(57)【要約】      （修正有）【課題】モデル動物として有用なモルモットにおけるCD4、及び該CD4をコードするポリヌクレオチド等を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｄ）：（ａ）特定のアミノ酸配列を含有するタンパク質、（ｂ）上記のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、（ｃ）上記のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、（ｄ）特定の塩基配列からなるＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、からなる群より選択されるタンパク質等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換細胞を培養し、請求項１に記載のタンパク質を生成させることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項２に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対するsiＲＮＡ。
【請求項９】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから選択される少なくとも１のポリヌクレオチドからなる、プローブ又はプライマー。
【請求項１０】
CT7抗体および被験サンプルを接触させる工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モルモットＣＤ４、及びモルモットＣＤ４をコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品を開発する上で、対象となる疾患の動物モデルは極めて重要であり、１）体重が小さいため医薬品の投与量が少ないこと、２）繁殖が容易であること等から、主にげっ歯類動物が用いられる。
しかし、ヒトとげっ歯類動物では、しばしば生体反応が異なる。免疫応答反応においても、マウスやラットでは病理組織学的にヒトとは異なる反応を示すことが知られている。一方、モルモットは、げっ歯類動物の中でも免疫応答反応においてヒトと同じ反応を示す。例えば、結核菌等のマイコバクテリアに対する皮膚反応は、マウスにおいては発赤・腫脹にとどまるが、ヒトやモルモットでは潰瘍や肉芽を形成する。また、暴露した抗原に対する遅延型皮膚反応についても、マウス及びラットにおいては反応局所に浸潤する主な細胞は好中球であるが、モルモット及びヒトにおいてはＴ細胞及び活性化マクロファージである。また、吸入した抗原に対する喘息反応は、マウス及びラットでは即時型の反応しか生じないが、モルモット及びヒトにおいては吸入数時間後に遅延型の反応が生じる。従って、免疫反応を調整するような薬剤、例えばワクチン、免疫賦活化剤、抗アレルギー剤などの効果を評価し、薬理作用を解析するためには、モルモットは欠かせない実験動物である。
【０００３】
一方、CD4は分子量約55ｋDaの糖タンパク質で、主として、末梢のT細胞、一部のマクロファージ、B細胞、又は顆粒球の細胞表面上に発現する。CD4は、抗原提示細胞により提示された抗原をヘルパーT細胞がT細胞受容体を介して認識する際の補助分子として機能し、T細胞の活性化に関与する。また、CD4はHIVのエンベロープタンパク質、gp120と結合し、HIVの感染に関与していることも報告されている(非特許文献１を参照)。
そのDNA配列は、ヒトCD4(非特許文献２を参照；Genbank  Accession No. NM_000612)、マウスCD4(非特許文献３を参照；Genbank  Accession No. NM_013488)、およびラットCD4（非特許文献４を参照；Genbank  Accession No. NM_012705）等について、既に報告されている。
【０００４】
CD4を発現するT細胞は、獲得免疫の確立に必須であり、抗原の認識に関与し免疫反応を調整する重要な役割を担うことが明らかにされている。そのため、免疫反応に作用する薬剤の機能を解析する場合、CD4を発現するT細胞の反応を解析することが重要であり、CD4を特異的に認識する抗体やCD4の発現を検出できるようなプローブあるいはCD4の発現を抑制するようなアンチセンス核酸が必要となる。しかしながら、モルモットにおいてはCD4の構造が明らかにされていないため、モデル動物としてはモルモットが優れているにもかかわらず、評価する方法が限られているという問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Eur. J Clin. Chem. Clin. Biochem. 1996, 34, 723-728
【非特許文献２】Cell, 1985, 42,  93-104
【非特許文献３】Science. 1986, 234, 610-4
【非特許文献４】Proc Natl Acad Sci U S A. 1987, 84, 1649-1653
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、医薬品の開発等に有用なモデル動物において、免疫学的な評価を行なうために必須となる、モルモットCD4及びこれをコードするポリヌクレオチドを得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、鋭意検討した結果、モルモットＣＤ４をクローニングし、その構造を決定することに成功した。すなわち本発明は、
［１］  以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
からなる群より選択されるタンパク質；
［２］  ［１］に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
［３］  ［２］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター；
［４］  ［３］に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞；
［５］  ［４］に記載の形質転換細胞を培養し、［１］に記載のタンパク質を生成させることを特徴とする、［１］に記載のタンパク質の製造方法；
［６］  ［１］に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片；
［７］  ［２］に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド；
［８］  ［２］に記載のポリヌクレオチドに対するsiRNA；
