(57)【要約】【課題】  蛍光特性と強い核酸凝縮化機能を併せ持ち、細胞や生物体に対して無害であり、かつ核酸の凝縮化状態を解除した際に、遺伝子操作又は遺伝子機能発現に対する阻害因子となる蛍光特性部が核酸から脱離する核酸処理剤と、その利用方法を提供する【解決手段】  蛍光特性部であるプテリジン構造体の２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置に核酸凝縮化機能部であるポリアミンを導入した化学構造を有し、核酸の凝縮可視化剤として用いられる核酸処理剤。この核酸処理剤を用いる核酸の凝縮可視化と、その凝縮状態の解除方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光特性部であるプテリジン構造体の２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置に、核酸凝縮化機能部であるポリアミンを導入した化学構造を有し、核酸の凝縮可視化剤として用いられることを特徴とする核酸処理剤。
【請求項２】
前記核酸処理剤が次の（１）及び／又は（２）の特性を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸処理剤。
（１）ポリアミン部分による核酸凝縮化機能が、当該ポリアミンを単独の化学構造体として用いた場合に比較して、強化されている。
（２）核酸処理剤により凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に、この核酸処理剤が核酸から脱離する。
【請求項３】
前記プテリジン構造体に対するポリアミンの導入位置が、２位又は６位のいずれか一つの置換位置であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸処理剤。
【請求項４】
前記ポリアミンが、１，３−ジアミノプロパン、スペルミジン又はスペルミンであることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の核酸処理剤。
【請求項５】
前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の核酸処理剤。
【請求項６】
蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸処理剤を核酸に作用させることにより、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行うことを特徴とする核酸の処理方法。
【請求項７】
蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸凝縮可視化剤であって、凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に核酸から脱離すると言う特性を示す核酸処理剤を核酸に作用させることにより、次の（３）、（４）を行うことを特徴とする核酸の処理方法。
（３）核酸を凝縮可視化する際には、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行い、
（４） in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現のために核酸の凝縮状態を解除させる際には、前記遺伝子操作又は遺伝子機能発現に対する阻害因子であり得る蛍光特性部を核酸から脱離させる。
【請求項８】
前記遺伝子操作又は遺伝子機能発現が、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅、細胞内での遺伝子融合又は遺伝子組替え、あるいは、 in vitro 又は in vivoでの遺伝子の転写又は複製であることを特徴とする請求項７に記載の核酸の処理方法。
【請求項９】
前記核酸処理剤が細胞及び生物体に対して無毒性なものであることを特徴とする請求項６〜請求項８のいずれかに記載の核酸の処理方法。
【請求項１０】
前記核酸処理剤として請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸処理剤を用いることを特徴とする請求項６〜請求項９のいずれかに記載の核酸の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸処理剤及び核酸の処理方法に関する。更に詳しくは、本発明は、蛍光特性部であるプテリジン構造体と核酸凝縮化機能部であるポリアミンとを備え、核酸の凝縮可視化剤として用いられる核酸処理剤と、核酸処理剤を用いて核酸の凝縮可視化を行い、更には in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現のために、凝縮可視化した核酸の凝縮状態の解除を、二重らせん構造の解裂が可能な状態で行う核酸の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、特にＤＮＡの凝縮（折り畳み）現象を制御することは、例えば、遺伝子治療においてリポソームからなる人工ベクターに遺伝子を封入し、これを標的細胞内に送り込むためには必須のテクニックである。その際、核酸を蛍光色素等で染色し可視化することは、顕微鏡下での取り扱いを容易にする。
