(57)【要約】      （修正有）【課題】サツマイモに導入したときに実際に病害に対する抵抗性を示す遺伝子を同定し、同遺伝子を用いて病害に対して抵抗性のサツマイモを提供すること。【解決手段】サツマイモ細胞を、イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターにより発現が誘導されるタンパク質であって、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質をサツマイモ細胞内で発現させることを特徴とする、サツマイモ細胞に黒斑病に対する抵抗性を付与する方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）該特定のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターにより発現が誘導されるタンパク質であって、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子が導入され、黒斑病に対する抵抗性を有するサツマイモ形質転換体。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである請求項１に記載のサツマイモ形質転換体。
（ａ）配列番号１の塩基番号１５３〜１５２３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号１５３〜１５２３からなる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
サツマイモ細胞を、イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターにより発現が誘導されるタンパク質であって、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質をサツマイモ細胞内で発現させることを特徴とする、サツマイモ細胞に黒斑病に対する抵抗性を付与する方法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒斑病に対して抵抗性を有するサツマイモ形質転換体、および、サツマイモ細胞に黒斑病に対する抵抗性を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は様々な病気に対する抵抗遺伝子を持つ。そのような遺伝子として、本発明者らは、イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターを処理した植物から、エリシター処理をした植物のみに発現する遺伝子Ｂ１×Ａ２−７００、Ｂ１×Ｃ４−６５０、Ｂ２×Ａ５−７００、Ｂ２×Ｂ１−６５０、Ｃ４×Ａ５−７５０およびＣ４×Ａ５−８００を単離することに成功し、それらの遺伝子のうち、Ｂ１×Ａ２−７００およびＣ４×Ａ５−７５０の発現と植物の獲得抵抗性との間に相関関係が認められることを見いだした（特許文献１参照）。そして、それらの配列データの解析から、Ｂ１×Ａ２−７００遺伝子が、ヒトやマウスにおいて解毒作用を発揮するselenium結合タンパク（ＳＢＰ）をコードする遺伝子（非特許文献１および非特許文献２参照）やacetoaminophen結合タンパクをコードする遺伝子（非特許文献３および非特許文献４参照）と高い相同性を示すことが分かった。
【０００３】
ＳＢＰは、知られている限りでも、バクテリア、線虫、植物、昆虫、ほ乳動物に至るまで広く生物界に存在するタンパク質で、その機能の重要性が示唆される。
【０００４】
例えば、ヒトやマウスにおいて、生体異物であるセレンやアセトアミノフェンを大量に投与した際に起こる発ガンを抑制するなどの解毒作用に関わる働きをすることが臨床学的に示唆されており（非特許文献５参照）、また、植物のヒメツリガネゴケにおいて、環境ストレスのシグナルアブシジン酸においてＳＢＰをコードする遺伝子の転写が活性されること（非特許文献６参照）が知られていた。
【０００５】
さらに、近年、イネにおいて、重要病原体の１つであるイネいもち病菌由来のエリシターを処理することで、ＳＢＰをコードする遺伝子が活性化されてくることが明らかになってきた（非特許文献７参照）。また、ＳＢＰをコードする遺伝子は、病害応答に重要なシグナル伝達物質であるサリチル酸やジャスモン酸、酸化ストレスを誘発するアブシジン酸や除草剤のパラコート処理にも転写が活性化されることが明らかになった（非特許文献８参照）。加えて、ＳＢＰをコードする遺伝子を導入したイネが、イネいもち病およびイネ白葉枯病に対して抵抗性が高まることが明らかになった（特許文献２参照）。
【０００６】
しかし、実際にイネ以外の植物において上記遺伝子が病原菌に対する抵抗性を高める作用を有することについては報告されていない。
【０００７】
一方、サツマイモは、元々熱帯性の作物であることから、温帯域ではめったに花が咲かない。また、サツマイモは一般に自家不和合性であり、かつ交配不和合性も存在することから、新品種の開発は困難である。これまで、温度、薬品、減圧、柱頭切断などさまざまな処理を用いた自家不和合性消去の研究が行われたが、成果は得られていない。また、一般に多収性の品種は病害抵抗性が低いこともあり、優良品種の開発には労力と時間を要する。そのため、病害について十分な抵抗性を有するサツマイモが求められていた。
【特許文献１】特開２０００−３４２２６２号公報
【特許文献２】特開２００２−２７２２９１号公報
【非特許文献１】Mohinder et al. 1990
【非特許文献２】Pumford et al. 1992
【非特許文献３】Bartolone et al. 1992
【非特許文献４】Lanfear et al. 1993
【非特許文献５】Pumford et al., Biochemical and Biophysical Reserch communication 182 31348-1355
【非特許文献６】Machuka, J et al., Plant Cell Physiol. 40(4) 378-387
【非特許文献７】Sawada and Iwata, J. Gen. Plant. Pathol 68 128-133
【非特許文献８】Sawada et al., Plant Biotechnol. 20 177-181
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記観点からなされたものであり、サツマイモに導入したときに実際に病害に対する抵抗性を示す遺伝子を同定し、同遺伝子を用いて病害に対して抵抗性を有するサツマイモを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｂ１×Ａ２−７００遺伝子産物）、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いることによって、上記目的を達成し得ることを見出し、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターにより発現が誘導されるタンパク質であって、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子が導入され、黒斑病に対する抵抗性を有するサツマイモ形質転換体。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質。
