(57)【要約】【課題】スポット後の各スポットの画像取得を容易にし、コントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を高精度で評価できるプローブ担体を製造する。【解決手段】標的物質と特異的に結合可能な複数種のプローブを含有するプローブ溶液を担体上の所定位置にスポッティングして、互いに独立した複数のスポットを有するプローブ担体を得るプローブ担体製造方法であって、プローブ溶液中に指示物質を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質と特異的に結合可能なプローブを液媒体中に含有する複数のプローブ溶液の各々を担体上の所定位置にスポッティングして、互いに独立した複数のスポットを有するプローブ担体を得るプローブ担体製造方法であって、
該プローブ溶液中に、前記スポット中に含まれた状態で光学的に検出可能な指示物質を更に含むことを特徴とするプローブ担体製造方法。
【請求項２】
前記スポッティングをインクジェット法により行なう請求項１に記載のプローブ担体製造方法。
【請求項３】
前記スポッティングをピン法により行なう請求項１に記載のプローブ担体製造方法。
【請求項４】
前記プローブが、核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖及びポリ糖からなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載のプローブ担体製造方法。
【請求項５】
前記指示物質が、染料、顔料、高分子物質、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のプローブ担体製造方法。
【請求項６】
標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上での各スポットのサイズ、形状及び位置の少なくとも一つの情報を特定するための方法であって、
各スポットに検出可能な指示物質を含有させておき、該指示物質を検出手段によって光学的に検出し、検出された光学的な情報に基づき各スポットにおける前記情報の特定を行なう
ことを特徴とする特定方法。
【請求項７】
標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上での各スポット中に含まれるプローブの識別方法であって、
各スポット毎に含まれるプローブを識別可能とするための光学的に検出可能な指示物質を、各スポットに含有させておき、該スポット中に含まれる指示物質を検出手段によって光学的に検出し、検出された光学情報に基づき該スポットに含まれるプローブの識別を行なう
ことを特徴とする識別方法。
【請求項８】
標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上の所定スポットのサイズ、形状及び位置の少なくとも一つの情報を特定するための装置であって、
光学的に検出可能な指示物質を含有するスポットを有するプローブ担体を支持するための支持手段と、
該スポット中に含有される指示物質を光学的に検出して、該スポットに関する情報の特定を行なうための光学的情報を取得する手段と、
を有することを特徴とするスポット情報特定用装置。
【請求項９】
標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上の所定のスポット中に含まれるプローブを識別するための装置であって、
各スポット毎に含まれるプローブを識別可能とするための光学的に検出可能な指示物質を、該プローブとともに含有するスポットを有するプローブ担体を支持するための支持手段と、
該スポット中に含有される指示物質を光学的に検出して該スポット中に含まれるプローブの識別のための情報を得る手段と、
を有することを特徴とするプローブ識別装置。
【請求項１０】
標的物質と特異的に結合可能なプローブと、染料、顔料、高分子、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種からなる光学的に検出可能な指示物質と、液媒体と、を含むことを特徴とするプローブ溶液。
【請求項１１】
担体と、該担体上に互いに独立して形成された複数のスポットとを有するプローブ担体であって、
該スポットが、標的物質と特異的に結合可能なプローブと、染料、顔料、高分子、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種からなる光学的に検出可能な指示物質とを含むことを特徴とするプローブ担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを有するプローブ担体の製造方法、プローブ担体中のスポットの配置確認、プローブアレイ、標的物質の検出方法、及びサンプル中の一本鎖核酸の塩基配列を特定する方法、さらにはサンプル中の標的物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列の決定やサンプル中の標的核酸の検出、各種細菌の同定を迅速かつ正確に行える技術のひとつとして、例えば、特定の塩基配列を有する標的核酸と特異的に結合する物質、いわゆるプローブを利用して固相上に複数種のプローブをアレイ状に配置したプローブアレイ基板とした上で、同時に複数種のプローブに対する特異的な結合能力を評価する方法が提案されている。プローブ担体とは、プローブアレイとも言い、ガラス基板やプラスチック基板、メンブランなどの上に数十から一千種類以上の異なる種類のＤＮＡ断片などからなるプローブをスポットとして高密度に整列固定させた物である。
