(57)【要約】【課題】観測位置において励起光の正確な強度を検出し、励起光の強度の制御可能な蛍光顕微鏡を提供する。【解決手段】励起光を発生する光源１と、光源１と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器３と、励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系６と、励起光の照射により試料から発する蛍光を観測する観測系と、試料を観測位置から退避させた状態で観測位置にて励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、第１の光強度検出器の検出値と第２の光強度検出器の検出値を対応付けすることにより、第１の光強度検出器を使用して光源１の励起光強度を制御する。【選択図】図１
2005091701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、前記第１の光強度検出器から出力される検出信号の値と前記第２の光強度検出器から出力される検出信号の値を対応付けして、前記光源の励起光強度を制御することを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
前記光源がレーザであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項３】
前記第２の光強度検出器は、観測位置での励起光強度の絶対値を検出することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項４】
前記第２の光強度検出器の受光面の中心位置を試料の観測位置に合致させて、励起光強度の絶対値を検出することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項５】
前記第２の光強度検出器の受光面のエッジを観測系にて画像認識して前記受光面の中心位置を試料の観測位置に合致させて、励起光強度の絶対値を検出することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項６】
前記第２の光強度検出器は、試料を配置する試料ホルダー上に一体的に固定され励起光強度測定時、試料に替わって観測位置に配置されることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項７】
励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器と、前記第２の光強度検出器からの検出信号の値に基づいて前記光源の励起光強度の制御信号を生成し前記制御信号を前記第１の光強度検出器からの検出信号の値に対応付ける変換テーブルとを備えた蛍光顕微鏡。
【請求項８】
励起光強度を制御する制御信号は、変換テーブルより取得されることを特徴とする請求項７に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項９】
前記変換テーブルは、所定時間経過後、更新されることを特徴とする請求項８に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、
前記第１の光強度検出器からの検出信号の値と前記第２の光強度検出器からの検出信号の値を対応付けし、前記試料から発せられる蛍光を測定中は、前記第１の光強度検出器を用いて前記観測位置での励起光強度を制御することを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料中の蛍光体から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で前記観測位置にて前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器と、前記第２の光強度検出器からの検出信号の値に基づいて前記光源の励起光強度の制御信号を生成し前記制御信号を前記第１の光強度検出器からの検出信号の値に対応付ける変換テーブルと、前記変換テーブルを使用して制御される前記光源の励起により前記試料から発せられる蛍光の波長の選択を行うフィルタと、前記選択された波長の蛍光を観測する観測系とを備えた蛍光顕微鏡。
【請求項１２】
前記観測系は白黒ＣＣＤカメラを用いることを特徴とする請求項１１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１３】
前記試料の蛍光体の蛍光物質は、所定の粒子径を有するＣｄＳｅであり、その粒子径に対応した波長を有する蛍光を発することを特徴とする請求項１１に記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１４】
