(57)【要約】【課題】摂取することによりアレルギー症状を改善することである。【解決手段】キノコを抽出することにより得られ、摂取することにより免疫グロブリンＩｇＡ及び免疫細胞B細胞を増加させ、結果としてアレルゲン物質の体内侵入を防ぐことと免疫グロブリンの産生が増強されることを特徴とする免疫賦活化組成物、並びにそれが含まれた医薬品、動物薬、食品、飼料及び化粧品である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌門から親水性溶媒によって抽出される抽出組成物が含まれていることを特徴とする免疫賦活化組成物。
【請求項２】
前記抽出組成物は、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖及び酸性のペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項３】
前記抽出組成物は、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖ペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項４】
前記抽出組成物は、平均分子量が１０００以下である酸性、かつ酢酸エチル可能性の糖ペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項５】
薬学上許容可能な製剤用添加剤成分が更に含まれていることを特徴とする請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする医薬品。
【請求項７】
請求項１乃至５いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする動物薬。
【請求項８】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする食品。
【請求項９】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする飼料。
【請求項１０】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌門を親水系溶媒で抽出して得られ、摂取することにより特定の免疫機能であるB細胞の活性化及びＩｇＡの増加を促すことができる免疫賦活化組成物、並びにそれが含まれた医薬品、動物薬、食品、飼料及び化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品成分は古くから生命維持のために欠かせない栄養素を提供するものとして考えられてきた。最近では、食品成分は、その働きによって栄養機能、感覚機能、および生体調節機能の3つを提供するものと考えられ、それらはそれぞれ食品の一次機能、二次機能、および三次機能と呼ばれている。これら３つの食品機能のうちでも、三次機能への関心が最近急激に高まり、生活習慣病の一次予防や、健康の増進のためにその機能を利用とする試みが活発化している。
【０００３】
一般に免疫は、身の回りに存在する細菌、花粉、食物抗原などの外来性の異物、および癌細胞やウイルス感染細胞など自己由来の異物的成分の排除を行う生体防御機構である。この機構は、皮膚や粘膜などによる物理的排除機構、補体やリゾチームなどの液性排除機構、さらにナチュラルキラー細胞やマクロファージなどの細胞性排除機構などの非特異的排除機構である自然免疫と、微生物や異物を構成する部分と特異的に反応する抗体やキラーT細胞による特異的排除機構である獲得免疫系に大別され、それらが互いに連携することで成り立っている。なお、獲得免疫系では、キラーTリンパ球が関与する場合を細胞性免疫と呼び、Bリンパ球の産生する抗体が関与する場合を液性免疫と呼んでいる。
【０００４】
キノコは、古くから日本人がよく口にする食材の一つであるとともに、種類によっては漢方胃腸薬などの生薬として利用されてきた。近年になって、キノコは様々な生理活性を有することが明らかにされ、食による疾病防御を目的とする医食同源の考えの普及に伴い、キノコは機能性食品素材として注目されてきた。
【０００５】
キノコの生理活性の中では、サルノコシカケ科およびキコブタケ科をはじめとする食用キノコの熱湯抽出物が腫瘍細胞であるＳａｒｃｏｍａ１８０に対して、宿主仲介性の抗腫瘍活性を示すことが知られており、（非特許文献１）、最近では、食用キノコの抗腫瘍活性はβ‐D‐グルカンと呼ばれる分子量が数十万の多糖類に由来することが明らかにされている。β‐D‐グルカンの制癌機能は宿主の細胞性免疫機能、すなわち、キラーT細胞やナチュラルキラー細胞の機能を増強し、癌細胞の増殖を抑制することに基づくと考えられている。また、このようなβ‐D‐グルカンは、カワラタケ、シイタケ、スエヒロタケなど多くの食用キノコに含まれることが明らかにされている。一方、液性免疫に及ぼすキノコの作用に関しては、乾燥アガリクスの熱湯抽出物のマウスへの腹腔内投与がＩＬ‐１βやＩＬ‐６の産生を促すことによりプラーク形成細胞数を増加させることが知られている（非特許文献２）。また、メシマコブの菌糸体から抽出した多糖体が抗体産生を増強することも知られている。
【０００６】
【非特許文献１】T. Ikekawa, M. Nakanihi, N. Uehara, G. Chihara and R. Tokuzen, Noncytotoxic, Antitumor Polysaccharides (ed. By R. S. Tipson and D. Horton), Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 32, 235-275: Academic Press, New York, 1976.
