(57)【要約】【課題】観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に効率よく収集することができる細胞観察用容器を提供すること。【解決手段】本発明にかかる細胞観察用容器は細胞を観察するために細胞４を含む培養液３を注入する細胞観察用容器であって、チップ１に設けられたバッファー１１と、バッファー１１から延在してバッファー１１よりも浅く形成された流路１２とバッファー１１及び流路１２に細胞を含む培養液を注入する注入口１３を備えている。バッファー１１と流路１２を覆うようにチップ１にガラス板２を取り付けている。この細胞観察用容器を回転させて遠心力によって細胞４を移動させる。細胞４をストッパー１４近傍で停止させて高密度に収集して、観察を行う。【選択図】  図４
2005000075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を観察するために細胞を含む流体を注入する細胞観察用容器であって、
ベースに設けられた第１の凹部と、
前記第１の凹部から延在して前記第１の凹部よりも浅く形成された第２の凹部と、
前記第１の凹部及び第２の凹部を覆うように前記ベースに取り付けられたプレートと、
前記第１の凹部及び前記第２の凹部に前記流体を注入する注入口と、
前記第２の凹部に形成され、前記細胞の移動を停止させるストッパーとを備え、
前記ベース又は前記プレートが透明材料からなる細胞観察用容器。
【請求項２】
前記第２の凹部が観察対象となる細胞の大きさの１／２倍以上１．５倍以下の深さを有することを特徴とする請求項１記載の細胞観察用容器。
【請求項３】
前記第２の凹部の深さが１μｍ以上３０μｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の細胞観察用容器。
【請求項４】
前記第２の凹部が前記第１の凹部から放射状に複数形成されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の細胞観察用容器。
【請求項５】
前記第２の凹部から延在して形成され、当該第２の凹部よりも深く設けられた第３の凹部をさらに備え、
前記第２の凹部が曲部を有し、当該曲部を介して前記第１の凹部と前記第３の凹部が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の細胞観察用容器。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか記載の細胞観察用容器に前記注入口から前記細胞を含む前記流体を注入するステップと、
前記第１の凹部を中心側にして前期細胞観察容器を回転させるステップを有する細胞収集方法。
【請求項７】
細胞を観察するために細胞を含む流体を注入する細胞観察用容器と、
前記細胞観察用容器を載置するステージと、
前記ステージを回転させる回転部とを備えた細胞収集装置であって、
前記細胞観察用容器が、ベースに設けられた第１の凹部と、
前記第１の凹部から延在して前記第１の凹部よりも浅く形成された第２の凹部と、
前記第１の凹部及び第２の凹部を覆うように前記ベースに取り付けられたプレートと、
前記第１の凹部及び前記第２の凹部に前記流体を注入する注入口と、
前記第２の凹部に形成され、前記細胞の移動を停止させるストッパーとを備える細胞収集装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞を観察するための細胞観察用容器及び細胞を高密度に収集する細胞収集装置、細胞収集方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、動物や植物の細胞を観察するためには細胞を含む培養液を平坦なスライドやシャーレに滴下して、顕微鏡で観察していた。またスライド上に設けた凹部に培養液を滴下して、細胞を観察するものもある（例えば、特許文献１）。あるいは走化性を有する細胞等を観測する観測チップが本件の出願人から出願されている（例えば、特許文献２）
【０００３】
ところで、細胞を観察する効率を上げるためには培養液中の細胞の密度を高くした状態にすることが望ましい。しかしながら培養液中の細胞の密度を上げることができない希少な細胞がある。このような細胞をスライド上で高密度に収集する場合、ピン状の道具などを用いてスライド上の細胞を個別に収集していた。しかし、ピン状の道具などを用いた場合、１つ１つの細胞をピン状の道具で移動させて密度を上げていくため、作業の手間がかかってしまい収集効率がよくなかった。さらに、ピン状の道具で細胞に触れるため細胞が破壊されてしまうことがあった。このようにピン状の道具を用いた場合、細胞を破壊せずに効率よく細胞を収集することが困難であった。
