(57)【要約】【課題】多数の実験動物を使うことなく、経済的に、効率良く、化学物質や医薬品、環境試料の毒性を測定し、人の健康に及ぼす影響の種類と程度を評価することのできる試験方法を提供する。【解決手段】多種類の遺伝子改変細胞や突然変異細胞を、種類別に区分された培地中で培養しておく。これを被検物質に曝露して一定時間後に、細胞の機能や生存率を測定し、細胞の種類ごとに異なる反応をパターンとして類型化する。別に、複数の既知の有害物質における反応パターンをあらかじめ求めておき、これと被検物質における反応パターンを比較することにより、被検物質が人の健康に及ぼす影響の種類と程度を推定する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種類の細胞を、種類別に区分された培地中で培養した後、これを被検物質に曝露し、一定時間後に細胞の機能および／または生存率を求め、細胞の種類ごとに影響の程度をパターン化して評価することを特徴とする細胞毒性試験方法。
【請求項２】
既知の有害物質に対して、あらかじめ請求項１の細胞毒性試験方法で細胞の種類ごとに影響の大小をパターン化しておき、これと被検物質に対するパターンを比較することにより、被検物質の種類、毒性の程度、または人の健康に及ぼす影響の種類もしくは程度を推定することを特徴とする細胞毒性試験方法。
【請求項３】
細胞が、特定の有害物質もしくは有害因子に対し異なる感受性を有する遺伝子改変細胞および／または突然変異細胞である請求項１もしくは２記載の細胞毒性試験方法。
【請求項４】
細胞が、付着性細胞である請求項１〜３のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【請求項５】
付着性細胞が、ＣＨＯ細胞、ｘｒｓ−５細胞もしくはｉｒｓ−２０細胞である請求項１〜４のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【請求項６】
多種類の細胞が、同一の培養条件下で培養される請求項１〜５のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【請求項７】
培養が哺乳動物細胞用の培養液を含む培地で行なわれる請求項１〜６のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【請求項８】
機能および／または生存率が、放射能標識、色素標識、細胞数計測もしくは細胞形態測定を用いて求められる請求項１〜７のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【請求項９】
パターン化が画像解析もしくは統計解析により行なわれる請求項１項１〜８のいずれか記載の細胞毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞毒性試験方法に関し、さらに詳しくは化学物質、医薬品、環境物質（下水、河川水、大気粉塵等）の安全性、毒性、人の健康への影響の推定等に有用な細胞毒性試験方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、化学物質、医薬品、環境物質等の毒性を明らかにし、人の健康に及ぼす影響の種類と程度を明らかにする（安全性評価）には、種々の方法・技術が用いられている。
【０００３】
疫学的調査方法は、被検物質またはその類似物質が、過去に人や環境に及ぼした有害作用を調査し、その結果から被検物質の毒性や人の健康への影響を類推する方法である。たとえば水俣病の原因である有機水銀、イタイイタイ病でのカドミウムなどは、このような疫学的調査結果に基づきその安全性の評価が可能である。しかし、本法に適用できる被検物質の種類はきわめて限定されており、未知の環境試料や新たに合成されてくる化学物質や医薬品等には適用できない。
【０００４】
動物実験法は、被検物質を実験動物に投与し、その影響を調べるものである。信頼性が高く医薬品等の安全性評価において標準的な方法として使用されているが、膨大な数の実験動物と労力を必要とし、動物愛護の観点からも批判が多い。
【０００５】
