(57)【要約】【課題】  p38/JTV-1蛋白質を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及び癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  p38/JTV-1蛋白質または前記蛋白質を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及びp38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準増加に影響を与える物質を選別することを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法を提供する。【選択図】 図２２
2005139121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
p38/JTV-1蛋白質またはその断片を有効成分とする癌治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記p38/JTV-1蛋白質が、TGF-β2から誘導されることを特徴とする、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記p38/JTV-1蛋白質が、配列番号4で表示されることを特徴とする、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記断片が、配列番号4の84番から161番のアミノ酸を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記断片が、配列番号5または配列番号6で表示される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１のp38/JTV-1蛋白質またはその断片を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号1で表示されることを特徴とする、請求項６に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号1の250番から483番の塩基配列を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号2または配列番号3で表示される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記核酸が、発現ベクター内に含まれていることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、プラスミドまたはウイルス性ベクターである、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記プラスミドが、pRK5、pSV16B、pVL1392及びpcDNA3からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ウイルス性ベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びヘルペスウイルスベクターの中から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記癌が、乳房癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部癌、皮膚または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、輸卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌、膣癌、陰門癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌線癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、CNS腫瘍、1次CNSリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫等の癌またはこれら癌の一つ以上の組み合わせであることを特徴とする、請求項１または請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
(a) p38/JTV-1蛋白質または前記蛋白質を発現する組換え細胞と候補物質を培養する工程及び、
(b)p38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準増加におよぼす効果を測定する工程を含むことを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記(b)工程のp38/JTV-1蛋白質活性の増加が、p38/JTV-1蛋白質がFBPまたはPDKと結合できる能力が増加したものであることを特徴とする、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記(b)工程のp38/JTV-1蛋白質の細胞内水準の増加が、p38/JTV-1遺伝子の発現が増加されたりまたは蛋白質分解が抑制され蛋白質濃度が増加したものであることを特徴とする、請求項１５に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記p38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準を、免疫沈殿法(coimmunoprecipitation)、放射能免疫分析法(RIA)、酵素免疫分析法(ELISA)、免疫組織化学、ウエスタンブロット法(Western Blotting)及びFACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)で測定することを特徴とする、請求項１５に記載の癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、p38/JTV-1を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及び癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法に関するものである。より詳細には、本発明はp38/JTV-1蛋白質または前記蛋白質を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物及びp38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準増加に影響を与える物質を選別することを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌と言うのは、細胞が分化(differentiation)能力を喪失して細胞の成長(growth)及び増殖(proliferation)が調節されず、過剰増殖が起きる細胞の集合を言う。大部分の癌は発癌遺伝子(oncogene)と腫瘍抑制遺伝子(tumor suppressor gene)の変異が5〜8段階にわたって起き、窮極的に癌細胞が生成される多段階発癌説(multistep carcinogenesis)で説明されている。癌を誘発する発癌遺伝子が活性化されると細胞の非正常的な増殖が誘導され、腫瘍抑制遺伝子が活性化されると細胞の非正常的な増殖が抑制され細胞死滅プログラムが作動して特定細胞を死滅させることによって癌細胞の生成を遮断すると公知されている。
【０００３】
現在まで、癌の発生と関連した遺伝子は100余種類以上が発見された。代表的な発癌遺伝子としては、H-ras、N-ras、K-ras、c-myc及びN-myc遺伝子がある。これらの発癌遺伝子は、ヒトのほとんどすべての染色体に分布している。これら遺伝子に変異が起きると細胞の非正常的な増殖が起きてこれが癌細胞に発展する。この中で、特に、c-mycの過発現はヒトの多様な癌例えば、乳房癌(breast cancer)の80%、大腸癌(colon cancer)の70%、婦人科癌(gynecological cancer)の90%及び肝細胞性癌(hepatocellular cancer)の50%で観察されたことがある。この他にも、c-mycの非正常的な過発現は血液腫瘍、子宮頚部癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、生殖器癌、結腸癌、胃腺癌、前骨髄細胞白血病、繊維芽細胞腫、上皮細胞腫及び骨髄細胞腫等と関連があると公知されている。
【０００４】
細胞の非正常的な増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子では、p53、p16、p21、p24及びp27等が代表的である。腫瘍抑制遺伝子は、細胞の非正常的分裂と増殖を抑制するだけではなく、細胞DNAが損傷した時にそれを正常復旧する機能を遂行し、DNAの無制限的な増幅を防止するために細胞増殖及びアポトーシス(apoptosis)の調節に関与すると公知されている。
【０００５】
最近では、究明された発癌遺伝子と腫瘍抑制遺伝子を利用して癌を治療しようとする試みが活溌に行なわれている。即ち、過発現された発癌遺伝子をダウンレギュレーションできる化合物の開発及び前記発癌遺伝子に対するアンチセンスを開発して遺伝子の活性を抑制したり、生体内の損傷した腫瘍抑制遺伝子を正常遺伝子に代替する多様な遺伝子治療が試みられている。合わせて、癌細胞のアポトーシスを誘導する因子等が抗癌剤として多様に開発されている。
【０００６】
