の「本発明のプロモーターを含む発現ベクター」を任意の細胞に導入した形質転換細胞を、公知の手法に従って提供することができる。例えば、上述の本発明のプロモーターを含む発現ベクターをアグロバクテリウムに導入することができる。形質転換により得られたアグロバクテリウムは、アグロバクテリウムの植物への感染力により、発現ベクター内の目的タンパク質コード遺伝子を植物に導入することができる。
【００２７】
４．本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞を含む形質転換体
更に本発明は、上述の「本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞」を含む形質転換体を、公知の手法に従って提供することができる。例えば、上述の本発明のプロモーターを含む発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、アグロバクテリウムの有する植物への感染力を利用して、植物あるいは植物細胞に導入することができる。
【００２８】
一般に、植物あるいは植物細胞の形質転換法として様々な方法が知られている。例えば、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、リーフディスク法やバキュームインフィルトレーション法等のアグロバクテリウム感染法が挙げられる。パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法により植物細胞を形質転換する際は、市販のｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の大腸菌で増殖可能なベクターを形質転換ベクターとして用いることができる。また、リーフディスク法やバキュームインフィルトレーション法等のアグロバクテリウム感染法によって植物体や植物細胞を形質転換する際は、Ｔｉプラスミド由来のｐＧＶ３８５０（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ３  （１９８４）  １６８１−１６８９）等のベクターやｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）等のバイナリーベクターを利用することができる。
【００２９】
５．本発明のプロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を調節する方法
更に本発明は、本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞内において、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を調節する方法を提供する。また本発明は、本発明のプロモーターを含む発現ベクターを保持する細胞を含む形質転換体において、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現量を調節する方法を提供する。
【００３０】
本発明の方法により、本発明のプロモーターの有する硝酸イオン感受性の性質に従って、該プロモーターの下流に存在する遺伝子の発現を調節することが可能である。より具体的には、ｎｒｔ１．１群の上流域に由来するプロモーター（即ち、配列番号７または８に記載の塩基配列を少なくとも含むプロモーター）を使用した場合、植物の全器官において硝酸イオンの有無に関わらず外来遺伝子を発現させることが可能であるとともに、硝酸イオンの添加によりその発現量を増大させることが可能である（図２Ａ参照）。一方、ｎｒｔ１．２群の上流域に由来するプロモーター（即ち、配列番号９〜１２の何れかに記載の塩基配列を少なくとも含むプロモーター）を使用した場合、特定の器官のみにおいて硝酸イオンの存在下でのみ外来遺伝子を誘導させることが可能である（図２Ｂ参照）。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の単離
（１）ニコチアナ  タバカム  ｃｖ．バーレー２１の総ＲＮＡの抽出
標準的な水耕液（５ｍＭのＫＮＯ３、２．５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、２ｍＭのＣａ（ＮＯ３）、０．０５ｍＭのＦｅ−ＥＤＴＡ、７０μＭのＨ３ＢＯ３、１４μＭのＭｎＣｌ２、０．５μＭのＣｕＳＯ４、１μＭのＺｎＳＯ４、０．２μＭのＮａＭｏＯ４、１０μＭのＮａＣｌ、０．０１μＭのＣｏＣｌ２）で２〜３週間栽培したニコチアナ  タバカム  ｃｖ．バーレー２１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｂｕｒｌｅｙ  ２１）の根を総ＲＮＡの調製に供した。０．５ｇの根をＦａｓｔ  ＲＮＡ−Ｇｒｅｅｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１）のチューブに入れ、これをＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０装置にセットして磨砕した。更に、添付されたプロトコールに従い総ＲＮＡを得た。
【００３３】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法による低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の単離
