(57)【要約】【課題】  本発明は、キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させることを課題とする。【解決手段】  キシラナーゼにおける少なくとも１個のアミノ酸残基をアルギニンで置換することにより、該キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシラナーゼにおける少なくとも１個のアミノ酸残基をアルギニンで置換することにより、該キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させる方法。
【請求項２】
アミノ酸残基の少なくとも１個がアルギニンで置換されたキシラナーゼであって、アルギニン置換を有しないキシラナーゼと比較して向上したパルプ漂白能力を有する該キシラナーゼ。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、２０残基目のＫ、５９残基目のＱ、１１７残基目のＱ、１９７残基目のＨ、２０１残基目のＩの少なくとも1個のアミノ酸残基がアルギニンで置換されたアミノ酸配列を含むキシラナーゼ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のキシラナーゼを用いてパルプを漂白する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼを用いてパルプを漂白する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製紙工業においてパルプの漂白は重要な工程である。漂白工程の概略を以下に示す。
クラフト蒸解後、酸素脱リグニン工程においてパルプをｐＨ１０〜１２、８０℃で処理し、パルプを茶色に着色しているリグニンの大部分を除去する。この段階でパルプ中のリグニン含量は２〜５％である。続いて、塩素、二酸化塩素、過酸化水素及び／又はオゾン等の化学物質を使用した多段階漂白プロセスにおいて更にパルプを漂白し、高品質紙用のパルプを得る。
【０００３】
しかし、リグニンを除去するために使用されている塩素及び塩素含有化学物質は副産物として、ダイオキシン及びその他の有機塩素化合物を生成し、環境を汚染する恐れがある。そのため近年、塩素及び塩素含有化学物質の使用が控えられる傾向にあり、エレメンタリー塩素フリー（ＥＣＦ）漂白及び全塩素フリー（ＴＣＦ）漂白の導入又は開発が推進されている。１９８６年、パルプをキシラナーゼ処理することが、塩素及び塩素含有化学物質の使用量の削減に非常に有効であることが報告された（非特許文献１）。
【０００４】
パルプをキシラナーゼ処理することにより、リグニンとセルロース間に存在しているヘミセルロース鎖が切断される。これにより、以降の工程において、紙の質を低下させることなく、リグニンを抽出除去することが容易になり、塩素及び／又は塩素含有化学物質の使用量を２５〜３０％減少させることができ、結果として漂白薬品コストを削減できる（非特許文献２）。
【０００５】
パルプ漂白に使用されるキシラナーゼに求められる性質としては以下の性質が挙げられる。クラフト蒸解後、漂白の全工程は６０℃以上の高温で実施されるため、至適温度及び温度安定性の低い酵素では失活してしまう。また、酵素失活を避けるため、キシラナーゼ漂白工程中、パルプ温度を下げ、次の段階において再度温度を上げるといった温度調節を行う方法が考えられるが、莫大なエネルギーロスを生じるため現実的ではない。以上から、キシラナーゼは、６０℃以上の高温で安定に作用できるような至適温度及び温度安定性を有することが必要とされる。
【０００６】
また、通常、キシラナーゼによる漂白は、酸素脱リグニン後のｐＨ１０〜１２で行われるため、このような条件下では、反応至適ｐＨが中性域〜酸性域にある酵素は作用しない。このような酵素を作用させるためには、パルプのｐＨを調整する必要がある。この操作は漂白工程を煩雑にするだけでなく、パルプの液性を中性域から酸性域にするため、可溶化していたリグニンやヘミセルロースの不溶化をもたらす。これらがパルプに付着してしまうため、洗浄効果の悪化という問題が生じる。以上から、アルカリ性で作用するキシラナーゼが求められる。
【０００７】
キシラナーゼは、Ｄ−キシロースがβ１，４−グリコシド結合した多糖であるキシランを分解する酵素として定義される。漂白用キシラナーゼは、実際のパルプ漂白工程において、塩素及び塩素含有化学物質の使用量を削減できる能力を有することが必須である。しかし、キシラン分解活性を有するすべてのキシラナーゼが、パルプ漂白工程において塩素及び塩素含有化学物質の使用量を削減できるという訳ではない。すなわち、キシラナーゼの漂白能力は、オート麦キシランやカバキシランなど市販の可溶性キシランを分解する能力に比例するわけではなく、個々のキシラナーゼによって、可溶性キシラン分解活性と漂白能力との関係は異なっている。そして、この能力の違いが、キシラナーゼを産生する微生物種の違いによるものか、又は、キシラナーゼの属するファミリーの違いによるものか検討されてきたが、未だ明らかでない（非特許文献３）。
