(57)【要約】【課題】量子ドットを提供する。【解決手段】ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドット。
【請求項２】
前記ポリカルボン酸化合物が、硫黄原子を介して蛍光性半導体量子ドットの表面に結合されてなる請求項１に記載の蛍光性半導体量子ドット。
【請求項３】
生体試料と結合可能な物質をカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を介して結合してなる請求項１又は２に記載の量子ドット。
【請求項４】
生体試料と結合可能な物質がレクチンである請求項３に記載の量子ドット。
【請求項５】
量子ドットの平均粒子径が、5nm以下である請求項１〜４のいずれかに記載の量子ドット。
【請求項６】
ポリカルボン酸化合物がメルカプトコハク酸である請求項１〜５のいずれかに記載の量子ドット
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の量子ドットを含む生体試料標識用蛍光プローブ。
【請求項８】
蛍光性半導体量子ドットと２以上のＣＯＯＨ基及びチオール基を有するポリカルボン酸化合物を混合し、硫黄原子を介して該化合物を蛍光性半導体量子ドットに結合し、次いで、該ＣＯＯＨ基を介して生体試料と結合可能な物質を結合することを特徴とする、生体試料標識用蛍光プローブの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性の蛍光性半導体量子ドット、生体試料標識用蛍光プローブとその調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光性の半導体量子ドットは、1）サイズに依存して蛍光の色が変化する、2）蛍光スペクトルの幅が小さい、3）蛍光スペクトルの裾の広がりが少ない、4）蛍光の色を区別することが容易である、5）消光しにくい、６）半導体のバンドギャップ以上の光エネルギーを吸収できる等の特異な性質を持っている（特許文献１〜２；非特許文献１〜２）。
【０００３】
しかしながら、このような量子ドットは水に溶解しないため、その用途は限られたものであった。
【特許文献１】U.S. 5,990,479
【特許文献２】U.S. 6,194,213
【非特許文献１】Kortan et al., "Nucleation and growth of CdSe on ZnS quantumcrystallite seeds, and vice versa, in inverse micellar media", J. Am. Chem. Soc. (1990) 112:1327.
【非特許文献２】Murray et al., "Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E=S, Se, Te) semiconductor nanocrystallites", J. Am. Chem. Soc. (1993) 115:8706.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、水溶性の量子ドットを提供し、該量子ドットを利用して生体試料標識用蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の量子ドット、標識用蛍光プローブ及びその製造法を提供するものである。
１．  ポリカルボン酸化合物で表面処理された蛍光性半導体量子ドット。
２．  前記ポリカルボン酸化合物が、硫黄原子を介して蛍光性半導体量子ドットの表面に結合されてなる項１に記載の蛍光性半導体量子ドット。
３．  生体試料と結合可能な物質をカルボン酸基（ＣＯＯＨ）を介して結合してなる項１又は２に記載の量子ドット。
４．  生体試料と結合可能な物質がレクチンである項３に記載の量子ドット。
５．  量子ドットの平均粒子径が、5nm以下である項１〜４のいずれかに記載の量子ドット。
６．  ポリカルボン酸化合物がメルカプトコハク酸である項１〜５のいずれかに記載の量子ドット
７．  項１〜６のいずれかに記載の量子ドットを含む生体試料標識用蛍光プローブ。
８．  蛍光性半導体量子ドットと２以上のＣＯＯＨ基及びチオール基を有するポリカルボン酸化合物を混合し、硫黄原子を介して該化合物を蛍光性半導体量子ドットに結合し、次いで、該ＣＯＯＨ基を介して生体試料と結合可能な物質を結合することを特徴とする、生体試料標識用蛍光プローブの製造法。
以下本発明をより詳細に説明する。
【０００６】
代表的な蛍光性半導体量子ドットであるＣｄＳｅは高い発光効率を示し、サイズを2.3 nmから5.5 nmまで制御することによって、470nmから620nmまでの蛍光色が得られる。
【０００７】
本発明の量子ドットの粒径は、通常１〜１０ｎｍ程度、好ましくは１〜５ｎｍ程度である。
【０００８】
発光性半導体量子ドットとしては、例えば、II-VI族の半導体として、CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTeなどが挙げられ、III-V族としてInPやGaPなどが挙げられる。さらに、(In、Ga)Pのように、複数の金属種を含むもの、あるいは、Cd（Se、Te）やGa(As、P)のように複数の６B族原子もしくは５B族原子を含むものを用いることができる。また、CdSe/ZnS  コア／シェル  ナノ結晶のように、ある種のナノ結晶をコアとして他種の半導体物質を被覆した構造の発光性半導体量子ドットも利用することができる。これらの発光性半導体量子ドットの中で、CdSeが、簡便に応用できるため特に好ましい。
