(57)【要約】【課題】固体表面と特異的に結合する部位を有するリボソームを提供する。【解決手段】アフィニティータグ付きリボソーム。核酸塩基配列識別又は無細胞系におけるタンパク質の生合成のために用いられるアフィニティータグ付きリボソーム。リボソームタンパク質をコードする遺伝子と、アフィニティータグをコードする遺伝子とを含み、前記リボソームタンパク質をコードする遺伝子と前記アフィニティータグをコードする遺伝子とが同一の読み枠となるように配置された融合遺伝子を構成し、前記融合遺伝子をベクターに組み込み、得られた組み換えベクターを宿主生物中で発現させることによって、アフィニティータグが付加されたリボソームを融合タンパク質として生産する、アフィニティータグ付きリボソームの製造方法。【選択図】図１
2005261313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項２】
固体表面へ固定化するためのアフィニティータグがリボソームに付加された、アフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項３】
前記リボソームが原核生物由来のものである、請求項１又は２に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項４】
前記リボソームが大腸菌由来のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項５】
前記アフィニティータグがポリヒスチジンタグである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項６】
前記アフィニティータグが、３０Ｓサブユニットを構成するリボソームタンパク質に付加した、請求項３〜５のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項７】
前記アフィニティータグが、リボソームタンパク質のＣ末端に付加した、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項８】
核酸塩基配列識別のために用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項９】
無細胞系におけるタンパク質の生合成のために用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項１０】
固体基板上又はマイクロチップ上でのタンパク質の生合成のために用いられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【請求項１１】
リボソームタンパク質をコードする遺伝子と、アフィニティータグをコードする遺伝子とを含み、前記リボソームタンパク質をコードする遺伝子と前記アフィニティータグをコードする遺伝子とが同一の読み枠となるように配置された融合遺伝子を構成し、前記融合遺伝子をベクターに組み込み、得られた組み換えベクターを宿主生物中で発現させることによって、アフィニティータグが付加されたリボソームを融合タンパク質として生産する、アフィニティータグ付きリボソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティータグ付きリボソームに関する。また本発明は、アフィニティータグ付きリボソームを製造するためのＤＮＡ組み換え技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸塩基配列識別法として、生体分子を用いた方法や、ナノポアを用いる方法が、欧米の大学やベンチャー企業などで研究されている。例えばハーバード大学においては、微生物由来の毒素を用いたＤＮＡ塩基配列検出技術や、ナノ加工技術を利用して作成したナノポアを用いたＤＮＡ塩基配列検出技術が研究されている。その一例として、米国特許第５，７９５，７８２号明細書においては、ＤＮＡがナノポアを通過する際にナノポアを流れる電流の塩基依存性からシークエンスを行っている。
【０００３】
一方、タンパク質の生合成法として、in vitroでのＤＮＡ転写・翻訳系又はＲＮＡ翻訳系を可能とする、無細胞系におけるペプチド又はペプチド誘導体の製造法が、特開２００３−１０２４９５号公報に記載されている。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，７９５，７８２号明細書
【特許文献２】特開２００３−１０２４９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リボソームは、核酸とタンパク質との複合体であり、ｍＲＮＡと結合してその塩基配列を認識し、配列情報に応じたタンパク質の生合成を行う。このようなリボソームの機能を利用し、核酸塩基配列識別技術、及び固体基板上又はマイクロチップ上でのタンパク質の生合成システムへの応用展開が期待される。
