(57)【要約】【解決課題】  簡便で精度の高いバイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法を提供すること。【解決手段】  生体由来血清試料にレクチンを添加し、放置する工程を含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来血清試料にレクチンを添加し、放置する工程を含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法。
【請求項２】
レクチンを用いて、生体由来血清試料中のＳＨＢＧ結合型ステロイドホルモンを、レクチン結合性糖鎖構造を有するタンパク質と一緒になって凝集及び／又は沈殿させる工程を含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法。
【請求項３】
レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
バイオアベイラブルステロイドホルモンが、バイオアベイラブルテストステロンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
レクチンを含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモン測定用試薬。
【請求項６】
レクチンが、コンカナバリンＡである、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法に用いるための、請求項５又は６に記載の試薬。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬を含む、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定キット。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬を含む、血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患の鑑別キット。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患の鑑別方法。
【請求項１１】
血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患が、パダム（Partia1 Androgen Deficiencyin Aging Ma1e）である、請求項１０に記載の鑑別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中におけるバイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法に関するものである。本発明の方法は、血中に存在するステロイドホルモンの中で活性を示す状態で存在しているもの、すなわち、バイオアベイラブルな状態にあるステロイドホルモンの血中レベルを知るのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
生体内循環血中のステロイドホルモンは、そのほとんどが性ホルモン結合蛋白やアルブミン等の蛋白と結合しており（蛋白結合型）、遊離した状態（遊離型）にて存在するものはごくわずかである。
【０００３】
例えば、テストステロンは、性ホルモン結合グロブリン（sex hormone binding globulin; SHBG）結合型が約３０％、アルブミン結合型が約６８％、遊離型が約２％という割合で生体内に存在している。そして、ＳＨＢＧが血中に増加すると、テストステロンが高親和性にＳＨＢＧに結合する結果、遊離型のテストステロンが減少し、生体内でのアンドロゲン作用が減弱される。一方、アルブミンに対するテストステロンの親和性はＳＨＢＧに対するそれの１／１０００ときわめて低く、また、血中におけるテストステロンの蛋白結合型−遊離型は平衡状態にあるため、血中の遊離型テストステロンが減少すると、アルブミンに結合しているテストステロンが解離して遊離型となる。このようなことから、生物活性を有するとされる遊離型テストステロン及び親和性が低くて遊離しやすいために標的器官へテストステロンを提供する能力を有するとされるアルブミン結合型のテストステロンの２者をまとめて、バイオアベイラブルテストステロンと呼ばれている。
【０００４】