【０００４】
また、スライドの上では、カバーガラスを置いた場合であっても培養液中の水分が蒸発してしまう。その際に、培養液が動いてしまうため、収集した細胞が観察者の意図しない方向に移動してしまい、観察に支障を及ぼすことになる。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００１−５１５２１１号公報（図３）
【特許文献２】
特願２００２−０１９３４５号公報
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来は効率よく細胞を高密度に収集することができないという問題点があった。
【０００６】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたもので、効率よく観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に収集することができる細胞観察用容器及び細胞収集方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明にかかる細胞観察用容器は、細胞（例えば、本発明の実施の形態における細胞４）を観察するために細胞を含む流体（例えば、本発明の実施の形態における培養液３）を注入する細胞観察用容器であって、ベース（例えば、本発明の実施の形態におけるチップ１又はウェハ１６）に設けられた第１の凹部（例えば、本発明の実施の形態におけるバッファー１１）と、前記第１の凹部から延在して前記第１の凹部よりも浅く形成された第２の凹部（例えば、本発明の実施の形態における流路１２）と、前記第１の凹部及び第２の凹部を覆うように前記ベースに取り付けられたプレート（例えば、本発明の実施の形態におけるガラス板２）と、前記第１の凹部及び前記第２の凹部に前記流体を注入する注入口（例えば、本発明の実施の形態における注入口１３）と、前記第２の凹部に形成され、前記細胞の移動を停止させるストッパー（例えば、本発明の実施の形態におけるストッパー１４）とを備え、前記ベース又は前記プレートが透明材料からなるものである。これにより、観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に効率よく収集することができる。
【０００８】
上述の細胞観察用容器の好適な実施例は前記第２の凹部が観察対象となる細胞の大きさの１／２倍以上１．５倍以下の深さを有することを特徴とするものである。これにより、細胞を壊さずに高密度に収集することができる。
【０００９】
上述の細胞観察用容器の好適な実施例は前記第２の凹部の深さが１μｍ以上３０μｍ以下であることを特徴とするものである。
【００１０】
上述の細胞観察用容器において、前記第２の凹部が前記第１の凹部から放射状に複数形成されていることが望ましい。これにより、同じ収集条件の細胞を効率よく収集することができ、比較観察を正確に行うことができる。
【００１１】
本発明にかかる細胞観察用容器は上述の細胞観察用容器において、前記第２の凹部から延在して形成され、当該第２の凹部よりも深く設けられた第３の凹部をさらに備え、前記第２の凹部が曲部を有し、当該曲部を介して前記第１の凹部と前記第３の凹部が形成されているものである。これにより、薬液の濃度勾配を長時間設けることができる。
【００１２】
本発明にかかる細胞収集方法は、上述のいずれかの細胞観察用容器に前記注入口から前記細胞を含む前記流体を注入するステップと、前記第１の凹部を中心側にして前期細胞観察容器を回転させるステップを有するものである。これにより、観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に効率よく収集することができる。
【００１３】
本発明にかかる細胞収集装置は、細胞を観察するために細胞を含む流体を注入する細胞観察用容器と、前記観察用容器を載置するステージ（例えば、本実施の形態におけるステージ２０）と、前記ステージを回転させる回転部（例えば、本実施の形態におけるモーター２１）とを備えた細胞収集装置であって、前記細胞観察用容器が、ベースに設けられた第１の凹部と、前記第１の凹部から延在して前記第１の凹部よりも浅く形成された第２の凹部と、前記第１の凹部及び第２の凹部を覆うように前記ベースに取り付けられたプレートと、前記第１の凹部及び前記第２の凹部に前記流体を注入する注入口と、前記第２の凹部に形成され、前記細胞の移動を停止させるストッパーとを備えるものである。これにより、観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に効率よく収集することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態１．
