(57)【要約】【課題】ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成能を備える菌体から、分子量の低下を招くことなく、安価で簡便な方法により高純度のＰＨＡが得られるＰＨＡ精製方法を提供する。【解決手段】ＰＨＡを含有する菌体に塩基性成分を添加してＰＨＡを分離精製した後、更に、この分離精製したＰＨＡに次亜塩素酸塩を添加して分離精製するという安価で簡便な方法を採用することにより、分子量の低下を招くことなく、高純度のＰＨＡが得られる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える菌体からＰＨＡを分離して精製するＰＨＡ精製方法であって、
前記菌体によりＰＨＡを生成させて、ＰＨＡを含有する菌体を得る工程と、
前記ＰＨＡを含有する菌体に塩基性成分を添加して、第１ＰＨＡ画分を分離する工程と、
前記第１ＰＨＡ画分に次亜塩素酸塩を添加して、第２ＰＨＡ画分を分離する工程と、を含むＰＨＡ精製方法。
【請求項２】
前記ＰＨＡは、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）である請求項１記載のＰＨＡ精製方法。
【請求項３】
前記塩基性成分は、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムを含む請求項１又は２記載のＰＨＡ精製方法。
【請求項４】
前記塩基性成分は、界面活性剤を含む請求項１から３いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【請求項５】
前記次亜塩素酸塩は、次亜塩素酸ナトリウム及び／又は次亜塩素酸カリウムを含む請求項１から４いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【請求項６】
前記菌体は、ＰＨＡ生産遺伝子組み換え大腸菌である請求項１から５いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を有する菌体を利用して生成させたＰＨＡを精製する方法に関する。ここで、ＰＨＡは、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ＰＨＢとＰＨＶとの共重合体、ＰＨＢとＰＨＨｘとの共重合体等を含むことができる。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる合成プラスチックは腐りにくく、不要になった合成プラスチックの処理には種々の困難性を伴う。このため、自然界に存在する生物により消化分解され、最終的には水と二酸化炭素になる生分解性プラスチックが着目されている（例えば、特許文献１から６）。このような生分解性プラスチックの一例としては、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ、poly(3-hydroxybutyric  acid)）を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ、polyhydroxyalkanoic  acid）が挙げられる。このＰＨＡは、ある種の菌が細胞内蓄積物質として生産するエネルギー物質であると同時に、熱可塑性で、生分解性のあるポリマーとして今後の需要の高まりが見込まれている材料の一つである（例えば、非特許文献１から３）。
【０００３】
しかしながら、その生産コストの高さ故、今日まで大規模に生産された例はごくわずかである。ＰＨＡ、特にＰＨＢの生産において、その生産コストを低減する方法としては、培地コストの低減化、培養効率の向上、ＰＨＢの菌体からの抽出、及び、精製工程の簡略化などが挙げられる（非特許文献４、５）。例えば、ＰＨＢを含有する微生物菌体の高圧ホモジナイザーを利用したＰＨＢの分離精製方法（特許文献７）や、ＰＨＢを含有する微生物菌体の懸濁液のｐＨを調整して行うＰＨＢの回収方法（特許文献８）の他、微生物菌体の懸濁液に界面活性剤を添加したＰＨＢの分離精製方法（特許文献９）や、金属塩や界面活性剤を添加したＰＨＢの抽出方法について報告なされている（特許文献１０）。また、菌体からのＰＨＢ抽出、精製工程では、現在のところクロロホルム等の塩素系有機溶媒を用いる方法（非特許文献６）、次亜塩素酸と界面活性剤を組み合わせて用いる方法（非特許文献７）、超臨界水を用いる方法（非特許文献８）、ファージの溶菌酵素遺伝子を組み込んだＰＨＢ生産遺伝子組み換え大腸菌にＰＨＢを生産させ、自己溶解後、ＰＨＢを精製する方法（非特許文献９）などが提案されている。
【０００４】
しかしながら、有機溶媒を用いる方法は、有機溶媒が大量に必要であるため、環境面に与える影響も考慮しなければならないことに加え、ＰＨＢを溶解した溶液の粘度が著しく高くなってしまうことなどから実用化は困難である。また、次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理方法は、ＰＨＢの分子量が低下することが知られており、高分子量のＰＨＢを得ることが難しい。これら以外の他の方法も、コストや効率の面などから実用化には更なる技術的改変が必要と考えられている。この点、Ｌｅｅらの報告によれば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＢ生産遺伝子を組み込んだ、遺伝子組み換え大腸菌Ｅｓｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ｐＳＹＬ１０７）を０．２Ｎ水酸化ナトリウム処理することで、分子量の低下を引き起こすことなく高純度のＰＨＢを精製できるとされている（非特許文献２）。また、ＰＨＢを多量に蓄積したＰＨＢ生産遺伝子組み換え大腸菌は比較的破壊されやすく、他のＰＨＢ生産菌に比べてＰＨＢの精製が容易である旨が示唆されている（非特許文献１０）。
