(57)【要約】【課題】  デルマタン硫酸を含む複合グリコサミノグリカンを、豚腸粘膜から効率よく抽出することができる製法を提供すること。【解決手段】  （１）豚の腸粘膜を、酵素処理に適した状態にする工程、（２）酵素により腸粘膜を加水分解する工程、（３）溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程、（４）溶液から、デルマタン硫酸を吸着分離する工程、（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程、（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程、を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す手順（１）〜（６）を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法。
（１）豚の腸粘膜を、酵素処理に適した状態にする工程
（２）酵素により腸粘膜を加水分解する工程
（３）溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程
（４）溶液から、デルマタン硫酸を吸着分離する工程
（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程
（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程
【請求項２】
前記酵素が、タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素を含むことを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法。
【請求項３】
前記酵素が、デンプン分解酵素を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のデルマタン硫酸の製法。
【請求項４】
多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、酵素分解反応を止めることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のデルマタン硫酸の製法。
【請求項５】
前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項４に記載のデルマタン硫酸の製法。
【請求項６】
前記デルマタン硫酸を吸着分離する工程が、陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のデルマタン硫酸の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、デルマタン硫酸の製法に関する。さらに詳しくは、デルマタン硫酸を含む複合グリコサミノグリカンを、豚腸粘膜から効率よく抽出することができる製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デルマタン硫酸はコンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれる分子量２〜３０万のグリコサミノグリカンの一種である。一般的には、デルマタン硫酸は次式１（化１）に示されるＬ−イズロン酸とＮ-アセチルガラクトサミン−４−硫酸からなる二糖単位の繰り返しが主体となっているが、ウロン酸の一部がＬ−イズロン酸硫酸あるいはＤ−グルクロン酸である場合や、Ｎ-アセチルガラクトサミン−４−硫酸の一部が硫酸化されていない場合や、４,６−二硫酸化されている場合がある。
【０００３】
【化１】
2005139409.tif 000002
【０００４】
デルマタン硫酸やヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンは陰イオン性であるため、高分子構造をとった場合、多数の水分子を含むことができる。このため、これらの高分子化合物は、皮膚の水分を保持することができるとされており、中でも、ヒアルロン酸を含有する健康食品に関しては、いくつかの提案がなされている（特許文献１、２）。
一方、生体内においては、ヒアルロン酸には、グリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸等が結合していることから、デルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸を摂取すると、体内でヒアルロン酸と結合し、皮膚の水分を保持する効果が上がると指摘されている。このうち、コンドロイチン硫酸に関しては、いくつかの製造法が提案されているが（特許文献３、４）、デルマタン硫酸の製造法に関しては、豚皮を原料とするデルマタン硫酸の製造方法が提案されているのみである（特許文献５）。
【０００５】
特許文献５に係る製造法は、カチオン性物質であるキトサンによりデルマタン硫酸を吸着することで、効率的な抽出を可能にしたとしている。しかしながら、特許文献５の実施例を参照すると、原料として用いられている濃厚シロップ状の豚皮エキス（Ｐｏｒｋ  Ｓｋｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ）は、一般的に知られているものではなく、その製造法も明細書中に示されていないことから、特許文献５の記載に基づいて当業者が発明の実施を行うことは困難である。
さらに、実施例に示されている製造法には、高速遠心分離工程が含まれているが、数ｋｇ〜数百ｋｇの原料を用いて製造を行う場合に、大量の液体を遠心分離するには、液体の操作により多くの手間・時間・空間を必要とするため、遠心分離工程自体が採用され得ず、この方法は現実的でない。よって、特許文献５には、当業者が現実的に採用できるデルマタン硫酸の製造法が記載されていない。
尚、現在までのところ、デルマタン硫酸を含有する食品に関する提案はなされていないが、この理由は、デルマタン硫酸の有効な製造法が確立されていなかったからと考えられる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３６０２９２号公報
【特許文献２】特開平９−９８７３９号公報
【特許文献３】特開２００１−２４７６０２号公報
【特許文献４】特開２０００−２７３１０２号公報
【特許文献５】特開２００３−４０９００１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、これまでにないデルマタン硫酸の効率的な抽出方法及びその方法により抽出されたデルマタン硫酸を含有する健康食品を提供することを課題とするものである。具体的には、これまでデルマタン硫酸の原料としては注目されていなかった豚腸粘膜から、デルマタン硫酸を抽出する方法を提供し、上記の方法が効率的であるが故に安価であるデルマタン硫酸を含有する健康食品を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に記載の発明は、（１）豚の腸粘膜を、酵素処理に適した状態にする工程、（２）酵素により腸粘膜を加水分解する工程、（３）溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程、（４）溶液から、デルマタン硫酸を吸着分離する工程、（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程、（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程、を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項２に記載の発明は、前記酵素が、タンパク質分解酵素及び脂肪分解酵素を含むことを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項３に記載の発明は、前記酵素が、デンプン分解酵素を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項４に記載の発明は、多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、酵素分解反応を止めることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項５に記載の発明は、前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項４に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項６に記載の発明は、前記デルマタン硫酸を吸着分離する工程が、陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
