(57)【要約】【課題】  プローブの配列が決定した後、直ちに所望のプローブアレイを製造することができるプローブアレイ製造用部材及び該プローブアレイ製造用部材を利用したプローブアレイの製造方法を提供する。【解決手段】  プローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２、・・・Ｍｎを切断して切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを製造し、所定個数の切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを剥離シート１３から剥がし、接着剤層１２を介して支持部材２ａの所定箇所に接着する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材表面の第一領域に固定されたプローブと、前記基材表面の第二領域に設けられた接着剤層とを備えたプローブアレイ製造用部材。
【請求項２】
前記基材がシート状基材であり、前記第一領域が前記シート状基材の一方の面に位置し、前記第二領域が前記シート状基材の他方の面に位置する請求項１記載のプローブアレイ製造用部材。
【請求項３】
前記第一領域に一種類のプローブのみが固定されている請求項１又は２記載のプローブアレイ製造用部材。
【請求項４】
支持部材と、前記支持部材表面に配列された請求項１〜３のいずれかに記載のプローブアレイ製造用部材又はその切断片とを備えたプローブアレイであって、
前記プローブアレイ製造用部材又はその切断片が、前記プローブが露出するように前記接着剤層を介して前記支持部材に接着されている前記プローブアレイ。
【請求項５】
前記支持部材が筒状部材であり、前記プローブ製造用部材又はその切断片が前記筒状部材の内周面に接着されている請求項４記載のプローブアレイ。
【請求項６】
前記プローブアレイが筒状部材をさらに備えており、前記プローブが前記筒状部材の中空部に露出するように、前記支持部材が前記筒状部材の中空部に収容されている請求項４記載のプローブアレイ。
【請求項７】
前記支持部材の外周面と前記筒状部材の内周面との接触を防止するスペーサー部材が前記支持部材の外周面又は前記筒状部材の内周面に設けられている請求項６記載のプローブアレイ。
【請求項８】
支持部材と、前記支持部材表面に配列された請求項１〜３のいずれかに記載のプローブアレイ製造用部材又はその切断片とを備えたプローブアレイの製造方法であって、
前記プローブアレイ製造用部材又はその切断片を、前記プローブが露出するように前記接着剤層を介して前記支持部材に接着する工程を含むプローブアレイの製造方法。
【請求項９】
前記支持部材が筒状部材であり、前記工程において、前記プローブ製造用部材又はその切断片を前記筒状部材の内周面に接着する請求項８記載のプローブアレイの製造方法。
【請求項１０】
前記プローブアレイが筒状部材をさらに備えており、前記プローブが前記筒状部材の中空部に露出するように、前記支持部材を前記筒状部材に収容する工程をさらに含む請求項８記載のプローブアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブアレイ製造用部材、並びに該プローブアレイ製造用部材を利用したプローブアレイ及びプローブアレイの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、標的物質と反応できるプローブ（例えば、ＤＮＡ、タンパク質等の生体物質）をガラス、シリコン等の基材上に固定化し、標的物質の検出を行うＤＮＡチップ、プロテインチップ等のプローブアレイが開発されている。
プローブアレイの製造方法としては、スポッティング用ピン内に吸い上げられたプローブ含有液を基材上の所定部位にスポッティングする方法（特許文献１参照）が知られている。また、ＤＮＡチップの製造方法としては、半導体製造のフォトリソグラフィー技術を応用して基材上で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（特許文献２参照）が知られている。
【特許文献１】米国特許第５，８０７，５２２号公報
【特許文献２】米国特許第５，４２４，１８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記従来の製造方法においては、プローブの配列（すなわちプローブの種類及び固定位置）が決定されて初めてプローブアレイの製造が開始され、プローブアレイの製造開始から製造完了までに一定の時間を要する。
【０００４】
したがって、プローブの配列が予め決定している場合のように、プローブの配列の決定時とプローブアレイの使用時との間に十分な時間的余裕がある場合には、上記従来の製造方法でも対応することができる。
【０００５】
しかしながら、プローブの配列がプローブアレイの使用直前まで決定されていない場合や、プローブの配列を臨機応変に変更したい場合のように、プローブの配列の決定時とプローブアレイの使用時との間に十分な時間的余裕がない場合には、上記従来の製造方法では対応することができない。
【０００６】
また、上記従来の製造方法において、プローブアレイの製造にあたり準備されるプローブの量は、通常、実際に基材上に固定されるプローブの量よりも多いため、準備されたプローブのうち一部の不要なプローブは基材上に固定されず、無駄になってしまう。例えば、スポッティング用ピン内に吸い上げられたプローブ含有液の量は一度のスポッティングで消費されるプローブ含有液の量よりも多いため、スポッティング後、スポッティング用ピン内にはプローブ含有液が残存するが、スポッティング用ピン内に残存するプローブ含有液は再利用することができないため、無駄になってしまう。プローブを有効活用するために、残ったプローブを利用してさらに別のプローブアレイを製造することも考えられるが、こうして製造されるプローブアレイにおけるプローブの配列は、残ったプローブの種類及び量に依存するため、必ずしも所望のプローブアレイを製造することができない。
【０００７】
