(57)【要約】【課題】連続的にエネルギーが供給される無細胞タンパク質合成系において、高い効率でもってタンパク質を合成する方法を提供する。【解決手段】連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、小胞体成分を中心とする画分の共存下で合成反応を行うことを特徴とする、タンパク質合成方法。この中でも、無細胞タンパク合成方法が、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液との少なくとも二種類の溶液から構成されるタンパク質合成方法であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、小胞体成分を中心とする画分の共存下で合成反応を行うことを特徴とする、タンパク質合成方法。
【請求項２】
該無細胞タンパク合成方法が、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液との少なくとも二種類の溶液から構成される、請求項１に記載のタンパク質合成方法。
【請求項３】
請求項２に記載の少なくとも二種類の溶液から構成される無細胞タンパク質合成方法において、第一の溶液が無細胞タンパク合成に使用する要素をすべて含み、この溶液を反応容器中の下部に持つ構成で、その上部にエネルギー源となる物質を含んだ第二の溶液を、第一の溶液と混合しないように重層し、第一および第二の溶液が徐々に拡散していくことでタンパク質合成が進行していくことを特徴とする、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
請求項２に記載の該無細胞タンパク合成方法が、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液の間に、エネルギー物質は透過させるが、それ以外の構成要素は透過させないような半透膜構造をもった膜を存在させることからなる、タンパク質合成方法。
【請求項５】
該小胞体成分を中心とする画分が、ミクロソーム画分を中心とする画分である、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
【請求項６】
該細胞中のミクロソーム画分が、動物の細胞由来である、請求項５に記載のタンパク質合成方法。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞中のミクロソーム画分が、動物の膵臓由来であることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項８】
請求項６に記載の細胞中のミクロソーム画分が、動物の肝臓由来であることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項９】
請求項６に記載の細胞中のミクロソーム画分が、動物の卵管由来であることを特徴とするタンパク質合成方法。
【請求項１０】
該細胞中のミクロソーム画分が、酵母由来である、請求項５に記載のタンパク質合成方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の、小胞体成分を中心とする画分の共存下で実施される、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、該無細胞合成系が植物種子由来の抽出物を含むことを特徴とする、タンパク質合成方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の、小胞体成分を中心とする画分の共存下で実施される、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、該無細胞合成系が哺乳類の網状赤血球由来の抽出物を含むことを特徴とする、タンパク質合成方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の、小胞体成分を中心とする画分の共存下で実施される、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、該無細胞合成系が大腸菌由来の抽出物を含むことを特徴とする、タンパク質合成方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の、小胞体成分を中心とする画分の共存下で実施される、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、該無細胞合成系が酵母由来の抽出物を含むことを特徴とする、タンパク質合成方法。
【請求項１５】
