(57)【要約】【課題】本発明は、高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントを提供する。また、本発明は、高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するための高等植物の形質転換方法を提供する。【解決手段】本発明は、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物、それからなるシスエレメント、及びそれを含むプロモーターなどに関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）、
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｈｈｄｖ−３’        （Ｉ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
で表される塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチド単離物が、前記一般式（Ｉ）で表される塩基配列部分を少なくとも２箇所有するものである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）で表される塩基配列が、次の一般式（ＩＩ）、
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｗｈｄｖ−３’        （ＩＩ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
で表される塩基配列を有するものである請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項４】
一般式（Ｉ）で表される塩基配列が、次の一般式（ＩＩＩ）、
５’−ｎｎｎｍｗｇｃｒｗｇ  ｙｗｙｙｗｙｒｖ−３’        （ＩＩＩ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示し、ｒはａ又はｇを示し、ｗはａ又はｔを示す。）
で表される塩基配列を有するものである請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）で表される塩基配列が、次の、
５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、
５’−ｇａａｃｇｇｃａａｇ  ｔｔｔｃａｃｇｃ−３’
で表される塩基配列を有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項６】
５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド単離物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド単離物からなる高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント。
【請求項８】
請求項７に記載のシスエレメントを含有してなる高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するためのプロモーター。
【請求項９】
請求項７に記載のシスエレメント部分を２箇所以上有する請求項８に記載のプロモーター。
【請求項１０】
２箇所以上のシスエレメント部分の各々のシスエレメント部分が、少なくとも５０塩基以上離れている請求項９に記載のプロモーター。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載されたプロモーターの下流側に発現可能な遺伝子が結合されている請求項８〜１０のいずれかに記載されたプロモーター。
【請求項１２】
請求項８〜９のいずれかに記載のプロモーターの下流側に発現可能な遺伝子を結合させた遺伝子を用いて、高等植物を形質転換する方法。
【請求項１３】
高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与又は促進させるための方法である請求項１２に記載の形質転換方法。
【請求項１４】
高等植物が、穀物植物である請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４に記載の方法で形質転換された植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント、及びそれを含有してなるプロモーターに関する。より詳細には、本発明は、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド単離物、それからなる高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメント、それを含有してなるプロモーター、並びにそれを用いた植物の形質転換方法、及びその植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
地球上に広く存在する石灰質土壌においては、高いｐＨのために鉄をはじめとする徴量元素の溶解度が低いため、植物はクロロシス症状を起こすことが多い。これは実際の耕地において植物の成長を阻害し、収量を低下させる主要な原因となっている。このような環境に適応するために、高等植物は少なくとも２種類の鉄の獲得機構を持っている。双子葉植物およびイネ科以外の単子葉植物が持つストラテージ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）−Ｉ機構では、鉄欠乏に応答して根の吸収圏内へプロトンの放出を増加させ、根の細胞膜上の三価鉄還元酵素の活性を誘導し、生成した二価鉄を根の細胞膜上にある二価鉄トランスポーターにより吸収する。一方、イネ科植物ではストラテージ（ｓｔｒａｔｅｇｙ）−ＩＩ機構により鉄を吸収する。イネ科植物は鉄要求性が高まると、根において独自の三価鉄キレーターであるムギネ酸類（ＭＡｓ）を合成し、根の吸収圏へ分泌する。分泌されたムギネ酸類は土壌中の不溶態の鉄をキレート化し、「三価鉄‐ムギネ酸類」錯体として根の細胞膜上にあるトランスポーターにより再吸収される。現在までのところ、７種類のムギネ酸類が同定され、それらの生合成経路が解明されてきている。
近年になってストラテージ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）−Ｉ、ストラテージ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）−ＩＩの双方において、鉄獲得機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子の多くが単離された。
【０００３】
ストラテージ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ）−ＩＩに包含される多数の遺伝子はオオムギから単離されている。例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン合成遺伝子（ＨｖＳＡＭＳ）、ニコチアナミン合成遺伝子（ＨｖＮＡＳ）、ニコチアナミンアミノ基転移酵素遺伝子（ＨｖＮＡＡＴ）などが次々と単離されてきた。さらに、ムギネ酸類（ＭＡｓ）のＣ−３位及びＣ−２’位をそれぞれヒドロキシル化するジオキシゲナーゼ類をコードする遺伝子であるＩＤＳ２及びＩＤＳ３がディファレンシャルハイブリダイゼーション法によりそれぞれ単離された（非特許文献１及び２参照）。
これらの遺伝子はすべて、鉄の欠乏により発現が誘導され、その発現は根に特異的であることが判明している。
【０００４】
さらに、近年のマイクロアレイ技術の進歩により、鉄欠乏によって誘導される多数の遺伝子を直ちに検索することが可能になった。例えば、ムギネ酸類（ＭＡｓ）の合成に関与している多くの遺伝子が大麦の根において鉄欠乏で誘導されることが確認された（非特許文献３参照）。シロイヌナズナにおいて、鉄欠乏により地上部では好気的呼吸が、根では嫌気的呼吸が促進されることが示された。
（非特許文献４参照）。また、トマトの根において、シグナル系やトランスポーターの遺伝子が、リン、カリウム、及び鉄の欠乏により同様に誘導されることが示された（非特許文献５参照）。
しかし、このように多くの遺伝子が単離されているにもかかわらず、鉄欠乏に応答した遺伝子の発現制御のメカニズムについてはほとんど明らかになっていない。とりわけ、鉄欠乏誘導性遺伝子のプロモーター領域に存在する鉄欠乏応答性のエレメントについては、未だに報告例がない。
鉄欠乏で誘導される大麦の遺伝子における発現のメカニズムを解明するために、本発明者らは、これらの遺伝子を他の種の植物に導入して、その発現を解析してきた。大麦のＨｖＮＡＳ１、ＩＤＳ３、又はＨｖＮＡＡＴ−ＡとＨｖＮＡＡＴ−Ｂのセットからなるゲノム遺伝子をイネに導入したところ、鉄欠乏によりコード遺伝子の発現が誘導されることが明らかになった。（非特許文献６、１及び７参照）。さらに、大麦のＨｖＮＡＳ１又はＩＤＳ２遺伝子のプロモーターにＧＵＳ遺伝子を結合させた遺伝子でタバコを形質転換し、形質転換されたタバコの根において鉄欠乏に応答してＧＵＳ活性が強く発現することを示してきた（非特許文献８及び９参照）。このことは、植物における２つの異なる鉄の獲得機構、即ち、ストラテージ（ｓｔｒａｔｅｇｙ）−ＩＩ機構（大麦）及びストラテージ（ｓｔｒａｔｅｇｙ）−Ｉ機構（タバコ）においてこれらの遺伝子の発現の制御が保存されていることを示している。
【０００５】
ＩＤＳ２のプロモーターは野生型の大麦の根においてマンガン及び亜鉛の欠乏によっても発現を誘導するが、形質転換タバコにおいてはマンガン及び亜鉛の欠乏に対する応答は見られなかった。このことは、大麦とタバコでは、マンガンや亜鉛の欠乏に対する内在性のトランス活性化因子に何らかの相違があることを示唆している。また、ＨｖＮＡＳ１及びＩＤＳ２のプロモーターの５’欠失解析により、翻訳開始点からＩＤＳ２では−２７２位、ＨｖＮＡＳ１では−３４８位までの領域に、鉄欠乏誘導性及び根特異的な発現性を与える主要なシスエレメントが存在していることが示された（非特許文献８及び９参照）。
このように、鉄欠乏に応答するシスエレメントおよびトランス活性化因子については植物間でよく保存されており、このシスエレメントを特定することができれば、植物における鉄欠乏に対する応答性や根特異的な発現性を制御できることになる。
【０００６】
