(57)【要約】【課題】  希釈などの操作無しに、計測濃度域を拡大する。【解決手段】  濁度変化の過渡現象を観察し、濁度の極大値または極小値を検出し、これら極大値または極小値を示す時間と、濁度、ならびに極大値および／または極小値から被検液の濃度を決定する。【選択図】図１
2005043350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物である抗原を含む被検液と、前記分析対象物と特異結合反応する抗体を含む試薬とを混合し、前記特異結合反応により生じた抗原抗体複合物に由来して発生した濁度に関する信号を検出することによって前記分析対象物を定性または定量する免疫比濁計測方法であって、
（１）前記被検液および前記試薬を混合して混合液を得る工程、
（２）得られた前記混合液の濁度を、離散的に複数回または連続的に計測する工程、
（３）得られた濁度の計測値と混合後の経過時間との関係を求める工程、ならびに
（４）前記関係に基づいて、前記計測値の極大値または極小値であるＳpeakを検出し、前記Ｓpeakを示す経過時間Ｔpeakを求める工程を含むことを特徴とする免疫比濁計測方法。
【請求項２】
前記工程（２）において散乱光によって前記濁度を計測し、前記工程（４）において極大値を検出する請求項１記載の免疫比濁計測方法。
【請求項３】
前記Ｓpeakと前記Ｔpeakとの関係より、前記分析対象物の濃度を決定する請求項１記載の免疫比濁計測方法。
【請求項４】
前記混合後に時間Ｔが経過した時点の前記濁度の計測値Ｓ（Ｔ）と、前記経過時間Ｔpeakとの関係より、前記分析対象物の濃度を決定する請求項１記載の免疫比濁計測方法。
【請求項５】
Ｔ＞Ｔpeakを満たす請求項４記載の免疫比濁計測方法。
【請求項６】
前記混合後に時間Ｔが経過した時点の前記濁度の計測値Ｓ（Ｔ）の微分値ｄＳ（Ｔ）／ｄＴを算出し、前記微分値の極性が反転する時点を前記Ｔpeakとしこの時点の計測値Ｓ（Ｔ）をＳpeakとすることによって、Ｓpeakを検出するとともに前記Ｓpeakを示す前記Ｔpeakを求める請求項１記載の免疫比濁計測方法。
【請求項７】
前記Ｔpeakが所定値Ｔ0以下であるとき、前記被検液中の前記分析対象物の濃度が所定値Ｃ0以上と判定する請求項１記載の免疫比濁計測方法。
【請求項８】
前記分析対象物がヒト血清アルブミンである請求項１〜７のいずれかに記載の免疫比濁計測方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体であり、前記試薬中に前記モノクローナル抗体が２種類以上含まれており、前記２種以上のモノクローナル抗体が、それぞれヒト血清アルブミンの異なる部位と特異結合する請求項８記載の免疫比濁計測方法。
【請求項１０】
前記被検液が尿である請求項９記載の免疫比濁計測方法。
【請求項１１】
前記被検液に光を照射する光源と、
前記光が前記被検液を透過するように前記被検液を保持し、前記被検液と抗体を含んだ試薬とが混合されるサンプルセルと、
前記被検液を透過した透過光を検知する光センサ１および／または前記光が前記被検液  中を伝搬する際に発生した散乱光を検知するための光センサ２と、
前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号を解析するコンピューターとを備え、
前記被検液と前記試薬との混合後の前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号より、前記被検液中の抗原濃度を計測することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫比濁計測方法を実施するための免疫比濁計測装置。
【請求項１２】
前記被検液に光を照射する光源と、
前記光が前記被検液を透過するように前記被検液を保持し、前記被検液と前記抗体を含んだ試薬とが混合されるサンプルセルと、
前記被検液を透過した透過光を検知する光センサ１および／または前記光が前記被検液中を伝搬する際に発生した散乱光を検知する光センサ２と、
前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号を微分する微分器１および／または微分器２と、
前記光センサ１、前記光センサ２、前記微分器１および／または前記微分器２の出力信号を解析するコンピューターとを備え、
