(57)【要約】      （修正有）【課題】  組成が明確で血清を添加した培地に係る不都合な要因、例えばウイルスへの感染や正常な胚発生の阻害、胎仔の過大化などを排除可能な無血清の培養液であって、比較的簡単な組成で取扱いも容易でしかも安価に製造することが可能な無血清初期胚培養液を提供する。【解決手段】  培養液ＳＯＦ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｖｉｄｕｃｔ  Ｆｌｕｉｄ）に含有される塩化カルシウムに代えてヘミカルシウムラクテートを添加することを特徴とする無血清初期胚培養液を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液ＳＯＦ(Synthetic Oviduct Fluid)に含有される塩化カルシウムに代えてヘミカルシウムラクテートを添加することを特徴とする無血清初期胚培養液。
【請求項２】
アラニン、グリシン、タウリン、インスリンのうち少なくとも１つのアミノ酸構成成分を添加することを特徴とする請求項１記載の無血清初期胚培養液。
【請求項３】
含有成分が表１で表される濃度であることを特徴とする無血清初期胚培養液：
【表１】
2005261252.tif 000005
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は初期胚組織を培養するための培養液であって、特に血清を含まず体外受精胚やクローン胚の構築・発育をも可能な培地たり得る無血清初期胚培養液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、牛の体外受精卵子を培養する際には、胚組織培養液に血清をエネルギー源として添加していた。また、体外受精卵子の胚発育効率を改善するためには、体外受精直後から初期胚の体外発生培養に、各種体細胞との共培養を実施することが普通で、この共培養も血清培地中で行われていた。例えば非特許文献１には、過排卵処理された牛から得られた５〜８細胞の胚が卵管細胞と共培養された結果が示されている。
しかしながら、血清の化学的組成は不明であるとともにそのロットによって胚に及ぼす生物活性は大きく変動するなどの難点がある。また、血清には脂肪が含まれるため、胚組織に脂肪が蓄積されてしまうことで例えば巨大児が発生してしまうというような不具合も生じている。しかも、血清は高価であるため多量に使用することが困難である場合も多く、血清がウイルスなどに汚染されていることも多い。このようなウイルスは胚の発育に悪影響を与え、作出効率にも影響が及ぶ場合もある。
そこで、無血清培地による牛胚組織の培養に関する研究が行われるようになり、例えば非特許文献２では、過排卵処理された牛から１〜２細胞の胚や卵を外科的な処置により取り出して、胚をグルコースフリーかつ無血清で共培養する実験について開示している。この非特許文献２においては、この胚が胚盤胞まで成長したことが紹介されている。
さらに、特許文献１においては「牛胚の体外発生方法」として、無血清培地中メタロプロテイナーゼインヒビターの存在下で牛受精卵を体外培養することを特徴とする胚発生方法が開示されている。この発明では、顆粒膜細胞を無血清培地中で長期にわたって培養することに成功し、その結果、培養上清中に含まれる有効成分として前述のメタロプロテイナーゼインヒビター（以下、ＴＩＭＰ[Tissue Inhibitor of Metallo Proteinase]と略す。）を見出して、その存在下で牛受精卵を培養するものである。具体的には、基礎培地に市販の組織培養培地ＴＣＭ１９９（日水製薬製）を用い、これにＴＩＭＰを添加して牛受精卵を体外培養している。
本発明によれば、組成が不明である血清を用いることなく、組成が明らかな無血清培地を用いて胚の発生を促すことが可能である。
【０００３】
【非特許文献１】W. H. Eyestone and N. L. First, "Co-culture of early embryos to the blastocyst stage with oviducal tissue or in conditioned medium", Journal of Reproduction & Fertility, 1989
【非特許文献２】J. E. Ellington et al, "Bovine 1-2-cell embryo development using a simple medium in three oviduct epithelial cell coculture systems", Biology of Reproduction, 1990
