(57)【要約】【目的】  PCR反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅できる核酸増幅方法を提供すること。【構成】  核酸増幅方法は、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、Expand High Fidelity PCR Master、Expand High Fidelity Plus PCR System、Expand Long Template PCR System、Expand 20kb Plus PCR System 等を用いる。そして、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来する T.th. RecAタンパク質及びこの T.th. RecAタンパク質を改変したタンパク質であってこの T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有する T.th. RecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行う。【選択図】        図１
2005261255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PCRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、Roche社製の Expand High Fidelity PCR Master、Roche社製の Expand High Fidelity Plus PCR System、Roche社製の Expand Long Template PCR System、Roche社製の Expand 20kb Plus PCR System、または、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用い、
反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来する T.th. RecAタンパク質及びこの T.th. RecAタンパク質を改変したタンパク質であってこの T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有する T.th. RecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行う
核酸増幅方法。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸増幅方法であって、
複数種のプライマーセットを用いて、複数種の核酸を同時に増幅させる
核酸増幅方法。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸増幅方法であって、
前記複数種のプライマーセットは、５種類以上のプライマーセットである
核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を増幅させる核酸増幅方法に関し、特に、PCR反応により特定の核酸を増幅させる核酸増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、PCR反応（ポリメラーゼ連鎖反応）により特定の核酸を増幅させる核酸増幅方法が知られている。即ち、反応液中に、鋳型DNA、プライマーDNA、DNAポリメラーゼ等を混合して、鋳型DNAのうち、プライマーDNAセットによって挟まれた領域を特異的に増幅させ、特定の核酸を得るものである。PCRは、ターゲットとする特定の核酸を短時間で10万倍以上に増幅できる画期的な技術である。
【０００３】
しかし、PCRは、その反応を最適化することが難しく、所望の核酸が増幅されなかったり、非特異的な核酸が増幅されることがある。このような課題に対して、従来より様々な改善案が提案されている。例えば、非特許文献１では、大腸菌（Escherichia coli）の一本鎖DNA結合タンパク質を反応液中に加えることにより、所望の核酸を特異的に増幅できる旨が開示されている。また、特許文献１には、大腸菌（Escherichia coli）等のRecAタンパク質を利用するPCR方法が開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein, a molecular tool for improved sequence quality in pyrosequencing.  Electrophoresis. 2002 Sep;23(19):3289-99
【特許文献１】特許第３０１０７３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の様々な改善法を利用しても、所望の核酸（特異的なPCR産物）が十分に増幅されなかったり、或いは、所望の核酸（特異的なPCR産物）と一緒に副産物（非特異的なPCR産物）も多く増幅される場合がある。
ところで、一般に、PCRは、一対のプライマーセットのみを加えて行われる。従って、複数種のプライマーセットについてPCRをしたい場合には、各々のプライマーセットに対して別個にPCRを行うのが一般的である。しかし、サンプル（鋳型DNA）量が限られている場合、例えば、ヒトの臓器の一部の細胞からDNAを抽出した場合などには、複数種のプライマーセットに対して別個にPCRを行えないことがある。このような状況では、複数種のプライマーセットを一緒に用いて複数種の核酸を同時に増幅させる、いわゆるマルチプライマーPCRが行われる。
このようなマルチプライマーPCRにおいては、前述の問題点に加え、所望の複数種の核酸が均一に増加しにくいという問題も生じる。即ち、ある核酸は非常に多量に増幅されるが、ある核酸は少量しか増幅されないため、例えば、PCR産物を電気泳動したときにシグナルの強弱が大きく現れ、試験の信頼性や再現性に欠ける。
【０００６】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであって、PCR反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅できる核酸増幅方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
その解決手段は、PCRにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、Roche社製の Expand High Fidelity PCR Master、Roche社製の Expand High Fidelity Plus PCR System、Roche社製の Expand Long Template PCR System、Roche社製の Expand 20kb Plus PCR System、または、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用い、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来する T.th. RecAタンパク質及びこの T.th. RecAタンパク質を改変したタンパク質であってこの T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有する T.th. RecA改変タンパク質の少なくともいずれかを含む T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行う核酸増幅方法である。
【０００８】
本発明によれば、PCRによる核酸増幅方法に、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、Expand High Fidelity PCR Master、Expand High Fidelity Plus PCR System、Expand Long Template PCR System、若しくはExpand 20kb Plus PCR System、または、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用いる。そして、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）に由来する RecAタンパク質等の T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行い、所望の核酸を増幅させる。このようにPCRを行えば、従来に比して、所望の核酸（正しい特異的なPCR産物）の増幅効率を向上させることができる。一方、従来に比して、副産物（非特異的なPCR産物）の増幅を低く抑えることができる。
【０００９】
ここで、「T.th. RecA様タンパク質」は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）のRecAタンパク質（T.th. RecAタンパク質）、及び、T.th. RecAタンパク質を改変したものであって T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有するRecA改変タンパク質（T.th. RecA改変タンパク質）、の少なくともいずれかを含むものであれば、いかなるものを用いてもよい。T.th. RecA改変タンパク質としては、例えば、T.th. RecAタンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、1または数個のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、T.th. RecAタンパク質のタンパク質断片であって、T.th. RecAタンパク質と類似する機能を有するもの（T.th. RecAフラグメント）などであってよい。
なお、T.th. RecA様タンパク質は、全プライマーDNAの 1μg に対して、0.1μg〜100μgの範囲で混合するのが好ましく、更には 1μg〜10μgの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲でPCRを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。
【００１０】
「Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、Roche社製の Expand High Fidelity PCR Master、Roche社製の Expand High Fidelity Plus PCR System、Roche社製の Expand Long Template PCR System、Roche社製の Expand 20kb Plus PCR System、または、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用いる」とは、広くこれらの試薬セット（キット）を利用するという意味であり、必ずしもそのプロトコールに従ってPCRを行う必要はない。従って、例えば、PCR反応の熱サイクル条件を適宜変更してもよい。
【００１１】
また、例えば、PCRを行う際、その反応液には、本発明に記載したもの以外の試薬や酵素等を添加してもよい。
具体的には、別途用意したDNAポリメラーゼを添加してもよい。このようなDNAポリメラーゼは、PCRにおいてDNA鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Methanothermus fervidus）、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、T.フラブス（T.flavus）、T.ラクテウス（T.lacteus）、T.ルベンス（T.rubens）、T.ルバー（T.ruber）及び T.サーモフィルス（T.thermophilus）などの高熱菌由来のDNAポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Desulfurococcus mobilis）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Methanobacterium thermoautotrophilcum）、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）、S.アシドカルダリウス（S.acidocaldarius）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）などの高熱性古細菌由来のDNAポリメラーゼなどが挙げられる。
【００１２】
更に、PCR反応液に、上記試薬キットに含まれるDNAポリメラーゼや他のDNAポリメラーゼを別途添加する場合にはそのDNAポリメラーゼに対する、特異的な抗体を混合するようにしてもよい。DNAポリメラーゼによる核酸増幅前の活性を阻害するためである。即ち、常温での酵素反応によりプライマーダイマーなどの副産物が生産されることを抑制したり、プライマーの分解を保護するためである。このような抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Fabフラグメント）が挙げられる。このうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。