前記被検液と前記試薬との混合後の前記微分器１および／または前記微分器２の出力信号より、前記被検液中の抗原濃度を計測することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫比濁計測方法を実施するための免疫比濁計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検液中に溶解している抗原、特に尿中のアルブミンの濃度を計測する免疫比濁計測方法、および計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の抗原の計測方式としては、被検液に含まれる抗原に特異的に結合する抗体を混合し、抗原抗体反応により抗原抗体複合物を生成させて前記被検液を混濁させ、その濁度から抗原濃度を求める方法がある。ここで、濁度は、前記被検液に光を照射し、溶液中で発生した散乱光または溶液を透過した透過光を検出することで計測することができる。ただし、濁度が大きくなると散乱光強度は大きくなるが、透過光強度は小さくなる。
【０００３】
この計測方式では、図１７に示すように、抗原のモル濃度に比べて抗体のモル濃度が大きい領域からほぼ等しい領域、すなわち抗体過剰域Ａ〜Ｂから当量域Ｃで計測が行われていた。一方、図１７のＡ〜Ｂの領域においては抗原濃度に応じて濁度が増加するが、Ｃの領域においては濁度の抗原濃度に対する変化量が小さくなる。また、抗原過剰域Ｄにおいては抗原濃度が増加するにつれて濁度が低下する（プロゾーン現象）。したがって、抗原濃度を計測するには、図１７のＡ〜Ｂの領域で検量線を作成し、これに基づいて濁度の計測値から算出していた。
【０００４】
このように、計測は、抗原濃度が抗体過剰域Ａ〜Ｂから当量域Ｃにある場合に行う必要があるため、抗体濃度を大きくする必要があった。この場合、低濃度域での感度が犠牲にされることがあった。また、実際に抗原濃度が抗原過剰域Ｄにないこと、即ち図１７のＤの領域でないことを確認するため、被検液を希釈したり、抗体を追加添加する動作を行っていた。抗原濃度がＤの領域にあり得る被検液の場合、濁度の計測値から、２つの濃度が算出され得る。そのため、抗原濃度が、Ｄの領域にないことを確認する必要があるのである（例えば特許文献１および２）。
【特許文献１】特開２００４−０４５３８４号公報
【特許文献２】国際公開第０２／０５２２６５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、免疫比濁計測方法において上記の問題を解決し、低濃度域の感度を犠牲にすることなく、計測できる被検液の濃度域を拡大することを目的とする。また、抗原濃度が抗原過剰域にないこと、即ち図１７のＤの領域でないことを確認するため、被検液を希釈したり、抗体を追加的に添加する動作を不要とする免疫比濁計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る免疫比濁計測方法においては、まず、分析対象物である抗原を含む被検液に、前記分析対象物と特異結合反応する抗体を含む試薬を混合して混合液を得る。このとき、特異結合反応によって抗原抗体複合体が生成し、これに起因して前記被検液の濁度が上昇することになる。
そこで、得られた前記混合液の濁度を離散的に複数回または連続的に計測し、得られた濁度の計測値と混合後の経過時間との関係を求める。そして、前記関係に基づき、前記計測値の極大値または極小値であるＳpeakを検出し、前記Ｓpeakを示す経過時間Ｔpeakを求める。
これらの工程を行うことによって前記濁度の変化を調べ、当該変化に基づいて前記被検液にプロゾーン現象が発生するか否かを確認し、プロゾーン現象の有無によって前記分析対象物の濃度を決定することができる。
【０００７】
前記工程（２）においては散乱光によって前記濁度を計測し、前記工程（４）においては極大値を検出するのが好ましい。
また、前記Ｓpeakと前記Ｔpeakとの関係より、前記分析対象物の濃度を決定することが好ましい。
前記混合後に時間Ｔが経過した時点の前記濁度の計測値Ｓ（Ｔ）と、前記経過時間Ｔpeakとの関係より、前記分析対象物の濃度を決定することが好ましい。ただし、この場合、T＞Ｔpeakを満たすのが好ましい。
また、前記混合後時間ｔが経過した時点の前記濁度の計測値Ｓ（T）の微分値ｄＳ（T）／ｄTを算出し、前記微分値の極性が反転する時点を前記Ｔpeakとしこの時点の計測値Ｓ（T）をＳpeakとすることによって、Ｓpeakを検出するとともに前記Ｓpeakを示す前記Ｔpeakを求めることが好ましい。
【０００８】
また、前記Ｔpeakが所定値Ｔ0以下であるとき、前記被検液中の前記分析対象物の濃度が所定値Ｃ0以上と判定することが好ましい。
また、前記分析対象物がヒト血清アルブミンであることが好ましい。
また、前記抗体がモノクローナル抗体であり、前記試薬中に前記モノクローナル抗体が２種類以上含まれており、前記２種以上のモノクローナル抗体が、それぞれヒト血清アルブミンの異なる部位と特異結合することが好ましい。
また、前記被検液が尿であることが好ましい。
【０００９】
さらに、本発明は、上記免疫比濁計測方法を実施するための免疫比濁計測装置に関する。
