(57)【要約】  【課題】ヒト肝細胞または肝組織の培養または保存用培地組成物、特に、薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させるための上記組成物を提供する。  【解決手段】薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させるための培地組成物であって、基礎培地に脂肪乳剤を配合したことを特徴とするヒト肝細胞または肝組織の培養または保存用培地組成物。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させるための培地組成物であって、基礎培地に脂肪乳剤を配合したことを特徴とするヒト肝細胞または肝組織の培養または保存用培地組成物。
【請求項２】
薬物代謝酵素がチトクロムP450である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
肝機能の指標となる蛋白質がアルブミンおよびトランスフェリンである請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
基礎培地がCS-C培地である請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
基礎培地がウイリアムスE培地である請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
脂肪乳剤が精製大豆油200g/L、精製卵黄レシチン12g/Lおよび濃グリセリン22g/Lを含む脂肪乳剤である請求項1に記載の組成物。
【請求項７】
基礎培地と脂肪乳剤との配合割合が、4:1〜20:1(重量比)である請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
基礎培地がCS-C培地である請求項7に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝細胞または肝組織の培養または保存用培地組成物、特に、薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させるための上記組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、新薬などの生体内における吸収、代謝、排泄などに関する安全性試験は、動物個体を用いて行われてきており、特に、肝細胞における薬物代謝などが該安全性試験の重要な一つとされている。しかしながら、動物を用いた試験では、検査結果の定量化、薬物投与と検査結果との因果関係の判定が困難であるなどの欠点があり、しかも一種類の薬物の検査に多数の動物個体を必要とする不利もある。
【０００３】
これらの欠点を解決するために、生体外において培養した肝細胞を利用して上記薬物代謝試験などを行う試みがなされている。即ち、生体から取り出した肝細胞乃至肝組織を適当な肝細胞培養用培地にて生存維持(増殖、分化)して、該培養細胞の薬物代謝機能などを測定、試験する試みがなされている。また、そのような試験のための肝細胞培養用培地なども種々提案されている。
【０００４】
しかしながら、上記試験における重要な一つの課題は、培養肝細胞の増殖維持には限度があり、長期に亘る維持が困難で、しかも、培養肝細胞では肝細胞機能が生体内におけるそれと同様に発揮され難いことにある。
【０００５】
例えば、Rodriguez-Antonaらは、培養維持したヒト肝細胞の初代培養系においては、経時的に、チトクロームP450 mRNAの発現量が低下することを報告している（非特許文献1参照）。本発明者らも、例えばBioWhittaker, Incの専用培地キットHCMTMBulletKitにて培養維持したヒト肝細胞の初代培養系においては、経時的に、薬物代謝酵素およびアルブミンなどの肝機能の指標となる蛋白質の各mRNAの発現量が低下することを確認している。
【０００６】
このような酵素および蛋白質の発現量の経時的低下は、薬物代謝機能および肝機能の正確な測定を不可能とし、ひいては新薬の安全性を確認できない不利を招く。
【０００７】
以上のように、現在、生体肝と同等の肝機能を長期に亘って維持できる培養肝細胞系、およびそのための肝細胞培養用培地は開発されていない現状にある。このような培養肝細胞系およびその培地の確立が、薬物代謝、肝細胞移植、人工肝開発、基礎的肝細胞研究などの分野で強く要望されている。
【０００８】
尚、従来、活性化Tリンパ球の培養培地に脂質(ダイズ油と卵黄レシチンからなる注射用脂肪乳剤(日本製薬))を添加することによって、その標的細胞障害活性などの機能を高め得ることは報告されている（非特許文献2参照）が、肝細胞などの接着細胞の培養系に脂肪を添加した例は報告されていないし、薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質の発現維持に関する報告も皆無である。
【０００９】
また、従来、培養肝細胞における薬物代謝が胆汁酸によって制御される旨の報告はある（非特許文献3参照）が、該肝細胞における薬物代謝が脂肪によって制御される旨の報告はない。
【非特許文献１】Rodriguez-Antona, C., Donato, M.T., Boobis, A., Edwards, R.J., Watts, P.S., Castell, J.V. and Gomez-Lechon, M.-J., (2002), Xenobiotica, 32, 505-520
【非特許文献２】Kitahara, M., Sekine, T., Kuroiwa, Y., Yamaguchi, T., Bamba, K., Jin, G., Hong, T. and Cyong, J., (2000), Biotherapy, 14, 547-549