【０００６】
核酸塩基配列識別技術、及び固体基板上又はマイクロチップ上でのタンパク質の生合成を可能にするためには、固体表面へのリボソームの固定化が要求される。しかし、固体表面へのリボソームの固定化においては、リボソーム内の多数部位が、固体表面に非特異的に吸着してしまうという問題がある。これは、固体表面と特異的に結合する部位がリボソームに存在しないということに起因する。
【０００７】
そこで本発明の目的は、核酸塩基配列識別技術、及び固体基板上又はマイクロチップ上でのタンパク質の生合成システムへの応用展開のため、固体表面と特異的に結合する部位を有するリボソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遺伝子工学的手法を用い、リボソームタンパク質にアフィニティータグを付加することによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下の発明を含む。
（１）アフィニティータグ付きリボソーム。
（２）固体表面へ固定化するためのアフィニティータグがリボソームに付加された、アフィニティータグ付きリボソーム。
（３）前記リボソームが原核生物由来のものである、（１）又は（２）に記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
（４）前記リボソームが大腸菌由来のものである、（１）〜（３）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【０００９】
（５）前記アフィニティータグがポリヒスチジンタグである、（１）〜（４）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
（６）前記アフィニティータグが、３０Ｓサブユニットを構成するリボソームタンパク質に結合した、（３）〜（５）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
（７）前記アフィニティータグが、リボソームタンパク質のＣ末端に付加した、（１）〜（６）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【００１０】
（８）核酸塩基配列識別のために用いられる、（１）〜（７）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
（９）無細胞系におけるタンパク質の生合成のために用いられる、（１）〜（７）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
（１０）固体基板上又はマイクロチップ上でのタンパク質の生合成のために用いられる、（１）〜（７）のいずれかに記載のアフィニティータグ付きリボソーム。
【００１１】
（１１）リボソームタンパク質をコードする遺伝子と、アフィニティータグをコードする遺伝子とを含み、前記リボソームタンパク質をコードする遺伝子と前記アフィニティータグをコードする遺伝子とが同一の読み枠となるように配置された融合遺伝子を構成し、前記融合遺伝子をベクターに組み込み、得られた組み換えベクターを宿主生物中で発現させることによって、アフィニティータグが付加されたリボソームを融合タンパク質として生産する、アフィニティータグ付きリボソームの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、固体表面と特異的に結合する部位を有するリボソームを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、アフィニティータグ付きリボソームである。より詳しくは、固体表面と特異的に結合可能な部位を有するリボソームである。本発明のアフィニティータグ付きリボソームにおいては、特定のリガンドに親和性を有するアフィニティータグを含むペプチドが、直接的に又は適当な長さの介在ペプチドを介して間接的にリボソームタンパク質に結合している。
【００１４】
本発明のアフィニティータグ付きリボソームは、固体表面にアフィニティータグを介して特異的に結合することができる。本発明のリボソームがアフィニティータグを介して固定化される対象としては、タグの種類に応じたリガンドを備えたものであれば基板、マイクロチップ、微粒子など、特に限定されない。タグを介して固定化された本発明のリボソームは、原子間力顕微鏡などを用いて観察することが可能である。
【００１５】
本発明のアフィニティータグ付きリボソームは、適切な固体表面上に固定化することによって、塩基配列識別技術や無細胞系におけるタンパク質の生合成技術において特に有用に用いることができる。なお、アフィニティータグの固定化の方法としては、公知の方法を特に限定することなく用いることができる。
【００１６】
