(57)【要約】【課題】Ｌｉｂ遺伝子および／またはその遺伝子産物の新規の用途を提供すること。【解決手段】  Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤を含有する乳癌の予防剤および／または治療剤、Ｌｉｂ蛋白質の阻害を特徴とする乳癌の予防方法および／または治療方法、組織中のＬｉｂ遺伝子の発現量を測定し、Ｌｉｂ遺伝子発現陽性の場合、乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法、組織中のＬｉｂ蛋白質の発現量を測定し、Ｌｉｂ蛋白質発現陽性の場合、乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法、Ｌｉｂ蛋白質特異抗体作製方法、該方法に用いるペプチドを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤を含有する乳癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項２】
Ｌｉｂ蛋白質の阻害を特徴とする乳癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項３】
被検組織中のＬｉｂ遺伝子の発現を測定し、Ｌｉｂ遺伝子の発現が陽性の場合、乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法。
【請求項４】
被検組織中のＬｉｂ蛋白質の発現を測定し、Ｌｉｂ蛋白質の発現が陽性の場合、乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法。
【請求項５】
同一個体由来の被検組織と正常組織のＬｉｂ遺伝子の発現量を比較し、被検組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現量が正常組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現量と比べて２倍以上である場合、被検組織は乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法。
【請求項６】
同一個体由来の被検組織と正常組織のＬｉｂ蛋白質の発現量を比較し、被検組織におけるＬｉｂ蛋白質の発現量が正常組織におけるＬｉｂ蛋白質の発現量と比べて２倍以上である場合、被検組織は乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法。
【請求項７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列に１ないし数個のペプチドの欠失、置換、付加が施されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項９】
請求項７または８に記載のペプチドを用いることを特徴とするＬｉｂ蛋白質に対する抗体の作製方法。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のペプチドを認識する抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体を用いることを特徴とする請求項４または６に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療剤および／または検査方法、特に、乳癌の治療剤および／または検査方法に関する。より詳しくは、Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤を含有する乳癌の治療剤、Ｌｉｂ蛋白質を阻害することを特徴とする乳癌の治療方法、Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現を測定することを特徴とする乳癌の検査方法、また、該検査方法に用いる抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌｉｂ遺伝子はβアミロイドにより誘導される遺伝子として本発明者により見出された遺伝子であり、ヒトＬｉｂ遺伝子の塩基配列は特許文献１の配列番号２に開示されている。また、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＡＢ０７１０３７で登録されている。
【０００３】
Ｌｉｂ遺伝子はロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）構造の繰り返し配列を有するＬＲＲスーパーファミリーに属する遺伝子であり、他のＬＲＲファミリーに属する遺伝子（非特許文献１、２、３）と同様に、細胞・細胞間、細胞・細胞外マトリックス間の相互作用に関与する分子であると考えられている（特許文献１）。
【０００４】
また、Ｌｉｂ遺伝子が常発現性でなく、サイトカイン類で発現誘導されたことから、新規炎症関連因子であると考えられている（特許文献１）。
【０００５】
さらには上記のようなＬｉｂ遺伝子の機能に基づき、Ｌｉｂ遺伝子をアルツハイマー病変等の神経疾患の診断・制御を目的とする手段として使用すること、Ｌｉｂ遺伝子がコードするポリペプチドに対する抗体が提供されること、また、Ｌｉｂ遺伝子の作用および／または発現を調節する化合物の同定方法、該同定方法で同定される化合物、これらを利用した疾病の診断手段、疾病診断用キット、疾病治療薬が提供されることが特許文献１に開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１６４２９０号公報