【非特許文献２】H. M. Kim, S. B. Han, G. T. Oh, Y. H. Kim, D. H. Hong and I. D. Yoo, Stimulation of humoral and cell mediated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus Liteus, J. Immunopharm., 18, 295-303, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、液性免疫の中でも粘膜免疫の主役を担うのはＩｇＡである。粘膜ＩｇＡは、腸管からのアレルゲンの吸収を阻害したり、肥満細胞上のＩｇＥにアレルゲンが結合するのを阻害することにより抗アレルギー作用を示すとともに、体内に侵入した病原性微生物と結合してそれを体外に排出することにより感染防御作用を示すことは周知のところであるが、これまで報告されている真菌門の免疫関連生体調節活性に関与する報告において、ＩｇＡの産生を向上させるものは皆無である。
【０００８】
そこで、本発明は、摂取することにより、免疫グロブリンＩｇＡ及び免疫細胞B細胞を増加させる免疫賦活化組成物、並びにそれが含まれた医薬品、動物薬、食品、飼料及び化粧品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
以上の目的を達成するため、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、真菌門から親水性溶媒によって抽出される抽出組成物が、B細胞の活性化およびＩｇＡの産生量を増加することができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明に係る免疫賦活化組成物は、免疫グロブリンを産生するＢ細胞を賦活化し液性免疫の応答を開始させることと、更に加えて、ヘルパーＴｈ２細胞を賦活化することでサイトカインＩＬ‐５、ＩＬ‐６の発現を向上させ、粘膜免疫であるＩｇＡの産生量を特異的に増加することの２つの異なる部位で免疫作用機序に働きかける。本発明に係る免疫賦活化組成物は、多量に発現した粘膜上のＩｇＡと結合することにより、抗原であるアレルゲンや花粉が体内に侵入することを阻害するので、アレルギーの原因であるＩｇＥの産生を阻止し、結果、アレルギーが生じるのを防止することができる。
【発明の効果】
【００１１】
以上のように、本発明に係る免疫賦活化組成物によれば、摂取することで免疫グロブリンＩｇＡ及び免疫細胞B細胞を増加させることができ、アレルゲンの体内侵入を防ぎ更に免疫作用を増強することによりアレルギー症状を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、真菌門としては、クロカワ、シシタケ、コウタケ、ショウゲンジ、エリンギなどがあり、特にイボタケ科の子実体を含むことが望ましく、他の真菌門と比してＩｇＡ産生促進活性が高いクロカワ、シシタケ、コウタケなどがこの科に属する。
【００１３】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、親水系溶媒としては、脱塩水、緩衝塩を含んだ溶液、エタノールなどがあり、例えば、熱が加えられた親水系溶媒に子実体を細断、磨砕したものを入れることにより、または入れた後に熱を加えることにより抽出することが考えられる。
【００１４】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、前記組成物は、７０％エタノールの沈殿画分や、７０％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分にも含まれない性質をもっている。すなわち、７０％エタノールで沈殿するβ‐D‐グルカンに代表されるような抗腫瘍性活性をもつ高分子量の多糖類や、建石らが受身皮膚アナフィラキシー抑制成分として報告した７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿する高分子量の糖タンパク質と異なる新規な成分である。
【００１５】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、前記抽出組成物は、免疫賦活化組成物として知られている分子量数十万のβ‐D‐グルカンに比べて平均分子量が低い、例えば分子量１００００以下の複数の低分子化合物が含まれていることが好ましい。また、前記抽出組成物は、中性の糖であるβ‐D‐グルカンと異なり、分子の極性が酸性であることが好ましい。例えば、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖及び酸性のペプチド、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖ペプチド、平均分子量が１０００以下である酸性、かつ酢酸エチル可能性の糖ペプチドのいずれか１以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、薬学上許容可能な製剤用添加剤成分が更に含まれていることが好ましく、薬学上許容可能な製剤用添加剤成分としては、例えば乳糖、結晶セルロース、乳化剤、プルラン、寒天などがある。