［９］  ［２］に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドから選択される少なくとも１のポリヌクレオチドからなる、プローブ又はプライマー；
［１０］  以下の工程：
（１）モルモット生体組織サンプルから調製されたタンパク質と、［６］に記載の抗体またはその断片を接触させる工程、
（２）前記抗体もしくはその断片に結合した前記タンパク質を、前記抗体もしくはその断片を指標として測定する工程、
を含むことを特徴とする、モルモットにおけるCD4発現Ｔ細胞の検出方法；
［１１］  以下の工程：
（１）モルモット生体組織サンプルから調製されたRNA又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、［９］に記載のプローブ又はプライマーを接触させる工程、
（２）前記プローブもしくはプライマーに結合した前記RNA又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチドを、前記プローブもしくはプライマーを指標として測定する工程；
［１２］  CT7抗体および被験サンプルを接触させる工程を含むことを特徴とする、［１］に記載のタンパク質を検出する方法、
を含むことを特徴とする、モルモットにおけるCD4発現Ｔ細胞の検出方法；
に関するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、モルモットをモデル動物に用いて免疫賦活剤等の医薬品の評価に必要な、モルモットＣＤ４、モルモットＣＤ４をコードするポリヌクレオチド、及びモルモットＣＤ４抗体等を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下本発明の実施の態様について詳細に説明する。
本発明の第１の態様はモルモットＣＤ４及びこれをコードするポリヌクレオチドに関する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」とはＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。また、ポリヌクレオチドには２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００１０】
本明細書において、モルモットＣＤ４とは、主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有する、主にＴ細胞上に発現するモルモットのＣＤ４分子を表す。具体的には、モルモットＣＤ４とは、
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、又は、
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対し相補性を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性を有するタンパク質、
を表す。
【００１１】
前記（ｂ）において、「1個以上」とは1又は数個、又はそれ以上の個数を表し、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個を表す。
前記（ｂ）における「アミノ酸の欠失、付加、挿入、および／又は置換」には、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、生物学的機能及び／または免疫学的活性が保持される限り制限はない。生物学的機能や免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入、欠失あるいは付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の20％以内であり、好ましくは１０％以内であり、より好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、更に好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また前記欠失、付加、挿入、又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましく、置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がモルモットＣＤ４の生物学的機能及び／または免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe及びTrpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及びGlnは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Asp及びGluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またLys、Arg及びHisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
【００１２】
前記（ｃ）における「アミノ酸の欠失、付加、挿入、又は置換」を人為的に行なう場合の手法としては、例えば、配列番号：２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このポリヌクレオチドを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
【００１３】
前記（ｃ）における「配列同一性」とは、２つのタンパク質間の配列の同一性及び相同性を表す。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク質は２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。該配列同一性は、７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である。
【００１４】
前記（ｄ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行なうことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００１５】
本明細書において、「主要組織適合遺伝子複合体Class II結合活性」とは、抗原提示細胞上に発現する主要組織適合遺伝子複合体Class II (Major Histocompatibility Complex Class II:以下MHC Class IIと略す)とT細胞上に発現するCD4との結合活性を意味する。抗原提示細胞上のMHC Class IIに提示された抗原ペプチドとMHC Class II複合体がCD4陽性T細胞上のT細胞受容体と相互作用することによって、T細胞は活性化する。その際、CD4がMHC Class IIと結合することがT細胞の活性化には必要である。
