(57)【要約】【課題】本発明の目的は、神経保護またはニューロンのリモデリングに関与する内因性分子を同定することである。【解決手段】本発明により、Nedd9及びFAKの遅延型発現が、虚血損傷後のニューロンのリモデリングに重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、Nedd9は、NGF非依存的に、神経突起形成を促進することが示された。そこで本発明は、Nedd9蛋白質を含む薬学的組成物、及びNedd9蛋白質に加えてFAK蛋白質を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、神経障害及び神経変性疾患の治療に使用することができる。より具体的には、本発明の薬学的組成物は一過性全脳虚血、脳卒中等の虚血性疾患に対して用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｄｄ９蛋白質を含む薬学的組成物。
【請求項２】
さらにＦＡＫ蛋白質を含む、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
該組成物が神経障害または神経変性疾患の治療のためのものである、請求項１または２記載の薬学的組成物。
【請求項４】
該神経障害が虚血性疾患である、請求項３記載の薬学的組成物。
【請求項５】
該虚血性疾患が一過性全脳虚血または脳卒中である、請求項４記載の薬学的組成物。
【請求項６】
該神経障害または神経変性疾患が脳または脊髄にある神経障害である、請求項１または２記載の薬学的組成物。
【請求項７】
Nedd9蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより細胞を形質転換する工程、及び該細胞を該遺伝子が発現される条件下で培養する工程を含む、ニューロン細胞を分化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Nedd9蛋白質を含む薬学的組成物に関する。また、本発明は、Nedd9蛋白質に加えてFAK蛋白質を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、神経障害及び神経変性疾患の治療に使用することができる。より具体的には、本発明の薬学的組成物は一過性全脳虚血、脳卒中等の虚血性疾患に対して用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
最近、成体哺乳動物脳において神経幹細胞が同定されたことは、成体脳に、虚血に反応して自己修復を行う潜在的能力がある可能性を示唆する。虚血は、脳にとって再構成および再プログラミングを促す強力な刺激であり、損傷を来した脳の病態生理と関係のある内因性蛋白質を誘導する（Barone and Feuerstein,J.Cereb.Blood Flow Metab.(1999)19: 819-34）。即ち、虚血などのある種の病的状態は成体哺乳動物脳における神経発生を誘導することが知られている（Liu et al.,J.Neurosci.(1998)18:7768-78;Yagita et al.,Stroke (2001)32:1890-6）。最近の知見により、脳では損傷または疾患に応じて内因性NSCまたは神経前駆細胞により自己修復を行う潜在的能力があるとの可能性が浮上している（Magavi et al.,Nature(2000)405:951-5;Bjorklund and Lindvall,Nature(2000)405:892-5）。
【０００３】
マウスの局所虚血モデルにおいて数種の遺伝子のアップレギュレーションが調べられ、発現の時間的エピソードまたは「波」が異なる遺伝子群としてグループ分けされている（Barone and Feuerstein,J.Cereb.Blood Flow Metab.(1999)19: 819-34）。これらの内因性蛋白質のうち、例えば、ニューロカン(Haas et al., J.Neurosci. (1999)19:9953-63)、及び神経前駆細胞により発現され、発生的にダウンレギュレートされる遺伝子9（Neuronal precursor cell-expressed, developmentally down-regulated gene; Nedd9）／カスパーゼ2（Kinoshita et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.(1997)17: 507-14）は、主として胚発生時にニューロンまたはグリアによって発現され、出生後初期には強くダウンレギュレートされる因子である。
【０００４】
Nedd9は当初、マウス中枢神経系（CNS）において、神経前駆細胞（NPC）により発現され、発生的にダウンレギュレートされる遺伝子として同定された(非特許文献1)。Nedd9の遺伝子発現は、胚齢10及び14日に検出され、成体マウス脳では消失する(非特許文献1)。Nedd9のような新たな遺伝子発現に続く波には、トランスフォーミング増殖因子（Wang et al.,Brain Res. Bull.(1995)36:607-9）及びオステオポンチン（Wang et al., J.Neurosci.(1998)18:2075-83）といった組織リモデリング及び機能回復に重要と思われるメディエーターが含まれる（Read et al.,J.Cereb.Blood Flow Metab.(2001)21:755-78）。
【０００５】
その後、Nedd9の遺伝子産物は、マウスCrk関連基質（Cas）リンパ球型（Cas-L）と同一であることが報告された (ホモロジーデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。Cas-Lは、別のグループにより完全に異なる戦略によってクローニングされたヒト線糸形成エンハンサー（enhancer filamentation）1（HEF1）としても知られている(非特許文献2)。ヒトCas-Lは、ヒト白血病H9細胞におけるβ1インテグリンとの連結により、主としてチロシンリン酸化された105kDa蛋白質として、本発明者らの研究室で初めて同定された(非特許文献3)。Cas-Lの主な生物的機能は、β1インテグリンおよびT細胞受容体（TCR）複合体との同時刺激によるIL-2産生の回復（非特許文献4）、並びにβ1インテグリン及びTCR複合体との、またはβ1インテグリンのみとの結合による細胞遊走の増強（非特許文献5）である。これらの機能を発揮するためには、Cas-Lが、接着斑キナーゼ(FAK)またはPyk2と会合し、これらのキナーゼによってチロシンリン酸化されることが必要である（非特許文献6）。本発明者らは、Cas-Lがp130Casの造血系バリアントであることを示した（非特許文献3）。p130Casは、v-Src形質転換細胞（非特許文献7）及びv-Crk形質転換細胞（非特許文献8）において高度にチロシンリン酸化された130kDa蛋白質として同定された。これらの蛋白質及びEfs／Sinは、Casファミリーを構成し、さまざまな蛋白質-蛋白質相互作用を行う保存的なアミノ酸二次構造、例えばSrc-ホモロジー3（SH3）ドメイン、基質ドメイン、セリンリッチドメイン、コイルドコイル領域、ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、及びC末端ドメイン等を有している（非特許文献3;非特許文献9）。これらは、接着斑キナーゼ（FAK）またはプロリンリッチチロシンキナーゼ2（Pyk2）と相互作用するドッキング分子に特徴的な構造である。Nedd9／Cas-Lは、CNSの発生及び分化において何らかの役割を果たしている可能性が高いが、胎児脳における蛋白質発現及び機能は報告されていない。さらに重要なことに、脳虚血の発生、及び成体脳発現における機能は未だに不明である。
【０００６】
非受容体型チロシンキナーゼFAK及びPyk2は、増殖因子およびインテグリンによるシグナル伝達の共通のメディエーターである可能性があるものとして同定された（Clark and Brugge,Science(1995)268:233-9;Nett and Hunter,Genes to Cells(1996)1:147-69; Avraham et al.,Cell.Signal.(2000)12:123-33;Girault et al.,Trends Neurosci.(1999)22: 257-63）。Pyk2は、CNSにおいて高発現され（Menegon et al.,Eur.J.Neurosci.(1999)11: 3777-88）、脱分極及び細胞内Ca2+レベルの上昇を含む多様な細胞刺激に応答して、MAPKシグナル伝達経路の上流調節因子として作用する（Lev et al.,Nature(1995)376:737-45;Yu et al.,J.Biol.Chem(1996)271:29993-8）。Pyk2は、ラットにおける局所脳虚血後に皮質ニューロン内で急速にチロシンリン酸化され、ニューロン及びミクログリアの両方において活性化p38MAPKと共局在化する（Tian et al.,J.Neurosci.(2000)20:6478-87）。FAKも、主にスプライスアイソフォームFAK+6,7として、CNSで高発現される（Burgaya et al., Eur.J.Neurosci.(1995)7:1810-21;Toutant et al.,Biochem.J.(2000)348 Pt 1:119-28; Menegon et al.,Eur.J.Neurosci.(1999)11:3777-88）。FAKには、非神経細胞において細胞接着によるアポトーシスの阻止という重要な役割がある（Frisch et al.,J.Cell Biol.(1996) 134:793-9; Hungerford et al., J.Cell Biol.(1996)135:1383-90）。FAKは、CNSの発生および分化に重要な役割を果たすものの（Hungerford et al., J.Cell Biol.(1996)135: 1383-90）、成体脳におけるその機能、特に脳虚血の発生に関しては、ほとんど報告がない（Cheung et al.,J. Cereb.Blood Flow Metab.(2000)20:505-12;Zalewska et al.,Brain Res. (2003)977:62-9）。
