(57)【要約】【課題】ｄｓＲＮＡを転写と同時に形成させることが可能なイン・ビトロ転写反応を利用した機能性ＲＮＡ分子の製造方法を提供する。【解決手段】鋳型領域及びこの鋳型領域の両側にＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター領域をそれぞれ有する２本鎖ＤＮＡであって、鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にニックが存在するか、または、鋳型領域の５’末端の少なくとも１塩基が欠損しており、かつ鋳型領域の塩基数が５０以下である２本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、ＲＮＡポリメラーゼの基質の存在下で、プロモーター領域により転写が開始されるＲＮＡポリメラーゼを作用させて、少なくとも鋳型領域に相当するＲＮＡ領域を含む２本鎖ＲＮＡを調製する方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型領域及びこの鋳型領域の両側にＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター領域をそれぞれ有する２本鎖ＤＮＡであって、前記鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にニックが存在するか、または、鋳型領域の５’末端の少なくとも１塩基が欠損しており、かつ鋳型領域の塩基数が５０以下である２本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、
ＲＮＡポリメラーゼの基質の存在下で、前記プロモーター領域により転写が開始されるＲＮＡポリメラーゼを作用させて、少なくとも前記鋳型領域に相当するＲＮＡ領域を含む２本鎖ＲＮＡを調製する方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡポリメラーゼの作用をピロホスファターゼ及びマグネシウムイオンの存在下で行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡポリメラーゼの濃度が２．５〜３２．５ｕｎｉｔ／μＬの範囲であり、マグネシウムイオンの濃度が１５〜３０ｍＭの範囲である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ピロホスファターゼの濃度が０．０２５〜０．０２５ｕｎｉｔ／μＬの範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡポリメラーゼの基質が、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、及びウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡポリメラーゼの各基質の濃度が６〜７．５ｍＭの範囲である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡポリメラーゼの基質の少なくとも１つが、標識されている請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標識が、蛍光標識、放射性同位体標識、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、２’−フルオロ標識または２’−Ｏ−メチル標識である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型領域の塩基数が、１９〜２３の範囲であり、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端または５’末端に１または２塩基の突出端を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端に１、２または３塩基の追加の塩基配列を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型領域の塩基数が１９〜２１であり、前記２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端の追加の塩基配列が２または３塩基であり、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端に２塩基の突出端を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記２本鎖ＤＮＡは、
（１）  鋳型領域のセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（２）  鋳型領域のアンチセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（３）（１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、及び
（４）（２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、
のアニール生成物である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と（２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域とが同一の配列を有し、（３）及び（４）の１本鎖ＤＮＡが同一の配列を有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型ＲＮＡポリメラーゼであって、前記アミノ酸の欠失が、プロテアーゼが作用する領域中、または大腸菌プロテアーゼが作用する領域中に存在する塩基性アミノ酸について行われ、かつ前記塩基性アミノ酸が、リジン及び／又はアルギニンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＫ１１  ＲＮＡポリメラーゼの変異体である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７２、１７３、１７８、１７９及び１８０から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７３、１７４、１７９、１８０及び１８１から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｋ１１ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１９２、１９３、１９８、１９９及び２００から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１３６、１３７、１４０、１４１、１４２及び１４３から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記欠失したアミノ酸の数が１〜１０である請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸の置換及び／又は欠失以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有する請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、以下の（１）〜（１２）に示すいずれかのＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１４に記載の方法。
（１）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（２）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（３）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジンと１７３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（４）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（５）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（６）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（７）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（８）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（９）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１０）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１１）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１２）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
【請求項２４】
少なくとも一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であり、他方のプロモーター領域の３’末端がアデニン残基、シトシン残基またはウリジン残基である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
生成した２本鎖ＲＮＡをグアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼを用いて処理する請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＴ１である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも（１）  ＲＮＡポリメラーゼ及び
（２）  ＲＮＡポリメラーゼの基質を含む２本鎖ＲＮＡ調製用キット。
【請求項３０】
（３）ピロホスファターゼ及び（４）マグネシウム塩をさらに含む請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
（５）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域であるＤＮＡの５’鎖の一本鎖ＤＮＡの一方または両方をさらに含む請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
転写反応用バッファーをさらに含む請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
グアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼをさらに含む請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＴ１である請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ＲＮＡポリメラーゼが、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
取扱説明書をさらに含む請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イン・ビトロ転写反応を利用した、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）などに利用できる短鎖の２本鎖ＲＮＡ分子の製造方法に関するものである。特に、細胞や生体内に導入後、特異的な遺伝子機能を効率的に抑制することができる、所望の塩基数を有する機能性の高い２本鎖ＲＮＡ分子を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子機能の解析方法の１つとして、その遺伝子を特異的に不活性化し、欠失した表現型を解析する方法がある。
【０００３】
１９９８年に、Ｆｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６（１９９８）］（非特許文献１）は、二本鎖ＲＮＡ（以後、ｄｓＲＮＡと略記）を線虫に微量導入すると、そのＲＮＡに相同な配列を持つ標的遺伝子の発現を極めて効率よく阻害することができることを示した（この現象はＲＮＡ干渉；  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；  ＲＮＡｉと呼ばれている）。線虫のさまざまな遺伝子について、完全な機能欠失表現型が作製されたこと及びショウジョウバエ胚にｄｓＲＮＡを導入し、同様に機能欠失表現型個体が作製されたこと［Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ，  ９５：１０１７（１９９８）］（非特許文献２）から、生物学的な現象として、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡｉ現象が起こっていると考えられている。これらの現象は、現在では、遺伝子が転写されてから不活化される（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；  ＰＴＧＳ）という、細胞のウイルスに対する防御システムに由来すると考えられている。即ち、標的遺伝子が転写された後に、そのｍＲＮＡが分解されることがＲＮＡｉ現象を説明しているが、ＲＮＡｉの無細胞実験系からその生化学的及び遺伝学的な研究が行われ、次第にその分子機構が明らかになってきた［Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １３：３１９１（１９９９）］（非特許文献３）。
【０００４】
ショウジョウバエの無細胞系抽出液を用いた研究より明らかになったＲＮＡｉの分子機構は以下のように現在、説明されている。ｄｓＲＮＡはまず、２１〜２３塩基の小さな断片に分解される。この短い分解産物はｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。さらに詳細には、このｓｉＲＮＡは、２１〜２３塩基からなるｄｓＲＮＡのことである。このｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡに相補的な配列部分で会合し、その分解を誘導する。
【０００５】
さらに、このＲＮＡｉ技術が哺乳類細胞で適応できるかという試みが行われ、２０００年に初めて哺乳類細胞で抑制効果が報告された［Ｗｉａｎｎｙ，Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２：７０（２０００）］（非特許文献４）。しかし、その効果は初期胚に限定され、培養細胞では確認できなかった。そして、その翌年に、２１  塩基からなる化学合成されたｄｓＲＮＡをトランスフェクションする方法が考案され、これにより哺乳類細胞においても効果的なＲＮＡｉを行うのが可能であることが示された［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４（２００１）］  （非特許文献５）。
【０００６】
