(57)【要約】【課題】  糖化タンパク質を酵素を用いて測定するにあたり、１点のみの検量物質を用いることにより、より簡便に、より安価に、より正確にキャリブレーションを行う方法を提供する。【解決手段】  冷蔵保存１週間後の酵素の残存活性が９０％以上である酵素含有液を用い、かつ１点の検量物質を用いることにより、より簡便に、より安価に、より正確にキャリブレーションを行うことが可能になる。またタンパク質がアルブミンである場合ブロモクレゾールパープルを含む試薬をアルブミン試薬に用いることにより、さらに正確に糖化アルブミンを測定することが出来る。【選択図】  選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化タンパク質の酵素による測定において、１点のみの検量物質により検量線を作成する方法であって、酵素含有溶液を冷蔵保存し、１週間毎日キャリブレーションを行った場合のキャリブレーション間差が１．５％以下であることを特徴とする検量線の作成方法。
【請求項２】
糖化タンパク質割合の酵素による測定において、１点のみの検量物質により検量線を作成する方法であって、酵素含有溶液を冷蔵保存し、１週間毎日キャリブレーションを行った場合のキャリブレーション間差が１．５％以下であることを特徴とする検量線の作成方法。
【請求項３】
酵素含有溶液を１週間冷蔵保存した後の酵素の残存活性を９０％以上とすることを特徴とする請求項１若しくは２に記載の方法。
【請求項４】
酵素がプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼである請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
プロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼの安定化剤を含有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
糖化タンパク質が糖化アルブミン若しくは糖化ヘモグロビンである請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
糖化タンパク質割合測定法において、タンパク質がアルブミンであり、アルブミンを測定する方法がブロモクレゾールパープルを用いる方法であることを特徴とする請求項２〜６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも下記ａ）〜ｅ）を含有することを特徴とする検量線作成用キット。
ａ）プロテアーゼ
ｂ）ケトアミンオキシダーゼ
ｃ）プロテアーゼの安定化剤
ｄ）ケトアミンオキシダーゼの安定化剤
ｅ）１点のみの検量物質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化タンパク質測定に有用な検量線の作成方法及びそれを用いた糖化タンパク質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理行う上で糖化タンパク質の測定は非常に重要であり、過去約１〜２ヶ月の平均血糖値を反映する、ヘモグロビンＡ１ｃ(ＨｂＡ１ｃ)、過去約２週間の平均血糖値を反映する糖化アルブミン（ＧＡ）等が日常的に測定されている。なかでもＧＡは治療効果の確認や投薬量の調節に有用であり、近年検査数が増加している。
酵素を用いてＧＡを測定する方法としては各社様々な方法が考案されている（非特許文献１）。しかしながら、その検量線を作成するために使用する検量物質については報告が少なく、人工的に糖化反応を行い作成されたＧＡよりも、健常者から精製したＧＡが好ましいことが唯一知られているのみである（特許文献１）。
また、ＧＡの酵素測定法としてはルシカＧＡ（旭化成ファーマ社製）及びGlyAlb-OY（オリエンタル酵母社製）が発売されているが、これらのキットに用いられる検量物質は健常者領域と異常領域の２点の検量物質及び水の３点を直線回帰するキャリブレーションを採用している。非特許文献１及び特許文献１及に関しても同様である。２点の検量物質を用いる場合には、ブランク及び２点の検量物質により計３点で検量線を引くことになるが、完全に直線にならないことがあり、本来ならばこのような誤差を生まない１点の検量物質を用いる方法が好ましい。
【０００３】
特許文献２には、糖化タンパク質を測定するには１点の検量用物質及び水を用いたキャリブレーションも可能である旨示されている。しかし、冷蔵１週間程度の保存をした場合には２点キャリブレーションの方が正確にキャリブレーションでき、１点キャリブレーションでは十分満足いくものではなかった。よって、これまで試薬の保存を考慮すると、ＧＡを測定するにあたり、１点の検量物質で正確にキャリブレーションできる方法は報告されていない。
一方、酵素を用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法が知られている（特許文献３〜６）。しかしながら、これまで酵素を用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法に於いて１点の検量物質でキャリブレーションを行った例は報告されていない。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ  ０１／９４６１８号公報
