(57)【要約】      （修正有）【課題】エステラーゼ活性非存在下で７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を酵素触媒製造する方法の提供。【解決手段】フェニルメチルスルホニルフロリドで処理することにより、エステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性及び／またはエステラーゼ活性とグルタリルアシラーゼ活性を有する混合物中のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の存在下またはグルタリルアシラーゼ活性の存在下で存在するエステラーゼ活性を低下させる方法、酵素活性を有する微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマー、水と２相系を形成し得る有機溶媒及び二官能性物質で処理することにより得られ得る球状粒子形態の固定化生体触媒、並びに前記方法及び前記生体触媒の７−アミノセファロスポラン酸、７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸及びセファロスポリ抗生物質の製造における使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素活性を有する微生物細胞から球状粒子を製造する方法であって、ｉ）微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、ｉｉ）水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物に接触させるステップ、及びｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離するステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
酵素活性を有する微生物細胞含有球状粒子であって、ｉ）酵素活性を有する微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、ｉｉ）水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物に接触させるステップ、及びｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離するステップを含む方法により得られることを特徴とする前記球状粒子。
【請求項３】
酵素活性がＤ−アミノ酸オキシダーゼまたはグルタリルアシラーゼ活性である、請求項２に記載の球状粒子。
【請求項４】
グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法であって、セファロスポリンＣを酵素活性がＤ−アミノ酸オキシダーゼである請求項３に記載の球状粒子と反応させるステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項５】
さらにグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を単離するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
７−アミノセファロスポラン酸の製造方法であって、セファロスポリンＣを酵素活性がＤ−アミノ酸オキシダーゼである請求項３に記載の球状粒子と反応させるステップ、及び得られたグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を７−アミノセファロスポラン酸に変換することを特徴とする前記方法。
【請求項７】
７−アミノセファロスポラン酸の製造方法であって、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を酵素活性がグルタリルアシラーゼである請求項３に記載の球状粒子と反応させるステップを含むことを特徴とする前記方法。
【請求項８】
グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸が請求項４または５に記載の方法によって製造されたものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに７−アミノセファロスポラン酸を単離するステップを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
セファロスポリンを製造する方法であって、ｉ）グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を酵素活性がグルタリルアシラーゼである請求項３に記載の球状粒子と反応させて７−アミノセファロスポラン酸を得るステップ、及び得られた７−アミノセファロスポラン酸をセファロスポリンに変換するステップを含む前記方法。
【請求項１１】
セファロスポリンを製造する方法であって、ｉ）セファロスポリンＣを酵素活性がＤ−アミノ酸アキシダーゼである請求項３に記載の球状粒子と反応させてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得るステップ、得られたグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を７−アミノセファロスポラン酸に変換するステップ、及び得られた７−アミノセファロスポラン酸をセファロスポリンに変換するステップを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）の酵素触媒製造において有用な酵素製剤中のエステラーゼ活性を抑制する方法、及び例えば７−ＡＣＡ及び／または７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフエム−４−カルボン酸の製造において有用な酵素製剤の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
７−ＡＣＡは、例えば医薬的に活性なセファロスポリン抗生物質の製造において重要な中間体である。例えば、７−ＡＣＡにおいて、環系の７位のアミン基は、例えば環系の３位にメチルアセトキシ基を有する７−アミノアシル化セファロスポリン（例えば、セホタキシム、セフポドキシムプロクセチル、セファログリシン）を得るために、セファロスポリン抗生物質の製造において有効な基として公知であるかまたはその製造用中間体において有効な基として公知であり、７−ＡＣＡから誘導され得る他のセファロスポリン抗生物質またはその製造用中間体の製造において有効な基として公知の基によりアシル化され得る。例えば、環系の３位のメチルアセトキシ基を更に例えばアセトキシ基の求核置換により反応させると、アセトキシメチル基とは異なる基、例えばセファロスポリン抗生物質の製造において有効な基として公知であるかまたはその製造用中間体において有効な基として公知である基で置換された３−置換セファロスポリンが得られる。また、例えば前記メチルアセトキシ基を脱アセチル化すると、ヒドロキシメチル基（例えば、ＨＡＣＡ）が得られ、例えば環系の３位に得られたヒドロキシメチル基を更に例えばヒドロキシ基の求核置換、またはヒドロキシメチル基のヒドロキシ機能の除去または環系の３位のヒドロキシメチル基の除去により反応させる。所望により、環系の４位のカルボキシル基を、例えばセファロスポリン抗生物質の製造において有効な基として公知であるかまたはその製造用中間体において有効な基として公知の基によりエステル化し、所望により、前記反応で得られるセファロスポリン化合物の塩及び／または溶媒を例えば一般的方法に従って形成する。７−ＡＣＡ及びＨＡＣＡは、例えばセファロスポリンＣ（Ｃｅｐｈ  Ｃ）から酵素的にまたはその他の方法により環系の７位のアミン基を脱アシル化し、環系の３位のメチルアセトキシ基を脱アセチル化することにより得ることができる。Ｃｅｐｈ  Ｃの酵素的脱アシル化において有用な酵素の例は、中間体α−ケトアジポリ−７−アミノセファロスポラン酸（ＫＡ−７−ＡＣＡ）を経てグルタリル−７−アミノセファスポラン酸（Ｇｌ−７−ＡＣＡ）を形成するためのＣｅｐｈ  Ｃの酸化的脱アミノ化を触媒するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）である。Ｇｌ−７−ＡＣＡは、例えばグルタリルアシラーゼ（ＧＡＣ）による加水分解を受けるとグルタル酸と７−ＡＣＡが得られ得る。ＤＡＯ及びＧＡＣ含有酵素製剤、例えば微生物細胞が更にエステラーゼ活性を含む場合もあることは公知である。酵素触媒されるＣｅｐｈ  Ｃ脱アシル化においてエステラーゼ活性が存在したりすると、セファロスポリンの環構造の３位の側鎖で望ましくない脱アセチル化が起こり得、例えばＣｅｐｈ  Ｃ及びＧｌ−７−ＡＣＡの３−ヒドロキシメチル誘導体が形成され得る。これにより、７−ＡＣＡの品質及び収率が大きく低下し得る。ＤＡＯ活性の存在下で存在するエステラーゼ活性をアセトンまたはＣｕＳＯ４処理により低下させる従来方法では、エステラーゼ活性の低下が不完全であり得る。