励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を、観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、
前記第１の光強度検出器からの検出信号の値と前記第２の光強度検出器からの検出信号の値を対応付けし、前記試料から発せられる蛍光を測定中は、前記第１の光強度検出器を用いて前記観測位置での励起光強度を制御し、前記蛍光の測定時以外で前記第２の光強度検出器の検出信号を用いて前記光源の観測位置での励起光強度の絶対値の較正をすることを特徴とする蛍光顕微鏡の光強度制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は励起光を照射した試料の蛍光像を観測及び検出する蛍光顕微鏡及び蛍光顕微鏡の励起光源制御方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡では、細胞の経時変化の現象を観測するために、励起光源を用いて指標となる蛍光体を発光させ、蛍光画像を連続的に観測したり、発光波長の異なる蛍光体を含んだ観測対象物の画像解析を行うために、複数の異なる波長域の観測用フィルターを通して一つの観測対象物を複数回撮影して、それらの画像からある一つのデータが分析される。  
【０００３】
その際、蛍光顕微鏡で観測した蛍光像から得られたデータの再現性および、一つの観測対象物の観測中および複数対象物におよぶ対象物の撮影中における撮影条件が条件設定どおり安定していることが重要になってくる。例えば蛍光体の発光を観測する場合、経時変化の観測中および一つの観測対象物の観測中および複数対象物におよぶ対象物の撮影中における励起光源の条件設定の値に対して、励起光が安定して調整できる必要がある。
【０００４】
従来は、このような励起光の条件設定および安定化の調整に、励起光から対物レンズまでの光路に光の強度測定するための光学系を設け、励起光の一部を光強度検出器に導いて、この強度検出器で検出した信号に基づいて光強度を調整していた。
【０００５】
また、観測対象試料を観測位置から退避させた状態で、当該観測位置を通過した励起光の強度を検出する強度検出装置の信号を用いて励起光の調整を行っていた（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１１−２５８５１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、励起光から対物レンズまでの光路に光の強度測定するための光学系を設け、励起光の一部が強度検出器に導かれるので、観測試料に照射される励起光の利用効率が悪くなっていた。また、対物レンズまでの光路で励起光の一部が検出器に導かれるため、試料面での強度の絶対値を導き出すことが難しかった。また、励起光から対物レンズまでの光路に光の強度測定するための光学系を設けるため、光路以降試料面までの間の光学系の変化や劣化を見積もることができなかった。さらに、試料を透過した励起光の強度を検出する方法では、透過側に検出器または光学系付の検出器を配置させなければならないため蛍光顕微鏡本体が大きくなるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、励起光の利用効率を高めて、観測位置において前記励起光の強度を検出し、高精度の強度測定および励起光の強度制御することを目的とする。また、試料の観測位置での励起光強度の絶対値の測定を可能にするとともに、励起光源から観測位置までの間の光学系の変化や劣化を考慮した励起光の強度を検出し、高精度の光強度測定をして最適な励起光強度を得ることを目的とする。
【０００８】
また、観測位置での励起光強度の測定を行う構成により、蛍光顕微鏡自体の小型化を実現することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明の蛍光顕微鏡は、励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を、観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、前記第１の光強度検出器から出力される検出信号の値と前記第２の光強度検出器から出力される検出信号の値を対応付けして、前記光源の励起光強度を制御することを特徴としたものである。
【００１０】