請求項１〜６に係る発明は、これまで存在しなかった、デルマタン硫酸を抽出する方法を提供できる。より具体的には、数ｋｇ〜数百ｋｇの原料から、デルマタン硫酸を効率よく抽出する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明に係るデルマタン硫酸の製法について詳述する。本件発明に用いられる豚腸粘膜は、どの品種の豚に由来してもよく、例として、デュロック種（Duroc）、バークシャー種（Berkshire）、ハンプシャー種（Hampshire）、ランドレース種（Landrace）、大ヨークシャー種（Large Yorkshire, Large White）、中ヨークシャー種（Middle Yorkshire, Middle White）等やそれらの雑種等を挙げることができる。上記豚の年齢または月齢は特に限定されないが、生後２４ヶ月以下の個体が好ましく、生後３〜６ヶ月の個体がより好ましい。
本発明で使用される豚腸粘膜が由来する消化管は、デルマタン硫酸を含む消化管であれば特に限定されないが、例として、食道、胃、十二指腸、小腸、盲腸、結腸、直腸などが挙げられ、本発明では十二指腸及び小腸が、好ましく用いられる。
【００１１】
本件発明のデルマタン硫酸の製造法は、最初に、豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にする。豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にする方法は特に限定されず、後の酵素処理が滞りなく進む方法であれば、どのような方法でもよい。例えば、最も簡単な方法としては、腸管を細かいミンチ状にし、粘度を下げるために水を加えた後、酸またはアルカリを用いて、後の酵素処理に適したｐＨに調整する方法が挙げられる。別の方法としては、腸管を切開し、流水にさらしながら、内膜を板状の器具等でこすり取った後、酸またはアルカリを用いて、後の酵素処理に適したｐＨに調整する方法を例示できる。
ｐＨ調整に用いる酸またはアルカリは、後の酵素処理工程で用いる酵素が活性を有するｐＨに調整することができるものであれば特に限定されず、例としては、ＨＣｌやＮａＯＨ等を挙げることができる。
【００１２】
本件発明では、豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にした後、酵素により腸粘膜を加水分解する。本発明で使用される加水分解酵素は特に限定されない。例としては、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、デンプン分解酵素等が挙げられる。あるいは、別の例示としては、エステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、（チオエーテル結合）、ペプチド結合、アミドなどのＣ−Ｎ結合、酸無水物、Ｃ−Ｃ結合及びＰ−Ｎ結合を加水分解する酵素等が挙げられる。本発明では、上記の酵素のうち２種以上の酵素を混合して使用するのが好ましい。
酵素処理の温度は、酵素が失活しない範囲であれば特に限定されないが、本発明では３０〜６０℃の範囲で行われ、好ましくは、４０〜５０℃の範囲で行われる。
酵素処理に使用する酵素量は、加水分解処理が滞りなく行われる範囲であれば特に限定されず、反応温度や腸粘膜の量に応じて、適宜調節するとよい。例としては、水４０Ｌに混濁されたミンチ状豚腸粘膜１０ｋｇに対して、１．０×１０５〜１．０×１０７ユニット程度、好ましくは、２．０×１０６ユニット程度使用する。
酵素処理の時間は、上記酵素濃度であれば４時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましい。４時間より短い場合、酵素反応が十分ではなく効率的なデルマタン硫酸の製造が望めない場合がある。酵素反応は溶液を撹拌しながら行う。反応終了後は、濾過を行い、不純物を取り除く。
市販のタンパク質分解酵素の一例としては、商品名「Alcalase」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。市販の脂肪分解酵素の一例としては、商品名「Palatase」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。市販のデンプン分解酵素の一例としては、商品名「BAN」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。
【００１３】
本件発明では、酵素により腸粘膜を加水分解した後、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う。溶液中の酵素分解反応を止める方法は特に限定されず、例としては、溶液の温度を酵素が失活する温度まで上昇させ、数分〜数十分間その温度を保つ方法が挙げられる。別の方法としては、溶液のｐＨを酵素が失活するｐＨにまで変化させる方法が挙げられる。さらに別の例としては、溶液中から、酵素そのものを取り除く方法が挙げられ、具体的な例としては、酵素を吸着させることができる多孔質物質を溶液に加え、撹拌しながら、酵素を吸着させる方法を例示できる。吸着させた後は、濾過を行い、多孔質物質を除去する。濾過方法は、多孔質物質を除去できる方法であれば特に限定されない。多孔質物質を用いる場合は、用いる多孔質物質に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。
上記の多孔質物質は、酵素を吸着させることができる多孔質物質であれば特に限定されないが、例としては、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末等が挙げられる。用いる濃度は、酵素を除去できる濃度であれば特に限定されないが、本件発明では、０．５〜２．０ｗ/ｖ％程度用いるのが好ましい。多孔質物質の形状は特に限定されないが、本件発明では微小な粒子または粉末が好ましく用いられる。
【００１４】
溶液の脱色を行う方法も特に限定されず、例としては、着色物質を吸着させることができる多孔質物質を溶液に加え、撹拌しながら、着色物質を吸着させる方法が例示できる。吸着させた後は、濾過を行い、多孔質物質を除去する。濾過方法は、多孔質物質を除去できる方法であれば特に限定されない。多孔質物質を用いる場合は、用いる多孔質物質に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。
用いることのできる多孔質物質は、着色物質を吸着させることができる多孔質物質であれば特に限定されず、例としては、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末等が挙げられる。用いる濃度は、着色物質を除去できる濃度であれば特に限定されないが、本件発明では、０．５〜２．０ｗ/ｖ％程度用いるのが好ましい。多孔質物質の形状は特に限定されないが、本件発明では微小な粒子または粉末が好ましく用いられる。
【００１５】
本件発明では、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行った後、溶液からデルマタン硫酸を吸着分離する。溶液からデルマタン硫酸を吸着分離する方法は、デルマタン硫酸を吸着させることのできる物質を用いた方法であれば特に限定されない。例として、陰イオン交換樹脂を用いた方法が挙げられる。陰イオン交換樹脂を用いる場合は、用いる陰イオン交換樹脂に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。本件発明で用いることのできる陰イオン交換樹脂は特に限定されないが、例として、日本錬水株式会社製のダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名）を挙げることができる。
【００１６】
本件発明では、溶液からデルマタン硫酸を吸着分離した後、通常公知の有機溶媒による沈殿法で、高分子グルコサミノグリカンを除去する。用いることのできる有機溶媒は、水に溶け、常温で液状であり、高分子グルコサミノグリカンを沈殿させることができるものなら特に限定されないが、メタノール、エタノール、n-プロパノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、アセトン等を例示できる。尚、本発明のデルマタン硫酸は主に食品に用いられることから、本発明ではエタノールが好んで用いられる。
エタノール沈殿を用いる場合は、純度９５％以上のエタノールを溶液の１〜１．５倍量程度加え、ＮａＣｌを４％の濃度となるよう溶液に加える。その後、常温で１２〜２４時間放置し、沈殿が形成されるのを待つ。沈殿が形成されたら、濾過または遠心によって沈殿と上清を分離し、上清を回収する。尚、この沈殿は、６５％以上がヘパリンである。
【００１７】