【特許文献２】ＷＯ  ０２／０６１１１９号公報
【特許文献３】特開２００１−５７８９７
【特許文献４】ＷＯ  ００／５０５７９
【特許文献５】ＷＯ  ００／６１７３２
【特許文献６】特開２０００−３００２９４
【非特許文献１】Kouzuma et.al. An enzymatic method for the measurement of glycated albumin in biological sample. Clinica Chimica Acta 324 (2002) 61-71
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、糖化タンパク質を酵素を用いて測定するにあたり、１点のみの検量物質を用いることにより、より簡便に、より安価に、より正確にキャリブレーションを行う方法を提供することを目的とする。さらに具体的には、臨床生化学検査における有用な酵素を用いた糖化タンパク質測定の為のキャリブレーション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
糖化タンパク質を測定するにあたり、キャリブレーションは１点のみの検量物質とブランクで作成するほうが好ましい。よって本発明者らは、これまでの酵素を用いた糖化タンパク質の測定方法に１点のみの検量物質を用いたキャリブレーションが適用できない原因を鋭意検討した。結果、試薬を保存すると試薬の感度が低下し、測定したい範囲に於ける検量線が特に高濃度領域で微妙に直線からずれることにより、低値、高値の２点の検量物質を用いた方が、より正確にキャリブレーションが出来ることを見出した。さらに、この現象はプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼが次第に失活していく為であることを突き止めた。
【０００７】
次いで本発明者らは、すでに酵素類を各種の安定化剤により安定化する技術を見出していることから（特許文献１）、安定化剤を用いた安定化組成に於いて鋭意キャリブレーション方法を検討した結果、安定な組成においては、従来の２点の検量物質をもちいたキャリブレーションよりも１点の検量物質を用いた方がより正確にＧＡを測定することができることを見出した。
またあわせて、本検量用物質にタンパク質濃度、糖化タンパク質濃度を同時に表示することにより、たとえ検量物質に濃縮がかかっても、常に同じ試料からは、同一の糖化タンパク質割合が得られること、さらに、タンパク質がアルブミンである場合ブロモクレゾールパープルを含む試薬をアルブミン試薬に用いることにより、検量用物質の表示値がグロブリン等の影響を受けず正確に決定できることを見出し本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は
（１）  糖化タンパク質の酵素による測定において、１点のみの検量物質により検量線を作成する方法であって、酵素含有溶液を冷蔵保存し、１週間毎日キャリブレーションを行った場合のキャリブレーション間差が１．５％以下であることを特徴とする検量線の作成方法。
（２）  糖化タンパク質割合の酵素による測定において、１点のみの検量物質により検量線を作成する方法であって、酵素含有溶液を冷蔵保存し、１週間毎日キャリブレーションを行った場合のキャリブレーション間差が１．５％以下であることを特徴とする検量線の作成方法。
（３）  酵素含有溶液を１週間冷蔵保存した後の酵素の残存活性を９０％以上とすることを特徴とする（１）若しくは（２）に記載の方法。
（４）  酵素がプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼである（１）〜（３）に記載の方法。
（５）  プロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼの安定化剤を含有することを特徴とする（４）に記載の方法。
（６）  糖化タンパク質が糖化アルブミン若しくは糖化ヘモグロビンである（１）〜（５）いずれかに記載の方法。
（７）  糖化タンパク質割合測定法において、タンパク質がアルブミンであり、アルブミンを測定する方法がブロモクレゾールパープルを用いる方法であることを特徴とする（２）〜（６）に記載の方法。
（８）少なくとも下記ａ）〜ｅ）を含有することを特徴とする検量線作成用キット。
ａ）プロテアーゼ
ｂ）ケトアミンオキシダーゼ
ｃ）プロテアーゼの安定化剤
ｄ）ケトアミンオキシダーゼの安定化剤
ｅ）１点のみの検量物質
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明について、以下具体的に説明する。
＜２点−１点の検量物質＞
本発明に於ける２点検量物質とは濃度の異なる２点の糖化タンパク質濃度を有する検量物質であり、通常低濃度と高濃度の２点である。検量線は水若しくは生理的食塩水のような糖化タンパク質濃度がゼロとなる物質とこれらの低値、高値の３点を多重測定し最小二乗法で直線回帰させ検量線とする。一方１点検量物質を用いる場合には、水若しくは生理的食塩水のような糖化タンパク質濃度がゼロとなる物質と検量物質を多重測定し２点を結ぶ直線を検量線とする。
