(57)【要約】      （修正有）【課題】排他的ではないが、主として、口腔外科の診療での適用のための、骨組織再生で用いるための組成物及びその製造のための方法。【解決手段】処置を受ける患者から採取した血液から得た成長因子に富む血漿（P.R.G.F.）のゲル及び／または自家骨またはリン酸３カルシウムとの混合物を利用する。この組成物は、現在知られている材料及び技術によって得られる結果よりも迅速で効果的に移植部位の再生を促進する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリア材料を伴う若しくは伴わない、自家骨又は他の充填材量の混合物からなる、移植材料で被移植部位が充填される、特に、口腔外科処置に適用可能な、骨組織再生用化合物及びその製造方法であって、
充填材量中で用いられる主要成分が、患者の血液から直接得られる成長因子に富む血漿（Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．）のゲルであり、該ゲルが、再生されるべき空洞を、少なくとも部分的に占有することを特徴とする骨組織再生用化合物及びその製造方法。
【請求項２】
前記血漿ゲルが、単独で空洞全体を完全に占有することを特徴とする請求項１記載の骨組織再生用化合物及びその製造方法。
【請求項３】
前記血漿ゲルを、自家骨のみと混合するか、又は硫酸カルシウムと組み合わせることを特徴とする請求項１記載の骨組織再生用化合物及びその製造方法。
【請求項４】
前記血漿ゲルを、他の骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）若しくは骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）再生材料、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸３カルシウム、再吸収性（ｒｅａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）ハイドロキシアパタイトなどと混合することを特徴とする請求項１記載の骨組織再生用化合物及びその製造方法。
【請求項５】
（ａ）外科手術（ｓｕｒｇｅｒｙ）開始直前及び麻酔薬投与前に、１０％クエン酸３ナトリウムで保存されたチューブに（ｔｏ  ｔｕｂｅｓ  ｃｉｔｒａｔｅｄ  ｔｏ  １０％  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）患者からの血液を採取する工程；（ｂ）１６０〜８００Ｇの間で、６〜７分間、室温で、該チューブを遠心分離して、血液を、最下層の赤血球；中間の生長因子に富む血漿（Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．）；上層の成長因子が乏しい血漿（Ｐ．Ｐ．Ｇ．Ｆ．）の成分に分ける工程；
（ｃ）遠心分離生成物（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の成長因子に富む血漿（Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．）部分を抽出し、それをエッペンドルフチューブ又はガラス試験管に移し、１０％塩化カルシウムを添加し、ゲルが生成する間待つ工程
を含む化合物の製造方法。
【請求項６】
遠心分離生成物から抽出した前記部分が赤血球層の上部を含んでいてもよいことを特徴とする請求項５記載の化合物の製造方法。
【請求項７】
前記血液の抽出物の量が１０〜５０ｍＬであり、５〜１０ｍＬのチューブを用いて、６〜８分間前記遠心分離を行い、エッペンドルフチューブに移されたＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．の量が１ｍＬであり、塩化カルシウムの添加後、前記ゲルが形成される時間が２〜２０分であることを特徴とする請求項１及び５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記塩化カルシウムと共にヒトトロンビンの添加をさらに含むことを特徴とする請求項１及び５記載の製造方法。
【請求項９】
遠心分離器、個々の血漿層（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｌａｙｅｒｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ）を抽出するためのピペット、血液採取のためのシステム、並びに試験管、エッペンドルフチューブ、ピペットの先端（チップ）及び３７℃に加熱する装置を含むことを特徴とする請求項１及び５の化合物製造用キット。
【請求項１０】
被移植部位を充填する移植材料及び該移植材料を覆う別個のバリア材料に基づく、骨組織再生方法であって、
（ａ）成長因子に富む血漿ゲルと種々の粒径のリン酸３カルシウムとの混合物を含む移植材料によって骨空洞を充填する工程；
（ｂ）該移植材料の少なくとも一部を覆うバリア層を配置する工程
を含み、
該バリア材料がＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．から抽出された成長因子、又は骨材料（ｂｏｎｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）と混合されたリン酸３カルシウムからなることを特徴とする骨組織再生方法。
