(57)【要約】【課題】  ユビキチン鎖を認識する特異的抗体を用いてユビキチン化タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーや免疫沈降法等の免疫学的手法により回収し、脱ユビキチン化酵素を用いて回収したユビキチン化タンパク質からユビキチンを外し、ユビキチン化されていたタンパク質を回収する方法の提供。【解決手段】  抗ユビキチン鎖抗体および脱ユビキチン化酵素を用いて試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質を回収する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ユビキチン鎖抗体および脱ユビキチン化酵素を用いて試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質を回収する方法。
【請求項２】
固定化用支持体に固定化した抗ユビキチン鎖抗体と試料を接触させ、ユビキチン化タンパク質を固定化用支持体に固定化した抗ユビキチン鎖抗体と結合させる工程、固定化した抗ユビキチン鎖抗体に結合していない試料中の成分を除去する工程、および抗体に結合したユビキチン化タンパク質に脱ユビキチン化酵素を接触させ、タンパク質をユビキチンから切り離す工程を含む、請求項１記載のユビキチン化を受けるタンパク質を回収する方法。
【請求項３】
抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP１からUBP16の少なくとも１つである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
脱ユビキチン化酵素が、それぞれ配列番号２０、２５、３０、３５、３８、４１、４６、４９、５２、５５、５８、６３、６６、６９、７４および７７で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素の少なくとも１つである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP12である、請求項５記載の方法。
【請求項８】
脱ユビキチン化酵素が配列番号６３で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
脱ユビキチン化酵素がそれぞれ配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により回収したタンパク質を質量分析により同定する、試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質の同定方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により回収したタンパク質を一次元あるいは二次元電気泳動分析により同定する、試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質の同定方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により回収したタンパク質を一次元あるいは二次元電気泳動法により単離し、アミノ酸配列を決定する請求項１１記載のタンパク質の同定方法。
【請求項１３】
ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する抗ユビキチン鎖抗体。
【請求項１４】
ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、請求項１３記載の抗ユビキチン鎖抗体。
【請求項１５】
抗ユビキチン鎖抗体および脱ユビキチン化酵素を含む生体内でユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質を回収するためのキット。
【請求項１６】
抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP１からUBP16の少なくとも１つである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
脱ユビキチン化酵素が、それぞれ配列番号２０、２５、３０、３５、３８、４１、４６、４９、５２、５５、５８、６３、６６、６９、７４および７７で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素の少なくとも１つである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP12である、請求項１８記載のキット。
【請求項２１】
脱ユビキチン化酵素が配列番号６３で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
脱ユビキチン化酵素がそれぞれ配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体である、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞内におけるユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解されるタンパク質群を同定する技術に関するものである。さらに詳しくは、ユビキチン鎖を認識する特異的抗体を固定したアフィニティー担体を用いてユビキチン化タンパク質を該担体に結合させ、非吸着タンパク質を除去した後に、脱ユビキチン化酵素を添加することで、ユビキチン化タンパク質のユビキチンを切り離しユビキチン化されていたタンパク質を遊離させ回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチンは、76アミノ酸からなる酵母からヒトに至るまで高度に保存されているタンパク質である(配列番号1)。このタンパク質は、元々ヌクレオソームの構成成分であるヒストン2HAにイソペプチド結合しているタンパク質として同定されていたが、細胞内のタンパク質分解における分解シグナルとして機能することが判明して以来、ユビキチン依存性タンパク質分解系の研究が大きく進展した。ユビキチンは、E1(ユビキチン活性化酵素)、E2(ユビキチン結合酵素)、E3(ユビキチンリガーゼ)の3種の酵素群の協調的反応により標的タンパク質のリジン残基のε-アミノ基にユビキチンのC末端グリシンがイソペプチド結合させられ、標的タンパク質上にユビキチン分子が1 分子結合することから反応は開始する。その後、タンパク質に結合したユビキチンのリジン残基のε-アミノ基に別のユビキチンのC末端グリシンがイソペプチド結合し、この反応が繰り返されることで、複数のユビキチンが結合したユビキチン鎖を形成する。このユビキチンが4分子以上連結することにより、初めて分解シグナルとしてタンパク質分解酵素である26Sプロテアソームにより認識され分解される(Thrower, J. S., et al., EMBO J., 19, 94-102(2000))。分解シグナルであるユビキチン鎖は、標的タンパク質分解時に脱ユビキチン化酵素により遊離型ユビキチン分子へと分解され、ユビキチンは再利用されることが知られる(Hershko, A., & Ciechanover, A., Annu. Rev. Biochem., 67, 425-479(1992))。
【０００３】
標的タンパク質へのユビキチン付加反応に対してユビキチンを外す機構は、脱ユビキチン化反応と言われ、細胞内には複数の脱ユビキチン化酵素(DUB: de-ubiquitinating enzyme)が存在していることが知られる。脱ユビキチン化酵素は、一次構造の相同性からユビキチンC末端加水分解酵素(UCH: ubiquitin C-terminal hydrolase)とユビキチン特異プロテアーゼ(UBP: ubiquitin specific protease)に大別される。出芽酵母においては、UCHに分類される酵素が1種類、UBPに分類される酵素が16種類存在する。UBP酵素は、システインボックスとヒスチジンボックスと言われる保存された領域をもち、その他に保存されているアスパラギン酸残基と共に活性中心を形成している(Hochstrasser, M., Annu. Rev. Genet., 30, 405-439(1996))。それぞれのUBPタンパク質について、遺伝学的手法や生化学的手法で解析が行われているが、全てのUBPについて調べられているわけではなくUBP8, 12, 13, 15, 16についての報告はまだ無い。また脱ユビキチン化酵素については酵母以外のタンパク質について4件特許が出願されている(特開2000-125880号公報、特開2001-128680号公報、特開2002-300880号公報、特開2003-070498号公報)。
【０００４】
細胞内の多数の機能タンパク質がユビキチン依存的に分解されることが知られており、このことは、細胞の機能はタンパク質の分解制御によって大きく左右されることを意味する。事実、ユビキチン依存性タンパク質分解系は、細胞周期の制御に大きく関与しているほか(Huibregtse, J. et al., Science, 274, 1652-1659(1996))、シグナル伝達(Joazeiro, C. A. P., Science, 286, 309-32(1999); Jiang, J., & Struhl, G., Nature, 391, 493-496(1998))、転写(Conaway, R. C., et al., Science, 296, 1254-1258(2002))、アポトーシス(Jesenberger, V., & Jentsh, S., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 3, 112-112(2002))、小胞体内タンパク質の品質管理(Hiller, M. M. et al., Science, 273, 1725-1728(1996); Plemper, R. K., & Wolf, D. H., Trends Biochem. Sci., 24, 266-270(1999))、MHC-classI抗原プロセシング(Kloetzel, P.-M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2, 179-187(2001)) 、発癌(Lisztwzn, J. et al., Genes Dev., 13, 1822-1833(1999); Higashitsuji, H. et al., Nature Med., 6, 96-99(2000))、ウイルス感染(Ferrel, K. et al., Trends Biochem. Sci., 25, 83-88(2000))、神経変性疾患(Kishino, T.,et al., Nature Genet., 15, 70-73(1997); Shimura, H., et al., Nature Genet., 25, 302-305(2000))など多くの生体反応に関与している。
【０００５】
このことから、ユビキチン化タンパク質を同定する技術は、生体反応を理解する上で欠かせない基盤技術になると考えられる。しかし、現在進められているプロテオーム解析を用いた手法では、ユビキチン化タンパク質の同定は容易ではない。なぜなら、タンパク質にユビキチンが結合する数は一定ではなく不特定数結合することが大きな理由として挙げられる。即ち、ユビキチンが1分子標的タンパク質に結合する毎に分子量と等電点が変化するため、2次元電気泳動後に特定のスポットとして認識することは困難だからである。従って、他の手法を用いてユビキチン化タンパク質を同定する技術の開発が必要であり、これまで幾つかの手法が開発されている。最初に、ユビキチン鎖に対する特異的モノクローナル抗体FK2(特開平7-238096号公報)を用いてユビキチン化タンパク質を精製後、該タンパク質をリジルエンドペプチダーゼで分解し、その分解産物を解析する方法が挙げられる(Takada, K., et al., Biochem. J., 356, 199-206(2001))。次に、酵母細胞内にアフィニティー精製可能な異なるタグを融合させたユビキチンを2種類同時に発現させ、ユビキチン化タンパク質を2段階のアフィニティー精製により回収し、その後、精製ユビキチン化タンパク質を質量分析へ供する方法が開発されている(第25回分子生物学会大会要旨、横浜(2002))。更に、出芽酵母由来Rad23タンパク質の分子内に内包するユビキチン結合領域(UBA domain: ubiquitin associated domain)を介してユビキチン化タンパク質を回収することが可能であることが発表され(Chen, L., & Madura, K., Mol. Cell. Biol., 22, 4902-4913(2002))、この手法を用いたユビキチン化タンパク質濃縮キットが販売されている(CALBIOCHEM社)。同様にUBAペプチドをアガロースに架橋したアフィニティー精製担体、ポリユビキチンを認識する26Sプロテアソーム成分S5aをアガロースビーズに共有結合させたアフィニティー精製担体などが市販されている(Affiniti社)。これらいずれの方法においても、ユビキチン化タンパク質を濃縮することは出来るが、そのままではユビキチン化されたタンパク質1 分子に対し複数分子のユビキチンが結合した状態で解析する必要がある。ユビキチン化タンパク質の解析には、質量分析計等を用いた方法が最も適していると考えられるが、タンパク質分解酵素で処理したユビキチン化タンパク質は、ユビキチン化されたタンパク質由来ペプチドに対して大きくモル比の異なるユビキチン由来ペプチドが混在するため、その解析は容易ではなく、HPLCなどでペプチドを分離する必要がある。このような状況下、ユビキチン化タンパク質の同定技術の改良が望まれている。
