(57)【要約】      （修正有）【課題】神経変性疾患を処置する方法の提供。【解決手段】式（Ｉ）で示される化合物を、処理を必要とする対象に投与することを含む方法。2005075834.tif 000008（式中、Ａは、Ｈ、Ｒ等であり；Ａｒ１、Ａｒ２のそれぞれは、独立してフェニル、チエニル、フリルまたはピロリルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、のそれぞれは、独立してＨ、ハロゲン、Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ等、もしくはＲＮＲ’Ｒ’’であるか；またはＲ１およびＲ２が一緒に、Ｒ３およびＲ４が一緒に、ＯＲＯであり；Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；ｎは、１、２または３である）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患を処置する方法であって、該処置を必要とする対象に下記式の化合物を投与することを含む方法
【化１】
2005075834.tif 000005
（式中、
Ａは、Ｈ、Ｒまたは、
【化２】
2005075834.tif 000006
であり；
Ａｒ１、Ａｒ２およびＡｒ３のそれぞれは、独立してフェニル、チエニル、フリルまたはピロリルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、ニトロ、ハロゲン、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、ＲＯＨ、ＲＯＲ’、ＲＳＨ、ＲＳＲ’、ＲＯＣ（Ｏ）Ｒ’ＯＨ、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＲＮＨＲ’もしくはＲＮＲ’Ｒ’’であるか；またはＲ１およびＲ２が一緒に、Ｒ３およびＲ４が一緒に、もしくはＲ５およびＲ６が一緒に、ＯＲＯであり；Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ｎは、１、２または３である）。
【請求項２】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病またはアルツハイマー病である、請求項1 に記載の方法。
【請求項３】
Ａが、
【化３】
2005075834.tif 000007
である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ａｒ１が、フェニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれフェニルの４位および５位で置換されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ａｒ２が、５’−フリルである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ３およびＲ４の一方が、フリルの２位で置換されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａｒ３が、フェニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ｎが、１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ａｒ１が、フェニルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれフェニルの４位および５位で置換されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａｒ２が、５’−フリルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ５およびＲ６のそれぞれが、Ｈであり、Ｒ３およびＲ４の一方が、フリルの２位で置換されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、Ｈである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ２ＮＨＣＨ３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ２ＯＨである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ２ＯＣＨ３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＯＯＣＨ３である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ２ＯＨである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ２の一方が、Ｈである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１が、Ｈであり、Ｒ２が、Ｆである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１が、Ｈであり、Ｒ２が、ＯＣＨ３である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１およびＲ２が一緒に、ＯＣＨ２Ｏである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
Ａｒ１が、チエニルである、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
