(57)【要約】【課題】  Thermus属細菌内で、挿入する外来遺伝子を高いレベルで発現させることができる発現ベクターおよびこの発現ベクターを用いた効率的なタンパク質生産方法を提供する。【解決手段】  プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子とを含む、２〜20kbpの大きさの発現ベクター。この発現ベクターに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入され、全体として30kbp以下の大きさである組み換え発現ベクターを用いてThermus属細菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、培養物から目的タンパク質を回収する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子と  を含む、２〜20kbpの大きさの発現ベクター。
【請求項２】
プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域が15kbp以下の大き  さの領域である請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域が、プラスミドpTT2  7を制限酵素PvuIIで切断することにより得られる15kbp以下の断片  である請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
マーカー遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、GFP遺伝子からな  る群より選ばれる遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター  。
【請求項５】
さらに、外来遺伝子を含み、全体として30kbp以下の大きさであ  る請求項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターでThermus属細菌を形質  転換することにより得られる形質転換体。
【請求項７】
Thermus属細菌が、Thermus thermophilusであ  る請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
Thermus thermophilusがThermus thermophilus   HB27株である請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から外来遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Thermus属細菌内で外来遺伝子を発現させるための発現ベクター及びそれを用いたタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
70℃以上で生育する高度好熱菌であるThermus属細菌は、高温環境下での耐熱性タンパク質の生産などに有用な細菌である。Thermus属細菌については、本出願人が、Thermus属細菌に感染できる好熱性ファージφIN93を発見し（特開平7-67633号公報）、外来遺伝子を組み込んだファージφIN93を用いてThermus属細菌を形質転換する方法（特開2000-287686号公報）を報告している。
【０００３】
また、プラスミドベクターは、ファージベクターに較べて、安定して存在するため継代培養することができるというメリットがあるところ、７0℃で生育する高度好熱菌を宿主とするプラスミドにおいても、遺伝子導入系がこれまでに確立されている。これまでの発現プラスミドは、Thermus属細菌の中のThermus thermophilus HB8株由来のプラスミドｐTT8を改良して構築されていた。
【０００４】
しかし、Thermus thermophilus HB8株は、制限作用が強いため、外来遺伝子がThermus thermophilus HB8株内に導入された際に、細胞内の制限酵素により切断され、発現量が低くなるという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高度好熱菌であるThermus属細菌内で、外来遺伝子を高レベルで発現させることができる発現ベクターおよびこの発現ベクターを用いた効率的なタンパク質生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  Thermus属細菌の中で、Thermus thermophilus HB27株に存在するプラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子とを含む発現ベクターに、目的タンパク質をコードする外来遺伝子を挿入して、全体として大きさを30kbp以下にした組み換え発現ベクターは、Thermus属細菌内で維持されるプラスミド量が従来のThermus属細菌用のプラスミドに較べて高い。
(ii)  その結果、この発現ベクターは、Thermus属細菌内で、高レベルで外来遺伝子を発現させることができる。
(iii)  またこの発現ベクターは、外来遺伝子挿入後の大きさが全体として30kbp以下であるため、形質転換やプラスミドの抽出を容易に行うことができる。
【０００７】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の発現ベクター、形質転換体及びタンパク質の生産方法を提供する。
【０００８】
項１．  プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子とを含む、２〜20kbpの大きさの発現ベクター。
【０００９】
項２．  プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域が15kbp以下の大きさの領域である項１に記載の発現ベクター。
【００１０】
項３．  プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域が、プラスミドpTT27を制限酵素PvuIIで切断することにより得られる15kbp以下の断片である項２に記載の発現ベクター。
【００１１】
項４．  マーカー遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、GFP遺伝子からなる群より選ばれる遺伝子である項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
【００１２】
項５．  さらに、外来遺伝子を含み、全体として30kbp以下の大きさである項１〜４のいずれかに記載の発現ベクター。
