(57)【要約】【課題】簡便にかつ短時間で、ＤＮＡとＤＮＡ中の特定配列に特異的に結合する分子との結合を検出する。【解決手段】転写因子ＴＦＩＩＤ１および転写因子ＴＦＩＩＢ２の結合サイト１６が標識済みＤＮＡに存在するか否か検出する場合には、転写因子ＴＦＩＩＤ１、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３のすべてをＤＮＡ溶液に添加し、結合性生物をＦＣＳ測定して並進拡散時間を求めることにより、結合サイト１６の存在を精度良く検出することができる。試料の混合と蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による計測により、並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液と転写因子ＴＦＩＩＤとを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。
【請求項２】
前記混合するステップは、転写因子ＴＦＩＩＢをさらに混合することを特徴とする請求項１の転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。
【請求項３】
前記混合するステップは、転写因子ＴＦＩＩＢおよび抗ＴＦＩＩＢ抗体をさらに混合することを特徴とする請求項１の転写因子ＴＦＩＩＤと二本鎖ＤＮＡの結合を検出する方法。
【請求項４】
検出の対象である溶液と転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする溶液中の転写因子ＡＰ−１を検出する方法。
【請求項５】
検出の対象である二本鎖ＤＮＡを含む溶液と、転写因子ＡＰ−１と、転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする転写因子ＡＰ−１が結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを検出する方法。
【請求項６】
検出の対象である溶液と、転写因子が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有し、
前記混合するステップにおいて前記検出の対象である溶液の量を段階的に増加して混合し、各段階の量で前記検出の対象である溶液を混合した後に前記並進拡散時間を求めるステップを行うことを特徴とする溶液中の転写因子を検出する方法。
【請求項７】
細胞に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加した後に細胞核の抽出を行うステップと、
抽出された前記細胞核と、転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする細胞の核抽出物中の転写因子ＡＰ−１を検出する方法。
【請求項８】
細胞に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加した後に細胞核の抽出を行うステップと、
抽出された前記細胞核と転写因子ＮＦ−κＢが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする細胞の核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢを検出する方法。
【請求項９】
細胞にＡＰＤＣ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ）を添加した後に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加し、その後に細胞核の抽出を行うステップと、
抽出された前記細胞核と転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合するステップと、
蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めるステップとを有することを特徴とする細胞の核抽出物中の転写因子ＡＰ−１を検出する方法。
【請求項１０】
細胞に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加した後に細胞核の抽出を行い、抽出された前記細胞核と転写因子ＮＦ−κＢが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合する第一の混合ステップと、
細胞にＡＰＤＣを添加した後に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加し、その後に細胞核の抽出を行い、抽出された前記細胞核と転写因子ＮＦ−κＢが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合する第二の混合ステップと、
前記第一の混合ステップで得られた混合液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を、蛍光相関分光法により求める第一の算出ステップと、
前記第二の混合ステップで得られた混合液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を、蛍光相関分光法により求める第二の算出ステップと、
前記第一の算出ステップで求められた並進拡散時間と前記第二の算出ステップで求められた並進拡散時間とを比較するステップとを有することを特徴とする細胞の核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢを検出する方法。
【請求項１１】
前記蛍光相関分光法のコンフォーカルボリューム中における前記蛍光標識された二本鎖ＤＮＡの粒子数が２〜５であることを特徴とする請求項１，４，５，６，７，８，９または１０のＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法に関し、特に蛍光相関分光計（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＦＣＳ）を用いた検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１（特許第３１６９６１０号公報）は、二本鎖ＤＮＡ中の選択されたテスト配列に結合し得る分子をスクリーニングする方法を記載する。
特許文献２（特許第２９５３７８３号公報）は、遺伝子転写レベルで活性な医薬の有効な同定方法を記載する。
特許文献３（特開２００１−３２１１９９号公報）は、生物学的資料中のＤＮＡ結合タンパク質を定量する方法を記載する。
特許文献４（特開２００３−８８３６９号公報）は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を利用してＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を検出する方法、および分子量の大小と並進拡散時間（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｉｍｅ）の大小との関係を記載する。
特許文献５（特表２００２−５４３４１４号公報）は、試料中の蛍光分子又は他の粒子を特徴付ける方法、および蛍光強度多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）分布分析（ＦＩＭＤＡ）および蛍光自己たたみ込み（ａｕｔｏｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）強度分布分析（ＦＡＣＩＤ）から並進拡散時間が得られることを記載する。
【０００３】
【特許文献１】
特許第３１６９６１０号公報
【特許文献２】
特許第２９５３７８３号公報
【特許文献３】
特開２００１−３２１１９９号公報
【特許文献４】
特開２００３−８８３６９号公報
【特許文献５】
特表２００２−５４３４１４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来技術のうち、特許文献２（特許第２９５３７８３号公報）、特許文献３（特開２００１−３２１１９９号公報）および特許文献４（特開２００３−８８３６９号公報）に記載される各検出方法は、特定の配列、または特定の配列を有する分子を検出する際に、放射性同位元素を用いたり、電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などを行うので、操作が煩雑で検出結果を得るまでに時間がかかる問題がある。
特許文献４（特開２００３−８８３６９号公報）および特許文献５（特表２００２−５４３４１４号公報）は、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法については記載しない。
