(57)【要約】      （修正有）【課題】製品ビール、半製品および培養酵母に混入し得るビール有害菌、ラクトバチルスsp.ABBC74(Lactobacillus sp. ABBC74)株(受託番号FERMP-19330)またはラクトバチルス・リンドネリ(Lactobacillus lindneri)を迅速に検出することができ、かつ偽陽性が生じにくい検出および同定方法を提供する。【解決手段】プライマーLPCITSL2およびLPCF1を用いて試料中のDNAを鋳型としてPCRを行うことによりラクトバチルスsp.ABBC74(FERMP-19330)を検出する、または、プライマーLLITSF8およびLL23SR12を用いて試料中のDNAを鋳型としてPCRを行うことによりLactobacillus lindneriを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーＬＰＣＩＴＳＬ２（配列番号１０）およびＬＰＣＦ１（配列番号１１）を用いて試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）の検出方法。
【請求項２】
プライマーＬＬＩＴＳＦ８（配列番号１６）およびＬＬ２３ＳＲ１２（配列番号１７）からなるプライマーセットＬＬ２を用いて試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、ラクトバチルス・リンドネリの検出方法。
【請求項３】
プライマーＬＬＩＴＳＦ８（配列番号１６）およびＬＬ２３ＳＲ１２（配列番号１７）からなるプライマーセットＬＬ２を用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＬＩＴＳＮＰＦ１（配列番号１８）およびＬＬ２３ＳＲ１０（配列番号１９）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ１、プライマーＬＬＩＴＳＮＰＦ１（配列番号１８）およびＬＬＩＴＳＮＰＲ１（配列番号２０）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ２、および、プライマーＬＬ２３ＳＮＰＦ７（配列番号２１）およびＬＬ２３ＳＲ６（配列番号２２）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて前記第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ラクトバチルス・リンドネリの検出方法。
【請求項４】
配列番号１０に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１１に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）検出用キット。
【請求項５】
配列番号１６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１７に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ラクトバチルス・リンドネリ検出用キット。
【請求項６】
配列番号１６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１７に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドからなる第１のプライマーセットＬＬ２、および、配列番号１８に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号１９に記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットＬＬ２Ｎ１、配列番号１８に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２０に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットＬＬ２Ｎ２、および、配列番号２１に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号２２に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットＬＬ２Ｎ３、からなる群より選ばれる第２のプライマーセットを含む、クトバチルス・リンドネリ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビール有害菌、特にビール中で生育する乳酸菌の検出および同定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
製品ビール、半製品および培養酵母にビール有害菌が存在しないことを保証することは、品質管理上極めて重要である。そのため、これらを製品等を検査対象として、ビ−ル有害菌である乳酸菌をＰＣＲ法によって同定あるいは検出する方法が開発されてきた（特開平７−２８９２９５、特開２００２−３４５７８）。
【０００３】
ラクトバチルス属の中で、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  （受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）株は、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）属と１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列において９９．５％の類似性を持っている（Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４  １６Ｓ  ｒＤＮＡ配列；ＤＤＢＪアクセッション番号Ｅ１６６５１；  Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ  １６ＳｒＤＮＡ配列；ＤＤＢＪアクセッション番号  ＡＢ００５８９３  ）。一方、Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株はＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション法においてＬ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓとの相同性は３７％と低く、菌種レベルで異なる微生物と考えられる。また、Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓは一般的な知見より、ビール混濁性がある微生物としては認識されておらず、強いビール混濁性を持つＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株と識別して同定検出を行うことが望まれていた。また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉも、ビールに混入した場合混濁事故につながる可能性が高い微生物であり、特に注意を要する微生物として迅速かつできるだけ正確に検出及び同定することが望まれてきた。
