(57)【要約】【課題】  従来、多数の止血材や組織修復材が提案されているが、それらのうちの止血材については、有意な組織修復促進効果が報告されておらず、他方、組織修復材については、止血効果が認められていない。そのため、損傷部分にあるいは手術箇所に添付することが可能な、止血性と優れた組織修復促進作用を合わせ持つ止血性組織修復材を提供することを課題とする。【解決手段】  カルシウムを４．１〜６．０重量％の範囲に含有する多糖類を基材として使用することにより、組織修復材を作成する。当該多糖類は、カルボキシル基を有する多糖類分子を、分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬で共有結合して得られる架橋体であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムを４．１〜６．０重量％の範囲に含有する多糖類を基材とすることを特徴とする、止血性組織修復材。
【請求項２】
多糖類が、酸性多糖類である、請求項１に記載の組織修復材。
【請求項３】
酸性多糖類が、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、カルボキシル化澱粉、カルボキシル化アミロースおよびカルボキシル化セルロースから成る群から選択されたものである、請求項２に記載の組織修復材。
【請求項４】
多糖類が、カルボキシル基を有する多糖類分子を、分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬で共有結合して得られる架橋体である、請求項１〜３の何れかに記載の組織修復材。
【請求項５】
分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬が、窒素原子上にリジル基を有することもあるジアミノアルカンである、請求項１〜４の何れかに記載の組織修復材。
【請求項６】
窒素原子上にリジル基を有することもあるジアミノアルカンが、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘキサン、ジアミノヘプタン、ジアミノオクタン、ジアミノノナン、ジアミノデカン、ジアミノドデカン、ジアミノオクタデカン、N-（リジル）-ジアミノエタン、N,N’-（ジリジル）-ジアミノエタン、N-（リジル）-ジアミノヘキサンおよびN,N’-（ジリジル）-ジアミノヘキサンから選択されたものである、請求項１〜５の何れかに記載の組織修復材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血性組織修復材、特に特定のカルシウム含量を有する多糖類を基材とする止血性と組織修復力に優れた組織修復材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、止血材としては、酸化セルロース粉末、コラーゲン繊維および粉末、コラーゲンスポンジ、アルギン酸カルシウム線維不織布、トロンビンとフィブリノーゲンを含む製剤などが知られている。これらは、通常、一時的に使用され、止血後に、除去されるものである。また、細胞毒性物質の存否や、組織修復促進作用の有無について、考慮が払われていないのが普通である。
【０００３】
比較的最近に提案された止血材を例示すれば、次のとおりである：０．５〜４．０重量％のカルシウムを含む酸化セルロースの止血材（特開平7-255830）；脱アセチル化キチンのマレイン酸塩からなる止血材（特開2003-26578）；カルボキシメチルセルロースなどの水溶性繊維集合体からなる止血材（特開2002-39874）；核酸のカルシウム塩を主成分とする止血材（特開2002-60341）；カルボキシメチルセルロースを成分とする細胞接着促進効果を有する創傷止血材（特開平11-322614）；配向度が50〜98％のキチン繊維からなるキチン止血材（特開平9-169653）；ゼラチンをスクシンイミド化ポリグルタミン酸により架橋してなる止血材（特開平9-103479）；プロトロンビンのアクチベーターまたはプロアクチベーター、プロトロンビン、フィブリノーゲンを含む止血性を有する組織接着剤（特開平9-2971）；止血能を有するコラーゲン繊維不織シート（特開8-35193）；D,L-ラクチドとポリエチレングリコールの共重合体からなる止血材(特開平7-118157）など。
【０００４】
他方、組織修復材（または創傷被覆材）としては、コラーゲンスポンジ、アルギン酸塩不織布およびスポンジ、キトサン不織布およびスポンジなどが知られているが、これらは止血効果をほとんど有しておらず、専ら止血後の創傷に適用されている。比較的最近に提案された代表例として、次のものを挙げることができる：架橋ヒアルロン酸スポンジ層および未架橋ヒアルロン酸スポンジ層からなる創傷被覆材（特開2002-233542）；コラーゲンおよび酸を含有する液体状創傷被覆材（特開2001-137327）など。
