(57)【要約】【課題】  ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を調節し、且つヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘルパー細胞系を提供するために、改変されたアデノウイルスベクターを提供する。【解決手段】  Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが含む単離ＤＮＡ分子である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記弱力化パッケージ化シグナルがアデノ富化モチーフ（Ａ反復）の部分的な欠失を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するように直接反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するようにＡ反復配列の直列反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記弱力化パッケージ化シグナルが該ＤＮＡ分子上のタンパク結合部位に隣接して位置し、それにより該タンパク質の該タンパク結合部位への結合がパッケージ化タンパク質と該弱力化パッケージ化シグナルとの会合を妨げる単離ＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記パッケージ化シグナルが前記Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノム内の野生型ヘルパーＡｄゲノムに見出されるもの以外の位置に位置する、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記パッケージ化シグナルが、パッケージ化タンパク質に対する親和性が野生型パッケージ化タンパク質よりも低い合成パッケージ化シグナルである、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記アデノウイルスゲノムがＥ１に加えてアデノウイルス遺伝子の欠失を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。
【請求項９】
Ａｄ  Ｅ１遺伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞であって、該配列がＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たない細胞。
【請求項１０】
非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、
胚幹細胞に、ＡＡＶＳ１配列及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程；
該薬剤選択マーカー遺伝子の発現により耐性が付与される薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程；
該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程；
該胚盤胞を仮母に移植する工程；
得られた子孫を飼育する工程；
該子孫をＡＡＶＳ１配列の存在について検定する工程；及び
ＡＡＶＳ１配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程；
を組み合わせて包含し、
それによりそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニック動物が生じる方法。
【請求項１１】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ分子が図５０に示されるｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物がマウスである非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに有する、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸をさらに有する、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記動物が血友病表現型、及び該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記動物が血友病表現型及び該動物のゲノムに安定に組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、請求項１４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１９】
そのゲノムに安定に組み込まれているＤＮＡ分子ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ又はそれらの断片を有する、非ヒトトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
前記動物がマウスである、請求項１９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２１】
そのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれている非ヒトトランスジェニック動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲを含むウイルスベクターのイン・ビボ送達を試験するための方法であって、
生理学的に許容し得るバッファ中の、ＡＡＶ−ＩＴＲ配列を有するＤＮＡ分子を含み、かつレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするベクターを該動物の静脈内又は門脈に注射する工程；
該動物から複数の血液試料を得る工程；
該血液試料における遺伝子発現の水準を測定して導入遺伝子の発現の持続を決定する工程；及び
該動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する工程；及び
ＡＡＶＳ１特異的プライマーを用いて該組織のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を行って該動物のゲノムへの該ベクターの組み込みを検出する工程；
を組み合わせて包含する方法。
【請求項２２】
前記ゲノムＤＮＡに対する蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション分析を行って、前記ＡＡＶＳ１配列の染色体位置を決定し、かつ前記ＡＡＶＳ１配列での前記レポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを検出する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、転写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、転写制御領域、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、転写制御領域、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸、及びＲｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、
胚幹細胞にヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程；
該薬剤選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現により耐性が付与される薬剤の存在下において該細胞を成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程；
該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程；
該胚盤胞を仮母に移植する工程；
得られた子孫を飼育する工程；
該子孫を、該子孫のゲノム内の該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の存在について検定する工程；及び
該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程；
を組み合わせて包含し、
それによりヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニック動物が生じる方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ分子が、合成プロモーター、発生的に調節されるプロモーター又は組織特異的プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ分子が、α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ分子が図５７に示されるｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物がマウスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓特異的プロモーターの転写制御の下に含むＤＮＡ分子を含む胚幹細胞であって、該ＤＮＡ分子が薬剤選択マーカー遺伝子をさらに含む胚幹細胞。
【請求項３２】
ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。
【請求項３３】
α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に、そのゲノムに組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。
【請求項３４】
図５７に示されるＤＮＡ分子ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏ又は、それらの断片を有し、前期マウスのゲノムに組み込まれているトランスジェニックマウス。
【請求項３５】
緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、
胚幹細胞に、合成プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生的に調節されるプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に緑色蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程；
該薬剤選択マーカー遺伝子のタンパク質産生物の発現により耐性が付与される薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程；
該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程；
該胚盤胞を仮母に移植する工程；
得られた子孫を飼育する工程；
該子孫を緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の存在について検定する工程；及び
そのゲノム内に緑色蛍光タンパク質遺伝子配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程；
を組み合わせて包含し、
それにより緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されたトランスジェニック動物が生じる方法。
【請求項３６】
前記動物がマウスである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織特異的プロモーターがα−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα１−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ分子が図６０に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマウス。
【請求項４１】
そのゲノムに安定に組み込まれている、図６０に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択されるＤＮＡ分子を有するトランスジェニックマウス。
【請求項４２】
そのゲノム内にＡＡＶＳ１配列を含む非ヒトトランスジェニック緑色蛍光タンパク質寛容化動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ及び緑色蛍光タンパク質遺伝子を含むベクターのイン・ビボ送達を試験する方法であって、
該ベクターを該動物に注射する工程；
該動物から血液試料を単離し、該血液試料を緑色タンパク質の存在について分析する工程；
該動物から肝臓組織を単離する工程；
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列をコードする核酸の存在について該肝臓組織を分析する工程；
該肝臓組織の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡技術を用いて該凍結切片を緑色蛍光タンパク質の存在について分析する工程；
を組み合わせて包含し、
緑色蛍光タンパク質の存在は該トランスジェニック動物内で検出される方法。
【請求項４３】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
図４２に示される、ＧＴ２０７４と呼ばれるＤＮＡ分子。
【請求項４５】
図４３に示される、ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩミニと呼ばれるＤＮＡ分子。
【請求項４６】
図６０に示される、ＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１と呼ばれるＤＮＡ分子。
【請求項４７】
図５６に示される、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏと呼ばれるＤＮＡ分子。
【請求項４８】
図６０に示される、ＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰと呼ばれるＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、１９９６年５月３１日出願の米国出願番号０８／６５８，９６１号及び１９９７年１月３１日出願の米国出願番号０８／７９１，２１８号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、並びに遺伝子移入、遺伝子治療、及び遺伝子ワクチン接種を含む遺伝学的医療の分野におけるそれらの用途に関する。特に、本発明は、Ａｄゲノムの最小ｃｉｓ−要素を坦持し（ミニＡｄベクター）、且つ約３６ｋｂまでの導入遺伝子及び／又は異種ＤＮＡを送達することが可能なＡｄベクターに関する。このミニＡｄベクターの生成及び増殖には、Ａｄヘルパー細胞系におけるパッケージ化弱力化複製欠損ヘルパーＡｄ（ヘルパー）のトランス補完性が必要とされる。
【０００３】
本発明は、さらに、血友病の遺伝子治療において用いるためのミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクター及びこのＡｄベクターのイン・ビボ評価のための動物試験系を生成するための方法論を包含する。特には、本発明では、Ａｄゲノムの最小シス−要素（いわゆるミニＡｄ）のみを有し、且つヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを他の支持ＤＮＡ要素と共に３６ｋｄまで含む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ａｄベクターが説明される。このＦＶＩＩＩミニＡｄは、パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ及びヘルパー細胞系の補助により生成し、優先的に増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄのイン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニックマウスモデルを生成するための構造及び方法も報告する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝学的医療の開発における重要な問題は好ましい遺伝子送達系の開発である。この好ましい遺伝子送達系は、単一の遺伝子治療ベクターにおいて現在利用不可能である幾つかの特性を有していなければならない。この好ましいベクターは、大きな、もしくは複数の、調節要素を含む導入遺伝子を受け入れるのに適する収容力を保持し、且つ製造のための簡潔な操作及びスケールアップに順応しなければならない。また、このようなベクターは安全で低毒性を示すことはもちろん、標的細胞又は組織への非常に効率的且つ選択的な導入遺伝子の送達を示さなければならない。最後に、このようなベクターは、標的細胞における導入遺伝子の適切な保持、発現、及び調節を支持することが可能でなければならない。本発明は、新規構造の高収容力且つ高効率Ａｄベクター系を包含し、好ましい遺伝子送達系に関する問題及び当業者の関心を解決することに焦点を当てる。
【０００５】
血友病Ａは、疾患に冒された個体において凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の発現又は機能における欠損の結果生じる。血友病の治療は、現在、血漿濃縮物から得られ、又は組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現するように操作された培養細胞から精製して得られる正常ＦＶＩＩＩタンパク質の注入を含む（１）。治療上の利点は血漿濃度が正常血漿濃度（ミリリットル当たり２００−３００ｎｇもしくは１単位；参考文献２）の５−１０％にまで回復することにより達成される。正常血漿濃度の３０％を上回る濃度の維持が正常な生活様式の近いものと見込まれることが研究により示されている（３）。血友病の治療を指向する遺伝子治療アプローチは刺激的な潜在力を有する；しかしながら、幾つかの主な挑戦は、これらの治療様式を現実のものとするために克服すべきもののままである（４）。本発明は、これらの困難を解決することが可能な幾つかの手段を提供する。
【０００６】
ＦＶＩＩＩは通常肝臓において生成され、新生ポリペプチドのアミノ末端から誘導される、９２ｋＤａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポリペプチド及び８０ｋＤａのＣ−末端軽鎖を含んでなる（５３）。これは、ファンデルワールス力（ｖＷＦ）での複合体の形成によりタンパク分解から保護されている。その活性化形態は、血液凝固カスケードにおいて、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウムイオンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態Ｘａに変換する。ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、数種類のドメインをＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のペプチドをコードする（５−７）。Ａ及びＣドメインは機能的な活性に重要であり、これに対して約９８０アミノ酸からなるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。完全長ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡはレトロウイルス及びアデノウイルスベクターのサイズ制限を超えるため、現在までに当業者によって用いられる遺伝子治療プロトコルの大部分は、残りのｃＤＮＡが約４．５ｋｂとなるようにＢドメインを欠失させたＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを用いる。
【０００７】
レトロウイルスベクターは遺伝子治療における使用について最初に研究すべきもののうちの１つであった（６４、６５）。外来性ＤＮＡの挿入に対するサイズ容量は約７．５ｋｂに制限される。一般には、ウイルスｍＲＮＡの不安定性の問題及びＦＶＩＩＩ遺伝子産生物（６１，６３，７４）をコードするｍＲＮＡの発現の困難性のため、レトロウイルスベクターから高水準のＦＶＩＩＩの発現を得ることは困難である。加えて、大部分の肝細胞のような非分裂細胞の感染にも問題がある。この制限を克服する方法の１つは、レトロウイルス感染に先立って２／３部分的肝切除を行い、活発に再生する肝細胞の感染を可能にすることである（７３）。別のアプローチにおいては、筋肉特異的エンハンサーを用いて長期間の発現が達成されているが、低水準の遺伝子産生物ＦＩＸのみが達成されただけである（７８）。治療水準のＦＶＩＩＩはマウスにおいて達成されている（７７）。
【０００８】
近年、ネズミアルブミンプロモーターの制御の下にあるＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含むＥ１置換アデノウイルスベクターが用いられ、マウス及びイヌにおいて治療水準のヒトＦＶＩＩＩの発現が達成されている（１３−１５）。ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含むこのアデノウイルスベクターを高用量（４Ｘ１０９ｐｆｕ）投与した場合、免疫適格動物における遺伝子の発現は持続性の点で制限された；遺伝子発現の漸進的な低下は肝臓組織におけるアデノウイルスベクターＤＮＡの検出の喪失と相関していた（１３）。発現の低下はベクター接種物を減少させることにより部分的に解消され、その結果、ＦＶＩＩＩの治療血漿濃度が投与の後２２週間続いた（１６）。しかしながら、これらの研究において用いられたＣ５７Ｂ１／６株のマウスは免疫応答が弱力化された；このため、これらの結果は、完全に免疫適格の動物を用いて得ることができるものを反映していない可能性がある。イヌにおける、これらのベクターを用いる発現の急速な低下は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質又はアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答に起因するものであると考えることが可能であった。このようなＥ１置換アデノウイルスベクターのヒトにおける潜在的な使用を確認するには、イヌのようなより大型の動物でイヌＦＶＩＩＩを用いて実験を行うことが必要であろう。
【０００９】
アデノウイルスベクターは、１）アデノウイルスの静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射の結果、部分的にはこのアデノウイルスベクターが主として肝臓組織に蓄積するため、遺伝子発現の標的が肝臓に設定され；２）肝臓からのＦＶＩＩＩの発現が血漿中のＦＶＩＩＩの濃度を大きく上昇させ；及び３）正常な個体においては肝臓がＦＶＩＩＩの合成の主要部位であるという事実により、ＦＶＩＩＩの送達に好ましいものであり得る。
【００１０】
しかしながら、重大な困難はアデノウイルス遺伝子の送達に関連する。例えば、Ａｄは通常宿主細胞のゲノムに組み込まれない。導入遺伝子の発現を長期間維持するためには、Ａｄが宿主細胞の統合に必要な要素又はＤＮＡ保持の他の機構を含まなければならない。加えて、アデノウイルスベクターに対して介在する免疫応答がそのベクターの再投与を非常に困難なものとする（７６）。本発明のミニＡｄベクターは、導入遺伝子を坦持するミニＡｄベクターから全てのアデノウイルス遺伝子が排除されている。これは、少なくとも部分的に、宿主細胞におけるＡｄ遺伝子の発現によって生じる可能性がある、導入遺伝子の発現の低下に寄与し得るあらゆる有害な免疫応答を排除する。
【００１１】
大きな異種ＤＮＡインサートを考慮したアデノウイルスベクターが国際特許出願ＷＯ９６／３３２８０号に記述されている（参考文献１３２を参照）；しかしながら、このベクターは、標的細胞に侵入した際にこのベクターを標的細胞ゲノムに組み込むための、又はエピソーム維持のための要素を提供しない。本発明は、標的細胞ゲノムに組み込むことにより、又はエピソーム核酸として維持することにより、宿主細胞における送達された導入遺伝子の保持が考慮された要素を提供する。本発明によってこれが達成される方法の１つは、ウイルス組み込み機構を用いて宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを容易にすることを含む。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは感染した細胞のＤＮＡに組み込まれる能力を有し、ヒトゲノムの特定の部位、１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒのＡＡＶＳ1に組み込まれる外来性ＤＮＡの唯一の例である（３５、１３３）。ＡＡＶ組み込みの最小要素は逆末端反復（ＩＴＲ）配列及び機能的Ｒｅｐ７８／６８タンパク質である。本発明は、導入遺伝子の発現を持続させるために宿主細胞のゲノムに導入遺伝子を組み込むためのこれらの組み込み要素を包含する。また、本発明は、標的細胞のゲノムへの異種組換えが可能なアデノウイルスベクター、当業者が現在利用可能なアデノウイルスベクターを上回る別の重要な利点をも提供する。また、本発明は、導入遺伝子のエピソーム複製を可能にする要素をも提供する。
【００１２】
不死化細胞系（２２−２４、１３４）、エピソーム系（２５−２７）、及び細胞非含有抽出物（２８）におけるＡＡＶ又はＡＡＶベースのベクターの部位特異的組み込みを検出するためにイン・ビトロモデル系が開発されている。始原ヒト細胞又は不死化細胞系を用いるＡＡＶの形質導入効率の比較は、形質導入効率が不死化ヒト細胞において始原細胞よりも１０−６０倍高いことを示した（２９）。これらの結果は始原細胞を用いることの重要性を、又は、イン・ビボモデル系においてＡＡＶベクターを遺伝子治療用途について正確に評価することがさらに良いことを強調する。しかしながら、現在に至るまで、部位特異的組み込みを検出するためのイン・ビボ動物モデル系は開発されていない。そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１配列が組み込まれた動物モデルが本発明において提供される。この動物モデルは、部位特異的組み込みを試験するだけではなく、イン・ビボでの遺伝子送達、遺伝子導入効率、組織分布、及び遺伝子の発現の持続をも試験するための、ＡＡＶ組み込み機構を有するベクターの評価に有用である。
【００１３】
血友病のイヌ及びマウスを含む動物モデルがＦＶＩＩＩ調製品の効率の試験に用いられている（１１、１３−１５、８２、８３）。しかしながら、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子治療については、動物モデルにおけるヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫応答がＦＶＩＩＩの長期送達の研究を複雑なものにする可能性がある。本発明はヒトＦＶＩＩＩに対して寛容である動物モデルを提供する。このような動物におけるヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答の欠如には、ヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答によって生じ得る免疫学的な複雑性なしに導入遺伝子の送達を正確に評価する余地がある。
【００１４】
本発明のミニＡｄベクター系は２つの重要な発見に基づいて開発された：１）ウイルスゲノムの大部分がＳＶ４０の配列で置換されているものの、Ａｄ  ＩＴＲ及びパッケージ化要素が存在するため処理を受けてパッケージ化され得るＡｄ−ＳＶ４０ハイブリッドの発見（１７）；及び２）パッケージ化シグナルの部分的な欠失によりＡｄのパッケージ化を弱力化することが可能であること（１８）。パッケージ化及びゲノム複製のための最小シス要素の組み込みに基づく他のアデノウイルスベクターパッケージング系を他者が開発中である（１９−２１）。
【特許文献および非特許文献】
【００１５】
2005000172.tif 000002
2005000172.tif 000003
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2005000172.tif 000013
【発明の開示】
【００１６】
本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３６ｋｂの異種ＤＮＡを挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（“ミニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設計され、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがより大きなベクターにパッケージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有する同族ヘルパーＡｄベクター；及び３）ミニＡｄベクター及びヘルパーＡｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘルパー細胞系であって、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を調節し、且つヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘルパー細胞系を提供するために、改変されたアデノウイルスベクターを提供することである。
【００１７】
当業者が遭遇する問題は、従来のベクターに挿入することができる外来性ＤＮＡの量が現在の最大で約８ｋｂに制限されることである。本発明の目的は、約３７ｋｂまでのインサート収容力を提供することが可能なミニＡｄベクターを提供することにあり、この収容力は大きなコーディング領域を有するタンパク質をコードする核酸の送達に十分なものである。
【００１８】
態様の１つにおいて、本発明はミニＡｄベクターを単離ＤＮＡ分子として提供し、この単離ＤＮＡ分子は複製、パッケージ化及び持続性の遺伝子発現に必要な要素、例えば、逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写調節領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれかを有し、これらの全ては感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターを産生するために作動の上で協働し、前記ＤＮＡ分子の残りの部分はアデノウイルスのタンパク質をコードしない。このようなベクターの例の１つにおいては、ヒトＦＶＩＩＩをコードするミニＡｄベクターが提供される。
【００１９】
当業者が遭遇する別の問題は、標的細胞に導入した後の遺伝子発現の持続期間が制限されることである。本発明のさらに別の目的は、標的細胞に導入した後の導入遺伝子の発現の持続時間を延長させるのに必要な要素を有するベクターを提供することである。したがって、本発明は、標的細胞における導入遺伝子発現の安定化をエピソームとして、又は導入された遺伝子のその細胞のゲノムへの組み込みを容易にすることにより、助成し得る要素を有するベクターを提供する。態様の１つにおいて、本発明は、ミニＡｄベクター内にゲノム組み込み要素又はエピソーム維持要素のいずれかを提供する。このような系の一例では、ＡＡＶの組み込み要素を含むミニＡｄベクターが提供される。このような系の別の例では、ミニＡｄベクター内に相同組換えアームが提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、パッケージ化が弱力化された複製不全ヘルパーＡｄをＥ１補完性Ａｄヘルパー細胞系と組み合わせて用いて、ミニＡｄベクターを生成するための試薬及び方法論を提供することにある。態様の１つにおいて、Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ化されるように変更されたパッケージ化シグナルを有するＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムが提供される。別の態様においては、Ａｄ  Ｅ１遺伝子配列が安定に形質移入された細胞としてヘルパー又は産生細胞が提供され、このＡｄ  Ｅ１遺伝子欠失配列にはＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列がない。加えて、さらに別の態様においては、ヘルパー又は産生細胞にミニＡｄベクター及びＡｄヘルパーゲノムを同時形質移入し、及び／又はこの細胞にＡｄヘルパーウイルスを感染させ、且つ該産生細胞の細胞非含有溶解物を調製することにより、組換えアデノウイルスベクターを生成する方法が提供される。このようにして調製される細胞非含有溶解物はこの感染性複製障害組換えアデノウイルスベクター粒子を含み、その大部分はミニＡｄベクターＤＮＡを含む。
【００２１】
動物モデル系においてイン・ビボで、形質導入効率を分析し、且つＡＡＶの標的をその組み込み部位ＡＡＶＳ１に設定することが困難であることも当業者にとっては立証されている。本発明のさらに別の目的は、本発明のミニＡｄベクターに組み込まれたＡＡＶ組み込み機構によって指向される標的組み込みを評価するための動物モデル系を提供することにある。一例として、本発明は、それらのゲノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスを生成するための方法論を提供する。このような動物にミニＡｄベクターを注射した後、ＡＡＶＳ１部位への導入遺伝子の標的組み込みを評価することができる。
【００２２】
また、当業者は、ヒトＦＶＩＩＩの外来タンパク質としての免疫学的認識のため、ヒトＦＶＩＩＩベクターの毒性及び長期間の効力の決定において困難に直面している。本発明の目的は、ヒトＦＶＩＩＩの発現を評価するためのヒト第ＶＩＩＩ因子寛容動物を提供する。本発明は、成熟動物ではなく発生中のマウスにおいてヒトＦＶＩＩＩが発現するように、発生的に調節されたプロモーター（すなわち、α−胎児タンパク質プロモーター）に作動可能に連結されたヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを開発するための方法論を提供する。この一時的な発現の結果、その動物はヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対して寛容となり、それによりヒトＦＶＩＩＩを“自己”タンパク質として認識する。この場合、そのような動物においてはヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答は生じない。本発明は、さらに、ヒトＦＶＩＩＩ寛容友血病マウス種に加えて、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１予備組み込み部位が組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ寛容友血病マウスを提供する。
【００２３】
したがって、本発明は、当業者が遭遇している、遺伝子治療ベクターに関連する多くの困難を克服するのに必要とされる試薬及び方法論を提供する。本発明の上述の目的はもちろん、他の目的も、以下に記載される発明の詳細な説明に鑑みて理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３７ｋｂまでの異種ＤＮＡを挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（“ミニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設計され、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがヘルパーＡｄベクターよりも高い頻度でパッケージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有する同族ヘルパーＡｄベクター；及び３）ミニＡｄベクター及びヘルパーＡｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘルパー細胞系であって、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を制御し、且つヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘルパー細胞系を提供するために、改変されたアデノウイルスベクターを提供することである。
【００２５】
本発明は、ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡのような治療用遺伝子をイン・ビボで標的組織に送達することが可能なウイルスベクターの生成に有用な３つの成分を包含する。これらの成分はヘルパーウイルス、ミニウイルスゲノム、及びヘルパー細胞系からなる。ヘルパーウイルス及びヘルパー細胞系はミニウイルスゲノムを遺伝子送達用のウイルス粒子内にパッケージ化するのに用いられる。この系を用いて生成されるミニウイルスは、ヘルパーウイルスが誘導されたアデノウイルス株と等しい向性及び宿主範囲を有する。
【００２６】
本発明は、さらに、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から誘導される要素を含めるためのミニＡｄベクターの改変を提供する。これらの要素は、宿主細胞ゲノムへの遺伝物質の組み込みを促進する能力を有するものである。本発明においては、宿主細胞ゲノムへのミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを促進するのにこれらの要素が用いられる。このようにして、遺伝子の発現が従来のアデノウイルスベクターよりも長い期間宿主細胞において観察される。
【００２７】
本発明は、さらに、ミニＡｄベクターであって、このベクターを宿主細胞内でエピソームとして維持して送達される遺伝子（１つ又は複数）の発現を長期化させるための要素を含むミニＡｄベクターを提供する。宿主細胞におけるＥ１欠失ウイルスのウイルスゲノムの制限された複製には、複製が不可能であるゲノムと比較して関心のある遺伝子がより長期間発現する余地があることが測定されている（８８）。アデノウイルスゲノムのＥ２領域を欠失させると、そのＥ２欠失アデノウイルスベクターからの遺伝子の発現の複製及び持続が減少する。したがって、本発明の目的は、標的細胞におけるミニＡｄゲノムのＤＮＡ複製を容易にする、正常な細胞ゲノムから誘導されるＤＮＡ配列又はそれと等価の配列を本発明のミニＡｄベクターに組み込むことである。ＤＮＡの複製を容易にするような配列の１つはアルフォイド（ａｌｐｈｏｉｄ）ＤＮＡである。アルフォイドＤＮＡ反復の１６．２ｋｂ配列はＤＮＡ複製は可能にするが、そのＤＮＡの人工染色体としての分離は許容しない。本発明には、この１６．２ｋｂ配列（７０−７２）のミニＡｄベクターへの組み込みの備えがある。したがって、これらの配列を含むミニＡｄベクターの複製は、標的細胞内でのミニＡｄベクターＤＮＡの持続及び関心のある遺伝子の発現を長期化させる。
【００２８】
本発明の改変ベクターを評価するための動物モデル試験系も提供される。本発明によって提供される動物モデルには：１）ＡＡＶベースの組み込み機構を評価するためにそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウス；及び２）そのゲノムに挿入されている発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結するヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物が含まれる。この第２のモデルにおいては、発生の過程でのそのトランスジェニック非ヒト動物におけるヒトＦＶＩＩＩの一時的な発現の結果、その動物のヒトＦＶＩＩＩに対する寛容化が生じる。この動物のヒトＦＶＩＩＩ遺伝子はひとたびその動物が成熟すると発現せず、したがって、これらの動物へのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の送達の評価が導入遺伝子からのｈＦＶＩＩＩの発現により、又はｈＦＶＩＩＩに対する免疫応答により複雑になることがない。したがって、このようにして、その動物による抗−ｈＦＶＩＩＩ免疫応答によってもたらされる潜在的な複雑性が加わることなく、ベクターによる遺伝子送達の効率を評価することができる。
