(57)【要約】【課題】  金コロイド凝集反応を利用する測定において、自動分析装置での測定の測定精度および正確性を向上させる方法を提供すること。【解決手段】  本発明の金コロイド凝集反応の測定方法は、被測定物質と、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を、６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質と、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を、６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定する工程を含む、金コロイド凝集反応の測定方法。
【請求項２】
前記反応開始後の吸光度変化を、６１０ｎｍ〜８００ｎｍおよび３６０ｎｍ〜５１０ｎｍの二波長で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被測定物質と特異的に結合し得る物質が、抗体または抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
被測定物質と、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を、６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定することにより、該被測定物質を測定する工程を含む、被測定物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金コロイド凝集反応の測定方法、すなわち感作金コロイド粒子と被測定物質との反応により金コロイド凝集を生じさせ、その反応の吸光度変化を測定する方法の改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査などの各種検査では自動化および測定時間の短縮が図られている。その検査の方法として、生体試料中の物質を測定するために免疫反応を利用する測定方法が広く用いられている。免疫測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などの多くの方法がある。その中でもラテックス凝集法や金コロイド凝集法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないため、測定の自動化や短時間での測定に適している。一般に測定に用いられる金コロイド粒子は５ｎｍ〜１００ｎｍの大きさであり、これはラテックス粒子より小さいため、より微量物質の測定に利用可能と思われる。
【０００３】
金コロイド凝集法を用いる測定は、種々知られており、生体試料の各種物質が測定されている（特許文献１および２、非特許文献１〜３）。これらの金コロイド凝集反応の測定では、いずれも、金コロイドの最大吸収を示す５４０ｎｍ付近の波長を測定波長としている。しかし、現在、それらの技術を用い、かつ臨床検査分野で普及している自動分析装置を利用して、１０分間での測定が行われているが、さらに測定の感度や測定精度の面での向上が求められている。特に微量物質の測定を行う場合には、臨床的に求められる低濃度域での測定精度を向上させることが重要である。
【特許文献１】特開平６−９４７１９号公報
【特許文献２】特開平６−１１８０８３号公報
【非特許文献１】Leuvering JH，Thal PJ，Van der Waart M，およびSchuurs AH，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏ．，１９８１年，４５巻，１８３−１９４頁
【非特許文献２】Leuvering JH，Thal PJ，White DD，およびSchuurs AH，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏ．，１９８３年，６２巻，１６３−１７４頁
【非特許文献３】Wielaard F，Denissen A，Van der Veen L，およびRutjes I，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ．Ｍｅｔｈｏ．，１９８７年，１７巻，１４９−１５８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、金コロイド凝集反応を利用する測定において、自動分析装置での測定の測定精度および正確性を向上させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために鋭意検討した結果、金コロイド凝集反応の反応開始後の吸光度変化を、金コロイドの最大吸収波長である５４０ｎｍ付近の波長で測定することなく、６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定することにより、測定精度および正確性を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、被測定物質と、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定する工程を含む、金コロイド凝集反応の測定方法を提供する。この測定波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍは、金コロイドの最大吸収のピークから大きく長波長側に離れた波長域であり、このような波長での一波長測定は、これまでに行われたことがない。
【０００７】
好適な実施態様では、上記反応開始後の吸光度変化を、６１０ｎｍ〜８００ｎｍおよび３６０ｎｍ〜５１０ｎｍの二波長で測定する。この３６０ｎｍ〜５１０ｎｍの波長は、金コロイドの最大吸収付近の波長よりも短波長側である。