さらに、上記従来の製造方法では、異なる種類のプローブを同一の基材上に固定するため、プローブの基材への固定化方法をプローブの種類に応じて最適化することができない。
【０００８】
一方、プローブアレイを使用した標的物質の一般的な検出方法においては、プローブを固定化したプレート状基材上に、標的物質を含む液体試料を添加し、乾燥を防ぐためにカバーグラス等を被せ、プローブと標的物質とを反応させた後、洗浄してプローブと反応した標的物質以外の物質を除去し、予め標的物質に結合させておいた標識物質（例えば、蛍光物質、酵素等）を検出する。この際、微量な液体試料をマイクロピペットで吸い取り、均一にプレート状基材に添加し、カバーグラスを被せ、反応後にカバーグラスを外して均一にプレート状担体を洗浄するという操作を手作業で行わなければならず、各作業は非常に繊細であるため、作業する者によって結果に大きな差が生じ、再現性のある結果を得ることが困難である。これに対して、筒状部材の内周面にプローブを固定したプローブアレイを使用すれば、筒状部材の中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
【０００９】
しかしながら、上記従来の製造方法では、プローブを筒状部材の内周面に固定することは困難である。
【００１０】
そこで、本発明は、第一に、プローブの配列が決定した後、直ちに所望のプローブアレイを製造することができるプローブアレイ製造用部材を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、第二に、プローブアレイの製造にあたり準備されるプローブを有効に活用することができるプローブアレイ製造用部材を提供することを目的とする。
【００１２】
さらに、本発明は、第三に、プローブの基材への固定化方法をプローブの種類に応じて最適化することができるプローブアレイ製造用部材を提供することを目的とする。
【００１３】
さらに、本発明は、第四に、プローブを筒状部材の内周面へ容易に固定することができるプローブアレイ製造用部材を提供することを目的とする。
【００１４】
さらに、本発明は、第五に、上記プローブアレイ製造用部材を利用して製造されるプローブアレイを提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、第六に、上記プローブアレイ製造用部材を利用したプローブアレイの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明は、基材と、前記基材表面の第一領域に固定されたプローブと、前記基材表面の第二領域に設けられた接着剤層とを備えたプローブアレイ製造用部材を提供する。
【００１７】
本発明のプローブアレイ製造用部材は、プローブが露出するように接着剤層を介して支持部材に接着することができる。また、基材表面の第一領域及び第二領域を含む本発明のプローブアレイ製造用部材の切断片も同様に、プローブが露出するように接着剤層を介して支持部材に接着することができる。
したがって、本発明のプローブアレイ製造用部材又はその切断片を支持部材表面に接着して配列させることにより、プローブアレイを製造することができる。
【００１８】
この際、プローブアレイにおけるプローブの配列は、プローブアレイ製造用部材又はその切断片の配列の仕方によって自由に調節することができる。したがって、プローブの配列が決定した後、プローブの配列に応じてプローブアレイ製造用部材又はその切断片を支持部材表面に接着して配列することにより、直ちに所望のプローブアレイを製造することができる。
【００１９】
また、プローブアレイの製造にあたり準備された全てのプローブを使用してプローブアレイ製造用部材を製造し、プローブアレイの製造に使用しなかったプローブアレイ製造用部材又はその切断片は、必要になるときまで保管しておくことができるので、プローブアレイの製造にあたり準備されるプローブを有効に活用することができる。プローブアレイ製造用部材又はその切断片の保管時には、接着剤層に剥離シートを積層し、接着剤層を保護することが好ましい。
【００２０】
さらに、本発明のプローブアレイ製造用部材においては、異なる種類のプローブを別々の基材へ固定することができるので、プローブの基材への固定化方法をプローブの種類に応じて最適化することができる。
【００２１】
さらに、本発明のプローブアレイ製造用部材又はその断片を、接着剤層を介して筒状部材の内周面に接着することにより、プローブを筒状部材の内周面に容易に固定することができる。
【００２２】
本発明のプローブアレイ製造用部材において、基材の形態は特に限定されるものではなく、また、第一領域及び第二領域の位置は基材表面の異なる領域である限り特に限定されるものではないが、前記基材がシート状基材であり、前記第一領域が前記シート状基材の一方の面に位置し、前記第二領域が前記シート状基材の他方の面に位置することが好ましい。これにより、基材表面の第一領域及び第二領域を含むプローブアレイ製造用部材の切断片を容易に作製することができる。
【００２３】
本発明のプローブアレイ製造用部材において、第一領域に固定されるプローブの種類は特に限定されるものではないが、前記第一領域に一種類のプローブのみが固定されていることが好ましい。このような構成のプローブアレイ製造用部材又はその切断片を利用してプローブアレイを製造することにより、プローブの組み合わせの自由度が増すので、プローブを多種多様に配列することができる。また、第一領域においてプローブの種類と固定位置とを対応付ける必要がないので、第一領域へのプローブの固定化を容易に行なうことができる。
【００２４】
上記課題を解決するために、本発明は、支持部材と、前記支持部材表面に配列された本発明のプローブアレイ製造用部材又はその切断片とを備えたプローブアレイであって、前記プローブアレイ製造用部材又はその切断片が、前記プローブが露出するように前記接着剤層を介して前記支持部材に接着されている前記プローブアレイを提供する。
【００２５】
本発明のプローブアレイにおいて、前記支持部材が筒状部材であり、前記プローブ製造用部材が前記筒状部材の内周面に接着されていることが好ましい。これにより、筒状部材の中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
