(57)【要約】【課題】二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡ複合体を可視化して検出できる核酸検出方法を提供すること。【解決手段】核酸検出方法は、直鎖状の二本鎖ＤＮＡと、この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡとからなり、二本鎖ＤＮＡのうち、一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍を含む末端近傍包含領域に、一本鎖ＤＮＡのうち、相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなるＤＮＡ複合体を試料として、原子間力顕微鏡により、ＤＮＡ複合体を検出する。【選択図】        図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状の二本鎖ＤＮＡ、
この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡ、
相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、並びに、
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ及びこのエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであるヌクレアーゼ、
を反応させて、上記二本鎖ＤＮＡのうち、上記一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖ＤＮＡのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、
上記組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、上記二本鎖ＤＮＡの末端近傍包含領域に上記一本鎖ＤＮＡの相補的領域が結合してなるＤＮＡ複合体を形成するタンパク質失活工程と、
原子間力顕微鏡により、上記ＤＮＡ複合体を検出するＡＦＭ検出工程と、
を備えることを特徴とする核酸検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸検出方法であって、
上記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、このＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかである
ことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の核酸検出方法であって、
上記ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加える
ことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の核酸検出方法であって、
上記ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸を加える
ことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸検出方法であって、
上記タンパク質失活工程後、上記ＡＦＭ検出工程前に、上記ＤＮＡ複合体と上記ヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を備える
ことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項６】
直鎖状の二本鎖ＤＮＡと、この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡとからなり、
上記二本鎖ＤＮＡのうち、上記一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖ＤＮＡのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなるＤＮＡ複合体を試料として、
原子間力顕微鏡により、上記ＤＮＡ複合体を検出する
ことを特徴とする核酸検出方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の核酸検出方法であって、
上記一本鎖ＤＮＡは、６０ｍｅｒ以上の塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが結合してなるＤＮＡ複合体を検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとを含む複合体の形成方法が知られている。即ち、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を用意すると共に、このターゲットＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのＤＮＡと大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質とからなるＤＮＡ−タンパク質複合体が形成される。具体的には、まず、プローブＤＮＡにＲｅｃＡタンパク質が結合してプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体が、ターゲットＤＮＡに結合し、三本鎖形成領域を有するＤＮＡ−タンパク質複合体が形成される。その際、プローブＤＮＡは、ＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で、ターゲットＤＮＡのうち、プローブＤＮＡと相補的な塩基配列からなる領域に結合すると考えられている。この状態のＤＮＡ−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【０００３】
ところが、このＤＮＡ−タンパク質複合体に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やタンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼＫ）などを加えて十分な時間保温し、ＲｅｃＡタンパク質を失活させると、ＤＮＡ−タンパク質複合体からＲｅｃＡタンパク質が除去されるだけでなく、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとの結合も解消される。つまり、ＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＲｅｃＡタンパク質の存在下においてのみ、その構造が安定に維持され、ＲｅｃＡタンパク質がない状態では、安定なＤＮＡ複合体を形成することができなかった。遺伝子工学等の分野において、ＤＮＡ複合体を利用しようとした場合、ＲｅｃＡタンパク質が結合した状態の複合体では、ＲｅｃＡタンパク質の存在により多くの制限を受け、その利用範囲が狭くなる。そこで、このようなタンパク質が存在しなくても安定な構造を維持できるＤＮＡ複合体の形成方法の開発が待たれていた。
【０００４】
このような問題に対し、本出願人は、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるＤＮＡ複合体の形成方法を見出した（特許文献１参照。）。即ち、直鎖状の二本鎖ＤＮＡと、この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡを用意する。次に、緩衝剤等を含む反応液に、これらのＤＮＡと大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を混ぜ、さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩを混ぜて、十分な時間保温する。そうすると、少なくとも二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質を含む比較的安定なＤＮＡ−タンパク質複合体が形成される。このようにして形成したＤＮＡ−タンパク質複合体は、その後、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させても、安定なＤＮＡ複合体を形成できる。つまり、複合体中にタンパク質を含有しないにも拘わらず、安定な状態を維持できるＤＮＡ複合体を形成できる。
【発明が解決しようとする課題】
このようなＤＮＡ複合体は、例えば、予め一本鎖ＤＮＡを標識しておけば、ＤＮＡ複合体が標識されるため、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法により、その存在を確認できる。
しかしながら、従来は、ＤＮＡ複合体を可視化して確認することはできなかったため、ＤＮＡ複合体の構造や形態などを調べることができなかった。また、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法では、ＤＮＡ複合体の集団（バルク）を検出するため、試料が微量の場合には、ＤＮＡ複合体を確実に検出することができない。また、検出に時間を要するなどの問題点があった。
【０００５】
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡ複合体を可視化して検出できる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
その解決手段は、直鎖状の二本鎖ＤＮＡ、この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡ、相同的組換えタンパク質及びこの相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかである組換えタンパク質、並びに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ及びこのエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであるヌクレアーゼ、を反応させて、上記二本鎖ＤＮＡのうち、上記一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖ＤＮＡのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が、少なくとも上記組換えタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成するＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程と、上記組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、上記二本鎖ＤＮＡの末端近傍包含領域に上記一本鎖ＤＮＡの相補的領域が結合してなるＤＮＡ複合体を形成するタンパク質失活工程と、原子間力顕微鏡により、上記ＤＮＡ複合体を検出するＡＦＭ検出工程と、を備えることを特徴とする核酸検出方法である。
