(57)【要約】【課題】  検水に希薄に含まれるウイルスを濃縮分離する際に、濃縮分離処理前後における検水の紫外波長域の吸光度を測定することを特徴とするウイルスの濃縮分離率の測定方法を提供する。【解決手段】  水中のウイルスは希薄なため検査に先立って濃縮する必要があり、様々なウイルス濃縮分離方法が提案されているが、濃縮分離率を簡便に判定する方法がないため、ウイルス濃度に関する定量的な評価ができない。そこで本発明は、水中のウイルスの濃縮分離率を簡便に判定するため方法を提供する。本発明に係る方法において、検水および濃縮分離工程を経た検水の紫外波長域の吸光度を比較すれば、濃縮分離工程で検水から分離除去されたウイルスの量比を推定でき、ウイルスの濃縮分離率を判定できる。【選択図】      図５
2005261223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン交換能を有するろ過膜もしくは充填材と検水を接触させて検水中のウイルスの一部を該ろ過膜もしくは該充填材に吸着し、または、砂もしくは膜に検水をろ過してウイルスの一部を物理的に除去し、または、凝集剤を検水に添加して検水中のウイルスの一部を濁質と共に凝集分離して、水中のウイルスを濃縮分離し、該濃縮分離の処理前および処理後における検水の紫外波長域の吸光度を計測し、該処理前後の吸光度を比較することを特徴とする水中のウイルスの濃縮分離率測定方法。
【請求項２】
前記濃縮分離の処理後の検水を分画回収して、紫外波長域の吸光度を各回収検水毎に計測し、該回収検水毎の吸光度を前記処理前の検水の吸光度と比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記紫外波長域として、波長２５０ｎｍ〜３００ｎｍの吸光度を計測することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により測定した前記濃縮分離の処理前および処理後の検水における紫外波長域の吸光度と、予め測定した水中のウイルスの濃度検量線に基づいて、該濃縮分離の処理前および処理後の検水のウイルスの濃度を推定することを特徴とする水中のウイルスの濃度推定方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により測定した前記濃縮分離の処理前および処理後の検水における紫外波長域の吸光度と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材に吸着されたウイルスの個数と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材を通過した検水の液量に基づいて、濃縮分離処理前後の検水のウイルス濃度を推定することを特徴とする水中のウイルスの濃度推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中に希薄に含まれるウイルスを濃縮分離してウイルスの種類や量を検出する際のウイルスの濃縮分離方法に関する。特に、ウイルスの濃縮分離前後のウイルスの濃縮分離率を測定する方法およびウイルスの濃度を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にウイルスが高濃度で含まれる魚介類中のウイルスの検出方法についての報告例は多数あるが、ウイルスが非常に希薄に含まれる水中の、特に夾雑物が多量に含まれる下水放流水中のウイルスを検出する方法についての報告例は少なく、さらに、濃縮分離の効率を加味した水中のウイルス濃度についての定量評価に関する報告は少ない。  非特許文献１では、試料水中に陰イオン交換体であるＤＥＡＥ−セルロースを直接添加（０．０３％）し、水中ウイルス（弱毒ポリオウイルス１型（Ｌｓｃ，２ａｂ株））を吸着させ、その後、アニオン系有機凝集剤でセルロースを凝集させ、凝集塊をナイロンメッシュで回収して、ビーフエキストラクト溶液でウイルスを誘出させる濃縮分離方法を記載している。
【０００３】
非特許文献２では、特殊なグラスウール、ｏｉｌｅｄ  ｓｏｄｏｃａｌｃｉｃ  ｇｌａｓｓ  ｗｏｏｌ（Ｓａｉｎｔ  Ｇｏｂａｉｎ  Ｒ．７２５）を使用した１００〜１，０００Ｌのサンプル水中のエンテロウイルスを濃縮分離する方法を記載している。
【０００４】
非特許文献３では、粒状活性炭（ＧＡＣ）を充填した濾過カラムを通すことにより飲料水サンプルからエンテロウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、及びロタウイルスを同時濃縮分離する方法を開示している。ｐＨ９．０の溶出液として尿素−アルギニン・ホスフェート・バッファー（ＵＡＰＢ）を、ＧＡＣからの有効な脱着及び溶出のために使用する。上記方法の結果として得られたウイルス濃縮液に関して、核酸抽出、ｃＤＮＡ合成、各ウイルスに特異的なプライマー・セットを用いたＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）にてウイルス濃度を定量している。