合成されたｓｉＲＮＡを細胞に導入する方法の方は、簡便であり、そのための利用方法もある。即ち、ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションするこの方法は、大規模スクリーニング等に向いていると思われる。更に、安定な抑制効果ではなく、一時的な抑制効果が必要な場合、ｓｉＲＮＡの直接導入法が利用されている［文献］。また、今後、ポストシークエンス時代の遺伝子の機能解析方法の一つとしてＲＮＡｉを用いる場合、複数種類或いは大量のｓｉＲＮＡが必要となり、効率の良い標的配列の設定を含めると、ｓｉＲＮＡをイン・ビトロで合成し、細胞に導入する方法は発現ベクターを導入してＲＮＡｉを行う場合と比較して有効な方法であると考えられ、将来的には医薬品として使う場合、持続性を持たない性質は非常に魅力的な性質になると考えられる。この一連の現象から、一般にこのＲＮＡｉは、細胞内の細胞質で起こっていると考えられているが、核内でも遺伝子の抑制のために何らかの現象が起こっているのではないかと考えている研究者もおり、いずれにしても現在、このｓｉＲＮＡによって遺伝子発現抑制効果が何故起こるのかという点については、精力的に研究が行われている段階でその正確な機構はまだ明確になってはいない。
【０００７】
ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの合成方法としては、化学合成法及びＲＮＡポリメラーゼを用いる酵素法が知られている。
【０００８】
化学合成法及び酵素法の特徴として以下の点が挙げられる。
（１）化学合成法によってｓｉＲＮＡを合成する場合は、標的配列が決定されれば、その自由度は高い。しかし、ＲＮＡ合成は、ＤＮＡ合成に比べて、その構造の唯一の違いである２’−ＯＨのために、反応性が高くこのため副反応を抑える目的でこの官能基のマスクが必要となり、一般的にはＤＮＡ合成よりその製造工程が長く、コストと時間がかかる。しかし、現在では、そのほとんどが自動化されているため、簡便になってはきたが、ＤＮＡ合成よりもコストははるかに高く、またＲＮＡ自身がＤＮＡより安定性が低いため注意深い取り扱いが必要となる。更に、ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡであるため、相補的な配列を合成後、二本鎖とするために、混合し二本鎖化の工程を経る必要がある。
【０００９】
（２）ＲＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロ転写反応を利用してｓｉＲＮＡを合成する場合は、使用するＲＮＡポリメラーゼが転写の開始に必要な特異的なプロモーターと呼ばれる配列を鋳型ＤＮＡに導入する必要がある。しかし、プロモーターとなるＤＮＡ及び目的とするｓｉＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ自体の合成は化学合成法によって、ＲＮＡを合成する場合に比べて遙かに容易に、非常に安価に実施できる。また、イン・ビトロ転写反応に利用できるＲＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌の溶菌ファージとして知られているＴ３或いはＴ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼか、また、サルモネラ菌に感染する溶菌ファージであるＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼが知られている。
【００１０】
イン・ビトロ転写反応の強い合成能力を利用してｓｉＲＮＡを作る方法の一つは米国・アンビオン社が開発しており、キットとして入手することができる（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。しかし、このキットを用いる場合、イン・ビトロ転写反応における転写効率を高める配列として、転写産物に余分な配列が付加されるため、ｓｉＲＮＡを得るには、この余分な配列を除去する、ＲＮＡ構造に特異的なリボヌクレアーゼを用いて余分な配列をトリミングする必要が有る。更に詳しく述べると、まず、互いに相補的な一本鎖ＲＮＡを別々に合成し、生成した一本鎖ＲＮＡを混合して二本鎖ＲＮＡを形成させた後、リボヌクレアーゼ処理を行う必要がある。また、鋳型調製時には、Ｔ７プロモーター配列を含み、部分的に相補的な合成ＤＮＡをアニーリングさせた後に、クレノーフラグメント処理を行い、鋳型を二本鎖ＤＮＡとする工程が含まれており、最終産物としてｓｉＲＮＡを得るまでに、非常に煩雑な作業を経ることになる。
【００１１】
そこで、強い合成能力を利用して、余分な配列を極力付加しないように工夫した更に簡便な方法が報告された［Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０：ｅ４６（２００２）  ；  Ｙｕ，Ｊ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：６０４７（２００２）］  （非特許文献６及び７）。これらの方法は、いずれもＲＮＡ合成よりも安価な合成ＤＮＡを用いて鋳型ＤＮＡとして利用し、転写開始塩基は、その最低限の転写効率を維持するためにグアニン残基を一塩基のみ配置し、３’−末端はｄｓＲＮＡとしたときに、２塩基が突出するように設計されている。相補的な一本鎖ＲＮＡを別々に合成し、その後二本鎖ＲＮＡを形成するという操作の問題は残されているが、鋳型は合成ＤＮＡを混合する操作のみに留められており、速やかにイン・ビトロ転写反応を行うことが可能となった。また、これらの方法で合成されたｓｉＲＮＡは、哺乳類の培養細胞に導入した際、効率的な遺伝子抑制効果を示した。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、哺乳類細胞に導入するｓｉＲＮＡは、その配列が短いことから、効率的なＲＮＡｉを起こさせるためには、ｍＲＮＡ上の標的配列により、効率に差があることが知られている。また、この配列がそのｍＲＮＡ上にのみ存在する場合は、そのｍＲＮＡのみの発現を特異的に抑制することが期待できるが、その場合、配列が短い故に、別なｍＲＮＡにそれと相補する配列、あるいは類似配列が存在した場合には、抑制効果は、その類似配列を持つｍＲＮＡにも及ぶ可能性が指摘されており、表現系が果たして、特異的な効果を見ているのかどうか疑わしい場合もある。さらにイン・ビトロ転写反応で短い転写物を合成すると３’−末端に余分な塩基が付加されることがある［Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １５：８７８３（１９８７）］（非特許文献８）。これらの問題は、２１塩基という短いＲＮＡ鎖で、ＲＮＡｉを行う場合、その特異性は、１塩基の違いを識別することが可能であることに影響する［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：６８７７（２００１）］（非特許文献９）。この３’−末端の付加は、鋳型ＤＮＡに依存しないポリメラーゼ活性（鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性）と呼ぶことができるが、合成された転写物の末端に、ある確率で付加されているため、この影響がＲＮＡｉにどれだけ影響するか、実験によって異なることになる。現在までにこの３’−末端の不均一な転写物を使った問題点は、機能性ＲＮＡ（ここではｒＲＮＡやｔＲＮＡ）の構造解析の目的で、ＲＮＡを準備する場合に、しばしば、問題点として指摘されている［Ｐｒｉｃｅ，  Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２４９：３９８（１９９５）  ；Ｏｕｂｒｉｄｇｅ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４９：  ４０９  （１９９５）］（非特許文献１０及び１１）。従って、ｓｉＲＮＡの３’−末端に２塩基突出したものが、最も効率の良いＲＮＡｉ効果を発揮する［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：６８７７（２００１）］（非特許文献９）と言われているため、合成ロット毎に効果が変化することが考えられる。
【００１３】
即ち、Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０：ｅ４６（２００２）；  Ｙｕ，Ｊ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：６０４７（２００２）  （非特許文献６及び７）に記載の方法であっても、依然としてｓｉＲＮＡの合成法としては不十分であり、イン・ビトロ転写反応でｓｉＲＮＡを合成する際には、正確な転写反応が望まれていた。哺乳類細胞を代表とする高等生物の細胞内で、ＲＮＡｉによって、特定の遺伝子の発現を抑制したい場合、特異性が高く、安定な抑制が可能であるｓｉＲＮＡを安価に提供し得る方法が切望されていた。
【００１４】
通常のイン・ビトロ転写反応を利用するＲＮＡ調製方法では、一種類（一本鎖）の鋳型ＤＮＡから１種類（一本鎖）の転写物（ＲＮＡ）を得る。従って、従来のｓｉＲＮＡをイン・ビトロ転写反応で調製する方法においても、互いに相補的な一種類（一本鎖）のＲＮＡをそれぞれ別々に転写製造し、得られた相補的なＲＮＡｓを混合し、ｄｓＲＮＡを形成させる必要があった。
【００１５】
また、イン・ビトロ転写反応を利用してＲＮＡを調製する場合、鋳型の両端にプロモーター配列を配置し、センス鎖及びアンチセンス鎖を同時に（交互に）転写させることも考えられている［Ｃｌｅｍｅｎｓ，  Ｊ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９７：６５０３（２０００）］  （非特許文献１２）。
ところが、実際に転写シークケンス法と呼ぶ塩基配列決定法において、この方法が試されたが、センス鎖及びアンチセンス鎖を同時に（交互に）転写さようとすると、ＲＮＡの転写効率が悪いか、あるいは一方の鎖のみ優先的に転写されて、ｄｓＲＮＡを効率よく得ることはできなかった。
これは、一方のプロモーター配列と結合したＲＮＡポリメラーゼが他方のプロモーター配列と結合したＲＮＡポリメラーゼと、何らかの干渉を起こしているためであると推察されている。
【００１６】
そこで、本発明の第一の目的は、ｄｓＲＮＡを転写と同時に形成させることが可能な方法を提供することにある。特に、大量のｄｓＲＮＡを容易に得られる方法を、提供することに有る。
【００１７】
上述のように、従来の方法では、鋳型ＤＮＡに依存しないポリメラーゼ活性により、合成された転写物の３’−末端にある確率で余分な配列が付加され、このような３’−末端の不均一な転写物はＲＮＡｉに利用するｓｉＲＮＡとしては不適切である。
そこで本発明の第二の目的は、副反応（ここでは、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成の結果生ずるＲＮＡのこと）が少なく、その結果、比活性の高い機能性ｓｉＲＮＡを合成することができる方法を提供することにある。
【００１８】
また、上記Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０：ｅ４６（２００２）；  Ｙｕ，Ｊ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：６０４７（２００２）  （非特許文献６及び７）に記載の方法では、転写開始塩基を転写効率を維持するためにグアニン残基（Ｇ）としている。そして、本発明の方法においても、優れた転写効率を得るために転写開始塩基をＧとする場合がある。しかし、転写開始塩基をＧとすると、得られるｄｓＲＮＡの５’−末端にＧが不可避的に付加される。しかし、目的とするｄｓＲＮＡは、５’−末端がＧ以外の塩基である場合もある。
【００１９】
そこで、本発明の第三の目的は、転写産物の転写開始点がグアニン残基の場合であっても、所望の配列を有するｄｓＲＮＡを得ることが可能である、イン・ビトロ転写反応によるｄｓＲＮＡの合成方法を提供することにある。
【００２０】
さらに本発明の第四の目的は、自動化しやすい極めてシンプルな工程で、機能性ｓｉＲＮＡとして有用であるｄｓＲＮＡが得られる方法及びキットを提供することにある。
【００２１】
上記目的を達成するために本発明者らは、種々の検討を重ねた。
その結果、両側にプロモーター配列を有する２本鎖の鋳型ＤＮＡを用いたイン・ビトロ転写反応であっても、目的とするＲＮＡに相当する鋳型ＤＮＡの塩基数が少なくとも５０以下であれば、ＲＮＡの転写効率が悪かったり、あるいは一方の鎖のみ優先的に転写されたりすることはなく、予想に反して、ｄｓＲＮＡを効率よく得ることはできることを見出し、本発明の第一の目的を達成する請求項１〜１３に記載の本発明を完成した。
【００２２】
上記態様の本発明では、標的遺伝子の配列に基づいて、その３’−末端にＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼが特異的に認識するプロモーター配列を付加し、ターゲット配列の相補分をＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、通常、カスタム合成サービスを受けることができるので、簡単に入手できる。これとＴ７プロモーターの共通部分の相補的なオリゴを混合し、イン・ビトロ転写反応を行うと、反応終了後には、何も手を加えずに、ｓｉＲＮＡとなるｄｓＲＮＡを形成することができる。
【００２３】
特に、上記本発明の方法では、転写反応をピロホスファターゼとマグネシウムイオンの存在下で行うことで、多量の転写生成物を比較的短時間に得られる。
【００２４】
さらに発明者らは、イン・ビトロ転写反応のひとつの応用技術として、転写シークエンス法と呼ぶ塩基配列決定法を開発し［Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５：３４５５（１９９８）  （非特許文献１３）；特許  ３１７２７１０（特許文献１）］、併せて、この方法に最適な変異型ＲＮＡポリメラーゼを開発した［ＷＯ  ０２／１０１０３２］（特許文献２）。この変異型ＲＮＡポリメラーゼの第一の変異は、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、６４４番目のアミノ酸であるフェニルアラニンをチロシンに置換し、ＲＮＡポリメラーゼの合成反応におけるターミネーターである３’−デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（３’−ｄＮＴＰ）の取り込み能力を増大させたものである。これにより、塩基配列決定時におけるターミネーターの取り込み効率が増大し、転写量の増大と、野生型酵素に比較して正確な塩基配列決定が可能となった。また、第二の変異は、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、１７２及び１７３番目のアミノ酸が欠損した変異（Δ１７２−１７３）である。
【００２５】
本発明者らは、上記変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、上記請求項１〜１１に記載の発明のイン・ビトロ転写反応において短いＲＮＡを合成したときに、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、数塩基が付加された転写物が有意に少ないことを発見し、本発明の第二の目的を達成する請求項１４〜２３に記載の本発明に到った。
この変異型ＲＮＡポリメラーゼの性質は、イン・ビトロ転写反応を行う際、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるよりも、正確な転写物を得ることを可能とするため、イン・ビトロ転写反応で、ｓｉＲＮＡを合成するのに最適である。
【００２６】