また、励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を、観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器と、前記第２の光強度検出器からの検出信号の値に対応する前記光源の励起光強度の制御信号を生成し前記制御信号を前記第１の光強度検出器からの検出信号の値に対応付ける変換テーブルとを備えたものである。
【００１１】
また、励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を、観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、
前記第１の光強度検出器からの検出信号の値と前記第２の光強度検出器からの検出信号の値を対応付けし、前記試料から発せられる蛍光を測定中は、前記第１の光強度検出器を用いて前記観測位置での励起光強度を制御することを特徴としたものである。
【００１２】
また、励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器と、前記第２の光強度検出器からの検出信号の値に対応する前記光源の励起光強度の制御信号を生成し前記制御信号を前記第１の光強度検出器からの検出信号の値に対応付ける変換テーブルと、前記変換テーブルより得られる制御信号に基づいて制御される前記励起光源の光強度を前記試料に照射して前記試料より発せられる蛍光の波長の選択を行うフィルタと、前記選択された波長の蛍光を観測する観測系とを備えたものである。
【００１３】
また、励起光を発生する光源と、前記光源と一体的に配置され、その励起光強度を測定する第１の光強度検出器と、前記光源からの励起光を、観測位置に配置した試料に照射する照明光学系と、前記励起光の照射により前記試料から発する蛍光を観測する観測系と、前記試料を観測位置から退避させた状態で、前記観測位置において前記励起光強度を測定する第２の光強度検出器とを備え、
前記第１の光強度検出器からの検出信号の値と前記第２の光強度検出器からの検出信号の値を対応付けし、前記試料から発せられる蛍光を測定中は、前記第１の光強度検出器を用いて前記観測位置での励起光強度を制御し、前記第２の光強度検出器の検出信号を用いて前記光源の観測位置での励起光強度の絶対値の較正をすることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡の励起光源制御方法によれば、励起光の利用効率を高めて、試料の観測位置において励起光の絶対強度を検出し、更に光源側に設けた強度検出器を用いて励起強度を測定して両者の強度測定値を利用して、励起光強度を高精度に制御することができる。
【００１５】
従って、励起光から試料面までの間の光学系の変化や劣化を考慮した前記励起光の強度を検出し、制御することができる。さらに、外部光検出器が小型となり蛍光顕微鏡装置を小さくすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明の蛍光顕微鏡装置と励起光源の制御方法について実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【実施例１】
【００１７】
図１は、本発明の第１の実施例における蛍光顕微鏡の構成図を示すものである。
【００１８】
図１において、励起光源１は発光体５および光を集光するための集光ミラー４と内部の光強度検出器３から構成されている。出射側と反対の方向に集光ミラーを透過する光２２を内部光強度検出器３に導びき、内部の光強度検出器３で検出することができる。励起光２は例えばレンズ７とファイバー８とで構成される照明光学系６に導かれ、ダイクロイックミラー９で反射し対物レンズ１０を通って試料１３に照射される。試料１３は試料ホルダー１４の中に固定され、観測位置２６に配置されている。試料ホルダー１４は、Ｘ−Ｙステージ１５によって移動する。光源側に設けられた内部光強度検出器３とは別に、試料１３の観測位置での励起強度を検出するために外部光強度検出器１６が設置され、その外部光強度検出器１６は移動することができる移動支持台１８の上に固定されている。試料１３から発した蛍光１１は対物レンズ１０を通り、ダイクロイックミラー９とエミッションフィルター２３を通って観測系１２に導かれる。観測系１２は、制御系１７により制御信号２１で光検出動作が制御されるが、観測系１２は、エミッションフィルター２３により観測波長を切り替えることにより、白黒ＣＣＤカメラを用いることができる。外部光強度検出器１６からの信号２４および内部光強度検出器３からの信号１９が制御系１７に取り込まれる。制御系１７は、外部光強度検出器１６と内部光強度検出器３により得られる検出信号２４、検出信号１９に基づき生成される制御信号２０によって励起光源１の光強度を制御することができる。
【００１９】