上記（１）で得られた総ＲＮＡを鋳型として使用し、逆転写反応を行った。即ち、総ＲＮＡ１〜２μｇ、１０×ＲＴ緩衝液、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（１５）プライマー１０  ｐｍｏｌｅｓ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １０ユニット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １ユニット（Ｑｉａｇｅｎ）、合計１０μＬにＲＮａｓｅ−フリー  ウォーター（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）で調製後、３７℃で６０分間逆転写反応を行い、９３℃で５分間処理して酵素を失活した。
【００３４】
次に、反応溶液の一部を鋳型にしてＰＣＲを行った。即ち、反応液５μＬ、１０×緩衝液１０μＬ、終濃度０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーセット、５ユニットのＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、合計５０μＬに調整後、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００）を用いて９４℃で２分を１サイクル、９４℃で３０秒→５５℃で３０秒→７２℃で１．５分を３０サイクル、７２℃で７分を１サイクルとして反応を行った。プライマーセットの配列は、配列番号２１、配列番号２２に示したＮ−１（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ  ＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡ  ＡＣＡＡ−３’）とＮ−２（５’−ＴＴＡＧＴＧＧＣＡＡ  ＧＣＴＧＧＴＴＣＴＧ  ＡＡＴＣ−３’），及び配列番号２３および配列番号２４に示したＮ−３（５’−ＡＴＧＧＣＡＣＴＴＣ  ＣＴＧＡＧＡＣＡＣＡ  ＧＣ−３’）とＮ−４（５’−ＴＣＡＡＴＧＡＣＡ  ＡＡＣＣＧＧＴＣＣＡ  ＴＣＡＴ−３’）の２組を用いた。
【００３５】
Ｎ−１とＮ−２、Ｎ−３とＮ−４の２組のプライマーセットを用いて、それぞれ約１．８ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。それぞれの増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ｐＵＣ１９（ＴａＫａＲａ）にクローニングした。大腸菌数十コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し，ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００に供して塩基配列を解析した。その結果、各プライマーセットで２分子種ずつが増幅されることが判明した。その塩基配列を配列番号１３、１５、１７、及び１９に示す。これら塩基配列から構成される遺伝子を、それぞれｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａ、及びｎｒｔ１．２Ｂと称する。これら塩基配列にコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４、１６、１８、及び２０に示す。
【００３６】
このように、４種類の低親和性硝酸トランスポーター遺伝子を、ニコチアナ  タバカム  ｃｖ．バーレー２１の各器官（例えば葉肉、中骨、茎および根など）の総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により単離することができた。
【００３７】
実施例２：低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の単離
実施例１で単離された低親和性硝酸トランスポーター遺伝子のうち、ｎｒｔ１．１群（ｎｒｔ１．１Ａおよびｎｒｔ１．１Ｂ）とｎｒｔ１．２群（ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂ）とは相同性が高く、共通配列部分が存在した。その共通配列部分を基にオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。その塩基配列は、
４３３−４５８Ｆ：５’−ＡＡＡＣＡＡＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＴＡＣＡＴＴＧＣ−３’（５’側プライマー）  （配列番号２５）
７７７−７５１Ｒ：５’−ＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＣＴ−３’（３’側プライマー）  （配列番号２６）
である。このプライマーを用いて、タバコＢＡＣライブラリーからＰＣＲによって低親和性硝酸トランスポーター遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。
【００３８】
タバコＢＡＣライブラリーの作製方法は以下のとおりである。タバコ染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分分解し、ｐＢＡＣＬａｃＳｐベクターに挿入した。これを大腸菌ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポレーション法で導入することにより、平均挿入断片長１４０  ｋｂのＢＡＣクローンを約１０万個得た。
【００３９】
