(57)【要約】  【課題】  培養液中の種細胞を規則配列された細胞培養セル内に着床させ、この種細胞を均一な大きさの球状細胞組織体に培養してこれらをそれぞれ規則配列させた状態で担持させることができ、また中心壊死などを生じさせることがなく、しかも細胞が本来有する生体機能を高いレベルで長期的に維持させることができる細胞培養チップを提供する。  【解決手段】  種細胞を分散させた培養液中に載置されその基板表面１０ａ上に前記種細胞を着床させて培養する細胞培養チップ１０であって、基板表面１０ａ上にアレイ状やハニカム状等に規則配列された細胞培養セル１１を備える。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面上に種細胞を着床させる細胞培養チップであって、前記基板表面上にアレイ状やハニカム状等に規則配列され前記種細胞を凝集させて保持する細胞培養セルを備えたことを特徴とする細胞培養チップ。
【請求項２】
前記細胞培養セルが、前記基板に窪み状に形成された有底孔であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養チップ。
【請求項３】
前記細胞培養セルが、前記基板に形成された無底孔と、前記無底孔の底部を形成して前記基板の一面に積層されたメンブレンフィルム等の透水膜と、を有していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養チップ。
【請求項４】
前記細胞培養セルが円形又は多角形状の開口部を有し、その開口径が培養される前記種細胞の大きさに対して２〜５０倍の範囲であることを特徴とする請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の細胞培養チップ。
【請求項５】
前記細胞培養セルの底面や壁面の一部又は全部が下方中心に向けて傾斜状に形成されたテーパ部や湾曲部を有していることを特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の細胞培養チップ。
【請求項６】
前記基板表面や前記細胞培養セルの内表面が親水性であることを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の細胞培養チップ。
【請求項７】
請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の細胞培養チップの前記基板の外周部の一方向に立設された側壁を備えていることを特徴とする培養器。
【請求項８】
請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の細胞培養チップを培養器の底部に固定して、又は、請求項７に記載の培養器を用いて、前記培養器に所定濃度の種細胞が分散された培養液を充填して静置し、前記種細胞を前記細胞培養セル内に着床させる種細胞着床工程と、
前記培養器を連続的又は間欠的に所定加速度で水平回転又は往復揺動させながら前記細胞培養セル内の前記種細胞同士を凝集培養させて球状細胞組織体に成長させる球状細胞培養工程と、を有することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項９】
前記種細胞が肝細胞であることを特徴とする請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の細胞培養方法を用いて請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞培養チップの前記細胞培養セル内に球状細胞組織体を担持させてなる細胞担持モジュールであって、複数個の前記細胞培養チップをそのモジュールケース内に平面状及び／又は積層状に規則配列させたことを特徴とする球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール。
【請求項１１】
請求項９記載の細胞培養方法を用いて前記肝細胞から培養された球状細胞組織体であって、その全体サイズが５０〜３００μｍの範囲であり、そのアルブミン分泌速度が細胞１０6個当り２０〜５００μｇ／日の範囲であることを特徴とする球状細胞組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養して担持させるための細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた球状細胞組織体の細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞を組織培養させる技術は、再生医療や、ハイブリッド型人工臓器（バイオ人工臓器ともいう）、生体有用物質生産、生物組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニング、内分泌かく乱物質等の影響を評価する動物実験代替法、センサ機能を有する細胞チップ等の各分野への産業利用が期待されている。
従来、動物細胞の培養方法としては、ポリスチレンやガラスなどの培養ディッシュや培養基板を用い、その表面を生体由来物質でコーティングしたり、あるいは化学的または物理化学的に処理したりして、その表面上で細胞を接着、伸展させる二次元培養法、いわゆる単層培養法によるものが一般的である。
【０００３】
例えば、生体由来因子を有するコラーゲンをコートしたポリスチレンディッシュ上で細胞を培養すると、細胞はその表面に付着、伸展し、細胞質が扁平状に伸展した細胞形態をとる。
一方、生体組織や臓器などから単離した細胞、いわゆる初代細胞は、その由来する生体組織や臓器の特性や機能を保持している場合が多く、これらの細胞は産業上の利用価値が高い。しかし、ほとんどの場合、単層培養法では各種の細胞が持つ特性や機能が数日間から数週間で消失することが知られている。
特に、初代細胞の中でも高度に分化し、複雑多岐な機能を持つ初代肝細胞の場合、単層培養法ではその特性や機能が失われやすい。例えば、ラットの肝臓より単離した肝細胞を単層培養すると、肝臓の重要な機能であるタンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能などは培養開始から数日内に低下してしまう。これは単層培養法で培養された細胞では、細胞質が扁平した二次元状態となるため、本来生体内で細胞が有している細胞内構造や極性、隣接する細胞との結合による情報交換などの機能が低下、消失するためである。
【０００４】
このような細胞が本来持つ特性や機能の低下や消失を回避するために、細胞同士を集合化させ、生体組織に類似した三次元組織構造を備える球状細胞組織体（以下スフェロイドともいう）を構築させる三次元培養法（三次元組織化培養法）が注目されている。この球状細胞組織体を培養する技術に関連して、例えば以下のような技術が開示されている。
【０００５】
特許文献１には、肝細胞増殖因子及び上皮細胞増殖因子を有効成分として含有するスフェロイド形成促進剤を用いて、ラット初代肝細胞をポリウレタンフォームを用いた培養担体内で肝細胞スフェロイドに形成させる技術が記載されている。
【０００６】
非特許文献１には三次元培養法として、５００μｍ程度の平均孔径を持つ多孔質材のポリウレタン発泡体孔内において、約２００個程度の肝細胞が集合して形成される球状細胞組織体が記載され、このスフェロイドは培養条件下で数週間以上の機能発現ができることが示されている。
【０００７】
特許文献２には、アミノ基とカルボキシル基とを有する高分子により表面処理されたポリスチレン基板上で肝細胞を培養すると、スフェロイドが形成され、数週間の機能発現ができることが記載されている。また、フェニルボロン酸基を有するモノマー、アミノ基を有するモノマー、および２−ヒドロキシエチルメタクリレートの共重合体からなる高分子材料によって基板（シャーレ）表面をコーティングした培養床においても、肝細胞スフェロイドが形成され、アルブミン分泌能が維持されることが記載されている。
【０００８】
非特許文献２には、スピナーフラスコ内で浮遊培養した肝細胞がスフェロイドを形成し、機能発現を長期的に維持できることが記載されている。
