(57)【要約】【課題】  黄色ブドウ球菌に対する新規なワクチンの提供。【解決手段】  ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの変異体であって、Ｔ−細胞受容体結合部位及び主要組織適合性抗原II結合部位に変異を有し、これによりスーパー抗原活性を欠失しており、且つエンエロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質を免疫原とするワクチン。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの変異体であって、Ｔ−細胞受容体結合部位及び主要組織適合性抗原II結合部位に変異を有し、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンエロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAsp及び94位のTyrが他のアミノ酸により置換されており、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質。
【請求項３】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているエンテロトキシンＣ免疫原性タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を含んで成るブドウ球菌に対するワクチン。
【請求項５】
MRSAの病院感染、ウシ乳房炎等の動物感染症等に有効な請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項２又は３に記載のタンパク質の製造方法において、請求項７に記載の宿主細胞を培養し、そして培養物から当該タンパク質を採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無毒化されたタンパク質性ワクチンに関し、さらに詳しくは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のエンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの無毒性変異体、及び当該変異体タンパク質を含んで成るワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は、病院感染及び日和見感染の重要な病原菌である。また、生活習慣病のリスクを上昇させる一因となっている。MRSAは生体表層部及び深部において常在性を示し、他の多くの病原性細菌と比べて、宿主感染防御が有効に働かず、特に糖尿病患者および高齢者において慢性化・反復感染しやすい。MRSAに対する治療のために抗生物質が使用されているが、近年、多剤耐性菌株が続出し、MRSAに対する治療はますます困難になっている。
【０００３】
これまで、ブドウ球菌感染に対するワクチンの開発については、死菌ワクチン、トキソイドワクチン、莢膜ワクチンなどについて研究が行なわれてきた。しかしながら、死菌ワクチンは十分な獲得防御免疫を誘導せず、トキソイドワクチンは化学的不活性化工程を介して調製されるため生成物の特徴付けが困難である。不活性化された毒素は活性をもつ毒素に戻る可能性が否定できない。また、トキソイドの調製に使用する野生型毒素をブドウ球菌から精製するのは非常に煩雑であり、収量が低く、そのうえ、不活性化のために使用される化学物質の多くが毒性を示す。これらの理由から、今までの研究は満足な成果が得られず、ブドウ球菌に対するワクチンはまだ、実用化されていない。
【０００４】
黄色ブドウ球菌が産生する菌体外タンパク質毒素であるエンテロトキシンはスーパー抗原活性を有し、重要な病原因子であることが知られている。黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原は、食中毒、毒素性ショック症候群、炎症性疾患である川崎病症候群と関連があることが知られている。MRSAの病院感染、ウシ乳房炎等の動物感染症に対する無毒・安全なワクチンの開発が、特に臨床及び食料品の生産現場において求められている。
しかしながら、スーパー抗原活性の喪失により上記の毒性を有さず、且つブドウ球菌に対する免疫原性を十分に維持しているワクチンは知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、スーパー抗原活性の喪失により上記の毒性を有さず、且つブドウ球菌に対する免疫原性を十分に維持しているワクチンを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討の結果、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンＣのＴ細胞受容体結合部位および主要組織適合性抗原複合体（MHC）クラスII結合部位に変異を導入することによりスーパー抗原活性を欠損または低下せしめることが出来、これによりエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しながら、エンテロトキシンＣの毒性を低減せしめることが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