【０００９】
量子ドットに結合される生体試料としては例えば、タンパク質（酵素、ホルモン、リンホカイン、サイトカインなどの液性因子、受容体、成長因子、抗体など）、核酸（DNA、RNAなど）、糖質（多糖、ムコ多糖など）、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖等が挙げられる。
【００１０】
本発明において、量子ドットは、２以上のカルボキシル基と該量子ドットの結合可能な官能基（例えばＳＨ基）を有する化合物（即ちポリカルボン酸化合物）と水溶液中で反応することにより表面に該化合物を結合し、ＣＯＯＨ基により水溶性になった量子ドットを得ることができる。このようなポリカルボン酸化合物としては、メルカプトコハク酸、２，３−ジメルカプトコハク酸などのカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を２以上有する化合物が挙げられる。
【００１１】
ポリカルボン酸化合物に関し、水溶性向上の観点からはチオール基（ＳＨ）が１つで、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を２以上有する化合物が好ましい。
【００１２】
一方、２，３−ジメルカプトコハク酸のようなチオール基を複数有する化合物は、量子ドットとの結合性が強まる可能性があり、利点も期待される。
【００１３】
これらの化合物は、チオール基（−SH）を介して量子ドットを構成する金属と結合することができ、チオール基以外の２以上のカルボキシル基を有する水溶性量子ドットを得ることができる。ＨＳ−ＣＨ2ＣＯＯＨのようなモノカルボン酸を用いて量子ドットを処理すると、水溶液中での十分な安定性が得られず、量子ドットが凝集等により沈殿し、生物材料の蛍光標識が十分に行えない。一方、本発明のポリカルボン酸化合物を用いた場合には、量子ドットの凝集が起こらず、２４〜４８時間、或いはそれ以上の水溶液中で溶解状態となり、凝集による沈殿は実質的に起こらない。
【００１４】
量子ドットに水溶性を付与するための該処理は、例えば量子ドット１ｇに対し、ポリカルボン酸化合物を通常０．００５〜０．１モル程度、好ましくは０．０２〜０．０３モル程度使用し、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素、メタノール、エタノールなどのアルコール、酢酸エチルなどのエステル、ＴＨＦ、ジオキサンなどのエーテル、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ、ホルムアミド、アセトニトリル、酢酸などの有機溶媒の存在下に、０℃から溶媒の沸点程度の温度下に１０分から２４時間程度反応させることにより、有利に行うことができる。反応終了後は、溶媒を留去することで、これらの化合物で表面処理された水溶性の量子ドットを得ることができる。
【００１５】
例えば、ポリカルボン酸化合物としてメルカプトコハク酸を使用する場合、CdSe コアナノ結晶10 mgあたりメルカプトコハク酸を10-150 mg、好ましくは30-40 mg使用するのがよい。
【００１６】
過剰量のポリカルボン酸化合物が存在すると、溶液／懸濁液が濁る原因になるので、Vivaspin 限外濾過等により過剰量のポリカルボン酸化合物を除去するのが好ましい。
【００１７】
多量のポリカルボン酸化合物を使用すると、限外濾過等により過剰量のメルカプトコハク酸を除去するのが困難であり、溶液／懸濁液は曇る(cloudy)傾向にある。
【００１８】
適正な量のポリカルボン酸化合物を使用すると、除去が容易であるので、透明な溶液を得ることができる。
【００１９】
得られた化合物は、例えば図２に示すスキームに従いレクチンその他の生体試料を結合することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の量子ドットは、例えば蛍光の色が異なる半導体量子ドットを用いて、複数種のタンパク質を標識し、細胞内における挙動を、一つの励起光源を用いて、同時にリアルタイムでかつ長時間にわたり観察することが可能になる。
【００２１】
２以上のCOOH基を有する化合物で表面処理された本発明の量子ドットは、１つのCOOH基を有する化合物で表面処理された量子ドットよりも水溶性が高く、凝集され難い利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例１
遮光下で保存していたCdSeナノ結晶をクロロホルム溶液に分散させ、その濃度を25mg/mlに調整した。濃度調整の目安として、吸収端付近の最大となる吸光度の値（以下、OD at MAX）が、0.5となるようにした。12.75mlの当該CdSeナノ結晶溶液に対してメタノールに溶解した2.5mlのメルカプトコハク酸
