(57)【要約】【課題】光電変換して積分した電気信号がＡ／Ｄ変換の最大出力レンジを超えないように制御し、短時間にコントラストのよい画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供すること。【解決手段】レーザ光源１からのレーザ光を光量調節部２によって光強度を制御して試料４に照射し、試料４からの光を光電変換して積分し、積分された電気信号ＶINTを順次デジタル信号に変換し、デジタル信号を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置１００において、デジタル信号がＡ／Ｄ変換器のレンジ上限を超えた場合、レンジ上限を超えるまでのデジタル信号をもとに外挿処理を行ってデジタル信号を推定し、光電変換素子６および／または光量調節部２を制御し、デジタル信号をレンジ上限近傍に収束させる制御を行う制御部１３を備える。【選択図】        図１
2005338465.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源から出射されたレーザ光を光強度制御手段によって光強度を制御して試料に照射しつつ走査し、前記試料から発する光を光電変換手段によって電気信号に変換し、該電気信号を積分するとともに該積分された電気信号をデジタル変換手段によって順次デジタル信号に変換し、画像表示における表示単位に同期して前記積分をリセットする処理を行って、該リセット時の前記デジタル信号を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置において、
前記デジタル信号が前記変換手段のレンジ上限を超えた場合、該レンジ上限を超えるまでの前記デジタル信号をもとに外挿処理を行って前記リセット時の前記デジタル信号を推定し、該推定された前記デジタル信号をもとに前記光電変換手段および／または前記光強度制御手段を制御し、前記リセット時の前記デジタル信号を前記レンジ上限近傍に収束させる制御を行う制御手段を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記レンジ上限近傍は、前記レンジ上限以下であることを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
前記制御手段は、前記デジタル信号のサンプリング数をカウントするカウント手段をさらに備え、
前記制御手段は、前記リセット時のサンプリング数を前記レンジ上限に達するまでの前記サンプリング数で除算し、この除算値を前記レンジ上限の値に乗算した値を推定値とすることを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
【請求項４】
前記制御手段は、最尤推定法によって前記リセット時の前記デジタル信号を推定することを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
【請求項５】
前記最尤推定法は、最小二乗法であることを特徴とする請求項４に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料にレーザ光を照射しつつ走査し、試料から発する光を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、レーザ光を試料に照射しつつ走査し、試料から発する光を光電変換して電気信号に変換し、この電気信号を画像表示して試料からの光を画像化する走査型レーザ顕微鏡装置が多用されている。一般に光電変換された電気信号を画像化する場合、電気信号を積分回路に入力して所定間隔で積分し、積分された電気信号をＡ／Ｄ変換してデジタル信号に変換し、このデジタル信号を画像化している。しかし、光電変換における感度が高い場合、あるいはレーザ光の光強度が高い場合、光電変換された電気信号は、Ａ／Ｄ変換の出力レンジを超え、デジタル信号は飽和する。デジタル信号が飽和すると、コントラストの悪い画像となる。そこで、このような場合、積分回路に入力する電気信号の大きさをもとに光強度を検出し、ＣＣＤ等の２次元撮像素子を用いてＡ／Ｄ変換の出力レンジを超えた光を画像化する技術が提示されている（特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−６７０４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、走査型レーザ顕微鏡装置は、レーザ光のスポット走査によって画像を取得するため、上述したＣＣＤ等の２次元撮像素子を用いる技術を適用することができない。したがって、走査型レーザ顕微鏡装置においては、コントラストの悪い画像が取得され、光電変換された電気信号が大きすぎることが分かった場合でも、光電変換の感度をどの程度下げるべきか、あるいはレーザ光の光強度をどの程度下げるべきかの定量的指標が得られず、光電変換の感度、あるいはレーザ光の光強度を制御するために多大の労力と時間とを要するという問題点があった。
