(57)【要約】【課題】  環境付加の少ない環境中のリン酸モニタリング技術を提供する。【解決手段】  現在排水中のリン含量測定にはモリブデンなど有害物質を使用し、環境規制物質のモニタリングのために、重金属等の新たな環境汚染物質が発生するという矛盾を含んでいる。本発明では、酵母細胞など微生物のもつ鋭敏なリン酸応答機構に着目し、微生物細胞自体（例えば、ＰＨＯ８４プロモーター及びＥＧＦＰ遺伝子含有プラスミドで形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をリン酸センサーとして利用することによるリン酸モニタリング技術を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸により厳密に発現が制御されている遺伝子のプロモーターの下流に蛍光発色又は化学発色を行うレポーター遺伝子を連結してなる連結遺伝子を含有すること、を特徴とする組換えプラスミド。
【請求項２】
該遺伝子のプロモーターが配列番号１の塩基配列で示されるＰＨＯ８４遺伝子プロモーターであること、を特徴とする請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項３】
レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
ＧＦＰ遺伝子が配列番号２の塩基配列で示されるものであること、を特徴とする請求項３に記載の組換えプラスミド。
【請求項５】
ＰＨＯ８４プロモーターの下流に蛍光を発する蛋白質ＧＦＰをコードするＧＦＰ遺伝子を連結した連結遺伝子を含有すること、を特徴とする組換えプラスミド。
【請求項６】
組換えプラスミドｐＰＰＧ２。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えプラスミドを酵母に導入してなる形質転換体。
【請求項８】
酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母であること、を特徴とする請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
形質転換体Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＰＰＧ２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９３）。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換体を使用すること、を特徴とするリン酸の測定方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の形質転換体を含有してなること、を特徴とするリン酸測定用試薬。
【請求項１２】
ＰＨＯ８４プロモーター及びＧＦＰ遺伝子含有組換えプラスミドを酵母に導入してなる形質転換体自体をリン酸センサーとして使用し、それ自体の蛍光発色を検出すること、を特徴とする排水等環境中のリン酸濃度をモニタリングする方法。
【請求項１３】
ＰＨＯ８４プロモーター及びＧＦＰ遺伝子含有組換えプラスミドを酵母に導入してなる形質転換体自体をリン酸センサーとして使用し、それ自体の蛍光発色を検出することにより排水中のリン酸濃度をモニタリングしながら排水処理すること、を特徴とする排水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物細胞の環境応答反応を利用し、環境中のリン酸濃度をモニタリングする酵母の取得と利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の産業活動の発展、消費量の拡大にともない、大気中のＣＯ2濃度増加や河川、海洋の富栄養化等、様々な汚染物質による環境付加が深刻になってきており、より環境付加の少ない循環型社会の構築が求められるようになってきている。このような中、排水中の環境汚染物質についても一層の規制強化がもとめられ、第５次水質総量規制その他排水規制の強化により、水質汚濁の要監視項目が増加するに至っている。しかしながら、排水中のリン酸含量の測定ではモリブデンを、ＣＯＤの測定ではマンガンを使用するなど、環境規制物質のモニタリングをするために、重金属等の新たな環境汚染物質が発生するという矛盾を含んでいる。また一方、リン酸測定に使用されるモリブデンは希少の資源の一つである。