【非特許文献１】Ｓｈｉｓｈｉｄｏ  Ｅ．他  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，２１１８−２１２１（１９９８）
【非特許文献２】Ｈｉｃｋｅｙ，Ｍ．Ｊ．他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，８３２７−８３２１（１９９３）
【非特許文献３】Ｌａｎｚａ，Ｆ．他  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８，２０８０１−２０８０７（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、Ｌｉｂ遺伝子および／またはその遺伝子産物の新規の用途を提供することである。さらには、Ｌｉｂ蛋白質に対する特異的抗体および該抗体の用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒト同一個体由来の各種癌由来組織と正常組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現について比較を行い、各種癌由来組織において、特に乳癌由来組織では高率に、Ｌｉｂ遺伝子の発現が有意に亢進していることを見出して本発明を完成した。
【０００９】
さらには、Ｌｉｂ遺伝子産物に対する特異的抗体の作製を試み、Ｌｉｂ遺伝子産物に対する特異的抗体作製に有用なペプチドを見出すとともに、該ペプチドを用いて抗体を作製し、その用途を見出した。
【００１０】
特許文献１にはＬｉｂ遺伝子と癌、特に乳癌との関係についてや、特異的抗体作製に関する具体的開示や示唆は一切ない。
【００１１】
すなわち、本発明は、Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤を含有する癌の防止剤および／または治療剤、特に、乳癌の防止剤および／または治療剤に関する。
【００１２】
さらに、Ｌｉｂ蛋白質の阻害を特徴とする癌の防止方法および／または治療方法、特に、乳癌の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１３】
また、被検組織中のＬｉｂ遺伝子の発現を測定し、Ｌｉｂ遺伝子の発現が陽性の場合、癌由来組織、特に、乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法に関する。
【００１４】
さらに、被検組織中のＬｉｂ蛋白質の発現を測定し、Ｌｉｂ蛋白質の発現が陽性の場合、癌由来組織、特に乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法に関する。
【００１５】
また、同一個体由来の被検組織と正常組織のＬｉｂ遺伝子の発現量を比較し、被検組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現量が正常組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現量と比べて２倍以上である場合、被検組織は癌由来組織、特に乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法に関する。
【００１６】
さらに、同一個体由来の被検組織と正常組織のＬｉｂ蛋白質の発現量を比較し、被検組織におけるＬｉｂ蛋白質の発現量が正常組織におけるＬｉｂ蛋白質の発現量と比べて２倍以上である場合、被検組織は癌由来組織、特に乳癌由来組織であると判断することを特徴とする検査方法に関する。
【００１７】
また、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００１８】
さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列に１ないし数個のペプチドの欠失、置換、付加が施されたアミノ酸配列を有するペプチドに関する。
【００１９】
また、上記のペプチドを用いることを特徴とするＬｉｂ蛋白質に対する抗体の作製方法に関する。
【００２０】
さらに、上記のペプチドを認識する抗体に関する。
【００２１】
また、上記の抗体を用いることを特徴とする上記の検査方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の防止剤およびまたは／治療剤を用いることにより、癌の防止および／治療、特に、乳癌の防止および／または治療が可能ととなる。また、本発明の検査方法を用いることにより、癌の防止および／または治療、特に、乳癌の検査が可能となる。さらに、本発明のペプチドおよび抗体は、癌、特に、乳癌の検査、治療等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者は、癌患者由来の各種癌組織および同一個体由来の正常組織から抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡ化したものに、ヒトＬｉｂ遺伝子の１４７１番目から１７４６番目の部分塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２）をハイブリダイゼーションさせ、各組織中のＬｉｂ遺伝子の発現について解析を行った。その結果、各種癌組織でＬｉｂ遺伝子の発現亢進が認められ、特に乳癌組織においては発現率が８割を超えていた。さらには、ヒト乳癌由来組織および正常組織を用いてＬｉｂ遺伝子に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション行った結果、乳癌由来組織のほぼ全例において、特に上皮細胞でのＬｉｂ遺伝子の発現亢進が認められた。