【０００６】
【特許文献１】特開2000-125880号公報
【特許文献２】特開2001-128680号公報
【特許文献３】特開2002-300880号公報
【特許文献４】特開2003-070498号公報
【特許文献５】特開平7-238096号公報
【非特許文献１】Hochstrasser, M., Annu. Rev. Genet., 30, 405-439(1996)
【非特許文献２】Takada, K., et al., Biochem. J., 356, 199-206(2001)
【非特許文献３】第25回分子生物学会大会要旨、横浜(2002)
【非特許文献４】Chen, L., & Madura, K., Mol. Cell. Biol., 22, 4902-4913(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明では、ユビキチン化タンパク質を濃縮・精製可能なモノクローナル抗体を作製後、該抗体をセファロースに共有結合させたアフィニティー精製用担体を作製し、ユビキチン化タンパク質を濃縮する方法を確立する。一方、ユビキチン化タンパク質からタンパク質を外すため、組換え脱ユビキチン化酵素を調製する。最終的に、ユビキチン化タンパク質をアフィニティー精製担体により濃縮後、脱ユビキチン化酵素添加によりタンパク質からユビキチンを外し、該タンパク質を回収する一連の反応系を構築することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明を解決するために、大きく3つの要素が挙げられる。すなわち、ユビキチン鎖に対する特異的モノクローナル抗体の作製、組換え脱ユビキチン化酵素の生産およびユビキチン化タンパク質の精製並びにユビキチンを外したタンパク質の回収である。
【０００９】
ユビキチン鎖に対するモノクローナル抗体の作製は、抗原となるユビキチン化リゾチームを作製しマウスに免疫する。免疫処理後、常法に従いハイブリドーマを作製しユビキチン化リゾチームを抗原としたELISAを行い、ユビキチン化リゾチームに反応する抗体産生細胞を選別する。その後、ユビキチン単独、あるいはリゾチーム単独に反応する抗体産生細胞を除いていくことで、ユビキチン鎖特異的な抗体産生細胞を選択する。最終的に得られた抗体産生細胞を用いて抗体を調製する。
【００１０】
次に、組換え脱ユビキチン化酵素を作製する。脱ユビキチン化酵素は、同一種において複数存在しており、どの酵素を選択すれば良いのか判断が難しい。従って、ゲノム情報が明らかで脱ユビキチン化酵素の情報が得られる出芽酵母に焦点を絞って組換え脱ユビキチン化酵素を大腸菌を宿主として発現させる。計16種類の組換え脱ユビキチン化酵素を生産し、ユビキチン化リゾチームをモデル基質として脱ユビキチン化反応を確認する。同時に、リゾチーム以外の基質として、蛍光タンパク質を改変し、ユビキチン化させたユビキチン化蛍光タンパク質も同様にモデル基質として用いる。16 種類のUBPの中から、実験に最も適したUBPを選択し系の構築に用いる。
【００１１】
最後に、調製した上記抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体をセファロースビーズに共有結合させ、アフィニティー精製用担体を作製する。その後、該担体をユビキチン化リゾチームを含む水溶液に加え、攪拌し、ユビキチン化リゾチームを精製担体に吸着させる。ユビキチン化リゾチーム吸着後の担体を回収した後、組換え脱ユビキチン化酵素を添加しユビキチン鎖の分解を進める。この反応により、ユビキチン化リゾチームからユビキチンが取り除かれると同時にリゾチームが精製担体より外れ、ユビキチンの付加していないリゾチームが回収できるはずである。
【００１２】
以上手法を基本として、培養細胞をはじめ生体試料からユビキチン化タンパク質を精製・濃縮し、脱ユビキチン化酵素を用いてタンパク質からユビキチンを切り放して該タンパク質を回収する技術を開発することとした。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  抗ユビキチン鎖抗体および脱ユビキチン化酵素を用いて試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質を回収する方法、
[２]  固定化用支持体に固定化した抗ユビキチン鎖抗体と試料を接触させ、ユビキチン化タンパク質を固定化用支持体に固定化した抗ユビキチン鎖抗体と結合させる工程、固定化した抗ユビキチン鎖抗体に結合していない試料中の成分を除去する工程、および抗体に結合したユビキチン化タンパク質に脱ユビキチン化酵素を接触させ、タンパク質をユビキチンから切り離す工程を含む、[１]のユビキチン化を受けるタンパク質を回収する方法、
[３]  抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する、[１]または[２]の方法、
[４]  抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、[３]の方法、
[５]  脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP１からUBP16の少なくとも１つである、[１]から[４]のいずれかの方法、
[６]  脱ユビキチン化酵素が、それぞれ配列番号２０、２５、３０、３５、３８、４１、４６、４９、５２、５５、５８、６３、６６、６９、７４および７７で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素の少なくとも１つである、[１]から[４]のいずれかの方法、
[７]  脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP12である、[５]の方法、
[８]  脱ユビキチン化酵素が配列番号６３で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素である、[６]の方法、
[９]  脱ユビキチン化酵素がそれぞれ配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体である、[１]から[４]のいずれかの方法、
[１０]  [１]から[９]のいずれかの方法により回収したタンパク質を質量分析により同定する、試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質の同定方法、
[１１]  [１]から[９]のいずれかの方法により回収したタンパク質を一次元あるいは二次元電気泳動分析により同定する、試料中のユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質の同定方法、
[１２]  [１]から[９]のいずれかの方法により回収したタンパク質を一次元あるいは二次元電気泳動法により単離し、アミノ酸配列を決定する[１１]のタンパク質の同定方法、
[１３]  ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する抗ユビキチン鎖抗体、
[１４]  ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、[１３]の抗ユビキチン鎖抗体、
[１５]  抗ユビキチン鎖抗体および脱ユビキチン化酵素を含む生体内でユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解され得るタンパク質を回収するためのキット、
[１６]  抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端領域のアミノ酸配列とタンパク質との結合領域を認識する、[１５]のキット、
[１７]  抗ユビキチン鎖抗体が、ユビキチンのC末端アミノ酸配列LHLVLRLRGGに含まれるエピトープを認識する、[１６]のキット、
[１８]  脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP１からUBP16の少なくとも１つである、[１５]から[１７]のいずれかのキット、
[１９]  脱ユビキチン化酵素が、それぞれ配列番号２０、２５、３０、３５、３８、４１、４６、４９、５２、５５、５８、６３、６６、６９、７４および７７で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素の少なくとも１つである、[１５]から[１７]のいずれかのキット、
[２０]  脱ユビキチン化酵素が出芽酵母由来のUBP12である、[１８]のキット、
[２１]  脱ユビキチン化酵素が配列番号６３で表される塩基配列からなるDNAがコードするユビキチン化酵素または該DNAに相補的な塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするユビキチン化酵素である、[１９]のキット、
[２２]  脱ユビキチン化酵素がそれぞれ配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体である、[１５]から[１７]のいずれかのキット、ならびに
[２３]  配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体および脱ユビキチン化酵素を用いることにより、簡単な操作で生体中のユビキチン化を受けるタンパク質を単離・回収することができ、生体内のユビキチン化タンパク質を網羅的に解析することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ユビキチン鎖に対するモノクローナル抗体の作製
本発明で用いる抗体は、ユビキチンが連結してできたユビキチン鎖を認識する抗体であり、単体のユビキチンを認識しない抗体である。ユビキチンは標的タンパク質に結合してはじめてユビキチン鎖として存在し得るので、このような抗体を得るには、抗体を産生させる動物において、ユビキチン鎖が認識されればよい。ユビキチン鎖のみを免疫原として用いるのは困難であるので、ユビキチン鎖が結合した標的タンパク質（ポリユビキチン化標的タンパク質）を抗原として用いればよい。標的タンパク質はユビキチン鎖が結合し得る限り限定されない。このような標的タンパク質は、生体内でユビキチン依存的に分解されるタンパク質であり、分子中の適当な位置に１個以上のリジン残基を有するタンパク質である。
【００１６】
本発明の抗ユビキチン鎖抗体の作製に用い得るタンパク質として、例えば、リゾチーム、ヘモグロビン、リボヌクレアーゼA等が挙げられる。これらの標的タンパク質へのユビキチン鎖の結合は、標的タンパク質のユビキチン化に必要な酵素、およびATP存在下で標的タンパク質と、遊離型のユビキチンを混合反応させればよい。ユビキチン化に必要な酵素としてはE1（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）およびE3（ユビキチン識別タンパク質）からなる酵素群が挙げられ、例えばウサギの網状赤血球から公知の方法で取得することができる。
この際、標的タンパク質をあらかじめ熱変性させておいてもよい。
【００１７】
本発明の抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のように公知の手段で作製することができる。
【００１８】
すなわち、上記ユビキチン鎖が結合したタンパク質を免疫原として用いて、通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１９】
まず、上記免疫原で動物を免疫する。免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択すればよい。一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等が使用される。免疫したマウスの脾細胞またはリンパ節細胞とマウスのミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマの培養上清又は該ハイブリドーマを腹腔内に投与して産生されるマウスの腹水から調製することができる。ミエローマ細胞は、一般に被免疫動物と同種の動物より得られたものを用いるが、異種間でも可能な場合がある。また、免疫されていない動物の脾細胞またはリンパ節をin vitroで免疫して、感作細胞を得ることもできる。動物の免疫は、公知の方法に従って行えばよい。例えば、免疫原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射する。具体的には、免疫原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに必要に応じてアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に数日毎に数回投与する。