【０００３】
今後、より一層の規制、モニタリング頻度の増加が行われれば、環境汚染物賀も一層増加する事から、環境付加のより少ない、また貴重な資源を浪費しない環境モニタリング技術が求められる。
【０００４】
本発明は、酵母等の微生物による環境モニタリング及び特に排水中のリン酸の検出にはじめて成功したものであるが、従来、酵母においては鉄や亜鉛など一部の重金属の取り込みが知られているものの（例えば、特許文献１参照）、これらの技術はミネラル強化パン酵母などの栄養ないし食品上の技術であり、これら重金属のモニタリング方法でもなければ排水等環境中のリン酸の検出に関するものでもない。
【特許文献１】特許第３２７２５７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、排水中の全リン含量の測定ではモリブデン、ＣＯＤの測定ではマンガンを使用する等環境制御物質のモニタリングには重金属が使用されている。しかしながら、重金属も環境汚染物質であるところから、環境保全を目的とした水質分析に環境に有害な化学物質（試薬類）を多量に使用することとなり、一種のジレンマに陥っているのが現状であり、この点を解決する方策の早急な確立が当業界で強く希求されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記当業界における要望に応える目的で成されたものであって、排水中のリン酸濃度を重金属等を使用することなく安全に、しかも迅速、正確にモニタリングするシステムを新たに構築することとし、各方面から検討の結果、微生物に着目した。
【０００７】
生物細胞は有機物質やリン、窒素、あるいは亜鉛、鉄など一部の重金属などには環境中の栄養源として、また、その他の重金属、毒性化学物質等には有害物質として、その種類と濃度を関知する敏感なセンサー（シグナル伝達系）を備えている。
【０００８】
特に、酵母はこのような鋭敏なセンサー機能を持つのはもちろんのこと、単細胞生物でありながら、我々ヒトと同じ真核生物に属すことから、モデル細胞として盛んに研究が行われ、分子生物学的技術が集積している生物である。我々は、酵母のもつセンサーとしての機能、および知見や実験技術の豊富さに着目し、酵母細胞自体をセンサーとして利用する、より環境付加の少ないリン酸のモニタリング技術の開発を行った。
【０００９】
先ずはじめに、本発明者らは、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）が有する数多くの機能の内、ＰＨＯ調節経路（ＰＨＯ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ）に着目し、リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：以下、Ｐｉということもある）が不足するとこの経路が活性化して、下流ＰＨＯ遺伝子の発現を促し、一方、過剰にＰｉが存在するとこれらの遺伝子の発現を抑制するという現象に改めて着目した。
【００１０】
そして更に検討の結果、ＰＨＯ調節経路制御下の遺伝子プロモーターを利用し、その制御下に蛍光発色や化学発色を行うレポーター遺伝子を連結することにより、リン酸低濃度下で発色するモニタリング酵母の作成を設計した。
【００１１】
そこで本発明者らは、上記設計にしたがい、ＤＮＡマイクロアレイやノーザンハイブリダイゼーションを行った結果から、ＰＨＯ８４プロモーターを利用し、その下流に緑色蛍光を発するＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）蛋白質をコードする遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子）を連結し、これを酵母に導入して、低リン酸環境下で蛍光を発するバイオモニタリング酵母を創製するのにはじめて成功した。
【００１２】
そして更に検討した結果、本新規酵母は、リン酸濃度０〜５０ｐｐｍの範囲で、好適には０〜４０ｐｐｍの範囲で、蛍光顕微鏡あるいは蛍光活性セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）および蛍光マイクロプレートリーダーにより、精度良くリン酸濃度を測定できることを確認し、併せて、排水基準（最大値）であるリン酸濃度５０ｐｐｍ、及びそれ以下では蛍光を発するのに対してそれよりも高濃度の場合は蛍光を発しないことも確認した。
