(57)【要約】【課題】トリアジン系農薬を速やかに完全に分解すること。【解決手段】ベータプロテオバクテリアに属する細菌及び／又はこれを含む複合微生物系を用いることにより、トリアジン系化合物、特にシマジンを広範囲な培養条件下で、より速やかに完全に分解することが可能である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌を単独で、または１種以上の共生菌と組み合わせて用いることを特徴とするハロゲン含有トリアジン系農薬の分解方法。
【請求項２】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌がベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株およびその変異株である請求項１に記載の分解方法。
【請求項３】
共生菌が、ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株、ロドコッカス  ロドクラウス、ステノトロフォモナス  マルトフィリア、ノカルディオイデス  ジェンセニ、ノカルディオイデス  フルヴス、ノカルディオイデス  シンプレックス、及びシュードモナス  エルギノーサから選ばれるいずれかである請求項１又は２に記載の分解方法。
【請求項４】
共生菌が、ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株である請求項１〜３のいずれかに記載の分解方法
【請求項５】
ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株とブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株の複合微生物系を用いる請求項１〜４のいずれかに記載の分解方法。
【請求項６】
ハロゲン含有トリアジン系農薬が、ｓ−トリアジン系農薬である請求項１〜５のいずれかに記載の分解方法。
【請求項７】
ハロゲン含有トリアジン系農薬が、シマジンまたはアトラジンである請求項１〜６のいずれかに記載の分解方法。
【請求項８】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌であって、シマジン分解能を有する細菌。
【請求項９】
ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
細菌がベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株である請求項８又は９に記載の細菌。
【請求項１１】
ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるハロゲン含有トリアジン分解菌の１種以上と、ハロゲン含有トリアジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する１種以上の共生菌を含有してなる複合微生物系。
【請求項１２】
複合微生物系が、シマジン又はアトラジンの分解能を有する請求項１１に記載の複合微生物系。
【請求項１３】
シマジン分解菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株である請求項１１又は１２に記載の複合微生物系。
【請求項１４】
共生菌が、ブラディリゾビウム  ジャポニカムに属する細菌である請求項１１〜１３のいずれかに記載の複合微生物系。
【請求項１５】
共生菌が、ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株である請求項１１〜１４のいずれかに記載の複合微生物系。
【請求項１６】
ブラディリゾビウム  ジャポニカムに属する細菌であって、ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるシマジン分解菌のシマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する細菌。
【請求項１７】
ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する請求項１６に記載の細菌。
【請求項１８】
ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株である請求項１７に記載の細菌。
【請求項１９】
請求項８〜１５のいずれかに記載の細菌又は複合微生物系の中から選ばれる少なくとも１種を微生物保持体に保持させた浄化用資材。
【請求項２０】
微生物保持体が、多孔質の木質炭化材料からなる請求項１９記載の浄化用資材。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の浄化用資材を含有してなるハロゲン含有トリアジン系農薬の浄化装置。
【請求項２２】
ハロゲン含有トリアジン系農薬がシマジン又はアトラジンである、請求項２１記載の浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トリアジン系農薬、より詳細にはハロゲン含有トリアジン系農薬を分解する方法及びトリアジン系農薬分解能、より詳細にはハロゲン含有トリアジン系農薬分解能、更に詳細にはシマジン分解能を有する新規微生物、当該微生物を含む複合微生物系、それらを保持した浄化用資材、及びそれを含有してなる浄化用装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日の農業生産を維持するには農薬が欠かせず、またゴルフ場などで場内の植物相を保つのにも農薬が多用されている。その一方で農薬は汚染物質となって環境に好ましからざる影響をもたらすこと、特に地下水の汚染源となることが懸念されている。飲料水としての地下水の使用が少なくなってきている日本では大きな問題とされていないが、飲料水の約７０％を地下水に依存している欧米では大きな問題となっている。また、残留農薬による土壌汚染の問題も有り、我が国では土壌残留性の高い（半減期が１年以上）有機塩素系殺虫剤は使用が禁止されているが、半減期が比較的短い農薬においても土壌中における分解物質（代謝物など）による二次汚染の問題が懸念されてきている。さらに、近年では、これらの汚染物質は超微量（数十ｐｐｔ程度）であっても生物の生殖器官に対して大きな影響を与えることが報告され、残留する農薬の完全な無害化が望まれてきている。
このためその機能を終えた農薬などが汚染物質となって環境に残留したり拡散するのを効果的に防止する技術の開発が望まれる。
【０００３】
シマジン（２−ｃｈｌｏｒｏ−４，６−ｂｉｓ（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ）やアトラジン（２−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−６−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ）などのトリアジン系農薬は長年にわたり、世界中で多用されており、環境汚染物質としても問題となっている。シマジンはゴルフ場等の雑草管理に広く使用されてきたが、平成６年に水質汚濁性農薬に指定されてからその使用量は減少してきている。しかし、シマジンはその半減期が長く（７０〜１１０日）、土壌吸着係数が低いために地下水や排水中から最も多く検出された農薬のひとつである。また、欧米ではアトラジンによる地下水の汚染が環境問題になってきている。これらの農薬はいずれも分子中に塩素原子及び窒素原子を含有し、難分解性である。
