(57)【要約】      （修正有）【課題】融解曲線分析の増感試薬及び融解曲線分析用組成物であって、核酸の融解曲線分析を高感度で行える安価な試薬及び組成物、並びに安価に行えるとともに高感度な核酸の融解曲線分析方法を提供する。【解決手段】ポリアミン錯体を含む核酸の融解曲線分析増感試薬。代表的なポリアミン錯体は、以下の構造式（１）で表される化合物である。2005338024.tif 000010【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミン錯体を含む、核酸の融解曲線分析増感試薬。
【請求項２】
ポリアミン錯体が環状ポリアミン錯体である請求項１に記載の増感試薬。
【請求項３】
ポリアミン錯体がポリアミン亜鉛錯体である請求項１に記載の増感試薬。
【請求項４】
ポリアミン錯体が環状テトラアミン亜鉛錯体である請求項２又は３に記載の増感試薬。
【請求項５】
環状テトラアミン亜鉛錯体が下記の構造式（１）で表される化合物である請求項４に記載の増感試薬。
【化１】
2005338024.tif 000009
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬、核酸の融解指示薬、及び２本鎖核酸を含む核酸の融解曲線分析用組成物。
【請求項７】
ポリアミン錯体の濃度が１〜500mMである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬の存在下で、核酸の融解曲線分析を行う方法。
【請求項９】
融解曲線分析機器を用いて２本鎖核酸及び核酸融解指示薬を含むサンプル溶液を昇温させつつこの指示薬によるシグナル強度の変化を監視する融解曲線分析において、請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬を含むサンプル溶液を用いる融解曲線分析方法。
【請求項１０】
(i)  請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬及び核酸融解指示薬を含む被験２本鎖核酸溶液、並びに請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬及び核酸融解指示薬を含む野生型２本鎖核酸溶液について、それぞれ融解曲線分析機器を用いて分析することにより融解曲線を得る工程と、
(ii)  両核酸の融解曲線を比較することにより、被験２本鎖核酸に変異が存在するか否かを判定する工程と
を含む核酸の融解曲線分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融解曲線分析により核酸の変異や多型などを検出する際に用いられる融解曲線分析増感試薬、融解曲線分析用組成物、及びそれらを用いた核酸の融解曲線分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、融解曲線分析は、核酸、特にＤＮＡの配列の差異を分析することを目的に広く使用されている。
【０００３】
２本鎖ＤＮＡの半分が１本鎖になる温度を融解温度（Ｔｍ）と呼ぶ。ＤＮＡのＴｍ値は、基本的に、そのＤＮＡに含まれている塩基の含量に依存しているため、ＤＮＡ断片は、そこに含まれる塩基の含量に応じた固有のＴｍ値を持つ。融解曲線分析は、ＤＮＡが有する、ある一定の温度で２本鎖から１本鎖に解離するという性質を利用した解析方法である。
【０００４】
また、融解曲線分析は、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン、ＬＣグリーンのようなインターカレーターの性質を利用している。インターカレーターは２本鎖ＤＮＡのマイナーグローブに結合し、励起をうけることにより発光する。一方、ＤＮＡと結合していないフリーのインターカレーターは励起を受けてもほとんど発光しない。インターカレーターが結合したＤＮＡを昇温させていくと、ある融解温度点において２本鎖から１本鎖に解離すると同時にインターカレーターが遊離される。遊離したインターカレーターは発光を伴わないため、結果的に融解温度点において発光シグナルが急激に減衰する。
【０００５】
温度変化に対して発光シグナル強度をリアルタイムでモニタリングし、温度に対して、発光シグナル強度の変化（−ｄＩ）を温度変化（ｄＴ）の値で微分した一次微分値をプロットすると、得られる融解曲線（温度−一次微分値曲線）において、Ｔｍをピークとして表示することができるようになる。このように、一般的な融解曲線分析は、インターカレーターの性質を利用した方法といえる。
