(57)【要約】【課題】  簡便かつ正確なイノシトールリン脂質の定量法を提供すること。【解決手段】  本発明のイノシトールリン脂質の測定方法は、試料中に含まれるイノシトールリン脂質を固相に固定する工程；該固定されたイノシトールリン脂質にイノシトールリン脂質結合性蛋白質を接触させ、イノシトールリン脂質とイノシトールリン脂質結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；該結合体と標識蛋白質とを接触させ、標識結合体を形成させる工程；および、該標識結合体中の標識量を測定する工程；を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるイノシトールリン脂質を固相に固定する工程；
該固定されたリン脂質を、イノシトールリン脂質結合性蛋白質と接触させて、該リン脂質と該結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および
該結合体中の結合性蛋白質の量を測定する工程
を含む、イノシトールリン脂質の測定方法。
【請求項２】
固相に固定されたイノシトールリン脂質を準備する工程；
該固定されたイノシトールリン脂質に試料およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたイノシトールリン脂質と該試料中のイノシトールリン脂質とを該結合性蛋白質に対して競合的に結合させる工程；および
該固相に固定された該結合性蛋白質の量を測定する工程
を含む、イノシトールリン脂質の測定方法。
【請求項３】
前記結合性蛋白質が、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合ドメインであるか、またはイノシトールリン脂質結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合性蛋白質の量が、前記結合性蛋白質に特異的に結合する標識蛋白質を用いる酵素免疫アッセイにより測定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記結合性蛋白質が、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、そして前記標識蛋白質が、ペルオキシダーゼで標識された抗ＧＳＴ抗体またはグルタチオン（ＧＳＨ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記結合性蛋白質が、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、該融合蛋白質が酵素標識されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、ペルオキシダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
固相に固定された第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を準備する工程；
該固定された第一の結合性蛋白質に対して、該試料中のイノシトールリン脂質とキャリア結合イノシトールリン脂質とを競合的に結合させる工程；
該固相を洗浄後、第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたキャリア結合イノシトールリン脂質と該第二の結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および
該結合体を洗浄後、該固定された第二の結合性蛋白質の量を測定する工程
を含む、イノシトールリン脂質の測定方法。
【請求項９】
前記第二の結合性蛋白質が、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合ドメインであるか、またはリン脂質結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二の結合性蛋白質の量が、該第二の結合性蛋白質に特異的に結合する標識蛋白質を用いる酵素免疫アッセイにより測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二の結合性蛋白質が、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、そして前記標識蛋白質が、ペルオキシダーゼで標識された抗ＧＳＴ抗体またはグルタチオン（ＧＳＨ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第二の結合性蛋白質が、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、該融合蛋白質が酵素標識されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が、ペルオキシダーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記イノシトールリン脂質結合性蛋白質が、２以上のリン脂質結合ドメインを含有する、請求項１から１３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】
前記イノシトールリン脂質結合性蛋白質が、ＰＨドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン、およびＧＲＡＭドメインからなる群より選択される少なくとも１つのイノシトールリン脂質結合ドメインを含有する、請求項１から１４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＨドメインが、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン、またはＧＲＰ１ＰＨドメインである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記イノシトールリン脂質が、ホスファチジルイノシトール３−リン酸、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸、およびホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１から１６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１８】
固相、試料中のイノシトールリン脂質を該固相に固定するための試薬、ブロッキング剤を含有する緩衝液、およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む、イノシトールリン脂質測定用キット。
【請求項１９】
イノシトールリン脂質が固定された固相、およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む、イノシトールリン脂質測定用キット。
【請求項２０】
前記イノシトールリン脂質結合性蛋白質が標識されている、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記イノシトールリン脂質結合性蛋白質と特異的に結合し得る標識蛋白質をさらに含有する、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２２】
第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質が固定された固相、キャリア結合イノシトールリン脂質、および第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含有する、イノシトールリン脂質測定用キット。
【請求項２３】
前記第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質が標識されている、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質と特異的に結合する標識蛋白質および標識検出試薬をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のイノシトールリン脂質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イノシトールリン脂質は、細胞膜に普遍的に存在するリン脂質の１つであり、親水性部分であるイノシトール環と疎水性部分であるジアシルグリセロールとがリン酸基を介して結合した構造を有している。このイノシトール環は、リン酸基で置換され得、置換される位置と数によって、様々な分子種が存在する。近年、イノシトールリン脂質ならびにその多様な分子種がシグナル伝達に関与していると考えられ、それぞれの分子種について、シグナル伝達に関する研究が盛んに行われている。例えば、イノシトールリン脂質の１つであるホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸は、受容体刺激により活性化されたホスホリパーゼＣにより分解され、二次メッセンジャーであるイノシトール３−リン酸およびジアシルグリセロールが産生されて、小胞輸送やアクチン骨格系の制御などに関わっていることが知られている。
【０００３】
また、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸も、増殖や分化のほか、癌化や細胞極性制御、小胞輸送、インスリンのシグナル伝達などの多様な情報伝達の役割を果たし、多くの研究者の注目を集めている。
【０００４】
他方、脂質によって活性制御を受ける蛋白質は、ＰＨドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン（いずれも後述）などが知られており、これらは脂質と結合し得る脂質結合ドメインを有する。これらのドメインを有する融合蛋白質を用いて、リン脂質の代謝、特に膜構造における代謝を可視化する研究が行われている。例えば、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）と融合したＰＨドメインを用いて、ＰＣ１２ｈ細胞内のイノシトールリン脂質の代謝を画像化ならびに数値化する方法（非特許文献１参照）が検討されている。また、脂質抽出物をニトロセルロース膜に固定し、ＰＨドメインを有する融合蛋白質、この融合蛋白質に対する抗体および金標識プロテインＡを用いて、免疫学的に膜に結合したリン脂質が検出できることを確認し、さらに、細胞の電子顕微鏡用の切片について、同様の免疫学的操作を行い、細胞内のホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸の局在を、電子顕微鏡で同定する方法（非特許文献２参照）も知られている。
【０００５】
ところで、イノシトールリン脂質を検出あるいは定量することは、イノシトールリン酸のシグナル伝達機構解明に重要であるばかりでなく、細胞の癌化あるいは糖尿病のマーカーとしての利用などの面においても重要である。特許文献１には、ＧＦＰで標識したＰＨドメインを、リン脂質の代謝産物であるイノシトール３−リン酸と接触させ、ＧＦＰが発する蛍光強度を測定することにより、試料中のイノシトール３−リン酸濃度を定量する方法が記載されている。しかしながら、試料中に含まれる微量のイノシトールリン脂質を簡便に定量する方法については、未だ報告されていない。
【特許文献１】特開２０００−６０５６５号公報
【非特許文献１】Moritaら、BBRC (2003年) 308巻，673-678頁 "Simultaneous imaging of phosphatidyl inositol metabolism and Ca levels in PC12h cells"
