(57)【要約】【課題】  品質に優れ、かつ保存安定性も優れたリゾホスファチジルグリセロールの製造方法を提供すること。【解決手段】  水系溶媒中で、ＰＬＤの存在下、リン脂質とグリセロールとを反応させて、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含有する水系反応液を調製する工程；該水系反応液に極性溶媒を添加して該ＰＬＤを除去し、ＰＧ含有画分を回収する工程；該画分から極性溶媒を除去し、水系画分を得る工程；該水系画分に、ＰＬＡ２を添加し、リゾＰＧを含有する水系反応液を調製する工程；および、該リゾＰＧを含む水系反応液に低級アルコールを添加してＰＬＡ２を除去し、リゾＰＧを含有する画分を回収する工程；を含む方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水系溶媒中で、ホスホリパーゼＤの存在下、リン脂質とグリセロールとを反応させて、ホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液を調製する工程；
該水系反応液に極性溶媒を添加してホスホリパーゼＤを除去し、ホスファチジルグリセロール含有画分を回収する工程；
該画分から極性溶媒を除去し、水系画分を得る工程；
該水系画分にホスホリパーゼＡ２を添加し、リゾホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液を調製する工程；および、
該リゾホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液に低級アルコールを添加してホスホリパーゼＡ２を除去し、リゾホスファチジルグリセロールを含有する画分を回収する工程；
を含む、リゾホスファチジルグリセロールの製造方法。
【請求項２】
前記極性溶媒が、アセトンおよびエタノールからなる群から選択される少なくとも一つの溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低級アルコールがエタノールである、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水系溶媒を用いるリゾホスファチジルグリセロールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾホスファチジルグリセロールは、スポンジケーキ、パウンドケーキなどの食品に用いられる起泡剤中の起泡力安定剤（特許文献１）、澱粉の老化防止剤（特許文献２）などとして使用されるリン脂質であり、一般に酵素法により製造されている。この酵素法による合成スキームを図１に示す。図１によれば、リン脂質（レシチン）とグリセロール（グリセリンを含む）とをホスホリパーゼＤ（以下、ＰＬＤという）の存在下反応させてホスファチジルグリセロール（以下、ＰＧという）を生成させ（第１段階）、次いで、このＰＧにホスホリパーゼＡ２（以下、ＰＬＡ２という）を作用させ、リゾホスファチジルグリセロール（以下、リゾＰＧという）を得る（第２段階）という２段階の反応で、リゾＰＧが製造される。
【０００３】
第１段階の反応について、種々検討がなされている。例えば、アルキルジエーテルを含む１相の水系溶媒を用いて、ＰＧを製造する方法（特許文献３）；有機溶媒と水との均一相の１相系の溶媒を用いてＰＧを製造する方法（特許文献４）；特定の放線菌に由来するホスホリパーゼＤを用い、単一水性相で反応後、ヘキサン／イソプロパノール／水を用いてＰＧを抽出し、さらに水／イソプロパノールおよび酢酸ナトリウム／イソプロパノールの順で抽出し、ついでシリカゲルカラムによりＰＧを精製する方法（特許文献５）；ＰＬＤとグリセロールとを疎水性担体に固定化し、エーテル類、非極性溶媒などの有機溶媒中でリン脂質からＰＧを製造する方法（特許文献６）；水または一価の金属塩溶液を溶媒として酵素反応させ、反応後、水洗して未反応のグリセリンおよびＰＬＤを濾過または遠心分離で除去する操作を繰返してＰＧを製造する方法（特許文献７）；酢酸エチル、ケトンなどの有機溶媒と水との１相系溶媒を用いてＰＧを製造し、濃縮後、エタノールでＰＧを抽出する方法（特許文献８）；などがある。
【０００４】
第２段階の反応については、ＰＧにＰＬＡ２を作用させ、反応後加熱処理して酵素を失活させた後、濃縮してリゾＰＧを得る方法がある（特許文献９）。
【０００５】
この第１段階と第２段階の反応を一連の反応として行うと、残存するＰＬＤが問題となる。すなわち、ＰＬＤが第２段階の反応に存在すると、最終目的物であるリゾＰＧがリゾＰＡあるいは環状ホスファチジン酸に変換されるということである。また、ＰＬＡ２が最終製品に混入するとリゾＰＧの応用の場面で不都合を生じることがあり、望ましくない。このように、最終製品にＰＬＤおよびＰＬＡ２が残存すると品質の低下、保存安定性の低下を招くという問題がある。