【００２９】
本願においては、他に述べられない限り、用いられる技術は幾つかの公知の参考文献のいずれかに見出すことができ、これらには：分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratovy Manual）（Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）、遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）（酵素学における方法（Methods in Enzymology）, 第185巻, D. Goeddel編, 1991. Academic Press, San Diego, CA）、ＰＣＲプロトコル：方法及び適用の手引（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）（Innisら, 1990. Academic Press, San Diego, CA）、動物細胞の培養：基礎技術マニュアル（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）第２版（R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY），抗体：実験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）（Harlow及びLane. 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）、タンパク質生成の手引：酵素学における方法（Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology）第182巻（M.P. Deutscher編, Academic Press, San Diego, CA）、酵素学における方法（Methods in Enzymology）第225巻（参考文献５７−６０を参照）及び奇形癌腫及び胚性幹細胞−実用アプローチ（Teratocarcinomas and embryonic stem cells - a practical approach）（Robertson, E.J.編, 1987. IRL Press, Washington, D.C.；参考文献６１も参照）。
【００３０】
本願においては、転写調節領域又は転写制御領域は遺伝子の転写の調節に関わるあらゆる核酸要素として定義され、これにはプロモーター、エンハンサー、サイレンサー及びリプレッサーが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００３１】
ＤＮＡ断片は、あらゆる源から誘導される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのセグメントとして定義される。
【００３２】
ＤＮＡ構築体は、あらゆる源から誘導されるプラスミド、ウイルス、自立的に複製する配列、ファージ又は一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの直鎖セグメントとして定義される。
【００３３】
レポーター構築体は、検定可能な産生物をコードする遺伝子を含む染色体下の精製ＤＮＡ分子として定義される。
【００３４】
検定可能な産生物は、検定を用いて検出可能である遺伝子によってコードされるあらゆる産生物を含む。さらに、この検定可能な産生物の検出及び定量は、その遺伝子の発現の水準に直接比例するものと予想される。
【００３５】
組織特異的な方法で発現する遺伝子は、ある生物において１以上の第２の組織とは対照的に１つの組織においてより多くの量の発現を示すものである。
【００３６】
エフェクター遺伝子は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現により、生物、組織又は細胞に効果を及ぼすあらゆる遺伝として定義される。
【００３７】
異種ＤＮＡは、アデノウイルスゲノム以外の源から単離された、アデノウイルス構築体に導入されるＤＮＡとして定義される。
【００３８】
導入遺伝子は、生物のゲノムに挿入されている、その生物のゲノムに通常存在するもの以外の遺伝子として定義される。
【００３９】
組換えアデノウイルスベクターは、そのゲノムに少なくとも１つの異種ＤＮＡのセグメントが含められているアデノウイルスとして定義される。
【００４０】
アデノウイルス粒子は、野生型又は組換えの両者を含む感染性アデノウイルスとして定義される。アデノウイルスにはアデノウイルスゲノム内にコードされるタンパク質外被によってキャプシドが形成されているＤＮＡ分子が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
組換えアデノウイルス粒子は、少なくともそのゲノムの一部に少なくとも１つの他の源から誘導されるものを有し、アデノウイルス遺伝物質はもちろんアデノウイルス遺伝物質以外の遺伝物質をも含む感染性アデノウイルスとして定義される。
【００４２】
安定な遺伝子の発現は、少なくとも７日を上回る期間宿主において一貫して検出することができる遺伝子の発現として定義される。
【００４３】
治療可能な状態は、ある形態の治療の執行により変更することが可能な生物の状態として定義され、この治療には通常医療起源のものであると定義される治療が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００４４】
抗原は、抗体が結合し、且つ免疫応答の活性化及び阻止もしくは抑制の両者を含めて免疫応答を刺激することが可能なあらゆる分子をさらに含むことができる分子として定義される。
【００４５】
腫瘍抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、腫瘍の発生を抑制する役目を果たす遺伝子として定義され、この抑制には成長の抑制又は細胞の死の誘発が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００４６】
成長抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、細胞の成長を抑制する役目を果たす遺伝子として定義される。
【００４７】
癌遺伝子は癌を引き起こす遺伝子として定義される。
【００４８】
免疫調節遺伝子は、その核酸もしくはタンパク産生物の発現により、免疫反応を変更する役目を果たすあらゆる遺伝子として定義される。
【００４９】
リボザイムは、他の核酸分子を分解する能力を有するＲＮＡ分子として定義される。
【００５０】
遺伝的状態は、本願においては、少なくとも部分的には少なくとも１つの特定の遺伝子の発現の結果である生物の状態として定義され、この特定の遺伝子にはその遺伝子の野生型形態及びその遺伝子のあらゆる突然変異体形態が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００５１】
発現カセットは、コーディング配列を含むＤＮＡ断片であって、このコーディング配列がコードされたタンパク質の適切な細胞型における発現に十分な転写調節領域又は転写制御領域に作動可能に連結するレポーター又はエフェクターのものであるＤＮＡ断片である。
【００５２】
Ｉ．ミニＡｄベクター系の基本概念
１．系の構成  ミニＡｄベクター系は３つの主要部分：１）パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ；２）最少量のウイルスゲノムを有する同族Ａｄベクター；及び３）２９３細胞と同様のＥ１トランス活性化の機能及び／又はヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルの調節をもたらすＡｄヘルパー細胞系からなる。パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄは、自己複製に必要されるのはもちろんミニＡｄベクターの複製のトランス補完にも必要とされるウイルス性遺伝物質を含む。ヘルパーＡｄは、Ｅ１の欠失又は置換、及びヘルパーＡｄのパッケージ化を本発明のミニＡｄベクターのパッケージ化に有利に制御又は区別するのに有用な操作されたパッケージ化シグナルを除いて、野生型のＡｄ遺伝物質を保持する。このミニＡｄベクターは、逆末端反復（ＩＴＲ）のみを含む最小Ａｄ遺伝物質、並びにこのミニＡｄベクターの複製及びパッケージ化を促進する役割を果たすシス要素としての野生型パッケージ化シグナルを含む。このミニＡｄベクターの残部は導入遺伝子、すなわち異種ＤＮＡを含む。本発明のＡｄヘルパー細胞系は、Ａｄ  Ｅ１遺伝子を含み、且つヘルパーＡｄの複製を支持するＡｄ  Ｅ１遺伝子産生物をもたらすという点で２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５３７）に類似する。この細胞系は、さらに、ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化するための制御機構を含んでいてもよい（図１）。
【００５３】
２．系の作動機構  Ａｄのパッケージ化タンパク質は感染細胞内に少量存在するトランス作動性因子であり、Ａｄのパッケージ化において速度制限因子としての役割を果たす。本発明のミニＡｄベクターによって処理された野生型パッケージ化シグナルはヘルパーＡｄの操作されたパッケージ化シグナルよりも高い親和性でパッケージ化タンパク質によって認識されるため、ヘルパーＡｄ遺伝物質のパッケージ化はこのミニＡｄベクターの存在下において部分的に、もしくは完全に抑制される。その結果、ミニＡｄベクターの優先的なパッケージ化が生じる。ミニＡｄベクターを高力価で複製及びパッケージ化するため、ウイルスＤＮＡの複製のためのタンパク質及びキャプシド組み立てのためのタンパク質が適度の量でもたらされなければならない。これらのタンパク質は幾つかの異なる源からもたらすことができ、これらの源には細胞系又はウイルスが含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の好ましい態様においては、これらのタンパク質はヘルパーＡｄによってもたらされる。本発明では、多量のＡｄ構造タンパク質をミニＡｄベクターが利用可能であるように、ヘルパーＡｄがヘルパー細胞内でそれ自体を複製する点において完全に機能的なままであることが考慮される。ミニＡｄベクターが存在しない状況において、パッケージ化の弱力化の選択圧なしで、徐々に、又は非効率的にではあるが、ヘルパーＡｄはパッケージ化される。ミニＡｄベクターの複数のコピーを生成するため、ミニＡｄベクターＤＮＡの増幅にウイルスＤＮＡ複製タンパク質も必要である。本発明の好ましい態様においては、これらのタンパク質はヘルパーＡｄによってもたらされる。野生型パッケージ化シグナルを含むミニＡｄベクターは、感染性複製適格Ａｄ粒子としてＡｄビリオンにパッケージ化される。対照的に、ヘルパーＡｄ  ＤＮＡは操作されたパッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の乏しい認識又は低親和性により競合で排除され、そのためヘルパー細胞内で完全に、又は部分的に遊離したままである。このヘルパーＡｄのパッケージ化の弱力化及びミニＡｄベクターのパッケージ化の選択により、本発明の系はミニＡｄベクターの優先的な増殖を生じる。この系を用いて生成されたミニＡｄベクターは少量のヘルパーＡｄで汚染される可能性があり、したがって、このミニＡｄ粒子調製品は１００％純粋ではない可能性がある。必要であれば、汚染されているヘルパーＡｄを生物学的、生化学的、又は物理的方法を用いて除去することができ、これらの方法にはＣｓＣｌ勾配を通す超遠心が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００５４】
３．系の収容力  本発明のミニＡｄベクター系の３つの主な特徴は、それを独自の、洗練された、現在当業者が利用可能なＡｄベクターより大きく進歩したものにする（図２）。これらの特徴には以下のものが含まれるがこれらに限定されるものではない：１）このミニＡｄベクターは最小の免疫原性を示す；２）粉のミニＡｄベクターは現実には複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）を生成することができない；及び３）このミニＡｄベクターは従来のＡｄベクターよりも非常に大きな異種ＤＮＡセグメントを含むことができる。免疫原性及びＲＣＡ生成の低下（遺伝子治療の分野における主な安全性上の関心）は、このミニＡｄベクターが最少量のウイルスシス要素（ＩＴＲ及びパッケージ化シグナル）のみを坦持し、それだけではＡｄタンパク質をコードしないために可能となる。このため、現在利用可能なＡｄベクターの免疫原性及び細胞毒性の主な源は大部分が除去されている。したがって、通常宿主細胞内又はその細胞表面上でのＡｄウイルスタンパク質の発現から生じる細胞毒性、炎症性、及び免疫原性応答が減少する。
【００５５】
本発明のミニＡｄベクターは、さらに、従来のＡｄベクターよりも異種ＤＮＡの収容力が増大している。野生型Ａｄは３６ｋｂの平均ゲノムサイズを有する。Ａｄの最大パッケージ化収容力はそのゲノムの約１０５％、すなわち、約３８ｋｂである。本発明のミニＡｄベクターは１ｋｂ未満のＡｄ遺伝物質を含むことができる；したがって、このミニＡｄベクターの異種ＤＮＡの収容力は３７ｋｂであり得る。異種ＤＮＡには導入遺伝子発現カセット、調節要素、又はレポーターもしくはエフェクター遺伝子に作動可能に連結する転写制御領域が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。発現カセットには単一又は複数の発現カセットが含まれ得るがこれらに限定されるものではない。調節要素には導入遺伝子の保持、組み込み、転写、及び／又はベクターターゲティングを制御するためのＤＮＡ配列が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００５６】
４．パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ
ａ．ヘルパーの原型構造  このヘルパーＡｄベクターは、操作されたパッケージ化シグナル及び変更されたＥ１遺伝子を有する野生型Ａｄゲノムを含む。安全性の理由から、ヘルパーＡｄは現在利用可能なＥ１欠失もしくは置換ウイルス構築体のように複製が不完全でなければならない。ミニＡｄベクターの存在下においてパッケージ化を制御するため、このヘルパーはパッケージ化も不完全でなければならない（以下に詳述）。したがって、このヘルパーの一般構造は、Ｅ１領域及びパッケージ化シグナルが操作されていることを除いて野生型ゲノムを有するＡｄベクターとして要約することができる。しかしながら、Ｅ２及びＥ４のような他の必須調節遺伝子を操作することも可能である。ウイルスゲノムは、ヘルパーＡｄの複製適格性をさらに無効とするため、又はＣｓＣｌ勾配を通す超遠心を含むがこれに限定されるものではない生物学的、生化学的、もしくは物理的方法を用いてミニＡｄベクターから分離するためにヘルパーＡｄのゲノムサイズを減少させるため、断片に分割することができる。ヘルパーＡｄの力価が大きな影響を受けない限り、ヘルパーＡｄのウイルス複製の不全及びパッケージ化の弱力化の両者をヘルパーＡｄの設計に含めることができる。
【００５７】
ｂ．ヘルパーＡｄの一般的な機能  ヘルパーＡｄの主要機能はミニＡｄベクターのパッケージ化に必要なキャプシドタンパク質を供給することである。このタンパク質を提供するため、ヘルパーＡｄは、野生型Ａｄより効率が劣るとしても、宿主細胞内で複製可能でなければならない。好ましくは、ヘルパーのゲノムの複製及び転写は影響を受けない。ヘルパーＡｄゲノムの合成が阻害される場合、後期遺伝子産生物（キャプシドタンパク質）の収量が変化し、ミニＡｄベクターの力価に悪影響を及ぼし得る（すなわち、力価が低下する）。特定の用途については、ミニＡｄからのヘルパーＡｄの除去が不必要であることがある。このような状況においては、ヘルパーＡｄのパッケージ化弱力化の厳密性は大きく低下し得る。
【００５８】
ｃ．パッケージ化弱力化の設計  ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化する目的は、ミニＡｄベクターの調製品におけるヘルパーＡｄ汚染の可能性を減少させることである。これは、特定の用途に比較的純粋なミニＡｄベクターのバッチが必要とされる場合に特に重要である。ヘルパーＡｄのパッケージ化機能は、ミニＡｄベクターが存在しない状況においてはヘルパーＡｄが徐々にではあっても増殖することが可能でなければならないため、不完全ではあるが完全に無効ではないように設計される。以下の遺伝子操作をパッケージ化弱力化ヘルパーＡｄの生成に用いることができる。
【００５９】
１．パッケージ化シグナルの突然変異  Ａｄ５パッケージ化シグナルは機能的に縮退した反復要素を含んでなる（１８）。このパッケージ化シグナル要素を部分的に欠失させることにより、変異体Ａｄの収量が野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄと比較して数倍から約１００倍減少することが示されている（１８）。したがって、本発明のパッケージ化シグナル突然変異の設計には、野生型Ａｄパッケージ化シグナルからの共通アデノシン富化モチーフ（例えば、“Ａ反復”：ＴＡＡＡＴＴＴＧ；図３）の部分的欠失を取り込むことができる。
【００６０】
２．合成パッケージ化シグナル  Ａｄ５パッケージ化シグナルが共通Ａ（アデノシン）富化モチーフ（例えば、Ａ反復：ＴＡＡＡＴＴＴＧ）を有するため、選択されたＡ−反復又は人工パッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の親和性を変更することが可能なあらゆる合成ＤＮＡモチーフを含むがこれらに限定されるものではない直列反復の組み込み。
【００６１】
３．パッケージ化シグナルの妨害  Ａｄパッケージ化シグナルは、パッケージ化タンパク質によって認識され、且つそれと結合する特異的ＤＮＡ配列である。このシグナルへのパッケージ化タンパク質の有効な結合を妨害するため、ヘルパーＡｄパッケージ化シグナルのＡ反復列の近位又はその内部に他のＤＮＡ配列を配置することができる。挿入されたＤＮＡはそれらの同族ＤＮＡ結合タンパク質による結合を可能にし、この同族ＤＮＡ結合タンパク質はＡｄパッケージ化シグナルへのＡｄパッケージ化タンパク質の結合を位置的に競合して排除することが可能なものである。
【００６２】
４．パッケージ化シグナルの再配置  野生型Ａｄパッケージ化シグナルは野生型Ａｄゲノムの左端に位置する。研究者らはこのパッケージ化シグナルが右端に位置してその機能を保持し得ることを見出しており（７５）、これはパッケージ化シグナルを再配置することができることを示す。操作されたパッケージ化シグナルを野生型以外の位置に配置することは、ヘルパーＡｄのパッケージ化効率をさらに弱力化するのに有用である可能性がある。加えて、Ａｄゲノムの別の領域へのパッケージ化シグナルの再配置は、ヘルパーＡｄの加工されたパッケージ化シグナルとミニＡｄベクターの野生型パッケージ化シグナルとの間の相同組換えによるヘルパーＡｄの野生型Ａｄの回帰（すなわち、ＲＣＡの生成）の可能性を最小にする助けとなり得る。
【００６３】
５．さらなる可能性  ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化してミニＡｄベクターの調製に対するヘルパーの汚染を最小にするため、２つの因子を考慮することができる：シス要素及びトランス作動性因子。したがって、他の可能性のある設計はこれらの２つの因子のいずれか、もしくは両者の操作を指向する。操作することができるシス要素の例はＡ反復モチーフである。操作することができるトランス作動性因子の例はパッケージ化タンパク質である。その系によるミニＡｄベクターの高力価産生量を犠牲にすることなくパッケージ化を制御することができる機構をさらに考慮すべきである。
【００６４】
ＩＩ．ミニＡｄベクター
Ａ．ミニＡｄベクターの基本構造  ＡｄベクターはＡｄ  ＩＴＲの融合による環化プラスミドとして用いることができる（５４）。本発明のミニＡｄベクターの最も単純なプラスミド形態は、（野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄ  ＩＴＲを含む）ＩＴＲ融合配列、プラスミドＤＮＡ複製起点、及び１つもしくは複数の制限酵素部位からなるポリクローン化部位を含む環状ＤＮＡ分子である。ＩＴＲ融合配列は、野生型Ａｄの左端、好ましくはマップ単位０乃至１、及び右端、好ましくはマップ単位９９乃至１００を含む。Ａｄ  ＤＮＡ複製基点は各々のＩＴＲ内に位置し、野生型パッケージ化シグナルは左ＩＴＲに隣接して位置する。
【００６５】
Ｂ．ミニＡｄベクターの構造的及び機能的可能性  以下に記載され、且つ図７Ｂに示されるものを含むがこれらに限定されるものではない他のＤＮＡ配列及び要素をミニＡｄベクターに含めることができる。
【００６６】
１．導入遺伝子の発現カセット  発現カセットは基本的な転写単位である。所定の遺伝子の単純な発現カセットは、一般に、転写制御領域、関心のある遺伝子（すなわち、異種ＤＮＡ、インサートＤＮＡ）、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。発現カセット内には、２以上の遺伝子を、これらの遺伝子の間にＲＮＡの転写もしくはスプライシングのためのさらなる要素がもたらされている限り、二もしくは多シストロン単位として含めることができる。一般に、ミニＡｄベクターは１つもしくは複数の発現カセットを含む。
【００６７】
２．ベクターＤＮＡ保持のための機能的要素  標的細胞ゲノムへの発現カセットの組み込みを助成し得る（すなわち、ＡＡＶ組み込み要素）又は宿主細胞においてミニＡｄベクターをエピソーム形態として維持する要素。組み込みを助成することが示されている要素はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の逆末端反復（ＩＴＲ）及びＲｅｐ７８／６８タンパク質である。ＡＡＶは、これらの要素を、ヒト染色体１９（１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒ）のＡＡＶＳ１と命名された部位へのそのゲノムの特異的組み込みを達成するのに用いる。
【００６８】
ＡＡＶは遺伝子治療のための候補ベクターとして考えられているが、幾つかの制限が研究者によって同定されている。ＡＡＶは：１）外来性ＤＮＡに対する低収容力（４．３ｋｂ）；２）大規模調製における高力価の達成の困難性；及び３）組換えＡＡＶの特異的組換えの喪失により制限される。これらの各々は、当業者にとって困難な挑戦であることが立証されている。本発明は、ＡＡＶ−ＩＴＲ配列及びＲｅｐ７８／６８発現カセット（Ｒｅｐ発現カセット）をベクターに組み込むことにより、ミニＡｄベクターの利点をＡＡＶの組み込み収容力と組み合わせる。
【００６９】
同様にミニＡｄゲノムに含めることができる機構には染色体外複製配列（７０）が含まれる。染色体又はウイルス配列のいずれかを含んでなるこのような配列は、ベクターが哺乳動物細胞内で効率的に複製し、且つ保持されることを可能にする役割を果たす。これらの配列は、ヒトゲノムＤＮＡのような複製成分及び／又は保持成分、例えば、ヒトセントロメア配列もしくはｏｒｉＰ族の反復及び／又はＥＢＮＡ−１のようなエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）から誘導される配列を含むことができる（７０）。ヒトゲノムＤＮＡはテロメア及び／又はアルフォイドＤＮＡを含むことができる（７０）。このような要素をミニＡｄベクターに含めることにより、ミニＡｄゲノムが宿主細胞においてより高いコピー数に複製し、それによりミニＡｄゲノムがヘルパーウイルスより高い効率でパッケージ化される可能性が増加する。加えて、これらの配列は、宿主細胞内でのエフェクター又はレポーター遺伝子の発現の持続を長期化する役割を果たす。このような機能は遺伝子治療へのミニＡｄベクターの使用において有用である。
【００７０】
３．ＤＮＡの転写を制御するための調節要素  エンハンサー、リプレッサー、活性化因子結合部位、イントロン、及び５’もしくは３’非翻訳領域を含むがこれらに限定されるものではない転写調節機能を有する要素。
【００７１】
４．ベクター及び導入遺伝子ターゲティングのための要素  ターゲティングは幾つかの方法で達成することができ、この方法にはベクター表面修飾及び組織特異的発現が含まれるがこれらに制限されるものではない。特定の細胞型又は組織における遺伝子の発現を駆動させるのに組織特異的プロモーターを用いることができる。
【００７２】
５．さらなる支持要素  これらには原核細胞もしくは真核細胞のＤＮＡ複製起点、プラスミドもしくはベクター選択マーカー、及びベクター主鎖が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
Ｃ．ミニＡｄベクターの高力価生成の設計  ミニＡｄベクターの高力価生成は本発明の別の主要な側面である。他のウイルスベクターを上回るＡｄベクターの利点の１つは、Ａｄ粒子が高力価調製品保存物の調製に貢献することである（６７）。ＡＤの高力価増殖は、主として、感染の間に２９３細胞のような宿主細胞内に生じる多量のウイルスキャプシドタンパク質及びウイルスゲノムコピーのために可能である。以下に記載されるものは、高力価ミニＡｄベクターの生成方法の設計において考慮することができる因子の幾つかである。
【００７４】
１．増強されたＤＮＡの複製  ＡｄはＤＮＡ複製のためのそれ自体の酵素系を有する。Ｅ２領域タンパク質がウイルスＤＮＡの複製を生じる主要トランス作動性要素である。複製起点はウイルスゲノムのいずれかの端部又は両端に位置するシス要素である。ミニＡｄゲノムの複製を支持するため、十分な量のＥ２タンパク質がヘルパーウイルスによってもたらされなければならない。ヘルパーウイルスゲノムを適切に設計することにより、（ＡｄのＥ２領域内でコードされる）Ｅ２タンパク質の高水準の発現が保証される。ミニＡｄゲノムのコピー数を増加させるための他のこのような機構を考慮することもできる。このような機構には、ミニＡｄゲノムにＳＶ４０のＤＮＡ複製起点（５４）を挿入し、ヘルパー細胞におけるＳＶ４０  Ｔ−Ａｇ発現と同時にミニＡｄのコピー数を増加させることが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
２．増強されたパッケージ化シグナル  より多数の、又はより効率的なパッケージ化配列を、例えば、ミニＡｄゲノムの一端もしくは両端により多数の直列配列を組み込むことにより、又は野生型パッケージ化シグナルより効率的な様式で機能する１つもしくは複数の合成パッケージ化シグナルを組み込むことにより用いることができる。
【００７６】
３．増強されたパッケージ化プロセス  Ａｄのパッケージ化プロセス及び機構は当業者によって未だに完全に理解されているわけではない。Ａｄのパッケージ化シグナル以外のＤＮＡ結合タンパク質がパッケージ化に対して相乗的な役割を有しているかどうかは明確ではない。“パッケージ化の足場”と呼ばれ、且つＡｄゲノム内に天然に存在する、ＤＮＡ結合タンパク質が親和性を示す配列をミニＡｄベクターに組み込むことができる。
【００７７】
Ｄ．Ａｄヘルパー細胞系
１．Ａｄヘルパー細胞の基本要素及び一般的機能  （宿主細胞としての役割を果たす）本発明の細胞系は、従来用いられる細胞系２９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）を改善する幾つかの重要な改変を提供する。好ましい態様において、宿主細胞は、ヘルパーＡｄゲノムの転写プログラムをトランス活性化するためのＡｄ−Ｅ１断片をコードする核酸配列を含む（図１）。現在当業者に利用可能な２９３細胞のＥ１断片とは異なって独自に、本発明の細胞系はヘルパーＡｄゲノムと重複する核酸配列を持たないＥ１断片をコードする核酸配列を含むことができる。したがって、本発明は、Ａｄベクターに関連する現在の困難の１つ：相同組換えによる野生型Ａｄ、すなわち複製適格Ａｄ（ＲＣＡ）の生成を排除する。他の要素にはミニＡｄベクターの高コピー数生成の支持、ミニＡｄベクターのパッケージ化の増強、及び／又はヘルパーＡｄのパッケージ化の弱力化に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
２．ヘルパーＡｄのパッケージ化弱力化のための補助機構  ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化する他の方法には、ヘルパーＡｄゲノム内のパッケージ化タンパク質結合部位の近傍に異なるタンパク質の結合部位を配置することによりパッケージ化タンパク質の結合部位を妨害することが含まれ得る。このような系にはテトラサイクリン−リプレッサー（Ｔｅｔ−Ｒ）、リコンビナーゼ、及び／又は変更されたパッケージ化タンパク質の使用が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、この異なるタンパク質は宿主細胞内で発現する。Ｔｅｔ−Ｒは、Ｔｅｔ−Ｒの結合部位、ｔｅｔ−オペロン（Ｔｅｔ−Ｏ）を含むヘルパーウイルスの操作されたパッケージ化シグナルに結合し、それにより、パッケージ化タンパク質の結合を阻害することでパッケージ化を抑制することが可能である。Ｔｅｔ−ＲのＴｅｔ−Ｏへの結合はテトラサイクリンによって制御される。細胞培養培地にテトラサイクリンを添加することによりＴｅｔ−Ｒへのテトラサイクリンの結合が生じ、それがｔｅｔ−Ｏに結合することを妨げる。テトラサイクリンを除去することによりＴｅｔ−Ｒは加工されたパッケージ化シグナルへの結合について自由になり、ヘルパーウイルスのパッケージ化をさらに弱力化する役割を果たす。
【００７９】
Ｃｒｅ又はＦｌｐのようなリコンビナーゼの発現も、ヘルパーウイルスのパッケージ化シグナルにそれぞれｌｏｘ−ｐ又はＦＲＰのような組換え部位が隣接するのであれば、パッケージ化を阻害することが可能である（６６、６８）。ヘルパーウイルスの複製をさらに弱力化するため、ヘルパーウイルスゲノム内の他の遺伝的改変を上に記載されるものとは別に、又はそれに加えて提供することもできる。
【００８０】
幾つかの方法のいずれかによりパッケージ化タンパク質を変更することが可能であり、これらの方法には、Ａｄの特定のパッケージ化タンパク質が同定されるという条件の下でミニＡｄのパッケージ化をヘルパーＡｄと区別するのにパッケージ化シグナルが異なる特定の血清型又は種を用いることが含まれるがこれに限定されるものではない。加えて、パッケージ化タンパク質は、そのパッケージ化タンパク質をコードする遺伝子を遺伝的に改変することにより変更することができる。この改変は、そのパッケージ化タンパク質を野生型パッケージ化シグナルに対するその結合が増大するように変更するものであってもよい。それにより、その改変されたパッケージ化タンパク質はミニＡｄゲノムの好ましいパッケージ化をさらに提供し得る。
【００８１】
３．ミニＡｄベクターの高力価生成のための補助機構  宿主細胞内でのミニＡＤゲノムのコピー数が増加するように設計されたミニＡｄベクターの改変は、高力価ミニＡｄベクターの開発において有用である。宿主細胞によるＳＶ４０Ｔ−Ａｇ（形質転換活性を持たない変異Ｔ−Ａｇ）の発現は、ＳＶ４０  ＤＮＡ複製起点がミニＡｄプラスミドベクターに組み込まれている場合、ミニＡｄゲノムのコピー数を増加させ得る。
【００８２】
ＩＶ．本発明の潜在的な用途
ａ．遺伝病の治療のためのイン・ビボでの遺伝子の送達  大きな治療用遺伝子又は複数の遺伝はもちろん、制御可能な、もしくは組織特異的な発現を決定し、且つより有効な治療上の効果を生じ得る、主要治療用遺伝子に伴う調節要素及び／又は他の関連遺伝子の送達に大きな収容力が必要である。例には、嚢胞性線維症の遺伝子治療の最適化に幾つかの遺伝子の制御可能な発現を必要とする嚢胞性線維症が含まれるが、これに限定されるものではない。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の遺伝子治療が、その治療に大容量ベクターが必要とされる状態の別の例である。この疾患を治療するには、完全な生理学的効果をもたらして患者の筋肉機能を回復させるため、筋肉及び神経成長因子を含むがこれらに限定されるものではない遺伝子を同時送達することが必要となり得る。
【００８３】
ｂ．ベクターの腫瘍内注射による宿主の抗癌性免疫の誘発  Ａｄベクターは、培養腫瘍細胞及びイン・ビボでの異なる型の固形腫瘍モデルにおいて高水準の感染性を示す。Ａｄベクターのこの特徴は癌の治療において用いられている。治療の効率はベクターによって送達される遺伝子に依存する。腫瘍抑制及び免疫調節の機能を併せ持つものを含むがこれに限定されるものではない複数の遺伝子が抗癌効果の最適化に用いられる。このミニＡｄベクターは複数の遺伝子を送達する能力を有し、腫瘍内注射のための抗癌性Ａｄベクターの構築に有用である。
【００８４】
ｃ．移植細胞又は組織の遺伝的改変による宿主の免疫の調節  移植には宿主の免疫の一時的な、又は恒久的な抑制が必要である。移植細胞又は移植組織を含むがこれらに限定されるものではない細胞又は組織に免疫抑制遺伝子を送達することが、免疫抑制剤の投与に代わるアプローチであり得る。本発明において用いられる免疫抑制タンパク質をコードする遺伝子の例には、本発明のミニＡｄベクターによって単独で、又は組み合わせて送達することが可能なＴＧＦｂ、ＩＬ−１０、ウイルスタンパク質ＨＳＶ−ＩＣＰ４７及びＣＭＶ−ＵＳ１１、並びに分泌性Ｆａｓリガンドタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
ｄ．遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞機能の改変又は標的細胞の成長の調節  Ａｄベクターは高力価の貯蔵物を生成することが可能であるという点で他のウイルスベクターを上回る別の利点を有しており、これはイン・ビボ遺伝子治療において有用である。ミニＡｄベクターは最少量のＡｄゲノムのシス要素のみを含むため、ミニＡｄの免疫原性は最小化されている。したがって、ミニＡｄベクターは、遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞の機能の改変又は標的細胞の成長の調節に有用である。
【００８６】
ｅ．ベクターの表面修飾によるイン・ビボでの標的細胞又は組織への導入遺伝子の特異的送達  アデノウイルスのヘキソン及び腺維タンパク質をコードする遺伝子を、標的細胞表面上に存在する特定のエピトープ又はリガンド（例えば、ＩｇＧのＦｃ断片に結合するプロテインＡ）と融合するように加工する。これらの改変遺伝子を、標的細胞表面に対するターゲティング作用因子として作用するリガンドと相互作用する表面部位を有するウイルスを生成するため、組換えウイルスゲノムに組み込む。これにより、生成したウイルス粒子は組織又は細胞認識能を有する。
【００８７】
ｆ．直接イン・ビボアプローチによるＡｄ介在ワクチン接種への使用  ワクチン接種の目的に、Ｅ１置換Ａｄベクターの免疫原性は利益をもたらす可能性があり、Ａｄベースの組換えベクターの開発において用いられている。この型の用途において用いられるミニＡｄベクターは、Ｅ１置換Ａｄベクターを含むがこれに限定されるものではないヘルパーウイルスはもちろんのこと、免疫をもたらす抗原及び免疫源をコードする遺伝子の同時送達を用いる。
【００８８】
ｇ．エキソ・ビボ遺伝子送達への使用  従来のＡｄベクターの使用に関連する一時的な遺伝子の保持及び発現は、Ａｄがエキソ・ビボ送達プロトコルにおいて広く用いられることを妨げている。ＤＮＡ保持機構を有するこのミニＡｄベクターはこの目的に有用である。さらに、培養細胞系におけるＡｄの高い感染性が、このミニＡｄベクターを遺伝子治療に対するエキソ・ビボアプローチにとって非常に有効な遺伝子送達系にしている。
【００８９】
ｈ．アデノウイルス学の基本的な研究及び開発並びに新規ベクターの構築のための手段としての使用  ミニＡｄベクター系それ自体は基本的なアデノウイルス学の研究にとって高い価値を有する。その構築と実施可能性及び作動の立証は既に当該分野における大きな進歩である。このヘルパーＡｄ及びミニＡｄは、Ａｄ及びその潜在的な用途を研究するのに好都合の手段を提供する。これはミニＡｄベクターについて特に言えることである。ミニＡｄの複製、パッケージ化、及び増殖効率の特徴は、従来入手することができなかった重要な新しい情報を備える場を提供する。
【００９０】
ｉ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の方法論と組み合わせての使用  Ａｄベクターはポリリジン、リポソーム、及び他の結合物質と共に遺伝子送達複合体として用いられている。このミニＡｄベクターも、これらの化合物はもちろんのこと、遺伝子送達複合体としての役目を果たす能力を有する他の化合物と共に用いることができる。
【００９１】
ｊ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の目的での使用  このミニＡｄベクター系は、上に論じられているものに加えて、遺伝子伝達及び治療に用いられる大きな潜在性を有している。この可能性は遺伝子伝達及び治療の分野のさらなる開発に沿って理解されるであろう。
【００９２】
ＩＶ．肝臓関連疾患の治療のためのミニＡｄベクター
アデノウイルスの静脈内注射の後、９０％を上回るウイルス粒子が肝臓に局在する。ウイルス粒子の投与の後にアデノウイルス遺伝子又はアデノウイルスベクターの導入遺伝子の発現が観察されるのは肝臓においてである。本発明は、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を駆動することが可能な転写調節遺伝子、すなわちプロモーターを改変され、且つ大きく改善されたアデノウイルスベクターと組み合わせて用いて、遺伝子の発現を肝臓に向けるための方法論を包含する。当業者は、肝臓における異常な遺伝子又は遺伝子の遺伝子産生物の発現によって引き起こされる多くの疾患を思い描くことができる。異常な遺伝子又は遺伝子産生物の発現は肝臓に通常見出されるものを上回り、又は下回る水準の発現を含むことがあり、それは、遺伝子転写の構造もしくは機能の遺伝子欠失、複製、挿入、もしくは変化、又は遺伝子それ自体もしくはそのタンパク産生物のいずれかの他の変更の結果であり得る。また、異常な遺伝子又は遺伝子産生物の発現は、それぞれ、遺伝子及び遺伝子産生物の転写又は翻訳の上で機構的に調節する発現の変化からも生じ得る。
【００９３】
治療用又はレポーター遺伝子を肝臓に送達するためのベクターは本発明の重要な利点を含んでいる。肝臓における遺伝子又はタンパク質のいずれかの発現の欠陥に基づく多数の疾患の治療に本発明を用いることができることを当業者は理解するであろう。本発明を用いて治療又は利用することができる疾患及び遺伝子の例がそれぞれ表1にまとめられている。加えて、これらの遺伝子全てのプロモーターが、肝臓における遺伝子又は遺伝子産生物の発現を駆動する目的で肝臓における遺伝子の発現の駆動に有用であることが判明する。
【表１】
2005000172.tif 000014
2005000172.tif 000015
2005000172.tif 000016
2005000172.tif 000017
＊表１は参考文献５５からのデータ及び情報を含んでなる。
【００９４】
本発明のさらに別の態様は、本発明のミニＡｄベクターを含む医薬組成物を包含する。この医薬組成物は固体形態（顆粒、粉末又は座剤を含む）又は液体形態（例えば、溶液、懸濁液、又はエマルジョン）で製造することができる。経口投与のための固体投与形態にはカプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒が含まれ得る。経口投与のための液体投与形態には、当該技術分野において一般に用いられる不活性希釈剤、例えば水を含む、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれ得る。このような組成物は、湿潤剤、甘味料、調味料、香料のような添加剤を含んでいてもよい。本発明の化合物は無機又は有機酸から誘導される塩の形態で用いることができる。
【００９５】
本発明のベクターは単独の活性医薬組成物として投与することができるが、本発明の１以上のベクター又は他の薬剤と組み合わせて用いることも可能である。組み合わせとして投与する場合、治療剤は同時に、もしくは異なる時期に投与される別々の組成物として処方することも、単一の組成物として投与することもできる。