【０００５】
非特許文献４では、飲料水及び廃水サンプル中のコリファージを、正に帯電した膜フィルター上に吸着させ、尿素−アルギニン・ホスフェートバッファー（ＵＡＰＢ）で溶出させ、再濃縮し、そしてＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ（ＡＴＣＣ  １３７０６）により検出する濃縮分離方法を記載している。
【０００６】
特許文献１では、ウイルスに対する抗体を表面に有するウイルス濃縮用材料、及び当該材料を用いるウイルス濃縮分離方法を、記載している。
【０００７】
特許文献２では、ウイルスを含有する流体よりウイルスを捕捉する方法において、アニオン性基を分子内に有する単量体を１構成成分とした重合体を基材の少なくとも一部に保持させてなるウイルス捕捉体に、該ウイルスを含有する流体を通過させ、該ウイルスを該ウイルス捕捉体に吸着させることを特徴とするウイルス捕捉方法を記載している。
【０００８】
以上列挙した文献においては、最終的に得られたウイルス濃縮液について、生物学的な検定法や遺伝子検査法によってウイルスの種類を確認し、濃縮液中の存在量を推定していた。従って、元の水中のウイルス濃度については判らず、ウイルスの濃縮前後の濃縮分離率についても不明であった。
【０００９】
また、非特許文献５では、紫外線消毒による大腸菌ファージの不活化を判定するために、プラーク形成法で大腸菌ファージ濃度を測定する方法を記載している。この方法では濃縮しなくとも水中の希薄な大腸菌ファージの濃度を推定することができる。
【００１０】
上記の様に、特定のウイルスについては、水中の希薄なウイルス濃度を生物学的または遺伝子工学的方法によって測定できているものもあるが、測定可能なウイルスの種類が限られる上、測定に数時間〜数日の時間を要し、これらの方法を水中に希薄に含まれるウイルスの濃縮分離前後のウイルスの濃縮分離率を判定する方法に適用しても、タイムラグの無い分離率の判定はできなかった。
【非特許文献１】矢野ら「セルロース吸着・凝集法による水中ウイルス試験方法の検討」水道協会雑誌、第６０巻、第５号（第６８０号）、第１０〜２３頁（１９９１）
【非特許文献２】Ph. Vilagin et al., "Glass wool for virus concentration at ambient water pH level", Wat. Sci. Tech. Vol.27, No.3-4 pp.299-306 (1993)
【非特許文献３】N. Jothikumar et al., "A simple device for the concentration and detection of enterovirus, hepatitis E virus and rotavirus from water samples by reverse transcription-polymerase chain reation", Journal of Virological Methods 55 (1995) 401-415
【非特許文献４】N. Jothikumar et al., "Elution and reconcentration of coliphages in water from positively charged membrane filters with urea-arginine phosphate buffer", Journal of Virological Methods 65 (1997) 281-286
【非特許文献５】片山ら「ＵＶ照射により不活化されたＲＮＡファージのＲＴ−ＰＣＲ法による定量」環境工学研究論文集、第３４巻、８３〜９１頁（１９９７）
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎら：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．３、ｐ８５８（１９９８）
【特許文献１】特開２００２−７８４８５号公報
【特許文献２】特開平５−８４０７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
