(57)【要約】【課題】環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とマーカー遺伝子とを組合わせて利用することによって、細胞を生きた状態でも環境変化による刺激の受容や応答をリアルタイムで検出・検定することのできる機能化細胞が提供される。【解決手段】環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とその３’末端側にマーカー遺伝子とが連結された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とその３’末端側にマーカー遺伝子とが連結された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
機能遺伝子の転写調節領域が、ストレス応答遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする請求項１の発現ベクター。
【請求項３】
ストレス応答遺伝子の転写調節領域が、ヒートショックタンパク質７０Ｂの転写調節領域であることを特徴とする請求項２の発現ベクター。
【請求項４】
マーカー遺伝子が、発光遺伝子であることを特徴とする請求項１から３いずれかの発現ベクター。
【請求項５】
発光遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑蛍光遺伝子、青蛍光遺伝子、赤蛍光遺伝子および黄蛍光遺伝子からなる群より少なくとも１つ以上が選択されることを特徴とする請求項４の発現ベクター。
【請求項６】
請求項１から５いずれかの発現ベクターによって、形質転換されていることを特徴とする機能化細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、機能化細胞とその発現ベクターに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域を利用した機能化細胞に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体の細胞組織は、人工的に生育に必要な栄養素を適切に付与し、また培養環境等を整備することによって、生体外においても一定期間、分裂および成長をする。このような技術（組織細胞培養法）は、従来より生物学、医学、ウイルス学、生化学や生理学、病理学基礎研究等において広く用いられてきている。たとえば、各種臓器の形態や機能の解析にとって細胞組織を直接観察することができることは、大変有効な実験手法である。また、医薬品等の有効性や安全性を試験する際にも組織細胞培養法は、迅速、廉価、さらに精細な検討が可能である利点を有した、研究・実験手段となっている。
【０００３】
このような細胞は、様々な環境の変化に敏感に応答する。この反応を医薬品や、食品添加物等の安全評価に応用することにより、高感度な物質測定や毒性検定法が実現することができる。
【０００４】
たとえば、モノクローナル抗体を利用した細胞内における発現物質の検出（特許文献１）等が提案されている。この検出は、抗ヒトＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ−１）モノクローナル抗体の存在下および非存在下に、ＨＯ全活性を測定することにより、細胞や組織におけるヒトＨＯ−１量を測定し、また２種の前記モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡにより細胞や組織におけるヒトＨＯ−１量を測定して、ストレスを検出する。そして、細胞等をパラホルムアルデヒドで処理し、次いでサポニンと上記モノクローナル抗体で処理し、蛍光染色することにより、ヒトＨＯ−１を検出してストレス応答を検出する。
【０００５】
しかしながら、このような検出では、細胞をパラホルムアルデヒド処理により固定化しているため、細胞を生きた状態における環境変化による刺激の受容や応答をリアルタイムで検出・検定することができないという問題があった。
【０００６】
また、ストレス応答遺伝子、たとえば、熱刺激等のストレスによって、発現が上昇するタンパク質として発見されたヒートショックタンパク質（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、ＨＳＰとすることがある）を利用した遺伝子発現の制御（たとえば、非特許文献１）等は知られているが、ストレス応答遺伝子の転写調節領域を利用して、環境変化等の刺激（ストレス）を測定する方法や検定する方法においては知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−１１２７９１号公報
【非特許文献１】
Ｓｃｈｈｉｌｌｅｒ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０３；９７−１０５，  １９８８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、以上の事情を鑑みてなされたものであって、環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とマーカー遺伝子とを組合わせて利用することによって、細胞を生きた状態でも環境変化による刺激の受容や応答をリアルタイムで検出・検定することのできる機能化細胞を提供することを課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、前記の課題を解決するものとして、第１には、環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とその３’末端側にマーカー遺伝子とが連結された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクターを提供し、第２には、機能遺伝子の転写調節領域が、ストレス応答遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする発現ベクターを、第３には、ストレス応答遺伝子の転写調節領域が、ヒートショックタンパク質７０Ｂの転写調節領域であることを特徴とする発現ベクターを提供する。
【００１０】
またこの出願の発明は、第４には、マーカー遺伝子が、発光遺伝子であることを特徴とする発現ベクターを、第５には、発光遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑蛍光遺伝子、青蛍光遺伝子、赤蛍光遺伝子および黄蛍光遺伝子からなる群より少なくとも１つ以上が選択されることを特徴とする発現ベクターを提供する。
【００１１】
そして、この出願の発明は、第６には、前記第１から第５いずれかの発明の発現ベクターによって形質転換されていることを特徴とする機能化細胞を提供する。
【００１２】