＜糖化ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ＞
ヘモグロビンがグルコースと非酵素的に反応した糖化タンパクを糖化ヘモグロビンと言う。糖化ヘモグロビンはα鎖及びβ鎖Ｎ末端のバリンや分子内のリジンのε位が糖化されていると言われているが、糖化ヘモグロビンのうちヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化された分子をヘモグロビンＡ１Ｃと呼ぶ。ヘモグロビンＡ１ｃには、アマドリ転移する前のシッフベースである不安定型ヘモグロビンは含まれない。
本発明に於ける検量物質とは糖化タンパク質を含む物質であれば何れを用いても良いが、タンパク質がアルブミンである場合には糖化タンパク質とは糖化アルブミンであり、タンパク質がヘモグロビンである場合には、糖化タンパク質とは糖化ヘモグロビン若しくはヘモグロビンＡ１ｃのことを指す。
【００１０】
糖化アルブミンを含む検量物質としては、例えばアルブミン溶液、少なくともアルブミンを含む溶液、血清、血漿、全血等が挙げられ、糖化ヘモグロビン若しくはヘモグロビンＡ１ｃを含む検量物質としては例えばヘモグロビン溶液、少なくともヘモグロビンを含む溶液、全血、赤血球、溶血液等が挙げられる。またこれらの材料は必ずしも高い糖化タンパク質濃度を示すわけではないので、必要に応じて健常者等の血液から糖化タンパク質を精製、高血糖者の血液の使用、血液の人工的な糖化反応による糖化タンパク質合成等を用いて目的とする濃度の糖化タンパク質を得ることが出来る。糖化タンパク質の精製はホウ酸や亜鉛と糖のキレートを用いたクロマト法で精製が可能である。人工的な糖化反応はグルコースと例えば３７度にてインキュベーションすることにより得ることが出来る。通常は２週間程度でよいが、それ以上の時間反応させても良い。
【００１１】
検量物質は純粋な糖化タンパク質、あるいは、その混合品でも良く、また血液成分を含む糖化タンパク質含有物質、血液成分を含む非糖化タンパク含有物質、その混合品でも良い。また、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
さらに本発明に記載の検量物質の組成には、例えば検量物質の保存安定性を悪くする物質を除去し、また保存安定性を改善する物質を添加しても良い。例えば、検量物質の保存安定性を悪くする物質としては、糖化反応を引き起こす還元糖、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース等、濁りを引き起こす血液凝固系のタンパク質、例えばフィブリノーゲン等が挙げられ、極力除去することが好ましい。除去の程度の確認としては市販の測定キットを用い、安定性を悪くする物質の含有量を測定すればよい。除去の目標は好ましくは、市販のキットで測定限界以下であり、例えばグルコースであれば１０ｍｇ／ｄｌ以下、フィブリノーゲンであれば４０ｍｇ／ｄｌ以下が好ましい。除去の方法としてはグルコースに代表される還元糖は低分子を除去する方法、例えば透析、分子ふるいを用いた低分子除去、クロマトグラフィーを用いた分離等を用いればよい。フィブリノーゲンの様に凝固に関するタンパク質を除去するには、血液の凝固反応を十分に行うか、カラム法や沈殿法等を用いて精製すれば良い。
【００１２】
また保存安定性を改善する物質としては、非還元糖であるグルシトール、ガラクチトール、マンニトール、トレハロース、スクロース、イノシトール、グリセロール等が挙げられ、これらの物質の添加が効果的であるが、これ以外の安定化剤を添加しても問題ない。例えばケーソン、アジ化ナトリウム等の防腐剤も保存安定性を改善する物質と考えられる。
本発明に使用しうる１点の標準物質の糖化タンパク質およびタンパク質濃度としては、実際に臨床現場で最も多くの頻度で測定される値の前後若しくは最も多くの頻度で測定される値よりも大きな値をもつ検量物質が好ましく、例えばタンパク質がアルブミンの場合には最も頻度の多いアルブミン濃度が４〜５ｇ／ｄｌであり、最も頻度の多いグリコアルブミン濃度が０．４〜１．０ｇ／ｄｌであることから、アルブミン濃度３〜７ｇ／ｄｌ、グリコアルブミン濃度０．３〜２．０ｇ／ｄｌが好ましい。
【００１３】
一方例えばタンパク質がヘモグロビンの場合には最も頻度の多いヘモグロビン濃度が１３〜１８ｇ／ｄｌであり、最も頻度の多いヘモグロビンＡ１ｃ濃度が０．６５〜１．０ｇ／ｄｌであることから、ヘモグロビン濃度１０〜２０ｇ／ｄｌ、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度０．４〜２．０ｇ／ｄｌが好ましい。
検量物質への値付けは、タンパク質（例えばアルブミンやヘモグロビン）及び糖化タンパク質（例えばヘモグロビンＡ1ｃ）のように市販の濃度既知の標準物質が容易に手に入る場合には、その標準物質、例えばＣＲＭ６７０などの標準物質から検量物質に、用いる試薬を用いて値を移せばよい。一方糖化アルブミンのように標準物質が無いものについては、公知の物理的な糖化アルブミンの測定方法（ＨＰＬＣ法；グリコアルブミン計；ＧＡＡ２０００、アークレイ社製）を用いてアルブミンの糖化割合を求め、別途アルブミン濃度を求め、その値から糖化アルブミン濃度を算出すればよい。また、非特許文献１で示したように、アルブミン中の糖化アミノ酸濃度をアルブミン濃度で除し、さらにアルブミン中の平均糖結合量（約２個）で割っても同様の結果を得ることができる。
