(57)【要約】【課題】  配列構造形成の選択自由度が高く、可逆的に開裂が可能であり、しかもヌクレオチド末端に連結性基を有していない分枝形成用ヌクレオチドを用いることのできる新しい、分枝ヌクレオチド構造の形成方法を提供する。【解決手段】  光応答性塩基がヌクレオチド鎖中に含まれている次式  【化１】2005348646.tif 000004（式中のＲはアルコキシカルボニル基またはシアノ基を示し、ＤＮＡは同一または別異のヌクレオチド鎖を示す。）で表わされる構造を有する光応答性ヌクレオチドと分枝形成用ヌクレオチドに対し、鋳型ヌクレオチドの存在下に光照射して、光応答性塩基の位置において分枝形成用ヌクレオチドによる分枝構造を形成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光応答性塩基がヌクレオチド鎖中に含まれている次式
【化１】
2005348646.tif 000003
（式中のＲはアルコキシカルボニル基またはシアノ基を示し、ＤＮＡは同一または別異のヌクレオチド鎖を示す。）
で表わされる構造を有する光応答性ヌクレオチドと分枝形成用ヌクレオチドに対し、鋳型ヌクレオチドの存在下に光照射して、光応答性塩基の位置において分枝形成用ヌクレオチドによる分枝構造を形成することを特徴とする分枝ヌクレオチド構造の形成方法。
【請求項２】
光応答性塩基がヌクレオチド鎖中に含まれている前記式で表わされる構造を複数有する光応答性ヌクレオチドにおいて、一または複数の分枝構造を形成することを特徴とする請求項１の分枝ヌクレオチド構造の形成方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法により形成した分枝ヌクレオチド構造において、分枝形成用ヌクレオチドの連結部位に光照射して分枝構造を開裂させることを特徴とする分枝ヌクレオチド構造の開裂方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、ＤＮＡナノ構造の構築や、アンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、点変異操作等への利用として有用な、光化学的な分枝ヌクレオチド構造の形成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ヌクレオチドに枝分かれした分枝構造を導入することが検討されてきている。このような分枝構造の形成は、ＤＮＡナノ構造の構築や、アンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、点変異操作等において極めて重要なツールとなることが期待されているからである。
【０００３】
従来では、このような分枝ヌクレオチド構造の形成に際しては、枝分かれのための分枝用ユニットのフォスフォアミダイト体を用いることが一般的であった。しかしながら、この方法の場合には、
１）対称的な配列しか形成できないこと
２）一度形成した分枝部を開裂して取り外すことが困難であること
という制約があった。このため、これらの制約を克服することのできる汎用性、一般性が高く、ほぼ可逆的な形成−開裂の操作が可能とされる新しい方策の実現が求められていた。
【０００４】
一方、この出願の発明者らは、これまで、ヌクレオチド鎖の連結や架橋等を可能にするための方法の探索を進めてきており、その過程において、塩基として５−ピリミジン基を末端に有するヌクレオチドを用いて光化学的に分枝ヌクレオチド構造を形成する方法を見出し、これを特許として提案した（特許文献１）。この方法は、分枝ヌクレオチド構造の形成の自由度が大きく、光照射により、簡便に穏和な条件下に可能とされるという大きな特徴を有している。
【０００５】
ただ、上記のとおりの従来の問題点の解消には必ずしも有効、効率的でない場合があり、また分枝形成用ヌクレオチの末端にピリミジン塩基を有していることから、位置特異的な分枝構造の形成の選択性に若干の難点があり、さらには、分枝形成用ヌクレオチドを有用分子鎖として応用しようとする場合、末端ピリミジン塩基の存在が支障になることが懸念されていた。
【特許文献１】特開２００１−３４８３９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この出願の発明は、上記のとおりの背景から、従来の問題点を解消し、発明者らのこれまでの検討をさらに進めることで、配列構造形成の選択自由度が高く、可逆的に連結と開裂が可能であり、しかもヌクレオチド末端に連結性基を有していない分枝形成用ヌクレオチドを用いることのできる、新しい分枝ヌクレオチド構造の形成方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この出願は、上記の課題を解決するものとして次の発明を提供する。
〔１〕光応答性塩基がヌクレオチド鎖中に含まれている次式
【０００８】
【化２】
2005348646.tif 000002
（式中のＲはアルコキシカルボニル基またはシアノ基を示し、ＤＮＡは同一または別異のヌクレオチド鎖を示す。）
で表わされる構造を有する光応答性ヌクレオチドと分枝形成用ヌクレオチドに対し、鋳型ヌクレオチドの存在下に光照射して、光応答性塩基の位置において分枝形成用ヌクレオチドによる分枝構造を形成することを特徴とする分枝ヌクレオチド構造の形成方法。
〔２〕光応答性塩基がヌクレオチド鎖中に含まれている前記式で表わされる構造を複数有する光応答性ヌクレオチドにおいて一または複数の分枝構造を形成することを特徴とする上記の分枝ヌクレオチド構造の形成方法。