細胞毒性試験方法は、動植物の細胞を用い、被検物質を分離培養された細胞に曝露した後、細胞の機能や生存を調べることによって、被検物質の毒性や人への影響を評価する方法である。比較的簡便に、多数の被検物質を同時に評価できることから広く使用されている。
【０００６】
このような細胞毒性試験法は、被検物質の曝露の仕方、測定対象とする細胞の機能、測定の方法などにより多種類のものが提唱され、従来種々の細胞毒性試験方法が使用されている（たとえば非特許文献１には１５種類が記載されている）。そしてさらに、種々の新しい機能測定を用いた細胞毒性試験法が開発されている（たとえば特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、従来の細胞毒性試験方法では、被検試料に含まれる有害物質の種類については情報が得られない。すなわち毒性（有害性）の程度は明らかにできるが、どのような種類の有害物質が含まれることによってもたらされる毒性であるかは判断できなかった。このことは、被検試料が人の健康に及ぼす影響の程度や種類を推定するうえでの難点であった。
【０００８】
特に、新規に開発された化学物質や医薬品、環境試料の場合、毒性の程度だけでなく、どのような既知の有害物質と類似の影響を人の健康に及ぼすか（毒性の種類）を、簡便かつ精度良く検知できるような細胞毒性試験法が必要であった。また、下水処理水や河川水のような環境試料の場合、試料の毒性の程度だけでなく、その毒性が重金属によるものか、ダイオキシンのような化学物質によるものかなど、含まれる有害物質の種類や性質に関する情報は、その後の処理方法の立案や、行政的な対策を立てるうえでも必須である。
【０００９】
【非特許文献１】
「細胞トキシコロジー試験法」（朝倉書店、１９９１年）
【特許文献１】
特開平７−１２３９９９号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、被検物質の細胞に対する毒性について、その強弱のみならず、その特性や他の既知の有害物質との類似性を明らかにし、人の健康への影響の程度と種類をより精度良く推定することを可能とする細胞毒性試験法を提供しようとするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞毒性試験方法においては、多種類の細胞を、種類別に区分された培地中で培養した後、これを被検物質に曝露し、一定時間後に細胞の機能および／または生存率を求め、細胞の種類ごとに影響の程度をパターン化して評価する。これらの細胞は、特定の有害物質もしくは有害因子に対し異なる感受性を有する遺伝子改変細胞および／または突然変異細胞であるのが好適である。本発明においては、既知の有害物質に対して、予め上記の細胞毒性試験方法で細胞の種類ごとに影響の大小をパターン化しておき、これと被検物質に対するパターンを比較することにより、被検物質の種類、毒性の程度、または人の健康に及ぼす影響の種類もしくは程度を推定することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
生体は、外部からの有害物質（毒物）に対して、その影響を低減するような機能を有しており、その機能は、いくつかの遺伝子によって制御されている。したがって、このような遺伝子を改変することで、特定の有害物質に対して感受性のある（弱い）、あるいは耐性のある（強い）細胞を作成することができる。このような細胞は遺伝子改変細胞（トランスジェニック細胞）と呼ばれる。
【００１３】
また、細胞を培養していると、ある特定の有害物質に対して感受性が異なる細胞が突然変異によってあらわれる。このような細胞は突然変異細胞と呼ばれる。
【００１４】
本発明は、種々の有害物質に対して異なる感受性を有するこれらの遺伝子改変細胞や突然変異細胞を、種類別に区分された培地中で培養した後、これを被検物質に曝露し、一定時間後に細胞の機能および／または生存率を求め、細胞の種類ごとに影響の程度をパターン化すると、有害物質の種類やその毒性の強弱によって、特有のパターンが生じることを見出し、この知見を利用するものである。本発明においては、上記のように多種類の細胞を、種類別に区分された培地中で培養する。この培養自体は常法によることができる。