【０００３】
近年、このようなプローブアレイを利用する標的物質の検出や定量に関する研究は精力的に行われてきている。例えば、特許文献１にはフォトリソグラフィーを用いた固相担体上でのＤＮＡ逐次伸長反応によるプローブアレイ作製方法が、特許文献２には、キャピラリーを用いてＤＮＡをメンブラン上へ供給するプローブアレイ作製方法が、特許文献３にはピエゾ・ジェット・ノズルを用いてＤＮＡ複数種を固相合成するプローブアレイ作製方法が、特許文献４にはインクジェットヘッドによりプローブを含む液体を液滴として固相に付着させるプローブアレイ作製方法が記載されている。
【０００４】
いずれの方法でも、各スポットのサイズと形状のばらつきを低く抑え、各スポット間の距離を一定に保ち、想定したスポット以外（ゴミや微小スポット）のものが無いことを保つことが重要である。
また、プローブアレイの更なる高密度化に向けて、各スポットのサイズと形状や位置（各スポットが指定した所に配置されていること）の制御は重要であり、生産性に優れたプローブアレイ作製方法の開発が望まれており、生産後には各スポットのサイズと形状や位置が規定通りの値を保っているのかを確認することは非常に重要であり、プローブアレイを販売するには、品質保証の観点からも解決しなければならないことである。
【０００５】
従来のプローブアレイ作製方法は、特許文献４の（００８７）実施例１〜（００９０）に記載してあるが、この方法では超音波洗浄及びアルカリ洗浄をしたガラス基板を、アミノ基を結合したシラン化合物を含むシランカップリング剤及びＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミドで表面処理を施した後、５’ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ３’の塩基配列を１本鎖ＤＮＡプローブとして有する透明な液体を、インクジェット法を用いて前記処理済のガラス基板にスポッティングし、ＤＮＡプローブアレイを作製していた。
【０００６】
プローブアレイ作製後、各スポットのサイズと形状や位置が規定通りの値を保っているのかの確認方法は、光学顕微鏡またはレーザー顕微鏡を用いてプローブアレイの各スポットの画像を取得し、画像解析ソフトを用いて各スポットの画像を解析して各スポットのサイズと形状や位置を評価していた。
【０００７】
一方、インクジェット用インクの色材としての染料として特許文献５には、銅フタロシアニン構造を有する色材Ｃ．Ｉ．ＡｃｉｄＢｌｕｅ  ２４９、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  ８６、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  １９９、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  ３０７が記載されている。その他の染料としては、水溶性のキサンテン系、モノアゾ系、ジスアゾ系、トリスアゾ系、テトラアゾ系等が挙げられる。
【特許文献１】米国特許第５，４２４，１８６５号明細書
【特許文献２】国際公開第９５／３５５０５号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第０７０３８２５号明細書
【特許文献４】特開平１１−１８７９００号公報
【特許文献５】特開２００２−６９３４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、特許文献４記載の方法であると、透明なガラス基板上に透明な液体をスポッティングしている為、画像を取得する際にうまくコントラストが取れないことがあった。また、溶液のスポッティングに長時間かかってしまうと、溶液が蒸発してしまうことで、各スポットのサイズと形状や位置を評価できないことがあった。
【０００９】
このように各スポットの画像が解析不可能であったり、プローブアレイ作製中またはプローブアレイ作製後のプローブ溶液が乾燥によりその位置関係が確認できなくなると、各スポットのサイズと形状や位置が規定通りの値を保っているのかを確認することが難しい場合があった。
【００１０】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、指示物質（染料や顔料、高分子や無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体など）を含有したプローブ溶液をスポットすることで、スポット後の各スポットの画像取得を容易にし、コントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来るようにすることを目的とする。
また、プローブ溶液が乾燥した後もスポットされた各スポットのサイズと形状や位置を容易に観察できることで品質保証が出来るようになる。
さらに、上記の評価にかかる時間が短縮でき、プローブ担体製造及び評価の歩留まりが向上する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明者は、プローブアレイなどの標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを有するプローブ担体において、プローブアレイ作製の際に用いるプローブ溶液中に染料や顔料、高分子や無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体などを含有させて、そのプローブ溶液を用いてスポッティングすることで、各スポットの画像取得を容易にしたり、プローブ溶液が乾燥した後もスポッティングされた各スポットのサイズと形状や位置を容易に観察できることを可能とした。
