(57)【要約】      （修正有）【課題】チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さい表面プラズモン共鳴分析で用いるバイオセンサー用検出表面を提供する。【解決手段】疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした基板から成るバイオセンサーで、基板上の最表面には生理活性物質を固定化することができる官能基を有し、表面プラズモン共鳴により生体分子間の相互作用を分析する。官能基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＨ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、ビニル基などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした基板から成るバイオセンサー。
【請求項２】
疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした金属表面あるいは金属膜から成る、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さが１オングストローム以上５０００オングストローム以下である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項５】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さが１０オングストローム以上２０００オングストローム以下である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項６】
基板上の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有する、請求項１から５の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項７】
生理活性物質を固定化することができる官能基が、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基である、請求項６に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
非電気化学的検出に使用される、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から８の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
円盤上に保持されている基板表面に疎水性高分子化合物を含む塗布液を滴下した後、円盤を回転せしめることで均一な液膜を形成し、これを乾燥し薄膜を作成することによってスピンコートによるコーティングを行う、請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
【請求項１１】
滴下された前記塗布液による基板表面の被覆率が８０％以上１００％以下である、請求項１０に記載のスピンコートによるバイオセンサーの製造方法。
【請求項１２】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している、請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
【請求項１４】
生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１５】
生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。
【０００６】
上記測定チップにおいては、チップ内の位置による信号変化のバラツキが生じるという問題があった。そこで、チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さいバイオセンサー用検出表面を作製する技術が求められた。
【０００７】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さいバイオセンサー用検出表面を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、基板の表面を疎水性高分子化合物でスピンコートによりコーティングすることによって、チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さいバイオセンサーを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした基板から成るバイオセンサーが提供される。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした金属表面あるいは金属膜から成るバイオセンサーである。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる。
【００１１】
好ましくは、疎水性高分子化合物のコーティング厚さは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、さらに好ましくは１０オングストローム以上２０００オングストローム以下である。
【００１２】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、基板上の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有する。
好ましくは、生理活性物質を固定化することができる官能基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基である。
【００１３】
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用することができ、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用することができる。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、円盤上に保持されている基板表面に疎水性高分子化合物を含む塗布液を滴下した後、円盤を回転せしめることで均一な液膜を形成し、これを乾燥し薄膜を作成することによってスピンコートによるコーティングを行う、上記バイオセンサーの製造方法が提供される。
好ましくは、滴下された前記塗布液による基板表面の被覆率は８０％以上１００％以下である。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している、上記バイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記バイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記バイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定することができ、さらに好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さいバイオセンサー用検出表面を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、疎水性高分子化合物をスピンコートによりコーティングした基板から成ることを特徴とする。
【００１９】
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００２０】
本発明で用い疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００２１】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２２】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２３】
本発明においては、疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは、スピンコート法により行う。
【００２４】
スピンコート法とは、回転する円盤上等の基板に、溶液を滴下し、薄膜を製造する方法であり、溶液の濃度、円盤の回転数、溶剤の蒸気圧等により膜厚を制御する方法である。
【００２５】
スピンコート法において使用される溶液中の疎水性高分子化合物の濃度は、0.001重量％以上50重量％以下が好ましく、0.01重量％以上10重量％以下がより好ましく、0.1重量％以上5重量％以下がさらに好ましい。
【００２６】
スピンコート時の円盤の回転数は、10rpm以上10,000rpm以下が好ましく、50rpm以上7500rpm以下がより好ましく、100rpm以上5000rpm以下がさらに好ましい。
【００２７】
スピンコート法において使用される溶剤は、スピンコートによる薄膜製造時の環境温度における蒸気圧が0.1kPa以上100kPa以下であることが好ましく、0.5kPa以上50kPa以下がより好ましく、1kPa以上30kPa以下がさらに好ましい。使用できる溶剤の具体例としては、メタノール、エタノール、i-プロパノール、n-ブタノール、t-ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、などが挙げられる。
【００２８】
本発明のバイオセンサーの製造方法は、円盤上に保持されている基板表面に塗布液を滴下した後、円盤を回転させることが好ましい。
【００２９】
また、塗布液を基板表面に滴下する際、基板表面に対する被覆率が８０％以上１００％以下であることが好ましく、９０％以上１００％以下であることがより好ましい。
【００３０】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００３１】
本発明のバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を疎水性高分子化合物でスピンコートによりコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００３２】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００３３】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００３４】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３５】