さらに、本発明者らは、転写産物の転写開始点がグアニン残基の場合であっても、リボヌクレアーゼＴ１を用いることにより、所望の塩基配列を有するｄｓＲＮＡを得ることが可能であり、イン・ビトロ転写反応で短鎖ＲＮＡを合成する場合の制約が少ない方法を提供するできることを見出し、本発明の第三の目的を達成する請求項２４〜２８に記載の本発明を完成させた。
【００２７】
さらに本発明者らの検討の結果、上記本発明を用いることで、自動化しやすい極めてシンプルな工程で、機能性ｓｉＲＮＡとして有用であるｄｓＲＮＡが得られる方法及びキットを提供することができることを見出し、本発明の第四の目的を達成する請求項２９〜３６に記載の本発明を完成させた。
【００２８】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６（１９９８）
【非特許文献２】Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ，  ９５：１０１７（１９９８）
【非特許文献３】Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １３：３１９１（１９９９）
【非特許文献４】Ｗｉａｎｎｙ，Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２：７０（２０００）
【非特許文献５】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４（２００１）
【非特許文献６】Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３０：ｅ４６（２００２）
【非特許文献７】Ｙｕ，Ｊ．Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９９：６０４７（２００２）
【非特許文献８】Ｍｉｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １５：８７８３（１９８７）
【非特許文献９】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：６８７７（２００１）
【非特許文献１０】Ｐｒｉｃｅ，  Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２４９：３９８（１９９５）
【非特許文献１１】Ｏｕｂｒｉｄｇｅ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２４９：  ４０９  （１９９５）
【非特許文献１２】Ｃｌｅｍｅｎｓ，  Ｊ．  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９７：６５０３（２０００）
【非特許文献１３】Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５：３４５５（１９９８）
【特許文献１】日本特許  ３１７２７１０
【特許文献２】ＷＯ  ０２／１０１０３２
【００２９】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の通りである。
［請求項１］鋳型領域及びこの鋳型領域の両側にＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター領域をそれぞれ有する２本鎖ＤＮＡであって、前記鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にニックが存在するか、または、鋳型領域の５’末端の少なくとも１塩基が欠損しており、かつ鋳型領域の塩基数が５０以下である２本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、
ＲＮＡポリメラーゼの基質の存在下で、前記プロモーター領域により転写が開始されるＲＮＡポリメラーゼを作用させて、少なくとも前記鋳型領域に相当するＲＮＡ領域を含む２本鎖ＲＮＡを調製する方法。
［請求項２］前記ＲＮＡポリメラーゼの作用をピロホスファターゼ及びマグネシウムイオンの存在下で行う請求項１に記載の方法。
［請求項３］ＲＮＡポリメラーゼの濃度が２．５〜３２．５ｕｎｉｔ／μＬの範囲であり、マグネシウムイオンの濃度が１５〜３０ｍＭの範囲である請求項１または２に記載の方法。
［請求項４］ピロホスファターゼの濃度が０．０２５〜０．０２５ｕｎｉｔ／μＬの範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］ＲＮＡポリメラーゼの基質が、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、及びウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］ＲＮＡポリメラーゼの各基質の濃度が６〜７．５ｍＭの範囲である請求項５に記載の方法。
［請求項７］前記ＲＮＡポリメラーゼの基質の少なくとも１つが、標識されている請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］前記標識が、蛍光標識、放射性同位体標識、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、２’−フルオロ標識または２’−Ｏ−メチル標識である請求項７に記載の方法。
［請求項９］前記鋳型領域の塩基数が、１９〜２３の範囲であり、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端または５’末端に１または２塩基の突出端を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］前記２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端に１、２または３塩基の追加の塩基配列を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１１］前記鋳型領域の塩基数が１９〜２１であり、前記２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端の追加の塩基配列が２または３塩基であり、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端に２塩基の突出端を有する請求項１０に記載の方法。
［請求項１２］前記２本鎖ＤＮＡは、
（１）  鋳型領域のセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（２）  鋳型領域のアンチセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（３）（１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、及び
（４）（２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、
のアニール生成物である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］（１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と（２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域とが同一の配列を有し、（３）及び（４）の１本鎖ＤＮＡが同一の配列を有する請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］前記ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１５］前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型ＲＮＡポリメラーゼであって、前記アミノ酸の欠失が、プロテアーゼが作用する領域中、または大腸菌プロテアーゼが作用する領域中に存在する塩基性アミノ酸について行われ、かつ前記塩基性アミノ酸が、リジン及び／又はアルギニンである請求項１４に記載の方法。
［請求項１６］ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＫ１１  ＲＮＡポリメラーゼの変異体である請求項１４または１５に記載の方法。
［請求項１７］前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７２、１７３、１７８、１７９及び１８０から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
［請求項１８］前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７３、１７４、１７９、１８０及び１８１から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
［請求項１９］前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｋ１１ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１９２、１９３、１９８、１９９及び２００から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
［請求項２０］前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１３６、１３７、１４０、１４１、１４２及び１４３から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
［請求項２１］前記欠失したアミノ酸の数が１〜１０である請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２２］前記アミノ酸の置換及び／又は欠失以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有する請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２３］ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、以下の（１）〜（１２）に示すいずれかのＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１４に記載の方法。
（１）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（２）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（３）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジンと１７３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（４）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（５）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（６）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（７）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（８）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（９）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１０）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１１）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１２）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
［請求項２４］少なくとも一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２５］一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であり、他方のプロモーター領域の３’末端がアデニン残基、シトシン残基またはウリジン残基である請求項２４に記載の方法。
［請求項２６］両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である請求項２２に記載の方法。
［請求項２７］生成した２本鎖ＲＮＡをグアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼを用いて処理する請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２８］リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＴ１である請求項２７に記載の方法。
［請求項２９］少なくとも（１）  ＲＮＡポリメラーゼ及び
（２）  ＲＮＡポリメラーゼの基質を含む２本鎖ＲＮＡ調製用キット。
［請求項３０］（３）ピロホスファターゼ及び（４）マグネシウム塩をさらに含む請求項２９に記載のキット。
［請求項３１］（５）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域であるＤＮＡの５’鎖の一本鎖ＤＮＡの一方または両方をさらに含む請求項２９または３０に記載のキット。
［請求項３２］転写反応用バッファーをさらに含む請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のキット。
［請求項３３］グアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼをさらに含む請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のキット。
［請求項３４］リボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＴ１である請求項３３に記載のキット。
［請求項３５］ＲＮＡポリメラーゼが、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体である請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のキット。
［請求項３６］取扱説明書をさらに含む請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【００３０】
【発明の実施の態様】
以下本発明について詳細に説明する。
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写反応により２本鎖ＲＮＡを調製する方法である。本発明のこの方法では、鋳型として、鋳型領域及びこの鋳型領域の両側にＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター領域をそれぞれ有する２本鎖ＤＮＡであって、鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にニックが存在するか、または、鋳型領域の５’末端の少なくとも１塩基が欠損しており、かつ鋳型領域の塩基数が５０以下である２本鎖ＤＮＡを用いる。
