(57)【要約】【課題】導入された遺伝子を速やかに発現させる。【解決手段】細胞の培養培地を除去した後に細胞に遺伝子を含む溶液を適用し、エレクトロポレーションを行うことを特徴とする遺伝子を細胞に導入する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養培地を除去した後に細胞に遺伝子を含む溶液を適用し、エレクトロポレーションを行うことを特徴とする遺伝子を細胞に導入する方法。
【請求項２】
細胞に導入される遺伝子が、２０〜１００μｌの溶液として細胞に適用される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気パルスの長さが１０〜２０msecであり、電気パルスの印加回数が５〜２０である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
培地量は、細胞を含む容器1cm2当たり２００〜３００μｌである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも２つの電極を有するエレクトロポレーション装置であって、第１電極が囲む面内に第２電極の一部を固定し、第１電極と前記第２電極の一部の間に流れる電流が遺伝子を導入される細胞に通電されることを特徴とする装置。
【請求項６】
第１電極が円形の電極であり、第２電極の先端が第１電極が囲む円の中心付近に存在する請求項５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入法及びエレクトロポレーション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に任意の蛋白質を発現させることは、遺伝子操作における最も重要な技術の１つである。
【０００３】
培養した細胞へ遺伝子導入する方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いる方法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。これらの方法により細胞に遺伝子を導入することができるが、それらのすべては細胞の中に蛋白質を発現させるまでに数時間から数日を要するものである。
【０００４】
従って、より速やかにタンパク質の発現を行うことができる技術が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞に遺伝子を導入し、導入された遺伝子を速やかに発現させる方法及びそのための装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、エレクトロポレーションの前に培地を抜き取ることで遺伝子を含有する高濃度のプラスミドDNAが細胞に直接触れるようにした点に特徴を有する。その結果、例えば
数時間以内という極めて短時間で蛋白質を培養細胞中に高効率で発現させることができることを見出し、本発明を完成した。
１．  細胞の培養培地を除去した後に細胞に遺伝子を含む溶液を適用し、エレクトロポレーションを行うことを特徴とする遺伝子を細胞に導入する方法。
２．  細胞に導入される遺伝子が、２０〜１００μｌの溶液として細胞に適用される項１に記載の方法。
３．  電気パルスの長さが１０〜２０msecであり、電気パルスの印加回数が５〜２０である項１または２に記載の方法。
４．  培地量は、細胞を含む容器1cm2当たり２００〜３００μｌである項１〜３のいずれかに記載の方法。
５．  少なくとも２つの電極を有するエレクトロポレーション装置であって、第１電極が囲む面内に第２電極の一部を固定し、第１電極と前記第２電極の一部の間に流れる電流が遺伝子を導入される細胞に通電されることを特徴とする装置。
６．  第１電極が円形の電極であり、第２電極の先端が第１電極が囲む円の中心付近に存在する項５に記載の装置。
【０００７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【０００８】
本発明において、細胞に導入される遺伝子としては、タンパク質をコードするものであれば特に限定されず、任意の遺伝子が対象になる。該遺伝子は、宿主となる培養細胞にとって異種の遺伝子であってもよく、宿主由来の遺伝子を導入してもよい。
【０００９】
遺伝子はそれ自身を使用してもよいが、通常は宿主に適したベクターに発現可能に組み込んだ発現ベクターとして宿主となる培養細胞に導入される。発現ベクターを構成するベクター、プロモーター、エンハンサーなどは宿主となる培養細胞に応じて適切に選択すれ
ばよい。
【００１０】
宿主となる細胞としては、ディッシュに接着している細胞が挙げられ、具体的には植物細胞、動物細胞（哺乳動物、昆虫、鳥類、両生類、は虫類、魚類等の細胞）が含まれる。
【００１１】
好ましい宿主は哺乳動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞であり、哺乳動物としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ、サル、ラット、マウス、ハムスターなどが挙げられ、好ましくはヒトの細胞、例えば神経細胞である。
【００１２】
本発明の方法では、細胞の培養液をできるだけ取り除くことが重要である。細胞の培養液（培地）が少ないと、遺伝子を含む溶液を細胞に適用した場合に、遺伝子の濃度が希釈されず、液量が少ないために導入効率を高く維持することができる。
【００１３】
培養液と添加される遺伝子を含む溶液の合計量は、細胞４０万個当たり、１５０μｌ以下、好ましくは１２０μｌ以下、より好ましくは１００μｌ以下である。