【０００５】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、光電変換される電気信号がＡ／Ｄ変換の出力レンジを超えないように制御し、短時間にコントラストのよい画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、請求項１にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、レーザ光源から出射されたレーザ光を光強度制御手段によって光強度を制御して試料に照射しつつ走査し、前記試料から発する光を光電変換手段によって電気信号に変換し、該電気信号を積分するとともに該積分された電気信号をデジタル変換手段によって順次デジタル信号に変換し、画像表示における表示単位に同期して前記積分をリセットする処理を行って、該リセット時の前記デジタル信号を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置において、前記デジタル信号が前記変換手段のレンジ上限を超えた場合、該レンジ上限を超えるまでの前記デジタル信号をもとに外挿処理を行って前記リセット時の前記デジタル信号を推定し、該推定された前記デジタル信号をもとに前記光電変換手段および／または前記光強度制御手段を制御し、前記リセット時の前記デジタル信号を前記レンジ上限近傍に収束させる制御を行う制御手段を備えたことを特徴とする。
【０００７】
また、請求項２にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記レンジ上限近傍は、前記レンジ上限以下であることを特徴とする。
【０００８】
また、請求項３にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記制御手段は、前記デジタル信号のサンプリング数をカウントするカウント手段をさらに備え、前記制御手段は、前記リセット時のサンプリング数を前記レンジ上限に達するまでの前記サンプリング数で除算し、この除算値を前記レンジ上限の値に乗算した値を推定値とすることを特徴とする。
【０００９】
また、請求項４にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記制御手段は、最尤推定法によって前記リセット時の前記デジタル信号を推定することを特徴とする。
【００１０】
また、請求項５にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記最尤推定法は、最小二乗法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、光電変換した電気信号を積分し、Ａ／Ｄ変換する場合、電気信号を積分した積分値が、Ａ／Ｄ変換の最大出力レンジを超えて飽和した場合、１画素分の積分値を推定し、この推定した積分値をもとに光電変換の感度、あるいはレーザ光の光強度を制御し、短時間にコントラストのよい画像が取得できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に添付図面を参照して、この発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。
【００１３】
（実施の形態１）
この実施の形態１では、レーザ光を試料に照射して試料から発する光を光電変換して積分し、積分した積分値が増大してＡ／Ｄ変換の最大出力レンジを超えた場合、この増大傾向にしたがって積分値を増大させて１画素分の積分値を推定し、この推定された１画素分の積分値をもとに光電変換の感度、あるいはレーザ光の光強度を制御し、積分値がＡ／Ｄ変換の最大出力レンジを超えないようにしている。
【００１４】
図１は、この発明の実施の形態１である走査型レーザ顕微鏡装置１００の概要構成を示すブロック図である。図１において、この走査型レーザ顕微鏡装置１００は、レーザ光源１と、光量調節部２と、照明光学系３と、観察光学系５と、光電変換素子６と、光電変換素子駆動部７と、スイッチ駆動部８と、スイッチ９と、コンデンサ１０と、オペアンプ１１と、クリップダイオード１２と、制御部１３と、表示部１４とを有している。さらに制御部１３は、サンプリング部１３０と、走査制御部１３１と、光量制御部１３２と、画像表示制御部１３３とを有している。
【００１５】
まず、レーザ光源１から出射されたレーザは、音響光学素子（ＡＯＴＦ）等によって実現される光量調節部２によってレーザ光の光強度が調整され、照明光学系３を介して試料４に入射する。照明光学系３は、レーザ光を走査する機能を有するガルバノミラー、レーザ光を試料４に集光する機能を有する対物レンズ等によって構成される。試料４に入射したレーザ光は、試料４を励起、反射、あるいは透過する。試料４からは、蛍光、反射光、あるいは透過光が出射し、観察光学系５を介して光電変換素子６に入射する。
【００１６】
光電変換素子６は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシュダイオード（ＡＰＤ）等によって実現され、入射した光を光強度に対応した電気信号（電流）に変換してオペアンプ１１に出力する。光電変換素子６は、高圧電源等によって実現される光電変換素子駆動部７によって制御され、光電変換素子駆動部７から印加される電圧ＶHVによって単位光量あたりの出力電流が制御されている。
【００１７】
