(57)【要約】【解決手段】  遺伝子操作由来のヒト血清アルブミン(rHSA)産生宿主の培養液を宿主菌体を含んだまま加熱処理し、該加熱処理液を吸着体粒子が浮遊する流動床に上方送液して接触させた後、下降法により吸着画分を回収することを特徴とするrHSAの精製方法。rHSA 25% 溶液の場合にA350/A280 が0.015以下であることを特徴とするrHSA含有組成物。【効果】  培養液を酵母菌体を含んだまま加熱することで簡単かつ有効にプロテアーゼを不活化できることが判明し、ｒＨＳＡ精製工程に吸着流動床システム（ストリームラインＳＰ）の適用が可能となった。本発明は精製工程の短縮および収量アップ、品質向上に寄与するｒＨＳＡ精製方法として極めて有用。本発明によれば、産生宿主関連成分あるいはその他の夾雑成分を含まず、着色も充分抑えられた遺伝子操作由来のＨＳＡが提供できる。【選択図】図６  
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とする遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項２】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を吸着体粒子が浮遊する流動床に上方送液することにより該吸着体粒子に接触させた後、送液方向を切替えて緩衝液を下方送液することによりその吸着画分を溶出、回収することを特徴とする遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項３】
加熱処理の温度が５０〜１００℃、時間が１分〜１０時間であることを特徴とする請求項１または２記載の遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項４】
加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、ｐＨ３〜５にて行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項５】
加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、電気伝導度０．１〜５０ｍＳの雰囲気にて行われることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項６】
前記吸着体粒子が強陽イオン交換基を有する吸着体粒子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの精製方法で回収されるヒト血清アルブミンを含有する吸着画分を、さらに疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理および限外濾過膜処理からなる群から選ばれる少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とする遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかの精製方法で回収されるヒト血清アルブミンを含有する吸着画分を、還元剤の存在下で加熱処理した後、さらに疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理および限外濾過膜処理からなる群から選ばれる少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とする遺伝子操作由来ヒト血清アルブミンの精製方法。
【請求項９】
遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンを含有し、当該アルブミン２５％溶液の場合にＡ350 ／Ａ280 が０．０１５以下であることを特徴とするヒト血清アルブミン含有組成物。
【請求項１０】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とする遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１１】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの産生宿主を含有する培養液を加熱処理し、該加熱処理液を吸着体粒子が浮遊する流動床に上方送液することにより該吸着体粒子に接触させた後、送液方向を切替えて緩衝液を下方送液することによりその吸着画分を溶出、回収することを特徴とする遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１２】
加熱処理の温度が５０〜１００℃、時間が１分〜１０時間であることを特徴とする請求項１０または１１記載の遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１３】
加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、ｐＨ３〜５にて行われることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１４】
加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、電気伝導度０．１〜５０ｍＳの雰囲気にて行われることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１５】
前記吸着体粒子が強陽イオン交換基を有する吸着体粒子であることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれかに記載の遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれかの製造方法で回収されるヒト血清アルブミンを含有する吸着画分を、さらに疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理および限外濾過膜処理からなる群から選ばれる少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とする、遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【請求項１７】
請求項１０〜１５のいずれかの製造方法で回収されるヒト血清アルブミンを含有する吸着画分を、還元剤の存在下で加熱処理した後、さらに疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理および限外濾過膜処理からなる群から選ばれる少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とする、遺伝子操作由来の精製ヒト血清アルブミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子操作によって得られるヒト血清アルブミンの簡易でかつ高収率な精製方法に関する。また、本発明は遺伝子操作由来のＨＳＡに特有の問題である着色度に関し、当該着色度が極めて低いことを特徴とする遺伝子操作由来のヒト血清アルブミン含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという）は血漿中に最も多く含まれている蛋白質で、血液中で浸透圧の維持、栄養物質や代謝物質と結合してその運搬などの機能を果たしている。かかる機能を有するＨＳＡは、アルブミンの喪失及びアルブミン合成低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどを治療する医薬品として用いられている。
【０００３】
従来より、ＨＳＡは主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。しかし、血液を原料とするＨＳＡの製造法は、血液供給の困難性、不経済性、および肝炎ウイルスのように好ましくない物質混入のおそれ等の欠点を有しており、代替の原料の開発が望まれている。
【０００４】