以上のように構成された蛍光顕微鏡装置について、以下その動作、作用を説明する。
【００２０】
まず、発光体５から発生された光が集光ミラー４によって集光された光は励起光２として出射される。発光体としては、紫外線ランプ、キセノンランプ、紫外線ＬＥＤなどを用いることができる。出射された励起光２は、照明光学系６を通る間の透過率やファイバー８とレンズ７のＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ａｐｅｒｔｕｒｅ：開口数）比で決められるカップリング効率のために減衰して、試料１３を観測する観測位置２６に照射される。集光ミラー４は極わずかな光が透過するようにできており、励起光２の出射側と反対の方向に透過する光２２が内部光強度検出器３に到達するため、励起光２の一部を妨げたり、影響を与えたりすることなく、照射中リアルタイムで、内部光強度検出器３を用いて励起光２および観測位置２６の強度に対応づけのできる相対強度を検出し、測定することができる。
【００２１】
試料１３の観測位置２６での励起光２の絶対強度の見積もりは、外部光強度検出器１６を用いる。すなわち、試料１３が固定されている試料ホルダー１４をＸ−Ｙステージ１５で移動させ、観測位置２６から退避させた後、外部光強度検出器１６が固定された移動支持台１８を観測位置２６まで動かして、観測位置２６での励起光２の強度を外部光強度検出器１６で検出し、測定することができる。例えば、外部光強度検出器１６はPD（Photo  Diode）、Phototransistorなどの小型の素子で構成されているので、検出器を小型に構成することができる。また、外部光強度検出器１６は、光強度の絶対値を検知する照度計を用いたり、照度計を用いて予め、外部光強度検出器１６の検出信号２４と光強度の絶対値を対応付けを行って、制御系１７内のメモリー（図示せず）に記憶させ、検出信号２４から観測位置２６での光強度の絶対値を知ることができる。
【００２２】
そして、検出信号２４に基づき励起光源１の制御信号を生成して、観測位置２６での光強度の絶対値を測定することができるので、内部光強度検出器３からの検出信号１９と対応付けることにより、観測位置２６での要求光強度を高精度で得ることができる。
【００２３】
図１、図４を用いて具体的方法を説明する。図４は試料１３および試料ホルダー１４、外部光強度検出器１６の断面図である。ここで、観測位置２６において試料１３を観測する面を観測面３５とする。試料１３は蛍光体３２および溶液３４で構成されている。蛍光体３２は、例えば半導体ナノ粒子や蛍光色素と検体細胞で構成される。蛍光体３２は、試料ホルダー１４の底板を形成しているカバーガラス３３に対して蛍光体３２と比重の異なる溶液３４を用いて沈められている。また、図４の下方側からカバーガラス３３を通して蛍光体３２に、ダイクロイックミラー９、対物レンズ１０を介して励起光２が照射される。そのため、蛍光体３２および溶液３４に照射される正味の光強度は、予めカバーガラス３３での減衰量を見積もっておくことで、観測面２６での絶対強度を算出することができる。カバーガラス３３は蛍光体３２に対しての底板部分で、試料ホルダー１４と一体化されており、通常、試料を作成するごとに新しい試料ホルダーが用いられるので、常に新しいカバーガラスを使用することとなり、カバーガラス３３の変化や劣化は起こらないと考えられる。
【００２４】
蛍光体３２を構成する蛍光粒子（図示せず）は、直径の異なるＣｄＳｅ（セレン化カドミウム）の粒子状の結晶で、直径が２ｎｍから１０ｎｍの大きさの粒子を用い、これらの粒子に励起光が照射されると、その粒子径に応じた波長の光を蛍光する。粒子径の異なる複数種類の蛍光粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ、以後、ＱＤと略す）を所定の比率で透明な樹脂製の球体に付着させて、特定の色を発光する標識用粒子（Ｑｕａｎｔｕｍ  ｂｅａｄ、以後ＱＢと略す）とし、そのＱＢに特定の検体細胞（例えば、特定の遺伝情報伝達物ｍＲＮＡ）と結びつく鍵穴を取り付け、特定の検体細胞と結合するようにする。そして蛍光体（即ち、ＱＢ）３２に励起光を照射し、ＱＢに付着しているＱＤを励起して特定の色を発光させ、その蛍光スペクトルをエミッションフィルター２３を切り替えて、即ち、観測波長を切り替えて観測することにより、観測系１２は、白黒ＣＣＤカメラを使用して蛍光を観測し波長分析をすることができる。
【００２５】
従って、蛍光体３２（即ち、ＱＢ）より発する蛍光の蛍光スペクトル分析を観測系１２において白黒ＣＣＤカメラを用いて観測するため、1試料につき、複数の蛍光画像データを取得する必要があり、画像データの取得中、光強度の安定した励起光源が必要となる。
