(57)【要約】【課題】骨粗鬆症の素因を、予防診断学的に検出可能な指標として用い得る遺伝子多型を見出し、かかる遺伝子多型を指標として用いた骨粗鬆症を診断するための検出方法を提供すること。【解決手段】多数の要因の組み合わせによって発症する多因子性成人疾患である骨粗鬆症について、腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子、逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子、熱ショック蛋白７０遺伝子、および、α−２−糖蛋白１遺伝子は、骨粗鬆症の素因を規定する遺伝子であり、これらの遺伝子多型を検出することにより、骨粗鬆症の素因を特定することが可能であることを見出し、上記の課題を解決するに至った。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子、逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子、熱ショック蛋白７０遺伝子、および、α−２−糖蛋白１遺伝子からなる群から選ばれる１種または２種以上の遺伝子における遺伝子多型を、骨粗鬆症の素因を規定する指標として上記遺伝子の検出を行う、遺伝子の検出方法。
【請求項２】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子における遺伝子多型が、下記１および／または２の遺伝子多型である、請求項１記載の遺伝子の検出方法。
１．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−２１４１番目の塩基における多型
２．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−１５４２番目の塩基における多型
３．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−５２５番目の塩基における多型
【請求項３】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−２１４１番目の塩基における多型が、当該塩基がグアニンまたはシトシンであることで表現される多型である、請求項２記載の遺伝子の検出方法。
【請求項４】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−１５４２番目の塩基における多型が、当該塩基がチミンまたはグアニンであることで表現される多型である、請求項２または３記載の遺伝子の検出方法。
【請求項５】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−５２５番目の塩基における多型が、当該塩基がグアニンまたはシトシンであることで表現される多型である、請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項６】
逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子における遺伝子多型が、当該遺伝子配列のー６３６４番目の塩基における多型である、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項７】
逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子の塩基配列のー６３６４番目の塩基の多型が、当該塩基がチミンまたはシトシンで表現される多型である、請求項６記載の遺伝子の検出方法。
【請求項８】
熱ショック蛋白７０遺伝子における遺伝子多型が、当該遺伝子の熱ショック蛋白７０のアミノ酸配列の１１０番目のグルタミン酸をコードする塩基配列における多型である、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項９】
熱ショック蛋白７０遺伝子の、熱ショック蛋白７０のアミノ酸配列の１１０番目のグルタミン酸をコードする塩基配列における多型が、当該遺伝子の塩基配列の３３０番目の塩基が、グアニンまたはシトシンであることで表現される多型である、請求項８記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１０】
α−２−糖蛋白１遺伝子の塩基配列の−１１１５番目の塩基における多型が、当該塩基がチミンまたはアデニンであることで表現される多型である、請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝子の検出方法。
【請求項１１】
骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症である、請求項１〜１０のいずれかに記載の骨粗鬆症の素因を規定する遺伝子の検出方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の検出方法が、インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子を検出する方法である、遺伝子の検出方法。
【請求項１３】
腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子、逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子、熱ショック蛋白７０遺伝子、および、α−２−糖蛋白１遺伝子からなる群から選ばれる１種または２種以上の遺伝子における遺伝子多型を、骨粗鬆症の素因を規定する指標として上記遺伝子の検出を行うための要素を具備する、遺伝子検出用キット。
【請求項１４】
請求項１２記載の遺伝子検出用キットが、下記１〜６で示される遺伝子多型を検出するための要素を具備する、遺伝子検出用キット。
１．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−２１４１番目の塩基における多型
２．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−１５４２番目の塩基における多型
３．腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白遺伝子の塩基配列の−５２５番目の塩基における多型
４．逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白遺伝子の塩基配列のー６３６４番目の塩基における多型
５．熱ショック蛋白７０遺伝子の、熱ショック蛋白７０のアミノ酸配列の１１０番目グルタミン酸をコードする塩基配列における多型
６．α−２−糖蛋白１遺伝子の塩基配列の−１１１５番目の塩基の多型
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のキットが、インベーダー・アッセイ法を行って遺伝子を検出するキットである、遺伝子検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの遺伝子の検出方法に関し、より具体的には、ヒトの骨粗鬆症の素因を検出するための指標となり得る、遺伝子多型の検出方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗鬆症は、老齢者、特に、閉経後の女性に多く認められる疾患である。骨粗鬆症の臨床診断は、骨密度値の計測と、単純エックス線撮影による老人性骨折の有無等を指標として行われるが、これらの診断方法には、予防診断学的な意味は乏しい。なお、一部の健康診断等において、若年者に対する骨密度値の測定が予防診断学的な目的で行われているが、骨密度値は、環境要因を含めた全ての要因の総合結果を示すもので、骨粗鬆症の個々のリスクファクターの存在を直接的に示すものではない。