【００２０】
免疫した動物の血清の抗体価が十分に上昇した時点で、動物から免疫細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させる。免疫細胞としては、脾細胞、リンパ節細胞等を用いることができる。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株を使用することができ、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、 P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、 NS-1 （Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0 （Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が挙げられる。
【００２１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に従い行うことができる。細胞融合は、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等を融合促進剤として用いて行う。また、電気細胞融合の技術を用いて行ってもよい。融合時の免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1〜10倍とするのが好ましい。免疫細胞とミエローマ細胞をMEM培養液等の培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液（平均分子量1000〜6000程度）を30〜60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによってハイブリドーマが得られる。
【００２２】
このようにして得られたハイブリドーマは、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）等の選択培養液で培養することにより選択する。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、限界希釈法によりクローニングを行い、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
【００２３】
ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法で実施することができ、例えばELISA法、ウエスタンブロット法等が利用できる。この際、ユビキチン鎖のみを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択するためには、ユビキチン鎖を結合させた標的タンパク質を認識するが、標的タンパク質単独および遊離型のモノユビキチンを認識しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択すればよい。ユビキチン鎖を認識する抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することも可能である。
【００２４】
ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、ハイブリドーマを通常の方法で培養し、その培養上清として得ることもできるし、またハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２５】
ハイブリドーマ上清またはマウス腹水からのモノクローナル抗体の調製は、当業者に知られた免疫グロブリン精製法を用いればよく、例えば、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２６】
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体は、ユビキチンが連結したユビキチン鎖を認識する。本発明の抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体は、標的タンパク質にイソペプチド結合しているユビキチンのC末端の結合領域を認識するものであってもよいし、モノユビキチンどうしがイソペプチド結合している結合領域を認識するものでもよいし、ユビキチン鎖の連結により形成される立体構造を認識するのもでもよい。好適には、ユビキチンのC末端領域を含むアミノ酸配列と、そこへ結合しているタンパク質との結合領域を認識する抗体を用いる。このような結合領域の配列として配列番号１５で表されるアミノ酸配列が例示できる。従って、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むエピトープを認識するモノクローナル抗体を含む。
【００２７】
２．組換え脱ユビキチン化酵素の生産
脱ユビキチン化酵素（DUB）は、ユビキチン化タンパク質からユビキチンを切り離す酵素である。酵母やショウジョウバエなどの種々の生物種由来の種々の脱ユビキチン化酵素がしられており、本発明においてこれらの脱ユビキチン化酵素を用いることができる。脱ユビキチン化酵素にはUCHおよびUBPの２つのタイプが存在するが、本発明の方法においてはいずれのタイプの脱ユビキチン化酵素も使用することができる。例えば、出芽酵母では１７種類の脱ユビキチン化酵素が知られており、そのうちYuh1以外の16種類がUBP群に属する（UBP１〜UBP16）。一方、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)に対し、同じ酵母で解析が進んでいる分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)由来UBPの情報は少なく、サンガー研究所の分裂酵母のゲノムデータベース(http://www.genedb.org/genedb/pombe/index.jsp) によるとubpとしては16種類見つかっており、現在までに得られる情報はubp5とubp15に対する報告(Richert, K. et al., Mol. Genet. Gomonics, 267, 88-95(2002))とubp12に対する報告(Zhou, C. et al., Mol. Cell, 11, 9227-938(2003)の2報が挙げられる。分裂酵母ubp12は組換えタンパク質として生産されその生化学的情報も一部明らかとなっている。出芽酵母と分裂酵母のUBP間の相同性を遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX(株式会社ゼネティクス社製)を用いてグローバルホモロジー解析を行うと、UBPホモローグ間の相同性は48〜75%を示しそれほど高くない。またそれぞれのタンパク質の全長もほぼ同じサイズ(例、UBP6(出芽酵母由来、499アミノ酸)に対してubp6(分裂酵母由来、467アミノ酸))から数百アミノ酸長さが異なるもの(例、UBP12(出芽酵母由来、1254アミノ酸)に対してubp12(分裂酵母、979アミノ酸)まで様々である。従って、UBPの選択には相同性だけで判断するのは注意が必要である。脱ユビキチン化酵素については、例えば、実験医学  増刊  タンパク質分解の最前線2001  田中啓二他  編集  羊土社  2001年1月30日発行等に記載されている。
【００２８】
好適には、出芽酵母由来の脱ユビキチン化酵素（UBP1〜UBP16）を用いる。脱ユビキチン化酵素は、天然のものを単離精製して用いることもできるが、大量安定生産の観点からは、組換え酵素を用いるのが好ましい。UBP１〜UBP16をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、該公知の配列情報に基づいて公知の手法を用い酵母ゲノムDNAからUBP１〜UBP16をコードする塩基配列を取得することができる。例えば、配列情報に基づいて増幅用プライマーを設計・製造し、該プライマーを用いて脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子を増幅すればよい。得られた塩基配列を発現ベクターに組込むことにより、それぞれの脱ユビキチン化酵素発現用ベクターを得ることができ、該発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、培養することにより、UBP１〜UBP16を得ることができる。
【００２９】
ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pKC30、pCFM536等の大腸菌プラスミド、pUB110等の枯草菌プラスミド、pG-1、YEp13、YCp50等の酵母プラスミド、λgt110、λZAPII等のファージのDNA等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスDNA、SV40とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００３０】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではpET22b、pET28a、pET3a、pET3b、pET3c、pET-11a(Novagen)、pEF1、pPROEX（Invitrogen）、pQE30、pQE31、pQE32、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pBluescriptII KS、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)、pUC118（宝酒造）、真核性のものではpXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、SV40（Pharmacia）等がある。
【００３１】
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばColiE1、R因子、F因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば2μmDNA、ARS1由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばSV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はSV40プロモーター、大腸菌lacまたはtrpプロモーター、ファージラムダPLプロモーター、酵母用としてのADH、PHO5、GPD、PGK、AOX1プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。また、組込んだ遺伝子を誘導的に発現させることもでき、この場合は、プロモーターとしてプロモーター下流の遺伝子の発現を誘導し得るものを用いる。
【００３２】
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、LEU2、TRP1、URA3遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いることができる。
【００３３】
DNAのベクターへの導入は、任意の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にDNAを挿入すればよい。本発明の融合遺伝子を含む発現ベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換することにより、宿主細胞に前記融合遺伝子がコードするタンパク質を発現、産生させることができる。
【００３４】
宿主細胞としては、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、HB101、DH5、TG1、JM109、XL1-blue、等の大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞、CHO、COS、BHK、3T3、C127等の哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション等の公知の方法で行うことができる。
【００３５】