光電変換素子６から出力された電流は、スイッチ９と、コンデンサ１０と、オペアンプ１１と、クリップダイオード１２等によって構成される積分回路に入力され、電圧信号ＶINTに変換される。コンデンサ１０は、光電変換素子６から出力された電流の電荷を蓄積し、オペアンプ１１は、この蓄積された電荷を電圧信号ＶINTに変換して出力し、スイッチ９は、コンデンサ１０に蓄積される電荷の充放電を制御する。クリップダイオード１２は、オペアンプ１１から出力された電圧信号ＶINTが所定の閾値電圧ＶMAXを超えて制御部１３に入力されないように配置されている。スイッチ駆動部８は、サンプリング部１３０によって制御され、スイッチ９の開閉を駆動し、コンデンサ１０に蓄積された電荷の充放電を制御する。
【００１８】
サンプリング部１３０は、マイクロプロセッサ（ＭＰＵ）、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、集積回路（ＬＳＩ）等によって実現され、走査制御部１３１と、光量制御部１３２と、画像表示制御部１３３とにそれぞれ信号を出力している。走査制御部１３１は、照明系３を制御し、光量制御部１３２は、光量調節部２と光電変換素子駆動部７とを制御し、画像表示制御部１３３は、表示部１４を制御している。サンプリング部１３０に出力された電圧信号ＶINTは、サンプリング部１３０で画像信号に変換され、画像表示制御部１３３を介して表示部１４に出力表示される。
【００１９】
つぎに、サンプリング部１３０の動作について説明する。図２は、サンプリング部１３０の概要構成を示すブロック図である。サンプリング部１３０は、タイミングジェネレータ（ＴＧ）１３０１と、遅延器１３０２と、ＡＮＤ回路１３０３と、カウンタ１３０４と、比較器１３０５，１３１０と、Ａ／Ｄ変換器１３０６と、ラッチ回路１３０７，１３０８，１３０９と、基準クロック１３１１と、ＯＲ回路１３１２とを有している。
【００２０】
基準クロック１３１１は、所定周期で「Ｈ」「Ｌ」を繰返すクロック信号ＣＬＫを出力している。ＴＧ１３０１は、クロック信号ＣＬＫを入力すると、クロック信号ＣＬＫに同期して垂直同期信号ＶＤと、水平同期信号ＨＤと、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫとを生成し、垂直同期信号ＶＤと、水平同期信号ＨＤと、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫとを走査制御部１３１と画像表示制御部１３３とに出力するとともに、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫをＡＮＤ回路１３０３と遅延器１３０２とに出力する。遅延器１３０２は、入力したピクセルクロック信号ＰＣＬＫを１クロック遅延してＡＮＤ回路１３０３に出力する。ＡＮＤ回路１３０３は、ＴＧ１３０１からの入力を正論理とし、遅延器１３０２からの入力を負論理としている。したがって、ＡＮＤ回路１３０３は、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫが「Ｌ」から「Ｈ」に立上がった１クロック期間のみリセット信号ＲＳＴを出力する。このリセット信号ＲＳＴは、スイッチ駆動部８と、画像表示制御部１３３と、カウンタ１３０４と、ラッチ回路１３０７，１３０８と、ＯＲ回路１３１２とに出力される。カウンタ１３０４は、クロック信号ＣＬＫを入力し、クロック信号ＣＬＫ「Ｈ」に同期してカウントアップを開始し、カウントアップしたカウント信号ＣＮＴをラッチ回路１３０８に出力する。また、カウンタ１３０４は、リセット信号ＲＳＴ「Ｈ」を入力すると、カウントアップを終了してカウンタを「０」にリセットする。
【００２１】
オペアンプ１１から出力された電圧信号ＶINTは、Ａ／Ｄ変換器１３０６によってデジタル信号ＤＳに変換される。デジタル信号ＤＳは、ラッチ回路１３０７と、比較器１３０５とに出力される。比較器１３０５は、入力したデジタル信号ＤＳがＡ／Ｄ変換器１３０６の最大出力レンジである最大デジタル信号ＤＳMAXに達した場合、閾値オーバー信号ＯＶＲTH「Ｈ」をＯＲ回路１３１２に出力し、デジタル信号ＤＳが最大デジタル信号ＤＳMAX未満である場合、閾値オーバー信号ＯＶＲTH「Ｌ」をＯＲ回路１３１２に出力する。
【００２２】
ラッチ回路１３０７は、リセット信号ＲＳＴ「Ｈ」を入力すると、デジタル信号ＤＳをラッチして最終デジタル信号ＤＳLを光量制御部１３２と画像表示制御部１３３出力する。ＯＲ回路１３１２は、リセット信号ＲＳＴと閾値オーバー信号ＯＶＲTHとのいずれかが「Ｈ」の場合、「Ｈ」をラッチ回路１３０９に出力し、リセット信号ＲＳＴと閾値オーバー信号ＯＶＲTHとの双方が「Ｌ」の場合、「Ｌ」をラッチ回路１３０９に出力する。
【００２３】
ラッチ回路１３０８は、リセット信号ＲＳＴ「Ｈ」を入力すると、カウンタ１３０４から入力したカウント信号ＣＮＴをラッチしてカウント終了信号ＣＮＴENDを比較器１３１０に出力する。
【００２４】
ラッチ回路１３０９は、ＯＲ回路１３１２から「Ｈ」を入力すると、カウンタ１３０４から入力したカウント信号ＣＮＴをラッチして上限値信号ＣＮＴLIMを比較器１３１０と光量制御部１３２とに出力する。
【００２５】