本発明の実施の形態ついて以下に図面を参照して説明する。以下の説明は、本発明の好適な実施の形態を示すものであって、本発明の範囲が以下の実施の形態に限定されるものではない。以下の説明において、同一の符号が付されたものを実質的に同様の内容を示している。
【００１５】
図１（ａ）は細胞観察用容器の構成を示す断面図であり、図１（ｂ）は断面図である。図２は細胞観察用容器に用いられるチップの斜視図である。１はチップ、２はガラス板、１１はバッファー、１２は流路、１３は注入口、１４はストッパーである。図２に示すようにチップ１の１つの面には段差を有する溝をパターニングしており、深い溝は培養液を蓄えるバッファー１１、浅い溝は細胞が流れる流路１２である。流路１２はバッファー１１から延在して形成されて、細胞及び培養液がバッファー１１から流路１２に流れ込むようになっている。この上からバッファー１１及び流路１２を覆うようにガラス板２をチップ１に取り付けて、図１に示すような細胞観察用容器を構成する。この細胞観察用容器を回転装置により回転して、遠心力により細胞を高密度かつ適度な分布に収集する。
【００１６】
チップ１のガラス板２が設けられる面と反対側の面の一部には細胞を含む培養液を注入する注入口１３が設けられている。注入口１３はバッファー１１まで貫通しており、この注入口１３を上にしてバッファー１１と流路１２に細胞を含む培養液を注入する。細胞４は白血球に含まれる細胞であり、外径が数μｍから十数μｍ程度の大きさである。チップ１において流路１２のバッファー１１と反対側の側壁は細胞の流れを停止させるためのストッパー１４となる。チップ１はシリコンウェハから切り出されている。ガラス板２は厚さ０．１ｍｍ〜１．５ｍｍ程度の透明基板であり、このガラス板側からレンズ系を有する光学顕微鏡を用いて細胞の挙動を観察する。またはチップ１をガラスや樹脂（ＰＭＭＡ、ＰＤＭＳ）の透明性材料で構成した場合はチップ１側（ガラス板２が設けられている面と反対側の面）から観察することもできる。
【００１７】
チップ１の流路１２は幅が数十μｍ〜１ｍｍであり、長さが数百μｍ〜数ｍｍ程度である。もちろんバッファー１１と流路は同じ幅として図示したが異なる幅であってもよい。さらに、流路１２の幅は一定でなくてもよく、ストッパー１４側の幅が狭くなっていても良い。また、本実施の形態にかかるチップ１の大きさは１辺が数ｍｍ〜数ｃｍ程度であり、高さが数ｍｍ程度の直方体である。なお、チップ１は直方体に限らず、円柱等の形状をしていてもよい。注入口１３の大きさは１ｍｍ〜数ｍｍである。図においてバッファー１１は流路１２と同じ幅で形成しているが、収集したい細胞の数や培養液中の細胞濃度等に応じて、適当な大きさに形成することも可能である。
【００１８】
この細胞観察用のチップ１に培養液を注入した状態を図３に示す。図３（ａ）は培養液を注入した状態の構成を示す断面図であり、図３（ｂ）はその断面図である。注入口１３を上にした状態で、培養液３のみを注入して容器内を培養液３で満たした後、細胞４を含む培養液３をバッファー１１及び流路１２に流し込むと最初に注入した培養液３があふれ、細胞４が容器内に注入される。あるいは細胞４を含む培養液３を最初から注入してもよい。なお、培養液３の注入前に注入口１３からバッファー１１及び流路１２を減圧した状態としてもよい。あるいはストッパー１４近傍に空気穴をあけても良い。細胞４は培養液３よりも比重が重いため、底面であるガラス板２まで沈んでいく。培養液の液面が流路よりも高くなるように注入しているため、バッファー１１中の細胞４が底面に沈殿していく。よって、バッファー１１の底面における培養液中の細胞の密度は流路１２の底面における培養液中の細胞４の密度よりも高くなる。また、バッファー１１の底面における細胞４の密度は均一である。また、流路１２の底面における細胞４の密度も均一である。培養液３の注入が終わったら回転時の液漏れを防ぐため注入口１３に蓋５をして密封する。蓋５にはゴム等の弾性を有するキャップが用いられ、注入口１３にはめ込むことで容器の密閉を行う。あるいは、注入口１３に粘着性を有するテープなどを貼り付けてもよい。なお、細胞４を注入した後、この注入口１３から薬液を投入して、薬液と細胞との反応を観察することも可能である。
【００１９】