【特許文献１】特開平６−１９７６６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述の非特許文献１に開示された発明においては、前述のとおり血清が使用されており、その化学的組成が不明で品質にもばらつきがありウイルスによる汚染などの可能性もあるという課題があった。また、これらの原因によって正常な胚の発生阻害や胎仔の過大化などの可能性もあるという課題もあった。
非特許文献２に開示された発明においては、卵管細胞と共培養する必要があり、胚組織の培養に手間がかかるという課題があった。
さらに、特許文献１に開示された発明においては、ＴＩＭＰが発育促進の機能を発揮するものの、ＴＩＭＰが高価であり広く普及するにはコスト的な課題があった。
本発明はかかる従来の事情に対処してなされたものであり、組成が明確で血清を添加した培地に係る不都合な要因、例えばウイルスへの感染や正常な胚発生の阻害、胎仔の過大化などを排除可能な無血清の培養液であって、比較的簡単な組成で取扱いも容易でしかも安価に製造することが可能な無血清初期胚培養液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の請求項１に記載の無血清初期胚培養液においては、上述の問題点を解決するため、培養液ＳＯＦ(Synthetic Oviduct Fluid)に含有される塩化カルシウムに代えてヘミカルシウムラクテートを添加するものである。
上記構成の無血清初期胚培養液においては、塩化カルシウムに代えられるヘミカルシウムラクテートが、カルシウム濃度を維持し、かつエネルギー源として胚の発育を支持するように作用する。
【０００６】
また、請求項２に記載の発明である無血清初期胚培養液においては、請求項１に記載の無血清初期胚培養液において、アラニン、グリシン、タウリン、インスリンのうち少なくとも１つのアミノ酸構成成分を添加するものである。
上記構成の無血清初期胚培養液においては、これらのアミノ酸構成成分が添加されることによって、エネルギー源となると同時に解毒作用やｐＨの調整を促進させてタンパク合成を活発化させる作用を有する。
さらに、請求項３に記載の発明である無血清初期胚培養液においては、含有成分が特許請求の範囲の表１で表される濃度であることを特徴とするものである。
上記構成の無血清初期胚培養液においては、請求項１と請求項２に記載の無血清初期胚培養液の両方の作用を備えている。なお、濃度の範囲として±１０％と記載しているのは、特にその数値のみに限定するものではないという意味があるのと同時に、試験などを実施した際には培養液を調製する際に、略±１０％程度の液量測定誤差が生じており、そのような範囲にあっても試験結果では略同等の効果を得ていることが根拠となっている。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の無血清初期胚培養液においては、成分の明確な無血清培養液であるため血清を用いた培地のようなウイルス汚染や品質のばらつきがなく、正常な胚発生や胚組織の培養を行うことができる。また、取扱いが容易で、比較的簡単な組成であることから製造コストも抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明の実施の形態に係る無血清初期胚培養液について表２を参照しながら説明する。
表２の左欄Ａは、培養液ＳＯＦ(Synthetic Oviduct Fluid)の組成表であり、右欄Ｂは本発明の実施の形態に係る無血清初期胚培養液の組成表である。それぞれの組成は１００ｍｌ当たりに含まれる成分量を示している。
【０００９】
【表２】
2005261252.tif 000002
【００１０】
表２の左欄及び右欄において、ＢＳＡは牛血清アルブミンを意味している。本実施の形態に係る無血清初期胚培養液では、培養液ＳＯＦに含まれていた塩化カルシウムに代えてヘミカルシウムラクテートを０．５４ｇ含んでいる。また、その他ＳＯＦに含まれずに本実施の形態に係る無血清初期胚培養液に含まれる成分として、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）が１ｇ含まれている。さらに、グルタミン、アラニン、グリシン、タウリン及びインスリンなどのアミノ酸構成成分がそれぞれ０．１４６ｇ、０．４５５ｇ、０．３７５ｇ、１．２５ｇ、５ｍｇほど含まれている。