【０００６】
融解曲線分析のより具体的な応用分野は、核酸の変異の検出である。核酸に変異が生じると、Ｔｍの変化が検出される。変異は、多くの場合疾患の原因となる。今後の医学、遺伝子診断研究の進展と共に、鎌形赤血球貧血のように単一の点突然変異が重篤な疾患の原因となる例が多く見い出されることが予想される。
【０００７】
核酸の変異の検出を行うサンプルには、変異体とオリジナルの遺伝子のいずれかが単一のもの(ホモ)と、変異体とオリジナルの遺伝子が混合されたもの（ヘテロ）とに分類される。検出する変異が致死的なものであれば、変異体のホモはサンプルとしては存在し得ないため、通常は、ヘテロ変異体を検出することとなる。ヘテロなサンプルは、変異体とオリジナル遺伝子が混合された状態のままで加熱（１本鎖への解離）及び冷却（アニーリング）する。それにより、ミスマッチ（AG、TG、AC、TC）部分をもつ２本鎖遺伝子を形成させる。ミスマッチ部分をもつ２本鎖遺伝子は、２本鎖構造の変性が容易に起き、オリジナルの遺伝子より融解温度は低くなる。したがって、Ｔｍの変化を検出する融解曲線分析は、このような変異検出に有効である。
【０００８】
このように、融解曲線分析は利便性が高いという長所により広く普及する可能性の高い方法であるが、現在のところ、その検出能力には限界がある。すなわち、従来の融解曲線分析による遺伝子変異検出方法では、数塩基程度、特に１塩基の変異の検出が困難である。検出の困難さは、対象となる遺伝子の配列や実験条件に依存し、変異により融解曲線が明確に変化しない場合が多い。変異の位置および個数が既知である場合は、分析条件を種々検討することにより変異の検出に最適な条件を採用することができる。しかし、遺伝子変異の位置および個数が未知である一般的なサンプルの場合、それぞれのサンプルに応じた最適分析条件を検討できず、その結果、変異を検出できない場合がある。
【０００９】
融解曲線分析における核酸の分離能力が改善されることにより、種々の基礎研究分野、産業分野への応用が可能となる。
【００１０】
また、１〜数塩基の遺伝子変異を検出する方法であって融解曲線分析以外の方法としては、従来、遺伝子配列の違いに基づいた遺伝子の物理化学的性質の差を利用した方法や、変異配列に相補的な核酸分子を利用したＤＮＡマイクロアレイ法、変異配列の質量の差を利用した質量分析法などが知られている。これらの方法にはそれぞれ長所及び短所があり、遺伝子変異の解析規模や解析目的に応じて選択されて利用されている。しかし、いずれの方法も高価な装置や試薬を必要とする。
【００１１】
従って、安価で簡便な融解曲線分析方法であって、核酸の配列の差異の検出感度が改善された方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、核酸の融解曲線分析の増感試薬及び核酸の融解曲線分析用組成物であって、核酸の融解曲線分析を高感度で行える安価な試薬及び組成物、並びに安価に行えるとともに高感度な核酸の融解曲線分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討し、核酸の融解曲線分析を行うに当たり、核酸溶液中にポリアミン錯体を含ませておくことにより、同一塩基数の核酸において、核酸配列の差異の検出感度が著しく向上することを見出した。また、これにより１塩基の差異さえ検出できることを見出した。
【００１４】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の核酸の融解曲線分析増感試薬、核酸の融解曲線分析用組成物、及び融解曲線分析方法を提供する。
【００１５】
項１．  ポリアミン錯体を含む核酸の融解曲線分析増感試薬。
【００１６】
項２．  ポリアミン錯体が環状ポリアミン錯体である項１に記載の増感試薬。
【００１７】
項３．  ポリアミン錯体がポリアミン亜鉛錯体である項１に記載の増感試薬。
【００１８】
項４．  ポリアミン錯体が環状テトラアミン亜鉛錯体である項２又は３に記載の増感試薬。
【００１９】
項５．  環状テトラアミン亜鉛錯体が下記の構造式（１）で表される化合物である項４に記載の増感試薬。
【００２０】
【化１】
2005338024.tif 000002
【００２１】
項６．  項１〜５のいずれかに記載の増感試薬、核酸の融解指示薬、及び２本鎖核酸を含む核酸の融解曲線分析用組成物。
【００２２】
項７．  ポリアミン錯体の濃度が１〜500mMである項６に記載の組成物。
【００２３】
項８．  項１〜５のいずれかに記載の増感試薬の存在下で、核酸の融解曲線分析を行う方法。