【０００３】
また、骨粗鬆症は、最も一般的に見られる多因子疾患のひとつであり、治療応答性を早期に予測することが非常に重要である。さらに、若年齢のうちに、運動や食事により骨密度を向上させることにより、たとえ、骨粗鬆症の素因を有する者であっても、中年期以降の発症を抑止または緩和することが可能であると考えられている。
【０００４】
しかしながら、骨粗鬆症に対して予防医学的なアプローチがなされることは、むしろ稀であり、現実的には、骨粗鬆症患者に、事後的に、既存の治療法を逐次行った結果を個別に評価して、はじめて治療応答性についての評価が得られるのが常である。
【０００５】
骨粗鬆症における治療応答性の事前の検出手段として、骨粗鬆症についての遺伝要因の関与の検討が挙げられる。このような遺伝要因の関与を検討した成果として、ビタミンＤ受容体遺伝子、Ｉ型コラーゲン遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子、および、インターロイキン６遺伝子における遺伝子多型と骨密度との相関が示されてきた。しかしながら、遺伝子多型が、骨粗鬆症の素因の実用的な診断マーカーとして提供された例は、未だ、認められない。
【０００６】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｏｒｉｍｏ，  Ｈ．，  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｆｕｋｕｎａｇａ，  Ｍ．，  Ｓｏｎｅ，  Ｔ．，  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｒａｋｉ，  Ｍ．，  Ｋｕｓｈｉｄａ，  Ｋ．，  Ｍｉｙａｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｓｏｅｎ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｊ．，  Ｏｈ−ｈａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｈｏｓｏｉ，  Ｔ．，  Ｇｏｒａｉ，  Ｉ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｈ．，  Ｉｇａｉ，  Ｔ．，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｈ．  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：  ｙｅａｒ  ２０００  ｒｅｖｉｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｍｅｔａｂ  １９：  ３３１−３３７，  ２００１．
【非特許文献２】
Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＮＡ，  Ｑｉ  ＪＣ，  Ｔｏｋｉｔａ  Ａ，  Ｋｅｌｌｙ  ＰＪ，  Ｃｒｏｆｔｓ  Ｌ，  Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＶ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＰＮ，  Ｅｉｓｍａｎ  ＪＡ．  １９９４  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｌｅｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６７：  ２８４−２８７
【非特許文献３】
Ｇｒａｎｔ  ＳＦＡ，  Ｒｅｉｄ  ＤＭ，  Ｂｌａａｋｅ  Ｇ，  Ｈｅｒｄ  Ｒ，  Ｆｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ，  Ｒａｌｓｔｏｎ  ＳＨ．  １９９６  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂｏｎｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｐ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｐｈａ  １  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １４；  ２０３−２０５
【非特許文献４】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｓ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，  Ｈｏｓｏｉ  Ｔ，  Ｏｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｓｈｉｒａｋｉ  Ｍ，  Ｏｒｉｍｏ  Ｈ  １９９６  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １１；  ３０６−３１１
【非特許文献５】
Ｍｕｒｒａｙ  ＲＥ，  ＭｃＧｕｉｇａｎ  Ｆ，  Ｇｒａｎｔ  ＳＦＡ，  Ｒｅｉｄ  ＤＭ，  Ｒａｌｓｔｏｎ  ＳＨ．  １９９７  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ．  Ｂｏｎｅ  ２１；  ８９−９２
【非特許文献６】
Ｏｔａ  Ｎ，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ，  Ｎａｋａｚａｗａ  Ｉ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，  Ｈｏｓｏｉ  Ｔ，  Ｏｒｉｍｏ  Ｈ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，  Ｓｈｉｒａｋｉ  Ｍ，  Ｅｍｉ  Ｍ．  ２００１  Ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ．  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ４６：  ２６７−２７２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、骨粗鬆症の素因を、予防診断学的に検出可能な指標として用い得る遺伝子多型を見出し、かかる遺伝子多型を指標として用いた骨粗鬆症を診断するための検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、多数の要因の組み合わせによって発症する多因子性成人疾患である骨粗鬆症について、腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白（以下、Ｉ−ＴＲＡＦともいう）遺伝子、逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白（以下、ＲＩＬともいう）遺伝子、熱ショック蛋白７０（以下、ＨＳＰＡ１ともいう）遺伝子、および、α−２−糖蛋白１（以下、ＡＺＧＰ１ともいう）遺伝子は、骨粗鬆症の素因を規定する遺伝子であり、これらの遺伝子多型を検出することにより、骨粗鬆症の素因を特定することが可能であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子、ＲＩＬ遺伝子、ＨＳＰＡ１遺伝子、および、ＡＺＧＰ１遺伝子からなる群から選ばれる１種または２種以上の遺伝子における遺伝子多型を、骨粗鬆症の素因を規定する指標として上記遺伝子の検出を行う、遺伝子の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１１】