男性においては一般に、加齢に伴い、アンドロゲンの低下に基づく精神、身体及び性機能低下などのいわば男性更年期とも呼ぶべき症状が見られる。最近、これらの症状に対し、Partial Androgen Deficiency in Aging Male（ＰＡＤＡＭ）という診断名が付されるようになった。血中総テストステロンの量は、エストロゲンと異なり、加齢による低下は緩徐であるが、ＳＨＢＧが加齢とともに増加するため、血中バイオアベイラブルテストステロンの量は加齢に伴って顕著に低下する（非特許文献２参照）。Nankinらは、健常高齢者の血中のテストステロン値、遊離型テストステロン値及び黄体ホルモン値は若年者と有意差を認めないものの、血中バイオアベイラブルテストステロン値は若年者に比べて有意に低く、さらに勃起不全を有する患者群においては血中バイオアベイラブルテストステロン値は有意に低下していることを報告している（非特許文献５参照）。また、男性のうつ状態及び意欲低下等が血中バイオアベイラブルテストステロン値の低下と相関することも報告されている（非特許文献６参照）。このようなことから、血中バイオアベイラブルテストステロン値は、ＰＡＤＡＭの診断において重要な指標となるものと考えられる。
【０００５】
血中バイオアベイラブルテストステロン値の測定には、これまで、硫安沈殿法（非特許文献１乃至非特許文献４参照）及びＩＳＳＡＭ法が用いられてきた。硫安沈殿法は、血清に硫酸アンモニウムを加えてＳＨＢＧ結合型テストステロンを沈殿させて除去し、非ＳＨＢＧ画分中のテストステロンの量をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等により測定するものである。しかし、この方法においては、アルブミンとグロブリンの分離が悪く、アルブミンのおよそ半量が沈殿してしまううえに沈殿しないＳＨＢＧが１５％程度残るという欠点がある。
【０００６】
ＩＳＳＡＭ法は、血清中の総テストステロンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで、また、ＳＨＢＧ及びアルブミンをＲＩＡ及び比色法でそれぞれ定量し、それらの値をInternational Society for the Study of the Aging Male（ＩＳＳＡＭ）の計算式に代入してバイオアベイラブルテストステロンの値を求めるものである（非特許文献７参照)。しかし、ＩＳＳＡＭ法においては３つの化合物を測定しなければならないのでかなり煩雑である。
【０００７】
また、ＩＳＳＡＭ法においては総ＳＨＢＧの値が用いられるため、ＳＨＢＧの結合状態の違いは測定値に反映されない。例えば、ＳＨＢＧはエストロゲンに対しても親和性が高いため、エストロゲンが増加した状態にある患者においてはＳＨＢＧがエストロゲンと多く結合する結果、その患者における遊離型テストステロンの値が高くなっている（非特許文献８参照）。しかし、ＩＳＳＡＭ法において測定されるＳＨＢＧの値にはこのような状態は反映されない。さらに、ＳＨＢＧの変異型とテストステロンとの結合は野生型のそれと異なり、変異型ＳＨＢＧの量が遊離型テストステロンの量に影響を及ぼす（非特許文献９参照）のであるが、このことは、ＩＳＳＡＭ法におけるＳＨＢＧの値には考慮されない。またさらに、ＳＨＢＧとテストステロンとの結合は金属イオンやステロイド性薬物の存在により影響を受ける（非特許文献１０及び非特許文献１１参照）が、このこともＩＳＳＡＭ法において測定されるＳＨＢＧの値には考慮されない。
【０００８】
一方、グロブリン等のレクチン結合性糖鎖構造を有する蛋白質はコンカナバリンＡ等のレクチンによって凝集等することが一般的に知られており、特許文献１乃至特許文献４にも、血清中のグロブリンがレクチンによって除去しうる旨が記載されている。
【０００９】
しかし、レクチンによるレクチン結合性糖鎖構造を有する蛋白質の除去が選択的であるかどうか、また、上記凝集等の際にＳＨＢＧ結合型ステロイドホルモンがＳＨＢＧに包含されたまま凝集等するかどうかは明らかにされていない。したがって、レクチンがＳＨＢＧ結合型ステロイドホルモンの除去に適しているかどうかについては不明であり、また、レクチンを用いてＳＨＢＧ結合型ステロイドホルモンを除去したという報告もなされていない。
【００１０】
ところで、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定においては、血清中の含有量が微量であることから、内部標準物質を指標として作成した検量線等を用いてその量を求めるのが簡便である。しかし、その内部標準物質が測定対象物質の誘導体、例えば、重水素化テストステロンなどであるときは、添加した内部標準物質とＳＨＢＧに包含されているステロイドホルモンとの交換が起きてしまう。したがって、上記内部標準物質を指標とした検量線を作成するためには、この問題を解決する必要があった。
【００１１】
上記のようなことから、これまでに、レクチンを用いてバイオアベイラブルステロイドホルモンを測定したという報告は全くなされていなかった。
【００１２】
【特許文献１】特許公開２０００−０８１４３４号公報
【特許文献２】特許公表２００１−５１５７８８号公報
【特許文献３】特許公表２００１−５０４６８６号公報
【特許文献４】再公表ＷＯ００／０５７１９１号公報
【非特許文献１】Clinica Chimica Acta; 132, 101-110(1983)