【００３１】
従来の方法では、少なくとも鋳型領域は一本鎖である鋳型を用いて、一本鎖のＲＮＡを合成し、これをアニールして２本鎖としていたが、本発明の方法の特徴は、鋳型とて２本鎖ＤＮＡを用い、目的とする２本鎖ＲＮＡを１つの転写反応で同時に合成することにある。この転写反応を可能にするため、本発明では、（１）鋳型とて用いる２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にニックが存在するか、または、鋳型領域の５’末端の少なくとも１塩基が欠損しており、かつ（２）鋳型領域の塩基数が５０以下である。
【００３２】
鋳型領域の５’末端にニックまたは塩基の欠損があることで、鋳型領域に相当する所望の配列を有するＲＮＡが合成できる。鋳型領域の５’末端にニックまたは塩基の欠損がないと、引き続きプロモーター領域に相当するＤＮＡも鋳型としてＲＮＡが合成されてしまう。
鋳型領域の５’末端に塩基の欠損が存在する場合、その数は少なくとも１塩基であり、欠損する塩基数は、目的生成物であるＲＮＡにどのような末端突出部を設けたいかにより適宜決定できる。欠損する塩基数は、例えば、１〜１０の範囲であるが、これに限定されない。
【００３３】
鋳型領域の塩基数は５０以下である。
前述のように、両末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを転写生成させることが、転写シーケンス法の一環として検討されたことが有る。しかし、理由は定かでないが、そのような系では、必ずしも予期した様な転写結果は得られなかった。即ち、実際に転写シークケンス法と呼ぶ塩基配列決定法において、数百塩基の鋳型領域をＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域で挟んだ２本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、この方法が試された。しかし、この鋳型を用いてセンス鎖及びアンチセンス鎖を同時に（交互に）転写さようとすると、ＲＮＡの転写効率が悪いか、あるいは一方の鎖のみ優先的に転写されて、ｄｓＲＮＡを効率よく得ることはできなかった。これは、一方のプロモーター配列と結合したＲＮＡポリメラーゼが他方のプロモーター配列と結合したＲＮＡポリメラーゼと、何らかの干渉を起こしているためであると推察されている。
【００３４】
ところが、転写シーケンス法の場合のように長鎖のＤＮＡを鋳型とするのではなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域に挟まれる鋳型領域の塩基数が短くなると、ｄｓＲＮＡの転写効率の阻害が解消することが、本発明者らによって見出された。本発明者らは、鋳型領域の塩基数が５０以下であれば、ｄｓＲＮＡの転写効率阻害はなく、転写物である２本鎖ＲＮＡが得られることを見出した。
また、転写シーケンス法では、その理由は定かでないが、鋳型となるＤＮＡの鎖長が短くなりすぎると、シーケンス自体ができないことがよく知られていて、少なくとも鋳型領域の塩基数が５０以下の場合は、シーケンスできなかった。
鋳型領域の塩基数は、５０以下であれば、目的とするｄｓＲＮＡの配列と塩基数を考慮して適宜決定すればよい。鋳型領域の塩基数は、４０以下でも、３０以下でも、２５以下であっても、本発明の方法によりｄｓＲＮＡを転写作成することは可能である。
【００３５】
前記鋳型領域の塩基数は、ｄｓＲＮＡの用途がＲＮＡｉである場合には、１９〜２３の範囲であることが好ましく、さらに生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端または５’末端に１または２塩基の突出端を有することが好ましい。３’末端に１または２塩基の突出端を有する２本鎖ＲＮＡは、前記２本鎖ＤＮＡとして、鋳型領域の５’末端に１、２または３塩基の追加の塩基配列を有する２本鎖ＤＮＡを用いることで得ることができる。特に、前記鋳型領域の塩基数が１９〜２１であり、前記２本鎖ＤＮＡは、鋳型領域の５’末端の追加の塩基配列が２または３塩基であり、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端に２塩基の突出端を有するものが好ましい。
【００３６】
さらに前記２本鎖ＤＮＡは、
（１）  鋳型領域のセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（２）  鋳型領域のアンチセンス鎖及びその３’側に延在するプロモーター領域からなる１本鎖ＤＮＡ、
（３）  （１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、及び
（４）  （２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と相補的な１本鎖ＤＮＡ、
のアニール生成物であることが好ましい。上記各１本鎖ＤＮＡは化学合成法により容易に入手可能である。
【００３７】
また、操作の簡便性を考慮すると、（１）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域と（２）の１本鎖ＤＮＡのプロモーター領域とが同一の配列を有し、（３）及び（４）の１本鎖ＤＮＡが同一の配列を有することが好ましい。この場合、（３）及び（４）の１本鎖ＤＮＡとして、同一配列の１本鎖ＤＮＡを共用でき、目的ＲＮＡの調製はより容易になる。
【００３８】
本発明の方法では、上記鋳型２本鎖ＤＮＡと、ＲＮＡポリメラーゼの基質の存在下で、前記鋳型２本鎖ＤＮＡが有するプロモーター領域により転写が開始されるＲＮＡポリメラーゼを作用させて、少なくとも前記鋳型領域に相当するＲＮＡ領域を含む２本鎖ＲＮＡを調製する。
ＲＮＡポリメラーゼの基質には、特に制限はないが、例えば、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、及びウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の混合物であることができる。また、ＲＮＡポリメラーゼの基質は、少なくとも１つが、標識されていてもよい。標識の種類には制限はないが、例えば、蛍光標識、放射性同位体標識、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、２’−フルオロ標識または２’−Ｏ−メチル標識であるであることができる。
【００３９】
本発明の方法では、ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応をピロホスファターゼ及びマグネシウムイオンの存在下で行うことが、比較的多量の転写産物を容易に得るという観点から好ましい。
マグネシウムイオンは、例えば、塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩として反応系に導入することができる。マグネシウムイオンの添加は、ＲＮＡポリメラーゼの転写反応を促進する。本発明の方法では、後述するように、反応系中のＲＮＡポリメラーゼ及び基質（ＮＴＰ）の濃度が、転写シーケンス法と比べて格段に高いので、マグネシウムイオンの濃度も高くすることが適当である。
また、ピロホスファターゼとしては、無機ピロホスファターゼ（ＥＣ．３．６．１．１）  が一般的であり、市販品を入手可能である。
【００４０】
一般に、転写反応により基質が消費される際にピロリン酸が発生することが知られている。このピロリン酸は、反応液中にマグネシウムイオンが含まれていると結合し、ピロリン酸マグネシウムと呼ばれる不溶性物質を形成して、蓄積する。一方、ピロホスファターゼは、ピロリン酸を無機リン酸に分解する作用があり、結果的にピロリン酸マグネシウムの生成を抑制できる。特開平１１−１８７９９には、転写シーケンス法において、ピロホスファターゼを併用すると、標識されたリボヌクレオチドに対応して得られるピークの高さ（シグナルの強弱）の差を小さくできその結果安定したシーケンスデータが得られることが記載されている。
【００４１】
ところが、本発明のｄｓＲＮＡの転写合成自体新規であり、そこにおいて、ピロホスファターゼの影響
（効果）がどのようなものであるかは全く未知であった。本発明者らの検討の結果、詳細は後述の実施例に記載されているが、本発明の方法においては、ｄｓＲＮＡの転写合成を行うと、ある程度転写反応進むと、それ以上反応が進みにくい状態が生じることが分かった。それに対して、反応液中にマグネシウムイオンに加えてピロホスファターゼを存在させると、転写反応が頭打ちになることなく進み、大量の転写生成物の生成が可能であることが分かった。
【００４２】
本発明の方法で用いるＲＮＡポリメラーゼは、各種ＲＮＡポリメラーゼであることができる。
但し、鋳型ＤＮＡに依存しないポリメラーゼ活性により、合成された転写物の３’−末端にある確率で余分な配列が付加され、このような３’−末端の不均一な転写物はＲＮＡｉに利用するｓｉＲＮＡとしては不適切であり、野生型のＲＮＡポリメラーゼを用いるとそのような現象が生じる。そこで、ＲＮＡポリメラーゼとしては、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いることが好ましい。このようなＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いると、従来の方法に比べて、大量の転写物を、しかも副反応（ここでは、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成の結果生ずるＲＮＡのこと）が少なく、比活性の高い、機能性ｓｉＲＮＡを合成することができる。
【００４３】
また、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＫ１１  ＲＮＡポリメラーゼの変異体であることができる。
【００４４】
前記鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体は、より具体的には、野生型ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１つのアミノ酸を置換し、かつ少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた変異型ＲＮＡポリメラーゼであって、前記アミノ酸の欠失が、プロテアーゼが作用する領域中、または大腸菌プロテアーゼが作用する領域中に存在する塩基性アミノ酸について行われ、かつ前記塩基性アミノ酸が、リジン及び／又はアルギニンである変異型ＲＮＡポリメラーゼを挙げることができる。
【００４５】
さらに上記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の変異体であることができる。
（１）野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７２、１７３、１７８、１７９及び１８０から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたもの、
（２）野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ３ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１７３、１７４、１７９、１８０及び１８１から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたもの、
（３）野生型ＲＮＡポリメラーゼが、Ｋ１１ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１９２、１９３、１９８、１９９及び２００から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたもの、
（４）野生型ＲＮＡポリメラーゼが、ＳＰ６ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであり、かつ前記アミノ酸の欠失が、アミノ酸１３６、１３７、１４０、１４１、１４２及び１４３から成る群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む領域で行われたもの。
上記において、欠失したアミノ酸の数は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜７、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１、２、または３であることができる。
【００４６】
また、上記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、アミノ酸の置換及び／又は欠失以外のアミノ酸の置換、挿入または欠失をさらに有することもできる。
【００４７】
上記ＲＮＡポリメラーゼ変異体としては、より具体的には、以下の（１）〜（１２）に示すいずれかのＲＮＡポリメラーゼ変異体を挙げることができる。尚、これらのＲＮＡポリメラーゼ変異体については、ＷＯ０２／１０１０３２に記載されている。
（１）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジン及び１７３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（２）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（３）Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４、６６７、または６４４および６６７におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７２のリジンと１７３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７８から１８０の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（４）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（５）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（６）Ｔ３ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４５、６６８、または６４５および６６８におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１７３のリジンと１７４のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１７９から１８１の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（７）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（８）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（９）Ｋ１１ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６９０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１９２のリジンと１９３のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１９８から２００の３つのアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１０）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１１）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