【発明の開示】
【０００３】
驚くことに、ＤＡＯ活性の存在下またはＧＡＣ活性の存在下でエステラーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）で処理するとエステラーゼ活性をかなり（例えば、実質的に完全に）低下させ得るが、ＤＡＯまたはＧＡＣ活性は依然として高いまま（例えば、実質的に未変化）であり得ることが知見された。この知見は驚くべきことである。なぜならば、本発明によれば、例えばセリン含有タンパク質のセリンスルホニル化による不可逆阻害剤として公知のＰＭＳＦにより、ＤＡＯまたはＧＡＣ活性に（例えば、実質的な）影響を及ぼすことなくＤＡＯ活性の存在下またはＧＡＣ活性の存在下で存在するエステラーゼ活性を選択的に低下させ得るからである。また、ＧＡＣ活性の存在下で存在するエステラーゼ活性がＰＭＳＦにより選択的且つ効果的に阻害されることも更に驚くことである。なぜならば、例えばアシラーゼ及びエステラーゼの機能及び構造が類似していからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明の１態様によれば、例えば微生物細胞の形態でまたはその無細胞抽出物（例えば、その無細胞抽出物）の形態で存在するエステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性及び／またはグルタリルアシラーゼ活性を有する混合物中のＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の存在下またはグルタリルアシラーゼ活性の存在下で存在するエステラーゼ活性を低下させる（例えば、実質的に除去する）方法が提供され、その方法は、エステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性及び／またはグルタリルアシラーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理することを含み、例えばこの場合Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性またはグルタリルアシラーゼ活性は維持され、例えばフェニルメチルスルホニルフロリド処理後も該処理前と実質的に同じである。典型的には、残存しているＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性は元の値の９１％以上であり、グルタリルアシラーゼ活性の場合には元の値の９７％以上でありさえする。
【０００５】
本発明の方法は、例えば次のように実施され得る。
【０００６】
ＤＡＯ活性を生ずる公知の、例えば市販されている微生物の例には、トリグノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が含まれ、好ましくはトリグノプシス・バリアビリス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）微生物である。ＧＡＣ活性を生ずる公知の、例えば市販されている微生物の例には、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、または例えば一般的方法により形質転換された形質転換体、例えば大腸菌形質転換体が含まれる。ＤＡＯ活性またはＧＡＣ活性とエステラーゼ活性を有する混合物は、例えば市販されているかまたは例えば一般的方法により入手され得、例えば無細胞抽出物の形態（例えば、固定化形態）、または発酵ブロスから例えば一般的方法により得られ得るような部分精製または未精製細胞、及び／または透過または非透過細胞、及び／または部分分解または無傷の細胞、及び／または固定化または非固定化細胞の形態のような微生物細胞の形態であり得、好ましくは（例えば、固定化されている）無細胞抽出物の形態である。例えば、微生物細胞は単離され、例えば発酵ブロスから収集され、そのまま、例えば発酵ブロスを遠心後湿った形態で使用され得る。また、細胞は、発酵ブロスから単離する前またはその後に、（例えば、部分的に）分解した細胞を得るために細胞を均質化する、及び／または透過細胞または細胞断片を得るために細胞またはその断片を透過する、及び／または（例えば、部分的に）精製した細胞及び／または細胞断片及び／または（例えば、細胞フロキュレーションによる）無細胞抽出物を得るために細胞または細胞断片を精製する、及び／または固定化細胞及び／または固定化細胞断片及び／または固定化無細胞抽出物を得るために細胞または無細胞抽出物を固定化するような一般的方法に従って更に処理され得る。例えば、固定化は、例えばＥｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）のようなアクリル（固定化）ビーズの存在下またはＲｅｌｉｔｅ  Ｄｉａｎｉｏｎ（登録商標）のようなイオン交換樹脂の存在下で一般的方法に従って、例えば下記実施例に記載されている方法または例えば下記する本発明の別の態様に従って実施され得る。
【０００７】
微生物細胞は、例えば発酵ブロスから単離後に水または緩衝液中に細胞を再懸濁させることにより得られ得るような（例えば、緩衝）水性細胞懸濁液の形態で使用され得る。無細胞抽出物の場合には、無細胞抽出物の水溶液が使用され得る。懸濁液または溶液のｐＨは、例えばほぼ中性であり得る。例えば、ｐＨ６．５〜８．５（例えば、７．０または約７．０）が適当であり得る。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様では、エステラーゼ及びＤＡＯ活性を有する混合物は、例えばｐＨ９〜１１．５（例えば、１０〜１１）で、例えば苛性ソーダ溶液の存在下で塩基性培地中でＤＡＯ、エステラーゼ及びカタラーゼ活性を有する水性細胞混合物を処理することにより得られ得るような、例えば天然カタラーゼ活性を（例えば、実質的に）有していなくてもよい。
【０００９】
エステラーゼ活性とＤＡＯ活性を有する化合物またはエステラーゼ活性とＧＡＣ活性を有する混合物は、アルコール（例えば、エタノールのようなＣ１−４アルコール）のような適当な溶媒中に０．５〜２５％（例えば、１〜１０％）のような適当な濃度でＰＭＳＦを含むＰＭＳＦ溶液を添加することにより、適当な温度（例えば、室温）で数時間（例えば、２．５〜４時間以上のような１〜５時間）のような適当な時間処理（例えば、インキュベート）され得る。例えば出発混合物中に存在するＤＡＯまたはＧＡＣ活性を（例えば、実質的に）低下させることなく望ましくないエステラーゼ活性を実際完全に且つ不可逆的に除去するには、細胞懸濁液１００リッターあたり例えば上記した濃度範囲のＰＭＳＦ溶液１０００ｍｌで十分である。エステラーゼ活性の除去は、Ｃｅｐｈ  ＣからＰＭＳＦ処理ＤＡＯまたはＧＡＣ含有混合物を用いるＧｌ−７−ＡＣＡまたは７−ＡＣＡの反応中に得られる脱アセチル化生成物を測定することにより測定され得る。比較のために、反応は同等の反応条件下でＰＭＳＦ処理していないＤＡＯまたはＧＡＣ含有混合物を用いて実施し得る。
【００１０】
ＤＡＯまたはＧＡＣ活性が高い、例えばＰＭＳＦ処理前と実質的に同じであり且つエステラーゼ活性が（例えば、実質的に）完全に除去されている混合物が得られ得る。本発明に従って得られ得る混合物は、例えばＣｅｐｈ  Ｃから７−ＡＣＡの製造において有用である。ＰＭＳＦ処理したＤＡＯ及び／またはＧＡＣ活性を使用して得られる７−ＡＣＡの収率及び純度は、同等の反応条件下でＰＭＳＦ処理していないＤＡＯ及び／またはＧＡＣ活性を使用した場合に比して改善され得る。従って、例えば本発明によりエステラーゼ活性を除去すると、ＤＡＯ及び／またはＧＡＣ反応中にエステラーゼ活性が存在するために生ずる３−脱アセチル化副生成物が低減する（例えば、実質的にゼロ）。本発明の方法により得られるＧｌ−７−ＡＣＡまたは７−ＡＣＡ中の３−脱アセチル化副生成物の望ましくない量は、出発材料として使用するＣｅｐｈ  Ｃ中の量と（例えば、実質的に）同じであり得る（通常、３％出発活性を与える方法において１％以内であり、ＰＭＳＦを使用しないときには６％に増加し得る）。
【００１１】
別の態様で、本発明はグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法を提供し、その方法は、
ｉ）例えば、実質的にエステラーゼ活性を有さず且つ例えばＰＭＳＦ処理前と実質的に同じＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物を得るために、エステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、
