(57)【要約】      （修正有）【課題】植物の根の環境変化に対応して根毛の成長や形状を変化させる原因となっている遺伝子、及びそのプロモーターを提供し、環境の変化に対応した根毛の形成を制御する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は当該アミノ酸配列における１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって根毛の伸長及び／又は伸長する方向を制御する作用を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、及び当該タンパク質からなる根毛の伸長及び／又は伸長する方向の調整剤などに関する。また、当該遺伝子の少なくとも一部が欠損した変異体植物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は当該アミノ酸配列における１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって根毛の伸長及び／又は伸長する方向を制御する作用を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列、又はこれらの塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有する請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１に記載のタンパク質を含有してなる植物の根毛の伸長及び／又は伸長する方向の調整剤。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を含有してなる組成物を植物の培地に散布することからなる根毛の伸長及び／又は伸長する方向を調整する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部が改変されて、当該遺伝子の機能が欠損した植物。
【請求項７】
植物が、シロイヌナズナである請求項６に記載の植物。
【請求項８】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、又はこれらの塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡであって植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーターとしての作用を有するＤＮＡ。
【請求項９】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、又はこれらの塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡであって植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーター。
【請求項１０】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する遺伝子発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のＤＮＡの下流に外来遺伝子を連結してなる請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する遺伝子発現ベクター。
【請求項１３】
請求項２又は３に記載の遺伝子の上流に請求項９に記載のプロモーターを有する請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する遺伝子が導入された細胞。
【請求項１５】
請求項２又は３に記載の遺伝子が導入された細胞。
【請求項１６】
細胞が植物細胞である、請求項１４又は１５に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項８に記載のＤＮＡを含有する遺伝子が導入された植物。
【請求項１８】
請求項２又は３に記載の遺伝子が導入された植物。
【請求項１９】
請求項２又は３に記載の遺伝子中の１０〜５０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、請求項１に記載のタンパク質又はそのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項８に記載のＤＮＡ中の１０〜５０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、請求項９に記載のプロモーターの機能を有するＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、根毛の伸長、特に植物の根におかれている環境が変化したときに根毛において発現が促進されるタンパク質、それをコードしている遺伝子、そのプロモーターなどに関する。より詳細には、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は当該アミノ酸配列における１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって根毛の伸長及び／又は伸長する方向を制御する作用を有するタンパク質、それをコードする遺伝子、及び当該タンパク質からなる根毛の伸長及び／又は伸長する方向の調整剤などに関する。また、本発明は当該遺伝子の少なくとも一部が欠損した変異体植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物の根は、植物体の支持及び水などの土中の成分の吸収を主な機能としている器官である。植物の根のこのような機能は、主として根毛と称される細胞が担っている。根毛は、根の表皮系起源の毛状の細胞で、根端から少し離れた伸長の終わった部分に生じる。根毛の径は数μｍ〜十数μｍで、長さは数十μｍ〜千μｍ以上にもなることがある。根毛の細胞壁は比較的薄く、水分などの吸収がし易いようにできている。根毛の寿命は一般に短く、古くなると死滅する。
野生型のシロイヌナズナでは、根が培地から離れて空中に浮いて伸長すると、この根に新しく形成される根毛は根端に対して鋭角的に長く伸長する（空中型根毛）ことが知られている。これは、根毛を延ばして培地などの何かの物体に接触して、根を固定化しようとするためと考えられる。根のこのような環境変化に対応した成長の変化のメカニズムについては未だほとんど解明されていない。
