(57)【要約】【課題】簡便な構成で、安定で再現性が高く、有機物質との相互作用の測定が可能なプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置を提供する。【解決手段】試料と相互作用する探針３とカンチレバー２を有する原子間力顕微鏡に用いるプローブであって、前記探針３が硫黄原子を介した化学結合によって固定された有機分子５を備えた構成とし、例えば該プローブを用いて基板上に固定された有機分子との相互作用を測定する測定方法あるいは測定装置等を構成し、とりわけ近年注目されているバイオチップ等の測定においてきわめて有用な手段を提供する。【選択図】            図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料と相互作用する探針を有する原子間力顕微鏡に用いるプローブであって、前記探針が硫黄原子を介した化学結合によって固定された有機分子を備えていることを特徴とするプローブ。
【請求項２】
前記探針が導電性を有する探針で構成されていることを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記探針の導電性を構成する部材が金であり、前記有機分子の化学結合部位がテオール基であることを特徴とする請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブの製造方法であって、
基板上にパターニングしたマスクを用いて凸状の探針となるべき部分を形成する工程と、
前記凸状の探針となるべき部分を含む基板の表面の全面に、マスク層を形成する工程と、
前記基板の裏面側からエッチングし、断面が台形状となる部分を形成する工程と、
前記基板の表面の全面に形成したマスク層の表面に、金属膜を被着する工程と、
前記金属膜が被着された凸状の探針部表面に、有機膜の修飾を行う工程と、
を有することを特徴とするプローブの製造方法。
【請求項５】
プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法において、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブを用い、基板上に固定された有機分子との相互作用を測定することを特徴とする分子間の相互作用の測定方法。
【請求項６】
プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法において、請求項１に記載のプローブとして探針にＤＮＡが化学結合されたプローブを用い、基板上に固定されたＤＮＡとの相互作用を測定することを特徴とする分子間の相互作用の測定方法。
【請求項７】
請求項６に記載の分子間の相互作用の測定が、ハイブリダイゼーション反応の測定であることを特徴とする分子間の相互作用の測定方法。
【請求項８】
請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の分子間の相互作用の測定方法が、前記探針と前記基板上に固定された有機分子またはＤＮＡ等の試料との距離を相対的に変化させながら、該探針に作用する力を測定する測定方法であることを特徴とする分子間の相互作用の測定方法。
【請求項９】
請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の分子間の相互作用の測定方法が、前記探針と前記基板間に電圧を印加して、前記探針と基板間に流れる電流量を用いて、分子間の相互作用を測定する測定方法であることを特徴とする分子間の相互作用の測定方法。
【請求項１０】
分子間の相互作用を測定する測定装置において、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプローブと、
請求項８に記載の測定方法が実施可能な探針と基板上に固定された有機分子またはＤＮＡ等の試料との距離を相対的に変化させながら、該探針に作用する力を測定する手段及び／または、請求項９に記載の測定方法が実施可能な探針と基板間に電圧を印加して、原子間力探針と基板間に流れる電流量を用いて、分子間の相互作用を測定する手段と、