本件発明では、有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収した後、デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る。デルマタン硫酸を含む液層から水分を除去する方法は特に限定されないが、有機溶媒による沈殿法、スプレードライ法、フリーズドライ法等を例示できる。
本件発明の製造法により製造される複合グリコサミノグリカンを、アルコール沈殿法により精製する場合、生成率は０．１〜０．２％であり（１ｋｇの原材料から、１０〜２０ｇの製品が得られる）、製造された複合グリコサミノグリカンには、４〜７％のデルマタン硫酸と、０．１〜０．３％のヒアルロン酸と、８〜１５％のポリペプチドが含まれる。
本件発明の製造法により製造される複合グリコサミノグリカンを、スプレードライ法により精製する場合、生成率は０．１５〜０．３％であり（１ｋｇの原材料から、１５〜３０ｇの製品が得られる）、製造された複合グリコサミノグリカンには、２〜４％のデルマタン硫酸と、０．０５〜０．１５％のヒアルロン酸と、１０〜１８％のポリペプチドが含まれる。
【００１８】
上記製法によって製造されたデルマタン硫酸を含有する複合グリコサミノグリカンは食品、具体的には、錠剤、カプセル剤、クッキー、ビスケット、ガム、キャンデー、麺類、飲料等の健康増進を目的とした食品に含有させることができる。
【実施例１】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（デルマタン硫酸の製造）
（１）イギリスのＰＩＣ社（PIC International Group）より導入した雑種豚由来の小腸１０ｋｇを切開し、流水にさらしながら、内膜を板状の器具でこすり取った。こすり取った小腸内膜を、流水とともに酵素分解用の容器に入れ、溶液が約４０Ｌになるよう水でメスアップし、ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを８．５に調整した。
（２）上記の溶液に、パンクレアチン（日本バイオコン株式会社製）を２０g加え、４０℃で８時間、溶液を撹拌しながら小腸粘膜の加水分解を行った。加水分解中は、１５分に１回程度、溶液のｐＨを測定した。ｐＨが下がっている場合は、ＮａＯＨを加えて、ｐＨが８．０〜９．５の間になるよう調節した。反応終了後、濾布を用いて濾過を行い、不純物を取り除いた。
（３）酵素処理が終わった溶液に、ＨＣｌを加え、ｐＨを５．０に調整した後、活性炭（１００〜２００メッシュの粉末）を全体の０．５〜１．０ｗ/ｖ％になるよう加えた。１〜２時間、撹拌し、溶液の脱色と、酵素の除去を行った。撹拌終了後、加圧濾過にて、活性炭を除去した。
（４）濾過液のｐＨをＮａＯＨで７．０前後に調整した後、陰イオン交換樹脂膜が入った容器に、濾過液を移し、常温で６時間撹拌し、陰イオン交換樹脂膜にデルマタン硫酸を吸着させた。陰イオン交換樹脂膜は、ダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名、日本錬水株式会社製）を使用した。
（５）陰イオン交換樹脂膜に、デルマタン硫酸を吸着させた後、溶液を捨て、２ＭのＮａＣｌを加えて、吸着していたデルマタン硫酸を溶出させた。
（６）溶液に、１〜１．５倍量のエタノールと、ＮａＣｌを加えた。ＮａＣｌは、溶液において、最終濃度が４％程度になるよう加えた。その後、常温で、１２時間放置し、高分子グリコサミノグリカンを沈殿させた。濾過により沈殿を除去した。
（７）濾過液をスプレードライ法により精製し、粉末のデルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカンを約３０ｇ得た。
（８）後述の試験法により、デルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカン中のデルマタン硫酸含有量、ヒアルロン酸含有量及びポリペプチド含有量を測定した結果、デルマタン硫酸含有量は３．８％、ヒアルロン酸含有量は０．０７５％、ポリペプチド含有量は１５．３％であった。
【実施例２】
【００２０】
（デルマタン硫酸の製造）
（１）イギリスのＰＩＣ社（PIC International Group）より導入した雑種豚由来の小腸１００ｋｇをミンチ状にすりつぶし、溶液が約４００Ｌになるよう水でメスアップし、ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを９．０に調整した。
（２）上記の溶液に、パンクレアチン（日本バイオコン株式会社製）を２００g加え、４０℃で１２時間、溶液を撹拌しながら、小腸粘膜の加水分解を行った。加水分解中は、１５分に１回程度、溶液のｐＨを測定した。ｐＨが下がっている場合は、ＮａＯＨを加えて、ｐＨが８．０〜９．５の間になるよう調節した。反応終了後、濾布を用いて濾過を行い、不純物を取り除いた。
（３）酵素処理が終わった溶液に、ＨＣｌを加え、ｐＨを５．０に調整した後、活性炭（１００〜２００メッシュの粉末）を全体の０．５〜１．０ｗ/ｖ％になるよう加えた。１〜２時間、撹拌し、溶液の脱色と、酵素の除去を行った。撹拌終了後、加圧濾過にて、活性炭を除去した。
（４）濾過液のｐＨをＮａＯＨで７．０前後に調整した後、陰イオン交換樹脂膜が入った容器に、濾過液を移し、常温で６時間撹拌し、陰イオン交換樹脂膜にデルマタン硫酸を吸着させた。陰イオン交換樹脂膜は、ダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名、日本錬水株式会社製）を使用した。
（５）陰イオン交換樹脂膜に、デルマタン硫酸を吸着させた後、溶液を捨て、２ＭのＮａＣｌを加えて、吸着していたデルマタン硫酸を溶出させた。
（６）溶液に、１〜１．５倍量のエタノールと、ＮａＣｌを加えた。ＮａＣｌは、溶液において、最終濃度が４％程度になるよう加えた。その後、常温で、２４時間放置し、高分子グリコサミノグリカンを沈殿させた。濾過により沈殿を除去した。
（７）濾過液をエタノール沈殿法により精製し、粉末のデルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカンを約２００ｇ得た。
（８）後述の試験法により、デルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカン中のデルマタン硫酸含有量、ヒアルロン酸含有量及びポリペプチド含有量を測定した結果、デルマタン硫酸含有量は４．０７％、ヒアルロン酸含有量は０．１６５％、ポリペプチド含有量は１０．８％であった。ポリペプチド中のアミノ酸組成は表１に示される通りである。
【００２１】
【表１】
2005139409.tif 000003
【実施例３】
【００２２】
（試験例１；ウロン酸含有量の測定）
１．グルクロン酸標準溶液の調製
１０５℃で乾燥したグルクロン酸標準品５０ｍｇを水に溶解して１００ｍＬにメスアップした。十分に撹拌溶解したものを水で１０倍希釈してグルクロン酸標準溶液を調製した。
２．カルバゾール試薬の調製
カルバゾール０．１２５ｇを秤量し、無水アルコール１００ｍＬに溶解してカルバゾール試薬を調製した。
３．ホウ酸溶液の調製
四ホウ酸ナトリウム４．７７ｇを秤量し、濃硫酸５００ｍＬに溶解してホウ酸溶液を調製した。
４．標準曲線の作成
グルクロン酸標準溶液を０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ及び１．０ｍＬずつ試験管に秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。これらを撹拌した後、４℃以下になるまで冷却した。
次いで、振動撹拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、沸騰水中で１０分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて撹拌した後、沸騰水中で１５分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、基準曲線を作成した。
５．ウロン酸含有量の測定
実施例２の調製の際に、アルコール沈殿処理して得られた上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。この濃縮液５ｍＬを水で２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
試料溶液１．０ｍＬを４℃以下になるまで冷却した。次いで、振動撹拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、沸騰水中で１０分間加熱した後、室温まで水で冷却した。さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて撹拌した後、沸騰水中で１５分間加熱し、室温まで水で冷却した。紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した基準曲線からウロン酸含有量を算出した。
【００２３】
（試験例２；ペプチド含有量の測定）
１．牛血清アルブミン標準溶液の調製