この免疫比濁計測装置は、前記被検液に光を照射する光源と、前記光が前記被検液を透過するように前記被検液を保持するサンプルセルと、前記被検液を透過した透過光を検知する光センサ１および／または前記光が前記被検液中を伝搬する際に発生した散乱光を検知するための光センサ２と、前記サンプルセルにおいて前記被検液と前記抗体を含んだ試薬とを混合する混合機と、前記混合機を制御し、前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号を解析するコンピューターとを備える。
そして、前記被検液と前記試薬との混合後の前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号より、前記被検液中の抗原濃度を計測する。
【００１０】
また、本発明に係る別の免疫比濁計測装置は、前記被検液に光を照射する光源と、前記光が前記被検液を透過するように前記被検液を保持するサンプルセルと、前記被検液を透過した透過光を検知する光センサ１および／または前記光が前記被検液中を伝搬する際に発生した散乱光を検知する光センサ２と、前記光センサ１および／または前記光センサ２の出力信号を微分する微分器１および／または微分器２と、前記サンプルセルにおいて前記被検液と前記抗体を含んだ試薬とを混合する混合機と、前記混合機を制御し、前記光センサ１、前記光センサ２、前記微分器１および／または前記微分器２の出力信号を解析するコンピューターとを備える。
そして、前記被検液と前記試薬との混合後の前記光センサ１および／もしくは前記光センサ２の出力信号、または前記微分器１および／または前記微分器２の出力信号より、前記被検液中の抗原濃度を計測する。
なお、前記混合機は省略してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、希釈等の操作を行うことなく、計測できる被検溶液の抗原濃度域を拡大することができ、その実用的効果は大きく、計測および検査の効率化と省力化が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
まず、本発明の課題を生み出した従来の免疫比濁方法について説明する。図１および２に示す装置を用いた免疫比濁計測方法の実施方法を示す。図１は、従来例および本発明の溶液濃度の計測方法に使用する装置の概略構成を示す上面図である。図２は図１における光学系を示す側面図である。図１および２に示すサンプルセル１は、上部に開放された開口部を有する直方体状のアルミ製の容器で構成されている。
【００１３】
そして、サンプルセル１には、光路の両端に光学窓としてガラス板がはめ込まれている。被検液がサンプルセル１内に保持された状態で、光が被検液中を透過することができる。このサンプルセル１における光の伝搬方向の距離、即ち光学窓間の距離は、Ａで示し、光の伝搬方向に対して垂直方向の距離をＢで示した。ここでは、Ａ＝０．７５ｃｍ、Ｂ＝０．４ｃｍの場合を説明する。
【００１４】
注入口２は、図１に示したようにサンプルセル１の光学窓がない側面に配置され、その内径（直径）は０．１ｃｍである。図２に示すように、この注入口２の断面の中心はサンプルセル１の底面から距離ｘ、光学窓から距離ｚに位置している。
矢印１０で示される試薬の注入方向は、光学窓と平行で、後述する略平行光４の光軸と垂直である。このように配置することで、注入口２の断面の中心から注入方向へ伸びる注入軸と略平行光４の光軸とが、前記サンプルセルの溶液中で交点を有する。ここでは、ｘ＝０．１５ｃｍ、ｚ＝０．１ｃｍの場合を示す。
【００１５】
この装置は光源である半導体レーザモジュール３を具備し、波長７８０ｎｍ、強度３．０ｍＷ、ビーム直径０．１２ｃｍの略平行光４を投射している。この略平行光４の光軸はサンプルセル１の底面と平行で、底面から距離０．４ｃｍに位置している。したがって、光軸と注入口２は、底面から同じ高さに位置している。
光センサ５は、被検液中を略平行光４が伝搬する際に発生した散乱光１１を検知する。また、ポンプは、試薬液を注入口２より、サンプルセル中の被検液に注入し、コンピューター７は光センサ５の出力信号を解析し、ポンプの制御もする。
【００１６】
また、図１においては、符号８で、注入口２より試薬溶液が注入された時に発生する渦を模式的に示した。符号９は、被検液の液面を示し、この液面の最下部がサンプルセル１の底面より高さｈに位置する。
このサンプルセル１は内壁の角にｒを有する。すなわち、角部が厳密には直角でないため、ｈ＝０．８ｃｍの時、約０．２３ｍｌの液体を保持している。なお、本発明では、液面９の最下部に接する面を液面と定義する。この定義に基づくと、本実施の形態では、注入方向が、液面に対して平行になる。
【００１７】
本装置を用いて、尿を被検液として尿中ヒト血清アルブミン濃度を計測する手順を以下に説明する。
まず、ヒト血清アルブミン濃度が０．０３ｍｇ／ｄｌ以下と確認された尿を溶媒として用い、この溶媒にヒト血清アルブミンを添加し、濃度＝１ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ、および１００ｍｇ／ｄｌの被検液を調製する。