【００１４】
培養液の残存量と添加される遺伝子を含む溶液の各量は、合計量が上記の範囲内であれば特に限定されないが、培養液の残存量としては、細胞４０万個当たり、５０μｌ程度以下、例えば１０〜５０μｌ程度であり、添加される遺伝子を含む溶液の量は、細胞４０万個当たり、２０〜１００μｌ程度が使用される。
【００１５】
本発明では、培養液等の液体をほとんど含まない状態でのエレクトロポレーションにより細胞に遺伝子、例えば外来遺伝子をベクターに組み込んで導入する。このため、例えば図１に示すような、一方の電極２（第２電極）の端部２ａが円形であり、他方の電極１（第１電極）の一部、特に先端１ａが第２電極の円の中心付近になるように２つの電極を絶縁材３（例えばゴム）に固定したものを使用することができる。該電極１，２は、図２に示されるように、培養細胞を含む容器上６に固定され、円形２ａの第２電極２と該電極の支持体を兼ねた絶縁材３で囲まれる狭い空間５内に細胞４を閉じこめ、エレクトロポレーションを行うことにより遺伝子を細胞内に効率よく導入することができる。
【００１６】
第１電極と第２電極は、少ない溶液量で細胞に電流が十分に流れるようなものであれば、特に限定されないが、第１電極と絶縁性支持体を細胞培養容器上に固定したときに、第１電極と絶縁性支持体と該容器により囲まれる狭い空間内に細胞が閉じこめられ、且つ該空間内に第２電極の一部（特に先端）が固定され、細胞に効率よく通電されるようにすることが、好ましい実施形態の１つとして例示される。
【００１７】
細胞を閉じこめることが可能な第２電極の厚みは、０．２〜３mm程度、より好ましくは０．５〜１mm程度である。
【００１８】
第１電極と第２電極の一部（先端）の距離は、特に限定されないが、通常５〜２０mm程度である。
【００１９】
好ましい実施形態において、第２電極上の絶縁材は、細胞を傷つけない程度に接触するか、或いは、細胞に近い位置に固定される。細胞と絶縁材の距離は、好ましくは０．５〜１mm程度である。細胞と絶縁材の距離が近い方が、細胞への通電を効率的に行うことができる。
【００２０】
エレクトロポレーションで用いる電圧としては１０〜２０００Ｖ／ｃｍの範囲で適用でき、皮膚に対する電気刺激を考慮すると好ましくは５０〜１０００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは１００〜５００Ｖ／ｃｍの範囲で適用される。通電パターンとしては特に限定はない
が、指数対数型パルスか矩形型パルスであるのが好ましく、矩形型パルスがより好ましい。エレクトロポレーション は１回以上通電すれば効果は見られるが、回数が多いほどそ
の効果は増加する。通電時間は電気刺激による細胞への障害を抑制するために、１０〜２０ｍｓｅｃ程度であるのが望ましい。
【００２１】
エレクトロポレーション後は、培地を加えてインキュベートすることにより、速やかに遺伝子の発現を行うことができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、遺伝子導入後数時間以内、好ましくは３０分から２時間程度の短時間で遺伝子産物であるタンパク質が発現しているのが観察された。
【００２３】
このような短時間でのタンパク質の発現が可能になることにより、タンパク質の機能をより正確に評価することが可能になる。
【００２４】
また、遺伝子治療に応用される際に、慢性的な病気に対してのみではなく、突発的な病気やけがなどに対して、患部に特異的に必要とされる蛋白質を数十分以内に発現させる技術を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、遺伝子を導入する細胞として神経細胞を例にとり説明する。
（材料と方法）
細胞培養
SDラット海馬または皮質ニューロン(E18)をCa2+, Mg2+-フリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS-)中でバラバラにした。胚からの組織を同じ培地中37℃で２０分間0.125%トリプシンで処理した。DMEMでリンス後, これらの組織を使い捨てのプラスチックピペットを用いて穏やかに解離することによりバラバラにした。解離されたニューロンを、10% FCS, グル
コース(10 mM), グルタミン(2 mM)及びインスリン(2μg/ml)で補足したDMEMとともに、ポリエチレンイミンでコートされたガラスベースのディッシュ (Matsunami, Japan)上にプ
レートした。ニューロンは5% CO2 /95%空気および飽和湿度において37℃で10-13日間培養した。培養物を 実験に使用した。
免疫組織化学
ガラスベースディッシュ(Matsunami, Japan)で増殖した海馬ニューロンを4% パラホル
ムアルデヒドとTBS中15分間室温で固定した。該ニューロンは抗ラットフェリチンポリク
ローナル抗体 とインキュベートし、次いでHRP複合体化抗ウサギIgG (Panafarm, Japan)
とPBS中でインキュベートされた。次いで、シグナルを3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)及
びH2O2と共にインキュベーションすることにより可視化した。
培養海馬ニューロンとのIn situハイブリダイゼーション
培養されたニューロンを4% ホルムアルデヒドで固定し、0.2 M HClで10分間、 0.1 Mトリエタノールアミン(pH 8.0)中の0.25%無水酢酸で10分間処理し、エタノールで脱水した
。ハイブリダイゼーションを50%ホルムアミド, 10 mM Tris (pH 7.6), 200 μg/ml tRNA,