また、PCR反応液に、T.th. RecA様タンパク質に対する特異的な抗体を加えてもよい。
【００１３】
また、PCR反応液には、試薬等として、トリシン（TRICINE）、ビスートリシン（BIS-TRICINE）、ヘペス（HEPES）、モプス（MOPS）、テス（TES）、タプス（TAPS）、ピペス（PIPES）、キャプス（CAPS）などの緩衝剤や、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウムなどの塩を、別途添加してもよい。
【００１４】
また、PCR反応液には、5％〜10％のDMSOと1％〜2％のベタインを添加してもよい。鋳型DNAの二字構造により目的とする産物が増幅されにくい問題を最小限に留める効果を有するものである。このような変性剤に対し、大腸菌由来のRecAタンパク質等は耐性を有しないが、T.th. RecA様タンパク質は耐性を有するので、本発明において使用することが可能である。また、その他の添加物として、グリセロール、ホルムアルデヒド、塩化テトラメチルアンモニウム、ジメチルスルフォキシド、ポリエチレングリコール（PEG）、ツイン20（Tween20）、ノニデット-P40（NP40）、エクトイン（ectoine）、トリトン-100（Triton-X100）、ポリオール類を別途添加してもよい。
【００１５】
また、PCR反応液には、ATP-γSを別途添加してもよい。所望の核酸を更に特異的に増幅させることができる可能性があるからである。なお、ATP-γSを加えた場合と同様に、ATPを加えても、PCRの特異性が増すと推測される。しかし、ATPは、T.th. RecA様タンパク質によりADPに分解され、ADPは、T.th. RecA様タンパク質がプライマーDNA等に結合することを阻害する。このため、ATPを加えても、PCRの特異性が向上しにくい場合がある。従って、ADPに分解されないATP-γSを反応液に加えるのがよい。なお、ATP-γSの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、0.01 mM 〜 10 mM、好ましくは、0.1 mM 〜 1 mM とするのがよい。
【００１６】
鋳型DNAは、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、3000Mbpといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なDNAであっても構わない。勿論、その由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のDNAやそれらを改変したDNAであっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種のDNA断片を挿入したキメラDNA等であっても、或いは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。また、鋳型DNAとしては、二本鎖DNAでも一本鎖DNAでも利用できる。更に、RNAを逆転写することで得られるcDNAを鋳型DNAとして利用することもできる。
【００１７】
プライマーDNAは、鋳型DNAのうち増幅すべき配列（領域）の両端に位置する相当数の配列と実質的に相補的であれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、その由来も問われない。実質的に相補的な程度は、鋳型DNAに対する塩基のミスマッチが3塩基以内であるのが好ましく、更には、塩基のミスマッチが2塩基以内、また更には、塩基のミスマッチが1塩基以内、特に、100％の相補性を有するのが好ましい。前述したように、T.th. RecA様タンパク質が存在することにより、PCR反応の特異性が向上するため、プライマーDNAの相補性が低いと、所望の核酸が増幅されにくくなるからである。なお、プライマーDNAは、各々のプライマーDNAについて、最終濃度で0.01μM〜10μMの範囲で混合するのが好ましく、更には、0.1μM〜1μMの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でPCRを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。
【００１８】
更に、前記の核酸増幅方法であって、複数種のプライマーセットを用いて、複数種の核酸を同時に増幅させる核酸増幅方法とすると良い。
【００１９】
本発明によれば、複数種のプライマーセットを用いて複数種の核酸を同時に増幅させる。即ち、マルチプライマーPCRによって核酸を増幅させる。前述したように、従来のマルチプライマーPCRでは、所望の核酸が十分に増幅されなかったり、或いは、所望の核酸と一緒に副産物も多く増幅される場合があることに加え、所望の複数種の核酸が均一に増加しにくいという問題も生じる。従って、マルチプライマーPCRでは、PCR反応の最適化が特に難しい。
これに対し、本発明では、前述したように、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System等を用い、反応液中に T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行う。このようにすることで、従来のマルチプライマーPCRに比して、特に効果的に、所望の核酸の増幅効率を向上させることができる。一方、従来のマルチプライマーPCRに比して、特に効果的に、副産物の増幅を低く抑えることができる。しかも、従来のマルチプライマーPCRに比して、各プライマーセットに対応した所望の核酸をより均一に増幅させることができる。
【００２０】
更に、前記の核酸増幅方法であって、前記複数種のプライマーセットは、５種類以上のプライマーセットである核酸増幅方法とすると良い。
【００２１】
一般に、マルチプライマーPCRは、プライマーセット数が多くなるほど、特にプライマーセット数が５種以上になると、前述した問題が生じやすい。即ち、プライマーセット数が多くなるほど、所望の核酸が十分に増幅されなかったり、或いは、所望の核酸と一緒に副産物も多く増幅される場合があり、また、所望の複数種の核酸が均一に増加しにくい。
これに対し、本発明では、前述したように、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System等を用い、反応液中に T.th. RecA様タンパク質を混合して、PCRを行う。このようにすることで、プライマーセット数が５種以上と多くなっても、従来に比して、特に効果的に、所望の核酸の増幅効率を向上させることができる。一方、従来に比して、特に効果的に、副産物の増幅を低く抑えることができる。しかも、従来に比して、各プライマーセットに対応した所望の核酸をより均一に増幅させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施例を、図面を参照しつつ説明する。
（実施例１）
まず、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーセットとして８セット（１６種類）のプライマーDNA１〜１６（オリゴヌクレオチド１〜１６）を用意した。プライマーDNA１（オリゴヌクレオチド１）及びプライマーDNA２（オリゴヌクレオチド２）は、Homo sapiens isolate J3-08 mitochondrion（ACCESSION AY495225）を参考にして設計した。プライマーDNA３（オリゴヌクレオチド３）及びプライマーDNA４（オリゴヌクレオチド４）は、Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21-hydroxylase (CYP21) gene（ACCESSION M12792 M23280）を参考にして設計した。プライマーDNA５（オリゴヌクレオチド５）及びプライマーDNA６（オリゴヌクレオチド６）は、Human S100 protein beta-subunit gene（ACCESSION M59486 J05600）を参考にして設計した。プライマーDNA７（オリゴヌクレオチド７）及びプライマーDNA８（オリゴヌクレオチド８）は、Homo sapiens MYC gene for c-myc proto-oncogene and ORF1（ACCESSION X00364 J00120 K01908 M23541 V00501）を参考にして設計した。プライマーDNA９（オリゴヌクレオチド９）及びプライマーDNA１０（オリゴヌクレオチド１０）は、Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD) gene（ACCESSION AY340484）を参考にして設計した。プライマーDNA１１（オリゴヌクレオチド１１）及びプライマーDNA１２（オリゴヌクレオチド１２）は、Homo sapiens beta globin region on chromosome 11（ACCESSION NG_000007）を参考にして設計した。プライマーDNA１３（オリゴヌクレオチド１３）及びプライマーDNA１４（オリゴヌクレオチド１４）は、Homo sapiens transferin gene（ACCESSION AF294270）を参考にして設計した。プライマーDNA１５（オリゴヌクレオチド１５）及びプライマーDNA１６（オリゴヌクレオチド１６）は、Homo sapiens isolate J3-06 mitochondrion, complete genome（ACCESSION AY495223）を参考にして設計した。なお、ACCESSIONナンバーは、Gene Bank のアクセスナンバーを示している。各プライマーDNA１〜１６は、それぞれ鋳型DNAと100％相補的な塩基配列からなる。各プライマーDNA１〜１６は、鋳型DNAの塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。
【００２３】
プライマーDNA１（オリゴヌクレオチド１）：
5'-acaatgggctcactcaccc-3'
プライマーDNA２（オリゴヌクレオチド２）：
5'-ctaagaccaatggatagctg-3'
プライマーDNA３（オリゴヌクレオチド３）：
5'-gctcagcatggtggtggcataa-3'
プライマーDNA４（オリゴヌクレオチド４）：
5'-cctcataccttcccccccattt-3'
プライマーDNA５（オリゴヌクレオチド５）：
5'-gactactctagcgactgtccatctc-3'
プライマーDNA６（オリゴヌクレオチド６）：
5'-gacagccaccagatccaatc-3'
プライマーDNA７（オリゴヌクレオチド７）：
5'-aacctcacaaccttggctga-3'
プライマーDNA８（オリゴヌクレオチド８）：
5'-ttcacaacttaagatttggc-3'
プライマーDNA９（オリゴヌクレオチド９）：
5'-aggcaactaggatggtgtgg-3'
プライマーDNA１０（オリゴヌクレオチド１０）：
5'-cagggagcgtgtccatagg-3'
プライマーDNA１１（オリゴヌクレオチド１１）：
5'-ctgctgaaagagatgcggtgg-3'
プライマーDNA１２（オリゴヌクレオチド１２）：
5'-aggaaaacagcccaagggacag-3'
プライマーDNA１３（オリゴヌクレオチド１３）：
5'-actttgttctgagcctcaca-3'
プライマーDNA１４（オリゴヌクレオチド１４）：
5'-gttgcccaatcgcccctctc-3'
プライマーDNA１５（オリゴヌクレオチド１５）：
5'-aacctgactagaaaagctat-3'
プライマーDNA１６（オリゴヌクレオチド１６）：
5'-gaatgagtggttaattaatt-3'
【００２４】
また、T.th. RecA様タンパク質として、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の T.th. RecAタンパク質を用意した。更に、PCR用試薬キットとして、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System を用意した。
【００２５】
次に、上記 Expand High Fidelity PCR System のプロトコールに従って、PCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。具体的には、25μlのPCR反応液中に、1.0μM（最終濃度）のプライマーDNA１（オリゴヌクレオチド１）及び1.0μM（最終濃度）のプライマーDNA２（オリゴヌクレオチド２）と、20ngのヒトゲノムDNAと、1.4unitのDNAポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるenzyme）と、200μm（最終濃度）のdNTPs混合液と、0.1μgの T.th. RecAタンパク質とを、1×DNA polymerase buffer（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるbuffer）に混合した。そして、PCR反応を、1サイクル（94℃，2min）、35サイクル（94℃，10sec−55℃，30sec−70℃，90sec）、1サイクル（70℃，7min）で行った。その後、そのPCR反応液の 10μlを、1.2％のアガロースゲルで電気泳動し、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色して可視化した。そして、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を図１（ａ）に示す。