（２）前記遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである（１）に記載のサツマイモ形質転換体。
（ａ）配列番号１の塩基番号１５３〜１５２３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基番号１５３〜１５２３からなる塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）サツマイモ細胞を、イネに獲得抵抗性を誘導するイネいもち病菌由来cerebroside型エリシターにより発現が誘導されるタンパク質であって、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えＤＮＡで形質転換し、前記タンパク質をサツマイモ細胞内で発現させることを特徴とする、サツマイモ細胞に黒斑病に対する抵抗性を付与する方法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有し、かつ、サツマイモに黒斑病に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質。
【００１１】
なお、本発明において、「獲得抵抗性」とは、植物がある病原菌に感染した場合に、感染した植物がそれ以降広い種類の病原菌に対し抵抗性を示す現象（例えば、病原菌の感染によって過敏感反応による壊死斑の形成が起こり、その周辺組織もしくは全身的に病原菌の再接種に対し抵抗的となる現象）、またはエリシター処理によって全身的に病原菌の接
種に対し抵抗的となる現象を指す。
【００１２】
また、本発明において、黒斑病に対する抵抗性とは、黒斑病に対する予防的作用、および、獲得抵抗性のいずれであってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のサツマイモ形質転換体は、各種病原菌に対する抵抗性、特に黒斑病に対する抵抗性を有するために生産性の向上と収量の安定化、農薬使用量の軽減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の削減に効果があると期待される。また耐病性であるために有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、植物の獲得抵抗性を誘導するエリシターにより発現が誘導され、植物に耐病性を付与するタンパク質をコードする遺伝子のうち、Ｂ１×Ａ２−７００と名付けた遺伝子を利用するものである。Ｂ１×Ａ２−７００は、植物の獲得抵抗性を誘導するエリシターの処理を行ったイネから単離された遺伝子であり、このエリシターによる処理を行った植物体に特異的に発現する遺伝子である。
【００１６】
植物に獲得抵抗性を付与するエリシターによる遺伝子の発現の誘導は、エリシターを処理した植物（対象として無処理の植物）からＲＮＡを抽出して、各種遺伝子をプローブとしたノーザンハイブリダイゼーション法（Alwine et al. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350, Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratory Press）や、タンパク質を抽出してＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロッティング法により検出することが可能である。
【００１７】
Ｂ１×Ａ２−７００遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本発明に用いる遺伝子は、Ｂ１×Ａ２−７００によってコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする限り、その塩基配列は制限されない。配列番号２に示すアミノ酸配列コードするＤＮＡとしては、少なくとも配列番号１の塩基番号１５３〜１５２３からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。また、本発明に用いる遺伝子がコードするタンパク質は、サツマイモに導入したときに黒斑病に対する抵抗性をサツマイモに付与する活性を有する限り、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加したアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００１８】
上記のような変異を有する遺伝子は、例えば、部位特異的変異等の常法により、配列番号２に記載のタンパク質中のアミノ酸を適宜置換などが生じるように、配列番号１に記載のＤＮＡを改変することによって得ることができる。さらに、本発明に用いる遺伝子は、アミノ酸の変異として、自然界において生じるアミノ酸の変異を含んでいてもよい。
【００１９】
アミノ酸の改変は、通常全アミノ酸のうち５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、アミノ酸の変異や置換であれば、「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「ExSite PCR-Based Site directed Mutagenesis Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能であり、またアミノ酸の欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。
【００２０】
また、本発明に用いる遺伝子の由来はイネに限定されることはなく、種々の分子種を用いることができる。本発明の配列番号１の遺伝子（Ｂ１×Ａ２−７００）は、ヒトやマウスの解毒作用のあるselenium結合タンパク（ＳＢＰ）遺伝子（Mohinder et al. 1990、Pumford et al. 1992）と５７％の相同性を示し、ＳＢＰ遺伝子と考えられている。ＳＢＰは現在までに、ヒト、マウス等のほ乳動物やイネ、アラビドプシス、コケ等の植物に至るまで幅広い生物種において存在が明らかにされている。
【００２１】
