(57)【要約】【課題】塩基配列依存性を持たず、かつ、アデニン特異的なクロスリンク反応を生成することが可能なデオキシリボース誘導体および、それを利用した光応答性ヌクレオチドを提供することを課題とする。【解決手段】一般式（１）  【化７】2005348645.tif 000010〔Ｘは水素原子、ジメトキシトリチル基、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｙは水素原子、次式（２）のフォスフォロアミダイト基  【化８】2005348645.tif 000011（Ａは結合部位を示す。）、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｒは−ＣＮ、アミド結合を特徴とする−ＣＯＮＲ1Ｒ2、またはカルボニル結合を特徴とする−ＣＯＯＲ3であって、かかるＲ1ないしＲ3はそれぞれ水素原子またはアルキル基ＣnＨ2n+1（ｎ≧１）を示す。〕であるフェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2005348645.tif 000008
〔Ｘは水素原子、ジメトキシトリチル基、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｙは水素原子、次式（２）のフォスフォロアミダイト基
【化２】
2005348645.tif 000009
（Ａは結合部位を示す。）、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｒは−ＣＮ、アミド結合を特徴とする−ＣＯＮＲ1Ｒ2、またはカルボニル結合を特徴とする−ＣＯＯＲ3であって、かかるＲ1ないしＲ3はそれぞれ水素原子またはアルキル基ＣnＨ2n+1（ｎ≧１）を示す。〕であるフェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体。
【請求項２】
Ｙが式（２）に示すフォスフォロアミダイト基である請求項1のデオキシリボース誘導体を含むことを特徴とする核酸合成用アミダイト試薬。
【請求項３】
ＸおよびＹそれぞれに１塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする請求項１記載のデオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチド。
【請求項４】
ＸまたはＹのいずれか一方に１塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする請求項１記載のデオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２の核酸合成用アミダイト試薬を使用することを特徴とする請求項３または４記載の光応答性ヌクレオチドの合成方法。
【請求項６】
請求項３または４記載の光応答性ヌクレオチドを含む核酸のクロスリンク試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、光応答性ヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、この出願の発明は、アンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、光遺伝子診断治療、ＤＮＡ−蛋白質相互作用の解析等への応用に有用で、光照射により核酸に対し選択的にクロスリンクし、核酸を選択的にラベル化することが可能な光応答性ヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等の核酸の相互における核酸同士のクロスリンク（架橋反応）を特異的に制御することは、遺伝子機能の解析、各種の生理活性物質や生体分子の作用機構の解明など分子遺伝学分野において重要である。さらに、新規な生理活性物質の探索や創製、具体的にはアンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、遺伝子診断治療、すなわち遺伝子発現の制御にかかる分子医薬分野おいても極めて重要である。
現在までのところ、核酸に対するクロスリンクを行う手段としては、ソラレン誘導体（Chang, E. et al. Biochemistry 1991, 30, 8283）やアミノプリン誘導体（特開2001-206896）が知られている。しかしながら、前者は５´−ＡＴ−３´である塩基配列のチミン特異的に反応し、後者は配列依存性はないもののシチジン特異的であるなど、適用範囲に一定の制約があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この出願の発明は、上記の従来技術にかかる核酸架橋反応試薬における問題点を鑑み、塩基配列依存性を持たず、かつ、従来技術においては不可能であったアデニン特異的なクロスリンク反応を生成することが可能なデオキシリボース誘導体および、それを利用した光応答性ヌクレオチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この出願の発明は上記の課題を解決するために下記の手段を提供する。すなわち、この出願の発明は、第一に、一般式（１）
【０００５】
【化３】
2005348645.tif 000002
【０００６】
〔Ｘは水素原子、ジメトキシトリチル基、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｙは水素原子、次式（２）のフォスフォロアミダイト基