このような状況下、組換ＤＮＡ技術の出現に伴い、血液由来のＨＳＡに替わるべく、遺伝子操作によるＨＳＡの大量生産および精製の技術が確立されつつある。
遺伝子操作により得られるＨＳＡ（本発明において、遺伝子操作由来ＨＳＡという。なお以下、ｒＨＳＡと略称する。）の精製について、従来の血漿由来のＨＳＡに関する精製方法をそのまま適用することは不適切である。というのも、除去すべき夾雑成分が血漿由来のＨＳＡとは全く異なっているからである。例えば、遺伝子操作由来のＨＳＡに特有の着色物質、宿主細胞に由来する蛋白質、多糖類もしくはその他の夾雑成分などである。特に宿主細胞に由来する成分は、ヒトなどの生体にとって異物であるため抗原性の問題からこれらの成分を十分除去する必要がある。
このため、培養処理により産生されたｒＨＳＡを宿主細胞に由来する成分および培養成分等から、十分な精度をもって単離・精製する方法が各種研究されている。例えば、従来行われている方法としてｒＨＳＡを含有する酵母培養液を、圧搾→限外濾過膜処理→加熱処理→限外濾過膜処理に供した後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換体のカラムクロマトグラフィー処理等の工程に供する方法（特許文献１、非特許文献１）が挙げられる。また、上記従来法の後で、さらにキレート樹脂処理またはホウ酸・塩処理の工程に供する方法も報告されている（特許文献２、３）。
【０００５】
従来法による上記数工程からなる精製処理は、宿主細胞に由来する抗原を除去し高い精製度を担保するため不可欠である一方、多工程を経ることによるｒＨＳＡの収率の低下、処理時間の長期化等の欠点を有している。ｒＨＳＡの収率を上げるため各工程の歩留向上が図られてはいるが、もはや改善しつくした感があり収率の向上も頭うち状態となっている。また、上記従来法では圧搾処理を開放系で行うことにより汚染物が混入するおそれがあり、ｒＨＳＡを医薬品として調整する場合に必須である衛生管理が難しい等の問題がある。また、従来法に基づく精製法では、ｒＨＳＡの着色度を、ｒＨＳＡ濃度として２５０ｍｇ／ｍｌに調製したものの場合でＡ350 ／Ａ280 ＝約０．０１５程度までに低減させることが限度であった（特許文献４，５）
【０００６】
ところで、最近、培養後の菌体細胞の除去や濃縮操作等の前処理を行わず、クルードな培養原液から直接目的のタンパク質を回収する方法が開発されている〔ファルマシア社が開発している吸着流動床技術（Expanded Bed Adsorption)を用いたストリームライン法など（特許文献６）〕。
今までこのような吸着流動床技術がｒＨＳＡの精製、特に酵母培養液からｒＨＳＡを回収・精製するために応用された例はなく、実際にこの方法がｒＨＳＡ精製の合理化、収量アップを図るのに有用であるか等についてはまったく知られていない。しかし、ｒＨＳＡについてもこの方法ないしはこれに準ずる方法が適用できれば、従来行われている数工程からなる精製処理を簡略化することができるものと考えられる。
【０００７】
ところが、上記方法で用いられるストリームラインカラム（吸着体：ストリームラインＳＰ）等への吸着条件である酸性下では、培養液中のプロテアーゼにより該培養液に含まれるｒＨＳＡが速やかに低分子化されてしまいｒＨＳＡの収率が著しく低下するという問題があって、ｒＨＳＡの精製に上記吸着流動床技術をそのまま用いることは困難であった。そこで、吸着流動床技術の精製工程の簡略，簡便化等というメリットを減殺することなく、ｒＨＳＡを安定な状態で、高い収率をもって高度精製を図る方法の開発が望まれる。
【特許文献１】特開平５−３１７０７９号公報
【特許文献２】特開平６−５６８８３号公報
【特許文献３】特開平６−２４５７８９号公報
【特許文献４】特開平７−１７０９９３号公報
【特許文献５】特開平７−１７０９９４号公報
【特許文献６】特表平６−５０００５０号公報
【非特許文献１】Biotechnology of Blood Proteins. 1993, Vol. 227, 293-298
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、遺伝子操作により得られるＨＳＡの精製方法に関し、純度の高い高品質のｒＨＳＡを高収率でかつ短時間に取得しうる簡易な方法を提供することである。また、本発明の課題は遺伝子操作によって得られ、かつ産生宿主または培地等に由来する遺伝子操作特有の着色成分が十分除去されたｒＨＳＡ、及びｒＨＳＡ含有組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討を重ねていたところ、ｒＨＳＡ産生宿主の培養液を宿主細胞を含んだまま直接加熱することで簡単かつ有効にプロテアーゼを不活性化させることができることを見出した。さらにこの知見をもとに該加熱処理液を、菌体細胞を除去することなく直接流動床中に浮遊する吸着体粒子と接触処理したところ、高い収率で簡便にｒＨＳＡが精製できることを見出した。また、当該加熱処理と吸着体粒子処理を組み合わせることにより、従来のｒＨＳＡ精製法である圧搾−限外濾過膜処理−加熱処理−限外濾過膜処理−陽イオン交換体処理からなる５工程が加熱処理−吸着体粒子処理からなる２工程に簡素化でき、精製工程時間が大幅に短縮できるとともに回収率も向上することを確認して本発明を完成した。さらに、当該方法を用いることにより、宿主細胞に由来する夾雑物質を実質的に含有せず、従来法以上に着色度が極めて低減されたｒＨＳＡが得られることを確認して本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、遺伝子操作により得られるＨＳＡ産生宿主の培養液をｒＨＳＡと産生宿主を含んだまま加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とするｒＨＳＡの精製方法である。より詳細には、遺伝子操作により得られるＨＳＡ産生宿主の培養液をｒＨＳＡと産生宿主を含んだまま加熱処理し、該加熱処理液を吸着体粒子が浮遊する流動床に上方送液して該吸着体粒子に接触させた後、送液方向を切替えて緩衝液を下方送液することにより吸着体粒子に吸着させたｒＨＳＡを溶出、回収することを特徴とするｒＨＳＡの精製方法である。
また、本発明は該精製方法において、ｒＨＳＡ産生宿主の培養液の加熱処理温度が５０〜１００℃、時間が１分〜１０時間であることを特徴とする精製方法、加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、ｐＨ３〜５の液性、および電気伝導度０．１〜５０ｍＳの雰囲気にて行われることを特徴とするｒＨＳＡの精製方法、また前記吸着体粒子が強陽イオン交換基を有するものであることを特徴とするｒＨＳＡの精製方法である。
【００１１】
さらに、本発明は、上記本発明の精製方法において流動床から回収されたｒＨＳＡ含有画分を、好ましくは還元剤の存在下で加熱処理した後、疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理及び限外濾過膜処理からなる群から選択される少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とするｒＨＳＡの精製方法である。
また、本発明は、遺伝子操作由来のヒト血清アルブミンを含有し、当該アルブミン２５％溶液（ｒＨＳＡ濃度として２５０ｍｇ／ｍｌ）の場合にＡ350 ／Ａ280 が０．０１５以下であることを特徴とするヒト血清アルブミン含有組成物である。
さらに、本発明は、遺伝子操作により得られるＨＳＡ産生宿主の培養液をｒＨＳＡと産生宿主を含んだまま加熱処理し、該加熱処理液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ、その吸着画分を回収することを特徴とするｒＨＳＡの製造方法を提供する。当該製造方法は、より詳細には、遺伝子操作により得られるＨＳＡ産生宿主の培養液をｒＨＳＡと産生宿主を含んだまま加熱処理し、該加熱処理液を吸着体粒子が浮遊する流動床に上方送液して該吸着体粒子に接触させた後、送液方向を切替えて緩衝液を下方送液することにより吸着体粒子に吸着させたｒＨＳＡを溶出、回収することを特徴とするｒＨＳＡの製造方法である。