（１２）ＳＰ６ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６７０におけるフェニルアラニンがチロシンに置換され、かつアミノ酸残基１３６のリジンと１３７のアルギニンの一方または両方が欠失し、さらにアミノ酸残基１４０から１４３の４つのアミノ酸残基の少なくとも１つの塩基性アミノ酸が欠失したＲＮＡポリメラーゼ
【００４８】
前記鋳型として用いる２本鎖ＤＮＡのプロモーター領域は、転写に使用するＲＮＡポリメラーゼの種類に応じて適宜決定することができる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼとして、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体を用いる場合のプロモーター配列を図５に示す。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに限らず、少なくとも一方のプロモーター領域の３’末端がグアニンであることが、転写効率を高めるために好ましい。プロモーター領域の３’末端は、一方がグアニン残基である場合、他方のプロモーター領域の３’末端は、例えば、アデニン残基またはシトシン残基またはウリジン残基であることもできる。あるいは、両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であることもできる。
【００４９】
上述のように、転写効率を高めるためにプロモーター領域の３’末端にある転写開始塩基をグアニン残基（Ｇ）とすることが好ましいが、この場合、得られるｄｓＲＮＡの５’−末端にＧが不可避的に付加される。このＧは、得られたｄｓＲＮＡをＲＮＡｉに使用し、かつＲＮＡｉに必要とするｄｓＲＮＡの５’−末端がＧ以外の塩基である場合、不要な物である。そこで、本発明では、不可避的に付加されたＧが不要である場合には、生成した２本鎖ＲＮＡをリボヌクレアーゼ処理することで、Ｇを除去できる。ここで使用するリボヌクレアーゼは、生成した２本鎖ＲＮＡをグアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼである。そのようなリボヌクレアーゼは、好ましくは、ＲＮａｓｅＴ１である。ＲＮａｓｅＴ１処理することで、転写産物の転写開始点がグアニン残基の場合は、相補的な塩基がない場合でも、機能性ｄｓＲＮＡにすることが可能であり、イン・ビトロ転写反応で短鎖ＲＮＡを合成する場合の制約が少ない方法とすることができる。この点について、図１４及び１５に基づいて、以下にさらに説明する。尚、図中の左側はＤＮＡ鋳型、右側は転写産物であるｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分は１９〜２１  ｂｐである。
【００５０】
［１］両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である場合
図１４に示す（１）及び（２）の例は、両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であり、かつ目的産物であるｄｓＲＮＡの５’−末端がＧ以外の塩基である場合である。この場合、転写生成したｄｓＲＮＡ  をＲＮａｓｅＴ１処理して、５’末端に突出する不要なグアニン残基を削除する。
（１）目的産物であるｓｉＲＮＡの５’末端がセンス鎖、アンチセンス鎖ともにＧで無い場合
鋳型ＤＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに転写開始点Ｇの３’側にニックを有し、ニック部分の突出塩基は２塩基ＮＮである。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに５’末端１塩基Ｇが突出し、３’末端に２塩基ＮＮが突出する。このとき、ｓｉＲＮＡの３’末端突出部分ＮＮの１塩基目（２本鎖側）にＧ及びＣを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＣの場合、ＣはＧと相補性であるため二本鎖になってしまうためＲＮａｓｅＴ１で切断、除去できなくなる。また、３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
ｓｉＲＮＡのセンス、アンチセンスの５’末端１塩基Ｇは、ＲＮａｓｅＴ１処理して削除される。
（２）目的産物であるｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖のうち一方の５’末端がＧである場合
鋳型ＤＮＡの形状は、ｓｉＲＮＡの５’末端に１塩基Ｇが突出する側のＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖はニック部分に３塩基ＧＮＮを突出する（図の上側の鎖）。もう一方のＤＮＡ鎖は、２塩基ＮＮが突出する（図の下側の鎖）。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの形状は、センス、アンチセンスのうち一方が、５’末端１塩基Ｇが突出し、３’末端はセンス、アンチセンスともに２塩基ＮＮが突出する。このとき、ｓｉＲＮＡの３’末端突出部分ＮＮの１塩基目（２本鎖側）にＧ及びＣを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＣの場合、ＣはＧと相補性であるため二本鎖になってしまうためＲＮａｓｅＴ１で切断、除去できなくなる。また、３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
ｓｉＲＮＡのセンス、アンチセンスの一方の５’末端にある１塩基Ｇは、ＲＮａｓｅＴ１処理して削除される。
［２］両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である場合（その２）
図１５の（３）に示す例は、両方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であり、かつ目的産物であるｄｓＲＮＡの５’−末端がＧ塩基である場合である。この場合、転写生成したｄｓＲＮＡ  をＲＮａｓｅＴ１処理する必要はない。
（３）目的産物とするｓｉＲＮＡの５’末端がセンス、アンチセンスともにＧである場合鋳型ＤＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに転写開始点Ｇの３’側にニックを有し、ニック部分の突出塩基は３塩基ＮＮＧである。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの構造は、センス、アンチセンスともに３’末端に２塩基ＮＮが突出する。このとき、３’末端突出部分の１塩基目にＧを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
［３］一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基である場合
図１５の（４）〜（６）に示す例は、一方のプロモーター領域の３’末端がグアニン残基であり、かつ目的産物であるｄｓＲＮＡの一方の鎖の５’−末端がＧ塩基である場合である。この場合、転写生成したｄｓＲＮＡ  をＲＮａｓｅＴ１処理する必要はない。
（４）目的産物とするｓｉＲＮＡのセンス、アンチセンスのうち一方の５’末端がＧであり、もう一方がＡである場合
鋳型ＤＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに転写開始点Ｇの３’側にニックを有し、ニック部分の突出塩基は３塩基ＮＮＣ及びＮＮＡである。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの構造は、センス、アンチセンスともに３’末端２塩基突出ＮＮを有する。このとき、３’末端突出部分の１塩基目にＧを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
（５）目的産物とするｓｉＲＮＡのセンス、アンチセンスのうち一方の５’末端がＧであり、もう一方がＣである場合
鋳型ＤＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに転写開始点Ｇの３’側にニックを有し、ニック部分の突出塩基は３塩基ＧＮＮ及びＣＮＮである。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの構造は、センス、アンチセンスともに３’末端２塩基突出ＮＮを有する。このとき、３’末端突出部分の１塩基目にＧを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
（６）目的産物とするｓｉＲＮＡのセンス、アンチセンスのうち一方の５’末端がＧであり、もう一方がＵである場合
鋳型ＤＮＡの形状は、センス、アンチセンスともに転写開始点Ｇの３’側にニックを有し、ニック部分の突出塩基は３塩基ＧＮＮ及びＵＮＮである。この鋳型ＤＮＡを用いて得られる転写産物、ｓｉＲＮＡの構造は、センス、アンチセンスともに３’末端２塩基突出ＮＮを有する。このとき、３’末端突出部分の１塩基目にＧを含まないようにする。３’末端突出部分ＮＮの１塩基目がＧの場合、３’末端突出部分がＲＮａｓｅＴ１で切断、除去されてしまうからである。
【００５１】
本発明の方法における転写反応の一般的条件を示すと以下の通りである。
鋳型濃度：０．１〜１０μＭ、好ましくは０．５〜２μＭ
基質濃度（各ＮＴＰについて）：３〜１０ｍＭ、好ましくは６〜７．５ｍＭ
ＲＮＡポリメラーゼ濃度：１〜５０ｕｎｉｔ／μＬ、好ましくは２．５〜３２．５ｕｎｉｔ／μＬ
ピロホスファターゼ濃度：０．０１〜０．０５ｕｎｉｔ／μＬ、好ましくは０．０２５〜０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ
マグネシウムイオン濃度：５〜５０ｍＭ、好ましくは１５〜３０ｍＭ
緩衝液（転写反応用バッファー）の種類：ＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳからなる一般的な転写反応用緩衝液
転写反応温度４〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃
転写反応時間５分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間
【００５２】
上記成分以外に本発明の転写反応の反応液には、スペルミジン（例えば、２ｍＭ）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール（還元剤））（例えば、５〜１０ｍＭ）を添加することができる。
【００５３】
また、ＲＮａｓｅＴ１処理をする場合、ＲＮａｓｅＴ１の濃度は、例えば、０．１〜１ｕｎｉｔ／μＬ、好ましくは０．２５〜０．７５ｕｎｉｔ／μＬの範囲である。
さらに、転写産物の精製を目的として、鋳型ＤＮＡを断片化するためにＤＮａｓｅをＲＮａｓｅＴ１処理に併用することができる。また、ＲＮａｓｅＴ１処理をしない場合には、ＤＮａｓｅ処理のみを行うこともできる。ＤＮａｓｅ処理を行う場合のＤＮａｓｅの濃度は、例えば、０．１〜０．５ｕｎｉｔ／μＬ、好ましくは０．１２５〜０．２５ｕｎｉｔ／μＬの範囲である。
【００５４】
本発明の方法は、図５に基づいて、さらに詳細に説明する。
まず、標的配列として、鋳型領域とプロモーター領域からなる一本鎖ＤＮＡをセンス鎖及びアンチセンス鎖について用意する。
さらに、上記センス鎖及びアンチセンス鎖の各プロモーター領域に相補的な一本鎖ＤＮＡも用意する。センス鎖及びアンチセンス鎖の各プロモーター領域が、同一の塩基配列を有する場合は、上記相補的な一本鎖ＤＮＡは一種類で済む。
これら一本鎖ＤＮＡを混合し、アニールして、鋳型となる二本鎖ＤＮＡを調製する。図中の二段目の鋳型ＤＮＡが得られる。この鋳型ＤＮＡは、１８塩基からなるプロモーター領域を両末端に有し、プロモーター領域の３’末端がグアニンであり、中央部に塩基数１９の鋳型領域がある。図中では、鋳型領域の塩基は、塩基を特定しないＮで表示されている。鋳型領域の配列は、目的とする二本鎖ＲＮＡに応じて、適宜決定すればよい。また、鋳型領域の５’末端とプロモーター領域の３’末端の間にはそれぞれニックが存在する。さらに、鋳型領域の５’末端の追加の塩基配列が２塩基であり、これにより、生成する２本鎖ＲＮＡは、３’末端に２塩基の突出端を有することになる。
【００５５】
上記鋳型ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）を、ＲＮＡポリメラーゼの基質であるアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、及びウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の混合物及びＲＮＡポリメラーゼと混合し、所定の転写反応温度、例えば、３７℃で二時間、転写反応を行う。その結果、二本鎖ＲＮＡが得られる。
図中にも記載のように、図に示した例では、プロモーター領域の３’末端がグアニン残基であるため、二本鎖ＲＮＡの各５’末端にグアニンが付加される。
そこで、好ましくは、得られた二本鎖ＲＮＡをさらにＲＮａｓｅＴ１で処理して、この各５’末端のグアニンを除去する。
このようにして、目的物であるｄｓＲＮＡが得られる。
【００５６】
尚、前述のようにプロモーター領域の３’末端がグアニン残基でない場合、またはグアニン残基であってもグアニンが目的とするＲＮＡの配列に含まれる場合には、ＲＮａｓｅＴ１処理なしに、目的物であるｄｓＲＮＡが得られる。
また、得られた生成物は、さらに、ＲＮＡの一般的な精製を利用して、ｄｓＲＮＡを精製することもでき、精製することでｓｉＲＮＡにより適した純度のｄｓＲＮＡとすることが可能である。
【００５７】
本発明は、２本鎖ＲＮＡ調製用キットを包含し、このキットは、少なくとも（１）  ＲＮＡポリメラーゼ及び（２）  ＲＮＡポリメラーゼの基質を含む。
（１）  ＲＮＡポリメラーゼ及び（２）  ＲＮＡポリメラーゼの基質ともに、上記方法において説明したものの中から適宜選択される。特に、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ非依存的なＲＮＡ合成活性を実質的に有さないＲＮＡポリメラーゼ変異体であることが好ましい。また、ＲＮＡポリメラーゼは、水溶液として含まれていることが好ましい。
また、ＲＮＡポリメラーゼの基質は、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）、及びウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）の混合物であることが好ましい。
【００５８】
さらに本発明のキットは、（３）ピロホスファターゼ及び（４）マグネシウム塩をさらに含むことができ、上記方法において説明したものの中から適宜選択される。さらに本発明のキットは、（５）  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域であるＤＮＡの５’鎖の一本鎖ＤＮＡの一方または両方をさらに含むことができる。
【００５９】
本発明のキットは、さらに転写反応用バッファーを含むことができる。転写反応用バッファーとしては、上記のものを挙げることができる。