【特許文献１】特開平７−２５５８３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように多数の止血材や組織修復材が提案されているが、それらのうちの止血材については、有意な組織修復促進効果が報告されておらず、他方、組織修復材については、止血効果が認められていない。すなわち、止血作用および組織修復促進作用を併せ持つ、実用性のある基材は、これまで知られていなかった。本発明の目的は、止血性と組織修復力に優れた組織修復材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、先に、カルボキシル基を有する多糖類を２価または４価のアミン化合物で架橋して得られる水膨潤性高分子ゲルが皮膚や神経の創傷の修復促進に優れていることを見出した（特開平8-24325；J. Biomed. Mate. Res. (Appl. Biomater.), 48, 522-527，1999；J. Biomed. Mater. Res., 39, 317-322,1998；Neuroscience Lett., 259, 75-78, 1999；NeuroReport, 10, 2891-2894,1999）。この知見に基づいて、更に研究を進めた結果、上記目的を達成する基材、すなわち止血性と組織修復力に優れた組織修復材を開発することに成功した。
【０００７】
すなわち、本発明は、カルシウムを４．１〜６．０重量％の範囲に含有する多糖類を基材とすることを特徴とする止血性組織修復材を提供するものであって、当該多糖類としては酸性多糖類、特に多糖類が多糖類分子を分子内に２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬で共有結合して得られる架橋体であるものが好ましい。
【０００８】
上記したように、０．５〜４．０重量％のカルシウムを含む酸化セルロースが止血剤として有用であることは公知である(特開平7-255830号公報)。しかしながら、当該特許文献には、組織修復作用について、何ら触れるところがない。本発明は、カルシウム含量を４．１〜６．０％の範囲に維持した多糖類を主成分とするものであって、これにより実用性のある組織修復作用と止血作用が発揮されることを見出したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、カルシウムを４．１〜６．０重量％の範囲に含有する多糖類を基材とする組織修復材が得られる。この組織修復材は、止血性と優れた組織修復促進作用を合わせ持つ点において、従来の止血材や組織修復材には無かった特徴を有するものである。また、当該組織修復材は、細胞毒性が少なく、安全性が高いので、皮膚や骨、軟骨、血管、神経、肝などの損傷部分にあるいは手術箇所に適用することが可能であり、優れた止血効果および組織修復効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の止血性組織修復材は、カルシウムを４．１〜６．０重量％の範囲に含有する多糖類を基材とすることを特徴とする。
【００１１】
ここに、「多糖類」は、カルシウムを捕捉できる限り、特に制限されるものではないが、血液凝固系活性化作用を有し、かつ、カルシウムとの塩形成能を有する点において、酸性多糖類が好ましい。酸性多糖類の具体例としては、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、カルボキシル化澱粉、カルボキシル化アミロース、カルボキシル化セルロースなどのようなカルボキシル基を有する多糖類を挙げることができる。これらは、カルボキシル基が遊離のものであっても、水溶性塩を形成しているものであってもよい。特に好ましいものは、アルギン酸のナトリウム塩、カルボキシル化アミロースなどである。これらの多糖類は市販品から入手することができる。分子内にカルボキシル基を有する多糖類の好ましい分子量は、多糖類の性質により一概に決められないが、一般に５万〜１０００万、より好ましくは１０万〜３００万の範囲内である。
【００１２】
「多糖類」は、ここに例示したようなカルボキシル基を有する多糖類の分子を、２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬で共有結合して得られる架橋体を包含するものであって、そのような架橋体の多糖類が特に好ましい。
【００１３】
「２〜４個のアミノ基を有する架橋性試薬」としては、窒素原子上にリジル（lysyl）基を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含される。
【００１４】
従って、当該架橋性試薬には、一般式(I)：
Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２
