(57)【要約】【解決手段】本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、更には当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤、並びに当該微生物もしくは当該微生物とプロテアーゼとの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。【効果】本発明によれば、難防除植物ウイルス汚染圃場などのウイルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用でき、従来にない、新しい土壌消毒法が確立し、ウイルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となる。また、減農薬による環境保全型農業が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物。
【請求項２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶから少なくとも一種選ばれる植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする請求項１記載の微生物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の微生物と、プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズからなることを特徴とする植物ウィルス防除剤。
【請求項４】
植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物により植物ウィルスを不活化する方法。
【請求項５】
請求項４記載の微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶから少なくとも一種選ばれることを特徴とする植物ウィルスを不活化する方法。
【請求項６】
植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物を種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなることを特徴とする植物ウィルスの防除方法。
【請求項７】
請求項６記載の微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶから少なくとも一種選ばれることを特徴とする植物ウィルスの防除方法。
【請求項８】
プロテアーゼと、植物ウィルスの不活化能を有することを特徴とする微生物を栽培植物の種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなることを特徴とする植物ウィルスの防除方法。
【請求項９】
請求項８記載の微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ  及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶから少なくとも一種選ばれることを特徴とする植物ウィルスの防除方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼとの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。本発明は農業及び園芸の分野において、植物ウイルス病の防除を目的として広く利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
農業生産において栽培されるタバコ、ピーマン、メロン、スイカ、キュウリ、トマトなどの各種作物は、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＴＭＶ−Ｐ）、トマトモザイクウイルス（ＴＭＶ−Ｔ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）、メロンえそ斑点ウイルス（ＭＮＳＶ）、レタスビックベインウイルス（ＬＢＶＶ）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）などによって引き起こされる土壌伝染性のウイルスに罹病し、著しい被害を受けることが多い。これらの病原ウイルスは土壌、残渣・残根、雑草、種子に存在し、定植や作業時の管理作業によって伝播する。
【０００３】
このような土壌伝染性のウイルス病害対策として、従来は臭化メチル剤の土壌くん蒸消毒により防除されてきた。しかし、本薬剤は国際規約によって２００５年に全廃され、現在のところ植物ウイルス病防除における臭化メチル代替剤がない。これらのことから、本病害の土壌伝染を阻止するための技術開発が急務であり、必要不可欠なものである。また、近年の環境問題への意識の高まりから減農薬への動きも大きくなってきている。そういった状況の中で、今後生物的な防除による環境保全型のウイルス病害防除が必要不可欠である。
その他、植物ウイルスの防除剤としては、アルギン酸ナトリウム剤や、シイタケ菌糸体培養抽出物（特公昭５４−３３９９４号）があるが、いずれも土壌消毒を目的として使用するものではなく、植物体の全面に漏れなく一様に散布する必要があり、また畑での効果はあまり高くない。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】
