(57)【要約】【課題】乾燥および貯蔵中に生成されるＴＳＮＡを低減する方法を提供する。【解決手段】葉タバコにアグロバクテリウム属に属し脱窒能を有する微生物を処理し、葉タバコ中の亜硝酸含量を低減することによって、葉タバコ中の亜硝酸含量および／またはニトロソアミン含量を低減する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱窒能を有する微生物を葉タバコに処理することを特徴とする葉タバコ中の亜硝酸および／またはニトロソアミン含量を低減する方法。
【請求項２】
亜硝酸が葉タバコ中に蓄積される以前に脱窒能を有する微生物を葉タバコに処理することを特徴とする葉タバコ中の亜硝酸および／またはニトロソアミン含量を低減する方法。
【請求項３】
前記脱窒能を有する微生物がアグロバクテリウム属微生物である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脱窒能を有する微生物がアグロバクテリウム・ラジオバクターＬＧ７７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８６）である請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、葉タバコの乾燥および／または貯蔵中に、葉タバコ中で亜硝酸とアルカロイドなどが反応して生成するタバコ特異的ニトロソアミン（Ｔａｂａｃｃｏ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ；以下「ＴＳＮＡ」と記す）含量を低減する方法に関する。より詳しくは、葉たばこ中の硝酸あるいは亜硝酸を脱窒化することで亜硝酸の蓄積を減少させＴＳＮＡの生成を阻害する方法である。
【０００２】
【従来の技術】
乾燥した葉タバコに特異的に含まれるＴＳＮＡは、収穫直後の葉タバコには存在しない。しかし、その後の乾燥および貯蔵の過程において、葉タバコに含まれる亜硝酸態窒素とアルカロイドが反応することによって生成される。このように生成されるＴＳＮＡの主成分は、Ｎ−ニトロソノルニコチン（以下「ＮＮＮ」と記す）、４−（Ｎ−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（以下「ＮＮＫ」と記す）、Ｎ−ニトロソアナタビン（以下「ＮＡＴ」と記す）およびＮ−ニトロソアナバシン（以下「ＮＡＢ」と記す）などである。
【０００３】
日本で栽培されているタバコは、大きく、黄色種、バーレー種および在来種の三つの品種に分類することができる。
これらのタバコの葉は、収穫時には緑色をしているが、乾燥過程を経ることによりクロロフィルが分解されてカロチノイド系色素が現れる。このカロチノイド系色素は黄色の色素であるので、葉タバコの色は黄変する。
黄色種では、黄変した段階で脱水速度を速めて葉肉および中骨が乾固され、葉色が黄色に固定される。
一方、在来種やバーレー種では、黄変後も引き続き乾燥が行われ、この続く乾燥過程においてカロチノイド系色素は分解し、褐色の色素が生成されて葉タバコは褐色に変化する。その後、葉肉や中骨を乾固して乾燥は終了する。このように、バーレー種および在来種は、収穫後に黄変期、褐変期および中骨乾燥期を経て乾葉となる。
【０００４】
また、黄色種と、バーレー種および在来種とでは乾燥方法が異なる。黄色種は、収穫した葉タバコを加熱器の装備された乾燥機（バルク乾燥機）内に吊り込み、風火力を利用して温度および湿度を制御しながら乾燥し、黄変期、色沢固定期および中骨乾燥期を順次経て５〜７日間で乾燥される。これに対してバーレー種および在来種の乾燥は、収穫した葉タバコをパイプハウスや木造乾燥室に吊り込んで、主に自然の温度および湿度条件下での制御を行いながら乾燥を実行し、黄変期、褐変期および中骨乾燥期を経て、２５〜３５日間に亘って乾燥される。
【０００５】
このような葉タバコの乾燥は、葉タバコ中の水分を除いて乾かすというだけでなく、葉タバコ中の内容成分を変化させ、品種特有の色と香喫味を付与する目的をもっている。そして、乾燥過程を経た葉タバコはさらに香喫味を熟成するために貯蔵が行われる。しかし、このような乾燥と貯蔵の過程において、葉タバコに含まれる亜硝酸態窒素とアルカロイドが反応することによってＴＳＮＡが生成される。黄色種の場合、ＴＳＮＡは主に加熱乾燥中に生成され、バーレー種の場合、ＴＳＮＡは、乾燥過程の褐変期から中骨乾燥期に生成する。
【０００６】