ヘミカルシウムラクテートは、塩化カルシウムを除去して加えることによって、カルシウム濃度を維持し、かつエネルギー源として胚の発育が支持されるという効果がある。
また、ＰＶＡは、タンパク質の代替物質として添加するものであり、胚細胞の骨格が維持されるという効果がある。
さらに、グルタミンなどのアミノ酸は、全般的にエネルギー源として機能するとともに、タンパクの合成促進やｐＨや浸透圧の調整のため、あるいは抗酸化剤やキレート剤として働く。
具体的には、タウリンは元々卵胞・卵管に存在するタンパク質であり細胞毒を中和するキレート剤として、あるいは抗酸化剤として働くことがわかっており、この作用を利用するものである。
また、グリシンも卵管あるいは子宮に存在するタンパク質であるが、このグリシンは胚組織の浸透圧を調整する作用や胚の代謝能を向上させる機能も備えている。
インスリンも胚の代謝能を高め、胚組織におけるグルコースの吸収を促進する作用がある。
アラニンは、毒性のあるアンモニウムイオンを中和するキレート効果を備えている。
【００１１】
したがって、これらのアミノ酸構成成分を無血清初期胚培養液に添加することによって、血清添加培地を用いず成分の明確な無血清培地として、しかも高価な薬剤も用いることなく、クローン胚の構築と発育を促進することができる。添加されるアミノ酸は、卵管や子宮などにゆかりのものであるため他の無血清培養液に比較すると卵管液に近い、すなわち自然に近い組成とすることができる。
また、卵丘細胞や卵管上皮細胞などとの共培養も不要であるため取扱いが容易で熟練の研究員でなくとも胚組織の培養を行うことも可能である。さらに、通常の受精胚から核移植胚などの再構築胚まで広く使用することができる。
【００１２】
次に、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液について、受精卵の発育に係る効果を確認するための試験を実施したのでその試験方法とその結果について説明する。なお、対照区として本実施の形態に係る無血清初期胚培養液のヘミカルシウムラクテートに代えて塩化カルシウムを使用した培養液についても併せて試験を実施したので比較しながら説明する。なお、本試験に用いた実施形態に係る無血清初期胚培養液は、請求項３に記載された表に示される濃度範囲の中央値に調整されている。また、対照区の塩化カルシウムを使用した培養液は、本実施の形態に係る培養液においてヘミカルシウムラクテートに代えて塩化カルシウムを加えてヘミカルシウムラクテートの受精卵発育に関する効果を確認するために行う試験であるため、塩化カルシウムを添加した対照区にもグルタミン、アラニン、タウリン、インスリンの４種類のアミノ酸がそれぞれ、０．１４６ｇ／ｌ、０．４５５ｇ／ｌ、０．３７５ｇ／ｌ、５ｍｇ／ｌほど含まれている。
（１）試験方法
ａ）屠場未成熟卵の回収と成熟培養法
屠殺後３〜４時間以内に採取された成牛卵巣を、３０℃〜３４℃の生理食塩液で温めて実験室に運び、実験に供した。卵巣表面の卵胞（５ｍｍ〜７ｍｍ）から１８ゲージ付きのシリンジで卵母細胞を吸引採取した。
採取後、卵母細胞を抗生物質ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）と０．３％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。洗浄後、顆粒膜細胞の付着した卵子を回収し実験に用いた。採取された卵子／顆粒膜細胞複合体を成熟培地（ＴＣＭ１９９液、１０％胎児牛血清）で２回洗浄し、各々約３０個の卵子／顆粒膜細胞複合体を５００μｌの成熟培地に入れ、３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿したインキュベーター内で２０〜２２時間培養した。
ｂ）体外受精
市販の黒毛和牛凍結精液（０．５ｍｌ）を３５℃の温水中で融解し、遠心管にこの精液を入れ、５ｍＭカフェインを含み牛血清アルブミンを含まないＢＯ(Brackett and Oliphant)培地（６ｍｌ）を加えて混合した。この混合液を５分間、１８００回転で遠心分離し、上澄み液を捨てた。この精子洗浄操作をさらに１回同様に行った。その後血球計算盤を用いて精子の濃度を２×１０６個／ｍｌに調整した。