これらの農薬を除去する方法として、バルク重合や懸濁重合などの鋳型重合法により合成したレセプターポリマーを用いてシマジンやアトラジンなどのトリアジン系農薬を補足する方法（特許文献１参照）、プロトン遊離基を有するプレポリマーの共存下でトリアジン化合物を鋳型として鋳型重合法により合成したポリマーを用いてトリアジン化合物を分解する方法（特許文献２参照）などが報告されている。しかし、残留農薬などによる汚染は、汚染範囲が広く、かつ汚染濃度が極めて低いことから、これらの物理的手法や化学的手法によって完全に除去することは極めて困難であり、また、使用する化学物質により二次汚染の可能性もあり新たな手法が求められている。
【０００４】
広範囲かつ低濃度の化学物質の汚染に対して、物理的手法や化学的手法に代えて生物学的手法が注目されてきている。
土壌中には多種多様な微生物が生息しており、これらの微生物の中には、多くの農薬などにおける機能骨格となっている有機化合物を分解して無害化したり、あるいは環境中から消失させたりする能力を持つ分解菌が存在する。このような分解菌の能力を利用することで農薬などの汚染物質を環境から除去することが可能である。しかし自然のままの状態では、特定の有機化合物に対し分解能力のある分解菌の密度は低く、汚染物質が環境中に残留したり拡散するのを効果的に防止するまでには至らないのが通常である。
【０００５】
例えば、トリアジン系農薬であるアトラジンに関しては多くの微生物がこれを分解する事が知られているが、その多くは単独でアトラジンを完全に分解することができず、不完全な分解物による二次的な環境汚染が懸念される。この為に、複数の微生物を組合せてアトラジンを完全に分解する方法が試みられている。一方、同じくトリアジン系農薬であるシマジンはより難分解性であり、より深刻な環境汚染物質として懸念されている。アトラジン分解菌の多くはシマジンを分解するが、シマジンのトリアジン環を完全に分解するという報告は無く、不完全な分解物による二次的な汚染が生じる可能性がある。このように、トリアジン系農薬、特に塩素系のトリアジン農薬、具体的にはシマジンやアトラジンなどを完全に分解できる分解菌あるいは分解菌の組合せを見出すことが望まれていた。特にシマジンに関しては、二次的な環境汚染の心配のない完全分解に至る分解菌あるいは分解菌の組合せを見出すことが望まれていた。
そこでこのような分解菌を土壌中から選択的に集積且つ単離した後、これを単独、又は組合せて、農薬などの有機汚染物質を分解する方法が有効と考えられる。本発明者らは、多孔質の木質炭化材料を用いて土壌中の有機汚染物質を分解する分解菌を集積させる方法を開発してきた（特許文献３及び４参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２３９２９３号
【特許文献２】特開２００１−７９４１８号
【特許文献３】特開平１０−２２５２８８号（特許第３０３０３７０号）
【特許文献４】特開平１１−３１８４３５号（特許第２９０４４３２号）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はシマジンを分解することが出来る新規な細菌及び当該細菌と他の微生物を組合せた複合微生物系を提供すること、これらの細菌あるいは複合微生物系を用いたトリアジン系農薬の分解方法、特にシマジンの完全分解方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、多孔質の木質炭化材料を用いてシマジンなどの農薬を唯一の炭素源及び窒素源とする無機塩培地を還流させて、当該農薬の消失速度が増加した中からシマジン分解菌群ＣＤ７Ｗを分離した。そして、この分解菌群ＣＤ７Ｗの中から新規なシマジン分解菌を単離することに成功した。
【０００９】
本発明は前記の課題を解決する手段として、土壌からシマジンに対する集積培養をした後、単離することができるシマジン分解菌、それを含有する複合微生物系、それを用いたハロゲン含有トリアジン系農薬を分解する方法、及びそのための装置などを提供する。本発明のシマジン分解菌はベータプロテオバクテリアに属する新規細菌であり、具体的には配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ−ｒＲＮＡ）遺伝子を有することを特徴とするベータプロテオバクテリアに属するＣＤＢ２１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９５）などが挙げられる。
【００１０】
即ち、本発明は、ベータプロテオバクテリアに属する細菌を単独で、または１種以上の共生菌と組み合わせて用いることを特徴とするハロゲン含有トリアジン系農薬の分解方法に関する。
また、ベータプロテオバクテリアに属する細菌であって、シマジン分解能を有する細菌、即ちシマジン分解菌に関する。
さらに、本発明は、ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるシマジン分解菌の１種以上と、シマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する１種以上の共生菌を含有してなる複合微生物系に関する。
また、本発明は、前記した本発明のシマジン分解菌からなる微生物又は複合微生物系の中から選ばれる少なくとも１種を微生物保持体に保持させた浄化用資材、及びそれを含有してなるハロゲン含有トリアジン系農薬の浄化装置に関する。
また、本発明は、ブラディリゾビウム  ジャポニカムに属する細菌であって、ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるシマジン分解菌のシマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する細菌に関する。
【００１１】
本発明者らは、シマジン分解菌を探索するために多孔質の木質炭化材料（特許文献３及び４参照）を用いてシマジンなどの農薬を唯一の炭素源及び窒素源とする無機塩培地を還流させて、当該農薬の消失速度が増加した中からシマジン分解菌群ＣＤ７Ｗを分離した。具体的には、図１に示す集積装置を使用した。当該集積装置の土壌層タンク１に集積用土壌層２を形成し、この集積用土壌層２に、５〜１０ｍｍ程度に砕片化した木質炭化材料である人工マイクロハビタット５重量％を分解菌が生息すると思われる土壌に混入させた土壌を充填した。そしてシマジンのみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地３を貯液タンク４から集積用土壌層２に還流させた。還流液中のシマジンの残留濃度やシマジンの分解による塩化物イオンの濃度を測定し、所定の集積レベルに達した集積装置を回収し、集積用土壌層２から人工マイクロハビタットを取り出した。
この集積装置には、シマジンを唯一の炭素源及び窒素源とする菌が集積している可能性が高く、そして集積用土壌層２の人工マイクロハビタットは細菌類が生息し易い環境となっていることから、当該人工マイクロハビタットに目的のシマジン分解菌が集積している可能性が高くなっているはずである。そこで、この人工マイクロハビタットからシマジン分解菌のコロニーの形成を試みた。その結果、シマジンを５ｍｇ／Ｌ含む無機塩寒天培地平板からシマジン分解コロニーＣＤ７Ｗを単離することに成功した。
【００１２】
このシマジン分解コロニーＣＤ７Ｗから、シマジン分解菌を単離するためにこれをシマジン５ｍｇ／Ｌを含む０．１％バクトトリプトン寒天培地平板に接種し、同様に単コロニー分離を行なった。その結果、形態の異なる３種のコロニーが得られた。それぞれをＣＤ７ＷＬ、ＣＤＢ２１、及びＣＳＢ１と名付けた。
これらの菌株ＣＤ７ＷＬ又はＣＤＢ２１をシマジン約５ｍｇ／Ｌを含む培地に植菌して３０℃、１２０ｒｐｍで４日間振とうし、培養した後の培養液中のシマジン濃度は次の表１のとおりであった。なお、対照として菌株を植菌しないものを用いた。
【００１３】
2005027536.tif 000002
また、同様にして、菌株ＣＳＢ１又はＣＤＢ２１を用いてシマジン分解能を調べた。結果を次の表２に示す。
【００１４】
2005027536.tif 000003