【００２６】
一方、外部光検出器の受光素子３６は、図４の下方側に受光素子面３７を持ち、下方側からの励起光２を検出する。蛍光顕微鏡のフォーカスは、蛍光体３２に合うようなフォーカス位置３８となる。観測位置２６は、励起光２が照射されかつ、フォーカス位置３８である。そこで、観測位置２６での励起光２を外部光強度検出器１６で検出するために、観測位置２６から試料ホルダー１４を退避させた後、外部光強度検出器１６の受光素子面３７が観測位置２６と一致する位置に移動させ、検出を行う。
【００２７】
以上のように本実施例１においては内部光強度検出器３による励起光強度の相対強度の測定と外部光強度検出器１６を蛍光顕微鏡に備えることにより励起光２の利用効率を高めて、観測位置２６においての励起光２の絶対強度を検出し、蛍光スペクトルを測定分析する事ができる。
【００２８】
即ち、励起光２の強度を観測位置２６で直接的に外部光強度検出器１６で検出するため、励起光２が観測位置２６までに通過する光学系の透過率やカップリング効率による減衰や、光学系の変化や劣化を考慮した絶対強度を検出することができ、高精度で励起光強度を制御して、安定した励起光源を試料に照射することができる。
【００２９】
さらに、光源１から照明光学系６を介して試料１３を透過した励起光を測定することなく観測位置２６で直接的に小型の外部光強度検出器１６を用いる構成のため、蛍光顕微鏡自体を小さくすることができる。即ち、透過側に検出器や光学系を配置することがないため、小型化が図れる。
【００３０】
上記の蛍光顕微鏡の構成は、対物レンズを通して照明する落射照明法のみならず対物レンズを通さず例えば対物レンズと試料の間の空間に光ファイバーで励起光を導き、それ以外の光学系を介さないような直接照明にも適用できる。
【実施例２】
【００３１】
図２は、本発明の第２の実施例における蛍光顕微鏡の構成図を示すものである。
実施例１の構成を示す図１との相違点は、励起光源１のみで、他の構成は、同じである。
【００３２】
図２において、励起光源１は出射側レーザミラー３０とレーザミラー３１と内部の光強度検出器３から構成されている。出射側と反対の方向に透過する光２２を内部の光強度検出器３に導かれ、内部の光強度検出器３で検出することができる。励起光２はレンズ７とファイバー８とで構成される照明光学系６に導かれ、ダイクロイックミラー９で反射し対物レンズを通って試料１３に照射される。試料１３は試料ホルダー１４の中に固定され、観測位置２６に配置されている。試料ホルダー１４は、Ｘ−Ｙステージ１５によって移動する。外部光強度検出器１６は移動することができる移動支持台１７の上に固定されている。試料１３から発した蛍光１１は対物レンズ１０を通り、ダイクロイックミラー９とエミッションフィルター２３を通って観測系１２に導かれる。観測系１２は制御系１７により制御信号２１で制御される。外部光強度検出器１６の信号２４および内部の光強度検出器３の信号１９が制御系１７に取り込まれる。また制御系１７は、外部光強度検出器１６と内部光強度検出器３により得られる検出信号２４、検出信号１９に基づき生成される制御信号２０によって励起光源１の光強度を制御することができる。
【００３３】
以上のように構成された蛍光顕微鏡装置について、以下その動作、作用を説明する。
【００３４】
まず、励起光源１の出射側レーザミラー３０とレーザミラー３１間でポンピングされ出射した励起光２とレーザミラー３１を通して出射側と反対の方向に透過する光２２が内部光強度検出器３に導かれ、励起光２を妨げることなく、励起光源１から出射される励起光２の出射側と反対の方向に透過する光２２を参照した相対強度を内部光強度検出器３で検出し、測定することができる。レーザミラー３１を透過した光は指向性があり、コヒーレント光であるため、内部光検出器３を配置させる位置の調整が用意に行うことができる。
以下、実施例１と同様にして、励起光強度を高精度に制御することができる。
【実施例３】
【００３５】
図３は、本発明の第３の実施例における蛍光顕微鏡の構成図を示すものである。
【００３６】
図３において、励起光源１は発光体５および光を集光するためのミラー４と内部の光強度検出器３から構成されている。出射側と反対の方向に透過する光２２を内部光強度検出器３に導かれ、内部の光強度検出器３で検出することができる。励起光２は例えばレンズ７とファイバー８とで構成される照明光学系６に導かれ、ダイクロイックミラー９で反射し対物レンズを通って試料１３に照射される。試料１３は試料ホルダー１４の中に固定され、観測位置２６に配置されている。試料ホルダー１４は、Ｘ−Ｙステージ１５によって移動する。外部光強度検出器１６はＸ−Ｙステージ１５に固定されて一体化しており、Ｘ−Ｙステージ１５が所定の位置に移動するのと同時に外部光強度検出器１６がちょうど観測面２６に配置するようになっている。Ｘ−Ｙステージ１５は制御系１７により制御信号２１−１によって制御されている。試料１３から発した蛍光１１は対物レンズ１０を通り、ダイクロイックミラー９とエミッションフィルター２３を通って観測系１２に導かれる。観測系１２は制御系１７により制御信号２１で制御される。外部光強度検出器１６の信号２４および内部の光強度検出器３の信号１９が制御系１７に取り込まれる。また制御系１７は信号２０によって励起光源１を制御することができる。