この精子液５０μｌを５ｍＭカフェイン、へパリン（１０μｇ／ｍｌ）及び脂肪酸フリーの牛血清アルブミン（６ｍｇ／ｍｌ）を含むＢＯ培地５０μｌ中に加えた。２１〜２３時間成熟培養した卵を、上記の培地で３回洗浄後、精子浮遊液中に入れ、３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿インキュベーター内で５時間培養することにより受精させた。
受精の時のＢＯ液中の濃度は、精子１×１０６個／ｍｌ、２．５ｍＭカフェイン、へパリン（１０μｇ／ｍｌ）、牛血清アルブミン（３ｍｇ／ｍｌ）であった。
受精卵は、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液で２回洗浄した後、毛細管様ピペットを用いて、受精卵の回りに付着している卵丘／顆粒膜細胞を裸化した。得られた裸化受精卵を、５００μｌの培地中に移した。受精卵はそれぞれの培地中で３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿されたインキュベーター内で培養した。培地は、体外受精後３日目に培地交換を行い、胚の発生状況は、１２日目まで毎日顕微鏡を用いて観察し調べた。ここで、培地交換とは、胚が呼吸し、また、培地中の栄養分の代謝を行う際には、ｐＨの変動、毒性物質（エンドトキシン等）、不要物の増加等があるため、胚を除去しないように培地だけをピペットで吸って、次に新しい培地を入れることにより交換する作業をいう。
試験用培地中の組成において、ヘミカルシウムラクテートを添加した区と、塩化カルシウムを添加した区と、２区間で胚の発生を比較した。培養数は、ヘミカルシウムラクテートを添加した区では１１２、塩化カルシウムを添加した区では１１０である。
【００１３】
（２）試験結果
試験の結果を表３に示す。
【００１４】
【表３】
2005261252.tif 000003
【００１５】
表３において、培養液の欄にヘミカルシウムラクテートとあるのは本実施の形態に係る培養液であり、塩化カルシウムとあるのは、対照区としてヘミカルシウムに代えて塩化カルシウムを添加した培養液である。表３によれば、３日目の胚分割に至った受精卵は、ヘミカルシウムラクテートの区で８１で、塩化カルシウムの区では７０と、若干ヘミカルシウムラクテートの区の方が成績はよいが、これは統計的にいえば有意な差とはいえなかった。２区間の検定は、カイ２乗検定法で行った。数値が５以下の場合にはFisherの直接確率計算法により比較した。危険率が５％以下のものを有意な差があるものと判定した。
一方、８日目に桑実胚あるいは胚盤胞まで至っている受精卵は、ヘミカルシウムラクテートの区では符号ａで示すとおり５４であるのに対し、塩化カルシウムの区では符号ｂで示すとおり３３となった。この結果については、前述のとおり５％の危険率でカイ２乗検定を実施した結果、ａ，ｂの異符号間で有意な差と認められた。但し、胚盤胞のみで見るとヘミカルシウムラクテートの区で１０であるのに対して塩化カルシウムの区では５であり、これに対しては試料数が小さいために統計的には有意な差は認められなかったが、胚盤胞に至る確率もほぼ倍の数値を得ることができた。
以上の試験結果からすると、塩化カルシウムよりもヘミカルシウムラクテートを添加した無血清初期胚培養液の方が受精卵が発育する際、特に８日目以降の桑実胚から胚盤胞に至るまでの培養に大きな効果を発揮しており、培養液として望ましいことがわかる。
なお、本試験を実施するに際して、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液を調製する際に各成分の液量を測定しながら行ったが、測定には略１０％の誤差が含まれていたものの、その試験結果については概ね同等の結果が得られた。
【００１６】
次に、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液に対し、核移植した胚組織の培養に関する効果について他の無血清培養液と比較する試験を実施したのでその結果について説明する。ここでも、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液とは、請求項３に記載された無血清初期胚培養液の中央値の成分を備える培養液である。
（１）試験方法
ａ）屠場未成熟卵の回収と成熟培養法
屠場未成熟卵を、ヘミカルシウムラクテートの効果を確認するための試験と同じ方法で回収し、成熟培養した。
ｂ）卵子の除核
