(57)【要約】【課題】ビール有害菌、特にラクトバチルス属菌およびペクチネイタス属菌を迅速に検出する方法であって、偽陽性が生じにくい検出方法を提供すること。【解決手段】ラクトバチルス属菌およびペクチネイタス属菌、特に、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチル・リンドネリ、ラクトバチルスＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・コリニフォルミス、ラクトバチルス・プランタルム、ペクチネイタス・フリシンゲンシスおよびペクチネイタス・セレヴィシィフィルスのゲノムＤＮＡを増幅し得るプライマーを組み合わせて、ネスティッドＰＣＲにより各菌種に極めて特異的なＤＮＡ増幅を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーＬＢＰ２（配列番号１）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＢを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＢＮＰＸＦ（配列番号３）およびＬＢＮＰＸＲ（配列番号４）からなるプライマーセットＬＢＮ、プライマーＬＢＰ３（配列番号５）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ２、および、プライマーＬＢＮＰ２Ｆ（配列番号７）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルス・ブレビスの検出方法。
【請求項２】
プライマー１６Ｆ−Ｆ（配列番号８）およびＩＦ−Ｒ（配列番号９）からなる第１のプライマーセットＰｆＩＩを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＦＲ−Ｆ２（配列番号１０）およびＦＲ−Ｒ３（配列番号１１）からなるプライマーセットＰｆＮ１、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＦＲ−Ｒ４（配列番号１３）からなるプライマーセットＰｆＮ２、および、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＰＦＮＰ−２Ｒ（配列番号１４）からなるプライマーセットＰｆＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法。
【請求項３】
プライマー１６Ｃ−Ｆ（配列番号１５）およびＩＣ−Ｒ（配列番号１６）からなる第１のプライマーセットＰｃＩＩを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＰＣＮＰ５Ｆ（配列番号１７）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ１、または、プライマーＰＣＮＰＦ６（配列番号１９）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ２、を第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ペクチネイタス・セレヴィシィフィルスの検出方法。
【請求項４】
プライマーＬＬＰ２（配列番号２０）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＬを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＬＮＰＸＦ３（配列番号２１）およびＬＬＮＰＸＲ３（配列番号２２）からなるプライマーセットＬＬＮ、プライマーＬＬＮＰ３Ｆ（配列番号２３）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットセットＬＬＮ２、および、プライマーＬＬＮＰ４Ｆ（配列番号２５）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットＬＬＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルス・リンドネリの検出方法
【請求項５】
プライマーＬ７４Ｐ４−３（配列番号２６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬ７４を用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬ７４ＮＰＸＦ（配列番号２７）およびＬ７４ＮＰＸＲ（配列番号２８）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ、プライマーＬ７４ＮＰ１Ｆ（配列番号２９）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ２、および、プライマーＬ７４ＮＰ２Ｆ（配列番号３１）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルスＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）の検出方法。
【請求項６】
プライマーＬＣＰ１（配列番号３２）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣまたはプライマーＬＣＰ１１（配列番号３３）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣ２のいずれかを第１のプライマーセットとして試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＣＮＰ１Ｆ（配列番号３４）およびＬＣＮＰ１Ｒ（配列番号３５）からなるプライマーセットＬＣＮを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルス・カゼイの検出方法。
【請求項７】
プライマーＬＯＰ４（配列番号３６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＯを第１のプライマーセットとして用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＯＮＰ２Ｆ（配列番号３７）およびＬＯＮＰ１Ｒ（配列番号３８）からなるプライマーセットＬＯＮを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルス・コリニフォルミスの検出方法
【請求項８】
プライマーＬＰＰ１（配列番号３９）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＰを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＰＮＰＸＦ（配列番号４０）およびＬＰＮＰＸＲ（配列番号４１）からなるプライマーセットＬＰＮ、プライマーＬＰＮＰ２Ｆ（配列番号４２）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ２、および、プライマーＬＰＮＰ３Ｆ（配列番号４４）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌ラクトバチルス・プランタルムの検出方法
【請求項９】
プライマーＬＢＰ２（配列番号１）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＢ、並びに、プライマーＬＢＮＰＸＦ（配列番号３）およびＬＢＮＰＸＲ（配列番号４）からなるプライマーセットＬＢＮ、プライマーＬＢＰ３（配列番号５）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ２、および、プライマーＬＢＮＰ２Ｆ（配列番号７）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ラクトバチルス・ブレビス検出用キット。
【請求項１０】
プライマー１６Ｆ−Ｆ（配列番号８）およびＩＦ−Ｒ（配列番号９）からなる第１のプライマーセットＰｆＩＩ、並びに、プライマーＦＲ−Ｆ２（配列番号１０）およびＦＲ−Ｒ３（配列番号１１）からなるプライマーセットＰｆＮ１、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＦＲ−Ｒ４（配列番号１３）からなるプライマーセットＰｆＮ２、および、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＰＦＮＰ−２Ｒ（配列番号１４）からなるプライマーセットＰｆＮ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用キット。
【請求項１１】
