(57)【要約】【課題】迅速性、簡便性を有し、かつ、感度及び定量性にも優れた、造血幹細胞移植における混合キメラの定量法を提供すること。【解決手段】マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列と複数の蛍光標識を用いて、複数の検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物におけるＤＮＡを定量解析することを特徴とする混合キメラの定量法。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列と２以上の蛍光標識を用いて、２以上の検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物のＤＮＡを定量解析することを特徴とする混合キメラの定量解析法。
【請求項２】
２以上の検体が、移植前患者検体、ドナー検体及び移植後患者検体からなる群から選ばれる少なくとも２つの検体を含んでいる請求項1に記載の混合キメラの定量解析法。
【請求項３】
マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列と３つの蛍光標識を用いて、移植前患者検体、ドナー検体及び移植後患者検体の３つの検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物のＤＮＡを定量解析することを特徴とする混合キメラの定量解析法。
【請求項４】
３つの蛍光標識が、６−ＦＡＭ、ＮＥＤ及びＨＥＸである請求項３に記載の混合キメラの定量解析法。
【請求項５】
マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列が、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＦＧＡの４つからなる群から選ばれるいずれかのマイクロサテライト領域を増幅させるプライマー配列を１組以上含んでいる請求項３又は４に記載の混合キメラの定量解析方法。
【請求項６】
マイクロサテライト領域が、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＦＧＡの４つのマイクロサテライト領域であり、マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列が、配列表の配列番号１〜８で表される４組のプライマー配列である請求項５に記載の混合キメラの定量解析法。
【請求項７】
マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列と２以上の蛍光標識を組み合わせて成る、２以上の検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物における混合キメラの定量解析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞移植後の移植細胞生着をモニターするためのマイクロサテライト多型を利用した混合キメラの定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植などにおける混合キメラの評価は、生着不全や再発、拒絶の診断と治療、モニタリングなどを行う上で極めて重要である。
【０００３】
現在、混合キメラ評価法として、異性間ＸＹ染色体に着目したfluorescence in situ hybridization法（FISH）法の有用性が指摘されている。しかし、FISH法は、同性間には応用できず、また操作も比較的煩雑であり、解析者の技量に追うところが大きいなど、効率性や迅速性、簡便性などの点で問題があった。
【０００４】
近年、マイクロサテライトと呼ばれる個体間で多型性に富む塩基の繰り返し配列を用いた解析が混合キメラの定量法にも用いられるようになってきた（非特許文献１及び２等参照）。
【０００５】
しかし、マイクロサテライトによる解析は、識別強度が、対象集団における多型様式及び多型頻度に著しく影響される、また、マイクロサテライト配列をPCRで増幅する場合、鋳型量依存的に定量的に増幅することが困難な場合があるなどの問題があった。
【０００６】
造血幹細胞移植において、診療サイドが必要とする情報は、主にドナー由来造血器系細胞の量的状態であるため、解析には、その感度に加えて、定量性が求められている。また、治療の過程では、しばしばドナー由来の細胞とレシピエント（患者）細胞とが混在する状態がみられる。更に、昨今のミニ移植(Non-myeloablative stem cell transplantation、骨髄非破壊的前処置を用いた造血幹細胞移植)の増加により、ドナー・レシピエント細胞混合状態の正確な解析に対する要請が高まっている。
【非特許文献１】C Thiede et al., Rapid quantification of mixed chimerism u    sing multiplex amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection, Bone Marrow Transplantation, (1999) 23 1055-1060.