【０００７】
【非特許文献１】Kumar et al.,Biochem.Biophys.Res. Commun.(1992)185: 1155-61
【非特許文献２】Law et al.,Mol.Cell.Biol.(1996)16:3327-37
【非特許文献３】Minegishi et al., J.Exp.Med.(1996)184:1365-75
【非特許文献４】Kamiguchi et al., J.Immunol.(1999)163:563-8
【非特許文献５】Ohasi et al.,J.Immunol.(1999)163: 3727-34
【非特許文献６】Tachibana et al., J.Biol.Chem.(1997)272:29083-90
【非特許文献７】Reynolds et al.,Mol.Cell.Biol.(1989)9:3951-8
【非特許文献８】Sakai et al.,EMBO J.(1994)13:3748-56
【非特許文献９】O’Neill et al., Trends Cell Biol.(2000)10:111-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
脳卒中は、日本及び米国における第二の死因であり、長期的な能力障害の主因でもある。卒中は、一般的に脳へと血液を運ぶ動脈が何らかの原因により封鎖され、その結果、その動脈により血液が供給されていた脳細胞が死ぬことにより起こる。このような虚血の結果生じる神経学的障害を軽減する目的で、神経障害を減少させるための研究が多くなされてきた。予防的な卒中の治療方法としては、血圧、脂肪、心臓病等を調整して動脈封鎖を防ぐことが挙げられる。また、現在、動脈封鎖が起こってしまった脳卒中治療の取り組みの多くは、続発性急性病変の軽減及びサイズ抑制を目的としている。即ち、血栓溶解剤等を用いた動脈内の凝血塊の溶解、または、脳組織を保護するための神経保護剤の投与等が行われている。しかしながら、この動脈封鎖後の症状緩和の目的は、多くの患者では達成されておらず、脳卒中後期の治療は残念ながら確立されていない。これまでのところ、急性低灌流及びエネルギー代謝不全においては、治療が可能な時間範囲が、発症後のごく短い時間に限られていた。そのため、神経保護、またはさらに進んでニューロンのリモデリングに関与する内因性分子の同定は、卒中等の神経障害について治療方法を確立する上で重要と考えられる。そこで、本発明の目的は、神経保護またはニューロンのリモデリングに関与する内因性分子を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本研究において、本発明者らは、マウスCas-L遺伝子をクローニングし、一過性全脳虚血ラットの脳におけるNedd9／Cas-L、並びに、その関連分子p130Cas、FAK及びPYK2の時間的発現プロファイルを評価した。また、本発明者らはマウス胚、ニューロスフェア、及びPC-12細胞の形質転換体を用いて、脳における該遺伝子の機能についても調べた。その結果、本発明者らは、Nedd9がCas-Lのスプライシングバリアントであり、虚血から3〜14日後、大脳皮質及び海馬のニューロンの樹状突起及び細胞体に選択的に誘導されることを見いだした。誘導されたNedd9蛋白質は、チロシンリン酸化されており、虚血後のニューロンの樹状突起及び細胞体においてFAKと結合していた。生理的な過程では、発生期間中、Nedd9は、大脳皮質内及び海馬内の発生過程にあるニューロンの神経突起及び細胞体において一過性に発現されていた。また、PC-12細胞における神経突起の伸長をNGF非依存的に促進することが見出された。これらの結果は、成体脳では消失するNedd9が、神経分化及び虚血後のリモデリングのために再びアップレギュレートされることを示している。ニューロンにおけるNedd9の遅延型アップレギュレーションが、全脳虚血後のニューロンリモデリングに重要な役割を果たすことが本発明において示唆された。Nedd9の過剰発現は、特に脳卒中後期において、脳虚血に対する治療可能な時間範囲を広げる可能性がある。
【００１０】
そこで、本発明は、Nedd9蛋白質を含む薬学的組成物に関する。また、本発明はNedd9蛋白質に加えてFAK蛋白質を含む薬学的組成物に関する。これらの本発明の薬学的組成物は、一過性全脳虚血、脳卒中等の虚血性疾患を含む神経障害及び神経変性疾患の治療に使用することができる。
【００１１】
さらに、Nedd9発現がPC12細胞における神経突起の伸長を促進したことから、本発明は、Nedd9遺伝子を細胞内に導入し、発現させる工程を含む、ニューロン細胞を分化させる方法に関する。より詳細には、Nedd9蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより細胞を形質転換させる工程、及び該培養を、導入した遺伝子が発現されるような条件下で培養する工程を含む、ニューロン細胞を分化させる方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
このようにして同定された神経保護またはニューロンのリモデリングに関与する内因性分子であるNedd9は、脳卒中等の虚血の結果生じる神経学的障害を軽減するための薬剤として役立つものと期待される。また、Nedd9陽性ニューロンを脳虚血部の中核に移植することも移植損傷からの脳組織の回復に有用と思われるが、このようなニューロン送達システムは最近確立されている（Borlongan et al.,Exp.Neurol.(1998)149:31-21;Kondziolka et al., Neurology(2000)55:565-9）。さらに、Nedd9が正常成体脳は発現されないという事実は、その過剰発現が再生ニューロンのリモデリングを特異的に促進し得ることを示し、ニューロンを標的とする治療法の適用に有用である。再生療法の標的範囲は拡大しているため、Nedd9発現に関する今後の研究は、神経変性疾患（アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳性運動失調症、ハンチントン病、パーキンソン病及び進行性核上麻痺）、または脳及び脊髄の損傷等の他の疾患に対しても適用可能と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明により、Nedd9蛋白質を活性成分として含む薬学的組成物が提供される。本発明の薬学的組成物中に含まれるNedd9蛋白質は、神経突起伸長を促進し、神経細胞の分化促進に寄与するものであればよく、その由来・構造等は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びゴリラ等の霊長類を含む、その他の哺乳動物由来のNedd9蛋白質を用いることができる。公知のNedd9蛋白質をコードする遺伝子配列を元に作製したプローブ、またはプライマーを利用してハイブリダイゼーション、PCR等の技術を応用して所望の種由来のNedd9遺伝子を取得することにより、あらゆる動物由来のNedd9蛋白質を得、本発明において用いることができる。しかしながら、好ましくは、本発明の薬学的組成物においては、投与する対象と同じ由来の蛋白質(ヒトに投与するのであればヒト由来Nedd9蛋白質)を使用する。マウス及びラットのNedd9蛋白質のアミノ酸配列を図1aに示す。マウスNedd9蛋白質をコードするｍRNAは、GenBank Accession No. NM_017464として登録されている。そこで、該ｍRNAの塩基配列またはその一部をプローブとして、遺伝子ライブラリー等をスクリーニングすることにより、ヒトを含む種々の哺乳動物由来の対応するNedd9 mRNAを取得し、様々な哺乳動物由来のNedd9蛋白質を得、本発明において用いることができる。
【００１４】
さらに、本発明では、天然由来のNedd9蛋白質に限定されず、同等の機能を示すNedd9蛋白質を組換え法または合成法により調製して利用することもできる。ここで、天然由来Nedd9蛋白質と同等の機能を示す蛋白質としては、天然由来Nedd9蛋白質と高いアミノ酸配列相同性を示すものを例示することができる。高いアミノ酸配列相同性とは、例えば、70％以上の同一性を意味し、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、より一層好ましくは97％以上、例えば99％の同一性を意味する。ここで「％同一性」とは、2つの配列を最大の同一性が得られるよう、必要に応じスペースを含むように整列させた場合、いかなる保存的置換も含まない、アミノ酸配列同士が一致する割合として定義される。即ち、アミノ酸配列の％同一性は、整列させた領域内のアミノ酸残基の総数で、一致する残基を割って得られた値である。このようなアミノ酸配列の同一性は、当業者に公知のBLAST、BLAST-2、Megalign等のソフトウェアを用いて計算することができる。計算に必要とされる各調節可能なパラメーターは、感度等を考慮して当業者であれば適宜決定することができる。
【００１５】
