(57)【要約】    【課題】  細胞培養からＤＮＡ抽出までを簡単に行なうことができるようにする。    【解決手段】  細胞培養チャンバー５で細胞を培養した後、液入口３からタンパク質との間にキレート化合物を生成しうる金属イオン及びリゾチームを供給し、加熱して、細胞の細胞膜を破壊し、タンパク質とその金属イオンによりキレート化合物を生成させる。その後、液入口３から溶出液を供給し、フィルター１０により、キレート化合物を生成したタンパク質１６を遮蔽しＤＮＡ１４を透過させることによりＤＮＡ１４を抽出する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体内部に形成され液体を流すことのできる流路、前記流路の両端部につながる液出入口、前記基体内部で前記流路の途中に設けられ、前記流路に対し段差をもち、液体の流通方向に直交する断面積が前記流路の断面積よりも大きくなった細胞培養チャンバー、及び前記流路で前記細胞培養チャンバーよりも出口側の部分で流路を遮るように配置され、ＤＮＡを透過させタンパク質より大きい分子を遮蔽するフィルターを前記基体に一体的に備え、
かつ前記基体には前記細胞培養チャンバーの温度を調節する温度調節機構を備えていることを特徴とするＤＮＡ抽出装置。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ抽出装置を使用し、以下の工程（Ａ）から（Ｃ）をその順に含んでＤＮＡを抽出することを特徴とするＤＮＡ抽出方法。
（Ａ）前記細胞培養チャンバーで細胞を培養する工程、
（Ｂ）前記ＤＮＡ抽出装置の液入口からタンパク質との間にキレート化合物を生成しうる金属イオン及びリゾチームを供給し、加熱して、細胞の細胞膜を破壊し、タンパク質と前記金属イオンによりキレート化合物を生成させる工程、及び
（Ｃ）その後、前記ＤＮＡ抽出装置の液入口から溶出液を供給し、前記フィルターにより、キレート化合物を生成したタンパク質を遮蔽しＤＮＡを透過させることによりＤＮＡを抽出する工程。
【請求項３】
前記金属イオンは亜鉛イオン、銅イオン又はコバルトイオンである請求項２に記載のＤＮＡ抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、μＴＡＳ（Micro Total Analysis Systems）、ＭＥＭＳ（マイクロマシン）、生化学、医学などの分野において、細胞からＤＮＡを抽出するための装置とそれを使ったＤＮＡ抽出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
創薬や食品、作物開発や遺伝子工学等の分野においては、幅広く、細胞を扱う研究が行なわれている。従来、細胞はシャーレなどに入れられた培養地等により培養され、様々な実験に用いられている。細胞の機能解明を行なう場合には、多くの薬品や導入物質による反応を調べる必要がある。したがって、特定の反応を効率よく、しかも少量の試料で結果が得られる方法が望まれている。
【０００３】
近年、分析化学の分野ではμＴＡＳの研究が盛んになりつつあり、マイクロチップのような小型の装置を用いて分析の高速化、省サンプル化、省溶媒化を図ることが期待されている。マイクロチップ上の微小空間中の反応では、従来の化学操作を用いた反応よりも反応効率を向上できる可能性も示されている。
【０００４】
また、培養された細胞から取り出されたＤＮＡをタンパク質などの不要な成分から分離するために、イオン交換クロマトグラフィーにより（非特許文献１参照。）、又はＣ18ビーズのベッドをマイクロ流路内に構築して、目的とするＤＮＡの分離抽出を行なっていた。そこで使用されるＤＮＡ抽出用マイクロ流路では、目的物質であるＤＮＡをイオン交換ビーズに吸着させ、最初に低い塩濃度でタンパク質などの不純物を溶出し、その後塩濃度の高い緩衝液（例えば、０．８Ｍ  ＮａＣｌ溶液）に替えてビーズに吸着していたＤＮＡを溶出していた。
