(57)【要約】      （修正有）【課題】ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子等の提供、及び診断用酵素として測定用キットに利用する。【解決手段】Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ由来の特定のアミノ酸配列からなるジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。該タンパク質のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質及び該タンパク質のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質。並びに、上記酵素をコードする遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
【請求項２】
以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
（ｃ）至適ｐＨ：７．０〜１０．０
【請求項３】
以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
（ｃ）至適ｐＨ：７．０〜１０．０
（ｄ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ４．０〜１０．０
（ｅ）作用適温の範囲：３０〜４０℃
（ｆ）熱安定性：４０℃、１０分の熱処理で７０％以上の活性が残存する。
（ｇ）分子量：約３１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼをコードするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
請求項５記載の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼを採取することを特徴とするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非対称ジメチルアルギニン（以下、ADMAと略称する。）は、ヒト生体内において、NO合成酵素の内因性阻害剤として知られており、生体内でのNOの生成量をコントロールするもののひとつである可能性が示唆されている（非特許文献１参照）。NOの役割としては、血管収縮弛緩コントロール、マクロファージより産生されたNOによる生体防御、神経伝達物質としての利用などが現在知られている。
【０００３】
近年、NOと関連する疾患についての研究が進み、動脈硬化、高血圧、妊娠中毒症等においてADMAとの関連性が知られるようになった（非特許文献２及び非特許文献３参照）。すなわち、ADMA量を測定することにより、上記動脈硬化等の疾患の診断が可能であることが示唆されている。
【０００４】
現在ADMAは、HPLCを用いる方法（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８及び非特許文献９参照）あるいはELISA（特許文献１参照）により測定されている。更にジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（以下、DDAHと略称する。）を用いた酵素的測定法も開示されている（特許文献２参照）。
【０００５】
この測定法は、生体中ADMAをDDAHによりシトルリンに変換し、シトルリン量を測定する方法である。DDAHは、小川等により初めてラットより単離されており（非特許文献１０参照）、ヒト由来遺伝子（非特許文献１１及び非特許文献１２参照）、ラット由来遺伝子（非特許文献１３参照）等が知られている。しかしながら、生体組織からDDAHを大量に抽出精製することは困難であり、これまでに知られている組み換え型ｓDDAHは、ヒスチジンタグ、GSTタグ等を付加しなければ大腸菌で発現できず、発現量もわずかであることが報告されている。
【０００６】
微生物由来遺伝子については、組み換え型DDAHについて報告がされている（非特許文献１４及び非特許文献１５参照）。
【０００７】
しかし、微生物培養物から天然型酵素を精製した例は報告されていない。組み換え型DDAHは、ヒスチジンタグを付加した形で大腸菌で発現することが報告されている。しかし、詳細な酵素的性質は明らかになっていない。また、ADMAに対する比活性が報告されている微生物由来酵素の中で一番強いと思われるPseudomonas aeruginosa由来酵素はわずかではあるがアルギニンデイミナーゼ活性を有することから高感度ADMA測定キットに用いる場合、充分とはいえない。
【０００８】
更に、タグを付加したDDAHを精製するには、タグをトラップする専用の樹脂を用いることが有用であり、精製後、タグを専用のプロテアーゼで処理してやる必要がある場合が多い。
【０００９】
このように、従来知られているDDAHは、発現量が少ないこと、あるいは、専用の樹脂もしくはプロテアーゼを用いるという点から、大量精製には向かず、測定キットの調製上極めて困難な点があった。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第98／49199号パンフレット
【特許文献２】米国特許第6358699号明細書
【非特許文献１】PNAS  99、13527-13532、2002
【非特許文献２】Lancet 339、572-575、1992
【非特許文献３】Circulation 98、1842-1847、1998
【非特許文献４】J.Chromatogr.B 692、257-262、1997
【非特許文献５】Biochem.Biophys.Res.Commun. 219、598-603、1996
【非特許文献６】J.Chromatogr.B 742、199-203、2000
【非特許文献７】J.Chromatogr.B 659、185-207、1994
【非特許文献８】Anal.Biochem.303、131-137、2002
【非特許文献９】Anal.Biochem. 318、13-17,2003
【非特許文献１０】J.Biol.Chem.264、10205-10209、1989
【非特許文献１１】Eur.J.Biochem.258、863-868、1998
【非特許文献１２】Biochem.J. 343、209-214、1999
【非特許文献１３】Biochim.Biophys.Acta 1337、6-10、1997
【非特許文献１４】Biochem.J. 343、209-214、1999