1x デンハルト溶液, 10%デキストラン硫酸, 600 mM NaCl, 0.25% SDS, 1 mM EDTAおよびDIG標識RNAプローブを含む溶液と50℃で18時間行った。200 bpsのフェリチンH鎖3'領域をPCRで増幅し、pGEM-T ベクター(PROMEGA, USA)にサブクローニングし、プローブをDIG RNAラベリングキット(Boehringer, Germany)で合成した。スライドグラス上でハイブリダイズされたサンプルを2x SSC中50%ホルムアミド、2x SSC, 0.2x SSCで50℃において洗浄し
た。サンプルをアルカリ性ホスファターゼ複合体化抗DIG Fab フラグメント(Boehringer,
Germany)と反応させ、ニトロブルーテトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリ
ルホスフェートとともにインキュベーションすることにより可視化した。
翻訳分析のためのプラスミド構築
フェリチン H 鎖 mRNA (Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR)の5'及び3'UTR 配列を含むプラスミ
ドをpd2EGFP-N1 (Clontech, USA)を用いて調製した。フェリチンH鎖の5' UTRをプラスミ
ドのNheI, AgeI部位に挿入し、フェリチン H 鎖 mRNAの3'UTRをNotI, BsmI部位に挿入し
た。各挿入フラグメントを以下のプライマー：
NheI, AgeI: 5'-TTGGGGCTAGCCAGACGTTCTCGCCCAGAG3'（配列番号１）, 5'-GGTTACCGGTGATGGCGGCTGGGCAGGG-3' （配列番号２）, 
NotI, BsmI: 5'-CCTTTGCGGCCGCGCTGACGTCCCCAAGGCCAT-3' （配列番号３）, TTTCCGAATGCAGGGTACCAAAATTCTTTATTTGAAG-3' （配列番号４）を用いるPCRにより増幅した。該プラスミドをトランスフェクション用のQIAprep Spin Mini prep Kit (QIAGEN, Germany)を用いて精製した。鉄応答配列(Iron Responsive Element; IRE)欠損プラスミド(Ft5'UTR(IREを含まない)-d2EGFP-Ft3'UTR)について,プライマー(5'-CCAGACGTTCTCGCCCAGAGGTGCTCGACC-3' （配列番号５）, 5'-CGTCCTTGAAGAAGATGGTGCG-3' （配列番号６）)を用いたPCR産物を
精製し、プライマー(5'-TTGGGGCTAGCCAGACGTTCTCGCCCAGAG-3' （配列番号７）,5'-GGTTACCGGTGATGGCGGCTGGGCAGGG-3' （配列番号８）)を用いて再増幅された。PCR産物をpd2EGFP-N1プラスミドのNheI, AgeI 部位に挿入した。局所翻訳の観察のあいだ、培養ディッシュ
を37℃に維持し、タイロード液（Tyrode solution ; 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Hepes, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 30 mM グルコース, pH 7.4）をディッシュに2 ml/minで連続的に流した。図５に示されるように、ガラスピペットを用いた近位位置の標的樹状突起の解離後、グルタミン酸 (最終濃度100μM)またはキサンチン(最終濃度50μM)およびキサンチンオキシダーゼ(最終濃度0.05U/ml) (Nacalai, Japan)を浴適用(bath-application)
により培養ディッシュに加えた。図６において、グルタミン酸(1 mM)をピコポンプ(WPI, USA)に接続されたガラスマイクロピペット (Matsunami, Japan, 先端直径; 1μm)を用い
て標的にパフした(puffed)。部位指向性パフ(Site-directed puff)を、FITCを用いるコントロール実験において10μm (半径)の領域に限定した。パフ後、こぼれたグルタミン酸による過度の刺激を防止するためにピペットをすぐに取り除いた。得られた画像は、 MetaMorph (Universal Imaging,USA)を用いて解析した。
エレクトロポレーション
翻訳分析のためのエレクトロポレーションをSquare Electroporator CUY21 (BEX, Japan)を用いて行った。海馬解離ニューロン(10 DIV)の培養培地を吸引により除去した。プラスミド溶液(40μg /40μlのPBS-)をニューロンに加え、10矩形パルス(300 V, 10 msec)をそれらに適用した。各パルスの間隔は900 msecであった。
シンドビスウイルス
２シストロン性(bicistronic)ベクタープラスミド(pSinEGdsp)をDr. Kawamura (Niigata University)よりご提供いただいた。該プラスミドはpSinRep5 (Invitrogen, USA)から
誘導され、２つのサブゲノムプロモーターとそれに続く任意の遺伝子挿入及びEGFP ORFのためのマルチクローニング部位 を有し、従って、該ウイルスは感染細胞において任意の