プライマー１６Ｃ−Ｆ（配列番号１５）およびＩＣ−Ｒ（配列番号１６）からなる第１のプライマーセットＰｃＩＩ、並びに、プライマーＰＣＮＰ５Ｆ（配列番号１７）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ１、およびプライマーＰＣＮＰＦ６（配列番号１９）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ２、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ペクチネイタス・セレヴィシィフィルス検出用キット。
【請求項１２】
プライマーＬＬＰ２（配列番号２０）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＬＮＰＸＦ３（配列番号２１）およびＬＬＮＰＸＲ３（配列番号２２）からなるプライマーセットＬＬＮ、プライマーＬＬＮＰ３Ｆ（配列番号２３）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットセットＬＬＮ２、および、プライマーＬＬＮＰ４Ｆ（配列番号２５）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットＬＬＮ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ラクトバチルス・リンドネリ検出用キット。
【請求項１３】
プライマーＬ７４Ｐ４−３（配列番号２６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬ７４、並びに、プライマーＬ７４ＮＰＸＦ（配列番号２７）およびＬ７４ＮＰＸＲ（配列番号２８）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ、プライマーＬ７４ＮＰ１Ｆ（配列番号２９）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ２、および、プライマーＬ７４ＮＰ２Ｆ（配列番号３１）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ラクトバチルスＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）検出用キット。
【請求項１４】
プライマーＬＣＰ１（配列番号３２）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣ、および、プライマーＬＣＰ１１（配列番号３３）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣ２、からなる群より選ばれる１以上の第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＣＮＰ１Ｆ（配列番号３４）およびＬＣＮＰ１Ｒ（配列番号３５）からなる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ラクトバチルス・カゼイの検出用キット。
【請求項１５】
プライマーＬＯＰ４（配列番号３６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＯＮＰ２Ｆ（配列番号３７）およびＬＯＮＰ１Ｒ（配列番号３８）からなる第２のプライマーセットＬＯＮを含む、ビール有害菌ラクトバチルス・コリニフォルミス検出用キット。
【請求項１６】
プライマーＬＰＰ１（配列番号３９）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＰＮＰＸＦ（配列番号４０）およびＬＰＮＰＸＲ（配列番号４１）からなるプライマーセットＬＰＮ、プライマーＬＰＮＰ２Ｆ（配列番号４２）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ２、および、プライマーＬＰＮＰ３Ｆ（配列番号４４）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌ラクトバチルス・プランタルム検出用キット。
【請求項１７】
少なくとも１つのプライマーが標識されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのプライマーの５’末端に１〜８個のヌクレオチドが付加された、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのプライマーが標識されている、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
少なくとも１つのプライマーの５’末端に１〜８個のヌクレオチドが付加された、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
配列番号１〜４３に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ビール有害菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビール有害菌、特にビール中で生育する乳酸菌およびペクチネイタス属菌の検出および同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
製品ビール、半製品および培養酵母にビール有害菌が存在しないことを保証することは、品質管理上極めて重要である。そのため、これらを製品等を検査対象として、ビ−ル有害菌である乳酸菌をＰＣＲ法によって同定あるいは検出する方法が開発されてきた（特開平７−２８９２９５、特開２００２−３４５７８）。また、同じくビール有害菌であるペクチネイタス属菌についても同様な方法が開発されている（特開２００２−３４５７８）。
一方、特異性の高いＤＮＡ増幅を行うための技術として、ネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ；「入れ子ＰＣＲ」）が知られている（ワトソン・組換えＤＮＡの分子生物学第２版）。例えば、特開平１１−７５８５２にはＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子、この遺伝子を含むプラスミド、およびＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼに関する発明で、前記遺伝子をクローニングするのに、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いたことが記載されている。また、特開平２０００−１５７２９９には、ＨＩＶウィルスＤＮＡの一部を欠失する配列を競合ＤＮＡ断片として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて当該ウィルスを定量する方法が記載されている。さらに、特開２００２−１５９２９５にはＨＩＶ−１ウィルスと相同な配列を競合ＤＮＡ断片として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いることにより、患者の細胞中のＲＮＡ―ＤＮＡハイブリッド濃度を測定する方法が記載されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−２８９２５９
【特許文献２】
特開２００２−３４５７８
【特許文献３】
特開平１１−７５８５２
【特許文献４】
特開２０００−１５７２９９
【特許文献５】
特開２００２−１５９２９５
【非特許文献１】
「ワトソン・組換えＤＮＡの分子生物学」、第２版、丸善（株）、平成７年５月２５日発行
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的はビール有害菌、特にラクトバチルス属菌（乳酸菌）およびペクチネイタス属菌を迅速に検出する方法であって、偽陽性が生じにくい検出方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上述した先行技術による方法は当該微生物を検出あるいは同定するのに有効であるが、これらの方法においては、著しく少ない菌数の当該菌種の検出も可能にするため、ＰＣＲ法による増殖回数を高めに設定する、あるいは、増幅効率の高い酵素を使用する。このため、当該菌が存在しない場合でも、判定に迷う程度のうっすらとしたバンドが生じることがある。通常、このような場合を「擬陽性」と呼び、当該菌の存在が疑わしい検体と仮判定し、ＰＣＲ試験の再実施をしてきた。しかし、擬陽性である場合は、再試験によっても再度擬陽性反応が生じることがあり、判断に支障をきたすことがあった。これに対して、偽陽性検体については増幅されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定することによって菌種の特定を行い、ビール有害菌か否かを最終判定することも可能であるが、そのような方法は極めて高い精度を有する方法であるものの、２〜３日程度の時間を要する点で改善すべき点があった。本発明者らは、ビール有害菌、特に乳酸菌およびペクチネイタス属菌の特定の菌種に対してネスティッドＰＣＲ行った場合に、各菌種について極めて特異的な増幅を行い得るプライマーセットの組み合わせが存在することを見いだし、これらのプライマーセットを用いることによって、各菌種を個別に特異的に検出および同定する方法を開発するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、乳酸菌およびペクチネイタス属菌のそれぞれの菌種由来ＤＮＡに特異的な２組のプライマーセットを使用してネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ；「入れ子ＰＣＲ」）を行い、乳酸菌およびペクチネイタス属菌を検出および同定する方法である。