従って、本発明は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）エンテロトキシン（enterotoxin）Ｃの変異体であって、Ｔ−細胞受容体結合部位及び主要組織適合性抗原クラスII結合部位に変異を有し、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質を提供する。このようなタンパク質の具体例として、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAsp及び94位のTyrが他のアミノ酸により置換されており、これによりスーパー抗原活性を欠損しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているタンパク質が挙げられる。
【０００８】
より具体的な例として、本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するブドウ球菌のエンテロトキシンＣの23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているエンテロトキシンＣ免疫原性タンパク質を提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質を含んで成るブドウ球菌に対するワクチンを提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、上記の核酸を含んで成るベクターを提供する。本発明はまた、上記のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質の製造方法において、上記の宿主細胞を培養し、そして培養物から当該タンパク質を採取することを特徴とする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンには、Ａ〜Ｒが知られており、本発明はエンテロトキシンＣに関する。本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の基礎となる生来のエンテロトキシンＣをコードする核酸、例えばDNAは、黄色ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌のFRI株（Bergdoll博士．Bergdoll.MS. 1983.Enterotoxins, in C.S.F.Easton and C.Adlam(ed), Staphylococci and Staphylococcal infections.Academic Press, United Kingdom.）から、常法に従ってクローニングすることが出来る。一例として、エンテロトキシンＣは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有し、例えば配列番号：１に記載の塩基配列を有する核酸によりコードされている。
【００１０】
しかしながら、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の元になるエンテロトキシンＣは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するもののみならず、対立遺伝子変異、その他の天然変異、あるいは人工的変異誘発により、配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加・挿入、及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ生来のエンテロトキシンＣの活性を有するタンパク質も含む。
【００１１】
生来のエンテロトキシンＣをコードする核酸はまた、配列番号：１に示す塩基は配列から設計されたプローブ、又はプライマー対を用いて、黄色ブドウ球菌のDNAからクローニングすることが出来る。従って、本願発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体の基礎になる生来のエンテロトキシンＣには、高ストリンジエント条件下で、配列番号：１に記載の塩基配列を有する核酸又はその断片、好ましくは15塩基以上の長さを有する断片にハイブリダイズする核酸にコードされており、且つ生来のエンテロトキシンＣの活性、即ちスーパー抗原活性及びエンテロトキシンＣ免疫原性を有するタンパク質も含まれる。
【００１２】
エンテロトキシンＣは、その分子中にＴ細胞受容体に対する結合部位（配列番号：２に示すアミノ酸配列中、アミノ酸番号20及び23）及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位（配列番号：２に示すアミノ酸配列中、アミノ酸番号90、94及び103）を含み、これによりＴ細胞受容体と主要組織適合性抗原クラスIIとの間の相互作用を介在し、これによりＴ細胞が腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、インターフェロン−γ（IFN-γ）、インターロイキン−２（IL-2）、インターロイキン−６（IL-6）を分泌し、エンテロトキシンＣのスーパー抗原活性が惹起される。
【００１３】
本発明によれば、エンテロトキシンＣ分子中のＴ細胞受容体に対する結合部位及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位中に変異を導入することにより、エンテロトキシンＣの免疫原性を維持しながら、スーパー抗原活性を欠損又は低下せしめることが出来る。変異部位としては、上記の結合部位の範囲内で選択することが出来、具体例としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、Ｔ細胞に対する結合部位内に存在する23位のAsp、及び主要組織適合性抗原クラスIIに対する結合部位内に存在する94位のTyrが挙げられる。