【００２４】
項９．  融解曲線分析機器を用いて２本鎖核酸及び核酸融解指示薬を含むサンプル溶液を昇温させつつこの指示薬によるシグナル強度の変化を監視する融解曲線分析において、項１〜５のいずれかに記載の増感試薬を含むサンプル溶液を用いる融解曲線分析方法。
【００２５】
項１０．  (i)  項１〜５のいずれかに記載の増感試薬及び核酸融解指示薬を含む被験２本鎖核酸溶液、並びに請求項１〜５のいずれかに記載の増感試薬及び核酸融解指示薬を含む野生型２本鎖核酸溶液について、それぞれ融解曲線分析機器を用いて分析することにより融解曲線を得る工程と、
(ii)  両核酸の融解曲線を比較することにより、被験２本鎖核酸に変異が存在するか否かを判定する工程と
を含む核酸の融解曲線分析方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、効果的かつ安価な、核酸の融解曲線分析増感試薬、及び核酸の融解曲線分析用組成物、並びに安価に行えるとともに高感度な核酸の融解曲線分析方法が提供された。
【００２７】
さらにいえば、汎用の融解曲線分析装置を用いて核酸の配列の差異を検出するに当たり、本発明の増感試薬を被験核酸を含む溶液及び対応する野生型核酸を含む溶液に添加しておくだけで、簡単に、検出感度を向上させることができる。特に、本発明の増感試薬を使用することにより、１塩基の差異から検出できるようになる。また、このように簡単に融解曲線分析の感度を向上させることができることから、分析機器の種類を選ばず、また多数の検体の処理にも適している。また、本発明の増感試薬は、安価で安全な試薬である。
【００２８】
本発明により、核酸の融解曲線分析の基礎研究分野及び産業分野への応用が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）核酸の融解曲線分析増感試薬
本発明の核酸の融解曲線分析増感試薬は、ポリアミン錯体を含む増感試薬（特に、ポリアミン錯体からなる増感試薬）である。本発明で用いられるポリアミン錯体は、核酸への結合能を有するものであればよく、特に限定されない。核酸への結合部位は特に限定されず、塩基部分、リン酸部分、糖部分のいずれに結合するものであってもよい。
【００３０】
このようなポリアミン錯体の配位子であるポリアミンとしては、例えば、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、ジプロピルトリアミンのような鎖状ポリアミン；1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン、1,5,9-トリアザシクロドデカンのような環状ポリアミンなどが挙げられる。中心金属としては、特に限定されないが、例えば、亜鉛、銅、ニッケル、コバルト、マンガン、マグネシウムなどが挙げられ、特に亜鉛が好ましい。また中でも、配位結合の強度の点で、環状ポリアミン錯体が好ましく、環状ポリアミン亜鉛錯体がより好ましい。
【００３１】
また、環状ポリアミン錯体としては、例えば、環状トリアミン錯体、環状テトラアミン錯体、環状ペンタアミン錯体などが挙げられる。中でも、環状テトラアミン錯体が好ましく、環状テトラアミン亜鉛錯体がより好ましい。
【００３２】
さらに、本発明のポリアミン錯体は、塩を形成していることが好ましく、このような塩として、塩酸塩、硝酸塩、臭化物塩、過塩素酸塩などが挙げられる。
【００３３】
好ましい環状テトラアミン亜鉛錯体として、以下の構造式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００３４】
【化２】
2005338024.tif 000003
【００３５】
また、その他の環状ポリアミン錯体の具体例として、以下の構造式（２）〜（６）の化合物などを例示できる。
【００３６】
【化３】
2005338024.tif 000004
【００３７】
【化４】
2005338024.tif 000005
【００３８】
【化５】
2005338024.tif 000006
【００３９】
【化６】
2005338024.tif 000007
【００４０】
【化７】
2005338024.tif 000008
【００４１】