より具体的には、本発明は、プライマーＬＢＰ２およびＵＮＰ１からなる第１のプライマーセットＬＢを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＢＮＰＸＦおよびＬＢＮＰＸＲからなるプライマーセットＬＢＮ、プライマーＬＢＰ３およびＬＢＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＢＮ２、および、プライマーＬＢＮＰ２ＦおよびＬＢＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＢＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（ラクトバチルス・ブレビス）の検出方法である。
【０００７】
プライマーＬＢＰ２：５’−  ＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＣ  −３’  （配列番号１）
プライマーＵＮＰ１：５’−  ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ  −３’    （配列番号２）
プライマーＬＢＮＰＸＦ：  ５’−  ＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＡＧＧＣＣ  −３’  （配列番号３）
プライマーＬＢＮＰＸＲ：  ５’−  ＴＡＡＡＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＣＣＴ  −３’    （配列番号４）
プライマーＬＢＰ３：５’−  ＧＴＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣ  −３’    （配列番号５）
プライマーＬＢＮＰ１Ｒ：５’−  ＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ  −３’    （配列番号６）
プライマーＬＢＮＰ２Ｆ：５’−  ＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧ  −３’    （配列番号７）
【０００８】
本発明はまた、プライマー１６Ｆ−ＦおよびＩＦ−Ｒからなる第１のプライマーセットＰｆＩＩを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＦＲ−Ｆ２およびＦＲ−Ｒ３からなるプライマーセットＰｆＮ１、プライマーＦＲ−Ｆ５およびＦＲ−Ｒ４からなるプライマーセットＰｆＮ２、および、プライマーＦＲ−Ｆ５およびＰＦＮＰ−２ＲからなるプライマーセットＰｆＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌であるペクチネイタス属菌Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ（ペクチネイタス・フリシンゲンシス）の検出方法である。
【０００９】
プライマー１６Ｆ−Ｆ：５’−  ＣＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴ  −３’（配列番号８）
プライマーＩＦ−Ｒ：５’−  ＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣ  −３’’  （配列番号９）
プライマーＦＲ−Ｆ２：５’−  ＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＴ  −３’（配列番号１０）
プライマーＦＲ−Ｒ３：５’−  ＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡ  −３’（配列番号１１）
プライマーＦＲ−Ｆ５：５’−  ＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＡＡＧＴ  −３’（配列番号１２）
プライマーＦＲ−Ｒ４：５’−  ＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡ  −３’（配列番号１３）
プライマーＰＦＮＰ−２Ｒ：５’−  ＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＧ  −３’（配列番号１４）
【００１０】
本発明はまた、プライマー１６Ｃ−ＦおよびＩＣ−Ｒからなる第１のプライマーセットＰｃＩＩを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＰＣＮＰ５ＦおよびＰＣＮＰ２Ｒ−ＸからなるプライマーセットＰｃＮ１、または、プライマーＰＣＮＰＦ６およびＰＣＮＰ２Ｒ−ＸからなるプライマーセットＰｃＮ２、を第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌であるペクチネイタス属菌Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ（ペクチネイタス・セレヴィシィフィルス）の検出方法である。
【００１１】
プライマー１６Ｃ−Ｆ：５’−  ＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴ  −３’  （配列番号１５）
プライマーＩＣ−Ｒ：５’−  ＣＡＣＴＣＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＴＡＣ  −３’  （配列番号１６）
プライマーＰＣＮＰ５Ｆ：５’−  ＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣ  −３’  （配列番号１７）
プライマーＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ：５’−  ＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＴＣ  −３’  （配列番号１８）
プライマーＰＣＮＰＦ６：５’−  ＡＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣ  −３’  （配列番号１９）
【００１２】
本発明はまた、プライマーＬＬＰ２およびＵＮＰ１からなる第１のプライマーセットＬＬを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＬＮＰＸＦ３およびＬＬＮＰＸＲ３からなるプライマーセットＬＬＮ、プライマーＬＬＮＰ３ＦおよびＬＬＮＰ１ＲからなるプライマーセットセットＬＬＮ２、および、プライマーＬＬＮＰ４ＦおよびＬＬＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＬＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ（ラクトバチルス・リンドネリ）の検出方法である。
【００１３】
プライマーＬＬＰ２：５’−  ＧＴＣＴＣＣＴＡＡＣＴＧＡＴＡＧＣＴ  −３’  （配列番号２０）
プライマーＬＬＮＰＸＦ３：５’−  ＴＴＧＡＣＧＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣ  −３’  （配列番号２１）
プライマーＬＬＮＰＸＲ３：５’−  ＧＣＡＧＴＴＧＣＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣ  −３’  （配列番号２２）
プライマーＬＬＮＰ３Ｆ：５’−  ＡＧＡＡＣＧＡＣＣＧＴＧＡＧＡＧＣ  −３’  （配列番号２３）
プライマーＬＬＮＰ１Ｒ：５’−  ＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＧＡ  −３’  （配列番号２４）
プライマーＬＬＮＰ４Ｆ：５’−  ＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＣＧＧＴＧ  −３’  （配列番号２５）
【００１４】
