(57)【要約】【課題】  生体組織補填材に細胞を効率的に播種するとともに、細胞の成長に合わせた培養容器の交換等を省略して、短期間に生体組織補填体を製造することを可能とする。【解決手段】  容器２内に、所定の培地４と、付着性の細胞と、生体組織補填材とを投入し、その容器２を略水平な軸線Ｃ回りに、２ｒｐｍ以上１０ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させながら、容器２内部を所定の培養条件に維持する生体組織補填体の製造方法を提供する。【選択図】    図１
2005066028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に、所定の培地と、付着性の細胞と、生体組織補填材とを投入し、
その容器を略水平な軸線回りに、２ｒｐｍ以上１０ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させながら、容器内部を所定の培養条件に維持する生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
前記容器を、３ｒｐｍ以上５ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させる請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
前記容器の内面に、細胞の付着を防止する付着防止処理が施されている請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
前記生体組織補填材に、細胞の付着を促進する付着促進処理が施されている請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
略水平な軸線回りに回転可能に支持され、内部に所定の培地と、付着性の細胞と、生体組織補填材とを投入可能な容器と、
該容器を前記軸線回りに回転させる回転駆動装置とを備え、
前記容器の内面に、細胞の付着を防止する付着防止処理が施されている生体組織補填体の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。この場合において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、例えば、デキサメタゾンのような分化誘導因子が有効であることが知られている。したがって、このような分化誘導因子とともに培養されることにより、骨芽細胞が骨補填材を足場にして増殖した状態の培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、患者の体内から採取可能な間葉系幹細胞は極めて微量であるため、培養骨を製造するためには、十分に多くの細胞数まで増殖させる必要がある。
間葉系幹細胞のような付着性の細胞は、培地を貯留した培養容器内において培養する場合には、培養容器の底面に付着することにより成長する。また、付着性の細胞は、その投入されている培養容器の底面の広さによっても成長速度が変化する。すなわち、狭い底面積を有する培養容器内において培養する場合には、細胞は早期にコンフルエント状態になるため、細胞成長が制限されてしまう。一方、あまりに広い底面積の培養容器に投入しても、十分な成長速度は得られないという不都合がある。このため、細胞の成長に合わせて、細胞を継代して新しい培養容に移す必要がある。
【０００５】
細胞の成長に合わせて培養容器を大きいものへと交換するには、一旦培養容器の底面に堅固に付着した細胞を、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素により剥離させた上で、遠心分離により細胞からトリプシンを除去し、再度、新たな培養容器内に培地とともに投入する処理を行う必要がある。
さらに、例えば、培養骨のような生体組織補填体を製造するには、トリプシンで細胞を培養容器から回収し、例えば、リン酸カルシウム多孔体からなる生体組織補填材に細胞を播種してしっかりと接着させる必要があるが、従来の播種方法では、細胞の多くは培養容器の底面に付着してしまい効率的に生体組織補填材に付着させることは困難であった。
【０００６】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織補填材に細胞を効率的に播種するとともに、細胞の成長に合わせた培養容器の交換等を省略して、短期間に生体組織補填体を製造することを可能とする生体組織補填体の製造方法および製造装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、容器内に、所定の培地と、付着性の細胞と、生体組織補填材とを投入し、その容器を略水平な軸線回りに、２ｒｐｍ以上１０ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させながら、容器内部を所定の培養条件に維持する生体組織補填体の製造方法を提供する。
【０００８】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の生体組織補填体の製造方法において、前記容器を、３ｒｐｍ以上５ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させる製造方法を提供する。
請求項３に係る発明は、請求項１または請求項２に記載の生体組織補填体の製造方法において、前記容器の内面に、細胞の付着を防止する付着防止処理が施されている製造方法を提供する。
請求項４に係る発明は、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の生体組織補填体の製造方法において、前記生体組織補填材に、細胞の付着を促進する付着促進処理が施されている製造方法を提供する。
【０００９】
請求項５に係る発明は、略水平な軸線回りに回転可能に支持され、内部に所定の培地と、付着性の細胞と、生体組織補填材とを投入可能な容器と、該容器を前記軸線回りに回転させる回転駆動装置とを備え、前記容器の内面に、細胞の付着を防止する付着防止処理が施されている生体組織補填体の製造装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
請求項１に係る発明によれば、付着性の細胞と、培地と、生体組織補填材とを投入した容器を、略水平な軸線回りに２ｒｐｍ以上１０ｒｐｍ以下の範囲の回転速度で回転させることにより、容器内面への細胞の付着を抑制しながら、生体組織補填材に細胞を付着させることが可能となる。細胞は容器の底面積に制限されることなく、生体組織補填材の表面に３次元的に成長できるので、成長に合わせた容器の交換が不要となる。その結果、トリプシン処理や遠心分離等も不要となり、種々の工程を省くことができるので、短期間で効率的に生体組織補填体を製造することができるという効果がある。
なお、請求項２に係る発明のように、容器の回転速度を３ｒｐｍ以上５ｒｐｍ以下の範囲に設定すれば、さらに効率的である。
【００１１】
請求項３に係る発明によれば、容器の内面に施された付着防止処理により、付着性の細胞が容器の内面に付着する可能性がさらに低減されるので、生体組織補填材への細胞の付着効率をさらに高めることができる。