ｉｉ）セファロスポリンＣをステップｉ）で得た混合物と反応させて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得、所望によりグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を単離するステップ
を含む。
【００１２】
別の態様で、本発明は７−アミノセファロスポラン酸の製造方法を提供し、その方法は、
ｉ）例えば、実質的にエステラーゼ活性を有さず且つ例えばＰＭＳＦ処理前と実質的に同じＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物を得るために、エステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、
ｉｉ）セファロスポリンＣをステップｉ）で得た混合物と反応させて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得、
ｉｉｉ）グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を７−アミノセファロスポラン酸に変換し、所望により得られた７−アミノセファロスポラン酸を単離するステップ
を含む。
【００１３】
グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の７−アミノセファロスポラン酸への変換は、一般的方法、例えば化学的または酵素的方法に従って、または例えば本明細書に記載されているような本発明の別の態様に従って実施され得る。
【００１４】
別の態様で、本発明は７−アミノセファロスポラン酸の製造方法を提供し、その方法は、
ｉ）例えば、実質的にエステラーゼ活性を有さず且つ例えばＰＭＳＦ処理前と実質的に同じＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物を得るために、エステラーゼ活性とＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、
ｉｉ）セファロスポリンＣをステップｉ）で得た混合物と反応させて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得、
ｉｉｉ）例えば、実質的にエステラーゼ活性を有さず且つ例えばＰＭＳＦ処理前と実質的に同じグルタリルアシラーゼ活性を有する混合物を得るために、エステラーゼ活性とグルタリルアシラーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、
ｉｖ）ステップｉｉ）で得たグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸をステップｉｉｉ）で得た混合物と反応させて、７−アミノセファロスポラン酸を得、所望によりステップｉｖ）で得た７−アミノセファロスポラン酸を単離するステップ
を含む。
【００１５】
Ｃｅｐｈ  Ｃから７−ＡＣＡを得るための本発明の方法は、例えば次のように実施され得る。出発材料のＣｅｐｈ  Ｃは、例えば遊離形態または塩形態のＣｅｐｈ  Ｃの水性懸濁液または溶液の形態であり得る。例えば、Ｃｅｐｈ  Ｃは、例えば一般的方法に従って細胞及び固体が除去されているＣｅｐｈ  Ｃ含有発酵ブロスの形態、またはＣｅｐｈ  Ｃ塩（例えば、ナトリウム塩）の形態であり得る。Ｃｅｐｈ  Ｃの懸濁液または溶液は、例えば上記した形態の、本発明に従ってＰＭＳＦで予備処理したＤＡＯ活性を有する混合物で処理させ得る。例えば、微生物細胞の水性懸濁液または無細胞抽出物を、Ｃｅｐｈ  Ｃの水性懸濁液もしくは溶液に例えば所望により加圧下で、該懸濁液または溶液に例えば酸素ガス形態及び／または空気形態で酸素を導入しながら添加してもよく、その逆でもよい。
【００１６】
前記反応は、ほぼ中性ｐＨ、例えばｐＨ６．５〜８．０（例えば、７．０〜７．５）のような適当なｐＨ及び１０〜３０℃（例えば、室温）のような適当な温度で実施され得る。Ｃｅｐｈ  Ｃの量に対するＤＡＯ活性の量、例えばＤＡＯ活性を有する細胞懸濁液または無細胞抽出物の量は、使用する細胞懸濁液中に存在するＤＡＯ活性及び反応させるＣｅｐｈ  Ｃの量に依存するが、臨界的でない。例えば短い反応時間のために必要な量は、例えば混合物中に形成されたＧｌ−７−ＡＣＡの量をＨＰＬＣ測定のような一般的方法により、例えば定期的に測定することにより容易に決定することができる。
【００１７】
得られたＧｌ−７−ＡＣＡは、例えば一般的方法により単離、精製してもよく、または例えば７−ＡＣＡの製造において更に処理するためにそのまま使用してもよい。
【００１８】
オキシダーゼ活性は、次のようにして測定され得る。透過細胞形態のＤＡＯ活性を有する混合物０．２〜５ｇを、酸素が飽和されるまで混合物に酸素流を導入しながらｐＨ８．０及び２５℃で２０ｍＭ  Ｃｅｐｈ  Ｃ水溶液中に撹拌しながら懸濁させる。Ｇｌ−７−ＡＣＡ及びＫＡ−７−ＡＣＡの増加をＨＰＬＣにより測定する。１Ｕ  オキシダーゼの活性は、上記条件下での１μｍｏｌ／分のＧｌ−７−ＡＣＡ及びＫＡ−７−ＡＣＡの形成に相当する。
【００１９】
例えば本発明により得られ得るかまたは得られたＧｌ−７−ＡＣＡの水性溶液または懸濁液を、本発明に従ってＰＭＳＦ予備処理したＧＡＣ活性を有する混合物と接触させてもよい。例えば、水性の（例えば、緩衝させた）細胞懸濁液または無細胞抽出物をＧｌ−７−ＡＣＡの水性溶液または懸濁液に添加してもよく、その逆でもよい。前記反応は、例えば僅かに塩基性のｐＨ（例えば、約８．２のようなｐＨ７．５〜８．０の範囲）のような適当なｐＨ及び１０〜３０℃（例えば、室温）のような適当な温度で実施され得る。Ｇｌ−７−ＡＣＡの量に対するＧＡＣ活性の量は、使用する細胞懸濁液または無細胞抽出物中に存在するＧＡＣ活性及び反応させるＧｌ−７−ＡＣＡの量に依存するが、臨界的でない。例えば短い反応時間のために必要な量は、例えば混合物中に形成された７−ＡＣＡの量をＨＰＬＣ測定のような一般的方法により、例えば定期的に測定することにより容易に決定することができる。
【００２０】
ＧＡＣ活性は、次のようにして測定され得る。ＧＡＣ活性を有する混合物０．５〜２．０ｇを、ｐＨ８．０及び３７℃で５ｍＭ  ホスフェート含有２％  Ｇｌ−７−ＡＣＡ水溶液中に撹拌しながら懸濁させる。ｐＨを、１００ｍＭ  水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより８．０に維持する。使用した水酸化ナトリウムの量を測定し、この量はそれぞれＧｌ−７−ＡＣＡから形成されたグルタル酸または７−ＡＣＡの量に相当する。１Ｕ  アシラーゼの活性は、上記条件下でのそれぞれ１μｍｏｌ／分のグルタル酸または７−ＡＣＡの形成に相当する。
【００２１】
得られた７−ＡＣＡは、例えば一般的方法により単離、精製してもよく、または所望により、例えば７−ＡＣＡの反応において例えば一般的方法に従って更に処理するためにそのまま使用してもよい。
【００２２】
本発明で得られた７−ＡＣＡは高い純度を有し得る。例えば、得られた７−ＡＣＡ中の３−脱アセチル化生成物は低量であり得る。７−ＡＣＡは、予備処理されていないＤＡＯ活性及び／または予備処理されていないＧＡＣ活性を同等の反応条件下で使用する方法の場合に比して高い収率で得られ得る。
【００２３】
例えば酵素含有微生物細胞を固定化し得ることは公知である。固定化された酵素含有微生物細胞は、例えば容易に回収され、再使用される可能性があるので有用である。固定化微生物細胞を製造するための公知方法は幾つかの欠点を有する。例えば、乏しい酵素安定性及び／または低い特異的酵素活性を有する固定化細胞しか得られないことがあったり、及び／または固定化方法が複雑であり得る。驚くことに、例えばＤＡＯまたはＧＡＣ活性のような酵素活性を有する微生物細胞のための簡単な固定化方法が今回知見された。この方法では、固定化細胞を安定で高い特異的酵素活性を有し得る固体球状粒子の形態で得ることができる。
【００２４】
別の態様で、本発明は酵素活性を有する微生物細胞から（例えば、固体形態の）球状粒子を製造する方法を提供し、その方法は、
ｉ）微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、
ｉｉ）例えば水と２相系を形成し得る溶媒に微生物細胞混合物を添加することにより、水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物と接触させるステップ、及び
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離するステップ
を含み、前記方法は更に、ステップｉ）またはｉｉ）を実施する前に微生物細胞を二官能性物質で予備処理し、及び／または球状粒子を単離する前にステップｉｉｉ）で得た混合物に水混和性溶媒を添加し、及び／またはステップｉ）で得た混合物またはステップｉ）を実施する前の微生物細胞に固体を添加することを含む。
【００２５】