【０００５】
本発明の目的は、簡便にかつ短時間で、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を検出する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する本発明の特徴は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液および転写因子ＴＦＩＩＤを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子ＴＦＩＩＤとの反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、サンプル中の二本鎖ＤＮＡの濃度が２ｎＭ〜５ｎＭである溶液を用いて各実験を行うと、ＦＣＳ測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくＦＣＳ測定が行え、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
【０００７】
本発明の他の特徴は、蛍光標識を付加された二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子ＴＦＩＩＤおよび転写因子ＴＦＩＩＢを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにあり、転写因子ＴＦＩＩＢを加えることによって、反応物の並進拡散時間が大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。また、さらに抗ＴＦＩＩＢ抗体を加えることによって、反応物の並進拡散時間がさらに大きくなるので、結合がより精度良く検出できる。
二本鎖ＤＮＡに転写因子ＦＴＩＩＤが結合する配列が含まれているか検出する場合は、二本鎖ＤＮＡに蛍光標識を付加して請求項１から３の方法を行い、結合が検出されれば二本鎖ＤＮＡに転写因子ＦＴＩＩＤが結合する配列が含まれることになる。
また、溶液中に転写因子ＦＴＩＩＤが含まれているか検出する場合は、この溶液と、転写因子ＦＴＩＩＤが結合する配列を有しかつ蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求める。このとき、転写因子ＴＦＩＩＢを添加するか、または、転写因子ＴＦＩＩＢおよび抗ＴＦＩＩＢ抗体を添加することにより、転写因子ＴＦＩＩＤの存在を精度良く検出することができる。
【０００８】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを含む溶液とを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子ＡＰ−１との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【０００９】
本発明の他の特徴は、検出の対象である二本鎖ＤＮＡを含む溶液、転写因子ＡＰ−１、および転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。
この特徴によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子ＡＰ−１との反応を簡便に短時間で得ることができる。
【００１０】
本発明の他の特徴は、検出の対象である溶液と転写因子が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合する際に、検出の対象である溶液の量を段階的に増加して、各段階で蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１を検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子ＡＰ−１が結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢを検出する場合は、蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとして転写因子ＮＦ−κＢが結合する結合サイトを有する二本鎖ＤＮＡを用い、細胞核抽出物の溶液の量を段階的に増加して混合する。
【００１１】
本発明の他の特徴は、細胞に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。ＨｅＬａ細胞の核抽出物中の転写因子ＡＰ−１を検出する場合は濃度５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αで３０分間刺激し、ＨｅＬａ細胞の核抽出物中の転写因子ＡＰ−１を検出する場合は１５分間刺激するとよい。腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの刺激によって細胞核抽出物中の転写因子が活性化し、二本鎖ＤＮＡとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子を検出することができる。
【００１２】
本発明の他の特徴は、細胞にＡＰＤＣを添加した後に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と転写因子ＡＰ−１が結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとを混合し、蛍光相関分光法により混合溶液中の蛍光標識を有する物質の並進拡散時間を求めることにある。本発明によれば、細胞核抽出の際にＡＰＤＣおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激を行うことによって、転写因子ＡＰ−１が活性化し二本鎖ＤＮＡとの結合がしやすくなるので、精度良く転写因子ＡＰ−１を検出することができる。ＡＰＤＣによる刺激時間は２時間、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激時間は３０分間であるとよい。
【００１３】
本発明の他の特徴は、細胞の核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢと、転写因子ＮＦ−κＢが結合する配列を有して蛍光標識された二本鎖ＤＮＡとの反応生成物の並進拡散時間から細胞の核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢを検出するにあたって、細胞に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αのみで刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間と、ＡＰＤＣ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ）および腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの刺激を行った場合の反応生成物の並進拡散時間とを比較することにある。腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αは転写因子ＮＦ−κＢを活性化し、ＡＰＤＣは転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制するので、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ、細胞核抽出物に転写因子ＮＦ−κＢが含まれると言え、精度良く転写因子ＮＦ−κＢを検出することができる。
【００１４】
また、ＦＣＳ測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５であれば、精度よくＦＣＳ測定が行え、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。特に、コンフォーカルボリュームにおける粒子数が２〜３でも精度良い検出ができるので、多量の二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ結合タンパク質を用意できない場合や、少量のサンプルだけで検出結果を得たい場合にも、本発明の検出方法は適している。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード（ｃｒｕｄｅ）な試料を用いても、二本鎖ＤＮＡと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖ＤＮＡと１塩基またな２塩基しか違いのない二本鎖ＤＮＡを添加しても、本来の二本鎖ＤＮＡと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、ＦＣＳによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のＤＮＡ結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の様態では、ＤＮＡとＤＮＡ中の特定配列部分に結合するタンパク質（以下ＤＮＡ結合タンパク質と呼ぶ）との結合を検出するための様々な実験を行う。実験の目的別に実施例として説明する。実験では生体分子の反応過程後にＦＣＳ測定を行って、生体分子の並進拡散時間を求める。