【０００３】
従来、核酸凝縮化剤としてはポリアミン等の多価カチオンが公知であり、一方、核酸を可視化するための蛍光色素としてＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロライド）等が公知である。
【０００４】
【非特許文献１】"Discrete Coil-Grobule Transition of Single Duplex DNAs Induced by Polyamines", M. Takahashi, K. Yoshikawa, V. V. Vasilevskaya, and A. R. Khokhlov, J. Phys. Chem. B, 101, 9396-9401, (1997)
【非特許文献２】"Direct Visualization of Individual DNA Moleculesby Fluorescence Microscopy; Characterization of the Factors AffectingSignal/Background and Optimization of Imazing Conditions Using YOYO",Sergio Gurrieri, K. Sam Wells, Iain D. Johnson, and Carlos Bustamante, Analytical biochemistry, 249, 44-53, (1997)  上記の非特許文献１には、ＤＮＡを凝縮化させる凝縮化剤として、ポリアミンを用いることが開示されている。上記の非特許文献２には、ＤＮＡを可視化させる蛍光色素として、ＹＯＹＯを用いることが開示されている。「ＹＯＹＯ」とは、「１，１’−（４，４，７，７−テトラメチル−４，７−ジアザウンデカメチレン）−ビス−４−〔３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−オキサゾル）−２−メチリデン〕−キノリニウムテトライオダイド」を言い、当業者に周知の化合物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、従来は、核酸を凝縮化させ可視化して取り扱うことを考えた場合、核酸凝縮化剤による核酸の凝縮化操作と蛍光色素等による染色操作とをそれぞれ行う必要があるため、面倒であった。
【０００６】
又、技術的な目的からすると、凝縮化された核酸だけを蛍光色素等により可視化したい訳であるが、それぞれ別の試薬によって別のプロセスとして行う凝縮化と染色とを良好に同調させ得るか否かと言う不安があった。核酸の凝縮化と染色が良好に同調しない場合、例えば凝縮化された核酸と十分に凝縮化されていない核酸とを蛍光強度によって明瞭に識別できないと言う不具合や、凝縮化された核酸による蛍光をバックグラウンドからの蛍光と明瞭に識別できないと言う不具合があった。
【０００７】
次に、従来の核酸凝縮化剤には、例えば発ガン性を示す等と言う、細胞又は生物体に対して有害なものもあった。一方、細胞や生物体に対して無毒性であると考えられる一定のポリアミン等の核酸凝縮化剤は、その核酸凝縮化機能が必ずしも十分に強くなかった。
【０００８】
更に、遺伝子たる核酸を凝縮可視化する操作では、その後に核酸の凝縮化状態を解除して、 in vitro で各種の遺伝子操作を行ったり、 in vivoで遺伝子機能を発現させたりしたい場合が多い。このような場合、凝縮化した核酸に対して、人為的操作により又は核酸の細胞内への導入によって希釈化やイオン強度（塩濃度）の変化をもたらすと、凝縮化状態が解除されることが了知されている。
【０００９】
しかしながら、核酸の凝縮化状態を解除した際、核酸可視化剤が核酸から脱離するかどうかは別な問題である。核酸可視化剤には、核酸に対して電気化学的に結合するタイプと、核酸の二重らせん構造にインターカレートされるタイプとがある。インターカレータタイプの核酸可視化剤は、核酸の凝縮化状態を解除しても、核酸から脱離しない。その結果、核酸の二重らせん構造は、インターカレートされた可視化剤によって開裂が阻害されるため、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅、細胞内での遺伝子融合又は遺伝子組替え、あるいは in vitro 又は in vivoでの遺伝子の転写又は複製等に供することができなかった。
【００１０】
従来技術においては、このような不具合を回避するために、核酸の凝縮可視化操作と、核酸の凝縮化状態の解除を前提とする核酸の凝縮化操作とを、別々に切り離して行わねばならなかった。即ち、第１の実験として、核酸凝縮化剤と核酸可視化剤を併用した核酸の凝縮可視化操作を行い、これによって核酸凝縮化に必要な核酸凝縮化剤の種類、使用量、使用条件等のデータを得る。次に、第２の実験として、これらのデータを参照しながら、核酸可視化剤を併用せずに、核酸の凝縮化状態の解除を前提とする核酸の凝縮化操作を行う。このような二段階の実験操作は非常に面倒であり、研究の効率を低下させ、かつ、いわば「目隠し」の状態で第２の実験を行うため、その信頼性を損ないかねないものであった。
【００１１】