【００２６】
本発明のプローブアレイにおいて、前記プローブアレイが筒状部材をさらに備えており、前記プローブが前記筒状部材の中空部に露出するように、前記支持部材が前記筒状部材の中空部に収容されていることが好ましい。本態様においては、筒状部材の中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。本態様において、前記支持部材の外周面と前記筒状部材の内周面との接触を防止するスペーサー部が前記支持部材の外周面又は前記筒状部材の内周面に設けられていることが好ましい。これにより、支持部材に固定されたプローブが、筒状部材の中空部に流入した液体試料、洗浄液等と確実に接触することができるので、反応効率、洗浄効率等が向上し、標的物質の検出精度が向上する。
【００２７】
上記課題を解決するために、本発明は、支持部材と、前記支持部材表面に配列された本発明のプローブアレイ製造用部材又はその切断片とを備えたプローブアレイの製造方法であって、前記プローブアレイ製造用部材又はその切断片を、前記プローブが露出するように前記接着剤層を介して支持部材に接着する工程を含むプローブアレイの製造方法を提供する。
【００２８】
本発明のプローブアレイの製造方法において、プローブアレイにおけるプローブの配列は、プローブアレイ製造用部材又はその切断片の配列の仕方によって自由に調節することができる。したがって、プローブの配列が決定した後、プローブの配列に応じてプローブアレイ製造用部材又はその切断片を支持部材表面に接着して配列することにより、直ちに所望のプローブアレイを製造することができる。
【００２９】
本発明のプローブアレイの製造方法において、前記支持部材が筒状部材であり、前記工程において、前記プローブ製造用部材又はその切断片を前記筒状部材の内周面に接着することが好ましい。本態様においては、プローブアレイ製造用部材又はその断片を、接着剤層を介して筒状部材の内周面に接着することにより、プローブを筒状部材の内周面へ容易に固定することができる。
【００３０】
本発明のプローブアレイの製造方法において、前記プローブアレイが筒状部材をさらに備えており、前記プローブが前記筒状部材の中空部に露出するように、前記支持部材を前記筒状部材に収容する工程をさらに含むことを好ましい。本態様においては、プローブアレイ製造用部材又はその断片が接着剤層を介して接着された支持部材を筒状部材に収容することにより、プローブを筒状部材の中空部へ容易に配列することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、第一に、プローブの配列が決定した後、直ちに所望のプローブアレイを製造することができるプローブアレイ製造用部材が提供される。また、第二に、プローブアレイの製造にあたり準備されるプローブを有効に活用することができるプローブアレイ製造用部材が提供される。さらに、第三に、プローブの基材への固定化方法をプローブの種類に応じて最適化することができるプローブアレイ製造用部材が提供される。さらに、第四に、プローブを筒状部材の内周面へ容易に固定することができるプローブアレイ製造用部材が提供される。さらに、第五に、上記プローブアレイ製造用部材を利用して製造されるプローブアレイが提供される。さらに、第六に、上記プローブアレイ製造用部材を利用したプローブアレイの製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図１に示すように、本実施形態に係るプローブアレイ製造用部材Ｍ１は、矩形シート状の基材１１と、基材１１の上面に固定されたプローブＰ１と、基材１１の下面に積層された接着剤層１２とを備えており、接着剤層１２の下面には剥離シート１３が積層されている。
【００３３】
基材１１の材質は、その表面にプローブＰ１を固定化でき、かつ一連の実験操作に使用される液体（例えば、液体試料、洗浄液等）に不溶性である限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、プラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、ガラス、セラミック、これらの複合材料等が挙げられる。
【００３４】
プラスチックの具体例としては、ポリエチレン、ポリエチレン共重合体（例えば、エチレン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体）等のポリエチレン系樹脂；ポリプロピレン；ポリスチレン、ポリスチレン共重合体（例えばアクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−スチレン−ブタジエン共重合体）等のポリスチレン系樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂；ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル等のアクリル樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート等のポリエステル；ポリカーボネート等の熱可塑性樹脂が挙げられ、無機高分子の具体例としては、−Ｓｉ−Ｏ−結合、−Ｐ−Ｎ−結合を有する重合体等が挙げられ、金属の具体例としては、金、白金、アルミニウム等が挙げられ、天然高分子の具体例としては、セルロース系、タンパク質系、イソプレン系等の高分子が挙げられる。
【００３５】
基材１１は多孔質であってもよいし無孔質であってもよいが、多孔質である場合には基材１１の表面積が増加するので、基材１１の表面に固定できるプローブ量も増加する。
【００３６】
基材１１は、例えば、上記熱可塑性樹脂からなるシート又はそれらの積層シートであり、その厚みは例えば１０〜１０００μｍである。
【００３７】
