(57)【要約】 【課題】  本発明は、生体に存在するドーパミン２ニューロン賦活作用を有するグリコシドを提供することを目的とする。【解決手段】    本発明のグリコシドは、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドである。  本発明の誘導体は、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドの誘導体である。  本発明は、上記グリコシド又は誘導体を利用したうつ病・パーキンソン病治療薬及びそれらの診断薬である。  本発明は、上記グリコシド又は誘導体を利用したたばこ依存症代用薬である。  本発明は、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つグリコシドを含む医薬または診断薬である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシド。
【請求項２】
請求項１に記載のマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造に持つグリコシドを含む誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のグリコシド又は誘導体あるいはこれを発現する遺伝子を挿入した発現ベクター、ペプチド、タンパク質、酵素、ストレプトアビジンから成る群から選択される結合分子の結合体を含む医薬または診断薬。
【請求項４】
請求項３に記載のグリコシド、誘導体又は結合体を含む新規抗うつ薬およびパーキンソン病治療薬及びそれらの診断薬。
【請求項５】
請求項３に記載のグリコシド、誘導体又は結合体を含む新規たばこ依存症代用薬。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のグリコシド又は誘導体を含むドーパミンニューロン作用の基礎的研究の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たばこに存在する、ドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドに関する。
【背景技術】
【０００２】
たばこに含まれるニコチンやその他の物質が，抑うつなどの精神医学的障害を引き起こす上でなんらかの役割を果たしていることは，これまでの研究によって示唆されている。うつ病は、抑うつ気分、悲壮感などの感情障害、思考抑止などの思考障害、意欲低下、睡眠障害、抑うつ状態の日内変動などを主症状とする情動性精神障害が原因である。うつ病患者は、年々増加しており、その数は米国では2000万人、日本では20万人といわれ、潜在患者を含めればこの何倍にも及ぶと考えられる。
【０００３】
パーキンソン病は50歳代後半を発症のピークとし、震え、筋肉の固縮、無動、姿勢保持障害などを主な症状とする疾患であり、神経伝達物質ドーパミンの前駆物質であるＬードーパなどが症状の改善に効果を示す。肺ガンなどの発ガンの原因である喫煙の主因であるニコチンが、パーキンソン病の治療に効果があるとの研究成果が、「米学術振興会」（ＡＡＡＳ）で発表された。
【０００４】
米バーモント大学のポール・ニューハウス博士は、ニコチンパッチを15人のパーキンソン病患者に与えたところ、運動機能の改善と、精神的な障害が緩和されたという
【０００５】
パーキンソン病発症率と喫煙の負の相関関係は、1966年以来複数の疫学調査によって確かめられている。
【０００６】
ニコチンがパーキンソン病に有効なのは、ニコチンに神経伝達物質であるドーパミンやアセチルコリンの働きを調整する能力があるためと見られている。                    
【０００７】
一方、今までにたばこに存在するニコチン以外の物質が抗うつ作用やパーキンソン病の抑制作用を有することは知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体に存在するドーパミン２ニューロン賦活作用を有するグリコシドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のグリコシドは、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドである。
【００１０】
本発明の誘導体は、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドの誘導体である。
【００１１】
本発明は、上記グリコシド又は誘導体を利用したうつ病・パーキンソン病治療薬及びそれらの診断薬である。
【００１２】
本発明は、上記グリコシド又は誘導体を利用したたばこ依存症代用薬である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAcF構造を持つグリコシドは、新規なうつ病治療薬及びパーキンソン病治療薬およびそれぞれの診断薬として医療に新しい貢献ができる。
【発明の実施するための最良の形態】
【００１４】
たばこに存在するグリコシドは、マウス強制水泳試験による持久時間を短縮させたが、その有効なグリコシドはマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つグリコシドであることが判明した。また、本グリコシドはマウスに嗜好行動を示した。
【００１５】
したがって、たばこから部分精製したマンノースのポリマー骨格の末端にFuca1-2Gal, Galb1-4GlcNAc, GalNAc a1-3GalNAc構造を持つことを特徴とするドーパミンニューロン賦活作用を有するグリコシドはうつ病およびパーキンソン病の治療薬及びそれらの診断薬として有効である。また、たばこ依存症の代用薬として有効である。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００１７】
動物：体重20-25ｇの８週齢の雄のddYマウス（SLC社、東京、日本）を使用した。マウスは５群に分けて、プラスチックケージ（338×140×225mm）内で自由飲食にて飼育した。
【００１８】
飼育室は、湿度50-60％、室温21-25℃に保たれており、7:00から19:00まで点灯した。実験の24時間前に論文[Masuda Y．他，Exp．Animal，50，331-335，2001]で記述された方法で、マウスに6分間の強制水泳を行った。
【００１９】
ドーパミンニューロン賦活効果の測定法：ドーパミンニューロン賦活作用を測定する装置と実験過程は以前に発表された論文[Porsolt  R.D.他、Arch.  Int.  Pharmacol.，229，327-336,1977]に記載されている。
