(57)【要約】    【課題】 ヒトにおける気管支喘息発症危険因子を検出する方法、そのために用いられるオリゴヌクレオチドおよび検出キットを提供する。    【解決手段】ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝子の変異を伴う遺伝子多型を検出する方法であって、（a）被検者からヒトTRAIL受容体遺伝子を含む核酸を得、（b）当該核酸のDNA配列を決定して、ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型を検出する、気管支喘息発症危険因子の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝子の変異を伴う遺伝子多型を検出する方法であって：
（a）被検者からヒトTRAIL受容体遺伝子を含む核酸を得、
（b）当該核酸のDNA配列を決定して、ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型を検出する、気管支喘息発症危険因子の検出方法。
【請求項２】
ヒトTRAIL受容体遺伝子が、ヒトDR4遺伝子である請求項1に記載の検出方法。
【請求項３】
気管支喘息が、成人気管支喘息である請求項2に記載の検出方法。
【請求項４】
遺伝子の変異が、配列番号1に記載のDNA配列の25394番目のGからAへの変異である請求項2または3に記載の検出方法。
【請求項５】
ヒトTRAIL受容体遺伝子が、ヒトDR5遺伝子である請求項1に記載の検出方法。
【請求項６】
気管支喘息が、小児気管支喘息である請求項5に記載の検出方法。
【請求項７】
遺伝子の変異が、配列番号2に記載のDNA配列の137番目のCからTへの変異である請求項5または6に記載の検出方法。
【請求項８】
ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、ヌクレオチド直接配列決定法、PCR-対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)とドットブロットハイブリダイゼーションによる分析法、一塩基伸長法、PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析法、PCR-制限酵素断片長多型(RFLP)分析法、インベーダー法および定量的リアルタイムPCR検出法からなる群から選ばれる少なくとも一つの方法によって行われる請求項1に記載の検出方法。
【請求項９】
ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、制限酵素Mbo Iを用いたPCR-RFLP分析法によって行われる請求項8に記載の検出方法。
【請求項１０】
ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、制限酵素Pst Iを用いたPCR-RFLP分析法によって行われる請求項8に記載の検出方法。
【請求項１１】
請求項1に記載の検出方法においてPCR反応用プライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号3から6のいずれかから選択される請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項11または12に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、請求項1に記載の検出方法のための検出キット。
【請求項１４】
更に制限酵素Mbo Iを有効成分として含有する、請求項9に記載の検出方法のための請求項13に記載の検出キット。
【請求項１５】
更に制限酵素Pst Iを有効成分として含有する、請求項10に記載の検出方法のための請求項13に記載の検出キット。
【請求項１６】
配列番号1に記載のDNA配列において、25394番目のGからAへの変異を有することを特徴とするヒトDR4遺伝子。
【請求項１７】
配列番号2に記載のDNA配列において、137番目のCからTへの変異を有することを特徴とするヒトDR5遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝子の変異(遺伝子多型)を検出する方法、即ち、ヒト気管支喘息発症の危険因子を検出する方法、該検出方法に利用するオリゴヌクレオチドおよび検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本人成人の約3％および小児の約6％は、気管支喘息に罹患しているといわれている。この気管支喘息（複合疾患）は、喘鳴、咳、息切れなどを伴う慢性の可逆的気道閉塞を臨床的特徴としている。該気管支喘息は、近年増加の一途をたどっている疾患の一つであり、その病態の解明などが待たれている。
【０００３】
該気管支喘息の病態解明の手がかりとしての遺伝因子に関する報告の一つに、双生児研究において、どちらか一方がアレルギー疾患に罹患していると、片方の羅患率は一卵性双生児の方が二卵生双生児より高い旨の報告がある(Manian P, Chest 112, 1397-1408, 1997)。この報告では上記アレルギー疾患に関連する遺伝素因をアトピーと呼んでいる。またこの報告は、喘息とアトピー感受性に対する全ゲノムスクリーニングの結果、これら疾患に関連する幾つかの染色体上の候補領域を示唆している。
【０００４】
近年、かかるアトピー性の皮膚炎や気管支喘息に関して、数多くの遺伝素因の同定が活発に行われている。この同定のための解析手法は、(1)患者−対照研究（ケースコントロールスタディ）、(2)兄弟例を用いた罹患同胞対解析、(3)大家系を用いたリンケージ解析、および(4)動物モデルを用いた解析に大別される（Lander ES et al.,Science 265, 2037-2048, 1994）。そのうちの(2)に属する気管支喘息・アトピー性皮膚炎患者の全ゲノムスクリー二ングの解析結果から、これら疾患に関連する幾つかの染色体上の候補領域が明らかにされた(非特許文献1)。
【０００５】
また、喘息の病態から考えられる機能異常を引き起こす遺伝子についての解析も行われ、気管支喘息発症に相関する関連遺伝子群の多型が報告されている (非特許文献2)。
【０００６】
上記の他にも、以下の各種遺伝子の多型が、気管支喘息の発症に相関することが報告されている。
(1)β2 アドレノレセプター("β2-adrenorecepter", Hopes, E., et al., BMJ., 316, 664, 1998)、
(2)腫瘍壊死因子("tumor necrosis factor; TNF", Moffatt, M.F. & Cookson, W.O., Hum. Molec. Genet., 6, 551-554, 1997)、
(3)血小板活性化因子("platelet-activating factor; PAF", Stafforini, D.M., et al., J. Clin. Invest., 103, 989-997, 1999)、
(4)顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子("granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF", Rohrbach, M., et al., J. Allergy Clin. Immunol., 104, 247-248, 1999)、