【０００８】
好適な至適ｐＨ及び至適温度、温度安定性及びパルプ中のキシランを分解する能力の全てを兼ね備えたキシラナーゼを取得するには、スクリーニングに多大な労力を有する。そのため、近年、有効なキシラナーゼを得るために、分子生物学的手法を用いて、既存のキシラナーゼを改変する試みが行われている。例えば、耐熱性を改善する試みや至適ｐＨを改変する試みが行われている（非特許文献４及び５）。
【０００９】
これらの試みの多くはＸ線解析等から得られた立体構造又は性質の異なるキシラナーゼの一次構造を比較検討し、部位特異的にアミノ酸を置換又は付加するものである。しかし、現在まで耐熱性及び至適ｐＨに影響を及ぼすアミノ酸は特定されていない。そのため、試行錯誤により、置換位置、置換アミノ酸種を見出さなくてはならず、多大の労力を要していた。これらの方法とは別に遺伝子シャッフリング法又は無作為変異法等の分子進化的手法により、キシラナーゼの耐熱性、至適ｐＨ等を改善する試みもなされている（非特許文献６〜９）。
【００１０】
しかし、これらの試みは、タンパク質あたりのキシラン分解活性に注目したものであり、タンパク質あたりの漂白能力及び実際にパルプに作用させた場合の漂白効果については検討していない。さらに、パルプ漂白用キシラナーゼにとって重要なキシラナーゼ活性あたりの漂白能力を向上させる試みは全く行われていない。
【００１１】
また、これらの方法は通常、無作為にペプチド鎖又はアミノ酸を置換し、得られた大量の変異体群から最も性質の改善した変異体を選抜、取得するものである。すなわち、変異・選抜の一連の操作を１ラウンドとし、ラウンドを繰り返すことにより、有用な変異を蓄積させ、目的の性質が改善したタンパク質を取得するものである。しかしながら、不必要な変異及び不利な効果を及ぼす変異もラウンドが進むにつれて蓄積されてしまうため、全体としての改善度合いを低下させてしまう。よって、変異体を最適化するためには、不利及び不必要な効果を及ぼす変異を取り除かねばならない。しかし、多数の変異の中から、これらを見出すことは容易でない。現在、これらの変異を除去するためには、親クローンと変異体との間での中和操作等を行う必要があり、多大な労力を要していた。
【００１２】
従って、キシラナーゼのパルプ漂白能力の向上に関与するアミノ酸変異を特定できれば、多大な労力削減が期待できる。
【００１３】
【非特許文献１】Viikariら, Proceeding of the 3rd International Conference on Biotechnology in Pulp and Paper Industry, ストックホルム, p.67-69, 1986
【非特許文献２】Bajpaiら, Process Biochemistry, 27:319-325, 1992
【非特許文献３】J.H.Clarkeら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 48:177-183, 1997
【非特許文献４】Jacquesら, Protein Science, 9:466-475, 2000
【非特許文献５】Manishら, J. Mol. Bio. 299:255-279, 2000
【非特許文献６】Willemら, Nature, 370:389-391, 1994
【非特許文献７】Craigら, PCR Methods and Applications, 2:28-33, 1992
【非特許文献８】Araseら, FEBS Lett., 25;316(2):123-7, 1993
【非特許文献９】Shibuyaら, Biochem. J., 349:651-656, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、漂白能力のないキシラナーゼに様々なアミノ酸置換を施した結果、該キシラナーゼに漂白能力を付与することに成功した。また、これらの改変キシラナーゼのパルプ漂白能力をさらに高めるため、再度アミノ酸置換を行い、漂白能力をさらに向上させることに成功した。そして、これらの改変キシラナーゼのアミノ酸配列を詳細に検討した結果、該改変キシラナーゼがアルギニン置換を含んでいること、さらに、アルギニン置換数を増加させるほどキシラナーゼのパルプ漂白能力が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