【００１７】
本発明は、前記免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする医薬品であって、医薬品としては、例えばエアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、ローション剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、流エキス剤などがある。
【００１８】
本発明は、前記免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする動物薬であって、動物薬としては、例えばエアゾール剤、液剤、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、ローション剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、流エキス剤などがある。
【００１９】
本発明は、前記免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする食品であって、食品としては、例えば麺加工品、農産加工品、製菓、製パン、調理食品、缶・びん詰食品、冷凍食品、畜産加工品、水産加工品、乳製品、油脂加工品、酒類、飲料、調味料、健康食品などがある。
【００２０】
本発明は、前記免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする飼料であって、飼料としては、例えば粉状飼料、ミール状飼料、フレーク状飼料、ペレット状飼料、缶・びん詰状飼料、液状飼料などがある。
【００２１】
本発明は、前記免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする化粧品であって、化粧品としては、例えば基礎化粧品、メーキャップ化粧品、ボディ化粧品、頭髪用化粧品、頭皮用化粧品、口腔用化粧品、芳香化粧品などがある。
【００２２】
本発明に係る免疫賦活化組成物は、複数の組成物から構成されており、このうち、平均分子量が１０００以下の低分子のものは、酢酸エチルに可溶であるため、酢酸エチルを用いることにより効果的に抽出することができる。
【００２３】
また、本発明に係る免疫賦活化組成物は注射による直接投与のみならず、経口摂取することでもB細胞の活性化及びＩｇＡの産生促進活性を向上させることができる。
【００２４】
本発明に係る免疫賦活化組成物は熱安定性があり、９０℃１０分間、加熱を保持してもB細胞の活性化及びＩｇＡの産生促進活性を向上させることが可能である。また、冷凍解凍してもB細胞の活性化及びＩｇＡの産生促進活性を向上させることが可能である。
【００２５】
さらに、本発明に係る免疫賦活化組成物は、ＩｇＡ産生促進活性を向上させるために既にＩｇＡ産生能が確認されているカゼインホスホペプチドやリン酸化デキストリンと併用することができる。
【実施例】
【００２６】
次に、本発明に係る免疫賦活化組成物の実施例について説明する。
実施例１乃至５
先ず、生のクロカワ、シシタケ、コウタケ、ショウゲンジ及びエリンギそれぞれの子実体１００ｇを細断し、脱塩水７０ｍｌ及び海砂３０ｇと共に乳鉢に入れ、２０分間磨砕した。粉砕物を５００ｍｌの沸騰脱塩水に入れ、１分間沸騰した。遠心分離により得た上清をセライトで濾過し、濾液を凍結乾燥することで表１に示すように実施例１乃至５に係る免疫賦活化組成物を得た。
【００２７】
【表１】
2005075740.tif 000002
【００２８】
実験例１
次に、実施例１乃至５に係るＩｇＡ産生促進活性化剤のマウス脾臓細胞培養上清中のＩｇＡを測定した。実験例１においては６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス（雄）（日本ＳＬＣ株式会社、浜松）を用いた。このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、無菌的に脾臓を採取した。次いで、１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＧｌａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）中で脾臓を丁寧にほぐし、１０ｍｌの同培地で１５００ｒｐｍ、５分間の遠心洗浄を３回行った後、細胞の濃度を４〜６×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、これを細胞浮遊液として用いた。なお、得られた細胞浮遊液をトリパンブルー排除試験に供し、細胞の生存率を測定したところ、染色されていない細胞数を測定することにより決定した細胞の生存率は９８％であった。                                                              