(5)インターロイキン-4 レセプター("interleukin 4 receptor; IL-4 receptor", Ober, C., et al., Am. J. Hum. Genet., 66, 517-526, 2000)、
(6)ディスインテグリンアンドメタロプロテアーゼドメイン33("disintegrin and metaroprotease domain 33", Van Eerdewegh, P., et al., Nature, 418, 426-430, 2002)。
【０００７】
更に、気管支喘息・アトピー性皮膚炎に関連する候補遺伝子のひとつが、第8 染色体上に位置することが報告されている。例えば、オーバー(Ober)らは、693 人で行った連鎖解析において、第8 染色体長腕に、喘息感受性(p=0.0009)との連鎖を見出している(非特許文献3)。
【０００８】
以上のように、気管支喘息乃至アトピー性皮膚炎疾患に関与する候補遺伝子およびその多型（変異）について種々の報告が既になされている。
【０００９】
一方、ヒトゲノムにおいて、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism: SNP)は、最も頻度の高い遺伝子多型マーカーであり、これまでにありふれた疾患、薬剤応答などの関連解析で有用であることが示されている(非特許文献4-6)。
【非特許文献１】Sengler C et al., Respir Res 3, 7-7, 2002
【非特許文献２】Cookson W, Nature 402, B5-11, 1999
【非特許文献３】Ober, C., et al., Am. J. Hum. Genet., 68, 1437-1446, 2001
【非特許文献４】Brookes, A.J., Gene, 234, 177-186, 1999
【非特許文献５】Cargill, M., et al., Nature Genet., 22, 231-238, 1999
【非特許文献６】Evans, W.E. & Relling, M.V., Science, 286, 487-491,1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の主要な目的は、ヒトにおける気管支喘息の発症を引き起こすかまたは将来子孫に先天的に気管支喘息発症を伝達する可能性を有する遺伝的変異(遺伝子の多型, SNP)、即ち、気管支喘息を発症する危険因子(変異遺伝子)を検出する手段を提供することにある。
【００１１】
本発明者らは、従来より、気管支喘息の発症に相関する遺伝子およびその多型につき鋭意研究を重ねてきたが、その過程で、従来報告された例のないヒトTRAIL受容体遺伝子に着目した。
【００１２】
該TRAIL受容体は、TNF受容体スーパーファミリーのメンバーに属する細胞膜蛋白質であり、各種細胞のアポトーシス誘導能を持つことが知られている。また、TRAIL受容体の一つであるDR4(death recepter-4)の遺伝子は、ヒト染色体8p21に存在しており、他の一つであるDR5(death receptor-5)の遺伝子は、8p22-p21に存在している。しかしながら、これまでTRAIL受容体遺伝子もしくはその変異が気管支喘息乃至アトピー性皮膚炎に関連する旨の報告は皆無である。
【００１３】
本発明者らは、引き続く研究の結果、このTRAIL受容体DR4およびDR5の各遺伝子の特定位置における変異が、それぞれヒト気管支喘息の発症に関与するという新しい事実を見出した。本発明はこの新しい知見を基礎として完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、下記項1-項10に示す気管支喘息発症危険因子の検出方法並びに下記項11-項17に示す本発明検出法に用いるオリゴヌクレオチド、検出用キットおよび変異を有するヒトTRAIL受容体遺伝子を提供する。
【００１５】
項1. ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝子の変異を伴う遺伝子多型を検出する方法であって：
（a）被検者からヒトTRAIL受容体遺伝子を含む核酸を得、
（b）当該核酸のDNA配列を決定して、ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型を検出する、気管支喘息発症危険因子の検出方法。
【００１６】
項2. ヒトTRAIL受容体遺伝子が、ヒトDR4遺伝子である項1に記載の検出方法。
【００１７】
項3. 気管支喘息が、成人気管支喘息である項2に記載の検出方法。
【００１８】
項4. 遺伝子の変異が、配列番号1に記載のDNA配列の25394番目のGからAへの変異である項2または3に記載の検出方法。
【００１９】
項5. ヒトTRAIL受容体遺伝子が、ヒトDR5遺伝子である項1に記載の検出方法。
【００２０】
項6. 気管支喘息が、小児気管支喘息である項5に記載の検出方法。
【００２１】
項7. 遺伝子の変異が、配列番号2に記載のDNA配列の137番目のCからTへの変異である項5または6に記載の検出方法。
【００２２】
項8. ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、ヌクレオチド直接配列決定法、PCR-対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)とドットブロットハイブリダイゼーションによる分析法、一塩基伸長法、PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析法、PCR-制限酵素断片長多型(RFLP)分析法、インベーダー法および定量的リアルタイムPCR検出法からなる群から選ばれる少なくとも一つの方法によって行われる項1に記載の検出方法。
【００２３】
項9. ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、制限酵素Mbo Iを用いたPCR-RFLP分析法によって行われる項8に記載の検出方法。
【００２４】
項10. ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型の検出が、制限酵素Pst Iを用いたPCR-RFLP分析法によって行われる項8に記載の検出方法。
【００２５】
項11. 項1に記載の検出方法においてPCR反応用プライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチド。
【００２６】
項12. 配列番号3から6のいずれかから選択される項11に記載のオリゴヌクレオチド。
【００２７】
項13. 項11または12に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、項1に記載の検出方法のための検出キット。
【００２８】
項14. 更に制限酵素Mbo Iを有効成分として含有する、項9に記載の検出方法のための項13に記載の検出キット。
【００２９】
項15. 更に制限酵素Pst Iを有効成分として含有する、項10に記載の検出方法のための項13に記載の検出キット。
【００３０】
項16. 配列番号1に記載のDNA配列の25394番目のGからAへの変異を有することを特徴とするヒトDR4遺伝子。