さらに本発明のキットは、鋳型ＤＮＡを調製するために使用するアニーリングバッファーを含むこともできる。アニーリングバッファーは、通常ｄｓＤＮＡの作成に使用されている物から適宜選ばれる。
【００６０】
本発明のキットは、生成した２本鎖ＲＮＡをグアニル酸残基の３’側のホスホジエステル結合を特異的に加水分解物するリボヌクレアーゼをさらに含むことができ、リボヌクレアーゼはＲＮａｓｅＴ１であることが好ましい。
さらに本発明のキットは、ＤＮａｓｅをさらに含むこともできる。ＤＮａｓｅは、鋳型として使用した二本鎖ＤＮＡを分解するために使用される。
これらの酵素は、溶液としてキットに含まれていることが好ましい。
さらに本発明のキットは、上記酵素や反応液を希釈するための希釈液をさらに含むこともできる。
本発明のキットは、取扱説明書をさらに含むことが好ましい。
【００６１】
ｓｉＲＮＡを合成するには、一般に、以下の点に考慮すべきであると言われている。本発明の方法及びキットを使用してｓｉＲＮＡを合成する場合にも、同様の考慮がなされることが好ましい。
１）導入するｓｉＲＮＡの長さは、２１〜２３塩基になるように設計し、その二本鎖の３’−末端は、二塩基突出するように設計する［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４（２００２）］。
２）ＲＮＡ結合タンパク質結合部位が少ない、標的遺伝子のコード領域の翻訳開始アミノ酸であるメチオニンをコードするＡＴＧコドンの５０から１００ヌクレオチド下流の領域を選択するのが望ましい［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４（２００２）］。
３）ｓｉＲＮＡはその標的配列が短いために、目的遺伝子以外の遺伝子に同じ配列があれば二次的な遺伝子の抑制効果となって表現系に現われる可能性がある。即ち、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中のターゲット配列により、ＲＮＡｉ効果に差があることが報告されているため、効果的な部位をあらかじめＥＳＴデータベース等を用いて検索し、他のｍＲＮＡとクロスしない配列を選択する［Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：６８７７（２００１）］。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、短いＲＮＡをイン・ビトロ転写反応で合成する場合、極めて正確な転写物を得ることができる。さらに、これを用いてＲＮＡｉを行う際に、相補的な鋳型ＤＮＡを同時に添加し、反応させることで簡単にしかも必要により多量にｄｓＲＮＡを作成することができる。また、同時に加えることで、転写開始点をグアニン残基に限定せずに、一方にアデニン残基（他の塩基）を用いても、ｄｓＲＮＡを定量的に合成することが可能であり、これまで存在していたイン・ビトロ転写反応でｓｉＲＮＡを作る際の制約が少なくなった。従って、これまで以上に、簡単にｓｉＲＮＡを安価に合成することが可能となり、この効果は、ポスト・シークエンス時代の遺伝子機能解析分野で極めて大きいと考えられる。即ち、操作が非常に簡便なため、自動化に向いており、大規模スクリーニング系を組み立てやすい。このため、遺伝子機能解析分野はもとより、ドラッグスクリーニング等の創薬分野でも大きな効果を発揮する。
【００６３】
また、本発明により、正確なＲＮＡを得ることができるため、抑制効果の再現性が極めてよいことが指摘できる。このことは、将来、ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子治療や、そのｓｉＲＮＡを医薬品として利用することにも利用できる。
【００６４】
また、このｓｉＲＮＡは新しい診断法としても利用できる。ゲノム配列が判明した後の、そのゲノム情報の利用法として、マイクロサテライト、ＳＮＰｓ（一塩基多型）を利用した、テーラーメード医療の開発が行われている。これは、遺伝子タイピングと呼ばれる分野であり、個人の体質にあったオーダーメード医療が可能になると考えられている。しかしながら、遺伝子タイピングだけで、その人の体質を的確に判断するには限界がある。このことは、ゲノム配列が判明しても、それほど病気の理解には繋がっていないという事実が示している。従って、遺伝子タイピングの限界を補う方法として、エキソ・ビボにおいて、患者の細胞を用いて、遺伝子発現抑制から、個人の生きた反応性を安全に診断できる。しかも、このＲＮＡｉを用いた場合、その抑制効果が一過性であるため、細胞を使った診断法の確立が実現すると考えられ、試験管内で、個人的な治療のシュミレーションが可能になると思われる。
【００６５】
【実施例】
以下に、本発明の内容を実施例により説明する。ただし、下記の実施例は本発明を利用する際の具体例を述べたものであり、本発明は原理的には生体内で発現している全ての遺伝子に普遍的に適用可能であるため、下記の実施例により適用の範囲を限定されるものではない。
【００６６】
［例１］野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｓｉＲＮＡ合成
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＷＯ０２／１０１０３２に記載の方法に基づいて、Ｔ７ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基６４４におけるフェニルアラニンをチロシンに置換し、かつアミノ酸残基１７２のリジン及び１７３のアルギニンが欠失させて作成したＲＮＡポリメラーゼである。以下、特に断らない限り、同様とする。
【００６７】
下記の反応系を用いて、イン・ビトロ転写反応におけるＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（野生型；  ストラタジーン社製）と変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの性質の違いを比較した。まず、鋳型ＤＮＡとしてＴ７  プロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）からなる合成オリゴヌクレオチドと、これに相補的な配列（５’−ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’）の５’−側に５’−ＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣ−３’或いは５’−ＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣ−３’の配列（前者をセンス、後者をアンチセンスとする）をそれぞれ付加した合成オリゴヌクレオチドを委託合成（ニッポンイージーティー社）した。Ｔ７プロモーター配列からなる合成オリゴヌクレオチドをセンス、アンチセンスとそれぞれ別の容器内で等ｍｏｌずつ混合して７５℃に加熱し、その後緩やかに冷却して二本鎖を形成させたものを準備した。この鋳型ＤＮＡ  １００  ｐｍｏｌと転写反応用緩衝液［４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０，  ２５℃）、１００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２０ｍＭスペルミジン、３００ｍＭ４０塩化マグネシウム、１．２５％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）］及び１００  ｍＭ  ＣＴＰ、１００  ｍＭ  ＵＴＰ、１００  ｍＭ  ＧＴＰ、１００  ｍＭ  ＡＴＰを使用して転写反応溶液をそれぞれ２本の容器に調製した（各ヌクレオチド溶液の終濃度はそれぞれ７．５  ｍＭとした）。一方にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）  １００  Ｕ、無機ピロホスファターゼ  ０．０５  Ｕを加え、他方には変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ１００Ｕ、無機ピロホスファターゼ  ０．０５  Ｕ
を加えて、ともに液量を２０μｌに調整し、３７℃で２時間反応を行った。
【００６８】
反応後、この溶液に滅菌蒸留水８０μｌとフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール  （２５：２４：１；ニッポンジーン社製）１００μｌをそれぞれ加え、転倒混和したのち、１２，０００  ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心した。水相を別の容器に移し、５  Ｍ  酢酸アンモニウム  （ｐＨ  ８．０）１００μｌ、９９．５  ％  エタノール４００μｌを添加し、転倒混和したのち、１６，０００  ｒｐｍ、２５  ℃で１５分間遠心してＲＮＡを濃縮した。沈殿物を７０  ％  エタノール  でリンスしたのち真空乾燥機でエタノールを除去した。沈殿物を滅菌蒸留水４０μｌに溶解し、このうち４μｌに８  Ｍ  尿素／２  ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０２  ％  ブロモフェノールブルー／０．０２  ％  キシレンシアノール混合液４μｌを加えて１×ＴＢＥ（８９．２  ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／８９．０  ｍＭ  ホウ酸／２  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ  ８．０）  を電気泳動用緩衝液として６  Ｍ  尿素／２０  ％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ（和光純薬工業株式会社製）を含む染色液（０．４  ％  Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ／１０  ％  酢酸／４０  ％  メタノール）中で５分間染色し、染色終了後、ゲルをイオン交換水に移し、脱染色を行った。電気泳動像はＦｌｕｏｒｏ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（バイオラッド社製）  の添付ソフトであるＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（バイオラッド社製）により取り込んだ（図１）。
【００６９】
図１に示した結果において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行った場合、目的のバンド以外に、数塩基伸長したと見られるバンドがスメアリングにより検出されたのに対し、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行った場合ではこのような余分な塩基伸長を起こしていない正確な長さのＲＮＡが得られており、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは短鎖のＲＮＡをイン・ビトロ転写反応によって調製する際に効果的である事が示された。
【００７０】
上記の結果は、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが有する最大の特長である、新生ＲＮＡとの速やかな解離に起因していると考えられる。そこで、同様のコンセプトに基づいて製造、販売されている、野生型酵素を用いたキット試薬である、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（エピセンタ社製）及びＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ（アンビオン社製）を対照として、イン・ビトロ転写反応における  ＲＮＡの調製量を比較した。
【００７１】
クローニングベクターｐＴＳ１（ニッポンジーンテク社製）に含まれるＴ７プロモーターの転写開始点から１，８６８塩基目を平滑末端に切断する制限酵素ＳｃａＩ（ニッポンジーン社製）を用いてｐＴＳ１を直鎖化し、これを転写反応のイン・ビトロ転写反応の鋳型ＤＮＡとした。
【００７２】
この鋳型ＤＮＡ  １００  ｆｍｏｌを用いて、上記の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するか市販の２種類のキットをそれぞれ使用し、イン・ビトロ転写反応を行った。方法は各キット添付の取扱説明書に従った。
【００７３】
反応開始から１時間後、２時間後、３時間後に１０分の１量（２μｌ）ずつサンプリングを行い、これらのサンプルに２５×ＭＯＰＳ（１  Ｍ  ３−［Ｎ−モルフォリノ］  プロパンスルホン酸）０．８μｌ、ホルムアミド１０μｌを加え、滅菌蒸留水で液量を２０μｌに調整した。１×ＭＯＰＳ  を電気泳動用緩衝液として２．２  Ｍホルムアルデヒド／１．０  ％アガロースゲルにより電気泳動を行い、電気泳動終了後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（モレキュラープローブ社製）の１０，０００倍希釈溶液中で３０分間染色した。電気泳動像をＦｌｕｏｒｏ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒの添付ソフトであるＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅにより取り込み、画像解析ソフトであるＭｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ（バイオラッド社製）を用いてＲＮＡ量を数値化した。電気泳動時に同時に濃度既知のＲＮＡを一定量アプライしておき、この数値と比較することで各キットの１反応あたりのＲＮＡ調製量を算出し、折れ線グラフを作成した（図２）。
【００７４】
図  ２に示した結果において、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行った場合では１反応あたりのＲＮＡ生成量が他の２キットと比較して顕著に高いことが示された。
【００７５】
次に、イン・ビトロ転写反応を用いて短鎖の二本鎖ＲＮＡを調製する場合におけるＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼと変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの性質の違いを比較した。
【００７６】