上記請求項１〜１３を実施するために必要な試薬類等を含むことを特徴とする、無細胞タンパク質合成用の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞合成系を使用してタンパク質を合成する方法に関する。より詳細には、細胞中の小胞体成分を中心とする画分を共存させることによってタンパク質の合成を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子工学や分子生物学等の分野の進歩により、所望する遺伝子の産物であるタンパク質を発現させ、その生化学的ならびに構造生物学的な性質を解析することが比較的容易となってきた。特にその遺伝子配列が判明しているタンパク質においては、そのＤＮＡ配列を適当な発現ベクター上にクローン化し、例えば大腸菌のような発現・生産系を利用することによって、必要なタンパク質を得ることが可能である。このほか、大腸菌や他の生物による合成に加えて、近年の細胞工学的アプローチにより、種々の培養細胞を用いてもタンパク質合成が可能になってきている。
【０００３】
ただし、このような生細胞を用いたタンパク質合成系においては、比較的生産されにくいタンパク質が存在する。例えば、それ自身が合成されることでその細胞に対して成育を阻害するような物質、特に毒性を示すようなタンパク質については、発現させてそれを回収することはきわめて困難である。この他、毒性は示さずともＤＮＡ複製や組換えに関わるタンパク質のような細胞が分裂する際に重要な役割を果たすタンパク質等についても同様に発現が容易でない。
【０００４】
このような問題点を克服するために考案されたのが、いわゆる無細胞タンパク質合成システムである。これは、生細胞の代わりに、種々の細胞系の破砕物を準備し、基質やエネルギー源等を必要に応じて添加することで、細胞の成育とは無関係にタンパク質を合成・発現させる技術である。そのため技術的にほぼあらゆる種類のタンパク質を合成することが可能で、その応用範囲はきわめて広い。現在無細胞タンパク合成系として知られているものは、大腸菌の細胞破砕物、哺乳類の網状赤血球の抽出物それに、植物種子のエキストラクト等である。これらを用いることで、無細胞系においてタンパクの合成が可能である。
【０００５】
このように、生細胞を使用する方法よりも応用範囲の広い無細胞タンパク質合成系であるが、ある種のタンパク質の合成については十分な合成量を示さないか、あるいは得られたタンパク質が本来の活性を保持していないケースがある。そのうちの一つに、生体膜上または生体膜内に存在する、いわゆる膜系タンパク質がある。無細胞合成系において膜系タンパク質は、そのアミノ酸配列を一次構造的に合成できるものは存在するが、多くのものが、その二次構造あるいはそれ以上の高次構造を正確に形成できず、不溶性になったり活性を示さない形となる。これを克服するためには、正確な高次構造を形成できるような「場」が必要となると考えられている。この「場」となるものとしては、人為的に合成した脂質二重膜や生体からとった臓器等由来の膜成分などが使用可能と考えられている。ただしこの場合でも、通常これらの成分を無細胞系に単に加えるだけでは、その合成機構を阻害するケースも多く、容易に実施できないという問題があった。すなわち、添加する膜構造体と無細胞系との共役が必要で、再現性よく高い効率で合成・発現させることは容易ではなかった。
【０００６】
これを解決するために動物由来のミクロソームの調製法が考えられ（例えば非特許文献１）、イヌ由来ミクロソームとウサギ網状赤血球由来の無細胞タンパク質合成系の共役ならびに、イヌ由来ミクロソームと小麦胚芽由来の無細胞タンパク質合成系が考案された。これらの技術を使用し、通常バッチ法と呼ばれる各構成要素を一液として混合する方法に対して、そこへミクロソームを加えることで、膜系タンパク質の合成が可能になった。ただしこのバッチ法では、合成反応中に必要となる、タンパク質の材料となるアミノ酸や、エネルギー源として働くＡＴＰやＧＴＰ等の低分子成分がおよそ２〜３時間程度で枯渇することから、タンパク質合成を連続的に持続させることが難しく、その収率も非常に低い量が回収されるにすぎず、生産物の解析検討は極めて困難であった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３年，  第９６巻，  第８４−９３頁
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、連続的にエネルギーが供給される無細胞タンパク質合成系において、小胞体成分を中心とする画分を共存させることにより、高い効率でもってタンパク質を合成する方法を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、所望のタンパク質を合成する際、小胞体成分を中心とする画分を反応系中に共存させる無細胞合成系において、連続的にエネルギ−を供給されるタンパク質合成系を使用することが有効であることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち本発明は、小胞体成分を中心とする画分を共存させた無細胞タンパク質合成系において、連続的にエネルギー源を供給することによってその合成効率を高めることを特徴とする、タンパク質合成方法である。