【特許文献１】特開平１０−２９９５１号公報
【特許文献２】特許第３０２０９３０号公報
【非特許文献１】Ｈ．Ｉｊｉｍａ等"Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ"第４巻、第２号、２１３−２２６頁（１９９８））
【非特許文献２】（Ｙ．Ｓａｋａｉ等"Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１  Ｊｏｕｒｎａ１  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ"第１９巻、２９４−３０１頁（１９９６））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記従来の球状細胞組織体の培養法では以下のような課題を有していた。
（ａ）特許文献１や非特許文献１に記載のスフェロイド形成促進剤を用いてポリウレタンフォームの培養担体内で肝細胞スフェロイドを培養する方法や、特許文献２に記載の表面処理されたポリスチレン基板上に培養させる方法では、培養担体内や基板上に形成されるスフェロイドの粒径や担持位置のバラツキが大きく、スフェロイドの形態制御が困難であるため、球形に揃った球状細胞組織体が得られないという課題があった。
（ｂ）このため培養された球状細胞組織体を生体機能のチェックや新薬のスクリーニング等にバイオセンサとして用いる場合などに必要な一定の生体反応機能が得られず、センサなどとしての応答性や信頼性に欠けると共に、その適用範囲が限定され汎用性に欠けるという課題があった。
（ｃ）非特許文献２に記載の方法では、形成されるスフェロイドは培養液中に浮遊した状態となって規定の位置に確実に固定化できないため、培養されたスフェロイドを検知体として光ビームなどを所定パターンでスキャンして光学的な測定を行う新薬スクリーニング等のための自動測定機器に適用できないという問題があった。
（ｄ）さらに、前記特許文献１、２や非特許文献１、２に記載の方法ではスフェロイドの粒径制御が困難であるために、粒径が過度に大きくなるとその中心部の細胞には酸素や栄養分が充分に供給されずに中心部が壊死してしまい全体の細胞を有効に利用できないという問題があった。
【００１０】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、球状細胞組織体を均一な所定の大きさに培養してこれを規則配列させた状態で担持させることのできる細胞培養チップや培養器を提供すると共に、培養される球状細胞組織体の中心部を壊死させることなく維持して生産性に優れた球状細胞組織体の細胞培養方法を提供し、生体反応機能を有する球状細胞組織体を担持させてなる細胞培養チップを複数配列して新薬等をスクリーニング処理する自動検査システム等を効率的に構成できる細胞担持モジュールを提供し、かつ生体反応の応答性と信頼性に優れた球状細胞組織体を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の請求項１に記載の細胞培養チップは、基板表面上に種細胞を着床させる細胞培養チップであって、前記基板表面上にアレイ状やハニカム状等に規則配列され前記種細胞を凝集させて保持する細胞培養セルを備えた構成を有している。
この構成によって、以下の作用を有する。
（ａ）細胞培養セルがチップ基板表面上に規則配列されているので、培養液中の種細胞を規則配列された細胞培養セル内に着床させ、この種細胞を均一な大きさの球状細胞組織体に培養してこれらをそれぞれ規則配列させた状態で担持させることができる。
（ｂ）このような球状細胞組織体を規則配列させた細胞培養チップを用いて信頼性に優れた自動分析システムなどを構築でき、新薬スクリーニングなどの検査処理を効率的に行うことができる。
（ｃ）細胞培養チップの細胞培養セル内で、バラツキのない所定大きさの球状細胞組織体を培養できるので、中心壊死などを生じさせることがなく、しかも細胞が本来有する生体機能を高いレベルで長期的に維持させることができる。
（ｄ）このような球状細胞組織体は、アルブミンなどの特定タンパク質の分泌特性に優れているので、再生医療や、ハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、生物組織や器官、臓器の機能の調査、探索、新薬のスクリーニングや内分泌かく乱物質などの影響を評価するための動物実験代替法、センサ電極上に細胞を担持させて構築される細胞チップ関連技術などの各分野を開発するために好適に利用できる。
【００１２】
ここで、種細胞としては、１種類の細胞を単独で、又は２種以上のものを混合した状態で用いることができる。例えばヒト、ブタ、イヌ、ラット、マウス等の動物由来の肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚などから得られる初代細胞、または樹立された株化細胞を単独で用いたり、もしくは複数種のものを混合したりして用いることができる。特に、単層培養法では短期間で機能が低下するような細胞を本発明の対象となる種細胞として球状細胞組織体に培養することにより長期間に渡ってその生体機能を良好に保持させることができる。
なお、球状細胞組織体（スフェロイド）とは、分散状態から出発した細胞同士が高度に接着した状態、または高頻度に接着した状態の細胞群であり、細胞は単層でなく規則的又は不規則的に重なり合った複数細胞層を形成している球状またはそれに近い形状のものをいう。
細胞培養チップの基板用材料としては、ガラス等の無機材料、ステンレス鋼等の金属材料、もしくは、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタールなどや、不飽和ポリエステル、ポリウレタン、シリコン樹脂、ＥＰＤＭ等の可撓性合成樹脂などの合成樹脂、ゴムが適用できる。これら可撓性のものを用いることによって、全体を湾曲させて円筒状などに形成して培養器中に配置できる。また、これらを平板状に用いてもよいし、又はこれらを円筒形や楕円筒形に加工して用いてもよい。
基板には、その基板表面を必要に応じてコラーゲンやホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、レシチンなどやこれらの不飽和脂肪酸を水添したもの等で被覆して、着床される種細胞に対する親和性や付着性などの表面性状を調整したものや、これら異なる素材のものを複数組み合わせて積層させた複合構造のもの等も用いることができる。
細胞培養チップの基板はその全体が略矩形板状や円盤状でその表面が平滑状に形成される。この基板表面上に規則配列される細胞培養セルは、マシニングセンタ、マイクロマシンなどを用いた穿孔加工、エッチング加工、フォトグラフィック加工などの手段で形成したり、又は射出成形型やプレス成形型などを用いて基板成形時に形成したりするようにしてもよい。
【００１３】
細胞培養セルは、基板表面上に窪み状などに形成された有底孔や、基板に穿設された無底孔の開口部を透水膜や非透水膜で覆設して形成したセル状部などであって、その開口部が円形状や多角形などに形成される。これら複数個の細胞培養セルを細胞培養チップの基板表面上に規則的に配列させてアレイ構造やハニカム構造などを有するセグメントとすることができる。また、一基板内に多数のセグメントを配置することもできる。
細胞培養セルの大きさは、その内部に所定数の種細胞が保持できる状態であればよい。また、その壁面及び／又は底面は、培養液や栄養液の不透過状態としたり、培養液や栄養液が透過できるように通液孔を設けたり、通液性の材質で構成したりすることができる。このようにセル内に培養液が流れるようにした場合には、セル内に栄養分等を供給できると共に、細胞培養セル内で培養される細胞の周囲に下降流や旋回流が形成されるので、球状細胞組織体をセル中心に位置付けしかも球状細胞組織体の生成を同時に助長させることができる。
【００１４】
