(57)【要約】【課題】  真に目的とする幹細胞／前駆細胞が得られ、他の細胞の混入がないかあるいは最小限であり、幹細胞／前駆細胞に高い増殖能を付与するような幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法、そのための培地組成物、ならびにそのためのキットを開発する。【解決手段】  細胞の培養・増殖時に細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加することを特徴とする幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する培地組成物、ならびにかかる培地組成物を必須として含む幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した培地を用いることを特徴とする幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法。
【請求項２】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する無血清培地を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、ｄｂ−ｃＡＭＰおよびＳｐ−ｃＡＭＰからなる群より選択される１種またはそれ以上のものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰである請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞が内胚葉由来の臓器に由来するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
細胞が膵管上皮由来細胞である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する、幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するための培地組成物。
【請求項８】
無血清培地組成物である請求項７記載の組成物。
【請求項９】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、ｄｂ−ｃＡＭＰおよびＳｐ−ｃＡＭＰからなる群より選択されるものである請求項７または８記載の組成物。
【請求項１０】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰである請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項記載の組成物を必須として含む、幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞／前駆細胞の新規取得方法、新規維持方法、ならびに幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するための新規培地組成物、および該培地組成物を必須として含む幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は未分化の状態で増殖能を有している細胞であり、様々な臓器や組織を形成する細胞に分化する能力があるので、再生医療の主役ともいえる存在である。それゆえ、幹細胞の増殖・分化方法とともに、その取得方法に関しても活発に研究が行われており、種々の方法が開発されている。幹細胞は未分化の状態で増殖能を維持した細胞であり、初期胚由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児由来の胎性生殖細胞（ＥＧ細胞）、成体由来の幹細胞などがある。
【０００３】
現在のところ、臓器不全に対する典型的治療法である移植手術に関しては、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓等のドナーが不足しており、ドナーが現れたとしても移植手術には手間がかかるといった問題がある。そこで、注目されるのが再生医療であるが、これを推進するには臓器、例えば膵臓や肝臓などに由来する細胞から多数の幹細胞／前駆細胞を迅速かつ簡便に取得することが早急の課題となっている。また、得られた幹細胞／前駆細胞を増殖可能な状態に長期間維持しておくことも必要である。
【０００４】
種々の細胞から幹細胞／前駆細胞を単離・取得あるいは維持する方法が発表されている。これらの細胞のなかでも、膵内分泌細胞は多くの点で神経細胞に類似しており、その由来や発生過程は発生生物学の主たる対象となっていたので、多数の情報の蓄積があり、膵内分泌細胞からの幹細胞／前駆細胞の取得に関して多数の例がある。しかしながら、膵内分泌細胞からのインビトロにおける幹細胞／前駆細胞の取得および維持については、以下に示すように問題点が多い。
【０００５】
Ramiya VK.らは、成体ＮＯＤマウスから膵管細胞を単離した（非特許文献１参照）。彼らの実験によると、膵臓をハサミで十分に切り刻んだ後、コラゲナーゼ溶液で処理する。顕微鏡下で膵管を含む組織をハンドピックアップし、これをＥＨＡＡ培養液にて培養を開始している。この培養液には、０．５％ ＮＯＤマウス由来の血清が添加されており、増殖因子の添加などはなされていない。つまり、血清内に含まれる増殖因子を含めた様々な因子が増殖を刺激している。したがって、膵管細胞とされる細胞はすべて紡錘状の形態を示し、多数の線維芽細胞が混入しているものと考えられる。
【０００６】
Wang X.らは、成体マウスからの膵管細胞の単離を行っている（非特許文献２参照）。彼らの実験によると、まず膵臓をハサミで細かく切断して、次にコラゲナーゼ溶液で消化する。さらに、これを径８５μｍのナイロンメッシュに通して、メッシュを通過した細かい組織から培養を開始した。彼らの培養条件は、増殖のためにインスリンと増殖因子ＥＧＦ、５％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍが添加されている。さらに、あくまで線維芽細胞の増殖を抑えるためにコレラトキシンが添加されているが、増殖因子やＮｕ−ｓｅｒｕｍが添加されているためその増殖が完全に抑えられているとはいえない。得られた細胞をインビボに戻すことで肝細胞になると報告しているが、その確証は得られていない。