【００１０】
本発明の連続的にエネルギーが供給される無細胞タンパク質合成方法においては、その方法が、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液との少なくとも二種類の溶液から構成される、いわゆる拡散重層法（以下重層法）を使用することができる（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００２，  Ｖｏｌ．５１４，  １０２−１０５）。
また、他の連続的にエネルギーが供給される無細胞タンパク合成方法には、合成用の溶液とエネルギーを供給するための溶液の間に、エネルギー物質は透過させるが、それ以外の構成要素は透過させないような半透膜構造をもった膜を存在させることからなる、透析法というタンパク質合成方法を利用することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  Ｖｏｌ．２４２，  １１６２−１１６４）。
【００１１】
本発明の小胞体成分を中心とする画分は、ミクロソーム画分を中心とする画分であることが好ましい。この場合、該細胞中のミクロソーム画分が、動物の細胞由来であることが好ましい。またこの場合、該細胞中のミクロソーム画分を取り出すための動物の細胞が、膵臓、肝臓、卵管等から選択される臓器由来のものであることがより好ましい。この他、酵母由来のミクロソーム画分を、本発明の小胞体成分として用いることも可能である。これに加えて、細胞中の小器官であるミクロボディー画分を使用することもできる。細胞由来のミクロボディー画分である、ペルオキシソームやグリオキシソーム等の器官を、同様の目的に使用することが可能であると考えられる。
【００１２】
本発明の、小胞体成分を中心とする画分を反応系中に共存させ、連続的にエネルギ−を供給される無細胞タンパク質合成系において、植物種子由来の抽出物を使用することが好ましい。または、該無細胞合成系において、哺乳類の網状赤血球由来の抽出物を使用することもできる。あるいは、該無細胞合成系において、大腸菌由来の抽出物を使用することも可能である。この他、該無細胞合成系において、酵母由来の抽出物をタンパク質合成に使用することも可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に本発明において使用する言葉を定義し、その内容について説明する。
本発明は、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク質合成方法において、小胞体成分を中心とする画分の共存下で合成反応を行うことを特徴とする、タンパク質合成方法である。
小胞体とは、真核細胞の細胞質内に網目状に広がる膜系で、扁平な袋状構造が重層して連続した構造をもつ。特にその表面にリボソームが多数結合した粗面小胞体は、タンパク質合成の主役である。またミクロソームとは、組織のホモジネートから、遠心および超遠心分離することで沈殿として回収できる画分で、小胞体が細胞の破砕によってちぎれてできたものが主成分である。
【００１４】
無細胞タンパク質合成方法においては、一般的に合成しようとするタンパク質の遺伝子の配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡと、タンパク合成のためのコンポーネントである細胞由来の抽出物、それに各種類のアミノ酸やＡＴＰおよびＧＴＰ等のエネルギー源を加えて実施される。細胞由来の抽出物としては、植物種子由来の抽出物を使用することができ、好ましくは、この抽出物は新鮮な小麦胚芽を用いて調製することが可能である。この技術に関してはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ３８−５０、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＵＳＡ，  ２０００，  Ｖｏｌ．９７，
５５９−５６４等を参考とすることが出来る。
【００１５】
また、哺乳類の網状赤血球由来の抽出物を使用することもできる。この抽出物は哺乳類の類の血液、好ましくはウサギの血液を採取し、これを用いて調製することが可能である。この技術に関してはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９７６，  Ｖｏｌ．６７，  ２４７−２５６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ５０−７４等を参考にすることが出来る。
【００１６】
