(57)【要約】  【課題】  質量分析を用いたタンパク質やペプチドのアミノ酸配列決定の際の、マススペクトルデータの解釈を容易にする。  【解決手段】  50%の重水中でタンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該タンパク質やペプチドを質量分析装置による分析に供する。得られるマススペクトルは重水素置換された割合に応じて一連のピーク群を形成する。該ピーク群の中心にある50%重水素置換ピークを選び出し、MS/MS分析を行うと、プロダクトイオンは重水素の重合度により同位体パターンを形成する。この同位体パターンを加味することにより、スペクトルデータを解釈し、アミノ酸配列を同定する。【選択図】  図２
2005283430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の割合でD2Oを含む水の中で、生体試料の交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該生体試料を質量分析装置で分析することによって、その構造情報を得ることを特徴とする生体試料の構造解析法。
【請求項２】
所定の割合でD2Oを含む水の中で、タンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該タンパク質やペプチドを質量分析装置で分析することによって、そのアミノ酸配列を決定することを特徴とするアミノ酸配列決定法。
【請求項３】
所定の割合でD2Oを含む水の中で、タンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該タンパク質やペプチドを質量分析装置でMS/MS(PSD)分析を行い、プロダクトイオンの同位体の存在比からアミノ酸配列を決定することを特徴とするアミノ酸配列決定法。
【請求項４】
所定の割合でD2Oを含む水の中で、糖鎖の交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該糖鎖を質量分析装置で分析することによって、その構造を決定することを特徴とする糖鎖構造解析法。
【請求項５】
上記所定の割合が50%であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体試料の構造解析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法を用いて、タンパク質、ペプチド、糖鎖などの生体試料の構造情報を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は遺伝情報によって規定される一定のアミノ酸配列を有する。しかし、実際に発現されるタンパク質は、翻訳後に様々な修飾を受けているため、特定の遺伝情報とタンパク質とを１対１に対応させるには、発現されたタンパク質のアミノ酸配列を実験的に決定しなければならない。
【０００３】
近年、このようなタンパク質のアミノ酸配列を決定する方法として、質量分析装置を用いた解析が広く行われるようになってきており、PSD（Post-source decay：ポストソース分解）やQIT（quadrupole ion trap：四重極型イオントラップ）などによって特定のピークの捕捉と二次的開裂を行う、いわゆるMS/MS分析（またはMSn分析）が威力を発揮している。
このような手法によって得られたプリカーサイオンやプロダクトイオンのスペクトルパターンからアミノ酸配列を求める方法としては、得られたプロダクトイオンのスペクトルパターンを配列データベース検索に供することによって被検ペプチドを同定する方法や、コンピュータソフトウェアを用いてスペクトルパターンを数理的に解析することで、構造を推定する方法などがある。
【０００４】
しかし、データベース検索を用いた方法は、データベースに登録されていないタンパク質に関しては同定を行うことができないという問題がある。また、コンピュータソフトウェアによる配列の解析には以下のような問題点がある。
【０００５】
プリカーサイオンの開裂パターンには種々の様式があり、開裂によって得られるプロダクトイオンのイオン種を予測することは非常に困難である。例えば、ペプチド結合周辺で起こる断片化は、便宜上、図１のように定義される。ここで、rはこのペプチドの全アミノ酸残基数、nはN末端から数えた残基番号を示す。一般的にはy-イオンとb-イオンの系列が最もよく観測されるが、実際には、これに側鎖のいずれかで断片化した生成物や脱水した生成物も加わるため、得られるマススペクトルは更に複雑なものとなる。従って、上記のようなコンピュータソフトウェアによる解析では、ピークの帰属が難しく、正確な配列決定が行うことができなかった。また、試料を化学的に処理して特定の系列のピーク強度を増大させたり、消去させたりする方法も行われているが、このような化学修飾を行う場合は、修飾反応、脱塩などの煩雑な操作が必要であった。
【０００６】
更に、MS/MSスペクトルデータの解釈を容易にするための方法として、非特許文献１及び非特許文献２に記載のように、タンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を、重水素で100%置換する方法が提案されている。これは、交換可能な水素原子の数がアミノ酸によって決まっており、重水素置換を行うことによって、試料の分子量がアミノ酸組成に依存してシフトすることを利用したものである。