【０００６】
この問題を解消するためには、第１段階の生成物（ＰＧ）からＰＬＤを有効に除去し、第２段階の生成物（リゾＰＧ）からＰＬＡ２を有効に除去することが必要となる。特許文献９には、加熱により、酵素を失活させることが記載されているが、加熱処理では、ＰＧあるいはリゾＰＧが分解され、品質が低下するという問題がある。
【０００７】
上記各先行技術は、ＰＧあるいはリゾＰＧの収率向上を目的としており、特許文献７を除き、ＰＬＤあるいはＰＬＡ２の除去は検討されていない。しかし、この特許文献７の方法は、複数回の水洗を必要とし、工程が複雑である。
【０００８】
このように、一連の反応でリン脂質からリゾＰＧを生産する試みはほとんどなく、いったん、ＰＧを単離し、ついで、この単離したＰＧを用いて、リゾＰＧを製造しているのが現状である。そのうえ、第１段階において、反応溶媒として有機溶媒を用いると、ＰＬＤを容易に除去できないことが、本発明者の研究で明らかとなった。
【特許文献１】特開平３−１２７９５１号公報
【特許文献２】特開平２−２４２６４３号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ８９／０１５２４号公報
【特許文献４】特開昭６３−２４５６８５号公報
【特許文献５】特開２００２−２３２８８号公報
【特許文献６】特開昭６２−２０５７８８号公報
【特許文献７】特開２００３−１６９６９２号公報
【特許文献８】特開平３−２２９９１号公報
【特許文献９】特開平２−２７３５３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような実状に鑑み、本発明は、簡単な方法で、効率よく、保存安定性に優れたリゾＰＧを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、前述の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、２種類の酵素を用いてリン脂質からリゾＰＧを合成する方法において、２段階の酵素反応をそれぞれ水系溶媒で行い、第１段階終了後に極性溶媒処理を行い、第２段階終了後に低級アルコール処理を行うことによって、品質および安定性に優れたリゾＰＧが効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、水系溶媒中で、ホスホリパーゼＤの存在下、リン脂質とグリセロールとを反応させて、ホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液を調製する工程；該水系反応液に極性溶媒を添加してホスホリパーゼＤを除去し、ホスファチジルグリセロール含有画分を回収する工程；該画分から極性溶媒を除去し、水系画分を得る工程；該水系画分にホスホリパーゼＡ２を添加し、リゾホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液を調製する工程；および、該リゾホスファチジルグリセロールを含有する水系反応液に低級アルコールを添加してホスホリパーゼＡ２を除去し、リゾホスファチジルグリセロールを含有する画分を回収する工程；を含む、リゾホスファチジルグリセロールの製造方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様においては、前記極性溶媒がアセトンおよびエタノールからなる群から選択される少なくとも一つの溶媒である。
【００１３】
また、好ましい実施態様においては、前記低級アルコールがエタノールである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、２種類の酵素を用いて、リン脂質からリゾＰＧを２段階反応で合成する方法において、２段階の酵素反応をそれぞれ水系溶媒で行うことでリゾＰＧが効率よく生産され、かつ、第１段階終了後に極性溶媒処理および第２段階終了後に低級アルコール処理という簡単な操作を行うことによって、各酵素が反応系から容易に除去される。従って、加熱処理が不要であるため、得られる合成リン脂質の品質を低下させることがなく、保存安定性に優れる。さらに、最終製品から酵素が除去されているため、最終製品でも品質を低下させることなく、保存安定性の優れる。このように簡単な工程で安定性に優れたリゾＰＧを効率よく得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