【００９６】
ＩＶ．ＦＶＩＩＩ活性を置換するためのミニＡｄベクター
ＦＶＩＩＩ遺伝子を含むＥ１置換アデノウイルスベクターが宿主動物における治療水準のＦＶＩＩＩの発現の達成に用いられている（１３）。しかしながら、アデノウイルスベクターを遺伝子治療に用いることを試みている研究者は幾つかの困難に遭遇している。本発明は、以下に説明されるように、これらの問題の多くの解決法を提供する。
【００９７】
Ａｄ  ＤＮＡ複製及びパッケージ化の必須シス作動性要素がウイルスゲノムの端部に位置するため（ＩＴＲに加えてパッケージ化シグナル、１ｋｂ未満）、ミニＡｄベクターの主鎖はこの必須シス要素のみを含むように改変されている。ミニＡｄゲノムの残部は、その約３８ｋｂのパッケージ化限界まで、異種ＤＮＡを含むことが可能である。本発明においては、この異種ＤＮＡはヒトＦＶＩＩＩに類似する活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。ＦＶＩＩＩは通常肝臓において生成し、発生期ポリペプチドのアミノ末端から誘導される９２ｋＤａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポリペプチド及び８０ｋＤａのＣ末端軽鎖を含む（５３）。その活性化形態は、血液凝固カスケードにおいて活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウムイオンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態、Ｘａに変換する。ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、幾つかのドメインをＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のポリペプチドをコードする（５−７）。Ａ及びＣドメインは機能的活性に重要であり、これに対して約９８０アミノ酸からなるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。本発明は、ＦＶＩＩＩ様活性を有するミニＡｄベクターの例として、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含むミニＡｄベクターを提供する。ＦＶＩＩＩ様活性（すなわち、第Ｘ因子のその活性化形態Ｘａへの変換において補因子として作用する能力）を有するタンパク質をコードする遺伝物質を含むミニＡｄベクターが本発明に包含されることは当業者によって理解されるはずである。
【００９８】
本発明のＦＶＩＩＩミニＡｄは、ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡはもちろんのこと、宿主細胞ゲノムへの遺伝子の組み込み及び宿主細胞内でのヒトＦＶＩＩＩの発現を支持するＤＮＡ要素（すなわち、異種組換えアーム、ＡＡＶ／ＩＴＲ配列、及び転写制御領域）をも含む。ＤＮＡの複製及びＦＶＩＩＩミニＡｄベクターのキャプシド形成に必要なウイルスタンパク質はヘルパーＡｄ（トランス補完）からトランスでもたらされる。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの比較的純粋な調製品をウイルス粒子として生成するため、そのパッケージ化シグナルの改変によりヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化が弱毒化されている。これは、ヘルパー細胞系におけるＦＶＩＩＩミニＡｄベクターゲノムの優先的なパッケージ化を斟酌する。
【００９９】
態様の１つにおいて、このＦＶＩＩＩミニＡｄは部位特異的組み込み機構を含む。この機構は、ヒト組み込み配列（ＡＡＶＳ１部位）に標的設定された異種組換え配列又はＡＡＶ／ＩＴＲを含むことができる。この組み込み機構を試験するためには、ＡＡＶＳ１部位をマウスゲノムに移さなければならない。これを伴う方法の１つは、胚幹細胞形質転換のような遺伝子導入技術を用いることにより、又はＡＡＶＳ１部位を含む導入遺伝子をマウス単細胞卵子の雄性前核に直接ＤＮＡを注射することにより達成することができる（５７−６０）。このような方法論によって開発されたトランスジェニックマウスをミニＡｄベクターの組み込み効率及び特異性の試験に用いることができる。
【０１００】
本発明のさらなる態様は、宿主動物体内で生じ得る潜在的な抗−ヒトＦＶＩＩＩ免疫応答に取り組む。このような免疫応答は、ミニＡｄベクターの利用又はこのベクターの効率の分析を妨害する可能性がある。ミニＡｄベクターが送達され、且つマウス体内でのヒトＦＶＩＩＩの発現を駆動するため、処置マウスの免疫応答がＦＶＩＩＩの発現の持続及び水準の評価を複雑にする可能性がある。これらの、及び他の理由から、ＦＶＩＩＩ不全トランスジェニックマウスモデルが本発明によって提供される。ミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝子が移入され、その結果そのレポーター又はエフェクター遺伝子の遺伝子産生物に対して寛容である非ヒトトランスジェニック動物を本発明が包含することは理解されるであろう。
【０１０１】
上述のトランスジェニックマウスの各々の例が本発明によって提供され、これらは遺伝的に改変された胚幹（ＥＳ）細胞の微量注入により生成される。本発明の一態様においては、一時的な遺伝子の発現を可能とするために発生的に調節されたシス作動性制御要素に作動可能に連結する二本鎖ヒトＦＶＩＩＩ  ＤＮＡが組み込まれている非ヒトトランスジェニック動物が提供される。プロモーターは、発生の間の一時的なヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の発現をその発現した外来性タンパク質に対する寛容化が生じるように方向付けることが可能な発生的に調節されたあらゆる遺伝子単位から誘導することができる。その動物の寛容化及び成熟の後には、そのＦＶＩＩＩ導入遺伝子はもはや発現しない。本発明においては、α−胎児タンパク質プロモーターがヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに作動可能に連結され、そのゲノム内にヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを有するトランスジェニックマウスの生成に用いられた。このようなマウスは発生的に調節された様式でｈＦＶＩＩＩを発現し、そのようなものとしてヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化される。別のモデルには、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターの部位特異的組み込みの標的である二本鎖ＡＡＶＳ１配列を有するトランスジェニック動物が含まれる。ヒト第ＦＶＩＩＩ因子寛容血友病動物モデルを作製するため、このヒトＦＶＩＩＩ及びＡＡＶＳ１トランスジェニック動物を飼育して血友病動物とすることができる。
【０１０２】
以下の例は本発明の特定の態様を説明するものであり、本明細書及び請求の範囲をいかなる意味においても限定するものではない。
【実施例】
【０１０３】
ＩＶ．実施例
＜実施例１＞パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を坦持するミニＡｄベクターの構築及び特徴付け
１．１  パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄの生成
Ａｄ５のパッケージ化シグナル欠失変異体の幾つかが記述されている（９０）。変異体ｄｌ１０／２８（ｄｌ３０９−１９４／２４３：２７４／３５８とも記述される）はＡｄ５のｎｔ１９４乃至２４３及び２７４乃至３５８が欠失している。ｄｌ１０／２８ウイルスは、Ｓｔｏｗの方法（８９）により、Ａｄ５の左端含むプラスミドをこの二重変異体（ｐＥ１Ａ−１０／２８）及びＡｄ５ゲノムの残部とライゲートすることにより生成した（９０）。ｄｌ１０／２８は単一のウイルス感染におけるウイルスの収量で１４３倍の低下を示し、野生型ウイルスと同時感染した場合には検出されなかった。我々は、ｄｌ１０／２８と同じ突然変異を有するヘルパーウイルスに関して、低収量であってもそのウイルスを増幅することが可能であり、且つ野生型パッケージ化シグナルを含むミニウイルスベクターの存在下においてそのヘルパーウイルスは未包被のままであるはずだと結論付けた。
【０１０４】
このパッケージ化シグナルをＰＣＲによりｐＥ１Ａ−１０／２８から下記プライマーを用いて増幅した。
【０１０５】
Ｒ７：５’−ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ
（Ａｄ５のｎｔ１３７乃至１６３、ＡｆｌＩＩＩ部位には下線が付されている）及び
Ｒ８：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧ
（ｎｔ４４９乃至４２１、ＣｌａＩ部位が結合している）
増幅した１３３ｂｐの断片をＡｆｌＩＩＩ及びＣｌａＩで切断し、シャトルベクターＧＴ４００４の対応する配列の置換に用いた（この構築スキームについては図4を参照）。ＧＴ４００４はＡｄ５の左領域をＸｈｏＩ部位（ｎｔ５７９２、１６ｍｕ）からＳｎａＢＩ部位（ｎｔ１０３０７、２８ｍｕ）まで伸長することによりｐＸＣＸ２（９１）から誘導され、したがって、ＧＴ４００４はＡｄ５の左端を０．３８ｍｕのＡｆｌＩＩＩ部位を含めて０ｍｕから１．２ｍｕまで、Ｅ１欠失をこの欠失点内のＣｌａＩを含めて１．２ｍｕから９．２ｍｕまで、及びＡｄ５の左アームの残部を２８ｍｕまで含む。この伸長された左アームは組換えウイルスの生成に用いられる相同組換えの頻度を高める。野生型パッケージ化シグナルが欠失したもので置換されているＧＴ４００４はＧＴ５０００と命名された。ｐＴｋβ（クローンテック、Ｃａ）に由来するβ−ｇａｌ発現カセットをＳａｌＩ断片として切断し、クレノウ酵素で平滑末端化して、ＧＴ５０００の平滑末端化ＣｌａＩ部位に挿入した。したがって、得られたプラスミドＧＴ５００１は二重欠失パッケージ化シグナル及びＴｋプロモーターによって駆動されるβ−ｇａｌ遺伝子で置換されたＥ１領域を含む（図４）。この構築体では、Ｘ−ｇａｌ染色によるヘルパーウイルスの検出が斟酌される。
【０１０６】
ヘルパーウイルスを生成するのに、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃによって記述される方法を用いた（９１）（図５）。ＡＴＣＣから入手した２９３細胞の早期継代をＭＥＭ−１０％ウマ血清において成長させ、６０ｍｍプレートに播種した。３０％集密で、ＣａＰＯ４により、プレート当たり２ｍｇのＧＴ５００１及び４ｍｇのｐＪＭ１７（９１）を用いて細胞に同時形質移入した。同時形質移入の３日後、細胞を０．５％アガロースを含む培地で覆い、その後そのオーバーレイ上の培地を毎日代えた。プラークが視認されるようになったら、Ｘ−ｇａｌ（ＤＭＳＯ中４０ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍｇ／ｍｌまで培地に直接添加し、一晩インキュベートした。所望のヘルパーウイルスを生成するプラークを青色で識別した（図６）。青色プラークを採取し、そのアガロースプラグを１ｍｌＭＥＭ−１０％ＦＢＳに再懸濁した。この培地の３７０ｍｌをパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅のために以下のように処理した：４０ｍｌの１０ＸＤＮＡ分解酵素Ｉバッファ（４００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、６０ｍＭ  Ｃｌ２Ｍｇ、２０ｍＭ  Ｃｌ２Ｃａ）（この処理の対照として０．５ｍｇのシャトルベクターを収容する管を用いた）及び１ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ（ベーリンガーＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍ）、１０ｕ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ分解酵素Ｉを不活性化し、３２ｍｌ  ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）、ＥＧＴＡ（０．２５Ｍ）、１０ｍｌ  ＳＤＳ（２０％）、５ｍｌプロテイナーゼＫ（１６ｍｇ／ｍｌ）を添加することによりウイルスのキャプシドを開裂させ、５６℃で２時間インキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１：１：１／２４）で１回抽出した後、１ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加してウイルスＤＮＡの調製を助成し、これを微量遠心において１２０００ｒｐｍで遠心することに集めて２０ｍｌのＨ２Ｏに再懸濁した。５ｍｌを、プライマーＲ７及びＲ８を用いるＰＣＲ反応に用いた。
【０１０７】
所望の欠失パッケージ化シグナルを含む青色プラークの１つをＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で成長する２９３細胞においてさらに増幅させた。以下、Ａｄヘルパー−βｇａｌ又はＡｄＨβと命名する（図５を参照）。このウイルスを、感染後４８時間で、集めた細胞の８００ｇで５分間の遠心並びに細胞ペレットの３回の急速冷凍及び解凍サイクルにより抽出した。このＸ細胞からの粗製抽出物を３Ｘ細胞の感染に用いた（増幅スケールは、野生型パッケージ化シグナルを有するウイルスの１対２０とは対照的に１対３であった）（図６）。継代毎に、上清のＰＣＲによりパッケージ化シグナルの欠失サイズを検証した（図７）。この欠失及びβ−ｇａｌの発現は分析した継代の全てにおいて安定であった。継代９で、ＡｄＨβをＣｓＣｌにより精製した。精製は、凍結−解凍サイクルを３回行い、その溶解物を０．５ｍｌ  ＣｓＣｌ  １．５ｍｇ／ｍｌ＋２．５ｍｌ  ＣｓＣｌ  １．３５ｍｇ／ｍｌ＋２．５ｍｌ  ＣｓＣｌ  １．２５ｍｇ／ｍｌの段階的勾配に積層し、ＳＷ４１ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ローターにおいて１０℃、３５０００ｒｐｍで１時間遠心することにより行った。集めたウイルスバンドをＣｓＣｌ  １．３５ｍｇ／ｍｌと混合し、前と同様に１８時間遠心した。このウイルスバンドをＰＢＳに対して２回、ＰＢＳ−１０％グリセロールに対して１回透析し、−８０℃で保存した。第２勾配の後に５つの異なるバンドが見られ、それらの全てを別々に精製した。精製したウイルスから、ＥＤＴＡ／ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ処理、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿（ＰＣＲについて上述されるものと同じ条件）によりウイルスＤＮＡを抽出した。臭化エチジウムゲルにおいては上部３つのバンドにはＤＮＡが検出されず、それらは大部分が空のキャプシドであると考えられる。下部の２つのバンドはウイルスＤＮＡを含み、したがって、完全なキャプシドであり、これは制限マップ分析によりＡｄＨβと一致することが示された。Ｒ７＋Ｒ８オリゴを用いるＰＣＲにより欠失パッケージ化シグナルが全てのバンドから増幅され、これは、ウイルスが所望の弱力化を備えることを示す。溶液中のウイルスのミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数で表される力価を決定するため、ウイルス含有溶液をＤ−ＭＥＭ１０％ＦＢＳで連続的に希釈し（１：１０希釈で１０−１２まで）、９０％集密の２９３細胞（６ウェルプレート内に０．５ｍｌ／ウェル）の感染に用いた。３７℃で１時間感染させた後、ウイルス懸濁液を新鮮な培地で置き換えた。翌日、細胞を０．５％アガロース、０．０２５％酵母抽出物及び５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．4を含む培地で覆った。６乃至１０日後、プラークをカウントした。ＡｄＨβの増幅及び精製の後に得られた力価は約１０９ＰＦＵ／ｍｌ（ウイルスを１５０ｍｍ２のプレート２枚から精製し、再懸濁して最終容積１ｍｌとした）であった。この力価は、ｗｔパッケージ化シグナルを含む類似のウイルスベクターを用いて得られるものより約１００Ｘ低い。
【０１０８】
１．２  ミニウイルスベクター用のプラスミドの構築
直鎖アデノウイルスＤＮＡは、その末端ＩＴＲによって頭部と尾部とが共有結合で環化した場合、細菌内でプラスミドとして成長することが可能であるが、許容的ヒト細胞に移入された場合に複製してウイルスを精製することが示されている（９２）。機能的接合は、感染細胞から抽出された環状ＤＮＡを用いて細菌を形質転換することにより自然に選択されている。接合部には小さな欠失が観察されており、それは、おそらく、アデノウイルスＤＮＡのＩＴＲの頭部と尾部との融合の結果生じた完全な回文構造を破壊することによりそのプラスミドに安定性を付与している。したがって、基本的なミニウイルスの構造はＡｄ５の右端（少なくとも１０３ｎｔ−ＩＴＲを含む）に融合したＡｄ５の左端（１０３ｎｔ−ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルをｎｔ３５８まで含む）を含むプラスミドである。ミニウイルスベクター系の試験に用いられた初期のアプローチには、機能的ＩＴＲ融合を含むプラスミドｐＪＭ１７において漸進性欠失を生成することが含まれていた。ｐＪＭ１７は、Ａｄ５のゲノム全体をＩＴＲ配列で環化したＤＮＡ分子として、及び（細菌複製起点並びにアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子をもたらす）Ｅ１Ａに挿入されたｐＢＲ３２２誘導体ｐＢＲＸを含むプラスミドである（９３）。Ｅ１Ａの欠陥を補完する２９３細胞内に形質移入されると、ｐＪＭ１７は複製するが、アデノウイルスキャプシド（最大は３８ｋｂ）内にパッケージ化するには大きすぎる（４０．３ｋｂ）ためパッケージ化はされない。
【０１０９】
本発明のものに加えて現在の文献示される様々なミニウイルスベクターの例が図５に示されている。ｐＪＭ１７をＡｓｃＩで切断し、再ライゲートしてｐＢＲＸ−ＡｓｃＩを得た。これによりＡｄ５のｍｕ４３．５乃至７０．２が除去され、これはＥ２Ａ（ＤＮＡ結合タンパク質）及びＬ３（ヘキソン、ヘキソン関連タンパク質及び２３Ｋプロテアーゼ）を完全に欠失させ、且つＬ２（ペントン基部及び核タンパク質）及びＬ４（ヘキソン関連タンパク質、ヘキソン−三量体足場タンパク質、及び３３Ｋタンパク質）を部分的に欠失させる。この欠失は環状ウイルスＤＮＡから複製及びキャプシド形成を抑止し、それを十分な量の必要とされる複製タンパク質をトランス作動的に提供するヘルパーウイルスに完全に依存性にする。ｐＢＲＸ−ＡｓｃＩは７５．２ｍｕ（Ｌ４）に独自ＳｐｅＩ部位を含み、Ｍ３２（３２ｋＢのミニウイルス）を得るため、そこに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含む２．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された。このＧＦＰカセットは、ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター（ＣＡプロモーター）、エクオレア・ビクトリアＧＦＰ  ｃＤＮＡ、及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含んでなる。ミニウイルスベクター構築体におけるＧＦＰの使用は、細胞におけるこのベクターの存在を蛍光顕微鏡法を用いて測定するために用いた。蛍光顕微鏡法は、ＧＦＰを発現する細胞の検出に用いることができるフローサイトメトリーを含むがこれに限定されるものではない幾つかの方法のうちの１つを代表する。ＡｄＨβの存在はＸ−ｇａｌ染色の青色によって検出することができる。Ｍ３１を生成するため、Ｍ３２をＭｌｕＩで切断して再ライゲートした。これにより３１．４乃至３４．５ｍｕが除去され、これはＬ１（５２Ｋ、５５Ｋ及びペントン関連タンパク質）を部分的に欠失させた。Ｍ２８を生成するため、Ｍ３２をＭｌｕＩ及びＡｓｃＩで切断して再ライゲートした。これにより３１．４乃至４３．５ｍｕが除去され、これはＭ３２に依然として残留していたＬ１及びＬ２タンパク質を完全に欠失させた。Ｍ２６を生成するため、Ｍ２８をＲｓｒＩＩ及びＳｐｅＩで切断して再ライゲートした。これにより３０．９乃至７５．２ｍｕが除去され、これはＬ１及びＬ４の欠失に及んだ。Ｍ２３を生成するため、Ｍ３２をＮｓｉＩで消化して再ライゲートした。ＧＦＰカセットを含む、３２．２ｍｕ乃至ＣＡプロモーターのＮｓｉＩ断片（７５．２ｍｕでの融合の次のＮｓｉＩ部位を含む）は再ライゲートされ、その結果、ＣＡプロモーターのＮｓｉＩ部位は５．５ｍｕにライゲートされ、３２．２のＮｓｉＩ部位は７５．３ｍｕでライゲートされた。これは、Ｅ２ｂ（末端タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ）及びＩＶａ２タンパク質を含む５．５乃至７５．３ｍｕの全てのタンパク質の発現を抑止する。Ｍ２０を生成するため、Ｍ２３をＭｌｕＩ及びＡｓｃＩで切断し（これは、Ｍ２３のＮｓｉＩ断片の３４．５乃至４３．５ｍｕの領域を除去する）、再ライゲートした。
【０１１０】
ｐＪＭ１７におけるものような環化完全長ウイルスゲノムの切り落としの代わりに、ＩＴＲ配列及びパッケージ化シグナルを含む、複製及びパッケージ化に必要な最小シス要素をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のような小プラスミドにサブクローン化し、導入遺伝子カセット及びそのウイルスベクターの治療上の潜在性を改善し得る他の要素、例えば、エピソーム維持もしくは染色体組み込みのための要素を漸進的に加えることにより他のミニウイルスベクターを構築した（図８、最下部）。頭部と尾部とが融合したＩＴＲ及び左ＩＴＲの次のパッケージ化シグナル（ＩＴＲ／ＩＴＲ＋ｐａｃ）をＥｃｏ４７ＩＩＩ（９８．７ｍｕ）及びＰｖｕＩＩ（１．２６ｍｕ）を用いてｐＢＲＸ−ＡｓｃＩから切断し、平滑末端化して、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶにサブクローン化した。得られたプラスミドｐＢＳ／ミニＩＴＲ、すなわちＧＴ４００７は、発現カセットを含まず、且つＩＴＲ／ＩＴＲ＋ｐａｃに隣接する幾つかの独自制限部位を有する３．８ミニウイルスプラスミドである。ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩを用いて、上述のＧＦＰ発現カセットをｐＢＳ／ミニＩＴＲにサブクローン化してＭ６．５を生成した。次に、内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）及びネオマイシン（ｎｅｏ）ｃＤＮＡをＣＡプロモーターとＧＦＰ遺伝子との間にサブクローン化してＭ７．０を生成した。２つの別々のカセットにｎｅｏ及びＧＦＰを含む類似のミニウイルスＭ８．５を生成した；Ｔｋプロモーター、ｎｅｏ  ｃＤＮＡ及びＴｋ  ｐＡを含むｐＲＥＰ９（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に由来するＮｒｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を平滑末端化し、Ｍ６．５のＳｔｕＩ−ＥｃｏＲＩにサブクローン化した。アデノウイルスゲノムを外来性ＤＮＡで完全に置換したミニＡｄベクターのパッケージ化を試験するため、より大きなミニＡｄプラスミドの構築にＭ８．５を用いた。インサートとして、アルブミン遺伝子の３’、半分及びα−胎児タンパク質遺伝子の５’、半分に相当するゲノム断片を用いた。これらの断片は、潜在的なアームとして、この部位での相同組換えを研究する見込みで選択した。これらの断片は、Ｍ８．５の二重ＧＦＰ／ｎｅｏ発現カセットの上流及び下流に挿入した。したがって、得られた構築体においては、ｐＧｎＥ５Ｅ３（２３．８Ｋｂ）、ＧＦＰ及びｎｅｏ導入遺伝子がそのヒトゲノム内に存在する対応１０Ｋｂアルブミン−ａ−胎児タンパク質遺伝子間領域を置換する。図９は上述のプラスミドを用いて得られるミニウイルスの構造を示す。
【０１１１】
１．３  ミニＡｄＧＦＰベクターの生成及び増幅
様々なミニＡｄプラスミドの複製及びパッケージ化を支持するのにＡｄＨβを用いた。ミニウイルスがパッケージ化可能であったかどうかを決定することが重要であった。また、ミニウイルスのサイズがパッケージ化効率に影響を及ぼすかどうかを決定することも重要であった。
【０１１２】
アデノウイルスにおいては、１００％野生型長のＤＮＡが最も効率的にパッケージ化され、ゲノムサイズが最大で１０５％まで増加し、又は１００％未満に減少するに従いパッケージ化の効率が低下した。野生型アデノウイルスを欠陥ミニウイルスの補完に用いた場合、６９％（２５ｋｂ）というより低い限界が示唆されている（９４）が、弱力化ヘルパーウイルスを用いることにより、より短いミニウイルスのパッケージ化が可能であった。
【０１１３】
本発明のミニウイルスを補完するため、各々同様の効率で作用する２つの方法を用いた（図１０）。第１の方法においては、ＣｓＣｌ精製ミニウイルスプラスミドを精製ＡｄＨβから抽出した直鎖ウイルスＤＮＡと共に同時形質移入した。このウイルスＤＮＡの精製に用いられた方法は、複製の初回刺激の原因である末端タンパク質を破壊するＳＤＳ及びプロテイナーゼＫに処されることに注意されたい。この方法は、同様に末端タンパク質を欠くミニウイルスプラスミドを上回る複製の利点をヘルパーウイルスに付与することを回避するために用いた。したがって、ＡｄＨβでの直接感染による補完がミニウイルスを救済することはなかった。同時形質移入は、５０％集密の２９３細胞で、６ウェルプレートのウェル当たりＣａ２ＰＯ４及び２ｍｇのミニウイルスプラスミド及び１ｍｇのウイルスＤＮＡを用いて行った。この形質移入混合物中で一晩インキュベートした後、培地を代え、蛍光顕微鏡法を用いて細胞を検査することにより形質移入の効率を評価した。ＣｓＣｌ精製プラスミドで、この効率はプラスミドのサイズに関わりなく１００％に達した（図１１）。同時形質移入の６日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルスを細胞から回収した。第２の補完方法においては、ミニウイルスプラスミドをｐＢＨＧ１０、パッケージ化シグナルが完全に欠失しているためにパッケージ化が不可能であるｐＪＭ１７に類似する環化アデノウイルスプラスミド（９５）、と共に同時形質移入した。このプラスミドは、複製に必要な早期タンパク質の全てに加えてキャプシドを形成する後期タンパク質をも生成する。ミニウイルスがｐＢＨＧ１０と同じ細胞内に存在する場合、それもまた複製し、且つ、ミニウイルスが野生型パッケージ化シグナルを含むため、ミニウイルスベクターがキャプシドに包まれる主要核酸である。しかしながら、ミニウイルスが隣接細胞に放出される場合、欠陥を有するために増幅しない。したがって、このミニウイルスを増幅させるため、同時感染の３日後、その細胞単層に１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）でＡｄＨβを感染させた。同時形質移入の３日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルスを回収した。
【０１１４】
補完の方法に関わりなく、その溶解物（生成ミニウイルスの継代０）を用いて９０％集密２９３細胞の新鮮な単層に（１対３の増幅スケールを用いて）感染させた。感染後の当日、ミニウイルスの存在を蛍光により観察し、ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により確認した。どのようなものであっても溶解物中にヘルパーウイルスが存在した場合には、それらの細胞のさらなるインキュベーションによりミニウイルス＋ヘルパー混合物の増幅がＣＰＥの出現を伴って導かれた（この単層の新たな溶解物はミニウイルスの継代１と考えられる）。溶解物中にヘルパーが存在しない場合には、ミニウイルス単独ではパッケージ化せず、新たなヘルパーを添加することによってのみＣＰＥが出現した。したがって、ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により、及びより高い感度でＣＰＥの出現により評価した。
【０１１５】
ミニウイルス構築体（Ｍ３２、Ｍ３１、Ｍ２８、Ｍ２６、Ｍ２３、及びＭ２０）の各々を用いて別々に形質移入した後、ＧＦＰを含むプラークの出現を観察した（図１２）。これにより、試験したプラスミドの各々について補完が可能であったことが示された。新鮮な２９３細胞単層に各々のウイルスの粗製抽出物を感染させた２日後にＣＰＥが観察され、これはヘルパーウイルスの存在を示した。さらなるミニウイルスの継代の結果は、全ての継代において５倍の増幅が生じ、パッケージ化効率がミニウイルスのサイズに比例することを示した（図１３）。ベクターサイズが３ｋｂ減少する毎に効率が２倍低下することが観察された。例えば、Ｍ２０のパッケージ化効率は野生型（（３６−ｘｋｂ）／３＝ｎ、効率は０．５ｎである）の２．４８％である。しかしながら、Ｍ６．５、Ｍ７．９及びＭ８．５では蛍光プラークは見出されず、これは非常に非能率的なパッケージ化、又はパッケージ化が存在しないことを示した（図１３）。これは、８．５Ｋｂ乃至２０Ｋｂのどこかに存在するパッケージ化下限を反映している可能性があった。しかしながら、これらの限界の間でもパッケージ化は依然として生じているが、観察された線形の減少によると、１１．５Ｋｂのサイズの差が７．６倍のパッケージ化効率の低下を生じ、それにより増殖が不可能になり得るというのがより確からしいように思われる。
【０１１６】
外来ＤＮＡによるウイルスゲノムの完全な置換が可能であり、これがパッケージ化効率に影響を及ぼすかどうかを試験した。Ａｄ５のＩＴＲ及びパッケージ化シグナルのみを含む２３．８Ｋｂの完全に置換されたミニＡｄを構築した。外来性ＤＮＡとして、一方がＧＦＰで他方がネオマイシンのものである２つの直列の発現カセットにアルブミン ａ−胎児タンパク質ゲノムＤＮＡの２つの長アームを隣接させた（図９）。ＡｄＨｂ  ｖＤＮＡで最初に補完した後に得られたウイルスを継代させたときに、ＧＦＰ−陽性２９３細胞の数を増加させることによりパッケージ化が示された。この形質導入単位力価はＭ２３で得られるものに類似しており（図１３）、これは、Ａｄ５  ＤＮＡと比較した場合、外来性ＤＮＡがパッケージ化効率において有害な効果を持たないことを示した。
【０１１７】
１．４  ミニＡｄＧＦＰウイルス（Ｍ３２）の精製
ミニウイルスの継代に続いて、感染後に全ての細胞が蛍光を発するようになるまで力価を増加させた。これは、例えば、Ｍ３２の継代４で生じた。Ｍ３２を１対３の増幅スケールで連続的に継代することにより継代８に達したとき、１５０ｍｍ２のプレート７５枚を感染させるのに十分なウイルスが得られた。ＣＰＥが出現したら、上述のように３回の凍結／解凍サイクルによりウイルスを抽出し、ＣｓＣｌ勾配により精製した。勾配中には、３つの上部バンドと遠心管の中央部のより濃い１つのバンドとの４つのバンドが観察された（図１４のスキームを参照）。管の頂部から吸引することによりそれぞれのバンドを別々に集め、透析した。２９３細胞にそれぞれのバンドを感染させて蛍光を観察し、又はＸ−ｇａｌ染色することにより、ミニウイルス及びヘルパーウイルスが両者とも高密度バンドに存在することが示された（図１５）。緑色及び青色細胞の数に基づいて、ミニウイルス及びヘルパーの量が同じ範囲内にあることが決定された。Ｍ３２（３２Ｋｂ）及びＡｄＨβ（３７．１Ｋｂ）内に存在するウイルスＤＮＡのサイズの相違は、Ｍ３２をＡｄＨβよりも密度が僅かに劣るものとした。ミニＡｄベクターのヘルパーに対する比を増加させるため、高密度バンドを１．３５ｇ／ｍｌ連続ＣｓＣｌ勾配中に分離し、その管の底部から画分を集めた。それぞれの画分の０．５ｍｌを亜集密の２９３細胞の感染に直接用い、２４時間後に蛍光性及び青色細胞をチェックした。多量のＡｄＨβを含むピーク（図１６、画分７乃至１６）の後により軽い画分が続き、これはＡｄＨβに対して１０倍のＭ３２の濃縮を示した（画分１７乃至２９）。したがって、ミニＡｄ調製品中に存在するヘルパーウイルスの量の低減にＣｓＣｌによる分画を用いることができる。
【０１１８】
まとめると、これらの結果は、ｄｌ１８／２８から採取されたパッケージ化シグナルにおける部分的な欠失と共に用いられるヘルパーはミニウイルス系における大きな欠失を補完することが可能であるが、ミニウイルスの存在下において依然としてパッケージ化することを示す。このヘルパーは、純粋なミニウイルスの集団が重要ではない場合、例えば、幾つかの治療用遺伝子（例えば、インターロイキン及び腫瘍抑制遺伝子）を含むミニウイルスを他の治療用遺伝子を含むこのヘルパーに結合させることが可能な抗腫瘍ベクター系において用いることができる。ヘルパーに対するより高いミニＡｄの比が必要である場合には、このヘルパーをそのパッケージ化においてさらに弱力化する必要がある。
【０１１９】
＜実施例２＞パッケージ化シグナルが妨害されたヘルパーＡｄの設計
アデノウイルスのパッケージ化はパッケージ化要素（Ａ反復）に結合するのにパッケージ化タンパク質を必要とする（９０、９６）ため、本発明ではＡｄ５パッケージ化シグナル（Ａ反復）に隣接する幾つかの特定のＤＮＡ結合配列を導入してヘルパーウイルスのパッケージ化機能をさらに物理的に妨害する。２つのＤＮＡ結合配列が選択されている：Ａ．ＧＡＬ４結合配列（９７）；Ｂ．テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）（９８、９９）。ＧＡＬ４は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における転写を活性化する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。ＧＡＬ4の最初の１４７アミノ酸は、ガラクトース中の活性化領域ＵＡＳＧ又は自然に生じる部位、“１−量体”５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’もしくは５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’近似共通の上流の４つの部位に結合する（９７）。ｔｅｔＯは大腸菌のＴｎ１０特異的テトラサイクリン耐性オペロンに由来するものであり、耐性介在遺伝子の転写はｔｅｔＯの１９−ｂｐ逆転反復配列５’ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’の結合するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）によって負に調節される（９８、９９）。
【０１２０】
パッケージ化シグナル変異構築体ＧＴ５０００（実施例、第１項）に基づいて、ＧＴ５０００のＸｈｏＩ乃至ＸｂａＩ（ｎｔ１９４、０．５ｍｕ乃至ｎｔ４５２、１．２５ｍｕ）の配列の置換に合成配列が用いられている。４種類の合成配列（図２１及び２２）が設計されている。４種類の合成配列は全て、Ａｄ５パッケージ化要素（Ａ反復）Ｉ、II、ＶＩ及びＶＩＩを含む。１７量体ＧＡＬ４結合配列（５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’（９７）又は１９量体ｔｅｔＯ配列（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’（１００、１０２）の３つもしくは４つの反復をこれらのＡ反復の周囲又はそれらの間に導入した（図１７及び１８）。Ａ反復の間の領域はパッケージ化効率に影響を及ぼす（９０、９６）ため、各Ａ反復間の距離はそのヘリックスのほぼ完全なターン、すなわち、１０、２１又は３１ｂｐに維持する（図１７及び１８）。図１９及び２０は合成オリゴ配列及び位置を示す。
【０１２１】
＜実施例３＞Ａｄ−Ｅ１ヘルパー細胞系の構築及び特徴付け
遺伝子治療用途において用いられるアデノウイルスベクターの大部分はアデノウイルス５（Ａｄ５）ゲノムのＥ１領域に欠失を有するように設計されていた。領域ＩＸを含まないＥ１領域はＡｄ５の左端の９％（１．２−９．８マップ単位）からなり、２つの早期領域タンパク質Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする。Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂの発現には、ウイルスの複製並びにＥ２−Ｅ４及び後期タンパク質のような他のＡｄ５タンパク質全ての発現が必要とされる（１００）。Ｅ１の欠失は、理論上は、全てのＡｄ５タンパク質の発現について無活動であり、且つ関心のある導入遺伝子のみを発現する複製不適格ウイルスを創出する。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂの欠失も、これらの２種類のタンパク質が組み合わせて哺乳類動物細胞の癌遺伝子性形質転換に関連付けられているため、安全性の理由から関心のあるものである（１０１−１０３）。ヒトの臨床試験において現在までに用いられている全てのクラスＩアデノウイルスベクターに加えて、実施例１に記述される新規パッケージ化不全ヘルパーウイルスもＥ１が欠失されている。
【０１２２】
Ｅ１不全アデノウイルスは２９３と呼ばれるＡｄ５ヘルパー細胞系において増殖する（１０４）。２９３細胞は、Ａｄ５  ＤＮＡの共有断片を含むヒト胚性腎臓細胞を形質転換することにより誘導された。ゲノムの分析により、２９３細胞は細胞当たり４乃至５コピーのウイルスゲノムの左側１２％（Ｅ１領域全体を含む）及び細胞当たり約１コピーの右端、Ｅ４領域の９％を含むことが明らかになった（１０５）。２９３細胞は高力価のＥ１不全アデノウイルスを生成する点では非常に効率的ではあるが、（Ｅ１領域以外の）２９３ゲノムに組み込まれている外来性Ａｄ５配列の存在のため、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター中の配列との組換えが生じ、それがＥ１を含む複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）の生成を引き起こす可能性があるという不利な点を有する。Ｅ１不全アデノウイルスの増幅及び増殖の間にいかに早い継代（この継代はアデノウイルス貯蔵物の大規模生成に用いられるものである）で異常な組換え現象が生じるのかに依存して、２９３細胞におけるＲＣＡの生成はヒト遺伝子治療試験の安全性に対する深刻な結果を提示し得る（１０６）。ＲＣＡの生成に加えて、２９３細胞における組換えは、導入遺伝子の発現に影響を与え、それにより機能的アデノウイルス粒子の力価を低下させる欠失及び再配置をも引き起こし得る。近年、Ｅ１領域を含む決定されたＡｄ５  ＤＮＡを用いて細胞系が開発されているが、これらの細胞系はＥ１欠失アデノウイルスベクター中の相同配列と重複する重要な配列を保持し、これが望ましくない相同組換え現象及びＲＣＡの生成の可能性の余地を残す（１０７、１０８）。
【０１２３】
３．１  細胞系生成のためのプラスミドの構築
アデノウイルスベクターとの組換えの可能性を排除するため、補完に必要とされるＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列のみを有し、且つＥ１不全アデノウイルス中の領域と重複するいかなる相同配列をも含まない新規Ａｄ５ヘルパー細胞系が開発されている。Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする配列を含む、ＡｆＩ  ＩＩＩ（４６２ｂｐ）部位とＡｆＩ  ＩＩ（３５３７ｂｐ）部位との間の３．１ｋｂ  ＤＮＡ断片を、以下のように、スーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（インビトロゲン）に２つの断片として連続的にクローン化した：まず、８８１ｂｐのＡｆｌＩＩＩ乃至ＸｂａＩ断片（Ａｄ５  ｂｐ４６２−１３４３）をｐｂＲＸａｄ５ＫｐｎＩＣｌ（ｐＪＭ１７のサブクローン）からｐＳＬ３０１（ＡｆｌＩＩＩ／ＸｂａＩ）にクローン化した。次に、近接する２１９４ｂｐのＸｂａＩ乃至ＡｆｌＩＩ（Ａｄ５  ｂｐ１１３４３−３５３７）をｐＢＲＸａｄ５ＸｈｏＩＣｌから同じベクターにクローン化した。得られた３０７５ｂｐのＥ１断片（ｐＳＬ３０１中）は、Ｅ１ＡのＴＡＴＡボックス及びＲＮＡキャップ部位、Ｅ１Ａコーディング配列、完全なＥ１Ｂプロモーター、並びにＥ１Ｂコーディング配列を含み、これにはＥ１Ｂｐ５５タンパク質の停止コドンが含まれるが領域ＩＸは含まれない。この３０７５ｂｐのＡｆｌＩＩＩ−ＡｆｌＩＩ  Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ断片（Ａｄ５  ｂｐ４６２−３５３７）を単離し、クレノウ酵素で平滑末端化して、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御の下で哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３（インビトロゲン）のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端ライゲートした。このプロセスによりＡｄ５Ｅ１発現ベクターＣＭＶ−Ｅ１が生じた（図２１）。