また、本発明は該製造方法において、ｒＨＳＡ産生宿主の培養液の加熱処理温度が５０〜１００℃、時間が１分〜１０時間であることを特徴とする製造方法、加熱処理液と前記吸着体粒子との接触が、ｐＨ３〜５の液性、および電気伝導度０．１〜５０ｍＳの雰囲気にて行われることを特徴とするｒＨＳＡの製造方法、また前記吸着体粒子が強陽イオン交換基を有するものであることを特徴とするｒＨＳＡの製造方法である。
また、本発明は、上記本発明の製造方法において流動床から回収されたｒＨＳＡ含有画分を、好ましくは還元剤の存在下で加熱処理した後、疎水性クロマト処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理、ホウ酸・塩処理及び限外濾過膜処理からなる群から選択される少なくとも１つの精製処理に付すことを特徴とするｒＨＳＡの製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、培養液を酵母菌体を含んだまま直接加熱することで簡単かつ有効にプロテアーゼを不活化できるという知見に基づいて完成したものである。すなわち、本発明は、培養液を酵母菌体を含んだまま加熱した処理液を直接吸着層に浮遊する吸着体粒子と接触させることにより簡便かつ効果的にｒＨＳＡを精製する方法である。これにより、従来の圧搾−膜−加熱−膜−陽イオン交換体処理までの５工程が２工程（加熱−吸着体粒子処理）に簡素化でき工程時間が大幅に短縮されるとともに回収率も向上した。また、遺伝子操作により製造されるＨＳＡに特有の着色という問題も、本発明の精製方法によればその原因である着色物質を効果的に除去することができるため、解消することができる。
さらに本発明の精製方法によれば、菌体の培養から精製に至る遺伝子操作によるＨＳＡの製造工程全てを閉鎖系の１ライン上で行うことが可能となり、ｒＨＳＡ製造の自動化が図れるとともにｒＨＳＡを医薬品として調製する場合に必須である衛生管理が容易に行われるという利点がある。
すなわち、本発明はｒＨＳＡ精製において、工程の短縮および収量アップのみならず、品質向上にも寄与する方法として極めて有用である。
また、本発明によれば、遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連成分あるいはその他の夾雑成分を含まず、着色も充分抑えられた、医薬品として有用なｒＨＳＡを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について説明する。  
【００１４】
（１）遺伝子操作により得られるＨＳＡ
本発明において用いられる遺伝子操作により調製されるｒＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。具体的には、遺伝子操作を経てｒＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細胞などが例示される。特に、宿主として酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris) 〕を用いることが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を用いてもよい。さらに好適には、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株(a, his 4, leu 2, can 1)、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株(his 4) が用いられる。
【００１５】
これらのｒＨＳＡ産生宿主の調製方法、該宿主を培養することによるｒＨＳＡの生産方法及び培養物からのｒＨＳＡの分離採取方法は、公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施することができる。例えば、ｒＨＳＡ産生宿主の調製方法としては、例えば通常のＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号公報）、新規なＨＳＡ遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ2 プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）が例示される。
【００１６】
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ1 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ1 プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１７】
また、ｒＨＳＡ産生宿主の培養方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養（半回分培養）により、高濃度のグルコース或いはメタノール等を適度に少量ずつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特開平３−８３５９５号公報）、培地中に脂肪酸を添加してｒＨＳＡの産生を増強する方法（特開平４−２９３４９５号公報）等が例示される。
【００１８】
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一般的な常法に準じて実施することができる。培地は合成培地、天然培地のいずれを用いてもよく、特に液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ，Ｃａ，Ｆｅ，Ｎａ，Ｋ，Ｍｎ，Ｃｏ，Ｃｕなど例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジェンのベース(Difco社製) 、２％グルコース〕等が挙げられる。また、天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト(Difco社製) 、２％バクトペプトン(Difco社製) 、２％グルコース〕など例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１９】
培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が好ましい。
【００２０】
（２）ｒＨＳＡの精製
(i) 加熱処理
本発明のｒＨＳＡ精製方法において、加熱処理は、前述の培養工程で得られるｒＨＳＡ産生宿主の培養液を遠心分離や限外濾過等の分離処理に付すことなく、宿主菌体を含んだまま直接加熱することを特徴とする。すなわち、加熱処理は本発明精製方法の第一番目に行なわれる。
加熱条件としては、通常５０〜１００℃で１分〜１０時間程度、好ましくは６０〜８０℃で２０分〜３時間程度、より好ましくは６８℃で３０分間程度である。また、本処理は安定化剤の存在下に行うことが好ましい。安定化剤としては、アセチルトリプトファン，炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩等が例示される。両者の安定化剤は併用してもよい。アセチルトリプトファンの添加量としては溶液終濃度１〜１００ｍＭ程度が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸としてはカプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸などが例示される。好ましくは１０ｍＭのカプリル酸である。その塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩，カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩等）が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩の添加量としては、１〜１００ｍＭ程度が例示される。
