(57)【要約】【課題】本発明は、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数の増減に起因する表現型に対し、前記ＤＮＡ配列を同定するためのスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】正常細胞に由来するホールゲノムをカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、検体細胞または検体細胞集団より抽出した検体ゲノムＤＮＡと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムＤＮＡを異なる蛍光色素でラベルし、ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、競合的にハイブリダイズさせる。得られたシグナルにおける両者の蛍光強度の比を算出すれば、各プローブで、どちらのゲノムＤＮＡがより多くハイブリダイズしたか明らかになるので、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を有する少なくとも一つのプローブを同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している少なくとも一つのＤＮＡ配列を同定するための包括的スクリーニング方法であって、
正常細胞に由来する１組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡマイクロアレイを作製する工程と、
各プローブのＤＮＡ配列を明らかにする工程と、
前記検体細胞または前記検体細胞集団より抽出した検体ゲノムＤＮＡと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムＤＮＡを、異なる標識物でラベルする工程と、
前記ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムＤＮＡと前記正常ＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせる工程と、
得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、
を備える包括的スクリーニング方法。
【請求項２】
前記検体細胞または検体細胞集団が腫瘍細胞または腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の包括的スクリーニング方法。
【請求項３】
少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数が正常より増減していることが起因となる表現型を有する検体細胞または検体細胞集団において、前記ＤＮＡ配列を同定するための前記表現型の原因遺伝子同定方法であって、
正常細胞に由来する１組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡマイクロアレイを作製する工程と、
各プローブのＤＮＡ配列を明らかにする工程と、
前記検体細胞または前記検体細胞集団より抽出した検体ゲノムＤＮＡと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムＤＮＡを、異なる標識物でラベルする工程と、
前記ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムＤＮＡと前記正常ＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせる工程と、
得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、
を備える原因ＤＮＡ配列同定方法。
【請求項４】
前記表現型が細胞の腫瘍化であることを特徴とする請求項３に記載の原因ＤＮＡ配列同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している、少なくとも一つのＤＮＡ配列を同定するための包括的スクリーニング方法に関する。また、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数が正常より増減していることが起因となる表現型を有する検体細胞または検体細胞集団において、前記ＤＮＡ配列を同定するための原因ＤＮＡ配列同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
担持体上にＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質をアレイ状に固定したデバイスとして、マイクロアレイが知られており、生物学、医学の分野において研究や診断に用いられている。マイクロアレイの表面にはＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質などのプローブが固定されるが、例えばＤＮＡとしては、オリゴＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどが使用される。
【０００３】