ポリアミン錯体は常法に従い合成できる。例えば、構造式（１）の環状テトラアミン亜鉛錯体は、市販の1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン（サイクレン）と硝酸亜鉛六水塩を原料として、次のようにして合成できる。すなわち、硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）とサイクレンとをエタノールなどの溶媒に添加して溶解する。この溶液を撹拌しながら加熱処理する。処理後の溶液を濾紙などでろ過し、ロータリーエバポレーターなどを用いてゆっくり濃縮する。この濃縮により無色プリズム結晶が析出するので、濃縮液を室温で１〜数時間放置した後、グラスフィルターなどを用いてその結晶を濾取し、減圧乾燥すると、構造式（１）のサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩が高収率で得られる。
【００４２】
融解曲線分析における融解曲線を、例えば、野生型の２本鎖核酸とヘテロ変異型の２本鎖核酸との間で比較すると、ヘテロ変異型では、ミスマッチ部分を有するために、変性し易く、その分、融解温度（Ｔｍ）が低温側にシフトしている。従来の融解曲線分析では、このシフト幅が小さく、また融解曲線の形状自体が両者間で紛らわしいため、いずれが変異型であるかさえ判別できない傾向にあった。
【００４３】
本発明の増感試薬を核酸溶液に添加することにより、変異による核酸の融解温度（変性温度）の低温側へのシフトが増大する。
【００４４】
具体的には、例えばAT対のGC対への変異、GC対のAT対への変異のようなチミンの数が変化した遺伝子変異の検出感度が増大する。また、例えばAT対のTA対への変異、GC対のCG対への変異のように、２本鎖の塩基の配列が互いの鎖で置き換わった場合は、本発明の増感試薬の添加によっても融解温度のシフトは増大しない。従って、本発明の増感試薬を使用して融解曲線分析を行うに当たっては、このような変異の検出をも増感できるように、好ましくは、変異体とオリジナルの遺伝子を混合した状態で加熱（１本鎖への解離）と冷却（アニーリング）を行い、それによりミスマッチ（AG、TG、AC、TC）部分をもつ２本鎖遺伝子を形成させた被験核酸を使用すればよい。ミスマッチ部分をもつ２本鎖遺伝子は、オリジナルの遺伝子より変性温度は低くなる。
【００４５】
本発明の増感試薬を用いることにより、チミン以外の塩基が変異している場合でも、変異による２本鎖核酸の変性が促進されて遺伝子変異の検出感度が向上する。
【００４６】
本発明の核酸の融解曲線分析増感試薬は、ポリアミン錯体を含む水性組成物であってよい。水性組成物中のポリアミン錯体の濃度は10〜500mM程度が好ましい。この範囲であれば、組成物中でポリアミン錯体が析出し難い。
【００４７】
この水性組成物は、さらに緩衝剤が含まれることにより緩衝液となっていてもよい。緩衝剤は、組成物のpHを中性ないしアルカリ性付近（pH６〜８程度）に保つことができるものであればよく、特に限定されない。使用可能な緩衝液としては、例えば、リン酸−リン酸塩緩衝液、トリス塩酸塩緩衝液、トリシン緩衝液などを例示できる。緩衝剤の濃度は、10〜100mM程度が好ましい。
【００４８】
また、本発明の核酸の融解曲線分析増感試薬は、ポリアミン錯体を含む固体組成物であってもよい。この場合も、例えば緩衝剤が含まれていることができる。
（II）核酸の融解曲線分析用組成物
本発明の核酸の融解曲線分析用組成物は、ポリアミン錯体、核酸融解指示薬及び２本鎖核酸を含む組成物である。この組成物は、通常水性組成物であり、融解曲線分析において分析機器にアプライされて、融解曲線分析に供されるものである。好ましいポリアミン錯体については前述した通りである。
【００４９】
この組成物中のポリアミン錯体の含有割合は、通常１〜500mM程度が好ましく、１〜10mM程度がより好ましく、２〜５mM程度がさらにより好ましい。ポリアミン錯体の濃度が上記範囲であれば、その効果が十分に得られるとともに、組成物中でポリアミン錯体が析出し難い。
【００５０】
この組成物には、融解曲線分析に使用される融解指示薬が含まれる。融解指示薬は、２本鎖核酸に結合している間には例えば蛍光などのシグナルを発し、２本鎖核酸が融解（解離）するとそのシグナルが低下することにより、２本鎖核酸の解離を示す指示薬である。核酸融解指示薬には、例えばインターカレーターや標識されたハイブリダイゼーションプローブなどが含まれる。
【００５１】
インターカレーターの種類は特に限定されず、例えば臭化エチジウム、サイバーグリーン（SYBRグリーン）、LCグリーン、ナフタレンジイミドなどの公知のものを制限なく使用できる。インターカレーターの濃度は、通常、それに添付されたマニュアルに従えばよい。
【００５２】