【００１２】
すなわち本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブを液媒体中に含有する複数のプローブ溶液の各々を担体上の所定位置にスポッティングして、互いに独立した複数のスポットを有するプローブ担体を得るプローブ担体製造方法であって、
該プローブ溶液中に、前記スポット中に含まれた状態で光学的に検出可能な指示物質を更に含むことを特徴とするプローブ担体製造方法に関する。
【００１３】
本発明は更に、前記スポッティングをインクジェット法により行なうことが好ましい。
本発明は更に、前記スポッティングをピン法により行なうことが好ましい。
本発明は更に、前記プローブが、核酸であることが好ましい。
【００１４】
本発明は更に、前記指示物質が、染料、顔料、高分子物質、無機粒子、無機化合粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種であることが好ましい。
【００１５】
本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上での各スポットのサイズ、形状及び位置の少なくとも一つの情報を特定するための方法であって、
各スポットに検出可能な指示物質を含有させておき、該指示物質を検出手段によって光学的に検出し、検出された光学的な情報に基づき各スポットにおける前記情報の特定を行なうことを特徴とする特定方法に関する。
【００１６】
本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上での各スポット中に含まれるプローブの識別方法であって、
各スポット毎に含まれるプローブを識別可能とするための光学的に検出可能な指示物質を、各スポットに含有させておき、該スポット中に含まれる指示物質を検出手段によって光学的に検出し、検出された光学情報に基づき該スポットに含まれるプローブの識別を行なう
ことを特徴とする識別方法に関する。
【００１７】
本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上の所定スポットのサイズ、形状及び位置の少なくとも一つの情報を特定するための装置であって、
光学的に検出可能な指示物質を含有するスポットを有するプローブ担体を支持するための支持手段と、
該スポット中に含有される指示物質を光学的に検出して、該スポットに関する情報の特定を行なうための光学的情報を取得する手段と、
を有することを特徴とするスポット情報特定用装置に関する。
【００１８】
本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブを含む複数のスポットを担体上に互いに独立して配置したプローブ担体上の所定のスポット中に含まれるプローブを識別するための装置であって、
各スポット毎に含まれるプローブを識別可能とするための光学的に検出可能な指示物質を、該プローブとともに含有するスポットを有するプローブ担体を支持するための支持手段と、
該スポット中に含有される指示物質を光学的に検出して該スポット中に含まれるプローブの識別のための情報を得る手段と、
を有することを特徴とするプローブ識別装置に関する。
【００１９】
本発明は、標的物質と特異的に結合可能なプローブと、染料、顔料、高分子、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種からなる光学的に検出可能な指示物質と、液媒体と、を含むことを特徴とするプローブ溶液に関する。
【００２０】
本発明は、担体と、該担体上に互いに独立して形成された複数のスポットとを有するプローブ担体であって、
該スポットが、標的物質と特異的に結合可能なプローブと、染料、顔料、高分子、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体からなる群から選択された少なくとも一種からなる光学的に検出可能な指示物質とを含むことを特徴とするプローブ担体に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、指示物質（染料や顔料、高分子、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体や無機−有機錯体など）を含有したプローブ溶液をスポットすることで、スポット後の各スポットの画像取得を容易にし、コントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来るようになる。
また、プローブ溶液が乾燥した後もスポットされた各スポットのサイズと形状や位置を容易に観察できることで品質保証が出来るようになる。
さらに、上記の評価にかかる時間が短縮でき、プローブ担体製造安定性が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
プローブ溶液中に含有させる指示物質は、担体上のスポット中にプローブとともに含有された際に光学的に検出可能な物質であり、スポットに関する情報やスポット内のプローブの識別を定量的に行う場合については、不揮発性であって光学的な検出を定量的に行うことが可能な物質が好ましい。ここで、不揮発性とはプローブ担体を得るために基材上にスポッティングしたプローブ溶液を蒸発、乾燥させた場合にプローブ溶液中の溶媒と共に蒸発，乾燥しない性質であることを示す。