比較器１３１０は、カウント終了信号ＣＮＴENDの値と上限値信号ＣＮＴLIMの値とを比較し、上限値信号ＣＮＴLIMの値がカウント終了信号ＣＮＴENDの値未満である場合、オーバーレンジ信号ＯＶＲ「Ｈ」を光量制御部１３２に出力し、上限値信号ＣＮＴLIMの値がカウント終了信号ＣＮＴEND以上である場合、オーバーレンジ信号ＯＶＲ「Ｌ」を光量制御部１３２に出力する。
【００２６】
図３は、クロック信号ＣＬＫの「Ｈ」「Ｌ」、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫの「Ｈ」「Ｌ」、リセット信号ＲＳＴの「Ｈ」「Ｌ」、スイッチ９の「開」「閉」、カウント信号ＣＮＴの値、電圧信号ＶINT（最大デジタル信号ＤＳMAX）およびデジタル信号ＤＳ、閾値オーバー信号ＯＶＲTHの「Ｈ」「Ｌ」、カウント終了信号ＣＮＴENDの値、上限値信号ＣＮＴLIMの値、オーバーレンジ信号ＯＶＲの「Ｈ」「Ｌ」を示すタイミングチャートである。
【００２７】
図３において、クロック信号ＣＬＫは、基準クロック１３１１から出力され、時刻Ｔ１〜Ｔ２で「Ｈ」「Ｌ」となる周期で「Ｈ」「Ｌ」が出力される。ピクセルクロック信号ＰＣＬＫは、ＴＧ１３０１から出力され、レーザ光が１画素を走査する周期に同期して時刻Ｔ１，Ｔ４で「Ｈ」となる。リセット信号ＲＳＴは、ＡＮＤ回路１３０３から出力され、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫが「Ｈ」に立上がった時刻Ｔ１，Ｔ４に同期して１クロック「Ｈ」となる。スイッチ９は、リセット信号ＲＳＴの「Ｈ」に同期して「閉」となり、コンデンサ１０に蓄積されている電荷を放電する。カウント信号ＣＮＴの値は、カウンタ１３０４から出力され、カウンタ１３０４がカウントアップしたカウント信号ＣＮＴの値である。１画素の周期をカウント信号の値では、「０」〜「３９」に設定してある。電圧信号ＶINTは、コンデンサ１０から出力され、時間の経過とともに増加している。また、デジタル信号ＤＳは、Ａ／Ｄ変換器１３０６から出力され、電圧信号ＶINTをクロック信号ＣＬＫに同期してＡ／Ｄ変換器１３０６によってサンプリングされた信号である。そのため、電圧信号ＶINTは、連続的な値となるが、デジタル信号ＤＳは、電圧信号ＶINTの連続的な線上の離散的な点となる。
【００２８】
閾値オーバー信号ＯＶＲTHは、比較器１３０５から出力され、電圧信号ＶINTが閾値電圧ＶMAXに達し、つまりデジタル信号ＤＳが最大デジタル信号ＤＳMAXに達した場合に「Ｈ」が出力される。カウント終了信号ＣＮＴENDの値は、ラッチ回路１３０８から出力され、リセット信号ＲＳＴの「Ｈ」に同期してデジタル信号ＤＳをカウントアップした値であり、次のリセット信号ＲＳＴの「Ｈ」の立ち上がりによって前回のカウントアップしたデジタル信号の値を出力する。図３においては、時刻Ｔ１から装置が始動されているため、時刻Ｔ１〜Ｔ４では、カウント終了信号ＣＮＴENDの値は、「０」であるが、時刻Ｔ４以降は、１画素の周期が変わらない限り、装置が停止するまで「３９」となる。上限値信号ＣＮＴLIMの値は、ラッチ回路１３０９から出力され、デジタル信号ＤＳが最大デジタル信号ＤＳMAXに達するまでカウントアップされたカウント信号ＣＮＴの値である。図３においては、時刻Ｔ３でデジタル信号ＤＳが最大デジタル信号ＤＳMAXに達しているため、時刻Ｔ３以降、上限値信号ＣＮＴLIMの値は、時刻Ｔ１〜Ｔ３でカウントアップされた「２９」となる。オーバーレンジ信号ＯＶＲは、比較器１３１０から出力され、上限値信号ＣＮＴLIMの値がカウント終了信号ＣＮＴENDの値未満である場合、「Ｈ」が出力される。
【００２９】
図３において、デジタル信号ＤＳは、時刻Ｔ２〜Ｔ３において増加し、時刻Ｔ３〜Ｔ４において最大デジタル信号ＤＳMAXに達し飽和する。そのため、１画素の終了時である時刻Ｔ４における最終デジタル信号ＤＳLは、最大デジタル信号ＤＳMAXに飽和した値となっている。そこで、光量制御部１３２は、デジタル信号ＤＳが時刻Ｔ２〜Ｔ３において増加した割合と同じ割合で時刻Ｔ３〜Ｔ４においてデジタル信号ＤＳを増加させ、時刻Ｔ４での推定電圧値ＶLASTを演算する。そして、この推定電圧値ＶLASTをもとに電圧信号ＶINTが閾値電圧ＶMAXを超えないように制御を行う。
【００３０】
そこで、まず推定電圧値ＶLASTを求める。時刻Ｔ２〜Ｔ４に対応してカウントされたカウント信号ＣＮＴの値「１」〜「３９」を初期値ＣＮＴMAXとし、時刻Ｔ２〜Ｔ３に対応してカウントされたカウント信号ＣＮＴの値「１」〜「２９」を最小値ＣＮＴMINとし、この最小値ＣＮＴMINが１画面中で極小である極小値ＣＮＴLIMである場合、この最小値ＣＮＴMINを極小値ＣＮＴLIMに置換えると、推定電圧値ＶLASTは、以下の式（１）によって求められる。
ＶLAST＝ＶMAX×ＣＮＴMAX／ＣＮＴLIM                    ・・・・・・（１）
【００３１】
つぎに、推定電圧値ＶLASTが閾値電圧ＶMAX未満となるように光電変換素子６に印加する最適電圧ＶHV(NEW)を求める。最適電圧ＶHV(NEW)は、極小値ＣＮＴLIMを導出した時に光電変換素子６に印加した電圧ＶHVとした場合、以下の式（２）によって求められる。
ＶHV(NEW)＝ＶHV×（ＶMAX／ＶLAST）1/C                  ・・・・・・（２）