収穫直後の葉タバコの葉身（ラミナ）中には、アミノ酸、タンパク質およびアルカロイドが含有されると共に、硝酸塩と亜硝酸塩も含まれることが知られている。通常、植物はその体内で硝酸塩から亜硝酸塩を経てアミノ酸を生成し、植物体の形成に利用する。その一方で、高濃度の亜硝酸塩は生体の生存に悪影響を及ぼすので、植物体の形成に利用するための最小限を合成するのみである。従って、収穫直後の葉タバコ中の亜硝酸態窒素含量は１ｐｐｍ以下である。
【０００７】
しかしながら、葉タバコの乾燥過程で、葉タバコ表面に存在する微生物の硝酸還元酵素の作用により、葉タバコ中の硝酸塩が亜硝酸塩に還元されてしまう。この生成された亜硝酸塩が、葉タバコ中のアルカロイドと反応してＴＳＮＡが生成される。
【０００８】
従来から葉タバコ中のＴＳＮＡ含有量を低減するために様々な技術が提案されており、例えば以下のようなものがある。
▲１▼タバコの栽培面では、窒素肥料の施用量を低減する方法が挙げられる。窒素肥料の施用量を減らすことによってＴＳＮＡの生成原因物質である葉中のアルカロイド含量が減少する。この方法によって葉中のＴＳＮＡ含量が低下することも証明されている。
【０００９】
▲２▼品種改良の面からは、例えば、葉中のアルカロイド含量の低い品種の新たな開発が行われている。このような開発では、アルカロイド含量が低い個体から種子を採取し栽培することによって、ＴＳＮＡ含量が低い品種を得ることが可能である。
【００１０】
▲３▼黄色種タバコに関しては、直熱方式から間熱方式の乾燥機を用いる方法が提案されている。これは、間熱方式の乾燥機の使用によって、ＴＳＮＡの前駆物質である燃料由来のＮＯｘを減少させ、乾燥中のＴＳＮＡ生成を抑制する方法である（特許文献１）。
また、乾燥初期のＴＳＮＡ含量の低い黄変期の葉タバコに対してマイクロ波処理を行って、急激脱水を施して乾燥を終了する方法が提案されている（特許文献２）。しかしながらこの方法では、従来の乾燥の途中でその乾燥を終了させることになり、乾燥の目的である葉中に含まれる内容成分を変化させ、特有の色と香喫味を出すことができない。従って、従来法によって乾燥した葉タバコよりも喫味が悪くなってしまうという問題がある。
【００１１】
▲４▼葉タバコの乾燥過程で、葉タバコ表面に生存する微生物の硝酸還元酵素の作用により、葉タバコ中の硝酸塩が亜硝酸塩に還元されることを阻害するために、葉タバコ表層の関与する微生物を取り除く方法が提案されている。例えば、重炭酸ソーダなどで洗浄する方法（特許文献３）、二酸化塩素ガスなどで微生物を死滅する方法（特許文献４）が知られている。
また、葉タバコに由来する微生物を利用し、乾燥を終了した葉タバコの脱窒素処理をする方法も開示されている（特許文献５）。しかし、この方法は、乾燥が終了した葉タバコの硝酸含量および窒素化合物を低減する方法であって、ＴＳＮＡを効果的に低減することはできない。
なお、本発明者らは、乾燥／貯蔵中に生成する葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減する方法としてＴＳＮＡ分解菌を用いる方法を提案している（特許文献６）。
【００１２】
【特許文献１】
ＵＳ２００１／３８６号公報
【特許文献２】
特表２００１−５０３２４７号公報
【特許文献３】
ＷＯ０１／３５７７０号公報
【特許文献４】
ＷＯ０２／１３６３６号公報
【特許文献５】
特開昭５８−５０１５７３号公報
【特許文献６】
特願２００２−１３５７７７号
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、収穫直後の黄変期では、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の微生物など、非腸内微生物（すなわち、好気性微生物）が優勢種であるが、続く褐変期になると、硝酸還元能を有する腸内微生物（すなわち、通性嫌気性微生物）、特にエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）やパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属の微生物が優勢種となることを見出した。
【００１４】
通気性嫌気性微生物は、好気性微生物に比較して、高い硝酸還元能を有する。実際に、褐変期に葉面上から分離されたエンテロバクターおよびパントエア属の微生物を葉タバコに添加処理してみると、葉タバコ中に亜硝酸態窒素が蓄積されていた。
【００１５】
