(57)【要約】【課題】  鋳型とする核酸分子より、ＰＣＲ増幅法を利用して、所望の核酸配列を有する核酸鎖を優先的に増幅することが可能な、より簡便で、かつ高い再現性を有する核酸増幅方法の提供。【解決手段】  ＰＣＲ増幅反応に用いる、増幅すべき塩基配列領域を挟む２つのプライマーのメルティング温度Ｔｍ値が、ＰＣＲ反応条件下において、異なるように、２つのプライマーの塩基配列をそれぞれ設計した上、この異なるＴｍ値を有する２つのプライマーを用いて、鋳型とする核酸分子から、ＰＣＲ増幅反応を行う方法。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の中に含まれる核酸分子より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する方法であって、
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーとして、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるメルティング温度（Ｔｍ）値を有するプライマーを用いる
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
ＰＣＲ増幅反応において増幅される、前記複数種のプライマーより伸長される、複数種のプライマー伸長鎖のうち、優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を構成するプライマーとして、前記プライマー・セットを構成する少なくとも１つの他のプライマーよりも高いＴｍ値を有するプライマーを用いる
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、その中に複数種の核酸分子が混在している検体であり、
前記検体中に混在する複数種の核酸分子から、増幅したい１つ以上の核酸分子を選択する工程と、
選択された、増幅したい１つ以上の核酸分子の全塩基配列中から、１つ以上の増幅したい塩基配列領域を選択する工程と、選択された塩基配列領域に対して、ＰＣＲ増幅用のフォワード・プライマーならびにリバース・プライマーを設計して、前記少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットとする工程と、
前記プライマー・セットを構成する少なくとも２つのプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応において増幅される、前記複数種のプライマーより伸長される、複数種のプライマー伸長鎖のうち、１つ以上の優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を選択する工程とをさらに含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰＣＲ増幅反応において、試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の特定の塩基配列を有する増幅産物を増幅する際、２つのプライマーを用い、
前記２つのプライマーより伸長される、二種のプライマー伸長鎖のうち、優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を構成するプライマーとして、他のプライマーよりも高いＴｍ値を有するプライマーを用いる
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲ増幅反応において、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーが示す、各プライマーのＴｍ値のうち、最も高いＴｍ値と最も低いＴｍ値とを上限、下限とする温度範囲内に、鋳型に対して、プライマーを結合させるアニール工程におけるアニール温度を設定する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲ増幅反応において、試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の特定の塩基配列を有する増幅産物を増幅する際、２つのプライマーを用い、
前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、前記２つのプライマーがそれぞれ示すＴｍ値を、上限、下限とする温度範囲内に、鋳型に対して、プライマーを結合させるアニール工程におけるアニール温度を設定する
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、１０℃〜２０℃の範囲に選択する
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、５℃〜１０℃の範囲に選択する
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、１℃〜５℃の範囲に選択する
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるＴｍ値を有するプライマーとする手段として、プライマーの有する塩基配列におけるＧＣ％を調整することにより、該塩基配列のプライマーが示すＴｍ値を調整する手段を用いて、該プライマーの有する塩基配列の選択により、他のプライマーとのＴｍ値の差を設ける
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるＴｍ値を有するプライマーとする手段として、プライマーの有する塩基配列の塩基鎖長を調整ことにより、該塩基配列のプライマーが示すＴｍ値を調整する手段を用いて、該プライマーの有する塩基配列の選択により、他のプライマーとのＴｍ値の差を設ける
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるＴｍ値を有するプライマーとする手段として、プライマーに化学的な修飾を施す
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
該化学的な修飾は、核酸の二本鎖安定性を上昇する性質を有する化学物質である
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該化学的な修飾は、核酸の二本鎖安定性を低下する性質を有する化学物質である
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
該化学物質は、核酸のインターカレータ−としての性質を有する
ことを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該化学物質は、核酸のグルーブバインダーとしての性質を有する
ことを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、最近接塩基対法を用いる
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、Ｗａｌｌａｃｅ法を用いる
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、ＧＣ％法を用いる
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲ増幅により得られる増幅産物は、標識物質により標識された増幅産物を含む
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識物質により標識された増幅産物は、ＰＣＲ増幅反応において基質として用いるデオキシヌクレオチド中に、標識デオキシヌクレオチドを含有させ、ＰＣＲ増幅反応による伸長鎖中に前記標識デオキシヌクレオチドに由来する標識を有する増幅産物である
ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識物質により標識された増幅産物は、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマー中に、予め標識されたプライマーを含有させ、ＰＣＲ増幅反応によって、前記標識されたプライマーの伸長鎖とされた増幅産物である
ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
含有される予め標識されたプライマーにおいて、該プライマーに予め施す標識は、５'末端標識である
ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識物質により標識された増幅産物において、該標識物質は、蛍光物質である
ことを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識物質により標識された増幅産物において、該標識物質は、放射性同位体である
ことを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料は、ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出の対象とされる試料であり、
前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出において、検出される少なくとも一つの核酸分子は、前記少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、ＰＣＲ増幅法により製造される少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物であり、