【非特許文献２】J.Clin.Endocrin.Metab.; 61(4), 705-710(1985)
【非特許文献３】J.Clin.Endocrin.Metab.; 71(4), 963-969(1990)
【非特許文献４】医学のあゆみ；205(6), 407-410(2003)
【非特許文献５】J.Clin.Endocrin.Metab.; 63,1418(1986)
【非特許文献６】J.Clin.Endocrin.Metab.; 84,573-577(1999)
【非特許文献７】J. Clin. Endocrinol. Metab.; 84, 3666-3672(1999)
【非特許文献８】J.Biol.Chem.; 277, 45219-45225(2002)
【非特許文献９】J.Clin.Endocrin.Metab.; 75, 1066-1070(1992)
【非特許文献１０】J.Steroid Biochem.; 17, 375-380(2002)
【非特許文献１１】Steroids; 64, 328-334(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、コンカナバリンＡ等のレクチンによりレクチン結合性糖鎖構造を有する蛋白質を凝集及び／又は沈殿させ、生体由来血清試料中のバイオアベイラブルステロイドホルモン、特にバイオアベイラブルテストステロンを測定する方法を提供することである。
【００１４】
また、本発明の別の目的は、コンカナバリンＡ等のレクチンを含有してなる、生体由来血清試料中のバイオアベイラブルステロイドホルモン、特にバイオアベイラブルテストステロンの測定用試薬を提供することである。
【００１５】
さらに、本発明の別の目的は、血中のステロイドホルモンの状態に基づいてＰＡＤＡＭを鑑別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者らは、鋭意研究した結果、生体由来血清試料にレクチンを添加すると、レクチン結合性糖鎖構造を有する蛋白質のみがステロイドホルモンを包含したまま凝集し、バイオアベイラブルステロイドホルモンを血清中に特異的且つ簡便に分離できることを見出した。そして、血清中のバイオアベイラブルステロイドホルモンの量を測定する方法を開発して、本願発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明によれば、生体由来血清試料にレクチンを添加し、放置する工程を含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法が提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、レクチンを用いて、生体由来血清試料中のＳＨＢＧ結合型ステロイドホルモンを、レクチン結合性糖鎖構造を有するタンパク質と一緒になって凝集及び／又は沈殿させる工程を含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法が提供される。
【００１９】
また、本発明によれば、レクチンを含むことを特徴とする、バイオアベイラブルステロイドホルモン測定用試薬が提供される。
【００２０】
さらに、本発明によれば、上記本発明のバイオアベイラブルステロイドホルモンの測定方法を用いることを特徴とする、血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患の鑑別方法が提供される。
【００２１】
また、本発明によれば、上記本発明のバイオアベイラブルステロイドホルモン測定用試薬を含む、バイオアベイラブルステロイドホルモンの測定キット及び血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患の鑑別キットも提供される。
【００２２】
本明細書において、「レクチン結合性糖鎖構造を有する蛋白質」とは、水溶性の血清蛋白質であって、レクチンがその糖鎖結合部位を認識して結合するような糖鎖構造を有する蛋白質を意味し、具体的には、α−グロブリン、β−グロブリン及びγ−グロブリンが挙げられる。
【００２３】
また、本明細書において、「バイオアベイラブルステロイドホルモン」とは、血中に存在するステロイドホルモンの中で、遊離型で存在するステロイドホルモン及び蛋白結合型であるが標的器官へステロイドホルモンを提供する能力を有する状態で存在するステロイドホルモンを意味する。なお、本発明において測定対象となる「ステロイドホルモン」は、生体内に存在する天然型のステロイドホルモンであり、例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン、アンドロステンジオン、デハイドロエピアンドロステロン、アルドステロン等を挙げることができる。これらのステロイドホルモンの中でも、テストステロン、ジヒドロテストステロン及びエストラジオールが好ましく、特に、テストステロンが好適である。これらのステロイドホルモンの測定により、血中バイオアベイラブルステロイドホルモン値に顕著な影響を及ぼす疾患、すなわち、骨粗しょう症、更年期障害、副腎不全症、ＰＡＤＡＭを鑑別することができる。
