(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする心疾患治療剤を提供する。【解決手段】未分化のヒト羊膜由来間葉系細胞が心筋細胞に分化できることを見出した。この細胞を有効成分とする、心疾患治療のための医薬組成物を提供が可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする医薬組成物。
【請求項２】
ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする心疾患治療剤。
【請求項３】
ヒト羊膜由来間葉系細胞を心疾患患者に投与することを特徴とする心疾患治療法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする心臓疾患治療剤及びヒト羊膜由来間葉系細胞を心臓疾患患者に投与することを特徴とする心臓疾患治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、再生医療なる技術が脚光を浴びるようになった。すなわち、ヒト又は他の生物の体は、一生の間に外傷や疾病によって組織の一部を失ったり、大きな障害を受けたりするが、この場合の再生能力は、動物種によっても、また、組織によっても異なっている。自然には再生できない臓器や組織を再生させ、機能を回復させるべく、未分化の細胞より生物機能を有する細胞を分化せしめる技術が発達した。このような技術は、一般に再生医療と呼ばれている。
【０００３】
しかしながら、従来、このような技術に供される細胞として、一般にヒト胎児由来の幹細胞が使用されており、倫理的な側面より問題視されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、かかる問題を克服すべく、ヒト胎児由来の幹細胞に代替し得る細胞を模索していたところ、ヒト羊膜由来の間葉系細胞を一定条件下で培養すれば、心筋細胞様細胞に分化することを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、
（１）
ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする医薬組成物、
（２）
ヒト羊膜由来間葉系細胞を有効成分とする心疾患治療剤、
（３）
ヒト羊膜由来間葉系細胞を心疾患患者に投与することを特徴とする心疾患治療法、
に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、ヒト羊膜細胞は、インフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、通常の外科的手法で得ることができる。
【０００７】
羊膜より間葉系細胞は以下の方法で得ることができる。
【０００８】
得られた羊膜を、滅菌したハサミ等を用い断片化し、ダルベッコ修正イーグル培地等の通常の動物細胞の培養に用いられる培養液に入れ、振盪する。この場合、羊膜断片を個々の細胞に分散化するため、トリプシン等の蛋白質分解酵素を共存させることが望ましい。好適な蛋白質分解酵素の濃度は、０．１％から０．５％である。また、振盪する場合の温度は、２５℃から４０℃の間が好ましい。振盪の間隔は、５０ｒｐｍから２００ｒｐｍが好ましく、振盪時間は、２０分から６０分が好ましい。
【０００９】
遠心操作で細胞を集めた後、上清を除去後、該細胞を前記と同様の条件下で、蛋白質分解酵素が共存する培養液中で再度振盪する。但し、振盪の間隔は、４００ｒｐｍから６００ｒｐｍが好ましく、振盪時間は、２０分から６０分が好ましい。
【００１０】
この後、培養溶液を滅菌ガーゼなどのメッシュで越し、上皮細胞を除く。ガーゼに残された羊膜を上記と同じ方法で、再度断片化、さらに細胞分散化し、ガーゼで越し、上皮細胞を完全に除く。ガーゼなどのメッシュ上に残された羊膜を０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（和光純薬（株）製）等の蛋白質分解酵素及０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡアーゼ（シグマ社製）等の核酸分解酵素により振盪し、消化することができる。振盪の温度は、２０℃から４０℃の間が好ましく、振盪時間は３０分から１２０分が好ましく、振盪の間隔は、１００ｒｐｍから１０００ｒｐｍが好ましい。
【００１１】
消化された羊膜をガーゼなどのメッシュで越し、間葉系細胞を分離することができる。得られた間葉系細胞を遠心で集め、１０％の血清を含む培養液中で、ＣＯ２インキュベータ中で培養する。培養温度は３７℃、ＣＯ２濃度は５％が好ましい。血清は子牛血清又は子牛胎児血清が好ましい。また、培養液には、濃度１％前後の抗生物質（例えば、ペニシリンＧ、１００単位／ｍｌ：ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ：アンフォテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍｌ）を共存させることが好ましい。細胞密度は、１０５〜１０６細胞／ｍｌが好ましい。間葉系細胞は、通常羊膜一枚から５×１０６個細胞が分離できる。
