(57)【要約】【課題】植物の発熱反応に関連するタンパク質を利用して、より有効な恒温性発現システムを提供する。【解決手段】動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法であって、外来性シアン耐性呼吸酵素および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現させる。【選択図】      図１
2005027513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法であって、外来性シアン耐性呼吸酵素および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現させることを特徴とする方法。
【請求項２】
外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆ−ＡＯＸである請求項１の方法。
【請求項３】
外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来シアン耐性呼吸酵素Ｈｍ−ＡＯＸである請求項１の方法。
【請求項４】
外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質が、ザゼンソウ由来脱共役タンパク質ＳｆＵＣＰＢである請求項１の方法。
【請求項５】
シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドおよび５回膜貫通型脱共役タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを保有し、シアン耐性呼吸酵素および５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現する発現ベクター。
【請求項６】
シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである請求項５の発現ベクター。
【請求項７】
シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである請求項５の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかの方法によって恒温性を獲得した動植物個体または動植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、動植物細胞または動植物個体に恒温性を発現させる方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、恒温性機能発現による低温回避植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満の治療に関する医学分野、植物由来の温度制御素材開発等を含む工学分野、環境浄化微生物開発のための遺伝子工学分野において有用な恒温性の発現方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
一般に植物は発熱あるいは恒温維持能力がなく、その体温は気温の変化とともに変動するものと考えられているが、ある種の植物には自ら発熱し、その体温を外気温より高い温度に保つことができるものがある。特に、我が国に自生し、早春に開花するザゼンソウは、氷点下を含む外気温の変動にもかかわらず、その肉穂花序の温度を２５℃程度に維持できることが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。このようなザゼンソウに見られる体温維持現象は、植物における恒温性維持メカニズムの存在を明示しており、近年、ザゼンソウを模倣した発熱制御デバイスの開発への期待が高まっている。従来、発熱能力を持たない作物においては、低温障害あるいは凍結障害がその生産性を制限する最も重要な因子であるとされており（非特許文献３）、熱産生および恒温性発現に関わる遺伝子を用いた、“恒温性維持能力を有する低温回避作物の開発”は、農業分野における食糧問題に対する多大な貢献が予想される。
【０００３】
このような発熱植物の恒温性の維持メカニズムについては、恒温植物自体が極めて例外的な存在であるため、関連する遺伝子等に関わる研究は多くはない。これまで報告されている植物界における恒温植物は、ザゼンソウとハスの２つの植物種のみであり（非特許文献１、非特許文献４）、解析が進んでいる発熱関連遺伝子も限定されている。一方、ザゼンソウの恒温性に関わる生理学的研究からは、そのメカニズムには、発熱部位である肉穂花序における呼吸が重要であるとされてきた（非特許文献１）。ザゼンソウの肉穂花序における呼吸量は、外気温の変動と逆相関の関係にあることから、発熱細胞内のミトコンドリアにおける呼吸活性の調節がその体温維持に密接に関連するものと推定されている（非特許化文献１）。
【０００４】
このような呼吸活性の調節に関わる因子としては、哺乳動物における非ふるえ熱産生の主たる原因因子である脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ＵＣＰ）の重要性が指摘されている（非特許文献５）。ＵＣＰはミトコンドリア内膜内外に生じたＨ＋をＡＴＰ合成と共役することなく、マトリックス内に流入させる機能を有する。哺乳動物におけては、少なくとも５種類のＵＣＰ（ＵＣＰ１〜ＵＣＰ４およびＢＭＣＰ１）の存在が報告されているが（非特許文献６）、この出願の発明者はザゼンソウが少なくとも２種類のＵＣＰ関連タンパク質（ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ）を持つことを明らかにし、それれらを特許出願している（特許文献１）。ザゼンソウが持つ２つのＵＣＰ因子のうちの１種であるＳｆＵＣＰｂは、植物および哺乳動物において従来知られているいずれのＵＣＰとも異なるトポロジーを有している（図１、非特許文献５）。一方、ＳｆＵＣＰａと命名した哺乳動物および非発熱植物に広く分布する６回膜貫通型タイプのＵＣＰ因子の発現は極めて微少であり、かつ、その発現分布にも明確な組織特異性が観察されないことから（図３）、その熱産生への寄与は小さいことが推定されている。一方、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅと呼ばれる発熱植物からもザゼンソウのＳｆＵＣＰａに相当する因子（ＨｍＵＣＰａ）が同定されているが（特許文献３）、その転写産物は、発熱組織において特異的な発現が認められないことから（非特許文献７）、植物においては、哺乳動物で重要な働きを有している６回膜貫通型ＵＣＰ因子は直接あるいは単独でその熱産生あるいは恒温性の維持に関与している可能性は低い。
