(57)【要約】【課題】  本発明は、従来の中和滴定に基づく油脂酸価測定法において見られる低再現性や低い分析精度といった問題を解決することを課題とする。【解決手段】  油脂試料を、カルボン酸誘導体化試薬と反応させ、生成したカルボン酸誘導体を定量し、および該カルボン酸の定量値から前記油脂試料の酸価を算出する工程を含むことを特徴とする方法。本発明においては、従来のアルカリ中和滴定におけるアーティファクトによる測定妨害を回避する酸価の測定方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物を含有する油脂試料の酸価測定方法であって、該非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物は測定溶液中においてｐＨ１０以下で加水分解し、該方法は、以下の、
１）前記油脂試料を、カルボン酸誘導体化試薬と反応させ、
２）生成したカルボン酸誘導体を定量し、および
３）該カルボン酸の定量値から前記油脂試料の酸価を算出する、
工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物が測定溶液中においてｐＨ８以下で加水分解するエステル化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物がＣ１〜Ｃ１１脂肪酸のモノエステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物がカプシノイドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導体化試薬が蛍光誘導体化試薬である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光誘導体化試薬が、４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光誘導体化試薬が９−アンスリルジアゾメタンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記カルボン酸誘導体の定量がＨＰＬＣ分析により行われる、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記油脂試料がサンプルを非極性溶媒で抽出して得られる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
油脂試料の酸価測定方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）油脂試料をカルボン酸誘導体化試薬と反応させて、該試料中に存在する遊離カルボン酸を誘導体化し、
ｂ）生成したカルボン酸誘導体を定量し、および
ｃ）該カルボン酸の定量値から前記油脂試料の酸価を算出する、
工程を含み、
それにより、アルカリ中和滴定に基づく酸価測定において生じるエステル化合物の加水分解に基づく測定誤差を低減および／または排除する、前記方法。
【請求項１１】
前記カルボン酸誘導体化試薬が、４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光誘導体化試薬が９−アンスリルジアゾメタンである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂試料の酸価測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
油脂の酸価は、当該油脂の変敗等の好適な指標となりうることから、これを正確に測定することは各種の工業分野において極めて重要な課題である。食品産業を例にとれば、厚生省環境衛生局長通知・環食第２４８号（昭和５２年１１月１６日）により、油脂で処理した菓子で油脂分を粗脂肪として１０重量％以上含むものについては、そこに含まれる油脂の酸価が３を超え、かつ、過酸化物価が３０を超えるものであってはならず、またそこに含まれる油脂の酸価が５を超え、または過酸化物価が５０を越えるものであってならないとされている。
【０００３】
そして、当該通知に具体的に示された酸価の測定方法は、サンプルである菓子から抽出した油脂試料をアルコール・エ−テル混液に溶解し、フェノールフタレイン試薬を指示薬として０．１Ｎアルコール性水酸化カリウム溶液で滴定するというものである。他の一般的な酸価の測定方法も、同様に、アルカリによる中和滴定に基づくものであり、基準油脂分析試験法と衛生試験・注解やＡＯＣＳに記載の方法も、やはりフェノールフタレイン等を指示薬とするか、或いは電位差滴定で中和的に酸価を測定することを推奨する。
【０００４】
一方、酸価とは「油脂またはロウ１ｇ中に含まれる遊離脂肪酸を中和するのに必要な水酸化カリウムのｍｇ数」と定義されるように、結局、当該測定においては油脂中の遊離脂肪酸を測定することが求められているということができる。そして、そのような遊離脂肪酸の測定については、近年、上記の中和滴定以外の方法が特許文献１等において提案されている。
【０００５】
すなわち、該特許文献１に記載の方法は、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンで脂肪酸を誘導体化し、これをクロマトグラフィーで分析するという原理に基づくものである。また、非特許文献１では、９−アンスリルジアゾメタン（ＡＤＡＭ）による遊離脂肪酸の誘導体化に基づいて酸価を測定することも開示されている。
【０００６】
しかしながら、いずれの文献も、従来の中和滴定法による酸価測定の問題点を提示するものではなく、特に、ある種の油脂試料を測定する際の、中和滴定法による低再現性と低い分析精度は全く意図されていない。
