(57)【要約】【課題】  インスリン応答性マーカー及び該マーカーを指標として生体におけるインスリン応答性を評価する方法を提供する。【解決手段】  Stra13遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチド；Stra13を特異的に認識する抗体からなるインスリン応答性マーカー及び、該マーカーを用いたインスリン応答性の評価方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Stra13遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるインスリン応答性マーカー。
【請求項２】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、被験者におけるインスリン応答性の評価方法：
（ａ）  被験者の生体組織試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、請求項１に記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）  請求項１に記載のマーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、該マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）  （ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が増大していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の上昇を判断し、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が減少していることを指標として、該生体組織におけるインスリン応答性の低下を判断する工程。
【請求項３】
生体組織が、肝臓であることを特徴とする、請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
Stra13を特異的に認識する抗体からなるインスリン応答性マーカー。
【請求項５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、被験者におけるインスリン応答性の評価方法：
（ａ）  被験者の生体組織試料から調製されたポリペプチドと、請求項４に記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）  請求項４に記載のマーカーに特異的に結合したポリペプチドを、該マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）  （ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が増大していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の上昇を判断し、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が減少していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の低下を判断する工程。
【請求項６】
生体組織が、肝臓であることを特徴とする、請求項５に記載の評価方法。
【請求項７】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むインスリン応答性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、Stra13遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、Stra13遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、Stra13遺伝子の発現量を増大させる被験物質をインスリン応答性促進物質として選択するか、又は、Stra13遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン応答性抑制物質として選択する工程。
【請求項８】
請求項７に記載のスクリーニング方法で得られるインスリン応答性促進物質を候補物質として選別することを特徴とする、糖新生抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
インスリン抵抗性疾患の予防、改善又は治療剤の候補物質の探索のために行われることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
糖代謝異常を伴う疾患の予防、改善または治療剤の候補物質の探索のために行われることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
Stra13遺伝子、Stra13、又はStra13遺伝子もしくはStra13の発現促進物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性もしくは糖代謝の予防、改善又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン誘導性転写調節因子：Stra13及びStra13遺伝子の、インスリン応答性のマーカーとしての利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓等における糖・脂質代謝の調節で、最も重要な役割を果たしているのはインスリンである。インスリンは糖、脂質、蛋白質の代謝作用の他、細胞増殖、細胞骨格の制御、筋肉、肝臓細胞の分化、転写調節、アポトーシスの抑制と多岐にわたる生理作用を有するホルモンである。
特に糖代謝に関しては、インスリンは肝臓に直接作用し、糖産生を抑制することで糖代謝の恒常性を維持している。また血糖を調節するホルモン類の中で、インスリンは唯一血糖低下作用を示す。
従って、インスリンの作用不全は直接体内の糖代謝の恒常性維持に問題を引き起こす。例えば糖尿病患者の空腹時における血糖上昇は、主に肝臓におけるインスリンの糖産生抑制作用、すなわち糖新生系酵素遺伝子の発現抑制等の生理作用が充分に働かないためであると考えられている（インスリン抵抗性状態）。この様なインスリン応答性の低下で見られるインスリン抵抗性状態は糖尿病の他にも動脈硬化、高血圧、高脂血症といった症例にも見られることが知られている。このため、肝臓におけるインスリン作用の発現機構の解明はこのようなインスリンの作用不全に起因する病態の改善に必要とされている。
一方、インスリンは肝臓において脂肪酸、中性脂肪の合成に関与するSREBP‐1cの発現量を増加させることも知られている。高インスリン血症を呈する脂肪萎縮症マウスや肥満マウスの肝臓においてはこのSREBP‐1cの発現量が顕著に上昇しており、脂肪酸合成活性の増加が見られ、インスリン感受性が維持されることが報告されている（J. Biol. Chem. Vol.274 p30028 (1999) ）。
このようなインスリンの作用は、標的細胞上に存在するインスリンレセプターに結合し、レセプターチロシンキナーゼが活性化されることによりシグナル伝達が生じ、種々の転写因子の発現が誘導されることにより、生じると考えられている。
しかし、これまでに知られている転写調節因子の作用では、上記インスリン抵抗性状態の肝臓における生理作用を十分に説明できない。このことから肝臓においてインスリン応答性に関与する新たな転写因子が存在すると考えられるが、未だ特定されるには至っていない。
一方、Stra13（Dec1、Clast5又はSharp2とも呼ばれている。）はレチノイン酸で誘導される因子として単離された、bHLH型転写因子（非特許文献１）である。該転写因子についてはHypoxia（低酸素条件）により誘導され、脂肪細胞の分化抑制作用を有するということや（非特許文献２、特許文献１）、レプチンにより誘導される遺伝子の一つであることや（特許文献２）、マウスEC細胞株ATDC5でTGF−β、BMP2もしくはインスリンで発現誘導されること（非特許文献３）が報告されている。しかし、Stra13と肝臓におけるインスリンの作用との関係は全く知られていなかった。
【０００３】
【特許文献１】特表2002−507405
【特許文献２】特表2002−525067
【非特許文献１】Genes & Dev., 11, 2052-2065 (1997)
【非特許文献２】Dev. Cell, 2, 331-341 (2002)
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 277, 50112-50120 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、肝臓においてインスリンにより誘導され、インスリンの生理作用に関与する転写因子を同定し、該転写因子の発現を指標として、患者におけるインスリン応答性異常を検出するための診断マーカーや、インスリン抵抗性等のインスリン応答性異常を伴う疾患を改善／治療する薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、インスリンにより発現誘導される遺伝子を同定すべく鋭意検討した結果、肝臓細胞において、これまで知られているSREBP-1、グルコキナーゼ、脂肪酸合成酵素といった既知のインスリン誘導性遺伝子の発現よりも早い段階で、Stra13遺伝子の発現が誘導されることを見出した。
更に、インスリン拮抗剤であるデキサメサゾンやグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるcAMPで細胞を処理すると、インスリン依存性のStra13遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
上記の知見からStra13遺伝子又は該遺伝子がコードするタンパク質（Stra13）の発現を指標とすることにより、迅速に肝臓におけるインスリン由来シグナル伝達、すなわちインスリン応答性を検出することが可能となった。すなわちインスリン応答性異常を伴う疾患の予防／治療のために有用となる、インスリン応答性の評価方法、又はStra13遺伝子もしくはStra13の発現を指標とするインスリン応答性を制御する物質のスクリーニング方法を提供できる。
更に、Stra13は、肝臓細胞において糖新生に関与する因子の発現を抑制する作用を有することがわかった。従って、Stra13遺伝子、Stra13及びこれらの発現促進物質は肝臓における糖新生抑制剤、ひいてはインスリン抵抗性もしくは糖代謝の予防、改善又は治療剤と成り得る。
本発明は上記の知見をもとに完成するに至ったものである。すなわち本発明は、
［１］  Stra13遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるインスリン応答性マーカー；
［２］  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、被験者におけるインスリン応答性の評価方法：
（ａ）  被験者の生体組織試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、［１］に記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）  ［１］に記載のマーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、該マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）  （ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が増大していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の上昇を判断し、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が減少していることを指標として、該生体組織におけるインスリン応答性の低下を判断する工程；
［３］  生体組織が、肝臓であることを特徴とする、［２］に記載の評価方法；
［４］  Stra13を特異的に認識する抗体からなるインスリン応答性マーカー；
［５］  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする、被験者におけるインスリン応答性の評価方法：
（ａ）  被験者の生体組織試料から調製されたポリペプチドと、［４］に記載のマーカーとを結合させる工程、
（ｂ）  ［４］に記載のマーカーに特異的に結合したポリペプチドを、該マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）  （ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が増大していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の上昇を判断し、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が減少していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の低下を判断する工程；
［６］  生体組織が、肝臓であることを特徴とする、［５］に記載の評価方法；