増幅によって調製される該増幅産物を含む試料は、前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出における検体として用いられる
ことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出では、固相表面に固定、あるいは吸着したＤＮＡ分子を、該ハイブリダイゼーション反応用プローブとして用いる
ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記固相表面に固定あるいは吸着したＤＮＡ分子において、前記固相は、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態である
ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固相表面に固定あるいは吸着したＤＮＡ分子において、前記固相は、ビーズである
ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する際に用いる少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットであって、
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法を用いて、前記増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する工程に適合する複数種のプライマーから構成されるプライマー・セットである
ことを特徴とするプライマー・セット。
【請求項３１】
試料の中に含まれる核酸分子より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、ＰＣＲ増幅法により製造される該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物であって、
前記増幅産物は、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の核酸増幅方法により調製されている
ことを特徴とするＰＣＲ増幅産物。
【請求項３２】
ハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸分子を検出する方法であって、
検出の対象とされる核酸分子を含む試料より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造し、
増幅によって調製される該増幅産物を含む試料を、前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出における検体として用い、
前記増幅産物のＰＣＲ増幅法による製造に際して、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸増幅方法を用いる
ことを特徴とする核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型とする核酸分子より、ＰＣＲ増幅法を利用して、所望の核酸配列を有する核酸鎖を優先的に増幅する方法に関する。また、本発明は、かかる核酸のＰＣＲ増幅方法に利用されるＰＣＲプライマー・セット、該方法を利用して得られるＰＣＲ増幅産物、ならびに、該増幅方法を利用する核酸の検出方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子配列解析技術の飛躍的な向上とともに、ヒト・ゲノムを中心として、多くの遺伝子塩基配列の解読が進み、また、解読された遺伝子がコードするタンパク質、核酸分子の生体内における機能が解明されてきている。そして、遺伝子がコードするタンパク質、核酸分子が示す機能の解明が進む中で、これら遺伝子の発現状態や塩基配列の変異、コードされているタンパク質のアミノ酸配列の変異が、様々な病気や体質と関連していることも解明されてきてしている。かかる遺伝子情報の蓄積を背景として、検体試料中に含有される、特定の塩基配列を有する核酸分子を高い確度で検出する技術のニーズは急速に高まっている。その要望に沿って、前記検出技術への応用可能な、様々な関連技術もこれまでに開発されている。
【０００３】
数ある核酸検出技術の中でも、非常に多く利用されているのは、ハイブリダイゼーション法を利用した核酸分子の検出技術である。このハイブリダイゼーション法による検出方法では、検出したい核酸分子の塩基配列に対する相補鎖に相当する核酸プローブを予め用意しておき、核酸プローブを固相上に固定した上で、もしくは、そのまま液相において、検体中に含まれる検出対象の核酸分子と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を行わせ、得られるハイブリッド体を然るべき手法により検出し、検出対象の該塩基配列を有する核酸分子の有無を検証する、さらには、その定量的な検出をも試みるものである。
【０００４】
検体中に含まれる特定の塩基配列を有する核酸分子を検出することは、マーカー遺伝子等を利用する、各種の遺伝病の診断への応用に留まらず、癌、感染症等においても、検体中に含まれる特異的な核酸分子とその症例との相関が続々と判明しており、種々の疾患の診断における広範な応用が期待されている。
【０００５】
このハイブリダイゼーション法に基づく、核酸分子の検出方法において、近年特に利用の拡大が進められている手法は、核酸プローブを固相上に固定する、ＤＮＡチップ、もしくはＤＮＡマイクロアレイを利用した検出技術である。このＤＮＡチップ、もしくはＤＮＡマイクロアレイを利用する方法は、ガラス基板などの固相表面に、検出したい核酸分子の塩基配列に対する合成相補鎖（ＤＮＡプローブ）を固定しておき、予め蛍光物質等で標識を施した検体中の核酸分子と固相上でハイブリダイゼーション反応させ、基板上にハイブリッド体を形成して固定化された、例えば、予め蛍光標識を施した核酸分子に由来する蛍光強度を測定し、対象となる塩基配列を有する核酸分子の検体中での有無、さらには、検体中に含有されている量を調べる技術である。ＤＮＡチップの作製技術として、様々な技術開発がなされた結果、多種の核酸プローブ（ＤＮＡプローブ）を高密度に配置できることが可能となっており、高感度でかつ同時多項目の検出への適用が可能な画期的な技術として、大いに期待されている。
【０００６】
ＤＮＡチップは高感度検出が可能ではあるが、一般的に検体中に含まれる検出対象核酸の絶対量は極めて少なく、また、適当な方法により蛍光物質等により標識する必要があることから、ＤＮＡチップを利用した核酸配列の検出においては、ＤＮＡチップの作製技術と並んで、検体処理技術の重要性は高い。
【０００７】
様々な核酸増幅技術のなかで最も広く利用されているのが、ポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）と呼ばれる方法である。このＰＣＲ法は試料中に含まれる特定の配列を極めて高い増幅率で増幅する方法である。ＰＣＲ法については米国特許第４６８３１９５号、４６８３２０２号、４９６５１８８号等に記載されている。
【０００８】
ＤＮＡチップ等の固相上ハイブリダイゼーションのために検体調製を行う場合には、固相上に固定してあるプローブ領域を含むように増幅領域を設定し、増幅領域の両末端にプライマーを設計する。そして設計した両プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、所望のプローブ領域を含む二本鎖核酸を大量に合成する。また、検体を何らかの標識物質で標識したい場合には、ＰＣＲ反応の基質（すなわち核酸のモノマー）に、標識物質の結合した標識モノマーを一定の割合で添加してＰＣＲ反応を行うか、あるいは、プライマーを何らかの標識物質により標識してＰＣＲ反応を行い、標識された二本鎖核酸を得る。
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９６５１８８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ハイブリダイゼーション反応を利用して、特定の塩基配列を有する核酸分子の検出を行う際、プローブとハイブリッド体を形成する一本鎖核酸分子の存在量が多いほど、より高い確度で検出を行うことが可能となる。通常、一次試料中に含まれる検出対象の核酸分子の含有量は十分でない場合が多く、一次試料中に含まれる検出対象の核酸分子を鋳型として、予め増幅反応によって、検出対象の核酸分子の含有量に応じて、定量的に増幅した増幅産物を含む検体試料を調製した上で、核酸分子の検出を行う手法が利用されている。その検体試料の調製工程では、プローブの相補鎖側のＤＮＡ鎖を多く合成することが望ましい。すなわち、検体試料中に含まれる二本鎖のうち、プローブと同じ塩基配列を含むＤＮＡ鎖よりも、プローブとハイブリダイゼーションする相補的な塩基配列を含むＤＮＡ鎖（ターゲット鎖）が多く存在するほうが、その後のハイブリダイゼーション反応を効率的に進める上で望ましい。これは、単純に、プローブとハイブリダイゼーション反応するターゲット鎖の濃度が高い方が感度的に好ましいという理由のみでなく、共存しているプローブと同じ塩基配列を含むＤＮＡ鎖は、プローブのハイブリダイゼーション反応と競合するが、かかるプローブと同じ塩基配列を含むＤＮＡ鎖の濃度を相対的に低減することで、プローブによるハイブリダイゼーション反応の効率をさらに高める効果もあり、この二つの理由から、プローブと同じ塩基配列を含むＤＮＡ鎖よりも、相補的な塩基配列を含むＤＮＡ鎖（ターゲット鎖）の含有比率を高くすることが望まれる。