【非特許文献１】Integrated Micro Device for DNA Extraction from A Single Hair, Nae Yoon Lee et al. Micro Total Analysis System 2002 Proceeding of the μTAS Symposium, November 3-7, 2002, Nara, Japan, Vol. 1, p.195-197
【非特許文献２】Agric. Biol. Chem., 53(4), p.1151-1152, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のＤＮＡ抽出用マイクロ流路を使用した方法では、イオン交換樹脂ビーズに吸着した目的のＤＮＡが溶出されないことが起こる。また溶出液を塩濃度の低い緩衝液から塩濃度の高い緩衝液に替えねばならず、操作が煩雑であった。
本発明の第１の目的は、細胞培養からＤＮＡ抽出までを１つの装置で行なうことのできる反応装置を提供することである。
本発明の第２の目的は、細胞培養からＤＮＡ抽出までを簡単に行なうことができる方法提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、マイクロ流路内に温度調節機能を有する細胞培養用チャンバーとフィルター機構を構築して細胞培養からＤＮＡ抽出まで一連の反応を１つの反応装置上で行なえるようにする。
そのための本発明のＤＮＡ抽出装置は、図1に概略的に示されるように、基体内部に形成され液体を流すことのできる流路６、その流路６の両端部につながる液出入口３，４、基体内部で流路６の途中に設けられ、流路６に対し段差をもち、液体の流通方向に直交する断面積が流路６の断面積よりも大きくなった細胞培養チャンバー５、及び流路６で細胞培養チャンバー５よりも出口側の部分で流路を遮るように配置され、ＤＮＡを透過させタンパク質より大きい分子を遮蔽するフィルター１０を基体に一体的に備え、かつ基体には細胞培養チャンバー５の温度を調節する温度調節機構を備えている。
【０００７】
本発明のＤＮＡ抽出方法は上記の本発明のＤＮＡ抽出装置を使用し、以下の工程（Ａ）から（Ｃ）をその順に含んでＤＮＡを抽出する。
（Ａ）細胞培養チャンバー５で細胞を培養する工程、
（Ｂ）ＤＮＡ抽出装置の液入口３からタンパク質との間にキレート化合物を生成しうる金属イオン及びリゾチームを供給し、加熱して、細胞の細胞膜を破壊し、タンパク質と前記金属イオンによりキレート化合物を生成させる工程、及び
（Ｃ）その後、ＤＮＡ抽出装置の液入口３から溶出液を供給し、フィルター１０により、キレート化合物を生成したタンパク質１６を遮蔽しＤＮＡ１４を透過させることによりＤＮＡ１４を抽出する工程。
【０００８】
本発明のＤＮＡ抽出方法において、マイクロ流路内に構築された細胞培養チャンバー５中の培養細胞１２にリゾチームを添加し、加熱（例えば９５℃）すると、細胞１２の細胞膜が破壊され、細胞１２内にあったＤＮＡ１４やタンパク質１６が放出される。タンパク質１６は金属イオンとの間にキレート化合物を生成（変性）し、分子量が増大する。１２ａは細胞膜が破壊された細胞を示している。
【０００９】
その後、溶出液が細胞培養チャンバー５に供給されると、ＤＮＡ１４はフィルタ１０を通過するが、タンパク質１６はキレート化合物を生成して分子量が増大しているためフィルタ１０を通過することができず、ＤＮＡ１４はタンパク質１６から分離される。
【００１０】
タンパク質との間にキレート化合物を生成しうる金属イオンは、２価の金属イオンであり、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）、銅イオン（Ｃｕ2+）又はコバルトイオン（Ｃｏ2+）であることが好ましい。これらの金属イオンは、ＺｎＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＣｏＣｌ2などの塩の適宜の濃度、例えば１重量％、の水溶液として添加することができる。
【００１１】
