(57)【要約】      （修正有）【課題】接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留及び接種反応が極めて軽度で、高い安全性と有効性を保持するワクチン製剤を提供する。【解決手段】アルテリウイルス科の豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）ウイルス由来の抗原と、グルコン酸マンガン等のキレーチ化剤を有するマイクロエマルジョンを免疫賦活剤として含有するPRRS予防用ワクチン製剤。更に、豚由来の細菌性又はウイルス性病原体抗原を含む豚用混合ワクチン。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス由来抗原と、キレート化剤を有するマイクロエマルジョンを免疫賦活剤として含有することを特徴とする豚繁殖・呼吸障害症候群用ワクチン製剤。
【請求項２】
前記豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス由来抗原が、豚繁殖・呼吸障害症候群不活化ウイルスである請求項１に記載の豚繁殖・呼吸障害症候群用ワクチン製剤。
【請求項３】
前記豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス由来抗原が、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの構造タンパクである請求項1に記載の豚繁殖・呼吸障害症候群用ワクチン製剤。
【請求項４】
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス由来抗原の他に、さらに豚に由来する細菌性またはウイルス性の病原体由来抗原の１種または２種以上を含む混合ワクチンである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の豚繁殖・呼吸障害症候群用ワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚繁殖・呼吸障害症候群（porcine reproductive and respiratory syndrome、以下PRRSと略記）の予防用ワクチン製剤に関し、詳しくは、高い安全性と優れた有効性を発現する豚用ワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
PRRSは、1987年米国で始めて報告された、妊娠後期の繁殖障害と新生豚および育成豚の呼吸障害を特徴とする豚の新しいウイルス感染症である（非特許文献１）。
【０００３】
本疾患は、その後1990年代に入り、欧米諸国や我が国を含むアジア各国での発生が確認され、現在では世界的な蔓延が明らかにされている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
本病の原因ウイルスであるPRRSウイルスはアルテリウイルス科（Arteriviridae）に属するRNAウイルスで、豚体内ではマクロファージを標的とする。豚間の接触がPRRSウイルスの主な感染ルートであるが、空気伝播による感染や人工授精による精液を介した感染も知られている。自然感染では、経気道的に侵入したウイルスは粘膜を介して局所のマクロファージで増殖し、ウイルス血症を経て全身に分布する。妊娠後期に発生する繁殖障害は死産、流産、早産などを主とし、その結果、総産子数や離乳子豚数が減少する。また、発情周期の異常や不妊の原因にもなる。新生豚や育成豚がPRRSウイルスに感染すると間質性肺炎を起こし、アクチノバシラスやパスツレラなどの細菌ならびにマイコプラズマによる二次感染を併発する。すなわち、PRRSウイルスはいわゆる豚呼吸器複合感染（PRDC）の主要因子であり、繁殖障害を含めた本ウイルス感染による経済的損耗は甚大なものとなっている。
【０００５】
本病の予防のため、（アメリカ型）PRRSウイルスの弱毒生ワクチンが開発され、各国で広く利用されている。また、ヨーロッパ型のPRRSウイルスを用いた不活化オイルアジュバントワクチンも最近開発され、欧州で利用されている。
【０００６】
しかしながら、生ワクチンの場合には以下に示すような問題点がある。まず、ワクチンウイルスが免疫のない妊娠豚に感染するとウイルス血症を起こし、胎子に垂直感染して流産を起こすことがある。また、免疫のない種雄豚に感染するとウイルス血症を起こし、精液中にウイルスが出現し精液を介した感染を起こす可能性がある。さらに、PRRSウイルスではウイルスゲノムの変異率が高いため、生ワクチン株に変異が起こり病原性が復帰する可能性がある。実際、PRRS発生農場からワクチン由来と考えられるウイルスが分離され、さらに、このウイルスの病原性が確認されたという報告がある（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００７】