【０００４】
また、さらに特異性の高いＤＮＡ増幅を行うための技術として、ネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ；「入れ子ＰＣＲ」）が知られている。例えば、特開平１１−７５８５２にはＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼ遺伝子、この遺伝子を含むプラスミド、およびＬ−ガラクトノラクトンデヒドロゲナーゼに関する発明で、前記遺伝子をクローニングするのに、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いたことが記載されている。また、特開平２０００−１５７２９９には、ＨＩＶウィルスＤＮＡの一部を欠失する配列を競合ＤＮＡ断片として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて当該ウィルスを定量する方法が記載されている。さらに、特開２００２−１５９２９５にはＨＩＶ−１ウィルスと相同な配列を競合ＤＮＡ断片として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いることにより、患者の細胞中のＲＮＡ―ＤＮＡハイブリッド濃度を測定する方法が記載されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平７−２８９２５９
【特許文献２】
特開２００２−３４５７８
【特許文献３】
特開平１１−７５８５２
【特許文献４】
特開２０００−１５７２９９
【特許文献５】
特開２００２−１５９２９５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は製品ビール、半製品および培養酵母に混入し得るビール有害菌、特にラクトバチルス属菌（乳酸菌）、より具体的にはラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４）株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）またはラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）を迅速に検出および同定する方法であって、偽陽性が生じにくい検出および同定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株は、ビールに混入した場合、混濁事故につながる可能性が高く、特に注意を要する微生物である。出願人らは１６Ｓ  ｒＤＮＡを解読しその配列をもとにプライマーを開発していた。しかしながら、上述したように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株は、ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）属と１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列において９９．５％の類似性を持っており（Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４  １６Ｓ  ｒＤＮＡ配列；ＤＤＢＪアクセッション番号Ｅ１６６５１；  Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ  １６ＳｒＤＮＡ配列；ＤＤＢＪアクセッション番号  ＡＢ００５８９３  ）、当該遺伝子領域をもとに設計したいずれのプライマーもＬ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓと交差反応を示した。本発明者らは、菌種間の配列の比較において多様性が高いと報告されている１６ＳｒＤＮＡおよび２３ＳｒＤＮＡのスペーサー領域の遺伝子配列を新規に解読し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株を特異的に検出できる実用性の高いプライマーを得ることに成功した。
【０００７】
従って、本発明は下記のプライマーＬＰＣＩＴＳＬ２（配列番号１０）およびＬＰＣＦ１（配列番号１１）を用いて試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、製品ビール、半製品および培養酵母に混入し得るビール有害乳酸菌ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）を検出する方法である。
ＬＰＣＩＴＳＬ２    ５’−ＧＴＴＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧ−３’  （配列番号１０）
ＬＰＣＦ１          ５’−ＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＧＧ−３’  （配列番号１１）
【０００８】
一方、出願人は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株と同様にビール有害菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉの２３ＳｒＤＮＡを解読しその配列をもとにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉを検出するためのプライマーをいくつか作製してきたが、ごくまれなケースであるものの偽陽性反応を生ずることがあった。偽陽性反応とは、当該菌が存在しない場合でも、判定に迷う程度のうっすらとしたバンドを生じさせる反応をいう。この場合、偽陽性検体については増幅されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定することによって菌種の特定を行い、ビール有害菌か否かを最終判定することが可能であるが、そのような方法は極めて高い精度を有する方法であるものの、２〜３日程度の時間を要するので、より迅速に判定することができることが好ましい。