【００３７】
実施例１と異なるところは、外部光強度検出器１６はＸ−Ｙステージ１５に固定されて一体化しており、Ｘ−Ｙステージ１５が所定の位置に移動するのと同時に外部光強度検出器１６がちょうど観測面２６に配置するようになっており、Ｘ−Ｙステージ１５の移動が制御系１７により制御信号２１−１によって制御されている点である。
【００３８】
以上のように構成された蛍光顕微鏡について、以下その動作、作用を説明する。
【００３９】
まず、励起光源１の出射側と反対の方向に透過する光２２が内部の光強度検出器３に導かれ、励起光２を妨げることなく、励起光源１から出射される励起光２の出射側と反対の方向に透過する光２２を参照した相対強度を内部光強度検出器３で検出し、測定することができる。また、試料１３を、固定している試料ホルダー１４を介して、Ｘ−Ｙステージ１５の移動によって、観測位置２６から退避させると同時に、外部光強度検出器１６を観測位置２６に導入させ、観測位置２６での励起光２の絶対強度を外部光強度検出器１６で検出し、測定することができる。Ｘ−Ｙステージ１５を用いた場合、外部光強度検出器１６の位置座標の情報をあらかじめ制御系１７に記憶させておけば、制御信号２１−１を用いて、自動で外部光強度検出器１６を観測位置２６に導入させることができる。
【００４０】
また、観測位置２６に外部光強度検出器１６を導入する方法として、他の方法を図５を用いて説明する。
【００４１】
図５は、図４における受光素子３７の励起光の照射方向から見た受光素子受光面３９を示す図である。受光素子３７は、例えば円形をしており、励起光２を照明光として受光素子３７を対物レンズ１０と例えばCCDカメラと画像処理装置を備えた観測系１２を用いて画像として認識することができる。そこで、受光素子３７のエッジを観測系１２で認識し、Ｘ−Ｙステージ１５を動かしながらその中心を見つけ、その中心を観測位置２６に配置することにより外部光強度検出器１６を観測位置に正確に導くことができる。
【００４２】
即ち、見つけた受光素子３７の中心位置を観測位置２６に合わせることによって、外部光強度検出器１６を正確に観測位置に設置することができる。受光素子３７の領域に対して、励起光２がカバーする領域が大きい時は、受光素子３７に励起光２の全光量の評価ができ、励起光２がカバーする領域が小さい時は、受光素子３７に励起光２の光密度的な評価ができる。全光量の評価、密度的な評価のいずれにおいても、照度計などを用いて受光素子３７の検出信号を校正し、観測位置２６での光強度の絶対値を求めることができる。
【００４３】
以上のように本実施例３において、内部光強度検出器３による励起光強度の相対強度の測定と外部光強度検出器１６を蛍光顕微鏡に備えることにより励起光２の利用効率を高めて、観測位置２６においての励起光２の絶対強度を検出し、蛍光スペクトルを測定分析する事ができる。更に、試料１３の退避手段と外部光強度検出器１６の導入手段が一体化になっているため、容易に、外部光強度検出器１６を観測位置に正確に導入して観測を行うことができる。
【００４４】
さらに、光源１から照明光学系６を介して試料１３を透過した励起光を測定することなく観測位置２６で直接的に小型の外部光強度検出器１６を用いる構成のため、蛍光顕微鏡自体を小さくすることができる。即ち、透過側に検出器や光学系を配置することがないため、小型化が図れる。
【実施例４】
【００４５】
図３を用いて、本発明の第４の実施例を説明する。
【００４６】
図３において、励起光源１は発光体５および光を集光するためのミラー４と内部の光強度検出器３から構成されている。出射側と反対の方向に透過する光２２を内部光強度検出器３に導かれ、内部光強度検出器３で検出することができる。励起光２は例えばレンズ７とファイバー８とで構成される照明光学系６に導かれ、ダイクロイックミラー９で反射し対物レンズを通って試料１３に照射される。試料１３は試料ホルダー１４の中に固定され、観測位置２６配置されている。試料ホルダー１４は、Ｘ−Ｙステージ１５によって移動する。外部光強度検出器１６はＸ−Ｙステージ１５に固定されて一体化しており、Ｘ−Ｙステージ１５が所定の位置に移動するのと同時に外部光強度検出器１６がちょうど観測面３５に配置するようになっている。試料１３から発した蛍光１１は対物レンズ１０を通り、ダイクロイックミラー９とエミッションフィルター２３を通って観測系１２に導かれる。内部光強度検出器３からの検出信号１９は制御系１７に取り込まれ、検出信号１９に基づいて生成される制御信号２０によって励起光源１の光強度を制御する。