また標識されたハイブリダイゼーションプローブは、２本鎖核酸に結合して標識に応じたシグナルを発するとともに、２本鎖核酸が融解するとその核酸から解離してシグナルが消失するものであればよい。このようなプローブは１本鎖核酸であり、プローブの長さは好ましくは15〜30塩基程度である。また、プローブ内に相補的な配列を含まないことが好ましく求められる。
【００５３】
ハイブリダーゼーションプローブの濃度は、核酸及びハイブリダーゼーションプローブの種類によって異なるが0.01μM〜1mM程度が好ましく、0.1〜100μM程度がより好ましい。ハイブリダーゼーションプローブの濃度が上記範囲であれば、その効果が十分に得られるとともに、非特異的な結合が生じ難い。
【００５４】
２本鎖核酸の種類については後述する。また、組成物中の核酸の濃度は、通常0.01μM〜1mM程度とすればよく、0.1〜10μM程度とすることが好ましい。
【００５５】
この組成物は、さらに緩衝剤が含まれることにより緩衝液となっていてもよい。緩衝液は、組成物のpHを中性ないしは弱アルカリ性付近（pH６〜８程度）に保つことができるものであればよく、特に限定されない。使用可能な緩衝液は前述した通りである。緩衝液の濃度は、10〜100mM程度が好ましく、20〜50mM程度がより好ましい。
（III）核酸の融解曲線分析方法
本発明の核酸の融解曲線分析方法は、ポリアミン錯体の存在下で被験２本鎖核酸の融解曲線分析を行う方法である。即ち、本発明の核酸の融解曲線分析方法は、上記説明した本発明の融解曲線分析用組成物を融解曲線分析に供する方法である。
【００５６】
詳細には、本発明の核酸の融解曲線分析方法は、融解曲線分析機器を用いて、２本鎖核酸及び融解指示薬を含むサンプル溶液を昇温させつつ融解指示薬によるシグナル強度の変化を監視する融解曲線分析において、ポリアミン錯体を含むサンプル溶液を使用する方法である。サンプル溶液としては、上記説明した本発明の融解曲線分析用組成物を使用する。また、サンプル溶液としては、被験核酸を含むサンプル溶液と、対応する野生型核酸を含むサンプル溶液を、それぞれ使用する。
【００５７】
より詳細には、本発明の核酸の融解曲線分析方法は
(i)  ポリアミン錯体及び核酸融解指示薬を含む被験２本鎖核酸溶液、並びにポリアミン錯体及び核酸融解指示薬を含む対応野生型２本鎖核酸溶液を、それぞれ融解曲線分析機器を用いて分析することにより融解曲線を得る工程と、
(ii)  両核酸の融解曲線を比較することにより、被験２本鎖核酸に変異が存在するか否かを判定する工程と
を含む方法である。
【００５８】
本発明方法の対象となる２本鎖核酸は、特に制限されず、ＤＮＡやＲＮＡなどのいずれであってもよい。また、核酸を酵素処理したものであってもよい。また、核酸は、細菌、始原菌、酵母、カビ、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、植物組織、動物組織、血液、血清、血漿、髄液、尿などのいずれの生物試料から調製されたものであってもよい。このような生物試料から調製された核酸を使用する場合は、融解曲線分析に供する前に、例えば有機溶媒による除タンパク質のような前処理を行ってもよい。
【００５９】
被験核酸に対応する野生型核酸は、合成核酸やプラスミドにクローニングし増幅した核酸を使用することができる。野生型核酸としては、変異が生じていない核酸を使用するが、特に被験核酸において変異が生じているか否かを調べようとする遺伝子に変異が生じていない核酸を使用すればよい。
【００６０】
また、融解曲線分析の感度を向上させるために、被験核酸及び対応する野生型核酸は、予め、増幅されたものであることが好ましい。増幅方法は特に限定されないが、代表的にはPCRにより増幅すればよい。この場合の本発明方法は、上記工程(i)に先立ち、被験２本鎖核酸及び野生型２本鎖核酸をそれぞれ増幅させる工程を含む。核酸増幅に当たっては、核酸溶液に予め核酸融解指示薬を含ませておくことができる。これにより増幅された核酸の溶液に本発明の増感試薬を添加したものを、そのまま融解曲線分析に供することができる。
【００６１】
本発明方法において、融解曲線分析は、サンプルの温度変化を正確にコントロールでき、適切な温度−シグナル強度プロットでシグナル強度の変化をモニターすることができる条件で行えばよく、分析条件は特に限定されない。このような条件で融解曲線分析を行える装置は普及しており、どのような機種であってもよい。また、ＰＣＲ用温度コントローラーのうち蛍光検出できるタイプのものは、一般的に融解曲線分析にも使用可能であるため、このようなタイプのＰＣＲ用温度コントローラーを使用することも可能である。より好ましくは融解曲線分析の専用装置が用いられる。融解曲線分析の専用装置としては、例えばＨＲ−１  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｅｒ（アイダホ・テクノロジー社製）等が挙げられる。