あるいは、該無細胞合成系において、大腸菌由来の抽出物を使用することも可能である。この抽出物は、大腸菌Ｋ００２株より調製することができる。この技術に関しては蛋白質核酸酵素，  １９９２，  Ｖｏｌ．３７，  ６８−７４等を参考とすることが出来る。
【００１７】
この他、該無細胞合成系において、酵母由来の抽出物を使用することもできる。この抽出物は、酵母を培養した溶液を用いて調製することが可能である。この記述に関してはＹｅａｓｔ，  １９８６，  Ｖｏｌ．２，  ３５−５２、蛋白質核酸酵素，  １９９１，  Ｖｏｌ．３６，  ２５４８−２５５４等を参考とすることが出来る。
【００１８】
これらの抽出物を用いて無細胞タンパク質合成を実施する際に、普通は合成用抽出物に加えて各種アミノ酸、エネルギー源等の構成要素を一度に混合し、反応を開始させる。しかし、この方法では反応が進むにつれてエネルギー物質等が不足していき、反応系にもよるが通常２〜３時間でタンパク質合成反応はプラトーに達し、それ以上の合成は停止してしまう。
【００１９】
このエネルギーが枯渇する問題を避けるため、反応を進めるのに必要なコンポーネントとエネルギーを含む溶液とをあらかじめ二層に分けた形で反応させ、その界面付近から徐々に反応を進める、前記した「重層法」が考案された。この方法を用いることで、エネルギー物質の枯渇により数時間程度でプラトーに達していた反応が十数時間以上継続可能になり、大幅な収量の増加が達成された。反応の中核を成す無細胞タンパク質合成用抽出物を同じ量使用した場合に、数倍以上高い回収量を達成することができる。
【００２０】
また別の方法として、前記したようにタンパク質合成用の反応系とエネルギー源を含む溶液とを半透膜のような仕切りで隔絶し、合成に伴ってエネルギー源等を供給していく「透析法」を利用することもできる。この方法は、半透膜を装着したキュベットのようなインスツルメントが必要となるものの、スケールアップについても容易に可能で、非常に高い収量が期待される。この方法によっても、合成するタンパク質の性質にもよるが、小胞体成分を中心とする画分を存在させることで高い回収量の実現が期待できる。
本発明ではこれらのいずれの方法も使用することができる。
【００２１】
すなわち本発明は、連続的にエネルギーを供給される構成の無細胞タンパク合成方法において、小胞体成分を中心とする画分を共存させることでその合成効率を高める方法であり、そのエネルギー源としては各種アミノ酸やＡＴＰ等の物質があげられる。また、その小胞体成分は、ミクロソーム画分であることが望ましい。このミクロソーム画分は動物の臓器等から回収することが可能で、特に膵臓（蛋白質核酸酵素，１９９２，Ｖｏｌ．３７，  １５１−１５６等参照）、肝臓（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  １９８８，  Ｖｏｌ．１５６，  ９６４−９６９等参照）、卵管（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９９，  Ｖｏｌ．２７４，  ２５６７５−２５６８１等参照）等から抽出し、用いることができる。また酵母の細胞からも抽出して利用することが可能である（Ｙｅａｓｔ，  １９８６，  Ｖｏｌ．２，  ３５−５２、蛋白質核酸酵素，  １９９１，  Ｖｏｌ．３６，  ２５４８−２５５４等参照）。
【００２２】
この他、細胞内器官である、ミクロボディー画分を使用することもできる。ペルオキシソームやグリオキシソームのようなミクロボディー画分を、膜構造上に存在するタンパク質の合成等に用いることができ（蛋白質核酸酵素、１９９２、Ｖｏｌ．３７、７５９−７６３等参照）、ミクロソームと同様の効果を持つことが予測される。
【００２３】
このようにして構築した無細胞タンパク質合成系は、あらゆる種類のタンパク質を合成できる可能性を持つが、特に通常のタンパク質合成系で発現が困難な細胞膜中に存在するタンパク質、特に細胞膜を貫通すると予測されるアミノ酸配列を含んだ、いわゆる膜タンパク質の活性型での発現に効果を発揮する。一般的に無細胞合成系で単に膜タンパク質を合成すると、アミノ酸配列通りの一次構造を合成することは可能であるが、活性を発現するために必要な二次構造等の複雑な構造を形成することは極めて困難である。しかし、小胞体画分、特にミクロソーム画分を共存させることにより、二次構造の形成を可能にし、活性のある形での合成を実現できる。
また、単に無細胞系でタンパク合成を実施した場合には、本来糖鎖を持つタンパク質であっても糖鎖が付加されないケースが大部分であるが、ミクロソーム画分を無細胞合成系に加えることで、タンパク質合成の際に糖鎖を付加することができ、より生体内で機能しているタンパク質と近い構造で発現させることが可能であり、この技術に関してはＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００１，  Ｖｏｌ．５０７，  ３４１−３４５等を参考とすることが出来る。この糖鎖が付加されるという性質は、合成されたタンパク質の分子量を増大させ、これによってタンパク質が活性型で合成されたか否かの判断をアシストすることができる。特に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような電気泳動的な検出法により、それは達成できる。