下水を介した水域汚染や飲料水を介した水系感染などの原因病原体として様々な種類の腸管系ウイルスがあり、ウイルス汚染状況の把握や対策技術の確立が公衆衛生上の急務の課題となっている。水中のウイルスは希薄なため検査に先立って濃縮する必要があり、前述した様々なウイルス濃縮分離方法が提案されている。しかしながら、濃縮分離の効率については、濃度を測定できるウイルスの種類が限られる上、簡便に判定する方法がなく、特に実生活で使用される下水や飲料水などに存在する、ウイルス濃度を測定できないウイルス、濃縮後しか測定できないウイルス、および複数混在するウイルス、を含む水中のウイルスの濃縮分離率は判定できなかった。
【００１２】
また、濃縮前の検水中のウイルスの濃度を定量的に求めるにあたっては、検水を濃縮した後の検査可能な試料のウイルス濃度を測定すると共に、濃縮分離工程におけるウイルスの濃縮分離率を求める必要がある。また、検水中のウイルスの存否を定性的に判断するにあたっても、検水を濃縮した後の検査可能な試料を得ようとする際に、濃縮分離工程における濃縮分離率が判ると、濃縮分離に供する検水の容量が適切か否か判断する目安となる。
【００１３】
すなわち、本発明では、水中のウイルスを濃縮分離してウイルスの種類や量を検出する方法において、ウイルスの濃縮分離工程前後におけるウイルスの濃縮分離率（ウイルスの除去率ともいう）を、簡便に、短時間に、且つウイルスの種類を問わずに測定する方法、および、測定したウイルスの濃縮分離率を用いて、元の水中のウイルス濃度を推定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、本発明者は、上記課題を解決すべく実験を重ねた結果、水中のウイルス濃度と水の紫外波長域の吸光度との間に密接な相関性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、水中のウイルスを濃縮分離処理する前および後における、水の紫外波長域の吸光度を計測して、両者を比較することによる、水中のウイルスの濃縮分離率測定方法および濃度推定方法を提供する。その内容を以下に示す。
【００１６】
（１）陰イオン交換能を有するろ過膜もしくは充填材と検水を接触させて検水中のウイルスの一部を該ろ過膜もしくは該充填材に吸着し、または、砂もしくは膜に検水をろ過してウイルスの一部を物理的に除去し、または、凝集剤を検水に添加して検水中のウイルスの一部を濁質と共に凝集分離して、水中のウイルスを濃縮分離し、該濃縮分離の処理前および処理後の検水における紫外波長域の吸光度を計測し、該処理前後の吸光度を比較することを特徴とする水中のウイルスの濃縮分離率測定方法。
【００１７】
（２）前記濃縮分離の処理後の検水を分画回収して、紫外波長域の吸光度を各回収検水毎に計測し、該回収検水毎の吸光度を前記処理前の検水の吸光度と比較することを特徴とする上記（１）に記載の方法。
【００１８】
（３）前記紫外波長域として、波長２５０ｎｍ〜３００ｎｍの吸光度を計測することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の方法。
【００１９】
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により測定した前記濃縮分離の処理前および処理後の検水における紫外波長域の吸光度と、予め測定した水中のウイルスの濃度検量線に基づいて、該濃縮分離の処理前および処理後の検水のウイルスの濃度を推定することを特徴とする水中のウイルスの濃度推定方法。
【００２０】
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法により測定した前記濃縮分離の処理前および処理後の検水の紫外波長域の吸光度と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材に吸着されたウイルスの個数と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材を通過した検水の液量に基づいて、濃縮分離処理前後の検水のウイルス濃度を推定することを特徴とする水中のウイルスの濃度推定方法。
【発明の効果】
【００２１】
水中に希薄に含まれるウイルスを濃縮分離してウイルスの種類や量を検出する方法において、ウイルスの濃縮分離工程前後での濃縮分離率を簡便に、短時間に、且つウイルスの種類を問わずに測定することができ、また、濃縮工程前後の水中のウイルス濃度を推定することもできる。これにより、上下水等のウイルスの汚染状況の判定や、対策技術及び装置の開発における評価手法として活用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