本発明者らは、菌種間の配列の比較において多様性が高いと報告されている１６ＳｒＤＮＡおよび２３ＳｒＤＮＡのスペーサー領域の遺伝子配列を新規に解読し、その領域の配列を有するプライマーを用いて、ビール有害菌、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉに対してＰＣＲ行った場合に、極めて特異的な増幅を行い得ることを見いだし、これらのプライマーを用いることによって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉを特異的かつ高感度に検出および同定する方法を開発するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記のプライマーＬＬＩＴＳＦ８（配列番号１６）およびＬＬ２３ＳＲ１２（配列番号１７）からなるプライマーセットＬＬ２を用いて試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする、製品ビール、半製品および培養酵母等に混入し得るビール有害乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉを検出する方法である。
ＬＬＩＴＳＦ８    ５’−ＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’  （配列番号１６）
ＬＬ２３ＳＲ１２    ５’−ＣＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴ−３’  （配列番号１７）
【００１０】
さらに、発明者らは、上記プライマーセットＬＬ２を用いて得られたＰＣＲ産物を鋳型として、第２のＰＣＲを行うネスティッドＰＣＲを行うことによって、より感度高くビール有害乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉを検出することが出来ることを見いだした。
従って、本発明は上記プライマーＬＬＩＴＳＦ８およびＬＬ２３ＳＲ１２からなる第１のプライマーセットＬＬ２を用いて試料中のＤＮＡを鋳型として第１のＰＣＲを行い、プライマーＬＬＩＴＳＮＰＦ１（配列番号１８）およびＬＬ２３ＳＲ１０（配列番号１９）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ１、プライマーＬＬＩＴＳＮＰＦ１（配列番号１８）およびＬＬＩＴＳＮＰＲ１（配列番号２０）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ２、および、プライマーＬＬ２３ＳＮＰＦ７（配列番号２１）およびＬＬ２３ＳＲ６（配列番号２２）からなるプライマーセットＬＬ２Ｎ３、からなる群より選ばれるプライマーセットを第２のプライマーセットとして用いて前記第１のＰＣＲの反応産物を鋳型として第２のＰＣＲを行うことを特徴とする、ビール有害乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉの検出方法である。
【００１１】
ＬＬＩＴＳＮＰＦ１      ５’−ＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＡ−３’  （配列番号１８）
ＬＬ２３ＳＲ１０        ５’−ＡＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴＧＧＴＧＣＡ−３’  （配列番号１９）
ＬＬＩＴＳＮＰＲ１        ５’−ＡＣＴＡＣＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＴＣ−３’  （配列番号２０）
ＬＬ２３ＳＮＰＦ７        ５’−ＡＡＴＡＣＡＴＡＧＣＴＧＣＧＣ−３’  （配列番号２１）
ＬＬ２３ＳＲ６          ５’−ＣＧＣＣＧＴＴＡＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣ−３’  （配列番号２２）
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ビール中で生育し混濁事故を引き起こす可能性のある微生物、すなわち「ビール有害菌」が試料中に存在するか否かが、各菌種に特異的な２組のプライマーセットを用いたＰＣＲまたはネスティッドＰＣＲによって判定される。特に、ビール有害菌として、乳酸菌、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４；特開２００２−３４５７８；ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３０）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）が本発明によって検出及び同定される。いずれの菌種もビール製造において大きな問題となる。また、ビール製造業界においては、特に上記の菌を含む、ビール製造において有害である菌を概念的に一括りにして「ビール有害菌」と呼ぶことがあり、この「ビール有害菌」を検出および同定する簡便且つ迅速な方法が望まれてきた。
本発明によって検査される対象物（試料または検体とも呼ぶ）は特に限定されないが、一般にはビールの製造工程において存在する、あるいは排出される一切の材料、中間産物、最終産物その他が含まれる。本発明における検体としては、製品ビール、半製品ビール、培養酵母液が特に適しており、また工業上有用でもある。
【００１３】
本発明においては、検体中に含まれる微生物由来のＤＮＡ、特にビール有害菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲが行われる。必要に応じて検体の微生物を培養した後に、ＰＣＲを行うこともできる。ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡは通常ＰＣＲ工程中の高温処理によって微生物から流出するためＰＣＲに先立つ前処理は必須ではないが、ＤＮＡを簡便に抽出してもよい。例えば、リゾチームやＮ−アセチルムラミダーゼ等により細胞を溶解し、必要によりタンパク質分解酵素を作用させてタンパク質を分解し、クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、水相にエタノールまたはイソプロパノール等を加え、遠心分離することによって、上述したビール有害菌から簡便にＤＮＡを抽出することができる。このような、ビール有害菌から簡便にＤＮＡを抽出する方法は当業者によく知られたものである。
例えば、ビール製造工程中のサンプル、あるいは排出物を各微生物に応じた適切な寒天培地上に塗布し、各微生物に応じた適切な条件下で培養し、出現したコロニーを上述したような処理にかけることができる。培地としては、例えばＭＲＳ寒天培地、ＧＡＭ寒天培地を利用することができる。その他の条件、例えば、温度、酸素等の条件は各微生物の特性に応じて選択することができる。