【００２３】
具体的には、プローブ担体を形成する上での乾燥工程において気化、昇華しないものであれば良い。乾燥工程における温度としてはプローブ特性を維持する観点より１５０℃、更には１１０℃以下であることが好ましい。
【００２４】
指示物質には、染料や顔料、高分子物質や無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体や無機−有機錯体などが挙げられ、指示物質を含有させたプローブ溶液で作製したプローブアレイは、蛍光標識された標的物質と反応させられ（ハイブリダイゼーション反応という）、その後に蛍光観察にて蛍光標識の蛍光強度を検出することから、標的物質とプローブの結合反応や標的物質が有する蛍光標識の検出を阻害してはならず、かつ目視や顕微鏡観察時に容易にスポット後の各スポットの存在が確認できたり、スポット後の各スポット画像取得の際にコントラストがとり易くなる濃度でプローブ溶液に含有されることを特徴とする。
【００２５】
例えば、染料は、特許文献５にあるように銅フタロシアニン構造を有する色材Ｃ．Ｉ．ＡｃｉｄＢｌｕｅ  ２４９、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  ８６、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  １９９、Ｃ．Ｉ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ  ３０７が挙げられ、他には水溶性のキサンテン系、モノアゾ系、ジスアゾ系、トリスアゾ系、テトラアゾ系等が挙げられる。プローブ溶液中の染料濃度は０．００５〜５質量％であることが好ましく、０．００５〜０．５質量％であることがより好ましい。
【００２６】
また、顔料では、カーボンブラックなどで例えば、Ｎｏ．２３００、Ｎｏ．９００、ＭＣＦ８８、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．５２、ＭＡ７、ＭＡ８、Ｎｏ．２２００Ｂ（以上、三菱化成製）、ＲＡＶＥＮ１２５５（コロンビア製）、ＲＥＧＡＬ４００Ｒ、ＲＥＧＡＬ６６０Ｒ、ＭＯＧＵＬＬ（以上、キャボット製）、Ｃｏｌｏｒ  Ｂｌａｃｋ  ＦＷ１、  Ｃｏｌｏｒ  Ｂｌａｃｋ  ＦＷ１８、Ｃｏｌｏｒ  Ｂｌａｃｋ  Ｓ１７０、Ｃｏｌｏｒ  Ｂｌａｃｋ  １５０、Ｐｒｉｎｔｅｘ  ３５、Ｐｒｉｎｔｅｘ  Ｕ（以上、デグッサ製）、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １３、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １６、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ８３等が挙げられる。
プローブ溶液中の顔料の濃度は０．０１〜１０質量％であることが好ましく、０．０１〜１質量％であることがより好ましい。
【００２７】
例えば、高分子では、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、パオゲン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、デキストラン、プルランなどが挙げられる。これらの中で、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は汎用的な材料でありプローブに対しても安定であることから好ましい。
【００２８】
プローブ溶液中の高分子濃度は０．００１〜０．５質量％であることが好ましく、０．０１〜０．２質量％であることがより好ましい。
高分子物質はプローブ溶液中への混合およびスポッティングする観点より、プローブ溶液溶媒中に溶解もしくは安定に分散するものが好ましい。溶解するものとしてはプローブ溶液溶媒が水である場合は水溶性高分子であり、プローブ溶液溶媒が有機溶媒である場合には有機溶媒中に安定溶解するものであれば特に制約されるものではない。水溶性高分子である場合、水への溶解性を考慮し低い重合度を有し５００〜６００程度が好ましい。また、低いけん化度を有し８７〜８９であるものが好ましい。また、有機溶媒中に溶解させる場合については、溶媒種に応じて変更することが可能である。プローブ溶液中に安定に分散するものとしては、ポリマービーズ、高分子ミセルなどが上げられるが、分散安定性、スポッティングでの容易性及び検出の容易性などの観点から高分子物質のサイズは小さいものが好ましく、具体的には、平均粒子径が３μｍ以下であり、さらに平均粒子径が１μｍ以下であるポリマービーズなどが好ましく、また、平均粒子径が１０ｎｍ以上の高分子ミセルなどが好ましい。
【００２９】
高分子物質の検出方法としては、金属顕微鏡を用いての検出方法、エリプソメーターによる検出方法などが挙げられる。具体的な分析方法としては高分子物質の種類に応じて変更することが好ましい。溶媒中に高分子材料を溶解させた場合、溶解量が十分である場合については金属顕微鏡を用いての微分干渉測定、反射光測定、透過光測定が可能であるが、添加量が微量である場合、測定が困難であるためエリプソメーターによる測定であることが好ましい。エリプソメーターによる測定方法ではプローブの識別が困難であるが、スポットサイズ、形状、位置の情報を特定することが好適である。また、高分子物質がプローブ中に分散するポリマービーズなどである場合、金属顕微鏡による検出が適当である。具体的には、微分干渉測定、反射光測定、透過光測定を用いて測定することによりスポットサイズ、形状、位置の情報を特定することができる。また、高分子物質が高分子ミセルなどである場合、金属顕微鏡による検出が適当である。具体的には高分子ミセルの乾燥後の状態により変化するが、波長２００〜４００ｎｍの透過光測定を用いて測定することにより、スポットサイズ、形状、位置の情報を特定することが可能である。