水中のウイルスを濃縮分離する方法としては、陰イオン交換能を有する、ろ過膜または充填材と、検水を接触させ、検水中のウイルス粒子を前記ろ過膜または充填材に吸着させる方法、砂もしくは膜などで検水をろ過して、検水中のウイルスを物理的に除去する方法、アルミニウム塩もしくは鉄塩を含む凝集剤を検水に添加して、検水中のウイルス粒子を濁質とともに凝集分離する方法等を対象とする。
【００２３】
ウイルスは蛋白質と核酸で構成されており、これら構成成分は紫外線を吸収する性質があり、この原理に基づいて水の紫外部吸収を測定すれば水中の蛋白質や核酸の濃度を推定できると考えられる。例えば、蛋白質は図１に例示するような波長２８０ｎｍ付近を極値とする吸光度分布を示し、また、核酸は図２に例示するような波長２６０ｎｍ付近を極値とする吸光度分布示す。
【００２４】
しかしながら、水中にはウイルスばかりでなく様々な種類の有機物も夾雑していることがほとんどである。
【００２５】
水中の有機物の濃度は、水の紫外部波長域の吸光度と相関性があることが多く、特に波長２６０ｎｍ付近の吸光度（以下、Ｅ２６０という）との相関性が高い。例えば、複数の下水放流水について、「下水試験方法（日本下水道協会編）」に準拠して、水中の有機物濃度指標である化学的酸素要求量（以下、ＣＯＤという）とＥ２６０をそれぞれ測定した結果、図３に示すようにCODとＥ２６０との間に明確な相関性が認められた。
【００２６】
ところで、大量の水中に混入している微量のウイルスは、通常マイナスに帯電しているため、大部分のウイルスはこれら有機物のプラスの極性を持つ部分に付着していると考えられる。つまり、上記の濃縮分離方法を用いて、有機物を含むウイルスを濃縮分離した場合、有機物の濃縮分離率とウイルスの濃縮分離率は、ほぼ一致すると考えられる。
【００２７】
ここで、濃縮分離率は下記のように定義する。
【００２８】
濃縮分離率＝｛（濃縮分離処理前の水中の濃度−濃縮分離処理後の水中の濃度）／濃縮分離処理前の水中の濃度｝
【００２９】
したがって、検水の紫外波長域の吸光度を予め測定するともに、検水からウイルスを濃縮分離処理した後の紫外波長域の吸光度を測定し、両者の吸光度の値を比較することで、ウイルス分離の除去率すなわちウイルスの濃縮分離率を判定することができる。また、紫外波長域はより好ましくは波長２５０ｎｍから波長３００ｎｍまでであることが検討の結果判った。
【００３０】
濃縮分離処理前の検水および濃縮分離後の検水の紫外波長域の吸光度を測定するには、それぞれ１検体以上を分画回収して吸光度の測定に供することができる。または、連続的に濃縮分離処理を行う場合にあっては当該検水の紫外波長域の吸光度を連続的もしくは定期的に測定することができる。
【００３１】
濃縮分離前後の検水について測定した紫外波長域の吸光度について下式を用いてウイルスの濃縮分離率を算出することができる。
【００３２】
濃縮分離率＝｛（濃縮分離処理前の検水の紫外波長域の吸光度−濃縮分離処理後の検水の紫外波長域の吸光度）／濃縮分離処理前の検水の紫外波長域の吸光度｝
【００３３】
ウイルスの含有濃度が既知の検水については、紫外波長域の吸光度を測定し、ウイルス濃度と吸光度との関係式、すなわち吸光度からウイルス濃度を算出する検量線、を予め作成すれば、当該検量線に基づいて、濃縮分離前後の検水の紫外波長域の吸光度から該検水中のウイルス濃度を容易に算出することができる。
【００３４】
また、濃縮分離したウイルスを回収し、そのウイルス濃度を測定すれば、濃縮分離前後の検水のウイルス濃度を推定することができる。例えば、陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材を用いてウイルスを濃縮分離処理した場合、濃縮分離後の該ろ過膜または充填材を、所定量のアルカリ溶液（例えば、５０ｍＭグリシン、５ｇ／Ｌ肉エキス、ｐＨ９．５）に接触させて、該ろ過膜または充填材に吸着したウイルスをアルカリ溶液中に溶離させることができ、当該溶液を回収すればウイルス濃縮液を得ることができ、当該ウイルス濃縮液のウイルス濃度を適切な方法で測定することできる。ウイルス濃度の測定方法は、それぞれ対象とするウイルスに応じて選定すればよく、例えば、プラーク形成法や遺伝子増幅法などが挙げられる。当該ウイルス濃縮液の液量とウイルス濃度を乗じれば、前記濃縮分離処理によって分離されたウイルスの個数が算出できる。このようにして算出したウイルスの個数と、前記濃縮分離処理を通過した検水の液量と、該濃縮分離処理前後の紫外波長域の吸光度とから、下式に基づいて検水のウイルス濃度を推定することができる。
【００３５】
なお、前記濃縮分離処理を通過した検水の液量は、該濃縮分離処理に供した検水の液量としてもよい。また、下式中の濃縮分離率は前記したように濃縮分離処理前後の紫外波長域の吸光度から算出することができる。