【０１２４】
３．２  新規細胞系の生成及び特徴付け
このＣＭＶ−Ｅ１発現ベクター（Ｇ４１８耐性遺伝子、ｎｅｏを含む）をリポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）を用いてＡ５４９ヒト肺癌細胞に形質移入し、Ｇ４１８Ｒコロニーを単離した。単細胞クローンを機能的なＥ１Ａ／Ｅ１Ｂの発現についてスクリーニングした；緑色蛍光タンパク質（ＦＧＰ）発現カセットをＣＭＶ／β−アクチン（ＣＡ）プロモーターＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰの存在下に含むＥ１欠失アデノウイルスをＡ５４９−Ｅ１クローンの感染に用いた。感染の３日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）の目視検査によりＥ１補完Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰアデノウイルスの生成についてクローンをスクリーニングした。クローンの１つ、Ａ５４９Ｅ１−６８が３日間で（２９３細胞について観察されるものに類似する）１００％のＣＰＥを示した。このクローンは高い感染性も示し、実質的に１００％の細胞が感染後２４時間で緑色の蛍光を発した（図２２）。
【０１２５】
この細胞系に誘発されたＣＰＥの迅速な生成に加えてこの高い感染率は、Ｅ１欠失Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰウイルスの複製及び増幅を促進することが可能な機能的Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質が生じていることの強力な証拠である。Ｅ１配列特異的プローブを用いるサザンブロット分析により、Ａ５４９Ｅ１−６８、Ａ５４９Ｅ１−６８のサブクローン（Ｅ１−６８．３）、及び２９３細胞におけるＣＭＶ−Ｅ１導入遺伝子の存在が示されたが、親のＡ５４９細胞系には示されなかった（図２３）。これらのＥ１形質移入細胞の形態は親のＡ５４９細胞系とは大きく異なっていた。亜集密密度のＡ５４９細胞は細長い線維芽細胞様の形態を有する別々の単細胞として成長し、これに対してＥ１細胞系、Ａ５４９Ｅ１−６８はより立方体状の形態を有する細胞のコロニーとして成長する（図２４）。
【０１２６】
Ｅ１欠失アデノウイルス（Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰ）の生成についてプラーク検定によりＡ５４９Ｅ１−６８を２９３細胞と比較し、等しい力価の補完ウイルス（Ａ５４９Ｅ１−６８についての７Ｘ１０９ＰＦＵ対２９３についての９Ｘ１０９ＰＦＵ）を生成することが見出された。免疫沈殿及びＥ１Ａ特異的抗体（Ｍ７３、オンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いるウェスタンブロットにより４６ｋｄ及び４２ｋｄの見かけの分子量を有する２つのＥ１Ａ特異的バンドが明らかとなり、これらはＥ１Ａ  １３Ｓ及び１２Ｓ  ｍＲＮＡから予想される産生物（６）に相当し、且つ２９３細胞中に観察されるものと同じサイズであった（図２５Ａ）。Ａ５４９Ｅ１−６８は、Ｅ１Ｂｐ５５に特異的なモノクローナルＡｂを用いて約５５ｋｄのバンドを生成した。この５５ｋｄのＥ１Ｂ特異的バンドはもちろん、二次バックグランドバンドも、同様に２９３細胞において観察された（図２５Ｂ）。実験及び対照レーンの両者に見出される余分な“バックグラウンド”バンドは他の著者によって観察されており、サイクリン、ｐ５３、及びＲｂを含む様々なタンパク質の同時免疫沈殿によるものと考えられている。Ａ５４９Ｅ１−６８及び２９３細胞とは異なり、親のＡ５４９細胞系は４６ｋｄ、４２ｋｄ、又は５５ｋｄ  Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質の発現を示さなかった。Ａ５４９Ｅ１−６８がＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現するだけではなくそれらが機能的であることは、この細胞系が高力価のＥ１欠失組換えアデノウイルスの生成を補完することが可能であることから明らかである。この新規Ａｄ５ヘルパー細胞系がＲＣＡを生成することなく補完可能であることを立証するため、Ａ５４９Ｅ１−６８細胞でＥ１欠失アデノウイルスを連続的に継代し、継代の間に増幅したウイルスを、Ｅ１を含む複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）については親Ａ５４９細胞を用いて、ＣＰＥによってはもちろん、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いることにより試験した。この細胞系は、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの増殖及びスケールアップの間に、製造ロットがＲＣＡを含まないことを保証するために用いられる。
【０１２７】
＜実施例４＞ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含む発現カセット
本発明のＡｄミニベクターの関心のある遺伝子に対する大きな収容力は、従来のＡｄベクターのサイズ容量を大きく上回る大プロモーター及びタンパク質コーディング領域の組み込みを許容する。本発明の目的上、このＦＶＩＩＩミニＡｄベクターはＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓に送達することが好ましい。したがって、肝臓において作用する非常に活性の高いプロモーターを用いることが重要である。このようなプロモーターの１つはヒトアルブミン遺伝子プロモーターである（３２）。ヒトアルブミンプロモーターの１２．５ｋｂ領域はカルガリー大学のＴａｍａｏｋｉ博士から入手した。この１２．５ｋｂプロモーター内の３つの領域がプロモーターの活性に大きく影響することが決定されている（３２）：１）ＴＡＴＡボックスを含む近位領域（５５０ｂｐ）；２）−１．７ｋｂのエンハンサー領域；及び３）−６．０ｋｂの第２エンハンサー領域（図２６）。合わせると、これらの領域は１２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター全体の強度に近づく。ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴの１０．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＡｖａＩ断片（図２）をＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ近位ヒトアルブミンプロモーター断片と共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に同時ライゲートして組換えプラスミドＧＴ４０３１を生成した（図２７）。５’側接ＳＶ４０最初期イントロン及び３’側接ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有する７．２ｋｂ完全長ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡをプラスミドＧＴ２０５１からＸｈｏＩ／ＳａｌＩ消化により切り出し、ＧＴ４０３１のＳａｌＩ部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０５３を生成した（図２８）。次に、最小ＩＴＲ領域及びＡｄパッケージ化シグナルを含むＧＴ２０３３から誘導されるＸｈｏＩ断片をＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位に正方向又は逆方向のいずれかにクローン化し、それぞれ、アルブミン／ｈＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１を生成した（図２９）。このＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１ミニウイルスプラスミドの制限酵素消化パターンが図３０及び３１に示されている。
【０１２８】
ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡはプロモーターもしくは転写制御要素に作動可能に連結させることが可能であり、この要素は合成であっても、制御可能もしくは調節可能であっても、あるいは組織／細胞型に特異的であってもよい。好ましくは、産生もしくはヘルパー細胞におけるＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡの発現はウイルス生成の間抑制され、標的細胞に送達された後に活性化する。このようにして、このミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝子の弁別的発現が活性化される。このような弁別された発現は、α１−抗トリプシン（α１−ＡＴ）プロモーターに作動可能に連結する肝臓特異的エンハンサーを有するもの又はテトラサイクリンオペロン（ｔｅｔＯ）がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｔｅｔＯ−ＣＭＶ）に作動可能に連結するもの（この場合、ｔｅｔ−ＫＲＡＢ転写リプレッサータンパク質を発現する細胞系が用いられる）のような合成プロモーターの転写制御の下にＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを有するＤＮＡ分子を構築することにより達成される。
【０１２９】
＜実施例５＞ＦＶＩＩＩ発現カセットの相同組換えアーム
外来性遺伝子を標的細胞のゲノムに挿入して安定な遺伝子発現を得るのに相同組換えを用いることができる。この技術を用いて、ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡの標的を標的細胞のゲノムＤＮＡに設定することができる。ヒトアルブミン遺伝子又はヒトα−胎児タンパク質から誘導される細胞ＤＮＡの大セグメントを用いた（３２、３３）。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクター中の１２．５ｋｂアルブミンプロモーターは、６ｋｂを上回る幾つかの下流断片が潜在的な３’組換えアームとして調製されたのに対して、上流相同組換えアームとして作用する。本発明において用いられるアルブミン遺伝子、遺伝子間領域及びα−胎児タンパク質遺伝子領域の形状が図３１に示されている。５’末端にこの１２．５ｋｂアルブミンプロモーターを含み、且つ３’同族組換えアームとしての役割を果たす幾つかの領域を含むプラスミドＧＴ２０６１内の発現カセットの構造が図３２に示されている。これらのベクターは、これらのアームの方向が正常ヒトゲノムにおける配列と同じ方向であるため、相同組換え置換ベクターとしての役割を果たす。ヒトアルブミン遺伝子から誘導される３’ＸｈｏＩ組換えアーム及びＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位にクローン化されたｐＡｌｂ−Ｅ５セグメントを含む構築体（ＧＴ２０６３）が図３３に示されている。３’アルブミン相同組換えアームに隣接するヒトアルブミンプロモーター誘導ｈＦＶＩＩＩを構築するのに適するベクターの制限酵素消化が図３４に示されている。プラスミドｐＥ５のＸｈｏＩアルブミン遺伝子断片をＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位に挿入することによりプラスミドＧＴ２０６３を構築した。
【０１３０】
＜実施例６＞ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの生成
１２．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヒトアルブミンプロモーター断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＣＡ）に挿入した。これにより、ヒトアルブミンプロモーターベクターＧＴ４０３１は、ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ（５’末端にＳＶ４０早期イントロンを、及び３’末端にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む、ＧＴ２０５１のＸｈｏＩ乃至ＳａｌＩの領域）が挿入されている独自ＳａｌＩ部位を含む。得られたプラスミドＧＴ２０５３は、ポリアデニル化部位の３’、に位置する独自ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を含む（図２９）。Ａｄ最小ＩＴＲ及び野生型パッケージ化シグナルをプラスミドＧＴ２０３３からＸｈｏＩ消化により切り出し、プラスミドＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０６１を生成した。アルブミン遺伝子の６．８ｋｂアームｐＡｌｂ−Ｅ５から単離し、ＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０６３を生成した。ＧＴ２０６３をヘルパーウイルスＤＮＡと共に２９３細胞に形質移入し、ＧＴＶ２０６３と呼ばれるミニＡｄ  ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成した。
【０１３１】
ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成するため、ヘルパーウイルスゲノム（２μｇ）をウイルス粒子から精製し、ヘルパーＡｄゲノム（０．２μｇ）と共にリン酸カルシウム介在形質移入（８１）により２９３細胞に同時形質移入した。ＣＰＥが出現した後、細胞非含有凍結解凍溶解物を調製し、新鮮な２９３細胞の感染に用いた。その細胞上清中に、コーテスト色素生成検定（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて、ＦＶＩＩＩＧＴ２０６３ミニＡｄの存在を示すヒトＦＶＩＩＩが検出された。これらのデータはヘルパー／ＧＴ２０６３ミニＡｄベクター混合物の増殖と一致した。
【０１３２】
さらに別のアプローチ（図３５）においては、Ａｄパッケージ化シグナル及びＥ１領域を欠いているがＡｄタンパク質の残部をコードするアデノウイルスヘルパープラスミドｐＢＨＧ１０をミニＡｄクローンＧＴ２０６３と共に２９３細胞に同時形質移入した。このＡｄミニウイルスゲノムの救済は、２９３細胞の感染の後、弱力化パッケージ化機能を有するＥ１置換ヘルパーウイルスを用いて達成した。本発明の方法論を用いて、ヘルパーＡｄ／ミニＡｄ比は変化し得るが、これらのＡｄヘルパー及びミニＡｄゲノムの両者をパッケージ化することが可能であり、いずれかのゲノムを坦持するアデノウイルス粒子を生成することが可能である。
【０１３３】
ＦＶＩＩＩミニＡｄの生成及び検出がそれぞれ図３５及び３６に示されている。ヘルパープラスミドｐＢＨＧ１０（０μｇ）及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含むミニＡｄベクター（ＧＴ２０６３；２μｇ）を、リン酸カルシウム形質移入（８１）により２９３細胞に同時形質移入した。２９３細胞への形質移入は、公知の広く利用可能な技術のいずれか、例えば、リポフェクチン（すなわち、ギブコ／ＢＲＬ製のリポフェクタミン）又は電気穿孔法（すなわち、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能な試薬及びエレクロトポレーター）を用いて行うことができる。形質移入２９３細胞への弱力化ヘルパーウイルスの感染は形質移入の３日後に行った（図３５Ｂ）。アデノウイルスの感染が十分に進行していることを示す図３５Ｂの細胞変性効果（ＣＰＥ）は感染の４日後に観察された。その後、ウイルス貯蔵物（継代０、すなわちＰ０）を、感染細胞ペレットを複数回凍結−解凍することにより調製した。次に、２９３細胞をＰ０貯蔵物に感染させ（１：１）、感染の２４時間後に集めた上清はｈＦＶＩＩＩ配列の存在に特異的なＰＣＲで陽性であった。６日後にＣＰＥが検出され、凍結−解凍溶解物（Ｐ２）を調製した。次いで、このＰ２溶解物をＰＣＲによりパッケージ化ＧＴ２０６３ミニＡｄの存在及び機能的ｈＦＶＩＩＩについて試験した。２９３細胞におけるｈＦＶＩＩＩの発現は、ヒトアルブミンプロモーターがこれらの細胞においては活性が低いため、最小であるものと予想された。これは、リン酸カルシウム沈殿形質移入法を用いて２９３細胞にＧＴ２０６１を形質移入した後、ＣＡＴ検定（６９）及びＦＶＩＩＩ色素産生検定（ヘレナ・ラボラトリーズ（Ｈｅｌｅｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ファルマシア）の両者を用いて測定されている。
【０１３４】
＜実施例７＞ミニＡｄＦＶＩＩＩの増幅及び生成
出願人は、以前、１９９６年５月３１日に米国特許出願番号０８／６５８，９６１号を出願し、その出願の中でミニＡｄＦＶＩＩＩベクターＧＴ２０６３を生成し、且つ増殖物の初期継代を実施するための試薬及び方法論を提供した（７９、８０）。これらの増殖段階において、出願人は、ヘルパーウイルスＡｄＨβに対するミニＡｄＦＶＩＩＩの比が増殖の進行に従って増加することを見出した。本願は、いずれも当業者に公知の通常の技術であるＰＣＲ及びサザンブロットを用いる、ヘルパーに対するベクターの比の分析を提供する。全ての継代について、５００μｌの（感染細胞の３回の凍結／解凍サイクルにより得られた）ウイルス粗製抽出物を６ウェルプレートのウェルにおける２９３細胞の新たな亜集密単層の感染に用いた。感染の１時間後、１．５ｍｌの新鮮な培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）を添加した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したら直ちに細胞を回収し、再度ウイルスを抽出した。各々の継代において、２ｍｌのうちの０．５ｍｌが用いられ、そのためこの増殖の増幅スケールは１対４である。全ての継代の清澄化した粗製溶解物を用いて、ＳＤＳ／ＥＤＴＡ／プロテイナーゼＫ消化及びエタノール沈殿によりウイルスＤＮＡを精製した。このウイルスＤＮＡをＰＣＲ及びサザンブロットに用いてミニＡｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄウイルスＤＮＡを検出した。
【０１３５】
ＰＣＲはヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いて行い、増幅は、ＤＮＡ抽出の前にＤＮＡ分解酵素処理を行ってあらゆる残留非ウイルス汚染プラスミドＤＮＡを除去したウイルスに対して行った。ＰＣＲは、テンプレートとしての単離ウイルスＤＮＡ（単離されたウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μＭのＦＶＩＩＩプライマー＃１（配列番号１；ＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡとして記載）、最終濃度１μＭのＦＶＩＩＩプライマー＃２（配列番号２；ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴとして記載）、及び以下の条件を用いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の重合、９４℃で１分間の変性を合計３５サイクル。これらの結果は、ＦＶＩＩＩミニウイルスが早期継代中に存在することを示した（継代３；データは示さず）。
【０１３６】
図３６は、ＦＶＩＩＩミニＡｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅の結果を示す。ＰＣＲをパッケージ化シグナル領域に対しても行った。ＰＣＲは、テンプレートとしての単離ウイルスＤＮＡ（単離された全ウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μＭのパッケージ化シグナルプライマー＃１（配列番号３；ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ）、最終濃度１μＭのパッケージ化シグナルプライマー＃２（配列番号４；ＣＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧ）及び以下の条件を用いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の重合、９４℃で１分間の変性を合成３５サイクル。ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルが部分的に欠失しているため、パッケージ化シグナル欠失ヘルパーからのＰＣＲ産生物は野生型パッケージ化シグナルを有するミニＡｄのもの（約３１０ｂｐ）より短い（１７７ｂｐ）。初期継代においてはＦＶＩＩＩミニＡｄは検出されないが、その存在は継代３乃至６において徐々に検出された。同じ結果がサザンブロット分析を用いて得られた（図３７）。サザンブロット分析におけるプローブとして、ＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄの両者に存在する右ＩＴＲに隣接するＡｄ  ＤＮＡ断片を用いた。ミニＡｄ  ＧＴ２０６３及びＡｄＨβのＰｓｔＩ消化の後に検出される断片の予想される長さは、それぞれ、３．３及び２．２Ｋである。図３７は、継代１乃至２１から独立に単離されたＦＶＩＩＩミニＡｄ  ＤＮＡの４つのサザンブロット（Ａ−Ｄ）を編集したものである。ミニＡｄＦＶＩＩＩに相当する３．３Ｋｂバンドが継代５−２１から単離されたＤＮＡに検出された。ＦＶＩＩＩミニＡｄ  ＤＮＡの安定な増加が継代１０まで検出され、その後継代１２までＦＶＩＩＩミニＡｄが漸進的に減少した。このＦＶＩＩＩミニＡｄ  ＤＮＡの水準の増加及び減少のサイクルは４つの継代ほぼ全てに生じることが観察され、これには僅かに早く開始するヘルパーＡｄ  ＤＮＡの水準の平行なサイクルが付随した。これらのサイクルをより十分に決定するため、サザンブロットからＦＶＩＩＩミニＡｄ  ＤＮＡ及びヘルパーＡｄ  ＤＮＡの量を濃度測定により定量し、図３８にプロットした。等量のマーカー（ギブコ、ゲーサーズバーグ、ＭＤからの１Ｋｂラダーマーカー）からのバンドの強度を用いて、異なるブロットの結果を標準化した。観察されたサイクルは、欠陥妨害性ウイルスに関連して生成するウイルス集団（本発明の系においては、このウイルス集団はＦＶＩＩＩミニＡｄを含む）及びヘルパーウイルスの公知の動態と一致する。これらのサイクルの理解及び制御は、最適力価を得るためにどの継代でミニＡｄベクターを精製するべきであるのかを決定するのに重要である。＃１８（Ｐ１８）のような継代は、低力価ではあるが、ＦＶＩＩＩミニＡｄに富むベクター調製品を生じる（すなわち、Ｐ１８はヘルパーＡｄより１０倍多いＦＶＩＩＩミニＡｄを含むものと考えられる）。＃２０（ｐ２０）のような継代は、１：１の望ましくないＦＶＩＩＩミニＡｄ対ヘルパーＡｄ比ではあるが、高濃度のＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄを含む。
【０１３７】
大規模増幅をｐ２０で行った。各々約１０９個の感染２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）を収容する１００の１５ｃｍ皿をＣＰＥが完了したら直ちに回収した。その後、粗製溶解物を３回の凍結／解凍サイクルによって調製してウイルスを抽出した。この粗製溶解物を遠心によって清澄化し、ＣｓＣｌの段階濃度勾配（１．５、１．３５、及び１．２５ｇ／ｍｌの３層）にのせて３５０００Ｘｇで１時間遠心した。ミニＡｄ及びヘルパーＡｄに相当するバンドを、１．３５ｇ／ｍｌの第２連続ＣｓＣｌ勾配を用いてさらに精製した。３５，０００ｒｐｍ（１５０，０００Ｘｇ）で１６時間遠心した後に類似の強度を有する２つのバンドが観察され、それらを別々に単離して１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に透析した。各々のバンドの一定分量からウイルスＤＮＡを精製し、ミニＡｄＦＶＩＩＩ及びヘルパーの量をサザンブロットにより分析した。上部バンド（より軽量）は主としてミニＡｄを含み、下部バンドは主としてヘルパーＡｄを含むものと思われた。これらの結果はＦＶＩＩＩミニＡｄゲノム（ＧＴ２０６３＝３１Ｋｂ）がヘルパーＡｄゲノム（ＡｄＨβ＝３７．１Ｋｂ）より小さいことから予想されたことであり、本願の親出願（１９９６年５月３１日出願の米国０８／６５９，９６１号）において示されるＭ３２ミニＡｄについての以前のＣｓＣｌ分画結果と一致する。
【０１３８】
＜実施例８＞細胞系におけるミニＡｄＦＶＩＩＩの試験
ＦＶＩＩＩミニＡｄ（ＧＴ２０６３）を上述の通りＣｓＣｌにより精製し、このベクターで感染した宿主細胞におけるＦＶＩＩＩの生成を示すのに用いた。この目的を達成するため、２９３及びＨｅｐＧ２細胞を、アルブミンプロモーターを用いるそれらの能力のために用いた。これらの細胞におけるＦＶＩＩＩの生成は感染の２４時間後に免疫組織化学及び機能的検定により検定した。精製ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターを０．５ｍｌの培地に添加し、４ｃｍ２ウェルにおける６Ｘ１０５個の２９３及びＨｅｐＧ２細胞の感染に用いた。４時間インキュベートしてウイルス粒子を宿主細胞に吸着させた後、その感染培地を新鮮な培地に置き換えた。ＦＶＩＩＩミニＡｄを含むより軽量の画分の１／１００希釈液０．１μｌで２９３細胞を感染させ、これらの細胞をヒトＦＶＩＩＩの存在について免疫組織科学的分析を行った後、これらの細胞の約１０％がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（図４０、パネルＡ−Ｄ）。ミリリットル当たりの形質導入単位での見積もり力価は６Ｘ１０９形質導入単位／ｍｌと決定された。４時間の吸着時間、４ｃｍ２に０．５ｍｌの吸着容積、及び非振盪吸着を考慮に入れた場合、見積もり力価はそれぞれ０．４２、０．５６、及び０．５３の因子だけ減少し得る（４９）。したがって、ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターの実際の力価は、４．６Ｘ１０１０形質導入因子／ｍｌと見積もられる。ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を反映する２６０ｎｍでの光学吸収によって決定される力価は、ＦＶＩＩＩミニＡｄの軽量画分について３．６Ｘ１０１２粒子／ｍｌと決定された。したがって、ＦＶＩＩＩミニＡｄの生物活性は７８ウイルス粒子毎に１ＦＶＩＩＩ形質導入単位と算出することができ、これは食品医薬品局が推奨する許容度の水準内に入る。
【０１３９】
形質導入細胞の上清中の機能的ＦＶＩＩＩの量を色素産生コースターＦＶＩＩＩ試験（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて測定した。１００万個の２９３細胞又は、独立に、ＨｅｐＧ２細胞に、１００％の形質導入を達成するため、過剰量の精製ベクターを感染させた。感染条件は上述の通りであり、感染の２４時間後に上清（２ｍｌ）を集めた。標準曲線を作成するため、標準ヒト血漿試料を細胞培養培地で連続的に希釈して６２．５乃至４０００ｎｇ／ｍｌの最終ＦＶＩＩＩ濃度範囲を得た。これらの結果が図４１に示される。ＨｅｐＧ２及び２９３上清中に検出されたＦＶＩＩＩの量は、それぞれ、０．８及び０．２３ｎｇ／ｍｌであった。したがって、２４時間で生成したＦＶＩＩＩの総量は１００万個のＨｅｐＧ２細胞当たり１．６ｎｇ、１００万個の２９３細胞当たり０．４６ｎｇであった。
【０１４０】
＜実施例９＞イン・ビボでのミニＡｄＦＶＩＩＩの改善
様々な発現カセットをクローン化することができるベクターを生成することによりベクター系の改善を達成した。近位アルブミンプロモーター領域並びにＰｍｅＩ及びＳａｌＩ部位の間に位置するヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を切除することによりベクターＧＴ２０６３を改変した。これは、まず、ＳａｌＩリンカーをＰｍｅ部位にライゲートすることによってＧＴ２０６３のＰｍｅＩ部位をＳａｌＩ部位に変換することにより達成した。得られたクローンＧＴ２０７２をＳａｌＩで処理し、再ライゲートして近位アルブミンプロモーター／ｈＦＶＩＩＩ遺伝子を除去し、それにより様々な発現カセットを挿入するための独自ＳａｌＩクローニング部位を有するミニＡｄベクターを作製した。このようなカセットからの発現は上流に位置するアルブミン遺伝子エンハンサーの影響を受ける可能性がある。各々のクローンを分析して導入遺伝子の発現の水準を決定した。
【０１４１】
この改善されたベクターＧＴ２０７２に挿入するため、発現カセットを調製した。この例の発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、伸長因子Ｉ（ＥＦ−Ｉ）プロモーター（これは様々な細胞型で作用することが知られている）又はピルビン酸ホスホエノールカルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子の肝臓特異的プロモーターを含む。ＥＦ−Ｉ及びＣＭＶプロモーターは、各々別々に、完全長ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ又はＢドメイン欠失（ＢＤＤ）第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのいずれかの発現を駆動するのに用いた（それぞれ、図４２及び４３）。次に、ＳａｌＩ部位が隣接するＥＦ−１  ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩカセットをＧＴ２０７３のＳａｌＩ部位にクローン化し、図４２に示されるプラスミドを生成した。完全長ヒトＦＶＩＩＩコーディング領域をＣＭＶプロモーターの制御の下に含む発現ベクターも構築し、これは図４３に示される。
【０１４２】
＜実施例１０＞組み込み可能なＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐ系ベースのベクターの構築
アデノ関連ウイルスは、アデノウイルス又はヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスの存在下においてのみ複製する、ヒト非病原性一本鎖直鎖パルボウイルスである。しかしながら、ヘルパーが存在しない状況では、ＡＡＶは宿主細胞ゲノムに特異的に組み込まれ、潜在的なプロウイルスとして維持される（３４）。ＡＡＶが組み込まれる特定の遺伝子座は染色体１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒに位置しており、ＡＡＶＳ１と呼ばれる（２２−２５、３５）。
【０１４３】
ＡＡＶ組み込みの機構は完全には解明されていない。しかしながら、２つのウイルス要素がこのプロセスに関連付けられている：ＡＡＶ  ＩＴＲ及び２つの形態のＲｅｐウイルスタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）。ＡＡＶ  ＩＴＲ（逆末端反復）はＡＡＶゲノムの両端に存在する回文構造配列であり、これはヘアピン構造に折り畳まれ、複製起点として作用する。Ｒｅｐ７８／６８タンパク質については、配列特異的ＤＮＡ結合（３６、３７）、配列及び鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性（３８）、及びＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性（３８−４０）を含む幾つかの活性が記述されている。これらのタンパク質はＩＴＲ  ＤＮＡの特定の配列に結合することが可能であり、それによってＩＴＲヘアピンに切れ目が入って複製が行われる末端分解と呼ばれるプロセスを促進する。Ｒｅｐ結合モチーフ及び末端分解部位（ｔｒｓ）はＡＡＶ  ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１の両者において同定されており、Ｒｅｐの存在下においてイン・ビトロＤＮＡ複製を促進することが示されている（２８）。また、Ｒｅｐ６８タンパク質がイン・ビトロでのＡＡＶ  ＩＴＲとＡＡＶＳ１部位との複合体形成に介在し得ることも示されている（４１）。これらの発見は、ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１部位でのＲｅｐのＤＮＡ結合及びエンドヌクレアーゼ活性が、制限されたＤＮＡシンターゼと共に、ＩＴＲの間に含まれる配列の標的設定された組み込みを可能にすることを示唆する（２７）。
【０１４４】
ＡＡＶは遺伝子治療の候補ベクターとして考えられている。しかしながら、それが受け入れることができる外来性ＤＮＡのサイズの制限（４．２Ｋｂ）、大規模調製において高力価を得ることの困難性、及び組換えＡＡＶの特異的組み込みの喪失がこのウイルスを遺伝子治療ベクターとして用いる上での問題を引き起こす。
【０１４５】
１０．１  ＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系を試験するためのプラスミドの構築
ミニＡｄベクターへのＡＡＶ組み込み機構の取り込みに向けて（図４４）、出願人は組み込みに必要なアデノ関連ウイルス要素を含むプラスミドベクターを開発して試験している。本発明の設計（図４５）において、このベクターは（ウイルス内在性プロモーターを含む）Ｒｅｐ発現カセットに加えて２つのＡＡＶ  ＩＴＲが隣接するレポーター遺伝子の発現のためのカセットからなる。このＲｅｐ発現カセットは、プラスミドｐＳＵＢ２０１（４１）に由来するＡＡＶゲノムの配列１９３乃至２２１６のＰＣＲ増幅の後に得られた。この断片はＩＴＲの後の右側から始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅｐ７８コーディング領域を通して延びる。
【０１４６】
１０．２  培養細胞におけるＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験
一時的に形質移入した２９３細胞及びＥ１非発現細胞系（チャン肝細胞）におけるこのプラスミドからのＲｅｐの発現を、免疫沈殿に加えて、特異的抗体を用いるウェスタンブロットにより試験した。それらの結果（図４６）は、２種類の異なる形態のＲｅｐが２９３及びチャン肝細胞に生成されることを示す。Ｒｅｐ７８は二重の白色として現れ、Ｒｅｐ５２、ｐ１９プロモーターの産生物は単一のバンドとして現れる。チャン肝細胞においては、信号は２９３細胞のほうがより強いものの、２種類の主要な形態、同様に二重線としてのＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２、が検出される。
【０１４７】
これらのプラスミドの特異的組み込み能力を試験するため、Ｒｅｐ発現カセットを除去し、しかしながらレポーター遺伝子発現カセットは２つのＡＡＶ  ＩＴＲの間に配置したままにすることにより対照プラスミドを構築した。２９３細胞にプラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した後、Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）で１２日間選択した。Ｇ４１８耐性コロニーを単離して増殖させ、ゲノムＤＮＡを異なるコロニーから塩沈殿法（１２５）により抽出した。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＡＡＶＳ１に対するプローブを用いるサザンブロットにより分析した。ＥｃｏＲＩは、ＡＡＶＳ１遺伝子座が８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片内に含まれることから選択した。図４７（パネルＡ）は、正常な配列に相当する８ｋｂのバンドに加えてシフトしたバンドの存在により示されるように、プラスミドＧＴ９００３（Ｒｅｐ発現プラスミド）から誘導した分析済の耐性コロニーの５０％が少なくとも１つのＡＡＶＳ１遺伝子座の再配置を見せたことを示す。プラスミドＧＴ９００４から誘導されるコロニーにおいては再配置は観察されず、これは、この現象がＲｅｐの発現に依存することを示す。これらの結果は、Ｒｅｐが導入遺伝子の特異的組み込みを駆動し得ることを示唆していた。次に、これらのメンブランをｎｅｏに対する特異的プローブと再度ハイブリダイズさせた（図４８、パネルＢ）。得られたバンドのパターンは、幾つかのＡＡＶＳ１の再配置がｎｅｏに相当する（例えば、クローン２Ｌ２）ことを示したが、おそらくは適用した選択圧のために分析したクローンにおいて無作為組換え現象が頻繁に生じることをも示唆していた。
【０１４８】
１０．３  選択圧のないＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験
この可能性を除外するため、プラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を用いて別の一組の実験を行った。これらのプラスミドにおいては、レポーター遺伝子はＧＦＰ（エクオレア・ビクトリア緑色蛍光タンパク質）である。このレポーターは細胞を、フローサイトメトリーによる仕分け及び単細胞クローン化を含むがこれに限定されるものではない方法を用いる単離に適するものとし、それによりｎｅｏ発現カセットによって付与される選択圧の効果を排除する。２９３細胞にいずれかのプラスミドを形質移入した。形質移入の１日後、所定の蛍光範囲に入る（それにより形質移入性の相違による可変性を除去する）細胞をフローサイトメトリーにより仕分け、単細胞を９６ウェルプレートにおいてクローン化した。仕分けの２乃至３週間後、コロニーを蛍光について採点した。３回の独立の実験を行い、それらの結果が表２−1に示されている。クローン化効率（播種ウェルの総数当たりの発生したコロニーの数）はＧＴ９０１３誘導細胞について幾らかの可変性を示したが、プラスミドＧＴ９０１２を形質移入したものについては一般に一定であった。プラスミドＧＴ９０１２から誘導されるコロニーは約５０％が蛍光を発し、且つ引き続く継代においてそれらの蛍光を維持し、それに対してプラスミドＧＴ９０１３から誘導されるものは８％が幾らかの蛍光を示した。蛍光強度は微かであり、観察は宿主細胞ゲノムへの１もしくは数コピーのＧＦＰ発現カセットの組み込みと一致する。興味深いことに、幾つかのコロニーはＧＦＰ発現のモザイク現象を示した。これの説明の１つは、仕分けされた細胞が分裂を始めた後に組み込み現象が生じ、これが２種類の異なる集団を発生させたとするものであり得る。平行する実験においては、ＧＦＰ発現カセットを単独で含むプラスミドｐＣＡ−ＧＦＰ（ウイルス配列を含まない）を細胞に形質移入した。仕分けに加えて単細胞クローン化の後、蛍光を発するコロニーは検出されなかった（表２−１）。考え合わせると、これらの結果は、組み込みの効率はＡＡＶ  ＩＴＲの存在によって高められるが、Ｒｅｐが発現する場合には４−５倍高いことを示す。ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの標的設定された組み込みをさらに分析するため、幾つかのコロニー（蛍光性及び非蛍光性）を成長させ、ゲノムＤＮＡを上述の通りに抽出した。図４８（パネルＡ）は、ＡＡＶＳ１に対するプローブを用いるサザンブロットによって得られた結果を示す。プラスミドＧＴ９０１２から誘導される幾つかのコロニーにおいてはＡＡＳＶ１の再配置が実際に検出され、これに対してＧＴ９０１３誘導コロニーにおいては再配置は検出されず、これは、Ｒｅｐの存在が標的設定された組み込みに必要であることを示す。次に、このメンブランをＧＦＰについて探索し、再配置されたバンドとの一致をチェックした（図４８、パネルＢ）。親細胞系２９３は予想通り陰性であった。５つのコロニーがＡＡＶＳ１で得られるものに一致する８Ｋｂ上回るバンドを示し、したがって、ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの特異的組み込みを示す。全体的に見て、上に示される結果は、ＡＡＶ  ＩＴＲ及びＲｅｐを含むプラスミドが宿主ゲノムＤＮＡに高頻度で組み込まれ得ることを示し、且つこの設計がアデノウイルスベク���ーによって送達される配列の組み込みに有用であることを示唆する（図４４）。