なお、本明細書におけるアミノ酸の表記方法は、三文字法及び一文字法による。念のために、かかる表記内容をここに記載する。
『アラニン〔Ａｌａ（三文字法、以下同様）、Ａ（一文字法、以下同様）〕
バリン〔Ｖａｌ、Ｖ〕、ロイシン〔Ｌｅｕ、Ｌ〕、イソロイシン〔Ｉｌｅ、Ｉ〕、プロリン〔Ｐｒｏ、Ｐ〕、フェニルアラニン〔Ｐｈｅ、Ｆ〕、トリプトファン〔Ｔｒｐ、Ｗ〕、メチオニン〔Ｍｅｔ、Ｍ〕、グリシン〔Ｇｌｙ、Ｇ〕、セリン〔Ｓｅｒ  Ｓ〕、スレオニン〔Ｔｈｒ、Ｔ〕、システイン〔Ｃｙｓ、Ｃ〕、グルタミン〔Ｇｌｎ、Ｑ〕、アスパラギン〔Ａｓｎ、Ｎ〕、チロシン〔Ｔｙｒ、Ｙ〕、リジン〔Ｌｙｓ、Ｋ〕、アルギニン〔Ａｒｇ、Ｒ〕、ヒスチジン〔Ｈｉｓ、Ｈ〕、アスパラギン酸〔Ａｓｐ、Ｄ〕、グルタミン酸〔Ｇｌｕ、Ｅ〕』
また、本明細書中の表記で、例えば、「Ａ１００Ｖ」とは、「アミノ酸配列における１００番目のアミノ酸が、アラニンまたはバリンであることにより表現される遺伝子多型であって、当該アミノ酸がアラニンである頻度が、バリンである頻度よりも高いこと」を意味するものとする。また、例えば、「１００Ｇ＞Ａ」とは、「塩基配列における１００番目塩基が、グアニンまたはアデニンである遺伝子多型であって、当該塩基がグアニンである頻度が、アデニンである頻度よりも高いこと」を示すものとする。また、「１００Ｇ＞Ａ」のような記載に加えて、その前方に当該多型を有する遺伝子名を付加することもある、例えば、「ＡＢＣ＋１００Ｇ＞Ａ」とは、「ＡＢＣ遺伝子の塩基配列における＋１００番目の塩基が、グアニンまたはアデニンである遺伝子多型であって、当該塩基がグアニンである頻度が、アデニンである頻度よりも高いこと」を示すものとする。
【００１２】
また、後述する遺伝子多型を特定する基となる、野生型の遺伝子配列（多型部分において頻度が高い方の塩基を有している配列）は、特に断らない限り、全て、ゲノムＤＮＡの塩基配列番号である。よって、後述する遺伝子多型は、全て、少なくともゲノムＤＮＡにおいて認められる多型である。ただし、かかるゲノムＤＮＡの多型に対応するｃＤＮＡにおける多型を指標として、骨粗鬆症の素因を特定する遺伝子の検出方法も、本検出方法の技術的範囲に包含される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
上述したように、本発明は、腫瘍壊死因子受容体随伴因子結合蛋白（Ｉ−ＴＲＡＦ）遺伝子、逆転誘導性ＬＩＭドメイン蛋白（ＲＩＬ）遺伝子、熱ショック蛋白７０（ＨＳＰＡ１）遺伝子、および、α−２−糖蛋白１（ＡＺＧＰ１）遺伝子からなる群の遺伝子から選ばれる１種または２種以上における多型を検出することで、骨粗鬆症の素因を検出する、遺伝子の検出方法である。
【００１４】
Ｉ−ＴＲＡＦ（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＨＦ）のシグナル伝達に必須の調節因子として知られており、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子と、これがコードするＩ−ＴＲＡＦ蛋白質については、すでに解析がなされている（後述する）。
【００１５】
このＩ−ＴＲＡＦのゲノムＤＮＡの塩基配列の一部を、第１図（１）（−２５９１〜−９１２）（２）（−９１１〜ＩＶＳ１＋２０）と配列番号１に示した。
ＲＩＬ（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＬＩＭ  ）遺伝子は、第５染色体上のサイトカインクラスター内（５ｑ３１．１）に位置する、ＰＤＺ  ドメインと  ＬＩＭ  ドメインを含む蛋白をコードする遺伝子として知られており、ＲＩＬ遺伝子と、これがコードするＲＩＬ蛋白質については、すでに解析がなされている（後述する）。
【００１６】
このＲＩＬのゲノムＤＮＡの塩基配列の一部（−６５７１〜−５２９２）は、第２図と配列番号２に示した。
ＨＳＰＡ１（  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ７０ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）遺伝子は、第６染色体上のＭＨＣクラスＩＩＩ  領域（６ｐ２１．３）内で、腫瘍壊死因子遺伝子の下流・中心体側約２５０ｋｂに位置する約７０ｋＤａの熱ショック蛋白をコードする遺伝子として知られており、ＨＳＰＡ１遺伝子と、これがコードするＨＳＰＡ１蛋白質については、すでに解析がなされている（後述する）。
【００１７】
このＨＳＰＡ１のゲノムＤＮＡの塩基配列の一部（−２３４〜＋４０６）と、それに対応するアミノ酸配列（＋１〜＋１３５）は、第３図と配列番号３に示した。
【００１８】
ＡＺＧＰ１（ａｌｐｈａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １）遺伝子は、第７染色体上の  領域  （７ｑ２２．１）  内に位置する２９８アミノ酸から成り免疫グロブリンＣ２タイプドメインとＭＨＣクラスＩ抗原ドメインを有する血清蛋白をコードする遺伝子として知られており、ＡＺＧＰ１遺伝子と、これがコードするＡＺＧＰ１蛋白質については、すでに解析がなされている（後述する）。
【００１９】
このＡＺＧＰ１のゲノムＤＮＡの塩基配列の一部（−１２５６〜＋６４）を、第４図と配列番号４に示した。
なお、第１図〜第４図に示した各遺伝子の塩基配列と配列表における配列番号１〜４の塩基配列は同一の配列であるが、その塩基の番号の付け方が異なっている。本明細書における、各遺伝子の多型塩基等を特定する番号は、第１図〜第４図に従うこととする。なお、第１図〜第４図において、囲みを施してある部分は、対象となる多型塩基またはアミノ酸残基であり、カッコ内は、当該多型の低頻度塩基またはアミノ酸残基を示している。数字は塩基配列番号またはアミノ酸配列番号である。
【００２０】
遺伝子における多型と、これらの多型に起因する蛋白のアミノ酸配列の相違や、遺伝子からｍＲＮＡへの転写効率の変化等により惹起されると考えられる現象、すなわち、骨密度の減少、生化学的代謝マーカーの変動、性ホルモン調節レベルの変動等との関係を具体的に解析することにより、本検出方法において利用し得る、遺伝子の特定の遺伝子多型を見出すことができる。すなわち、骨粗鬆症患者と健常人との組合せにおいて、遺伝子の多型が高頻度で認められる部分、その多型が構造遺伝子部分の多型である場合には、当該多型による蛋白質の機能への影響等を解析することにより、骨粗鬆症の素因の指標となり得る、特定の遺伝子多型を見出すことができる。
【００２１】
すなわち、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子、ＲＩＬ遺伝子、ＨＳＰＡ１遺伝子、および／または、ＡＺＧＰ１遺伝子（以下、これらの４種類の遺伝子全てを意味する用語として、「特定遺伝子」という用語を用いることもある）における多型と、これらの多型に起因する蛋白のアミノ酸配列の相違や、遺伝子からｍＲＮＡへの転写効率の変化等により惹起されると考えられる現象、すなわち、骨密度の減少、生化学的代謝マーカーの変動、性ホルモン調節レベルの変動等との関係を具体的に解析することにより、本検出方法において利用し得る、特定遺伝子の遺伝子多型を見出すことができる。すなわち、骨粗鬆症患者と健常人との組合せにおいて、特定遺伝子の多型が高頻度で認められる部分、その多型が構造遺伝子部分の多型である場合には、当該多型による蛋白質の機能への影響等を解析することにより、骨粗鬆症の素因の指標となり得る遺伝子多型を見出すことができる。
