(57)【要約】【課題】本発明は、肺癌の発症リスクを予測するためのデータを収集する方法を提供する。【解決手段】本発明は、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法であって、（ａ）ヘムオキシゲナーゼ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列を含有する試料からＤＮＡを調製する工程と、（ｂ）前記試料中の前記ＧＴ反復配列の反復回数を決定する工程とを具備する方法を提供する。また、上記方法を使用して、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットを提供する。【選択図】    図１
2005000093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法であって、
（ａ）ヘムオキシゲナーゼ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列を含有する試料からＤＮＡを調製する工程と、
（ｂ）前記試料中の前記ＧＴ反復配列の反復回数を決定する工程と、
を具備する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記試料が、前記被験者から採取された血液である方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）におけるＧＴ反復配列の反復回数の決定が、ＰＣＲ増幅した前記ＧＴ反復配列を電気泳動にかけることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項４】
被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットであって、配列番号１に記載の配列を増幅することが可能なプライマーを含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットであって、ＣＡの繰り返し単位を有するプローブを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肺癌の発症リスクを予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肺癌は、我が国のみならず世界的にも罹患率／死亡率が増加しており、その予防法、発症因子を含めた癌化機序の解明、診断法、および治療法の開発は、緊急を要している。喫煙は、肺癌の主要な危険因子である。喫煙中には、種々の活性酸素および芳香族炭化水素およびニトロサミンなどの発癌物質を含有する。これらの成分は、気道上皮細胞のＤＮＡ損傷と癌化に関連するといわれている。他方、喫煙者の中の一部分にしかこれらの疾患が発症しないため、内因性の発症要因の関与が指摘されている。
【０００３】
従来明らかにされているｐ５３などの癌抑制遺伝子のほとんどは、癌化した細胞の増殖を抑制する。さらに、癌化した細胞を死滅させる働きをもつ。この癌抑制遺伝子が欠損している場合に、肺癌になると理解されている。これに対して、生体には、喫煙中の活性酸素および発ガン物質を不活性化する酵素として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの抗酸化酵素の存在が知られている。抗酸化作用をもつ酵素には多型性があり、酵素活性と喫煙関連疾患である慢性肺気腫との関係が明らかにされ始めている。
【０００４】
たとえば、本発明者は、ヘムを分解してビリベルジンと一酸化炭素と鉄を合成するヘムオキシゲナーゼ−１がオキシダントによる肺細胞傷害を抑制する報告をしてきた。さらに、ＧＴ反復配列の長い遺伝子多型性がヘムオキシゲナーゼ−１を発現しにくく、喫煙者に発症する慢性肺気腫発症に関係することを明らかにした（特許文献１、非特許文献１）。
【０００５】
一方、喫煙は、気管支および肺胞上皮細胞のＤＮＡを損傷し、癌化に関与すると考えられている。喫煙によるＤＮＡ損傷を抑制する抗酸化酵素については、酵素活性の低下と肺癌との関係が検討されている。喫煙によるＤＮＡ損傷を抑制する抗酸化酵素についても、酵素活性の低下と肺癌との関係が検討されているが、これまで抗酸化酵素の活性と肺癌発症との関係を証明した研究は存在しない。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００１−１４９０８７号公報
【０００７】
【非特許文献１】
Ｈｉｒａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．、“Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ”、（ＵＫ）、２０００年、１６巻、ｐ．５２６ｓ
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、肺癌の発症リスクを予測するためのデータを収集する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗酸化作用をもつヘムオキシゲナーゼ−１の発現を抑制するＧＴ反復配列遺伝子多型性と肺癌との関連を明らかにしたことにより、完成に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集する方法であって、
（ａ）ヘムオキシゲナーゼ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列を含有する試料からＤＮＡを調製する工程と、
（ｂ）試料中の前記ＧＴ反復配列の反復回数を決定する工程と、
