(57)【要約】  【課題】    迅速で簡便であり少量試料など多くの利点を持つＦＩＡ法と新しく開発した二波長検出システムを組み合わせて、血清中等の銅と鉄の二成分同時定量を可能とし、特に１ｐｐｂ程度の低濃度の銅と鉄を同時に測定する方法を提供する。  【解決手段】    セルの光路長による影響を検討し、２０ｍｍ付近のものが最も大きなS/Nを与えることを見出した。その結果、１ｐｐｂの銅、鉄の検出が可能となった。即ち、銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液の吸収スペクトルを測定することにより銅(II)と鉄(II)を同時に定量する方法であって、銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液を直列に連結された２つのセルに流すこと、及びこれら２つのセルにおいて銅(II)及び鉄(II)を含む化合物の吸収スペクトルを別個に測定することから成り、かつこれらセルの光路長が１５〜３５ｍｍであることを特徴とする銅(II)と鉄(II)の同時定量法である。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液の吸収スペクトルを測定することにより銅(II)と鉄(II)を同時に定量する方法であって、銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液を直列に連結された２つのセルに流すこと、及びそれぞれのセルにおいて銅(II)及び鉄(II)を含む化合物の吸収スペクトルを別個に測定することから成り、かつこれらセルの光路長が１５〜３５ｍｍであることを特徴とする銅(II)と鉄(II)の同時定量法。
【請求項２】
被検溶液のｐＨが４〜６であり、銅(II)の吸収スペクトルを測定するセルにおいて被検溶液が還元剤を含まず、鉄(II)の吸収スペクトルを測定するセルにおいて被検溶液が還元剤を含むよう構成された請求項１に記載の方法。
【請求項３】
銅(II)を含む化合物が銅(II)と5-Br-PSAAとのキレートであって、その吸収の測定波長が543又は580nm付近であり、鉄(II)を含む化合物が鉄(II)と5-Br-PSAAとのキレートであって、その吸収の測定波長が710nm付近である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被検溶液がヒト又はその他の動物の血清である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
キャリアー、キレート試薬、還元剤及び試料の各注入口、直列に連結された２つの光学セル、並びにこれら２つの光学セルにおける可視領域の吸収スペクトルを測定する分光装置から成る銅(II)と鉄(II)の同時定量装置であって、これらがキャリアーの注入口の下流でキャリアーに試料が合流し、更にその下流でキレート試薬が合流し、この合流した被検溶液が第１の光学セルを通過し、第１の光学セルと第２の光学セルの間で被検溶液に還元剤が合流して第２の光学セルを通過するように配置され、分光装置が第１の光学セルにおいて銅(II)を含む化合物の吸収を測定し、第２の光学セルにおいて鉄(II)を含む化合物の吸収を測定するように配置されており、これら２つのセルの光路長が１５〜３５ｍｍであることを特徴とする銅(II)と鉄(II)の同時定量装置。
【請求項６】
キレート試薬が5-Br-PSAAであり、第１の光学セルにおける測定波長が543又は580nm付近であり、第２の光学セルにおける測定波長が710nm付近である請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、低濃度の銅(II)と鉄(II)を同時に定量する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
銅、鉄、亜鉛は人体にとって必須元素で生体内では重要な酵素を形成し、生命の維持に寄与する。従ってこれらの金属は恒常性がある。しかし病態により増減するため、これらの濃度変動の把握は重要である。
現在使用されている分析は数千万円の大型装置によるもので、試薬消費量、分析試料ともに多い。また測定に供される試料の９０％は廃棄され効率が悪い。
本発明者らは先に５０ｍｍの光路長を持つ二波長検出システムを用いる銅と鉄の分析法について論文発表したが（非特許文献１）、光路長が長いためバックグランド吸収の影響が強くS/N比が悪かった。
【０００３】
【非特許文献１】Tadao S. et al., Talanta 52(2000) 153-159
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、迅速で簡便であり少量試料など多くの利点を持つＦＩＡ法と新しく開発した二波長検出システムを組み合わせて、血清中等の銅と鉄の二成分同時定量を可能とし、特に1ppb程度の銅と鉄を同時に測定する方法を提供する。
本発明の装置は安価で小型化が可能であり、1時間で２０〜３０試料を分析することが可能である。また、1回の測定における試料量は１００μｌ程度でよく、例えば、検査する血清量が少なくて済み患者への負担の軽減に繋がる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、セルの光路長による影響を検討し、２０ｍｍ付近のものが最も大きなS/Nを与えることを見出し、その結果、１ｐｐｂ程度の低濃度の銅と鉄の同時検出が可能となった。