得られた組換えタンパク質は、公知の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がGST等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているタンパク質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えば、FLAGタグとの融合タンパク質として発現させた場合、Anti-FLAG M2 agarose等の市販のアフィニティー担体を用いてアフィニティー精製を行うことができる。また、ヒスチジンが6個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有するタンパク質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる、またGSTとの融合タンパク質として発現させた場合、GSTはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。
【００３６】
配列番号２０、２５、３０、３５、３８、４１、４６、４９、５２、５５、５８、６３、６６、６９、７４および７７には、それぞれUBP１〜UBP16をコードする遺伝子が組込まれた発現ベクター中のそれぞれの脱ユビキチン化酵素がコードする遺伝子の塩基配列を示す。また、配列番号１６〜１９、２１〜２４、２６〜２９、３１〜３４、３６および３７、３９および４０、４２〜４５、４７および４８、５０および５１、５３および５４、５６および５７、５９〜６２、６４および６５、６７および６８、７０から７３ならびに７５および７６には、それぞれUBP１〜UBP16をコードする遺伝子を増幅するのに用いたプライマーの配列が示される。本発明に用いる脱ユビキチン化酵素は、上記配列番号で示されるベクター配列中の脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子の塩基配列に相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脱ユビキチン化活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子であってもよい。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が500〜1000mM、好ましくは700mMであり、温度が50〜70℃、好ましくは65℃での条件をいう。また上記配列からなるDNAと、BLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有しており脱ユビキチン化活性を有する酵素をコードするDNAからなる遺伝子であってもよい。さらに、上記配列で表される塩基配列からなるDNAにおいて、１または複数の塩基が欠失、置換、付加され、かつ脱ユビキチン化活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子であってもよい。ここで、１または複数の塩基とは、１〜200個、好ましくは１〜100個、さらに好ましくは１〜50個、特に好ましくは１〜20個もしくは１〜10個の塩基をいう。このようなタンパク質として、UBP12の変異体が挙げられ、例えば配列番号８０、８３、８６および８９で表される塩基配列からなるDNAがコードするUBP12の変異体、および該DNAに相補的なDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするUBP12の変異体がある。
【００３７】
これらの配列に変異を有する脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子は、Kunkel法若しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異誘発法に基づいて変異を導入するが、変異導入用キット（例えばMutan-K(TAKARA社製)、Mutan-G(TAKARA社製)、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットなど）を用いて変異を導入することもできる。
さらに、酵母由来の脱ユビキチン化酵素を大腸菌で製造した場合、UBP1〜UBP16のうち、UBP２、３、10および12の活性が高く、これらが好適に用いられる。さらに、この中でもUBP12の活性が高く、本発明において特に好適に用いられる。
【００３８】
３．ユビキチン化タンパク質の回収、酵素処理
本発明は、上記抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体を用いて生体試料からユビキチン化された未知のタンパク質群を回収し、上記脱ユビキチン化酵素でユビキチンを切り離し、残ったタンパク質群を同定することにより、生体内でユビキチン化されているタンパク質群を同定する手法に関する。
【００３９】
ユビキチン化タンパク質の回収は、上記の抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーの手法を用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーは適当な固定化用支持体に抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体を結合させ、該抗体を固定化した支持体と試料を、両者が結合する条件で接触させ、固定化抗体と試料中のユビキチン化タンパク質を結合させ、次いでアフィニティークロマトグラフィー固定化用支持体にユビキチン化タンパク質が結合している状態で脱ユビキチン化酵素を作用させて、タンパク質とユビキチンを切り離して、タンパク質を回収する。本発明で用いる試料はユビキチン化タンパク質が含まれている可能性がある試料ならば限定されず、真核細胞由来培養細胞抽出液、組織抽出液、等を広く用いることができる。支持体は通常アフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる支持体ならばいずれも用いることができ、Sepharose等のアガロース、Sephadex等のデキストラン、セルロース、Biogel等のポリアクリルアミド、多孔性シリカビーズ等を用いることができる。抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体の支持体への結合も前記支持体の水酸基やアミノ基等の官能基とモノクローナル抗体の官能基を活性化させて結合させればよい。官能基が活性化されたアフィニティークロマトグラフィー用支持体が種々市販されており、これらを用いることにより容易に抗体固定化支持体を得ることができる。また、支持体と抗体をスペーサーを介して結合させてもよい。この際、シアノゲンブロマイドやN-ヒドロキシサクシニイミド等を用いて結合させればよい。
【００４０】
また、上記の抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体はIgMであることから、κL鎖と結合することが知られるProtein Lをアガロースに結合させた市販ビーズを用いて、抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体とprotein Lアガロースビーズを結合させることでユビキチン化タンパク質の回収を行ってもよい。この場合、抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体を試料と混合しユビキチン化タンパク質と該抗体を結合させた後、ユビキチン化タンパク質-抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体複合体をprotein Lアガロースビーズに結合させて回収することが可能になる。
【００４１】
このようにして得られた抗ユビキチン鎖モノクローナル抗体固定化支持体に試料を接触させて、試料中のユビキチン化タンパク質と抗体とを結合させて、結合していない試料中の成分を洗浄除去する。抗体とユビキチン化タンパク質の結合は、通常抗体の保存等に用いられるリン酸バッファーやTris-HClバッファー等中で両者を混合すればよい。結合したユビキチン化タンパク質に上述の方法で得られた脱ユビキチン化酵素を作用させることにより、タンパク質とユビキチン鎖を切り離すことができる。タンパク質とユビキチンとの切り離しは、上記の脱ユビキチン化酵素を、２０℃〜３７℃、pH７．５〜８．５、０．５〜３時間作用させればよい。タンパク質とユビキチンを切り離すとき、連結していたユビキチンも解離し、回収したタンパク質調製物中に、遊離型のユビキチンが含まれるが、両者の分子量との特性は大きく異なるので、後述の１次元あるいは２次元電気泳動を行うことにより完全に分離することができるし、また後述の質量分析による解析もユビキチンが混入した状態で行うことができる。
【００４２】
ユビキチン化タンパク質の結合およびユビキチンとタンパク質の切り離しは、適当な容器を用いたバッチ法で行ってもよいし、抗体を固定化した支持体をカラムに詰め、該カラムに試料、緩衝液、酵素溶液等を流して、結合解離させるカラム法により行ってもよい。
【００４３】
このようにして回収・単離したユビキチンと結合し得るタンパク質試料中には、生体内に存在するユビキチン化を受ける多くのタンパク質が存在しており、次いで、この試料について公知のタンパク質解析方法を用いてプロテオーム解析することができる。
【００４４】
例えば、タンパク質をその電荷と分子量で分離し得る一次元電気泳動あるいは二次元電気泳動法を用いて分析する。二次元電気泳動法は、一般的に一次元目に等電点電気泳動を行い、二次元目にSDS-PAGEあるいは密度勾配ゲル電気泳動を行うことによって、タンパク質を電荷と分子量に従って、二次元的に展開する手法である。二次元電気泳動用ゲルとして、固定化pH勾配（immobilized pH gradient）ゲル等種々のゲルが市販されており、これらを用いて容易に二次元電気泳動を行うことができる。試料中にユビキチンが含まれていても、二次元電気泳動により各タンパク質のスポットとユビキチンのスポットが出現し、二次元情報に基づいてそれぞれのタンパク質を同定することが可能であるし、また各タンパク質をそれぞれ抽出回収し各々のタンパク質を単離することができる。回収単離したタンパク質は、さらに、質量分析により解析したり、アミノ酸配列を決定し、同定する。アミノ酸配列の決定は、エドマン分解法等の公知の方法により行うことができる。
【００４５】
二次元電気泳動法については、下記のプロテオーム解析についての文献の他に、新生化学実験講座１  タンパク質I  分離・精製・性質  日本生化学会編  東京化学同人  1990年２月２６日発行、実験医学  Vol.20, No.1, pp.85-88, 2002等に記載されており、これらの記載に従って行うことができる。
【００４６】
質量分析はMALDI-TOF型の質量分析計やLC-MS/MS等のタンデム質量（MS/MS）分析法により行うことができる。例えば、LC-MS/MSによればアミノ酸配列を決定することができるし（de novo seuquencing 法）、またMS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報を用いて直接データベースサーチを行いタンパク質を同定することもできる。この際、分析を行う試料中にユビキチンが含まれていてもタンパク質自体の解析を行うことが可能である。
【００４７】
その他、公知の種々の方法でポリユビキチン化を受け得るタンパク質を解析することができる。プロテオーム解析は、例えば、実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座２  プロテオーム解析法  礒辺俊明  他編  羊土社  2000年７月10日発行、実験医学  増刊  プロテオミクス時代のタンパク質研究  宮崎香  他編  羊土社  2002年９月２５日発行、ポストシークエンスのゲノム化学(3)  プロテオミクス  タンパク質の系統的・網羅的解析  松原謙一  他監修  中山書店  2000年11月30日発行、等に記載の方法で行うことができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４９】
実施例において行う実験の方法
まず、以下の実施例１から実施例１４に書かれた実験に用いた手法を列挙する。
プラスミドは全て、常法（Sambrook, J., & Russell, D. W., Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition [2001], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に従って構築した。ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、PCRと略記； Saiki et al., Science 239 487-491 [1988]）には全てPfu turbo （STRATAGENE社製）を用いた。増幅したDNA断片は1.0%アガロースゲル電気泳動に供し、目的のDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いて、使用説明書に準じて精製した。遺伝子に点変異を導入する際には、インバースPCR法(Clackson et al. (1992), In PCR-a practical approach (Mcpherson, M. J., eds.), Oxford university press, 187-215)を用いた。出芽酵母野生株w303株のゲノムDNAはQIAGEN社製QIAGEN Genome-tipを用い、使用説明書に準じて精製した。DNA断片の5'末端をリン酸化する必要のある場合は東洋紡社製T4 polynucleotide kinaseを用いた。塩基配列決定にはDNAシークエンサーABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer（ABI社製）を用いた。リガーゼ反応にはNew England Biolabs社製のT4 DNA ligaseを用いた。