CD4とMHC Class IIとの直接の結合活性を確認するには、例えばCD4を発現させた組換え体とMHC Class IIを発現する細胞とが結合することを以下の方法等によって測定することで可能である。
すなわち、CD4を発現させるベクターあるいはmockのベクターをCHO細胞にリポフェクション法により導入する。導入48時間後、培地を除く。次に、MHC Class II分子(Genbank Accession No. AB084158)を発現するベクターをエレクトロポレーション法により導入し48時間培養したマウス胸腺腫EL4細胞を、標識用培地(メチオニン不含のDMEM培地に200μCi/mLの[35S]-メチオニンを加えた培地)下で37℃、1時間培養する。35S放射線同位元素で標識した細胞を回収し、CD4を発現させるベクターあるいはmockのベクターを導入したCHO細胞に添加する。1時間、37℃で培養を行ない、培地で十分に洗浄する。CD4を発現させるベクターあるいはmockのベクターを導入したCHO細胞に付着した細胞をトリプシン処理により培養プレートから回収し液体シンチレーション溶液に入れる。液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定することによって、CD4を発現させるベクターあるいはmockのベクターを導入したCHO細胞に結合した35S放射線同位元素で標識したMHC Class II発現EL4細胞の量を求めることができる。CD4発現CHO細胞とMHC Class II発現EL4細胞を用いた場合に放射活性が増加することにより、CD4とMHC Class II分子の結合を確認できる(参考文献：Nature, 1987, 330:256-259)。
また、精製したCD4タンパク質とMHC Class IIタンパク質の結合を、表面プラズモン共鳴を原理とするバイオセンサー(BIAcore、ビアコア株式会社製)を用いて直接測定することもできる（「タンパク質  核酸  酵素」  第３７巻、２９７７頁（１９９２）参照。）。具体的には、精製したモルモットCD4タンパク質を５０μｇ／mLとなるように１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、これをセンサーチップCM5（ビアコア株式会社製）に固定化する。固定化後、０．０５％ (w/v)のTween２０、０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び３．４ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）でセンサーチップ表面を洗浄した後、サンプルとして精製したMHC  Class  IIタンパク質の溶液を注入し、共鳴シグナル〔Resonance unit（以下、ＲＵと略す。）〕の変化を、BIAcoreバイオセンサーを用いて測定する。共鳴シグナルはその値が高いほどセンサーチップ表面の濃度が高いことを示し、１０００ＲＵの変化はセンサーチップ表面の濃度1nm/mm2 の変化に相当する。
【００１６】
また、CD4とMHC  Class  IIタンパク質の相互作用を、T細胞の増殖等のT細胞の活性化反応で測定することも可能であり、例えば3H-チミジンの取り込み量を指標として測定することができる。具体的には、安楽死させたHartley系モルモット2匹より摘出した脾臓から常法に従い脾細胞を調製する。一方の個体より調製した脾細胞に50μg/mLのマイトマイシンCを添加し、37℃で30分培養する。Hanks’液で遠心洗浄しRPMI1640液体培地(10%ウシ胎児血清、55μM 2-メルカプトエタノール、50 U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシンを含む)に浮遊させる。96穴平底プレートへ1×105個、1×104個、あるいは1×103個ずつ播種する。続いてもう一方のモルモットより調製した脾細胞をRPMI1640液体培地に浮遊させ、上記プレートに5×105個ずつ播種する。37℃で2日間培養した後、[3H]−チミジンを含む培地を添加し37℃で6時間培養する。他個体のモルモット脾細胞に反応してDNA合成を開始した脾細胞の活性化を[3H]−チミジンの放射活性を指標に測定する。この試験方法において、あらかじめモルモット脾細胞にCD4の発現を抑制する核酸やCD4に対する抗体を処理することにより、脾細胞の活性化に本発明のCD4が関与していることを確認することができる。
【００１７】
更に、本発明のモルモットCD4に特異的な抗体を作成し、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（CD4）とMHC Class IIの結合活性の上記測定系に添加することにより、該抗体がCD4とMHC Class IIの結合活性やT細胞の活性化反応を抑制するか否かを評価することもできる。
【００１８】
本発明のモルモットＣＤ４は、解析を行なう上で、その塩基配列もしくはアミノ酸配列を改変（置換、欠失、付加及び挿入など）したり、他のタンパク質と融合を行ったり、誘導体へと変換して用いることができ、該改変体もしくは誘導体や、該改変体・誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範疇である。更に、本発明のモルモットＣＤ４の断片もまた、本発明の範疇である。
具体的には、配列番号：２において、第1残基〜第399残基に相当する部分配列（ＣＤ４細胞外領域）、前記ＣＤ４細胞外領域とイムノグロブリンとの融合タンパク質、又は、前記ＣＤ４細胞外領域の１もしくは複数のアミノ酸配列を改変したタンパク質であって、かつＣＤ４とMHC Class IIのタンパク質相互作用を競合阻害する活性を有するものが挙げられる。
また、配列番号：２において、第442残基〜第519残基に相当する部分配列（ＣＤ４細胞内領域）の１又は複数のアミノ酸残基を改変した改変体であって、ＣＤ４の細胞内シグナル伝達を競合阻害する活性を有するものが挙げられる。更に、CD4細胞内領域において、配列番号：２の第447残基〜第450残基（ＣＱＣＨ配列）は、Ｔ細胞の活性化に必要な補助シグナルを伝達するp56 lck蛋白（チロシンキナーゼの一種）と会合する領域と予想される。従って、該ＣＱＣＨ配列を改変した改変体であって、かつＣＤ４細胞内シグナル伝達を競合阻害する活性を有する断片もまた、本発明の範疇である。
【００１９】
本発明の第２の態様は、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクター、該発現ベクターを含む形質転換細胞、及び該形質転換細胞を用いた本発明のタンパク質の製造方法に関する。