【非特許文献１５】Molecular Microbiology 33、1278-1279、1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、機能未知で、Sinorhizobium meliloti由来の遺伝子配列が、新規なジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていること、また、このジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子にタグを付加することなく、極めて効率よく該遺伝子を発現させることができること等を見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
（２）以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
（ｃ）至適ｐＨ：７．０〜１０．０
（３）以下の理化学的性質を有するジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）作用：非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：アルギニンには作用しない。
（ｃ）至適ｐＨ：７．０〜１０．０
（ｄ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ４．０〜１０．０
（ｅ）作用適温の範囲：３０〜４０℃
（ｆ）熱安定性：４０℃、１０分の熱処理で７０％以上の活性が残存する。
（ｇ）分子量：約３１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（５） 以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼをコードするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
（６） 項目（５）記載の遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
（７）項目（６）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
（８）項目（７）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼを採取することを特徴とするジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの製造法が提供され、診断用酵素として測定用キットに容易に利用されると共に、このジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ遺伝子にタグを付加することなく安価に、かつ、大量に供給されるため産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のＤＤＡＨとは、非対称ジメチルアルギニンに作用し、シトルリン及びジメチルアミンを生成する反応を触媒する酵素であり、アルギニンには作用しない酵素である。この作用を有する酵素であれば、如何なる酵素でも本発明ＤＤＡＨに含まれる。
【００１７】
ジメチルアルギニン + H2O → ジメチルアミン＋シトルリン 
【００１８】
また、ＤＤＡＨの一形態として、例えば、上記反応を触媒する作用を有するアルギニンには作用しないＤＤＡＨ、上記反応を触媒する作用を有し、かつｐＨ７．０〜１０．０で作用するＤＤＡＨ、上記反応を触媒する作用を有し、かつｐＨ７．０〜１０．０で作用し、アルギニンに作用しないＤＤＡＨ等が挙げられる。
更には、上記反応を触媒する作用を有すると同時に、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の理化学的性質を夫々もしくはそれらを適宜併せて有するＤＤＡＨ等も本発明ＤＤＡＨとして挙げられる。
（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜１０．０
例えば、緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜８．５）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行ない、至適ｐＨを求める。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ７．０〜１０．０、好ましくはｐＨ９．０〜１０．０の理化学的性質を有する本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。
（ｂ）作用適温の範囲：３０〜４０℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行ない作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃の理化学的性質を有する本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。          
（ｃ）熱安定性：４０℃、１０分間の熱処理で７０％以上の活性が残存する。
例えば、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、４０℃で１０分間処理した後、本酵素の残存活性を測定する。例えば、上記処理条件下で、５０％以上、好ましくは７０％以上活性が残存している本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。
（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ４．０〜１０．０
例えば、緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜８．５）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明ＤＤＡＨの残存活性を測定する。例えば、安定ｐＨ範囲として、ｐＨ４．０〜１０．０、好ましくはｐＨ８．０〜１０．０の理化学的性質を有する本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。
（ｅ）分子量：約３１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
例えば、マルチゲル４／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求める。例えば、分子量として２５，０００〜６０，０００、好ましくは、３０，０００〜４０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の分子量を有する本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。
【００１９】