【０００７】
【化４】
2005348645.tif 000003
【０００８】
（Ａは結合部位を示す。）、リン酸基または１塩基以上のヌクレオチド鎖を示し、Ｒは−ＣＮ、アミド結合を特徴とする−ＣＯＮＲ1Ｒ2、またはカルボニル結合を特徴とする−ＣＯＯＲ3であって、かかるＲ1ないしＲ3はそれぞれ水素原子またはアルキル基ＣnＨ2n+1（ｎ≧１）を示す。〕であるフェノール骨格を有するデオキシリボース誘導体を提供する。
【０００９】
さらに、この出願の発明は、第２には前記Ｙが式２に示すフォスフォロアミダイト基である前記デオキシリボース誘導体を含むことを特徴とする核酸合成用アミダイト試薬を、第３には、前記Ｘおよび前記Ｙそれぞれに１塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする前記デオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチドを提供する。そして第４には、前記Ｘまたは前記Ｙのいずれか一方に１塩基以上のヌクレオチド鎖が結合されていることを特徴とする前記デオキシリボース誘導体からなる光応答性ヌクレオチドを提供する。
【００１０】
加えて、この出願の発明は、第５には、前記核酸合成用アミダイト試薬を使用することを特徴とする前記光応答性ヌクレオチドの合成方法、ならびに第６には、前記光応答性ヌクレオチドを含む核酸のクロスリンク試薬を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、塩基配列依存性を持たず、かつ、従来技術においては不可能であったアデニン特異的なクロスリンク反応を生成することが可能なデオキシリボース誘導体および、それを利用した光応答性ヌクレオチドを提供する。この出願の発明は、各種の生理活性物質や生体分子の作用機構の解明、新規な生理活性物質の探索や創製、遺伝子の機能解析や発現制御おいての研究開発や実施利用への応用によるそれらの発展に寄与するものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１３】
前記式（１）に示すこの出願の発明の提供するデオキシリボース誘導体は、２−デオキシリボースの１位Ｃに、フェノキシ基がα位で結合しており、このフェノキシ基の３位Ｃにはフェノール骨格に対しＥ配置で置換基Ｒを有するビニル基が付加されている特徴のある構造を有している。Ｒとしては適当な置換基を用いることができ、たとえば、−ＣＮ、アミド結合を特徴とする−ＣＯＮＲ1Ｒ2、またはカルボニル結合を特徴とする−ＣＯＯＲ3が挙げられる。かかるＲ1ないしＲ3はそれぞれ水素原子またはアルキル基ＣnＨ2n+1（ｎ≧１）であるが、Ｒ1およびＲ2は好ましくは水素原子、Ｒ3はメチル基（ＣＨ3）である。この構造における２−ビニルフェノキシ基および置換基Ｒの存在が、核酸との架橋反応を光制御可能とせしめている。
【００１４】
この出願の発明の提供するデオキシリボース誘導体（式１）は、２−デオキシリボースの５位Ｃに結合したＯと結合するＸが、水素原子であってもよく、アセチル基、４，４'，４''−トリス（４−ベンゾイルオキシ）トリチル基、ジメトキシトリチル基などの適当な保護基を導入してもよく、保護基を導入する場合、好ましくは容易で効率的に除去可能であるジメトキシトリチル基を用いる。また、３位Ｃに結合したＯと結合するＹは、水素原子あるいは式（２）のフォスフォロアミダイト基である。
【００１５】
この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、前記式（１）のデオキシリボース誘導体のＹを式（２）のフォスフォロアミダイト基としたデオキシリボース誘導体を含むアミダイド試薬により、フォスフォロアミダイト法によるＤＮＡ合成により提供され、前記式（１）のデオキシリボース誘導体のＸおよびＹのいずれか一方、あるいは双方に１塩基以上のヌクレオチド鎖、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＰＮＡのヌクレオチド鎖を結合したものである。また、前記デオキシリボース誘導体のＸおよびＹは、これらヌクレオチド鎖とのフォスフォジエステル結合形成を目的としてリン酸基によって修飾されていてもよい。
【００１６】
また、この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、前記デオキシリボース誘導体を含む機能性核酸と呼ぶこともできる。ベンゼン環やヌクレオシド部分に許容される他の置換基を有していてもよい。
【００１７】
以下、この出願の発明の提供するデオキシリボース誘導体の作成方法を説明する。
【００１８】
【化５】
2005348645.tif 000004
【００１９】
この出願の発明の提供する式（１）に示すデオキシリボース誘導体の一態様であって、Ｘ、Ｙともに水素原子、すなわち２−デオキシリボースの３位および５位がともにヒドロキシル基あって、Ｒがメチルカルボニル基である式（７）に示す（Ｅ）−１−α−（３´−（メトキシカルボニルビニル）フェノキシ）−２−デオキシリボースは、化５に示す経路によって、式（３）に示すm-iodophenol、および式（４）に示すChlorosugarより、式（４）、式（５）および式（６）に示す反応中間体を経由することによって合成することができる。
【００２０】