【００１３】
このことは、排水中の全リン（Ｐ）の規制値は一日平均８ｐｐｍ（リン酸（Ｐｉ）として２５ｐｐｍ）、最大値１６ｐｐｍ（リン酸として５０ｐｐｍ）であることを考慮すると、本新規酵母は規制値付近で精度良く蛍光の変化が現れることとなり、モニタリング酵母として特に廃水処理において好適であることを示すことにほかならない。
本発明は、これらの有用新知見に基づき更に研究の結果、遂に完成されたものである。
【００１４】
すなわち、本発明は、リン酸により厳密に発現が制御されている遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結してなる連結遺伝子を含有する組換えプラスミド；該組換えプラスミドを酵母に導入してなる形質転換体（バイオモニタリング酵母）；該形質転換体を使用するリン酸の測定及び／又はモニタリング方法；該方法を利用する排水の処理方法等を包含するものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１５】
プロモーターとしては各種プロモーターが使用可能であるが、ＤＮＡマイクロアレイやノーザンハイブリダイゼーションの結果から、例えばＰＨＯ８４遺伝子のプロモーターが有利に使用できることを見出した。また、レポーター遺伝子としては、蛍光発色や化学発色を生じるものが好ましく、例えば蛍光発色蛋白質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子）のほか、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、グルクロニダーゼ遺伝子等が使用できることも見出した。本発明においては、これらの遺伝子を適宜連結した連結遺伝子を含有する組換えプラスミドを使用するものであるが、ＰＨＯ８４プロモーターの下流に蛍光を発するＧＦＰ遺伝子を連結したプラスミドを代表例にとって、以下に説明する。
【００１６】
先ず、ＰＨＯ８４プロモーター制御下に緑色の蛍光を放つ蛋白質ＧＦＰとしてはＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手）を使用した。 ＥＧＦＰ遺伝子はｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より入手）からＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ消化により調製し、ベクターの同制限酵素サイトクローニングする。ＥＧＦＰの塩基配列を配列表の配列番号２に示す（図２）。ＥＧＦＰはＰＨＯ８４プロモーターの下流に連結する。一方、ＰＨＯ８４プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１０８−１ＡのゲノムＤＮＡをテンプレートに、プライマーＰＨ８４ＰＵＢａ及びＰＨ８４ＰＵＢｇ１（その塩基配列を配列番号３及び４（図３、図４）に示す。但し、ｎはＴｇを表わす。）を用いてＰＣＲにより調製する。
【００１７】
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化後、上記ＥＧＦＰ含有ベクターの同サイトに挿入して、ＰＨＯ８４プロモーターの制御下にｐＥＧＦＰ遺伝子を保持した多コピー型プラスミド（ｐＰＰＧ２）を作成する。上記したようにＰＣＲにより増幅を行ったＰＨＯ８４プロモーター断片についてはシーケンスを行い、配列の確認を行った。ＰＨＯ８４プロモーターの塩基配列を配列番号１に示す（図１）。
【００１８】
このようにして作成した組換えプラスミドの内、マルチコピー型プラスミド（ｐＰＰＧ２：その制限酵素地図を図５に示す。）をワンステップ法にて宿主Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入し、得られた形質転換体の内のひとつをサッカロマイセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｐＰＰＧ２と命名し、これを（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９３として寄託した。
【００１９】