並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。
従って、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応の前後でＤＮＡの並進拡散時間の増加を検出することにより、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との結合反応を検出することができる。
【００１６】
【実施例】
各実施例の実験内容と実験結果の概要を表１〜４に示し、後に各実施例を説明する。
【００１７】
【表１】
2005006566.tif 000003
【００１８】
【表２】
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【００１９】
【表３】
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【００２０】
【表４】
2005006566.tif 000006
【００２１】
（実施例１）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子ＴＦＩＩＤおよび転写因子ＴＦＩＩＢとの結合反応を検出する。
ＤＮＡとして、図５に示す二本鎖ＤＮＡ１０を用いる。二本鎖ＤＮＡ１０は、５’末端に蛍光標識４（ＴＡＭＲＡラベル）をラベル済みのオリゴＤＮＡ１１と、オリゴＤＮＡ１１に相補的な拡散配列を持つオリゴＤＮＡ１２とからなる。二本鎖ＤＮＡ１０は転写因子ＴＦＩＩＤおよび転写因子ＴＦＩＩＢの結合する結合サイト１６であるＴＡＴＡＡ配列（相補配列はＡＴＡＴＴ配列）を有する。
ＤＮＡ結合タンパク質として、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＡＴＡ結合タンパク質）を含む転写因子ＴＦＩＩＤ１、および転写因子ＴＦＩＩＢ２を用いる。さらに、転写因子ＴＦＩＩＢ２に結合する抗体として抗ＴＦＩＩＢ抗体３を用いる。
転写因子ＴＦＩＩＤ１、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３として以下のものを用いる。
【００２２】
【表５】
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【００２３】
＜二本鎖ＤＮＡ１０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ１０を準備する。二本鎖ＤＮＡ１０を準備するために以下のものを用いる。
【００２４】
【表６】
2005006566.tif 000008
【００２５】
ＳＴＥバッファー中でオリゴＤＮＡ１１およびオリゴＤＮＡ１２を反応させ、９５℃で５分間加熱した後、２０℃までゆっくり冷却する。次いで、ＰＣＲ機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびＭｇＣｌ２を添加し、３７℃で１時間反応させる。添加量は反応液１００μｌに対してそれぞれ１μｌである。その後、反応液を精製キットＭＥＲｍａｉｄ  ＳＰＩＮ（ＢＩＯ社  １０１）によって精製し、オリゴＤＮＡ１１とオリゴＤＮＡ１２とからなる二本鎖ＤＮＡ１０をｄＷで抽出する。
抽出した二本鎖ＤＮＡ１０を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）で測定し、粒子数（ｎ）が２０程度になるようにｄＷで希釈し、二本鎖ＤＮＡ１０の溶液を作る（溶液中の二本鎖ＤＮＡ１０の濃度は２ｎＭ〜５ｎＭとなる）。粒子数（ｎ）が２０程度の二本鎖ＤＮＡの溶液を用いて各実験を行うと、ＦＣＳ測定の際にコンフォーカルボリュームにおける粒子数は２〜５となり、精度よくＦＣＳ測定が行え、二本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との結合反応が精度良く検出できる。
【００２６】
実験１−１．ＴＦＩＩＤ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と転写因子ＴＦＩＩＤ、転写因子ＴＦＩＩＢおよび抗ＴＦＩＩＢ抗体の反応実験
図１に実験１−１の手順と生成物の概略を示す。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００２７】
（１）未反応の二本鎖ＤＮＡ１０のＦＣＳ測定
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を３０分間静置した後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。
【００２８】
【表７】
2005006566.tif 000009
【００２９】
【表８】
2005006566.tif 000010
【００３０】
【表９】
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【００３１】
ＤＮＡ結合タンパク質は添加されていないのでＤＮＡ−タンパク複合体は形成せず、二本鎖ＤＮＡ１０は未反応のままである。
【００３２】
（２）二本鎖ＤＮＡ１０と転写因子ＴＦＩＩＤ１との反応
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を３０分間静置した後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。転写因子ＴＦＩＩＤは予めＴＦＩＩＤ用バッファーで２５ｎｇ／μｌに調整しておく。
【００３３】
【表１０】
2005006566.tif 000012
【００３４】
生成物は二本鎖ＤＮＡ１０の結合サイト１６に転写因子ＴＦＩＩＤ１が結合したＤＮＡ−タンパク複合体である。
【００３５】
（３）（２）の反応済み溶液と転写因子ＴＦＩＩＢ２との反応
（２）の反応済み溶液２０μｌに、８５ｎｇ／μｌの転写因子ＴＦＩＩＢ２を１μｌ加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を２０分間静置した後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖ＤＮＡ１０の結合サイト１６に転写因子ＴＦＩＩＤ１と転写因子ＴＦＩＩＢ２が結合したＤＮＡ−タンパク複合体である。
【００３６】
（４）（３）の反応済み溶液と抗ＴＦＩＩＢ抗体３との反応
（３）の反応済み溶液２０μｌに、抗ＴＦＩＩＢ抗体３を１μｌ加え、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、室温を２０分間静置した後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。
生成物は二本鎖ＤＮＡ１０の結合サイト１６に転写因子ＴＦＩＩＤ１と転写因子ＴＦＩＩＢ２が結合し、さらに転写因子ＴＦＩＩＢ２に抗ＴＦＩＩＢ抗体３が結合したＤＮＡ−タンパク複合体である。
【００３７】
実験１−２．ＴＦＩＩＤ結合配列を持たないＤＮＡ（蛍光標識有り）と転写因子ＴＦＩＩＤ、転写因子ＴＦＩＩＢおよび抗ＴＦＩＩＢ抗体の反応実験
二本鎖ＤＮＡ１０の代わりに、転写因子ＴＦＩＩＤと結合する結合サイト１６を含まない二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いて、実験１−１（１）〜（４）と同様の反応実験を行った。
【００３８】