【００１４】
ＰＣＲにおいて増幅すべき断片の長さは特に限定されないが、取り扱いの容易さと反応条件の設定しやすさの観点から約１００〜約９００塩基対が好ましく、約２００〜約９００塩基対がより好ましく、約４００〜約９００塩基対であることが特に好ましい。本発明においては使用するプライマー対の少なくとも一方は、各菌についてそれぞれ１６Ｓ  ｒＤＮＡと２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー領域配列から選ばれる。特に、他の菌種と比較して相同性が高い場合には、プライマーの３’末端付近に変異を導入して良い。本発明の好ましい実施態様においては、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４を検出するためのプライマーＬＰＣＩＴＳＬ２は、ラクトバチルス・コリノイデスとの交差反応を防止するため、３’末端付近に変異が導入される。
本明細書において用語「プライマーセット」とは、ＰＣＲにおいてプライマーとして機能する２本のオリゴヌクレオチドの組をいい、用語「プライマー対」あるいは「プライマーの組」と互換的に使用される。
【００１５】
本発明においては更に感度の高い、かつ特異性の高い増幅を行うために上述のＰＣＲ反応後、第２のＰＣＲを行ってもよい。このような方法はネスティッドＰＣＲ法（「入れ子ＰＣＲ法」とも呼ばれる）と呼ばれる。ネスティッドＰＣＲ法は、増幅対象配列特異的な第１のプライマーセットを用いて１回目のＰＣＲを行い、次に第１のプライマーセットによって増幅されるＤＮＡ断片を増幅し得る１対のプライマーであって第１のプライマーセットと共通のプライマーを含まない第２のプライマーセットを用いて、第１のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応生成物を鋳型として２回目のＰＣＲを行う方法である。これによって、１回目のＰＣＲにおいて目的とするＤＮＡ断片以外が増幅されることがあったとしても、２回目のＰＣＲにおいて再びその目的とするＤＮＡ断片でないＤＮＡ断片が増幅される可能性が極めて低いため、増幅すべきＤＮＡ配列に非常に特性の高い増幅を行うことができる。１回目のＰＣＲにおいて増幅すべき断片の長さは特に限定されないが、取り扱いの容易さと反応条件の設定しやすさの観点から約１００〜約９００塩基対が好ましく、約２００〜約９００塩基対がより好ましく、約４００〜約９００塩基対であることが特に好ましい。
【００１６】
２回目のＰＣＲにおいて増幅すべき断片の長さは、１回目のＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片より短いという点以外には特に限定されず、一般にＰＣＲにおいて適切な増幅が可能である範囲内であればよい。１回目のＰＣＲに使用できる好ましいプライマーは上述したとおりである。２回目のＰＣＲに使用するプライマー対は少なくともその一方が１６Ｓ  ｒＤＮＡと２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー領域配列から選ばれてもよく、２つのプライマーのいずれもが１６Ｓ  ｒＤＮＡまたは２３Ｓ  ｒＤＮＡ領域から選ばれてもよい。また、上述した１回目のＰＣＲおよび２回目のＰＣＲは、順番が逆でも良いが、その場合は、２回目のＰＣＲに使用するプライマー対の少なくとの１つのプライマーが１６Ｓ  ｒＤＮＡと２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー領域配列から選ばれるように１回目のＰＣＲに使用するプライマー対を選択しなければならない。
【００１７】
種々の生物のｒＤＮＡおよびスペーサー領域のヌクレオチド配列は当業者に知られており、本発明において検出対象とする乳酸菌（ラクトバチルス属細菌）についてもこれらの配列情報は例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅａ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄから入手可能である。得られた配列情報を詳細に比較検討することによって、目的とする菌種に特異的な一群のプライマーが選択される。
本発明においては、上述したような２本のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を用いて試料中のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。更に、場合により、上述第２のプライマー対を用いて１回目のＰＣＲの生成物を鋳型として２回目のＰＣＲが行われる。一方、増幅対象となるＤＮＡ断片（検出対象となるビール有害菌ＤＮＡ）を陽性対照として試料に用いた場合と同じプライマー対および反応条件を用いてＰＣＲを行うことができる。陽性対照として、一連の検査の対象となる菌種由来のＤＮＡを予め混合したＤＮＡ混合物を用いても良い。本発明に用いるプライマーは特異性が高いため、そのような混合物を鋳型とした場合でも各検査における陽性対照ＤＮＡのみを増幅することができる。
ＰＣＲの反応条件は一般的な条件で良く、例えば、約９５℃にて５〜１０分間処理した後、約９５℃にて１５〜秒間、約５５℃〜６０℃にて１５〜３０秒間、約７２℃にて１５〜３０秒間を２５〜３０サイクルでよい。これらの温度および時間はプライマーの長さおよびＧＣ含量等を考慮して、当業者の一般的能力の範囲で適宜変更することができることは言うまでもない。
【００１８】
増幅された核酸分子は、電気泳動等によってその存在およびヌクレオチド長（大きさ）を確認することができる。単に存在だけを知るためには、予めプライマーを標識しておき、ＰＣＲ後、ゲルろ過等により短いオリゴヌクレオチドを除去し、残存する標識を調べることができる。より正確には、存在及び長さ（大きさ）を同定し、陽性対照と同じ大きさの分子が試料を増幅対象としたＰＣＲ産物において観察された場合に（例えば、ゲル電気泳動上のバンドとして）、検出対象とした微生物、特にビール有害菌が存在していたと判断することができる。そのような分子が観察されない場合には、試料中には検出対象の微生物が存在していなかったと判断することができる。本発明において検査対象とするビール有害菌はいずれも商業的に入手可能、あるいは公的機関から分譲を受けることが可能である。
【００１９】
本発明の実施態様の一つにおいて、以下の表１に示したプライマー対を用いたＰＣＲを行うことにより、上述したように、増幅産物の有無を指標として試料中のラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４が検出される。