【００３１】
項17. 配列番号2に記載のDNA配列の137番目のCからTへの変異を有することを特徴とするヒトDR5遺伝子。
【００３２】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３３】
尚、本明細書中に示されるヒトTRAIL受容体遺伝子の核酸の番号は、DR4遺伝子については次の通りとする。即ち、パンら(Pan et al.)によってジーンバンク(GenBank)にアクセッション番号U90875として登録されているDR4mRNA配列(全長1407bp)を元にして検索して得られたDR4遺伝子を含むゲノム配列（ビレーネら(Birrne et al., ), GenBank アクセッション番号AC100861、全長164,692bp）中の54,205-87,572配列を配列番号1として、この配列番号1に示される開始コドンATGのAを1として3'下流側に向かって連続して数えるものとする。この数え方によれば、本発明における特定の変異の位置、即ちGからAへの変異の位置は、配列番号1に示される配列の25,394番目と数えられる。この位置は、DR4遺伝子を含むゲノム配列(AC100861)の79,598番目に相当する。
【００３４】
また、DR5遺伝子については次の通りとする。即ち、シェリダンら(Sheridan et al.)によってジーンバンク(GenBank)にアクセッション番号AF012535として登録されているDR5mRNA配列(全長1799bp)を元にして検索して得られたDR5遺伝子を含むゲノム配列（ビレーネら(Birrne et al., ), GenBank アクセッション番号AC107959、全長211,291bp）中の85,014-131,819配列の相補鎖の核酸配列を配列番号2として、この配列番号2に示される開始コドンATGのAを1としてこれに隣接する5'上流側に順次マイナス(-)を付して数えるものとする。この数え方によれば、本発明における特定の変異の位置、即ちCからTへの変異の位置は、-91番目（配列番号2に示される配列の先頭から137番目）と数えられる。この位置はDR5遺伝子を含むゲノム配列(AC107959、相補鎖)の131,680番目に相当し、この変異は該相補鎖ではGからAへの変異になる。
【００３５】
本明細書において「遺伝子」なる語は、2本鎖DNAのみならず、それを構成する各1本鎖DNA（センス鎖およびアンチセンス鎖）を包含する。即ち、遺伝子（DNA）は、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNA、cDNAを含む1本鎖DNA（センス鎖）、該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNAおよびそれらの断片を含む。また、上記遺伝子（DNA）は、調節領域、コード領域、エキソンおよびイントロンを含んでいてもよい。ヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、RNAおよびDNAを包含する。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む。ポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体および変異体を含む。
【００３６】
また、本明細書において、SNP（Single nucleotide polymorphism: 一塩基多型）とは、ある遺伝子乃至遺伝子群における一塩基の核酸の置換(変異)として表わされる。
【００３７】
本発明は、TRAIL受容体遺伝子の特定位置における変異(SNP)がヒト気管支喘息の疾患感受性と強く相関しており、該特定のSNPを検出すれば、気管支喘息の発症乃至その危険性を予測診断できるという事実の発見に基づいて完成されている。本発明に係わる検出方法は、検体におけるSNPの検出を行うことを必須の要件とする。
【００３８】
本発明方法によって検出(解析)される、ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝的変異を含むSNP（気管支喘息発症危険因子のSNP）は、ヒトTRAIL受容体遺伝子の特定位置における特定の変異、即ち(1)配列番号1に記載のDNA配列の25394番目のGからAへの変異、および(2)配列番号2に記載のDNA配列の-91番目(先頭から137番目)のCからTへの変異である。
【００３９】
本発明に係る遺伝子多型の検出方法およびこれによって検出される変異を有するTRAIL受容体遺伝子の提供は、ヒト気管支喘息、特に早期発症の気管支喘息における発症危険因子の解明、把握、診断、予防および治療に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明に係るTRAIL受容体遺伝子多型の検出は、気管支喘息の治療または処置に有効と考えられる新薬、例えばTRAIL受容体遺伝子の多型部位の作用点を標的とした薬剤などの開発の上でも有用である。更に、個体或は組織における本発明遺伝子多型の検出は、気管支喘息の解明、喘息発症前の早期診断にも有用である。
【００４０】
本発明方法によって検出されるヒトTRAIL受容体遺伝子の変異には、上記(1)および(2)として示される具体的なヒトTRAIL受容体遺伝子の変異と共に該遺伝子の相補鎖における対応する変異も包含される。
【００４１】
本発明TRAIL受容体遺伝子の変異を有するDNA分子は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体的配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。より具体的には、上記特定の変異を有するTRAIL受容体遺伝子を保有するヒトまたは気管支喘息患者より、常法に従ってcDNAまたはゲノムDNAを抽出し、本発明TRAIL受容体遺伝子に特有の変異を含む適当なプローブ、制限酵素、抗体などを用いて所望クローンを選択することにより取得できる。かかるクローンの選択は常法に従うことができる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など参照〕。
【００４２】
上記において、cDNAまたはゲノムDNAの起源としては、TRAIL受容体遺伝子を有する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示できる。具体的には、口腔粘膜、血液（血清、血漿などを含む）、唾液、リンパ、気道粘液、尿、精液などの体液を例示することができる。これら起源材料からのRNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得、そのクローニングなどは、いずれも常法に従うことができる。また、cDNAライブラリーは市販されており、本発明においてはそれらcDNAライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.Inc.）などより市販されている各種cDNAライブラリーなどを用いることもできる。
【００４３】
本発明遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、目的の変異を有するDNA配列に選択的に結合し得る変異部分を含むプローブを作成し、これを用いてプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどを実施するかこれらを組合せて実施すればよい。