また、近年の植物遺伝子工学技術の発展に伴い、病害虫抵抗性や除草剤耐性などの有用形質を備えた植物品種等を育成することが可能となってきた。目的の形質の発現に関与する構造遺伝子を、植物で発現可能なプロモーターに結合してキメラ遺伝子ベクターを構築し、それを植物に導入することにより、その目的の形質の発現を促進又は抑制するのである。現在までに、この手法を応用して、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ  ）由来の殺虫性ＢＴ毒素遺伝子を導入した病害虫抵抗性植物や、トマトの果実の過熟に関するポリガラクツロナーゼ遺伝子アンチセンスを導入した日持ちの良好なトマト等が実用化されている。
これらの植物に導入される構造遺伝子のプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターが広く用いられている。このＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、強力に構造遺伝子の転写を促進する働きを有する。さらに、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによる転写促進は非特異的であって、植物の生長ステージ、植物の置かれた環境、発現部位を問わず、植物体の全身で、その制御下におかれた構造遺伝子の転写を恒常的に促進する。従って産業上有用である物質を効率的に生産を行う目的や、植物体の代謝系に大きな影響を与えない遺伝子の発現を行う目的で有用である。
【０００７】
しかし、遺伝子の種類によっては、その過剰な発現から遺伝子導入細胞の代謝異常、植物組織や植物自体の奇形・生育障害を引き起こすことがあった。植物育種の面からは、恒常的に発現を促進させることは必ずしも好ましいことではなく、植物の置かれた環境に対応して、必要な量を、必要な部位で選択的に発現することが求められている。
したがって、遺伝子の発現を所望な条件に対応して、発現量、発現部位を制御することが可能なプロモーターは、上記の問題を回避し植物育種の面で非常に有用である。さらに、このような発現を制御することができるプロモーターを組み合わせることにより、その下流に存在する遺伝子群の発現を調節し、制御することができることになる。
しかし、ゲノム上に存在しているプロモーター領域と考えられる領域はかなりの長さを有するものであり、ゲノムのプロモーター領域をそのまま使用することは技術的にも困難な問題があった。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），Ｐｌａｎｔａ，  ２１２，８６４−８７１
【非特許文献２】
Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４４，  １９９−２０７
【非特許文献３】
Ｎｅｇｉｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  ３０，８３−９４
【非特許文献４】
Ｔｈｉｍｍ，Ｏ．，Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ，Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １２７，  １０３０−１０４３
【非特許文献５】
Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｈ．，Ｇａｒｖｉｎ，Ｄ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １３０，  １３６１−１３７０
【非特許文献６】
Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  ２５，  １５９−１６７
【非特許文献７】
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １９，  ４６６−４６９
【非特許文献８】
Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎｉ，Ｍ．，  （２００１），  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６５，  １６９２−１６９６
【非特許文献９】
Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３），  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２０，  ３３−４１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物体がおかれた環境に応答して、組織特異的、環境ストレスに特異的に遺伝子の発現を制御し得るシスエレメント、より詳細には高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントを提供するものである。また、本発明は、高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するための高等植物の形質転換方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オオムギＩＤＳ２遺伝子のプロモーター領域に存在する、鉄欠乏応答性・根特異的発現を付与するシスエレメントを同定した。オオムギＩＤＳ２遺伝子（Ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｏｎｅ  ｎｏ．２）は、鉄欠乏応答性遺伝子としてオオムギ根から単離されたものであり、ムギネ酸類のＣ‐３位を水酸化するジオキシゲナーゼをコードしている。このＩＤＳ２遺伝子のプロモーター領域をβ−グルクロニダーゼ（β‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（以下、ＧＵＳ  と表記する。））遺伝子の上流に連結してタバコに導入したところ、この形質転換タバコにおいてもＩＤＳ２プロモーターがオオムギと同様に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与することが明らかになった。また、‐１６９６／‐４７配列（翻訳開始点を＋１として数えた。ＩＤＳ２プロモーターについては、以下同様である。）についての  ５’‐欠失解析により、‐２７２／‐４７配列がその応答性を付与するのに十分であることを確認した。本発明は、形質転換タバコの系を用いて、ＩＤＳ２プロモーターの  ３’‐欠失解析およびリンカースキャン解析を行い、協同的に作用する２つのシスエレメントを同定した。本発明は、高等植物の徴量要素欠乏に応答するシスエレメントの同定についての最初のものである。
【００１１】
本発明は、一般式（Ｉ）、
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｈｈｄｖ−３’        （Ｉ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
で表される塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物に関する。また、本発明は、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド単離物に関する。
また、本発明は、前記した本発明のオリゴヌクレオチド単離物からなる高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントに関する。さらに、本発明は、前記した本発明のシスエレメントを含有してなる高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するためのプロモーター、並びにこれを用いて高等植物を形質転換する方法、及び当該方法で形質転換された植物に関する。
【００１２】
本発明者らは、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの‐１６９６／‐４７配列について、８種類の５’−欠失断片についての活性を解析してきた（非特許文献９参照）。このプロモーターの機能をさらに解析するために、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの‐１６９６／‐９１配列について、各種の３’‐欠失断片を新規に作製した。なお、３’‐欠失の起点（‐９１）は、ＴＡＴＡボックスと考えられる配列の３’‐側の直近である。図１に作製した８種類の３’‐欠失断片（−１６９６／‐９１，‐１６９６／‐２７３，‐１６９６／４９２，‐１６９６／‐６８６，‐１６９６／‐８６６，‐１６９６／‐１１２９，‐１６９６／‐１２７４，‐１６９６／‐１５４１）を示す。各々の３’欠失断片をカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの、転写開始点を＋１として数えて、−４６／＋８部位の領域（以下、３５ＳΔ４６と表記する）−ＧＵＳに連結してタバコに導入し、Ｔ１世代の形質転換体における鉄欠乏応答性をＧＵＳ活性として検出した。鉄十分条件（＋Ｆｅ）または鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）における  ３０日間の生育の後、ＧＵＳ  活性の測定を行った。対照としてＩＤＳ２遺伝子プロモーターを有さないもの（０−４６）、及び野生型（ＷＴ）を用いた。
各クローンにつき独立の１０−１３系統を解析し（野生型については７系統）、図１にＧＵＳ活性の平均値（棒グラフ）と標準誤差（棒線）を示した。根におけるＧＵＳ活性を図１の左側のグラフに、葉におけるＧＵＳ活性を図１の右側のグラフにそれぞれ示す。各グラフ中の白抜きは鉄十分条件（＋Ｆｅ）の場合を示し、黒抜きは鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）の場合を示す。各グラフの横軸はＧＵＳ活性を示し、単位はｐｍｏｌ  ＭＵ／分／ｍｇタンパク質である。各グラフの右側の数値は、鉄十分条件（＋Ｆｅ）に対する鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）でのＧＵＳ活性の相対比を示し、アスタリスク（＊又は＊＊）は有意差（＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５）があることを示す。
【００１３】