このようなことから、生ワクチンの安全性に関してはいくつかの問題が存在し、従って、不活化ワクチンがより好ましい形態であると考えられる。一般に不活化ワクチンでは、生ワクチンと比較してより多くの抗原を必要とし、さらに免疫効果を高めるために免疫賦活剤（アジュバント）の添加を必要とする。アジュバントは油性アジュバントと水酸化アルミニウムゲルアジュバントの二つに区別される。油性アジュバントを含むワクチンは、一般に高い免疫応答を誘導する反面、接種豚に強いストレスを誘発し、接種部位に重度な反応を惹起して接種物や接種痕を遺残させることがある。一方、水酸化アルミニウムゲルアジュバントを含むワクチンは、上記ストレスおよび遺残に関する問題はないが、そのアジュバント効果は油性アジュバントに比べると弱い場合が多い。
【０００８】
【非特許文献１】K.K.Keffaber, Am. Assoc. Swine Pract.News, 1, 1-9, 1989
【非特許文献２】H.Kuwahara, et al., J.Vet.Med.Sci., 56, 901-909, 1994
【非特許文献３】K.D.Rossow, Vet. Pathol., 35, 1-20, 1998
【非特許文献４】W.L.Mengeling, et al., Am. J. Vet. Res., 60, 334-340, 1999
【非特許文献５】S.Kay, et al., Am. Assoc. Swine Pract. 403-406, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のようにPRRS不活化ワクチンにおいては、高い安全性を保持しつつ優れた有効性を発現することが可能なアジュバントを含む製剤が要望されている。
【００１０】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留および接種反応が極めて軽度で、高い安全性を保持するPRRS用ワクチン製剤を提供することである。
【００１１】
さらに、本発明の他の課題は、子豚あるいは母豚への注射によってPRRSウイルスに対して高値の抗体を誘導し、子豚あるいは母豚およびその母豚から生まれた子豚にPRRSウイルスに対する高度な防御能を賦与する優れた有効性を保持するワクチン製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明者らはマイクロエマルジョンをPRRSワクチンのアジュバントに応用することを試み、鋭意研究を進め、上記のような問題を解決できることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。
（1）PRRSウイルス由来抗原と、キレート化剤を有するマイクロエマルジョンを免疫賦活剤として含有することを特徴とするPRRS用ワクチン製剤。
（2）前記PRRSウイルス由来抗原が、PRRS不活化ウイルスである前記（1）に記載のPRRS用ワクチン製剤。
（3）前記PRRSウイルス由来抗原が、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの構造タンパクである前記（1）に記載のPRRS用ワクチン製剤。
（4）PRRSウイルス由来抗原の他に、さらに豚に由来する細菌性またはウイルス性の病原体由来抗原の1種または2種以上を含む混合ワクチンである、前記（1）ないし（3）のいずれかに記載のPRRS用ワクチン製剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のマイクロエマルジョンをアジュバントに用いたPRRS用ワクチン製剤は、接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留および接種反応が極めて軽度で、高い安全性を保持するものである。加えて、豚に高い抗体を長期間にわたって誘導し、これにより、本ワクチンを注射された豚は、強毒PRRSウイルスの攻撃に対して、ウイルス血症の発現の程度及び期間を低減する効果を示す。
【００１４】
従って、本発明は安全で有効性の高いPRRS不活化ワクチンの製造方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上記課題を解決するために本発明より提供される動物用ワクチン製剤の特徴は、PRRSウイルス由来抗原ならびにマイクロエマルジョンを含有するワクチンであり、特に、このワクチンがPRRS予防用のものであるところにある。
【００１６】