【００２４】
したがって、発明者は、Ｌｉｂ遺伝子は癌、特に、乳癌の発生および／または進行に関与すると考えている。Ｌｉｂ蛋白質は上記のように細胞・細胞間、細胞・細胞外マトリックス間の相互作用に関与する分子であると考えられていることから、Ｌｉｂ遺伝子は癌における腫瘍形成や細胞浸潤、転移等に関与していると発明者は考えている。
【００２５】
Ｌｉｂ遺伝子は上記のごとく癌の発生および／または進行に関与するので、Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤は、癌の防止剤および／または治療剤として用いることができる。特に、乳癌の防止剤および／または治療剤として好適に用いることができる。また、Ｌｉｂ蛋白質の阻害は癌の防止方法および／または治療方法に応用できる。特に、乳癌の防止方法および／または治療方法に好適に応用できる。ここで、Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤は、Ｌｉｂ蛋白質が有する機能を阻害するものでもよいし、Ｌｉｂ蛋白質の発現自体を阻害するものでもよい。同様に、Ｌｉｂ蛋白質の阻害は、Ｌｉｂ蛋白質が有する機能の阻害でもよいし、Ｌｉｂ蛋白質の発現自体の阻害でもよい。
【００２６】
Ｌｉｂ蛋白質の阻害剤は適当な医薬担体と組み合わせて処方して癌の防止剤および／または治療剤、特に、乳癌の防止剤および／または治療剤として用いると良い。かかる処方は、治療上有効量の上記阻害剤、医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。処方は投与経路に適したものを選択すればよい。
【００２７】
投与経路は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば、静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内、または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様として、腸溶処方またはカプセル処方等の経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる形粘膜または経皮投与を用いることもできる。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲルなどの形態を利用できる。
【００２８】
必要な用量範囲は、上記阻害剤の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状および担当医師の判断によるが、適当な用量は、例えば、対象の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇの範囲である。
【００２９】
製剤化にあたっては、例えば、阻害剤の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば、散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法を利用できる。
【００３０】
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００３１】
懸濁剤は、水や、シュークロース、ソルビトールおよびフラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコールなどのグリコール類、油類等を使用して製造できる。
【００３２】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体等を用いて調製可能である。
【００３３】
リポソーム化は、例えば、リン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心分離した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
【００３４】
脂肪乳化剤は、例えば、当該阻害剤、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油など）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリン、糖類（例えば、ブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
【００３５】
シクロデキストリン包接化は、例えば、当該阻害剤を溶媒（エタノール）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該阻害剤の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α型、β型、γ型）を適宜選択すればよい。
【００３６】
かくして得られたＬｉｂ蛋白質の阻害剤はＬｉｂ蛋白質の阻害を特徴とする癌の防止方法および／または治療方法、特に、乳癌の防止方法および／または治療方法に好適に用いることができる。
【００３７】
本発明の別の態様は、被検組織中のＬｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現を測定し、Ｌｉｂ遺伝子発現および／またはＬｉｂ蛋白質の発現が陽性の場合、癌由来組織であると判断する検査方法を提供するものである。
【００３８】