【００２６】
レーン９は、上述した反応を行った結果である。即ち、プライマーDNA１とプライマーDNA２とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。なお、図１（ａ）中下方にレーン番号が示してある。
レーン１０は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA３とプライマーDNA４とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１１は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA５とプライマーDNA６とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１２は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA７とプライマーDNA８とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１３は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA９とプライマーDNA１０とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１４は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA１１とプライマーDNA１２とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１５は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA１３とプライマーDNA１４とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
レーン１６は、上記プライマーセットに変えて、プライマーDNA１５とプライマーDNA１６とからなる１種類のプライマーセットを用いた結果である。
【００２７】
上記レーン９〜１６に対し、レーン１〜８はいずれも比較例である。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン９と同じである。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１０と同じである。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１１と同じである。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１２と同じである。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１３と同じである。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１４と同じである。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１５と同じである。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、レーン１６と同じである。
【００２８】
まず、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン１〜８）の結果を順番に見る。
レーン１では、300bp の所望の核酸（正しい特異的なPCR産物）が検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン２では、319bp の所望の核酸が検出された。しかし、900bp程度の大きさの副産物も強く検出された。
レーン３では、そもそも 360bp の所望の核酸が殆ど検出されなかった。
レーン４では、400bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン５では、450bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン６では、469bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン７では、650bp の所望の核酸が僅かしか検出されなかった。その上、450bp程度の大きさの副産物も検出された。
レーン８では、800bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
従って、これらの比較例においては、レーン１，４，５，６，８で良好な結果が得られたが、レーン２，３，７では、所望の核酸が十分に増幅しなかったり副産物が増幅するなど、良い結果が得られなかった。
【００２９】
次に、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った実施例（レーン９〜１６）の結果を順番に見る。
レーン９では、300bp の所望の核酸（正しい特異的なPCR産物）が検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン１０では、319bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１１では、360bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１２では、400bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１３では、450bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１４では、469bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１５では、650bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン１６では、800bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
従って、これらの実施例においては、良好な結果が得られた。
【００３０】
次いで、Expand High Fidelity PCR System を用いた上で、T.th. RecAタンパク質を加えてPCR反応を行うことの有効性を検証するために、別の比較実験を行った。
上記実施例と同様に、鋳型DNA（ヒトゲノムDNA）と、プライマーセット（オリゴヌクレオチド１〜１６）と、T.th. RecAタンパク質を用意した。一方、本比較例では、PCR用試薬キットとして、上記の Expand High Fidelity PCR System の代わりに、Roche社製の Taq DNA polymerase を用意した。
【００３１】
次に、基本的には上記実施例または比較例と同様にしてPCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。なお、Expand High Fidelity PCR System の代わりに Taq DNA polymerase を用いたことに伴い、DNAポリメラーゼは Taq DNA polymerase の enzyme を、1×DNA polymerase bufferは Taq DNA polymerase に含まれるbufferを使用した。また、T.th. RecAタンパク質を添加する場合の添加量は 0.2μgとした。PCR反応後は、上記実施例や比較例と同様に、電気泳動を行って、ゲル中のDNAを可視化し、写真に記録した。その結果を図１（ｂ）に示す。
【００３２】
レーン１７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン９と同じである。なお、図１（ｂ）中下方にレーン番号が示してある。
レーン１８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１０と同じである。
レーン１９は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１１と同じである。
レーン２０は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１２と同じである。
レーン２１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１３と同じである。
レーン２２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１４と同じである。
レーン２３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１５と同じである。
レーン２４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１６と同じである。
【００３３】
レーン２５は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン９と同じである。
レーン２６は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１０と同じである。
レーン２７は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１１と同じである。
レーン２８は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１２と同じである。
レーン２９は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１３と同じである。
レーン３０は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１４と同じである。
レーン３１は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１５と同じである。
レーン３２は、T.th. RecAタンパク質を加えて、上記のPCR反応を行った結果であり、プライマーセットは、上記実施例のレーン１６と同じである。
【００３４】
まず、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン１７〜２４）の結果を順番に見る。
レーン１７では、そもそも 300bp の所望の核酸（正しい特異的なPCR産物）が殆ど検出されなかった。
レーン１８では、319bp の所望の核酸が検出された。しかし、900bp程度の大きさの副産物も強く検出された。
レーン１９では、そもそも 360bp の所望の核酸が殆ど検出されなかった。
レーン２０では、400bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２１では、450bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２２では、469bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２３では、650bp の所望の核酸が検出された。しかし、450bp程度の大きさの副産物も検出された。
レーン２４では、800bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
従って、これらの比較例においては、レーン２０〜２２，２４で良好な結果が得られたが、レーン１７〜１９，２３では、所望の核酸が増幅しなかったり副産物が増幅するなど、良い結果が得られなかった。
【００３５】
次に、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った比較例（レーン２５〜３２）の結果を順番に見る。
レーン２５では、300bp の所望の核酸（正しい特異的なPCR産物）が検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン２６では、319bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２７では、360bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２８では、400bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン２９では、450bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
レーン３０では、469bp の所望の核酸が検出された。しかし、450bp程度の大きさの副産物も若干検出された。
レーン３１では、そもそも 650bp の所望の核酸が殆ど検出されなかった。
レーン３２では、800bp の所望の核酸が検出された。一方、副産物は殆ど検出されなかった。
従って、これらの比較例においては、レーン２５〜２９，３２で良好な結果が得られたが、レーン３０，３１では、所望の核酸が増幅しなかったり副産物が増幅するなど、良い結果が得られなかった。