【０００７】
特に、非特許文献１においては、当該文献に記載の方法と従来の中和滴定に基づく酸価測定方法がよく一致したとされており（第２３２頁右欄下から第１行目〜第２３３頁左欄第２行目）、本発明がはじめて提示し、その原因を解明した上記問題点が示唆すらもされていないのである。
【０００８】
【特許文献１】特開平５−３４３２７号公報
【非特許文献１】食品衛生学雑誌、Ｖｏｌ．４３、Ｎｏ．４、ｐｐ．２３０−２３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、従来の中和滴定に基づく油脂酸価測定法において見られる低再現性や低い分析精度といった問題を解決することを課題とする。
【００１０】
これまでに、ある種の油脂試料においてそのような問題点が存在していることが十分に検証されたこともなく、また、その原因がいかなるものかについて探求されたことはなかった。而して、本発明の重要な意義の一つは、それ自体で新規な技術的課題を提示し、更にその原因を解明したことにあるともいうべく、あわせて、本発明は、当該新規な課題を解決するための測定方法をも提供するのである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
具体的に、ある種の油脂試料を従来の電位差滴定法で測定した場合、複数の測定機関の測定において許容できないほどの測定値のばらつきが観察された。更に、本来同じであるべき筈の電位差測定法による酸価測定値とフェノールフタレイン法による酸価測定値との間には有意な隔たりがあることも示された。本発明者は、そのような測定値の低再現性や誤差を生じる油脂試料について精査し、その原因が測定操作自体によるものではなく、油脂試料に含まれるある種の成分に起因するものであり、更に当該成分がアルカリによる加水分解を受けやすいエステル化合物であることを見出してこれを検証したのである。
【００１２】
理論に拘束されることは好まないが、そのようなエステル化合物は、通常の油脂構成成分であるトリグリセライドとは異なり、弱アルカリ〜酸性領域でも容易に加水分解してしまい、従来の中和滴定操作においては対応するアルコールとカルボン酸を生成してしまう。そうすると、本来、油脂の酸価とは、変敗により生じた脂肪酸（カルボン酸）のみを油脂の劣化の指標とするものであるが、上記のように、中和滴定中に生成したカルボン酸がアーティファクトとして当該中和滴定を妨害し、ひいては酸価測定値の測定誤差に寄与したものと推測されるのである。従って、そのように加水分解を受けやすいエステル化合物を含む油脂試料の場合、中和滴定法を用いることはできない。つまり、本発明の第１の側面は、
（１）非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物を含有する油脂試料の酸価測定方法であって、該非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物は測定溶液中においてｐＨ１０以下で加水分解し、該方法は、以下の、
１）前記油脂試料を、カルボン酸誘導体化試薬と反応させ、
２）生成したカルボン酸誘導体を定量し、および
３）該カルボン酸の定量値から前記油脂試料の酸価を算出する、
工程を含むことを特徴とする方法である。
【００１３】
カルボン酸誘導体化試薬の使用により、変敗の結果として油脂試料にもとから存在した脂肪酸のみが油脂劣化の指標として正しく測定され、本来、変敗とは無関係である、脆弱なエステル化合物からのアーティファクトとしてのカルボン酸の影響は排除される。
【００１４】
また、特にフェノールフタレインを指示薬として用いる場合、その変色域はｐＨ８．０〜９．８であるので、それ以下のｐＨで加水分解するようなエステル化合物を含む油脂試料において、本発明が対象とする大きなばらつき（低再現性）／低測定精度が経験されやすく、従って、本発明の第２は、
（２）前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物が測定溶液中においてｐＨ８以下で加水分解するエステル化合物である上記（１）に記載の方法である。
【００１５】
特に、そのように加水分解を受けやすいエステルは短鎖脂肪酸のエステル化合物中に多く見出され、植物由来の成分、例えばカプシエイト（バニルアルコールのＣ１０脂肪酸エステル）等を非限定的に例示できる。従って本発明の第３および第４の側面では、
（３）前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物がＣ１〜Ｃ１１脂肪酸（好ましくはＣ２〜Ｃ１１脂肪酸）のモノエステルである上記（１）または（２）に記載の方法、および
（４）前記非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物がカプシノイドである上記（３）に記載の方法が提供される。
【００１６】
前記の方法においては、試料の性質や実験室の設備、試薬自体の利用性等を考慮して種々のカルボン酸誘導体化試薬を使用できるが、検出感度や取り扱いの容易性等を考慮すれば蛍光誘導体化試薬を用いることが好ましく、その例として４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンをあげることができる。つまり、本発明の第５乃至７は、
（５）前記誘導体化試薬が蛍光誘導体化試薬である上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法、
