(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、天然物由来のエンドセリン−１産生抑制剤を提供することである。【解決手段】  本発明は、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有する植物抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤、ならびに、クダモノトケイソウの抽出物、特に果皮抽出物または果肉抽出物、を含有するエンドセリン−１産生抑制剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
【請求項２】
ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有する植物抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
【請求項３】
クダモノトケイソウの抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
【請求項４】
クダモノトケイソウの抽出物が、果皮抽出物または果肉抽出物である請求項３に記載のエンドセリン−１産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧症、心臓病、シミ、ソバカスなどの疾患の治療または予防に利用できるエンドセリン−１産生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン−１は血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドであり、21残基のアミノ酸からなる。エンドセリン−１は血管内皮細胞に存在するエンドセリン変換酵素の働きによりビッグエンドセリンから生成される。エンドセリン−１は、標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン−１の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの疾患の原因となる。従って、エンドセリン−１の産生を抑制することができれば高血圧症などの疾患を治療または予防することができる。
【０００３】
エンドセリン−１はまた、血管以外の種々の組織細胞でも産生され、様々な生理的役割を担っている。例えば、紫外線が肌にあたるとエンドセリン変換酵素が活発に働き、ケラチノサイトにあるビッグエンドセリンが分解されてエンドセリン−１が産生されるのであるが、こうして産生されたエンドセリン−１は、メラノサイトを刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。従って、エンドセリン−１の産生を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる。
【０００４】
高血圧症、心臓病、シミ、ソバカスを治療または予防する薬剤は市場において必要とされている。なかでも、高血圧症は、長期間放置すると心血管系に強い負担がかかり、動脈硬化が進行し、脳梗塞、心臓病などの症状を引き起こす重大な疾患であり、血圧が140/90 mmHg以上の高血圧症の患者は日本全国で約3,000万人と推定され、４人に１人、５０歳以上では２人に１人が高血圧症とされることから、高血圧症の治療または予防のための薬剤は切望されている。
【０００５】
かかる市場の要求に応えるべく、エンドセリン−１産生抑制剤が研究されてきた。従来エンドセリン−１産生抑制剤として検討されたものは化学合成品が中心であるが、安全性を考慮すれば天然物で同様の効果を有するものが望まれる。これまでに天然物として、赤ワイン抽出物に含まれるポリフェノール（ピセアタンノール、デルフィニジンなど）（非特許文献１参照）、および大豆イソフラボン（ゲニステイン）（非特許文献２参照）が血管内皮細胞エンドセリン−１の産生抑制剤として検討されてはいるものの、安全面およびコスト面において市場の要求に十分応えているとはいえない。例えばイソフラボンのなかにはエストロゲン様作用を示すものがあり過剰摂取による悪影響が懸念される。かくして、医薬品、特定保健用食品、機能性食品、化粧品などに使用可能な安全且つ安価なエンドセリン−１産生抑制剤は依然として必要とされている。
【０００６】
この出願に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
【非特許文献１】ネイチャー (Nature), (英国),2001年, 414巻, p.863-864
【非特許文献２】アテロスクレロシス (Atherosclerosis), (アイルランド), 2002年, 163巻, p. 339-347
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、天然物由来のエンドセリン−１産生抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）  ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
（２）  ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有する植物抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