本実施形態では、基材１１の上面のほぼ全体にプローブＰ１を固定したが、プローブＰ１を固定する領域の位置及び面積は適宜調節することができる。プローブＰ１を固定する領域の面積は、準備された全てのプローブＰ１を固定化できるように調節することが好ましい。これにより、準備された全てのプローブＰ１を有効に活用することができる。
【００３８】
本実施形態では、基材１１の形状を矩形シート状としたが、基材１１の形状はこれに限定されるものではなく、適宜変更することができる。基材１１の形状は、例えば、円形シート状に変更することができる。
【００３９】
基材１１の上面には、図１に示すように、一種類のプローブＰ１のみが固定されている。プローブＰ１は、標的物質と反応できる限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられ、プローブ及び標的物質の組み合わせとしては、例えば、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。なお、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
【００４０】
本実施形態では、基材１１の上面に一種類のプローブＰ１のみを固定したが、基材１１の上面に二種類以上のプローブを固定してもよい。その場合、プローブの種類と固定位置とを対応付け、プローブの種類を位置により識別できるようにしておく。
【００４１】
プローブＰ１は、例えば、静電結合、共有結合、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−低分子相互作用等を利用して基材１１の表面に固定化することができ、このような固定化が可能となるように、公知の技術を用いて基材１１の表面又はプローブＰ１に適当な化学修飾を施すことができる。
【００４２】
静電結合を利用する場合には、例えば、基材１１の表面をポリカチオン性物質でコーティングする。「カチオン性物質」とは、分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、カチオン性物質は静電的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性基としては、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられ、カチオン性物質としては、例えば、カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー等が挙げられる。
【００４３】
共有結合を利用する場合には、例えば、基材１１の表面又はプローブＰ１に存在する官能基を利用して共有結合を形成させる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。基材１１の表面にカルボキシル基が存在する場合には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、プローブＰ１に存在するアミノ基と反応させることにより、基材１１とプローブＰ１とをアミド結合させることができる。また、基材１１の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、プローブＰ１に存在するアミノ基と反応させることにより、基材１１とプローブＰ１とをアミド結合させることができる。
【００４４】
この他、ストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、プローブＰ１を基材１１に固定化することができる。
【００４５】
接着剤層１２を構成する接着剤は、接着剤層を形成することができ、固化後の接着剤が一連の実験操作に使用される液体（例えば、液体試料、洗浄液等）に対して不溶であり、当該液体に悪影響を与えるものでない限り特に限定されるものではない。接着剤の具体例としては、感圧型接着剤、化学反応型接着剤、熱溶融型接着剤等が挙げられるが、これらのうち、感圧型接着剤が好ましい。感圧型接着剤を利用すれば、プローブアレイ製造用部材Ｍ１又はその切断片を容易かつ迅速に支持部材に圧着することができる。
【００４６】
感圧型接着剤（粘着剤）の具体例としては、アクリル系粘着剤、ポリエステル系粘着剤、ウレタン系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等が挙げられる。アクリル系粘着剤の具体例としては、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸２−ジエチルブチル、（メタ）アクリル酸イソオクチル、（メタ）アクリル酸２−メトキシエチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸デシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸トリデシル等の（メタ）アクリル酸エステルの一種又は二種以上と、それら（メタ）アクリル酸エステルと共重合可能な（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、メタクリル酸メチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル等の官能性モノマーとの共重合物等が挙げられ、ゴム系粘着剤の具体例としては、スチレン−イソプレン−スチレンブロック共重合体ゴム、スチレン−ブタジエンゴム、ポリブテンゴム、ブチルゴム等の合成ゴムや天然ゴムを主成分とするもの等が挙げられ、ビニルエーテル系粘着剤の具体例としては、エチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、２−エチルヘキシルビニルエーテル等が挙げられ、シリコーン系粘着剤の具体例としては、ジメチルシロキサンガムとジメチルシロキサンレジンとの混合物及び／又は重合物により構成されるもの等が挙げられる。感圧性接着剤型は溶剤型及びエマルジョン型のいずれであってもよい。
【００４７】