【００１５】
この結果、速やかなシマジン分解を示したＣＤＢ２１株と異なり、ＣＤ７ＷＬ株及びＣＳＢ１株ではシマジン濃度が対照とほとんどかわらなかった。このことからＣＤ７ＷＬ株及びＣＳＢ１株はシマジン分解能を有しないと結論した。
しかし、ＣＤ７ＷＬ、ＣＤＢ２１、ＣＳＢ１はいずれも単独でシマジン５ｍｇ／Ｌを含む無機塩寒天培地平板に接種したところ明確なコロニーを形成しなかった。そこで、これらの微生物を組合せて同無機塩培地に接種したところ、ＣＤＢ２１とＣＳＢ１の組合せのみにコロニーが出現した。得られたＣＤＢ２１とＣＳＢ１よりなる複合微生物系はシマジン５ｍｇ／Ｌを含む無機塩寒天培地に接種することにより継代維持できることもわかった。
即ち、単離されたＣＤＢ２１は、単独でもシマジンを分解することができるが、これを継代培養する場合はＣＤＢ２１とＣＳＢ１よりなる複合微生物系が好ましいことがわかった。
【００１６】
次に単離したＣＤＢ２１の菌学的位置づけを行うために、形態的性質、培地における生育の様相および生理学的性質について検討した。培養温度は特記しない限り３０℃で実施し、次の表３に示す形態、培養、生理学的性質が認められた。
【００１７】
2005027536.tif 000004
Ｃ．生理学的性質
（１）  グラム染色                              ：  −
（２）  ３７℃における生育                      ：  ＋
（３）  ４２℃における生育                      ：  ＋
（４）  ４５℃における生育                      ：  ＋
（５）  カタラーゼ                              ：  ＋
（６）  オキシダーゼ                            ：  ＋
（７）  酸／ガス産生（グルコース）              ：  −／−
（８）  Ｏ／Ｆテスト（グルコース）              ：  −／−
（９）  好気条件下での生育性                    ：  ＋
（１０）  嫌気条件下での生育性                  ：  −
（１１）  マッコンキー寒天培地上の生育          ：  −
（１２）  硝酸塩還元                            ：  ＋
（１３）  インドール産生                        ：  −
（１４）  ブドウ糖  酸性化                      ：  −
（１５）  アルギニンジヒドロラーゼ              ：  −
（１６）  ウレアーゼ                            ：  −
（１７）  エスクリン加水分解                    ：  −
（１８）  ゼラチン加水分解                      ：  −
（１９）  β−ガラクトシダーゼ                  ：  −
（２０）  チトクロームオキシダーゼ              ：  ＋
（２１）  ブドウ糖資化性                        ：  −
（２２）  Ｌ−アラビノース資化性                ：  −
（２３）  Ｄ−マンノース資化性                  ：  −
（２４）  Ｄ−マンニトール資化性                ：  −
（２５）  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性  ：  −
（２６）  マルトース資化性                      ：  −
（２７）  グルコン酸カリウム資化性              ：  −
（２８）  ｎ−カプリン酸資化性                  ：  −
（２９）  アジピン酸資化性                      ：  −
（３０）  ＤＬ−リンゴ酸資化性                  ：  ＋
（３１）  クエン酸ナトリウム資化性              ：  −
（３２）  酢酸フェニル資化性                    ：  −              
【００１８】
上記の結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  第９版に従って同定を行なったところ、本発明のＣＤＢ２１株はシュードモナス群（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する菌株と推定された。
【００１９】
同様に、単離されたＣＳＢ１の菌学的位置づけを行うために、形態的性質、培地における生育の様相および生理学的性質について検討した。培養温度は特記しない限り３０℃で実施し、次の表４に示す形態、培養、生理学的性質が認められた。
【００２０】
2005027536.tif 000005
Ｃ．生理学的性質
（１）  グラム染色                              ：  −
（２）  ３７℃における生育                      ：  ＋
（３）  ４５℃における生育                      ：  −
（４）  カタラーゼ                              ：  ＋
（５）  オキシダーゼ                            ：  ＋
（６）  酸／ガス産生（グルコース）              ：  −／−
（７）  Ｏ／Ｆテスト（グルコース）              ：  −／−
（８）  好気条件下での生育性                    ：  ＋
（９）  硝酸塩還元                              ：  −
（１０）  インドール産生                        ：  −
（１１）  ブドウ糖  酸性化                      ：  −
（１２）  アルギニンジヒドロラーゼ              ：  −
（１３）  ウレアーゼ                            ：  ＋
（１４）  エスクリン加水分解                    ：  −
（１５）  ゼラチン加水分解                      ：  −
（１６）  β−ガラクトシダーゼ                  ：  −
（１７）  チトクロームオキシダーゼ              ：  ＋
（１８）  ブドウ糖資化性                        ：  −
（１９）  Ｌ−アラビノース資化性                ：  −
（２０）  Ｄ−マンノース資化性                  ：  −
（２１）  Ｄ−マンニトール資化性                ：  −
（２２）  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン資化性  ：  −
（２３）  マルトース資化性                      ：  −
（２４）  グルコン酸カリウム資化性              ：  −
（２５）  ｎ−カプリン酸資化性                  ：  −
（２６）  アジピン酸資化性                      ：  −
（２７）  ＤＬ−リンゴ酸資化性                  ：  −
（２８）  クエン酸ナトリウム資化性              ：  −
（２９）  酢酸フェニル資化性                    ：  −                
【００２１】