一方、p38/JTV-1は、高等真核細胞(eukaryotes)のアミノアシル-tRNA合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetases; ARSs)蛋白質複合体の補助因子(auxiliary factor)として公知されている (非特許文献１参照)。前記ARSsはアミノ酸とtRNAのライゲーション(ligation)を触媒する酵素であるため、p38/JTV-1は蛋白質合成と関連した機能を遂行すると推定されている。一方、p38/JTV-1をコーディングする遺伝子は、ヒト7番染色体に位置していて、ミスマッチDNA修復(mismatch DNA repair)と関連したPMS2をコーディングする遺伝子とヘッドツーヘッド(head to head)方式で整列されている(非特許文献２参照)。前記p38/JTV-1遺伝子により暗号化されるp38/JTV-1蛋白質は、マウスの場合に320個のアミノ酸残基からなっていて、ヒトの場合には312個のアミノ酸残基からなっていて、その配列は公知されている(非特許文献１参照) 。p38/JTV-1蛋白質は疎水性蛋白質として蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction)と関連した領域のロイシン-ジッパーモチーフ(leucine-zipper motif)が含まれているものと推定されている(非特許文献１参照) 。また、p38/JTV-1は、JTV-1蛋白質という名称で報告されたこともある(非特許文献３参照)。しかし、現在までp38/JTV-1の機能に対して正確に究明されたことはない。
【０００７】
本発明者らは、p38/JTV-1の機能を究明するための実験を遂行中にp38/JTV-1がc-mycの転写を促進するFBP(FUSE binding protein)と結合し、アポトーシス(apoptosis)を調節するAKT-PI3K経路でPDK(phosphate dependent protein kinase)と結合するという新しい事実を発見した。それで、本発明者らは、p38/JTV-1がFBPと相互作用することによってc-mycをダウンレギュレーション(downregulation)して細胞増殖を抑制し、PDKと相互作用することによってAKT(serin/ threonine kinase)のリン酸化を抑制してアポトーシスを促進する新しい活性を持っていることを究明し、前記の特性によりp38/JTV-1が腫瘍抑制因子として有用に使用できることを確認することによって本発明を完成した。
【０００８】
【非特許文献１】Quevillon S. 等, J. Mol. Biol., 1999年、第285巻、P.183-195
【非特許文献２】Kolodner R. D. 等, Curr. Opin. Gene. Dev., 1999年、第9巻、P.89-96
【非特許文献３】Nicolaides等, Genomics, 1995年、第29巻、P.329-334
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、p38/JTV-1蛋白質またはその断片を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記蛋白質またはその断片を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１１】
また、本発明のまた他の目的は、p38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準を増加させる物質を選別することを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するために、本発明はp38/JTV-1蛋白質またはその断片を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明の他の目的を達成するために、本発明は前記蛋白質またはその断片を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明のまた他の目的を達成するために、本発明はp38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準を増加させる物質を選別することを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による癌治療用薬学的組成物は、FBP(FUSE-binding protein)と結合してガン原遺伝子(proto-oncogene)であるc-myc遺伝子をダウンレギュレーション(downregulation)することによって癌細胞の増殖を抑制する機序とPDKと結合してAKTのリン酸化をを抑制して細胞のアポトーシス(apoptosis)を促進する機序を通して癌を治療するのに有用に利用できる。また、前記のp38/JTV-1の調節機序を利用してp38/JTV-1を新しい抗癌剤のスクリーニングのための標的に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明者らは、アミノアシル-tRNA合成酵素複合体(Aminoacyl-tRNA synthe tases: ARSs)形成の安定性と活性に重要な役割を果たすと公知されている p38/JTV-1遺伝子の今までに報告されていない新しい機能を究明した。本発明者らは、p38/JTV-1遺伝子が欠損したマウスの場合には、生後2日以内にすべて死亡する特性があることを観察し、マウスの死亡原因を調査した。その結果、p38/JTV-1遺伝子の欠損は蛋白質合成には影響を与えないが、肺胞細胞の過増殖を誘発するという事実が確認できた。また、p38/JTV-1遺伝子が欠損したマウスの場合に、野生型マウスに比べてアポトーシス(apoptosis)した細胞の数が減少することが観察された(結果未図示)。それで、本発明者らは、p38/JTV-1がARSsの補助因子として機能するだけではなく、細胞増殖抑制及びアポトーシス(apoptosis)と関連して今までに報告されていない新しい機能を持っていると推定した。
【００１８】
本発明者らは、p38/JTV-1の新しい機能を究明するため、酵母ツーハイブリッド分析法(yeast two hybrid assay)を使用してp38/JTV-1と結合する結合蛋白質をスクリーニングした。実験の結果、p38/JTV-1がc-mycプロモーターから上流側に位置している1.5kbの単一鎖ファー-上流配列要素(single stranded far-upstream sequence element, FUSE)と結合している(Duncan R. 等, Genes Dev., 1994年、第8巻、P.465-480) FBP(FUSE-binding protein)と特異的に相互作用するという新しい事実を確認するに至った(図１参照)。前記p38/JTV-1とFBPの相互作用は、親和的精製法(affinity purification)と免疫沈殿法(immunoprecipitation)によっても確認できた(結果未図示)。
【００１９】
前記FBP(FUSE-binding protein)は、活性化されたc-mycプロモーターの上流に位置するFUSEに結合することによってc-mycの発現を誘導する蛋白質として公知されている。したがって、FBPはc-myc発現のDNA-結合調節因子(DNA-binding regulator of c-myc expression, DROME)とも呼ばれる(M. I. Avigan等, J. Biol. Chem., 1990年、第265巻、P.18538-18545)。最近、FBPの活性がFIR(FBP-相互作用抑制因子)によって陰性的に調節できることが報告されたことがある(Liu J. 等, Mol. Cell, 2000年、第5巻、P.331-341)。この場合に、FIRはc-mycの活性因子による発現を抑制するためにFUSE DNA上のFBPと複合体を形成すると報告されている。
【００２０】
以上のことを鑑みて本発明者らは、本発明で新しく発見したp38/JTV-1とFBPの相互作用がc-mycの発現と関連してどのような機能を遂行するのかをp38/JTV-1欠損マウス(p38/JTV-1 deficient mouse)を利用して究明した。
【００２１】
本発明の一実施例では、p38/JTV-1欠損マウスと野生型マウスの肺組織から蛋白質を抽出してFBP、p38/JTV-1及びc-mycに特異的な抗体で免疫ブロット分析を行なった。その結果、p38/JTV-1欠損突然変異マウスの場合に野生型マウスに比べてFBPとc-myc水準が高く現れた(図２参照)。このような結果からp38/JTV-1がFBPとc-mycの細胞内水準を減少させる効果があると推定した。
【００２２】
前記の推定を確認するために本発明の他の実施例でp38/JTV-1の発現増加による細胞内FBPとc-mycの水準変化を調査した結果、p38/JTV-1の発現水準が増加するほどFBPとc-mycの細胞内水準は減少する傾向を示した(図３参照)。
【００２３】
本発明の他の実施例では、FBPのユビキチン化にp38/JTV-1が関連しているかどうかを調査した。その結果、FBPのユビキチン化は26Sプロテオゾームと関連があり、p38/JTV-1がFBPのユビキチン化を促進させるという事実を確認できた(図４及び図５参照)。
【００２４】
さらに、本発明者らは、p38/JTV-1欠失断片を製造してFBPと相互作用する領域を究明した。実験の結果、p38/JTV-1のFBPとの相互作用は、p38/JTV-1のN-末端領域と関連があることが分かった。また、p38/JTV-1断片がFBPに結合してFBPのユビキチン化を促進させ、それによってc-myc発現が抑制されることを確認できた(図６〜図９参照)。
【００２５】
また、本発明の他の実施例では、TGF-β2がp38/JTV-1の発現に及ぼす影響を調査した。その結果、p38/JTV-1の発現がTGF-β2の処理によって増加することを確認できた(図１０参照)。結論的に本発明者らは、TGF-β2によってp38/JTV-1の発現が増加し発現されたp38/JTV-1がFBPと結合してユビキチン化を促進することによってc-mycの発現をダウンレギュレーションするTGF-β2→p38/JTV-1→FBP→c-myc調節機序を究明できた(図１１参照)。
【００２６】