本発明の方法は、通常生体触媒として設計される酵素活性を有する微生物細胞を固定化するために有用である。本発明方法で使用され得る微生物には、細菌、酵母、真菌及び放線菌を含めたあらゆる種類の微生物が含まれ、その例としてトリグノプシス（例えば、トリグノプシス・バリアビリス）、アグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター）、ロドトルラ（例えば、ロドトルラ・グルティニス）、プレウロツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）（例えば、プレウツロス・オストレアツス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ））、アスペルギルス、ペニシリウム、シュードモナス、アクロモバクター、バシラス（例えば、バシラス・セレウス）、スキゾサッカロミセス（例えば、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））が挙げられる。また、酵素活性を有する大腸菌形質転換体のような形質転換体も本発明では使用され得る。酵素活性には、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、デカルボキシラーゼ及びオキシレダクターゼ活性を含めたあらゆる酵素活性が含まれる。酵素活性を有する微生物細胞の例には、プレウツロス（例えば、ペニシリン−Ｖアシラーゼ活性を有するようなプレウツロス・オストレアツス細胞）、アグロバクテリウム（例えば、ヒダントイナーゼ及び／またはＮ−デカルバモイラーゼ活性を有するようなアグロバクテリウム・ラジオバクター細胞）、ロドトルラ（例えば、エステラーゼ及び／またはオキシダーゼ活性を有するようなロドトルラ・グルティニス細胞）、トリグノプシス（例えば、ＤＡＯ活性を有するようなトリグノプシス・バリアビリス）、スキゾサッカロミセス（例えば、ＧＡＣ活性を有するようなスキゾサッカロミセス・ポンベ）、及び形質転換体細胞（例えば、ＧＡＣ及び／またはエステラーゼ活性を有するような大腸菌）が含まれる。
【００２６】
本発明の方法は、例えばＣｅｐｈ  Ｃからの７−ＡＣＡまたはＨＡＣＡの製造において有用な固定化微生物細胞、例えばエステラーゼ（及び／または脱アセチラーゼ）活性の存在下でＤＡＯ活性を有する細胞及び／または例えばエステラーゼ（及び／または脱アセチラーゼ）活性の存在下でＧＡＣ活性を有する細胞の作成において特に興味深い。
【００２７】
本発明の方法は次のようにして実施され得る。酵素活性を有する微生物細胞は、例えば一般的方法に従って発酵ブロスから入手され得る。微生物細胞には、（例えば、部分的に）精製もしくは未精製細胞、及び／または透過もしくは非透過細胞、及び／または（例えば、部分的に）分解もしくは無傷の細胞を含めた任意の形態の細胞が含まれる。例えば、微生物細胞は、発酵ブロスから単離（例えば、収集）され、そのまま、例えば発酵ブロスを遠心後の湿った形態で使用し得る。また、細胞を発酵ブロスから単離する前またはその後に、（例えば、部分的に）分解した細胞を得るために細胞を均質化する、及び／または透過細胞またはその断片を得るために細胞またはその断片を透過させる、及び／または（例えば、部分的に）精製した細胞及び／または細胞断片を得るために細胞を精製するような一般的方法に従って更に処理してもよい。微生物細胞中の望ましくない酵素活性は、細胞を固定化する前に例えば一般的方法に従って除去され得る。例えば、トリグノプシス（例えば、トリグノプシス・バリアビリス）細胞中のカタラーゼ活性は、例えば塩基性ｐＨ（例えばｐＨ９〜１２の範囲）において、場合によりβ−メルカプトエタノール、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような添加剤の存在下で微生物細胞の単独混合物または第１級及び／または第２級アミン含有ポリマーが存在する微生物混合物中に苛性ソーダ溶液を添加して或る程度の時間（例えば約１５分以上）処理することにより除去され得る。
【００２８】
本発明では、微生物細胞を二官能性物質で予備処理してもよい。本発明で使用される二官能性物質は、第１級及び／または第２級アミン基と反応し得る少なくとも２つの反応性基を有する化合物であると理解され、その例にはグルタルアルデヒド、ジメチルピメリイミデート、エピクロロヒドリン、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、無水マレイン酸、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネートが含まれ、好ましくはグルタルアルデヒドである。細胞の予備処理は発酵ブロス中で実施しても微生物細胞を単離後に実施してもよく、好ましくは発酵ブロス中で実施される。例えば、二官能性物質を（例えば、溶解状態の）微生物細胞懸濁液に添加してもよい。例えば、グルタルアルデヒドは水溶液（例えば、１０〜３０％水溶液）として使用され得る。添加後に得られた混合物を、例えば３０分間〜数時間（例えば、３０分間〜５時間）撹拌してもよい。細胞の量に対する二官能性物質の量は臨界的でない。例えば、乾燥細胞重量１００ｇあたり例えば０．１〜１００ｇ（例えば、５〜５０ｇ）の二官能性物質を使用することが好都合である。例えばグルタルアルデヒドを二官能性物質として使用する場合には、０．５〜２００ｇ（例えば、１〜１００ｇ）の２５％水溶液が適当であり得る。二官能性物質で予備処理後、細胞を例えば一般的方法に従って収集し、単離してもよい。例えば、微細濾過及び／または遠心により濃縮し、冷所で（例えば、凍結状態で）保存してもよい。更に使用するためには、凍結細胞を融解し、湧水で洗浄し、所望により、例えば微細濾過のような一般的方法に従って濃縮し得る。
【００２９】
例えば上記したように予備処理した微生物細胞は、例えば発酵ブロスから単離後細胞を水に再懸濁し、場合により例えばｐＨ６．０〜１０．０（例えば、８．０または約８．０）で更に処理することにより、（例えば緩衝）水性細胞懸濁液の形態で使用され得る。所望により、例えば通常量の慣用されているような添加剤、例えばβ−メルカプトエタノール、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を前記懸濁液に添加してもよい。得られた懸濁液に、好ましくは水溶性の第１級及び／または第２級アミン含有ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン及びポリビニルアミン）を例えば水溶液として添加する。例えば、６００，０００〜１，０００，０００の分子量を有するようなポリエチレンイミンを例えば１０〜５０％水溶液として添加する。第１級及び／または第２級アミン含有ポリマーは例えば市販されているか、または例えば一般的方法により製造され得る。乾燥細胞量に対する第１級及び／または第２級アミン含有ポリマーの量は臨界的でない。例えば、乾燥微生物細胞重量１００ｇあたり１〜１００ｇ（例えば、１０〜５０ｇのような５〜７０ｇ）を使用する。
【００３０】
細胞／ポリマー混合物を水と２相系を形成し得る有機溶媒と接触させる。例えば、細胞／ポリマー混合物を水と２相系を形成し得る有機溶媒に導入する。適当な有機溶媒の例には、トリアルキルホスフェート類（例えば、ｎ−トリブチルホスフェートのようなトリブチルホスフェート）、アルカン類（例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン）、芳香族炭化水素類（例えば、トルエン）、天然または合成油類（例えば、大豆油、シリコーン油、ジーゼル油）、芳香族または脂肪族化合物類［例えば、Ｃ３−８アルキル（例えば、モノ−またはジ−カルボン酸アルキルのようなＣ４−６アルキル）、Ｃ１−８アルキル（例えば、グルタル酸、コハク酸またはアジピン酸ジメチル−またはジエチルエステル、安息香酸またはフタル酸エチル、ブチル、ジブチルまたはジイソブチルエステル、及びアニスアルコールのようなＣ１−４アルキル）］が含まれ、好ましくはトリアルキルホスフェートである。有機溶媒の量は、微生物細胞懸濁液が例えば溶媒中に層流撹拌することにより、有機溶媒に分散され得るような量である。乾燥細胞重量１ｇあたり、例えば１〜１００ｍｌ（例えば、３〜５ｍｌ）の溶媒を使用することが好都合である。
【００３１】