【００２９】
次に、この細胞浮遊液１００μｌ（マウス脾臓細胞数３．０×１０５ｃｅｌｌ／１００μｌＲＰＭＩ１６４０／ｗｅｌｌの１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０／ｗｅｌｌ）、実施例１乃至５に係るＩｇＡ産生促進活性化剤それぞれ１０μｌ（最終濃度０〜４００μｇ／ｍｌ）、及びＰＢＳに溶解したマイトージェン溶液１０μｌ（最終濃度  ＣｏｎＡ１μｇ／ｍｌ、ＰＨＡ５μｇ／ｍｌ、ＬＰＳ５０μｇ／ｍｌ）を平底の９６穴マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）に分注し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で７２時間培養し、培養上清中のＩｇＡを酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量した。
【００３０】
定量した結果、無添加中のＩｇＡ分泌量と比較して実施例４に係るショウゲンジの抽出物が約６％、実施例２に係るシシタケの抽出物、実施例３に係るコウタケの抽出物、実施例５に係るエリンギの抽出物が約１１〜１２％、実施例１に係るクロカワの抽出物が約５０％のＩｇＡ産生促進活性を示した。
【００３１】
実験例２
次にB細胞の分化が促進されるか否かを調べるためにＢ細胞のマイトージェン活性を測定した。細胞の分化はＭＴＴ（３‐（４，５‐dimethyl-thiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）法により測定した。すなわち、培養終了後のマイクロプレートに０．１５ＭＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）に溶解した０．５％ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ、ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ．）を１０μｌずつ加えた。B細胞分化の刺激としてサルモネラ菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Salmonella typhimurium由来、Difco Laboratories、Detroit、USA）１０μｌ（最終濃度で５０μg/ｍｌ）を培養液に添加した。これを３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間培養した。その後、０．０４Ｍ ＨＣｌを含むイソプロパノール（ＨＣｌ：イソプロパノール＝１：２８９）１００μｌを添加し、形成された赤紫色のホルマザンを溶解するためにマイクロピペットでよく撹拌した後、モデル５５０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ．）を用いて、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた５つのＭＴＴ値の平均値および標準偏差を求め、ｔ検定分析に供した。
【００３２】
無添加品のＭＴＴ値が０．６７であることと比べて、クロカワ抽出物添加品は５０〜１００μg/ｍｌ添加することで０．７１〜０．７８となり、ｔ検定において有意にＭＴＴ値の値が向上していることを示した。すなわち、実施例１に係るクロカワ抽出物中にB細胞の分化促進成分が存在することが考えられる。
【００３３】
実験例３
動物培養細胞による効果ではなく実際の生体への効果を調べた。まず、４週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ系マウス（雄）（ＯｒｉｅｎｔａｌＹｅａｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ）４匹を１群として、１週間予備飼育した後、表２に示す配合の実施例サンプル１に係る飼料を経口投与し、３５日間飼育した。また、同様に１週間予備飼育した後、表２に示す配合の比較例サンプル１に係る飼料を経口投与し、３５日間飼育した。比較例サンプル１に係る飼料を与えたものは２群設定した。また、３５日間の飼育中、飼料及び水は、自由摂取とした。試験飼料での飼育開始後、７、１４、２１日目に比較例サンプル１を投与している１群以外の比較例サンプル１群と実施例サンプル１群のマウスには殺菌した０．０１５Ｍ塩酸ナトリウムを含み０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁させたＬＰＳ（１０μｇ／０．２ｍｌ）をゾンデを用いて経口投与した。また、比較例サンプル１を投与している一群にはＰＢＳ（０．２ｍｌ）をゾンデを用いて投与した。
【００３４】
【表２】
2005075740.tif 000003
【００３５】