【０００８】
より好適な実施態様では、上記被測定物質と特異的に結合し得る物質は、抗体または抗原である。
【０００９】
本発明はまた、被測定物質と、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子とを溶液中で反応させ、反応開始後の吸光度変化を６１０ｎｍ〜８００ｎｍで測定することにより、該被測定物質を測定する工程を含む、被測定物質の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、金コロイド凝集反応に伴う吸光度変化を６１０ｎｍ〜８００ｎｍの波長で測定する。そのため、従来行われているような金コロイドの最大吸収波長である５４０ｎｍ付近の波長を主とした測定と比較して、被測定物質の低濃度域での吸光度変化量が大きくなり、さらに吸光度変化のばらつきが少なくなるので、測定精度が改善される。また、本発明の方法では６１０ｎｍ〜８００ｎｍの一波長測定または６１０ｎｍ〜８００ｎｍと３６０ｎｍ〜５１０ｎｍとの二波長測定を行うため、従来のような５４０ｎｍ付近の波長による一波長または二波長測定と比較して、血清や血漿中のヘモグロビンの影響が少なくなり、より正確な測定ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法の被測定物質は、該被測定物質と特異的に結合し得る物質が存在し、そして該特異的に結合し得る物質が金コロイド粒子に結合し得るものであれば、特に限定されない。
【００１２】
測定に供する被測定物質を含む検体としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料；環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。被測定物質としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびII、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、これらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンが挙げられる。
【００１３】
被測定物質と特異的に結合し得る物質は、金コロイド粒子に結合し得るものであれば特に限定されない。特異的に結合し得る物質としては、被測定物質に対する抗体あるいは抗原；レセプターやレクチンなどの結合親和性を有する物質などが挙げられる。
【００１４】
本発明の方法に用いられる金コロイド粒子は、市販されているものを用いてもよく、あるいは当業者が通常用いる方法（例えば、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法）により調製したものを用いてもよい。金コロイドの粒子の粒径は、通常１０ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００１５】
本発明の方法に用いられる被測定物質と特異的に結合し得る物質が結合した金コロイド粒子（以下、感作金コロイド粒子と略記する）は、例えば、以下のように調製し得る：調製金コロイド粒子溶液（５４０ｎｍにおける吸光度が約２．０）１Ｌに対して、通常、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇの被測定物質と特異的に結合し得る物質（例えば、抗体）を添加し、冷蔵または室温下で５分〜２４時間撹拌する。次いで、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングし、遠心分離などを行うことにより、目的の感作金コロイド粒子を得ることができる。得られた感作金コロイド粒子は、測定に必要な濃度となるように緩衝液に分散させる。緩衝液のｐＨは、４．５〜９．５、好ましくは５．５〜８．５の範囲である。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液が好適に用いられる。緩衝液の濃度は、１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭである。緩衝液は、必要に応じて、アジ化ナトリウム、ＢＳＡ、塩化ナトリウムなどの塩類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡなどのキレート剤などを含有してもよい。
【００１６】
被測定物質と感作金コロイド粒子との凝集反応において、反応温度、ｐＨ、緩衝液の種類、共存する塩の種類や濃度、その他の共存物質などの反応条件については、従来の免疫学的反応と同様である。例えば、一般的に行われているように、反応促進の目的で、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの水溶性高分子を反応系に添加してもよい。
【００１７】
本発明の方法は、例えば、以下のように行われる：上記のように得られた感作金コロイド粒子と、被測定物質を含む検体または該検体を緩衝液などで適切に希釈したものなどとを混合することにより、被測定物質と感作金コロイド粒子とが反応し、金コロイド凝集反応が生じる。この金コロイド凝集反応に起因する所定の波長における吸光度変化を測定する。測定結果を、予め作成しておいた金コロイド凝集反応の吸光度変化と被測定物質の量との関係を表す検量線に当てはめることにより、容易に検体中の被測定物質の量を求めることができる。なお、吸光度変化が一定値以下であれば陰性、一定値以上であれば陽性として判定を行う、定性および半定量をすることも可能である。
【００１８】
