(57)【要約】【課題】生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供する。【解決手段】チオラーゼ活性を低下させ、かつエタノール及び／または脂質を存在させる条件下で、細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオラーゼ活性を低下させ、かつエタノール及び／または脂質を存在させる条件下で細胞を培養し、
培養物中からプレニルアルコールを回収する、
プレニルアルコールの製造方法。
【請求項２】
複数のチオラーゼ遺伝子のうち、少なくとも１のチオラーゼ遺伝子を除く他のチオラーゼ遺伝子を破壊した細胞を用いることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項３】
チオラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、チオラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項４】
チオラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、チオラーゼ活性を低下させることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項５】
エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項６】
上記エタノールは０．１〜１０％の濃度で存在することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項７】
上記エタノールは０．５〜５％の濃度で存在することを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項８】
細胞の培養に際して、さらにスクアレン合成酵素活性を低下させる条件下とすることを特徴とする請求項１記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項９】
スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする請求項８記載のプレニルアルコールの製造方法。
【請求項１０】
エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする請求項９記載のプレニルアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、細胞を培養し、得られた培養物からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プレニルアルコールは、ピルビン酸よりアセチル−ＣｏＡとメバロン酸を経るメバロン酸経路と、ピルビン酸よりグリセルアルデヒド三リン酸を経る非メバロン酸経路とによって合成される。ファルネソールやゲラニルゲラニオール等のプレニルアルコールは、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な種々のテルペノイドの他、トコフェロール、カロチノイドをはじめとするビタミン類の合成出発物質としてもまた重要な物質である。
【０００３】
従来、プレニルアルコールの生産性を向上させる試みとしては、上述した代謝経路の酵素を強化したり、変異導入して酵素の特異性を改変するといった手法が取られてきた。特許文献１及び２には、メバロン酸合成経路に関与するチオラーゼ（ＥＲＧ１０）、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＳ）及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ１）を酵母に発現させたところ、ファルネソールが顕著に生産されることが開示されている。
【０００４】
ＥＲＧ１０は、メバロン酸合成経路の入口に位置し、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ及びその逆のアセトアセチル−ＣｏＡからアセチル−ＣｏＡの反応を可逆的に変換する酵素である。またＥＲＧ１０は、メバロン酸合成経路以外に脂質の合成及び分解、並びにリジン及びトリプトファンの分解に関与している。なおＥＲＧ１０の欠損は致死であるが、エルゴステロール添加により生育するようになる。従って、ＥＲＧ１０はプレニルアルコールを始めとするテルペノイド合成に必須な酵素と考えられる。
【０００５】
一方、ＨＭＧ１はメバロン酸合成経路の律速酵素である。ＨＭＧ１活性を強化することでテルペノイド生産が上昇することが数多く報告されている。
【０００６】
しかしながら、グルコース等の炭素源からの変換率は著しく低く、殆どの炭素源はプレニルアルコールの生合成以外の代謝経路に使用されている。したがって、培地に含まれる炭素源をプレニルアルコールの生合成に効果的に使用できれば、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法として大いに期待できるが、現在そのような報告例はない。
【０００７】
すなわち、プレニルアルコールの生産性を向上させるため、簡易に且つ、十分な生産効率を達成できるプレニルアルコールの製造方法は確立されていない。
【０００８】
【特許文献１】
特表２００２−５１９３９７号公報
【特許文献２】
特表２００２−５１９０４９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、生産効率に優れたプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）チオラーゼ活性を低下させ、かつエタノール及び／または脂質を存在させる条件下で細胞を培養し、培養物中からプレニルアルコールを回収するプレニルアルコールの製造方法。