そこで本発明は、従来技術における上記各種の不具合を解消することを、解決すべき技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、蛍光特性部であるプテリジン構造体の２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置に、核酸凝縮化機能部であるポリアミンを導入した化学構造を有し、核酸の凝縮可視化剤として用いられる、核酸処理剤である。
【００１３】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、
前記第１発明に係る核酸処理剤が次の（１）及び／又は（２）の特性を有する、核酸処理剤である。
（１）ポリアミン部分による核酸凝縮化機能が、当該ポリアミンを単独の化学構造体として用いた場合に比較して、強化されている。
（２）核酸処理剤により凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に、この核酸処理剤が核酸から脱離する。
【００１４】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明に係るプテリジン構造体に対するポリアミンの導入位置が、２位又は６位のいずれか一つの置換位置である、核酸処理剤である。
【００１５】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係るポリアミンが、１，３−ジアミノプロパン、スペルミジン又はスペルミンである、核酸処理剤である。
【００１６】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る核酸がＤＮＡである、核酸処理剤である。
【００１７】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸処理剤を核酸に作用させることにより、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行う、核酸の処理方法である。
【００１８】
第６発明において、「蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸処理剤」とは、必ずしも上記の第１発明〜第５発明に係る核酸処理剤に限定されず、要するに核酸に対する蛍光染色機能を発揮する蛍光特性部と、核酸に対する凝縮化機能を発揮する核酸凝縮化機能部とを併せ備える単一の化合物であれば、使用可能である。
【００１９】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸凝縮可視化剤であって、凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に核酸から脱離すると言う特性を示す核酸処理剤を核酸に作用させることにより、次の（３）、（４）を行う、核酸の処理方法である。
（３）核酸を凝縮可視化する際には、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行い、
（４） in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現のために核酸の凝縮状態を解除させる際には、前記遺伝子操作又は遺伝子機能発現に対する阻害因子であり得る蛍光特性部を核酸から脱離させる。
【００２０】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第７発明における遺伝子操作又は遺伝子機能発現が、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅、細胞内での遺伝子融合又は遺伝子組替え、あるいは、 in vitro 又は in vivoでの遺伝子の転写又は複製である、核酸の処理方法である。
【００２１】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第６発明〜第８発明のいずれかに係る核酸処理剤が細胞及び生物体に対して無毒性なものである、核酸の処理方法である。
【００２２】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第６発明〜第９発明のいずれかに係る核酸処理剤として第１発明〜第５発明のいずれかに係る核酸処理剤を用いる、核酸の処理方法である。
【発明の効果】
【００２３】
（第１発明の効果）
第１発明の核酸処理剤は、プテリジン構造体の２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置にポリアミンを導入した単一の化学構造体であり、核酸の凝縮可視化剤として用いられる。ここにおいて「プテリジン構造体」とは、プテリジン骨格からなる化合物又はその置換基誘導体、プテリジン構造を含む骨格からなる化合物（例えば、フラビン系化合物）又はその置換基誘導体を言う。又、「ポリアミン」とは、ジアミン以上の多価アミン化合物を言う。
【００２４】
プテリジン構造体が蛍光特性を有することは公知であり、一定の化学構造を持つポリアミンも核酸凝縮化剤として公知である。しかし、この両者を一体的に結合させた単一の化学構造体が、そのプテリジン構造体部分において蛍光特性を良好に維持するか否か、あるいはそのポリアミン部分において良好な核酸凝縮化機能を維持するか否か、と言う点については、化学常識からしても容易に予測できない。