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）標準品を計量して０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加えて、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン標準溶液を調製した。
２．アルカリ性酒石酸銅試薬の調製
無水炭酸ナトリウム１０ｇ、水酸化ナトリウム２ｇ、酒石酸カリウムナトリウム０．２５ｇに水５００ｍＬを加えて溶解した第一液と、硫酸銅０．５ｇを水１００ｍＬに溶解した第二液とを、５０：１の割合で混合してアルカリ性酒石酸銅試薬を調製した。
３．標準曲線の作成
牛血清アルブミン標準溶液を０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬを秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて撹拌した後１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、標準曲線を作成した。
４．ペプチド含有量の測定
アルコール沈殿処理した際の上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。濃縮液を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で１００倍希釈して試料溶液を調製した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて撹拌した後１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて、７５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した基準曲線からウロン酸含有量を算出した。
【００２４】
（試験例３；ｐＨ値測定）
実施例１及び２の各試料０．１０ｇを秤量し、これに煮沸した後冷却した蒸留水を加えて溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。中国薬典２０００年版附録ＶＩ Ｈに基づいてｐＨ測定を行なった。結果を表２に記載する。
【００２５】
（試験例４；水分含有量の測定）
実施例１及び２の各試料０．３ｇを用いて、ハロゲン水分測定器（ＨＧ５３、メトラー・トレド社製）により、１１０℃の条件下で水分含有量を測定した。尚、測定時間は１５分間であった。結果を表２に記載する。
【００２６】
（試験例５；アミノ酸組成の分析）
１２０℃の６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いて、実施例２の各試料を１時間加水分解した後、減圧して乾燥した。さらに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを使用して一定濃度に希釈した後、８３５−５０型アミノ酸自動分析器（日立社製）によって、アミノ酸組成を分析した。結果は表１に記載した通りである。
【００２７】
（試験例６；ヒアルロン酸ナトリウム含有量の測定）
一定量秤量した実施例１及び２の各試料溶液を、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で１００ｍＬにメスアップした。１５ｍＬに２％ＣＰＣ（セチルピリジニウムクロライド）溶液（０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解）を加えて、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液でメスアップして撹拌した。その後、４０００ｒｐｍで遠心分離した。
上清液を回収して、上記ウロン酸含有量の測定方法と同様の方法で、ウロン酸の含有量を測定した。
得られたウロン酸の含有量から、次式１（数１）に基づいてヒアルロン酸ナトリウムの含有量を算出した。結果を表２に記載する。
（数１）
ヒアルロン酸ナトリウムの含有量（％）＝ウロン酸（％）×２．０６７５
【００２８】
（試験例７；デルマタン硫酸含有量の測定）
１．トリス塩酸緩衝液
トリス０．２１ｇ及び無水酢酸ナトリウム０．８２ｇを秤量し、１５ｍＬの水を加えて溶解した後に、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加えてｐＨ８．０に調整した。その後、水を加えて全量を２５ｍＬとすることにより、トリス塩酸緩衝液を調製した。
２．測定用溶液の調製
デルマタン硫酸標準品（Sigma Chemical Co.製  製品番号C2905）を秤量し、水を加えて１ｍＬ中にデルマタン硫酸を８０μｇ含有するデルマタン硫酸標準液を調製した。
実施例１及び２の各試料を２５．０ｍｇ秤量して、水で２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
３．測定用溶液の前処理
上記調製した試料溶液とコンドロイチン硫酸標準液を、それぞれ０．２０ｍＬずつ２ｍＬの試験管に採取した。コンドロイチナーゼＡＢＣを０．２単位加えて、さらにトリス塩酸緩衝液を０．２０ｍＬ加えて撹拌した後、３７℃の恒温槽で１時間保温した。次いで、沸騰した湯で３分間加熱した後、冷却して測定用溶液の前処理を行った。
４．デルマタン硫酸含有量の測定
前処理を行なった試料溶液及び対照品溶液を、以下の条件でＨＰＬＣ分析した。各試料のピーク面積から実施例１及び２のデルマタン硫酸含有量を算出した。対照品のＨＰＬＣチャートを図１に、実施例１のＨＰＬＣチャートを図２にそれぞれ示す。結果を表２に記載する。
ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｗａｔｅｒｓ高性能糖分析カラム（６０Å、４μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
移動相；混合塩溶液（リン酸水素二ナトリウム１．５６ｇ、硫酸アンモニウム３．９６ｇを秤量し、水を加えて１０００ｍＬにメスアップして調製した。）
波長；２３０ｎｍ
理論段数；４０００以上（４ｓピークと６ｓピークの分離度は２以上）
【００２９】
（試験例８；ポリペプチド含有量の測定）
試験例２と同様の方法で、実施例１及び２のポリペプチド含有量を測定した。結果を表２に記載する。
【００３０】
【表２】
2005139409.tif 000004
【実施例４】
【００３１】
下記の成分を混合し、造粒して乾燥させた後、デルマタン硫酸を含む錠剤を打錠した。
（錠剤の組成）
デルマタン硫酸                                １００ｇ
コンドロイチン硫酸                              ４０ｇ
プロポリス粉末                                  ２０ｇ
微結晶セルロース                                ２０ｇ
澱粉                                            ５０ｇ
デキストリン                                    ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ３ｇ
アルファ化澱粉                                  ２５ｇ
上記のカプセル剤は、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸を同時に含むため、それぞれを単独で摂取した場合に比べて皮膚の水分を保持する効果が相乗的に上がる。
【実施例５】
【００３２】
下記の成分を均等に混合し、デルマタン硫酸を含むカプセル剤を製造した。
（カプセル剤の組成）
デルマタン硫酸                                  ３０ｇ
コンドロイチン硫酸                              ３０ｇ
レシチン                                        １０ｇ
真珠粉末                                        １０ｇ
澱粉                                            ３０ｇ
上記のカプセル剤は、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸を同時に含むため、それぞれを単独で摂取した場合に比べて皮膚の水分を保持する効果が相乗的に上がる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】試験例７のデルマタン硫酸含有量の測定試験で得られた対照品のＨＰＬＣチャートである。
【図２】試験例７のデルマタン硫酸含有量の測定試験で得られた実施例１のＨＰＬＣチャートである。
【図１】