葉タバコ中に蓄積された亜硝酸はアルカロイドと反応してＴＳＮＡを生成する。しかしながら、生成された亜硝酸が更なる還元を受けたとすれば、Ｎ２ＯやＮ２などのガス態として放出されるので、葉面での亜硝酸の蓄積はなくなり、それによってＴＳＮＡの生成は抑制されるだろうと予想される。
【００１６】
葉タバコ葉面での亜硝酸還元の手段の１つは、微生物により達成されることが期待される。微生物による硝酸還元の形態は、同化型と異化型に分けられる。同化型還元は、亜硝酸塩を経てアミノ酸を合成し、合成されたアミノ酸は細胞形態の維持や増殖のために利用される。異化型還元には、硝酸呼吸と脱窒があり、微生物の活動のためのエネルギーを得るためのものである。硝酸呼吸は、硝酸塩を亜硝酸塩に還元はするが、それから先の還元までには至らない。これに対して、脱窒は、硝酸塩をＮＯ３‐→ＮＯ２‐→ＮＯ→Ｎ２Ｏ→Ｎ２の反応により還元し、最終的にガス態の窒素として体外に放出することになる。
【００１７】
そこで、本発明者らは亜硝酸を還元する能力を有することが知られているシュードモナス属微生物により葉タバコ中のＴＳＮＡ生成阻害効果を試みた。しかし、シュードモナス属微生物は、葉タバコの乾燥過程において葉タバコの表面上では優勢種になりえないことから、期待した亜硝酸還元効果が得られず、その結果、ＴＳＮＡ低減も十分に達成されなことが判明した。
【００１８】
本発明の目的は、乾燥および貯蔵中に葉タバコ中に蓄積される亜硝酸を還元することにより、葉タバコ中でのＴＳＮＡ生成を阻害し、結果としてＴＳＮＡ含量を低減することである。さらに、葉タバコの香喫味品質に悪影響を与えることなく、また現在行われている乾燥および貯蔵形態を変更せずに葉タバコ中のＴＳＮＡを低減する方法を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、葉タバコの乾燥過程において、葉タバコ表面での生存率が高く、かつ脱窒能を有する微生物であってタバコの香喫味に悪影響を与えない微生物を調査した結果、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する微生物が該当することを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、アグロバクテリウムに属し、脱窒能を有する微生物を葉タバコに処理することを特徴とする葉タバコ中の亜硝酸含量および／またはＴＳＮＡを低減する方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、アグロバクテリウム属に属し、脱窒能を有する微生物を葉タバコに処理することを特徴とする葉タバコ中のＴＳＮＡ含量を低減する方法と、アグロバクテリウム属に属し、脱窒能を有する微生物を葉タバコに処理することを特徴とする葉タバコ中の亜硝酸含量を低減する方法を提供する。
ここで、脱窒能とは、亜硝酸／亜硝酸塩を還元する能力をいい、本発明方法で用いられる微生物は、アグロバクテリウム属に属し脱窒能を有する微生物が含まれる。好ましくは、脱窒能を有するアグロバクテリウム・ラジオバクター微生物である。
【００２１】
なお、本発明者らにより分離された微生物は、菌学的性質から、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）に属する微生物であると同定され、ＬＧ７７として特許生物寄託センターに寄託されている（ＦＥＲＭ
ＢＰ−８３８６）。
また、ＬＧ７７は、上述のように葉タバコの表層から分離された株であり、葉タバコの品質に悪影響を及ぼさない菌株である。
【００２２】
前述したように、本発明に従う方法は、当該微生物を処理する以外は、現行の葉タバコ乾燥方法を変更することなく利用して実施することが可能である。従って、種々の研究開発によって達成された現行の葉タバコの品質を同様に維持できるものである。
本発明により処理される葉タバコは、バルク乾燥や自然乾燥を行うものであれば何れの品種であってもよい。好ましくは、自然乾燥される品種であり、より具体的にはバーレー種および在来種である。
【００２３】
本発明における微生物を「処理」するとは、対象となる葉タバコに対して微生物を添加することをいい、例えば、本発明に従う微生物の懸濁液の噴霧、微生物の菌体を含む粉末の塗布、および微生物を含む液体への葉タバコの浸漬など何れの方法により行ってもよい。
また、ここで使用される「低減」とは、葉タバコにおいて乾燥以後に生成する亜硝酸態窒素および／またはＴＳＮＡの含量および蓄積を減少させることを意味する。