【００２５】
実際、本願発明者が試作した多様なプテリジン−ポリアミン複合構造体において、蛍光特性と核酸凝縮化機能とを良好に発揮できない化合物例が非常に多かった。そして本願発明者は、試行錯誤の末に、プテリジン構造体の２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置にポリアミンを導入したプテリジン−ポリアミン複合構造体においてのみ、蛍光特性と核酸凝縮化機能とが良好に維持されると言う事実を突き止めたのである。更に驚くべきことに、このようなプテリジン−ポリアミン複合構造体の幾つかのものは、後述するように、ポリアミン部分の核酸凝縮化機能が著しく強化されていた。
【００２６】
このような第１発明の核酸処理剤は、ポリアミン部分による核酸の凝縮化機能と、プテリジン構造体部分による蛍光染色機能とを併せ持つので、単一の作用薬として核酸の凝縮化と蛍光染色とを同時に行うことができ、前記した従来技術のような面倒がない。
【００２７】
次に、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とが必ず同調して発現するので、核酸の凝縮化が起こっていることの確認が極めて容易であり、又、例えば凝縮可視化された核酸をレーザートラッピング等の手法で目的の部位に移動させることも容易である。そして、凝縮化された核酸と十分に凝縮化されていない核酸とを蛍光強度によって明瞭に識別できないと言う不具合や、凝縮化された核酸による蛍光をバックグラウンドからの蛍光と明瞭に識別できないと言う不具合を伴わない。即ち、核酸の凝縮可視化操作を確実かつ容易に行うことができる。
【００２８】
（第２発明の効果）
第２発明の核酸処理剤は、第１に、ポリアミン部分による核酸凝縮化機能が当該ポリアミンを単独の化学構造体として用いた場合に比較して強化されている。従って、より無害性で、より強力な核酸凝縮化剤の提供と言う世間の要求に応えることができるし、相対的に核酸凝縮化剤の使用量を低減させることができるので、その点に基づく種々のメリットも享受できる。
【００２９】
第２発明の核酸処理剤は、第２に、これにより凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に、この核酸処理剤が核酸から脱離する。このような脱離特性が、蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを一体化させた化合物ならば必ず得られるのか、あるいは第１発明の核酸処理剤のようにプテリジン構造体にポリアミンを導入した化合物であるために得られたのかは、未だ明確ではない。
【００３０】
上記のような脱離特性を持つ核酸処理剤を使用する場合には、核酸の凝縮可視化操作の後、核酸の凝縮状態を解除させる際には、同時に核酸処理剤が核酸から脱離するので、非常に有利である。即ち、核酸の凝縮状態の解除と同時に蛍光特性部が核酸から脱離するので、核酸の二重らせん構造の開裂が支障なく起こり、その後の in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現等を問題なく行わせることができる。
【００３１】
このため、前記したような、核酸の凝縮可視化操作と、核酸の凝縮化状態の解除を前提とする核酸の凝縮化操作とを別々に切り離して二段階で行うと言う研究者の苦労が解消される。又、核酸可視化剤を併用せずに核酸凝縮化剤のみを用いると言う「目隠し」状態の核酸凝縮化操作による、実験の信頼性に対する不安からも開放される。
【００３２】
（第３発明の効果）
第３発明のように、プテリジン構造体に対するポリアミンの導入位置が、２位又は６位のいずれか一つの置換位置である場合には、当該ポリアミンを単独の化学構造体として用いた場合に比較して、ポリアミン部分の核酸凝縮化機能が特に著しく強化される。
【００３３】
（第４発明の効果）
核酸処理剤の構成要素であるポリアミンの種類は限定されないが、第４発明のように、１，３−ジアミノプロパン、スペルミジン又はスペルミンを特に好ましく例示することができる。
【００３４】
（第５発明の効果）
核酸処理剤の処理対象である核酸の種類は特段限定されず、例えば、ＲＮＡや、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖等も包含されるが、二重らせん構造を形成すると言う特性や、典型的な核酸凝縮化現象を発現すると言う点から、特にＤＮＡが好ましい。
【００３５】
（第６発明の効果）
第６発明においては、蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸処理剤を核酸に作用させるので、単一の作用薬により核酸の凝縮化と蛍光染色とを同時に行うことができ、研究効率が向上する。
【００３６】
又、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とが必ず同調して発現するので、凝縮化された核酸の蛍光強度による識別を明瞭に行うことができ、核酸の凝縮可視化操作を確実かつ容易に行うことができる。
【００３７】
（第７発明の効果）