【０００７】
本発明によれば、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡと組換えタンパク質とヌクレアーゼから、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。そしてその後、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させると、二本鎖ＤＮＡの末端近傍包含領域に一本鎖ＤＮＡの相補的領域が結合したＤＮＡ複合体を形成できる。このようなＤＮＡ複合体は、その構造を安定化させるための特別なタンパク質等（例えば、前述したＲｅｃＡタンパク質）が存在しなくても、多少の熱を加えるなどしても解離することなく、安定な状態を維持できる。その後は、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により、このＤＮＡ複合体を検出する。
【０００８】
このような方法によりＤＮＡ複合体を検出すれば、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができる。また、ＤＮＡ複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、ＤＮＡ複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、ＤＮＡの一部を標識するなどの手間もなく、また、ＤＮＡ複合体を電気泳動したり、そのゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
なお、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの結合領域は、二本鎖ＤＮＡの一方の末端近傍包含領域に形成するだけでなく、二本鎖ＤＮＡの両方の末端近傍包含領域に形成することも可能である。
【０００９】
ここで、ＤＮＡ結合体は、二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の末端近傍包含領域に、一本鎖ＤＮＡの相補的領域が結合したものであれば、その結合形態は問われない。つまり、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの間で、必ずしも、ワトソン・クリック型塩基対やフーグスティーン型塩基対のような特定の構造をとっている必要はなく、二本鎖ＤＮＡの末端近傍包含領域と一本鎖ＤＮＡの相補的領域との間で、何らかの特異的な相互作用によって結合されていればよい。
【００１０】
二本鎖ＤＮＡは、直鎖状であれば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、３０００Ｍｂｐといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なＤＮＡであっても構わない。勿論、二本鎖ＤＮＡの由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のＤＮＡやそれらを改変したＤＮＡであっても、微生物等のもつプラスミドＤＮＡ等やプラスミドＤＮＡ等に異種のＤＮＡ断片を挿入したキメラＤＮＡ等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。
【００１１】
一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状のものであれば、いかなるもの用いてもよい。即ち、この条件を満たす限り、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、理論上それらの鎖長に上限は存在しない。また、その由来も問われない。これらの点は、二本鎖ＤＮＡと同様である。
【００１２】
実質的に相補的な程度は、一般的には、およそ７０〜８０％以上の相補性を有することが必要とされ、より好ましくは、ほぼ１００％の相補性を有することである。相補性が高いほど、より安定なＤＮＡ複合体を形成できるからである。但し、必要とされる相補性の程度は、相補的領域の長さによって若干変動する。また、相補的領域全体の相補性は同じ（例えば７０％）であっても、相補的領域内全体でほぼ等しい相補性（７０％）を有する場合と、相補的領域内に相補性が高い領域（例えば９０％）と低い領域（例えば５０％）が偏在する場合とによっても、若干変動する。
【００１３】
また、一本鎖ＤＮＡは、相補的領域を含むものであればよいから、一本鎖ＤＮＡ全体が相補的領域からなるものであっても、あるいは、相補的領域にさらに他の塩基配列が付加されたものであっても構わない。但し、一本鎖ＤＮＡ全体が相補的領域からなるものの方が、より安定なＤＮＡ複合体を形成しやすいので好ましい。
なお、一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の「末端近傍の塩基から始まる塩基配列」と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのは、次のような理由による。即ち、一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の末端近傍以外の塩基配列（例えば、中央付近の塩基配列）にだけ相補的である場合には、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において安定なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成できるが、タンパク質失活工程でタンパク質を失活させると、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが解離してしまい、安定なＤＮＡ複合体が得られないからである。
【００１４】
また、一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の「５’末端近傍」の塩基から始まる塩基配列と、実質的に相補的な塩基配列を含む必要があるのも、同様な理由による。即ち、一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の「３’末端近傍」の塩基配列にだけ相補的である場合には、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において安定なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成することはできるが、タンパク質を失活させると、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが解離してしまい、安定なＤＮＡ複合体が得られないからである。
【００１５】
組換えタンパク質は、相同的組換えタンパク質及びこれと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであって、それが関与した状態で二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとが安定な複合体を形成できるものであれば、いかなるものを用いてもよい。具体的には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するＲｅｃＡタンパク質の他、耐熱性細菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やその他の腸内細菌においてＲｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能タンパク質、あるいは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、メチロフィルス  メチロトローファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ウスティラゴ  メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）等に由来するＲｅｃＡ類似タンパク質などが挙げられる。また、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やヒトなど真核生物に由来するＲｅｃＡ類似タンパク質もこれに含まれる。
【００１６】
また、これらのタンパク質と類似する機能を有するものであれば、これらのタンパク質を改変した改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質としては、例えば、相同的組換えタンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変異誘発等により作出された遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、相同的組換えタンパク質をコードする遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片（ＲｅｃＡフラグメント）など、相同的組換えタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片であってもよい。
【００１７】
ヌクレアーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）及びこのエキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質の少なくともいずれかであれば、いかなるものを用いてもよい。エキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質には、細菌等の原核生物に由来するエキソヌクレアーゼＩ類似タンパク質だけでなく、真核生物等に由来するエキソヌクレアーゼＩ類似タンパク質も挙げられる。
また、エキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するものであれば、これらのタンパク質を改変した改変タンパク質であってもよい。改変タンパク質としては、例えば、エキソヌクレアーゼＩ遺伝子から、部位特異的変異誘発等により作出されたエキソヌクレアーゼＩ遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、エキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するものが挙げられる。また、エキソヌクレアーゼＩ遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、エキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、エキソヌクレアーゼＩと類似する機能を有するエキソヌクレアーゼＩのタンパク質断片（エキソヌクレアーゼＩフラグメント）であってもよい。
【００１８】
ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程は、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体の存在下において、緩衝液中で行うのが好ましい。効率よく、安定なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成できるからである。
緩衝液は、使用する組換えタンパク質及びヌクレアーゼにより、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）と酢酸や塩酸等の適当な酸とにより、ｐＨを約４．０〜９．０、より好ましくは、約７．０〜８．０に調節したトリス系の緩衝液を使用すればよい。緩衝剤は、一般に約１０〜１００ｍＭ、好ましくは、約３０ｍＭで使用する。
【００１９】
ヌクレオシド三リン酸またはその類似体としては、例えば、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）、ＵＴＰ、ＣＴＰや、アデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、グアノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＧＴＰ−γＳ）、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰなどを挙げることができる。これらは、さらにヌクレオシド二リン酸（例えば、ＡＤＰ）と組み合わせて使用することもできる。なお、これらヌクレオシド三リン酸等は、０．１〜１０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭで使用する。
【００２０】
反応液中の核酸（二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ）の濃度は、核酸が十分に溶解できる濃度であればよく、適宜変更できる。二本鎖ＤＮＡに対する一本鎖ＤＮＡの割合は、モル比で約１〜１００倍とするのが好ましい。また、組換えタンパク質は、一本鎖ＤＮＡの３塩基当たり１分子に相当するように加えるのが好ましい。但し、使用する組換えタンパク質によってその最適量は若干変動する。また、ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの１μｇ当たり約１ｕｎｉｔ加えるのが好ましい。但し、これも使用するヌクレアーゼによってその最適量は若干変動する。
このように調製した反応液は、４〜６０℃、好ましくは約３７℃のおいて、５分間以上、一般には約３０〜６０分間保温することにより、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成できる。
【００２１】
なお、この工程では、上記のように反応液中にすべてのもの加えて一定時間保温する方法の他、次のような方法を採ることもできる。即ち、まず、ヌクレオシド三リン酸等を含む緩衝液に、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡと組換えタンパク質とを加えて、４〜６０℃、好ましくは約３７℃のおいて、数分間以上、好ましくは約１０分間保温する。そしてその後、この反応液にヌクレアーゼを加えて、さらに、４〜６０℃、好ましくは約３７℃のおいて、５分間以上、一般には約３０分間保温する。
【００２２】
このような方法で反応させると、特に安定なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成できる。その理由としては、エキソヌクレアーゼＩ等は、本来、一本鎖ＤＮＡを末端から切断していく酵素であるから、最初から反応液に加えると、一本鎖ＤＮＡが削られてしまうことがある。しかし、このようにエキソヌクレアーゼＩ等を後から加えると、一本鎖ＤＮＡには先に組換えタンパク質が結合して、エキソヌクレアーゼＩから保護されるため、一本鎖ＤＮＡが切断されにくくなり、安定なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成できると考えられるからである。
【００２３】
タンパク質失活工程で、タンパク質を失活させるには、反応液にキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）を加えるか、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えるか、または、タンパク質分解酵素（例えば、プロティナーゼＫ）を加え、あるいは、これらの処理を組み合わせて行った後、例えば、約３７℃で１０分間以上保温すればよい。こうして得られる反応液からＤＮＡ複合体だけを回収するには、フェノール、クロロホルム等の溶媒抽出により除タンパク質処理を行った後、適当なカラムクロマトグラフィーで回収する方法を利用したり、あるいは、エタノール沈殿で一旦ＤＮＡを析出させる方法を利用すればよい。
【００２４】
さらに、上記の核酸検出方法であって、上記組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質、及び、このＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質、の少なくともいずれかであることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００２５】
前述したように、組換えタンパク質には、様々なものを適宜選択できる。これらのうち、入手容易性、安全性、機能性を考えると、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質を用いるのが好ましい。また、このＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であり、かつ、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有する改変タンパク質でもよい。このような改変タンパク質としては、例えば、ＲｅｃＡ遺伝子から部位特異的変異誘発等により作出されたＲｅｃＡ遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、ＲｅｃＡ遺伝子を改変した遺伝子の産物であって、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するタンパク質断片からなるものでもよい。また、ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片（ＲｅｃＡフラグメント）であってもよい。
【００２６】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸検出方法であって、上記ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加えることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００２７】
このように、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加えて反応させれば、より効率よく、ＤＮＡタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくＤＮＡ複合体を形成できる。
【００２８】
さらに、上記のいずれかに記載の酸検出方法であって、上記ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ヌクレオシド三リン酸を加えることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００２９】
このように、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ等のヌクレオシド三リン酸を加えて反応させれば、より効率よく、ＤＮＡタンパク質複合体を形成できる。その結果、より効率よくＤＮＡ複合体を形成できる。
【００３０】
さらに、前記の核酸検出方法であって、上記タンパク質失活工程後、上記ＡＦＭ検出工程前に、上記ＤＮＡ複合体と上記ヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を備えることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００３１】
ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程でＡＴＰ−γＳを加えてＤＮＡタンパク質複合体を形成する場合、二本鎖ＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の一部がひげ状に遊離したＤＮＡ複合体が形成されることがある。