以上の結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  第９版に従って同定を行なったところ、本発明のＣＳＢ１株はシュードモナス群（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する菌株と推定された。
【００２２】
シュードモナス群に属する細菌は遺伝子的に多様な細菌を含む細菌群であることが知られており、本発明のＣＤＢ２１及びＣＳＢ１の菌学的性状のみから分類を同定することは困難と考え、ＣＤＢ２１及びＣＳＢ１の菌学的位置づけを遺伝子工学的側面から特徴付けるために、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定（解析）を行った。
本発明のＣＤＢ２１及びＣＳＢ１の菌体を用いてｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、公知のユーバクテリア１６Ｓ−ｒＲＮＡ増幅用プライマーを用いてＰＣＲ法によりＣＤＢ２１及びＣＳＢ１のそれぞれの１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、塩基配列を決定（解析）した。
以上により得られたＣＤＢ２１の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片の塩基配列より、両端のＰＣＲ用プライマー配列を除いた１４８８塩基を配列表の配列番号１に示す。更に、ＣＳＢ１について得られた１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片の塩基配列より、両端のＰＣＲ用プライマー配列を除いた１４６２塩基を配列表の配列番号２に示す。
【００２３】
配列番号１に示したＣＤＢ２１の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片塩基配列に対してジェネティクスＰＤＢ（ＧＥＮＥＴＹＸ  ＰＤＢ）を用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）  に登録された他の微生物が保有する１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の配列とＦＡＳＴＡ法により相同性比較を行なった。
その結果、ＣＤＢ２１は、未培養のバクテリアクローンＩ１２  （ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｉ１２，  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＹ１８７８９５）と９９．９％の相同性（１３６９／１３７０、ＩＮＴ．Ｓｃｏｒｅ  ＝  ５４７４、ＯＰＴ．Ｓｃｏｒｅ  ＝  ５４７４）を示した。これ以外では多くの未培養ベータプロテオバクテリア（ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂｅｔａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、未同定ベータプロテオバクテリア、チオバシラス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）などのベータプロテオバクテリアと９０％以上の相同性が得られた。
近隣結合法（ＮＪ法）により近縁株と系統樹を作成し、類縁関係を解析したところ、ベータプロテオバクテリアの範疇に属することが明らかとなった。以上より、本発明者らは本発明の菌株ＣＤＢ２１を、これまで単離培養されたことのない、いかなる既知の属種にも帰属しない新規なベータプロテオバクテリアに属するＣＤＢ２１株と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９５として寄託した。
【００２４】
同様に、配列番号２に示したＣＤＢ２１の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片塩基配列に対してジェネティクスＰＤＢ（ＧＥＮＥＴＹＸ  ＰＤＢ）を用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録された他の微生物が保有する１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の配列とＦＡＳＴＡ法により相同性比較を行なった。ＣＳＢ１はブラディリゾビウム  ジャポニカム  （Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ｓｔｒａｉｎ  ＵＳＤＡ  ６２，  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＡＦ２０８５１７）と９９．６％の相同性（１４５６／１４６２、ＩＮＴ．Ｓｃｏｒｅ  ＝  ５８１２、ＯＰＴ．Ｓｃｏｒｅ  ＝  ５８１２）を示した。ＤＮＡ塩基配列データベースに登録された他のブラディリゾビウム  ジャポニカム１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列とも９９％以上の相同性を示した。
近隣結合法（ＮＪ法）により系統樹を作成し、比較したところ、ＣＳＢ１はブラディリゾビウム  ジャポニカムの範疇に属する事が明らかとなった。以上より、本発明者らは本発明の菌株ＣＳＢ１をブラディリゾビウム  ジャポニカム  ＣＳＢ１株と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９４として寄託した。
【００２５】
次に本発明のＣＤＢ２１株によるシマジンの分解と菌の活性を更に詳細に検討した。バクトトリプトン１ｇ／Ｌ、シマジン５ｍｇ／Ｌを添加した培地に、ＣＤＢ２１株を接種して、３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、菌体の生育、シマジンの分解とそれに伴う塩素イオンの発生を測定した。結果を図２に示す。図２の白丸印（○）はシマジンの残存率（％）を示し、白四角印（□）は生成した塩素イオンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。図２のグラフの縦軸は左側がシマジンの残存率（％）を示し、右側が生成した塩素イオンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。横軸は培養時間（日）を示す。
シマジンは、培養開始後３日目に殆ど分解され、４日目にはほぼ完全に分解された。また、シマジンの分解量に見合った塩素イオンの生成が認められ、さらに菌体の増殖が認められた。このように本発明のＣＤＢ２１株は、約３日から４日でほぼ完全にシマジンを分解することができ、かつ培養条件によってはＣＤＢ２１株単独であっても菌体が増殖しながらシマジンを分解することができる。
【００２６】
次に、ＣＤＢ２１株との複合微生物系によるシマジンの分解を検討した。
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ／Ｌ、さらにシマジン５ｍｇ／Ｌを含有する平板培地にＣＤＢ２１株菌体を接種し、次いで他の菌株を接種した後に中央で両菌株を混合し、３０℃で７日間培養した。それぞれ単独で接種した部分には生育せず、培養器の中央部で混合した部分にコロニーが生じた組み合せを複合微生物系とした。このようにして複合微生物系を形成したコロニーから得られた複合微生物系をシマジン含有無機塩液体培地に接種し、３０℃、１２０ｒｐｍにて４日間振盪培養を行い、シマジンの分解を測定した。結果を表５に示す。検討した菌株のうち５種類との組み合せで、ＣＤＢ２１複合微生物系の構築が可能であり、いずれも無機塩培地中でシマジンを分解した。
【００２７】
【表５】
2005027536.tif 000006
【００２８】