【００１８】
つぎに、中性反応系を構成するために、０．０５Ｍモプスおよび４重量％ポリエチレングリコール６０００を用いてモプス緩衝液を調製し、ｐＨは７．４とする。
さらに、ウサギ由来のポリクローナルヒトアルブミン抗体を、０．０５Ｍモプス水溶液（ｐＨ７．４）に溶解し、抗体濃度が２．５ｍｇ／ｄｌの試薬（抗体水溶液）を調製する。
【００１９】
そして、ヒト血清アルブミン濃度が０ｍｇ／ｄｌ（溶媒として用いた尿（ヒト血清アルブミンを添加していないので、実質的にヒト血清アルブミン濃度はゼロとみなせる）被検液９μｌをサンプルセル１へ導入する。さらに、モプス緩衝液１４５μｌをサンプルセル１へ導入し攪拌する。
ここで、コンピューター７は、光センサ５の出力信号の記録を開始する。開始以降の、光センサ５の出力信号の時間変化を図１８に示す。図１８において、横軸は、出力信号の記録開始後の経過時間を示し、縦軸は光センサ５の出力信号（ＳＣ９０と記載）を示す。なお、被検液中で発生した散乱光のうち、略平行光４の伝搬方向に対して９０度の方向へ伝搬する散乱光を光センサ５が検出しているため、「ＳＣ９０」と記載する。
【００２０】
５秒経過した時点で、コンピューター７がピペッタまたはポンプなどの混合機６を制御して、注入口２より試薬（抗体水溶液）４０μｌをサンプルセル１へ約３秒間で注入する。
なお、図１８で、試薬の混合を開始する５秒経過時点から３秒以上の期間は、混合された試薬の流束そのものが略平行光４の光路に侵入するため、透過光の強度および伝搬方向が乱れ、光センサ５の出力信号は激しく変化する。このように出力信号が変化している領域をハッチングで示す。
【００２１】
同様にし、ヒト血清アルブミン濃度が１ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、１５ｍｇ／ｄｌ、２０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ、および１００ｍｇ／ｄｌの被検液を計測する。
このうち、ヒト血清アルブミン濃度が３ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、および１００ｍｇ／ｄｌの被検液に対する光センサ５の出力信号の時間変化をそれぞれ図１９〜２１に示す。これらの図においても、図１８と同様に、光センサ５の出力信号が激しく変化する領域をハッチングで示す。
【００２２】
図１８〜２１からわかるように、３００秒経過すると、濁度を示す光センサ５の出力信号は飽和している。そこで、これらの被検液に対する３００秒経過時点の光センサ５の出力信号を濁度として縦軸に示し、被検液の濃度を横軸に示したグラフが図２２である。
図２２から、濃度が０〜３０ｍｇ／ｄｌの領域が図１７のＡ〜Ｂの領域に相当し、濃度が５０ｍｇ／ｄｌの領域が領域Ｃに相当し、濃度が１００ｍｇ／ｄｌ付近の領域が領域Ｄに相当していることがわかる。
【００２３】
図２２の場合、濃度が０〜３０ｍｇ／ｄｌの濁度で検量線を作成し、濃度を定量することができる。
しかし、被検液の濃度が約５０ｍｇ／ｄｌ以上である場合は、被検液と試薬を混合して一定時間経過後の濁度からのみでは、プロゾーン現象によって、濃度を一意的に決定できないことがある。例えば、濁度（３００秒経過時点の光センサ５の出力信号）が７．５の場合には、被検液の濃度は約２０ｍｇ／ｄｌであるか、５０〜１００ｍｇ／ｄｌであるかが区別できない。
したがって、被検液のヒト血清アルブミン濃度が５０ｍｇ／ｄｌ以下であることを、何らかの方法で別途確認する必要がある。換言すると、上記計測方法で計測できる被検液の濃度域は、５０ｍｇ／ｄｌ以下に制限されていた。
【００２４】
これに対し、本発明は、免疫比濁計測方法において上記の問題を解決し、低濃度域の感度を犠牲にすることなく、計測できる被検液の濃度域を拡大することを目的とする。また、抗原濃度が抗原過剰域にないこと、即ち図１７のＤの領域にないことを確認するため、被検液を希釈したり、抗体を追加的に添加する動作を不要とする免疫比濁計測方法を提供する。
【００２５】
具体的には、本発明に係る免疫比濁計測方法では、（１）分析対象物である抗原を含む被検液を試薬と混合して混合液を得る工程、（２）得られた前記混合液の濁度を、離散的に複数回または連続的に計測する工程、（３）得られた濁度の計測値と混合後の経過時間との関係を求める工程、（４）前記関係に基づき、前記計測値の極大値または極小値であるＳpeakを検出し、前記Ｓpeakを示す前記経過時間Ｔpeakを求める工程を行うことによって、プロゾーン現象による上記問題を回避する。
【００２６】
実施の形態１
本実施の形態は、ヒト血清アルブミンと特異結合するモノクローナル抗体を用いて、尿を被検液として、尿中のアルブミンを計測した例を示す。