【表１】
表１．ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４検出用プライマー
2005006557.tif 000002
【００２０】
本発明の別の実施態様において、表２に示したプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、増幅産物の有無を指標として試料中のラクトバチルス・リンドネリが検出される。
【表２】
表２．ラクトバチルス・リンドネリ検出用プライマー
2005006557.tif 000003
【００２１】
本発明のさらに別の実施態様において、上記表２に示したプライマー対を用いてＰＣＲを行った結果、増幅産物（増幅断片）が得られた場合に、得られた増幅産物を鋳型として、下記表３に記載のプライマーセットＬＬ２Ｎ１、ＬＬ２Ｎ２またはＬＬ２Ｎ３のいずれかを用いてさらに第２のＰＣＲを行うことにより、第２のＰＣＲによる増幅産物の有無を指標として試料中のラクトバチルス・リンドネリが検出される。
【表３】
表３．ラクトバチルス・リンドネリ検出用プライマー（第２のＰＣＲ用）
2005006557.tif 000004
【００２２】
本発明に使用する各ＰＣＲにおけるプライマーの設計及び選択においては更に一般にＰＣＲ用プライマーとして望ましい条件を十分に考慮することができる。そのような条件は当業者にはよく知られたものであり、そのためのコンピュータープログラムも商業的に入手可能である。また、本発明のプライマーは、検出可能な適当な物質で標識されていてもよく、１〜８ヌクレオチドからなる追加の配列が５’末端側に付加されていてもよい。例えば、増幅された断片のヌクレオチド配列を決定する目的でこの断片を適当なベクターにクローニングできるように、各プライマーの５’末端に制限酵素の認識配列を含む６〜８ヌクレオチド程度の配列を付加することもできる。その場合に特異性を失わないように、上述したようなコンピュータープログラムを使用することもできる。
これらの各プライマーは、検出対象となる菌種に応じて組み合わせてキットとすることができる。また、複数の菌種を検出するために、各菌種に対応した複数のプライマーを同一キットに含めることもできる。
【００２３】
【実施例】
実施例１．  ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４）の検出および同定
（１）１６Ｓ  ｒＤＮＡ−２３Ｓ  ｒＤＮＡスペーサー領域の解析
特異的プライマーを設計するため、Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌ．ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）  ＪＣＭ１１２３  （標準株）の１６ＳｒＤＮＡおよび２３ＳｒＤＮＡのスペーサー領域の解析を実施した。
ＭＲＳ液体培地（メルク社）を用いて２５℃にてＬ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４株およびＬ．ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ  ＪＣＭ１１２３を３日間嫌気培養した。得られた菌体約１０８細胞を細胞溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．３５ｍＭ  シュークロース（ｐＨ８．０），  １ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム（シグマ社）、５０μｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチルムラミダーゼ（生化学工業社））０．９ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １．５Ｍ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ２０ｍｇ／ｍｌ  ＣＴＡＢ，  ４０ｍｇ／ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（ｐＨ８．０），  ８０μｇ／ｍｌ  プロテイナーゼ  Ｋ（ナカライテスク社））２ｍｌを添加し、５０℃で２時間インキュベートした。
【００２４】
インキュベート後、本溶液に２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（９７：３）の混合溶液を加え、良く懸濁した。懸濁後、１，０００ｇにて１０分間遠心分離を行い、水相と溶媒相（クロロホルム−イソアミルアルコール混合液相）に分離した。水相２ｍｌを新しい１５ｍｌ容遠心用チューブ採取し、等量のイソプロパノールおよび２μｌのグリコーゲン（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を加えて良く混和し、４℃で１時間放置した。放置後、１，０００ｇにて１０分間遠心分離を行うことにより、菌体ＤＮＡをペレット化した。得られたペレットを７０％エタノール１ｍｌで洗浄後、風乾し、０．５ｍｌ  Ｔｒｉｓバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解し、抽出ＤＮＡ溶液を得た。
【００２５】
得られた抽出ＤＮＡ溶液それぞれ５μｌを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応はタカラバイオ社のＥｘ  Ｔａｑを用いて表４に記載した反応液組成で行った。プライマーは細菌に対するユニバーサルプライマーである１５１２Ｆ  （５’−ＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴ−３’（配列番号１））およびＬＳ２３ｒ  （５’−ＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号２））を用いた。反応はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用いて、表５に記載の条件で実施した。
【００２６】
【表４】
表４．ＰＣＲ反応液組成
2005006557.tif 000005
【００２７】
【表５】
表５．ＰＣＲ反応条件
2005006557.tif 000006
【００２８】