本発明はまた、プライマーＬ７４Ｐ４−３およびＵＮＰ１からなる第１のプライマーセットＬ７４を用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬ７４ＮＰＸＦおよびＬ７４ＮＰＸＲからなるプライマーセットＬ７４Ｎ、プライマーＬ７４ＮＰ１ＦおよびＬ７４ＮＰ２ＲからなるプライマーセットＬ７４Ｎ２、および、プライマーＬ７４ＮＰ２ＦおよびＬ７４ＮＰ２ＲからなるプライマーセットＬ７４Ｎ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（ラクトバチルス  ＡＢＢＣ７４）（特開２００２−３４５７８）（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）の検出方法である。
【００１５】
プライマーＬ７４Ｐ４−３：５’−  ＴＴＴＴＡＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＡＧ  −３’    （配列番号２６）
プライマーＬ７４ＮＰＸＦ：５’−  ＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＧＡ  −３’    （配列番号２７）
プライマーＬ７４ＮＰＸＲ：５’−  ＴＧＡＡＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴＣ  −３’    （配列番号２８）
プライマーＬ７４ＮＰ１Ｆ：５’−  ＴＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧ  −３’    （配列番号２９）
プライマーＬ７４ＮＰ２Ｒ：５’−  ＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣ  −３’    （配列番号３０）
プライマーＬ７４ＮＰ２Ｆ：５’−  ＧＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＴＧ  −３’    （配列番号３１）
【００１６】
本発明はまた、プライマーＬＣＰ１およびＵＮＰ１からなるプライマーセットＬＣまたはプライマーＬＣＰ１１およびＵＮＰ１からなるプライマーセットＬＣ２のいずれかを第１のプライマーセットとして試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＣＮＰ１ＦおよびＬＣＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＣＮを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ（ラクトバチルス・カゼイ）の検出方法である。
【００１７】
プライマーＬＣＰ１：５’−  ＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＣ  −３’    （配列番号３２）
プライマーＬＣＰ１１：５’−  ＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＣ  −３’    （配列番号３３）
プライマーＬＣＮＰ１Ｆ：５’−  ＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴ  −３’    （配列番号３４）
プライマーＬＣＮＰ１Ｒ：５’−  ＣＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＣＡＴＧ  −３’    （配列番号３５）
【００１８】
本発明はまた、プライマーＬＯＰ４およびＵＮＰ１からなるプライマーセットＬＯを第１のプライマーセットとして用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＯＮＰ２ＦおよびＬＯＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＯＮを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ（ラクトバチルス・コリニフォルミス）の検出方法である。
【００１９】
プライマーＬＯＰ４：５’−  ＧＧＧＡＣＴＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣＣ  −３’    （配列番号３６）
プライマーＬＯＮＰ２Ｆ：５’−  ＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡ  −３’    （配列番号３７）
プライマーＬＯＮＰ１Ｒ：５’−  ＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＣＣ  −３’    （配列番号３８）
【００２０】
本発明はまた、プライマーＬＰＰ１およびＵＮＰ１からなる第１のプライマーセットＬＰを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＰＮＰＸＦおよびＬＰＮＰＸＲからなるプライマーセットＬＰＮ、プライマーＬＰＮＰ２ＦおよびＬＰＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＰＮ２、および、プライマーＬＰＮＰ３ＦおよびＬＰＮＰ１ＲからなるプライマーセットＬＰＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害菌である乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ラクトバチルス・プランタルム）の検出方法である。
【００２１】
プライマーＬＰＰ１：５’−  ＴＧＧＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣ  −３’    （配列番号３９）
プライマーＬＰＮＰＸＦ：５’−  ＣＴＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＡＣ  −３’    （配列番号４０）
プライマーＬＰＮＰＸＲ：５’−  ＡＣＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣＡＧＡＴＡ  −３’    （配列番号４１）
プライマーＬＰＮＰ２Ｆ：５’−  ＴＴＧＡＣＧＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣ  −３’    （配列番号４２）
プライマーＬＰＮＰ１Ｒ：５’−ＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧ    −３’    （配列番号４３）
プライマーＬＰＮＰ３Ｆ：５’−  ＧＣＴＣＡＡＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＧ  −３’    （配列番号４４）
【００２２】
更に本発明は、プライマーＬＢＰ２（配列番号１）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＢ、並びに、プライマーＬＢＮＰＸＦ（配列番号３）およびＬＢＮＰＸＲ（配列番号４）からなるプライマーセットＬＢＮ、プライマーＬＢＰ３（配列番号５）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ２、および、プライマーＬＢＮＰ２Ｆ（配列番号７）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ３、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ検出用キットでもある。
【００２３】
本発明は、  プライマー１６Ｆ−Ｆ（配列番号８）およびＩＦ−Ｒ（配列番号９）からなる第１のプライマーセットＰｆＩＩ、並びに、プライマーＦＲ−Ｆ２（配列番号１０）およびＦＲ−Ｒ３（配列番号１１）からなるプライマーセットＰｆＮ１、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＦＲ−Ｒ４（配列番号１３）からなるプライマーセットＰｆＮ２、および、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＰＦＮＰ−２Ｒ（配列番号１４）からなるプライマーセットＰｆＮ３、からなる群より選ばれる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ検出用キットでもある。
【００２４】
また本発明は、プライマー１６Ｃ−Ｆ（配列番号１５）およびＩＣ−Ｒ（配列番号１６）からなる第１のプライマーセットＰｃＩＩ、並びに、プライマーＰＣＮＰ５Ｆ（配列番号１７）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ１、およびプライマーＰＣＮＰＦ６（配列番号１９）およびＰＣＮＰ２Ｒ−Ｘ（配列番号１８）からなるプライマーセットＰｃＮ２、からなる群より選ばれる１以上の第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ検出用キットでもある。