図８に実験１−１および１−２での生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖ＤＮＡ１０を用いた実験１−１では、反応前の二本鎖ＤＮＡ１０の並進拡散時間に比べて、各反応後のＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間が大きくなっており、二本鎖ＤＮＡ１０と転写因子ＴＦＩＩＤ１、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３とが結合したことが確認できた。一方、二本鎖大腸菌由来ランダム配列ＤＮＡ１７を用いた実験１−２では、いずれも並進拡散時間の変化はほとんどなく、ＤＮＡ結合タンパク質との結合は確認できなかった。特に、転写因子ＴＦＩＩＤ１、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３の３つのタンパク質すべてが結合したＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間は他のＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間よりも著しく大きい。
【００３９】
従って、転写因子ＴＦＩＩＤ１および転写因子ＴＦＩＩＢ２の結合サイト１６が蛍光標識ＤＮＡに存在するか否か検出する場合には、転写因子ＴＦＩＩＤ１、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３のすべてをＤＮＡ溶液に添加し、ＤＮＡ−タンパク複合体をＦＣＳ測定して並進拡散時間を求めることにより、結合サイト１６の存在を精度良く検出することができる。
また、ＤＮＡ結合タンパク質の溶液に転写因子ＴＦＩＩＤ１が存在するか否か検出する場合には、結合サイト１６を有する蛍光標識二本鎖ＤＮＡ１０とともに、転写因子ＴＦＩＩＢ２および抗ＴＦＩＩＢ抗体３を反応液に添加し、ＤＮＡ−タンパク複合体をＦＣＳ測定して並進拡散時間を求めることにより、転写因子ＴＦＩＩＤ１の存在を精度良く検出することができる。
【００４０】
（実施例２）
本実施例ではＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質である転写因子ＡＰ−１との結合反応について、転写因子ＡＰ−１の濃度依存を検出する。
ＤＮＡとして、図６に示す二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。二本鎖ＤＮＡ２０は、５’末端に蛍光標識４（ＴＡＭＲＡラベル）を有するオリゴＤＮＡ２１と、オリゴＤＮＡ２１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ２２とからなる。二本鎖ＤＮＡ２０は転写因子ＡＰ−１の結合する結合サイト２６であるＴＧＡＧＴＣＡ配列（相補配列はＡＣＴＣＡＧＴ配列）を有する。
ＤＮＡ結合タンパク質として次の転写因子ＡＰ−１５を用いる。
【００４１】
【表１１】
2005006566.tif 000013
【００４２】
＜二本鎖ＤＮＡ２０の作成と調整＞
まず、検出実験に用いる二本鎖ＤＮＡ２０を準備する。二本鎖ＤＮＡ２０を準備するために以下のものを用いる。
【００４３】
【表１２】
2005006566.tif 000014
【００４４】
ＳＴＥバッファー中でオリゴＤＮＡ２１およびオリゴＤＮＡ２２を反応させ、９５℃で５分間加熱した後、２０℃までゆっくり冷却する。次いで、ＰＣＲ機器内または室温放置でアニーリングする。アニーリングした反応液にエキソヌクレアーゼＩおよびＭｇＣｌ２を添加し、３７℃で１時間反応させる。添加量は反応液１００μｌに対してそれぞれ１μｌである。その後、反応液をＭＥＲｍａｉｄ  ＳＰＩＮ（ＢＩＯ社  １０１）によって精製し、オリゴＤＮＡ２１とオリゴＤＮＡ２２とからなる二本鎖ＤＮＡ２０をｄＷで抽出する。
抽出した二本鎖ＤＮＡ２０を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）で測定し、粒子数（ｎ）が２０〜３０程度になるようにｄＷで希釈し、二本鎖ＤＮＡ２０の溶液を作る。
未標識の二本鎖ＤＮＡ２４は、オリゴＤＮＡ２１（蛍光標識４をラベル済み）の代わりに同じ配列で蛍光標識していないオリゴＤＮＡを用いて、二本鎖ＤＮＡ２０と同様にして作成・抽出する。抽出した二本鎖ＤＮＡ２４を吸光度（ＯＤ２６０値）を測定し、ＯＤ２６０値が２０となるようにｄＷで希釈し、二本鎖ＤＮＡ２４の溶液を作る。
【００４５】
実験２−１．ＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と転写因子ＡＰ−１との反応実験。濃度が異なる転写因子ＡＰ−１を添加して実験。
図２に実験２−１の手順と生成物の概略を示す。以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００４６】
【表１３】
2005006566.tif 000015
【００４７】
【表１４】
2005006566.tif 000016
【００４８】
濃度０ｎｇ／μｌの転写因子ＡＰ−１５を用いた反応では、ＤＮＡ結合タンパク質は添加されていないのでＤＮＡ−タンパク質複合体は存在せず、二本鎖ＤＮＡ２０は未反応のままである（図２の（１）を参照）。反応後の生成物は二本鎖ＤＮＡ２０の結合サイト２６に転写因子ＡＰ−１５が結合したものである（図２の（２）を参照）。未反応の二本鎖ＤＮＡ２０と各転写因子ＡＰ−１５濃度のときの生成物について、ＦＣＳ測定の結果を表１５に示す。
【００４９】
【表１５】
2005006566.tif 000017
【００５０】
結転写因子ＡＰ−１の濃度が６００ｎｇ／μｌのときに生成物の並進拡散時間が大きく伸び、濃度依存性が認められた。転写因子ＡＰ−１の濃度が３００ｎｇ／μｌまでと比較して、６００ｎｇ／μｌから１５００ｎｇ／μｌまでの並進拡散時間との差は小さいので、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子ＡＰ−１５との結合が６００ｎｇ／μｌで飽和に達していると言える（図９参照）。
また、並進拡散時間が４３２μｓである未反応の二本鎖ＤＮＡ２０（Ｋ１）と、並進拡散時間が８６２．４μｓである生成物（Ｋ２）との存在比は、転写因子ＡＰ−１の濃度が６００ｎｇ／μｌ以上でほぼ一定なので、濃度６００ｎｇ／μｌで十分に結合反応が生じており、そして飽和転写因子ＡＰ−１の濃度が１５００ｎｇ／μｌの場合には、一定濃度の二本鎖ＤＮＡ２０に対する転写因子ＡＰ−１の結合が飽和状態にあると考えられる（図１０参照）。
【００５１】
実験２−２．ＡＰ−１結合配列を持つ二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と転写因子ＡＰ−１との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
図３に実験２−２の手順と生成物の概略を示す。配列は二本鎖ＤＮＡ２０と同じであるが未標識二本鎖ＤＮＡ２４を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。転写因子ＡＰ−１５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じていた６００ｎｇ／μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００５２】
【表１６】
2005006566.tif 000018
【００５３】
実験２−３．ＡＰ−１結合配列を持たないＤＮＡ（未標識）と転写因子ＡＰ−１との反応実験。ＡＰ−１結合配列を持たないＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験
図４に実験２−３の手順と生成物の概略を示す。配列がＡＰ−１結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ１８を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。転写因子ＡＰ−１５の濃度は、実験２−１で十分に結合反応が生じている６００ｎｇ／μｌとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００５４】
【表１７】
2005006566.tif 000019
【００５５】
実験２−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０ろ転写因子ＡＰ−１  ５とのＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖ＤＮＡ２４を添加することで、未反応ＤＮＡの並進拡散時間に近づいた。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子ＡＰ−１５との結合が阻害されることが確認できた（図３の（２）、図１１参照）。
また、実験２−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と転写因子ＡＰ−１５とのＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間は、未標識二本鎖ＤＮＡ１８を添加しても未反応ＤＮＡの並進拡散時間には近づかなかった（図４の（２）、図１１参照）。