本発明のモルモットＣＤ４は、ＤＮＡクローニング、プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行なうことができる。具体的にはモルモットＣＤ４をコードするポリヌクレオチドが所望の宿主細胞中で発現できる組換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換細胞を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。以下詳細に説明する。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含有するものであり、本発明のポリヌクレオチドを挿入でき、発現可能なベクターであれば特に限定されない。すなわち、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが導入されたものを挙げることができる。該発現ベクターの構築は、当業者に公知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行なうことができる。
【００２１】
発現ベクターの調製に用いられるベクターは、各種市販されている。該ベクターとして、具体的には、エシェリヒア属菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
【００２２】
ここで用いられるプロモーターは、DNAの発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｔａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２３】
前記ベクターに本発明のポリヌクレオチドを導入するために用いられる制限酵素も各種市販されており、具体的にはEcoRI (タカラバイオ株式会社)などが挙げられる。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても目的遺伝子を選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のレセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本発明のポリヌクレオチドの上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００２５】
前記のようにして得られた発現ベクターは、通常の遺伝子工学的方法により宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを導入して形質転換細胞を調製する方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法（F.M. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987))等の公知の方法を用いればよい。
【００２６】
宿主としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、大腸菌、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトHEK２９３細胞、ヒトHeLa細胞などが用いられる。
【００２７】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Gene），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）, 6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
本発明のタンパク質（モルモットＣＤ４）の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。また、糖鎖が結合した糖タンパク質として発現させるためには、CHO細胞等の哺乳動物由来細胞が好ましい。
【００２８】
前記形質転換細胞の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行なうことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行なう。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００２９】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル  アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., ネイチャー（Nature）, 195, 788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内又は細胞外（培養液中）に本発明のタンパク質を生成させることができる。
【００３０】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するには、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の抽出液を得る方法などが適宜用いられる。ここで、必要に応じて本発明のタンパク質を可溶化することができ、緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、それ自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３１】
また、本発明のタンパク質は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号２）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。該化学合成法としては文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００３２】
本発明の第３の態様は、モルモットCD4をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するアンチセンスポリヌクレオチド、及びRNAi効果によりモルモットCD4の発現を抑制するsiRNAに関する。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスDNA、及びアンチセンスRNAを共に含む概念である。アンチセンスDNA及びアンチセンスRNAは、合成機を用いて人工的に合成したり、通常と逆の向き（すなわちアンチセンスの向き）にDNAを転写させることなどによって得ることができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、前記本発明のポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、特に限定はないが、前記アンチセンスDNA及びアンチセンスRNAの長さは、通常15〜30塩基であり、通常20塩基程度が好ましい。これらは、細胞内に導入されて本発明のタンパク質の発現を抑制することが可能であり、モルモット生体内においてCD4の発現を抑制するために有用である。また、in situハイブリダイゼーションなどの研究用試薬としても利用できる。