なお、式（２）におけるＣは、光電変換素子６によって決まる定数である。しかし、光電変換素子６が正常に機能するために最小限界電圧ＶHV(LIM)があり、最適電圧ＶHV(NEW)を最小限界電圧ＶHV(LIM)以下に設定することができない。したがって、最適電圧ＶHV(NEW)が最小限界電圧ＶHV(LIM)以下である場合、光量制御部１３２は、光電変換素子６に対しては、最小限界電圧ＶHV(LIM)を設定し、光量調節部２を介してレーザ光源１から出射されたレーザ光の光量ＬEXを制御して推定電圧値ＶLASTが閾値電圧ＶMAX未満となるように最適光量ＬEX(NEW)を設定する。
【００３２】
ところで、最適光量ＬEX(NEW)は、最適電圧ＶHV(NEW)を導出した時にレーザ光源１から出射されたレーザ光の光量ＬEXとした場合、以下の式（３）によって求められる。
ＬEX(NEW)＝ＬEX×（ＶHV(NEW)／ＶHV(LIM)）C          ・・・・・・（３）
なお、式（３）におけるＣは、式（２）で用いられたＣと同じ値の定数である。
【００３３】
つぎに、図４に示すフローチャートを参照して、サンプリング部１３０と、光量制御部１３２と、画像表示制御部１３３との動作を説明する。まず、光量制御部１３２は、１画素に対応する初期値ＣＮＴMAXを決定し、１画面中の極小値ＣＮＴLIMの初期化を行い、極小値ＣＮＴLIMを初期値ＣＮＴMAXに置換える（ステップＳ１０１）。また、１画面中でオーバーレンジ信号ＯＶＲが発生したか否かを判別するフラグＦＬＡＧの初期化を行い、フラグＦＬＡＧを「０」にする（ステップＳ１０２）。
【００３４】
つぎに、光量制御部１３２は、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」であるか否かを判断し（ステップＳ１０３）、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」である場合（ステップＳ１０３，ＹＥＳ）、レンジオーバー信号ＯＶＲが「Ｈ」であるか否かを判断する（ステップＳ１０４）。レンジオーバー信号ＯＶＲが「Ｈ」である場合（ステップＳ１０４，ＹＥＳ）、フラグＦＬＡＧを「０」→「１」に変更し（ステップＳ１０５）、最小値ＣＮＴMINが極小値ＣＮＴLIM未満であるか否かを判断する（ステップＳ１０６）。最小値ＣＮＴMINが極小値ＣＮＴLIM未満である場合（ステップＳ１０６，ＹＥＳ）、極小値ＣＮＴLIMを最小値ＣＮＴMINに置換え更新する（ステップＳ１０７）。
【００３５】
また、画像表示制御部１３３は、レンジオーバー信号ＯＶＲが「Ｌ」である場合（ステップＳ１０４，ＮＯ）と最小値ＣＮＴMINが極小値ＣＮＴLIM以上である場合（ステップＳ１０６，ＮＯ）と極小値ＣＮＴLIMを更新した場合（ステップＳ１０７）とにおいて、１画面分のサンプリングが完了したか否かを判断する（ステップＳ１０８）。リセット信号ＲＳＴが「Ｌ」である場合（ステップＳ１０３，ＮＯ）、また、１画面分のサンプリングが完了していない場合（ステップＳ１０８，ＮＯ）、次の画素に対してサンプリングを行う（ステップＳ１０３）。
【００３６】
光量制御部１３２は、フラグＦＬＡＧが「１」であるか否かを判断し（ステップＳ１０９）、フラグＦＬＡＧが「１」である場合（ステップＳ１０９，ＹＥＳ）、極小値ＣＮＴLIMから推定電圧値ＶLASTを求める（ステップＳ１１０）。推定電圧値ＶLASTから光電素子６に印加する最適電圧ＶHV(NEW)を求める（ステップＳ１１１）。
【００３７】
つぎに、光量制御部１３２は、最適電圧ＶHV(NEW)が最小限界電圧ＶHV(LIM)未満か否かを判断する（ステップＳ１１２）。最適電圧ＶHV(NEW)が最小限界電圧ＶHV(LIM)未満である場合（ステップＳ１１２，ＹＥＳ）、光量制御部１３２は、光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最小限界電圧ＶHV(NEW)を設定し（ステップＳ１１３）、最適電圧ＶHV(NEW)が最小限界電圧ＶHV(LIM)以上である場合（ステップＳ１１２，ＮＯ）、光量制御部１３２は、光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最適電圧ＶHV(LIM)を設定する（ステップＳ１１４）。
【００３８】
光量制御部１３２は、光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最小限界電圧ＶHV(LIM)を設定した場合（ステップＳ１１４）、光量調節部２を介して最適光量ＬEX(NEW)（＝（ＶHV(NEW)／ＶHV(LIM)）1/C）を設定する（ステップＳ１１５）。
【００３９】
この実施の形態１では、コンデンサ１０に蓄積された電荷がＡ／Ｄ変換器１３０６の出力レンジをオーバーし、Ａ／Ｄ変換されたデジタル信号が飽和した場合、推定電圧値ＶLASTを演算し、この推定電圧値ＶLASTをもとに光量を制御するようにしている。このようにすると、１画面を走査するだけで、次の画面から適正光量に制御された画像が取得できる。つまり、短時間に多大な労力をかけずに光量制御が行える。
【００４０】
なお、この実施の形態１では、光電変換素子６への印加電圧の可変と光量調節部２への制御との双方の制御を行うようにしていたが、装置の状態と観察の状況とを鑑みて光電変換素子６への印加電圧の可変か、光量調節部２への制御かのいずれか一つの制御を行うようにしてもよい。