ＩＤＳ２プロモーター断片を持たない対照区であるクローン０‐４６では、根においても葉においても非形質転換体とほぼ同等の活性しか検出されなかったが、根において弱いながらも有意な鉄欠乏誘導性が認められた。最長のプロモーター断片を持つクローン１‐４６は、根において、鉄欠乏条件で鉄十分条件に対して１９６倍ものＧＵＳ活性を誘導した。それに対して、−９１から‐２７２までの配列を持たない７種のクローン２‐４６、３‐４６、４‐４６、５‐４６、６‐４６、７‐４６、及び８‐４６は、いずれも鉄欠乏により活性を全く誘導しなかったことから、‐２７２／‐９１配列がＩＤＳ２プロモーターのタバコ根における鉄欠乏誘導性発現に必須であることが示された。葉においても、いくつかのクローンが若干の活性を示したが、３’‐欠失の明確な効果は認められなかった。
【００１４】
次に、ＩＤＳ２遺伝子プロモーターの‐２７２／‐９１の配列について、さらに詳細に検討した。図２に示した４種類の３’‐欠失断片（‐２７２／‐９１，‐２７２／‐１３６，‐２７２／‐１８１，‐２７２／‐２２７）を作製し、各々を３５Ｓ△４６‐ＧＵＳ  またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの、転写開始点を＋１として数えて−９０／＋８部位の領域（以下、３５ＳΔ９０と表記する）−ＧＵＳ  に連結した。３５Ｓ△４６がＴＡＴＡ  ボックスを含む基本転写装置のみを持つのに対し、３５Ｓ△９０は形質転換タバコに導入した時、主に根での発現を付与する配列を含む。図１の場合と同様にコンストラクトをタバコに導入し、Ｔ１  世代での鉄欠乏応答性を検出した。根におけるＧＵＳ活性を図２の左側のグラフに、葉におけるＧＵＳ活性を図２の右側のグラフに示す。図２の各グラフは図１のグラフの説明と同様である。
この結果、３５Ｓ△４６に連結した場合、‐２７２／‐９１配列は鉄欠乏の根においてのみ強い発現を付与した（クローン１１‐４６）。鉄欠乏の根での正味のＧＵＳ活性値は、５’‐側が‐１６９６まで延びたクローン１‐４６（図１参照）に対しておよそ７分の１であったが．鉄十分条件の根でのＧＵＳ活性値に対する比（誘導率）は両クローンともほぼ２００倍と同等であった。クローン１２‐４６での鉄欠乏の根でのＧＵＳ活性はクローン１１‐４６での活性の約半分であったが、その差は統計的に有意ではなかった。さらに‐１８１までの３’‐欠失を施したクローン１３‐４６においては、鉄欠乏根での発現がクローン１２‐４６に対して劇的に低下したが、クローン０‐４６に対しては有意に高いＧＵＳ活性を保持しており、弱い鉄欠乏誘導性を示した。クローン１４‐４６での発現はクローン１３‐４６とほぼ同等であったが，鉄欠乏の根でのＧＵＳ活性はクローン０４６に対して有意な差がみられなかった。クローン１１‐４６、１２‐４６、１３‐４６、１４‐４６とも、葉および鉄十分条件の根においては、クローン０‐４６に対して有意な発現誘導はみられなかった。
【００１５】
一方、３５Ｓ△９０  を導入したクローン０−９０は、根において鉄十分条件、鉄欠乏条件の双方において明確なＧＵＳ発現を示したほか、鉄欠乏条件の葉でも野生型に対して有意に高いＧＵＳ発現を示した。しかし、鉄欠乏による発現誘導は認められなかった。ＩＤＳ２プロモーターの３’‐欠失断片を３５Ｓ△９０に連結したクローン１１‐９０、１２‐９０、１３‐９０および１４‐９０では、根でのＧＵＳ活性は鉄十分条件においてはクローン０‐９０とほぼ同等であったのに対し、鉄欠乏条件において有意に高い活性を持ち、明確な鉄欠乏誘導性を示した。３’‐欠失による顕著な効果は認められなかったが、‐１３６から‐１８１までの３’‐欠失により、鉄欠乏根でのＧＵＳ活性および誘導率が、有意ではないながらも減少していた。また、鉄欠乏条件の葉においてもクローン１１‐９０、１２‐９０、１３‐９０および１４‐９０は基底レベルを超えるＧＵＳ活性を示し、クローン１１‐９０、１２‐９０および１３‐９０では、クローン０−９０に対しても有意に高い  ＧＵＳ  活性を示した。葉においてクローン１１‐９０  および１４‐９０は鉄欠乏誘導性を示したがクローン１２‐９０および１３‐９０は鉄欠乏誘導性を示さなかった。
【００１６】
以上の結果から、ＩＤＳ２プロモーターの‐２７２／‐９１配列は２つの鉄欠乏応答性領域を持つことが明らかになった。‐１８０／‐１３６領域は３５Ｓ△４６に連結した場合に強い鉄欠乏応答性を付与するのに必須な領域と考えられ、‐２７２／‐２２７  領域は  ３５Ｓ△４６に連結した場合には明確な機能を持たないが３５Ｓ△９０に連結することにより明確な鉄欠乏応答性を付与する領域と考えられた。
【００１７】
ＩＤＳ２プロモーターの‐１８０／‐１３６領域内に存在が予測されたシスエレメントの部位を特定するために、リンカースキャン解析を行った。解析のために新たに構築して用いたＩＤＳ２遺伝子のプロモーター由来の配列を図３（ａ）に示す。各コンストラクトを３５Ｓ△４６に連結したプロモーター‐ＧＵＳ部位を図３（ｂ）の左側に示す。
変異を導入しない元々の‐２７２／‐１３６配列（１２−４６）の−１８２／−１８１の配列のみを変異させた配列（Ｎ１−４６）を作製した。さらに、‐１８０／‐１３６領域内に連続した９塩基の変異を導入した５種類の配列を構築し、各々を‐２７２／‐１８１配列の下流につないだ（Ｍ１‐４６、Ｍ２‐４６、Ｍ３‐４６、Ｍ４‐４６、及びＭ５‐４６）。変異を導入しない元々の配列の−２７２／−１８１を欠失させた‐１８０／‐１３６配列（Ｎ３‐４６）、及びそれを−２２８／−２２７配列のみを変異させた‐２７２／‐２２７  配列の下流につないだもの（Ｎ２‐４６）も構築した。ＩＤＳ２プロモーターの‐２７２／‐１８１配列および‐２７２／‐２２７配列の３’‐端には、‐１８０／‐１３６領域と連結するために２塩基の置換と１塩基の挿入を施した。
構築した各断片を、それぞれ３５ＳΔ４６‐ＧＵＳに連結し、タバコに導入した。Ｔ１世代で７日間の鉄欠乏処理による応答性を検出した。根におけるＧＵＳ活性を図３（ｂ）の右側のグラフに示す。クローンＮ１‐４６での鉄欠乏応答性はクローン１２‐４６と同等であったことから、‐１８２／‐１８１に施した変異による影響がないことが確認された。‐１８０／‐１５４の間に施した３種の変異はいずれも鉄欠乏の応答性を変化させなかった（クローンＭ１‐４６、Ｍ２‐４６及びＭ３‐４６）。これと対照的に、‐１５３／‐１３６の間に変異を施した２種の変異体は、鉄欠乏の根での発現が劇的に低下した（クローンＭ４‐４６及びＭ５‐４６）。このことから、‐１８０／‐１３６領域内の鉄欠乏応答性シスエレメントは‐１５３／‐１３６に存在することが明らかになった。‐２７２／‐１３６配列中の‐２２６／‐１８１を欠失させても鉄欠乏応答性に変化が見られなかった（クローンＮ２‐４６）のに対し、‐２７２／‐１８１配列全体を欠失させると根での発現および鉄欠乏の応答性は完全に失われた（クローンＮ３‐４６）。また、別の実験において−１８０／−１３６にクローンＭ１‐４６、Ｍ２‐４６、Ｍ３‐４６、Ｍ４‐４６、及びＭ５‐４６の配列を持つものから‐２７２／‐１８１配列を欠失させてタバコに導入した場合にも、発現は全く誘導されなかった。
【００１８】
これらのことから、少なくとも３５ＳΔ４６に連結した場合には、‐１５３／‐１３６の間のシスエレメントが機能するためには、上流の‐２７２／‐２２７の領域内に存在するシスエレメントが必須であることが示された。なお、図３に示したクローンはいずれも葉においては明確な発現を示さなかった。
【００１９】
次に、−２７２／−２２７領域内に存在が予測されたシスエレメントの部位を、同様にリンカースキャン解析により特定した。解析のために新たに構築して用いたＩＤＳ２遺伝子のプロモーター由来の配列を図４（ａ）に示す。各コンストラクトを３５ＳΔ４６に連結したプロモーター−ＧＵＳ部位を図４（ｂ）の左側に示す。
−２７２／−２２７領域内に連続した９ないし１０塩基の変異を導入した５種類の配列を構築し、各々を−１８０／−１３６配列の上流につないだ（Ｍ２１−４６、Ｍ２２−４６、Ｍ２３−４６、Ｍ２４−４６およびＭ２５−４６）。構築した各断片を３５ＳΔ４６−ＧＵＳに連結し、タバコに導入した。Ｔ１世代で７日間の鉄欠乏処理による応答性を検出し、連結部以外に変異を導入しないクローンＮ２−４６における鉄欠乏誘導性と比較した。根におけるＧＵＳ活性を図４（ｂ）の右側のグラフに示す。−２７２／−２６３または−２３５／−２２７に施した変異は鉄欠乏誘導性を変化させなかった（クローンＭ２１−４６、Ｍ２５−４６）。これと対照的に、−２６２／−２３６間に施した３種の変異により、鉄欠乏根での発現はほとんど見られなくなった（クローン  Ｍ２２−４６、Ｍ２３−４６およびＭ２４−４６）。このことから、−２７２／２２７領域内の鉄欠乏誘導性シス要素は−２６２／−２３６に存在することが明らかになった。なお、図４に示したクローンはいずれも葉においては明確な発現を示さなかった。
【００２０】
以上の結果から、ＩＤＳ２プロモーターの−２７２／−９１配列に存在する２つの鉄欠乏誘導性シス要素は、−１５３／−１３６および−２６２／−２３６に存在し、少なくとも３５ＳΔ４６に連結した場合には、この２つのシス要素が共存することが、強い鉄欠乏誘導性および根特異的発現を付与するために必須であることが示された。
【００２１】
図１，２，３及び４に示した各クローンによる発現の組織特異性を、組織化学染色により確認した。結果を図面に代わるカラー写真で図５に示す。図５は、ＩＤＳ２プロモーター断片を３５Ｓ△４６‐ＧＵＳ（図５のａ，ｂ，ｃ）、または３５Ｓ△９０‐ＧＵＳ（図５のｄ）に連結したコンストラクトを導入した形質転換タバコの根における代表的なＧＵＳ染色のパターンを示す。Ｔ１世代の形質転換体を鉄欠乏条件で（ａ），（ｂ），（ｃ）については、６日間、（ｄ）については２０日間生育させた後、組織化学染色を行った結果を示すものである。図５の各写真のスケールバーは１００μｍである。図５の（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ
（ａ）クローン１‐４６の鉄欠乏条件の根の横断切片、
（ｂ）（ａ）の拡大図（Ｃｏは皮層、Ｅｎは内皮、Ｐｅは内鞘、Ｐｈは篩部、Ｘｙは木部）、
（ｃ）クローン１‐４６の鉄欠乏条件の根の拡大像、
（ｄ）クローン１２‐９０の鉄欠乏条件の根の横断切片、
のカラー写真である。
【００２２】