【００２４】
さらに、本明細書において、「ＰＡＤＡＭ」とは、老若男女を問わず、生体内アンドロゲンの低下に由来する精神的、身体的及び性機能低下の症状を意味する。ここで、精神的症状としては、例えば、無気力、疲労倦怠感、抑うつ、不眠、イライラ、集中力低下等を挙げることができ、身体的症状としては、例えば、発汗、耳鳴り、頭痛、しびれ、動悸、めまい、肩こり、寝汗等を挙げることができる。また、性機能低下の症状としては、例えば、勃起障害、性欲低下等が挙げられる。
【００２５】
本発明において用いることのできるレクチンとしては、ガレクチン、アネキシン、Ｃ−型レクチン等の動物由来レクチン及び豆科レクチン等の植物由来レクチンを挙げることができるが、中でも、豆科レクチン、例えば、コンカナバリンＡ、ヒマレクチン、ピーナッツレクチン、レンズマメレクチン等が好ましく、とりわけ、コンカナバリンＡが好適である。
【００２６】
本発明の測定方法の概略は次の通りである。
測定方法の概略：生体由来血清試料にレクチンのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）溶液を添加して混和し、室温にて放置する。その後、ＰＢＳでさらに希釈した後、凝集及び／又は沈殿物を除去し、溶液中に含まれる測定対象物を定量する。
【００２７】
レクチンのＰＢＳ溶液の濃度は特に制限されるものではないが、０．５重量％以上、特に１重量％以上であることが好ましく、また、２０重量％以下、特に１０重量％以下であることが好ましい。また、その量は、生体由来血清試料に対して１０分の１乃至１０倍量とすることができ、中でも、５分の１乃至５倍量が好ましい。
【００２８】
レクチンのＰＢＳ溶液を添加して混和した生体由来血清試料を室温にて放置する時間は、少なくとも１５分、好ましくは３０分以上必要であるが、多くとも６時間までとし、好ましくは３時間以下とするのが良い。
【００２９】
上記の測定方法の概略において、室温放置が終了した後に希釈のために加えるＰＢＳの量は、特に制限されるものではないが、生体由来血清試料に対して半量乃至２０倍量、好ましくは等量乃至１０倍量とすることができる。
【００３０】
また、上記の測定方法の概略における凝集及び／又は沈殿物の除去は、一般的な方法、例えば、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により行うことができる。中でも、遠心分離が簡便である。なお、上記の測定方法の概略において、生体由来血清試料にレクチンを加えてから凝集及び／又は沈殿物を除去するまでの操作は、更なる簡便な方法、例えば、レクチンを結合させたカラムに生体由来血清試料を通過させる、等をもって代用することができる。さらに、凝集及び／又は沈殿物を除去した溶液中より、必要に応じて、測定対象物を有機溶媒等により抽出したものを定量に供することもできる。測定対象物の抽出に用いうる有機溶媒としては、例えば、エーテル、酢酸エチル、ジクロロメタン、トルエン等を挙げることができる。
【００３１】
本発明における測定対象物質の定量には、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等の分析機器、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等による測定試薬等を用いることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法は、血中に存在するバイオアベイラブルステロイドホルモンを測定するのに有用である。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：コンカナバリンＡを用いたバイオアベイラブルテストステロンの測定
（１）測定条件、補正値等についての検討
（i）コンカナバリンＡによる血清処理条件の検討
ＳＨＢＧを凝集及び／又は沈殿させるためのコンカナバリンＡの濃度及び反応時間について検討した。
まず、４本のプラスチックチューブそれぞれにボランティア健常男性の血清試料１００μLを加え、それに125Ｉ−ＳＨＢＧ（セティカンパニーより購入、ヒト血清由来）をそれぞれ添加した。さらに、２．５％、５％、１０％及び２０％の濃度に調製したコンカナバリンＡ（アマシャムバイオサイエンシズより購入）のＰＢＳ（０．０５mol/Lリン酸緩衝液、０．９％ＮａＣｌ含有、ｐＨ７．４。以下、「ＰＢＳ−１」という。）溶液５０μLをそれぞれのチューブに加えて混和した。これらを室温にて１時間放置した後、ＰＢＳ−１溶液５００μLを加えて希釈し、遠心分離（４℃、３０００rpm、１０分）して、沈殿物に含まれる125Ｉ−ＳＨＢＧの量をγ−カウンター（ＡＲＣ−１０００Ｍ、アロカ社）にて測定した。そして、添加した125Ｉ−ＳＨＢＧの放射活性に対する測定値の割合を求めた。その結果を図１−Ａ）に示す。