請求項４に係る発明によれば、付着促進処理により、生体組織補填材への細胞の付着が促進されているので、さらに効率的に生体組織補填材に細胞を付着させることができる。
請求項５に係る発明によれば、上記と同様、簡易な構造で、短期間で効率的に生体組織補填体を製造することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この発明の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法および製造装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１は、例えば、培養骨を製造する製造装置１であって、図１に示されるように、略円筒状の培養容器２と、該培養容器２をその中心軸線が略水平となるように支持し、かつ、この略水平な回転軸線Ｃ回りに前記培養容器２を回転させるモータ３とを備えている。
【００１３】
前記培養容器２には、付着性の細胞（図示略）、例えば、間葉系幹細胞と、所定の培地４と、生体組織補填材（図示略）とを投入可能な投入口５が設けられており、該投入口５は、密封可能な蓋体６により閉塞されるようになっている。培養容器２の内面には、疎水性処理が施されている。疎水性処理は、培養容器２内面にポリスチレン被膜を形成することでもよく、他の任意の方法でよい。
また、培養容器２内部を所定の培養条件に維持するための装置（図示略）が接続されていてもよい。
【００１４】
次に、本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について説明する。
本実施形態に係る製造方法は、上記製造装置１の培養容器２内に間葉系幹細胞と、所定の培地４と生体組織補填材とを投入口５から投入し、蓋体６によって密封する。
所定の培地４は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）および抗生物質を適当な比率で混合することにより構成される。サイトカイン等の成長因子を混合してもよい。
また、所定の培養条件は、例えば、３７±０．５℃およびＣＯ２濃度５％である。
また、生体組織補填材は、例えば、顆粒状のβ−ＴＣＰ多孔体である。
【００１５】
次いで、モータ３を作動させて培養容器２を略水平な回転軸線Ｃ回りに回転させる。このとき、回転速度は、２ｒｐｍ以上１０ｒｐｍ以下の範囲に調整する。好ましくは、３ｒｐｍ以上５ｒｐｍ以下の範囲に調整するのがよい。
【００１６】
本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１および製造方法によれば、培養容器２がモータ３によって回転され続けるので、間葉系幹細胞が付着しようとする底面が時々刻々と入れ替わる。したがって、間葉系幹細胞は培養容器２の内面に付着することができず、培養容器２内に投入された培地４内において、生体組織補填材とともに浮遊し続けることになる。
この場合において、上述した回転速度範囲にあっては、培地４内における生体組織補填材と間葉系幹細胞は、相互に攪拌されるのではなく、接触状態を維持したまま浮遊させられるようになり、時間の経過とともに、間葉系幹細胞が生体組織補填材の表面に付着して成長するようになる。
【００１７】
すなわち、本実施形態に係る生体組織補填体の製造装置１および製造方法によれば、培養容器２内において、間葉系幹細胞を培養容器２の内面に付着させることなく生体組織補填材の表面に付着させることができる。
間葉系幹細胞を培養容器の底面に付着させて成長させる場合には、その底面積を成長に合わせて拡大するように、培養容器を交換する必要がある。これに対して、本実施形態のように培養容器２の内面に付着させることなく、直接、生体組織補填材の表面に付着させる場合には、間葉系幹細胞に対して、比較的成長しやすい環境を与え続けることができるので、成長に合わせた培養容器２の交換が不要となる。したがって、培養容器２を交換する工程が不要となり、培養期間を短縮することができる。
【００１８】
また、培養容器の内面に付着して成長した場合に、培養容器を交換するには、付着した細胞を培養容器の内面から剥離するのにトリプシン処理を行う必要がある。これに対して、本実施形態に係る製造装置１および製造方法によれば、培養容器２の内面への付着が抑制されるので、トリプシン処理が不要となる。トリプシン処理は、間葉系幹細胞の周囲の蛋白質をある程度分解するものであるため、これを行わないで済む本実施形態の製造装置
１および製造方法によれば、細胞の健全性をより高く維持することができる利点がある。
【００１９】
また、トリプシン処理を行う場合には、剥離した間葉系幹細胞をトリプシンから分離するために、培養容器外に取り出して遠心分離機にかける必要があるが、培養容器からの出し入れが必要となるために、外部の塵埃等が混入する可能性もある。本実施形態に係る製造装置１および製造方法によれば、培養容器２から取り出すことなく生体組織補填材に間葉系幹細胞を付着させることができるので、塵埃等の混入の可能性をより低減することができる。
【００２０】
さらに、単に容器内において生体組織補填材に間葉系幹細胞を付着させようとする場合には、多くの間葉系幹細胞が容器の内面に付着してしまい、効率的に生体組織補填材に付着させることが困難である。これに対して、本実施形態に係る製造装置１および製造方法によれば、培養容器２の内面への付着が抑制されるので、生体組織補填材に間葉系幹細胞を効率的に播種することができるという効果もある。
【００２１】
なお、この発明は、上記実施形態に示した構成に限定されるものではない。すなわち、培養容器２の形状を、略円筒状としたが、これに限定されるものではない。また、培養容器２をモータ３に取り付けて略水平な回転軸線Ｃ回りに回転させることとしたが、これに代えて、図２に示されるように、同一方向に回転する２つのローラ１０，１１上に、ボトル状の培養容器１２を載せて、略水平な回転軸線Ｃ回りに回転させる、いわゆるローラボトルとしてもよい。ローラ１０，１１は、両方とも駆動ローラである必要はなく、一方は従動ローラでもよい。
【００２２】
また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００２３】
また、生体組織補填材としては、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。
また、生体組織補填材の表面に、フィブロネクチンやラミニン等の細胞の付着を促進する前処理を施しておいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】この発明の一実施形態に係る生体組織補填体の製造装置を示す模式図である。
【図２】図１の製造装置の変形例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００２５】
１  製造装置
２，１２  培養容器（容器）
３  モータ（回転駆動装置）
４  培地
Ｃ  回転軸線（軸線）
【図１】
2005066028.tif 000003
【図２】
2005066028.tif 000004