2005139409.tif 000005
【図２】
2005139409.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月26日(2004.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す手順（１）〜（６）を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法。
（１）豚の腸粘膜を、酵素処理に適した状態にする工程
（２）タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及びデンプン分解酵素を含む酵素により腸粘膜を加水分解する工程
（３）多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程
（４）溶液から、デルマタン硫酸を吸着分離する工程
（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程
（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程
【請求項２】
前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法。
【請求項３】
前記デルマタン硫酸を吸着分離する工程が、陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のデルマタン硫酸の製法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
請求項１に係る発明は、（１）豚の腸粘膜を、酵素処理に適した状態にする工程、（２）タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及びデンプン分解酵素を含む酵素により腸粘膜を加水分解する工程、（３）多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程、（４）溶液から、デルマタン硫酸を吸着分離する工程、（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程、（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程、を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項２に係る発明は、前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項３に係る発明は、前記デルマタン硫酸を吸着分離する工程が、陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
請求項１〜３に係る発明は、これまで存在しなかった、デルマタン硫酸を抽出する方法を提供できる。より具体的には、数ｋｇ〜数百ｋｇの原料から、デルマタン硫酸を効率よく抽出する方法を提供できる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月21日(2004.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す手順（１）〜（６）を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法。
（１）豚の小腸を切開し、流水にさらしながらこすり取った内膜を、酵素処理に適した状態にする工程
（２）タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及びデンプン分解酵素を含む酵素により小腸内膜を加水分解する工程
（３）多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程
（４）溶液から、デルマタン硫酸を陰イオン交換樹脂で吸着分離する工程
（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程
（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程
【請求項２】
前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、デルマタン硫酸の製法に関する。さらに詳しくは、デルマタン硫酸を含む複合グリコサミノグリカンを、豚腸粘膜から効率よく抽出することができる製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デルマタン硫酸はコンドロイチン硫酸Ｂとも呼ばれる分子量２〜３０万のグリコサミノグリカンの一種である。一般的には、デルマタン硫酸は次式１（化１）に示されるＬ−イズロン酸とＮ-アセチルガラクトサミン−４−硫酸からなる二糖単位の繰り返しが主体となっているが、ウロン酸の一部がＬ−イズロン酸硫酸あるいはＤ−グルクロン酸である場合や、Ｎ-アセチルガラクトサミン−４−硫酸の一部が硫酸化されていない場合や、４,６−二硫酸化されている場合がある。
【０００３】
【化１】
2005139409.tif 000007
【０００４】
デルマタン硫酸やヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンは陰イオン性であるため、高分子構造をとった場合、多数の水分子を含むことができる。このため、これらの高分子化合物は、皮膚の水分を保持することができるとされており、中でも、ヒアルロン酸を含有する健康食品に関しては、いくつかの提案がなされている（特許文献１、２）。
一方、生体内においては、ヒアルロン酸には、グリコサミノグリカンであるデルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸等が結合していることから、デルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸を摂取すると、体内でヒアルロン酸と結合し、皮膚の水分を保持する効果が上がると指摘されている。このうち、コンドロイチン硫酸に関しては、いくつかの製造法が提案されているが（特許文献３、４）、デルマタン硫酸の製造法に関しては、豚皮を原料とするデルマタン硫酸の製造方法が提案されているのみである（特許文献５）。
【０００５】
特許文献５に係る製造法は、カチオン性物質であるキトサンによりデルマタン硫酸を吸着することで、効率的な抽出を可能にしたとしている。しかしながら、特許文献５の実施例を参照すると、原料として用いられている濃厚シロップ状の豚皮エキス（Ｐｏｒｋ  Ｓｋｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ）は、一般的に知られているものではなく、その製造法も明細書中に示されていないことから、特許文献５の記載に基づいて当業者が発明の実施を行うことは困難である。
さらに、実施例に示されている製造法には、高速遠心分離工程が含まれているが、数ｋｇ〜数百ｋｇの原料を用いて製造を行う場合に、大量の液体を遠心分離するには、液体の操作により多くの手間・時間・空間を必要とするため、遠心分離工程自体が採用され得ず、この方法は現実的でない。よって、特許文献５には、当業者が現実的に採用できるデルマタン硫酸の製造法が記載されていない。
尚、現在までのところ、デルマタン硫酸を含有する食品に関する提案はなされていないが、この理由は、デルマタン硫酸の有効な製造法が確立されていなかったからと考えられる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３６０２９２号公報
【特許文献２】特開平９−９８７３９号公報
【特許文献３】特開２００１−２４７６０２号公報
【特許文献４】特開２０００−２７３１０２号公報
【特許文献５】特開２００３−４０９００１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、これまでにないデルマタン硫酸の効率的な抽出方法及びその方法により抽出されたデルマタン硫酸を含有する健康食品を提供することを課題とするものである。具体的には、これまでデルマタン硫酸の原料としては注目されていなかった豚腸粘膜から、デルマタン硫酸を抽出する方法を提供し、上記の方法が効率的であるが故に安価であるデルマタン硫酸を含有する健康食品を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、（１）豚の小腸を切開し、流水にさらしながらこすり取った内膜を、酵素処理に適した状態にする工程、（２）タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素及びデンプン分解酵素を含む酵素により小腸内膜を加水分解する工程、（３）多孔質物質を用いて酵素を吸着除去することにより、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う工程、（４）溶液から、デルマタン硫酸を陰イオン交換樹脂で吸着分離する工程、（５）有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収する工程、（６）デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る工程、を含むことを特徴とする、豚の腸粘膜を原料とするデルマタン硫酸の製法に関する。
