(57)【要約】      （修正有）【課題】大豆発酵物の蛋白質分解酵素の分解液から、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する新規なヘクサペプチドを提供する。【解決手段】大豆発酵物を蛋白質分解酵素等で処理し、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する新規なヘクサペプチドは、Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであり、生体内での血圧降下作用を有し、毒性も極めて低い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチド。
【請求項２】
次式；Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、新規なヘクサペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】食品由来のペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害剤及び血圧降下剤としての利点を持つ。
【特許文献１】    特開平０６−２５６３８７
【特許文献２】    特開平０６−３４０６９２
【特許文献３】    特開平０７−１８８２８３
【特許文献４】    特開平０９−０５９２９６
【特許文献５】    特開平１０−０３６３９１
【特許文献６】    特開２００３−２６７９９３
【特許文献７】    特開平１１−３３５３９３
【特許文献８】    特開平１１−３４３２９８
【特許文献９】    特開２００１−１０６６９８
【特許文献１０】  特開２００１−１０６６９９
【特許文献１１】  特開２００１−１０６７００
【特許文献１２】  特開２００３−２６７９９５
【特許文献１３】  特開２００１−０６４２９９
【特許文献１４】  特開２００３−１２８６９５
【特許文献１５】  特開２００３−２４６７９６
【特許文献１６】  特開２００３−２４６７９７
【特許文献１７】  特開２００３−２５２８９７
【特許文献１８】  特開２００３−２６７９９４
【特許文献１９】  特開平０７−１８８２８２
【特許文献２０】  特開平０８−２２５５９３
【特許文献２１】  特開平０９−１５７２９２
【特許文献２２】  特開平１１−０３５５９８
【特許文献２３】  特開平０８−２２５５９４
【特許文献２４】  特開平０８−２３１５８９
【非特許文献１】  Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）
【非特許文献２】  Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）
【非特許文献３】  Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）
【非特許文献４】  山本節子等：日胸疾会誌，１８，２９７−３０２（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】レニン−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果たしていることはよく知られている。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系ならびに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のためプロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は、高血圧は、本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出されている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ところで、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［非特許文献１］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の、６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ）［非特許文献２］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［非特許文献３］等に始まり、本発明者等による、ニンニク由来のジペプチド［特許文献１］、イワシ筋肉由来の５種のヘクサペプチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特許文献２］、ブタプラズマ由来のトリペプチド［特許文献３］、海苔・ヒジキ由来のペプチド［特許文献４、５、６］、朝鮮人参由来のペンタペプチド［特許文献７］、クロレラ由来のペンタペプチド［特許文献８］、スピルリナ由来のテトラペプチド［特許文献９］、アコヤ貝由来のヘクサペプチド［特許文献１０］、アサリ貝由来のペンタペプチド［特許文献１１］、ウロコ由来のヘプタペプチド［特許文献１２］及びワカメ由来のペプチド［特許文献１３〜１８］等が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤及び血圧降下剤となり得ることが開示されている。一方，大豆由来の生理活性ペプチドとしても同様に、本発明者等は数多くの特許を開示してきたが、その中で血圧降下ペプチドとしては大豆由来の２７種のトリペプチドＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ［特許文献１９］及びＧｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ、Ｇｌｙ−Ａｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ［特許文献２０］が開示され、活性化酸素阻害ペプチドとしてはＬｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ［特許文献２１］及びＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ［特許文献２２］が開示され、更に、免疫賦活ペプチドとしてはＰｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ［特許文献２３］及びＩｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ［特許文献２４］等が開示されてきた。このような生理活性ペプチドの中で、先に述べたように、これまでＡＣＥ阻害剤としての食品タンパク質由来の血圧降下ペプチドに関して数多くの提案がなされてきたが、規則性を持ったアミノ酸配列を有する鎖長の長いペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による降圧効果（薬理効果）については未だ不明であり、発見されてから長時間経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、前記の課題を解決するために鋭意研究した結果、大豆蛋白質から得られた本発明に係る新規なヘクサペプチドが血圧降下作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、大豆蛋白質の蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）の分解液から薬理作用を有する物質を検索し、この新規なヘクサペプチドが強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。そして、この新規なヘクサペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行い、その結果、この新規なヘクサペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見い出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る新規なヘクサペプチドは、次式、
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘクサペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。【０００５】本発明に係る新規なヘクサペプチドは、化学的に合成する方法、又は大豆蛋白質の蛋白質分解酵素の分解液から分離精製する方法をあげることができる。本発明に係る新規なヘクサペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常の合成方法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記のヘクサペプチドのカルボキシル末端側（フェニルアラニン）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ヘクサペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素などを用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。【０００６】上記したように、本発明に係る新規なヘクサペプチドは、大豆蛋白質の蛋白質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば以下のようにして行うことができる。本発明に係る新規なヘクサペプチドを含有している大豆蛋白質を用いて加水分解する。加水分解方法は常法に従って行う。例えば、ペプシン等の蛋白質分解酵素で加水分解する場合は、大豆蛋白質のホモジネイトを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ５０Ｗ、アンバーライト社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０等）にかけ、その吸着溶出分画からアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、その得られたＡＣＥ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、バイオラッド社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５、生化学工業社製のＳＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ等）によって分画し、最終的に得られたＡＣＥ阻害活性画分を逆相ＨＰＬＣによって分離することによって単離精製を行うことができる。【０００７】本発明に係る新規なヘクサペプチドの製法において用いる大豆蛋白質としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるマメ科植物の蛋白質を用いても良いが、好ましくは大豆蛋白質を用いるのが良い。以上のようにして得られたこの新規なヘクサペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、この新規なヘ���サペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。この新規なヘクサペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重当たりこの新規なヘクサペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。【０００８】上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、とくに限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なヘクサペプチドを、注射用水、生理食塩水およびキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。この新規なヘクサペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水または生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【０００９】本発明に係る新規なヘクサペプチドは、優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態・実施例】