【請求項１１】
前記移植材料が、血小板に富む血漿とリン酸３カルシウムとの混合物であることを特徴とする請求項１０記載の骨組織再生方法。
【請求項１２】
前記移植材料が、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．を伴う若しくは伴わない、自家骨とリン酸３カルシウムとの混合物であることを特徴とする請求項１０記載の骨組織再生方法。
【請求項１３】
前記移植材料が、凍結乾燥された骨とリン酸３カルシウムとの混合物であることを特徴とする請求項１０記載の骨組織再生方法。
【請求項１４】
前記移植材料が、リン酸３カルシウムとそれ以外の前記成分（ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｓａｉｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）の組み合わせからなることを特徴とする請求項１０、１１、１２及び１３記載の骨組織再生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、再生を刺激し促進する移植材料（ｇｒａｆｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）によって骨空洞（ｂｏｎｅ  ｃａｖｉｔｙ）を充填することによる、一般的な外科診療（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）の範囲内、特に、口腔外科診療における骨組織の再生に関する。
【０００２】
現在まで、種々の移植材料が用いられており、用いられた材料の性質が、骨組織がどの様に再生されるかを決定する。
【０００３】
この点に関し、幾人かの著者が、この目的のための、異なる材料及び／又は化合物の使用についての研究を公表し、報告している。
【０００４】
Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｙ，  Ｏｉｄａ  Ｓ，  Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｓｈｉｏｓａ  Ｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓ  （１９８８：  ２３４；  ２４０−９）は、このタイプの再生のための石膏（硫酸カルシウム）と結合された骨由来形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の使用に言及している。
【０００５】
伝統的に、自家骨（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ）及び脱塩された（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｓｅｄ）骨（ＤＦＤＢＡ）の両者は、単独又は他の要素との組み合わせのいずれかで、この技術の範囲内で骨空洞用の移植材料を構築するのに用いられてきた。
【０００６】
さらに、このタイプの移植材料はまた、隣接組織が移植材料へ侵入（ｅｎｃｒｏａｃｈｉｎｇ）することを防止するために、別のバリア材料（ｂａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）で保護されている。
【０００７】
それは生分解性ではなく、場合によっては、感染を引き起こしうるという事実による問題を生じるにもかかわらず、種々の材料が前述の移植材料のためのバリアとして使用されており、最もポピュラーなものは、ポリ−テトラフルオロエチレンメンブランである。これに加え、それは一般に、固体状で用いられるので、手術の間に削られて被移植部位（ｇｒａｆｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ）に合致させ、次いで、所定位置で縫合しなければならない。
【０００８】
米国特許第５，３６６，５０７号明細書には、脱塩された骨と硫酸カルシウムとの混合物に基づく移植材料と、硫酸カルシウムからなるバリア材料とを組み合わせた組成物が特定されている。この組成物は、従前の技術を大きく改善するものではない。
【０００９】
様々な研究で、血液中に見出される成長因子、特に成長因子Ｐ．Ｄ．Ｇ．Ｆ．及びＴ．Ｇ．Ｆ．Ｂ．が、骨形成を促進することが示されている。
【００１０】
しかしながら、これらの成長因子の臨床的に観察可能であり、かつ測定可能な効果であるが（ａｓ  ｉｓ）、外来患者の条件下（ｉｎ  ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において、そのような生長因子を抽出し濃縮するプラクティス（ｐｒａｃｔｉｃｅ）は知られていない。
【００１１】
本発明の特定の実施態様においては、骨空洞（ｂｏｎｅ  ｉｎ  ｃａｖｉｔｉｅｓ）及び骨欠損（ｂｏｎｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ）の充填及び再生のための、又は再生のための移植材料として、成長因子（Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．）に富む血漿ゲル（ａ  ｇｅｌ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）を提供する。