【００３６】
濃縮分離前の検水のウイルス濃度＝｛ウイルス濃縮液のウイルスの個数／濃縮分離率／濃縮分離処理を通過した検水の液量｝
【００３７】
濃縮分離後の検水のウイルス濃度＝｛（１−濃縮分離率）×ウイルス濃縮液のウイルスの個数／濃縮分離率／濃縮分離処理を通過した検水の液量｝
【００３８】
以下の実施例及び添付図面により、本発明を詳細に説明するが、これらにより、本発明の範囲が限定されるものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
水中のウイルスの濃縮分離方法として、陰イオン交換能を有する充填剤を使用した例を示す。
実施例１
ＤＥＡＥセルロースを充填したカラムに検水として下水処理水を通水するウイルス濃縮分離試験において、カラム通水前後のＥ２６０および大腸菌ファージ濃度を測定した。
まず、ＤＥＡＥセルロース（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを純水で膨潤させ、１Ｎ塩酸で酸洗浄し、その後１Ｎ苛性ソーダでアルカリ洗浄し、ｐＨが中性になるまで純水で洗浄した。洗浄を経た当該セルロースを、容積５０ｍＬのガラス製カラムに充填し、ウイルス吸着分離用カラムを作成した。
【００４０】
実下水処理場より採取した下水処理水の検水を前記カラムの底部より通水量５Ｌ／時の上向流で通水し、前記カラムの上部より流出する検水すなわちカラム通過液を２Ｌごとに分画回収した。
【００４１】
前記カラム通過前の供試液（濃縮分離処理前の検水）、および分画回収したカラム通過液（濃縮分離処理後の分画回収した検水）について、それぞれＥ２６０および大腸菌ファージ濃度を測定した。
【００４２】
Ｅ２６０は、島津製作所製分光光度分析計（モデルＵＶ−２２００）を用いた。
ウイルスの一種である大腸菌ファージは、濃縮技術の検討や消毒技術の検討などにおいて、モデルウイルスとして汎用されている。大腸菌ファージ濃度は、大腸菌Ｋ１２株を宿主としたプラーク形成法で測定した。
【００４３】
図４にカラム通過前の供試液、およびカラム通過液についてＥ２６０および大腸菌ファージ濃度を測定した結果を示す。本図は、横軸に試料名を、縦軸にＥ２６０または大腸菌ファージ濃度を示している。試料名として記載した供試液は上記カラム通過前の供試液、通過液１はカラム通過初期〜２Ｌの通過液画分、通過液２はカラム通過２Ｌ〜４Ｌの通過液画分、通過液３はカラム通過４Ｌ〜６Ｌの通過液画分、に関する測定結果をそれぞれ示している。
【００４４】
Ｅ２６０は、供試液においては０．２程度であったが、通過液１で０．１以下に減少し、カラム内の充填材に有機化合物が吸着分離されていることが分かる。継続してカラムへの通水を行うと、通過液のＥ２６０は徐々に高まり、通過液３では０．１５程度まで悪化したことから、通水を継続するにしたがって有機化合物のカラム内の充填材へ濃縮分離能が低下することが分かる。
【００４５】
一方、大腸菌ファージ濃度は、供試液において５０ｐｆｕ／ｍＬであったが、通過液１で２０ｐｆｕ／ｍＬ以下に低減し、カラム内の充填材に大腸菌ファージが吸着されていることが分かる。継続してカラムへの通水を行うと、通過液中に残留する大腸菌ファージ濃度が徐々に高まり、通過液３では４０ｐｆｕ／ｍＬ程度まで悪化した。
【００４６】
各試料のＥ２６０および大腸菌ファージ濃度の傾向は極めて類似していることから、カラムへの大腸菌ファージの濃縮分離率はＥ２６０を計測することで簡便に推定できることは明らかである。
【００４７】
また、下式にてＥ２６０もしくは大腸菌ファージの濃縮分離率を算出し、その結果を図５に示す。
【００４８】
濃縮分離率［％］＝｛１−（分画回収した各通過液の吸光度）／（供試液の吸光度）｝×１００
【００４９】
カラム通過に伴うＥ２６０の濃縮分離率と大腸菌ファージの濃縮分離率との間に正の相関が認められ、Ｅ２６０を計測することによって、カラム内充填材へのウイルスの濃縮分離率を容易に推定できる。
【００５０】
実施例２
まず、ウイルス濃度評価のための検量線を作成した。Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐII）の一部分の遺伝子配列を保持したウイルス粒子Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（米国Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ）に関して、リアルタイムＰＣＲを用いてウイルス濃度を定量評価するための検量線を作成した。