（３）  クダモノトケイソウ（Passiflora edulis、別名パッションフルーツ）の抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤。
（４）  クダモノトケイソウの抽出物が、果皮抽出物または果肉抽出物である上記（３）に記載のエンドセリン−１産生抑制剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、安全性が高い天然物由来のエンドセリン−１産生抑制剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、上記本発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜実施し得る。
【００１１】
本発明者らは、天然物由来のエンドセリン−１産生抑制剤を求めて鋭意探索した結果、ルテオリンおよび／またはその配糖体が血管内皮細胞に働いてエンドセリン−１産生を抑制する効果を有することを見出した。
【００１２】
すなわち本発明は、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤に関する。ルテオリン(3', 4', 5, 7-テトラヒドロキシフラボン)はフラボノイドの一種であり、セロリ、ピーマン、春菊、カモミール、紫蘇などに含まれている天然物である。また、種々の配糖体が天然に存在し、例えばクダモノトケイソウから6-C-フコシルルテオリン、6-C-キノボシルルテオリンが単離されている（Phytochemistry, 30, 3486, 1991）。従来、ルテオリンまたはその配糖体がエンドセリン−１の産生を抑制する効果を有することは知られていない。
【００１３】
本発明において、ルテオリンは市販品を用いることもできるが、種々の植物から単離して用いてもよい。本発明に使用できるルテオリン配糖体はルテオリンと任意の糖（例えばグルコース、フコース、ガラクトース、6-デオキシグルコース）との配糖体であってよく、また、糖の結合位置は例えばルテオリン分子の6-C、8-C、7-O、または4'-Oであり、好ましいルテオリンの配糖体はルテオリン-6-C-グルコシドである。
【００１４】
本発明の、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤は、ルテオリンおよび／もしくはその配糖体それ自体であっても、または通常用いられる固体または液体の担体、乳化分散剤等により錠剤、粉剤、乳剤、カプセル剤等の剤形に製剤化されたものであってもよい。上記担体としては、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。該エンドセリン−１産生抑制剤は更なる成分を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤中でのルテオリンおよび／またはその配糖体の含有量は、投与目的、投与経路、剤形等によって適宜変更しうるが、例えば、製剤全重量に対して1.0〜20重量％である。
【００１６】
本発明はさらに、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有する植物抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤に関する。植物抽出物は安全性が高く且つ安価であるため、医薬品、特定保健用食品、機能性食品、化粧品などへの使用に特に適している。ここで植物抽出物とは、植物の全部または根、茎、葉、花、果実などの部分に含まれる成分を、水、エタノールなどの溶媒に溶解させて抽出し適宜乾燥させた、通常は液体または固体のものを指す。本発明には、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有する限り任意の植物の抽出物を用いることができ、例えば、クダモノトケイソウのほかに、青ジソ、赤ジソ、エゴマなどのシソ科植物、セリ、アシタバなどのセリ科の植物、セロリ、レタス、春菊、ピーマンなどの野菜、大豆の葉、ピーナッツ種皮、イチョウ、スイカズラ、西洋サクラソウ、カモミール、ペパーミントなどの抽出物を用いることができる。なかでもクダモノトケイソウの抽出物が好ましい。
【００１７】
本発明はさらにまた、クダモノトケイソウの抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤に関する。クダモノトケイソウの抽出物としては、果皮、果肉、果実、葉、茎または根の抽出物が好ましく、果皮抽出物または果肉抽出物が特に好ましい。
【００１８】
クダモノトケイソウは南米原産のつる性多年生熱帯果樹であり、現在では世界中の熱帯、亜熱帯地域に広まっており、オーストラリアや東南アジア、台湾などで産業的に栽培されている。日本では沖縄での生産が一番多いが、奄美諸島、小笠原諸島でも栽培されておいる。本発明に使用するクダモノトケイソウの品種と産地は、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明に使用できるクダモノトケイソウ果皮抽出物は、例えば、クダモノトケイソウの果皮をミキサー等で細かく破砕した後、抽出溶媒中で攪拌し、遠心分離または濾過により不溶物を除去し、上清または濾液を減圧下で乾燥することにより粉末として得ることができる。本発明において「果皮」とは、果実の外側の皮の部分を意味するが、一般に言う果肉の部分が付着していてもよい。抽出溶媒は任意の溶媒であってよく、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、酢酸エチル、その他の有機溶剤、および水のうち１種または２種以上を用いることができる。