【０１４９】
表２−１．単細胞クローン化実験の結果
【表２】
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【０１５０】
＊播種したウェルの数当たりのコロニー数を示す。
【０１５１】
＊＊コロニーの数当たりの、仕分けの２週間後に蛍光性細胞を示すコロニーの数を示す。
【０１５２】
＜実施例１１＞ＦＶＩＩＩ発現カセットの部位特異的組み込み
Ｒｅｐ７８の発現と結び付けられるプラスミドへのＩＴＲ  ＤＮＡ配列の導入が関心のあるＤＮＡ配列の細胞ゲノムへの組み込みを増強することは、本願の親出願（１９９６年５月３１日に出願された米国０８／６５９，９６１号）において本出願人らによって以前に示されている（５６）。この以前の発明は、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接するレポーター遺伝子［すなわち、ｎｅｏ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子］を有する発現カセット（以下、組み込みカセットと称する）を上流Ｒｅｐ発現カセットと組み合わせて含む複数のプラスミドを包含する（図４４、パネルＡ−Ｄ）。実験の結果は、これらのプラスミド（すなわち、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）の組み込み効率がＲｅｐ活性を欠くプラスミド（すなわち、ＧＴ９００４及びＧＴ９０１３）よりも約１０倍高いことを示す。このデータは、さらに、Ｒｅｐが宿主細胞ゲノムへの外来性ＤＮＡの効率的な標的設定された組み込みに必須であることを示す。これらの結果を鑑みて、本発明は、Ａｄベクターの利点（高力価調製品、外来性ＤＮＡに対する大きな収容力、複数の細胞型の高水準の感染性）及びＡＡＶの組み込み能力を兼ね備えるハイブリッドベクターを提供する。本発明のこのハイブリッドウイルスはアデノウイルスとして複製し、組み込みに十分なＡＡＶ要素を含む。
【０１５３】
本発明は、Ｒｅｐ発現カセット及びＡＡＶ  ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩ発現カセットを有するミニＡｄベクターを含む（図４４）。さらなる外来性ＤＮＡ（３６ｋｂまで）をこのベクターに挿入することができる。このベクターのさらなる外来性ＤＮＡはヒトアルブミンゲノム配列（非コーディング）に相当する。Ｒｅｐ発現カセットはＡＡＶゲノムの１９３乃至２２１６ｂｐを含む。この断片はＩＴＲの直後で始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅｐ７８コーディング配列を通して延びる。以下に記載される理由により、７つのｔｅｔオペレーターを含む断片をｐ５プロモーターの上流に導入し、ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサー（４２）によるｒｅｐ遺伝子の転写抑制を可能とするために含めた。
【０１５４】
細胞内の高濃度のＲｅｐタンパク質が細胞成長抑制性であり、ことによるとミニＡｄベクターの複製を妨害する可能性がある。そこで、ウイルスベクターの生成の間Ｒｅｐの発現を阻止するため、ｔｅｔ−ＫＲＡＶリプレッサーを転写スイッチとして提供することができる。この目的を達成するため、本発明は、ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を安定に発現する２９３細胞系を提供する。ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現しない宿主細胞にウイルスが侵入すると、それらの細胞内にリプレッサーが存在しないためＲｅｐの発現が生じ、それによりＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する配列の細胞ゲノムへの組み込みが促進される。このようにして生成するウイルスベクターは、イン・ビトロ及びイン・ビボで、組み込みの頻度及び特異性について試験することができる。
【０１５５】
＜実施例１２＞ＡＡＶＳ１のクローン化及びベクターの構築
本発明の態様の１つは、イン・ビボ動物モデルとして用いられる、ヒトＡＡＶＳ１組み込み部位を有するトランスジェニックマウスを生成するための方法論である。この動物モデルは、上述のＡＡＶ組み込み機構を含むウイルスベクターの部位特異的組み込みの試験に用いられる。この動物モデルの開発を目指す第１の段階は、ＡＡＶＳ１部位のクローン化及びその配列の哺乳動物発現ベクターへの挿入である。
【０１５６】
ＡＡＶＳ１ヒト組み込み部位は、最初に、Ｋｏｔｉｎら（５０）によって８．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローン化され、その最初の４０６７ｂｐは配列決定されている。このＤＮＡ配列情報を用いて２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、続いてそれらを、ＡＡＶＳ１特異的プローブとして用いるための２５３ｂｐＰＣＲ産生物の生成に用いた。上方プライマーＵ２４９３（配列番号５：ＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ）はＡＡＶＳ１配列の塩基対２４９２−２５１５に延びる２３量体であり、下方プライマーＬ２７２２（配列番号６：ＴＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＧ）もＡＡＶＳ１配列の塩基対２７２２−２７５４に延びる２３量体である。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしての１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ並びに最終濃度１μＭのＵ２４９２及びＬ２７２２プライマー（それぞれ、配列番号５及び配列番号６）を用いて以下の通りに行った：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サイクル。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特異的ＰＣＲ産生物をゲノム・システム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）（セントルイス、ＭＯ）に送り、そこでヒトＰ１ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。８０−１２０ｋｂのサイズ範囲の４つのＰ１クローン（＃６５７６、６５７７、６５７８、６５７９）を正しい２５３ｂｐ  ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ断片を生じるものと同定した。これらのクローンがＡＡＶＳ１配列を含むことを確認するため、これら４つのＰ１クローンからＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ単独で、又はＥｃｏＲＩをＥｃｏＲＶと組み合わせて消化し、サザンブロット分析に用いた。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特異的ＰＣＲ産生物をプローブとして用いるブロットのハイブリダイゼーションにより、全てのクローンが予想される８．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片（図４９Ａ）及び予想される５．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片（図４９Ｂ）を含むことが明らかとなり、これは、これらがヒトＡＡＶＳ１配列の無傷の完全長コピーを含むことを示す。８．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン＃６５７６から単離し、哺乳動物発現ベクターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。得られた１２．９ｋｂのプラスミドｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏは、ヒトＡＡＶＳ１配列に加えて、哺乳動物細胞での選択のためのネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）有する（図５０）。
【０１５７】
＜実施例１３＞ＡＡＶＳ１（＋）ＥＳ細胞系の生成及び特徴付け
ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成において用いられるＡＡＳＶ１配列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞系を生成するため、ｐＡＡＶＳ１−ＮｅｏプラスミドをマウスＥＳ細胞（１２９Ｓｖアグーチ、ゲノム・システムズ）に形質移入した（図５１）。２５μｇのｐＡＡＶＳ１−ＮｅｏプラスミドＤＮＡをＸｂａＩで直線化し、バイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）を用いて電気穿孔法（９７５μＦｄ、２５２ｖ）によりＥＳ細胞に形質移入した。形質移入細胞を２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８において１週間選択した。２４のｎｅｏ−耐性（ＮｅｏＲ）コロニーが単離され、分化全能性表現型を維持する細胞系を富化させるため、それらを増殖させ、形態により特徴付けて＞９５％が“非微分化”であるクローンを得た。１７のＮｅｏＲ  ＥＳクローンに加えて非形質移入親ＥＳ細胞系からゲノムＤＮＡを単離し、そのＤＮＡ  １００ｎｇをテンプレートとして、プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それぞれ、配列番号５及び配列番号６；最終濃度１μＭ）を用いて、ＡＡＶＳ１特異的ＰＣＲに用いた。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サイクルであった。図５２に示されるように、１７／１７ＮｅｏＲ  ＥＳクローンに由来するＤＮＡのＰＣＲでは予想される２５３ｂｐのＡＡＶＳ１  ＰＣＲ産生物が生成し、一方、非形質移入対照ＥＳ細胞に由来するＤＮＡのＰＣＲ分析では検出可能なＰＣＲ産生物は生成しなかった。サザンブロット分析を対照及びＡＡＶＳ１（＋）ＥＳ細胞系に対して行い、機能的ＡＡＶＳ１配列が形質移入及びゲノム組み込みの後に保存されていることを確認した（図５３）。（ＰＣＲによる検定で）ＡＡＶＳ１陽性のＥＳ細胞系（ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６）をＥｃｏＲＩにＥｃｏＲＶを組み合わせて消化し、電気泳動してブロットし、８．２ｋｂ  ＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせた。ＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６細胞系の両者は予想される５．２ｋｂ及び３．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片を含み、これは８．２ｋｂ  ＡＡＶＳ１配列全体の組み込みを示す（図５３）。非形質移入親ＥＳ細胞は、このヒトＡＡＶＳ１特異的プローブを用いてハイブリダイズするバンドを示さなかった。ＡＡＶウイルスはヒトに加えてマウスゲノムに組み込まれるが、ＡＡＶＳ１のマウス相同体（これは未だ同定されていない）はヒトの配列とは大きく相違するはずでヒトＡＡＶＳ１プローブとは交差ハイブリダイズしないことが知られているため、対照マウスＥＳ細胞に幾らかのハイブリダイゼーションが検出されることが予想されていた。これらのＡＡＶＳ１（＋）細胞系ＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６の各々を、ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成を目指す次の胚盤胞微量注入実験に用いた。
【０１５８】
＜実施例１４＞ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成
未分化の分化全能性表現型を保存するため、ＡＡＶＳ１陽性ＥＳクローンＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６を白血病抑制因子（ＬＩＦ−抗分化因子）の存在下において１゜ネズミ胚性線維芽細胞支持層上で成長させ、非常に低い継代（Ｐ．２−Ｐ．７）で維持した。第３．５ｐ．ｃ．に胚盤胞段階の胚を過剰排卵Ｃ５７ＢＬ／６マウスから集め、Ｍ１６胚培地において維持した。１５−２０個のＥＳ細胞（ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４又はＥＳ＃３．１６）を３．５日の胚の胞胚腔にライツ（Ｌｉｅｔｚ）ＤＭ−ＩＬＢマイクロインジェクション・ワークステーション（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて微量注入した。微量注入に続いて、これらの胚をＭ１６培地に戻し、５％ＣＯ２中３７℃で２時間インキュベートして胚盤胞に再度腔を形成させた。続いて、１０−１５個の注入胚盤胞を、交尾後（ｐ．ｃ．）第２．５日の偽妊娠ＣＧ６Ｆ１仮母の子宮に移した。子宮に移入された後、それらの胚盤胞は子宮壁に植え付けられ、ＡＡＶＳ１陽性ＥＳ細胞が胚の内部細胞塊に取り込まれてそれらの遺伝情報を胚の発生に渡し、その結果約１７日後にトランスジェニック（キメラ）子孫が誕生する。現在までに４０を上回る高率で雄キメラ（始祖）が生成されている。ＥＳ細胞誘導アグーチ（茶色）毛皮色遺伝子の高率の寄与を示すこれらのキメラ始祖の幾つかの例が図５４に示されている。キメラマウスにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためにＰＣＲ分析を行った。ゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラ及び非キメラ同腹子の尾から単離し、これらのＤＮＡ  １００ｎｇを、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それぞれ、配列番号５及び配列番号６）を最終濃度１μＭで用いるＰＣＲ分析によりスクリーニングした。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サイクルであった。正しい２５３ｂｐ  ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ産生物が高率キメラに由来する尾ＤＮＡにおいては実際に検出された（図５７、レーン７）が、非キメラ同腹子の尾ＤＮＡ又は１０％未満のアグーチ毛皮色キメラ現象を示す低率キメラにおいては検出されなかった（図５５、それぞれレーン５及び６）。したがって、ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列をクローン化し、それをマウス胚性幹細胞に形質移入し、これらのＥＳ細胞を胚盤胞段階の胚に微量注入し、得られたトランスジェニックマウスのゲノム内にこのヒト導入遺伝子の存在を示すことに成功している。これらのキメラ始祖は、現在、ヒトＡＡＶＳ１導入遺伝子の生殖系列伝達を得るために野生型Ｃ５７ＢＬ／６の雌と共に飼育されている。ひとたび生殖系列伝達が達成されると、そのＦ１へテロ接合体子孫を飼育することでホモ接合ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス系が得られる。次に、このホモ接合系を用いてＡＡＶウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶウイルスベクター、又はＡＡＶＳ１部位での組み込みに必要とされるＡＡＶ  ＩＴＲ及びＲｅｐ７８／６８遺伝子を含む他のあらゆるプラスミドベクターのいずれかのＡＡＶＳ１部位特異的組み込みの試験に用いることができる。このＡＡＶ導入遺伝子は、ウイルスの感染（Ｉ．Ｖ．注入���後）により、又はリガンド介在ＤＮＡ／リポソーム複合体を用いることにより、イン・ビボでＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスに送達することができる。部位特異的組み込みの頻度、組み込まれた導入遺伝子の安定性及び安定なタンパク質発現の持続期間（すなわち、ヒト第ＶＩＩＩ因子又は第IX因子）は標的細胞への組み込みの後に評価することができる。
【０１５９】
ゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウスへのアデノ関連組み込み要素を含むウイルスベクターのイン・ビボ送達の効率は以下の方法で試験することができる。本発明のウイルスベクターをトランスジェニックマウスの静脈内又は門脈に注射する。このベクターは医薬組成物の一部であってもよく、且つリポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）のような脂質及び／又は肝臓特異的リガンド（７９、８０）と複合体を形成していてもいなくてもよい。マウスにウイルスベクターを投与した後、血液試料を１年まで、もしくはそれ以上、毎週尾の静脈から採取して導入遺伝子の発現の持続を評価する。ウイルスベクターのエフェクター又はレポーター遺伝子の発現水準は、ノーザンブロット、ＲＮＡ分解酵素保護検定、又はＰＣＲのような技術を用いて測定する。ＦＶＩＩＩミニＡｄの試験において、ＦＶＩＩＩはＥＬＩＳＡ検定により検出する。導入遺伝子の発現の持続を決定するため、各血液試料中のエフェクター又はレポーター遺伝子の発現水準を互いに比較する。また、ベクターの部位特異的組み込みを決定するため、その動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する。その後、ＡＡＶＳ１特異的プライマー及びこのベクターの配列と相同の配列を含むプライマーを用いるゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析を行う。このベクターの、トランスジェニック動物ゲノムのＡＡＶＳ１部位での部位特異的組み込みにより、ＡＡＶＳ１及びベクター配列の両者を含む産生物が生じる。増幅したＰＣＲ産生物は、ウイルスベクターがその動物のＡＡＶＳ１部位に組み込まれているのであれば、ベクター配列を含む。
【０１６０】
＜実施例１１＞
Ａ．ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス
ｎｅｏ又はＧＦＰレポーター遺伝子のいずれかを含むＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐベクター（それぞれ、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）をヒト２９３細胞に形質移入した。次に、これらの細胞の抽出物を、サザンブロットにより、内在性ＡＡＶＳ１部位でのこのベクターの部位特異的組み込みについて検定した。ＡＡＶＳ１での組み込みは、ＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐベクターのｎｅｏ又はＧＦＰバージョン（それぞれ、ＧＴ９００３又はＧＴ９０１２）のいずれかを形質移入した後に得られた試料において５０％の頻度で観察された。これらの結果は、これらのＡＡＶ  ＩＴＲ及びＲｅｐコーディング領域がＡＡＶＳ１での高効率の部位特異的組み込みを導くのに十分なものであることを示す（５６）。ＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐ組み込み要素を含むミニＡｄ−ｈＦＶＩＩＩベクターがイン・ビボでＡＡＶＳ１を標的とし、部位特異的な様式で組み込まれ、且つｈＦＶＩＩＩの長期間の発現を維持することを示すため、動物モデル系を開発した。
【０１６１】
本発明は、そのゲノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み部位を有するトランスジェニックマウスを包含する。このトランスジェニックマウスは、図５１に示される胚幹細胞操作技術（４３）を用いて生成される。８．２ｋｂヒトＡＡＶＳ１配列全体及びｎｅｏ（もしくはＮｅｏ）選択マーカーを含む発現ベクターを構築する。このＡＡＶＳ１／Ｎｅｏベクターを分化全能性マウス胚幹（ＥＳ）細胞に移入してＮｅｏＲ、ＡＡＶＳ１＋  ＥＳ細胞クローンを得、続いてこれをマウス胚盤胞段階の胚に微量注入して仮母の子宮に移植する。移植の後、このＡＡＶＳ１＋  ＥＳ細胞は正常な胚発生を再開し、それらのゲノム情報（ヒトＡＡＶＳ１配列を含む）を発生する胚に渡す。キメラ（トランスジェニック）子孫はＥＳ細胞誘導アグーチ茶毛皮色の存在によって同定する。次に、キメラ始祖を野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと共に飼育して導入遺伝子の生殖系列伝達を得る。Ｆ１へテロ接合体を飼育して、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１組み込み配列が安定に取り込まれているホモ接合マウス系を得る。次いで、このマウスモデルに尾の静脈又は門脈を介してＡＡＶ−ＩＴＲ／ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩベクターを注射し、イン・ビボ形質導入効率、ヒトＡＡＶＳ１配列での組み込み、及び導入遺伝子発現の持続を評価する。
【０１６２】
Ｂ．ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニックマウス
ＦＶＩＩＩ寛容化マウスモデル系も本発明によって提供される。過去、ＦＶＩＩＩ寛容化は、新生児マウスにＦＶＩＩＩを一時的に注入することにより達成されている（４４）。本発明は、発生期特異的な様式で作用するプロモーターの制御下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するマウスを包含する。このようなプロモーターにはα−胎児タンパク質遺伝子又は胚性グロビン遺伝子、イプシロンのものが含まれ得るが、これらに限定されるものではない。α−胎児タンパク質プロモーターは、成熟動物においては不活性である早期発生段階特異的プロモーターの例である（４５）。胚性グロビン遺伝子、イプシロンは、本発明において用いることができる発生的に調節される遺伝子の別の例である。α−胎児タンパク質プロモーターの制御下において、遺伝子の発現は肝臓に限定され、活性化については肝臓特異的転写因子に依存する（４６、４７）。ＦＶＩＩＩ発現の正常部位及びＦＶＩＩＩ遺伝子送達の好ましい標的臓器が肝臓であるため、同様に発生的に調節される肝臓特異的プロモーター要素が好ましい。α−胎児タンパク質プロモーター（ＡＦＰ）はこれらの基準の両者を満たす。α−胎児タンパク質プロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作用しないが、分化の間に誘発される（４８）；これは、そのようなものとして、トランスジェニックマウスにおけるｈＦＶＩＩＩの発現の制御に用いることができる。
【０１６３】
本発明の目的の１つは、異種間ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマウスを提供することである。このトランスジェニックマウスは、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用いて、又は免疫単離装置内でＦＶＩＩＩ分泌細胞を用いて、イン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の試験に用いることができる。この系においては、ヒトＦＶＩＩＩは、発生するトランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の下に胚性に発現する。これにより、ＨＦＶＩＩＩがマウスから“自己”と見なされ、寛容が生じる。マウスがｈＦＶＩＩＩに対して寛容であるため、異種間ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子が治療用ベクター（すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩ）によって送達されたときに、それに対する免疫反応は生じない。このようにして、ウイルスベクター主鎖の抗原性の正確な評価が、イン・ビボでの遺伝子発現の持続の信頼のおける測定に加えてなされる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ導入遺伝子は胚形成の間にのみ発現する（動物が成熟した後には発現しない）ため、正確な濃度のｈＦＶＩＩＩが成熟トランスジェニックマウスの肝臓に送達される。
【０１６４】
＜実施例１６＞ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏベクターの構築
トランスジェニックマウスの子宮内寛容化を達成するため、細胞において時間的に調節された胚特異的な様式でヒト第ＶＩＩＩ因子の発現を駆動することが可能なベクターを生成するのにマウスα−胎児タンパク質（ＡＦＰ）プロモーターを用いた。プラスミドＧＴ２０５７は７．５ｋｂ  ＡＦＰプロモーター配列を含み、この配列は最初にＵｒａｎｏらによって特徴付けられた（３３）。完全長ヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む７．２ｋｂ  ＮｏｔＩ断片をｐＣＭＶ−ＦＶＩＩＩ（ＧＴ２０５１）から単離し、ＧＴ２０５７のＡＦＰプロモーターの後ろのＮｏｔＩ部位にクローン化した（図５６）。続いて、ＡＦＰプロモーター及びｈＦＶＩＩＩ遺伝子を含むカセットをＡａｔＩＩ／ＳａｌＩ断片としてＮｅｏ発現ベクターｐＧＫＮｅｏのＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩにクローン化した。得られた２０．２ｋｂのベクター、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ（図５６）はｈＦＶＩＩＩ遺伝子を胚性プロモーター（ＡＦＰ）の制御の下に有し、且つ哺乳動物細胞における選択のためのＮｅｏ発現カセットを有する。
【０１６５】
＜実施例１７＞ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳ細胞クローンの生成及び特徴付け
トランスジェニックマウスの生成において用いられる、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ配列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞を生成するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターをマウスＥＳ細胞に安定に形質移入した。２０μｇのＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏ  ＤＮＡをＡａｔＩＩで直線化し、バイオラッド・ジーン・パルサーを用いて電気穿孔によりＥＳ細胞に移入した（９７５μＦｄ、２５２ｖ）。電気穿孔の後、ＥＳ細胞を胚性線維芽細胞支持層上で２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中において増殖させてＮｅｏＲクローンについて選択した。４８のＮｅｏＲクローンを取り出し、増殖させ、コーテストキットを用いて機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質について分析した。これらの４８のクローンのいずれの組織培養上清においてもＦＶＩＩＩは検出されなかった。ゲノムＤＮＡを１３のＮｅｏＲ  ＥＳクローン及び非形質移入親ＥＳ細胞から単離し、ＸｂａＩで消化して、ＧＴ２０５１に由来する７．２ｋｂ  ＦＶＩＩＩ  ＮｏｔＩ断片をプローブとして用いるサザンブロット分析によりスクリーニングした。１１／１３の形質移入クローンが予想される７．８ｋｂ  ＸｂａＩ断片を含んでおり、ｈＦＶＩＩＩ配列はもちろん、ＡＦＰプロモーターの３’末端の５００ｂｐの存在も確認された。これらのＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうちの４つに加えて親ＥＳ細胞対照の分析が図５７に示されている。これらの結果は、ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子がＮｅｏＲクローン内に存在していたことを示す。
【０１６６】
ＡＦＰプロモーターがＥＳ細胞内において機能的であったかどうかを試験するため、ＡＦＰプロモーターをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片としてレポータープラスミドｐＥＧＦＰ−１（クローンテック）にクローン化し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；図５８を参照）の発現を駆動させた。このｐＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１プラスミドをＥＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞（高水準のα−胎児タンパク質を発現することが知られる肝細胞系）の両者に一時的に形質移入し、ＦＩＴＣフィルターを備えるニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ）広範囲顕微鏡を用いる直接可視化により、２４時間後に緑色蛍光性細胞について検査した。ＧＦＰの発現はＨｅｐＧ２細胞系においては検出されたがマウスＥＳ細胞においては検出されず（データは示さず）、ＡＦＰプロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作用しないが分化した肝細胞系においては作用することが確認された。これらの結果は、ＡＦＰプロモーターが未分化Ｆ９胚幹細胞において活動休止状態であり、レチノイン酸で処理された後に分化するように誘発されたときに活性化されることを示すＶｏｇｔら（４８）のものと一致する。発現が期待される細胞系においてｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターが機能的であったことを確認するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターをＨｅｐＧ２細胞に形質移入し、１０ラ濃縮上清を色素生成コーテストＦＶＩＩＩ検定（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いてｈＦＶＩＩＩタンパク質の発現について分析した。ヒトＦＶＩＩＩが３．０ｎｇ／１０６細胞／２４時間の濃度で検出され、これによりＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ構築体が機能的であり、且つ７．５ｋｂ  ＡＦＰプロモーター／エンハンサー要素の組織特異的及び発生特異的発現パターンが保存されていたことが確認された。ＡＰＦ−ＦＶＩＩＩベクターが相応に機能性であることが示されたことで、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうちの１つ、クローン＃２２（図５７、レーン３）をその未分化成長表現型に基づいて選択し、胚盤胞微量注入実験に用いた。
【０１６７】
＜実施例１８＞ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスの生成
本発明は、異種間ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対して子宮内で寛容化されているトランスジェニックマウスを提供する。このトランスジェニックマウスは、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用い、又は米国特許５，３１４，４１７号；５，３４４，４５４号；５，４２１９２３号；５，４５３，２７８号；５，５４５，２２３号；もしくは５，５６９，４６２号に記述されるもののようなセラサイト（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ）免疫単離装置においてＦＶＩＩＩ分泌細胞を用いるイン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の試験に用いられる。ｈＦＶＩＩＩが発生中のトランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の下で胚性に発現するため、治療用ベクター（すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦＶＩＩＩ）によって送達されるｈＦＶＩＩＩはマウスの免疫系によって梼ゥ己剥R原として認識される。そのようなものとして、ｈＦＶＩＩＩタンパク質に対する寛容が生じる。このトランスジェニックマウスはｈＦＶＩＩＩに対して寛容化されているため、“異種間”ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫反応が生じることはなく、ウイルスベクター主鎖の抗原性の正確な評価及びイン・ビボでの遺伝子発現の持続の現実的な測定を決定することができる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ導入遺伝子は主として胚形成の間に発現するため、成熟トランスジェニックマウスにおいてこのベクターによる形質導入の結果として肝臓が発現するｈＦＶＩＩＩタンパク質の量を正確に定量することができる。
【０１６８】
ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを生成するためのスキームはその概要が図５９に記されている。ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローン＃２２からのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に微量注入し、仮母の子宮内に移植した。現在までに、ＥＳクローン＃２２を用いて４匹のキメラ子孫が生み出されている。それらを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとつがわせて生殖系列伝達について試験し、生殖系列始祖を飼育してホモ接合ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス系を得る。このキメラ子孫は、定義上、それらの組織の全てにおいてＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子のモザイク発現を示すため、ホモ接合系の生成を待つことなく、イン・ビボ遺伝子送達実験にも直接用いられる。このスキームによって生成されるトランスジェニック動物に、最初にｈＦＶＩＩＩタンパク質を注射することにより抗原投与して飼育し、ヒトタンパク質に対する抗体についてスクリーニングしてｈＦＶＩＩＩに対する寛容化を確かなものとする。また、このＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを、成体動物におけるｈＦＶＩＩＩの“漏出性”出現についても試験する。少量のｈＦＶＩＩＩタンパク質が成体トランスジェニック動物において生成される場合には、治療用ベクター又はタンパク質送達装置によって送達されるｈＦＶＩＩＩの濃度から減ずることができるようにそれを正確に定量する。トランスジェニック動物がｈＦＶＩＩＩに対して寛容化され、且つ有意の水準で内在性ヒトタンパク質を発現することがないのであれば、それをｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達の効率の試験に用いることが可能であり、遺伝子発現の持続、組織分布、及び導入遺伝子以外の送達系の要素（すなわち、ベクター主鎖、ウイルス被覆タンパク質）に対する免疫反応を分析することができる。他のパラメータもこのトランスジェニック動物を用いて試験することができる。
【０１６９】
＜実施例１５＞第２世代トランスジェニック動物モデル
ａ．ＦＶＩＩＩノックアウトマウスとのＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化マウスの飼育
マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子の標的設定破壊（遺伝子ノックアウト）が行われているトランスジェニックマウス株が、ジョンホプキンス大学及びペンシルバニア大学と結ばれた非排他的使用制限付きライセンスにより得られている。このマウス系はｍＦＶＩＩＩの欠乏が深刻であり、したがって血友病Ａの有用なモデルである（５１）。ヒト第ＶＩＩＩ因子に対して寛容化された我々のトランスジェニックマウスを全体に的にマウス第ＶＩＩＩ因子が欠乏するマウスと交雑させることにより、ｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試験するための“クリーン”モデルを生成することが可能である。ｈＦＶＩＩＩと交差反応する潜在能力を有するマウスＦＶＩＩＩが存在しない状況において、ｈＦＶＩＩＩの正確な定量。加えて、この二重トランスジェニックマウスは、遺伝子治療を用いる血友病Ａの表現型修正の有用なモデルを提供する。
【０１７０】
ｂ．三重トランスジェニックマウス
本発明のさらなる態様は、上記３種類のトランスジェニック動物全てを交雑させて“三重トランスジェニック”マウスモデルを生成することを含む。ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化され、且つマウスＦＶＩＩＩが欠乏する、前項に記述されるマウスをＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス系と交雑飼育する。この三重トランスジェニックマウスモデルは、ＡＡＶ  ＩＴＲ／Ｒｅｐ組換え系によるＡＡＶＳ１での部位特異的組み込み；寛容化された導入遺伝子に対する免疫反応を伴わないヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子の送達及び長期間の発現；ヒトＦＶＩＩＩの成体発現の欠如に加えて交差反応性マウスＦＶＩＩＩタンパク質の欠如による送達されたｈＦＶＩＩＩの正確な定量；並びに、最後に、深刻なＦＶＩＩＩの欠乏（血友病Ａ）の遺伝上及び表現型上の修正を含む我々のＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦＶＩＩＩベクター系の全ての側面の試験に好ましく適する。
【０１７１】
ｃ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニックマウス
ＧＦＰ発現カセットを様々なウイルスベクターにレポーター遺伝子として組み込み、新規ミニＡｄベクター、ＡＡＶベクター、及び新規バージョンのヘルパーウイルスを開発することが好都合である。ウイルス感染、増殖、ヘルパー補完及び標的細胞へのイン・ビボ送達は緑色蛍光の目視検出により容易に理解される。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する免疫応答が、アデノウイルスベクターの注入後の遺伝子発現の安定性に負に衝撃を与え得ることが示されている（３０）。マウスに注入した後のＧＦＰ発現の持続期間を短くし得る、ベクターに組み込まれるＧＦＰ導入遺伝子に対する免疫応答を排除するため、ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウスを開発する。図５８に示されるＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター、又はＧＦＰの膵臓特異的発現のためのラットインシュリンプロモーター（ＲＩＰ）を含む類似のベクターをこの目的で用いることができる。