【００２４】
本発明に使用され得る微生物を培養するための培地は、微生物培養用としてそれ自身公知の何れの培地を使用してもよい。また、微生物を培養するための条件は、例えば、温度が２５〜３５℃の範囲、ｐＨが６．０〜８．０の範囲であればよく、好ましくは温度が２８〜３２℃、ｐＨが７．０前後である。
【００２５】
本発明に従う何れかの微生物を本発明に使用する場合、当該微生物を一定期間培養した後に、遠心分離により集菌して、特定の緩衝液に懸濁して菌液を作成すればよい。本菌体を懸濁させる緩衝液は、例えば、滅菌蒸留水およびリン酸緩衝液を使用してよい。
また、本発明に従う何れかの菌体を緩衝液に懸濁する場合には、緩衝液１ｍＬ当たり、１０７〜１０１２個、好ましくは１０８〜１０１０個であり、この濃度に当該何れかの菌体を懸濁して用いることが好ましい。
【００２６】
上述のように調製した菌体を用いて葉タバコの処理を行う。例えば、必要な菌量を含有する当該菌液に滅菌蒸留水を加えて接種液を作成し、この液を葉タバコに均一に噴霧すればよい。
噴霧量は、上記のように調製した菌体懸濁液を葉タバコ１枚当たり、収穫直後および乾燥初期では２〜１０ｍＬ、乾燥中期以降では０．５〜３ｍＬでよい。
【００２７】
本発明の方法に従って、微生物を処理するための時期は、対象となる葉タバコの乾燥前後の何れの期間であってもよいが、少なくとも亜硝酸が葉タバコ中に蓄積される以前、すなわち黄色種にあっては黄変期以前、バーレー種にあっては褐変期前に処理することが望ましい。例えば、収穫直前にほ場で処理し、その後に収穫して乾燥に供してもよい。微生物の処理は、前記期間に１回以上処理してもよい。なお、２回目以降の処理を乾燥後から貯蔵期間に行う場合は、貯蔵開始時に処理することが好ましい。
【００２８】
【実施例】
［実施例１］脱窒菌の分離・選抜
栃木県小山市のタバコ畑の葉タバコから微生物を以下の手順で分離した。
【００２９】
バーレー種タバコのみちのく１号の本葉を収穫し、収穫した葉タバコの葉肉部分の一部を切り取ってサンプルとした。得られたサンプルを５ｍｍ角に細断し、その約１０ｇを３００ｍＬ容の三角フラスコに採取した。２００ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、これをホモジナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を、微生物分離用のタバコ懸濁液とした。
【００３０】
タバコ懸濁液を微生物が分離できる濃度（１０２〜１０５倍）に前述と同様のリン酸緩衝液を用いて希釈した。
得られた希釈液をＹＧ寒天平板培地（酵母エキス：１．０ｇ、グルコース：１．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．２ｇ、寒天：１５ｇ、蒸留水：１０００ｍＬ、ｐＨ６．８）に０．１ｍＬずつ滴下して塗抹した後、３０℃で７日間培養した。
【００３１】
生育したコロニーを新しいＹＧ寒天平板培地を用いて単一コロニーに分離した。分離した微生物は使用時まで−８０℃で保存した。
分離した微生物から以下の操作により脱窒能を有する微生物を選抜した。
供試微生物の前培養には、ＹＧ寒天平板培地を使用した。生育した微生物を滅菌蒸留水に約１０７ｃｆｕ／ｍＬになるように懸濁し、接種用菌液とした。
【００３２】
ダーラム管とＧｉｌｔａｙ培地（ＫＮＯ３：１．０ｇ、アスパラギン：１．０ｇ、１％ブロモチモールブルー溶液：５ｍＬ、クエン酸ナトリウム：８．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：１．０ｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ：０．０５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：１．０ｇ、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ：０．２ｇ、蒸留水：１，０００ｍＬ、ｐＨ７．０）を１ｍＬずつ入れた試験管とＧｉｌｔａｒｙ培地のみを入れた試験管に、上記の葉タバコ表面から分離した菌株をリン酸緩衝液で希釈した微生物懸濁液を１００μＬずつ接種した。夫々の試験管を３０℃で７日間培養した。
【００３３】
ダーラム管とＧｉｌｔａｙ培地については、硝酸塩の消失によって培地の色が緑から濃青色への変化、硝酸塩のガス化によるダーラム管への気泡の生成の有無について調査した。