作製したアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAは、細胞外からアンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAを直接導入したり、該アンチセンスRNAを転写によって生成することが可能なベクターを、本発明のタンパク質を発現し得る細胞に導入したりすることによって、使用することができる。
また、モルモットＣＤ４をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に対するsiRNAもまた、本発明の範疇に含まれる。siRNAとしては、本発明のモルモットCD4をコードするポリヌクレオチドの部分配列である、21〜23塩基の二本鎖RNAが挙げられる。具体的には、スタートコドンから、75塩基以上下流に存在する塩基配列「AA」に続く19〜21塩基を選択することができる。ここで、選択した21〜23塩基の配列がモルモットCD4特異的であることは、NCBI（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）のBLAST検索を用いて確認することができる。また、siRNAの設計には、「Jack Lin's siRNA sequence finder」（http://www.sinc.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html）又は「siDirect」（http://133.11.210.226/sidirect/index.php）等の設計用ソフトウェアを適宜用いることができる。
【００３３】
本発明の第４の態様は、モルモットＣＤ４に特異的に結合する抗体に関する。
本明細書における抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本発明タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。
また本発明の抗体は、モルモットＣＤ４の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体誘導のために用いられるオリゴペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、モルモットＣＤ４のアミノ酸配列において少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
【００３４】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13；Antibodies、A Laboratory Manual, Lane, H,D.ら編,  Cold Spring Harber Laboratory Press出版（1989））。抗体製造に用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられ、本発明のタンパク質又は該タンパク質のアミノ酸配列の一部からなるオリゴペプチドが免疫抗原として用いられる。免疫抗原は、通常、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。
具体的には、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し、可溶化もしくは精製したモルモットＣＤ４、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、これを、ポリエチレングリコール法等の手法により、骨髄腫細胞（例えば、PS2/0等のマウスミエローマが挙げられる。）と細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。すなわち、得られたハイブリドーマの培養上清をスクリーニングし、モルモットCD4に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマの培養上清より、常法に従ってモノクローナル抗体を得ることができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化モルモットＣＤ４等と抗血清とを反応させるなどの方法で測定することができる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ポリエチレングリコール（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のタンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のタンパク質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３５】
一方、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したモルモットＣＤ４を用いて、あるいは常法に従って当該いずれかのモルモットCD4の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成し、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。通常は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等のキャリアータンパクと結合し、免疫抗原とする。
上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３６】
また、得られた抗体をプロテアーゼ等で切断することにより、抗体断片を調製することができる。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシンなどが用いられる。
抗体の作製に使用されるタンパク質は、上記のＤＮＡクローニング、プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。
【００３７】