【０００５】
一方、ミトコンドリアで機能する熱産生因子として、脱共役タンパク質以外に、代替酸化酵素（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｓｅ：  ＡＯＸ）の関与も示唆されている（非特許文献８）。ＡＯＸは、ミトコンドリアにおいてユビキノンから供与された電子用いて酸素を還元することにより呼吸活性を上昇させる機能を持つ因子である（非特許文献９）。ＡＯＸによる酸化反応は、シアンなどのチトクロームｃ酸化経路の阻害剤に耐性をもつことから、シアン耐性呼吸酵素とも呼称されている。このＡＯＸは、ヨーロッパに自生するＶｏｏｄｏｏ  ｌｉｌｙと呼ばれる発熱植物において顕著にその活性が増大することが報告されており、植物の主たる発熱因子であると考えられていた（非特許文献１０）。一方、恒温動物においてはＡＯＸに相当する因子の存在は確認されておらず、ＡＯＸは植物独自の発熱関連因子であるとされている。しかしながらこれまでの研究により、非発熱植物であるタバコやシロイヌナズナにおいてもＡＯＸタンパク質が存在していることが示され、さらに、タバコＡＯＸタンパク質を過剰発現させるタバコが作成されているが、この形質転換タバコにおける発熱現象は確認できなかった旨の報告がなされている（非特許文献８）。なお、この出願の発明者は、ザゼンソウ由来のＡＯＸタンパク質とその遺伝子を同定し、特許出願している（特願２００３−０３８８７４号）。また発明者は、Ｄｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来のＡＯＸタンパク質とその遺伝子を同定し、特許出願している（特願２００３−９５７９９号）。
【０００６】
このように、それぞれの作用機構が異なるＵＣＰおよびＡＯＸについては、それぞれ、恒温動物および発熱植物における発熱因子として個別に位置づけられており、両者を同一の恒温植物種で詳細に解析した事例はこれまで存在していなかった。
【０００７】
さらに、哺乳動物の恒温性の維持には、神経系を介したアドレナリンを含む各種ホルモンの作用が密接に関与していることが知られているが、神経系を有さない植物における恒温性のメカニズムには、植物独自の制御システムが存在するものと考えられていた。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４４８９号公報
【非特許文献１】
Ｋｎｕｔｓｏｎ  （１９７４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８６−１８７．
【非特許文献２】
Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｐｌａｎｔ，  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，  ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献３】
Ｌｅｖｉｔｔ  （１９８０）  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ．  ２ｎｄ  ｅｎｄ
【非特許文献４】
Ｓｅｙｍｏｕｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚｅ−Ｍｏｔｅｌ  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ２８３，  ３０５．
【非特許文献５】
Ｉｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １４２，  ５７−６５．
【非特許文献６】
Ｂｏｕｉｌｌａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １５０４，  １０７−１１９．
【非特許文献７】
Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．  ５４，  １１１３−１１１４．
【非特許文献８】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ＆  ＭｃＩｎｔｏｓｈ  （１９９７）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ７０３−７３４．
【非特許文献９】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０５，  ７８１−７８６．
【非特許文献１０】
Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０６，  １５０３−１５１０．
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