【００１０】
一方のＤＮＡ鎖をより効率的に増幅するため、様々な工夫が行われている。代表的な方法としては、ＰＣＲ増幅反応において、優先的に多く合成したいＤＮＡ鎖の伸長合成に用いるプライマーの濃度を高めに調製して、ＰＣＲ増幅反応を行う方法（非対称ＰＣＲ）や、あるいは、一旦、ターゲット鎖を含む二本鎖ＤＮＡを通常のＰＣＲ増幅反応により合成した後、ターゲット鎖伸長合成に用いるプライマーのみを加えて、再度増幅反応を行う方法（二段階ＰＣＲ）などがある。
【００１１】
しかし、これら従来の手法は、様々な要因により、目的とするターゲット鎖の優先的な増幅が達成されない場合も少なくない。具体的には、非対称ＰＣＲ法に関しては、ＰＣＲ増幅産物の収量が十分に得られない場合があり、収量が十分に得られている場合でも、ＰＣＲ増幅産物の収率が非対称にならず、結果として、ＰＣＲ増幅産物は、ほとんど二本鎖ＤＮＡとなってしまう場合がある。また、二段階ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応を二段回に分けて行うことによる煩雑さに加えて、全体工程における増幅収率にバラツキを生じ易く、再現性という観点で問題がある。さらには、二段階目のＰＣＲ反応では、プライマーを片鎖のみ加えているが、場合によっては、二段階目のＰＣＲ反応が全く進行しない等の問題が生じることがある。従って、より簡便で、かつ高い再現性で、目的とする一本鎖ＤＮＡ（ターゲット鎖）を優先的に増幅合成可能な核酸増幅方法の開発が望まれている。
【００１２】
本発明は前記の課題を解決するもので、本発明の目的は、鋳型とする核酸分子より、ＰＣＲ増幅法を利用して、所望の核酸配列を有する核酸鎖を優先的に増幅することが可能な、より簡便で、かつ高い再現性を有する核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、ハイブリダイゼーション反応を利用して、特定の塩基配列を有する核酸分子の検出において、その検体試料の調製に応用可能な、より簡便で、かつ高い再現性を有する手段によって、鋳型とする核酸分子より、ＰＣＲ増幅法を利用して、所望の核酸配列を有する核酸鎖の優先的な増幅を可能とする方法を開発すべく、鋭意研究を進めた。その際、ＰＣＲ増幅反応に用いる、増幅すべき塩基配列領域を挟む２つのプライマーのメルティング温度（Ｔｍ）値が、ＰＣＲ反応条件下において、異なるように、２つのプライマーの塩基配列をそれぞれ設計した上、この異なるＴｍ値を有する２つのプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行うことで、各プライマーより伸長される一本鎖ＤＮＡの収率を高い再現性で異なったものとできることを見出した。すなわち、前記の手法を適用することで、一方のプライマーより伸長される一本鎖ＤＮＡを優先的に増幅合成できることを見出した。特に、ＰＣＲ増幅反応におけるアニール温度を、互いに異なるように設計した２つのプライマーのＴｍ値間に設定すると、かかる温度条件でＰＣＲ増幅反応を行うことにより、Ｔｍ値が高いプライマーからの伸長鎖が、Ｔｍ値が低いプライマーからの伸長鎖に比べて、顕著に高い効率で増幅されることを、本発明者は確認して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかる核酸増幅方法は、
試料の中に含まれる核酸分子より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する方法であって、
前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーとして、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるメルティング温度（Ｔｍ）値を有するプライマーを用いることを特徴とする核酸増幅方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる核酸増幅方法によれば、ＰＣＲ増幅反応において用いる、複数種のプライマーのＴｍ値、プライマーに結合する化学修飾基、ならびに、増幅反応中のアニール温度を適切に設定することにより、ＰＣＲ増幅産物において、各プライマーのから伸長鎖として合成し得る、互いに相補的な塩基配列を有する二本の伸長鎖ＤＮＡのうち、所望のプライマー伸長鎖を相補鎖側のプライマー伸長鎖に比べて、優先的に合成することが可能である。また、本発明にかかる核酸増幅方法によって達成される所望のプライマー伸長鎖の優先的な増幅は、ＤＮＡチップなどを利用する核酸分子の検出において、プローブＤＮＡとハイブリダイゼーションする、相補的な塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡの効率的な合成が望まれる、検体試料の調製に好適に応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次に、本発明にかかる核酸増幅方法を実施する際の形態、ならびに、本発明にかかる核酸増幅方法に専ら利用されるプライマー・セット、また、本発明にかかる核酸増幅方法の応用により得られるＰＣＲ増殖産物、核酸検出方法の発明について説明する。
【００１７】
先ず、上記する本発明にかかる核酸増幅方法においては、
ＰＣＲ増幅反応において増幅される、前記複数種のプライマーより伸長される、複数種のプライマー伸長鎖のうち、
優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を構成するプライマーとして、前記プライマー・セットを構成する少なくとも１つの他のプライマーよりも高いＴｍ値を有するプライマーを用いることができる。加えて、前記試料は、その中に複数種の核酸分子が混在している検体である際には、
前記検体中に混在する複数種の核酸分子から、増幅したい１つ以上の核酸分子を選択する工程と、
選択された、増幅したい１つ以上の核酸分子の全塩基配列中から、１つ以上の増幅したい塩基配列領域を選択する工程と、
選択された塩基配列領域に対して、ＰＣＲ増幅用のフォワード・プライマーならびにリバース・プライマーを設計して、前記少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットとする工程と、
前記プライマー・セットを構成する少なくとも２つのプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応において増幅される、前記複数種のプライマーより伸長される、複数種のプライマー伸長鎖のうち、１つ以上の優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を選択する工程とをさらに含む方法とすることが好ましい。
【００１８】
例えば、ＰＣＲ増幅反応において、試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の特定の塩基配列を有する増幅産物を増幅する際、２つのプライマーを用い、
前記２つのプライマーより伸長される、二種のプライマー伸長鎖のうち、
優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を構成するプライマーとして、他のプライマーよりも高いＴｍ値を有するプライマーを用いることを特徴とする方法とすることができる。
【００１９】
あるいは、ＰＣＲ増幅反応において、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーが示す、各プライマーのＴｍ値のうち、最も高いＴｍ値と最も低いＴｍ値とを上限、下限とする温度範囲内に、
鋳型に対して、プライマーを結合させるアニール工程におけるアニール温度を設定することを特徴とする方法とすることもできる。その際、ＰＣＲ増幅反応において、試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の特定の塩基配列を有する増幅産物を増幅する際、２つのプライマーを用い、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、前記２つのプライマーがそれぞれ示すＴｍ値を、上限、下限とする温度範囲内に、鋳型に対して、プライマーを結合させるアニール工程におけるアニール温度を設定することが好ましい。
【００２０】
より具体的には、前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、１０℃〜２０℃の範囲に選択することがより好ましく、また、前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、５℃〜１０℃の範囲に選択することも好ましい。さらには、前記２つのプライマーの示すＴｍ値間の温度差を、１℃〜５℃の範囲に選択することもできる。
【００２１】
なお、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるＴｍ値を有するプライマーとする手段として、
プライマーの有する塩基配列におけるＧＣ％を調整することにより、該塩基配列のプライマーが示すＴｍ値を調整する手段を用いて、
