(57)【要約】【課題】コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）ＣＪＰＶ  ９７５６５２及びそれを利用したプラバスタチンの製造法を提供する。【解決手段】コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）および、コンパクチンを含む培地でストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を培養して、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を利用したプラバスタチンの製造法。これにより、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換でき、またプラバスタチンを高効率で製造できる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）。
【請求項２】
コンパクチンを含む培地でストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を培養し、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を利用したプラバスタチンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できる新規のストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）及びそれを利用したプラバスタチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）とコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）とは高脂血症に対する治療効果を有する物質である。高脂血症は先進国で心血管係疾患のうち主要死亡原因となっている動脈硬化症及び冠状動脈症の重要な原因となる。高脂血症とは、血しょう内の脂質−コレステロール、中性脂肪の濃度が脂蛋白質の代謝異常に正常範囲を超えて増加した状態を意味する。身体のコレステロールは６０％以上が体内で生合成によって得られる。コレステロールの生合成過程には２５個以上の酵素が関するが、それら酵素のうち３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡ還元酵素が主要速度制限段階の酵素である。したがって、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の作用を選択的に阻害することによって、かかる疾病を効果的に治療できる。コンパクチン及びプラバスタチンはこのようなＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の競争的な抑制剤であって、そのうち一つが存在すれば、コレステロール生合成を抑制できる。例えば、プラバスタチンを一日５ｍｇ〜１０ｍｇずつ約３ケ月服用すれば、総コレステロール値と体に悪いＬＤＬ−コレステロール値とが２０％ないし４０％減少すると知られている。前記プラバスタチンは、例えば、コンパクチンを微生物によって水酸化させて製造され、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素に対する抑制剤としてコンパクチンより効果的である。
【０００３】
現在公知の高脂血症治療剤のうちＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を抑制する医薬品のうち、合成医薬品としてはシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）及びアトルバスタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）などがある。また、微生物の醗酵によって生産されうる医薬品にはロバスタチンとプラバスタチンとが代表的である。前記プラバスタチンは前駆体であるコンパクチンの水酸化によって生合成される薬物であって、１９８０年代初めに開発された以降、その効能および安全性が立証されて活発に高脂血症患者に使用されてきた。
【０００４】
コンパクチンはアクチノミセテス群のノカルディア属；マドゥロミセテス群のアクチノミュドラ属；及びストレプトミセテス群のその他の種のうちストレプトミセスロセオクロモゲネス属及びストレプトミセスカルボフィルス属の細菌及び多様な真菌属を使用した微生物的水酸化によりプラバスタチンに転換できると報告されたことがある（例えば、特許文献１ないし５参照）。
【０００５】
しかし、依然として醗酵液から高濃度及び高収率でプラバスタチンを生産できる微生物及びプラバスタチンの改善された微生物学的製造法が要求されている。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，１７９，０１３号公報
【特許文献２】
米国特許第４，４４８，９７９号公報
【特許文献３】
米国特許第４，３４６，２２７号公報
【特許文献４】
米国特許第４，５３７，８５９号公報
【特許文献５】
日本国特許第５８−１０５７３号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、コンパクチンをプラバスタチンに高効率に転換できる新規なストレプトミセス菌株を提供することである。
【０００８】
また、本発明の目的は、前記新規のストレプトミセス菌株を利用してコンパクチンをプラバスタチンに転換する段階を含むプラバスタチンの製造法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明はコンパクチンをプラバスタチンに転換できるストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を提供する。前記菌株は培養液中でコンパクチンをプラバスタチンに高収率に転換できる。
【００１０】
また、本発明はコンパクチンを含む培地でストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を培養し、その培養物からプラバスタチンを回収する段階を含むストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を利用したプラバスタチンの製造法を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明において、「コンパクチン」とは、メバスタチンと知されたラクトン構造を有する形態、酸形態及びその塩形態いずれも含むものであって、それらの構造は次の化学式１ないし３と同一である。図３は、塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【００１２】