【非特許文献３】Sugihara, N., Ise, H., Negishi, N., Nikaido, T. and Akaike, T., (2002), Cell Biochem. Funct., 20, 11-17
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、前記要望に合致する、培養肝細胞系の確立、特にそのための肝細胞培養用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、通常の肝細胞培養用培地に、従来添加配合された例のない脂肪乳剤を添加配合して、該培地で肝細胞を培養するときには、培養肝細胞は初期の肝機能を維持し、特に薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質の発現量の低下が防止されるという事実を発見した。
【００１２】
本発明は、この知見を基礎として更に研究を重ねた結果完成されたものである。本発明は、下記項1.-8.に記載のヒト肝細胞用培地組成物を提供する。
【００１３】
項1. 薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させるための培地組成物であって、基礎培地に脂肪乳剤を配合したことを特徴とするヒト肝細胞または肝組織の培養または保存用培地組成物。
【００１４】
項2. 薬物代謝酵素がチトクロムP450である項1に記載の組成物。
【００１５】
項3. 肝機能の指標となる蛋白質がアルブミンおよびトランスフェリンである項1に記載の組成物。
【００１６】
項4. 基礎培地がCS-C培地である項1に記載の組成物。
【００１７】
項5. 基礎培地がウイリアムスE培地である項1に記載の組成物。
【００１８】
項6. 脂肪乳剤が精製大豆油200g/L、精製卵黄レシチン12g/Lおよび濃グリセリン22g/Lを含む脂肪乳剤である項1に記載の組成物。
【００１９】
項7. 基礎培地と脂肪乳剤との配合割合が、4:1〜20:1(重量比)である項1に記載の組成物。
【００２０】
項8. 基礎培地がCS-C培地である項7に記載の組成物。
【００２１】
尚、CS-C培地は公知であり、例えば下記文献に記載されている。
1) Kobayashi  N., Noguchi, H., Watanabe, T., Matsumura, T., Totsugawa, T., Fujiwara, T., Taguchi, T., Urata, H., Kishimoto, N., Hayashi, N., Nakaji, S., Westerman, K.A., Leboulch, P., Murakami, T. and Tanaka, N. A new approach to develop a biohybrid artificial liver using a tightly regulated human hepatocyte cell line. (2000), Hum. Cell, 13, 229-235
2) Murata, M., Kador, P.F. and Sato, S, Vascular endothelial growth factor (VEGF) enhances the expression of receptors and activates mitogen-activated protein (MAP) kinase of dog retinal capillary endothelial cells. (2000), J. Ocul. Pharmacol. Ther., 16, 383-391
本発明組成物は、薬物代謝酵素の発現能および肝機能の指標となる蛋白質の発現能を培養肝細胞に維持させる作用を奏する点において特徴づけられる。特に、この効果は、薬物代謝酵素であるチトクロムP450の各種分子種において顕著である。その具体例としてはCYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP3A4, CYP2E1などを挙げることができる。
【００２２】
以下、本発明組成物につき詳述する。
【００２３】
基礎培地
本発明において使用可能な培地としては、従来より肝細胞を含む動物細胞の培地として一般に使用されることの知られている各種培地を例示することができる。該基礎培地には、例えばCS-C培地、肝細胞専用培地キットHCMTMBulletKit (BioWhittaker, Inc.社製)、L-15培地、William's E培地、Waymouth's MB 752/1培地、ダルベッコの修飾イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)、イーグル基礎培地(Basal Media Eagle; BME)、DMEM/F-12培地(DMEM:F-12=1:1(v/v))、199培地、F-12培地、F-10培地、MEM培地、RPMI1640培地などが含まれる。これらは、例えばギブコー社(Gibco-BRL/Life Technologies Inc.）、バイオフィッカー社(BioWhittaker)、タカラ社などから入手可能である。これらの内では、特にCS-C培地および肝細胞専用培地キットHCMTMBulletKitが好ましい。
【００２４】