【００４７】
また、外部光強度検出器１６からの検出信号２４は制御系１７に取り込まれ、検出信号２４に基づいて生成される制御信号２０によって励起光源１の光強度を制御する。
【００４８】
実施例１と異なる点は以下の点である。つまり、内部光強度検出器３からの検出信号１９は制御系１７に取り込まれ、制御信号２０によって励起光源１の光強度を制御し、又、外部光強度検出器１６からの検出信号２４は制御系１７に取り込まれ、制御信号２０によって励起光源１を制御するが、その際、検出信号２４と検出信号１９を制御信号２０を介して対応付けられた変換テーブルを作成し、適宜、所定時間経過時に、変換テーブルを更新して励起光源の光強度の校正を行う点である。変換テーブルの更新は、蛍光顕微鏡の電源ＯＮ時、或いは、試料プレート１４には数百個のセルが配置されておるが、その試料プレート１４の測定開始時に行い、励起光強度の校正を通じて、観測位置２６に正確な要求光強度を照射することができる。
【００４９】
以上のように構成された蛍光顕微鏡について、以下その動作、作用を説明する。
まず、外部光強度検出器１６を観測位置２６に配置させ、励起光源１を制御系１７から制御信号２０によって励起光２の強度を最小値から最大値まで変化させる。そのときの、外部光強度検出器１６が検出する検出信号２４とそれに対応した制御信号２０を制御系１７の外部出力テーブル値として記憶させておく。それと同時に内部光強度検出器３が検出する検出信号１９とそれに対応した制御信号２０を制御系１７に内部光強度検出器の内部出力テーブル値として記憶させておく。すなわち制御信号２０とそれぞれの検出信号との対応付けが行われる。
【００５０】
このとき、外部光強度検出器１６に、光強度の絶対値を検知する照度計を用いた場合、そのまま外部出力テーブル値を絶対値光強度テーブルとして制御系１７に記憶させ、フォトダイオードやフォトトランジスタなどの受光素子を用いた場合は、照度計を用いて、外部出力テーブル値を、外部光強度検出器１６の検出信号２４と光強度の絶対値の対応付けを行って、絶対値光強度テーブル値として制御系１７に記憶させ、検出信号２４から光強度の絶対値が分かるようにしておく。このときの外部光強度検出器１６の検出信号２４を用いた絶対値光強度テーブルが初期出力テーブルとなる。
【００５１】
つまり、検出信号２４と観測位置２６での絶対値光強度の対応表が絶対値光強度テーブル、即ち、初期出力テーブルである。
【００５２】
従って、外部光強度検出器１６の検出信号２４に対応して観測位置２６での光強度の絶対値を記憶しておき、内部光強度検出器３の検出信号１９と関連付けさせておくことにより、内部光強度検出器３からの検出信号１９から観測位置２６での光強度の絶対値を求めることができる。
【００５３】
次に、観測面３５において試料１３に照射したい光強度すなわち要求光強度を得るために、外部光検出器１６を観測位置２６に配置し、外部光強度検出器１６の検出信号２４が、前述した初期出力テーブルを参照して要求光強度が得られるまで、励起光源１の光出力を、制御系１７からの制御信号２０で変化させる。要求光強度が得られたときの内部光強度検出器３の出力信号１９の値（以後この値をＴ１９とする。）を制御系１７に記憶させておく。
【００５４】
次に、外部光出力検出器１６を退避させ、観測位置２６に試料１３を導入し、要求光強度を試料１３に照射するために、内部光強度検出器３からの検出信号１９がＴ１９の値になるように、制御系にて励起光源１の制御信号２０を制御する。この制御は、検出信号１９を制御系１７にフィードバックさせ一般的な手法であるＡＰＣ（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）回路を用いて励起光源１の光強度を制御することができる。照射中内部光強度の検出信号１９を参照しながら制御信号２０を制御する。そのため、照射中は、観測面３５に要求光強度の絶対値が精度良く照射されていることになる。要求光強度は必ずしも一定値をとらなくてもよく、時間的に変化するものであってもよい。その時は、Ｔ１９が時間とともに変化する時間の関数となる。
【００５５】
また、光源１および内部検出器３の劣化がなく変動しないと考えられる短期間の間は、上述した内部出力テーブルを用いて、外部光検出器１６の検出信号２４を参照せず、励起光源１の制御信号２０に検出信号１９をフィードバックさせることで、観測面３５において要求強度を得ることができる。