成熟培養後、卵子を０．１％ヒアルロニダーゼ添加ＴＣＭ１９９液内で卵子に付着している卵丘／顆粒膜細胞を裸化した。これらの裸化卵子から第１極体を放出している成熟卵子を実体顕微鏡下で選別し、５μｇ／ｍｌヘキスト添加ＴＣＭ１９９液内で１０分間染色した。その後、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーターに取り付けたガラス微細針を使って卵子の透明体を切開して第１極体と周辺の細胞質を押し出し、紫外線をあてて押し出した卵子細胞質内の核を確認した。
ｃ）細胞融合
雌成牛の皮膚に由来する培養細胞株をトリプシン処置してドナー核となる体細胞を準備した。これらの体細胞を上記の方法で除核した卵子の囲卵腔内に微細ガラスピペットを使って注入し卵子細胞質と密着させた。細胞注入後、卵子を細胞融合液（０．３Ｍマンニトール、０．０５ｍＭカルシウム、０．１ｍＭマグネシウム）内に移し、２．２５ｋＶ／ｃｍの直流電流を２５μｓｅｃ間隔で２回与え、卵子細胞質と注入した体細胞を電気的に融合した。その後、細胞融合した胚を１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド添加ＴＣＭ１９９液内で４時間培養して活性化処置した。
活性化処置後に得られた核移植胚を本実施の形態に係る無血清初期胚培養液で３回洗浄し、１００μｌの培地中に移した。核移植胚はそれぞれの培地中で３８．５℃で５％炭酸ガス／９５％空気の加湿されたインキュベーター内で培養した。培地は、体外受精後３日目に培地交換を行い、胚の発生状況は、１２日目まで毎日顕微鏡を用いて観察し調べた。
試験では、核移植胚を本実施の形態に係る無血清初期胚培養液で培養した区と５％牛胎仔血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）添加ＣＲ１ａａ液で培養した区の２区間で胚の発生を比較した。培養数は、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液による区では１０４、ＦＢＳを含む培地による区は１５４である。
【００１７】
（２）試験結果
試験の結果を表４に示す。
【００１８】
【表４】
2005261252.tif 000004
【００１９】
表４によれば、２日目において胚分割に至っている核移植胚の数は、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液の区で９３、ＦＢＳを含む培地による区では１４０となっており、発育における差はほとんど見られない。もちろん、検定によって有意な差は認められなかった。
しかし、７日目において桑実胚あるいは胚盤胞まで至っている核移植胚は、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液による区では６１、ＦＢＳを含む培地による区では７７と、桑実胚と胚盤胞の数を加えた場合では統計的な有意差はないものの若干ながら本実施の形態に係る無血清初期胚培養液による区の方が発育の促進効果がより高く現れている。
但し、胚盤胞のみに限定してみると、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液にのよる区が符号ａで示されるように１８であるのに対し、ＦＢＳを含む培地の方が符号ｂで示されるように５８と２倍以上の確率で発育していることがわかる。この数については、前述の５％の危険率でカイ２乗検定を実施したところ、ａ，ｂの異符号間で有意な差として認められた。
以上の試験結果から、通常クローン胚の培養に使用されているＣＲ１ａａ液と対照させながら、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液が体細胞クローン胚の発育を支持するか否かについては、桑実期胚以上への核移植胚の発育は血清を添加しているＣＲ１ａａ液と同等であった。また、胚盤胞までの発育では、ＣＲ１ａａ液と有意な差を生じてしまったが、本実施の形態に係る無血清初期胚培養液であっても、ＣＲ１ａａ液の約５割の確率では培養が可能であることが示された。
本試験を実施する際においても、無血清初期胚培養液を調製する際に、各成分の液量を測定しながら行ったが、測定には略１０％の誤差が含まれていたものの、その試験結果については概ね同等の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明に係る無血清初期胚培養液は、組成が明確であると同時に安価な成分を用いるものであるので、低いコストで量産が可能であり、体外受精卵の培養液の他、クローン胚の構築、発育のための培養液として利用することができる。