(57)【要約】【課題】これまでにはない新たな性質を有するタンパク質を得るために、天然に存在するアミノ酸とは異なった構造を有する新規な非天然アミノ酸を得ることが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、新規な非天然ヒスチジンアナログであるβ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンが与えられた。またヒスチジン要求性の大腸菌を用いて、当該新規アミノ酸をタンパク質（キチンバインディングドメイン）に導入することに成功した。本発明の非天然ヒスチジンアナログは、タンパク質に新たな機能を付与するための新たなツールを与えるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式
【化１】
2005075765.tif 000005
からなる構造を有することを特徴とするアミノ酸。
【請求項２】
下記の化学式
【化２】
2005075765.tif 000006
からなる構造を有するアミノ酸を製造する方法。
【請求項３】
下記の化学式
【化３】
2005075765.tif 000007
からなる構造を有するアミノ酸が導入されたことを特徴とする蛋白質。
【請求項４】
下記の化学式
【化４】
2005075765.tif 000008
からなる構造を有するアミノ酸が導入された蛋白質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記の化学式
【化１】
2005075765.tif 000002
からなる構造を有することを特徴とするアミノ酸に関する。即ち、本発明は新規の非天然ヒスチジンアナログである、β-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然のタンパク質は２０種類のアミノ酸から構成されており、それら２０種類のアミノ酸中には酸として機能するもの、塩基として機能するもの、疎水性のもの、親水性のものなどがある。それらが巧みな配列と高次構造を構成することにより、タンパク質は様々な機能を担っている。このアミノ酸配列を人工的に設計することにより、またランダム変異によりin vivo又はin vitro選択などを行うことにより、タンパク質をエンジニアリングすることが最近盛んに行われている。
【０００３】
しかしながら、天然に存在するアミノ酸だけではアミノ酸の化学的性質（酸性・塩基性の強さ）に限界があるため、酵素活性のpH依存性や温度依存性の向上または変化を試みても限界があると考えられる。そこで近年天然に存在しないアミノ酸の合成なども試みられており、その一環として、米国などを中心にヒスチジンのアナログなどが報告されている。下記の実施例において使用したヒスチジン(化合物1)及びそのアナログ(化合物2〜5)の構造を図１に示す。
【０００４】
例えば図1の化合物(3)のアミノ酸については１９５５年にアメリカで特許が取得されており（米国特許番号 2,719,849：特許文献１）高血圧の薬の中間体として有用であると言われている。また、図1の化合物(4)のアミノ酸についてはN-methyl-D-aspartate(HMDA) receptor の拮抗薬としての可能性が示唆されている（Bioorganic & Medical chemistry letters (1993) 3 (1) 43-48.：非特許文献１）。
【０００５】
【特許文献１】米国特許番号 2,719,849
【非特許文献１】Bioorganic & Medical chemistry letters (1993) 3 (1) 43-48.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明者は、タンパク質の機能を改変するための新たなツールを得るために、天然には存在しないアミノ酸を設計して合成することを考えた。よって天然に存在するアミノ酸とは異なった化学構造を有する、新規な非天然のアミノ酸を得ることが本発明の課題である。更に、そのようにして得られた非天然のアミノ酸をタンパク質中に導入することにより、タンパク質に新たな機能を付与する途を開くこともまた本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
よって本発明により、新規な非天然ヒスチジンアナログであるβ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンが与えられた。当該アミノ酸は、ヒスチジンよりも酸として強いアナログを提供するものである。また、大腸菌によるシステムを用いて、当該新規アミノ酸をタンパク質（キチンバインディングドメイン）に導入することに成功した。
【発明の効果】
【０００８】