細胞、ポリマー及び有機溶媒を含有する混合物を、例えば均質懸濁液が得られるまで或る時間撹拌し、グルタルアルデヒド、エピクロロヒドリン、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダソール、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、無水マレイン酸、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヘキサメチレンジイソシアネートのような二官能性物質で処理する。グルタルアルデヒドが好ましく使用される。微生物細胞を二官能性物質を用いて予備処理する場合には、予備処理で使用したのと同じ二官能性物質を使用することが好都合である。二官能性物質の量は臨界的でなく、乾燥細胞重量１００ｇあたり例えば０．５〜１００ｇの二官能性物質を使用する。例えば二官能性物質としてグルタルアルデヒドを使用する場合には、例えば２５％水溶液を１〜２００ｇ使用することが好都合である。細胞、ポリマー及び有機溶媒を含有する混合物に二官能性物質を添加すると、架橋が始まり、例えば数分以内に停止し得る。使用する溶媒混合物中に例えば微生物細胞の固体球状粒子を含む懸濁液が得られ得る。所望により、得られた懸濁液を、酵素活性に影響を与えない、例えば酵素活性を低下させない水混和性有機溶媒と接触させてもよい。前記有機溶媒の例には、アルコール、ケトン、ポリエチレングリコール、グリセロールが含まれるが、グリセロールが好ましい。例えば、得られた細胞懸濁液を有機溶媒に添加してもよく、または有機溶媒を得られた細胞懸濁液に添加してもよい。水混和性有機溶媒の量は臨界的でなく、反応混合物中で液体−液体２相系を形成するに十分な量であり得る。乾燥細胞重量１００ｇあたり、例えば１００〜５０００ｇ以上（例えば、５００〜５０００ｇ）の水混和性有機溶媒を使用し得る。溶媒が細胞懸濁液に接触すると、（例えば直ちに）相分離が起こり得る。形成された球状細胞粒子（例えば、固体）は、得られた水性下相中に存在し得る。例えば主として水と２相を形成し得る有機溶媒を含む上相は、下相から容易に、（例えば、実質的に）完全に分離され得、例えば次の固定化プロセスで再使用され得る。得られた球状細胞粒子は固体形態であってもよく、例えば多孔底部を有する容器への懸濁液の注入、遠心、濾過のような一般的方法により有機混和性溶媒相から単離してもよい。単離された球状粒子を、例えば湧水を用いて洗浄すると溶媒残留物が除去され得る。
【００３２】
架橋前に、すなわち二官能性物質の添加前（例えば、水と２相系を形成し得る溶媒の添加前）に、酸化アルミニウム、活性炭やベントナイトのような固体を細胞混合物に添加してもよい。固体の量は臨界的でなく、乾燥細胞重量１００ｇあたり５〜２００ｇ（例えば、５０〜１５０ｇ）の量を使用するのが好都合である。水と２相系を形成し得る有機溶媒中に懸濁させ、混合物中に２官能性物質を添加して架橋した後、球状細胞粒子が得られ得る。この粒子は特に簡単に単離され得、有利な狭い粒径分布範囲及び優れた機械的安定性を有し得る。
【００３３】
本発明に従って製造された（例えば、固体形態の）球状微生物細胞粒子のような生体触媒は、後続での使用のために保存され得る。例えば、冷所で、適当な緩衝液中に、凍結もしくは凍結乾燥形態で保存され得る。
【００３４】
本発明に従って得られ得る（例えば、得られた）酵素活性を有する微生物細胞含有球状粒子は新規である。
【００３５】
別の態様で、本発明は酵素活性を有する（例えば、固体形態の）微生物細胞含有球状粒子を提供し、その球状粒子は、
ｉ）酵素活性を有する微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、
ｉｉ）例えばステップｉ）を実施した後、例えば水と２相系を形成し得る溶媒に微生物細胞混合物を添加することにより、水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物と接触させるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離するステップ、
を含む方法により得られ得るかまたは得られ、前記方法は例えば更に、ステップｉ）またはｉｉ）を実施する前に微生物細胞を二官能性物質で予備処理し、及び／または球状粒子を単離する前にステップｉｉｉ）で得た混合物に水混和性溶媒を添加し、及び／またはステップｉ）で得た混合物またはステップｉ）を実施する前の微生物細胞に固体を添加することを含む。
【００３６】
本発明の方法により得られる酵素活性を有する（例えば、固体）球状粒子は酵素反応において有用であり得る。例えば、例えばＰＭＳＦで（予備）処理したＤＡＯ活性を有する（例えば、固体）球状粒子及び例えばＰＭＳＦで（予備）処理したＧＡＣ活性を有する（例えば、固体）球状粒子は、７−ＡＣＡ及び／またはＧｌ−７−ＡＣＡ及び／またはＨＡＣＡの製造において有用であり得る。
【００３７】
別の態様で、本発明はグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法を提供し、その方法は、
ｉ）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性を有する微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、
ｉｉ）例えばステップｉ）を実施後、例えば微生物細胞混合物を水と２相系を形成し得る溶媒に添加することにより、水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物と接触させるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離し、所望により例えばステップｉｉｉ）の前にまたは例えばステップｉ）の前に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性の存在下でエステラーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するか、またはステップｉｉｉ）で得たＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の存在下でエステラーゼ活性を有する球状粒子をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、及び
ｉｖ）セファロスポリンＣをステップｉｉｉ）で得た球状粒子と反応させて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得、所望によりグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を単離し、例えば更にステップｉｖ）で得たグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を７−アミノセファロスポラン酸に変換するステップを含む。
【００３８】
別の態様で、本発明はグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造方法を提供し、その方法は、セファロスポリンＣをステップｉｉｉ）で得られ得る球状粒子と反応させてグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を得、所望によりグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸を単離することを含む。
【００３９】
ステップｉｖ）で得たグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の７−アミノセファロスポラン酸への変換は、例えば本発明の上記したようにして得られ得るかまたは得られたＧＡＣ活性を有する球状粒子を用いて、一般的方法、例えば化学的または酵素的方法によりまたは本発明の別の態様に従って実施され得る。本発明により脱アセチラーゼ活性の存在下でＤＡＯ酵素活性を有する及び／または脱アセチラーゼ活性の存在下でＧＡＣ活性を有する球状粒子を使用すると、ＨＡＣＡをＣｅｐｈ  ＣまたはＧｌ−７−ＡＣＡとの反応で得ることができる。
【００４０】
別の態様で、本発明は、セファロスポリンＣまたはグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸からの７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸の製造における本発明の球状粒子の製造方法の使用または本発明により製造した球状粒子の使用を提供する。
【００４１】
本発明で製造した７−ＡＣＡまたはＨＡＣＡは、例えば上記したように、例えば
−環系の７位のアミノ基をアシル化することによる、
−環系の３位のアセトキシメチル基を更に反応させることによる、
−環系の４位のカルボキシル基をエステル化することによる、
−塩及び／または溶媒形成による、
セファロスポリン（例えば、セファロスポリン抗生物質）またはその製造における別の中間体の製造における中間体として有用である。
【００４２】
別の態様で、本発明は７−アミノセファロスポラン酸の製造方法をも提供し、その方法は、
ｉ）グルタリルアシラーゼ活性を有する微生物細胞を第１級もしくは第２級アミン含有ポリマーで処理するステップ、
ｉｉ）水と２相系を形成し得る有機溶媒を微生物細胞混合物と接触させるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得た混合物を二官能性物質で処理し、得られた球状粒子を単離するステップ、