以上の実験２−２および実験２−３で行われた競合アッセイの結果から、転写因子ＡＰ−１は、二本鎖ＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００５６】
タンパク質の溶液中に転写因子ＡＰ−１が含まれるか検出する場合、蛍光標識をラベルされた二本鎖ＤＮＡ２０を含む溶液に、タンパク質の溶液を段階的に添加して生成物をＦＣＳ測定し、並進拡散時間を求めれば、転写因子ＡＰ−１の存在を検出することができる。
【００５７】
（実施例３）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物内の転写因子との結合反応について、細胞核抽出物の濃度依存を検出する。ＤＮＡとして、実施例２で用いた二本鎖ＤＮＡ２０を用いる。
【００５８】
＜細胞から核抽出物を生成する＞
細胞から核抽出物を生成するために以下のものを用いる。
【表１８】
2005006566.tif 000020
【００５９】
ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍディッシュにコンフルエントの状態にする。ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、０．５％ＦＣＳ／ＤＭＥＭに交換し、ＴＮＦ−α１００ｎｇ／ｍｌで刺激する。刺激から２時間後の細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄後、下記の操作を行い核抽出物を得る。
▲１▼１ｍｌの氷温低浸透圧溶解バッファーにスクレーパーで回収する。バッファーは、ｐＨ７．４で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのジチオスレイトール、Ｅ−６４含有プロテアーゼ阻害剤混合物、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲２▼１５分後、氷温でインキュベートし、０．０５％ＮＰ−４０を添加する。その後、４℃で１分間、１０００ｇで遠心分離する。
▲３▼核ペレットが集められ、１００μｌの高浸透圧抽出バッファー中に再混濁される。バッファーは、ｐＨ７．４で２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、０．５ｍＭのジチオスレイトール、Ｅ−６４含有プロテアーゼ阻害混合剤、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、ベスタチン、アプロチニンを含む。
▲４▼１５分後、氷温でインキュベートし、４℃で１分間、１０００ｇで遠心分離する。
▲５▼上澄みを核抽出物として得、タンパク質定量キットを用いて核抽出物の含有タンパク量を定量する。核抽出物はスモールスケールで分注して−８０℃以下で保存する。
【００６０】
＜Ｐｏｌｙ  ｄＩ−ｄＣコポリマーの調整＞
二本鎖ＤＮＡ２０に目標タンパク質以外の物質が付着しないように、核抽出物にコポリマーを加える。コポリマーとしてＰｏｌｙ  ｄＩ−ｄＣ（Ｓｉｇｍａ製  Ｐ−４９２９）を用いる。コポリマーを以下のように調整する。
▲１▼再生バッファーにコポリマーを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように混濁し、１．５ｍｌ容量のマイクロ遠心チューブに入れる。再生バッファーは、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０で１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で１ｍＭのＥＤＴＡを含む。
▲２▼コポリマーを超音波セッティング４で２０秒間超音波処理し、均一な長さにする。
▲３▼コポリマーを９０℃で１０分間熱した後、室温までゆっくり冷却する。
▲４▼５μｌずつ分注して−２０℃で保存する。
▲５▼使用前に４５μｌの蒸留水を加えて、１ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
【００６１】
実験３−１．ＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００６２】
【表１９】
2005006566.tif 000021
【００６３】
０ｎｇの細胞核抽出物を用いた反応では、ＤＮＡ結合タンパク質は添加されていないのでＤＮＡ−タンパク複合体は存在せず、二本鎖ＤＮＡ２０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖ＤＮＡ２０に細胞核抽出物中に含まれるＤＮＡ結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖ＤＮＡ２０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、ＦＣＳ測定の結果を表２０に示す。
【００６４】
【表２０】
2005006566.tif 000022
【００６５】
細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が３０μｇで最大となる濃度依存性が認められた。（図１２参照）
また、二本鎖ＤＮＡ２０に転写因子ＡＰ−１がｃ−Ｊｕｎ／ｃ−Ｊｕｎのホモダイマーで結合してＤＮＡ−タンパク複合体が構成されていると仮定した場合、分子量の３乗根と並進拡散時間は比例するからＤＮＡ−タンパク複合体の分子量から求めて、ＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間が１１１３．０μｓとなる。並進拡散時間が１１１３．０μｓである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が６５８．５μｓである未反応の二本鎖ＤＮＡ２０の存在割合との合計が略１００％である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１が二本鎖ＤＮＡ２０に結合したものであると言える。（図１３参照）
【００６６】
実験３−２．ＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出物濃度を段階的に変えて実験。
ＤＮＡとして、図７に示す二本鎖ＤＮＡ３０を用いる。二本鎖ＤＮＡ３０は、５’末端に蛍光標識４（ＴＡＭＲＡラベル）を有するオリゴＤＮＡ３１と、オリゴＤＮＡ３１に相補的な核酸配列を持つオリゴＤＮＡ３２とからなる。二本鎖ＤＮＡ３０は転写因子ＮＦ−κＢの結合する結合サイト３３であるＧＧＧＧＣＴＴＴ配列（相補配列はＣＣＣＣＴＧＡＡＡ配列）を有する。
二本鎖ＤＮＡ３０は１００ｎＭのオリゴＤＮＡ３１（蛍光標識）と１００ｎＭのオリゴＤＮＡ３２を用いて、二本鎖ＤＮＡ２０と同様にして作成する（実施例２を参照）。以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行い、反応生成物をＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。
【００６７】
【表２１】
2005006566.tif 000023
【００６８】
【表２２】
2005006566.tif 000024
【００６９】
実験３−１の場合と同様に、濃度０μｇの細胞核抽出物を用いた反応では、ＤＮＡ結合タンパク質は添加されていないのでＤＮＡ−タンパク複合体は存在せず、二本鎖ＤＮＡ３０は未反応のままである。反応後の生成物は二本鎖ＤＮＡ３０に細胞核抽出物中に含まれるＤＮＡ結合タンパク質が結合したものである。未反応の二本鎖ＤＮＡ３０および細胞核抽出物が各濃度のときの生成物について、ＦＣＳ測定の結果を表２３に示す。
【００７０】
【表２３】
2005006566.tif 000025
【００７１】
本実験でも、実験３−１の場合と同様に、細胞核抽出物の濃度の増加と共に、生成物の並進拡散時間が増加し、細胞核抽出物の濃度が３０μｇで最大となり、濃度依存性が認められた。（図１４参照）
また、反応生成物が二本鎖ＤＮＡ３０と転写因子ＮＦ−κＢとの結合生成物で、＊ｐ５０／ｐ５０による結合とｐ５０／ｐ６５による結合が平均的に存在していると仮定した場合、反応生成物の並進拡散時間が１４６８．７μｓとなる。並進拡散時間が１４６８．７μｓである反応生成物の存在割合と並進拡散時間が５６８．７μｓである未反応の二本鎖ＤＮＡ３０の存在割合を図１５に示す。各存在割の合計は略１００％である。従って、この実験での反応生成物は細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢが二本鎖ＤＮＡ３０に結合したものであると言える。