このような天然Nedd9蛋白質に対して高い相同性を有する蛋白質は、例えば、公知のNedd9蛋白質またはその一部をコードするポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして、ハイブリダイゼーションまたはPCR等の手法により標的蛋白質をコードする遺伝子を、該遺伝子を発現する組織または適当な遺伝子ライブラリーから単離し、単離された遺伝子を発現させることにより得ることができる（Sambrook et al."Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed.", Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。
【００１６】
また、本発明の薬学的組成物中に含まれるNedd9蛋白質は、公知のNedd9蛋白質より、該蛋白質の一部分を欠失させたり、または、アミノ酸残基若しくは別のポリペプチド鎖を付加したりした蛋白質であってもよい。アミノ酸配列が公知の蛋白質において、任意のアミノ酸残基を欠失・挿入・置換・付加・修飾する方法は周知であり、本発明の薬学的組成物中のNedd9蛋白質についても、慣用の方法に従って、生体内における活性を上げること、安定性を付与するため等、任意の目的により改変を加えることができる。本発明において好ましい改変Nedd9蛋白質は、天然のNedd9蛋白質の生物学的活性を保持する、保存的改変を加えた蛋白質である。例えば、1以上のアミノ酸残基をグリコシル化またはリン酸化により修飾することができる。また逆に、化学的または酵素的に脱グリコシル化、脱リン酸化を行って蛋白質を改変することもできる。そしてさらに、天然アミノ酸配列のN末端またはC末端へ1以上のアミノ酸残基を付加するか、１以上のアミノ酸残基を欠失させてもよい。さらに、天然アミノ酸配列中の任意の箇所へ1以上のアミノ酸残基を挿入してもよい。また、天然アミノ酸配列中の1以上の任意のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することもできる。このような置換は、元のアミノ酸残基と同様の側鎖を有する残基による交換、即ち、保存的アミノ酸置換により行う。保存的アミノ酸置換において相互交換することができるアミノ酸は、それらの側鎖の化学的性質に従って、例えば、次のようにグループ化することができる：(1)中生疎水性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン）、(2)中生極性側鎖（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン）、(3)塩基性側鎖（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、(4)酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）、(5)脂肪族側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、(6)脂肪族水酸基側鎖（セリン、トレオニン）、(7)アミン含有側鎖（アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、(8)芳香族側鎖（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、(9)硫黄含有側鎖（システイン、メチオニン）。改変されたNedd9蛋白質については、その神経突起促進活性を測定することにより、その生物学的活性が保持されていることを確認し、本発明の薬学的組成物として使用可能であるかどうかを確認することができる。ここで、生物学的活性の保持とは、必ずしも天然蛋白質と同程度の活性レベルを示すことを意味せず、元の活性と同じ活性を有すればよく、その活性レベルは元のレベルより高くとも、または多少低くなっていてもよい。
【００１７】
本発明により、Nedd9とFAKは、生体における発現時期が一致していることが示され、発生中の脳におけるニューロンの分化に共同的に作用すると考えられた。そこで本発明は、さらに、Nedd9蛋白質に加えてFAK蛋白質を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物中に含まれるFAK蛋白質も、Nedd9蛋白質の場合と同様に、その由来・構造等は特に限定されず、Nedd9蛋白質との結合性を示し、神経突起の伸長を促進させるものであればよい。好ましくは、本発明の薬学的組成物においては、投与する対象と同じ由来の蛋白質(ヒトに投与するのであればヒト由来FAK蛋白質)を使用する。好ましいヒトFAK蛋白質としては、GenBank Accession No. L13616で登録されているｍRNAにコードされる蛋白質のアミノ酸配列を有するものを例示することができる（Whitney,G.S.,Chan,P.Y., Blake,J.,Cosand,W.L.,Neubauer,M.G.,Aruffo,A. and Kanner,S.B.,"Human T and B lymphocytes express a structurally conserved focal adhesion kinase, pp125FAK", DNA Cell Biol(1993)12(9):823-30）。また、Nedd9蛋白質の場合と同様に、必要に応じ、天然のアミノ酸配列を改変したFAK改変体を作製し、該改変体をFAKとして、本発明の薬学的組成物に使用してもよい。
【００１８】
組換え蛋白質を製造する方法も周知である。in vitro系及び宿主-ベクター系を含む適当な発現系により、Nedd9蛋白質及びFAK蛋白質を産生させることができる。例えば、まず、適当な転写/翻訳制御領域と蛋白質コード配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築する。ここで、「転写/翻訳制御領域」とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結した蛋白質コード配列を発現するために必要なDNA配列を指し、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、オペレーター配列、リボソーム結合部位、及び開始シグナル等を含む。真核細胞での発現を目的とする場合、好ましくは、プロモーター／エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含め、宿主細胞における所望の蛋白質発現を制御できるようにする。また、「作動可能に」連結または結合とは、制御配列下流に結合された蛋白質コード配列が、該制御配列の指令により、読み枠がずれたりすることなく宿主中において発現されるように結合されていることを意味する。発現ベクターとしては、哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び酵母細胞等の発現に適した様々なベクターが公知であり、Nedd9蛋白質及びFAK蛋白質の製造に用いることができる。次に構築した発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。様々な細胞が宿主細胞株として確立されており、当業者であれば各選択した宿主細胞に適した発現ベクターの導入法を選択することができる。原核細胞に対しては、例えば、カルシウム処理、またはエレクトポレーションによる形質転換が可能である。また、これに限定されるわけではないが、植物細胞については、アグロバクテリウムを用いた方法が公知であり、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム沈降法を例示することができる。その他、核マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、DEAE-デキストラン法、細胞融合、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法（GIBCO BRL）、FuGENE6試薬(Boehringer-Mannheim)を用いた方法等の方法も公知である。哺乳動物細胞の形質転換については、例えば、Keown et al.,Methods in Enzymol.(1990)185:527-37及びMansour et al., Nature(1988)336:348-52の記載を参照することができる。天然型のグリコシル化を保証するためには、哺乳動物細胞を宿主細胞として用いることが望ましい。哺乳動物細胞としては、CHO、COS、293、A431、205、CV-1、Hela、BHK、HL-60、U937、HaK、Jurkat細胞等を含む多数の細胞が公知であり、Nedd9蛋白質及びFAK蛋白質の製造に用いることができる。次に所望の遺伝子が導入された宿主細胞を培養し、所望の蛋白質を発現させ、培養物より蛋白質を回収する。宿主において認識される分泌シグナルを所望の蛋白質に付加しておくことにより細胞外へと所望蛋白質を分泌させ、培地から所望蛋白質を取得することもできる。さらに、必要に応じ、トランスジェニック動物を作製し、本発明で使用するNedd9蛋白質及びFAK蛋白質を該動物より産生させてもよい。トランスジェニック動物による蛋白質生産を行う場合、組織特異的発現を可能にするプロモーターを用いて蛋白質を発現させることが望ましい（例えば、哺乳動物の乳汁中への蛋白質発現）。