【００２５】
本発明は、プライマーＬＬＰ２（配列番号２０）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＬＮＰＸＦ３（配列番号２１）およびＬＬＮＰＸＲ３（配列番号２２）からなるプライマーセットＬＬＮ、プライマーＬＬＮＰ３Ｆ（配列番号２３）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットセットＬＬＮ２、および、プライマーＬＬＮＰ４Ｆ（配列番号２５）およびＬＬＮＰ１Ｒ（配列番号２４）からなるプライマーセットＬＬＮ３、からなる群より選ばれる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ検出用キットでもある。
【００２６】
本発明は、プライマーＬ７４Ｐ４−３（配列番号２６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬ７４、並びに、プライマーＬ７４ＮＰＸＦ（配列番号２７）およびＬ７４ＮＰＸＲ（配列番号２８）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ、プライマーＬ７４ＮＰ１Ｆ（配列番号２９）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ２、および、プライマーＬ７４ＮＰ２Ｆ（配列番号３１）およびＬ７４ＮＰ２Ｒ（配列番号３０）からなるプライマーセットＬ７４Ｎ３、からなる群より選ばれる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＡＢＢＣ７４（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）検出用キットでもある。
【００２７】
また本発明は、プライマーＬＣＰ１（配列番号３２）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣ、および、プライマーＬＣＰ１１（配列番号３３）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなるプライマーセットＬＣ２、からなる群より選ばれる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＣＮＰ１Ｆ（配列番号３４）およびＬＣＮＰ１Ｒ（配列番号３５）からなる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉの検出用キットでもある。
【００２８】
本発明は、プライマーＬＯＰ４（配列番号３６）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＯＮＰ２Ｆ（配列番号３７）およびＬＯＮＰ１Ｒ（配列番号３８）からなる第２のプライマーセットＬＯＮを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ検出用キットでもある。
【００２９】
更に、本発明は、プライマーＬＰＰ１（配列番号３９）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセット、並びに、プライマーＬＰＮＰＸＦ（配列番号４０）およびＬＰＮＰＸＲ（配列番号４１）からなるプライマーセットＬＰＮ、プライマーＬＰＮＰ２Ｆ（配列番号４２）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ２、および、プライマーＬＰＮＰ３Ｆ（配列番号４４）およびＬＰＮＰ１Ｒ（配列番号４３）からなるプライマーセットＬＰＮ３、からなる群より選ばれる第２のプライマーセットを含む、ビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ検出用キットでもある。
【００３０】
本発明のこれらのキットに含まれるプライマーセットを用いて、一般的な条件下においてＰＣＲを行うことによって各プライマーセットに対応したビール有害菌の各菌種に特異的な検出が可能である。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ビール中で生育し混濁事故を引き起こす可能性のある微生物、すなわち「ビール有害菌」が試料中に存在するか否かが、各菌種に特異的な２組のプライマーセットを用いたネスティッドＰＣＲによって判定される。ビール有害菌には、乳酸菌、例えばラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチル・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４；特開２００２−３４５７８；ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペクチネイタス属菌、例えば、ペクチネイタス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）およびペクチネイタス・セレヴィシィフィルス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）が含まれる。ビール製造において最も問題となるのはこれらの菌種である。また、ビール製造業界においては、特に上記の菌を含む、ビール製造において有害である菌を概念的に一括りにして「ビール有害菌」と呼ぶことがあり、この「ビール有害菌」を検出および同定する簡便且つ迅速な方法が望まれてきた。
本発明によって検査される対象物（試料または検体とも呼ぶ）は特に限定されないが、一般にはビールの製造工程において存在する、あるいは排出される一切の材料、中間産物、最終産物その他が含まれる。本発明における検体としは、製品ビール、半製品ビール、培養酵母液が特に適しており、また有用でもある。
【００３２】
本発明においては、検体中に含まれる微生物由来のＤＮＡ、特にビール有害菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲが行われる。必要に応じて検体の微生物を培養した後に、ＰＣＲを行うこともできる。ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡは通常ＰＣＲ工程中の高温処理によって微生物から流出するためＰＣＲに先立つ前処理は必須ではないが、ＤＮＡを簡便に抽出してもよい。例えば、リゾチームやＮ−アセチルムラミダーゼ等により細胞を溶解し、必要によりタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解し、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、水相にエタノールまたはイソプロパノール等を加え、遠心分離することによって、上述したビール有害菌から簡便にＤＮＡを抽出することができる。このような、ビール有害菌から簡便にＤＮＡを抽出する方法は当業者によく知られたものである。
例えば、ビール製造工程中のサンプル、あるいは排出物を各微生物に応じた適切な寒天培地上に塗布し、各微生物に応じた適切な条件下で培養し、出現したコロニーを上述したような処理にかけることができる。培地としては、例えばＭＲＳ寒天培地、ＧＡＭ寒天培地を利用することができる。その他の条件、例えば、温度、酸素等の条件は各微生物の特性に応じて選択することができる。
【００３３】
本発明においては特異性の高い増幅を行うためネスティッドＰＣＲ法（「入れ子ＰＣＲ法」とも呼ばれる）が行われる。ネスティッドＰＣＲ法は、増幅対象配列特異的な第１のプライマーセットを用いて１回目のＰＣＲを行い、次に第１のプライマーセットによって増幅されるＤＮＡ断片を増幅し得る１対のプライマーであって第１のプライマーセットと共通のプライマーを含まない第２のプライマーセットを用いて、第１のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応生成物を鋳型として２回目のＰＣＲを行う方法である。これによって、１回目のＰＣＲにおいて目的とするＤＮＡ断片以外が増幅されることがあったとしても、２回目のＰＣＲにおいて再びその目的とするＤＮＡ断片でないＤＮＡ断片が増幅される可能性が極めて低いため、増幅すべきＤＮＡ配列に非常に特性の高い増幅を行うことができる。１回目のＰＣＲにおいて増幅すべき断片の長さは特に限定されないが、取り扱いの容易さと反応条件の設定しやすさの観点から約１００〜約９００塩基対が好ましく、約２００〜約９００塩基対がより好ましく、約４００〜約９００塩基対であることが特に好ましい。２回目のＰＣＲにおいて増幅すべき断片の長さは、１回目のＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片より短いという点以外には特に限定されず、一般にＰＣＲにおいて適切な増幅が可能である範囲内であればよい。ここで本明細書において用語「プライマーセット」とは、ＰＣＲにおいてプライマーとして機能する２本のオリゴヌクレオチドの組をいい、用語「プライマー対」あるいは「プライマーの組」と互換的に使用される。