【００１４】
変異の種類としては、上記の特定の部位の欠失、又は他のアミノ酸による置換が挙げられる。例えば、配列番号：２における23位のAspは、Asp以外のアミノ酸により置換することが出来、94位のTyrはTyr以外のアミノ酸により置換することが出来る。好ましくは、中性アミノ酸、例えばAla、Val、Leu、Ileなどを挙げることが出来、特にAlaが好ましい。変異の導入は、常法に従って、例えば部位特定点変異誘発法により行なうことが出来る。
【００１５】
本発明の、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、生来のエンテロトキシンＣをコードするDNAに、上記のようにした変異を導入した後、変異したDNAを適当な発現用ベクターに挿入し、このベクターにより宿主細胞を形質転換し、形質転換体を培養し、培養物からエンテロトキシンＣ無毒性変異体を採取することにより得ることができる。宿主としては、原核生物細胞、例えば細菌細胞、典型的には大腸菌細胞、真核微生物細胞、例えば真菌細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞、などを使用することが出来、酵母としてはサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母が挙げられ、糸状菌としては、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属の糸状菌が挙げられる。更に、高等真核細胞として、培養された植物細胞や動物の培養細胞が挙げられる。これらの宿主細胞に使用は常用技術であり、本願発明の特徴を構成するものではない。
【００１６】
本発明の発現ベクターは、少なくとも、エンテロトキシンＣの無毒性変異体をコードするDNA及び当該DNAの発現を制御する制御配列を含んで成る。プロモーターなどの制御配列は、宿主細胞に依存して選択することが出来、常用のプロモーターなどを適宜使用することが出来る。
また、発現ベクターの構築、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行なうことが出来る。
【００１７】
エンテロトキシンＣ無毒性変異体の製造のための宿主細胞の培養は、宿主の種類やプロモーターの種類等に依存して、常法に従って行なうことが出来る。培養物からの、目的エンテロトキシンＣ無毒性変異体の採取は、タンパク質の回収・精製に用いる常法に従って行なうことができる。例えば、大腸菌宿主等の培養により生産されたエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、宿主培養物から当該変異体タンパク質を含む溶液を得た後、SDS-PAGE、および抗エンテロトキシンＣ抗体とのゲル内沈降反応により、高純度の、免疫原性を有し、且つスーパー抗原活性が欠損し、又は低下したエンテロトキシンＣ無毒性変異体を得ることができる。
【００１８】
本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、スーパー抗原活性が欠損または低下しており、このことは、当該変異体の存在下及び非存在下で、例えば脾細胞を培養し、培養上清中のサイトカイン、例えば腫瘍壊死因子−α（TNF-α）、インターフェロン−γ（IFN-γ）、インターロイキン−２（IL-2）、インターロイキン−６（IL-6）等を測定し、エンテロトキシンＣの変異体の存否による上記のサイトカインの差（サイトカインの産生量が、前記エンテロトキシンＣ変異体の非存在下に比べて存在下において減少すること）により確認することが出来る。実施例２の結果を示す図１から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣの変異体の存在下でインターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子−αの産生が低下し、スーパー抗原活性の阻害が確認された。
【００１９】
本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、エンテロトキシンＣの免疫原性を有し、黄色ブドウ球菌の感染に対するワクチン効果を有する。このことを確認するため、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されているもの；本明細書、特に実施例において、「dmSEC」と称する場合がある）、23位のAspのみをAlaにより置換したエンドトキシンＣ変異体（本明細書、特に実施例において「mSEC」と称する）、組換え生産された生来のエンドトキシンＣ（本明細書、特に実施例において、「rSEC」と称する場合がある）、アジュバントとして機能するコレラトキシン（CTと称する場合がある）のみ、及びリン酸緩衝液のみ（PBSと称する）、を用いて、次の実験を行った。
【００２０】
（Ａ）マウスの感染生存試験