【００１２】
本発明の医薬組成物は、上述の方法で得られた、ヒト羊膜由来の間葉系細胞を含むことを特徴とする。
【００１３】
間葉系細胞を患者に投与する場合、共存する抗生物質や異種血清を完全に除去するために、生理食塩水で細胞を丹念に洗浄する。細胞を投与する場合には、細胞を生理食塩水又は培養液にサスペンジョンしたものを用いる。細胞濃度は、１０６〜１０８細胞／ｍｌが好ましい。細胞を補助するために、増殖因子や細胞安定剤を混在させてもよい。
【００１４】
投与部位は、特に限定はないが、疾患に応じて、心疾患部位等の局所や種々の血管内が選択される。
【００１５】
投与する総細胞数は、患者の病態、体重等に依存する。
【００１６】
本発明の医薬組成物又は治療法により治療可能な疾患は、以下の通りである。
【００１７】
虚血性心疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞、川崎病等）、弁膜症（例えば、僧帽弁狭窄症、僧帽弁閉鎖不全症、僧帽弁逸脱症候群、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症等）、不整脈（例えば、心房細動、心房粗動、発作性上室性頻拍、ＷＰＷ症候群、房室結節回帰性頻拍、心室性期外収縮、心室頻拍、心室細動、徐脈性不整脈、洞不全症候群等）、大動脈・血管疾患（例えば、上行部大動脈瘤、弓部大動脈瘤、胸部大動脈瘤、胸部下行大動脈瘤、胸腹部大動脈瘤、腹部大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症、静脈血栓、肺血栓閉塞症等）、先天性心疾患（例えば、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、Ｅｉｓｅｎｍｅｎｇｅｒ症候群、肺動脈還流異常、動脈管開存症、心内膜床欠損症、完全大血管転移症、修正大血管転移症、肺動脈狭窄症、Ｆａｌｌｏｔ四徴症、大動脈縮窄症、Ｖａｌｓａｌｖａ洞動脈瘤、Ｅｂｓｔｅｉｎ奇形等）、心筋症（拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症等）。
【００１８】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１．ヒト間葉系細胞の分離
インフォームドコンセントを得たヒト妊婦を帝王切開し、羊膜を入手した。得られた羊膜を滅菌した手術用ハサミで断片化し、０．２％トリプシンを含む細胞培養液（ダルベッコ修正イーグル培地：以下、「ＤＭＥＭ」という。）と共に５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、３７℃のシェーカーで１００ｒｐｍで３０分間振盪した。遠心後上清を除去し、再度滅菌した手術用ハサミで断片化し、３７℃のシェーカーで４００ｒｐｍ〜６００ｒｐｍで３０分間振盪し、０．２％トリプシンで消化した。溶液を滅菌ガーゼで越し、上皮細胞を除いた。ガーゼに残された羊膜は、再度滅菌した手術用ハサミで断片化し、同様に０．２％トリプシンで３０分間消化した。トリプシン消化と細胞回収の操作を３回繰り返し、上皮細胞を完全に除去した。ガーゼ上に残された、上皮細胞が完全に取り除かれた羊膜をコラゲナーゼ（０．７５ｍｇ／ｍｌ、和光純薬（株）製）、ＤＮＡアーゼ（０．０７５ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）で、３７℃で６０分間、６００ｒｐｍで振盪し、消化した。消化された羊膜をガーゼで越し、間葉系細胞を分離した。得られた間葉系細胞を遠心で集め、４×１０５細胞／ｍｌの密度で１０％子牛胎児血清を含むＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ２下で抗生物質（ペニシリンＧ、１００単位／ｍｌ：ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ：アンフォテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍｌ）存在下で培養した。間葉系細胞は、通常羊膜一枚から５×１０６個細胞が分離できた。分離した羊膜由来上皮細胞と間葉系細胞の写真を図１に示す。
試験例１．
ヒト羊膜由来間葉系細胞の心筋細胞への分化