請求項２に係る発明は、前記多孔質物質が、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末のうちの１つまたは２つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のデルマタン硫酸の製法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
請求項１〜２に係る発明は、これまで存在しなかった、デルマタン硫酸を抽出する方法を提供できる。より具体的には、数ｋｇ〜数百ｋｇの原料から、デルマタン硫酸を効率よく抽出する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明に係るデルマタン硫酸の製法について詳述する。本件発明に用いられる豚腸粘膜は、どの品種の豚に由来してもよく、例として、デュロック種（Duroc）、バークシャー種（Berkshire）、ハンプシャー種（Hampshire）、ランドレース種（Landrace）、大ヨークシャー種（Large Yorkshire, Large White）、中ヨークシャー種（Middle Yorkshire, Middle White）等やそれらの雑種等を挙げることができる。上記豚の年齢または月齢は特に限定されないが、生後２４ヶ月以下の個体が好ましく、生後３〜６ヶ月の個体がより好ましい。
本発明で使用される豚腸粘膜が由来する消化管は、デルマタン硫酸を含む消化管であれば特に限定されないが、例として、食道、胃、十二指腸、小腸、盲腸、結腸、直腸などが挙げられ、本発明では十二指腸及び小腸が、好ましく用いられる。
【００１１】
本件発明のデルマタン硫酸の製造法は、最初に、豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にする。豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にする方法は特に限定されず、後の酵素処理が滞りなく進む方法であれば、どのような方法でもよい。例えば、最も簡単な方法としては、腸管を細かいミンチ状にし、粘度を下げるために水を加えた後、酸またはアルカリを用いて、後の酵素処理に適したｐＨに調整する方法が挙げられる。別の方法としては、腸管を切開し、流水にさらしながら、内膜を板状の器具等でこすり取った後、酸またはアルカリを用いて、後の酵素処理に適したｐＨに調整する方法を例示できる。
ｐＨ調整に用いる酸またはアルカリは、後の酵素処理工程で用いる酵素が活性を有するｐＨに調整することができるものであれば特に限定されず、例としては、ＨＣｌやＮａＯＨ等を挙げることができる。
【００１２】
本件発明では、豚の腸粘膜を酵素処理に適した状態にした後、酵素により腸粘膜を加水分解する。本発明で使用される加水分解酵素は特に限定されない。例としては、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、デンプン分解酵素等が挙げられる。あるいは、別の例示としては、エステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、（チオエーテル結合）、ペプチド結合、アミドなどのＣ−Ｎ結合、酸無水物、Ｃ−Ｃ結合及びＰ−Ｎ結合を加水分解する酵素等が挙げられる。本発明では、上記の酵素のうち２種以上の酵素を混合して使用するのが好ましい。
酵素処理の温度は、酵素が失活しない範囲であれば特に限定されないが、本発明では３０〜６０℃の範囲で行われ、好ましくは、４０〜５０℃の範囲で行われる。
酵素処理に使用する酵素量は、加水分解処理が滞りなく行われる範囲であれば特に限定されず、反応温度や腸粘膜の量に応じて、適宜調節するとよい。例としては、水４０Ｌに混濁されたミンチ状豚腸粘膜１０ｋｇに対して、１．０×１０５〜１．０×１０７ユニット程度、好ましくは、２．０×１０６ユニット程度使用する。
酵素処理の時間は、上記酵素濃度であれば４時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましい。４時間より短い場合、酵素反応が十分ではなく効率的なデルマタン硫酸の製造が望めない場合がある。酵素反応は溶液を撹拌しながら行う。反応終了後は、濾過を行い、不純物を取り除く。
市販のタンパク質分解酵素の一例としては、商品名「Alcalase」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。市販の脂肪分解酵素の一例としては、商品名「Palatase」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。市販のデンプン分解酵素の一例としては、商品名「BAN」（NOVOZYMES社製）を例示することができる。
【００１３】
本件発明では、酵素により腸粘膜を加水分解した後、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行う。溶液中の酵素分解反応を止める方法は特に限定されず、例としては、溶液の温度を酵素が失活する温度まで上昇させ、数分〜数十分間その温度を保つ方法が挙げられる。別の方法としては、溶液のｐＨを酵素が失活するｐＨにまで変化させる方法が挙げられる。さらに別の例としては、溶液中から、酵素そのものを取り除く方法が挙げられ、具体的な例としては、酵素を吸着させることができる多孔質物質を溶液に加え、撹拌しながら、酵素を吸着させる方法を例示できる。吸着させた後は、濾過を行い、多孔質物質を除去する。濾過方法は、多孔質物質を除去できる方法であれば特に限定されない。多孔質物質を用いる場合は、用いる多孔質物質に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。
上記の多孔質物質は、酵素を吸着させることができる多孔質物質であれば特に限定されないが、例としては、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末等が挙げられる。用いる濃度は、酵素を除去できる濃度であれば特に限定されないが、本件発明では、０．５〜２．０ｗ/ｖ％程度用いるのが好ましい。多孔質物質の形状は特に限定されないが、本件発明では微小な粒子または粉末が好ましく用いられる。
【００１４】
溶液の脱色を行う方法も特に限定されず、例としては、着色物質を吸着させることができる多孔質物質を溶液に加え、撹拌しながら、着色物質を吸着させる方法が例示できる。吸着させた後は、濾過を行い、多孔質物質を除去する。濾過方法は、多孔質物質を除去できる方法であれば特に限定されない。多孔質物質を用いる場合は、用いる多孔質物質に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。
用いることのできる多孔質物質は、着色物質を吸着させることができる多孔質物質であれば特に限定されず、例としては、真珠岩、カオリン、珪藻土、活性炭、タルク粉末等が挙げられる。用いる濃度は、着色物質を除去できる濃度であれば特に限定されないが、本件発明では、０．５〜２．０ｗ/ｖ％程度用いるのが好ましい。多孔質物質の形状は特に限定されないが、本件発明では微小な粒子または粉末が好ましく用いられる。
【００１５】
本件発明では、溶液中の酵素分解反応を止め、溶液の脱色を行った後、溶液からデルマタン硫酸を吸着分離する。溶液からデルマタン硫酸を吸着分離する方法は、デルマタン硫酸を吸着させることのできる物質を用いた方法であれば特に限定されない。例として、陰イオン交換樹脂を用いた方法が挙げられる。陰イオン交換樹脂を用いる場合は、用いる陰イオン交換樹脂に応じて、溶液のｐＨを適宜調整するとよい。本件発明で用いることのできる陰イオン交換樹脂は特に限定されないが、例として、日本錬水株式会社製のダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名）を挙げることができる。
【００１６】
本件発明では、溶液からデルマタン硫酸を吸着分離した後、通常公知の有機溶媒による沈殿法で、高分子グルコサミノグリカンを除去する。用いることのできる有機溶媒は、水に溶け、常温で液状であり、高分子グルコサミノグリカンを沈殿させることができるものなら特に限定されないが、メタノール、エタノール、n-プロパノール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、アセトン等を例示できる。尚、本発明のデルマタン硫酸は主に食品に用いられることから、本発明ではエタノールが好んで用いられる。