本発明者らは、ＤＮＡとタンパク質が共存する溶液にＺｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+などの２価の金属イオンを添加すると、遠心分離によってＤＮＡをタンパク質から容易に分離できることを見いだし、報告した（非特許文献２参照。）。これは、２価の金属イオンを添加すると、ＤＮＡは安定であるがタンパク質は金属イオンとの間にキレート化合物を生成して分子量が増大するためである。
【発明の効果】
【００１２】
従来法ではマイクロ流路を用いて細胞培養を行ない、細胞膜溶解後に除蛋白してＤＮＡを抽出する際、ＤＮＡのイオン交換樹脂ビーズにおける吸着や、除蛋白するのに煩雑な操作や複雑な流路系を用いる必要があるが、本発明においては簡単な一本のマイクロ流路で連続的に一連の操作を行なうことができる。
【００１３】
本発明により精製されたＤＮＡは次の分析、例えばＰＣＲやシーケンス解析用にその場で使用できる。
また本発明の装置は温度調節機能をもつので、二本鎖ＤＮＡを温度上昇（例えば６５℃）により一本鎖ＤＮＡを作成する装置としても用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図２は一実施例のＤＮＡ抽出装置を概略的に示した平面図、図３はその基体部分を流路に沿って切断した状態で示す断面図である。
ガラス基板１，２からなる基体内部に液体を流すことのできる流路６が形成され、流路６の一端には液入口３、他端には液出口４が外部に通じる開口として設けられている。基体内部で流路６の途中には、流路６に対し段差をもち、液体の流通方向に直交する断面積が流路６の断面積よりも大きくなった細胞培養チャンバー５が設けられている。
流路６の内壁面は、ＤＮＡの吸着を防ぐためにシリル化処理が施されていることが好ましい。
【００１５】
流路６で細胞培養チャンバー５よりも出口側の部分には、流路６を遮るようにフィルター１０が配置されている。フィルター１０はＤＮＡを透過させタンパク質より大きい分子を遮蔽する大きさの孔をもっている。
【００１６】
フィルター１０の一例は、無機系多孔質体で、孔径５００ｎｍ以上で３次元網目状に連続した貫通孔と、その貫通孔の内壁面に形成された孔径５〜１００ｎｍの細孔とを有し、細孔の全容積が１０ｍ3 ／ｔ以下であって全体に対して貫通孔の占める容積率が２０〜９０％で、全気孔中の細孔の占める容積率が１０％以上であるものである。
【００１７】
また、基体には細胞培養チャンバー５の温度を調節する温度調節機構が設けられている。温度調節機構は、基体の上面と下面にそれぞれ設けられたヒータ２０と温度センサー２２とからなっている。温度センサー２２により基板１，２の温度を検出し、その検出温度が所定の温度になるようにヒータ２０への通電量を制御する。
【００１８】
さらに具体的に説明すると、基板１，２はガラス基板、例えば合成石英ガラス基板である。一方のガラス基板１には液出入口３，４が貫通孔として形成され、他方のガラス基板２の片面には数１００μｍ以下の幅と深さをもつ微小な溝からなる流路６と、流路６より深く直径が１ｍｍ程度の円形凹部からなる細胞培養チャンバー５が形成されている。
【００１９】
基板２の流路溝６と細胞培養チャンバー５が形成された面に基板１の面が向かい合わせて密着させられ、液密に接合されて、内部に流路６及び細胞培養チャンバー５をもつ装置が形成されている。
ガラス基板１，２の接合には、後の製造方法で説明するように、例えばフッ酸溶液による接合などの手段を用いることができる。
【００２０】
貫通穴３，４の形状は実施例では上方になるほど広くなるようなテーパー形状に形成されているので、溶液の注入や排出の処理が容易になる。しかし、貫通穴３，４の形状はこのようなテーパー形状に限らず、垂直な壁面をもつ穴であってもよい。
【００２１】
このような構成の装置において、基板１が上側、基板２が下側になるように配置し、導入穴３から細胞を含んだ溶液を流し込むと、溶液は流路溝６に沿って流れるが、細胞培養チャンバー５で著しく流速が減少し、かつ細胞培養チャンバー５は流路溝６より下方に配置されているために、細胞は細胞培養チャンバー５に捕捉される。細胞培養チャンバー５は、流路溝６の底面より下方に存在し、また、細胞培養チャンバー５では液体の流速が減少しているために、細胞培養チャンバー５の底に沈んだ細胞には液体の流れる力が加わりにくく、底面への接着が促進される。