試験飼料での飼育開始後３５日目にマウスをエーテルで麻酔し、心臓採血を行った。また、頚椎脱臼により屠殺後、十二指腸から直腸までの器官を摘出した。採取した血液は、３７℃で１時間放置後、血餅をチューブからはずし、４℃で一晩置き、４℃３０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離を行い、得られた血清を分析に使用するまで−３０℃で保存した。一方、内容物を含む腸管は、腸管２ｇに対して海砂３ｇ、殺菌ＰＢＳ５ｍｌとともに乳鉢で１５分間磨砕し、腸管抽出液とし、分析に使用するまで−３０℃で保存した。血清及び腸管抽出液中の総ＩｇＡ量とＬＰＳ特異抗体量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。
【００３６】
すなわち、０．０５M炭酸緩衝液（ｐH９．５）に溶解したヤギ抗マウスIｇＡ抗体（１０μｇ／ｍｌ、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,Ｉｎｃ., ＵＳＡ）、あるいは、０．１M炭酸緩衝液に溶解したＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）２００μｌを９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の各ウェルに分注し、４℃で一晩放置した。放置後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で３回プレートを洗浄した。次いで、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を含んだ０．１Ｍ炭酸緩衝液３００μｌを各ウェルに分注し、２５℃で９０分静置することにより抗原でコーティングされていない部分をＢＳＡで保護した。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈した血清（総ＩｇＡの場合は６４００倍希釈、抗ＬＰＳＩｇＡの場合には１００倍希釈、抗ＬＰＳ ＩｇＧの場合は６４００倍希釈、抗ＬＰＳＩｇＭの場合は３２００倍希釈）または腸管抽出液（総ＩｇＡの場合は６４００倍希釈、抗ＬＰＳ ＩｇＡの場合には４００倍希釈、抗ＬＰＳ ＩｇＧの場合は８００倍希釈、抗ＬＰＳＩｇＭの場合は１６００倍希釈）１００μｌを各ウェルに分注し、２５℃で１２０分反応させた。反応終了後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、２％ＰＶＰを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈したペルオキシダーゼ標識抗体（ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（０．１μｌ／ｍｌ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１μｌ／ｍｌ）またはヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（０．２５μｌ／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに分注し、２５℃で６０分間反応させた。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、暗室で０．４％ｏ−フェニレンジアミンと０．０３％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸―０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μｌを各ウェルに分注し、プレートにアルミホイルを巻いて完全に遮光し、２５℃で反応させた。反応１５分後、直ちに暗室で４Ｎ硫酸２５μｌを加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、結果は、得られた４９０ｎｍにおける吸光度に血清または腸管抽出液の希釈倍率を乗じたものの平均値と標準誤差により示し、ｔ検定分析により、比較例サンプル１のマウスと実施例サンプル１のマウスの間におけるＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡの発現量の統計的有意差を求めた。
【００３７】
実施例サンプル１、又は比較例サンプル１を３５日間自由摂取させたマウスの体重を７日間間隔で測定した。その結果、実施例サンプル１を摂取させたマウスと比較例サンプル１を摂取させたマウスの増体重の間に有意な違いは見られなかった。このことから実施例サンプル１と比較例サンプル１にストレス及び飼料の栄養価の違いは殆ど無く、本実験で得られる抗体産生量の違いは、キノコ抽出物による影響と考えることができる。
【００３８】