これに対し、本発明では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、ＤＮＡ複合体とヌクレアーゼとを反応させるので、ひげ状に遊離したＤＮＡはヌクレアーゼにより分解される。従って、ひげ状に遊離した部分のないＤＮＡ複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００３２】
また、他の解決手段は、直鎖状の二本鎖ＤＮＡと、この二本鎖ＤＮＡのうち一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍の塩基から始まる塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を含む直鎖状の一本鎖ＤＮＡとからなり、上記二本鎖ＤＮＡのうち、上記一方のＤＮＡ鎖の５’末端近傍を含む末端近傍包含領域に、上記一本鎖ＤＮＡのうち、上記相補的な塩基配列を有する相補的領域が結合してなるＤＮＡ複合体を試料として、原子間力顕微鏡により、上記ＤＮＡ複合体を検出することを特徴とする核酸検出方法である。
【００３３】
このような方法によりＤＮＡ複合体を検出すれば、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができる。また、ＤＮＡ複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、ＤＮＡ複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、ＤＮＡの一部を標識するなどの手間もなく、また、ＤＮＡ複合体を電気泳動したり、そのゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
【００３４】
さらに、上記のいずれかに記載の核酸検出方法であって、上記一本鎖ＤＮＡは、６０ｍｅｒ以上の塩基配列からなることを特徴とする核酸検出方法とすると良い。
【００３５】
一本鎖ＤＮＡは、その鎖長が短くても、二本鎖ＤＮＡに結合してＤＮＡ複合体を形成できる。しかし、一本鎖ＤＮＡが短いと、具体的には、６０ｍｅｒよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ複合体との区別がつきにくい。即ち、ＤＮＡ複合体の検出がより難しくなる。
これに対し、本発明では、６０ｍｅｒ以上の塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡを使用する。従って、原子力顕微鏡で観察した場合に、ＤＮＡ複合体をより確実に検出できる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
（実施形態１）
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。
まず、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を用意する（図１参照）。図１はＤＮＡ複合体の形成について模式的に示したものである。本実施形態では、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（３０３０ｂｐ）を制限酵素ＲｓａＩで３つのＤＮＡ断片（１８９２ｂｐと６７６ｂｐと４６２ｂｐのＤＮＡ断片）に切断し、このうちの最も大きいＤＮＡ断片（約１．９ｋｂｐ）をターゲットＤＮＡとした。具体的には、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで切断した後、ゲル濾過を用いて目的のＤＮＡ断片を分離精製した。ゲル濾過は、Ｓ−１０００セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出緩衝液にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて、１００ｃｍのオープンカラムで行った。溶出されてきたＤＮＡサンプル液を１ｍＬ／ｍｉｎの速度で２ｍｌずつ回収した。そして、回収したそれぞれのサンプルの一部を電気泳動して確認した。その結果を図２に示す。
【００３７】
図２から明らかなように、レーン１〜レーン２あたりでは、シグナルがほとんど検出されなかった。また、レーン３〜レーン２０あたりでは、最も大きい約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２１〜レーン２７あたりでは、最も大きい約１．９ｋｂｐの断片に由来するシグナルと共に、２番目に大きい約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン２８〜レーン２９あたりでは、２番目に大きい約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に由来するシグナルが主として確認された。また、レーン３０〜レーン３７では、２番目に大きい約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片に由来するシグナルと、最も小さい約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片に由来するシグナルが主として確認された。このような結果に基づいて、ターゲットＤＮＡには、レーン３〜レーン２０に使用したサンプルを利用した。
【００３８】
次に、プローブＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を用意する（図１参照）。本実施形態では、長さの異なる５種類のプローブＤＮＡ、即ち、１５０ｍｅｒの第１プローブＤＮＡ、３００ｍｅｒの第２プローブＤＮＡ、６００ｍｅｒの第３プローブＤＮＡ、９００ｍｅｒの第４プローブＤＮＡ、及び、１２００ｍｅｒの第５プローブＤＮＡを用意した。具体的には、最も短い第１プローブＤＮＡは、ＤＮＡ合成によりオリゴヌクレオチド１として調製した。一方、第２プローブＤＮＡ〜第５プローブＤＮＡは、ＰＣＲ反応を利用して調製した。ＰＣＲ反応は、６００ｎｇのｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を鋳型として、５０μｌのＰＣＲ反応液に、０．５ｍＭ（最終濃度）のフォワード側のプライマーＤＮＡと０．５ｍＭ（最終濃度）のリバース側のプライマーＤＮＡ、０．２５ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  に混合した。ＰＣＲ反応は、１サイクル（９４℃，２ｍｉｎ）、３０サイクル（９４℃，３０ｓｅｃ−６０℃，３０ｓｅｃ−７４℃，６０ｓｅｃ）、１サイクル（７４℃，７ｍｉｎ−４℃，１ｍｉｎ）の条件で行った。その後、ＰＣＲ反応液に色素液を加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図３のレーン１〜レーン４に示す。
【００３９】
なお、第２プローブＤＮＡは、フォワード側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド２を、リバース側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第３プローブＤＮＡは、フォワード側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド４を、リバース側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第４プローブＤＮＡは、フォワード側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド５を、リバース側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド３を使用した。また、第５プローブＤＮＡは、フォワード側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド６を、リバース側のプライマーＤＮＡにオリゴヌクレオチド３を使用した。オリゴヌクレオチド１〜オリゴヌクレオチド６は、いずれもｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡに１００％相補的な配列からなるものである。なお、オリゴヌクレオチド３の５’末端には、後に一本鎖のプローブＤＮＡを調製するために、ビオチンを付加させておいた。
【００４０】
オリゴヌクレオチド１：
５’−ｔｇｔｔｇｔｇｃａａａａａａｇｃｇｇｔｔａｇｃｔｃｃｔｔｃｇｇｔｃｃｔｃｃｇａｔｃｇｔｔｇｔｃａｇａａｇｔａａｇｔｔｇｇｃｃｇｃａｇｔｇｔｔａｔｃａｃｔｃａｔｇｇｔｔａｔｇｇｃａｇｃａｃｔｇｃａｔａａｔｔｃｔｃｔｔａｃｔｇｔｃａｔｇｃｃａｔｃｃｇｔａａｇａｔｇｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇａｃｔｇｇｔｇａｇｔ−３’
オリゴヌクレオチド２：
５’−ｇｃｃｇｇｇａａｇｃｔａｇａｇｔａａｇｔａｇｔｔ−３’
オリゴヌクレオチド３：
５’−ａｃｔｃａｃｃａｇｔｃａｃａｇａａａａｇｃａｔｃ−３’
オリゴヌクレオチド４：
５’−ｇｔｔｔｔａａａｔｃａａｔｃｔａａａｇｔａｔａｔ−３’
オリゴヌクレオチド５：
５’−ｇｇｔｇｇｃｃｔａａｃｔａｃｇｇｃｔａｃａｃｔａ−３’
オリゴヌクレオチド６：
５’−ｔｃｇｔｇｃｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｇａｃｃｃ−３’
【００４１】
図３から明らかなように、レーン１には、３００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出された。また、レーン２には、６００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン３には、９００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出された。レーン４には、１２００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出された。
【００４２】