［７］  下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含むインスリン応答性を制御する物質のスクリーニング方法：
（ａ）  被験物質と、Stra13遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、Stra13遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、Stra13遺伝子の発現量を増大させる被験物質をインスリン応答性促進物質として選択するか、又は、Stra13遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン応答性抑制物質として選択する工程；
［８］  ［７］に記載のスクリーニング方法で得られるインスリン応答性促進物質を候補物質として選別することを特徴とする、糖新生抑制物質のスクリーニング方法；
［９］  インスリン抵抗性疾患の予防、改善又は治療剤の候補物質の探索のために行われることを特徴とする、［８］に記載のスクリーニング方法；
［１０］  糖代謝異常を伴う疾患の予防、改善または治療剤の候補物質の探索のために行われることを特徴とする、［８］に記載のスクリーニング方法；
［１１］  Stra13遺伝子、Stra13、又はStra13遺伝子もしくはStra13の発現促進物質を有効成分として含有する、インスリン抵抗性もしくは糖代謝の改善又は治療剤；
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、肝臓におけるインスリン応答性を評価する方法、患者におけるインスリン応答性異常を伴う疾患の罹患を診断するためのインスリン応答性マーカー、該マーカーを用いてインスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性を制御する物質のスクリーニング方法、インスリン抵抗性もしくは糖代謝の改善又は治療剤等を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【０００８】
本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子(DNA)とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号：1）で示される「遺伝子」または「DNA」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体(ホモログ)等）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。具体的には、「Stra13遺伝子」は配列番号：１で表されるヒトStra13遺伝子のみならず、その同族体（ホモログ）や、後述の(1-1)項に記載のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：1で示される特定塩基配列もしくは前記同族体の塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「遺伝子」または「DNA」を包含する。
【０００９】
例えばヒト由来のタンパク質の同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示できる。これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http: // www. ncbi. nlm. nih. Gov / HomoloGene/）により同定することができる。当該遺伝子（ホモログ）は、具体的には、例えば下記のようにして取得することができる：特定のヒト遺伝子の塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http: // www. ncbi. nlm. nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが0でかつIdentityが100%を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜する。具体的には、配列番号３で表されるマウスStra13遺伝子（Genbank  Acc.No.：NM_011498）や、配列番号５で表されるラットStra13遺伝子（Genbank  Acc.No.：  NM_053328）を挙げることができる。
【００１０】
なお、遺伝子またはDNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１１】
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログ）、誘導体、および変異体が包含される。具体的には、上記Stra13遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「Stra13」とも言う）は、配列番号2に示すタンパク質のみならず、その相同物、すなわち同族体（ホモログ）や前記変異体をも包含する。
【００１２】
例えば、ヒト由来のタンパク質の同族体（ホモログ）としては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。具体的には、配列番号：４で表されるマウスStra13や、配列番号：６で表されるラットStra13を挙げることができる。
また変異体とはヒト由来のタンパク質もしくはその同族体の変異体をあらわし、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、アミノ酸配列が少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
【００１３】
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がStra13の生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１４】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００１５】
本明細書において「インスリン応答性」とは、インスリンシグナルにより生ずる転写因子の活性化、及び該転写因子の活性化によるインスリン作用の発現、具体的には例えば肝臓における糖新生抑制作用の惹起や、脂肪酸合成活性の促進などを表す。すなわち、特に言及しない限り、本明細書において「インスリン応答性」とは、肝臓における糖新生抑制作用に関わる一連のシグナル伝達作用の総称として用いられる。
本明細書において「インスリン応答性マーカー」とは、インスリン応答性を評価するために、インスリン応答性異常の有無を診断するために、またはインスリン応答性異常を伴う疾患の予防／改善／治療に有用な候補物質、すなわちインスリン応答性を制御する物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものである。これには、インスリンの分泌に応答して生体内での発現が迅速に誘導される、Stra13遺伝子を特異的に認識し結合することのできるヌクレオチド（オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドが含まれる）、または該遺伝子がコードするタンパク質（Stra13）を特異的に認識し結合することのできる抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００１６】
以下、これらの本発明遺伝子、並びにその発現産物（Stra13、以下本発明タンパク質ともいう）やそれらの派生物について、具体的な用途を説明する。
【００１７】
（１）インスリン応答性マーカー及びその応用
(1-1) ポリヌクレオチド
本発明においてStra13遺伝子とは、公知遺伝子であり、ヒト由来のStra13遺伝子としては、配列番号１に示すポリヌクレオチドが知られており（GenBank Accession No.  NM_003670）、その取得方法についてもBiochem. Biophys. Res. Commun. 236 (2), 294-298 (1997)に記載されるように公知である。その同族体(ホモログ)としては、配列番号３に記載のマウスStra13遺伝子（Genbank  Accession  No. NM_011498）や配列番号５に記載のラットStra13遺伝子（Genbank  Accession  No. NM_053328）が挙げられ、これらの取得方法についてもGenes Dev. 11 (16), 2052-2065 (1997)、Mol. Cell. Neurosci. 10 (3-4), 460-475 (1997)に記載されるように公知である。本明細書においてStra13遺伝子という場合、ヒトStra13遺伝子だけでなく、その同族体（ホモログ）等、該遺伝子によりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質をコードする遺伝子も含む概念である。
【００１８】
本発明は、前述するように、Stra13遺伝子（本発明遺伝子）の発現が、肝臓由来細胞においてインスリンの分泌に応答して上昇しており、インスリン拮抗物質により、その発現が抑制されるという知見に基づく。すなわち、これらの遺伝子の発現誘導の有無や発現誘導の程度を検出することによって、インスリン応答性の程度を評価したり、インスリン応答性異常を特異的に検出したり、インスリン応答性異常を伴う疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドは、被験者のインスリン応答性を評価するためのツール（インスリン応答性マーカー）として有用である。具体的には、当該ポリヌクレオチド（インスリン応答性マーカー）は、被験者における本発明遺伝子の発現の有無またはその程度（発現量）の検出に使用される。
【００２０】
また上記ポリヌクレオチドは、後述の(3-1)項に記載するようなインスリン応答性を制御する物質のスクリーニングにおいて、本発明遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出するためのスクリーニングツール（インスリン応答性マーカー）としても有用である。
ここで、インスリン応答性マーカーを被験者におけるインスリン応答性の評価やインスリン応答性異常に関する診断に用いる場合、該マーカーは、配列番号１に記載されたヒトStra13遺伝子の塩基配列に基づくものであることが好ましい。
【００２１】
かかる本発明のインスリン応答性マーカーは、Stra13遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
【００２２】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、Stra13遺伝子の全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１ｘSSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5ｘSSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1ｘSSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００２３】
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、Stra13遺伝子の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
【００２４】
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態でインスリン応答性マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態でインスリン応答性マーカーとして使用されてもよい。
【００２５】
本発明のインスリン応答性マーカーは、具体的にはヒトStra13遺伝子の塩基配列に関する配列番号１に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、マウスStra13遺伝子の塩基配列に関する配列番号３に記載される塩基配列（全長配列）もしくはラットStra13遺伝子の塩基配列に関する配列番号５に記載される塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。更に、前記各配列番号で示される本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列若しくはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２６】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノザンブロット法を用いた場合は、Stra13遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またRT-PCR法を用いた場合は、Stra13遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
【００２７】
そのような本発明のインスリン応答性マーカーは、配列番号1、配列番号３、又は配列番号５で示される塩基配列等の本発明遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００２８】