次に、ＣＤＢ２１株若しくはＣＳＢ１株単独、又はＣＤＢ２１及びＣＳＢ１株との複合微生物系によるシマジンの分解を検討した。
シマジン含有無機塩液体培地にＣＤＢ２１株単独、若しくはＣＳＢ１株単独、又はＣＤＢ２１株及びＣＳＢ１株より構成される複合微生物系を接種した。３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、菌体の生育、シマジンの分解とそれに伴う塩素イオンの発生を測定した。結果を図３に示す。図３の（Ａ）はシマジンの残存率（％）を示し、図３の（Ｂ）は生成した塩素イオンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。図３の（Ａ）のグラフの縦軸はシマジンの残存率（％）を示し、図３の（Ｂ）は生成した塩素イオンの濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。横軸はいずれも培養時間（日）を示す。図３中の黒丸印（●）はＣＤＢ２１株を単独で接種した場合を示し、黒三角印（▲）はＣＳＢ１株を単独で接種した場合を示し、黒四角印（■）はＣＤＢ２１株及びＣＳＢ１株より構成される複合微生物系を接種した場合を示す。
この結果、ＣＤＢ２１株ではシマジンは培養開始後７日目に殆ど分解され、シマジンの分解量に見合った塩素イオンの生成が認められたが、この場合には菌体の増殖は殆ど認められなかった。ＣＳＢ１株では培養期間中、シマジンの分解、塩素イオンの生成、菌体の増殖のいずれも認められなかった。ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株より成る複合微生物系では、シマジンは培養開始後、１日間で速やかにシマジンが分解され、２日目には完全に分解された。また、シマジンの分解量に見合った塩素イオンの生成が認められ、複合微生物系の菌体の速やかな増殖が認められた。
【００２９】
次に、本発明のＣＤＢ２１複合微生物系によるシマジンの分解によりトリアジン環が開裂し無機化されるか否かについて検討した。まずシマジン含有無機塩培地にトリアジン環の炭素原子を１４Ｃで標識したシマジン（ｓｉｍａｚｉｎｅ−ｒｉｎｇ−ＵＬ−１４Ｃ）を添加した。本培地中には１４Ｃ標識シマジン０．７５ｍｇ／Ｌ及び非標識シマジン３．４ｍｇ／Ｌが含まれる。これにＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系を接種し、水酸化ナトリウムトラップを通過させた空気を２ｍｌ／分で連続的に通気させながら２５℃暗所にて８日間静置培養した。培養期間中、培養液中の１４Ｃ標識シマジン及びその代謝物濃度をラジオアナライザー付高速液体クロマトグラフで、捕集した１４Ｃ標識二酸化炭素を液体シンチレーションカウンターで定量した。結果を図４に示す。図４の黒丸印（●）は１４Ｃ標識シマジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を、黒四角印（■）は１４Ｃ標識シアヌール酸濃度（ｍｇ／Ｌ）を、黒三角（▲）は発生した１４Ｃ標識二酸化炭素の理論量に対する割合（％）を示す。図４の縦軸は左側が１４Ｃ標識シマジン及び１４Ｃ標識シアヌール酸の濃度（ｍｇ／Ｌ）を、右側が発生した１４Ｃ標識二酸化炭素量の理論量に対する割合（％）を示す。横軸は培養期間（日）を示す。
この結果、シマジンは培養６日目に大部分が分解し、８日目には完全に分解していた。シマジンの分解に伴い分解中間代謝産物であるシアヌール酸濃度が上昇したが、大量に蓄積する様子はなく、完全分解物である１４Ｃ標識二酸化炭素の発生が認められた。このことは本発明のＣＤＢ２１株や、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系によるシマジン分解は、トリアジン環も完全に分解し、シマジンを無害化することができることを示している。
【００３０】
次に、ＣＤＢ２１複合微生物系による各種のトリアジン系除草剤の分解について検討した。シマジン含有無機塩培地にシマジンの代りに各種のトリアジン系農薬５ｍｇ／Ｌを添加し、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株より構成される複合微生物系を接種した。３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、これらの除草剤の分解を測定した。結果を次の表６に示す。
【００３１】
【表６】
2005027536.tif 000007
【００３２】
この結果、トリアジン環の２位が塩素化されたシマジンとアトラジンは３日以内に速やかに分解されたが、塩素を持たない２位がチオメチル化されたシメトリン、プロメトリン、ジメタメトリンはこの培養条件では分解されなかった。
【００３３】
以上のように、本発明は、シマジンやアトラジンなどのハロゲン含有トリアジン系除草剤を効率良く分解し、無害化できる微生物、並びにそれを用いたハロゲン含有トリアジン系除草剤の分解方法、及びそのための前記微生物含有組成物を提供するものである。特に本発明は、シマジンを生物学的手法で効率良く分解できる単一の菌株が存在することを初めて報告するものであり、シマジンを分解、好ましくはほぼ完全に無害化できる能力を有する微生物又は複合微生物系を提供するものである。
本発明のシマジン分解菌ＣＤＢ２１株は、土壌からシマジンに対する集積培養後、単離したものであるが、これに限定されるものではなく、ベータプロテオバクテリアに属する細菌であってシマジンの分解能を有する細菌、好ましくはさらに前記したベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌が含まれる。
また、本発明のシマジン分解菌は、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列によっても特徴付けられるものである。即ち、本発明のシマジン分解菌は、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号１に記載された塩基配列、又は当該塩基配列と相同性、好ましくは５０％以上、７０％以上、より好ましくは８０％以上、又は９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する細菌であって、シマジンの分解能を有する、好ましくはさらに前記したベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株の菌学的特徴の一部又は全部を有するものが含まれる。
【００３４】
本発明のシマジン分解菌の具体的な一例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「ＣＤＢ２１」、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９５」として寄託されている新規ベータプロテオバクテリアを挙げることができるができるがこれに限定されるものではない。
【００３５】
更に本発明は、本発明の前記したシマジン分解菌と当該分解菌のシマジン分解及び／又は生育を補助する能力を持った微生物との組合せにより構成される複合微生物系を提供するものである。本発明の複合微生物系としては、ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるシマジン分解菌の１種以上と、シマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する１種以上の共生菌を含有してなる複合微生物系が挙げられる。本発明の複合微生物系は、トリアジン系農薬好ましくはハロゲン含有トリアジン系農薬の分解能を有する。
本発明の好ましい複合微生物系としては、シマジン分解菌が、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株である複合微生物系が挙げられる。