を有することを特徴とする分子間の相互作用を測定する測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料と相互作用する探針を有するプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置に関し、特に有機物質との相互作用の測定を可能としたプローブ、該プローブの製造方法、測定方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の材料微細化に伴いｎｍレベルの分析、評価手法の重要性が増加している。走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）に代表される走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）は、その測定の簡易性及び試料の自由度が高い等の点からそのようなｎｍレベルの代表的な評価手法として多くの注目を集めている。とりわけ非導電性試料に対しても適用が可能なＡＦＭは、有機分子や生体試料を大気中及び液体中で観察することができ、その方面での応用例は多数報告されている。このようなナノレベルの分子集合体の評価では、その表面形態のみならず、表面物性あるいは他の物質との相互作用について調べることも重要である。ＡＦＭでは高分解能の表面観察が行えるのみならず、原子間力探針とサンプル表面の相互作用を直接観測することができる。
【０００３】
ＡＦＭのプローブとサンプルの間に働く力を測定する手法として、ＡＦＭのプローブと試料表面との距離を相対的に近づけたり、遠ざけたりした際にプローブにかかる力を測定する、フォースカーブ測定の手法が知られている。図２に一般的なフォースカーブ測定の模式図を示す。図２（ａ）において、図中の（１）はＡＦＭのプローブにおけるカンチレバーと試料が相対的に離れている状態を表す。この位置からカンチレバーと試料を近づけていくと、試料にカンチレバーが触れた状態（（２）の状態）から、プローブの探針部に力が加わりはじめ、カンチレバーは反ってくる。
【０００４】
ある一定距離近づいた後、カンチレバーと試料を相対的に離していくと、今度はカンチレバーが撓んできて（（５）の状態）、ある一定距離以上に離れると最終的にはカンチレバーと試料は完全に離れてしまう。この一連の動作におけるピエゾの印加電圧とプローブの探針部に働く力の関係を示したのが、図２（ｂ）に示すフォースカーブである。
例えばこのフォースカーブの（４）の領域の傾きや（５）から（６）の状態への力を見積ることで、プローブとサンプル間の力を評価したり、サンプル表面の状態を調べたりすることが可能となる。
このフォースカーブ測定の応用として、試料と相互作用する物質をプローブに化学修飾することで、分子間の相互作用を測定することが可能になる。またその状態で、領域を走査することで相互作用を画像化する化学力顕微鏡の実現も可能である。
【０００５】
従来、このように試料と相互作用する物質をプローブに化学修飾する方法としては、特許文献１において表面にプラズマ処理を施す方法が提案されている。また、これ以外にも特許文献２に開示されているようなプローブ自体をアルカリ性溶液に長時間浸けることで、表面に水酸基を導入する方法などが知られている。    
【特許文献１】特開平６−２７３１５６号公報
【特許文献２】特開平１０−０８２７９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したプローブを化学修飾し、サンプルとの相互作用を測定する手法はナノ領域の物性を調べることを可能とし、今後さらに需要が増し非常に有用な技術であると考えられている。しかしながら、このようにプローブを化学修飾することで、特定の分子等の相互作用を測定する方法においては、安定して再現性よく化学修飾されたプローブを作成することが必要であるが、上記した従来例の表面をプラズマ処理する方法やアルカリ性溶液中に浸す方法では、プローブの表面を改質処理することで水酸基等を導入する方法であり、実際にプローブに固定したい化学種を導入するために、更にもう一段の工程が必要となり、煩雑であると共に時間を要するものであった。
【０００７】
そこで、本発明はこのような問題点を克服し、簡便な構成で、安定で再現性が高く、有機物質との相互作用の測定が可能なプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下のように構成したプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置を提供するものである。
すなわち、本発明のプローブは、試料と相互作用する探針を有する原子間力顕微鏡に用いるプローブであって、前記探針が硫黄原子を介した化学結合によって固定された有機分子を備えていることを特徴としている。
また、本発明のプローブは、前記探針が導電性を有する探針で構成されていることを特徴としている。
また、本発明のプローブは、前記探針の導電性を構成する部材が金であり、前記有機分子の化学結合部位がテオール基であることを特徴としている。
また、本発明のプローブの製造方法は、上記したいずれかに記載のプローブの製造方法であって、基板上にパターニングしたマスクを用いて凸状の探針となるべき部分を形成する工程と、前記凸状の探針となるべき部分を含む基板の表面の全面に、マスク層を形成する工程と、前記基板の裏面側からエッチングし、断面が台形状となる部分を形成する工程と、前記基板の表面の全面に形成したマスク層の表面に、金属膜を被着する工程と、前記金属膜が被着された凸状の探針部表面に、有機膜の修飾を行う工程と、を有することを特徴としている。