【００７２】
細胞核抽出物に転写因子が含まれるか検出する場合、実施例２で説明したのと同様に、転写因子が結合する結合サイトを有し、かつ蛍光標識をラベルされた二本鎖ＤＮＡを含む溶液に、細胞核抽出物を段階的に添加して生成物をＦＣＳ測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、ＦＣＳ測定結果、ＤＮＡ−タンパク複合体の分子量および未反応二本鎖ＤＮＡの分子量から、ＤＮＡ−タンパク複合体と未反応二本鎖ＤＮＡとのおおよその存在比を検出することができる。
細胞核抽出物に転写因子ＡＰ−１が含まれるか検出する場合には、二本鎖ＤＮＡとして転写因子ＡＰ−１が結合する結合サイト２６を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖ＤＮＡ２０を、細胞核抽出物に転写因子ＮＦ−κＢが含まれるか検出する場合には、二本鎖ＤＮＡとして転写因子ＮＦ−κＢが結合する結合サイト３３を有しかつ蛍光標識をラベルされた二本鎖ＤＮＡ３０を用いる。細胞核抽出物の添加量が増加すると共に並進拡散時間が大きくなり、最大値を取った後に並進拡散時間が減少すれば、転写因子が細胞核抽出物中に含まれることになる。
【００７３】
（実施例４）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１との結合反応を、競合ＤＮＡを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００７４】
実験４−１．ＡＰ−１結合配列を持つ二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ２０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ２４を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた３０μｇとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００７５】
【表２４】
2005006566.tif 000026
【００７６】
実験４−２．ＡＰ−１結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ２０と一部異なっていて蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ２５を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。二本鎖ＤＮＡ２５は二本鎖ＤＮＡ２０の結合サイト２６部分が２塩基だけ異なっている配列である（図６参照）。二本鎖ＤＮＡ２５を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７７】
実験４−３．ＡＰ−１結合配列を持たない二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列がＡＰ−１結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、未標識の二本鎖ＤＮＡ１８を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。二本鎖ＤＮＡ１８を用いて実験４−１と同様に実験を行った。
【００７８】
図１６に実験４−１から４−３の結果を示す。実験４−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質とが結合してできたＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ２０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、二本鎖ＤＮＡ２４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験４−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ２５を添加した場合と競合ＤＮＡが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１５との反応について、二本鎖ＤＮＡ２０と２塩基しか差がない二本鎖ＤＮＡ２５による結合阻害は認められなかった。
また、実験４−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合ＤＮＡが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ２０と細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１５との反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験４−１から４−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１は、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００７９】
（実施例５）
本実施例ではＤＮＡと細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢとの結合反応を、競合ＤＮＡを添加した競合アッセイを行うことによって検出する。
【００８０】
実験５−１．ＮＦ−κＢ結合配列を持つ二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ３０と同じであるが蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ３４を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。細胞核抽出物の濃度は、実験３−１で十分に結合反応が生じていた３０μｇとする。
以下の溶液を容器内に入れ、チップの先端で静かにかき混ぜ、軽くタッピングをして、３４℃で１時間反応後、ＦＣＳ測定して並進拡散時間を求める。ＦＣＳ測定は各反応後に、波長５４３ｎｍ、出力１００μＷのレーザー光を１回に１５秒照射する条件で５回行った。
【００８１】
【表２５】
2005006566.tif 000027
【００８２】
実験５−２．ＮＦ−κＢ結合配列と一部異なる配列を持つ二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列が二本鎖ＤＮＡ３０と一部異なり蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ３５を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。二本鎖ＤＮＡ３５は二本鎖ＤＮＡ３０の結合サイト３３部分が１塩基だけ異なっている配列である（図７参照）。二本鎖ＤＮＡ３５を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８３】
実験５−３．ＮＦ−κＢ結合配列を持たない二本鎖ＤＮＡ（未標識）を添加した場合のＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度を段階的に変えて実験。
配列がＮＦ−κＢ結合配列を持たない二本鎖大腸菌由来ランダム配列で、蛍光標識されていない二本鎖ＤＮＡ１８を添加する二本鎖ＤＮＡとして用いる。二本鎖ＤＮＡ１８を用いて実験５−１と同様に実験を行った。
【００８４】
図１７に実験５−１から５−３の結果を示す。実験５−１の結果から、蛍光標識で確認できる生成物すなわち二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中のＤＮＡ結合タンパク質とが結合してできたＤＮＡ−タンパク複合体の並進拡散時間は、未反応の二本鎖ＤＮＡ３０の並進拡散時間と比較して大きな伸びは無かった。従って、競合二本鎖ＤＮＡ３４を添加することにより、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１５との結合が阻害されることが確認できた。
また、実験５−２の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ３５を添加した場合と何も加えない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３５と細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢとの反応について、二本鎖ＤＮＡ３０と１塩基しか差がない二本鎖ＤＮＡ３５による結合阻害は認められなかった。