次に、レーン１に用いたＰＣＲ反応液から、ゲル濾過を用いて目的のＰＣＲ産物を分離精製した。ゲル濾過は、Ｓ−４００セファクリル（アマシャム・マルマシア株式会社）を用い、溶出液にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて、２０ｃｍのオープンカラムで行った。その後、精製したＤＮＡ液に色素液を加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。同様に、レーン２〜レーン４に用いたＰＣＲ反応液からも、ゲル濾過を用いてそれぞれ目的のＰＣＲ産物を分離精製し、電気泳動を行った。その結果を図３のレーン５〜レーン８に示す。
【００４３】
図３から明らかなように、レーン５には、３００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン１よりも減少した。また、レーン６には、６００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン２よりも減少した。また、レーン７には、９００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン３よりも減少した。また、レーン８には、１２００ｂｐの目的のＤＮＡ断片に由来するシグナルが強く検出され、その他のシグナルがレーン４よりも減少した。従って、ＰＣＲ反応液をゲル濾過したことにより、目的のＰＣＲ産物をより高純度で分離精製することができた。
【００４４】
次に、二本鎖である各ＰＣＲ産物から一本鎖のプローブＤＮＡ（第２プローブＤＮＡ〜第５プローブＤＮＡ）をそれぞれ調製した。具体的には、１２５ｕｌ（１０ｕｇ／ｕｌ）のＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＤＹＮＡＬ社）をＭａｇｎｅｔ  ｓｔａｎｄを用いて、５００ｕｌの６ＸＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、１２５ｕｌの６ＸＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。上澄液を除き、そこに１２５ｕｌの６ＸＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒに希釈したゲルろ過精製を行った５０ｕｌのＰＣＲ増幅産物を混ぜ合わせた。ＰＣＲ産物とＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎとの結合反応は、室温で６０分間行った。Ｍａｇｎｅｔ  ｓｔａｎｄを用いて上澄を除いた後、５００ｕｌの６ＸＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄、２５０ｕｌの１ＸＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄して、未反応のＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔを除いた。一本鎖ＤＮＡの変性は、１００ｕｌのＮａＯＨ（０．１５Ｍ）を加え室温で１０分間反応を行い、Ｍａｇｎｅｔ  ｓｔａｎｄを用いて上澄を新しいチューブに移した。そこに１１ｕｌの１０ＸＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５），  ６．５ｕｌ  Ａｃｅｔｉｃ  ｓｃｉｄ  （１．２５Ｍ）を加え、エタノール沈殿を行い一本鎖ＤＮＡを濃縮回収した。
【００４５】
なお、第１プローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の５’末端の塩基から始まる１５０ｍｅｒの塩基配列と１００％相補的な１５０ｍｅｒの塩基配列からなる。また、第２プローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の５’末端の塩基から始まる３００ｍｅｒの塩基配列と１００％相補的な３００ｍｅｒの塩基配列からなる。また、第３プローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の５’末端の塩基から始まる６００ｍｅｒの塩基配列と１００％相補的な６００ｍｅｒの塩基配列からなる。また、第４プローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の５’末端の塩基から始まる９００ｍｅｒの塩基配列と１００％相補的な９００ｍｅｒの塩基配列からなる。また、第５プローブＤＮＡは、ターゲットＤＮＡの一方のＤＮＡ鎖の５’末端の塩基から始まる１２００ｍｅｒの塩基配列と、１００％相補的な１２００ｍｅｒの塩基配列からなる。
【００４６】
ここで、準備した二本鎖ターゲットＤＮＡと一本鎖プローブＤＮＡを原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）により観察した。ＡＦＭ標本作製の手順は次の通り行った。まず、二本鎖ターゲットＤＮＡと一本鎖の第３プローブＤＮＡを含むＤＮＡ液に最終濃度１０ｍＭとなるように塩化マグネシウムを加え、１０ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に５０μｌ滴下し、室温で５分間静置した。次に、これを滅菌水５ｍｌで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で４０℃、１５分乾燥して作製した。そして、この標本について、原子間力顕微鏡で観察した。ＤＮＡの可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープＩＩＩａ）（Ｄｅｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（Ｄ−ＮＣＨ−１０Ｖ）を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に０．５−２μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に２ｎｍで行った。ＤＮＡの長さはフリーウエアであるＮＩＨｉｍａｇｅを使用して計測した。その結果を図４に示す。また、図４の写真を模式的に示したものを図５に示す。
【００４７】
図４から明らかなように、原子間力顕微鏡によれば、約１．９ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡが線状に存在する様子を各々の分子について確実に観察できた（図中左側）。また、６００ｍｅｒの一本鎖の第３プローブＤＮＡについてもその存在を各々の分子について確実に観察できた（図中右上）。一本鎖ＤＮＡでは、太くなっている部分や粒状になっている部分が所々見られるが、これは、一本鎖ＤＮＡは、同一分子内で相補的な配列が結合して高次構造をとるためであると考えられる。なお、この原子間力顕微鏡による観察では、少なくとも１００ｍｅｒ程度の長さを有するものであれば、十分にその存在を確認できることが判った。
【００４８】
次に、組換えタンパク質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を、また、ヌクレアーゼとして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ＡＴＰ−γＳを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００４９】
次に、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ターゲットＤＮＡと、プローブＤＮＡと、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）とを反応させて、ターゲットＤＮＡのうち、一方のＤＮＡ鎖の５’末端を含む末端包含領域に、プローブＤＮＡ、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する（図１参照）。具体的には、１ｐｍｏｌのプローブＤＮＡ、３．０  μｇのＲｅｃＡタンパク、４  ｕｎｉｔのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ、４．８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、６００  ｎｇのターゲットＤＮＡを、２０  ｍＭ  酢酸マグネシウム、３０  ｍＭ  酢酸トリス（ｐＨ７．２）中で、３７℃で３０分間保温した。この反応では、まず、プローブＤＮＡにＲｅｃＡタンパク質が結合してプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体が形成される。続いて、このプローブＤＮＡ−ＲｅｃＡタンパク質複合体が、ターゲットＤＮＡに結合し、ＤＮＡ−タンパク質複合体が形成される。その際、このＤＮＡ−タンパク質複合体は、少なくともＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で、プローブＤＮＡが、ターゲットＤＮＡのうち、プローブＤＮＡと相補的な塩基配列からなる領域（末端領域）に結合すると考えられる。なお、エキソヌクレアーゼＩは、このＤＮＡ−タンパク質複合体の安定化に作用するものと考えられる。このようなＤＮＡ−タンパク質複合体は、比較的安定なものである。
【００５０】
次に、タンパク質失活工程において、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットＤＮＡの末端近傍包含領域にプローブＤＮＡが結合してなるＤＮＡ複合体を形成する（図１参照）。具体的には、上記の反応液に、０．５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳと０．７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃において６０分間保温し、ＲｅｃＡタンパク質とエキソヌクレアーゼＩを失活させた（除タンパクを行った）。これにより、ターゲットＤＮＡの末端近傍包含領域にプローブＤＮＡが結合してなるＤＮＡ複合体が形成される。このようなＤＮＡ複合体は、その構造を維持するために特別なタンパク質等を必要とせず、多少の熱を加えても、安定な状態を維持できる。
【００５１】
