(57)【要約】  【課題】  タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物、当該宿主微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供する。  【解決手段】  Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域から選ばれる１以上の領域がゲノムから削除又は不活性化された微生物。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域から選ばれる１以上の領域がゲノムから削除又は不活性化された微生物。
【請求項２】
削除又は不活性化する遺伝子領域がPro1、Pro3、Pro4、Pro7、PBSX、spβ及びpksで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域から選ばれる１以上である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
削除又は不活性化する遺伝子領域がPro1、Pro3、Pro4及びPro7の４領域、又は当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の４領域の組合わせである請求項２記載の微生物。
【請求項４】
更にspβ、PBSX及びpksの３領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の３領域から選ばれる１以上の領域を組合わせて削除又は不活性化するものである請求項３記載の微生物。
【請求項５】
削除又は不活性化する領域がPro1、Pro3、Pro4、Pro7、spβ、PBSX及びpksの７領域、又は当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の７領域の組合わせである請求項２記載の微生物。
【請求項６】
微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項１〜５のいずれか１項記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の微生物に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項８】
請求項７記載の微生物を宿主として用いることを特徴とするポリペプチド又はタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、組換え微生物及び有用タンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解読の成果を産業的に応用しようとする動きも活発で、ゲノム情報を利用した遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が行われている。例えば、宿主微生物として安全性が認められ、且つ優良と認められた微生物菌株において、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC13032（非特許文献３）などではそのゲノム配列が明らかにされており、これらゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
しかしながら、微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多様な遺伝子を有しており、限定された培地と安定な培養条件が用いられる工業的生産に於いては、タンパク質又はポリペプチドの生産にとって無駄な遺伝子発現も多く、上記の様な改良にも関わらず、必ずしも生産効率が高いとは言えない状況であった。
【非特許文献１】Nature, 390, 249, 1997
【非特許文献２】Science, 277, 1453, 1997
【非特許文献３】Appl.Environ.Microbiol., 62, 99, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はタンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物、また、当該微生物にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、種々検討したところ、特定の遺伝子領域が、目的タンパク質又はポリペプチドの生産には直接関与しておらず、また、通常の工業的生産培地における微生物の生育にも不要であることを見出した。そして、当該遺伝子領域をゲノム上から削除又は不活性化した微生物変異株を宿主とし、これに目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、削除又は不活性化を行わなかった場合と比較して向上することを見出した。
【０００７】
すなわち本発明は、Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域から選ばれる１以上の領域がゲノムから削除又は不活性化された微生物、当該微生物に異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、及び当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物を宿主として用いることにより、目的生産物以外の無駄なタンパク質や不要な核酸の合成を低減化し、炭素源、窒素源といった培地成分の浪費を大幅に抑えて効率の良い目的タンパク質又はポリペプチドの生産を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, 1985) によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１０】
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、ゲノム情報の明らかな微生物がよく、Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域、並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域を有するものであればよく、野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、枯草菌などのバチルス(Bacillus)属細菌や、大腸菌などの(Escherichia)属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、或いは酵母（Saccharomyces属）等が挙げられ、中でもバチルス(Bacillus)属細菌が好ましい。このうち、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から枯草菌が好ましい。