酵素を用いて、リン脂質からリゾＰＧを製造する方法は、上記の通り、一般に、図１に示すスキームで表される。この図１のスキームにおいて、ＲおよびＲ’は脂肪酸残基であり、その種類は特に制限はないが、Ｒは、炭素数１４〜２４の飽和または不飽和脂肪酸に由来することが好ましい。このような脂肪酸残基は、直鎖であってもよく、分岐鎖を有していてもよい。
【００１６】
本発明の方法は、上記スキームに従って行われる。本発明の方法の特徴は、図１に示す第１段階の反応を水系溶媒中で行うこと、第１段階終了後の水系反応液について極性溶媒処理を行ってＰＬＤを除去すること、ＰＬＤを除去したＰＧを含む画分を第２段階の水系反応に供すること、そして、第２段階反応後の水系反応液について低級アルコール処理を行うことである。以下、本発明について説明する。
【００１７】
（出発材料：原料リン脂質）
本発明に用いられるリン脂質（原料リン脂質）としては、特に制限はなく、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などが挙げられる。
【００１８】
これらのリン脂質の由来は問わず、植物、動物および微生物由来のリン脂質が用いられる。例えば、卵黄リン脂質、大豆リン脂質、菜種リン脂質などが用いられる。卵黄リン脂質には、ＰＣが７３．０％、ＰＥが１５．０％、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が０．６％含まれている。また、大豆リン脂質にはＰＣが３８．２％、ＰＥが１７．３％、ＰＩが１６．０％含まれている（いずれも、新食品機能素材の開発、太田明監修、シーエムシー社、１９９６年）。従って、卵黄リン脂質、大豆リン脂質、菜種リン脂などは、出発材料として有用である。
【００１９】
このような卵黄リン脂質、大豆リン脂質、菜種リン脂質などは、高度に精製されたものでなくともよい。例えば、リン脂質以外にタンパク質、糖脂質、多糖類、塩類などの成分を含有している粗抽出物あるいは粗精製物を出発原料とする場合であっても、これらの成分が酵素反応を阻害しない程度に含まれていれば、原料リン脂質として、用いられる。また、化学的にあるいは酵素学的に合成されたリン脂質も原料リン脂質として用いることができる。１０〜９９．５質量％のアセトン不溶物を有するリン脂質が好ましく用いられる。界面活性剤を使用しない本発明においては、リン脂質のアセトン不溶物は５０〜９５質量％であることが、さらに好ましい。
【００２０】
（ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ））
ＰＬＤは、ホスファチジル基転移活性を有する、リン脂質の塩基部分とグリセロールとのエステル交換を行い得る酵素である。本発明に用いられるＰＬＤとしては、植物由来のＰＬＤ（例えば、キャベツのＰＬＤ）、微生物由来のＰＬＤ（例えば、ストレプトマイセス属(Streptomyces)に属する放線菌が生産するＰＬＤ）などが好ましく用いられる。中でも、ストレプトマイセス・シンナモネウム (Streptomyces cinnamoneum)が生産するホスホリパーゼＤが好適に用いられる。この微生物が生産するＰＬＤは、分子量約５４，０００であり、至適ｐＨは５〜６、至適温度は４０〜６０℃である (Chiaki 0gmoらJ.Biol.Chem. 125巻、263‐269頁(1999))。
【００２１】
（ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２））
ＰＬＡ２は、ＰＧをリゾＰＧに変換し得る酵素である。ＰＬＡ２としては、動物（例えば、ブタの膵臓）由来の酵素、微生物由来の酵素などが挙げられる。ブタ膵臓に由来する酵素としては、ノボザイムズジャパン(株)製のレシターゼ１０Ｌが挙げられる。微生物由来の酵素としては、ナガセケムテックス社製のＰＬＡ２（商品名：ホスホリパーゼＡ２ナガセ）が挙げられる。これらの酵素の至適ｐＨは７〜９、至適温度は４０〜６０℃である。
【００２２】
（水系溶媒）
本発明に用いられる水系溶媒とは、水および水性の緩衝液をいう。水としては、イオン交換水、精製水、または蒸留水を用いることが好ましいが、水道水も使用できる。水性の緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが好ましく用いられる。これらの水または緩衝液のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに応じて、調整すればよい。
【００２３】
（リン脂質からのリゾＰＧの製造）
（１）第１段階の反応：リン脂質からのＰＧの生成