【００４４】
上記スクリーニング用プライマーとしては、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーを用いることができる。これらは常法に従い、例えば自動合成装置を用いて合成することができる。該スクリーニング用プローブは、通常、標識したプローブであるが、直接的または間接的に標識したリガンドと特異的結合できるものであれば、非標識のものであってもよい。プローブおよびリガンドの標識剤および標識法は、既にこの種技術分野でよく知られている。その例としては、例えばニック・トランスレーション、ランダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識剤、ビオチン、蛍光性色素、化学発光剤、ルシフェラーゼなどの酵素、抗体などを例示することができる。
【００４５】
抽出した遺伝子あるいはmRNAは、遺伝子増幅法によって増幅させ得る。この増幅によって、本発明検出方法における検出をより容易に且つ精度の高いものとすることができる。遺伝子増幅法の例としては、PCR法（Saiki, R.K., Bugawan, T.L., et al., Nature, 324, 163-166(1986))、NASBA法（Comptom, J., Nature, 650, 91-92(1991)）、TMA法（Kacian, D.L., and Fultz, T.J. , 米国特許第5,399,491号 (1995)）、SDA法（Walker, G.T., Little, M.C., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396 (1992)）などが挙げられる。
【００４６】
尚、かかるPCR法などで増幅させた遺伝子断片の単離精製は、常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法などによればよく、またカラムを利用して精製してもよい。その確認は例えばマススペクトルによることができる。
【００４７】
これらの方法により増幅された遺伝子は、その増幅物の特性に応じて、本発明に係るTRAIL受容体遺伝子の検出に供される。
【００４８】
以下、本発明検出方法につき詳述する。
【００４９】
本発明検出方法では、まず被験者からヒトTRAIL受容体遺伝子を含む核酸(検体)を調製する。被験者としては変異を有するヒトTRAIL受容体遺伝子を保有すると想定されるヒト(通常、気管支喘息患者)を挙げることができる。核酸としては、好ましくは該被験者由来のDNAまたはゲノムDNAを例示できる。かかる核酸は、被験者の組織、細胞など、好ましくは血液、標的組織細胞などより、常法に従い抽出して調製できる。
【００５０】
次いで、本発明方法では上記核酸のDNA配列を決定して、ヒトTRAIL受容体遺伝子の多型を検出する。DNA配列の決定および多型の検出は、例えば以下に示すような各種の方法に従って実施することができる。
【００５１】
(1)  ヌクレオチド直接塩基決定法
DNA配列の決定は、この種遺伝子のDNA配列決定に慣用されている、例えばダイデオキシ法(Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977))、マキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などの直接塩基配列決定法に従って実施することができる。
【００５２】
これらの方法は、PCR法などのDNA増幅法と組合せて実施することもできる。特に、少量のDNA試料を用いて簡便かつ容易にしかも感度および精度の高い検出が可能である観点からは、PCR法もしくはそれに準じたDNA増幅法を組合せた方法が好ましい。
【００５３】
この好ましい方法は、基本的には、例えばPCR法で増幅させた遺伝子断片（検体）をプラスミドにクローニングし、次いでダイデオキシ法、マキサム−ギルバート法などに従って、直接塩基配列をシーケンスすることにより、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いてヌクレオチド配列を決定することにより実施できる。かくして、ヒトTRAIL受容体遺伝子における前述した特定部位における変異の存在の有無を検出できる。
【００５４】
上記方法および以下に示す各方法において、検体としてのPCR法で増幅させるDNAは、前述した変異の存在が想定される特定部位を含む限り特にその長さに限定はない。通常、約数十(50-100程度)から数千塩基の長さ、好ましくは数十(50-100)から数百塩基の長さを有するものであるのがよい。
【００５５】
(2)  対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド−ドットプロット分析
本発明に係るDNA塩基配列の決定および遺伝子多型(SNP)の検出の別法は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)ドットブロット法(Conner, B.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 278-282(1983))に従うことができる。該方法は、例えば目的とするSNPを挟むように設計したフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーを利用して、PCR増幅した遺伝子断片に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズするDNA断片を、ドット・ブロット分析することにより実施できる。かくして、該断片中にSNPが存在するか否かを決定できる。
【００５６】
(3)  一塩基伸長法
本発明TRAIL受容体遺伝子多型（SNP）の検出は、また、スナップショット法、ピロシーケンス法、特開平2000-279197号に開示の点変異検出法のような一塩基伸長法を用いても実施することができる。これらの方法を採用する場合、目的の変異(SNP)の直前の塩基または数塩基前の塩基に対応するように設定したプローブ、即ち、その3'末端を検出目的である変異の1塩基上流または近傍に設定したプローブをDNA検体にアニーリングさせればよい。上記各方法は、市販のSNP検出用キットおよび該キットに添付のソフトウエアを利用して実施することができる。
【００５７】
例えばスナップショット法は、ABI PRISM SNaPshot ddNTP Primer Extension Kit(ABIバイオシステムズ社製)を用いて実施できる。SNPは、反応後に生成した蛍光フラグメントを、ABI PRISM310/337/3100/3700DNA Analyzer(いずれもABIバイオシステムズ社製)とGeneScanソフトウエアを用いて解析することにより、検出できる。
【００５８】