また、本発明の分子間の相互作用の測定方法は、上記したいずれかに記載のプローブを用い、基板上に固定された有機分子との相互作用を測定することを特徴としている。この測定方法によれば、探針側の有機分子と試料上との有機分子の組み合わせを変えることで各種の有機分子間の小さな相互作用を簡易に測定することが可能となる。
また、本発明の分子間の相互作用の測定方法は、上記したプローブとして探針にＤＮＡが化学結合されたプローブを用い、基板上に固定されたＤＮＡとの相互作用を測定することを特徴としている。その際、本発明においてはこの分子間の相互作用の測定として、ハイブリダイゼーション反応を測定する構成を採ることができる。
これらの測定方法によれば、簡便な構成で基板上に固定されたバイオチップを調べることができ、また溶液中のバイオチップの環境を変化させること等の外部環境による相互作用の変化の様子を対応させて調べることが可能となる。
また、本発明の上記したいずれかに記載の分子間の相互作用の測定方法には、前記探針と前記基板上に固定された有機分子またはＤＮＡ等の試料との距離を相対的に変化させながら、該探針に作用する力を測定する測定方法を用いることができる。
また、本発明の上記したいずれかに記載の分子間の相互作用の測定方法には、前記探針と前記基板間に電圧を印加して、前記探針と基板間に流れる電流量を用いて、分子間の相互作用を測定する測定方法を用いることができる。
また、本発明の分子間の相互作用を測定する測定装置は、上記したいずれかに記載のプローブと、上記した測定方法が実施可能な探針と基板上に固定された有機分子またはＤＮＡ等の試料との距離を相対的に変化させながら、該探針に作用する力を測定する手段及び／または、上記した測定方法が実施可能な探針と基板間に電圧を印加して、原子間力探針と基板間に流れる電流量を用いて、分子間の相互作用を測定する手段と、を有することを特徴としている。
【０００９】
以上の構成によれば、有機物質との相互作用をより高い精度で測定することが可能となり、とりわけ近年注目されている固体基板上に複数の生体関連物質がマトリクス状に配置されたバイオチップ等の測定においてきわめて有用であり、これらに対する期待に大きく応えることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、簡便な構成で、安定で再現性が高く、有機物質との相互作用の測定が可能なプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の実施形態の説明として、まず有機分子の相互作用を測定するためのＡＦＭプローブ（以下、原子間力探針と記す）について説明する。
図１は本発明の有機分子の相互作用を測定するための原子間力探針の模式図である。図１において、１は支持体であり、通常シリコン（Ｓｉ）や窒化シリコン（Ｓｉ３Ｎ４）等の材料で構成されている。
２はカンチレバーアーム、３は探針部であり、カンチレバーアーム２によって支持体１と探針部３とが接続されている。カンチレバーアーム２及び探針部３の材料は、支持体１と同様にシリコンや窒化シリコン等が用いられている。
カンチレバーアーム２の形状は短冊型形状のものやＶ字型形状のものがあるが、特に規定されるものではなく、測定対象に応じて適宜選択が可能である。
探針部３は、通常は四角錘形状を有しており、後述されるプロセス等で作成されている。４は導電性の薄膜である。材質としては金、白金、銀、銅などの金属材料を選択することが可能である。
【００１２】
５の有機膜は一般的には（化１）に示される構造を有する。
Ｘ−Ｙ                                （化１）
（化１）中でＸは機能性部位であり、相互作用の測定対象に応じて最適なものを選択することが可能である。Ｙは結合性部位を意味し、導電性膜４と化学結合によって結合している。具体的には官能基としてのチオール基（−ＳＨ）やスルフィド基（−Ｓ−）、あるいはジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）などを含有するように選択することができる。導電性膜４と結合性部位Ｙは硫黄原子を介して結合することが本発明の一つの特徴である。
有機膜５の結合性部位Ｙとしてチオール基を、導電性膜４として金を選択するのが、本発明を実施する際には最も安定で望ましい。理由としてはチオール基と金の間では以下に示される反応が起こり安定な化学結合が形成されるからである。下式中Ｒは結合性部位Ｙのチオール基以外の部分を表す。
−Ａｕ＋Ｘ−Ｒ−ＳＨ      →    −Ａｕ−Ｓ−Ｒ−Ｘ＋１／２Ｈ２
