(57)【要約】【課題】本発明の課題は、海水等の高塩分環境において、環境ホルモンを効率的に分解する方法を提供することである。【解決手段】環境ホルモン分解能を有する海洋性微生物を用いることにより高塩分環境における環境ホルモンを分解する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境ホルモン分解能を有する海洋性微生物を用いることにより高塩分環境における環境ホルモンを分解する方法。
【請求項２】
環境ホルモンがフェノール系化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
海洋性微生物がアルファプロテオバクテリウム属に属する微生物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
アルファプロテオバクテリウム属に属する微生物がアルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境ホルモンを分解する方法及び環境ホルモン分解能を有する海洋性微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
工業技術の発達、社会活動の多様化により事業場から排出される廃棄物の量は近年増大し、さらに複雑多様化している。結果として、河川、湖沼、海域をはじめ廃棄物埋め立て地浸出水等に含有される、難分解性かつ生体毒性及び生物濃縮性を有する微量物質の存在が大きな問題となってきている。
【０００３】
例えば、合成洗剤、塗料、化粧品、プラスチック可塑剤等に含まれる化学物質のなかで、ビスフェノールＡ（２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン：ＢＰＡ）などのビスフェノールや、ブチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノールなどのアルキルフェノールは、ごく微量で生体内のホルモンの分泌を撹乱させることが知られている。このような化合物は、一般に環境ホルモンと言われている（内分泌撹乱化学物質とも称される）。
【０００４】
アルキルフェノールは主に、プラスチック重合の際の好酸化剤、可塑剤及び界面活性剤（アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）の形で）として用いられている。世界中で約７０万トン／年、日本でも約４万トン／年が生産されている。アルキルフェノールは、エストロゲン様活性を持つと言われており、環境省のリストではこのうちノニルフェノールと４−オクチルフェノールが環境汚染物質として挙げられている。また、アメリカにおいてＡＰＥはノニオン系界面活性剤の２５％を閉め、主に、線維、ゴム、塗料などの工業分野の洗浄剤、乳化剤、農薬の乳化剤などに広く使用されている。アルキル基がオクチル（ｎ＝８）、ノニル（ｎ＝９）であるＡＰＥは、避妊製品（マイルーラ等）にも用いられている。ＡＰＥが微生物などにより分解されて生成するアルキルフェノールは生体残留性が高く、生物の脂質中に蓄積するため、イギリスの河川における魚の生殖異変の原因物質とみなされている。
【０００５】
環境ホルモンの脅威は、生物の存在を危うくする生殖や発育への深刻な影響であり、メスでは性成熟の遅れ、生殖可能齢の短縮、妊娠維持困難及び流産などが、オスでは、精巣萎縮、精子減少、性行動の異常などが報告されている。
【０００６】
環境ホルモンを分解する方法として、汚染された土壌を回収して加熱処理により分解する方法（特許文献１参照）、汚染された土壌を微生物で浄化する方法（特許文献２参照）、汚染された土壌で植物を栽培して植物に環境ホルモンを吸収させその植物を焼却する方法（特許文献３参照）などが提案されているが、これらの方法は、いずれも陸水系（淡水系）の微生物や植物が生育できる環境でしか浄化できないといった問題点があった。従来、海水等の高塩分環境中の環境ホルモンを効率的に処理する方法は存在しなかったことから、このような特殊環境における環境ホルモンの効率的処理方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特開平９−１９２６４１号
【特許文献２】
特開平９−２２５４５０号
【特許文献３】
特開平１１−３３３４４２号
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、海水等の高塩分環境において、環境ホルモンを効率的に分解、浄化する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、海洋性微生物を用いることによって、高塩分環境下における環境ホルモンを効率的に分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）環境ホルモン分解能を有する海洋性微生物を用いることにより高塩分環境における環境ホルモンを分解する方法。
（２）環境ホルモンがフェノール系化合物である（１）に記載の方法。
（３）海洋性微生物がアルファプロテオバクテリウム属に属する微生物である（１）又は（２）に記載の方法。
（４）アルファプロテオバクテリウム属に属する微生物がアルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株である（３）に記載の方法。
（５）アルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、環境ホルモンで汚染された塩分の高い土壌、水域又は廃水環境等に海洋性微生物を供給することにより、環境ホルモンを効率的に浄化する方法である。