上記のように、Ｌｉｂ遺伝子は、各種癌由来組織において発現が亢進しているので、Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現が陽性の組織は、癌由来組織であると判断できる。特に、乳癌由来組織においては高率に発現が亢進しているので、被検組織中のＬｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現を測定し、Ｌｉｂ遺伝子発現および／またはＬｉｂ蛋白質の発現が陽性の場合、乳癌由来組織であると判断する検査方法は乳癌の検査に有用である。  
Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現を測定するための被検組織としては、個体由来の細胞、例えば、血液、組織生検サンプル、剖検サンプルなどを挙げることができる。これらの組織から、自体公知の方法により、遺伝子や蛋白質、これらに由来するポリヌクレオチド断片、ペプチド断片などを精製するなどして測定に用いるとよい。遺伝子および蛋白質の発現の測定は、定量的な測定のみならず、定性的な測定を含む。
【００３９】
Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現が陽性であるとの判断においては、被検組織におけるＬｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現と、同一個体由来の正常組織におけるＬｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現との比較を行うことが望ましい。比較を行う組織を同一臓器から取得することがさらに望ましい。Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現を最終的に画像あるいは写真データとして得る場合は、目視による比較も可能と考えられるが、画像処理装置、デンシトメーター等色濃度を数値化することが可能な機器を用いて解析を行うことがさらに望ましい。放射活性として結果を得る場合には、その放射活性を数値化できるような機器を用いて解析を行うとよい。被検組織におけるＬｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現量が正常組織と比較して好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上である場合は、Ｌｉｂ遺伝子および／またはＬｉｂ蛋白質の発現が陽性であると判断できる。
【００４０】
遺伝子発現の測定は、例えば、サザンブロッティング法などのように、遺伝子そのものの増幅を確認する方法、ノーザンブロッティング法などのようにｍＲＮＡの量を測定する方法やＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップを用いた解析などのようにｍＲＮＡを一旦ｃＤＮＡ化し、さらに増幅等を行って測定する方法など、発現遺伝子を直接的、間接的に測定できるいかなる方法を適用してもよい。核酸の検出にはヌクレオチドプローブが好適に用いられるが、プローブは蛍光物質、放射性物質、発色性酵素等の修飾を施してもよい。ここでプローブとは、対象のヌクレオチドとハイブリッド形成をすることが可能なポリヌクレオチドを言う。Ｌｉｂ遺伝子の発現を確認するためのプローブとしては、本発明の実施例において用いたヒトＬｉｂ遺伝子の１４７１番目から１７４６番目の部分塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２）が好適に用いられるが、これに限定されない。
【００４１】
また、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法のようにサンプル組織を可溶化することなく所定の固定等を行って直接組織中の遺伝子の発現を測定する方法も適用できる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いるプローブとしては、実施例において用いた３０５ｂｐ程度のヌクレオチド（配列番号３）を用いて作製したＲＮＡプローブが好適に用いられるがこれに限定されない。
【００４２】
蛋白質の発現を測定する方法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ法、蛍光抗体法等、Ｌｉｂ蛋白質の一部を認識する抗体を用いた方法が好適に用いられるが、その他公知のいかなる手段を適用してもよい。
【００４３】
本発明の別の態様は、Ｌｉｂ蛋白質を特異的に認識する抗体を提供するものである。配列番号１に記載のペプチドをウサギに免疫して得た抗体は、ウエスタンブロッティングにおいて、Ｌｉｂ蛋白質を特異的に認識した。したがって、配列番号１に記載のペプチドは、Ｌｉｂ蛋白質に対する特異的抗体を作製する際に好適に用いることができる。該ペプチドには、免疫原性を失わない限りにおいて、適宜、１ないし数個のペプチドの欠失、置換、付加を施して用いることができる。
【００４４】
配列番号１に記載のペプチドは、（１）ＬＲＲ領域（Ｌｉｂアミノ酸配列の２５番目〜４７５番目）はＬＲＲファミリーに属する蛋白質に保存されているので避ける、（２）ＦＡＣＳ法などのように、細胞を可溶化しない用途にも使用できるよう、膜貫通領域（Ｌｉｂアミノ酸配列の第５３５番目〜第５５７番目）より外側の細胞外領域を狙う、（３）ヒトとげっ歯類とでクロスしない抗体となるようにヒトＬｉｂアミノ酸配列の第４８３目〜第４８５番目の、ヒトのみでの３残基挿入に着目してその周辺を狙うという３つの条件を満たすものとして選択したものである。前記（１）、（２）、（３）の条件を満たすＬｉｂアミノ酸配列第４８０番目〜第４９９番目（配列番号１）および（１）、（２）の条件のみを満たす同第５２０番目〜第５３１番目の領域の２つを抗原配列を選択して免疫を実施したところ、前者のペプチドを用いて得た抗体のみリコンビナントＬｉｂ蛋白質を認識でき、後者のペプチドを用いて得た抗体は認識できなかった。したがって、本発明のペプチドは、特異性が高く汎用性もある抗Ｌｉｂ抗体の作製に有用である。