(式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子またはリジル基であり、ｎは２〜１８、好ましくは２〜１２の整数を表わす。）で表わされる化合物を含まれ、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘキサン、ジアミノヘプタン、ジアミノオクタン、ジアミノノナン、ジアミノデカン、ジアミノドデカン、ジアミノオクタデカン、N-（リジル）-ジアミノエタン、N,N’-（ジリジル）-ジアミノエタン、N-（リジル）-ジアミノヘキサン, N,N’-（ジリジル）-ジアミノヘキサンなどが例示される。これらの化合物は、遊離形でもよいが、通常は塩形（たとえばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩）であるのが好ましい。
【００１５】
架橋性試薬のうち、ジアミノアルカン類は、市販品として容易に入手できる。モノまたはジリジルジアミノアルカン類は、通常の有機合成法により合成できる。たとえば、α−アミノ基とε−アミノ基を保護したリジンのカルボキシル基とジアミノアルカン類のアミノ基とをカルボジイミド等の脱水縮合剤を用いて結合させ、その後α−アミノ基とε−アミノ基の保護基を除去する方法や、α−アミノ基とε−アミノ基を保護したリジンをＮ−ヒドロキシコハク酸イミドなどとの活性エステルとした後、ジアミノアルカン類と反応させ、その後α−アミノ基とε−アミノ基の保護基を除去する方法が挙げられる。
【００１６】
α−アミノ基とε−アミノ基の保護基の除去は、自体常套の方法で行うことができる。たとえば保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基の場合には、トリフルオロ酢酸や４規定の塩化水素を溶解したジオキサンで処理することにより行われる。また、保護基がフルオレニルメチルオキシカルボニル基の場合には、２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液で処理することで除去できる。
【００１７】
α−アミノ基とε−アミノ基を保護したリジンとジアミノアルカン類の反応を、モル比１：１で行えばモノリジルジアミノアルカンが、２：１で行えばジリジルジアミノアルカンが主たる生成物として得られる。これらが遊離形で得られる場合には、適宜の溶媒（たとえば酢酸エチル）に溶解し、アミノ基と当量のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを加えることにより、塩形とすることができる。塩酸塩やトリフルオロ酢酸塩などの形で得られる場合には、その水溶液をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドで平衡化した陰イオン交換樹脂カラムに通じることによって、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が得られる。
【００１８】
架橋性試薬による、分子内にカルボキシル基を有する多糖類の架橋反応は、水性媒体中、カルボジイミドのような脱水縮合剤の存在下、当該多糖類と架橋性試薬を反応させることにより実施することができる。反応温度は、一般に４〜３７℃の範囲内で実施することができるが、反応効率の点で２０〜３０℃の範囲が好ましい。架橋反応は、時間と共に進行するので、高い架橋率が必要な場合には、反応時間を長くすればよい。通常、６〜７２時間の範囲であるが、反応効率の点で２４〜４８時間が好ましい。
【００１９】
架橋率は、用いる架橋性試薬の多糖類に対するモル比や反応時間で制御することができる。架橋率を低くすると、柔軟で含水率の高い架橋体が得られる。架橋率を高くすると、強固で含水率が低い架橋体が得られる。架橋率は、架橋体の用途に応じて適宜に選択すればよい。架橋率が低すぎると、実用的な機械的強度や安定性を有する架橋体が得られ難く、好ましくない。また、高すぎると、架橋体試薬のアミノ基が未反応のまま架橋体中に存在することになり、好ましくない。従って、架橋性試薬の多糖類に対する反応率は、多糖類の有するカルボキシル基に対して１〜５０モル％の割合であることが好ましく、１０〜４０モル％の範囲にあることがさらに好ましい。
【００２０】
また、架橋反応に際して多糖類の水溶液の濃度が低すぎると、十分な機械的強度を有する架橋体が得られず、濃度が高すぎると溶解に時間がかかり、かつ得られる架橋体が含水率の低い、硬いものとなるので、好ましくない。従って、多糖類の水溶液の濃度は、０．１〜５％の範囲にあることが好ましく、０．５〜４％の範囲にあることがさらに好ましい。
【００２１】
架橋率は、元素分析法、ＮＭＲ法などによって実測することができる。たとえば、アルギン酸やヒアルロン酸などの窒素原子を含まない多糖類を用いる場合には、得られた架橋体中の窒素原子の元素分析により、架橋率が求められる。また、得られた架橋体のプロトンＮＭＲにおける、多糖類のメチンプロトンと架橋性試薬のメチレンプロトンのシグナル強度比からも求めることができる。
【００２２】
架橋反応によって得られた架橋体は、それ自身でも実用的な強度と安定性を示すが、用途によりさらにイオン結合架橋、疎水結合架橋などの他のゲル化方法と併用してもよい。
【００２３】