Ａｒ２が、フェニルである、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ３およびＲ４の一方が、フェニルの４位で置換されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ３である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ａｒ３が、フェニルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ｎが、１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｒ３およびＲ４の一方が、フェニルの４位で置換されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＨ３である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、Ｈであり、Ｒ５およびＲ６の一方が、Ｈであり、他方が、フェニルの３位で置換されているＣｌである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、Ｈであり、Ｒ５およびＲ６の一方が、Ｈであり、他方が、フェニルの４位で置換されているＮＯ２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ａが、Ｈである、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
Ａｒ１が、フェニルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれフェニルの４位および５位で置換されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ａｒ２が、５’−フリルである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ３およびＲ４の一方が、フリルの２位で置換されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、Ｈである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ３およびＲ４の一方が、Ｈであり、他方が、ＣＯＯＣＨ３である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ａｒ２が、５’−フリルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
Ｒ３およびＲ４の一方が、フリルの２位で置換されている、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本出願は、２００２年９月１３日に出願された米国特許出願第１０／２４２，８２６号の一部継続出願であり、その優先権を主張するものである。米国特許出願第１０／２４２，８２６号の内容は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、神経学的障害の大きな群であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、緑内障性神経変性および筋萎縮性側索硬化症などが含まれる。これらの疾患は、進行性で特異的なニューロン損失を特徴とする。神経変性疾患の患者は、中枢および／または末梢ニューロンの限局的ないしは広汎的な萎縮を示し、精神機能と身体機能の両面に影響が及ぶといわれる。患者は、精神的には物忘れ、記憶力の低下、知力の衰え、感情障害または不明瞭な言語（ｕｎｃｌｅａｒ−ｓｐｅｅｃｈ）を示す。身体的には、患者は、不完全失禁ないし完全失禁、粒状食の誤嚥、振せん、平衡失調（ｐｏｏｒ−ｂａｌａｎｃｅ）、筋肉硬直または筋肉麻痺を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、一態様において、神経変性疾患を処置する方法を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記方法は、処置を必要とする対象に下記式（Ｉ）の縮合ピラゾリル化合物を投与することを含む。
【０００５】
【化１】
2005075834.tif 000002
上記式中、
Ａは、Ｈ、Ｒまたは、
【化２】
2005075834.tif 000003
（以後、「（ＣＨ２）ｎＡｒ３（Ｒ５）（Ｒ６）」で示す）であり；Ａｒ１、Ａｒ２およびＡｒ３それぞれは、独立してフェニル、チエニル、フリルまたはピロリルであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、ハロゲン、Ｒ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｏ）ＳＨ、Ｃ（Ｏ）ＳＲ，Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’、ＲＯＨ、ＲＯＲ’、ＲＳＨ、ＲＳＲ’、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＲＮＨＲ’もしくはＲＮＲ’Ｒ’’であるか；またはＲ１およびＲ２が一緒に、Ｒ３およびＲ４
が一緒に、もしくはＲ５およびＲ６が一緒に、ＯＲＯである。Ｒ、Ｒ’およびＲ’’のそれぞれは、独立してＣ１〜Ｃ６アルキルであり；ｎは、１、２または３である。前記化合物は、神経変性疾患の処置に有効な量で存在する。
【０００６】