リン脂質からのＰＧの製造には、水系溶媒にリン質、グリセロールおよびＰＬＤを分散あるいは溶解させた水系反応液を用いる。水系溶媒としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が好ましく用いられる。ｐＨは３〜１０、好ましくは７〜８．５に調整する。
【００２４】
リン脂質の濃度は特に制限はないが、３０質量／容量％（以下、ｗ／ｖ％）以下が好ましく、１０〜２０ｗ／ｖ％がより好ましい。グリセロールはリン脂質に対して、モル比でグリセロール：リン脂質＝０．５〜１０：１の割合で、好ましくは３〜５：１の割合で使用される。
【００２５】
使用するＰＬＤの量は、用いるリン脂質の種類に応じて決定すればよい。レシチンを例にとると、２〜１００００Ｕ／ｇレシチン、好ましくは１０〜１５０Ｕ／ｇレシチンの割合で使用される。その他のリン脂質の場合も、同様の量が使用される。なお、ＰＬＤの１Ｕは、ホスファチジルコリン（レシチン）を基質とし、３７℃、１分間で１μｍｏｌのコリンを遊離させるのに必要な酵素量をいう。
【００２６】
水系反応液を３０〜７０℃、好ましくは４０〜５５℃に維持し、酵素反応が行われる。反応時間に特に制限はないが、雑菌の混入および生育を考慮すると、１〜１２時間であることが好ましく、３〜５時間であることが、より好ましい。
【００２７】
（２）極性溶媒処理
第１段階の反応でＰＧが生成したことを確認した後、水系反応液を極性溶媒で処理する。極性溶媒としては、例えばアセトン、酢酸エチル、炭素数が１〜５の低級アルコールなどの溶媒、あるいはこれらの混合溶媒が好ましく用いられる。なかでも、アセトンおよびエタノールが好ましく用いられる。極性溶媒は、水系反応液の容量の０．５〜１０倍量、好ましくは２〜３倍量添加される。水系反応液を予め濃縮しておき、極性溶媒を添加してもよい。極性溶媒を添加後、４〜７０℃、好ましくは４〜５０℃で、適切な時間（例えば２時間）攪拌する。極性溶媒処理により、ＰＬＤが失活し沈澱を生じる。沈澱は、遠心分離あるいはろ過などによって、除去し得る。沈澱の除去をろ過で行う場合、活性白土、セライト、シリカゲル、活性炭などのろ過助剤を用いることが好ましい。
【００２８】
（３）極性溶媒の除去
遠心分離の上清あるいはろ液は回収され、減圧あるいは凍結乾燥により、極性溶媒を除去し、必要に応じて、濃縮される。極性溶媒を除去することにより、次の第２段階の反応を水系溶媒で行うことができる。
【００２９】
（４）第２段階の反応：ＰＧからのリゾＰＧの生成
極性溶媒が除去された、ＰＧを含む水系の液に、ＰＬＡ２を添加して水系反応液を調整する。水系反応液中のリン脂質の濃度は第１段階と同程度に調整する。水系反応液のｐＨは、４〜１１、好ましくは７〜９に調整される。また、ＰＬＡ２の活性化因子として、適量（例えば、１０ｍＭ）の塩化カルシウムを添加してもよい。
【００３０】
使用するＰＬＡ２の量には特に制限はなく、１００〜１００００Ｕ／ｇＰＧ、好ましくは１０００〜３０００Ｕ／ｇＰＧである。ＰＧの代わりに第１段階で用いたリン脂質を基準にＰＬＡ２の使用量を決定してもよく、この場合でも、上記活性単位数（Ｕ）が適用される。なお、ＰＬＡ２の１Ｕは、ホスファチジルコリン（レシチン）を基質とし、３７℃、１分間で１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させるのに必要な酵素量をいう。
【００３１】
水系反応液を２０〜９０℃、好ましくは４０〜５５℃に維持し、酵素反応が行われる。反応時間に特に制限はないが、３０分〜１２時間であることが好ましく、５〜８時間であることが、より好ましい。
【００３２】
（５）低級アルコール処理
リゾＰＧの生成が確認された水系反応液に低級アルコールを添加する。低級アルコールとしては、炭素数が１〜５のアルコールが好ましく用いられ、エタノールが最も好ましく用いられる。低級アルコールは、水系反応液の容量の２〜１０倍、好ましくは３〜５倍量添加される。予め、水系反応液を濃縮した後、低級アルコールを加えることもできる。この処理により、リゾＰＧは低級アルコールに抽出される。沈澱は、遠心分離あるいはろ過などによって、除去し得る。沈澱の除去をろ過で行う場合、活性白土、セライト、シリカゲル、活性炭などのろ過助剤を用いることが好ましい。ＰＬＡ２は、沈澱として除去されるか、ろ過助剤で吸着され得る。
【００３３】
（６）リゾＰＧの精製