ピロシーケンス法は、例えば、以下のごとくして実施できる。即ち、血液サンプルなどから常法によりゲノムDNAを単離し、ビオチン標識したプライマーを用いて変異を含む数十から数百塩基をPCR増幅させ、マグネットビーズを用いて一本鎖DNAを精製し、この精製DNAを検体とする。該検体に、所望の変異の数塩基上流からシーケンスするように設定したプライマーをアニリングさせ、次いでソフトウェアに入力された変異付近のシーケンスに従って装置に1種類ずつdNTPを添加する。DNAポリメラーゼが塩基伸長するとピロリン酸(PPi)を生成するので、該PPiをスルフリラーゼ(Sulfurylase)によりATPに返還させ、これをルシフェラーゼの基質として発光検出器、CCDカメラなどを用いて化学発光を検出する。かくして、添加したdNTPに応じて得られる発光のピークを解析することによって遺伝子のタイピングが可能となる。該方法を用いれば、96サンプルを15分ほどでタイピングすることができる。
【００５９】
上記方法において試薬および装置としては、通常のもの、例えばDNAポリメラーゼ、ATP-スルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ(apyrase)の4種の酵素混合液、ルシフェリンおよびAPS（アデノシン5'硫酸リン酸）からなる基質液、dATP(デオキシアデノシンα−チオ・３リン酸)、dCTP、dGTPおよびdTTPからなるdNTPを構成要素とする市販のSNP Reagent Kits(Pyrosequencing AB社製)などの試薬、並びに自動DNA配列分析のためのPSQ96システム(Pyrosequencing AB社製)およびその使用のためのSNPソフトウェア(Pyrosequencing AB社製)を用いることができる。
【００６０】
また、上記ピロシーケンス法は、例えば米国特許第6,159,693号の記載に従って、核酸を単離後、増幅させ、増幅したPCR産物を精製後、READITTM System(プロメガ・コーポレーション社製)を用いて、これにピロリン酸を反応させ、得られデータを分析することによっても実施できる。このデータ分析には、例えば市販のREADIT技術(プロメガ・コーポレーション社製)を利用したExcel分析を採用できる。
【００６１】
(4)  PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析法
更に、本発明に係る検出法には、前述したPCR増幅産物(一本鎖DNA）を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動して、その移動度の差異により一塩基変異の有無を識別するPCR-SSCP法（Orita, M., Iwahara, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86, 2776-2770(1989)）を採用することもできる。
【００６２】
(5)  PCR-制限酵素断片長多型（RFLP）分析法
本発明TRAIL受容体遺伝子のSNPの検出にあたり、検出目的とする変異を含む核酸配列が制限酵素認識部位を含んでいる場合、該検出は、制限酵素断片長多型分析法（RFLP法: Botstein, D. R., et al., Am. J. Hum. Gen., 32, 314-331(1980)）によることもできる。
【００６３】
ヒトTRAIL受容体遺伝子がヒトDR4遺伝子の場合、該遺伝子はその塩基配列の25393〜25396領域に制限酵素Mbo Iの特異的切断サイト（GATC）を生じさせるため、この変異はRFLP法によって検出することができる。また、ヒトTRAIL受容体遺伝子がヒトDR5遺伝子の場合、該遺伝子はその塩基配列の-137〜142領域に制限酵素Pst Iの特異的切断サイト（CTGCAG）を生じさせるため、この変異がRFLP法によって検出できる。
【００６４】
かかるRFLP法に用いられる酵素は、目的とするそれぞれの変異箇所の前後配列を認識し得る各種公知の制限酵素であればよい。その具体例としては、例えばMbo IおよびPst Iを例示できる。
【００６５】
RFLP法は、より好適には、PCR-RFLP法によることができる。PCR-RFLP法は、予めPCR法またはその変法などによって検体DNAを増幅・調製後、多量に調製され且つ濃縮された検体DNAについてRFLP法を実施する方法である。かくして、特異的切断サイトの存在の有無を検出することができる。
【００６６】
PCR-RFLP法による本発明TRAIL受容体遺伝子のSNPの検出は、より具体的には、例えば次のようにして行われる。即ち、まず、ヒト生体試料からゲノムDNAを抽出し、該DNAのコード領域の塩基配列番号3473番の位置を含む数十から数百塩基長のDNA断片を増幅させて、多量に且つ濃縮された検体サンプルを得る。次いで、増幅DNA検体を制限酵素Mbo Iを用いて消化し、DNAの切断様式（切断の有無、切断フラグメントの塩基長など）を常法に従って確認する。所望の変異を有する増幅DNAは、上記Mbo I消化により2つのフラグメントを生じるが、この変異を有しない増幅DNAはかかるフラグメントを生じないため、当該方法によって本発明遺伝子の変異を検出できる。
【００６７】
DR4遺伝子多型については、配列番号1中の25393〜25396番目を含む適当な領域を増幅させ、次いでこれを制限酵素Mbo Iで消化し、消化物のDNA切断様式(切断の有無、切断フラグメントの塩基長)を常法に従って確認する。所望の変異を有する増幅DNAは、Mbo Iでは切断されない。変異を有しない増幅DNAは、Mbo I消化により2つのフラグメントを生じるため、当該方法によって本発明遺伝子の変異を検出できる。
【００６８】
DR5遺伝子多型については、配列番号2中の137〜142番目を含む適当な領域を増幅させ、次いでこれを制限酵素Pst Iで消化し、消化物のDNA切断様式(切断の有無、切断フラグメントの塩基長)を常法に従って確認する。所望の変異を有する増幅DNAは、Pst Iでは切断されない。変異を有しない増幅DNAは、Pst I消化により2つのフラグメントを生じるため、当該方法によって本発明遺伝子の変異を検出できる。
【００６９】
(6)  インベーダー法
本発明TRAIL受容体遺伝子のSNPの検出は、またインベーダー(Invader)法により実施することもできる。インベーダー法の実施には、以下の文献が参照できる。
・Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17(3)292-296(1999)および
・国際特許公開WO9823774号(98/6/4)。
【００７０】
インベーダー法は、ゲノムDNAのSNPを分析するのに予め標的DNAを増幅する必要がない方法であって、以下のごとくして実施される。即ち、目的とするTRAIL受容体遺伝子のSNPが存在するかどうかを検出するために、先ずゲノムDNAを単離した後、15から50塩基長からなる5'フラップと検出したい核酸(本発明ではSNP)を5'フラップの3'端に配し、変異核酸以外は標的ゲノムDNAに相補するように合成された30から数百塩基のオリゴヌクレオチドからなる第一の標的プローブと、検出したい核酸に相補的な核酸を3'端に配する以外は、標的ゲノムDNAに相補するように合成された15から数十塩基長のオリゴヌクレオチドからなるインベーダー・オリゴヌクレオチド・プローブとを、例えば自動合成機により合成する。これらのプローブに、単離したゲノムDNAおよび第一のプローブの5'フラップを切断する酵素を同時に加えて適当な反応液中で反応させる。
【００７１】
もし検体中のゲノムDNAが所望の変異核酸(SNP)を有している場合は、変異核酸を3'端に有する5'フラップを遊離する第一の反応が終了する。もし、検体中のゲノムDNAが変異核酸配列を有していない場合は、前記制限酵素による切断が生じない。