本発明に係る形質転換酵母は、リン酸が環境中に少ないときに蛍光を発し、しかもその蛍光強度と培地中のリン酸濃度は非常に良好な相関を示すことから、本酵母を利用してリン濃度を測定することが可能であり、特に、高リン酸培地で前培養した無蛍光細胞を使用することで、より良くリン酸の濃度をモニタリングすることが可能である。
【００２０】
この場合、本酵母は、高リン酸培地で前培養しておくと良好な結果が得られる。リン酸２０ｐｐｍ含有培地で前培養した場合は良好な結果が得られないので、これ以上の高濃度リン酸含有培地（例えば５０〜８００ｐｐｍ、通常、４００〜６００ｐｐｍ）で、１０時間〜３６時間、通常２０〜３０時間、前培養しておくのが好ましい。
【００２１】
このようにして高濃度リン酸培地で前培養した組換え酵母は、環境中のリン酸濃度が０ｐｐｍの場合は約７０％程度の細胞が蛍光を発しており、その割合はリン酸濃度の上昇とともに減少し、４０ｐｐｍのリン酸濃度で大半がそして６０ｐｐｍでほとんどの細胞が蛍光を失ってしまう。このことは、排水中の全リンの規制値の最大値１６ｐｐｍ（リン酸として５０ｐｐｍ）をこえると蛍光が発生しないこと、換言すれば蛍光を発している排水サンプルは全リンが規制値以下であることを示すことにほかならない。したがって、これらの点からしても、本発明に係る形質転換酵母はリン酸モニタリング酵母として特に好適であることがわかる。
【００２２】
したがって、本発明に係る形質転換酵母（バイオモニタリング酵母）を使用すれば、リン酸の定性及び／又は定量分析、リン酸のモニタリング、リン酸をモニタリングしながらの効率的排水処理等が可能となる。また、本酵母を用いたリン酸測定試薬、あるいは本酵母を用いてリン酸測定用キットを組むことも可能であって、その場合凍結乾燥した本酵母を使用してもよい。
【００２３】
本発明に係るリン酸モニタリング酵母での排水のモニタリングは、例えば次のようにして行えばよい。
本システムにしたがって全リンを測定する場合には、前処理として加水分解を行って（例えば、ペルオキソ２硫酸カリウム分解法）、廃液中のリンをリン酸としておく。次に、排水サンプルに必要な栄養素と高リン酸下で前培養しておいた酵母細胞を加え、３０℃で適宜培養を行う。リン酸の濃度が規制値以下であれば、蛍光顕微鏡で３０分以内、ＦＡＣＳで４〜８時間以内に蛍光が現れる。しかし、規制値以上、あるいは添加した培地およびモニタリング酵母の不全、毒性化学物質の混入等があれば、蛍光が発生しない。このように、生細胞であるモニタリング酵母を用いることで、リン酸の濃度と同時に、測定系の信頼性を確認できるとともに、未知の毒性化学物質を検出することもでき、本システムは安全性がより高いモニタリング系であるということができる。しかも、ＥＧＦＰ遺伝子を使用する場合には、リン酸が存在すれば他の蛍光基質が存在していなくても酵母自体が蛍光発色するという著効も奏される。
【発明の効果】
【００２４】
ＰＨＯ調節経路支配下のＰＨＯ遺伝子群の中で、厳密に制御され、転写量も多い遺伝子のプロモーターを使用し（例えば、ＰＨＯ遺伝子のプロモーター）、さらに検出が容易な蛋白質をレポーター（例えば光学的に検出が容易なＧＦＰ蛋白質）とすることで、リン酸の濃度に鋭敏に反応するモニタリング酵母の創製開発に成功した。
【００２５】
本酵母を用いることにより、リン酸濃度が測定できるだけでなく、リン酸や毒性化学物質含有排水をモニタリングしながら効率的に処理することも可能である。
【００２６】
また、本酵母を用いる測定試薬や測定キットの創製も可能であって、例えば、酵母は凍結乾燥等の手法により、長く、安定に保存することが可能である。モニタリングに必要な培地成分と共に、凍結乾燥を行い、供給することで、酵母細胞の調製や培地の添加等を省略し、しかも簡単に安定して使用できるモニタリング酵母システムの供給を行うことが可能である。
【００２７】
また、本発明に係るモニタリング酵母は、設計したところにしたがい遺伝子操作によって作成できるほか、突然変異処理や自然界におけるスクリーニングによっても収得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
（１）使用菌株及び培地
