(57)【要約】【解決手段】メスアフリカツメガエルから摘出し、定法で選別した卵母細胞にＧＰＣＲをコードするＲＮＡ及びＧ１１またはＧｑとＧ１４、Ｇ１５またはＧ１６のキメラＧ蛋白質をコードするＲＮＡを共導入する。ＲＮＡ導入後、通常の期間培養した卵母細胞にリガンド候補物質を添加し、活性を測定する。【効果】本法を用いれば、１つの測定方法でリガンドか否かを判断することが可能である。本発明は、機能未知のＧＰＣＲのリガンドを同定する際の測定方法を単純化・高速化することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードする遺伝子、及びＧｑα若しくはＧ１１αと、Ｇ１４α、Ｇ１５α若しくはＧ１６αとのキメラ蛋白質であるＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を動物細胞に発現させることを特徴とする、外来蛋白質発現細胞の作製方法。
【請求項２】
キメラ蛋白質のＮ末端側がＧｑまたはＧ１１由来の配列であり、Ｃ末端側がＧ１４、Ｇ１５またはＧ１６由来の配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＰＣＲをコードする遺伝子を導入してから、１２〜３６時間後にＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｇｑαサブユニットをコードする遺伝子の量が、ＧＰＣＲをコードする遺伝子の量に対し、１／１０〜１０の比であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって作製される、外来蛋白質発現細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の外来蛋白質発現細胞におけるイノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を測定することを特徴とする、ＧＰＣＲを介したシグナル伝達系の活性化を測定する方法。
【請求項７】
細胞内Ｃａイオン濃度の上昇を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞内Ｃａイオン濃度の上昇の指標としてＣａイオン濃度依存性Ｃｌ電流変化を測定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
特定のＧＰＣＲを発現する請求項５に記載の外来蛋白質発現細胞を販売または譲渡する方法。
【請求項１０】
Ｇｑα若しくはＧ１１αと、Ｇ１４α、Ｇ１５α若しくはＧ１６αとのキメラ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子を販売または譲渡する方法。
【請求項１１】
キメラ蛋白質のＮ末端側がＧｑまたはＧ１１由来の配列であり、Ｃ末端側がＧ１４、Ｇ１５またはＧ１６由来の配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験物質を請求項５に記載の外来蛋白質発現細胞と接触させることを特徴とする、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１３】
顧客の要請に応じて請求項５に記載の外来蛋白質発現細胞を作製し、該細胞で発現するＧＰＣＲに対するリガンドをスクリーニングし、得られた解析データを顧客に提供することを特徴とする、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングサービス方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアフリカツメガエル卵母細胞等の動物細胞を用いたＧ蛋白質共役受容体（以下、ＧＰＣＲという）を介したシグナル伝達活性の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオチドの一種であるＧＤＰもしくはＧＴＰと特異的に結合するＧＴＰ結合蛋白質の中で、細胞外情報物質（アゴニスト）が結合する細胞膜上の受容体であるＧＰＣＲと共役して細胞内へのシグナル伝達・増幅機能を有するものはＧ蛋白質と呼ばれている。ＧＰＣＲへのアゴニストの結合によって活性化されるＧ蛋白質はα、β、γサブユニットからなる三量体を形成していることから、三量体Ｇ蛋白質とも呼ばれている。Ｇ蛋白質は、機能等の違いにより、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、Ｇｔ、Ｇｏｌｆ等のいろいろなサブタイプが存在する。例えば、ＧＰＣＲの１種であるロドプシンによって活性化されるＧ蛋白質はＧｔ、あるいはトランスデューシンと呼ばれる場合がある。Ｇｑサブタイプには更に、動物種によって呼称は様々であるが、例えばＧｑ、Ｇ１１〜Ｇ１６と呼ばれる種類があることが知られている。Ｇ蛋白質のαサブユニットの機能を検討するために、これらＧ１１〜Ｇ１６間でキメラ蛋白質を作製する試みがされている（例えば非特許文献１等）。一方、公知のＧＰＣＲとしては、Ｈ１〜２受容体、Ｍ１〜Ｍ５受容体、δオピオイド受容体、ｍＧｌｕ１受容体、ロドプシン等が知られている。