【００５０】
プラスミド構築に用いた大腸菌の培養はLuria Broth（LB: 1% Bacto trypton, 0.5 % Bacto yeast extract, 1 % 塩化ナトリウム）で行った。形質転換体を選択する際には、カナマイシン（10μg / ml）、クロラムフェニコール（34μg / ml）、アンピシリン（100μg / ml）を用いた。
【００５１】
組換えタンパク質は、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現するよう発現ベクターを構築し、大腸菌BL21(DE3)RIL(STRATAGENE社製)に形質転換した。
IPTG (イソプロピル1-チオ-β-D-ガラクトシド)によるタンパク質発現誘導後、Ni-NTA Superflow(Qiagen社製)を用いたアフィニティ精製を行った。尚、組換えタンパク質の誘導方法及び精製方法はQiagen社による説明書に準じた。
【００５２】
ウェスタンブロッティング法によるタンパク質の検出は、SDSポリアクリルアミド電気泳動によりタンパク質を分離後、トランスブロットSDセル(Bio-Rad社製)を用いてニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell社製)へ転写後、常法に従って目的とするタンパク質を検出した(Harlow, E., & Lane, D., 1992, Antibodies-a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) 。検出は、2 次抗体としてアルカリホスファターゼが結合した抗ポリクローナル抗体(Promega社製)又は抗モノクローナル抗体(Promega社製)を用い、NBT(Nitro blue tetrazolium)とBCI(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-phosphate)試薬(Promega社製)を用いて発色させた。
【実施例１】
【００５３】
ユビキチン化に必要な、E1, E2, E3酵素群の調製
ユビキチン化タンパク質を調製するための酵素群(E1, E2及びE3)の調製法は、ウサギより調製した網状赤血球を用いて田村らの方法をもとに調製した(Tamura, T et al., FEBS Lett., 292, 154-158(1991))。ウサギ網状赤血球を溶血させた後の粗抽出画分からFractionIIを調製した後、ユビキチン-セファロース(20 mgユビキチン/ml担体)に酵素群を結合させ、洗浄後、50mM Tris-HCl (pH 9.0)/1M KCl/20 mM DTTで酵素群を溶出させ、1M Tris-HCl (pH 7.0)を溶出液に加えて直ちに中和した。回収した溶出液は、容量が約1/10になるまで限外ろ過により濃縮した後、50mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM ATP/ 1 mM DTT/20 %グリセロールで透析した。透析後タンパク質量を測定後、-80℃に保存した。
【実施例２】
【００５４】
ユビキチン化リゾチームの調製
実施例１で精製した酵素群270μl (0.4 mg/ml)に、60μlの1M Tris-HCl (pH 9.0)、10.8μlの300 mM MgCl2、10.8μlの200 mM ATP、6μlの100 mM DTT、6μlの無機ピロフォスファターゼ (200 U/μl、酵母由来、Roche社製)、90μlの熱変性したリゾチーム(2 mg/ml、ニワトリ卵白由来，生化学工業社製)、66μlのユビキチン(10 mg/ml、ウシ赤血球由来、Sigma社製)を加え、milliQ水で総容量が600μlになるように加えて、37 ℃で90分間反応を行った。反応終了後、未反応のユビキチンとリゾチームを除くため、田村らの方法 (Tamura, T et al., FEBS Lett., 292, 154-158 (1991))によりユビキチン化リゾチームを回収した。回収したユビキチン化リゾチームは濃縮後-20℃に保存し、抗体作製用の抗原として、また脱ユビキチン化酵素の活性測定の基質として用いた。反応時に経時的に回収した15μlのユビキチン化リゾチーム溶液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、クーマーシー染色で確認すると、リゾチームに結合するユビキチン数依存的にバンドが多数確認され、ユビキチン化リゾチームの合成が確認された(図1)。
【実施例３】
【００５５】
モノクローナル抗体産生細胞の樹立
実施例２で得られたユビキチン化リゾチーム溶液100μlに等量のアジュバント(一回目はフロイント完全アジュバント、二回目以降はフロイント不完全アジュバント)を加え乳化しBALB/cマウス一匹の免疫感作に用いた。免疫抗原は1.5週間隔で計４回マウス背部皮下に分散投与した。感作開始後七週にマウス尾静脈より採血し、抗体価の上昇を確認し、常法（安藤民衛・千葉丈著「単クローン抗体実験操作入門」講談社、1991年）に従って上記マウスの脾細胞を採取し、マウス・ミエローマ細胞 (Sp2/o-Ag14)と融合させてハイブリドーマを調製した。得られたハイブリドーマ集団の中から遊離ユビキチンとリゾチームには反応せずユビキチン化リゾチームに反応する抗体産生細胞をELISA法にてスクリーニングした。
【００５６】
このようにして選択した抗体産生細胞株を選択後、0.5 ml/匹プリスタン(Sigma社製)を投与後2週間経過したBALB/cマウス腹腔内に、1匹当たり細胞数5 x 106個注入し、10〜14日飼育した後に腹水を回収した。回収した腹水から、HighTrapIgM(amasham biosciences社製)を用いて抗体を精製した。精製方法は、HighTrapIgMに添付の説明書に従い、精製後の抗体はPBS緩衝液で透析しBradford法(Bradford, M., Anal. Biochem., 72, 248 (1976))をもとにしたProtein assay溶液(Bio-Rad社製)でタンパク質濃度を測定した。測定した抗体は使用するまで-20℃に保存した。
【００５７】
本実施例において、ユビキチン鎖を認識する抗体スクリーニング時に、平行して遊離ユビキチンだけに反応する抗ユビキチン抗体と遊離リゾチームだけに反応する抗リゾチーム抗体を生産するハイブリドーマ細胞をそれぞれスクリーニングし抗体産生細胞を樹立した。得られたハイブリドーマを用いて、抗ユビキチン鎖抗体同様、マウスから腹水を回収し、Protein A-Sepharose(amersham biosciences社製)を用いて抗体を精製した。精製方法は、Protein A-Sepharoseに添付の説明書に従い、精製後の抗体はPBS緩衝液で透析し分子吸光計数をもとにタンパク質濃度を測定後、-20℃に保存した。
【００５８】
スクリーニングで得られた3種の抗体について、Mouse monoclonal antibody isotyping kit  (HyCult biotechnology社製)を用いて抗体のサブクラスを調べた。その結果、抗ユビキチン鎖抗体はIgMであることが判明した。また抗ユビキチン抗体及び抗リゾチーム抗体は、それぞれIgGであることが判明した。
【００５９】
実施例１で調製した、4μlのユビキチン化リゾチーム(図2、レーン3)、300 ngのリゾチーム(図2、レーン1)と1μgのユビキチン(図2、レーン2)をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、精製した上記3種のモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング法で検出した。その結果、抗ユビキチン抗体は、リゾチームには反応せず、遊離のユビキチン並びにユビキチン化リゾチームに反応することが判明した。抗リゾチーム抗体は、遊離のリゾチームとユビキチン化リゾチームに対し反応を示し、遊離のユビキチンには反応を示さなかった。最後に抗ユビキチン鎖抗体は、遊離型ユビキチンとリゾチームには反応を示さず、ユビキチン化リゾチームやユビキチン2量体に反応を示すことが明らかとなった(図２)。以上の結果から、抗ユビキチン鎖抗体はユビキチン鎖を特異的に認識していることが判明した。
【実施例４】
【００６０】
ユビキチン(Ub)とシアン色蛍光タンパク質(ECFP)の融合タンパク質(Ub-ECFP)の構築
ユビキチン化リゾチームに加え、もう１つのモデルユビキチン化タンパク質、ユビキチン化ECFPを調製するため、ユビキチンと蛍光タンパク質ECFPを融合したタンパク質の発現ベクターを構築した。ECFPへのユビキチン化を促進するために、ユビキチンとECFPの間にユビキチン付加領域(Suzuki, T., & Varshavsky, A., EMBO J., 18, 6017-6026 (1999))を挿入した。ユビキチン付加領域は、Ｎ末端のアミノ酸から数えて3番目及び15番目の残基がリジンであること、2番目の残基がリジンでないことが重要な配列関係となる。構築したUb-ECFPタンパク質は、脱ユビキチン化酵素によりＮ末端のユビキチンが切断されると、新たなＮ末端としてリジン残基を露出する。このＮ末端から数えて、3, 8及び15番目に相当するアミノ酸がリジン、その他のアミノ酸がアスパラギンであるようにデザインした(KLKNNNNKNNNNNNK)（配列番号２）。また2番目に相当するアミノ酸は、立体的な障害が少ないようにロイシンとした。更に、ECFPとユビキチン付加領域との間に充分なスペースを確保する目的で、クローニングベクターpBluescript II (KS-) (Stratagene社製)のマルチクローニングサイト由来のアミノ酸17残基(VDGIDKLDIEFLQPGGSMV)（配列番号３）を挿入した。
【００６１】
実際には、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー(以下プライマーと略記)Ub-S (配列番号４)とUb-AS (配列番号５)を用いて、ヒト由来Ub-UBCP80 (I.M.A.G.E clone No. 1928724)をコードするcDNAを鋳型としてPCRを行い、約230塩基対のDNA断片を回収した後、制限酵素KpnIとAflIIで二重消化した。一方、ユビキチン付加領域をコードする合成プライマーInsert-S (配列番号６)とInsert-AS (配列番号７)の両プライマーの5'末端をリン酸化した後、2本鎖DNAを形成させた。該2本鎖DNAと上記DNA断片をKpnIとSalIで二重消化したpBluescriptII (KS-)クローニングベクターに導入した。ユビキチン-ユビキチン付加領域を融合したDNA断片を持つプラスミドを単離、精製し、該プラスミドをNdeIとBamHIで二重消化し、ユビキチン-ユビキチン付加領域融合DNA断片をアガロースゲルより回収した。
【００６２】
ECFPをコードするcDNAをもつベクターpECFP-C1(Clontech社製)を鋳型に、プライマーUb-ECFP-S (配列番号８)とUb-ECFP-AS (配列番号９)でPCRを行い、約720bpのDNA断片を回収した。このDNA断片をBamHIとXhoIで切断し、pET22b発現ベクター(Novagen社製)のBamHIとXhoIサイトに挿入した。増幅したDNA断片のXhoIサイト側は終止コドンを除去し、ECFPのC末端にベクター由来のヒスチジンタグを融合する蛋白質として発現するようデザインした。ECFPが導入された発現ベクターをNdeIとBamHIで二重消化し、両酵素で消化した上記ユビキチン-ユビキチン付加領域融合DNA断片を挿入し、発現ベクターpET22-Ub-ECFPを構築した。該ベクターは、融合タンパク質、ユビキチン-KLKNNNNKNNNNNNKVDGIDKLDIEFLQPGGS（配列番号１０）-蛍光タンパク質(ECFP)-HHHHHH(ヒスチジンタグ)を生産する発現ベクターである(配列番号１１)。pET22-Ub-ECFPを大腸菌BL21(DE3)RIL細胞に形質転換し、Qiagenの説明書に準じてNi-NTA superflow(Qiagen社製)を用いて組換えタンパク質の生産及び精製を行った。精製後のタンパク質は25mM Tris-HCl (pH7.5)/20%グリセロールで透析し、透析後のタンパク質を-20℃で保存した。
【実施例５】
【００６３】
抗ECFPポリクローナル抗体の作製