ＩＤＳ２遺伝子プロモーターの３’‐欠失／変異断片を３５Ｓ△４６に連結したクローンのうち、鉄欠乏応答性を持つものは、鉄欠乏根においていずれも同様の組織特異性を示した（図５のａ‐ｃ参照）。主に根の内皮細胞、内鞘細胞、および皮層細胞において、強い発現がみられた（図５のａ，ｂ参照）。表皮細胞および中心柱にも弱い発現がみられた（図５ａ，ｂ参照）。発現は典型的な鉄欠乏症状を示す根端近くで特に強かったが、根端そのものでは発現していないことが多かった（図５のｃ参照）。これに加えて、別に行った実験結果によれば、系統によっては表皮細胞および根端において強い発現がみられた。表皮細胞と根端で強い発現がみられた系統の割合は、最長のプロモーター断片を持つクローン１‐４６で際立って高かったほかは、クローン間に明確な差は認められなかった。別に行った実験結果によれば、クローン１‐４６では、鉄十分条件の根の皮層細胞、および鉄欠乏条件の葉脈においても発現がみられたが、その他の３’‐欠失／変異クローンでは、葉または鉄欠乏根での発現はみられなかった。
一方、３５Ｓ△９０に連結した３’‐欠失断片を持つクローンでは、鉄十分条件、鉄欠乏条件のいずれにおいても発現を示したが、鉄欠乏条件における発現は鉄十分条件よりもずっと強かった。鉄欠乏条件においては、ほぼ根全体で強い発現がみられ、特に表皮細胞、内皮細胞および内鞘細胞（図５のｄ参照）において顕著な発現がみられたが、根端近くは発現していないこともあった。
別の実験結果によれば、鉄十分条件の根では、主に内鞘細胞、内皮細胞、皮層細胞および中心柱に発現がみられたが、表皮細胞には発現がみられなかった。
また、別の実験結果によれば、鉄十分条件、鉄欠乏条件のいずれにおいても、葉脈に弱い発現がみられることがあった。３’‐欠失断片の長さによってこれらの発現パターンに差は認められなかった。ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターをもたないクローン０−９０での発現パターンは、鉄十分条件、鉄欠乏条件のいずれにおいても、３５Ｓ△９０に連結したＩＤＳ２遺伝子のプロモーター断片を持つクローンの鉄十分条件における発現パターンと同様であったことも別の実験により示された。
これらの結果から、ＩＤＳ２遺伝子プロモーター断片が付与する鉄欠乏応答の組織特異性は、自らのＴＡＴＡボックスを持つ５’‐欠失断片、３５Ｓ△４６に連結した３’‐欠失／変異断片、３５Ｓ△９０に連結した３’‐欠失断片のそれぞれで、異なっていることが示された。また、ＩＤＳ２プロモーターと３５ＳΔ９０とを連結させることにより、双方に含まれるシスエレメントが協同的に作用して鉄欠乏条件下において広範囲の組織での発現を誘導するものと考えられる。
【００２３】
以上において、オオムギＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの鉄欠乏応答性・根特異的発現を解析してきた。一過性発現系では、植物の組織特異的発現や栄養欠乏に対する応答性を検出することは困難であるので、より正確で詳細な解析が可能である形質転換タバコを用いた系を採用した。これまでに報告されている５’‐欠失解析により、オオムギのＩＤＳ２プロモーターがタバコにおいても鉄欠乏応答性を持つこと、また、‐２７２／‐４７配列だけでもその応答性が保持されることが確認された（非特許文献９参照）。前記してきた‐１６９６／‐９１配列についての３’‐欠失解析により、‐２７２／‐９１配列がタバコの根における鉄欠乏の応答性に十分なだけでなく必要であることが確認された。５’‐欠失解析で‐１６９６／‐４７から‐２７２／‐４７への欠失が鉄欠乏応答性を弱めたことと合わせて考えると、‐１６９６  から‐２７２  までの上流配列は‐２７２／‐９１配列が存在する時にのみ、根での鉄欠乏応答性に寄与するものと推測される。
‐２７２／‐９１配列についてのさらなる解析により、鉄欠乏に応答して根での発現を誘導する２つの新規なシスエレメントを同定することができた。即ち、３５Ｓ△４６に連結した場合、‐１３６から‐１８１への３’‐欠失により鉄欠乏応答性が顕著に低下した（図２のクローン１２−４６及び１３−４６参照）。このことから，‐１８０／‐１３６  領域内にシスエレメントの存在が強く示された。このシスエレメントを今後「ＩＤＥ１」（Ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  １  の略）と呼ぶ。３５Ｓ△９０に連結した場合には、ＩＤＥ１を欠失させても顕著な鉄欠乏の誘導性の低下はみられず、‐２７２／‐２２７領域のみでも明確な鉄欠乏応答性を付与した（図２参照）。このことから、−２７２／‐２２７領域にも別のシスエレメントが存在することが示された。このシスエレメントを今後「ＩＤＥ２」（Ｉｒｏｎ  ｇｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｌｅｍｅｎｔ  ２の略）と呼ぶ。３５Ｓ△４６を用いたリンカースキャン解析により、「ＩＤＥ１」が‐１５３／‐１３６  に存在することが示された（図３参照）。さらに「ＩＤＥ２」が−２６２／−２３６に存在することが示された（図４参照）。
【００２４】
図６は、ＩＤＥ１とＩＤＥ２の協同的な機能についてまとめたものである。図６の楕円はそれぞれのシスエレメントに結合すると考えられるトランス因子を表す。実線と矢印は鉄欠乏に応答した根での発現誘導の状況を模式的に示したものであり、線の太さは誘導性の強さに対応している。破線は３５Ｓ△９０による根での構成的発現を示す。網掛け部位は−２６３／−２５４，−２５３／−２４５，−２４４／−２３６，‐１５３／‐１４５または‐１４５／‐１３６  の変異を示す。これらの変異はいずれも、図３および図４に示したように、鉄欠乏応答性を顕著に低下させた。
【００２５】
最小プロモーターとして３５Ｓ△４６を用いた場合には、ＩＤＥ１の機能はＩＤＥ２の欠失または変異により失われた（図３のクローンＮ３−４６、並びに図４のクローンＭ２２−４６，Ｍ２３−４６およびＭ２４−４６参照）。一方で、ＩＤＥ２の機能はＩＤＥ１の欠失または変異によりきわめて弱くなった（図２のクローン１３‐４６、並びに図３のＭ４‐４６およびＭ５‐４６）。これらのことから、ＩＤＥ１とＩＤＥ２が協同的に作用して、それぞれに結合するトランス因子が下流の基本転写装置に働きかけることにより、鉄欠乏応答性を付与しているものと推察される。この鉄欠乏応答性発現は、３５Ｓ△４６を用いた‐２７２／‐９１配列の欠失／変異解析において常に根でのみ付与され、一定の組織特異性を保持していた（図５のａ，ｂ，及びｃ参照）。ＩＤＥ１とＩＤＥ２の間の距離による効果は明瞭ではなかった。なぜなら‐２２６／‐１８１配列の内部欠失により鉄欠乏応答性に変化が見られなかったからである（図３  のクローンＮ２‐４６参照）。３５Ｓ△９０に連結した場合には、ＩＤＥ２を含む−２７２／−２２７領域による鉄欠乏の応答性はＩＤＥ１の存在下（図２のクローン１１−９０及び１２‐９０参照）のみならず、ＩＤＥ１が欠失した配列（図２のクローン１３−９０及び１４‐９０参照）でも明確であった。ＩＤＥ１が、ＩＤＥ２の非存在下で３５ＳΔ９０に連結された場合にも、鉄欠乏誘導性が付与されるかもしれない。
【００２６】
２つ以上のシスエレメントが協同的に作用して発現を制御する例は、他の植物プロモーターでもしばしば見出されている。例えば、ルビスコ・スモールサブユニット遺伝子の光応答性・緑色組織特異的発現、カルコンシンターゼ遺伝子の花における発現、アルファアミラーゼ遺伝子の発現の糖による抑制などである。
ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターによる発現の組織特異性が、３５Ｓ△９０に連結することにより弱まったことは注目に値する。‐２７２／‐９１配列またはその３’‐欠失配列を持つクローンは、鉄欠乏に応答して、表皮細胞、内皮細胞および内鞘細胞を含む根のほぼ全体で発現を増大させた（図５のｄ参照）。これらのクローンは鉄欠乏条件の葉においても、発現を示し、そのうちクローン１１‐９０および１４‐９０は鉄欠乏の応答性を示した（図２参照）。これらの発現パターンはＩＤＳ２プロモーター断片のみでも３５ＳΔ９０のみでも付与されなかったものであり、両者の協同的相互作用を示唆している。
カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの（転写開始点を＋１として）‐９０／‐４７部位の領域には、主に根での発現を付与するａｓ−ｌと呼ばれるシス配列が存在し、この配列は他のシスエレメントとの組み合わせによりさまざまな協同的な相互作用を持つことが知られている。この協同的な相互作用には、光や病害応答性などの刺激に対する応答性の付与のほか、単一のシスエレメントによる発現パターンとは異なるさまざまな組織特異的な発現が含まれている。本発明の場合も、ＩＤＳ２プロモーター内のＩＤＥ１、ＩＤＥ２、あるいはまた他の未知のシスエレメントがａｓ−ｌ配列と複雑な相互作用を示したものと推測される。
【００２７】
これまでに、鉄栄養状態に応答して遺伝子発現を制御するいくつかのシスエレメントが報告されている。鉄欠乏条件において発現が誘導される鉄吸収関連の遺伝子のプロモーター部位にみられるシスエレメントとしては、グラム陰性細菌のＦｕｒ  ボックス、酵母の  ＡＦＴ１  結合配列、脊椎動物のＩＲＥ  などが知られており、このうちＩＲＥ  は、転写後の制御によって、鉄吸収関連の遺伝子の発現を鉄欠乏条件において促進するとともに、同条件下でフェリチン遺伝子の発現を抑制する。
一方高等植物では、フェリチン遺伝子の鉄による発現制御に関わるシスエレメントが一過性発現系を用いた解析で同定された。ダイズのフェリチン遺伝子プロモーター内の  ＦＲＥ  と呼ばれる  ８６塩基の領域、およびトウモロコシとシロイヌナズナのフェリチン遺伝子プロモーター内に存在するＩＤＲＳ  と呼ばれる  １４塩基の配列が、それぞれ転写レベルにおいて鉄の投与により発現抑制を解除する。しかしながら、高等植物において鉄欠乏に応答するシスエレメントについては、これまでに同定が報告されておらず、本発明で同定した二つのシスエレメントが初めての報告例である。
【００２８】