【００３４】
本発明において特異的増幅に用いるプライマーとしては、１６Ｓあるいは２３ＳリボゾームＲＮＡをコードする遺伝子（ｒＤＮＡ）の部分配列を有するオリゴヌクレオチドまたは、ｒＤＮＡ配列間に存在するスペーサー領域の部分配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。種々の生物のｒＤＮＡおよびスペーサー領域のヌクレオチド配列は当業者に知られており、本発明において検出対象とする乳酸菌およびペクチネイタス属菌を含むビール有害菌についてもこれらの配列情報は例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅａ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄから入手可能である。得られた配列情報を詳細に比較検討することによって、目的とする菌種に特異的な一群のプライマーが選択される。この場合、本発明においては２段階（２回）のＰＣＲを行うため、各段階におけるプライマーセットの特異性は必ずしも極めて高くなくてもよく、２回のＰＣＲを総合的に考慮して特異性の高い２つのプライマーセットを設計することができる。実際、各段階での各プライマーセットの特異性があまり高くない場合でも、異なるプライマーセットを用いて連続的に２回のＰＣＲを行った場合には高い特異性が得られることもある。
【００３５】
本発明においては、上述したような２本のオリゴヌクレオチドからなる第１のプライマー対を用いて試料中のＤＮＡを鋳型として１回目のＰＣＲを行い、更に、上述したような２本のオリゴヌクレオチドからなる第２のプライマー対を用いて１回目のＰＣＲの生成物を鋳型として２回目のＰＣＲが行われる。一方、増幅対象となるＤＮＡ断片（検出対象となるビール有害菌ＤＮＡ）を陽性対照として試料に用いた場合と同じ２種のプライマー対および反応条件を用いてＰＣＲを行うことができる。陽性対照として、一連の検査の対象となる菌種由来のＤＮＡを予め混合したＤＮＡ混合物を用いても良い。本発明に用いるプライマーは特異性が高いため、そのような混合物を鋳型とした場合でも各検査における陽性対照ＤＮＡのみを増幅することができる。  ＰＣＲの反応条件は一般的な条件で良く、例えば、約９５℃にて５〜１０分間処理した後、約９５℃にて１５〜秒間、約５５℃〜６０℃にて１５〜３０秒間、約７２℃にて１５〜３０秒間を２５〜３０サイクルでよい。これらの温度および時間はプライマーの長さおよびＧＣ含量等を考慮して、当業者の一般的能力の範囲で適宜変更することができることは言うまでもない。
【００３６】
増幅された核酸分子は、電気泳動等によってその存在およびヌクレオチド長（大きさ）を確認することができる。単に存在だけを知るためには、予めプライマーを標識しておき、ＰＣＲ後、ゲルろ過等により短いオリゴヌクレオチドを除去し、残存する標識を調べることができる。より正確には、存在及び長さ（大きさ）を同定し、陽性対照と同じ大きさの分子が試料を増幅対象としたＰＣＲ産物において観察された場合に（例えば、ゲル電気泳動上のバンドとして）、検出対象とした微生物、特にビール有害菌が存在していたと判断することができる。そのような分子が観察されない場合には、試料中には検出対象の微生物が存在していなかったと判断することができる。本発明において検査対象とするビール有害菌はいずれも商業的に入手可能、あるいは公的機関から分譲を受けることが可能である。
【００３７】
本発明の一つの実施態様において、上述のＬＢＰ２（配列番号１）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる第１のプライマーセットＬＢを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＢＮＰＸＦ（配列番号３）およびＬＢＮＰＸＲ（配列番号４）からなるプライマーセットＬＢＮ、プライマーＬＢＰ３（配列番号５）およびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ２、および、プライマーＬＢＮＰ２（配列番号７）ＦおよびＬＢＮＰ１Ｒ（配列番号６）からなるプライマーセットＬＢＮ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことによって、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓの存在の有無が検出される。陽性対照としてはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（例えば、ＤＳＭ２００５４）のゲノムＤＮＡを利用することができる。
【００３８】
本発明の別の実施態様においては、プライマー１６Ｆ−Ｆ（配列番号８）およびＩＦ−Ｒ（配列番号９）からなる第１のプライマーセットＰｆＩＩを用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＦＲ−Ｆ２（配列番号１０）およびＦＲ−Ｒ３（配列番号１１）からなるプライマーセットＰｆＮ１、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＦＲ−Ｒ４（配列番号１３）からなるプライマーセットＰｆＮ２、および、プライマーＦＲ−Ｆ５（配列番号１２）およびＰＦＮＰ−２Ｒ（配列番号１４）からなるプライマーセットＰｆＮ３、からなる群より選ばれる第２のプラマーセットを用いて第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことにより、ペクチネイタス属菌Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓが検出される。陽性対照としては、例えば、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ６３０６のゲノムＤＮＡを使用することができる。
【００３９】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表１に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＰ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓが検出される。
【表１】
表１．Ｐ．ｃｅｒｅｖｉｉｓｉｐｈｉｌｕ検出用プライマーセット
2005006556.tif 000002
【００４０】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表２に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉが検出される。
【００４１】
【表２】
表２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ検出用プライマーセット
2005006556.tif 000003
【００４２】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表３に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４が検出される。
【表３】
表３．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４検出用プライマーセット
2005006556.tif 000004
【００４３】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表４に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉが検出される。
【表４】
表４．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ検出用プライマーセット
2005006556.tif 000005
【００４４】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表５に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓが検出される。
【表５】
表５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ検出用プライマーセット
2005006556.tif 000006
【００４５】
更にまた、本発明の別の実施態様においては、上述した方法と同様にして、以下の表６に示したプライマーセットの組み合わせを用いることにより、試料中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍが検出される。