第７発明においては、上記の第６発明と同様の効果に加え、凝縮可視化操作による所定の実験目的を達した後、 in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現のために核酸の凝縮状態を解除させる際に、核酸処理剤（蛍光特性部）が核酸から脱離する。
【００３８】
即ち、遺伝子操作又は遺伝子機能発現に対する阻害因子であり得る蛍光特性部が排除されるので、核酸の二重らせん構造の開裂が阻害されず、従ってその後の遺伝子操作又は遺伝子機能発現を支障なく行わせることができる。
【００３９】
又、同じ目的の達成のために従来は必要であった、核酸の凝縮可視化操作と核酸の凝縮化状態の解除を前提とする核酸の凝縮化操作とを切り離して二段階で行うと言う面倒が不要となり、核酸可視化剤を併用せずに「目隠し」状態で行っていた核酸凝縮化操作を回避できる。
【００４０】
（第８発明の効果）
上記の第７発明で言う「遺伝子操作又は遺伝子機能発現」の内容や種類は限定されないが、第８発明に規定するように、ＰＣＲ法による遺伝子の増幅、細胞内での遺伝子融合又は遺伝子組替え、あるいは、 in vitro 又は in vivoでの遺伝子の転写又は複製を好ましく例示することができる。
【００４１】
（第９発明の効果）
核酸の処理方法に用いる核酸処理剤としては、細胞及び生物体に対して無毒性なものであることが、より好ましい。第１発明〜第５発明に係る核酸処理剤は、特殊な化学構造のポリアミンを含むものは別としても、一般的に細胞や生物体内に存在するプテリジン構造体及びポリアミンからなるので、少なくとも細胞及び生物体に対して無毒性である。
【００４２】
従って、核酸処理剤によって処理した核酸についての所定の操作目的を達成した後、そのままであるいは凝縮化状態を解除したもとで、更に in vivoの細胞実験等に供したり、又は医療目的から実験動物体内や人体内に導入する場合、これらの細胞及び生物体に対して有害な作用を起こさない。
【００４３】
（第１０発明の効果）
核酸の処理方法に用いる核酸処理剤としては、第１発明〜第５発明に係る核酸処理剤を特に好ましく例示することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
次に、本願の第１発明〜第１０発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。
【００４５】
〔核酸処理剤〕
本発明の核酸処理剤は、核酸に対する蛍光染色機能を有する蛍光特性部としてのプテリジン構造体に対して、その２位、４位及び６位の内の少なくとも一つの置換位置に、核酸に対する凝縮化機能を有する核酸凝縮化機能部としてのポリアミンを導入した化学構造を有するものであり、核酸の凝縮可視化剤として用いられる。
【００４６】
ポリアミンは、プテリジン構造体の２位、４位及び６位のいずれか一つの置換位置だけに導入されていても良いが、これらの二つ以上の置換位置に導入されていても良い。プテリジン構造体においてポリアミンが導入されていない任意の置換位置には、本発明の効果を阻害しない限りにおいて、任意の置換基を導入することができる。上記の「任意の置換位置」とは、２位、４位及び６位のうちポリアミンが導入されていない置換位置と、その他の置換位置とを含む。
【００４７】
これらの核酸処理剤における第１の特徴点は、プテリジンを単独の蛍光染色剤として用いる場合に比較して、プテリジン構造体の蛍光染色機能が遜色なく維持されていることである。核酸処理剤における第２の特徴点は、ポリアミンを単独の核酸凝縮化剤として用いる場合に比較して、核酸処理剤のポリアミン部分の核酸凝縮化機能がむしろ強化されていることである。プテリジン構造体に対するポリアミンの導入位置が、２位又は６位のいずれか一つの置換位置である場合には、その核酸凝縮化機能が著しく強化されている。核酸処理剤における第３の特徴点は、後述する代表的なポリアミンの実施形態において、構成要素たるプテリジン構造体及びポリアミンの特性から見て、核酸処理剤が細胞及び生物体に対して発ガン性その他の毒性を持たないことである。
【００４８】
核酸処理剤における第４の、特に重大な特徴点は、これらの核酸処理剤によって凝縮可視化させた核酸の凝縮状態を適宜な手段（希釈化、溶液のイオン強度の変化等）によって解除した場合、核酸処理剤が核酸から脱離し、ひいてはプテリジン構造体が核酸から脱離する、と言う事実である。
【００４９】
以上の第１〜第４の特徴点に基づく効果は、前記の「発明の効果」の欄で述べた通りである。
【００５０】
プテリジン構造体としては、プテリジンが例示される。発明の目的を阻害しない限りにおいて、プテリジンの任意の置換位置に任意の置換基が導入された誘導体も例示される。フラビン系化合物で例示されるようなプテリジン構造を含む骨格からなる化合物や、発明の目的を阻害しない限りにおいてその任意の置換位置に任意の置換基が導入された誘導体も例示される。
【００５１】
ポリアミンとは、要するにジアミン以上の多価アミン化合物を意味する。従って、炭素骨格構造や炭素−窒素骨格構造その他の任意の骨格構造を持つ多価アミン（例えば、トリエチレンジアミン等）はいずれも包含される。特に好ましい例が、細胞又は生物体に対する無害性が既に確認されており、あるいはそのような無害性が確実に予測されるポリアミンである。とりわけ好ましい例が、比較的低分子量の炭素直鎖の両端にアミノ基を有するジアミンや、このようなジアミンが直列状に（リニアに）連結された炭素−窒素骨格構造を有するポリアミンである。