さらに、ＩＤＥ１またはＩＤＥ２に相同性のある配列が、他の鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターに存在するかどうかを調査したところ、多くの鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターがＩＤＥ１に近い配列を持つことが明らかになった。図７にその結果を一覧表として示す。図７はＩＤＥ１とその３’−側の隣接４塩基（ＩＤＥ１＋）と、他の鉄欠乏誘導性プロモーターおよびＩＤＥ２との配列を比較したものである。ＩＤＥ１およびＩＤＥ２のかぎ括弧で囲った部位は、前記したリンカースキャン解析で変異を導入した部位を示す。ＩＤＥ１内のパリンドローム配列を四角で囲い、中心位置を黒抜きの三角で示す。ＩＤＥ１＋と一致する配列を黒い領域に白文字で示す。翻訳開始点からの距離を括弧内に示す。コンセンサス配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）のうち、特に保存性が高かった塩基を大文字に下線で示す。図７のＨｖｎａａｔ−ＡおよびＨｖｎａａｔ−Ｂは、それぞれオオムギのニコチアナミンアミノ基転移酵素遺伝子、ＨｖＮＡＳ１はオオムギのニコチアナミン合成酵素遺伝子、ＯｓＮＡＳ１およびのＯｓＮＡＳ２はイネのニコチアナミン合成酵素遺伝子、ＨｖＩＤＳ３はオオムギのムギネ酸合成酵素遺伝子、ＯｓＩＲＴ１はイネの二価鉄トランスポーター遺伝子、ＡｔＩＲＴ１はシロイヌナズナの二価鉄トランスポーター遺伝子、ＡｔＦＲＯ２はシロイヌナズナの三価鉄キレート還元酵素遺伝子、ＡｔＮＡＳ１はシロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子をそれぞれ示す。ＩＤＥ２の配列の下の破線は、既知の植物のシスエレメントとの相同性を示したものである。ＴＣＡＣはタバコｇ１０プロモーターのＧＴＧＡモチーフ。ＣＴＧＴＣＡＣは病原関連の遺伝子プロモーターにみられるジャガイモサイレンシングエレメント結合因子の結合サイト（ＹＴＧＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｃ）を示す。
【００２９】
ＩＤＥ１とその３’−側に隣接する４塩基に極めて相同性の高い配列が、Ｈｖｎａａｔ−ＡおよびＨｖｎａａｔ−Ｂプロモーターに存在していた。このことから、ＩＤＥ１の３’−側に隣接する配列は、３’‐欠失解析においては有意な影響はみられなかったものの（図２のクローン１１‐４６及び１２‐４６）、何らかの機能を持つ可能性が考えられる。ＩＤＥ１に相同性のある配列は、ＨｖＮＡＳ１、ＯｓＮＡＳ１、ＯｓＮＡＳ２、ＨｖＩＤＳ３の各プロモーター内にも存在していた。このことは、現在までにオオムギおよびイネで同定されている全てのムギネ酸類生合成関連の鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターがＩＤＥ１に相同性のある配列を持つことを示している。これらの鉄吸収関連の遺伝子は、同種のシスエレメントによって協同的に制御されているのかもしれない。ＨｖＮＡＳ１プロモーターの‐１９０／‐２０７および‐３０９／‐２９７部位に見つかったＩＤＥ１との相同配列は、樋口らの文献（非特許文献８参照）に記載の５’‐欠失解析により鉄欠乏応答性のシスエレメントの存在が予測された‐３４８／‐１７１領域に含まれることから、実際に機能するシス配列である可能性が大きいと考えられる。
【００３０】
ＩＤＥ１に相同性のある配列は、シロイヌナズナで知られている鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターの多くにも存在していた。そのうちシロイヌナズナのストラテージ−Ｉによる鉄獲得機構における主要な遺伝子であるＡｔＩＲＴ１およびＡｔＦＲＯ２プロモーターには、ＩＤＥ１のパリンドローム配列（ＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴ）の大部分が保存された配列が存在した（図７参照）。このようにストラテージ−Ｉまたはストラテージ−ＩＩの鉄獲得機構に関与する遺伝子が互いに相同性のあるシス配列を持つ可能性が見出され、そのうえオオムギ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−ＩＩ）のＩＤＳ２とＨｖＮＡＳ１の各プロモーターがタバコ（Ｓｔｒａｔｅｇｙ−Ｉ）で機能することから、鉄欠乏応答性の遺伝子発現に関わるシス／トランス系のメカニズムの少なくとも一部分が、鉄獲得機構の異なる植物種の間で広く保存されていることが推察される。
これらのことから、本発明において同定したＩＤＥ１は、植物における鉄欠乏応答性の普遍的なシスエレメントとしての性質を備えている可能性が考えられる。
また、シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子の一つであるＡｔＮＡＳ１のプロモーターもＩＤＥ１に相同性のある配列を持っていた。
【００３１】
ＩＤＳ２プロモーター自身の上流領域にも、ＩＤＥ１と相同性のある配列が存在した（−７７２／−７８９）。さらに興味深いことに、ＩＤＥ２もＩＤＥ１とその３’−側の隣接４塩基に相同性を持っていた（図７）。ＩＤＥ２と他の鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターとの相同配列を検索したところ、ＩＤＥ１とＩＤＥ２との相同性配列以外の部位では、明確な相同性は見出されなかった。したがって、ＩＤＥ２  の実際に機能する配列はＩＤＥ１と相同性を持つ可能性が考えられる。ＩＤＥ１とＩＤＥ２の組み合わせばかりでなく、ＩＤＥ１のみ、またはＩＤＥ２  のみを重複させた配列も機能を持つかもしれない。
【００３２】
本発明者らは、ＩＤＥ１またはＩＤＥ２が、既知のシス配列に相同性を持つかどうかについても調査を行った。ＩＤＥ１と，それに相同性のある  ＩＤＥ２  の部分配列は、酵母のメタロチオネイン遺伝子の銅応答性トランス因子（ＡＣＥ１）結合配列（ＴＣＹ（４−６）ＧＣＴＧ）と相同性を持つ。ＩＤＥ１またはＩＤＥ２は、その他の金属ホメオスタシスや根特異的発現に関与する既知のシスエレメントとの相同性は確認されなかった。また、トマトの鉄シグナル伝達系の異常な変異体であるＴ３２３８ｆｅｒの原因遺伝子（ｆｅｒ）がｂＨＬＨの転写因子をコードすることが報告されているが、ＩＤＥ１またはＩＤＥ２は、ｂＨＬＨのコンセンサス結合配列（ＣＡＮＮＴＧ）も持たない。既知の植物のシスエレメントとの相同性をＰＬＡＣＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ＰＬＡＣＥ）で検索したところ、ＩＤＥ２は２種のシスエレメント配列を持つことが示された（図７参照）。それらは、タバコのｇ１０プロモーターのＧＴＧＡモチーフ（ＧＴＧＡ；花粉での発現に関わると考えられる）、および病原関連の遺伝子プロモーターにみられるジャガイモサイレンシングエレメント結合因子の結合サイト（ＹＴＧＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｃ）である。しかしながら、これらの既知のシスエレメント配列が鉄欠乏応答性に関与する可能性を示唆する現象は見つかっていない。
【００３３】
高等植物での鉄の代謝制御に関わるメカニズムは、これまでのところほとんどが生理学的知見に限られており、分子機構についてはほとんど未解明のままである。本発明で示された鉄欠乏応答性・根特異的発現を付与するシスエレメントの同定は、鉄欠乏応答性遺伝子を制御する分子メカニズム、さらにはその根底にある鉄の代謝制御メカニズムの解明に向けた強力な手段を提供するものである。同定されたシスエレメントに結合するトランス因子を単離することができれば、鉄欠乏耐性植物の創製に向けての新たなアプローチが可能となる。トランス因子の発現を改変した植物、またはシスエレメントを改変して有用遺伝子を発現させた植物、あるいはその組み合わせにより、これまでに創製された鉄欠乏耐性植物よりもさらに耐性の強まった、あるいはより望ましい特性を持つ植物の創製が可能となるであろう。
このような観点からも、本発明は、高等植物での鉄の代謝制御の分子機構、また鉄欠乏応答性遺伝子を制御する分子メカニズムなどを解明し、鉄欠乏耐性が改善され鉄の代謝が制御された新たな有用な植物を構築して上での基本的な技術課題を解決するものである。
【００３４】
前記してきた方法により得られたＩＤＥ１の塩基配列及びＩＤＥ２の塩基はそれぞれ以下のとおりである。
ＩＤＥ１  ：  ５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’
ＩＤＥ２  ：  ５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’
これらの塩基配列を配列表の配列番号１及び２にそれぞれ示す。
本発明は、これら塩基配列又はこれらの配列と相同性を有する、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は８５％〜９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供するものである。
図７に示されているように各種の植物のシスエレメントの塩基配列を考慮して本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列を一般式で表すと次の一般式（Ｉ）として表すことができる。
【００３５】
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｈｈｄｖ−３’        （Ｉ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、
ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
また、同様にして本発明のオリゴヌクレオチドのより詳細な塩基配列を一般式で表すと次の一般式（ＩＩ）として表すことができる。
【００３６】
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｗｈｄｖ−３’        （ＩＩ）
（式中の記号は前記と同じである。）
さらに、同様にして本発明のオリゴヌクレオチドのさらに詳細な塩基配列を一般式で表すと次の一般式（ＩＩＩ）として表すことができる。
【００３７】
５’−ｎｎｎｍｗｇｃｒｗｇ  ｙｗｙｙｗｙｒｖ−３’        （ＩＩＩ）
（式中の記号は前記と同じであり、ｒはａ又はｇを示す。）
本発明のオリゴヌクレオチドは、前記してきた一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列を有するものに限定されるものではなく、鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの活性を有するものであって、前記してきた一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列と相同性を有するものを包含している。前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列は、図７に示される各種の植物における鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの配列の相同性から導入されたものであり、植物が高度に保存している鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントを初めて見出した本発明のシスエレメントの塩基配列をより具体的に塩基配列に示すための指標として創製されたものであり、本発明のシスエレメントの塩基配列が前記一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列のみに限定されるものでないことは当業者には自明のことである。