本発明の抗体の生成は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行なうこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００３８】
本発明の抗体はモルモットＣＤ４に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、モルモットの組織内に発現したＣＤ４を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は組織内におけるモルモットＣＤ４のタンパク質発現の有無を検出するプローブとして有用である。
ＣＤ４陽性細胞の検出は、癌・喘息等の疾患モデル動物において、該モデル動物の免疫機能を示す重要な指標の一つであり、薬物の評価試験を行なう場合には必須である。すなわち、本発明の抗体によって、モルモットをモデル動物として用いて該モデル動物の免疫機能を検査する場合に、CD4陽性細胞を検出することが可能になる。具体的には、１）CD4陽性細胞の存在を免疫組織染色により解析すること、２）血中やリンパ節等でのCD4陽性細胞の割合をFlow Cytometry法により解析すること、又は３）CD4陽性細胞の機能を阻害することで、CD4の機能解析を行なうこと等が挙げられる。また、例えば、イムノブロット法、放射免疫測定法（RIA)、酵素免疫測定法（ELISA）等に用いることで血中の可溶型CD4蛋白の定量ができる。
【００３９】
本発明のプライマーまたはプローブは、例えば本発明の遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記本発明のポリヌクレオチドの塩基配列を primer 3またはベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００４０】
本発明のプライマーまたはプローブは、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった方法で、本発明のポリヌクレオチドより転写されたRNAを特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。これにより、モルモット組織・細胞等におけるモルモットCD4の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
また、本発明のプローブは、当該DNAチップのプローブとして使用することもできる（例えば、アフィメトリックス社の Gene Chip Human Genome U95 A,B,C,D,E等のＤＮＡチップの場合、25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。
【００４１】
本発明の第６の態様は、モルモット生体組織サンプルに含まれるCD4発現Ｔ細胞の検出方法に関する。該検出方法は、癌・喘息等の疾患モデル動物において、該モデル動物の免疫機能を示す重要な指標の一つであるＣＤ４発現Ｔ細胞を検出し、薬物の評価試験を行なう場合には必須である。
ここで「モルモット生体組織サンプル」は、特に限定されないが、例えば、生体外に取り出した血液、髄液、リンパ節、脾臓、胸腺、肝臓、骨髄等の生体試料から常法に従って調製した細胞、組織片、組織ホモジネート、細胞ホモジネート、組織抽出物、細胞抽出物、total  RNAなどを用いることができる。
「モルモットＣＤ４マーカー」とは、生体組織サンプル中のＣＤ４を認識することができる上記本発明の抗体や、ＣＤ４由来遺伝子産物（ｍＲＮＡ等）を認識することができる上記本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、プライマーもしくはプローブを表す。
モルモットＣＤ４マーカーが、アンチセンスポリヌクレオチド、プライマーもしくはプローブである場合、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法等といった特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法を用いてＴ細胞を検出することができる。
ノーザンブロット法を用いる場合は、モルモットＣＤ４マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI)や蛍光物質などで標識し、それを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスフェクトした被験者の生態組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成されたマーカーとRNAとの二重鎖を、マーカーの標識物に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出・測定する方法を例示することができる。
RT-PCR法を利用する場合は、該マーカーをプライマーとして用いることにより、RNA中のモルモットCD4遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出・測定することができる。具体的には生体組織サンプル由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製し、これを鋳型として標的のCD4の領域が増幅できるように前記プライマーをハイブリダイズさせ、PCR法を行ない、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、検出は、プライマーとして予めRIや蛍光物質で標識したものを用いる方法、または産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて標識したマーカーをプローブとして使用してこれをハイブリダイズさせて検出する方法等を用いることができる。
【００４２】
また、モルモットＣＤ４マーカーが抗体である場合、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を用いてCD4の発現を検出することができる。
該ウェスタンブロット法は、一次抗体として前記CD4抗体を用いて生体組織サンプル由来のCD4と結合させた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素や蛍光物質あるいは酵素で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて該放射性同位元素や該蛍光物質由来のシグナルあるいは酵素反応によって産生された蛍光・発光・発色シグナルを放射性測定器や蛍光検出器で検出して測定することにより実施できる。
【００４３】
本発明はまた、CT7抗体及び被験サンプルを接触させることを特徴とする、本発明のタンパク質を検出する方法を提供する。