【００４１】
また、この実施の形態１では、光量がＡ／Ｄ変換器１３０６のレンジをオーバーする場合について説明したが、１画面の走査において、光量がレンジ以下である場合は、光量制御部１３２が閾値電圧ＶTHとラッチ回路１３０７から出力される最終デジタル信号ＤＳLとの差分から光量を増大させる制御を行うようにしてもよい。
【００４２】
（実施の形態２）
つぎに、この実施の形態２について説明する。実施の形態１では、１画面を走査し、光量がＡ／Ｄ変換器１３０６のレンジをオーバーしている場合、推定電圧値ＶLASTを求めるようにしていたが、この実施の形態２では、試料４からの光が微弱でＡ／Ｄ変換器１３０６によって変換されるデジタル信号ＤＳが線形に増加しない場合、最小二乗法を用いて推定電圧値ＶLASTを求めるようにしている。
【００４３】
走査型レーザ顕微鏡装置において、試料の経時変化を観察する場合、レーザ光を高速に走査させる必要がある。このような場合、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫは短くなり、コンデンサ１０に蓄積される電荷量が少なくなる。このため、十分な輝度の蛍光画像を取得するために、光電変換素子６への印加電圧ＶHVを高めて検出感度を増大させることになる。また、観察試料が微弱な蛍光を発する生物標本である場合、光電変換素子６に入射する光子数の絶対量が少なく、図５の模式図に示すように光電変換素子の出力電流は、連続的ではなく、パルス状となる。また、この電流パルスは、生物標本から確率的に発せられる光子によるものであるため、この電流パルスの電荷総量には、大きなばらつきが生じる。したがって、実施の形態１で説明した推定電圧ＶLASTにも大きなばらつきが生じ、このばらつきを伴った推定電圧ＶLASTをもとに光量を制御すると、光量に大きな誤差が生じる。
【００４４】
図６は、クロック信号ＣＬＫの「Ｈ」「Ｌ」、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫの「Ｈ」「Ｌ」、リセット信号ＲＳＴの「Ｈ」「Ｌ」、スイッチ９の「開」「閉」、電圧信号ＶINT（最大デジタル信号ＤＳMAX）およびデジタル信号ＤＳ、オーバーレンジ信号ＯＶＲの「Ｈ」「Ｌ」を示すタイミングチャートである。図６に示すように、時刻Ｔ３においてデジタル信号ＤＳは、閾値電圧ＶMAXに達し、時刻Ｔ２における「０」と時刻Ｔ３における「ＶMAX」とを結ぶ線を外挿線（ａ）から導かれる推定電圧値ＶａLASTと時刻Ｔ２における「０」と時刻Ｔ３に対して１クロック後の時刻Ｔ４における「ＶMAX」とを結ぶ線を外挿線（ｂ）から導かれる推定電圧値ＶｂLASTとを比較すると、わずか１クロックずれただけにも係わらず、推定電圧値ＶａLAST，ＶｂLASTに大きな差が生じる。したがって、このような場合、時刻Ｔ２〜Ｔ３で得られるデジタル信号ＤＳを用いて最小二乗法による直線回帰演算を行い、最も誤差の少ない外挿線（ｃ）から推定電圧値ＶLASTを導き出すようにしている。
【００４５】
図７は、この発明の実施の形態２である走査型レーザ顕微鏡装置２００の概要構成を示すブロック図である。図７において、この走査型レーザ顕微鏡装置２００は、制御部１３に代えて制御部１５を配置している。制御部１５は、サンプリング部１５０と、走査制御部１５１と、光量制御部１５２と、画像表示制御部１５３とを有している。なお、図１と同一の構成部分には、同一の符号を付している。
【００４６】
サンプリング部１５０は、走査制御部１５１と、光量制御部１５２と、画像表示制御部１５３とにそれぞれ信号を出力している。走査制御部１５１は、照明系３を制御し、光量制御部１５２は、光量調節部２と光電変換素子駆動部７とを制御し、画像表示制御部１５３は、表示部１４を制御している。サンプリング部１５０に出力された電圧信号ＶINTは、サンプリング部１５０で画像信号に変換され、画像表示制御部１５３を介して表示部１４に出力表示される。
【００４７】
つぎに、サンプリング部１５０の動作について説明する。図８は、サンプリング部１５０の概要構成を示すブロック図である。サンプリング部１５０は、トグルフリップフロップ（Ｔ−ＦＦ）１５０１と、ＮＯＲ回路１５０２と、ＮＯＴ回路１５０３と、ＡＮＤ回路１５０４，１５０５と、ＦＩＦＯメモリ（First-In/First-Out）１５０６，１５０７とを有している。なお、図２と同一の構成部分には、同一の符号を付している。
【００４８】
オペアンプ１１から出力された電圧信号ＶINTは、Ａ／Ｄ変換器１３０６によってデジタル信号ＤＳに変換され、デジタル信号ＤＳは、ラッチ回路１３０７と、比較器１３０５と、ＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７とに出力される。比較器１３０５は、入力したデジタル信号ＤＳがＡ／Ｄ変換器１３０６の最大出力の最大デジタル信号ＤＳMAX以上である場合、閾値オーバー信号ＯＶＲTH「Ｈ」をＮＯＲ回路１５０２と光量制御部１５２とに出力し、デジタル信号ＤＳがデジタル信号ＤＳMAX未満である場合、閾値オーバー信号ＯＶＲTH「Ｌ」をＯＲ回路１３１２と光量制御部１５２とに出力する。
【００４９】