【００１５】
さらに、本発明によれば、別に既知の有害物質について、あらかじめ各細胞の種類ごとに影響のパターンを求めておき、これと被検物質で得られた影響のパターンを比べることにより、被検物質の毒性の強弱だけでなく、その特性および他の既知の有害物質との類似性を明らかにすることが可能である。特性および類似性が明らかになると、既知の有害物質の毒性データから、人の健康に及ぼす程度と種類を類推することができる。
【００１６】
ここでは支持体に付着する性質のある細胞（付着性細胞）を用いた実施形態について説明する。支持体に付着する性質の無い細胞（浮遊細胞）では、細胞の培養に用いる培養液を寒天でゲル状にするなどして、使用する複数の種類の細胞が、その後の培養と被検物質への曝露中に、混じらないようにすることで実施できる。
【００１７】
付着性細胞として、たとえばチャイニーズハムスターの卵巣から分離したＣＨＯ細胞、ならびにその突然変異株であるｘｒｓ−５細胞（ＤＮＡの再接合酵素Ｋｕ−８０を欠損する）およびｉｒｓ−２０細胞（ＤＮＡの再接合を促進するＤＮＡ−ＰＫｃｓを欠損する）が挙げられるが、各種の有害物質に対して異なる感受性を有するものであれば、その種類を問わず使用しうる。それらの例としては、薬物代謝研究に多用されているＨｅｐａ−１細胞、ＡＨＲのノックアウト細胞であるＨｅｐａ−１／ＡＨＲ（−）細胞（ダイオキシン高感受性）、貪食作用を有するＭφ細胞（大気中微粒子の処理細胞）、Ｍφの起源細胞であり、貪食能のない血液単球細胞、等が挙げられる。
【００１８】
細胞は液体培養液を用いる通常の哺乳動物細胞培養法により培養しうる。現在、種々の培養液が市販されており、本発明においては多種類の細胞の有害物質に対する反応をパターンとして相対的に測定するため、使用する細胞について概ね良好な生育が得られる一般的な哺乳動物細胞用の培養液であれば、特にその種類を問わない。
【００１９】
細胞を曝露する被検物質は、これまでの毒性試験に用いられている一般的な方法で調整されるのが好適である。たとえば、下水、河川水のような液体試料については濃縮操作を行なった後、放射線もしくは高温による滅菌を行なう。さらに、大気粉塵、ディーゼルエンジン排気ガス中の固体試料等については、試料そのままを用いることもできるが、溶媒抽出による可溶成分についてのみ毒性試験を行なうこともできる。
【００２０】
細胞の機能もしくは生存性の測定自体も、従来の方法によることができる。たとえば、細胞の生存性を細胞膜の透過性を指標として調べる色素排除能試験、増殖能を調べるコロニー形成試験法、細胞の代謝活性を調べるＭＴＴ法、細胞の分裂に伴うサイミジン等の核酸前駆物質の取り込みを指標とする放射性チミジン標識法等が使用され得る。細胞機能の測定も多種多様な指標を利用できるが、たとえば細胞の貪食能、アミノ酸のタンパク質への取り込み能、サイトカイン等の生理活性物質産生能等が挙げられる。
【００２１】
本発明における上記のパターン化自体は、画像解析もしくは統計解析等の常法により行なわれうる。
【００２２】
さらに、これらの細胞機能の測定には、市販の高感度検出機器、画像解析機器、放射能測定機器等を使用することもできる。
【００２３】
【実施例】
以下の実施例により本発明方法をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
細胞培養の可能な平板上に、細胞培養において障害とならない材質で作成した仕切りを多数列配置し、種類の異なる細胞を列ごとにそれぞれの仕切りの内部に入れ培養する。ここでは、細胞培養用プラスチック平板上に、プラスチック薄板で多数の隔壁を作成した部材をシリコンで接着し、仕切りとしたものを用いた。培養液は使用する細胞に適したものとし、ここでは市販のＦ−１２培養液に牛胎児血清を加えたものを用いた。
【００２４】
一定時間、細胞の培養に適した温度下（ここでは２４時間、３７℃）で培養すると、細胞は平板上に付着する。次に、培養液中に被検物質を加える。ここでは、産業汚染物質である石炭フライアッシュ、酸化ニッケル溶液および亜ヒ酸溶液を被検物質とした。
【００２５】