Ｂ１×Ａ２−７００によってコードされるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質を単離するための、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern 1975 J. Mol. Biol. 98:503, Maniatis et al. Molecular Cloning ColdSpring harbor Laboratory Press）が挙げられる。すなわち、当業者にとっては、ハイブリダイゼーション技術を用いて、配列番号１に記載のＤＮＡ配列（またはその一部）をもとに、これと相同性を示すＤＮＡを単離して、当該ＤＮＡから本発明のタンパク質の機能的同等物を得ることも常套手段である。従って、配列番号１に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、サツマイモに導入したときに黒斑病に対する抵抗性をサツマイモに付与するタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。ハイブリダイズ技術により得られたタンパク質は、機能的観点から、本発明のタンパク質とアミノ酸配列において４５％以上の相同性を有することが好ましく、６０％以上の相同性を有することがさらに好ましく、７５％以上の相同性を有することがさらに好ましく、９０％以上の相同性を有することがさらに好ましく、９５％以上の相同性を有することがさらに好ましい。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃で２０分間の洗浄を２回等が挙げられる。
【００２２】
本発明に用いるＤＮＡは、Ｂ１×Ａ２−７００によってコードされるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質をコードしうるものであれば特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノミックＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡなども本発明のＤＮＡに含まれる。ゲノムＤＮＡは例えば、文献（Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69 (1985)）記載の方法にしたがって調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１に記載のＢ１×Ａ２−７００遺伝子の塩基配列を基に作製したプライマーを用いてＰＣＲ（Saiki et al. Science 239:487 (1988)）を行うことにより調製することが可能である。またｃＤＮＡであれば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratory Press）により植物からｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、配列番号１に記載のＢ１×Ａ２−７００遺伝子の塩基配列を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることが可能である。なお、得られたＤＮＡの塩基配列は、例えば「シークエンサーModel 373」（ＡＢＩ社製）を用いて決定することが可能である。
【００２３】
上記のようなＢ１×Ａ２−７００、又はＢ１×Ａ２−７００によってコードされるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、通常、適当なベクターに挿入して組換えＤＮＡを調製し、該組換えＤＮＡを用いて植物に導入される。
【００２４】
また、上記ベクターとしては、形質転換植物体の作製のため通常用いられている、植物細胞内で外来遺伝子を発現させるためのベクターが挙げられる。このようなベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限はなく、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」、「pIG121Hm」、「pMSH2」などが挙げられる。
【００２５】
なお、当該ベクターは、本発明の遺伝子を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。本発明の遺伝子を恒常的に発現させると、同遺伝子を導入した植物に対し、病害に対する抵抗性を付与することができる。また、本発明の遺伝子を誘導的に発現させると、病害抵抗性を後天的に誘導することもできる。
【００２６】
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991 Plant Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23:567）などが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、ウィルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al. 1996 Plant Mol. Biol. 30:387）やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohshima et
al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Augan et al. 1993 Mol. Gen. Genet. 240:1）、高音によって誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta
193:57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab16」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1406）、紫外線照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:651）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624）などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００２７】
上記のような本発明に係る遺伝子を含有する組換えＤＮＡで形質転換する植物細胞としては、特に制限はないが、例えばイネ、トウモロコシ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ダイズ、サツマイモなどの、植物体への再分化の系が確立されている細胞が好ましく、サツマイモ細胞が特に好ましい。なお、ここでいう植物細胞には、培養細胞の他、植物体の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
【００２８】
上記のような本発明に係る遺伝子を含有する組換えＤＮＡを植物細胞へ導入するには、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al. 1993 Transgenic Res. 2:218, Hiei et al, 1994 Plant J. 6:271）、エレクトロポーレーション法（Tada et al.