（HOOC-CH2-CH(SH)-COOH）溶液（30mg/ml、アルドリッチ社）を添加し、室温、遮光下で、溶液が白濁するまで約2時間インキュベートした。用いたクロロホルムとメタノールは吸引エヴァポレートにより除去し、CdSeナノ結晶の表面にメルカプトコハク酸がメルカプト基に由来する硫黄原子（-S-）を介して結合した表面処理量子ドットの乾燥粉末を得た。当該乾燥粉末に5.5mlのPBS(-)溶液（pH7.3）を添加し、緩やかに混合することにより、溶解させた。当該溶解液は4℃で20分間遠心（12,000×g）し、凝集していない水溶性CdSeナノ結晶を含む中間水層画分を注意深く回収した。さらに回収した当該画分は4℃で一晩保持した後、4℃で20分間遠心（1,200×g）し、不溶物を除去した。水溶性CdSeナノ結晶を含む上清はVivaspin-20（分画分子量：3,000MW、ザルトリウス社製）を用いた遠心ろ過濃縮により、分子量3,000以下のものを除いた後、さらにVivaspin-20（分画分子量：30,000MW、ザルトリウス社製）を用いた遠心ろ過濃縮により分子量30,000以上のものを除き、精製、濃縮した。最終的にはVivaspin-20により水溶性のCdSeナノ結晶を濃縮し、PBS(-)溶液（pH7.3）中で目的の濃度（OD at MAX =0.5）に調整した。
【００２３】
このようにして得られた水溶性CdSeナノ結晶は、クロロホルム中よりも2倍の強さの蛍光発光強度(最大蛍光波長：525nm、励起波長：420nm)を示し、PBS(-)溶液（pH7.3）中、４℃において蛍光発光強度が1月半以上変化しないという非常に優れた蛍光安定性をもつことが明らかとなった（図1）。
実施例２
実施例１で調製した水溶性CdSeナノ結晶の生体試料との結合性をレクチンを用いて評価した。レクチンは細胞を凝集させるタンパク質の総称である。レクチンは分子内に2つ以上の糖結合部位を持ち、細胞表面に存在する多数の糖鎖に結合し、細胞同士を架橋させることにより細胞を凝集させる。凝集の度合いは糖鎖構造の違いにより異なる。また、ガン細胞と正常細胞では細胞表面に存在する糖鎖の構造が互いに異なる。我々はこれらの事実を考慮して、水溶性CdSeナノ結晶（以下Qdot）で標識したレクチンを作成し、これを使ってガン細胞と正常細胞を視覚的に識別することに取り組み、種々検討した結果、両者を識別することに成功した。
以下にこれらについて具体的内容を述べる。
【００２４】
レクチンは、ドリコスマメ、ダイズ、ナタマメ、ジャガイモ、小麦胚芽由来の5種のレクチンを選んだ。細胞はガン細胞としてヒト急性リンパ性白血病罹患者由来の株化細胞であるJurkatを5%CO2雰囲気下、37℃でRPMI-1640培地を用いて培養し、対数増殖期にあるものを実験に供した。対照となる正常細胞は健常者（40歳、女性）の末梢血からリンホセパールIを用いて分離し、同上条件下、同上培地で2日間培養した白血球細胞を用いた。Qdotとレクチンのコンジュゲートはペプチド合成の縮合剤として用いられる1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, hydrochloride（以下、EDC）を用いて、Qdotのカルボキシル基を活性化した後、レクチンのアミノ基との間で脱水縮合させることで行った。この反応様式は図２に示す。Qdot標識レクチンと細胞の相互作用は共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ライカ社製）を用いて評価した。
１）Qdotとレクチンのコンジュゲート
150mMのPBS溶液（pH7.3）に溶解した1.3mlのQdot溶液に対して、PBS溶液（pH7.3）で調製した150μlの各レクチン溶液（5mg）を添加、混合した。さらに当該混合溶液に水で7.2mg/mlの濃度に調製したEDC溶液を添加、混合し、2時間、室温で反応させた。未反応のQdot及び反応副産物のイソウレアはVivaspin-6（限界分子量：3,000MW、ザルトリウス社製）を用いて遠心ろ過濃縮により除去した。当該精製Qdot標識レクチンは同様に遠心ろ過濃縮法で1mg/mlの濃度にPBS溶液（pH7.3）で調整した。
２）Qdotレクチンと細胞の相互作用観察
10μlのQdotレクチン溶液を200μlのJurkat細胞と正常白血球細胞にそれぞれ添加し、5時間培養した。この間一定時間毎に細胞懸濁液を採取し、PBS(-)溶液（pH7.3）で2回洗浄することにより未反応のQdotレクチンを除去後、Qdotレクチンと細胞との結合の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。その結果、用いた５種のレクチンの中でQdot-SBA（ダイズレクチン）とQdot-DBA（ドリコスマメレクチン）の2種が正常白血球細胞には全く結合しないが、Jurkat細胞には特異的に結合することが判明した。また、反応5時間後にはこれらレクチンが細胞内部に取り込まれている様子も捉えることができた。ここではQdot-SBAで得られた結果のみを図３-A１、-B、-Cに示す。また、市販されているFITC-SBAを用いて上記と同様に処理した蛍光画像（図３−A2）と比較した場合、Qdot-SBAの方が蛍光の明るさの点で遥かに優れていることが明らかとなった。
実施例３：毒性試験（メチルテトラゾリウム化合物に基づく試験、Promega）
製造業者の説明書に従い行われた。
実験プロトコール:
水溶性量子ドット − 2 mg/mlから始めて連続的に２倍希釈を行った(2; 1; 0.5; 0.25; 0.125; 0.0625; 0.03125; 0.015625; 0 mg/ml).