【０００３】
従来、アフリカツメガエル卵母細胞や動物培養細胞による発現系を用いて、ＧＰＣＲを介したシグナル伝達活性を測定することが行われていたが、その際、ＧＰＣＲと共役するＧ蛋白質のサブタイプに応じてその測定手法を変える必要があった。アフリカツメガエル卵母細胞を用いた測定系を例に説明すると、ＧｑサブタイプのＧ蛋白質と共役するＧＰＣＲでは、Ｃａイオン濃度依存性Ｃｌ電流変化を指標として測定することが可能であるが、Ｇｉサブタイプのものでは、細胞内ｃＡＭＰ濃度イオン依存性のＫチャネル活性を指標として測定することが必要である。
【０００４】
【非特許文献】
Ｋｏｊｉ  Ｎａｋａｍｕｒａら、「ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９６年、１２０巻、ｐ．９９６−ｐ．１００１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、測定しようとするシグナル伝達系におけるＧ蛋白質のサブタイプが既知であるときには、そのサブタイプに応じた測定方法を採用することにより、対応可能である。しかし、近年のヒトゲノム計画の進行により、塩基配列またはアミノ酸配列の情報からＧＰＣＲであることが示唆される蛋白質が多数見つかっている。これらの機能を確認するには、リガンド候補物質がそのＧＰＣＲと推定される蛋白質を介してシグナル伝達系を活性化させるかどうかを測定することが必要である。この場合、配列のみの情報からは確認対象となる系におけるＧ蛋白質のサブタイプは通常不明なため、従来法で活性を確認するには、１つのリガンドに対して複数の測定方法を試みる必要があり、手間がかかるものであった。換言すれば、単一の測定方法のみを用いれば、ＧＰＣＲにアゴニストが結合したとしても、測定方法が不適当である場合には活性化を検出することができず、偽陰性の結果を生じてしまうことになる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、天然においてＧＰＣＲと共役するＧ蛋白質のサブタイプが不明である場合にも、そのＧＰＣＲを介したシグナル伝達系の活性化を測定する単一の方法を開発すべく検討した結果達成されたものであって、アフリカツメガエル卵母細胞等の動物細胞にＧＰＣＲと共に特定のＧ蛋白質を共発現する方法を提供するものである。
【０００７】
具体的には、本発明は、Ｇ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードする遺伝子、及びＧｑα若しくはＧ１１αと、Ｇ１４α、Ｇ１５α若しくはＧ１６αとのキメラ蛋白質であるＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を動物の卵母細胞に導入することを特徴とする、外来蛋白質発現細胞の作製方法を提供する。
【０００８】
本発明において用いるＧＰＣＲとしては、特に限定するものではないが、例えばＨ１〜２受容体、Ｍ１〜Ｍ５受容体、δオピオイド受容体、ｍＧｌｕ１受容体等が挙げられる。ＧＰＣＲをコードする遺伝子は、例えばＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから塩基配列情報を入手し、それに基づいて定法により化学合成することによって得ることができる。遺伝子としては、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれでも良く、また導入する宿主における翻訳効率を高めるために当分野で通常行われるように適宜改変することもできる。
【０００９】
ＧＰＣＲと共発現させるＧｑαサブユニットをコードする遺伝子も、上記と同様にして化学合成することによって得ることができる。本発明においては、Ｇｑαサブユニットは、Ｇｑα若しくはＧ１１αと、Ｇ１４α、Ｇ１５α若しくはＧ１６αとのキメラ蛋白質とすることが必要である。キメラ蛋白質の構成は、特に限定するものではないが、例えばキメラ蛋白質のＮ末端側をＧｑまたはＧ１１由来の配列とし、Ｃ末端側をＧ１４、Ｇ１５またはＧ１６由来の配列とすることが好ましい。例としてＧ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質の構成を図１に示す。Ｇαサブユニットは、全長約三百数十個のアミノ酸からなり、そのＮ末端にβγサブユニットとの作用部位、Ｃ末端に受容体結合部位が存在することが知られている。本発明者等が種々検討した結果、Ｇ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質としては、Ｎ末端側から４分の１〜２分の１までをＧ１１α由来の配列とし、それからＣ末端までをＧ１４α由来の配列とすることが特に有効であることが確認された。
【００１０】