【非特許文献２】齋藤明子他、「マイクロサテライト多型を利用したmixed chimerismの迅速定量診断法の確立」、第４３回日本臨床血液学会総会、シンポジウム４．造血器腫瘍の臨床検査の進歩、p.327-332
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、迅速性、簡便性を有し、かつ、感度及び定量性にも優れた、造血幹細胞移植における混合キメラの定量法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決することを主な課題として鋭意検討を行った結果、移植前患者検体、ドナー検体、移植後患者検体という３つの混合物を一度に解析することとし、更にそのための適切なマイクロサテライト領域の選択と、最適な蛍光標識の選択を行って、鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、従来少なくとも３回の電気泳動が必要であった移植におけるマイクロサテライトPCR定量解析が１回の電気泳動ですべて終了するため、解析時間が大幅に短縮されることなど、効率性、簡便性、及び迅速性などの点で、従来にない有利な効果を発揮する。更に、本発明は、従来の方法と同様の感度、定量性、識別性を有している。また各PCR増幅産物を混合後に同一レーンで電気泳動するため各ピークの識別が極めて容易となる。
【００１０】
このように、本発明の方法は、利便性と正確性を兼ね備えた、従来にない優れた方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸、制限酵素、その他に関する略号による表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法乃至規定及び「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成２年１１月、特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。
【００１２】
解析原理
マイクロサテライト領域は、２−８塩基からなる基本反復配列が繰り返す領域で、その反復回数がアレルにより異なることで多型性を示し、ヒト染色体上に５−１０万箇所存在すると推定されている。マイクロサテライト領域をＰＣＲ増幅すると、反復回数の差が各ＰＣＲ産物の長さの差として検出可能となる。従来は、ＰＣＲ増幅後、増幅した検体毎に解析を行っている。
【００１３】
本発明においては、複数の検体（サンプル）に対するＰＣＲ増幅を、複数の蛍光物  質で標識したプライマーを用いて行い、該複数の検体のＤＮＡ増幅後産物の混和物（混合物）を一度に自動シーケンサーで解析することとした。これによって、一回のランで複数検体の解析が全て終了することになる。また電気泳動に要する時間が大幅に減少し、解析時間も大幅に選択されることになる。
【００１４】
マイクロサテライト領域を増幅させるためのプライマー配列
本発明においては、検出を容易とするために、定量的に増幅可能なマイクロサテライト領域及び該マイクロサテライト領域を増幅させるためのプライマー配列を適宜選定することが好ましい。
【００１５】
マイクロサテライト領域は、対象の種類や解析条件等に応じて適宜選定できるが、ペア検体（対となる検体、例えば、ドナー検体とレシピエント検体）間で、識別強度の高い領域、つまり、ペア検体間で反復配列の繰り返し回数に違いがある確率が高いものを用いることが好ましい。
【００１６】
特に、造血幹細胞移植におけるドナー検体とレシピエント検体を用いて各検体のＤＮＡ増幅産物の混合物を解析する場合には、該ペア検体について識別強度の高い4領域(D5S818、D7S820、D13S317、FGA)を用いることが好ましい
また、該マイクロサテライト領域の増幅を効率よく行うためには、該領域を増幅するための適当な１組のプライマー配列を選定することが好ましい。
【００１７】
上記、D5S818、D7S820、D13S317、FGAをマイクロサテライト領域とする場合には、D5S818について配列表の配列番号１及び２で表される１組のプライマー配列、D7S820について配列表の配列番号３及び４で表される１組のプライマー配列、D13S317について配列表の配列番号５及び６で表される１組のプライマー配列、FGAについて配列表の配列番号７及び８で表される１組のプライマー配列を用いることが好ましい。
【００１８】
蛍光標識
本発明においては、複数の検体に由来するの混合物の解析結果の判読を容易にするために、適切な蛍光標識を複数選定することが重要である。
【００１９】
蛍光標識の泳動度には違いがあるため、複数の蛍光標識を用いる場合に、蛍光物質で標識されたフラグメントの泳動度を特に考慮する必要がある。
【００２０】
定量解析に用いる蛍光標識の数は、混合物が由来する検体の数に応じて適宜設定される。例えば、３つの検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物を用いる場合には３つの蛍光標識、また、４つの検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物を用いる場合には４つの蛍光標識を用いる。
【００２１】
該複数の蛍光標識の組合せは、対象の種類や解析条件などに応じて適宜設定できる。
【００２２】