【００１２】
本発明は、外来患者用に用いる因子に富む血漿を取得及び製造する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、改善された再生率を示し、患者に素早く投与できる、骨組織の再生方法及び再生用組成物を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様では、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルの製造に用いられるキットを提供する。
【００１５】
有利には、骨組織再生用のＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルの使用が、現在使われている技術よりも大きな骨再生の促進及び利益（ｂｅｎｅｆｉｔｓ）のみならず、軟組織のより早い及びより予測可能な治癒をもたらすことは、後記する得られた結果から明らかになるであろう。
【００１６】
本発明は、外科手術開始の数分前及び麻酔薬の投与の前に、治療を受ける患者から血液を採取する（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ）ことから始まる、上述のゲルの製造方法を提供する。抗凝血剤として作用する１０％クエン酸三ナトリウム塩を入れた５ｍＬのチューブを用いて、各患者から１０ｍＬ及び４０ｍＬの間の血液を採取した。
【００１７】
このチューブを、（適用されうる各手順に従って）１６０Ｇ及び８００Ｇの間のスピードで、（スピードに応じて）６分未満の間、室温で遠心分離した。血液は、下記の３つの主要成分に分かれる。
・チューブの底に、赤血球細胞。
・赤色の層の上の、チューブの中央に、成長因子に富む血漿（Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．）。
・チューブの上部に、成長因子の乏しい血漿（Ｐ．Ｐ．Ｇ．Ｆ．）。
【００１８】
上部のＰ．Ｐ．Ｇ．Ｆ．の１ｍＬずつを、それぞれ５ｍＬのチューブに廃棄した（ｄｉｓｃａｒｄｅｄ）。このＰ．Ｐ．Ｇ．Ｆ．中に存在する血小板は、ｎ＝１０の検体数で測定したところ（ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｕｎｔ  ｎ＝１０）、１５％未満であった。
【００１９】
チューブの中央層由来の因子に富む血漿を、エッペンドルフチューブに移し、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．がそれぞれ１．２ｍＬ含有されているエッペンドルフチューブに、１０％塩化カルシウム５０ｍＬ（５０  （ｌ）を加え、この状態で血漿を放置することにより、１５〜２５分後にＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルが形成された。また、即座に（３秒及び１０秒の間）ゲルを得て、それを注射器で投与可能にするために、この血漿を、ヒトトロンビン（５００単位）及び塩化カルシウムと混合することもできる。
【００２０】
ゲルを単独で用いて、再生が必要な骨空洞を充填し、最適な結果を得るか、又は、従来のバリア材料の助けをかりて、下記で説明する、外部保護を提供した。
【００２１】
ゲルを、硫酸カルシウム、自家骨、再吸収可能なハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム又は骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）若しくは骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）の他の再生材料（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、などの他の成分と組み合わせることができる。
【００２２】
Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．の製造のための製造キットは、遠心分離機、血漿層の分離のためのピペット及び血液採取のためのシステム（ｓｙｓｔｅｍ）を含むであろう。
【００２３】
患者は、処置によって逆の表示を為しうる、全身性又は局所性の疾患が無いことに基づいて選択した。研究を告知した全患者から同意を得た。２０名の患者は、摘出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を必要とする垂直な骨折（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）又は進行した歯周病（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｉｌｌｎｅｓｓ）を呈し、移植領域（ａｒｅａ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔ）に、さらなる不快感を伴うことなく後に続く生検が可能なので選択した。患者を、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．処置群と対照群とに無作為に分けた。Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．群の平均年齢は４１歳（範囲：３５〜５５歳）、４名の患者が男性で、６名が女性であった。対照群の平均年齢は４２歳（範囲：３８〜５４歳）、４名が男性で、６名が女性であった。