【０００５】
一方、従来より得られているＰＨＢの重量平均分子量は５０万から１００万程度であり、このようなＰＨＢは硬くて脆いといった欠点を有するため、その応用範囲が限定される（非特許文献１１、１２）。この点、土肥らによれば、重量平均分子量が２００万から３００万程度のＰＨＢは、その成形法を工夫することにより物性が格段に向上し、石油由来のポリマーと同等若しくはそれ以上の物性を有する旨が報告されている（非特許文献１１、１２）。この分子量２００万から３００万程度のＰＨＢ（超高分子量ＰＨＢ）はＰＨＢ生産遺伝子を組み込んだ遺伝子組み換え大腸菌で生産されることがわかっており、この遺伝子組み換え大腸菌にＰＨＢを生産させ、分子量の低下を招くことなく簡便な方法で安価に高純度のＰＨＢを得る技術を開発することは、ＰＨＢの量産化にとって有益である。
【特許文献１】特開平１１−３３２５８８号公報
【特許文献２】特開平６−４９２７５号公報
【特許文献３】特開平１０−２１９０８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２６４号公報
【特許文献５】特開２００１−４００７９号公報
【特許文献６】特開２００２−１７３５５３号公報
【特許文献７】特開平７−１７７８９４号公報
【特許文献８】特開平１１−２６６８９１号公報
【特許文献９】特開２００１−４６０９４号公報
【特許文献１０】特開２００１−５７８９５号公報
【非特許文献１】Lee,  Sang  Yup  et  al.,  J.  Env.  Poly.  Deg.,  Vol.  2,No.  3  (1994) pp.  169-176
【非特許文献２】Choi,J.  and  Lee,S.Y.,  Biotechnology  and  Bioengineering,  Vo.  62,  No.  5  (1999) pp.  546-553
【非特許文献３】Lee,  Sang  Yup,  Biotechnology  and  Bioengineering,  Vo.  49,  No.  1  (1996)  pp.  1-14
【非特許文献４】Akiyama,  M.,  Tsuge,  T.  and  Doi,  Y.  Poly.  Degrad.  Stabil.,  Vo.80,  (2003)  pp.  183-194
【非特許文献５】Choi,  J.  and  Lee,  S.  Y.,  Biopro.  Eng.,  Vo.  17,  (1997)  pp.  335-342
【非特許文献６】Haln,  S.K.,  Chang,  Y.K.,  Kim,  B.S.  and  Chang,  H.N.,  Biotechnology  and  Bioengineering,  Vo.  44,  (1994)  pp.  256-261
【非特許文献７】Ramsay,  J.A.,  Berger,  E.,  Ramsay,  B.A.  and  Chavarie,  C.,  Biotechol.  Tech.,  Vo.  4,  (1990)  pp.  221-226
【非特許文献８】Hejazi,  P.,  Vasheghani,F.E.  and  Yamini,Y.,  Biotechol.  Prog.,  Vol.  19,  (2003)  pp.  1519-1523
【非特許文献９】Resch,S.,  Gruber,K.,  Wanner,G.,  Slater,S.,  Dennis,D.  and  Lubitz,W.,  J.  Biotech.,  Vol.  65,  (1998)  pp.  173-182
【非特許文献１０】Hahn,S.K.,  Change,Y.K.  and  Lee,S.Y.,  Appl.  Enviro.  Microbiol.,  Vol.  61,  (1995) pp.  34-39
【非特許文献１１】Kusaka,S.,  Iwata,T.  and  Doi,Y.,  J.  Macromol.  Sci.,  Pure  Appl.  Chem.,  Vol.  A35,  (1998)  pp.  319-335
【非特許文献１２】Kusaka,S.,  Iwata,T.  and  Doi,Y.,  Int.  J.  Macromol.,  Vol.  25,  (1999)  pp.  87-94
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は以上のような課題に鑑みてなされたものであり、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成能を備える菌体から、分子量の低下を招くことなく、安価で簡便な方法により高純度のＰＨＡが得られるＰＨＡ精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＰＨＡを含有する菌体に塩基性成分を添加してＰＨＡを分離精製した後、更に、この分離精製したＰＨＡに次亜塩素酸塩を添加して分離精製するという安価で簡便な方法を採用することにより、分子量の低下を招くことなく、高純度のＰＨＡが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、より具体的には、以下のようなものを提供する。
【０００８】