【００７２】
制限酵素で切断された第一のプローブから遊離した5'フラップは、標的として蛍光共鳴エネルギー移転(FRET)プローブに相補的に結合し、5'フラップの3'端がFRETプローブ内に侵入(invasion)する。同様に、制限酵素による反応が起こり、蛍光色素が遊離する。
【００７３】
次いで第二の反応に用いられる各FRETプローブは、検出される標的にもかかわらず、同一の配列を含んでいて、本質的に以下の2つのエレメントからなるように構築される：(1)第一の反応から割裂した産物に相補する3'領域、および(2)一本鎖プローブを模倣するために複式を形成し、そして標的が共にハイブリダイズして、それらがレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素を含んでいる自家相補的領域。
【００７４】
前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には、蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制される。前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では、蛍光強度が抑制されない。従って、切断された第一のプローブ・オリゴからの遊離した5'フラップが、FRETプローブにハイブリダイズしたとき、それは第二の反応においてインベーダー・オリゴとして作用し、特異的な構造を認識する酵素によって認識された侵入複合物を産生する。かくして、FRETプローブの特異的な構造を認識する酵素による切断が、二つの蛍光色素を分離し、検出可能な蛍光シグナルを産生する。このようにして標準蛍光マイクロタイタープレート読み取り機器が産物を読み取り検出することができる。第一と第二の反応の組み合わせにより、シグナルを1から1×106倍まで増幅することができる。
【００７５】
(7)  定量的リアルタイムPCR検出法
本発明TRAIL受容体遺伝子の変異の検出は、また定量的リアルタイムPCR検出法(TaqMan法)によっても簡便に実施することができる。
【００７６】
該方法は、以下のごとくして実施できる。即ち、まず、目的とする変異の有無を検出すべき所定の核酸部位を含むDNA断片を、20-25塩基からなるフォワード側プライマーとリバース側プライマーとして作成する。但し、フォワード側プライマーとリバース側プライマーは、いずれも目的とする変異部位を含まないように作成する。次いで、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが結合しており且つフォワード側プライマーがハイブリダイズする領域とプローブがハイブリダイズする領域が互いに重複することがない組み合わせを選択したプローブ(15-50塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド)を作成する。該プローブは、目的とする一塩基の核酸変異の有無を検出するための対立遺伝子特異的配列に相補的な配列を有するように作成する。該プローブを用いて、検体中の測定すべきTRAIL受容体遺伝子の所望の領域をPCRにて増幅し、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。かくして、変異の有無を検出することができる。
【００７７】
尚、前記(6)に示すインベーダー法、およびこの項におけるTaqMan法に用いられるレポーター蛍光色素としては、FAM(6-カルボキシ-フルオレッセイン)のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、TAMRA(6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイム検出PCR用キットに含まれているものを用いることができる。レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチドの一端（好ましくは5'末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合されるのが好ましい。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に記載されている。
【００７８】
リアルタイム検出PCR法自体は公知であり、そのための装置およびキットも市販されている。本発明検出方法ではこのような市販の装置およびキットを用いて実施することができる。また、例えば特許第2825976号に記載の方法に従うか、PEバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決定システム・ユーザーマニュアルに従って実施することもできる。
【００７９】
(8)  その他の検出法
本発明TRAIL受容体遺伝子のSNPの検出は、更に、従来より一般にDNAについてその塩基配列の決定法として、また変異の検出法として知られている、以下に挙げる如き各種の方法によって実施することもできる。
【００８０】
(8-a)  配列特異的オリゴヌクレオチドを用いるPCR-SSO法；各変異に対するプローブを担体に固相化し、これに検体(遺伝子増幅産物)をハイブリダイズさせ、ミスマッチの有無によるハイブリダゼーションの効率の差を判定するもの。
【００８１】
(8-b)  点変異を検出するPCR-SSP法；点変異に対応する塩基を3'末端に設定した遺伝子増幅用配列特異的プライマーを用いて、プライマーの3'末端が相補的であるか否かによってPCRによる増幅効率に著しい差が生じることを利用したもの。
【００８２】
(8-c)  PCR-DGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法；変異DNA断片と正常DNA断片とを混合してハイブリッド結合させた後、尿素、ホルムアミドなどの変性剤の濃度が徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、ミスマッチのないホモ2本鎖に比べて、より低い濃度の変性剤の位置で1本鎖に解離する。1本鎖DNAは、2本鎖DNAに比べて泳動速度が速いため、移動度の差を比較することで1塩基の変異を検出することができる。
【００８３】
(8-d)  PCR-DGGE/GCクランプ法(Shefield,V.C.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86,232-236(1989))；上記PCR-DGGE法に加えて、GC含量の高い領域を変異核酸の検出対象であるDNA断片につなげることにより複数の塩基置換、欠失、付加および挿入がある場合の検出の欠点を補った方法である。該方法は特に変異検出の対象DNA断片にGCクランプを付加する工程を必要とする。
【００８４】
(8-e)  RNase保護アッセイ法(Finkelstein,J., et al., Genomics, 7, 167-172(1990))。
【００８５】
(8-f)  in situ RT-PCR法(Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993))。
【００８６】
(8-g)  in situ ハイブリダイゼーション法。
【００８７】