【０００７】
Bonner-Weir S.らはヒト（成人）からの膵管細胞の単離を行っている（非特許文献３参照）。彼らの実験によると、コラゲナーゼ（リベラーゼ）溶液を膵管内に注入して、膵臓を膨化させて消化し、フィルターにかける。この時のフィルターは、消化しきれていない腺房細胞や血管などの大きな組織を除去するためのものである。フィルターを通過した細胞群をＦｉｃｏｌｌ液にて比重分離して、膵島を単離するのであるが、この時に生じる別の層に存在する細胞群から、膵管細胞単離を行っている。ＫＧＦの添加により、無血清培地でも増殖は可能であるが、線維芽細胞や膵島細胞などの混入の可能性が十分にある。
【０００８】
Heremans Y.らは、ヒト（成人）からの膵管細胞の単離を行っている（非特許文献４参照）。彼らの実験によると、Bonner-Weir S.らと同様に、コラゲナーゼ消化の後、Ｆｉｃｏｌｌ液にて比重分離して、膵管細胞の多い層から組織を採取して培養を開始する。最初４日間は、無血清培地であるが、５日目以降は５％ ＦＢＳが添加されている。よって、彼らは、この細胞にアデノウイルスにより転写因子Ｎｇｎ３を導入してインスリン陽性細胞を作成しているが、膵管細胞以外の細胞もかなりの割合で混入しており、しかも真に膵管細胞が分化転換したという確証は得られていない。
【０００９】
Gmyr V.らも、ほぼ同様の方法で、ヒト（成人）からの膵管細胞の単離を行っているが（非特許文献５参照）、ここでは最初から１０％ ＦＢＳが含まれている。線維芽細胞の増殖を抑えるために、Geneticin（Ｇ４１８）が使用されているが、ＲＴ−ＰＣＲの結果からも、膵内分泌細胞がかなり混入している。得られた細胞は培養後７〜９日目において一時的に増殖はしているが、１４〜１５日目には死滅しているようである。
【００１０】
しかしながら、上述のごとく、これらの方法は満足な幹細胞／前駆細胞の取得方法あるいは維持方法とはいえなかった。これらの方法を含めて、従来の幹細胞／前駆細胞の取得あるいは維持方法においては、他の細胞が混入して真に必要とする幹細胞／前駆細胞が得られない、あるいは得られた幹細胞／前駆細胞の増殖能が低く、分化が自然に進んでしまう、早くに死滅してしまう、手順・操作が複雑である等の問題があった。
【非特許文献１】Ramiya VK. et al., Nature Med. 6: 278-282. 2000
【非特許文献２】Wang X. et al., Am. J. Pathol. 158: 571-579. 2001
【非特許文献３】Bonner-Weir S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 7999-8004. 2000
【非特許文献４】Heremans Y. et al., J. Cell Biol. 159: 303-311. 2002
【非特許文献５】Gmyr V. et al., Diabetes 49: 1671-1680. 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の事情に鑑みると、効率的で簡便な幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法の確立が望まれている。すなわち、真に目的とする幹細胞／前駆細胞が多数得られ、他の細胞の混入がないかあるいは極力抑制され、幹細胞／前駆細胞をよく増殖させ、長期間維持できるような幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法、そのための培地、ならびにそのためのキットを開発することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、これらの課題を解決せんと鋭意研究を重ねた結果、幹細胞／前駆細胞を得る際および／または維持する際の培地に、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加すると上記問題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は：
（１）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した培地を用いることを特徴とする幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法；
（２）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する無血清培地を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（３）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、ｄｂ−ｃＡＭＰおよびＳｐ−ｃＡＭＰからなる群より選択される１種またはそれ以上のものである（１）または（２）記載の方法；
（４）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰである（３）記載の方法；
（５）細胞が内胚葉由来の臓器に由来するものである（１）〜（４）のいずれかに記載の方法；
（６）細胞が膵管上皮由来細胞である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する、幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するための培地組成物；
（８）無血清培地組成物である（７）記載の組成物；
（９）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、ｄｂ−ｃＡＭＰおよびＳｐ−ｃＡＭＰからなる群より選択されるものである（７）または（８）記載の組成物；