該プライマーの有する塩基配列の選択により、他のプライマーとのＴｍ値の差を設けることができる。あるいは、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも１つのプライマーを、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下において、他のプライマーと異なるＴｍ値を有するプライマーとする手段として、
プライマーの有する塩基配列の塩基鎖長を調整することにより、該塩基配列のプライマーが示すＴｍ値を調整する手段を用いて、
該プライマーの有する塩基配列の選択により、他のプライマーとのＴｍ値の差を設けることもできる。
【００２２】
また、プライマーに何らかの化学的な修飾を施すことにより、プライマーのＴｍ値を調整することもできる。これは修飾された化学修飾基等がプライマーとその相補鎖との二本鎖安定性に影響を与え、結果として、プライマーのＴｍ値を変化させる現象等に基づく。すなわち、導入された化学修飾基が二本鎖の安定性を増加させる場合には、Ｔｍ値は上昇し、逆に、安定性を低下させる場合にはＴｍ値は下降させることができる。
【００２３】
化学修飾基によるＴｍ値の調整は、特に、該化学修飾がインターカレータとしての性質を有する場合、あるいはグルーブバインダーとしての性質を有する場合に、二本鎖安定性に大きな影響を与えることができる。従って、インターカレータあるいはグルーブバインダーとして機能する化学修飾基を導入することで、プライマーのＴｍ値を調製することが可能である。
【００２４】
一方、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、最近接塩基対法を用いることができる。あるいは、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、Ｗａｌｌａｃｅ法を用いることもできる。さらには、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマーのうち、
少なくとも２つのプライマーについて、前記ＰＣＲ増幅反応の条件下における、該プライマーのＴｍ値を相互に比較する工程をさらに設け、
比較する該プライマーのＴｍ値として、該プライマーの有する塩基配列に基づき計算された値を用い、
該プライマーのＴｍ値の計算手法として、ＧＣ％法を用いることもできる。
【００２５】
本発明にかかる核酸増幅方法では、ＰＣＲ増幅により得られる増幅産物は、標識物質により標識された増幅産物を含むことができる。
【００２６】
その際、前記標識物質により標識された増幅産物は、ＰＣＲ増幅反応において基質として用いるデオキシヌクレオチド中に、標識デオキシヌクレオチドを含有させ、ＰＣＲ増幅反応による伸長鎖中に前記標識デオキシヌクレオチドに由来する標識を有する増幅産物であってもよい。また、前記化学修飾したプライマーを用いたＰＣＲと同様に、前記プライマー・セットを構成する複数種のプライマー中に、予め標識されたプライマーを含有させ、ＰＣＲ増幅反応によって、前記標識されたプライマーの伸長鎖とされた増幅産物であってもよい。その際には、含有される予め標識されたプライマーにおいて、該プライマーに予め施す標識は、５'末端標識であることがより好ましい。また、その際には、化学修飾基を用いたときと同様に、標識物質によるＴｍ値の影響を考慮してプライマーの配列あるいは塩基長を調整することが望ましい。
【００２７】
加えて、前記標識物質により標識された増幅産物において、該標識物質は、蛍光物質であることが好ましい。あるいは、前記標識物質により標識された増幅産物において、該標識物質は、放射性同位体であってもよい。
【００２８】
上述する本発明にかかる核酸増幅方法の応用として、
前記試料は、ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出の対象とされる試料であり、
前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出において、検出される少なくとも一つの核酸分子は、前記少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、ＰＣＲ増幅法により製造される少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物であり、
増幅によって調製される該増幅産物を含む試料が、前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出における検体として用いられることを特徴とする方法の形態とすることができる。なお、前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出では、固相表面に固定あるいは吸着したＤＮＡ分子を、該ハイブリダイゼーション反応用プローブとして用いることが好ましい。例えば、前記固相表面に固定あるいは吸着したＤＮＡ分子において、前記固相は、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態であることがより好ましい。また、前記固相表面に固定あるいは吸着したＤＮＡ分子において、前記固相は、ビーズであってもよい。
【００２９】
本発明は、さらに、上述の本発明にかかる核酸増幅方法に専ら利用されるＰＣＲ用のプライマー・セットの発明をも提供しており、すなわち、本発明にかかるプライマー・セットは、
試料の中に含まれる核酸分子より、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する際に用いる少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットであって、
上述する何れかの形態を有する本発明にかかる核酸増幅方法を用いて、前記増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造する工程に適合する複数種のプライマーから構成されるプライマー・セットであることを特徴とする、プライマー・セットである。
【００３０】
同時に、本発明は、上述の本発明にかかる核酸増幅方法を用いることで得られるＰＣＲ増幅産物の発明を提供しており、すなわち、本発明にかかるＰＣＲ増幅産物は、
試料の中に含まれる核酸分子より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、ＰＣＲ増幅法により製造される該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物であって、
前記増幅産物は、上述する何れかの形態を有する本発明にかかる核酸増幅方法により調製されていることを特徴とするＰＣＲ増幅産物である。
【００３１】
また、本発明にかかる核酸増幅方法を利用する核酸検出方法の発明も、本発明は提供し、すなわち、本発明にかかる核酸検出方法は、
ハイブリダイゼーション反応を利用して、核酸分子を検出する方法であって、
検出の対象とされる核酸分子を含む試料より、少なくとも２つのプライマーから構成されるプライマー・セットを用いて、該核酸分子中の少なくとも１つ以上の特定の塩基配列を有する増幅産物をＰＣＲ増幅法により製造し、
増幅によって調製される該増幅産物を含む試料を、前記ハイブリダイゼーション反応を利用した核酸分子の検出における検体として用い
前記増幅産物のＰＣＲ増幅法による製造に際して、上述する何れかの形態を有する本発明にかかる核酸増幅方法を用いることを特徴とする、核酸検出方法である。
以下に、本発明にかかる核酸増幅方法に関して、より詳しく説明する。
【００３２】
本発明にかかる核酸増幅方法では、ＰＣＲ増幅反応によって、鋳型とする核酸分子の全塩基配列中から選択した、所望の塩基配列領域に相当する核酸鎖を増幅合成する際、ＰＣＲ増幅反応に用いる反応液組成における、各プライマーのメルティング温度（Ｔｍ）値と、ＰＣＲ増幅反応において、鋳型と各プライマーとの結合を行うアニーリング過程のアニール温度を適宜設定する。その設定により、Ｔｍ値の異なるプライマーから伸長される一本鎖ＤＮＡ分子の収率に差異を設けることによって、特定のプライマーの伸長鎖を効率よく増幅することを可能としている。したがって、優先的に増幅したい一本鎖ＤＮＡ分子の伸長に用いるプライマーのＴｍ値が、他のプライマーのＴｍ値より高くなるように、各プライマーの塩基配列を選択している。多くの場合、多く増幅したい一本鎖ＤＮＡ分子の伸長に用いるプライマーのＴｍ値は、アニール温度よりも高くなるように、その塩基配列を設計し、一方、相対的に増幅収率を抑えたい相補鎖側の一本鎖ＤＮＡ分子の伸長に用いるプライマーのＴｍ値は、アニール温度よりも低くなるように、その塩基配列を設定すると、所望の一本鎖ＤＮＡ鎖のみを優先的に、同時に効率的に増幅することができる。
【００３３】
以上の本発明にかかる核酸増幅方法に利用される、技術的な原理を図１に模式的に示す。アニーリング過程において、Ｔｍ値のより高いプライマー２は、鋳型に対して、より強い結合を形成するため、かかるＴｍ値のより高いプライマー２から伸長されるプライマー２伸長鎖の収率はより高いものとなる。一方、アニーリング過程において、Ｔｍ値のより低いプライマー１は、鋳型に対して、より弱い結合しか形成できないため、かかるＴｍ値のより低いプライマー１から伸長されるプライマー１伸長鎖の収率はより低いものとなる。ＰＣＲ増幅反応では、温度サイクルを繰り返すことで、前段までに合成された一本鎖ＤＮＡ分子を鋳型として、プライマーからのＤＮＡ鎖の伸長がなされ、反復的に増幅が進むため、本発明の方法のように、複数のプライマーの添加量は等しくする結果、Ｔｍ値のより低いプライマー１から伸長されるプライマー１伸長鎖の収量も一定の範囲で維持される。その結果、各段において、Ｔｍ値のより高いプライマー２からのＤＮＡ鎖の伸長において、その鋳型となるＴｍ値のより低いプライマー１から伸長されるプライマー１伸長鎖の含有量が極端に少なくなり、実質的に増幅の進行が停止する事態を回避しつつ、目的とするＴｍ値のより高いプライマー２から伸長されるプライマー２伸長鎖の収率をより高いものとすることが可能となっている。