【００３８】
したがって、本発明は、ＩＤＳ２プロモーターから同定したＩＤＥ１又はＩＤＥ２である、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド単離物を提供するものである。本発明における「単離物」とは、天然にそのままの状態で存在するオリゴヌクレオチドと区別されるためのものであり、本発明の「単離物」は、天然に存在している遺伝子から単離されてきたもの、及び人工的に合成されたものなどを包含している。
本発明のオリゴヌクレオチド単離物を塩基配列の一般式を用いて示すならば、本発明は、一般式（Ｉ）、
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｈｈｄｖ−３’        （Ｉ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
で表される塩基配列、又はそれと８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物ということであり、より詳細には、本発明は、一般式（Ｉ）で表される塩基配列が、次の一般式（ＩＩ）、
５’−ｎｎｎｖｄｇｃｄｗｇ  ｙｈｂｈｗｈｄｖ−３’        （ＩＩ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｗはａ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示す。）
で表される塩基配列、又はそれと７０％以上、好ましくは８０以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物であり、さらに詳細には、本発明は、一般式（Ｉ）で表される塩基配列が、次の一般式（ＩＩＩ）、
５’−ｎｎｎｍｗｇｃｒｗｇ  ｙｗｙｙｗｒｖ−３’        （ＩＩＩ）
（式中の塩基の記号は配列表における塩基の表現についての記号の規則に従うものであり、即ち、ｎは任意の塩基を示し、ａはアデニンを示し、ｃはシトシンを示し、ｇはグアニンを示し、ｔはチミンを示し、ｖはａ、ｇ又はｃを示し、ｄはａ、ｇ又はｔを示し、ｈはａ、ｃ又はｔを示し、ｂはｇ、ｃ又はｔを示し、ｙはｔ又はｃを示し、ｍはａ又はｃを示し、ｋはｇ又はｔを示し、ｒはａ又はｇを示し、ｗはａ又はｔを示す。）
で表される塩基配列、又はそれと６０％以上、好ましくは７０以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を少なくとも有するオリゴヌクレオチド単離物を提供するものである。
本発明のオリゴヌクレオチド単離物としては、ＩＤＳ２プロモーターから同定されたＩＤＥ１やＩＤＥ２である、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’が挙げられるが、これに限定されるものではなく、図７に示されるような各種の植物のプロモーター中に存在しているシスエレメント相当の塩基配列が挙げられる。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチド単離物は、前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で示される１８塩基のものに限定されるものではなく、高等植物における鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有するものであって、前記した一般式の部分配列と一致又は相同性を有するものであれば、１８塩基より短くてもよいし、またそれ以上の長さを有するものであってもよい。
また、本発明のオリゴヌクレオチド単離物は、その一部に前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で示される塩基配列を有する部分が存在していればよく、したがって、本発明のオリゴヌクレオチド単離物は、シスエレメントの機能を有する塩基配列部分のほかに他の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド部分を有してもよい。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド単離物は、前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列の部分を少なくとも２箇所有するものが好ましいが、３箇所以上有するものであってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチド単離物は、一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される１８塩基のオリゴヌクレオチドのほかに、さらに他の塩基配列を含む５０〜１５００塩基、５０〜１０００塩基、５０〜８００塩基、１００〜１０００塩基程度のものであってもよい。
【００４０】
本発明のシスエレメントは、高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントである。
本発明のシスエレメントは、ＩＤＳ２プロモーターから同定したＩＤＥ１又はＩＤＥ２である、５’−ａｔｃａａｇｃａｔｇ  ｃｔｔｃｔｔｇｃ−３’、又は、５’−ｔｔｇａａｃｇｇｃａ  ａｇｔｔｔｃａｃｇｃ  ｔｇｔｃａｃｔ−３’で表される塩基配列、又はそれと相同性を有し、高等植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上を含有するものである。また、本発明のシスエレメントは前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列、又はこれらと相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分からなるものである。本発明のシスエレメントは少なくとも前記した塩基配列を有していればよく、また、植物によっては、高等植物における鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントの機能を有するものであって、前記した一般式の部分配列と一致又は相同性を有するものであれば、１８塩基より短くてもよいし、またそれ以上の長さを有するものであってもよい。本発明のシスエレメントは、オリゴヌクレオチド中に前記した一般式（Ｉ）、一般式（ＩＩ）、又は一般式（ＩＩＩ）で表される塩基配列、又はこれらと相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を少なくとも１箇所、好ましくは２個、又は２個よりも多く有するものである。これらが存在する位置は、遺伝子が発現する植物によっても異なるが、翻訳開始点を＋１として−５〜−１０００、−５０〜−９００、好ましくは−１００〜−３００の間のあたりであるが、特に限定されるものではなく本発明のシスエレメントが導入される植物において当該シスエレメントが十分に機能できる位置であればよい。第２番目のシスエレメントは、第１番目のシスエレメントから上流側に３０塩基以上、５０塩基以上、好ましくは８０塩基以上はなれた位置の導入するのが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明のプロモーターは、前記してきた本発明のシスエレメントを含有してなるものであり、高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するためのものである。本発明のプロモーターは、前記してきた本発明のシスエレメント部分を２箇所以上有するものが好ましいが、これに限定されるものではなく高等植物に鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与又は促進することができる機能を有するものであればよい。
本発明のプロモーターの下流側に発現可能な遺伝子を結合させることができる。このような遺伝子としては、ニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子などの鉄吸収に関連する遺伝子に限定されるものではなく、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子や有用なタンパク質をコードしている遺伝子などが挙げられる。本発明のプロモーターの下流側に結合されたこれらの遺伝子は、植物が鉄を十分に吸収できる状態であるときは発現せずに、植物が鉄欠乏の環境になったときに特異的に発現し、特に根において発現するものであり、植物の環境を設定することによりその発現を制御することができる。
【００４２】
また、本発明は、前記してきた本発明のプロモーターの下流側に発現可能な遺伝子を結合させた遺伝子を用いて、高等植物を形質転換する方法を提供するものである。本発明の方法は、高等植物を鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与又は促進させるための方法であり、本発明のプロモーターの下流に結合された遺伝子を、植物が鉄を十分に吸収できる状態であるときは発現せずに、植物が鉄欠乏の環境になったときに特異的に発現し、特に根において発現させることができ、植物の環境を設定することによりその発現を制御することができる。
本発明の形質転換方法としては、公知の遺伝子の導入技術、例えばバキュロウイルスを用いる方法などにより行うことができる。形質転換された植物を生育させて、目的の形質を有する植物を選別することにより、形質転換植物を得ることができる。
植物としては、高等植物であれば特に制限はないが、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどの穀物植物が好ましいが、これに限定されるものではない。本発明のシスエレメントは、鉄吸収におけるストラテージ−Ｉの植物にも、ストラテージ−ＩＩの植物にも適用することができる。
また、本発明は、このような方法により形質転換された植物、好ましくは高等植物を提供するものでもある。