上述のＰＣＲ反応により得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙ（プロメガ社）にクローニングした。得られたコロニーからＭ１３−２０とＭ１３Ｒｅｖのプライマーを用いてＰＣＲ反応で直接ＤＮＡ増幅産物を得た。得られた約５００ｂｐのＰＣＲ産物をそれぞれＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用いて精製し、Ｍ１３−２０あるいはＭ１３Ｒｅｖのプライマーを用いてシーケンス反応を行い、ＲＩＳＡ３８４（島津製作所）で塩基配列を決定した。シーケンス反応はアマシャム・バイオサイエンス社のダイターミネーターキットを用い、実験手順はキットの説明書に従って実施した。
スペーサー領域配列の増幅およびシーケンス反応に用いたプライマーの配列は以下の通りである。
Ｍ１３−２０      ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ  （配列番号３）
Ｍ１３Ｒｅｖ    ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ  （配列番号４）
【００２９】
塩基配列解析の結果得られたＬ．  ｓｐ．  ＡＢＣＣ７４のスペーサー領域のヌクレオチド配列を配列番号５に、Ｌ．ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓのスペーサー領域のヌクレオチド配列を配列番号６に示した。
（２）特異的プライマーの設計
（１）で得られた遺伝子配列を比較した結果、下記の配列部のみ２塩基以上異なっていることが判明した（配列番号７（Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４）および８（Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ））。
2005006557.tif 000007
そこで、特異的プライマーを取得するため、以下の配列の下流プライマーを設計した。
ＬＰＣＩＴＳＬ      ５’−ＧＴＴＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧ−３’  （配列番号９）
また、両者塩基配列の差異は２塩基であったため、特異性を高めるためにプライマー３’側から３番目の塩基を本来のＡの代わりにＣとしたＬＰＣＩＴＳＬ２を設計して特異性評価を行った。
ＬＰＣＩＴＳＬ２    ５’−ＧＴＴＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧ−３’  （配列番号１０）
以上のプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓおよびＬ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４とが識別され得るかを調査した。
【００３０】
上流プライマーは１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列中に存在する配列から得たＬＰＣＦ１（５’−ＣＡＣＣＣＡＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＧＧ−３’  （配列番号１１））を共通で用いた。
供試菌株の培養条件およびＤＮＡ抽出法は（１）と同様とし、ＰＣＲ反応は（１）に示した反応条件および試薬を用いて同様に実施した。ＰＣＲ反応により得られた反応液５μｌを、アガロース・ゲル電気泳動（２％  Ｗ／Ｖ、ＴＡＥバッファー（組成：１ＬあたりＴｒｉｓ  ４．８ｇ，  酢酸１．１４ｍｌ，  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０））に供した（１００Ｖ  ３０分間）。電気泳動後、サイバーグリーンにより３０分間染色し、陽性対照と同じ分子量のＰＣＲ産物の有無により判定した。アガロースは、シグマ社のＡ−９５３９を用い、ＴＡＥ緩衝液はナカライテスク社のものを用いた。また、サイバーグリーンはＢＭＡ社のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを１００ｍｌのＴＡＥバッファーに１０μｌを添加して作製した。
【００３１】
試験の結果、ＬＰＣＦ１とＬＰＣＩＴＳＬの組み合わせには十分な特異性は認められなかったものの、ＬＰＣＦ１とＬＰＣＩＴＳＬ２については、Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓとＬ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４を識別可能であることが判明した（表６）。
【表６】
表６．プライマーの特性評価
2005006557.tif 000008
【００３２】
（３）プライマーＬＰＣＦ１およびＬＰＣＩＴＳＬ２を組み合わせた場合の特異性調査
プライマーＬＰＣＦ１およびＬＰＣＩＴＳＬ２の組み合わせの特異性調査を以下の１１株を用いて実施した。微生物の培養およびＰＣＲは（１）および（２）と同様に行った。
【００３３】
調査した株：ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌ．  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）  ＤＳＭ２０６９０，  ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓ）  ＪＣＭ１０５９，  ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  ＪＣＭ  １１４９，  ラクトバチルス・ブクネリ（Ｌ．  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）  ＪＣＭ１１１５，  ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）  ＪＣＭ１１３３，  ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）  ＪＣＭ  １１２３，  ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）  ＪＣＭ  １１７３，  ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌ．  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）  ＪＣＭ  １１６４，  ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）  ＪＣＭ  １１３６，  ラクトバチルス・デルブルエキィ（Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）ＪＣＭ  １０１２，  ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．  ｃａｓｅｉ）  ＡＴＣＣ３３４。