【００１１】
本発明において削除、又は不活性化の対象となる遺伝子領域は、Pro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsで示される枯草菌ゲノムの遺伝子領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域のいずれかであり、これらはバクテリオファージ由来の遺伝子領域が微生物ゲノム上に統合されたプロファージ領域、又は抗生物質の生産に関与する遺伝子領域である。
斯かる遺伝子領域を削除又は不活性化することにより、不必要な遺伝子の発現や複製、不要タンパク質の生産が減少し、また培地成分中の炭素源や窒素源がより効率良く利用されることなどによって目的タンパク質又はポリペプチドの生産効率が向上するものと期待される。
【００１２】
ここで、枯草菌ゲノムの遺伝子領域であるPro1、Pro2、Pro3、Pro4、Pro5、Pro6、Pro7、PBSX、SKIN、spβ、pks及びppsは、表１に示すように、Pro1はybbU−ybdE遺伝子領域、Pro2はydcL−ydeJ遺伝子領域、Pro3はydiM−ydjC遺伝子領域、Pro4はyjcM−yjdJ遺伝子領域、Pro5はynxB（ynaA）−dut（yncF）遺伝子領域、Pro6はyoaV−yobO遺伝子領域、Pro7はyrkM−yraK遺伝子領域、PBSXはxkdA (ykxA)−xlyA遺伝子領域、SKINはspoIVCB−spoIIIC遺伝子領域、spβはyodU−ypqP遺伝子領域、pksはpksA−ymaC遺伝子領域、ppsはppsE−ppsA（pps1）遺伝子領域をそれぞれ意味する。
【００１３】
尚、表１中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature, 390, 249, 1997で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。
【００１４】
【表１】
2005348641.tif 000002
【００１５】
また、上記枯草菌の各遺伝子領域と同じ機能を有する遺伝子領域は本発明の削除又は不活性化の対象となる遺伝子領域に包含されるものであり、当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域がこれに該当する。該遺伝子領域としては、表１の各遺伝子の塩基配列において１若しくは数個の塩基配列が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子であって、同じ機能を有する遺伝子が挙げられる。さらに、表１の各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはバチルス属細菌の由来の遺伝子領域が挙げられ、同じ機能を有することがより好ましい。尚、塩基配列の同一性は前述のLipman-Pearson法によって計算される。
【００１６】
削除又は不活性化する遺伝子領域は、１以上であればよいが、ゲノム複製の負担をより軽減するといった観点からは、複数、特に４以上が好ましく、更には７以上であることが好ましい。
具体的には、Pro1、Pro3、Pro4、Pro7、PBSX、spβ及びpksから選ばれる領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の遺伝子領域が好ましく、更にPro1、Pro3、Pro4及びPro7の４領域、又は当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の４領域の組合わせが好ましく、更にこれにspβ、PBSX及びpksの３領域並びに当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の３領域から選ばれる１以上の領域を組合わせるのが好ましく、更にPro1、Pro3、Pro4、Pro7、spβ、PBSX及びpksの７領域、又は当該遺伝子領域に相当する枯草菌以外の微生物の７領域を組み合わせて削除又は不活性化するのが好ましい。
【００１７】
また、本発明は標的とする遺伝子領域内の各遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、あるいは当該遺伝子の発現に関連する遺伝子、例えば転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって各遺伝子を不活性化することによっても達成できるが、好適にはゲノム複製の負担をより軽減するといった観点からは標的遺伝子領域を物理的に削除することがより望ましい。
【００１８】
更に本発明の微生物の構築には、上記以外の遺伝子領域の削除又は不活性化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。組み合わされる遺伝子領域としては、例えば、表１記載以外の枯草菌のプロファージ領域や抗生物質生産に関与する領域などが挙げられる。
【００１９】
遺伝子領域の削除又は不活性化の手順としては、例えば表１に示した標的遺伝子領域を計画的に削除又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子領域の削除又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２０】
標的とする遺伝子領域を削除又は不活性化するには、当該遺伝子領域に含まれる各遺伝子を順次、削除又は不活性化することも可能であるが、より効率的には、当該遺伝子領域を一括して削除する方法を用いることができる。複数の遺伝子が連続して存在する遺伝子領域を一括して削除する方法は特に限定されないが、例えば、標的遺伝子領域の上流及び下流側の両外側領域を含むが標的遺伝子領域を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子領域の外側２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子領域を削除することが可能である。