４８時間培養した後、ＭＴＴ（メチルチアゾ−ルテトラゾリウム）試験法（ＭＴＴがミトコンドリアの酸化的リン酸化能に伴い還元、分解される現象を利用して細胞の生存率を簡便に定量し得る）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７，９３６−９４２（１９８７））  により、生存細胞数を測定し、細胞数の増減を記録する。まず細胞数を段階希釈して培養した後、ＭＴＴ試験法を行なった結果を図１に示す。
【００２６】
すなわち、３種類の細胞（ＣＨＯ，ｉｒｓ−２０およびｘｒｓ−５）をそれぞれ段階希釈（１／１〜１／８）して培養し、４８時間後にＭＴＴ試験を行なった（ＭＴＴを添加してさらに２時間培養した後に培養液を除去し、ＤＭＳＯ溶液を添加して細胞を溶解し、その発色を観察するためにカメラ撮影した。）。図１に示すように、細胞溶解液の吸光度（５５０ｎｍ）を分光計で測定し、グラフ化した。希釈率１／１を１００％とすると、３種類の細胞はいずれも希釈率に比例して直線的に吸光度が減少する。
【００２７】
被検物質での試験に先立ち、放射線、重金属、化学物質などの代表的な有害物質（標準有害物質と呼ぶ）に単独で曝露し、曝露後の細胞数を記録し、そのパターンをグラフ化しておく（図２の（ａ）−（ｃ））。すなわち、上記３種類の細胞を２４時間、前培養した後、Ｘ線照射（ａ），カドミウム（ｂ）、パラコート（ビピリジニウム系除草剤）（ｃ）を２．５時間曝露した。ついで、図１における実験と同様に４８時間培養し、ＭＴＴ試験を行なった。何も曝露しない場合の吸光度を１００％としてグラフ化した。Ｘ線照射はＣＨＯ＞ｉｒｓ−２０＞ｘｒｓ−５の順で抵抗性、カドミウム曝露はＣＨＯ＝ｉｒｓ−２０＝ｘｒｓ−５、パラコート曝露はＣＨＯ＝ｉｒｓ−２０＞ｘｒｓ−５の順で抵抗性というパターンがみられる。
【００２８】
各細胞の種類と被検物質の濃度（希釈率）ごとに、被検物質への曝露後の細胞数を記録し、そのパターンをグラフ化する（図３の（ａ）−（ｃ））。すなわち、上記３種類の細胞を２４時間、前培養した後、亜ヒ酸溶液に２．５時間曝露し、その後図１と同様に４８時間培養し、ＭＴＴ試験を行なった。石炭フライアッシュおよび酸化ニッケル溶液の場合、添加後洗浄せずにＭＴＴ試験の実施まで曝露を継続した（２．５時間＋４８時間の曝露）。被検物質を曝露しない場合の吸光度を１００％としてグラフ化した。石炭フライアッシュはＣＨＯ＝ｉｒｓ−２０＞ｘｒｓ−５の順で抵抗性（ａ）、酸化ニッケル溶液はＣＨＯ＝ｉｒｓ−２０＝ｘｒｓ−５（ｂ）、亜ヒ酸溶液ではＣＨＯ＝ｉｒｓ−２０＞ｘｒｓ−５の順で抵抗性（ｃ）というパターンがみられる。
【００２９】
以上のように、被検物質でのパターンを、標準有害物質におけるパターンと比較することで、被検物質の影響の種類と程度を決定する。図２と図３を比較すると、被検物質の中で、石炭フライアッシュおよび亜ヒ酸溶液は標準有害物質のパラコートタイプ、被検物質の酸化ニッケルは標準有害物質として使用した重金属のカドミウムに類似するパターンを呈する。
【００３０】
なお、本発明の一部は、文部科学省委託の「地球環境保全等試験研究費」により支援された研究によるものである。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、被検物質の全体としての毒性の程度だけでなく、既知の有害物質のうち、どのような有害物質に近似した性質の毒性であるかがわかり、人の健康への影響の程度と種類の適切な推定が可能となる。また、高度な技術が必要な高額の化学分析機器を使用せずに、どのような有害物質が含まれている可能性があるかを、簡単な細胞培養装置だけで知ることができ、未知の環境試料の毒性の迅速、簡便な評価が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における細胞数希釈倍率と吸光度の関係を示すグラフ。
【図２】３種類の細胞を標準有害物質に曝露した後の細胞数を記録したパターンを示すグラフ。
【図３】３種類の細胞を被検物質に曝露した後の細胞数を記録したパターンを示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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