試験の結果、いずれの細菌とも偽陽性反応を生じることはなく、プライマー、ＬＰＣＦ１およびＬＰＣＩＴＳＬ２の組み合わせの特異性は高いことが示された。
【００３４】
（４）プライマー対、ＬＰＣＦ１およびＬＰＣＩＴＳＬ２の組み合わせによる検出感度
ＬＰＣＩＴＳＬ２の配列は、本来のＬ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４由来の配列と１塩基異なっているので、ＬＰＣＦ１およびＬＰＣＩＴＳＬ２を用いた場合の検出感度の確認を行った。
Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４  株を実施例１の培養条件に準拠して培養し、バクテリア計算盤（エルマ社）を用いて、菌数を計測した。滅菌生理食塩水を用いて段階希釈を行い、検出用サンプルが５０細胞から５００００細胞の菌を含むように調製した。これを菌液として、（１）、（２）と同様にＤＮＡの抽出およびＰＣＲを行った。その結果、５０細胞程度の菌数があれば検出が可能であることが明らかになり、十分実用的な検出感度を持っていることが示された。
【００３５】
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１、３、４：ＰＣＲプライマー
配列番号１０：改変ＰＣＲプライマー
【００３６】
実施例２．ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌ．  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）の検出及び同定
（１）Ｌ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ６Ｓ  ｒＤＮＡ−２３Ｓ  ｒＤＮＡ間のスペーサー領域の解析
プライマーを設計するため、Ｌ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ＤＳＭ２０６９０の１６Ｓ  ｒＤＮＡと２３Ｓ  ｒＤＮＡの間にあるスペーサー領域の解析を実施した。
ＭＲＳ液体培地（メルク社）を用いて２５℃でＬ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ＤＳＭ２０６９０を３日間嫌気培養した。得られた菌体１０８細胞を実施例１に記載した細胞溶解バッファー０．９ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、実施例１に記載のＣＴＡＢバッファー２ｍｌを添加し、５０℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、本溶液に２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（９７：３）の混合溶液を加え、良く懸濁した。懸濁後、１，０００ｇにて１０分間遠心分離を行い、水相と溶媒相（クロロホルム−イソアミルアルコール混合相）に分離した。水相２ｍｌを新しい１５ｍｌ容遠心用チューブ採取し、等量のイソプロパノールを加えて良く混和し、４℃で１時間放置した。放置後、１，０００ｇにて１０分間遠心分離を行うことにより、菌体ＤＮＡをペレット化した。得られたペレットを７０％エタノール１ｍｌで洗浄後、風乾し、０．５ｍｌ  Ｔｒｉｓバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に溶解し、抽出ＤＮＡ溶液を得た。
得られたＤＮＡ溶液５μｌを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。反応液組成および反応条件は実施例１と同様である。プライマーは細菌に対するユニバーサルプライマーである１５１２Ｆ  （５’−ＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＧＴ−３’（配列番号１２））およびＬＳ２３ｒ  （５’−ＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１３））を用いた。
【００３７】
得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙ（プロメガ社）にクローニングした。得られたコロニーを直接Ｍ１３−２０（配列番号３）ならびにＭ１３Ｒｅｖ（配列番号４）のプライマーを用いてＰＣＲ反応で増幅しＤＮＡ増幅産物を得た。得られた約３００ｂｐのＰＣＲ産物（スペーサー領域１）ならびに約５００ｂｐのＰＣＲ産物（スペーサー領域２）をそれぞれＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（アマシャム・バイオサイエンス社）で精製し、Ｍ１３−２０あるいはＭ１３Ｒｅｖのプライマーを用いてシーケンス反応を行い、ＲＩＳＡ３８４（島津製作所）で塩基配列を決定した。シーケンス反応はアマシャム・バイオサイエンス社のダイターミネーターキットを用い、実験手順はキットの説明書に従って実施した。
スペーサー領域は長さと配列の異なるものが複数存在することが知られており、上記方法により２種のクローンが得られた。得られた２種類のスペーサー領域のヌクレオチド配列を配列番号１４（スペーサー領域１）及び配列番号１５（スペーサー領域２）に示した。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１２：ＰＣＲプライマー
【００３８】
（２）プライマーの設計
得られたスペーサー領域１の塩基配列をもとに上流プライマーＬＬＩＴＳＦ８  （５’−ＡＡＣＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号１６））を設計した。下流プライマーは既に公知配列である２３Ｓ  ｒＤＮＡ配列を参照してＬＬ２３ＳＲ１２（５’−ＣＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＡＡＣＴ−３’（配列番号１７））を設計した。このプライマー対は本明細書においてプライマーセットＬＬ２とも称する。
本プライマーの特異性調査を以下の１１株を用いて実施した。微生物の培養およびＤＮＡ抽出法は（１）と同様に行った。
【００３９】