すなわち、前記Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡを２×１０7個／μＬで含んだ溶液３０μＬより米国Ｑｉａｇｅｎ社製ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡを回収し、１×１０6コピー／μＬのＲＮＡ溶液を得た。当該溶液を緩衝液にて順次希釈し、５μＬあたり１×１０2から１×１０7個の範囲で１０倍希釈系列６段階の標準溶液をそれぞれ調製した。ＴａＫａＲａ社製Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて逆転写ポリメラーゼ遺伝子増幅法（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法）の反応試料を各標準溶液について調製した。なお、増幅ＤＮＡの検出用色素としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いた。また、ＤＮＡ増幅用のプライマーは、非特許文献６に準じ、以下の表１に示すＮＩプライマーおよびＥ３プライマーを用いた。
【００５１】
【表１】
2005261223.tif 000003
【００５２】
前記したＲＴ−ＰＣＲ法の反応試料について、リアルタイムＰＣＲ装置（米国Ｃｅｐｈｅｉｄ社製Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  II）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。なお、ＲＴ−ＰＣＲ反応は以下の表２に示す条件で実施した。
【００５３】
【表２】
2005261223.tif 000004
【００５４】
リアルタイムＰＣＲ装置を用いた場合、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡの増幅量を蛍光強度として観測することができる。ＰＣＲ法の反応試料中の標的遺伝子数が多いほど、少ないＰＣＲ反応サイクル数で蛍光強度が増加し、逆に、ＰＣＲ法の反応試料中の標的遺伝子数が少ないほど、蛍光強度の増加に要するＰＣＲ反応サイクル数が長くなることになる。この原理に基づいて反応試料中のウイルス濃度を推定することができる。さらに、ウイルス濃度が既知の溶液を順次希釈して得た、種々の濃度でウイルスを含んだ複数濃度段階の標準溶液に関して、リアルタイムＰＣＲを実施し、それぞれの標準溶液について計測されたＰＣＲ反応サイクル数とＰＣＲ反応試料中のウイルス濃度との関連性から近似式を導き、かかる近似式を検量線とすれば、未知の濃度でウイルスを含んだ試料に関するＰＣＲ反応サイクル数から試料中のウイルス濃度を推算することができる。すなわち、本実施例において各標準溶液のＰＣＲ反応試料に関して計測されたＰＣＲ反応サイクル数とＰＣＲ反応試料中のウイルス数との関係を図６に示す。本図から明らかなようにＰＣＲ反応試料中のウイルス数の対数とＤＮＡの増幅に要したＰＣＲ反応サイクル数との間に比例関係があり、未知試料について同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施して得たＤＮＡの増幅に要したＰＣＲ反応サイクル数から未知試料中のウイルス数を推算できる。すなわち図中に示した回帰式を変形して得られる下式（以下、検量線回帰式という）で算定できる。
【００５５】
ｘ＝ｅｘｐ｛（ｙ−３９．１４）／（−１．５６）｝
【００５６】
ここで、ｘはＰＣＲ反応試料中のウイルス数を、ｙはＰＣＲ反応サイクル数をそれぞれ示す。
【００５７】
次いで、ウイルスの濃縮分離工程におけるウイルスおよびＥ２６０の濃縮分離率を求めた。以下に説明する。前記Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡを添加した下水処理水を、ＤＥＡＥセルロースを充填したカラムに通水するウイルス濃縮分離試験において、カラム通水前後のＥ２６０、ウイルス濃度を測定した。
【００５８】
ＤＥＡＥセルロース（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを純水で膨潤させ、１Ｎ塩酸で酸洗浄し、その後１Ｎ苛性ソーダでアルカリ洗浄し、ｐＨが中性になるまで純水で洗浄した。洗浄を経た当該セルロースを、容積５０ｍＬのガラス製カラムに充填し、ウイルス濃縮分離用カラムを作成した。
【００５９】
実下水処理場より採取した下水処理水１０Ｌに、Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ  Ｎｏｒｗａｌｋウイルス（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐII）（米国Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ）を２×１０7個／μＬで含んだウイルス溶液１００μＬを添加して、２×１０5個／ｍＬの供試液を調製した。当該供試液を前記カラムの底部より通水量５Ｌ／時の上向流で通水し、前記カラムの上部より流出するカラム通過液を２Ｌごとに分画回収した。