【００２４】
３名の追加の患者（２名の男性及び１名の女性）は、口の異なる場所での複数回の摘出を必要とした。各患者は、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．を１部位に用いるが、その他には用いず、処置のタイプは、無作為にその部位に割り当てた。同じ患者で、同じ外科的処置で、同一の微生物学的条件及び同じ外科医で、両方のタイプの処置を行ったので、これにより、最良の対照群を含めることが可能となった。
【００２５】
全ての患者が、アモキシシリン（１．５ｇ／日）を用いた抗生物質治療を受けた。皮膚弁（ｓｋｉｎ  ｆｌａｐｓ）が持ち上がってきて（ｅｌｅｖａｔｅｄ）十分に目に見えるようになり（ａｌｌｏｗ  ａｄｅｑｕａｔｅ  ｖｉｓｉｂｉｌｉｔｙ）、かつ、最初の試みで傷口がふさがるのを可能にした。
【００２６】
各部位を、摘出後に注意深く解体した（ｓｃｒａｐｅｄ）。実験処置群の１０名の患者で、欠損部位を、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルによって充填した。５つのケースで、血漿を自家骨と混合し、皮膚弁が崩壊するのを防止した。対照群については、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルを用いなかったが、操作は同じであった。いずれの群にも、メンブランは用いず、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．の可能な利益と干渉するバリア効果の可能性を排除した。
【００２７】
生検方法：
被移植部位（ｇｒａｆｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ）を、患者の利用可能性によって、１０週間及び１５週間の間に生検を行った。全ての生検は、いずれの処置が各欠損部位に施されたかを知らない検査員（ｅｘａｍｉｎｅｒ）によって行われた。生検は、被移植部位の中央で、深さ３ｍｍまで、中空の穿孔用歯科用ドリルを用いて採取した。骨生検を、スワブ（ｓｗａｂｓ）上の５％ギ酸中１０％ホルマリンを用いて、４８時間固定し、パラフィン蝋に埋め込んだ（ｍｏｕｎｔｅｄ  ｉｎ）。各生検から厚さ５ｍｍの切片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を作製し、これらをヘマトキシリン及びエオシンで染色した。染色した切片を、明るい光の下で写真撮影した。全ての生検を、どれが対照群に属し、どれが試験実施群を形成するかを特定せずに、分析のための研究室に送った。
【００２８】
結果
Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置した１０名全ての患者での上皮組織の形成を、非常に良好（ｖｅｒｙ  ｇｏｏｄ）又は優秀（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）（通常見られるより非常に良好、及び対照群よりも比較的良好）と評価した。処置領域の再生は、実際には１０例中８例で完全であった。再生の程度を、歯肉消息子（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｐｒｏｂｅ）によって、及び写真撮影しておいた、試験前の欠損との比較によって評価した。これらの領域の生検は、十分に組織化され（ｗｅｌｌ−ｏｒｇａｎｉｓｅｄ）、形態学的に正常な小柱（ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）を有する成熟緻密骨（ｍａｔｕｒｅ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｂｏｎｅ）示した。
【００２９】
Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置したその他の２例では、生検において、まとまりのない小柱（ｂａｄｌｙ  ｏｒｇａｎｉｓｅｄ  ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）を有する結合組織を呈する、部分的な再生を示した。男性１名及び女性１名の患者は、いずれも喫煙者であり、３つの歯槽壁（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｗａｌｌｓ）に主要な欠損を呈した。
【００３０】
１０週間で採取した生検と１６週間で採取した生検との間、及び欠損箇所のサイズ及び形状によっても小柱の組織化の程度に有意な差が有った。皮膚弁が圧潰される（ｃｏｌｌａｐｓｅ）のを防ぐために、自家骨と組み合わせたＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置された主要な欠損を有する患者では、より大きな前庭−舌幅（ｖｅｓｔｉｂｕｌｅ−ｌｉｎｇｕａｌ  ［ａｎｃｈｕｒａｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌｏ−ｌｉｎｇｕａｌｅｓ］）が得られた。