本発明のシマジン分解菌とこのような複合微生物系を構成することができる共生菌としては、ブラディリゾビウム・ジャポニカム、ロドコッカス・ロドクラウス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、ノカルディオイデス・ジェンセニ、ノカルディオイデス・フルヴス、ノカルディオイデス・シンプレックス、シュードモナス・エルギノーサなどが挙げられるが、本発明のシマジン分解菌と当該分解菌のシマジン分解及び／又は生育を補助する能力を持った微生物であれば、前記で例示した微生物に限定されるものではない。
このような複合微生物系を構成できるか否かは、シマジンを含有する寒天培地において、本発明のシマジン分解菌と他の菌を混合して接種して、培養後、コロニーを形成できるか否かにより判定することができる。コロニーを形成することができる菌の組み合わせは本発明の複合微生物系を構成できるものである。
【００３６】
本発明のシマジン分解菌と共に複合微生物系を構築することができる微生物の好ましい例としては、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「ブラディリゾビウム・ジャポニカムＣＳＢ１」、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９４」として寄託されている新規な細菌を挙げることができる。
また、ブラディリゾビウム・ジャポニカムに属する菌であって、本発明のシマジン分解菌のシマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する細菌、好ましくはさらに前記した菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌が含まれる。さらに、その１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号２に記載する塩基配列、又は当該塩基配列と相同性、好ましくは５０％以上、７０％以上、より好ましくは８０％以上、又は９０％以上の相同性を有する塩基配列を有する細菌であって、本発明のシマジン分解菌のシマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する、好ましくはさらに前記した菌学的特徴の一部又は全部を有するものが含まれる。
【００３７】
また、本発明は、ブラディリゾビウム  ジャポニカムに属する細菌であって、ベータプロテオバクテリアに属する細菌からなるシマジン分解菌のシマジンの分解及び／又は生育を補助する能力を有する細菌、好ましくはさらに前記したブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌を提供する。本発明のブラディリゾビウム  ジャポニカムに属する細菌としては、例えば前記してきたブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株などが挙げられる。
さらに、本発明は、ベータプロテオバクテリアに属する細菌であってシマジン分解能を有する細菌の１種以上を単独で、またはこれと１種以上の共生菌と組み合わせてなる複合微生物系を用いることを特徴とするトリアジン系農薬、好ましくはハロゲン含有トリアジン系農薬の分解方法を提供する。ベータプロテオバクテリアに属する細菌であってシマジン分解能を有する細菌としては、前記したシマジン分解菌およびその変異株から選ばれる細菌が挙げられる。このようなシマジン分解菌と組み合わされる共生菌としては、ブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株、ロドコッカス  ロドクラウス、ステノトロフォモナス  マルトフィリア、ノカルディオイデス  ジェンセニ、ノカルディオイデス  フルヴス、ノカルディオイデス  シンプレックス、及びシュードモナス  エルギノーサなどから選ばれる細菌が好ましいが、本発明のシマジン分解菌と当該分解菌のシマジン分解及び／又は生育を補助する能力を持った微生物であれば、前記で例示した微生物に限定されるものではない。好ましい共生菌としては、例えばブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１株が挙げられる。また、好ましい複合微生物系としては、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１株とブラディリゾビウム  ジャポニカムＣＳＢ１株からなる複合微生物系が挙げられる。
分解培養の際に使用する培地としてはシマジンを始めとするトリアジン系農薬を含有している無機塩培地を使用することが出来る。更に本発明分解菌単独で用いる場合は窒素源を添加できる。窒素源としてはトリプトン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アンモニウム塩、硝酸塩を使用することが出来る。炭素源の添加は必要ないが、シマジンを始めとするトリアジン系農薬が消費された後に菌体を維持するためにはＤＬ−リンゴ酸等の本分解菌が資化可能な炭素源を添加することが出来る。
本発明のトリアジン系農薬の分解方法におけるトリアジン系農薬としては、トリアジン環と共にハロゲン原子を含有するハロゲン含有トリアジン系農薬が挙げられる。当該ハロゲン含有トリアジン系農薬におけるハロゲン原子は、分子中のいずれに存在していてもよいが、好ましくはトリアジン環に直接結合するものが挙げられる。本発明のハロゲン含有トリアジン系農薬におけるハロゲンとしては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子などが挙げられるが、塩素原子が好ましい。また、トリアジン環としては３個の窒素原子を有する６員環からなるものであれば単環式、多環式、又は縮合環式のいずれでもよいが、好ましくはトリアジン環を１個含有するトリアジン系農薬が挙げられる。好ましいハロゲン含有トリアジン系農薬としては、ｓ−トリアジン骨格を有するシマジンまたはアトラジンなどが挙げられる。
【００３８】
また、本発明は、前記してきた本発明のシマジン分解菌又は本発明の複合微生物系の中から選ばれる少なくとも１種を微生物保持体に保持させた浄化用資材を提供する。本発明の微生物保持体としては、本発明のシマジン分解菌又は本発明の複合微生物系を安定に保持することができるものであれば特に制限はないが、多孔質素材、更に具体的には当該細菌又は複合微生物系を集積させた多孔質の木質炭化材料、竹炭材料、綿布材料などが挙げられる。より具体的には特開平１０−２２５２８８号（特許第３０３０３７０号公報）又は特開平１１−３１８４３５号（特許第２９０４４３２号公報）に記載の多孔質材料が挙げられ、これらの公報に記載の内容を本明細書に全て取り込む。
本発明の浄化用資材の製法としては、まず培地、例えば１／１０ＬＢ液体培地に多孔質資材、例えば炭、煉石あるいはバーミキュライトを入れて滅菌し、これに本発明で見出したシマジン分解菌を植菌して振とう培養し、培養終了後に培養液を除去することでシマジン分解菌を定着させた浄化用資材を得ることができる。
本発明の浄化用資材の大きさには特に制限はないが、１〜５０ｍｍ、好ましくは５〜２０ｍｍ、５〜１０ｍｍ程度の大きさが好ましい。本発明の浄化用資材は、このままトリアジン系農薬、好ましくはハロゲン含有トリアジン系農薬が残留している可能性のある土壌や用水などに混合して使用することができる。また、使用前に無機塩溶液で処理するか、無機塩溶液と共に使用することもできる。