（２）複数のチオラーゼ遺伝子のうち、少なくとも１のチオラーゼ遺伝子を除く他のチオラーゼ遺伝子を破壊した細胞を用いることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（３）チオラーゼ遺伝子の発現を低下させることで、チオラーゼ活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（４）チオラーゼ遺伝子の翻訳効率を低下させることで、チオラーゼ活性を低下させることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（５）エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（６）上記エタノールは０．１〜１０％の濃度で存在することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（７）上記エタノールは０．５〜５％の濃度で存在することを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（８）細胞の培養に際して、さらにスクアレン合成酵素活性を低下させる条件下とすることを特徴とする（１）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（９）スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加することで、スクアレン合成酵素活性を低下させることを特徴とする（８）記載のプレニルアルコールの製造方法。
（１０）エルゴステロールを培地に添加することを特徴とする（９）記載のプレニルアルコールの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプレニルアルコールの製造方法は、チオラーゼ活性を低下させ、かつエタノール及び／または脂質を存在させる条件下で細胞を培養することで、当該細胞のプレニルアルコール生産能を亢進させ、プレニルアルコールを回収するものである。本発明において、プレニルアルコールとは、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、ネロリドール、リナロール、ゲラニオール及びゲラニルリナロール等を意味する。本発明によれば、これらプレニルアルコールのうち少なくとも１種の生産性を向上することができる。
【００１２】
本発明においては、プレニルアルコールを生合成する代謝経路と、チオラーゼの作用によってアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ及びその逆のアセトアセチル−ＣｏＡからアセチル−ＣｏＡの反応を可逆的に変換する経路とを併せ持つ細胞を対象としている。プレニルアルコールを合成する代謝経路では、図１に示すように、グルコース、エタノール、脂質等から合成されたアセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡからメバロン酸を経てイソペンテニル二リン酸が合成される。イソペンテニル二リン酸は、さらにイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼによりジメチルアリル二リン酸に異性化される。また、図１に示すように、１分子のジメチルアリル二リン酸と２分子のイソペンテニル二リン酸とが縮合反応してゲラニル二リン酸が合成され、更に１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してファルネシル二リン酸が合成され、さらにこれに１分子のイソペンテニル二リン酸が反応してゲラニルゲラニル二リン酸が順次合成される。プレニルアルコールであるファルネソールとネロリドールはファルネシル二リン酸から合成され、また、ゲラニルゲラニオールはゲラニルゲラニル二リン酸から合成される。一方、ファルネシル二リン酸は、図１に示すように、スクアレン合成酵素によりスクアレンに変換される。スクアレンは、ステロイドの前駆体物質であり、酵母、カビ類の場合は最終的にエルゴステロールに変換される。
【００１３】
このプレニルアルコール合成経路において、チオラーゼはアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ及びその逆のアセトアセチル−ＣｏＡからアセチル−ＣｏＡの反応を触媒する酵素であり、本合成経路の入口部分に位置していることから、プレニルアルコール、ステロイド合成において重要な役割を演じる酵素である。また、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとの平衡は、アセチル−ＣｏＡの生成方向に傾いているが、可逆反応であることから脂質の分解で生じたアセトアセチルＣｏＡの分解にも関与していると考えられる。
【００１４】
なお、図１並びに以下の説明において、各化合物を以下のように略記する場合もある。
イソペンテニル二リン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＩＰＰ）
ジメチルアリル二リン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＭＡＰＰ）
ゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＧＰＰ）
ファルネシル二リン酸（ｆａｒｎｅｓｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＦＰＰ）
ファルネソール（ｆａｒｎｅｓｏｌ；ＦＯＨ）
ネロリドール（ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ；ＮＯＨ）
ゲラニルゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＧＧＰＰ）
ゲラニルゲラニオール（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｉｏｌ；ＧＧＯＨ）
【００１５】
本方法においては、チオラーゼ活性を低下させる条件下で細胞を培養する。ここでチオラーゼ活性を低下させる方法としては、