また、本発明において、「プラバスタチン」とは、前記コンパクチンの６β位置で水酸化された化合物をいい、ラクトン、酸及びその塩形態を含むものである（化学式４ないし６）。化学式６は塩形態の一例であるナトリウム塩を示す。
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【００１３】
前記培地は通常のストレプトミセス属菌株の培養に使われるものであればいかなるものでもよいが、ここに限定されることではない。また、前記培養物からプラバスタチンを回収する段階は通常の分離・精製手段を使用できる。例えば、抽出及びＨＰＬＣを使用できる。
【００１４】
以下、本発明は実施例を通じて詳細に説明する。しかし、それら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれら実施例に限定されることではない。
【００１５】
【実施例】
＜実施例１＞  土壌微生物の分離及び同定
土壌は朝鮮人参の畑（京畿道、江華島地域）から採取し、４０℃で２４時間乾燥させた。前記乾燥された土壌試料１．０ｇを１０ｍｌの滅菌蒸溜水に懸濁、２回続けて希釈し，  それを０．１ｍｌずつ放線菌分離用寒天培地（表１参照）２０ｍｌ塗抹し、２８℃で１４〜２１日間培養して土壌微生物を分離した。前記放線菌分離用培地は抗真菌剤であるシクロヘキシミド（５０μｇ／ｍｌ）と抗菌剤ナリジクス酸（ｎａｌｉｄｉｘｉｃ  ａｃｉｄ，２００μ  ｇ  ／ｍｌ）とを含むフミン酸−ビタミン寒天培地を使用（ｈｕｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｖｉｔａｍｉｎ  ａｇａｒ）し、１２１℃で１５分間滅菌した後、別途にろ過殺菌した抗真菌剤および抗菌剤を添加した。フミン酸−ビタミン寒天培地の組成は表１の通りである。
【００１６】
【表１】フミン酸−ビタミン寒天培地の組成
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【００１７】
このような方法により得られた土壌放線菌集落を純粋分離し、培養中にコンパクチンを前駆体として添加した時、コンパクチンをプラバスタチンに転換する放線菌を分離してそれをストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）と名づけた。
【００１８】
前記微生物の生育は全般的に良好であり、基菌糸（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｍｙｃｅｌｉｕｍ）は主に黄色、灰色であり、背面色は主に薄い黄色であった。前記微生物の電子顕微鏡による観察結果、胞子鎖は直線型であり、胞子の表面は滑らかであり、分節された形態を示す。前記微生物は培地内のＤ−グルコース、蔗糖、Ｄ−マニトール、Ｄ−フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｉ−イノシトール、ラムノース、ラフィノース等の大部分の糖類を使用し、ゼラチン液化力も、澱粉分解力も陽性を示した。また、細胞壁を分解して細胞壁内の糖分析を実施した結果、グルコース、アラビノース、ガラクトース、リボースが検出され、アミノ酸の分析結果、メゾ−ジアミノピメリン酸が検出された。
【００１９】
このような前記分離株の形態学的、培養学的特性及び生理学的特性を総合して既存の放線菌と比較した結果、ストレプトミセス属の新しい種と判断されてこの分離株をストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２と名づけ、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２００３年５月１２日付に寄託した（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）。前記ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の培養学的特性は表２の通りである。
【００２０】
【表２】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の培養学的特性
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【００２１】
また、前記ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の炭素源利用特性は表３の通りである。
【００２２】
【表３】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の炭素源利用特性
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【００２３】
また、前記ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の生理学的特性は表４の通りである。
【００２４】
【表４】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の生理学的特性
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【００２５】
また、前記ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の細胞壁成分の特性は表５の通りである。
【００２６】
【表５】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）の細胞壁成分
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【００２７】
＜実施例２＞  ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（受託番号ＫＣＣＭ−１０４９７）によるコンパクチンのプラバスタチンへの転換確認
使用菌株：ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２。
培養方法：前培養培地（表６）５０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに分株し、１２１℃で２０分間加圧殺菌した。平板培地で２週間育った培地（菌株を含む）切れ（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）を殺菌された前培養培地に植菌し、回転攪拌培養器で分当り２５０回転速度で攪拌しながら２８℃で２日間培養した。
【００２８】