【００１９】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、主成分としての蛋白質を生理的・製剤的に許容される担体中に含むものである。主成分として含まれるNedd9蛋白質及び/またはFAK蛋白質は、実質的に精製された形で担体中に含まれることが望ましい。「実質的に精製された」とは、自然環境においてコンタミする成分が含まれていないこと、即ち、天然においてNedd9蛋白質またはFAK蛋白質に付随するその他の蛋白質、または、組換え生産する際に混入し得る宿主由来の蛋白質等をできるだけ含まない状態を意味する。このような実質的に精製された蛋白質は、ゲル濾過、逆相、吸着、イオン交換、及び疎水性相互作用等のクロマトグラフィー、並びに、エタノール沈澱、電気泳動、蒸留、溶媒抽出、免疫沈降、透析、再結晶、及び硫酸アンモニウム沈澱のような公知の手段を用いた精製により得ることができる。また、蛋白質を特異的に認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を利用したアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行ってもよい。しかしながら、これは本発明の薬学的組成物が、Nedd9蛋白質またはFAK蛋白質以外の蛋白質を活性成分として含むことを妨げるものではない。即ち、本発明の薬学的組成物は、必要に応じ、Nedd9蛋白質またはFAK蛋白質以外の活性成分を含んでもよい。追加で加えられる特に好ましい活性成分として、Nedd9蛋白質及びFAK蛋白質の活性を阻害せず、且つ、これらの蛋白質とは異なる作用機序により神経障害または神経変性疾患の治療または予防を可能にする成分を挙げることができる。例えば、繊維芽細胞成長因子(FGF)（塩基性FGF;酸性FGF;FGF-3；FGF-4；FGF-5;FGF-6；FGF-7;FGF-8；FGF-9）、ニューロトロフィン(NT)（神経成長因子(NGF);脳由来神経栄養因子(BDNF);NT-3；NT4/5；NT6）、インスリン様成長因子(IGF)（IGF-1;IGF-2）、毛様体神経栄養性成長因子、上皮増殖因子（EGF）（EGF；TGFα;ヘパリン結合EGF；アンフィレグリン；ベタセルリン；ワクシニア成長因子；neu分化因子）、トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)、血小板由来成長因子、及び血管形成誘導因子(VEGF)等のファミリー由来メンバー、並びに、白血病阻止因子(LIF)、オンコスタチンM、インターロイキン-11(IL-11)、及びIL-6、IL-1等を挙げることができる。また、本発明の薬学的組成物は、蛋白質以外でも、Nedd9蛋白質及びFAK蛋白質の活性を阻害せず、且つ、これらの蛋白質とは異なる作用機序により神経障害または神経変性疾患の治療または予防を可能にする化合物を含んでもよい。例えば、FK-506のようなタクロリムス結合蛋白質(FKBP)と結合する化合物は、神経細胞における神経突起の成長を刺激することが明らかにされている(Lyons et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91:3191-5;米国特許第5,696,135号)。また、本薬学的組成物を投与した周囲の神経膠細胞、神経膠星状細胞等の増殖が望ましくない場合には、サイトシン、アラビノシド、5-フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、メトトレキセート等の公知の抗分裂促進剤を併用してもよい。
【００２０】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは注射薬として構成される。例えば、脳室内投与または病巣局所への注射により患者に対して投与することが考えられる。さらに、Nedd9蛋白質及び/またはFAK蛋白質は、所望の薬学的または薬理学的性質を付与する薬剤と結合させてもよい。例えば、投与した蛋白質が血液脳関門を超えてターゲットとなる病変部へ運搬されるように製剤化することにより、静脈注射による本発明の薬学的組成物の投与も可能となる。また、例えば、表面に抗体、リガンド、受容体等の特定の細胞表面分子へ選択的に結合する分子を含ませたリポソームまたはポリマーのような担体中にNedd9蛋白質及び/またはFAK蛋白質を含ませ、標的細胞への蛋白質の選択的な運搬を行わせることもできる。
【００２１】
ここで、本発明の薬学的組成物に含まれる「担体」とは、触媒作用を示す蛋白質を分散させ、保持する物質のことであり、用いられる用量及び濃度で、投与される動物に対して非毒性で、主成分たる蛋白質の作用を妨げるものでなければよい。例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸塩の緩衝液、グルコース溶液、滅菌水等を担体として用いることができる。このような溶液中に溶解させたNedd9蛋白質及び/またはFAK蛋白質は、場合により凍結乾燥させ、無菌アンプル中に保存し、投与直前に滅菌水を添加することにより再構成してから投与するような形態としてもよい。また、治療を必要とする組織にうめ込むための固形、半固形、または相溶性の基質にNedd9蛋白質及び/またはFAK蛋白質を組込むこともできる。
【００２２】
さらに、本発明の薬学的組成物には、必要に応じ、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、甘味料、芳香剤、矯味剤、安定剤、酸化防止剤、表面活性剤、抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、粘度安定剤、透過促進剤等の成分を加えてもよい。その他、投与後の活性成分の放出速度を調節できるようにするために、公知の手法に従って組成物を調製することもできる。ポリ乳酸コグリコール酸(PLGA)ポリマー等を用いた徐放剤が公知である。
【００２３】
本発明の薬学的組成物は、神経障害または神経変性疾患の治療に使用することができる。ここで使用される「治療」には、治療的療法及び予防的療法の両方が含まれる。本発明の薬学的組成物は、治療を必要とする患者に対して投与されるものであるが、この「治療を必要とする患者」とは、既に疾患を患っている患者に加え、現在、発症してはいないが疾患に罹る可能性のある者が包含される。本発明の薬学的組成物が対象とする神経障害および神経変性疾患は、好ましくは脳または脊髄における障害・疾患である。神経障害としては、一過性全脳虚欠、脳卒中等の虚血性疾患を挙げることができる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、小脳性運動失調症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、パーキンソン病及び進行性核上麻痺を挙げることができる。
【００２４】
本発明の薬学的組成物は、哺乳動物を対象として使用することができる。ここで、哺乳動物とはこれらに限定される訳ではないが、ヒト、ペット等の家庭用動物、家畜等の農業用動物が含まれ、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット等の哺乳類に分類される任意の動物を挙げることができる。好ましくは、本発明の薬学的組成物はヒトを治療する目的で使用される。
【００２５】
本発明の薬学的組成物の投与量は、ニューロンの最終分化を誘導するのに十分な量であればよく、その剤形、投与方法、並びに患者の症状、体重、性別及び年齢等によって変化するが、通常、成人（体重60kgとした場合）に対し、一日当たり0.1μg〜10g、好ましくは1μg〜1g、より好ましくは100μg〜100mgの投与を行うことが考えられる。ヒト以外の患者に対しては、該用量を体重当たりで計算した量の蛋白質を含む組成物を投与すればよい。
【００２６】
本発明により、Nedd9のPC12細胞における強制的発現が、該細胞における神経突起伸長を促進させることが確認された。そこで本発明はさらに、上記Nedd9蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより細胞を形質転換し、該細胞を該遺伝子が発現される条件下で培養することによりニューロン細胞を分化させる方法に関する。ここで、発現ベクターは、形質転換される細胞により認識される適当な転写/翻訳制御領域を含み、Nedd9蛋白質をコードする遺伝子は該転写/翻訳制御領域に対して作動可能に連結される。また、発現ベクターは、該ベクターにより形質転換された細胞を選択するためのマーカーを含んでもよい。マーカーは、特に限定されず、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、またはバキュロウイルスによる封入体形成等の有無に基づいて、組換えられた細胞の検出を可能とするものであればよい。また形質転換される細胞としては、ニューロンに分化し得る細胞であればよく、あらゆる発達段階の未成熟ニューロンが含まれる。このような細胞には神経幹細胞、造血幹細胞が含まれ、骨髄、末梢血液、臍帯血等から採取することができる。また、げっ歯類及びヒトの脳よりこのような幹細胞系統の分離・クローン化も既に成功している（Snyder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:11663-8;Gage et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:11879-83;Kuhn et al.,J.Neurosci.(1997)17: 5820-9;米国特許第5,270,191号；米国特許5,750,376；米国特許5,753,506；米国特許5,968,829号）。
【００２７】