このようなＤＮＡを用いたマイクロアレイの応用例として、ＣＧＨ(comparative genomic hybridization)マイクロアレイ法が知られている。この方法によると、多数の遺伝子、多数のｃＤＮＡ、または特定の染色体領域をカバーする多数のゲノムＤＮＡ断片を固定したマイクロアレイに対し、異なる蛍光色素を用いて標識した検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせ、各プローブの蛍光シグナルを検出することにより、検体ゲノムＤＮＡ中で、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡを含む領域、またはそこに含まれる遺伝子を同定することができる（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】メソッズ  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Methods Mol. Biol.）  2004年  256巻  39-56頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような、多数の遺伝子、多数のｃＤＮＡ、または特定の染色体領域をカバーする多数のゲノムＤＮＡ断片を固定したマイクロアレイを用いても、検体ゲノムＤＮＡ中で、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡを含む領域がそのアレイ上に含まれていない場合、その領域は同定できない。また、複数のＤＮＡ配列の細胞当たりのコピー数が増減することによって、細胞の腫瘍化などの表現型が生じる場合、上記マイクロアレイでゲノムＤＮＡの増幅領域や欠失領域が検出されても、それだけでは、その表現型の原因を特定できないかもしれない。また、ある表現型が、複数のＤＮＡ配列の細胞当たりのコピー数の増減が有する冗長な（redundant）効果による場合、検体によって、アレイ上の特定のプローブについてシグナルが得られる場合も得られない場合もあり、結果の解釈が難しくなる。
【０００５】
しかし、現在の解析技術では、ゲノムワイドな遺伝子異常の検出は、染色体の核型分析以外に有効な方法がないが、核型分析は解像度が低い。最近、染色体を用いたＣＧＨ(comparative genomic hybridization)が開発されているが、操作が煩雑すぎることと、再現性にも乏しいため、ほとんど臨床検査として実用化されていない。
【０００６】
そこで、本発明は、ゲノムＤＮＡマイクロアレイを用い、検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している少なくとも一つのＤＮＡ配列を同定するための包括的スクリーニング方法を提供することを目的としてなされた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の包括的スクリーニング方法は、検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している少なくとも一つのＤＮＡ配列を同定するための包括的スクリーニング方法であって、正常細胞に由来する１組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡマイクロアレイを作製する工程と、各プローブのＤＮＡ配列を明らかにする工程と、前記検体細胞または前記検体細胞集団より検体ゲノムＤＮＡを抽出し、正常の前記細胞または前記細胞集団より正常ゲノムＤＮＡを抽出し、各々を異なる標識物でラベルする工程と、前記ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムＤＮＡと前記正常ＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせる工程と、得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、を備える。前記検体細胞集団が腫瘍であってもよい。
【０００８】
さらに、本発明の原因遺伝子同定方法は、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数の増減が起因となる表現型を有する検体細胞または検体細胞集団において、前記ＤＮＡ配列を同定するための原因遺伝子同定方法であって、正常細胞に由来する１組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡマイクロアレイを作製する工程と、各プローブのＤＮＡ配列を明らかにする工程と、前記検体細胞または前記検体細胞集団より検体ゲノムＤＮＡを抽出し、正常の前記細胞または前記細胞集団より正常ゲノムＤＮＡを抽出し、各々を異なる標識物でラベルする工程と、前記ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムＤＮＡと前記正常ＤＮＡを競合的にハイブリダイズさせる工程と、得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、を備える。前記表現型が細胞の腫瘍化であってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している少なくとも一つのＤＮＡ配列を同定するための包括的スクリーニング方法を提供することができる。このようにして包括的にスクリーニングすることにより、効率よく細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を同定できるばかりでなく、特に、検体細胞または検体細胞集団が、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数の増減が起因となる表現型を有する場合において、前記ＤＮＡ配列を同定するための原因遺伝子同定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１２】
＝＝ゲノムＤＮＡマイクロアレイの作製＝＝
本発明の包括的スクリーニング方法を行うために、まず正常細胞に由来する１組のゲノム全体（whole genome）をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡアレイを作製する。
【００１３】
例えば、BACライブラリーを用いて、ランダムに選んだクローンからＤＮＡを抽出し、両端の塩基配列を決定する。ゲノムＤＮＡのデータベースを参照して、各クローンの染色体上での位置決定及びＤＮＡ配列決定を行い、ゲノム全域をカバーするクローンが得られるまで、この作業を繰り返す。
