(57)【要約】【課題】簡便にかつ短時間で信頼性の高い、糖鎖と生体分子との反応を検出する方法を提供する。【解決手段】蛍光標識された糖鎖を含む溶液と糖鎖に結合する物質を含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求める。溶液中にコンカナバリンＡが含まれるか検出する場合、蛍光標識したトリマンノースを含む溶液に、コンカナバリンＡが含まれるかもしれない溶液を徐々に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めれば、コンカナバリンＡの存在を検出することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識された糖鎖を含む溶液と糖鎖に結合する物質を含む溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする糖鎖と糖鎖に結合する物質との反応を検出する方法。
【請求項２】
前記糖鎖に結合する物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学物質または脂質を含む生体分子を含むことを特徴とする請求項１の糖鎖と糖鎖に結合する物質との反応を検出する方法。
【請求項３】
検出の対象である溶液と、蛍光標識された糖鎖とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有し、
前記混合するステップにおいて前記検出の対象である溶液の量を段階的に増加して混合し、各段階の量で前記検出の対象である溶液を混合した後に前記並進拡散時間を求めるステップを行うことを特徴とする溶液中の糖鎖に結合する物質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖鎖と生体分子との反応を検出する方法に関し、特に蛍光相関分光計(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いて相互作用解析を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１（I.Okazaki., Trend in Glycoscience and Glycotechnology. 54 (1998), 321-329）は、糖鎖または糖鎖に反応する物質を膜上に固定し、固定化した物質に結合する物質を含む溶液を膜上に加え、膜上に固定した物質の重量変化を表面プラズモン反応を用いて測定し、結合反応を検出することを記載する。
【０００３】
非特許文献２（Y.Ohyama et al., Journal of Biological Chemistry. 280 (1985), 6882-6887）は、糖鎖に結合する物質を担体（カラム）上に固定し、放射性同位体元素で標識した糖鎖を含む溶液を担体上に加え、結合反応によって担体に残った糖鎖を、担体から回収して放射線計測し、結合反応の有無や結合量などを検出することを記載する。
【０００４】
特許文献１（特開2003-88369号公報）は、蛍光相関分光法(FCS)を利用してDNAエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間(translational diffusion time)の大小との関係を記載する。
【０００５】
特許文献２（特表2002-543414号公報）は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重(multiple)分布分析(FIMDA)および蛍光自己たたみ込み(autoconvoluted)強度分布分析(FACID)から並進拡散時間が得られることを記載する。
【非特許文献１】I.Okazaki., Trend in Glycoscience and Glycotechnology. 54 (1998), 321-329
【非特許文献２】Y.Ohyama et al., Journal of Biological Chemistry. 280 (1985), 6882-6887
【特許文献１】特開2003-88369号公報
【特許文献２】特表2002-543414号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記背景技術のうち、非特許文献１（I.Okazaki., Trend in Glycoscience and Glycotechnology. 54 (1998), 321-329）および非特許文献２（Y.Ohyama et al., Journal of Biological Chemistry. 280 (1985), 6882-6887）に記載される各検出方法は、固体基質への分子の固定したり放射性同位元素を用いたりするので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかる問題がある。
【０００７】
特に、糖鎖または糖鎖に反応する物質を膜や担体に固定した場合、一方の物質が固定されているために、結合時に生じるはずの形状変化が妨げられて、実際に生体内で生じている結合反応とは異なる反応が生じている可能性がある。実際に生体内で生じている結合反応とは異なる反応が生じていると、検出された結合反応の有無や結合量の信頼性が低くなる問題がある。
【０００８】
特許文献１（特開2003-88369号公報）および特許文献２（特表2002-543414号公報）は、糖鎖と生体分子との反応を検出する方法については記載しない。
【０００９】
本発明の目的は、簡便にかつ短時間で信頼性の高い、糖鎖と生体分子との反応を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成する本発明の特徴は、蛍光標識された糖鎖を含む溶液および糖鎖に結合する物質を含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。
【００１１】
この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、糖鎖または糖鎖に反応する物質を膜や担体に固定することなく、簡便にかつ短時間で糖鎖と生体分子との反応を検出することができる。また、糖鎖と生体分子とを生体内に近い環境で反応させるので、信頼性の高い結合反応の有無や結合量を検出することができる。
【００１２】
また、糖鎖に結合する物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学物質または脂質を含む生体分子であり、生体分子は生物由来でも化学合成したものでもよい。
【００１３】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と蛍光標識された糖鎖とを混合する際に、検出の対象である溶液の量を段階的に増加して、各段階で蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。
【００１４】