ラッチ回路１３０７は、リセット信号ＲＳＴ「Ｈ」を入力すると、デジタル信号ＤＳをラッチして最終デジタル信号ＤＳLを光量制御部１５２と画像表示制御部１５３と出力する。Ｔ−ＦＦ１５０１は、リセット信号ＲＳＴを入力すると、つぎのリセット信号ＲＳＴを入力するまでセレクト信号Ｓ１をＮＯＴ回路１５０３と、ＡＮＤ回路１５０４と、ＦＩＦＯメモリ１５０７とに出力する。
【００５０】
セレクト信号Ｓ１は、リセット信号ＲＳＴが「Ｌ」から「Ｈ」に変化すると、「Ｌ」となり、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」から「Ｌ」に変化すると、「Ｈ」となる。ＮＯＲ回路１５０２は、リセット信号ＲＳＴと閾値オーバー信号ＯＶＲTHとが「Ｌ」の場合、ライトイネーブル信号ＷＥ「Ｈ」をＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７に出力し、リセット信号ＲＳＴと閾値オーバー信号ＯＶＲTHとが「Ｈ」の場合、ライトイネーブル信号ＷＥ「Ｌ」をＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７に出力する。
【００５１】
ＮＯＴ回路１５０３は、Ｔ−ＦＦ１５０１から出力されたセレクト信号Ｓ１を反転したセレクト信号Ｓ２をＡＮＤ回路１５０５とＦＩＦＯメモリ１５０６とに出力する。
【００５２】
ＡＮＤ回路１５０４は、リセット信号ＲＳＴとＴ−ＦＦ１５０１からの出力とを入力し、論理積であるクリア信号ＣＬＲ１をＦＩＦＯメモリ１５０６に出力し、ＡＮＤ回路１５０５は、リセット信号ＲＳＴとＮＯＴ回路からの出力とを入力し、論理積であるクリア信号ＣＬＲ２をＦＩＦＯメモリ１５０７に出力する。
【００５３】
ＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７は、ライトイネーブル信号ＷＥが「Ｈ」であり、かつ夫々のライトチップセレクト端子ＷＣＳ１，ＷＣＳ２に入力したセレクト信号Ｓ１，Ｓ２が「Ｈ」の場合、デジタル信号ＤＳをクロック信号ＣＬＫに同期して記憶し、リードイネーブル信号ＲＥが「Ｈ」であり、かつ夫々のリードチップセレクト端子ＲＣＳ１，ＲＣＳ２に入力したセレクト信号Ｓ１，２が「Ｈ」の場合、記憶したデジタル信号ＤＳを記憶した順番にしたがって光量制御部１５２に出力する。また、ＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７は、クリア信号ＣＬＲ１，ＣＬＲ２「Ｈ」を入力すると、記憶内容を全てクリアする。
【００５４】
図６に示すように、時刻Ｔ１において、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫが「Ｈ」となると、リセット信号ＲＳＴが１クロックの期間「Ｈ」となるとともにスイッチ９が「閉」となり、コンデンサ１０に蓄積された電荷が放電される。この時、Ｔ−ＦＦ１５０１から出力されるセレクト信号Ｓ１は「Ｈ」であり、ＦＩＦＯメモリ１５０６のライトチップセレクト端子ＷＣＳ１と、リードチップセレクト端子ＲＣＳ１とに入力されるセレクト信号Ｓ１は、「Ｈ」とり、ＦＩＦＯメモリ１５０６は、記憶している内容をクリアする。
【００５５】
時刻Ｔ２において、リセット信号ＲＳＴが「Ｌ」となるとともにスイッチ９が「開」となり、コンデンサ１０に電荷が蓄積される。さらに、時刻Ｔ２〜Ｔ３において、リセット信号ＲＳＴは「Ｌ」であり、閾値オーバー信号ＯＶＲTHは「Ｌ」であるため、ライトイネーブル信号ＷＥは、「Ｈ」となる。この時、ＦＩＦＯメモリ１５０６のライトチップセレクト端子ＷＣＳ１は、セレクト信号Ｓ１「Ｈ」を入力しているため、ＦＩＦＯメモリ１５０６にＡ／Ｄ変換器１３０６から出力されたデジタル信号ＤＳが書込まれる。
【００５６】
時刻Ｔ３において、デジタル信号ＤＳは、閾値電圧ＶMAX以上になり、比較器１３０５から出力される閾値オーバー信号ＯＶＲTHが「Ｌ」から「Ｈ」に変化するとともに、ＮＯＲ回路１５０２から出力されるライトイネーブル信号ＷＥが「Ｈ」から「Ｌ」に変化し、ＦＩＦＯメモリ１５０６への書込みが完了する。
【００５７】
時刻Ｔ３〜Ｔ５において、デジタル信号ＤＳは、閾値電圧ＶMAXに飽和し、時刻Ｔ５において、ピクセルクロック信号ＰＣＬＫが再び「Ｈ」となり、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」となるとともにスイッチ９が「閉」となり、コンデンサ１０に蓄積された電荷が放電される。
【００５８】
時刻Ｔ５において、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」になると、Ｔ−ＦＦ１５０１が出力するセレクト信号Ｓ１は、トグルして「Ｈ」から「Ｌ」に変化し、セレクト信号Ｓ２は、「Ｌ」から「Ｈ」に変化する。この時、ＦＩＦＯメモリ１５０７は、ＡＮＤ回路１５０５からクリア信号ＣＬＲ２を入力し、ＦＩＦＯメモリ１５０７が記憶している内容をクリアする。さらにＦＩＦＯメモリ１５０７のライトチップセレクト端子ＷＣＳ２は、セレクト信号Ｓ２「Ｈ」を入力し、ＦＩＦＯメモリ１５０７にＡ／Ｄ変換器１３０６から出力されたデジタル信号ＤＳが書込まれる。
【００５９】
