(57)【要約】【課題】    蛍光物質やタンパク質の非特異吸着が従来のバイオチップよりも低減されたバイオチップ及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  バイオチップは、炭素基板上に、アミンを介して親水性スペーサーの一端が結合され、親水性スペーサーの他端に所望の生体関連物質が結合されて成る。バイオチップの製造方法は、炭素基板に、一般式[I] X-A-NH-CHR1-COOH（ただし、Ａは親水性スペーサー、Ｘは保護されたアミノ基、R1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基）のαアミノ酸と、一般式[II] R2CHO（ただし、R2は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）で示されるアルデヒドとを反応させて、前記親水性スペーサーを炭素基板に結合させる段階と、次いで、前記Ｘを脱保護して前記生体関連物質を結合する段階を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素基板上に、アミンを介して親水性スペーサーの一端が結合され、該親水性スペーサーの他端に所望の生体関連物質が結合されて成るバイオチップ。
【請求項２】
前記アミンがピロリジン環であり、前記親水性スペーサーは該ピロリジン環の窒素原子に結合されている請求項１記載のバイオチップ。
【請求項３】
前記親水性スペーサーがポリオキシエチレン鎖である請求項１又は２記載のバイオチップ。
【請求項４】
前記ポリオキシエチレン鎖の分子量が２００００以下である請求項３記載のバイオチップ。
【請求項５】
前記生体関連物質がペプチド又は標識ペプチドである請求項１ないし３記載のバイオチップ。
【請求項６】
前記ペプチドが-S-C-結合を介して前記親水性スペーサーに結合されている請求項５記載のバイオチップ。
【請求項７】
炭素基板に、一般式[I] X-A-NH-CHR1-COOH（ただし、Ａは親水性スペーサー、Ｘは保護されたアミノ基、R1は水素または炭素数１〜４のアルキル基を表す）で示されるαアミノ酸と、一般式[II] R2CHO（ただし、R2は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）で示されるアルデヒドとを反応させて、前記親水性スペーサーを炭素基板に結合させる段階と、次いで、前記Ｘを脱保護して前記生体関連物質を結合する段階を含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項８】
前記一般式[I]中のR1が水素あるいはアルキル基、XがBoc-NH-（ただし、Bocはターシャリブチルオキシカルボニル基）であり、一般式[II]中のR2が水素原子である請求項７記載の方法。
【請求項９】
炭素基板上に、アミンを介して親水性スペーサーの一端が結合された、請求項１記載のバイオチップの作製用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上にペプチドや核酸等の所望の生体関連物質を固定化したバイオチップ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、検体中の被検生体関連物質の検出又は定量のために、基板上にDNAのような核酸や、抗原又は抗体を固定化したバイオチップが用いられている。本願発明者は、先に、化学合成したペプチドを固定化したペプチドチップを発明した（国際公開WO02/090985)。これらの公知のバイオチップでは、基板としては主としてガラス基板が用いられている。核酸等を共有結合にて基板に結合するのに適したガラス基板として、ガラス板を直接アミノ化した商品が知られている。たとえばCorning社からCMT-GAPSコートスライドとして市販されている。
【０００３】
一方、バイオチップを用いた被検物質の検出又は定量のために、しばしば蛍光標識が用いられる。しかしながら、蛍光標識の多くは、ガラス基板に吸着されやすいという問題がある。また、タンパク質もガラス基板に吸着されやすい。蛍光標識やタンパク質が非特異的にガラス基板に吸着すると、検出を目的とする場合にはバックグランドが上がり、検出感度が低下する。定量を目的とする場合には大きな誤差の原因となり、正確な定量ができなくなる。
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報WO02/090985
【特許文献２】特開2002-211954号公報