【非特許文献２】Wattら、Biochem. J. (2002年) 363巻，657-666頁  "Subcellular localization of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate using the pleckstrin homology domain of phospholipase C delta1"
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、試料中に微量に含まれるイノシトールリン脂質の量を簡便に測定する方法およびそのための測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、イノシトールリン脂質とイノシトールリン脂質結合性蛋白質とを結合させることによって、細胞抽出液などの生体試料中に微量にしか含まれないイノシトールリン脂質を正確に定量できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、イノシトールリン脂質の測定方法を提供し、該方法は、試料中に含まれるイノシトールリン脂質を固相に固定する工程；該固定されたリン脂質を、イノシトールリン脂質結合性蛋白質と接触させて、該リン脂質と該結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および、該結合体中の結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。
【０００９】
本発明はまた、イノシトールリン脂質の他の測定方法を提供し、該方法は、固相に固定されたイノシトールリン脂質を準備する工程；該固定されたイノシトールリン脂質に試料およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたイノシトールリン脂質と該試料中のイノシトールリン脂質とを該結合性蛋白質に対して競合的に結合させる工程；および、該固相に固定された該結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。
【００１０】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記結合性蛋白質は、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合ドメインであるか、またはイノシトールリン脂質結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質である。
【００１１】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記結合性蛋白質の量は、上記結合性蛋白質に特異的に結合する標識蛋白質を用いる酵素免疫アッセイにより測定される。
【００１２】
より好適な実施態様では、上記結合性蛋白質は、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、そして上記標識蛋白質は、ペルオキシダーゼで標識された抗ＧＳＴ抗体またはグルタチオン（ＧＳＨ）である。
【００１３】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記結合性蛋白質は、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、該融合蛋白質は酵素標識されている。
【００１４】
好適な実施態様では、上記酵素は、ペルオキシダーゼである。
【００１５】
本発明は、イノシトールリン脂質のさらに他の測定方法を提供し、該方法は、固相に固定された第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を準備する工程；該固定された第一の結合性蛋白質に対して、該試料中のイノシトールリン脂質とキャリア結合イノシトールリン脂質とを競合的に結合させる工程；該固相を洗浄後、第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたキャリア結合イノシトールリン脂質と該第二の結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および、該結合体を洗浄後、該固定された第二の結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。
【００１６】
好適な実施態様では、上記第二の結合性蛋白質は、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合ドメインであるか、またはリン脂質結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質である。
【００１７】
好適な実施態様では、上記第二の結合性蛋白質の量は、該第二の結合性蛋白質に特異的に結合する標識蛋白質を用いる酵素免疫アッセイにより測定される。
【００１８】
より好適な実施態様では、上記第二の結合性蛋白質は、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、そして上記標識蛋白質は、ペルオキシダーゼで標識された抗ＧＳＴ抗体またはＧＳＨである。
【００１９】
好適な実施態様では、上記第二の結合性蛋白質は、イノシトールリン脂質結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質であり、該融合蛋白質は酵素標識されている。
【００２０】
好適な実施態様では、上記酵素は、ペルオキシダーゼである。
【００２１】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記イノシトールリン脂質結合性蛋白質は、２以上のリン脂質結合ドメインを含有する。
【００２２】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記イノシトールリン脂質結合性蛋白質は、ＰＨドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン、およびＧＲＡＭドメインからなる群より選択される少なくとも１つのイノシトールリン脂質結合ドメインを含有する。
【００２３】
より好適な実施態様では、上記ＰＨドメインは、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン、またはＧＲＰ１ＰＨドメインである。
【００２４】
好適な実施態様では、上記のいずれの方法においても、上記イノシトールリン脂質は、ホスファチジルイノシトール３−リン酸、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸、およびホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００２５】
本発明はまた、固相、試料中のイノシトールリン脂質を該固相に固定するための試薬、ブロッキング剤を含有する緩衝液、およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む、イノシトールリン脂質測定用キットを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、イノシトールリン脂質が固定された固相、およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む、イノシトールリン脂質測定用キットを提供する。
【００２７】
好適な実施態様では、上記イノシトールリン脂質結合性蛋白質は標識されている。
【００２８】
より好適な実施態様では、上記キットは、上記イノシトールリン脂質結合性蛋白質と特異的に結合し得る標識蛋白質をさらに含有する。
【００２９】
本発明はまた、第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質が固定された固相、キャリア結合イノシトールリン脂質、および第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含有する、イノシトールリン脂質測定用キットを提供する。
【００３０】
好適な実施態様では、上記第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質は標識されている。
【００３１】
他の好適な実施態様では、上記キットは、上記第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質と特異的に結合する標識蛋白質および標識検出試薬をさらに含む。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法により、試料中に微量しか存在しないイノシトールリン脂質を正確にかつ簡便に検出することができる。特にＥＬＩＳＡを用いるイノシトールリン脂質の定量法を用いると、癌、糖尿病などの早期発見が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（本発明に用いられる材料）
Ａ．試料
本発明に用いられる試料としては、その由来に特に制限はない。血液、血清、血漿等の体液、組織、細胞等が挙げられる。組織および細胞の場合は、これらを破砕しその抽出液を試料とし得る。
【００３４】
Ｂ．イノシトールリン脂質
本発明における測定対象であるイノシトールリン脂質は、特に制限はない。例えば、ホスファチジルイノシトールおよびそのイノシトール部位がリン酸化されたものであれば、本発明の方法により測定され得る。以下に、略号とともに、本発明の測定対象のイノシトールリン脂質を例示する。
ＰＩ                  ：ホスファチジルイノシトール 
ＰＩ（３）Ｐ          ：ホスファチジルイノシトール３−リン酸
ＰＩ（４）Ｐ          ：ホスファチジルイノシトール４−リン酸
ＰＩ（５）Ｐ          ：ホスファチジルイノシトール５−リン酸
ＰＩ（３，４）Ｐ２    ：ホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸
ＰＩ（３，５）Ｐ２    ：ホスファチジルイノシトール３，５−二リン酸
ＰＩ（４，５）Ｐ２    ：ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３：ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸
【００３５】
本発明においては、これらのリン脂質の総量を測定できるだけでなく、用いるイノシトールリン脂質結合性蛋白質（後述）の特異性に対応して、単一のリン脂質の量だけでなく、複数のリン脂質の量を、それぞれ独立して測定することができる。
【００３６】
Ｃ．イノシトールリン脂質結合性蛋白質（結合性蛋白質）
本発明の方法に用いられる「イノシトールリン脂質結合性蛋白質」は、イノシトールリン脂質と特異的に結合する「イノシトールリン脂質結合ドメイン」を有する蛋白質をいい、その種類ならびに由来は問わない。本発明においては、イノシトールリン脂質結合ドメインを有する融合蛋白質が好ましく用いられる。以下、「イノシトールリン脂質結合ドメイン」を単に「ＰＩ結合ドメイン」といい、そして「イノシトールリン脂質結合ドメインを含有する融合蛋白質」を「結合性融合蛋白質」ということがある。
【００３７】
本発明に用いられるイノシトールリン脂質結合ドメイン（ＰＩ結合ドメイン）としては、例えば、ＰＨドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＰＸドメイン、ＥＮＴＨドメイン、ＧＲＡＭドメインなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３８】