【０１７２】
安定なＮｅｏＲ  ＲＩＰ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞系［ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ］を開発するため、ＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター（図６０）をマウスＥＳ細胞の形質移入に用いた。ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ細胞を、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化マウスモデルの生成について説明されるもの（図５９）と同じ様式で、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩベクターの代わりにＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターを用いて、ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウスの生成に用いる。このようにして生成したＲＩＰ−ＧＦＰ寛容化マウスは、新規アデノウイルスベクター又はＧＦＰ導入遺伝子をレポーターとして用いる他の送達系を開発するための有用な研究手段を提供する。
【０１７３】
実施例１２に提供されるＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス、実施例１５のｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウス、及び実施例１９ＣのＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウスを含む上述のトランスジェニック動物モデルは全て、導入遺伝子（それぞれ、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ及びＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１）の直接ＤＮＡ注入により代わりに生成させることができる。これは、上述のＥＳ細胞技術を用いる代わりに、導入遺伝子をマウス単細胞卵子の雄性前核に注入してトランスジェニックマウスを生成することにより達成される。当業者にとっては、これはトランスジェニックマウスを生成するための明白な代替法である。したがって、本発明は、本願において論じられる方法のいずれかによって生成することができる（５７−６１）。
【０１７４】
＜実施例２０＞エピソームミニＡｄウイルスの設計
ミニウイルスベクターによって送達される導入遺伝子の長期間の発現を可能にする要素を提供する別のアプローチとして、本発明は、標的細胞の感染の際にミニウイルス配列から自己複製エピソームを切除することを可能にする部位特異的リコンビナーゼベースの系の設計を提供する。
【０１７５】
部位特異的リコンビナーゼはＤＮＡの操作に広く用いられている。部位特異的リコンビナーゼは２つの適切な標的配列の間の正確な組換えを触媒するもので、ＤＮＡ特定の部位で開裂させ、それを開裂されたＤＮＡの第２部位にライゲートする（再検討のためには、参考文献１１１を参照）。バクテリオファージＰ１に由来するｃｒｅ／ｌｏｘＰ系（１１１）又は酵母に由来するＦＬＰ／ＦＲＴ（１１２）のような幾つかの系が同定され、特徴付けられている。両リコンビナーゼ（ｃｒｅ及びＦＬＰ）の認識部位（ｌｏｘＰ及びＦＲＴ）は共通の構造を共有する：これらは中央コア領域（乗換え部位）に隣接する２つの逆反復要素（リコンビナーゼ結合部位）を有する。（コア領域によって決定される）これらの標的部位の方向は最終的な結果に影響を及ぼす：同じ分子上の２つの平行な部位の間の組換えは介在する配列の切除を生じ、各々標的部位を有する２つの分子を生成する。２つの逆平行部位の間の組換えは介在配列の逆転を生じる。異なる分子における２つの平行な部位の間の組換えは標的部位が隣接する配列の組み込みを生じる。切除は分子内の現象であるため、組み込みよりも好ましい。
【０１７６】
本発明の設計において、リコンビナーゼは真核細胞複製起点（ｏｒｉ）を有する配列の切除に用いられる。哺乳動物ｏｒｉ配列及び結合因子は現在までには特徴付けられていない。しかしながら、幾つかのウイルスｏｒｉ配列及び複製の開始に必要とされるウイルスタンパク質が特徴付けられ、プラスミドベクターに組み込まれており、その例の幾つかにはシミアンウイルス４０に由来するＳＶ４０  ｏｒｉ／Ｔ−Ａｇ（１１３）及びエプスタイン・バーウイルスに由来するｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ−１（１１４）が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの要素は真核細胞において自立的に複製し、且つ選択圧に対して安定に維持されるプラスミドの生成を可能にしている。ｏｒｉＰを含み、且つＥＢＮＡ−１を発現するプラスミドは細胞サイクル当たり１回複製し（１１５、１１６）、培養において細胞から選択圧が除去されると失われる。しかしながら、肝細胞のような非分裂細胞におけるエピソームプラスミドの安定性に関するイン・ビボデータは存在しない。非分裂細胞（すなわち、分化した細胞）において、且つ選択なしで、エピソームが長期間安定のままであり得ることが予想される。本発明者らは、ミニウイルスＤＮＡにｏｒｉ配列を組み込むことにより非分裂細胞における導入遺伝子の発現を長期化することが可能であるものと信じる。
【０１７７】
エピソームミニウイルスには以下のものが含まれるがこれらに限定されるものではない（図６１）：
ａ）リコンビナーゼ発現カセット：ウイルスの生成に用いられる細胞における不適切な発現は２つの組換え部位の間に含まれる配列の切除を促進するため、リコンビナーゼは標的細胞内でのみ発現しなければならない。このため、発現は、プロモーターの上流に転写リプレッサーの結合配列を加えるか（例えば、ｔｅｔＯ）、又は組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロモーター）を用いることにより厳密に制御される。
【０１７８】
ｂ）複製起点（ｏｒｉ）：これはＤＮＡの複製を開始させるための配列及び複製に必要とされる他のあらゆる要素（例えば、起点の配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質）を含んでいなければならない。
【０１７９】
ｃ）導入遺伝子：これは組換え部位（５秩j及びポリＡシグナル配列（３秩jが隣接するあらゆる治療用又はレポーター遺伝子であり得る。これは、そのＤＮＡの環化の際に標的細胞内でのみ発現する。
【０１８０】
ｄ）リコンビナーゼ標的部位：平行な方向の２つの部位が必要であり、一方はプロモーターとリコンビナーゼｃＤＮＡとの間に配置され、他方は治療用遺伝子ｃＤＮＡの上流に配置される。
【０１８１】
ｅ）アデノウイルスＩＴＲ：これはミニウイルスの複製及びパッケージ化に必要である。
【０１８２】
ｆ）スタファーＤＮＡ配列：ミニウイルスのサイズをパッケージ化可能な長さまで増加させる必要がある場合。スタファーＤＮＡ配列はいかなる長さのいかなるＤＮＡ断片であってもよい。
【０１８３】
この設計で、ミニウイルスが増幅する間リコンビナーゼは発現しない。ミニウイルスベクターが標的細胞に送達されると、プロモーターが機能的になってリコンビナーゼが発現し、２つのリコンビナーゼ標的部位の間に含まれる配列を切除して環化する。リコンビナーゼプロモーターは導入遺伝子プロモーターとなり、複製起点が存在することでそのプラスミドの安定な維持が可能となり、したがって、導入遺伝子の安定な発現が保証される。
【０１８４】
＜実施例２１＞癌治療のためのミニＡｄの設計
現在、遺伝子治療を用いる癌の治療に対する最も有効なアプローチの１つは、腫瘍−宿主の関係を変化させ、免疫系を用いて悪性細胞の認識及び破壊を容易にすることである。腫瘍を有する個人において、有効な免疫応答の欠如は、部分的には、腫瘍細胞の弱い免疫原性、免疫同時刺激の欠如、又は腫瘍特異的免疫抑制環境のいずれかのためである可能性がある。腫瘍細胞のサイトカイン介在遺伝子移入は、免疫系を増強してより有効な抗腫瘍応答を導く方策の１つを提供する（１１７）。近年、多くのサイトカイン遺伝子が単離され、クローン化され、特徴付けられている。これらの免疫調節因子の特定のもの、例えばＩＬ−２、の全身投与により一定の割合の抗腫瘍応答が生じている。しかしながら、臨床効果を生成させるのに必要とされる高い濃度のため、これらの生物製剤の多くはその使用に毒性が伴う。極めて望ましくない効果と全身投与による最低限の治療結果との組み合わせは、腫瘍細胞を遺伝的に加工してサイトカインそれ自体を生成させる努力を刺激している（１１８）。
【０１８５】
動物モデルにおいて、遺伝子改変腫瘍細胞がワクチンとして抗腫瘍応答の刺激に用いられている（１１７、１１９）。腫瘍指向サイトカイン遺伝子移入の訴求点は、局部的に生成されるサイトカインが免疫学的により効率的であり、全身的な毒性を生じないことである。このサイトカイン（１種もしくは複数）の高い局所濃度で示される、新生物細胞上に発現する腫瘍抗原は、外来性サイトカインの投与では再現することができない免疫学的微小環境を創出する。サイトカイン生成性腫瘍細胞によって創出されるこの免疫学的微小環境は細胞毒性Ｔリンパ球の生成に有効である。幾つかの異なる動物モデルにおいて、サイトカイン生成性腫瘍細胞は腫瘍原性の低下及び免疫学的に重要な分子の発現の増加に有効であることが示されている（１１７、１１９）。初期抗腫瘍拒絶には非特異的炎症応答が付随するように思われる。しかしながら、サイトカイン分泌腫瘍細胞の拒絶は、ほとんどの場合、Ｔ細胞依存性の全身性腫瘍特異的免疫の生成につながった。
【０１８６】
予め存在する腫瘍免疫原性に対する要求はほとんどの遺伝子移入モデルで確立されていない；しかしながら、多くの十分に特徴付けられている腫瘍細胞系は高度に分化し、且つ免疫原性である。幾つかの系において、非免疫原性腫瘍がサイトカイン遺伝子移入の後に免疫を生成することが示されている。さらに、腫瘍指向遺伝子移入モデルの大部分は、これらの悪性物の急速な成長が免疫治療が介入する時間をほとんど与えないため、それ自体では既存腫瘍負荷の存在下において宿主を治療する研究の役に立たない（１１９）。
【０１８７】
近年の研究は、腫瘍細胞によるＴＧＦβの分泌の低下が癌遺伝子治療の重要なアプローチであり得ることを示している（１２０、１２１）。一組の実験において、Ｆａｋｈｒａｉらは、ラットグリアサルコーマ（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）細胞系におけるそのサイトカインの発現の阻害にＴＧＦβのアンチセンスを用いた。このアンチセンス改変腫瘍細胞での腫瘍坦持ラットの免疫は、対照ベクターで改変した腫瘍細胞での動物の免疫と比較して動物の高い生存を生じた。異なるアプローチを用いて、Ｉｓａｋａらは、骨格筋にｃＤＮＡコーディングデコリンを形質移入することにより、ラットにおける繊維性疾患の量を低下させることが可能であった。デコリンはＴＧＦβの発現を阻害する小プロテオグリカンである。したがって、ＴＧＦｂの発現を阻害する２つの異なるアプローチが癌又は前癌の２種類の異なるモデルにおける効力を示している。
【０１８８】
加えて、Ｂ７によるＴ細胞の同時刺激がＴ細胞の活性化に対する正及び負の両者の効果を有することが新たな証拠により示されている（１２２）。Ｔ細胞の他の同時刺激性分子、例えば、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＬＦＡ−３及びＶＣＡＭ−Ｉも適切な抗腫瘍応答の誘発に関連付けられている（１２３）。当業者の間での一般的な総意は、これらの同時刺激性信号のうちの最も重要なものがＴ細胞上のＣＤ２８とその一次リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）及び抗原提示細胞表面上のＢ７−２（ＣＤ８６）との相互作用によってもたらされるものであるというものである（１２４）。様々なモデル系において、Ｂ７ｃＤＮＡが形質移入された腫瘍細胞が、改変及び非改変腫瘍細胞の両者に対する強力な抗腫瘍応答を誘発した。同様にＴ細胞上に発現する分子であるＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも非常に高い親和性でＢ７−１及びＢ７−２を結合する。幾つかの研究の結果は、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞応答性の負の調節因子として作用し、ＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作用によってもたらされる阻害の遮断が腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を増強し、且つ抗腫瘍活性を高める可能性を生じることを示す。Ｌｅａｃｈらは、ＣＴＬＡ−４に抗体を注入した結果、マウスモデルにおける予め確立された腫瘍を含む腫瘍の拒絶が生じることを示した（１２４）。これは、遺伝子移入実験の設計においては、所望の効果が他の潜在的な有害効果によって覆い隠されないように注意を払わなければならないことを示す。
【０１８９】
癌の遺伝的基礎には癌遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子における異常が含まれる。両方の型が癌遺伝子治療の標的になっている。腫瘍抑制遺伝子の癌関連欠陥が通常突然変異又は欠失であるため、これまで開発されている腫瘍抑制遺伝子治療における方策は遺伝子置換治療であり、この治療では野生型腫瘍抑制遺伝子を癌細胞に移入して欠陥遺伝子の正常な機能を回復させ、又は殺腫瘍性効果を誘発する（１２４）。クローン化されて特徴付けられているヒト腫瘍抑制遺伝子には、小児癌に関与するＲｂ、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍（ＷＴ１）、及び神経線維腫症（ＮＦ１）；結腸直腸癌に寄与する腺腫ポリープ症ｃｏｌｉ（ＡＰＣ）及び結腸癌における欠失（ＤＣＣ）；広範囲のヒト癌において変異形態で見出されるｐ５３が含まれる（再検討のためには、参考文献１２５を参照）。近年、新たな腫瘍抑制因子又は癌感受性遺伝子の同定の領域において２つの大きな事件が発生した。第１に、ｐ１６（主要腫瘍抑制因子１、ＭＴＳ１）及びｐ１５（ＭＴＳ２）と呼ばれるサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害因子集団の２つの高度に関連するメンバーが、染色体領域９ｐ２１から単離された（１２６−１２８）。第２に、乳癌及び卵巣癌感受性遺伝子ＢＲＣＡ１の強力な候補が単離された（１２９）。ｐ１６は広範囲の癌細胞系において欠失もしくは変異を受けていることが示されたが、ｐ１５はＴＧＦ−β誘発細胞サイクル停止の強力なエフェクターであることが示された（１３０）。これら全ての腫瘍抑制遺伝子の中で、これまでに癌の遺伝子治療に用いられているものはｐ５３遺伝子である（１３１）。
【０１９０】
癌の遺伝子治療に対する我々の現在の努力は、腫瘍抑制遺伝子及び癌の免疫調節遺伝子治療を他の分子、例えば、腫瘍抗原、ＭＨＣ分子、細胞接着分子及び他の免疫調節因子の導入と組み合わせることである。以下は、抗癌超Ａｄベクターの２つの設計の一般的な説明である。
【０１９１】
２１．１  第１バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築
免疫分子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄベクターの構築に用いることができる。このミニＡｄベクターは、腫瘍の成長を抑制し、又は宿主の抗癌免疫応答を誘発するように作用する複数の遺伝子を坦持することができる。この型のベクターは抗癌超Ａｄベクターと呼ばれる。この超Ａｄベクターの第１バージョンは、ヒトｐ５３  ｃＤＮＡ、ＧＦＰマーカー遺伝子、ヒトＩＬ２  ｃＤＮＡ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ、ヒトＢ７−１  ｃＤＮＡ、ヒトＩＬ７  ｃＤＮＡ並びにヒトＩＬ１２  ｐ３５及びｐ４０  ｃＤＮＡの４つの二重発現カセットを坦持する。また、これは、左及び右Ａｄ５  ＩＴＲ及びＡｄ５パッケージ化配列の最小配列（合計６６０ｂｐ）並びにヒトａ−胎児タンパク質遺伝子の約１８ｋｂゲノム配列をも有し、３０ｋｂを超えるサイズに到達する（図６２）。カセット１はＣＭＶプロモーター、ヒトｐ５３  ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ＧＦＰ遺伝子及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット２はＥＦプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２  ｃＤＮＡ及びウシ成長ホルモンｐＡを含む。カセット３はＳＶ４０プロモーター、ヒトＢ７−１  ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ７  ｃＤＮＡ及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット４はｔｋプロモーター、ヒトＩＬ１２  ｐ３５  ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２  ｐ４０  ｃＤＮＡ及びウシ成長ホルモンｐＡを含む（図６４）。
【０１９２】
２１．２  第２バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築
抗癌超Ａｄベクターの第２バージョンは第１バージョンに類似する構造を有し、５’及び３’末端の両者にアデノウイルス逆末端反復を含み、且つ４つの別々の発現カセットを含む。調節分子及び遺伝子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄベクターの構築において用いることができる。以下に説明される例は、腫瘍細胞の成長を調節するために構築することが可能なミニＡｄベクターの型をいかなる点においても限定するものではない。各々の発現カセットには５’末端に独自プロモーターが隣接する。加えて、各々の発現カセットは、“末端”遺伝子の独立の翻訳を完了させるための、脳心筋炎ウイルス内部リボソームエントリ部位配列で連結された２つの遺伝子を含む。このベクターのために示される遺伝子には、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＧＭ−ＣＳＦによって代表されるサイトカイン遺伝子；ｐ５３に代表される腫瘍抑制遺伝子；Ｂ７−１及びＩＣＡＭ−１に代表される免疫細胞同時刺激性分子；並びに、しばしば癌に関連する免疫抑制を保存することが可能な分子、抗−ＴＧＦβ及びＳＣＡ乃至ＣＴＬＡ−４が含まれる。ベクターのサイズを増加させて子孫ウイルス内に効率的にパッケージ化させるため、ヒトα−胎児タンパク質の“スタファーＤＮＡ”が含められている。スタファーＤＮＡは、いかなる長さのＤＮＡフラグメントを含んでいてもよい。第２バージョンの抗癌超Ａｄベクターの一般構造が図６３に示されている。
【０１９３】
＜実施例２２＞系を改善するための他の設計
１．標的設定能力を有するミニＡｄベクター。遺伝子発現の標的を特定の細胞型又は組織に設定するのに、複数の機構を用いることができる。そのような機構の１つは、細胞型、細胞型サブセット又は特定の組織の転写ターゲティングに関与する。転写ターゲティングは特定の型の細胞又は組織においてのみ遺伝子の発現を駆動する転写調節単位の使用を含む。このような転写調節単位は組織特異的と呼ばれる。ミニａｄベクターは、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を駆動する組織特異的転写調節単位を含めるように設計される。このようにして、組織特異的転写調節単位の制御の下にあるレポーター又はエフェクター遺伝子の発現は、この転写調節単位が活性である特定の組織において高水準で検出される。遺伝子の発現を特定の細胞型又は組織に限定することが好ましいことがある。治療用遺伝子は、多量に発現する場合、しばしば毒性である。そのため、遺伝子の発現の特定の組織への調節は、特定の治療用遺伝子の高水準の遺伝子発現の悪影響から宿主を保護する役割を果たし得る。
【０１９４】
組織特異的な遺伝子発現を導くさらなる方法は、関心のある細胞型上のリガンドに対して反応性の細胞表面タンパク質をコードするヘルパーウイルスを用いることである。例えば、ヘルパーウイルスを、細胞表面受容体に対するリガンドを発現するように加工することができる。本発明の組換えパッケージ化適格ＤＮＡ構築体のパッケージ化により、細胞表面上の受容体に結合する組換えアデノウイルス粒子が生成する。さらなる例は、そのウイルス外被の表面上に抗体又は抗体断片を発現する組換えアデノウイルスを含む。このような組換えウイルスは、パッケージ化不全ヘルパーウイルスを、そのウイルス外被上に抗体又は抗体断片を融合タンパク質又は別々のタンパク質として発現するように加工することにより生成することができる。少なくとも１つのアデノウイルスパッケージ化配列及び少なくとも１つのレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするＤＮＡ分子を形質移入した細胞の感染により、標的細胞上の細胞表面分子に対して反応性の抗体又は抗体断片を有する組換えアデノウイルス粒子が生成する。このようにして、組換えアデノウイルス粒子は、その抗体又は抗体断片に対して反応性の細胞表面分子を発現する宿主中の細胞に特異的に結合する。
【０１９５】
２．局所免疫抑制機能を有するミニＡｄベクター。特定の自己免疫疾患は不適切な免疫反応から生じる。この自己免疫反応を妨げ、停止させ、又は遅らせるのに用いることができる方法の１つはそのような反応の部位に免疫調節タンパク質を導くことである。これは、本願で示されるように、ミニＡｄゲノムから構築されるアデノウイルス粒子を適用することにより達成することができる。特定のサイトカイン又はケモカインをコードする遺伝子を発現させることが可能であり、そのような発現は免疫応答の弱力化を生じ得る。この免疫応答における弱力化は自己免疫反応の症状の緩和につながる。さらなる例には、アレルギー反応の弱力化が含まれ得る。アレルギー反応を引き起こすことが知られる抗原をミニＡｄベクターでコードすることができる。組換えアデノウイルス粒子によって細胞に送達されたこのミニＡｄベクターで駆動される、低濃度もしくは極端に高濃度の抗原のいずれかの発現により寛容が生じ得る。さらに、この抗原の発現を、この抗原の発現が寛容を誘発し得る組織に向けることができる。このような組織には発生中の胸腺が含まれ得る。脱感作の後、組換えアデノウイルス粒子が送達された宿主はその抗原との相互作用でアレルギー反応を示すことがない。このようにして、加工されたミニＡｄ  ＤＮＡ分子を坦持する組換えアデノウイルス粒子を投与することにより、免疫抑制の一形態が達成される。
【０１９６】
３．他の要素とハイブリダイズするミニＡｄベクター。本願において説明されるミニＡｄベクターを宿主内でのウイルス感染及び複製の予防又は排除に用いることも可能である。ミニＡｄベクターは、ウイルスの特定の遺伝的プロセスが妨害もしくは排除され得るように設計することができる。ミニＡｄベクターは、感染の転写又は翻訳段階でウイルスの複製を妨害するアンチセンス核酸を発現するように設計することができる。妨害は、伝令ＲＮＡに結合し、又はウイルスゲノムへの組み込みの後にＤＮＡに結合して転写を妨げるものを含むアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡの発現により促進することができる。さらに、特定のウイルス転写体を破壊の標的に設定するリボザイムを設計することができる。ミニＡｄベクターによって“おとり”分子をコードすることもできる。このようなおとりは、ウイルスの転写に必要とされる転写因子に、ウイルス遺伝子の発現及び複製に必要とされる遺伝子への結合及びその転写の駆動にその転写因子がもはや利用可能ではなくなるように結合することにより作用し得る。
【０１９７】
４．ワクチン接種に用いることができるミニＡｄベクター。発現が生じる生物において免疫を生成するように働く特定の抗原又は免疫源の発現を駆動するようにミニＡｄベクターを加工することができる。免疫反応を誘発し、それにより免疫を生じる細菌又はウイルス遺伝子の発現を駆動するミニＡｄベクターを設計することができる。例えば、ＨＩＶのようなレトロウイルスに由来する外被タンパク質をミニＡｄベクターでコードすることができる。このミニＡｄベクターを含む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染させることにより、ＨＩＶウイルスに対する免疫を確実なものとすることができる。また、癌特異的抗原の発現を駆動するようにミニＡｄベクターを設計することもできる。癌抗原の発現を導くミニＡｄベクターを含む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染させることにより、その型の癌に対する免疫が生じる。最適には、このような免疫は、その原発腫瘍はもちろんのこと、治療した生物全体にわたって存在する他の転移及び微小転移をも広範囲にわたって根絶する。加えて、寄生虫から誘導される抗原性分子をコードするミニＡｄベクターを設計することができる。このミニＡｄベクターを含む組換えアデノウイルスベクターの投与に続いて、この寄生虫による感染に対する免疫が生じる。
【０１９８】
本発明の好ましい形態が図面に示され、かつ記述されているが、この好ましい形態の変形が当該技術分野における熟練者に明らかであるため、本発明は図示され、かつ記述される特定の形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、その代わりに請求の範囲に記載される通りのものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】ミニＡｄベクター系の原理。ミニＡｄベクター系の３つの主要成分：ヘルパーＡｄ、ミニＡｄベクター、及びＡｄヘルパーが示される。ヘルパー細胞によって供給されるＥ１はヘルパーＡｄがそれ自体で複製し、ウイルスキャプシドを形成する後期ウイルスタンパク質を合成することを可能にする。このキャプシド内へのヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化は、本発明のヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルが弱力化されているため非能率的である。ミニＡｄベクターゲノムの存在下において、ヘルパーＡｄはそのミニＡｄベクターゲノムの複製を支持し、これはその野生型パッケージ化シグナルがヘルパーウイルスパッケージ化タンパク質に対して高い親和性を有するため優先的にパッケージ化される（３１）。ミニＡｄベクターのさらなる精製は、生化学的又は物理的方法、例えば超遠心、を用いて達成することができる。
【図２】現在のＡｄベクターの本発明との比較。このミニＡｄベクター系と比較した、現在のＡｄベクターの一般的な設計及び補完機構が図示される。
【図３】ヘルパーウイルス及びミニＡｄベクターの原型。Ａ．アデノウイルスの左ＩＴＲを参照したパッケージ化シグナルの配置。Ｂ．野生型アデノウイルス5のパッケージ化シグナル配列領域の配列が示される。角括弧は弱力化ヘルパーウイルスパッケージ化シグナルを含めるために欠失された領域を示す。Ｃ．Ｂに示される配列の反復領域は共通反復と共に記載されている。
【図４】パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄＨβを生成するためのシャトルベクターの構築。ＧＴ５０００を構築するため、突然変異パッケージ化シグナル配列ｍｔΨをＰＣＲにより増幅し、シャトルベクター内で２８．９ｍｕまで延びるＡｄ５配列で置換した（ＧＴ４００４）。ｐＴｋ−βに由来するβ−ｇａｌ発現カセットをＧＴ５０００のＥ１欠失物にクローン化し、シャトルベクターＧＴ５００１を得た。
【図５】ＡｄＨβの生成。シャトルベクターＧＴ５００１（図８を参照）をｐＪＭ１７と共に２９３細胞に同時形質移入した。これらのプラスミドの間の相同７Ｋｂ領域（Ａｄ５の９．２４乃至２８．９）での組換えにより、ＧＴ５００１から誘導される左アームを有するパッケージ化可能なウイルスが生じる。最下部に示されるＡｄＨβの左領域の数字はＡｄ５  ｎｔ配列に相当し、パッケージ化シグナルに加えてβ−ｇａｌ発現カセットが挿入されているＥ1における二重欠失の伸長を示す。同時形質移入の２週間後、幾つかの青色プラークを単離し、パッケージ化シグナル中の突然変異をオリゴ７及び８を用いてＰＣＲにより分析した。増幅した断片のサイズ、野生型パッケージ化シグナル（ｗｔΨ）については３１０ｂｐ、突然変異パッケージ化シグナル（ｍｔΨ）については１７７ｂｐは、示されるように、２％アガロースゲルにおいて区別することが可能である。１Ｋｂラダー、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（ゲーサースバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカー；ｗｔΨ及びｍｔΨ、ｖＤＮＲがそれぞれＥ１欠失ベクターＡｄ−ＣＭＶβｇａｌ及びｄｌ１０／２８ウイルスから抽出されたＰＣＲ対照；青色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されたプラークからのｖＤＮＡ；白色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されなかったプラークからのｖＤＮＡ（図６を参照）。
【図６】Ｘ−ｇａｌでの染色によるＡｄＨβプラーク対他のものの同定。［これらのプラークのパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅が図５に示される。］
【図７】ＡｄＨβの増幅及び特徴付け。２９３細胞中に存在する内在性左Ａｄ５配列を用いる組換えが複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ、Ｅ１＋）又はｗｔΨを有するＥ１アデノウイルスを生じ得る可能性があるため、ＡｄＨβのパッケージ化シグナルを各継代後に増幅した。ＣｓＣｌ精製以前には継代中にｗｔΨは検出されなかった（４乃至８）。継代９では、ＡｄＨβを精製したときに、ウイルスＤＮＡ含量を勾配の５つのバンドの全てについて別々に分析した。１％アガロースゲル（最下部左）においては上方の３つのバンドにおいてｖＤＮＡはほとんど観察されず、これは、これらが大部分空のキャプシドによって形成されることを示す。下方のバンド（４及び５）は充満キャプシドによって形成される。ＰＣＲにより、全てのバンドにおいて期待される突然変異パッケージ化シグナルが検出される（最下部右）。１Ｋｂラダーマーカー（図９と同様）は各々のゲルの左レーンである。ｖＤＮＡを含むゲルはｌ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーも含む。
【図８】ミニウイルスプラスミドの構築。これらのプラスミドは、ＡｄＨβで補完された場合のパッケージ化に対するアデノウイルスゲノムの様々な欠失の効果を決定するために構築する。全ての構築体は、ＣＭＶプロモーターによってβ−アクチンエンハンサー（濃い矢印）で駆動される緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ、縦線付きのボックス）を含む。Ｍ７．９（最下部右）はネオマイシンｃＤＮＡ及び内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）をも有する。上部の６つはＭ３２から誘導され、これはＡｄ５ゲノムの中間に１０Ｋｂの欠失があるｐＪＭ１７誘導体である。最下部の２つはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＣＡ）からＡｄ５の複製及びパッケージ化のための最小シス要素を含めて誘導される。数字はＡｄ５マップ単位に対応し、欠失及び挿入部位を示す。０／１００及び１００／０はＡｄ５  ＤＮＡの逆末端反復（ＩＴＲ）、Ａｄ５  ＤＮＡの天然の融合を示す、濃いレーン；プラスミド主鎖ＤＮＡ、薄いレーン。
【図９】パッケージ化のために構築されたミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクターの模式的図示。最上部は、初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）転写領域を伴うＡｄ５転写マップ及びマップ単位（ｍｕ）。ＭＬＰ／ＴＬ：主要後期プロモーター及び三部構成ラダー。逆末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージ化シグナル（Ψ）は全てのミニＡｄベクターにおける独自の共通配列である。ベクターは、複製の後にキャプシド内で見出される通りに、直鎖形態で示される。ベクターの生成に用いられる環状プラスミドは、同じ配列を有するがＩＲＴにより頭部が尾部に融合している。それぞれのミニＡｄベクターの名称はＫｂでのそのサイズを引き合いにする。Ｍ３２乃至Ｍ２０はｐＨＭ１７から中央アデノウイルスゲノムの漸進的欠失により誘導される。これらのベクターにおいては、プラスミド主鎖（ｐＢＲＸ、図示せず）は３．７ｍｕに位置する。Ｍ６．５乃至ｖＧｎＥ５Ｅ３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖（図示せず；ＧＦＰ発現カセットの前に位置する）において、ネオマイシンｃＤＮＡ及びｃｈｒ．４ｑ１１−２２に由来するヒトゲノム断片を挿入することにより構築される。
【図１０】補完の２つの方法。ミニウイルスベクターを生成するのに、類似の収量が得られる２つの別々の補完プロトコルを用いた。第１の方法においては、ミニＡｄプラスミドをＡｄＨβに由来するウイルスＤＮＡと共に同時形質移入し、それらの細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。第２の方法においては、ミニＡｄプラスミドをｐＢＨＧ１０と共に同時形質移入した３日後にＡｄＨβをウイルスとして加え、細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。
【図１１】ミニウイルスプラスミドでの２９３細胞の同時形質移入。ＣａＰＯ４改変プロトコルを用いることによりほとんど全ての細胞に形質移入した。Ｍ３２プラスミドの形質移入は形質移入の１日後に示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。
【図１２】ミニウイルス含有プラーク。ミニウイルス（ここではＭ３２）の存在がプラークの蛍光によって示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。
【図１３】異なるサイズのミニウイルスベクターのパッケージ化効率。異なるサイズのミニＡｄベクターのパッキング効率及び増幅。同時形質移入の後に生成されるウイルスを継代０と命名する。その粗製溶解物を用いて２９３細胞を感染させ、継代１を生成した。１ｍｌの粗製溶解物継代１を用いて１０６個の２９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（形質導入単位／ｍｌ、黒柱）。２４時間後にＣＰＥが出現し、凍結／解凍によりウイルスを抽出した（粗製溶解物継代２）。再度、１ｍｌの粗製溶解物継代２を用いて１０６個の２９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（斜線付きの柱）。継代１と２との相違は５Ｘの増幅収量を示し、異なるミニＡｄベクター間の相違はパッケージ化におけるサイズの効果を示す。
【図１４】Ｍ３２の精製スキーム。数回継代することによりＭ３２を増幅させた後、粗製抽出物をＣｓＣｌ分離した。第１勾配の結果４つのバンドが生じた：３つは上方で１つが下方。これらを別々に集めて透析し、図１２に示されるように２９３細胞の感染に用いた。上方及び下方バンドの第２分離勾配から画分を集め、図１６に示されるように２９３細胞の感染に用いた。
【図１５】Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（１）。第１ＣｓＣｌ勾配。Ｍ３２及びＡｄＨβをより高密度のバンドにおいて同時精製する（第４番以下）。蛍光のチェックに用いたものと同じウェルを後に固定及びＸ−ｇａｌでの染色に用いる。
【図１６】Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（２）：第２ＣｓＣｌ勾配を用いる第１ＣｓＣｌ勾配からの下方バンドの分画。各画分の一定分量０．５μｌを、６０％集密の２９３細胞を収容する９６ウェル／プレートのウェルの１つを感染するのに用いた。最初の画分（１乃至６）はＭ３２又はＡｄＨβを含んでいなかった（これらの画分は勾配の３ｍｌまでを表す）。画分７乃至１６の１００μｌの試料は多量のＭ３２及びＡｄＨβを明らかにする（パネルＡにおいて蛍光の下で示されるものと同じ画分のβ−ｇａｌ染色についてはパネルＢを参照）。続く画分（１７乃至２９）はそれ以前の画分に類似する濃度のＭ３２を示すが、ＡｄＨβの濃度は約１０倍低い。したがって、画分１７−２９は、ＡｄＨβに対して約１０倍のＭ３２の濃縮を表す。
【図１７】ＧＡＬ４結合部位を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、Ａ反復IIとＶＩとの間に１つのＧＡＬ４結合部位が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、別の２つのＧＡＬ４結合部位がＡ反復ＶＩＩの後に存在する。下線が付された配列は１７量体ＧＡＬ４結合部位である。イタリック体の配列はＡ反復である。各ＧＡＬ４結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示される。
【図１８】ｔｅｔＯ配列を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＩＩとＶＩとの間に１つのｔｅｔＯ配列が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＶＩＩの後にさらなるｔｅｔＯ配列が存在する。下線が付された配列は１９量体ｔｅｔＯ配列である。イタリック体の配列はＡ反復である。各ｔｅｔＯ結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示される。
【図１９】Ａｄ  Ｐａｃ−ＧＡＬ４改変のための合成オリゴの位置及び配列。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃８は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間の配列に隣接する合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃8の配列が記載される。
【図２０】ａｄ  Ｐａｃ−ｔｅｒＯ改変のための合成オリゴの位置及び配列。ｔｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間の配列を覆う合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。ｔｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０の配列が記載される。
【図２１】ＣＭＶ−Ｅ１哺乳動物発現ベクターの構築。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードするアデノウイルス５配列４６２−３５３７（ＡｆｌＩＩＩ−ＡｆＩＩＩ断片）をｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端クローン化した。
【図２２】Ｅ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８におけるＧＦＰ発現及びプラーク形成。Ｅ１欠失アデノウイルスＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰを感染させた後。このプラークの中心の透明領域はＥ１補完ウイルスの増幅によって生じるＣＰＥの証拠である。