また、この出願の発明の提供する式（１）のデオキシリボース誘導体の一態様であって、Ｘがジメトキシトリチル基、Ｙが水素原子である式（８）に示す（Ｅ）−１−α−（３´−（メトキシカルボニルビニル）フェノキシ）−２−デオキシ―５−Ｏ−（４，４´−ジメトキシトリチル）―リボース、および別の態様である、Ｘがジメトキシトリチル基、Ｙが式（２）のフォスフォロアミダイトである式（９）に示す（Ｅ）−１−α−（３´−（メトキシカルボニルビニル）フェノキシ）−２−デオキシ―５−Ｏ−ジメトキシトリチル―リボシド−３−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）フォスフォロアミダイトは、それぞれ化５に示す経路によって、式（７）で示す（Ｅ）−１−α−（３´−（メトキシカルボニルビニル）フェノキシ）−２−デオキシリボースより合成することができる。
【００２１】
前記式（９）のフォスフォロアミダイトは核酸合成用アミダイト試薬としてＤＮＡ合成およびＲＮＡ合成に用いることができる。
【００２２】
この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、２塩基以上１００塩基未満のオリゴヌクレオチドあるいは１００塩基以上のポリヌクレオチドからなるＤＮＡあるいはＲＮＡであり、これより誘導されるＰＮＡも含まれる。この光応答性ヌクレオチドは、前記式（９）のフォスフォロアミダイトを用いフォスフォロアミダイト法によって合成することが可能であり、この合成核酸をもとに公知の方法あるいはこの出願の発明の提供する方法によって切断、あるいはさらに他のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の生体分子と結合、またはこれらの結合・切断方法を組み合わせて作成されたＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＰＮＡであってもよい。この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドは、各種の分析や診断を目的として公知の方法により放射性同位体、蛍光物質の結合などによって化学修飾されたヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
この出願の発明の提供する光応答性ヌクレオチドをもちいた光架橋反応は、架橋形成対象の核酸の共存下に光照射することで可能とされる。具体的には、たとえば３６６ｎｍの光励起により光架橋反応を生じさせることができる。これら光の照射の方法としては各種の手段から選択され、たとえばトランスイルミネータを用いることができる。
【００２４】
以下に実施例を用いてこの出願の発明をさらに詳細に説明するが、下記実施例はこの出願の発明の一態様にすぎず、この出願の発明の実施が下記実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００２５】
〔実施例１〕＜反応中間体の合成１＞
式（３）に示すm-iodophenol (1.04 g, 4.74 mmol)のTHF溶液 (80 mL)に0 °CでNaH (0.20 g, 5.00 mmol)と式（４）に示すChlorosugar（2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-α- D -ribofuranosyl chloride） (2.14 g, 5.00 mmol)を順に加えて10分間撹拌した。反応溶液を室温で19時間撹拌し、TLC (CHCl3)で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー (CHCl3)で精製し、無色油状の生成物１(1.97 g, 73%)を得た。この生成物１は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式（５）に示す反応中間体、すなわち1-α-(m-iodo)phenoxy-2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-riboseと同定された。
【００２６】
1H NMR (CDCl3) d 7.91 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.85 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.34 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 7.28 (dt, 1H, J = 6.9, 1.8 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.18 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 6.90-6.98 (m, 2H), 5.92 (dd, 1H, J = 5.9, 2.7 Hz), 5.67-5.72 (m, 1H), 4.59-4.63 (m, 1H), 4.54-4.59 (m, 1H), 4.40 (dd, 1H, J = 11.6, 3.4 Hz), 2.82 (ddd, 1H, J = 14.5, 6.9, 2.4 Hz), 2.53 (ddd, 1H, J = 14.5, 5.3, 5.1 Hz), 2.40 (s, 3H), 2.38 (s, 3H);
HRMS (ESI) cald. for C27H25IO6Na (MNa+): 595.0588, found: 595.0531.