使用酵母菌株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１０８−１Ａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ−７（協会７号酵母）をＤＮＡマイクロアレイ及びノーザンハイブリダイゼーションに使用し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ  ４９９（ＭＡＴａ、ｕｒａ３、ｌｙｓ２、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｈｉｓ３、ａｎｄ  ｌｅｕ２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＴ−１（ＭＡＴａｌａ、ｕｒａ３、ｔｒｐ１）をＧＦＰ発現等の遺伝子操作に使用した。また、基本的な遺伝子操作の宿主としてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を使用した。
【００３０】
培地としては、酵母の一般的な培養にはＹＰＤ培地（イーストエキストラクト  １％、ペプトン  ２％、１％  グルコース）を使用し、酵母の形質転換体の取得、培養にはＹＮＢ培地（０．６７％  イーストナイトロジェン  ベース（アミノ酸なし）、１％  グルコース）に必要なアミノ酸等を添加して使用した。また、各種濃度のリン酸含有ＹＮＢ培地は、０．５７％  ＹＮＢ、ｗ／ｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１％  ｇｌｕｃｏｓｅに必要なアミノ酸および適当量のＫ2ＨＰＯ4を添加し調整した。なお、常にＫの量が一定となるように、ＫＣｌを用いて調整を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９の培養にはアンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地を使用した。
【００３１】
（２）ＧＦＰ発現プラスミドの作成
ＤＮＡマイクロアレイ及びノーザン解析の結果から、ＰＨＯ８４プロモーターを選択し、その下流に緑色蛍光を発するＧＦＰをコードする遺伝子（ＥＧＦＰ）を連結し、この連結遺伝子を含有する組換えプラスミドを作成することとした。
【００３２】
使用したＥＧＦＰはｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ消化により調整し、ｐＲＳ４２４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の同制限酵素サイトにクローニングした（ｐＲＳ４２４＋ＧＦＰ）。ＰＨＯ８４プロモーターについては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｘ２１８０−１ＡゲノムＤＮＡよりプライマーＰＨ８４ＰＵＢａ（配列番号３：図３）及びプライマーＰＨ８４ＰＵＢｇ１（配列番号４：図４）を用い（これらの配列中、ｎはＴｇを示す）、ＰＣＲにより増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩにより消化後、ｐＲＳ４２４＋ＧＦＰの同サイトに挿入した（多コピー型プラスミドｐＰＰＧ２）。ＰＣＲにより増幅を行ったＰＨＯ８４プロモーター断片についてはシーケンスを行い配列の確認を行った。
【００３３】
ＰＨＯ８４プロモーターの塩基配列を配列番号１（図１）に示し、ＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列を配列番号２（図２）に示し、マルチコピー型プラスミドｐＰＰＧ２（プラスミドサイズ：７７３０ｂｐ）の制限酵素地図を図５に示した。
【００３４】
（３）酵母の形質転換
形質転換は、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｈｕｍａｎａ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．  ５３，  １３９−１４５（１９９６））により行い、宿主としては、各ベクターのマーカー遺伝子（ＴＲＰＩ）を使用するため、Ｘ２１８０−１Ａ株由来の栄養要求性変異株であるＹＰＨ４９９株、Ｋ−７株由来の栄養要求性変異株であるＵＴ−１株を使用した。プラスミドｐＰＰＧ２を保持した形質転換体を、低リン酸培地および高リン酸培地で２０時間培養し、各酵母の蛍光について、蛍光顕微鏡にて観察を行った。
【００３５】