具体的には本発明遺伝子をprimer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００２９】
本発明で用いるインスリン応答性マーカーは、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００３０】
本発明においてインスリン応答性の評価は、被験者の生体組織、特に肝臓組織における、Stra13遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明のインスリン応答性マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００３１】
上記インスリン応答性マーカーをプライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
【００３２】
本発明のインスリン応答性マーカーは、ノザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができ、これによってStra13遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）に基づきインスリン応答性を評価することができる。なお、測定対象試料としては、使用する検出方法の種類や目的に応じて、被験者の肝臓組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくは該組織周辺の血液を採取することによって体外に取り出した生体試料から常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００３３】
また、生体組織における本発明遺伝子の遺伝子発現レベルは、DNAチップを利用して検出あるいは定量することもできる。この場合、本発明のインスリン応答性マーカーは当該DNAチップのプローブとして使用することができる（例えば、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,Eの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるDNAチップを、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたは標識RNAとハイブリダイズさせて、ハイブリダイズによって形成されたチップ上の上記プローブ（インスリン応答性マーカー）と標識DNAまたは標識RNAとの複合体を、該標識DNAまたは標識RNAの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
【００３４】
本発明のインスリン応答性マーカーは、インスリン応答性異常を伴う疾患の罹患が疑われる患者におけるインスリン応答性を評価し、該疾患の検出や診断（罹患の有無や罹患の程度の診断）するために有用である。具体的には、被験者の生体組織と正常者の生体組織（いずれも採取された組織を含む。以下、同じ）におけるStra13遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、「遺伝子発現レベルの違い」には、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の肝臓組織と正常者の肝臓組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上ある場合が含まれる。具体的にはStra13遺伝子はインスリンに応答して発現誘導されるので、被験者の肝臓組織で特異的に発現しているか、あるいは該発現量が正常な肝臓組織の発現量と比べて1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上であれば、被験者においてインスリン応答性が上昇していると判断される。一方、被験者の肝臓組織で特異的に発現が減少しているか、あるいは該発現量が正常な肝臓組織の発現量と比べて3/4倍以下、好ましくは1/2倍以下、より好ましくは1/3倍以下であれば、被験者においてインスリン応答性が低下していると判断され、インスリン応答性異常やインスリン抵抗性糖尿病等の罹患が疑われる。
【００３５】
本発明においてインスリン応答性の評価は、被験者の肝臓組織におけるStra13遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。
【００３６】
上記の本発明インスリン応答性マーカー（以下本遺伝子とも称する。）は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得することができる。
具体的には、まず、ヒト、マウス又はラット等の組織、細胞やこれらに由来する培養細胞などからＲＮＡを調製する。例えば、ラット肝臓を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等の強力な蛋白質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることにより蛋白質を変性させる。変性蛋白質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。なお、これらの方法に基づいた市販の試薬としては、例えばISOGEN（ニッポンジーン製）、トリゾル試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）等がある。
得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプライマーをＲＮＡのポリＡ配列にアニールさせ、逆転写酵素を作用させることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつStra13遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５に記載の塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、本遺伝子を増幅し、取得することができる。
また、上記の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより二本鎖のｃＤＮＡを合成する。得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えばプラスミドpUC118やファージλgt10などのベクターに挿入することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。このようにして得られるｃＤＮＡライブラリーや市販のｃＤＮＡライブラリーから、本遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、本遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列）に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、本遺伝子を取得することもできる。
ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、約15bpから約50bp程度の長さでかつGまたはC塩基の割合が約40%から約60%程度の塩基配列を、上記のような本タンパク質をコードする既知の塩基配列から選択し、該塩基配列に基いてオリゴヌクレオチドを設計し、合成するとよい。
得られた本遺伝子の塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載の方法)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載の方法）により確認することができる。
上記のようにして得られた本遺伝子は、例えば、J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラー クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、１９８９年等記載の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
ベクターとしては、具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えばプラスミドpUC119(宝酒造（株）製)や、ファージミドpBluescriptII(ストラタジーン社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、プラスミドpACT2(Clontech社製)などをあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRC/RSV、pRC/CMV(Invitrogen社製)等のプラスミド、ウシパピローマウイルスプラスミドpBPV(アマシャムファルマシア社製)、EBウイルスプラスミドpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルスなどをあげることができる。昆虫類動物細胞（以下、昆虫細胞と記す。）を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
本遺伝子の上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上述のようなベクターに組み込むことにより、本遺伝子を宿主細胞で発現させることの可能な発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、本遺伝子が宿主細胞に導入された際に、宿主細胞においてプロモーターの制御下に発現されるように、当該プロモーターと本遺伝子とを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、シミアンウイルス(SV40)の初期もしくは後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス(MMTV)プロモーター等をあげることができる。宿主細胞が出芽酵母である場合には、ADH1プロモーター（尚、ADH1プロモーターは、例えばADH1プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5 〔Washington Research Fundation から入手可能、Ammerer ら、Method in Enzymology、101 part（p.192-201）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）などをあげることができる。
一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを、宿主細胞で利用可能なベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターを使用する場合には、ベクター保有のプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で結合するように、該プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すればよい。例えば、前述のプラスミドpRC/RSV,pRC/CMV等は、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられており、該クローニング部位に本遺伝子を挿入し動物細胞へ導入することにより、本遺伝子を発現させることができる。また、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、該プラスミドまたはその誘導体のADH1プロモーターの下流に本遺伝子を挿入すれば、本遺伝子を例えばCG1945(Clontech社製)等の出芽酵母内で発現させることが可能な発現ベクターが構築できる。マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本遺伝子が導入された形質転換体を当該マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
本遺伝子が組み込まれたベクター（以下、本ベクターと記すこともある。）を宿主細胞へ導入する方法としては、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の方法を用いることにより本ベクターを宿主細胞へ導入することができる。また、哺乳類動物細胞または昆虫細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法により前記細胞に本ベクターを導入することができる。酵母菌を宿主細胞とする場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(Clontech社製)などを用いて導入することができる。