pECFP-C1ベクター(Clontech社製)をテンプレートとして、プライマーECFP-S (配列番号１２)とECFP-AS (配列番号１３)を用いて、PCRによるDNAの増幅を行った。プライマーはECFPのN末端にヒスチジンタグが融合されるよう設計した。増幅された約750bpのECFPをコードするDNA断片をNcoIとEcoRIで二重消化し、両酵素で消化したpTrc99aベクター(Amersham Biosciences社製)に導入し、pTrc99a-ECFPを構築した (配列番号１４)。次に、該ベクターを大腸菌BL21(DE3)RIL細胞に形質転換しIPTGによる発現誘導を行いNi-NTA Superflow を用いて精製した。精製したタンパク質は25 mM Tris-HCl (pH 7.5)/20%グリセロールで透析し、透析後のタンパク質を-20℃で保存し、抗ECFPポリクローナル抗体作製のための抗原として用いた。
【００６４】
精製したECFPは、常法(Harlow, E., & Lane, D., 1992, Antibodies-a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)に従い、ウサギに免疫し、抗体力価が充分上昇するまで200μgタンパク質を2 週間毎に免疫し、その後全採血を行い血清を回収し-20℃で保存した。この血清を用いたウエスタンブロッティング法によるECFPの検出は、抗血清を10,000倍希釈して使用することが可能な抗体であることが確認された。
【実施例６】
【００６５】
抗ユビキチン鎖抗体の認識特異性
実施例３で作製した、ユビキチン鎖に特異的に反応する抗体について、更にその認識特異性を検証した。図2に示すように、該抗体は、遊離型のユビキチンとリゾチームには反応しないことを確認している。このことは、リゾチームにイソペプチド結合しているユビキチンのC-末端を認識している可能性、あるいはユビキチン同士がイソペプチド結合している結合領域を認識している可能性がある。
【００６６】
更には、ユビキチン鎖における複数のユビキチン分子が構築する立体構造を認識している可能性も否定できない。そこで実施例5で作製したUb-ECFPを用いて、抗体の認識部位の検証を行った。
【００６７】
最初にユビキチン化ECFPを作製した。60μlの1M Tris-HCl (pH 9.0)、10.8μlの300 mM MgCl2、10.8μlの200 mM ATP、6μlの100 mM DTT、6μlの無機ピロホスファーゼ (200 U/μl、酵母由来、Roche社製)、270μlの実施例2で精製した酵素群(E1,E2及びE3)、36μlのUb-ECFP (1.7  mg/ml)、66μlのユビキチン(10mg/ml、ウシ赤血球由来、Sigma社製)を混ぜ合わせ、総容量を600μlになるようmilliQ水を加え、37℃で90分反応を行った。反応終了後、実施例2で作製したユビキチン化リゾチームと同様にユビキチン化ECFPを精製した後-20℃に保存した。
【００６８】
1レーン当たり300ngのUb-ECFP単独あるいは300ngのUb-ECFP に40μgのFraction IIを混合した後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、抗ユビキチン鎖抗体あるいは抗ECFP抗体を用いてウエスタンブロッティング法でタンパク質を検出した(図3A)。また、上記した方法で作製したユビキチン化ECFPを8μlをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し抗ユビキチン鎖抗体あるいは抗ECFP抗体を用いてウエスタンブロッティング法でタンパク質を検出した（図３B）。図3Aに示すように、Ub-ECFPにFraction IIを混ぜ合わせると、Fraction IIに含まれる脱ユビキチン化酵素によりUb-ECFP融合タンパク質はUbとECFPに分解される。
【００６９】
そのため、Fraction IIの有無により抗ECFP抗体が認識するバンドはユビキチンの分子量の差だけ異なって検出される(図3A右)。一方、抗ユビキチン鎖抗体はUb-ECFP融合タンパク質は認識するが、Fraction IIでユビキチンが切断されると検出不能になることが判明した(図3A左)。また、抗ユビキチン鎖抗体はユビキチン化ECFPをユビキチン化リゾチームと同様認識し(図2および3B)、ECFPにユビキチンが1分子以上結合したユビキチン化ECFPを認識することが判明した(図3B)。
【００７０】
以上のことから、抗ユビキチン鎖抗体はユビキチンのC末端領域を含むアミノ酸配列と、そこへ結合しているタンパク質との結合領域を認識していると考えられる。このことは、Ub-ECFPからユビキチンが切断されることで、遊離したユビキチンあるいはECFPをそれぞれ認識できなくなることから判断される。一般的に、抗体が認識するエピトープは通常6〜10アミノ酸であることから、抗ユビキチン鎖抗体は、ユビキチンのC-末端から10残基以内の配列(LHLVLRLRGG（配列番号１５）-COOH)を含む領域を認識すると考えられる。また、ユビキチン化反応は、ユビキチンのC末端グリシンが相手側のタンパク質のリジン残基のε-アミノ基にペプチド結合するので、該抗体は、ユビキチンC末端領域に加え、相手側のタンパク質のリジン残基を含むアミノ酸配列を認識していると考えられる。この時、ユビキチンと結合するタンパク質はユビキチンでもリゾチームでもECFPでも特定されないことから相手側のリジン残基周辺のアミノ酸配列は限定されないと考えられる(図4)。
【００７１】
以上のことから、抗ユビキチン鎖抗体は、ユビキチンC末端領域とタンパク質(ユビキチンを含む不特定タンパク質)との結合領域を認識することから、該抗体を抗ubiquitin-X抗体と命名した。
【実施例７】
【００７２】
脱ユビキチン化酵素の発現ベクターの構築
ユビキチン鎖に対する抗体作製に続き、ユビキチン化タンパク質からユビキチンを切り放す酵素、脱ユビキチン化酵素の発現ベクターを構築した。脱ユビキチン化酵素(UBP1〜16)をコードする遺伝子は、出芽酵母ゲノムDNAを鋳型としてそれぞれのUBPに対応するプライマーを用いてPCRにより各標的遺伝子を増幅した。
また2500塩基対を超える遺伝子については分割して増幅後、制限酵素部位を利用して結合させた。また、構築した16種の発現ベクターは、発現する組換えタンパク質のＣ末端にヒスチジンタグが融合するように設計を行った。
【００７３】
UBP1はプライマーUBP1S(配列番号１６)とUBP1AS(配列番号１７)およびプライマーUBP1S2(配列番号１８)とUBP1AS2(配列番号１９)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された1061塩基対のDNA断片(UBP1 N-末端側)を制限酵素NdeIとHindIIIで二重消化し、1376塩基対のDNA断片(UBP1 C-末端側)を制限酵素HindIIIとXhoIで二重消化した後、制限酵素HindIIIの部位で両DNA断片を連結させ、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP1(配列番号２０)発現ベクターを構築した。
【００７４】
UBP2はプライマーUBP2S(配列番号２１)とUBP2AS(配列番号２２)およびプライマーUBP2S2(配列番号２３)とUBP2AS2(配列番号２４)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された1415塩基対のDNA断片(UBP2 N-末端側)を制限酵素NdeIとBamHIで二重消化し、2401塩基対のDNA断片(UBP2 C-末端側)を制限酵素BamHIとXhoIで二重消化した後、制限酵素BamHIの部位で両DNA断片を連結させ、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP2(配列番号２５)発現ベクターを構築した。
【００７５】
UBP3はプライマーUBP3S(配列番号２６)とUBP3AS(配列番号２７)およびプライマーUBP3S2(配列番号２８)とUBP3AS2(配列番号２９)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された737塩基対のDNA断片(UBP3 N-末端側)を制限酵素NdeIとSacIで二重消化し、1999塩基対のDNA断片(UBP3 C-末端側)を制限酵素SacIとXhoIで二重消化した後、制限酵素SacIの部位で両DNA断片を連結させ、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP3(配列番号３０)発現ベクターを構築した。
【００７６】
UBP4はプライマーUBP4S(配列番号３１)とUBP4AS(配列番号３２)およびプライマーUBP4S2(配列番号３３)とUBP4AS2(配列番号３４)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された2154塩基対のDNA断片(UBP4 N-末端側)を制限酵素NcoIとSalIで二重消化し、624塩基対のDNA断片(UBP4 C-末端側)を制限酵素SalIとXhoIで二重消化した後、制限酵素SalIの部位で両DNA断片を連結させ、pET28a(Novagen社製)の制限酵素NcoIとXhoI部位へ導入しpET28a-UBP4(配列番号３５)発現ベクターを構築した。
【００７７】
UBP5はプライマーUBP5S(配列番号３６)とUBP5AS(配列番号３７)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。得られた2415塩基対のDNA断片を制限酵素NcoIとNotIで二重消化した後、pET28aの制限酵素NcoIとNotI部位へ導入しpET28a-UBP5(配列番号３８)を構築した。
【００７８】
UBP6はプライマーUBP6S(配列番号３９)とUBP6AS(配列番号４０)の組合せでDNAを増幅した。得られた1497塩基対のDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化した後、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP6(配列番号４１)を構築した。
【００７９】
UBP7はプライマーUBP7S(配列番号４２)とUBP7AS(配列番号４３)およびプライマーUBP7S2(配列番号４４)とUBP7AS2(配列番号４５)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された1982塩基対のDNA断片(UBP7 N-末端側)を制限酵素NdeIとEcoRIで二重消化し、1231塩基対のDNA断片(UBP7 C-末端側)を制限酵素EcoRIとNotIで二重消化した後、制限酵素EcoRIの部位で両DNA断片を連結させ、pET22bの制限酵素NdeIとNotI部位へ導入しpET22b-UBP7(配列番号４６)発現ベクターを構築した。
【００８０】
UBP8はプライマーUBP8S(配列番号４７)とUBP8AS(配列番号４８)の組合せでDNAを増幅した。得られた1413塩基対のDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化した後、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP8(配列番号４９)を構築した。
【００８１】
UBP9はプライマーUBP9S(配列番号５０)とUBP9AS(配列番号５１)の組合せでDNAを増幅した。得られた2262塩基対のDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化した後、pET28aの制限酵素NcoIとXhoI部位へ導入しpET28a-UBP9(配列番号５２)を構築した。
【００８２】
UBP10はプライマーUBP10S(配列番号５３)とUBP10AS(配列番号５４)の組合せでDNAを増幅した。得られた2376塩基対のDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化した後、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP10(配列番号５５)を構築した。
【００８３】
UBP11はプライマーUBP11S(配列番号５６)とUBP11AS(配列番号５７)の組合せでDNAを増幅した。得られた2151塩基対のDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化した後、pET28aの制限酵素NcoIとXhoI部位へ導入しpET28a-UBP11(配列番号５８)を構築した。
【００８４】
UBP12はプライマーUBP12S(配列番号５９)とUBP12AS(配列番号６０)およびプライマーUBP12S2(配列番号６１)とUBP12AS2(配列番号６２)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された892塩基対のDNA断片(UBP12 N-末端側)を制限酵素NcoIとNdeIで二重消化し、2870塩基対のDNA断片(UBP12 C-末端側)を制限酵素NdeIとNotIで二重消化した後、制限酵素NdeIの部位で両DNA断片を連結させ、pET28aの制限酵素NcoIとNotI部位へ導入しpET28a-UBP12(配列番号６３)発現ベクターを構築した。