エタノール沈殿を用いる場合は、純度９５％以上のエタノールを溶液の１〜１．５倍量程度加え、ＮａＣｌを４％の濃度となるよう溶液に加える。その後、常温で１２〜２４時間放置し、沈殿が形成されるのを待つ。沈殿が形成されたら、濾過または遠心によって沈殿と上清を分離し、上清を回収する。尚、この沈殿は、６５％以上がヘパリンである。
【００１７】
本件発明では、有機溶媒による沈殿で、高分子グルコサミノグリカンを除去し、デルマタン硫酸を含む上層の液体を回収した後、デルマタン硫酸を含む液体の水分を除去して粉末のデルマタン硫酸を得る。デルマタン硫酸を含む液層から水分を除去する方法は特に限定されないが、有機溶媒による沈殿法、スプレードライ法、フリーズドライ法等を例示できる。
本件発明の製造法により製造される複合グリコサミノグリカンを、アルコール沈殿法により精製する場合、生成率は０．１〜０．２％であり（１ｋｇの原材料から、１０〜２０ｇの製品が得られる）、製造された複合グリコサミノグリカンには、４〜７％のデルマタン硫酸と、０．１〜０．３％のヒアルロン酸と、８〜１５％のポリペプチドが含まれる。
本件発明の製造法により製造される複合グリコサミノグリカンを、スプレードライ法により精製する場合、生成率は０．１５〜０．３％であり（１ｋｇの原材料から、１５〜３０ｇの製品が得られる）、製造された複合グリコサミノグリカンには、２〜４％のデルマタン硫酸と、０．０５〜０．１５％のヒアルロン酸と、１０〜１８％のポリペプチドが含まれる。
【００１８】
上記製法によって製造されたデルマタン硫酸を含有する複合グリコサミノグリカンは食品、具体的には、錠剤、カプセル剤、クッキー、ビスケット、ガム、キャンデー、麺類、飲料等の健康増進を目的とした食品に含有させることができる。
【実施例１】
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（デルマタン硫酸の製造）
（１）イギリスのＰＩＣ社（PIC International Group）より導入した雑種豚由来の小腸１０ｋｇを切開し、流水にさらしながら、内膜を板状の器具でこすり取った。こすり取った小腸内膜を、流水とともに酵素分解用の容器に入れ、溶液が約４０Ｌになるよう水でメスアップし、ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを８．５に調整した。
（２）上記の溶液に、パンクレアチン（日本バイオコン株式会社製）を２０g加え、４０℃で８時間、溶液を撹拌しながら小腸粘膜の加水分解を行った。加水分解中は、１５分に１回程度、溶液のｐＨを測定した。ｐＨが下がっている場合は、ＮａＯＨを加えて、ｐＨが８．０〜９．５の間になるよう調節した。反応終了後、濾布を用いて濾過を行い、不純物を取り除いた。
（３）酵素処理が終わった溶液に、ＨＣｌを加え、ｐＨを５．０に調整した後、活性炭（１００〜２００メッシュの粉末）を全体の０．５〜１．０ｗ/ｖ％になるよう加えた。１〜２時間、撹拌し、溶液の脱色と、酵素の除去を行った。撹拌終了後、加圧濾過にて、活性炭を除去した。
（４）濾過液のｐＨをＮａＯＨで７．０前後に調整した後、陰イオン交換樹脂膜が入った容器に、濾過液を移し、常温で６時間撹拌し、陰イオン交換樹脂膜にデルマタン硫酸を吸着させた。陰イオン交換樹脂膜は、ダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名、日本錬水株式会社製）を使用した。
（５）陰イオン交換樹脂膜に、デルマタン硫酸を吸着させた後、溶液を捨て、２ＭのＮａＣｌを加えて、吸着していたデルマタン硫酸を溶出させた。
（６）溶液に、１〜１．５倍量のエタノールと、ＮａＣｌを加えた。ＮａＣｌは、溶液において、最終濃度が４％程度になるよう加えた。その後、常温で、１２時間放置し、高分子グリコサミノグリカンを沈殿させた。濾過により沈殿を除去した。
（７）濾過液をスプレードライ法により精製し、粉末のデルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカンを約３０ｇ得た。
（８）後述の試験法により、デルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカン中のデルマタン硫酸含有量、ヒアルロン酸含有量及びポリペプチド含有量を測定した結果、デルマタン硫酸含有量は３．８％、ヒアルロン酸含有量は０．０７５％、ポリペプチド含有量は１５．３％であった。
【００２０】
［比較例１］
（デルマタン硫酸の製造）
（１）イギリスのＰＩＣ社（PIC International Group）より導入した雑種豚由来の小腸１００ｋｇをミンチ状にすりつぶし、溶液が約４００Ｌになるよう水でメスアップし、ＮａＯＨを用いて、溶液のｐＨを９．０に調整した。
（２）上記の溶液に、パンクレアチン（日本バイオコン株式会社製）を２００g加え、４０℃で１２時間、溶液を撹拌しながら、小腸粘膜の加水分解を行った。加水分解中は、１５分に１回程度、溶液のｐＨを測定した。ｐＨが下がっている場合は、ＮａＯＨを加えて、ｐＨが８．０〜９．５の間になるよう調節した。反応終了後、濾布を用いて濾過を行い、不純物を取り除いた。
（３）酵素処理が終わった溶液に、ＨＣｌを加え、ｐＨを５．０に調整した後、活性炭（１００〜２００メッシュの粉末）を全体の０．５〜１．０ｗ/ｖ％になるよう加えた。１〜２時間、撹拌し、溶液の脱色と、酵素の除去を行った。撹拌終了後、加圧濾過にて、活性炭を除去した。
（４）濾過液のｐＨをＮａＯＨで７．０前後に調整した後、陰イオン交換樹脂膜が入った容器に、濾過液を移し、常温で６時間撹拌し、陰イオン交換樹脂膜にデルマタン硫酸を吸着させた。陰イオン交換樹脂膜は、ダイヤイオンＲＤＡ０２（商品名、日本錬水株式会社製）を使用した。
（５）陰イオン交換樹脂膜に、デルマタン硫酸を吸着させた後、溶液を捨て、２ＭのＮａＣｌを加えて、吸着していたデルマタン硫酸を溶出させた。
（６）溶液に、１〜１．５倍量のエタノールと、ＮａＣｌを加えた。ＮａＣｌは、溶液において、最終濃度が４％程度になるよう加えた。その後、常温で、２４時間放置し、高分子グリコサミノグリカンを沈殿させた。濾過により沈殿を除去した。
（７）濾過液をエタノール沈殿法により精製し、粉末のデルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカンを約２００ｇ得た。
（８）後述の試験法により、デルマタン硫酸含有複合グリコサミノグリカン中のデルマタン硫酸含有量、ヒアルロン酸含有量及びポリペプチド含有量を測定した結果、デルマタン硫酸含有量は４．０７％、ヒアルロン酸含有量は０．１６５％、ポリペプチド含有量は１０．８％であった。ポリペプチド中のアミノ酸組成は表１に示される通りである。
【００２１】
【表１】
2005139409.tif 000008
【００２２】
（試験例１；ウロン酸含有量の測定）
１．グルクロン酸標準溶液の調製
１０５℃で乾燥したグルクロン酸標準品５０ｍｇを水に溶解して１００ｍＬにメスアップした。十分に撹拌溶解したものを水で１０倍希釈してグルクロン酸標準溶液を調製した。
２．カルバゾール試薬の調製
カルバゾール０．１２５ｇを秤量し、無水アルコール１００ｍＬに溶解してカルバゾール試薬を調製した。
３．ホウ酸溶液の調製
四ホウ酸ナトリウム４．７７ｇを秤量し、濃硫酸５００ｍＬに溶解してホウ酸溶液を調製した。
４．標準曲線の作成
グルクロン酸標準溶液を０．２ｍＬ、０．４ｍＬ、０．６ｍＬ、０．８ｍＬ及び１．０ｍＬずつ試験管に秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。これらを撹拌した後、４℃以下になるまで冷却した。
次いで、振動撹拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、沸騰水中で１０分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて撹拌した後、沸騰水中で１５分間加熱した後、水で室温まで冷却した。
紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、基準曲線を作成した。
５．ウロン酸含有量の測定
比較例１の調製の際に、アルコール沈殿処理して得られた上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。この濃縮液５ｍＬを水で２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
試料溶液１．０ｍＬを４℃以下になるまで冷却した。次いで、振動撹拌している状態で、ホウ酸溶液５ｍＬを加えて、沸騰水中で１０分間加熱した後、室温まで水で冷却した。さらに、カルバゾール試薬０．２ｍＬを加えて撹拌した後、沸騰水中で１５分間加熱し、室温まで水で冷却した。紫外線可視光分光光度計によって５３０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した基準曲線からウロン酸含有量を算出した。