【００２０】
手短に言うと、マウスを10cmの高さまで25℃の水をはったシリンダー（直径10cm、高さ20cm）に入れてから6分間そのままにした。残りの3分間でシリンダーの壁をよじ登るまでの時間を、ドーパミンニューロン賦活作用のインデックスとした。この「よじ登り行動」の測定は、15:00から17:00までの時間帯に実行された。
【００２１】
薬物依存性試験：薬物依存性試験は禁断症状の程度で判定した。すなわち、各群５匹のマウスを用いて飲水中に各種濃度の本グリコシドあるいはニコチンを加えた自由飲水群および対照として何も添加しない飲水群に分け、９日間の自由飲水量と体重を測定した。つぎに、２日間通常の水で自由飲水させた後、再び一回目の用量で自由飲水させて、１日間の飲水量と体重を測定した。
【００２２】
グリコシドの調製：論文[Masuda Y．他，Methods Find．Exp．Clin．Pharmacol.，25，2003, in press]で記載された方法でグリコシドを調製した。紙たばこ80gに100mlの水を加え、１２時間室温に放置した。抽出液を10mM炭酸ナトリウム、pH8.3で平衡化したDE-52イオン交換カラムにかけた後、塩化ナトリウム100-1000mMの段階的な濃度で溶出される分画を集めた。それぞれの分画をCD-10カラムで脱塩した後、限外濾過膜を用いて30kDa, 30-10kDa, 10-3kDa, 3kDa以下の分子量に分画した。それぞれの画分を4mlの滅菌水に分散した後、300mlをマウスの腹腔内に投与し、「よじ登り行動」の測定を行った。
【００２３】
100mM塩化ナトリウムで溶出された30-10kDa分画を高速液体クロマトグラフィーで分析し、さらにレクチン-ELISA法で糖鎖を解析した。
【００２４】
グリコシドのレクチンに対する反応性：論文[Masuda Y．他，Tohoku J. Exp. Med. 192, 283, 2000] に記載された方法に従った。lectin-ELISAの測定には住友ベークライト製の96穴プラスティックプレートを用いた。レクチンConAはマンノース多糖体を認識し、レクチンABAはGalb1-3GlcNAcを認識する。それぞれのレクチンを生理食塩水でに調整して、それぞれ200ml取り、９６穴マイクロプレートに注入した。２時間後各穴（well）は洗浄液（0.005%Tween20を含む生食）で３回洗浄した。次に各穴に５％ウシ血清アルブミンを加えて３０分反応させ、反応基をブロックした。その後画分100mlを穴に注入して１時間室温で反応させた後、３回洗浄液で洗浄した。５種類のビオチン化レクチン(2mg/ml)を100ml各穴に注入して、１時間室温で反応させた後、洗浄液で３回洗浄した。次に、ワサビ  パーオキシダーゼ結合アビジン(horse-radish peroxidase-conjugated avidin)(生化学工業)を添加した後、その反応性は分光光度計で455/600nmの波長で吸光度を測定して求めた。
【００２５】
活性分画の「よじ登り行動」に対する効果：凍結乾燥した活性分画を滅菌水に溶解し、それぞれを一群5匹のマウスに10,2,0.4mg/kg体重の量をそれぞれ腹腔内に注射して、注射４０分後、先に記述したような方法で「よじ登り行動」に対する効果を測定した。
【００２６】
ドーパミンニューロン阻害剤の効果：5匹のマウスに10mg/kg体重の量をそれぞれ腹腔内に注射して、注射３０分後、ドーパミン１ニューロン阻害剤SCH-23390およびドーパミン２ニューロン阻害剤、スルピリドを100,10,1mg/kgBW腹腔内に投与し、それから３０分後に先に記述したような方法で「よじ登り行動」に対する効果を測定した。
【００２７】
結果： 100mM塩化ナトリウムで溶出された30-10kDa分画にのみ「よじ登り行動」に対する持久効果が認められた。高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、有効な分画は多糖体で蛋白質ではなかった。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
表１はConA塗布プレートを用いて行ったたばこの活性分画の糖鎖構造を示した。
Fuca1-2Gal,Galb1-4GlcNAc,GalNAc a1-3GalNAc構造に対する発色が認められた。一方、ABA塗布プレートを用いて行ったたばこの活性分画の発色は見られなかった。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
表２は活性分画の「よじ登り行動」に対する効果を示した。用量依存的に持久時間の延長が観察された。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
表３は、ドーパミン２ニューロン阻害剤、スルピルドにより用量依存的にたばこグリコシドの持久時間の延長効果を抑制した。一方、ドーパミン１ニューロン阻害剤、SCH-23390は全く抑制しなかった。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
９日間の前投与実験のうち、１０m g/mlグリコシド投与群のみ有意に自由飲水係数が増していた（表４）。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
投与実験では、グリコシドを添加した群では有意に用量依存的に飲水係数が増大したが、一方ニコチンでは変化がなかった（表５）。本グリコシドはマウスにおいて嗜好性と依存性を誘導した。この結果は喫煙習慣はニコチンではなく、本グリコシドであることを示唆する。高用量のニコチンはドーパミンニューロンを最終的には賦活することを報告したが、10mg/mlの持続投与ではかえって減弱させる。ニコチン投与法は、禁煙療法としては有効かもしれないが、本グリコシドは喫煙依存から回避する療法として有効である。
【００３８】
本グリコシドは以前発表した漢方薬に加えて新規のドーパミン２ニューロンの作用薬である。漢方薬はGalb1-3GlcNAcの基本骨格にO-結合した構造体であるが、本グリコシドはマンノース多糖骨格にＮ−結合構造体であった。漢方薬と比べてその作用用量は２００分の１で有効であった。
【００３９】
本発明は、ヒト喫煙による大脳活動がニコチンによるコリン作動性ニューロンを介する作用ばかりでなく、ドーパミン２ニューロンの直接作用が示唆された。また、ある薬剤はドーパミンニューロンを介して、精神的な依存症を呈することが知られている。これは急性期では現れないが、本グリコシドは喫煙依存性に関与すると考えられる。