【００５２】
ポリアミンの代表的な具体例として、１，３−ジアミノプロパン、スペルミジン又はスペルミンを挙げることができる。これらの内のいずれかのポリアミンを含む核酸処理剤は、強い核酸凝縮化機能を発揮し、しかも細胞又は生物体に対して無毒性である。
【００５３】
プテリジン構造体の２位の置換位置に１，３−ジアミノプロパンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化１」に、プテリジン構造体の２位の置換位置にスペルミジンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化２」に、プテリジン構造体の２位の置換位置にスペルミンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化３」に、それぞれ示す。
【００５４】
【化１】
2005027612.tif 000003
【００５５】
【化２】
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【００５６】
【化３】
2005027612.tif 000005
又、上記の「化１」及び「化３」に示された核酸処理剤の合成スキームの一例を図１に示す。図１において、中間生成物及び最終生成物の化学構造式の下部には、その生成物の百分比（％）による収率を表記している。
【００５７】
次に、プテリジン構造体の６位の置換位置に１，３−ジアミノプロパンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化４」に、プテリジン構造体の６位の置換位置にスペルミンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化５」に、それぞれ示す。
【００５８】
【化４】
2005027612.tif 000006
【００５９】
【化５】
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更に、プテリジン構造体の４位の置換位置に１，３−ジアミノプロパンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化６」に、プテリジン構造体の４位の置換位置にスペルミンが導入された核酸処理剤の化学構造式を下記の「化７」に、それぞれ示す。
【００６０】
【化６】
2005027612.tif 000008
【００６１】
【化７】
2005027612.tif 000009
又、上記の「化６」及び「化７」に示された核酸処理剤の合成スキームの一例を図２に示す。図２において、中間生成物及び最終生成物の構造式の下部には、その生成物の百分比による収率を表記している。
【００６２】
〔核酸の処理方法〕
本発明に係る核酸の処理方法は、要するに核酸に対して適用可能であり、好ましくはＤＮＡに対して適用されるが、その他のポリヌクレオチド、例えばＲＮＡやＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖等も適用の対象であり得る。核酸処理の目的に「凝縮化」が含まれることから、余り短い核酸は、事実上、処理の対象とならない。具体的には、例えば１０，０００塩基（塩基対）程度以上の核酸が対象物として好ましい。
【００６３】
本発明の核酸の処理方法において、核酸処理剤としては、上記した各種の核酸処理剤を好ましく使用できるが、それ以外の蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有効に併せ備える単一の化合物も使用できる。例えば、プテリジン構造体以外の蛍光特性部とポリアミンからなる核酸凝縮化機能部とを併せ備える単一の化合物、プテリジン構造体とポリアミン以外の核酸凝縮化機能部とを併せ備える単一の化合物、プテリジン構造体以外の蛍光特性部とポリアミン以外の核酸凝縮化機能部とを併せ備える単一の化合物、等を使用できる可能性がある。
【００６４】
（第１の核酸の処理方法）
本発明に係る第１の核酸の処理方法は、核酸の凝縮可視化方法である。即ち、蛍光特性部と核酸凝縮化機能部とを有する核酸処理剤を核酸に作用させることにより、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行う、と言う内容である。
【００６５】
第１の核酸の処理方法においては、核酸の凝縮可視化を行う目的は限定されず、凝縮可視化を行った後に、更に後工程として何らかの操作又は実験を行うか否かも限定されない。即ち、単に凝縮可視化のみを目的とする場合も含まれる。
【００６６】
（第２の核酸の処理方法）
本発明に係る第２の核酸の処理方法は、核酸の凝縮可視化を行い、かつ、その後に核酸の凝縮状態を解除する方法である。即ち、この方法は、凝縮可視化した核酸の凝縮状態が解除された際に、核酸処理剤が核酸から脱離すると言う特性を利用して、次の第１工程と第２工程とを行う。
【００６７】
第１工程：核酸を凝縮可視化する際に、核酸の凝縮化と、凝縮化された核酸における蛍光特性部の高密度化に基づく核酸の可視化とを同調させた核酸の凝縮可視化を行う。