（６）前記蛍光誘導体化試薬が、４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンからなる群から選択される上記（５）に記載の方法、および
（７）前記蛍光誘導体化試薬が９−アンスリルジアゾメタンである上記（６）に記載の方法である。
【００１７】
また、蛍光誘導体化試薬を用いる場合は生成したカルボン酸誘導体をＨＰＬＣで分析するのが好ましい。よって、本発明の第８は、
（８）前記カルボン酸誘導体の定量がＨＰＬＣ分析により行われる上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の方法である。
【００１８】
なお、酸価の直接の測定対象は油脂試料であるが、分析の目的によっては油脂を成分として含む特定のサンプル全体について酸価を決定する必要があり、その場合、当該サンプルから油脂を抽出してそれを油脂試料とする。当該サンプルからの油脂の抽出は非極性溶媒による溶媒抽出が好適に用いられ、従って、本発明の第９は、
（９）前記油脂試料がサンプルを非極性溶媒で抽出して得られる上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法である。
【００１９】
既に明らかなように、本発明においては、従来のアルカリ中和滴定におけるアーティファクト、すなわち、容易に加水分解を受けるエステル化合物による測定妨害を回避する酸価の測定方法が提供され、該方法においては、カルボン酸誘導体化試薬により油脂試料にもとから存在していた脂肪酸のみが誘導体化されそして測定される。従って、本発明の別の側面では、その第１０乃至１２として、
（１０）油脂試料の酸価測定方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）油脂試料をカルボン酸誘導体化試薬と反応させて、該試料中に存在する遊離カルボン酸を誘導体化し、
ｂ）生成したカルボン酸誘導体を定量し、および
ｃ）該カルボン酸の定量値から前記油脂試料の酸価を算出する、
工程を含み、
それにより、アルカリ中和滴定に基づく酸価測定において生じるエステル化合物の加水分解に基づく測定誤差を低減および／または排除する、前記方法、
（１１）前記カルボン酸誘導体化試薬が、４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンからなる群から選択される上記（１０）に記載の方法、および
（１２）前記蛍光誘導体化試薬が９−アンスリルジアゾメタンである上記（１１）に記載の方法が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、従来のアルカリ中和滴定におけるアーティファクト、すなわち、容易に加水分解を受けるエステル化合物由来のカルボン酸化合物による測定妨害を回避する、改良された酸価の測定方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
用語
本明細書において、「油脂試料」なる用語は、従来法に基づきアルカリ中和滴定でその酸価を測定し得る全ての油脂性（ロウを含む）試料を指し、その由来や用途によって限定されない。通常、油脂試料は、トリグリセライドを主体とするものであるが、ジグリセライド、モノグリセライド若しくは脂肪酸エステルまたはそれらの混合物を一部に含み、或いはそれを主体とするものであっても、それがアルカリに対して一定限度のエステル加水分解抵抗性を示し、従来のアルカリ中和滴定法による酸価分析に供し得るものであれば、本発明の油脂試料と見做し得る。好ましい油脂試料の非限定的な例は、いわゆる植物油、動物油および鉱物油であり、植物油の例としては、菜種油、コーン油、サフラワー油、椰子油およびココアバターがあげられる。動物油としては、ラード、乳脂、牛脂、鯨油、魚油等があげられるがこれらに限定されない。油脂試料は、そのままでは非極性である多様な副成分を所与の濃度で含み得、特に比較的容易に加水分解して遊離のカルボン酸を生成するような、非極性エステル分子を含有する油脂試料が、本発明の対象とする油脂試料として興味深い。
【００２２】
本明細書における「サンプル」は、前記油脂試料自体であり得るし、また油脂試料を含む天然物や組成物でもあり得る。従って、サンプルは液体に限定されず、固体状のものも含む。サンプルが油脂試料自体でないとき、油脂試料は、サンプルから抽出して調製されなければならない。サンプルからの油脂試料の調製は、サンプル自体の性質やそこに含まれる油脂の性質、或いは分析の目的等に基づいて、種々の公知の方法を適用し得る。例えば、圧搾、ろ過、遠心分離或いは溶媒抽出等を例示できる。溶媒抽出においては、サンプルから油脂成分を非極性溶媒または非極性溶媒／低極性溶媒、例えばエーテル、エーテル／アルコール混液、ヘキサン等により抽出し、所望により溶媒を留去して油脂試料と成し得る。そのような溶媒抽出の方法として、ソックスレー抽出法等を適用してもよい。サンプルから調製される油脂試料には、実質的な量の極性物質、特に高極性カルボン酸が含まれない。
【００２３】