塩基配列識別技術に用いられる場合、本発明のリボソームは固体基板表面に固定化され、電気化学的手法又は電界効果トランジスタを用いた電気的信号として検出する方法や、表面プラズモン法を用いた光学的変化として検出する方法など、固体基板上で達成される方法によって塩基配列識別が行われる。さらに、リボソームの塩基配列識別能を利用することによって、読み取り速度が10コドン／秒という驚異的なスピードを達成するとともに、原理的に無限長の核酸の読み取りが可能となる。
【００１７】
またタンパク質の生合成に用いられる場合、本発明のリボソームは適切な条件下でｍＲＮＡと結合してその塩基配列を認識し、塩基配列情報に応じたアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖に翻訳することができる。この場合、本発明のリボソームを適切な固体表面上に固定化する以外は、タンパク質生合成に用いられる器具、装置、試薬及び反応条件として公知の方法を特に限定することなく用いることができる。本発明のリボソームは固体表面に固定化することが可能であるため、特に固体基板上又はマイクロチップ上において、タンパク質の生合成を可能にする。本発明のリボソームは、タグによる結合によって高集積化することを可能にするため、固定化用の固体表面における単位面積あたりのタンパク質発現量を向上させることができる。その結果、タンパク質生合成をより微小なチップ上で行うことが可能になる。
【００１８】
さらに、リボソーム粒子におけるアフィニティータグの位置が統一されるため、リボソーム粒子の特定の部分が特異的に固体表面上に固定化される。すなわち、固体表面上にリボソーム粒子を同じ向きに配置することが可能になる。本発明においては、アフィニティータグの結合位置を適宜選択することができるため、リボソーム粒子をタンパク質合成のために適した向き、例えば大腸菌のリボソームであれば３０Ｓサブユニット側が固体表面に固定化された向きに配置することが可能になる。
【００１９】
本発明のアフィニティータグ付きリボソームにおけるタンパク質のアミノ酸配列は、アフィニティータグのアミノ酸配列とリボソームタンパク質のアミノ酸配列とを含む。このアミノ酸配列は、アフィニティータグの親和能としての機能、或いはこの機能とリボソームのタンパク質合成能としての機能とを維持できる程度に、さらなるアミノ酸が付加していても良い。さらに、介在ペプチドのアミノ酸配列がそれら配列の間に位置していても良い。リボソームの由来元としては原核生物及び真核生物を問わない。原核生物としては、大腸菌が代表的な例として挙げられる。
【００２０】
リボソームタンパク質としては、すでに決定されたアミノ酸配列を有するものを特に限定することなく挙げることが出来る。
【００２１】
アフィニティータグは、特定のリガンドに親和性を有するものである。本発明におけるアフィニティータグは、固体表面に存在する特定のリガンドに吸着又は結合することによって、固体表面に特異的に固定化される。アフィニティータグとしては、例えば通常アフィニティー精製用タグとして用いられるものなどを特に限定することなく挙げることができる。具体的には、ポリヒスチジンタグが好ましい。ポリヒスチジンタグは、連続した少なくとも６個のヒスチジンを含むアミノ酸配列を有するペプチドであり、通常連続した６個のヒスチジンからなるヒスチジンヘキサマーが選ばれる。
【００２２】
また、アフィニティータグを付与する位置については特に限定されない。本発明のアフィニティータグ付きリボソームの用途に応じて適宜タグの位置が決定される。
【００２３】
リボソームが大腸菌に由来する例において、例えば、タンパク質の生合成に用いられる場合、アフィニティータグは、リボソームの３０Ｓサブユニットを構成するリボソームタンパク質の少なくとも１つに付加していることが好ましい。このことによって、３０Ｓサブユニット側が固体表面へ固定化され、一方翻訳活性部位からリボソーム外へ伸長するペプチド鎖の通り道を有する５０Ｓサブユニット側が反応系中の空間の方へ向くため（後述の図１を参照）、ペプチド鎖の伸長及びフォールディングが阻害されない点で好ましい。
【００２４】
３０Ｓサブユニットを構成するリボソームタンパク質の中では例えばＳ６が好ましく挙げられる。また、アフィニティータグはリボソームタンパク質のＣ末端に結合していることが好ましい。このような特長を満たすことにより、リボソーム粒子表面にタグ部分が露出することとなり、固体表面への固定化が行い易くなる。さらに、アフィニティータグが適当な長さの介在ペプチドを介してリボソームタンパク質に結合していると、この介在ペプチドがヒンジとして働くため、タグ部分をリボソーム粒子の外に露出させて固体表面への固定化をさらに容易にする点で好ましい。本発明においては、タグによってリボソームと基板とを強く結合させることができるが、この上、タグを介することで結合部位がリボソームから離れている。従って、基板との結合によるリボソーム自身の構造変性を避けることが期待される。
【００２５】