ＰＨドメインは、プレクストリン中に最初に見出されたドメインであり、プレクストリン相同ドメイン（Pleckstrin homology domain）として、古くから知られ、よく研究されている。ＰＨドメインは、血小板に多く含まれる蛋白質であり、１００〜１２０アミノ酸よりなる。
【００３９】
ＰＨドメインを有する蛋白質は、１００以上も存在する。ＰＨドメインには、ＰＩ（４，５）Ｐ２と優先的に結合するドメイン、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３と優先的に結合するドメインなどがあり、その結合の特異性に基づいて、数種のサブグループに分けられる。例えば、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のＰＩ結合ドメインであるＰＬＣδ１ＰＨドメインは、ＰＩ（４，５）Ｐ２に特異的に結合する。Ｔａｐｐ１（Tandem-PH-domain-containing protein-1）ＰＨドメインは、ＰＩ（３，４）Ｐ２に特異的に結合し、そしてＧＲＰ１（General receptor for phosohoinositides-1）ＰＨドメインは、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３に特異的に結合する。
【００４０】
ＦＹＶＥドメインは、初期エンドソーム抗原（early endosome antigen：以下、ＥＥＡ１という）中の亜鉛フィンガードメイン（zinc finger domain）として見出されたドメインである。Ｆａｂ１ｐ、ＹＯＴＢ、Ｖａｃ１ｐ、およびＥＥＡ１などの蛋白質が共通して有するドメインであるため、その頭文字をとってＦＹＶＥドメインと名づけられている。このＦＹＶＥドメインは、ＰＩ（３）Ｐと特異性に結合するドメインである。
【００４１】
ＰＸドメイン（Phox homology domain）は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを構成するｐ４７ｐｈｏｘやｐ４０ｐｈｏｘに含有されているドメインである。ＰＸドメインは、ＳＮＸ３、ＳＮＸ７、Ｖａｍｌｐ、Ｂｅｍｌ、ＣＩＳＫなどの蛋白質にも含まれる。ＰＩ（３，４）Ｐ２およびＰＩ（３）Ｐと結合するが、ＦＹＶＥほど結合特異性は高くなく、主としてホスファチジルイノシトール３−リン酸キナーゼの産物と結合することが知られている。
【００４２】
ＥＮＴＨドメイン（Epsin N-terminal homology domain）は、クラスリンによって媒介されるエンドサイトーシスに関与する蛋白質のドメインである。このドメインは、エプシン１〜３、ＡＰ１８０、Ｈｉｐ１Ｒなどの蛋白質中に含まれる１４０アミノ酸からなるドメインであり、ＰＩ（４，５）Ｐ２と結合することが知られている。
【００４３】
ＧＲＡＭドメイン（Glucosyltransferases, Rab-like GTPase activators, and Myotubularins）は、ヒト脱リン酸化酵素の１つであるミオツブラリン（Myotubularin）などの蛋白質中に含まれるドメインであり、ＰＩ（３，５）Ｐ２を認識することが知られている。
【００４４】
これらのＰＩ結合ドメインは、イノシトールリン脂質結合性蛋白質中に１つだけ含まれていてもよいし、２以上含まれてもよい。特異性および感度の面から、複数含まれることが好ましい。
【００４５】
ＰＩ結合ドメインを含有する融合蛋白質（結合性融合蛋白質）としてＰＩ結合ドメインと融合される蛋白質は、特に制限はないが、一般に免疫学的アッセイに使用される配列既知の蛋白質が好ましく用いられる。例えば、ＰＩ結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰという）との融合蛋白質、ＰＩ結合ドメインとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、ＧＳＴという）との融合蛋白質などが用いられる。
【００４６】
結合性融合蛋白質は、当業者が通常用いる技法によって容易に調製される。例えば、ＰＩ結合ドメインをコードする塩基配列および融合される蛋白質をコードする塩基配列に基づいて、ＰＣＲなどを用いて、該結合性融合蛋白質をコードする遺伝子が調製される。得られた結合性融合蛋白質遺伝子は、適切な発現ベクターに導入され、適切な宿主（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞など）に導入され、該遺伝子を発現させることにより、ＰＩ結合ドメインを有する融合蛋白質が得られる。
【００４７】
イノシトールリン脂質結合ドメインをコードする配列は公知であり、例えば、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession Number: NM 019676 region: 1-140a.a.から、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession Number: AF286160 region: 180-405a.a.から、そして、ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列は、GenBank Accession Number: AJ005197region: 253-392a.a.から入手可能である。
【００４８】
Ｄ．標識
標識は、イノシトールリン脂質とイノシトールリン脂質結合性蛋白質との結合体（以下、単に「結合体」という場合がある）を検出するために用いられる。本発明に用いられる標識は、各種測定機器により測定可能であれば、特に限定されない。化学的反応、酵素学的反応、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）などで当業者が通常用いる標識が用いられる。本発明においては、（d-1）標識されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質を用いる場合、および（d-2）標識蛋白質を用いる場合があるので、それぞれについて、説明する。
【００４９】
（d-1）標識を有するイノシトールリン脂質結合性蛋白質
標識を有するイノシトールリン脂質結合性蛋白質は、結合体を直接的に検出するために用いられる。このような目的で使用する場合、例えば蛍光物質のような、結合体を直接検出できる標識が好ましく用いられる。このような例として、ＰＬＣδ１ＰＨドメインに蛍光物質をカップリングした例がある（特許文献１参照）。なお、標識を有するイノシトールリン脂質結合性蛋白質には、それ自体が標識として機能する蛋白質、例えば、ＧＦＰなどの蛍光発色性蛋白質も含まれる。
【００５０】
また、酵素で標識し、各種基質を添加することにより、結合体を検出することも可能である。このような例として、酵素標識された、ＰＩ結合ドメインとＧＳＴとの融合蛋白質を用いることができる。標識に用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが好ましい。なお、融合蛋白質を、複数個の酵素で標識することにより、酵素活性を高め、感度を上げることも可能である。
【００５１】
（d-2）標識蛋白質
標識蛋白質は、イノシトールリン脂質結合性蛋白質に特異的に結合し得、そして、測定のための標識を有する蛋白質をいう。標識蛋白質は、ＰＩ結合ドメインを含有する融合蛋白質とイノシトールリン脂質との結合体の検出に有用である。標識蛋白質としては、融合蛋白質のＰＩ結合ドメイン以外の部位に対する抗体であって、標識を有する抗体が好ましい。特に、標識が酵素である抗体、すなわち、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡなど）に使用され得る酵素標識抗体が、最も好ましく用いられる。例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどで標識された抗体が好ましい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００５２】
本発明においては、例えば、イノシトールリン脂質結合性蛋白質としてＰＩ結合ドメインとＧＳＴとの融合蛋白質を用いる場合には、標識蛋白質として、例えば、ペルオキシダーゼ標識抗ＧＳＴ抗体、あるいはグルタチオン（ＧＳＨ）とペルオキシダーゼとの融合体が用いられる。
【００５３】
Ｅ．キャリア結合イノシトールリン脂質
キャリア結合イノシトールリン脂質は、固相に固定されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質に対して、試料中のイノシトールリン脂質と競合的に結合させるために用いられる。キャリアとしては、ＢＳＡなどの蛋白質が好ましく用いられる。キャリア結合イノシトールリン脂質は、固相に固定されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質と結合し、さらにその後に添加される遊離のイノシトールリン脂質結合性蛋白質とも結合する必要がある点から、イノシトールリン脂質を少なくとも２分子有することが好ましい。
【００５４】
キャリアとイノシトールリン脂質とは、例えば、以下のようにして結合することができる。ＢＳＡを用いる場合を例に挙げると、まず、モノベンジルカルボン酸エステルと１−アシルグリセロホスホイノシトールとを反応させて、１−アシル−２−モノベンジルカルボニルホスホイノシトールを得る。これを、パラジウム／炭素を用いて水素ガス雰囲気下で脱ベンジル化し、１−アシル−２−モノカルボニルホスホイノシトールを得る。次いで、得られた１−アシル−２−モノカルボニルホスホイノシトールを、塩化オキザリルにより塩素化し、発色団である芳香族ヒドロキシ化合物（例えば、ｐ−ニトロフェノール）をトリエチルアミン存在下でエステル化し、ＢＳＡのアミノ基と反応させて、ＢＳＡ結合イノシトールリン脂質を得ることができる。
【００５５】
Ｆ．固相
本発明において、固相とは、イノシトールリン脂質またはイノシトールリン脂質結合性蛋白質をその表面に結合または固定し得る材料をいう。固相には、免疫学的測定に用いられるマイクロタイタープレート、マイクロチューブ、シャーレ、試験管などの容器、並びに、ビーズ、ラテックス、金コロイド、メンブラン（ニトロセルロースメンブラン）、磁性粒子体、赤血球等の担体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５６】
Ｇ．固相に固定されたイノシトールリン脂質またはイノシトールリン脂質結合性蛋白質
固相に固定されたイノシトールリン脂質またはイノシトールリン脂質結合性蛋白質は、競合アッセイによる試料中のイノシトールリン脂質の測定に用いられる。イノシトールリン脂質またはイノシトールリン脂質結合性蛋白質を適切な溶媒（例えば、エタノールなど）に溶解し、固相に塗布することにより、調製される。好ましくは、固定後、ＥＬＩＳＡなどにおいて当業者が一般的に使用するスキムミルク、ＢＳＡ（ウシ胎児血清）などのブロッキング剤で固相をブロッキングすることにより、試料中のイノシトールリン脂質またはイノシトールリン脂質結合性蛋白質の固相への非特異的な結合を防ぐことができる。
【００５７】
（本発明の方法およびキット）
本発明のイノシトールリン脂質の測定方法は、イノシトールリン脂質結合性蛋白質を利用するが、３種の方法に大別され得る。すなわち、第１の方法は、イノシトールリン脂質と結合したイノシトールリン脂質結合性蛋白質の量を測定する方法であり、第２の方法は、イノシトールリン脂質を固相に固定し、競合反応により、試料中のイノシトールリン脂質を測定する方法であり、そして第３の方法は、イノシトールリン脂質結合性蛋白質を固相に固定し、競合反応により、試料中のイノシトールリン脂質を測定する方法である。以下、各方法について詳細に説明する。