上記遺伝子を導入して外来蛋白質を発現させる動物細胞としては、株化細胞、昆虫細胞、アフリカツメガエル等の卵母細胞が挙げられ、特に限定するものではない。ＧＰＣＲを動物細胞に発現させ、その機能を調べる、リガンド等を探索するという方法は当分野において一般的であり、多くの成書がある（例えば、「最先端創薬」（長尾  拓ら編、共立出版）  第８２１−８２６頁「オーファン受容体」；「シグナル伝達実験法」（宇井  理生編、羊土社）  第３章  第５４−７３頁「受容体分子の解析」）が、入手し易く、操作も容易である等の理由から、アフリカツメガエル卵母細胞を使用するのが特に好ましい。
【００１１】
動物細胞への遺伝子の導入は、当分野で通常行われている方法を適宜利用可能であるが、試料導入用の針を用いて自動または手動でマイクロインジェクションすることが確実であり好ましい。遺伝子導入は、同時に行っても良いが、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を導入してから、１２〜３６時間後にＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入すると応答が増大し、特に好ましい。
【００１２】
またＧｑαサブユニットをコードする遺伝子の量は、ＧＰＣＲをコードする遺伝子の量に対し、１／１０〜１０の比であるのが好ましく、アフリカツメガエル卵母細胞の場合には、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を１〜１０ｎｇの範囲とし、Ｇｑαサブユニットをコードする遺伝子の量を１〜１０ｎｇの範囲とすると良好な結果を得ることができる。
ＧＰＣＲ遺伝子の導入後、１〜３日間培養することで、上記２種の外来蛋白質が発現した卵母細胞を得ることができる。
【００１３】
上記のようにして得られた外来蛋白質発現卵母細胞を使用して、イノシトールリン脂質代謝回転系の活性化を測定することにより、リガンド結合によって引き起こされるＧＰＣＲを介したシグナル伝達系の活性化を測定することができる。イノシトールリン脂質代謝回転系について、図２に模式図として示す。ＧＰＣＲ及びキメラαサブユニット（図中ではＧＸ）を発現させた卵母細胞をリガンドで刺激する。リガンドが受容体に結合すると、三量体であったＧ蛋白質がＧαサブユニットとＧβＧγサブユニットに解離する。この解離のシグナルを受けて、酵素ＰＬＣが活性化し、細胞膜のリン脂質であるＰＩＰ２を分解する。この反応の結果、ＩｎｓＰ３が産生される。ＩｎｓＰ３は細胞内の粗面小胞体（ＥＲ）のＩｎｓＰ３に結合し、細胞内にＣａを動員させる。その結果、細胞内Ｃａ濃度が上昇し、細胞内Ｃａ濃度依存性Ｃｌチャネルを開口させる。
【００１４】
測定方法としては、Ｇｑ蛋白質の活性化を測定し得る方法であれば良く、例えば蛍光法による細胞内Ｃａイオン濃度上昇測定や、細胞内Ｃａイオン濃度上昇の指標としてＣａイオン濃度依存性Ｃｌ電流変化を用いる方法等を使用することができる。本発明により、いかなるＧＰＣＲに結合するリガンドであっても、単一の測定方法で被験物質がリガンドか否かを判断することが可能である。本発明の測定方法について、図３に模式的に示す。ＧＰＣＲ及びキメラαサブユニットをコードするＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、マイクロインジェクションによって卵母細胞に導入する。リガンドの結合によってＧＰＣＲを介したシグナル伝達系が活性化され、その結果、上記のようにＣａ依存性Ｃｌイオンチャネルが開口して塩素イオンの放出が生じ、細胞内外の電位差に変化（電流応答）が生じるため、これをガラス電極を用いて検出することによって、リガンドに対する応答の有無、すなわちリガンド結合による活性化の有無を測定することができる。
【００１５】
測定の際には、リガンド候補である被験物質を上記外来蛋白質発現卵母細胞と接触させ、その結果、例えばＣａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答が生じるか否かを検出する。その際、特定のＧＰＣＲを発現させた卵母細胞のみを使用しても良く、また、複数種のＧＰＣＲについて上記外来蛋白質発現卵母細胞を作製し、並行して測定を行うこともできる。
【００１６】
本発明はまた、特定のＧＰＣＲを発現する上記本発明の外来蛋白質発現細胞を販売または譲渡する方法を提供する。この場合、特定の１種のＧＰＣＲを発現する卵母細胞のみを販売または譲渡しても良いが、複数のＧＰＣＲについて細胞を作製し、それらをセットとして合わせて販売または譲渡しても良い。その際、導入した遺伝子の種類、導入日時等の情報を、例えば情報を記したラベルの形で細胞に添付して販売または譲渡することができる。
【００１７】
あるいはまた、Ｇｑα若しくはＧ１１αと、Ｇ１４α、Ｇ１５α若しくはＧ１６αとのキメラ蛋白質αサブユニットをコードする遺伝子を販売または譲渡する方法も提供する。キメラ蛋白質は、特に限定するものではないが、Ｎ末端側がＧｑまたはＧ１１由来の配列であり、Ｃ末端側がＧ１４、Ｇ１５またはＧ１６由来の配列であることが好ましい。この遺伝子は、上記のように、ＧＰＣＲをコードする遺伝子と共に動物細胞に導入することで、これらの遺伝子を発現する細胞を作製し、リガンド結合によって活性化されるＧＰＣＲを介したシグナル伝達を測定するために使用することができる。