高感度化が図られることにより採血量は0.5ｍｌでも測定を可能にし従来法の1/10以下で済む。またICP-AESでは測定が困難である鉄は他の金属イオンからの妨害を受けることなく定量できる大きなメリットがある。
【０００６】
即ち、本発明は、銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液の吸収スペクトルを測定することにより銅(II)と鉄(II)を同時に定量する方法であって、銅(II)及び鉄(II)を含む被検溶液を直列に連結された２つのセルに流すこと、及びそれぞれのセルにおいて銅(II)及び鉄(II)を含む化合物の吸収スペクトルを別個に測定することから成り、かつこれらセルの光路長が１５〜３５ｍｍであることを特徴とする銅(II)と鉄(II)の同時定量法である。
【０００７】
この被検溶液のｐＨが４〜６であり、銅(II)の吸収スペクトルを測定するセルにおいて被検溶液が還元剤を含まず、鉄(II)の吸収スペクトルを測定するセルにおいて被検溶液が還元剤を含むよう構成されことが好ましい。
また、前記銅(II)を含む化合物が銅(II)と5-Br-PSAAとのキレートであって、その吸収の測定波長が543又は580nm付近であり、前記鉄(II)を含む化合物が鉄(II)と5-Br-PSAAとのキレートであって、その吸収の測定波長が710nm付近であることが好ましい。
更に、被検溶液がヒト又はその他の動物の血清であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
この検出システムにより銅と鉄を同時に測定でき、血清成分の他に環境水中、金属試料にも適用が可能である。例えばボイラー水中に含まれる微量の銅と鉄の分析により給水管理ができる。また、それぞれのセルの検出器にはそれぞれ増幅機能があるので、鉄と銅を異なった出力で検出すれば、鉄と銅の濃度が数倍異なっていても測定できる。例えば、肝硬変の患者血清では銅：鉄＝１：１．５の含有比の場合もあるが問題なく測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のフローシステムを図１に示す。このシステムは、キャリアー、キレート試薬、還元剤及び試料の各注入口、直列に連結された２つの光学セル、並びにこれら２つの光学セルにおける可視領域の吸収スペクトルを測定する分光装置から成る。
このシステムは銅(II)と鉄(II)とを含む少量のサンプル一つで測定できるところに特徴がある。これら各部品は、キャリアーの注入口の下流でキャリアーに試料が合流し、更にその下流でキレート試薬が合流し、この合流した被検溶液が第１の光学セルを通過し、第１の光学セルと第２の光学セルの間で被検溶液に還元剤が合流して第２の光学セルを通過するように配置されている。各注入口は適宜他を兼ねるよう改変してもよい。また各成分の合流地点の下流に適宜混合手段を用いてもよい。還元剤を混合した後は反応促進のため60℃程度に加熱してもよい。
また分光装置は２つの光学セルを別々の波長で測定できるようなものであって、第１の光学セルにおいて銅(II)を含む化合物（例えば、銅(II)と5-Br-PSAAとのキレート化合物）の吸収を測定し、第２の光学セルにおいて鉄(II)を含む化合物（例えば、鉄(II)と5-Br-PSAAとのキレート化合物）の吸収を測定する。
このシステムの最大の特徴はこれら２つのセルの光路長が１５〜３５ｍｍ、好ましくは２０±５ｍｍ、最も好ましくは２０ｍｍであることである。光路長が短いと微量な銅(II)と鉄(II)を同時に測定することがより困難になり、長いとＳ／Ｎ比がより高くなり測定が困難になる。
【００１０】
本発明は銅(II)と鉄(II)がそれぞれ特徴のある吸収波長を有する錯体を形成することを利用したものである。そのキレート試薬として5-Br-PSAAが挙げられる。
5-Br-PSAAはｐＨ４〜６において銅(II)や鉄(II)と錯形成をするが銅(I)や鉄(III)とは錯形成をしない。従って還元剤が存在しない時は銅(II)のみが、また還元剤が存在する時は鉄(II)のみが錯体を作る。本発明の方法においては、この原理を用いて銅と鉄の選択的な同時定量を行うことができる。
即ち、図１において、試料（Ｓ）を含むキャリアー（ＣＳ）にキレート試薬（ＲＳ）が加えられると、銅錯体が形成し、ＦＣ１において銅錯体が検出される。一方、ＦＣ１を通過した溶液にアスコルビン酸（ＡＳ）が加えられると、銅錯体は消滅し、鉄錯体が形成し、ＦＣ２において鉄錯体が検出される。
図２は、アスコルビン酸ナトリウムの有無に対応した5-Br-PASSと銅(II)と鉄(II)のキレートの吸収スペクトルを示す。銅との複合体（カーブＡ）は543及び580nmに吸収ピークを有し、鉄との複合体（カーブＣ）は515、558及び710nmに吸収ピークを有する。従って、これら両方の元素を感度よく検出するためには、銅については580nm、鉄については710nmの吸収を用いるのがよい。5-Br-PASSの吸収は458nmにあり、その吸収はアスコルビン酸ナトリウムの添加に従って減少する。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１１】
本実施例においては、分光計（相馬光学 S-3220）とｐＨメーター（Horiba D-12）を用いて測定した。希釈には塩酸と超純水（Tamapure-AA, Tama Chemicals）を用いた。