移植前患者検体、ドナー検体、移植後患者検体という３つの検体の各ＤＮＡ増幅産物の混合物について解析を行う場合には、色調の異なる３つの蛍光物質を用いることが好ましい。該３つの蛍光物質の組合せとしては、特に、６−ＦＡＭ(6-carboxyfluorescein)、ＮＥＤ、ＨＥＸ(6-carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorofluorescein)の組合せを用いることが好ましい。
【００２３】
例えば、移植前の患者検体、ドナー検体、移植後の患者検体という３つの検体のＤＮＡ増幅後産物の混和物について解析を行う場合には、移植前患者検体にＮＥＤ、ドナー検体に６−ＦＡＭ、移植後患者検体にＨＥＸという蛍光標識を用いる。
【００２４】
このように、複数の検体に、異なる蛍光物質を用いて、異なる蛍光標識を与えることにより、解析画面において、常にドナーと患者（レシピエント）のシグナルがバックグラウンドとして存在し、その上に移植後患者検体のシグナルが示されるので、各検体の識別が極めて容易となる。また、従来法では電気泳動を別々に行うので、複数の検体における反復配列繰り返し回数が異なるが、その複数の検体に由来するピーク（例えば、ドナーとレシピエントに由来するピーク）が非常に近い位置に検出された場合に、ピークの同定が難しいが、本発明の方法を用いれば、同じレーンで電気泳動し、また各ピークを違う色で認識できるので、判別が容易となる。結果として、極めて判読のしやすい解析結果が得られることとなる。
【００２５】
解析対象
本発明の解析対象の種類は特に限定されないが、特に、造血幹細胞移植における検体の解析に適している。造血幹細胞移植の種類は特に限定されず、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植、同種移植などに適用される。また、ミニ移植や非骨髄破壊的前処置による移植などにも適用される。
【００２６】
定量法
本発明の具体的な定量法について、移植前患者検体、ドナー検体、及び移植後患者検体の３検体を用いる場合により、説明する。
まず、各種検体から、ＤＮＡを抽出する。ＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができ、例えば、フェノール・クロロホルム法などを用いることができる。
【００２７】
次いで、マイクロサテライト領域を増幅するプライマーを蛍光物質で標識して作成した蛍光標識プライマーを用いて、各検体から抽出したＤＮＡをＰＣＲ増幅する。蛍光標識プライマーを作成する方法は特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。
【００２８】
次いで、各検体のＰＣＲ増幅産物を混和して検体の混合物を作成する。
【００２９】
該検体の混合物を、自動シーケンサーを用いて、電気泳動及び検出を行い、多型に基づく電気泳動度の相違を、解析システムを用いて解析・定量する。自動シーケンサーとしては、適宜公知のものを用いることができ、例えば、ABI PRISM 310などを用いることができる。また解析システムも適宜公知のものを用いることができ、例えば、GeneScanなどを用いることができる。
【００３０】
定量は、移植後検体におけるドナー・レシピエント各ピーク面積の比率より算出して行う。
【００３１】
本発明の方法を用いれば、経時的に定量を行う際、検体混合物における複数の検体について一度に解析結果を得ることができる。複数の検体について複数の蛍光物質が用いられていることから、極めて容易に解析結果を判別することが可能になる。
【００３２】
また、本発明の方法で得られる解析結果は、有用性が示されている従来のＦＩＳＨ法と高い相関関係を示し、さらには検出感度もFISH法より優れていると考えられる。従って、本発明の方法により、感度及び定量性にも優れた結果が得られる。
【００３３】
キット
本発明の他の態様は、混合キメラの定量解析用キットである。本発明のキットは、マイクロサテライト領域を増幅させる１組以上のプライマー配列と２以上の蛍光標識を組み合わせて構成される。具体的な構成としては、例えば、配列表の配列番号１〜８で表れる４組のプライマー配列と、６−ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＨＥＸという３つの蛍光標識の組合せが挙げられる。
【００３４】
本発明のキットには、本発明の定量解析方法を効率良く実施するための各種成分、例えば種々の媒体を含んで構成されるものであってもよい。
【００３５】
本発明のキットは、本発明における定量解析法の実施に好適に使用し得るものである。
【実施例１】
【００３６】
以下、本発明を詳しく説明するため実施例をあげるが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
【００３７】
１−１．検体からのDNA抽出
移植前患者検体、ドナー検体、移植後患者検体の３つの検体について、次に記載の方法によりＤＮＡの抽出を行った。
【００３８】
末梢血あるいは骨髄血およそ１mlをフィコールを用いて単核球に分離し細胞ペレットを作成した。これにprotease K 2μｌとlysis buffer400μｌを添加し、ミキシングした後、５５℃で30-60分間ミキシングしたのち、抽出溶媒として、フェノール、フェノールクロロホルム、クロロホルムを用いて抽出処理を行った後、エタノール沈殿を行い、50μｌの1xTE bufferに溶解させた。
【００３９】
３つの検体について、それぞれ１０μｇのＤＮＡが抽出された。
【００４０】
１−２．DNAの増幅と解析