本発明ＤＤＡＨの酵素活性の測定方法としては、トリチウムラベルしたADMAを用いる方法、あるいは、酵素の反応により生成するシトルリンを測定する方法が主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、シトルリンを測定する方法について示す。以下、本発明ＤＤＡＨの活性測定には、ことわりのない限り、ADMAを基質として用いる。なお、酵素力価は、ADMAを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌのシトルリンを生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【００２０】
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：発色液Ａ
５００ｍｇのアンチピリン、２７８ｍｇの硫酸鉄を５０％硫酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（２）試薬２：発色液Ｂ
８００ｍｇのジアセチルモノオキシムを５％酢酸に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１０ｍＭ；終濃度  １ｍＭ）
非対称ジメチルアルギニン２５ｍｇをイオン交換水に溶解して９．１ｍｌに定容する。対称ジメチルアルギニン又はＬ−アルギニンを基質として用いるときは夫々、２５ｍｇ、１６ｍｇをイオン交換水に溶解して、９．１ｍｌに定容した溶液を用いる。
（４）試薬４：２００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）
（５）試薬５：混合発色液
使用直前に試薬１及び試薬２を等量混合する。
【００２１】
Ｂ．測定法
０．２５ｍｌの試薬４及び０．２ｍｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後０．０５ｍｌの試薬３を加えて充分混合した後、３７℃で２０分間インキュベートする。０．２５ｍｌの試薬５を添加し、よく攪拌した後、８５℃で４０分反応させる。放冷後、分光光度計で４６６ｎｍにおける吸光度を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これを予め作製しておいたシトルリンを試薬３の代わりに、又酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分間当たりに生成されるシトルリンのマイクロモルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。アルギニンに作用するか否かを測定するときは、非対称ジメチルアルギニンの代わりにＬ−アルギニンを基質として用いた試薬３（基質溶液）を用いることにより、上記と同様の操作で測定することができる。
【００２２】
このように本発明ＤＤＡＨ等は、非対称ジメチルアルギニンに作用し、ジメチルアミン及びシトルリンを生成する、前式に示した反応を触媒するＤＤＡＨであり、例えば、前記作用を有し、前述した種々の理化学的性質を夫々もしくは適宜組み合わせて、併せ持つ本発明ＤＤＡＨ等も挙げることができる。そしてこれらの本発明ＤＤＡＨは、生体材料あるいは試料中の非対称ジメチルアルギニンに効率よく作用するため、非対称ジメチルアルギニン測定用酵素として有効に用いられる。更に、タグを付加することなく組み換え体で充分に生産でき、アルギニンに作用しない本発明酵素は、臨床診断用酵素として利用する上で、特に好ましい本発明ＤＤＡＨとして挙げられる。
【００２３】
本発明ＤＤＡＨ等は、微生物、動物、植物等起源の酵素を探索して、自然界より取得することができる。例えば、本発明ＤＤＡＨを生産する能力を有する微生物を探索する場合、非対称ジメチルアルギニン等の酵素生産誘導物質を加えた培地で微生物を培養し、得られた微生物菌体を破砕し、非対称ジメチルアルギニンを基質として用い、ＤＤＡＨ活性を調べることにより本発明ＤＤＡＨ生産能を有する微生物を取得できる。ここで用いる微生物は、土壌から新たに分離してもよく、更には、微生物保存機関等より入手した微生物を用いることもできる。更に、現在までに知られているＤＤＡＨ遺伝子配列により相同性検索を行ない、機能未知の遺伝子配列情報を入手し、クローニングしてもよい。
【００２４】
更に、本発明ＤＤＡＨとして、遺伝子工学的技術あるいは変異処理等の方法により、天然型の本発明ＤＤＡＨを改変して得られる本発明ＤＤＡＨも挙げられる。
【００２５】
改変する方法としては、例えば、上記ＤＤＡＨを生産する生物に、紫外線、Ｘ線、放射線等を照射したり、もしくはエチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の変異誘発剤を接触させることにより、改変された本発明ＤＤＡＨを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明ＤＤＡＨを得る方法等が挙げられる。一般的には、遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするＤＤＡＨ等をコードする遺伝子を改変することにより、本発明ＤＤＡＨを得ることもできる。
【００２６】
更に、本発明ＤＤＡＨとして、例えば、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）等の本発明ＤＤＡＨ等が挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＤＤＡＨ。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むＤＤＡＨ。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含むＤＤＡＨ。
【００２７】
ここで、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたことを意味する。
【００２８】
また、「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であれば特に制限がなく、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００２９】
上記本発明ＤＤＡＨとして、例えば、シノリゾビウム メリロッティ ＡＴＣＣ５１１２４ (Sinorhizobium  meliloti ATCC51124)の染色体ＤＮＡ由来の天然型ＤＤＡＨ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られるＤＤＡＨが挙げられる。更に、自然界より取得された種々起源のＤＤＡＨ等からも得られる。
【００３０】
次に、本発明遺伝子の取得法について説明する。