本発明のニューロン細胞を分化させる方法の培養工程においては、例えば、血清を添加したDMEM等の培地中で培養することができる。培養は、適当な培養容器中で、例えば、5％CO2、37℃のような培養条件で維持する。好ましくは十分な通気及び振とうを行う。本発明の方法はこの培養条件に限定されるわけではなく、細胞の培養が維持され、ニューロン細胞への分化が起こり得る範囲であればよい。好ましくは、生理学的条件に近いpH及び温度において培養を行うことが望ましい。例えば、pH6〜8、好ましくはよりpH7に近い値（例えばpH7.4）、30〜40℃、好ましくは32〜38℃、より好ましくは35〜37℃の範囲で、培養のpH及び温度を選択する。その他、ニューロンの生育・分化に必要とされる神経成長因子及び/または神経刺激剤を培地中に添加してもよい。例えば、FGF（塩基性FGF;酸性FGF;FGF-3；FGF-4；FGF-5;FGF-6；FGF-7;FGF-8；FGF-9）、NT（NGF;BDNF;NT-3；NT4/5；NT6）、IGF（IGF-1;IGF-2）、毛様体神経栄養性成長因子、EGF（EGF；TGFα;ヘパリン結合EGF；アンフィレグリン；ベタセルリン；ワクシニア成長因子；neu分化因子）、TGFβ、血小板由来成長因子、及びVEGF等のファミリー由来メンバー、並びに、LIF、オンコスタチンM、IL-11、及びIL-6等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の方法により最終分化を経たニューロンは、将来的に様々な神経障害及び神経変性疾患における移植治療に使用できるものと期待される。移植に用いることを目的とする場合には、好ましい態様として、幹細胞を患者自身から得、必要に応じ、移植に先立ちin vitroにおいて培養または濃縮する。また、移植に先立ち、細胞表面のマーカー蛋白質（例えば、微小管関連蛋白質2(MAP2)；タウ；β-チューブリン；ニューロフィラメントLまたはM；神経特異的エノラーゼ、NeuN）の存在に基づき、所望のニューロン細胞を選択することもできる。細胞の移植は、例えば、直接卒中の腔(脳室内、鞘内、槽内)の脊髄液、または病変部の周辺領域へ投与することができる。好ましくは、細胞は生理的に許容される液体担体中に含まれた形で投与する。細胞の投与部位は例えば、標準的なCT、MRIスキャンにより特定することができる。一般的には、例えば、全体で106〜1012、好ましくは107〜1011、より好ましくは108〜1010個の細胞を投与する。細胞の投与は一度に行うこともできるが、必要に応じ、適当な間隔を空け複数回にわたって行ってもよい。
【００２９】
本発明により、Nedd9及びFAKの過剰発現が特に脳虚血の治療により有効である可能性が示されたことから、Nedd9蛋白質及び／またはFAK蛋白質ではなく、これらの蛋白質をコードする遺伝子を、病変部またはその周囲において発現されるように導入することにより脳虚血等の神経障害及び神経変性疾患を治療することも可能である。遺伝子の導入は、直接遺伝子を体内へ導入するin vivo法、または、患者から細胞を取り出し体外で遺伝子を導入した後に細胞を体内へ戻すex vivo法のどちらによって行ってもよい。より簡便な方法として、in vivo法が好ましい。このような遺伝子の導入は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて公知の遺伝子治療の方法に従って行うことができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、免疫不全症ウイルス等の各種DNAまたはRNAウイルス由来のベクターが公知である。また、非ウイルス的な方法により目的の遺伝子を導入するための方法としては、リポソーム、ポリリシン複合体、人工的なウイルスエンベロープ、コロイド金粒子のようなビーズ等を利用した手法が開発されている。遺伝子治療の方法については、例えば「別冊実験医学  遺伝子治療の基礎技術」（羊土社;1996）、「別冊実験医学  遺伝子導入&発現解析実験法」(羊土社;1997)、及び日本遺伝子治療学会編「遺伝子治療開発研究ハンドブック」(NTS;1999)等の記載を参照することができる。その他、Nedd9陽性ニューロンを取得し、該ニューロンを病変部またはその周辺部に移植することにより治療を行うことも考えられる。
本明細書中に引用した全ての刊行物は参照として組み入れられる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
１．実験方法
(１)抗体および試薬
pp125FAK、p130Cas及びPYK2に対するモノクローナル抗体は、Transduction Laboratories社（Lexington, KY）から入手した。抗ホスホチロシン抗体（4G10）はUpstate Biotechnology, Inc.（Lake Placid, NY）から購入した。抗βアクチンポリクローナル抗体（pAb）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）、マウス抗ニューロン特異的核タンパク質（NeuN, Chemicon）、正常ウサギ血清（Sigma, St. Louis, MO）、正常マウスIgG1（Sigma）、並びに、ヤギ抗マウス抗体及びヤギ抗ウサギ抗体のHRP結合物（Promega, Madison, WI）を購入した。Cas-Lに対して特異的なpAbの製造は、以前記載の方法に従って（Ohashi et al.,J.Biol.Chem.(1998)273:6446-51;Miyake-Nishijima et al.,Arthritis Rheum.(2003)48:1890-900）。具体的には、Cas-L（アミノ酸419〜524）とグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白質をウサギに免疫処置した。蛋白質の当該部分は、p130Casとのアミノ酸配列の相同性が比較的低いことを理由として選択した。抗Cas-L血清及び抗p130Cas血清をGST-p130Casにより吸収した後に、Cas-L pAbに対する特異抗体をGST-Cas-Lによりアフィニティー精製した。基本的に、抗Cas-L pAbとの免疫沈降物は、p130Casを含まない（Ohashi et al.,J.Biol.Chem.(1998)273:6446-51）。アフィニティー精製されたウサギ抗マウス抗体は、Jackson Laboratories（West Grove, PA）から購入した。他の化学物質はすべて、別に明記する場合を除き、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から購入した。プロテインAセファロースビーズは、Pharmacia Biotech社（Uppsala, Sweden）から購入した。
【００３１】
(２) マウスCas-L／HEF1のcDNAクローニング、及び（自動サイクル）シークエンシング
λgt11ヒト胎盤cDNAライブラリー（Clontech）を、32P標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、50mM Tris-HCl（pH 7.5）、1M NaCl、1％SDSおよび100μg／ml超音波処理サケ精巣DNAを含む溶液中にて50℃で16時間かけてスクリーニングし、続いて1％SDSを含む0.1×SSC（SSC；150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0）により65℃で洗浄した。約1.0×106個のプラークをペトリ皿に播き、スクリーニングのためにナイロンフィルターへ移した（colony／plaque screen, NEN Research Products, Boston, MA）。用いたハイブリダイゼーションプローブは、ヒトCas-L／HEF1に対する完全長cDNAであり、これをランダムプライマー標識法（Feinberg and Vogelstein, Anal.Biochem.(1983)132:6-13）により[α-32P]dCTP（Amersham）で標識した。ハイブリダイゼーション陽性クローンを制限酵素マッピング、並びにプライマーウォーキング及びサブクローニングを用いたヌクレオチドシークエンシングにより分析した。pBluescriptファージミド（Stratagene）サブクローンのシークエンシングには、ABI Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencingキット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、DNAシークエンシングシステム（model 373A, Applied Biosystems）にて分析した。マウスCas-Lのオープンリーディングフレームは、内部プライマーを用い、両方の鎖について完全に配列決定を行った。
【００３２】
本発明により、Cas-L及びNedd9がスプライシングバリアントであることが初めて報告された。Cas-LとNedd9との唯一の遺伝的な違いは、オープンリーディングフレームの最初の位置にある3つのアミノ酸である（図1a）。
【００３３】
(３)動物
一過性全脳虚血モデル作製のため、体重250〜350gの雄性Sprague-Dawleyラットにペントバルビタールナトリウム（40mg／kg）を腹腔内注射し、麻酔をかけた。ラットの体温を連続的にモニターし、虚血及び再灌流の間は直腸内サーミスタプローブと接続したサーモスタット制御式加熱パッドを用いて37.0〜37.5℃に保った。片側の大腿静脈及び尾動脈に、それぞれ瀉血導入用及び血圧連続モニタリング用のカテーテルを挿入した。血圧は、圧力トランストランスデューサを介して多ペン式記録計を用いて連続的に記録した。両側の総頸動脈を単離し、FE-10ポリエチレンカテーテルで作ったループを後の閉塞のために頸動脈の周囲に通した。