細胞 − Jurkat (5x105 細胞/ml)
インキュベーション − 湿潤条件下で24時間, 48時間
【００２５】
【表１】
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【００２６】
量子ドット−レクチン複合体の細胞毒性は、検出されなかった。何故なら、量子ドット−レクチン複合体の標識実験において、量子ドットの濃度は2 mg/ml (< 2 mg/ml) (量子ドット−レクチン複合体の蛍光スペクトルにより測定され、共焦点顕微鏡に適用される)であり, レクチンの濃度は0.05 mg レクチン/mlだからである。この濃度において、量子ドットは細胞毒性を示さなかった(上記表参照)。0.05 mg/mlの濃度において (SBA について0.4 mM, DBA について0.45 mM)レクチンはJurkat細胞に対して細胞毒性を発現しない(Cancer Chemother. Pharmacol. 2003, 51: 451-458; Ohba, H. & Bakalova, R.).
以上の結果から、本発明の量子ドットは細胞毒性を発現しない濃度で細胞を標識可能であることが明らかになった。
実施例４
カルボン酸が１個であるメルカトイソプロピル酸を用いて量子ドット表面処理すると、水もしくは水溶液に溶解して３〜４時間後には、量子ドットの水溶性は低下して、沈降した。そのように水溶性の低下しやすい量子ドットは、EDCとの反応性が弱いため、生体試料とのコンジュゲートが困難であった。
【００２７】
一方、メルカプトコハク酸のような、ポリカルボン酸化合物を用いて表面処理すると、水もしくは水溶液に溶解後2ヶ月以上水溶性が維持され、量子ドットの凝集は認められなかった。このような量子ドットは、EDCとの反応性も強く、容易に生体試料とコンジュゲートすることができ、また、生体分子との共役化も長時間安定であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】メルカプトコハク酸でキャッピングした後のクロロホルム中及び水中でのCdSeコアナノ結晶の光ルミネセンス。青スペクトルはクロロホルム中に分散させたCdSeコアナノ結晶；緑スペクトルは水溶性CdSeコアナノ結晶；赤スペクトルはローダミン。励起波長：４２０ｎｍ。
【図２】量子ドット−レクチンコンジュゲートの化学
【図３】蛍光共焦点顕微鏡により分析された、合成量子ドット−ＳＢＡ及び市販のFITC-SBAと白血病細胞(Jurkat)及び正常リンパ球との相互作用蛍光物質（Quandrant）； (a) − 緑色蛍光; (b) − 赤色蛍光; (c) −透過率（transmission）; (d) − 赤色/緑色蛍光及び透過率 なお、量子ドット-SBAは正常リンパ球と相互作用することなく白血病細胞と特異的に認識及び相互作用する。量子ドット-SBAの明るさは市販のFITC-SBAよりも強い。白血病細胞の量子ドット-SBA による標識を用いるとより高品質の画像が得られた。これらの画像はまた、量子ドット-DBA及びFITC-DBAと白血病細胞及び正常リンパ球の相互作用を代表する。白血病細胞との量子ドット−レクチン複合体の特異的相互作用はJurkat, K-562, Raji及びDaudi白血病細胞株について評価された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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