この特徴によれば、検出の対象である溶液の添加量の増加と共に、蛍光標識を有する物質の並進拡散時間が増加した場合、溶液中の糖鎖に結合する物質と糖鎖とが結合したことになり、したがって、検出の対象である溶液中に糖鎖に結合する物質を検出できたことになる。蛍光標識を有する物質の並進拡散時間が増加しない場合。検出の対象である溶液中に糖鎖に結合する物質が含まれないことが検出される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、糖鎖または糖鎖に反応する物質を膜や担体に固定することなく、簡便にかつ短時間で糖鎖と生体分子との反応を検出することができる。また、糖鎖と生体分子とを生体内に近い環境で反応させるので、信頼性の高い結合反応の有無や結合量を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本実施の様態では、糖鎖と糖鎖に結合する生体物質との結合を検出するための実験を行う。実験では糖鎖と生体物質との反応過程後にＦＣＳ測定を行って、反応物の並進拡散時間を求める。
【００１７】
並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は糖鎖と生体物質との結合反応を、分子量の減少は糖鎖の分解反応を、分子量の維持は糖鎖と生体物質との間に結合も分解も無かったことを示す。従って、糖鎖と生体物質との反応の前後で糖鎖の並進拡散時間の増加を検出することにより、糖鎖と生体物質との結合反応を検出することができる。
【００１８】
図３に本実施例で用いる蛍光標識糖鎖１を示す。蛍光標識糖鎖１は、糖鎖とそれに結合させた蛍光色素を有する。糖鎖としてトリマンノース２を、蛍光色素としてローダミングリーン３を用いた。
【００１９】
蛍光標識糖鎖１に結合する生体物質として、コンカナバリンＡ（和光製033-08773）を用いる。
【００２０】
反応バッファー(Buffer)として10mMのHEPES(pH7.2)、500mMのNaCl、100mMのMnCl2および100mMのCaCl2の混合液を用いる。
【００２１】
実験のための試料の作り方を説明する。
【００２２】
蛍光標識糖鎖１を10mMのHEPES(pH7.2)で1mg/mlに希釈し、これをさらに反応バッファーで希釈し、FCS測定時にコンフォーカルボリュームにおける粒子数が５程度になるように調整した（約10万分の2倍の希釈）。
【００２３】
コンカナバリンＡは反応バッファーを用いて、0(成分なし)、0.2、0.5、1、2.5、5、10および50μMの各種濃度のものを用意した。
【００２４】
次に蛍光標識糖鎖１とコンカナバリンＡの反応実験の方法を説明する。
【００２５】
希釈した蛍光標識糖鎖１と各種濃度のコンカナバリンＡとを25μlずつ混合した。各溶液中のコンカナバリンＡの濃度は、0、0.1、0.25、0.5、1.25、2.5、5および25μMとなる。これらの混合液を室温15分間反応させた後、測定用プレートに移し、生成物をFCS測定して並進拡散時間を求めた。FCS測定は波長488nm、出力200μWのレーザー光を1回に20秒照射する条件で3回行った。同一の反応条件で2回の実験Ａ、Ｂを行った。
【００２６】
実験Ａ，ＢのFCS測定の結果を表１に示す。
【表１】
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図１にコンカナバリンＡの濃度に対する反応物の並進拡散時間の変化を示す。実験Ａ、Ｂ共に、コンカナバリンＡの濃度が増加すると生成物の並進拡散時間が増加しており、コンカナバリンＡの濃度が5μM以上でほぼ一定となった。従って、糖鎖とコンカナバリンＡとに分子間相互作用があることが分かる。
【００２７】
コンカナバリンＡ濃度が0μＭのときの生成物すなわち未反応の蛍光標識糖鎖１の並進拡散時間（実験Ａでは226μs、実験Ｂでは215μs）に比べて、コンカナバリンＡ濃度が5μM以上のときの反応物の並進拡散時間が大きくなっており（実験Ａでは607μs、実験Ｂでは558μs）、蛍光標識糖鎖１とコンカナバリンＡとが結合したことが確認できた。
【００２８】
次に、このFCS測定結果を基に、未反応の蛍光標識糖鎖１（K1：並進拡散時間が実験Ａでは226μs、実験Ｂでは215μsであるもの）と反応生成物（K2：並進拡散時間が実験Ａでは607μs、実験Ｂでは558μsであるもの）との存在割合を解析した。解析結果を表２に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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図２にコンカナバリンＡの濃度に対する未反応の蛍光標識糖鎖１(K1)と反応生成物(K2)との存在割合を示す。実験Ａ、Ｂ共に顕著に、コンカナバリンＡの濃度が増加すると未反応の蛍光標識糖鎖１の割合が減り、反応生成物の割合が増加した。
【００２９】
測定結果から、蛍光標識糖鎖１とコンカナバリンＡとが１対１で結合すると仮定して（実際にはコンカナバリンＡには複数の糖鎖がつく）Kd値を求めると、実験Ａでは3.2±0.7×10-7M、実験Ｂでは3.8±1.2×10-7Mとなった。
【００３０】
本実施の様態によって、ローダミングリーンで標識したトリマンノースとコンカナバリンＡとの反応をFCS測定することができた。また、簡易ながらKd値を求めることができた。この実験系を使えば、レクチン反応阻害剤のスクリーニングなどをFCS測定し、解析することも十分可能であると考えられる。
【００３１】
溶液中にコンカナバリンＡが含まれるか検出する場合、蛍光標識したトリマンノースを含む溶液に、コンカナバリンＡが含まれるかもしれない溶液を徐々に添加して生成物をFCS測定し、並進拡散時間を求めれば、コンカナバリンＡの存在を検出することができる。このとき、蛍光標識したトリマンノースの最終濃度が5nM程度になるように、蛍光標識したトリマンノースを含む溶液の濃度を調整するとよい。
【００３２】
上述した実施の形態では、生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS法)を用いたが、蛍光相関分光法(FCS)の代わりに、蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy, FCCS法)や蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis, FIMDA法）を用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実験ＡおよびＢでの各反応後の生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２】実験ＡおよびＢでのコンカナバリンＡ濃度に対する未反応物(K1)と反応生成物(K2)との存在割合を示すグラフ。
【図３】実験で用いる蛍光標識糖鎖１を示す図。
【符号の説明】
【００３４】
１…蛍光標識糖鎖、２…トリマンノース、３…ローダミングリーン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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