【００３６】
以上の結果を踏まえて、各実施例（レーン９〜１６）の結果を考察する。
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン１７では、所望の核酸が殆ど検出されなかった。これに対し、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン２５、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン１、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン９では、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、少なくとも、Expand High Fidelity PCR System を用いるか、或いは、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合があることが判る。
【００３７】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン１８、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２では、所望の核酸と共に、副産物も強く検出された。これに対し、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン２６、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１０では、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合があることが判る。
【００３８】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン１９、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン３では、所望の核酸が検出されなかった。これに対し、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン２７、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１１では、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合があることが判る。
【００３９】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２０、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン２８、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン４、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１２のいずれにおいても、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、Expand High Fidelity PCR System や T.th. RecAタンパク質を利用しなくても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合もあることが判る。
【００４０】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２１、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン２９、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン５、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１３のいずれにおいても、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、Expand High Fidelity PCR System や T.th. RecAタンパク質を利用しなくても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合もあることが判る。
【００４１】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン３０では、所望の核酸が検出されたが、副産物も検出された。これに対し、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２２、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン６、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１４では、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、T.th. RecAタンパク質を加えると、かえって悪い結果を招くこともあるが、Expand High Fidelity PCR Systemを用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCR反応を行えば、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合があることが判る。
【００４２】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２３、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン７では、所望の核酸が検出された一方、副産物も多く検出された。また、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン３１では、所望の核酸が殆ど検出されなかった。これに対し、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１５では、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、Expand High Fidelity PCR System を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合があることが判る。
【００４３】
Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン２４、Taq DNA polymerase を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン３２、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行ったレーン８、及び、Expand High Fidelity PCR System を用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行ったレーン１６のいずれにおいても、所望の核酸が検出された一方、副産物は殆ど検出されなかった。このことから、Expand High Fidelity PCR System や T.th. RecAタンパク質を利用しなくても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合もあることが判る。
【００４４】
以上より、Expand High Fidelity PCR System を用いたり、或いは、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことで、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅できる場合もある。しかし、Expand High Fidelity PCR System を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、より効果的に、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅させることが可能になると言える。
【００４５】
（実施例２）
次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーセットとして１２セット（２４種類）のプライマーDNA１７〜４０（オリゴヌクレオチド１７〜４０）を用意した。プライマーDNA１７（オリゴヌクレオチド１７）及びプライマーDNA１８（オリゴヌクレオチド１８）は、Homo sapiens target of methylation-induced silencing 1 (TMS1) gene（ACCESSION AF184072）を参考にして設計した。プライマーDNA１９（オリゴヌクレオチド１９）及びプライマーDNA２０（オリゴヌクレオチド２０）は、Human thalassemia beta globin gene（ACCESSION U20223）を参考にして設計した。プライマーDNA２１（オリゴヌクレオチド２１）及びプライマーDNA２２（オリゴヌクレオチド２２）は、Human RPE-retinal G protein coupled receptor (rgr) gene（ACCESSION U15790）を参考にして設計した。プライマーDNA２３（オリゴヌクレオチド２３）及びプライマーDNA２４（オリゴヌクレオチド２４）は、Homo sapiens hemoglobin gene（ACCESSION NM_000518）を参考にして設計した。プライマーDNA２５（オリゴヌクレオチド２５）及びプライマーDNA２６（オリゴヌクレオチド２６）は、Homo sapiens MYC gene for c-myc proto-oncogene（ACCESSION X00364 J00120 K01908 M23541 V00501）を参考にして設計した。プライマーDNA２７（オリゴヌクレオチド２７）及びプライマーDNA２８（オリゴヌクレオチド２８）は、Homo sapiens neural retinal-specific leucine zipper protein (NRL) gene（ACCESSION U95012）を参考にして設計した。プライマーDNA２９（オリゴヌクレオチド２９）及びプライマーDNA３０（オリゴヌクレオチド３０）は、Human chorionic somatomammotropin gene hCS-1（ACCESSION K02401）を参考にして設計した。プライマーDNA３１（オリゴヌクレオチド３１）及びプライマーDNA３２（オリゴヌクレオチド３２）は、Human subtelomeric DNA sequence（ACCESSION M84016）を参考にして設計した。プライマーDNA３３（オリゴヌクレオチド３３）及びプライマーDNA３４（オリゴヌクレオチド３４）は、Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter gene（ACCESSION AB044401）を参考にして設計した。プライマーDNA３５（オリゴヌクレオチド３５）及びプライマーDNA３６（オリゴヌクレオチド３６）は、Homo spaiens HPFH6OR gene for olfactory receptor（ACCESSION X81445 X91835）を参考にして設計した。プライマーDNA３７（オリゴヌクレオチド３７）及びプライマーDNA３８（オリゴヌクレオチド３８）は、Human p53 (TP53) gene（ACCESSION U94788）を参考にして設計した。プライマーDNA３９（オリゴヌクレオチド３９）及びプライマーDNA４０（オリゴヌクレオチド４０）は、Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene（ACCESSION U72959 U72960）を参考にして設計した。なお、各プライマーDNA１７〜４０は、鋳型DNAと100％相補的な塩基配列からなる。
【００４６】
プライマーDNA１７（オリゴヌクレオチド１７）：
5'-GGCTGGAGTGCAGTGGTGCAAT-3'
プライマーDNA１８（オリゴヌクレオチド１８）：
5'-GGCAGAGGCTACAGTGAGCCAA-3'
プライマーDNA１９（オリゴヌクレオチド１９）：
5'-GGGCAGAGCCATCTATTGCTTACA-3'
プライマーDNA２０（オリゴヌクレオチド２０）：
5'-GGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCA-3'
プライマーDNA２１（オリゴヌクレオチド２１）：
5'-CCCACGATCAATGCCATCAACT-3'
プライマーDNA２２（オリゴヌクレオチド２２）：
5'-CGGTGAGAGGCACTGCCAGATT-3'
プライマーDNA２３（オリゴヌクレオチド２３）：
5'-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAAT-3'
プライマーDNA２４（オリゴヌクレオチド２４）：
5'-GCCCTTCATAATATCCCCCAGTTT-3'
プライマーDNA２５（オリゴヌクレオチド２５）：