【００３４】
また、６本のプラスチックチューブに、上記と同様に、ボランティア健常男性の血清試料１００μL及び125Ｉ−ＳＨＢＧをそれぞれ加え、さらに、コンカナバリンＡの５％ＰＢＳ−１溶液５０μLを加えて混和した。そして、一定時間経過するごとにＰＢＳ−１を５００μL加えて希釈し、直ちに遠心分離（４℃、３０００rpm、１０分）した。上記と同様に、沈殿物に含まれる125Ｉ−ＳＨＢＧの量をγ−カウンターにて測定し、添加した125Ｉ−ＳＨＢＧの放射活性に対する測定値の割合を求めた。その結果を図１−Ｂ）に示す。
上記実験の結果、反応時間が１時間及び加えるコンカナバリンＡのＰＢＳ−１溶液の濃度が５％のときに、ＳＨＢＧの除去率が最大で約８０％となることがわかった。
【００３５】
（ii）125Ｉ−ＳＨＢＧの凝集率の検討
125Ｉ−ＳＨＢＧを添加した後にコンカナバリンＡにより処理した（血清試料１００μLにコンカナバリンＡの５％ＰＢＳ−１溶液５０μLを加えて混和し、室温にて１時間放置したもの。以下、単に「処理」という。）血清及び125Ｉ−ＳＨＢＧを添加しコンカナバリンＡで処理しない血清を、それぞれＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００（アマシャムバイオサイエンスより購入、ＰＢＳ−１に懸濁して調製）のカラムクロマトグラフィー（０．５×６０cmのガラスカラム）に添加した。そして、移動相をＰＢＳ−１、流速を１mL／分とし、溶出物を２mLごとに分画してそれぞれの画分に含まれる125Ｉ−ＳＨＢＧ及びテストステロンを、γ−カウンター及び液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＱｕａｔｔｒｏII、マイクロマス社）により測定した。その結果を図２に示す。
【００３６】
コンカナバリンＡ未処理の血清においては、125Ｉ−ＳＨＢＧ及びテストステロンの殆んどが高分子画分に見られ、テストステロンは低分子画分にも一部見られた。一方、コンカナバリンＡにより処理した血清においては、高分子画分におけるテストステロンが殆んど消失しており、また、125Ｉ−ＳＨＢＧはコンカナバリンＡ未処理に対し、面積比で２０％程度に低下していた。
【００３７】
125Ｉ−ＳＨＢＧを添加する代わりに14Ｃ−アルブミンを添加して上記と同様の操作を行ったところ、テストステロンについては同様の結果を示したが、14Ｃ−アルブミンについては、処理及び未処理の場合とも、測定された放射活性の強さはほぼ同じであった。このことより、アルブミンはコンカナバリンＡにより殆んど影響を受けないと考えられる。
【００３８】
コンカナバリンＡによるＳＨＢＧの凝集及び／又は沈殿率が約８０％であることから、ＳＨＢＧの中にレクチン結合性糖鎖構造を有しないものが約２０％含まれていることが予想される。また、コンカナバリンAにより処理した場合、高分子画分のテストステロンが殆んど消失していたことから、ＳＨＢＧはテストステロンを包含したまま凝集及び／又は沈殿するものと推察される。
【００３９】
（iii）測定における補正値の検討
バイオアベイラブルテストステロンの測定における補正値を得るため、血清中のアルブミンの回収率を求めた。
まず、14Ｃ−ヒトアルブミン（パーキンエルマーより購入）のＰＢＳ−１溶液（14Ｃ−ヒトアルブミンを適量のＰＢＳ−１に溶解したもの）１mLと、コンカナバリンＡの１０％水溶液１mLを混合し、14Ｃ−ヒトアルブミンを含有するコンカナバリンＡの５％ＰＢＳ溶液を調製した（以下、この溶液を「ＣｏｎＡ５％液」という）。そして、ＣｏｎＡ５％液５０μLの放射活性を測定したところ、３７７０．７dpmであった。
【００４０】
ヒトアルブミンのＰＢＳ−１溶液（９ｇのヒトアルブミンを１０mLのＰＢＳ−１に溶解したもの）１００μLにＣｏｎＡ５％液５０μLを加え、室温にて１時間放置した後、遠心分離したところ、その沈殿物には放射活性（シンチレーションカウンターはアロカ社のＬＳＣ−５１００を用いた）は見られなかった。このことより、上記ヒトアルブミンのＰＢＳ−１溶液はＣｏｎＡ５％液５０μLにより凝集及び／又は沈殿しないことを確認した。
【００４１】
次に、ボランティア健常男性の血清試料１００μLにＣｏｎＡ５％液５０μLを添加し、室温にて１時間放置した後、２００μL又は５００μLのＰＢＳ−１にて希釈し遠心分離した。そして、沈殿物中の放射活性と添加した14Ｃ−アルブミンの放射活性とを比較することにより、14Ｃ−アルブミンの回収率を求めた。希釈に用いたＰＢＳ−１の量とその場合の14Ｃ−アルブミンの回収率を下記表１に示す。下記表１に示すように、バイオアベイラブルテストステロンを測定する際の補正値について、例えば、５００μLのＰＢＳ−１で希釈した際の補正値を７５％とするなどと設定した。
【００４２】
【表１】