実施例サンプル１で３５日間飼育したマウスからえた血液から調整した血清の、経口投与したサルモネラ菌ＬＰＳに対するＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡクラスの特異抗体量をＥＬＩＳＡにより求めた結果を表３に示した。表３から実施例サンプル１を与えたマウスの抗ＬＰＳに対する総てのクラスの抗体量、すなわち、抗ＬＰＳ特異ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ量は、比較例サンプル１（ＬＰＳ投与及びＬＰＳ非投与キノコ抽出物無添加飼料群）と比べて統計的に有意に高くなることが分かる。すなわち、以上の結果から、実施例サンプル１のマウスへの経口投与は、血液を介した全身免疫の中心抗体であるＩｇＧクラスの抗体を始めとしてＩｇＭクラス及びＩｇＡクラスの抗体応答を増強することが明らかであり、実施例サンプル１の経口摂取により、全身免疫増強による感染予防効果が期待できる。
【００３９】
【表３】
2005075740.tif 000004
【００４０】
実施例サンプル１で３５日間飼育したマウスから得られた腸管の総ＩｇＡ量及び経口投与したサルモネラ菌ＬＰＳに対するＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡクラスの特異抗体量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により求めた。その結果を表４に示した。表４から、実施例サンプル１で飼育したマウスの総ＩｇＡ量と抗ＬＰＳ特異ＩｇＡ量は、比較例サンプル１で飼育したマウス（ＬＰＳ非投与、ＬＰＳ投与群ともに）に比べて統計的に有意に高いことが分かる。しかし、表４に示したように、抗ＬＰＳ特異ＩｇＧおよびＩｇＭ量には、両者の間に殆ど違いは見られないことがわかる。すなわち、以上の結果から、実施例サンプル１のマウスへの経口投与は、腸管を介した粘膜免疫の中心抗体であるＩｇＡクラスの抗体応答を増強することが明らかである。
【００４１】
【表４】
2005075740.tif 000005
【００４２】
実験例４及び実験例５
次に、実施例１に係るクロカワの抽出物が既知の免疫賦活化組物であるβ‐D‐グルカンといった中性糖や糖タンパク質と異なることを確認するための実験を行った。まず、実施例１に係るクロカワの抽出物を７０％エタノールまたは７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させたもの（それぞれ「実施例サンプル２」及び「実施例サンプル３」とする）をマウス脾臓細胞に投与してＩｇＡの産生活性を確認した。その結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】
2005075740.tif 000006
【００４４】
実施例サンプル２及び実施例サンプル３には、ＩｇＡ産生促進活性が見られず、むしろＩｇＡ産生を抑制した。従来のキノコの抗腫瘍活性と言われている細胞性免疫を増強する物質は高分子の多糖類であるために全て７０％エタノールで沈殿画分に含まれる。また、モルモットの受身皮膚アナフィラキシー抑制成分と報告されている物質は高分子の糖タンパク質とされているために７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿する画分に入る。したがって、本結果は、実施例１に係るクロカワの抽出物は、従来のキノコに含まれることが知られている免疫調整物質とは全く異なった成分であることがわかる。
【００４５】
実験例６
次に、実施例１に係るクロカワの抽出物中の免疫賦活化組成物の、およその分子量を測定するための実験を行った。すなわち、実施例１に係るクロカワの抽出物溶液を各種限外濾過膜により限外濾過を行い、分子量により分画した。それら分画した各分画のＩｇＡ産生調節活性を調べた。その結果を表６に示す。
【００４６】
【表６】
2005075740.tif 000007
【００４７】
表６から明らかなように、分子量１０００以下及び分子量５０００〜１００００の画分に、それらを加えない場合と比べて有意なＩｇＡ産生促進活性がみられ、また分子量１０００〜５０００においても高濃度で添加した場合にＩｇＡ産生促進活性がみられたが、分子量１００００以上の画分にはＩｇＡ産生促進活性は全くみられなかった。その結果から、実施例１に係るクロカワの抽出物に含まれるＩｇＡ産生促進物質は分子量１００００以下という極めて低分子のものであることがわかる。実施例１に係るクロカワの抽出物がＢ細胞の分化を促進する物質であり、恐らく膜状のレセプターと結合することによりアクチベーターとして機能すると考えられる。一般的にアクチベーターとして機能する際に、高分子物質は分子の３次元構造が重要であったりレセプター結合部位が高分子のごく一部であるために、低分子物質のほうが感作性に優れていると考えられる。
【００４８】
実施例７