本明細書における用語「非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物」は、従来のアルカリ中和滴定に基づく酸価測定条件下ではエステル加水分解を受けないと一般的に信じられている、「トリグリセライド」との対比の意味においてのみ用いられている。すなわち、当該非グリセライド脂肪酸エステル化合物とは、アルカリ中和滴定の測定条件下でも容易に加水分解してしまうような、脆弱なエステル結合を有する化合物を指すと見做される。通常、そのような非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物は、化学構造において、グリセリンの３つの水酸基全てがエステル結合により同一または異なる中〜長鎖脂肪酸と結合している化合物を包含しない。しかしながら、化学構造的には、広義のトリグリセライドの範疇にあると言い得ても、アルカリ中和滴定におけるエステル結合の安定性の観点からは、一般的なトリグリセライドとは性質を異にするものが存在し得、当該化合物が、本発明の課題に対応する酸価測定を妨害し得るほどの低い安定性を示す場合には、その化合物が、本発明の「非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物」に属することを排除しない。しかしながら、現実に最もしばしば経験される低アルカリ加水分解耐性の化合物は、その構造からしてもトリグリセライドとされないものが主流であり、多くの場合、それらは、動植物或いは微生物のような生体由来の天然成分として存在している。本発明における非トリグリセライド脂肪酸エステル化合物の非限定的な例として、カプシノイド或いは２−メチル酪酸エチル等の香油成分をあげることができる。これらの化合物は、従来法であるアルカリ中和滴定処理で、極めて容易に分解してしまい、アーティファクトとしてのカルボン酸（脂肪酸）を遊離することが立証された。
【００２４】
用語「カルボン酸誘導体化試薬」は、化合物の遊離カルボキシル基を標識するための試薬であり、当該官能基と高い反応性を有し、かつ、検出可能なシグナルを生成し得る試薬である。検出可能なシグナルとは、紫外〜可視部吸収、蛍光、りん光、化学発光、電気化学分析、放射線科学等による種々の分析において測定可能な応答を指し、例えば、化合物の特定の発色団構造や放射性同位元素により与えられ得る。本発明のカルボン酸誘導体化試薬は、好ましくは、極めて温和な条件下で速やかに反応を進行させ、油脂試料に存在する遊離カルボン酸と結合し、これを標識する。当然のことながら、カルボン酸誘導体化試薬による反応は、追加のカルボン酸を更に生成させるような、エステル分解過程を含むべきではない。
【００２５】
用語「蛍光誘導体化試薬」は、前記カルボン酸誘導体化試薬のうち、特に検出可能なシグナルとして蛍光を与えるものである。蛍光検出は、高感度で特異的であるので、迅速で簡便な測定を可能にする。好ましい蛍光誘導体化試薬の例としては、４−ヒドロキシメトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリンおよび９−アンスリルジアゾメタンがあげられる。
【００２６】
測定
本発明の酸価測定方法においては、まず、油脂試料に存在するカルボン酸化合物を前記のカルボン酸誘導体化試薬と反応させる。これにより、変敗により生成した油脂中のカルボン酸が標識される。いっぽう、当該処理は、従来のアルカリ中和滴定法に基づく酸価測定において容易に分解してしまうような、脆弱なエステル結合を有する化合物については作用せず、これによりアルカリ中和滴定による場合のアーティファクトの影響を解消する。カルボン酸誘導体化試薬による標識方法は、用いる試薬の性質に依存してその具体的手順が規定されるが、９−アンスリルジアゾメタン（ＡＤＡＭ）の場合においては、単に油脂試料を適切な溶媒、例えば酢酸エチルで正確に希釈し、その溶液の所定量を前記ＡＤＡＭ試薬の所定量と混合して、室温に数十分〜数時間程度、好ましくは、一時間前後、放置するだけでよい。
【００２７】
カルボン酸誘導体化試薬により誘導体化され、標識されたカルボン酸は、次いで適切な分析手段、好ましくは、ＨＰＬＣにより分析され得る。ＡＤＡＭでの誘導体を例にとれば、前記のごとくに誘導体化処理の完了した油脂試料を、逆相のＨＰＬＣカラムに付して、蛍光検出器によりその溶出パターンを得、関連する各ピークの面積或いはピーク高と、標準化合物の誘導体のそれらを比較して、当該関連する脂肪酸（カルボン酸）の定量分析を行うことができる。そのような分析方法の非限定的な例としては、逆相ＨＰＬＣカラムとしてＬｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ８−5（４．６ｍｍＸ２５０ｍｍ、ケムコ社製）を用い、前記の誘導体化した油脂試料の５μｌをカラムに注入し、流速１．１ｍｌ／ｍｉｎのアセトニトリル／水（８０：２０）の移動相でクロマトグラフを行う。検出は、蛍光検出器（Ｅｘ３６５ｎｍ、Ｅｍ４１２ｎｍ）により行い得る。また、定量分析のための標準化合物としては、オクタン酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ｎ−ペンタデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸（いずれも、ナカライテスク社より入手可能）を、同様にＡＤＡＭ試薬（フナコシ社より入手）で誘導体化したものを用いることができ、これらの誘導体と油脂試料の分析データを比較して、関連する脂肪（カルボン）酸の定量が可能である。なお、ＡＤＡＭ誘導体化脂肪酸１モルあたりの相対蛍光強度は、脂肪酸の種類に関係なく、概ね一定の値を示すので、前記標準物質以外の脂肪酸の量も、標準物質からの値を基にして算出することが可能である。
【００２８】
最後に、上記のようにして定量した、個々の関連する脂肪酸の含量から、油脂試料１ｇ中の総脂肪酸のモル数を算出し、これを中和するのに必要な水酸化カリウムのｍｇ数を計算して、油脂試料の酸価を計算により得ることができる。
【００２９】