(8-h)  サザンブロッティング法(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press:NY.(1989))。
【００８８】
(8-i)ドットハイブリダイゼーション法（Southern, E. M. , J. Mol. Biol., 98:503-517 (1975)など参照）。
【００８９】
(8-j)  蛍光in situ ハイブリダイゼーション法(FISH:Takahashi E., et al., Hum. Genet., 86, 1416 (1990))。
【００９０】
(8-k)  競合的ゲノミック・ハイブリダイゼーション法(Comparative Genomic Hybridization:CGH: Kallioneimi, A.,et al., Science, 258,818-821(1992))、(Spectral karyotyping: SKY: Rowley,J.D., et al.,Blood, 93, 2038-2042(1999))。
【００９１】
(8-l)  酵母人工染色体（YAC）ベクターのクローンをプローブとする方法(Lengauer, C., et al., Cancer Res., 52, 2590-2596(1992))。
【００９２】
かくして、本発明方法によれば、検体における気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有する遺伝的変異を含む多型、即ち気管支喘息発症危険因子の存在を検出することができる。
【００９３】
尚、本発明検出方法において、PCR法を採用する場合、該方法に用いられるプライマーまたはプローブは、本発明遺伝子における変異部分(SNP)を含む領域のみを特異的に増幅できるものである限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報に基いて常法に従って適宜合成、構築することができる。例えば、ホスホロアミダイト法またはリン酸トリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置、例えば(Pharmacia LKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)などを使用して合成することもできる。二本鎖断片は、化学合成した一本鎖生成物とその相補鎖を合成し、両者を適当な条件下でアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列とDNAポリメラーゼとを用いて、上記一本鎖生成物に相補鎖を付加させることによって、得ることができる。
【００９４】
前記プローブまたはプライマーとして用いられるヌクレオチドの好適なものとしては、ヒトTRAIL受容体遺伝子の変異を含むように設定されたDNAに対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも10個、通常10-35個、好ましくは少なくとも15個の連続した塩基を有するものを挙げることができる。プライマー対としては、所望の変異部位を挟むように設計、合成されたヌクレオチド配列を有するものを利用する。プローブとして用いられるヌクレオチド配列としては、陽性クローン自体を用いることもできる。
【００９５】
本発明は、TRAIL受容体遺伝子のSNPを検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドをも提供する。該特異プライマーの具体例としては、後記実施例に示される配列番号3-6に示されるフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーを挙げることができる。また、特異プローブとしては、例えばDR4遺伝子の検出の場合は、配列番号1中の25384〜25404番目の配列を、DR5遺伝子の検出の場合は、配列番号2中の127〜147番目の配列をそれぞれ挙げることができる。
【００９６】
本発明検出方法は、検体中のヒトTRAIL受容体遺伝子のSNPの検出のための試薬キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明はかかる検出用キットをも提供する。
【００９７】
本発明キットは、少なくともヒトTRAIL受容体遺伝子(SNP)を含む塩基配列もしくはその相補的塩基配列に(あるいは変異部位の1塩基前または数塩基前の配列からなる配列に)ハイブリダイズするDNA断片、または変異部位を含む数塩基の核酸配列を認識する制限酵素を構成成分として含むことを必須とする。
【００９８】
本発明キットにおける他の成分としては、標識剤、PCR法に必須な試薬（例えば、TaqDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、DNA増幅用プライマーなど）を例示することができる。標識剤としては、放射性同位元素または発光または蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、DNA断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。
【００９９】
本発明は、本発明検出法を利用してヒトにおける気管支喘息発症を引き起こす可能性がある遺伝子の多型を検出する、ヒト気管支喘息発症危険因子の検出方法、特に成人または小児気管支喘息の検出に用いる診断剤並びに診断用キットも提供する。
【発明の効果】
【０１００】
本発明は、ヒト気管支喘息発症危険因子の検出方法、検出用キット、それらに利用する変異検出用プライマーまたはプローブ、およびヒト気管支喘息発症の危険因子に関連する遺伝子を提供する。これらはヒト気管支喘息発症危険因子の新しい検出手段として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０１】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【０１０２】
a) 対象患者（被検者）
対象患者は、大阪府立羽曳野病院に小児気管支喘息で外来および入院している患者384人である。これらの患者の平均年齢は9.75歳(1-17歳、男性：女性比＝1.47：1.0、平均IgEレベル1005.9U/ml)である。これらの患者の多くは、アトピー性喘息と診断されている。また、大阪府立羽曳野病院の内科からの103人、宮武内科からの377人の成人気管支喘息患者(平均年齢45.9歳、18-83歳；男性：女性比＝1.0：1.16、平均IgEレベル441.7U/ml）も対象患者とした。成人患者の20％はアトピー性である。更に、コントロール（対照）として、非喘息ボランティア(健常者)384人を選択した。
【０１０３】
上記対象患者（小児気管支喘息患者および成人気管支喘息患者）および健常者から、それぞれ末梢血を採血し、ゲノムDNAを調製し、これらをゲノム検体として以下の試験に利用した。尚、すべての気管支喘息患者は、日本アレルギー学会のガイドラインに沿う気管支喘息として診断されたものであ流。特に小児気管支喘息疾患の病態は、以下の4つのカテゴリーに分類された。
1)無投薬、2)クロモグリケート(DSCG)および／またはテオフィリン、3)400μg/日以下の吸入グルココルチコイドおよび4)400μg/日以上の吸入グルココルチコイド。
【０１０４】
b) SNPの検出