（１）  ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える菌体からＰＨＡを分離して精製するＰＨＡ精製方法であって、前記菌体によりＰＨＡを生成させて、ＰＨＡを含有する菌体を得る工程と、前記ＰＨＡを含有する菌体に塩基性成分を添加して、第１ＰＨＡ画分を分離する工程と、前記第１ＰＨＡ画分に次亜塩素酸塩を添加して、第２ＰＨＡ画分を分離する工程と、を含むＰＨＡ精製方法。
【０００９】
（２）  前記ＰＨＡは、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）である（１）記載のＰＨＡ精製方法。
【００１０】
（３）  前記塩基性成分は、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムを含む（１）又は（２）記載のＰＨＡ精製方法。
【００１１】
（４）  前記塩基性成分は、界面活性剤を含む（１）から（３）いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【００１２】
（５）  前記次亜塩素酸塩は、次亜塩素酸ナトリウム及び／又は次亜塩素酸カリウムを含む（１）から（４）いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【００１３】
（６）  前記菌体は、ＰＨＡ生産遺伝子組み換え大腸菌である（１）から（５）いずれか記載のＰＨＡ精製方法。
【００１４】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、細菌ポリエステルに該当し、生物界における重要な高分子であり、核酸、蛋白質、多糖に次ぐ第四の生体高分子である。ＰＨＡは細菌が細胞内に合成するエネルギー／炭素の貯蔵物質となり得るが、生分解性と同時に熱可塑性を有するため、生分解性プラスチックとしての応用が期待されている。
【００１５】
このＰＨＡの一種であるポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、生分解性のポリマーとして広く研究がなされている。このポリマーは、３−ヒドロキシ酪酸が数十〜数千個重合したものを含む。このＰＨＢは、微生物等により分解され、疎水性が強く、水に溶け難いが、可塑性を有する。
【００１６】
ここで、ＰＨＡ生成能を備える菌は、自然界に得られる菌を含んでよく、また、遺伝子操作により、ＰＨＡ生成能が組み込まれた菌を含んでよい。例えば、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産遺伝子を組み込んだ遺伝子組み換え大腸菌を含むことができる。
【００１７】
塩基性成分は、塩基性の水溶液又は分散液を含んでよく、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムを含む水溶液であることが好ましい。また、次亜塩素酸塩は、次亜塩素酸ナトリウムであることが好ましい。なお、塩基性成分は、界面活性剤を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明では、ＰＨＡを生成、蓄積した菌体に、塩基性成分を添加して第１ＰＨＡ画分を分離した後、この第１ＰＨＡ画分に次亜塩素酸塩を添加して第２ＰＨＡ画分を分離することを特徴とする。これら塩基性成分及び次亜塩素酸塩を用いることにより、ＰＨＡを蓄積している菌体を破壊、溶解し、高純度のＰＨＡを効率的に分離、精製することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、安価で簡便な方法により、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成能を備える菌体から、分子量の低下を招くことなく、効率良く精製して高純度のＰＨＡを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明に係るＰＨＡ精製方法について具体的に説明する。
【００２１】
ＰＨＢを蓄積した遺伝子組み換え大腸菌の水性懸濁液（乾燥菌体重量１７．５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率７３．８％）に最終濃度０．１Ｎになるように水酸化ナトリウムを添加し、４０℃で３０分反応させる。その後、遠心分離でＰＨＢ画分を分離して蒸留水で２回洗浄後、蒸留水に再懸濁し、この懸濁液に最終濃度５％になるように次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加した後、６０℃で１５分間反応させる。
【００２２】
上述の方法によれば、安価な化学薬品である水酸化ナトリウム水溶液、および次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて、ＰＨＢ蓄積率が高い菌体から分子量の低下を招くことなく、高純度のＰＨＢを精製できる。ＰＨＢはその重量平均分子量が２００万以上であれば、その成型、加工法を工夫することにより、従来の石油由来のプラスチックと同等かそれ以上の物性を有することが知られている。上述のようなＰＨＢの精製では重量平均分子量は２００万程度を維持することができることから、付加価値の高いプラスチックの製造技術が大きく進歩したといえる。また、本発明によれば、分子量分布が広範囲に亘ったＰＨＢを得ることができ、このような分子量分布に広がりを有するものの方が成型、加工に適しているとされているため、本発明に係るＰＨＢ精製方法は有用である。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例及び実験例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例又は実験例に限定されるものではない。