植物の発熱反応を利用した恒温性維持に関わるシステムは、低温環境下においても、目的とする個体組織あるいは器官の温度を発熱により一定に保温することを可能とする技術である。これは、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた低温回避作物の開発などに極めて有用な手段を提供する。この出願の発明者が既に発明したザゼンソウ由来の脱共役タンパク質ＳｆＵＣＰａおよびＳｆＵＣＰｂ（特許文献１）、ザゼンソウ由来のＳｆ−ＡＯＸ（特願２００３−０３８８７４号）さらに、新規発熱植物であるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来のＨｍ−ＡＯＸ（特願２００３−９５７９９号）は、恒温性発現システムを構築するための有力な材料である。
【００１０】
この出願の発明は、この出願の発明者による前記の先願発明をさらに発展させ、より有効な恒温性発現システムを提供することを課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するためのものとして、以下の（１）〜（８）の発明を提供する。
（１）    動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法であって、外来性シアン耐性呼吸酵素および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現させることを特徴とする方法。
（２）    外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を有するザゼンソウ由来シアン耐性呼吸酵素Ｓｆ−ＡＯＸである前記発明（１）の方法。
（３）    外来性シアン耐性呼吸酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を有するＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来シアン耐性呼吸酵素Ｈｍ−ＡＯＸである前記発明（１）の方法。
（４）    外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質が、ザゼンソウ由来脱共役タンパク質ＳｆＵＣＰｂである前記発明（１）の方法。
（５）    シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドおよび５回膜貫通型脱共役タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを保有し、シアン耐性呼吸酵素および５回膜貫通型脱共役タンパク質を共発現する発現ベクター。
（６）    シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである前記発明（５）の発現ベクター。
（７）    シアン耐性呼吸酵素をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３の塩基配列またはその一部連続配列からなるポリヌクレオチドである前記発明（５）の発現ベクター。
（８）    前記発明（１）から（４）のいずれかの方法によって恒温性を獲得した動植物個体または動植物細胞。
【００１２】
すなわち、この出願の発明者は、発熱中のザゼンソウ個体から、葉、仏炎苞、肉穂花序、および、根を採取し、それぞれの全ＲＮＡを調製し、ＳｆＡＯＸならびにＳｆＵＣＰｂ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして公知の方法によりｍＲＮＡの発現量をノーザン解析した結果、図３に示したおり、ザゼンソウの発熱部位である肉穂花序における両遺伝子の発現が最も高いことを明らかにした。そしてこの結果から、ザゼンソウの肉穂花序における恒温発熱特性においては、二種類の作用機作の異なる因子であるＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂの共発現が重要であることを見出し、前記の発明を完成させた。
【００１３】
なお、前記発明において、恒温性の発現対象である「動植物個体または動植物細胞」とは、例えば、恒温性を持たない動植物個体やその細胞、あるいは低温環境下でその機能を低下させる動植物個体等である。また、低温保存によってその機能を低下される動植物培養細胞や、組織および器官等も含まれる。「外来性」とは、前記の動植物個体やその細胞には内在しないことを意味する。例えば、ザゼンソウ由来の脱共役タンパク質（ＵＣＰｂ）を用いる場合は、ザゼンソウ以外の動植物個体や細胞が対象となる。
【００１４】
また、この発明において、「酵素」、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジン糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個結合した分子を言う。
【００１６】
また、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ，  １９９５等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、外来性のシアン耐性呼吸酵素（ＡＯＸ）および外来性５回膜貫通型脱共役タンパク質（ＵＣＰｂ）を共発現させることによって、動植物個体または動植物細胞に恒温性を発現させる方法である。
【００１８】
ＵＣＰｂは特許文献１の配列番号３に示されているＳｆＵＣＰｂ、ＡＯＸとしては配列番号２のアミノ酸配列からなるザゼンソウ由来Ｓｆ−ＡＯＸまたは配列番号４のアミノ酸配列からなるＤｅａｄ  Ｈｏｒｓｅ由来Ｈｍ−ＡＯＸを使用することができる。
【００１９】
具体的な方法は、例えば、前記のＵＣＰｂをコードするポリヌクレオチド（特許文献１の配列番号１）と、Ｓｆ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）またはＨｍ−ＡＯＸをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を動植物個体または動植物細胞に導入し、両者を共発現させる。また、配列番号１および３のポリヌクレオチドは、その一部連続配列であってもよい。すなわち、それぞれのタンパク質コード領域を構成する配列（配列番号１の１０３−１１５２  ｎｔ、配列番号３の１３４−１１７１  ｎｔ）である。またＳｆ−ＡＯＸおよびＨｍ−ＡＯＸは、ミトコンドリア移行シグナルペプチドとミトコンドリア内膜に移行してシアン耐性呼吸酵素として機能する成熟タンパク質領域からなっている。従って、この発明の方法では、ＡＯＸの成熟タンパク質領域のみを発現させるようにしてもよい。その場合のポリヌクレオチドは、Ｓｆ−ＡＯＸの場合は配列番号１の１６６−１５２２  ｎｔ、Ｈｍ−ＡＯＸの場合は、配列番号３の３１７−１１６８  ｎｔである。