【００１４】
本発明に於ける１点の検量物質を用いた検量線の作製方法としては、前記検量物質１点及び水若しくは生理的食塩水のようなブランクとなる物質を、後述する糖化タンパク質の測定方法を用いて多重測定し、２点を結ぶ直線を検量線とすれば良い。
本発明に於けるキャリブレーション間差とは、例えば１週間毎日キャリブレーションを行い試料を測定した場合の再現性のことを指し、統計的に有意に再現性が低下する方法であればいずれの方法を用いても良い。本発明において、キャリブレーション間差は、酵素含有溶液を冷蔵保存した条件下で求める。冷蔵は、通常、４℃〜１０℃を意味するが、好ましくは、４℃である。酵素含有溶液とは、糖化タンパク質の測定に使用する酵素を含んだ溶液をいい、例えば、プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを用いて糖化タンパク質を測定する系であれば、プロテアーゼ含有溶液やケトアミンオキシダーゼ含有溶液をいう。酵素含有溶液は、必要に応じて、後述に例示するような安定化剤などを含んでいてもよい。
【００１５】
例えば通常２点の検量物質を用いた場合のキャリブレーション間差は１．５％以上であるが、１点のみの検量物質を用いた場合であって、１週間感度が変化しない試薬を用いた場合０〜１．０％程度である。より具体的には例えば１週間毎日キャリブレーションを行い試料を測定した場合の再現性が１．５％以下であることが好ましく、１．０％以下であればより好ましく、０．７％以下であれば最も好ましい。
また、本発明における安定な試薬組成としては、例えば冷蔵保存１週間後の酵素の残存活性が９０％以上であることが好ましく、９５％以上がより好ましく、実質的に活性低下がないことが最も好ましい。
【００１６】
本発明に於ける糖化タンパク質の酵素測定法とは、糖化タンパク質濃度が測定出来る酵素を用いた方法であれば、如何なる方法を用いても良いが、例えば、よく研究されているプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼを用いた方法が好ましい。
本発明に使用しうるプロテアーゼとしては、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該タンパク質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良いが、例えば動物、植物、バチルス(Bacillus)属、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾパス(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、リソバクター(Lysobacter)、グリフォラ(Glifila)、酵母(Yeast)、トリチラチウム(Tritirachium)、サーマス(Thermus)、シュードモナス(Pseudomonus)、アクロモバクター(Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
また測定対象である糖化タンパク質がグリコアルブミンである場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大きい為より好ましい。また測定対象である糖化蛋白質が糖化ヘモグロビン若しくはヘモグロビンＡ１ｃで有る場合にはバチルス属、アスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大きい為により好ましい。
【００１７】
尚プロテアーゼの活性は公知のカゼイン−フォリン法を用いて測定した。
また、上記のようなプロテアーゼによる処理により生成した糖化アミノ酸又は糖化ペプチドに使用しうる酵素は、本発明に使用しうるプロテアーゼ処理により断片化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、前述のようにオキシダーゼが最もよく研究されており好ましい。しかしながらキナーゼ、デヒドロゲナーゼを用いても良く、なんら限定されるものではない。
糖化アミノ酸または糖化ペプチドの測定に使用する酵素の特異性としてはαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドによく作用する酵素、εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドによく作用する酵素等が挙げられる。
プロテアーゼ処理により断片化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用するオキシダーゼのうち、εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドによく作用する酵素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus ）属カンジダ（Candida ）属、ペニシリウム（Penicillium ）属、フサリウム（Fusarium）属、アクレモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