介在ペプチドのアミノ酸配列としては特に限定されないが、親水性のアミノ酸から構成されているものが好ましい。例えば、グリシン−セリン−セリン等の配列が挙げられる。
【００２６】
図１に、本発明のアフィニティータグ付きリボソームがタンパク質の生合成に用いられる場合の概念図を示す。すなわち、図１には、リボソーム、ｍＲＮＡ、アンチコドン、ｔＲＮＡ、及び合成されたペプチド鎖が模式的に描かれ、タンパク質が生合成される様子が描かれている。また、３０Ｓサブユニットを構成するＳ６リボソームタンパク質において、表面固定用タグ部分が付加したＣ末端部分が拡大して描かれている。
【００２７】
図１中の表面固定用タグ部分の拡大図が示すように、本来のＣ末端から延長する形でタグ部分が付加されている。さらに詳しくは、Ｓ６の本来のＣ末端から、自由度を保つためのヒンジとしての介在ペプチドのアミノ酸配列を介し、ヒスチジンヘキサマーが連結した構造をとっている。リボソームタンパク質の種類によって本来のＣ末端アミノ酸残基の種類は異なるが、表面固定用タグ部分は共通の化学構造となる。
【００２８】
本発明のアフィニティータグ付きリボソームは、遺伝子組み換え法により製造すると良い。すなわち、アフィニティータグ付きリボソームタンパク質をコードする遺伝子を導入した組み換えベクターを用いて宿主生物中で大量発現させることにより、融合タンパク質として生産することで得ることができる。
【００２９】
アフィニティータグ付きリボソームタンパク質、すなわちアフィニティータグ・リボソームタンパク質融合タンパク質をコードする遺伝子は、この融合タンパク質のアミノ酸配列を、コドン表に従ってアミノ酸を核酸配列に読み替えたときのＤＮＡ群から選ばれたＤＮＡからなる。本発明における融合タンパク質をコードする遺伝子、すなわち融合遺伝子においては、リボソームタンパク質をコードする遺伝子と固体表面に特異的に固定化することができるアフィニティータグをコードする遺伝子とを含み、それら遺伝子が同一の読み枠となるよう配置されている。この融合遺伝子には、生産される融合タンパク質において、アフィニティータグの親和能としての機能、或いはこの機能とリボソームのタンパク質合成能としての機能とを維持できる程度に、さらなる核酸配列が付加していても良い。さらに介在ペプチドをコードする遺伝子がそれら遺伝子の間に位置していても良い。アフィニティータグをコードする遺伝子及び介在ペプチドをコードする遺伝子においては、融合タンパク質においてリボソームタンパク質の正常なフォールディングを妨げない程度の、比較的少ないアミノ酸配列をコードするよう選択することができる。
【００３０】
本発明における組み換えベクターは、上記融合遺伝子、プロモーター配列、その他通常のベクターが有しうる部位を含む。組み換えベクターを作成するにあたっては、融合遺伝子をベクターに挿入する方法や、アフィニティータグをコードする遺伝子があらかじめ組み込まれたベクターに、リボソームタンパク質をコードする遺伝子を挿入する方法などが挙げられるが、これらの形態に限定されない。ベクターとしては、プラスミドやファージなど、通常用いられるものを特に限定することなく用いることができる。
【００３１】
組み換えベクターは、適当な宿主生物に導入し、保存及び増幅する。宿主としては、組み換えベクターの種類によって適宜選択すると良い。例えばベクターとして大腸菌由来のプラスミドベクターを用いる場合、宿主としては大腸菌が好ましい。
【００３２】
適切な条件でクローニング及び培養を行うことにより生産した融合タンパク質は、宿主に物理的衝撃を与えて破砕することにより回収を行い、その後、遠心分離やアフィニティーカラム等により精製を行うことができる。
【００３３】
以下に、本発明のアフィニティータグ付きリボソームを生産する方法の一例として、遺伝子工学的手法により目的タンパク質のＣ末端にヒスチジンヘキサマーを付加させた融合タンパク質を得る具体的な方法として、以下の手順１〜１３による方法を挙げる。なお、以下に示す手順において、％で表される数字は、特に断りのない限り重量基準で表されるものである。
【００３４】
１．大腸菌のゲノムＤＮＡを回収する。
２．ＰＣＲでリボソームの塩基配列を取り出す。
１）１回目のＰＣＲ反応液を調製する。
Pfu 10×Rxn.バッファー
(Pfu 10×Rxn.Buffer, Promega製)     5μl
dNTP(2mM)
(dNTPs Mixture (2 mM), TOYOBO製)    5μl
プライマーI(10μM)                    1μl
プライマーII(10μM)                   1μl
Pfu DNA ポリメラーゼ
(Pfu DNA Plymerase, Promega製)    0.5μl
テンプレートDNA（大腸菌ゲノムDNA）    1μl
オートクレーブ水                   36.5μl
計                                   50μl
【００３５】