本ベクターが導入された形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時に下記のようなマーカー遺伝子を宿主細胞に導入し、導入されたマーカー遺伝子の性質に応じた方法で本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。例えば、当該マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子（薬剤耐性付与遺伝子）である場合には、該薬剤を添加した培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すれば良い。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、当該マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、該栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。
上述のようにして得られた本ベクターが導入された形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）を培養することにより本遺伝子を発現させることができる。
本発明評価法において用いられるインスリン応答性マーカーとなる、本遺伝子をコードする核酸は、前述の如く調製すればよいが、例えば、当該核酸を含有する組換えベクター又は組換えウイルス等の形態で使用されることもある。このような形態では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ポリオーマウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターをあげることができる。さらに、アデノウイルスベクターを使用する場合には、例えばＱＵＡＮＴＵＭ社製のＡｄＥａｓｙ  Ｋｉｔを用い、本遺伝子をＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトに組み込み、得られた組換えベクターを直線化した後に、ｐＡｄＥａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒと共に大腸菌にトランスフォームし、相同組換え体ＤＮＡをヒト２９３Ａ細胞に組み込むことにより、本遺伝子を含有する組換えウイルスを産生させ、これを回収し、使用することもできる。
また、ヒトサイトメガウイルスのプロモーター領域を有するプラスミドＤＮＡ等のような非ウイルス系のベクターを用いることもできる。本遺伝子を線維化組織部位に直接注入する場合のように、非ウイルスベクターを用いて本遺伝子を局所的に送達するシステムにおいては、プラスミドＤＮＡの使用は極めて有益である。体外に取り出された細胞に発現ベクターを導入して体内に戻す方法、すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ法を使えば、あらゆる既知の導入方法が利用可能である。例えば、ａ）直接注入、ｂ）リポソームを介する形質導入、ｃ）リン酸カルシウム法・エレクトロポレーション法・ＤＥＡＥ−デキストラン法による細胞トランスフェクション、ｄ）ポリブレンを介した送達、ｅ）プロトプラスト融合、ｆ）マイクロインジェクション、ｇ）ポリリシンを使った形質導入などによって、非ウイルスベクターを導入することができる。  又、本発明インスリン応答性マーカーは一般技術として公知の化学合成法を用いて調製することもできる。
【００３７】
（1-2）抗体
また本発明は、インスリン応答性マーカーとしてStra13遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「Stra13」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
【００３８】
Stra13としては配列番号１に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を挙げることができる。すなわち、配列番号1に示されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の具体的態様としては配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができ、その取得方法についてもBiochemical Journal. Vol367 p413-22 (2002)に記載されるように公知である。また、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるマウスStra13および配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるラットStra13等の同族体（ホモログ）も挙げることができる。
【００３９】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本発明タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該本発明タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００４０】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したStra13を用いて、あるいは常法に従って当該いずれかの本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。例えば(Genes Dev, 11:2052-2065, 1997)記載の方法で取得することもできる。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したStra13、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００４１】
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、後記配列表に記載する遺伝子の配列情報（配列番号1、３、５）等に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作等、通常の遺伝子工学的方法により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法［例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press；DM. Gloverら著、DNA クローニング（ IRL プレス発行、1985）等に記載されている方法］などに準じて行うことができる。具体的にはStra13をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらStra13は、後記配列表に記載するアミノ酸配列の情報（配列番号2、4、6）等に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００４２】
また本発明の抗体は、Stra13の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、Stra13と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはかかる特性を有し、Stra13のアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
なお、ここで「Stra13と同様な免疫原特性を有するオリゴペプチド」とは、免疫学的活性においてStra13と同等の活性を有するオリゴペプチドを表し、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつStra13に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
【００４３】
かかるポリペプチドに対する抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００４４】
本発明の抗体はStra13に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記本発明タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるStra13のタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
ここで、該抗体を被験者におけるインスリン応答性の評価やインスリン応答性異常に関する診断に用いる場合、該マーカーは、配列番号2に記載されたヒトStra13のアミノ酸配列を認識する抗体であることが好ましい。
【００４５】
具体的には、被験者の肝臓組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこから常法に従ってタンパク質画分を調製して、例えばウェスタンブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプローブとして使用することによってStra13を検出することができる。
【００４６】
インスリン応答性の診断に際しては、被験者の生体組織におけるStra13と正常な生体組織におけるStra13との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク質量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが3/4倍以下、好ましくは1/2倍以下、より好ましくは1/3倍以下である場合が含まれる。具体的には、被験者の肝臓組織に該遺伝子の発現産物（Stra13）が存在しており、該量が正常な肝臓の発現産物量と比べて3/4倍以下、好ましくは1/2倍以下、より好ましくは1/3倍以下であることが判定されれば、被験者についてインスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性異常を伴う疾患の罹患が疑われる。
【００４７】
（２）インスリン応答性の評価方法（診断方法）
本発明は、前述する本発明のインスリン応答性マーカーを利用したインスリン応答性の評価方法を提供するものである。
具体的には、本発明の評価方法は、被験者の生体組織、例えば肝臓組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこに含まれるStra13遺伝子の遺伝子発現レベル、あるいはこれらの遺伝子に由来するタンパク質（Stra13）を検出し、その発現量を測定することにより、インスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性異常を伴う疾患の罹患の有無またはその程度を診断するものである。
【００４８】
ここで用いられる生体試料は、被験者から採取される生体組織（例えば肝臓組織、あるいはこれら組織の周辺に存在する血液・滑液）、該組織から調製されるRNA若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチド、または上記組織から調製されるタンパク質である。かかるRNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、被験者の生体組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれらの組織周辺の血液・滑液を採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００４９】
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００５０】
(2-1) 測定対象の生体試料としてRNAを利用する場合
診断に用いる生体試料としてRNAを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は該RNA中のStra13遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。
【００５１】
この場合、本発明の検出方法は次の（a）、（b）及び（c）の工程を含む：
（ａ）  被験者の生体組織試料から調製されたRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドと、本発明のインスリン応答性マーカー（ポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
（ｂ）  前記インスリン応答性マーカーに特異的に結合したRNAまたはそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを、該マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）  （ｂ）で得られる被験者の測定結果が、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が増大していることを指標として該生体組織におけるインスリン応答性の上昇を判断し、正常な生体試料について得られる結果に比してマーカーへの結合量が減少していることを指標として、該生体組織におけるインスリン応答性の低下を判断する工程。
【００５２】
本発明のインスリン応答性の評価方法（診断方法）は、特に測定対象の生体試料としてRNAを利用して、該RNA中のStra13遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明のインスリン応答性マーカー（Stra13遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００５３】
ノザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記インスリン応答性マーカーをプローブとして用いることによって、RNA中のStra13遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明のインスリン応答性マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後（工程(a)）、形成されたインスリン応答性マーカー（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、インスリン応答性マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する（工程(b)）方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従ってインスリン応答性マーカー（プローブDNA）を標識し、被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後（工程(a)）、インスリン応答性マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する（工程(b)）方法を使用することもできる。
【００５４】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記インスリン応答性マーカーをプライマーとして用いことによって、RNA中のStra13遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のStra13遺伝子の領域が増幅できるように、本発明のインスリン応答性マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて（工程(a)）、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する（工程(b)）方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識したインスリン応答性マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００５５】
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記インスリン応答性マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて（工程(a)）、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明のインスリン応答性マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する（工程(b)）方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、Stra13遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Affymetrix社のGene Chip Human Genome U95 A, B,C, D, Eを挙げることができる。
【００５６】
(2-2) 測定対象物としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の評価方法（診断方法）は生体試料中のStra13を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、抗体に関する本発明のインスリン応答性マーカー（配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を認識する抗体等）を用いてウェスタンブロット法などの公知方法で、Stra13を検出、定量する方法を挙げることができる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明の上記インスリン応答性マーカーを用いて測定対象タンパク質と結合させた後（工程(a)）、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素や蛍光物質で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、測定対象タンパク質を間接的に標識し、該放射性同位元素若しくは蛍光物質由来のシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）若しくは蛍光検出器で検出し、測定する（工程(b)）ことによって実施できる。また、一次抗体として本発明の上記インスリン応答性マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham Pharmacia Biotech 社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(Amersham Pharmacia Biotech 社製)で測定することもできる。
【００５７】
測定対象物としてRNAを用いる場合、及びタンパク質を用いる場合のいずれも、工程(c)は下記のようにして行うことができる。
【００５８】
まず、被験者の生体組織、例えば肝臓組織、あるいはこれらの組織周辺に存在する血液・滑液におけるStra13遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（Stra13）の量を正常な前記組織の当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質の量と比較し、両者の違いを評価する。
【００５９】
この場合、正常な生体組織から採取調製した生体試料（RNAまたはタンパク質）が必要であるが、これらはインスリン抵抗性糖尿病等に罹患していない、インスリン応答性が正常である人由来の生体試料をバイオプシ等で採取するか、若しくはこれら組織周辺の血液を採取することによって取得することができる。なお、ここでいう「インスリン抵抗性糖尿病等に罹患していない人」や「インスリン応答性が正常である人」とは、少なくとも血液検査などの検査方法による診断の結果、血中インスリンレベルが正常値を示し、インスリン抵抗性糖尿病やインスリン抵抗性異常でないと診断された人をいう。なお、当該これらについて、本明細書では単に正常者という場合もある。
【００６０】
被験者の生体組織と正常者の生体組織との遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行なわない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な生体組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたStra13遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（Stra13）の量の平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベル若しくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
【００６１】
次いで、上記判定の結果に基づいてインスリン応答性のレベルを判断する。具体的には被験者の生体組織における前記本発明遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物である本発明タンパク質の量が、正常者のそれらと比較して1.5倍以上、好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上であれば、インスリン応答性が高いと判断することができる。一方、被験者の生体組織における前記本発明遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物である本発明タンパク質の量が、正常者のそれらと比較して3/4倍以下、好ましくは1/2倍以下、さらに好ましくは1/3倍以下であれば、インスリン応答性が低いと判断することができる。
【００６２】
（３）候補薬のスクリーニング方法
(3-1) 遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、Stra13遺伝子の発現レベルを指標として、Stra13遺伝子の発現誘導物質(発現量を増大させる物質）をインスリン応答性促進物質として選択するか、あるいはStra13遺伝子の発現抑制物質（発現量を減少させる物質）をインスリン応答性抑制物質として選択することを特徴とするスクリーニングする方法を提供する。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）  被験物質と、Stra13遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、Stra13遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞の上記遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、Stra13遺伝子の発現量を増大させる被験物質をインスリン応答性促進物質として選択するか、又は、Stra13遺伝子の発現量を減少させる被験物質をインスリン応答性抑制物質として選択する工程。
【００６４】
かかるスクリーニングに用いられるStra13遺伝子は、使用する細胞の内在性のStra13遺伝子が好ましい。あるいはStra13遺伝子を外来遺伝子として遺伝子導入することもできる。更に、Stra13遺伝子の発現制御領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を外来遺伝子として遺伝子導入することもできる。
外来遺伝子として導入する場合、Stra13遺伝子は用いられる細胞の由来動物種のStra13遺伝子であることが好ましい。
【００６５】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、Stra13遺伝子を発現する肝臓由来細胞であれば特に限定は無いが、例えば肝臓組織から調製した肝臓細胞を挙げることができる。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。
例えば、ラット肝臓細胞は当業者に公知のコラゲナーゼ潅流法を用いて単離することができる（J Cell Biol., 43:506-520, 1969）。
あるいは、肝臓由来の培養細胞を用いることもできる。例えばヒト肝ガン細胞HepG2やマウスH35細胞、ラットHIIC細胞などを用いることもできる。
【００６６】
以上に挙げたような細胞の他、細胞の集合体である組織（例えば肝臓組織片）も、本発明のスクリーニングに用いられる「細胞」の範疇に含まれる。
【００６７】
被験物質となりえるものとしては、制限されないが、核酸（本発明遺伝子のアンチセンス核酸を含む）、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記組織／または細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００６８】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【００６９】
実施例に示すように、肝臓細胞では、インスリン刺激により特異的かつ迅速にStra13遺伝子が発現上昇している。また、該遺伝子の発現はインスリン拮抗剤により抑制される。この知見は、Stra13遺伝子の発現はインスリン応答性であることを示している。よって、本発明のスクリーニング方法で得られるStra13遺伝子の発現誘導物質はインスリン応答性を促進させる。該物質はインスリン応答性の異常な低下の改善作用を示す。又、本発明のスクリーニング方法で得られるStra13遺伝子の発現抑制物質はインスリン応答性を抑制する。該物質はインスリン応答性の異常な亢進の改善作用を示す。
【００７０】
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、インスリン応答性異常を伴う疾患の予防／改善／治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００７１】
Stra13遺伝子の発現誘導物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞におけるStra13遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して高くなることをもって、行うことができる。一方、Stra13遺伝子の発現抑制物質の探索は、具体的には被験物質を添加した細胞におけるStra13遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることをもって行うことができる。
【００７２】
このような遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。これら公知の方法については、前記本発明の診断方法に関する(2−1)の項を参照されたい。被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるStra13遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して1.5倍以上、好ましくは2倍以上、更に好ましくは３倍以上であれば、該被験物質は発現誘導物質として選択することができる。一方、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるStra13遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して3/4倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被験物質は発現抑制物質として選択することができる。