（１０）細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子がコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰである（９）記載の組成物；
（１１）（７）〜（１０）のいずれかに記載の組成物を必須として含む、幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するためのキット
に関するものである。
【発明の効果】
【００１４】
真に目的とする幹細胞／前駆細胞が多数得られ、他の細胞の混入がないかあるいは極力抑制され、幹細胞／前駆細胞をよく増殖させ、長期間維持できるような、簡便な幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法、そのための培地組成物、ならびにそのためのキットが提供される。本発明によれば、多数の幹細胞／前駆細胞が高純度で得られ、維持されるので、その後の分化誘導・分化転換が容易である。また、再生医療への利用も容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上述のごとく、本発明は、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した培地を用いることを特徴とする幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法に関するものである。細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加するだけで、正の細胞の増殖シグナルが生じ、幹細胞／前駆細胞の増殖が促進される。本明細書において、「幹細胞／前駆細胞」とは、幹細胞および／または分化・転換して目的細胞となるべき細胞をいう。幹細胞／前駆細胞の「維持」とは、増殖能を保持したまま培養すること、典型的には継代培養を意味する。
【００１６】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子はいずれのものであってもよく、コレラトキシン、フォルスコリン、ｃＡＭＰアナログもしくは誘導体、例えばｄｂ−ｃＡＭＰ、Ｓｐ−ｃＡＭＰ、８−ブロモ−ｃＡＭＰなどが好ましい例として挙げられ、このうちコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰが特に好ましい。これらの因子を単独で培地に添加してもよく、２種以上培地に添加してもよい。
【００１７】
本発明の方法に使用する培地は特に限定されず、動物細胞、特に哺乳動物細胞培養用の培地であればよい。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、Ham's F-12等の培地がよく知られている。また、血清含有培地、無血清培地いずれの培地であってもよいが、無血清培地を用いることが好ましい。細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子の存在下においては、無血清培地中であっても幹細胞／前駆細胞の増殖が促進され、その数を増加させることができる。本発明の幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法においては、特に増殖因子を添加する必要もない。無血清培地を用いた場合、目的とする幹細胞／前駆細胞以外の他の細胞、例えば線維芽細胞、血管内皮細胞などの増殖が抑制されて、目的とする幹細胞／前駆細胞が高純度で得られ、維持される。さらに、無血清培地を用いると、血清由来の因子が存在しないので、得られた幹細胞／前駆細胞を未分化の状態で培養・増殖あるいは維持することができる。すなわち、本発明の方法によれば、目的とする幹細胞／前駆細胞が高純度で多数得られ、しかも増殖能を低下させずに維持されるのである。このように、本発明により所望の幹細胞／前駆細胞を高純度で多数取得し、維持することができるので、これらを動物の医療、とりわけ再生医療に使用することができる。
【００１８】
幹細胞／前駆細胞を取得すべき細胞の起源は、哺乳動物細胞であればいずれの細胞であってもよい。本発明の方法に使用する好ましい哺乳動物細胞としてはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、サル、ヒトなどの細胞が挙げられる。また、幹細胞／前駆細胞を取得すべき細胞が由来する臓器や組織の種類および部位についても特に制限はなく、初期胚由来、胎児由来あるいは成体由来のものが使用できる。なかでも、内胚葉由来の臓器から得られる細胞、例えば、肝臓あるいは膵臓の系統の細胞が好ましく、膵管上皮由来細胞が特に好ましい。動物臓器や組織などからの細胞の取得方法には特に制限はなく、当業者に公知の一般的な方法を適用できる。また、本発明の方法における培養条件も、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加する以外は、通常の幹細胞／前駆細胞の取得および／維持のための条件を採用することができる。これらの条件は当業者に公知であり、適宜選択されうる。
【００１９】