また、Ｇｉｌｔａｙ培地については、グリース・イロスベイ試薬（１液  スルファニル酸：０．５ｇ、酢酸：３０ｍＬ、蒸留水：７０ｍＬ、２液  α−ナフチルアミン：０．５ｇ、酢酸：３０ｍＬ、蒸留水：７０ｍＬ、１液と２液を当量混合する）と、亜鉛抹で液体中の硝酸塩と亜硝酸塩の有無を調査した。
【００３４】
その結果、８８菌株中４菌株について、ダーラム管中への気泡の生成がみられ、且つ培養後の培地における硝酸塩および亜硝酸塩の存在は認めらなかった。
従って、当該４菌株が脱窒能を有する菌株であると判定し、選抜した。
【００３５】
次に、得られた脱窒菌４菌株の硝酸還元能を評価した。
【００３６】
各々の微生物をトリプチックソイ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔ；すなわち、Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下、１／１０ＴＳ液体培地と記す）で培養した後、遠心集菌した。集菌菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液で２回洗浄した後、再度リン酸緩衝液に懸濁した。更に、それらの懸濁液中の菌数を１０８〜１０９ｃｆｕ／ｍＬに調整した。
［１／１０ＴＳ液体培地の組成］
・最終容量            蒸留水で１０００ｍｌにする
・カゼイン                        １．７ｇ
・Ｄ−グルコース                  ０．２５ｇ
・ＮａＣｌ                        ０．５ｇ
・Ｋ２ＨＰＯ４                      ２．５ｇ
【００３７】
微生物懸濁液１００μＬを硝酸ナトリウムとグルコースを含む１００ｍＭリン酸緩衝液に添加し、全量を５００μＬにした。反応液中には１０ｍＭ硝酸ナトリウムと１０ｍＭグルコースが含まれている。これを３０℃で１時間静置した。氷冷して反応を停止した後、遠心して反応液上清を採取した。反応液上清中の亜硝酸態窒素の発色には、スルファニルアミドとＮ−ナフチルエチレンジアミン塩酸塩を使用した。ＢＩＯＬＩＳＥを使用して、５５０ｎｍのフィルターの透過率から反応液中の亜硝酸態窒素濃度を換算した。結果を図１に示す。
この結果を基に硝酸還元能力の強い菌株を選抜し、ＬＧ７７と命名した。
【００３８】
［実施例２］脱窒微生物の同定
実施例１で選抜した脱窒能を有する微生物ＬＧ７７菌株の菌学的性質を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2005027545.tif 000002
【００４０】
表１に示す結果から、ＬＧ７７菌株は、アグロバクテリウム・ラジオバクターに属すると同定された。
なお、上記の同定は財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。
また、ＬＧ７７菌株は、アグロバクテリウム・ラジオバクター  ＬＧ７７として特許生物寄託センターに寄託されている（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８６）。
【００４１】
［実施例３］乾燥期間中の処理による葉タバコ中のＴＳＮＡ生成抑制効果
実施例２に記載した１／１０ＴＳ培地にＬＧ７７菌株を接種し、３０℃で７２時間培養した。培養後、この菌体を含む培地を５，０００ｒｐｍで遠心して菌体を集めた。
得られた菌体を滅菌蒸留水で２回洗浄した後、再度滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液の菌体濃度を１０８〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬに蒸留水で調整した。
【００４２】
前述の微生物懸濁液を、収穫して乾燥に供するバーレー種（きたかみ１号）の葉タバコに対して処理した。
処理時期は、収穫直後、収穫３日および８日後の３回で、葉タバコ１枚当たり１０ｍＬとなるように、葉タバコの表裏に噴霧器を使用して処理した。無処理および微生物懸濁液処理と同時に当量の菌体を含有しない滅菌蒸留水を処理したものを対照とした。
【００４３】
葉タバコの乾燥は、パイプハウスを使用して行った。
乾燥２１日および３２日後に無処理区と各処理区の葉タバコを採取した。採取した葉タバコを、葉肉部分と中骨部分に分離した後、凍結乾燥を行った。