ｉｖ）所望により、例えばステップｉｉｉ）または例えばステップｉ）の前に、グルタリルアシラーゼ活性の存在下でエステラーゼ活性を有する混合物をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するか、または所望によりステップｉｉｉ）で得たグルタリルアシラーゼ活性の存在下でエステラーゼ活性を有する球状粒子をフェニルメチルスルホニルフロリドで処理するステップ、
ｖ）グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸をステップｉｉｉ）で得たまたはステップｉｖ）で得た球状粒子と反応させて、７−アミノセファロスポラン酸を得、所望により得られた７−アミノセファロスポラン酸を単離することを含む。
【００４３】
別の態様で、本発明はセファロスポリン、例えばセファロスポリン抗生物質またはその製造における中間体の製造方法を提供し、この場合本発明により製造される７−アミノセファロスポラン酸または７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（例えば、７−アミノセファロスポラン酸）は中間体として使用される。
【００４４】
本明細書中、「実質的」とは、例えば元の値の９５％より大きく（例えば、９６％または９７％）、或いは場合により元の値の５％未満（例えば、４％または３％）であることを意味する。
【００４５】
以下の実施例において、温度はすべて℃で示す。
【００４６】
次の略号を使用する：
７−ＡＣＡ：７−アミノセファロスポラン酸、
Ｃｅｐｈ  Ｃ：セファロスポリンＣ、
ＤＡＯ：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、
ＧＡＣ：グルタリルアシラーゼ、
ＧＤＡ：グルタルアルデヒド、
Ｇｌ−７−ＡＣＡ：グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸、
ＫＡ−７−ＡＣＡ：α−ケトアジポリ−７−アミノセファロスポラン酸、
ＰＥＩ：ポリエチレンイミン、
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフロリド、
ＴＢＰ：ｎ−トリブチルホスフェート。
【００４７】
「１Ｕ  オキシダーゼ」の活性は、ｐＨ８及び２５℃において酸素飽和２０ｍＭ  Ｃｅｐｈ  Ｃ水溶液中での１μｍｏｌ／分のＧｌ−７−ＡＣＡ及びＫＡ−７−ＡＣＡの形成に相当する。
【００４８】
「１Ｕ  アシラーゼ」の活性は、ｐＨ８及び３７℃において２％  Ｇｌ−７−ＡＣＡ水溶液中での１μｍｏｌ／分のグルタル酸または７−ＡＣＡの形成に相当する。
【実施例１】
【００４９】
エステラーゼ活性が実質的にない、ＤＡＯ活性を有する混合物を得るための一般的方法
水中にエステラーゼ活性及びＤＡＯ活性を有する水性発酵ブロスから出発して、収集した細胞から一般的方法（例えば、Ｋｕｂｉｃｅｋ−Ｐｒａｎｚ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１，ｐｐ．６２４−６２８（１９８５）参照）に従って細胞ペレットを得る。こうして得た細胞ペレット（１０ｇ）を水（５０ｍｌ）中に再懸濁し、ｐＨ約１１、室温において苛性ソーダ溶液で約９０分間処理して、カタラーゼ活性を除く。混合物のｐＨを、リン酸を添加して約７に調節する。
【００５０】
得られた混合物に、１０ｍｇ  ＰＭＳＦ／ｍｌ−エタノールを含有するエタノール溶液（５００μｌ）を添加し、得られた混合物を室温で約３時間インキュベートする。得られた細胞懸濁液を、ＤＡＯ活性を必要とする反応にそのまま使用してもよい。
【００５１】
細胞ペレットのＤＡＯ活性：５３０Ｕ  オキシダーゼ。
【００５２】
苛性ソーダ処理後のＤＡＯ活性：４９０Ｕ  オキシダーゼ。
【００５３】
ＰＭＳＦ処理後のＤＡＯ活性：４５０Ｕ  オキシダーゼ（＝ＰＭＳＦ処理前の活性の９２％）。
【実施例２】
【００５４】
実施例１に記載のようにして得たＤＡＯ活性を有するＰＭＳＦ処理細胞懸濁液を、Ｃｅｐｈ  Ｃ（１０ｇ）の水（１０００ｍｌ）溶液に添加し、得られた溶液のｐＨを７．５に調節する。得られた混合物を、混合物に酸素を導入しながら室温で約１８０分間撹拌する。
【００５５】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：９１％。
【００５６】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００５７】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００５８】
ＰＭＳＦ処理なしのＤＡＯ活性を用いて実施例２を繰り返す。
【００５９】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：８８％。
【００６０】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００６１】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して６％。
【実施例３】
【００６２】
実施例１に記載のようにして得た細胞懸濁液をＰＭＳＦ処理前に均質化し（均質化細胞中のＤＡＯ活性：３８５Ｕ  オキシダーゼ）、得られた均質化細胞を実施例１に記載のようにＰＭＳＦで処理する（均質化し、ＰＭＳＦ処理した細胞中のＤＡＯ活性：ＰＭＳＦ処理前の活性の９６％に相当する３７２Ｕ  オキシダーゼ）。得られた細胞懸濁液を実施例１に記載のようにＣｅｐｈ  Ｃと反応させる。
【００６３】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：９３％。
【００６４】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００６５】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００６６】
ＰＭＳＦ処理なしのＤＡＯ活性を用いて実施例３を繰り返す。
【００６７】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：８９％。
【００６８】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００６９】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して７％。
【実施例４】
【００７０】
苛性ソーダ処理前の、実施例１に記載のように得た細胞ペレット（１０ｇ）を水（５０ｍｌ）に懸濁し、得られた懸濁液に分子量６００，０００〜１，０００，０００のポリエチレンイミン（２ｇ）を添加し、得られた混合物をｐＨ１１（苛性ソーダを添加して調節した）、室温において９０分間インキュベートする。得られた混合物のｐＨをリン酸を添加して８．５に調節し、得られた懸濁液をトルエン（５０ｍｌ）と共に撹拌する。溶媒中に微小滴様細胞粒子を含む乳濁液が得られ、これに２５％  ＧＤＡ溶液（８ｍｌ）を添加する。微小滴様細胞粒子は固化して固体球状粒子が形成される。固体球状粒子を単離し、湧水して洗浄する。
【００７１】
球状粒子中のＤＡＯ活性：２９０Ｕ  オキシダーゼ。
【００７２】
得られた固体球状粒子を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（５０ｍｌ）に懸濁し、実施例１と同様にしてＰＭＳＦ溶液（５００μｌ）と混合し、得られた混合物を１８０分間インキュベートする。
【００７３】
ＰＭＳＦ処理固体球状粒子中のＤＡＯ活性：３０５Ｕ  オキシダーゼ。
【００７４】
得られたＰＭＳＦ処理固体球状粒子は、実施例２と同様にＣｅｐｈ  Ｃ反応に使用される。
【００７５】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：９２％。
【００７６】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００７７】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００７８】
ＰＭＳＦ処理なしの固体球状粒子を用いて実施例４を繰り返す。
【００７９】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：８９％。
【００８０】
出発Ｃｅｐｈ  Ｃ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｃｅｐｈ  Ｃに対して３％。
【００８１】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｃｅｐｈ  Ｃに対して７％。
【実施例５】
【００８２】