上述のごとく、本発明の幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法においては、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地を用いることが好ましいが、培養および／または維持すべき幹細胞／前駆細胞の種類やその使用目的等に応じて、幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持工程の全体または一部において細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地を用いればよい。すなわち、必ずしも幹細胞／前駆細胞の取得または維持の全工程において細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地を用いなければならないというのではない。例えば、１の態様において、動物組織から得た細胞を、当初から細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地で培養し、得られた幹細胞／前駆細胞を、引き続き細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地で維持してもよい。別の態様において、培養初期において細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加したあるいは添加しない血清含有培地で培養して、一定数の細胞を得た後、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地に交換して培養し、次いで、得られた幹細胞／前駆細胞を、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加した無血清培地あるいは血清含有培地で維持してもよい。
【００２０】
細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子の添加量もまた、細胞の種類や培養条件等により適宜選択できる。例えば、コレラトキシンの添加量は、細胞の種類や培地の種類等の培養条件にもよるが、一般的には１０ないし５００ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの範囲であろう。また、８−ブロモ−ｃＡＭＰの添加量も細胞の種類や培地の種類等の培養条件に左右されるが、一般的には０．５ｍＭないし５０ｍＭ、例えば１ｍＭないし２５ｍＭの範囲であろう。
【００２１】
さらに本発明は、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を含有する、幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持用培地組成物に関する。本発明の培地組成物に含有される細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子はいずれのものであってもよい。かかる因子としては、コレラトキシン、フォルスコリン、ｃＡＭＰアナログもしくは誘導体、例えばｄｂ−ｃＡＭＰ、Ｓｐ−ｃＡＭＰ、８−ブロモ−ｃＡＭＰなどが好ましい例として挙げられ、このうちコレラトキシンまたは８−ブロモ−ｃＡＭＰが好ましい。本発明の培地組成物は血清含有培地組成物であってもよく、無血清培地組成物であってもよいが、上述の理由により無血清培地組成物であることが好ましい。公知の一般的な培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地、Ham's F-12培地などに細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子を添加したものであってもよい。使用目的に応じて他の成分を本発明の培地組成物に添加してもよい。本発明の培地組成物に含有される細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化させる因子の量は、目的に応じて適宜増減できる。例えば、コレラトキシンの添加量は、細胞の種類や培地の種類等の培養条件にもよるが、一般的には、これらの組成物を用いて最終的に得られる培地中１０ないし５００ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ないし２５０ｎｇ／ｍｌの範囲であろう。また、８−ブロモ−ｃＡＭＰの添加量も細胞の種類や培地の種類等の培養条件に左右されるが、一般的には、最終的に得られる培地中０．５ｍＭないし５０ｍＭ、例えば１ｍＭないし２５ｍＭの範囲であろう。本発明の培地組成物の形態はいずれの形態であってもよく、そのまま使用できる液体培地の形態であってもよいが、一般的には濃縮物（例えば、ペースト状など）の形態または粉末もしくは顆粒の形態であってもよい。ペースト状あるいは粉末状の本発明の培地組成物を使用前に精製水で所定濃度に希釈して使用してもよい。
【００２２】
さらに本発明は、上記の培地組成物を必須として含む、幹細胞／前駆細胞を取得および／または維持するためのキットにも関する。該キットは上記培地組成物のほかに、細胞取得器具、細胞の培養に使用される培養容器、例えば培養皿、および／または培地調製のための器具、例えば滅菌用フィルターなどを適宜含んでいてもよい。通常には、キットの取扱説明書を添付する。
【００２３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでの本発明を説明するための例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２４】
膵島単離の際に従来から行われているコラゲナーゼ法と同様に、総胆管と十二指腸接合部である乳頭部を結紮したあと、マウス総胆管に２９Ｇ針をカニュレーションして、約１ｍｌのType XIコラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）０．７ｍｇ／ｍｌ ＨＢＳＳ；Invitrogen）溶液を注入した。これにより、膵臓全体が膨張し、これをハサミでよく切り刻み、３７℃ウォーターバスにて消化した。この時、膵島単離の時よりも十分に消化されるように、やや長い時間（約１５〜２０分間）インキュベートした。これをＨＢＳＳで数回洗浄した後、フィルター（孔サイズ８５０μｍ）にかけて、フィルター上に残った組織をすべて回収して、培養を開始した。
【００２５】
開始時の培養液は、ＣＭＲＬ−１０６６（Sigma-Aldrich）で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、antibiotics-antimycotic（Invitrogen）、１００ｎｇ／ｍｌコレラトキシン（ＣＴｘ；Sigma-Aldrich）をそれぞれ添加したものであった。培養３日目頃より細胞がディッシュ底面に単層状で島状に接着した。培養５日目に無血清培地に交換した。