培養液中に分散される種細胞の濃度は、１個の細胞培養セル内に着床する種細胞の数が２〜１．５×１０5個となるように設定することが好ましく、より好ましくは５０〜３．０×１０4個の範囲である。これは適用する種細胞や培養液の種類、温度や時間などの培養条件にもよるが以下の理由による。すなわち、細胞培養セル中に着床して保持される種細胞数が５０個より少なくなるにつれ、バイオセンサなどに必要なタンパク質分泌機能などを効果的に発揮させることが困難となる傾向が現れ、逆に種細胞数が３．０×１０4個を超えるにつれ、セル内で培養される球状細胞組織体が大きくなりすぎてその中心部まで酸素や栄養分を行き渡らせることができず球状細胞組織体の中心部に壊死を生じさせるような傾向が生じ、これらの傾向は２個より少なくなるか又は１．５×１０5個を超えるとさらに顕著になるからである。
なお、細胞培養チップに入れられる培養液中の種細胞の濃度は、細胞培養チップの実効着床面積、前記細胞培養チップが配置される培養器の底面積、培養液量などの条件に応じて、前記細胞培養セル内の細胞数が前記適正細胞数となるように実験的に又は推定計算によりに設定することができる。
【００１５】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の細胞培養チップであって、前記細胞培養セルが、前記基板に窪み状に形成された有底孔を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
（ａ）細胞培養セルが有底孔で形成されるので、基板が合成樹脂などからなる場合にエンボス加工やドリルを用いた穿孔加工など適用して、規則配列された細胞培養セルを精度よく基板上に形成させることができる。
（ｂ）細胞培養セルを有底孔としているので、その深さや孔径、内壁面の形状などを適正に設定することで内部に着床される種細胞の保持性を高め、凝集される球状細胞組織体の球形度を高めることができる。
【００１６】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の細胞培養チップであって、前記細胞培養セルが、前記基板に形成された無底孔と、前記無底孔の底部を形成して前記基板の一面に積層されたメンブレンフィルム等の透水膜と、を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
（ａ）透水膜を介して細胞培養セル内の種細胞凝集体の周囲に培養液などによる旋回流や下降流を形成することができるので、球状細胞組織体の形成を促進させることができる。
（ｂ）培養中における細胞培養セル内への培養液の循環流通を良好に維持させることができ、培養効率性に優れた細胞培養チップを提供できる。
（ｃ）培養液による上下方向への循環流を細胞培養チップが配置される培養器や細胞担持モジュール内に形成できるので、細胞培養チップを一定スペース内に多数積層させて配置したり、それぞれ異なる種類の細胞培養チップを高密度で平面配置させたりすることができる。
（ｄ）これによって種々の医療システムのデバイスとして適用できると共に、有用細胞の培養生産性やセンサ検知性能の向上をさらに図ることができる。
【００１７】
ここで、透水膜としては、細胞培養セルの内部に細胞を保持しておくために適用する種細胞より小さい孔径、例えば０．００１〜５μｍの範囲の孔径を有する細孔が形成されたものが好適に用いられる。また、細孔密度としては１０5〜１０11個／ｃｍ2、開孔率としては１４〜５０％のものが好適に用いられる。これにより、種細胞がセル外に流出するのを防止するとともに、セル内に形成される培養液や栄養液の流れを維持して種細胞を凝集させて球形度に優れた所定サイズの球状細胞組織体に成長させることができる。
【００１８】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の細胞培養チップであって、前記細胞培養セルが円形又は多角形状の開口部を有し、その開口径が培養される前記種細胞の大きさに対して２〜５０倍の範囲である構成を有している。
この構成によって、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の作用に加えて、以下の作用を有する。
（ａ）セル形状を特定範囲に設定しているので、各セル内で培養される種細胞同士が凝集して球状化するのをさらに促進させることができる。
（ｂ）各セル内にそれぞれ均一サイズの球状細胞組織体を効率的に培養することができ、常時一定の反応特性を有するバイオセンサなどとして機能させることができる。
ここで細胞培養セルは、開口径が種細胞の大きさに対して２〜５０倍、好ましくは４〜３０倍に形成される。その開口径が培養液を介して供給される種細胞の大きさに対してその４倍より小さくなるにつれ、所望の生体機能を発揮させるのに必要な所定数以上の種細胞をセル内に着床させるのが困難になるような傾向が生じ、逆に３０倍を超えるにつれ、球状細胞組織体が肥大して栄養分の供給不足により中心組織の壊死が生じたり、あるいは１つのセル内に複数個の球状細胞組織体が生じたりする傾向が生じ、これらの傾向は開口径が２倍より小さくなるかまたは５０倍を超えるとさらに顕著になるので好ましくない。
また、細胞培養セルが有底孔である場合には、細胞培養セルの深さは種細胞の大きさに対して１〜５０倍、好ましくは２〜３０倍に形成される。細胞培養セルの深さが２倍より少なくなるにつれ、セル内に保持できる種細胞の絶対数が不足したり、着床率が極端に低下したりするような弊害が生じ、逆に３０倍を超えるにつれ、培養液のセル内への流れが少なくなって酸素や養分の供給が阻害されるなどの弊害を生じ、特に、１倍未満又は５０倍を超えると更にこの傾向が種細胞の種類によって顕著になるので好ましくない。
なお、細胞培養セルが基板に形成された無底孔と無底孔の底部を形成する透水膜とを備えている場合は、細胞培養セルの深さは限定する必要がない。透水膜を介して、酸素や養分が豊富な新鮮な培養液をセル内に供給して老廃物が含まれる培養液と交換させることができ種細胞の培養を促進できるからである。また、透水膜を介して培養液に旋回流や下降流を形成することができるので、培養される球状細胞組織体の形成を促進させることができるからである。
【００１９】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の細胞培養チップであって、前記細胞培養セルの底面や壁面の一部又は全部が下方中心に向けて傾斜状に形成されたテーパ部や湾曲部を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１乃至４の内のいずれか１項に記載の作用に加えて、以下の作用を有する。
（ａ）細胞培養セルがその内壁部や底部にテーパ部やＵ字状などの湾曲部を備えるので、細胞培養セル内に種細胞を着床させて細胞培養チップを静置したり、又は同細胞培養チップに所定の水平回転や揺動を付与したりすることによって、そのセル内の種細胞をセル中心部に効率的に凝集させて担持させることができる。
（ｂ）球状細胞組織体に培養される担持位置をさらに正確に規定できるので、この球状細胞組織体が担持された細胞培養チップをバイオセンサなどに適用して、光ビームを所定のパターンで細胞培養チップ上のそれぞれの球状細胞組織体にあてるようにスキャンさせて、その反射光や透過光を検出してセル内の球状細胞組織体の薬剤に対する反応特性を取得する際の測定信頼性などを高めることができる。
【００２０】
ここで、細胞培養セルの壁面に形成されるテーパ部は、基板の開口表面側や底面側の一部もしくは壁面及び底面の全面に渡って形成することができる。
【００２１】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の細胞培養チップであって、前記基板表面や前記細胞培養セルの内表面が親水性を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
（ａ）基板表面に着床した種細胞を付着させることなく、その近傍に穿設された細胞培養セルに落とし込むことができ、少ない種細胞濃度の培養液であっても所定の細胞数をセル内に確保することができる。
（ｂ）セルの内表面が親水性高分子などで形成されるので、種細胞の細胞培養セル壁への付着が抑制され、球状細胞組織体の形成を促進できる。