次に上記の構成からなる原子間力探針の製造方法について簡単に説明する。
まず図３（ａ）に示すように、シリコン基板３２の両面にマスク層３１を形成する。そして表面側に設けたマスク層３１について、探針となるべき部分以外を除去し、シリコン基板３２の結晶異方性エッチングを行う。このとき探針となるべき位置ではマスク層３１を円形もしくは正方形状にパターニングしておく。その結果、シリコン基板３２は、探針となるべき部分が凸状に突出するようになる（図３（ｂ））。
続いて、シリコン基板３２の表面の全面にマスク層３１ａを形成する（図３（ｃ））。このマスク層３１ａは探針となるべき部分を除いて平面であり、探針となるべき位置だけ突出している。
【００１３】
次に、シリコン基板３２の裏面側のマスク層３１をパターニングして開口部を形成し（図３（ｄ））、裏面側からシリコン基板３２に対して結晶異方性エッチングを行い、断面が台形状である貫通孔３３を形成する（図３（ｅ））。
次に、シリコン基板３２の表面側のマスク３１ａの表面に真空蒸着やスパッタリングなどによって金属膜３４を被着する（図３（ｆ））。
最後に有機膜５の探針上への修飾を行う。有機膜の選択は、試料に応じて相互作用が測定できる部位を有するものが選択され、その成膜は例えばプローブ自体を液体中につけて成長させる方法、真空蒸着法等が用いられるが材料に応じて適宜選択すればよい。
【００１４】
次に図４を用いて、上記した原子間力探針を用いて有機分子の相互作用を測定するための方法について説明する。
図４において、４１は上で説明した原子間力探針（プローブ）であり、探針部には有機膜が形成されている。４２はサンプルである。また、４７はプローブバイアス印加手段であり、４８は試料バイアス印加手段である。
図中ではサンプルが液体４４中に固定されている例を図示してあるが、試料は必ずしも液体中である必要はない。しかしながら液体中での測定は後述する生体材料の相互作用の測定では、温度、ｐＨ等を自由に制御することが可能であるため非常に有用である。４３は電圧を印加することで伸縮するピエゾ素子を内蔵したＺ軸ステージである。ここではサンプル側にピエゾ素子を用いた例で説明しているが、サンプルとプローブ間の距離を制御できればピエゾ素子はサンプル側、プローブ側いずれに設置しても構わない。
【００１５】
相互作用の測定に際しては、あらかじめプローブ４１の背面にレーザー４５を照射し、その反射光をフォトダイオード等の光検出器４６で検出できるように調整をしておく。光検出器４６は通常分割（通常は上下２分割）したフォトダイオードの光入射位置によってカンチレバーの変位を検出している。
測定試料４２内の測定対象部位とプローブ４１の位置合わせ（プローブと試料間の距離を近づけたときにプローブの接触位置に試料があるようにすること）をした後で、ピエゾ素子４３に電圧を印加し光検出器４６で探針に働く力をモニターしながら、制御コンピューター４９でピエゾ素子４３にフィードバックを行いながら試料とプローブの相対的な距離を近づけていく。図２中（２）の状態でプローブと試料とが接触した後、ピエゾは伸び続け、ある力を検知した時点から今度はピエゾ素子４３に逆電圧が印加され今度は縮んで行き、最終的には図２の（６）の状態で完全にプローブが試料から離れた状態で終了となる。尚測定は上記動作を複数回動作させることも可能である。
【００１６】
本装置を用いて測定される対象サンプルであるが、代表的なものとして前述したバイオチップが挙げられる。上記バイオチップに搭載される生体関連物質は、核酸、蛋白質等が選択されている。核酸の例としてはオリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）等のＤＮＡ、または、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ、または骨格がペプチドで構成されるＰＮＡ（ペプチド核酸）で代表される核酸アナログが挙げられる。蛋白質の例としてはオリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、抗体等を例として挙げることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではなく、本発明の目的が達成される範囲内での各要素の置換や設計変更がなされたものをも包含する。また、実施例内で用いている符号は、図１、図４で用いた符号と同一である。
［実施例１］
実施例１においては、本発明の測定装置を用いて、基板上に固定されたＤＮＡプローブアレイの評価を行った例を示す。
原子間力探針の作成は、市販の窒化シリコン製Ｖ字形状のカンチレバー（型名：ＤＮＰＳ）にスパッタリング装置を用いて金の薄膜をおよそ１０ｎｍ程度蒸着したものを用いた。ばね定数は０．０６Ｎ／ｍであった。