【００２６】
無血清培地はダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma-Aldrich）とＨａｍ’ｓ Ｆ−１２（Invitrogen）の１：１ミックス（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に交換した。無血清で、１００ｎｇ／ｍｌ ＣＴｘ、ＩＴＳ（５μｇ／ｍｌインスリン（Sigma-Aldrich）、５μｇ／ｍｌトランスフェリン（Sigma-Aldrich）、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich））、０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma-Aldrich）、２５ｎｇ／ｍｌケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ；Sigma-Aldrich）、およびantibiotics-antimycoticを添加したものであった。上記無血清培地にて継代培養することにより、コンタミネーションしていた線維芽細胞、膵島細胞、腺房細胞などが死滅し、膵管細胞だけが純化され、約１ヶ月で膵管細胞のコロニーが敷石状に増殖してきた。この段階以後は、ＩＴＳ、ＫＧＦなしに細胞は増殖可能であり、限界希釈法によりシングルセルクローニングも可能で、この条件での細胞の増殖能は維持されていた。この培地での膵管細胞の増殖の様子を図１に示す。図１の左パネルはこの培地での膵管細胞増殖の経時変化の写真である。経時的に細胞コロニーが順調に成長したことがわかる。図１の右パネルは、上記無血清培地においてＣＴｘが存在する場合と存在しない場合とにおける細胞増殖の比較を示す。ＣＴｘ１００ｎｇ／ｍｌ添加系では、培養７日目に細胞数は約２１０個／コロニーにまで増殖したのに対し、ＣＴｘ無添加系では培養７日目で約１５個未満／コロニーとなっていた。このように、ＣＴｘの添加により細胞増殖が著しく促進され、無血清培地中でも十分な増殖能を発揮したことがわかる。また、ＣＴｘの代わりに、上記無血清培地に８−ブロモ−ｃＡＭＰ（１ｍＭ）を添加した場合にも、同様の細胞増殖効果を得られることを確認した（７日培養で約２６０個／コロニー）。このように、膵管細胞の培養・増殖あるいは維持にコレラトキシンの添加、つまり、細胞内ｃＡＭＰシグナルを活性化する物質の添加が重要であることが初めて示された。
【００２７】
上記実験で得られた膵管細胞をさらに上記無血清培地（ＣＴｘ １００ｎｇ／ｍｌ添加）で約２ヶ月間培養し、ＲＴ−ＰＣＲにより各種遺伝子の発現を調べた（図２）。膵管細胞に特異的なマーカーであるＣＫ１９、ＣＡＩＩが強発現していたが、膵外分泌系、およびインスリンを含めた膵内分泌系のマーカーはいずれも検出されなかった。一方、膵発生のマスター遺伝子と考えられるＰｄｘ−１をはじめＩｓｌ−１はともに低レベルながら発現が認められ、それに対し、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ４、ｐ４８はほとんど発現していなかった。さらに、ＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔは強く発現していた。これらの結果から、得られた膵管細胞は未分化な性質を有していると考えられ、幹細胞／前駆細胞であることが示された。上記無血清培地で約１年以上の長期培養を行ったが、膵臓関連転写因子の発現パターンに変化はなく、図２とほぼ同じであった。したがって、本発明の幹細胞／前駆細胞の維持方法を用いれば無血清培地においては約１年という長期わたり幹細胞／前駆細胞を維持できることが示された。
【００２８】
さらに、上記実験で得られた膵管細胞を、１０％ ＦＣＳおよびＣＴｘ １００ｎｇ／ｍｌを添加した培地で約１０ヶ月培養し、その遺伝子発現パターンを調べた（図示せず）。ＣＫ１９、ＣＡＩＩの発現レベルは図２に示した場合とほとんど変わらず、外分泌系、膵内分泌系、いずれのマーカーも同様に検出されなかったが、それ以外の遺伝子発現パターンには大きな変化が見られ、肝臓のマーカー遺伝子の発現も認められた。これらの結果から、ＦＣＳ存在下で維持したため分化が進んだことが示された。この実験によっても本発明の方法による幹細胞／前駆細胞の長期維持可能性が示されたが、細胞を未分化状態に保つという点からは無血清培地中での維持が好ましいことがわかった。
【００２９】
このように、本発明の方法によれば、簡単に、多数の幹細胞／前駆細胞を高純度で得ることができ、その増殖能も高められ、長期にわたって維持できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、真に目的とする幹細胞／前駆細胞が多数得られ、他の細胞の混入がないかあるいは極力抑制され、幹細胞／前駆細胞をよく増殖させ、長期間維持できるような幹細胞／前駆細胞の取得および／または維持方法、そのための培地、ならびにそのためのキットに関するものであり、すなわち、本発明により多数の幹細胞／前駆細胞が得られ、維持されるので、本発明は医薬分野および／または再生医療分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、無血清培地における膵管細胞の増殖に対するコレラトキシンの影響を示す図である。左パネルはＣＴｘ含有無血清培地（ＤＭＥＤ／Ｆ１２）での膵管細胞増殖の経時変化の写真である。右パネルは無血清培養においてＣＴｘが存在する場合（１００ｎｇ／ｍｌ）と存在しない場合（−）とにおける細胞増殖の比較を示すグラフである（ｎ＝２０）。
【図２】図２は、本発明の方法により得られた膵管細胞の各種遺伝子の発現パターンを示す図である。ＦＣＳ−はウシ胎仔血清不含培地での培養であることを示す。
【図１】
2005261344.tif 000002
【図２】
2005261344.tif 000003