解析の対象となるマイクロサテライト領域について、ABI社のAmpFLSTR Profiler Kit（製品コード403038）で用いられている10領域（FGA, vWA, D3S1358, D18S51, D21S11, D8S1179, D7S820, D13S317, D5S818, Amelogenin ）の中から、鋳型DNA量に対して定量的に増幅可能かどうかという点と、72例のドナー・レシピエントペア検体に対する識別割合が高い(68-77%)という点の２つの観点から、4領域(D5S818、D7S820、D13S317、FGA)のプライマー配列を選定した。
【００４１】
また、蛍光標識について、泳動度の差が極力小さいことを考慮し、6-FAM, NED, HEXの３つを蛍光標識選定した。
【００４２】
該４領域を増幅するために用いたプライマーの塩基配列と蛍光標識の種類を図１に示す。
【００４３】
１−１にて抽出した0.5ng/μlのDNA溶液10μlに、2.5μlの10x PCR Buffer、2μl の2.5mM dNTPs、各1μl の蛍光標識フォワードプライマーと非標識リバースプライマー (25 pmol/μl)、0.125μlの5 U/μl TaKaRaTaq DNA polymeraseを加えた後、滅菌蒸留水を加えて25μｌとした。その際、移植前患者検体・ドナー検体、移植後患者検体から抽出した各DNAに対して、それぞれドナー検体（６−ＦＡＭ）、移植前患者検体（ＮＥＤ）、移植後患者検体（ＨＥＸ）の各々異なる蛍光標識のフォワードプライマーを用意した。
【００４４】
PCR反応はABI  9700（ABI社）を用いて行った。PCRのサイクル条件は９4℃で5分を１サイクル、９4℃で30秒・56℃で３０秒・７２℃で３０秒を２７サイクル行った。
【００４５】
これら3種類のPCR産物を等量ずつ混合し、ABI Prism 310 capillary sequencerおよび解析ソフトGeneScan ver 3.1.2.を用いて、3者を一度に解析し、各フラグメントのピーク面積比から、患者細胞割合（ドナー・レシピエントキメラ比率）を算出した。
【００４６】
１−3．検量線
異なるアリルタイプを持つ２個人由来のDNAを一定の割合（DNA混合割合：0, 2.5,5,10,15,20,30,40,50,100%）で混和したサンプルについて、２個人をドナー・レシピエント検体とみなして、一定の割合で混合したものを移植後患者検体と見立てて、１−２と同様の方法でＤＮＡ増幅産物混合物の解析を行って、定量性を確認した（R2=0.99）。その代表例を図２に示す。図２において、グラフ上のD5S818-6-FAMは移植後患者検体を増幅したプライマーを示す。D13S317-NEDについても同様である。）
【００４７】
１−4．感度試験
２個人由来のDNAを様々な割合で混和したサンプルを用いて、２個人をドナー・レシピエント検体とみなして、一定の割合で混合したものを移植後患者検体と見立てて、1-２と同様の解析方法で定量を行った。解析の際は、各ポイントにつき５重測定を行って解析した。その結果を図３に示す。混合割合が2.5％である場合に検出が可能であることから、検出感度を3%とした。
【００４８】
１−5．本発明の定量解析法とFISH法の相関  
従来法（FISH法）と相関するかどうかを検討するため、男女のペアの白血球を用いて、様々な割合で混和したサンプルを調整した。（男性細胞割合：0,2,5,10,20,50,75,100% ）。このサンプルよりDNAを抽出し、男女２個人をドナー・レシピエント検体とみなして、一定の割合で混合したものを移植後患者検体と見立てて、1-２と同様で解析した本発明の方法とFISH法で解析を行って比較検討した。その結果、本発明の方法とFISH法は危険率１％未満で相関係数１と統計学的に有意に完全な相関関係を示した（図４）。
【００４９】
１−6．解析例
造血幹細胞移植症例１例について解析した。まず、4領域(D5S818、D7S820、D13S317、FGA)のうちいずれか一つドナーとレシピエントの識別に有用なものをあらかじめ選定し、D13S317で解析を行うことにした。赤色が移植前患者（レシピエント）検体、青色がドナー検体、緑色が移植後患者検体由来のフラグメントである。図５aは、移植後14日目、図５bは、移植後113日目の解析結果である。図5aにおいて、患者細胞割合（患者残存細胞割合(%)  ＝ areaB / (areA + areaB)（areaA、areaBは、それぞれドナー検体のピークＡ、移植前患者検体のピークＢの位置における、移植後患者検体のピークのピーク面積を意味する。）を計算したところ、14%と計算できた。同様に、図５bについて患者細胞割合を計算したところ、65%と計算できた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、実施例で用いたプライマーの配列及び蛍光標識の種類を示した図面である。
【図２】図２は、異なるアリルタイプを持つ２個人由来のDNAを一定の割合で混和したサンプルを本発明の方法で定量解析して作成した検量線の一例を示す図面である。
【図３】図３は、本発明の定量解析法の検出感度の限界を測定した結果を示す図面である。
【図４】図４は、本発明の定量解析法とＦＩＳＨ法の相関関係を示した図面である。
【図５】図５は、本発明の定量法を用いて解析した結果の一例を示す図面である。図５ａは、移植後１４日目の結果を、図５ｂは移植後１１３日目の結果を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【配列表】
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