次に培養液中の細胞４を高密度に収集するために、上述のチップ１を図４示すように回転装置に載置する。回転装置はステージ２０とステージ２０を回転するためのモーター２１を備えている。このステージ２０の上にバッファー１１が中心側に、流路１２が外側になるようにチップ１を載置する。このチップ１を回転半径が数十ｃｍの位置で固定して、モーター２１によってステージ２０を数百〜数千ｒｐｍで数十秒〜十数分間回転させる。チップ１の細胞４に遠心力が加わり、細胞４がステージ２１の外側に移動する。この回転速度、回転半径及び回転時間は細胞及び容器の寸法並びに収集する細胞の濃度などに基づいて設定する。
【００２０】
この細胞４が移動した状態を図４に示す。遠心力によりバッファー１１から流路１２に細胞４が移動して、流路端部の側壁であるストッパー１４で停止される。回転を続けることによって、細胞の移動が順次停止していき、ストッパー１４近傍で細胞４を高密度で収集することができる。流路１２の溝深さを細胞４の大きさの１／２以上とすると回転時に細胞４が流路１２を障害なく通過することができる。また、流路１２の溝深さを細胞４の大きさの１．５倍以下にすると細胞４が深さ方向に重ならずに１面に拡がった状態で収集され、観察時に他の細胞と重なることがなくなり、各々の細胞を別々に観察することができる。流路１２の深さを観察対象となる細胞４の０．５倍以上１．５倍以下にすると、回転時における細胞の損傷を防止することができ、外乱による細胞４も移動もなくなるため観察に適している。これにより、細胞の収集効率及び観察効率を向上することができる。例えば、白血球等の細胞を観察する場合、白血球等の細胞サイズは数μｍ〜十数μｍ程度であるので、流路１２を１μｍ以上３０μｍ以下とすることが望ましい。もちろん、細胞のサイズによって、流路１２の深さを最適化することが望ましい。そして、容器を顕微鏡などに載置して観察を行う。ここでは図４（ｂ）の点線の領域を顕微鏡で拡大して細胞の挙動を観察している。細胞を高密度で収集することによって、白血球中にわずか割合でしか含まれない特殊な細胞であっても効率よく観察することができる。
【００２１】
次に図６を用いて容器の製造工程の一例について説明する。チップ１のパターン形成には通常のフォトリソグラフィー工程を複数回用いている。３０はウェハ、３１、３２、３３はレジストである。ここではウェハ３０にはＳｉウェハを用いている。図６はウェハ３０のチップが形成される部分の構成を示す断面図である。図６（ａ）に示すようにＳｉのウェハ３０上にフォトレジスト３１を塗布する。これにより、図６（ｂ）に示す構成となる。次にレジスト３１を露光、現像して、バッファー１１及び流路１２を形成するパターンのレジストを除去する。Ｓｉウェハ３０のエッチングを行うと図６（ｃ）に示す構成となる。ここでウェハ３０に凹部が形成され、この凹部の一部が流路１２になる。なお、エッチングはドライエッチング、ウェットエッチングのいずれのエッチング方法をも用いることができる。さらに残存したレジスト３１を剥離すると図６（ｄ）に示す構成となる。その上からレジスト３２を塗布して露光、現像を行い、バッファー１１に対応するパターンのレジスト３２を除去する。これにより図６（ｅ）に示す構成となる。この上から再度エッチングを行い、バッファー１１となる凹部を形成する。レジスト３２を剥離すると図６（ｆ）に示す構成となる。これにより流路１２とバッファー１１に対応する凹部の溝パターンが形成される。
次にウェハ３０の反対面からレジスト３３を塗布し、同様に露光、現像して注入口１３のパターンのレジスト３３を除去する。ウェハ３０を貫通するまでエッチングして、注入口１３を形成すると図６（ｇ）に構成とする。レジスト３３を除去して、パターン形成が完了する。ウェハ３０とガラス板２を陽極接合により接合させる。陽極接合の場合、ガラス板の厚さを薄くすることができるので顕微鏡の対物レンズと細胞との距離を短くすることができ、細胞の観察倍率を向上することが可能になる。これにより図６（ｈ）に示す構成となる。このようなパターンはウェハ３０上に多数設けられており、ウェハ３０をダイシングすることにより多数の細胞観察用容器を１度に製造することができる。ウェハ状態でパターンを形成することにより、細胞観察用容器の生産性を向上することができる。またリソグラフィー工程では精度よく凹部を形成することが出来るため、流路１１２の溝深さ等の細かなパターン形成が可能になる。なお、本発明にかかる細胞観察用容器において凹部のパターンを形成するのはチップ１に限られず、ガラス板２に凹部を形成してもよい。例えば、チップ１にバッファー用の凹部を設け、ガラス板２に流路用の凹部を形成して、このチップ１とガラス板２を貼り合わせても同様の効果を得ることが出来る。さらには凹部を形成した２枚以上のウェハを貼合わせても同様の効果を得ることができる。また上述の説明ではチップ１とガラス板２を貼り合わせて製造したが、本発明にかかる細胞観察用容器はチップ１とガラス板２を一体形成した容器に穴を設けて流路及びバッファー等を形成してと容器も含まれるものとする。