このときプライマーとしては、目的リボソームタンパク質における翻訳開始コドン又は翻訳終了コドン近辺にハイブリダイズするための少なくとも５コドンを、制限酵素切断部位を導入するための配列又は介在ペプチドを導入するための配列と組み合わせて設計したものを用いることができる。
例えば以下の配列を有するプライマーを用いることができる。
【００３６】
プライマーI :
5’- GGC GTA CGC ATG (配列番号1)＋目的リボソームタンパク質の５コドン - 3’
プライマーII : 
5’- GTG GTG GTG GGA CGA ACC (配列番号2)＋目的リボソームタンパク質の６コドン-3’
【００３７】
ここで、プライマーIにおける３〜８番目の配列は制限酵素BsiWI切断部位を導入するためのものであり、プライマーIIにおける１０〜１８番目の配列は介在ペプチドを導入するためのものである。目的リボソームタンパク質をＳ６タンパク質とする場合は、上記プライマーI及びIIとしてそれぞれ以下の配列のものを用いることができる。
【００３８】
プライマーI : 
5’- GGC GTA CGC ATG CGT CAT TAC GAA ATC - 3’(配列番号3)
プライマーII : 
5’- GTG GTG GTG GGA CGA ACC CTC TTC AGA ATC CCC AGC - 3’(配列番号4)
【００３９】
２）ＰＣＲ反応を行う。
<1>  95℃−5分
<2>  95℃−20秒
<3>  45℃−30秒
<4>  72℃−2分
<5>   <2>〜<4>の一連の手順を３回繰り返す。
<6>  95℃−20秒
<7>  60℃−30秒
<8>  72℃−2分
<9>   <6>〜<8>の一連の手順を２５回繰り返す。
<10>  72℃−10分
<11>   4℃に保つ。
終了
【００４０】
３．ポリヒスチジンコードを付加する。
１）２回目のＰＣＲ溶液を調製する。
Pfu 10×Rxn.バッファー
(Pfu 10×Rxn.Buffer, Promega製)    5μl
dNTP(2mM)
(dNTPs Mixture (2 mM), TOYOBO製)   5μl
プライマーI(10μM)                   1μl
プライマーIII(10μM)                 1μl
Pfu DNA ポリメラーゼ
(Pfu DNA Plymerase, Promega製)   0.5μl
テンプレートDNA（工程２で得たDNA）   1μl
オートクレーブ水                  36.5μl
計                                  50μl
【００４１】
このときプライマーとしては、一方は１回目のＰＣＲ反応で用いられた制限酵素切断部位導入のための配列を有するプライマーと同じものを用いることができ、他方はアフィニティータグ配列を導入するための配列と、その両端に、制限酵素切断部位を導入するための配列及び前記した介在ペプチドを導入するための配列と同じ配列とを有するものを用いることができる。
【００４２】
例えば以下の配列を有するプライマーを用いることができる。
プライマーIII : 
5’ - CCG GGA TCC TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GGA CGA ACC - 3’ (配列番号5)
ここで、プライマーIIIにおける４〜９番目の配列は制限酵素BamHI切断部位を導入するためのものであり、１３〜３０番目の配列はヒスチジンヘキサマーを導入するためのものであり、３１〜３９番目の配列は介在ペプチドに対応する配列にハイブリダイズするためのものである。
【００４３】
２）ＰＣＲ反応を行う。（上記工程２の２）と同じ条件を用いることができる。）
以上の操作により、アフィニティータグ配列を付加するための配列が導入された遺伝子を得ることができる。
【００４４】
４．アデニンを増幅したＤＮＡの末端につける。
１）Amplitaq Gold DNA Plomerase, LD (Applied Biosystems製) 0.5 μlをＰＣＲ後のＤＮＡに直接入れる。
２） 72℃、15分置く。
【００４５】
５．ＤＮＡをＴ−ベクター(Bluescript II, Stragene製)にライゲーションキット（DNA Ligation Kit Ver. 1, Takara製）を使用して連結する。
６．大腸菌DH5a(Competent high DH5a, TOYOBO製)を用いてクローニングする。
７．プラスミドを回収し、塩基配列を確認する。
【００４６】
８．プラスミドを制限酵素BsiWIで切る。
１）反応溶液を調製する。
テンプレートプラスミド                 6 μl
NE バッファー 3
(NE Buffer 3, New England BioLabs製) 2 μl          
BsiWI (制限酵素) 