以下に上記の各発明について実施の形態を詳しく説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、環境変化あるいは環境刺激に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とその３’末端側にマーカー遺伝子とが連結された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクターである。
【００１４】
上記の環境変化に呼応する機能遺伝子とは、熱刺激や冷刺激、痛感刺激、光刺激等のストレス応答遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子（ｂｃｌ−２やｐ５３等）、薬物代謝に関与する遺伝子（Ｐ４５０等）、環境ホルモンに関与する遺伝子（エストロゲン、アンドロゲン等）であることを特徴としている。また、多種多様な環境変化を同時に検出・検定するため、これら機能遺伝子の転写調節領域を複数組合わせて用いてもよい。
【００１５】
この機能遺伝子の転写調節領域は、刺激を与える容易性等の観点から、ストレス応答遺伝子の転写調節領域であることが好ましく、またヒートショックタンパク質７０（以下、ＨＳＰ７０とすることがある）のファミリーであり、熱刺激の応答性が高いヒートショックタンパク質７０Ｂ（以下、ＨＳＰ７０Ｂとすることがある）の転写調節領域であることが、さらに好ましい。
【００１６】
このＨＳＰ７０Ｂは、多くの細胞に発現し、しかも熱刺激等のストレスによって、発現が上昇するタンパク質として発見されたＨＳＰの１種であり、このＨＳＰの多くは、分子量に基づいて、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ３２、ＨＳＰ２７等に分類されている。たとえば、ＨＳＰ７０は分子量が７０ｋＤａであることを意味する。ＨＳＰは不安定な状態のタンパク質と結合し、安定化（シャペロン作用）させることによって、細胞の保護作用を担っている。
【００１７】
図１に例示した、この出願の発明に用いるＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域（配列番号１）は、ヒトＨＳＰ７０ＢゲノムＤＮＡ（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ５９０３８５等）からクローン化することができる。たとえば、ＨＳＰ７０ＢのゲノムＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいて、目的とするポリヌクレオチドの両末端にハイブリダイズをするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして、ＰＣＲ法を行うことによって、任意のＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域をコードするポリヌクレオチドを調製することができ、またＰＣＲ法で目的の領域を増幅する際に、プライマーに適当な制限酵素サイトを付与することによって、このポリヌクレオチドを適当な制限酵素でダイジェストすることができ、簡便に発現ベクター等に導入することができる。
【００１８】
そして、この出願の発明はマーカー遺伝子が、発光遺伝子であることが好ましい。この発光遺伝子は、特に限定されるものではないが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑蛍光遺伝子、青蛍光遺伝子、赤蛍光遺伝子および黄蛍光遺伝子のいずれかであることが好ましい。さらに、たとえば、これら発光遺伝子を組合わせて細胞に導入し、複数の発光色としてもよい。
【００１９】
上記のようにＨＳＰ７０Ｂをはじめとする機能遺伝子の転写調節領域とマーカー遺伝子は、公知の方法（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９等）に従い連結させ、実験目的等に合わせて適当なベースベクターに導入し、発現ベクターとする。このベースベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。また、発光遺伝子を有するベクターをベースベクターとして利用することで、より簡便にこの出願の発明の発現ベクターを調整することができる。たとえば、ｐＥＧＦＰ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）やｐＥＢＦＰ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等が使用できる。
【００２０】
この出願の発明は、前記のように調製された発現ベクターを各種の培養細胞に導入することによって得られる機能化細胞も提供する。
【００２１】
導入方法としては、リポフェクション法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法等、公知の導入方法が利用できる。
【００２２】
また、発現ベクターを導入するための細胞は、特に限定されるものではないが、真核細胞が望ましい。たとえば、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト肝ガン細胞ＨｅｐＧ２やＨｕｈ７等の各種ヒト腫瘍株化細胞、哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞等が例示できる。また、混合培養が可能であれば、由来する種や組織が異なる２種類以上の真核細胞を用いても良い。
【００２３】
そして、この機能化細胞には、刺激を与える容易性や発光測定の容易性を考慮すると、ヒートショックタンパク質７０Ｂの転写調節領域とともに、発光遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑蛍光遺伝子、青蛍光遺伝子、赤蛍光遺伝子および黄蛍光遺伝子の少なくとも１つが導入されていることが好ましい。
【００２４】
このように、熱刺激に応答するＨＳＰ７０Ｂ等の環境変化に呼応する機能遺伝子（ストレス応答遺伝子等）の転写調節領域を用いることによって、特定の刺激に対して特異的に応答し、その結果発光遺伝子が発現して発光を生じる機能化細胞を得ることができる。この機能化細胞によって非侵襲的に、また簡便に機能遺伝子の発現変化を高感度に視覚化することができる。これによって、医薬品や食品添加物等を試料として、その毒性検定等に活用することができる。
【００２５】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】
実施例１：発現ベクターの構築
発現ベクターは、公知の方法（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９等）に従い、８パターンのＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域とその３’末端側にマーカー遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結した。