5'-GTCCTTCCCCCGCTGGAAAC-3'
プライマーDNA２６（オリゴヌクレオチド２６）：
5'-GCAGCAGAGATCATCGCGCC-3'
プライマーDNA２７（オリゴヌクレオチド２７）：
5'-GTGGGGGTGCTGGGAGTTTGT-3'
プライマーDNA２８（オリゴヌクレオチド２８）：
5'-TCGGACAGAAACATGGGTCTGAA-3'
プライマーDNA２９（オリゴヌクレオチド２９）：
5'-GGTGCTCAGAACCCCCACAATC-3'
プライマーDNA３０（オリゴヌクレオチド３０）：
5'-CCTACCGACCCCATTCCACTCT-3'
プライマーDNA３１（オリゴヌクレオチド３１）：
5'-CACAGATTTCCAAGGATGCGCTG-3'
プライマーDNA３２（オリゴヌクレオチド３２）：
5'-CGTGCTCTGTTCCAGACTTG-3'
プライマーDNA３３（オリゴヌクレオチド３３）：
5'-CGTCTGGCGATTGCTCCAAATG-3'
プライマーDNA３４（オリゴヌクレオチド３４）：
5'-GGGCAGTTGTGATCCATGAGAA-3'
プライマーDNA３５（オリゴヌクレオチド３５）：
5'-GGCTTGCACCAGCTTAGGAAAG-3'
プライマーDNA３６（オリゴヌクレオチド３６）：
5'-CGTTAGGCATAATCAGTGGGATAGT-3'
プライマーDNA３７（オリゴヌクレオチド３７）：
5'-GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTCT-3'
プライマーDNA３８（オリゴヌクレオチド３８）：
5'-TGTCAACCACCCTTAACCCCTCC-3'
プライマーDNA３９（オリゴヌクレオチド３９）：
5'-TTGGAGGGGTGGGTGAGTCAAG-3'
プライマーDNA４０（オリゴヌクレオチド４０）：
5'-GGAGGGGTGGGGGTTAATGGTTA-3'
【００４７】
また、T.th. RecA様タンパク質として、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の T.th. RecAタンパク質を、更に、PCR用試薬キットとして、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System を用意した。
【００４８】
次に、上記 Expand High Fidelity PCR System のプロトコールに従って、PCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。本実施例では、上記１２種類のプライマーセットのうち、８種類、１０種類、または、１２種類全てを一緒に用いて、８種類、１０種類、または、１２種類の核酸を同時に増幅させた。具体的には、25μlのPCR反応液中に、各々0.08μM（最終濃度）のプライマーDNA１７〜３２（オリゴヌクレオチド１７〜３２）、プライマーDNA１７〜３６（オリゴヌクレオチド１７〜３６）、または、プライマーDNA１７〜４０（オリゴヌクレオチド１７〜４０）と、50ngのヒトゲノムDNAと、1.4unitのDNAポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるenzyme）と、200μm（最終濃度）のdNTPs混合液と、0.1μgの T.th. RecAタンパク質とを、1×DNA polymerase buffer（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるbuffer）に混合した。そして、PCR反応を、上記実施例１と同様に、1サイクル（94℃，2min）、35サイクル（94℃，10sec−55℃，30sec−70℃，90sec）、1サイクル（70℃，7min）で行った。その後、そのPCR反応液の 10μlを、8.0％のアクリルアミドゲルで電気泳動し、このゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色して可視化した。そして、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を図２に示す。
【００４９】
レーン３は、８種類のプライマーセット（プライマーDNA１７〜３２）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン４は、各々のプライマーDNA１７〜３２の最終濃度を0.08μMから0.04μMに減らして、上記のPCR反応を行った結果である。
レーン１は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン３と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.08μM）を行った結果である。
レーン２は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン４と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.04μM）を行った結果である。
【００５０】
レーン７は、１０種類のプライマーセット（プライマーDNA１７〜３６）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン８は、各々のプライマーDNA１７〜３６の最終濃度を0.08μMから0.04μMに減らして、上記のPCR反応を行った結果である。
レーン５は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン７と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.08μM）を行った結果である。
レーン６は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン８と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.04μM）を行った結果である。
【００５１】
レーン１１は、１２種類のプライマーセット（プライマーDNA１７〜４０）全てを用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１２は、各々のプライマーDNA１７〜４０の最終濃度を0.08μMから0.04μMに減らして、上記のPCR反応を行った結果である。
レーン９は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１１と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.08μM）を行った結果である。
レーン１０は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１２と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.04μM）を行った結果である。
【００５２】
なお、プライマーDNA１７及び１８によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１とする）の大きさは 44bpである。プライマーDNA１９及び２０によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸２とする）の大きさは 57bpである。プライマーDNA２１及び２２によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸３とする）の大きさは 74bpである。プライマーDNA２３及び２４によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸４とする）の大きさは 84bpである。プライマーDNA２５及び２６によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸５とする）の大きさは 100bpである。プライマーDNA２７及び２８によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸６とする）の大きさは 116bpである。プライマーDNA２９及び３０によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸７とする）の大きさは 135bpである。プライマーDNA３１及び３２によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸８とする）の大きさは 153bpである。プライマーDNA３３及び３４によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸９とする）の大きさは 170bpである。プライマーDNA３５及び３６によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１０とする）の大きさは 183bpである。プライマーDNA３７及び３８によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１１とする）の大きさは 193bpである。プライマーDNA３９及び４０によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１２とする）の大きさは 237bpである。
【００５３】
まず、８種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン１，２）の結果を見る。
レーン１では、所望の標的核酸１〜８（正しい特異的なPCR産物）全てがほぼ均一に検出された。しかし、副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
レーン２では、所望の標的核酸１〜８全てがほぼ均一に検出された。しかし、副産物も若干検出された。
【００５４】
次に、８種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った実施例（レーン３，４）の結果を見る。
レーン３では、８種類の所望の標的核酸１〜８（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン４でも、８種類の所望の標的核酸１〜８（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
【００５５】
次に、１０種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン５，６）の結果を見る。
レーン５では、所望の標的核酸１，２，３，４，９（正しい特異的なPCR産物）が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸５，６，７，８，１０は殆ど検出されなかった。更に、副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
レーン６では、所望の標的核酸１〜１０全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、副産物も若干検出された。
【００５６】
次に、１０種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った実施例（レーン７，８）の結果を見る。
レーン７では、１０種類の所望の標的核酸１〜１０（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン８でも、１０種類の所望の標的核酸１〜１０（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
【００５７】
次に、１２種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン９，１０）の結果を見る。
レーン９では、所望の標的核酸１〜１２（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
レーン１０では、所望の標的核酸３〜１２が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸１，２は殆ど検出されなかった。更に、副産物も若干検出された。
【００５８】
次に、１２種類のプライマーセットを用い、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った実施例（レーン１１，１２）の結果を見る。
レーン１１では、１２種類の所望の標的核酸１〜１２（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン１２でも、１２種類の所望の標的核酸１〜１２（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
【００５９】
このような結果から、Expand High Fidelity PCR System を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、より効果的に、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅させること可能になると言える。また、マルチプライマーPCRにおいては、複数種の核酸をほぼ均一に増幅させることができることが判る。