【００１０】本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するヘクサペプチド及びこのヘクサペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１１】製造例１
大豆２００ｇに脱イオン水１を加えホミジナイズした後、１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）１０ｇを添加し、３７℃、２０時間撹拌しながら加水分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．５×１５ｃｍ）に負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水２Ｌを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液４０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ２．５×１５０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍＬ／ｈｒ、各分画量８．６ｍＬでゲル濾過操作を行った。ゲル濾過操作を繰り返して大量分取したＡＣＥ阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥し大豆蛋白質由来の粗ペプチド粉末とした。この大豆蛋白質由来の粗ペプチド粉末３ｇを脱イオン水２０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水１Ｌから３％塩化ナトリウム水１Ｌの濃度勾配法を行い、流速１０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィー操作を行った。その結果は図１に示すとおりである。ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５クロマトグラフ中のＡＣＥ阻害活性画分、分画番号３２〜３８（ＳＰ−１画分）を集めて凍結乾燥し大豆由来の精製ペプチド粉末（以下、大豆ペプチドと略記する）を得た。この大豆ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣ操作を行った。カラムとしてはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（野村化学社製、４．５ｍｍＩＤ×２５ｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣ操作を行った結果、溶出時間；６２．４分にＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントのピークを得た。この逆相ＨＰＬＣ分析の結果は図２に示す通りである。再度、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのアミン酸分析を行ったところ、Ｔｈｒ；１．０２、Ｔｙｒ；１．１１、Ｇｌｎ；１．０９、Ａｌａ；１．１０、Ｐｒｏ；０．９３及びＰｈｅ；１．０６であった。更に、逆相ＨＰＬＣリクロマトグラフィーして得たペプチドフラグメントのＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；１．３４μＭであった。このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本発明に係る新規なペプチドは、次式、
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘクサペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なヘクサペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ペプチド１５ｇ、▲２▼乳糖８５ｇ、▲３▼コーンスターチ３０ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１６ｇのコーンスターチを混和し、８．５ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に５．５ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１２】製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ヘクサペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のフェニルアラニンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次に、このペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が９４分間で６３％→１４％の濃度勾配法により流速１．２ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１７ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘクサペプチドを得た。
【００１３】この合成ヘクサペプチドをマススペクトル分析により分析した結果、アミノ酸配列が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであることが確認された。このマススペクトル分析の結果は図３に示す通りである。更に、この合成ヘクサペプチドのＡＣＥ阻害活性を測定したところ、ＩＣ５０値；１．０４μＭであった。
このような合成によって得られた本発明に係る新規のヘクサペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１４】試験例１（アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法）
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５ｍＵ、合成基質ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法［非特許文献４］に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。
【００１５】試験例２（高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果）
実験動物は日本チャールズ・リバー社より１５週令雄性高血圧自然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する）を購入し、１週間の予備飼育後、血圧値（以下、収縮期血圧値；ＳＢＰを表す）が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０−３３０ｇ）の動物６匹１群として用いた。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％および１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。ラットは４群に分け、第１群には対照として蒸留水を体重１００ｇ当たり０．５ｍＬの割合で強制経口投与した。第２群には、大豆ペプチド粉末（ＳＰ−１画分）３００ｍｇ／ｋｇの用量を蒸留水で調製し、体重１００ｇ当たり０．５ｍＬの割合で強制経口投与し、第３群には、大豆ペプチド粉末（ＳＰ−１画分）６００ｍｇ／ｋｇの用量を蒸留水で調製し、体重１００ｇ当たり０．５ｍＬの割合で強制経口投与し、及び、第４群には、大豆ペプチド粉末（ＳＰ−１画分）１，２００ｍｇ／ｋｇの用量を蒸留水で調製し、体重１００ｇ当たり０．５ｍＬの割合で強制経口投与した。血圧値は非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後３０分、１時間、２時間、４時間及び６時間の血圧値を測定した。血圧値は連続３回測定し、その最高値と最低値の差が１０ｍｍＨｇ以内の場合、その３回の平均血圧値を求め、差が１１ｍｍＨｇ以上の場合には更に２回測定し、最高値及び最低値を除き３回の平均血圧値を求めた。その結果を図４に示した。更に、本発明に係る新規なヘクサペプチド２０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与した時の収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）への作用についての結果は、表１に示す通りである。
2005139158.tif 000002
以上の試験の結果、本発明に係る新規なヘクサペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。従って、この新規なヘクサペプチドは高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、この新規なヘクサペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る新規なヘクサペプチドの、製造例１におけるＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィー操作によるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図２】本発明に係る新規なヘクサペプチドの、製造例１における逆相ＨＰＬＣ操作によるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図３】本発明に係る新規なヘクサペプチドの、製造例２で得られた合成ヘクサペプチドのマススペクトルを示す図である。
【図４】本発明に係る新規なヘクサペプチドの、製造例１におけるＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラムクロマトグラフィー操作によって得られた大豆ペプチド粉末（ＳＰ−１画分）を、ＳＨＲに投与した場合の血圧値の経時的変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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