本発明におけるマイクロエマルジョンとは、免疫賦活剤として機能するものであり、水中に分散された微小油性粒子からなるものである。微小油性粒子とは、軽鉱物油と界面活性剤を混合し、水中で乳化することにより5 nmから500 nmの粒子を形成させたものである。軽鉱物油としては、たとえばエーテル化流動パラフィン、マコール52（商品名、セピック（株）製）、ドラケオール6VR（商品名、ペンレコ（株）製）、軽質流動化パラフィン（日局）等を挙げることができる。
【００１７】
界面活性剤としては、たとえばマンナイドモノオレイン酸、オレイン酸マンニタンエステルのエトキシル化誘導体、モノステアリン酸グリセリル、モノラウリン酸デカグリセリル、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（20）ソルピタンモノパルミテート等が使用できるが、軽鉱物油からマイクロエマルジョンを調製できればこれらのものに限定されない。
【００１８】
本発明のマイクロエマルジョンは、これらの軽鉱物油をマイクロエマルジョン当り、0.001〜10.O wt％、好ましくは、0.01〜0.1 wt％含むものである．0.001 wt％未満では粒子が不安定となり、10 wt％を超えて添加すると接種動物に対して接種物の遺残をもたらすことになる。
【００１９】
また、界面活性剤は、上記軽鉱物油を乳化してマイクロエマルジョンとすることができれば、その添加量は特に限定されない。
【００２０】
本発明のマイクロエマルジョンに含まれるキレート化剤は、微小油性微粒子に結合した抗原の安定化と、微小油性粒子の免疫担当細胞への結合を介助する作用があり、例として、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、サリチル酸アルミニウムまたは可溶性酢酸アルミニウム等の多イオン性酸複合体等が使用できる。これらのキレート化剤の添加量は、マイクロエマルジョン当り0.002〜30 wt％、好ましくは0.01〜15 wt％である。0.002 wt％未満では免疫増幅効果が期待されず、30 wt％を超えて添加すると接種動物に対して副作用がもたらされる。
【００２１】
本発明のキレート化剤を有するマイクロエマルジョンを調製する方法は、例えば、水に、上記軽鉱物油、界面活性剤およびキレート化剤を加えて、公知の乳化手段により乳化して、マイクロエマルジョンとすればよい。
【００２２】
キレート化剤を有するマイクロエマルジョンの最終ワクチン製剤液量に対する添加量は、好ましくは20〜80％（V／V）の範囲であり、特に好ましくは50％（V／V）とする。
【００２３】
本発明の対象となるPRRSウイルス由来抗原としては、PRRSウイルスに由来し、抗原として作用するものを用いることができ、具体的にはPRRS不活化ウイルスまたはそのウイルス由来成分が含まれる。ウイルス由来成分は、ウイルス感染細胞および（または）その培養上清より抽出・精製したもの、あるいはPRRSウイルスの遺伝子をもとにバキュロウイルス等の他の生物または細胞で発現させたウイルス構造タンパク質等の組換えタンパク質であってもよい。
【００２４】
また、本発明のワクチン製剤には、PRRSウイルス由来抗原の他に、抗原性を有する物質を混合してもよい。例えば、豚由来病原性細菌または病原ウイルス由来抗原が好適であり、より具体的には、エリジベロスリックス・ルジオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopeumoniae）、アクチノバシラス・ブルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、ヘモフィルス・バラスイス（Haemophilus parasuis）、大腸菌（Esherichia coli）、サルモネラ・コレレエスイス（Salmonella choleraesuis）、連鎖球菌（Streptococcus suis）、日本脳炎ウイルス（Ｊapanese encephalitis virus）、豚パルボウイルス（porcine parvovirus)、豚サーコウイルス（porcine circovirus）、豚インフルエンザウイルス（swine influenza virus）、オーエスキー病ウイルス（Aujeszky's disease virus）等を挙げることができる。病原体由来抗原とは、当該菌またはウイルスそのもの、あるいは当該菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子をもとにバキュロウイルス等の他の生物で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００２５】