【非特許文献１】J. Org. Chem. 2001, 66, 4915-4920
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、蛍光物質やタンパク質の非特異吸着が従来のバイオチップよりも低減されたバイオチップ及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者は、鋭意研究の結果、基板として、炭素材料あるいは炭素をコーティングして基板としたものを用い、かつ基板上に固定化すべき生体関連物質を基板に直接固定化するのではなく、アミン及び親水性スペーサーを介して基板に結合することにより蛍光物質やタンパク質の非特異吸着を低減することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、炭素基板上に、アミンを介して親水性スペーサーの一端が結合され、該親水性スペーサーの他端に所望の生体関連物質が結合されて成るバイオチップを提供する。また、本発明は、炭素基板に、一般式[I] X-A-NH-CHR1-COOH（ただし、Ａは親水性スペーサー、Ｘは保護されたアミノ基、R1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基）のαアミノ酸と、一般式[II] R2CHO（ただし、R2は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）で示されるアルデヒドとを反応させて、前記親水性スペーサーを炭素基板に結合させる段階と、次いで、前記Ｘを脱保護して前記生体関連物質を結合する段階を含む上記本発明のバイオチップの製造方法を提供する。さらに、本発明は、炭素基板上に、アミンを介して親水性スペーサーの一端が結合された、上記本発明のバイオチップの作製用チップを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、蛍光物質やタンパク質の非特異吸着が従来のバイオチップよりも低減されたバイオチップ及びその製造方法が提供された。本発明のバイオチップを用いると、蛍光物質やタンパク質の非特異吸着が低減されているので、公知のバイオチップを用いる場合に比べて、より正確に被検物質を定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のバイオチップでは、基板として炭素基板を用いる。ここで、「炭素基板」とは、少なくとも表面が炭素原子から成る基板を意味し、例えば、グラファイトから成る基板や、金属基板やガラス基板の表面をカーボンコーティングしたものを挙げることができる。なお、カーボンコーティングの方法は周知であり、例えば電子線マイクロアナライザーで表面解析をする場合しばしば炭素コーティングが行われており、特許文献２にもカーボンコーティングの方法が記載されている。さらに市販もされている（例えば東洋鋼鈑社から市販）。また、グラファイトの基板はコンピュータの記録媒体などに広く用いられている物質であり、板状の物が市販もされている。（例えば、燃料電池用に開発したガラス状カーボン板が昭和電工株式会社からＳＧカーボン板として市販されている）。なお、基板の形状は必ずしも平板状に限定されるものではなく、平板上に微小な凹部や溝を形成したものであってもよいし、マイクロプレートのウェル等も基板として利用することができる。マイクロプレートのウェルを基板として利用する場合には、各ウェルの内壁がそれぞれペプチド固定化基板を構成する。なお、炭素基板は、レーザー光線を照射することにより、容易に加工することができるので、溝や穴等を形成しやすいという利点もある。
【００１０】
本発明のバイオチップでは、上記炭素基板にアミンを介して親水性スペーサーの一端が結合される。ここで、親水性のスペーサーとしては、親水性の構造であれば特に限定されるものではなく、好ましい例として、ポリオキシエチレン鎖やポリオキシプロピレン鎖のようなポリオキシアルキレン鎖（ただし、アルキル基の炭素数は好ましくは２〜４）、等を例示することができる。これらのうち、ポリオキシエチレン鎖が原料入手価格などから特に好ましく、また、ポリオキシエチレン鎖の分子量は２００００以下が好ましい。オキシエチレンユニットの数は、１以上であればよいが、親水性を獲得するため３以上が好ましい。
【００１１】