また、加熱処理時にチオール系化合物（例えば、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオン等）を１〜１００ｍＭ程度、好ましくは５〜３０ｍＭ、さらにアミノグアニジンを１０〜１０００ｍＭ添加することにより、加熱で生じる着色を抑制することができる（特開平３−１０３１８８号公報）という効果が得られる。
【００２１】
従来から加熱処理は、宿主培養液を遠心分離または濾過することにより得られる上清（濾液）に対して行なわれている。菌体を含んだ培養液を直接加熱処理すると、菌体内に存する不純物、脂質、核酸、蛋白分解酵素等が漏洩することによって、目的物質の精製に悪影響が及ぶことが懸念されるからである。しかして、今まで宿主菌体を含んだ培養液の直接加熱処理が目的物質の精製に有効か否か全く不明であった。
【００２２】
しかし、本発明によって、ｒＨＳＡとｒＨＳＡ産生宿主菌体を含んだ状態の培養液を直接加熱しても、ｒＨＳＡの構造上の機能および収率を低下させることなく、培養液中に存在する強力なプロテアーゼを効果的に不活化できることが判明し、プロテアーゼ不活性化処理の簡便化を図ることができた。さらにこのことにより、遺伝子操作によって得られるＨＳＡを後述する精製処理により効果的に精製できることとなった。
【００２３】
(ii)加熱処理液の希釈および液性の調整
(i)で得られる加熱処理液は、つぎに流動床中に浮遊する吸着体粒子処理に付されるが、その前に、加熱処理液と吸着体粒子との接触が電気伝導度０．１〜５０ｍＳ，好ましくは０．５〜３５ｍＳ，より好ましくは５〜１５ｍＳの雰囲気で行われるように加熱処理液を希釈することが好ましい。後述の実験例３で示されるように、加熱処理液の希釈倍数を上げ、加熱処理液と吸着体粒子との接触雰囲気中の電気伝導度が低くなるに伴い、吸着体粒子へのｒＨＳＡの結合量は増加し、該電気伝導度が８〜１２ｍＳ付近である場合にほぼ最高に達する。希釈溶媒は、加熱処理液中のｒＨＳＡの構造上の機能を低下させない限り特に限定されず、吸着体粒子への吸着条件を考慮して適宜選択することができる。５０ｍＭ程度もしくはそれ以下の濃度の酢酸緩衝液、または蒸留水が例示される。簡便性等の点から好ましくは蒸留水である。ついで、該溶液の液性を吸着体粒子への吸着条件である酸性、通常ｐＨ３〜５、好ましくはｐＨ４〜４．８程度、より好ましくはｐＨ４．５程度に調整する。調整に使用される酸性溶液は、特に制限されないが、好ましくは酢酸が挙げられる。
【００２４】
(iii)吸着体粒子処理
次に、希釈、ｐＨ調整された加熱処理液を吸着体粒子に接触させる。
用いられる吸着体粒子としては、陽イオン交換基を有する担体（陽イオン吸着体）が挙げられ、具体的にはスルホ基型、カルボキシル基型等の吸着体粒子が例示される。スルホ基型としては、スルホ−アガロース〔商品名：ストリームラインＳＰ，Ｓ−セファロース（共にファルマシア社製）〕、スルホ−セルロース〔商品名：Ｓ−セルロファイン（チッソ社製）〕、スルホプロピル−アガロース〔商品名：ＳＰ−セファロース（ファルマシア社製），ＳＰ−セルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社製）〕、スルホプロピル−デキストラン〔商品名：ＳＰ−セファデックス（ファルマシア社製）〕、スルホプロピル−ポリビニル〔商品名：ＳＰ−トヨパール（東ソー社製）〕等が例示される。また、カルボキシル基型としては、カルボキシメチル−アガロース〔商品名：ＣＭセルスル−ビッグビーズ（ステロジーン社製）〕，カルボキシメチル−デキストラン〔商品名：ＣＭ−セファデックス（ファルマシア社製）〕，カルボキシメチル−セルロース〔商品名：ＣＭ−セルロファイン（チッソ社製）〕等が例示される。好ましくは、スルホ基型の強陽イオン吸着体粒子であり、より好ましくは、ストリームラインＳＰ（ファルマシア社製）である。
また用いられる吸着体粒子の粒子径としては、通常３０〜１１００μｍ、好ましくは１００〜３００μｍが例示される。
【００２５】
接触条件としては、ｐＨ３〜５程度、好ましくはｐＨ４〜４．８程度、より好ましくはｐＨ４．５程度、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．１Ｍ程度が例示される。
吸着体粒子は、予めかかる接触条件で平衡化しておくことが好ましい。具体的には、５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化しておくことが好ましい。
【００２６】
吸着体粒子の平衡化、吸着体粒子を含む流動床への試料の注入、吸着体粒子への接触および流動床からの溶出は、通常下記の方法に従って行われる。
すなわち、まず前述の吸着体粒子を適当なカラムに充填し沈降させた後、当該カラム下部出口から上方向に平衡化緩衝液を送液し、吸着体粒子を浮遊させる。この際、カラム内では、カラム下から上昇する緩衝液の流速と重力により沈降する吸着体粒子が互いの力を打ち消しあって、吸着体粒子による均一な浮遊平衡状態が形成される（これを流動床という）。ついで、かかる流動床が形成されたカラム内に、上記(i) 、(ii)処理した菌体を含む培養粗液をカラム下部出口から上方送液により添加する。この際、目的のｒＨＳＡは吸着体粒子と結合し、一方、宿主菌体や培養液に由来する微粒子および夾雑物は流動床の吸着体粒子を素通りしカラム上部出口から排出除去され、またゆるく結合した夾雑成分も、引き続いて上方送液される洗浄緩衝液で洗い流される。好ましくは、吸着流動床技術に従って行われる〔Journal of Chromatography, 597 (1992), 129-145〕。
【００２７】
洗浄緩衝液としては、平衡化緩衝液が用いられる。目的タンパク質であるｒＨＳＡの回収は、送液方向を逆転し、溶出用の緩衝液をカラム上部出口から下方向に送液することにより行われる。ｒＨＳＡの溶出条件としては、ｐＨ８〜１０程度、好ましくはｐＨ８．５〜９．５程度、より好ましくはｐＨ９程度、塩濃度０．２〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．３〜０．４Ｍ程度が例示される。溶出用の緩衝液としてより具体的には、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ９）が例示される。
上記の吸着体粒子の平衡化、吸着体粒子を含む流動床への試料の注入、吸着体粒子への接触および流動床からの溶出等の操作は、ストリームラインカラム（吸着体：ストリームラインＳＰ、ファルマシア社製）を備したストリームラインシステム（ファルマシア社製）を用いることにより、より簡便に効率よく、かつ再現性よく行うことができる。
【００２８】
以上の操作により、高い精製度をもったｒＨＳＡが取得できる。すなわち、上記吸着体粒子処理を施すことにより得られるｒＨＳＡの精製度は、従来の圧搾−限外濾過膜処理−加熱処理−限外濾過膜処理−陽イオン交換体処理の数工程を経て得られるｒＨＳＡの精製度とほぼ同一である。また、吸着体粒子処理工程の前に培養液の加熱処理を行うことにより、ｒＨＳＡを安定に（低分子化されずに）高収率で取得することができる。よって、本発明によれば、上記５工程を２工程に簡素化することができるとともに、工程時間を大幅に短縮化することができる。さらに本発明によれば、従来法によるｒＨＳＡの培養液から回収率を向上させることができる。
【００２９】
また、以上の処理により得られたｒＨＳＡは、引き続き通常の精製方法に付すことによりさらに高度に精製することができる。用いられる精製方法としては、例えば通常使用される精製処理、疎水性クロマト処理、限外濾過膜処理、陰イオン交換体処理、キレート樹脂処理およびホウ酸塩処理等が挙げられる。なお、これらの精製処理は、単独もしくは数種組み合わせて行うこともでき、一層高品質のｒＨＳＡ精製品を得るためには疎水性クロマト処理、限外濾過膜処理、陰イオン交換体処理、限外濾過膜処理、キレート樹脂処理およびホウ酸塩処理、限外濾過膜処理の順で行われることが好ましい。
【００３０】