さらに、本発明のワクチン製剤には、一般にワクチン製剤に混合することがある他の成分を配合してもよい。
【００２６】
本発明のワクチン製剤は、各成分を攪拌しながら混合することにより得られる各成分の配合順序は限定されない。
【００２７】
本発明のワクチン製剤は、筋肉内接種しても接種豚に過度の局所および全身性の接種反応を惹起せず、接種物の残存も比較的短期間に消失する。これらの性状は豚用のワクチンとして重要である。
【００２８】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【実施例１】
【００２９】
マイクロエマルジョンワクチンの調製
（１）抗原液の調製
PRRSウイルス GU922M株（野外採取し、日生研株式会社が保有）を回転培養器29本分のVero細胞に接種し、37℃、5日間培養後、培養上清15,000 mLを回収した。分子量30万カットのフィルターを用いた限外濾過法により500 mLまで濃縮後、リン酸緩衝食塩液（以下PBSと略）を3,000 mL追加し、再び500 mLまで濃縮することによりウイルス粒子を部分精製した。これをPBSで2倍に希釈し、0.2％（V/V）の割合で日局ホルマリンを加えて不活化した。各ウイルス価は、培養上清で107.0TCID50/mL、濃縮液で108. 0 TCID50/mLであった。
【００３０】
（2）マイクロエマルジョンの調製
牛脂を40気圧下にて200℃で20分間処理して水解した。得られた水解物よりグリセロール分画を除去し、180℃にて減圧下に蒸留した。蒸留により得られたオレイン酸にブリオレン6930（商品名、セピック（株）製）とマンニトールを加え、230℃で6時間加温してエステル化した。形成されたマンナイドモノオレイン酸70 g、エーテル化流動パラフィン10 g、およびキレート化剤であるグルコン酸マンガン10 gを、900 mLのPBSに溶解し、エマルジョン形成用乳化機を用いて室温で処理することにより乳化し、マイクロエマルジョンを調製した。
なお、得られたマイクロエマルジョンの物性値は以下の通りであった。
【００３１】
・粒子サイズ：200 nm
・比重：0.9
・粘度：5mPas（25℃）
・屈折率：1.367
・固形物含量：22.3％
・外観：白色不透明液体
・過酸化物値：2mmole以下
・ヨウ素値：3.6g I2／100 g
・ケン化値：22 mg KOH／g
・pH：6.0
・総灰分：0.5％
・異常毒性：なし
【００３２】
（3）ワクチン製剤の調製
調製したそれぞれの抗原液とマイクロエマルジョンとを、等量に混合し、室温で5分間以上攪拌した。
【実施例２】
【００３３】
マイクロエマルジョンワクチンの豚に対する安全性
実施例1で調製したワクチン1mLずつを、約1か月齢のPRRSフリー豚4頭の頚部筋肉内に3週間隔で2回注射した。各回注射後14日間、臨床上の異常（震顫、嘔吐、横臥、食欲消失等）の有無を観察した。さらに第2回注射後6週に剖検して注射局所の肉眼的観察を行い、異常（投与物質の残存、肉芽腫の形成、筋肉の変色等）の有無を調べた。結果は表１及び表２に示した。
【００３４】
【表１】
2005075752.tif 000002
表１中、臨床的に異常のないものは−で示した。
【００３５】
表１に示す通り、本試作ワクチンを注射した豚はいずれも臨床的異常を示さな
かった。
【００３６】
【表２】
2005075752.tif 000003
表２中、異常のないものは−で示した。
【００３７】
表２に示す通り、初回（剖検時接種後9週）及び第2回（剖検時接種後6週）注射局所のいずれにも異常は見られなかった。
【００３８】
このように、マイクロエマルジョンを用いたPRRS不活化ワクチンは、接種豚に対して極めて安全であることが示された。
【実施例３】
【００３９】
マイクロエマルジョンワクチンと水酸化アルミニウムゲルワクチン（従来技術）との比較
5週令のPRRSフリー豚6頭を用いた。これらを2群に分け、第一群には実施例1で作製したマイクロエマルジョンワクチンを4週間隔で2回、筋肉内に注射した。第二群には同じウイルス濃縮液を用いて、アジュバントを水酸化アルミニウムゲルに置き変えて調製したワクチン（以下、水酸化アルミニウムゲルワクチンと略）を同じプログラムで注射した。第1回注射時より、5週目まで1週間隔で採血し、ELISAを用いて抗体レベルを測定した。ELISAには、可溶化したPRRSウイルス抗原を用い、波長４０５nmにおける吸光度（OD）値を測定した。
【００４０】
ワクチン接種後１週ごとに経時的に採血した各群３頭の平均ＯＤ値を図１に示した。5週目の採血時点（2回免疫後2週）において、マイクロエマルジョンワクチンでは水酸化アルミニウムゲルワクチンに比べ、有意（危険率1％）に高いOD値を示した。このことから、PRRS不活化ウイルスを免疫原としたマイクロエマルジョンワクチンは、水酸化アルミニウムゲル等の従来用いられてきたアジュバントに比べ、より高度な抗体応答が誘導されることが示された。