以下、各試験例により、従来のアルカリ中和滴定に基づく酸価測定の有する問題点を例証し、そのような問題の原因を特定するに至った根拠を示す。更に、実施例により本発明を詳細に説明するが、それらの試験例および実施例は、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
試験例１  アルカリ中和滴定（従来法）における酸価測定値の再現性／分析精度
試料：  Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｕｍ  ｃｖ．ＣＨ−１９  ｓｗｅｅｔから調製したトウガラシ油を油脂試料として用いた。当該トウガラシ品種に代表されるある種のトウガラシは、通常の辛味成分であるカプサイシノイド（バニリルアミンと脂肪酸のアミド）の代わりに、カプシノイドと総称される、バニリルアルコールと脂肪酸のエステル化合物を多量に含む（矢澤  進、末留  昇、岡本佳奈、並木隆和．’CH-19甘’を片親としたトウガラシ(Capsicum annuum L.)の雑種におけるカプサイシノイドならびにカプサイシノイド様物質の含量．園芸学会雑誌1989, 58:601-607： Kobata K, Todo T, Yazawa S, Iwai K, Watanabe T. Novel capsaicinoid-like substances, capsiate and dihydrocapsiate, from the fruits of a nonpungent cultivar, CH-19 sweet, of pepper (Capsicum annuum L.). J. Agric. Food Chem. 1998, 46:1695-1697： Kobata K, Satoh K, Todo T, Yazawa S, Iwai K, Watanabe T. Nordihydrocapsiate, a new capsinoid from the fruits of a nonpungent pepper, Capsicum annuum.  J. Nat. Prod. 1999, 62:335-336）。なお、当該カプシノイドは、辛味をほとんど有さないにもかかわらず、カプサイシノイドと同様のエネルギー代謝促進作用や持久力増強作用等の各種の生理作用を示すことで注目されている化合物である（Watanabe T, Kawada T, Iwai K. Enhancement by capsaicin of energy metabolism in rats through secretion of catecholamine from adrenal medulla. Agric. Biol. Chem. 1987, 51:75-79： Kawada T, Watanabe T, Takaishi T, Tanaka T, Iwai K. Capsaicin-induced β-adrenergic action on energy metabolism in rats: influence of capsaicin on oxygen consumption, the respiratory quotient, and substrate utilization. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1986, 183:250-256： Watanabe T, Kawada T, Kurosawa M, Sato A, Iwai K. Adrenal sympathetic efferent nerve and catecholamine secretion excitation caused by capsaicin in rats. 1988, 255:E-23-E-27： Watanabe T, Kawada T, Kato T, Harada T, Iwai K. Effects of capsaicin analogs on adrenal catecholamine secretion in rats. Life Sciences 1994, 54:369-374： Kawada T, Hagihara K, Iwai K. Effects of capsaicin on lipid metabolism in rats fed a high fat diet. J. Nutr. 1986, 116:1272-1278： Ohnuki K, Haramizu S, Watanabe T, Yazawa S, Fushiki T. CH-19 sweet, nonpungent cultivar of red pepper, increased body temperature in mice with vanilloid receptors stimulation by capsiate. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo) 2001, 47:295-298： Ohnuki K, Haramizu S, Oki K, Watanabe T, Yazawa S, Fushiki T. Administration of capsiate, a non-pungent capsaicin analog, promotes energy metabilism and supresses body fat accumulation in mice. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65:2735-2740： Ohnuki K, Niwa S, Maeda S, Inoue N, Yazawa S, Fushiki T. CH-19 sweet, a non-pungent cultivar of red pepper, increased body temperature and oxygen consumption in humans. Biosci Biotechnol Biochem. 2001, 65:2033-2036： Kim KM, Kawada T, Ishihara K, Inoue K, Fushiki T.  Increase in swimming endurance capacity of mice by capsaicin-induced adrenal catecholamine secretion. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:1718-1723： 伏木  亨，矢澤  進，渡辺達夫，橋爪秀一，加藤正俊，稲垣宏之．新規なカプサイシノイド様物質を含有する持久力向上用組成物．特許公開公報2002-114676）。
【００３１】
酸価測定法：  アルカリ中和滴定に基づく従来の酸価測定法として、フェノールフタレイン変色法（「基準油脂分析試験法」、社団法人  日本油化学会発行、２．３．１、１９９６年）および電位差滴定法を評価した。電位差滴定法は、フェノールフタレイン変色法において、滴定終点の判定を、フェノールフタレインの変色の変わりに、滴定中の電位差曲線（滴定曲線）の変曲点において行う方法である。
【００３２】
評価：  前記トウガラシ油の４ロットを試料１〜４として、電位差滴定法については分析機関Ａ乃至Ｃ、フェノールフタレイン変色法については分析機関ＡおよびＢで酸価測定した。
【００３３】
結果：
電位差滴定法による酸価の測定結果を表１に、フェノールフタレイン変色法による測定結果を表２に、夫々、示す。
【００３４】
【表１】
2005037225.tif 000002
【００３５】
【表２】
2005037225.tif 000003
【００３６】
表１から明らかなように、同じトウガラシ油（試料１乃至４）を用いて、電位差滴定法により酸価を測定した結果では、分析機関の違いによって測定値に大きなばらつきが認められた。また、表２においては、そのような分析機関間でのばらつきは見受けられないが、本来、一致すべき電位差滴定法の結果とフェノールフタレイン変色法の結果が大きく食い違っていた。従って、本試験例のような油脂試料では、従来法の再現性および分析精度に、看過しがたいほどの問題があることが明らかとなった。
【００３７】
更に、電位差滴定法における滴定曲線（図１）を精査すると、本来、脂肪酸（カルボン酸）の滴定ではそれが極めて単純な曲線を示すべきであるにもかかわらず、当該曲線が複数の変曲点を示す結果となっており、電位差滴定における中和点の判断のばらつきが、異なる変曲点を滴定終点として採用した結果であることを強く示唆した。フェノールフタレイン変色法においては、当該滴定終点が、変色という比較的一定の指標により判定されるため、電位差滴定法の場合のようなばらつきが生じにくいが、それにしても、電位差滴定法における滴定曲線から見て、その滴定量が、正確に当該試料の酸価を反映しているとは許容しがたいものであった。
【００３８】
試験例２  アルカリ中和滴定操作中のカプシノイドの分解
試験例１の結果から、カプシノイドを含むトウガラシ油については、中和滴定中に何らかの副反応が進行して滴定曲線の不安定性をもたらし、その結果として、酸価測定の低再現性／低分析精度を引き起こすものと推測された。特にカプシノイドの代表であるカプシエイト、ジヒドロカプシエイトでは、以下の式
【００３９】
【化１】
2005037225.tif 000004
で表される反応が進行し、新たに生成した脂肪酸がアーティファクトとして分析の再現性・精度に大きく影響していると考えられた。それを実証するため、以下の実験を行った。
【００４０】
Ｉ．アルカリ中和滴定中のカプシノイドの分解
カプシノイドがアルカリ滴定中に実際に分解されているか否かを確かめるために、アルカリ滴定前後のトウガラシ油試料溶液をＯＤＳカラム上でＨＰＬＣ分析した（図２）。アルカリ滴定前の試料をＨＰＬＣ分析した結果、クロマトグラムのパターンに２本のカプシノイドのピーク（カプシエイトＲｔ＝７．３分およびジヒドロカプシエイトＲｔ＝１０．１分）が観測された（図２Ａ）。これに対し、アルカリ滴定後においては、これら２本のカプシノイドピークが完全に消滅し、それらの分解物と思われるピーク（Ｒｔ＝  ２．５分）が新たに出現している（図２Ｂ）。これらの結果より、アルカリ滴定中にカプシノイドが分解されたことは明らかである。
【００４１】
ＩＩ−１．アルカリ中和滴定中のカプシノイドの分解様式
次に、アルカリ滴定におけるカプシノイドの分解が、予想するバニリルアルコールと脂肪酸へのエステル加水分解であるかどうかを確かめた（図３）。すなわち、酢酸エチルに溶解した合成カプシノイド（３０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを２ｍｌマイクロ遠心チューブに入れた。０．０４Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて全量を８００μｌとし、ボルテックスミキサー等を使用し激しく撹拌した。一定時間（０分、１５分）室温で静置後、１０μｌの濃塩酸を加えて反応を停止し、さらに２００μｌのメタノールを加え、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００４２】