本発明における反応開始後の吸光度変化は、一波長測定であっても二波長測定であってもよい。一波長測定の場合は、測定波長は、６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍである。二波長測定の場合は、測定波長は、第一波長６１０ｎｍ〜８００ｎｍ、好ましくは６３０ｎｍ〜７５０ｎｍと、第二波長３６０ｎｍ〜５１０ｎｍ、好ましくは４００ｎｍ〜５００ｎｍである。本発明の方法において吸光度変化とは、以下の２通りの測定により得られた値であり、いずれであってもよい：
（１）反応開始後に反応液の吸光度を適当な間隔で２回測定し、その差を吸光度変化とする；または
（２）反応開始後に反応液の吸光度を連続的に測定し、時間当たりの吸光度変化率（その最大変化率を用いる場合もある）を吸光度変化とする。
【００１９】
上記測定には、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析装置などが利用できる。特に、本発明の方法を生化学自動分析装置での測定にに適用することにより、多数の検体を短時間に測定することが可能である。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１：金コロイド液の調製）
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸溶液２ｍＬを撹拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間撹拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１％炭酸カリウムでｐＨ７．１に調節した。
【００２２】
（実施例２：抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬の調製）
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・サイトメーション株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この液の１００ｍＬを上記実施例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間撹拌した。５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分撹拌した。８０００回転で４０分間遠心分離し、上清を除去した。残渣に、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）約１Ｌを加えて抗体結合金コロイドを分散させた後、８０００回転で４０分間遠心分離して上清を除去し、Ａ溶液を加えて抗体感作金コロイドを分散させ、全量を１６０ｍＬとし、抗シスタチンＣ抗体感作金コロイド試薬を調製した。
【００２３】
（実施例３：シスタチンＣ測定における金コロイドの凝集反応に伴う吸収スペクトル変化の測定）
シスタチンＣ濃度８ｍｇ／Ｌの検体３０μＬに、５％塩化ナトリウム、０．２％ＥＤＴＡ、０．２％アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテル、および２．５％ポリエチレングリコールを含む０．５Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）溶液（Ｂ溶液）２．４ｍＬを添加し、３７℃で約５分間加温した。これに、上記実施例２で調製した抗シスタチンＣ抗体感作金コロイド試薬０．６ｍＬを加えて反応を開始し、反応開始後２分毎に吸収スペクトルの変化を島津ＵＶ−２２００で測定した。その結果を図１に示す。
【００２４】
金コロイドの凝集反応に伴って、金コロイドの最大吸収を示す５４０ｎｍ付近の吸光度の減少が認められた以外に、６１０〜８００ｎｍの波長域での吸光度の上昇が認められた。この６１０〜８００ｎｍの波長域での吸光度変化量は、金コロイドの最大吸収を示す５４０ｎｍ付近の変化量と同程度あるいはそれ以上であった。また、金コロイドの最大吸収波長よりも短波長側の５１０〜３６０ｎｍ波長でも、吸光度の減少が認められた。このことから、金コロイドの最大吸収波長付近よりも長波長側の６１０〜８００ｎｍの波長の単一波長、あるいは、６１０〜８００ｎｍの波長と金コロイドの最大吸収波長よりも短波長側の５１０〜３６０ｎｍの波長との二波長における吸光度変化量を測定することにより、金コロイドの最大吸収波長付近の波長を測定することなしに、金コロイドの凝集反応の過程を把握することができると考えられる。
【００２５】
（実施例４：一波長測定の検討）
シスタチンＣ濃度０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、および４ｍｇ／Ｌのそれぞれの検体３μＬに、Ｂ溶液をＲ１試薬として２４０μＬ添加した。３７℃で約５分間加温した後、Ｒ２試薬として上記実施例２で調製した抗シスタチンＣ抗体感作金コロイド試薬６０μＬを加えて３７℃で反応させ、日立７０７０自動分析装置により、種々の波長（４５０、４８０、５０５、５４６、６６０、および７００ｎｍ）での測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化量を測定した。シスタチンＣ濃度１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、および４ｍｇ／Ｌ検体の各波長における吸光度変化量を表１に示す。なお、シスタチンＣ濃度０ｍｇ／Ｌの検体をブランクとした。
【００２６】
【表１】
2005283250.tif 000002
【００２７】