【００２４】
図１に、本発明に係るＰＨＡ精製方法の１つである実施例を説明するフローを示す。この実施例では、まず、ＰＨＡ（ＰＨＢを含む）を生成できる大腸菌等の微生物を準備し、適切な培地と所定の培養条件を満足する設備を準備する（Ｓ１１０）。次に、所定の条件で前記微生物を培養し、ＰＨＡを蓄積する（Ｓ１２０）。蓄積されたＰＨＡを生成する微生物と共に洗浄し、集める（Ｓ１３０）。このとき、次の工程における塩基性の試薬との反応を十分起こさせるために、微生物の破壊又は溶解等の適切な処理を行うことがより好ましい。集めたＰＨＡ混合物に塩基性の試薬を加え、反応させる（Ｓ１４０）。この塩基性の試薬は、水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムの水溶液がより好ましく、水酸化ナトリウムの水溶液が好ましい。この塩基性の試薬は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤等の界面活性剤を含んでよい。含んでよい界面活性剤としては、例えば、ＳＤＳ（sodium  dodecyl  sulfate）、Ｂｒｉｊ（登録商標）  ３５（polyoxyethylene  dodecyl  ether）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０（polyoxyethylene  sorbitan  monolaurate）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標)  Ｘ−１００（polyoxyethyleneglycol  p-t-octylphenyl  ester類）、ＥＤＴＡ（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic  acid）等やこれらの組合せを挙げることができる。
【００２５】
次に、反応生成物からＰＨＡ画分を分離し、洗浄する（Ｓ１５０）。この分離したＰＨＡ画分に、次亜塩素系の試薬を加える（Ｓ１６０）。この次亜塩素系の試薬としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム等の無機塩素酸化合物及びそれらの組合せが挙げられる。次亜塩素酸ナトリウムが好ましく、特にＳ１４０工程で水酸化ナトリウムを用いた場合は、より好ましい。このような次亜塩素系の試薬による反応生成物からＰＨＡ画分を分離して、洗浄することにより（Ｓ１７０）、高純度のＰＨＡを得ることができる。
【００２６】
図２は、精製されたＰＨＡを分析するフローを示している。図１にあるような方法で、精製されたＰＨＡ成分入りのサンプルを準備する（Ｓ２１０）。これに、硫酸等を加え、処理を行い（Ｓ２２０）、所定の条件で、ＨＰＬＣ測定を行う（Ｓ２３０）。測定結果から、ＰＨＡの収率や純度等のデータを処理し算出する（Ｓ２４０）。
【００２７】
以下、具体的な実験例を示して、本願の発明の実施例の内容をより詳しく説明する。
【００２８】
＜実験例１＞
ＰＨＢを蓄積した遺伝子組み換え大腸菌の水性懸濁液（乾燥菌体重量１７．５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率７３．８％）に最終濃度０．１Ｎになるように水酸化ナトリウムを添加し、４０℃で３０分反応させた。その後遠心分離でＰＨＢ画分を分離し、蒸留水で２回洗浄後、蒸留水に再懸濁した。この懸濁液に最終濃度５％になるように次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加し、６０℃で１５分間反応させた。この液を遠心分離して得られたＰＨＢの純度をＨＰＬＣを用いて測定したところ純度９９．０％であった。さらに分子量をＧＰＣで測定したところ、重量平均分子量の低下を引き起こすとされていた次亜塩素酸ナトリウムを用いても、重量平均分子量が低下しなかったが、これはＰＨＢの結晶化度が関与しているものと考えられる。
【００２９】
安価な化学薬品である水酸化ナトリウム水溶液、および次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いてＰＨＢ蓄積率７３．８％の菌体から分子量の低下を招くことなく、９９．０％という高純度で精製できることが分かった。ＰＨＢはその重量平均分子量が２００万以上であれば、その成型、加工法を工夫することにより、従来の石油由来のプラスチックと同等かそれ以上の物性を有することが知られている。本法によるＰＨＢの精製では重量平均分子量は２００万程度であることから、付加価値の高いプラスチックの製造技術の一部を開発したといえる。また分子量の分散度を示すＭｗ／Ｍｎは６．３７であり、ある程度の分子量の広がりをもっていた。
【００３０】
＜実験例２＞
以下に説明する、培養条件、ＰＨＢの精製方法、分析条件によりＰＨＢを精製し評価を行った。
【００３１】
［菌株、培地、培養条件］