まず、鋳型ＤＮＡとしてＴ７  プロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）からなる合成オリゴヌクレオチドと、これに相補的な配列（５’−ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’）の５’−側に５’−ＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＴＡＡＧＣ−３’或いは５’−ＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣ−３’の配列をそれぞれ付加した合成オリゴヌクレオチドを委託合成し、これを２：１：１のｍｏｌ比で混合して７５℃に加熱し、その後緩やかに冷却して二本鎖を形成させたものを準備した。この鋳型ＤＮＡ  ５０  ｐｍｏｌと転写反応用緩衝液［４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０，  ２５℃）、１００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２０ｍＭスペルミジン、３００ｍＭ４０塩化マグネシウム、１．２５％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）］及び１００  ｍＭ  ＣＴＰ、１００ｍＭ  ＵＴＰ、１００  ｍＭ  ＧＴＰ、１００  ｍＭ  ＡＴＰを使用して転写反応溶液を２本の容器に調製した（各ヌクレオチド溶液の終濃度はそれぞれ７．５  ｍＭとした）。一方にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）  ３００  Ｕ、無機ピロホスファターゼ  ０．０５  Ｕを加え、他方には変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ３００Ｕ、無機ピロホスファターゼ  ０．０５  Ｕ  を加えて、ともに液量を４０μｌに調整し、３７℃で２時間反応を行った。
【００７７】
反応後、この溶液に滅菌蒸留水６０μｌとフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール  １００μｌをそれぞれ加え、転倒混和したのち、１２，０００  ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心した。水相を別の容器に移し、５  Ｍ  酢酸アンモニウム  （ｐＨ  ８．０）１００μｌ、９９．５  ％  エタノール４００μｌを添加し、転倒混和したのち、１６，０００  ｒｐｍ、２５  ℃で１５分間遠心してＲＮＡを濃縮した。沈殿物を７０  ％  エタノール  でリンスしたのち真空乾燥機でエタノールを除去した。沈殿物を滅菌蒸留水８０μｌに溶解し、このうち４μｌに２  ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０２  ％  ブロモフェノールブルー／０．０２  ％  キシレンシアノール混合液４μｌを加えて１×ＴＢＥを電気泳動用緩衝液として２０  ％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ（和光純薬工業株式会社製）を含む染色液（０．４  ％  Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ／１０  ％  酢酸／４０  ％  メタノール）中で５分間染色し、染色終了後、ゲルをイオン交換水に移し、脱染色を行った。電気泳動像はＦｌｕｏｒｏ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  の添付ソフトであるＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅにより取り込んだ（図３）。
【００７８】
図１と同様に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行った場合、目的のバンド以外に、数塩基伸長したと見られるバンドが検出されたのに対し、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行った場合ではこのような余分な塩基伸長を起こしていない正確な長さのＲＮＡが得られた。また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合は、目的の転写産物に対して塩基伸長したと見られる転写産物の比率が明らかに多いため、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼは短鎖の二本鎖ＲＮＡをイン・ビトロ転写反応によって調製する際にも有用であることが示された。
【００７９】
［例２］化学合成法と酵素法によるｓｉＲＮＡの構造の比較
上記の方法で調製した二本鎖ＲＮＡは転写開始点のグアニン残基が余分に付加しているため、一般的に言われているｓｉＲＮＡの形状とは若干異なる（図４）。そこで、一本鎖ＲＮＡ特異的であり、グアニン残基の３’末端にリン酸基を残して消化する酵素であるリボヌクレアーゼＴ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて５’末端のグアニン残基を除去した。上記の転写反応液４０μｌに対し、リボヌクレアーゼＴ１を５０  Ｕ添加して３７℃で２時間消化反応を行った。また、この工程を含む本発明の一連の概略図を図５に示した。
【００８０】
このサンプルを用いて上記と同様にポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＲＮＡの検出を行い、比較として、化学合成品であるＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ，  Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ（ニッポンジーン社製）を使用した（図６）。図６の結果から、リボヌクレアーゼＴ１処理を行ったサンプルは未処理のサンプルに比べてＲＮＡが短くなっていることが分かる。また、化学合成品のｓｉＲＮＡは３’側の二塩基突出末端がデオキシチミジンモノホスフェートになっているため、リボヌクレアーゼＴ１処理したサンプルよりも若干分子量が小さい位置にバンドが現れている。
【００８１】
［例３］遺伝子発現抑制効果の確認
作製したｓｉＲＮＡが実際に哺乳類培養細胞で遺伝子機能発現抑制を引き起こすかどうかを確認するために、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ社製）によってコードされる改変型ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ＧＬ３遺伝子；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４７２９５）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック社製）によってコードされるオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ遺伝子；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ５５７６２）、及びヒトの内在性遺伝子であるＣｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ  １遺伝子（ｃｄｋ１遺伝子；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＃００１７８６）を標的としてＲＮＡｉ実験を行った。それぞれの遺伝子に対するｓｉＲＮＡは全て上記の方法により調製し、使用したｓｉＲＮＡの配列及び構造を図７に示した。
【００８２】
（１）デュアルルシフェラーゼアッセイによるＧＬ３遺伝子発現抑制の検出
ＧＬ３遺伝子の遺伝子発現抑制は、ヒト子宮頸ガン由来のＨｅＬａ細胞株（厚生労働省ヒューマンサイエンス研究資源バンク；ＨＳＲＲＢより入手）を用いて検討した。ｓｉＲＮＡは上記の方法により調製したものを使用し、対照としてＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ，  Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ３及びＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して調製したものを用いた。
【００８３】
培地は５％非働化ウシ胎児血清（ハイクローン社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）５００μｌを用い、２４ウェルプレートの各ウェルに細胞を５×１０４個ずつプレーティングし、１６時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００８４】
トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を用いた。レポーター・ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  １μｇ及びインターナルコントロール・ｐＲＬ−ＴＫ−Ｌｕｃ（ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードする；プロメガ社製）０．１μｇにエフェクター・ｓｉＲＮＡを培地中に終濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭになるようにそれぞれ混和し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  （インビトロジェン社製）  ５０μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ２μｌを加えてあらかじめ調製しておいた希釈液を加えて混和した後、２０分間、室温に放置した。この脂質−ＤＮＡ−ｓｉＲＮＡ複合体  １００μｌをプレーティングした細胞に加え、続けて２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００８５】
培地を除去し、ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｄｕａｌ  ＳｅａＰａｎｓｙ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（東洋インキ社製）添付のＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  １００μｌを加え、１５分間、室温で振盪して細胞を破壊し、これを細胞抽出液とした。ルミノメーター・Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＤ２０／２０  （プロメガ社製）を用い、この細胞抽出液中に含まれるホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの活性値を測定した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性値を基に、ホタルルシフェラーゼの活性値を標準化した（図８）。一検体につき、同様の測定を３回行った。
【００８６】
ＧＬ３のみの活性を１とした際に、ネガティブコントロールとして変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを用いて合成したＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、遺伝子発現抑制は見られなかった。ＧＬ３  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合は全ての細胞で抑制効果が観察されたが、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで酵素的に合成したＧＬ３  ｓｉＲＮＡは、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼで酵素的に合成したｓｉＲＮＡ及び化学合成したｓｉＲＮＡと比較して抑制効果が弱いことが明らかとなった。
【００８７】
そこで、本発明を用いて変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼにより合成したｓｉＲＮＡとＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて合成したｓｉＲＮＡを比較するために、２０  ％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ染色し、ＲＮＡを検出した（図９）。図９において、本発明を用いて合成したｓｉＲＮＡはリボヌクレアーゼＴ１処理により、バンドが低分子量側にシフトしており、バンドはシングルバンドとして検出されている。一方、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した場合は、バンドがさらに低分子側にシフトしており、バンドも数本検出されている。これは３’−突出部位が非特異的に消化されている可能性を示唆しており、このことが、遺伝子発現抑制効果の低下を引き起こしていると考えられる。
【００８８】
また、上記とは別に、ＧＬ３  ｓｉＲＮＡを対象として野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Δ１７２−１７３）、及び変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼの差を、合成されるｓｉＲＮＡの抑制効果により比較した（図１０）。条件は、上記の方法と同様に行った。ここでも、一検体につき、同様の測定を３回行った。図１０において、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを用いて合成したｓｉＲＮＡが最も抑制効果が高いことが確認された。
【００８９】
（２）蛍光顕微鏡を用いたＥＧＦＰ遺伝子発現抑制の検出
ＥＧＦＰ遺伝子の遺伝子発現抑制は、同様にＨｅＬａ細胞株を用いて検討した。ｓｉＲＮＡは上記の方法により調製したものを使用し、対照としてＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ，  Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ  ＧＦＰ（ニッポンジーン社製）を用いた。
培地は１０％非働化ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５００μｌを用い、２４ウェルプレートの各ウェルに細胞を５×１０４個ずつプレーティングし、１６時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００９０】
トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１  １μｇ及びＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを培地中に終濃度１００ｎＭになるように混和し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ  ５０μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ２μｌを加えてあらかじめ調製しておいた希釈液を加えて混和した後、２０分間、室温に放置した。この脂質−ＤＮＡ−ｓｉＲＮＡ複合体  １００μｌをプレーティングした細胞に加え、続けて２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した後、蛍光顕微鏡ＡＲＧＡＳ／ＦＩＳＨ  （浜松ホトニクス）を用いて観察を行った（図１１）。
【００９１】
ここでも、化学合成ＥＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ同様に、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを用いて調製したｓｉＲＮＡは高効率にＥＧＦＰの発光を抑制した。
【００９２】
（３）ウエスタンブロッティング法によるｃｄｋ１遺伝子発現抑制の検出