免疫比濁法の場合、抗原抗体反応により抗原と抗体が凝集する必要がある。即ち、抗原と抗体が結合し、この結合物が抗体分子よって架橋して大きな粒子（抗原抗体複合物）が生成される必要がある。したがって、抗原と結合する結合部位が互いに異なる抗体が少なくとも２種類必要である。
また、抗原抗体複合物の粒径は、前記計測値が極大値または最小値を示す程度の大きさであることが必要であり、種々の条件によって異なるが、例えば約２５μｍ以上であることが好ましい。
【００２７】
これにより、免疫比濁法の場合、一般的には、ポリクローナル抗体が使用されている。ただし、結合部位が互いに異なるモノクローナル抗体を複数混合して試薬とした場合でも、抗原と抗体が凝集し、抗原抗体複合物が生成され、免疫比濁法により抗原濃度を計測できることがわかった。さらに、被検液と、結合部位が互いに異なる複数にモノクローナル抗体を含有した試薬を混合し、この濁度の過渡現象を観察しこれを分析することで、計測濃度域を拡大することができた。
【００２８】
以下に、図１〜２２を用いて具体的な例を示す。図１および２は従来の技術について上述したものと全く同一であり、同様に動作する。本実施の形態においては、本装置を用い、尿を被検液として尿中ヒト血清アルブミン濃度を計測した。
まず、従来の技術と同様にヒト血清アルブミン濃度が０．０３ｍｇ／ｄｌ以下と確認された尿を溶媒として用い、当該溶媒にヒト血清アルブミンを添加して、濃度が３ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ，１００ｍｇ／ｄｌ、１５０ｍｇ／ｄｌ、２５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ、および５００ｍｇ／ｄｌの被検液を調製した。
【００２９】
つぎに、従来の技術と同様にして、中性反応系を構成するための緩衝液の構成にはモプスを使用し、その濃度および緩衝液のｐＨには一般的によく用いられるものを採用した。０．０５Ｍモプスおよび４重量％ポリエチレングリコール６０００を含み、ｐＨ７．４のモプス緩衝液を調製した。
さらに、ヒト血清アルブミンの互いに異なる結合部位と特異結合するマウス由来のモノクローナル抗体を３種類（ＡＨＳＡ１、ＡＨＳＡ２、ＡＨＳＡ３）準備した。ＡＨＳＡ１、ＡＨＳＡ２、ＡＨＳＡ３としては、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０８号、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０９号およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７９３８号で示される細胞株により産生されるモノクローナル抗体である。
【００３０】
これら３種類のモノクローナル抗体を、モル比で１：１：８（＝ＡＨＳＡ１のモル濃度：ＡＨＳＡ２のモル濃度：ＡＨＳＡ３のモル濃度）になるように、上記モプス緩衝液に溶解し、試薬（抗体水溶液）を調製した。３種類の抗体の合計濃度は２．４ｍｇ／ｄｌになった。
そして、従来の技術と同様に、ヒト血清アルブミン濃度が０ｍｇ／ｄｌ（溶媒として用いた尿（ヒト血清アルブミンを添加していないためその濃度は実質的にゼロとみなせる））、３ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１５０ｍｇ／ｄｌ、２５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ、および５００ｍｇ／ｄｌの被検液９μｌをサンプルセル１へ導入し、さらに、上記試薬１４５μｌをサンプルセル１へ導入して攪拌した。
【００３１】
ここで、コンピューター７は、光センサ５の出力信号の記録を開始させた。開始以降の、光センサ５の出力信号の時間変化を図３〜１３に示した。図３〜１３において、横軸は、出力信号の記録開始後の経過時間を示し、縦軸は光センサ５の出力信号（ＳＣ９０と記載）を示す。５秒経過した時点で、コンピューター７が混合機６を制御して、注入口２より試薬（抗体水溶液）４０μｌをサンプルセル１へ約３秒で注入した。
なお、図３〜１３で、試薬の混合を開始する５秒経過時点から３秒以上の期間は、混合された試薬の流束そのものが略平行光４の光路に侵入したため、透過光の強度及び伝搬方向が乱れ、光センサ５の出力信号は激しく変化した。この変化している領域をハッチングで示した。
【００３２】
濃度が０ｍｇ／ｄｌおよび３ｍｇ／ｄｌの被検液についての試薬混合後の経過時間と光センサ５の出力信号との関係を示す図３および４においては、従来の技術についての図１８〜２１と場合と同様に、出力信号は単調に増加し、３００秒経過すると飽和して一定値に至る。