【００３０】
また、指示物質としては無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体には様々な物が挙げられるが、例えば、プローブ溶液をインクジェットで吐出する場合には、吐出可能な大きさであり、さらに吐出に悪影響を与えないことが望まれる。
プローブ溶液中の無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体の濃度は０．０１〜５質量％であることが好ましく、０．１〜２質量％であることがより好ましい。
無機粒子の例としては金属粒子があげられ、該金属としては、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｃｒ，Ａｌ，Ｔａ，Ｐｔ，Ｐｔ，Ｐｄ，Ｚｎ，Ｓｎ等を例としてあげることができる。また、無機化合物粒子の例としてはＴｉＯ2、Ａｌ2Ｏ3、ＺｒＯ等の金属酸化物粒子をあげることができる。
【００３１】
また、無機錯体、無機−有機錯体としてはそれぞれ金属錯体、有機金属錯体を例としてあげることができ、これらの金属錯体に用いられる金属の例としてはＡｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｎｉ，Ｃｏ，Ｃｒ，Ａｌ，Ｔａ，Ｐｔ，Ｐｄ，Ｚｎ，Ｓｎ等を例としてあげることができる。
【００３２】
無機化合物粒子の平均粒子径はプローブ溶液安定性、スポッティング安定性などの観点から１ｎｍ以上１００ｎｍ以下が好適である。これらの無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体の検出方法としては金属顕微鏡による検出が適当である。無機錯体及び無機−有機錯体である場合、錯体種類による特異的な吸収もしくは反射光特性を有することから反射光測定、透過光測定を実施することによりスポットサイズ、形状、位置の情報を特定することができる。また、無機粒子、無機化合物粒子である場合、粒子による光散乱特性を用いて反射光測定を実施することによりスポットサイズ、形状、位置の情報を特定することができる。このようにしてスポットのスポットサイズ、形状、位置およびプローブの識別を行うことが可能となる。
【００３３】
また、プローブ溶液中における指示物質とプローブの使用比は質量基準で２０００：１〜２０：１が好ましい。
例えば、ピン法の場合であると、吐出しないため、使用できる無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体の大きさの制限は小さくなる。また、無機粒子、無機化合物粒子、無機錯体及び無機−有機錯体には様々な物が挙げられるが、吐出可能な大きさであり、さらに良好な吐出特性を有する必要がある。
【００３４】
以上の指示物質を単体でプローブ溶液に含有させて使用しても良いし、何種類かの指示物質を混合してプローブ溶液に使用しても良い。
また、本発明における指示物質は、必ずしも基板表面に吸着または固定されている必要はない。標的物質とのハイブリダイゼーション反応を行なう際には、基板上に存在していなくても良い。
【００３５】
ハイブリダイゼーション時に指示物質が基板上に存在する場合には、実質的にハイブリダイゼーションに影響を及ぼさない範囲で指示物質を含有させることがより好ましいが、指示物質を洗浄などで除去する工程をハイブリダイゼーション反応させる工程の前に設けても良い。
【００３６】
また、プローブとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、酵素に対する基質、抗体、抗体に対するエピトープ、抗原、ホルモン、ホルモンレセプター、リガンド、リガンドレセプター、オリゴ糖及びポリ糖からなる群から選択された少なくとも一種を用いることが好ましい。
【００３７】
プローブ溶液としては例えば、グリセリン７．５質量％、尿素７．５質量％、チオジグリコール７．５質量％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１質量％を含む水溶液を用意し、一本鎖ＤＮＡであるＨＳ−（ＣＨ2）6−Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−を含む溶液（一本鎖ＤＮＡ濃度が約４００ｍｇ／ｍｌであるＴＥ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液））に加え、一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整したものが挙げられる。このプローブ溶液の表面張力は３０〜５０ｄｙｎｅ／ｃｍの範囲内であり、また粘度は１．８ｃｐｓ（Ｅ型粘度計：東京計器（株）社製）である。
【００３８】
これらのプローブ溶液をプローブ担体上へスポッティングする方法は、ピン法、インクジェット法などが挙げられるが、これらの形式に限定されるわけではなく、プローブ溶液をプローブ担体上へスポットすることが可能である方法であれば種類は問わない。なお、インクジェット法の場合は、吐出口から溶液を吐出させるための吐出エネルギーとして熱エネルギーを用い、溶液中に気泡を発生させてその際の発泡圧力を利用する、いわゆるバブルジェット方式及びピエゾ方式による液体吐出装置のいずれも用いることができる。