を具備する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、上記方法であって、試料が前記被験者から採取された血液である方法を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、上記方法であって、上記工程（ｂ）におけるＧＴ反復配列の反復回数の決定がＰＣＲ増幅した前記ＧＴ反復配列を電気泳動にかけることによって行われることを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットであって、配列番号１に記載の配列を増幅することが可能なプライマーを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットであって、ＣＡの繰り返し単位を有するプローブを含むことを特徴とするキットを提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ヘム代謝の初発反応を触媒するヘムオキシゲナーゼ−１（以下ＨＯ−１と略記する）の遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列の多型が、肺癌の発症に関与していることを明らかにした本発明者らの疫学的研究に基づいてなされたものである。
【００１６】
より具体的には、本発明の方法は、ＨＯ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列の反復回数を測定することにより、被験者が肺癌を発症するリスクを予測する。
【００１７】
ここで、「ＧＴ反復配列」とは、グアニン（Ｇ）とチミン（Ｔ）からなる反復単位が繰り返し存在する反復配列をいい、「反復回数」とは、ＧＴ反復配列中に存在する反復単位ＧＴの個数をいう。
【００１８】
本発明の方法は、ＨＯ−１遺伝子の上流域に位置するＧＴ反復配列を含む試料を使用する。このような試料は、本発明の方法を適用すべき被験者から採取された任意の生体成分、例えば血液である。
【００１９】
なお、本発明に使用する「試料」としては、医師等によってあらかじめ採取または調製された試料をすればよい。
【００２０】
本発明の方法を適用すべき「被験者」は、ヒトを含む哺乳動物であることが好ましいが、ＧＴ配列の多型は哺乳類以外の多くの種について知られているので、ＨＯ−１を備えている動物種は全て「被験者」に含まれる。
【００２１】
本発明の方法は、まず、上記試料から核酸試料を調製する。生体成分から核酸を抽出する方法は、当業者に周知であり、いずれの方法を使用してもよいが、たとえばフェノール抽出、エタノール沈殿等によって行うことができる。
【００２２】
核酸試料を準備した後には、ＨＯ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列の反復回数を決定するする工程を実施する。ＨＯ−１遺伝子の上流の配列（配列番号１）及び任意の反復配列の反復回数を測定する方法は周知であるから、当業者であれば、ＧＴ反復配列の反復回数は容易に測定できる。
【００２３】
たとえば、反復配列の反復回数を測定する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を利用することができる。ＰＣＲを用いてＧＴ反復配列の反復回数を測定するには、ＧＴ反復配列の上流及び下流に存在するユニークな配列からなるプライマー対を用いてＧＴ反復配列を増幅した後、ＰＣＲ生成物を電気泳動にかけて移動度を測定すればよい。
【００２４】
あるいは、測定する試料の数が多い場合には、ＤＮＡチップによってＧＴ反復配列の反復回数を決定してもよい。ＤＮＡチップを用いる場合には、たとえばＣＡの繰り返し単位を有するプローブが固相化されたチップにＧＴ反復配列を含有する試料を注入した後、反復回数の差に応じた解離条件（解離温度等）の差を測定して、ＧＴ反復配列の反復回数を決定することができる。たとえば、３３回以上の繰り返しを有するＤＮＡはハイブリダイズするが、３３回以下の繰り返しを有するＤＮＡはハイブリダイズしない条件下で、ＤＮＡ試料がプローブにハイブリダイズするか否かを測定して反復回数を決定することができる。
【００２５】
さらに、必要であれば、ＧＴ反復配列の塩基配列を決定することにより、反復回数を決定してもよい。
【００２６】
下記の実施例において詳述されているように、ＨＯ−１遺伝子上流のＧＴ反復配列の反復回数が３３回以上である対立遺伝子を有する被験者は、肺癌に罹患するリスクが高い。従って、ＧＴ反復配列の反復回数を測定することによって、被験者の肺癌の発症リスクを予測することが可能になる。より詳細には、反復回数３３回以上の対立遺伝子の存在と喫煙被験者における肺癌の発症との関連を調べた疫学調査では、オッズ比は２．２であった（反復回数３３回以上の対立遺伝子を有する喫煙者が肺癌に罹患するリスクは、そうでない喫煙者の約２．２倍である）。
【００２７】
本発明の方法はデータを収集する方法であるから、該方法を実施する者は、医療機関に限定されない。
【００２８】
加えて、本発明は、上記方法を使用して、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを収集するためのキットを提供する。該キットには、配列番号１に記載の配列を増幅することが可能なプライマーを含むことを特徴とする。たとえば、キットに含まれるプライマーは、５’−ａｇａｇｃｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｔｃａｇａ−３’（配列番号２）および５’−ａｃａａａｇｔｃｔｇｇｃｃａｔａｇｇａｃ−３’（配列番号３）のプライマーであってもよい。また、該キットは、プライマーの他にＰＣＲ反応を行うために必要な酵素、バッファーなどを含んでいてもよく、試料からＤＮＡを調製するための試薬などを含んでいてもよい。この場合、該プライマーを使用してＰＣＲ反応を行うことにより、反復回数を決定することができる。また、該プライマーを使用してＧＴ反復配列の塩基配列を決定することにより、反復回数を決定することもできる。