【００７３】
またStra13遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、これらの遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のStra13遺伝子の発現制御物質（発現誘導物質又は発現抑制物質）のスクリーニング方法には、かかるレポーター遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において請求項７に記載する「Stra13遺伝子」の概念には、これら本発明遺伝子の発現制御領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【００７４】
なお、上記レポーター遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子もまた使用することができる。ここでStra13遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いることができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００７５】
上記スクリーニング方法によって選別されるStra13発現誘導剤の候補物質の中から、さらにインスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性異常の改善薬または治療薬あるいは糖代謝改善又は治療剤の有効成分となる候補物質を選別する方法としては、従来公知である如何なる選別方法をも用いることができるが、代表的な方法として、例えばインスリン負荷試験、ブドウ糖負荷試験を挙げることができる。
【００７６】
(3-2)  タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、Stra13の発現レベルを指標として、Stra13の発現誘導物質(発現量を増大させる物質）をインスリン応答性促進物質として選択するか、あるいはStra13の発現抑制物質（発現量を減少させる物質）をインスリン応答性抑制物質として選択することを特徴とするスクリーニングする方法を提供する。
【００７７】
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）〜（ｃ）を含む：
（ａ）  被験物質と、Stra13を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）  被験物質を接触させた細胞における、Stra13の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞のStra13の発現量と比較する工程、
（ｃ）  （ｂ）の比較結果に基づいて、Stra13の発現量を増大させる被験物質をインスリン応答性促進物質として選択するか、又は、Stra13の発現量を減少させる被験物質をインスリン応答性抑制物質として選択する工程。
【００７８】
本発明スクリーニング方法に用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、Stra13を有する肝臓由来の培養細胞全般を挙げることができる。具体的には上記（3-1)項に記載された細胞を挙げることができる。
Stra13の発現は、Stra13遺伝子発現産物であるタンパク質を検出することにより、容易に確認することができる。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法にかかるStra13の発現量は、前述したように、例えば抗体に関する本発明インスリン応答性マーカー（例えばヒトStra13タンパク質またはそのホモログを認識する抗体）を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明インスリン応答性マーカーを用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明インスリン応答性マーカーを用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００８０】
候補物質となりえるものとしては、前記（3-1)と同じものが挙げられる。また、インスリン応答性促進物質もしくはインスリン応答性抑制物質の選択についても、前記（3-1)と同様に行うことができる。
【００８１】
（４）インスリン応答性異常を伴う疾患の予防、改善又は治療剤
本発明は、インスリン応答性を制御する物質を提供する。該物質は、インスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性異常を伴う疾患の予防・改善・治療剤の有効成分として有用である。
本明細書実施例に示すとおり、肝細胞にStra13を強発現させるアデノウイルスを添加したところ、用量依存的に糖新生系遺伝子PEPCK、G6PaseおよびIGFBP−1の発現が抑制された。すなわち、Stra13、Stra13遺伝子又はこれらの発現誘導物質は、PEPCK、G6Paseおよび／又はIGFBP−1の発現抑制剤として用いることができる。
また、上記のように、Stra13はインスリン類似の糖新生抑制作用を示し、Stra13遺伝子もしくはStra13の発現誘導物質は、肝臓における糖新生を抑制する因子として作用することがわかった。従って、Stra13、Stra13遺伝子、又はこれらの発現誘導物質は、インスリン抵抗性糖尿病等のインスリン応答性異常の改善薬または治療薬、あるいは糖代謝改善又は治療剤の有効成分として有用である。
【００８２】
当該有効成分となるStra13、Stra13遺伝子、またはこれらの発現誘導物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて常法に従って工業的に製造されたものであってもよい。
【００８３】
本発明遺伝子・タンパク質の発現制御物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
【００８４】
本発明の改善剤又は治療剤の有効成分が、タンパク質すなわちStra13である場合、Stra13としては以下の（ａ）〜（ｄ）を挙げることができる：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ糖新生系遺伝子の発現抑制活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ糖新生系遺伝子の発現抑制活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ糖新生系遺伝子の発現抑制活性を有する蛋白質のアミノ酸配列からなるタンパク質。
ここで「ストリンジェントな条件」としては、上記(1-1)に記載された条件が挙げられる。また、「糖新生系遺伝子の発現抑制活性」とは、本明細書実施例に記載された方法で測定されるPEPCK、G6Pase又はIGFBP-1、好ましくはPEPCKの発現を抑制する活性を表す。
Stra13は上記（1-1）又は（1-2)に記載の方法で調製することができる。
【００８５】
また、上記の物質がDNAによりコードされるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、投与量、投与方法は患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばStra13遺伝子またはそれらの化学的修飾体（以下本遺伝子と称することがある。）を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【００８６】
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS刊、1992年、pp.1-50、J. Med. Chem. 36, :1923-1937(, 1993))が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
【００８７】
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
【００８８】
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは100塩基以上、より好ましくは300塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上の長さを有するもので、かつ糖新生系遺伝子の発現抑制活性を有する蛋白質を発現するものが好ましい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するin vivo法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すex vivo法を包含する(日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15), 全頁 (1994)など参照）。この内ではin vivo法が好ましく、これには、ウイルス的導入法(組換えウイルスを用いる方法)と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照)。
【００８９】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムにStra13遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【００９０】
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。in vivo法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態(センダイウイルス(HVJ)-リポソームなど)とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人1人当たり約0.0001-100mg、好ましくは約0.001-10mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1ｘ103pfu-1ｘ1015pfuとなる量範囲から選ぶことができる。本意電子を導入した細胞の場合は、1ｘ104細胞/body-1ｘ1015細胞/body程度を投与すればよい。
【００９１】
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、もとより本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００９２】
（cDNAの調製）
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、マウス肝組織、及びラット初代培養系肝細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNA 10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μlの混合液を、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液に、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5ｘFirst Strand cDNA Buffer 4μl、該キットに含まれる0.1M DTT 2μl及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μlを添加し、この混合液を42℃、2分間加熱した。更に、当該混合液に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μl(400U)を添加し、この混合液を42℃、1時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合液にDEPC処理滅菌蒸留水91μl、当該キットに含まれる5ｘSecond Strand Reaction Buffer 30μl、10mM dNTP Mix 3μl、当該キットに含まれるE. coli  DNA Ligase 1μl(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μl(40U)及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μl(2U)を添加し、この混合液を16℃、2時間反応させた。次いで、当該混合液に当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μl(10U)を加え、この混合液を16℃、5分間反応させた後、当該混合液に0.5M EDTA 10μlを添加した。次いで、この混合液にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μlを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、これを室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。遠心分離後、145μlの水層をエッペンドルフチューブに回収した。回収された水層に、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μl及びエタノール362.5μlを加え混合した後、この混合液を4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得た。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを再び得た。得られたDNAペレットに再度80%エタノール0.5mLを添加した。この混合液を4℃、14,000rpm、5分間遠心分離した後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得た。得られたＤＮＡペレットを乾燥させた後、DEPC処理滅菌蒸留水12μlに溶解することにより、ｃDNA溶液を得た。