【００３４】
本発明による核酸増幅方法で増幅合成されるＰＣＲ増幅産物は、かかるプライマーからＤＮＡ鎖を伸長する過程において、蛍光物質等の標識物質を取り込ませることが可能である。この標識物質を取り込ませる方法としては、用いるプライマーに、予め標識を付加しておく手法、あるいは、ポリメラーゼ酵素によるＤＮＡ鎖の伸長において、基質として標識化したヌクレオチドを使用して、伸長されるＤＮＡ鎖部に標識を導入する手法が利用できる。
【００３５】
これら標識を付した一本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応を利用する核酸分子の検出における検体試料とすると、得られるハイブリッド体を、この標識を利用することで、容易に定量的に検出することを可能とする。例えば、核酸検出用に作製されたＤＮＡチップなどにハイブリダイゼーションさせる検体試料の調製において、目的とする一本鎖ＤＮＡ分子を優先的に、かつ定量的に増幅するともに、所定の蛍光物質等の標識物質を取り込ませる核酸増幅を伴う検体調製工程に、本発明にかかる核酸増幅方法を好適に適用することができる。
【００３６】
本発明による核酸増幅方法では、先ず、対象となる核酸分子の増幅したい塩基配列領域を挟むプライマーを設計する。プライマー設計においては、増幅したい塩基配列領域を挟むフォワード・プライマー用とリバース・プライマー用の２つのプライマー（１組のプライマー・セット）を、ＰＣＲ反応条件におけるＴｍ値が異なるように設計する。その際、ＰＣＲ反応条件におけるプライマーのＴｍ値として、優先的に多く増幅したいＤＮＡ鎖の伸長に用いるプライマーのＴｍ値が、
もう一方のＤＮＡ鎖の伸長に用いるプライマーのＴｍ値よりも高くなるように、２つのプライマーを設計することで、より高いＴｍ値を有するプライマーから伸長される所望のＤＮＡ鎖を多く増幅することができる。
【００３７】
ＰＣＲ反応条件におけるプライマーのＴｍ値が所望の温度となるように、プライマーを設計する方法としては、プライマーとしての配列特異性を著しく損なわない範囲で、プライマーの塩基配列の長さを変えるか、あるいは、プライマーの塩基配列におけるＧＣ％（核酸配列中のグアニンおよびアデニンの構成率）を変えるように、プライマーの塩基配列を選択することが一般的である。また、設計されたプライマーのＴｍ値の算出方法は、実際のＰＣＲ反応条件下で温度を変えて、鋳型と結合するプライマーの比率を、例えば、プライマーに付した蛍光標識由来の吸収強度を測定することによって求め、その温度依存性から算出することも可能である。加えて、プライマーの塩基配列に基づき、プライマーのＴｍ値を計算により高い精度で推定する手法として、一般的に良く知られている、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法等の方法によって計算値を求めることも可能である。
【００３８】
なお、最近接塩基対法に関しては、
Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., Markey L.A. (1986) Predicting DNA duplex stability from the base sequence - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3746-3750、
Freier S.M., Kierzek R., Jaeger J.A., Sugimoto N., Caruthers M.H., Nielson T., Turner D.H. (1986) Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stabilit. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9373-9377、
Schildkraut C., Lifson S. (1965) Dependence of the melting temperature of DNA on salt concentration - Biopolymers 3, 195-208  などを参照し、
Ｗａｌｌａｃｅ法に関しては、
Wallace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy R.F.; Bonner, J.; Hirose, T.; Itakura, K.; (1979) Nucelic Acid Res. 6, 3543  などを参照し、
ＧＣ％法に関しては、
Dependence of the Melting Temperature of DNA on Salt Concentration、Schildkraut C.,Lifson S. (1965) BIOPOLYMERS 3.195-208、
Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro、W.Rychlik、  Nucl.Acids Res.(1990) 18(21)6409-6412  などを参照する。
【００３９】
また、ＰＣＲ反応条件におけるプライマーのＴｍ値が所望の温度となるようにプライマーを設計する方法として、プライマーに対し化学的な修飾を施し、その化学修飾基の作用によりプライマーのＴｍ値を調整することができる。プライマーに結合した化学修飾基はプライマーの二本鎖安定性に影響を与え、例えば二本鎖の安定性を増強させる効果がある化学修飾基の場合にはＴｍ値は上昇し、反対に安定性を低下させる効果がある化学修飾基の場合にはＴｍ値は低下する。
【００４０】
化学修飾基としては、種類、結合様式ともに特に制限無く利用することができるが、中でも、核酸の二本鎖構造と強い相互作用をするインターカレータ、あるいはグルーブバインダーのような性質を有する物質は、Ｔｍ値の調整に特に有効である。インターカレータとしては、エチジウムブロマイド、９−アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、その他アントラセンなどの多環芳香族分子が一般的によく用いられる。あるいは、グルーブバインダーとしては、市販されている、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、Ｐｅｎｔａｍｉｄｉｎｅ、Ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ、ＤＡＰＩなどが挙げられます。エチジウムブロマイド、アントラセンなどの芳香族化合物が一般的によく用いられる。その他にも、特開平７-２３３０６５号公報に開示されているピリリウム色素なども二本鎖核酸と強い相互作用をする物質としてよく用いられる。一部のグルーブバインダーには、例えば、ＤＡＰＩのようにＡＴが多く存在する領域により高い頻度で相互作用するものも報告されている。一方、多くのインターカレータ、あるいはグルーブバインダーは、塩基配列に非特異的に、核酸の二本鎖構造と強い相互作用をする。その際、相互作用の対象となる核酸の二本鎖構造部分の塩基配列、ならびに、インターカレータ、あるいはグルーブバインダーの種類によって、得られる複合体の構造、熱的安定性は種々に変化する。
【００４１】
インターカレータは、二本鎖核酸の塩基対のスタッキング間に入り込み、また、グルーブバインダーは二本鎖らせん構造の溝に入り込み、両者とも二本鎖構造の安定性に強い影響を与えるが、種類により二本鎖構造の安定性を増強させるものと低下させるものがある。
【００４２】
これらの化学修飾基をプライマーに導入する方法としては、例えば、予めプライマーの５’末端にアミノ基やビオチンを修飾しておき、そのアミノ基やヒドロキシ基などの官能基に対して、例えば、各種の二価性試薬を介して、所望の化学修飾基を結合させる方法等があるが、特に制限無く各種の結合様式を利用することができる。
【００４３】
基本的なＰＣＲ増幅反応では、用いるプライマー・セットは、増幅したい塩基配列領域を挟む１組のフォワード・プライマーとリバース・プライマーのプライマー・セットで構成されるが、本発明による核酸増幅方法は、必ずしもこれに限定されない。１組以上のプライマーにより、１つの塩基配列領域を増幅する場合や、１組のプライマー・セットにより複数の増幅領域を増幅する場合、あるいは、これらを組み合わせた複合的なＰＣＲ増幅においても、本発明の核酸増幅方法を適用することができる。複数のプライマー・セットを用いたＰＣＲ増幅反応は、１つ以上の核酸分子の中から、増幅したい１つ以上の核酸分子を選び、選んだ核酸分子の塩基配列中から１つ以上の増幅したい領域を選び、選んだ各領域に対してプライマーを設計し、さらに、ＰＣＲ反応反応により優先的に増幅したい１つ以上のＤＮＡ鎖を選ぶ、一連の選択工程を行った後、本発明の核酸増幅方法に従って、用いるプライマーの設計およびＰＣＲ増幅反応の条件設定を行うことで、本発明の核酸増幅方法を適用することが可能となる。