本発明におけるＩｇＡ産性促進活性化剤の極性を確認するために、実施例１に係るクロカワの抽出物についてイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、マウス脾臓細胞に投与して各分画のＩｇＡ産生活性を確認した。マウス脾臓細胞は実施例1と同様に調整した。イオン交換クロマトグラフィーは塩基性・両性物質を吸着する性質のカラム（Ｈ+型）としてＣＭ‐Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０を、酸性物質を吸着する性質のカラム（ＯＨ‐型）としてＤＥＡＥセルロースを使用した。中性物質として両イオン交換クロマトグラフィーに吸着しなかった素通り画分を用いた。各分画のＩｇＡ産生活性は表７に示す。塩基性・両性物質の画分について無添加のものと比べて添加濃度２０μｇ／ｍｌのときに有意なＩｇＡ産生活性がみられ（ｐ＜０．０１）、酸性物質の画分についても添加濃度４０μｇ／ｍｌのとき（ｐ＜０．００１）と添加濃度８０μｇ／ｍｌのとき（ｐ＜０．０１）に有意なＩｇＡ産生活性がみられた。しかし、中性物質の画分はＩｇＡ産生活性がみられず、添加濃度に従いＩｇＡ産生活性は抑制された。
【００４９】
【表７】
2005075740.tif 000008
【００５０】
実験例８
本発明におけるB細胞の分化活性の効果を確認するために、実施例１に係るクロカワの抽出物についてイオン交換クロマトグラフィーを用いて分画し、マウス脾臓細胞に投与して各分画のB細胞の分化活性を確認した。マウス脾臓細胞は実施例1と同様に調整した。イオン交換クロマトグラフィーは実施例７と同様に調整した。各分画のB細胞の分化活性は表８に示す。塩基性・両性物質の画分について無添加のものと比べて有意に（ｐ＜０．０５）B細胞の増殖活性がみられたが酸性物質や中性物質の画分はB細胞の増殖活性がみられなかった。
【００５１】
【表８】
2005075740.tif 000009
【００５２】
実験例９
本発明におけるＩｇＡ産性促進活性化剤の特性を、更に分画し、調べるために、実験例７でイオンクロマトグラフィーで画分した酸性物質をＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０カラムを用いて０．１Ｍリン酸緩衝液を溶媒として吸着させた。次に溶媒を０．１Ｍリン酸緩衝液、０．２ＭＮａＣｌに変えることにより吸着物を溶出させ、吸光度（Ａ２８０）で反応のあった画分を実施例サンプル４、実施例サンプル５、実施例サンプル６として得た。これらと、比較としてＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０カラムに吸着しなかった画分のＩｇＡ産生促進活性について表９に示す。
【００５３】
【表９】
2005075740.tif 000010
【００５４】
非吸着画分はＩｇＡ産生促進活性が無いのに対して、実施例サンプル４、実施例サンプル５及び実施例サンプル６はＩｇＡ産生促進活性が向上した。特に実施例サンプル４においては著しい効果が見られ、無添加の時と比べて約２７％もＩｇＡ産生促進活性が向上した。これらより、本発明に係るＩｇＡ産生促進活性を持つ物質は酸性物質であることがわかる。
【００５５】
実験例１０
本発明におけるＩｇＡ産性促進活性化剤の特性を、更に分画し、調べるために、実験例９でＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ５０カラムに吸着した物質をゲル濾過カラムであるＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−１０カラムを用いて分子量による画分を試みた。ペプチドの吸収波長であるＡ２２０と糖の吸収波長であるＡ４９０において反応のあった画分としてＡ〜Ｅの５つの画分を得た。画分ごとのＩｇＡ産生促進活性を表１０に示す。
【００５６】
【表１０】
2005075740.tif 000011
【００５７】
画分Ａ、Ｂ及びＤにおいてはＩｇＡ産生促進活性が向上することが示されるのに対して画分Ｃ及びＥにおいては逆に抑制されることが示された。分子量において、画分ＡおよびＢは実験例６に係る分子量５０００〜１００００の画分に相当し、画分Ｄは分子量１０００以下の画分に相当する。画分ＡはＡ２２０のピークであり、すなわちペプチドであり、画分ＢはＡ４９０のピークであり、すなわち糖である。つまり実験例６に係る分子量５０００〜１００００の画分はペプチド及び糖であるか、或いは糖ペプチドであることが示された。糖とペプチドが同一分子に存在するか、異なる２つの物質であるかは本実験のみでは決定されない。実験例６に係る分子量１０００以下の画分において、画分ＤはＡ２２０とＡ４９０の両方のピークが一致しているため、糖ペプチドであることが示された。
【００５８】
実験例１１