上記親水性スペーサーは、アミンを介して上記炭素基板に結合される。ここで、アミンを介するのは、親水性スペーサーの一端にアミノ基を配置し、このアミノ基を利用して炭素基板に親水性スペーサーを結合するからである。アミンとしては、ピロリジン環が好ましく、前記親水性スペーサーは該ピロリジン環の窒素原子に結合されることが好ましい。このピロリジン環を構成する炭素原子のうち、２個の炭素原子が炭素基板を構成している炭素原子である。このようなピロリジン環を介する結合は、親水性スペーサーのαアミノ酸誘導体とアルデヒドを炭素基板と反応させることにより達成することができ、この反応については後で詳述する。
【００１２】
上記親水性スペーサーの他端には、所望の生体関連物質を結合することができる。生体関連物質としては、各種ペプチド（糖や脂質と複合したものや標識されたペプチドを包含する）、核酸、多糖類等を挙げることができ、通常、検体中の標的物質と相互作用（結合等）する性質を有するものである。特に、国際公開WO02/090985に記載されたような、化学合成したペプチドを好ましい例として挙げることができる。このような生体関連物質を結合（固定化という）した基板を、本明細書では「バイオチップ」と呼んでおり、好ましい例として、多種類の生体関連物質をアレイ状に固定化したペプチドチップ、DNAチップ、免疫測定用チップ等が包含される。
【００１３】
上記生体関連物質は、前記親水性スペーサーの他端に、アミノ基やカルボキシル基のような官能基を配置しておき、これを直接あるいは、一旦ブロモアセチル化し、固定化したい分子中のシステインの-SH基（スルフィドリル基）と特異的に反応させることによって位置特異的な固定化が可能である。生体関連物質を親水性スペーサーの他端に結合する反応は後で詳述する。
【００１４】
アミンを介して親水性スペーサーを炭素基板に結合させる好ましい方法として、炭素基板に、一般式[I] X-A-NH-CHR1-COOH（ただし、Ａは親水性スペーサー、Ｘは保護されたアミノ基、好ましくはBoc-NH-、R1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基を表す）で示されるαアミノ酸と、一般式[II] R2CHO（ただし、R2は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基、好ましくは水素原子を表す）で示されるアルデヒドとを反応させて、前記親水性スペーサーを炭素基板に結合させる方法を挙げることができる。これを化学反応式で示すと次のようになる。
【００１５】
【化１】
2005091245.tif 000002
【００１６】
なお、上記反応式中、
【００１７】
【化２】
2005091245.tif 000003
【００１８】
は、炭素基板の表面の炭素原子を示す。
【００１９】
上記の反応は、例えば、トルエン、キシレン及びベンゼン等の溶媒、好ましくはトルエン中、一般式[I]で示されるαアミノ酸と一般式[II]で示されるアルデヒドとを好ましくは還流下、好ましくは１分間〜３６０分間程度反応させることにより行うことができる。一般式[I]で示されるαアミノ酸と一般式[II]で示されるアルデヒドの混合比率は、モル比で１：１〜１：１０程度が好ましく、また、反応開始時における反応混合物中の一般式[I]で示されるαアミノ酸の濃度は、通常、１mM〜１００mM程度が適当である。なお、このような反応自体は公知であり、上記非特許文献１に記載されている。
【００２０】
なお、上記一般式[I]で表される出発物質は、公知の方法により製造することができる（非特許文献１参照）。例えば、NH2-A-NH2で表される親水性スペーサーのジアミノ化物の一方のアミノ基をBoc（ターシャリブチルオキシカルボニル基）等により保護し、これに一般式[III] Y-R1-COOR3（ただし、R1は一般式[I]中のR1と同義、R3は、ベンジル基あるいはアリル基、Ｙはハロゲン、好ましくは臭素）で表されるハロゲン化エステルを反応させて一般式[IV] X-A-NH-CHR1-COOR3とし、これにPd/C等の水素添加触媒を用いて水素添加することにより得ることができる。この方法の各工程の好ましい具体的な条件は、下記実施例に記載されている。
【００２１】
上記のようにして親水性スペーサーを炭素基板に結合した後、Xを脱保護して所望の生体関連物質を結合させる。Xの脱保護は、例えばトリフルオロ酢酸を作用させる等の周知の方法により容易に行うことができる。脱保護により得られるアミノ基に、所望の生体関連物質を直接結合してもよいし、他の構造を介して間接的に結合してもよい。例えば、下記実施例に示すように、脱保護後のアミノ基にハロゲン化酸無水物を反応させてハロゲン化アミドを形成させ、一方、所望のペプチドの固定化予定位置にCys(SH)を結合させ、これらを反応させることにより-S-C-結合を介して所望のペプチドを親水性スペーサーの他端に結合することができる。この方法の各工程の好ましい具体的な条件は、下記実施例に記載されている。