ここで、親水性を備えた細胞培養チップは、基板が疎水性の場合は、親水性高分子膜でコートしたりプラズマ処理等の表面処理等によって形成することができる。また、基板をポリアセタール、ポリビニール、ポリエステル、ポリアミド等の親水性高分子で形成してもよい。
【００２２】
本発明の請求項７に記載の培養器は、請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の細胞培養チップの前記基板の外周部の一方向に立設された側壁を備えた構成を有している。
この構成によって、請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の作用に加えて、以下の作用を有する。
（ａ）培養器本体と細胞培養チップとが一体に形成されるので、耐久性や取り扱い性に優れている。
（ｂ）培養器内に培養液を供給して、細胞培養セル内に種細胞を着床させたり、培養器を揺動させたりする際に、培養器の底部が平面状に形成されているので、培養液の流れが妨げられることがなく、その培養条件を常時適正に維持させることができる。
【００２３】
本発明の請求項８に記載の細胞培養方法は、請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の細胞培養チップを培養器の底部に固定して、又は、請求項７に記載の培養器を用いて、前記培養器に所定濃度の種細胞が分散された培養液を充填して静置し、前記種細胞を前記細胞培養セル内に着床させる細胞着床工程と、前記培養器を連続的又は間欠的に所定加速度で水平回転又は往復揺動させながら前記細胞培養セル内の前記種細胞同士を凝集培養させて球状細胞組織体に成長させる細胞培養工程と、を備えた構成を有している。
この構成によって、以下の作用を有する。
（ａ）所定種細胞濃度の培養液中に細胞培養チップを保持させた培養器を静置する静置工程を有するので、種細胞が沈降して細胞培養セル内に所定数の種細胞を着床させることができる。
（ｂ）培養器を水平回転又は揺動させながら培養する細胞培養工程を有するので、細胞培養セル内に保持された種細胞を効率的にセル中心部分に凝集、担持させ、所定大きさで球形に整った形状の球状細胞組織体に培養できる。
（ｃ）培養される球状細胞組織体を細胞培養セルの中心に位置付けて培養できるので、球形度に優れた球状細胞組織体を生産することができる。
【００２４】
ここで、培養器を水平方向に回転または往復動させるなどの揺動操作は、培養器を一方向に回転させる場合や、交互に逆方向に回転させる場合などが含まれる。また、この揺動操作には、往復運動の方向を所定パターンで変化させる場合や、超音波振動などを付加する場合などが含まれる。これによって、種細胞が細胞培養セルのセル壁に沿って旋回しながら凝集成長して球状細胞組織体に培養され、三次元細胞組織化が促進される。この細胞培養セル内の種細胞やその凝集体に付加される揺動や回転の加速度及び付加時間などの揺動培養条件は、種細胞の種類、目的とする球状細胞組織体の大きさや生体機能、テーパ部などを有する細胞培養セルの形状や大きさなどに応じて、実験的にその適正範囲を定めることができる。
【００２５】
本発明の請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の細胞培養方法であって、前記種細胞が肝細胞である構成を有している。
この構成によって、請求項８に記載の作用に加えて以下の作用を有する。
（ａ）種細胞としてヒトなどの肝臓由来の肝細胞を用いるので、種々の新薬の肝臓への影響調査等の機能チェックにこの肝細胞から培養された球状細胞組織体を適用して、広範囲の医療分野に適用することができる。
特に、肝臓から単離された初代肝細胞は、初代細胞の中でも高度に分化した機能を有しており、その肝臓に由来するタンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能などを保持している。制御された大きさを備えてチップ上に規則配列された担持位置を有する球状細胞組織体は産業上や医療上への利用価値が極めて高いものである。
【００２６】
本発明の請求項１０に記載の細胞担持モジュールは、請求項８又は９に記載の細胞培養方法を用いて請求項１乃至７のいずれか１項に記載の細胞培養チップの前記細胞培養セル内に前記球状細胞組織体を担持させてなる細胞担持モジュールであって、複数個の前記細胞培養チップをそのモジュールケース内に平面状及び／又は積層状に規則配列させた構成を有している。
この構成によって以下の作用を有する。
（ａ）単位スペース内に配置される細胞培養チップの配置密度を高めることができるので、細胞担持モジュールが適用される医療機器などの小型化、高密度化が図られ、種々の用途に適用でき、汎用性に優れている。
（ｂ）同一モジュールケース内にそれぞれ種類の異なる球状細胞組織体を担持させた細胞培養チップを配置して、同時に複数の医薬品に対する応答性等を効率的にチェックでき、薬品検査や生体機能性チェック等の効率性に優れている。
（ｃ）モジュール内の球状細胞組織体の保持密度が高められ、検出感度に優れたバイオセンサシステムを構築できる。
【００２７】
本発明の請求項１１に記載の発明は、請求項９に記載の細胞培養方法を用いて前記肝細胞から培養された球状細胞組織体であって、その全体サイズが５０〜３００μｍの範囲であり、そのアルブミン分泌速度が細胞１０6個当り２０〜５００μｇ／日の範囲である構成を有している。
この構成によって以下の作用を有する。
（ａ）その全体サイズとアルブミン分泌速度が所定範囲に規定されるので、常時一定の反応特性を維持して薬剤の機能性や種々の細胞応答性をチェックするバイオセンサとしての信頼性に優れた球状細胞組織体を提供できる。
（ｂ）このように形態及び機能が制御された球状細胞組織体を細胞担持モジュールなどに担持させたり、あるいは単独で用いたりして、これを再生医療や、ハイブリッド型人工臓器、器官臓器の機能調査用センサ、新薬のスクリーニング用センサデバイス、各種のバイオチップ等の各分野へ広く利用することができ、汎用性に優れている。
ここで、肝細胞から培養される球状細胞組織体の全体サイズが５０μｍより小さくなると、被検知体と接触して分泌されるアルブミン量が不足して検知感度が低下し、逆に３００μｍを超えて大きくなると、中心壊死などの弊害が生じて生体機能測定の安定性が損なわれるので好ましくない。
また、そのアルブミン分泌速度が細胞（細胞数：１０6個）当り２０μｇ／日より低下する場合は、細胞が有する本来の機能が低下し、細胞応答性などを良好に検出することができない。逆に、５００μｇ／日を超えると細胞の生理機能レベルが不安定化しているおそれがあるので好ましくない。
【発明の効果】
【００２８】
請求項１記載の発明によれば、以下の効果を有する。
（ａ）細胞培養セルがチップ基板表面上に規則配列されているので、培養液中の種細胞を規則配列された細胞培養セル内に着床させ、この種細胞を均一な大きさの球状細胞組織体に培養してこれらをそれぞれ規則配列させた状態で担持させることができる。
（ｂ）このような球状細胞組織体を規則配列させた細胞培養チップを用いて信頼性に優れた自動分析システムなどを構築でき、新薬スクリーニングなどの検査処理を効率的に行うことができる。
（ｃ）細胞培養チップの細胞培養セル内で、バラツキのない所定大きさの球状細胞組織体を培養できるので、中心壊死などを生じさせることがなく、しかも細胞が本来有する生体機能を高いレベルで長期的に維持させることができる。
（ｄ）このような球状細胞組織体は、アルブミンなどの特定タンパク質の分泌特性に優れているので、再生医療や、ハイブリッド型人工臓器、有用物質生産、生物組織や器官、臓器の機能の調査、探索、新薬のスクリーニングや内分泌かく乱物質などの影響を評価するための動物実験代替法、センサ電極上に細胞を担持させて構築される細胞チップ関連技術などの各分野を開発するために好適に利用できる。
【００２９】
請求項２記載の発明によれば、請求項１記載の効果に加えて以下の効果を有する。