尚、上記精製処理を行う前、吸着体粒子への接触処理後、溶出されたｒＨＳＡ含有吸着画分を再度、還元剤の存在下で加熱処理することが好ましい。後述の実験例６で示されるように、当該加熱処理を行う場合と行わない場合とを比較すると、ｒＨＳＡの回収率には差がないが、ｒＨＳＡに特有の着色に関して顕著な効果が認められ、加熱処理をすることによってその後の精製処理により着色物質が有意に除去される。
処理温度としては通常５０〜１００℃、好ましくは６０〜８０℃程度、より好ましくは６０℃が例示される。処理時間としては通常１０分間〜１０時間、、好ましくは３０分間〜５時間程度、より好ましくは１時間が例示される。
【００３１】
用いられる還元剤としては、還元作用を有する物質であれば、特に制限されないが、具体的にはＳＨ基を含む低分子化合物（例えば、システイン、システアミン、シスタミン、メチオニン、グルタチオン等）、亜硫酸塩、ピロ亜硫酸塩、亜リン酸・ピロ亜硫酸塩、アスコルビン酸など例示される。好ましくはシステインである。添加量としては、システイン等の場合で終濃度１〜１００ｍＭ程度、亜硫酸塩等の場合で終濃度０．００１〜１０％程度が例示される。
【００３２】
また、本処理は安定化剤の存在下に行うことが好ましい。安定化剤としては、アセチルトリプトファン，炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩等が例示される。両者の安定化剤は併用してもよい。アセチルトリプトファンの添加量としては溶液終濃度１〜１００ｍＭ程度が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸としてはカプロン酸，カプリル酸，カプリン酸，ラウリン酸，パルミチン酸，オレイン酸等が例示される。好ましくは１０ｍＭのカプリル酸である。その塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩，カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩等）が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸またはその塩の添加量としては、１〜１００ｍＭ程度が例示される。さらにアミノグアニジンを１０〜１０００ｍＭ添加することにより、加熱で生じる着色を抑制することができる（特開平３−１０３１８８号公報）という効果が得られる。
【００３３】
＜１＞疎水性クロマト処理
疎水性クロマト処理は、常法に従って行うことができる。疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基（ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル基型等）、フェニル基を有する不溶性担体が例示される。好適にはフェニル基型が挙げられ、具体的にはフェニル−セルロース（商品名：フェニルセルロファイン、チッソ社製）が例示される。本工程では、ｒＨＳＡを担体非吸着画分に回収することができる。接触条件としてはｐＨ６〜８程度、好ましくはｐＨ６．５〜７程度、塩濃度０．０１〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度が挙げられる。
【００３４】
＜２＞陰イオン交換体処理
陰イオン交換体処理もまた、常法に従って行うことができる。陰イオン交換体としては、陰イオン交換基を有する不溶性担体であればいずれも使用することができる。陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基型、四級アミノエチル（ＱＡＥ）基型等が例示される。好ましくはＤＥＡＥ基型であり、具体的には、ＤＥＡＥ−アガロース（商品名：ＤＥＡＥ−セファロース、ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名：ＤＥＡＥ−セファデックス、ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−ポリビニル（商品名：ＤＥＡＥ−トヨパール、東ソー社製）等が例示される。本工程では、ｒＨＳＡを非吸着画分に回収することができる。接触条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくはｐＨ６．５〜７程度、塩濃度０．０１〜０．１Ｍ程度が挙げられる。
この陰イオン交換体処理により着色成分や微量存在する夾雑物等が除去される。
【００３５】
＜３＞限外濾過膜処理
疎水性クロマト処理後および／または陰イオン交換体処理後、回収されたｒＨＳＡ含有画分は限外濾過処理に付されることが好ましい。当該限外濾過処理により、発熱性物質（パイロジェン）を除去することができる。限外濾過処理は、分画分子量１００〜３００Ｋの限外濾過膜が好適に使用される。具体的には、ペリコンカセット膜１００Ｋ（ミリポア社製）が例示される。
【００３６】
＜４＞キレート樹脂処理
キレート樹脂処理は、特に遺伝子操作によって得られるＨＳＡに特有の着色物質の除去に効果がある。当該処理は、前述の精製工程において、特に好ましくは疎水性クロマト処理−限外濾過膜処理−陰イオン交換体処理−限外濾過膜処理の後の工程に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とｒＨＳＡとを接触させることにより行われ、パス画分にｒＨＳＡが取得される。キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体等が例示される。一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミン基等のポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基等を分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミン等のポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、及びチオ尿素基が挙げられる。簡便には、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるDIAION CRB02（リガンド部：Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成社製）、LEWATIT TP214 （リガンド部：─ＮＨＣＳＮＨ2 ：バイエル社製）、アンバライトＣＧ４０００などの市販品が用いられる。
【００３７】
当該キレート樹脂により処理条件は、好適には次の通りである。
ｐＨ条件  ：酸性、中性またはアルカリ性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７）
時    間  ：１時間以上、好ましくは６時間以上
イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍｍｈｏ
混合比    ：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
【００３８】
＜５＞ホウ酸またはその塩による処理
さらに、前述の処理により得られたｒＨＳＡ含有溶液をホウ酸またはその塩（本発明において、ホウ酸・塩ともいう。）で処理することによって、宿主由来の抗原性を有する夾雑物質、フェノール硫酸法により検出可能な非抗原性の遊離の夾雑物質を除去することができる。
用いられるホウ酸としては、オルトホウ酸、メタホウ酸、四ホウ酸などが例示される。またその塩として、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カリウム塩等）などが例示される。好ましくは、四ホウ酸カルシウムを用いる。ホウ酸またはその塩の添加量は、終濃度で０．０１〜１Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度である。処理ｐＨは８〜１１程度、好ましくはｐＨ９〜１０程度が例示される。また処理時間は１〜１００時間程度、好ましくは５〜５０時間程度が例示される。処理時のｒＨＳＡ含有溶液の電導度は低いほうがよく、具体的には１ｍＳ以下が例示される。さらに、ｒＨＳＡ含有溶液中のｒＨＳＡ濃度は、高いほうがよく、具体的にはｒＨＳＡ５％以上、好ましくは１５〜２５％程度が例示される。