【００２２】
もちろん、容器の製造方法は上述のものに限られるものではない。例えば、Ｓｉウェハの他にガラス板などをパターニングしてよい。またパターニングの順番も図示したものに限られるものではない。ウェハ３０に深さの異なる凹部を設けることにより、流路１２とバッファー１１に対応するパターンを形成すればよい。また、注入口１３の位置はガラス板２と反対側の面に限られない。流路１２とバッファー１１に細胞及び培養液を注入できれば良く、例えばチップ１の側壁に設けても良い。
【００２３】
なお、上述の製造方法ではＳｉウェハをパターニングしたが、樹脂により観察用容器を形成することもできる。樹脂を用いて観察用容器を形成する場合、型（スタンパ）を用いて射出成形することにより、チップ１と同様の形状を得ることができる。あるいは、光硬化性樹脂を用いて光を照射してパターニングすることも可能である。この樹脂とガラス板を貼り合わせることによっても同様に観察用容器を製造することができる。あるいは透明の樹脂を用いてもよい。チップ１を透明な材料で形成することにより、ガラス板２側及びチップ１側のいずれの面からでも細胞の観察を行うことができる。もちろん、チップ１又はガラス板２のいずれか一方が透明であればよく、チップ１が透明材料から構成される場合はガラス板２を不透明な材料で形成しても良い。
【００２４】
発明の実施の形態２．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図７を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は実施の形態１と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では図７に示すようにバッファー１１から流路４が分離しており、細胞を含む培養液を分注できるようになっている。１つのバッファー１１から分岐された４本の流路１２が設けられており、細胞４をそれぞれ高密度で収集することができるようになっている。４本の流路１２が外側になるよう回転装置に載置して容器を回転させることで、１度に４本の流路で細胞の収集が可能になり、細胞収集のスループットを向上することができる。もちろん流路の数は２本以上であればよい。
図に示す点線から先端側が浅い溝であり、分岐部分の途中までが深い溝である。この深い溝をバッファー１１、浅い溝を流路１２としている。さらに分岐部分には薬液投入口１５が設けられている。この薬液投入口１５からそれぞれの流路１２に薬液を投入することができるようになっている。それぞれの流路１２で薬液と細胞との反応を観察することが可能になる。また、薬液投入口１５には注入口１３と同様に蓋をすることができるようになっており、回転時には蓋をして培養液の液漏れを防ぐ。
【００２５】
また図２に示すように４つの薬液投入口１５を直線状に設けることによって、多連シリンジで一度に薬液を投入することができる。このため観察効率を向上することができる。また市販されている多連シリンジを利用することができるため、特別な器具が不要となり利便性を向上できる。さらに４本の流路１２を異なる条件で観察することを可能である。例えば、それぞれの流路１２を異なる温度条件に設定して細胞の状態を比較観察することも可能になる。また、それぞれの流路に異なる薬液を投入して比較観察することもできる。このように本実施の形態の構成により、収集効率及び観察効率を向上することができる。
【００２６】
本発明の実施の形態３．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図８を用いて説明する。図８は本実施の形態にかかる細胞観察用容器の断面図である。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では図８に示すように円状のウェハ１６の中心に培養液を注入するための注入口１３が形成され、その周りに培養液を蓄える円形の溝パターンが形成されている。さらに円形のパターンからは放射状に複数本の溝パターンが延在されている。これらの溝パターンは実施の形態１と同様にＳｉウェハ上に形成されている。図８において放射状に伸びた溝パターンの途中で溝の深さが変わっており、点線より中心側は溝が深く、外側は溝が浅くなっている。この点線より内側の深い溝をバッファー１１、点線の位置から放射状に伸びた浅い溝を流路１２とする。流路１２の末端の側壁は細胞の移動を停止するストッパー１４として機能している。このバッファー１１と流路１２の上にはガラス板が取り付けられている。