【００２４】
この他、通常無細胞合成系では困難なジスルフィド結合の形成についても、ミクロソーム画分のもつ折り畳み構造の形成能によって、その構造形成が可能になるタンパク質も存在する。加えて、合成された後細胞外へ輸送されるいわゆる分泌型タンパク質においても、小胞体膜中に入った後その小胞体の持つシグナルペプチドの切断等の作用により、成熟型のタンパク質へと変換され、その機能を発現し得ることが容易に想像できる。
【００２５】
以上のことより、本発明における構成要素としては、以下のようなタンパク質合成系を有するものが好ましい。
（１）無細胞タンパク質合成系は、連続的にエネルギー物質を供給される構成でなる。
（２）無細胞合成系中に小胞体成分を中心とする画分を共存させる。
（３）連続的にエネルギー物質を供給される無細胞合成系は、その比重が異なる二種類の溶液から構成され、その二種類の溶液が界面を介して接触し重層され、該界面から拡散し合うことで、徐々にその成分を交換しタンパク質を合成する反応系であることを特徴とする。
（４）または該連続的にエネルギー物質を供給される無細胞合成系は、二種類の溶液から構成され、一方が他方に対してエネルギー物質は透過させるがそれ以外の構成要素は透過させないような半透膜構造をもった膜を構成要素として持つ、タンパク質合成系であることを特徴とする。
（５）小胞体成分を中心とする画分はミクロソーム画分を中心とする画分であることを特徴とする。
（６）ミクロソーム画分が動物の臓器由来であることを特徴とする。特に、動物の膵臓、肝臓、卵管等に由来するものであればより望ましい。
（７）またはミクロソーム画分が酵母の細胞由来であっても良い。
【００２６】
本発明では、このような無細胞合成系と小胞体成分とを用いてタンパク質の合成を行い、活性を持った形で発現させるものである。本発明の無細胞タンパク質合成方法は具体的には下記の工程を含む。
（ａ）小麦胚芽抽出液、ＡＴＰ等のエネルギー物質、クレアチンキナーゼそしてＲＮＡの分解を防ぐためのＲＮａｓｅインヒビターを準備する工程、
（ｂ）合成させようとするタンパク質のｍＲＮＡを調製し、上記（ａ）の無細胞合成系に供する工程、
（ｃ）小胞体成分を中心とする画分を添加する工程、
（ｄ）そして連続的にエネルギーを供給される反応系において一晩ないしはそれ以上の時間タンパク質の合成を行う工程。
【００２７】
ここでエネルギー物質とはＡＴＰやＧＴＰに代表されるものが使用できる。またクレアチンキナーゼやＲＮａｓｅインヒビターは市販のものを使用することができる。またｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）は、合成を所望するタンパク質の遺伝子を含んでなり、そのコード配列（いわゆるオープンリーディングフレーム）およびリボゾーム結合部位等を含んでなる。反応系中にＲＮａｓｅが混入しないことが好ましく、さらにＲＮａｓｅインヒビターを添加することで、分解を防ぐことができる。
【００２８】
本発明の（ａ）工程では、小麦胚芽抽出液、エネルギー物質、クレアチンキナーゼそしてＲＮａｓｅインヒビターを混合する。混合は氷上等の低温化で行い、失活を防ぐように注意する必要がある。
【００２９】
（ｂ）工程では、例えばプロモーター配列を持ったプラスミドのプロモーター配列の直後に所望の遺伝子配列を配置し、このプラスミドとＲＮＡポリメラーゼとを混合し反応させることで、ｍＲＮＡを取得することができる。また必要であれば、得られたｍＲＮＡを精製し、タンパク質合成に用いる。
【００３０】
（ｃ）工程においては、用意された小胞体成分を無細胞タンパク質合成反応液に加えることができる。添加する量は任意であるが、好ましくは、反応系の容量の３〜３０％程度が望ましい。さらに好ましくは、５〜２０％程度添加するのが良い。添加量が少なすぎるとタンパク質合成を向上させる効果が見られず、また多すぎる場合には反応系の進行に影響を与える可能性が考えられる。
【００３１】
そして（ｄ）工程では、（ａ）〜（ｃ）工程で混合した反応液を静置して、タンパク質合成反応を促進させる。例えば２６℃で一晩程度おくことで目的のタンパク質を得ることができる。ここで一晩とは、約１２〜１８時間と考えられることが多いが、４〜３５時間、好ましくは６〜３０時間程度が望ましい。ただし、合成するタンパク質の種類により異なると考えられる。
【００３２】