式（Ｉ）は、ピラゾリル核と少なくとも２個のアリール基、例えばＡｒ１またはＡｒ２とを含む。式（Ｉ）で示される化合物のサブセットは、Ａが、（ＣＨ２）ｎＡｒ３（Ｒ５）（Ｒ６）であることを特徴とする。これらの化合物において、Ａｒ１はフェニルであり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれフェニルの４位および５位で置換されている。あるいは、Ａｒ２が、５’−フリルであり、Ｒ３およびＲ４の一方が、５’−フリルの２位で置換されている。幾つかの実施形態において、Ａｒ３は、フェニルである。
【０００７】
式（Ｉ）で示される化合物の別のサブセットは、ＡがＨであることを特徴とする。これらの化合物において、Ａｒ１はフェニルであり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれフェニルの４位および５位で置換されている。あるいは、Ａｒ２が、５’−フリルであり、Ｒ３およびＲ４の一方が、５’−フリルの２位で置換されている。
【０００８】
本明細書で用いられる用語「アリール」は、フェニル、チエニル、フリルまたはピロリルを含み、それらの各々は、任意で１個以上の置換部分を有する。置換部分は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６と同一であっても、または異なっていてもよい。それらは、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、メルカプト、シアノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであってもよく、その場合のアルキル、アルケニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキルは、任意でＣ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、シアノで置換されている。用語「アルキル」は、直鎖状および分枝状アルキルの双方を含み、任意で直前に記載した、置換部分を１個以上含む。
【０００９】
以下の説明は、本発明の方法を実施するために用いられ得る縮合ピラゾリル化合物の例である。
【００１０】
【化３】
2005075834.tif 000004
１−ベンジル−３−（５’−メトキシメチル−２’−フリル）−インダゾール
【００１１】
上記の縮合ピラゾリル化合物は、それらの化合物自体だけでなく、適宜、それらの塩およびプロドラッグを含む。そのような塩は、例えば、縮合ピラゾリル化合物上の負電荷を有する置換基（例えばカルボキシレート）と、カチオンとで形成され得る。適切なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオンなどのアンモニウムカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、正電荷を有する置換基（例えばアミノ）は、負電荷の対イオンと塩を形成することができる。適切な対イオンとしては、塩素、臭素、ヨウ素、
硫酸、硝酸、リン酸または酢酸イオンが挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグの例としては、対象に投与すると上記の縮合ピラゾリル化合物を提供し得る、エステルおよび他の薬学的に許容可能な誘導体が挙げられる。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「神経変性疾患」は、進行性で特異的なニューロン損失に関連する障害を指す。例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、炎症性脳疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ関連痴呆症、多発性硬化症、緑内障性神経変性および神経興奮性毒性（ｅｘｃｉｔｏｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明の方法が、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）、カイニン酸、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）などの様々な神経毒によって誘発される細胞毒性からニューロンを保護することは予期されていなかった。本発明の他の特徴、目的および利点は、本明細書および特許請求の範囲から明白となろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法を実施するために用いられる縮合ピラゾリル化合物は、当業者に周知の手順によって製造されることができる（例えば、米国特許第５，５７４，１６８号明細書参照）。前記手順は、以下の合成経路を含む。最初に、塩化アリールカルボニルを別のアリール化合物とカップリングさせることによって、アリールアリールケトンを調製する。アリール化合物のどちらか一方は、任意で一置換または多置換されている。その後、そのケトンを、アリール基が任意で一置換または多置換されていてもよいアリールアルキルヒドラジンと反応させて、３個のアリール基を含むヒドラゾンを形成する。ヒドラゾン基は、アルキレンリンカーを介して縮合ピラゾリル核に変換されし、別のアリール基は、ピラゾリル核の４位Ｃおよび５位Ｃで縮合して、３番目のアリール基は、ピラゾリル核の３位Ｃに直接結合する。縮合ピラゾリル化合物の誘導体は、いずれのアリール基の置換基を修飾することによって得られてもよい。
【００１５】