【００１４】
次に、BACクローンから得られたＤＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡマイクロアレイを作製する。各BACクローンからＤＮＡを抽出し、直接ガラスに貼り付けてもよいが、各BACクローンをＰＣＲで増幅させたＤＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイを作製する方が簡便で効率がよい。ＤＮＡマイクロアレイ作製のためのＤＮＡを得る方法は、RCA（Rolling Circle Amplification ）、Adaptor PCR、DOP-PCR（Degenerate oligonucleotide primer PCR）等が考えられるが、操作が簡便なこととアミノ基標識効率がよいことから、以下の実施例ではDOP-PCRを利用した。
【００１５】
以上、BACクローンを利用した、１組のゲノム全体（whole genome）をカバーするプローブ群を有するゲノムＤＮＡアレイの作製方法を述べたが、ゲノムＤＮＡアレイの作製方法はこれに限らず、プローブ群の有するＤＮＡが、全体として、１組のゲノム全体（whole genome）をカバーするようなゲノムＤＮＡアレイを作製できれば、どんなものでもよい。
【００１６】
＝＝ＣＧＨ(comparative genomic hybridization)法＝＝
（１）まず、検体細胞または検体細胞集団より検体ゲノムＤＮＡを、正常の細胞または細胞集団より正常ゲノムＤＮＡを抽出する。
【００１７】
検体細胞または検体細胞集団の由来する生物種は何でも良く、原核生物であっても真核生物であっても良く、真核生物では、酵母などの単細胞生物であっても、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、メダカ、カエル、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒト等を含む多細胞生物であってもよい。
【００１８】
細胞集団とは、複数の細胞からなる集団のことであり、組織、器官、個体などであってよい。
【００１９】
正常ゲノムＤＮＡは、正常細胞由来であれば、細胞タイプ（cell-type）には関わらないが、検体細胞または検体細胞集団と同じ細胞タイプあるいは同じ細胞タイプ由来の細胞から抽出されることが望ましい。例えば、検体細胞集団がヒト腫瘍である場合、正常の細胞集団はヒト腫瘍が由来するヒト組織であることが好ましい。
【００２０】
検体細胞または検体細胞集団は、顕著な表現型があってもなくてもよい。一見正常にみえる検体でも、ＤＮＡレベルで異常が検出されたりすると、将来的に発生する疾患の予測などに利用できる可能性がある。
【００２１】
検体細胞集団は、均一な（homogenous）集団であることが好ましい。正常細胞が混入していると、検体細胞集団中の変異が希釈され、検出しにくくなるからである。
【００２２】
（２）次に、抽出した検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡを異なる標識物でラベルする。
【００２３】
標識物は、ジコキシゲニンやビオチンなどでラベルされたｄＮＴＰなどを用いてもよい。その場合、抗ジコキシゲニン抗体や抗ビオチン抗体を用いた抗原抗体反応により、酵素反応あるいは蛍光で検出するが、解析のしやすさから蛍光で検出するのが好ましい。定量性の面からは、蛍光色素でラベルされたｄＮＴＰを用いて、ゲノムＤＮＡを直接蛍光色素でラベルするのが好ましい。いずれの場合も、最終的に検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡが、異なる放射波長を有する蛍光色素でラベルされる。蛍光色素の種類は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ３などがあるが、特に限定されない。
【００２４】
ラベルの方法は、ニックトランスレーション法やランダムラベリング法が用いられるが、これらに限らない。
【００２５】
（３）次に、ゲノムＤＮＡマイクロアレイに対し、定法に従い、ラベルした検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡを、同じハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイズさせる。これにより、検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡは競合的にゲノムＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズする。
【００２６】
検体ゲノムＤＮＡと正常ゲノムＤＮＡは、例えば、緑色を発色する蛍光色素と赤色を発色するような異なる蛍光色素で標識されているため、両者について、一細胞当たりの量が同じであれば、プローブに対し同じ量がハイブリダイズし、両者の蛍光強度比が全体にほぼ一定となる。
【００２７】
しかし、検体ゲノムＤＮＡについて、一細胞当たりの量が正常ゲノムＤＮＡより多ければ、その検体ゲノムＤＮＡを標識した蛍光強度が強くなり、一細胞当たりの量が正常ゲノムＤＮＡより少なければ、正常ゲノムＤＮＡを標識した蛍光強度が強くなり、それぞれ蛍光強度比が偏る。
【００２８】
このようにして、各プローブに対し、得られたシグナルを解析し、検体ゲノムＤＮＡ中に、一細胞当たりの量が正常ゲノムＤＮＡと同じであるかどうか調べることにより、検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているＤＮＡ配列を包括的にスクリーニングすることができる。
【００２９】
＝＝原因ＤＮＡ配列同定方法＝＝