【００１８】
αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドによく作用する酵素の例としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）由来の酵素が挙げられる。
さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可能な酵素の例としては、遺伝子組み替え型ケトアミンオキシダーゼ（KAOD；旭化成ファーマ社製；非特許文献１に記載）および加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD（KAOD-V；旭化成ファーマ社製；特許文献２に記載のFOD遺伝子を含有する形質転換微生物JM109・pcmFOD5(FERM BP-7848)が生産するKAOD）が挙げられる。
ケトアミンオキシダーゼの活性は下記の方法にて測定した。
【００１９】
＜反応液の組成＞
50mM      トリス緩衝液  pH7.5
0.03%      4-アミノアンチピリン（和光純薬社製）
0.02%      フェノール（和光純薬社製）
4.5U/ml      パーオキシダーゼ （シグマ社製）
1.0mM      α-カルボベンズオキシ-ε-D-フルクトシル-L-リジン若しくはフ              ルクトシルバリン（ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Hashiba H、J.Agric.Food Chem.24：70、1976 以下ZFL、FVと略す。）
上記の反応液１ｍｌを小試験管に入れ、３７度-５分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液０．０２ｍｌを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に１０分間反応の後に０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止し、波長５００ｎｍの吸光度を測定する（Ａｓ）。またブランクとして酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素作用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。別にあらかじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べ、３７度−１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
本発明に於いて、酵素含有溶液を１週間冷蔵保存するとは、酵素が凍結乾燥品の場合、緩衝液、溶解液若しくは蒸留水等で調製後１週間冷蔵保存することをいい、酵素が液状品の場合は開封後１週間冷蔵保存することを指す。
【００２０】
一般的に前記のプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼは溶液中では安定ではない。よって必要に応じてプロテアーゼ及びケトアミンオキシダーゼ安定化剤等を添加することにより溶液中で安定化することができる。
プロテアーゼの安定化剤としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、カルシウム、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤があげられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、グリセリン等が、第四級アンモニウム塩第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等があげられる。
【００２１】
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば通常0.01%〜50%、好ましくは0.1%〜40%の濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
ケトアミンオキシダーゼの安定化剤としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば好ましい。
【００２２】
好ましい安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、マグネシウム、カルシウム、硫安、アミノ酸、ザルコシンがあげられる。糖アルコールの例としては、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が、アミノ酸としては全てのアミノ酸に強い安定か効果があるが中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸、アラニン、バリン、グリシン、リジン等があげられる。
また、これらのケトアミンオキシダーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば糖アルコール、スクロース、アミノ酸、ザルコシンの場合、通常0.01%〜30%、好ましくは0.1%〜20%の濃度で用いればよく、マグネシウム、カルシウム、硫安の場合、通常1mM〜1M、好ましくは10mM〜500mMの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
【００２３】
以上のように本発明に使用しうる糖化タンパク質における検量線作成用キットとしては、プロテアーゼ及びその安定化剤よりなる糖化タンパク質分解試薬とケトアミンオキシダーゼ及びその安定化剤、および１点のみの検量物質を少なくとも含むキットが例示される。さらに必要に応じて、発色試薬（たとえば、パーオキシダーゼ及びトリンダー型の色素やロイコ型の色素）、界面活性剤、金属塩、共存物質を消去する酵素（例えばアスコルビン酸オキシダーゼやビリルビンオキシダーゼ）などを付加することもできる。。
糖化タンパク質分解試薬の組成としては、蛋白質分解反応が効率よく進行するようにpH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後プロテアーゼ安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して添加すればよい。
例えばプロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いる場合にはpHが7 〜10付近で蛋白質分解活性が強く、反応のｐＨは7 〜10を選択できる。緩衝液としては例えばｐＨ7.2〜8.5に緩衝作用のあるPOPSO緩衝液を使用することが出来、POPSOの濃度は1〜100mMの濃度、好ましくは10〜500mMで使用すればよい。      
またプロテアーゼ添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の糖化タンパク質を十分に分解し得る濃度で有れば良く、100 〜50万PU/ml が好ましく、500〜10万PU/ml がより好ましい。安定化剤としてはジメチルスルホキシド5〜60%、好ましくは10~50%程度を添加すればよい。
【００２４】
一方発色試薬の組成としては、糖化タンパク質分解試薬の作用により生じた糖化アミノ酸若しくはペプチドを効率よく検出できるようにpH、緩衝剤及びケトアミンオキシダーゼ濃度を決定し、その後ケトアミンオキシダーゼの安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して添加すればよい。
例えばFOD（旭化成ファーマ社製）を使用する場合、最大活性の50% 以上の活性を示す領域がpH6.5 〜10と広く、反応のpHは6.5 〜10を選択できる。また酵素添加濃度は、使用される反応液中で糖化アミノ酸を十分に検出し得る濃度で有れば良く、0.5〜200U/mlが好ましく、1〜50U/ml がより好ましい。
【００２５】
ケトアミンオキシダーゼの安定化剤としては、例えばグルタミン酸を用いることができ、0.01%〜30%、好ましくは0.1%〜20%の濃度で用いればよい。
本発明に使用しうる糖化タンパク質の定量方法としては、前記の糖化タンパク分解試薬0.01〜10mlに被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、第一の測光（A0）を行い、続いて発色試薬0.01〜5mlを添加し37℃の温度にて反応させ反応開始後一定時間後の変化した過酸化水素若しくはその他生成物の量を測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化タンパク質を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化タンパク質の量を求めることができる。
また本発明に於ける糖化タンパク質割合の測定方法としては、を求めるには別途タンパク質を測定して糖化タンパク質割合を算出する必要がある。タンパク質の測定方法とは、例えば、クロマトグラフィーを用いて目的とするタンパク質を試料より分離し、分離されたタンパク質を公知の方法で定量すれば良く、また直接抗体や発色色素を用いて測定しても良い。
【００２６】
直接発色色素を用いて、例えばアルブミンを測定する方法としては、ブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモフェノールブルー、メチルオレンジ、又は２-（４-ヒドロキシベンゼンアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）等の色素を用いる方法が知られているが、特異性の点からブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）を用いは方法が好ましい。
また例えばヘモグロビンを測定する方法としては、例えばメトヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、アザイドメトヘモグロビン法、緑色発色団形成法またはオキシヘモグロビン法が挙げられる。緑色発色団形成法とは緑色発色団形成試薬とヘモグロビンを反応させ、安定な生成物（緑色発色団）を形成する方法であり、緑色発色団は英国特許公開第2052056に記述されるアルカリ性ヘマチンＤ-575と同様な吸収スペクトルを有する。