【実施例２】
【００９３】
（ヒト由来の本遺伝子のクローニング）
Human Liver cDNA 1μl、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマー1 20pmol、配列番号８で示される塩基配列からなるプライマー2 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μl及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μlを含む50μlの反応液を調製する。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行う。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1．3kbpを示すPCR産物を回収する。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換する。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ヒト由来のStra13（hStra13）の塩基配列を含むプラスミドを得る。
【実施例３】
【００９４】
（ヒト由来の本遺伝子（hStra13）の塩基配列の決定）
実施例２で得られたPCR産物（約1．3kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（Applied Biosystems社）を用いて、あるいはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）及びABI3100Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、ヒト由来の本遺伝子の塩基配列を決定する。
【実施例４】
【００９５】
（マウス由来の本遺伝子のクローニング）
Mouse Liver cDNA Library (TAKARA)1μl、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマー3 20pmol、配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー4 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μl及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μlを含む50μlの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで65℃で30秒間、更に72℃で2分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.4kbpを示すPCR産物を回収した。回収されたPCR産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、マウス由来の本遺伝子（mStra13）の塩基配列を含むプラスミドを得た。
【実施例５】
【００９６】
（マウス由来の本遺伝子の塩基配列の決定）
実施例４で得られたPCR産物（約1.4kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（Applied Biosystems社）を用いて、あるいはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）及びABI3100Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号１１で示される塩基配列からなるマウス由来の本遺伝子（mStra13）の塩基配列を決定した。
【実施例６】
【００９７】
（ラット由来の本遺伝子のクローニング）
Rat Liver cDNA library (TAKARA)1μl、配列番号１３で示された塩基配列からなるプライマー5 20pmol、配列番号１４で示される塩基配列からなるプライマー6 20pmol、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ（宝酒造社）2U、TaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のバッファー 5μl及びTaKaRa Ex-Taqポリメラーゼ添付のdNTP mixture（2.5mM）4μlを含む50μlの反応液を調製した。PCRは、まず94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、更に72℃で1分間からなる保温サイクルを50回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件にて行われた。ＰＣＲ後、アガロース電気泳動で約1.2kbpを示すPCR産物を回収した。次いで回収されたＰＣＲ産物をpT7-Blue vector(Novagen社)にサブクローニングした後、当該プラスミドでE.coliJM109株コンピテントセル（東洋紡社）を形質転換した。形質転換された細胞を50μg/mLアンピシリン含有LB培地100mLで培養することにより得られる培養菌体からQIAGEN Plasmid Maxi kit(QIAGEN社)を用いて分離・精製することにより、ラット由来の本遺伝子（rStra13）を含むプラスミドを得た。
【実施例７】
【００９８】
（ラット由来の本遺伝子（rStra13）の塩基配列の決定）
実施例６で得られたPCR産物（約1.3kbp）を含むプラスミドを鋳型として、Thermo Sequenase IIダイ・ターミネーターキット（Amersham Pharmacia Biotech社）及びABI373DNA配列読み取り装置（Applied Biosystems社）を用いて、あるいはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）及びABI3100Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いて、サンガーの方法〔F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson著、Proceedings of National Academy of Science U.S.A.(1977), 74, 5463-5467〕により、配列番号１５で示される塩基配列からなるラット由来の本遺伝子の塩基配列を決定した。
【実施例８】
【００９９】
（ノザンブロット）
RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて、マウス肝組織、及びラット初代培養系肝細胞からtotal RNAを抽出した。抽出したRNAサンプルは、１％ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動法にて泳動した後、Hybond-N+メンブレン（Amersham）に転写した。メンブレンのプレハイブリダイゼーションは、Rapid-hyb buffer(Amersham)を用いて65℃で2時間行った。その後、α−32P標識プローブを加えてハイブリダイゼーションを65℃で16時間行った。プローブは、Bca Best Labeling Kit(Takara)を用いて、マウス由来mStra13 cDNAからランダムプライム法により作製した。プローブの標識には、1.85MBqの[α−32P]dCTP（Amersham）を用いた。メンブレンの洗いは、SSC with 0.1％ SDSにより行った。SSCの濃度は、2ｘ、1ｘ、0.1ｘの順で洗いを繰り返す毎にその濃度を下げていった。メンブレンのオートラジオグラフィーには、BAS2000 image analyzer(Fuji)を用いた。
【実施例９】
【０１００】
（RT−PCR）
RT-PCR法を利用する場合は、肝臓組織あるいは肝臓細胞から調製したRNAを、あるいは得られたRNAを鋳型として調製したcDNAを鋳型としてStra13をコードする塩基配列領域が特異的に増幅できるように、一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）を設計し、通常の方法で合成する。マウスStra13を定量する際には配列番号１７と１８の配列を有するプライマーを用いた。ラットStra13を定量する際には配列番号１９と２０の配列を有するプライマーを用いた。合成したプライマーを用いてSYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)を用いてプロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出、定量した。
【実施例１０】
【０１０１】
（ウェスタンブロット）
ラット初代培養系肝細胞をRIPA buffer[50mM NaCl, 1%(vol/vol) nonidet P-40, 0.5%(vol/vol) deoxycholate, 0.1%(vol/vol) SDS, 50mM Tris-Cl ph8.0, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM Na3VO4, 1mM DTT, 10mM NaF, 30mM NaPPi, 15μｇ/ml Aprotinin, 10μｇ/ml Leupeptin]にて溶解し、遠心上清をタンパク抽出サンプルとした。抽出したタンパクサンプルは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて泳動した後、ニトロセルロースメンブレン（Advantec）に転写した。1次抗体に抗-Stra13 ポリクローナルラビット抗体（Genes Dev, 11:2052-2065, 1997）、2次抗体に抗-ラビットIgG HRP標識ヤギ抗体（Santa cruz）を用いた。抗原抗体反応は、ECL Western Blotting Detection Reagents(Amersham)を用いてHyperfilm ECL(Amersham)上に検出した。
【実施例１１】
【０１０２】
（絶食再摂食時マウスの肝臓遺伝子発現解析）
7〜8週齢の雄性C57BL/6マウス(日本クレア)を用いた。飼育室の照明時間は、6時〜18時までを明期、18時〜6時までを暗期とした。飼育飼料としてＣE−2型固形飼料(日本クレア)、飲料水として水道水を与え飼育した。
24時間絶食の後、高炭水化物食（70％ シュクロース、20％ カゼイン）(オリエンタル酵母工業)を用いて再摂食を12時間行なった。随時摂食、絶食24時間後、絶食後再摂食6時間後と12時間後のマウスの肝臓を摘出した。摘出した肝組織は、液体窒素にて早急に凍結し、RNAのRNaseによる分解を防いだ。摘出した肝臓よりRNAを抽出し、RT−PCRを行なった。
絶食時のmRNAの発現は随時摂食時と比較して約0．4倍に低下した。再摂食時の発現は絶食時と比較して6時間後で3倍、12時間後で4倍の上昇が見られ、随時摂食時よりも高い発現が見られた。（図1参照）
【実施例１２】
【０１０３】
（Streptozotocin 糖尿病マウスにおけるインスリン投与時の肝臓遺伝子発現解析）
7〜8週齢の雄性C57BL/6マウス(日本クレア)、及び体重150〜250gの雄性Wisterラット(日本クレア)を用いた。飼育室の照明時間は、6時〜18時までを明期、18時〜6時までを暗期とした。飼育飼料としてＣE−2型固形飼料(日本クレア)、飲料水として水道水を与え飼育した。
0.05M Sodium Citrate ph4.5に溶かした(Wako)をマウス体重あたり0.2 mg/gにて腹腔内投与した。Streptozotocin投与48時間後に血糖値が300mg/dl以上のマウスを糖尿病発症マウスとし、さらに12時間後に絶食を12時間行なった。絶食の後、中間型インスリン（Novo Nordisk,ノボリンN注40）をマウス体重あたり5mU/gにて皮下投与し、投与1時間後と3時間後に肝を摘出した。摘出した肝組織は、液体窒素にて早急に凍結し、RNAのRNaseによる分解を防いだ。対照群としてPBSを皮下投与して3時間後の肝を同様に摘出した。摘出した肝臓よりRNAを抽出し、RT−PCRを行なった。
インスリン投与後1時間後のStra13のmRNAの発現が約3倍に上昇していた。投与後3時間後では約1.5倍に上昇していた。（図2参照）