ここで、ＤＮＡ複合体の形成を確認するための実験を行った。即ち、タンパク質失活工程を行った後の反応液に色素液を加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図６のレーン５に示す。なお、このレーン５は、プローブＤＮＡとして６００ｍｅｒの第３プローブＤＮＡを使用して上述の各反応を行ったものである。
【００５２】
図６のレーン５を見ると、図中に矢印Ａ、矢印Ｂ、矢印Ｃで示したように、３本のシグナルが検出された。このうち矢印Ａで示す位置のシグナルが、その大きさからしてＤＮＡ複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印Ｂで示す位置のシグナルは、その大きさからしてＤＮＡ複合体を形成していないターゲットＤＮＡに由来するものと考えられる。また、矢印Ｃで示す位置のシグナルは、その大きさからしてＤＮＡ複合体を形成していないプローブＤＮＡに由来するものと考えられる。
【００５３】
次に、図６に結果を示した比較実験について説明する。
レーン１は、上述のＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン２は、上述のＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン３は、上述のＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを加えずに、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン４は、上述のＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では３０分間）を０分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
レーン６は、上述のＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間（レーン５では３０分間）を６０分間とし、それ以外はレーン５と同じ反応を行った結果を示す。
【００５４】
これから明らかなように、レーン１及びレーン３では、矢印Ａで示す位置にシグナルが検出されなかった。つまり、レーン１及びレーン３では、ＤＮＡ複合体が形成されていない。この結果から、安定なＤＮＡ複合体の形成には、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＲｅｃＡタンパク質が必要であることが判る。また、レーン２では矢印Ａで示す位置にごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なＤＮＡ複合体の形成には、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加えるのが好適であることが判る。また、レーン４でも矢印Ａで示す位置にはごく弱いシグナルしか検出されなかった。この結果から、安定なＤＮＡ複合体の形成には、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ある程度の反応時間を要することが判る。一方、レーン６では、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程を十分に長い反応時間で行っているため、レーン５と同様に、矢印Ａで示す位置に強いシグナルが検出されている。即ち、安定なＤＮＡ複合体が形成されている。
【００５５】
また、その他のプローブＤＮＡについても、上述した各反応を行い、図６のレーン５と同様に、ＤＮＡ複合体の形成を確認するための電気泳動を行った。その結果を図７に示す。
レーン１は、第１プローブＤＮＡ（１５０ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が３０分間）を行った結果を示す。
レーン２は、第２プローブＤＮＡ（３００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が３０分間）を行った結果を示す。
レーン３は、第４プローブＤＮＡ（９００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が３０分間）を行った結果を示す。
レーン４は、第５プローブＤＮＡ（１２００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン５と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が３０分間）を行った結果を示す。
レーン５は、第１プローブＤＮＡ（１５０ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が６０分間）を行った結果を示す。
レーン６は、第２プローブＤＮＡ（３００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が６０分間）を行った結果を示す。
レーン７は、第４プローブＤＮＡ（９００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が６０分間）を行った結果を示す。
レーン８は、第５プローブＤＮＡ（１２００ｍｅｒ）を用いて、図６のレーン６と同じ反応（ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程の反応時間が６０分間）を行った結果を示す。
【００５６】
図７のいずれもレーンにおいても、図中に矢印で示したシグナルと共に、それよりも大きい位置（図中上方）と小さい位置（図中下方）にそれぞれシグナルが観察された。大きい位置のシグナルは、その大きさからしてそれぞれのＤＮＡ複合体に由来するものと考えられる。一方、矢印で示す位置のシグナルは、その大きさからしてＤＮＡ複合体を形成していないターゲットＤＮＡに由来するものと考えられる。また、小さい位置のシグナルは、その大きさからしてＤＮＡ複合体を形成していないそれぞれのプローブＤＮＡに由来するものと考えられる。このように、いずれのプローブＤＮＡを用いても、ＤＮＡ複合体が形成されているのが判る。
【００５７】
次に、図６及び図７のゲル写真で観察されているＤＮＡ複合体を、ゲルから切り出し精製した。精製は、Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア）を用いて、そのプロトコルに従って行った。その後、精製した各ＤＮＡ液に色素液を加え、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後にアガロースゲルをエチジウムブロミド染色し、泳動ゲルの写真を記録した。その結果を図８に示す。
レーン１は、図７のレーン１のＤＮＡ複合体を切り出し精製した結果、即ち、第１プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン２は、図７のレーン２のＤＮＡ複合体を切り出し精製した結果、即ち、第２プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン３は、図６のレーン５のＤＮＡ複合体を切り出し精製した結果、即ち、第３プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン４は、図７のレーン３のＤＮＡ複合体を切り出し精製した結果、即ち、第４プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す。
レーン５は、図７のレーン４のＤＮＡ複合体を切り出し精製した結果、即ち、第５プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す。
【００５８】
図８のいずれのレーンにおいても、各々のＤＮＡ複合体に由来するシグナルが観察され、それ以外のジグナルは僅かしか観察されなかった。この結果より、いずれのサンプルも、高純度にＤＮＡ複合体が分離精製されていることが判る。
【００５９】
次に、ＡＦＭ検出工程において、原子間力顕微鏡により、精製したＤＮＡ複合体を観察した。ＡＦＭ標本作製の手順は次の通りに行った。ＤＮＡ液に最終濃度１０ｍＭとなるように塩化マグネシウムを加え、１０ミリ角の雲母基板のへき開直後の新鮮な表面に５０μｌ滴下し、室温にて５分間静置した。次に、これを滅菌水５ｍｌで洗浄し、窒素ガスで水分を吹き飛ばし、さらに真空下で４０℃１５分乾燥して作製した。遺伝子の可視化条件は、上記で作製した標本を走査型プローブ顕微鏡（ナノスコープＩＩＩａ）（Ｄｅｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  社）にセットし、シリコン単結晶カンチレバー（Ｄ−ＮＣＨ−１０Ｖ）を用いて、タッピングモードにて測定した。スキャン範囲はＸ−Ｙ方向に０．５−２μｍ、高さ（Ｚ軸）方向に２ｎｍで行った。ＤＮＡの長さはフリーウエアであるＮＩＨｉｍａｇｅを使用して計測した。
【００６０】
なお、プローブＤＮＡとして第１プローブＤＮＡ（１５０ｍｅｒ）を使用した結果を図９に示し、図９の写真を模式的に示したものを図１０に示す。また、プローブＤＮＡとして第２プローブＤＮＡ（３００ｍｅｒ）を使用した結果を図１１に示し、図１１の写真を模式的に示したものを図１２に示す。また、プローブＤＮＡとして第３プローブＤＮＡ（６００ｍｅｒ）を使用した結果を図１３に示し、図１３の写真を模式的に示したものを図１４に示す。また、プローブＤＮＡとして第４プローブＤＮＡ（９００ｍｅｒ）を使用した結果を図１５に示し、図１５の写真を模式的に示したものを図１６に示す。また、プローブＤＮＡとして第５プローブＤＮＡ（１２００ｍｅｒ）を使用した結果を図１７に示し、図１７の写真を模式的に示したものを図１８に示す。
【００６１】