【００４４】
設計したプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応は、いかなる反応条件においても可能であるが、本発明による核酸増幅方法をより効果的に実施するためには、ＰＣＲ増幅反応におけるアニール温度を、一組のフォワード・プライマーとリバース・プライマーである、２つのプライマーが有する、異なるＴｍ値の間に設定し、ＰＣＲ増幅反応を行えばよい。ＰＣＲ増幅反応によっては、アニール温度とポリメラーゼ酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応温度が同一の温度となり、必ずしも、アニール反応を別途に実施する必要がない場合もあるが、その場合には、アニール処理を同時に行う、酵素反応温度は、前記２つのプライマーのＴｍ値間になるように、各プライマーのＴｍ値を設定することにより、本発明の方法による優先的な核酸増幅が可能である。
【００４５】
２つのプライマーのＴｍ値とＰＣＲ増幅反応におけるアニール温度との関係は上述した関係にあることが望ましいが、例えば、２つのプライマーのＴｍ値よりもアニール温度が低い場合でも、ＰＣＲ増幅反応は可能である。しかし、アニール温度に対して相対的に２つのプライマーのＴｍ値の実質的な差異が小さくなり、本発明の効果は低くなってしまう。また、その反対に、２つのプライマーのＴｍ値よりもアニール温度が高い場合には、ＰＣＲ増幅反応自体の効率が低くなってしまうという懸念が生じる。したがって、本発明における増幅方法においては、２つのプライマーのＴｍ値の間に、ＰＣＲ増幅反応のアニール温度を設定することが最も望ましく、設定できない場合には、一方のプライマーのＴｍ値から５℃以内の範囲でアニール温度を設定することが望ましい。
【００４６】
ＰＣＲ増幅反応条件における、２つのプライマーのＴｍ値に、適当な差があれば、本発明の核酸増幅方法は実施可能であるが、そのＴｍ値間の温度差は、１〜５℃の範囲であれば望ましい。さらには、Ｔｍ値間の温度差が、５〜１０℃の範囲であればなお望ましい。さらに望ましくは、Ｔｍ値間の温度差は、１０〜２０℃の範囲であれば望ましい。
【００４７】
さらに詳細に説明すると、２つのプライマーのＴｍ値に大きな差異がある場合、本発明の目的である「優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を相補鎖より多く増幅する」という観点では望ましい。しかし、ＰＣＲ増幅反応の効率という観点では、過度に大きな差異は、あまり好ましくない。従って、増幅率よりも増幅産物の非対称化が強く求められる場合には、１０〜２０℃、もしくは５〜１０℃のＴｍ値の差を２つのプライマー間に設定し、反対に、増幅産物の非対称化よりも増幅率が強く求められる場合には、Ｔｍ値の差を比較的小さく設定する方がより好ましい。
【００４８】
本発明による核酸増幅方法は、ＰＣＲ増幅が必要な様々な検体調製に特に制限無く応用可能であるが、特に、その効果が期待される実施形態として、ハイブリダイゼーション反応を利用した、特定の核酸配列を有する核酸分子の検出に適用可能である。その中でも、核酸検出方法として、近年広く利用されている応用形態として、固相上に固定されたＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用した検出方法がある。固相としては、ガラス、プラスチック、金属などがよく用いられ、本発明の核酸増幅方法は、これら固相の種類に特に制限無く利用可能である。中でも、平板状に多数のＤＮＡプローブが固定されたＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイなどを利用する核酸分子の検出手法は、その検体試料の調製工程に、本発明の核酸増幅方法が最も好適に利用できる核酸検出方法の１つである。また、平板状のＤＮＡチップ以外にも、ＤＮＡプローブを固定したビーズを用いた核酸検出方法も近年よく利用されているが、本発明の核酸増幅方法は、このビーズ表面に固定化されたＤＮＡプローブを用いる核酸検出方法における、検体試料の調製にも適用可能である。
【００４９】
固相上に固定されたＤＮＡプローブは、一本鎖ＤＮＡ断片で、一本鎖ＤＮＡ断片の鎖長が６０ｍｅｒ程度と比較的に長い場合、一本鎖ＤＮＡプローブのＴｍ値は高く、比較的強いハイブリダイゼーション反応が可能である。そのため、検出対象となるＰＣＲ増幅産物がその相補鎖と二本鎖を形成していたとしても、加熱処理を施して二本鎖を解離し、検出対象となるＤＮＡ鎖とハイブリッド体を効率よく形成することができる。しかし、固相上の一本鎖ＤＮＡプローブの鎖長が２０ｍｅｒ程度と比較的に短い場合、一本鎖ＤＮＡプローブのＴｍ値は低く、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖を解離して、二本鎖を再構成する過程と競争して、ハイブリッド体を効率よく形成することが不可能となる。この２０ｍｅｒ程度と比較的に短いＤＮＡプローブを利用する場合、本発明による核酸増幅方法は、目的とするターゲット鎖を優先的に増幅できるので、特に効果的であり、優先的に増幅合成されているターゲット鎖を含む検体試料を用いることで、感度の高い検出を可能とする。
【００５０】
ＤＮＡチップ等の固定化したＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成するターゲット鎖を含む検体試料の調製工程において、本核酸増幅方法を実施する場合、ターゲット鎖である、多く増幅したいプライマー伸長鎖に何らかの形で標識を施すことが多い。本発明による核酸増幅方法は、標識化を伴う核酸増幅方法にも適用可能であり、その場合、標識方法に制限されること無く実施することが可能である。標識を行う方法としては、前述の化学修飾を施したプライマーと同様に、予めプライマーの一部に何らかの標識を行い、標識されたプライマーによるＰＣＲ増幅反応を行う方法が、最も良く行われている方法の１つである。特に、プライマーの５'側末端等に予め蛍光物質等を標識しておき、この標識化プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅反応を行う方法がその中でも代表的である。ただしその際には、化学修飾基を用いたプライマーと同様に、標識物質が結合したことによるＴｍ値の影響を考慮して、プライマーの塩基配列等を設計する必要がある。また、この方法以外にも、ＰＣＲ増幅反応の基質として、伸長されるＤＮＡ鎖に取り込まれるデオキシヌクレオチドを蛍光物質等により標識化し、この基質をＰＣＲ反応液に添加することにより、ＰＣＲ増幅産物を標識化する方法もあり、広く用いられている。本発明による核酸増幅方法は、これらいずれの標識方法にも特に制限されること無く応用可能である。
【００５１】
利用する標識物質としては、感度の高さや取扱いの簡便性から蛍光物質による標識が一般的であるが、放射性同位体などによる標識や、ビオチンを標識したＰＣＲ増幅産物に対し、標識したアビジンをビオチンに結合することで、間接的に標識することも可能である。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５３】
＜実施例１＞  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
市販のＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）の塩基配列中より、下記の配列を有するプライマー４種を設計した。なお、ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。
【００５４】
また、これら４種のプライマーについて、その塩基配列に基づき、計算により求めたメルティング温度Ｔｍ値を表１に示す。利用したＴｍ値の計算方法は、上記の手法であり、その計算の際、ＰＣＲ反応における諸条件として、反応液中におけるＮａ+濃度５０ｍＭ、Ｍｇ2+濃度１．５ｍＭ、また、各プライマー濃度０．５Ｍとした。
【００５５】
【表１】
2005000162.tif 000003
【００５６】
これら４種のプライマーから構成されるプライマー・セットのうち、下記のフォワード・プライマーとリバース・プライマーの組み合わせによって得られる、二本鎖のＰＣＲ増幅産物の塩基配列鎖長は、表２に示すものとなる。
【００５７】
【表２】
2005000162.tif 000004
【００５８】
（２）プライマーの合成
実施例１の（１）で設計した４種のプライマーの合成を行った。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を常法に従ってＤＮＡ合成機で合成し、さらに、ＤＮＡ鎖の５'末端側にヘキサメチレンリンカーを介してアミノ基を修飾した。得られた５'末端アミノ修飾ＤＮＡ（プライマー）は、カートリッジ精製した後、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３に関しては、アミノ基に結合するＮＨＳタイプＣｙ３標識試薬（アマシャム・ファルマシア製）で処理し、Ｒ１に関しては、ＮＨＳタイプＣｙ５標識試薬（アマシャム・ファルマシア製）にて処理し、５'末端に蛍光色素標識を導入した。得られた標識化プライマーを、それぞれＨＰＬＣ精製し、Ｃｙ３標識Ｆ１、Ｃｙ３標識Ｆ２、Ｃｙ３標識Ｆ３、Ｃｙ５標識Ｒ１の４種のプライマーを得た。得られた各標識化プライマーは、ＴＥバッファーにて１０Ｍの濃度に希釈した。
【００５９】
（３）ＰＣＲ増幅反応