【００２７】
実施の形態１と同様に注入口１３から細胞を含む培養液をバッファー１１と流路１２に注入する。そして図９に示す回転装置に回転中心と円形のウェハ１６の中心が一致するようにウェハ１６を載置させる。矢印の方向にウェハ１６を回転させると、遠心力により細胞が外側へと移動する。なお、図９においてウェハ１６のパターンは省略して図示している。遠心力が加えられた細胞はバッファー１１から流路１２へと移動していき、ストッパー１４の位置で順次停止する。これにより、ストッパー１４近傍で細胞を高密度に収集することができる。ウェハ１６の中心から放射状に流路１２を設けることによって、複数の流路１２において細胞を均一に収集することができる。これにより、それぞれの流路１２との比較観察を正確に行うことができる。このように円形の深い溝とその深い溝から放射状に伸びた浅い溝を形成することによって、バッファー１１からの分流条件が平等になるため、細胞の収集条件に各流路同じにすることができる。なお、流路の本数は２本以上設ければよい。
【００２８】
さらに本実施の形態では放射状に伸びた溝の途中に薬液投入口１５を設け、それぞれの流路に薬液を投入できるようにしている。これによりそれぞれの流路に異なる薬液を投入することができ、それぞれの流路１２異なる薬液と細胞の反応を比較観察することができる。このように円形のパターンを円形のウェハ上に形成することによって、効率よくウェハを利用することができる。このウェアには４インチのＳｉウェハ等をそのまま利用することができ、ダイシングする工程が必要なくなるため生産性を向上することができる。もちろん、Ｓｉウェハから溝パターンを有する円形のチップを切り出してもよく、矩形のチップに円形のパターンを形成してもよい。
【００２９】
本発明の実施の形態４．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１０を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では図１０に示すように矩形状のチップにＵ字型の溝が形成されている。そして曲部の側壁をストッパー１４として、細胞を収集している。
【００３０】
Ｕ字型の溝の直線部分には深い溝が形成されている。Ｕ字の湾曲部分には浅い溝が形成されている。図１０の点線で溝の深さが変わっている。直線部分の一方には培養液を注入するための注入口１３が設けられている。この注入口１３が設けられている直線部分がバッファー１１となり、反対側の直線部分がリザーバー１７となる。そして、バッファー１１とリザーバー１７の間に設けられた溝の浅い湾曲部分が流路１２となる。バッファー１１とリザーバー１７には同じ深さの深い溝を形成しているため、リソグラフィー工程を増やすことなくリザーバー１７を形成することができ、生産性の低下を防ぐことができる。なお、リザーバー１７とバッファー１１を異なる深さにしてもよい。
【００３１】
湾曲部分を外側、直線部分を内側にして上述の実施の形態と同様に回転装置に載置して容器を高速で回転させる。これによりバッファー１１にある細胞が流路１２に移動していく。このとき、流路１２の湾曲部分において外側の側壁がストッパーとして機能して、細胞４の移動を停止させる。これにより、図１０に示す構成となり、培養液中の細胞４を高密度に収集することができる。さらに湾曲している流路１２のバッファーの反対側にリザーバー１７を設けている。注入口１３から薬液を投入した場合、リザーバー１７の体積によって、薬液の拡散時間が長くなる。流路１２の部分に薬液の濃度勾配を長時間作ることができる。これにより、薬液と細胞の反応を長時間観察することが出来る。なお、パターンはＵ字型に限らず、Ｖ字型、コの字型等でも曲部を有していればよい。
【００３２】
図１０に示す構成で走化性を有する細胞を収集する場合、走化性を有する細胞のサイズが１μｍ〜２０μｍであるとすると流路１２の溝の深さは０．５μｍ〜３０μｍ程度になる。注入口１３から走化性因子を注入するとパターン内で走化性因子の濃度勾配ができる。走化性因子の濃度が高いリザーバー１７側に走活性を有する細胞が移動する。図１０の矢印の方向に細胞４が移動していく。このように薬液の度勾配を長時間保つことにより、走化性を有する細胞の挙動を観察することができるようになる。
【００３３】