【００２０】
動植物細胞にポリヌクレオチドを導入する場合には、動植物種に応じたプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターにポリヌクレオチドを挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いて細胞に導入すればよい。
【００２１】
また、動物個体にポリヌクレオチドを導入する場合には、例えば、前記の発現ベクターを、生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等に組み込み、動物個体内に導入する方法を採用することもできる。また、非ヒト動物個体の場合には、公知のトランスジェニック動物作成法（例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｌ．  ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，  １９８０）に従って、動物個体の全ての体細胞においてＵＣＰｂおよびＡＯＸを共発現させるようにしてもよい。
【００２２】
さらに、植物個体にポリヌクレオチドを導入する場合には、植物の種類等に応じて、公知の方法を適宜に採用して行うことができる。すなわち、リーフディスク共存培養法（ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：２５３１，  １９８７）、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４，  １９８９、Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＣｕｌｔｕｒｅＬｅｔｔｅｒｓ  １１：１９９，  １９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １０：１０６，  １９９１）、アグロバクテリウム法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：２７１，  １９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６：１１１５，  １９９４、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９１５，  １９８８）、パーティクルガン法（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １４：５８６，  １９９５、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｎｅｔ．  ７９：３３７，  １９９０）等である。
【００２３】
以上の方法によって、ＵＣＰｂおよびＡＯＸを共発現する動植物個体または動植物細胞（発明（８））が得られる。
【００２４】
なお、ＵＣＰｂポリヌクレオチドとＡＯＸポリヌクレオチドは、それぞれ別個の発現ベクターに組み込み、それらはコトランスフェクションすることもできる。あるいは発明（５）〜（７）の発現ベクターを使用することもできる。すなわち発明（５）の発現ベクターは、１個のベクター内にＵＣＰｂポリヌクレオチドとＡＯＸポリヌクレオチドを保有している。この場合に、両ポリヌクレオチドは、それぞれのリーディングフレームを一致させてＵＣＰｂおよびＡＯＸを融合タンパク質として発現させるようにしてもよく、あるいはＵＣＰｂおよびＡＯＸをそれぞれ別個の成熟タンパク質として発現させるものであってもよい。
【００２５】
以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】
以下は、恒温性を示すザゼンソウ肉穂花序におけるＳｆＡＯＸおよびＳｆＵＣＰｂのより詳細な発現例を記述したものである。ザゼンソウの花が密集している器官である肉穂花序は、雌雄異熟と呼ばれる特性を示し、その分化の過程において、雌期から両生期を経て雄期へと変化する。一般的に、雌期は肉穂花序表面に多数のめしべが観察される時期であり、両生期は、その表面の一部に花粉が認められ始める時期を指す。その後、肉穂花序には、花粉が出現し、雄期と呼ばれる時期に入る。興味深いことに、ザゼンソウで見られる恒温性は、その発熱部位である肉穂花序が雌期においてのみ特徴的に観察される。この肉穂花序の組織切片を拡大した画像が図４である。肉穂花序表面により近いところに小花と呼ばれる部分があり、その内側には、維管束が存在している。発熱中の肉穂花序断片を用いてｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果が図５である。アンチセンスプローブで検出されるそれぞれの遺伝子の転写産物の分布は、小花に限定されていることが明らかである（図５）。さらに、図５の枠の部分をより拡大した結果が図６である。ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂは雄蘂を除く小花で特異的に発現している。一方、発熱が終了した肉穂花序断片では、両遺伝子の発現はほぼ完全に抑制されている（図７）。従って、発熱中の肉穂花序においては、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂが共に発現している細胞群は小花であり、しかも、その発現は、発熱後の肉穂花序においては、ほぼ消失することになる（図８）。
【００２７】