一方、本発明者らは、p38/JTV-1が欠損したマウスから分離した組織の場合に、野生型に比べてアポトーシス(apoptosis)が起きる細胞の数が顕著に減少する事実を発見して、p38/JTV-1とアポトーシス調節機序との関連性を究明しようとした。
【００２７】
生体内で細胞の生存及び細胞のアポトーシスを調節する重要な機序としては、AKT-PI3K経路が公知されている (Kulik等, Mol. Cell. Biol., 1997年、第17(3)巻、P.1595-1606; Franke等, Cell, 1997年、第188(4)巻、P.435-437; Kauffmann-Zeh等, Nature, 1997年、第385(6616)巻、P.544-548; Hemmings, Science, 1997年、第275(5300)巻、P.628-630)。細胞の生存因子、例えば、血小板誘導された成長因子(PDGF)、神経成長因子(NGF)及びインシュリン形成長因子-1(IGF-1)は、PI3Kの活性を誘導する。活性化されたPI3Kは、ホスファチジルイノシトール(3,4,5)-トリホスファート(Ptdlns(3,4,5)-P3)の生成を誘導し、前記Ptdlns(3,4,5)-P3は、セリン/スレオニンキナーゼであるAKTに結合し、AKTを細胞質から細胞質膜への転座を惹起させる。このために、AKTのアミノ酸残基308番のスレオニン(Thr308)とアミノ酸残基473番セリン(Ser473)のリン酸化が起きる。リン酸化されたAKTは、アポトーシスを抑制して細胞の生存を促進させる。最近、前記Thr308をリン酸化させる機能をする蛋白質キナーゼPDK1が同定されたことがあり、Ser473をリン酸化させるキナーゼはまだ同定されていない(Stokeo等, Science, 1997年、第277巻、P.567-570; Stephens等, Science, 1998年、第279巻、P.710-714)。
【００２８】
それで、本発明者らは、p38/JTV-1とAKT-PI3K経路との関連性を調査するために、本発明の一実施例でp38/JTV-1欠損マウスから色々な組織を分離してリン酸化されたAKTの発現程度とPI3Kの発現程度をウエスタンブロット分析で調査した。その結果、p38/JTV-1欠損マウスでPI3K及び総AKTの発現程度は、野生型と差がないけれどリン酸化されたAKT(p-AKT)の発現が野生型に比べて増加して現れた(図１２及び図１３参照)。
【００２９】
p38/JTV-1とAKT活性との関連性をより詳細に調査するために、本発明の他の実施例では癌細胞株でp38/JTV-1の発現増加及び時間の経過によるAKT-PI3K経路と関連した因子の発現変化を調査した。その結果、p38/JTV-1の発現が増加するにしたがってリン酸化されたAKT(p-308及びp-473)とPDKの発現は減少した。Bcl-2系列と総AKTの発現は変化がなかった(図１４参照)。また、前記p38/JTV-1によるAKTのリン酸化抑制活性は時間の経過につれて増加することが分かった(図１５参照)。このような結果は、p38/JTV-1がAKT活性を陰性的に調節する新しい調節因子である可能性を提示してくれる。
【００３０】
本発明の実施例では、p38/JTV-1とPDKとの相互作用を酵母ツーハイブリッド分析法と免疫沈殿法で調査した結果、p38/JTV-1とPDKの強い相互作用を確認した。反面、p38/JTV-1とPI3K間には相互作用が見られなかった(図１６参照)。
【００３１】
前記p38/JTV-1とPDKとの相互作用は、PDK欠失断片とp38/JTV-1の相互作用傾向を分析することによって確証できた。即ち、p38/JTV-1とPDK全体断片が強い相互作用を示したのに比べてAKTをリン酸化する活性を持っているPDKのキナーゼドメインが欠失した場合、p38/JTV-1と相互作用を示さなかった(図１７及び図１８参照)。このことからp38/JTV-1がPDKのキナーゼドメインに結合してAKTのリン酸化を抑制するということを知ることができた。
【００３２】
本発明の実施例では、アポトーシス(apoptosis)を促進する死滅リガンド(death ligand)のFasLとTNF処理による癌細胞株でp38/JTV-1の発現程度を調査した結果、死滅リガンドの処理によりp38/JTV-1の発現が増加した。p38/JTV-1の発現増加によりリン酸化されたAKTは減少し、p38/JTV-1とPDKの相互作用は増加することを確認した(図１９及び図２０参照)。
【００３３】
前記実験結果から本発明者らは、死滅リガンドによりp38/JTV-1の発現が促進されると発現されたp38/JTV-1がPDKとの相互作用を通してAKTのリン酸化を抑制することによってアポトーシスを促進する機序を新しく究明した(図２１参照)。
【００３４】
したがって、今までARSsの補助因子としてだけ公知されているp38/JTV-1は、前記FBP及びPDKとの相互作用を通して細胞の過増殖を抑制しアポトーシスを促進する新規な癌抑制因子(tumor supressor)として提供できる。本発明者らは、p38/JTV-1の癌抑制因子としての用途を確認するために癌細胞株でp38/JTV-1の発現増加による細胞増殖抑制程度及びアポトーシス程度を調査した。
【００３５】
本発明の一実施例でヒト結腸癌細胞株、子宮頚部癌細胞株及び肺上皮内癌腫細胞株をp38/JTV-1発現プラスミドでトランスフェクションさせた後、細胞増殖程度を調査した結果、p38/JTV-1遺伝子の発現が増加するにつれて癌細胞の増殖が有意に抑制されることを確認できた(図２２参照)。
【００３６】
また、本発明の実施例では子宮頚部癌細胞株をp38/JTV-1発現プラスミドでトランスフェクションさせた後、細胞のアポトーシス程度及びチトクロームCの放出程度を測定した。その結果、細胞内にp38/JTV-1遺伝子が導入されない場合に比べてアポトーシスとチトクロームCの放出程度が増加した。また、前記アポトーシスは死滅リガンドのTNFの処理によって増加することが分かった(図２３及び図２４参照)。このことからp38/JTV-1がアポトーシスを促進するため、抗癌剤に使用できることを確認できた。
【００３７】
したがって、本発明はp38/JTV-1蛋白質またはその断片を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００３８】
本発明の薬学的組成物に含まれるp38/JTV-1蛋白質は、天然形または組換えp38/JTV-1蛋白質またはこれらと実質的に同等な生理活性を持つ蛋白質を言う。実質的に同等な生理活性を持つ蛋白質には、天然形/組換えp38/JTV-1蛋白質とその機能的同等物(functional equivalent)及び機能的誘導体(functional derivative)が含まれる。
【００３９】
前記「機能的同等物」には、天然形蛋白質アミノ酸中の一部または全部が置換されるか、アミノ酸の一部が欠失または付加されたアミノ酸配列変形体として天然形p38/JTV-1蛋白質と実質的に同等な生理活性を持つことを言う。「機能的誘導体」は、前記p38/JTV-1蛋白質の物理化学的性質を増加または減少させるための変形を加えた蛋白質として天然形p38/JTV-1蛋白質と実質的に同等な生理活性を持つものを意味する。
【００４０】
本発明のp38/JTV-1蛋白質のアミノ酸配列は公知されていて、哺乳動物から由来したものである。好ましくは、前記哺乳動物はヒトを含む。最も好ましくは、本発明のp38/JTV-1蛋白質は配列番号4で表示されるアミノ酸配列を持つ蛋白質を言う。
【００４１】
また、本発明の薬学的組成物には、p38/JTV-1蛋白質の断片が含まれ得る。p38/JTV-1蛋白質断片は配列番号4で表示されるp38/JTV-1蛋白質の84番から161番のアミノ酸配列を含む断片を言う。より好ましくは、配列番号5または配列番号6で表示されるアミノ酸配列を含む断片を言う。
【００４２】
本発明に使用したp38/JTV-1蛋白質またはその断片は、公知された配列から遺伝工学的方法で製造できる(Park等, J. Biol. Chem. 1999年、第274巻、P.166673-166676)。
【００４３】
また、本発明による薬学的組成物は、経口によりまたは静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内等に非経口的にヒトと動物に投与される。経口投与は舌下適用も含む。非経口的投与は皮下注射、筋肉内注射及び静脈注射等の注射法及び点滴法を含む。これ以外に、本発明薬学的組成物は各種の剤形形態で通用している技法により製造できる。
【００４４】
本発明のp38/JTV-1蛋白質またはその断片を有効成分とする癌治療用薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことによって各種の剤形の形態に製造できる。前記「薬学的に許容される」というのは、生理学的に許容されヒトに投与される時、 通常的に胃腸障害、目眩等のアレルギー反応またはそれと類似な反応を起こさない組成物を言う。薬学的に許容される担体は、経口投与時には結合剤、滑濁剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素及び香料を使用できる。注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤及び安定化剤を混合して使用でき、局所投与用製剤の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤及び保存剤を使用できる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述した薬学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハー(wafer)等の形態で製造でき、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬包含剤形態で製造できる。
【００４５】
また、本発明は前記p38/JTV-1蛋白質またはその断片を暗号化する核酸を有効成分とする癌治療用薬学的組成物を提供する。
【００４６】