本発明遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、現在までに知られているDDAH遺伝子配列を公開されているデータベースを用いて相同性検索を行ない、相同性の高いホモログをピックアップしてくる。得られたホモログ遺伝子情報より構造遺伝子を増幅できるようプライマーを設計する。前述した本発明ＤＤＡＨホモログを有する微生物菌体あるいは種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology （WILEY Interscience，1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する。上記構造遺伝子を増幅できるプライマーを用いて、染色体DNA又はｍRNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）あるいは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、目的の遺伝子ＤＮＡを増幅させ本発明遺伝子ＤＮＡを得ることができる。例えば、シノリゾビウム メリロティ ATCC５１１２４ (Sinorhizobium  meliloti ATCC51124)の本発明遺伝子を以下のようにして得ることができる。
【００３１】
先ず、上記微生物等を培養し、得られた菌体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢等を用いて物理的に磨砕することにより、細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて、通常の方法により染色体ＤＮＡを抽出する。本発明ＤＤＡＨホモログの遺伝子配列から構造遺伝子を増幅できるＰＣＲに用いるプライマーを合成する。これらのプライマーと上記の得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行ない、本発明ＤＤＡＨをコードするＤＮＡ断片を得る。増幅されたＤＮＡは、通常の方法に準じてクローニングできる。この増幅されたＤＮＡを適当なベクターに挿入して組み換え体ＤＮＡを得る。クローニングには、例えば、ＴＡ Cloning Kit （Invitrogen 社）等の市販のキットあるいはベクターとしては、ｐUC１１９（寶酒造社製）、ｐBR３２２（寶酒造社製）、ｐMAL−C2（NEW England Labs 社製）、ｐBluescript I I  SK+（Stratagene社製）、pKK223-3（アマシャム・バイオテク社）等のプラスミドベクターDNAあるいはλENBL3（Stratagene社製）、λDASH I I （フナコシ社製）等のバクテリオファージベクターDNA等を用いることができる。
【００３２】
このようにして得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９、ＤＨ５α（共に東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ〔フナコシ（株）製〕等を形質転換又は形質導入し、組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得ることができる。形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法(Methods in Enzymology,68,326-331,1979)により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方法 (Methods in Enzymology,68,299-309,1979)により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞等使用できる。
【００３３】
上記増幅されたＤＮＡの全塩基配列は、例えば、LI-COR MODEL 4200L シークエンサー（LI-COR社製）、３７０Ａ  ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社製）等を用いて、解析することができる。得られた本発明遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、本発明ＤＤＡＨのアミノ酸配列が確認される。
【００３４】
本発明遺伝子の一例として、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子等が挙げられる。配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミドｐＴ７ｓＤＤＡＨは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３５として寄託されている。
【００３５】
更に、上記本発明遺伝子を改変することにより、種々の改変された本発明ＤＤＡＨを得ることができる。
【００３６】
上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができ、例えば、前記の組み換え体ＤＮＡに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸等の化学変異剤を接触させる方法、又はＰＣＲ法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換又は欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組み換え体ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組み換え体ＤＮＡを脱塩カラム、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の組み換え体ＤＮＡを得ることができる。
【００３７】
これらの改変により、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＤＡＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡあるいは配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示し、かつＤＤＡＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる本発明遺伝子が得られる。
【００３８】
更に、本発明遺伝子を改変することにより、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＤＡＨ活性を有するタンパク質あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつＤＤＡＨ活性を有するタンパク質等の本発明ＤＤＡＨがえられる。
【００３９】
次に、本発明ＤＤＡＨ等の製造法について述べる。