【００５８】
（１）第１の方法および第１の方法を実施するためのキット
本発明の第１の方法は、上述のように、試料中に含まれるイノシトールリン脂質を固相に固定し、このイノシトールリン脂質と結合したイノシトールリン脂質結合性蛋白質の量を測定する方法である。この方法は、試料中に含まれるイノシトールリン脂質を固相に固定する工程；該固定されたリン脂質を、イノシトールリン脂質結合性蛋白質と接触させて、該リン脂質と該結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および、該結合体中の結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。ここで、測定の工程において、（1-1）イノシトールリン脂質結合性蛋白質を直接的に検出可能な場合、および（1-2）イノシトールリン脂質結合性蛋白質を直接的に検出できない場合がある。
【００５９】
（1-1）イノシトールリン脂質結合性蛋白質自体を直接的に検出可能な場合
この場合は、イノシトールリン脂質結合性蛋白質は、蛍光標識されたＰＩ結合ドメインであり、例えば、ＰＩ結合ドメインと緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質である。したがって、直接蛍光強度を測定し、予め作成したイノシトールリン脂質濃度と蛍光強度との関係に基づいて、イノシトールリン脂質の量を定量することができる。
【００６０】
また、イノシトールリン脂質結合性蛋白質は、酵素で標識されている場合もあり、例えば、酵素標識された、ＰＩ結合ドメインとＧＳＴとの融合蛋白質である。この場合、酵素活性による各種基質の吸光度変化を測定し、予め作成したイノシトールリン脂質濃度と吸光度変化との関係に基づいて、イノシトールリン脂質の量を定量することができる。
【００６１】
例えば、測定しようとする試料を乾燥させた後、適切な溶媒に溶解する。これを、プラスチック製のマイクロタイタープレート上に塗布し、所定の時間静置することにより、イノシトールリン脂質をプレートの底面に固定し得る。固定後、上記ブロッキング剤を含有する緩衝液でブロッキングを行う。次いで、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質（例えば、ＰＩ結合ドメインとＧＦＰとの融合蛋白質）を含む緩衝液をプレートに添加して、蛍光標識イノシトールリン脂質結合性蛋白質と固定されているイノシトールリン脂質とを結合させ、プレート上で結合体を形成させる。洗浄により遊離の蛋白質を除いた後、結合体の蛍光量を測定する。予め作成した検量線により、イノシトールリン脂質の量が測定され得る。
【００６２】
また、蛍光標識されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質の代わりに、酵素標識されたイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む緩衝液をプレートに添加して、酵素標識イノシトールリン脂質結合性蛋白質と固定されているイノシトールリン脂質とを結合させ、プレート上で結合体を形成させる。洗浄により遊離の蛋白質を除いた後、結合体の酵素活性を測定する。予め作成した検量線により、イノシトールリン脂質の量が測定され得る。
【００６３】
本発明の第１の方法におけるこの態様を実施するためのキットは、固相（例えばマイクロタイタープレート）、試料中のイノシトールリン脂質を固相に固定するための試薬（例えば、エタノールなどの溶媒）、上記ブロッキング剤を含有する緩衝液、および標識を有するイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む。必要に応じて、蛍光測定装置または吸光度測定装置などの標識測定装置も、キットに含まれる。
【００６４】
（1-2）イノシトールリン脂質結合性蛋白質自体を直接検出できない場合
イノシトールリン脂質結合性蛋白質が蛍光標識などを有しない場合、一般的にイノシトールリン脂質結合性蛋白質のＰＩ結合ドメイン以外の部分に特異的に結合する標識蛋白質を用いる酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）により測定される。例えば、固定されたイノシトールリン脂質とイノシトールリン脂質結合性蛋白質との結合体に特異的に結合する標識蛋白質を添加して、標識結合体を形成させる。次いで、遊離の標識蛋白質を洗浄により除き、この標識結合体中の酵素活性を測定する。予め作成した検量線により、イノシトールリン脂質の量が測定される。
【００６５】
結合性蛋白質と標識蛋白質との組合せは、特に制限がなく、結合性蛋白質とそれに対する抗体であれば、特に制限はない。当業者が通常用いる方法で、その組み合わせを選択すればよい。例えば、上記のように、結合性蛋白質がＰＩ結合ドメインとＧＳＴとの融合蛋白質である場合は、標識蛋白質としてペルオキシダーゼ標識抗ＧＳＴ抗体などが用いられ得る。
【００６６】
本発明の第１の方法においてこの第２の態様を実施するためのキットは、固相（例えばマイクロタイタープレート）、試料中のイノシトールリン脂質を固相に固定するための試薬（例えば、エタノールなどの溶媒）、上記ブロッキング剤を含有する緩衝液、イノシトールリン脂質結合性蛋白質、および標識蛋白質（好ましくは酵素標識抗体）、ならびに標識検出用の基質（例えば、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素を含む緩衝液）を含む。必要に応じて、吸光度測定装置、蛍光測定装置などの標識測定装置も、キットに含まれる。
【００６７】
（２）第２の方法および第２の方法を実施するためのキット
本発明の第２の方法は、上述のように、固定されたイノシトールリン脂質と試料中のイノシトールリン脂質とをイノシトールリン脂質結合性蛋白質に対して競合的に結合させ、固定されたイノシトールリン脂質へのイノシトールリン脂質結合性蛋白質の結合を阻害することにより、試料中のイノシトールリン脂質の量を測定する方法である。すなわち、本発明の第２の方法は、固相に固定されたイノシトールリン脂質を準備する工程；該固定されたイノシトールリン脂質に試料およびイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたイノシトールリン脂質と該試料中のイノシトールリン脂質とを該結合性蛋白質に対して競合的に結合させる工程；および、該固相に固定された該結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。ここで、測定の工程において、（2-1）イノシトールリン脂質結合性蛋白質を直接的に検出可能な場合、および（2-2）イノシトールリン脂質結合性蛋白質を直接的に検出できない場合がある。
【００６８】
（2-1）イノシトールリン脂質結合性蛋白質自体を直接的に検出可能な場合
イノシトールリン脂質結合性蛋白質が、蛍光または酵素標識されたイノシトールリン脂質結合ドメインである場合、上記（1-1）と同様、直接蛍光強度または酵素活性を測定し、予め作成したリン脂質濃度と蛍光強度または酵素活性との関係に基づいて、リン脂質の量を定量することができる。
【００６９】
この第２の方法におけるこの態様を実施するためのキットは、イノシトールリン脂質が固定された固相、および標識を有するイノシトールリン脂質結合性蛋白質を含む。必要に応じて、吸光度測定装置、蛍光測定装置などの標識測定装置も、キットに含まれる。
【００７０】
（2-2）イノシトールリン脂質結合性蛋白質自体を直接的に検出できない場合
イノシトールリン脂質結合性蛋白質が、蛍光標識などを有しない場合、上記（1-2）と同様、ＥＬＩＳＡなどが適用され得る。
【００７１】
本発明の第２の方法におけるこの第２の態様を実施するためのキットは、イノシトールリン脂質が固定された固相、イノシトールリン脂質結合性蛋白質、および標識蛋白質（好ましくは酵素標識抗体）並びに標識検出用の基質（例えば、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素を含む緩衝液）を含む。必要に応じて、吸光度測定装置、蛍光測定装置などの標識測定装置も、キットに含まれる。
【００７２】
（３）第３の方法および第３の方法を実施するためのキット
本発明の第３の方法は、イノシトールリン脂質結合性蛋白質を固相に固定し、試料中のイノシトールリン脂質と既知量のキャリア結合イノシトールリン脂質とを競合させることにより、試料中のイノシトールリン脂質を測定する方法である。すなわち、第３の方法は、固相に固定された第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を準備する工程；該固定された第一の結合性蛋白質に対して、該試料中のイノシトールリン脂質とキャリア結合イノシトールリン脂質とを競合的に結合させる工程；該固相を洗浄後、第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を添加して、該固定されたキャリア結合イノシトールリン脂質と該第二の結合性蛋白質との結合体を形成させる工程；および、該結合体を洗浄後、該固定された第二の結合性蛋白質の量を測定する工程、を含む。
【００７３】
本発明の第３の方法の特徴は、キャリア結合イノシトールリン脂質と、キャリア結合イノシトールリン脂質中のリン脂質部位に結合し得る２種類のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を用いる点にある。固相に固定される第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質と、検出用の第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００７４】
イノシトールリン脂質結合性蛋白質（ＰＩ結合蛋白質）としては、ＰＩ結合ドメインとＧＦＰとの融合蛋白質（以下、ＧＦＰ融合蛋白質）、およびＰＩ結合ドメインとＧＳＴとの融合蛋白質（以下、ＧＳＴ融合蛋白質）が挙げられる。また、キャリア結合イノシトールリン脂質としては、ＢＳＡ結合イノシトールリン脂質が挙げられる。
【００７５】
例えば、第一のＰＩ結合性蛋白質としてＧＳＴ融合蛋白質を用いる場合、まず、固相にＧＳＴ融合蛋白質を固定する。キャリア結合イノシトールリン脂質としてＢＳＡ結合イノシトールリン脂質を試料と混合し、この混合物を、ＧＳＴ融合蛋白質を固定した固相に添加して、試料中のイノシトールリン脂質とＢＳＡ結合イノシトールリン脂質とを固定されたＧＳＴ融合蛋白質に対して競合的に結合させる。次いで、試料および遊離のＢＳＡ結合イノシトールリン脂質を洗浄により取り除く。これに、第二のＰＩ結合性蛋白質としてのＧＦＰ融合蛋白質を接触させて、固定されたＢＳＡ結合イノシトールリン脂質との結合体を形成させる。次いで、遊離のＧＦＰ融合蛋白質を洗浄により除いた後、固定されたＧＦＰ融合蛋白質の蛍光を上記（1-1）と同様にして測定する。
【００７６】
例えば、第一のＰＩ結合性蛋白質として固相に固定したＧＦＰ融合蛋白質を用いる場合、まず、固相にＧＦＰ融合蛋白質を固定する。この固相に、試料とＢＳＡ結合イノシトールリン脂質とを混合して添加し、固定されたＧＦＰ融合蛋白質と競合的に結合させる。次いで、試料および遊離のＢＳＡ結合イノシトールリン脂質を洗浄により取り除く。これに、第二のＰＩ結合性蛋白質としてのＧＳＴ融合蛋白質を接触させて、固定されたＢＳＡ結合イノシトールリン脂質との結合体を形成させる。次いで、遊離のＧＳＴ融合蛋白質を洗浄により除いた後、固定されたＧＳＴ融合蛋白質に標識蛋白質であるペルオキシダーゼ標識抗ＧＳＴ抗体あるいはＧＳＨ−ペルオキシダーゼ複合体を接触させて、上記（1-2）と同様に、ペルオキシダーゼ活性を測定する。
【００７７】