図９及び図１０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第１プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。このＤＮＡ複合体は、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。そして、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１１及び図１２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第２プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。このＤＮＡ複合体も、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。そして、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１３及び図１４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第３プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。このＤＮＡ複合体も、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。そして、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１５及び図１６に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第４プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。このＤＮＡ複合体も、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。そして、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている。
また、図１７及び図１８に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第５プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。このＤＮＡ複合体も、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。そして、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている。
【００６２】
以上で説明したようにしてＤＮＡ複合体を検出すれば、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができる。また、ＤＮＡ複合体の一つ一つを可視化するので、試料が微量であっても、ＤＮＡ複合体を確実に検出できる。さらに、サザンハイブリダイゼーションを応用した手法に比して、ＤＮＡの一部を標識するなどの手間もなく、また、ＤＮＡ複合体を電気泳動したり、ゲルを乾燥させる必要もないため、検出に要する時間も短くて済む。
【００６３】
また、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程で用いる組換えタンパク質には、様々なものを適宜選択できるが、入手容易性、安全性、機能性を考えると、本実施形態のように、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質を用いるのが好ましい。
また、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳを加えて反応させることにより、より効率よく、ＤＮＡタンパク質複合体を形成でき、その結果、より効率よく、ＤＮＡ複合体を形成できる。
また、一本鎖ＤＮＡは、その鎖長が短くても、二本鎖ＤＮＡに結合してＤＮＡ複合体を形成できる。しかし、一本鎖ＤＮＡが短いと、具体的には、６０ｍｅｒよりも短いと、原子間力顕微鏡で観察を行ったときに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ複合体との区別がつきにくい。即ち、ＤＮＡ複合体の検出がより難しくなる。そこで、本実施形態のように、６０ｍｅｒ以上の塩基配列からなる一本鎖ＤＮＡを使用すると、原子力顕微鏡で観察した場合に、ＤＮＡ複合体をより確実に検出できる。
【００６４】
（実施形態２）
次いで、第２の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、ＤＮＡ複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行う。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同じである。
【００６５】
具体的に説明すると、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１と同様に、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで３つのＤＮＡ断片に切断し、このうちの最も大きいＤＮＡ断片（約１．９ｋｂｐ）を精製した。また、プローブＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１でも利用した１５０ｍｅｒの第１プローブＤＮＡを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）を用意した。さらに、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ＡＴＰ−γＳを、また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。
【００６６】
そして次に、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットＤＮＡと、プローブＤＮＡと、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）とを反応させて、ターゲットＤＮＡのうち、一方のＤＮＡ鎖の５’末端を含む末端包含領域に、プローブＤＮＡ、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した。
次に、タンパク質失活工程において、上記実施形態１と同様にして、組換えタンパク質及びヌクレアーゼを失活させて、ターゲットＤＮＡの末端近傍包含領域にプローブＤＮＡが結合してなるＤＮＡ複合体を形成した。
その後、上記実施形態１と同様に、反応液を電気泳動した後、ＤＮＡ結合体をゲルから切り出して精製した。
【００６７】
次に、本実施形態では、ＤＮＡ複合体とヌクレアーゼとを反応させるヌクレアーゼ処理工程を行った。詳細には、精製した上記のＤＮＡ溶液について、１０  ｕｎｉｔｓの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）、３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ中で、３７℃において２０分間反応させた。
【００６８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、ＤＮＡ複合体を観察した。その結果を図１９に示す。また、図１９の写真を模式的に示したものを図２０に示す。
図１９及び図２０に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第１プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのＤＮＡ複合体が観察されている。このＤＮＡ複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。上記実施形態１では、図９及び図１０に示したように、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のＤＮＡ複合体を観察したが、図１９及び図２０に示すように、ひげ状の部分を持つＤＮＡ複合体は観察されなかった。なお、観察されたＤＮＡ複合体の長さは、ターゲットＤＮＡの長さと同じであった。このことから、ひげ状に遊離したターゲットＤＮＡの一部は、ヌクレアーゼ処理工程において、一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００６９】
以上で説明したように、本実施形態においても、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、タンパク質失活工程後、ＡＦＭ検出工程前に、ヌクレアーゼ処理工程を行っているので、ひげ状に遊離したＤＮＡ鎖のないＤＮＡ複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７０】
（実施形態３）
次いで、第３の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１または実施形態２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳの代わりにＡＴＰを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７１】
具体的に説明すると、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１と同様に、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで３つのＤＮＡ断片に切断し、このうちの最も大きいＤＮＡ断片（約１．９ｋｂｐ）を精製した。また、プローブＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１でも利用した９００ｍｅｒの第４プローブＤＮＡを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ＡＴＰを用意した。
【００７２】
そして次に、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットＤＮＡと、プローブＤＮＡと、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）とを反応させて、ターゲットＤＮＡのうち、一方のＤＮＡ鎖の５’末端を含む末端包含領域に、プローブＤＮＡ、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した。即ち、ＡＴＰ−γＳの代わりにＡＴＰを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した。
【００７３】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、ＤＮＡ複合体を観察した。その結果を図２１に示す。また、図２１の写真を模式的に示したものを図２２に示す。