【００６８】
第２工程：第１工程において凝縮可視化された核酸について、 in vitro 又は in vivoでの核酸の遺伝子操作又は遺伝子機能発現のために、核酸の凝縮状態を解除させる。この工程では、上記のように、遺伝子操作又は遺伝子機能発現に対する阻害因子であり得る蛍光特性部が核酸から脱離する。第２工程における遺伝子操作又は遺伝子機能発現としては、少なくともＰＣＲ法による遺伝子の増幅、細胞内での遺伝子融合又は遺伝子組替え、あるいは in vitro 又は in vivoでの遺伝子の転写又は複製が含まれる。
【実施例】
【００６９】
（実施例１：核酸処理剤の蛍光特性の確認）
前記した「化１」及び「化３」に示す核酸処理剤の１０−６モル水溶液をそれぞれ調製し、JASCO FP-6600 スペクトルフルオロメーターを用いて蛍光スペクトルを測定したところ、波長３６０ｎｍの紫外光による励起に対して、「化１」に示す核酸処理剤は波長４４７ｎｍの蛍光（強度１２４）を発し、「化３」に示す核酸処理剤は波長４４８ｎｍの蛍光（強度１２７）を発することを確認した。
【００７０】
（実施例２：核酸の凝縮可視化）
本実施例を行う前提として、核酸の凝縮化状態についての３種類のスタンダードな状態を図３〜図５の蛍光顕微鏡観察像によって示す。図３は核酸が凝縮化していない「coil」状態であり、図５は核酸が十分に凝縮化した「globule 」状態である。これらに対して、図４に示す状態は、核酸の凝縮化部と非凝縮化部とが共存する「coexist 」状態である。これらのスタンダードを基準として、以下の実験における効果判定を行った。
【００７１】
又、本実施例においては、試料用核酸として、約１６５．６ｋｂｐの非凝縮化状態にある２本鎖ＤＮＡ（T4DNA, Nippon Gene社）を用いた。そして、このＤＮＡと本発明に係る各種の核酸処理剤とを含む以下の組成液を調製した。
【００７２】
水                            ４６０μＬ
０．１Ｍ  トリス緩衝液          ５０μＬ
２−メルカプトエタノール        ２０μＬ
１０μＭ  ＤＮＡ溶液            １０μＬ
核酸処理剤溶液                  １０μＬ（濃度は後述）
この組成液の調製に当たっては、上記の所定量の水、トリス緩衝液、２−メルカプトエタノール及び前記従来技術の項で述べたＤＡＰＩからなる混液を調製した。次に、上記のＤＮＡ溶液を加えて緩やかに攪拌した。その後、５〜１０分間静置してから上記の核酸処理剤溶液を加えて緩やかに攪拌した。
【００７３】
こうして調製した組成液を更に５〜１０分間静置してから、この組成液を試料液として常法に従い観察用プレパラートを調製し、図８に示す構成の蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００７４】
又、実施例２に対する比較例として、このＤＮＡと、前記従来技術の項で述べた蛍光染色剤であるＹＯＹＯ（ Molecular Probes 社製）と、後述する公知の各種タイプの核酸凝縮化剤とを含む以下の組成液を同上の要領で調製し、かつ同上の要領で蛍光顕微鏡観察に供した。
【００７５】
水                            ４００μＬ
０．１Ｍ  トリス緩衝液          ５０μＬ
２−メルカプトエタノール        ２０μＬ
２μＭ  ＹＯＹＯ溶液            １０μＬ
１０μＭ  ＤＮＡ溶液            １０μＬ
公知核酸凝縮化剤溶液            １０μＬ（濃度は後述）
表１に、比較例の公知核酸凝縮化剤溶液としてスペルミンをそれぞれ５〜４０μＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「ｓｐｍ」と表記された欄）、実施例の核酸処理剤溶液として前記「化３」に示す化合物をそれぞれ５〜３０μＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「Ａ−ｓｐｍ」と表記された欄）、及び、実施例の核酸処理剤溶液として前記「化７」に示す化合物をそれぞれ１０〜７５μＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「Ｃ−ｓｐｍ」と表記された欄）について、蛍光顕微鏡観察による核酸の凝縮化効果の判定結果を示す。表１中、破線で「−−−」と表記した項目はデータを出していない（以下同様）。
【００７６】
【表１】
2005027612.tif 000010
表２に、比較例の公知核酸凝縮化剤溶液としてスペルミジンをそれぞれ１０μＭ〜１ｍＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「ｓｐｄ」と表記された欄）、及び、実施例の核酸処理剤溶液として前記「化２」に示す化合物をそれぞれ０．２〜１００μＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「Ａ−ｓｐｄ」と表記された欄）について、蛍光顕微鏡観察による核酸の凝縮化効果の判定結果を示す。
【００７７】
【表２】
2005027612.tif 000011