本発明の実施の形態５．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１１を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では溝パターンがコの字型に形成されている。実施の形態４と同様に直線部分には深い溝が形成され、屈曲部分には浅い溝が形成されている。図１１の点線部分で溝の深さが変わっている。この間に延在している屈曲部分が流路１２となる。直線部分の一方がバッファー１１、もう一方がリザーバー１７となる。バッファー１１には注入口１３が形成され、ここから細胞を含む培養液が注入される。リザーバー１７には薬液投入口１５が形成されている。これにより実施の形態４と同様に細胞を収集することができる。この薬液投入口１５及び注入口１３の両方から同じ薬液あるいは異なる薬液を注入することができる。さらに薬液投入口１５は培養液３を注入する際には空気穴として機能するため、培養液３の注入を容易に行うことができる。
図１１に示すようにコの字型のパターンが形成されている構成で走化性を有する細胞を収集する場合、
ストッパーを直線的に形成することができる。そのため、収集された細胞が直線状に配列され、走化性を有する細胞の挙動を定量的に観察することができる。
【００３４】
本発明の実施の形態６．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１２を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では実施の形態３の構成に実施の形態４を組み合わせた構成をしている。すなわち、放射状に形成された溝パターンの先端部分をＵ字型の流路１２としている。本実施の形態では実施の形態３と同様に異なる深さの溝を有するパターンが形成された円形のウェハ１６を用いている。このウェハ１６をガラス板２と貼合せ、ダイシングしない状態のままで観察用容器として用いている。ウェハ１６と同心円状に深い溝パターンが形成されており、この部分がバッファー１１となる。さらの深い溝パターンから放射状に溝パターンが形成されている。図１２の点線が浅い溝パターンと深い溝パターンの境界となる。各流路１２のそれぞれで均一に細胞を収集することができる。これによりそれぞれの流路１２に収集された細胞を比較観察することが可能になり、細胞の収集効率、観察効率を向上することができる。
【００３５】
浅い溝パターンは実施の形態４と同様に湾曲して形成されている。これにより流路１２の下流側に薬液のリザーバー１７を設けることができる。よって薬液の拡散時間を長くすることができ、濃度勾配を長時間設けることが可能になる。これにより、観察効率を向上することができる。
【００３６】
本発明の実施の形態７．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１３を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態で実施の形態４に示す構成の観察用容器において流路１２の内側の薬液流路１９を設けている。薬液流路１９の溝はバッファー１１と同じ深さにしている。これにより、細胞収集後のリザーバー側に薬液を送る際に細胞に薬液は内側の深い部分を流れ、外側の浅い部分はほとんど流れない。そのため、観察中の細胞に対して薬液の流れに影響を与えないようにすることができる。
【００３７】
本発明の実施の形態８．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１４を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では、実施の形態２と実施の形態４を組み合わせた構成となっている。すなわち、流路１２を複数形成するように溝パターンを分岐しており、それぞれのパターンの先端部分が流路１２となる。そして、流路１２の形状がＵ字型になっている。これにより、細胞の収集効率を向上することができるとともに、比較観察を行うことができる。また、流路１２には薬液投入口１５が直線状に設けられているので多連のシリンジを用いて一度に薬液を投入することができる。
【００３８】
発明の実施の形態９．