▲１▼チオラーゼ欠損株を用いる
▲２▼チオラーゼ遺伝子の転写を抑制する
▲３▼チオラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する
方法が挙げられる。
【００１６】
▲１▼チオラーゼ欠損株を用いる方法
本発明において、チオラーゼ欠損株とは、本来的には対立遺伝子、アイソマーなどの複数のチオラーゼ遺伝子を有するが、これらのうち少なくとも１のチオラーゼ遺伝子を除く他のチオラーゼ遺伝子を破壊した株を意味する。例えば、サッカロミセス・セレビシエは、本来的に、ＥＲＧ１０と呼ばれるチオラーゼを有している。従って、例えば、チオラーゼ欠損株としては、ＥＲＧ１０をコードする対立遺伝子のうち一方のみを破壊したサッカロミセス・セレビシエを挙げることができる。なお、ＥＲＧ１０をコードする遺伝子を欠損したサッカロミセス・セレビシエはＡＴＣＣ４０２２８００としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。
【００１７】
チオラーゼ欠損株としては、既存の菌株を用いても良いし、野生型の菌株に対して新たに変異を導入して作出したものを用いても良い。チオラーゼ欠損株は、エルゴステロールを含む通常の培地を用いて培養することができる。
【００１８】
▲２▼チオラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法
チオラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、対象となる細胞におけるチオラーゼ遺伝子の転写プロモーター領域を転写抑制型プロモーターで置換してなる変異型細胞を調製し、当該変化型細胞を転写抑制条件で培養する方法が挙げられる。具体的には、転写抑制型プロモーターとして、ＧＡＬ１遺伝子の転写プロモーターを使用することができ、この場合、グルコース含有培地で培養することで転写抑制条件とすることができる。
【００１９】
また、チオラーゼ遺伝子の転写を抑制する方法としては、細胞におけるチオラーゼ遺伝子の転写に関わる領域に転写抑制活性のある塩基配列を挿入してなる変異型細胞を調製し、当該細胞を培養しても良い。
【００２０】
▲３▼チオラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法
また、チオラーゼ遺伝子の翻訳を抑制する方法としては、いわゆるアンチセンスＲＮＡを用いる方法が挙げられる。すなわち、チオラーゼ遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを転写する遺伝子を、細胞ゲノムに組み込み、当該アンチセンスＲＮＡを過剰発現させることで、チオラーゼ遺伝子のｍＲＮＡの翻訳が抑制される。アンチセンスＲＮＡに関する技術は、細菌である大腸菌だけでなく高等生物、例えば哺乳類（マウス）、昆虫（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））や被子植物（トマト）を宿主とした場合でも知られている（Ｍｉｚｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８１，  １９６６−１９７０；  Ａｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １６９，  ３００７−３０１２；  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５５，  ５６９−５９７；  Ｈａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０１，  １０９４−１０９９；  Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｃｅｌｌ，  ３７，  ４２９−３６；  Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８８，  ４３１３−４３１７；  Ｈａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １２４，  １０７９−８６）。
【００２１】
上記▲１▼〜▲３▼の方法において、対象となる細胞としてはプレニルアルコールを生合成する代謝経路と、チオラーゼの作用によってアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ及びアセトアセチル−ＣｏＡからアセチル−ＣｏＡに可逆的に変換する経路とを併せ持つ細胞であれば特に限定されない。対象となる細胞／その細胞が有するチオラーゼとしては、微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ／ＥＲＧ１０、シゾサッカロマイセス・ポンベ／ＳＰＢＣ２１５．０９Ｃ、大腸菌／ａｔｏＢ及びｙｑｅＦ、バシラス・サブチリス／ｍｍｇＡ及びｙｈｆＳ、ザントモナス・カンペストリス／ａｔｏＢ、スタフィロコッカス・アウレウス／ＳＡ０３４２、並びにコリネバクテリウム・エフィシエンス／ＣＥＯ７３１及びＣＥ２２９５等を挙げることができる。
【００２２】
また微生物以外には、例えば、ヒト／ＡＣＡＴ１及びＡＣＡＴ２、線虫、Ｃ．エレガンス／Ｔ０２Ｇ５．４、Ｔ０２Ｇ５．７及びＴ０２Ｇ５．８、並びにシロイヌナズナ／ＭＣＡ２３．４及びＭＩＦ２１．１２等の細胞／チオラーゼを挙げることができる。
【００２３】
また、本方法においては、これら細胞に対して、プレニルアルコール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、フォスファチジン酸フォスファターゼ等の遺伝子を強化し、プレニルアルコールの生産能を向上させた変異型細胞を使用しても良い。これら遺伝子を強化する方法としては、遺伝子の発現制御領域（プロモーター等のシス領域）を置換したり、遺伝子に変異を導入して酵素活性を増強させたりする方法が挙げられる。
【００２４】