（ａ）20 μg/マウスのdmSECのみ［dmSEC］；（ｂ）20 μg/マウスのdmSECと、アジュバントとしてのCT［dmSEC＋CT］；及び（ｃ）CTのみ、をBALB/cマウスに経鼻投与し、更に２週間後及び４週間後に追加経鼻免疫を行なった。２回目の追加免疫の１週間後、黄色ブドウ球菌（MRSA臨床分離株、SEC生産株）を致死量（生菌として5000万個/マウス）を経静脈感染させた。実施例３のＡの結果示す図２から明らかな通り、コレラトキシン（CT）のみに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ（dmSEC）の場合、黄色ブドウ球菌に感染されたマウスの生存率が上昇し、特にエンテロトキシンＣ（dmSEC）のアジュバントとしてコレラトキシン（CT）を用いた場合［dmSEC＋CT］、生存率は大きく上昇した。
【００２１】
（Ｂ）細菌残留試験
上記（Ａ）の方法において、黄色ブドウ球菌を感染させた後３日目にマウスを失血死させ、脾臓、肝臓及び腎臓に存在する菌数を、寒天平板上のコロニー数（CFU）として求めた。実施例３のＢの結果を示す図３から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）をコレラトキシン（CT）とともに投与した場合、脾臓及び肝臓において、黄色ブドウ球菌の数は有意に低下した。
【００２２】
（Ｃ）各種抗体の生成
上記の実験において、５から６週間後のマウスの血清中の各種の抗エンテロトキシンＣ抗体を、組換えエンテロトキシンＣを抗原として用いて、ELISAにより測定した。実施例３のＣの結果を示す図４から明らかな通り、殆どの抗体について、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体（dmSEC）を投与した場合と、生来の組換えエンテロトキシンＣを投与した場合とで、抗体の産生レベルはほぼ同じであり、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体において、エンテロトキシンＣに対する免疫原性が維持されていることが確認された。
【００２３】
上記の通り、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、スーパー抗原活性が欠失又は低下しており、そのため毒性が無く又は低下しており、且つエンテロトキシンＣの免疫原性を維持しているため黄色ブドウ球菌の感染に対してワクチン活性を有し、従って、MRSAの病院感染、ウシの乳房炎、その他黄色ブドウ球菌の感染に関する疾患の予防又は治療剤として有用である。
本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体は、常法に従って、常用の医薬キャリヤーと配合することにより、ワクチン製剤に製剤化することが出来る。ワクチン製剤は通常、非経口的に、例えば注射により投与される。
【実施例】
【００２４】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
実施例１. エンテロトキシンＣの無毒性変異体の調製
１．エンテロトキシンＣ（SEC）をコードするDNAのクローニング
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）FRI 361株（Bergdoll, MS. 1983, Enterotoxins, in C.S.F.Easton and C.Adlam(ed), Staphylococci and Staphylococcal infections. Academic Press, United Kindom.）から、常法により（Betley.M.J.and Mekalanos, J.J. 1988. J.Bacteriol.170:34-41.）sec２遺伝子を含むゲノムDNAを分離した。遺伝子組換えSEC（rSEC）発現ベクターを構築するため、sec2遺伝子を、プライマー（（プライマーの塩基配列5'-CCCCGGATTCGAGAGCCAACCAGACCCTACG（配列番号：３；及び5'-CCCCGAATTCTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG）（配列番号：４）を用いてPCR法により増幅し、大腸菌ベクターpGEM3Zf(+)にサブクローニングした。次に、sec2遺伝子をBam HI及びEco RIにより切り出し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（glutation  S-transferase；GST）発現ベクターpGEX-6P-1に導入し、発現ベクター（pKC2X1）を構築した。
【００２５】
２．エンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）の調製
前記のベクターpKC2X1から、エンテロトキシンＣ分子のＮ末端から23位のAsp（Ｔ細胞受容体への結合部位に含まれる）及び94位のTyr（MHCクラスIIの結合部位に含まれる）をそれぞれAlaで置換するため、23位のAspのコドンATTをAlaのコドンGCTに変え、そして94位のTyrのコドンTATをAlaのコドンGCTに変えた。変異を導入したDNA断片を含む発現ベクター（pGXmSECとpGXdmSEC）を構築した。次に、この発現ベクターにより大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換体pGXmSEC/DH52とpGXdmSEC/DH52を得た。
この形質転換体を、アンピシリンを含む2×YTA培地で培養し、菌体から抽出したタンパク質を、GST精製モジュールにより精製した。
【００２６】