なお、本比較例は Expand High Fidelity PCR System を利用しているが、Expand High Fidelity PCR System の代わりに、例えば、前述した Taq DNA polymerase を用いた場合には、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行っても、本実施例よりも結果が悪くなることが判っている。従って、上記のように、Expand High Fidelity PCR System を用いた上で、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うのが好適である。
【００６０】
（実施例３）
次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記実施例１または２と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーセットとして、上記実施例２と同じ１２セット（２４種類）のプライマーDNA１７〜４０（オリゴヌクレオチド１７〜４０）を用意した。また、T.th. RecA様タンパク質として、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の T.th. RecAタンパク質を用意した。また、本実施例では、上記実施例２の Expand High Fidelity PCR System の代わりに、Roche社製の Expand Long Template PCR System を用意した。
【００６１】
次に、上記 Expand Long Template PCR System のプロトコールに従って、PCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。本実施例も、上記実施例２と同様に、上記１２種類のプライマーセットを一緒に用いて、１２種類の核酸を同時に増幅させた。具体的には、25μlのPCR反応液中に、各々0.08μM（最終濃度）のプライマーDNA１７〜４０（オリゴヌクレオチド１７〜４０）と、50ngのヒトゲノムDNAと、1.4unitのDNAポリメラーゼ（Expand Long Template PCR Systemに含まれるenzyme）と、200μm（最終濃度）のdNTPs混合液と、0.1μgの T.th. RecAタンパク質とを、1×DNA polymerase buffer（Expand Long Template PCR Systemに含まれるbuffer）に混合した。そして、PCR反応を、上記実施例１，２と同様に、1サイクル（94℃，2min）、35サイクル（94℃，10sec−55℃，30sec−70℃，90sec）、1サイクル（70℃，7min）で行った。その後、そのPCR反応液の 10μlを、8.0％のアクリルアミドゲルで電気泳動し、このゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のDNAを染色して可視化した。そして、染色されたDNAを写真に記録した。その結果を図３に示す。
【００６２】
レーン３は、上述した反応を行った結果である。
レーン４は、各々のプライマーDNA１７〜４０の最終濃度を0.08μMから0.04μMに減らして、上記のPCR反応を行った結果である。
レーン１は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン３と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.08μM）を行った結果である。
レーン２は、比較例であり、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン４と同じ反応（各プライマーDNAの最終濃度0.04μM）を行った結果である。
【００６３】
まず、T.th. RecAタンパク質を加えずにPCRを行った比較例（レーン１，２）の結果を見る。なお、各プライマーセットによって増幅されるべき核酸は、上記実施例２と同様である（標的核酸１〜１２）。
レーン１では、所望の標的核酸１〜７，９〜１２（正しい特異的なPCR産物）が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸８は殆ど検出されなかった。更に、副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
レーン２では、所望の標的核酸１〜７，９〜１２が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸８は殆ど検出されなかった。更に、副産物も若干検出された。
【００６４】
次に、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行った実施例（レーン３，４）の結果を見る。
レーン３では、所望の標的核酸１〜１２（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
レーン４でも、所望の標的核酸１〜１２（正しい特異的なPCR産物）が、全てほぼ均一に検出された。一方、副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
【００６５】
このような結果から、Expand Long Template PCR System を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、より効果的に、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅させることが可能になると言える。また、マルチプライマーPCRにおいては、複数種の核酸をほぼ均一に増幅させることができることが判る。
なお、本比較例は Expand Long Template PCR System を利用しているが、Expand Long Template PCR System の代わりに、例えば、前述のTaq DNA polymerase を用いた場合には、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行っても、本実施例よりも結果が悪くなることが判っている。従って、上記のように、Expand Long Template PCR System を用いた上で、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うのが好適である。
【００６６】
（実施例４）
次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜３のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーセットとして、上記実施例２で示したプライマーDNA２１〜４０（オリゴヌクレオチド２１〜４０）を含む１５セット（３０種類）のプライマーセット２１〜５０を用意した。プライマーDNA４１（オリゴヌクレオチド４１）及びプライマーDNA４２（オリゴヌクレオチド４２）は、Human midkine gene（ACCESSION D10604 D90540）を参考にして設計した。プライマーDNA４３（オリゴヌクレオチド１９）及びプライマーDNA４４（オリゴヌクレオチド２０）は、Human rhodopsin gene（ACCESSION U49742 K02281）を参考にして設計した。プライマーDNA４５（オリゴヌクレオチド２１）及びプライマーDNA４６（オリゴヌクレオチド２２）は、Human DNA for CAAF1 (calcium-binding protein in amniotic fluid 1)（ACCESSION D83657）を参考にして設計した。プライマーDNA４７（オリゴヌクレオチド２３）及びプライマーDNA４８（オリゴヌクレオチド２４）は、Homo sapiens CYP21 gene, exons 1 through 10; and steroid 21-hydroxylase (CYP21) gene（ACCESSION M12792 M23280）を参考にして設計した。プライマーDNA４９（オリゴヌクレオチド２５）及びプライマーDNA５０（オリゴヌクレオチド２６）は、Human S100 protein beta-subunit gene（ACCESSION M59486 J05600）を参考にして設計した。なお、これらのプライマーDNA４１〜５０も、鋳型DNAと100％相補的な塩基配列からなる。
【００６７】
プライマーDNA４１（オリゴヌクレオチド４１）：
5'-GGAACAAGACACGGCTGGGTT-3'
プライマーDNA４２（オリゴヌクレオチド４２）：
5'-AGCAAGGCAGGGCAGGCAAGT-3'
プライマーDNA４３（オリゴヌクレオチド４３）：
5'-CGGTCCCATTCTCAGGGAATCT-3'
プライマーDNA４４（オリゴヌクレオチド４４）：
5'-GCCCAGAGGAAGAAGAAGGAAA-3'
プライマーDNA４５（オリゴヌクレオチド４５）：
5'-GCCCCCACCCAGGTTGGTTTCTA-3'
プライマーDNA４６（オリゴヌクレオチド４６）：
5'-ATGCCTTCATCTGGCTCAGTGAA-3'
プライマーDNA４７（オリゴヌクレオチド４７）：
5'-GCTCAGCATGGTGGTGGCATAA-3'
プライマーDNA４８（オリゴヌクレオチド４８）：
5'-CCTCATACCTTCCCCCCCATTT-3'
プライマーDNA４９（オリゴヌクレオチド４９）：
5'-GACTACTCTAGCGACTGTCCATCTC-3'
プライマーDNA５０（オリゴヌクレオチド５０）：
5'-GACAGCCACCAGATCCAATC-3'
【００６８】
また、T.th. RecA様タンパク質として、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の T.th. RecAタンパク質を用意した。更に、PCR試薬キットとして、実施例１，２と同じく、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System を用意した。
【００６９】
次に、上記 Expand High Fidelity PCR System のプロトコールに従って、PCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。本実施例では、上記１５セットのプライマーセットのうち、８セット〜１５セットを一緒に用いて、８種類〜１５種類の核酸を同時に増幅させた。具体的には、50μlのPCR反応液中に、各々0.07μM（最終濃度）のプライマーDNA２１〜３６（オリゴヌクレオチド２１〜３６）、プライマーDNA２１〜３８（オリゴヌクレオチド２１〜３８）、プライマーDNA２１〜４０（オリゴヌクレオチド２１〜４０）、プライマーDNA２１〜４２（オリゴヌクレオチド２１〜４２）、プライマーDNA２１〜４４（オリゴヌクレオチド２１〜４４）、プライマーDNA２１〜４６（オリゴヌクレオチド２１〜４６）、プライマーDNA２１〜４８（オリゴヌクレオチド２１〜４８）、または、プライマーDNA２１〜５０（オリゴヌクレオチド２１〜５０）と、50ngのヒトゲノムDNAと、3.0 unitのDNAポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるenzyme）と、200μm（最終濃度）のdNTPs混合液と、0.5μgの T.th. RecAタンパク質とを、1×DNA polymerase buffer（Expand High Fidelity PCR Systemに含まれるbuffer）に混合した。そして、PCR反応を、1サイクル（93℃，30sec）、35サイクル（94℃，15sec−55℃，30sec−72℃，30sec）、1サイクル（72℃，7min）で行った。その後、そのPCR反応液の 10μlを、12.0％のアクリルアミドゲルで電気泳動し、SYBR Green I（Cambrex社）により染色してDNAを可視化した。そして、これを写真に記録した。その結果を図４に示す。
【００７０】
レーン１７は、８種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜３６）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１８は、９種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜３８）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１９は、１０種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４０）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン２０は、１１種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４２）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン２１は、１２種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４４）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン２２は、１３種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４６）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン２３は、１４種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４８）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン２４は、１５種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜５０）を用いて、上述した反応を行った結果である。