【００３１】
対照群では、患者の生検で同様の状況が見られた。すなわち、結合組織が欠損部位のより大きな部分を満たしており、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置したケースと明瞭に異なっていた。全ての対照群の生検では、結合組織及び骨小柱を含む結合組織が見られた。
【００３２】
成熟した骨は、いずれのケースでも見られなかった。上皮形成の状態は、正常と評価され、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置したケースに対して有意な差を示した。
【００３３】
１箇所以上の被移植部位を有する患者では、１部位をＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置し、それ以外の部位は従来の方法を用いて処置し、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．で処置した範囲は、非常に速く上皮で覆われた。Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．処置領域の生検では、より良好に組織化された小柱及びより進んだ骨再生を有するより成熟した骨が示された。
【００３４】
Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．を用いることによって、より迅速で、より効果的な骨再生のための条件が提供される。このＰ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．ゲルは、取り扱いが容易であるが、生長因子の有効性を保存するために、速やかに使用されなければならない。
【００３５】
最適な投薬量は、まだ決定されていないが、この技術の使用は患者にリスクをもたらすことがなく、患者の血液は、摘出後短時間（３０分〜８時間）で用いられ、動物又はヒト起源の如何なる他の成分とも混合しない。現在までのところ、およそ２５０名の患者が治療され、良好な臨床結果を示した。
【００３６】
硫酸カルシウムは、水、生理食塩水及び局所麻酔液などの、滅菌した生体適合性の液体を用いた適用剤（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を調製する場合、場合によっては、調和性に欠ける（ｌａｃｋ  ｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）ことが、慣習により観察されており、このことは、その適用の際に、崩壊しやすく、かつ非常に溶解しやすいため、取り扱いを難しくしうる。
【００３７】
さらに、それは血液中で素早く希釈され、そのため、その骨組織再生効率が改善される。
【００３８】
実験室での実験の結果は、（リン酸３カルシウムの）使用が、顕著な利点を提供することを示している。
【００３９】
第１に、まさにその本質から、リン酸３カルシウムは、カルシウム含有量が高い。
【００４０】
第２に、リン酸３カルシウム（パテ色の、過飽和溶液）、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．（生長因子に富む血漿）と混合された自家骨、Ｐ．Ｒ．Ｐ．（血小板に富む血漿）、Ｐ．Ｒ．Ｇ．Ｆ．自家骨＋リン酸３カルシウムの、その希釈状態での処置の際の挙動は、それが十分な柔軟性を提供し、取り扱いをより容易にするので、より均一である。
【００４１】
第３に、血液中のリン酸３カルシウムの希釈率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）は、より制限されており、硫酸カルシウムよりも低く、それをバリア材料としてより効果的にする。
【００４２】
上記で指摘したように、骨空洞の充填材料は、本質的に、成長因子に富む血漿のジェルと混合されたリン酸３カルシウム、又はバリアとして用いられる材料がリン酸３カルシウムである条件との他の組み合わせであり得る。
【００４３】
本発明の特定の実施態様では、充填材料のための下記のような他の組み合わせが試験された（いずれもリン酸３カルシウムとの組み合わせ）：
・血小板に富む血漿
・自家骨
・凍結乾燥された骨
・上記のものの混合物
【００４４】
本発明によって提案された組み合わせは、骨組織再生のための作業における仕事を、より扱い易くし、より容易に完全にし、そして、より重要なことは、再生の進行が現在知られている方法又は調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）よりも速いことである。
【外国語明細書】
2005006883.tif 000002
2005006883.tif 000003
2005006883.tif 000004
2005006883.tif 000005
2005006883.tif 000006
2005006883.tif 000007
2005006883.tif 000008
2005006883.tif 000009
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