本発明の浄化用資材は、図１に示される土壌層タンク１に単独で又は土壌と共に収納して汚染水などを浄化するための浄化装置とすることもできる。即ち、本発明は、前記した本発明の浄化用資材を含有してなるハロゲン含有トリアジン系農薬の浄化装置を提供する。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明のシマジン分解菌及び本発明複合微生物系を構成する共存細菌の単離培養、分類同定、更に本発明分解菌及び本発明複合微生物系を用いたシマジンを始めとするトリアジン系農薬分解の実験例を示して、本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  （単離培養）
図１に示すように、土壌層タンク１に集積用土壌層２を形成した。この集積用土壌層２は、５〜１０ｍｍ程度に砕片化した木質炭化材を人工マイクロハビタットとして用い、これを分解菌が生息する土壌に５重量％混入させて形成した。そしてシマジンのみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地３を貯液タンク４から集積用土壌層２に還流させた。還流液中のシマジンの残留濃度やシマジンの分解による塩化物イオンの濃度を測定し、所定の集積レベルに達した集積開始３週間後に集積用土壌層２から人工マイクロハビタットを取り出した。そしてこの分解菌集積済の人工マイクロハビタットを別に用意した人工マイクロハビタットに接種、つまり混入して人工マイクロハビタットだけによる集積用層を形成し、この集積用層に上記と同様な還流を行なった。そしてこの操作を３回繰り返した後、人工マイクロハビタットを取り出し、生理食塩リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で十分に洗浄後粉砕し、ＰＢＳで希釈後、シマジン５ｍｇ／Ｌを含む無機塩寒天培地平板に接種し、２５℃で７日間培養を行なった。生じたコロニーをシマジン５ｍｇ／Ｌを含む無機塩液体培地に接種し、２５℃で５日間培養を行なった後、シマジン分解の認められた培養液を再度シマジンを５ｍｇ／Ｌ含む無機塩寒天培地平板に接種し、シマジン分解コロニーＣＤ７Ｗを単離した。ＣＤ７Ｗをシマジン５ｍｇ／Ｌを含む０．１％バクトトリプトン寒天培地平板に接種し、同様に単コロニー分離を行なったところ形態の異なる３種のコロニーが得られた。それぞれを、ＣＤ７ＷＬ、ＣＤＢ２１、ＣＳＢ１と名付けた。
【００４１】
実施例２  （ＣＤ７ＷＬ、ＣＤＢ２１、及びＣＳＢ１のシマジン分解能の検定）シマジン約５ｍｇ／Ｌを含む１／１０Ｔ培地１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れ、これにシマジン分解コロニーから単離した各株を植菌して３０℃、１２０ｒｐｍで、４日間又は５日間振とう培養した後の培養液中のシマジン濃度を測定した。結果を前記表１及び表２に示す。
この結果、ＣＤＢ２１株のみが速やかなシマジン分解能を有することがわかった。
【００４２】
実施例３  （ＣＤＢ２１の菌学的性質）
実施例１にて単離したＣＤＢ２１の菌学的位置づけを行うために、形態的性質、培地における生育の様相および生理学的性質についてエヌシーアイエムビー・ジャパン社にて分析を行った。培養温度は特記しない限り３０℃で実施し、前記表３に示したとおりの形態、培養、生理学的性質が認められた。
上記の結果、本発明のＣＤＢ２１株はシュードモナス群（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する菌株と推定された。
【００４３】
さらに、実施例１で得られたＣＤＢ２１の菌学的性状から分類同定することは困難と考え、ＣＤＢ２１の菌学的位置づけを遺伝子工学的側面から特徴付けるために、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定（解析）を行った。
（１）実施例１で得られたＣＤＢ２１の菌体より、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  （株式会社キアゲン製）を用いてＤＮＡを調製した。
（２）上記、ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、公知のユーバクテリア１６Ｓ−ｒＲＮＡ増幅用プライマーを用いてＰＣＲによりＣＤＢ２１の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いてＤＮＡを精製した。
（３）上記精製ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして蛍光ラベルした公知のユーバクテリア１６Ｓ−ｒＲＮＡ塩基配列解析用プライマーを用いてサイクルシーケンス反応を行い、日立ＤＮＡシーケンサＳＱ５５００Ｅにより塩基配列の決定（解析）を行った。
【００４４】
以上により得られたＣＤＢ２１の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片の塩基配列より、両端のＰＣＲ用プライマー配列を除いた１４８８塩基を配列番号１に示す。
近隣結合法（ＮＪ法）により近縁株と系統樹を作成し、類縁関係を解析したところ、ベータプロテオバクテリアの範疇に属することが明らかとなった。以上より、本発明者らは本発明のＣＤＢ２１株をこれまで単離培養されたことのない、いかなる既知の属種にも帰属しない新規なベータプロテオバクテリアに属するＣＤＢ２１株と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９５として寄託した。
【００４５】
実施例４  （ＣＳＢ１の菌学的性質）
実施例１にて単離したＣＳＢ１の菌学的位置づけを行うために、形態的性質、培地における生育の様相および生理学的性質についてエヌシーアイエムビー・ジャパン社にて分析を行った。培養温度は特記しない限り３０℃で実施し、前記表４に示したとおりの形態、培養、生理学的性質が認められた。
以上の結果から、本発明のＣＳＢ１株はシュードモナス群（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｏｕｐ）に属する菌株と推定された。
【００４６】
実施例３と同様にしてＣＳＢ１について得られた１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子断片の塩基配列より、両端のＰＣＲ用プライマー配列を除いた１４６２塩基を配列番号２に示す。
さらに、実施例３と同様に、近隣結合法（ＮＪ法）により系統樹を作成し、比較したところ、ＣＳＢ１はブラディリゾビウム  ジャポニカムの範疇に属する事が明らかとなった。以上より、発明者らは本菌株をブラディリゾビウム  ジャポニカム  ＣＳＢ１株と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３９４として寄託した。
【００４７】
実施例５  （ＣＤＢ２１株によるシマジンの分解培養）
精製水１リットルあたりバクトトリプトン１ｇを溶解し、メタノール１ｍｌに懸濁したシマジン５ｍｇを添加した後、１２１℃、２０分間蒸気滅菌した。本培地５０ｍｌを滅菌した５００ｍｌの三角フラスコに分注し、１白金耳のＣＤＢ２１株を接種した。３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、菌体の生育、シマジンの分解とそれに伴う塩素イオンの発生を測定した。結果を図２に示す。
【００４８】
実施例６  （ＣＤＢ２１株との複合微生物系の作製）
精製水１リットルあたりＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  １．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇを溶解し、メタノール１ｍｌに懸濁したシマジン５ｍｇを添加し、寒天（ＡＧＡＲ  ＮＯＢＬＥ  ，  ＤＩＦＣＯ）１．５ｇを加えた後、１２１℃、２０分間蒸気滅菌した。滅菌後、微量要素液１０ｍｌを添加してシマジン含有無機塩寒天培地を作製し平板とした。微量要素液は精製水１リットルあたりＥＤＴＡ  ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３０ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２４ｍｇ、ＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４  ５ｍｇ、Ｃａ（ＯＨ）２  ５０ｍｇを溶解した後、１２１℃、２０分間蒸気滅菌して調製した。