【００６２】
融解曲線分析は、一般的な条件で行えばよい。核酸を含むサンプル溶液の温度は一定の昇温速度で上昇させればよい。当初は、２本鎖核酸と共に存在するインターカレーターや特定の配列でデザインされた標識ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合され、シグナルが検出される。核酸溶液を昇温させてゆくと、２本鎖核酸の融解温度において、インターカレーターや標識ハイブリダイゼーションプローブのような核酸融解指示薬は、その標的から解離し、この指示試薬によるシグナルがバックグラウンドレベルにまで、直ちに減少する。
【００６３】
融解曲線分析機器から、温度(T)に対してシグナル強度(I)をプロットした融解曲線が得られる。さらに通常は、温度(T)に対して、シグナル強度変化(-dI)を温度変化(dT)で微分した一次微分値(-dI/dT)をプロットした融解曲線も得られる。Tに対して-dI/dTをプロットした融解曲線において、極大の-dI/dT値を与える温度がその２本鎖核酸の融解温度である。
【００６４】
本発明方法においては、被験２本鎖核酸と野生型２本鎖核酸との間で融解曲線又は融解温度を比較する。通常は、両者の融解曲線において融解温度に差異が認められれば、被験２本鎖核酸に変異が生じていると判断することができる。両者の融解温度の差が、使用装置の温度精度限界より高い場合に、被験２本鎖核酸に変異が生じていると判断することができる。
【００６５】
ポリアミン錯体を含む本発明の増感試薬、好ましいポリアミン錯体、及び融解曲線分析機器にアプライされる融解曲線分析用組成物については前述した通りである。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
使用した機器及び試薬
融解曲線分析機器としては、アイダホ・テクノロジー社製のＨＲ−１  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｅｒを使用し、サンプル用容器は、ロシュ社のライトサイクラー・キャピラリー（２０μＬ用）を使用した。
【００６７】
核酸サンプルは、アプライド・バイオシステムズ社のＰＣＲ装置（サーマルサイクラー）ＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いて実施した。
【００６８】
インターカレーターとしては、ＬＣグリーンＩ（アイダホ・テクノロジー社製
）を用いた。
錯体の合成
硝酸亜鉛六水塩（Zn(NO3)2・6H2O）0.10 mmol（29.7 g）とサイクレン0.10 mmol（17.2 g）とを250 mLのエタノールに加え溶解した。その溶液をマグネティックスターラーで撹拌しながら70℃で30分間加温した。濾紙で濾過した溶液をロータリーエバポレーターを用いて約50mlまでゆっくり濃縮した。その濃縮により、無色プリズム結晶が析出した。濃縮液を室温で1時間放置した後、グラスフィルターでその結晶を濾取し、50 ℃、5 mmHgで減圧加熱乾燥し。33.2gの結晶を得た。収率は92％であった。
【００６９】
得られた結晶を元素分析、NMR及びIRに供することにより、以下に示すように、上記構造式（１）で表されるサイクレン亜鉛錯体の硝酸塩であると同定された。
【００７０】
上記構造式（１）の化合物の元素分析の理論値はC8H20N6O6Zn:C,26.57; H, 5.57; N, 23.24であるが、得られた結晶の元素分析の実測値はC,26.61; H, 5.60; N, 23.28であった。
【００７１】
1H-NMR（500 MHz, in D2O）の結果は、δ ＝ 2.80（8H,m），2.94（8H,m）であった。13C-NMR（125 MHz, in D2O）の結果は、δ ＝ 46.6であった。
【００７２】
赤外線分析の主要吸収体の測定結果は、IR（cm-1）：  3177, 2918, 1482, 1444, 1384(NO3-), 1279, 1092, 1010, 993, 806であった。
ＰＣＲによる被験核酸の増幅
ＰＣＲによるサンプルの調製は、以下の条件で行った。テンプレートＤＮＡとしては、対象遺伝子がクローニングされたプラスミドを用いた。
＜試薬条件＞
プライマー：０．２μＭづつ
ｄＮＴＰｓ：０．２ｍＭづつ
ＭｇＳＯ4：０．８ｍＭ