【表６】
表６．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ検出用プライマーセット
2005006556.tif 000007
【００４６】
また１回目、２回目の各ＰＣＲにおけるプライマーの設計及び選択においては更に一般にＰＣＲ用プライマーとして望ましい条件を十分に考慮して行うことができる。そのような条件は当業者にはよく知られたものであり、そのためのコンピュータプログラムも商業的に入手可能である。また、本発明のプライマーは、検出可能な適当な物質で標識されていてもよく、１〜８ヌクレオチドからなる追加の配列が５’末端側に付加されていてもよい。例えば、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定する目的でこの断片を適当なベクターにクローニングできるように、各プライマーの５’末端に制限酵素の認識配列を含む６〜８ヌクレオチド程度の配列を付加することもできる。その場合に特異性を失わないように、上述したようなコンピュータープログラムを使用することもできる。
【００４７】
これらの各プライマーセットは、１回目のＰＣＲに使用するプライマーセットを第１のプライマーセットとし、２回目のＰＣＲに使用するプライマーセットを第２のプライマーセットとして、検出対象となる菌種に応じて第１のプライマーセットおよび第２のプライマーセットを組み合わせてキットとすることができる。また、複数の菌種を検出するために、各菌種に対応した複数のプライマーセットを同一キットに含めることもでき、更に、キットに含まれる一の菌種検出用のプライマーは、第１のプライマーセット、第２のプライマーセットを、それぞれ１づつ含んでも複数組含んでいてもよい。
【００４８】
【実施例】
実施例１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）の検出
（１）試料の調製
あらかじめ滅菌しておいた綿棒を用いて工場排水口のふき取り試験を実施した。検体をＭＲＳ寒天培地（メルク社；１リットルあたり、ペプトン１０．０ｇ、肉エキストラクト８．０ｇ、酵母エキストラクト４．０ｇ、Ｄ−グルコース２０．０ｇ、リン酸水素二カリウム２．０ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  １．０ｇ、クエン酸水素二アンモニウム２．０ｇ、酢酸ナトリウム５．０ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、硫酸マンガン０．０４ｇ、寒天１５．０ｇ、ｐＨ  ５．８）に塗沫し、２５℃にて１週間嫌気培養を行った。得られた微生物コロニーを３個単離し、さらにＭＲＳ寒天培地に塗沫し、同様の条件で嫌気培養を行うことによりそれぞれについて単一コロニーを得た。
得られた菌体約１０８細胞を細胞溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５ｍＭシュークロース（ｐＨ８．０）、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ社）、５０μｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生化学工業社））０．９ｍｌに懸濁し、３７℃にて１時間インキュベートすることにより溶菌した。インキュベート後、背散るトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍｇ／ｍｌ  ＣＴＡＢ、４０ｍｇ／ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（ｐＨ８．０）、８０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ナカライテスク社））２ｍｌを添加し、５０℃で２時間インキュベートすることによりタンパク質分解を行った。
【００４９】
インキュベート後、この溶液に２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（９７：３）の混合液を加え、よく懸濁した。１，０００  ｘ  ｇにて１０分間遠心分離を行い、水相と溶媒相（クロロホルム−イソアミルアルコール混合液）に分離した。水相２ｍｌを新しい１５ｍｌ遠心チューブに採取し、等量のイソプロパノールを加えてよく混和し、４℃にて１時間放置してＤＮＡを析出させた。放置後、１，０００  ｘ  ｇにて１０分間遠心分離を行うことにより、菌由来ＤＮＡをペレット化した。得られたペレットを７０％エタノール１ｍｌで洗浄後、風乾し、０．５ｍｌ  Ｔｒｉｓバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解し、抽出ＤＮＡ溶液を得た。
【００５０】
（２）ＰＣＲ
得られた抽出ＤＮＡ溶液５μｌを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。
Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ１０５９に特異的になるよう設計されたプライマーセットＬＢ（プライマーＰＢＰ２（配列番号１）およびＵＮＰ１（配列番号２）からなる）（図１）を各プライマーが最終濃度１  ｐｍｏｌ／μｌとなるように用いて、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ試薬はすべて宝酒造社製ＰＣＲ用酵素ＥＸ  Ｔａｑを用い、サーマルサイクラーはＡＢＩ社のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用いた。陽性対照としては、Ｌａｃｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＤＳＭ２００５４から上述したように抽出したＤＮＡを鋳型として用いた。
【００５１】
2005006556.tif 000008
【００５２】
2005006556.tif 000009
【００５３】
上述のＰＣＲ反応により得られた反応液５μｌをアガロースゲル電気泳動（２％ｗ／ｖ、ＴＡＥバッファー（１Ｌあたり、Ｔｒｉｓ  ４．８ｇ、酢酸１．１４ｍｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に供した（１００Ｖ、３０分間）。電気泳動後、サイバーグリーンにより３０分間染色し、陽性対照と同じ分子量のＰＣＲ産物の存在を調べた。アガロースはＳｉｇｍａ社のＡ−９５３９を用い、ＴＡＥ緩衝液はナカライ・テスク社製のものを用いた。また、サイバーグリーンはＢＭＡ社のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ  １０μｌを１００ｍｌのＴＡＥバッファーに添加して調製した。
上述の第１のＰＣＲにより、単離した３株のいずれについても陽性対照と同じ塩基長のＰＣＲ産物が得られた。次に、このＰＣＲ反応液１μｌ中の反応生成物をテンプレートとして第２のＰＣＲを行った（ネスティッドＰＣＲ）。第２のＰＣＲのために、プライマーセットとして、ＬＢＮ（配列番号３および４に記載の配列を有するプライマーからなる）、ＬＢＮ２（配列番号５および６に記載の配列を有するプライマーからなる）およびＬＢＮ３（配列番号７および６に記載の配列を有するプライマーからなる）を使用した（図１）。
ＰＣＲの反応条件は以下の通りである。
【００５４】
2005006556.tif 000010
【００５５】
2005006556.tif 000011
【００５６】
第２のＰＣＲにより得られたＰＣＲ反応液１０μｌを第１のＰＣＲ反応物と同様にアガロース電気泳動に供し、陽性対照と同じ分子量のＰＣＲ産物の有無を調べた。
ビール有害細菌Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ１０５９に対する３種の特異的プライマーセットＬＢＮ、ＬＢＮ２およびＬＢＮ３（図１）を使用した結果、いずれのプライマーセットを用いた場合も増幅断片が観察されなかった。従って、試料中にＬ．ｂｒｅｖｉｓが存在しなかったと判定した。
【００５７】
実施例２．Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓの検出
あらかじめ滅菌しておいた綿棒を用いて工場排水口のふき取り試験を実施した。検体をＧＡＭ寒天培地（日水製薬社；１リットルあたり、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素ナトリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、寒天１５．０ｇ、ｐＨ  ７．１）に塗沫し、３０℃にて１週間嫌気培養を行った。得られた微生物コロニーを３個単離し、さらにＧＡＭ寒天培地に塗沫し、同様の条件で嫌気培養を行うことによりそれぞれについて単一コロニーを得た。