【００４３】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  （コンストラクトの構築）
タバコに導入するために構築したコンストラクトの、融合プロモーターの下流にＧＵＳ遺伝子を連結した部分の構造を図１、図２、図３、及び図４に示す。これらのコンストラクトの基本骨格は、ＧＵＳ遺伝子の下流にノパリン合成酵素の転写終止配列を連結した構造および、カナマイシン耐性遺伝子カセットをＴ−ＤＮＡ領域内に持つバイナリーベクターである。ｐＬＰ１９（Ｓｚａｂａｄｏｓ，Ｌ．，Ｒａｔｅｔ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２，  ９７３−９８６）またはｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に由来している。ｐＬＰ１９はＧＵＳ遺伝子の上流に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの、転写開始点を＋１として数えて‐９０／＋８部位の領域（以下、３５ＳΔ９０と表記する）をもつ。一方、ｐＢＩ１０１のＧＵＳ遺伝子の上流に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの、転写開始点を＋１として数えて‐４６／＋８部位の領域（以下、３５Ｓ△４６と表記する）を挿入したコンストラクトを以下のようにして作製した。
まず、３５ＳΔ４６配列を以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって増幅した。
３５Ｓ‐４６Ｆ  ：  ＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴ
３５Ｓ−４６Ｒ  ：  ＣＣＣＧＧＧＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧ
【００４５】
増幅断片を  ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサプクローニングし、配列をＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０）で確認した。この３５Ｓ△４６配列を、３５Ｓ−４６Ｆおよび３５Ｓ‐４６Ｒプライマーの５’端にあらかじめ設計しておいた、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩのサイトにおいて制限酵素で切り出し、ｐＢＩ１０１の同サイトに挿入した。こうして完成したコンストラクトを、以下ｐＢＩ１０１ｄ４６と表記する。
ＩＤＳ２遺伝子のプロモーター領域は、オクムラらにより、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．  ｃｖ．ＮＫ  １５５８）から単離された（Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｎ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５，  ７０５−７１９）。これをもとに、図１、及び図２に示した３’‐欠失断片（‐１６９６／‐９１，‐１６９６／‐２７３，‐１６９６／４９２，‐１６９６／‐６８６，‐１６９６／‐６６，‐１６９６／‐１１２９，−１６９６／‐１２７４，‐１６９６／‐１５４１，‐２７２／−９１，‐２７２／‐１３６，‐２７２／‐１８１，および‐２７２／−２２７の配列）を以下のプライマー対を用いたＰＣＲによって増幅した。
【００４６】
‐１６９６Ｆ：  ＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＣ
−２７２Ｆ  ：  ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＴＴＴＧＡＡＣＧＧＣ
‐９１Ｒ    ：  ＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＴＧ
‐２７３Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＴＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡ
−４９２Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＣＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡ
‐６８６Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧ
‐８６６Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＡＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴ
−１１２９Ｒ：  ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＡＧＡ
‐１２７４Ｒ：  ＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧＡＴＴＧＡ
‐１５４１Ｒ：  ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＴＡＧＣＣＴＣＣ
−１３６Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡ
‐１８１Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴ
‐２２７Ｒ  ：  ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣ
【００４７】
なお、各プライマー名における数字はプロモーター断片端の翻訳開始点からの位置を示し、ＦおよびＲはそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーを意味している。増幅断片をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯへサブクローニングし、配列をＤＮＡシーケンサーで確認した。これらのプロモーター配列を、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’端にあらかじめ設計しておいた、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩサイトにおいて制限酵素で切り出し、ｐＢＩ１０１ｄ４６またはｐＬＰＩ９の同サイトに挿入した。
図３および図４に示した変異断片は、３’端がお互いに相補配列である合成オリゴマー対をアニーリングし、フィリング−イン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）することにより作製した。
ＩＤＳ２遺伝子プロモーターの‐１８０／‐１３６領域をもとに、連続した９塩基について、Ａ→Ｃ、Ｃ→Ａ、Ｇ→Ｔ、Ｔ→Ｇの変異を導入し、各々の５’端には、ＢｇｌＩＩまたはＸｈｏＩサイトを、３’端にはＢａｍＨＩサイトを付加した断片を作製した（図３ａ参照）。これらの断片に連結する上流配列として、ＩＤＳ２遺伝子プロモーターの‐２７２／‐１８１配列または‐２７２／‐２２７配列をもとに、３’端近傍の‐１８５／‐１８１（ＡＧＡＣＡ）または‐２３１／‐２２７（ＣＴＣＴＣ）配列をそれぞれＡＧＡＴＣＴまたはＣＴＣＧＡＧ配列に置換して、ＢｇｌＩＩまたはＸｈｏＩサイトとしたものを作製した（図３ａおよび図４ａ参照）。また、−２７２／−２２７領域をもとに、連続した９ないし１０塩基対について、Ａ→Ｃ，Ｃ→Ａ，Ｇ→Ｔ，Ｔ→Ｇの変異を導入し、各々の５’端にはＨｉｎｄＩＩＩサイトを、３’端にはＸｈｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した断片を作成した（図４ａ参照）。以上の合成オリゴマー対を各々アニーリングし、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素を用いてフィリング−イン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）した後、ゲル精製して制限酵素処理を行った。これらの断片をｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）またはｐＣＲ２．１ＴＯＰＯへサブクローニングして適切な順序に連結し、配列をＤＮＡシーケンサーで確認した。これらの構築断片を、ｐＢＩ１０１ｄ４６のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩサイトに挿入した。
【００４８】
実施例２  （形質転換タバコの作製）
実施例１で構築したコンストラクトを、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣ５８株に導入し、常法（リーフディスク法）により、タバコ（Ｎａｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｐｅｔｉｔ‐Ｈａｖａｎａ  ＳＲＩ）を形質転換した。再分化したカナマイシン耐性体（Ｔ０世代）は鉢上げして土に植え、閉鎖系温室で栽培して種子（Ｔ１世代）を収穫した。温室の条件は３０±３℃、１２時間明−１２時間暗サイクルとした。葉片からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認した。
【００４９】
実施例３  （ＧＵＳ活性測定のための栽培条件）
Ｔ１世代の形質転換体を用いて、鉄十分条件（＋Ｆｅ）および鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）におけるＧＵＳ活性の測定を行った。栽培条件は２８±１℃、１６時間明−８時間暗サイクルとした。まず、Ｔ１種子を３％シュークロース、０．２％  ゲランガム、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むムラシゲ・スクーグ培地に無菌的に播種し、およそ２０日間生育させた。次いで、マジェンダボックスの中に通常の（＋Ｆｅ）、または鉄を除いた（‐Ｆｅ）ムラシゲ・スクーグ液体培地を入れ、メンブレン培養システムのラフト（Ｌｉｆｅ  ｒａｆｔ、ポアサイズ  ２５μｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を浮かべた上に、各ラインにつき５個体の形質転換体を移植し、６日間、７日間、２０日間、３０日間のいずれかの生育の後、植物体をサンプリングし、ＧＵＳアッセイに供した。