【００３４】
全脳虚血は、ポリエチレンループを用いた両側総頸動脈の閉塞と全身性低血圧との併用よって誘導した。大腿静脈から採血することにより、平均動脈圧を50mmHg未満に維持した（Smith et al.,Acta Neurol.Scand.(1984)69:385-401）。いくつかのケースにおいて、局所脳血流をレーザードプラ血流計によって測定し、虚血が誘導されたことを確認した。虚血から21分後に、総頸動脈周囲のポリエチレンループを開放し、血圧を正常化することによって脳再灌流を実現した。
【００３５】
まず、生理的パラメーター（動脈血の血圧、PaO2、PaCO2、及びpH）を虚血の誘導前に測定した。また、発生学的な検討のために、ICRマウスを日本チャールズ・リバー株式会社（Charles River Japan Inc）から購入した。出生日は、胚齢（E）12.5日、14日、および生後（P）0日、3日として指定した。
【００３６】
(４)逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
過剰量のペントバルビタールナトリウムの投与後、大脳皮質及び海馬を分離し、シャム手術を受けたラット、及び一過性全脳虚血後に1〜14日の再灌流を受けたラットの脳を頭蓋骨から直ちに摘出した。H9 T細胞株をCas-L mRNAの陽性対照として培養した。試料からの全RNAの単離は直ちに行った。ISOGEN試薬（ニッポンジーン株式会社、東京、日本）。RNA含有量は、分光光度計（DU7500, Beckman, USA）を用いて測定した。相補的DNA（cDNA）をRNA試料から合成し、BcaBEST（商標）RNA PCR Kit（タカラバイオ株式会社、東京、日本）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。具体的には、第一鎖cDNAのアリコートを、2.5mmol／L MgCl2、0.5mmol／L dNTP、2.5U／100μl Bca-Optimized Taqポリメラーゼ、並びに、0.2μmolの以下のプライマー：順方向5'-AAATGTGGGCGAGGAAT-3'(配列番号:１)（ラットNedd9の場合）、5'-AGGGCTCATCTGACCAC-3'(配列番号:２)（ラットCas-Lの場合）、及び、逆方向5'-TGACTGGAGGGCTCTTTG-3'（配列番号:３）（いずれのcDNAの場合も）と混合した。PCRサイクルは以下の通りとした；95℃、3分間：94℃、1分間：55.6℃、1分間：72℃、2分間（30サイクル）：72℃、2分間。対照として、ハウスキーピング遺伝子の1つであるβ-アクチンのcDNAを同一条件下で以下のプライマーを用いて増幅した：5'-CTATGAGCTGCCTGACGGTC-3'（配列番号:４）。
【００３７】
その結果、虚血に反応してNedd9のみの発現が誘導され、Cas-Lの発現は誘導されないことが判明した(図2a)。この事実は、Nedd9が脳の発生過程でNPCにおいて発現される点からみてその生理的役割を改めて示している。ラットNedd9遺伝子の上流領域には転写因子結合部位が存在することから、脳内でのNedd9とCas-Lと発現の間の違いは、核因子-κB、熱ショック因子1、または虚血後に徐々に誘導されることが知られる他の関連した転写因子によって媒介されるNedd9遺伝子のトランス活性化に起因する可能性がある。これらのニューロンにおけるNedd9遺伝子調節の分子的機序は、今後の研究の重要な主題であると考えられる。
【００３８】
(５)免疫沈降及びイムノブロット法
ラット及びマウスからのタンパク質抽出は、それぞれペントバルビタール40mg／kg及びエーテル吸入による麻酔下で行った。再灌流から1、3、7および14日後にラットの大脳皮質及び海馬の組織を小片にし、マウス胎仔E12.5、E14、P0、P3及び成体マウスの全脳も小片にした。ガラス製組織粉砕器を30回動かすことにより、1mlの冷却懸濁緩衝液（20mmol／L HEPES-KOH［pH 7.5］、250mmol／Lスクロース、10mmol／L KCl、1.5mmol／L MgCl2、1mmol／L EDTA、1mmol／L EGTA、1mmol／Lジチオトレイトール、0.1mmol／Lフェニルメチルスルホニルフルオリド、2μg／mLアプロチニン、10μg／mLロイペプチンおよび5μg／mLペプスタチン）中でそれらの小片を丁寧にホモジネート化した。タンパク質濃度は、クーマシー法（Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.）により決定した。免疫沈降は、溶解物を抗Cas-L pAb及びプロテインAセファロースビーズと処理して行った。沈降した溶解物または組織溶解物を、それぞれ1×または3×サンプルバッファーと混合し、95℃で10分間加熱した。適切な量のタンパク質を含むアリコートを8％SDS-PAGEによって分離し、PVDF膜（Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA）へのエレクトロトランスファーを行った。5％脱脂乳でブロックした後、膜をTBS中の一次Ab：抗Cas-L pAb（1：1000）、抗PYK2 mAb（1：1000）、抗FAK mAb（1：1000）、抗p130Cas mAb（1：1000）によりブロットした。膜をTBS-Tで洗浄し、HRPを結合した抗ウサギまたは抗マウスIgG AbとともにTBS-T中にてインキュベートした。この膜を高感度化学発光（enhanced chemiluminescence）（ECL）システム（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）により現像した。
【００３９】
(６)濃度測定分析
蛋白質量は、濃度測定法によって決定した。決定値は、シャム手術ラットにおける蛋白質量に対して相対化した。各蛋白質量を、レーン上にローディングした蛋白質量に対して標準化した。
【００４０】
(７)組織学的検査
一過性全脳虚血に関する組織学的検査のために、前脳虚血から0、1、3、7または14日後に、ラットに過剰量のペントバルビタールナトリウム（100mg／kg）で深麻酔をかけ、ヘパリンを添加した生理食塩水を経心臓的に灌流した後に、組織固定のために4％パラホルムアルデヒド／PBSを灌流した。脳を4％パラホルムアルデヒド／PBS中、4℃で後固定してパラフィン包埋切片を作成した。パラフィン包埋切片（10μm）の脱ロウ処理を行い、PBSで3回洗った。切片の0.1％Triton X-100／PBSによる透過化処理を室温で10分間行った後に4％FBS／PBSで60分間ブロックした。その後に、それらを一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。一次Ab及びその希釈度は、以下の通りとした：抗Cas-LウサギpAb、1：200；抗FAK mAb、1：200；NeuN、1：200。ビオチン化した抗ウサギIgG及び抗ウサギIgGを1：1000で二次抗体として用いた。
【００４１】
発生学的検討は、エーテル吸入により麻酔をかけた新生仔及び成体に対して左室を介して4％パラホルムアルデヒド（0.1M PBS、pH 7.4中）を灌流し、その後に脳を摘出した上で、同じ固定液中に4℃で一晩おいて後固定して行った。切片（8μm）をミクロトームで切り出し、MASをコーティングしたスライドにマウントした。Cas-Lの可視化は、TSA（商標）システムSystems（FITC, NEL701, NEM（商標）Life Science Products, Boston, MA, U.S.A.）を用いたチラミドシグナル増幅によって行った。
【００４２】
(８)ニューロスフェア培養
20ng／mlの上皮増殖因子（Sigma）及び10ng／mlのFGF2（R & D Systems）を含む基本培地、並びに、ニューロスフェア形成及び分化アッセイのための手順は記載された通りにした（Nakamura et al.,J.NEurosci.(2000)20:283-93）。具体的には、P0線条体の脳室下領域由来の細胞を一次スフェアの形成に用いた（1×105個／ml）。24時間インキュベートした後、スフェアを機械的に解離し、マトリゲルをコーティングしたカラーグラス上にプレーティングした。1、3及び5日後、これらのスライドを、主要な3種類の細胞、即ち、ニューロン、稀突起膠細胞、及び星状細胞をそれぞれTuj1抗体、抗O4抗体および抗GFAP抗体を用いて検出する三重標識間接免疫細胞化学検査のために処理した。前駆細胞の表現型は、細胞数にかかわらず、クローンに存在した細胞種（ニューロン、星状細胞、及び／または稀突起膠細胞）に基づいて判定した。動物1匹当たり約24個のスフェアを3回の独立した実験で検討した。
【００４３】
(９)レトロウイルスを用いた遺伝子導入
レトロウイルス遺伝子導入を、Ping-pong感染法を用いて行った。具体的には、Plat-E細胞（Gojo et al.,Cell Transplantation(1996)5:S81-4）を、2×105個／ウェルの密度で6ウェルプレートに播いた。その翌日に、Fugene6試薬（Boehringer Mannheim）を用いて、1μgのpMX-Cas-Lwt-IRES-GFP、pMX-SH3-IRES-GFP、pMX-Cas-LF-IRES-GFP、pMX-Cas-LdeltaSH3-IRES-GFP、pMX-Cas-LdeltaSD-IRES-GFPまたはpMX-IRES-GFPを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、ウイルス上清を収集し、0.45mmポリスルホンフィルターで濾過し、PT-67細胞（Clontech）の感染に用いた。レトロウイルスを安定的に産生するPT-67感染株を樹立した後に上清を収集し、5μg／mlのポリブレン（Sigma）を用いる32℃でのPC-12細胞の感染に用いた。感染96時間後に感染細胞を通常の増殖培地に入れた。