細胞を培養する培地としては、特に限定されず、上述した細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。細胞としてサッカロミセス・セレビシエを用いる場合、例えば、グルコース及び大豆油を添加したＹＰＤ培地を使用することができる。
【００２５】
また、培地にテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加したり、培地中の窒素源や炭素源濃度を高くすることで、プレニルアルコールの生産効率をさらに高めることもできる。これらの添加剤としては以下のものを例示できる。
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンＸ−３０５、スパン８５、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９４（旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ  （旭電化製）、アデカノールＬＧ−２９７  （旭電化製）、アデカノールＢ−３００９Ａ  （旭電化製）、アデカプロニックＬ−６１  （旭電化製）
テルペノイド濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、油脂濃度は０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは１〜３％（ｗ／ｖ）であり、界面活性剤濃度は０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２６】
さらに、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。チオラーゼ活性を低下させた場合、細胞において、ステロイド合成が低下する。ステロイドの１つであるエルゴステロールは酵母、カビ類の細胞膜成分の１つであり、生育に必須である。このため、チオラーゼ活性を低下させるとエルゴステロール要求性となる。エルゴステロールの添加量は、１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００２７】
一方、本方法において、培地は、エタノール及び／または脂質を含有する。エタノールは好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．５〜５％、最も好ましくは１〜３％の濃度で含有する。脂質としては、例えばパルミチン酸を挙げることができる。
【００２８】
また、本方法においては、さらにスクアレン合成酵素活性を低下させる条件で、細胞を培養することが好ましい。スクアレン合成酵素活性を低下させる条件としては、上述したチオラーゼ活性を低下させる場合と同様な方法を使用することができる。すなわち、スクアレン合成酵素活性を低下させる条件下としては、スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法が挙げられる。加えて、スクアレン合成酵素阻害剤を培地に添加する方法が挙げられる。
【００２９】
スクアレン合成酵素遺伝子の転写を抑制する方法及びスクアレン合成酵素遺伝子の翻訳を抑制する方法については、ＷＯ  ０２／０５３７４７に開示されている方法を、細胞に適用することができる。
【００３０】
またスクアレン合成酵素阻害剤としては、例えば、ＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報）、ＢＳＭ−１８７７４５（Ｔｏｘｉ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈａｒｍ．，  １４５，  ９１−９８  （１９８７））、ＥＲ−２７８５６（Ｊ．  ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．  ４４，  １２８−１３５  （２００２））などの合成品の他、カビ類が生産するｚａｒａｇｏｚｉｃ  ａｃｉｄ（Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  Ｒｅｐ．  １１，  ２７９−３０２  （１９９４））などを挙げることができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを使用した場合、ＳＱＡＤの添加量は、細胞を培養する培地中に５〜２００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００３１】
本方法においては、細胞を、チオラーゼ活性を低下させ、エタノール及び／または脂質を存在させる条件下で培養し、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００３２】
本方法においては、プレニルアルコールを高収率で生産することができる。なお、プレニルアルコールを大量培養するには、ジャーファーメンター培養装置等を用いることもできる。培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、プレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
【００３３】
図１に示した生合成経路から判るように、チオラーゼは、基質であるアセチル−ＣｏＡ及びアセトアセチル−ＣｏＡに作用し、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとの平衡反応を触媒する酵素である。従って、チオラーゼ活性を低下させた場合、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡとの平衡が崩れ、脂質の分解等により供給されたアセトアセチル−ＣｏＡが蓄積され、以降のプレニルアルコールを合成する代謝経路がより進行すると考えられた。しかしながら、予想に反してチオラーゼ活性を低下させるだけは、プレニルアルコールの生産量は増加しなかった。チオラーゼの反応が可逆反応である限り、アセトアセチルＣｏＡが過剰に存在しても、分解されてプレニルアルコール合成につながらない可能性がある。