【００２７】
試料中のタンパク質を測定するには、通常試料例えば０．０１μｌ〜１０ｍｌに、例えばＨＡＢＡを用いる場合、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ４〜９に於いて、０．００１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜５％の濃度で使用すればよく、４８０〜５５０ｎｍの吸光度変化を測定すればよい。また同様にＢＣＰを用いる場合には、ｐＨ４〜８、好ましくは４．５〜７．５に於いて着色を抑える界面活性剤、例えばＢｒｉｊ３５等を０．０１％〜５％好ましくは０．０５％〜３％の共存下０．０００１〜０．２％、好ましくは０．０００５〜０．１％で使用すればよく６００ｎｍ付近の吸光度変化を測定すればよい。
また、ヘモグロビンを測定する場合に、オキシヘモグロビン法を用いる場合には、例えば試料を蒸留水で希釈しオキシヘモグロビンに変換後５４０ｎｍ付近の吸収を測定すればよい。またヘモグロビンの変性を防ぐ目的で界面活性剤、例えば少なくとも硫酸基を有する界面活性剤、及び／又は非イオン性界面活性剤、及び／又は両イオン性界面活性剤を好ましくは０．００１〜１０％の濃度で添加すると良い。
【実施例】
【００２８】
本発明を実施例に基づいて説明する。
[実施例１]  糖化アルブミンの測定に及ぼす１点検量線及び２点検量線の影響
糖化アルブミン測定試薬（安定化剤＋／−）を用いて１点検量線及び２点検量線の性能を試薬調製直後及び冷蔵保存１週間後で比較した。
【００２９】
＜反応液組成＞
R-1 タンパク質分解試薬
150mM    トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml  プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
±30％    ジメチルスルホオキシド（和光純薬社製；安定化剤）
R-2 糖化アミノ酸定量試薬
150mM    トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
0.12%     4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
0.08%     N-エチル-N- （2-ヒドロキシ-3- スルホプロピル）-m- トルイジン（TOOS；同人化学研究所社製）
24U/ml    ケトアミンオキシダーゼ（KAOD；旭化成ファーマ社製）
20U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
±１％    ソルビトール（和光純薬社製；安定化剤）
R-3  アルブミン定量試薬（ブロモクレゾールパープルを用いる方法）
アクアオート  カイノス  ＡＬＢ試薬（カイノス社製）を使用した。
アルブミン測定方法を比較する為にブロモクレゾールグリーンを用いた方法、カイノスオートシリーズ  ＡＬＢ試薬（カイノス社製）を同時に測定した。  
【００３０】
＜試料＞
1; 健常者プール血清；12.1％、患者プール血清１；25.7％、患者プール血清２；33.2％、（GA%はアークレイ社製ハイオートGAA2000にて測定した。）
＜キャリブレーター＞
ルシカＧＡ用キャリブレーター、lot0202A  Ｌ（GA濃度=0.539g/dl、ALB濃度=4.56  g/dl，Ｈ  GA濃度=1.795  g/dl；旭化成ファーマ社製）をキャリブレーターとして使用し、２点の検量物質を用いる場合には、水と２点の検量物質の計３点を２重測定し、最小二乗法で検量線を求めた。また１点の検量物質を用いる場合には、水と１点の検量用物質（Ｈを使用）を２重測定し、検量線を求めた。
【００３１】
＜反応手順＞
37度にインキュベートされたR-1;240μLに基質溶液（HSA基質溶液、G-I基質溶液）  8μｌを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μLを添加した。R-2添加前後の546nmの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また試料の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
【００３２】
試料から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いた△Aをキャリブレーションから得られた検量線と比較することにより、糖化アルブミン濃度を求めた。BCP試薬を用いたアルブミンの定量は、試薬の用法用量に基づいて測定した。
試料及びブランク試料は、安定化剤±の試薬を用いて、キャリブレーションを行いｎ＝３の測定を行い、これを１週間行いキャリブレーションの再現性を確認した。試薬は冷蔵（約４℃）で保存した。その結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005261383.tif 000002
表１から分かるように、安定化剤がない場合のキャリブレーション間差は、２点の検量用物質を用いる場合の方が１点の検量物質を用いる場合よりも小さく、健常者プール血清で1.85％であった。一方安定化剤がある場合のキャリブレーション間差は、１点の検量用物質を用いる場合の方が２点の検量物質を用いる場合よりも小さく0.59％であった。
