(57)【要約】      （修正有）【課題】羊膜縫合過程の不便と移植する際に縫合糸を除去する不便を解消して、膜の上下両面で目的とする細胞の培養が可能なだけでなく、膜に付着された細胞の気液界面培養の際に傾斜振動培養が可能な細胞培養用膜の支持装置の提供。【解決手段】中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に３個以上の脚(ｌｅｇ)を備えた第１部材；及び中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第１部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第２部材を含み、第１部材の突出部と第２部材の受容部はその間に介在される細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置を提供する。【選択図】図１ａ
2005348736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第１部材；及び
中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第１部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第２部材を含み、
第１部材の突出部と第２部材の受容部とはその間に細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置。
【請求項２】
前記第１部材の突出部と第２部材の受容部との間に中間輪が挿入されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１部材及び第２部材は円型部材であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記第１部材及び第２部材の材質がポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ；商標名：テフロン（登録商標）)、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、ポリアクリロニトリル(ＰＡＮ)、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)及びシリコーンからなる群から選択される生体適合高分子物質であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記受容部は凹溝の形態であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記膜が羊膜、コラーゲン膜、ゼラチン膜、キチン膜、キトサン膜、アルジネート膜、ヒアルロン酸膜、ＰＬＧＡ(poly(D, L-lactic-co-glycolic acid))膜、ＰＧＡ(polyglycolic acid)膜、ＰＬＡ(poly(lactic acid))膜からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養用膜の支持装置と前記膜とを用いて、目的とする細胞を培養する方法。
【請求項８】
目的とする細胞が角膜上皮細胞、皮膚表皮細胞、粘膜上皮細胞及び気道上皮細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
目的とする細胞を気液界面培養で培養する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
気液界面培養を傾斜振動培養で行う請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
傾斜振動培養を６〜１０ｒｐｍの速度で３〜１２日間培養することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用膜の支持装置に関するものであって、より詳しくは、細胞培養用膜を支持するための別途の締付け手段を用いることなく膜の上下両面で目的とする細胞の培養が可能であるだけでなく、膜に付着した細胞の気液界面培養の際に、傾斜振動培養が可能である細胞培養用膜の支持装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
科学の発達と共に医学の飛躍的な発展によって、現在は殆どすべての臓器を移植できる水準にまで至った。しかし、このような臓器移植技術の発達が人類の健康増進には非常に重要な役割を果たすが、臓器移植手術の技術的な難しさ、高コスト及び免疫抑制剤の使用による副作用などの限界がある。このような状況下で、一部の科学者は人工的に生体組織又は臓器を作って移植する方法の研究を行い、その結果、組織工学(tissue engineering)という新しい分野が誕生することになった。
【０００３】
組織工学は、細胞を生体適合性(biocompatibility)基質に３次元的に培養して細胞−基質複合体を製造し、これを用いて生体組織及び臓器を再生する分野に関する学問であって、細胞工学技術と生体材料技術が組合されて人工組織及び臓器開発、遺伝子及び細胞治療分野などに適用されている。より具体的に、骨と軟骨、筋肉、皮膚、肝、腎臓、心臓、弁膜などの人工臓器の開発及び組織工学的再生を通じた交替、血管構成細胞と生分解性ポリマーを用いて作った人工血管の開発及び透明な生体材料に角膜上皮細胞を移植して作った人工角膜などの製造に該組織工学技術が適用され得る。
【０００４】
このような組織工学技術を用いた生体組織及び臓器再生のためには、まず生体適合性膜(biocompatible membrane)又は基質膜上で細胞を培養する必要があり、このように膜に細胞を培養するためには膜を支持する器具又は装置が必要になる。
【０００５】