上記合成経路で用いられた化学物質は、例えば溶剤、試薬、触媒、保護基試薬および脱保護基試薬を含んでいてもよい。最終的に縮合ピラゾリル化合物を合成させるために、上記方法が、本明細書に詳細に記載したステップの前または後のどちらかに別のステップを含むことによって、適切な保護基を付加または除去してもよい。加えて、様々な合成ステップを別の順序で実施して、所望の化合物を与えてもよい。適切な縮合ピラゾリル化合物を合成する際に有用な合成化学変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は、当該技術分野で知られており、例えばＲ．ラロック著、コンプレヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ，ＶＣＨパブリッシャーズ（１９８９年）(R.Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989))；Ｔ．Ｗ．グリーンおよびＰ．Ｇ．Ｍ．ウッツ著、プロテクティブ・グループ・イン・オーガニック・シンセシス，第２版、ジョン・ウィリー・アンド・ソンズ出版（１９９１年）(T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd. Ed., John Wiley and Sons (1991))；Ｌ．フィーサーおよびＭ．フィーサー著、フィーサー・アンド・フィーサーズ・リーゼンツ・フォー・オーガニック・シンセシス、ジョン・ウィリー・アンド・ソンズ出版（１９９４年）(L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organid Synthesis, John Wiley and Sons (1994)) ；Ｌ．パケット版、エンサイクロピディア・オブ・リーゼンツ・フォー・オーガニック・シンセシス、ジョン・ウィリー・アンド・ソンズ出版（１９９５年）(L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Son (1995)) ならびにその次版が挙げられる。
【００１６】
こうして合成された縮合ピラゾリル化合物は、カラムクロマトグラフィー、高速液体ク
ロマトグラフィーまたは再結晶化などの方法によって更に精製されてもよい。
本発明の一態様は、パーキンソン病、ハンチントン病、炎症性脳疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ関連痴呆症、多発性硬化症または神経興奮性毒性などの神経変性疾患を処置する方法である。その方法は、有効量の縮合ピラゾリル化合物を１種以上と、薬学的に許容可能な担体とを、必要とする患者に投与することを含む。本明細書で用いられる用語「処置する」は、神経変性疾患を治療する、治癒する、軽減する、緩和する、変質させる、修復する、回復させる、または防止することを指す。「有効量」は、必要とする患者に投与する際に、患者に対して治療的効果を付与するのに必要とされる縮合ピラゾリル化合物の量と定義される。有効量の縮合ピラゾリル化合物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。有効な用量は、当業者によって認識されるとおり、投与経路、賦形剤の使用、神経変性疾患を処置する別の薬剤を併用する可能性に応じて変動する。
【００１７】
本発明の方法を実施するために、縮合ピラゾリル化合物を経口投与、非経口投与するか、または吸入スプレーもしくは埋込み式リザーバーによって投与することができる。本明細書で用いられる用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内および病変内注入法または輸液法などが挙げられる。
【００１８】
経口投与用の組成物は、非限定的にカプセル、錠剤、乳濁液、水性懸濁物、分散体および溶液をはじめとする、経口的に許容可能な投与形態であってもよい。経口使用する錠剤の場合、一般に用いられる担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。通常は、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤も添加される。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤として、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液または乳濁液が経口投与される場合、乳化剤または沈殿防止剤を含む油相に、有効成分が懸濁または溶解されてもよい。所望により、特定の甘味料、調味料または着色剤が添加されてもよい。吸入組成物は、医薬製剤の業界で周知の技法によって調製されてもよく、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存料、生物学的利用度を高める吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で知られる他の可溶化剤もしくは分散剤を用いながら、生理食塩水中の溶液として調製されてもよい。
【００１９】