（ａ）細胞培養セルが有底孔で形成されるので、基板が合成樹脂などからなる場合にエンボス加工やドリルを用いた穿孔加工など適用して、規則配列された細胞培養セルを精度よく基板上に形成させることができる。
（ｂ）細胞培養セルを有底孔としているので、その深さや孔径、内壁面の形状などを適正に設定することで内部に着床される種細胞の保持性を高め、凝集される球状細胞組織体の球形度を高めることができる。
【００３０】
請求項３記載の発明によれば、請求項１記載の効果に加えて以下の効果を有する。
（ａ）透水膜を介して細胞培養セル内の種細胞凝集体の周囲に培養液などによる旋回流や下降流を形成することができるので、球状細胞組織体の形成を促進させることができる。
（ｂ）培養中における細胞培養セル内への培養液の循環流通を良好に維持させることができ、培養効率性に優れた細胞培養チップを提供できる。
（ｃ）培養液による上下方向への循環流を細胞培養チップが配置される培養器や細胞担持モジュール内に形成できるので、細胞培養チップを一定スペース内に多数積層させて配置したり、それぞれ異なる種類の細胞培養チップを高密度で平面配置させたりすることができる。
（ｄ）これによって種々の医療システムのデバイスとして適用できると共に、有用細胞の培養生産性やセンサ検知性能の向上をさらに図ることができる。
【００３１】
請求項４記載の発明によれば、請求項１乃至３の内いずれか１項に記載の効果に加えて、以下の効果を有する。
（ａ）セル形状を特定範囲に設定しているので、各セル内で培養される種細胞同士が凝集して球状化するのをさらに促進させることができる。
（ｂ）各セル内にそれぞれ均一サイズの球状細胞組織体を効率的に培養することができ、常時一定の反応特性を有するバイオセンサなどとして機能させることができる。
【００３２】
請求項５記載の発明によれば、請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の効果に加えて、以下の効果を有する。
（ａ）細胞培養セルがその内壁部や底部にテーパ部やＵ字状などの湾曲部を備えるので、細胞培養セル内に種細胞を着床させて細胞培養チップを静置したり、又は同細胞培養チップに所定の水平回転や揺動を付与したりすることによって、そのセル内の種細胞をセル中心部に効率的に凝集させて担持させることができる。
（ｂ）球状細胞組織体に培養される担持位置をさらに正確に規定できるので、この球状細胞組織体が担持された細胞培養チップをバイオセンサなどに適用して、光ビームを所定のパターンで細胞培養チップ上のそれぞれの球状細胞組織体にあてるようにスキャンさせて、その反射光や透過光を検出してセル内の球状細胞組織体の薬剤に対する反応特性を取得する際の測定信頼性などを高めることができる。
【００３３】
請求項６記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の効果に加えて以下の効果を有する。
（ａ）基板表面に着床した種細胞を付着させることなく、その近傍に穿設された細胞培養セルに落とし込むことができ、少ない種細胞濃度の培養液であっても所定の細胞数をセル内に確保することができる。
（ｂ）セルの内表面が親水性高分子などで形成されるので、種細胞の細胞培養セル壁への付着が抑制され、球状細胞組織体の形成を促進できる。
【００３４】
請求項７記載の発明によれば、請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の効果に加えて、以下の効果を有する。
（ａ）培養器本体と細胞培養チップとが一体に形成されるので、耐久性や取り扱い性に優れている。
（ｂ）培養器内に培養液を供給して、細胞培養セル内に種細胞を着床させたり、培養器を揺動させたりする際に、培養器の底部が平面状に形成されているので、培養液の流れが妨げられることがなく、その培養条件を常時適正に維持させることができる。
【００３５】
請求項８記載の発明によれば、以下の効果を有する。
（ａ）所定種細胞濃度の培養液中に細胞培養チップを保持させた培養器を静置する静置工程を有するので、種細胞が沈降して細胞培養セル内に所定数の種細胞を着床させることができる。
（ｂ）培養器を水平回転又は揺動させながら培養する細胞培養工程を有するので、細胞培養セル内に保持された種細胞を効率的にセル中心部分に凝集、担持させ、所定大きさで球形に整った形状の球状細胞組織体に培養できる。
（ｃ）培養される球状細胞組織体を細胞培養セルの中心に位置付けて培養できるので、球形度に優れた球状細胞組織体を生産することができる。
【００３６】
請求項９記載の発明によれば、請求項８記載の効果に加えて以下の効果を有する。
（ａ）種細胞としてヒトなどの肝臓由来の肝細胞を用いるので、種々の新薬の肝臓への影響調査等の機能チェックにこの肝細胞から培養された球状細胞組織体を適用して、広範囲の医療分野に適用することができる。
【００３７】
請求項１０記載の発明によれば、以下の効果を有する。
（ａ）単位スペース内に配置される細胞培養チップの配置密度を高めることができるので、細胞担持モジュールが適用される医療機器などの小型化、高密度化が図られ、種々の用途に適用でき、汎用性に優れている。
（ｂ）同一モジュールケース内にそれぞれ種類の異なる球状細胞組織体を担持させた細胞培養チップを配置して、同時に複数の医薬品に対する応答性等を効率的にチェックでき、薬品検査や生体機能性チェック等の効率性に優れている。
（ｃ）モジュール内の球状細胞組織体の保持密度が高められ、検出感度に優れたバイオセンサシステムを構築できる。
【００３８】
請求項１１記載の発明によれば、以下の効果を有する。
（ａ）その全体サイズとアルブミン分泌速度が所定範囲に規定されるので、常時一定の反応特性を維持して薬剤の機能性や種々の細胞応答性をチェックするバイオセンサとしての信頼性に優れた球状細胞組織体を提供できる。
（ｂ）このように形態及び機能が制御された球状細胞組織体を細胞担持モジュールなどに担持させたり、あるいは単独で用いたりして、これを再生医療や、ハイブリッド型人工臓器、器官臓器の機能調査用センサ、新薬のスクリーニング用センサデバイス、各種のバイオチップ等の各分野へ広く利用することができ、汎用性に優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１に係る細胞培養チップが載置された培養器の斜視図であり、図２は細胞培養チップの拡大断面図である。但し、細胞培養チップの形状はこれに限定されるものではない。
図１及び図２において、１０はポリスチレンやポリカーボネート、ポリサルホン、ポリアクリレート、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート）、ポリウレタン等の合成樹脂を素材とする板状体を加工して載置したり又は合成樹脂製の容器底部を穿孔加工やエンボス加工等を施して培養容器と一体に形成されたりした実施の形態１の細胞培養チップ、１１は細胞培養チップ１０の基板表面１０ａに穿設されアレイ状やハニカム状などに規則配列された複数の細胞培養セル、１２は細胞培養チップ１０がその底部に載置又は形成され種細胞を含む培養液が入れられる円筒容器状の培養器である。
図２（ａ）に示すように細胞培養セル１１は円筒状の底部１１ａと壁部１１ｂとを備えた有底孔であって、その開口径が５０〜５００μｍ、その深さが２０〜２０００μｍに形成されている。
細胞培養チップ１０は、例えば一辺の長さが１５ｍｍ、厚さが０．１〜１０ｍｍの正方形板状や円盤状であって、その基板表面１０ａ上の各格子点に規則配列される細胞培養セル１１が４．０×１０2〜４．０×１０4個／ｃｍ2の配置密度となるようにマシニングセンタ等を用いた穿孔加工やエンボス加工等により形成される。
【００４０】
なお、細胞培養セル１１は図２（ｂ）〜（ｇ）の変形例１〜６に示すようにその底面や壁面の一部又は全部にテーパ部１１ｃを設けることができる。
すなわち、図２（ｂ）は細胞培養セル１１の底面にすり鉢状のテーパ部１１ｃを設けた例を、図２（ｃ）は垂直壁面と底面との間にテーパ部１１ｃを設けた例を、図２（ｄ）は壁部全部をテーパ部１１ｃとした例を、図２（ｅ）は開口部近傍にのみテーパ部１１ｃを設けた例を示している。また図２（ｆ）は垂直壁を設けることなく、全体をすり鉢状に形成した例を、図２（ｇ）はセル底部を丸く湾曲させて形成した例を示している。