該培地には、被培養物である肝細胞が同化しうる各種の栄養源、例えば炭素源、窒素源、無機塩などを補足添加することも可能である。また、必要に応じてアミノ酸、微量金属元素乃至微量栄養素、抗生物質、脂肪酸、ビタミン類、浸透圧調整剤、pH指示薬などを添加することもできる。ここで炭素源としては、グルコース、ガラクトース、マンニトール、グリセロール、フルクトースなどを例示することができる。窒素源としては、カゼイン、ウシ血清アルブミン(BSA)、ニコチンアミドなどの有機窒素化合物、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素化合物を例示することができる。アミノ酸としてはL-プロリン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-オルニチンなどを例示することができる。微量金属乃至微量栄養素としては、例えば亜鉛、マンガン、銅、セレンなどの微量金属元素；鉄結合トランスフェリン、鉄グルコネートと組み合わせたアポトランスフェリン(apo-transferrin)、デキサメタゾン、インシュリンなどのホルモン類、HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸])などを例示することができる。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンなどを例示することができる。
【００２５】
一般に、基礎培地は6.5-8.2、好ましくは7.0-7.7、最も好ましくは7.2-7.5の範囲のpHに調整される。
【００２６】
また、本発明において基礎培地は、所望により成長因子、例えばHGF/SF、EGFおよびTGF-αなどを補足されていてもよい。
【００２７】
本発明において使用可能な好ましい基礎培地の組成を下記表1(CS-C培地)および2(ウイリアムスE培地)に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
【表２】
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脂肪乳剤
本発明ヒト肝細胞用組成物において、基礎培地に配合される脂肪乳剤は、一般に油性成分(脂肪)を乳化剤により乳化させた水中油型乳剤形態のものである。ここで、油性成分としては、通常植物油を使用することができる。その具体例としては、例えば大豆油、綿実油、菜種油、胡麻油、サフラワー油、コーン油、落花生油、オリーブ油、ヤシ油、シソ油、ヒマシ油などを挙げることができる。また、該油性成分は、例えば2-リノレオイル-1,3-ジオクタノイルグリセロールなどの化学合成トリグリセリドであってもよく、中鎖トリグリセリド(MCT)、例えば炭素数8-10の脂肪酸のトリグリセリド(これらを主成分とする市販品としては、商品名:「ココナード」(花王社製)、「ODO」(日清製油社製)、「ミグリオール」(ミツバ貿易社)、「パナセート」(日本油脂社製)などを例示できる)であってもよい。更に、油性成分は動物油、鉱油などのであってもよい。これらはその1種を単独で利用することもでき、2種以上を併用することもできる。
【００３０】
乳化剤としては、代表的には、天然のリン脂質である卵黄レシチン、大豆レシチン、それらを水素添加した水添卵黄レシチン、水添大豆レシチンを挙げることができる。また、乳化剤は化学合成したリン脂質でもよい。該化学合成したリン脂質には、ホスファチジルコリン(ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンなど)、ホスファチジルグリセロール（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなど）などが含まれる。これら乳化剤は1種単独でまたは2種以上混合して利用される。好ましい乳化剤は卵黄レシチンおよび大豆レシチンである。
【００３１】
脂肪乳剤は、乳化剤を用いて上記油性成分を水中に乳化分散させることにより調製される。乳化分散方法は当業界でよく知られている。例えば両者の混合物に注射用水を加えて粗乳化後、得られる粗乳化液を適当な高圧乳化機などを利用して乳化（精乳化）する方法によることができる。油性成分および乳化剤の配合割合は、脂肪乳剤が得られる限り特に限定されるものではない。通常油性成分は、得られる脂肪乳剤中に2-40重量％程度、好ましくは10-20重量％となる範囲で配合されるのがよい。乳化剤は、得られる脂肪乳剤中に0.25-5重量％程度、好ましくは0.5-2重量％程度となる範囲から選ばれるのがよい。
【００３２】
脂肪乳剤中には、特に必要ではないが、この種脂肪乳剤中に添加配合できることの知られている各種の添加剤を更に添加配合されていてもよい。該添加剤としては、例えば、酸化防止剤、抗菌剤、pH調整剤、等張化剤などを挙げることができる。酸化防止剤には、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウムなどが含まれる。抗菌剤には、カプリル酸ナトリウム、安息香酸メチル、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、亜硫酸水素ナトリウムなどが含まれる。pH調整剤には、塩酸、酢酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが含まれる。等張化剤としては、グリセリン；ブドウ糖、果糖、マルトールなどの糖類；キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール類などが含まれる。これらの内、油溶性材料は、乳化液を構成する油性成分に予め混合して利用することができる。水溶性材料は、注射用水に混合するか、または得られる脂肪乳剤の水相中に添加配合することができる。これらの添加配合量は、当業者に自明であり、従来知られているそれらの添加配合量と同様のものでよい。