ここでCT７抗体とは、Strain 13モルモットの腹腔滲出細胞をナイロンウールカラムに供し得られたT細胞を免疫原として作製された、モルモットヘルパーT細胞を認識することが知られていた公知のモノクローナル抗体であり、その製造方法等はHYBRIDOMA (1985) volume 4 115-124に開示されている。CT7抗体が認識するタンパク質についてはこれまで不明であったが、本発明実施例に示されるとおり、配列番号２で表される本発明のタンパク質を認識することが明らかになった。
ここで用いられるCT7抗体は、検出可能なように、蛍光物質、32P等の放射性同位元素、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等、当業者に汎用されている方法で標識されていることが好ましい。具体的にはFITC標識CT7抗体(コスモバイオ)等の市販品を例示することができる。
被験サンプルとしては、測定対象として本発明のタンパク質を含むものであれば特に限定は無いが、具体的には前記のモルモット生体組織サンプル等が挙げられる。
本発明のタンパク質を検出する手順については、前述のとおりである。
【００４４】
以下実施例により、具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
モルモットCD4をコードするポリヌクレオチドは、以下の手順で得た。すなわち、モルモットの脾臓、あるいはリンパ節からRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製し、配列番号：３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、該プローブにハイブリダイズするcDNAを選択した。RT-PCR法によりcDNAを増幅しクローニングした。このように選択したcDNAの塩基配列を解析し、モルモットCD4を得た。以下詳細に記載する。
(モルモット脾臓細胞のcDNAライブラリーの作製)
Hartley系モルモット雄性２３週齡(日本チャールスリバー社より購入)より脾臓を取り出し、ハンクス液中でスライドグラスを用いて細胞懸濁液を調製した。細胞塊はろ過にて除去した。細胞を遠心分離により集め、０.１×生理リン酸緩衝液 7 mLにて懸濁後、速やかに２×生理リン酸緩衝液 7 mL、ハンクス液 10 mLを加え、溶血させた。遠心分離後、１０%ウシ胎児血清、５０μM 2-メルカプトエタノール、５０ U/mLペニシリン、５０μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI培地(阪大微研)に脾細胞を５×１０6個/mLの濃度で懸濁した。コンカナバリンAを５μg/mLになるように添加し、５%二酸化炭素存在下37℃で培養した。24時間後細胞を遠心分離により集め、凍結保存した。TRIZOL Reagent (Gibco BRL)を用い、凍結した細胞からRNAを調製し、mRNA purification kit (Pharmacia)を用いてpolyA画分を得た。cDNA合成は、Superscript Choice System for cDNA Synthesis Kit (Gibco BRL)を用いて行った。cDNAに制限酵素EcoRI/NotIアダプターを連結し、あらかじめEcoRIで消化されたファージベクターλZAPIIと連結し、Gigapac III Gold Packaging Extract (Stratagene)を用いてファージの殻に封入した。
【００４６】
(CD4 DNAに対するプローブの合成)
ラットCD4 DNAの1287-1390の配列を合成し、モルモットCD4用DNAプローブとした。
合成DNAプローブの配列
5´-GGGCTCTGCA TCCTATTCTG TGTCAGGTGC CGGCACCAAC AGCGCCAGGC AGCACGGATG TCTCAGATCA AGAGGCTTCT CAGTGAGAAG AAGACTTGCC AGTG-3´(配列番号：３)
【００４７】
(CD4cDNAのクローニング)
上記記載の方法で作製したプローブを用いてモルモット脾臓由来cDNAライブラリーをスクリーニングすることによりモルモットCD4 DNAをクローニングした。
まずモルモット脾臓由来cDNAライブラリーであるファージを適当に希釈し、10 mM MgCl2でOD600＝0.5に調製した大腸菌XL1-Blue MRF’（Stratagene社製）に添加し、37℃で15分保温した。それにNZY top agarを加え、NZY agar plateに広げ固めた。37℃で1晩培養後、出現したプラークを常法に従い、ナイロンメンブレン（HybondN+：アマシャムファルマシア社製）にトランスファー、変性、固定した。
次にAlkPhos DirectTM（アマシャムファルマシア社製）を用いてハイブリダイゼーションを行なった。10 ng/μLのモルモットCD4用DNAプローブ溶液100 μLに氷中で100 μLのReaction bufferを加え、穏やかに攪拌し、次に20 μLのlabelling reagentを加え、穏やかに攪拌した。100 μLのCross-linker solutionを加え、穏やかに攪拌し、37℃、30分反応した。キットに添付のハイブリダイゼーションバッファーに上記フィルターを浸し、上記標識プローブを添加して50℃で一晩放置した。その後、56℃で100 mlのPrimary wash buffer（2M urea、0.1% SDS、50 mMリン酸ナトリウム pH7.0、150 mM 塩化ナトリウム、1 mM 塩化マグネシウム）で10分間の洗浄を2回繰り返し、室温でSecondary wash buffer（50 mM Tris pH10.0、100 mM 塩化ナトリウム、2 mM 塩化マグネシウム）で5分間の洗浄を2回繰り返した。フィルターの水分をろ紙上で取り除き、サランラップの上にひろげ、発色試薬であるCDP-Star 4 mLをかけ、2〜5分反応させた。余分な試薬を除き、フィルターを、サランラップで包んでオートラジオグラフィー用フィルム（HyperfilmECL：アマシャムファルマシア社製）とともにカセットに入れ、室温で1時間置き、感光させた後、現像した。その結果、約25万個のプラークから7個のポジティブなシグナルが得られた。そのうちの３つのプラーク（C-１、-２、-４）を大腸菌 XPORTに704 helper phageおよび大腸菌XLOLRと共に加え、さらに3〜5 mLの溶かしたNZY top agarを加えて、NZY agar plate（9cm）上に広げた。37℃で一晩保温し不透明なプラークを3 mLのLB/tet/Ampに植菌した。37℃、一晩培養後、常法にて、プラスミドを調製した。このプラスミドにはポジティブなシグナルを出すファージの挿入部分が挿入されている。
【００４８】