次いで、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂが共発現している小花が実際に発熱細胞として機能するか否かを解析した結果が図９である。図９左は、高感度赤外線カメラにて肉穂花序そのものを画像解析した結果であり、図９右は、肉穂花序縦断面を赤外線カメラにて画像解析した結果である。この図から明らかなように、肉穂花序の発熱細胞群は、その最表面にある小花で特異的である。
【００２８】
従って、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂを共発現している肉穂花序小花細胞群がザゼンソウの発熱細胞であると結論することができる（図１０）。また、これらの遺伝子が共発現している小花を含む肉穂花序温度を連続的にモニタリングした結果が図１１である。両遺伝子が発現している発熱中（雌期）の肉穂花序温度は、外気温度の変動にもかかわらずほぼ一定温度を維持している。より具体的には、野外の外気温が例えば１５℃程度から氷点下まで大幅に変動しても群落地に自生している雌期のザゼンソウの肉穂花序の温度は精度よく２３℃程度に維持される（図１１）。一方、このような恒温性は、両生期で崩壊しはじめ、花粉が肉穂花序表面を覆う雄期になるとその体温維持能力はほぼ完全に失われてしまう（図１１）。このような恒温性が失われる時期は、ＳｆＡＯＸとＳｆＵＣＰｂの発現がほぼ完全に消失する時期と照合する。
【００２９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、植物の発熱関連遺伝子をより効率よく発現させる方法が提供される。これによって、ザゼンソウ等の発熱植物と同様のメカニズムにより恒温性を発現する低温耐性植物の開発等が可能となる。
【００３０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ザゼンソウから得られた２種類のＵＣＰ因子の構造（左図）およびその疎水性プロット（右図）。ＳｆＵＣＰａは哺乳動物および非発熱植物に広く分布する６回膜貫通型の脱共役タンパク質であり、発現量は少ない。ＳｆＵＣＰｂは５回膜貫通型の脱共役タンパク質であり、ザゼンソウ以外に報告例のない新規の因子で、発現量が多い。また、発熱中の肉穂花序における両因子の転写産物の発現量は、ＳｆＵＣＰｂが主体を占める。
【図２】ＳｆＵＣＰａ  ｍＲＮＡの発現を発熱中および発熱後のザゼンソウ肉穂花序で解析したノーザンブロットの結果。ＳｆＵＣＰａの転写産物は、葉、仏炎苞、肉穂花序および根において、極めて少なく、また、その発現分布も明確な組織特異性を示さない。
【図３】発熱中のザゼンソウ各組織におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現パターンをノーザンブロットにより解析した結果。発熱中の肉穂花序においてＳｆＵＣＰｂとＳｆＡＯＸの発現が最も高いことが明らかである。
【図４】群落地にて自生しているザゼンソウとその肉穂花序の横断面写真。肉穂花序横断面には、その表面近傍に小花が存在し、中心部には、維管束などを含む組織が観察される。
【図５】Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによる発熱中の肉穂花序断面におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸ  ｍＲＮＡの発現分布。それぞれのアンチセンスおよびセンスプローブを作成し、肉穂花序横断面由来の組織切片とハイブリダイズした。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、ｓは雄ずい、バーは２ｍｍである。
【図６】図５の四角で囲まれた部分の拡大図。ＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸアンチセンスプローブで検出されるシグナルは、肉穂花序の雄蘂を除く小花で特異的である。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、ｓは雄ずい、バーは０．５ｍｍである。
【図７】発熱後の肉穂花序横断面におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸ  ｍＲＮＡの発現分布。両遺伝子の転写産物の発現はほとんど検出されないことが明らかである。左がアンチセンスプローブ、右がセンスプローブ。ｆは小花、バーは２ｍｍである。
【図８】肉穂花序におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸ遺伝子の発現分布のまとめ。左図に示した発熱中（雌期）の肉穂花序における両遺伝子の発現は、小花で特異的である。しかし、右図に示した発熱後（雄期）の肉穂花序においては、両遺伝子の発現はほぼ消失している。
【図９】赤外線熱画像解析による肉穂花序組織における発熱細胞群の同定。肉穂花序の横断面をサーモグラフィーにより解析すると、その発熱細胞群は、小花に特異的であることが明らかである。
【図１０】ザゼンソウ肉穂花序におけるＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現部位と赤外線画像解析で得られた発熱細胞群との関係。発熱細胞群は、小花に限定され、かつ、小花細胞群が発熱細胞でもあることが明らかである。またＳｆＵＣＰｂおよびＳｆＡＯＸの発現も小花に局在している。
【図１１】群落地に自生するザゼンソウの肉穂花序および外気温の変動を示したグラフである。氷点下を含む外気温の変動にもかかわらず雌期の肉穂花序の温度はほぼ２３℃内外に維持されている。このような恒温性は、肉穂花序が両性期および雄期に移行すると失われることが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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