架橋反応によって得られた架橋体は、通常、水洗により未反応の試薬や不活性化した脱水縮合剤を除去し、精製することができる。その後、そのままあるいは生理的食塩水などの生理的に許容される塩類溶液に置換して用いるか、水洗浄後、凍結乾燥してスポンジ状のキセロゲルとして用いてもよい。
【００２４】
凍結乾燥して得られるスポンジ状のキセロゲルの場合は、γ線滅菌やエチレンオキシドガス滅菌により滅菌されるが、γ線滅菌が最も好ましい。含水ゲルの状態での滅菌は一般に困難であるので、架橋反応の段階から無菌的に行うことが望ましい。
【００２５】
キセロゲルや含水ゲルの状態の基材にカルシウムを含有させる方法としては、カルシウムを含む生理学的に許容される塩類の水溶液をキセロゲルに添加する方法、含水ゲルの状態でカルシウムを含む生理学的に許容される塩類の水溶液を数時間接触させる方法などがある。
【００２６】
本発明の止血性組織修復材に含まれるカルシウムの量は、乾燥重量換算で、基材総重量の４．１〜６．０％（重量）の範囲に調整する。４．１％以下のカルシウム含有量では十分な止血作用が発揮できない。６．０％を超えるカルシウムを含む場合には、カルシウムに由来する細胞毒性のために、十分な組織修復促進作用が発揮されない。
【００２７】
上記した「カルシウムを含む生理学的に許容される塩類」としては、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム、ギ酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、シュウ酸カルシウムなどを例示することができる。これらの中でも、塩化カルシウムや酢酸カルシウムが特に好ましい。
【００２８】
本発明の止血性組織修復材は、通常の方法により、平板状、織布状、不織布状、微粒子状、スポンジ状など適宜の形態に成形し、皮膚や神経、内蔵などの出血性の欠損部や損傷部、手術創などに直接適用することによって使用される。また、本発明の止血性組織修復材に、必要に応じて、薬理学的に許容される塩類溶液や安定化剤、抗菌剤などを含有させてもよい。
【００２９】
本発明の止血性組織修復材は、多糖類からなるので免疫原性が低く、かつ、上記含量範囲のカルシウムは細胞毒性が極めて低い。また、多糖類の架橋体は、低細胞毒性であって、生体内でも吸収と排泄が容易に行われる。従って、本発明の組織修復材は、生体親和性と安全性に優れた医療材料である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
2.3ｇ（20mmol）のＮ-ヒドロキシコハク酸イミド（HOSu,（株）ペプチド研究所）を酢酸エチル150mlに溶解し、10mlの酢酸エチルに溶解した0.6g（10mmol）のエチレンジアミン（EDA、和光純薬工業株式会社）を、室温で攪拌しながら滴下した。滴下終了後、さらに１時間攪拌を続けた。析出した結晶を熱メタノールから再結晶して、2.0g（収率約70%）のエチレンジアミン２Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド塩（EDA・２HOSu）を得た。
アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製、９９mPa・s）の１質量％水溶液70mlに、0.154gのEDA・２HOSu、1.12gの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（EDC・HC１、（株）ペプチド研究所）を溶解し、13cmｘ17cmのテフロン（登録商標）被覆したステンレス製トレイに流延し、約25℃で約72時間静置することにより、架橋体を得た。
【００３２】
得られた架橋体を、2.5mMの塩化カルシウムと143mMの塩化ナトリウムを含む水溶液で十分に洗浄した。その後0.1％の塩化カルシウム水溶液で数回置換し、さらに数回水で洗浄し、凍結乾燥してキセロゲル状の止血性組織修復材を得た。
得られた止血性組織修復材10mgを生理食塩液50mLに浸漬して、２４時間振盪した。上清に含まれるカルシウムの濃度をカルシウム電極で測定し、止血性組織修復材中に含まれていたカルシウムの割合を計算したところ、5.1％であった。
【００３３】
実施例２
アルギン酸ナトリウム（株式会社キミカ製、９９mPa・s）の１質量％水溶液70mlに、0.1gの塩化カルシウムと0.09gの塩化ナトリウムを含む水溶液5mlを混合し、直ちに13cmｘ17cmのテフロン（登録商標）被覆したステンレス製トレイに流延し、約25℃で数時間静置して、ゲル状物を得た。このゲル状物を数回水で洗浄し、凍結乾燥して、キセロゲル状の止血性組織修復材を得た。
【００３４】
得られた止血性組織修復材10mgを生理食塩液50mLに浸漬し、２４時間振盪した。上清に含まれるカルシウムの濃度をカルシウム電極で測定し、止血性組織修復材中に含まれているカルシウムの割合を計算したところ、4.8％であった。
【００３５】
比較例１
実施例１と同様の方法で得られた架橋体を、2.5mMの塩化カルシウムと143mMの塩化ナトリウムを含む水溶液で十分に洗浄した。その後、0.1％の塩化カルシウム水溶液で置換することなく、数回水で洗浄し、凍結乾燥してキセロゲル状の止血性組織修復材を得た。