１２１℃で２０分間加圧殺菌された本培養培地（表７）５０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れて前記得られた前培養液を１０％（５ｍｌ，  ｖ／ｖ）接種し、回転攪拌培養器で分当り２５０回転速度で攪拌しながら２８℃で５日間培養した。培養２日目から滅菌されたコンパクチン（ナトリウム塩形態）を０．５ｇ／Ｌの濃度で毎日２回ずつ添加してプラバスタチンへの転換を誘導した。菌体の成長は醗酵液１０ｍｌをとって４５０ｘｇで１０分間遠心分離した後、ＰＭＶ（Ｐａｃｋｅｄ  Ｍｙｃｅｌｌｉｕｍ  Ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。
【００２９】
その結果、培養液のｐＨは７．５０、ＰＭＶは２３％であった。プラバスタチン分析はウォーターズＣ１８カラム（３．９×３００ｍｍ）と、島津（ＭｏｄｅｌＬＣ−１０ＡＤ）ＨＰＬＣ機器を使用した。この培養液６００μｌに４００μｌのエタノールを加えて混合し、１５分ないし３０分間攪拌して遠心分離してＨＰＬＣ分析法（メタノール：トリエチルアミン：酢酸：水＝５００：１：１：５００、１ｍｌ／ｍｉｎ流速）で定量した時、培養液中のプラバスタチンが確認された（図１）。また、ＬＣ−ＭＳ及び紫外線吸光度を測定してプラバスタチンを再確認した（図２、図３及び図４）。ＬＣはＰＤＡ２９９６（ウォーターズ社）を使用し、質量分析器はＵｌｔｉｍａ−ＰＴ（マイクロマス社）を使用した。質量分析条件は毛細管電圧１９７０Ｖ、コーン電圧９７Ｖ、衝突エネルギー１３ｅＶであり、ネガティブモードで測定した。
【００３０】
図１で、プラバスタチンの滞留時間は１２．７６６分（面積４０１２９８）であり、コンパクチンの滞留時間は１８．３３７分（面積２３０２５８）であった。図１に示した、ＨＰＬＣクロマトグラムにおいてコンパクチンとプラバスタチンとの面積和に対するプラバスタチンの面積比率は約６４％であって、コンパクチンからプラバスタチンへの転換比率が約６４％以上で非常に高いことが分かった。
【００３１】
図２及び図３において、４２３の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。前記プラバスタチンはネガティブモード測定されたので、ナトリウムイオンが離脱した形態と思われる。３２１の位置にあるピークはプラバスタチンの分節（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により形成された物質（子形物質、ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｔｙｐｅ）を示し、プラバスタチンの特徴的なピークである。
【００３２】
【表６】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２の前培養培地
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【００３３】
【表７】ストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２の本培養培地
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【００３４】
＜実施例３＞  プラバスタチンの精製
培養が終わった微生物の培養物３Ｌを２倍の蒸溜水で希釈した後、３％体積の硅藻土を攪拌しながら加えて、硅藻土で満たされたろ過用じょうごにろ過させた。次に、５００ｍｌのＨＰ−２０樹脂が満たされたカラムに前記ろ過物を吸着させた。十分量の水で洗浄した後、５０％のエタノール溶液で湧出した。湧出された溶液に活性弾及びアルミナ樹脂を使用して色抜きした後、減圧濃縮器を使用して濃縮させた。
【００３５】
濃縮された粗精製物をＸＡＤ−１６００（アンバーライト社）樹脂が２００ｍｌ満たされたカラムに吸着させ、１０％エタノールを利用して洗浄した後、４０％のエタノール溶液でプラバスタチンを分離した。前記分離された溶液を減圧濃縮し、このプラバスタチン精製物をエタノールおよびエチルアセテートを使用して結晶化させ、かつろ過して減圧乾燥を通じて１．３ｇの白色結晶を得た。前記得られたプラバスタチンを水素核磁気共鳴（Ｈ−ＮＭＲ）分析し、その結果を図５に示した。該  ＮＭＲ  器機は  Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＡＲＸ４００  ＦＴ−ＮＭＲであり、溶媒としてはＭｅＯＨ−ｄ４を使用した。図５で、各化学的シフトに対する割当て結果は次の表８の通りである。
【００３６】
【表８】化学的シフトの割当て結果
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【化７】
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【００３７】
図５に示したように、プラバスタチンを確認できた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によるストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）によれば、コンパクチンをプラバスタチンに高効率で転換できる。
【００３９】
本発明によるストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）を利用したプラバスタチンの製造法によれば、プラバスタチンを高効率で製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）によって転換されたプラバスタチンのＨＰＬＣクロマトグラムを示す図面である。図１で、プラバスタチンの滞留時間は１２．７６６分（面積４０１２９８）であり、コンパクチンの滞留時間は１８．３３７分（面積２３０２５８）であった。
【図２】ＨＰＬＣで得られたプラバスタチン分画をＬＣ−ＭＳ分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで測定しており、４２３の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークである。
【図３】ＨＰＬＣで得られたプラバスタチン分画をＭＳ  ドータースキャン分析した結果を示す図面である。ネガティブモードで  測定しており、４２３の位置にあるピークがプラバスタチンを示すピークであり、３２１の位置にあるピークがプラバスタチンの特徴的な分節産物を示すピークである。
【図４】精製されたプラバスタチンの紫外線スペクトルを示す図面である。
【図５】精製されたプラバスタチンの水素−核磁気共鳴（Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを示す図面である。
【図６】本発明のストレプトミセス種ＣＪＰＶ  ９７５６５２（ＫＣＣＭ−１０４９７）の電子顕微鏡による観察結果を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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