1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri et al. 1991
Theor. Appl. Genet 81:437）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1987 J. Part. Sci. tech. 5:27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
【００２９】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2.74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603
(1990)）が挙げられ、ジャガイモであればVisserら（Theor. Appl. Genet 78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99:12 (1971)）の方法が挙げられ、サツマイモであればOtaniら（Plant Biotechnol. 15:11 (1998)）の方法が挙げられる。
【００３０】
上記のようにして本発明に係る遺伝子が導入された植物細胞又は植物体は、植物病原菌
が生産する毒素に対する耐性を有する。
【００３１】
また、ＳＢＰをコードする遺伝子を導入したイネは、病原菌の感染時に抗菌物質（ファイトアレキシン）の生成量が野性型に比べて増大し、感染防御タンパク質をコードする遺伝子の発現が活性化することが、本願発明者により明らかにされている。
【００３２】
よって、上記のようにして本発明に係る遺伝子が導入された植物細胞又は植物体がイネ以外の場合であっても、そのような植物細胞又は植物体は、病原菌感染時にファイトアレキシンの生成量が野性型に比べて増大し、感染防御タンパク質をコードする遺伝子の発現が活性化すると考えられる。植物病原菌が生産する毒素としては、サツマイモ黒斑病菌が生産する毒素、イネいもち病菌が生産する毒素が挙げられ、より具体的にはCerato-platanin、テヌアゾン酸およびピリクラリン酸等が挙げられる。
【００３３】
すなわち、上記のようにして本発明に係る遺伝子が導入されたサツマイモ形質転換植物体は、各種病原菌に対する抵抗性、特に黒斑病に対する抵抗性を有するために生産性の向上と収量の安定化、農薬使用量の軽減化とそれによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する負荷の削減に効果があると期待される。また耐病性であるために有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確保できることが期待できる。
【００３４】
サツマイモにおける黒斑病は、Ceratocystis fimbriataという糸状菌によって引き起こされる病害である。この糸状菌と同属同種の異なる菌株は、サトイモ、コーヒー、プルーン、アーモンド、カカオ、オークなどのそれぞれにおいて黒斑病を引き起こすことが知られている。
【実施例１】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
（Ｂ１×Ａ２−７００ ｃＤＮＡの単離）
イネＲＮＡより、特開２０００−３４２２６２号公報記載の「Ｂ１×Ａ２−７００」遺伝子を単離した。「Marathon cDNA Amplification Kit」（Clontech社製）を用いて、クローン同遺伝子の５’側の塩基配列を増幅した。本方法は、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、両端にアダプター配列を付加した後に、内部の既知配列とアダプター配列をプライマーとしたＰＣＲによって既知配列の両端の未知のｃＤＮＡ配列を合成するものである。５’側を増幅するためのアダプタープライマーとしては、いずれの場合も「Marathon cDNA Adaptor （CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC）」（配列番号３）を用い、Ｂ１×Ａ２−７００の既知プライマーは「GCCAGCAGCATTTCCCTCCTTATCCC」（配列番号４）を用いた。鋳型にはcerebroside型エリシター処理８時間後のイネのＲＮＡを用いた。すべての反応条件はキットのマニュアルに記載の方法で行った。増幅された５’側断片を「TOPO TA CLONING KIT」（Invitrogen社製）を用いてPCRII TOPOベクターにクローニングし、塩基配列を決定した。配列番号１に両配列を結合したＢ１×Ａ２−７００遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を示す。
【実施例２】
【００３６】
（Ｂ１×Ａ２−７００遺伝子のサツマイモへの導入）
「Ｂ１×Ａ２−７００」遺伝子を植物体において恒常的に発現させるためのベクターを構築した。カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターを持つ発現ベクターｐＭＳＨ２を制限酵素XbaIで切断後、バクテリアルアルカリホスファターゼ（Bacterial alkaline phosphatase）処理を行い、５’末端を脱リン酸化した。これに５’側断片および３’側断片の間で重複する領域にある制限酵素サイトHaeIIで切断した断片を、DNA Ligation Kit（タカラ社製）でつなぎ、完全長ｃＤＮＡを含む発現ベクター「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」（図１参照）を構築した。