(BisWI, New England BioLabs製)       2 μl          
オートクレーブ水                      10 μl
計                                    20 μl
２） 55℃、2時間置く。
【００４７】
９．プラスミドを制限酵素BamHIで切る。
１）反応溶液を調製する。
テンプレートプラスミド                20 μl
H.バッファー     
(Universal Buffer H, TOYOBO製)       2 μl            
BamHI (制限酵素) 
(BamHI, TOYOBO製)                    2 μl              
オートクレーブ水                      16 μl
計                                    40 μl
２） 37℃、2時間置く。
【００４８】
１０．発現ベクターpPROlarを直線化にする。
１）反応溶液を調製する。
発現ベクター (0.25 g/l)
(pPROlar.A122, Clontech製)           4 μl             
H. バッファー    
(Universal Buffer H, TOYOBO製)       4 μl           
BamHI (制限酵素) 
(BamHI, TOYOBO製)                    2 μl         
Acc65I (制限酵素) 
(Acc65I, Promega製)                  2 μl           
オートクレーブ水                      28 μl
計                                    40 μl
２）37℃で、1時間置く。
【００４９】
１１．pPROlarの部分脱リン酸化を行う。
１）CIAP(アルカリホスファターゼ, Promega製)を2 μl加える。
２）37℃で、1時間置く。
【００５０】
１２．目的ＤＮＡ配列を発現ベクターにライゲーションキット（DNA Ligation Kit Ver. 1, Takara製）を使用して連結する。
１３．大腸菌JM109(Competent high JM109, TOYOBO製)を使って、クローニングする。
【００５１】
得られたリボソームを単離する方法を、模式的に図２に示す。図２が示すように、タグ付きリボソームを発現させた大腸菌を培養し、集められた大腸菌をアルミナによって破砕し、破砕液を洗浄及び遠心分離することによって単離を行う。単離されたタグ付きリボソームは、適当なバッファーに溶解すると良い。この方法は、以下の手順１４〜３２によって行うことができる。
【００５２】
１４．0.1%カナマイシン(Wako製)を入れたSOB液体培地[(20 g Tryptone-B、5 g Yeast extract-B、0.5 g NaCl、5 g MgSO4・7H2O) / L] (Gentra system製)で大腸菌を37℃でミッドログフェイズまで振とう培養する。
１５．誘導剤として、IPTG (Takara製)とL(+)-アラビノース(Wako製)とを、それぞれ終濃度が1 mMと0.1%とになるように加え、37℃で2時間振とう培養する。
１６．培養した大腸菌を2,800 g、4℃で15分間遠心する。
１７．上澄を除去する。
１８．ペレットをバッファーI [20 mM  Tris-HCl (ニッポンジーン製)、10.5 mM  酢酸マグネシウム  (Wako製)、100 mM  塩化アンモニウム (Wako製)、0.5 mM EDTA  (ニッポンジーン製)、3 mM 2-メルカプトエタノール (Wako製)]に懸濁する。
【００５３】
１９．遠心（2,800 g、4℃、15分間）を2回行う。
２０．氷上で大腸菌のペレットの重さの2倍量のアルミナを加える。
２１．ボールミルで4℃、3,000 rpm、30秒間の破砕を3回行う。
２２．破砕後、DNase (RQ1 RNase-free DNase, Promega製)を加える。
２３．遠心（480 g、4℃、15分間）を行う。
２４．上澄を回収する。
２５．遠心（30,000 g、4℃、45分間）を行う。
２６．上澄を回収する。
【００５４】
２７．遠心チューブにバッファーII [1.1 M  ショ糖 (Wako製)、20 mM Tris-HCl (ニッポンジーン製)、10.5 mM  酢酸マグネシウム (Wako製)、500 mM  塩化アンモニウム (Wako)、0.5 mM EDTA (ニッポンジーン製)、3 mM 2-メルカプトエタノール (Wako製)]を入れた後、その上に、等量の上澄回収液を載せ、層を作る。
２８．遠心（100,000 g、4℃、15時間）を行う。
２９．上澄を除去する。
【００５５】
３０．回収したペレットをバッファーIに懸濁する。