（１）キシラナーゼにおける少なくとも１個のアミノ酸残基をアルギニンで置換することにより、該キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させる方法。
（２）アミノ酸残基の少なくとも１個がアルギニンで置換されたキシラナーゼであって、アルギニン置換を有しないキシラナーゼと比較して向上したパルプ漂白能力を有する該キシラナーゼ。
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、２０残基目のＫ、５９残基目のＱ、１１７残基目のＱ、１９７残基目のＨ、２０１残基目のＩの少なくとも1個のアミノ酸残基がアルギニンで置換されたアミノ酸配列を含むキシラナーゼ。
（４）（２）又は（３）に記載のキシラナーゼを用いてパルプを漂白する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、キシラナーゼの漂白能力を向上させることができる。そして、この漂白能力の向上したキシラナーゼを用いてパルプの漂白を行うことにより、パルプ漂白工程における漂白薬品の量を削減することができる。また、漂白能力のないキシラナーゼに漂白能力を付与することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の方法は、標的となるキシラナーゼ（以下、標的キシラナーゼと称する）を構成するアミノ酸配列における少なくとも１個のアミノ酸残基をアルギニンに置換することにより、標的キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させるものである。標的キシラナーゼは特に限定されるものではなく、パルプ漂白能力を有するキシラナーゼ及びパルプ漂白能力を有しないキシラナーゼの双方が標的となりうる。本発明の方法は、パルプ漂白能力を有しないキシラナーゼに対し、特に好適に用いられる。また、キシラナーゼ活性の高いキシラナーゼを標的とするのが好ましい。標的キシラナーゼ種としては、特に限定されないが、例えば、Bacillus属、Neocallimastix属、Ruminococcus属、Clostridium属、Oryza属、Aspergillus属、Streptomyces属、Cellvibrio属、Butyrivibrio属、Filobasidium属、Caldicellulosiruptor属等に属する微生物及びウイルスが挙げられ、Bacillus属に属する微生物に由来するキシラナーゼが好ましい。例えば、Bacillus subtilis、Neocallimastix patriciarum、Ruminococcus flavefaciens、Clostridium saccharobutylicum、Oryza sativa、Aspergillus kawachii、Streptomyces lividans、Bacillus pumilus、Cellvibrio japonicus、Butyrivibrio fibrisolvens、Filobasidium floriforme、Caldicellulosiruptor saccharolyticus、Belladonna mottle virus、Human parainfluenza virus 1に由来するキシラナーゼが挙げられる。具体的には、例えば、EMBL accession番号M36648、X54523、X65526、Z11127、M31726、D23325、D14848、M64553、M64552、X00660、D00087、X15429、X61495、M64551、M22624、D14847、X12596、M34459、A37755、A40176等で特定されるキシラナーゼが標的となりうる。特に好ましくは、配列番号２で表される塩基配列でコードされるキシラナーゼを標的キシラナーゼとして用いる。
【００１９】
上記標的キシラナーゼを構成するアミノ酸配列において、アルギニンに置換されるアミノ酸残基は、標的キシラナーゼのキシラナーゼ活性中心を構成するアミノ酸残基以外であれば特に限定されない。本明細書においてキシラナーゼ活性とは、キシランを加水分解してキシロース及びその少糖を生成する活性を意味する。キシラナーゼ活性中心とは、キシラナーゼ分子中の、キシランの加水分解を触媒するために必須の部位を意味する。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するキシラナーゼＡＴＳ（Bacillus由来）のキシラナーゼ活性中心を構成するアミノ酸残基としては、９５残基目のグルタミン酸（Ｅ）及び１８５残基目のグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。