【００２２】
特定遺伝子における特定の多型のうち、２種類以上の異なる多型を選択して、これらを組み合わせて、骨粗鬆症の素因の指標として用いて、特定遺伝子を検出することにより、さらに的確に骨粗鬆症の素因を検出することが可能である。
【００２３】
この特定遺伝子における、２種類以上の異なる多型の組合せによる骨粗鬆症の素因の検出は、この異なる多型の組合せの方式をアルゴリズム化して、かかるアルゴリズムを実行することができるコンピュータソフトウエアを用いて行うことが好適である。
【００２４】
この、異なる多型の組合せの方式を行うことができるアルゴリズムは、適切なプログラム言語、例えば、機械語、アセンブラ言語等の低水準言語；Ｆｏｒｔｒａｎ、ＣＯＢＯＬ、ＢＡＳＩＣ、Ｃ等の手続型言語；ＲＰＧ、Ｐｒｏｌｏｇ、ＬＩＳＰ、ＡＰＬ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡ（登録商標）等の非手続型言語等に従い、ソフトウエア化され、コンピュータ端末等のハードウエアに組み込まれて実行することで、２種類以上の異なる特定遺伝子の多型を骨粗鬆症の素因の検出の指標とする、本検出方法を、好適な態様として行うことができる。
【００２５】
本発明者は、前述したように、特定遺伝子において見出され、骨粗鬆症素因と関連が認められる遺伝子多型として、下記の１〜５の多型を見出した。これらの遺伝子多型は、上記のコンピュータソフトウエアのアルゴリズムを構成する、２種類以上の特定の多型として選択することが可能であり、かつ、好適である。
【００２６】
１．Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列の−２１４１番目の塩基における多型（例えば、当該塩基がグアニンまたはシトシンであることで表現される多型等）
２．Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列の−１５４２番目の塩基における多型（例えば、当該塩基がチミンまたはグアニンであることで表現される多型等）
３．Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列の−５２５番目の塩基における多型（例えば、当該塩基がグアニンまたはシトシンであることで表現される多型等）
４．ＲＩＬ遺伝子の塩基配列のー６３６４番目の塩基における多型（当該塩基がチミンまたはシトシンで表現される多型等）
５．ＨＳＰＡ１遺伝子の、熱ショック蛋白７０のアミノ酸配列の１１０番目グルタミン酸をコードする塩基配列における多型［例えば、ＨＳＰＡ１遺伝子の３３０番目の塩基における多型（例えば、当該塩基におけるグアニンとシトシンの相違による多型により、ＨＳＰＡ１遺伝子蛋白質のアミノ酸配列の１１０番目が、グルタミン酸またはアスパラギン酸であることにより表現される多型）］
６．ＡＺＧＰ１遺伝子の塩基配列の−１１１５番目の塩基の多型（当該塩基がチミンまたはアデニンで表現される多型等）
【００２７】
遺伝子多型の検出方法としては、通常公知の方法、例えば、サザンブロット法を用いたＲＦＬＰ法や、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＨＥＴ（ｈｅｔｅｒｏ  ｄｕｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤＧＧＥ法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）  法、ＤＳ（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）  法、ＣＣＭ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）法、ＣＤＩ（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、さらにはＰＣＲ法を用いた一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法〔ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）  法、以下、本明細書においてはＳＳＣＰ法という〕、ＰＣＲ／  ＧＣ−ｃｌａｍｐ  法、インベーダー・アッセイ法〔Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  社（米国）〕、Ｓｄ−ＰＣＲ法等を用いることができる〔例えば、バイオマニュアルシリーズ１，遺伝子工学の基礎技術，山本  雅編，羊土社（１９９３）等を参照のこと、特に、ＰＣＲ／  ＧＣ−ｃｌａｍｐ  法については、Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．（１９８８）  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｋ．Ｄａｖｉｅｓ，ｅｄ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９５−１３９  等を参照のこと〕が、簡便かつ正確に遺伝子多型を特定し得るという点において、インベーダー・アッセイ法を選択することが好ましい。
【００２８】
第５図は、このインベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
第５図において、鋳型ヌクレオチド鎖１１［野生型遺伝子（ゲノムＤＮＡの塩基配列であっても、ｃＤＮＡの塩基配列であってもよい）］に対して、まず、第１のヌクレオチド鎖１２をハイブリダイズさせる。
【００２９】
第１のヌクレオチド鎖１２は、鋳型ヌクレオチド鎖１１における、多型検出対象塩基〔本図では、野生型がＴ（チミン）〕に相補的な塩基〔本図では、Ａ（アデニン）〕が３’末端に位置する、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的なヌクレオチド鎖である（なお、この例では、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端の塩基は、多型検出対象塩基に対して相補的であるが、たとえ相補的塩基ではなくても、その塩基が、多型検出対象塩基と第２のヌクレオチド鎖の会合反応に干渉することにより、部分的三重鎖構造が形成され得る）。
【００３０】
次いで、この鋳型ヌクレオチド鎖１１と第１のヌクレオチド鎖１２との部分的２本鎖に対して、さらに、第２のヌクレオチド鎖１３をハイブリダイズさせる。
第２のヌクレオチド鎖１３は、鋳型ヌクレオチド鎖１１に対して相補的な「相補的部分」１３１が、３’側にあり、これと連続して、検出要素が設けられた、鋳型ヌクレオチド鎖に対して非相補的な「検出用部分」１３２が、５’側にある、複合的ヌクレオチド鎖であり、「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的な塩基（Ａ）となっている。
【００３１】
この第２のハイブリダイズ反応によって、鋳型ヌクレオチド鎖１１の多型検出対象塩基部分（Ｔ）は、第１のヌクレオチド鎖１２の３’末端塩基と、第２のヌクレオチド鎖の「相補的部分」１３１の最も５’側の塩基（Ａ）との、部分的三重鎖構造が形成されることとなる。
