(57)【要約】      （修正有）【課題】フローサイトメトリーを用いて骨髄異形成症候群の細胞を解析し、臨床的に有用な分類を可能にする方法を提供する。【解決手段】骨髄異形成症候群解析のために最適なモノクローナル抗体の組み合わせを考案し、得られた芽球、骨髄球、単球の表面抗原の発現異常を、健常人表面抗原発現の結果を基にして、予めパターン化しておき、その後、症例分類を目的として患者から採取された骨髄血または末梢血について芽球、骨髄球、単球の表面抗原の発現異常を検出し、予め作成されたパターン表に従って判定することで、骨髄異形成症候群の分類が迅速かつ簡便に検出でき、治療方針を検討する際の有用な診断情報を提供できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の分類を目的として採取された骨髄血または末梢血について、特定のモノクローナル抗体の組み合わせを用いて芽球、骨髄球、および単球の細胞表面抗原を検出し、得られた表面抗原パターンと、予め作成された細胞表面抗原の発現異常パターンとを対比することを特徴とする骨髄異形成症候群細胞の解析方法。
【請求項２】
細胞表面抗原の検出が、芽球、骨髄球、および単球の表面抗原に対する抗体と反応する細胞をフローサイトメトリーにより検出するものである請求項１記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、臨床検査として行われているフローサイトメトリーを用いて、骨髄異形成症候群の症例分類を行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  従来、造血器腫瘍である骨髄異形成症候群の分類は、形態学的手法や細胞遺伝学的手法によって行われてきた。フローサイトメトリーでは、骨髄球系白血病細胞の検出を目的とした手法で代用されてきた（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．８９，２０７９−２０８８，１９９７）。
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  そのために次のような問題点があった。
イ．骨髄異形成症候群は症例が多彩であり、また芽球以外の骨髄球や単球にも異常が多発するため、形態学的手法や細胞遺伝学的手法ではどの細胞を対象に判断をすべきか困難であった。
ロ．骨髄異形成症候群は、もともと腫瘍細胞の比率が小さく、治療によって腫瘍細胞が減少した場合、形態学的手法や細胞遺伝学的手法では解析が困難か、あるいは不可能であった。
ハ．フローサイトメトリーを用いた解析においても同様で、骨髄異形成症候群では表面抗原の発現異常が、芽球以外の骨髄球や単球においても高頻度に検出されるため、どの細胞を対象に判断をすべきか困難であった。
ニ．従来のモノクローナル抗体が陽性か陰性かというマーカーを用いて判定する方法では、骨髄血中または末梢血中の芽球、骨髄球、単球の細胞表面抗原の発現異常が、抗癌化学療法によって細胞表面が損傷を受けたために見られたものなのか、本当の骨髄異形成症候群細胞の抗原発現異常なのかを判別することは不可能であった。
ホ．以上の理由により、骨髄異形成症候群の症例分類は、非常に困難であった（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９８，９７９−９８７，２００１．Ｍａｙｎａｄｉｅ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２３４９−５６，２００２）。
本発明は、これらの問題点を解決し、フローサイトメーターを用いて骨髄異形成症候群細胞を正確に検出し、症例判定を行い、治療方針の検討に有用な情報を提供するために発明されたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、骨髄異形成症候群解析のために最適なモノクローナル抗体の組み合わせを考案し、得られた芽球、骨髄球、単球の表面抗原の発現異常を、同じモノクローナル抗体の組み合わせを用いて解析した健常人骨髄血中または末梢血中細胞の芽球、骨髄球、単球の表面抗原発現の結果を基にして、予めパターン化しておき、その後、症例分類を目的として患者から採取された骨髄血または末梢血について芽球、骨髄球、単球の表面抗原の発現異常を検出し、予め作成されたパターン表に従って判定することで、骨髄異形成症候群の分類が迅速かつ簡便に検出でき、治療方針を検討する際の有用な診断情報の提供が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】  以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明方法においては、まず、骨髄血中または末梢血中に存在する芽球、骨髄球、単球の表面抗原異常発現のパターン化を行う。細胞表面抗原としては、たとえば、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ等が例示できる。【０００６】  骨髄血中または末梢血中に存在する芽球、骨髄球、単球の表面抗原異常発現のパターン化は、細胞に細胞表面抗原に対する抗体を反応させ、反応した細胞をフローサイトメトリーにより検出することにより行うのが好ましい。【０００７】  本発明で使用される細胞膜表面抗原に対する抗体としては、種々の細胞膜表面マーカー解析用として用いられる抗体であれば特に制限されないが、モノクローナル抗体が望ましい。使用する抗体は、同じモノクローナル抗体であっても、抗体の種類や蛍光物質によって、細胞上で検出される抗原の蛍光強度に差がみられる。若干の差であれば、判定に優位な差を認めることはないが、蛍光強度が弱く判定が不明暸になるようなこともある。また、抗体の添加量は、陽性細胞が著しく増加している検体においては、規定の添加量では抗体量が不足するため陽性細胞群の蛍光強度が低下する場合が有り得るので、使用する抗体と、その抗体量については予め検討することが望ましい。【０００８】  細胞の染色は、３重蛍光染色を行い、使用する標識モノクローナル抗体としては、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ２ａ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ５６、及びｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰｅｒＣＰ）標識ＣＤ４５等が例示できる。【０００９】  ３重蛍光染色を行う際に用いるモノクローナル抗体の組み合わせは、マウスＩｇＧ１／マウスＩｇＧ２ａ／ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ４５、ＣＤ５／ＣＤ１９／ＣＤ４５、ＣＤ３８／ＣＤ５６／ＣＤ４５、ＣＤ１６／ＣＤ１３／ＣＤ４５、ＣＤ１５／ＣＤ３４／ＣＤ４５、ＣＤ１４／ＣＤ３３／ＣＤ４５、ＣＤ７／ＣＤ５６／ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ／ＣＤ３４／ＣＤ４５等が例示できる。【００１０】  より具体的には、骨髄異形成症候群が疑われる患者より採取された骨髄血又は末梢血を溶血剤（８．２６ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１．００ｇ  ＫＨＣＯ３、０．０４ｇ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ／ＬＤＷ）を加えて室温にて５分間反応を行い、混入赤血球の溶血操作を行った後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、溶血赤血球を含む上清を除く。