【００３３】
上記粗乳化は、より詳しくは、例えば特殊機化工業社製T.K.ホモミクサーなどのホモミキサーを用いて、通常5000回転／分以上で5分間以上を要して実施できる。精乳化は、例えばマントンゴウリンホモジナイザー(ゴウリン社製)などの高圧ホモジナイザーまたは超音波ホモジナイザーを用いて実施できる。高圧ホモジナイザーを用いる場合、一般には約200kg/cm2以上の圧力条件下に、2-50回程度、好ましくは5-20回程度通過させることにより実施することができる。これらの混合乳化操作は、常温下に実施してもよく、若干の加温操作(通常55-80℃程度)を採用して実施してもよい。
【００３４】
かくして得られる脂肪乳剤は、通常pH5.0-8.5程度、好ましくは5.5-8.0程度に調整することができる。特に好適な脂肪乳剤の組成は、下記表3に示すとおりである。
【００３５】
【表３】
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本発明ヒト肝細胞用組成物
本発明組成物は、前記基礎培地に脂肪乳剤を混合することにより調製される。両者の混合割合は、基礎培地と脂肪乳剤とが、重量比で前者対後者=4:1〜20:1となる割合、即ち脂肪乳剤1重量部に対して基礎培地4-20重量部となる割合、還元すれば、基礎培地に対して脂肪乳剤が5-25重量％となる割合から選択されるのが好ましい。
【００３６】
かくして得られる本発明組成物は、常法に従って、濾過、滅菌して製品とすることができる。濾過は通常0.45μmメンブランフィルターを使用して実施できる。滅菌は、例えば高圧蒸気滅菌、熱水浸漬滅菌、シャワー滅菌などにより行ない得る。
【００３７】
本発明組成物は、薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質の発現維持を目的として、肝細胞または肝組織の培養または保存に利用される。
【００３８】
薬物代謝酵素としては、代表的にはチトクロムP450を挙げることができる。該チトクロムP450には、多数の分子種が存在することが知られている。これらの分子種は、その酵素活性に個体差はあるものの、分子種毎にそれぞれ、例えば三環系抗うつ薬、抗てんかん薬、ベンゾジアゼピン系製剤、β−遮断薬、バルビタール系就眠性催眠剤などの医薬品有効成分化合物、ジメチルニトロソアミン、ベンゼンなどの有機溶剤、環境中の低分子発癌性物質などの代謝に関与することが報告されている（例えば、Yoo, J. S. H., Chung, R. C., Wade, D., and Yang, C. S. (1987), Cancer Res., 47, 3378-3383など参照）。該チトクロムP450の分子種の例としては、例えばCYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP1E1, CYP3A4などを挙げることができる。
【００３９】
肝機能の指標となる蛋白質としては、代表的にはアルブミン、トランスフェリン、フェリチン、セルロプラスミンなどを例示することができる。
【００４０】
また、上記本発明組成物を利用して培養される肝細胞または肝組織としては、初代培養肝細胞、株化肝細胞などの肝由来の細胞およびその集合体である組織であれば、その種類は特に限定されるものではない。通常、初代培養肝細胞を有利に用いることができる。
【００４１】
肝細胞の培養方法
本発明組成物を用いて肝細胞または肝組織を培養する方法は、基本的には、従来知られている肝細胞培養用培地を用いる方法と同様にして実施することができる。即ち公知の肝細胞培養用培地に代えて本発明組成物を利用して、同様にして実施することができる。
【００４２】
肝細胞凝集塊の形成は、肝細胞を本発明組成物上に播くだけでよく、播種後、数時間〜1日で肝細胞は本発明組成物の上面に接着し、2〜3日後に凝集塊を形成する。肝細胞の凝集塊を形成した後、培養を続行することによって、培養肝細胞において、所望のmRNAが発現し、これによりコードされる蛋白質が合成され、薬物代謝酵素などの活性の維持が可能となる。更に、本培養方法で培養されている肝細胞に、被検物質を投与して肝細胞の機能を評価することによって安全性毒性試験評価を行うことが可能である。
【００４３】
培養肝細胞を利用した酵素および蛋白質mRNAの測定
本発明組成物を利用して培養された肝細胞または肝組織による薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質mRNAの発現量の測定は、常法に従うことができる（例えば、WO01/92538A1参照、CYPsの発現量測定については、Nishimura, M., Yoshitsugu, H., Naito, S. & Hiraoka, I., (2002) Yakugaku Zasshi, 122, 339-361 および Nishimura, M., Yaguri, H., Yoshitsugu, H., Naito, S. & Satoh, T., (2003) Yakugaku Zasshi, 123, 369-375参照）。
【００４４】
一般には、該測定は、測定対象とする薬物代謝酵素もしくは蛋白質に応じてそれぞれ既知の適当なプライマー対およびプローブを利用して、公知のPCR法(例えば、Science, 230, 1350 (1985)参照)、RT-PCR(Genome Res., 6(10), 986 (1996)参照)など、特にリアルタイム検出法(例えばTaqMan PCR, ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTION SYSTEM, Applied Biosystems, Ver1, June 1996参照)に従い実施することができる。