【００２２】
この実施例のＤＮＡ抽出装置で、例えば流路６は幅が０．１ｍｍ、深さが０．０５ｍｍ、細胞培養チャンバー５は直径１ｍｍの円形、深さが０．１ｍｍであったとすると、細胞培養チャンバー５は流路６に対してかなり大きな容量となるため、この部分では溶液の流れが非常に遅くなる。このため、この場所に細胞をトラップすることが可能となる。また、細胞培養チャンバー５の底に沈んだ細胞の付近は非常に静かな環境となり細胞が壁面に接着しやすい。この程度のサイズの細胞培養チャンバー５であれば、従来の系に比べて十分小さく、装置の特徴である微小空間を保つことができる。この実施例のように、流路６に対しては十分大きな容量であり、かつ微小空間の特徴を崩さない程度の細胞培養チャンバー５を形成することによって、微小空間に細胞をトラップし、かつ増殖させることが可能な装置を実現できる。
【００２３】
この実施例の製造方法を、石英ガラス基板を用いる場合を例にしてその製造方法を説明する。
石英ガラス基板２に流路６のための溝と細胞培養チャンバー５のための凹部を形成するには、洗浄したガラス基板２に薄膜形成装置（例えばスパッタ成膜装置）にてエッチング保護膜、例えばシリコン（Ｓｉ）薄膜を形成し、その上にそのエッチング保護膜をパターニングするためのフォトレジスト層を形成する。ガラス基板２としては、例えば直径３インチ、厚さが１ｍｍのものを使用する。エッチング保護膜となるシリコン薄膜の膜厚は、例えば２００ｎｍである。
【００２４】
次に、流路６のための溝と細胞培養チャンバー５のための凹部用に予めデザインしたフォトマスクを用いてフォトレジストを露光し、続いて現像してフォトレジストをパターニングする。フォトレジストの露光は、一般に半導体装置の製造に用いられているアライナを用いて行なうことができる。
【００２５】
次に、フォトレジストのパターンをマスクとしてエッチング保護膜をパターニングする。エッチング保護膜がシリコンであれば、ＲＩＥ（反応性イオンエッチング）、例えばＳＦ6ガス中での高周波プラズマを用いたドライエッチングなどを用いることができる。
【００２６】
次に、パターニングされたエッチング保護膜及びフォトレジストをマスクとして、ガラス基板２をエッチングして溝と凹部を形成する。ガラス基板２のエッチングには、例えば４６％フッ酸水溶液をエッチング液として使用し、３７℃で１２７分間反応させて流路及び細胞培養用チャンバーをウェットエッチングにより作製する。
その後、フォトレジストを除去し、エッチング保護膜をエッチング除去する。
【００２７】
一方、ガラス基板１に貫通穴３，４を開けるための加工は、例えばサンドブラスト等により行なうことができる。
このようにして所定の加工が施されて準備されたガラス基板１，２を重ね合わせて接合する。接合方法の一例として、例えば１％のフッ酸水溶液をガラス基板の界面に介在させ、必要に応じて１ＭＰａ程度の荷重を印加しつつ、室温で２４時間程度放置する。
その後、ダイサーによりダイシングして、内部に細胞培養チャンバー５と流路６をもつ基体を得る。
【００２８】
次にその基体内部の流路６の一部にフィルター１０として無機系多孔質体を形成する。その方法は次のように行なうことができる。まず、ポリエチレングリコール（分子量約１万）８．０ｇを１０-2Ｍ酢酸水溶液１００ｍｌに溶解する。氷冷下で、これにテトラメトキシシラン５０ｍｌを加え加水分解反応を行なう。数分間攪拌したのち透明溶液を濾過し、密閉容器に移し、４０℃の恒温漕中に保持すると、約６０分間でゲル化する。ゲル化後、２時間程度そのまま放置し熟成させる。０．０００１規定のアンモニア水溶液に２時間程度浸漬したのち、０．００１規定、０．０１規定、０．１規定のアンモニア水溶液にそれぞれ２時間程度ずつ漬け、最後に１規定アンモニア水溶液で一昼夜反応させる。その反応液の適量をシリンジポンプなどを用いて基体の穴４から注入し、空気圧で押して流路の所定の位置に詰める。その後、４０℃で乾燥した後、６０℃で２日間乾燥する。十分に乾燥したら６００℃で２時間程度の熱処理を行なう。