実施例１の（２）で合成した４種の標識化プライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、ならびに、ＱＩＡＧＥＮ社製ＰＣＲキット  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００６０】
フォワード・プライマーとリバース・プライマーの組み合わせとして、（１）中の表２に記載した３組の組み合わせについて、ＰＣＲの反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表３に示す組成の反応液の調製を行った。
【００６１】
【表３】
2005000162.tif 000005
【００６２】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表４の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００６３】
【表４】
2005000162.tif 000006
【００６４】
増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０ｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、常法に従って電気泳動を行い、目的とする７６０ｂｐ相当のバンドが出ていることを確認した。図２に、フォワード・プライマーとリバース・プライマーの組み合わせ〔１〕、〔２〕、〔３〕を用いた際に得られるＰＣＲ増幅産物に対する電気泳動の画像を示す。
【００６５】
（４）吸収測定
実施例１の（２）で合成した４種の標識化プライマーの溶液、及び（３）で調製したＰＣＲ増幅産物溶液の吸収を測定した。なお、各標識プライマー溶液は、０．５Ｍの濃度に調製し、各標識化プライマーの標識蛍光物質（Ｃｙ３またはＣｙ５）に応じて、下記の吸収波長における、標識蛍光物質に由来する吸収強度を測定した。
【００６６】
また、ＰＣＲ増幅産物溶液については、標識化したフォワード・プライマーとリバース・プライマーに由来する標識蛍光物質の両吸収波長において、吸収強度を測定した。
【００６７】
【表５】
2005000162.tif 000007
【００６８】
【表６】
2005000162.tif 000008
【００６９】
続いて、ＰＣＲ増幅産物溶液において測定された吸収強度に基づき、ＰＣＲ増幅反応による、各標識化プライマーの取り込み収率を算出した。この取り込み収率は、ＰＣＲ増幅反応おいて、反応液中に添加したプライマーのうち、何％が伸長反応を起こし、ＰＣＲ増幅産物のプライマー伸長鎖となったかを示す。
【００７０】
【表７】
2005000162.tif 000009
【００７１】
ＰＣＲ増幅産物〔２〕においては、Ｃｙ３標識Ｆ２とＣｙ５標識Ｒ１のＴｍ値がほとんど等しく、その結果、両者の取り込み収率に大きな違いは無く、対応する二本鎖が均等に合成されていることが判った。一方、ＰＣＲ増幅産物〔１〕においては、Ｃｙ３標識Ｆ１のＴｍ値は、Ｃｙ５標識Ｒ１のＴｍ値より低いため、Ｃｙ５標識Ｒ１からの伸長鎖が優先的に合成され、それに付随して、各伸長鎖における、Ｃｙ３標識Ｆ１の取り込み収率と比較して、Ｃｙ５標識Ｒ１の取り込み収率が大きく上回っていた。一方、ＰＣＲ増幅産物〔３〕においては、Ｃｙ３標識Ｆ３のＴｍ値がＣｙ５標識Ｒ１のＴｍ値よりも高いため、Ｃｙ３標識Ｆ３からの伸長鎖が優先的に合成され、それに付随して、各伸長鎖における、Ｃｙ５標識Ｒ１の取り込み収率の取り込み収率と比較して、Ｃｙ３標識Ｆ３の取り込み収率も高くなった。
【００７２】
＜実施例２＞  ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーション反応
（１）ＤＮＡマイクロチップの作製
（１）−１ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（ＷＬＴ）：２５ｍｍ７５ｍｍ１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００７３】
（１）−２表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００７４】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００７５】
（１）−３  プローブ用ＤＮＡの合成
下記の塩基配列を有するプローブＰ１を合成した。なお、この塩基配列は、実施例１におけるＰＣＲ増幅産物〔１〕、〔２〕、〔３〕のＲｅｖｅｒｓｅ側の伸長鎖の部分塩基配列に対して、１００％相補的な塩基配列となっている。
プローブＰ１：５' ccttaacgtgagttttcg ３'
プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、常法に従って、５'末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護を施している保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。
【００７６】
得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０Ｍとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００７７】
（１）−４  ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０Ｍ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００７８】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１２０ｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００７９】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。１枚のＤＮＡチップ当たり、１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５'末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００８０】
（１）−５  洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＡＮマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。
【００８１】
（２）ハイブリダイゼーション反応
実施例２の（１）で作製したＤＮＡチップと、検体として、実施例１で作製したＰＣＲ増幅産物を用いて、目的の核酸分子に対する検出反応を行った。
【００８２】
（２）−１  ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミン  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液に実施例２の（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）  ３０ｍＭ、ｐＨ  ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。
【００８３】
（２）−２  ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ増幅産物溶液中のターゲット核酸量（モル数）を同じにするため、Ｒｅｖｅｒｓｅ鎖に標識してあるＣｙ５による吸収強度が同じになるよう、３種のＰＣＲ増幅産物の濃度を調製した。続いて、等量のＰＣＲ増幅産物溶液を用いて最終濃度が下記の構成となるよう３種のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００８４】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、  ｐＨ  ７．４）
（２）−３  ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８５】
＜ハイブリダイゼーション条件・手順＞
【表８】
2005000162.tif 000010
【００８６】
（３）  蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。該ハイブリッド体に由来する蛍光は、プローブＤＮＡとハイブリッド体を形成する、実施例１におけるＰＣＲ増幅産物〔１〕、〔２〕、〔３〕のＲｅｖｅｒｓｅ側の伸長鎖上の蛍光標識に由来するものである。
【００８７】
ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。また、下記表９には、測定を２回実施し、その実測値の平均値を示す。
【００８８】
【表９】
2005000162.tif 000011
【００８９】
この結果から、Ｆｏｒｗａｒｄ鎖とＲｅｖｅｒｓｅ鎖が均等に合成されているＰＣＲ増幅産物〔２〕による検体試料に比べて、Ｆｏｒｗａｒｄ鎖と較べて、Ｒｅｖｅｒｓｅ鎖が優先的に合成されているＰＣＲ増幅産物〔１〕による検体試料において、より効率よくＤＮＡチップ上で、Ｒｅｖｅｒｓｅ鎖のハイブリダイゼーションが生じていることが判る。従って、本発明にかかる核酸増幅方法を適用することで、所望のＰＣＲ増幅伸長鎖を、より優先的に合成することが可能となり、ＤＮＡチップを用いた核酸分子の検出に供する検体試料の調製工程に、本発明にかかる核酸増幅方法は好適に適用可能であることが判った。