【００４５】
より詳しくは、本発明組成物を利用して培養されており、測定対象である酵素もしくは蛋白質のmRNAを発現している培養肝細胞から、常法に従って全RNAを抽出し、次にそれに対して相補性のcDNAを常法に従って合成した後、適当なプライマー対とプローブとを用いて、PCRを行えばよい。また、常法に従って全RNAを抽出後、適当なプライマー対とプローブとを用いて、直接RT-PCRを行うこともできる。
【００４６】
PCR反応、RT-PCR反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができ、特に異なるものではない。具体的には、後記実施例に示す条件を好ましいものとして採用できる。
【００４７】
検出も、基本的には常法に従って、例えばアルゴンレーザ光をPCR反応液に照射し、放射される蛍光をCCDカメラを用いて検出することにより行うことができる。
【００４８】
かくして、本発明組成物を利用して培養された肝細胞乃至肝組織を利用して、薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質のmRNAの発現を容易且つ迅速に、しかも正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。尚、％は特に断らない限り重量％を示す。
【実施例１】
【００５０】
(1)  ヒト肝細胞用培地「専用培地キットHCMTMBulletKit」(BioWhittaker, Inc社製)に、脂肪乳剤「イントラリポス」20%液(株式会社大塚製薬工場社製)の5-25%を加えて、本発明組成物を調製した。
【００５１】
(2)  上記(1)においてヒト肝細胞用培地として前記表1に記載のCS-C培地を用いて同様にして、本発明組成物を調製した。
【００５２】
(3)  上記(1)においてヒト肝細胞用培地として前記表1に記載のウイリアムスE培地を用いて同様にして、本発明組成物を調製した。
【試験例１】
【００５３】
この試験は、本発明組成物を利用して培養維持した肝細胞の薬物代謝酵素mRNAもしくは肝機能の指標となる蛋白質mRNAの発現能の経時的変化を調べたものであり、以下の通り実施された。
【００５４】
(1)測定項目
薬物代謝酵素としてP450の分子種であるCYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2E1およびCYP3A4のそれぞれのmRNAを測定した。これら各P450分子種は、それぞれ以下の通りGenBankに登録されており、それらの各塩基配列は登録されたそれらに従うものである。
CYP1A1；GenBank accession number NM#000499
CYP1A2；GenBank accession number AF182274
CYP1B1；GenBank accession number NM#000104
CYP2E1；GenBank accession number AF182276
CYP3A4；GenBank accession number AF182273
また、肝機能の指標となる蛋白質としては、アルブミンおよびトランスフェリンを選択した。これらはGenBank以下の通り登録されており、各塩基配列は登録されたそれらに従うものである。
アルブミン；GenBank accession number XM#031322
トランスフェリン；GenBank accession number XM#002793
尚、対照としてハウスキーピング遺伝子であるベータアクチン(β-actin)について同一試験を実施した。
【００５５】
(2)供試培地組成物
基礎培地としてはヒト肝細胞用培地(Bio Whittaker, Inc.社製、肝細胞専用培地キットHCMTMBulletKit、代理店；旭テクノグラス社)を利用した。また、脂肪乳剤としては、株式会社大塚製薬工場社製「イントラリポス」20%液（100mL中に精製大豆油20g、精製卵黄レシチン1.2gおよび濃グリセリン2.2gを含む脂肪乳剤）を利用した。
【００５６】
(3)供試肝細胞
肝細胞としては、ヒト正常肝細胞(Human Normal Hepatocytes, Lot. No. 100, In Vitro Technologies, Inc.社製、トリパンブルー染色(trypan blue dye exclusion)による生存率：91.0%)を利用した。
【００５７】
(4)試薬
以下の試薬を利用した。
【００５８】
RNaseフリーの蒸留水：和光純薬工業株式会社
Rneasy Mini Kit(50)：キアゲン株式会社
QIAshredder(50)：キアゲン株式会社
Yeast tRNA：GIBCO BRL
TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit：Applied Biosystems
TaqManβ-actin Control Reagents：Applied Biosystems(製品番号401846)
Micro Amp Optical 96-well Plate：Applied Biosystems
Optical Adhesive Covers：Applied Biosystems
Optical Cover Compression Pads：Applied Biosystems
24ウエル平底プレート：旭テクノグラス社(コラーゲンタイプIコート)
Trypan blue：Flow Laboratories LTD.(0.4% solution in 0.85% saline)
β-メルカプトエタノール：Sigma Chemical Co.