【００３９】
上記ホウ酸・塩処理後、ｒＨＳＡは、例えば遠心分離または限外濾過等の常法により、上清から回収される。
【００４０】
（３）高度精製された遺伝子操作由来のＨＳＡの性状
高度精製により得られるｒＨＳＡは、分子量約６７０００，等電点４．９の単一物質である。単量体のみからなり、二量体あるいは重合体、分解物（分子量約４３０００）を実質的に含まない。また、産生宿主に由来する抗原性を有する夾雑成分、多糖類も実質的に含まない。着色度は、ｒＨＳＡ濃度として２５０ｍｇ／ｍｌの溶液（２５％溶液）に調製した場合で、Ａ350 ／Ａ280 が０．０１５以下、好ましくは０．０１３以下、就中０．０１〜０．０１５程度である。なお、公知の精製方法（例えば、前述の＜１＞〜＜５＞の方法等）をさらに適宜組み合わせて用いることにより、さらに着色度が抑制された、即ちＡ350 ／Ａ280 の値が低いｒＨＳＡを得ることができる。
遺伝子操作に由来するＨＳＡ（含有組成物）で、着色度が、ｒＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ350 ／Ａ280 が０．０１５以下であるというものは、本発明により初めて提供される。
【００４１】
（４）製剤化
本発明の方法で得られるｒＨＳＡは公知の手法（例えば、限外濾過、安定化剤の添加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化することができる。こうして調製されるｒＨＳＡ製剤は、血清アルブミン製剤として従来の血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に、また同様の用量、用法で、臨床上用いることができる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体としても利用することができる。
なお、本発明でいうｒＨＳＡ含有組成物の意味は、本発明のｒＨＳＡが高純度であるが１００％純品ではなく、ｒＨＳＡ以外の物質が微量でも混在する状態を示す。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を具体的に説明するため実施例および参考例を示すが、本発明はこれら実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００４３】
実施例１
スモールスケールでのストリームラインＳＰによるｒＨＳＡの精製
（１）培養液の加熱処理
ｒＨＳＡ産生酵母菌ピキアパストリスの取得およびその培養については、特開平５−３１７０７９号公報の第８欄第１８行〜第１１欄第１９行、欧州公開特許６５５５０３号に記載される方法に従って行った。
得られた培養液（含酵母菌体）約２．８リットルをそのまま６８℃、３０分の加熱処理に付した。加熱処理は１０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下で行った。なお、この際の培養液の液性はｐＨ６であった。該加熱処理液を急速に約１５℃に冷却し、蒸留水で約２倍容量になるように希釈した後（総容量５．５リットル）、酢酸水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。
【００４４】
（２）吸着体粒子処理（ストリームラインＳＰ処理）
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したストリームラインＳＰカラム（Ｃ５０、５×１００ｃｍ：ゲル量３００ｍｌ、ファルマシア社製）に、（１）の加熱処理で得られた酵母菌体を含む培養液５．５リットル（電気伝導度〜１０ｍＳ）を上方送液することにより添加した（攪拌しながら流速１００ｃｍ／ｈで添加）。次にカラムを、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液（カラム容量の２．５倍量）を上昇法で送液することにより洗浄し（条件：流速１００ｃｍ／ｈで１時間、続いて流速３００ｃｍ／ｈで３０分）、ついで送液方向を逆転させて、溶出溶液〔３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ９）を送液（流速：５０ｃｍ／ｈ）して、ｒＨＳＡを含有する画分を得た。
なお、溶出するｒＨＳＡ含有画分の検出は２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって行った。
【００４５】
（３）加熱処理
得られたｒＨＳＡ含有画分に対して、１０ｍＭシステイン，５ｍＭカプリル酸ナトリウム，１００ｍＭアミノグアニジン塩酸，ｐＨ７．５の共存下に６０℃、１時間の加熱処理を行った。
【００４６】
（４）疎水性クロマト処理
（３）で加熱処理したｒＨＳＡ溶液を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを充填したカラム（５×２５ｃｍ，ゲル量５００ｍｌ：チッソ社製）に添加した。この条件ではｒＨＳＡはフェニルセルロファインに吸着することなくカラムを通過した。カラムを通過したｒＨＳＡ含有溶液を分画分子量３万の限外濾過膜（ミリポア社製）を用いて液量を約０．２リットルまで濃縮するとともに、ｒＨＳＡ含有溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００４７】
（５）陰イオン交換体処理
疎水性クロマト処理後、濃縮および緩衝液交換を行ったｒＨＳＡ含有溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦを充填したカラム（５×２５ｃｍ，ゲル量５００ｍｌ：ミリポア社製）に添加した。この条件ではｒＨＳＡはＤＥＡＥ−セファロースＦＦに吸着することなくカラムを通過した。カラムを通過したｒＨＳＡは、分画分子量３万の限外濾過膜（ミリポア社製）を用いて液量を約０．２リットルに濃縮するとともに、ｒＨＳＡ含有溶液を蒸留水に交換した。
【００４８】
（６）キレート処理
約７％濃度の精製ｒＨＳＡ０．２リットルに酢酸を添加してｐＨを４．５とし、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４．５で平衡化したＤＩＡＩＯＮ  ＣＲＢ０２を充填したカラム（５×２．５ｃｍ，ゲル量５００ｍｌ：三菱化成製）に添加後、一夜循環した。この条件ではｒＨＳＡは当該ゲルに吸着することなくカラムを通過した。
【００４９】
（７）ホウ酸・塩処理
ｒＨＳＡ濃度を２．５％に調製し、溶液を電気伝導度１ｍＳ以下とした。四ホウ酸ナトリウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ついで塩化カルシウムを終濃度が１００ｍＭになるように添加し、ｐＨを９．５に維持した。１０時間程度放置した後に沈澱を除去し、上清を回収して濃縮脱塩した。次いで分画分子量約３万の限外濾過膜（ミリポア社製）を用いて濃縮および緩衝液交換を行った。必要に応じて、安定化剤（カプリル酸ナトリウム，アセチルトリプトファン）を添加した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）を用いて除菌濾過することにより、ｒＨＳＡを注射剤として使用することができる。
【００５０】
実験例１  ｒＨＳＡ培養液の加熱処理による安定化効果
ｒＨＳＡ培養液中には強力なプロテアーゼが存在し、ｒＨＳＡを低分子化することが知られているが、表１に示すように特に酸性下ｐＨ４の条件で低分子化が著しく速い。 
【００５１】
【表１】
2005348745.tif 000003
【００５２】
ところで、ストリームラインＳＰのｒＨＳＡの吸着条件は、ｐＨ４．５付近で行われることから、ｐＨ４．５付近での培養液中のｒＨＳＡの安定性を調べるとともに、より安定に保てるような前処理としてプロテアーゼの不活化に有効な加熱処理条件を、加熱処理後の溶液のｐＨを４．５に調製し室温で一晩放置した後のｒＨＳＡの安定性をみることにより検討した。結果を図１に示す。なお、加熱時には全検体に終濃度が１０ｍＭとなるようにカプリル酸ナトリウムを添加した。用いた加熱処理条件は、下記の通りである。