実施例２. スーパー抗原活性の低下
BALB/cマウスの脾細胞を調製し、100万個/mlとなるように、10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地に懸濁し、これに、（ａ）本発明のエンテロトキシンＣ変異体（dmSEC）、（ｂ）エンドトキシンＣの23位のAspをAlaに置換したのみの変異体（mSEC）、及び組換え産生された生来のエンテロトキシン（rSEC）を、種々の濃度で添加し、二酸化炭素培養装置中で72時間インキュベートし、培養上清中のインターフェロン−γ（IFN-γ）及び腫瘍壊死因子−α（TNF-α）をELISAにより測定した。結果を図１に示す。
【００２７】
この図から明らかな通り、rSECは濃度依存的にIFN-γの産生を誘導するのに対して、dmSECはIFN-γの産生を殆ど誘導しなかった。また、TNF-αの誘導量も、rSECに比べてdmSECの方が有意に低かった。脾細胞の培養におけるIFN-γやTNF-αなどのサイトカインの産生誘導はスーパー抗原活性の指標となるので、実施例２の結果を示す図２は、生来のエンテロトキシンＣに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ変異体のスーパー抗原活性は有意に低下していることを示している。
【００２８】
実施例３. エンテロトキシンＣの免疫原活性の維持
本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体は、エンテロトキシンＣの免疫原性を有し、黄色ブドウ球菌の感染に対するワクチン効果を有する。このことを確認するため、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、23位のAspがAlaにより置換されており、且つ94位のTyrがAlaにより置換されておるもの；本明細書、特に実施例において、「dmSEC」と称する場合がある）、23位のAspのみをAlaにより置換したエンテロトキシンＣ変異体（本明細書、特に実施例において「mSEC」と称する）、組換え生産された生来のエンテロトキシンＣ（本明細書、特に実施例において、「rSEC」と称する場合がある）、アジュバントとして機能するコレラトキシン（CTと称する場合がある）のみ、及びリン酸緩衝液のみ（PBSと称する）、を用いて、次の実験を行った。
【００２９】
（Ａ）マウスの感染生存試験
（ａ）20 μg/マウスのdmSECのみ［dmSEC］；（ｂ）20 μg/マウスのdmSECと、アジュバントとしてのCT［dmSEC＋CT］；及び（ｃ）CTのみ、をBALB/cマウスに経鼻投与し、更に２週間後及び４週間後に追加経鼻免疫を行なった。２回目の追加免疫の１週間後、黄色ブドウ球菌（MRSA臨床分離株、SEC産生株）を致死量（生菌として5000万個/マウス）を経尾静脈感染させ、その後15日間のマウスの生存状態を観察した。図２から明らかな通り、コレラトキシン（CT）のみに比べて、本発明のエンテロトキシンＣ（dmSEC）の場合、黄色ブドウ球菌に感染されたマウスの生存率が上昇し、特にエンテロトキシンＣ（dmSEC）のアジュバントとしてコレラトキシン（CT）を用いた場合［dmSEC＋CT］、生存率は大きく上昇した。これにより、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体が黄色ブドウ球菌に対するワクチンとして有効であることが確認された。
【００３０】
（Ｂ）細菌残留試験
上記（Ａ）の方法において、黄色ブドウ球菌を感染させた後３日目にマウスを失血死させ、脾臓、肝臓及び腎臓に存在する菌数を、寒天平板上のコロニー数（CFU）として求めた。図３から明らかな通り、本発明のエンテロトキシンＣ無毒性変異体（dmSEC）をコレラトキシン（CT）とともに投与した場合、脾臓及び肝臓において、黄色ブドウ球菌の数は有意に低下した。
【００３１】
（Ｃ）各種抗体の生成
上記の実験において、５から６週間後のマウスの血清中の各種の抗エンテロトキシンＣ抗体を、組換えエンテロトキシンＣを抗原として用いて、ELISAにより測定した。図４から明らかな通り、測定した殆どの抗体について、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体（dmSEC）を投与した場合と、生来の組換えエンテロトキシンＣを投与した場合とで、抗体の産生レベルはほぼ同じであり、本発明のエンテロトキシンＣの無毒性変異体において、エンテロトキシンＣに対する免疫原性が維持されていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、脾細胞の培養における、各種形態のエンテロトキシンＣの添加と、産生されるIFN-γ（図１のＡ）及びTNF-α（図１のＢ）との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、各種被験体により免疫されたマウスに黄色ブドウ球菌を接種した後のマウスの生存率の経過を示すグラフである。
【図３】図３は、各種被験体により免疫されたマウスに黄色ブドウ球菌を接種した後に、マウスの各器官に存在する黄色ブドウ球菌の数を示すグラフである。
【図４】図４は、各種被験体により免疫されたマウスの血清に生成する各種抗体の量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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