本発明の疎水性高分子化合物でコーティングした基板から成るバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。
【００３６】
好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３７】
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する疎水性高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ3基を含有する疎水性高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。
【００３８】
上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３９】
本発明のバイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００４０】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００４１】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００４２】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００４３】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００４４】
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。
【００４５】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４６】
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明のバイオセンサーを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【００４７】
本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４９】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００５０】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００５１】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５２】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００５３】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００５４】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００５５】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５６】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５７】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５８】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５９】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００６０】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００６１】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００６２】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００６３】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：バイオセンサー用チップの作製
（１）スピンコートによりポリメチルメタクリレートでコートしたバイオセンサー用チップ（PMMA表面チップA）の作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した縦8mm×横80mmのガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットした。金蒸着カバーガラスに塗布液１（ポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（0.25重量％））を100μl滴下した。金蒸着ガラス上の溶液の被覆率は９５％であった。この金蒸着ガラスを600rpmにて回転させ、30秒後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは平均100オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップAと呼ぶ。
【００６５】
（２）キャスト法によりポリメチルメタクリレートでコートしたバイオセンサー用チップ（PMMA表面チップB）の作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した縦8mm×横80mmのガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、塗布液２（ポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（0.005重量％））を１００μｌ滴下した。金蒸着ガラス上の溶液の被覆率は９５％であった。この金蒸着ガラスを放置し、メチルエチルケトンを乾燥させた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは平均120オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップBと呼ぶ。
【００６６】
（３）PMMA表面へのCOOH基の導入
上記のように作成したPMMA表面チップA及びPMMA表面チップBをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをそれぞれPMMA/COOH表面チップA及びPMMA/COOH表面チップBと呼ぶ。
【００６７】
実施例２：バイオセンサー用チップの性能評価：
（１）ProteinAの固定化
作成したPMMA/COOH表面チップA及びPMMA/COOH表面チップBに、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（２００ｍＭ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５０ｍＭ）との混合液を３０分接触させ、次に５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５、ビアコア製）で洗浄した。次に、ProteinA（ナカライテスク製）溶液（１００μｇ／ｍｌ、５０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．５）を３０分間接触させ、その後５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で洗浄した。
【００６８】
さらに、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）を３０分間接触させた後、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）で洗浄することにより、ProteinAと反応せずに残存した活性化COOH基をブロックした。
【００６９】
さらに、NaOH水溶液（１０ｍＭ）を１分間接触させた後、HBS-EPバッファー（HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、NaCl0.15mol/l、EDTA 0.003mol/l、Surfactant P20 0.005重量％、ビアコア社製）で洗浄することにより、PMMA/COOH表面に非特異的に吸着しているProteinAを除去した。このサンプルをそれぞれProteinA固定チップA及びProteinA固定チップBと呼ぶ。
【００７０】
（２）mouse IgGの結合信号の検出
ProteinA固定チップの検出位置によらず、結合信号が安定しているほど、実験の信頼性が高い。mouse IgGの結合量のProteinA固定チップ位置依存性は以下の方法で評価した。上記（１）の手順で作成したProteinA固定チップA及びProteinA固定チップBをそれぞれ表面プラズモン共鳴測定装置（Applied Spectroscopy、４２（８）、1375-1379（１９８８）の図５に記載のSPR共鳴装置）にセットした。チップをセットする位置は、レーザー光のあたる中心位置が縦方向は中央に、横方向は端部から10mmの位置にセットした。チップ上にはポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅（縦方向）1mm、長さ（横方向）7.5mm、深さ1mmの測定セルを作成した。
【００７１】
測定セル内をHBS-EPバッファーで満たし、測定を開始した。セル内をmouse IgG（コスモバイオ製）溶液（１０μg／ｍｌ、HBS-EPバッファー）に置き換え、５分間静置した。５分後の信号変化を算出した。
【００７２】
さらに、セル内をNaOH水溶液（１０ｍＭ）を１分間接触させた後、HBS-EPバッファーで洗浄することにより、mouse IgGの結合がはずれ、信号がベースラインに戻ることを確認した。
【００７３】
チップの位置を横方向に端部からさらに10mm離れた位置に固定し、同様にmouse IgGの結合測定を行った。さらに、チップを横方向の端部から10mmおきになるようそれぞれセットし、ProteinA固定チップA及びProteinA固定チップBともに合計7点測定した。
【００７４】
（３）結果
表１にmouse IgG結合による信号変化を示す。ＣＶは、変動係数（標準偏差を平均値で割った値の百分率）を示す。
【００７５】
【表１】
2005283144.tif 000002
【００７６】
表１の結果から、本発明の測定チップは、チップ内の位置による信号変化のバラツキが小さいことが分かる。