〔３〕上記いずれかの方法により形成した分枝ヌクレオチド構造において、分枝形成用ヌクレオチドの連結部位に光照射して分枝構造を開裂させることを特徴とする分枝ヌクレオチド構造の開裂方法。
【発明の効果】
【０００９】
光応答性塩基をヌクレオチド鎖の末端ではなく内部に埋め込んだ光応答性ヌクレオチドを用いるこの出願の発明によれば、配列構造形成の選択自由度が高く、可逆的に開裂が可能であり、しかもヌクレオチド末端に連結性基を有していない分枝形成用ヌクレオチドを用いることのできる新しい分枝ヌクレオチド構造の形成方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが以下にその実施の形態について説明する。
【００１１】
前記の式で表わされる光応答性ヌクレオチドについては符号Ｒのアルコキシカルボニル基は、炭素数６以下程度のアルコキシカルボニル基であることが好適な例として示される。たとえば、−ＣＯ2ＣＨ3、−ＣＯ2Ｃ2Ｈ5−ＣＯ2Ｃ4Ｈ9等である。
【００１２】
光応答性ヌクレオチドは、ピリミジン塩基化合物が合成されるが、前記式中のＤＮＡは、同一または別異なものとして、利用、応用の目的等に対応して適宜に選択されてよい。この合成については各種の方法であってよく、たとえば発明者がすでに提案している前記特許文献１の記載方法に沿って、ＤＮＡ合成機等を用いて行うことができる。
【００１３】
分枝形成用ヌクレオチド、そして鋳型ヌクレオチドも上記同様に適宜に定められることになる。そして光照射については、符号ＲがＣＯ2ＣＨ3またはＣＮの場合の分枝構造形成時には、たとえば３６６ｎｍもしくはその前後の波長の光が効果的に照射される。一方、分枝部の開裂時には、たとえば３１２ｎｍもしくはその前後の波長の光が効果的に照射される。もちろん、光化学的な連結と開裂の度合、速度を考慮して波長が選択されてよい。
【００１４】
この出願の発明においては、前記の式で表わされる構造は、単一のヌクレオチド鎖中に複数存在していてもよい。分枝形成用ヌクレオチドの使用量や光の波長と照射時間等の条件を適宜に定めることによって、所定の一個所のみ、あるいは複数個所において選択的な分枝構造の形成が可能とされる。
【００１５】
そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。なお、以下の例においては、光応答性塩基の導入部位は、「CVＵ」として表示される。
【実施例】
【００１６】
＜実施例１＞
図１のスキームに従って実際に光反応を行なった。
【００１７】
反応条件（全てのオリゴマー１０μＭ，ＮａＣｌ，１００ｍＭ，Na Cacodylate（ｐＨ７．０）５０ｍＭ，０℃）トランスイルミネーター（３６６ｎｍ）
その結果、３６６ｎｍ光照射１時間で内部のCVＵを起点とした枝分かれ構造を持つ連結体が９３％の収率で得られた。また連結されたヌクレオチドをＨＰＬＣを用いて単離したものに対して３１２ｎｍの光照射を行なったところ、原料のオリゴヌクレオチドの生成を確認した。このことによりこの光連結反応が可逆的であることを見出した。連結体のオリゴヌクレオチドについてはMALDI TOF MASSにより連結体であることを確認した。
＜実施例２＞
内部に複数CVＵを含むオリゴヌクレオチドを用いた枝分かれ構造の多点導入を図２のスキームに従って行った。すなわち、CVＵを２個含むオリゴヌクレオチドに対して枝分れ構造を複数導入した。
【００１８】
反応条件（全てのオリゴマー１０μＭ，ＮａＣｌ，１００ｍＭ，Na Cacodylate （ｐＨ７．０）５０ｍＭ，０℃）トランスイルミネーター（３６６ｎｍ）
３６６ｎｍの光照射を５時間行なったところMALDI-TOF MASSを用いた分子量測定の結果、１個導入された枝分かれ核酸ＯＤＮ５及び２個導入されたＯＤＮ４周辺に目的の分子量に相当するピークを得ることができた（図３）。キャピラリー電気泳動を用いて同じサンプルを用いた結果次の通りとなった。すなわち図４（光反応前）および図５（光反応後）のように、光反応後のサンプル解析にとり高分子領域に新たに二つのＯＤＮ５及びＯＤＮ４由来のピークを検出することができた。以上の結果より内部に埋め込んだCVＵ核酸を用いることでその埋め込んだCVＵより枝分かれ構造を複数同時に持たせることができることを見出した。
【００１９】
あらかじめＤＮＡ合成機やＰＣＲ等でｃｖＵを含むオリゴ核酸を作っておけばその設計した通りに枝分かれ構造をポスト修飾的に合成することが可能となり、今まで酵素では作ることのできなかった枝分かれ構造を容易に作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１のスキームとＨＰＬＣの結果を例示した図である。
【図２】実施例２のスキームを例示した図である。
【図３】分子量測定の結果を例示した図である。
【図４】キャピラリー電気泳動の結果を例示した図である。
【図１】
2005348646.tif 000005
【図２】
2005348646.tif 000006
【図３】
2005348646.tif 000007
【図４】
2005348646.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月28日(2005.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
あらかじめＤＮＡ合成機やＰＣＲ等でcvＵを含むオリゴ核酸を作っておけばその設計した通りに枝分かれ構造をポスト修飾的に合成することが可能となり、今まで酵素では作ることのできなかった枝分かれ構造を容易に作ることができる。