【００２２】
保護されたアミノ基を脱保護後、所望の生体関連物質を、市販のアレイヤーを用いてスポットし、上記のように反応させることにより、ペプチドチップやDNAチップのようなマイクロアレイを作製することができる。
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例中、次の略号はそれぞれ次の意味を示す。
NMP: N-メチルピロリドン
POE:ポリオキシエチレン
TFA:トリフルオロ酢酸
DCM: メチレンクロライド
DIC:  ジイソプロピルカルボジイミド
【実施例１】
【００２４】
下記のスキームに従い、グラファイト基板上に各種ペプチドをアレイ状に固定化した。
【００２５】
【化３】
2005091245.tif 000004
【００２６】
１．  ペプチド固定化用ブロモアセチル化（BrAc化）グラファイトプレートの調製
(A)モノN-Boc保護ジアミンの合成
【００２７】
表１
試薬:
2005091245.tif 000005
【００２８】
操作:
(1)  ポリオキシエチレンジアミンを1000mlのナスフラスコに入れ150mlの1,4-ジオキサンに溶かした。
(2)  (Boc)2Oを150mlの1,4-ジオキサンに溶かし上記溶液に加えスターラーで24時間撹拌した。
(3)  ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。
(4)  残査に250mlの水を加え不溶物をろ過した。
(5)  ろ液からDCM（250mlX３）で抽出した。
(6)  DCM溶液をH2O (50mlX2)で洗浄後、MgSO4で乾燥した。  
(7)  MgSO4をろ過、濃縮後目的物をNMRで確認した。
【００２９】
結果:
5.95g (収率70.0%)のモノBoc保護ジアミンが得られた。
NMR (CDCl3, TMS): 1H, δ 1.12 (br), 1.19 (s), 2.63 (t), 3.07 (m), 3.28 (t), 3.31 (t), 3.38 (s) and 5.28 (br).
【００３０】
(2) グリシンベンジルエステルの合成
【００３１】
表２
試薬
2005091245.tif 000006
【００３２】
操作:
(1)  モノN-Boc保護ジアミンを100mlのナスフラスコに入れ50mlの1,4-ジオキサンに溶かし0℃に冷やした。
(2)  ブロモ酢酸ベンジルの1,4-ジオキサン溶液を上記溶液に1時間かけて滴下し、その後一晩撹拌した。
(3)  ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。
(4)  残査に20mlの水を加え酢エチ(20mlX3)で抽出した。
(5)  有機層をNa2SO4で乾燥した。
(6)  濃縮後、残査をカラムクロマトグラフィー (EtOAc/pet. Ether=1/1)で精製し目的物をIRとNMRで確認した。
【００３３】
結果:
1.49g (収率70.0%)のグリシンベンジルエステルが得られた。
FT-IR: cm-1 3347, 2871, 1712, 1512, 1458, 1368, 1248, 1175, 966, 865, 747, 701.
NMR (CDCl3, TMS): 1H, δ 1.41 (s), 2.78 (t), 3.28 (m), 3.46-3.51 (m), 3.51-3.59 (m), 5.15 (s), 5.21 (bs), and 7.32 (m).
【００３４】
(C)αアミノ酸の合成
【００３５】
表３
試薬: 
2005091245.tif 000007
【００３６】
操作:
(1)  グリシンベンジルエステルを50mlのナスフラスコに入れ10mlのMeOHに溶かした。
(2)  上記溶液に5mgの10%Pd/Cを加え水素雰囲気下で24時間撹拌した。
(3)  セライトろ過で触媒を除去後、濃縮した。
(4)  残査をエーテルに加え白色の固体沈殿物を得た。目的物をIRとNMRで確認した。
【００３７】
結果:
1.28g (収率90.0%)のαアミノ酸が得られた。
IR: cm-1 3250, 2970, 1706, 1620, 1540, 1365, 1115, 686, 590, 480.
NMR (CDCl3, TMS): 1H, δ 1.40 (s), 3.22 (m), 3.49 (t), 3.53-3.64 (m), 3.79 (bt), 5.54 (bt), 6.23 (bs), and 8.21 (bs).