【図２３】Ｇ４１８ｒ  Ａ５４９Ｅ１クローンのサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、７５０ｂｐのＥ１プローブ（ＰｓｔＩ断片）で探索した。レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー；レーン２：Ａ５４９；レーン３：２９３；レーン４：Ａ５４９Ｅ１−６８；レーン５：サブクローンＡ５４９Ｅ１−６８．３。
【図２４】新規細胞系の形態学的分析。親Ａ５４９細胞（上部パネル）及びＥ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８（下部パネル）の形態学的比較。
【図２５】形質転換細胞系におけるＥ１タンパク質の発現の分析。Ａ．Ａ５４９細胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１Ａタンパク質の発現の、Ｅ１Ａ特異的モノクローナル抗体（Ｍ７３、オンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いるウェスタンブロット分析。Ｂ．Ｅ１Ｂ  ｐ５５特異的モノクローナル抗体（オンコジーン・サイエンス）を用いる、Ａ５４９細胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１Ｂタンパク質の代謝性３５Ｓ標識及び免疫沈殿。
【図２６】ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴプラスミドの模式図。このプラスミドは、ｐＢＲＣＡＴプラスミドベクター中に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）の上流に作動可能に連結するｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴ  １２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター（ＥｃｏＲＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩ）を含む。近位プロモーター及びエンハンサー領域（Ｅ１．７及びＥ６）が示される。
【図２７】ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクターへの１２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーターのクローン化。ＥｃｏＲＩ乃至ＡｖａＩの１０．５ｋｂ断片及び２．０ｋｂのＡｖａＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩアルブミンプロモーター断片をｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴから別々に単離し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に同時にライゲートしてＧＴ４０３１を生成した。
【図２８】ＧＴ４０３１へのｈＦＶＩＩＩ発現カセットのクローン化。７．５ｋｂヒトＦＶＩＩＩカセットをプラスミドＧＴ２０５１からＸｈｏＩ及びＳａｌＩを用いて切り出してＧＴ４０３１のＳａｌＩ部位にライゲートし、ｈＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに作動可能に連結するヒトアルブミンプロモーターを含むＧＴ２０５３を得た。
【図２９】アルブミンプロモーター−ＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドの構築。ＧＴ２０３３に由来するアデノウイルス５’ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルを含む断片をＸｈｏＩを用いて切り出し、ＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位にクローン化した。順方向又は逆方向（それぞれＧＴ２０６１及びＧＴ２０５９）のいずれかのＩＴＲを有するプラスミドを得た。ＧＴ２０６１中のインサートは、ＦＶＩＩＩ遺伝子に近接する独自ＳａｌＩ部位と共に配向される。ＧＴ２０５９はＧＴ２０６１とは反対の方向のＡｄ  ＩＴＲを含む。
【図３０】ＧＴ２０５３、ＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１の制限消化プロフィール。消化により、ＳａｌＩとの組み合わせでＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ及びＸｈｏＩに期待される結合パターンが示される。
【図３１】染色体４上のアルブミン／α−胎児タンパク質遺伝子領域の図。この図は相同組換えのための３’組換えアームとしての機能を果たす３つの領域：１）Ａｌｂ−Ｅ５、アルブミン遺伝子の３’領域；２）ＡＦＰ−３、α−胎児タンパク質遺伝子の中央領域；及び３）α−胎児タンパク質のさらに３’、に位置するＥＢＢ１４を示す。
【図３２】クローン化スキーム。異なる３酎鞄ッ組換えアームを含む３つのベクター（Ａ、Ｂ、及びＣ）の、それらのアームを（パネルＡ、Ｂ、及びＣの上に示される）ＧＴ２０６１にクローン化した後の制限酵素マップ。
【図３３】クローン化スキーム。クローンｐＡｌｂ−Ｅ５のヒトアルブミン遺伝子の３窒U．８Ｋｂ  ＸｈｏＩ断片がＧＴ２０６１のＳａｌＩ部位にクローン化されているＧＴ２０６３の詳細なクローン化スキーム。このベクターをベースとするミニウイルスはＦＶＩＩＩ遺伝子の潜在的なイン・ビトロ治療手段である。
【図３４】制限酵素マッピング。図９に示される３’相同アルブミン相同組換えアームを有するアルブミンプロモーター駆動ｈＦＶＩＩＩを含むプラスミドの生成に用いられたベクターの制限酵素消化を示すアガロースゲル。示される構築体の各々についてＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ消化が示されている。
【図３５】ミニＡｄＦＶＩＩＩウイルスを生成するためのスキーム。ｈＦＶＩＩＩミニウイルスを生成するための２つのスキーム（Ａ及びＢ）が示される。スキームＡ：第１日に、ヘルパーウイルスゲノムＤＮＡ及びプラスミドＧＴ２０６３をリン酸カルシウム沈殿により２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）に同時形質移入した。形質移入はリン酸カルシウム沈殿によるものであった。第６日に、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、細胞溶解物を調製した。その後、継代４まで毎回、感染に続く３日間溶解物を回収し、その時点でウイルス調製物は５倍に増幅していた。培地は感染後毎日代えた。スキームＢ：プラスミドｐＢＨＧ１０をプラスミドＧＴ２０６３と共にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ギブコ）を用いて２９３細胞に同時形質移入した。７２時間後に、５ｐｆｕ／細胞の多重度でヘルパーＡｄを感染させた。５日後、ＣＰＥを観察し、細胞溶解物を調製した。その後、等しい接種容積を用いて継代３まで感染させ、その時点でウイルスは５倍に増幅し得る。培地は感染後毎日代えた。
【図３６】ＦＶＩＩＩを含むミニＡｄベクターの生成。ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターを、ミニＡｄプラスミドＧＴ２０６３を２９３細胞に形質移入し、ヘルパーＡｄＨβを感染させることにより生成した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したとき、それらの細胞及び上清を集めた（継代０）。増殖させるため、数回の凍結／解凍サイクルによりウイルスを細胞から抽出し、新鮮な２９３細胞の感染に用いた。各々の継代時に、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、及びプロテイナーゼＫを含む溶液中でのインキュベーション及び続くエタノール沈殿によるウイルスＤＮＡの抽出に７４０μｌの上清を用いた。ビリオン溶解工程に先立って、上清をＤＮＡ分解酵素Ｉ消化に処し、ＧＴ２０６３プラスミドＤＮＡからの汚染を回避した。１／２０の精製ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＴ）によるパッケージ化シグナル配列の増幅における基質として用いた。ＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパー増幅領域の予想されるサイズは、それぞれ、１７７及び３１０ｂｐであった。ＤＮＡサイズマーカー：ギブコ（ゲーサーズバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂラダー。さらなるＧＴ２０６３プラスミドを含み、又は含まない、非形質移入２３９細胞からの上清を、それぞれ、陰性対照及びＤＮＡ分解酵素Ｉ処理の対照として用いた。
【図３７】ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターの継代０乃至２１に由来するｖＤＮＡのサザンブロット分析。ｖＤＮＡは図１４と同様に精製した。１／２の精製ｖＤＮＡ（３７０μｌの上清に相当）をＰｓｔＩで消化し、１％アガロースゲルで分離してナイロンメンブランにブロットした。ミニＡｄ及びヘルパーの両者に存在する右（３秩jＩＴＲに隣接する配列に対応するプローブをｖＤＮＡの検出に用いた。検出される断片の予想サイズ：ミニＡｄＦＶＩＩＩ＝３．３Ｋｂ；ＡｄＨβ＝２．２Ｋｂ。４つの独立のブロットが示される（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。マーカー断片への特異的ハイブリダイゼーションを標準化のために用いた。
【図３８】連続継代の全期間にわたる、ミニＡｄＦＶＩＩＩ及びヘルパーにおける動的変動。このプロットは、図１５に示されるバンドの濃度測定による定量化によって得た。ヘルパーは方形を伴う明線によって示される；ミニＡｄＦＶＩＩＩは菱形を伴う暗線によって示される。１単位はＹ軸上で検出される最低量と定義される（継代１８でのヘルパーｖＤＮＡの量に相当）。他の値はこの単位に標準化される。
【図３９】ＣｓＣｌ勾配遠心によるミニＡｄＦＶＩＩＩ及びＡｄＨβの分離。第１勾配からの最下部バンドはビリオンを含んでおり、これらを第２勾配に適用することによりさらに分離した。ミニＡｄ（３１ｋｂ）とヘルパー（３７．１ｋｂ）とのサイズが異なることにより分離が可能となり、その結果、サザンブロットによる測定で、１０：１  ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する上部画分及び１：１０  ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する下部画分が生じた。
【図４０】ミニＡｄベクターが形質導入された細胞におけるＦＶＩＩＩの発現。２９３細胞をチャンバスライドにおいて成長させ、図１８Ｃに示されるように上部又は下部画分の希釈した（１／１００）一定分量１μｌで感染させた。感染の２４時間後、これらの細胞を固定し、ＦＶＩＩＩ特異的ｍＡｂ（シーダーレーンシープ（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｓｈｅｅｐ）抗ヒトＦＶＩＩＩＣ、＃ＣＬ２００３５Ａ、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストバリー、ＮＹ）、続いて二次抗体（ビオチン化ロバ抗ヒツジＩｇＧ、ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、＃７１３−０６５−１４７）及びＤＡＢ（赤みを帯びた茶色を生じる；シグマ（ＳＩＧＭＡ）カタログ番号Ｄ７６７９）で染色した。Ａ．模倣非感染対照２９３細胞。Ｂ及びＣ．図１８Ｃに示されるような上部画分の２つの独立の調製品での形質導入（ミニＡｄＦＶＩＩＩ濃縮）。Ｂ及びＣの両者において、１０％の細胞がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（矢印）。Ｃ．図１８Ｃ（ヘルパーウイルス濃縮）に示されるような下部画分での形質導入の結果、０．１％の細胞がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された。
【図４１】ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターが形質導入された細胞における機能的ＦＶＩＩＩ発現。機能的ＦＶＩＩＩのコーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）色素生成検定。上の表はＯＤ読み取り値を示す。試料からの読み取り値を外挿するための等式を得るため、４０００ｎｇ／ｍｌ乃至６２．５ｎｇ／ｍｌ（列Ａ乃至Ｇ）から３回（レーン１、２、及び３）作成した標準曲線もプロットする。レーン４、５及び６は試料から３回得たものである。Ａ：２９３細胞中の一定分量１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｂ：２９３細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｃ：ＨｅｐＧ２細胞中の１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｄ：ＨｅｐＧ２細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ。Ｅ：非形質導入２９３細胞からの馴化培地。Ｆ：非形質導入ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地。
【図４２】クローンＧＴ２０７４のマップ。このプラスミドは、プラスミドＧＴ４０２０からＳａｌＩ消化によって切り出され、ＧＴ２０７３の独自ＳａｌＩ部位にクローン化された、［Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに作動可能に連結された伸長因子−１（ＥＦ−１；参考文献５２）プロモーターを含む］発現カセットを含む。ＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴを含むｐＡＬＢ１２．５におけるＰｍｅＩ部位の下流の３’近位アルブミンプロモーター領域（３２）が欠失していた。この発現カセットはＢ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに連結する伸長因子Ｉプロモーターを含む。
【図４３】ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩのマップ。このプラスミドは、ＧＴ２０７３のＳａｌＩ部位にクローン化されている完全長ｈＦＶＩＩＩコーディング領域に作動可能に連結するＣＭＶプロモーターを含む。このサイトメガロウイルスプロモーターはｐＣＭＶβ（クローンテック、パロアルト、ＣＡ）から誘導した。
【図４４】組み込み頻度及び特異性の試験に用いられるプラスミドの模式図。プラスミドＧＴ９００３及びＧＴ９００４は両側にＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接するｎｅｏ発現カセットを含む；ＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３はＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接するＧＦＰ発現カセットを含む；ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２は組み込みカセットの上流にＲｅｐ７８発現カセットも含む。プラスミドＧＴ９００３を構築するため、ＡＡＶゲノムの１９３乃至２１２６のＲｅｐ配列をプラスミドｐＳＵＢ２０１からＰＣＲ（Ｐｆｕ  ｐｏｌ）により増幅し、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＡ）にクローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９０００）をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＳＶ４０ポリＡ部位（Ｎｏｔ−ＳａｌＩ）を含む断片をその部位にクローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９００１）をＸｂａＩで消化し、クレノウで平滑末端化した。全ＡＡＶゲノムを含むＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＳＵＢ２０１から得、ＧＴ９００１の平滑末端化ＸｂａＩ部位にサブクローン化した。その後、このプラスミド（ＧＴ９００２）をＸｂａＩで開裂させた。これは、ＡＡＶコーディング配列を除去してＡＡＶ  ＩＴＲを残す。次に、ｎｅｏ発現カセット（ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ）をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩアダプターを用いてＧＴ９００２にサブクローン化し、プラスミドＧＴ９００３を生成させた。ＥｃｏＲＩを用いてＧＴ９００３からＲｅｐコーディング配列を除去することによりプラスミドＧＴ９００４を生成した。ＧＴ９００３及びＧＴ９００４のｎｅｏ配列（ＸｂａＩ−ＸｂａＩ）をそれぞれＧＦＰ発現カセット（ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ）で置換することによりプラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を生成した。
【図４５】組み込み可能な第ＶＩＩＩ因子カセットを含むミニアデノウイルスベクターの設計。この構築体中に存在する複製及びパッケージ化に必要なミニＡｄ要素はＡｄ  ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルである。第ＶＩＩＩ因子カセットは２つのＡＡＶ  ＩＴＲの間に含まれる。Ｒｅｐ発現カセットはこの組み込み可能なセグメントの外側に位置する。Ｒｅｐの発現はリプレッサーｔｅｔ−ＫＲＡＢを安定に発現する細胞系のＴｅｔオペレーターで調節することができる。標的細胞において、Ｒｅｐの発現は、ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する配列の染色体１９のＡＡＶＳ１部位を標的とする組み込みをもたらすはずである。
【図４６】２９３及びチャン（Ｃｈａｎｇ）肝細胞におけるＲｅｐタンパク質の免疫沈殿。１０ｃｍペトリ皿において成長させた細胞に１０ｍｇのプラスミドＧＴ９００１、ＧＴ９００３、及びＧＴ９００４を形質移入した（プラスミドの構築に関する詳細は図３１を参照）。非形質移入細胞及びＧＴ９００４形質移入細胞を陰性対照として用いた。形質移入の２日後、細胞を溶解し、プロテインＧ−アガロースに結合させた抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体（クローン２２６．７；ＡＲＰ、ベルモント、ＭＡ０２１７８）を用いてＲｅｐタンパク質を免疫沈殿させ、１０％ポリアクリルアミドゲルに流して、免疫沈殿において用いたものと同じ抗体で免疫ブロットした。タンパク質を化学発光（ＥＬＣキット、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））により可視化した。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の移動が示される。
【図４７】プラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した２９３クローンのサザンブロット。幾つかのｎｅｏ耐性クローンに加えてｎｅｏ耐性集団（プールで示される）からの１５ｍｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）、アマシャム）にブロットして８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片にわたるＡＡＶＳ１プローブにハイブリダイズさせた。正常なＡＡＶＳ１遺伝子座が示される（パネルＡ）。幾つかのＧＴ９００３クローンはバンドのずれを示し、これはＡＡＶＳ１遺伝子座のうちの１つの破壊に相当する。パネルＢはｎｅｏ配列に再度ハイブリダイズされた同じメンブランを示す。
【図４８】プラスミドＧＴ９０１２又はＧＴ９０１３を形質移入した２９３クローンのサザンブロット。条件は図３３に記述される通りである。Ａ）ＡＡＶＳ１サザンブロット。プラスミドＧＴ９０１２から誘導されたクローンの幾つかがＡＡＶＳ１の再編成を示す。Ｂ）幾つかのブロットをＧＦＰ配列に再度ハイブリダイズさせた。
【図４９】ＡＡＶＳ１  Ｐ１ゲノムクローンのサザンブロット分析。ＰＣＲ［ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）］によってＡＡＶＳ１配列が検出された（Ｐ１クローン６５７６、Ｐ１クローン６５７７、Ｐ１クローン６５７８、及びＰ１クローン６５７９と呼ばれる）４つのＰ１ゲノムクローンからプラスミドＤＮＡ（１μｇ）を単離し、ＥｃｏＲＩ（図２３Ａ）又はＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ（図２３Ｂ）で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋、アマシャム）にブロットし、２５３ｂｐのＡＡＶＳ１  ＰＣＲ産生物をプローブとして用いてハイブリダイズした。Ａ及びＢの両者において、レーン１はＰ１クローン６５７６を表し、レーン２はＰ１クローン６５７７を表し、レーン３はＰ１クローン６５７８を表し、且つレーン４はＰ１クローン６５７９を表す。
【図５０】ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏベクターの構築。ＡＡＶＳ１組み込み配列を含む８．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン６５７６から単離し、Ｎｅｏ発現ベクターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にライゲートしてｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを作製した。
【図５１】ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスの生成。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ＥＳ細胞にＡＡＶＳ１プラスミドクローンを形質移入して胚盤胞に微量注入した後、それらを仮母に移植した。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６と交雑育種し、子孫をＡＡＶＳ１導入遺伝子の存在について試験した。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。次いで、これらのモデルをアデノ関連ウイルス組み込み系を含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達を試験するのに用い、このベクターＤＮＡの部位特異的組み込みの効率を評価した。
【図５２】ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを形質移入した後のＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローンのＰＣＲ分析。１７のＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローン（３．１−３．１７）及び非形質移入親ＥＳ細胞から独立に単離されたゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９３及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、ＡＡＶＳ１配列を有するＮｅｏＲクローンを確認した。これらのＰＣＲ反応試料を以下のように１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｂＤＮＡサイズマーカー（ギブコ／ＢＲＬ）；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照；レーン３−非形質移入ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４乃至２０−１７の個々のｐＡＡＶＳ１Ｎｅｏ形質移入ＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローン。
【図５３】ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。２つのＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローン（ＥＳ＃４及びＥＳ３．１６）及び親ＥＳ細胞に由来するゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ＋ナイロンメンブランにブロットし、８．２ｋｂのＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせた。レーン１−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４；レーン２−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃３．１６；レーン３−親ＥＳ細胞。ＡＡＶＳ１配列全体をＥＳ細胞ゲノムに組み込んだ結果生じる、予想される断片は、５．２及び３．０ｋｂである。
【図５４】ＡＡＶＳ１キメラマウス。ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４細胞を用いる胚盤胞微量注入実験から得られた２匹の高パーセンテージトランスジェニック（キメラ）マウス。ＥＳ幹細胞を用いて生成した動物においては、キメラ現象の程度の高さは導入遺伝子の伝達の可能性の高さと相関する。
【図５５】キメラマウスにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためのＰＣＲ分析。ゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラの尾及び、独立に、非キメラ同腹子から単離し、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲ反応物を以下のように１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｇＤＮＡサイズマーカー；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照Ｃ；レーン３−非形質移入親ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４細胞ＤＮＡ（４）；レーン５−非キメラ同腹子からの尾のＤＮＡ；レーン６−低パーセンテージキメラ（１０％未満のアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ；レーン７−高パーセンテージＡＡＶＳ１キメラ（９０％を上回るアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ。予想ＰＣＲ産生物＝２５３ｂｐ。
【図５６】ｈＦＶＩＩＩマウス寛容化ベクターの構築。７．２ｋｂの完全長ｈＦＶＩＩＩ遺伝子をＮｏｔＩを用いてＧＴ２０５１から切り出し、ＧＴ２０５７のＮｏｔＩ部位にクローン化してＧＴ２０５８におけるｍＡＦＰ−ＦＶＩＩＩカセットを生成した。次に、このｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットをＡａｔＩＩ及びＳａｌＩ断片を用いてＧＴ２０５８から切り出し、ｐＧＫＮｅｏのＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩにクローン化してｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ（ＧＴ２０６２）を生成した。
【図５７】ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ  ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。非形質移入親ＥＳ細胞及び４つのＮｅｏＲ  ＥＳクローンに由来するゲノムＤＮＡをＸｂａＩで消化し（図２９を参照）、電気泳動し、ブロットし、完全長ｈＦＶＩＩＩ  ＮｏｔＩ断片をプローブとして用いてハイブリダイズさせた。図に示されるように、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットの挿入を示す予想断片サイズは７．８ｋｂであった。
【図５８】ｍＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターの構築。ＡＦＰプロモーター／エンハンサー領域全体を含む７．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＥＧＦＰ−１ベクター（クローンテック）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにクローン化し、ｐＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１を作製した。
【図５９】免疫という結果をもたらすことなくｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試験するためにｈＦＶＩＩＩに対して子宮内で寛容化されたトランスジェニックマウスの生成スキーム。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ａ−胎児タンパク質プロモーターに作動可能に連結するＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含むＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏプラスミドが形質移入されたＥＳ細胞を胚盤胞に微量注入し、それを仮母に移植する。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交雑育種し、子孫をＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子の存在について試験する。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。これらのモデルを、ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達の試験に用いる。
【図６０】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニックマウスの生成において用いられるＲＩＰ−ＥＧＦＰベクター。ＢＳプラスミドに由来するＲＩＰ−ｐＥＧＦＰの制限酵素マップが示される。このプラスミド（４８５５ｂｐ）は、ラットインシュリンプロモーターに作動可能に連結する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーディング領域を含む。このインシュリンプロモーターは、膵臓組織におけるＧＦＰの発現の駆動のためにこの構築体において用いられた。
【図６１】ＦＶＩＩＩカセットを含むエピソームミニアデノウイルスベクターの構造。このミニＡｄベクターは、このウイルスベクターが標的細胞に侵入した後に、エピソーム維持機構及びＦＶＩＩＩ発現カセットを含む環状プラスミド構造が形成されるように設計される。このベクターの一般的な構造は以下の成分：（ａ）組換え発現カセット；（ｂ）複製起点；（ｃ）ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ；（ｄ）リコンビナーゼ標的部位；（ｅ）アデノウイルスＩＴＲ；及び（ｆ）スタファー（Ｓｔｕｆｆｅｒ）ＤＮＡ配列を有する。
【図６２】第１バージョンの抗癌性超Ａｄ（ｓｕｐｅｒ−Ａｄ）ベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超−Ａｄからなる。送達のために選択された遺伝子が図中に示される。
【図６３】第２生成抗癌性超Ａｄベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超Ａｄ−からなる。その一般的な構造はこれらのベクターの第１バージョンに類似する。
【図６４】ミニＡｄベクター及びヘルパーＡｄベクターの変種。Ａ．ミニＡｄベクターの考えられる要素。Ｂ。ヘルパーＡｄベクターの考えられる要素。
【０２００】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
2005000172.tif 000087
【図６０】
2005000172.tif 000088
【図６１】
2005000172.tif 000089
【図６２】
2005000172.tif 000090
【図６３】
2005000172.tif 000091
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月30日(2004.8.30)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
【図１】ミニＡｄベクター系の原理。ミニＡｄベクター系の３つの主要成分：ヘルパーＡｄ、ミニＡｄベクター、及びＡｄヘルパーが示される。ヘルパー細胞によって供給されるＥ１はヘルパーＡｄがそれ自体で複製し、ウイルスキャプシドを形成する後期ウイルスタンパク質を合成することを可能にする。このキャプシド内へのヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化は、本発明のヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルが弱力化されているため非能率的である。ミニＡｄベクターゲノムの存在下において、ヘルパーＡｄはそのミニＡｄベクターゲノムの複製を支持し、これはその野生型パッケージ化シグナルがヘルパーウイルスパッケージ化タンパク質に対して高い親和性を有するため優先的にパッケージ化される（３１）。ミニＡｄベクターのさらなる精製は、生化学的又は物理的方法、例えば超遠心、を用いて達成することができる。
【図２】現在のＡｄベクターの本発明との比較。このミニＡｄベクター系と比較した、現在のＡｄベクターの一般的な設計及び補完機構が図示される。
【図３】ヘルパーウイルス及びミニＡｄベクターの原型。Ａ．アデノウイルスの左ＩＴＲを参照したパッケージ化シグナルの配置。Ｂ．野生型アデノウイルス5のパッケージ化シグナル配列領域の配列が示される。角括弧は弱力化ヘルパーウイルスパッケージ化シグナルを含めるために欠失された領域を示す。Ｃ．Ｂに示される配列の反復領域は共通反復と共に記載されている。
【図４】パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄＨβを生成するためのシャトルベクターの構築。ＧＴ５０００を構築するため、突然変異パッケージ化シグナル配列ｍｔΨをＰＣＲにより増幅し、シャトルベクター内で２８．９ｍｕまで延びるＡｄ５配列で置換した（ＧＴ４００４）。ｐＴｋ−βに由来するβ−ｇａｌ発現カセットをＧＴ５０００のＥ１欠失物にクローン化し、シャトルベクターＧＴ５００１を得た。
【図５】ＡｄＨβの生成。シャトルベクターＧＴ５００１（図８を参照）をｐＪＭ１７と共に２９３細胞に同時形質移入した。これらのプラスミドの間の相同７Ｋｂ領域（Ａｄ５の９．２４乃至２８．９）での組換えにより、ＧＴ５００１から誘導される左アームを有するパッケージ化可能なウイルスが生じる。最下部に示されるＡｄＨβの左領域の数字はＡｄ５  ｎｔ配列に相当し、パッケージ化シグナルに加えてβ−ｇａｌ発現カセットが挿入されているＥ1における二重欠失の伸長を示す。同時形質移入の２週間後、幾つかの青色プラークを単離し、パッケージ化シグナル中の突然変異をオリゴ７及び８を用いてＰＣＲにより分析した。増幅した断片のサイズ、野生型パッケージ化シグナル（ｗｔΨ）については３１０ｂｐ、突然変異パッケージ化シグナル（ｍｔΨ）については１７７ｂｐは、示されるように、２％アガロースゲルにおいて区別することが可能である。１Ｋｂラダー、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（ゲーサースバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂ  ＤＮＡラダーマーカー；ｗｔΨ及びｍｔΨ、ｖＤＮＲがそれぞれＥ１欠失ベクターＡｄ−ＣＭＶβｇａｌ及びｄｌ１０／２８ウイルスから抽出されたＰＣＲ対照；青色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されたプラークからのｖＤＮＡ；白色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されなかったプラークからのｖＤＮＡ（図６を参照）。
【図６】Ｘ−ｇａｌでの染色によるＡｄＨβプラーク対他のものの同定。［これらのプラークのパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅が図５に示される。］
【図７】ＡｄＨβの増幅及び特徴付け。２９３細胞中に存在する内在性左Ａｄ５配列を用いる組換えが複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ、Ｅ１＋）又はｗｔΨを有するＥ１アデノウイルスを生じ得る可能性があるため、ＡｄＨβのパッケージ化シグナルを各継代後に増幅した。ＣｓＣｌ精製以前には継代中にｗｔΨは検出されなかった（４乃至８）。継代９では、ＡｄＨβを精製したときに、ウイルスＤＮＡ含量を勾配の５つのバンドの全てについて別々に分析した。１％アガロースゲル（最下部左）においては上方の３つのバンドにおいてｖＤＮＡはほとんど観察されず、これは、これらが大部分空のキャプシドによって形成されることを示す。下方のバンド（４及び５）は充満キャプシドによって形成される。ＰＣＲにより、全てのバンドにおいて期待される突然変異パッケージ化シグナルが検出される（最下部右）。１Ｋｂラダーマーカー（図９と同様）は各々のゲルの左レーンである。ｖＤＮＡを含むゲルはｌ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーも含む。
【図８】ミニウイルスプラスミドの構築。これらのプラスミドは、ＡｄＨβで補完された場合のパッケージ化に対するアデノウイルスゲノムの様々な欠失の効果を決定するために構築する。全ての構築体は、ＣＭＶプロモーターによってβ−アクチンエンハンサー（濃い矢印）で駆動される緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ、縦線付きのボックス）を含む。Ｍ７．９（最下部右）はネオマイシンｃＤＮＡ及び内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）をも有する。上部の６つはＭ３２から誘導され、これはＡｄ５ゲノムの中間に１０Ｋｂの欠失があるｐＪＭ１７誘導体である。最下部の２つはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＣＡ）からＡｄ５の複製及びパッケージ化のための最小シス要素を含めて誘導される。数字はＡｄ５マップ単位に対応し、欠失及び挿入部位を示す。０／１００及び１００／０はＡｄ５  ＤＮＡの逆末端反復（ＩＴＲ）、Ａｄ５  ＤＮＡの天然の融合を示す、濃いレーン；プラスミド主鎖ＤＮＡ、薄いレーン。