2005283380.tif 000002
【００４３】
（iv）コンカナバリンＡ処理によるＳＨＢＧとアルブミンとの分離の確認
ボランティア健常男性の血清試料１００μLに、14Ｃ−ヒトアルブミン及び125Ｉ−ＳＨＢＧを加え、これを、コンカナバリンＡを結合させたＳｅｐｈａｄｅｘカラム（アマシャムバイオサイエンスより購入、ＰＢＳ−１溶液にて調製したもの）に添加した。そして、移動相をＰＢＳ−１、流速を１mL／分として、溶出画分に含まれる放射活性をシンチレーションカウンター及びγ−カウンターにて測定したところ、14Ｃ−ヒトアルブミンは殆んど溶出されたが、125Ｉ−ＳＨＢＧは約２０％しか溶出されなかった。溶出した２０％の125Ｉ−ＳＨＢＧは、前記（ii）の実験にて確認されたレクチン結合性糖鎖構造を有しないＳＨＢＧであると推察される。
【００４４】
この結果、血清をコンカナバリンＡで処理することにより、レクチン結合性糖鎖構造を有するＳＨＢＧとアルブミンが明確に分離されることが確認された。
【００４５】
（２）本発明の方法によるバイオアベイラブルテストステロンの測定（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
コンカナバリンＡを用いて、血清中のバイオアベイラブルテストステロンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定した（以後、下記の方法を「ＣｏｎＡ法」と呼ぶ）。
ボランティア健常男性の血清試料１００μLにコンカナバリンＡの５％ＰＢＳ−１溶液５０μLを加え、室温にて１時間放置した。その後、さらにＰＢＳ−１を５００μL加え、遠心分離（４℃、３０００rpm、１０分）した。上清をエーテル５mLで抽出し、抽出物に２−フルオロ−Ｎ−メチルピリジニウム  ｐ−スルフォネート（２−ＦＭＳ、東京化成より購入）の２％ジクロロメタン溶液２００μL及びトリエチルアミンの１０％ジクロロメタン溶液３０μLを加え、室温にて１．５時間放置した。次いで、溶媒を窒素ガスで留去した後、２５％メタノール水溶液１mLに溶解し、これを、予めメタノール６mL及び精製水６mLで調製したＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８カラムに添加した。このカラムを、精製水１mL、０．３％アンモニア水３mL、メタノール２mL及び０．０１％ギ酸：メタノール＝１：１混合液３mLで順次洗浄した後、１０％ギ酸：アセトニトリル＝１：４混合液２．５mLにて溶出した。溶出液を減圧下にて留去後、０．０５％ギ酸：メタノール＝３：２混合液１００μLに溶解して、そのうちの１０μLをＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入した。そして、観察された測定イオン（ｍ／ｚ）＝２５３の強度より、2Ｈ3−テストステロン（シグマより購入）を内部標準としたテストステロンの強度と量の関係を示す検量線に基づき、試料中のテストステロンの量を求めた。その結果を、後で述べるＲＩＡによるバイオアベイラブルテストステロンの測定における結果と合わせて、表２に示す。また、ＬＳ−ＭＳ／ＭＳによる測定値とＲＩＡによる測定値との相関を、図３に示す。図３より、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定値とＲＩＡによる測定値とは良好な相関を示すことがわかる。
【００４６】
なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件は次の通りとした。まず、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の条件としては、ウォーターズ社製のカラムＡｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８（５０×２．１mm、５μm）を用い、溶出溶媒を０．０５％ギ酸：メタノール＝３：２混合液とし、流速を０．２mL／分、カラム温度を４０℃とした。タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）の条件は、正イオンＥＳＩ法にて、コーン電圧を３０Ｖ、コリージョンエネルギーを２０ｅＶとした。
【００４７】
ところで、Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８カラムで精製する代わりに、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００カラムを用いて分画した場合についても検討したところ、同様の定量値が得られた。
【００４８】
（３）本発明の方法によるバイオアベイラブルテストステロンの測定（ＲＩＡ）
上記（２）で得られた上清を用い、そこに含まれるテストステロンの量をＲＩＡ測定キット（三菱ヤトロンより購入）を用いて測定した。その結果を、上記（２）における結果と合わせて、下記表２に示す。