Ａ：コントロール         
Ｂ：６８℃、３０分間、ｐＨ６．０
Ｃ：６８℃、３０分間、ｐＨ６．８
Ｄ：６８℃、３０分間、ｐＨ７．５
Ｅ：６８℃、３０分間、ｐＨ８．２
Ｆ：６０℃、２時間、ｐＨ６．０
Ｇ：６０℃、２時間、ｐＨ６．８
Ｈ：６０℃、２時間、ｐＨ７．５
Ｉ：６０℃、２時間、ｐＨ８．２
Ｊ：６０℃、２時間、ｐＨ６．８、１０ｍＭ  システイン
Ｋ：６０℃、２時間、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  システイン
Ｌ：室温（２５℃）、２時間、ｐＨ６．０
Ｍ：室温（２５℃）、２時間、ｐＨ８．２
【００５３】
その結果、加熱は６０℃で２時間の処理よりも６８℃で３０分の処理が有効であり、また加熱処理に付す培養液のｐＨは培養液の初期値であるｐＨ６付近が最も良好であった。
【００５４】
実験例２  ｒＨＳＡ培養液のｐＨと吸着体結合能との関係
酢酸で種々のｐＨ（４．５〜４．９）に調整した培養液（ｒＨＳＡ  ５５．６ｍｇ）に各ｐＨの酢酸緩衝液（５０ｍＭ）で平衡化したストリームラインＳＰゲル（１ｍｌ）を添加し、室温で１時間混合攪拌した後、各平衡化緩衝液で洗浄して未吸着画分のｒＨＳＡ残存量（％）を測定した。その結果、ｐＨを下げるに伴い結合量は増加し、ｐＨ４．５付近で最高に達した（表２）。
【００５５】
【表２】
2005348745.tif 000004
【００５６】
実験例３  加熱処理液と吸着体粒子との接触雰囲気中の電気伝導度とｒＨＳＡの吸着体粒子への結合能との関係
加熱処理を終えた培養液〔電気伝導度  約２０ｍＳ（２５℃）、ｒＨＳＡ  ４７．１ｍｇ）を蒸留水で種々の倍数に希釈した後、酢酸でｐＨを４．５に調整し、同ｐＨの５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したストリームラインＳＰゲルを１ｍｌ添加した。そして室温で１時間混合後、平衡化緩衝液で洗浄し、０．３Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）でｒＨＳＡを溶出した。その結果、希釈倍数を上げ、溶液中の電気伝導度を低下させるに伴いｒＨＳＡの吸着粒子への結合量は増加し、加熱処理液と吸着体粒子との接触雰囲気中（ゲル混合液中）の電気伝導度８〜１２ｍＳ付近で最高に達した（図２）。
【００５７】
実験例４  ストリームラインＳＰ溶出液の安定性
培養液を蒸留水で２倍希釈した後、酢酸でｐＨを４．５に調整し同ｐＨの５０ｍＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したストリームラインＳＰゲルを一定量添加し、室温で１時間混合攪拌した。次いで、ゲルを平衡化緩衝液で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９）を用いてｒＨＳＡを溶出し、得られた画分溶液（ｐＨ８）中のｒＨＳＡの室温での安定性を調べた。その結果、培養液を予め加熱処理（６８℃、３０分間）したものでは、３日後でも全く変化が見られなかったのに対して、未処理培養液由来のｒＨＳＡは約５０％にまで減少・分解していた（表３）。
【００５８】
【表３】
2005348745.tif 000005
【００５９】
実験例５  （加熱→吸着体粒子）処理と（非加熱→吸着体粒子）処理とのｒＨＳＡの回収率および着色度の比較
前述の実験例１〜４で検討した結果を踏まえて、加熱→吸着体粒子処理工程の至適化フローを設定した（図３）。
図３の工程フローに従い、ストリームラインＳＰ（５×１００ｃｍ、ゲル量３００ｍｌ）カラムを用い、酵母菌体を含んだ培養液（２．８リットル）からのｒＨＳＡの精製を試みた。一方で酵母菌体を含んだ培養液（２．７リットル）を加熱処理しないで同様に吸着体粒子処理を行い、ｒＨＳＡを精製した。
その結果、培養液からの総回収率は、（非加熱→吸着体粒子）処理が５０％であるのに対して本発明の（加熱→吸着体粒子）処理では約８５％と高く、得られるｒＨＳＡの着色度も、（非加熱→吸着体粒子）処理が A350/A280で０．０４８であるのに対して本発明の（加熱→吸着体粒子）処理では０．０３４５と低かった（表４）。尚、図４で（加熱→吸着体粒子）処理のストリームラインＳＰ溶出液のゲル濾過ＨＰＬＣプロファイルと（非加熱→吸着体粒子）処理のストリームラインＳＰ溶出液のゲル濾過ＨＰＬＣプロファイルとを比較した。後者にｒＨＳＡの著しい分解・低分子化がみられた。
【００６０】
【表４】
2005348745.tif 000006
【００６１】
実験例６  システイン加熱処理のｒＨＳＡ着色度に及ぼす効果
次に、表４で得られた（加熱→吸着体粒子）処理でのストリームラインＳＰカラムのｒＨＳＡ溶出画分を出発原料として、実施例１（４）および（５）に記載する疎水性クロマト処理および陰イオン交換体処理を行い着色度（A350/A280)の評価を行った。その際、ストリームラインＳＰ溶出画分をシステイン存在下（終濃度１０ｍＭ）で加熱処理したものと加熱処理しないものとの２通りで検討した。その結果、システイン加熱の有無にかかわらず同等のｒＨＳＡ回収率が得られたが、着色度において顕著な差が見られ、陰イオン交換体処理の段階において、システイン加熱処理しないほうは、０．０１８４であるのに対し、システイン加熱処理由来のものは０．０１２８と有意な低値を示した（表５）。
【００６２】
【表５】
2005348745.tif 000007
【００６３】
実験例７  ストリームラインＳＰ組入れによるｒＨＳＡ着色度（A350/A280)の低減
図５に従来精製法での工程別着色度（A350/A280)の推移とストリームラインＳＰ工程を組み入れた場合の陰イオン交換体処理濃縮工程段階までの工程別着色度（A350/A280)の推移との比較した。ストリームラインＳＰを組み入れその直後にシステイン加熱処理を施した本発明の精製法の場合、疎水性クロマト処理をする段階で既に従来法と比べ、大きな差が生じ、陰イオン交換体処理後の着色度は０．０１２８と極めて低い値を示した。図６に、従来法の後さらにキレート樹脂処理した検体（曲線１）と、ストリームラインＳＰを組み入れその直後にシステイン加熱処理を施した本発明の精製法による陰イオン交換体処理後およびキレート樹脂処理後の検体（曲線２、３）との吸収スペクトルによる比較を示す。その結果、本発明方法により精製したｒＨＳＡの吸収スペクトルは、陰イオン交換体処理の段階で既に従来法の後さらにキレート樹脂処理したサンプルの吸収スペクトルより可視（350nm-700nm)全域に渡り顕著に低いパターンを示し、同キレート樹脂処理後の段階ではその差はより大きくなった。
【００６４】
実験例８  本発明により得られるｒＨＳＡのゲル濾過ＨＰＬＣ分析
図７に、本発明方法により得られるｒＨＳＡの各工程サンプルのゲル濾過法による高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）分析結果を示す（ｒＨＳＡ培養液：ｒＨＳＡ培養液の上清、ストリームラインＳＰ溶出画分：実施例１と同様の工程においてストリームラインＳＰ溶出画分、ストリームラインＳＰ未吸着画分：実施例１と同様の工程においてストリームラインＳＰ未吸着画分、ＤＥＡＥ後精製画分：実施例１と同様の工程において陰イオン交換体（ＤＥＡＥ）処理後のもの）。その結果、培養液中のｒＨＳＡ以外の高分子や低分子物質の大半は酵母菌体と共に効率よくストリームラインＳＰ未吸着画分に洗い流され、アルブミンが特異的に溶出画分に回収されていることが明らかとなった。また、この画分を出発原料とし、更に精製の進んだ陰イオン交換体（ＤＥＡＥ）処理後の検体のＨＰＬＣのパターンはアルブミン（ＨＳＡモノマー）のシャープな単一ピークのみを示し、従来精製法によるＤＥＡＥ工程後のサンプルに比して、同一もしくはそれ以上の精製度を示した。
【００６５】
以上の実験例を踏まえて、従来精製法のＤＥＡＥ濃縮工程段階までの回収率と実施例１と同様の工程においてＤＥＡＥ濃縮工程段階までの回収率を算出し比較した。実施例１と同様の精製法を用いた場合、従来精製法の圧搾−膜−加熱処理−膜−陽イオン交換体処理までの５工程が２工程となり、工程時間が大幅に短縮されるとともに、回収率が３０％向上した。