【００２０】
また、置換されるアミノ酸残基の種類は特に限定されないが、好ましくは、リシン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）及びヒスチジン（Ｈ）である。
【００２１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するキシラナーゼを標的キシラナーゼとする場合、配列番号１で表されるアミノ酸配列における２０残基目のＫ、５９残基目のＱ、１１７残基目のＱ、１９７残基目のＨ、２０１残基目のＩの少なくとも1個のアミノ酸残基をアルギニンで置換するのが好ましく、これらすべてを置換するのがさらに好ましい。
【００２２】
アルギニン置換の数は、１個以上、好ましくは１〜２個、より好ましくは２〜３個である。さらに、本発明者らは、アルギニン置換数に比例して、キシラナーゼの漂白能力が向上することを見出した。従って、当業者であれば、アルギニン置換数を適宜選択することによって、キシラナーゼの漂白能力を調節することができる。
【００２３】
本発明はまた、アミノ酸残基の少なくとも１個がアルギニンで置換されたキシラナーゼであって、アルギニン置換を有しないキシラナーゼと比較して向上したパルプ漂白能力を有するキシラナーゼ（以下、アルギニン置換キシラナーゼと称する）に関する。本発明のアルギニン置換キシラナーゼにおいては、アルギニン置換を有しないキシラナーゼと比較して、キシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力の向上が認められる。すなわち、本発明のアルギニン置換キシラナーゼにおいては、キシラナーゼ活性が変化しない場合であっても、パルプ漂白能力の向上が認められる。
【００２４】
キシラナーゼにアルギニン置換を施すことによってキシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力が向上する理由としては、パルプ表面が負に帯電しているため、正電荷を有しているアルギニンを導入することにより、負に帯電しているパルプとキシラナーゼが接触し易くなることが考えられる。
【００２５】
キシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力が向上するとは、キシランを基質とし、キシロース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離するキシラナーゼタンパク質量を１Ｕ（ユニット）とし、アルギニン置換されていない標的キシラナーゼとアルギニン置換キシラナーゼとを、同じユニットのタンパク質量でそれぞれのパルプ漂白能力について比較した場合に、アルギニン置換キシラナーゼのパルプ漂白能力の方が高いことを意味する。これまでに報告された改変キシラナーゼにおいては、タンパク質量単位あたりのパルプ漂白能力については検討が行われているが、キシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力については全く検討されておらず、本発明者らは、キシラナーゼにアルギニン置換を施すことによって、キシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力が向上することを初めて見出したのである。すなわち、本発明により、キシラナーゼ活性にかかわらず、キシラナーゼのパルプ漂白能力を向上させることができる。また、本発明により、キシラナーゼ活性を有するがパルプ漂白能力を有しないキシラナーゼに対しても、パルプ漂白能力を付与することが可能になる。従って、例えば、パルプ漂白工程に好適な至適ｐＨ、至適温度及び温度安定性を有するがパルプ漂白能力を有しないようなキシラナーゼに対して、本発明の方法によってパルプ漂白能力を付与することにより、パルプ漂白に最適なキシラナーゼを得ることも可能になる。
【００２６】
キシラナーゼ活性は、当技術分野において通常用いられる方法によって測定することができ、例えば、基質として市販のオート麦製又はカバ由来若しくはブナ由来のキシランを用い、酵素反応の結果生じる還元末端を、ＤＮＳ法やソモギー・ネルソン法などの一般的な方法で測定することによって測定できる。また、アゾ染料等の染料を結合させたキシラン誘導体を用い、色素の遊離量を比色定量することによっても測定することができる。
【００２７】