表３に、比較例の公知核酸凝縮化剤溶液として１，３−ジアミノプロパンをそれぞれ１〜１５０ｍＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「ｄｉａ」と表記された欄）、実施例の核酸処理剤溶液として前記「化１」に示す化合物をそれぞれ２０μＭ〜２ｍＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「Ａ−ｄｉａ」と表記された欄）、及び、実施例の核酸処理剤溶液として前記「化６」に示す化合物をそれぞれ２０μＭ〜４ｍＭの範囲内で濃度を種々に変更して用いた場合（表中、「Ｃ−ｄｉａ」と表記された欄）について、蛍光顕微鏡観察による核酸の凝縮化効果の判定結果を示す。
【００７８】
【表３】
2005027612.tif 000012
（実施例２の評価）
表１〜表３より明らかなように、本発明に係る各種の核酸処理剤は、核酸に対する凝縮可視化効果が明瞭に認められた。
【００７９】
次に、本発明に係る各種の核酸処理剤を用いた実施例と、核酸処理剤におけるポリアミン部分に相当するポリアミン化合物と核酸可視化剤であるＹＯＹＯとをそれぞれ別個に用いた比較例との対比において、次の２点が確認された。
【００８０】
第１に、実施例及び比較例に係る多数の蛍光顕微鏡観察像の提示は差し控えるが、可視化効果において、各実施例は比較例に対して少なくとも遜色がなかった。比較例の幾つかの場合において、蛍光顕微鏡観察像が鮮明さに欠け、「coil」、「coexist 」又は「globule 」の判定に苦労するものがあった。
【００８１】
第２に、各実施例は比較例に対して、核酸凝縮化効果が強化されていた。核酸凝縮化効果の強化は、プテリジン構造体に対するポリアミンの導入位置が２位又は６位の置換位置である核酸処理剤において、特に著しかった。
【００８２】
（実施例３：核酸の凝縮状態の解除）
最初に、実施例２と同じ要領で、以下の第１の組成液を調製し、かつ、ＤＮＡの凝縮化の様子を蛍光顕微鏡で観察した。ＤＮＡは、Ｔ４  ベクターと連結された約１６５．６ｋｂｐの非凝縮化状態にある２本鎖ＤＮＡであり、「核酸処理剤溶液」とは前記の「化３」に示す核酸処理剤の溶液である。
【００８３】
水                            ４００μＬ
０．１Ｍ  トリス緩衝液          ５０μＬ
２−メルカプトエタノール        ２０μＬ
１０μＭ  ＤＮＡ溶液            １０μＬ
２μＭ  ＹＯＹＯ溶液            １０μＬ
１ｍＭ  核酸処理剤溶液          １０μＬ
上記の蛍光顕微鏡観察像を図６に示すが、十分な凝縮化状態にあるＤＮＡを、明瞭な蛍光によって識別・確認することができた。
【００８４】
次に、上記の組成液を１２，０００r.p.m.での５分間の遠心分離に供し、核酸処理剤により凝縮化されたＤＮＡを沈殿させてから上澄み液を捨て、この沈殿に対して下記の第２の組成液を注加した。
【００８５】
水                            ４００μＬ
０．１Ｍ  トリス緩衝液          ５０μＬ
２−メルカプトエタノール        ２０μＬ
２μＭ  ＹＯＹＯ溶液            １０μＬ
そして容器を激しく振とうし、１０分間静置した後に、組成液を同上の要領で蛍光顕微鏡観察に供した。図７に示すその観察像によれば、ＤＮＡの５０％以上が凝縮化状態を解除されており、前記の凝縮化効果の判定基準によれば、典型的な「coexist 」状態であった。
【００８６】
（実施例３の評価）
図６及び図７に示す結果より、次の点が確認された。即ち、核酸処理剤により凝縮化されたＤＮＡの沈殿に対する第２の組成液の注加によって、核酸処理剤が低濃度化されてＤＮＡから脱離し、ＤＮＡが凝縮化状態を解除された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によって、 in vitro 又は in vivoでの各種の遺伝子操作又は遺伝子機能発現、例えば遺伝子治療においてリポソームからなる人工ベクターに遺伝子を封入し、これを標的細胞内に送り込む等の操作に必要・有益な核酸の凝縮（折り畳み）現象の制御を、可視化したもとで自由に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】核酸処理剤の合成スキームを示す図である。
【００８９】
【図２】核酸処理剤の合成スキームを示す図である。
【００９０】
【図３】核酸の非凝縮化状態を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００９１】
【図４】核酸の凝縮化部と非凝縮化部の共存状態を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００９２】
【図５】核酸の十分な凝縮化状態を示す蛍光顕微鏡観察像である。
【００９３】
【図６】実施例に係る核酸の蛍光顕微鏡観察像である。
【００９４】
【図７】実施例に係る核酸の蛍光顕微鏡観察像である。
【００９５】
【図８】実施例で用いた蛍光顕微鏡の構成を簡略化して示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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