このようなテーパ部１１ｃが細胞培養セル１１に形成された細胞培養チップ１０を回転、揺動させたり、又は静置させたりすることによって、セル内で球状に凝集する種細胞をセル中心に位置付けることができ、細胞培養チップ１０上に配列される各球状細胞組織体の担持位置をより精密に規定することができる。こうして、細胞培養チップを多数のバイオ素子を有した複合センサに適用して自動化する際等の測定信頼性が高められる。
【００４１】
以下、細胞培養チップ１０を用いて、細胞が本来有するタンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能を高レベルで有する球状細胞組織体を培養する細胞培養方法について説明する。
まず、種細胞着床工程においては、培養器１２に所定濃度のラット肝細胞などの種細胞が分散された培養液を充填して所定時間例えば、０．１〜２４時間静置する。これによって、培養液中の前記種細胞を沈降させ、その所定数の種細胞を細胞培養セル１１内に着床させる。
次の細胞培養工程では、培養器１２を水平回転又は揺動させることにより、回転や振動による所定の加速度を細胞培養セル１１内の種細胞に連続的又は間欠的に付与させる。こうして、種細胞同士の凝集を助長させながら培養器１２内を所定の温度、湿度、炭酸ガス濃度となる培養条件に維持することにより、種細胞を培養して所定大きさ、例えば、５０〜３００μｍで、しかも所定のタンパク質分泌能を備えた球状細胞組織体に成長させることができる。
このように大きさや形状が所定値に制御された組織構造を有する球状細胞組織体は、タンパク質合成機能や解毒機能、薬物代謝機能を高レベルで保持しており、しかもバイオセンサなどに必要なバラツキの少ない反応特性を備えている。
なお、以上のように培養された球状細胞組織体を担持させた細胞培養セル１１を備える細胞培養チップ１０を容器内に複数組み規則配列するとことにより細胞担持モジュールを構成することもできる。
【００４２】
このように球状細胞組織体を担持させた細胞培養チップ１０や細胞培養モジュールは、再生医療、ハイブリッド型人工臓器、生体組織の機能探索、新薬のスクリーニング、内分泌かく乱物質等の影響評価、細胞チップ等の各技術分野に広く利用することができる。
以下に比較例を含む実施例を示して、本実施の形態１をさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のものに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
実施例で使用した肝細胞の調製および培養は以下のように行った。
まず、初代ラット肝細胞を調製するために０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（和光純薬杜）溶液１５０ｍＬを用意した。７週齢の雄ウィスター系ラット（体重２５０ｇ）の門脈（肝臓に入る血管）にカニューレを導入し、脱血液を３０ｍＬ／ｍｉｎで５分間流した後、３７℃に加温したコラゲナーゼ溶液を１５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流した。コラゲナーゼによって処理された肝臓を培養液に入れ、メスとピペットを使って肝細胞を分散させた。得られた肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を取り除いた（９５%以上の純度）。このようにして単離した肝細胞を以下の培養実験の種細胞として使用した。
【００４４】
肝細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ製：ｄｕ１ｂｅｃｃｏ'ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇ１ｅ  ｍｅｄｉｕｍ）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌプロリン、５０ｍｇ／ｍＬ上皮細胞成長因子（フナコシ製：ＥＧＦ）、１０ｍｇ／Ｌインシュリン（シグマ製）、７．５ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾン（和光純薬製）、０．１μＭ硫酸銅・５水和物（和光純薬製）、３μｇ／Ｌセレン酸（和光純薬製）、５０ｐＭ硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬製）、５０μｇ／Ｌリノール酸（シグマ製）、５８．８ｍｇ／Ｌペニシリン（明治製菓製）、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓製）、１．０５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（和光純薬製）、１．１９ｇ／Ｌの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（同人堂製：ＨＥＰＥＳ、２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を加えた無血清培地を用い、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下で培養を行った。また、上記の２ｍＬの新鮮培地を用い、２日毎に培地交換を行った。
【実施例２】
【００４５】
マイクロマシン等を用いて、直径３５ｍｍのポリスチレン製の培養容器１２（ファルコン製）表面に１．５ｃｍ角、厚さ１．２ｍｍの細胞培養チップ１０を作製した。
すなわち、細胞培養チップ１０の基板表面１０ａに直径３００μｍ、深さ５０μｍの円柱状セル（細胞培養セル１１）を、例えばピッチ３３０μｍ、軸角６０度で形成された三角配置の格子点上に配列して設けた。この細胞培養チップ１０はその基板１０ａ上に合計約２４００個の細穴状の細胞培養セル１１を有する。このようにして作製された細胞培養チップ１０をアルコール滅菌及び６時間の紫外線滅菌処理をして、肝細胞の培養実験に使用した。
上記記載の方法によってラット肝細胞をそれぞれ調製し、細胞密度が５．０×１０5ｃｅ１１ｓ／ｍＬのラット細胞を含む懸濁液（種細胞を含む培養液）を得た。この培養液２ｍＬを以下の各条件（１）〜（４）の基板上に播種して培養する比較実験を行った。
【００４６】
条件（１）：細胞培養セルの部分がない市販の平面基板を備えた培養容器（ファルコン社製、ポリスチレンディッシュ、３５ｍｍ径）に、種細胞を分散させた培養液を入れて静置し、その平面基板上で種細胞を培養したもの（平面基板−静置培養）。
条件（２）：前記市販の培養器をその平面基板の振幅２５ｍｍ、回転速度５０ｒｐｍで旋回させながら培養したもの（平面基板−旋回培養）。
条件（３）：細胞培養セルを格子点上に規則配列させて形成させた円柱セルアレイ化基板（細胞培養チップ１０）が形成された培養器１２に種細胞を分散させた培養液を入れ、これを静置状態で培養したもの（円柱セルアレイ化基板−静置培養）。
条件（４）：細胞培養チップ１０の振幅２５ｍｍ、回転速度５０ｒｐｍで、回転円盤上に載置された培養器１２を旋回させながら種細胞を培養したもの（円柱セルアレイ化基板−旋回培養）。
【００４７】
なお、得られた肝細胞の培養状態を評価するために、培養の各期間において、位相差顕微鏡による細胞形態を観察した。また、スフェロイドが形成された条件においてはその粒径を測定し、スフェロイド粒径分布を評価した。ここで、スフェロイド粒径の測定は、デジタルマイクロスコープ（キーエンス社）を用い、１条件当り１００個のスフェロイド粒径を測定し、粒径分布を求めた。
細胞播種直後（培養０日目）、培養３日目、培養７日目の各条件の肝細胞形態を図３〜６に示す。条件（３）の円柱セルアレイ化基板−静置培養ではスフェロイドの形成は見られなかったが、その他の条件では、培養初期に分散状態であった細胞が、徐々に集合化し、細胞同士が結合、凝集化して三次元的な細胞集合体であるスフェロイドを多数形成した。