【０００３】
このような根毛の機能を解明するために根毛の形状に関する突然変異体がいくつか作製されてきた。根毛の長さが異常になった突然変異体としてはｈｙ５、ｐｈｙＢ、ｒｈｄ２、ｔｉｐ１などが知られている（非特許文献１〜４参照）。また、根毛に関連する特許出願としては、プロフィリンにより根毛を伸長させる方法（特許文献１参照）、根毛などの根での発現を促進するためのプロモーターに関するもの（特許文献２及び３参照）、根毛の形成の開始を制御するＣＰＣ遺伝子に関するもの（特許文献４参照）、根毛の伸長を制御するＩＲＥ遺伝子に関するもの（特許文献５参照）などが報告されている。
これらのものはいずれも、通常の状態での根毛の形成や伸長又は形状に関するものであり、根の環境変化に対応した根毛の形状変化を生じさせる遺伝子については未だ報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１１−６９９２１号
【特許文献２】
特開平０５−１９２１７２号
【特許文献３】
特表２００２−５３００７５号
【特許文献４】
特開平１０−４９７８号
【特許文献５】
特開２０００−２７０８７３号
【非特許文献１】
Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｖｏｌ．１１，  ｐ２９８３−２９９５  （１９９７）
【非特許文献２】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．５，  ｐ１４７−１５７  （１９９３）
【非特許文献３】
Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．２，  ｐ２３５−２４３  （１９９０）
【非特許文献４】
Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１０３，  ｐ９７９−９８５  （１９９３）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物の根の環境変化に対応して根毛の成長や形状を変化させる原因となっている遺伝子、及びそのプロモーターを提供し、環境の変化に対応した根毛の形成を制御することを可能とならしめることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、植物の根の環境変化に対応して根毛の成長や形状に変化を生じる突然変異体を開発していたところ、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）により生じた突然変異体の根が培地から離れて空中に浮くと、根毛の形状に大きな変化が生じるものがあることを見出し、この突然変異体の遺伝子を解析することにより本発明に至った。
【０００７】
本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は当該アミノ酸配列における１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって根毛の伸長及び／又は伸長する方向を制御する作用を有するタンパク質、及び当該タンパク質をコードする遺伝子に関する。
また、本発明は、前記した本発明のタンパク質を含有してなる植物の根毛の伸長及び／又は伸長する方向の調整剤、及び当該タンパク質を含有してなる組成物を植物の培地に散布することからなる根毛の伸長及び／又は伸長する方向を調整する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部が改変されて、当該遺伝子の機能が欠損した植物に関する。
【０００８】
また、本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、又はこれらの塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡであって植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーターとしての作用を有するＤＮＡ、及び配列表の配列番号３に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、又はこれらの塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡであって植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーターに関する。
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子及び／又はＤＮＡを含有する発現ベクター、それを用いて形質転換された形質転換体に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子中の１０〜５０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、請求項１に記載のタンパク質又はそのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチド、及び前記した本発明のプロモーターのＤＮＡ中の１０〜５０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、請求項９に記載のプロモーターの機能を有するＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【０００９】
本発明者らは、植物の根の各種の機能を解析するために、シロイヌナズナにおいて根における形状などが変異した突然変異体を開発してきた。このような変異体の中でエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）により生じた突然変異体の中に、培地から露出した根において特異的な変異を発現する突然変異体を見出した。
即ち、野生型の種子を０．３％ＥＭＳ処理し、Ｍ１を自家受精させてＭ２を取り、Ｍ２世代は一部を切り取った寒天培地上で生育させ、根が培地に付かない部分で根毛が生えなくなるようなものをスクリーニングすることにより、本発明の突然変異体を得た。この本発明の突然変異体を以下の説明のために「ＴＩＭＩＤ変異体」と称する。ＴＩＭＩＤは、ＧＰＩ−アンカータンパク質の１種であるとされているが、その機能の詳細は不明であった。