上記包括的スクリーニング法を利用して、検体細胞または検体細胞集団が、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数の増減が起因となる表現型を有する場合において、前記ＤＮＡ配列を同定するための原因ＤＮＡ配列を同定できる。ここでは、ある形質に対し特定の表現型を有する検体細胞または検体細胞集団に対し、上記ＣＧＨ法を適用し、その表現型の原因ＤＮＡ配列を同定することを目的とする。
【００３０】
この場合の表現型は、少なくとも一つのＤＮＡ配列の、細胞当たりのコピー数の増減が起因となるものであれば、どんなものでもよいが、通常、このような変異は、体細胞あるいは生殖細胞において、そのＤＮＡ配列が重複または欠失することによって生じる。しかし、重複または欠失のような変異が生じていても、そのＤＮＡ配列に関し、細胞当たりのコピー数が変わらない場合、この方法は適用できない。例えば、ある細胞においてそのＤＮＡ配列の重複と欠失が同時に起きていたり、そのＤＮＡ配列の欠失とそのＤＮＡ配列を別の染色体に余分に有する転座が同時に起きていたりする場合である。
【００３１】
このような変異の例として、具体的には、ヒトの場合、体細胞変異であれば、細胞の腫瘍化などがあり、生殖細胞変異であれば、遺伝病などがある。また、ヒト以外の生物種を用いて、遺伝学的研究を行う際に作出した突然変異であってもよい。
【００３２】
変異が体細胞突然変異である場合、ゲノムＤＮＡを抽出する検体細胞または検体細胞集団は、その表現型が観察される検体細胞または検体細胞集団が好ましいが、変異が生殖細胞変異である場合は、ゲノムＤＮＡを抽出する検体細胞または検体細胞集団は、同じ個体に由来するものであれば、特に表現型が観察されない細胞または細胞集団であってもよい。
【００３３】
この原因ＤＮＡ配列同定方法は、ある形質に関する表現型の原因が、複数のＤＮＡ配列の変異によるものであるとき、特に効果が高い。なぜなら、ここでは１組のゲノム全体をカバーするようなゲノムＤＮＡアレイを用いるため、原因ＤＮＡ配列を包括的に、ゲノムワイドにスクリーニングすることができ、１回のスクリーニングで、変異を生じている配列を漏れなく同定できるからである。
【００３４】
例えば、表現型が複数のＤＮＡ配列さらには複数の染色体に渡る変異によって生じる場合、形質が量的なものであり表現型がポリジーンの変異によって生じる場合、形質が冗長性（redundancy）を有する遺伝子群に支配されている場合、表現型を生じる主要な変異以外にモディファイヤー（modifier）が存在する場合など、複雑な遺伝的相互作用があるほど、本発明の原因ＤＮＡ配列同定方法は効果を発揮すると考えられる。実際、腫瘍を生じる場合でも、例えばイニシエーター（initiator）及びプロモーター（promoter）の２段階あるいはそれ以上の多段階の遺伝的変異が必要とされる場合や、また、腫瘍化には直接関わりがないが、腫瘍の悪性化を引き起こすmycのような遺伝子が存在する場合など、ゲノム全体の解析をしないと、解析結果の解釈ができず、結論に結びつかない場合も多い。
【００３５】
最終的に、できるだけ多数の同じ表現型を示す細胞または細胞集団に対して、この原因ＤＮＡ配列同定方法を行い、結果を全体として統計的に解析することにより、どのＤＮＡ配列の変異が表現型に関係するかを明らかにすることができる。
【００３６】
一方、各ＤＮＡ配列中にどのような遺伝子が存在するかを、予め調べておくことにより、表現型の原因遺伝子の候補が得られる。より詳細に分子生物学的解析を行い、重複領域や欠失領域を絞り込むことにより、これらの遺伝子が実際に原因となっているか明らかにすることができる。
【００３７】
［実施例］
（１）BACクローンのスクリーニング
まず、BAC-DNAライブラリーから、1,0176クローンのBACクローンを選択し、R.E.A.L Prep 96 Plasmid Kit( QIAGEN)を用いて、ＤＮＡを抽出した。インサートの両端から、クローニングサイト近傍のＤＮＡ配列を決定し、プローブとして使用可能なサイズであることと、重複していないこと、全体としてホールゲノムがカバーされていることを基準に7400個以上のクローンを最終的に選別した。
【００３８】
各クローンのＤＮＡの増幅にはDOP-PCR法を用いた。DOP-PCRには以下のプライマーセットを用いた。  
DOP-1：5’-CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA-3’   （配列番号：１）
DOP-2：5’-CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG-3’   （配列番号：２）
DOP-3：5’-CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG-3’   （配列番号：３）
【００３９】
これら3種のプライマー用いて同一の鋳型BACクローンに対し、3回のDOP-PCRを行った。DOP-PCRは反応液量10μlとし、反応組成は15mM Tris-HCl pH8.0, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.2mM dNTP, 2μM DOP-PCR primer, 1.25U AmpliTaq Gold, 0.5μl BAC DNAとした。反応にはGene Amp PCR 9700( Perkin Elmer) を用いた。94℃ 3分の熱変性後、94℃ 1.5分, 30℃ 2.5分, ramp at 0.1℃/ sec to 72℃, 72℃ 3分を10サイクル行い、さらに94℃ 1分, 62℃ 1.5分, 72℃ 2分を30サイクル行った。
【００４０】
得られたDOP-PCR産物を鋳型としプライマー２を用いてSecondary PCRを行った。  
プライマー２：5’-XGGAAACAGCCCGACTCGAG-3’   （配列番号：４）