このようにして、目的のＤＮＡ抽出装置を得る。
【００２９】
最後に温調用ヒータを装置の細胞培養チャンバーの位置の上下に取り付ける。ヒータは図２に示されているような線状のものに限らず、ヒータ板としてもよい。ヒータ板の材料としては、ＮｉやＩＴＯ（indium tin oxide）などを用いることができる。
流路６の一部にフィルター１０として無機系多孔質体を形成する工程は、ガラス基板１，２を接合した後、ダイシングする前に行なってもよい。
【００３０】
無機系多孔質体を形成する上の方法では、ポリエチレングリコールの量を変化させることで無機系多孔質体の貫通孔の大きさを制御できる。１０-2Ｍ酢酸水溶液１００ｍｌに溶解させるポリエチレングリコールの量を変えて、できあがる無機系多孔質体の貫通孔の大きさを電子顕微鏡で観察したところ、上の条件では４〜６μｍ、ポリエチレングリコール量が９．５ｇで３μｍ、１０．０ｇで２μｍ、１０．３ｇで１μｍの貫通孔がそれぞれ形成される。
【００３１】
基体の材質としては、合成石英ガラス基板のほか、パイレックス（Corning Glass Works社（米国）の登録商標）ガラス基板などのガラス基板を初め、シリコン基板、耐薬品性のあるプラスチックなどを用いることができる。
【００３２】
フィルター１０として、ナノピラー構造を形成することもできる。ナノピラー構造としては、液の流れる方向に直交する方向に延びた微細な棒状のナノピラーが高密度に形成されたものであり、ナノピラー領域におけるナノピラーは、直径が１〜１０００ｎｍ、例えば２００ｎｍピッチが１〜２０００ｎｍ、例えば４００ｎｍの円柱状又は角柱状である。ピッチは対象となるＤＮＡが伸びた状態で通過できるように適当に設定する。
【００３３】
このようなナノピラーは、流路の溝や細胞培養チャンバーの凹部とともに形成すことができる。例えば、石英ガラス基板に電子ビーム用レジスト層を形成し、電子ビーム露光装置により、所定のパターンに直接描画して露光し、現像してレジストパターンを得る。そのレジストパターンを鋳型にしてニッケル層を電着しニッケルパターンを形成する。次に、そのニッケルパターンをマスクにしてＮＬＤ（磁気中性線放電）エッチング法により石英ガラス基板をドライエッチングしてピラーを形成する。ＮＬＤエッチングとはプラズマエッチングの一種で、コイルによってチャンバー内に磁気中性線を含む領域を生じさせ、この領域でプラズマを発生させることによって得た、低圧・高密度・低温のプラズマを用いてエッチングを行なうものである。微細加工に適し、かつエッチング速度も速い。
【００３４】
基体の内部に形成される流路６と細胞培養チャンバー５は図３に示されたものに限らない。例えば、流路６を穴３，４が形成されている基板１側に形成してもよく、細胞培養チャンバー５も穴３，４が形成されている基板１側に形成してもよい。
また、３枚の基板を張り合わせて基体とし、その内部に流路６と細胞培養チャンバー５が形成されるようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は細胞からＤＮＡを選択的に抽出するのに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明のＤＮＡ抽出方法を説明する概略図である。
【図２】一実施例のＤＮＡ抽出装置を示す概略平面図である。
【図３】同実施例を流路に沿って切断して示す断面図である。
【符号の説明】
【００３７】
３，４      液出入口
５      細胞培養チャンバー
６      流路
１０      フィルター
２０      ヒータ
２２      温度センサー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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