金コロイドの最大吸収付近よりも大きく長波長側に外れた６６０および７００ｎｍの吸光度変化量は、金コロイドの最大吸収付近の５４６ｎｍ、ならびに金コロイドの最大吸収付近よりも短波長側の５０５、４８０、および４５０ｎｍでの吸光度変化量よりも大きかった。このことより、単一波長測定を行う場合、金コロイドの最大吸収付近の波長域、あるいは金コロイドの最大吸収よりも大きく短波長側に外れた５０５、４８０、および４５０ｎｍ波長を測定するよりも、金コロイドの最大吸収付近よりも大きく長波長側に外れた６６０ｎｍまたは７００ｎｍの波長域を測定することにより、被測定物質を感度良く測定できる。
【００２８】
（実施例５：二波長測定の検討）
シスタチンＣ濃度０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、および４ｍｇ／Ｌのそれぞれの検体３μＬに、Ｂ溶液をＲ１試薬として２４０μＬ添加した。３７℃で約５分間加温した後、Ｒ２試薬として上記実施例２で調製した抗シスタチンＣ抗体感作金コロイド試薬６０μＬを加えて３７℃で反応させ、日立７０７０自動分析装置により、一方の波長を６６０ｎｍで、もう一方の波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍ、あるいは、金コロイドの最大吸収波長付近より短波長側に大きく外れた５０５、４８０、または４５０ｎｍのいずれかの波長で、測光ポイントとして１８から３１ポイントにおける吸光度変化を測定し、６６０ｎｍでの吸光度変化から上記のいずれかの波長での吸光度変化を差し引いた値の絶対値を、二波長測定の吸光度変化量とした。シスタチンＣ濃度１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、および４ｍｇ／Ｌ検体の各波長における吸光度変化量を表２に示す。なお、シスタチンＣ濃度０ｍｇ／Ｌの検体をブランクとした。
【００２９】
【表２】
2005283250.tif 000003
【００３０】
シスタチンＣが高濃度である４ｍｇ／Ｌの場合、６６０ｎｍと金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍとの組み合わせによる二波長測定の吸光度変化量は、他の二波長測定と比して大きかった。しかし、シスタチンＣ濃度が低濃度になるに従って、６６０ｎｍと短波長側の５０５、４８０、または４５０ｎｍとの組み合わせを用いた二波長測定の吸光度変化量が、６６０ｎｍと５４６ｎｍとの組み合わせによる二波長測定の吸光度変化量よりも大きくなった。このことより、二波長測定を行う場合、一方を６６０ｎｍとし、他方をあえて金コロイドの最大吸収波長付近より短波長側に外れた５０５、４８０、４５０ｎｍの波長とすることにより、金コロイドの最大吸収波長の５４０ｎｍ付近の波長を用いた二波長測定より、低濃度領域で感度良く測定できることがわかる。
【００３１】
（実施例６：血清における一波長測定）
シスタチンＣ濃度が１ｍｇ／Ｌ以下の３種類の血清検体を、上記実施例３に記載のように、検体量：Ｒ１量：Ｒ２量比が３：２４０：６０となるように調製した。これらの試料について、日立７０７０自動分析装置で、各波長（４８０、５０５、５４６、６６０、７００、および７５０ｎｍ）における単一波長測定を２０回行い、その測定値の各波長におけるばらつきを比較した。各波長における２０回測定のばらつきの指標であるＳＤ値およびＣＶ値を表３に示す。
【００３２】
【表３】
2005283250.tif 000004
【００３３】
金コロイドの最大吸収付近よりも長波長側に外れた６６０、７００、および７５０ｎｍでの測定は、金コロイドの最大吸収付近の５４６ｎｍ、短波長側の５０５および４８０ｎｍでの測定と比して、ＳＤ値およびＣＶ値が非常に小さかった。このことより、単一波長測定を行う場合、金コロイドの最大吸収付近よりも大きく長波長側に外れた６６０、７００、または７５０ｎｍでの測定を行うことより、被測定物質を非常に精度よく測定できることがわかる。
【００３４】
（実施例７：血清における二波長測定−１）
シスタチンＣ濃度１ｍｇ／Ｌ以下の３種類の血清検体を、上記実施例４に記載のように、検体量：Ｒ１量：Ｒ２量比が３：２４０：６０となるように調製した。これらの試料について、日立７０７０自動分析装置で、一方の波長を６６０ｎｍとし、もう一方の波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍ、短波長側の５０５または４８０ｎｍとした二波長による測定を２０回行い、その測定値の各二波長測定におけるばらつきを比較した。各二波長測定における２０回測定のばらつきの指標であるＳＤ値およびＣＶ値を表４に示す。
【００３５】
【表４】
2005283250.tif 000005
【００３６】
一方の波長を６６０ｎｍとした場合、もう一方の波長を金コロイドの最大吸収波長付近より短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍを用いた二波長測定のＳＤ値およびＣＶ値は、金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍを用いる場合と比して、シスタチンＣ濃度が０．７９ｍｇ／Ｌの血清３においては同等あるいは小さい値を示した。さらに、シスタチンＣ濃度が低濃度になるに従って明らかに小さい値を示した。このことより、一方を６６０ｎｍ付近の波長を用いる二波長測定を行う場合、もう一方の波長には、金コロイドの最大吸収の５４０ｎｍ波長付近よりも短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍ付近の波長を用いるほうが、特に低濃度の被測定物質を精度よく測定できることがわかる。
【００３７】
（実施例８：血清における二波長測定−２）