キシラナーゼのパルプ漂白能力は、キシラナーゼを加えずに漂白薬品のみでパルプ漂白を行った場合に目標白色度を得るまでに要した漂白薬品量と、一定ユニットのキシラナーゼで処理した後のパルプを、該目標白色度を得るまで漂白薬品で漂白した場合に要した漂白薬品量との比で表すことができる。すなわち、キシラナーゼ活性単位あたりのパルプ漂白能力は、一定のキシラナーゼ活性単位のキシラナーゼを用いることによって低減することのできる漂白薬品の割合として表すことができる。漂白薬品としては、塩素、二酸化塩素、苛性ソーダ、酸素などの一般的に用いられる漂白薬品及びそれらの組み合わせが用いられる。
【００２８】
標的キシラナーゼを構成するアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基のアルギニン置換は、目的とする遺伝子の遺伝情報を元に、当技術分野で通常用いられる部位特異的変異の導入方法、例えば、ギャップＤＮＡ法、ウラシルＤＮＡ法及びカセット変異法等によって実施することができる。
【００２９】
本発明のアルギニン置換キシラナーゼは、クローニングされた遺伝子を発現させることにより作製できる。その手法は、前記の部位特異的変異導入によって得られたアルギニン置換キシラナーゼ遺伝子を、適当な宿主・ベクターを用いて発現させることにより高生産することができる。発現に用いられるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター等が主に使われる。宿主として、大腸菌、枯草菌、酵母等が主に使われる。培養のための炭素源、窒素源には、資化してキシラナーゼを生産することができるものであればいずれも用いることができる。例えば、炭素源としては、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふすま、パルプ、バカス、コーンファイバー、稲わら等の農業廃棄物又は植物繊維等を使用することができる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用いることができる。また、各種塩類、ビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。培養温度及びｐＨは、菌が耐熱性キシラナーゼを生産する範囲であればいずれでも良く、培養温度は好ましくは３７℃、ｐＨは好ましくは７である。酵素の精製方法としては、硫安分画、ゲル濾過による分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシアパタイト、等電点分画等を適宜組み合わせ、また繰り返すことにより精製することができる（Sanbrookら, Molecular cloning a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。
【００３０】
次に、本発明のアルギニン置換キシラナーゼを用いたパルプの漂白方法について説明する。化学パルプ及び機械パルプ製造工程において、本発明のアルギニン置換キシラナーゼ又はアルギニン置換キシラナーゼ産生菌の培養物で、パルプを処理することで漂白を行うことができる。さらに酵素処理の前後、あるいは途中に化学漂白及び／又はアルカリ抽出を行うことでパルプの漂白を行うことができる。
【００３１】
本発明のパルプ漂白方法において、処理に使用する酵素量については、標的キシラナーゼの種類やアルギニン置換数などに依存するが、通常、パルプの絶乾重量１ｇあたり、キシラナーゼ活性単位として０．１〜５Ｕ、好ましくは０．５〜３Ｕ添加すればよい。反応条件についても標的キシラナーゼ等に依存するが、通常、反応温度３０〜７０℃、ｐＨ７〜９である。反応時間は、通常、０．２〜２４時間、好ましくは０．５〜８時間である。化学漂白に用いる試薬としては、塩素、二酸化塩素、二酸化窒素、次亜塩素酸塩、酸素、過酸化水素、オゾン等が挙げられる。またアルカリ抽出には、当業者に公知の多くのアルカリ性化合物を用いることができる。アルカリ抽出には、水酸化ナトリウム換算で０．５〜３％（対絶乾パルプ）のアルカリを用い、酸素や過酸化水素等を添加しながらアルカリ処理を行うことができる。
【００３２】
次に本発明について実施例で更に詳しく説明するが、これは単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３３】
プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（＋）のＮｄｅＩ及びＳａｌＩの間に連結してある配列番号２に示すキシラナーゼＡＴＳ遺伝子（Bacillus由来）を、変異用ＤＮＡプライマー、ｐＥＴＭｅｔプライマー（配列番号３）及びｐＥＴＳａｌプライマー（配列番号４）を用いて、０．２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＴＴＰ、１ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１７μｇ／μｌ ＢＳＡ、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００６７ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、６．１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５Ｕ△Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）からなる反応液中にて、アプライドバイオシステムズジャパン社ＰＣＲ９７００を用いて増幅することにより、無作為変異を導入したキシラナーゼ遺伝子を作製した。ＰＣＲは以下の反応条件にて実施した。
【００３４】
１サイクル：９４℃、５ｍｉｎ→（９４℃、１ｍｉｎ→５５℃、１ｍｉｎ→７２℃、２ｍｉｎ）→７２℃、１０ｍｉｎを３０サイクル実施した。
【００３５】
得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ(タカラバイオ株式会社製)及びＳａｌＩ(タカラバイオ株式会社製)にて消化し、同じく、制限酵素ＮｄｅＩ(タカラバイオ株式会社製)及びＳａｌＩ(タカラバイオ株式会社製)にて消化したプラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（＋）に連結し、プラスミドを得た。得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した後、５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩培養した。得られた形質転換体を５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地で、３７℃にて一晩培養後、遠心分離にて菌体を回収した。本菌体を超音波破砕し、再度遠心分離を行い、上清を回収し、酵素液とした。
【００３６】
キシランに対する活性の測定は次のように行った。キシラン（カバ材由来、シグマ社製）の１％溶液（ｐＨ ８．０、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）１ｍｌに、被検酵素液１００μｌを添加し、６０℃にて５分間反応させた。ＤＮＳ試薬を２ｍｌ添加して５分間煮沸した後、直ちに氷冷して５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。検量線は濃度既知のキシロースを用いて作製した。キシラナーゼ活性単位については、上記の条件で１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１Ｕ（Ｕ：ユニット）とした。
【実施例２】
【００３７】
キシラナーゼによる処理を行わない対照漂白パルプの漂白条件は次の通りとした。工場にてクラフト蒸解を行い、酸素脱リグニンを行った広葉樹パルプ（カッパー価８．５、白色度４６．０％、パルプ濃度１０％、ｐＨ８）に対して、酵素を添加せずに６０℃にて２時間処理した。続いて以下の条件にて二酸化塩素−アルカリ−二酸化塩素−二酸化塩素（Ｄ−Ｅ/Ｏ−Ｄ−Ｄ）の順で多段漂白を行った。すなわち、この未漂白パルプのｐＨを４、パルプ濃度１０％になるように調整した後、絶乾パルプ重量あたり二酸化塩素を０．４５％添加し、温度７０℃で７０分間処理を行った（Ｄ段）。冷却後、得られたパルプを洗浄、脱水した。パルプ濃度を１０％に調整した後、苛性ソーダを絶乾パルプ重量あたり１．５％添加し、７８０ｋＰａの酸素分圧下、９０℃にて３０分間の処理を行ってＥ/Ｏ段の抽出を行った。得られたパルプを洗浄、脱水した。ｐＨを４、パルプ濃度１０％に調整した後、絶乾パルプ重量あたり二酸化塩素を０．２％添加し、温度７０℃で２４０分間処理を行った（Ｄ段）。更に絶乾パルプ重量あたり二酸化塩素を０．２％添加し、温度７０℃で２４０分間処理を行った（Ｄ段）。得られたパルプを洗浄、脱水、離解した後、Ｔａｐｐｉ試験法Ｔ２０５ｏｓ−７１（ＪＩＳＰ ８２０９）に従って坪量６０ｇ／ｍ２のシートを作製し、ＪＩＳ Ｐ ８１２３に従ってパルプのハンター白色度を測定した。その結果、白色度は８５．０％であった。
【００３８】
キシラナーゼによる処理を伴う漂白方法は、上記のキシラナーゼによる処理を行わない漂白方法において、クラフト蒸解後、酸素脱リグニンを行った広葉樹パルプ（カッパー価８．５、白色度４６．０％、パルプ濃度１０％、ｐＨ８）に、実施例１で得られた変異キシラナーゼを、パルプ絶乾重量１ｇあたり２Ｕ添加して、６０℃にて２時間処理した。酵素処理後、パルプを上記と同様に、二酸化塩素−アルカリ−二酸化塩素−二酸化塩素（Ｄ−Ｅ/Ｏ−Ｄ−Ｄ）の漂白工程に付し、最終白色度が８５．０％となるように二酸化塩素量を調節し、漂白を行った。又、特に示さない限り、Ｄ段における薬品添加削減率は下記式（１）により算出した。