〔実施例２〕＜反応中間体の合成２＞
前記実施例１の生成物１(1.96 g, 3.43 mmol；式（５）)のdichloromethane溶液(100 mL) に0.5 M methanolic NaOMe (20 mL, 10 mmol)を加えて、反応溶液を45 °Cで12時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で精製し、白色粉末として生成物２ (0.77 g, 67%)を得た。この生成物２は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式（６）に示す反応中間体、すなわち1-α-(m-iodo)phenoxy-2-deoxyriboseと同定された。
1H NMR (CDCl3) d 7.37-7.38 (m, 1H), 7.31-7.34 (m, 1H), 6.96-6.98 (m, 2H), 5.83 (dd, 1H, J = 5.6, 1.8 Hz), 4.60-4.66 (m, 1H), 4.09 (dd, 1H, J = 8.7, 4.5 Hz), 3.60-3.76 (m, 2H), 2.52 (ddd, 1H, J = 13.8, 6.9, 1.8 Hz), 2.30 (dt, 1H, J = 13.8, 6.0 Hz), 1.89-1.95 (m, 2H); 
HRMS (ESI) cald. for C11H13IO4Na (MNa+): 358.9751, found: 358.9729. 
〔実施例３〕＜デオキシリボース誘導体の合成＞
triphenylphosphine (87 mg, 0.3 μmol)のジオキサン溶液(15 mL)にpalladium acetate (25 mg, 0.1 μmol)とtriethylamine (0.37μL, 2+.64 mmol)を順に加えて、75°Cで5分間撹拌した。前記実施例２の生成物２(0.74 g, 2.20 mmol)とmethyl acrylate (0.40 μL, 4.40 mmol)を加えて、反応溶液を2時間環流した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1)で生成物を確認した後、綿ろ過でpalladium粉末を取り除いた。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 95 : 5)で精製し、黄色油状物質として生成物３ (0.6 g, 93%)を得た。生成物３はNOESY実験（図１）によってα体と同定され、また下記の質量および紫外吸光度分析値およびNMR分析結果より、式（７）に示すデオキシリボース誘導体、すなわち(E)-1-α-(m-metoxycarbonylvinyl)phenoxy-2-deoxyriboseと同定された。
【００２７】
1H NMR (CDCl3) d 7.62 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.25-7.30 (m, 1H), 7.14-7.17 (m, 2H), 6.99-7.05 (m, 1H), 6.41 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 5.89 (dd, 1H, J = 5.6, 2.4 Hz), 4.63-4.69 (m, 1H), 4.10 (dd, 1H, J = 8.4, 4.2 Hz), 3.79 (s, 3H), 3.62-3.76 (m, 2H), 2.55 (ddd, 1H, J = 13.8, 6.6, 1.8 Hz), 2.33 (dt, 1H, J = 13.8, 5.7 Hz), 1.89-1.93 (m, 2H); 
HRMS (ESI) cald. for C15H18O6Na (MNa+): 317.0996, found: 317.0981; 
UV (H2O : CH3OH = 1 : 1) lmax (e) 278 nm (1.2×104 M-1cm-1), 366 nm (68 M-1cm-1).
〔実施例４〕＜ジメチルトリチル基を導入したデオキシリボース誘導体の合成＞
式（７）に示すデオキシリボース誘導体の５位のヒドロキシル基に保護基（ジメチルトリチル基）の導入を試みた。pyridine (2.0 mL×2)で共沸した前記デオキシリボース誘導体である実施例３得た生成物３(0.20 g, 0.68 mmol)にpyridine (1.0 mL)を加えた。反応溶液に4,4'-dimethoxytritylchloride (0.23 g, 0.82 mmol)と4-(dimethylamino)pyridine (17.0 mg, 0.14 mmol)のピリジン溶液(2.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で14時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 97 : 3)で生成物を確認した後、pyridineを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で精製し、黄色粉末として生成物４(0.30 g, 75%)を得た。生成物４は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式（８）に示すデオキシリボース誘導体と同定された。
【００２８】
1H NMR (CDCl3) d 7.62 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.35-7.38 (m, 1H), 7.23-7.28 (m, 6H), 7.10-7.17 (m, 5H), 6.99-7.02 (m, 1H), 6.69 (dd, 4H, J = 9.0, 2.4 Hz), 6.40 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 5.87 (dd, 1H, J = 5.3, 2.1 Hz), 4.56-4.62 (m, 1H), 4.05 (dd, 1H, J = 10.3, 5.7 Hz), 3.78 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.24 (dd, 1H, J = 9.2, 5.1 Hz), 3.16 (dd, 1H, J = 9.8, 5.4 Hz), 2.50 (ddd, 1H, J = 13.3, 6.8, 2.4 Hz), 2.27 (ddd, 1H, J = 14.2, 6.6, 5.4 Hz), 1.81-1.83 (m, 1H);
HRMS (ESI) cald. for C36H36O8Na (MNa+): 619.2302, found: 619.2268.