しかし、これらとは異なり、濃度が５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１５０ｍｇ／ｄｌ、２５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ、および５００ｍｇ／ｄｌの被検液についての図５〜１３では、試薬混合後、光センサ５の出力信号は、一旦急激に増加し極大値を示し、その後単調に減少し、３００秒経過すると飽和し一定値に至る。
【００３３】
ここで、濃度が０ｍｇ／ｄｌ、３ｍｇ／ｄｌ、５ｍｇ／ｄｌ、１０ｍｇ／ｄｌ、３０ｍｇ／ｄｌ、５０ｍｇ／ｄｌ、１００ｍｇ／ｄｌ、１５０ｍｇ／ｄｌ、２５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ、および５００ｍｇ／ｄｌの被検液に対する３００秒経過時点の光センサ５の出力信号を濁度として縦軸に示し、被検液の濃度を横軸に示したグラフが図１４である。図１４から、濃度が０〜５０ｍｇ／ｄｌの領域が、図１７のＡ〜Ｂの領域に相当し、濃度が１００ｍｇ／ｄｌの領域が領域Ｃに相当し、濃度が１５０ｍｇ／ｄｌ以上の領域が領域Ｄに相当することがわかる。
【００３４】
図１４の場合、濃度が０〜５０ｍｇ／ｄｌの濁度で検量線を作成し、濃度を定量することができる。しかし、被検液の濃度が約１００ｍｇ／ｄｌ以上である場合は、プロゾーン現象により、濃度を決定できないことがあり得る。例えば、濁度（３００秒経過時点の光センサ５の出力信号）が２．４の場合、被検液の濃度は約３０ｍｇ／ｄｌであるか、１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌであるかが区別できない。したがって、被検液のヒト血清アルブミン濃度が１００ｍｇ／ｄｌ以下であることを、何らかの方法で別途確認する必要がある。言い換えると、上記した計測方法で、計測できる被検液の濃度域は、１００ｍｇ／ｄｌ以下に制限されている。
【００３５】
このように、従来の技術と同様に、被検液と試薬を混合し一定時間経過後の濁度（図１４）からのみでは、プロゾーン現象により、濃度を一意的に決定できないことがあった。これにより、計測できる被検液の濃度域が制限されていた。
そこで、被検液と試薬を混合後の濁度の過渡現象を、次のように分析した。まず、図５〜１３における各被検液の濃度を横軸に、濁度の極大値（Ｓpeak）を縦軸に示し図１５を作成した。
次に、本極大値を示す経過時間（Ｔpeak）を横軸に、濁度の極大値（Ｓpeak）を縦軸に示し、図１６を作成した。図１６において、各点の横の数字は濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す。図１６から、濃度が高くなるに従って、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が短くなり、濃度が１００ｍｇ／ｄｌ以上になると、約１８秒に漸近することがわかった。
【００３６】
図１４に加え、この図１６を利用すると、計測できる被検液の濃度域を拡大できることがわかった。例えば、濁度（３００秒経過時点の光センサ５の出力信号）が２．４の場合、図１４のみからでは、被検液の濃度は約３０ｍｇ／ｄｌであるか、１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌであるかが区別できないが、図１６を併用するとこれらを区別でき濃度を決定できる。即ち、このときの極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が、約３５秒であれば濃度は３０ｍｇ／ｄｌと判定でき、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が、約１８秒であれば１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌであると判定できる。このように、被検液と試薬を混合し一定時間経過後の濁度（図１４）と、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）との関係から、濃度を一意的に決定できる。これにより、本実施の形態で示した例では、計測できる被検液の濃度域を〜５００ｍｇ／ｄｌまで拡大することに成功した。
【００３７】
上記のように、濁度の計測値の極大値（Ｓpeak）と、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）との関係を求め、混合後所定時間Ｔが経過した時点の濁度の計測値Ｓ（Ｔ）と、経過時間Ｔpeakとの関係より、被検液の濃度を決定することができた。
ただし、濃度が０ｍｇ／ｄｌおよび３ｍｇ／ｄｌのような低濃度の場合は、濁度の計測値の極大値が存在しない。この場合は、抗体過剰域である図１７のＡ〜Ｂ領域とみなせるので、所定時間Ｔが経過した時点の濁度の計測値Ｓ（Ｔ）のみで、濃度を一意的に決定できる。