【０００７】
タンパク質を構成する窒素、酸素、及びイオウ原子に共有結合した全ての水素原子は、水溶液中で容易に水の水素原子と交換反応を起こす。このような水素原子を交換可能であるといい、具体的には、R-NH2（アミノ基）、R-OH（水酸基）、R-C00H（カルボキシル基）、R-SH（チオール基）、R-CO-NH2及びR-NH-CO-R'（１級及び２級アミド基）、R-NH-R'（イミノ基）、R-NH-C(＝NH)NH2（グアニジノ基）などの水素原子が挙げられる。
【０００８】
ペプチド鎖の主鎖にはアミノ酸1残基あたりプロリンを除いて必ず1つの交換可能な水素原子が存在する。そのため分子量M，アミノ酸残基数r、各アミノ酸(j）の側鎖の交換可能な水素原子数がδjのペプチドを重水(100% D20)に溶解することによって、全ての交換可能な水素原子を重水素で置換すると、分子イオンピークの位置は、
[M＋D＋r＋Σδj]+−[M＋H]+＝r＋Σδj＋1            (1)
だけ、すなわち交換可能な水素原子の数だけ高質量側に移動する。ここで[M＋H]+は天然存在比の分子イオンピークのm/z比であり、各アミノ酸側鎖の交換可能な水素原子数(δj)は、
δj＝-1;Pro
δj＝0;Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Met,Cys/2,Phe
δj＝1;Ser,Thr,Asp,Glu,Cys,Tyr,Trp,His
δj＝2;Asn,Gln,Lys
δj＝4;Arg
である。Argは、プロトン化したArg+（δj＝５）が化学的には安定なのであるが、質量分析ではイオン全体に電荷に応じて１〜数個のプロトンを割り当てるので、Argを始め、Lys、Hisなどの塩基性アミノ酸の側鎖は、電気的に中性と考える。  
【０００９】
上記重水素で標識した試料と標識しない試料から得られる(1)式の結果と、やはりアミノ酸組成によって決まる分子量Mの値を用いて、データベース上のアミノ酸配列から分子イオンがどのタンパク質に相当するかを検索する方法などが考えられている。
しかし、上記の方法では、タンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を全て重水素で置換するため、ピークのシフトは起こるものの、得られるスペクトルパターンは本質的には重水素置換していないものと同じであるため、ピークの帰属が飛躍的に容易になることは期待できない。
【非特許文献１】Spengler, B., Luetzenkirchen, F., and Kaufmann, R. On target deuteration for peptide sequencing by laser mass spectrometry. Org. Mass Spectrom. 28, 1482-1490 (1993).
【非特許文献２】Sepetov, N.F., Issakova, O.L., Lebl, M., Swiderek, K., Stahl, D.C., and Lee, T.D. The use of hydrogen-deuterium exchange to facilitate peptide sequencing by electrospray tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 7, 58-62 (1993).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、質量分析によって得られるマススペクトルのピークの帰属が容易であり、正確な構造決定を行うことのできる生体試料の構造解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために成された本発明に係る生体試料の構造解析方法は、所定の割合でD2Oを含む水の中で、生体試料の交換可能な水素原子を重水素原子に置換し、該生体試料を質量分析装置で分析することによって、その構造情報を得ることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
上記のように、タンパク質やペプチドの交換可能な水素原子を、所定の割合でD2Oを含む水の中で重水素原子に置換し、MS/MS分析を行うことにより、プロダクトイオンはアミノ酸配列に特有の同位体パターンを示す。このプロダクトイオンの同位体パターンを加味することにより、MS/MSスペクトルデータの解釈が容易となり、データベースに登録されていないタンパク質やペプチドであっても、そのアミノ酸配列を正確に決定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
始めに、本発明に係る生体試料の構造解析方法の原理を説明する。
【００１４】