また、mRNAの定量は、下記表4に示す各配列のプライマー対およびプローブを(開始コドンの位置は、登録された各塩基配列に従うものである)用いて、RT-PCR(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase reaction)により実施した。各プライマーおよびプローブは、自動DNA合成機を用いて作成した。
【００５９】
【表４】
2005027574.tif 000005
(5)試験方法
(5-1)供試培地組成物の調製
供試培地組成物は、基礎培地320μL/ウエルに、下記表5に示すように、脂肪乳剤、脂肪乳剤と生理食塩水との混合物または生理食塩水をそれぞれ80μL/ウエルずつ添加して調製した。
【００６０】
【表５】
2005027574.tif 000006
(5-2)ヒト正常肝細胞の初代培養
ヒト肝細胞の初代培養は、文献記載の方法(Nishimura, M., Yoshitsugu, H., Naito, S. and Hiraoka, I., Yakugaku Zasshi, 122, 339-361(2002)）に従って実施した。即ち、凍結肝細胞の取扱説明書（旭テクノグラス社より入手）に従い、24 ウエルのプレートに基礎培地を400μL/wellを入れ、次いで、各ウエルにヒト肝細胞を1×105cells/wellずつ分注し、CO2インキュベーター内で培養し、3時間後に各供試培地組成物に培地交換して、更に21時間培養した。なお培地は、CO2インキュベーター内で1時間以上平衡化した後に使用した。なお、融解後の肝細胞のTrypan blueでみた生存率は91.0％であった。
【００６１】
(5-3) Total RNAの調製
Total RNAの抽出は次の通り行った。なお、抽出操作は全て室温で行った。即ち、培養開始3時間(試験前という)および24時間(試験後という)の各時点で、24ウエルプレートの各ウエルから培地を吸引除去した。次に、各ウエルにβ-メルカプトエタノールを含むRLT溶液(RLT溶液:Rneasy Mini Kit(50)として供給、β-メルカプトエタノール=100:1)を400μLずつ添加し、ピペッティングし、各ウエルから吸引除去およびピペッティングした培地を集めその全量をQIAshredderカラムに添加し、15,000回転/分で2分間遠心した。溶出液350μLを分取し、これに等量の70%エタノール溶液を添加した。該液を10秒間、3回攪拌後、Rneasy Mini spinカラムに添加し、12,000回転/分で30秒間遠心し、コレクションチューブ内の溶出液を吸引除去した。次いで、コレクションチューブに700μLのRW1溶液(Rneasy Mini Kit(50)として供給)を添加し、12,000回転/分で30秒間遠心後、コレクションチューブを取りかえた。このコレクションチューブに500μLのRPE溶液(Rneasy Mini Kit(50)として供給)を添加し、12,000回転/分で30秒間遠心し、コレクションチューブ内の溶出液を吸引除去した。コレクションチューブに更に500μLのRPE溶液を添加し、15,000回転/分で2分間遠心後、1.5mLのコレクションチューブに交換し、該チューブ内に50μLのRNaseフリーの蒸留水(Rneasy Mini Kit(50)として供給）を添加し、10,000回転/分で1分間遠心してtotal RNAを溶出させた。溶出液は50μg/mLのYeast tRNA液を用いて5倍希釈して測定用Total RNA溶液とした。尚、50μg/mLのYeast tRNA液は、Yeast tRNAをRNaseフリーの蒸留水で希釈して調製した。
【００６２】
(5-4) mRNAの測定
ABI PRISMTM7700 Sequence Detection Systemを利用してハウスキーピング遺伝子（β-アクチン）、薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質の各mRNAを、以下の通り定量した。
【００６３】