ヒスチジンは酸解離定数が７であり、様々なタンパク質において酸・塩基触媒として働いており、ヒスチジンのイミダゾール基は種々の酵素において重要な役割を果たしている。本発明の非天然ヒスチジンアナログは、天然のヒスチジンのイミダゾール環（窒素原子２つ）をトリアゾール環（窒素原子３つ）にしたものであって構造が非常によく似ている。よって、本発明の非天然ヒスチジンアナログをタンパク質中に導入しても、その構造をほとんど歪めないと考えられる。本発明の新規ヒスチジンアナログに含まれるトリアゾール環はイミダゾール環に比べて酸性が強く（pKa=2）、酸触媒としての機能が強い。よって、タンパク質中においてヒスチジンが酸として働いている部分に本発明のヒスチジンアナログを導入すれば、その活性が上がると考えられる。天然のヒスチジン（化学式２）と本発明の新規ヒスチジンアナログ（化学式３）の構造を示す。
【０００９】
【化２】
2005075765.tif 000003
【００１０】
【化３】
2005075765.tif 000004
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の非天然ヒスチジンアナログであるβ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンは、好ましくは図２に示す合成スキームにより合成される。しかし合成スキームはそれに限定されるものではなく、化学合成の分野で通常に行われる種々の改変した方法を用いることも当然に可能である。よって当業者の創意工夫によって種々の合成方法の改変や改良を行うことも、本発明の範囲内であると解されるべきである。
【００１２】
また、下記の実施例において、本発明の非天然ヒスチジンアナログであるβ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンを、ヒスチジン要求性の大腸菌の系を用いて、タンパク質であるキチンバインディングドメインに導入している。本発明の非天然ヒスチジンアナログを導入するタンパク質はキチンバインディングドメインに限定されるものではなく、その目的に応じて種々のタンパク質中に本発明の非天然ヒスチジンアナログを導入することが可能である。
【００１３】
非天然アミノ酸を導入するために利用できる方法はいくつか存在する(Liu, D. R., Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4780-4785； Kochendoerfer, G. G., Kent, S. B. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol., 3, 665-671; Sisido, M., Hohsaka, T. (1999) Bull. Chem. Soc. Jpn., 72, 1409-1425)。また、天然のアミノ酸の他にいくつかのアナログをタンパク質に導入した例が報告されている(Koide, H., Yokoyama S., Katayama, Y., Muto, Y., Kigawa, T., Kohno, T., Takusari, H., Oishi, M., Takahashi, S., Tsukumoto, K et al. (1994) Biochemistry., 33, 7470-7476; Koide, H., Yokoyama S., Kawai, G., Ha JM., Oka, T., Kawai, S., Miyake, T., Fuwa, T., Miyazawa, T. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.., 85, 6237-6241; van Hest, J. C. M., Kiick, K. L., Tirrell, D. A. (2000) J. Am. Chem. Soc., 122, 1282-1288)。そして、翻訳されたタンパク質について検討されたところ、非天然のアミノ酸は天然のアミノ酸を類似した構造を示したという報告がされている(van Hest, J. C. M., Kiick, K. L., Tirrell, D. A. (2000) J. Am. Chem. Soc., 122, 1282-1288)。
【実施例】
【００１４】
以下の実施例は、本発明の範囲をいかなる意味においても限定するものではない。なお、本実施例において使用した試薬、および使用した実験条件は以下のとおりである。また下記の実施例１の合成例において各化合物に付与した番号は、図２の合成スキームにおける化合物の番号である。
（ａ）DCC (2.2当量), MeOH (1.5当量), CH2Cl2, 室温, 12時間
（ｂ）LiBH4 (0.5当量), THF還流, 3時間
（ｃ）TBDMSCl (1.5当量), imidazole (2.0当量), DMF, 室温, 24時間
（ｄ）n-BuLi (0.95当量), トリメチルシリルジアゾメタン (1.2当量), Et2O, 0℃, 3時間
（ｅ）TBAF (2.2当量), THF, 室温, 2時間
（ｆ）PDC (3.5当量), DMF, 室温, 24時間
（ｇ）TFA, CH2Cl2, 室温, 12時間, Dowex 50WX-200. 