【００３２】
次いで、この部分的三重鎖構造を、その３’側で特異的に切断する活性を有するヌクレアーゼ１４を作用させて、このヌクレアーゼにより切断された、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２’〔３’末端が、多型検出対象塩基（Ｔ）に対して相補的塩基（Ａ）となっている〕を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、野生型であることを検出することができる。
【００３３】
本図においては、５’末端近傍に蛍光色素１５１とその３’側の近傍に蛍光消光物質（クエンチャー）１５２を標識した、ヘアピン型プローブ（ヌクレオチド鎖）１５を、上記のハイブリダイズ系と共存させることにより、上記の野生型の検出が可能である。
【００３４】
ヘアピン型プローブ１５の３’側の一本鎖部分は、第２のヌクレオチド鎖１３の検出用部分１３２に対して相補的に設計されており、かつ、かかる一本鎖部分の最も５’側の塩基に隣合うさらに５’側の一塩基は、多型検出対象塩基（Ｔ）となっている。そして、検出用部分１３２’が、ヘアピン型プローブ１５の一本鎖部分とハイブリダイズすると、検出用部分１３２’の３’末端の塩基（Ａ）が、ヘアピン型プローブ１５の二本鎖部分の先端において、再び、部分的三重鎖構造を形成する。これに対し、再度、ヌクレアーゼ１４が作用して、ヘアピン型プローブ１５における、蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２の間が切断され、蛍光色素１５１が遊離し、蛍光消光物質１５２による蛍光消光作用から開放されて、本来の蛍光が検出可能な状態となる。この蛍光を検出することにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１が、多型検出対象塩基において、存在頻度が高い塩基が認められる野生型遺伝子であることを検出することができる。
【００３５】
これに対して、鋳型ヌクレオチド１１の多型検出対象塩基が、野生型の塩基（Ｔ）ではなく、例えば、Ｇ（グアニン）であるＳＮＰ塩基であり、これをポジティブに検出する場合には、第１のヌクレオチド鎖１２と第２のヌクレオチド鎖１３における、相補的塩基を、上記のＡから、Ｇに相補的なＣ（シトシン）として、さらに、ヘアピン型プローブ１５における蛍光色素１５１と蛍光消光物質１５２を、上記の系とは異なる蛍光を発色する蛍光色素と、これに対する蛍光消光物質とすることにより、鋳型ヌクレオチド鎖１１におけるＳＮＰｓを、異なる蛍光色素の蛍光によって検出することが可能である。
【００３６】
また、鋳型ヌクレオチド１１に、頻度が高い多型塩基と頻度が低い多型塩基を有するものが、混在する場合（ヘテロ型）は、上記の２種類の蛍光の混合型蛍光として、ポジティブに検出することも可能である。
【００３７】
なお、ここには、ヘアピン型プローブを用いた検出システムを例示したが、これ以外にも、例えば、検出用部分１３２に、直接、蛍光標識やアイソトープ標識を行って、直接、検出用部分の検討を行うことにより、遺伝子多型の内容を検出することも可能である。さらに、ここでは、頻度の高い多型遺伝子を有する場合も、そうでない場合も、ポジティブに検出する例を示したが、いずれかの場合においては、蛍光等の標識が検出されない、ネガティブな検出を行うことも可能である。
【００３８】
上述したインベーダー・アッセイ法は、技術的には、反応の進行に伴い、部分的三重鎖構造を特異的に切断するヌクレアーゼが、第２のヌクレオチド鎖の「検出用部分」を切り出す段階において（ヘアピン型プローブを用いる場合には、標識された蛍光物質を蛍光消光物質と切り離す段階においても）、連続的に働くため、蛍光等の、インベーダー・アッセイ法において用いる標識が増感される、極めて鋭敏な液相反応である。
【００３９】
ＰＣＲ／  ＧＣ−ｃｌａｍｐ  法は、ＤＧＧＥ法（ＤＮＡ変性剤の直線的な濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルにおける、塩基置換を含む二本鎖ＤＮＡ断片と含まない二本鎖ＤＮＡ断片の、ＤＮＡを変性させるべきＤＮＡ変性剤濃度の相違に基づく移動度の差異を利用して、ＤＮＡの塩基置換を検出する方法）の変法であり、ＤＧＧＥ法における、「複数の塩基置換がある場合に、ポリアクリルアミドゲルにおいて、最後に融解するドメインの塩基置換を検出することができない」という欠点を、ＧＣ含量の高い領域（ＧＣ−ｃｌａｍｐ  ）を、塩基置換の検出対象であるＤＮＡ断片につなげることにより克服した方法である〔Ｓｈｅｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２３２−２３６等を参照のこと〕。
【００４０】
よって、ＰＣＲ／  ＧＣ−ｃｌａｍｐ  法の基本的操作等は、ＤＧＧＥ法に準ずるが、塩基置換検出の対象となるＤＮＡ断片に、ＧＣ−ｃｌａｍｐ  を付加する工程が必要となる。
【００４１】
本検出方法における、特定遺伝子の検出の対象となるＤＮＡの出所は、特に限定されるべきものではなく、被験者の体細胞であれば、特に限定されない。例えば、末梢血や白血球等の血液検体を、本発明において好適に選択することができる。
【００４２】
すなわち、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡにおいて、特定の遺伝子部位における遺伝子多型（具体的には、特定の遺伝子部位における塩基の置換、欠失、挿入等）を検出することが可能である。また、被験者の検体細胞（分離後、培養したものを用いることもできる）から、公知の方法を用いて、ｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡにおける多型を検出することも可能である。
【００４３】
そして、この検出作業の結果、上述した特定の遺伝子多型部位において低頻度塩基が認められた場合、この遺伝子多型部位と、骨粗鬆症の素因と関連付けて、被験者が発症する蓋然性の高い骨粗鬆症の種類や部位を特定することができる。また、現に発症している骨粗鬆症の原因を特定することができる。現状では、特定遺伝子の多型による、骨密度の相違は、橈骨（とうこつ：ｒａｄｉｕｓ）において認められており、この多型を指標として検出可能な骨粗鬆症は、股関節部や手関節部等への影響が大きいことが想定される。本検出方法の検出対象となる骨粗鬆症は特に限定されない。一例を挙げれば、閉経後骨粗鬆症（ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）の素因の検出を、本検出方法により行うことができる。
【００４４】
本検出方法を行う態様は、特に限定されず、選択する遺伝子多型の検出方法に応じて適宜選択することができる。典型的には、本検出方法を行うための要素が備わっている、遺伝子検出用キットを用いて行うことが可能である。具体的には、例えば、ウエルが設けられているマイクロプレートの個々のウエルに、本検出方法を行うために必要な材料や試薬を組み合わせて、遺伝子多型部位における塩基の相違を検出可能な反応を行い、かかる検出反応により、所望する遺伝子多型部位における塩基の相違を検出することができる。また、マイクロプレートに代えて、いわゆるマイクロアレイを用いて、遺伝子の検出を、さらに集約的に行うことも可能である。このように、この遺伝子検出用キットは、マイクロプレートやマイクロアレイ等の遺伝子検出を行う器具、試薬、希釈液等を、必要に応じて組み合わせて、その構成要素とすることができる。
【００４５】