ｃｄｋ１遺伝子の遺伝子発現抑制も、同様にＨｅＬａ細胞株を用いて検討した。ｓｉＲＮＡは上記の方法により調製したものを使用し、対照としてＣｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ，  Ｈｕｍａｎ  ｃｄｋ１（ニッポンジーン社製）を用いた。
【００９３】
培地は５％非働化ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍを用い、７５ｃｍ２フラスコに細胞を１×１０６個ずつプレーティングし、１６時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００９４】
トランスフェクションにはエレクトロポレーション法を用いた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒ  （アマクサ社製）９５μｌとｓｉＲＮＡ  １００ｐｍｏｌを用い、１×１０６個の細胞にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（アマクサ社製）のプログラムＡ−２８の条件でエレクトロポレーションを行い、細胞を５％非働化ウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２ｍｌに加え、６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
【００９５】
培地を除去し、細胞を回収してウエスタンブロッティングを行った。定法によりタンパク質を分離した後、ニトロセルロースフィルターに転写し、５，０００倍希釈したウサギ抗ｃｄｋ１抗体（シグマ社製）、１０，０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識−抗ウサギＩｇＧ抗体、及びＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた化学発光法により検出し、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  の添付ソフトであるＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅにより画像として取り込んだ（図１２−上）。
【００９６】
なお、ｓｉＲＮＡのクロスリンクの有無、タンパク質の分解、及び定量性確認を目的として、抗体のストリッピングを行った後、同様の方法でヒトグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の検出を行った（図１２−下）。
図１２において、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼにより合成したｃｄｋ１  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、内在性のｃｄｋ１タンパク質量を減少させた。また、変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼにより合成したＧＬ３  ｓｉＲＮＡはｃｄｋ１遺伝子の発現抑制効果を示さなかった。従って、本発明により合成したｓｉＲＮＡは内在性の遺伝子に対してもＧＬ３遺伝子、ＥＧＦＰ遺伝子と同様に特異的な抑制効果を示すことが明らかとなった。
【００９７】
［例４］ピロホスファターゼの使用の影響について
イン・ビトロ転写反応を用いて短鎖の二本鎖ＲＮＡを調製する本発明の方法において、無機ピロホスファターゼの添加効果を検討した。
まず、鋳型ＤＮＡとしてＴ７  プロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）からなる合成オリゴヌクレオチドと、これに相補的な配列（５’−ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’）の５’−側に５’−ＴＴＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＴＡＡＧＣ−３’或いは５’−ＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣ−３’の配列をそれぞれ付加した合成オリゴヌクレオチドを合成し、これを２：１：１のｍｏｌ比で混合して７５℃に加熱し、その後緩やかに冷却して二本鎖を形成させたものを準備した。この鋳型ＤＮＡ  ５０  ｐｍｏｌと転写反応用緩衝液［４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０，  ２５℃）、１００ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２０ｍＭスペルミジン、３００ｍＭ４０塩化マグネシウム、１．２５％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）］及び１００  ｍＭ  ＣＴＰ、１００ｍＭ  ＵＴＰ、１００  ｍＭ  ＧＴＰ、１００  ｍＭ  ＡＴＰを使用して転写反応溶液を１０本の容器に調製した（各ヌクレオチド溶液の終濃度はそれぞれ７．５  ｍＭとした）。
【００９８】
５本のチューブには変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ  ６５０  Ｕのみを加え、一方、残りの５本のチューブには、変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ６５０  Ｕと無機ピロホスファターゼ  ０．０５  Ｕを加えて、ともに液量を４０μｌに調整し、３７℃で同時に反応を開始した。無機ピロホスファターゼを添加していないサンプルと添加したサンプルのそれぞれについて、反応開始から５分後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後にサンプルを順次回収し、６５℃で５分間加熱して酵素を失活させた。
【００９９】
上記の溶液に滅菌蒸留水６０μｌとフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール  １００μｌをそれぞれ加え、転倒混和したのち、１２，０００  ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心した。水相を別の容器に移し、５  Ｍ  酢酸アンモニウム  （ｐＨ  ８．０）１００μｌ、９９．５  ％  エタノール４００μｌを添加し、転倒混和したのち、１６，０００  ｒｐｍ、２５  ℃で１５分間遠心してＲＮＡを濃縮した。沈殿物を７０  ％  エタノール  でリンスしたのち真空乾燥機でエタノールを除去した。沈殿物を滅菌蒸留水８０μｌに溶解し、このうち４μｌに２  ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０２  ％  ブロモフェノールブルー／０．０２  ％  キシレンシアノール混合液４μｌを加えて１×ＴＢＥを電気泳動用緩衝液として２０  ％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルをＴｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ（和光純薬工業株式会社製）を含む染色液（０．４  ％  Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ  Ｏ／１０  ％  酢酸／４０  ％  メタノール）中で５分間染色し、染色終了後、ゲルをイオン交換水に移し、脱染色を行った。電気泳動像はＦｌｕｏｒｏ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  の添付ソフトであるＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅにより取り込んだ（図１３）。
【０１００】
無機ピロホスファターゼを添加したサンプル（レーン６〜１０）では、反応時間に比例して転写産物が増加していることが明らかとなったが、添加していないサンプル（レーン１〜５）については、反応開始５分後に既に転写反応の副生成物であるピロリン酸マグネシウムの蓄積による白濁が観察され、その後も転写産物量が増加していなかった。従って、無機ピロホスファターゼの添加により、大量のｓｉＲＮＡを効率良く得ることができることが明らかとなった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】２２塩基長ＲＮＡのイン・ビトロ合成：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼによる比較。
転写反応物の検出は、転写反応後の一本鎖ＲＮＡを、変性条件下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動後、トルイジンブルーＯにて染色し、検出した。各レーンの説明は以下の通り。レーン１．野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して、センス２２塩基を合成、以下、レーン２．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼ使用、センス２２塩基、レーン３．野生型ＲＮＡポリメラーゼ使用、アンチセンス２２塩基、レーン４．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼ使用、アンチセンス２２塩基
【図２】野生型ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼのイン・ビトロ転写反応時の転写量の比較。
各キットの一反応において、一定時間内に合成されるＲＮＡ量を比較した。各グラフの説明は以下の通り。（−◆−）：変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼ、（−▲−）：野生型ＲＮＡポリメラーゼ・エピセンタ社、（−■−）：野生型ＲＮＡポリメラーゼ・アンビオン社
【図３】２１塩基長ｄｓＲＮＡ（５’−一塩基及び３’−二塩基突出型）のイン・ビトロ合成：野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼによる比較。
転写反応物の検出は、転写反応後のｄｓＲＮＡを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動後、トルイジンブルーＯにて染色し、検出した。各レーンの説明は以下の通り。レーン１．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを使用して、ｄｓＲＮＡを合成、以下、レーン２．野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ使用、ｄｓＲＮＡ
【図４】本発明により合成されるｄｓＲＮＡの模式図。
イン・ビトロ合成されたｄｓＲＮＡの構造を模式図により示した。
【図５】本発明によるｓｉＲＮＡ合成の概略。
ｄｓＲＮＡのイン・ビトロ合成から、精製、ｓｉＲＮＡ合成への工程を示した。
【図６】変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより合成したｓｉＲＮＡと化学合成ｓｉＲＮＡの電気泳動による比較。
転写反応物の検出は、転写反応後のｄｓＲＮＡを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動後、トルイジンブルーＯにて染色し、検出した。各レーンの説明は以下の通り。レーン１．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを使用して、ｄｓＲＮＡを合成、以下、レーン２．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼ使用、リボヌクレアーゼＴ１処理、レーン３．化学合成ｓｉＲＮＡ
【図７】ＧＬ３、ＥＧＦＰ、ｃｄｋ１各遺伝子に作用するｓｉＲＮＡの構造及びＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．と標的部位。
各遺伝子の発現抑制に用いたｓｉＲＮＡの構造を模式図により示した。
【図８】化学合成品と酵素合成品のＧＬ３遺伝子に対するＲＮＡｉ効果の比較。
ＨｅＬａ細胞における、ｓｉＲＮＡによるＧＬ３遺伝子の発現抑制を示した。
【図９】リボヌクレアーゼＴ１及びＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ添付のリボヌクレアーゼの比較。
転写反応物の検出は、転写反応後の二本鎖ＲＮＡを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動後、トルイジンブルーＯにて染色し、検出した。各レーンの説明は以下の通り。レーン１．変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼを使用して、ｄｓＲＮＡを合成、以下、レーン２．１のｄｓＲＮＡをリボヌクレアーゼＴ１により消化、レーン３．１のｄｓＲＮＡをＳｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ添付のリボヌクレアーゼ  により消化
【図１０】用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのＧＬ３遺伝子に対するＲＮＡｉ効果の比較。
ＨｅＬａ細胞における、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、変異型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Δ１７２−１７３）、及び変異型Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼの各ポリメラーゼで酵素合成したｓｉＲＮＡによるＧＬ３遺伝子の発現抑制を示した。
【図１１】化学合成品と酵素合成品のＥＧＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果の比較。
ＨｅＬａ細胞における、ｓｉＲＮＡによるＥＧＦＰ遺伝子の発現抑制を示した。
【図１２】ヒト内在性遺伝子に対するＲＮＡｉ効果。
ＨｅＬａ細胞における、ｓｉＲＮＡによる内在性ｃｄｋ１遺伝子の発現抑制を示した。
レーン１、ｓｉＲＮＡ未添加、レーン２、本発明によりイン・ビトロ合成したｃｄｋｌ  ｓｉＲＮＡ添加、レーン３、化学合成ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ添加
【図１３】ピロホスファターゼの添加効果。
レーン１〜５、無機ピロホスファターゼ未添加
レーン６〜１０、無機ピロホスファターゼ添加
レーン１及び６、反応開始から５分後に反応停止
レーン２及び７、反応開始から１５分後に反応停止
レーン３及び８、反応開始から３０分後に反応停止
レーン４及び９、反応開始から６０分後に反応停止
レーン５及び１０、反応開始から１２０分後に反応停止
【図１４】プロモーター領域の３’末端にある転写開始塩基をグアニン残基（Ｇ）とする場合の鋳型ＤＮＡと転写産物の関係の説明図。
【図１５】プロモーター領域の３’末端にある転写開始塩基をグアニン残基（Ｇ）とする場合の鋳型ＤＮＡと転写産物の関係の説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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