【００８５】
UBP13はプライマーUBP13S(配列番号６４)とUBP13AS(配列番号６５)の組合せでDNAを増幅した。得られた2244塩基対のDNA断片を制限酵素NcoIとXhoIで二重消化した後、pET28aの制限酵素NcoIとXhoI部位へ導入しpET28a-UBP13(配列番号６６)を構築した。
【００８６】
UBP14はプライマーUBP14S(配列番号６７)とUBP14AS(配列番号６８)の組合せでDNAを増幅した。得られた2409塩基対のDNA断片を制限酵素BspHIとXhoIで二重消化した後、pET28aの制限酵素NcoIとXhoI部位へ導入しpET28a-UBP14(配列番号６９)を構築した。
【００８７】
UBP15はプライマーUBP15S(配列番号７０)とUBP15AS(配列番号７１)およびプライマーUBP15S2(配列番号７２)とUBP15AS2(配列番号７３)の組合せでそれぞれDNAを増幅した。増幅された2197塩基対のDNA断片(UBP15 N-末端側)を制限酵素NdeIとHindIIIで二重消化し、1493塩基対のDNA断片(UBP15 C-末端側)を制限酵素HindIIIとXhoIで二重消化した後、制限酵素HindIIIの部位で両DNA断片を連結させ、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP15(配列番号７４)発現ベクターを構築した。
【００８８】
UBP16は合成プライマーUBP16S(配列番号７５)とUBP16AS(配列番号７６)の組合せでDNAを増幅した。得られた1497塩基対のDNA断片を制限酵素NdeIとXhoIで二重消化した後、pET22bの制限酵素NdeIとXhoI部位へ導入しpET22b-UBP16(配列番号７７)を構築した。
【実施例８】
【００８９】
UBPの発現と脱ユビキチン化活性の確認
各発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)RIL細胞に形質転換しLB寒天培地で選択培養を行った後(pET22bを用いた発現ベクターは、アンピシリンとクロラムフェニコール存在下で選択培養、pET28aを用いたベクターは、カナマイシンとクロラムフェニコール存在下で選択培養を行った)、それぞれのUBP発現ベクターを保持する大腸菌を抗生剤を含むLB培地で前培養(37℃、12時間)を行った。発現誘導は、前培養液4 mlを50 mlのLB培地に接種し、抗生剤に加え 2-メルカプトエタノール(終濃度 10 mM)とIPTG(終濃度 0.4 mM)を添加し20℃で24時間培養を行った。培養後、菌体を回収し、600μlのリン酸緩衝液(pH 8.0)/300 mM NaClで懸濁後、リゾチーム及び超音波破砕処理により細胞を破砕し遠心分離により粗抽出液を回収した。回収した粗抽出液は、-20℃で保存すると共に、脱ユビキチン化活性の確認に用いた。
【００９０】
調製した各UBPを含む大腸菌の粗抽出液3.5μlを、実施例２で調製したユビキチン化リゾチーム6μlと0.5μlの20 mM DTTと混合し、30℃で1時間反応させた。
【００９１】
反応液全液をSDSポリアクリルアミド電気泳動により分離後、抗ubiquitin-X抗体を用いたウエスタンブロッティング法でユビキチン化リゾチームを検出した(図5)。その結果、ユビキチン化リゾチームからユビキチンが外されて抗体が認識するバンドの消失が確認されたのは、UBP1, 2, 3, 6, 10, 12, 15であった。一方、UBP4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14, 16では脱ユビキチン化活性をほとんど示さなかった。これら、脱ユビキチン化活性を示さなかったUBPの多くは、組換えタンパク質として大腸菌内に生産されてはいたものの、不溶化タンパク質として回収され、可溶化タンパク質として生産されていないことをが判明した。このことが粗抽出液に活性型の可溶化タンパク質が回収されず脱ユビキチン化活性を確認出来なかった理由と考えられる。
【実施例９】
【００９２】
UBP2, 3, 10, 12各酵素の検討
脱ユビキチン化活性を示したUBPタンパク質の内、活性が高かったタンパク質UBP2, 3, 10, 12について各タンパク質を簡易精製し、タンパク質生産量と脱ユビキチン化反応を確認した。
UBPを実施例８に示す方法に従って発現誘導後、大腸菌粗抽出液を調製した。
【００９３】
該粗抽出液1 mlに対しQiagen社の説明書に準じて平衡化したNi-NTA Superflowを100μl加え、4℃で1時間転倒混和し、タンパク質を担体に結合させた。精製担体を洗浄液で洗浄後、0.1 M EDTA(pH 8.0)を含む洗浄液でUBPタンパク質を溶出させ、溶出液を使用時まで-20℃で保存した。
【００９４】
実施例２で調製したユビキチン化リゾチーム3μl、実施例４で調製したUb-ECFP 7μl (300ng)、または実施例7で調製したユビキチン化ECFP 7μlに対して上記調製したUBP溶出液を0.5μl加え、DTTの終濃度が1 mMになるよう添加した総容量10μlの反応液を35℃で2時間反応させた。反応後、全液をSDSポリアクリルアミド電気泳動により分離後、抗ubiquitin-X抗体を用いたウエスタンブロッティング法で脱ユビキチン反応を確認した(図6A〜図6C)。その結果、図6に示すように4種全てのタンパク質について、ユビキチン化リゾチームとユビキチン化ECFPからの脱ユビキチン化反応が確認された。また全てのUBPが、Ub-ECFP融合タンパク質からUbを切断することが判明した。これらUBPをSDSポリアクリルアミド電気泳動により確認すると、大腸菌内における組換えタンパク質としての生産量がそれぞれ異なっていることが判明した。また、それぞれタンパク質の保存性や活性の安定性等を比較した結果、UBP12が最も優れていると判断された。以上のことから、UBP12を本発明に用いる脱ユビキチン化酵素として選択し以下の実験を行った。
【実施例１０】
【００９５】
UBP12の生産性を高めるための遺伝子改変
実施例８に示す発現誘導法を用いてUBP12を6LのLB培地で発現誘導しNi-NTA superflowを用いて精製を行った。精製後のタンパク質を電気泳動で分離し染色すると、図7Aで示すように精製されてくるタンパク質の内、全長UBP12のタンパク質量は非常に少なく他のバンドが多数確認された。Ni-NTA superflowで精製されてくるタンパク質を電気泳動で分離したことから、バンドのいくつかはヒスチジンタグを持つUBP12由来のバンドであると考え、電気泳動で確認された主要なバンドについてN末端のアミノ酸配列を決定した。
【００９６】
N末端アミノ酸配列の決定は、精製UBP12溶液をSDSポリアクリルアミド電気泳動で分離後、PVDF(polyvinylidene diflouride)膜(Invitrogen社製)に転写し、タンパク質を染色し、プロテインシークエンサーABI 491型を用いてエドマン分解法によるシークエンスを行った。その結果、少なくとも4本のバンドがUBP12由来のものであることが判明した。バンド1は432番目のメチオニンから開始するMQRNA配列が確認された。バンド2は687番目のロイシンから開始するLNNPG配列が確認された。バンド3は871番目のメチオニンから開始するMELTD配列が確認された。そしてバンド4は1163番目のメチオニンから開始するMIECN配列が確認された。
【００９７】
このことからそれぞれのバンドは大腸菌内でタンパク質を合成する際に、合成されたUBP12のmRNAに対して本来タンパク質の翻訳を開始すべき開始コドンからタンパク質を合成するのではなく、途中に存在するメチオニンを開始コドンとして認識し合成開始したか、あるいはUBP12合成終了後に非特異的な分解を受けた可能性が考えられる。実際、4本のバンドの内3本はメチオニンから開始するアミノ酸配列が確認され、またアミノ酸配列領域の塩基配列を確認すると、メチオニンの上流にリボソーム結合配列(RBS)様の塩基配列が確認されるものもあった。以上のことから、確認された4種のバンドについて、それぞれのN末端アミノ酸配列をコードしている遺伝子領域に変異を導入して非特異的に生産されるUBP12が軽減できるか検討を行った。
【００９８】
変異の導入は、インバースPCR法を用い、変異を導入したプライマーをそれぞれ用意して配列番号59に示すpET28a-UBP12発現ベクターを丸ごと増幅する手法を取った。バンド1に対する改変はプライマーinverse1-S(配列番号７８)とinverse1-AS(配列番号７９)を用いてpET28a-UBP12をテンプレートにインバースPCRを行い、432番目のメチオニンをアラニンに改変すると共に、該メチオニン上流にあるRBS様配列をリボソームが結合しないようにそしてアミノ酸置換が起こらないよう改変しpET28a-UBP12-1(配列番号８０)を作製した。バンド2 に対する改変はプライマーinverse2-S(配列番号８１)とinverse2-AS(配列番号８２)を用いてpET28a-UBP12-1をテンプレートにインバースPCRを行い、687番目のロイシンをアラニンに改変しpET28a-UBP12-2(配列番号８３)を作製した。バンド3に対する改変はプライマーinverse3-S(配列番号８４)とinverse3-AS(配列番号８５)を用いてpET28a-UBP12-2をテンプレートにインバースPCRを行い、871番目のメチオニンをアラニンに改変すると共に、該メチオニン上流にあるRBS様配列をリボソームが結合しないようにそしてアミノ酸置換が起こらないよう改変しpET28a-UBP12-3(配列番号８６)を作製した。バンド4に対する改変はプライマーinverse4-S(配列番号８７)とプライマーinverse4-AS(配列番号８８)を用いてpET28a-UBP12-3をテンプレートにインバースPCRを行い、1163番目のメチオニン上流にあるRBS様配列をリボソームが結合しないように、そしてアミノ酸置換が起こらないように改変しpET28a-UBP12-4(配列番号８９)を作製した。それぞれの変異導入は、DNA塩基配列をシークエンサーで確認した。
【００９９】
4回に渡り変異を導入したUBP12発現ベクター(pET28a-UBP12-4)を、BL21(DE3)RIL細胞に形質転換し、発現の誘導を行い、Ni-NTA superflowを用いて精製を行った。精製タンパク質をSDSポリアクリルアミド電気泳動で分離、染色すると、図7Bに示すように、明らかにUBP12の生産量が増えUBP12の中間産物が減ったことが確認できた。また、遺伝子改変によるUBP12の活性に変化は認められないことを確認した。
【実施例１１】
【０１００】
UBP12へヒスチジンタグ(N末端)とFLAGタグ(C末端)の導入
UBP12の遺伝子改変による生産性と精製度は高まったが、まだ非特異的なバンドが確認されることが判明した(図7B)。このことは、まだUBP中間産物が合成されていることを示唆する。そこで、精製されるUBP12が限りなく全長鎖であるようにするために、これまで生産していたUBP12タンパク質に融合していたヒスタグをN末端に移し換え、C末端には新たにFLAGタグ(Brizzard, B. L. et al., BioTechniques, 16, 730-735 (1994))を融合させたUBP12発現ベクターの構築を行った。この発現ベクターより生産されるUBP12は、Ni-NTA superflowとAnti-FLAG M2 agarose (Sigma社製)を用いた2段階のアフィニティ精製が可能になり、UBP12の精製度は格段と高まることが予想された。
【０１０１】
そこでまずpET26(Novagen社製)のNdeIとEcoRI部位の間にヒスチジンタグをコードするリンカーを導入したベクターを構築した。プライマーlinker-S(配列番号９０)とlinker-AS(配列番号９１)を等モル量混ぜ合わせ70℃10分間熱変性させた後、変性プライマー混合液を1時間かけて室温へ戻すことで両プライマーのアニーリングを誘導し、リンカーを調製した。該リンカーをpET26のNdeIとEcoRI部位に挿入することで、NdeI部位に続いてヒスチジン6残基をコードする塩基とNcoI部位が挿入されたpET26M(配列番号９２)を構築した。
【０１０２】
次に、プライマーFLAG-S(配列番号９３)とFLAG-AS(配列番号９４)を用いてpET28a-UBP12-4をテンプレートにPCRを行い2.9kbのUBP12断片を増幅し、得られたDNA断片をNdeIとNotIで二重消化した。引き続き、pET28a-UBP12-4をNcoIとNdeIで消化し約900bpのUBP12のN末端領域をコードするDNA断片を精製した。調製した2本のDNA断片をNdeI部位同士で連結させNcoIとNotIで二重消化したpET26Mへ挿入しpET26M-UBP12-FLAG(配列番号９５)を構築した。該発現ベクターから生産されるUBP12は、N末端にヒスチジンタグが、そしてC末にFLAGタグ(DYKDDDDK)（配列番号９６）が融合したタンパク質として生産される。
【実施例１２】
【０１０３】