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＢ合成系遺伝子（ｐｈａ  ｃａｂ）を組み込んだＥｓｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ（ｐＳＹＬ１０５）株を用いてＰＨＢ生産を行った（１０）。ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｌ）に２０ｇ／ｌのグルコースを添加したものをＰＨＢ生産培地として用いた。前培養は−８０℃の保存菌液１００μｌを５ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液１ｍｌを５００ｍｌの坂口フラスコに１００ｍｌの上記培地（２０ｇ／ｌグルコースを含むＬＢ培地）が入ったものに接種し、３７℃で６４時間培養した。またジャーファーメンターによる培養は丸菱バイオエンジ社製５ｌジャーファーメンターに初発２．５ｌのＬＢ培地を入れて培養を行った。−８０℃のストック菌液１００μｌを５ｍｌのＬＢ培地の入った試験管に接種し、一晩培養したものを前々培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに１００ｍｌのＬＢ培地が入ったものに１ｍｌ接種して３７℃で一晩培養し、前培養を行った。この培養液１００ｍｌを２．５ｌＬＢ培地に接種し、本培養とした。一晩培養後、２０ｇ／ｌになるようにグルコースを加え培養を継続した。その後適宜グルコース濃度を計測しながらグルコースが完全に消費されるたびに、２０ｇ／ｌになるようにグルコースを添加した。
【００３２】
［ＰＨＢの精製方法］
ＰＨＢを蓄積した菌体の懸濁液を遠心分離で集菌し、得られた菌体を蒸留水で２回洗浄後、蒸留水に再懸濁させた。この菌体懸濁液をＰＨＢ精製用のサンプルとした。これに各試薬を添加し、それぞれの条件のもと攪拌しながら反応を行った。また二段階で精製を行う場合は一段階目の反応終了後、遠心分離でＰＨＢ分画を沈殿させ、蒸留水で２回洗浄後、蒸留水に再懸濁させ、各試薬を添加し二段階目の反応を行った。
【００３３】
クロロホルムを用いたＰＨＢの精製は以下のようにして行った。ＰＨＢを蓄積した菌体を蒸留水で２回洗浄後、菌体の凍結乾燥を行った。この凍結乾燥菌体に約２ｇ／ｌになるようにクロロホルムを加え、常温下、４８時間攪拌し、ＰＨＢをクロロホルムに溶解させた。この溶液を吸引ろ過し、得られたろ紙をロータリーエバポレーターでクロロホルムを蒸発させ、ＰＨＢを得た。
【００３４】
［分析条件］
ＰＨＢの濃度はＨＰＬＣを用いて測定した。あらかじめ重量を測定したチューブに１ｍｌから５ｍｌのサンプル溶液を入れ、蒸留水で２回洗浄後、１１０℃のオーブン中で一晩放置し、重量を測定した。これに１ｍｌの濃硫酸を加え１時間、沸騰した湯浴中で反応後、氷中で急冷した。これに氷中で攪拌しながら４ｍｌの０．０１４Ｎ硫酸を加え、さらに０．０１４Ｎ硫酸で適当に希釈し、ＰＨＢから生じたクロトン酸濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣのカラムはＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈ、カラム温度６０℃、溶離液は０．０１４Ｎ硫酸、検出は２１０ｍｍの吸光度でクロトン酸を検出した。純度、収率、ＮＰＣＭ（ＰＨＢ以外の不要成分＝菌体重量−ＰＨＢ重量）溶解率は以下の式で算出した。
【００３５】
【数１】
2005348640.tif 000002
【００３６】
【数２】
2005348640.tif 000003
【００３７】
【数３】
2005348640.tif 000004
【００３８】
用いるサンプル菌体のＰＨＢ蓄積率が異なると、精製後の純度に差が出てくる。用いるサンプル菌体のＰＨＢ蓄積率を考慮して、それぞれの精製法の比較をするため、ＰＨＢ以外の不要成分がどの程度溶解したかを示す値（ＮＰＣＭ溶解率）も精製法の比較を行う際の指標として用いた。
【００３９】
タンパク質の分析はＰＥＲＢＩＯ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いたＢＣＡ法で行った。
【００４０】
分子量の分析はＧＰＣで行った。ＰＨＢ濃度が２．０ｍｇ／ｍｌになるように常温、もしくは４０℃下でクロロホルムに溶解し、これを０．５μｍのフィルターでろ過し、サンプルとした。カラムはＴＳＫｇｅｌとＧＭＨＨＲ−Ｈを直列につなぎ、温度４０℃のもとで示差屈折率計を用いて検出した。
【００４１】
グルコース濃度の分析はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のグルコース測定キット、もしくはＹＳＩ社のグルコースアナライザーＹＳＩ２７００を用いて行った。
【００４２】
Ｌｅｅらの報告（非特許文献２）によると、ＰＨＢを蓄積した遺伝子組み換え大腸菌を水酸化ナトリウム溶液中で反応させることにより、ＰＨＢの純度の向上が見られたとしている。このことからまず取り扱いが容易で安価なアルカリ溶液を用いたＰＨＢ精製法を検討した。
【００４３】
［水酸化ナトリウム溶液と水酸化カリウム溶液の比較］
まず安価なアルカリである水酸化ナトリウム溶液と水酸化カリウム溶液を用いて菌体を処理することにより、ＰＨＢ純度を比較し、その有効性を検討した。反応は４０℃で攪拌しながら３０分間行った。この結果を表１（水酸化ナトリウム溶液と水酸化カリウム溶液を使用したＰＨＢの精製）に示す。この結果水酸化ナトリウム水溶液を使用した方がＰＨＢ純度の向上が見られたので今後の実験では水酸化ナトリウム水溶液を使用し、更なる条件検討を行うことにした。
【００４４】
【表１】
2005348640.tif 000005
【００４５】
［界面活性剤およびキレート剤添加の影響］