調査した株：ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４（Ｌ．  ｓｐ．  ＡＢＢＣ７４）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓ）  ＪＣＭ１０５９，  ラクトバチルス・プランタルム（Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＪＣＭ  １１４９，  ラクトバチルス・ブクネリ（Ｌ．  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）  ＪＣＭ１１１５，  ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＪＣＭ１１３３，  ラクトバチルス・コリノイデス（Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）ＪＣＭ  １１２３，  ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＪＣＭ  １１７３，  ラクトバチルス・コリニフォリミス（Ｌ．  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）  ＪＣＭ  １１６４，  ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＪＣＭ  １１３６，  ラクトバチルス・デルブルエキィ（Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）ＪＣＭ  １０１２，  ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．  ｃａｓｅｉ）  ＡＴＣＣ３３４。
【００４０】
ＰＣＲ反応は、実施例１に示した反応条件および試薬を用いて同様に実施した。本ＰＣＲ反応により得られた反応液５μｌを、アガロース・ゲル電気泳動（２％  Ｗ／Ｖ  ｉｎ  ＴＡＥバッファーに供した（１００Ｖ  ３０分間）。電気泳動後、サイバーグリーンにより３０分間染色し、陽性対照と同じ分子量のＰＣＲ産物の有無により判定した。アガロースは、シグマ社のＡ−９５３９を用い、ＴＡＥ緩衝液はナカライテスク社のものを用いた。また、サイバーグリーンはＢＭＡ社のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを１００ｍｌのＴＡＥバッファーに１０μｌを添加して作製した。
その結果、いずれの細菌とも偽陽性反応を生じることはなく特異性は高いことが示された。
【００４１】
（３）プライマーセットＬＬ２のＬ．ｌｉｎｄｅｎｒｉに対する反応性
プライマーセットＬＬ２のＬ．ｌｉｎｄｎｅｒｉに対する反応性を確認するため、３株のＬ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ（Ｌ．  ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ＤＳＭ２０６９０、Ｌ．  ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ＤＳＭ  ２０６９１、Ｌ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ  ＤＳＭ  ２０６９２）との反応性を調査した。
ＤＮＡ抽出法、ＰＣＲ反応および電気泳動はすべて（２）と同じである。
試験の結果、いずれの菌株に対しても反応性は良好であり、当該プライマーはＬ．ｌｉｎｄｅｎｒｉの検出及び同定のために使用できることが示された。
【００４２】
（４）Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法によるＬ．ｌｉｎｄｅｎｒｉの検出及び同定
（２）で得られたプライマーを用いた場合であっても陽性判定が得られた場合を想定して、この判定の真偽を迅速に確認するため、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を設計した。
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法に用いる第２プライマーの配列と設計のもととなった領域を表７に示す。
【表７】
表７．Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用プライマー（２回目のＰＣＲ用プライマー）
2005006557.tif 000009
【００４３】
上述のプライマーを用いて、（２）に示した供試菌由来のＤＮＡに対してＰＣＲ反応を実施し、プライマーの特異性を調査した。ＰＣＲ反応条件および電気泳動条件は（２）と同様である。その結果、いずれのプライマーも供試菌株との交差反応は認められなかった。
【００４４】
（５）Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法におけるプライマーセットＬＬ２および、プライマーセットＬＬ２Ｎ１、ＬＬ２Ｎ２およびＬＬ２Ｎ３のＬ．ｌｉｎｄｅｎｒｉに対する反応性
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法用第２プライマーの反応性を確認するため、（３）で得られたＰＣＲ産物を鋳型としてプライマーセットＬＬ２Ｎ１、ＬＬ２Ｎ２およびＬＬ２Ｎ３を用いてＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲ産物は１０００倍希釈したものを用い、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応液組成および反応条件は表８および表９の通りとした。試験の結果、これらの第２プライマーセットはいずれも低濃度のＰＣＲ産物にも良好な反応性を示した。
【００４５】
【表８】
表８．Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応液組成
2005006557.tif 000010
【００４６】
【表９】
表９．Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応条件
2005006557.tif 000011
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、ラクトバチルスｓｐ．  ＡＢＢＣ７４およびラクトバチルス・リンドネリを迅速かつ特異的に検出及び同定することが出来る。また、本発明の方法は極めて特異性が高いため、食品等の品質検査においてしばしば問題になる偽陽性反応を回避することが出来る。
【００４８】
【配列表】
2005006557.tif 000012
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2005006557.tif 000014
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