【００３６】
得られた止血性組織修復材10mgを生理食塩液50mLに浸漬して、２４時間振盪した。上清に含まれるカルシウムの濃度をカルシウム電極で測定し、止血性組織修復材中に含まれていたカルシウムの割合を計算したところ、1.6％であった。
【００３７】
実施例３
モノクロル酢酸（シグマ社）3gをメタノール20mlに溶解し、攪拌しながら、NaOH3.5gを溶解した3.5mlの水を滴下した。次にアミロース（シグマ社）10gを加え、40℃で38時間加温攪拌した。反応生成物を氷冷しながら氷酢酸でpH6.5に調整した後、アセトンで数回遠心洗浄した。減圧乾燥してカルボキシメチル化アミロース約10gを得た。導入されたカルボキシル基の量を電位差滴定で定量したところ、糖１残基当りのカルボキシル基導入率は0.36であった。
【００３８】
得られたカルボキシメチル化アミロースの2.5質量％水溶液70mlに、1.12gのEDA・２HOSuおよび2.2gの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（EDC・HC１、（株）ペプチド研究所）を溶解し、13cmｘ17cmのテフロン（登録商標）被覆したステンレス製トレイに流延し、約25℃で約72時間静置して、架橋体を得た。
【００３９】
得られた架橋体を2.5mMの塩化カルシウムと143mMの塩化ナトリウムを含む水溶液で十分に洗浄した。その後、0.1％の塩化カルシウム水溶液で数回置換し、さらに数回水で洗浄し、凍結乾燥して、キセロゲル状の止血性組織修復材を得た。
【００４０】
得られた止血性組織修復材10mgを生理食塩液50mLに浸漬して、２４時間振盪した。上清に含まれるカルシウムの濃度をカルシウム電極で測定し、止血性組織修復材中に含まれていたカルシウムの割合を計算したところ、4.6％であった。
【００４１】
（試験例）
実施例１及び比較例１で得られたキセロゲル状の止血性組織修復材を１ｃｍ角に切断し、エタノールに浸漬を繰り返した後、減圧乾燥することにより殺菌を行った。
【００４２】
SDラット（６週齢、雄性）をネンブタール麻酔下に開腹し、肝臓の一部を切除した。直ちに実施例１または比較例１で得られた１ｃｍ×１ｃｍの大きさの止血性組織修復材を貼り付け、止血が完了するまでの時間、止血に要する枚数、出血量を測定した。
【００４３】
実施例１の止血性組織修復材を貼り付けた１２匹のラットの平均値は、止血時間５５秒、止血に要する枚数２．９枚、出血量１０９μＬであった。
【００４４】
比較例１の止血性組織修復材を貼り付けた１２匹のラットの平均値は、止血時間１７１秒、止血に要する枚数３．９枚、出血量２７７μＬであった。
【００４５】
比較例２
実施例１と同様の方法で得られた架橋体を2.5mMの塩化カルシウムと143mMの塩化ナトリウムを含む水溶液で十分に洗浄した。その後、0.5％の塩化カルシウム水溶液で数回置換して、さらに数回水で洗浄し、凍結乾燥してキセロゲル状の止血性組織修復材を得た。
【００４６】
得られた止血性組織修復材10mgを生理食塩液50mLに浸漬して、２４時間振盪した。上清に含まれるカルシウムの濃度をカルシウム電極で測定し、止血性組織修復材中に含まれていたカルシウムの割合を計算したところ、6.6％であった。
【００４７】
（試験例２）細胞毒性試験
実施例１及び比較例２で得られた止血性組織修復材をそれぞれ１ｃｍ×１ｃｍの大きさに切断し、エタノールに浸漬を繰り返した後、減圧乾燥することにより殺菌を行った。
各１枚に対し10mLの10％ウシ胎児血清を含むイーグルMEM培地（日水製薬）を加え、３７℃で２４時間静置した。それぞれの上清を100個のL929細胞（大日本製薬）を含む６cmシャーレに５mLずつ加えた。その後、５％CO2下、３７℃で７日間培養した後にL929細胞のコロニー数をカウントした。
【００４８】
止血性組織修復材を加えずに３７℃で２４時間静置した10％ウシ胎児血清を含むイーグルMEM培地（コントロール）のコロニー数が96個であったのに対し、実施例１で93個、比較例２では82個であった。
【００４９】
（試験例３）
実施例１及び比較例２で得られた止血性組織修復材をそれぞれ１ｃｍ×１ｃｍの大きさに切断し、エタノールに浸漬を繰り返した後、減圧乾燥することにより殺菌を行った。
日本白色ウサギの耳に直径８mmの全層欠損層を作製し、上記の止血性組織修復材をそれぞれ貼付した。７日後に止血性組織修復材を除去して、残存する創の直径の平均値を求めた。
【００５０】
実施例１を貼付した創では直径の平均値が0.5mmであったのに対して、比較例２を貼付した創では直径の平均値は2.1mmであった。
【００５１】
上記の試験結果から明らかなように、本発明の止血性組織修復材は、顕著な止血効果を発揮する。また、細胞毒性も少なく、安全性が高い。さらに、組織の修復効果においても優れている。従って、本発明の止血性組織修復材は、皮膚や骨、軟骨、血管、神経、肝などの損傷あるいは手術後に適用することにより、優れた止血効果とその後の組織修復効果を期待できるものである。