前記膜の具体的な例として羊膜(amniotic membrane)が用いられ得る。羊膜は胎児膜の最内側にある膜であって、母体側からの各種感染及び免疫反応などから胎児を保護する重要な防壁の役割を果たし、厚い基底膜と無血管性間質からなっている(Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999); Nancy et al., Aorn Jour., 39:894-899 (1984))。このような羊膜は、現在やけど患者のドレッシング(dressing)と移植後カバー(cover)として用いられるだけではなく、神経冠、気道、粘膜組織の再構成(reconstruction)の支持体として用いらている。また、目球の表面の異常を有しているモデル又は患者に羊膜を角膜上皮細胞の自家移植のための基質として用いて移植した場合もある(Koizumi et al., Cornea, 19:65-71 (2000); Tsai et al., The New Eng. Jour. of Med., 343:86-93 (2000))。
【０００６】
一方、前記羊膜を支持するための器具と関連して、野口等の文献(Noguchi et al., Biochem. and Biophy. res. com., 210:302-309 (1995))は、羊膜を２個の同心円のポリカルボナート(polycarbonate)リング(ring)からなる上部リングと下部リングとの間に固定させ、気道上皮細胞を羊膜上皮面に接種して単層培養し、分化させるための組織支持装置(tissue holding device)を開示しており、米国特許第４,４４６,２３４号は天然障壁組織(natural barrier tissue)との細胞相互作用を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ方法において哺乳類胎盤に由来する羊膜が基質組織に用いられ得ることを明らかにすると共に、羊膜を上部リングと下部リングとの間にボルトのような締付け手段を用いて固定させることを一例として提示している。
【０００７】
また、既存の羊膜上で角膜上皮細胞を培養する実験と研究方法ではカルチャープレートインサート(culture plate insert; Corning Inc., Corning, NY)又はトレンスウェルインサート(TranswellＴＭ insert)のような器具を用いたが、このような商業用器具は細胞培養の前に羊膜を縫合し、移植前に縫合糸を除去しなければならないという不便があり、また、羊膜の上面での培養のみが可能であるため、角膜の三種類の細胞のうち、一種の細胞しか培養できないという問題があった。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４,４４６,２３４号
【非特許文献１】Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999); Nancy et al., Aorn Jour., 39:894-899 (1984)
【非特許文献２】Koizumi et al., Cornea, 19:65-71 (2000); Tsai et al., The New Eng. Jour. of Med., 343:86-93 (2000)
【非特許文献３】Noguchi et al., Biochem. and Biophy. res. com., 210:302-309 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記のような問題を解決するために案出されたものであって、本発明の目的は、羊膜縫合過程と移植する際に縫合糸を除去する過程における不便を解消し、膜の上下両面で目的とする細胞の培養が可能なだけでなく、膜に付着した細胞の気液界面培養の際に傾斜振動培養が可能な細胞培養用膜の支持装置を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記細胞培養用膜の支持装置と膜とを用いて、目的とする細胞を培養する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記のような目的を果たすために、本発明は、中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第１部材；及び中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第１部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に３個以上の脚(ｌｅｇ)を備えた第２部材を含み、第１部材の突出部と第２部材の受容部はその間に細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置を提供する。
【００１２】
本発明で用いた「再構成」という表現は体外で実際の組織と類似する形態で人工組織を作ることを意味する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の細胞培養用膜の支持装置は、別途の締付け手段を用いることなく膜を支持でき、しかも、膜の上下両面で目的とする細胞の培養が可能であり、膜に付着した細胞の気液界面培養の際に傾斜振動培養ができるため組織再構成期間を短縮できる。さらに、このように再構成された組織は毒性用モデルだけでなく移植用にも用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、組織工学を用いた人工器官の製造において、実際組織を構成する細胞を膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）上で培養する際に前記膜を支持する役割をする装置を提供することに特徴がある。
【００１５】
具体的に、本発明は中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に形成された突出部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第１部材；及び中央に貫通孔、貫通孔の側面に沿って一方の面に前記第１部材の突出部を取り込むための受容部、及び他方の面に３個以上の脚を備えた第２部材を含み、第１部材の突出部と第２部材の受容部とはその間に細胞培養用膜を固定させ得るように噛み合う、細胞培養用膜の支持装置を提供する。
【００１６】