用いたフローシステムの概略を図１に示す。このフローシステムは、キャリヤー（CS: 0.01M HCl, 0.2% TCA）、試薬溶液（RS: 5-Br-PSAA, pH 4.2 酢酸塩緩衝液）及び還元剤溶液（AS: Ｌ−アスコルビン酸、ｐＨ４．２酢酸塩緩衝液）の三流路とした。これらはダブルプランジャーポンプ（Ｐ１、Ｐ２、FLOM Model 201）により送られる。
フローセルには５８０nmと７１０nm干渉フィルターを装着した光路長２０ｍｍのツインフローセルを用いた（図３）。
【００１２】
試料溶液は六方バルブを用いてサンプルインジェクター（Ｓ、300μl）へ注入される。脱気するためにデガッサー（DG, FLOM Gastorr 154）を用いる。試料はキャリヤー（ＣＳ）の流れに従って5-Br-PSAA溶液（ＲＳ）と反応コイル（ＲＣ１）で混合され、フローセル１（ＦＣ１）において580nmにおける銅の吸光度が測定される。
還元剤溶液（AS）はダブルプランジャーポンプ（Ｐ２、FLOM Model 201）により送られ、反応コイル（ＲＣ２、60℃、Soma Optics S-3850）において鉄とのキレート形成が促進される。フローセル２（ＦＣ２）にて710nmにおける鉄の吸光度を測定した。その結果を図４に示す。
【００１３】
銅と鉄の同時定量における最適条件を検討した結果、ｐＨは4.1, 5-Br-PSAAの濃度は1×10-4 M, Ｌ−アスコルビン酸の濃度は5×10-3 Mが適していた。最適条件の下で鋼及び鉄は１００ｐｐｂ〜１０００ｐｐｂの濃度範囲において直線性の良い検量線を作成することができた。１００ｐｐｂの銅と１００ｐｐｂの鉄における相対標準偏差ＲＳＤ（ｎ＝１０）はそれぞれ０．１３％、０．３０％と再現性は良好であった。
また、銅と鉄の検出限界（３σ）はそれぞれ０．３９ppb，０．２０ppbとなり高感度な分析が可能であることが分かった。様々な混合比で銅と鉄を定量したところ、銅、鉄どちらを基準にしても混合比が等倍から１０倍の間であれば良好な回収率を得ることができた。
【００１４】
比較例１
フローセル１（ＦＣ１）とフローセル２（ＦＣ２）の光路長を50mmにした以外は実施例１と同様の測定を行った。結果を図５に示す。図５ではベースラインの不規則性が観察される。この検出感度は従来の約５倍であったが、試薬ブランクの影響も増幅され実際のS/Nは改善されず（LOD,1ppb）、低濃度領域の検出では大きな誤差（１％近い誤差）を与えた(RSD,0.99-1.1%)。
また、光路長が１０ｍｍの光学セルを作成して同様に試験したが、光路長が短いため感度は実施例１（光路長２０ｍｍ）の約1/2であり、検出限界(LOD)は2ppbであった。
【実施例２】
【００１５】
また、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ウマの標準血清(texp Cu 1.36; texp Fe 1.22; t(95%) 2.776)について実施例１の装置を用いて同様の方法で測定した測定値についてｔ検定を行い、比較のためＩＣＰ−ＡＥＳ（Jarrel-Ash Plasma AtomComp Mk II）による測定値についてｔ検定を行った。血清は従来法により処理（トリクロロ酢酸と塩酸により徐蛋白する）したものを試料として用いた。その結果を下表に示す。これら２方法間で有意差はないと判断できる。従って実施例１の方法の正確さは良好なものと考えられる。
【００１６】
【表１】
2005091259.tif 000002
【実施例３】
【００１７】
病名が判明している数人の患者血清中の銅と鉄を実施例１と同様の方法で定量したところ、下表に示すように鋼や鉄の増減は肝硬変や悪性腫瘍などの病気と関連があることが分かった。
【表２】
2005091259.tif 000003
また、結果は示さないが実施例１の装置を用いて、１００ｐｐｂの銅と鉄の混合物に種々の無機イオンを添加してピーク高さへの影響を調べたところ多くの無機イオンは妨害せず、本法は血清の定量に適していることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ダブルビームツインフローセル方式フローインジェクションアナリシスシステムを示す模式図である。CSはキャリヤー、RSは試料(5-Br-PSAA)溶液、ASは還元剤溶液、DGはデガサッサー、P1とP2はポンプ、Sはサンプルインジェクター、Dは分光計、TCは、RC1とRC2は反応コイル、BPCは背圧コイル、FC1とFC2はフローセルを示す。
【図２】5-Br-PASSと銅(II)と鉄(II)のキレートの吸収スペクトルを示す図である。Aは5-Br-PASSと銅(II)とのキレート、Bは5-Br-PASS、Cは5-Br-PASSと鉄(II)のキレート、Dはアスコルビン酸ナトリウム（還元剤ｄ）の存在下における5-Br-PASSの各吸収を示す。銅(II)と鉄(II)の濃度は各10ppmである。
【図３】フローセルの構造を示す図である。
【図４】実施例１（光路長20mm）の銅(II)と鉄(II)の吸光度を示す図である。
【図５】比較例１（光路長50mm）の銅(II)と鉄(II)の吸光度を示す図である。
【図１】
2005091259.tif 000004
【図２】
2005091259.tif 000005
【図３】
2005091259.tif 000006
【図４】
2005091259.tif 000007
【図５】
2005091259.tif 000008