バッファー：ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ用バッファー
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：１ユニット
総液量：２５μＬ
＜反応条件＞
９５℃で３分間を１サイクル
９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３０サイクル
６８℃で２分間を１サイクル
融解曲線分析
ＰＣＲ産物の融解曲線分析を、以下のようにして実施した。
【００７３】
先ず、ライトサイクラー・キャピラリーに以下の１）〜３）の液を加え、総液量を５μＬとした。
１）ＰＣＲ反応液：４μＬ
２）ＬＣグリーンＩ：０．５μＬ
３）亜鉛サイクレン水溶液、あるいは超純水：０．５μＬ
次いで、ＨＲ−１  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｅｒに上記のキャピラリーをセットして、融解曲線を測定した。測定は、０．３℃／秒の速度で約１００℃まで昇温させて、ＬＣグリーンIによるシグナルをモニターした。ＨＲ−１  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｅｒに付属した解析ソフトで融解曲線を一次微分曲線にグラフ化して、融解温度（Ｔｍ値）と一次微分曲線のピーク付近(Tm値付近）の形状を比較した。
実施例１
実験の対象として、ヒトの骨格筋ナトリウムチャネルの先天性パラミオトニアに関する遺伝子の変異モデルを作成し、プラスミドにクローニングした。変異モデルは、ヒト骨格筋ナトリウムチャネル遺伝子（日本DNAデータバンクaccession No. M26643）の4846番目のTをCに変換することにより作成した。
【００７４】
ヒト先天性パラミオトニアはナトリウムチャネル遺伝子の1473番目のフェニルアラニンがセリン（F1473S）に置換することで発症すると報告されている（Neurosci. Lett. 214: 9-12, 1996）。この病気は常染色体優勢の遺伝型式（ヘテロ変異）を示し、その症状としては運動後に悪化する筋硬直や寒冷により生じる筋硬直などが特徴的である。
【００７５】
ヒトの骨格筋ナトリウムチャネルのパラミオトニアに関する変異部位を含む１００ｂｐをＰＣＲで増幅し、以下の３サンプル溶液を調製した。
・野生型（オリジナル遺伝子）：T/Tホモ接合体
・変異体（F1473S）：C/C ホモ変異体
・野生型と変異体を混合してＰＣＲしたもの：T/C へテロ変異体モデル
次いで、PCRにより核酸を増幅した各サンプル溶液にＬＣグリーンＩ、及び亜
鉛サイクレン水溶液を添加した。各サンプル溶液について、亜鉛サイクレン濃度が１，２，３，５ｍＭとなる溶液を作製した。
【００７６】
各サンプル溶液を融解曲線分析に供した。
比較例１
実施例１において、亜鉛サイクレンに代えて、超純水を用いた他は実施例１と同様にして、融解曲線分析を行った。
融解曲線分析
実施例１及び比較例１の各サンプルについて、温度(T)に対して-dI/dTをプロットした一次微分曲線を図１〜５に示す。
【００７７】
亜鉛サイクレンの濃度に依存して、野生型とホモ変異体及びヘテロ変異体との融点（融解温度、グラフではピークの温度）の差が大きくなるとともに、野生型とホモ変異体及びヘテロ変異体との間で一次微分曲線の形の違いが明確になることが分かる。また、亜鉛サイクレン濃度1mM以上で、野生型とホモ変異型及びヘテロ変異型との融解温度差が１℃以上になることが分かる。また、亜鉛サイクレン濃度２ｍＭ以上の場合に、変異がより明確に把握できることが分かる。
【００７８】
また、亜鉛サイクレンを添加しない場合は、融解曲線により野生型とホモ変異型又はヘテロ変異型との融点の差を明確に検出することが難しいことも分かる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】亜鉛サイクレンを用いない融解曲線分析の結果を示す。
【図２】1mM濃度の亜鉛サイクレンを用いた融解曲線分析の結果を示す。
【図３】2mM濃度の亜鉛サイクレンを用いた融解曲線分析の結果を示す。
【図４】3mM濃度の亜鉛サイクレンを用いた融解曲線分析の結果を示す。
【図５】5mM濃度の亜鉛サイクレンを用いた融解曲線分析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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