【００１２】
本発明において環境ホルモンとは、生体の恒常性、生殖、発生又は行動に関与する種々の生体内ホルモンの合成、貯蔵、分泌、体内輸送、結合、そしてそのホルモン作用そのもの又はそのクリアランスなどの諸過程を阻害する性質を持つ外来性の物質を意味する。当技術分野においては、内分泌撹乱化学物質とも称される。
【００１３】
本発明の海洋性微生物によって分解できる環境ホルモンとしては、特に限定されないが、フェノール系化合物、ダイオキシン類（例えば、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，７，８，９−ヘキサクロロジベンゾフラン、２，３，４，６，７，８−ヘキサクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾフランなど）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ：例えば、３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル及び３，３’，４，４’，５，５’−ヘキサクロロビフェニルなど）、フタル酸エステル（例えば、ジブチルフタレート、ブチルベンジルフタレート及びジ−２−エチルヘキシルフタレートなど）、クロルピリホス、クロロフェノタン（ＤＤＴ）、ベンゾフェノン、ダイアジノン、フェニトロチオン（ＭＥＰ）、フェンチオン（ＭＰＰ）、ＥＰＮ（フェニルチオホスホン酸Ｏ−エチル−Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）等が挙げられる。
【００１４】
本発明の海洋性微生物は、上記環境ホルモンのうちフェノール系化合物の分解に好適に用いられる。本発明においてフェノール系化合物とは、フェニル基の水素原子をヒドロキシ基で置換したヒドロキシフェニル基を少なくとも１個有する化合物及びその誘導体を意味する。誘導体には、ベンゼン環の水素原子が炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のエーテル基及びハロゲンから選ばれる１〜５個の置換基で置換されたヒドロキシフェニル基を有する化合物、フェノールのアルキルエーテル部分（例えば、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、プロポキシフェニル基など）を有する化合物などが含まれる。フェノール系化合物としては、具体的には、ビスフェノール、ハロゲン化フェノール、アルキルフェノール及びこれらの上記誘導体が挙げられる。
【００１５】
ビスフェノールとは、ヒドロキシフェニル基が、好ましくはそれぞれパラ位で、２価の基を介して結合した化合物を意味する。ここで２価の基としては、スルホニル基、スルフィニル基、２価の有機基、例えば、炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキレン基、炭素数３〜６の２価の脂環式炭化水素基、フェニレン基、フェニレンジアルキリデン（オルト、メタ、パラ）等が挙げられる。これらの２価の有機基は、ハロゲン及びフェニル基等で置換されていてもよい。ビスフェノールとしては、具体的には、ビスフェノールＡ（２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン）、ビスフェノールＦ（ビス（４−ヒドロキシフェニル）メタン）、ビスフェノールＡＦ（２，２’−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ヘキサフルオロプロパン）、ビスフェノールＳ（４，４’−ジヒドロキシジフェニルスルホン）、ビスフェノールＭ（４，４’−（１，３−フェニレンジイソプロピリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＥ（４，４’−エチリデンビスフェノール）、ビスフェノールＰ（４，４’−（１，４−フェニレンジイソプロピリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＡＰ（４，４’−（１−フェニルエチリデン）ビスフェノール）、ビスフェノールＺ（４，４’−シクロヘキシリデンビスフェノール）等が挙げられる。本発明の海洋性微生物が、特に効果的に分解可能なビスフェノールは、ビスフェノールＡ、ビスフェノールＡＦ、ビスフェノールＦ、ビスフェノールＳである。
【００１６】
本発明においてハロゲン化フェノールは、フェノールの水素原子が１個以上のハロゲン（例えば、フッ素、塩素及び臭素、好ましくは塩素）で置換されたフェノールを意味し、本発明の海洋性微生物が特に効果的に分解可能なハロゲン化フェノール誘導体としては、ペンタクロロフェノール（ＰＣＰ）、クロロフェノール、ジクロロフェノール等が挙げられ、ハロゲン化フェノール誘導体としては、ブロモフェノールブルー、ブロモフェノールレッド等が挙げられる。
【００１７】