DR4遺伝子およびDR5遺伝子における特定の変異(SNP)を検出するために、各変異部位を含む所定のゲノム検体を増幅できるように、配列番号3-6に示される各配列を有するフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーからなる2組のプライマー・セットを設定し、各プライマーを自動DNA合成機により合成した。
【０１０５】
配列番号3に示される配列は、配列番号1に示すDR4遺伝子またはそのSNPを含むゲノム検体の増幅のためのフォワードプライマーであり、配列番号1に示される配列の25,275-25,293配列に相当する。
【０１０６】
配列番号4に示される配列は、配列番号1に示すDR4遺伝子またはそのSNPを含むゲノム検体の増幅のためのリバースプライマーであり、配列番号1に示される配列の25,395-25,414配列に相当する。但し、19番目のGは制限酵素認識部位を導入するために変異を入れたものである。
【０１０７】
配列番号5に示される配列は、配列番号2に示すDR5遺伝子またはそのSNPを含むゲノム検体の増幅のためのフォワードプライマーであり、配列番号2に示される配列の4-23配列に相当する。
【０１０８】
配列番号6に示される配列は、配列番号2に示すDR5遺伝子またはそのSNPを含むゲノム検体の増幅のためのフォワードプライマーであり、配列番号2に示される配列の138-159配列に相当する。但し、19-20番目のCTは制限酵素認識部位を導入するために変異を入れたものである。
【０１０９】
これらの各プライマーセットを用いて、ゲノム検体をGeneAmpPCRシステム9700 (PEアプライドバイオシステム社製)によって増幅させた。各PCR反応は、5ngのゲノムDNAを利用して実施した。11μLの反応液は、dNTPs(25mM)、塩化マグネシウム(6.68mM)、硫酸アンモニウム(16.6mM)、トリス塩酸(pH8.8、6.7mM)、β−メルカプトエタノール(10mM)、DR4遺伝子用PCRの場合のみ終濃度10%のDMSO、プライマー・セット(各12.5mM、2セット)およびTaKaRa EX Taq(2.5U;タカラ社製)を含んでいた。
【０１１０】
PCR反応は、95℃2分の後、94℃30秒、55℃(DR5遺伝子用PCRの場合)もしくは58℃(DR4遺伝子用PCRの場合)30秒および72℃30秒を37サイクル行った後、72℃10分間にて最終の伸長反応を行った。
【０１１１】
得られた各PCR産物について、PCR-制限酵素断片長多型(RFLP)分析を行って各SNPの頻度を同定した。
【０１１２】
DR4遺伝子についての変異(多型)を含む11μLのPCR産物に、2単位の制限酵素Mbo I (10Units/μL; TaKaRa社製)、2.1μLの10×Buffer K (TaKaRa社製)および最終液量が21μLとなる量の滅菌水を加えて、37℃で16時間インキュベートした。  DR5遺伝子についての変異(多型)を含む11μLのPCR産物には、同様に、2単位の制限酵素Pst I (50Units/μL; TaKaRa社製)、2.1μLの10×Buffer H (TaKaRa社製)および最終液量が21μLとなる量の滅菌水を加えて、37℃で16時間インキュベートした。
【０１１３】
インキュベート後の各反応産物を4％アガロースゲルで電気泳動し、0.5％エチジウムブロミド溶液にて染色後、UVトランスイルミネーターで染色像を認して、遺伝子型を決定した。
【０１１４】
また、気管支喘息患者と健常者（コントロール、対照）との対立遺伝子頻度をスタットビュJ4.02ソフトウェア(StatView-J4.02 software: Abacus Concepts社製)を使用するcontingency χ二乗テストによって比較した。オッズ比はブラウン(Brown)法に従い評価した(Brown, C.C., Am. J. Epidemiol., 113(4), 474-480, 1981)。
【０１１５】
c) 結果
対立遺伝子比較のために、コントロール（表中「コントロール群と表示する」）384人中359人（この検体数は表中の「N/2」(対立遺伝子の数)に相当する、以下同じ）、小児気管支喘息患者検体（表中「小児気管支喘息群」と表示する）384人中378人、および成人気管支喘息患者検体（表中「成人気管支喘息群」と表示する）480人中477人について、DR4遺伝子の遺伝子多型を解析した結果を表1に示す（表中、遺伝子変異(多型)は「G25394A」と表示する）。
【０１１６】
また、同様にして、コントロール（表中「コントロール群と表示する」）384人中375人（この症例数は表中の「N」(対立遺伝子の組数)に相当する、以下同じ）、小児気管支喘息患者検体（表中「小児気管支喘息群」と表示する）384人中371人、および成人気管支喘息患者検体（表中「成人気管支喘息群」と表示する）480人中380人について、DR5遺伝子の遺伝子多型を解析した結果を下記表2に示す（表中、遺伝子変異(多型)は「C -91T」と表示する)。
【０１１７】
【表１】
2005027595.tif 000002
【０１１８】
【表２】
2005027595.tif 000003
表2および表3に示される結果から、次のことが明らかである。即ち、成人気管支喘息群では、DR4遺伝子の25394番目のAがGに変異したSNP(A25394G(int7))に強い対立遺伝子の関連を観察した(χ2=7.26, df=1, P=0.007)。また、小児気管支喘息群においては、DR5遺伝子の-91番目のCがTに変異したSNP(C-91T(5' UTR))に強い対立遺伝子の関連を観察した（χ2=6.67, df=1, P=0.0098）。
【０１１９】
これらの結果より、DR4遺伝子およびDR5遺伝子における上記特定部位の変異(SNP)が、気管支喘息の病因学において、特に小児気管支喘息の発症において重要な役割を有していることが強く示唆される。
【０１２０】
更に、小児気管支喘息患者群のうち、アトピー性、外因性、抗ダニ抗体陽性の小児気管支喘息患者に対象を絞って（表中「小児気管支喘息(アトピー性喘息)群」と表示）、同様の解析を行った結果(DR5遺伝子の場合)を表3に示す。
【０１２１】
【表３】
2005027595.tif 000004
表3に示されるように、小児気管支喘息(アトピー性喘息)群では、DR5遺伝子の変異であるC -91T(5' UTR)におけるP値は、表2に示される0.0098から0.0082に減少する。このことから、DR5遺伝子における上記変異(SNP)は、特にハウスダストやダニなどに感作されやすくIgEの上昇を伴うアトピー性の小児気管支喘息の発症に関わっていることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明検出方法およびこれによって検出される変異を有するTRAIL受容体遺伝子の提供は、ヒト気管支喘息、特に早期発症の気管支喘息における発症危険因子の解明、把握、診断、予防および治療に極めて有用な情報乃至手段を与える。また、本発明検出方法は、気管支喘息の治療または処置に有効と考えられる新薬、例えばTRAIL受容体遺伝子の多型部位の作用点を標的とした薬剤などの開発にも有用である。更に、本発明方法に従う個体或は組織における遺伝子多型の検出は、気管支喘息の解明、喘息発症前の早期診断にも有用である。
【配列表】
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