【００３８】
(D)ポリオキシエチレンピロリジン誘導体コートグラファイトプレートの作製
【００３９】
表４
試薬:
2005091245.tif 000008
【００４０】
操作:
(1)  200mlのナスフラスコにαアミノ酸、ホルムアルデヒド、トルエン、グラファイトプレートを入れ、1時間還流した。
(2)  上記溶液を室温に戻した後、グラファイトプレートを取り出し、トルエン、メタノールで洗浄した。
(3)  グラファイトプレートを50％トリフルオロ酢酸(TFA)のDCM溶液に浸漬して3時間しんとう撹拌した。
(4)  グラファイトプレートをトルエンで洗浄後、デシケータに入れ減圧乾燥させた。
【００４１】
(E) ポリオキシエチレンピロリジン誘導体コートグラファイトプレートのブロモアセチル化
【００４２】
表５
試薬:
2005091245.tif 000009
【００４３】
操作:
(1)  ブロモ酢酸、DICをNMPに溶解し室温で60分間インキュベートし、ブロモ酢酸無水物を形成させた。
(2)  (1)の溶液にグラファイトプレートを室温で２時間浸し、ブロモ化させた。
(3)  (2)のグラファイトプレートをMilli Q（商標）水で洗浄し、窒素で乾燥させた。
【００４４】
(F) アミノ化基板（プレート）へのペプチド誘導体の固定化
蛍光標識したアレイ用ペプチド（デザインし化学合成したもの。一端にシステイニル残基Cys(SH)を有する。具体的な配列は、H-Cys-Gly-Lys(TAMRA)-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys(FAM)-Gly-NH2)（ただし、「TAMRA」はテトラメチルローダミン、「FAM」はカルボキシフルオレセインで、いずれも蛍光色素）をアセトニトリルー水（70:30 v/v）に溶解し1μMの濃度とし、500 nLを上記プレートにスポットした。室温で減圧乾燥した後、プレートを0.1%  システイン水溶液に１０分間浸してスポットのない部分をブロックした。プレートをミリQ（商標）水で洗浄し、乾燥してスキャナーで蛍光強度を測定し、標識ペプチド誘導体がプレートに固定化されたことを確認した。このようにして調整したプレートをバイオチップ（ペプチドチップ）として用い、特許文献１記載の種々のタンパク質溶液、すなわち、1. α-アミラーゼ from Aspergillus oryzae、2. 牛血清アルブミン (BSA), 3. β-グルコシダーゼ from Almonds,4.β-ガラクトシダーゼ from Aspergillus oryzae, 5. リゾチーム from Chicken egg white, 6. セルラーゼ from Aspergillus niger, 7. β-ラクトグロブリン from Bovine milk, 8. アーモンド粉（タンパク質混合物）、9. 1−7の混合物、10.  大腸菌可溶性タンパク質（細胞破砕液））の種類分（10本）に浸した後再び蛍光強度を測定し、フィンガープリント法（特許文献１）で可視化し、解析を行った。その結果、本手法でタンパク質の解析が可能であることが示された。
【実施例２】
【００４５】
非特異吸着の抑制効果
標識ペプチド、タンパク質および蛍光標識試薬の吸着性をテストするためにBSAウシ血清アルブミンをタンパク質の例とし、これを蛍光標識した。タンパク質の蛍光標識は一般に知られた手法、すなわち蛍光試薬の活性エステル（たとえばMolecular Probe 社で市販）をタンパク質に加え、ゲル濾過で残存蛍光試薬を除去することによって得た。本実験ではSephadex G25（商品名）を用いた。TAMRAやFAMで標識したBSAを緩衝液PBSに溶解し10μMの液とし、段階的に希釈して基板上添加（スポット）した。その結果、タンパク質もペプチドも1μMの濃度の液として基板に添加した場合効果の違いがもっとも顕著であった。なお、本発明の表面加工をした基板は、上記スキーム中の(4)の段階のものであった。
【００４６】
単なる付着（吸着）と洗浄効果を検討するため化学的に修飾した物ではない単なるガラスおよび炭素基板を共有結合ではない比較に用いた。蛍光検出には、蛍光スキャナーおよびUVライトを用い、洗浄時間と回数で蛍光強度の変化を追跡した。
【００４７】
蛍光標識BSAの添加では30分PBS緩衝液で５回洗浄したのち蛍光強度を比較したところ、本発明の表面加工をした基板ではしていない基板の約1/5に減少した。ペプチドでは1/10であった。
【配列表】
2005091245000001.app