【００２１】
標的遺伝子領域内の各遺伝子を個別に削除又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990等）、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２２】
また、ランダムな遺伝子領域の削除又は不活性化についてもランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２３】
以下に、より具体的にＳＯＥ−ＰＣＲ法（splicing by overlap extension PCR：Gene,  77, 61, 1989）によって調製される削除用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による遺伝子領域（又は遺伝子）削除方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子領域の削除方法を限定するものではない。
【００２４】
本方法で用いる遺伝子或いはゲノム上の連続領域の削除に用いるＤＮＡ断片は、削除対象遺伝子領域の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、削除対象の遺伝子領域の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１参照）。
【００２５】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を行う。このＰＣＲ反応により、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図１参照）。
【００２６】
ＳＯＥ−ＰＣＲのためのプライマーのデザインやＰＣＲ反応条件については、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press, pp251, 1993、Gene, 77, 61, 1989 等）に示されており、ＬＡＴａｑ（タカラバイオ製）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて実施することができる。
【００２７】
また、薬剤耐性マーカー遺伝子としては特に限定されず、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２８】
かくして得られた削除用ＤＮＡ断片をコンピテント法等によって細胞内に導入すると、相同性のある削除対象の遺伝子領域の上流及び下流において、細胞内で相同組換えが生じ、標的遺伝子領域が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーにより選択、分離することができる。即ち、表２に示したプライマーセットを用いて調製した削除用ＤＮＡ断片を導入した場合、テトラサイクリンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって標的とする遺伝子領域が削除され、テトラサイクリン耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。
【００２９】
本発明では、例えば表１に示される遺伝子領域を多重に削除することが好ましいが、削除する遺伝子領域毎に異なる薬剤耐性マーカーを利用することによって多重に削除された微生物を得ることができる。また、より好適には、遺伝子領域の削除の際に使用した薬剤耐性マーカー遺伝子を削除、不活性化することによって、必ずしも複数の異なる薬剤耐性マーカーを必要とせず、多重に削除された微生物を獲得することができる。
【００３０】
マーカー遺伝子の削除方法としても特に限定されない。例えば、枯草菌を用いる場合、Leenhoutsらの方法（Mol.Gen.Genet., 253, 217, 1996）、或いはFabretらのupp遺伝子（uracil phosphoribosyl transferase）と5-フルオロウラシル（５ＦＵ）を利用したマーカー遺伝子の除去方法（Mol.Microbiol., 46, 25, 2002）の応用が可能である。
【００３１】
Leenhoutsらの方法の応用としては、まず、削除対象であるマーカー遺伝子の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法等で結合させたＤＮＡ断片を、枯草菌内では自己複製できず、且つ選択可能な第２の薬剤耐性マーカーを持つプラスミドベクターにクローニングする。このプラスミドＤＮＡによって枯草菌を形質転換し、Campbellタイプの相同組換えによってプラスミドがゲノムに統合された形質転換体をプラスミドベクター上のマーカー遺伝子で選択し、分離する。次に、この形質転換体を薬剤を含まない非選択条件で培養することによってゲノム由来の隣接領域とプラスミド由来の隣接領域間で２回目の相同組換えを起こさせ、ＳＯＥ−ＰＣＲ断片がゲノム上に残り、同時に削除対象のマーカー遺伝子と第２の薬剤耐性マーカーを含むプラスミド由来の断片が除去できるものである。
【００３２】
一方、Fabretらの方法は枯草菌のピリミジンサルベージ合成に関与するupp遺伝子にコードされるuracil phosphoribosyltransferaseが５ＦＵを基質として細胞毒性を有する5-フルオロデオキシUMPを合成するため、upp遺伝子を有する細胞は５ＦＵ存在下では生存できないことを利用した方法である。５ＦＵ存在下で生育できるupp遺伝子変異株に於いて、upp遺伝子と適当な薬剤耐性遺伝子を組み合わせたマーカーカセットを用いることによって、マーカーカセットが除去された細胞を５ＦＵによって選択することができるものである。
【００３３】
斯くして、本発明の遺伝子領域が削除又は不活性化された宿主微生物変異株を得ることができ、これらに目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。そして当該微生物を用いることで、従来から利用されている微生物と比べて、効率の良い目的タンパク質又はポリペプチドの生産が可能となる。
【００３４】