【実施例４】
【００４１】
マイクロエマルジョンワクチンの豚における有効性
4〜8週令のPRRSフリー豚16頭を試験に供した。1群4頭ずつ4群に分け、それぞれPRRSウイルス含有量（不活化前）が1ドース当たり107.3 、106.6及び105.9 TCID50に調製したマイクロエマルジョンワクチンを、3週間隔で2回、筋肉内に注射した。残りの1群は非注射対照とした。第2回免疫後2週に、全頭に対して強毒PRRSウイルスを103 TCID50鼻腔内に接種して攻撃した。攻撃後2週及び3週に血液を採取して培養し、ウイルス血症の有無を調べた。また、第1回注射前、第2回注射時及び第2回注射後2週の血清について、ELISA（IDEXX社製）を用いて抗体測定を行なった。その結果を表３および表４に示す。
【００４２】
第1回注射前は、すべての豚で抗体陰性であった。107.3 TCID50のウイルス抗原を含むワクチン注射群では第2回注射時から、その他の注射群では第2回注射後2週から抗体上昇が認められた。第2回注射後2週の平均E値は、107.3ワクチン群で0.76、106.6ワクチン群で0.22及び105.9ワクチン群で0.10と、ワクチン中に含有されるウイルス抗原量が多いほど、高いE値を示した。非注射対照群に抗体上昇は認められなかった。攻撃後の血液中からのウイルス検出では、攻撃後2週では107.3ワクチン群の2頭でウイルスが検出されなかったものの、他の群のすべてで検出された。攻撃後3週では、非注射対照群で4頭中3頭に、105.9ワクチン群で1頭にウイルスが検出されたが、107.3 及び106.6ワクチン群では検出されなかった。
【００４３】
このことから、マイクロエマルジョンをアジュバントとしたPRRS不活化ワクチンは、注射豚にPRRSウイルスに対する抗体応答を誘導し、これによって強毒株の鼻腔内攻撃により惹起されるウイルス血症を抑制する防御効果を発現した。また、その効果はワクチン中に含有されるウイルス抗原量に比例することがあわせて明らかとなった。
【００４４】
【表３】
2005075752.tif 000004
【００４５】
【表４】
2005075752.tif 000005
【実施例５】
【００４６】
マイクロエマルジョンワクチン注射豚における免疫の持続
5週令のPRRSフリー豚4頭を2群に分けた。ワクチン群3頭には、不活化前のウイルス量として1ドーズ当たり107.3TCID50のPRRSウイルス抗原を含むマイクロエマルジョンワクチンを実施例1に従って調製し、3週間隔で2回、筋肉内に注射した。残り1頭は非注射対照とした。第2回注射後、16週まで4週間隔で経時的に採血し、ELISA（IDEXX社製）を用いて抗体測定を行なった。その結果を表５に示す。
【００４７】
ワクチン群のE値は、第2回注射後4週に平均E値1.99と最も高い値を示し、その後徐々に低下し、16週後の平均E値は0.76となった。実施例2においてE値0.2以上を示した時にウイルス攻撃に対して防御が認められたことから、第2回注射後16週においてもこれを上回る高いレベルの抗体を保持していることが判明した。一方、対照豚のE値は全期間を通じて低かった。
【００４８】
このことから、PRRSウイルスを抗原としたマイクロエマルジョンワクチンは、注射豚に高度な免疫応答を惹起し、少なくとも第2回注射後16週の長期にわたって抗体が持続することが判明した。
【００４９】
【表５】
2005075752.tif 000006
以上の試験により、本発明のマイクロエマルジョンをアジュバントに用いたPRRS用ワクチン製剤は、接種豚に過度のストレスを誘導せず、注射局所における接種物質の残留および接種反応が極めて軽度で、高い安全性を保持するものである。加えて、豚に高い抗体を長期間にわたって誘導し、これにより、本ワクチンを注射された豚は、強毒PRRSウイルスの攻撃に対して、ウイルス血症の発現の程度及び期間を低減する効果を示す。
【００５０】
このように、本発明は安全で有効性の高いPRRS不活化ワクチンの製造方法を提供するものである。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により得られるPRRS不活化ワクチン製剤は、安全で有効性が高く、養豚産業に有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例３における、マイクロエマルジョンワクチンと水酸化アルミニウムゲルワクチン（従来技術）との抗体応答を示したグラフ。
【図１】
2005075752.tif 000007