【００３９】
スポット径は、スポットが占める面積と等価な面積の円とした場合の等価円直径として表すことができ、該直径が１〜５００μｍであるとよく、さらに１μｍ〜２００μｍであることが好ましい。
【００４０】
プローブ中に含まれる指示物質は目視、カメラ、光学顕微鏡及びレーザー顕微鏡等の検出手段を用いて検出情報として光学的に検出することができる。この検出情報を例えば、画像解析を行なうことにより、スポットの評価（各スポットのサイズ、形状及び位置の評価）やスポット中のプローブの識別（どのスポットにどのようなプローブが含まれているかの判別）が可能となる。好ましくは、各スポット中に含まれる指示物質の種類と量を異なるものとしておくのが良い。指示物質の種類及び／または量がスポットごとに異なることによって、スポットの特定やプローブの識別がより容易となる。指示物質はプローブ溶液が乾燥されても揮発しないため、スポットの特定やプローブの識別はスポッティング直後及び乾燥後のいずれの時期に行なっても良い。
【００４１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
図１には、プローブ担体の作製からプローブ担体上にスポットされたスポットの評価（各スポットのサイズ、形状及び位置の評価）やスポット中のプローブの識別（どのスポットにどのようなプローブが含まれているかの判別）に関しての簡単なフローを示した。
また図２には、図１のフロー（４）及び（５）を可能にする装置の構成の例を示した。
以下に図面の説明をする。
【００４２】
図１では、（１）で担体を準備し、（２）で指示物質を含んだプローブ溶液を調整し、（３）でプローブ溶液を担体表面にスポッティングする。スポッティング後の担体を（４）で光学的な検出系にてスポットされたスポット情報（画像など）を取得する。その画像を元に（５）で画像解析を行い、スポットの評価（各スポットのサイズ、形状及び位置の評価）やスポット中のプローブの識別を行う。ここでスポットサイズとは、担体表面上での各スポットのスポット面積を意味する。
【００４３】
図２では、ｃのステージ上にスポッティング後の担体を複数枚並べ、ａの光学的な検出系にて各スポットの画像を取得する。このとき、ａとｃはｄの駆動制御部により、互いに独立して駆動することが可能であり、取得されたスポット画像はｅの画像取得部に保存されていく。取得された画像はｆの画像解析部により、スポット面積、スポット形状（真円度）、スポット位置が解析され、その結果がｇのスポット情報特定部に保存される。また解析の際のスポット画像のコントラスト比や色抽出結果なども結果として保存される。
【００４４】
ｈのプローブ識別部には、各プローブ溶液毎に異なる指示物質を加えた場合には、その情報（スポット画像として解析したときのコントラスト比や色抽出結果などの予想値）をあらかじめ登録しておき、ｇに保存された結果と比較することで、各スポット中に含まれるプローブ種の識別が可能となる。
以下に、本発明をより詳細に説明する。かかる実施例はここに例示するものに限られるものではない。
【実施例】
【００４５】
実験例１
青色染料を含有したプローブ溶液にて作製したプローブアレイを用いた標的物質の検出の実施
（１）あらかじめ、特許文献４の（００８７）実施例１〜（００８９）に記載してある方法と同様な方法で、表面処理を施したガラス基板と５’ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ３’の塩基配列の一本鎖ＤＮＡを用意した。
（２）特許文献４の（００９０）に記載されている水溶液に、キヤノン（株）社製シアンインク（商品名：ＢＣＩ−５Ｃ）が水溶液中で０．０１％、０．１％、１％、１０％の濃度になるように４種類調整し、その中へ（１）の一本鎖ＤＮＡを溶解させてプローブ溶液を作製した。
【００４６】
（１）、（２）のプローブ溶液をキヤノン（株）社製バブルジェットヘッド（商品名：ＢＴＪ８５０用ヘッド）で吐出できるように充填し、（１）で用意したガラス基板上に各スポット間隔が約１３０μｍで１２行１２列からなる１４４個のスポットマトリックスを１６マトリックス形成した。１６マトリックス中、各濃度の水溶液のマトリックスは、３マトリックスずつ形成し、残りの４マトリックスはシアンインク濃度が０％の水溶液を用いて形成した。
【００４７】
（１）スポッティング後、スポットに関する情報を得るための光学情報の取得手段としてのＣＣＤカラーカメラにて画像を取得したところ、４種類ともに従来よりもコントラストが良い画像が取得でき、画像解析より各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来た。
【００４８】
スポットサイズの評価は、画像解析ソフトから取得したスポット面積の値を用いて以下の様に評価した。各濃度の水溶液が形成したマトリックス毎にスポット面積の平均値を求め、バラツキ（３σ値）を求めた。各濃度の水溶液が形成したマトリックス毎に、バラツキ／平均値の値を計算したところ、表１のような結果となった。評価の閾値は、０．２５以下である。
【００４９】
【表１】
2005091145.tif 000003
【００５０】
表１において０％とは、シアンインクを全く含有していないものである。表１の結果より、全溶液共に評価の閾値以下であり、良好なスポットが形成されていることが確認でき、容易に評価を行うことができた。