なお、ＰＨＯ８４プロモーター制御下でのＥＧＦＰ遺伝子の発現解析は次のようにして行った。先ず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ４９９およびＵＴ−１の各形質転換株を２０ｐｐｍのリン酸を含むＹＮＢ培地（低リン酸培地）あるいは５００ｐｐｍのリン酸を含む高リン酸培地で３０℃、２４時間培養を行い、集菌後、滅菌水で２回洗浄し、各種濃度のリン酸を含むＹＮＢ培地に植菌した。３０℃で振とう培養を行い、各時間ごとに集菌し、洗浄後ＧＦＰの蛍光について、蛍光顕微鏡あるいはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（ＦＡＣＳ）にて解析を行った。
【００３６】
その結果、多コピー型プラスミドｐＰＰＧ２（図５）を保持した菌株は、ＹＰＨ４９９、ＵＴ−１両菌株とも低リン酸培地中で非常に強い蛍光が見られた。これに対し、高リン酸培地中では、ほとんど蛍光は観察されなかった。
【００３７】
各リン酸濃度下でのＥＧＦＰの蛍光についてより細かく検討するために次の実験を行った。まず、高リン酸あるいは低リン酸培地で前培養した酵母を０−１００ｐｐｍまでのリン酸を含むＹＮＢ培地に移し、２０時間培養後、蛍光を発する酵母の比率について蛍光顕微鏡にて検討を行った。
【００３８】
ＹＰＨ４９９を宿主とした形質転換体では、リン酸濃度が０ｐｐｍで約７０％程度の細胞が蛍光を発しており、その割合は、リン酸濃度の上昇とともに減少し、６０ｐｐｍのリン酸濃度でほとんどの細胞が蛍光を失っていた。これに対して、ＵＴ−１を宿主とした株では、０ｐｐｍで約３０％の細胞が蛍光を有しており、リン酸濃度の上昇とともに漸減したが、１００ｐｐｍでも約２０％の細胞が蛍光を発していた（図６）。ＹＰＨ４９９およびＵＴ−１どちらの場合にも、前培養の影響はほとんど見られなかった。
【００３９】
排水中の全リンの規制値は一日平均８ｐｐｍ（リン酸として２５ｐｐｍ）、最大値が１６ｐｐｍ（リン酸として５０ｐｐｍ）である。このことを考慮すると、ＹＰＨ４９９を宿主としたｐＰＰＧ２組換体は、規制値付近で精度良く、蛍光の変化が現れる事から、リン酸モニタリング酵母として適当であることが明らかとなった。よって、以降の実験には、本組換え体をモニタリング酵母として使用した。本組換え体をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＰＰＧ２と命名して、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９３として寄託した。
【００４０】
（４）リン酸濃度検出における培養時間
排水中のリン酸濃度の検出を行う上では、反応開始から検出が終了するまでの時間を正確に知る必要がある。また、モニタリング酵母をどのような条件で前培養するかも重要である。
そこで、高リン酸または低リン酸培地中で前培養した細胞を使用し、各種リン酸濃度のＹＮＢ培地を用い蛍光の変化について検討を行った。
【００４１】
その結果、低リン酸培地で前培養した酵母細胞では、０〜２０ｐｐｍのリン酸濃度ではほとんど蛍光の減少は見られなかった。また、４０〜１００ｐｐｍのリン酸濃度では、いずれの濃度においてもほぼ同様に蛍光が減少し、大きな違いは認められなかった（図７Ａ）。
【００４２】
一方、高リン酸培地で前培養した酵母細胞では、０ｐｐｍでは、培養開始後３０分で蛍光が見られ、その後２時間で０ｐｐｍで約６０％、１０ｐｐｍで約２０％、２０ｐｐｍで約５％の細胞に蛍光が見られ、それ以上の濃度では、蛍光が観察されなかった。また、培養２４時間後では、低リン酸培地で前培養をした細胞とほぼ同じ結果となった（図７Ｂ）。
【００４３】
このことから、モニタリング酵母によるリン酸濃度の検出には、培養時間の他に、前培養の条件が大きく影響を与えることが明らかとなった。高リン酸環境下で前培養されたモニタリング酵母を用いることで、０〜４０ｐｐｍの範囲で、２時間程度の培養により各リン酸の濃度を精度良く測定できることが示された。また、検出時間としては、２時間程度で十分であることがわかった。
【００４４】
（５）リン酸濃度測定への培地組成及び毒性化学物質の影響
酵母を利用したバイオモニタリングシステムは、生細胞を利用するという特徴を有する。このため、酵母の生理的活性自身が測定結果に影響を及ぼすことが考えられる。培地の組成や、培養温度、酵母の増殖フェーズ等が影響を及ぼすと考えられる。この中でも、特に培地組成が重要であると考え、検討を行った。
【００４５】