【００１５】
（実施例１：β-1,2,3-(トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンの合成
(1) 2L-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-シアノ-プロピオン酸メチルエーテル：化合物7の合成
N-α-Boc-L-アスパラギン(化合物6)（1.54 g, 6.65 mmol） を CH2Cl2 (15 mL) に溶解させDCC (3.02 g, 14.6 mmol)を加えた。室温で６時間撹拌した後、メタノール(400μL, 9.98 mmol)を加え、さらに６時間撹拌した。 不溶のジシクロヘキシルウレアをろ過して除き、5% NaHCO3 で洗浄した。その後、飽和食塩水と水で洗いエバポレーションで溶媒を除き、カラムで精製して化合物7を1.06 g (70%) 得た。
1H NMR (CDCl3):δ1.41 (s, 9H, C(CH3)3); 2.92 (dd, J = 16.8, 5.3, 2H, CH2CN); 3.79 (s, 3H, CH3); 4.49 (m, 1H, CH2CH); 5.55 (m, 1H, NH).  13C NMR (CDCl3) :δ21.9, 28.4, 50.4, 53.5, 81.1, 116.5, 155.1, 169.7.  IR (KBr): 3350 br (NH); 2253 (CN); 1739 (C=O, エステル); 1678 (C=O, カルバメート). HRMS found 229.1179.  Calcd for (MH+) C10H17N2O4: 229.1187.
【００１６】
(2) 2L- tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-シアノ-プロパノール：化合物8の合成
2L-タート-ブトキシカルボニルアミノ-3-シアノ-プロピオン酸メチルエーテル(化合物7)(1.48 g, 6.51 mmom) をTHF (6.8 mL)に溶解させLiBH4 (70.8 mg, 3.23 mmol) を窒素雰囲気下で加え、３時間還流させて反応させた。３時間後、冷却して2 M KHSO4を用いて酸性にした（pH4）。ろ過した後、溶媒をエバポレーションで除いた。残留物をCHCl3 で抽出した後に水で洗浄した。エバポレーションで溶媒を除き、カラムで精製して化合物8を1.17 g (90%) 得た。
1H NMR (CDCl3):δ1.44 (s, 9H, C(CH3)3); 2.22 (br s, 1H, CH2OH); 2.71 (m, 2H, CH2CN); 3.77 (dd, J = 10.9, 4.1, 2H, CH2OH); 3.93 (m, 1H, CH2CH); 5.12 (m, 1H, NH).  13C NMR (CDCl3):δ20.3, 28.5, 49.0, 62.9, 80.6, 117.9, 155.7.  IR (KBr)/ cm-1: 3339 br (NH); 2253 (CN); 1695 (C=O). HRMS found MH+ 201.1264. C9H17N2O3 requires 201.1238.
【００１７】
(3) 2L-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-シアノ-プロピル-tert -ブチルジメチルシリルエーテル：化合物9の合成
2L-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-シアノ-プロパノール(化合物8)(1.17g, 5.86 mmol)をDMFに溶解させ、tert-ブチルジメチルクロロシラン (1.32 g, 8.79 mmol)とイミダゾール (798 mg, 11.72 mmol)を加え一日撹拌した。溶媒をエバポレーションで除き、残留物をCHCl3 に溶解させた後、水で洗浄した。エバポレーションで溶媒を除きカラムで精製して化合物9を1.44 g (78%) 得た。
1H NMR (CDCl3) :δ0.06 (s, 6H, Si(CH3)2); 0.87 (s, 9H, SiC(CH3)3); 1.42 (s, 9H, C(CH3)3); 2.61 (d, J = 6.6, 2H, CH2CN); 3.68 (dd, J = 10.1, 5.0, 2H, CH2OSi); 3.92 (m, 1H, CH2CH); 4.83 (m, 1H, NH).  13C NMR (CDCl3) :δ5.7, 18.0, 19.9, 25.7, 28.2, 48.6, 63.1, 79.6, 117.2, 154.8.  IR (KBr) : 3358 br (NH); 2251 (CN); 1718 (C=O). HRMS found 314.2034.  Calcd for (MH+) C15H30N2O3Si1: 314.2024.