前述のとおり、このタバコＢＡＣライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行った結果、１４個の陽性クローンを得た。これらの大腸菌を液体培養してプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識し、その後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００に供して塩基配列を解析した。シークエンス用プライマーは、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子のアンチセンス方向鎖を設計、合成して用いた。
【００４０】
その結果、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の塩基配列が決定された。ここで、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の塩基配列は６種類得られた。これら６種類の上流域の塩基配列を、配列番号１〜６に示す。ｎｒｔ１．１Ａの上流域に相当する配列として、配列番号１で示される塩基配列が得られ、ｎｒｔ１．１Ｂの上流域に相当する配列として、配列番号２で示される塩基配列が得られた。ｎｒｔ１．２Ａの上流域またはｎｒｔ１．２Ｂの上流域の何れかに相当する配列として、配列番号３〜６に示される塩基配列が得られた。実施の形態の欄でも説明したとおり、本来、ｎｒｔ１．２Ａの上流域とｎｒｔ１．２Ｂの上流域は、それぞれ一つずつしか単離されないはずであるが、本実施例において４種類の上流域の塩基配列が得られている。これは、硝酸トランスポーター遺伝子が、ｎｒｔ１．１Ａ、ｎｒｔ１．１Ｂ、ｎｒｔ１．２Ａおよびｎｒｔ１．２Ｂ以外にも存在し、その上流域も単離されたためであると考えられる。また、本実施例で得られたｎｒｔ１．２Ａの上流域またはｎｒｔ１．２Ｂの上流域の何れかに相当する可能性がある配列（配列番号３〜６）は、ｎｒｔ１．２Ａの上流域に相当する配列であるのか、ｎｒｔ１．２Ｂの上流域に相当する配列であるのか、本実施例では確定されていない。
【００４１】
実施例３：低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の発現解析１
播種後１ヶ月のタバコの幼苗を水耕栽培し、開花時に花、ラミナ、中骨（主脈）、茎、および根から総ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として逆転写反応を行った。即ち、総ＲＮＡ１〜２μｇ、１０×ＲＴ緩衝液、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ、ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（１５）プライマー１０  ｐｍｏｌｅｓ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １０ユニット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １ユニット（Ｑｉａｇｅｎ）、合計１０μＬにＲＮａｓｅ−フリー  ウォーター（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ）で調製後、３７℃で６０分間逆転写反応を行い、９３℃で５分間処理して酵素を失活した。
【００４２】
この反応液を滅菌水で５倍に希釈し、そのうち５μＬを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量ＰＣＲを行った。定量ＰＣＲには、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、方法は添付のプロトコールに従った。定量する遺伝子（低親和性硝酸トランスポーター遺伝子）のプライマーセットとして、ｎｒｔ１．１群を特異的に増幅するプライマー、ｎｒｔ１．２群を特異的に増幅するプライマーを用いた。また、内部標準としてＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを用いた。各プライマーの塩基配列は以下のとおりである。
・ｎｒｔ１．１群のプライマーセット
Ｆ  ：  ５’−ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号２７）
Ｒ  ：  ５’−ＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＣ−３’（配列番号２８）
・ｎｒｔ１．２群のプライマーセット
Ｆ  ：  ５’−ＴＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号２９）
Ｒ  ：  ５’−ＡＡＴＣＣＣＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＣＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）
・ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子のプライマーセット
Ｆ  ：  ５’−ＡＡＡＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号３１）
Ｒ  ：  ５’−ＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＧＴＣＧＡＣ−３’（配列番号３２）
【００４３】
その結果を図１に示す。図１において、Ｆは花、Ｌはラミナ、Ｍは中骨、Ｓは茎、Ｒは根における遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡレベル）を示す。図１において遺伝子発現レベル（ｍＲＮＡレベル）は、ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅのｍＲＮＡ発現量に対する相対値である。