化学反応型接着剤は、構成成分が化学反応により高分子化して固化するタイプの接着剤であり、その具体例としては、外部から熱を与えることにより化学反応を開始する加熱硬化型接着剤、可視光、紫外線、電子線等の照射により化学反応を開始する光・電子線硬化型接着剤等が挙げられる。加熱硬化型接着剤の具体例としては、エポキシ系接着剤等が挙げられ、光・電子線硬化型接着剤の具体例としては、ポリエステルアクリレート等が挙げられる。
【００４８】
熱溶融型接着剤は、熱により一旦溶融し、冷却により元の固体に戻る、いわゆるホットメルトタイプの接着剤であり、その具体例としては、ポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体等が挙げられる。
【００４９】
接着剤層１２の厚さは、例えば５〜５０μｍである。
【００５０】
剥離シート１３としては、例えば、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ポリプロピレンフィルム等の樹脂フィルム；グラシン紙、クレーコート紙、ラミネート紙（主にポリエチレンラミネート紙）等の紙をシリコーン系剥離剤等で剥離処理したものが挙げられる。剥離シート１３の厚さは、例えば２５〜２００μｍである。
【００５１】
プローブアレイ製造用部材Ｍ１は、例えば、接着剤層１２を構成する接着剤と溶媒とを含有する塗布剤を調製し、塗工機によって剥離シート１３上に塗布して乾燥させ、接着剤層１２を形成した後、接着剤層１２の表面に基材１１を積層することにより製造することができる。この際、基材１１へのプローブＰ１の固定化は基材１１の積層前に行ってもよいし、積層後に行ってもよいが、積層前に行うことが好ましい。
【００５２】
互いに種類が異なるプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎ（ｎは２以上の整数である。以下同様。）が所定順序で配列したプローブアレイを製造する場合、図４に示すように、基材１１の上面にそれぞれプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎが固定化されたプローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎを準備する。
【００５３】
プローブアレイ製造用部材Ｍ２・・・・Ｍｎの構成は、基材１１の上面に固定化されたプローブの種類が異なる点を除き、プローブアレイ製造用部材Ｍ１の構成と同様である。プローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎにおいて、基材１１の材質は、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎの種類に応じて適宜選択することができる。これにより、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎの基材１１への固定化方法をプローブの種類に応じて最適化することができる。
【００５４】
図５に示すように、プレート状の支持部材２ａと、支持部材２ａ上に所定順序で接着されたプローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎの切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎとを備え、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎが支持部材２ａ上に所定順序で配列されたプローブ１ａは、以下の工程１ａ及び２ａにより製造することができる。
【００５５】
工程１ａ：図２及び図４に示すように、プローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２、・・・Ｍｎを厚さ方向に切断して、円形シート状の切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを製造する。
【００５６】
工程２ａ：図４に示すように、所定個数（本実施形態では各１個）の切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを剥離シート１３から剥がし、接着剤層１２を介して支持部材２ａの所定箇所に接着する。この際、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎと接着剤層１２とは基材１１の反対側の面に設けられているので、切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを支持部材２ａに接着すると、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎは支持部材２ａ上に露出する。なお、残りの切断片は、剥離シート１３から剥がさずに、必要になるときまで保管しておく。これにより、残りの切断片も有効に活用することができる。
【００５７】
図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、円筒状の支持部材２ｂと、支持部材２ｂの内周面に所定順序で接着されたプローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎの切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎとを備え、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎが支持部材２ｂの中空部に所定順序で配列されたプローブ１ｂは、以下の工程１ｂ及び２ｂにより製造することができる。
【００５８】
工程１ｂ：工程１ａと同様にして、円形シート状の切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを製造する。
【００５９】