本発明は、臭化メチル代替の土壌消毒材および土壌改良材として、土壌伝染性の植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止する、あるいは予防対策を目的に、有効な生物素材を提供することを課題とする。また、本生物素材を用い、減農薬による環境保全型農業が可能となるような、植物ウイルス病害の生物的防除方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群からウイルス分解・不活化菌の検索を行い、土壌伝染性のウイルス病害を引き起こすＴＭＶに対して高い不活化能を有する微生物を見出した。特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７８）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の菌株Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶ（寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５３）の３種の微生物が植物ウィルスの防除に有効であることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、植物ウィルスの不活化能を有する新規微生物及び当該微生物により植物ウイルスを不活化する方法に関する。また、本発明は、当該微生物と、タンパク質分解酵素プロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及び／又はアルギン酸ビーズとからなる植物ウィルス防除剤に関する。また更には、本発明は、当該微生物、又は当該微生物とプロテアーゼの組み合わせで種子、葉、根及び／又は土壌に処理してなる植物ウィルスの防除方法に関する。
【０００７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の微生物としては、植物ウィルスの不活化能を有する微生物が用いられる。細菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等の細菌、放線菌としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属等の放線菌、酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等の酵母、糸状菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属等の糸状菌等、植物ウィルスの不活化能を有する微生物であれば、本発明の微生物として用いることができる。
【０００８】
このうち、本発明の微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６  ＡＶ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶ、  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶ（それぞれ、以下  Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１とする）の活性が高く、有効に用いることができる。
Ｃ−１７６の菌学的特性は表１のとおりである。
【表１】
2005000145.tif 000002
【０００９】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状のグラム染色陰性で、運動性があり好気的・嫌気的条件で生育でき、グルコースから酸の生成を行うことからシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）に分類される。本菌の類縁種としてはシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）あるいはシュードモナス・ピケッティー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）があげられるが、Ｌ−ロイシンを分解しないことからシュードモナス・ピケッティーにより近い種である。また、アラビノースを分解しない点やＬ−ヒスチジンを分解する点からシュードモナス・ピケッティーと異なり、本菌株はシュードモナス属の新菌種であると認定した〔バージーズ・マニュアル  オブ  システマティク  バクテリオロジー第１巻（ＪＯＨＮ  Ｇ  ＨＯＬＴ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）〕。
【００１０】
本菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｃ−０１７６ＡＶは寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５２として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、ＹＰＭＧ寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるＹＰＭＧ培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。ＹＰＭＧ培地を用いた培養は３０℃で３日間行うことが好ましい。
ＢＳ−１７の菌学的特性は表２のとおりである。
【表２】
2005000145.tif 000003
【００１１】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状で胞子を形成し、主として好気的条件で増殖する菌であることからバチルス属に分類される。本菌の類縁種としては、バチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）があげられるが、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースを分解する点からバチルス・ポピリエと異なり、本菌株はバチルス属の新菌種であると認定した。
本菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＢＳ−００１７ＡＶは寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、ＹＰＭＧ寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるＹＰＭＧ培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。ＹＰＭＧ培地を用いた培養は３０℃で３日間行うことが好ましい。
Ｍ−２１の菌学的特性は表３のとおりである。
【表３】
2005000145.tif 000004
【００１２】
本菌株は、上記菌学的特徴において楕円形、円筒形で分裂増殖し、球形、卵形の胞子を形成する菌であることからシゾサッカロマイセス属に分類される。本菌の類縁種としてはシゾサッカロマイセス・ジャポニクス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）あるいはシゾサッカロマイセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）があげられるが、Ｄ−グルコースを分解しないことから、本菌株はシゾサッカロマイセス属の新菌種であると認定した。
本菌株Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍ−００２１ＡＶは寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５３として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
本菌株は、ＹＰＭＧ寒天培地で培養して増殖することができる。用いられるＹＰＭＧ培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。ＹＰＭＧ培地を用いた培養は３０℃で３日間行うことが好ましい。
【００１３】
本発明の微生物は、寒天培地又は液体培地を用いて、培養・増殖される。増殖された微生物は、白金耳等により採取、遠心分離等の操作により集菌して採取、あるいは培養液の状態として、植物ウィルスの防除又は植物ウィルス防除剤に用いることができる。
こうして培養・増殖して得られた本発明の微生物は、いずれか単独で用いることも２種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の微生物は、ウィルス不活化能を有し、本発明の微生物を種子、葉、根、土壌等に処理して植物ウィルスの防除効果が発揮される。たとえば、土壌中の残渣・残根に定着して土壌伝染を引き起こす植物ウイルスがある場合、これを分解し不活化することもできる。この処理方法としては、土壌への施用、育苗培土への添加、作物種子にバクテリゼーション処理、葉面散布、養液栽培における養液への添加、土耕栽培における株元への添加・潅注等をあげることができる。本発明の微生物処理により、栽培植物の植物ウィルス防除を行うことはもとより、植物ウイルス病害汚染圃場の伝染を阻止、あるいは予防対策として使用することができる。
【００１４】
本発明の植物ウィルスの防除方法としては、上記のように微生物単独で処理することもできるが、タンパク質分解酵素プロテアーゼと組み合わせて処理すると、より植物ウィルスの防除効果は高まる。プロテアーゼとしては、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ等があげられるが、酸性プロテアーゼを用いることが好ましい。プロテアーゼの処理の時期としては、本発明の微生物の処理と同時又は前処理として行うことができ、処理の方法としては種子、葉、根、土壌等に上記微生物の処理方法と同様にして行うことができる。
【００１５】
また、本発明の微生物は、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせ、植物ウィルス防除剤とすることができる。有機質基質としては菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ等があげられる。多孔質基質としてはゼオライト、イソライト、バーミキュライト等があげられる。こうして、本発明の植物ウィルス防除剤は、有機質基質、多孔質基質等と組み合わせることで効果が高まる。木質炭化物としては、バーク炭等があり微生物の住処となりやすい。
これら有機質基質、多孔質基質、木質炭化物の混合量は、植物ウィルス防除剤全量に対し、０．１％〜５０％が望ましい。
【００１６】
さらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、プロテアーゼを組み合わせることができる。これにより、上述したように、より植物ウィルスの防除効果は高まる。また、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物等と組み合わせることにより相乗効果も期待することができる。
またさらに、本発明の植物ウィルス防除剤には、アルギン酸ビーズを組み合わせることができる。アルギン酸は、海藻などに含まれる天然の多糖類であり、アルギン酸を組み合わせることにより、本発明の微生物はこのアルギン酸ビーズに固定化され、微生物が作物根圏および土壌へ優先的に定着して安定した効果が期待できる。また、アルギン酸ビーズは、生分解性であることから、環境汚染を引き起こすこともない。
【００１７】
本発明の植物ウィルス防除剤に、本発明の微生物と組み合わされるプロテアーゼ、有機質基質、多孔質基質、木質炭化物及びアルギン酸ビーズは、目的に応じ１種を選択し、組み合わせることもできるが、２種以上選択して組み合わせることもできる。