【００１８】
本発明はまた、上記のように、各種被験物質と上記外来蛋白質発現細胞とを接触させることによって、リガンドをスクリーニングする方法を提供する。
スクリーニングは、上記販売または譲渡された外来蛋白質発現細胞を用いて、あるいは上記販売または譲渡された遺伝子を用いて作製された外来蛋白質発現細胞を用いて行うことができる。
【００１９】
あるいはまた、顧客の要請に応じて上記外来蛋白質発現細胞を作製し、該細胞で発現するＧＰＣＲに対するリガンドをスクリーニングし、得られた解析データを顧客に提供することを特徴とする、ＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングサービスとして実施することもできる。
本発明のスクリーニング方法により、機能未知のＧＰＣＲのリガンドを同定する際の測定方法を単純化・高速化することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
ＧＰＣＲとして、Ｈ１〜２受容体、Ｍ１〜Ｍ５受容体、δオピオイド受容体、及びｍＧｌｕ１受容体を用い、またＧ蛋白質の例としてＧ１１蛋白質とＧ１４蛋白質を用いて、アフリカツメガエル卵母細胞における共発現を行った。Ｈ１受容体の遺伝子は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１（２），  ８９４−９０１  （１９９４）等に記載の配列情報（配列番号１）に基づいてＰＣＲ法を用いたクローニングにより取得した。Ｈ２受容体の遺伝子は、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５１（３），  ３２７−３３１（１９９９）等に記載の配列情報（配列番号２）に基づいてＰＣＲ法を用いたクローニングにより取得した。その他の遺伝子は、東京都精神医学研究所  額田敏秀博士より入手した。ＧＰＣＲを介したシグナル伝達の測定方法としてＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電流測定を用いるが、本発明は必ずしもこの測定方法に限定されるものではない。
【００２２】
メスアフリカツメガエルより摘出し、定法により卵母細胞を選別した。選別後の卵母細胞にＨ１〜２受容体、Ｍ１〜Ｍ５受容体、δオピオイド受容体、またはｍＧｌｕ１受容体をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成したＲＮＡと共に、同様に合成したＧ１１蛋白質αサブユニットとＧ１４蛋白質αサブユニットのキメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡを遺伝子導入した。またコントロールとしてキメラＧα蛋白質のＲＮＡを導入しない卵母細胞も作製した。その後、卵母細胞を培養した。
【００２３】
培養した卵母細胞を２電極膜電位固定法により−６０ｍＶに膜電位固定した。それぞれの遺伝子を導入した卵母細胞に、図４に示すように、ＧＰＣＲの型に応じてヒスタミン、アセチルコリン、Ｌｅｕ−Ｅｎｋ、またはグルタミン酸をリガンドとして添加し、その際のＣａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答の有無を測定した。
【００２４】
その結果、本来受容体と共役するＧ蛋白質がＧｑサブタイプであるＧＰＣＲのＨ１、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ５、及びｍＧｌｕ１受容体に関しては、キメラ蛋白質の共発現の有無に関わらず電流応答が得られたが、本来共役する受容体がＧｓやＧｉサブタイプである場合（Ｈ２、Ｍ２、Ｍ４、及びδオピオイド受容体）は、キメラ蛋白質を共発現させた場合にのみ電流応答が得られた。なお、Ｇ１１蛋白質単体やＧ１６蛋白質単体を共発現させた場合には、このような効果は見られなかった。
【００２５】
実施例２
実施例１で記述した方法を用いて、リガンド濃度と電流応答の関係について調べた。（１）Ｈ２受容体と、Ｇ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質とを発現する卵母細胞、（２）Ｍ１受容体と、Ｇ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質とを発現する卵母細胞、（３）Ｍ２受容体と、Ｇ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質とを発現する卵母細胞、は実施例１と同様の方法で作成した。
【００２６】
実施例１記載の方法にて各濃度のリガンド（Ｈ２；ヒスタミン、Ｍ１／４；ＡＣＨ）刺激による電流応答を測定した。その結果、Ｈ２受容体、Ｍ１受容体、Ｍ４受容体の例について図５に示した。この結果、キメラ蛋白質を共発現させた場合も、リガンド濃度と電流応答の大きさに相関関係があることが示された。尚、本来共役するＧ蛋白質がＧｑであるＭ１受容体（２）においては、キメラＧα蛋白質の共発現の有無による電流応答で有意な差は見られず、外来Ｇ蛋白質の発現によって応答性に影響がないことも確かめられた。