【実施例１３】
【０１０４】
（恒常的活性化型PI3Kアデノウイルスベクターを用いたラット初代培養肝細胞の遺伝子発現解析）
コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始8〜10時間後に10%(vol/vol) fetal bovine serumを含む培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]に培地交換すると共に3段階に濃度をふって恒常的活性化型PI3Kアデノウイルスベクター（Molecular and Cellular Biology, (1999) Vol.19 p6286-6296）による刺激を行った。
刺激後3〜4時間後に再度10%(vol/vol) fetal bovine serumを含む培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]に培地交換した。18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]にて14〜16時間培養した。比較対照として、100nM insulinによる刺激も行った。得られた細胞についてウェスタンブロット、ならびにノザンブロットでStra13の発現を検討した。インスリン非存在下にも、恒常的活性化型PI3Kによりインスリン処理と同様のStra13の発現の促進が見られた。（図3参照）
【実施例１４】
【０１０５】
（インスリン処理ラット初代培養肝細胞の遺伝子発現解析）
コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]にて14〜16時間培養し、100nM insulinによる刺激を行った。
インスリンで処理後、0，1，3，6，9，12，18時間後に培養肝臓細胞からRNAを抽出し、Northern  blottingを行なった。インスリン処理後、Stra13のmRNAは処理後1時間で既に発現が見られた。既知のインスリン誘導性遺伝子のグルコキナーゼは3時間、SREBP−1と脂肪酸合成酵素は9時間後に発現のピークが見られ、Stra13の発現誘導の時間経過はこれらの既知のインスリン誘導性遺伝子の発現に先行した。培養肝細胞におけるStra13の発現はピークではmRNA、蛋白レベルとも非刺激時の約3倍程度に増加した。この増加は30μMのPI3Kの薬理学的阻害剤LY294002の添加により抑制された。
【実施例１５】
【０１０６】
（デキサメサゾン、cAMP処理ラット初代培養肝細胞での肝細胞遺伝子発現解析）
コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した得られた肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6ｘ106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin]にて14〜16時間培養し、500nM デキサメサゾン（dexamethasone）, 100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphateの処理を行った。
薬剤処理後6時間後よりRNAを調製し、RT‐PCRを行なった。インスリン拮抗ホルモンであるデキサメサゾンおよびグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるcAMPで細胞を処理すると、インスリン依存性のStra13の発現は抑制された。
【実施例１６】
【０１０７】
（Stra13アデノウイルスベクターの構築）
実施例４で調製されたマウスStra13遺伝子のセンス鎖をコスミドベクターpAxCAwt（宝酒造社）のSwaI部位に挿入し、pAxCAwt-ｍSTRA13Sを得た。得られたpAxCAwt-ｍSTRA13SをλパッケージングキットGigapackXL（Stratagene社）を用いてインビトロパッケージングを行い大腸菌DH5αに感染させた。感染させた大腸菌を、50ml  50μg/mlアンピシリン含有LB培地で培養し、Lambda  DNA  purification  Kit(東洋紡社)によりコスミドDNAを大量調製した。
293細胞（宝酒造社）を10%FCS添加D-MEM培地（日水製薬）で37℃、5%二酸化炭素下で培養した。前述のようにして調製されたpAxCAwt-ｍSTRA13S  8μｇと制限酵素処理済みDNA-TPC（宝酒造）5μlとを混合し、当該混合物を用いてリン酸カルシウム法にて293細胞にコトランスフェクションを行った。当該細胞をそのまま18時間培養後、培地を10%FCS添加D-MEM培地（日水製薬）と交換し、さらに12時間培養した。培養終了後、後細胞をディッシュから剥がすことにより、回収された細胞懸濁液と293細胞を混ぜてさらに10%FCS添加D-MEM培地（日水製薬）にて培養をつづけ、293細胞が完全に死滅した時点で培養液をドライアイスにて急凍した。凍結融解6回後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を1次組換えアデノウイルス液（AxCAwt-ｍSTRA13S）として保存した。
293細胞（宝酒造社）に前述方法で調製された1次組換えウイルス液を１０μl加え、これに5%FCS添加D-MEM培地（日水製薬）を加えた後、当該混合物を37℃、5%二酸化炭素下で1時間培養した。さらに当該混合物に5%FCS添加D-MEM培地（宝酒造社）を加えた後、これを37℃、5%二酸化炭素下で培養した。3日間培養後、ウィルス感染させた293細胞（宝酒造社）の培養液を回収し、これをドライアイスにて急凍した。凍結融解6回後、5000rpm  5分間遠心することにより得られた上清を２次組換えアデノウイルス液として保存した。一方、前記操作により同時に得られた沈殿（細胞）も回収し、ドライアイスにて急凍した。回収された細胞に10ｘTNE（500mM  トリスー塩酸（pH=7.5）、1M  NaCl、100mM  EDTA）40μl及びproteinaseK(20mg/ml)4μl、滅菌蒸留水356μlを加え、当該混合液をVoltexでよく懸濁した。得られた懸濁物に、10%SDS  4μlを加え、これを50℃で1時間保温した。その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ニッポンジーン社）処理後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡペレットを風乾させた後、20μg/ml  RNaseA（ニッポンジーン社）を含む滅菌蒸留水50μlに溶解することにより、組換えアデノウイルスDNA溶液を得た。得られた組換えアデノウイルスDNA溶液をXhoI  5U(宝酒造社)にて切断し、目的の断片（0.48Kbp）を確認した。続いてこの組換えアデノウイルスDNAを前記操作を繰り返すことにより継代培養する。このようにしてし、高力価組換えウィルスを作製した。力価の測定は既存の方法（特開平7-298877）により測定した。
【実施例１７】
【０１０８】
（ラット初代培養肝細胞へのStra13アデノウイルス感染による糖新生系遺伝子の発現抑制）
コラゲナーゼ潅流法（J Cell Biol, 43:506-520, 1969）を用いてラット肝細胞を単離した。単離した得られた肝細胞は、TypeII Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson)に培養皿の直径10cmあたり7〜6×106個で撒き込んだ。培養液は、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用いた。培養開始8〜12時間後にアデノウイルスの感染を行なった。実施例１６で作製したStra13の強制発現をさせるアデノウイルスAxCAwt-ｍSTRA13SとコントロールとするウイルスAxβ−galを用いて感染させた。感染後２４時間後に細胞に100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphate（cAMP）を添加し、6時間後に細胞を回収してmRNAを抽出し、ノザンブロットを行なった。比較対照として、100μM 8-(4-chlorophenylthio)adenosine 3':5-cyclic monophosphate（cAMP）、100nM insulinの処理も行った。糖新生系遺伝子PEPCK、G6Pase、IGFBP−1の発現はインスリン拮抗ホルモンであるデキサメサゾンやグルカゴンのセカンドメッセンジャーであるcAMPの処理でその発現が誘導され、insulinの添加でその誘導は抑制された。コントロールであるAxβ−galではこのような抑制は見られなかったが、AxCAwt-ｍSTRA13Sでは添加量に応じた糖新生系遺伝子PEPCK、G6Pase、IGFBP−1の抑制が見られた（図４参照）。
【実施例１８】
【０１０９】
（動物へのStra13アデノウイルスベクターの投与）
8〜10週齢のオスBALB／cマウスに対して、アデノウイルス投与量1x109（1群10匹）の割合になるように、実施例１６により作製された組換えアデノウィルスを生理食塩水で希釈することにより調製された水溶剤を、マウス1匹当たり0.2mlずつシリンジを用いて尾静脈より投与する。
投与後、例えば3日から４週間後に被験動物であるBALB／cマウスに対しインスリン負荷試験を行なうことにより、インスリンに対する感受性の評価を行なうことができる。
【実施例１９】
【０１１０】
（スクリーニング）
ラット肝臓細胞を、「J Cell Biol., 43:506-520, 1969」に記載された方法で単離し、Type II Collagenでコートされた培養皿(Becton dickinson製)に培養皿の直径10cmあたり7〜6ｘ106個で撒き込み、Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin, 10%(vol/vol) fetal bovine serum, 100nM dexamethasone, 1nM insulin, 100nM triiodothyronine]を用い、培養開始18〜22時間後に血清を除いた培養液:Medium199 with Eearle's salts(GIBCO BRL)[100units/ml penicillin, 100μｇ/ml streptomycin]にて14〜16時間培養することができる。
このようにして調製した肝臓細胞に例えば、被験物質もしくは培養溶媒（対照の場合）、および必要に応じて０．５％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）を添加した培地で５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養することができる。
それぞれ培養混合物よりtotalRNAを調製、さらにｃDNAを調製する。調製したサンプルをノザンブロット法あるいはRT‐PCR法で分析し、Stra13遺伝子の発現レベルを定量する。Stra13遺伝子の発現量が、対照における発現量よりも1.5倍以上である被験物質を、インスリン応答性異常を改善する物質の候補物質として選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】絶食再摂食時マウスの肝臓遺伝子発現解析  実施例11での結果を示した。発現量をRT‐PCRで定量し、随時摂食時の値を1として相対値で示した。
【図２】Streptozotocin 糖尿病マウスにおけるインスリン投与時の肝臓遺伝子発現解析  実施例12での結果を示した。発現量をRT‐PCRで定量し、コントロールのPBSでの値を1として相対値で示した。
【図３】恒常的活性化型PI3Kアデノウイルスベクターを用いたラット初代培養肝細胞の遺伝子発現解析  実施例13での結果を示した。Stra13蛋白質の発現をウェスタンブロットで、Stra13遺伝子の発現をノザンブロットで検討した。100nM  インスリンの添加の有無を＋と−で示した。また、図の上の三角は恒常的活性化型PI3Kアデノウイルスベクターの添加量の増加を示した。
【図４】ラット初代培養肝細胞へのStra13アデノウイルス感染による糖新生系遺伝子の発現抑制  実施例17での結果を示した。PEPCK、G6Pase、IGFBP−1はこれら糖新生系遺伝子の発現量をノザンブロットでのバンドの濃さで示しており、それぞれのサンプルのRNA量については泳動したRNAの18S rRNAの量で差がないことを示した。AxCA−Stra13はStra13を発現するアデノウイルスAxCAwt-ｍSTRA13Sを示し、AxCA−β−galはコントロールアデノウイルスAxβ−galを示す。添加ウイルス量はMOIで示した。＋、−はそれぞれ添加の有無を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
配列番号７：PCR用プライマー
配列番号８：PCR用プライマー
配列番号９：PCR用プライマー
配列番号１０：PCR用プライマー
配列番号１３：PCR用プライマー
配列番号１４：PCR用プライマー
配列番号１７：PCR用プライマー
配列番号１８：PCR用プライマー
配列番号１９：PCR用プライマー
配列番号２０：PCR用プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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