まずはじめに、Ｃ源の影響について検討を行った。モニタリング酵母を、高リン酸あるいは低リン酸培地で２４時間前培殖行い、洗浄後、２０ｐｐｍあるいは５００ｐｐｍのリン酸を含むＣ源を欠如したＹＮＢ培地（ＹＮＢ−Ｃ培地）に植菌した。対象としては、通常のモデル排水を使用した。
【００４６】
その結果、低リン酸培地により前培養を行ったモニタリング酵母では、２０ｐｐｍ、５0０ｐｐｍいずれの濃度においても、対照と比較して、蛍光を有する酵母の割合が多かった。特に、５００ｐｐｍのリン酸培地では,対照では培養開始直後から減少しはじめ、培養２４時間後においては全く蛍光が観察されないのに対して、ＹＮＢ−Ｃ培地では、２時間のラグタイムを経て減少しはじめ、培養２４時間後においても約１０％の細胞に蛍光が観察された（図８Ａ）。
【００４７】
また、高リン酸培地で前培養したモニタリング酵母では、対照では、これまで同様培養２４時間後で約６０％の細胞に蛍光が観察されたのに対し、ＹＮＢ−Ｃ培地では、２０ｐｐｍにおいても全く蛍光が観察されなかった（図８Ｂ）。
【００４８】
つづいて同様に、Ｎ源の影響について検討を行った。Ｎ源を欠如したＹＮＢ培地（ＹＮＢ−Ｎ培地）を同様に調製し、先の実験と同様の操作を行った。その結果、ＹＮＨ−Ｃ培地とほぼ同様の結果が見られた。低リン酸培地により前培養したモニクリング酵母では、その影響はより深刻で、ＹＮＢ−Ｎ培地において、約４時間のラグタイムをおいて減少しはじめ、培養２４時間後で約３０％の細胞が蛍光を有していた（図９Ａ）。高リン酸培地で前培養したモニタリング酵母では、２０ｐｐｍのリン酸濃度においても全く蛍光が認められなかった（図９Ｂ）。
【００４９】
以上のことから、培地中のＣ源およびＮ源は、モニタリング酵母によるリン酸の検出、測定に大きな影響を与えることが明らかとなった。
【００５０】
さらに、排水中には様々な毒性化学物質が混入する可能性が考えられる。そこで、培地中への毒性化学物質の混入について検討を行った。毒性化学物質としては、５０ｐｐｍのシクロヘキシミドをモデル化合物として使用した。高リン酸あるいは低リン酸で前培養を行ったモニタリング酵母を、シクロヘキシミドを添加した２０ｐｐｍまたは５００ｐｐｍのリン酸を含んだＹＮＢ培地（ＹＮＢ＋Ｃｙｃ培地）で培養し、蛍光の経時変化について観察を行った。
【００５１】
その結果、低リン酸培地で前培養したモニタリング酵母では、ＹＮＢ＋Ｃｙｃ培地ではラグタイムなく蛍光を発する酵母の割合が減少しはじめたものの、その速度は遅く、培養２４時間後でも約３０％の細胞が蛍光を有していた（図１０Ａ）。また、高リン酸培地で培養した酵母では、シクロヘキシミドの混入によって２０ｐｐｍのリン酸濃度でも、培養期間中全く蛍光が観察されなかった（図１０Ｂ）。以上のことから、毒性化学物質の混入もモニタリング酵母によるリン酸の検出、測定に大きな影響を与えることが明らかとなった。
【００５２】
（６）ＦＡＣＳを用いたモニタリング酵母によるリン酸濃度の測定
ここまでの蛍光顕微鏡を用いた検討の結果、高リン酸培地で前培養を行ったモニタリンク酵母を用いることで、精度良く培地中のリン酸濃度を検出できることが明らかとなった。しかしながら、蛍光顕微鏡による観察では、試験者の主観による判断を伴うことから、より客観的な試験方法を検討する必要がある。そこで、細胞一つ一つの蛍光を定量的に測定できるＦＡＣＳを用いて検討を行った。すべての試験区分で１万個の細胞の蛍光強度（チャンネル数）を測定し、細胞一つあたりの蛍光強度で示した。
【００５３】
その結果、リン酸濃度が０ｐｐｍでは、４時間後、１０および２０ｐｐｍでは８時間後から蛍光が検出され、徐々に増加していった。蛍光の増加速度についても、各濃度間で違いが観察された。また、３０ｐｐｍのリン酸濃度においては２０時間後に蛍光が検出され、４０，５０ｐｐｍにおいては全く検出されなかった（図１１）。培養２０時間後の細胞を用いてリン酸濃度と蛍光強度との相関について検討を行ったところ、０．９３と高い相関係数を示した（図１２）。このことから、本システムを用いることで、培地中のリン酸濃度について十分に精度の高い測定を行える事が明らかとなった。また、ＦＡＣＳのかわりに蛍光マイクロプレートリーダーを用いた場合でも同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＰＨＯ８４プロモーターの塩基配列を示す。
【図２】蛍光蛋白質ＧＦＰをコードするＥＧＦＰ遺伝子の塩基配列を示す。
【図３】プライマーＰＨ８４ＰＵＢａを示す。
【図４】プライマーＰＨ８４ＰＵＢｇ１を示す。