本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、単独で使用することもできるが、適当な個体担体、液体担体、乳化分散剤などを用いて、粒剤、粉剤、錠剤、乳剤、水和剤等の任意の形状で使用できる。また、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤を無機質肥料、有機質肥料、除草剤、土壌等と共に使用し、肥料、土壌改良資材、育苗用培土等とすることができる。
【００１８】
本発明の微生物及び植物ウィルス防除剤の防除するウィルスとしては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トウガラシマイルドモットルウイルス（ＴＭＶ−Ｐ）、トマトモザイクウイルス（ＴＭＶ−Ｔ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣＧＭＭＶ）、メロンえそ斑点ウイルス（ＭＮＳＶ）、レタスビックベインウイルス（ＬＢＶＶ）、ビートえそ性葉脈黄化ウイルス（ＢＮＹＶＶ）等によって引き起こされる土壌伝染性のウイルスの他に、昆虫媒介によるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）等があげられる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施態様を示すが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
実施例１〜３  微生物を用いたウイルス不活化検定
（実施例１）Ｃ−１７６
ＹＰＭＧ寒天（酵母エキス３．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、肉エキス１．０ｇ、グルコース１０ｇ、寒天１６ｇ、蒸留水１．０リットル、ｐＨ７．０）斜面培地に分離した菌株Ｃ−１７６をＴＭＶ−Ｐ汚染ピーマン根に接種して、各温度区（３０℃、１０℃）の暗条件下で１ヶ月間静置培養した。各温度区において菌株を接種しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して磨砕した。検定にはウイルスを接種することによって局部病斑を生ずるタバコ品種（キサンチ・エヌシー）を用いた。検定用のタバコ品種は直径１２ｃｍの鉢で２ヶ月育成し、１区につき２鉢、３葉（第５〜第７葉）ずつ計６葉を用いた。それらの葉にカーボランダムを振掛けて、それぞれ磨砕した液を展開した葉の表の主脈を境とした半葉の半分（１／４葉）に各被検液（３０℃、１０℃）をそれぞれ塗抹接種し、もう半分に無処理液（３０℃、１０℃）をそれぞれ塗抹接種した。接種５日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、次式によって病斑出現率を算出した。結果を表４に示した。
【数１】
2005000145.tif 000005
【表４】
2005000145.tif 000006
【００２０】
（実施例２）ＢＳ−１７
菌株Ｃ−１７６のかわりに菌株ＢＳ−１７を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表５に示した。
【表５】
2005000145.tif 000007
【００２１】
（実施例３）Ｍ−２１
菌株Ｃ−１７６のかわりに菌株Ｍ−２１を用いる以外は、実施例１と同様の方法を行いウイルス不活化検定を行った。結果を表６に示した。
【表６】
2005000145.tif 000008
【００２２】
（結果の概要）
３０℃、１０℃のいずれの温度区においてもＣ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１とも無処理区に比較し、低い病斑出現率が確認された。すなわち、ウイルス汚染根（ＴＭＶ−Ｐ汚染根）とこれら微生物とを培養した後、培養後の磨砕液をウイルス検定植物であるタバコ品種に接種した結果、Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１に高いウイルス不活化能を有することが判明した。特にＣ−１７６によるウイルス不活化能が非常に高いことが判明した。
【００２３】
実施例４  プロテアーゼとの組合せによる不活化能
さらに、各ウイルス不活化微生物（Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１）と酵素処理の組み合わせによるウイルス不活化能をみた。各微生物をＴＭＶ−Ｐ汚染ピーマン根に接種して、培養温度は３０℃の暗条件下で、培養期間は酵素単独は２週間、酵素と微生物の組み合わせは各１週間培養で先に酵素で処理した。処理した酵素は１％濃度になるように蒸留水で希釈して添加した。菌株・酵素を接種及び添加しない以外は同様に培養した区を無処理区として設定した。培養後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加して磨砕した。その磨砕した無処理区、酵素単独区、酵素＋微生物区の３つの被検液を、実施例１と同様の方法で１枚のタバコ葉に１／４葉ずつ塗抹接種し、第５〜第７葉の２株（計６葉）用いた。接種５日後、接種葉に現れた斑点の数を数え、病斑出現率を算出した。
結果を表７に示した。本発明によって、ウイルス不活化微生物と酸性プロテアーゼなどの酵素処理との組み合わせにより、ウイルス不活化能がより一層高まりほぼ完全に防除できた。
【表７】
2005000145.tif 000009
【００２４】
実施例５  アルギン酸ビーズによる微生物の固定化
Ｃ−１７６をＹＰＭＧ液体培地に懸濁し３０℃で３日間培養した。培養後、ＹＰＭＧ液体培地を用いて菌密度を１０８ＣＦＵ／ｇに調整した。調整液と等量のアルギン酸ナトリウムを調製液に混合し、十分撹拌した。混合液に一定圧力を加え、２％塩化カルシウム溶液に滴下した。得られたビーズは滅菌水で洗浄し、真空乾燥した。
【００２５】