（１）分離した間葉系細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦまたは５μＭの５−アザシチヂン（５−ＡＺＡ）存在下で、約１ヶ月間、１０％子牛胎児血清を含む３７℃、５％ＣＯ２下で抗生物質（ペニシリンＧ、１００単位／ｍｌ：ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ：アンフォテリシンＢ、０．２５μｇ／ｍｌ）存在下で培養後、心筋細胞特異的な転写因子であるＮＫＸ２．５(Komuro, I.; Izumo, S. : Csx: a murine homeobox-containing gene specifically expressed in the developing heart. Proc. Nat. Acad. Sci. 90: 8145-8149, 1993.)に対する抗体を用いた蛍光免疫染色法により解析した。上記の培養間葉系細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１００％メタノールで−２０℃、１０分間、１００％アセトンで−２０℃、１分間処理して細胞を固定した。次に抗ヒトＮＫＸ２．５抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社製：ｓｃ−１４０３３を１：２００希釈したもの）を用い室温で１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ抗体で室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＦＧＦで処理した羊膜間葉系細胞のみで、ＮＫＸ２．５蛋白質の発現が認められた（図２）。この結果により、ヒト羊膜間葉系細胞から、心筋細胞が誘導できることが示された。
（２）ＲＴ−ＰＣＲによる検討
（１）で得られた細胞で心筋細胞特異的な転写因子ＮＫＸ２．５遺伝子の転写が亢進しているか否かを検討するために、上記細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＮＫＸ２．５遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。ＲＮＡｚｏｌ（モレキュラーリサーチセンター社製）を添付のプロトコールに従って用いて、（１）で得られた羊膜細胞よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、１μｇを基質とし、ヒトＮＫＸ２．５遺伝子中のヒト特異的ヌクレオチド配列に基づき設計したプライマー：
5’- cttcaagcca gaggcctacg -3’  （プライマー１：配列表の配列番号１）；および
5’- ccgcctctgt cttcttcagc -3’  （プライマー２：配列表の配列番号２）；を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。反応はＲＴ−ＰＣＲキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を添付のプロトコールに従って用い、逆転写酵素で４２℃、３０分間反応させてｃＤＮＡを作製し、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の温度サイクルを４０回繰り返してＰＣＲ反応を行った。得られた産物を２％アガロースゲルを用いて１００ボルトで１時間、電気泳動を行い、紫外線下でヒトＮＫＸ２．５のｍＲＮＡからの増幅産物に相当する２３３ｂｐのバンドを同定した。その結果、ＦＧＦ存在下で培養した細胞のみでヒトＮＫＸ２．５特異的な増幅産物が確認された（図３）。
【００１９】
【発明の効果】
本発明を利用することにより、倫理的問題の生じないように、再生医療技術を用い、心疾患治療薬を提供することが可能になり、または、心疾患患者を治療することが可能になる。
【００２０】
【配列表】
2005139067.tif 000002
2005139067.tif 000003
【００２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】羊膜由来上皮細胞（ＨＡＥ）及び間葉系細胞（ＨＡＭ）図。
【図２】分離した間葉系細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦまたは５μＭの５−アザシチヂン存在下で約１ヶ月間培養し、心筋特異的なＮＫＸ２．５に対する抗体で蛍光免疫染色法により染色した図。
【図３】分離した間葉系細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦまたは５μＭの５−アザシチヂン存在下で約１ヶ月間培養した後にＲＮＡを抽出し、ヒトＮＫＸ２．５遺伝子が発現しているか否かをＲＴ−ＰＣＲ法で確認した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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