適切な分散剤または湿潤剤（例えばツィーン８０など）および沈殿防止剤を用いて、当該技術分野で知られる技法によって、滅菌注射可能組成物、例えば滅菌注射可能水性または油性懸濁液を調剤してもよい。滅菌注射可能製剤は、非毒性で非経口投与が可能な希釈剤または溶剤中の滅菌注射可能溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用が可能で許容可能な媒体および溶剤には、マンニトール、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油は、溶剤または懸濁媒（例えば合成モノ−またはジ−グリセリド）として従来から用いられている。オレイン酸などの脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、特にポリオキシエチル化された形のものが、オリーブ油またはヒマシ油など天然の薬学的に許容可能な油と同様に、注射可能剤の製造において有用である。これらの油状溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散体、またはカルボキシメチルセルロース、あるいは同様の分散剤を含んでいてもよい。
【００２０】
医薬組成物中の担体は、製剤の有効成分と適合性があり（そして好ましくはそれを安定化することができ）、処置を受ける患者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。例えば、縮合ピラゾリル化合物と特異的でより可溶性のある複合体を形成するシクロデキストリンなどの可溶化剤、または１種以上の可溶化剤が、縮合ピラゾリル化合物を送達するための医薬賦形剤として用いられてもよい。他の担体の例としては、コロイド二酸化シリコン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ黄色１０号が挙げられる。
【００２１】
当該技術分野で周知の手順を用いることによって、インビボスクリーニングが実施されてもよい。例えば以下の特定の実施例を参照されたい。
更に詳述することなく、上記説明によって本発明の実行手段が適切に与えられたと思われる。それ故、以下の特有の実施形態は、単に例示であって、開示の残り部分を限定するものではない。本明細書に引用された、特許をはじめとする全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２２】
化学合成
まず、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中で無水塩化カルシウム（８８．８ｍｇ、０．８ミリモル）を水素化ホウ素ナトリウム（６０ｍｇ、１．６ミリモル）と一緒に４時間撹拌することによって、水素化ホウ素カルシウムを調製した。その後、１−ベンジル−３−（５’−メトキシカルボニル−２’−フリル）−インダゾール  ８８．０ｍｇ（０．２７ミリモル）を含むＴＨＦ溶液３０ｍＬを、３０±２℃の水素化ホウ素カルシウム溶液に滴下して加えた。その混合物を６時間、還流下で加熱し、冷却し、砕いた氷中で急冷し、減圧下に置いてＴＨＦを除去し、濾過して固形生成物を得た。その固形物をジクロロメタンで抽出した。抽出物を５０ｍＬに濃縮して、石油エーテルを添加した後、固形物を沈殿させた。沈殿を回収して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル−ベンゼン）で精製して、１−ベンジル−３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−インダゾール７０．０ｍｇを収率８７％で得た。この化合物を、以後「インダゾール１」と呼ぶ。
【００２３】
ｍｐ：１０８〜１０９℃
ＭＳ（％），ｍ／ｚ：３０４（Ｍ＋）
ＩＲ（ＫＢｒ）λｍａｘ：３３５０ｃｍ−１（−ＯＨ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，２００ＭＨｚ）δ：４．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＣＨ２Ｏ−），５．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，−ＯＨ），５．７０（２Ｈ，ｓ，＝ＮＣＨ２−），６．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−４’），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−３’），７．２１−７．３１（６Ｈ，ｍ，Ｈ−５，フェニル），７．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ−６），７．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．８Ｈｚ，Ｈ−７）、８．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．ｏＨｚ，Ｃ４−Ｈ）
【００２４】
生物学的アッセイ
方法
動物：体重２００〜３００ｇのスプラグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）（ＳＤ）ラットを使用した。これらの動物を、１２時間：１２時間の明暗周期で、温度（２４±１℃）および湿度（５５±５％）を管理した部屋で飼育した。飼料および飲水は、自由に摂取させた。手術を実施する際、動物にトリクロロアセトアルデヒド（４００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。      
パーキンソン病のモデル：ハミルトンシリンジを用いて、ＭＰＰ＋（９μｇ）またはＬＰＳ（２５μｇ）を、ブレグマの前方５．３ｍｍ、中線の右側２ｍｍ、硬膜の腹方７．８ｍｍの座標で、ＳＤラットの片側黒質内に注入した。ＭＰＰ＋注入の７日後に、アポモルフィン（腹腔内、５ｍｇ／ｋｇ）を用いてラットの回転行動をテストした。その後、トリクロロアセトアルデヒドでラットに深く麻酔をかけて、生理食塩水、その後、低温リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７．４）で灌流した。その後、脳を迅速に取り出して、免疫組織化学的試験のために２４時間、４％パラホルムアルデヒド溶液中で後固定した。