また、第二のＰＩ結合性蛋白質として、ペルオキシダーゼ標識ＧＳＴ融合蛋白質を接触させて、固定されたＢＳＡ結合イノシトールリン脂質との結合体を形成させる。次いで、遊離のペルオキシダーゼ標識ＧＳＴ融合蛋白質を洗浄により除いた後、固定されたペルオキシダーゼ標識ＧＳＴ融合蛋白質のペルオキシダーゼ活性を測定することもできる。
【００７８】
本発明の第３の方法を実施するためのキットは、第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質が固定された固相、キャリア結合イノシトールリン脂質、および第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質、必要に応じて、第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質を検出するための手段を含む。さらに、必要に応じて、吸光度測定装置、蛍光測定装置などの標識測定装置も、キットに含まれる。例えば、後者のＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットは、第一のイノシトールリン脂質結合性蛋白質が固定された固相、キャリア結合イノシトールリン脂質、第二のイノシトールリン脂質結合性蛋白質、および第二の蛋白質に特異的な標識蛋白質（好ましくは酵素標識抗体）、ならびに標識検出用の基質（例えば、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素を含む緩衝液）を含む。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００８０】
（実施例１）ＧＳＴとＰＬＣδ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の調製
（1-1）マウス肺由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
マウス（雑種）より肺を摘出し、Rneasy Mni Kit（Qiagen社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、精製した。得られたＲＮＡの１μｇを鋳型にして、スーパースクリプトII（ギブコ社製）を用いるランダムプライマー法によりｃＤＮＡを合成し、マウス肺由来ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【００８１】
（1-2）ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子の取得
ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列（GenBank Accession Number: NM_019676 region: 1-140a.a.）をもとにプライマーを作成した。(1-1)で作成したマウス肺由来ｃＤＮＡライブラリー１μＬを鋳型とし、これらの各プライマー（100pmol/μL）を０．５μＬ用い、TAKARA LATaq（タカラバイオ社製）のプロトコールに従って、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を含む４２０ｂｐのＤＮＡを得た。
【００８２】
（1-3）ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を含むプラスミドの調製
上記（1-2）で取得したＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を含むＤＮＡを、Mini Elute Gel Extraction kit(Qiagen社製)を用いて精製し、Qiagen PCR cloning kit(Qiagen社製)を用いて大腸菌ｐＭＢ１のＤＮＡ複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクターpDriveに組込み、大腸菌（ＪＭ１０９）に導入して、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を有する組換えプラスミドＡを含む形質転換体を得た。
【００８３】
次に、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法（BigDye Terminator v3.1/1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を使用）によって、組換えプラスミドＡの塩基配列を決定した。その結果、この組換えプラスミドＡは、５’末端にBglII制限酵素部位および３’末端にBamHI制限酵素部位を有する４２０ｂｐの構造遺伝子領域を有し、すなわち、１４０個のアミノ酸をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
【００８４】
（1-4）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＰＬＣδ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
上記（1-3）で得られた組換えプラスミドＡを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。一方、ＧＳＴをコードする遺伝子を有する大腸菌発現ベクターpGEX6P-1（アマシャム  ファルマシア社製）を予め制限酵素BamHIで切断し、次いでアルカリホスファターゼ（タカラバイオ社製）処理した。処理した発現ベクターpGEX6P-1断片と上記ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子とを連結し、ＧＳＴとＰＬＣδ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターpGEX6P-1-PLC delta1 PH domain（以下、発現ベクターＡという）を調製した。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子が一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約４３ｋＤａの融合蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、４３ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-PLC delta1 PH domain（以下、形質転換体Ａという）を得た。
【００８５】
（1-5）ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を２つ含む融合蛋白質の発現ベクターおよびその形質転換体の作成
上記（1-3）で得られた組換えプラスミドＡを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。この遺伝子と、上記（1-4）で取得した発現ベクターＡを制限酵素ＢａｍＨＩ−アルカリホスファターゼ処理して調製した断片とを連結して、発現ベクターpGEX6P-1-PLC delta1 PH domain×2（以下、発現ベクターＡ×２という）を調製した。なお、この発現ベクターＡ×２は、制限酵素BglIIの切断断片は制限酵素BamHIの切断断片とは連結できるが、連結後の塩基配列はどちらの制限酵素でも切断することはできないことを利用して、発現ベクターＡを制限酵素BamHIで切断し、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子断片を組込むことによって作成した。この発現ベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＰＬＣδ１ＰＨドメイン遺伝子が新たに一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約５９ｋＤａの蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、５９ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-PLC delta1 PH domain×2（以下、形質転換体Ａ×２という）を得た。
【００８６】
（1-6）ＧＳＴとＰＬＣδ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の発現と精製
上記で得られたＧＳＴとＰＬＣδ１ＰＨドメインとの融合蛋白質を産生する形質転換体Ａを、１０ｍＬのＬＢ培地に植菌して、３７℃で一晩培養後、全量を１ＬのＬＢ培地に接種して３７℃で培養を開始した。培養開始から３時間後、培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧと２−メルカプトエタノールをそれぞれ終濃度が１ｍＭとなるように加え、さらに３時間培養し、ＰＬＣδ１ＰＨドメイン結合ＧＳＴの発現を誘導した。培養終了後、４℃で、大腸菌を高速（8,000rpm）にて５分間遠心分離し、回収した。細胞を１０ｍＬの溶解緩衝液（50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、200mM NaCl、１％Triton-X（登録商標））に懸濁し、１５ｍＬのチューブに移し、約２分間超音波破砕した。破砕液を−８０℃のディープフリーザーで凍結させ、室温で融解した。さらに、約２分間超音波破砕した。超高速（35,000rpm）にて３０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を、溶解緩衝液に置換し、グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（Amersham cat.52-2303-00）を１００μＬ加え、２時間、ローターで回転させながら蛋白質をビーズに結合させた。3,000rpmで３０秒間遠心分離し、上清を捨て、１０ｍＬの洗浄緩衝液（50mM Tris-HCl（pH 7.5）、5mM EDTA、500mM NaCl、1％ Triton-X（登録商標））にて、ビーズを３回洗った。ビーズを１．５ｍＬのチューブに移し、１００μＬのグルタチオン溶液（10mM グルタチオン、50mM Tris-HCl（pH 8.0））を加えて約１分間撹拌して、蛋白質を溶出させた。その後、5,000rpmにて１分間遠心分離し、上清を新しい１．５ｍＬのチューブに回収した。これを３回繰り返し、合計３本のフラクションを得た。各フラクションの蛋白質の濃度をブラッドフォード法により測定した後、１μｇの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシー染色を行った。融合蛋白質以外のバンドは検出されなかった。この融合蛋白質をＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨと命名した。
【００８７】
形質転換体Ａ×２についても、前記と同様に培養し、融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨ×２を取得した。
【００８８】
（実施例２）ＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の調製
（2-1）ヒト血管内皮細胞(Huvec)由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
Rneasy Mni Kit（Qiagen社製）を用いて、ヒト血管内皮細胞(Huvec)から全ＲＮＡを抽出し、精製した。得られたＲＮＡの１μｇを鋳型にして、スーパースクリプトII（ギブコ社製）を用いるランダムプライマー法によりｃＤＮＡを合成し、ヒト血管内皮細胞由来ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【００８９】