本発明ＤＤＡＨ遺伝子を含む形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物より本発明ＤＤＡＨ等を、通常用いられている種々の蛋白質分離方法を用いて、回収することにより製造することができる。一例として、本発明ＤＤＡＨ遺伝子を含む形質転換体又は形質導入体を用いる以下の方法が、具体的な製造方法として採用できる。先ず、本発明ＤＤＡＨを生産する形質転換体又は形質導入体（以下「組み換え菌」と総称する）を培養する。この場合、固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのがより好ましい。又、上記微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆もしくは小麦麹の浸出液等１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に、必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。酵素生産誘導基質として、プロモーターに適した誘導基質、例えば、ＩＰＴＧ等を適宜添加するのも生産量を向上させるのに有効である。
【００４０】
なお、培地の初発ｐＨは、例えば、７．０〜９．０に調製するのが適当である。また培養は、例えば、２５〜４２℃、好ましくは３０℃前後で１〜５日間、通気攪拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明ＤＤＡＨを採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。
【００４１】
次いで、培養液から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明ＤＤＡＨを採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から本発明ＤＤＡＨを採取するのが好ましい。
【００４２】
このようにして得られた粗酵素液から本発明ＤＤＡＨを精製、単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。このようにして、本発明ＤＤＡＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドを示すまでに単離することができる。又、上記精製方法を適宜組み合わせて、用途に応じた精製度合の異なる酵素標品を調整することもできる。
【００４３】
このようにして得られた本発明ＤＤＡＨは、例えば、米国特許第6358699号明細書記載のジメチルアルギニン測定等に有効に用いられる。先ず、非対称ジメチルアルギニンを含むサンプルに本発明ＤＤＡＨを作用させ、シトルリンを遊離させる。遊離したシトルリン量を上記活性測定法に従って測定する。
【００４４】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
【実施例１】
【００４５】
（データベース検索）
ラット由来DDAHアミノ酸配列を用いてBLASTデータベース検索を行なった。その結果、ラット由来、ヒト由来の他に、昆虫由来あるいは微生物由来ホモログの存在が明らかになった。
2005261317.tif 000002
【００４６】
Sinorhizobium  meliloti  ATCC51124は、ゲノム解析されており、全ゲノムDNA情報が明らかにされている。該遺伝子は、活性の知られている哺乳類由来あるいは微生物由来のアミノ酸配列とは２８〜３８％の相同性にしか過ぎず、該遺伝子のコードする酵素の機能あるいは性質については、これまで調べられていなかった。
【実施例２】
【００４７】
［本発明遺伝子（Sinorhizobium  meliloti）のクローニング及び形質転換体による発現］
（１）プライマーの合成及びＤＮＡの調製
アミノ酸配列相同性検索より判明したSinorhizobium  meliloti由来遺伝子配列に基づいて構造遺伝子を増幅できるDNAプライマーをシグマジェネシス社の受託合成により作製した。Sinorhizobium  melilotiは、ATCCより菌株を購入し、ATCC指定の方法で復元した後、０．２ＬのTY培地に接種し、３０℃、１２０ｒ.ｐ.ｍ.で１日間回転振とう培養した。この培養液より、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体は、５ｍｌのＴＥバッファーで懸濁し、等量のＴＥ飽和フェノールを添加した後、緩やかに振とうすることにより溶菌させた。１２０００ｒ.ｐ.ｍ.で２分遠心後、上清を取りだし、更に、ＴＥ飽和フェノールで除蛋白処理を行なった。最後に、エタノール沈殿法によりＤＮＡを回収し、１．２０ｍｇのＤＮＡを得た。
【００４８】
（２）ＰＣＲ
反応液を以下の組成で調製し、変性を９４℃、３０秒間、アニールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、２分間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。
（反応液組成）
１０μＭプライマー（配列番号３）      ０．６μｌ
１０μＭプライマー（配列番号４）      ０．６μｌ
10×ＰＣＲバッファー                  ２μｌ
ｄＮＴＰ                              ２μｌ
１ｍＭ塩化マグネシウム                ０．８μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ                    ０．４Ｕ
Ｈ２Ｏ                    最終容量２０μｌになるよう加える。
ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約０．８kbの位置に目的の断片と思われるバンドが確認されたので、そのバンドをＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出した。
【００４９】
（３）精製ＤＮＡ断片の解析
精製したＤＮＡ断片を３７０Ａ ＤＮＡシークエンシス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列は、データベースのＤＮＡ配列と同じであった。一方プラスミドpT7−Blue（ノバジェン社製）を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、上記精製抽出したＤＮＡ断片とライゲーション反応を行ない、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたプラスミドｐＴ７ｓＤＤＡＨは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３５として寄託されている。
【００５０】
（４）活性の確認