あるタンパク質の交換可能な水素原子を所定の割合、例えば50%で置換すると、上記(1)式の交換可能な水素原子をｓ＝ｒ＋Σδj＋１個含む分子イオンピークは、r＋Σδj＋2＝s＋1本に分裂する。この時ピークの強度比はパスカルの三角形あるいは(p＋q)sの二項係数で表されるので、強度1の天然存在比のピーク1本に対応するイオンに含まれる交換可能な水素原子の半数が重水素で置換されると、分裂して生じるs＋1本のうちt番目のピークの強度は
sＣt(p)s-t(q)t＝sＣt(1/2)s     (t＝0,1,2,…,s-1,s)        (2)
となる。
【００１５】
ここで重水素置換の割合を50%としたため、p＝q＝1/2となり、一連のピークはt＝s/2(sは偶数)、又はt＝(s＋1)/2(sは奇数)を中心に対称的でベル型の輪郭を示す。その結果、sが大きくなってもベル型曲線の裾にあたる両端付近では(1/2)s≒0となるため、観測されるピークの範囲が不必要に広がることはない。中心極限定理(central limit theorem)によれば、これらのピークがベル型曲線でガウス分布を示すとき、この曲線の線幅(w1/2)はsが十分に大きければ、
w1/2＝s1/2/2            (3)
となると見積もられる。
【００１６】
例えばs＝200の場合、主なピークはたかだか±7質量単位の中に収まることになり、ピーク群の対称性からその中心を特定することができる。しかも、その中心のピークの強度I(t＝s/2)、すなわち(2)式の二項係数は、
I(t)＝sＣt(1/2)s≒1/(πs)-1/2            (4)
と近似されるので、s＝10の時には単一ピークの約25%、更に、s＝200となっても4%にまでしか減少しない。もとの1%になるのはs＞3000，すなわちアミノ酸残基数にして約2000を超えるかなり大きなタンパク質となるので、このような感度の低下はあまり問題にならない。
【００１７】
あるペプチドの交換可能な水素原子の50%を重水素で置換すると、そのマススペクトルは、ほとんど重水素を含まないものから、ほぼ完全に重水素で置換されたものまでの、(2)式で表される様々な同位体含有量を持つ分子種の存在比を反映する。そのピーク群の中心の最大ピークは、交換可能な水素原子が、正確に50%の割合で重水素に置換された分子種に対応する。但し、この最大強度のピークには、質量は正確に同じであっても、水素と重水素の分布が異なる種々の分子種が含まれており、その分布は交換可能な水素原子の数がs個であればsＣs/2通りとなる。
【００１８】
例えば、簡単にs＝6の場合については、
H-H-H-D-D-D    H-H-D-H-D-D    H-H-D-D-H-D    H-H-D-D-D-H
H-D-H-H-D-D    H-D-H-D-H-D    H-D-H-D-D-H    H-D-D-H-H-D
H-D-D-H-D-H    H-D-D-D-H-H    D-H-H-H-D-D    D-H-H-D-H-D
D-H-H-D-D-H    D-H-D-H-H-D    D-H-D-H-D-H    D-H-D-D-H-H
D-D-H-H-H-D    D-D-H-H-D-H    D-D-H-D-H-H    D-D-D-H-H-H
の6Ｃ3＝20種類のイオン種が単一で同一質量のイオンのピークに含まれる。
【００１９】
上記のピークをイオントラップによって取り出し、MS/MSによって、交換可能な水素原子を2個含むN末端側の部分と、残りのC末端側の部分とに開裂させたとすると、N末端側は、
H-H(4)； H-D,D-H(12)； D-D(4)
の存在確率から、強度比が1：3：1のトリプレット（triplet：三つ組）となり、C末端側も、
3H＋1D(4)； 2H＋2D(12)； 1H＋3D(4)
の強度比が1：3：1のトリプレットとして観測される。このとき、MS/MSピークの開裂後の本数と強度比は(2)式の対称性により、小さい方の断片の交換可能な水素原子の数によって簡単に予測できる。上記の例ではN末端の交換可能な水素原子が2個であるから、生じるピークの本数は2＋1＝3本となり、このトリプレットの強度比は、2Ｃ0・4Ｃ3：2Ｃ1・4Ｃ2：2Ｃ2・4Ｃ1＝4：12：4＝1：3：1と確率的に予想できる。
【００２０】
イオントラップした最初のピークに含まれる交換可能な水素原子の数をs、小さい方の断片の交換可能な水素原子数をu、残りをv(＝s−u)として、これらの数値と式を一般化すると、開裂によって生じるピークの本数はu＋1，それぞれのピーク強度Ijは、
Ij＝uＣj・vＣ(s/2-j)     (j＝0,1,…,u)           (5)
となる。なお、sは偶数として考えたが、sが奇数の場合には、イオントラップすべきピークは理論上、ピーク群の中心に現れる強度の等しい2本のピークの両方になる。しかし、sが十分に1よりも大きければ、s>>uとなり、(5)式の積の2項目は、jの変化に殆ど影響されないため、ピーク強度Ijは単なる二項係数だけで決まり、例えばu＝2ならばI0：I1：I2＝1：2：1のトリプレットが観測される。
【００２１】
片方の断片をb-イオン、もう一方の断片をy-イオンとすると、同じ結合の開裂で同時に生じた一対のb-イオンとy-イオンは、図２のように、マススペクトル上で全く同じパターンを示す。そのため、複数の結合が開裂して多くのピークが現れた複雑なスペクトルの中からこうしたb-イオンとy-イオン(あるいはa-イオンとz-イオン)の対を見つけ出すことが極めて容易になる。