一般的にミクロソーム画分等の小胞体を中心とする画分は、温度上昇に対して不安定で、常温で長時間保存することは難しいと考えられてきた。例えばミクロソーム画分では、通常−８０℃で保存することが強く推奨され、−２０℃の環境でも失活してしまう危険があることが、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３等で紹介されている。従来、特開２００２−０２２７３８号公報で示されているように、冷凍庫から取り出しインキュベートを開始した後は、約１時間程度で活性が低下する傾向にあると報告され、そのため常温やそれに近い反応温度の条件下で長時間静置することは考えられず、本発明のように常温に近い環境で一晩という長時間おくことは、その機能を維持することが困難であると考えられていた。
【００３３】
しかし今回、本発明者らの検討によって、無細胞タンパク合成系、特に連続的にエネルギーを供給できる無細胞タンパク質合成系にこれらを添加する条件においては、これまでに考えられていた約１〜２時間程度という保持時間よりも相当長い時間機能し続けることがわかった。このことによって、より長い時間その機能を発揮させ続けるためには、これまで一定の時間例えば２〜３時間ごとに、小胞体を中心とする画分を添加する必要があると考えられていたが、その必要がなくなり、反応の初期の段階で添加するのみで反応終了まで追加添加することなくタンパク合成反応を完了させることができ、産業的にも応用範囲が広くなった。
【００３４】
本発明の小胞体を中心とする画分は、由来となった臓器等をよく均質化し、数回遠心分離を繰り返すことで溶液中の細胞残渣を取り除き、そしてその上清画分に対し高速度で超遠心分離を行うことによって沈澱として回収できる（この方法に関してはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９８３，  Ｖｏｌ．９６，  ８４−９３等参照できる）。例えば上記ミクロソーム画分の場合には、均質化した溶液を約１０，０００×ｇで遠心分離しその上清を集め、次に１４０，０００×ｇで超遠心分離し得られた沈澱を集めることが望ましい。
【００３５】
ここでｇの値は、遠心分離時の回転半径と、回転数の２乗とに比例する数値で、一般的にはほぼ以下のような数式で計算される。
ｇ  ＝  １．１２×ｈ×ｒ２×１０−６    −−−  式１
（ここで、ｈは回転半径で単位ｍｍ、ｒは回転数）
仮に回転半径が１００ｍｍの遠心ローターを使用した場合、式１より１０，０００×ｇは約９，５００回転、１４０，０００×ｇは約３５，０００回転となる。回転半径が異なれば必要な回転数も異なる。そして遠心分離を行う時間は、得ようとする物質の沈降定数等に依存することが多く、その都度設定する必要がある。
【００３６】
この超遠心分離した沈澱を適当な緩衝液に懸濁し、必要であればホモジナイズすることにより、小胞体画分として回収することが可能となる。
【００３７】
このようにして準備した小胞体を中心とする画分がその活性を保持しているか否かについては、実際にタンパク質を合成し確認することが望ましい。その方法の一つとして、シナプトタグミン−２というタンパク質を合成し、その移動度を検出する方法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００１，  Ｖｏｌ．５０７，  ３４１−３４５、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０００，Ｖｏｌ．１５０，  ７１９−７２９等参照）が好適である。このタンパク質は主に脳や内分泌細胞中に存在し、カルシウムイオン依存性の神経伝達物質の放出機構に関わっていると考えられるもので、その分子内部に糖鎖の付加を受ける部位を持っている。活性のある小胞体画分を無細胞系に共存させ、このシナプトタグミン−２タンパク質を合成し、その得られた生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、糖鎖付加の有無を確認できる。ここで合成されたタンパク質が活性を持った形で発現していれば、本来のバンドの他に移動度が増加したバンドが観察される。このバンドは糖鎖が付加しているため相対的に分子量が増大しており、ゲルの上から下へ向けて電気泳動した場合に見かけ上オリジナルのバンドの上側に現れ、そのバンドが下側のバンドに対し濃いほど、活性のあるタンパク質がより多く生成していると予想される。従って、これらのバンドを視覚化し数値化して、上側のバンドの相対的な量を調べることで、活性のあるタンパク質が効率よく合成されているか否かを判断することができる。
【００３８】
タンパク質合成反応においては、反応温度は反応が行われる限り特に制限はなく、無細胞タンパク合成を実行させる細胞由来の抽出物等に合わせた温度で行われるが、通常は５〜６０℃で行われることが好ましい。さらには１０℃以上、特には２０℃以上であり、上限は５０℃以下がより好ましく、特には４０℃以下が好ましい。