p38/JTV-1蛋白質またはその断片を暗号化する核酸は、DNAまたはRNAを含む。好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトから由来したp38/JTV-1を暗号化するDNAを言う。前記ヒトp38/JTV-1遺伝子は公知されている(Genbank accession 番号: U24169)。
【００４７】
本発明の薬学的組成物に含まれる核酸は、好ましくは配列番号1で表示される。また、本発明の薬学的組成物にはp38/JTV-1蛋白質断片を暗号化する核酸が含まれ得る。前記p38/JTV-1蛋白質断片を暗号化する核酸は、配列番号1で表示されるp38/JTV-1遺伝子の250番から483番核の酸配列を含む。より好ましくは、前記核酸は配列番号2または配列番号3で表示できる。また、本発明による薬学的組成物は、前記p38/JTV-1蛋白質またはその断片を暗号化する核酸またはそれに相補的な塩基配列を含む核酸と少なくても80%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の配列相同性をもつ核酸が含まれる。
【００４８】
前記核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター内に公知の方法により導入させた後、前記発現ベクターを当業界に公知された多様な方法で感染(infection)または形質導入(transduction)により発現形で標的細胞内に導入させられる。
【００４９】
プラスミド発現ベクターは、ヒトに使用できるFDAの承認を受けた遺伝子伝達方法で、ヒト細胞に直接的にプラスミドDNAを伝達する方法である(Nabel, E. G., 等, Science, 1990年、第249巻、P.1285-1288)。プラスミドDNAは、ウイルスベクターとは異なり均質に精製できる長所がある。本発明で使用できるプラスミド発現ベクターとしては、当業界に公知された哺乳動物発現プラスミドを使用できる。例えば、pRK5(欧州特許 第307,247号)、pSV16B(国際特許公開 第91/08291号)及びpVL1392(PharMingen)等が代表的であるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施例ではpcDNA3(Invitrogen)プラスミドを使用した。
【００５０】
本発明による核酸を含むプラスミド発現ベクター(plasmid expression vector)は、当業界に公知された方法、例えば、一時的トランスフェクション(transient transfection)、微細注射、形質導入(transduction)、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクション(liposome-mediated transfection)、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション(DEAE Dextran- mediated transfection)、ポリブレン媒介トランスフェクション(polybrene-mediated trans fection)、電気穿孔法(electropora tion)、遺伝子ガン(gene gun)及び細胞内にDNAを導入させるための他の公知の方法により腫瘍細胞内に導入できるが、これに限定されるものではない(Wu 等, J. Bio. Chem., 1992年、第267巻、P.963-967; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 1988年、第263巻、P.14621-14624)。好ましくは、一時的トランスフェクション方法を使用する。
【００５１】
また、本発明による核酸を含むウイルス発現ベクターとしては、レトロウイルス(retrovirus)、アデノウイルス(adenovirus)、ヘルペスウイルス(herpes virus)及びアビポツクスウイルス(avipox virus)等が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００５２】
前記レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子がすべて除去されたりまたは変更され、非-ウイルス蛋白質がウイルスベクターによって感染された細胞内で作られるように作製されたものである。遺伝子療法のためのレトロウイルスベクターの主な長所は、多量の遺伝子を複製細胞内に伝達し、細胞DNA内に伝達された遺伝子を正確に統合して遺伝子形質感染後、連続的な感染が誘発されないことである(Miller, A.D., Nature, 1992年、第357巻、P.455-460)。FDAから認証受けたレトロウイルスベクターは、PA317アンフォトロピックレトロウイルスパッケージ細胞を利用して製造したものである(Miller, A.D. とButtimore, C., Molec. Cell Biol., 1986年、第6巻、P.2895-2902)。
【００５３】
非-レトロウイルスベクターとしては、前記で言及したようにアデノウイルスがある(Rosenfeld, M.A., 等, Cell, 1992年、第68巻、P.143-155; Jaffe, H.A. 等, Nature Genetics, 1992年、第1巻、P.372-378; Lemarchand, P.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992年、第89巻、P.6482-6486)。アデノウイルスの主な長所は、多量のDNA断片(36kbゲノム)を運搬し、非常に高い力価で非-複製細胞を感染させられる能力があることである。また、ヘルペスウイルスもヒト遺伝子療法に有用に使用できる(Wolfe, J.H., 等, Nature Genetics, 1992年、第1巻、P.379-384)。この他にも、公知された適切なウイルスベクターが本発明の薬学的組成物に使用できる。
【００５４】
前記p38/JTV-1を発現させられるベクターは、公知の方法により投与できる。例えば、局所的に、非経口、経口、鼻腔、静脈、筋肉内、皮下内または他の適切な手段により投与できる。特に、前記ベクターは標的組織の腫瘍細胞を治療するための有効量で標的癌または腫瘍細胞内に直接注射できる。特に、目、胃腸管、泌尿生殖器官、肺及び気管支システムのような体腔(body cavity)にある癌または腫瘍の場合には、本発明の薬学的組成物を癌または腫瘍により影響を受ける有腔器官(hollow organ)内に針、カテーテル(catheter)または他の種類の輸送チューブを利用して直接注入できる。この時、X-線、ソノグラム(sonogram)、または光ファイバーシステム(fiberoptic visualization system)等の映像装置が標的組織の位置確認と針またはカテーテルの注入に使用できる。その他に、直接的に到達できないか分析学的に分離できない腫瘍または癌の場合には、本発明による薬学的組成物を血液循環系内に投与できる。
【００５５】
また、本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含むことができる。このような担体または賦形剤には、分散剤、湿潤剤、懸濁剤、稀釈剤及び充填剤が含まれる。特定の薬学的に許容される担体と本発明の薬学的組成物に含まれる発現ベクターの比率は、組成物の溶解度と化学的性質、特定の投与方式等により決定できる。
【００５６】
本発明による薬学的組成物の治療学的または予防学的有効量は、投与対象、年齢、個人差及び疾病状態によって適切に選択できる。
【００５７】
前記本発明による薬学的組成物は、異常細胞の過増殖即ち、癌の治療にとても 効果的である。癌には、例えば、乳房癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部癌、皮膚または眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門付近癌、結腸癌、輸卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頚部癌、膣癌、陰門癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌線癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、CNS腫瘍、1次CNSリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫等の癌またはこれら癌の一つ以上の組合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【００５８】
また、本発明で究明したようにp38/JTV-1は、FBPと結合してFBPのユビキチン化を促進させることによってガン原遺伝子のc-mycをダウンレギュレーションする活性とPDKと結合してAKTのリン酸化をを抑制することによってアポトーシス(apoptosis)を促進する活性を持つため、p38/JTV-1のこのような特性は癌の治療及び予防に効果的な物質をスクリーニングするのに使用できる。
【００５９】
したがって、本発明は(a)p38/JTV-1蛋白質または前記蛋白質を発現する組換え細胞と候補物質を培養する工程;及び(b)p38/JTV-1蛋白質の活性または細胞内水準増加に及ぼす効果を測定する工程を含むことを特徴とする癌治療用薬学的組成物のスクリーニング方法を提供する。前記で、p38/JTV-1蛋白質活性の増加は、p38/JTV-1蛋白質がFBP蛋白質またはPDKと結合できる能力が増加したことを意味する。そして、p38/JTV-1蛋白質の細胞内水準増加と言うのは、p38/JTV-1遺伝子の発現が増加したりまたはp38/JTV-1蛋白質の分解が抑制され、p38/JTV-1蛋白質の濃度が増加することを言う。前記p38/JTV-1遺伝子発現は、p38/JTV-1遺伝子の転写及び蛋白質への翻訳過程を含む。したがって、本発明の癌治療用薬学的組成物の候補物質は、p38/JTV-1とFBPの結合を促進させたりp38/JTV-1とPDKの結合を促進させたりまたは細胞内p38/JTV-1蛋白質の水準を増加させる特性を持つ物質である。