ここで、所要時間Ｔは、Ｔ＞Ｔpeakを満たすことが好ましい。このようにすると、再現性を向上させることができる。さらに、Ｔは、Ｓが飽和する時間であるのが好ましい。一方、Ｔ＜Ｔpeakであってもよい。この場合は、より短い計測時間で濃度を決定することができる。
【００３８】
なお、本実施の形態では、濁度を散乱光で検出する場合を示したが、濁度を透過光で検出してもよい。ただし、この場合は、濁度は透過光強度と逆相で変化することから、透過光強度の極小値をＳpeakとして、さらに極小値を示す経過時間をＴpeakとして判定すれば、同様の効果が得られる。
さらに、散乱光および透過光とを双方検出し、これらの結果をお互い参照し、計測信頼性を向上させても良い。
【００３９】
実施の形態２
本発明の第２の実施の形態について図１５を用いて説明する。本実施の形態は、図１５と図１６を用いて濃度を決定する例である。
例えば、濁度の極大値が５．５の場合、図１５のみからでは、被検液の濃度は約３０ｍｇ／ｄｌであるか、１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌであるかが区別できないが、図１６を併用するとこれらを区別でき濃度を決定することができる。すなわち、このときの極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が約３５秒であれば、濃度は３０ｍｇ／ｄｌと判定でき、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が、約１８秒であれば、１５０〜２５０ｍｇ／ｄｌであると判定できる。
このように、被検液と試薬を混合して、濁度の極大値（Ｓpeak）（図１５）と、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）との関係から、濃度を一意的に決定できる。これにより、本実施の形態で示した例では、計測できる被検液の濃度域を〜５００ｍｇ／ｄｌまで拡大することに成功した。
【００４０】
本実施の形態では、濁度の極大値を検出した時点で、濃度を決定できるので、実施の形態１より、計測の高速化に有利である。ただし、極大値が存在しない低濃度の場合は、所定時間経過後の濁度で決定する。このように、本実施の形態と実施の形態１を併用すると効果が大きい。
【００４１】
実施の形態３
本発明の第３の実施の形態について図１６を用いて説明する。図１６からわかるように、極大値を示す経過時間（Ｔpeak）が所定値Ｔ0（図１６の場合Ｔ0≒１８秒）以上のときは、Ｔpeakのみから濃度を一意的に決定できる。したがって、経過時間（Ｔpeak）が所定値Ｔ0以下のときは、濃度を所定値Ｃ0（図１６の場合Ｃ0は１００ｍｇ／ｄｌ）と判定し、所定値Ｔ0以上のときは、図１６から読み取れるＴpeakに応じた濃度と判定することができる。本実施の形態も、濁度の極大値を検出した時点で、濃度を決定できるので、実施の形態１より、計測の高速化に有利である。
ただし、極大値が存在しない低濃度の場合は、所定時間経過後の濁度で決定する。このように、本実施の形態と実施の形態１を併用すると効果が大きい。
【００４２】
実施の形態４
本発明の第４の実施の形態について図２３を用いて説明する。図２３は、本発明において用いることのできる免疫比濁計測装置の別の実施の形態である。図２３において、符号１〜１１で示される構成要素は、図１の符号１〜１１で示される構成要素と同じものである。１２は、光センサ５の出力信号を微分する微分器で、その出力信号はコンピューター７によって分析される。この装置は、微分器１２の出力信号の符号が反転した時点を極大値とするため、より高精度かつ高速に極大値を認識できる。
以上のように、本実施の形態によれば、より微小な極大値を高速に認識できるので、低濃度の被検液の濃度を高速に決定できる。
【００４３】
なお、上記したような、ＳＣ９０と表記した散乱光強度に相当する光センサ５の出力信号が極大値を示す条件は、抗体と抗原が特異結合することによって生成された抗原抗体複合物の粒径が所定より大きくなることである。
これは、散乱光強度は、散乱光の伝搬方向によって変化することと関連がある。すなわち、溶液中に浮遊する粒子の粒径が、励起光（略平行光４に相当）の波長に対して十分小さい場合（波長の１／２０以下）は、散乱光強度の分布はその伝搬方向には依存しない。
【００４４】
しかし、粒径が大きくなるに従って、前方散乱光（励起光の伝搬方向との角度が９０度以下）の強度が大きくなる。また、抗原抗体複合物の粒径が大きくなることは、粒子濃度は小さくなることを意味する。
これらから、抗原抗体反応の進行に従って抗原抗体複合物が成長すると、一旦は、ＳＣ９０は増加するが、更に抗原抗体複合物が成長し粒径が大きくなると、前方散乱光強度は増加による反動と、粒子濃度が小さくなる影響により、ＳＣ９０は低下する。即ち、極大値が現れる。
【００４５】