タンパク質とEGFPを独立して産生できる(Kawamura et al., 2003)。特異的プライマー(5'-TCTAGACGACAGTGCTTGAACGGAACC-3' （配列番号９）, 5'-AGGCCTGGGTACCAAAATTCTTTATTTGAAG-3' （配列番号１０）)を用いたRT-PCRにより増幅されたフェリチンH鎖cDNAは、該プラスミドのXba1,Stu1部位に挿入された。該プラスミドはPac1で切断され、mRNAはmMESSAGE mMACHINE キット (Ambion, USA)を用いてin vitroで合成された。 次に、Baby Hamster Kidney (BHK) 細胞をGene Pulser2(BioRad, USA)を用いてエレクトロポレーション (1250 V/cm, 50 μF, 単一パルス)によりmRNA及び26SヘルパーmRNA(Invitrogen, USA)とともに
トランスフェクトした。細胞は10% FCSを補足したDMEMと24時間37℃でインキュベートさ
れ、上清をシュードビリオン含有溶液として集めた。
細胞生存/死アッセイ
ニューロンal細胞生存を、オリジナルの方法(Monsmann, 1983; Hansen et al., 1989)に
従いMTT アッセイにより測定した。簡単には、テトラゾリウム塩MTT (3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド)を最終濃度1 mg/mlで培養液
に加えた。37℃で２時間インキュベーション後、80体積%の溶解緩衝液 (50% N,N-ジメチ
ルホルムアミド中10% SDS, pH 4.7)を加えることによりアッセイを停止した。次に、吸光度を570 nm で分光学的に測定し、24時間37℃でインキュベーションした。生存細胞のパ
ーセントを下記式で定義した：
(A(実験ブランク)/A(コントロールブランク)) × 100
（ブランク値は細胞のないウェルから得られた）。アポトーシスを受ける細胞は、先行文献（Gavrieli et al., 1992）に従い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼ-介在dUTP-ビオチンニック末端標識(TUNEL)法により特定した。
シナプトソーム調製
マイナーな改変を行ったVerity's法(Verity, 1972)に従いシナプトソームを調製した。第１に, 第10日の皮質ニューロン培養物をホモジナイズ緩衝液 (0.35 Mシュクロース, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM Hepes pH 7.4)中でloose fitted Potter homogenizer(5 ml)でホモジナイズした。ホモジネートを1分間2,000xgで遠心分離し、ペレットを捨てた。
次に、上清を5分間23,000xgで遠心分離した。得られた粗ミトコンドリアペレットを2 ml
のホムジナイズ緩衝液に再懸濁し、不連続グラジエント (ホモジナイズ緩衝液中13%と5% Ficoll)に層状化した。グラジエントを40分間43,000xgでSW40.1ローター を備えたBeckman L7 超遠心分離機で遠心分離した。シナプトソームを5%-13%界面から集めた。
反応性酸素種(ROS)産生の分析
EGFPとフェリチンを発現するシンドビスウイルスで感染された培養皮質ニューロンを収穫し、シナプトソームフラクションを調製した。本発明者はフェリチン過剰発現ニューロンからのシナプトソームがSDS-PAGEにおいてEGFPを発現するシンドビスウイルスで感染されたニューロンからのコントロールシナプトソームと同一のタンパク質パターンを有することを確認した。該シナプトソームフラクションはオキシブロット キット(Intergen, USA)により分析された。タンパク質側鎖のカルボニル基は2, 4-フェニルヒドラジン(DNPH)
との反応により2, 4-ジニトロフェニルヒドラゾン(DNP-ヒドラゾン) に誘導体化された。該DNP-誘導体化 タンパク質はSDS-PAGE、さらに該タンパク質のDNP部分に特異的な一次抗体を用いるウェスタンブロッティングにより分離された。該シグナルはTSA ビオチンシステム(Perkin Elmer, USA)及びECL Plus システム (Amersham Bioscience, UK)により増強された。化学発光シグナルはLAS-1000 (Fujifilm, Japan)及びImage Gauge (Fujifilm, Japan)により検出及び分析された。
(結果)
樹状突起におけるフェリチンの局所翻訳の観察
仮説を試験するために、本発明者は免疫組織化学実験を行い、グルタミン酸刺激 (100 μM, 1 h)後のフェリチンタンパク質レベルの変化を観察した。フェリチンシグナルのわ
ずかな増加が樹状突起において観察されたが、(図３)、本発明者はこれがフェリチン翻訳レベルのアップレギュレーションのみによると結論付けるのには不十分であると考えた。何故なら予め存在したフェリチンのレベルが未知であるからである。培養ニューロンの樹状突起におけるフェリチン翻訳を直接確認するために、本発明者は新規観察システムを開発した。該システムにおいて、フェリチンの5'と3'のUTRs (Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR, 図４ａ)間のd2EGFP (Clontech, USA)の配列を含有するプラスミドが構築され、ニューロン
にトランスフェクトされた。転写物の樹状突起へのトランスロケーションは、本発明者の既報告(Ishimoto et al., 2000)に示されるように、ラット海馬からの10日間培養ニュー
ロンを用いてin situ ハイブリダイゼーションにより確認された（図４ｂ）。トランスフェクトされたニューロンは翻訳の阻害剤であるサイクロヘキシミドを含む第１培地中で２時間インキュベートされた。 次いで、トランスフェクトされたニューロンを、転写阻害