【００２７】
実施例３
ＧＰＣＲとしてＨ２受容体、導入する外来Ｇ蛋白質としてＧ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質を用い、遺伝子導入のタイミングによる電流応答に対する影響を検討した。
【００２８】
Ｈ２受容体をコードするＲＮＡを卵母細胞に導入すると同時、あるいはその２４時間後にＧ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡを導入した。その後、実施例１に記載の方法で、これらの卵母細胞のリガンド応答を測定した。リガンドには１０μＭヒスタミンを用いた。その結果、図６に示すように、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を導入してから２４時間後にキメラＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入した場合、同時に双方の遺伝子を導入した場合に比べ、ヒスタミンによる電流応答が増大した。
【００２９】
また図７に、ＧＰＣＲをコードする遺伝子導入後０〜４２時間後にＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入した場合の電流応答の結果を示す（導入後０時間は同時に導入した場合）。図７に示すように、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を導入してから、１２〜３６時間後にＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入することが好ましいことが示された。
【００３０】
実施例４
ＧＰＣＲをコードするＲＮＡを卵母細胞１個あたり１０ｎｇ導入後、２４時間後にＧ１１αサブユニットとＧ１４αサブユニットのキメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡを１ｎｇまたは１０ｎｇ導入した。その後、実施例１に記載の方法で、これらの卵母細胞のリガンド応答を測定した。その結果、図８に示すように、キメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡ量がＧＰＣＲをコードするＲＮＡ量の１０分の１の場合にも応答が確認されたが、キメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡをＧＰＣＲをコードするＲＮＡと同量の１０ｎｇ導入した場合の方がリガンドに対する電流応答が明らかに大きかった。
【００３１】
図９に、ＧＰＣＲをコードする遺伝子に対するＧｑαサブユニットをコードする遺伝子の比率が１：１／１０〜１：１０の場合の電流応答の結果を示す。図９に示すように、Ｇｑαサブユニットをコードする遺伝子の量が、ＧＰＣＲをコードする遺伝子の量に対し、１／１０〜１０の比であると好ましい。
【００３２】
実施例５
以下、本発明の一実施形態について、図１０を用いて詳細に説明する。
ＧＰＣＲをコードするＲＮＡ及びキメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡを合成する。顧客から供与されたＧＰＣＲをコードするＤＮＡを酵素処理し、鋳型を作成する。同時にキメラＧα蛋白質をコードするＤＮＡを酵素処理し、鋳型を作成する。これを基に、ＧＰＣＲをコードするＲＮＡとキメラＧα蛋白質をコードするＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に共導入する。一定期間培養後、これらの卵母細胞にＧＰＣＲのリガンド候補物質を添加し、その際の細胞応答を検出することにより、ＧＰＣＲのリガンドスクリーニングを行う。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によりアフリカツメガエル等の動物卵母細胞を用いた外来蛋白質発現系において、本来共役するＧ蛋白質のサブタイプがいずれであるかに関わらず、ＧＰＣＲを介したシグナル伝達系の活性をイノシトールリン脂質代謝回転系活性を指標に測定することができる。
【００３４】
【配列表】
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2005000132.tif 000004
2005000132.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いるＧｑαサブユニットキメラ蛋白質の例を示す。
【図２】イノシトールリン脂質代謝回転系の模式図を示す。
【図３】本発明の外来蛋白質発現卵母細胞の作製及びそれを用いたリガンドのスクリーニング方法について模式的に示す。