【００２０】
本発明に使用できるクダモノトケイソウ果肉抽出物は、例えば、クダモノトケイソウの果肉を水と共に攪拌し、遠心分離または濾過により不溶物を除去し、上清または濾液を分画分子量10,000の限外濾過膜を通過させ、回収した溶液を減圧下で乾燥することにより粉末として得ることができる。本発明において「果肉」とは、果実の半透明のゼリー状の部分を意味するが、一般に言う果皮、種子の部分が付着していてもよい。抽出溶媒は任意の溶媒であってよく、例えばメチルアルコール、エチルアルコール、酢酸エチル、その他の有機溶剤、および水のうち１種または２種以上を用いることができる。
【００２１】
本発明の、ルテオリンおよび／もしくはその配糖体を含有する植物抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤、またはクダモノトケイソウの抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤は、抽出物それ自体であっても、または通常用いられる固体または液体の担体、乳化分散剤等により錠剤、粉剤、乳剤、カプセル剤等の剤形に製剤化されたものであってもよい。上記担体としては、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。該エンドセリン−１産生抑制剤は更なる成分を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤中での植物抽出物の含有量は、投与目的、投与経路、剤形等によって適宜変更し得るが、例えば、クダモノトケイソウ果皮抽出物を含有する場合その含有量は製剤全重量に対して1.0〜80重量％であり、クダモノトケイソウ果肉抽出物を含有する場合その含有量は製剤全重量に対して1.0〜90重量％である。
【００２３】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤は医薬品として用いるほか、種々の食品中に添加して特定保健用食品または機能性食品として用いることができる。かかる食品としては、清涼飲料、乳酸飲料、スープ、ジャム、菓子などが挙げられる。本発明のエンドセリン−１産生抑制剤はまた、ペットフード、飼料などに添加してペットや家畜の心臓病、高血圧症の改善に用いることができる。更に、本発明のエンドセリン−１産生抑制剤は化粧品に添加して美白用化粧品として用いることもできる。
【００２４】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤の使用形態は使用目的に応じた任意の形態であってよく、例えば経口的投与が可能である。また、エンドセリン−１産生抑制剤を含有する化粧品は、典型的には、皮膚に直接塗布して用いられる。
【００２５】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤の投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、または投与方法などに応じて適宜決定することができる。例えば、軽症の高血圧症患者にクダモノトケイソウ果皮抽出物または果肉抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤を経口投与する場合には、クダモノトケイソウ果皮抽出物または果肉抽出物の投与量が１日当たり１mg/kg体重〜200mg/kg体重であることが好ましい。
【００２６】
本発明のエンドセリン−１産生抑制剤を特定保健用食品または機能性食品に添加する場合には目的に応じて適量を添加することができる。例えば、ルテオリンおよび／またはその配糖体を含有するエンドセリン−１産生抑制剤を食品に添加する場合には、ルテオリンおよび／またはその配糖体が食品中に例えば0.01〜1重量％含有されるように添加し、クダモノトケイソウ果皮抽出物または果肉抽出物を含有するエンドセリン−１産生抑制剤を食品に添加する場合には、クダモノトケイソウ果皮抽出物または果肉抽出物が食品中に例えば1.0〜100重量％含有されるように添加する。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
試験例１  ルテオリン及びルテオリン配糖体のエンドセリン−１産生抑制活性