得られた結果を図３に示す。０分、１５分と加水分解時間を長くし確認を行った結果、１５分の時点でカプシノイドが完全に加水分解し、予測どおり、バニリルアルコール（保持時間１１分）を生成していることが確認された。
【００４３】
ＩＩ−２．アルカリ中和滴定中のカプシノイドの分解様式
更に、ＩＩ−１のアルカリ加水分解した試料を、基準油脂分析法に基き、３−フッ化ホウ素メタノール法によりメチルエステル化し、ＧＣ−ＭＳにて脂肪酸生成物の測定を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。
【００４４】
図４の上段が、カプシノイドをＩＩ−１に従ってアルカリ処理した後、３−フッ化ホウ素メタノール法により生成させた脂肪酸メチルエステルのクロマトグラムであり、下段が市販のカプサイシン試薬（主としてカプサイシンとジヒドロカプサイシンの混合物）の塩酸メタノリシスによって生じた脂肪酸メチルエステル（８−メチルノネン酸メチルエステルおよび８−メチルノナン酸メチルエステル）のクロマトグラム（対照）である。なお、カプサイシンとジヒドロカプサイシンは塩酸メタノリシスによってバニリルアミンと脂肪酸メチルエステルに分解することが知られている。上段と下段のクロマトグラムの２本の主ピークの保持時間が同じことから、ＩＩ−１のようなカプシノイドのアルカリ処理によっても、８−メチルノネン酸および８−メチルノナン酸が生じたことを示している。
【００４５】
次に、図４の上段と下段のクロマトグラムで注目した２つの成分のマススペクトルの比較を行った。保持時間７．０５分のそれぞれのマススペクトルを図５に示し、保持時間７．１７分の成分のマススペクトルを図６に示す。図５および図６の結果から、ＧＣ−ＭＳの主要な２成分について、いずれの成分も上段と下段でそれぞれ同じマススペクトルを示し、カプシノイドのアルカリ中和滴定によって生じる脂肪酸は、８−メチルノネン酸および８−メチルノナン酸であることが裏付けられた。そして、これらの結果から、カプシノイドを含むトウガラシ油の酸価をアルカリ中和滴定法により測定した際に、測定結果のばらつきを発生させる主な原因は、滴定中にエステル化合物であるカプシノイドが、遊離脂肪酸とバニリルアルコールへと加水分解されるためであることが明らかとなった。
【００４６】
試験例３  その他のエステル化合物の従来法に対する影響の確認
容易にアルカリ加水分解するエステル化合物を多く含んでいるものとして香料がある。そこで、香料の例としてストロベリーフレーバーを用い、これと油脂を混合したモデル系について、それが酸価測定に対してカプシノイドと同様の影響を与えるかどうか確認した。具体的に、エステル化合物として２−メチル酪酸エチルを主成分とする２種のストロベリーフレーバーを試料として用いた（フレーバーＡ、フレーバーＢ）。予め酸価が０であることをアルカリ滴定にて確認した菜種油と、上記フレーバーを１：１で混合し、実験用のモデル系とした。以下、これらの混合物をフレーバー油Ａ、Ｂと称する。なお、理論的には、当該フレーバー油ＡおよびＢの酸価は、０となる筈である。
【００４７】
そこで、まず、試験例１と同じ方法により、当該フレーバー油の酸価を電位差滴定法（従来法）により測定した。結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2005037225.tif 000005
【００４９】
表３から判るように、本来、０となるべきの酸価測定値が１０以上になっており、本油脂試料においてもストロベリーフレーバー由来のエステル化合物が分析を妨害している可能性を窺わせた。
【００５０】
次に、上記のフレーバー油中のエステル化合物が、実際にアルカリ中和滴定によりエステル加水分解していることを検証すべく、上記のアルカリ滴定後のエステル成分の分解について調べた。すなわち、上記アルカリ滴定前及び、滴定後のフレーバー油のヘッドスペース成分を５０℃で１時間、ジメチルシリコーン固定相を塗布したチューブに分配後、加熱脱着−ＧＣ−ＭＳにて測定を行った。得られたトータルイオンクロマトグラムを図７に示す。当該図７のそれぞれ上段が滴定前、下段が滴定後である。５分に溶出している２−メチル酪酸エチルを主成分とする脂肪酸エステルを含むヘッドスペース成分が、アルカリ滴定によってほとんど消失していることが確認され、アルカリ中和滴定によりそれらのエステル化合物が分解していることが確認された。
【００５１】
実施例  ＡＤＡＭ標識法による酸価測定
以上の試験例により、油脂試料中に存在するエステル化合物が、アルカリ中和滴定操作中にアルカリ加水分解を受け、アーティファクトとしてのカルボン酸を生成することで、従来法において正常な酸価測定を妨害していることが実証された。そこで、当該妨害による酸価測定の誤差を解消するための、本発明による方法の実施例として、まずＡＤＡＭ試薬により油脂試料中の脂肪酸のみを誘導体化して標識し、当該標識化合物のみを選択的に定量する方法を以下に例示する。これにより、本来、油脂の変敗を正しく反映するものとして特異的に測定されるべき、油脂試料中の遊離脂肪酸のみが測定され、前記アーティファクトの影響を低減或いは解消し得る。
【００５２】
Ｉ．分析例１（トウガラシ油）
油脂試料：  試験例１のトウガラシ油（試料１〜４）
標準物質：  オクタン酸、ペラルゴン酸、デカン酸、ｎ−ペンタデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸（いずれも、ナカライテスク社より入手）
試薬：  ＡＤＡＭ試薬（フナコシ社）、１％アセトン溶液として保存。使用時に酢酸エチル（特級、和光純薬）で１０倍希釈して使用する。
【００５３】