本検出方法を行うことによって、例えば、特定の遺伝子多型部位に、低頻度の塩基、または、当該塩基の相違によるアミノ酸配列の相違が認められる場合には、被験者において、骨粗鬆症の素因が認められ、現時点で、被験者に異常がなくても、骨粗鬆症を発症するリスクが高いことを明らかにすることができる。このような場合、骨強化法（運動、食事・栄養指導、薬剤の投与等）を行うことによって、骨粗鬆症の発症を予防することが可能である。また、日常生活において、特定部分（例えば、股関節部や手関節部等）の保護に心がけることにより、骨密度の低下により、頻度が高くなる骨折を予防することも可能となる。
【００４６】
また、例えば、既に、骨粗鬆症を発症している被験者に対して、本検出方法を行うことにより、特定遺伝子の特定の遺伝子多型に起因する骨粗鬆症であるのか否かを、高い確度で推定することが可能である。このような場合、治療方法として適したものを選択することにより、より効果的な骨粗鬆症の治療を行うことができる。
【００４７】
さらに、特定遺伝子の多型が骨粗鬆症に関係しているメカニズムを明らかにすることにより、かかるメカニズムに対応した、骨粗鬆症の治療薬の開発の途を提供することも可能である。
【００４８】
【実施例】以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明するが、これにより、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［被験者の遺伝子の解析］
ＤＮＡの抽出
血液抽出ＤＮＡは、３８４名の成人日本人女性を被験者として、末梢血液から、常法により抽出された。被験者の平均年齢および平均肥満指数と標準偏差は  ５８．４  ±  ８．６  歳（３２歳−６９歳）  および  ２３．７  ±  ３．６１  ｋｇ／ｍ２  （１４．７−３８．５  ｋｇ／ｍ２）  であった。橈骨骨密度  （ｇ／ｃｍ２）  はＤＴＸ−２００  （Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ  Ｍｅｄｉｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いたＤＥＸＡ法（ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）によった。骨密度値に影響する年齢・伸長・体重差を補正するため年齢および肥満係数ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）を独立変数とした重回帰分析により標準化をおこなった補正骨密度値をＩｎｓｔａｔ  ３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）により計算した。
【００４９】
補正式を以下に示す。
2005006538.tif 000002
橈骨ＤＥＸＡによるＢＭＤは、日本国における原発性骨粗鬆症の診断基準に基づき、行った。
【００５０】
なお、被験者の中には、下垂体疾患や甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、腎不全、副腎疾患、リウマチ性疾患などの骨代謝に影響を及ぼすことの知られた疾患や治療を受けているものはいなかった。エストロゲン補充療法を受けているものはいなかった。本試験は、検体収集を行った所属機関におけるｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ  の承認を得て行なわれた。すべての被験者はボランティアであり、書面でのインフォームドコンセントの得られた研究参加者であった。
【００５１】
ＳＮＰ  選別
Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子  および  ＲＩＬ遺伝子、  ＨＳＰＡ１遺伝子、  ＡＺＧＰ１遺伝子の６つの遺伝子多型は公的データーベースＮＣＢＩ，  ｄｂＳＮＰ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）
およびＪＳＮＰ−ｄａｔａｂａｓｅ    （ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）  に登録された約１７万ＳＮＰのうち、翻訳領域およびプロモーター領域内に位置する約１万個  （９，４３０個）から、これまで我々が骨密度との相関を検討したことのないＳＮＰとして選別された１００個のＳＮＰの一部として選ばれた。Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子については、プロモーター領域から３つのＳＮＰ  ［Ｉ−ＴＲＡＦ−５２５Ｇ＞Ｃ  ，  Ｉ−ＴＲＡＦ−１５４２Ｔ＞Ｇ  およびＩ−ＴＲＡＦ−２１４１Ｇ＞Ｃ（ＩＭＳ−ＪＳＴ１０８０１０，    ＩＭＳ−ＪＳＴ１０８０１１  および  ＩＭＳ−ＪＳＴ１０８０１３）．を選んだ。  ＲＩＬ遺伝子についてはプロモーター領域ＳＮＰ、ＲＩＬ−６３６４Ｔ＞Ｃ  （ＩＭＳ−ＪＳＴ１０１６４１）  を、ＨＳＰＡ１遺伝子についてはアミノ酸置換を伴うＳＮＰ、  ＨＳＰＡ１＋３３０Ｇ＞Ｃ；  Ｅ１１０Ｄ  （ｒｓ５６２０４７  ｏｎ  ｄｂＳＮＰ）を、ＡＺＧＰ１遺伝子についてはプロモーター領域ＳＮＰ、ＡＺＧＰ１−１１１５Ｔ＞Ａ  （ＩＭＳ−ＪＳＴ０３２３３５３）
を選んだ。
【００５２】
遺伝子多型のタイピング法 
ＳＮＰの遺伝子多型タイプは、Ｓｄ−ＰＣＲ法（Ｉ−ＴＲＡＦ−５２５Ｇ＞Ｃ  および  Ｉ−ＴＲＡＦ−１５４２Ｔ＞Ｇ，  ＲＩＬ  −６３６４Ｔ＞Ｃ  ，  ＨＳＰＡ１  ＋３３０Ｇ＞Ｃ）  またはインベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法  （Ｉ−ＴＲＡＦ  −２１４１Ｇ＞Ｃ  およびＡＺＧＰ１  −１１１５Ｔ＞Ａ）を用いて決定された。
【００５３】
Ｓｄ−ＰＣＲ法は、アレル特異的な多型配列のＰＣＲ増幅法に改良を加えたもので、二つのアレル特異的配列をもったプライマー（ＡＳ−プライマー）とひとつの逆方向プライマーをＳＮＰごとに設計し、ＡＳ−プライマーの長さの相違に基づくＰＣＲ増幅断片のサイズの相違によりアレルの識別を行う方法である。ＡＳ−プライマーは３’‐端にＳＮＰ部位を有し、隣接する  ５’−  側の配列中に人工的なミスマッチ塩基を１つ保有させた。一方のアレルに対応するＡＳ−プライマーは、５塩基分の追加塩基を３’−端に持ち、もう一方のアレルのＡＳ−プライマーより長いため、増幅断片の長さの違いを電気泳動で同定することが出来る。
【００５４】
ａ）  Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列における−１５４２番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたＰＣＲプライマーは、
2005006538.tif 000003
であり、
【００５５】
ｂ）  塩基配列における  −５２５番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたＰＣＲプライマーは、
2005006538.tif 000004
であり、
【００５６】
ｃ）  ＲＩＬ遺伝子の塩基配列における−６３６４番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたＰＣＲプライマーは、
2005006538.tif 000005
である。
【００５７】
ｄ）  ＨＳＰＡ１遺伝子の塩基配列における  翻訳領域＋３３０番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたＰＣＲプライマーは、