【００１０】
野生型のシロイヌナズナの根の拡大写真を図１に図面に代わるカラー写真で示す。図１の中程の横線が培地の境界を示しており、その上側が培地中の状態であり、その下側が培地から離れた空中に浮いた状態である。培地中の根では、根のほぼ真横方向にほぼ規則的に根毛が延びている。しかし、空中に浮いた状態の根の部分では、根毛は根端方向（図１では下方向）に対して鋭角的に長く延びている（空中型根毛）。
次に、本発明のＴＩＭＩＤ変異体の根の拡大写真を図２に図面に代わるカラー写真で示す。図１と同様に、図２の中程の横線が培地の境界を示しており、その上側が培地中の状態であり、その下側が培地から離れた空中に浮いた状態である。培地中の根では、根のほぼ真横方向にほぼ規則的に根毛が延びているが、その数や長さが野生型に比べて約半分程度になっている。そして、空中に浮いた状態の根の部分（図２では横線の下側）では、根毛はほとんど延びていないことがわかる。
【００１１】
この本発明の突然変異体の遺伝子の変異について検討した。その結果、ＴＩＭＩＤをコードしている遺伝子の１箇所に変異が生じていることが判明した。
野生型のＴＩＭＩＤ遺伝子の翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。それによって翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
変異は、この遺伝子の翻訳開始コドンから２６７番目（アミノ酸で８９番目の箇所）で起こっており、当該箇所のグアニン（Ｇ）が、アデニン（Ａ）に変異していた。この箇所は、８９番目のアミノ酸であるトリプトファン（Ｔｒｐ）をコードしているところであり、このコドンのＴＧＧがＴＧＡに変異することにより、終止コドンに変異したことになる。即ち、６６３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしている遺伝子であるが、この８９番目のコドンが終止コドンに変異した結果、８８個のアミノ酸からなるタンパク質しか発現しなくなったものである。Ｎ末端側の全体の約１３％しか発現しなくなった結果、当該タンパク質が果たす機能のほぼ全てが欠失したものである。
【００１２】
本発明のＴＩＭＩＤ変異体は、ＴＩＭＩＤ遺伝子の欠損により生じたものであり、この結果ＴＩＭＩＤ遺伝子の果たすべき機能が、根毛の伸長及び／又は伸長方向の制御であることがわかった。当該遺伝子の機能については従来知られていないだけでなく、根毛のこのような機能の制御・調整方法についても従来全く知られていなかったものであり、本発明が初めて明らかにするものである。
さらに、本発明者らは、当該遺伝子のプロモーターを解析した。その結果当該遺伝子のプロモーターの塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表の配列番号３に示す。本発明のプロモーターは根毛での特異的な発現、とりわけ根が培地中から空中に露出し、根の環境が変化したときに特異的に発現を制御するプロモーターであると考えられる。
【００１３】
本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は当該アミノ酸配列における１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって根毛の伸長及び／又は伸長する方向を制御する作用を有するタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、それとアミノ酸において５０％以上、８０％以上又は８５％以上の相同性を有し、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同種の機能又は作用を有するタンパク質をも包含するものである。
【００１４】
本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明の遺伝子は、遺伝子単離物であって、天然に存在している状態の遺伝子そのものとは区別されるものであり、天然の遺伝子から当該部分を単離してきたもの、当該部分を含む部分を増幅して単離したもの、又は人工的に製造若しくは改変された遺伝子を包含するものである。
また、本発明の遺伝子の例としては、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するものが挙げられるがこれに限定されるものではなく、翻訳されたタンパク質が同種の機能を有するタンパク質をコードしている塩基配列を有するもの、さらに、その相補的な塩基配列を有するもの、又はこれらの塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものなどを包含するものである。
本発明は、前記した本発明の遺伝子の一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供するものでもある。即ち、前記した本発明の遺伝子中の１０〜５０塩基、好ましくは１５〜５０塩基、１５〜３０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記した本発明のタンパク質又はそのアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のこのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用のプライマーや、本発明の遺伝子を検出・同定するためのプローブとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、必要により蛍光標識などで標識化されていてもよい。
【００１５】
本発明は、前記した本発明のタンパク質を含有してなる植物の根毛の伸長及び／又は伸長する方向の調整剤を提供する。本発明の調整剤は、植物に適用されるものであり、植物成長調節剤などの植物に適用される薬剤に許容される担体成分を含有する組成物として提供される。また、本発明は、当該組成物を用いた植物の根毛の伸長及び／又は伸長する方向を調整する方法に関する。当該方法は、薬剤の散布や注入などにより行われる。また、本発明の遺伝子を含有するベクターを用いて、目的の植物を形質転換することにより、植物の根毛の伸長及び／又は伸長する方向を調整する方法も本発明の方法に包含される。