【００２３】
（試験例２；ペプチド含有量の測定）
１．牛血清アルブミン標準溶液の調製
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）標準品を計量して０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加えて、５００μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン標準溶液を調製した。
２．アルカリ性酒石酸銅試薬の調製
無水炭酸ナトリウム１０ｇ、水酸化ナトリウム２ｇ、酒石酸カリウムナトリウム０．２５ｇに水５００ｍＬを加えて溶解した第一液と、硫酸銅０．５ｇを水１００ｍＬに溶解した第二液とを、５０：１の割合で混合してアルカリ性酒石酸銅試薬を調製した。
３．標準曲線の作成
牛血清アルブミン標準溶液を０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬを秤量した後、それぞれ１．０ｍＬになるまで水を加えた。別途、水１．０ｍＬを試験管に秤量した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて撹拌した後１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて７５０ｎｍの吸光度を測定した。濃度を縦軸、吸光度を横軸にプロットして、標準曲線を作成した。
４．ペプチド含有量の測定
アルコール沈殿処理した際の上清液１２６０ｍＬを減圧濃縮して濃縮液７０ｍＬを得た。濃縮液を０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で１００倍希釈して試料溶液を調製した。アルカリ性酒石酸銅試薬５ｍＬを加えて撹拌した後１０分間放置した。さらに、Foline-Phenol試薬０．５ｍＬを加えて撹拌し、３７℃で３０分間保温した。
紫外線可視光分光光度計を用いて、７５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度と上記作成した基準曲線からペプチド含有量を算出した。
【００２４】
（試験例３；ｐＨ値測定）
実施例１及び比較例１の各試料０．１０ｇを秤量し、これに煮沸した後冷却した蒸留水を加えて溶解し、１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。中国薬典２０００年版附録ＶＩ Ｈに基づいてｐＨ測定を行なった。結果を表２に記載する。
【００２５】
（試験例４；水分含有量の測定）
実施例１及び比較例１の各試料０．３ｇを用いて、ハロゲン水分測定器（ＨＧ５３、メトラー・トレド社製）により、１１０℃の条件下で水分含有量を測定した。尚、測定時間は１５分間であった。結果を表２に記載する。
【００２６】
（試験例５；アミノ酸組成の分析）
１２０℃の６ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを用いて、比較例１の各試料を１時間加水分解した後、減圧して乾燥した。さらに、０．０２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを使用して一定濃度に希釈した後、８３５−５０型アミノ酸自動分析器（日立社製）によって、アミノ酸組成を分析した。結果は表１に記載した通りである。
【００２７】
（試験例６；ヒアルロン酸ナトリウム含有量の測定）
一定量秤量した実施例１及び比較例１の各試料溶液を、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で１００ｍＬにメスアップした。１５ｍＬに２％ＣＰＣ（セチルピリジニウムクロライド）溶液（０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解）を加えて、０．２５Ｍ塩化ナトリウム溶液でメスアップして撹拌した。その後、４０００ｒｐｍで遠心分離した。
上清液を回収して、上記ウロン酸含有量の測定方法と同様の方法で、ウロン酸の含有量を測定した。
得られたウロン酸の含有量から、次式１（数１）に基づいてヒアルロン酸ナトリウムの含有量を算出した。結果を表２に記載する。
（数１）
ヒアルロン酸ナトリウムの含有量（％）＝ウロン酸（％）×２．０６７５
【００２８】
（試験例７；デルマタン硫酸含有量の測定）
１．トリス塩酸緩衝液
トリス０．２１ｇ及び無水酢酸ナトリウム０．８２ｇを秤量し、１５ｍＬの水を加えて溶解した後に、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加えてｐＨ８．０に調整した。その後、水を加えて全量を２５ｍＬとすることにより、トリス塩酸緩衝液を調製した。
２．測定用溶液の調製
デルマタン硫酸標準品（Sigma Chemical Co.製  製品番号C2905）を秤量し、水を加えて１ｍＬ中にデルマタン硫酸を８０μｇ含有するデルマタン硫酸標準液を調製した。
実施例１及び比較例１の各試料を２５．０ｍｇ秤量して、水で２５ｍＬにメスアップして試料溶液を調製した。
３．測定用溶液の前処理
上記調製した試料溶液とコンドロイチン硫酸標準液を、それぞれ０．２０ｍＬずつ２ｍＬの試験管に採取した。コンドロイチナーゼＡＢＣを０．２単位加えて、さらにトリス塩酸緩衝液を０．２０ｍＬ加えて撹拌した後、３７℃の恒温槽で１時間保温した。次いで、沸騰した湯で３分間加熱した後、冷却して測定用溶液の前処理を行った。
４．デルマタン硫酸含有量の測定
前処理を行なった試料溶液及び対照品溶液を、以下の条件でＨＰＬＣ分析した。各試料のピーク面積から実施例１及び比較例１のデルマタン硫酸含有量を算出した。対照品のＨＰＬＣチャートを図１に、実施例１のＨＰＬＣチャートを図２にそれぞれ示す。結果を表２に記載する。
ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｗａｔｅｒｓ高性能糖分析カラム（６０Å、４μｍ、４．６×２５０ｍｍ）
移動相；混合塩溶液（リン酸水素二ナトリウム１．５６ｇ、硫酸アンモニウム３．９６ｇを秤量し、水を加えて１０００ｍＬにメスアップして調製した。）
波長；２３０ｎｍ
理論段数；４０００以上（４ｓピークと６ｓピークの分離度は２以上）
【００２９】
（試験例８；ポリペプチド含有量の測定）
試験例２と同様の方法で、実施例１及び比較例１のポリペプチド含有量を測定した。結果を表２に記載する。
【００３０】
【表２】
2005139409.tif 000009
【実施例２】
【００３１】
下記の成分を混合し、造粒して乾燥させた後、デルマタン硫酸を含む錠剤を打錠した。
（錠剤の組成）
デルマタン硫酸                                １００ｇ
コンドロイチン硫酸                              ４０ｇ
プロポリス粉末                                  ２０ｇ
微結晶セルロース                                ２０ｇ
澱粉                                            ５０ｇ
デキストリン                                    ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ３ｇ
アルファ化澱粉                                  ２５ｇ
上記のカプセル剤は、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸を同時に含むため、それぞれを単独で摂取した場合に比べて皮膚の水分を保持する効果が相乗的に上がる。
【実施例３】
【００３２】
下記の成分を均等に混合し、デルマタン硫酸を含むカプセル剤を製造した。
（カプセル剤の組成）
デルマタン硫酸                                  ３０ｇ
コンドロイチン硫酸                              ３０ｇ
レシチン                                        １０ｇ
真珠粉末                                        １０ｇ
澱粉                                            ３０ｇ
上記のカプセル剤は、デルマタン硫酸及びコンドロイチン硫酸を同時に含むため、それぞれを単独で摂取した場合に比べて皮膚の水分を保持する効果が相乗的に上がる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】試験例７のデルマタン硫酸含有量の測定試験で得られた対照品のＨＰＬＣチャートである。
【図２】試験例７のデルマタン硫酸含有量の測定試験で得られた実施例１のＨＰＬＣチャートである。