ブタ大動脈内皮細胞（継代数１、25 cm2培養フラスコ入り、大日本製薬（Cell Systems Corporation）より購入）をCS-C培地（D-MEM培地とハムF12培地を1：1に等比混合した培地に、10％ウシ胎児血清、15mM HEPES、酸性FGF、およびヘパリンを添加した培地、Cell Systems Corporationより購入）に分散させ、コラーゲンをコーティングした24穴（１穴2cm2）のプレート１枚に添加して、5％ CO2存在下、37℃で４日間の培養を行った。次にプレートの各穴の培地を廃棄し、1mlのクレブス-リンガー重炭酸(KRB)緩衝液（NaCl 129 mM、NaHCO3 5 mM、KCl 4.8 mM、KH2PO4 1.2 mM、CaCl2 1.0 mM、MgSO4 1.2 mM、グルコース 2.8 mM、 ウシ血清アルブミン 0.1%、HEPES 10 mM、PH 7.4）にて各穴を２回洗浄した。その後、360μl のKRB緩衝液に40μlの試料（10％DMSO (ジメチルスルホキシド)水溶液中の63〜500μＭルテオリン、10％DMSO水溶液中の250〜1000μＭルテオリン配糖体、または対照としての10％DMSO水溶液）を加えた溶液（反応液）400μlを各穴に添加し、5％CO2存在下、37℃で0〜８時間静置し、溶液中のエンドセリン−１濃度を測定した。その結果を表１及び図１に示す。表１は３時間の間に溶液中へ放出されたエンドセリン−１量を、10％DMSO水溶液添加時（反応液中でのDMSOの終濃度1％）のエンドセリン−１量（対照）を100％として比較した値（n = 4の平均値）で示す。図１は試料添加後の各時点における溶液中のエンドセリン−１濃度（n = 3の平均値）を示す。ルテオリン及びルテオリン配糖体（ルテオリン-6-C-グルコシド）にエンドセリン−１産生抑制効果が認められた。
【００２９】
次に、MTT (臭化 3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム)キット（Roche） により細胞増殖に対するクダモノトケイソウ果皮抽出物及び果肉抽出物の影響を検討したところ、表１の濃度範囲では細胞増殖に対して全く影響のないことが確認できた。
【００３０】
【表１】
2005075766.tif 000002
【００３１】
試験例２  クダモノトケイソウ果皮抽出物からなるエンドセリン−１産生抑制剤の製造法
クダモノトケイソウの果実３個（那覇市内で購入）から剥いた果皮（150g）をミキサーで細かく破砕した後、メタノール200mlを加え、十分に攪拌した（電磁スターラー、400rpm、60分間）。次いで、濾紙（アドバンテック東洋製濾紙、No.2、直径30cm）による濾過を行って不溶物を除去し濾液を回収した。濾液をロータリエバポレーターで濃縮し、さらに真空ポンプによる減圧下で乾燥することにより、紫色の粉末3.6gを得た。
【００３２】
試験例３  クダモノトケイソウ果肉抽出物からなるエンドセリン−１産生抑制剤の製造法
クダモノトケイソウの果実３個からゼリー状の果肉（種子を含む）110mlを採取し、これに同量の蒸留水を加え、十分に攪拌した（電磁スターラー、400rpm、60分間）。次いで、15,000rpmで20分間の遠心分離を行い不溶物を沈殿させ、上清を回収した。この溶液は限外濾過膜YM-10（分画分子量１万、Millipore）を通過させ、濾液を遠心式エバポレーターで濃縮し、さらに真空ポンプによる減圧下で乾燥することにより、薄いオレンジ色の粉末16gを得た。
【００３３】
試験例４  クダモノトケイソウ果皮抽出物及び果肉抽出物のエンドセリン−１産生抑制活性
試験例１と同様に24穴プレートで培養したブタ大動脈内皮細胞をKRB緩衝液で２回洗浄した後、360μl のKRB緩衝液に40μlの試料（2.5〜40 mg/mlのクダモノトケイソウ果皮抽出物水溶液、0.75〜7.5 mg/mlのクダモノトケイソウ果肉抽出物水溶液、または対照としての蒸留水）を加えた溶液（反応液）400μlを各穴に添加し、5％CO2存在下、37℃で0〜８時間静置した。なお、試料添加時における細胞数は１穴あたり4.0 x 105個である。その後、上清200μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。上清中のエンドセリン−１量は、エンドセリン−１ ELISAシステム（Amersham Biosciences）を用いた酵素免疫測定法により測定した。その結果を表２及び図２に示す。表２は３時間の間に溶液中へ放出されたエンドセリン−１量を、蒸留水添加時のエンドセリン−１量（対照）を100％として比較した値（n = 4の平均値）で示した。図２は試料添加後の各時点における溶液中のエンドセリン−１濃度（n = 3の平均値）を示した。クダモノトケイソウ果皮抽出物及びクダモノトケイソウ果肉抽出物にエンドセリン−１産生抑制効果が認められた。
【００３４】
次に、試験例１と同様に、MTT (臭化 3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム)キット（Roche） により細胞増殖に対するクダモノトケイソウ果皮抽出物及び果肉抽出物の影響を検討したところ、表２の濃度範囲では細胞増殖に対して全く影響のないことが確認できた。
【００３５】
【表２】
2005075766.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ルテオリンを添加した場合のKRB緩衝液中のブタ大動脈内皮細胞におけるエンドセリン−１の濃度変化を示す図である。
【図２】クダモノトケイソウ果皮抽出物を添加した場合のKRB緩衝液中のブタ大動脈内皮細胞におけるエンドセリン−１の濃度変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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