生産される目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子としては、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられるまた、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素 (Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 ,1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３５】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼ、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３６】
また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、および分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーターおよび転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位および開始コドンを含む翻訳開始領域、又、分泌用シグナルペプチド領域が適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域、分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号１又は３で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列中、上流０．６〜１ｋｂのからなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかのＤＮＡ断片の一部に欠失を有するＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００３７】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３８】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、微量の金属塩等その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００３９】
以上により、表１に示される枯草菌の遺伝子領域のいずれか、又は当該遺伝子領域に相当する遺伝子領域から選ばれた１以上の遺伝子領域が削除又は不活性化された宿主微生物変異株、及び当該変異株を用いて組換え微生物を構築することができ、これを用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。
【００４０】
以下に、枯草菌における本発明の微生物の構築方法と、当該組換え微生物を用いたセルラーゼの生産方法を例として具体的に説明する。
【実施例】
【００４１】
実施例１  upp遺伝子欠失株（薬剤耐性マーカーを含む）の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したupp-AFWとupp-ARV、及びupp-BFWとupp-BRVの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のupp遺伝子（BG 13408；uracil phosphoribosyl-transferase）の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（ａ）、及び下流に隣接する１．０ｋｂ断片（ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpMutinT3 （Microbiology ,144, 3097 ,1998）を鋳型として、表２に示したErm-FWとErm-RVプライマーのセットを用いてエリスロマイシン耐性遺伝子を含む１．２ｋｂ断片（ｃ）を、ＰＣＲによって調製した。尚、ＰＣＲ反応は反応系を２０μＬとして、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて添付のプロトコールに従い、（ａ）、（ｂ）については鋳型ＤＮＡである枯草菌168株ゲノム５０ｎｇ、（ｃ）についてはプラスミドＤＮＡ１ｎｇ、上記プライマーを各２００ｎＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを各２００μＭ、ＬＡＴａｑ０．２Ｕ、添付の１０×緩衝液を１×となるように混合した。増幅反応には、ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社製GeneAmp9700）を用い、９５℃で５分間の熱変性の後、９５℃で１５秒、次に５５℃で３０秒、さらに７２℃で６０秒間恒温し、これを繰り返し２５回おこない、最後に３０秒間７２℃で伸長を完了させた。このようにして得られた上記３つ（ａ）（ｂ）（ｃ）のＰＣＲ増幅断片をセントリコン（ミリポア社製）にて精製後、各０．５μLを混合し、さらに、プライマーUpp-AFWとUpp-BRVを加えて上記ＰＣＲ条件の７２℃での恒温を３分間に変更し、ＳＯＥ−ＰＣＲをおこなった。このＰＣＲの結果、３断片を（ａ）（ｃ）（ｂ）の順になる様に結合させた３．２ｋｂのＤＮＡ断片（ｄ）を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法（J.Bacteeriol.,81,741,1960）により枯草菌１６８株の形質転換を行い、０．５ｇ／ｍLのエリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってupp遺伝子がゲノム上から欠失し、エリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以後この株を168Δuppと表記する。
【００４２】
実施例２  cat-uppマーカーカセットＤＮＡ断片の構築（図２）