つぎに、図９に示すフローチャートを参照して、サンプリング部１５０と、光量制御部１５２と、画像表示制御部１５３との動作を説明する。まず、光量制御部１５２は、閾値オーバー信号ＯＶＲTHが「Ｈ」であるか否かを判断する（ステップＳ２０１）。閾値オーバー信号ＯＶＲTHが「Ｌ」である間は、電圧信号ＶINTがＡ／Ｄ変換器１３０６の出力レンジを超えていないため、光量を調節する必要がないからである。閾値オーバー信号ＯＶＲTHが「Ｈ」である場合（ステップＳ２０１，ＹＥＳ）、リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」であるか否かを判断する（ステップＳ２０２）。
【００６０】
リセット信号ＲＳＴが「Ｈ」である場合（ステップＳ２０２，Ｙｅｓ）、光量制御部１５２は、ＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７のいずれかに記憶されている１画素に対応するデジタル信号ＤＳの時系列データＤＳｎ（ｎ＝１，２，・・・，Ｎ）を読込む（ステップＳ２０３）。この場合、ＦＩＦＯメモリ１５０６，１５０７の一方は、書込み可能となり、他方は、読込み可能となる。つまり、一方のＦＩＦＯメモリから１画素分の画素データを読込んでいる間に他方のＦＩＦＯメモリに次の画素データが書込まれる。
【００６１】
つぎに、光量制御部１５２は、読み込んだ時系列データＤＳｎ（ｎ＝１，２，・・・，Ｎ）をもとに最小二乗法を用いて線形回帰演算を行い、推定電圧値ＶLASTを求め（ステップＳ２０４）、１画面分の推定電圧値ＶLASTを取得したか否かを判断する（ステップＳ２０５）。
【００６２】
１画面分の推定電圧値ＶLASTを取得した場合（ステップＳ２０５，ＹＥＳ）、取得した推定電圧値ＶLASTの中から最大の推定電圧値ＶLASTを抽出する（ステップＳ２０６）。光量制御部１５２は、最大の推定電圧値ＶLASTから最適電圧値ＶHV(NEW)を求める（ステップＳ２０７）。
【００６３】
つぎに、光量制御部１５２は、最適電圧ＶHV(NEW)が最小限度電圧ＶHV(LIM)未満か否かを判断する（ステップＳ２０８）。最適電圧ＶHV(NEW)が最小限度電圧ＶHV(LIM)未満である場合（ステップＳ２０８，ＹＥＳ）、光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最小限度電圧ＶHV(NEW)を設定し（ステップＳ２０９）、最適電圧ＶHV(NEW)が最小限度電圧ＶHV(LIM)以上である場合（ステップＳ２０８，ＮＯ）、光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最適電圧ＶHV(LIM)を設定する（ステップＳ２１０）。
【００６４】
光電変換素子駆動部７を介して光電変換素子６に最小限度電圧ＶHV(LIM)を設定した場合（ステップＳ２１０）、光量制御部１３２は、光量調節部２を介してレーザ光の光量を最適光量ＬEX(NEW)（＝（ＶHV(NEW)／ＶHV(LIM)）1/C）に設定する（ステップＳ２１０）。
【００６５】
この実施の形態２では、試料４からの光が微弱でＡ／Ｄ変換器１３０６によって変換されるデジタル信号ＤＳが線形に増加しない場合、最小二乗法を用いて推定電圧値ＶLASTを求めることによって、誤差の少ない光量の制御が行えるようにしている。このようにすると、短時間にノイズを除去できるためＳ／Ｎ比が高く、明るい画像信号が取得できる。
【００６６】
なお、上述の実施の形態１，２では、光量制御部１３２，１５２は、光量調節部２を介して光量を制御するようにしていたが、レーザ光源１が半導体レーザ（ＬＤ）であるような場合、光量調節部２を省いた上、光量制御部１３２，１５２は、レーザ光源１を直接制御して光量を制御するようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】この発明の実施の形態１にかかる走査型レーザ顕微鏡装置の機能ブロック図である。
【図２】この発明の実施の形態１にかかるサンプリング部の機能ブロック図である。
【図３】この発明の実施の形態１にかかるサンプリング部における各信号および各信号値のタイムチャートである。
【図４】この発明の実施の形態１にかかる制御部のフローチャートである。
【図５】この発明の実施の形態２にかかる光電変換素子の出力電流の時間変化を示す模式図である。
【図６】この発明の実施の形態２にかかるサンプリング部における各信号のタイムチャートである。
【図７】この発明の実施の形態２にかかる走査型レーザ顕微鏡装置の機能ブロック図である。
【図８】この発明の実施の形態２にかかるサンプリング部の機能ブロック図である。
【図９】この発明の実施の形態２にかかる制御部のフローチャートである。
【符号の説明】
【００６８】
１  レーザ光源
２  光量調節部
３  照明光学系
４  試料
５  観察光学系
６  光電変換素子
７  光電変換素子駆動部
８  スイッチ駆動部
９  スイッチ
１０  コンデンサ
１１  オペアンプ
１２  クリップダイオード
１３，１５  制御部
１００，２００  走査型レーザ顕微鏡装置
１３０，１５０  サンプリング部
１３１，１５１  走査制御部
１３２，１５２  光量制御部
１３３，１５３  画像表示制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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