(モルモットCD4 DNAの塩基配列の解析)
上記方法で得られた、プラスミド化された3つのクローンのうち長いC-2、C-4のクローン（約2.5kbp）についてABI PRISM model 3100により塩基配列を決定した。決定したDNA塩基配列を配列番号：１に、また推定されるアミノ酸配列を配列番号：2に示す。
その結果、C-2とC-4は5’末端領域、3’末端領域の長さが異なる、ほぼ同じcDNAが挿入されたクローンであることがわかった。
このように決定されたモルモットCD4及びそのDNAをヒトCD4及びそのDNAあるいはマウスCD4及びそのDNAと比較した。その結果、モルモットCD4とヒトCD4 (アミノ酸数458、GenBank Accession No. NM_000616)の間では、塩基配列において60.1%、アミノ酸配列において53.9%のホモロジーが認められた。モルモットCD4とマウスCD4(アミノ酸数457、GenBank Accession No. NM_013488)の間では、塩基配列において57.8％、アミノ酸配列において52.6%のホモロジーが認められた。
【実施例２】
【００４９】
モルモットCD4アミノ酸配列から、抗原ペプチド2種類gpCD4_41およびgpCD4_139+を選択した。gpCD4_41は41番目〜56番目のアミノ酸配列からなり、gpCD4_139+は139番目〜155番目のアミノ酸配列のN末端側にシステインを付加している。gpCD4_41およびgpCD4_139+を常法により合成しウシサイログロブリンと結合させた。ウサギに8回免疫を行ない抗血清を取得した。
（使用する抗原ペプチドの配列）
gpCD4_41：CIGSQRKNMPFSWKFL  (41〜56番目、16mer)(配列番号：4)
gpCD4_139+：CLNLIVEGPKNSQLPVQF  (139〜155番目、C+17mer)(配列番号：5)
【実施例３】
【００５０】
(モルモットCD4発現ベクターの構築)
実施例１で得たクローンC-2またはC-4が挿入されたプラスミドより、制限酵素SacIによる切断、Mung Bean Nucleaseによる突出末端の平滑化、制限酵素EcoRIによる切断によって制限酵素を用いて挿入断片を切り出し、制限酵素XbaIによる切断、Klenow fragmentによる突出末端の平滑化、制限酵素EcoRIによる切断を行った、pEF1/myc-His A(インビトロジェン)のマルチクローニングサイトに挿入した。
【実施例４】
【００５１】
(モルモットCD4の発現細胞の樹立)
トランスフェクション前日に9×105 /20 mL/T-75フラスコとなるようにCHO-K1を播種した。FuGENE6 (Roche Diagnostics Corporation) 15μLを血清不含の液体培地(Ham/F12, Invitrogen)と混合し5μg相当のベクターを添加した（total 1000μL）。穏やかに攪拌した後、室温15分静置した。CHO-K1細胞に添加し37℃設定のCO2インキュベータで2日間培養したのち、細胞を回収し、250μg/mLのG-418を含む液体培地で100倍希釈し、フラスコに播種した。２〜３日間隔で培地を交換して18日間培養した。
(ヘルパーT細胞に反応するモノクローナル抗体CT7に対する交差性の検討)
モルモットCD4の発現細胞をトリプシン／EDTAで2分間処理し細胞を回収した。2% FCSを含むCellWASH(日本ベクトン・ディッキンソン)に2×107 /mLとなるように懸濁した。FITC標識CT7抗体(コスモバイオ)を10μLずつ添加し、氷上に30分静置した。2 mLのCellWASHで2回遠心洗浄し(1,200 rpm, 5 min, 4℃)、1% パラホルムアルデヒド/PBSで細胞を固定した。FACScan(日本ベクトン・ディッキンソン)を用いて抗体の交差反応性を解析した。
pEF1/Myc-Hisベクターを導入したCHO-K1細胞(CHO/pEF1mycHis)に対して、CT7抗体は反応性を示さなかったが、モルモットCD4を発現するベクターpEF1/gpCD4を導入したCHO-K1細胞(CHO/CD4)に対して、FITC化されたCT7抗体は有意に結合した。一方、対照となるFITC化抗体は結合しなかった(図1)。
Tan等はモルモットT細胞の表面抗原に反応する8種類のモノクローナル抗体を作製した(Hybridoma 4:115-24, 1985)。そのうちCT7抗体はヘルパーT細胞に反応性を示すことが報告されたが、CT7抗原の抗原は明らかではない。この結果により、本発明の新規ポリヌクレオチドがヘルパーT細胞に対する抗体の抗原であることが示された。ヘルパーT細胞の特徴的な細胞表面抗原がCD4であることから、本発明の新規ポリヌクレオチドがコードするタンパク質がモルモットのCD4であることが確認できた。
【実施例５】
【００５２】
(MHC Class II陽性細胞との結合)
モルモット脾臓よりB細胞あるいはマクロファージを常法により調製し、35S-メチオニンを含む培地で1時間培養し標識する。上記プラスミドをマウス線維芽細胞L929等にリポフェクション法により導入する。モルモットCD4を導入した細胞を単層培養したプレートに、モルモット脾臓より調製した標識したB細胞またはマクロファージを添加し37℃で1時間培養する。培地で洗浄した後、細胞をトリプシン処理により回収し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定する。測定した値より、モルモットCD4を導入した細胞に結合した標識したB細胞あるいはマクロファージ量を求める。
【００５３】
(発現分布)
4%パラホルムアルデヒドで灌流固定したモルモット脾臓、リンパ節、胸腺より常法にしたがってパラフィン切片を作製する。クローンC-2またはクローンC-4が挿入されたプラスミドよりin vitro transcription法によりアンチセンス鎖を合成しアンチセンスプローブを調製する。アンチセンスプローブを用いてパラフィン切片のin situ hybridizationを行ない、モルモットCD4を発現する細胞を染色する。脾臓の白髄内のT細胞領域、胸腺の皮質領域、リンパ節の傍皮質領域内にあるT細胞領域の染色を検討し、T細胞に発現することを確認する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】モルモットCD4発現するベクターpEF1/gpCD4を導入したCHO-K1細胞(CHO/CD4)に対するCT7抗体の結合を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号３：DNA合成用プローブ
配列番号４：抗原ペプチド
配列番号５：抗原ペプチド
【図１】
2005027666.tif 000002
【配列表】
2005027666000001.app