図１ａ〜図１ｅは、本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する斜視図(図１ａ)、側面分離度(図１ｂ)、平面図(図１ｃ)、側面結合図(図１ｄ)及び設計図(図１ｅ)を示し、図２は、本発明の第１態様によって円型に製造された細胞培養用膜の支持装置に対する写真を示す。以下、添付の図面を参照して説明する。
【００１７】
前記第１部材(１５)及び第２部材(１６)の一方の面に形成された脚(ｌｅｇ)(１３)は、第１部材(１５)の突出部(１２)と第２部材(１６)の受容部(１４)との間に細胞培養用膜を置いて噛み合うように結合して膜が支持された装置を細胞培養培地に入れて膜で細胞を培養する際、細胞培養培地の底面と膜との間に空間を設けることによって気液界面培養(air liquid interface culture)が可能にする役割をする。
【００１８】
気液界面培養はラフトカルチャー(raft culture)とも言い、培養する細胞が付着した膜の下面には培地が、上面には空気が接するようにして培養することを意味する。このように気液界面培養を行う場合、下部からの栄養供給と上部からの空気との接触によって実際組織(例えば、皮膚の上皮細胞)の環境状態と同様な状態で分化を誘導できるという長所がある。
【００１９】
前記脚(１３)は培地の流動性を考慮して適正な数を有するように製造され得、前記支持装置の培地上における均衡維持のために３個以上を備えることが好ましい。また、前記脚(１３)は細胞培養容器の高さ、細胞培養容器内の培地の量及び培地交替時期などを勘案して様々な高さを有するように製造され得る。脚が高いほど培地交替を頻繁にしなくても良いという長所があるが、高すぎると培地が過度に所要されるという短所があり、脚が低すぎると支持装置内外の培地の流動が適切でないため、培養が十分に行われないという短所がある。具体的に、前記脚は１ｍｍ〜５ｍｍ、より好ましくは２ｍｍ〜４ｍｍの高さを有するように製造されることが好ましい。
【００２０】
前記第１部材(１５)の突出部(１２)の突出長さは前記第２部材(１６)の受容部(１４)の受容深さと同一であり、第１部材(１５)の突出部(１２)と第２部材(１６)の受容部(１４)との間に細胞培養用膜をおいて両側で力を加えて突出部(１２)を受容部(１４)に押し入れて組立てれば突出部(１２)と受容部(１４)が噛み合いながら膜を固定させて支持するようになる。前記受容部(１４)は凹溝の形態であることが好ましく、突出部(１２)の形状によって多様な形状に製造され得る。
【００２１】
一方、前記装置の第１部材(１５)及び第２部材(１６)は細胞が培養される膜の形態及び培養した細胞を移植する部位の形態などを考慮して中央に貫通孔(１１)を有する円形又は三角形、四角形などの多角形形態に製造され得るが、羊膜を固定して引っ張る力がすべての方向で一定である円型(ring type)部材に製造されることが好ましい。
【００２２】
また、前記第１部材(１５)及び第２部材(１６)の材質としては生体適合性に優れ、流動培養の際に培地に浮かばないほどの比重を有する高分子物質であることが好ましいが、具体的に、ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ；商標名：テフロン（登録商標）)、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、ポリアクリロニトリル(ＰＡＮ)、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)及びシリコーンなどを用いることが好ましく、テフロン（登録商標）を用いることが最も好ましい。
【００２３】
本発明による細胞培養用膜の支持装置は培養する組織及び培養基の大きさによって任意に大きさを調節して製造され得るが、組織の大きさ及び膜を張り切った状態で支持できることなどを考慮して円型に製造する場合には、直径が１０ｍｍ〜１５０ｍｍであることが好ましい。
【００２４】
本発明による支持装置に固定され得る膜としては一般的に組織工学の技術分野で細胞培養用膜に用いられ得るものであれば特別な限定なしに用いられ得るが、羊膜を用いることが最も好ましく、羊膜以外にも分解性人工基質として天然材料であるコラーゲン膜、ゼラチン膜、キチン膜、キトサン膜、アルジネート膜、ヒアルロン酸膜とこれらの誘導体を用いて製造した膜が用いられ得、合成基質としてPLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))膜、PGA(polyglycolic acid)膜、PLA(poly(lactic acid))膜などが用いられ得る。前記膜は治療のために培養された細胞からなる組織を移植してから除去しなければならない煩わしさを考慮すると、生体吸収材料を用いることが好ましく、特に、分解生成物が炎症反応を起こさない生体親和性の高いものが好ましい。
【００２５】
また、前記本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置には、図１ｆに示すように、第１部材(１５) の突出部と第２部材(１６) の受容部との間に中間輪(１７)が挿入され得る。このように中間輪が挿入された本発明の第２態様による細胞培養用膜の支持装置は、特に、目を瞬きする時のような乾燥状態(目を開けている場合)と湿潤状態(目をつぶっている場合)が反復的に起る環境で角膜細胞を培養して角膜を再構成することに有用である。
【００２６】
図１ｇは、本発明の第２態様による装置の側面分離図であり、第１部材(１５)の突出部と第２部材(１６) の受容部との間に中間輪(１７)が挿入される際の、細胞培養用膜の位置を示し、図１ｈは本発明の第２態様による細胞培養用膜の支持装置を製造し得る設計図が各部位の大きさ(気液界面：ｍｍ)と共に示されている。
【００２７】
本発明の第２態様による支持装置を用いた具体的な角膜細胞の培養方法は次のようである。まず、羊膜の上皮面上に角膜上皮細胞を接種して液体培養した後、第２部材(１６)を除去する。第２部材(１６)を除去しても中間輪(１７)と第１部材(１５)によって羊膜が依然として固定された状態で存在するようになり、第１部材(１５)の脚(１３)が底部へ向かうように置けば、周りには羊膜の表面の周りには障壁が存在しないようになる。これは図１ｇにおいて第２部材(１６)を除去した状態で中間輪(１７)と結合された第１部材(１５)を逆に覆した場合に該当する。このようにすれば、本発明の第１態様による装置において羊膜の周りに第１部材又は第２部材による壁が存在することとは異なって、羊膜の周りに壁が存在しなくなって培地が羊膜表面にさらに容易に接触できるようになる。以後、中間輪と結合された第１部材を培養容器の壁面の一方に片寄るようにした後、流動培養する。流動培養をする場合、羊膜上の角膜上皮層は培地への浸漬及び空気への露出を繰り返すことになるが、このような培養環境は角膜上皮細胞の実際の環境と類似するので、角膜上皮層を容易に再構成できる。