【００２９】
さらに、本発明のキットは、プライマーではなく、ＣＡの繰り返し単位を有するプローブが含まれていてもよい。特に、該プローブは、該プローブがチップに固相化された状態のＤＮＡチップを含む。また、該キットは、プローブの他にハイブリダイゼーション反応のためのバッファー等を含んでいてもよい。本発明のキットに含まれるプローブを使用して上記方法を実施することにより、反復回数を決定することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００３１】
【実施例】
肺癌患者１５１名、同様の喫煙歴・非喫煙者割合をもつ非癌対象者１５３名から、末梢血を採取してＤＮＡを抽出する。これを鋳型としてＰＣＲを行った。
【００３２】
ＨＯ−１遺伝子の上流に位置するＧＴ反復配列（配列番号１の２８５〜３４４）を増幅するためのプライマーとして、プライマーｐ１−ｓ（配列番号１の２４９〜２６８）（配列番号２）とｐ１−ａｓ（配列番号１の３５６〜３７５の相補配列）（配列番号３）を作成した（図１）。
【００３３】
次いで、常法に従って抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲによる増幅を行った。プライマーとして蛍光ラベルしたｐ１−ｓとラベルしていないｐ１−ａｓを使用し、増幅産物のサイズをレーザーベース自動化ＤＮＡシーケンサー（ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）で解析して、ＧＴ反復配列中の反復回数を決定した。
【００３４】
ＧＴ反復配列の反復数は、２３、３０、３３の３箇所にピークを有していた。測定した患者および対照者を、ＧＴ反復配列数にしたがって、＜２７、２７≦および＜３３、３３≦の３群（Ｓ、Ｍ、Ｌ）に分類した。さらに、遺伝子群を２群（群Ｉ（Ｌ／Ｌ、Ｌ／Ｍ、Ｌ／Ｓ）および群ＩＩ（Ｍ／Ｍ、Ｍ／Ｓ、Ｓ／Ｓ）に分類すると、Ｌ群のＧＴ配列数およびＩ群の遺伝子多型の割合が肺腺癌患者において顕著に上昇していた（表１）。
【００３５】
【表１】
2005000093.tif 000003
【００３６】
次に、ＧＴ反復配列回数にしたがって、喫煙者・非喫煙者双方を含む被験者全体をクラスＬ（３３回以上）、クラスＭ（２７回以上、３３回未満）、クラスｓ（２７回未満）に分類すると、ＧＴ反復配列回数の多いクラスＬの人数は、肺腺癌患者（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ）において明らかに増加していた。また、遺伝子型により被験者をグループＩ（Ｌ／Ｌ、Ｌ／Ｍ、Ｌ／Ｓ）とグループＩＩ（Ｍ／Ｍ、Ｍ／Ｓ、Ｓ／Ｓ）に分類すると、ＧＴ反復配列回数の多いクラスＬを有するグループＩの人数は、肺腺癌で明らかに増加していた（表１）。
【００３７】
ＧＴ反復配列回数にしたがって、喫煙被験者をクラスＬ（３３回以上）、クラスＭ（２７回以上、３３回未満）、クラスｓ（２７回未満）に分類すると、ＧＴ反復配列回数の多いクラスＬの人数は、肺腺癌患者（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ）において明らかに増加していた。また、遺伝子型により被験者をグループＩ（Ｌ／Ｌ、Ｌ／Ｍ、Ｌ／Ｓ）とグループＩＩ（Ｍ／Ｍ、Ｍ／Ｓ、Ｓ／Ｓ）に分類するとＧＴ反復配列回数の多いクラスＬを有するグループＩの人数は、肺腺癌で明らかに増加していた（表２）。
【００３８】
【表２】
2005000093.tif 000004
【００３９】
ＧＴ反復配列回数にしたがって、非喫煙被験者をクラスＬ（３３回以上）、クラスＭ（２７回以上、３３回未満）、クラスｓ（２７回未満）に分類すると、ＧＴ反復配列回数の多いクラスＬの人数は、肺腺癌患者（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ）と対照者（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｕｂｊｅｃｔ）の間に違いはなかった。また、遺伝子型により被験者をグループＩ（Ｌ／Ｌ、Ｌ／Ｍ、Ｌ／Ｓ）とグループＩＩ（Ｍ／Ｍ、Ｍ／Ｓ、Ｓ／Ｓ）に分類するとＧＴ反復配列回数の多いクラスＬを有するグループＩの人数は、肺腺癌と対照者の間で違いはなかった（表３）。
【００４０】
【表３】
2005000093.tif 000005
【００４１】
上記結果から、ヘムオキシゲナーゼ−１遺伝子におけるＧＴ反復配列数の長い遺伝子多型性が喫煙者における肺腺癌発症と関係していた（表２）。また、非喫煙者において、肺腺癌患者と非肺腺癌対照者では、Ｌ群／Ｉ群の割合に違いは認められなかった（表３）。この結果から、ヘムオキシゲナーゼ−１遺伝子のＧＴ反復配列数の長い遺伝子多型性が喫煙者における肺腺癌発症と関係することが明らかになった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の方法を使用することにより、被験者が肺癌を発症するリスクを予測するためのデータを得ることができる。したがって、この解析結果は、肺癌予防のための禁煙の判断根拠として利用することができる。
【００４３】
【配列表】
2005000093.tif 000006
2005000093.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ解析に使用したプライマーおよび増幅される配列を示す図。
【図１】
2005000093.tif 000008