〔実施例５〕＜フォスフォロアミダイト誘導体の合成＞
式（８）に示す５位をジメチルトリチル基で保護したデオキシリボース誘導体の３位のヒドロキシル基にフォスフォロアミダイトの導入を試みた。acetonitrile (1.0 mL)で共沸した前記実施例４で得た生成物４ (0.22 g, 0.36 mmol)にacetonitrile (3.0 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoro-diamidite (0.12 μL, 0.36 mmol)と0.45 M tetrazoleのacetonitrile溶液 (0.80 mL, 0.36 mmol)を加えて、反応溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2回抽出し、Sat. NaHCO3 aq.とH2Oで洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、溶媒を除去した。白色粉末の粗生成物である生成物５ (0.33 g)を得た。この生成物５は下記の質量分析値およびNMR分析結果より、式（９）に示すフォスフォロアミダイト誘導体と同定された。
【００２９】
1H NMR (CDCl3) d 7.63 (d, 1H, J = 16.2 Hz), 7.35-7.38 (m, 1H), 7.22-7.27 (m, 6H), 7.10-7.14 (m, 5H), 7.02-7.08 (m, 1H), 6.65 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 6.40 (d, 1H, J = 16.2 Hz), 5.90 (m, 1H), 4.60-4.70 (m, 1H), 4.18-4.22 (m, 1H), 4.10-4.14 (m, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.42-3.60 (m, 1H), 3.08-3.26 (m, 1H), 2.74 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 2.50-2.56 (m, 1H), 2.28-2.34 (m, 1H), 1.11-1.29 (m, 12H);
HRMS (MALDI) cald. for C45H53N2O9Na (MNa+): 819.3387, found: 819.8709.
〔実施例６〕＜光応答性ヌクレオチドの合成＞
ABI 3400 DNA合成機を用いてb-シアノエチルホスフォアミダイト法により以下のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をそれぞれ合成した。前記実施例５で得たフォスフォロアミダイト誘導体をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3回共沸した後、さらなる精製をせずにアミダイト試薬として使用した。ＯＤＮは得られた反応混合物のアンモニア水溶液を65 °Cで4時間置き、脱保護した。アンモニア水溶液を除去した後、日本分光PU-980、UV-970、HG-980-31による逆相高速液体クロマトグラフィーを通じて精製した。それぞれのＯＤＮはApplide Biosystems Voyager-DE-PRO-SFによる質量分析とＰ１ヌクレアーゼ、アルカリフォスファターゼを用いて酵素分解を行いＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕの各ヌクレオシドの組成比から下記のとおり塩基配列と分子量が同定された。
ODN1: HRMS (MALDI) calcd for 5'-TGTGCT: [(M-H)-] 1796.3, found 1796.6.
ODN2: HRMS (MALDI) calcd for 5'-cvPhGCGTG: [(M-H)-] 1858.4, found 1858.4.
ODN3: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGAACGCAC: [(M+H)+] 3607.4, found 3607.7.
ODN4: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGGACGCAC: [(M+H)+] 3625.4, found 3625.7.