【００２８】
一方、本発明は前記細胞培養用膜の支持装置を用いて、膜で目的とする細胞を培養(組織を再構成)する方法を提供する。このような方法を用いることによって、例えば角膜上皮層、単層の繊維芽細胞と角膜上皮層を再構成することができ、実際の角膜と類似の構造の角膜の部分層又は全層を再構成することができる。
【００２９】
本発明による支持装置に膜を固定させて皮膚、角膜、粘膜などの組織を再構成してから培養組織を移植する場合は、第１部材及び第２部材を分離して再構成された組織を移植すればよい。
【００３０】
本発明による装置を用いた細胞培養方法は静置培養だけでなく、傾斜振動培養(Tilting dynamic culture)のような動的培養又は流動培養を可能にして分化誘導期間を短縮させ得るだけではなく、実際組織と類似の基底層が得られるという長所があり、特に、角膜と同様に頑丈な基底膜が必要な組織構成に有利である。即ち、動的培養方法は拡散による培地栄養分を供給する静置培養より羊膜上の細胞に新鮮な培地内の栄養分供給を円滑にして頑丈な基底層と短時間で目的とする細胞層が得られるという長所がある。
【００３１】
図７は、本発明による装置を用いた流動培養方法の模式図を示す。図７において攪拌装置を、羊膜を固定した支持装置が動かないほどに遅い速度で動かせば、羊膜下の培地が動きながら羊膜上の細胞に栄養分を円滑に供給できるようになる。そのため、拡散によって培地が羊膜に供給される既存の静置培養より円滑に培地供給を行うことができる。
【００３２】
具体的な流動培養条件は、培養する細胞の種類によって異なるが、支持装置が動かない程度である６〜１０ｒｐｍの速度で３日〜１２日間培養することが好ましい。
【００３３】
さらに、本発明の細胞培養方法を用いることによって基底膜として用いられ得る羊膜やコラーゲン膜などを支持して上皮細胞を培養、分化させることによって培養し難い上皮細胞の毒性モデルを作り得るだけではなく、実際の角膜と類似する全層角膜を再構成することができる。
【００３４】
本発明の一実施例では前記装置を用いて羊膜の間質面(stromal side)に単層の角膜繊維芽細胞を培養し、羊膜の上皮面(epithelial side)には角膜上皮層を再構成した。その結果、図１２のＢに示すように、羊膜上に角膜上皮層がよく形成されていることが分かり、透明な角膜上皮層が得られることが確認できる。また、本発明の支持装置は羊膜だけでなくコラーゲン膜の支持(固定)にも有用であることが確認できる(図１４参照)。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を下記実施例によってより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
【００３６】
＜実施例１＞角膜細胞培養用膜の支持装置の製造
角膜(ｃｏｒｎｅａ)を実際組織と類似する形式に製造することにおいて、角膜細胞培養の基底膜として用いられる羊膜を支持できる角膜細胞培養用の羊膜支持装置を製造した。テフロン（登録商標）(ＴＥＦＬＯＮ商品名)を材質とし、角膜の大きさと培養の容易性を考慮して円型に製造した。前記支持装置の第１部材及び第２部材の内径は角膜の直径(平均：１０ｍｍ、全層角膜移植の場合は中間の７ｍｍ程度の直径の角膜をパンチングして移植)を考慮して１４ｍｍとし、第１部材と第２部材との間に羊膜を固定するために外径は２２ｍｍ(中間輪を第１部材と第２部材との間に挿入する場合には２６ｍｍ)とした。前記支持装置を製造できる設計図を各部位の大きさ(気液界面：ｍｍ)と共に図１ｅ及び図１ｈに示す。気液界面の培養を行うために脚を設け、培地の流動のために脚を３つ備えておき、脚の高さは２ｍｍとした。第１部材と第２部材とが組立てられた支持装置は市販の培養容器を用いるために高さを９ｍｍとした。
【００３７】
＜試験例＞角膜細胞培養用膜の支持装置を用いた細胞培養
＜試験例１＞羊膜の用意
角膜細胞を培養するための膜として羊膜を用いた。羊膜は、血清検査上Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)抗体、性病研究所(ＶＤＲＬ)実験において全て陰性であり、疾患のない健康な産母より帝王切開によって得られた胎盤を生理食塩水で洗浄した後、無菌環境で行う方法で分離した(Jerzy et al., Ann. of Trans., 4:85-90 (1999))。この分離した羊膜は０．３％オフロキサシン(ｏｆｌｏｘａｃｉｎ)を含むリン酸緩衝溶液(ＰＢＳ)で３〜４回洗浄した後、ニトロセルロースメンブラン(NC, Osmonics, U.S.A)に付着させた。
【００３８】
＜１−１＞冷凍保存羊膜の用意
ニトロセルロースメンブラン(NC, Osmonics, U.S.A)に付着させた羊膜を２ｃｍ×２ｃｍに切ってDMEM(Dulbecco's modified essential medium)とグリセロール(Sigma, U.S.A)とを１：１の比率で混合した羊膜保存溶液に入れて−８０℃で保管した。培養のためにまず冷凍保存羊膜を迅速に解凍した。解凍させた羊膜をＰＢＳで３回洗浄した後、０．０５％トリプシン(Sigma, T-4799, U.S.A)/０．０２％エチレンジアミンテトラアセト酸(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)で３７℃で３０分間処理した後、セルスクレーパー(Cell Scraper; Nunc, 179693, U.S.A)で羊膜上皮細胞を除去した。
【００３９】
羊膜上皮細胞は隙間なく羊膜の表面を不規則的に被っており、このような不規則な羊膜の表面は角膜上皮細胞の付着面を不規則にすることによって羊膜上で他の組織の上皮細胞培養に妨害になるので、平らな培養表面を提供するためには羊膜上皮細胞を除去することが好ましい。