本発明の海洋性微生物は、アルキルフェノールを特に効果的に分解する能力を有する。本発明においてアルキルフェノールとは、フェノールのベンゼン環に結合した水素原子が１〜５個のアルキル基で置換された化合物を意味する。本発明の海洋性微生物は、炭素数１〜９、好ましくは炭素数４〜９の直鎖状又は分枝状のアルキル基を有するアルキルフェノールの分解に好適に用いられる。本発明の海洋性微生物は、上記アルキルフェノールが炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のエーテル基及びハロゲンから選ばれる１〜４個の置換基で更に置換されたアルキルフェノール誘導体の分解にも好適に用いられる。好適なアルキルフェノールとしては、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、イソペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）等が挙げられ、アルキルフェノール誘導体としては、３−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等が挙げられる。これらアルキルフェノールは、アルキル基がヒドロキシ基に対してオルト、メタ又はパラ位にあるいずれの異性体についても本発明の方法を適用できる。本発明の海洋性微生物は、とりわけ、ノニルフェノール（ｏ−ノニルフェノール、ｍ−ノニルフェノール及びｐ−ノニルフェノール、特にｐ−ノニルフェノール）を効果的に分解する能力を有する。ノニルフェノール（Ｃ９Ｈ１９・Ｃ６Ｈ４ＯＨ）の化学構造式は以下の通りである。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
工場から廃水された界面活性剤であるアルキルフェノールエトキシレート等は、河川から海へ流入する過程で、微生物による分解を受けてノニルフェノール等のアルキルフェノールになり、沿岸海域を汚染している。本発明の海洋性微生物は、上記アルキルフェノールのアルキルエーテル、例えば、アルキルフェノールメトキシレート、アルキルフェノールエトキシレート及びアルキルフェノールプロポキシレートの分解にも好適である。
【００２０】
本発明において海洋性微生物とは、海水のような高塩分環境においても生存可能な微生物を意味する。本発明の海洋性微生物は、高塩分環境においても、環境ホルモン分解能を有する微生物である。本発明において、高塩分環境とは、塩が高濃度で存在する環境を意味し、例えば、海水、汽水域、塩湖、塩分集積地等が挙げられる。本発明における海洋性微生物は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＣａＣＯ３、ＭｇＢｒ２、ＣａＣｌ２、ＮａＦ、ＫＣｌ、ＫＩ、ＮａＢｒ、Ｈ３ＢＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３等の塩が高濃度で存在する環境、すなわち、これらの塩が合計で１質量％以上の濃度、好ましくは２．５質量％以上の濃度、より好ましくは３〜４質量％の濃度で存在する環境において、生育可能であるとともに、該環境において環境ホルモン分解能を有する。
【００２１】
そして、本発明における海洋性微生物は、ｐ−ノニルフェノールを５ｍｇ／５０ｍＬの濃度で含む海水培地に接種して、３０℃で２週間振盪培養を行った場合に、上記海水培地に微生物を添加せずに３０℃で２週間振盪させた対照における結果に基づいて、ｐ−ノニルフェノールを、７０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、より好ましくは４０〜６０質量％で分解する能力を有する。
【００２２】
本発明の海洋性微生物としては、具体的には、アルファプロテオバクテリウム（Ａｌｐｈａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アーソロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はラブリュス（Ｌａｂｒｙｓ）属に属する微生物が挙げられ、アルファプロテオバクテリウム属に属する微生物が好ましい。本発明においては、これらを単独で使用してもよく、複数種を組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
これらの微生物としては、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、それぞれ以下のかっこ内に示した受託番号で寄託された保存株を使用することができ、いずれも容易に入手可能である：アルファプロテオバクテリウム（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３４０）、シュードモナス（ＡＴＣＣ  １４２、ＡＴＣＣ  ７７００、ＡＴＣＣ  ８７０７、ＡＴＣＣ  ９０２７、ＡＴＣＣ  １５５２２など）、アルカリゲネス（ＡＴＣＣ  ８７５０、ＡＴＣＣ  １５１７３、ＡＴＣＣ  １７６７９、ＡＴＣＣ  ２９７１２など）、ロドコッカス（ＡＴＣＣ  ２７１、ＡＴＣＣ  １３８０８、ＡＴＣＣ  ２５７１４など）、マイクロコッカス（ＡＴＣＣ  １８６、ＡＴＣＣ  ４６９８、ＡＴＣＣ  ２７５６６など）、アシネトバクター（ＡＴＣＣ  １７９０６、ＡＴＣＣ  １７９０８、ＡＴＣＣ  １９６０６、ＡＴＣＣ  ２３０５５など）、バチルス（ＡＴＣＣ  ６６３３、ＡＴＣＣ  １０７９２、ＡＴＣＣ  １４５７７、ＡＴＣＣ  ４３８９７など）、アーソロバクター（ＡＴＣＣ  ８０１０、ＡＴＣＣ  １１６２４、ＡＴＣＣ  １３３４７、ＡＴＣＣ  １５５９０など）、オクロバクトラム（ＡＴＣＣ  ４９１８７、ＡＴＣＣ  ４９１８８、ＡＴＣＣ  ４９２３７など）、アグロバクテリウム（ＡＴＣＣ  １１３２５、ＡＴＣＣ  １９３５８、ＡＴＣＣ  ２３３０８、ＡＴＣＣ  ２５６５１など）、又はラブリュス（ＡＴＣＣ  ４３９３２など）。
【００２４】
本発明者らは、高塩分環境において環境ホルモンを分解する海洋性微生物としてアルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株を単離した。本菌株は、２００３年５月９日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１    中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３４０として寄託されている。