Secondary PCRは反応液量20μlとし、反応組成は5mM Tris-HCl pH8.5, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.25mM dNTP, 1.6μM a分o-link primer, 3U AmpliTaq Gold, 0.5μl 各DOP-PCR 産物とした。ＰＣＲ条件は95℃ 10分の熱変性後、95℃ 1分, 60℃ 1.5分, 72℃ 7分 を35サイクル行い、最後に72℃ 10分で伸張した。
【００４１】
増幅したPCR産物の精製には、マルチスクリーン384 PCRプレート（MILLIPORE）を用いた。精製後DNAは10μlの1x spotting buffer ( 250mM sodium phosphate buffer pH8.5, 0.00025% N-Lauroylsarcosine) に溶解しマイクロアレイの作製に用いた。
【００４２】
（２）マイクロアレイの作製
マイクロアレイの作製にはSPBIO2000（HITACHI）を用いた。調整したＤＮＡをガラススライド上にトリプルスポットし、飽和NaClチャンバーにて24時間インキュベートした。スライドガラス表面をBlocking Buffer（50mM ethanola分e, 0.1M Tris pH9.0, 0.1% SDS）で50℃、15分ブロッキングした後、滅菌蒸留水で2回洗浄し、さらに4x SSC, 0.1% SDS中で50℃、60分洗浄し、滅菌蒸留水で洗浄した。アレイ上のＤＮＡを1本鎖化するためスライドガラスを沸騰した滅菌蒸留水中で２分インキュベートした後、室温の滅菌蒸留水にて2回洗浄し、乾燥させ、デシケータ中で保管した。
【００４３】
（３）ＤＮＡのラベリング
ゲノムＤＮＡのラベリングにはBioprime Labeling kit（Invitrogen）を用いた。反応液量は50μlとし指定のプロトコールに従って1μgの健常人ＤＮＡ（健常人の末梢血より抽出したＤＮＡ） と1μgの扁平上皮癌細胞株ＤＮＡのラベリング反応を行ったが、反応組成のうち各dNTP濃度を終濃度200μM( dATP, dGTP, dTTP)、50μM( dCTP)、160μM（Cy3またはCy5標識dCTP）となるよう変更した。ラベル後のＤＮＡはSephadex G-50カラムを用いて精製し、67.5μgのHuman Cot-1 DNA (Invitrogen)とともにエタノール濃縮した。
【００４４】
（４）競合的ハイブリダイゼーション
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、Lucidea Slide Pro(Amersham Biosciences) を用いて行った。
【００４５】
まず、エタノール沈殿した各標識ゲノムＤＮＡ全量を30μlのハイブリダイゼーションバッファー（50% Formamide, 10% Dextransulfate, 0.1% Tween20, 2x SSC, 10mM Tris-HCl pH7.4）に溶解させ、3μl Yeast tRNA(100μg/μl) を加え72℃にて10分熱変性後、37℃、1時間プレハイブリダイゼーションを行った。一方、マイクロアレイに対しては、DNA mix( 40μg サケ精子DNA、67.5μg Human Cot-1 DNAを濃縮し100μlのハイブリダイゼーションバッファーに溶解した) を72℃、10分変性後、氷冷し、アレイと37℃、1時間プレハイブリダイズさせた。
【００４６】
プレハイブリダイゼーション後の標識ゲノムＤＮＡに200μlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、マイクロアレイと37℃、48時間ハイブリダイゼーションさせた。マイクロアレイは、washing buffer1( PBS, 0.05% Tween20) 中で10分間、室温洗浄し、42℃に温めたwashing buffer2( 50% Formamide, 2x SSC) 中で30分間、室温洗浄、さらにwashing buffer1( PBS, 0.05% Tween20) 中で再度10分間、室温洗浄した。さらに0.2xSSC、0.05x SSCで洗浄し、遠心乾燥させスキャニングするまでデシケータ中で遮光保存した。
【００４７】
（５）スキャニングおよびデータ解析
マイクロアレイのスキャニングにはGenePix4000B( Amersham Biosciences)を用いた。スキャニングには付属のソフトウェア設定のautomatic grid featureを使用し、必要な場合にはマニュアル補正を行った。測定したCy3およびCy5の蛍光量からバックグラウンドの蛍光量を引いたものを各スポットの蛍光強度とし、Cy3とCy5の蛍光強度比を算出した。データの標準化にはグローバル法を用いた。全スポットにおける蛍光強度比の平均値を算出し、その平均値で各スポットにおける蛍光強度比を割ったものを各スポットの平均蛍光強度比とした。
【００４８】
なお、コントロールとして、健常人のゲノムＤＮＡ同士で、上記マイクロアレイに対して競合的ハイブリダイゼーションを行った結果を表１に、扁平上皮癌細胞株と健常人のゲノムＤＮＡに対して行った結果を表２に示す。
【表１】
2005261366.tif 000002
【表２】
2005261366.tif 000003
【００４９】
表１では、平均蛍光強度比が０．９４〜１．１１の範囲に収まっているので、ここから大幅に外れた数値を取るＤＮＡ配列に、コピー数の増減が生じていると考えられる。こうして、表２より、扁平上皮癌細胞株では、c-raf1、FHIT、p53、BCL2のコピー数が減少し、EFGR、EMS1、INT2のコピー数が増加していることが明らかになった。
【００５０】
このように、本発明の包括的スクリーニング方法を用いれば、ゲノムＤＮＡ内の複数の異常を同時に検出することができる。
【配列表】
2005261366000001.app