【００４０】
羊膜上皮細胞を除去した羊膜をさらにＰＢＳで３〜４回洗浄した後、前記実施例１で製造した支持装置に固定させて培養に用いた。
【００４１】
＜１−２＞凍結乾燥羊膜の用意
予め洗浄した羊膜を０．０５％トリプシン(Sigma, T-4799, U.S.A)/０．０２％エチレンジアミンテトラアセト酸(Gibco BRL, Cat. No. 11266-012, U.S.A)で３７℃で３０分間処理した後、セルスクレーパー(Nunc, 179693, U.S.A)で羊膜上皮細胞を除去した。羊膜上皮細胞が除去された羊膜をさらにＰＢＳで３〜４回洗浄した。この洗浄した羊膜を８０℃で２４時間凍結後、−８０℃で４８時間凍結乾燥(FREEZE DRY SYSTEM, SAMWON, SFDSM06, KOREA)した。凍結乾燥した羊膜を前記実施例１で製造した支持装置に固定させた後、滅菌(２５ｋＧｙ、グリーンピア、韓国)して培養に用いた。
【００４２】
＜試験例２＞コラーゲン膜の用意
０．３％コラーゲン溶液(BioLand Ltd., Korea)でコラーゲン膜を製造した。まず、目的とするコラーゲン膜の形態と大きさを考慮して円形又は多角形の容器に２ｍｍの高さになるようにコラーゲン溶液を分株し、８０℃で２４時間凍結後、−８０℃で４８時間凍結乾燥してコラーゲンスポンジ(collagen sponge)を製造し、凍結乾燥したコラーゲンスポンジを０．３％コラーゲン溶液に少し濡らして平らな容器に置き、４℃で乾燥してコラーゲン膜を製造した。架橋結合の程度によってコラーゲン膜の分解速度を調節できる。このように製造されたコラーゲン膜を前記実施例１で製造した支持装置に固定した後、滅菌(２５ｋＧｙ、グリーンピア、韓国)して培養に用いた。
【００４３】
＜試験例３＞角膜繊維芽細胞、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞の一次培養
文献(Soverin Karmiol, Methods of Tissue Engineering, Chapeter 2(Cell isolation and selection)、２０頁、Academic Press, 2002)に記述されている組織付着法(Explant culture)の方法によって角膜繊維芽細胞及び角膜上皮細胞、角膜内皮細胞を一次培養した。
【００４４】
具体的な一次培養方法は次の通りである。まず、手術器具を用いてウサギの眼球から角鞏膜切片(cornealscleral button)を得た。前記角鞏膜切片から結膜を完全に除去した後、角膜と鞏膜がそれぞれ１ｍｍが含まれた輪部(limbus)を得た後、残った中央角膜を手術用メスを用いて間質部位を中心に上皮細胞のある層と内皮細胞のある層に分離した。このように分離された三部分の組織から角膜の三種類の細胞を組織付着法を通じて得られた。角膜上皮細胞、角膜繊維芽細胞、角膜内皮細胞をそれぞれ輪部、上皮細胞と角膜間質層を一部含む組織、内皮層と角膜間質層を一部含む組織から得られた。それぞれの組織を２２ｍｍの大きさに切った。角膜上皮細胞は空気と接触している輪部部位を培養容器の方向にして付着させて得られ、角膜繊維芽細胞は上皮細胞と間質層を一部含む組織を、間質層を容器の方向にして付着させて得られた。また角膜内皮細胞は内皮細胞を容器の方向にして付着させて得られた。付着させた組織は組織が完全に乾燥しないように培養培地を少量入れてひと晩培養した。翌日培地を添加し、３日に一回ずつ培地を入れ替えながら約７日〜１０日間培養した。付着させた組織から細胞が組織周辺に広がって培養されて一次細胞が得られた。角膜上皮細胞の培養培地はHCGS(Human corneal growth supplement; Cascade Biologics, U.S.A.)と０．０６ｍＭ ＣａＣｌ２を加えたEpiLife(Cascade Biologics, U.S.A))を用いた。ＨＣＧＳにはヒドロコーチゾン(hydrocortisone) ０．１８μｇ／ｍｌ、トランスフェリン(transferrin) ５μｇ／ｍｌ、ウシ脳下垂体抽出物(bovine pituitary extract; BPE) ０．２％ｖ／ｖ及びマウス上皮成長因子（ｍＥＧＦ）１μｇ／ｍｌ含有させた。
【００４５】
角膜繊維芽細胞の培養培地は牛胎児血清(FBS; GIBCO, U.S.A.)が１０％加えられたＤＭＥＭ培地(Dulbecco's modified Eagle's medium; GIBCO, U.S.A.)を用い、角膜内皮細胞培養培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地(Opti minimal essential medium; GIBCO)にＦＢＳ８％、 EGF(Sigma, U.S.A.)１０ｎｇ／ｍｌ、神経成長因子(NGF; R&D, U.S.A.)２０μｇ／ｍｌ、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF; Sigma, U.S.A.)１０ｎｇ／ｍｌ、ＲＰＭＩビタミン混合物(RPMI vitamin mixer; Sigma, U.S.A.)１％ｖ／ｖ、アスコルビン酸(Sigma, U.S.A.)５μｇ／ｍｌ、昆虫脂質(insect lipid; Sigma, U.S.A.)０．２ｍｇ／ｍｌ、 CaCl2(GIBCO) ０．２ｍｇ／ｍｌ、CaCl2(GIBCO)０．２ｍｇ／ｍｌ及びコンドロイチンスルファート(chondrotin sulfate; Sigma, U.S.A.)０．０８％を添加した培地を用いた。
【００４６】
＜試験例４＞３世代細胞を用いた角膜上皮層の再構成
培養容器で組織付着法で一次細胞を得た。この一次細胞の量によって１：２又は１：３で継代培養して５〜７日後２世代細胞を得、約１：４で継代培養して４〜６日後３世代細胞を得た。このようにして得た３世代細胞を角膜上皮層の再構成に用いた。
羊膜上に３世代角膜上皮細胞５×１０５個を接種した。１〜２日間液体培養した後、６日間気液界面培養して角膜上皮層を再構成した。培地はＨＣＧＳ(Human corneal growth supplement)を添加したＥｐｉＬｉｆｅ(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。