有機膜５として、ＤＮＡ合成業者（ベックス）に依頼して、以下の（式１）で示される一本鎖核酸（Ｔの４０量体）を合成した。なお（式１）の一本鎖ＤＮＡの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはＨＰＬＣを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
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【００１８】
上記配列番号１の一本鎖ＤＮＡを１μＭ含有する溶液中に前述の工程で作成されたプローブ探針を２０分間浸けておくことで最終的な修飾プローブ４１を作成した。
測定試料４２としては２５．４ｍｍ×２５．４ｍｍ×１ｍｍの合成石英基板上にスポッテイング形成されたＤＮＡプローブアレイを用いた。スポッティングの範囲は基板の中央部に１０ｍｍ×１０ｍｍの範囲に２００ｄｐｉすなわち１２７μｍのピッチで形成されており、スポッティングされたドットの直径は約５０μｍであった。
図５に測定試料４２の一部分を示す。スポッテイングに用いたＤＮＡは（式２）〜（式５）で示される一本鎖核酸であり、領域Ａには（式２）で示される一本鎖核酸を、領域Ｂには（式３）で示される一本鎖核酸を、領域Ｃには（式４）で示される一本鎖核酸を、領域Ｄには（式５）で示される一本鎖核酸を用いた。
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【００１９】
上述の修飾プローブ４１を用いて、領域Ａ〜領域Ｄに対して無作為に複数回連続で相互作用の測定を行った。
その結果領域Ｂと領域Ｃからは、図６（ａ）に示すような相互作用の曲線が得られたが、領域Ａと領域Ｄからは図６（ｂ）に示すような相互作用の曲線が得られた。領域ＡのＦｘと領域ＤのＦｘの値は領域Ａの方が大きかった。
【００２０】
［実施例２］
実施例２においては、実施例１で用いたのと同一の修飾プローブ４１と、同一構成の試料４２を用いた。本実施例では試料４２をリン酸溶液４４中に固定した。
この状態で溶液４４の温度を２５℃から＋５℃ずつ変化させながら６０℃まで上昇させて領域Ａと領域Ｄに対して相互作用の測定を行った。
初めの２５℃の状態ではＦｘの値は異なるものの、両領域ともに図６（ｂ）に示されるような相互作用曲線を示したが、温度の上昇とともにＦｘ値が徐々に小さくなる傾向が観測された。
【００２１】
［実施例３］
実施例３においては、修飾プローブ４１は実施例１で用いたのと同一のプローブを用意した。試料４２としては、シリコン単結晶基板上に真空蒸着によって約２００ｎｍの金を蒸着した基板を用い、その上に実施例１と同様にプローブアレイをスポッティングし、試料４２とした。
修飾プローブ４１にプローブバイアス印加手段４７より７Ｖ印加することで、領域Ａ〜領域Ｄの電流量を測定したところ、領域Ａのみに数ｐＡの電流を検出した。
【００２２】
［実施例４］
実施例４においては、修飾プローブ４１として、複数個のプローブを備えたプローブを作成し、その後に探針上に真空蒸着により金を蒸着した。プローブ間の間隔はＤＮＡをスポッティングした間隔と同程度とした。試料は実施例１で用いたものと同一のものを用いた。
相互作用の測定は、試料は図５中Ｓの地点から横ラインを複数個一度に相互作用を調べながら、図５中の矢印方向に調べるように試料を不図示のＸＹ移動機構を用いながら行った。
測定結果は実施例１とほぼ同一であったが、測定時間が実施例１より大幅に短縮された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施の形態における有機分子の相互作用を測定するための原子間力探針の模式図である。
【図２】原子間力探針によるフォースカーブの測定動作を示す模式図である。
【図３】本発明の実施の形態における原子間力探針の製造方法の一例を説明する図である。
【図４】本発明の実施の形態における原子間力探針を用いて有機分子の相互作用を測定する方法を説明する模式図である。
【図５】実施例１のサンプルとして用いたバイオチップの模式図である。
【図６】本発明の実施例において原子間力探針を用いてバイオチップ試料との相互作用を測定した際に得られたデータの模式図である。
【符号の説明】
【００２４】
１：支持体
２：カンチレバーアーム
３：探針部
４：導電性膜
５：有機膜
３１：マスク層
３２：シリコン基板
３３：貫通孔
３４：導電性膜（金属膜）
４１：修飾プローブ
４２：試料（サンプル）
４３：ピエゾ素子
４４：液体
４５：レーザー
４６：光検出器
４７：プローブバイアス印加手段
４８：試料バイアス印加手段
４９：制御コンピューター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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