upp遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の転写が確実に行われる様、枯草菌で転写が確認されているプラスミドpSM5022 (Mol. Microbiol. 6, 309 ,1992) のcat遺伝子の下流にupp遺伝子を結合させた。即ち、表２に示したcat-Fwとcat-Rvのプライマーセットを用い、pSM5022を鋳型として、ＰＣＲによりcatを含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。また、プライマーupp-Fwとupp-RVを用いて168株ゲノムを鋳型としてPCRを行いupp遺伝子を含む１．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。次にこれら2断片を精製後、ＳＯＥ−ＰＣＲにより結合し、cat遺伝子の下流にupp遺伝子が結合した２．４ｋｂのマーカーカセットＤＮＡ断片（C）を調製した。更にこの断片をプラスミドpBR322のClaI切断部位に挿入することにより組換えプラスミドpBRcatuppを得た。
【００４３】
実施例３  Ｐｒｏ１領域欠失株（マーカーカセット断片を含む）の作製（図３）
表２に示したPro1-AFＷとPro1-ARＶ、Pro1-BFＷとPro1-BRVの各プライマーセットを用いて、168株ゲノムを鋳型として、ＰＣＲによってPro1領域の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ａ）及び下流に隣接する０．３ｋｂ断片（Ｂ）を調製した。次いで、得られたＰＣＲ増幅断片（Ａ）（Ｂ）と実施例２のマーカーカセット断片（Ｃ）を鋳型として、プライマーPro1-AFＷとPro1-BRVによるＳＯＥ−ＰＣＲを行って３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に結合させた。得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いてコンピテント法により実施例２で示した168Δupp株の形質転換を行い、１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に生育可能な形質転換体を分離した。得られた形質転換体はＰＣＲによってPro1領域がゲノム上から欠失し、cat-uppマーカーカセットＤＮＡ断片に置換していることを確認した。更に、本形質転換体を種々の濃度の５ＦＵ（シグマアルドリッチ社製）を添加したCg + グルコース寒天培地（７％リン酸水素二カリウム、３％リン酸二水素カリウム、０．５％クエン酸ナトリウム、１％硫酸アンモニウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．０５％グルタミン酸、０．５％グルコース、１０ｎｇ／ｍＬ L-トリプトファン、０．５５μｇ／ｍＬ塩化カルシウム、０．１７μｇ／ｍＬ塩化亜鉛、４３ｎｇ／ｍＬ塩化銅二水和物、６０ｎｇ／ｍＬ塩化コバルト六水和物、６０ｎｇ／ｍＬモリブデン酸(IV)ナトリウムニ水和物、１．５％寒天）上で培養を行ったが、０．５μｇ/ｍＬ以上の５ＦＵを加えた培地では生育が認められなかった。一方、形質転換体の親株である168Δupp株は同一条件で５μｇ/ｍＬの５ＦＵを加えた培地でも生育が観察された。以上の結果から、形質転換体に導入されたupp遺伝子がcat遺伝子プロモーターからの転写により発現して５ＦＵに感受性になったものと推定された。このようにして得られた株をΔPro1::cat-upp株とした。
【００４４】
実施例４  Ｐｒｏ１領域欠失株のマーカーカセット断片の削除（図４）
表２に示したPro1-AFWとPro1-ERV及びPro1-FFWとPro1-BRVのプライマーセットを用いてＰｒｏ１領域の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｅ）、下流に隣接する０．３ｋｂ断片（Ｆ）を増幅し、更に、得られた両ＤＮＡ断片とPro1-AFW及びPro1-BRVプライマーセットによるＳＯＥ−ＰＣＲによって、両断片が結合した０．９ｋｂ断片（Ｇ）を調製した。この断片（Ｇ）によって、実施例４で作製した168ΔPro1::cat-upp株を形質転換し、１μｇ／ｍＬ/の５ＦＵを添加したCg + グルコース寒天培地に生育可能な株を取得した。得られた株においてクロラムフェニコール感受性と、ゲノム上のPro1領域及びcat-uppマーカーカセットＤＮＡ断片が欠失していることを確認し、これをΔPro1株とした。
【００４５】
実施例５  各単独領域欠失株の作製
表２に示した各領域-AFW、各領域-ARV、各領域-BFW及び各領域-BRVのプライマーのセットと、実施例２のマーカーカセット断片を用いて実施例３と同様の方法によって、マーカーカセット断片を含むPro3領域欠失株（ΔPro3::cat-upp株）、Pro4領域欠失株（ΔPro4::cat-upp株）、Pro7領域欠失株（ΔPro7::cat-upp株）、PBSX領域欠失株（ΔPBSX::cat-upp株）、spβ領域欠失株（Δspβ::cat-upp株）及びpks領域欠失株（Δpks::cat-upp株）を作製した。更に、表２に示した各領域-AFW、各領域-ERVと各領域-FFW及び各領域-BRVを用いて実施例４と同様にして、薬剤耐性マーカー遺伝子を含まないPro3領域欠失株（ΔPro3株）、Pro4領域欠失株（ΔPro4株）、Pro7領域欠失株（ΔPro7株）、PBSX領域欠失株（ΔPBSX株）、spβ領域欠失株（Δspβ株）及びpks領域欠失株（Δpks株）を作製した。また、同様にしてPro2領域欠失株（ΔPro2株）、Pro5領域欠失株（ΔPro5株）、Pro6領域欠失株（ΔPro6株）、SKIN領域欠失株（ΔSKIN株）及びpps領域欠失株（Δpps株）を構築した。
【００４６】
実施例６  多重欠失株の構築（４領域欠失株）
Pro1領域がcat-uppカセット断片で置換されたΔPro1::cat株のゲノムDNAを用いて168ΔPro7株を形質転換した。次に、得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換体を、実施例１の168ΔPro1株のゲノムDNAを用いて形質転換し、５ＦＵ耐性、クロラムフェニコール感受性を指標にPro1領域とPro7領域の両方が欠失し、更に、マーカーカセット断片を含まない２領域多重欠失株を分離した。同様の操作を繰り返すことによってPro4領域、Pro3領域を順次削除し、Pro1、Pro3、Pro4及びPro7領域を欠失させた168Δ４株を構築した。また、同様にして、Pro1、Pro4、Pro6及びPro７領域を欠失させた168Δ4-2株を構築した。
【００４７】
実施例７  多重欠失株の構築（７領域欠失株）