【００５０】
実施例４  （ＧＵＳ活性の測定）
ＧＵＳ酵素活性の定量的検出のためには、サンプリングした植物体の根または葉を、ＧＵＳ抽出バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭＮａ２−ＥＤＴＡ、０．１％ラウリルサルコシンナトリウム、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンｘ−１００）を用いて破砕した。１０分間の遠心の後に上清を回収し、ＧＵＳ抽出液とした。この抽出液について、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（４‐ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ‐β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）（ＭＵＧ）を基質とした酵素活性測定を行い、生成した４−メチルウムベリフェロン（４‐ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（ＭＵ）を分光蛍光光度計（Ｆ２５００、日立）で定量した。抽出液のタンパク質濃度をバイオ−ラッドプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）により定量し、ＧＵＳの比活性をｐｍｏｌ  ＭＵ  ｍｉｎ−１  ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１の単位で表した。実験区ごとの比活性の有意差検定は、ノンパラメトリック法のマン−フイットニー検定（Ｍａｎｎ‐Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ）により行った。
組織化学染色のためには、サンプリングした植物体の根を、染色液（１ｍＭ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニル−β−Ｄ−グルクロニド（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｙｌ‐β‐Ｄ‐ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）（Ｘ‐ｇｌｕｃ）、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、１０ｍＭＮａ２‐ＥＤＴＡ、１ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭフェロシアン化カリウム、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ‐１００）に浸潰して約４０分間の脱気の後、３７℃で一晩静置した。染色した根を固定液（４％パラホルムアルデヒド、５％  グルタルアルデヒド、０．１ＭＣａＣｌ２、０．１  Ｍカコジル酸バッファー（ｐＨ  ７．０））に浸漬して氷上で３時間固定した。次いで、試料をエタノール、アセトン順に脱水し、スパー樹脂に包埋した。５μｍの横断切片を制作し、トルイジンブルーと塩基性フクシン（ｅｐｏｘｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔａｉｎ；  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で緩く染色して光学顕微鏡で観察した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明は、植物の鉄欠乏応答性及び／又は根特異的発現を付与するシスエレメントを提供するものである。本発明のシスエレメントは、鉄吸収におけるストラテージ−Ｉの植物にも、ストラテージ−ＩＩの植物にも適用することができ、植物の種類にかかわりなく、広く高等植物に適用可能なものである。また、本発明のシスエレメントを使用することにより、下流に導入した遺伝子が鉄欠乏の環境により選択的に発現するように制御することができる。また、根に特異的に発現させることもできるようになる。このように本発明によれば、植物の組織特異的に発現する、また環境に応じて発現することができるように、発現を制御することができる新規なシスエレメントを提供するものである。
本発明は、このように発現を制御可能にするシスエレメントを初めて同定することに成功したものであり、植物の遺伝子の発現の制御の機構などの解明に極めて有用なだけでなく、アルカリ土壌などの鉄分や微量金属成分の不足している土地を利用して作物を生産することができる形質転換された新種の植物の創製に極めて重要な遺伝子制御の手法を提供するものである。
【００５２】
【配列表】
2005006599.tif 000002
2005006599.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの‐１６９６／‐９１配列について、各種の３’‐欠失断片を構築し（図１の左側）、それぞれのＧＵＳ活性を調べた結果を示す。図１の右側のグラフは、ＧＵＳ活性の平均値（棒グラフ）と標準誤差（棒線）を示した。根におけるＧＵＳ活性を図１の左側のグラフに、葉におけるＧＵＳ活性を図１の右側のグラフにそれぞれ示す。各グラフ中の白抜きは鉄十分条件（＋Ｆｅ）の場合を示し、黒抜きは鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）の場合を示す。各グラフの横軸はＧＵＳ活性を示し、単位はｐｍｏｌ  ＭＵ／分／ｍｇタンパク質である。各グラフの右側の数値は、鉄十分条件（＋Ｆｅ）に対する鉄欠乏条件（‐Ｆｅ）でのＧＵＳ活性の相対比を示し、アスタリスク（＊又は＊＊）は有意差（＊＊はｐ＜０．０１、＊はｐ＜０．０５）があることを示す。
【図２】図２は、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの‐２７２／‐９１の配列について、各種の３’‐欠失断片を構築し（図２の左側）、それぞれのＧＵＳ活性を調べた結果を示す。図２の右側のグラフは、図１におけるグラフの説明と同様である。
【図３】図３の（ａ）は、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの‐１８０／‐１３６の配列について、構築した各種の変異体の塩基配列を示し、図３の（ｂ）はこれらの変異体の各構築物を３５Ｓ△４６に連結したプロモーター‐ＧＵＳ部位（図３（ｂ）の左側）、及びそれらの根におけるＧＵＳ活性の測定結果を示す（図３（ｂ）の右側のグラフ）。図３の（ｂ）の右側のグラフは、図１におけるグラフの説明と同様である。
【図４】図４の（ａ）は、ＩＤＳ２遺伝子のプロモーターの−２７２／−２２７の配列について、構築した各種の変異体の塩基配列を示し、図４の（ｂ）はこれらの変異体の各構築物を３５Ｓ△４６に連結したプロモーター‐ＧＵＳ部位（図４（ｂ）の左側）、及びそれらの根におけるＧＵＳ活性の測定結果を示す（図４（ｂ）の右側のグラフ）。図４の（ｂ）の右側のグラフは、図３の（ｂ）におけるグラフの説明と同様である。
【図５】図５は、、ＩＤＳ２のプロモーターの断片をＧＵＳに連結したコンストラクトを導入した形質転換タバコのＴ１世代の形質転換体を鉄欠乏条件で生育させた後の根におけるＧＵＳ染色のパターンを示す図面に代わるカラー写真である。図５の各写真のスケールバーは１００μｍである。図５の（ａ）はクローン１‐４６の鉄欠乏条件の根の横断切片、図５の（ｂ）は（ａ）の拡大図（Ｃｏは皮層、Ｅｎは内皮、Ｐｅは内鞘、Ｐｈは篩部、Ｘｙは木部）、図５の（ｃ）はクローン１‐４６の鉄欠乏条件の根の拡大像、図５の（ｄ）はクローン１２‐９０の鉄欠乏条件の根の横断切片、をそれぞれ示す。
【図６】図６は、本発明のＩＤＥ１とＩＤＥ２の協同的な機能についてまとめたものである。図６の楕円はそれぞれのシスエレメントに結合すると考えられるトランス因子を表す。実線と矢印は鉄欠乏に応答した根での発現誘導の状況を模式的に示したものであり、線の太さは誘導性の強さに対応している。破線は３５Ｓ△９０による根での構成的発現を示す。網掛け部位は−２６３／−２５４，−２５３／−２４５，−２４４／−２３６，‐１５３／‐１４５または‐１４５／‐１３６の変異を示す。
【図７】図７は、本発明のＩＤＥ１またはＩＤＥ２に相同性がある各種の植物の鉄欠乏応答性遺伝子プロモーターの塩基配列を比較した一覧表である。図７の最上段はＩＤＥ１とその３’−側の隣接４塩基（ＩＤＥ１＋）を示し、最下段はこれらの比較から想定されるコンセンサス配列の例を示し、最下段のひとつ上の段はＩＤＥ２を示す。ＩＤＥ１およびＩＤＥ２のかぎ括弧で囲った部位は変異を導入した部位を示し、ＩＤＥ１内のパリンドローム配列を四角で囲い、中心位置を黒抜きの三角で示す。ＩＤＥ１＋と一致する配列を黒い領域に白文字で示す。翻訳開始点からの距離を括弧内に示す。コンセンサス配列（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）のうち、特に保存性が高かった塩基を大文字に下線で示す。図７のＨｖｎａａｔ−ＡおよびＨｖｎａａｔ−Ｂは、それぞれオオムギのニコチアナミンアミノ基転移酵素遺伝子、ＨｖＮＡＳ１はオオムギのニコチアナミン合成酵素遺伝子、ＯｓＮＡＳ１およびＯｓＮＡＳ２はイネのニコチアナミン合成酵素遺伝子、ＨｖＩＤＳ３はオオムギのムギネ酸合成酵素遺伝子、ＯｓＩＲＴ１はイネの二価鉄トランスポーター遺伝子、ＡｔＩＲＴ１はシロイヌナズナの二価鉄トランスポーター遺伝子、ＡｔＦＲＯ２はシロイヌナズナの三価鉄キレート還元酵素遺伝子、ＡｔＮＡＳ１はシロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子をそれぞれ示す。ＩＤＥ２の配列の下の破線は、既知の植物のシスエレメントとの相同性を示したものである。ＴＣＡＣはタバコｇ１０プロモーターのＧＴＧＡ  モチーフ。ＣＴＧＴＣＡＣは病原関連の遺伝子プロモーターにみられるジャガイモサイレンシングエレメント結合因子の結合サイト（ＹＴＧＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｃ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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