【００４７】
再構成された角膜上皮層に対して下記＜試験例９＞の組織学検査を行って、その結果を図３〜図６に示す。
図３は、再構成された角膜上皮層のＨ／Ｅ染色写真で、３日間気液界面培養を行った上皮層(Ａ)では接種した細胞が安定化されて２〜３層の上皮細胞がよく付着していることが確認でき、６日間気液界面培養を行った上皮層(Ｂ及びＣ)は実際の角膜の上皮層と類似する形態が確認できた。
【００４８】
一方、図４は再構成された角膜上皮層のＡＥ５で免疫組織化学染色した写真である。凍結乾燥羊膜でそれぞれ３日、６日間気液界面培養したもの(Ａ及びＢ)と冷凍保存羊膜で６日間気液界面培養した上皮層(Ｃ)の表面細胞(superficial cell)は、角膜上皮層の分化がよく行われて角膜の表面細胞と類似する形態が確認できた。
また、図５は、再構成された角膜上皮層をPCNA(proliferating cell nuclear antigen)で免疫組織化学染色した写真で、実際の角膜(Ｄ)から基底層付近に増殖能力の活発な細胞が観察されたように、羊膜で培養された角膜上皮細胞(Ａ〜Ｃ)も実際の角膜上皮細胞のように増殖能力が活発であることが確認できる。
【００４９】
さらに、図６は、再構成された角膜上皮層の透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)の写真で、冷凍保存羊膜(Ａ)と凍結乾燥羊膜(Ｄ)上に角膜上皮層がよく付着していることが確認でき、ヘミデスモゾーム(hemidesmosome)の形成から羊膜に角膜上皮細胞がよく付着していることが分かるだけではなく(Ｂ及びＥ)、デスモゾームの形成から細胞の間の交流が円滑に行われることが確認できる(Ｃ及びＦ)。
【００５０】
＜試験例５＞流動培養方法を用いた角膜上皮層の再構成
羊膜上に３世代と解凍した４世代の角膜上皮細胞５×１０５個を接種した。解凍した４世代の細胞は、３世代の細胞をＥｐｉＬｉｆｅ、血清、凍結細胞保護剤(Dimethyl sulfoxide(DMSO))をそれぞれ８：１：１で混合した後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で凍結保存した細胞を迅速に解凍した後、増殖させて得られた。１〜２日液体培養した後、９日間流動培養、例えば、傾斜振動培養(Tilting dynamic culture, RPM:6)を用いて気液界面培養して角膜上皮層を再構成した。培地はＨＣＧＳを添加したＥｐｉＬｉｆｅ(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。
【００５１】
再構成された角膜上皮層に対して下記＜試験例９＞の組織学検査を行って、その結果を図８〜図１０に示す。
【００５２】
図８は、流動培養方法を用いて羊膜上でそれぞれ９日(Ａ、Ｂ)、６日(Ｃ、Ｄ)間再構成した角膜上皮層のＨ／Ｅ染色写真である。図８のＡとＢとを比較してみる際、流動培養方法が静置培養に比べ、同一の期間中により多い角膜上皮層に培養されることが分かる。これは、流動培養が静置培養より羊膜上の角膜上皮細胞に培地の栄養分と酸素を円滑に供給して上皮細胞の成長と分化を促進するためである。図９のＣとＤとの比較によってこのような傾向が分かる。図９のＣとＤは解凍した４世代の角膜上皮細胞にて羊膜上で角膜上皮層をそれぞれ静置培養と流動培養で再構成したものを示す。通常、細胞を液体窒素で保存してから解凍する場合、貯蔵と解凍の方法によって異なるが、細胞が損傷を被るようになり、このように損傷を被った細胞に栄養分を充分に供給できる流動培養法を利用すれば、図９のＤのように角膜上皮層と同様な上皮層を再構成できる。静置培養では角膜上皮層を殆ど再構成できなかったが(図９のＣ参照)、流動培養を通じては実際の角膜の基底層と類似する角膜上皮層が得られた。
【００５３】
また、図１０は、流動培養方法を用いて羊膜上で再構成された角膜上皮層のＰＣＮＡ免疫組織化学染色写真で、図５のＢと比べて見れば、増殖能力に優れた能力を有する細胞が流動培養で得た上皮層の基底層に存在することが分かる。
【００５４】
＜試験例６＞羊膜の間質面と上皮面に単層の角膜繊維芽細胞と角膜上皮層の再構成
凍結乾燥羊膜の間質面(stromal side)に細胞を培養する場合は、羊膜のスポンジ層(Spongy layer)と母細胞層(Fibroblast layer)を除去してから培養しなければならない。羊膜の層は上皮面(epithelial side)から上皮層、基底膜、緻密層(Condense layer)、母細胞層、スポンジ層からなる。特に、間質面のスポンジ層は絨毛膜と付着される部位であって粘液性であるため、細胞が付着できずに球形の状態で途中壊死する。そのため羊膜の間質面に培養する際、羊膜の処理が重要である。従って、スポンジ層及び母細胞層が除去された凍結乾燥羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞２×１０５個を接種した後、５日間培養した。５日間培養した後、羊膜を覆して上皮面に５×１０５個の上皮細胞を接種し、２日間培養した後、６日間気液界面培養した。
【００５５】
培養した後＜試験例９＞の組織学検査を行って、その結果を図１１及び図１３に示す。
図１１は、羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮層を再構成したＨ／Ｅ染色写真で、Ａは静置培養、Ｂは流動培養で培養した写真である。本発明による支持装置によって羊膜の両面に二つの角膜細胞を容易に培養し得ることが分かる。
【００５６】
一方、図１３は、羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮層を再構成したＴＥＭ写真で、細胞間のデスモゾーム(Ａ及びＣ)と羊膜と角膜上皮細胞間のヘミデスモゾーム(Ｂ及びＤ)が観察できるため、これから再構成された角膜上皮層は細胞と細胞間の結合及び羊膜と角膜上皮細胞間の結合が非常によく行われていることが分かる。
【００５７】
＜試験例７＞コラーゲン膜を用いた皮膚表皮層の再構成