実施例１と同様の手法を用いて表１に示した各領域-AFW、各領域-ARVと各領域-BFW、各領域-BRV、erm-FWとerm-RV、cat-FWとcat-RV 、tet-FWとtet-RVのプライマーの組み合わせにより、PBSX領域をネオマイシン耐性遺伝子に、spβ領域をクロラムフェニコール耐性遺伝子に、pks領域をテトラサイクリン耐性遺伝子に置換するためのＤＮＡ断片をＳＯＥ―ＰＣＲ法にて調製した。これらのＤＮＡ断片を用いて実施例６で構築した168Δ４株に対して、順にPBSX領域の削除、spβ領域の削除、SKIN領域を欠失させた。得られた株は、Pro1領域、Pro3領域、Pro4領域、Pro7領域、PBSX領域、spβ領域及びpks領域が欠失しており、これを168Δ７株とした。
【００４８】
実施例８  多重欠失株（7領域欠失株）の生育
栄養豊富なＬＢ培地及び最少培地であるCg+グルコース培地を用いて多重欠失変異株の生育と細胞形態を観察した。多重欠失変異株の倍加時間を測定した所、ＬＢ培地及びCg+グルコース培地共にコントロールである168Δupp株とほぼ変化は無かった。また、細胞形態及び染色体形態の観察においても、多重欠失変異株と168Δupp株との間で顕著な変化は観察されなかった。
実施例９  多重欠失株（8-12領域欠失株）の構築
実施例6及び7と同様にして、Pro1、Pro3、Pro4、Pro6、Pro7、PBSX、spβ及びpks各領域が欠失した168Δ8株のほか、168Δ９株（Pro1、Pro3、Pro4、Pro6、Pro7、PBSX、spβ、pks及びSKIN各領域が欠失）、168Δ10株（Pro1、Pro3、Pro4、Pro6、Pro7、PBSX、spβ、pks、SKIN及びpps各領域が欠失）、168Δ11株（Pro1、Pro3、Pro4、Pro6、Pro7、PBSX、spβ、pks、SKIN、pps及びPro2各領域が欠失）、及び168Δ12株（Pro1、Pro3、Pro4、Pro6、Pro7、PBSX、spβ、pks、SKIN、pps、Pro2及びPro5各領域が欠失）をそれぞれ構築した。
【００４９】
実施例10  タンパク質生産性の検証
168株をコントロールとし、実施例6、7及び9で作製した168Δ４株、168Δ７株、168Δ８株、168Δ９株、168Δ10株、168Δ11株、168Δ12株、及び168Δ4-2株についてセルラーゼの分泌生産を指標とするタンパク質の生産性を検証した。プラスミドpHY300PLK（ヤクルト製）のBamHIサイトに配列番号１で示したKSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子をクローニングしたpHYS237を用いて、それぞれの枯草菌株をプロトプラスト法（Mol.Gen.Genet.,168,111,1979）により形質転換した。５０ppmのテトラサイクリン、１％ＣＭＣと０．００５%トリパンブルーを添加した改変ＤＭ３プロトプラスト再生培地（Mol.Gen.Genet.,168,111,1979）上に出現した形質転換体の中から、セルラーゼ生産による充分なハロー形成の確認できた再生体を選択し、以下の組成の種培養培地および主培養培地を用いた培養を行なった。
【００５０】
選択された形質転換体を５ｍＬの１５ｐｐｍのテトラサイクリンを添加したＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、これを種培養とした。更にこの種培養液０．０３ｍＬを３０ｍＬのＣＳＭ培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素二カリウム、０．６％リン酸二水素カリウム、０．１％クエン酸ナトリウム二水和物、０．５％グルコース、０．０２％カザミノ酸、０．１２４％硫酸マグネシウム七水和物、１ｍＭ硝酸カルシウム、１０μＭ塩化マンガン四−五水和物、１μＭ硫酸鉄（II）、０．００５％トリプトファン、０．００５％メチオニン、０．００５％リジン塩酸塩）に接種し、主培養として３０℃で２４時間振盪培養を行った。培養の１２時間目、２４時間目にサンプリングを行ない、培養液から３，０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離（日立工機製Himac CF7D2）によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定した。菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量はｐ−ニトロセロトリオシド（生化学工業製）を基質とし、遊離するｐ−ニトロフェノール量から算出し、求めた。この結果、表３に示すように168Δ４株、168Δ７株、168Δ８株、168Δ９株、168Δ10株、168Δ11株、168Δ12株、及び168Δ4-2株においていずれも、対照の168株（野生型）と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が確認された。
【００５１】
【表２−１】
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【００５２】
【表２−２】
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【００５３】
【表２−３】
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【００５４】
【表２−４】
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【００５５】
【表３】
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野生型を１００とする相対値でセルラーゼの生産性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子削除用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的領域を削除（薬剤耐性遺伝子と置換）する方法を模式的に示した図である。
【図２】ＳＯＥ−ＰＣＲによるクロラムフェニコール耐性遺伝子とupp遺伝子からなるマーカーカセット断片の構築手順を示した図である。
【図３】ＳＯＥ−ＰＣＲによる標的領域の削除（マーカーカセットとの置換）の手順を示した図である。
【図４】ＳＯＥ−ＰＣＲによるマーカーカセット削除の手順を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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