このプラスミドをアグロバクテリウム法（Otani. et al. (1998) Plant Biotechnol. 15:11）によりサツマイモ（高系１４号）に導入して形質転換植物体を得た。アグロバクテリウムは「ＥＨＡ１０１」（Hood et al. (1986) J. Bacteriol. 168:1291）を用いた。選択薬剤としてはhygromycin（50 mｇ/ml）およびkanamycin（50 mｇ/ml）を用いた。
【実施例３】
【００３７】
（組換え植物体からのＤＮＡの抽出とＰＣＲ法による目的遺伝子導入の確認）
サツマイモからのＤＮＡの抽出は、S.O. Rogers et al. (Plant. Mol. Biol. 5, 69 (1985))の方法により行った。プライマーは「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」の３５Ｓプロモーター領域からデザインした配列「CGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAG」（配列番号５）と「ACCATGTTGCTTGTCAGAGC」（配列番号６）を選択し、ＰＣＲを行った。その結果、「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」を導入した組換え体植物から調製したＤＮＡをテンプレートにした場合、前記領域に対応するＤＮＡ断片が増幅された。したがって、組換え体植物染色体ＤＮＡ中に目的遺伝子が組み込まれたことが確認された（図２参照）。
【実施例４】
【００３８】
（組換え植物体からのＲＮＡ抽出とノーザンブロッティング法による目的遺伝子発現の確認）
これら形質転換植物細胞のそれぞれにおいて、「Ｂ１×Ａ２−７００」遺伝子の発現と黒斑病抵抗性が相関していることを確認するためにノーザンブロッティングを行った。サツマイモの葉を、液体窒素を入れた乳鉢の中で十分に破砕し、Rneasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて回収した。10 mｇのトータルＲＮＡを6%フォルムアルデヒドを含む1.0%アガロースゲルにより50V、２時間展開し、Hybond-N+ nylon membranes (Amersham Pharmacia Biotech)に転写した。プローブは完全長OsSBP cDNA（配列番号１）を使用し、［a-32P］dCTPでラベルした。ハイブリダイゼーションは、ハイブリ溶液（0.25M NaCl, 1%BSA, 1mM EDTA pH8.0, 0.25M church buf., 7%SDS）（Church and Gilbert (1984) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81, 1991）を用いて、６５℃で２０分プレハイブリダイゼーションした後、プローブをハイブリ溶液に加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを適当量の洗浄液（2XSSC, 0.1%SDSおよび1XSSC, 0.1%SDS）で６５℃、各１５分間振とうにより洗浄した。メンブレンのシグナルをＧＭカウンターおよびイメージアナライザー（Fujifilm、BAS2500）で確認し、オートラジオグラフィーで検出した。解析の結果、いくつかの形質転換体において当該遺伝子が過剰に発現していることが判明した（図３参照）。
【実施例５】
【００３９】
（黒斑病に対する抵抗性検定）
黒斑病に対する抵抗性検定は、ハイグロマイシンで選抜して得られた形質転換サツマイモの当代の葉ならびに非形質転換サツマイモの葉を用いて行った。サツマイモの葉を葉柄部分で切断し、切断面を１×１０5分生胞子／ｍｌの黒斑病菌を含む0.01%Tween20懸濁液に３０秒間浸すことで接種し、葉柄の部分を水分を含んだ脱脂綿でカバーし２６℃で５日間インキュベートした。５日後、黒斑病菌の感染によって葉色の変化（黄化）した面積を葉全体に対する面積比として算出し、得られた各面積比を比形質転換サツマイモで得られた面積比を１００とした時の割合で表すことで耐病性の指標とした。
【００４０】
その結果を図４に示す。図４は、黒斑病に対する抵抗性を形成された黒斑病病徴度を用いて示したグラフである。形質転換サツマイモは１０系統を供試し、各系統から任意の２固体を選び、各固体の葉についてはそれぞれ４枚ずつ検定し、これを独立に５回繰り返し得た黒斑病病徴度を平均値ならびに標準誤差を加えてグラフで示した。図３で「Ｂ１×Ａ２−７００」遺伝子が過剰発現していることを確認した形質転換サツマイモの系統は黒斑病菌を接種した非形質転換サツマイモに対し、有意に病徴が抑制されることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】「Ｂ１×Ａ２−７００」を恒常的に発現させるためのプラスミド「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」を示す図である。
【図２】「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」形質転換サツマイモにおいて当該遺伝子の導入を確認した結果の電気泳動の像である。
【図３】「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」形質転換サツマイモにおいて当該遺伝子の過剰発現を確認した結果の電気泳動の像である。
【図４】「ｐＭＳＨ２（Ｂ１×Ａ２−７００）」形質転換サツマイモにおいてサツマイモ黒斑病に対する耐性を病徴度で比較し確認した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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