角質形成細胞の一次培養には酵素分解法(enzymatic digestion)を利用した。表皮組織(ｆｏｒｅｓｋｉｎ)をそれぞれカルシウムアセテート緩衝溶液（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０  ｍＭ カルシウムアセテート、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）に溶かしたコラゲナーゼ(ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ)溶液３ｍｇ(１０００Ｕ)／ｍＬとＰＢＳに溶かしたディスパーゼ(ｄｉｓｐａｓｅ)溶液１ｍｇ(１．５Ｕ)／ｍＬ、及び０．０５％トリプシン酵素溶液を用いた。角質形成細胞培養には角質形成細胞の分化と線維芽細胞の汚染を防ぐためにヒドロコーチゾン、インシュリン、トリヨードチロニン(triiodothyronine)など角質形成細胞の特異的成長ホルモン(keratinocyte specific growth hormone)を加えた、低いＣａ２＋濃度のＫ−ＳＦＭ(serum-free keratinocyte medium, Gibco. Cat.# 320-7005PJ)にEGF(epidermal growth factor, 5.0  g/L)とＢＰＥ(bovine pituitary extract, 50 mg/L)を添加した培地を用いた。一次培養で得た角質形成細胞を１：４の２回の継代培養を通じて３世代細胞を得た。コラーゲン膜の上に３世代角質形成細胞を５×１０５個接種した。１〜２日間液体培養した後、７日間気液界面培養して皮膚表皮層を再構成した。再構成された皮膚表皮層に対して下記＜試験例９＞の組織学検査のうち、Ｈ／Ｅ染色を行ってその結果を図１４に示す。図１４から分かるように、コラーゲン膜上で再構成された皮膚表皮層が得られた。
【００５８】
＜試験例８＞中間輪が挿入された支持装置に固定された羊膜における角膜上皮層の再構成
中間輪が挿入されて支持装置に固定された羊膜上皮面上に解凍した４世代の角膜上皮細胞５×１０５個を接種し、１〜２日間液体培養した。培地はＨＣＧＳ(Human corneal growth supplement)を添加したＥｐｉＬｉｆｅ(Cascade Biologics, U.S.A)を用いた。その後、中間輪の挿入された支持装置より第２部材を除去し、中間輪と結合された第１部材を脚を底面に向かうようにして培養容器の壁面の一方に片寄るように位置づけ、６ｒｐｍの速度で６日間流動培養した。
【００５９】
再構成された角膜上皮層に対して下記＜試験例９＞の組織学検査のうち、Ｈ／Ｅ染色を行ってその結果を図１５に示す。図８のＣ及びＤの写真と比べても図１５の角膜上皮層が実際の角膜と類似する形態で再構成されていることが確認できた。
【００６０】
＜試験例９＞組織学検査
組織学検査は組織検査学(全国臨床病理教授協議会、高麗医学、１９９２)と病理組織特殊染色図鑑(キム・ジュホ、シングァン出版社、１９９３)を参考して行った。
(１)ヘマトキシリン／エオシン染色(hematoxlyn/eosin(H/E) staining)
標本を４％ホルムアルデヒド溶液でしょりした後、パラフィンで固定したものを切断して得た切片をヘマトキシリン−エオシン染色を行った。
【００６１】
(２)ＡＥ５染色
標本を４％ホルムアルデヒド溶液で処理した後、パラフィンに固定したものを切断して得た切片を角膜上皮細胞の分化特異的蛋白質であるＡＥ５で染色した。この染色を通じて再構成された角膜上皮層が正しく分化されたかを観察した。
(３)ＰＣＮＡ染色
標本を４％ホルムアルデヒド溶液で処理した後、パラフィンで固定したものを切断して得た切片をＰＣＮＡ染色を行う。この染色を通じて増殖能のある細胞を観察した。
【００６２】
(４)電子顕微鏡検査
羊膜上皮細胞を除去した羊膜と除去していない羊膜の表面と断面、再構成された角膜上皮層の断面を電子顕微鏡で観察した。４％グルタールアルデヒドと２％ホルムアルデヒドで組織を固定した後、２％オスミウムテトロキシド(osmium tetroxide)で再固定した。再固定された組織を脱水した後、コーティングして走査電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope(SEM), JSM-35CF, Jeol, Japan)と透過電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope(TEM), JEM-200CX, Jeol, Japan)で観察した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する斜視図(図１ａ)を示す。
【図１ｂ】本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する側面分離図(図１ｂ)を示す。
【図１ｃ】本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する平面図(図１ｃ)を示す。
【図１ｄ】本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する側面結合図(図１ｄ)を示す。
【図１ｅ】本発明の第１態様による細胞培養用膜の支持装置に対する設計図(図１ｅ)を示す。
【図１ｆ】本発明の第２態様による細胞培養用膜の支持装置に対する斜視図(図１ｆ)を示す。
【図１ｇ】本発明の第２態様による細胞培養用膜の支持装置に対する側面分離図(図１ｇ)を示す。
【図１ｈ】本発明の第２態様による細胞培養用膜の支持装置に対する設計図(図１ｈ)を示す。
【図２】本発明の第１態様によって円型(ｒｉｎｇ ｔｙｐｅ)に製造された支持装置の写真(Ａ)であって、支持装置によって固定される膜が凍結乾燥羊膜である場合(Ｂ)と冷凍保存羊膜である場合(Ｃ)とをそれぞれ例として示す。
【図３】本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、これをヘマトキシリン／エオシン(Ｈ／Ｅ)(ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ)で染色した写真を示す。      Ａ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を３日間行った    Ｂ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｃ：冷凍保存羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｄ：実際ウサギ角膜の上皮層