剤であるアクチノマイシン Dとサイクロヘキシミドを含む第２培地に移した。30分間インキュベーション後, トランスフェクトされたニューロンをアクチノマイシンDを含有する
第３培地に移した。第１培地において、mRNAを翻訳抑制下に転写した。アクチノマイシン
Dを用いた第３培地において、d2EGFPの蛍光を局所フェリチン翻訳の指標として測定した。第３条件において転写作用はなかったので、第３条件において, 翻訳有効性はこのシステムにより正確に評価し得る(図４ｃ)。このプロセスの後、本発明者は、ニューロンがグ
ルタミン酸適用に応答して細胞内カルシウムを増加させることを確認した。これは、ニューロンが該プロセスにおける生存度を維持していることを意味する。
【００２６】
コントロール実験において、本発明者はアクチノマイシンDとサイクロヘキシミドがmRNAとタンパク質合成を阻害するのか否かを試験した。エレクトロポレーションの１時間後
に阻害剤のない培地中でインキュベートされた該ニューロンは、明らかにd2EGFP 蛍光を
発することが観察された(図４ｄ，４ｅ). アクチノマイシンD またはサイクロヘキシミドとインキュベートされた該ニューロンは、６時間後でさえ蛍光を示さなかった(図４ｆ，
４ｇ，４ｈ，４ｉ). これと比較して、第１培地で2時間, 第２培地で30分間、第３培地で30分間インキュベートされたニューロンは、有意なd2EGFPの蛍光シグナルを示した(図４
ｊ，４ｋ)。これらのシグナルはアクチノマイシン D存在下におけるd2EGFPタンパク質の
翻訳と見なされ、このシステムは、適切に働くことが確認された。このシステムを使用して、本発明者はグルタミン酸適用が樹状突起のフェリチン翻訳を誘導したか否かを試験した。蛍光は適用後２０分以内に部位-特異的に樹状突起において有意に増加し、該増加は
少なくとも４０分間維持された(図５ａ)。この翻訳応答はサブ細胞性フラクションと培養ニューロンにおいてグルタミン酸受容体-介在タンパク質合成と類似していたが、(Weiler., et al 1993; Scheetz., et al 2000; Job., et al 2001) BDNF 誘導したCaMK2翻訳よ
りも速かった(Aakalu., et al 2001). フェリチンUTR のないmRNAを用いるコントロール
実験において、蛍光強度における有意な増加はいかなる部位でも観察されなかった(図５
ｂ，５ｄ). この実験において、樹状突起は近位ポイントで切断されてグルタミン酸適用
前に体性合成されたd2EGFP の影響を避けた。Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクト
された樹状突起における全蛍光強度は有意に増加した(115% ± 7.7 S. D., n = 7)、一方、サイクロヘキシミドの存在下においてFt5'UTR(without IRE)-d2EGFP-Ft3'UTR (96.6% 
± 13.1 S. D., n = 6), d2EGFP (97.5% ± 6.8 S. D., n = 4) およびFt5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRを用いた３タイプのコントロール実験は増加を示さなかった(97.5% ± 3.4 S. D.,
n = 4)(図５ｅ)。
局所ニューロン活性により誘導した局所フェリチン翻訳
局所シナプス活性に応答した限定された位置での局所翻訳のより直接的な証拠を得るために、図５に示す実験におけるように阻害剤で処理された培養海馬ニューロンの樹状突起をガラスマイクロピペットを用いてグルタミン酸(1 mM)をパフした。蛍光強度はグルタミン酸パフ部位での適用後２０分以内に 増加を開始した(図６)。このような強度の局所増
加は試験されたニューロンの3.7% (5/136)において観察された。
【００２７】
スーパーオキシドによる局所フェリチン翻訳の直接誘導
反応性酸素種(ROS)は、ニューロン内への過剰なカルシウム流入後に発生し(Atlante et
al., 2001) そして ROSはフェリチンの発現を誘発するので  (Cairo et al., 1996; Cairo et al., 1998; Orino et al., 2001) 、該結果は、グルタミン酸シナプス部位におけ
るグルタミン酸適用はROSカスケードによりフェリチンを誘導することを示唆する。次に
、本発明者は、ROSがスーパーオキシドを産生することが知られているキサンチン/キサンチンオキシダーゼを用いてフェリチン 翻訳を直接誘導するか否かを試験した。キサンチ
ン/キサンチンオキシダーゼ適用の４０分後、t5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR発現ニューロンはその樹状突起において蛍光のわずかな増加を示した。一方、他のコントロール樹状突起は蛍光の減少を示した。蛍光の減少はスーパーオキシドによるd2EGFPの破壊により生ずるかもしれない。
ニューロンに対するフェリチン過剰発現の効果
局所フェリチン翻訳の生物学的意味を検討するために、本発明者は以下の実験を計画した。本発明者はEGFPとフェリチンを発現するための２つのサブゲノムプロモーターを有するシンドビスウイルスを用いて培養ラット海馬ニューロンの興奮毒性に対する過剰発現フェリチンタンパク質の効果を試験した。感染細胞は同時にフェリチンとEGFPを発現するので、フェリチン発現ニューロンはd2EGFP発現ニューロンとして蛍光顕微鏡により特定した