【００４４】
(１０)PC-12細胞の神経突起伸長の評価
感染したPC-12細胞を、10％ウシ胎仔血清及び5％ウマ血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。神経突起形成のためには、35mmプレート当たり5×104個の細胞を播き、一晩増殖させた上で飢餓状態に16〜20時間おいた（0.5％ウシ胎仔血清＋0.5％ウマ血清）。続いてこの培地に50ng／ml NGFを添加した。刺激して4日後に、細胞100〜250個を含む撮影した写真の視野にある神経突起の長さを測定した。神経突起の長さはは2通りに表現した；第1に、細胞体の全長にわたって平均した神経突起の長さとして（棒グラフ；y軸＝細胞の直径）；第2に、細胞1個当たりの神経突起数として。統計学的有意性のレベルは、両側Student t検定（不等分散）によって評価した。重要な結論はすべて、独立したクローン、及び／またはまとめて選択したクローンのプールで再確認した。
【００４５】
２．結果
(１)マウスCas-Lのクローニングにより、Nedd9及びCas-Lはスプライシングバリアントであるが、その機能ドメインは互いに同一であることが判明
マウスCas-L cDNAをクローニングするために、ヒトCas-L cDNAを、λファージのマウス胎盤cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。クローニングしたマウスCas-L cDNAを用いて、cDNAデータベース及びゲノムデータベースによる配列相同性検索を行った。Nedd9は、塩基配列及びアミノ酸配列の点でマウスCas-Lと高度の配列相同性を有することが判明した（図1a）。マウスゲノムデータベースの解析により、Nedd9がCas-Lのスプライシングバリアントであり、両蛋白質の機能ドメインが互いに同一であることが示された。ラットゲノムデータベースからは、マウス及びラットのNedd9の推定アミノ酸配列が種の間で高度に保存されていることが示された。ラットNedd9は、塩基配列及びアミノ酸配列のいずれに関してもラットCas-Lと高度の配列相同性を有していた（図1a、b）。
【００４６】
これまで、Nedd9の機能についての調べた報告はないが、本発明において、Nedd9の機能ドメインがCas-Lと同一であることが判明したため（図1b）、他の細胞種におけるCas-Lの機能からNedd9の機能を推測することが可能となった。現在の知見によれば、Cas-Lに関する一般的なシグナル伝達経路は次のように提唱することができる：細胞外マトリックスとの結合によるインテグリン受容体の連結後に、Cas蛋白質関連キナーゼFAK／PYK2が自己リン酸化を起こし、Crk及び他の蛋白質の結合部位を生じる（非特許文献9）。Cas-Lは、SH3ドメインを介してC末端のFAK／PYK2ポリプロリン領域と結合し（非特許文献3;Astier et al., J.Biol.Chem.(1997)272:19719-24）、FAK／PYK2により直接的にチロシンリン酸化を受ける（Astier et al.,J.Biol.Chem.(1997)272:19719-24;非特許文献6）。
【００４７】
(２) Cas-Lと異なり、 Nedd9は一過性全脳虚血後に大脳皮質及び海馬においてFAKと共に転写的にアップレギュレートされ、チロシンリン酸化を受ける。
表1に、虚血を誘導する直前の生理的パラメーターを示す。表中の数値は、平均±S.E.M.で示す。
【表１】
2005139164.tif 000002
【００４８】
パラメーターに関してグループ間に有意差は見られず、虚血試験に用いた全ラットの状態に有意差がないことが示された。全脳虚血を来したラットにおけるNedd9及びCas-L遺伝子の発現を、21分間の虚血から1、3、5、7若しくは14日後のラット、またはシャム手術から1時間後のラットから得たmRNAを用いるRT-PCRによって分析した。RT-PCRは、ラットNedd9 mRNA及びCas-L mRNA由来の断片を増幅するプライマーのセットを用いて行った（図1b）。Nedd9の発現は、虚血1〜14日後を通じて大脳皮質及び海馬のいずれにおいてもアップレギュレートされていた。これに対して、Cas-Lの発現は観察されなかった（図2a）。
【００４９】
Nedd9のアップレギュレーションに関係するシグナル伝達経路を取り扱うために、本発明者らは、Cas-L／Nedd9と関係のある他の蛋白質、即ち、FAK、PYK2、p130casの発現をウエスタンブロット分析によって検討した。非受容体型チロシンキナーゼであるPYK2及びFAKは、シグナル伝達における相互作用パートナーとして最も詳細に研究されており（非特許文献9）、p130CasはCas蛋白質ファミリーの別のメンバーである。Nedd9蛋白質、及びFAKは、いずれもNedd9発現と同時にアップレギュレートされるが、他の蛋白質は明らかな変化を示さない（図2b）。Nedd9蛋白質及びFAKが、一過性全脳虚血後に一緒にアップレギュレートされるか否かを明らかにするために、一過性全脳虚血から0、1、3、7または14日後にNedd9の免疫沈降を行い、免疫沈降物中のFAK含量を、抗FAK抗体を用いた可視化によって評価した。抗ホスホチロシン抗体4G10による免疫沈降物のブロッティングも行ったが、これは活性化Cas-L／Nedd9がチロシンリン酸化されることが知られているためである。その結果、本発明者らのデータにより、Nedd9蛋白質がFAKと結合し、Nedd9蛋白質の蓄積時に観察されるものと同程度のレベルで、類似した動態によってチロシンリン酸化されることが示された。
【００５０】
このように、本研究では、Nedd9蛋白質及びFAKの発現が、21分間の一過性全脳虚血から3〜14日後、大脳皮質及び海馬において同時に誘導された（図2b）。虚血後に誘導されたNedd9蛋白質は、チロシンリン酸化されており、FAKとの同時免疫沈降も生じた（図2c）。
【００５１】
(３)Nedd9蛋白質の大脳皮質及び海馬におけるニューロンの樹状突起様構造及び細胞体への局在
Nedd9及びFAKの細胞分布、及び、細胞内分布を評価するために、虚血損傷から7日後のラット脳切片をNedd9及びFAKに関して染色した。Nedd9及びFAKに対して免疫反応性を示す細胞が、大脳皮質及び海馬で検出された（図3a）。ラット大脳皮質及び海馬冠状切片では、樹状突起様構造及び細胞質に強いNedd9免疫反応性が認められた。これに対して、核にはNedd9染色は認められなかった。Nedd9蛋白質、及びFAKまたはNeuNの共局在化により、ニューロン内でNedd9蛋白質がFAKとともに発現されることが裏づけられた（図3b）。
【００５２】
組織化学分析による結果から、誘導されたNedd9蛋白質及びFAKが、大脳皮質内及び海馬内のニューロンの樹状突起様構造及び細胞体に局在することが明らかになった（図3a、b）。このような組織化学分析の結果、並びに、上記(1)において示したNedd9のスプライシングバリアントであるCas-Lについてのこれまでの報告、及び、上記(2)で示された一過性全脳虚血におけるNedd9蛋白質及びFAK発現の誘導の結果から、本発明者らは、Nedd9が神経分化のために必要であり、主として胚脳で発現され、完全に分化した成体ニューロンでは発現されないと仮定した。以上を要約すれば、成体脳におけるNedd9のアップレギュレーションは、虚血後のニューロンのリモデリングに役割を果たすように思われる。
【００５３】
(４)Nedd9の胚期及び生後早期のマウス脳の皮質板辺縁帯、及び、脳室部分のニューロン神経突起内での高発現
Nedd9の生理的役割を明確にするため、Nedd9が胚期には転写的に発現されるが成体では消失するとの報告に基き（非特許文献1）、本発明者らは、胚期及び生後早期のマウス脳におけるNedd9の発現時期を検討した。ウエスタンブロット分析により、Nedd9蛋白質は胚期及び生後期（ピークはP3）に発現されるが、成体では発現されないことが示された（図4a）。この結果は、非特許文献1におけるKumarらの報告と一致する。
【００５４】
さらに、免疫組織化学検査により、Nedd9は皮質板の辺縁帯及び脳室部分のニューロンの樹状突起様構造の遠位端で発現されることが明らかになった（図4b）。この染色パターンにより、Nedd9の大部分は、完全に分化したニューロンではなく、分化後期にあるニューロンの神経突起に局在する可能性が示唆された。前神経bHLH因子等の前駆細胞マーカーが脳室帯で発現され、その後、ニューロン及びグリアが生じるが、NeuroD／Nexファミリー等のbHLH分化遺伝子の発現は、未熟ニューロンで始まり、神経分化期間を通じて皮質板で維持される（Schwab et al.,J.Neurosci.(1998)18:1408-18）。このため、Nedd9の発現パターンからは、Nedd9を介したニューロンの最終分化が示唆される。哺乳動物においてFAKは脳で最も高レベルに発現され、ニューロンにも多く存在する（Andr and Becker-Andr,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1993)190:140-7;Burgaya et al., Eur.J.Neurosci.(1995)7:1810-21;Grant et al.,Genes Dev.(1995)9:1909-21）。Burgayaらは、FAKが発生中の脳で発現され、神経突起の伸長及び維持に重要と考えられることを報告している（Burgaya et al.,Eur.J.Neurosci.(1995)7:1810-21）。FAK蛋白質レベルは、胚の時期に最大で出生後は徐々に低下するが（Xie et al.,Cell(2003)114:469-82）、このことはNedd9の発現時期と一致する。このようにNedd9及びFAKは、共発現されており、発生中の脳におけるニューロンの分化に協同的に作用するように思われる。