発酵ブロスから単離した組換え大腸菌菌株、例えばＣＣＭ  ４２２９（ＧＡＣ活性：７２０Ｕ  アシラーゼ）の湿った細胞ペレット（１０ｇ）を洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（５０ｍｌ）中に再懸濁する。得られた懸濁液に、１０ｍｇ  ＰＭＳＦ／ｍｌを含有するエタノール溶液（０．５ｍｌ）を添加し、得られた混合物を室温において約３時間撹拌する。
【００８３】
ＧＡＣ活性：７０８Ｕ  アシラーゼ（ＰＭＳＦ処理前の活性の９８％）。
【００８４】
Ｇｌ−７−ＡＣＡ（１０ｇ）を水（１０００ｍｌ）に溶解し、ｐＨを８．２に調節する。上記のようにして得たＰＭＳＦ処理大腸菌懸濁液を添加し、得られた混合物を、ｐＨを約８．０〜８．２に維持しながら１２℃において約１８０分間撹拌する。
【００８５】
７−ＡＣＡの収率：９３％。
【００８６】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【００８７】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【００８８】
ＰＭＳＦ処理なしのＧＡＣ活性を用いて実施例５を繰り返す。
【００８９】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：９０％。
【００９０】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【００９１】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して７％。
【実施例６】
【００９２】
組換え大腸菌菌株、例えばＣＣＭ  ４２２９（ＧＡＣ活性：７２０Ｕ  アシラーゼ）の湿った洗浄細胞ペレット（１０ｇ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（５０ｍｌ）中に懸濁し、７００ｂａｒの圧力下で均質化する。均質化した細胞（ＧＡＣ活性：７５２Ｕ  アシラーゼ）を実施例５に記載のエタノール性ＰＭＳＦ溶液と混合する。
【００９３】
ＰＭＳＦ処理細胞中のＧＡＣ活性：７６８Ｕ  アシラーゼ。
【００９４】
得られた懸濁液をＧｌ−７−ＡＣＡ溶液に添加し、反応を実施例５に記載のように実施する。
【００９５】
７−ＡＣＡの収率：８９％。
【００９６】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【００９７】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【００９８】
ＰＭＳＦ処理なしのＧＡＣ活性を用いて実施例６を繰り返す。
【００９９】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：８３％。
【０１００】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【０１０１】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して６％。
【実施例７】
【０１０２】
組換え大腸菌菌株、例えばＣＣＭ  ４２２９細胞（ＧＡＣ活性：７３５０Ｕ  アシラーゼ）の湿った洗浄細胞ペレット（１０ｇ）由来の均質化細胞を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（５０ｍｌ）中に懸濁し、凝集剤（Ｓｅｄｉｆｌｏｃ（登録商標）ＣＬ  ９００−１８／４０，１ｍｌ）と混合する。得られた混合物のｐＨを酢酸を添加して５．２に調節し、得られた混合物を撹拌しながら約４０℃で約１時間インキュベートし、１０℃で更に約１時間撹拌する。得られた混合物を遠心して清澄化し、ＧＡＣ含有無細胞上清（ＧＡＣ活性：６１５０Ｕ  アシラーゼ）をｐＨ７．５に調節し、ＰＭＳＦ溶液と混合し、実施例５と同様にインキュベートする。
【０１０３】
ＰＭＳＦ処理後に得られた無細胞抽出物のＧＡＣ活性：６２２０Ｕ  アシラーゼ。
【０１０４】
得られた混合物をアクリル（固定化）ビーズ（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）Ｃ）と混合し、１モル硫酸ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）で処理し、振盪しながら室温において６４時間インキュベートする。得られた酵素含有担体材料を固定化溶液から分離し、実施例５と同様にＧｌ−７−ＡＣＡ溶液との反応において触媒として使用される。
【０１０５】
７−ＡＣＡの収率：９０％。
【０１０６】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【０１０７】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【０１０８】
ＰＭＳＦ処理なしの固定化ＧＡＣ活性を用いて実施例７を繰り返す。
【０１０９】
Ｇｌ−７−ＡＣＡの収率：８３％。
【０１１０】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【０１１１】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して６％。
【実施例８】
【０１１２】
ＧＡＣ活性を、ＰＭＳＦ処理を固定化後に実施せず、固定化中にＧＡＣ含有の無細胞上清、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ及び硫酸ナトリウムを含有する混合物中に実施例５と同様にＰＭＳＦ溶液（１ｍｌ）を添加する以外は実施例７と同様にして固定化する。
【０１１３】
得られた酵素含有ＰＭＳＦ処理担体材料を固定化溶液から分離し、実施例５と同様にＧｌ−７−ＡＣＡ溶液との反応において触媒として使用される。
【０１１４】
７−ＡＣＡ及び脱アセチル化生成物の収率は実施例７に記載の値と実質的に同じである。
【実施例９】
【０１１５】
ＧＡＣ含有上清を、ＰＭＳＦ処理を省いた以外は実施例７と同様にして作成する（ＧＡＣ活性：５８３０Ｕ  アシラーゼ）。得られた溶液をイオン交換樹脂（Ｒｅｌｉｔｅ（登録商標）Ｄｉａｉｏｎ−ＨＰＡ２５Ｌ）（４０ｇ）と混合し、得られた混合物をｐＨ７．５に調節し、振盪しながら室温において約３００分間インキュベートする。得られたイオン交換樹脂を単離し、洗浄する（ＧＡＣ活性：１８６５Ｕ  アシラーゼ）。
【０１１６】
得られた交換樹脂を５０ｍＭリン酸緩衝液（２００ｍｌ）中に懸濁し、実施例５で使用したようなＰＭＳＦ溶液（２ｍｌ）を添加し、得られた混合物を振盪しながら約１８０分間インキュベートする。
【０１１７】
ＰＭＳＦ処理イオン交換樹脂中のＧＡＣ活性：ＰＭＳＦ処理前の触媒の活性の９７％に相当する１８１０Ｕ  アシラーゼ。
【０１１８】
得られた酵素含有ＰＭＳＦ処理イオン交換樹脂は実施例５と同様にＧＬ−７−ＡＣＡ溶液との反応における触媒として使用される。
【０１１９】
出発Ｇｌ−７−ＡＣＡ溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して３％。
【０１２０】
得られた反応溶液中の３−脱アセチル化生成物の総量：出発Ｇｌ−７−ＡＣＡに対して６％。
【実施例１０】
【０１２１】
ａ．予備処理
トリグノプシス・バリアビリス細胞、例えばＡＴＣＣ  ５８５３６（湿潤重量５３５ｇ、ＤＡＯ活性：２５，９７０Ｕ  オキシダーゼ）を、発酵ブロス（２．７ｋｇ）中にｐＨ７．５、室温において２５％ＧＤＡ水溶液（２１ｇ）を約１時間撹拌添加することにより該発酵ブロスにおいて予備処理する。得られた細胞懸濁液から細胞を遠心により収集し、凍結状態で保存する。凍結した細胞マスを融解し、微細濾過により湧水で洗浄し、容量約７３５ｍｌまで濃縮する。
【０１２２】
濃縮細胞マス中のＤＡＯ活性：２６，３５０Ｕ。
【０１２３】
ｂ．ポリマー処理
ステップａに記載のようにして得た得た細胞マス（７３５ｍｌ、細胞乾燥重量１００ｇ）を、β−メルカプトエタノール（５ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）、及び水中に分子量６００，０００〜１，０００，０００のＰＥＩを含有する５０％ＰＥＩ水溶液（４０ｇ）と共に懸濁し（総容量約８０ｍｌ）、苛性ソーダ溶液を添加して調節したｐＨ１１及び室温において約９０分間ゆっくり撹拌する。得られた混合物のｐＨをリン酸を添加して９に調節する。
【０１２４】
ＤＡＯ活性：２４，３６０Ｕ（実施例１０ａに記載のようにして得た予備処理ＤＡＯ活性の９４％）。
【０１２５】
ｃ．架橋