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＴ７ｓＤＤＡＨ）菌体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて２８℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、更に、３時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒ.ｐ.ｍ.で１０分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵素活性測定法によりＤＤＡＨ活性を測定したところ、ＪＭ１０９（ｐＴ７ｓＤＤＡＨ）は、０．２３Ｕ／ｍｌとＤＤＡＨ活性を有していた。
【００５１】
（５）Sinorhizobium meliloti由来本発明ＤＤＡＨの製造
ＪＭ１０９（ｐＴ７ｓＤＤＡＨ）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％  バクトトリプトン、０．５％  バクトイースト・エクストラクト、０．５％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌに接種し、３０℃で１日間振とう培養した。これを種培養として、０．５Ｌ三角フラスコに入れた上記培地０．１Ｌに１ｍｌずつ接種し、２８℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなる如く添加し、更に、３時間培養した。この培養液より、遠心分離（１２０００ｒ.ｐ.ｍ.、１０分間）により菌体を回収した。得られた菌体を−８０℃で凍結保存した。
【００５２】
凍結菌体（３００ｍｌ分）をバッファーＡ（５０ｍＭ リン酸バッファー、５％ グリセロール、ｐＨ８．０）１５ｍｌに懸濁し、氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理した。破砕液を１２,０００ｒ.ｐ.ｍ.で、１０分間遠心し、上清を予めバッファーＡで平衡化したＱセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。１５０ｍｌのバッファーＡで洗浄後、バッファーＡからバッファーＢ（０．７Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ リン酸バッファー、５％ グリセロール、ｐＨ８．０）のリニアグラジェントで溶出させた。活性画分は、約０．３Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。
【００５３】
溶出された活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮、透析し、もう一度ＱセファロースＦＦにかけた。溶出は、バッファーＡ〜バッファーＢのリニアグラジェントで行なった。活性画分を約０．３Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。
【００５４】
得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、ほぼ単一なバンドが得られた（分子量約３１，０００）。得られた活性画分を以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
【実施例３】
【００５５】
（Sinorhizobium meliloti由来本発明ＤＤＡＨの理化学的性質）
実施例２により得られた本発明ＤＤＡＨの理化学的性質は、下記の通りであった。
（ａ）作用及び基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質として非対称ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、対称ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、Ｌ−アルギニンを用いて、本発明ｓＤＤＡＨの活性を測定した。本発明ＤＤＡＨは、ＳＤＭＡ，Ｌ−アルギニンには作用しなかった。
【００５６】
（ｂ）至適ｐＨ
緩衝液として２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜８．５）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜１１．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行なった。結果を図１に示した。
本発明ｓＤＤＡＨは、ｐＨ９．０〜１０．０において最も高い活性を示した。また、ｐＨ７．０〜１０．０でもｐＨ９．０付近における活性値の５０％以上を示したことから、本発明ＤＤＡＨの至適ｐＨは、ｐＨ７．０〜１０．０であり、最も好ましい至適ｐＨは、ｐＨ９．０〜１０．０であると判断した。
【００５７】
（ｃ）至適温度の範囲
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図２に示した。最も高い活性を示した温度である、３７℃付近での活性に対して６０％以上の活性を示す温度範囲は、３０〜４０℃であった。
以上から、本発明ＤＤＡＨの至適温度の範囲は、３０〜４０℃であると判断した。
【００５８】
（ｄ）熱安定性
２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果は、図３に示す通りであり、本発明ＤＤＡＨは、４０℃付近まで安定であった。
【００５９】
（ｅ）安定ｐＨ範囲
緩衝液として、２００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜８．５）、２００ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃で１０分間処理した後、本発明ＤＤＡＨの残存活性を測定した。結果を図４に示した。最も高い残存活性を示したｐＨである。ｐＨ１０．０付近での活性に対して５０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ４．０〜１０．０であった。
以上から、本発明ＤＤＡＨの安定ｐＨ範囲は、ｐＨ４．０〜１０．０であると判断した。
【００６０】
（ｆ）分子量
マルチゲル４／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた結果、本発明ＤＤＡＨの分子量は、約３１，０００であった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明DDAHの至適ｐHを示す図。
【図２】本発明DDAHの至適温度の範囲を示す図。
【図３】本発明DDAHの熱安定性を示す図。
【図４】本発明DDAHの安定ｐH範囲を示す図。
【図１】
2005261317.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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