反応時間は、２〜４０時間程度が好ましく、４時間以上、さらには６時間以上であることが望ましく、また、３５時間以下がより望ましく、特には３０時間以下が望ましい。
【００３９】
さらに、本発明は無細胞タンパク質合成用のキットである。キットとしては、、無細胞タンパク合成を実行させる細胞由来の抽出物、小胞体成分を中心とする画分が含まれている必要があり、さらには、エネルギー物質、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅインヒビター等が含まれていても良い。
【００４０】
【実施例】
以下に本発明の実施例をあげることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：小胞体成分の抽出
小胞体成分は、イヌの膵臓より抽出した。その操作について以下に示す。
（１）イヌから摘出した膵臓を氷冷したＢｕｆｆｅｒ−Ａ（５０ｍＭ−トリエタノールアミン，ｐＨ７．５、５０ｍＭ−酢酸カリウム、６ｍＭ−酢酸マグネシウム、１ｍＭ−エチレンジアミン四酢酸、１ｍＭ−ジチオスレイトール、０．５ｍＭ−フェニルメタンスルホニルフルオリド、０．２５Ｍ−ショ糖）で洗浄し、重量を測定した後細かく切断した。
【００４２】
（２）膵臓の重量に対して四倍量のｂｕｆｆｅｒ−Ａを加えてよくホモジナイズした。この溶液を、  約１，０００×ｇで１０分間遠心分離し上清を集めた。この上清を約１０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離し、同様に上清を集めた。
【００４３】
（３）この上清溶液を遠心管に入れ、１／３容量のＢｕｆｆｅｒ−Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ−Ａの組成でショ糖濃度だけを１．３Ｍとしたもの）を遠心管の底に静かに重層し、１４０，０００×ｇで２．５時間遠心分離した。
【００４４】
（４）沈澱物を集め、上記（２）の膵臓の重量と等量のｂｕｆｆｅｒ−Ｃ（５０ｍＭ−トリエタノールアミン，ｐＨ７．５、１ｍＭ−ジチオスレイトール、０．２５Ｍ−ショ糖）に懸濁し、よくホモジナイズした。この溶液を、小胞体画分としてタンパク質合成に使用した。
【００４５】
実施例２：無細胞系でのタンパク質合成（重層法）
小麦胚芽無細胞タンパク質合成系において、重層法を利用してマウスのシナプトタグミン−２（以下ＳＹＴ２）タンパク質の合成を行った。
このタンパク質をコードする遺伝子（コード配列の長さは１，２６９塩基対）の配列を、タンパク質発現用ベクターであるｐＥＵ３−ＮＩＩプラスミドののＥｃｏＲＶ部位とＢａｍＨＩ部位の間に入れ、発現可能な組換えプラスミドｐＳＹＴ−９Ｅを構築した。次にこのプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ｐＳＹＴ−９Ｅを保持した大腸菌を得、これを３７℃で培養しそのプラスミド溶液を抽出、精製した。取得した精製プラスミドに対してＲＮＡポリメラーゼを作用させ、ＳＹＴ２遺伝子を含むｍＲＮＡを回収した。このｍＲＮＡと小麦胚芽由来の抽出物を使用した無細胞タンパク質合成試薬キット「Ｐｒｏｔｅｉｏｓ」（和研薬、東洋紡製）それに、ＲＮａｓｅインヒビター等を含んだ溶液を混合して調製し、２５μｌとって９６穴マイクロプレートに分注した。次に、ＡＴＰ等のエネルギー成分や各種アミノ酸等を含む画分１２５μｌを同じマイクロプレートのウェルに静かに分注（重層）し（最終液量１５０μｌ）、２６℃で一晩（約１６時間）静置した。
【００４６】
比較例１：バッチ法による無細胞タンパク質合成
実施例２の重層法によるタンパク質合成結果と比較するため、バッチ法を用いたマウスのＳＹＴ２タンパク質を合成した。
ＳＹＴ２遺伝子のオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡを回収する工程までは実施例２と同様にして行い、このｍＲＮＡ溶液を以下の反応に用いた。このｍＲＮＡと小麦胚芽由来の抽出物を使用した無細胞タンパク質合成試薬キット「Ｐｒｏｔｅｉｏｓ」（和研薬、東洋紡製）それに、ＲＮａｓｅインヒビター等を含んだ溶液を混合して調製し、エッペンドルフチューブに２５μｌずつ分注し、２６℃で３時間反応させた。その他の反応条件等は、特に述べない限りキットに添付の取扱説明書に準じた。
【００４７】
実施例３：合成されたＳＹＴ２タンパク質の検出