更に本発明に係る免疫賦活化組成物の物性を調べるために、様々な溶媒の相溶性を調べた。まず、クロカワ５０ｇを磨砕し、エタノールに浸漬することで抽出を行い、この抽出工程を４回ほど繰り返した。この抽出液（約１２００ｍｌ）をロータリーエバポレーターでおよそ５０ｍｌまで濃縮をかけ、この濃縮液を４℃、３０００ｒｐｍで３０分間冷却遠心を行った。この際、沈殿した物質を脱イオン水に溶解し、凍結乾燥させたものを凍結乾燥物Ａとする。冷却遠心の上清はベンゼン：脱イオン水＝１：１の混合液２００ｍｌを加えて分液ロートにて振とうし、２０分間静置したのちに上層のベンゼン層を回収した。残った水層部に再びベンゼン：脱イオン水＝１：１の混合液２００ｍｌを加えて同様に振とうの後、ベンゼン層の回収する操作を３回繰り返した。回収したベンゼン層は全て集めて濃縮をかけ、溶媒を脱イオン水に置換後、凍結乾燥を行ったものを凍結乾燥物Ｂとする。次に、残った水層部に酢酸エチル２００ｍｌを加え分液ロートにて振とうし、２０分間静置したのちに上層の酢酸エチル層を回収した。残った水層部に再び酢酸エチル２００ｍｌを加えて同様に振とうの後、酢酸エチル層を回収する操作を３回繰り返した。回収した酢酸エチル層は全て集めて濃縮をかけ、溶媒を脱イオン水に置換後、凍結乾燥を行ったものを凍結乾燥物Ｃとする。残った水層は濃縮をかけて溶媒を脱イオン水に置換後、凍結乾燥を行い、得られたものを凍結乾燥物Ｄとした。得られた凍結乾燥物Ａ乃至Ｄを添加した際のＩｇＡ産生促進活性を表１１に示す。測定は５回試行され、その平均値、標準偏差よりｔ検定を行った。
【００５９】
【表１１】
2005075740.tif 000012
量（ng/ml）で示す
【００６０】
表１１に示すように、凍結乾燥物Ａには若干のＩｇＡ産生促進活性がみられ、凍結乾燥物Ｃ及びＤには著しいＩｇＡ産生促進活性がみられた。また、凍結乾燥物ＢはＩｇＡ産生促進活性がみられなかった。凍結乾燥物Ａは溶解度の低いものであり、このようなものにも若干のＩｇＡ産生促進活性があることが示された。凍結乾燥物Ｂは炭化水素に代表される有機溶媒に溶解するものであり、本発明に係るＩｇＡ産生促進活性を持つ物質はこのような物質でないことが示された。凍結乾燥物Ｃは酸素官能基のついた炭化水素の可能性が高く、すなわち、本発明に係るＩｇＡ産生促進活性物質はテルペン類、ポリケチド、アルカロイド或いは脂肪酸といった物質のいずれかであることが示された。凍結乾燥物Ｄは親水性物質であり、ペプチド類か配糖体である可能性が高く、実験例１０に係るＩｇＡ産生促進活性物質が糖、ペプチド或いは糖ペプチドという結果と合致した。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月5日(2004.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌門から親水性溶媒によって抽出される抽出組成物が含まれていることを特徴とする免疫賦活化組成物。
【請求項２】
前記抽出組成物は、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖及び酸性のペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項３】
前記抽出組成物は、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖ペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項４】
前記抽出組成物は、平均分子量が１０００以下である酸性、かつ酢酸エチル可溶性の糖ペプチドであることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活化組成物。
【請求項５】
薬学上許容可能な製剤用添加剤成分が更に含まれていることを特徴とする請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする医薬品。
【請求項７】
請求項１乃至５いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする動物薬。
【請求項８】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする食品。
【請求項９】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする飼料。
【請求項１０】
請求項１乃至４いずれか記載の免疫賦活化組成物が含まれていることを特徴とする化粧品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明に係る免疫賦活化組成物において、前記抽出組成物は、免疫賦活化組成物として知られている分子量数十万のβ‐D‐グルカンに比べて平均分子量が低い、例えば分子量１００００以下の複数の低分子化合物が含まれていることが好ましい。また、前記抽出組成物は、中性の糖であるβ‐D‐グルカンと異なり、分子の極性が酸性であることが好ましい。例えば、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖及び酸性のペプチド、平均分子量が５０００以上１００００以下である酸性の糖ペプチド、平均分子量が１０００以下である酸性、かつ酢酸エチル可溶性の糖ペプチドのいずれか１以上であることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
【表１１】
2005075740.tif 000013