工程２ｂ：所定個数（本実施形態では各４個）の切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを剥離シート１３から剥がし、接着剤層１２を介して支持部材２ｂの内周面の所定箇所に接着する。この際、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎと接着剤層１２とは基材１１の反対側の面に設けられているので、切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを支持部材２ｂに接着すると、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎは支持部材２ｂの中空部に露出する。なお、残りの切断片は、剥離シート１３から剥がさずに、必要になるときまで保管しておく。これにより、残りの切断片も有効に活用することができる。
【００６０】
図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、円筒状部材３と、円筒状部材３の中空部に収容された円柱状の支持部材２ｃと、支持部材２ｃの外周面に所定順序で接着されたプローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎの切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎとを備え、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎが円筒状部材３の中空部に所定順序で配列されたプローブ１ｃは、以下の工程１ｃ、２ｃ及び３ｃにより製造することができる。
【００６１】
工程１ｃ：工程１ａと同様にして、円形シート状の切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎを製造する。
【００６２】
工程２ｃ：所定個数（本実施形態では各４個）の切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎを剥離シート１３から剥がし、接着剤層１２を介して支持部材２ｃの外周面の所定箇所に接着する。プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎと接着剤層１２とは基材１１の反対側の面に設けられているので、切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを支持部材２ｃに接着すると、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎは支持部材２ｃ上に露出する。なお、残りの切断片は、剥離シート１３から剥がさずに、必要になるときまで保管しておく。これにより、残りの切断片も有効に活用することができる。
【００６３】
工程３ｃ：切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎが所定順序で接着された支持部材２ｃを円筒状部材３の中空部に収容する。図７に示すように、支持部材２ｃの外周面には、支持部材２ｃの外周面と円筒状部材３の内周面との接触を防止するスペーサー部４が設けられているので、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎが接着された支持部材２ｃを円筒状部材３の中空部に収容すると、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎは円筒状部材３の中空部に露出する。
【００６４】
プローブアレイ１ａ、１ｂ及び１ｃは、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎの配列が決定した後、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎの配列に応じて切断片Ｆ１、Ｆ２、・・・Ｆｎを支持部材２ａ、２ｂ及び２ｃに接着して配列することにより直ちに製造することができる。プローブアレイ１ａ、１ｂ及び１ｃにおいて、プローブの種類は、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎの接着位置に基づいて識別することができる。
【００６５】
本実施形態では、プローブアレイ製造用部材Ｍ１を厚さ方向に切断する際、図２に示すように、剥離シート１３まで切断していないので、各切断片Ｆ１の接着剤層１２の下面には同一の剥離シート１３が積層されているが、図３に示すように、剥離シート１３まで切断して、各切断片Ｆ１の接着剤層１２の下面に別々の剥離シート１３が積層されるようにしてもよい。プローブアレイ製造用部材Ｍ２・・・Ｍｎを厚さ方向に切断する際も同様である。
【００６６】
切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎの直径は、例えば１０μｍ〜１０ｍｍである。本実施形態では、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎの形状を円形シート状としたが、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎの形状は適宜変更することができる。切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎの形状は、例えば、矩形シート状に変更することができ、そのときの１辺の長さは、例えば１０μｍ〜１０ｍｍである。
【００６７】
本実施形態では、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎを支持部材２ａ、２ｂ又は２ｃに接着したが、プローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎが適当な大きさであれば、プローブアレイ製造用部材Ｍ１、Ｍ２・・・Ｍｎを切断することなく支持部材２ａ、２ｂ又は２ｃに接着してもよい。
【００６８】
支持部材２ａ、２ｂ又は２ｃの材質は、一連の実験操作に使用される液体（例えば、液体試料、洗浄液等）に対して不溶である限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、上記に例示したプラスチック、無機高分子、金属、天然高分子、ガラス、セラミック、これらの複合材料等が挙げられる。