。約65%のニューロンはこのウイルスベクターにより感染した。フェリチン発現ニューロ
ンはニューロン生存、細胞生存度およびアポトーシス細胞死の試験の４タイプにおいてグルタミン酸毒性に対しより高い耐性を示した(図８)。各実験において、過剰発現フェリチンは興奮毒性を有意に減少した。過剰発現フェリチンのこのニューロン保護効果は、ヒドロキシルラジカルを生じるフェントン反応の抑制により生じると考えられ、本発明者はフェリチン過剰発現がシナプスにおける酸化されたタンパク質を減少するか否かを試験した。本発明者は、フェリチン発現細胞(図９ａ)とEGFPのみを発現する細胞(図９ｂ)の間に感染率の差はないことを見出した。オキシブロット キットを用いて、本発明者は フェリチン−過剰発現ニューロンのシナプトソームにおいて酸化されたタンパク質の量の有意な減少を確認した(図９ｃ)。
(考察)
樹状突起におけるフェリチン翻訳のIRE-依存性迅速誘導はニューロン活性により開始される。
【００２８】
本発明者は樹状突起において翻訳されたフェリチンはシナプス活性に対する応答で鉄イオンを捕捉することによりヒドロキシルラジカル産生を抑制するという仮説をたてた。この仮説を試験するために、本発明者は抗体を用いてグルタミン酸 刺激後の増加したレベ
ルのフェリチンタンパク質を確認した。この結果は仮説と一致しているが、更なる証拠が最終的な結論のために必要とされた。次のステップにおいて、本発明者は局所フェリチン翻訳が海馬ニューロンの一次培養におけるグルタミン酸刺激により誘導されるか否かの観察を試みた。Aakaluらは樹状突起における翻訳を観察する方法を開発した。彼らはBDNF適用が海馬一次培養においてCaMK2 翻訳を誘導することを見出した(Akalu et al., 2001)。本発明者は、エレクトロポレーション、サイクロヘキシミドおよびアクチノマイシンDを
用いる彼らの方法を改良し予め存在するd2EGFPの影響と転写効率の変化を最小にした。
本発明者の観察システムにおいて、d2EGFP蛍光はFt5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR 発現ニューロ
ンにおけるグルタミン酸刺激後に増加した。Ft5'UTR(IREを含まない)-d2EGFP-Ft3'UTR、d2EGFPを発現するコントロールニューロンは蛍光の増加を示さなかった。さらに、Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRでトランスフェクトされ、 サイクロヘキシミドと培養されたニューロンはいかなる増加も示さなかった。
【００２９】
フェリチン翻訳がIRE-IRP相互作用により制御されることは十分に確立されているので
、蛍光の増加は局所フェリチン翻訳に依存する活性と見なされる。Weilerらは、シナプトニューロソーム中のmRNAは刺激に応答してリボソームに速やかに結合してポリソームになることを報告した(Weiler and Greenough, 1993). Scheetzらは、NMDA-R活性化が数分以
内にCaMK2タンパク質翻訳を誘発することを実証した(Scheetz et al., 2000)。同様な速
やかな局所翻訳が(RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン・0.5 H2O (DHPG)刺激された
樹状突起で見出された(Job et al., 2001; Eberwine et al., 2001)。本発明者の結果は
フェリチン翻訳が２０分以内に誘導されることを示したので、これらの比較的速やかな反応は神経伝達物質で誘導された局所翻訳に共通の特徴であり得、この局所翻訳は、シナプスが環境条件の変化に応答してその成分分子を速やかに変化させることを可能にする。本発明者は図５に示されるように樹状突起における蛍光は一様な増加ではないことを見出した。幾つかの限定部位は他と比較して相当大きな増加を示した。同様な現象が報告され(Akalu et al., 2001; Job et al., 2001; Eberwine et al., 2001)、ここで該部位はリボ
ソーム分布と相関するホットスポットと名付けられた。フェリチンの場合において、本発明者はmRNAが樹状突起に一様に輸送されないことを見出したので(Ishimoto et al., 2000)、蛍光の一様でない増加はリボソームの一様でない分布とフェリチンmRNAの両方により
説明され得る。図６において、本発明者は局所刺激が局所フェリチン翻訳を誘導したことを明らかに実証した。蛍光増加は２０分以内に観察されたが、翻訳に必要とされる実際の時間は20分よりも短いかもしれない。なぜなら、GFPはそのフォールディング後に蛍光を
発光するからである。局所的にパフされたグルタミン酸による翻訳誘導の低い成功率の一
部はホットスポットの外側での刺激によるかもしれない。
ニューロン興奮後に産生されたスーパーオキシドはフェリチン翻訳の直接的なインデューサーである。
【００３０】
ROSはニューロン興奮により産生され(Atlante et al., 2001)、スーパーオキシドと過
酸化水素はIREからIRPを放出する(Cairo et al., 1996; Cairo et al., 1998; Orino et al., 2001)。本発明者はスーパーオキシドの発生系としてのキサンチンとキサンチンオキシダーゼの適用が樹状突起における蛍光をわずかに増加させたことを観察したが、一方他のコントロール実験は蛍光の減少を示した。この結果はキサンチンとキサンチンオキシダーゼにより生成されたスーパーオキシドと過酸化水素が翻訳を誘導したことを示唆する。蛍光減少はROSにより引き起こされたd2EGFP分解のためであるかもしれない。