RT-PCRは、300nM Forward Primer、900nM Reverse Primerおよび200nM TaqMan Probeを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kitを用いて、50μL/tubeの系で行った。Total RNA溶液は5μLを使用した。PCR条件としては、48℃で30分間、その後95℃で10分間保温した後、95℃で15秒間、60℃で1分間のサイクルを40回行う条件とした。各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００６４】
なお、反応容器はMicro Amp Optical 96-well Plateを、カバーはOptical Adhesive Coversを、カバーの上にのせるパットはOptical Cover Compression Padsを用いた。
【００６５】
β-アクチンの測定の場合は、TaqManβ-actin Control Reagents （300nM Forward Primer、300nM Reverse Primerおよび200nM TaqMan Probe）を用いた。
【００６６】
(5-5) 結果の計算方法および統計処理
β-アクチンのmRNAを内在性コントロールとした。各mRNAの定量値は、ΔCt法(Nishimura, M., Yaguri, H., Yoshitsugu, H., Naito, S. & Satoh, T., (2003) Yakugaku Zasshi, 123, 369-375)にて算出し、試験はtriplicateで行い、結果は平均値と標準偏差で示した。更に、培地交換前（基礎培地での培養の開始3時間の時点）での発現量の平均値を100とした時の、供試培地組成物中での培養21時間の時点の発現量の測定結果(平均値)の相対値（％）も算出した。
【００６７】
(5-6) 結果および考察
得られた結果を表6、7および8に示す。
【００６８】
【表６】
2005027574.tif 000007
【００６９】
【表７】
2005027574.tif 000008
【００７０】
【表８】
2005027574.tif 000009
各表に示される結果から次のことが判る。即ち、表6に示されるとおり、CYP1A1、CYP1A2およびCYP1B1のmRNA発現量は、試験前(供試培地組成物に培地交換して培養する前)と比較して、対照群(基礎培地で培養21時間後)ではそれぞれ18％、8.8％および40％に低下したのに対して、本発明組成物を利用した群（本発明培地組成物に培地交換して21時間培養後)では、該組成物を構成する脂肪乳剤の濃度に依存して、発現量の低下が抑制され、例えば脂肪乳剤4%配合した群（本発明組成物1使用群）では、それぞれ64％、39％および99％と高い値を維持した。
【００７１】
また、上記mRNA発現量の低下抑制作用は、表7に示されるように、CYP3A4およびCYP2E1についても、弱いながらも確認された。
【００７２】
更に、アルブミンおよびトランスフェリンのmRNA発現量については、表8に示されるとおり、試験前と比較して対照群では、それぞれ5.4％およびと3.9％と非常に低い値に低下したのに対して、本発明組成物を利用した群では、これを構成する脂肪乳剤の濃度に依存して、発現量の低下が抑制される傾向が観察された。即ち、本発明組成物1使用群では、それぞれ10.4％および9.2％に維持されることが明らかとなった。
【００７３】
以上の結果は、基礎培地としてヒト肝細胞用培地(Bio Whittaker, Inc.社製、肝細胞専用培地キットHCMTMBulletKit)を利用して行われた試験の結果であるが、本発明者は、該基礎培地を実施例1の(2)および(3)に示されるように、CS-C培地およびウイリアムスE培地に変更して同一試験を行った場合も、同様の結果が得られることを確認している。
【００７４】
以上の通り、本発明組成物を利用すれば、薬物代謝酵素および肝機能の指標となる蛋白質のmRNA発現量の低下を抑えて、より生理的な条件下でのヒト肝細胞の初代培養系が確立できることが判る。該肝細胞培養系は、例えば、肝細胞および肝組織培養用培地として、移植用肝組織あるいは肝臓製造用の培養液として、また肝臓保存用の保存液として有効であることが判る。
【配列表】
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