また、実験５−３の結果から、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物との結合生成物の並進拡散時間は、二本鎖ＤＮＡ１８を添加した場合と競合ＤＮＡが含まれていない場合とで略同程度である。従って、二本鎖ＤＮＡ３０と細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢとの反応について、二本鎖ＤＮＡ１８による結合阻害は認められなかった。
以上の実験５−１から５−３で行われた競合アッセイの結果から、細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢは、細胞核抽出物に含まれるＤＮＡの特異的な配列に結合することが証明された。
【００８５】
（実施例６）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激依存を検出する。具体的には、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを用いてＨｅＬａ細胞を刺激し、時間経過による細胞核内の転写因子ＡＰ−１および転写因子ＮＦ−κＢについて活性化の程度を検出する。ＨｅＬａ細胞をＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ、フォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸）やサイトカインなどで刺激していない状態でも、ある程度の活性を有する転写因子ＡＰ−１および転写因子ＮＦ−κＢがＨｅＬａ細胞の核内に存在することが知られている。
【００８６】
実験６−１．ＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加して、０，１５，３０，６０，１２０，１８０分間刺激した各ＨｅＬａ細胞から核抽出物を生成した。（生成方法は実施例３を参照）核抽出物の濃度は２０μｇとした。
以下のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００８７】
【表２６】
2005006566.tif 000028
【００８８】
図１８に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖ＤＮＡ２０（標識済み）と腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αで３０分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−１における核抽出物濃度が２０μｇのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、３０分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１が十分に活性化されたと言える。
【００８９】
実験６−２．ＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激時間が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
実験６−１と同様に、５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加して、０，１５，３０，６０，１２０，１８０分間刺激した各ＨｅＬａ細胞から核抽出物を生成した。
以下のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９０】
【表２７】
2005006566.tif 000029
【００９１】
図１９に刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示す。二本鎖ＤＮＡ３０（標識済み）と腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αで１５分間刺激した細胞核抽出物との結合反応物の並進拡散時間が最も大きく、実験３−２における核抽出物濃度が２０μｇのときの反応物の並進拡散時間とほぼ同等の値である。従って、１５分の刺激時間で細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢが十分に活性化されたと言える。
【００９２】
細胞核抽出物に転写因子ＡＰ−１が含まれるか検出する場合、５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを細胞に添加して３０分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖ＤＮＡ２０とを結合反応させ、ＦＣＳ測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。また、細胞核抽出物に転写因子ＮＦ−κＢが含まれるか検出する場合には、５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを細胞に添加して１５分間刺激するとよい。
【００９３】
（実施例７）
本実施例では、細胞核内の転写因子の活性化について、細胞核抽出の際のＡＰＤＣ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ）および腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激依存を検出する。具体的には、ＡＰＤＣおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを用いてＨｅＬａ細胞を刺激し、細胞核内の転写因子ＡＰ−１および転写因子ＮＦ−κＢについて活性化の程度を検出する。ＡＰＤＣは、転写因子ＡＰ−１の活性化を促進する一方で、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制すると言われている。
ＡＰＤＣを添加した２時間後に、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加して３０分間刺激したＨｅＬａ細胞から核抽出物を生成する。核抽出物の濃度が５，１０，２０μｇであるものを用意する。細胞への刺激は次の２つの場合で行う。
（ｉ）腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激だけを３０分間行う場合。腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの濃度は０，１０，２５，５０ｎｇ／ｍｌである。
（ｉｉ）ＡＰＤＣを添加した２時間後に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加して３０分間刺激した場合。５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αに対し、ＡＰＤＣの濃度は１０，１００，２００μＭである。
【００９４】
実験７−１．ＡＰ−１結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α添加濃度およびＡＰＤＣ添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−１と同様に結合反応実験を行う。
【００９５】
【表２８】
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【００９６】
図２０に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの濃度およびＡＰＤＣの量による刺激依存が見られた。特に、ＡＰＤＣによる刺激と腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激との両方の刺激を行った場合で、５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αに対し、ＡＰＤＣの濃度が１００μＭおよび２００μＭであるときに生成物の並進拡散時間が大きい。従って、これらの濃度の組み合わせのときに、細胞核抽出物中の転写因子ＡＰ−１が最も活性化されたと言える。
【００９７】
実験７−２．ＮＦ−κＢ結合配列を持つＤＮＡ（蛍光標識）と細胞核抽出物との反応実験。細胞核抽出の際の腫瘍壊死因子ＴＮＦ−α添加濃度およびＡＰＤＣ添加濃度が異なる細胞核抽出物を用いて実験。
次のものを用いて、実験３−２と同様に結合反応実験を行う。
【００９８】
【表２９】
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【００９９】