【００３９】
Ｄ段における薬品添加削減率（％）＝｛（酵素未処理Ｄ段における合計薬品添加率−酵素処理Ｄ段における合計薬品添加率）／酵素未処理Ｄ段における合計薬品添加率｝×１００…（１）
【００４０】
実施例１で得られた変異キシラナーゼの酵素液を用いて上記パルプ漂白試験を行い、式（１）に従って薬品添加削減率を算出した。結果を表１に示す。表１から、未改変キシラナーゼＡＴＳで処理した場合は、酵素処理なしの場合と比べ、二酸化塩素添加量の減少は認められなかった。一方、変異キシラナーゼＲｄ１−２２、Ｒｄ１−１３及びＲｄ１−４の酵素液でそれぞれ処理した場合は、未改変キシラナーゼＡＴＳで処理した場合に比べ、二酸化塩素添加量が５〜１０％減少した。キシラナーゼＲｄ１−４、Ｒｄ１−１３及びＲｄ１−２２のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０、１１及び１２に示す。
【実施例３】
【００４１】
キシラナーゼＲｄ１−１３産生菌からプラスミドを抽出し、該プラスミドに対して再度、実施例１と同様に変異処理を行い、その結果、キシラナーゼＲｄ２−７、キシラナーゼＲｄ２−２３を得た。そしてこれらの酵素液について、実施例２と同様にパルプ漂白試験を行った。このキシラナーゼＲｄ２−７又はキシラナーゼＲｄ２−２３の酵素液でそれぞれ処理した場合は、未改変キシラナーゼＡＴＳで処理したものと比べ、二酸化塩素添加量が１３〜１５％減少していた。これらのキシラナーゼの塩基配列を決定し、アミノ酸配列を比較した結果、すべてのクローンにアルギニン置換が確認された（図１）。キシラナーゼＲｄ２−７のアミノ酸配列を配列番号１３に、キシラナーゼＲｄ２−２３のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。更に、アルギニン置換数が増加するにつれ、二酸化塩素添加量が減少する傾向があることが明らかとなった（表１）。
【００４２】
【表１】
2005171409.tif 000002
【実施例４】
【００４３】
配列番号５〜９に示すＤＮＡプライマー及びＭｕｔａｎ-Ｋ（タカラバイオ株式会社製）を用い、Ｋｕｎｋｅｌ法にて、キシラナーゼＡＴＳの２０残基目のＫ、５９残基目のＱ、１１７残基目のＱ、１９７残基目のＨ、２０１残基目のＩを部位特異的にアルギニン置換したキシラナーゼＡＴＳ５Ｒ（図１）を作製した。キシラナーゼＡＴＳ５Ｒのアミノ酸配列を配列番号１５に示す。実施例１と同様に酵素液を調製し、実施例２と同様に漂白試験を行った。その結果、キシラナーゼＡＴＳ５Ｒで処理した場合は、未改変キシラナーゼＡＴＳで処理した場合と比べて、二酸化塩素添加量が２０％減少していた（表１）。以上の結果より、アルギニン置換数が増加するにつれ、キシラナーゼ活性あたりのパルプ漂白能力が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、製紙工業における重要な工程であるパルプの漂白工程で、漂白薬品コストの削減及び環境汚染防止の観点から、非常に有利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】キシラナーゼＡＴＳのアミノ酸配列と、実施例で得られた各種アルギニン置換キシラナーゼ（Ｒｄ１−４、Ｒｄ１−１３、Ｒｄ１−２２、Ｒｄ２−７、Ｒｄ２−２３、ＡＴＳ５Ｒ）のアミノ酸配列とのアライメントを表す。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：キシラナーゼＡＴＳアミノ酸配列
配列番号２：キシラナーゼＡＴＳ塩基配列
配列番号３：変異プライマー配列
配列番号４：変異プライマー配列
配列番号５：変異プライマー配列
配列番号６：アルギニン置換変異プライマー配列 
配列番号７：アルギニン置換変異プライマー配列 
配列番号８：アルギニン置換変異プライマー配列 
配列番号９：アルギニン置換変異プライマー配列 
配列番号１０：キシラナーゼＲｄ１−４アミノ酸配列
配列番号１１：キシラナーゼＲｄ１−１３アミノ酸配列
配列番号１２：キシラナーゼＲｄ１−２２アミノ酸配列
配列番号１３：キシラナーゼＲｄ２−７アミノ酸配列
配列番号１４：キシラナーゼＲｄ２−２３アミノ酸配列
配列番号１５：キシラナーゼＡＴＳ５Ｒアミノ酸配列
【図１】
2005171409.tif 000003
【配列表】
2005171409000001.app