実施例６  アルギン酸ビーズを用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
ＴＭＶ−Ｐ汚染土（５００ｇ）に各微生物を固定化したアルギン酸ビーズを５．０％（ｗ／ｗ）添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、３０℃の一定条件に設定した人工気象器中に１ヶ月間静置した。その後、播種１０日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、１ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにＥＬＩＳＡ検定を行った。試験区は、ＴＭＶ−Ｐ汚染していない土（非汚染土）、ＴＭＶ−Ｐ汚染土に当該微生物を添加していない区（汚染土）、ＴＭＶ−Ｐ汚染土に当該微生物を添加したアルギン酸ビーズの区で、１試験区あたり１０株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表８）。特に、Ｃ−１７６区では発病の軽減効果が大きかった。
【表８】
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【００２６】
実施例７  有機質基質の評価
各有機質基質（菜種粕、大豆粕、魚粕、コメヌカ、フスマ）１００ｇをポリポットに入れ、水を２５ｍＬ加えて１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめＹＰＭＧ液体培地で培養しておいた各種微生物（Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１）の培養液を４ｍＬ（１０８ＣＦＵ／ｇ）ずつ添加して３０℃で培養を行い、培養２１日目の菌数を調査した。結果を表９に示した。培養２１日目で各微生物に共通して増殖量の大きかった資材は大豆粕、コメヌカ、フスマで、１０８オーダーであった。その他の資材では微生物の種類やアンモニアガスの発生などの影響で１０７オーダー以下になるものもあった。有機質基質としては大豆粕＞コメヌカ＞フスマの順に好ましい結果となった。
【表９】
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【００２７】
実施例８  多孔質基質及び木質炭化物の評価
大豆粕４０ｇと多孔質基質及び木質炭化物（ゼオライト、イソライト、バーク炭、バーミキュライト）の各供試資材３６０ｇをシナノパック（（株）シナノポリ製）へ入れ、水を１００ｍＬ加え混合し、封をして１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめＹＰＭＧ液体培地で培養しておいた各種微生物（Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１）の培養液を４ｍＬ（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）ずつ添加して３０℃で培養を行い、培養２１日後の菌数を測定した。結果を表１０に示した。バーク炭以外のいずれも１０７オーダー以上増殖し、ゼオライト＞バーミキュライト＞イソライト＞バーク炭の順に菌数が多かった。
【表１０】
2005000145.tif 000012
【００２８】
実施例９  各種基質を用いた資材製造
実施例７、８で菌数の多かった有機質基質の大豆粕と多孔質基質のゼオライトを重量比で２：８に混合したもの１ｋｇに、水を３００ｍＬ添加して混合し、シナノパック（（株）シナノポリ製）に入れ封をして１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、あらかじめＹＰＭＧ液体培地で培養しておいた各種微生物（Ｃ−１７６、ＢＳ−１７、Ｍ−２１）の培養液を１０ｍＬ（１０８ＣＦＵ／ｍｌ）ずつ添加して、３０℃で１ヶ月間培養を行い、植物ウイルス防除資材を製造した（以下、防除資材と略す）。
【００２９】
実施例１０  防除資材を用いたウイルス防除適用試験（ノイバウエルポット試験）
ＴＭＶ−Ｐ汚染土５００ｇに各微生物の基質資材を１０％（ｗ／ｗ）添加してよく混合し、ノイバウエルポットに充填した。充填後の土壌に潅水して、３０℃の一定条件に設定した人工気象器中に１ヶ月間静置した。その後、実施例６と同様の方法で播種１０日目のピーマン苗（ニュー土佐ひかり）を定植して、１ヶ月間栽培したピーマン苗の最上葉を摘み取り、発病株を調べるためにＥＬＩＳＡ検定を行った。試験区は、ＴＭＶ−Ｐ汚染していない土（非汚染土）、ＴＭＶ−Ｐ汚染土に各微生物の防除資材を添加していない区（汚染土）、ＴＭＶ−Ｐ汚染土に各微生物を添加した防除資材の区で、１試験区あたり１０株用いた。その結果、各微生物区ともにウイルス病の発病する株の割合が低下する傾向が認められた（表１１）。しかし、防除資材の場合はＣ−１７６区ではアルギン酸ビーズほどの発病の軽減効果はなかった。
【表１１】
2005000145.tif 000013
【００３０】
【発明の効果】
実施例による根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群から選抜された植物ウイルス不活化能を有する微生物は、高いウイルス防除効果を示した。さらには、プロテアーゼと当該微生物との組合せ処理によって、相乗的に非常に高いウイルス防除効果を示した。これらのことにより、本発明の微生物及び当該微生物からなる植物ウィルス防除剤は、難防除植物ウイルス汚染圃場などのウイルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できることがわかった。本発明により従来にない、新しい土壌消毒法が確立し、ウイルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となる。また、減農薬による環境保全型農業が可能となる。