図２１に各刺激条件に対する生成物の並進拡散時間を示す。生成物の並進拡散時間は腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの濃度およびＡＰＤＣの量による刺激依存が見られた。特に、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる刺激のみを行った場合で、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの濃度が５０ｎｇ／ｍｌであるときに生成物の並進拡散時間が大きく、このとき細胞核抽出物中の転写因子ＮＦ−κＢが最も活性化されたと言える。
実験７−１および７−２の結果から、ＡＰＤＣは腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αによる転写因子ＡＰ−１の活性化を促進し、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を抑制することが証明された。
【０１００】
細胞核抽出物に転写因子ＡＰ−１が含まれるか検出する場合、ＡＰＤＣを添加した２時間後に腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αを添加して３０分間刺激してから細胞核抽出を行い、この細胞核抽出物と二本鎖ＤＮＡ２０とを結合反応させ、ＦＣＳ測定し、並進拡散時間を求めることにより、転写因子の存在を検出することができる。５０ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αに対し、ＡＰＤＣの濃度を１００μＭ以上２００μＭ以下であるとよい。
また、細胞核抽出物に転写因子ＮＦ−κＢが含まれるか検出する場合には、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αのみで刺激を行った場合の並進拡散時間と、ＡＰＤＣおよび腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αの刺激を行った場合の並進拡散時間とを比較することによって、精度良く転写因子ＮＦ−κＢを検出することができる。腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αのみで刺激を行った場合に並進拡散時間が大きければ細胞核抽出物に転写因子ＮＦ−κＢが含まれると言える。
【０１０１】
上述した各実施例で示したように、試料の混合と蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による計測により、並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、検出結果を簡便に短時間で得ることができる。また、精製していない細胞核抽出物のようなクルード（ｃｒｕｄｅ）な試料を用いても、二本鎖ＤＮＡと転写因子とのＤＮＡ−タンパク複合体が精度良く検出できる。また、転写因子が結合する本来の二本鎖ＤＮＡと１塩基またな２塩基しか違いのない二本鎖ＤＮＡを添加しても、本来の二本鎖ＤＮＡと転写因子との結合反応が妨げられずにＤＮＡ−タンパク複合体が検出できるので、ＦＣＳによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のＤＮＡ結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。また、サイトカインの刺激による転写因子の時間経過による発現量、ＡＰＤＣの効果も精度良く検出できる。
【０１０２】
上述した各実施例では、生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いたが、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の代わりに、蛍光強度分布解析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いてもよい。
【０１０３】
【発明の効果】
本発明によれば、溶液の混合と蛍光相関分光法による計測により並進拡散時間を求めるための情報が得られ、放射性同位元素の利用や電気泳動法や固体基質への分子の固定による選別などの煩雑な操作を行わずに、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質との反応を簡便に短時間で得ることができる。
また、本発明によれば、精製していない細胞核抽出物のようなクルード（ｃｒｕｄｅ）な試料を用いても、二本鎖ＤＮＡと転写因子との結合反応が精度良く検出できる。
また、転写因子が結合する本来の二本鎖ＤＮＡと１塩基またな２塩基しか違いのない二本鎖ＤＮＡを添加しても、本来の二本鎖ＤＮＡと転写因子との結合反応が妨げられずに反応生成物が検出できるので、ＦＣＳによるこれらの測定方法は、細胞核抽出物などのクルードなサンプル中に存在する特定のＤＮＡ結合タンパク質（転写因子、核内レセプターなど）を検出するのに有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実験１−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図２】実験２−１の手順と生成物の概要を示す図。
【図３】実験２−２の手順と生成物の概要を示す図。
【図４】実験２−３の手順と生成物の概要を示す図。
【図５】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図６】各実験で用いるＤＮＡを示す図。
【図７】実施例２の対物レンズ１１付近を示す図。
【図８】実験１−１および１−２での各反応後の生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図９】実験２−１での転写因子ＡＰ−１濃度に対する生成物の並進拡散時間のグラフ。
【図１０】実験２−１での転写因子ＡＰ−１濃度に対する未反応物（Ｋ１）と反応生成物（Ｋ２）との存在比を示すグラフ。
【図１１】実験２−２での二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度に対する生成物の並進拡散時間、およびＡＰ−１結合配列を持たないＤＮＡ（未標識）濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１２】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１３】実験３−１での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１４】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１５】実験３−２での細胞核抽出物濃度に対する未反応物および生成物の存在比を示すグラフ。
【図１６】実験４−１から４−３での各二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１７】実験５−１から５−３での各二本鎖ＤＮＡ（未標識）濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１８】実験６−１での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図１９】実験６−２での刺激時間に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２０】実験７−１でのＴＮＦ−α添加濃度およびＡＰＤＣ添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【図２１】実験７−２でのＴＮＦ−α添加濃度およびＡＰＤＣ添加濃度に対する生成物の並進拡散時間を示すグラフ。
【符号の説明】
１…転写因子ＴＦＩＩＤ、２…転写因子ＴＦＩＩＢ、３…抗ＴＦＩＩＢ抗体、４…蛍光標識、５…転写因子ＡＰ−１、１０…二本鎖ＤＮＡ、１１…オリゴＤＮＡ、１２…オリゴＤＮＡ、１６…結合サイト、１７…二本鎖ＤＮＡ、１８…二本鎖ＤＮＡ、２０…二本鎖ＤＮＡ、２１…オリゴＤＮＡ、２２…オリゴＤＮＡ、２４…二本鎖ＤＮＡ、２５…二本鎖ＤＮＡ、２６…結合サイト、２６’…２塩基異なる結合サイト、３０…二本鎖ＤＮＡ、３１…オリゴＤＮＡ、３２…オリゴＤＮＡ、３３…結合サイト、３３’…１塩基異なる結合サイト、３４…二本鎖ＤＮＡ、３５…二本鎖ＤＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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