【００６０】
前記カラム通過前の供試液、および分画したカラム通過液について、それぞれＥ２６０およびウイルス濃度を測定した。
Ｅ２６０は、島津製作所製分光光度分析計（モデルＵＶ−２２００）を用いた。
【００６１】
ウイルス濃度は、前記リアルタイムＰＣＲ装置を用いて分析した。すなわち、前記カラム通過前の供試液、および分画したカラム通過液についてそれぞれ１００μＬよりＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（米国Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを回収し、１００μＬのＲＮＡ溶液を得た。当該溶液１０μＬを用いてＲＴ−ＰＣＲ法の反応試料（ＴａＫａＲａ社製Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ）を調製した。なお、増幅ＤＮＡの検出用色素としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用い、ＤＮＡ増幅用のプライマーは表１に示したＮＩプライマーおよびＥ３プライマーを用いた。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応は表２に示した条件で実施した。
【００６２】
以下の表３にカラム通過前の供試液、およびカラム通過液についてＥ２６０およびウイルス濃度を測定した結果を示す。なお、試料名として記載した供試液は上記カラム通過前の供試液、通過液１はカラム通過初期〜２Ｌの通過液画分、通過液２はカラム通過２Ｌ〜４Ｌの通過液画分、通過液３はカラム通過４Ｌ〜６Ｌの通過液画分、に関する測定結果をそれぞれ示している。本表中のウイルス濃度は、前記検量線回帰式に基づいてＰＣＲ反応サイクル数より算出した。また、ウイルスおよびＥ２６０の濃縮分離率はそれぞれ下式に基づいて算出した。
【００６３】
濃縮分離率［％］＝｛１−（分画回収した各通過液の吸光度）／（供試液の吸光度）｝×１００
【００６４】
【表３】
2005261223.tif 000005
【００６５】
さらに、表３に示したウイルス濃縮分離率とＥ２６０濃縮分離率の相関関係を図７に示した。本図よりＥ２６０濃縮分離率とウイルス濃縮分離率との間に比例関係があることは明らかであり、通過液のＥ２６０を観測することによってウイルスの濃縮分離率を推算できる。また、Ｅ２６０とＰＣＲ反応サイクル数から求めたウイルス濃度の関係を図８に示すが、Ｅ２６０とウイルス濃度は比例関係にあり、Ｅ２６０の測定により、ウイルス濃度が推定できることも判る。
【００６６】
実施例１および２の結果、ウイルス濃度と紫外波長域の吸光度（大腸菌ファージ濃度とＥ２６０、および、Ａｍｏｒｅｄ  ＲＮＡウイルス濃度とＥ２６０）との間に相関関係があることを確認した。水中のウイルスを濃縮分離する工程においてウイルス濃度そのものを指標として濃縮分離率をタイムラグなしに判定することはできない。例えば、大腸菌ファージのようにウイルスの濃度を定量評価する方法が確立している場合においてウイルス濃度の判定に１日以上、また、ＲＴ−ＰＣＲ法などによる遺伝子検査法が適用できる場合であっても数時間以上を要する。これに対して、実施例１および２で示したように紫外波長域の吸光度を指標とすれば大腸菌ファージやＡｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡウイルス等の濃縮分離率を即時判定することができる。また、予めウイルス濃度とＥ２６０の関係の検量線を作成しておけば、即時にウイルス濃度も推定することが可能となる。さらに供試液中に混在するその他のウイルスについても実施例１または２と同様に濃縮分離されていることが類推され、紫外波長域の吸光度をモニタリングすることによって、ウイルスの濃縮分離率が、水中のウイルス全体について種類を問わずに、且つタイムラグなしに判定することが可能である。
【００６７】
実施例３
ＤＥＡＥセルロースを充填したカラムに下水処理水を通水するウイルス濃縮分離試験において、カラム通水前後のＥ２６０および該充填材への吸着成分をアルカリ抽出して得た溶出液のウイルス濃度を測定し、濃縮分離前後の試料中のウイルス濃度を推定した。
【００６８】