本実施の形態にかかる細胞観察用容器について図１５を用いて説明する。本実施の形態では基本的な構成要素は上述の実施の形態と同様であるため、同様の構成、製造工程、サイズについては説明を省略する。本実施の形態では、実施の形態３と実施の形態８を組み合わせた構成となっている。すなわち、ウェハ１６上に円形の溝パターンとそこから伸びた複数の溝パターンを形成している。さらに複数の溝パターンを途中から平行にしている。点線の内側で溝の深さが変わっており、内側の深い溝をバッファー１１とし、外側の浅い溝を流路１２としている。そして流路１２の先端部分を湾曲させて略Ｕ字型としている。これにより薬液投入口１５を直線状にすることができ多連のシリンジを用いて一度に薬液を投入することができる。さらにこの構成によれば、バッファー１１が円形であるため、いずれの流路１２に対しても細胞を均一に分注することができる。これにより、細胞を略均一に収集することができ、正確に比較観察を行うことができる。
【００３９】
その他の実施の形態．
本発明は上述した実施の形態だけに限られず、様々な変更が可能である。例えば、上述の実施の形態において示した形状以外にも深いバッファーと浅い流路１２を備え、当該流路１２に回転動作によって細胞の移動を停止させるストッパー１４を有していればよい。実施の形態１では流路１２の側壁又は流路の端部がストッパー１４となっていたが、流路の途中に凸部を設けてストッパーとしてもよい。また流路の途中にメッシュ状のストッパーを設けても良い。実施の形態で示した観察用容器のサイズは１例であり、これに限るものではない。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、効率よく観察対象となる細胞を高密度かつ適度な分布状態に収集することができる細胞観察用容器、細胞収集装置及び細胞収集方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態１にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態１にかかる細胞観察用チップの構成を示す斜視図である。
【図３】本発明の実施の形態１にかかる細胞観察用チップに培養液を注入した状態を示す図である。
【図４】本発明にかかる細胞観察用チップを回転する回転装置の構成を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態１にかかる細胞観察用チップを回転して細胞を高密度に収集した状態を示す図である。
【図６】本発明にかかる細胞観察用チップの製造工程を示す断面図である。
【図７】本発明の実施の形態２にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図８】本発明の実施の形態３にかかる細胞観察用ウェハの構成を示す平面図である。
【図９】本発明にかかる細胞観察用ウェハを回転する回転装置の構成を示す図である。
【図１０】本発明の実施の形態４にかかる細胞観察用チップの構成を示す平面図である。
【図１１】本発明の実施の形態５にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図１２】本発明の実施の形態６にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図１３】本発明の実施の形態７にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図１４】本発明の実施の形態８にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【図１５】本発明の実施の形態９にかかる細胞観察用チップの構成を示す図である。
【符号の説明】
１  チップ、２  ガラス板、３  培養液、４  細胞、５  蓋、１１  バッファー、１２  流路、１３  注入口、１４  ストッパー、１５  薬液投入口、１６  ウェハ、１７  リザーバー、１９  薬液流路
２０  ステージ、２１  モーター、３０  基板、３１  レジスト、３２  レジスト、３３  レジスト
【図１】
2005000075.tif 000003
【図２】
2005000075.tif 000004
【図３】
2005000075.tif 000005
【図４】
2005000075.tif 000006
【図５】
2005000075.tif 000007
【図６】
2005000075.tif 000008
【図７】
2005000075.tif 000009
【図８】
2005000075.tif 000010
【図９】
2005000075.tif 000011
【図１０】
2005000075.tif 000012
【図１１】
2005000075.tif 000013
【図１２】
2005000075.tif 000014
【図１３】
2005000075.tif 000015
【図１４】
2005000075.tif 000016
【図１５】
2005000075.tif 000017