【００６０】
p38/JTV-1蛋白質の活性及び細胞内水準を測定する方法は当業界に公知された色々な方法を使用できる。例えば、免疫沈殿法(coimmunoprecipitation)、酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbentassay)、放射能免疫分析法(RIA)、免疫組織化学、ウエスタンブロット法(Western Blotting)及びFACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)が含まれるが、これに限定されない。
【００６１】
また、本発明のp38/JTV-1を標的にしたスクリーニング方法は、高効率スクリーニング(high throughput screening;HTS)を適用できる。HTSは多数の候補物質を並行試験して、多数の候補物質の生物学的活性について同時にまたはほとんど同時にスクリーニングする方法である。特定様態として、96-ウェル微細力価プレートまたは192-ウェル微細力価プレートで細胞株を培養し、ここに多数個の候補物質を処理した後、免疫化学的方法によりp38/JTV-1の発現程度を測定できる。このフォーマットでは、96回の独立的な試験を96個の反応ウェルを含有する単一8cm×12cmプラスチックプレート上で同時に遂行できる。前記ウェルは典型的に50μl〜500μlの検定容積を必要とする。プレート以外に、96-ウェルフォーマットを広範囲な均一系及び不均一系検定に適合させるために多数の計器、機構、ピペット、ロボット、プレート洗浄器及びプレート判読器が商業的に利用可能である。
【００６２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００６３】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
p38/JTV-1とFPBの相互作用によるc-myc調節機序究明
<実施例1-1>
酵母ツーハイブリッド分析法を利用したp38/JTV-1と相互作用する結合蛋白質の選別
【００６５】
酵母ツーハイブリッド分析法にはLexAシステムを利用した。ヒトp38/JTV-1とLexA蛋白質を融合させて発現させ、p38/JTV-1自体、ライシル-tRNA合成酵素(lysyl-tRNA synthetase, KRS)、FUSE-結合蛋白質(FUSE-binding protein; FBP)、トリプトファニル-tRNA合成酵素(tryptophanly-tRNA synthetase; WRS)、チロシル-tRNA合成酵素(tyrosyl-tRNA synthetase; YRS)及びグルタミニル-tRNA合成酵素(glutaminyl-tRNA synthetases; QRS)を各々B42蛋白質と融合させ発現させることによってp38/JTV-1蛋白質と結合する蛋白質を選別した。
【００６６】
p38/JTV-1とLexAの融合蛋白質を発現させるためにp38/JTV-1 cDNAが導入された組換えプラスミドpLexA-(p38/JTV-1)を製造した。前記p38/JTV-1 cDNAは、ヒト子宮頚部癌細胞株HeLa cDNAライブラリー(human cell line HeLa cDNA library; Clontech)を鋳型にしてp38/JTV-1 cDNAの公知された塩基配列から(Gene Bank Accession 番号: U24169)製造された下記表１の正方向プライマー(配列番号7)と逆方向プライマー(配列番号8)を利用してPCR増幅することによって収得した。前記収得したp38/JTV-1のcDNAをEcoRIとSalIで切断してpLex202ベクター(invitrogen)のEcoRI及びSalI位置にサブクローンすることによってpLexA-(p38/JTV-1)を製造した。この時、PCRは94℃で5分間鋳型DNAを変性させた後、94℃で1分、57℃で1分、72℃で1分で25回 反復遂行した。
【００６７】
【表１】
2005139121.tif 000003
【００６８】
結合蛋白質とB42の融合蛋白質を発現させるために組換えプラスミドpB42-(p38/JTV-1)、pB42-FBP、pB42-KRS、pB42-WRS、pB42-YRS及びpB42-QRSは、下記の方法で製造した。前記の方法で製造したp38/JTV-1 cDNAをpB42ベクター(Invitrogen)のEcoR1及びXho1部位に連結することによってpB42-(p38/JTV-1)プラスミドを製造した。全長ヒトFBPをコーディングするcDNA(Gene Bank Accession 番号: NM−003902)はレベンス博士(Dr. D. Levens, National Institutes of Health; NIH, USA)から提供を受けた。C-末端領域のアミノ酸564-645番までの断片をpB42のEcoR1及びXho1部位に連結してpB42-FBPプラスミドを製造した。KRS、WRS、YRS及びQRSのcDNAは、本発明者らが以前に製造したLexA-KRS、LexA-WRS、LexA-YRS及びLexA-QRS(Kang J. W. 等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.41,31682-31688)をEcoR1及びXho1で切断することによって収得した。前記cDNAをpB42のEcoR1及びXho1部位に連結してpB42-KRS、pB42-WRS、pB42-YRS及びpB42-QRSを製造した。
【００６９】
前記の方法で製造した組換えプラスミドをlacZプラスミド(p8op-LacZ)を標識遺伝子に持っているサッカロマイセスセレビシエEGY48 (Saccaromyces cerevisiae EGY48; Clontech laboratories Inc. Estojak等. (1995))に公知された方法を使用して形質転換させた(Golemis, E. A.等, In Current Protocols in Molecular Biology, 1994年)。形質転換された酵母菌株をX-galが含まれたYPDプレートで培養することによってB42融合形態で発現される結合蛋白質とLexA-(p38/JTV-1)との相互作用を分析した(Rho S. B.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999年、第96巻、P.4488-4493)。この時、結合蛋白質とLexA-(p38/JTV-1)の相互作用の陽性反応は青色コロニーの形態で現れる。
【００７０】
実験の結果、強い陽性の相互作用がp38/JTV-1、KRS及びFBPで現れたが、トリプトファニル-WRS、チロシル-YRSとQRSでは現れなかった(図１)。前記p38/JTV-1の同形二合体(homodimerization)は、すでに報告されていて、p38/JTV-1がKRSと特異的に相互作用するという事実もすでに公知されている。しかし、p38/JTV-1とFBPが相互作用するということは以前に報告されたことはなく、本発明で初めて究明したことである。
【００７１】
<実施例1-2>
p38/JTV-1-欠損突然変異マウスの肺でFBPとc-mycの細胞内水準測定
【００７２】
野生型マウス(+/+)、p38/JTV-1対立遺伝子の片側だけが欠損した異形接合性突然変異マウス(+/-)及びp38/JTV-1対立遺伝子がすべて欠損した同形接合性突然変異マウス(-/-)から肺を分離して前記肺から蛋白質を抽出した後、前記蛋白質を抗-p38/JTV-1抗体、抗-FBP抗体及び抗c-myc抗体でウエスタンブロットすることによって細胞内FBPとc-mycの水準を比較した。
【００７３】
野生型マウス(+/+)は、生後1日のオスC57Bマウス(Samtako)を使用した。p38/JTV-1突然変異マウスは、公知の方法で製造した(Kim等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2002年、99巻、P.7912-7916)。
【００７４】
前記野生型マウス及びp38/JTV-1突然変異マウスから肺を分離して前記肺から蛋白質を抽出した。前記マウスから分離した肺組織を20mMトリス緩衝液(pH 7.5)、10mM NaCl、0.5mM EDTA及び0.5mM フェニルメチルスロニルフルオライド(phenylmethylsulonyl fluoride)でポリトロンホモゲナイザー(polytron homogenizer)を利用して均質化した。前記均質化物を100,000gで1時間遠心分離して上澄み液(細胞質分画)を収集した後、0.5%トリトンX-100を処理して細胞蛋白質を抽出した。抽出された蛋白質を抗p38/JTV-1抗体、抗-FBP抗体及び抗c-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)を利用して公知された方法でウエスタンブロットした(Kim T. 等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21786-21772)。この時、抗-チュブリン抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)をローディング対照群に使用した。
【００７５】
実験の結果、FBPとc-mycの水準は野生型マウス(+/+)またはp38/JTV-1異形接合性突然変異マウス(+/-)に比べてp38/JTV-1同形接合性突然変異マウス(-/-)の肺でも高く現れた(図２)。これは、p38/JTV-1がFBPとc-mycの水準を減少させる効果があることを意味する。
【００７６】
<実施例1-3>
p38/JTV-1の発現増加によるFBPとc-myc細胞内水準の変化調査
【００７７】