（2-2）Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子の取得
Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列（GenBank Accession Number: AF286160 region: 180-405a.a.）をもとにプライマーを作成した。上記（2-1）で作成したヒト血管内皮細胞由来ｃＤＮＡライブラリー１μＬを鋳型とし、これらの各プライマー（100pmol/μL）を０．５μＬ用い、TAKARA LATaqのプロトコールに従って、ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を含む６７５ｂｐのＤＮＡを得た。
【００９０】
（2-3）Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を含むプラスミドの調製
上記（2-2）で取得したＴａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を含むＤＮＡを、実施例１の（1-2）と同じ操作で大腸菌ベクターpDriveに組込み、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を有する組換えプラスミドＢを含む形質転換体を得た。
【００９１】
次に、実施例１の（1-3）と同様に、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法によって、組換えプラスミドＢの塩基配列を決定した。その結果、この組換えプラスミドＢは、５’末端にＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限酵素部位および３’末端にEcoRIまたはSalI制限酵素部位を有する６７５ｂｐの構造遺伝子領域、すなわち、２２５個のアミノ酸をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
【００９２】
（2-4）ＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
ＧＳＴをコードする遺伝子を有する大腸菌発現ベクターpGEX6P-1と上記（2-3）で得られた組換えプラスミドＢとを用いて、ＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターを調製した。上記（2-3）で得られた組換えプラスミドＢを制限酵素BamHIおよびEcoRIで切断し、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。この遺伝子と、発現ベクターpGEX6P-1を予め制限酵素BamHIおよびEcoRIで切断し、次いでアルカリホスファターゼ処理して得られた断片とを連結し、発現ベクターpGEX6P-1-TAPP1 PH domain（以下、発現ベクターＢという）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＴａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子が一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約５３ｋＤａの融合蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、５３ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-TAPP1 PH domain（以下、形質転換体Ｂという）を得た。
【００９３】
（2-5）Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を２つ含む融合蛋白質の発現ベクターおよびその形質転換体の作成
上記（2-3）で得られた組換えプラスミドＢを制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、Ｔａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。この遺伝子と、上記（2-4）で取得した発現ベクターＢを制限酵素EcoRIおよびSalI−アルカリホスファターゼ処理して調製した断片とを連結して、発現ベクターpGEX6P-1TAPP1 PH domain×2（以下、発現ベクターＢ×２という）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＴａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子が新たに一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約７８ｋＤａの蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、７８ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-TAPP1 PH domain×2（以下、形質転換体Ｂ×２という）を得た。
【００９４】
（2-6）ＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の発現と精製
上記（2-5）で得られたＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質を発現する形質転換体Ｂおよび形質転換体Ｂ×２を、上記実施例１の（1-6）と同様に培養し、産生された蛋白質を精製して、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１および融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１×２を得た。図１ＡおよびＢに、融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１およびＧＳＴ−Ｔａｐｐ１×２の構造をそれぞれ模式的に示す。
【００９５】
（実施例３）ＧＳＴとＧＲＰ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の調製
（3-1）ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子の取得
ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列（GenBank Accession Number: AJ005197region: 253-392a.a.）をもとにプライマーを作成した。上記（2-1）で作成したヒト血管内皮細胞由来ｃＤＮＡライブラリー１μＬを鋳型とし、これらの各プライマー（100pmol/μL）を０．５μＬ用い、TAKARA LATaqのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行い、ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を含む４１７ｂｐのＤＮＡを得た。
【００９６】
（3-2）ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を含むプラスミドの調製
上記（3-1）で取得したＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を含むＤＮＡを、実施例１の（1-2）と同じ操作で大腸菌ベクターpDriveに組込み、大腸菌ＪＭ１０９株に導入してＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を有する組換えプラスミドＣを含む形質転換体を得た。
【００９７】
次に、実施例１の（1-3）と同様に、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法によって、組換えプラスミドＣの塩基配列を決定した。その結果、この組換えプラスミドＣは、５’末端にＢｇｌII制限酵素部位、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する４１７ｂｐの構造遺伝子領域を有し、すなわち、１３９個のアミノ酸をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
【００９８】
（3-3）ＧＳＴとＧＲＰ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
ＧＳＴをコードする遺伝子を有する大腸菌発現ベクターpGEX6P-1と上記（3-2）で得られた組換えプラスミドＣとを用いて、ＧＳＴとＧＲＰ１ＰＨドメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターを調製した。上記（3-2）で得られた組換えプラスミドＣを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。この遺伝子と、発現ベクターpGEX6P-1を予め制限酵素BamHIで切断し、次いでアルカリホスファターゼ処理して得られた断片とを連結し、発現ベクターpGEX6P-1-GRP1 PH domain（以下、発現ベクターＣという）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子が一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約４４ｋＤａの融合蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、４４ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-GRP1 PH domain（以下、形質転換体Ｃという）を得た。
【００９９】
（3-4）ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を２つ含む融合蛋白質の発現ベクターおよびその形質転換体の作成
上記（3-2）で得られた組換えプラスミドＣを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子を回収した。この遺伝子と、上記（3-3）で取得した発現ベクターＣを制限酵素BamHIで切断後、アルカリホスファターゼ処理して調製した断片とを連結して、発現ベクターpGEX6P-1-GRP1 PH domain×2（以下、発現ベクターＣ×２という）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＴａｐｐ１ＰＨドメイン遺伝子が新たに一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約６１ｋＤａの蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、６１ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-GRP1 PH domain×2（以下、形質転換体Ｃ×２という）を得た。
【０１００】
なお、この発現ベクターＣ×２は、実施例１と同様、制限酵素BglIIの切断断片は制限酵素BamHIの切断断片とは連結できるが、連結後の塩基配列はどちらの制限酵素でも切断することはできないことを利用し、発現ベクターＣを制限酵素BamHIで切断し、ＧＲＰ１ＰＨドメイン遺伝子断片を組込むことによって作成した。
【０１０１】
（3-5）ＧＳＴとＧＲＰ１ＰＨドメインとの融合蛋白質の発現と精製