この現象を図２４を用いて説明する。図２４の左側の縦軸は、溶液中で発生した散乱光のうち、略平行光４の伝搬方向に対して４５度の方向へ伝搬する散乱光強度に相当する。
これは、図１の光センサ５を、溶液中で発生した散乱光のうち、略平行光４の伝搬方向に対して４５度の方向へ伝搬する散乱光を検出するように配置した場合の光センサ５の出力信号である。これをＳＣ４５と記載する。アルブミン濃度が１０ｍｇ／ｄｌの場合のＳＣ４５を点線で示した。
【００４６】
一方、その際のSC９０の信号を実線で示した（図６相当）。これら、点線および実線の測定条件は図６の場合と同じである。ただし、SC45の縦軸の絶対値は、図６の場合と対応せず、任意値である。図２４から明かなように、３００秒間、SC45は、増加しつづけており、抗原抗体複合物が成長していることを示している。
また、このように、SC９０が極大値を示す一例の粒径は、図１の装置で、上記した抗体の組合せの場合、およそ２５μｍ以上のときであった。
【００４７】
なお、上記実施の形態３においては、図１６に示すＳＣ９０のピークと経過時間との関係を表すグラフを用いたが、図２５に示すように、Ｔpeakと濃度との関係を表すグラフを用いても、Ｔpeakのみから濃度を一意的に求めることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明に係る免疫比濁計測方法は尿検査等に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明において用いることのできる免疫比濁計測装置の一実施の形態の概略上面図である。
【図２】図１に示す免疫比濁計測装置の概略側面図である。
【図３】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図４】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図５】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図６】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図７】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図８】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図９】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図１０】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図１１】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図１２】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図１３】実施の形態１における光センサ５の出力信号の時間変化を示す図である。
【図１４】３００秒経過時点の光センサ５の出力信号を濁度として縦軸に示し、被検液の濃度を横軸に示したグラフである。
【図１５】図５〜１３における各被検液の濃度を横軸に、濁度の極大値（Ｓpeak）を縦軸に示したグラフである。
【図１６】極大値を示す経過時間（Ｔpeak）を横軸に、濁度の極大値（Ｓpeak）を縦軸に示したグラフである。
【図１７】抗原濃度と濁度との関係を示すグラフである。
【図１８】光センサ５の出力信号の時間変化を示すグラフである。
【図１９】光センサ５の出力信号の時間変化を示すグラフである。
【図２０】光センサ５の出力信号の時間変化を示すグラフである。
【図２１】光センサ５の出力信号の時間変化を示すグラフである。
【図２２】３００秒経過時点の光センサ５の出力信号を濁度として縦軸に示し、被検液の濃度を横軸に示したグラフである。
【図２３】本発明において用いることのできる免疫比濁計測装置の別の実施の形態の概略上面図である。
【図２４】時間に対するＳＣ４５（点線）およびＳＣ９０（実線）の変化を示すグラフである。
【図２５】Ｔpeakと濃度との関係を表すグラフである。
【符号の説明】
【００５０】
１  サンプルセル
２  注入口
３  半導体レーザモジュール
４  略平行光
５  光センサ
６  混合機
７  コンピューター
８  液体の流束方向を示す矢印
９  液面
１０  液体の注入方向を示す矢印
１１  散乱光
１２  微分器
【図１】
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【図２】
2005043350.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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