ヒト胚芽腎臓293細胞(human embryonic kidney 293 cell, ATCCから譲り受けた)を各々異なる量のp38/JTV-1プラスミドでトランスフェクションさせることによってp38/JTV-1の発現増加による細胞内FBPとc-mycの水準に及ぼす影響を調査した。ヒト胚芽腎臓293細胞をp38/JTV-1発現プラスミド0.5μg/mlまたは2μg/mlとFBP発現プラスミド2μg/mlで各々トランスフェクションさせた。p38/JTV-1発現プラスミドは、実施例1のp38/JTV-1 cDNAをmyc標識されたpcDNA3(Invitrogen)のEcoRI-XhoI部位に挿入することによって製造した。FBP発現プラスミドは、前記実施例1のFBP cDNAをHA標識されたpcDNA3(Invitrogen)のEcoR1-Xho1部位に挿入することによって製造した。前記と同じ方法で製造されたmyc-(p38/JTV-1)プラスミドとHA-FBPプラスミドをヒト胚芽腎臓細胞にトランスフェクションさせた後、37℃で24時間培養した後、前記細胞から実施例1-2と同じ方法により蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質を抗-HA抗体、抗c-myc抗体及び抗-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)でウエスタンブロットした(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。
【００７８】
実験の結果、p38/JTV-1の細胞内発現水準が増加するほど、FBPとc-mycの発現水準は減少すると現れた(図３)。
【００７９】
<実施例1-4>
p38/JTV-1が媒介したFBPのユビキチン化(ubiquitination)
【００８０】
FBPのユビキチン化を測定するために、ヒト胚芽腎臓293細胞(human embryonic kidney 293 cell, ATCCから譲り受けた)にALLN(N-acetyl-leucinal- leucinal-nor-leucinal)50μg/mlを3時間前処理してユビキチン化された蛋白質の26Sプロテオゾームによる分解を抑制させた後、(Zhou M.等, J. Biol. Chem.,1996年、第271巻、P.24769-24775)、前記実施例1-3のp38/JTV-1発現プラスミドを前記細胞に各々0、1及び2μg/mlでトランスフェクションさせた後、前記細胞から前記実施例1-2と同じ方法で蛋白質を抽出し、抗-FBP抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)を利用して免疫沈殿した。前記免疫沈殿した蛋白質を抗-FBP抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)と抗-ユビキチン抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)でウエスタンブロットした(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。
【００８１】
また、HA-ユビキチンプラスミド(浦項工大生命科学科リュ・ソンホ博士から提供受けた)と各々異なる量のmyc-(p38/JTV-1)プラスミドを前記293細胞に一緒にトランスフェクションさせた。即ち、前記細胞をmyc-(p38/JTV-1)プラスミド各々0、1及び2μg/mlとHA-ユビキチンプラスミドで一緒にトランスフェクションさせた後、RIPA緩衝液(10mM トリス緩衝液pH 7.5、0.1% SDS、1mM EDTA、1% NP-40、0.5%デオキシコレート、45mM β-グリセロールホスファート、50mM NaF、1mM ジチオトレイトール(dithiothreitol)、0.1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド及び1mMオルトバナジン酸ナトリウム(Sodium orthovanadate))で16時間溶解させて、前記実施例1-3と同じ方法、抗-FBP抗体で免疫沈殿した。ユビキチン化されたFBPを確認するために抗-HA抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)でウエスタンブロットした(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。
【００８２】
実験の結果、ALLN-処理された細胞でFBPの水準は、p38/JTV-1の変化により影響を受けなかった。これは、FBPの分解が26Sプロテオゾームによって媒介されたことを意味する(図４左側)。また、FBPと共に高分子量のバンドが検出された。前記バンドがユビキチン化されたFBPかどうかを確認するために、前記蛋白質を抗-FBP抗体で免疫沈殿して抗-ユビキチン抗体で免疫ブロットを遂行した結果、前記バンドが抗-ユビキチン抗体と反応した。したがって、前記高分子のバンドはユビキチン化されたFBPであることを確認できた(図４右側)。
【００８３】
一方、本発明者らは、293細胞で外因性HA-ユビキチンとp38/JTV-1を発現させて、FBPのユビキチン化がp38/JTV-1により増加するかどうかを調査した結果、ユビキチン化されたFBPがp38/JTV-1との共同-発現(co-expression)によって増加することが分かった(図５)。
【００８４】
結論的に、FBPの分解に26Sプロテオゾームが関与し、p38/JTV-1もFBPのユビキチン化と分解に関与することが分かった。
【００８５】
<実施例1-5>
p38/JTV-1とFBPの結合がFBPのユビキチン化とc-mycの抑制に及ぼす影響調査
【００８６】
p38/JTV-1欠失断片を各々製造した後、前記欠失断片がFBPと結合するかどうかを調査した。ヒトp38/JTV-1のアミノ酸1-312番(全長)をコーディングするcDNAは、前記実施例1-1と同じ方法で下記の表２に示したプライマーを利用して製造した。ヒトp38/JTV-1のアミノ酸1-161番、アミノ酸162-312番及びアミノ酸84-312番をコーディングする欠失断片のcDNAは、前記p38/JTV-1の全体cDNAを鋳型にして各々に特異的なプライマー対でPCR増幅することによって収得した。各々に特異的なプライマー対は下記の表２に示した通りである。PCR増幅は、95℃で 5分間変成させた後、95℃で1分、60℃で1分、72℃で1分及び72℃で5分間30回行った。
【００８７】
【表２】
2005139121.tif 000004
【００８８】
前記で収得した各々のcDNAをmyc-標識されたpcDNA3(invitorgen)のEcoRI-XhoI部位にサブクローンした。前記で作製したプラスミドを前記実施例1-3で製造したHA-FBPプラスミドと共にヒト胚芽腎臓293細胞にトランスフェクションさせた。前記トランスフェクションされた細胞をトランスフェクション後、16時間RIPA緩衝液で溶解した。細胞溶解物を4℃で3時間、抗-myc抗体で反応させた。前記反応物に蛋白質A-アガロースビード(bead)を添加した後、混合物を4℃でさらに1時間培養した。前記ビードを溶解緩衝液で4回洗浄した。沈殿した蛋白質をSDS-PAGEで分析した後、ニトロセルロース膜に移した。前記免疫沈殿物を抗-myc抗体と抗-HA抗体を利用してウエスタンブロットした(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。また、同じ方法で前記トランスフェクションされた293細胞の全体細胞溶解物を抗-myc抗体でウエスタンブロットすることによってp38/JTV-1が発現されるかどうかを確認した。
【００８９】
また、前記p38/JTV-1欠失断片がFBPのユビキチン化に及ぼす影響を調査するために前記で製造したp38/JTV-1欠失断片を発現するプラスミドとHA-ユビキチンプラスミドを293細胞にトランスフェクションさせた後、前記と同じ方法で抗-FBP抗体と抗-HA抗体を利用して免疫沈殿及びウエスタンブロットを遂行した。
【００９０】
さらに、前記p38/JTV-1欠失断片のc-myc発現に及ぼす影響は、RT-PCRによって測定した。前記p38/JTV-1欠失断片を発現するプラスミドを293細胞に24時間トランスフェクションさせた後、RNAsol 500μlとクロロホルム200μlを利用して細胞溶解物を収得してRNAを抽出した。収得した細胞溶解物を撹拌した後(vortexing)4℃で10分間定置した後、4℃、12000rpmで遠心分離した。上澄み液にイソプロパノール1mlを添加して-70℃で2時間定置させた後、4℃、12000rpmで30分間遠心分離した。沈殿物を蒸溜水に懸濁させた後、スペクトルフォトメータを利用してRNAを定量分析した。また、前記細胞溶解物から抽出したRNA 1μgとMoMuLV逆転写酵素200U、ランダムヘキサマー(random hexamer)10pM及びdNTP 10mMを混合した後、23℃で15分間アニーリング、42℃で60分間伸張及び95℃で5分間変性させる逆転写反応を遂行することによってcDNAを収得した。収得したcDNAを前記と同じ方法でPCR増幅した。この時、ローディング対照群にGADPHを使用し、対照群にc-mycを使用した。p38/JTV-1 欠失cDNAに特異的なプライマー対は、前記表２に示した通りで、GADPHとc-mycの増幅のためのプライマーは下記表３に示した通りである。最終的に増幅されたPCR産物を2%アガロースゲルで展開した後、エチジウムブロマイドで染色して UV下で観察した。
【００９１】
【表３】
2005139121.tif 000005
【００９２】
実験の結果、アミノ酸1-312番(全長)、アミノ酸1-161番及びアミノ酸84-312番のp38/JTV-1欠失断片は、FBPに結合した反面、アミノ酸162-312番のp38/JTV-1断片は結合できなかった。この時、免疫沈殿をしない全体細胞溶解物を抗-myc抗体でウエスタンブロットした結果、p38/JTV-1が発現されていることを確認した(図６)。また、FBPのユビキチン化は、FBPに結合できるp38/JTV-1 断片によってのみ促進されることが分かった(図７)。合わせて、FBPに結合するp38/JTV-1欠損断片は、c-myc発現を抑制し、FBPに結合しないp38/JTV-1欠損断片はc-mycの発現を抑制しなかった(図８)。前記結果からFBPとp38/JTV-1の結合は、FBPのユビキチン化とc-myc発現を抑制するに際して必須的であることを確認できた(図９)。