ｎｒｔ１．１群は、根での発現が特に高かったが、花、ラミナ、中骨、茎といった他の器官でも一様に発現していた。ｎｒｔ１．２群は、根で特に高く、茎、花でも発現が認められたが、ラミナや中骨ではほとんど発現していなかった。
【００４４】
実施例４：低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の発現解析２
播種後１ヶ月のタバコの幼苗を、１０ｍＭの硝酸イオン濃度の水耕液で１０日間栽培し、更に、５ｍＭの硝酸イオン濃度の水耕液、或いは無窒素の水耕液で７日間栽培した。その後、５ｍＭの硝酸イオン濃度の水耕液で栽培したタバコは、無窒素水耕液に移し、経時的に根を採取して総ＲＮＡを抽出した。無窒素の水耕液で栽培したタバコは、０．２ｍＭあるいは５ｍＭの硝酸イオンを含む水耕液に移し、経時的に根を採取して総ＲＮＡを抽出した。
【００４５】
実施例２に準じて、ｎｒｔ１．１群およびｎｒｔ１．２群の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した。その結果を図２に示す。図２Ａは、ｎｒｔ１．１群の発現量を示し、図２Ｂはｎｒｔ１．２群の発現量を示す。図２ＡおよびＢにおいて、「５ｍＭ→０ｍＭ」は、５ｍＭの硝酸イオン濃度の水耕液で栽培したタバコを無窒素水耕液に移した場合を示し、「０ｍＭ→５ｍＭ」は、無窒素水耕液で栽培したタバコを５ｍＭの硝酸イオンを含む水耕液に移した場合を示し、「０ｍＭ→０．２ｍＭ」は、無窒素水耕液で栽培したタバコを０．２ｍＭの硝酸イオンを含む水耕液に移した場合を示す。それぞれ、移した時点を０時間として、横軸は時間（ｈｏｕｒ）を示す。縦軸は、図２Ａではｎｒｔ１．１群  ｍＲＮＡ／ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍＲＮＡを示し、図２Ｂではｎｒｔ１．２群  ｍＲＮＡ／ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍＲＮＡを示す。
【００４６】
ｎｒｔ１．１群は、無窒素状態にしてもほとんど発現に変化はなかったが、硝酸イオンの添加により１時間で発現が誘導され、その後高い発現レベルで維持された（図２Ａ）。一方、ｎｒｔ１．２群は、無窒素状態にすると速やかにその発現は低下したが、硝酸イオンの添加により（添加後２時間までに）その発現は誘導された（図２Ｂ）。
【００４７】
実施例５：ＧＵＳ遺伝子を用いた低親和性硝酸トランスポーター遺伝子のプロモーター活性
ｎｒｔ１．１Ｂ遺伝子（配列番号１５）の上流域約１．６ｋｂをクローニングし、この下流にＧＵＳ遺伝子を挿入した。即ち、バイナリーベクターｐＢＩ１０１．２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）のＧＵＳ遺伝子上流に、ｎｒｔ１．１Ｂ遺伝子の上流域約１．６ｋｂをリーディングフレームが合致するようにクローニングした。得られたベクターの塩基配列を解析してリーディングフレームが正確であることを確認後、エレクトロポレーション法でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４株に導入した。カナマイシン１００ｐｐｍを含む培地で形質転換体を選抜し、多数の遺伝子導入株を得た。得られた形質転換体について組織学的にＧＵＳ染色を行った。即ち、１ｍＭ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、２０％メタノールの溶液に試料を浸し、３７℃で一晩反応させた。次いで、１００％メタノールで２〜３回、２時間おきに洗浄した。
【００４８】
その結果、根では表層と中心柱、葉では維管束組織で強い発現を検出した。この結果から、ｎｒｔ１．１Ｂのプロモーターは、根では外界からの硝酸イオンの吸収、並びに柔細胞から導管への輸送に関与し、葉では導管から葉肉細胞への輸送に関与していることが示唆された。
【００４９】
実施例６：  ＢＹ２培養細胞を用いた、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子プロモーターによる下流遺伝子の一過的発現
（１）ＢＹ２培養細胞のプロトプラスト作製
１×ＭＳ  ｓａｌｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ、２００ｍｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール、１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、０．２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、３％スクロース（ｐＨ５．８）で振とう培養した、植え継いで３〜４日目のＢＹ２培養細胞を、自然沈降で集めた。上清を除き、０．４Ｍマンニトールを加えて３０℃で１０分間静置した。上清を除き、酵素液（１％セルラーゼオノズカＲＳ、０．１％ペクトリアーゼＹ２３、０．４Ｍマンニトール）を加えて３０℃で１〜２時間反応させた。反応後、５０ｍＬの遠沈管に移し、１０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除き、氷冷した０．４Ｍマンニトールで６回以上遠心洗浄し、ＭＥＳ−マンニトール溶液（０．３Ｍマンニトール、５ｍＭ  ＭＥＳ、７０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ  ５．８）に懸濁した。