ＳＤＳ等の界面活性剤は菌体成分の溶解を引き起こし、ＰＨＢの純度の向上に寄与するものと考えられる。またキレート剤の添加により金属イオンが失われ、細胞膜の破壊が促進されることが期待される。そこで水酸化ナトリウム水溶液に各種界面活性剤もしくはキレート剤を添加しＰＨＢを蓄積した大腸菌と反応させた。反応は４０℃で攪拌しながら３０分間行った。この結果を表２に示す。ＳＤＳを使用時は水酸化ナトリウム水溶液単独で精製したときより純度が向上したが、その他の界面活性剤、キレート剤については目立った効果は見られなかった。ＳＤＳは菌体内のタンパク質の溶解を促進したものと考えられる。一方、本実験では菌体濃度１．７ｇ／ｌという低濃度で試験を行った。一般に溶解させるタンパク量と用いるＳＤＳ量は比例することが知られているため、高濃度の菌体を処理するためには大量のＳＤＳが必要になると思われる。そこで菌体濃度２．１ｇ／ｌの菌体懸濁液を用い、各濃度のＳＤＳを添加した０．１Ｎ水酸化ナトリウムによるＰＨＢの精製を行った。この結果を図３に示す。図３は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムとＳＤＳの組み合わせによるＰＨＢ精製におけるＳＤＳ濃度の影響をプロットしたもので、使用した菌体濃度は、２．１ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は２３．９％、攪拌しながら４０℃で３０分間反応させた。
【００４６】
【表２】
2005348640.tif 000006
【００４７】
この結果、ＳＤＳ濃度が０．２５％までは純度の向上が見られたが、０．２５以上の濃度では差が見られなかった。つまりこの蓄積率の菌体を用いた場合、菌体成分を溶解するのに菌体濃度と同濃度程度のＳＤＳの存在が好ましいということである。工業化にあたっては乾燥菌体重量で１００ｇ／ｌから２００ｇ／ｌ程度の菌体懸濁液を扱うことからかなりの量のＳＤＳが必要になる。しかもＳＤＳの添加によって純度が十分に上昇するとは限らないこと、ＳＤＳを用いた反応後、ＳＤＳを除去する工程が煩雑なことを考慮すると、ＳＤＳを添加するメリットは少ないとも考えられる。
【００４８】
［水酸化ナトリウム水溶液によるＰＨＢ精製の反応条件の検討］
水酸化ナトリウム水溶液によるＰＨＢ精製反応の条件を決定した。用いる水酸化ナトリウム濃度、反応温度、反応時間を精製後のＰＨＢの純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率に基づいてそれぞれ決定した。
【００４９】
［ＰＨＢ精製における水酸化ナトリウム濃度の影響］
ＰＨＢ精製において用いる水酸化ナトリウムの濃度の影響を検討した。水酸化ナトリウム濃度を０から１．０Ｎに変化させ、４０℃で３０分間反応させた。この時のＰＨＢ純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率の変化を図４に示す。図４は、水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での水酸化ナトリウム濃度の影響を表したもので、使用した菌体濃度は、８．４ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は４９．３％、攪拌しながら４０℃で３０分間反応させた。０．１Ｎより高濃度では徐々に純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率ともに低下していることがわかった。収率も低下していることから、水酸化ナトリウムによるＰＨＢの加水分解が起こっている可能性が示唆された。この結果から水酸化ナトリウム濃度は０．１Ｎが適当だと思われる。
【００５０】
［ＰＨＢ精製における反応温度の影響］
ＰＨＢ精製における水酸化ナトリウムでの反応温度の影響を検討した。反応温度を３０℃から８０℃まで変化させ、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで３０分間反応させた。この時のＰＨＢ純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率の変化を図５に示す。図５は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での反応温度の影響を表したもので、使用した菌体濃度は、６．５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は３１．４％、攪拌しながら所定温度で３０分間反応させた。純度については検討した温度範囲ではそれほど差は見られなかったが、収率は４０℃を境にそれ以上の温度では低下している。この点を考慮し、反応温度は４０℃が適していると考えられる。
【００５１】
［ＰＨＢ精製における反応時間の影響］
ＰＨＢ精製における水酸化ナトリウムでの反応時間の影響を検討した。０．１Ｎ水酸化ナトリウムを用い４０℃で反応させた。このときのＰＨＢ純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率の経持変化を図６に示す。図６は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での反応時間の影響を表したもので、使用した菌体濃度は、１０．８ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は５６．１％、攪拌しながら４０℃で所定時間反応させた。反応後５分で純度が最大に達した後は変化が見られなかった。本実験では、低濃度の菌体を扱っているが、将来的には高濃度の菌体を処理することになる。ＰＨＢ純度、収率、ＮＰＣＭ溶解率ともに５分以降変化がないことから、反応温度を長めに３０分とすると好ましいと考えられる。
【００５２】
以上の結果をまとめると、水酸化ナトリウム濃度０．１Ｎ、反応温度４０℃、反応時間３０分が適切であり、以降の実験では水酸化ナトリウムを用いたＰＨＢ精製ではこの条件で反応を行うこととした。この条件下でＰＨＢ蓄積率８４．３％の菌体（乾燥菌体重量９．９ｇ／ｌ）を処理すると純度９１．４％であった。