2005006538.tif 000006
である。
【００５８】
３種類の各プライマー  （２５０  ｎＭ）  （２本の遺伝子多型を含んだ前向きプライマーと１本の逆向きプライマー）  と  １０  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １  Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ，  ０．５  ｍＭ  蛍光標識−ｄＣＴＰ  （ＲＯＸ−ｄＣＴＰ；  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ）  を含む１０−μｌ  の反応系で１０  ｎｇ  のゲノムＤＮＡ  を増幅した。  反応はサーマルサイクラー  （Ｇｅｎｅ−ａｍｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ９６００，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）  を用い、はじめの変性を  ９４℃  で  ４  分間，  続いて  ５  サイクルのストリンジェント増幅  （９４ｏＣ  で  ２０  秒，  ６４ｏＣ  ２０  秒，  ７２ｏＣ  ２０  秒）  さらに  ２５  サイクルの通常の増幅  （９４ｏＣ  ２０  秒，  ６２ｏＣ  ２０  秒，  ７２ｏＣ  ２０  秒）  と２分間の  ７２ｏＣ  での最終延長によるプログラムで行った。  アレルの識別は自動ＤＮＡシーケンサー  （ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡ  ｓｙｓｔｅｍ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ））を用いた電気泳動とレーザースキャンにより行い、ＧｅｎｅＳｃａｎＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒ２．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）  を用いた。Ｓｄ−ＰＣＲ法の正確性の確認には  直接シーケンス法を  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）  を用いた。
【００５９】
インベーダー法はアレル特異的に鋳型となるゲノムＤＮＡにハイブリダイズする二つの特異的プローブと、これとＳＮＰ部位で競合的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、インベーダーオリゴおよび、蛍光色素と消光物質で標識したヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブ（ＦＲＥＴカセット）をもちいて遺伝子多型を判定するアッセイ法であり、その詳細については前述した通りである。
【００６０】
３種類の各プローブ  （２本の遺伝子多型部位を含んだアレル特異的プローブと１本のインベーダーオリゴ）  と蛍光標識−ＦＲＥＴ  カセットオリゴヌクレオチドはアッセイシステムを提供するＴｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社により行い、同社の提供するバファーとヌクレアーゼを含む  ６−μｌ  の反応系で、３８４ウェルプレートの各ウェルに１０  ｎｇ  のゲノムＤＮＡ  を増幅したＰＣＲ産物を１０００  倍希釈した鋳型ＤＮＡ  １  μｌを加えて行った。
【００６１】
ｅ）  Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の上流塩基配列における−２１４１番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたプローブは、
2005006538.tif 000007
であり、
【００６２】
ｆ）  ＡＧＺＰ１遺伝子の上流塩基配列における  −１１１５番目の塩基の遺伝子多型についてタイピングするために用いたプローブは、
2005006538.tif 000008
であり、
【００６３】
反応はサーマルサイクラー  （ＡＢＩ  ９７００；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）  を用い、はじめの変性を  ９３℃  で  １０  分間，  続いて  ６４ｏＣ  ６０  分のインキュベーションを行った。  アレルの識別は蛍光プレートリーダー  （ＡＢＩ  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【００６４】
転写因子のプロモーター領域内結合部位についての情報処理的なシーケンス解析は、公的データベース  ＴＲＡＮＳＦＡＣ４．０  ｄａｔａｂａｓｅ  （  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ”ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ”  ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）  に基づく  ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｖ２．２  により行った。
【００６５】
ハプロタイプの推定と連鎖不平衡解析
ハプロタイプの頻度推定の計算は、検討された７６８アレルについてＡｒｌｅｑｕｉｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）  を用いて行われた．  連鎖不平衡の解析はすべての可能な組み合わせについて通常行なわれる３つの方法  （Ｄ，  Ｄ’，  ａｎｄ  ｒ２）  について検討された。
【００６６】
統計解析
遺伝子型と補正ＢＭＤ値  （ｇ／ｃｍ２）との量的形質の相関は、ＡＮＯＶＡ  およびｐｏｓｔ−ｈｏｃテストとしての回帰分析により解析された。Ｉｎｓｔａｔ  ３  ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）  を使用した。各ＳＮＰ  （ｅｘ；  ｒｓ３７５４９７６のためのＣ／Ｃ、Ｃ／ＧおよびＧ／Ｇ）  の３つの遺伝子型カテゴリーは、ＳＮＰの頻度の低い対立遺伝子を所有する染色体の数に相当するインクリメント値、０、１および２に、それぞれ置き換えて解析した。有意水準は直線回帰分析の  ｐ−値  ５％未満  （ｐ＜０．０５）  とし、遺伝子多型タイピング結果のＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡についてはχ２乗検定により確認した（ｐ＞０．０５）。
【００６７】
骨粗鬆症感受性遺伝子に対する最も有望な候補群として上記４遺伝子の遺伝子多型とＢＭＤとの相関を検討した。検討に適したＳＮＰとして、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の５’上流領域に存在する３つのプロモーター領域ＳＮＰ  （Ｉ−ＴＲＡＦ−２１４１Ｇ＞Ｃ，  Ｉ−ＴＲＡＦ  −１５４２Ｔ＞ＧおよびＩ−ＴＲＡＦ  −５２５Ｇ＞Ｃ）と、ＲＩＬ遺伝子の５’上流領域におけるＳＮＰ、ＲＩＬ−６３６４Ｔ＞Ｃ  、ＨＳＰＡ１遺伝子の  第１エクソン内の翻訳領域におけるアミノ酸置換を伴うＳＮＰ、  ＨＳＰＡ１＋３３０Ｇ＞Ｃ（Ｅ１１０Ｄ）、およびＡＺＧＰ１遺伝子の５’上流領域に存在するプロモーター領域ＳＮＰ、ＡＺＧＰ１−１１１５Ｔ＞Ａを選択した  （第１表）。