【００１３】
項６．  項５に記載の発現ベクターでThermus属細菌を形質転換することにより得られる形質転換体。
【００１４】
項７．  Thermus属細菌が、Thermus thermophilusである項６に記載の形質転換体。
【００１５】
項８．  Thermus thermophilusがThermus thermophilus HB27株である項７に記載の形質転換体。
【００１６】
項９．  項６〜８のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、培養物から外来遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、高度好熱性細菌であるThermus属細菌内で複製でき、かつ組み換え操作などを容易に行えるプラスミドベクターであって、挿入した外来遺伝子を高レベルで発現させることができるものが提供された。
【００１８】
Thermus属細菌は一般に70℃以上の高温環境下で生存できることから、本発明の発現ベクターを用いることにより、高温環境下で効率良くタンパク質を生産することができる。特に、70℃以上の高温下でも機能する耐熱性タンパク質を高温環境下で生産することにより、このタンパク質およびこれをコードする遺伝子の耐熱性構造を維持したままでこのタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）発現ベクター
本発明の発現ベクターは、プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子とを含む、２〜20kbp程度の大きさの発現ベクターである。
【００２０】
本発明の発現ベクターの大きさは好ましくは２〜５kbp程度である。上記の範囲であれば、pTT27上の複製開始点を含む領域とマーカー遺伝子とを含むことができるとともに、形質転換効率が良好であり、またプラスミドの抽出に際して染色体DNAが共に抽出されてしまうことがない。
【００２１】
プラスミドpTT27は、Thermus termophilus HB27株中に存在する約230kbpのプラスミドである。Thermus termophilus HB27株は、公知の株であり、理化学研究所などから容易に入手できる。プラスミドpTT27は、Thermus termophilus HB27株から公知のプラスミド抽出方法、例えばアルカリSDS法などにより抽出することにより得られる。
【００２２】
プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域の大きさは、15kbp以下とすればよい。この領域の大きさの下限値は特に限定されないが、通常２kbp程度である。
【００２３】
プラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域は、例えば制限酵素PvuIIで消化して得られる、通常15kbp以下の断片中に存在する。従って、本発明の発現ベクターにおけるプラスミドpTT27上の複製開始点を含む領域としては、PvuIIで消化することにより得られる15kbp以下の断片を使用することができる。ベクターの複製には、複製開始点の他、種々の機能を有する領域が必要であることから、発現ベクターの複製機能を維持しつつ、その大きさをできるだけ小さくすることは、当業者にとっても非常に困難なことである。このような状況の下で、プラスミドpTT27をPvuIIで切断した15kbp以下の断片は、マーカー遺伝子及び外来遺伝子と連結して組み換え発現ベクターにした場合に、複製機能を維持しており、かつ高い形質転換効率を有し、染色体DNAとは分離してプラスミドを抽出し易いものである。
【００２４】
また本発明の発現ベクターは、20kbp以下の大きさになる範囲内で、Thermus属細菌内で複製可能な複製開始点（特に、Thermus thermophilus以外のThermus属細菌内で複製可能な複製開始点）や他の属に属する細菌内で複製可能な複製開始点も含むシャトルベクターであってもよい。これにより、ベクターの構築を扱い易い菌株内で行うことができるようになる。
【００２５】
マーカー遺伝子は、それを含む発現ベクター全体の大きさが20kbp以下となる大きさを有し、かつThermus属細菌内で発現できるものであればよく、公知のマーカー遺伝子を制限なく使用できる。このような公知のマーカー遺伝子としては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、GFP遺伝子などを例示できる。これらの遺伝子はThermus属細菌内で発現できるプロモーター、リボソーム結合配列、転写終結配列を備えていればよい。マーカー遺伝子は、１種を単独で使用でき、又は、発現ベクター全体の大きさが20kbp以下となる範囲内で２種以上を組み合わせて使用できる。
【００２６】
本発明の発現ベクターを用いてタンパク質を生産するにあたっては、目的タンパク質をコードする外来遺伝子を、マーカー遺伝子の発現及びプラスミド複製に影響のない位置に挿入すればよい。目的遺伝子は、これを挿入した後の発現ベクターの大きさが通常30kbp以下となる範囲で選択すればよい。
【００２７】
外来遺伝子の種類は特に限定されず、上記大きさを充たす範囲で公知の遺伝子を制限なく使用できる。好ましくは耐熱性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。耐熱性タンパク質をコードする遺伝子とは、通常40℃以上、好ましくは50℃以上、より好ましくは60℃以上、特に70℃以上の温度下でも活性を保持できるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。具体的には、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子、耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子、耐熱性グルタミナーゼ遺伝子、耐熱性プロテアーゼ遺伝子などの熱安定性酵素をコードする遺伝子、熱ショック蛋白質をコードする遺伝子、groEL遺伝子、groES遺伝子、dnaK遺伝子、hsp70遺伝子などが挙げられる。
（ＩＩ）形質転換体
本発明の形質転換体は、上記説明した目的遺伝子が挿入された本発明の発現ベクターでThermus属細菌を形質転換することにより得られるものである。
【００２８】