【図９】パッケージ化のために構築されたミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクターの模式的図示。最上部は、初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）転写領域を伴うＡｄ５転写マップ及びマップ単位（ｍｕ）。ＭＬＰ／ＴＬ：主要後期プロモーター及び三部構成ラダー。逆末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージ化シグナル（Ψ）は全てのミニＡｄベクターにおける独自の共通配列である。ベクターは、複製の後にキャプシド内で見出される通りに、直鎖形態で示される。ベクターの生成に用いられる環状プラスミドは、同じ配列を有するがＩＲＴにより頭部が尾部に融合している。それぞれのミニＡｄベクターの名称はＫｂでのそのサイズを引き合いにする。Ｍ３２乃至Ｍ２０はｐＨＭ１７から中央アデノウイルスゲノムの漸進的欠失により誘導される。これらのベクターにおいては、プラスミド主鎖（ｐＢＲＸ、図示せず）は３．７ｍｕに位置する。Ｍ６．５乃至ｖＧｎＥ５Ｅ３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖（図示せず；ＧＦＰ発現カセットの前に位置する）において、ネオマイシンｃＤＮＡ及びｃｈｒ．４ｑ１１−２２に由来するヒトゲノム断片を挿入することにより構築される。
【図１０】補完の２つの方法。ミニウイルスベクターを生成するのに、類似の収量が得られる２つの別々の補完プロトコルを用いた。第１の方法においては、ミニＡｄプラスミドをＡｄＨβに由来するウイルスＤＮＡと共に同時形質移入し、それらの細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。第２の方法においては、ミニＡｄプラスミドをｐＢＨＧ１０と共に同時形質移入した３日後にＡｄＨβをウイルスとして加え、細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。
【図１１】ミニウイルスプラスミドでの２９３細胞の同時形質移入。ＣａＰＯ４改変プロトコルを用いることによりほとんど全ての細胞に形質移入した。Ｍ３２プラスミドの形質移入は形質移入の１日後に示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。
【図１２】ミニウイルス含有プラーク。ミニウイルス（ここではＭ３２）の存在がプラークの蛍光によって示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。
【図１３】異なるサイズのミニウイルスベクターのパッケージ化効率。異なるサイズのミニＡｄベクターのパッキング効率及び増幅。同時形質移入の後に生成されるウイルスを継代０と命名する。その粗製溶解物を用いて２９３細胞を感染させ、継代１を生成した。１ｍｌの粗製溶解物継代１を用いて１０６個の２９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（形質導入単位／ｍｌ、黒柱）。２４時間後にＣＰＥが出現し、凍結／解凍によりウイルスを抽出した（粗製溶解物継代２）。再度、１ｍｌの粗製溶解物継代２を用いて１０６個の２９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（斜線付きの柱）。継代１と２との相違は５Ｘの増幅収量を示し、異なるミニＡｄベクター間の相違はパッケージ化におけるサイズの効果を示す。
【図１４】Ｍ３２の精製スキーム。数回継代することによりＭ３２を増幅させた後、粗製抽出物をＣｓＣｌ分離した。第１勾配の結果４つのバンドが生じた：３つは上方で１つが下方。これらを別々に集めて透析し、図１２に示されるように２９３細胞の感染に用いた。上方及び下方バンドの第２分離勾配から画分を集め、図１６に示されるように２９３細胞の感染に用いた。
【図１５】Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（１）。第１ＣｓＣｌ勾配。Ｍ３２及びＡｄＨβをより高密度のバンドにおいて同時精製する（第４番以下）。蛍光のチェックに用いたものと同じウェルを後に固定及びＸ−ｇａｌでの染色に用いる。
【図１６】Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（２）：第２ＣｓＣｌ勾配を用いる第１ＣｓＣｌ勾配からの下方バンドの分画。各画分の一定分量０．５μｌを、６０％集密の２９３細胞を収容する９６ウェル／プレートのウェルの１つを感染するのに用いた。最初の画分（１乃至６）はＭ３２又はＡｄＨβを含んでいなかった（これらの画分は勾配の３ｍｌまでを表す）。画分７乃至１６の１００μｌの試料は多量のＭ３２及びＡｄＨβを明らかにする（パネルＡにおいて蛍光の下で示されるものと同じ画分のβ−ｇａｌ染色についてはパネルＢを参照）。続く画分（１７乃至２９）はそれ以前の画分に類似する濃度のＭ３２を示すが、ＡｄＨβの濃度は約１０倍低い。したがって、画分１７−２９は、ＡｄＨβに対して約１０倍のＭ３２の濃縮を表す。
【図１７】ＧＡＬ４結合部位を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、Ａ反復IIとＶＩとの間に１つのＧＡＬ４結合部位が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、別の２つのＧＡＬ４結合部位がＡ反復ＶＩＩの後に存在する。下線が付された配列は１７量体ＧＡＬ４結合部位である。イタリック体の配列はＡ反復である。各ＧＡＬ４結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示される。
【図１８】ｔｅｔＯ配列を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＩＩとＶＩとの間に１つのｔｅｔＯ配列が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＶＩＩの後にさらなるｔｅｔＯ配列が存在する。下線が付された配列は１９量体ｔｅｔＯ配列である。イタリック体の配列はＡ反復である。各ｔｅｔＯ結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示される。
【図１９】Ａｄ  Ｐａｃ−ＧＡＬ４改変のための合成オリゴの位置及び配列。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃８は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間の配列に隣接する合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃8の配列が記載される。
【図２０】ａｄ  Ｐａｃ−ｔｅｒＯ改変のための合成オリゴの位置及び配列。ｔｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位の間の配列を覆う合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。ｔｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０の配列が記載される。
【図２１】ＣＭＶ−Ｅ１哺乳動物発現ベクターの構築。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードするアデノウイルス５配列４６２−３５３７（ＡｆｌＩＩＩ−ＡｆＩＩＩ断片）をｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端クローン化した。
【図２２】Ｅ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８におけるＧＦＰ発現及びプラーク形成。Ｅ１欠失アデノウイルスＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰを感染させた後。このプラークの中心の透明領域はＥ１補完ウイルスの増幅によって生じるＣＰＥの証拠である。
【図２３】Ｇ４１８ｒ  Ａ５４９Ｅ１クローンのサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、７５０ｂｐのＥ１プローブ（ＰｓｔＩ断片）で探索した。レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー；レーン２：Ａ５４９；レーン３：２９３；レーン４：Ａ５４９Ｅ１−６８；レーン５：サブクローンＡ５４９Ｅ１−６８．３。
【図２４】新規細胞系の形態学的分析。親Ａ５４９細胞（上部パネル）及びＥ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８（下部パネル）の形態学的比較。
【図２５】形質転換細胞系におけるＥ１タンパク質の発現の分析。Ａ．Ａ５４９細胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１Ａタンパク質の発現の、Ｅ１Ａ特異的モノクローナル抗体（Ｍ７３、オンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いるウェスタンブロット分析。Ｂ．Ｅ１Ｂ  ｐ５５特異的モノクローナル抗体（オンコジーン・サイエンス）を用いる、Ａ５４９細胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１Ｂタンパク質の代謝性３５Ｓ標識及び免疫沈殿。
【図２６】ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴプラスミドの模式図。このプラスミドは、ｐＢＲＣＡＴプラスミドベクター中に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）の上流に作動可能に連結するｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴ  １２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター（ＥｃｏＲＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩ）を含む。近位プロモーター及びエンハンサー領域（Ｅ１．７及びＥ６）が示される。
【図２７】ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクターへの１２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーターのクローン化。ＥｃｏＲＩ乃至ＡｖａＩの１０．５ｋｂ断片及び２．０ｋｂのＡｖａＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩアルブミンプロモーター断片をｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴから別々に単離し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＫＳ＋ベクターのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に同時にライゲートしてＧＴ４０３１を生成した。
【図２８】ＧＴ４０３１へのｈＦＶＩＩＩ発現カセットのクローン化。７．５ｋｂヒトＦＶＩＩＩカセットをプラスミドＧＴ２０５１からＸｈｏＩ及びＳａｌＩを用いて切り出してＧＴ４０３１のＳａｌＩ部位にライゲートし、ｈＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに作動可能に連結するヒトアルブミンプロモーターを含むＧＴ２０５３を得た。
【図２９】アルブミンプロモーター−ＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドの構築。ＧＴ２０３３に由来するアデノウイルス５’ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルを含む断片をＸｈｏＩを用いて切り出し、ＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位にクローン化した。順方向又は逆方向（それぞれＧＴ２０６１及びＧＴ２０５９）のいずれかのＩＴＲを有するプラスミドを得た。ＧＴ２０６１中のインサートは、ＦＶＩＩＩ遺伝子に近接する独自ＳａｌＩ部位と共に配向される。ＧＴ２０５９はＧＴ２０６１とは反対の方向のＡｄ  ＩＴＲを含む。
【図３０】ＧＴ２０５３、ＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１の制限消化プロフィール。消化により、ＳａｌＩとの組み合わせでＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ及びＸｈｏＩに期待される結合パターンが示される。
【図３１】染色体４上のアルブミン／α−胎児タンパク質遺伝子領域の図。この図は相同組換えのための３’組換えアームとしての機能を果たす３つの領域：１）Ａｌｂ−Ｅ５、アルブミン遺伝子の３’領域；２）ＡＦＰ−３、α−胎児タンパク質遺伝子の中央領域；及び３）α−胎児タンパク質のさらに３’、に位置するＥＢＢ１４を示す。
【図３２】クローン化スキーム。異なる３酎鞄ッ組換えアームを含む３つのベクター（Ａ、Ｂ、及びＣ）の、それらのアームを（パネルＡ、Ｂ、及びＣの上に示される）ＧＴ２０６１にクローン化した後の制限酵素マップ。
【図３３】クローン化スキーム。クローンｐＡｌｂ−Ｅ５のヒトアルブミン遺伝子の３窒U．８Ｋｂ  ＸｈｏＩ断片がＧＴ２０６１のＳａｌＩ部位にクローン化されているＧＴ２０６３の詳細なクローン化スキーム。このベクターをベースとするミニウイルスはＦＶＩＩＩ遺伝子の潜在的なイン・ビトロ治療手段である。
【図３４】制限酵素マッピング。図９に示される３’相同アルブミン相同組換えアームを有するアルブミンプロモーター駆動ｈＦＶＩＩＩを含むプラスミドの生成に用いられたベクターの制限酵素消化を示すアガロースゲル。示される構築体の各々についてＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ消化が示されている。
【図３５】ミニＡｄＦＶＩＩＩウイルスを生成するためのスキーム。ｈＦＶＩＩＩミニウイルスを生成するための２つのスキーム（Ａ及びＢ）が示される。スキームＡ：第１日に、ヘルパーウイルスゲノムＤＮＡ及びプラスミドＧＴ２０６３をリン酸カルシウム沈殿により２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）に同時形質移入した。形質移入はリン酸カルシウム沈殿によるものであった。第６日に、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、細胞溶解物を調製した。その後、継代４まで毎回、感染に続く３日間溶解物を回収し、その時点でウイルス調製物は５倍に増幅していた。培地は感染後毎日代えた。スキームＢ：プラスミドｐＢＨＧ１０をプラスミドＧＴ２０６３と共にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（ギブコ）を用いて２９３細胞に同時形質移入した。７２時間後に、５ｐｆｕ／細胞の多重度でヘルパーＡｄを感染させた。５日後、ＣＰＥを観察し、細胞溶解物を調製した。その後、等しい接種容積を用いて継代３まで感染させ、その時点でウイルスは５倍に増幅し得る。培地は感染後毎日代えた。
【図３６】ＦＶＩＩＩを含むミニＡｄベクターの生成。ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターを、ミニＡｄプラスミドＧＴ２０６３を２９３細胞に形質移入し、ヘルパーＡｄＨβを感染させることにより生成した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したとき、それらの細胞及び上清を集めた（継代０）。増殖させるため、数回の凍結／解凍サイクルによりウイルスを細胞から抽出し、新鮮な２９３細胞の感染に用いた。各々の継代時に、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、及びプロテイナーゼＫを含む溶液中でのインキュベーション及び続くエタノール沈殿によるウイルスＤＮＡの抽出に７４０μｌの上清を用いた。ビリオン溶解工程に先立って、上清をＤＮＡ分解酵素Ｉ消化に処し、ＧＴ２０６３プラスミドＤＮＡからの汚染を回避した。１／２０の精製ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＴ）によるパッケージ化シグナル配列の増幅における基質として用いた。ＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパー増幅領域の予想されるサイズは、それぞれ、１７７及び３１０ｂｐであった。ＤＮＡサイズマーカー：ギブコ（ゲーサーズバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂラダー。さらなるＧＴ２０６３プラスミドを含み、又は含まない、非形質移入２３９細胞からの上清を、それぞれ、陰性対照及びＤＮＡ分解酵素Ｉ処理の対照として用いた。
【図３７】ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターの継代０乃至２１に由来するｖＤＮＡのサザンブロット分析。ｖＤＮＡは図１４と同様に精製した。１／２の精製ｖＤＮＡ（３７０μｌの上清に相当）をＰｓｔＩで消化し、１％アガロースゲルで分離してナイロンメンブランにブロットした。ミニＡｄ及びヘルパーの両者に存在する右（３秩jＩＴＲに隣接する配列に対応するプローブをｖＤＮＡの検出に用いた。検出される断片の予想サイズ：ミニＡｄＦＶＩＩＩ＝３．３Ｋｂ；ＡｄＨβ＝２．２Ｋｂ。４つの独立のブロットが示される（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。マーカー断片への特異的ハイブリダイゼーションを標準化のために用いた。
【図３８】連続継代の全期間にわたる、ミニＡｄＦＶＩＩＩ及びヘルパーにおける動的変動。このプロットは、図１５に示されるバンドの濃度測定による定量化によって得た。ヘルパーは方形を伴う明線によって示される；ミニＡｄＦＶＩＩＩは菱形を伴う暗線によって示される。１単位はＹ軸上で検出される最低量と定義される（継代１８でのヘルパーｖＤＮＡの量に相当）。他の値はこの単位に標準化される。
【図３９】ＣｓＣｌ勾配遠心によるミニＡｄＦＶＩＩＩ及びＡｄＨβの分離。第１勾配からの最下部バンドはビリオンを含んでおり、これらを第２勾配に適用することによりさらに分離した。ミニＡｄ（３１ｋｂ）とヘルパー（３７．１ｋｂ）とのサイズが異なることにより分離が可能となり、その結果、サザンブロットによる測定で、１０：１  ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する上部画分及び１：１０  ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する下部画分が生じた。
【図４０】ミニＡｄベクターが形質導入された細胞におけるＦＶＩＩＩの発現。２９３細胞をチャンバスライドにおいて成長させ、図１８Ｃに示されるように上部又は下部画分の希釈した（１／１００）一定分量１μｌで感染させた。感染の２４時間後、これらの細胞を固定し、ＦＶＩＩＩ特異的ｍＡｂ（シーダーレーンシープ（Ｃｅｄａｒ  Ｌａｎｅ  Ｓｈｅｅｐ）抗ヒトＦＶＩＩＩＣ、＃ＣＬ２００３５Ａ、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストバリー、ＮＹ）、続いて二次抗体（ビオチン化ロバ抗ヒツジＩｇＧ、ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、＃７１３−０６５−１４７）及びＤＡＢ（赤みを帯びた茶色を生じる；シグマ（ＳＩＧＭＡ）カタログ番号Ｄ７６７９）で染色した。Ａ．模倣非感染対照２９３細胞。Ｂ及びＣ．図１８Ｃに示されるような上部画分の２つの独立の調製品での形質導入（ミニＡｄＦＶＩＩＩ濃縮）。Ｂ及びＣの両者において、１０％の細胞がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（矢印）。Ｃ．図１８Ｃ（ヘルパーウイルス濃縮）に示されるような下部画分での形質導入の結果、０．１％の細胞がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された。
【図４１】ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターが形質導入された細胞における機能的ＦＶＩＩＩ発現。機能的ＦＶＩＩＩのコーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）色素生成検定。上の表はＯＤ読み取り値を示す。試料からの読み取り値を外挿するための等式を得るため、４０００ｎｇ／ｍｌ乃至６２．５ｎｇ／ｍｌ（列Ａ乃至Ｇ）から３回（レーン１、２、及び３）作成した標準曲線もプロットする。レーン４、５及び６は試料から３回得たものである。Ａ：２９３細胞中の一定分量１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｂ：２９３細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｃ：ＨｅｐＧ２細胞中の１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｄ：ＨｅｐＧ２細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ。Ｅ：非形質導入２９３細胞からの馴化培地。Ｆ：非形質導入ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地。
【図４２】クローンＧＴ２０７４のマップ。このプラスミドは、プラスミドＧＴ４０２０からＳａｌＩ消化によって切り出され、ＧＴ２０７３の独自ＳａｌＩ部位にクローン化された、［Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに作動可能に連結された伸長因子−１（ＥＦ−１；参考文献５２）プロモーターを含む］発現カセットを含む。ＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴを含むｐＡＬＢ１２．５におけるＰｍｅＩ部位の下流の３’近位アルブミンプロモーター領域（３２）が欠失していた。この発現カセットはＢ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡに連結する伸長因子Ｉプロモーターを含む。
【図４３】ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩのマップ。このプラスミドは、ＧＴ２０７３のＳａｌＩ部位にクローン化されている完全長ｈＦＶＩＩＩコーディング領域に作動可能に連結するＣＭＶプロモーターを含む。このサイトメガロウイルスプロモーターはｐＣＭＶβ（クローンテック、パロアルト、ＣＡ）から誘導した。
【図４４】組み込み頻度及び特異性の試験に用いられるプラスミドの模式図。プラスミドＧＴ９００３及びＧＴ９００４は両側にＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接するｎｅｏ発現カセットを含む；ＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３はＡＡＶ  ＩＴＲ配列が隣接するＧＦＰ発現カセットを含む；ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２は組み込みカセットの上流にＲｅｐ７８発現カセットも含む。プラスミドＧＴ９００３を構築するため、ＡＡＶゲノムの１９３乃至２１２６のＲｅｐ配列をプラスミドｐＳＵＢ２０１からＰＣＲ（Ｐｆｕ  ｐｏｌ）により増幅し、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＡ）にクローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９０００）をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＳＶ４０ポリＡ部位（Ｎｏｔ−ＳａｌＩ）を含む断片をその部位にクローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９００１）をＸｂａＩで消化し、クレノウで平滑末端化した。全ＡＡＶゲノムを含むＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＳＵＢ２０１から得、ＧＴ９００１の平滑末端化ＸｂａＩ部位にサブクローン化した。その後、このプラスミド（ＧＴ９００２）をＸｂａＩで開裂させた。これは、ＡＡＶコーディング配列を除去してＡＡＶ  ＩＴＲを残す。次に、ｎｅｏ発現カセット（ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ）をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩアダプターを用いてＧＴ９００２にサブクローン化し、プラスミドＧＴ９００３を生成させた。ＥｃｏＲＩを用いてＧＴ９００３からＲｅｐコーディング配列を除去することによりプラスミドＧＴ９００４を生成した。ＧＴ９００３及びＧＴ９００４のｎｅｏ配列（ＸｂａＩ−ＸｂａＩ）をそれぞれＧＦＰ発現カセット（ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ）で置換することによりプラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を生成した。
【図４５】組み込み可能な第ＶＩＩＩ因子カセットを含むミニアデノウイルスベクターの設計。この構築体中に存在する複製及びパッケージ化に必要なミニＡｄ要素はＡｄ  ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルである。第ＶＩＩＩ因子カセットは２つのＡＡＶ  ＩＴＲの間に含まれる。Ｒｅｐ発現カセットはこの組み込み可能なセグメントの外側に位置する。Ｒｅｐの発現はリプレッサーｔｅｔ−ＫＲＡＢを安定に発現する細胞系のＴｅｔオペレーターで調節することができる。標的細胞において、Ｒｅｐの発現は、ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する配列の染色体１９のＡＡＶＳ１部位を標的とする組み込みをもたらすはずである。
【図４６】２９３及びチャン（Ｃｈａｎｇ）肝細胞におけるＲｅｐタンパク質の免疫沈殿。１０ｃｍペトリ皿において成長させた細胞に１０ｍｇのプラスミドＧＴ９００１、ＧＴ９００３、及びＧＴ９００４を形質移入した（プラスミドの構築に関する詳細は図３１を参照）。非形質移入細胞及びＧＴ９００４形質移入細胞を陰性対照として用いた。形質移入の２日後、細胞を溶解し、プロテインＧ−アガロースに結合させた抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体（クローン２２６．７；ＡＲＰ、ベルモント、ＭＡ０２１７８）を用いてＲｅｐタンパク質を免疫沈殿させ、１０％ポリアクリルアミドゲルに流して、免疫沈殿において用いたものと同じ抗体で免疫ブロットした。タンパク質を化学発光（ＥＬＣキット、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））により可視化した。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質の移動が示される。
【図４７】プラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した２９３クローンのサザンブロット。幾つかのｎｅｏ耐性クローンに加えてｎｅｏ耐性集団（プールで示される）からの１５ｍｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）、アマシャム）にブロットして８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片にわたるＡＡＶＳ１プローブにハイブリダイズさせた。正常なＡＡＶＳ１遺伝子座が示される（パネルＡ）。幾つかのＧＴ９００３クローンはバンドのずれを示し、これはＡＡＶＳ１遺伝子座のうちの１つの破壊に相当する。パネルＢはｎｅｏ配列に再度ハイブリダイズされた同じメンブランを示す。
【図４８】プラスミドＧＴ９０１２又はＧＴ９０１３を形質移入した２９３クローンのサザンブロット。条件は図３３に記述される通りである。Ａ）ＡＡＶＳ１サザンブロット。プラスミドＧＴ９０１２から誘導されたクローンの幾つかがＡＡＶＳ１の再編成を示す。Ｂ）幾つかのブロットをＧＦＰ配列に再度ハイブリダイズさせた。
【図４９】ＡＡＶＳ１  Ｐ１ゲノムクローンのサザンブロット分析。ＰＣＲ［ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）］によってＡＡＶＳ１配列が検出された（Ｐ１クローン６５７６、Ｐ１クローン６５７７、Ｐ１クローン６５７８、及びＰ１クローン６５７９と呼ばれる）４つのＰ１ゲノムクローンからプラスミドＤＮＡ（１μｇ）を単離し、ＥｃｏＲＩ（図２３Ａ）又はＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ（図２３Ｂ）で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋、アマシャム）にブロットし、２５３ｂｐのＡＡＶＳ１  ＰＣＲ産生物をプローブとして用いてハイブリダイズした。Ａ及びＢの両者において、レーン１はＰ１クローン６５７６を表し、レーン２はＰ１クローン６５７７を表し、レーン３はＰ１クローン６５７８を表し、且つレーン４はＰ１クローン６５７９を表す。
【図５０】ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏベクターの構築。ＡＡＶＳ１組み込み配列を含む８．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン６５７６から単離し、Ｎｅｏ発現ベクターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にライゲートしてｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを作製した。
【図５１】ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスの生成。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ＥＳ細胞にＡＡＶＳ１プラスミドクローンを形質移入して胚盤胞に微量注入した後、それらを仮母に移植した。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６と交雑育種し、子孫をＡＡＶＳ１導入遺伝子の存在について試験した。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。次いで、これらのモデルをアデノ関連ウイルス組み込み系を含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達を試験するのに用い、このベクターＤＮＡの部位特異的組み込みの効率を評価した。
【図５２】ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを形質移入した後のＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローンのＰＣＲ分析。１７のＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローン（３．１−３．１７）及び非形質移入親ＥＳ細胞から独立に単離されたゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９３及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、ＡＡＶＳ１配列を有するＮｅｏＲクローンを確認した。これらのＰＣＲ反応試料を以下のように１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｂＤＮＡサイズマーカー（ギブコ／ＢＲＬ）；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照；レーン３−非形質移入ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４乃至２０−１７の個々のｐＡＡＶＳ１Ｎｅｏ形質移入ＮｅｏＲ  ＥＳ細胞クローン。
【図５３】ＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。２つのＡＡＶＳ１  ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローン（ＥＳ＃４及びＥＳ３．１６）及び親ＥＳ細胞に由来するゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ＋ナイロンメンブランにブロットし、８．２ｋｂのＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせた。レーン１−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４；レーン２−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃３．１６；レーン３−親ＥＳ細胞。ＡＡＶＳ１配列全体をＥＳ細胞ゲノムに組み込んだ結果生じる、予想される断片は、５．２及び３．０ｋｂである。
【図５４】ＡＡＶＳ１キメラマウス。ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４細胞を用いる胚盤胞微量注入実験から得られた２匹の高パーセンテージトランスジェニック（キメラ）マウス。ＥＳ幹細胞を用いて生成した動物においては、キメラ現象の程度の高さは導入遺伝子の伝達の可能性の高さと相関する。
【図５５】キメラマウスにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためのＰＣＲ分析。ゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラの尾及び、独立に、非キメラ同腹子から単離し、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングした。ＰＣＲ反応物を以下のように１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｇＤＮＡサイズマーカー；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照Ｃ；レーン３−非形質移入親ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４−ＡＡＶＳ１  ＥＳ＃４細胞ＤＮＡ（４）；レーン５−非キメラ同腹子からの尾のＤＮＡ；レーン６−低パーセンテージキメラ（１０％未満のアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ；レーン７−高パーセンテージＡＡＶＳ１キメラ（９０％を上回るアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ。予想ＰＣＲ産生物＝２５３ｂｐ。
【図５６】ｈＦＶＩＩＩマウス寛容化ベクターの構築。７．２ｋｂの完全長ｈＦＶＩＩＩ遺伝子をＮｏｔＩを用いてＧＴ２０５１から切り出し、ＧＴ２０５７のＮｏｔＩ部位にクローン化してＧＴ２０５８におけるｍＡＦＰ−ＦＶＩＩＩカセットを生成した。次に、このｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットをＡａｔＩＩ及びＳａｌＩ断片を用いてＧＴ２０５８から切り出し、ｐＧＫＮｅｏのＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩにクローン化してｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ（ＧＴ２０６２）を生成した。
【図５７】ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ  ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。非形質移入親ＥＳ細胞及び４つのＮｅｏＲ  ＥＳクローンに由来するゲノムＤＮＡをＸｂａＩで消化し（図２９を参照）、電気泳動し、ブロットし、完全長ｈＦＶＩＩＩ  ＮｏｔＩ断片をプローブとして用いてハイブリダイズさせた。図に示されるように、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットの挿入を示す予想断片サイズは７．８ｋｂであった。
【図５８】ｍＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターの構築。ＡＦＰプロモーター／エンハンサー領域全体を含む７．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＥＧＦＰ−１ベクター（クローンテック）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにクローン化し、ｐＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１を作製した。
【図５９】免疫という結果をもたらすことなくｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試験するためにｈＦＶＩＩＩに対して子宮内で寛容化されたトランスジェニックマウスの生成スキーム。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ａ−胎児タンパク質プロモーターに作動可能に連結するＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡを含むＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏプラスミドが形質移入されたＥＳ細胞を胚盤胞に微量注入し、それを仮母に移植する。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交雑育種し、子孫をＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子の存在について試験する。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。これらのモデルを、ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達の試験に用いる。
【図６０】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニックマウスの生成において用いられるＲＩＰ−ＥＧＦＰベクター。ＢＳプラスミドに由来するＲＩＰ−ｐＥＧＦＰの制限酵素マップが示される。このプラスミド（４８５５ｂｐ）は、ラットインシュリンプロモーターに作動可能に連結する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーディング領域を含む。このインシュリンプロモーターは、膵臓組織におけるＧＦＰの発現の駆動のためにこの構築体において用いられた。
【図６１】ＦＶＩＩＩカセットを含むエピソームミニアデノウイルスベクターの構造。このミニＡｄベクターは、このウイルスベクターが標的細胞に侵入した後に、エピソーム維持機構及びＦＶＩＩＩ発現カセットを含む環状プラスミド構造が形成されるように設計される。このベクターの一般的な構造は以下の成分：（ａ）組換え発現カセット；（ｂ）複製起点；（ｃ）ヒトＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ；（ｄ）リコンビナーゼ標的部位；（ｅ）アデノウイルスＩＴＲ；及び（ｆ）スタファー（Ｓｔｕｆｆｅｒ）ＤＮＡ配列を有する。
【図６２】第１バージョンの抗癌性超Ａｄ（ｓｕｐｅｒ−Ａｄ）ベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超−Ａｄからなる。送達のために選択された遺伝子が図中に示される。
【図６３】第２生成抗癌性超Ａｄベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超Ａｄ−からなる。その一般的な構造はこれらのベクターの第１バージョンに類似する。