【００２５】
ハンチントン病のモデル：３−ニトロプロピオン酸（１５ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）を、ラットに５日連日注射した。ロータロッドテストを利用して学習行動を調査したのに加
え、脳を取り出し、クレシルバイオレット染色、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ＮＯＳ介在ニューロンおよびグリオーシス免疫染色によってニューロン損失を染色した。
【００２６】
アルツハイマー病のモデル：リン酸緩衝液に溶解した３−ＮＰ（２０ｍｇ／ｋｇ）を、ラットに単回腹腔内注入し、４時間後にアミロイドβ（Ａβ）フラグメント２５〜３５（２μｇ／μｌ）を海馬内の歯状回（座標：ＡＰ−３．６、ＭＬ−２．０、ＤＶ−２．７）に投与した。薬物投与後３日目に、ニューロンマーカーの免疫組織化学的染色のために、海馬領域を単離した。
【００２７】
カイニン酸誘発神経毒性のモデル：カイニン酸（ＫＡ）（０．２μｇ）を、ラットの海馬の片側（座標：ＡＰ−４．５；ＭＬ−２；ＤＶ−２．８）に注入した。注入後、ラットを１週間放置して回復させた。ニューロンマーカーの免疫組織化学的染色のために、海馬領域を単離した。
【００２８】
免疫組織化学：ドーパミン（ＤＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）およびニューロンマーカー、例えばグリア線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）またはＣＤ１１ｂを考察するために、様々な領域の脳切片を分離した。脳切片（３０μｍ）を、抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ドーパミンニューロンのマーカー）、抗ニューロン核、抗グルタメートデカルボキシラーゼ、抗ＧＦＡＰまたは抗ＣＤ１１ｂを含む一次抗体と一緒に、４℃で４８時間インキュベートした。その後、脳切片をビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ中でインキュベートした。ＡＢＣ法（ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories) 、カリフォルニア州バーリンゲーム）によって顕現させ、０．０４％（ｗ／ｖ）ジアミノベンジンを用いて発色させて、褐色の反応生成物を生成した。
【００２９】
クレシルバイオレット染色：凍結した切片をクリオスタットから得て、ゼラチンコートスライド上に載せて、一晩乾燥させた。水で洗浄した後、酢酸クレシルバイオレット（シグマ）の１％溶液を用いて切片を３分間染色し、１％氷酢酸溶液中で識別させて水道水で洗浄し、グリセリン−ゼラチンで被覆した。
【００３０】
ＮＡＤＰＨ／ｄ＋（ＮＯＳ）介在ニューロンの染色：０．１ＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰＨ（還元型；シグマ）および１ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム（シグマ）を含む反応混合物中、３７℃の暗所で６０分間インキュベートすることによって、浮動性のクリオスタット切片（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｒｙｏｓｔａｔ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ）に対してＮＡＤＰＨジアホラーゼ染色を行なった。トリスＨＣｌ緩衝液で反応を停止させ、その後切片をスライドガラスに載せて一晩乾燥させ、キシレンで洗浄して、それにパーマウントと一緒にカバースリップを載せた。      
ロータロッドテスト：ロータロッドテストでは各実験毎に３回試験した。各試験では、ラットを棒に乗せて、ラットが棒から落ちるまでの時間を測定した。テスト間隔は、１０分であった。棒は、１２ｒｐｍの電気モーターで回転させた。
【００３１】
結果
ＭＰＰ＋誘導性神経編成の防止：インダゾール１（１．２ナノモル）の非存在下または存在下のＭＰＰ＋（９μｇ）を、黒質または線条体のいずれかに片側注入した。ＭＰＰ＋を黒質（ＳＮ）に局所的に単回注入した後１週間目に、線条のドーパミン作動性ニューロンおよびドーパミン作動性神経末端の顕著な細胞損失が観察された。これとは対照的に、ＭＰＰ＋とインダゾール１とをＳＮに併用注入したところ、ドーパミン作動性ニューロンが、ＭＰＰ＋によって引起された毒性傷害から有意に保護され、軸索突起が保持された。インダゾール１で処置したラットでは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの８０．１±２．６％（ｎ＝６）が生存したが、対照群では、３２．１±５．９％（ｎ＝１０）のみで
あった。加えて、インダゾール１（腹腔内、１ｍｇ／ｋｇ／日；３〜５日間）の全身性の注入も、ＳＮへのＭＰＰ＋局所単回注射による神経毒性からの神経保護を発揮した（生存ニューロン：８０．０±２．２％、ｎ＝９）。
【００３２】
線条体内へのＭＰＰ＋の局所注入も、ＳＮでのＤＡニューロン損失を引き起こした（生存ニューロン：６１．２±６．５％、ｎ＝４）。インダゾール１とＭＰＰ＋との線条体への併用注入によって、ＳＮ内のＤＡニューロンの生存率が上昇した（生存ニューロン：８５．２±２．９％、ｎ＝６）。
【００３３】