【００６８】
【表１】
2005006538.tif 000009
【００６９】
３８４検体について、アレル特異的ＰＣＲ増幅法（Ｓｄ−ＰＣＲ）またはインベーダー・アッセイを行い、遺伝子多型の遺伝子型を決定することにより、今回検討した集団における対立遺伝子頻度および異型接合性を明らかにした  （第２表）。さらに、これらの解析結果について分散分析（ＡＮＯＶＡ）と直線回帰分析を行った（第２表）。
【００７０】
【表２】
2005006538.tif 000010
【００７１】
（１）解析されたＩ−ＴＲＡＦ遺伝子上のすべてのＳＮＰは補正橈骨の骨密度値と有意な相関を示し、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子第一エクソンの３’−端から１５４２塩基対上流に位置するＳＮＰ    Ｉ−ＴＲＡＦ−１５４２Ｔ＞Ｇ  （参照コンティグ；  ＮＴ＿００５１５１，  ＧｅｎＢａｎｋ）  では、頻度の低いＧ−アレルをホモで保有する者は最も低い骨密度を示し  （０．３７５  ±  ０．０６７  ｇ／ｃｍ２）  、ヘテロの被験者は中間の値を示し（０．３９５  ±  ０．０５６  ｇ／ｃｍ２）、頻度の高いＴ−アレルをホモで有するものでは最も高い骨密度を示した  （０．４０４  ±  ０．０５１  ｇ／ｃｍ２）。マイナーアレルのＧ−アレルが、共優性な効果をもつと推定すると、その相関は有意であった  （ｒ＝０．１３，  ｐ  ＝  ０．０１２）  ［第６図（１）］。また、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子第一エクソンの３’−端から５２５塩基対上流に位置するＳＮＰ  Ｉ−ＴＲＡＦ−５２５Ｇ＞Ｃについてもマイナーな  Ｃ−アレルをホモで持つものは最も低いＢＭＤを示し  （０．３８２  ±  ０．０６０  ｇ／ｃｍ２）、ヘテロでは中間値を  （０．３９５  ±  ０．０５６  ｇ／ｃｍ２）、メジャーアレルのＧホモで最も高いＢＭＤを示し  （０．４０５  ±  ０．０５１  ｇ／ｃｍ２）、同様の有意な相関を示していた  （ｒ  ＝  ０．１２，  ｐ  ＝  ０．０２０）  ［第６図（２）］。また、Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子第一エクソンの３’−端から２１４１塩基対上流に位置するＳＮＰ  Ｉ−ＴＲＡＦ−２１４１Ｇ＞Ｃについてもマイナーな  Ｃ−アレルをホモで持つものは最も低いＢＭＤを示し  （０．３７５±０．０６７ ｇ／ｃｍ２）、ヘテロでは中間値を  （０．３９６±０．０５６ ｇ／ｃｍ２）、メジャーアレルのＧホモで最も高いＢＭＤを示し  （０．４０４±０．０５１  ｇ／ｃｍ２）、同様の有意な相関を示していた  （ｒ  ＝０．１３，  ｐ  ＝０．０１４）  ［第６図（３）］。
【００７２】
三つのプロモーターＳＮＰ  Ｉ−ＴＲＡＦ−２１４１Ｇ＞Ｃ，  Ｉ−ＴＲＡＦ−１５４２Ｔ＞Ｇ  および  Ｉ−ＴＲＡＦ−５２５Ｇ＞Ｃは強い連鎖不平衡の関係にあることが示された  （Ｄ’  ＝  ０．９７８，  ｒ２  ＝  ０．９１７  ）。これらの結果は、３つのＳＮＰ（Ｉ−ＴＲＡＦ−２１４１Ｇ＞Ｃ，  Ｉ−ＴＲＡＦ  −１５４２Ｔ＞Ｇおよび  Ｉ−ＴＲＡＦ  −５２５Ｇ＞Ｃ）のいずれも、またはいずれかが骨密度の決定に作用していることを示唆していた。
【００７３】
同様にＲＩＬ遺伝子第一エクソンの３’−端から６３２３塩基対上流に位置するＳＮＰ  ＲＩＬ−６３６４Ｃ＞Ｔも補正橈骨の骨密度値と有意な相関を示し（参照コンティグ；  ＮＴ＿００７０７２．１１，  ＧｅｎＢａｎｋ）  、頻度の高いＴ−アレルをホモで保有する者  （ｎ  ＝２４０）  は最も低い骨密度を示し  （０．３７０  ±  ０．０５３  ｇ／ｃｍ２）  、ヘテロの被験者  （ｎ  ＝１１６）  は中間の値を示し（０．３９１  ±  ０．０５４  ｇ／ｃｍ２）、頻度の低いＣ−アレルをホモで有するもの（ｎ  ＝  １４）では最も高い骨密度を示した  （０．４０４  ±  ０．０５５  ｇ／ｃｍ２）。マイナーアレルのＣ−アレルが、共優性な効果をもつと推定すると、その相関は有意であった  （ｒ＝０．１５，  ｐ  ＝  ０．００３）  （第７図）。
【００７４】
さらにＨＳＰＡ１遺伝子の１１０番目のアミノ酸をグルタミン酸からアスパルギン酸に置換するＳＮＰ    ＨＳＰＡ１＋３３０Ｇ＞Ｃ  （Ｅ１１０Ｄ）も補正橈骨の骨密度値と有意な相関を示し（参照コンティグ；  ＮＴ＿００５３４５，  ＧｅｎＢａｎｋ）  、頻度の低いＣ−アレルをホモで保有する者  （ｎ  ＝３）  は最も低い骨密度を示し  （０．３６１  ±  ０．０１８  ｇ／ｃｍ２）  、ヘテロの被験者  （ｎ  ＝５０）  は中間の値を示し（０．３８０  ±  ０．０５０  ｇ／ｃｍ２）、頻度の高いＧ−アレルをホモで有するもの（ｎ  ＝  ３３０）では最も高い骨密度を示した  （０．４０２  ±  ０．０５５  ｇ／ｃｍ２）。マイナーアレルのＧ−アレルが、共優性な効果をもつと推定すると、その相関は有意であった  （ｒ＝０．１５，  ｐ  ＝  ０．００３）  （第８図）。
【００７５】
ＡＧＺＰ１遺伝子の第一エクソンの３’−端から１０９５塩基対上流に位置するＳＮＰ  ＡＧＺＰ１−１１１５Ｃ＞Ｔも補正橈骨の骨密度値と有意な相関を示し（参照コンティグ；  ＮＴ＿  ００７９３３，  ＧｅｎＢａｎｋ）  、頻度の低いＧ−アレルをホモで保有する者  （ｎ  ＝５０）  は最も低い骨密度を示し  （０．３７９  ±  ０．０５６  ｇ／ｃｍ２）  、ヘテロの被験者  （ｎ  ＝１７３）  は中間の値を示し（０．３９９  ±  ０．０５５  ｇ／ｃｍ２）、頻度の高いＡ−アレルをホモで有するもの（ｎ  ＝  １５７）では最も高い骨密度を示した  （０．４０５  ±  ０．０５２  ｇ／ｃｍ２）。マイナーアレルのＧ−アレルが、共優性な効果をもつと推定すると、その相関は有意であった  （ｒ＝０．１４，  ｐ  ＝  ０．００７）  （第９図）。
【００７６】
【発明の効果】
本発明により、骨密度に関連する遺伝子多型を用いた、骨粗鬆症の素因を検出可能な、遺伝子の検出方法が提供される。
【００７７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列の一部の前半（−２５９１〜−９１２）を示す図面である。
【図２】Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子の塩基配列の一部の後半（−９１１〜ＩＶＳ１＋２０）を示す図面である。
【図３】ＲＩＬ遺伝子の塩基配列の一部を示す図面である。
【図４】ＨＳＰＡ遺伝子の塩基配列の一部と、これがコードするアミノ酸配列の一部を示す図面である。
【図５】ＡＺＧＰ１遺伝子の塩基配列の一部を示す図面である。
【図６】インベーダー・アッセイ法のあらましを略図化した図面である。
【図７】Ｉ−ＴＲＡＦ遺伝子における特定の遺伝子多型と骨密度の減少の相関関係を示した図面である。
【図８】ＲＩＬ遺伝子における特定の遺伝子多型と骨密度の減少の相関関係を示した図面である。
【図９】ＨＳＰＡ１遺伝子における特定の遺伝子多型と骨密度の減少の相関関係を示した図面である。
【図１０】ＡＺＧＰ１遺伝子における特定の遺伝子多型と骨密度の減少の相関関係を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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