【００２７】
具体的には、ＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域をＰＣＲ法にて増幅させて、ベースベクターのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃが有するホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側（上流側）にＤＮＡリガーゼを利用して連結導入させ、発現ベクターとして作製した。ＰＣＲ法でＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域を増幅させる際、末端側にＸｈｏ  ＩサイトおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩサイトを付与させた。ＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域には以下の８パターンを調製した。
（ｉ）転写開始点から−８６ｂｐ（配列番号２）
（ｉｉ）転写開始点から−２８７ｂｐ（配列番号３）
（ｉｉｉ）転写開始点から−３７７ｂｐ（配列番号４）
（ｉｖ）転写開始点から−５５２ｂｐ（配列番号５）
（ｖ）転写開始点から−６９４ｂｐ（配列番号６）
（ｖｉ）転写開始点から−７９０ｂｐ（配列番号７）
（ｖｉｉ）転写開始点から−９５０ｂｐ（配列番号８）
（ｖｉｉｉ）転写開始点から−１１５７ｂｐ（配列番号９）
また、マーカー遺伝子を緑蛍光（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；  ＧＦＰ）遺伝子とした場合は、上記と同様にＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域をＰＣＲ法にて増幅させてＰＣＲ産物として得、このＰＣＲ産物をＧＦＰ遺伝子を有するベクターｐｄ２ＥＧＦＰに、ＧＦＰ遺伝子の５’末端側（上流側）にＤＮＡリガーゼを利用して連結導入させ、ＧＦＰを発現する発現ベクターとして作製した。この発現ベクターに用いるＨＳＰ７０Ｂの転写調節領域には、末端側にＸｈｏ  ＩサイトおよびＫｐｎ  Ｉサイトが付与されている。この場合のＨＳＰ７０Ｂ転写調節領域は、以下の３パターンを調製した。
（ｉ）転写開始点から−２８７ｂｐ（配列番号３）
（ｉｉ）転写開始点から−７９０ｂｐ（配列番号７）
（ｉｉｉ）転写開始点から−１１５７ｂｐ（配列番号９）
なお、転写開始点から上流に遡って、塩基番号を付しているため、塩基番号の前に「−」を表記した。
【００２８】
図２に機能化細胞の作製方法を模式図として例示した。また、図３は、ストレス応答に必要と思われる領域を模式的に例示した図である。
【００２９】
実施例２：培養細胞への導入
実施例１で得られた発現ベクターを、ヒト肝ガン細胞株ＨｅｐＧ２にリポフェクション法（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ試薬、ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、用いた試薬の説明書に従い導入した。
【００３０】
実施例３：蛍光発光測定
実施例２で得られた細胞は、遺伝子導入の４８時間後に４２℃、１時間の熱刺激を与えた。その２４時間後、マーカー遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞においては、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７、ＢＥＲＴＨＯＬＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてホタルルシフェラーゼに由来する生物発光の測定を行った。
【００３１】
結果は、図４に示したとおりである。３７℃の培養温度では、いずれの転写調節領域においても、殆ど発光しなかった。一方、４２℃での培養温度では、上記（ｉ）の転写調節領域−８６ｂｐ（配列番号２）を除き、全ての転写調節領域において発光することが確認された。すなわち、熱刺激に応答して発光作用を生じることが確認された。
【００３２】
特に、（ｖｉｉ）の転写調節領域−２８７ｂｐ（配列番号３）は強い発光が確認され、熱応答性に関して、必要な転写調節領域は−２８７ｂｐ（配列番号３）のみでも充分な熱刺激に応答することができることが明らかとなった。
【００３３】
また、マーカー遺伝子として緑蛍光（ＧＦＰ）遺伝子を導入した細胞の場合には、暗室内に設置した倒立蛍光顕微鏡を利用することによって、培養細胞を生きたままの状態（すなわち、リアルタイム）で、ＧＦＰに由来する蛍光発光の測定を行った。励起条件としては、およそ４６０−４８０ｎｍ、４９２−４５０ｎｍの波長の光を用いた。また、蛍光観察は、４２℃、１時間の熱刺激を与えた１時間後に行った。
【００３４】
結果は、図に示していないが、−２８７ｂｐ（配列番号３）、−７９０ｂｐ（配列番号７）、−１１５７ｂｐ（配列番号９）いずれの転写調節領域においても熱刺激に応答して、充分な蛍光を発することが確認された。
【００３５】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明は、環境変化に呼応する機能遺伝子の転写調節領域とマーカー遺伝子とを組合わせて利用することによって、細胞を生きた状態でも環境変化による刺激の受容や応答をリアルタイムで検出・検定することのできる機能化細胞を提供することができる。
【００３６】
【配列表】
2005000077.tif 000002
2005000077.tif 000003
2005000077.tif 000004
2005000077.tif 000005
2005000077.tif 000006
2005000077.tif 000007
2005000077.tif 000008
2005000077.tif 000009
2005000077.tif 000010
2005000077.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒートショックタンパク質７０Ｂにおける転写調節領域の塩基配列を例示した図である。
【図２】機能化細胞の作製方法を例示した模式図である。
【図３】熱刺激応答に必要なＨＳＰ７０Ｂにおける転写調節領域を例示した模式図である。
【図４】図３に例示した各ＨＳＰ７０Ｂ転写調節領域におけるホタルルシフェラーゼ活性を示した図である。
【図１】
2005000077.tif 000012
【図２】
2005000077.tif 000013
【図３】
2005000077.tif 000014
【図４】
2005000077.tif 000015