【００４４】
凍結乾燥した葉肉部分のサンプルを、ミキサーを使用して粉砕した。ＴＳＮＡ含量の定量には葉肉部分のサンプルのみを使用した。
前述の粉砕処理した各区の葉肉サンプル約５ｇを２００ｍＬ容三角フラスコに量り取り、０．０１ＭのＮａＯＨ溶液（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ：１００μｇ／ｍＬ含有）を１００ｍＬ加え、振盪機により室温で２時間抽出した。その後、ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｎｏ．５Ｃ）を用いて抽出液を濾過した。
【００４５】
ＴＳＮＡ４成分量（ＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢ）の定量は、次の方法で行った。すなわち、抽出液中のＮＮＮ、ＮＮＫ、ＮＡＴおよびＮＡＢを、改良Ｓｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒ法に準じたガスクロマトグラフィによって定量した（Ｓｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒ  Ｂ．，  Ｋｕｂａｃｋｉ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．（１９８９）Ｂｅｉｔｒ．  Ｔａｂａｋｆｏｒｓｃｈ．  Ｉｎｔ．，  １４（３），  １３５−１４３，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｈａｌｄｅｒ  Ｂ．，（１９８９）Ｂｅｉｔｒ．Ｔａｂａｋｆｏｒｃｈ．  Ｉｎｔ．，１４（３），１４５−１５３）。
【００４６】
まず、各濾液の１０ｍＬをキーゼルグール（粒径６０−１６０ｍｍ、ＭＥＲＣＫ社）及びアスコルビン酸を充填したカラムに添加した。ジクロロメタンを用いてＴＳＮＡを転溶、流下させた。このジクロロメタンの流下液をガスクロマトグラフィ用のサンプルとした。得られたサンプルを、カラムＤＢ−１７（Ｊ＆Ｗ社）、検出器ＴＥＡ−５４３（Ｔｈｅｒｍｅｄｉｃｓ社）を装備したガスクロマトグラフィＨＰ６８９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いて分析した。
【００４７】
結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
2005027545.tif 000003
【００４９】
ＴＳＮＡ含量は、３試験区の中で水のみを処理した区が最も高く、乾燥２１日、３２日目で各々３．４５、３．３６μｇ／ｇであった。脱窒菌を処理した葉タバコ中のＴＳＮＡ含量は、３試験区の中で最も低く、乾燥２１日、３２日目で各々２．２２、１．７１μｇ／ｇであり、無処理区の３．０１，２．３３μｇ／ｇと比較しても低かった。
以上の結果から、ＬＧ７７菌株は葉タバコ中のＴＳＮＡ生成を抑制することが示唆された。
【００５０】
［実施例４］乾燥期間中の処理のよる葉タバコ中の亜硝酸態窒素生成抑制効果実施例３で処理した葉タバコ中の亜硝酸態窒素含量を定量した。定量方法を次に記す。まず、各区の葉肉サンプル約０．５ｇを５０ｍＬ容の遠沈管に量り取り、下記に示す抽出液２５ｍＬを加え、室温で３０分間振盪して亜硝酸態窒素を抽出した。これらの抽出液を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｎｏ．１）を用いて濾過した後、濾液１０ｍＬを別の遠沈管に採取し、活性炭０．５ｇを加えて、室温で１５分間振盪した。更に、濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｎｏ．５Ｃ）を用いて濾過し、活性炭を除去した。得られた濾液を亜硝酸態窒素定量用試料とした。
2005027545.tif 000004
【００５１】
抽出液中の亜硝酸態窒素含量の定量には、アートアナライザー（ＢＲＡＮ＋ＬＵＥＢＢＥ社、ＡＡＣＳＩＩ）を使用し、５５０ｎｍのフィルターの透過率から亜硝酸態窒素含量を換算した。なお、亜硝酸態窒素の発色には、１％スルファニルアミドと０．１％Ｎ−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩を使用した。
【００５２】
結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