条件（１）の平面基板−静置培養および条件（２）の平面基板−旋回培養では、基板上におけるスフェロイドの形成がランダムであったが、条件（４）の円柱セルアレイ化基板−旋回培養では、１つの細胞培養セル１１に１個のスフェロイドが形成され、かつ全体的にみると基板上でアレイ化された状態であった。
スフェロイドが形成された三つの条件、すなわち、条件（１）の平面基板−静置培養、条件（２）の平面基板−旋回培養、条件（４）の円柱セルアレイ化基板−旋回培養のスフェロイド粒径分布を図７および表１に示す。この結果、条件（１）の平面基放−静置培養と条件（２）の平面基板−旋回培養では様々な粒径のスフェロイドが存在するが、条件（４）の円柱セルアレイ化基板−旋回培養では均一な粒径のスフェロイドが形成されることが示された。
【表１】
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【００４８】
これらの結果により、細胞培養チップ１０の基板上で細胞を旋回培養することによって、均一な所定粒径のスフェロイドが形成され、かつ多数のスフェロイドが基板上にアレイ配列されたセル内に固定化できることが示された。
【実施例３】
【００４９】
実施例２の条件（４）と同様の培養を行い、肝細胞の機能であるアルブミン分泌能を評価した。比較例として、２．５×１０5ｃｅ１１ｓ／ｍＬのラット細胞懸濁液２ｍＬを直径３５ｍｍのコラーゲンコートディッシュ（岩城硝子製）に播種することによって単層培養を行って比較した。単層培養の培養培地および条件は、上記と同様の条件を用いた。
培養１４日目に培養培地中に分泌されたアルブミンを酵素標識免疫測定法により定量し、単位細胞数あたりのアルブミン分泌速度（μｇ／１０6ｃｅ１１ｓ／ｄａｙ）に換算した。細胞数の測定は、クリスタルバイオレットにより細胞核を染色し、核数を計数する方法を用いた。すなわち、細胞数Ｘと、核数Ｙとの割合（Ｘ／Ｙ）は１：１．４５になることが実験的に知られており、この関係をもとに計数された核数を１．４５で除算して細胞数を算出した。この細胞数をもとに、上記の細胞（１０6ｃｅ１１ｓ）当りのアルブミン分泌速度を算出した。
図８に培養１４日目の肝細胞形態の比較を示す。
コラーゲンコートディッシュでは、ラット肝細胞は基板上に伸展した単層状態であったが、円柱セルアレイ化基板−旋回培養ではラット肝細胞はスフェロイドを形成し、その形態は良好に維持された。
図９にアルブミン分泌能の比較を示す。この結果、円柱セルアレイ化基板−旋回培養で形成されたスフェロイドは、単層培養の肝細胞よりも高機能発現ができることが示された。
【実施例４】
【００５０】
直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ（ファルコン製）表面の１．５ｃｍ角に、セル深さが５０μｍと一定で、セル直径とピッチが異なる三つの条件のハニカム構造を有する細胞培養チップを作製し、セル直径がスフェロイド形成に与える効果を比較した。
条件（５）：直径１００μｍ、深さ５０μｍの円柱状セルをピッチ１１０μｍの三角配置で設けた基板（１００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板）。
条件（６）：直径３００μｍ、深さ５０μｍの円柱状セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（３００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板）。
条件（７）：直径５００μｍ、深さ５０μｍの円柱状セルをピッチ５５０μｍの三角配置で設けた基板（５００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板）。
このようにして作製された各円柱セルアレイ化基板をアルコール滅菌および６時間の紫外線滅菌し、肝細胞の培養実験に使用した。
上記記載の方法によってラット肝細胞を調製し、細胞密度が５．０×１０5ｃｅ１１ｓ／ｍＬのラット細胞懸濁液を得た。この懸濁液２ｍＬを各条件（５）〜（７）の培養基板上に播種し、基板の振幅２５ｍｍ、回転速度５０ｒｐｍの条件で旋回培養を行った。培養の各期間において、位相差顕微鏡による観察を行い、各セル内の細胞形態を評価した。
【００５１】
図１０に培養７日目における各条件のラット肝細胞の形態を示す。
条件（５）の１００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板では、細胞培養セル内に細胞が導入されない部分も存在したが、細胞が導入された細胞培養セル内ではスフェロイドが形成された。
条件（７）の５００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板では、各細胞培養セル内においてスフェロイドの形成は見られるものの、１つの細胞培養セル内に２個以上のスフェロイドが形成される部分も存在した。
条件（６）の３００μｍ直径−円柱セルアレイ化基板では、１つの細胞培養セル内に１個のスフェロイドが形成された。
また、細胞培養セルの直径が５００μｍを超えるようになると、培養されるスフェロイドが大きくなりすぎてその中心部に壊死が生じたり、同一セル内に複数のスフェロイドが生じたりするなどの傾向が現れ、これらの結果より、スフェロイドを基板上で良好に培養させるためには、細胞培養セルの直径は５００μｍ以下が適していることが示された。
【実施例５】
【００５２】
直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ（ファルコン製）表面の１．５ｃｍ角に、セル直径が３００μｍ、ピッチが３３０μｍと一定で、セル深さが異なる三つの条件のアレイ構造を有する培養基板を作製し、セル深さがスフェロイドの形成に与える効果を比較した。
条件（８）：直径３００μｍ、深さ５０μｍの円柱セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（５０μｍ深さ−円柱セルアレイ化基板）。
条件（９）：直径３００μｍ、深さ１００μｍの円柱セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（１００μｍ深さ−円柱セルアレイ化基板）。
条件（１０）：直径３００μｍ、深さ２００μｍの円柱セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（２００μｍ深さ−円柱セルアレイ化基板）。
このようにして作製した円柱セルアレイ化基板をアルコール滅菌および６時間の紫外線滅菌し、肝細胞の培養実験に使用した。
上記記載の方法によってラット肝細胞を調製し、細胞密度が５．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬのラット細胞懸濁液を得た。この懸濁液２ｍＬを各条件の培養基板上に播種し、基板の振幅２５ｍｍ、回転速度５０ｒｐｍの旋回培養条件で旋回培養を行った。培養の各期間において、位相差顕微鏡による観察を行い、細胞形態を評価した。
図１１に培養７日目における各条件のラット肝細胞の形態を示す。いずれの条件においても、１つの細胞培養セル内に１個のスフェロイドが形成され、かつ形成されるスフェロイドの粒径はほぼ均一であった。
また、有底孔を有した細胞培養セルの場合はセルの深さが２０００μｍを超えるとスフェロイドへの酸素や栄養分の供給が阻害される場合があり、これらの結果より、細胞の生存に必要な酸素や栄養素などを十分に供給できる範囲のセル深さであれば、均一な粒径のスフェロイドを基板上でアレイ化することができることが示された。
【実施例６】
【００５３】
直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ（ファルコン製）表面の１．５ｃｍ角に、Ｕ字部またはテーパ部を備えた培養セルを有する細胞培養チップを作製し、セル形状がスフェロイドの配置に与える効果を検討した。
条件（１１）：直径３００μｍ、深さ１５０μｍの半球状セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（３００μｍ直径−半球セルアレイ化基板）。