【００９３】
<実施例1-6>
TGF-β2の処理がp38/JTV-1の発現に及ぼす影響
【００９４】
A549細胞(肺上皮内癌腫細胞、ATCCから分譲受けた)にTGF-β2(R&D)を2ng/mlずつ処理して抗p38/JTV-1抗体、抗-FBP抗体及び抗c-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)を利用して前記実施例1-2と同じ方法でウエスタンブロットを遂行した。この時、ローディング対照群にチュブリンを使用した。
【００９５】
実験の結果、TGF-β2の処理によってp38/JTV-1発現水準が増加することが分かった。また、TGFにより誘導されたp38/JTV-1は、FBPとc-mycの水準を減少させることが分かった(図１０)。結論的にp38/JTV-1がTGF-β2により発現が誘導された後、FBPと結合してc-myc遺伝子発現を抑制する新しい機序を究明できた(図１１)。
【実施例２】
【００９６】
p38/JTV-1とPDKの相互作用によるアポトーシス(apoptosis)調節機序の究明
【００９７】
<実施例2-1>
p38/JTV-1-欠損マウスから分離した組織でリン酸化されたAKTの活性調査
【００９８】
本発明者らは、p38/JTV-1 遺伝子がアポトーシス(apoptosis)を抑制する機序を究明するために、アポトーシスを調節する経路として公知されているAKT-PI3K経路との関連性を調査した。このために、野生型マウスとp38/JTV-1欠損マウスから心臓、肝、腸管及び脳組織を分離して前記組織から蛋白質を抽出した後、リン-特異的抗-AKT抗体(phospho-specific anti-AKT antibody, Santa Cruz Biotechnology, USA)とリン-特異的抗-PI3K抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)を利用して公知された方法でウエスタンブロット分析を遂行した(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。この時、チュブリンをローディング対照群に使用した。また、同じ方法で野生型とp38/JTV-1欠損マウスの胚芽繊維芽細胞でもリン酸化されたAKT(p-AKT)及びPI3Kの活性を調査した。前記p38/JTV-1欠損マウスの胚芽繊維芽細胞は、p38/JTV-1欠損マウスの13.5日になった胚芽を収得した後、組織をナイフとハサミで切り出した後、トリプシン-EDTA溶液で37℃で1時間培養した。前記培養液を1200rpmで5分間遠心分離して上澄み液を除去した後、沈殿した組織ペレットを培養培地(10% FBSを含んだRPMI-1640)で37℃で1日間培養した。培養された細胞を洗浄して回収して実験に使用した。
【００９９】
実験の結果、前記p38/JTV-1-欠損マウスから分離したすべての組織でPI3Kと総AKTの発現程度は、野生型と差がなかったが、リン酸化されたAKT(p-AKT)の発現程度は、野生型に比べて増加して現れた(図１２)。マウス胚芽繊維芽細胞を利用した実験の場合にも同一な結果を確認できた(図１３)。前記実験結果からp38/JTV-1がAKTのリン酸化活性と関連があるものと推定された。
【０１００】
<実施例2-2>
癌細胞でp38/JTV-1の発現増加及び時間の経過によるリン酸化されたAKT活性変化
【０１０１】
HCT116細胞株(ヒト結腸癌細胞株)に前記実施例1-3のp38/JTV-1発現プラスミド量を変えて(0、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)トランスフェクションさせた後、トランスフェクションされた細胞株でAKT-PI3K経路と関連したすべての因子即ち、リン酸化されたAKT、総AKT、PDK及びBcl-2系の発現程度を公知されたウエスタンブロット分析法で測定した(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。この時、抗BID、抗BCL-XL、抗Bax(Santa Cruz Biotechnology, USA)抗体をウエスタンブロットに使用した。また、前記細胞株をp38/JTV-1発現プラスミド1μg/mlでトランスフェクションさせた後、時間の経過によるリン酸化されたAKTの発現程度の変化をウエスタンブロット分析で調査した。
【０１０２】
実験の結果、p38/JTV-1の発現程度が増加するにつれてリン酸化されたAKT(p-308及びp-473)の発現程度は減少した。反面、Bcl-2系列は、p38/JTV-1の発現程度に影響を受けず、総AKTの発現程度も変化がなかった。また、PDKの発現程度は、細胞内p38/JTV-1の発現程度が増加するにつれて減少する傾向を示した(図１４)。前記p38/JTV-1によるAKTのリン酸化抑制活性は、時間の経過につれて増加することが分かった(図１５)。このような結果は、p38/JTV-1がAKT活性を陰性的に調節する新しい調節因子である可能性を提示している。
【０１０３】
<実施例2-3>
p38/JTV-1とPDKの相互作用分析
【０１０４】
p38/JTV-1とPDKの相互作用を免疫沈殿で確認した。HA-(p38/JTV-1)発現プラスミドをHCT116細胞株にトランスフェクションさせた後、IgGと抗-PDK抗体、抗-AKT抗体、抗-PI3K抗体で免疫沈殿した。これを抗-myc抗体、抗-PDK抗体、抗-PI3K抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)でウエスタンブロット分析した(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。
【０１０５】
実験の結果、p38/JTV-1とPDKの強い相互作用が確認された。反面、p38/JTV-1とPI3Kの相互作用は現れなかった(図１６)。
【０１０６】
<実施例2-4>
PDK欠失断片とp38/JTV-1の相互作用調査
【０１０７】
PDKがAKTを活性化するキナーゼドメイン(KH)とIP3によるメンブレイン固定及び活性に重要な役割をするプレクストリン同族体(plecstrin homologue, PH)ドメインからなる2個の機能的モチーブを持っているため本発明者らは、PDK欠失断片とp38/JTV-1との相互作用を調査した。
【０１０８】
PDKをコーディングするcDNAの塩基配列は、公知されている(Gene Bank Accession 番号: NM_003902)。各々のPDK欠失断片を発現するプラスミド即ち、PDKのアミノ酸1-556番、1-449番、アミノ酸52-341番、アミノ酸52-556番、アミノ酸156-556番及びアミノ酸244-556番(図１７)を発現するプラスミドは、日本の東京大学分子細胞学研究所から提供を受けて使用した(フジタナオヤ博士, Institute of Molecular and cellular bioscience, 東京大学)。前記各々のプラスミドにヒト胚芽腎臓細胞をトランスフェクションさせた後、細胞を培養して細胞溶解物を収得した後、抗-FLAG抗体で免疫沈殿を遂行し、抗p38/JTV-1抗体と抗-FLAG抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)でウエスタンブロット分析した(Kim T.等, J. Biol. Chem., 2000年、第275巻、P.21768-21772)。
【０１０９】
実験の結果、p38/JTV-1とPDK全体断片が強い相互作用を示したのに比べてキナーゼドメインが欠失した場合、p38/JTV-1と相互作用を示さなかった。反面、PHドメインの欠失は、p38/JTV-1との相互作用に影響を与えなかった(図１８)。したがって、AKTを活性化する機能をするキナーゼドメイン(KH)が欠失したPDK断片の場合にp38/JTV-1との相互作用が現れないことは、p38/JTV-1がPDKのKHドメインに結合してPDKがAKTを活性化することを抑制するということを確証させるものである。
【０１１０】
<実施例2-5>
死滅リガンド(death ligand)の処理によるp38/JTV-1の発現程度の変化
【０１１１】
死滅リガンドの存在下で、p38/JTV-1の発現程度の変化を調査した。アポトーシスを調節する信号伝達経路中の一つの死滅受用体(death receptor)に結合してアポトーシスを促進する死滅リガンドをp38/JTV-1発現プラスミドが導入されたHCT116 細胞(ヒト結腸癌腫、ATCCから分譲受けた)に処理してp38/JTV-1の発現程度を調査した。死滅リガンドとしては、FasL500ng/mlまたはTNF10ng/mlを使用した。前記細胞株に6時間処理した後、p38/JTV-1、p-AKT、総AKT及びPDKの発現程度を各々に特異的な抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)を利用したウエスタンブロット分析で調査した。チュブリンをローディング対照群に使用した。また、前記p38/JTV-1発現プラスミドが導入されたHCT116細胞に死滅リガンドを各々処理した後、抗-PDK抗体で免疫沈殿させた後、抗p38/JTV-1抗体でウエスタンブロットを実施した。
【０１１２】
実験の結果、死滅リガンドを処理しない場合に比べてFasLとTNFを処理した場合、p38/JTV-1の発現は増加し、p-AKTの発現程度は減少した(図１９)。また、p38/JTV-1とPDKの相互作用は死滅リガンドの処理により増加することが分かった(図２０)。
【実施例３】
【０１１３】
p38/JTV-1の抗癌剤としての用途確認
【０１１４】
<実施例3-1>
p38/JTV-1が癌細胞株の増殖に及ぼす影響調査
【０１１５】