沈澱をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１％  ＢＳＡ：０．１％  ｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ）にて細胞濃度を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整する。調整した細胞浮遊液をサンプリングした後、それぞれの試験管に抗体を添加する。その後４℃、遮光下にて３０分間反応させる。反応後、ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメトターを用いて測定する。【００１１】  フローサイトメーターは骨髄血中または末梢血中に存在する芽球、骨髄球、単球を正確に測定するために、ＣＤ４５−ＳＳＣ表示法による解析を行うのが望ましい。本方法は細胞に結合したＣＤ４５抗体の蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＦＬ）  と、細胞の内部構造を反映するＳＳＣ（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）のパラメーターで展開したｄｏｔ−ｐｌｏｔを用いる方法を採用するものである。このＣＤ４５−ＳＳＣ表示法による解析を行うと、骨髄血中または末梢血中に存在する芽球、骨髄球、単球の乖離が明確となり、信頼性の高い解析が可能となる（Ｓｔｅｌｚｅｒ  ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡｎｎＮＹＡｃａｄ  Ｓｃｉ，６７７，２６５−２８０，１９９３）。【００１２】  以上の操作により、細胞表面抗原の発現異常のパターン化がなされる。発現異常であるかどうかの判定は、健常人より採取された骨髄血または末梢血を用いて同様の操作を行い、芽球、骨髄球、単球のそれぞれのモノクローナル抗体の発現パターン（正常発現パターン）と比較して行う。【００１３】通常、骨髄血中および末梢血中の各種血液細胞は、その分化成熟段階に従って特定の細胞表面抗原の発現と消失が認められる。これらの細胞表面抗原の発現と消失は単に陽性か陰性かというものではなく、その発現しているレベル（発現強度）までもが規則正しく制御されている（Ｌｏｋｅｎ  ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，２０００）。特定のモノクローナル抗体の組み合わせを用いてフローサイトメトリーで解析することにより、芽球から骨髄球または単球へ分化成熟していく過程における細胞表面抗原の発現と消失は、正常な分化成熟の経路（ｎｏｒｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）として検出することができる。従って、この正常細胞の表面抗原発現パターンによって描かれる正常な分化成熟の経路から外れた経路を有する細胞群は、なんらかの細胞表面抗原発現異常であると判定できる（Ｌｏｋｅｎ  Ｍ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｐ  ｅｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９７．Ｗｅｌｌｓ  ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１１０，８４−９４，１９９８．Ｓｉｅｖｅｒｓ  ＥＬ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８８，１４８３−１４８８，１９９６）。細胞表面抗原発現異常のパターンの例としては、下記表１が挙げられる。細胞表面抗原発現異常のパターンはこの例に限定されるものではないことは言うまでもない。【００１４】
【表１】
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【００１５】  次に、それぞれの細胞表面抗原の発現異常パターンに、異常発現の内容に応じてスコアーを設定していく。スコアーの設定ルールとしては、下記表２が挙げられる。スコアーのルールはこの例に限定されるものではないことは言うまでもない。【００１６】
【表２】
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【００１７】  次に、予め作成した細胞表面抗原の発現異常のパターンを、スコアー設定のルールに従って、スコアリング（Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ）表を作成する。Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ表の例としては下記表３が挙げられる。Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ表はこの例に限定されるものではないことは言うまでもない。【００１８】
【表３】
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【００１９】  得られたＦｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅによって、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅが０から１の症例、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅが２から３の症例、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅが４以上の症例に分類する。【００２０】  骨髄異形成症候群患者は、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ別に症例分類が可能であり、同種幹細胞移植術を行った場合の治療成績に差異が認められる。すなわち、Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ別に治療に反応性が予測できるため、治療方針を検討する際の有用な情報を得ることが可能になる。Ｆｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ別の同種幹細胞移植術に対する治療成績結果を、下記表４に示す。治療方法が、同種幹細胞移植術のみではないこと、またＦｌｏｗ  Ｓｃｏｒｅ別に予測できる治療成績が同種幹細胞移植術に限定されるものではないことは言うまでもない。【００２１】
【表４】
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【発明の効果】
【００２２】本発明方法によれば、骨髄異形成症候群の分類が簡単かつ迅速に検出でき、治療に対する反応性の予測が可能になり、より良い治療法の選択を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  健常者骨髄血中の骨髄球と単球を、骨髄異形成症候群の解析用モノクローナル抗体の組み合わせを用いて染色、解析して得られた正常な細胞分化成熟の経路（ｎｏｒｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）のパターンを示す図である。
【図２】  骨髄異形成症候群患者より採取された骨髄血中の骨髄球と単球を、骨髄異形成症候群の解析用モノクローナル抗体の組み合わせを用いて染色、解析して得られた、細胞表面抗原の発現異常を示す図である。
【図１】
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【図２】
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