【図５】ＥＧＦＰ発現プラスミドｐＰＰＧ２の構築及びその制限酵素地図を示す。
【図６】ＥＧＦＰ発現におけるリン酸濃度の影響を示す。なお、各組換え酵母を低リン酸（Ｌｏｗ  Ｐｉ）および高リン酸（Ｈｉｇｈ  Ｐｉ）培地で培養後、各濃度のリン酸を含んだＹＮＢ培地に植菌後、３０℃で２４時間培養を行い、酵母細胞の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。
【図７】ＥＧＦＰ発現における培養時間の影響を示す。なお、Ａ：低リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母、Ｂ：高リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母、リン酸の濃度はそれぞれ０（◇）、１０（■）、２０（◆）、４０（□）、６０（▲）、８０（○）、１００（△）ｐｐｍを示す。
【図８】リン酸のモニタリングに及ぼす培地組成の影響（Ｃ源）を示す。なお、Ａ：低リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母、Ｂ：高リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母シンボルは○：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ−Ｃ培地、●：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地、□：５００ｐｐｍリン酸ＹＮＢ−Ｃ培地、■：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地を示す。
【図９】リン酸のモニタリングに及ぼす培地組成の影響（Ｎ源）を示す。なお、Ａ：低リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母、Ｂ：高リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母シンボルは○：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ−Ｎ培地、●：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地、■：５０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ−Ｎ培地、■：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地を示す。
【図１０】リン酸のモニタリングに及ぼす培地組成の影響（シクロヘキシミド）を示す。なお、Ａ：低リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母、Ｂ：高リン酸培地で前培養を行ったモニタリング酵母シンボルは◆：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ＋ＣＹＣ培地、◇：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地、▲：５００ｐｐｍリン酸ＹＮＢ＋ＣＹＣ培地、△：２０ｐｐｍリン酸ＹＮＢ培地を示す。
【図１１】ＦＡＣＳ解析によるモニタリング酵母蛍光解析を示す。なお、シンボルは０（◆）：１０（■）、２０（▲）、３０（△）、４０（○）  ａｎｄ  ５０（●）ｐｐｍのリン酸濃度を示す。
【図１２】モニタリング酵母によるリン酸の定量解析を示す。なお、各濃度のリン酸培地で２０時間培養し、その時の蛍光強度について解析した。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
<110>      National Research Institute of Brewing
<120>      Monitoring Method of Phosphate Concentration
<130>      6778
<141>      2004-3-17
<160>      4
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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