【００７１】
レーン１〜レーン８は、比較例である。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１７と同じ反応を行った結果である。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１８と同じ反応を行った結果である。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１９と同じ反応を行った結果である。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン２０と同じ反応を行った結果である。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン２１と同じ反応を行った結果である。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン２２と同じ反応を行った結果である。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン２３と同じ反応を行った結果である。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン２４と同じ反応を行った結果である。
【００７２】
レーン９〜レーン１６も、比較例である。
レーン９は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１７と同じ反応を行った結果である。
レーン１０は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１８と同じ反応を行った結果である。
レーン１１は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン１９と同じ反応を行った結果である。
レーン１２は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２０と同じ反応を行った結果である。
レーン１３は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２１と同じ反応を行った結果である。
レーン１４は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２２と同じ反応を行った結果である。
レーン１５は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２３と同じ反応を行った結果である。
レーン１６は、T.th. RecAタンパク質の代わりに、0.5μgのE.coli RecAタンパク質を加えて、それ以外はレーン２４と同じ反応を行った結果である。
【００７３】
なお、プライマーDNA２１〜４０によって増幅されるべき核酸は、実施例２で説明した通りである（標的核酸３〜１２）。
更に、プライマーDNA４１及び４２によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１３とする）の大きさは 243bpである。プライマーDNA４３及び４４によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１４とする）の大きさは 273bpである。プライマーDNA４５及び４６によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１５とする）の大きさは 300bpである。プライマーDNA４７及び４８によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１６とする）の大きさは 319bpである。プライマーDNA４９及び５０によって増幅されるべき核酸（これを標的核酸１７とする）の大きさは 360bpである。
【００７４】
まず、８種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン１，９）及び実施例（レーン１７）を見る。
レーン１では、８種類の所望の標的核酸３〜１０（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン９では、８種類の所望の標的核酸３〜１０全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン１７では、８種類の所望の標的核酸３〜１０が、全てほぼ均一に検出された。一方、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００７５】
次に、９種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン２，１０）及び実施例（レーン１８）を見る。
レーン２では、９種類の所望の標的核酸３〜１１（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１０では、９種類の所望の標的核酸３〜１１全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン１８では、９種類の所望の標的核酸３〜１１が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００７６】
次に、１０種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン３，１１）及び実施例（レーン１９）を見る。
レーン３では、１０種類の所望の標的核酸３〜１２（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１１では、１０種類の所望の標的核酸３〜１２全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン１９では、１０種類の所望の標的核酸３〜１２が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が、比較例よりも大幅に減少した。
【００７７】
次に、１１種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン４，１２）及び実施例（レーン２０）を見る。
レーン４では、１１種類の所望の標的核酸３〜１３（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１２では、１１種類の所望の標的核酸３〜１３全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン２０では、１１種類の所望の標的核酸３〜１３が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００７８】
次に、１２種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン５，１３）及び実施例（レーン２１）を見る。
レーン５では、１２種類の所望の標的核酸３〜１４（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１３では、１２種類の所望の標的核酸３〜１４全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン２１では、１２種類の所望の標的核酸３〜１４が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００７９】
次に、１３種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン６，１４）及び実施例（レーン２２）を見る。
レーン６では、１３種類の所望の標的核酸３〜１５（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１４では、１３種類の所望の標的核酸３〜１５全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン２２では、１３種類の所望の標的核酸３〜１５が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００８０】
次に、１４種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン７，１５）及び実施例（レーン２３）を見る。
レーン７では、１４種類の所望の標的核酸３〜１６（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１５では、１４種類の所望の標的核酸３〜１６全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン２３では、１４種類の所望の標的核酸３〜１６が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００８１】
次に、１５種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン８，１６）及び実施例（レーン２４）を見る。
レーン８では、所望の標的核酸４，５，８（正しい特異的なPCR産物）が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸３，６，７，９〜１７は殆ど検出されなかった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物（非特異的なPCR産物）が多量に検出された。
レーン１６では、所望の標的核酸３〜６，８，１５が検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。また、所望の標的核酸７，９〜１４，１６，１７は殆ど検出されなかった。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が多量に検出された。
これに対し、レーン２４では、１５種類の所望の標的核酸３〜１７が、全てほぼ均一に検出された。また、プライマーダイマーの形成に起因する副産物が、比較例よりも大幅に減少した。
【００８２】
このような結果から、Expand High Fidelity PCR System を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、より効果的に、ミスプライミングに起因する副産物やプライマーダイマーの形成に起因する副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅させること可能になると言える。また、マルチプライマーPCRにおいて、複数種の核酸をほぼ均一に増幅させることができることが判る。
なお、本比較例は Expand High Fidelity PCR System を利用しているが、Expand High Fidelity PCR System の代わりに、例えば、前述した Taq DNA polymerase を用いた場合には、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行っても、本実施例よりも結果が悪くなることが判っている。従って、上記のように、Expand High Fidelity PCR System を用いた上で、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うのが好適である。
【００８３】
（実施例５）
次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記実施例１〜４のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
まず、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA（Promega）を用意した。また、プライマーセットとして、上記実施例２または４で示した１５セット（３０種類）のプライマーセット２１〜５０（オリゴヌクレオチド２１〜５０）を用意した。また、T.th. RecA様タンパク質として、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）の T.th. RecAタンパク質を用意した。一方、本実施例では、PCR試薬キットとして、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用意した。
【００８４】