2005027545.tif 000005
【００５４】
亜硝酸態窒素含量は、３試験区の中で水のみを処理した区が最も高く、乾燥２１日、３２日目で各々４．５４、５．１７μｇ／ｇであった。脱窒菌を処理した葉タバコ中の亜硝酸態窒素含量は、３試験区の中で最も低く、乾燥２１日、３２日目で、各々３．９３、２．０９μｇ／ｇであり、無処理区と比較しても低かった。
実施例３および実施例４の結果から、葉タバコ中のＴＳＮＡは、葉タバコ中の亜硝酸含量との関連があることが示唆された。すなわち、亜硝酸含量が多いほどＴＳＮＡの生成が多くなることが示唆された。
【００５５】
［実施例５］乾燥期間中の脱窒菌の定着性
本実験に用いたＬＧ８１菌株は、実施例１で分離したアグロバクテリウム・ラジオバクターに属する脱窒菌Ａであり、ＬＧ３０およびＣＢ３０１菌株は、脱窒能を有するシュードモナス属微生物である。これらの菌株は、葉タバコ葉面上から分離した微生物であり、脱窒能を有する微生物である。
【００５６】
各々の菌株を、上述の実施例２と同様の組成の１／１０ＴＳ液体培地に接種し、３０℃で７２時間培養した。培養後、この菌体を含む培地を５，０００ｒｐｍで遠心して菌体を集めた。
得られた菌体を滅菌蒸留水で２回洗浄した後、再度滅菌蒸留水に懸濁した。懸濁液の菌体濃度を１０８〜１０１０ｃｆｕ／ｍＬに蒸留水で調整した。
【００５７】
得られた菌懸濁液を、収穫１日および７日後のバーレー種（きたかみ１号）の葉タバコ１枚当たり１０ｍＬとなるように、葉タバコの表裏に噴霧器を使用して処理した。
【００５８】
乾燥２０日後に、無処理葉と処理葉を採取した。採取した葉タバコを、葉肉部分と中骨部分に分離した後、葉肉部分の一部を切り取りサンプルとした。得られたサンプルを５ｍｍ角に切断し、その約１０ｇを３００ｍＬ容の三角フラスコに採取した。２００ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、これをホモジナイザーで粉砕した。得られた懸濁液を微生物分離用のタバコ懸濁液とした。
【００５９】
リン酸緩衝液を用いて、タバコ懸濁液を微生物が分離できる濃度（１０２〜１０５倍）に希釈した。得られた希釈液を実施例１と同様の組成のＹＧ寒天平板培地に０．１ｍＬずつ滴下して塗抹した後、３０℃で７日間培養した。生育したコロニーを新しいＹＧ寒天平板培地を用いて単一コロニーに分離した。分離した微生物は使用時まで−８０℃で保存した。
供試微生物の前培養には、ＹＧ寒天平板培地を使用した。生育した微生物を滅菌蒸留水に１０７ｃｆｕ／ｍＬになるように懸濁し、接種用菌液とした。
【００６０】
上述の例２と同様にダーラム管とＧｉｌｔａｙ培地について、硝酸塩の消失による培地の色の緑色から濃青色への変化、硝酸塩のガス化によるダーラム管への気泡の生成の有無を調査した。また、Ｇｉｌｔａｙ培地についても実施例１と同様に、グリース・イロスベイ試薬と、亜鉛抹で液体中の硝酸塩と亜硝酸塩の有無を調査した。
ＬＧ７７およびＬＧ８１菌株を処理した区から分離した脱窒能を有する微生物１０菌株について同定を行った。同定にはバイオログシステム（グンゼ産業社）を用いた。
【００６１】
結果を表４に示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
乾燥２０日目の分離微生物数に対する脱窒能を有する微生物の割合を指標としたところ、無処理区、シュードモナス  ｓｐｐ．の処理区において、脱窒能を有する微生物は分離されなかった。一方、アグロバクテリウム・ラジオバクターの処理区では、乾燥２０日でも分離微生物中の３０％近くが脱窒菌であった。また、アグロバクテリウム・ラジオバクター処理区から分離した脱窒能を有する微生物１０菌株を同定したところ、全ての微生物がアグロバクテリウム・ラジオバクターであった。このことから、アグロバクテリウム・ラジオバクターは、葉タバコの乾燥期間中の葉タバコにおいて定着性が高いことが示唆された。
【００６４】
【発明の効果】
以上のような本発明によれば、現在行われている乾燥および貯蔵形態の中において使用することが可能な、乾燥および貯蔵中に生成されるＴＳＮＡを低減する方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】分離した脱窒菌の中でＬＧ７７株の硝酸還元活性が最も強いことを示すグラフ。
【図１】
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