Thermus属細菌は特に限定されないが、例えばThermus thermophilus、Thermus aquaticus、Thermus nonproteolyticus、Thermus ruber、Thermus filiformisなどを例示できる。これらの種に属する菌株は理化学研究所などから容易に入手できる。本発明の発現ベクターは、特にThermus thermophilus内に存在させる場合に、宿主による制限作用を受け難い。従って、宿主としてはThermus thermophilusが特に好適である。宿主としてはThermus thermophilus HB27株が最も好適である。
【００２９】
形質転換方法は特に限定されず、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知の形質転換方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などが挙げられる。
（ＩＩＩ）タンパク質の生産方法
本発明のタンパク質の生産方法は、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、培養物から外来遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含む方法である。
【００３０】
培養に用いる培地としては、Thermus属細菌の培養に通常用いられる培地を使用すればよい。このような公知の培地として、例えばA2培地（0.1%トリプトンおよび0.1%酵母抽出液を含むCastenholtzの基礎塩溶液（pH7.5）:Brock,T.D.およびFreez,H.,(1969)J.Bacteriol.98,289-297）が挙げられる。Castenholtzの基礎塩溶液は、蒸留水1リットルにニトリロ三酢酸(1g)、CaSO4・2H2O(0.6g)、MgSO4・7H2O(1.0g)、NaCl(0.08g)、KNO3(1.03g)、NaNO3 (6.89g)、Na2HPO4 (1.11g)、FeCl3 (0.28g)、Nitsch微量元素溶液が含まれるものである。Nitsch微量元素溶液は、蒸留水1リットルにH2SO4 (0.5ml)、MnSO4・H2O（2.2g)、ZnSO4・７H2O(0.5g)、H3BO3 (0.5g)、CuSO4（0.016g）、Na2MoO4・2H2O(0.025g)、CoCl2・6H2O(0.046g)を溶解したものである。
【００３１】
培養温度は、通常60〜80℃程度の範囲で、使用菌株に適した温度とすればよい。培養時間は、通常４〜20時間程度とすればよい。
【００３２】
菌体内に生産されるタンパク質である場合は、超音波破砕やホモジナイズなどの公知の手段で菌体を破砕し、破砕液から目的とするタンパク質を回収すればよい。また培養液中に分泌されるタンパク質である場合は、培養液を回収することにより目的タンパク質を回収することができる。
【００３３】
回収された粗タンパク質は、塩析や各種クロマトグラフィーなどの公知の方法で精製することができる。
実施例
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜プラスミドベクターpIM03の作製＞
プラスミドpTT27をThermus thermophilus HB27株からプラスミド抽出の常法であるアルカリSDS法により抽出し、制限酵素PvuIIで切断した。また、モデル遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子（約0.8kbp）を含むPvuII断片（約4.3kbp）を、上述のプラスミドpTT27の制限酵素PvuII切断断片に加えてリガーゼ反応を行なった。使用する制限酵素、リガーゼは、宝酒造社製を使用し反応は添付マニュアルに従った。
【００３４】
リガーゼ反応したDNAは、Thermus thermophilus HB27株に形質転換し、40μg/ml濃度のカナマイシンを含むA2カステン寒天培地（0.1% tryptone (Difco), 0.1% yeast extract (Difco) を含む Castenholtz 基礎塩溶液（ pH 7.5））で培養（60℃）し、カナマイシン耐性遺伝子とｐTT27由来の複製開始領域を含む発現プラスミドpIM03を得た。プラスミドpIM03の構築手順を図1に示す。
【００３５】
発現プラスミドpIM03は、pTT27由来の約14kbpの複製開始領域とカナマイシン耐性遺伝子とから構成され、遺伝子組換えに有効な分子量まで小さくすることができた。
＜プラスミドベクターpIM03の制限酵素地図＞
得られた発現プラスミドpIM03について、各種制限酵素により切断して、制限酵素切断地図を作製した（図2）。用いた制限酵素は、HindIII,  PvuII, NheI（以上、宝酒造社製）で、マニュアル従って酵素反応を行った。反応には、各制限酵素単独、及び2種類の制限酵素を複合して反応させ、得られた各切断サンプルを1.0％アガロースゲル電気泳動により解析した。pIM03の制限酵素地図を図2に示す。
＜Thermus属細菌内に存在するDNA数の比較＞
前述したようにして作製した発現プラスミドpIM03で形質転換したThermus thermophilus HB27株を40μg/ml濃度のカナマイシンを含むA2カステン培地の５mlで60℃で一晩振とう培養し、3000rpmで遠心することにより集菌した。得られた菌体をプラスミド抽出方法であるアルカリ-SDS法により抽出した。抽出したDNAを50μlの滅菌水に溶解させ、この溶液の280nmにおける吸光度を測定することにより、溶液中のDNA濃度、ひいては抽出された全DNA量を評価した。
【００３６】
また、従来の発現ベクターpKM18（バイオツールズ社製）で形質転換したThermus thermophilus HB27株を、上記と同様の条件で培養し、集菌した。さらに、上記と同様にして水溶液を調製し、溶液中のDNA濃度、ひいては抽出された全DNA量を評価した。
【００３７】
結果を図３に示す。図３から明らかなように、本発明のプラスミドベクターpIM03は、従来の発現ベクターであるpKM18に較べて、Thermus 属細菌内におけるDNA保持量が約５倍である。
【００３８】
このことから、pIM03は、Thermus属細菌内で分解作用を受け難く、その結果、これに組み込まれる外来遺伝子の発現量も従来のプラスミドに較べて多いことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の発現ベクターの１例であるpIM03の構築手順を説明する図である。
【図２】pMI03の制限酵素地図である。
【図３】Thermus thermophilus内における、本発明の発現ベクターの保持量と従来の発現ベクターの保持量とを比較した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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