【００９０】
＜実施例３＞  アントラセン修飾プライマーを用いたＰＣＲおよびハイブリダイゼーション
（１）アントラセン修飾プライマーの合成
実施例１で設計したｐＵＣ１１８のプライマーＦ２の合成を行った。プライマーの合成は同塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ自動合成機で合成し、さらに、ＤＮＡ鎖の５’末端にメチレン鎖から構成されるリンカーを介してチオール基を修飾した。得られた５’末端チオール修飾ＤＮＡは、各官能基に結合した保護基を除去したのち、ゲルろ過及びエタノール沈澱により精製した。
【００９１】
続いて、得られたチオール修飾ＤＮＡ ３０ｎｍｏｌを、混合溶媒（水５０％、エタノール２５％、ジメチルスルホキシド２５％）１００マイクロリットルに溶解し、さらに１ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３時間反応させた。得られた混合物は、ゲルろ過及びエタノール沈澱により精製した。この反応によりＤＮＡの５’末端にＥＭＣＳが結合し、末端にスクシイミド基が結合した修飾ＤＮＡが合成された。
【００９２】
続いて、水とジメチルホルムアミドの混合溶媒（１：１）１００マイクロリットルに上記の修飾ＤＮＡを溶解した後、１０ｍｇの２−アミノアントラセンを添加、攪拌し、可能な限り溶解させた。さらに、攪拌を続けながら４５℃で約５時間反応を行った。この反応により、ＤＮＡ末端のスクシイミド基とアントラセンに結合したアミノ基が反応し、５’末端にアントラセンが結合したアントラセン修飾プライマー（以下Ｆ２ＡＮと略す）が得られた。
【００９３】
析出している成分等を濾過して取り除いたのち、定法に従って精製した。精製後、核酸成分の濃度測定を行い、ＴＥバッファーにて１０Ｍの濃度に希釈した。
【００９４】
（２）ＰＣＲ増幅反応
実施例１で設計したＦ２及びＲ１の配列を有する各プライマーを定法に従って合成した。合成にあたっては末端には特に修飾は施していない。合成したプライマーはＴＥバッファーにて１０Ｍの濃度に希釈した。
続いて、Ｆ２ＡＮ、Ｆ２、Ｒ１の３種のプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせは表１０に記載の組み合わせとした。
【００９５】
【表１０】
2005000162.tif 000012
【００９６】
ＰＣＲの詳細な反応組成は、下記の表１１の通りとした。Ｃｙ３ｄＵＴＰを標識基質として混在させてＰＣＲを行うことにより、得られるＰＣＲ産物を標識した。
【００９７】
【表１１】
2005000162.tif 000013
【００９８】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表１２の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００９９】
【表１２】
2005000162.tif 000014
【０１００】
増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０ｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、常法に従って電気泳動を行い、目的とする約７６０ｂｐ相当のバンドが出ていることを確認した。
【０１０１】
（３）ハイブリダイゼーション反応
得られたＰＣＲ産物２種は、それぞれ回収量の全量を、実施例２の（１）で作製したＤＮＡチップに対してハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液の組成、ハイブリダイゼーションの手順およびチップのスキャンは実施例２と同様に行った。実施例２と同様に２度のスキャンの平均を算出した結果を表１３に示す
【０１０２】
【表１３】
2005000162.tif 000015
【０１０３】
この結果から、プライマーにインターカレータであるアントラセンが結合したプライマーＦ２ＡＮはアントラセンの効果によりＴｍ値が上昇し、Ｒ１よりも優先的にＰＣＲの伸長反応が行われたことがわかる。その結果、修飾していないＦ２（〔５〕）に比べてＦ２ＡＮ（〔４〕）を用いた方が蛍光輝度が高くなった。
【０１０４】
＜実施例４＞  アダマンタン修飾プライマーを用いたＰＣＲおよびハイブリダイゼーション
（１）アダマンタン修飾プライマーの合成
実施例１で設計したｐＵＣ１１８のプライマーＲ１の合成を行った。プライマーの合成は同塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ自動合成機で合成し、さらに、ＤＮＡ鎖の５’末端にメチレン鎖から構成されるリンカーを介してチオール基を修飾した。得られた５’末端チオール修飾ＤＮＡは、各官能基に結合した保護基を除去したのち、ゲルろ過及びエタノール沈澱により精製した。
【０１０５】
続いて、得られたチオール修飾ＤＮＡ ３０ｎｍｏｌを、混合溶媒（水５０％、エタノール２５％、ジメチルスルホキシド２５％）１００マイクロリットルに溶解し、さらに１ｍｇのＥＭＣＳを加え、室温で３時間反応させた。得られた混合物は、ゲルろ過及びエタノール沈澱により精製した。この反応によりＤＮＡの５’末端にＥＭＣＳが結合し、末端にスクシイミド基が結合した修飾ＤＮＡが合成された。
【０１０６】
続いて、水１００マイクロリットルに上記の修飾ＤＮＡを溶解した後、１０ｍｇの塩酸アマンタジンを添加、攪拌し、可能な限り溶解させた。さらに、攪拌を続けながら４５℃で約５時間反応を行った。この反応により、ＤＮＡ末端のスクシイミド基とアダマンタンに結合したアミノ基が反応し、５’末端にアダマンタンが結合したアダマンタン修飾プライマー（以下Ｒ１ＡＤと略す）が得られた。
【０１０７】
析出している成分等を濾過して取り除いたのち、定法に従って精製した。精製後、核酸成分の濃度測定を行い、ＴＥバッファーにて１０Ｍの濃度に希釈した。
【０１０８】
（２）ＰＣＲ増幅反応
実施例１で設計したＦ２及びＲ１の配列を有する各プライマーを定法に従って合成した。合成にあたっては末端には特に修飾は施していない。合成したプライマーはＴＥバッファーにて１０Ｍの濃度に希釈した。
【０１０９】
続いて、Ｆ２、Ｒ１、Ｒ１ＡＤの３種のプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの組み合わせは表１０に記載の組み合わせとした。
【０１１０】
【表１４】
2005000162.tif 000016
【０１１１】
ＰＣＲの詳細な反応組成は、下記の表１５の通りとした。Ｃｙ３ｄＵＴＰを標識基質として混在させてＰＣＲを行うことにより、得られるＰＣＲ産物を標識した。
【０１１２】
【表１５】
2005000162.tif 000017
【０１１３】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表１６の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【０１１４】
【表１６】
2005000162.tif 000018
【０１１５】
増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０ｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、常法に従って電気泳動を行い、目的とする約７６０ｂｐ相当のバンドが出ていることを確認した。
【０１１６】
（３）ハイブリダイゼーション反応
得られたＰＣＲ産物２種は、それぞれ回収量の全量を、実施例２の（１）で作製したＤＮＡチップに対してハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液の組成、ハイブリダイゼーションの手順およびチップのスキャンは実施例２と同様に行った。実施例２と同様に２度のスキャンの平均を算出した結果を表１７に示す
【０１１７】
【表１７】
2005000162.tif 000019
【０１１８】
この結果から、プライマーにアダマンタンが化学修飾したプライマーＲ１ＡＤはアダマンタンの効果によりプライマーの二本鎖安定性が低下しＴｍ値が下がり、相対的にＦ２からの伸長鎖が優先されてＰＣＲの伸長反応がおこなわれたことがわかる。その結果、修飾していないＲ１（〔７〕）に比べてＲ１ＡＤ（〔６〕）を用いた方が蛍光輝度が高くなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明は、ＰＣＲ増幅法を利用し、所望の一本鎖核酸の含有比率を高めた検体調製に応用可能であり、特に、その所望の一本鎖核酸の含有比率を高める効果を利用することで、ハイブリダイゼーション反応によって、特定の核酸配列を有する核酸分子の検出に好適に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】本発明にかかる核酸増幅方法における、基本的な発明の技術的原理を模式的に示す図である。
【図２】実施例１におけるＰＣＲ増幅反応で得られる、精製済のＰＣＲ増幅産物溶液の電気泳動の画像を示す図である。
【図１】
2005000162.tif 000020
【図２】
2005000162.tif 000021
【配列表】
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