【００５３】
［水酸化ナトリウム水溶液で反応後のＰＨＢ画分中の不純物の分析］
これまでの結果から水酸化ナトリウム水溶液やこれに界面活性剤を添加しても純度の向上はさほど見られなかった。一方、一般的に常に発現するような系で外来遺伝子を大腸菌に導入した場合、その発現したタンパク質が正常な立体構造を有さず、タンパク質同士が凝集して不溶性のものとなることがある。これをタンパク質のインクリュージョンボディー（ＩＢ）と呼ぶが、本菌株によってもこのＩＢが発生し、水酸化ナトリウム水溶液ではＩＢが溶解せず、純度の向上を阻害していることが考えられる。そこで水酸化ナトリウム水溶液で反応後のＰＨＢ画分に含まれる不純物であるタンパク質量を定量した。この結果ＰＨＢ画分中の不純物のうち最低でも５２．５％がタンパク質であることが分かった。さらにＰＨＢ蓄積率７４．４％の菌体懸濁液（乾燥菌体重量７．８ｇ／ｌ）を水酸化ナトリウム水溶液で反応後（この時点で純度８７．０％）、さらにこのＰＨＢの水性懸濁液を１％プロテアーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ，  Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）と６０℃で３０分間反応させると純度が９５．３％まで上昇した。これらのことから大腸菌内で発現したＰＨＢ合成遺伝子がＩＢとなっているものと考え、一般的にＩＢの可溶化に使用される尿素、酢酸、アセトンを用いてＰＨＢの精製を行った。しかし、ＰＨＢ蓄積率７４．４％の菌体懸濁液（乾燥菌体重量７．８ｇ／ｌ）を水酸化ナトリウム水溶液で処理したのち（この段階で純度８７．０％）８Ｍ尿素溶液、４０％酢酸溶液、５０％アセトン溶液それぞれで４０℃、３０分間処理したが、純度はそれぞれ９３．８％、９３．６％、９３．２％までの上昇であった。
【００５４】
［次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いたＰＨＢの二段階精製法］
これまで行ってきた精製法では純度の向上がそれほど見込め無いため、その使用により分子量の低下が懸念されている次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用し、純度、分子量変化等を測定した。次亜塩素酸ナトリウムによる反応は菌体懸濁液に最終濃度５％となるように次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加し、４０℃で１５分間行った。この結果を表３に示す。次亜塩素酸ナトリウム溶液を単独で使用した場合はＰＨＢの純度は水酸化ナトリウム溶液を使用したときより向上しなかった。最初の段階では菌体の破壊並びに菌体内容物の溶解が必要なことから、この性質において水酸化ナトリウム水溶液の方が適していることが示唆された。さらに水酸化ナトリウム水溶液で反応後、次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応を行う、二段階精製法で精製すると、純度９７．１％とこれまでに得られた結果の中で最高の値を得た。そこで更なる純度向上を目指すべく、次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応時の反応温度の影響を検討した。反応温度を０℃から６０℃まで変化させ、それぞれの純度、分子量を測定した。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
この結果を図７、８に示す。図７は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで処理後、次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応時の反応温度の影響を表したもので、使用した菌体濃度は、１７．４５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は７３．８％、攪拌しながら所定温度で１５分間反応させた。図７から反応温度４０℃まではそれほど変化が無かったが、反応温度が４０℃を超えると純度、ＮＰＣＭ溶解率が上昇し、収率が低下した。水酸化ナトリウムで反応後のＰＨＢ以外の成分はほとんどがタンパク質であることは先にも述べたが、このタンパク質が次亜塩素酸存在下、４０℃以上で反応させたとき、溶解が進んで純度の上昇につながったものと考えられる。一方、４０℃以上で収率も減少していることからＰＨＢの加水分解が進行し、分子量の低下が懸念される。図８は、次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応時の反応温度のＰＨＢ分子量に与える影響を表したもので、図中のクロロホルムはクロロホルムにＰＨＢを溶解させて精製したもの、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムを用いて精製したもの、各温度は水酸化ナトリウムで精製後、次亜塩素酸ナトリウムで精製したときの反応温度をそれぞれ示す。ここで、Ｍｗは重量平均分子量を、Ｍｎは数平均分子量をそれぞれ示す。図８からクロロホルムで精製したＰＨＢよりも水酸化ナトリウムで精製したＰＨＢの方が重量平均分子量（Ｍｗ）が高いことがわかる。
【００５７】