【００１８】
(4) 2DL-tert-ブトキシカルボニルアミノ -(4-トリメチルシリル-1,2,3-トリアゾール-5-イル)-プロピル-tert-ブチルジメチルシリルエーテル：化合物10の合成
2.73 ml (4.34 mmol) の n-ブチルリチウム (1.59 M ヘキサン溶液) を トリメチルシリルジアゾメタン (2.0 M ヘキサン溶液, 2.74 mL, 5.48 mmol) のジエチルエーテル (28 mL)溶液に、0 ℃で滴下した。 その後２０分間攪拌し、更に化合物9 (1.44 g, 4.57 mmol) のジエチルエーテル (14 mL)溶液を0 ℃で滴下し、3時間撹拌した。３時間後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテル層を水で洗い、その後、エバポレーションで溶媒を除きカラムで精製して化合物10を1.47 g (75%) 得た。
1H NMR (CDCl3) :δ0.02 (s, 6H, Si(CH3)2); 0.35 (s, 9H, Si(CH3)3); 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3); 1.34 (s, 9H, C(CH3)3); 3.00 (dd, J = 15.0, 5.4, 2H, CH2C=C); 3.62 (dd, J = 9.9, 6.0, 2H, CH2OSi); 3.95 (m, 1H, CH2CH); 5.34 (m, 1H, NH). 13C NMR (CDCl3) :δ 5.5, -1.0, 18.2, 25.9, 27.5, 28.3, 52.2, 58.1, 64.3, 79.0, 155.6.  IR (KBr) : 3134 br (NH); 1716 (C=O); 1687 (C=N). HRMS found MH+ 429.2678.  Calcd for C19H41N4O3Si2: 429.2715.
【００１９】
(5) 2DL-tert-ブトキシカルボニルアミノ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-プロパノール：化合物11の合成
2DL-tert-ブトキシカルボニルアミノ -(4-トリメチルシリル-1,2,3-トリアゾール-5-イル)-プロピル-tert-ブチルジメチルシリルエーテル(化合物10) (1.46 g, 3.23 mmol) をTHF (7.1 mL)に溶解させ、TBAF (1.0 M THF 溶液, 7.1 mL, 7.1 mmol)を加え2 時間撹拌した。エバポレーションでTHFを除き、アンモニウム塩をイオン交換カラム（Dowex 50WX-200 イオン交換樹脂）で除き、カラムで精製して化合物11を得た(81 %)。
1H NMR (CDCl3) :δ1.32 (s, 9H, C(CH3)3); 2.98 (d, J = 6.6, 2H, CH2C=C); 3.57 (d, J = 3.9, 2H, CH2OH); 3.88 (m, 1H, CH2CH); 5.48 (m, 1H, NH); 7.55 (s, 1H, C=CH).13C NMR (CDCl3) :δ 28.5, 52.2, 63.4, 80.1, 110.0, 156.4. IR (KBr)/ cm-1: 3312br (NH / OH); 1685 (C=O / C=N).  HRMS found MH+ 243.1455. C10H19N4O3 requires 243.1453.
【００２０】
(6) N-α-Boc-β-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニン：化合物12の合成
2DL-tert-ブトキシカルボニルアミノ-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-プロパノール (化合物11) (634 mg, 2.62 mmol) をDMF (25 mL)に溶解させ、PDC (3.44 g, 9.17 mmol)とセライト(5.1 g)を加えて一日撹拌した。不要物をセライトで除き、エバポレーションで溶媒を除き、化合物12を658 mg（98%）得た。
HRMS found M+ 256.1164. C10H16N4O4 requires 256.1123.