遠心分離の上清あるいはろ液は回収され、減圧あるいは凍結乾燥により、低級アルコールを除去する。減圧濃縮は、４０〜７０℃で、好ましくは５５〜６０℃で行われる。得られた濃縮液からのリゾＰＧの回収は、例えば、ヘキサン、ヘプタンなどの非極性有機溶媒による抽出、アセトンによる結晶化などの方法により、行われる。また、リゾＰＧは塩化カルシウムなどの金属塩を用いて沈澱として回収され得る。脂肪酸の量が多い場合、アセトンで結晶化することによって、脂肪酸が除去でき、同時に精製が行われる。従って、アセトンを用いることが好ましい。また、抽出あるいは回収後、さらに、シリカゲルなどによるクロマトグラフによる精製を行ってもよい。
【００３４】
このようにして得られるリゾＰＧは、ＰＬＤ、およびＰＬＡ２などのリン脂質の塩基交換反応あるいは加水分解に関する酵素が除去されているので、長期にわたって安定に保存が可能である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
【００３６】
（実施例１）
５ｇのレシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（ツルーレシチン工業（株）製）および３ｇのグリセロールを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に分散し、１００ｍｌに調整して、４０℃、３０分間、プレインキュベートした。この分散液にホスホリパーゼＤナガセ（ナガセケムテックス（株）製）１５０００Ｕ（３０００Ｕ／ｇレシチン）を溶解し、水系反応液を調製し、４０℃、３時間反応させた。
【００３７】
反応終了後、水系反応液に３００ｍｌのアセトンを加え、室温で３０分間、攪拌した。遠心分離（８５００×ｇ）にて沈澱を分離し、上清３７５ｍｌを回収した。この上清を６０℃で減圧濃縮し、アセトンを除去して、約１００ｍｌの分散液とした。ＮａＯＨでこの分散液のｐＨを８．５に調整し、５ｍＭの濃度となるように塩化カルシウムを加え、さらにホスホリパーゼＡ２ナガセ（ナガセケムテックス（株）製）を１２０００Ｕ（２４００Ｕ／ｇレシチン）となるように添加し、水系反応液を調製した。攪拌下、４５℃、５時間反応を行った。反応液を凍結乾燥して、エタノールを１５０ｍｌ添加して、室温で２時間攪拌した。セルパウダー０．５ｇを加えて軽く攪拌した後、Ｎｏ．２ろ紙でろ過し、１３５ｍｌのろ液を得た。このろ液を６０℃にて、約３０ｍｌまで減圧濃縮した。この濃縮液中には、リゾＰＧが８．２質量％（全リン脂質に対する質量比６０％）および遊離脂肪酸が約１．６質量％含まれていた。また、この濃縮液の一部について、ＰＬＤ活性およびＰＬＡ２活性を測定したが、検出されなかった。
【００３８】
（実施例２）
１０ｇのレシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（ツルーレシチン工業（株）製）および１０ｇのグリセロールを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に分散し、１００ｍｌに調整して、５０℃、３０分間、プレインキュベートした。この分散液にホスホリパーゼＤナガセ（ナガセケムテックス（株）製）２５０００Ｕ（２５００Ｕ／ｇレシチン）を溶解し、水系反応液を調製し、４０℃、２時間反応させた。
【００３９】
反応終了後、水系反応液に５００ｍｌのエタノールを加え、室温で３０分間、攪拌したた後、セライト１ｇを添加した。Ｎｏ．２ろ紙を用いて吸引ろ過し、沈殿を除いた。ろ液を６０℃で減圧濃縮し、約９６ｍｌの濃縮液を得た。ＮａＯＨでこの濃縮液のｐＨを８．８に調整し、６ｍＭの濃度となるように塩化カルシウムを加え、さらにホスホリパーゼＡ２ナガセ（ナガセケムテックス（株）製）を３００００Ｕ（３０００Ｕ／ｇレシチン）となるように添加し、水系反応液を調製した。攪拌下、４５℃、３時間反応を行った。この水系反応液にエタノールを３００ｍｌ添加して、３０℃で１時間攪拌した後、セライト１ｇを加えて軽く攪拌し、Ｎｏ．２ろ紙でろ過し、３８５ｍｌのろ液を得た。このろ液を凍結乾燥した後、１００ｍｌのアセトンで３回洗浄し、真空乾燥し、純度約８９％のリゾＰＧ粉末４．２ｇを得た。この粉末には、ＰＬＤ活性およびＰＬＡ２活性は検出されず、遊離脂肪酸も０．５質量％以下であった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、リゾＰＧの製造を水系反応で行い、かつ製造に用いる酵素を加熱などの方法によらず簡単に除去できる。そのため、食品をはじめ各種産業分野において使用される、高品質かつ保存安定性に優れたリゾＰＧの効率よい製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】酵素法によるリゾホスファチジルグリセロールの合成スキームである。
【図１】
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