p38/JTV-1発現プラスミドを利用して癌細胞株をトランスフェクションさせた後、48時間培養して放射性チミジンを利用して細胞増殖を調査した。癌細胞株には、HCT116(ヒト結腸癌腫)、HeLa(子宮頚部癌)及びA549(肺上皮内癌腫)細胞をATCC(American type culture collection)から購入して利用した。前記トランスフェクションした細胞をluCi[3H]チミジンが含まれた新しい培地に移して4時間さらに培養した。前記培養された細胞を洗浄して、収集した後、RIPA緩衝液で溶解させた。混入したチミジンの量を液体閃光計数器(liquid scintillation counting)で定量化して混入されたチミジンの量からDNA合成率を計算した。この時、対照群のDNA合成率を1として実験群での相対的なDNA合成率を計算した。
【０１１６】
実験の結果、p38/JTV-1はHCT116(ヒト結腸癌腫)、HeLa(子宮頚部癌)及びA549(肺上皮内癌腫)細胞の増殖を有意に抑制できた(図２２)。
【０１１７】
<実施例3-2>
p38/JTV-1が導入された癌細胞株でのアポトーシスの変化
【０１１８】
HeLa細胞(子宮頚部癌細胞株)を1μg/mlのp38/JTV-1発現プラスミドで24時間トランスフェクションさせた後、FasL500ng/mlを添加してさらに24時間培養してこれによるアポトーシスが起きた細胞及びチトクロームC(cytochrome C)の放出程度を測定した。また、p38/JTV-1遺伝子が含まれていないpcDNAを利用して前記と同じ条件でHeLa細胞に処理してこれをp38/JTV-1遺伝子が導入された場合と比較した。前記チトクロームCの放出は、アポトーシスが起きた細胞で現れる生化学的変化してミトコンドリア電位差の損失によりミトコンドリアから放出されカスパーゼ9とapaf-1を活性化する機能をする。アポトーシスが起きた細胞の数は、トリパンブルー染色排除法(tyrphyan blue dye exclusion)で測定した(Rao M, Kumar等, J. Biochem. (Tokyo), 1999年、第125(2)巻、P.383-90)。ミトコンドリアでのチトクロームCの放出程度は、細胞質内チトクロームCを微細細胞器官分画の除去後にウエスタンブロット分析で検出した。即ち、前記HeLa細胞を貯蔵液(hypotonic ?solution、NaCl 10ml、MgCl2 1.5mM、Tris-Cl、pH7.5)と共に培養した後、MS緩衝液(マンニトール525mM、砂糖175mM、Tris-Cl 175mM、EDTA 2.5mM、pH7.5)下でグラスドウンスホモゲナイザー(glass dounce homogenizer)を利用して原形質膜(plsma membrane)を除去した。原形質膜が除去された細胞を4℃で1300rpmで5分間遠心分離して核を除去した。これを4℃で17000rpmで15分間超遠心分離(ultracentrifugation)して細胞質と微細細胞器官(microor ganells)に分離して微細細胞器官を除去した。これをSDS-PAGEで電気泳動した後、文献に公知された方法にしたがってウエスタンブロット分析を遂行することによってチトクロームCの放出程度を測定した(Marsden V. S.等, Nature 2002年、第419巻、P.634)。この時、ローディング対照群にチュブリンを使用した。
【０１１９】
実験の結果、癌細胞株内にp38/JTV-1遺伝子を導入することによってp38/JTV-1遺伝子が導入されない場合に比べてアポトーシスとチトクロームCの放出程度が増加した。また、アポトーシスは死滅リガンドのTNFの処理によって増加することが分かった(図２３、図２４)。このことは、p38/JTV-1がアポトーシスを促進することによって抗癌剤に使用できることを確証させる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】p38/JTV-1と相互作用する細胞蛋白質の選別のための酵母ツーハイブリッド分析(yeast two hybrid system)結果を示したものである(青色コロニー: 陽性反応)。
【図２】野生型マウスとp38/JTV-1欠損突然変異マウスの肺でc-myc、FBP及びp38/JTV-1の水準をウエスタンブロットにより比較した結果である。この時、チュブリンをローディング対照群に使用した(+/+野生型マウス、+/-異形接合性突然変異マウス、-/-同形接合性突然変異マウス)。
【図３】p38/JTV-1遺伝子の発現増加によるFBPとc-mycの変化をウエスタンブロットで分析した結果である。
【図４】p38/JTV-1遺伝子の発現増加によるFBPのユビキチン化程度を抗-FBP抗体を利用して免疫沈殿した後、抗-FBP抗体(左側)と抗-ユビキチン抗体(右側)で免疫ブロットした結果である(IB:免疫ブロット、抗-FBP抗体及び抗-ユビキチン抗体利用、 FBP-Ubi: ユビキチン化されたFBP)。
【図５】HA標識されたユビキチン遺伝子を含むプラスミドとp38/JTV-1遺伝子を含むプラスミドで細胞をトランスフェクションさせた後、抗-FBP抗体で免疫沈殿させ沈殿物を抗-HA抗体で免疫ブロットした結果を示したものである(IP: 免疫沈殿、抗-FBP抗体利用、IB: 免疫ブロット、抗-HA抗体利用、WCL: 全体細胞溶解物、-: HA-ユビキチンプラスミドを添加しない、 +: HA-ユビキチンプラスミドを添加した)。
【図６】p38/JTV-1欠失断片をコーディングするmyc-標識されたプラスミドとHA標識されたFBPをコーディングするプラスミドを293細胞にトランスフェクションさせた後、抗-myc抗体で免疫沈殿させた後、これを抗-FBP抗体を利用したウエスタンブロットで分析した結果である(IP:免疫沈殿、抗-myc抗体利用、WB:ウエスタンブロット、抗-FBP抗体利用、WCL:全体細胞溶解物、矢印:p38/JTV-1が発現される場合にp38/JTV-1と結合するベクター内に存在するペプチド)。
【図７】p38/JTV-1欠失断片をコーディングするプラスミドとHA-ユビキチンをコーディングするプラスミドを293細胞にトランスフェクションさせた後、これを抗-FBP抗体で免疫沈殿後、前記沈殿物を抗-HA抗体でウエスタンブロットした結果である(IP:免疫沈殿、抗-FBP抗体利用、WB: ウエスタンブロット、抗-HA抗体を利用)。
【図８】p38/JTV-1欠失断片のc-myc発現に及ぼす影響をRT-PCRで分析した結果である(GAPDH: ローディング対照群、対照群: c-myc)。
【図９】p38/JTV-1欠失断片のFBP結合能、FBPのユビキチン化及びc-myc調節有無を示したものである。
【図１０】A549細胞にTGF-β2を処理した後、p38/JTV-1、FBP及びc-mycの時間の経過による発現程度の変化を各々の特異的な抗体を利用したウエスタンブロットで分析した結果である。
【図１１】p38/JTV-1によるc-mycの調節機序を示した模式図である(実線:促進、点線: 抑制)。
【図１２】野生型マウスとp38/JTV-1-欠損マウスから分離された組織でリン酸化されたPI3KとAKTの発現程度をウエスタンブロットで分析した結果である(+/+野生型マウス、-/- p38/JTV-1欠損マウス)。
【図１３】野生型マウスとp38/JTV-1欠損マウス胚芽繊維芽細胞でリン酸化されたPI3KとAKTの発現程度をウエスタンブロットで分析した結果である(WT: 野生型マウス胚芽繊維芽細胞、p38/JTV-1 -/-: p38/JTV-1欠損マウス胚芽繊維芽細胞)。
【図１４】HCT116細胞株でp38/JTV-1の発現程度の増加によるリン酸化されたAKT、PDK、総AKT、Bcl-2系列の発現程度をウエスタンブロットで分析した結果である。
【図１５】p38/JTV-1発現プラスミドでトランスフェクションされたHCT116細胞株で時間の経過によるリン酸化されたAKTとPDKの発現程度をウエスタンブロットで分析した結果である。
【図１６】p38/JTV-1とPDKの相互作用を免疫沈殿法で確認した結果である(IP: 免疫沈殿、抗-IgG抗体、抗-PDK抗体、抗-AKT抗体及び抗-PI3K抗体利用、WB: ウエスタンブロット、抗-PI3K抗体、抗-AKT抗体、抗-PDK抗体及び抗p38/JTV-1抗体利用)。
【図１７】キナーゼドメインとPHドメインからなるPDKの欠失断片の模式図である。
【図１８】PDKの欠失断片とp38/JTV-1の相互作用をウエスタンブロットで分析した結果である(EV: pcDNAが導入された細胞、WT: 野生型細胞、IP: 免疫沈殿、抗-FLAG抗体利用)。
【図１９】死滅リガンドの処理によるp38/JTV-1の発現程度の変化及びリン酸化されたAKTの発現程度をウエスタンブロットで分析した結果である。
【図２０】死滅リガンドの処理によるp38/JTV-1とPDKの相互作用の変化を免疫沈殿法で分析した結果である(IP: 免疫沈殿、抗-PDK抗体処理、対照群: 死滅リガンドを処理していない)。
【図２１】p38/JTV-1によるアポトーシス(apoptosis)の調節機序を示した模式図である(矢印: 促進、T字形: 抑制)。
【図２２】p38/JTV-1が癌細胞株の細胞増殖に及ぼす影響を示したものである(HCT116 : ヒト結腸癌腫、HeLa:子宮頚部癌、A549: 肺上皮内癌腫)。
【図２３】癌細胞株内にp38/JTV-1遺伝子の導入と死滅リガンドの処理によるチトクロームC(cytochrom C)の放出程度をウエスタンブロットで分析した結果である(-: 添加しない、 +: 添加する)。
【図２４】癌細胞株内にp38/JTV-1遺伝子の導入と死滅リガンドの処理によるアポトーシスされた細胞の数を全体細胞数に対する%で表示した結果である(TNF-: TNF処理しない、TNF+: TNF処理する、pcDNA: pcDNAを導入した細胞、p38/JTV-1: p38/JTV-1遺伝子を導入した細胞)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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