【００２１】
(7) β-1,2,3-(トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンの合成
N-α-Boc-β-(1,2,3-トリアゾール-4-イル)-DL-アラニン(化合物12) (658 mg, 2.57 mmol)をCH2Cl2 に溶解させTFAとアニソールを加え、室温で12 時間撹拌した。溶媒をエバポレーションで除き、ジエチルエーテルで結晶化させるとTFAの塩が得られた。この塩をDowex 50WX-200 ion-exchange-resinで脱塩し、β-1,2,3-(トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンを612 mg（98%）得た。
mp 244-245℃, 1H NMR (D2O)  :δ 3.25 (m, 2H, CH2); 3.95 (dd, J = 6.8, 5.2, 1H, CH); 7.69 (s, 1H, C=CH).  IR (KBr) 3100〜2000 br (NH2); 1597 (C=O); 1549 (C=N).  Anal. Calcd for C5H8N4O2: C, 38.45; H, 5.17; N, 35.89.  Found: C, 38.47; H, 5.12; N, 35.46.  
【００２２】
（実施例２：非天然ヒスチジンアナログのタンパク質への導入）
調製できるタンパク質の量や簡便性、経済性を考え、非天然アミノ酸のタンパク質への導入法として大腸菌の系を用いることを試みた。大腸菌は通常、自身でヒスチジンを合成し、タンパク質中に取り込んでいるが、ヒスチジン欠損株はこの機能を持たない。そこで本発明者らは、今回合成したヒスチジン類似体の構造がヒスチジンに極めてよく似ているため、培地にこれら非天然アミノ酸を加えるだけで導入できないかと考えて検討を行った。そこで本発明者は、キチンバインディングドメインというタンパク質を選択し、このタンパク質に本発明のβ-1,2,3-(トリアゾール-4-イル)-DL-アラニンを導入することを試みた。
【００２３】
（プラスミドの構築）
通常のインバースPCRを用いて発現ベクター断片を調製した。１μｇの合成DNAプライマーを、高発現させるためにtacプロモーターを含んでいる市販のpGEX-4T-3（ファルマシア、アプサラ、スウェーデン）と混合し、Ex.TaqDNAポリメラーゼと共にPCR反応を行った。ここで用いたセンスとアンチセンスのプライマーは、それぞれ5’-GCCAAAGCATATGGGATCCCCGAATTCCCG-3’と 5’-CCGGGATCCCTCTTCATATTTTTCTTCAAGA-3’であった。センスプライマーはEcoRIサイトを有し、アンチセンスプライマーはBamHIサイト（下線）を含んでいた。1%アガロースゲル電気泳動上でPCR産物（ca. 4kbp）が単離され、BamHI とEcoRIで消化された。消化された産物はフェノール／クロロフォルム抽出によって精製し、エタノール沈殿した。
【００２４】
プラスミドベクターpHEX-CBDを下記の様に構築した。市販のCBD発現ベクターであるpTYB1（ニューイングランドバイオラブス、ビバリー、MA）をEx.TaqDNAポリメラーゼ（タカラ）と共にPCR反応を行った。センスとアンチセンスプライマーの配列はそれぞれ、5’-GCGGGATCCACGACAAATCCTGGTGTATC-3’ と5’-CGGAATTCTCATTGAAGCTGCCACAAGG-3’であった。PCR産物を４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動上で単離し、EcoRIとBamHIで消化した。消化した産物をフェノール／クロロホルム抽出で精製し、エタノール沈殿した。沈殿したDNA断片を上記の発現ベクター断片のEcoRIとBamHIサイトに結合させた。
【００２５】
pHEXプラスミドと上記のpHEX-CBDプラスミドを操作するために、大腸菌JM109株を使用した。各々のプラスミドで大腸菌株を形質転換し、アンピシリンンを含んでいるLB上に細菌を置いた。3mlのYT培地中でシングルコロニーを培養し、プラスミドミニプレップキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いてプラスミドを単離した。プラスミドの配列をDNA配列解析によって確認した。
【００２６】
（キチンバインディングドメインの発現）