３１．上記２７から２９の操作を繰り返す。
【００５６】
３２．回収したペレットをバッファー III [10 mM Tris-HCl (ニッポンジーン製)、10 mM 酢酸マグネシウム (Wako製)、60 mM 塩化アンモニウム (Wako製)、3 mM 2-メルカプトエタノール (Wako製)]に懸濁する。
【００５７】
３３．上記の手順によってリボソームが単離できていることは、例えば原子間力顕微鏡（AFM）を用いて観察することにより確認することができる。原子間力顕微鏡は、非常に鋭い針状チップの先を試料に近づけ、その間の原子間力を精密に制御することにより、表面の構造を観測できる装置であり、固体基板表面上に置かれた生体分子の構造を高分解能で調べる研究に広く使われている。
【００５８】
３４．実際に、上記の１〜３２の手順を行うことによりアフィニティータグ付きリボソームを生産及び単離し、得られた生成物を、原子間力顕微鏡を用いて観察した写真を図３に示す。すなわち図３は、マイカ表面に展開したポリヒスチジンが付加したリボソームの原子間力顕微鏡像を示す。白い丸のように見える物の大きさが47 nm、高さが11 nmである。したがって、白丸はリボソームを表している。このことから、本手順によってリボソームが単離できることが明らかとなった。
【００５９】
３５．単離されたリボソームにアフィニティータグが付加されていることは、例えばウエスタンブロット法を用いて確認することができる。ウエスタンブロット法とは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に電気的に転写し、そのタンパク質を抗体によって検出する方法あり、一般的に広く使われている。ポリヒスチジンの付加を確認する場合は、ポリヒスチジンを認識する一次抗体(Albumin-free 6xHis Monoclonal Antibody, Clontech製)を用いて、リボソームタンパク質に付加されたポリヒスチジンを標識し、二次抗体等で発色させる。つまり、ポリヒスチジンをもつタンパク質のみが、茶色のバンドとして現れ、それ以外のタンパク質は、検出されない。
【００６０】
３６．リボソームのS16タンパク質、S10タンパク質、S9タンパク質、S8タンパク質及びS6タンパク質のそれぞれを、ポリヒスチジンを付加する目的タンパク質とし、実際に、上述の１〜３２の手順を行った。得られた５種類の生成物にそれぞれポリヒスチジンタグが付加していることを、ウエスタンブロット法を用いて確認した。
【００６１】
このとき得られた電気泳動の結果を図４に示す。左のレーンから順に、「＋」はポリヒスチジンタグのポジティブマーカー、「S16」はリボソームのS16タンパク質に付加したポリヒスチジン、「S10」はリボソームのS10タンパク質に付加したポリヒスチジン、「M」はタンパク質マーカー(BenchMark Protein Ladder, Invitrogen製)、「S9」はリボソームのS9タンパク質に付加したポリヒスチジン、「S8」はリボソームのS8タンパク質に付加したポリヒスチジン、「S6」はリボソームのS6タンパク質に付加したポリヒスチジン、「M」はタンパク質マーカー(BenchMark Prestained Protein Ladder, Invitrogen製)を表す。
【００６２】
図４中、20 kDa以下に見られるバンドは、５種類の目的タンパク質のものである。各タンパク質は大きさが異なり、それぞれS6が17 kDa、S8が15 kDa、S9が16 kDa、S10が13 kDa、S16が11 kDaの位置に、特有のバンドが現れている。これらバンドが発色されていることから、ポリヒスチジンがそのタンパク質に付加されたことが示された。したがって、上記手順によって、目的のリボソームタンパク質へのポリヒスチジンの付加が成功したことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】表面固定用タグ部分を付加したリボソームの概念図である。
【図２】ポリヒスチジンが付加したリボソームの単離手順の模式図である。
【図３】マイカ表面に展開したポリヒスチジンが付加したリボソームの原子間力顕微鏡像である。
【図４】ポリヒスチジンが付加したリボソームタンパク質のウエスタンブロット電気泳動の結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１及び２は、合成プライマーの一部である。配列番号３〜５は、合成プライマーである。
【図１】
2005261313.tif 000003
【図２】
2005261313.tif 000004
【図３】
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【図４】
2005261313.tif 000006
【配列表】
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