【００６９】
本実施形態では、支持部材２ａの形状をプレート状とし、支持部材２ｂの形状を円筒状とし、支持部材２ｃの形状を円柱状としたが、支持部材２ａ、２ｂ又は２ｃの形状は適宜変更することができる。例えば、支持部材２ｂの形状を角筒状等の円筒状以外の筒状に変更することができる。また、支持部材２ｃの形状をシート状、プレート状、円筒状、角筒状、角柱状等に変更することができる。また、支持部材２ａ、２ｂ又は２ｃの大きさは、使用目的等に応じて適宜調節することができる。
【００７０】
図７に示すように、支持部材２ｃの外周面には、支持部材２ｃの外周面と円筒状部材３の内周面との接触を防止するスペーサー部４が設けられている。スペーサー部４の形状、構造等は支持部材２ｃの外周面と円筒状部材３の内周面との接触を防止できる範囲内で変更が可能である。本実施形態では、スペーサー部４を支持部材２ｃの外周面に設けたが、スペーサー部４は円筒状部材３の内周面に設けてもよい。
【００７１】
図７に示すように、スペーサー部４の大きさは、支持部材２ｃが円筒状部材３の中空部に収容されたとき、全てのスペーサー部４の端部が円筒状部材３の内周面に接触するように調節されているが、スペーサー部４の大きさは適宜変更が可能である。また、スペーサー部４の個数、配置等は適宜変更が可能である。
【００７２】
円筒状部材３及びスペーサー部４の材質は、液体試料に不溶性である限り特に限定されるものではなく、例えば、上記熱可塑性樹脂等のプラスチック；鉄、銅、アルミニウム等の金属；ガラス；セラミックス；これらの複合材料等が挙げられる。
【００７３】
プローブアレイ１ｂ又は１ｃの製造時において、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎは曲面（円筒状の支持部材２ｂの内周面又は円柱状の支持部材２ｃの外周面）に接着されるので、基材１１の材質は、可撓性を有する材質（例えば、上記に例示した熱可塑性樹脂等）であることが好ましい。これにより、切断片Ｆ１、Ｆ２・・・Ｆｎを曲面に密着させることができる。
【００７４】
プローブアレイ１ａ、１ｂ又は１ｃを利用した標的物質の検出は、例えば、次のようにして行うことができる。
【００７５】
第１工程：標識物質が結合した標的物質を含有する液体試料とプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎとを接触させる。
【００７６】
標識物質としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光物質、；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステルの化学発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質等が挙げられる。液体試料の溶媒は、例えば、水、緩衝液、有機溶媒であり、標的物質の種類に応じて適宜選択することができる。
【００７７】
プローブアレイ１ａを利用する場合、例えば、液体試料をプローブアレイ１ａ上に添加することにより、液体試料とプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎとを接触させることができる。
プローブアレイ１ｂ又は１ｃを利用する場合、例えば、毛細管現象、シリンジ等を利用して液体試料をプローブアレイ１ｂ又は１ｃの中空部に流入させることにより、液体試料とプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎとを接触させることができる。
【００７８】
第２工程：液体試料を除去した後、洗浄液によりプローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎを洗浄する。これにより、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎと反応した標的物質以外の物質を除去することができる。
【００７９】
プローブアレイ１ａを利用する場合、例えば、洗浄液をプローブアレイ１ａ上に添加することにより、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎを洗浄することができる。
プローブアレイ１ｂ又は１ｃを利用する場合、例えば、毛細管現象、シリンジ等を利用して洗浄液をプローブアレイ１ｂ又は１ｃの中空部に流入させることにより、プローブＰ１、Ｐ２・・・Ｐｎを洗浄することができる。
【００８０】
第３工程：標的物質に結合している標識物質を検出する。
標識物質が蛍光物質である場合、励起光を照射し、発せられる蛍光を蛍光検出器で検出することにより、標的物質を検出することができる。標識物質が酵素である場合、酵素呈色反応により標的物質を検出することができる。
【００８１】
プローブアレイ１ｂ又は１ｃを利用する場合、プローブアレイ１ｂ又は１ｃの中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
厚さ５０μｍのポリエチレンテレフタレートフィルム（以下「ＰＥＴフィルム」という。）をポリＬ−リジン溶液（濃度：０．０１％、溶媒：０．１×ＰＢＳ）に浸漬し、１時間振盪した。次いで、超純水中で４回激しく洗浄し、余分なポリＬ−リジンを洗い流した。次いで、バキュームオーブンによりＰＥＴフィルムを６０℃で４時間乾燥させ、ポリＬ−リジンをＰＥＴフィルムにコーティングした。
【００８３】
剥離剤としてシリコーン樹脂をコーティングした剥離フィルム（ＰＥＴフィルム、厚さ３８μｍ）の剥離層上に、感圧性接着剤としてアクリル系粘着剤（ＰＥ−３００，日本カーバイド工業株式会社製）を２０μｍの厚さで塗布し、乾燥させた後、ポリＬ−リジンをコーティングしたＰＥＴフィルムの表面のうち、ポリＬ−リジンがコーティングされていない面に転写させ、これを粘着フィルムとした。
【００８４】