【００６６】
実験例９  宿主由来夾雑成分の分析
アルブミン非産生酵母の培養液を本法と同様の方法で精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製アルブミン溶液中に存在する酵母由来夾雑成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行った。サンプルはアルブミン濃度として２５０ｍｇ／ｍｌに調製したものを用いて測定した。
その結果、実施例１と同様の工程においてホウ酸・塩処理後の精製アルブミンでは、０．１ｎｇ／ｍｌの検出限界において、酵母由来の抗原性を有する夾雑成分は検出されなかった。
【００６７】
実験例１０  本発明の精製ｒＨＳＡの性状
（１）分子量
分子量の測定は、前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発明の実施例１と同様の工程において、ホウ酸・塩処理後の精製ｒＨＳＡの分子量は、約６７，０００であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
（２）等電点
等電点は、ポリアクリルアミドゲルを用い、Ａｌｌｅｎらの方法〔J. Chromatog., 146, 1 (1978)〕に準じて測定した。本発明の精製ｒＨＳＡの等電点は約４．９であり、血漿由来のＨＳＡと同程度であった。
（３）着色度
着色度は、精製ｒＨＳＡをアルブミン濃度として２５０ｍｇ／ｍｌに調製したものを用いて、その２８０ｎｍ、３５０ｎｍでの吸光度を測定し、Ａ350 ／Ａ280 を算出して求めた。本発明の精製度ｒＨＳＡの着色度は、Ａ350 ／Ａ280 で約０．０１２であり、極めて低かった。
【００６８】
参考例    ｒＨＳＡの測定（回収率の評価）
上記実験例１〜８および実験例１０において、ｒＨＳＡの量的な評価（回収率を含む）は、ｒＨＳＡ含有溶液をゲル濾過用ＨＰＬＣに付すことにより行った。溶出条件は、詳細には、下記の条件によって行った。
ｒＨＳＡを含有する溶液をあらかじめ、０．１％のＮａＮ3 、０．３％ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたＴＳＫ−ゲル  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（０．７８×３０ｃｍ：東ソー社製）に付して、同平衡化緩衝液を溶離液として用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎでｒＨＳＡを分離し、２８０ｎｍおよび３５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した。
【００６９】
実施例２
ラージスケールでのストリームラインＳＰによる精製
実施例１の（１）の方法に従って得られたｒＨＳＡ産生酵母菌ピキアパストリス培養液（含酵母菌体）１０００Ｌを、実施例１の（１）の条件（１０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、培養液の液性ｐＨ６で、６８℃、３０分間）でそのまま加熱処理した。該加熱処理液を約２５℃に冷却し、蒸留水で約２倍容量になるように希釈した後（総容量約２０００Ｌ）酢酸（９９．７％）を用いてｐＨ４．５に調整した。次いで、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したストリームラインＳＰカラム（Ｃ１０００、１００ｃｍ×１１０ｃｍ：ゲル量１５０Ｌ、ファルマシア社製）に、上記加熱処理で得られた酵母菌体を含む培養液２０００Ｌをカラム下部から上方送液するこにより添加した（流速１００〜２５０ｃｍ／ｈ）。なお、培養液はカラムへの添加が終了するまで菌体が沈降しない程度に攪拌を続けた。次に、カラムを平衡化緩衝液と同じ緩衝液（カラム容量の約５倍量）を上昇法により送液することにより洗浄し（流速１００〜５００ｃｍ／ｈ）、次いで送液方向を逆転させ、カラム上部から溶出液（３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ９）を送液して（流速５０〜１００ｃｍ／ｈ）、ｒＨＳＡ含有画分を得た。なお、溶出するｒＨＳＡ含有画分の検出は２８０ｎｍによる吸光度を測定することにより行った。また、得られたｒＨＳＡ含有画分に対して、１０ｍＭシステイン、１０ｍＭカプリル酸ナトリウム、ｒＨＳＡの４倍モル量のオレイン酸ナトリウム、１００ｍＭアミノグアニジン塩酸の共存下、ｐＨ７．５で６０℃、１時間の加熱処理を実施し、ｒＨＳＡの着色度低減化および二量体から単量体への変換促進を行った。
【００７０】
実験例１１  ラージスケールでの精製によるｒＨＳＡの収量、回収率および着色度
１トン規模の培養液を６８℃、３０分間加熱処理し、該加熱処理液を蒸留水で約２倍容量に希釈、ｐＨ４．５に調整した後、ストリームラインＳＰ（Ｃ１０００）カラムによる吸着体粒子処理に付した。ｒＨＳＡを含有する溶出液を０．８μｍフィルターで濾過し、さらに分画分子量約３万の限外濾過膜に通して濃縮した後、システイン加熱処理を行い精製した。４ロットの成績（表６に示す）を平均すると、培養液から加熱処理までの回収率は９８．６％、加熱後からストリームラインを経てシステイン加熱処理までの回収率は８８．４％で、総回収率は８７．１％と良好であった。この値はＣ５０カラムを用いたスモールスケールでの実験結果とよく一致し、ラージスケールでの再現性が確認された。
【００７１】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ｒＨＳＡ培養液の加熱処理による安定化効果を示す図である。
【図２】吸着体粒子と加熱処理液との接触雰囲気中の電気伝導度と吸着体粒子に対するｒＨＳＡの結合能との関係を示す図である。
【図３】ストリームラインＳＰによる培養液（含酵母菌体）からのｒＨＳＡの精製の至適化フローを示す図である。
【図４】（加熱→吸着体粒子）処理のストリームラインＳＰ溶出液のゲル濾過ＨＰＬＣプロファイル〔図中、（ａ）〕および（非加熱→吸着体粒子）処理のストリームラインＳＰ溶出液のゲル濾過ＨＰＬＣのプロファイル〔図中、（ｂ）〕を示す（吸光度  ２８０ｎｍで測定）。
【図５】工程別のｒＨＳＡの着色度（A350/A280)の推移を従来法と本発明方法とを比較した図である。
【図６】本発明方法により得られたｒＨＳＡの吸収スペクトルを従来法のものと比較した図である。
【図７】本発明方法により得られたｒＨＳＡのＧＰＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示すクロマトグラムである（吸光度  ２８０ｎｍで測定）。
【符号の説明】
【００７３】
Ａ  コントロール
Ｂ  ６８℃、３０分間、ｐＨ６．０
Ｃ  ６８℃、３０分間、ｐＨ６．８
Ｄ  ６８℃、３０分間、ｐＨ７．５
Ｅ  ６８℃、３０分間、ｐＨ８．２
Ｆ  ６０℃、２時間、ｐＨ６．０
Ｇ  ６０℃、２時間、ｐＨ６．８
Ｈ  ６０℃、２時間、ｐＨ７．５
Ｉ  ６０℃、２時間、ｐＨ８．２
Ｊ  ６０℃、２時間、ｐＨ６．８、１０ｍＭ  システイン
Ｋ  ６０℃、２時間、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  システイン
Ｌ  室温（２５℃）、２時間、ｐＨ６．０
Ｍ  室温（２５℃）、２時間、ｐＨ８．２
１  従来法（圧搾→膜→加熱→膜→陽イオン交換体→疎水クロマト→陰イオン交換体処理）による精製の後、さらにキレート樹脂処理後のｒＨＳＡ
２  実施例１と同様の工程において、陰イオン交換体（ＤＥＡＥ）処理後のｒＨＳＡ
３  実施例１と同様の工程において、キレート樹脂処理後のｒＨＳＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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