(57)【要約】【課題】培養した生体材料を簡便かつ低コストに回収することが可能な方法の提供。【解決手段】  生体材料回収プレートであって、生体材料の培養容器に装着して反転したときに、生体材料が集合することができる凹部を有する前記プレート、及び当該プレートを、生体材料を培養した容器に装着し、反転して遠心分離することを特徴とする、生体材料の回収方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料回収プレートであって、生体材料の培養容器に装着して反転したときに、生体材料が集合することができる凹部を有する前記プレート。
【請求項２】
生体材料がスフェロイドである請求項１記載のプレート。
【請求項３】
１又は数個の凹部を有する請求項１記載のプレート。
【請求項４】
生体材料を培養した容器に請求項１記載の回収プレートを装着し、当該容器を反転することを特徴とする、生体材料の回収方法。
【請求項５】
容器を反転後、さらに遠心分離することを特徴とする、請求項4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養後の生体材料を効率よく回収するプレート及び回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織由来細胞の細胞塊（スフェロイド）は、単離した細胞を培養することにより作製するが、その作製した細胞塊を回収する作業は、肉眼でプレート内の培養液をピペッティングすることにより細胞塊を浮かせて、培養プレートをクリーンベンチの台に反射する光にかざして目視しながら手作業で一つ一つ細胞塊を取り出す（吸引する）ことにより行っている。しかし、１個の細胞塊は直径が0.5mm以下と非常に小さく肉眼では見えにくく、しかも、クリーンベンチ内では顕微鏡を用いて作業する場合、特殊な顕微鏡が必要なため、細胞塊を回収する作業は困難である。また、組織プラグなどの大きな組織片を作製するためには、細胞塊は約800〜1000個程度必要とされるため、このような大量の細胞塊を上記手作業により回収することは極めて非効率である。さらに、自動細胞培養ロボットが開発されているが、コスト面や操作が煩雑であることから、ロボットを使用することは必ずしも好ましいものではない。
【特許文献１】特開2003-144139号公報
【特許文献２】米国特許第6242247号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記生体材料を簡便かつ低コストに回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、生成した生体材料を有する培養容器を所定の回収プレートに装着して反転させて、遠心分離することにより、簡便かつ低コストで生体材料を回収しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、生体材料回収プレートであって、生体材料の培養容器に装着して反転したときに、生体材料が集合することができる凹部を有するプレートである。ここで、生体材料はスフェロイドが好ましい。また、プレートは１又は数個の凹部を有することができる。
【０００６】
また、本発明は、生体材料を培養した容器に上記回収プレートを装着し、当該容器を反転することを特徴とする、生体材料の回収方法である。なお、反転した後に、容器を遠心分離してもよい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、生体材料回収プレート、及び当該プレートを用いた生体材料回収方法が提供される。本発明の方法により、1個1個手作業で細胞塊を取り出す必要がなく、作業効率は極めて高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明は、生体材料回収プレートであって、生体材料の培養容器に装着し、反転したときに、生体材料が集合することができる凹部を有するプレートである。また、本発明は、生体材料を培養した容器に上記回収プレートを装着して培養容器を反転し、遠心分離することにより、生体材料を回収する方法を提供する。
【００１０】
１．生体材料回収プレート
本発明の回収プレートの一例を図１に示す。図１において、Aは、凹部を１箇所設けた回収プレートの斜視図であり、BはAのX-X断面図である。回収プレート１は、培養容器６との装着部２及び凹部３を有しており、培養容器６の蓋として使用される。装着部２は、回収プレート１の周囲を囲み、培養容器６に隙間なくはめ込み、また容易に取り外しができる構造となっている。凹部３は、回収プレート１の底部の窪み部分であって生体材料５が集合する領域である。凹部３の形状は特に限定されるものではなく、矩形、円形、その他任意の形状とすることができる。なお、凹部３の領域が小さい（狭い）ときは、凹部３が上向きになるように回収プレート１を置くと不安定となるため、回収プレート１は支持フレーム４を備えてもよい。支持フレーム４は、棒状、箱状等の任意の形状とすることができる。
【００１１】
本発明において生体材料を回収するときは、生体材料５を含む培養容器６に回収プレート１を装着して一体化させ（蓋をかぶせた状態）（図１(C)）、その一体化した容器の上下を反転し、必要に応じて遠心する（図１(D)）。「装着」とは、培養容器を逆さにしても培養液が装着部２から外部に漏れ出ないように培養容器６に回収プレート１を密着させることを意味する。従って、回収プレート１と培養容器６との装着部分は、例えば、培養容器６に回収プレート１がうまくはまり込むような形状とすることができる（図２A）。また、培養容器６及び回収プレート１の一方又は両方に天然ゴム、CRゴム、NBRゴム、EPTゴム、シリコンゴム、ウレタンゴム、フッ素ゴムなどのゴム製材料９を付けることも可能である（図２B）。但し、ゴム製材料は上記例示されたものに限定されるものではなく、また、培養液の漏れを防ぐことができる限りゴム以外の他の部材を使用することもできる。これにより、クリーンベンチ内で作業を行った場合でも、培養液がプレートから漏れることはない。