条件（１２）：直径３００μｍ、深さ１５０μｍの円すい状セルをピッチ３３０μｍの三角配置で設けた基板（３００μｍ直径−円すいセルアレイ化基板）。
このようにして作製された各アレイ化基板をアルコール滅菌および６時間の紫外線滅菌し、肝細胞の培養実験に使用した。
上記記載の方法によってラット肝細胞を調製し、細胞密度が２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬのラット肝細胞懸濁液を得た。この懸濁液２ｍＬを条件（１１）、（１２）の培養基板上に播種し、振幅２５ｍｍ、回転速度５０ｒｐｍの条件で旋回培養を行った。培養の各期間において、位相差顕微鏡による観察を行い、各セル内の細胞形態を評価した。
図１２に培養７日目における各条件のラット肝細胞の形態を示す。いずれの条件においても、１つの細胞培養セル内にほぼ均一な粒径のスフェロイドが形成された。これらの結果より、培養セルが湾曲部やテーパ部を備えることで、均一な粒径のスフェロイドを基板上でアレイ化できることが示された。
【００５４】
（実施の形態２）
図１３は実施の形態２の細胞担持モジュールの模式断面図である。
図１３において、２０は実施の形態２の細胞担持モジュール、２１はその底部に配設されたメンブレンフィルム２１ａを有して所定間隔を有して積層配置された細胞培養チップ、２２は細胞培養チップ２１の基板表面２１ｂ上に円形又は多角形状断面の壁部２２ａを有して穿設された無底孔の底部をメンブレンフィルム２１ａで封止して形成されその内部に球状細胞組織体Ｓを保持する細胞培養セルである。
【００５５】
細胞培養チップ２１は前記実施の形態１の細胞培養チップ１０と同様にその基板表面２１ｂに細胞培養セル２２が規則配列されて穿設されたポリアセタール等の親水性高分子からなる板状体である。
なお、細胞培養チップ２１の素材としては、ポリアセタール等の親水性高分子の他に、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−エチレン−ブチレン共重合体、イソプレン重合体、ブタジエン−スチレン共重合体、ポリブタジエン、１，２−ポリブタジエン、イソプレン−イソブチレン共重合体、クロロプレン重合体等のジエン系ポリマー等の疎水性の基板表面２１ｂを穿孔加工した後、コラーゲンやホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、レシチンなどやこれらの不飽和脂肪酸を水添したもの等で被覆したりプラズマ処理等を行って、表面及びセル内壁面を親水性表面にすることもできる。
このようにして、細胞培養チップ２１上に種細胞を所定濃度で分散させた培養液を入れて種細胞を着床させる際の基板表面２１ｂへの種細胞の付着を防止すると共に、細胞培養チップ２１を回転又は揺動させてセル内の種細胞を球状細胞組織体に培養保持させる際に、球状細胞組織体Ｓが側壁面に付着しないようにして、球状細胞組織体Ｓの担持位置をセル中心位置に位置付ける位置制御性を高めるようにしてもよい。
【００５６】
細胞培養セル２２を形成する無底孔は、機械加工又はレーザービーム加工などにより形成することができる。なお、細胞培養チップ２１をスポンジ状などの三次元網目状組織体で構成してこの網目間を通液孔として、細胞培養セル２２の壁面や底面側から栄養液や培養液が流通できるようにしたものを用いることも可能である。
【００５７】
メンブレンフィルム２１ａなどの透水膜は、供給される栄養液などを透過させると共に、細胞培養セル２２内に球状細胞組織体Ｓを保持させる機能を担っている。
メンブレンフィルム２１ａの素材としてはセルロース系や合成高分子系、セルロース−合成高分子複合系等からなる中空糸型や平膜型の透析膜が適用できる。合成高分子からなるメンブレンフィルムには、ポリテトラフルオロエチレン膜やポリフッ化ビニリデン膜，ポリカーボネート膜が用いられる。なお、膜面のタンパク質吸着性や疎水性、親水性などを調整する場合は、フィブロネクチンやラミニン、コラーゲン、マトリゲルなどの表面性状調整成分を必要に応じてコーティングすることができる。
【００５８】
細胞担持モジュール２０は、実施の形態１に記載の細胞培養方法を用いて、球状細胞組織体Ｓを細胞培養チップ２１の細胞培養セル２２内で培養して、これを担持させた細胞培養チップ２１を平面状又は図１３に示すように積層状に配列させて全体を構成することができる。
【００５９】
実施の形態２の細胞担持モジュール２０は以上のように構成されているので、以下の作用を有する。
（ａ）細胞担持モジュール２０は、球状細胞組織体Ｓをそれぞれ担持させた細胞培養チップ２１の高密度集積化が可能であり、このような細胞担持モジュール２０を用いて化学、生化学関連装置を微小化でき、試料の節減、操作の自動化、高速化などが図られる。
（ｂ）各細胞培養セル２２内にそれぞれ種類やタンパク質分泌機能などが異なる球状細胞組織体Ｓを配置することもでき、試験体に対する種々の官能性等を同時にチェックして、チェック項目が多岐にわたる新薬スクリーニング等の処理を迅速かつ的確に行うことができる。
（ｃ）各セル内に栄養分や酸素などを補給循環させるメンブレンフィルム２１ａを有し、球状細胞組織体Ｓを細胞培養セル２２内に保持させているので、三次元状に立体配置される各セル内の環境を球状細胞組織体が所定の生体機能を発現するような環境条件に設定でき、信頼性に優れた分析システムなどを構築することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、細胞を培養して担持させるための細胞培養チップ、培養器及びそれらを用いた球状細胞組織体の細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体などの細胞培養技術に関し、培養液中の種細胞を規則配列された細胞培養セル内に着床させ、この種細胞を均一な大きさの球状細胞組織体に培養してこれらをそれぞれ規則配列させた状態で担持させることができるので、再生医療や、ハイブリッド型人工臓器、生体有用物質生産、生物組織や器官・臓器の機能の調査・探索、新薬のスクリーニング、内分泌かく乱物質等の影響を評価する動物実験代替法、センサ機能を有する細胞チップ等の各分野へ適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施の形態１の細胞培養チップが載置された培養器の斜視図
【図２】細胞培養チップの拡大断面図
【図３】条件（１）平面基板−静置培養におけるラット肝細胞の形態比較図
【図４】条件（２）平面基板−旋回培養におけるラット肝細胞の形態比較図
【図５】条件（３）円柱セルアレイ化基板−静置培養におけるラット肝細胞の形態比較図
【図６】条件（４）円柱セルアレイ化基板−旋回培養におけるラット肝細胞の形態比較図
【図７】ラット肝細胞スフェロイドの培養７日目における粒径分布図
【図８】ラット肝細胞の形態比較図
【図９】アルブミン分泌能の比較図
【図１０】条件（５）〜（７）における培養７日目のラット肝細胞の形態比較図
【図１１】条件（８）〜（１０）における培養７日目のラット肝細胞の形態比較図
【図１２】条件（１１）、（１２）における培養７日目のラット肝細胞の形態比較図
【図１３】実施の形態２の細胞担持モジュールの模式断面図
【符号の説明】
【００６２】
１０  細胞培養チップ
１０ａ  基板表面
１１  細胞培養セル
１１ａ  底部
１１ｂ  壁部
１１ｃ  テーパ部
１２  培養器
２０  細胞担持モジュール
２１  細胞培養チップ
２１ａ  メンブレンフィルム
２１ｂ  基板表面
２２  細胞培養セル
２２ａ  壁部
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図９】
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【図１３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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