【図４】リガンド刺激によるＣａイオン濃度依存性Ｃｌ電流応答の有無に対するキメラＧ蛋白質の共発現の影響を示す。
【図５】キメラＧ蛋白質共発現卵母細胞における電流応答に対するリガンド濃度の影響を示す。
【図６】キメラＧｑαサブユニットをコードする遺伝子をＧＰＣＲをコードする遺伝子と同時に導入した卵母細胞と２４時間後に導入した卵母細胞における電流応答の例を示す。
【図７】ＧＰＣＲをコードする遺伝子導入後０〜４２時間後にＧｑαサブユニットをコードする遺伝子を導入した場合の電流応答の結果を示す。
【図８】キメラＧα蛋白質をコードする遺伝子をＧＰＣＲをコードする遺伝子と同量導入した卵母細胞と１０分の１量を導入した卵母細胞における電流応答の例を示す。
【図９】ＧＰＣＲをコードする遺伝子に対するＧｑαサブユニットをコードする遺伝子の比率の電流応答に対する影響を示す。
【図１０】顧客の要請によってリガンドスクリーニングサービスを行う場合について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005000132.tif 000012
【図８】
2005000132.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月1日(2003.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
G蛋白質共役受容体(GPCR)をコードする遺伝子と、
Gqα若しくはGllαと、G14α、G15α若しくはG16αとのキメラ蛋白質をコードする遺伝子とを動物細胞に導入し、発現させることを特徴とする外来蛋白質発現細胞の作製方法。
【請求項２】
請求項１記載の外来蛋白質発現細胞の作製方法において、前記キメラ蛋白質のN末端側がGqまたはG11由来の配列であり、C末端側がG14、G15またはG16由来の配列であることを特徴とする外来蛋白質発現細胞の作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の外来蛋白質発現細胞の作製方法において、GPCRをコードする遺伝子を導入してから、１２〜３６時間後に前記キメラ蛋白質をコードする遺伝子を導入することを特徴とする外来蛋白質発現細胞の作製方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の外来蛋白質発現細胞の作製方法において、前記キメラ蛋白質をコードする遺伝子の量が、GPCRをコードする遺伝子の量に対し、１／１０〜１０の比であることを特徴とする外来蛋白質発現細胞の作製方法。
【請求項５】
G蛋白質共役受容体(GPCR)と、
Gqα若しくはG11αと、G14α、G15α若しくはG16αとのキメラ蛋白質とを有することを特徴とする外来蛋白質発現細胞群。
【請求項６】
請求項５記載の外来蛋白質発現細胞群において、前記キメラ蛋白質のN末端側がGqまたはG11由来の配列であり、C末端側がG14、G15またはG16由来の配列であることを特徴とする外来蛋白質発現細胞群。
【請求項７】
G蛋白質共役受容体(GPCR)と、Gqα若しくはG11αと、G14α、G15α若しくはG16αとのキメラ蛋白質とを有する外来蛋白質発現細胞に対し、被験物質を接触させ、
GPCR活性を測定し、
GPCRに対するリガンドをスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項７記載のスクリーニング方法において、細胞内Caイオン濃度の上昇を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項７記載のスクリーニング方法において、細胞内Caイオン濃度の上昇の指標としてCaイオン濃度依存性Cl電流変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法において、前記キメラ蛋白質のN末端側がGqまたはG11由来の配列であり、C末端側がG14、G15またはG16由来の配列であることを特徴とするスクリーニング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
実施例１
GPCRとして、H1〜2受容体、M1〜M5受容体、δオピオイド受容体、及びmGlu1受容体を用い、またG蛋白質の例としてG11蛋白質とG14蛋白質を用いて、アフリカツメガエル卵母細胞における共発現を行った。H1受容体の遺伝子は、Biochem. Biophys. Res. Commun. 201(2), 894-901 (1994)等に記載の配列情報（配列番号１）に基づいてPCR法を用いたクローニングにより取得した。H2受容体の遺伝子は、FEBS Lett. 451(3), 327-331(1999)等に記載の配列情報（配列番号２）に基づいてPCR法を用いたクローニングにより取得した。その他の遺伝子は、東京都精神医学研究所  額田敏秀博士より入手した。GPCRを介したシグナル伝達の測定方法としてCaイオン濃度依存性Clイオン電流測定を用いるが、本発明は必ずしもこの測定方法に限定されるものではない。