ＬＳＰ誘導性ニューロン死の防止：パーキンソン病または炎症性ＣＮＳ病の試験用動物モデルとして、ＳＮ内のＬＰＳ誘導性ＤＡニューロン損失を用いた。ＬＰＳ（２５μｇ）の片側黒質内注入の７日後に、脳切片を得た。ＬＰＳの単回注入に応答して、注入していない反対側と比較すると、ＴＨ陽性ニューロンの５４．５±４．１％（ｎ＝１１）が生存した。ＬＰＳとインダゾール１（１．２ナノモル）との併用注入によって、ＬＰＳの神経毒性が弱められた（生存ニューロン：７４．５±３．４％、ｎ＝１０）。
【００３４】
カイニン酸誘導性海馬ニューロン死の防止：インダゾール１（１．２ナノモル）の非存在下または存在下で、カイニン酸（０．２μｇ）を海馬に片側注入した。７日後、カイニン酸のみの注入は、反対側に比較して錐体ニューロンのほぼ６０％の損失を引き起こした。その一方で、インダゾール１の海馬内への単回注入（１．２ナノモル）または腹腔内への単回注入（１ｍｇ／ｋｇ／日、７日間）は、ニューロンをカイニン酸誘導性ニューロン死から有意に保護した。インダゾール１の海馬内への単回注入によって８５．６±４．９％（ｎ＝１０）のニューロン、インダゾール１（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって８８．０±３．１％（ｎ＝１０）のニューロン、インダゾール１（０．１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入によって６６．４±３．２％（ｎ＝３）のニューロンが生存したが、対照では３７．８±６．５％（ｎ＝１１）のニューロンしか生存しなかった。
【００３５】
線条体における３−ＮＰ誘導性ニューロン死の防止：ラットに、３−ＮＰ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を５日間連日、腹腔内注入した。他のラットに、３−ＮＰ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）とインダゾール１（１ｍｇ／ｋｇ）とを併用して、５日間連日注入した。ラット全ての脳切片を、クレシルバイオレットで染色した。全身性の３−ＮＰの投与によって、線条体内で局所的ニューロン損失が起こった。しかし、インダゾール１による処置によって、３−ＮＰ誘導性ニューロン病変が、顕著に減少した。
【００３６】
その後、線条体における３−ＮＰ誘導性ＧＡＢＡ作動性神経毒性に対するインダゾール１の保護を考察するため、脳切片をＧＡＤに対する抗体で染色した。３−ＮＰの投与によって、ＧＡＢＡ作動性ニューロン損失が起こったが、インダゾール１による処置によって、ニューロンが３−ＮＰ中毒から保護された。
【００３７】
線条体における３−ＮＰ誘導性ＮＡＤＰＨ−ｄ／ｎＮＯＳニューロン死に対するインダゾール１の保護を考察するため、脳切片をＮＡＤＰＨ−ｄ組織化学によって染色して、酸化窒素を生成するニューロンを示した。ラット毎に４枚の脳薄片で、生存するニューロンの数をカウントした。対照では２２６±１／枚、３−ＮＰ注入では１１６±１０／枚、３−ＮＰおよびインダゾール１の注入では２０４±４／枚（それぞれｎ＝６）であった。つまり、３−ＮＰ中毒によって、ＮＡＤＰＨ−ｄ／ＮＯＳ介在ニューロンがニューロン死した。その一方で、インダゾール１によって、ＮＡＤＰＨ−ｄ／ＮＯＳ介在ニューロンの損傷が防御された。
【００３８】
その後、３−ＮＰ誘導性グリオーシスに対するインダゾール１の防御を考察するために、脳切片を、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰに対する抗体で染色した。その結果から
、３−ＮＰでの慢性的処置によって、３−ＮＰとインダゾール１との併用処置よりもかなり重度のグリオーシスが起こることが示された。
【００３９】
インダゾール１の３−ＮＰ誘導性運動障害への効果を考察するために、５日目にロータロッドを用いて運動機能をテストした。ロータロッドを１２ｒｐｍの電気モーターで回転させた。各ラットを１０分間隔で３回テストし、３−ＮＰを慢性的全身投与した後のロータロッド上に留まっている時間を記録した。対照ラットの行動は、試験の回数が増すごとに改善した。しかし、３−ＮＰ投与は、運動学習能力をかなり低下させた。インダゾール１による処置によって、運動機能が有意に改善した。試験３でのロータロッド上の時間は、対照では５０．８±２０．１秒（ｎ＝８）、３−ＮＰの注入によって２．９±０．４秒（ｎ＝９）、３−ＮＰおよびインダゾール１の注入によって１００．８±１９．４秒（ｎ＝１３）と測定された。
【００４０】
海馬におけるＡβ誘導性ニューロン死の防止：リン酸緩衝液に溶解した３−ＮＰ（２０ｍｇ／ｋｇ）をラットに単回腹腔内注入し、４時間後、それらのラットにＡβフラグメント２５〜３５（２μｇ／μｌ）を海馬内の歯状回に投与した。薬物投与後３日目に、ニューロンマーカーの免疫組織化学的染色のために、海馬領域を単離した。３−ＮＰの単回投与と共にＡβを注入したところ、反対側に比較して歯状回のニューロン損失が起こった。その一方で、インダゾール１（１．２ナノモル）の海馬内への単回注入によって、ニューロンがＡβ誘導性ニューロン死から著しく保護された。
【００４１】
結論としてインダゾール１によって、様々な神経毒、即ちＭＰＰ＋、カイニン酸、３−ＮＰ、ＬＰＳおよびＡβによって誘導された細胞毒性からニューロンが防御された。つまりインダゾール１関連化合物は、パーキンソン病、ハンチントン病、炎症性脳疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ＨＩＶ関連痴呆症、多発性硬化症、緑内障性神経変性および神経興奮性毒性をはじめとする多くの神経変性疾患を処置するための良好な候補薬物である。
【外国語明細書】
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