ヒドロキシルラジカルの攻撃からニューロンを保護するための局所フェリチン翻訳機能
フェリチンの過剰発現は明らかにグルタミン酸毒性を減少した。保護効果はグルタミン酸毒性のイニシエーターと考えられるカルシウム流入後のヒドロキシルラジカル産生抑制により引き起こされた。フェリチン過剰発現皮質培養物からのシナプトソームフラクションは酸化性タンパク質の量の有意な減少を示す。これらの結果は、フェリチンH鎖欠損マ
ウスが脳における増加した酸化タンパク質を示すとの報告と一致する(Thompson et al., 2003)。
【００３１】
脳は大量の酸素を消費するので、ROSを生成しやすい。その産生を抑制するために、ス
ーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンなどを含むスカベンジャーシステムが
存在する。しかしながら、ニューロンにおけるこれら分子の構成的な高発現はニューロンまたはシナプスの細胞生存度もしくはLTPの誘導性について悪影響を生じる(Thiels et al.,  2000; Jaarsma et al., 2000)。フェリチンの場合、構成的な高発現は非ニューロン
細胞増殖の遅延をもたらすことが報告された(Guo et al., 1998; Cozzi et al., 2000)。野生型よりもフェリチンを大量に発現するIRP2欠損マウスは運動障害と神経変性を示した(La Vaute et al., 2001)。細胞鉄レベルとパーキンゾン疾患及びアルツハイマー疾患の
関係が示唆されている(Thompson et al., 2001)。フェリチン局所翻訳がパーキンゾン疾
患もしくはアルツハイマー疾患の患者の脳に影響するのかは興味深い。それは該疾患の原因と治療法の発見を導くかもしれない。細胞性刺激に応答するフェリチンの局所活性依存性と一時的発現は、おそらくシナプスの正常な機能を維持するための目的にかなったメカニズムであろう。
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明のエレクトロポレーション装置に使用する電極の１例を示す。
【図２】本発明のエレクトロポレーション装置により細胞内に遺伝子を導入するときの模式図を示す。
【図３】グルタミン酸刺激後の培養海馬ニューロンの免疫染色。 グルタミン酸刺激(100μM, 1 h)、ニューロン(a)及びコントロールニューロン(b)は固定され、抗フェリチン抗体を用いて免疫染色された。バーは10μmを示す。
【図４】樹状突起における局所タンパク質合成用の検出システム。(a) 該システム用に使用されるmRNA。d2EGFP ORFはフェリチン H 鎖の5',3' UTR によりフランキングされる。(b) 培養海馬ニューロン(10 DIV)におけるトランスジェニックmRNA(Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR)用のIn situ ハイブリダイゼーション。 矢頭はmRNAのシグナルを示す。(c) 局所トランスフェクション用の観察スキーム。トランスフェクション後、ニューロンはサイクロヘキシミドと120分間インキュベートされた。アクチノマイシンD存在下でのトランスフェクションの180分後に蛍光d2EGFPの観察を開始した。(d)コントロール実験。細胞はトランスフェクション後FCS含有DMEMと１時間インキュベートした。(e)Dの明視野画像。(f)コントロール実験。細胞はトランスフェクション後６時間サイクロヘキシミド-含有培地とインキュベートした。(g)Fの明視野画像。(h)コントロール実験。細胞はトランスフェクション後アクチノマイシン D-含有培地と６時間インキュベートされた。(i)ｈの明視野画像。(j)Cのスキームにより処理されたニューロン。細胞はサイクロヘキシミド-含有培地と２時間、次いでサイクロヘキシミドとアクチノマイシンD含有培地と３０分間、そして最後にアクチノマイシンD含有培地と１時間インキュベートされた。(k)Jの明視野画像。全てのバーは10μmの長さを示す。
【図５】グルタミン酸の浴適用(bath-application)により誘導される局所フェリチントランスフェクション。(a) Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクション ニューロンの偽-着色蛍光画像。ニューロンは図４ｃに示されるように処理された。 近位位置における樹状突起の解離(dissection)後、グルタミン酸が100μMの最終濃度で適用された。画像は適用後0分,20分, 40分に撮影された。バーは10μmを示す。(b) d2EGFPを用いるコントロール実験。(c) 樹状突起の各部で０分の蛍光シグナルに対するグルタミン酸適用後４０分の蛍光シグナルの比。シグナル比は樹状突起において一様でなく増加する。(d) d2EGFPを用いたコントロール実験における蛍光比。(e) グルタミン酸適用後の蛍光変化の平均プロフィール(±S.D.)。 Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクトされた樹状突起は蛍光 (n=7)において顕著な増加を示し、一方Ft5'UTR(IREを含まない)-d2EGFP-Ft3'UTR (n = 6), d2EGFP (n = 4)及びサイクロヘキシミドとともにFt5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR(n = 4)を用いたコントロール実験は有意な増加を示さなかった。*P < 0.05, (スチューデントのt-検定).