撹拌容器中のＴＢＰ（３０００ｍｌ）に、ステップｂで得た細胞／ポリマー混合物を撹拌しながら室温において添加する。ＴＢＰ中の細胞／ポリマー液滴の均質分散液が約３０分以内に得られ、これに２５％  ＧＤＡ水溶液（４０ｇ）を添加する。直ちに架橋が始まり、数分後に停止し、細胞が固体球状粒子の形態で得られる。得られた混合物に１５〜２０℃においてグリセロール（２０００ｇ）を添加すると、ＴＢＰ相と水性相の相分離が生じる。主にグリセロール及び固体球状細胞粒子を含有する下相を、主にＴＢＰを含有する上相から分離する。得られた上相（２９００ｍｌ）を、例えば別の架橋バッチにおいて再使用してもよい。約９０分後、固体球状粒子を下相から分離し、ＴＢＰ及びグリセロール残渣を除去するために湧水で洗浄する。オキシダーゼ活性を有する湿った固体球状粒子５８０ｇが得られ、これは乾燥重量１２１ｇに相当する。固体球状粒子中の特異的ＤＡＯ活性は３２Ｕ／ｇ−湿潤重量（１５３Ｕ／ｇ−乾燥重量）である。すなわち、総ＤＡＯ活性は１８，５６０Ｕ（実施例１０ａに記載のようにして得た予備処理ＤＡＯ活性の７１％）である。
【実施例１１】
【０１２６】
実施例１０ｃで得た固体球状粒子（湿潤重量５８０ｇ）を湧水（２０００ｍｌ）中に懸濁し、室温で撹拌する。ＰＭＳＦ（２０ｍｇ）を無水エタノール（２０ｍｌ）中に溶解し、得られた溶液を約２分以内にオキシダーゼ懸濁液に添加する。混合物を約３時間インキュベートし、得られた固体球状粒子を単離し、水性エタノール（１０００ｍｌ，１０％）及び湧水で洗浄する。
【０１２７】
固体球状粒子５６３ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量１１８ｇに相当する。
【０１２８】
ＰＭＳＦ処理固体球状粒子中の特異的ＤＡＯ活性は３１Ｕ／ｇ−湿潤重量（１４８Ｕ／ｇ−乾燥重量）である。すなわち、総ＤＡＯ活性は１７，４５０Ｕ（実施例１０ａに記載のようにして得た予備処理ＤＡＯ活性の６７％、ＰＭＳＦ処理前の活性の９４％）である。得られた球状粒子中のエステラーゼ活性は実質的に除去されている。
【実施例１２】
【０１２９】
実施例１０ａ及びｂに記載のようにして製造した細胞／ポリマー混合物のｐＨをリン酸を添加して９．０に調節し、酸化アルミニウム（８０ｇ）を添加する。実施例１０ｃに記載のようにして得た混合物を用いて架橋を実施する。
【０１３０】
固体球状粒子６３０ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量１９３ｇに相当する。
【０１３１】
固体球状粒子中の特異的ＤＡＯ活性は２６Ｕ／ｇ−湿潤重量（８５Ｕ／ｇ−乾燥重量）である。すなわち、総ＤＡＯ活性は１６，４４０Ｕ（実施例１０ａに記載のようにして得た予備処理ＤＡＯ活性の６３％）である。粒子の粒径分布は２４０〜５００μｍの狭い範囲にある。
【実施例１３】
【０１３２】
グリセロールを添加しない以外は実施例１０と同様にして実施する。架橋後、懸濁液を約６０分間撹拌する。得られた懸濁液を、孔のサイズが得られる固体球状粒子のサイズよりも小さい多孔底部を有する容器に流すことにより、ＴＢＰ懸濁液中で得られた固体球状粒子を単離する。得られた固体球状粒子を湧水で洗浄することによりＴＢＰ残渣を除去する。
【０１３３】
固体球状粒子６１０ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量１２６ｇに相当する。
【０１３４】
固体球状粒子中の特異的ＤＡＯ活性は３６Ｕ／ｇ−湿潤重量（１７４Ｕ／ｇ−乾燥重量）である。すなわち、総活性は２１，９６０Ｕ（実施例１０ａに記載のようにして得た予備処理ＤＡＯ活性の８５％）である。
【実施例１４】
【０１３５】
実施例１０及び１１と同様にして得たＰＭＳＦ処理固体球状粒子（湿潤重量８１ｇ、ＤＡＯ活性：２，５００Ｕ）を、７５ｍＭ  Ｃｅｐｈ  Ｃ水溶液（ｐＨ７．２）（１Ｌ）と混合する。得られた混合物に５バール圧の空気を約８０分間流す。溶液を固体球状粒子から分離し、ＨＰＬＣにより分析する。０．６ｍＭ  Ｃｅｐｈ  Ｃ、７０．７ｍＭ  Ｇｌ−ＡＣＡ及び３ｍＭ  ＫＡ−７−ＡＣＡが別々の溶液中で測定される。
【０１３６】
毎回新鮮なＣｅｐｈ  Ｃ−溶液及び毎回実施例１４に記載されているのと同じＰＭＳＦ処理固体球状粒子を用いて、実施例１４を１４２回繰り返す。
【０１３７】
約１６０分のＣｅｐｈ  Ｃとの接触後バッチ１４２中の固体粒子から溶液を分離し、ＨＰＬＣにより分析する。０．５ｍＭ  Ｃｅｐｈ  Ｃ、６９．８ｍＭ  Ｇｌ−ＡＣＡ及び０．４ｍＭ  ＫＡ−７−ＡＣＡが別々の溶液中で測定される。
【０１３８】
バッチ１４２後、固体球状粒子を３０８時間使用した。
【０１３９】
固体球状粒子９３ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量２４ｇに相当する。
【０１４０】
得られた固体球状粒子中の特異的ＤＡＯ活性は１２Ｕ／ｇ−湿潤重量（４７Ｕ／ｇ−乾燥重量）である。すなわち、総活性は１，１２０Ｕ（元の活性の４５％）である。
【実施例１５】
【０１４１】
ＤＡＯ活性を有するスキゾサッカロミセス・ポンベ細胞、例えばＡＴＣＣ  ３８３９９及びＡＴＣＣ  ３８４３６（湿潤重量はそれぞれ８２ｇ及び９０ｇ）を、２５％  ＧＤＡ水溶液（３．３ｇ）を用いて実施例１０ａと同様にしてそれぞれ別々に予備処理し、収集し、凍結状態で保存する。融解後、混合物を湧水で洗浄し、濃縮して、例えばＡＴＣＣ  ３８３９９からは１６４ｍｌ中に２０．４ｇの乾燥物質、例えばＡＴＣＣ  ３８４３６からは１８０ｍｌ中に２４．１ｇの乾燥物質を得た。
【０１４２】
例えばＡＴＣＣ  ３８３９９及びＡＴＣＣ  ３８４３６の各細胞（乾燥重量７ｇ）を、実施例１０ｂに記載の５０％  ＰＥＩ水溶液（２．８ｇ）で別々に処理する。
【０１４３】
ＴＢＰ（２３０ｍｌ）中で２５％  ＧＤＡ水溶液（３．５ｇ）及びグリセロール（４００ｇ）を添加しながら実施例１０ｃと同様にして別々に得た懸濁液を用いて架橋を実施する。得られた固体球状粒子をシーブ上で湧水で洗浄してグリセロール及びＴＢＰ残渣を除去する。
【０１４４】
例えばＡＴＣＣ  ３８４３６からは、ＤＡＯ活性を有する固体球状粒子５９．５ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量１４．０ｇに相当する。例えばＡＴＣＣ  ３８３９９からは、ＤＡＯ活性を有する固体球状粒子５５．６ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量１６．１ｇに相当する。得られた固体球状粒子は、実施例１０ｃに記載のようにして得られる球状粒子と同様のＤＡＯ反応特性及び安定性を示す。
【０１４５】
スキゾサッカロミセス・ポンベは、各種酵素のクローニング及び発現用に好適である。他の生体触媒、例えば他の酵素活性を有する固体球状粒子は、本実施例に記載と同様の簡単な方法で得ることができる。
【実施例１６】
【０１４６】
プレウツロス・オストレアツス細胞（湿潤重量９０ｇ、１８，９７０Ｕ  ペニシリンＶアシラーゼ）を、２５％  ＧＤＡ水溶液（３．３ｇ）を用いて実施例１０ａと同様にして予備処理する。得られた細胞懸濁液から細胞を収集し、凍結状態で保存し、融解後湧水で洗浄し、微細濾過により濃縮する。
【０１４７】
得られた細胞（乾燥重量１８．６ｇ）を５０％  ＰＥＩ水溶液（７．４ｇ）で処理する。ＴＢＰ（５６０ｍｌ）中で２５％  ＧＤＡ水溶液（７．４ｇ）及びグリセロール（３７０ｇ）を添加しながら実施例１０ｃと同様にして架橋を実施する。得られた固体球状粒子をシーブを介して湧水で洗浄してグリセロール及びＴＢＰ残渣を除去する。
【０１４８】
ペニシリンＶアシラーゼを含有する固体球状粒子２２３ｇ（湿潤重量）が得られ、これは乾燥重量２９．４ｇに相当する。
【０１４９】
特異的ペニシリンＶアシラーゼは５０．４Ｕ／ｇ−湿潤重量である。すなわち、総ペニシリンＶアシラーゼは１１，２４０Ｕ（元の活性の５９％）である。
【０１５０】
１Ｕ  ペニシリンＶアシラーゼは、ｐＨ７．５及び２８℃においてリン酸緩衝Ｋ−ペニシリン−Ｖ水溶液（５０ｇ／ｌ）中での１μｍｏｌ／分の６−アミノペニシリン酸の形成に相当する。
【実施例１７】
【０１５１】
トリグノプシス・バリアビリス細胞、例えばＡＴＣＣ  ５８５３６（湿潤重量５４ｇ、ＤＡＯ活性：２，６００Ｕ  オキシダーゼ）を、実施例１０ａ及び１０ｂと同様にして製造する。
【０１５２】
トリグノプシス・バリアビリス細胞（乾燥重量約１０ｇ）を含有する細胞／ポリマー混合物を、（細胞乾燥重量１００ｇに対してＴＢＰ  ３０００ｍｌの代わりに）グルタル酸ジメチルエステル（３００ｍｌ）またはアジピン酸ジメチルエステル（３００ｍｌ）に撹拌しながら添加する以外は実施例１０と同様にして架橋を実施する。得られた各混合物において、該混合物に２５％  ＧＤＡ水溶液（５ｇ）及びグリセロール（４００ｇ）を添加しながら１５〜２０℃において実施例１０ｃと同様にして架橋を実施する。
【０１５３】
ＤＡＯ活性を有する固体球状粒子９３．４ｇ及び８６．９ｇ（湿潤重量）が得られ、これはそれぞれ乾燥重量２０．６ｇ及び２０．２ｇに相当する。
【０１５４】
特異的ＤＡＯ活性は１４．８Ｕ／ｇ−湿潤重量または１２．５Ｕ／ｇ−湿潤重量である。すなわち、総活性は１３８２Ｕ（元の活性の５３％）または１０８６Ｕ（元の活性の４２％）である。