【００４９】
【表２】
2005283380.tif 000003
【００５０】
（４）硫安沈殿法によるバイオアベイラブルテストステロンの測定（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
本実験においては、上記（２）及び（３）で使用したのと同じボランティア健常男性の血清試料を用いた。
血清試料３００μLに飽和硫酸アンモニウム水溶液３００μLを加えて混和し、４℃にて１０分間放置した。その後、遠心分離（４℃、１１００×ｇ、３０分）し、その上清に含まれるテストステロンを上記（２）と同様にして測定した。その結果を、後述するＩＳＳＡＭ法との比較における項の表３において示す。
【００５１】
なお、本実験では、遠心分離の条件を回転数（rpm）ではなく遠心力（ｇ）で設定した。これは、同じ回転数でも機種により遠心力が異なり、遠心力が上記設定を上回るとアルブミンがより多く沈殿してしまうためである。
【００５２】
（５）ＣｏｎＡ法、硫安沈殿法及びＩＳＳＡＭ法による測定値の比較
上記（２）〜（４）で使用したのと同じ血清試料を用いて、ＩＳＳＡＭ法によりバイオアベイラブルテストステロンの値を測定した。すなわち、血清中の総テストステロンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて、また、総ＳＨＢＧをＲＩＡにて定量し、それぞれの値をＩＳＳＡＭ法の計算式（http://www.issam.ch/freetesto.htmを参照）に代入した。そして、アルブミンの量を４．３g／１００mLとして、バイオアベイラブルテストステロンの値を算出した。その結果を、下記表３において、ＣｏｎＡ法及び硫安沈殿法における結果と合わせて示す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
また、図４に、硫安沈殿法とＩＳＳＡＭ法との相関及び本発明の方法とＩＳＳＡＭ法との相関を示す。ＩＳＳＡＭ法は現在、バイオアベイラブルテストステロンを測定するための基準的な方法とされているものである。グラフにおけるＹ切片の値が、図４−Ａ）では負で、図４−Ｂ）では正であることから、同じサンプルを測定した場合、本発明の方法が最も高い値を示し、硫安沈殿法が最も低い値を示す傾向にあることがわかる。
【００５５】
上記（２）の方法に従い、テストステロン以外のホルモン、例えば、ジヒドロテストステロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン、アンドロステンジオン、デハイドロエピアンドロステロン、アルドステロン等についても、そのバイオアベイラブルな状態にあるものの血中レベルを同様に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１−Ａ）は、コンカナバリンＡの濃度によるＳＨＢＧの除去率の変化を示す。  図１−Ｂ）は、コンカナバリンＡの５％ＰＢＳ−１溶液を用いてＳＨＢＧを除去する場合における、室温放置時間と除去率との関係を示す。
【図２】図２−Ａ）は、コンカナバリンＡ未処理の血清に125Ｉ−ＳＨＢＧを添加し、それをＳｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーにかけ、溶出画分に含まれる放射活性及びテストステロンの濃度をγ−カウンター及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した結果を示す。  図２−Ｂ）は、コンカナバリンＡで処理した上清に125Ｉ−ＳＨＢＧを添加し、それをＳｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーにかけ、溶出画分に含まれる放射活性及びテストステロンの濃度をγ−カウンター及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定した結果を示す。
【図３】図３は、コンカナバリンＡで処理した上清に含まれるテストステロンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びＲＩＡ測定キットで測定した場合の、それぞれの測定値の相関を示す。
【図４】図４−Ａ）は、ＩＳＳＡＭ法とＣｏｎＡ法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による血清試料中のバイオアベイラブルテストステロンの、それぞれの測定値の相関を示す。  図４−Ｂ）は、ＩＳＳＡＭ法と硫安沈殿法による血清試料中のバイオアベイラブルテストステロンの、それぞれの測定値の相関を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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