実施例１と同じ条件で菌体からＤＮＡを抽出し、第１のＰＣＲ反応を行った。
Ｐ．  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ６３０６に特異的なプライマー・セットＰｆ  ＩＩ（図２）を各プライマー（配列番号８および９に記載の配列を有するプライマー）が最終濃度１  ｐｍｏｌ／μｌとなるように用いて以下の条件でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、実施例１に記載したのと同様である。得られたＰＣＲ産物を実施例１と同様にして電気泳動に供し、染色後、陽性対照と同じ分子量を持つＰＣＲ産物の存在について調べた。第１のＰＣＲにより、単離した３株のいずれについても陽性対照と同じ塩基長のＰＣＲ産物が得られた。
【００５８】
次に、このＰＣＲ反応液１μｌ中の反応生成物をテンプレートとして第２のＰＣＲを行った（ネスティッドＰＣＲ）。プライマーセットとして、ＰｆＮ１（配列番号１０および１１に記載の配列を有するプライマーからなる）、ＰｆＮ２（配列番号１２および１３に記載の配列を有するプライマーからなる）およびＰｆＮ３（配列番号１２および１４に記載の配列を有するプライマーからなる）を用いた。
第２のＰＣＲにより得られたＰＣＲ反応液１０μｌをアガロース電気泳動（２％  Ｗ／Ｖ、  ＴＡＥ  緩衝液）に供した。電気泳動後、サイバーグリーンにより染色し、当該分子量のＰＣＲ産物の有無を調べた。アガロースはＳｉｇｍａ社のＡ−９５３９を用い、ＴＡＥ緩衝液はナカライ・テスク社製のものを用いた。また、サイバーグリーンはＢＭＡ社のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを使用した。
ビール有害細菌Ｐ．  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ６３０６に対する３種の特異的プライマーセット（ＰｆＮ１（配列番号１０および１１）、ＰｆＮ２（配列番号１２および１３）、ＰｆＮ３（配列番号１２および１４））（図２）を使用した結果、いずれのプライマーセットを使用した場合も所定のバンドが観察され、試料中に存在したビール有害菌はＰ．  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓであることが確認された。
【００５９】
実施例３．その他のビール有害菌の検出および特異性の確認
８種のビール有害菌に対するＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用プライマーセットについて特異性を試験した。各プライマーセットは、各菌種に特異的なｒＤＮＡ配列に基づいて設計したものである。設計したプライマーセットを用いて実施例１または２と同様にＰＣＲ反応を行い、電気泳動によって、各菌種の遺伝子配列から予想される分子量に応じたＤＮＡ分子が検出されるか否かにより特異性を判定した。
代表的な例として、Ｐ．ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓに関する結果を図３に示す。ＰＣＲの条件及び用いたプライマーは実施例２と同じである。Ｐ．ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ６３０６、Ｐ．ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ２０４６７、Ｓ．ｌａｃｔｉｃｉｆｅｘ  ＤＳＭ２０７５７、Ｚ．ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ  ＤＳＭ２０７５６、Ｚ．ｒａｆｆｉｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ  ＤＳＭ２７６５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅が見られた場合に“＋”、見られなかった場合に“−”として表した。図３に示したように、Ｐ．ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  用に設計したプライマーセットはＰ．ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ６３０６のゲノムＤＮＡのみを特異的に増幅した。
同様にして、プライマーゼットＬＢ（配列番号１および２に記載のプライマーからなる）＋ＬＢＮ２（配列番号３および４に記載のプライマーからなる）、プライマーゼットＬＢ（配列番号１および２に記載のプライマーからなる）＋ＬＢＮ３（配列番号５および４に記載のプライマーからなる）を用いたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより、いずれの場合もＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓのゲノムＤＮＡが特異的に増幅されることが示された。
【００６０】
さらに、プライマーセットｐｃＩＩ＋ｐｃＮ１、ｐｃＩＩ＋ｐｃＮ２（表１参照）によりＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓのゲノムＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＬＬ＋ＬＬＮ、ＬＬ＋ＬＬＮ２、ＬＬ＋ＬＬＮ３（表２参照）によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉゲノムＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＬＬ７４＋Ｌ７４Ｎ、Ｌ７４＋Ｌ７４Ｎ２、Ｌ７４＋Ｌ７４Ｎ３（表３参照）によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４ゲノムＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＬＣ＋ＬＣＮ、ＬＣ２＋ＬＣＮ（表４参照）によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉゲノムＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＬＯ＋ＬＯＮ（表５参照）によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓゲノムＤＮＡが特異的に増幅され、プライマーセットＬＰ＋ＬＰＮ、ＬＰ＋ＬＰＮ２、ＬＰ＋ＬＰＮ３（表６参照）によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍゲノムＤＮＡが特異的に増幅されることが確認された。
【発明の効果】
従来のＰＣＲ法を用いてわずかの菌数の有害菌を検出しようとする場合、有害菌が存在するかどうかの判定が混乱させる、ごく薄いバンドが生じることがある。このような場合であっても本発明により、確実に陽性か陰性かを判定することが可能になる。従って、本発明により品質管理検査などで問題となる擬陽性反応を回避することができる。
【００６１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ検出用のプライマーセットの名称および配列を示したものである。「第１のＰＣＲ」と記載されたプライマーセットはｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおける最初のＰＣＲに使用するプライマーセットを意味し、「第２のＰＣＲ」と記載されたプライマーセットはｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにおいて前記「第１のＰＣＲ」に続く第２のＰＣＲにおいて使用するプライマーセットを意味する。
【図２】図２は、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ検出用のプライマーセットの名称および配列を示したものである。「第１のＰＣＲ」、「第２のＰＣＲ」の意味は図１におけるのと同じである。
【図３】図３は、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ  ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ用プライマーを用いたＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲの特異性を示したものである。各プライマーセットに含まれるプライマーは図２に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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