誘導体化：  油脂試料１５ｍｇを１０ｍｌの褐色メスフラスコへ秤量し、内部標準（ノナデカン酸）を添加したあと酢酸エチル（特級、和光純薬）で定容する。得られた溶液を酢酸エチルにより５倍希釈し、その２５μＬを１００μＬバイアルに採取する。ＡＤＡＭ試薬２５μＬを加え、６０分間室温に放置し検液とする。標準物質についても同様の処理をする。
【００５４】
ＨＰＬＣ分析：
＜装置＞  ポンプ：ＰＵ−１５８０（日本分光）、オーブン：ＳＳＣ−２１２０（センシュー科学）、カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ８−５（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、ケムコ）、検出器：ＦＰ−９２０Ｓ（日本分光）
＜分析条件＞  移動相：アセトニトリル／水＝８０／２０、流量：１．１ｍＬ／ｍｉｎ、オーブン温度：２５℃、検出器：Ｅｘ３６５ｎｍ、Ｅｍ４１２ｎｍ、注入量５μＬ
上記分析の結果から換算した各油脂試料の酸価の測定値を、試験例１の表１中のデータと対比して表４に示す。なお、換算は、標準物質のピークの面積に基づき、ノナデカン酸（内部標準）のピーク面積で標準化して、試料中の脂肪酸の濃度を算定し、これを酸価に変換することで行った。
【００５５】
【表４】
2005037225.tif 000006
【００５６】
表４から、本発明の方法においては、従来法とは異なる結果が得られることが明らかとなった。なお、図８に、上記ＨＰＬＣ分析の一例を示した。
【００５７】
ＩＩ．分析例２（フレーバー油）
分析例１と同様にして、試験例３の２種のフレーバー油（フレーバー油ＡおよびＢ）と当該フレーバー油の調製に用いた菜種油の酸価を本発明の方法により測定した。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
2005037225.tif 000007
【００５９】
表５の結果から、本発明の方法を用いることで、脆弱なエステル化合物を含む油脂試料の酸価測定において、その測定を再現性よく、かつ高精度で行い得ることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、カプシノイド化合物を含むトウガラシ油の代表的な滴定曲線（電位差滴定法）を示す。
【図２】図２は、アルカリ中和滴定前後のトウガラシ油（カプシノイド含有）のＨＰＬＣ分析結果を示す。図中、Ａはアルカリ滴定前、Ｂはアルカリ滴定後のトウガラシ油の分析結果を示す。条件は、カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳ−Ｈ８０  ４．６×１５０ｍｍ  （ＹＭＣ）、移動相：８０％メタノール、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、蛍光検出器：Ｅｘ＝２８０ｎｍ、Ｅｍ＝３２０ｎｍ、温度：４０℃。
【図３】図３は、トウガラシ油（カプシノイド含有）のアルカリ加水分解生成物のＨＰＬＣ分析結果を示す。０分（０ｍｉｎ）および１５分（１５ｍｉｎ）経過後。条件は、カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（ＹＭＣ，  ４．６×１５０ｍｍ）、移動相：Ａ  ：  ０．１％トリフルオロ酢酸溶液  Ｂ  ：  メタノール、２０％−Ｂ（０ｍｉｎ）→１００％−Ｂ（２０ｍｉｎ）→１００％−Ｂ（３０ｍｉｎ）、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、温度：４０℃、検出器：ＵＶ２８０ｎｍ、注入量：５μｌ
【図４】図４は、カプシノイドのアルカリ分解によって生成した脂肪酸のトータルイオンクロマトグラムを示す。上段が、カプシノイドをアルカリ処理した後、３−フッ化ホウ素メタノール法により生成させた脂肪酸メチルエステルのクロマトグラムであり、下段が市販のカプサイシン試薬（主としてカプサイシンとジヒドロカプサイシンの混合物）の塩酸メタノリシスによって生じた脂肪酸メチルエステル（８−メチルノネン酸メチルエステルおよび８−メチルノナン酸メチルエステル）のクロマトグラム（対照）である。条件は、カラム：ＳＰ−２３８０（０．２５ｍｍ  ｉ．ｄ．  Ｘ  ３０ｍ、２５μｍ、ＳＰＥＬＣＯ）、キャリアガス：ヘリウム（４０ｃｍ／ｓ、線速度モード）、オーブン：４０℃（２ｍｉｎ）−２０℃／ｍｉｎ−２２０℃、注入口：２００℃（スプリット比  １：３０）、ＩＦ温度：２５０℃、イオン源温度：２００℃
【図５】図５は、図４において保持時間７．０５分の成分のマススペクトルを示す。
【図６】図６は、図４において保持時間７．１７分の成分のマススペクトルを示す。
【図７】図７は、フレーバー油のアルカリ滴定前と後のヘッドスペース分析結果を示す。それぞれ上段が滴定前、下段が滴定後である。分析は、アルカリ滴定前及び、滴定後のフレーバー油のヘッドスペース成分を５０℃で１時間、ジメチルシリコーン固定相を塗布したチューブに分配後、加熱脱着−ＧＣ−ＭＳにて測定を行った。
【図８】図８は、トウガラシ油のＡＤＡＭ誘導体化後のクロマトグラムを示す。
【図１】
2005037225.tif 000008
【図２】
2005037225.tif 000009
【図３】
2005037225.tif 000010
【図４】
2005037225.tif 000011
【図５】
2005037225.tif 000012
【図６】
2005037225.tif 000013
【図７】
2005037225.tif 000014
【図８】
2005037225.tif 000015