【００５１】
スポット形状の評価は、画像解析ソフトから取得した半径比を用いて以下の様に評価をした。各濃度の水溶液が形成したマトリックス毎にスポットの半径比の平均値を求め、バラツキ（３σ値）を求めた。各濃度の水溶液が形成したマトリックス毎に、バラツキ／平均値の値を計算したところ、表２のような結果となった。評価の閾値は、０．２５以下である。
【００５２】
【表２】
2005091145.tif 000004
【００５３】
表２において０％とは、シアンインクを全く含有していないものである。表２の結果より、全溶液共に評価の閾値以下であり、良好なスポットが形成されていることが確認でき、容易に評価を行うことができた。
【００５４】
スポット位置の評価は、画像解析ソフトから取得した各スポットの重心ＸＹ座標を用いて以下の様に評価を行った。各濃度の水溶液が形成したマトリックス毎に各スポットの重心ＸＹ座標（Ｘ，Ｙ）を取得し、その座標に最小二乗法を用いてθ補正をかけて座標変換を行う。変換後の座標を（ＸN、ＹN）とする。座標変換後に各マトリックスの重心ＸＹ座標（Ｘg、Ｙg）を求め、そこから理想格子座標（Ｘr、Ｙr）を作成する。この理想格子座標（Ｘr、Ｙr）と、座標変換後の実座標（ＸN、ＹN）の差をとる事で、スポット時の理想格子座標からのズレ量を知ることができる。１マトリックスから１４４個のスポットのズレ量が分かる。各水溶液のスポットのズレ量を、Ｘ方向のズレとＹ方向のズレで表し、各水溶液が作成した全スポットのズレ量を平均して評価したところ、表３の様になった。
また、表３内の記号は、表４のズレ量と記号の関係を当てはめて記入した。評価の閾値は、１３．０μｍ未満である。
【００５５】
【表３】
2005091145.tif 000005
【００５６】
【表４】
2005091145.tif 000006
【００５７】
表３において０％とは、シアンインクを全く含有していないものである。表３の結果より、全水溶液共に閾値以下であり、良好なスポット位置が形成されていることが確認でき、容易に評価を行うことができた。
また、スポット後の基板を乾燥させてプローブ溶液が乾燥した後にＣＣＤカラーカメラにて観察した所、各スポットのスポット位置を容易に確認することができ、表３と同様に全水溶液共に閾値以下であった。
【００５８】
（２）シアンインクのハイブリダイゼーション反応における影響を調べるために、以下の実験を行なった。スポッティング後の基板を１Ｍ  ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）のＢｕｆｆｅｒ溶液中に保管したものと、スポット後の基板を乾燥させたものの両方をそれぞれ３サンプル用意し、２％牛血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行った後、（１）の一本鎖ＤＮＡと相補的な１本鎖ＤＮＡ（５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）を標的物質として、標的物質を含む水溶液中で４５℃で２時間ハイブリダイゼーション反応を行い、その後基板をＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（商品名：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、蛍光観察を行った。Ｂｕｆｆｅｒ溶液中に保管したものの結果は、表１のようになり、乾燥させたものの結果は表２のようになった。各表中の平均値と３σ値の数値は、プローブ溶液中のシアンインク濃度０％の値を１として表記した。各表中の３σ値／平均値は、実測値での計算結果を示した。
【００５９】
【表５】
2005091145.tif 000007
【００６０】
表５において０％とは、シアンインクを全く含有していないものである。表５の結果より、プローブ溶液中のシアンインクの濃度が０．０１％〜０．１％までは、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応をほとんど阻害せず、蛍光観察時に十分な蛍光強度を発することが確認できた。また、１％の濃度においては、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応を多少阻害しているが、バックグラウンドよりもはるかに高い蛍光強度を発することが確認できた。
【００６１】
【表６】
2005091145.tif 000008
【００６２】
表６において０％とは、シアンインクを全く含有していないものである。表６の結果より、プローブ溶液中のシアンインクの濃度が０．０１％〜０．１％までは、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応をほとんど阻害せず、蛍光観察時に十分な蛍光強度を発することが確認できた。また、１％の濃度においては、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応を多少阻害しているが、バックグラウンドよりもはるかに高い蛍光強度を発することが確認できた。
【００６３】
（１）以上の事から、プローブ溶液をスポットすることで、スポット後の各スポットの画像取得を容易にし、コントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来た。またプローブ溶液が乾燥した後も描画された各スポットの位置を容易に観察できた。
【００６４】