クロロホルムで精製したＰＨＢは菌体が生産したＰＨＢの分子量から低下することはほとんど無いと考えられるため、水酸化ナトリウムで精製後Ｍｗが上昇したものと考えられる。一方、Ｍｗ／Ｍｎは上昇していることから考えると、水酸化ナトリウム処理によって低分子量のＰＨＢの分解は進行するが、高分子量のものはほとんど影響を受けていないものと推測できる。これはおそらく高分子量の結晶化しており、水酸化ナトリウムの加水分解を受けないが、低分子量のＰＨＢは加水分解しさらに分子量が低下、相対的にＭｗ、Ｍｗ／Ｍｎともに上昇したものと考えられる。また次亜塩素酸ナトリウムで反応時の反応温度を上昇させても分子量にはほとんど影響を及ぼさないことから、高分子量側のＰＨＢは次亜塩素酸ナトリウムによる加水分解を受けない程度に結晶化している可能性がある。これまでに報告されている次亜塩素酸ナトリウムによるＰＨＢの精製では野生株が生産した比較的低分子量のＰＨＢの精製についてであり、本実験で用いた超高分子量ＰＨＢとは異なる。野生型Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｏｒｏｐｈａが生産したＰＨＢは非晶質であることから次亜塩素酸ナトリウムによって分解されやすいということも考えられる。これらのことから次亜塩素酸ナトリウムやアルカリなどの加水分解を引き起こす可能性のある試薬を使用する場合、ＰＨＢの結晶化状態が非常に重要であると考えられる。
【００５８】
また土肥らの報告（非特許文献１１、１２）によるとＰＨＢを用いて強靭な糸を作成するにはＧＰＣによる重量平均分子量で約２００万あればよく、さらに一般的にポリマーの成型にはＭｗ／Ｍｎが高いほうが良いとされている。本法によるＰＨＢの精製では重量平均分子量が２．０８×１０６、Ｍｗ／Ｍｎが６．４となり、高純度でかつ高分子量、さらに分子量の分散度が高いため加工成型に適したものが得られる優れた方法といえる。
【００５９】
以上の結果から０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で４０℃、３０分間反応後、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応させる２段階精製法によりＰＨＢ蓄積率７３．８％の菌体から分子量の低下を招くことなく９９．０％という高純度で精製できることが分かった。本法によるＰＨＢの精製は安価で取り扱いが容易な試薬を用いて重量平均分子量の低下を引き起こすことなく、Ｍｗ／Ｍｎが高い高純度のＰＨＢを精製できるため優れた方法といえる。この方法によるＰＨＢの精製を工業規模へ応用するため高濃度の菌体を用いて高純度のＰＨＢが得られるような条件を求めることも考えられる。
【００６０】
＜実験例３＞
図９及び１０に、第２の実験例と同様にして行った第３の実験例の結果を示す。図９は、ＮａＯＨ＋ＳＤＳを用いた場合の純度及び収率を反応温度の関係でプロットしたものである。図９は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムと１％ＳＤＳによるＰＨＢ精製での反応温度の影響を表したもので、使用した菌体濃度は、６．５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は３１．４％、攪拌しながら所定温度で３０分間反応させた。図１０は、ＫＯＨ、ＫＯＨ＋ＳＤＳ、ＮａＯＨ、ＮａＯＨ＋ＳＤＳを用いた場合の純度、収率、及びＰＨＢ以外の成分の溶解した割合を棒グラフで表したもので、水酸化ナトリウムと水酸化カリウムはそれぞれ０．１Ｎ、ＳＤＳは１％で、使用した菌体濃度は、６．５ｇ／ｌ、ＰＨＢ蓄積率は３１．４％、攪拌しながら４０℃で３０分間反応させた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＰＨＡ精製方法の１つの実施例を説明するフローである。
【図２】精製されたＰＨＡを分析するフローである。
【図３】０．１Ｎ水酸化ナトリウムとＳＤＳの組み合わせによるＰＨＢ精製におけるＳＤＳ濃度の影響をプロットしたものである。
【図４】水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での水酸化ナトリウム濃度の影響を表したものである。
【図５】０．１Ｎ水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での反応温度の影響を表したものである。
【図６】０．１Ｎ水酸化ナトリウムによるＰＨＢ精製での反応時間の影響を表したものである。
【図７】０．１Ｎ水酸化ナトリウムで処理後、次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応時の反応温度の影響を表したものである。
【図８】次亜塩素酸ナトリウム溶液で反応時の反応温度のＰＨＢ分子量に与える影響を表したものである。
【図９】０．１Ｎ水酸化ナトリウムと１％ＳＤＳによるＰＨＢ精製での反応温度の影響を表したものである。
【図１０】ＫＯＨ、ＫＯＨ＋ＳＤＳ、ＮａＯＨ、ＮａＯＨ＋ＳＤＳを用いた場合の純度、収率、及びＰＨＢ以外の成分の溶解した割合を棒グラフで表したものである。
【符号の説明】
【００６２】
Ｓ１１０    培養準備工程
Ｓ１２０    培養工程
Ｓ１３０    洗浄・集菌工程
Ｓ１４０    塩基性試薬添加工程
Ｓ１５０    ＰＨＡ画分の分離・洗浄（１）工程
Ｓ１６０    次亜塩素酸系試薬の添加工程
Ｓ１７０    ＰＨＡ画分の分離・洗浄（２）工程
Ｓ２１０    サンプル準備工程
Ｓ２２０    酸処理工程
Ｓ２３０    ＨＰＬＣ測定工程
Ｓ２４０    データ処理工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005348640.tif 000013
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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