【００５５】
(５)神経前駆細胞からの分化過程にあるニューロンでのNedd9発現
神経分化過程におけるNedd9の発現パターンを解明するために、本発明者らは新生仔マウス脳の神経原性脳室下領域由来の幹／前駆細胞の培養物を調製した。単細胞浮遊液由来のクローンを増殖させ、EGF、bFGFの存在下における非付着性条件下でニューロスフェアとして培養し、その後、基質への付着及び分化を誘発するために10％ウシ胎仔血清と共にプレーティングした。培養ニューロスフェアの中心にある細胞は、幹／前駆細胞として増殖したが、培養物の周辺に遊走した細胞はニューロン、稀突起膠細胞、及び星状細胞に分化した。ニューロン、稀突起膠細胞、及び星状細胞のそれぞれのマーカーであるO-4、GFAP、及びTuj1を用いて共局在に関して検討した。Nedd9は、Tuj1と共発現されたが、O-4及びGFAPとは共発現されなかった。このことからNedd9が発生過程にあるニューロンで発現されることが示された（図5a、b）。Nedd9の発現は、ニューロンの近位神経突起及び細胞体に局在していたが、Tuj1では神経突起の遠位部分及び細胞体が染色された（図5b）。
【００５６】
即ち、本研究により、Nedd9蛋白質がニューロスフェア内のTuj1細胞及び陽性細胞で発現されることが確認された（図5b）。これらの所見は、Nedd9がマウス神経前駆細胞で発現されることを示唆し、これは、Nedd9蛋白質が発生過程にあるマウス脳の未熟ニューロンの神経突起内の辺縁帯及び脳室部分で発現されるという本発明者らの免疫組織化学分析の結果とも一致する。Tuj1は、ニューロンに特異的なβチューブリンIII型蛋白質であることから、ニューロン前駆細胞の核周囲領域におけるNedd9及びTuj1の共発現により、Nedd9が微小管組織化に役割を果たすことが判明した。最近、XieらはFAKも培養皮質ニューロンの核周囲領域で発現されることを報告した。彼らは、FAKのCdk5リン酸化が、微小管フォークの調節を介したニューロン移動に決定的に重要であることを示している（Xie et al.,Cell(2003)114:469-82）。Nedd9相同体であるCas-Lは主として接着斑及び近位緊張線維に局在し、種々の外部環境誘因に反応して細胞骨格を再組織化する（非特許文献9）。これらのデータは、Nedd9が神経移動または神経分化といった微小管を介した機能に関与することを示唆している。
【００５７】
(６) PC-12細胞のニューロン伸長のNedd9によるNGF非依存的促進
マウス胚及びニューロスフェアの検討により、分化過程にあるニューロンにおけるNeddの発現が認められた。そこで、本発明者らは、PC-12細胞における神経突起伸長に対するNedd9の作用を検討した。まず、myc標識Nedd9のサブクローニングを行い、その変異体をpMx-IRES-GFPベクターに挿入し、PC-12細胞に感染させた（図6a）。4日後、NGFまたは溶媒のみを感染細胞に添加し、GFP及びNedd9の発現を神経突起の出現に関して評価した。空ベクターを感染させた細胞、並びに、delta SH3、SH3及びdelta SD等の変異体とは異なり、外因性野生型Nedd9を発現する細胞は、NGFの存在下でも非存在下でも神経突起形成の促進を示した（図6b）。これらの所見から、Nedd9依存的機能が、PC-12細胞の分化促進にNGF非依存的に寄与することが示唆された。
【００５８】
以上のように、Nedd9がPC-12細胞で過剰発現されるとNGF非依存的な神経突起伸長に大きな影響を及ぼすことが示された。delta SH3、SH3及びdelta基質ドメインの発現によって神経突起伸長が阻害されたという事実は、Nedd9の構成要素の機能と一致する。即ち、Nedd9／Cas-LはSH3ドメインを介してFAKと結合し（非特許文献3）、Crk、Nck及びSH-PTP2等のSH2含有蛋白質との相互作用には基質ドメインが必要であるという事実と一致するものである。Crkは、PC-12の分化をNGF非依存的な様式で誘導することが報告されている（Tanaka et al., Mol.Cell.Biol.(1993)13:4409-15）。Altum-Gultekinらは、v-Crkを発現するPC-12細胞が神経突起伸長及びFAK発現のアップレギュレーションを示すことを報告しており（Altun-Gultekin et al.,Mol.Cell.Biol.(1998)18:3044-58）、このことはFAKがPC-12細胞のNGF非依存的な神経突起伸長に関与していることを裏づける。即ち、これらの結果は、Nedd9及びFAK の遅延型発現が脳における虚血損傷後のニューロンのリモデリングに寄与するという仮説を裏づけるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（a）マウス及びラット由来のNedd9及びCas-Lの推定アミノ酸配列の比較である。（b）Cas-Lの多ドメイン構造による、Nedd9及びCas-LのmRNAバリアントの生成についての提唱モデルの模式図である。（上部）Nedd9／Cas-L遺伝子の構成を示す。エクソンは黒ボックスによって示され、番号が付されている。（中央部）種々のmRNAにおけるエクソンの存在を、ボックスが線によって連結されたものとして表している。エクソン2A及び2Bにおける翻訳開始部位、並びにエクソン8における翻訳終止部位を示す。矢印は、それぞれNedd9 mRNA及びCas-L mRNAからの産物を生じるように設計されたPCR増幅用のプライマー部位を表す。（下部）Cas-Lのドメイン構造を示している。バーは、本研究で用いた抗Cas-L抗体によって認識される責任ドメインを示している。SD：基質ドメイン、SR：セリン-リッチ領域、CC：コイルドコイル領域、HLH：ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、CT：C末端ドメイン。
【図２】（a）Nedd9の2種類のスプライシングバリアントを、内部対照として用いたβ-アクチンと識別したRT-PCRの代表的な結果を示す写真である。H9細胞をCas-Lの陽性対照として用いた。（b）Nedd9／Cas-Lに関連するタンパク質の発現を調べたウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。Nedd9蛋白質、及びFAKの両方がアップレギュレートされ、これはNedd9発現の時間的プロフィールと一致した。しかし、その他の蛋白質は明らかな変化を示さなかった。（c）Nedd9を一過性全脳虚血から0、1、3、7または14日後に免疫沈降させ、免疫沈降物中のFAK含量を抗FAK抗体を用いた視覚化によって評価した結果を示す写真である。抗ホスホチロシン抗体4G10による免疫沈降物のブロッティングも行った。
【図３】（a）Nedd9免疫反応性細胞の大脳皮質及び海馬における検出を示す写真である。ラット大脳皮質及び海馬の冠状切片を調べたところ、ニューロンの樹状突起内に強いNedd9免疫反応性が認められた。これに対して、神経細胞核にはNedd9染色は認められなかった。（b）Nedd9とNeuNまたはFAKとの共局在を示す写真である。
【図４】（a）マウス脳発生における、Nedd9の時間的発現を調べたウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。胚齢12.5日及び14日の発生中の脳、並びに、生後0日及び3日の成体脳におけるNedd9発現を調べた。抗Nedd9Abを用いた標準的なウエスタンブロットにより、出生期及び生後早期の発生中の脳におけるNedd9蛋白質の発現が示されたが、成体脳では検出されなかった。（b）P0の大脳皮質、及び海馬におけるNedd9の免疫組織化学的分布を示す写真である。Nedd9との陽性免疫反応性は、皮質板の辺縁帯及び脳室部分では線維状であった。
【図５】マウスニューロスフェアにおける免疫細胞化学的検討の結果を示す写真である。（a）マウスニューロスフェア細胞におけるNedd9（緑色）、O-4／GFAP（赤色）及びHoechst 33258（青色）の免疫組織化学的分布から、Nedd9が稀突起膠細胞でも星状細胞でも発現されないことが示された。（b）マウスニューロスフェア細胞内のNedd9（赤色）、Tuj1（緑色）及びHoechst33258（青色）の免疫組織化学的分布から、Nedd9が発生過程にあるニューロンで発現されることが示された。
【図６】（a）GFP-Nedd9欠失変異体の構造の模式図である。略号：WT：野生型、dSH3：delta SH3、SD：基質ドメイン。F：YDYVHLモチーフ内の欠失、SR：セリンリッチドメイン、CC：コイルドコイル領域、HLH：ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、CT：C末端ドメイン。（b）NGFの存在下または非存在下における神経突起の形成について調べた結果を示す。データは、細胞体の直径にわたり平均した神経突起の長さ（棒グラフ；y軸＝細胞の直径）、及び細胞1個当たりの神経突起の数、として表した。統計学的有意性を、刺激していない対照PC-12細胞（*、p<0.001）との比較によって検討した。
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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