【００２５】
このアルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株の菌学的性質は以下の通りである。
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Ｍａｒｉｎｅ  ａｇａｒ等の海水を添加した培地で良好に増殖し、植菌後２〜３日でコロニーを形成する。
【００２６】
本発明の方法では、環境ホルモンで汚染された環境に上記のような海洋性微生物を添加して培養することにより環境ホルモンを分解することができる。海等の高塩分環境に海洋性微生物を直接散布してもよく、培養液中の分解酵素液を直接散布してもよい。分解酵素液は菌体を除去したものでもよい。あるいは、高塩分環境にある海水や廃水を汲み上げ、これに海洋性微生物を添加して培養してもよい。
【００２７】
培養は好気的又は嫌気的条件、好ましくは好気的条件下で行う。好気培養は、通常の中温菌の培養に準じ、振盪培養により行えばよい。培養液のｐＨは５〜８．５であり、さらに好ましくは６．５〜７．５である。
【００２８】
培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３０℃である。培養を継続する時間は、微生物の種類にもよるが、通常は２〜１４日間、好ましくは４〜７日間程度である。
【００２９】
培養においては、栄養塩、水及び空気を適用することにより、微生物が増殖し、効率的に環境ホルモンを分解することができる。栄養塩とは、生物が正常の生活を営むのに必要な塩類を意味する。本発明の方法において使用できる栄養塩としては、特に限定されないが、クエン酸第二鉄、塩化アンモニウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３０】
培地には、さらに必要に応じて各種の炭素源又は窒素源を添加する。炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、サッカロース、グルセリン、スターチ、糖蜜、廃糖蜜、マルツエキス等が挙げられる。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、グルテンミール、大豆粉、乾燥酵母、酵母エキス、硫酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム塩、尿素、Ｌ−アスパラギン等が挙げられる。その他、必要に応じて、ナトリウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩、カルシウム塩、リン酸塩等の無機塩類や、イノシトール、ビタミンＢ１塩酸塩、ビオチン等のビタミン類を添加してもよい。
【００３１】
本発明の方法の一態様においては、汚染された海水等を汲み上げ、予め環境ホルモンの吸着・濃縮を行った後で、海洋性微生物を添加して環境ホルモンの分解を行ってもよい。環境ホルモンを分解する前に、予め吸着・濃縮等を行うことにより、さらに効率的に分解を行うことができる。
【００３２】
吸着剤としては、特に限定されないが、アルミナ、イオン交換樹脂、活性炭、シリカ、木片、炭、木炭、活性白土、ゼオライト、アルカリ土類金属が挙げられ、特に活性炭が好ましい。次に、濃縮した環境ホルモンに、海洋性微生物ならびに栄養塩、水分及び空気等を添加し、微生物を増殖させて効率よく分解する。
【００３３】
本発明において、吸着剤による吸着を行う場合、吸着方法としては、汚染水を吸着剤充填カラムに通す方法、又は汚染された地中に吸着剤からなる隔壁を埋設する方法などがある（特開２００１−０１７９９１）。
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
以下に、アルファプロテオバクテリウム属に属する海洋性微生物を用いて海水中のノニルフェノールを処理した場合の結果を示す。
【００３５】
ノニルフェノールを含有する海水培地で生育可能なアルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３４０）のノニルフェノール分解能を調べた。ノニルフェノールとして、ｐ−ノニルフェノール（５ｍｇ／５０ｍＬ）を含む海水培地に、アルファプロテオバクテリウム属ｓｐ．ＭＫＮＰ−００４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３４０）を接種し、３０℃で２週間振盪培養を行った。この試料（試料Ｂ）について、ノニルフェノール残存量を測定した。なお、対照として、上記と同様のノニルフェノールを含む海水培地に、上記菌株を接種せずに３０℃で２週間振盪した試料（試料Ａ）についても、ノニルフェノール残存量を測定した。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2005000118.tif 000004
【００３７】
表１から、試料Ｂにおけるノニルフェノールの実質分解率は、４５質量％と算出できる。これは以下の式に基づく。
実質分解率
＝（１−試料Ａにおける残存質量／試料Ｂにおける残存質量）×１００
すなわち、海洋性微生物とともに培養した海水については、ノニルフェノールが効果的に分解されていることがわかる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によって、高塩分環境において環境ホルモンを効率的に分解することが可能になり、有用な環境浄化方法として期待できる。