【図４】本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、これを角膜上皮細胞の分化特異蛋白質であるＡＥ５で免疫組織化学染色した写真を示す。      Ａ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を３日間行った    Ｂ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｃ：冷凍保存羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｄ：実際ウサギ角膜の上皮層
【図５】本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、これをＰＣＮＡ(proliferating cell nuclear antigen)で免疫組織化学染色した写真を示す。      Ａ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を３日間行った    Ｂ：凍結乾燥羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｃ：冷凍保存羊膜上で気液界面培養を６日間行った    Ｄ：実際ウサギ角膜の上皮層
【図６】本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、透過電子顕微鏡(ＴＥＭ)で観察した写真である。      Ａ：冷凍保存羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(基底層)    Ｂ：冷凍保存羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(ヘミデスモゾーム)    Ｃ：冷凍保存羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(デスモゾーム)    Ｄ：凍結乾燥羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(基底層)    Ｅ：凍結乾燥羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(ヘミデスモゾーム)    Ｆ：凍結乾燥羊膜上で培養した角膜上皮層のＴＥＭ写真(デスモゾーム)
【図７】本発明による装置を用いた流動培養方法の模式図である。
【図８】流動培養方法を用いて本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、Ｈ／Ｅで染色した写真を示す。      Ａ：９日間静置培養で気液界面培養した    Ｂ：９日間流動培養で気液界面培養した    Ｃ：解凍した細胞を用いて６日間定置培養で気液界面培養した    Ｄ：解凍した細胞を用いて６日間流動培養で気液界面培養した
【図９】流動培養方法を用いて本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、ＡＥ５で免疫組織化学染色した写真を示す。      Ａ：６日間流動培養で気液界面培養した    Ｂ：９日間流動培養で気液界面培養した
【図１０】流動培養方法を用いて本発明の第１態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮細胞を培養した後、ＰＣＮＡで免疫組織化学染色した写真を示す。      Ａ：６日間流動培養で気液界面培養した    Ｂ：９日間流動培養で気液界面培養した
【図１１】本発明の第１態様による装置を用いて羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮細胞を培養した後、Ｈ／Ｅで染色した写真を示す。      Ａ：静置培養で培養した    Ｂ：流動培養で培養した
【図１２】本発明の第１態様による装置を用いて羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮細胞を培養した後の写真を示し、培養後のデジタル写真(Ａ)及び第１部材及び第２部材を除去した後の写真(Ｂ)を示す。
【図１３】本発明の第１態様による装置を用いて羊膜の間質面に角膜繊維芽細胞を単層培養し、上皮面には角膜上皮細胞を培養した後、ＴＥＭで観察した写真である。      Ａ：静置培養で培養した    Ｂ：流動培養で培養した
【図１４】本発明の第１態様による装置に固定されたコラーゲン膜上で皮膚表皮細胞を培養した後、これをＨ／Ｅで染色した写真を示す。
【図１５】本発明の第２態様による装置に固定された羊膜上で角膜上皮層を培養した後、これをＨ／Ｅで染色した写真を示す。
【図１ａ】
2005348736.tif 000003
【図１ｂ】
2005348736.tif 000004
【図１ｃ】
2005348736.tif 000005
【図１ｄ】
2005348736.tif 000006
【図１ｅ】
2005348736.tif 000007
【図１ｆ】
2005348736.tif 000008
【図１ｇ】
2005348736.tif 000009
【図１ｈ】
2005348736.tif 000010
【図２】
2005348736.tif 000011
【図３】
2005348736.tif 000012
【図４】
2005348736.tif 000013
【図５】
2005348736.tif 000014
【図６】
2005348736.tif 000015
【図７】
2005348736.tif 000016
【図８】
2005348736.tif 000017
【図９】
2005348736.tif 000018
【図１０】
2005348736.tif 000019
【図１１】
2005348736.tif 000020
【図１２】
2005348736.tif 000021
【図１３】
2005348736.tif 000022
【図１４】
2005348736.tif 000023
【図１５】
2005348736.tif 000024