【００３４】
そこで、チオラーゼ活性を低下させ、かつ脂質原料であるエタノール等を加えて、アセトアセチルＣｏＡを供給させれば、プレニルアルコール生産が増加すると考えた。
【００３５】
本発明においては、チオラーゼ活性を低下させることに加えて、エタノール及び／または脂質を存在させる条件下で、プレニルアルコールの生産性をより向上させることができることを実証した。
【００３６】
また、本方法においては、さらにスクアレン合成酵素活性を阻害する条件下で、細胞を培養することによって、プレニルアルコールの生産性をより向上させることができる。これは、図１に示す生合成経路において、スクアレン合成反応が抑制される結果、プレニルアルコールの合成反応が亢進するためであると考えられる。
【００３７】
スクアレン合成酵素活性を低下させた場合、細胞においてエルゴステロール生合成が抑制されるため、エルゴステロールを含む培地を用いるか、培地に必要量のエルゴステロールを添加することが好ましい。エルゴステロールを含む培地を用いるか、エルゴステロールを培地に追添加することによって、エルゴステロール生合成阻害による細胞の生育阻害等を防止することができる。スクアレン合成酵素阻害剤としてＳＱＡＤを用いた場合、エルゴステロールの添加量は、１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明に係るプレニルアルコールの製造方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
本例では、細胞としてサッカロミセス・セレビシエ  ＡＴＣＣ２０１３９０株（野生株）及びサッカロミセス・セレビシエ  ＡＴＣＣ４０２２８００株を使用した。培地は以下のように調製した。すなわち、４ｍｇ／ｌエルゴステロール、６％グルコース、及び１％大豆油を含有するＹＰＤ培地に、１％エタノールもしくは１％パルミチン酸、０．１％アデカノール  ＬＧ１０９（旭電化製）及び２０ｍｇ／ｌのＳＱＡＤ（特表平８−５０８２４５号公報参照）を添加した。なお、１％エタノールもしくは１％パルミチン酸、０．１％アデカノール  ＬＧ１０９（旭電化製）及びＳＱＡＤ以外の成分混合した後にオートクレーブによって培地を滅菌した。ＳＱＡＤ溶液は、当該水溶液をフィルターによって滅菌したのち、十分に冷えた培地に添加した。両株ともに、３０℃で２〜８日間培養した。さらに、エタノールもパルミチン酸を含まない培地において培養した両株を対照とした。
【００４０】
培養終了後、培養液２ｍｌを採取し、これにメタノール１．２ｍｌ及びペンタン２ｍｌを添加した。その後、培養液を十分に攪拌し、ペンタン層を成分分析に供した。成分分析は、以下の条件で行った。分析装置は、ヒューレットパッカード社製ＨＰ６８９０／５９７３  ＧＣ／ＭＳシステムを用いた。
インレット温度：２５０℃
ディテクター温度：２６０℃
ＭＳゾーン温度
ＭＳ  Ｑｕａｄ：１５０℃
ＭＳ  Ｓｏｕｒｃｅ：２３０℃
スキャンパラメーター
Ｌｏｗ  Ｍａｓｓ：３５
Ｈｉｇｈ  Ｍａｓｓ：２００
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：４０
インジェクションパラメーター
モード：自動インジェクション
サンプル量：２μｌ
洗浄回数：メタノールで３回、ヘキサンで２回
スプリット比：１：２０
カラム：ヒューレットパッカード社製ＨＰ−５ＭＳ（Ｏ．２５ｍｍ×３０Ｍ、フィルム厚Ｏ．２５μｍ）
キャリアーガス：１ヘリウム１．０ｍｌ／ｍｉｎ
ソルベントディレイ：２ｍｉｎ
オ一ブン昇温条件：ｌ１５℃、１．５分保持→７０／分で２５０℃まで昇温、２分保持→７０／分で３００℃まで昇温、７分保持
ポストタイム：Ｏ
内部標準：１−ウンデカノール／エタノール溶液（１μｌ／ｍｌ）を各バイアルに１０μ１添加
注入口ライナー：スプリット／スプリットレス  ライナー
解析：ＴＩＣを取り込んだ後、６９マスをセレクションし１ウンデカノール（ＲＴ＝３．３９ｍｉｎ）、ファルネソール（ＲＴ＝４．２３ｍｉｎ）、ゲラニルゲラニオ一ル（ＲＴ＝５．７８ｍｉｎ）のピーク面積を積分した。内部標準のウンデカノールに対するピーク面積比より定量。
【００４１】
各株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
2005000130.tif 000002
【００４３】
表１から判るように、１％エタノールもしくは１％パルミチン酸を培地に存在させた場合、サッカロミセス・セレビシエ  ＡＴＣＣ  ４０２２８００株においてプレニルアルコールの生産性が向上していることが判る。
【００４４】
さらに、培地にエタノールの代わりにブタノールを含む場合におけるプレニルアルコールの生産性を検討した。細胞は上記と同じ株を用い、培地は１％エタノールもしくは１％パルミチン酸の代わりに０．５％ブタノールを添加したこと以外は上記と同様に調製した。両株ともに、３０℃で８日間培養した。なお培養して４８時間後に０．５％ブタノールを培地に添加した。培養終了後、上記と同様の方法で成分分析を行った。
【００４５】
各株について、培養物の成分分析の結果及び菌数測定の結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2005000130.tif 000003
【００４７】
表２から判るように、ブタノールを培地に存在させた場合、両株においてプレニルアルコールの生産性に効果はなかった。
【００４８】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明に係るプレニルアルコールの製造方法では、細胞におけるプレニルアルコールの生産性を向上させることができ、各種の分野で有用なプレニルアルコールを優れた生産性で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞におけるプレニルアルコール生合成経路を模式的に示す図である。
【図１】
2005000130.tif 000004