UBP12-FLAGの発現と精製
pET26M-UBP12-FLAG(配列番号９５)をBL21(DE3)RIL細胞に形質転換し、実施例８で記載したUBPタンパク質生産条件と同様にUBP12-FLAGを発現・生産した。6LのLB培地を用いてUBP12-FLAGを発現誘導した大腸菌を回収し、Qiagenの説明書に従ってNi-NTA superflowにUBP12-FLAGを吸着、洗浄を行った。洗浄後、150 mM imidazoleによりUBP12-FLAGを一括溶出した。溶出した該タンパク質を、50mM Tris-HCl (pH 7.5)/150 mM NaClにて透析後、Sigma社の説明書に従ってAnti-FLAG M2 agaroseを用いてUBP12-FLAGを精製した。Anti-FLAG M2 agaroseへ結合したUBP12-FLAGタンパク質をFLAGペプチド(DYKDDDDK)で溶出した後、該タンパク質を25mM Tris-HCl (pH 7.5)/0.5 mM DTT/20 %グリセロールで透析し、透析後のタンパク質溶液を-20℃で保存した。精製タンパク質をSDSポリアクリルアミド電気泳動で確認すると、図7Cに示すように非特異的なバンドが少ない精製度の高いUBP12-FLAGタンパク質が回収された。
【実施例１３】
【０１０４】
抗ubiquitin-X抗体セファロースの作製
ユビキチン化リゾチームを濃縮・回収した後に、脱ユビキチン化酵素で、リゾチームを遊離させる実験を行うために、ユビキチン化リゾチームを濃縮・回収するための抗ubiquitin-X抗体をセファロースビーズに架橋したアフィニティ精製担体を以下のように作製した。
【０１０５】
Activated CH-Sepharose(Amersham Biosciences社製)を説明書に従い1 mM塩酸溶液にて膨潤、活性化した後、200μlのセファロースに対してカップリングバッファー(1M重炭酸ナトリウム溶液、pH 8.0)で透析した実施例4で作製した抗ubiquitin-X抗体を588μl (3.4 mg/ml)加え、室温で2時間転倒混和し抗体をセファロースに結合させた。セファロースからカップリングバッファーで過剰の抗体を洗い流し、残りの活性基を500μlの1Mエタノールアミンで1時間転倒混和しブロッキングした。その後、100 mM酢酸緩衝液(pH 4.0) / 500 mM塩化ナトリウムと100 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 500 mM 塩化ナトリウムで4回交互に洗浄した。洗浄後のセファロースを25 mM Tris-HCl (pH 7.5)に懸濁し4 度で保存した。
【実施例１４】
【０１０６】
ユビキチン化リゾチームの濃縮・回収およびリゾチームの遊離実験
実施例１３で作製した抗ubiquitin-X抗体セファロースを20μlに実施例２で作製したユビキチン化リゾチームを50μl加え、室温で2時間転倒混和しユビキチン化リゾチームを抗体に吸着させた。吸着後PBS緩衝液でセファロースを洗浄し非吸着ユビキチン化リゾチームを取り除き、セファロースを2 等分し(10μlずつ)、2 mM DTTを2μl、25 mM Tris-HCl (pH 8.0)を43μlずつ添加した。該セファロース溶液の一方には実施例１２で調製したUBP12-FLAG溶液を5μl (200ng)加え、もう一方には25 mM Tris-HCl (pH 8.0)を5μl加え35℃で2時間反応させた。反応後、セファロースを遠心分離により沈殿させ上清を回収した。
【０１０７】
ユビキチン化タンパク質を抗ubiquitin-X抗体セファロースと混合する前の試料(30μl)(図8、レーン1)、セファロースと転倒混和後の非吸着分画(30μl) (図8、レーン2)、セファロース洗浄後にUBP添加(図8、レーン4)あるいは未添加(図8、レーン3)で脱ユビキチン化反応させた反応液(30μl)をSDSポリアクリルアミド電気泳動で分離後、実施例３で作製した抗リゾチーム抗体を用いてウエスタンブロッティング法で解析した。その結果、ユビキチン化リゾチームを抗ubiquitin-X抗体セファロースに混ぜることでユビキチン化リゾチームがほぼ全てセファロースに結合し、遊離型リゾチームだけが結合せず残っていることが判明した(図8、レーン2)。ユビキチン化リゾチームが結合したセファロースは、緩衝液を加えただけではリゾチームが遊離せず(図8、レーン3)、UBP12-FLAGを添加することで初めてリゾチームが遊離してくることが判明した(図8、レーン4)。このとき観察されるリゾチームは、ユビキチンが1分子以上結合したリゾチームとしてではなく、ユビキチンが全て外れたリゾチームとして遊離されることが判明した。以上のことから、抗ubiquitin-X抗体セファロースを用いることでユビキチン化リゾチームを濃縮・回収できることが確認された。そしてユビキチン化リゾチームが結合したセファロースにUBP12-FLAGタンパク質を加えることで、脱ユビキチン化反応が起こり、ユビキチンを結合していないリゾチームを遊離することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明のモノクローナル抗体および脱ユビキチン化酵素を用いることにより、簡単な操作で生体中のユビキチン化を受けるタンパク質を単離・回収することができ、生体内のユビキチン化タンパク質を網羅的に解析することが可能である。この結果、真核細胞内におけるユビキチン依存性タンパク質分解経路によって分解されるタンパク質群を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ユビキチン化リゾチームの電気泳動の結果を示す図である。ユビキチン化リゾチームの反応開始後、30分おきに一部を回収し、それぞれ15μlをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。タンパク質はクーマーシーブリリアントブルーにより染色した。
【図２】調製したモノクローナル抗体群の認識特異性を示す図である。レーン1に300 ngのリゾチーム、レーン2に1μgのユビキチン、レーン3に実施例3で調製したユビキチン化リゾチーム4μlをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離後、実施例4で調製した抗ユビキチン抗体、抗リゾチーム抗体そして抗ubiquitin-X抗体を用いてウエスタンブロッティング法でタンパク質を検出した。
【図３Ａ】Ub-ECFPに対する抗ubiquitin-X抗体の特異性を示す図である。精製Ub-ECFPに調製したFraction II添加の有無により、Ub-ECFPからUbが切断され、それに伴い抗ubiquitin-X抗体はUb-ECFPを認識できなくなることがわかる。
【図３Ｂ】Ub-ECFPを用いて調製したユビキチン化ECFPに対する抗ubiquitin-X抗体の認識特異性を示す図である。抗ubiquitin-X抗体はユビキチン化されたECFPのみを認識する。
【図４】抗ubiquitin-X抗体認識部位の模式図を示す図である。抗ubiquitin-X抗体はユビキチンC末端と結合するタンパク質のリジン残基を含む、結合領域を認識する。このとき、ユビキチン-ユビキチン間あるいはユビキチン-タンパク質間のイソペプチド結合、並びにユビキチンとタンパク質の融合領域も同様に認識する。
【図５】酵母由来脱ユビキチン化酵素の活性測定の結果を示す図である。酵母由来の16種類のUBPを組換えタンパク質として大腸菌内で生産し、該大腸菌細胞の粗抽出分画をユビキチン化リゾチームと反応させた後電気泳動に供した。電気泳動後に抗ubiquitin-X抗体で脱ユビキチン化反応を確認した。各レーンの内、(-)で表示したものは、UBPを発現していない大腸菌から調製した粗抽出分画を示す。ラダーが消失しているレーンはユビキチン化リゾチームから脱ユビキチン化が起こっていることを示す。
【図６Ａ】ユビキチン化ECFPを用いてのUBP2, UBP3, UBP10, UBP12の比較を示す図である。UBP2, UBP3, UBP10, UBP12を大腸菌で発現後、簡易精製しユビキチン化ECFPに対して脱ユビキチン化活性を調べた。反応後のタンパク質を電気泳動で分離し、抗ubiquitin-Xを用いたウエスタンブロッティング法にて脱ユビキチンの程度を比較した。
【図６Ｂ】ユビキチン化リゾチームを用いてのUBP2, UBP3, UBP10, UBP12の比較を示す図である。UBP2, UBP3, UBP10, UBP12を大腸菌で発現後、簡易精製しユビキチン化リゾチームに対して脱ユビキチン化活性を調べた。反応後のタンパク質を電気泳動で分離し、抗ubiquitin-Xを用いたウエスタンブロッティング法にて脱ユビキチンの程度を比較した。
【図６Ｃ】Ub-ECFP融合タンパク質を用いてのUb-ECFP融合タンパク質UBP2, UBP3, UBP10, UBP12の比較を示す図である。UBP2, UBP3, UBP10, UBP12を大腸菌で発現後、簡易精製しUb-ECFP融合タンパク質に対して脱ユビキチン化活性を調べた。反応後のタンパク質を電気泳動で分離し、抗ubiquitin-Xを用いたウエスタンブロッティング法にて脱ユビキチンの程度を比較した。
【図７Ａ】野生型UBP12遺伝子を発現させ精製した組換えUBP12の電気泳動パターンを示す図である。
【図７Ｂ】UBP12遺伝子に変異導入後のUBP12の電気泳動パターンを示す図である。
【図７Ｃ】UBP12-FLAGの精製タンパク質の電気泳動パターンを示す図である。
【図８】ユビキチン化リゾチームからリゾチームの回収の結果を示す図である。ユビキチン化タンパク質を抗ubiquitin-X抗体セファロースと混合する前の試料(30μl)(レーン1)、セファロースと転倒混和後の非吸着分画(30μl) )(レーン2)、セファロース洗浄後にUBP添加)(レーン4)あるいは未添加)(レーン3)で脱ユビキチン反応させた反応液(30μl) )をSDSポリアクリルアミド電気泳動で分離後、実施例4で作製した抗リゾチーム抗体を用いてウエスタンブロッティング法で解析した。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号２，３、１０、１５：合成ペプチド
配列番号４〜９、１２〜１３、１６〜１９、２１〜２４、２６〜２９、３１〜３４、３６、３７、３９、４０、４２〜４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、５６、５７、５９〜６２、６４、６５、６７、６８、７０〜７３、７５、７６、７８、７９、８１、８２、８４、８５、８７、８８、９０、９１、９３、９４：合成DNA
配列番号１１：pET22b-Ub-ECFPのUb-ECFPタンパク質コード領域
配列番号１４：pTrc99a-ECFPのECFPコード領域
配列番号２０：pET22b-UBP1のUBP1コード領域
配列番号２５：pET22b-UBP2のUBP2コード領域
配列番号３０：pET22b-UBP3のUBP3コード領域
配列番号３５：pET28a-UBP4のUBP4コード領域
配列番号３８：pET28a-UBP5のUBP5コード領域
配列番号４１：pET22b-UBP6のUBP6コード領域
配列番号４６：pET22b-UBP7のUBP7コード領域
配列番号４９：pET22b-UBP8のUBP8コード領域
配列番号５２：pET28a-UBP9のUBP9コード領域
配列番号５５：pET22b-UBP10のUBP10コード領域
配列番号５８：pET28a-UBP11のUBP11コード領域
配列番号６３：pET28a-UBP12のUBP12コード領域
配列番号６６：pET28a-UBP13のUBP13コード領域
配列番号６９：pET28a-UBP14のUBP14コード領域
配列番号７４：pET22b-UBP15のUBP15コード領域
配列番号７７：pET22b-UBP16のUBP16コード領域
配列番号８０：pET28a-UBP12-1のUBP12-1コード領域
配列番号８３：pET28a-UBP12-2のUBP12-2コード領域
配列番号８６：pET28a-UBP12-3のUBP12-3コード領域
配列番号８９：pET28a-UBP12-4のUBP12-4コード領域
配列番号９２：pET26Mの全領域
配列番号９５：pET26M-UBP12-FLAGのUBP12-FLAGコード領域
【図１】
2005006637.tif 000002
【図２】
2005006637.tif 000003
【図３Ａ】
2005006637.tif 000004
【図３Ｂ】
2005006637.tif 000005
【図４】
2005006637.tif 000006
【図５】
2005006637.tif 000007
【図６Ａ】
2005006637.tif 000008
【図６Ｂ】
2005006637.tif 000009
【図６Ｃ】
2005006637.tif 000010
【図７Ａ】
2005006637.tif 000011
【図７Ｂ】
2005006637.tif 000012
【図７Ｃ】
2005006637.tif 000013
【図８】
2005006637.tif 000014
【配列表】
2005006637000001.app