上記で得られたＧＳＴとＧＲＰ１ＰＨドメインとの融合蛋白質を産生する形質転換体Ｃおよび形質転換体Ｃ×２を、実施例１の（1-6）と同様に培養し、産生された蛋白質を精製して、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１および融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１×２を得た。
【０１０２】
（実施例４）ＧＳＴとＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメインとの融合蛋白質の調製
（4-1）マウス腎臓由来由来ｃＤＮＡライブラリーの作成
マウス（雑種）より腎臓を摘出した。Rneasy Mni Kit（Qiagen社製）を用いて、この腎臓から全ＲＮＡを抽出し、精製した。得られたＲＮＡの１μｇを鋳型にして、スーパースクリプトII（ギブコ社製）を用いるランダムプライマー法によりｃＤＮＡを合成し、マウス腎臓由来由来ｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【０１０３】
（4-2）ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン遺伝子の取得
ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン遺伝子（以下、単にＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子ということがある）の塩基配列（GenBank Accession Number: NM_003566 region: 1336-1411a.a.）をもとにプライマーを作成した。上記（4-1）で作成したマウス腎臓由来由来ｃＤＮＡライブラリー１μＬを鋳型とし、これらの各プライマー（100pmol/μL）を０．５μＬ用い、TAKARA LATaqのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行い、ＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子を含む２２５ｂｐのＤＮＡを得た。
【０１０４】
（4-3）ＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子を含むプラスミドの調製
上記（4-1）で取得したＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子を含むＤＮＡを、実施例１の（1-2）と同じ操作で大腸菌ベクターpDriveに組込み、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して、ＥＥＡ１ＦＹＶＥを有する組換えプラスミドＤを含む形質転換体を得た。
【０１０５】
次に、実施例１の（1-3）と同様に、蛍光標識プライマーを用いたジデオキシターミネーター法によって、組換えプラスミドＤの塩基配列を決定した。その結果、この組換えプラスミドＤは、５’末端にＢｇｌII制限酵素部位および３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する２２５ｂｐの構造遺伝子領域、すなわち、７５個のアミノ酸をコードする塩基配列を有していた。この配列は、上記ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。
【０１０６】
（4-4）ＧＳＴとＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメインとの融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作成
ＧＳＴをコードする遺伝子を有する大腸菌発現ベクターpGEX6P-1と上記（4-3）で得られた組換えプラスミドＤとを用いて、ＧＳＴとＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン（以下、単にＥＥＡ１ＦＹＶＥということがある）との融合蛋白質遺伝子を含む発現ベクターを調製した。上記（4-3）で得られた組換えプラスミドＤを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子を回収した。この遺伝子と、発現ベクターpGEX6P-1を予め制限酵素BamHIで切断し、次いでアルカリホスファターゼ処理して得られた断片とを連結し、発現ベクターpGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain（以下、発現ベクターＤという）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子が一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約３７ｋＤａの融合蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、３７ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain（以下、形質転換体Ｄという）を得た。
【０１０７】
（4-5）ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン遺伝子を複数個含む融合蛋白質の発現ベクターおよびその形質転換体の作成
上記（4-3）で得られた組換えプラスミドＤを制限酵素BglIIおよびBamHIで切断し、ＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子を回収した。この遺伝子と、上記（4-4）で取得した発現ベクターＤを制限酵素BamHIで切断後、アルカリホスファターゼ処理して調製した断片とを連結して、発現ベクターpGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×2（以下、発現ベクターＤ×２という）を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。正しい向きにＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子が新たに一つ組込まれている場合、ＩＰＴＧの添加により約４５ｋＤａの蛋白質の発現が誘導される。そこで、ＩＰＴＧ誘導により、４５ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109- pGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×2（以下、形質転換体Ｄ×２という）を得た。
【０１０８】
なお、この発現ベクターＤ×２は、実施例１と同様、制限酵素BglIIの切断断片は制限酵素BamHIの切断断片とは連結できるが、連結後の塩基配列はどちらの制限酵素でも切断することはできないことを利用し、発現ベクターＤを制限酵素BamHIで切断し、ＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子断片を組込むことによって作成した。
【０１０９】
得られた発現ベクターＤ×２に、同様の手順でＥＥＡ１ＦＹＶＥ遺伝子断片を一つ組込むことにより、約５４ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×3（形質転換体Ｄ×３）および発現ベクターpGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×3（発現ベクターＤ×３）を得た。これを繰返して、約７０ｋＤａの蛋白質を発現する形質転換体JM109-pGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×5（形質転換体Ｄ×５）および発現ベクターpGEX6P-1-EEA1 FYVE finger domain×5（発現ベクターＤ×５）を得た。
【０１１０】
（4-6）ＧＳＴとＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメインとの融合蛋白質の発現と精製
上記で得られたＧＳＴとＥＥＡ１ＦＹＶＥとの融合蛋白質を産生する形質転換体Ｄ、形質転換体Ｄ×２、形質転換体Ｄ×３、および形質転換体Ｄ×５を、実施例１の（1-6）と同様に培養し、産生された蛋白質を精製して、融合蛋白質ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×２、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×３、およびＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×５をそれぞれ調製した。図２Ａ〜図２Ｄに、これらの融合蛋白質の構造を模式的に示す。
【０１１１】
（実施例５）固相に固定されたイノシトールリン脂質と融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１との結合に用いる緩衝液の検討
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３と特異的に結合するＧＲＰ１ＰＨドメインを用いて、最適な結合条件を検討した。イノシトールリン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）との１：１の混合物２質量部に対して、０．２質量部（すなわち、ＰＣ：ＰＥ：イノシトールリン脂質＝１：１：０．２）の割合となるように添加した。このリン脂質混合物を窒素ガスで乾燥した後、エタノールに溶解し、マイクロタイタープレートのウエルに室温にてコートした。５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、室温で６時間ブロッキングを行った。融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１を含有する以下の表１に記載の種々の緩衝液を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。緩衝液を除いた後、０．１％Triton含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でプレートを４回洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識グルタチオン（ＧＳＨ）１μg/mLを含む５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを８回洗浄した後、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素含有クエン酸緩衝液とを加えて発色させた。続いて、８Ｍ硫酸で発色を停止させ、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
結果を図３に示す。表１の緩衝液６（50mM HEPES (pH7.4, 150mM NaCl, 0.05%CHAPS, 0.5%SC)を用いた場合、Ｐ１（３，４，５）Ｐ３に対する感度および特異性が最も良好であった。なお、図３において、ＰＡはホスファチジル酸、ＰＳはホスファチジルセリンであり、他のイノシトールリン脂質の略号は上述のとおりである。
【０１１４】
（実施例６）ブロッキング緩衝液および反応緩衝液の検討
ＰＩ（３，４）Ｐ２に特異的に結合する融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１を用いて、脂質オーバーレイアッセイを行い、ブロッキング緩衝液および反応緩衝液の組合せのうち、最適な組合せを検討した。検討したブロッキング緩衝液および反応緩衝液の組合せを、表２に示す。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