ヒスチジン要求性のバクテリア発現宿主であるUTH780コンピーテント細胞を、pHEX-CBD発現ベクターで形質転換した。その形質転換体を、20 μg/mlのアンピシリンを添加した5mlの最小培地(１リットルあたり、Fe(NH4)2(SO4)3 10 mg, MgSO4・6H2O 55 mg, KH2PO4 4.4 g, K2HPO4・3H2O 6.0 g, NH4Cl 1.0 g, グルコース6 g, チアミン10 mg, ヒスチジン20 mg, pH7) 中で、600nmにおける濁度（A600）が0.6になるまで37℃でインキュベートした。
【００２７】
3000rpmで10分間遠心分離することによって細菌を回収し、M9培地で２回洗浄し、ヒスチジンを欠く最小培地5mL中に再懸濁した。細胞を37℃で20分間震盪することにより細胞内のヒスチジンを実質的に除去した。そしてヒスチジン又はヒスチジン同等物を培地に添加した。イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG、最終濃度0.4mM）を添加することにより誘導を行い、細菌を更に37℃で４時間培養し、3000rpmで10分間遠心分離することにより回収した。細菌のペレットを、1mlの0.1%(v/v)Triton X-100を含むPBSバッファー（pH 7.4）中に再懸濁し、氷上でソニケートした（50W, 15秒間５回）。ライゼートを12000rpmで1分間遠心分離し、上清中のキチンバインディングドメインタンパク質を下記のようにして検出した。
【００２８】
（野生型と変異したキチンバインディングドメインの検出）
野生型と変異したキチンバインディングドメインが生成していることを、15%ゲル上でSDS-PAGEを行い、次いで抗キチンバインディングドメイン抗体（ニューイングランドバイオラブス）及びアルカリホスファターゼでラベルした抗ウサギIgG抗体を用いたウエスタンブロッティングを行うことにより確認した。一定量（1μL）のライゼートを9μLの水と2xSB（サンプルバッファー；100Mm Tris-HCl, pH6.8, 8%ドデシル硫酸ナトリウム、4% 2-メルカプトエタノール, 24% グリセロール, 0.01%ブロモフェノールブルー）と混合した。この溶液を95℃で５分間インキュベートし、その溶液の5μLをゲル電気泳動にかけ、PVDF膜上に電気ブロットした。膜をトリス緩衝生理食塩水（20 mM Tris/HCl, 150 mM NaClと0.1% Tween-20を含む）中で37℃１時間インキュベートすることにより3%BSAでブロッキングし、同じバッファーで1:5000に希釈した抗キチンバインディングドメイン抗体とインキュベートした。洗浄した後、1:5000で希釈したアルカリホスファターゼ結合抗ウサギIgG抗体とインキュベートし、ウエスタンブルーサブストレート（プロメガ、マジソン、WI）を用いてブロットを可視化した。
【００２９】
図３はヒスチジン及びヒスチジンアナログのタンパク質への取り込みを示す、ブロッティングの写真である。各レーンにおいて、レーン１はIPTGを添加しなかったサンプルであり、レーン２はヒスチジンも本発明のアナログの添加しなかったサンプルの結果であり、レーン３はヒスチジンが添加されたサンプルの結果であり、レーン４、５、６、７は図１の化合物２、３、４、５について解析を行ったサンプルの結果である。図３の写真において、目的アミノ酸の導入は化合物２、３のみに認められた。すなわち、本発明のヒスチジンアナログ（化合物２）について、タンパク質中に効率良く導入されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のヒスチジンアナログは新規な非天然アミノ酸であるが、類似した他のヒスチジンアナログについて医薬として効果が報告されているために、本発明の非天然アミノ酸は医薬として有用である可能性がある。また、本発明の新規ヒスチジンアナログに含まれるトリアゾール環はイミダゾール環に比べて酸性が強く酸触媒としての機能が強いために、本発明のヒスチジンアナログをタンパク質に導入することにより、当該タンパク質の酸触媒活性を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の実施例において使用したヒスチジン及びそのアナログの構造を示した図である。
【図２】図２は、本発明の非天然ヒスチジンアナログの合成スキームを示した図である。
【図３】図３はヒスチジン及びヒスチジンアナログのタンパク質への取り込みを示す、ブロッティングの写真である
【図１】
2005075765.tif 000009
【図２】
2005075765.tif 000010
【図３】
2005075765.tif 000011
【配列表】
2005075765000001.xml