次に、上記 TaKaRa EX Taq Hot Start Version のプロトコールに従って、PCR反応を行い、所望の核酸を増幅させた。本実施例では、上記１５セットのプライマーセットのうち、８セット〜１５セットを一緒に用いて、８種類〜１５種類の核酸を同時に増幅させた。具体的には、50μlのPCR反応液中に、各々0.07μM（最終濃度）のプライマーDNA２１〜３６（オリゴヌクレオチド２１〜３６）、プライマーDNA２１〜３８（オリゴヌクレオチド２１〜３８）、プライマーDNA２１〜４０（オリゴヌクレオチド２１〜４０）、プライマーDNA２１〜４２（オリゴヌクレオチド２１〜４２）、プライマーDNA２１〜４４（オリゴヌクレオチド２１〜４４）、プライマーDNA２１〜４６（オリゴヌクレオチド２１〜４６）、プライマーDNA２１〜４８（オリゴヌクレオチド２１〜４８）、または、プライマーDNA２１〜５０（オリゴヌクレオチド２１〜５０）と、50ngのヒトゲノムDNAと、1.8 unitのDNAポリメラーゼ（TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに含まれるenzyme）と、200μM（最終濃度）のdNTPs混合液と、0.5μgの T.th. RecAタンパク質とを、1×DNA polymerase buffer（TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに含まれるbuffer）に混合した。そして、PCR反応を、1サイクル（93℃，30sec）、35サイクル（94℃，15sec−55℃，30sec−72℃，30sec）、1サイクル（72℃，7min）で行った。その後、そのPCR反応液の 10μlを、12.0％のアクリルアミドゲルで電気泳動し、SYBR Green I（Cambrex社）により染色してDNAを可視化した。そして、これを写真に記録した。その結果を図５に示す。
【００８５】
レーン９は、８種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜３６）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１０は、９種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜３８）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１１は、１０種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４０）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１２は、１１種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４２）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１３は、１２種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４４）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１４は、１３種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４６）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１５は、１４種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜４８）を用いて、上述した反応を行った結果である。
レーン１６は、１５種類のプライマーセット（プライマーDNA２１〜５０）を用いて、上述した反応を行った結果である。
【００８６】
レーン１〜レーン８は、比較例である。
レーン１は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン９と同じ反応を行った結果である。
レーン２は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１０と同じ反応を行った結果である。
レーン３は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１１と同じ反応を行った結果である。
レーン４は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１２と同じ反応を行った結果である。
レーン５は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１３と同じ反応を行った結果である。
レーン６は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１４と同じ反応を行った結果である。
レーン７は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１５と同じ反応を行った結果である。
レーン８は、T.th. RecAタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１６と同じ反応を行った結果である。
【００８７】
まず、８種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン１）及び実施例（レーン９）を見る。
レーン１では、８種類の所望の標的核酸３〜１０（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン９では、８種類の所望の標的核酸３〜１０が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）は殆ど検出されなかった。
【００８８】
次に、９種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン２）及び実施例（レーン１０）を見る。
レーン２では、９種類の所望の標的核酸３〜１１（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１０では、９種類の所望の標的核酸３〜１１が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００８９】
次に、１０種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン３）及び実施例（レーン１１）を見る。
レーン３では、１０種類の所望の標的核酸３〜１２（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１１では、１０種類の所望の標的核酸３〜１２が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９０】
次に、１１種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン４）及び実施例（レーン１２）を見る。
レーン４では、１１種類の所望の標的核酸３〜１３（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１２では、１１種類の所望の標的核酸３〜１３が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９１】
次に、１２種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン５）及び実施例（レーン１３）を見る。
レーン５では、１２種類の所望の標的核酸３〜１４（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１３では、１２種類の所望の標的核酸３〜１４が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９２】
次に、１３種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン６）及び実施例（レーン１４）を見る。
レーン６では、１３種類の所望の標的核酸３〜１５（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１４では、１３種類の所望の標的核酸３〜１５が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９３】
次に、１４種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン７）及び実施例（レーン１５）を見る。
レーン７では、１４種類の所望の標的核酸３〜１６（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１５では、１４種類の所望の標的核酸３〜１６が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９４】
次に、１５種類のプライマーセットを用いた比較例（レーン８）及び実施例（レーン１６）を見る。
レーン８では、１５種類の所望の標的核酸３〜１７（正しい特異的なPCR産物）全てが検出された。しかし、標的核酸毎に増幅のバラツキが見られ、不均一であった。更に、ミスプライミングに起因する副産物（非特異的なPCR産物）も若干検出された。
これに対し、レーン１６では、１５種類の所望の標的核酸３〜１６が、全てほぼ均一に検出された。一方、ミスプライミングに起因する副産物は殆ど検出されなかった。
【００９５】
このような結果から、TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用い、かつ、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うことにより、より効果的に、ミスプライミングに起因する副産物やプライマーダイマーの形成に起因する副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸を増幅させること可能になると言える。また、マルチプライマーPCRにおいて、複数種の核酸をほぼ均一に増幅させることができることが判る。
なお、本比較例は TaKaRa EX Taq Hot Start Version を利用しているが、この代わりに、例えば、前述した Taq DNA polymerase を用いた場合には、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行っても、本実施例よりも結果が悪くなることが判っている。従って、上記のように、TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用いた上で、T.th. RecAタンパク質を加えてPCRを行うのが好適である。
【００９６】
以上において、本発明を実施例に即して説明したが、本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることはいうまでもない。
例えば、上記各実施例では、別途抽出し精製したT.th. RecAタンパク質を反応液に加えてPCR反応を行っている。しかしながら、T.th. RecAタンパク質等のT.th. RecA様タンパク質を発現可能なように形質転換した大腸菌等を用意し、これに熱処理を行ったものをT.th. RecA様タンパク質として利用することもできる。つまり、大腸菌等を熱処理して、耐熱性の高いT.th. RecA様タンパク質等を残しつつ、その他のタンパク質を失活させて、これをPCRに利用する方法である。特に、大腸菌等の宿主細胞のゲノムDNAやプラスミドDNAを鋳型DNAとする場合には、T.th. RecA様タンパク質を発現する大腸菌等に熱処理を行うことで、鋳型DNAとT.th. RecA様タンパク質とを同時に得ることができるので、PCRを行うための作業効率を向上させることができる。
【００９７】
なお、上記実施例１〜５では、Roche社製の Expand High Fidelity PCR System、若しくは Expand Long Template PCR System、または、タカラバイオ社製の TaKaRa EX Taq Hot Start Version を用いているが、Roche社製の Expand High Fidelity PCR Master、Expand High Fidelity Plus PCR System、或いは、Expand 20kb Plus PCR System を用いても、従来に比して良好な結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】実施例１に関し、PCR反応物についての電気泳動の結果を示す図面に変わる写真であり、（ａ）は Expand High Fidelity PCR System を用いた結果であり、（ｂ）は Taq DNA polymerase を用いた結果である。
【図２】実施例２に関し、PCR反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】実施例３に関し、PCR反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】実施例４に関し、PCR反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】実施例５に関し、PCR反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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