【００５６】
一方、蛍光顕微鏡の長期に渡る運用に伴って、照明系６や対物レンズ１０、ダイクロイックミラー９、内部光出力検出器３の経年的な変化や劣化に対応するために、外部光出力検出器１６を用いることができる。外部光検出器１６は、その他前記照明系６などの、他の光学系に比べると、外部光検出器１６に励起光２が照射される時間が極めて短いので、ほとんど劣化がないと考えてよい。
【００５７】
経年的な変化や劣化が起こった場合に、同じ要求光強度を得ようとした場合、もはや初期に励起光源１を制御していた制御信号２０の値では、途中の光学系の劣化によって同じ要求光強度を得ることができない。
【００５８】
この場合、外部光出力検出器１６を観測面３５に配置させ、励起光源１を制御系１７から制御信号２０によって励起光２の強度を最小値から最大値まで変化させる。そのときの、外部光強度検出器１６が検出する検出信号２４から、内部光強度検出器３において、劣化した信号１９と制御信号２０の新たな内部強度テーブルを制御系１７に記憶させる。すなわち、検出信号２４と信号１９を新たに対応づける。この後は、新たな内部強度テーブルを内部強度テーブルとし、前述の短期間用の観測面３５におけると同様な要求強度を精度よく実現して制御することができる。
【００５９】
上述したように、励起光の強度を検出信号２４、検出信号１９に対応付けたテーブルを検出信号を光強度に変換する変換テーブルとして制御系１７の中に記憶しておくことにより、検出信号１９より観測面３５にて所定の要求光強度を得ることができる。
【００６０】
以上のように本実施例４においては内部光強度検出器３と外部光強度検出器１６を蛍光顕微鏡に備えることにより励起光２の利用効率を高めて、観測面３５において前記励起光２の絶対強度を外部光強度検出器１６で検出し、励起光源１を制御系１７によって調整することができる。さらに、試料１３の退避手段と外部光強度検出器１６の導入手段が一体化になっているため、容易に外部光強度検出器１６を用いた観測を行うことができる。
また、観測位置２６での前記励起光２の絶対値強度調整が可能である。
また、励起光２から観測面３５までの間の光学系の変化や劣化を考慮した前記励起光２の強度を検出し、測定することができる。
さらに、外部光強度検出器１６が小型であるため、蛍光顕微鏡自体を小さくすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明にかかる、蛍光顕微鏡および蛍光顕微鏡の励起光源制御方法は、照射光の光量調整を短期間および長期にわたって精度よく行えるため、試料に要求強度の光強度の照射を行う光学装置の光量の調整および制御に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施例１における蛍光顕微鏡の構成を説明するための図
【図２】本発明の実施例２における蛍光顕微鏡の構成を説明するための図
【図３】本発明の実施例３、実施例４における蛍光顕微鏡の構成を説明するための図
【図４】試料ホルダーとの外部光検出器の断面図
【図５】外部光検出器の受光素子の受光面における励起光の受光状態を模式的に示す図
【図６】従来の蛍光顕微鏡の構成を説明するための図
【符号の説明】
【００６３】
１  励起光源
２  励起光
３  内部光検出器
４  集光ミラー
５  発光体
６  照明光学系
７  レンズ
８  ファイバー
９  ダイクロイックミラー
１０  対物レンズ
１１  蛍光
１２  観測系
１３  試料
１４  試料ホルダー
１５  Ｘ−Ｙステージ
１６  外部光検出器
１７  制御系
１８  支持台
１９、２４  検出信号
２０、２１、２１−１  制御信号
２２  透過光
２３  エミッションフィルター
２６  観測位置
３０  出射側レーザミラー
３１  レーザミラー
３２  蛍光体
３３  カバーガラス
３４  溶液
３５  観測面
３６  外部光検出器の受光素子
３７  受光素子面
３８  フォーカス位置
３９  受光素子受光面
４０  励起光
４１  レーザ光源
４２  波長選択フィルタ
４３  ビームスプリッタ
４４  走査光学系
４５  対物レンズ
４６  試料本体
４７  ピント面
４８  スライドグラス
４９  顕微鏡ステージ
５０  集光レンズ
５１  ピンホール
５２、５９  検出器
５３  コンデンサレンズ
５５  ハーフミラー
５６  制御装置
５７  サンプル
５８  励起光
６０  通過光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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