【００２２】
一般にアミノ酸残基数r、分子量Mのペプチドにこの方法を適用し、MS/MSによって理想的にb-イオンとy-イオンの系列が観測されたとすると、同じ開裂パターンを示し、各対の質量数の和がプリカーサイオンの質量と同じになるb1-イオン(m/z＝M(b1))とyr-1-イオン(m/z＝M(yr-1))、b2-イオン(m/z＝M(b2))とyr-2-イオン(m/z＝M(yr-2))(ただし、M(b1)＋M(yr-1)＝M(b2)＋M(yr-2)＝M)などをスペクトル上で辿っていけば、容易にアミノ酸配列を読むことができ、当然、これを自動化するピークの帰属のためのコンピュータによるデータ処理アルゴリズムの精度の向上も見込まれる。なお、上記の質量数Mは、交換可能な水素原子の1/2が重水素で置換されたものを意味することは言うまでもない。
【００２３】
また、もちろんy-イオンのみといった、一つのイオンの系列からだけでも、次第に質量が減少するごとに分裂の度を増してゆくピークを順に辿れば、やはりアミノ酸配列が比較的容易に推定できる。
【００２４】
さらに、ピークの多重度は、(1)式で与えられる各アミノ酸残基に固有の交換可能な水素原子数に1を加えた、δj＋2となるので、この点からもピークの帰属結果の検証ができる。例えば、グルタミン酸(Glu)とグルタミン(Gln)は、それぞれ分子量が129と128であり、1質量単位の違いしかないが、50%重水素置換を行うことにより、Gluが脱離したピークはトリプレット、Glnが脱離したピークはカルテット(quartet：四つ組)となるので、両者の違いが明確になる。
【００２５】
以上のように、上記50%重水素置換に基づくタンパク質やペプチドのアミノ酸配列決定法の特色は、交換可能な水素原子の50%が重水素で置換されたピークをPSDやQIT等により特異的に捕捉すると共に、MS/MSあるいはMSnによって生じる、互いに対を成すピークに、開裂のパターン、または多重度で目印を付けて、アミノ酸配列の決定を容易且つ確実にする点にある。
【００２６】
なお、一回のMS/MS分析で末端から離れた断片について、多重度が大きくなりすぎるような場合には、適当な2次イオンのうち、特定のイオン群の中心ピーク1本を再びトラップしてMS3分析を行ってもよい。
【００２７】
上記のような生体試料の所定割合での重水素置換は、所定の割合でD2Oを含む水(H2O/D2O)の中に生体試料を溶解することによって行うことができる。質量分析用のサンプルとしては、該重水素置換を行った生体試料を凍結乾燥させたものを使用する。解析に使用する質量分析装置は特に限定しないが、イオントラップ型質量分析装置を用いることが望ましい。
【００２８】
本発明の所定の割合での重水素置換に基づく生体試料の構造解析法は、タンパク質・ペプチドの他に、糖鎖の構造解析に用いることもできる。特に、糖には多数の交換可能な水素原子が存在することから、糖鎖のついたペプチドの同定や分子量の決定に、この方法が威力を発揮する。
【００２９】
また、重水素による置換の割合は、上記の50%に限定するものではなく、例えば、純粋な多糖類の場合、H2OとD2Oの混合比を4：1に変えて、分岐しないピラノース環1個あたり重水素原子1個が対応するようにすると、ピラノース環のおおよその数を見積もることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、図３のようなアミノ酸配列を有するインスリンB鎖（アミノ酸残基数30、分子量3496、交換可能な水素原子の数49）に対し、交換可能な水素原子の50%を重水素で置換し、質量分析を行った例を以下に示す。
【００３１】
まず、2mgのインスリンB鎖を0.5mlの50%重水に溶解した後、凍結乾燥させることにより、交換可能な水素原子の50%が重水素置換されたインスリンB鎖サンプルを得た。
上記50%重水素置換されたインスリンB鎖サンプルと、重水素置換を行わなかったインスリンB鎖サンプルをMS/MS分析したところ、重水素置換を行わなかったもの（図４上段）では天然の同位体存在比により8本に分かれたピークの中心(m/z＝3496.71)が、50%重水素置換を行ったもの（図４下段）では、およそ2倍ほどに広がったピーク群の中心(m/z＝3521.78)に移動した。これは(1)式から期待される質量の増加(r＋Σδj＋1＝49＋1)の50%
3521.78−3496.71＝25.07≒(49＋1)/2
と正確に一致することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ペプチド結合周辺で生じる開裂のパターンを示す図。
【図２】本発明の構造解析法におけるプロダクトイオンの同位体パターンを示す概略図。
【図３】インスリンB鎖のアミノ酸配列。
【図４】インスリンB鎖の50%重水素置換によるマススペクトル。
【図１】
2005283430.tif 000003
【図２】
2005283430.tif 000004
【図３】
2005283430.tif 000005
【図４】
2005283430.tif 000006
【配列表】
2005283430000001.app