シスタチンＣ濃度０．７ｍｇ／Ｌ以下の３種類の血清検体を、上記実施例４に記載のように、検体量：Ｒ１量：Ｒ２量比が３：２４０：６０となるように調製した。これらの試料について、Ｐｏｌｙ−Ｃｈｅｍ自動分析装置で、一方の波長を６６０ｎｍとし、もう一方の波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍまたは短波長側の５１０ｎｍとした二波長による測定を２０回行い、その測定値の各二波長測定におけるばらつきを比較した。各二波長測定における２０回測定のばらつきの指標であるＳＤ値およびＣＶ値を表５に示す。
【００３８】
【表５】
2005283250.tif 000006
【００３９】
一方の波長を６６０ｎｍとした場合、もう一方の波長を金コロイドの最大吸収波長付近より短波長側に外れた５１０ｎｍを用いた二波長測定のＳＤ値およびＣＶ値は、金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍを用いる場合と比して、明らかに小さい値を示した。また、それはシスタチンＣ濃度が低濃度になるに従って顕著になった。このことより、一方を６６０ｎｍ付近の波長を用いた二波長による測定を行う場合、もう一方の波長には、金コロイドの最大吸収の５４０ｎｍ波長付近よりも短波長側に外れた波長を用いるほうが、特に低濃度の被測定物質を精度よく測定できることがわかる。
【００４０】
（実施例９：ヘモグロビンの影響の検討）
血清検体にヘモグロビンを５００ｍｇ／ｄＬになるように添加し、上記実施例４に記載のように、検体量：Ｒ１量：Ｒ２量比が３：２４０：６０となるように調製した。この試料について、日立７０７０自動分析装置で、第一波長を６６０または７００ｎｍとし、第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍ、短波長側の５０５または４８０ｎｍとした二波長による測定を行った。結果を表６に示す。
【００４１】
【表６】
2005283250.tif 000007
【００４２】
第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍに設定した場合、ヘモグロビンを５００ｍｇ／Ｌ添加することにより、測定値が５％以上の正の影響を受けた。しかし、第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近より短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍに設定した場合、ヘモグロビン添加による測定値へ影響は３％未満であり、ヘモグロビンの影響はほとんど受けなかった。このことより、第一波長として６６０または７００ｎｍ付近の波長を用いた二波長による測定を行う場合、第二波長として、金コロイドの最大吸収の５４０ｎｍ波長付近よりも短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍ付近の波長を用いて測定するほうが、溶血ヘモグロビンの影響を受けることなく被測定物質を正確に測定できることがわかる。
【００４３】
（実施例１０：抗フェリチン抗体結合金コロイド試薬の調製）
抗フェリチン抗体（ダコ・サイトメーション株式会社）と上記実施例１で調製した金コロイド液とを用いて、実施例２に記載のように抗フェリチンＣ抗体感作金コロイド試薬を調製した。
【００４４】
（実施例１１：フェリチン測定におけるヘモグロビンの影響）
５％塩化ナトリウム、０．５％ＥＤＴＡ、０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテル、および２．０％ポリエチレングリコールを含む０．２Ｍ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）溶液（Ｃ溶液）を調製した。ヘモグロビンを５００ｍｇ／ｄＬになるように添加した血清検体を、Ｃ溶液をＲ１とし、上記実施例１０で調製した抗フェリチンＣ抗体感作金コロイド試薬をＲ２として、検体量：Ｒ１量：Ｒ２量比が１０：１６０：８０となるように調製した。この試料について、日立７０７０自動分析装置で、第一波長を７００ｎｍとし、第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍ、短波長側の５０５または４８０ｎｍとした二波長による測定を行った。結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
2005283250.tif 000008
【００４６】
第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近の５４６ｎｍに設定した場合、ヘモグロビンを５００ｍｇ／Ｌ添加することにより、測定値において１０％以上の正の影響を受けた。しかし、第二波長を金コロイドの最大吸収波長付近よりも短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍに設定した場合、ヘモグロビン添加による測定値へ影響は３％未満であり、影響をほとんど受けなかった。このことより、第一波長として７００ｎｍ付近の波長を用いる二波長による測定を行う場合、第二波長として、金コロイドの最大吸収の５４０ｎｍ波長付近よりも短波長側に大きく外れた５０５または４８０ｎｍ付近の波長を用いて測定するほうが、溶血ヘモグロビンの影響を受けることなく被測定物質を正確に測定できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の方法によれば、臨床検査分野で普及している自動分析装置を利用して、低濃度の被測定物質を、短時間でより精度よく測定することができる。また、血清や血漿中のヘモグロビンの影響が少なくなり、より正確な測定ができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】シスタチンＣと抗シスタチンＣ抗体感作金コロイド試薬との反応開始後２分毎の吸収スペクトル図である。
【図１】
2005283250.tif 000009