【００５０】
（２）欠失プロモーターの作製
ｎｒｔ１．１Ａ遺伝子（配列番号１３）の上流域約３．３ｋｂにＧＵＳ遺伝子を連結したＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。これを大腸菌ＴＢ１株に導入して大量に抽出したプラスミドを、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａｒａ）を用いて、プロモーター領域の長さが異なるデリーションシリーズを得た。各クローンからプラスミドを抽出し、シークエンスを行うことによりプロモーター領域の長さを決定した。
【００５１】
（３）エレクトロポレーション
（１）で作製したＢＹ２プロトプラストを６×１０６／ｍＬ用意し、これに（２）のベクターを混合した。用いたベクター量は、３μｇずつで、対照としてＧＵＳ遺伝子を含むｐＢＩ１２１（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いた。氷中で５分間冷却後、０．２ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に移し、ジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて１６０ｋＶ、１２５μＦの減衰波をかけた。チューブに移して氷中で３０分間静置した後、３０℃で５分間処理した。１０００ｒｐｍ、２分間の遠心後、プロトプラスト培地（１×ＭＳ  ｓａｌｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１００ｍｇ／Ｌ  ミオイノシトール、１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩、０．２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ  ５．８）で懸濁して２８℃で１６時間培養した。
【００５２】
（４）ＧＵＳ活性の解析
（３）のプロトプラストを１０００ｒｐｍ、２分間の遠心で集め、抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ７．０、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％  Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を加えて超音波破砕した。１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心して得られて上清を試料とした。
【００５３】
試料に終濃度１ｍＭとなるように４−メチルウンベリフェリル  グルクロニド（ＭＵＧ）を加え、３７℃で３０分間反応させた。０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加えて反応を停止し、蛍光分光光度計ＧＵＳ酵素の反応産物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を測定した（励起波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５５ｎｍ）。標準曲線は、２００ｎＭ〜１０００ｎＭの４−ＭＵで作製し、ＧＵＳ酵素活性は１分、１ｍｇタンパク質当りの４−ＭＵ量で産出した。
【００５４】
その結果を表１に示す。
【表１】
2005006564.tif 000002
【００５５】
表１は、ＢＹ２プロトプラストに導入した欠失プロモーターによるＧＵＳの一過的発現量を示す。表１において「プロモーター領域の長さ（ｂｐ）」は、翻訳開始コドンＡＴＧから上流域の長さ（開始コドンＡＴＧは含まない）を示す。なお、「プロモーター領域の長さ（ｂｐ）」がマイナスの値を指す場合、プロモーターとして、開始コドンＡＴＧから下流の配列を使用したことを示す。本実施例で採用した欠失プロモーターが、開始コドンから上流域の配列である場合、その配列については配列番号１を参照されたい。また、欠失プロモーターとして、開始コドンから下流の配列を使用した場合、その配列については配列番号１３を参照されたい。表１において「ＧＵＳ相対活性」は、対照のｐＢＩ１２１におけるＧＵＳ活性を１．００とした場合の相対値で示す。
【００５６】
プロモーター領域の長さを１１４ｂｐまで短くしてプロモーター領域を欠失させてもプロモーター活性にほとんど変化はみられなかったが、２８ｂｐまで短くするとプロモーター活性が顕著に低下した。このことから、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の配列がプロモーターとして機能するためには、ＴＡＴＡボックスが必須であることが分かる。すなわち、低親和性硝酸トランスポーター遺伝子の上流域の配列のうち、ＴＡＴＡボックスからＡＴＧまでの配列（ＴＡＴＡボックスは含むがＡＴＧは含まない）がプロモーターとして必須であると推察される。
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】タバコの各器官におけるｎｒｔ１．１群の発現量およびｎｒｔ１．２群の発現量を示す図。
【図２】ｎｒｔ１．１群の発現における硝酸イオンの影響を示す図（図２Ａ）、およびｎｒｔ１．２群の発現における硝酸イオンの影響を示す図（図２Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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