【００１２】
本発明において、回収プレート１の凹部３には、生体材料５が１箇所に集合するように傾斜部８をさらに設けることも可能である（図１(E)）。傾斜部の位置は特に限定されるものではなく、凹部３の中央部に向かって傾斜させてもよく、凹部３の端に向かって傾斜させてもよい。
【００１３】
本発明の回収プレート１を培養容器６に装着させたときのモデル図（コンピュータグラフィック図）を図３に示す。図３において、Aは培養容器と回収プレートであり、Bはそのモデリングのための図である。Cは培養容器に回収プレートを装着して両者を一体化した図であり、Dはその一体化したプレートを反転（逆さ）したときの図である。
【００１４】
また、本発明の回収プレートは、凹部の数や位置を変えることにより、回収プレート１の窪みを複数（例えば２箇所、３箇所、４箇所、・・・）とすることができる（図４）。図４において、Aは回収プレート１の凹部を2箇所設けたときの斜視図であり、Bはその平面図である。Cは、凹部を４箇所設けたときの平面図であり、Dはそのコンピュータグラフィックによる模型図である。
【００１５】
このように凹部を複数設けると、ひとつの回収プレート内で複数種類の生体材料を回収することができる。但し、複数の凹部を有する回収プレートは、複数種類の生体材料を回収する場合に限定されるものではなく、1種類の生体材料を回収する場合に使用してもよい。また、複数の凹部を有する回収プレートにすることにより、１つの凹部に回収される生体材料の数を調節することができる。
【００１６】
このような複数の凹部を有する回収プレートは、あらかじめ、凹部の数に応じてモデリングすることができる。
【００１７】
本発明の回収プレート１の材質は、テフロン（登録商標）、Polyhydroxyethylmethacrylate polymers（ポリヒドロキシエチルメタキレート；poly-HEMA)、アクリル板、塩化ビニール板、ABS樹脂板、ポリエステル系樹脂板、ポリカーボネート板等の樹脂、PP(ポリプロピレン)、ABS(アクリルニトリルブタジエンスチレン)、PE(ポリエチレン)、POM(ポリアセタール)、PC(ポリカーボネート)、PEEK(ポリエーテルエーテルケトン)、MCN(モノマーキャステイングナイロン)、6N(6ナイロン)、66N(66ナイロン)等のエンジニアリングプラスティックでもよい。これらの素材以外にも、フッ素加工などを行って細胞接着性を低下させた素材でもよい。
【００１８】
また回収プレートは、上記樹脂等を射出型成形、ブロー成形、熱成形、圧縮成形、トランスファー成形、押出し成形等を用いて作製することができる。
【００１９】
２．生体材料
本発明で用いられる生体材料には、浮遊系細胞のほか、接着性細胞も含まれる。接着性細胞に分類される皮膚や骨などの細胞は、培養液中で浮いている状態では死んでしまうため、ガラスなどシャーレに付着することで増殖させる必要がある。この場合、テフロン（登録商標）中に細胞を一カ所に集めるようにすると、細胞は足場を求めて、お互いに接着し合い、細胞凝集塊、すなわちスフェロイド（細胞凝集塊）が形成される。
【００２０】
Molecular Biology of the cell 第三版に記載されているように、酵素処理などでばらばらにした細胞は、自然に凝集することが知られており、この現象はウニなどの下等動物から哺乳類の細胞でもみられることが知られている。この自然凝集は、カドヘリンおよび、CAMという細胞外接着因子によって引き起こされており、生物の発生初期における四肢の形成の際におこる間葉系幹細胞凝集とほぼ同様の現象が、成熟個体でも再現されていると考えられる（Gerisch, G. Curr. Top. Dev. Biol. 14: 243-270. 1980.; Hennings, H. Exp. Cell Res. 143: 127-142. 1983.; Moscona, A.A.; Hausman, R.E. Biological and biochemical studies on embryonic cell-cell recognition. In Cell and Tissue Interactions, Society of General Physiologists Series (J.W. Lash, M.M. Burger, eds.), Vol. 32, pp. 173-185. New York: Raven Press, 1977.;   Roth, S.; Weston, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 974-980. 1967.)。
【００２１】
さらに近年、間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化の際には、このカドヘリンを介した、細胞―細胞同士の接着がスイッチとなりコラーゲンなどの発現が開始することが示唆される報告があった（Yoon YM, J Cell Biochem 2002;87(3):342-59）。
【００２２】
回収の対象となる生体材料を上記スフェロイドにすることにより、細胞周期において細胞は静止期に移行し、タンパク質の産生が増加すると考えられる。このことは、スフェロイドが、立体的形状を有する組織片の生成、あるいは器官再生などの目的で使用される点で意味がある。
【００２３】
従って、本発明においては、生体材料としてスフェロイドが挙げられる。但し、上記スフェロイドに限定されるものではなく、Embryo body、Neuroshpere、chondrosphereTM  を使用することもできる。
【００２４】
スフェロイドに適する細胞は、幹細胞（ES細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞等）などの未分化細胞又はその分化型細胞である。
【００２５】
骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞は未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導が可能なため、これらの分化誘導した細胞（関節軟骨細胞、骨細胞等）も使用することができる。また、成体間葉系幹細胞を使用することもできる。従って、本発明において回収されるスフェロイドを、立体的形状を有する組織片の生成に応用する場合を考えると、このように立体的に構築される組織として、中胚葉系の組織を中心として、関節軟骨、骨のほか、乳房などの脂肪組織、靱帯、腱、歯、耳介、鼻などにも応用可能であるため、これらの組織をなす細胞も使用可能である。
【００２６】
間葉系幹細胞は、被検動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシなどの実験動物）又はヒトの骨髄からDexter法、磁気ビーズ法、セルソーティング法などの公知手法により採取することができる。また、皮膚、皮下脂肪、筋肉組織などから採取する方法も応用可能である。
【００２７】
ここで、生体材料を培養するためには、一度、上記間葉系幹細胞などを単層培養することが必要である。そして、単層培養した細胞をばらばらにし、培養容器に播く。本発明で用いるスフェロイドを培養するための容器は、撥水性又は細胞非接着性のものを使用することができる。ウェルの形状は特に限定されるものではなく、丸底マルチウェル又はＵ字型ウェルでもよい。市販の培養用プレートでよく、目的に応じた大きさのウェルを有するプレート、例えば96穴プレート、24穴ウェルプレート、６穴ウェルプレート等を使用することができる。
【００２８】
このウェルに細胞を播いたものを培養すると、細胞は自然に凝集してスフェロイド（細胞凝集塊）を生ずる。スフェロイドを生ずるまでの培養時間は、６〜２４時間、好ましくは２４〜４８時間である。細胞塊の作製方法は、上記の方法に限定されず、旋回している溶液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れ、遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギネートビーズ法など、多数の既知の方法がある。均一の細胞塊を大量に処理・回収できる点で、撥水性や細胞非接着性のマルチウェルに細胞懸濁液を入れる方法が、効率がよく好ましい。
【００２９】
３．生体材料の回収
培養容器６を反転すると、培養容器６のウェル７から生体材料５がこぼれて凹部３に集合する。培養容器６を反転するだけで生体材料５を回収することが可能であるが、遠心分離器にかけることにより回収効率を上げることができる。すなわち、生体材料の種類によっては、培養容器６を反転したときに培養容器６のウェルの壁に付着することがある。そこで、培養プレート６と回収プレート１が一体化したものを遠心分離装置にセットして遠心分離することによって、培養された生体材料（例えばスフェロイド）を回収プレートの窪みに収集させる（図１(D)、図５）。このときの遠心速度は、1000〜10000rpm、好ましくは1500〜2000rpmである。
【００３０】
遠心分離装置は、通常実験室で使用される装置を使用できる。
【００３１】
従来では、96穴プレート一枚（スフェロイド96個）を処理するのに30分〜1時間程度は要していたが、本発明の方法によれば、96穴プレートを２枚処理するのに１０分程度ですみ、作業時間がかなり低減される。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
ヒト骨髄細胞を10％牛血清添加DMEM培養液で37.5℃で細胞数にしておおよそ1x106になるまで二酸化酸素存在下で7日間培養した。
【００３４】
上記のように培養した細胞をピペットでかるくほぐしてばらばらにし、コールター社製セルカウンターZ1を用いて細胞数をカウントした。あらかじめ、培養液をして添加しておいた96穴ウェルに1x104細胞/ウェルになるように細胞を含む溶液を各ウェルに100μlずつ添加した。培養液には、10％牛血清添加DMEMを用いた。
【００３５】
培養翌日の培養容器をクリーンベンチに移し、４箇所のくぼみを有する回収プレートをクリーンベンチ内で装着し反転させた（図６）。
【００３６】
そして、遠心分離用アダプタ（図７）に装着し、遠心分離装置（TOMY社製EX-125）にセットして（図７）、1500rpmで5分間遠心した。
【００３７】
遠心後、回収プレートを培養容器からはずし、回収プレートの底に集まっている細胞塊（図８）をピペットを用いて取り出した。回収された細胞塊は、１つのくぼみあたり16個であった。
【００３８】
本発明により、手作業で行うと1時間かかる作業が、10分で終了し、極めて効率よく細胞塊を回収することができた。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の回収プレート及び回収工程の概要を示す図。
【図２】本発明の回収プレートと培養容器との装着部を示す図。
【図３】本発明の回収プレートのモデリング図及びプレートを反転させた図。
【図４】本発明の回収プレートの態様を示す図。
【図５】回収プレートから遠心分離により生体材料を回収する方法の概要を示す図。
【図６】本発明の回収プレートと培養容器とを装着し、反転させた図。
【図７】本発明の回収プレートを遠心分離装置にセットしたことを示す図。
【図８】スフェロイドが回収プレートの凹部に回収されたことを示す図。
【符号の説明】
【００４０】
１：回収プレート、  ２：装着部、  ３：凹部、  ４：支持フレーム、
５：生体材料、  ６：培養容器、７：ウェル、  ８：傾斜部、  ９：ゴム製材料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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