種々のイノシトールリン脂質をニトロセルロースメンブラン上にスポットし、乾燥させた後、表２のＮｏ．１のブロッキング緩衝液で５５℃、６時間ブロッキングした。次いで、表２のＮｏ．１の融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１を含有する反応緩衝液を用いて、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで５分間の洗浄を３回行った。続いて、抗ＧＳＴＩｇＧ含有ＰＢＳＴを加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５分間の洗浄を３回行い、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体含有ＰＢＳＴを添加し、室温で３０分インキュベートした。ＰＢＳＴで５分間の洗浄を３回行い、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ニトロブルー−テトラゾリウム／５−ブロモ−５−クロロ−３−インドリルホスフェート）による発色を観察した。同様にして、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．４のブロッキング緩衝液と反応緩衝液との組み合わせによる発色を検討した。
【０１１７】
結果を図４に示す。図４（０）は、図４（１）〜（４）における各スポットのイノシトールリン脂質の種類を示す。イノシトールリン脂質の略号は前述のとおりである。図４（１）〜（４）は、それぞれ、表２のＮｏ．１〜４の緩衝液の組み合わせを用いた場合に対応する。
【０１１８】
図４からわかるように、図４（４）のスポット、すなわち、表２のＮｏ．４のブロッキング緩衝液と反応緩衝液との組み合わせを用いた場合が、ＰＩ（３，４）Ｐ２に対する感度および特異性が最も良好であった。
【０１１９】
（実施例７）融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨを用いた、ＰＩ（４，５）Ｐ２の定量
ＰＣとＰＥとの等量混合物にＰＩ（４，５）Ｐ２を所定量混合して、種々の濃度のＰＩ（４，５）Ｐ２を含むリン脂質混合物を調製した。窒素ガスで乾燥した後、エタノールに溶解し、この溶解液を、マイクロタイタープレートの各ウエルに、ウエル当りのＰＩ（４，５）Ｐ２量が０〜２００ｎｇとなるように室温にてコートした。５％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて、室温で６時間ブロッキングを行った。融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨを溶解した50mM HEPES緩衝液（pH7.4、500mM NaClおよび0.05% CHAPS含有）を各ウエルに加えて、室温で１時間インキュベートした。以降、実施例５と同じ操作を行い、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。
【０１２０】
図５に示すように、ＰＩ（４，５）Ｐ２量と吸光度との間には高い相関が認められ、本発明の方法によりＰＩ（４，５）Ｐ２を定量できることが明らかとなった。
【０１２１】
（実施例８）融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１を用いるＰＩ（３，４，５）Ｐ３の定量
ＰＩ（４，５）Ｐ２の代わりにＰＩ（３，４，５）Ｐ３を用い、そして融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨの代わりに融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１を用いたこと以外は、実施例７と同様にして、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３量と吸光度との関係を検討した。結果を図６に示す。
【０１２２】
図６に示すように、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３量と吸光度との間には高い相関関係が認められ、本発明の方法によりＰＩ（３，４，５）Ｐ３を定量できることが明らかとなった。
【０１２３】
（実施例９）ＧＳＴとＴａｐｐ１ＰＨドメインとの融合蛋白質と、固相に固定されたイノシトールリン脂質との結合に関する検討
実施例５において、融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１の代わりに、実施例２で得られた２種類の融合蛋白質（図１参照）を用い、そして緩衝液として50mM HEPES緩衝液（pH7.4、1M NaClおよび0.05% CHAPS含有）を用いたこと以外は、実施例５と同様にして、イノシトールリン脂質に対する感度および特異性との関係を検討した。
【０１２４】
結果を図７に示す。図７において、ＡおよびＢは、図１のＡおよびＢに対応しており、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１およびＧＳＴ−Ｔａｐｐ１×２を示す。
【０１２５】
図７に示すように、ドメインの連結数が２個の融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１×２の方が、ＰＩ（３，４）Ｐ２に対する感度および特異性が高かった。
【０１２６】
（実施例１０）融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１を用いるＰＩ（３，４）Ｐ２の定量
実施例７において、ＰＩ（４，５）Ｐ２の代わりにＰＩ（３，４）Ｐ２を用い、そして融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨの代わりに実施例２で得られた２種類の融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１（図１参照）を用いたこと以外は、実施例７と同様にして、ＰＩ（３，４）Ｐ２量と吸光度との関係を検討した。
【０１２７】
結果を図８に示す。図８において、ＡおよびＢは、図１のＡおよびＢに対応しており、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１およびＧＳＴ−Ｔａｐｐ１×２を示す。
【０１２８】
図８に示すように、ＰＩ（３，４）Ｐ２量と吸光度との間には高い相関関係が認められ、本発明の方法によりＰＩ（３，４）Ｐ２を定量できることが明らかとなった。
【０１２９】
（実施例１１）ＧＳＴと複数個のＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメインとの融合蛋白質と、固相に固定されたイノシトールリン脂質との結合に関する検討
実施例５において、融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１の代わりに実施例４で得られた４種類の融合蛋白質（図２参照）を用い、そして緩衝液として50mM HEPES緩衝液（pH7.4、150mM NaClおよび0.05% CHAPS含有）を用いたこと以外は実施例５と同様にして、イノシトールリン脂質に対する感度および特異性との関係を検討した。
【０１３０】
結果を図９に示す。図９において、Ａ〜Ｄは図２のＡ〜Ｄに対応しており、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×２、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×３およびＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×５を示す。図９に示すように、ドメインの連結数を増加させることによって、ＰＩ（３）Ｐに対する感度および特異性が上昇した。
【０１３１】
（実施例１２）ＧＳＴと複数個のＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメインとの融合蛋白質を用いるＰＩ（３）Ｐの測定
実施例７において、ＰＩ（４，５）Ｐ２の代わりにＰＩ（３）Ｐを用い、そして融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨの代わりに実施例４で得られた４種類の融合蛋白質（図２参照）を用いたこと以外は、実施例７と同様にして、ＰＩ（３）Ｐ３量と吸光度との関係を検討した。結果を図１０に示す。図１０において、Ａ〜Ｄは図２のＡ〜Ｄに対応しており、それぞれ、融合蛋白質ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×２、ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×３およびＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥ×５を示す。
【０１３２】
図１０に示すように、ＰＩ（３）Ｐ量と吸光度との間に高い相関関係が認められ、本発明の方法によりＰＩ（３）Ｐ２を定量できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明のイノシトールリン脂質の測定方法は、イノシトールリン酸のシグナル伝達機構解明という学術的利用のみならず、癌化した細胞の検出あるいは糖尿病の検出など、診断・医療などの分野で利用される
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】結合性融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１の構造を示す模式図である。
【図２】結合性融合蛋白質ＧＳＴ−ＥＥＡ１ＦＹＶＥの構造を示す模式図である。
【図３】緩衝液１〜８中での結合性融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１と各種イノシトールリン脂質との結合体の形成量を示すグラフである。
【図４】緩衝液１〜４中での結合性融合蛋白質ＧＳＴ−Ｔａｐｐ１と各種イノシトールリン脂質との脂質オーバーレイアッセイの結果を示すニトロセルロースメンブランの写真である。
【図５】結合性融合蛋白質ＧＳＴ−ＰＬＣδＰＨを用いた場合の、ＰＩ（４，５）Ｐ２量と吸光度との関係を示すグラフである。
【図６】結合性融合蛋白質ＧＳＴ−ＧＲＰ１を用いた場合の、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３量と吸光度との関係を示すグラフである。
【図７】結合性融合蛋白質のＴａｐｐ１ＰＨ結合ドメイン数と、結合性融合蛋白質と各種イノシトールリン脂質との結合体の形成量との関係を示すグラフである。
【図８】Ｔａｐｐ１ＰＨ結合ドメイン数が異なる結合性融合蛋白質を用いた場合の、ＰＩ（３，４）Ｐ２量と結合体の形成量との関係を示すグラフである。
【図９】ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン数と、結合性融合蛋白質と各種イノシトールリン脂質との結合体の形成量との関係を示すグラフである。
【図１０】ＥＥＡ１ＦＹＶＥフィンガードメイン数が異なる結合性合蛋白質を用いた場合の、ＰＩ（３）Ｐ量と結合体の形成量との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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