【図６】限定領域でグルタミン酸適用により誘導された局所トランスフェクション。Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクトニューロンの蛍光画像。ニューロンは図４ｃに示されるように処理された。顕微鏡下に,矢印により示された部位にグルタミン酸パフにより樹状突起を刺激した。画像は刺激後0分, 10分、20分及び40分に撮影した。画像は偽-着色されていた。バーは10μmを示す。
【図７】スーパーオキサイドにより誘導された局所フェリチントランスフェクション。フェリチン局所トランスフェクションに対するスーパーオキサイドの影響が調べられた。キサンチン(50μM)及びキサンチンオキシダーゼ(0.05 u/ml)がスーパーオキサイドを産生するために添加された。(a) Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクトニューロンの偽-着色蛍光画像。ニューロンは図４ｃに示されるように処理された。画像は適用後0分,20分, 40分に撮影された。バーは10μmを示す。(b) d2EGFPを用いるコントロール実験。(c) 樹状突起の各部で０分の蛍光シグナルに対するグルタミン酸適用後４０分の蛍光シグナルの比。(d)d2EGFPを用いたコントロール実験における蛍光比。(e) キサンチン及びキサンチンオキシダーゼ適用後の蛍光変化の平均プロフィール(±S.D.)。 Ft5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTRトランスフェクトされた樹状突起は蛍光 (n=9)においてわずかな増加を示し、一方Ft5'UTR(IREを含まない)-d2EGFP-Ft3'UTR(n=5), d2EGFP (n=4)及びサイクロヘキシミドとともにFt5'UTR-d2EGFP-Ft3'UTR(n=5)を用いたコントロール実験は有意な増加を示さなかった。*P < 0.05, (スチューデントのt-検定).
【図８】グルタミン酸毒性に対するフェリチンの保護効果。グルタミン酸毒性は４つの方法によりアッセイされた。E18ラット由来の海馬ニューロンは７日間培養され、EGFPのみ或いはEGFPとフェリチンの両方を発現するシンドビスウイルスで感染された。感染後、グルタミン酸(100 μM、１時間)を該ニューロンに適用した。該アッセイは適用後１時間行った。各パネルにおいて、バーは非処理培養物のパーセントとしてグルタミン酸処理された培養物の値を示す。(a) グルタミン酸適用後の神経細胞死がMAP2陽性細胞をカウントすることにより測定された。(b) グルタミン酸適用後の神経細胞死がEGFP陽性細胞をカウントすることにより測定された。(c)MTT-減少活性がグルタミン酸刺激後に測定された。(d) TUNEL-陽性細胞がアポトーシス細胞の指数としてカウントされた。縦軸はグルタミン酸刺激を与えられていないコントロール実験のパーセントを示す。
【図９】フェリチン発現により減少されたシナプス部位での酸化タンパク質レベル。(a) EGFPとフェリチンH鎖を発現するシンドビスウイルス感染細胞。(b) EGFPを発現するシンドビスウイルス感染細胞。バーは10μmを示す。(c) ウイルス感染培養皮質ニューロンから調製されたシナプトソーム画分はオキシブロット キットを用いてウェスタンブロッティングにより分析する。縦軸は酸化されたタンパク質(±S.D.)の相対量を示す。
【符号の説明】
【００３３】
１  第１電極
１ａ  第１電極の先端
２  第２電極
２ａ  第２電極の円形部分
３  絶縁材
４  細胞
５  空間
６  容器
【図１】
2005261323.tif 000002
【図２】
2005261323.tif 000003
【図３】
2005261323.tif 000004
【図４】
2005261323.tif 000005
【図５】
2005261323.tif 000006
【図６】
2005261323.tif 000007
【図７】
2005261323.tif 000008
【図８】
2005261323.tif 000009
【図９】
2005261323.tif 000010
【配列表】
2005261323000001.app