ポジティブコントロール用プローブＤＮＡ（濃度：１００ｐｍｏｌ／μＬ、溶媒：超純水）を、上記粘着フィルム上に全面塗布し、乾燥させた後、ＵＶクロスリンカーにより紫外線を６００ｍＪ照射して、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した。また、別の粘着フィルムを対し、同様にしてネガティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した。なお、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＡ）を使用し、ネガティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。
【００８５】
上記方法で作製したプローブＤＮＡ固定化粘着フィルムを、直径２ｍｍのディスク状にダイカットし、不要なシート部分を除去してプローブＤＮＡ固定化粘着シールとした。
【００８６】
ポジティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した粘着シールの剥離フィルムを剥がし、スライドガラス上に３枚並べて貼付した。ネガティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した粘着シールについても同様にスライドガラス上に３枚並べて貼付した。
【００８７】
スライドガラスの粘着シールを貼付した部分に、標的オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液（標的オリゴヌクレオチド濃度：１ｐｍｏｌ／μＬ、イーストｔＲＮＡ濃度：１μｇ／μＬ、溶媒：０．２％ＳＤＳ含有３×ＳＳＣ）１００μＬを添加し、ギャップカバーガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）をかけて４０℃の恒温槽内で一晩加温した。なお、標的オリゴヌクレオチドとしては５’末端にビオチンを結合させた２２ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。
【００８８】
恒温槽からスライドガラスを取り出し、洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で満たした容器内でカバーガラスを外した。次いで、洗浄バッファー２（１×ＳＳＣ）中で２分間振盪洗浄した後、洗浄バッファー３（０．２×ＳＳＣ）中に２分間浸漬し、非特異的に吸着した標的オリゴヌクレオチドを洗い流した。
【００８９】
ブロッキング溶液（１％カゼイン、３×ＳＳＣ）１００μＬをスライドガラス上に添加し、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液をピペットで吸い取った後、ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体溶液（原液を０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％ カゼイン溶液で２０００倍に希釈したもの）１００μＬを添加し、室温で３０分間反応させた。
【００９０】
次いで、スライドガラスを緩衝液Ａ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）に浸漬し、室温で５分間放置した。これを２回繰り返し、標的オリゴヌクレオチドに結合しているビオチンに結合しなかったストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体を除去した。次いで、スライドガラスを緩衝液Ｂ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）中で１回洗浄した。最後に、基質溶液（緩衝液Ｂ １０ｍＬ、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）溶液９μＬ、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）溶液１８μＬ）を添加し、室温で３時間放置して発色反応を行った。
【００９１】
その結果、標的オリゴヌクレオチドと相補的であるポジティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した粘着シールを貼付した部位には明瞭なシグナルが現れたが、標的オリゴヌクレオチドと相補的でないネガティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した粘着シールを貼付した部位にはシグナルが全く現れなかった。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】プローブアレイ製造用部材の一実施形態を示す斜視図である。
【図２】プローブアレイ製造用部材を切断して作製した切断片の一実施形態を示す斜視図である。
【図３】プローブアレイ製造用部材を切断して作製した切断片の別の実施形態を示す斜視図である。
【図４】プローブアレイの製造工程の一実施形態を示す斜視図である。
【図５】プローブアレイの一実施形態を示す斜視図である。
【図６】（ａ）はプローブアレイの別の実施形態を示す平面図であり、（ｂ）は同実施形態を示すＸ−Ｘ断面図である。
【図７】（ａ）はプローブアレイのさらに別の実施形態を示す平面図であり、（ｂ）は同実施形態を示すＸ−Ｘ断面図である。
【符号の説明】
【００９３】
Ｍ１〜Ｍｎ・・・プローブアレイ製造用部材
Ｐ１〜Ｐｎ・・・プローブ
Ｆ１〜Ｆｎ・・・プローブアレイ製造用部材の切断片
１ａ〜１ｃ・・・プローブアレイ
１１・・・基材
１２・・・接着剤層
１３・・・剥離シート
２ａ〜２ｃ・・・支持部材
３・・・円筒状部材
４・・・スペーサー部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2005283306.tif 000006
【図５】
2005283306.tif 000007
【図６】
2005283306.tif 000008
【図７】
2005283306.tif 000009