図２１及び図２２に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第４プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのＤＮＡ複合体が観察されている。このＤＮＡ複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のＤＮＡ複合体を観察したが、図２１及び図２２に示すように、ひげ状の部分を持つＤＮＡ複合体は観察されなかった。なお、観察されたＤＮＡ複合体の長さは、ターゲットＤＮＡの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２と同様な結果が得られた。この理由としては、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程中に、ＡＴＰが生化学的に分解され、ＲｅｃＡタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖ＤＮＡから外れて、一本鎖ＤＮＡがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７４】
以上で説明したように、本実施形態においても、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１または２と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳの代わりにＡＴＰを用いているため、ひげ状に遊離したＤＮＡ鎖のないＤＮＡ複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００７５】
（実施形態４）
次いで、第４の実施の形態について説明する。なお、上記実施形態１〜実施形態３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施形態では、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳの代わりにＧＴＰを用いて反応させる点が、上記実施形態１と異なる。それ以外は、基本的に上記実施形態１と同様である。
【００７６】
具体的に説明すると、ターゲットＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１と同様に、ｐＳＰ６４ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩで３つのＤＮＡ断片に切断し、このうちの最も大きいＤＮＡ断片（約１．９ｋｂｐ）を精製した。また、プローブＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）として、上記実施形態１でも利用した９００ｍｅｒの第４プローブＤＮＡを用意した。また、上記実施形態１と同様に、組換えタンパク質として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を、ヌクレアーゼとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）を用意した。また、緩衝液として、酢酸マグネシウム及び酢酸トリスからなるものを用意した。なお、上記のように、本実施形態では、ヌクレオシド三リン酸またはその類似体として、ＧＴＰを用意した。
【００７７】
そして次に、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、上記実施形態１と同様にして、ターゲットＤＮＡと、プローブＤＮＡと、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質と、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩ）とを反応させて、ターゲットＤＮＡのうち、一方のＤＮＡ鎖の５’末端を含む末端包含領域に、プローブＤＮＡ、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質が関与した状態で結合してなるＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した。即ち、ＡＴＰ−γＳの代わりにＧＴＰを用いた以外は、上記実施形態１と同様な反応を行って、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した。
【００７８】
次に、ＡＦＭ検出工程において、上記実施形態１と同様にして、原子間力顕微鏡により、ＤＮＡ複合体を観察した。その結果を図２３に示す。また、図２３の写真を模式的に示したものを図２４に示す。
図２３及び図２４に示したように、原子間力顕微鏡により、ターゲットＤＮＡと第４プローブＤＮＡのＤＮＡ複合体を観察することができた。なお、図中では、２つのＤＮＡ複合体が観察されている。このＤＮＡ複合体は、上記実施形態１と同様に、ターゲットＤＮＡのうちプローブＤＮＡと相補的な領域に、プローブＤＮＡが結合している。上記実施形態１では、図１５及び図１６に示したように、ターゲットＤＮＡの一部（プローブＤＮＡが結合した部分）は、二本鎖ＤＮＡがほどけて一本鎖の状態となっている（ひげ状に遊離している）。これに対し、本実施形態では、およそ１００個のＤＮＡ複合体を観察したが、図２３及び図２４に示すように、ひげ状の部分を持つＤＮＡ複合体は観察されなかった。なお、観察されたＤＮＡ複合体の長さは、ターゲットＤＮＡの長さと同じであった。即ち、上記実施形態２及び実施形態３と同様な結果が得られた。この理由としては、上記実施形態３の場合と同様に、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程中に、ＧＴＰが生化学的に分解され、ＲｅｃＡタンパク質がひげ状に遊離した一本鎖ＤＮＡから外れて、一本鎖ＤＮＡがヌクレアーゼにより分解されてなくなったものと考えられる。
【００７９】
以上で説明したように、本実施形態においても、ＤＮＡ複合体を可視化して確認できるので、ＤＮＡ複合体の構造や形態なども調べることができるなど、上記実施形態１〜３と同様な効果を得ることができる。また、本実施形態では、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成工程において、ＡＴＰ−γＳの代わりにＧＴＰを用いているため、ひげ状に遊離したＤＮＡ鎖のないＤＮＡ複合体をＡＦＭにより観察できる。
【００８０】
以上において、本発明を実施形態に即して説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡが結合したＤＮＡ複合体を可視化して検出できる。
【００８２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施形態１に関し、ＤＮＡ複合体の形成について示す説明図である。
【図２】実施形態１に関し、ゲル濾過したターゲットＤＮＡを電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】実施形態１に関し、第２〜第５プローブＤＮＡを調製するためのＰＣＲ産物をそれぞれ電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】実施形態１に関し、ターゲットＤＮＡと第３プローブＤＮＡを原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図５】実施形態１に関し、図４の写真を模式的に示した説明図である。
【図６】実施形態１に関し、様々な反応条件でＤＮＡ複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】実施形態１に関し、様々なプローブＤＮＡでＤＮＡ複合体を形成したものについて電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】実施形態１に関し、精製した様々なＤＮＡ複合体を電気泳動した結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】実施形態１に関し、第１プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１０】実施形態１に関し、図９の写真を模式的に示した説明図である。
【図１１】実施形態１に関し、第２プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１２】実施形態１に関し、図１１の写真を模式的に示した説明図である。
【図１３】実施形態１に関し、第３プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１４】実施形態１に関し、図１３の写真を模式的に示した説明図である。
【図１５】実施形態１に関し、第４プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１６】実施形態１に関し、図１５の写真を模式的に示した説明図である。
【図１７】実施形態１に関し、第５プローブＤＮＡを用いて形成されたＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１８】実施形態１に関し、図１７の写真を模式的に示した説明図である。
【図１９】実施形態２に関し、ＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２０】実施形態２に関し、図１９の写真を模式的に示した説明図である。
【図２１】実施形態３に関し、ＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２２】実施形態３に関し、図２１の写真を模式的に示した説明図である。
【図２３】実施形態４に関し、ＤＮＡ複合体を原子間力顕微鏡で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図２４】実施形態３に関し、図２３の写真を模式的に示した説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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