合成されたタンパク質溶液を１０μｌ取り、１０％のアクリルアミドを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動を実施した。泳動後のゲルを濾紙に加熱しながら固定し、このゲルを固定した濾紙をイメージング装置ＢＡＳ−１８００（富士フィルム社製）用のイメージングプレートに転写した。タンパク質合成溶液中に使用した、放射性同位元素３５ＳでＳＨ基をラベルしたメチオニンの放射活性をＢＡＳ−１８００で視覚化し、定量モードにより数値化した。ここで、ＳＹＴ２タンパク質はその分子内に糖鎖によって修飾される部位を持ち、添加した小胞体成分がその活性を保持していればタンパク質内に糖鎖の付加を生じる。ＳＹＴ２タンパク質は４２２アミノ酸から成り、その分子量は通常４８ｋＤａ程度であるが、糖鎖が付加するとその分子量は糖鎖の分増加し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度が減少し、異なった位置にバンドを生じる。具体的には、小胞体成分を加えないと生じるバンドは１本のみであるのに対し、活性のある小胞体成分が存在すると元々のバンドよりも上側にもう１本のバンドが生じ、見かけ上２本のバンドが現れる。そしてこの２本のバンドのうち、上側のバンドは修飾されたタンパク質の合成量を反映し、その測定値が大きければ大きいほど、活性型のタンパク質をより多く合成できていることになる。
【００４８】
上記実施例１の方法によって得られた小胞体画分を使用してＳＹＴ２タンパク質を重層法およびバッチ法で合成した結果を表１に示す。表１において、上記の実施例２の方法（重層法）で実施した結果を実験１Ａおよび実験２Ａに、比較例１（バッチ法）で得られた測定値を実験１Ｂ並びに実験２Ｂに示した。ここで実験１Ａと実験１Ｂおよび実験２Ａと実験２Ｂは、再現性を確認するため同じ試験を二度実施した。また、実施例で得られた小胞体画分を共存させずに上記実施例２の方法（重層法）で行った結果を実験３Ａに、そして実験３Ｂには小胞体画分を共存させずに比較例１のバッチ法を用いてＳＹＴ２タンパク質を合成した結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
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表１は、小胞体画分を添加した無細胞タンパク質合成系によるＳＹＴ２タンパク質の検出量を示している。表中で、検出値（Ａ）は反応溶液１０μｌあたりの数値である。また検出量合計は、検出値（Ａ）を１０で割って１μｌあたりとしてから、反応容量（Ｂ）との積としたものである。
【００５０】
表１から明らかなように、実施例１で調製した小胞体画分を用いて実施例２の重層法により合成した結果は、同じ小胞体画分を使用して、バッチ法で行った結果よりも高い測定値を示した。実験１においては、重層法での１０μｌでの検出値がバッチ法の検出値の約２．５倍高く、実験２では同様に約３倍高かった。この結果は、得られたタンパク質合成溶液からいずれも１０μｌ分取して使用したもので、溶液中のタンパク質濃度が、重層法の方がより高いことを示している。
【００５１】
さらに、バッチ法と重層法は、タンパク質合成の担い手である小麦胚芽抽出液を同じ量使用しているにもかかわらず、その最終生成容量は重層法（１５０μｌ）の方がバッチ法（２５μｌ）よりも６倍多く、従って今回の測定値が仮に同じ数値であれば合計のタンパク質生産量は６倍多いことになる。従って実験１においては、
（２２４３／１０×１５０）／（９３６／１０×２５）≒１４．４倍
となり、そして実験２では、
（２００６／１０×１５０）／（６６５／１０×２５）≒１８．１倍
という結果となる。
【００５２】
式中、本実験における検出値は１０μｌあたりの数値であるため、その値を１／１０にして、これに対する反応液量との積で表す。本実験においては、重層法の方が等容量あたり約２．５〜３倍高いことより、最終反応液量６倍との積で、トータル１４〜１８倍の合成量向上が可能となった。
【００５３】
元来糖鎖の付加等の修飾を受けたタンパク質の収量はそれほど良くなく、また小胞体画分は一般的に安定性が良くないとされていたため、これほどの生産量の向上を予想することは非常に困難であった。実際実験３に見られるように、小胞体画分を共存させなければ修飾されたタンパク質は多くとも痕跡程度しか得られない。表１では重層法のブランクである実験３Ａにおいて検出値が若干出ているが、これはバックグラウンドの範囲内で、最終液量との積の数値についてはほとんど意味がなく、無視できる程度である。以上のことから、小胞体画分が修飾タンパク質の合成を担っており、重層法のような連続的にエネルギーを供給される無細胞合成系に小胞体画分を加えることは、その得られる効果があらかじめ予想されたものを大きく越えることを意味している。
【００５４】
【発明の効果】
本発明の、小胞体成分を中心とする画分を、連続的にエネルギーを供給される無細胞タンパク質合成系に加えることで、その合成量ならびに合成効率を高めることが可能になった。特に、細胞膜を貫通すると考えられる配列を持つタンパク質や、その配列中に糖鎖付加のような修飾部位を持ったタンパク質のような、従来の合成方法では活性を持った形での合成が困難であったタンパク質においては、飛躍的な効果が見られるという利点を有している。