実験例２
黒色染料を含有したプローブ溶液にて作製したプローブアレイを用いた標的物質の検出の実施
（１）あらかじめ、特許文献４の（００８７）実施例１〜（００８９）に記載してある方法と同様な方法で、表面処理を施したガラス基板と５’ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ３’の塩基配列の一本鎖ＤＮＡを用意した。
（２）特許文献４の（００９０）に記載されている水溶液に、キヤノン（株）社製ブラックインク（商品名：ＢＣＩ−５ＢＫ）が水溶液中で０．０１％、０．１％、１％、１０％の濃度になるように４種類調整し、その中へ（１）の一本鎖ＤＮＡを溶解させてプローブ溶液を作製した。
【００６５】
（１）、（２）のプローブ溶液をキヤノン（株）社製バブルジェットヘッド（商品名：ＢＴＪ８５０用ヘッド）で吐出できるように充填し、（１）で用意したガラス基板上に各スポット間隔が１３０μｍで１２行１２列からなる１４４個のスポットマトリックスを１６マトリックス形成した。
【００６６】
（１）スポット後スポットに関する情報を得るための光学情報の取得手段としてのＣＣＤカラーカメラにて画像を取得したところ、４種類ともに従来よりもコントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来た。また、スポット後の基板を乾燥させてプローブ溶液が乾燥した後にＣＣＤカラーカメラにて観察した所、各スポットのスポット位置を容易に確認することができ、位置を評価することができた。スポット後及びスポット後のプローブ溶液が乾燥した後も、実施例１と同様に、全水溶液共にスポットサイズと形状や位置は閾値内であり、、容易に評価を行うことができた。
【００６７】
（２）スポット後の基板を実験例１と同様のＢｕｆｆｅｒ溶液中に保管したものと、スポット後の基板を乾燥させたものの両方をそれぞれ３サンプル用意し、２％牛血清アルブミン水溶液中に浸して２時間放置し、ブロッキング反応を行った後、（１）の一本鎖ＤＮＡと相補的な１本鎖ＤＮＡ（５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’）を標的物質として、標的物質を含む水溶液中において４５℃で２時間ハイブリダイゼーション反応を行い、その後基板をＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（商品名：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ；Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、蛍光観察を行った。Ｂｕｆｆｅｒ溶液中に保管したものの結果は、表３のようになり、乾燥させたものの結果は表４のようになった。各表中の平均値と３σ値の数値は、プローブ溶液中のブラックインク濃度０％の値を１として表記した。各表中の３σ値／平均値は、実測値での計算結果を示した。
【００６８】
【表７】
2005091145.tif 000009
【００６９】
表７において０％とは、ブラックインクを全く含有していないものである。表７の結果より、プローブ溶液中のブラックインクの濃度が０．０１％〜１％までは、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応をほとんど阻害せず、蛍光観察時に十分な蛍光強度を発することが確認できた。また、１％の濃度においては、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応を阻害していないことが分かり、バックグラウンドよりもはるかに高い蛍光強度を発することが確認できた。
【００７０】
【表８】
2005091145.tif 000010
【００７１】
表８において０％とは、ブラックインクを全く含有していないものである。表８の結果より、プローブ溶液中のブラックインクの濃度が０．０１％〜０．１％までは、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応をほとんど阻害せず、蛍光観察時に十分な蛍光強度を発することが確認できた。また、１％の濃度においては、標的物質と特異的に結合可能なプローブと標的物質との結合反応を多少阻害しているが、バックグラウンドよりもはるかに高い蛍光強度を発することが確認できた。
【００７２】
（１）以上の事から、プローブ溶液をスポットすることで、スポット後の各スポットの画像取得を容易にし、コントラストが良い画像が取得でき、画像解析において各スポットのサイズと形状や位置を評価することが出来た。またプローブ溶液が乾燥した後も描画された各スポットの位置を容易に観察できた。
【００７３】
以上の各実施例においては、各プローブにおける指示物質は同一のものを用いているが、プローブ溶液毎に異なる指示物質を用いても良い。この場合、例えば吸収波長の異なる複数の指示物質を用いることにより、色の違いによってプローブ溶液を特定することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、スポットの評価やプローブの識別プロセスを表すフロー図である。
【図２】図２は、スポットの評価やプローブの識別を行う装置の構成を表す図である。
【符号の説明】
【００７５】
ａ  光学的な検出系
ｂ  スポッティング後の担体
ｃ  スポッティング後の担体を並べるステージ
【図１】
2005091145.tif 000011
【図２】
2005091145.tif 000012