１白金耳のＣＤＢ２１株菌体を平板の半分に塗抹し、残りの半分に他の菌株を塗抹した後に中央で両菌株を混合し、３０℃で７日間培養した。それぞれ単独で塗抹した部分には生育せず、中央で混合した部分にコロニーが生じた組み合せを複合微生物系とし、１白金耳をシマジン含有無機塩寒天培地から寒天を除いたシマジン含有無機塩液体培地１０ｍｌに接種し、１００ｍｌの三角フラスコ中で３０℃、１２０ｒｐｍにて４日間振盪培養を行い、シマジンの分解を測定した。結果を前記した表５に示す。検討した菌株のうち５種類との組み合せで、ＣＤＢ２１複合微生物系の構築が可能であり、いずれも無機塩培地中でシマジンを分解した。
【００４９】
実施例７  （ＣＤＢ２１複合微生物系によるシマジン分解培養）
実施例６記載のシマジン含有無機塩液体培地５０ｍｌを滅菌した５００ｍｌ三角フラスコに分注し、１白金耳のＣＤＢ２１株あるいはＣＳＢ１株あるいはＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株より構成される複合微生物系を接種した。３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、菌体の生育、シマジンの分解とそれに伴う塩素イオンの発生を測定した。結果を図３に示す。
【００５０】
実施例８（ＣＤＢ２１複合微生物系によるトリアジン環の分解）
実施例６記載のシマジン含有無機塩培地にトリアジン環の炭素原子を１４Ｃで標識したシマジン（ｓｉｍａｚｉｎｅ−ｒｉｎｇ−ＵＬ−１４Ｃ）を添加した。本培地中には１４Ｃ標識シマジン０．７５ｍｇ／Ｌ、非標識シマジン３．４ｍｇ／Ｌが含まれる。これにＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系を接種し、水酸化ナトリウムトラップを通過させた空気を２ｍｌ／分で連続的に通気させながら２５℃暗所にて８日間静置培養した。培養期間中、培養液中の１４Ｃ標識シマジン及びその代謝物濃度をラジオアナライザー付高速液体クロマトグラフで、捕集した１４Ｃ標識二酸化炭素を液体シンチレーションカウンターで定量した。結果を図４に示す。図４の黒丸印（●）は１４Ｃ標識シマジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を、黒四角印（■）は１４Ｃ標識シアヌール酸濃度（ｍｇ／Ｌ）を、黒三角（▲）は発生した１４Ｃ標識二酸化炭素の理論量に対する割合（％）を示す。図４の縦軸は左側が１４Ｃ標識シマジン及び１４Ｃ標識シアヌール酸の濃度（ｍｇ／Ｌ）を、右側が発生した１４Ｃ標識二酸化炭素量の理論量に対する割合（％）を示す。横軸は培養期間（日）を示す。
この結果、シマジンは培養６日目に大部分が分解し、８日目には完全に分解していた。シマジンの分解に伴い分解中間代謝産物であるシアヌール酸濃度が上昇したが、大量に蓄積する様子はなく、完全分解物である１４Ｃ標識二酸化炭素の発生が認められた。このことは本発明のＣＤＢ２１株や、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系によるシマジン分解は、トリアジン環も完全に分解し、シマジンを無害化することができることを示している。
【００５１】
実施例９（ＣＤＢ２１複合微生物系によるシマジン分解の安定性）
実施例６記載のシマジン含有無機塩液体培地２００ｍｌと木炭をＡｕｄｕｓの還流装置（１９５０，  Ｎａｔｕｒｅ，  １６６，  ３５６）の所定の位置に入れ、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系を接種した後、本液体培地を還流させた。７日目に還流液を新規なものと交換した後に、木炭上に水田土壌あるいはバーク堆肥を重層し、さらに還流を計５８日間継続した。５、９、１２、１６，１９、２７、３３、４０、４７、５４日目には５０００ｍｇ／Ｌに調製したシマジンのアセトン溶液を適量添加した。また７、１４、２２、３０、３７、４４及び５１日目に還流液そのものを新規なものと交換した。還流期間中、還流液を適宜採取してそのシマジン濃度を高速液体クロマトグラフ法にて測定した。結果を図５に示す。図５の黒四角印（■）は７日目に水田土壌を重層した場合の還流液中シマジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を、黒丸印（●）７日目にバーク堆肥を重層した場合の還流液中シマジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。図５の縦軸はシマジン濃度（ｍｇ／Ｌ）を、横軸は培養期間（日）を示す。
この結果、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系は、木炭の存在下で速やかにシマジンを分解した。この複合微生物系のシマジン分解能は、木炭の上部に多様な微生物を含む水田土壌やバーク堆肥を重層した後であってもその影響を全く受けなかった。以上の結果より、本発明のＣＤＢ２１株や、ＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株を含む複合微生物系によるシマジン分解は、一旦それが形成されれば他の微生物の影響を受けにくく、非常に安定であることを示している。
【００５２】
実施例１０  （ＣＤＢ２１複合微生物系によるトリアジン系除草剤の分解）
実施例６記載のシマジン含有無機塩培地にシマジンの代りに各種トリアジン系農薬５ｍｇ／Ｌを添加し、１０ｍｌの培地に１白金耳のＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株より構成される複合微生物系を接種した。１００ｍｌ三角フラスコ中で３０℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行い、シマジンの分解を測定した。結果を前記した表６に示す。２位が塩素化されたシマジンとアトラジンは３日以内に速やかに分解されたが、２位がチオメチル化されたシメトリン、プロメトリン、ジメタメトリンはこの培養条件では分解されなかった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明の分解菌によりトリアジン系農薬、特にシマジンを分解する事ができる。更に本発明の複合微生物系を用いる事により広範囲な培養条件下でより速やかに完全に当該農薬を分解することが可能であり、環境に残留することにより、環境汚染の原因となる農薬の分解法が提供される。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の集積方法で用いる装置の模式図である。
【図２】図２は、実施例５におけるＣＤＢ２１株によるシマジンの分解を示すグラフ図である。
【図３】図３は、実施例７におけるＣＤＢ２１株とＣＳＢ１株より構成される複合微生物系によるシマジンの分解及びＣＤＢ２１株、ＣＳＢ１株との比較を示すグラフ図である。
【図４】図４は、実験例８における炭素１４標識シマジンの分解を示すグラフ図である。
【図５】図５は、実験例９におけるシマジンの分解を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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