【００１６】
本発明は、前記した本発明のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも一部が改変されて、当該遺伝子の機能が欠損した植物を提供する。本発明のこのような変異体は、本明細書に具体例で記載されているように、ＥＭＳを用いて突然変異を誘発する方法によっても製造できるが、これに限定されるものではなく、ジーンターゲッティング法などの遺伝子改変方法により製造することもできる。このような変異体の植物としては、ＴＩＭＩＤ遺伝子を有する植物であれば、特に制限はないが、好ましい例示としてはシロイヌナズナが挙げられる。
【００１７】
本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列、若しくはその相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、又はこれらの塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡであって植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーターとしての作用を有するＤＮＡを提供する。本発明のこのＤＮＡは、根毛での発現や、植物の根の環境変化に応じた発現用のプロモーターとして有用である。したがって、本発明は、当該ＤＮＡからなる根毛での発現や植物の根の環境変化に対応して発現制御されるプロモーターを提供する。
本発明は、前記した本発明のＤＮＡの一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供するものでもある。即ち、前記した本発明のＤＮＡ中の１０〜５０塩基、好ましくは１５〜５０塩基、１５〜３０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであって、前記した本発明のプロモーターの機能を有するＤＮＡを検出・同定又は増幅するためのオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のこのオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ用のプライマーや、本発明のＤＮＡを検出・同定するためのプローブとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、必要により蛍光標識などで標識化されていてもよい。
【００１８】
また、本発明は、前記した本発明の遺伝子、及び／又は前記したプロモーター用のＤＮＡを含有してなるベクターを提供するものである。本発明のベクターには特に制限はないが、外来遺伝子による形質転換に使用するものとして発現ベクターが好ましい。このような本発明のベクターにおいては、前記したプロモーター用のＤＮＡの下流側には任意の遺伝子を結合させることができるし、また前記した本発明の遺伝子の上流側にも制御可能な各種のプロモーターを結合して使用することができる。本発明のベクターとしては、例えば、プラスミドや各種のウイルスなどが例示される。
本発明は、このような発現ベクターを用いて形質転換された細胞及び植物を提供する。形質転換の方法としては公知の各種の方法を採用することができる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  （ｔｉｍｉｄ  突然変異体の作成）
野生型のシロイヌナズナの種子を０．３％のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）で１８時間処理し、生育させたＭ１を自家受精させてＭ２を製造した。このＭ２世代を一部を切り取った寒天培地上で生育させて、根が培地に付かない部分で根毛が生えなくなるものをスクリーニングして、本発明のＴＩＭＩＤ変異体を得た。
【００２１】
実施例２  （本発明のＴＩＭＩＤ変異体と野生型との比較）
本発明のＴＩＭＩＤ変異体の根の長さは、野生型の２／３ほどであった。根毛は野生型に比べ、寒天上で５２％、空中では５％ほどの伸長しか示さなかった。
野生型の根の状態を図１に、本発明のＴＩＭＩＤ変異体の根の状態を図２にそれぞれ示す。
【００２２】
実施例３  （ＴＩＭＩＤ変異体の遺伝子の変異）
実施例１で製造した本発明のＴＩＭＩＤ変異体の遺伝子の変異を、遺伝子の変異の通常の手法により行った。その結果、本発明のＴＩＭＩＤ変異体は、配列表の配列番号１に示すＴＩＭＩＤ遺伝子の塩基配列の翻訳開始コドンのＡから数えて２６７番目のＧがＡに変異していることがわかった。
この変異により、当該箇所のコドンＴＧＧが、ＴＧＡへの変異し、その結果終止コドンに変異したものであることがわかった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明は、植物の根における根毛の形成、特に根のおかれた環境の変化に対する根毛の形成を制御するタンパク質、並びにそれをコードする遺伝子及びそのプロモーターなどを提供するものである。本発明の遺伝子は根毛の形成を数的及び形態的に促進するものであり、本発明の遺伝子が過剰発現する形質転換体とすることにより、根毛の形成が促進され、土壌などの培地からの栄養分の吸収効率の優れた植物や、根がしっかりと張った植物に形質転換することが可能となる。また、本発明のプロモーターは根毛の部位特異的か環境特異的に発現をするものであり、植物の根部分を用いたバイオマスのような物質製造装置における外来遺伝子の発現用のプロモーターなどとして有用である。
【００２４】
【配列表】
2005006570.tif 000002
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2005006570.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型のシロイヌナズナの根の状況を示す図面に代わるカラー写真である。
【図２】図２は、本発明のＴＩＭＩＤ変異体の根の状況を示す図面に代わるカラー写真である。
【図１】
2005006570.tif 000016
【図２】
2005006570.tif 000017