冷蔵１週間保存後の酵素の残存活性は安定化剤がない場合、プロテアーゼ：85%、ケトアミンオキシダーゼ：88%、安定化剤がある場合プロテアーゼ：95%、ケトアミンオキシダーゼ：98%であった。
【００３４】
つまり冷蔵保存１週間後の酵素の残存活性が９０％以上である場合に１点のみの検量物質を用いた場合がもっともキャリブレーション間差が少なく、正確にグリコアルブミンが測定されていることが明白であった。
また現在汎用されているブロモクレゾールグリーンを用いたアルブミンの測定方法はαグロブリンに反応することが知られている。キャリブレーター３種類に標準物質であるＣＲＭ470からブロモクレゾールグリーンおよびブロモクレゾールパープルを用いて値を移し、実際の検体を測定した結果、ブロモクレゾールパープルはどのキャリブレーターを用いても検体の値は同じであったが、ブロモクレゾールグリーンを用いた場合はキャリブレーターごとに値が異なり、検体の測定値は最大０．２ｇ／ｄｌの差があった。このことからグリコアルブミンを測定する場合のアルブミンの測定方法はブロモクレゾールパープルを用いた方が精度が良いことは明白である。
【００３５】
[実施例２]  糖化ヘモグロビンの測定に及ぼす１点検量線及び２点検量線の影響
R-1 タンパク質分解試薬
150mM     トリス緩衝液（和光純薬社製）pH8.0
2500U/ml  プロテアーゼタイプXIV（シグマ社製）
±30％    ジメチルスルホオキシド（和光純薬社製；安定化剤）
2mM  2-(4-lodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H- tetrazolium, mono sodium salt (同仁化学研究所社製）
R-2 糖化アミノ酸定量試薬
150mM    トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
24U/ml    ケトアミンオキシダーゼ（KAOD；旭化成ファーマ社製）
0.08mM N,N,N',N',N'',N''-Hexa(3-sulfopropyl)-4,4',4''-triaminotriphenyl methane, hexasodium salt. (同仁化学研究所社製)
20U/ml    パーオキシダーゼ(シグマ社製)
±１％    ソルビトール（和光純薬社製；安定化剤）
R-3  ヘモグロビン定量試薬（和光試薬）
【００３６】
＜試料＞
1; 健常者コントロール；4.69％、患者コントロール；9.91%  
＜キャリブレーター＞
HbA1c測定用実試料標準物質（１次キャリブレーター）JDS  HbA1c  Lot２（福祉・医療技術振興会製）を用いた。２点の検量物質（レベル２：５．３８％とレベル４：９．８８％）を用いる場合には、水と２点の検量物質の計３点を２重測定し、最小二乗法で検量線を求めた。また１点の検量物質（レベル３：７．３２％）を用いる場合には、水と１点の検量物質を２重測定し、検量線を求めた。
【００３７】
＜反応手順＞
37度にインキュベートされたR-1;216μLに試料24μLを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;54μLを添加した。R-2添加前後の546nmの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また試料の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
【００３８】
試料から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いた△Aをキャリブレーションから得られた検量線と比較することにより、糖化ヘモグロビン濃度を求めた。ヘモグロビンの定量は試薬の用法用量に基づいて測定した。
試料及びブランク試料は、安定化剤±の試薬を用いて、キャリブレーションを行いｎ＝３の測定を行い、これを１週間行いキャリブレーションの再現性を確認した。試薬は４℃で保存した。結果は糖化アルブミンの場合と同様であり、
安定化剤がない場合のキャリブレーション間差は、２点の検量物質を用いる場合の方が１点の検量物質を用いる場合よりも小さく、健常者レベルで2.15％であった。一方安定化剤がある場合のキャリブレーション間差は、１点の検量物質を用いる場合の方が２点の検量物質を用いる場合よりも小さく0.87％であった。冷蔵１週間保存後の酵素の残存活性は安定化剤がない場合、プロテアーゼ：88%、ケトアミンオキシダーゼ：85%、安定化剤がある場合プロテアーゼ：97%、ケトアミンオキシダーゼ：97%であった。
つまり冷蔵保存１週間後の酵素の残存活性が９０％以上である場合に１点の検量物質を用いた場合がもっともキャリブレーション間差が少なく、正確に糖化ヘモグロビン若しくはＨｂＡ１ｃが測定されていることが明白であった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の測定方法は臨床検査の分野、特に酵素を用いた糖化タンパク質の測定分野で好適に利用できる。