なお、ヌクレオチド配列中のcvPhはこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体を示す。
【００３０】
〔実施例７〕＜光応答性ヌクレオチドによる架橋反応１＞
ＯＤＮ１(10 mM)、ＯＤＮ２(20 mM)およびＯＤＮ３(10 mM)をカコジル酸ナトリウム緩衝溶液 (30 ml)に溶解し、トランスイルミネーターを用いて0℃で5時間、366 nmの光照射を行った。光反応生成物をChemcobond 5-ODS-Hカラムを用いＨＰＬＣ分析した（図２）。溶離液は、30分間にギ酸アンモニウム : アセトニトリル = 97 :3から80 : 20へと移動相の組成を変化させたものを用いた。
【００３１】
図２に示すＨＰＬＣ分析結果においては、光反応前後でＯＤＮ１のピーク面積がほとんど変化が認められなかった。また、天然の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）のみで構成されるのＯＤＮの場合、上記反応条件では相補鎖が形成されないことより、この出願の発明かかるデオキシリボース誘導体を含むＯＤＮ２のみがＯＤＮ３に366 nmの光照射によって特異的にクロスリンクしたことが確認された。図３に上記反応のスキームを示す。クロスリンクした光連結体ＯＤＮ４の分子量は実施例６と同様に下記のとおり同定した。
【００３２】
HRMS (MALDI) calcd for ODN: [(M+H)+] 5469.7, found 5470.3. 
次に、光連結体ＯＤＮ４をＰ１ヌクレアーゼとアルカリフォスファターゼとSnake Venomを用いて酵素分解を行った。この分解産物の分子量をMALDI-TOF MSで測定した結果、式（１０）に示すcvPh-Ａ付加体が検出され、これよりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体はアデニンとクロスリンクすることが確認された。
【００３３】
【化６】
2005348645.tif 000005
【００３４】
〔実施例８〕＜光応答性ヌクレオチドによる架橋反応２＞
ＯＤＮ２(20 mM)とＯＤＮ５(10 mM)をカコジル酸ナトリウム緩衝溶液 (30 ml)に溶解し、トランスイルミネーターを用いて0℃で5時間、366 nmの光照射を行った。光反応生成物を実施例７と同様にＨＰＬＣ分析した（図４）。
【００３５】
図３に示すＨＰＬＣ分析結果より、この出願の発明かかるデオキシリボース誘導体を含むＯＤＮ２とＯＤＮ５のクロスリンク生成が確認された。図５に上記反応のスキームを示す。クロスリンクした光連結体ＯＤＮ６の分子量は実施例６と同様に下記のとおり同定した。
【００３６】
HRMS (MALDI) calcd for ODN 6: [(M+H)+] 5485.7, found 5486.2.
次に、ＯＤＮ２／ＯＤＮ５のTm値、および光連結体ＯＤＮ６のTm値をJASCO V-550 UV/Vis spectrophotometerで測定した。標準プロトコールに従いそれぞれのＯＤＮ試料を1.0 °C/minの速度で昇温させ、紫外領域260 nmの吸光度を測定した（図６）。図６に示す吸光度曲線（ａ）は前者のＯＤＮ２／ＯＤＮ５、（ｂ）はＯＤＮ６をそれぞれ示す。これより前者のTm値は19.0 °Cであったが、後者のTm値は65.3 °Cと、この出願の発明かかるデオキシリボース誘導体によるクロスリンクは核酸の熱的安定性を向上させることを確認した。
【００３７】
〔実施例９〕＜光応答性ヌクレオチドによる架橋反応における塩基特異性、配列依存性の検討＞
実施例６と同様にＯＤＮ３Ｘ (3'-ACACGAXCGCAC-5'、塩基XはA,G,C,Tのいずれかを示す）を作成した。ＯＤＮ３Ｘ(20 mM)とＯＤＮ２(30 mM)を実施例７と同様に366 nm光照射によりクロスリンクさせた。各ＯＤＮ３Ｘの塩基Xの種類とクロスリンク形成効率であるＯＤＮの減少率を表１に示す。表1よりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体はアデニンとのクロスリンク形成において高い反応性を示し、シトシン、チミン、グアニンとは反応性が低いことが確認された。
【００３８】
【表１】
2005348645.tif 000006
【００３９】
次に、ＯＤＮ２(20 mM)とＯＤＮ３(20 mM)、およびＯＤＮ２(20 mM)とＯＤＮ５(20 mM)それぞれについて実施例７と同様に366 nm光照射によりクロスリンク反応を行った。それぞれのODNの減少率を表２に示す。なお、ＯＤＮ３およびＯＤＮ５は、それぞれ3'-ACACGYACGCAC-5'の塩基配列を有し、かかる塩基Yは前者においてはA、後者においてはGである。また、ＯＤＮ２のcvPhはかかる塩基Yの５´に隣接するAと特異的に反応することが上記実施例において確認されている。
表２よりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体におけるアデニンとのクロスリンク形成においては周辺の塩基配列依存性は認められなかった。
【００４０】
【表２】
2005348645.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例３におけるNOESY実験結果を示した図である。