まず、ＤＥＡＥセルロース（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを純水で膨潤させ、１Ｎ塩酸で酸洗浄し、その後１Ｎ苛性ソーダでアルカリ洗浄し、ｐＨが中性になるまで純水で洗浄した。洗浄を経た当該セルロースを、容積５０ｍＬのガラス製カラムに充填し、ウイルス濃縮分離用カラムを作成した。
【００６９】
実下水処理場より採取した下水処理水５Ｌを前記カラムの底部より通水量５Ｌ／時の上向流で通水し、前記カラムの上部より流出するカラム通過液を分画回収した。また、カラム通水前後の試料のＥ２６０を計測したところ、カラム通水前（すなわち下水処理水）では０．０８、カラム通水後（すなわちカラム通過液）では０．０５であった。
【００７０】
さらに、下水処理水５Ｌを全量通水させたのちのカラムに、アルカリ溶液（５０ｍＭグリシン、５ｇ／Ｌ肉エキス、ｐＨ９．５）１０ｍＬを注入し、ＤＥＡＥセルロース充填材に吸着した成分を溶離させた溶出液を回収した。
【００７１】
回収した溶出液のうちの１ｍＬについて、Ｑｉａｇｅｎ社ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてＲＮＡを回収し、１００μＬのＲＮＡ溶液を得た。
【００７２】
ＲＮＡ溶液１０μＬを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、当該ＲＮＡ溶液１０μＬを用いてＲＴ−ＰＣＲ法の反応試料（ＴａＫａＲａ社製Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ）を調製した。なお、増幅ＤＮＡの検出用色素としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用い、ＤＮＡ増幅用のプライマーは上記表１に示したＮＩプライマーおよびＥ３プライマーを用いた。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応は上記表２に示した条件で実施した。その結果、当該ＲＮＡ溶液におけるＰＣＲ反応サイクル数は２４．３６サイクルと計測され、実施例２に示した検量線回帰式より、当該ＲＮＡ溶液１０μＬ中のウイルス数は１．３×１０4個と算定された。当該ＲＮＡ溶液１０μＬは、前記カラム溶出液量として０．１ｍＬに相当することから、カラム溶出液１０ｍＬ中には１．３×１０6個のウイルスを含んでいるものと推算された。
【００７３】
ところで、前記したとおり、カラム通水前の供試水（濃縮分離処理前の検水）とカラム通過液（濃縮分離処理後の検水）のＥ２６０は、それぞれ、０．０８と０．０５であったことから、本実施例においては｛１−０．０５／０．０８｝×１００＝３７．５％のウイルスがＤＥＡＥセルロース充填材に吸着分離されたと推算される。ＤＥＡＥセルロースから溶出回収されたウイルス数は１．３×１０6個であったことから、供試した下水処理水中には１．３×１０6個÷０．３７５＝３．５×１０6個のウイルスが存在していたことが推算され、そのウイルス濃度は３．５×１０6個÷５０００ｍＬ＝６９３個／ｍＬと推算された。また、カラム通過液には６９３個／ｍＬ×（１−０．３７５）＝４３３個／ｍＬの濃度でウイルスがカラム吸着されずに通過したことが推算された。
【００７４】
以上のように、濃縮分離前および濃縮分離後の検水の紫外波長域の吸光度と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材に吸着されたウイルスの個数と、前記陰イオン交換能を有するろ過膜または充填材を通過した通過液の液量に基づいて、濃縮分離処理前後の検水のウイルス濃度を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】蛋白水溶液の吸光度分布を例示する図である。
【図２】核酸水溶液の吸光度分布を例示する図である。
【図３】Ｅ２６０とＣＯＤ濃度の相関関係を例示する図である。
【図４】本発明の実施例１におけるＥ２６０と大腸菌ファージ濃度の測定結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例１におけるＥ２６０濃縮分離率と大腸菌ファージ濃縮分離率の相関関係を示す図である。
【図６】本発明におけるリアルタイムＰＣＲを用いたウイルス濃度とＰＣＲ反応サイクル数の関係を示す検量線の図である。
【図７】本発明の実施例２におけるＥ２６０濃縮分離率とウイルス濃縮分離率の関係を示す図である。
【図８】本発明の実施例２におけるＥ２６０とウイルス濃度の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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