【図２】実施例７におけるクロスリンク反応のHPLC分析結果を示した図である。
【図３】実施例７におけるクロスリンク反応の模式図を示した図である。
【図４】実施例８におけるクロスリンク反応のHPLC分析結果を示した図である。
【図５】実施例８におけるクロスリンク反応の模式図を示した図である。
【図６】実施例８におけるTm値分析のための紫外吸光度測定結果を示した図である。
【図１】
2005348645.tif 000012
【図２】
2005348645.tif 000013
【図３】
2005348645.tif 000014
【図４】
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【図５】
2005348645.tif 000016
【図６】
2005348645.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月28日(2005.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
1H NMR (CDCl3) d 7.63 (d, 1H, J = 16.2 Hz), 7.35-7.38 (m, 1H), 7.22-7.27 (m, 6H), 7.10-7.14 (m, 5H), 7.02-7.08 (m, 1H), 6.65 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 6.40 (d, 1H,J = 16.2 Hz), 5.90 (m, 1H), 4.60-4.70 (m, 1H), 4.18-4.22 (m, 1H), 4.10-4.14 (m,1H), 3.78 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.42-3.60 (m, 1H), 3.08-3.26 (m,1H), 2.74 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 2.50-2.56 (m, 1H), 2.28-2.34 (m, 1H), 1.11-1.29 (m, 12H);HRMS (MALDI) cald. for C45H53N2O9Na (MNa+): 819.3387, found: 819.8709.
〔実施例６〕＜光応答性ヌクレオチドの合成＞
ABI 3400 DNA合成機を用いてb-シアノエチルホスフォアミダイト法により以下のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）をそれぞれ合成した。前記実施例５で得たフォスフォロアミダイト誘導体をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3回共沸した後、さらなる精製をせずにアミダイト試薬として使用した。ＯＤＮは得られた反応混合物のアンモニア水溶液を65 °Cで4時間置き、脱保護した。アンモニア水溶液を除去した後、日本分光PU-980、UV-970、HG-980-31による逆相高速液体クロマトグラフィーを通じて精製した。それぞれのＯＤＮはApplide Biosystems Voyager-DE-PRO-SFによる質量分析とＰ１ヌクレアーゼ、アルカリフォスファターゼを用いて酵素分解を行いＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕの各ヌクレオシドの組成比から下記のとおり塩基配列と分子量が同定された。
ODN1（配列番号１）: HRMS (MALDI) calcd for 5'-TGTGCT: [(M-H)-] 1796.3, found 1796.6.
ODN2（配列番号２）: HRMS (MALDI) calcd for 5'-cvPhGCGTG: [(M-H)-] 1858.4, found 1858.4.
ODN3（配列番号３）: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGAACGCAC: [(M+H)+] 3607.4, found 3607.7.
ODN5（配列番号４）: HRMS (MALDI) calcd for 3'-ACACGGACGCAC: [(M+H)+] 3625.4, found 3625.7.
なお、ヌクレオチド配列中のcvPhはこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
〔実施例９〕＜光応答性ヌクレオチドによる架橋反応における塩基特異性、配列依存性の検討＞
実施例６と同様にＯＤＮ３Ｘ (3'-ACACGAXCGCAC-5'、塩基XはA,G,C,Tのいずれかを示す；配列番号５)を作成した。ＯＤＮ３Ｘ(20 mM)とＯＤＮ２(30 mM)を実施例７と同様に366 nm光照射によりクロスリンクさせた。各ＯＤＮ３Ｘの塩基Xの種類とクロスリンク形成効率であるＯＤＮの減少率を表１に示す。表1よりこの出願の発明かかるデオキシリボース誘導体はアデニンとのクロスリンク形成において高い反応性を示し、シトシン、チミン、グアニンとは反応性が低いことが確認された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【表２】
2005348645.tif 000018