【００４５】
本発明のペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより、抗Ｌｉｂ抗体を作製することができる。担体は、自身が宿主に対して有害作用を起こさなければ特に限定されず、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得する。好ましい手段としては、免疫アフィニティクロマトグラフィー法である。
【００４６】
モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。
【００４７】
かくして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、Ｌｉｂ蛋白質を特異的に認識するので、Ｌｉｂ活性を制御可能であり、また、癌、特に好適には乳癌の防止、治療、検査等に用いることができる。
【実施例１】
【００４８】
（ヒト各種癌組織でのＬｉｂ遺伝子の発現解析）
クロンテック社製Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｒｒａｙ  （＃７８４１−１）をＬｉｂ遺伝子発現の確認試験に用いた。Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ａｒｒａｙは、ヒト癌患者の癌組織および同一個体由来の正常組織からＲＮＡを抽出し、それをｃＤＮＡ化したものを、同一個体でワンセットになるよう隣り合わせに配置し、計２４１個体由来サンプルをナイロンメンブレンにドットブロットして作製されたものである。
【００４９】
これに対するハイブリダイゼーションプローブは、ヒトＬｉｂ遺伝子の塩基配列の１４７１番目〜１７４６番目までの塩基配列からなるＤＮＡ断片（配列番号２）を制限酵素処理により作製し、さらに３２Ｐで放射ラベルして作製した。
【００５０】
ハイブリダイゼーションは、特許文献１に記載されているハイブリダイゼーション法にて実施した。ＢＡＳ２０００（富士フィルム社製）を用いて、放射活性を画像化して検出した（図１）。
【００５１】
Ｌｉｂ遺伝子発現の定量には、ＢＡＳ２０００（富士フィルム社製）の定量アプリケーション（Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  II）を用いた。同一メンブレン上でｃＤＮＡがブロットされていない部分をバックグラウンドとして設定した。バックグラウンド値を差し引いた上で、癌組織由来Ｌｉｂ  ｃＤＮＡの値を同一個体の正常組織由来Ｌｉｂ  ｃＤＮＡの値で除し、２以上であった個体の癌組織をＬｉｂ遺伝子の発現が陽性と判断した。
【００５２】
表１に示すように、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、卵巣癌、小腸癌、膵臓癌由来組織において、Ｌｉｂ遺伝子の発現亢進が見られた。特に、乳癌組織において高い陽性率となった。
【００５３】
【表１】
2005075795.tif 000002
【００５４】
乳癌組織について、ＢＡＳ２０００定量アプリケーションを用いて解析して得られた比較値（癌組織の値を正常組織の値で除した数値）を表２に示す。表中のアルファベットは図１のドットの位置に対応する。また、表中の＊は転移組織由来であることを示し、それぞれＧ右カラムについてはＨ右カラムが、Ｉ右カラムについてはＪ右カラムが、Ｋ右カラムについてはＬ右カラムが対応個体の原発組織でのデータである。
【００５５】
【表２】
2005075795.tif 000003
【実施例２】
【００５６】
（Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
Ｌｉｂ遺伝子の発現解析をｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ（Ｓｕｐｅｒｂｉｏｃｈｉｐｓ  Ｌａｂ．）を用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で実施した。プローブは、ＰＣＲにて増幅したヒトＬｉｂ  ｃＤＮＡの部分配列である配列番号３に示す塩基配列からなる３０５ｂｐのヌクレオチド断片より作製した。アンチセンスプローブ用にはｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＡＧＧＴＧＣＣＴＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡ−３’（配列番号４）とｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号５）、ネガティブコントロールとしてのセンスプローブ用にはｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧＡＡＡ−３’（配列番号６）とｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＡＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号７）を用いて増幅した。上記プライマーにはＴ７プロモーター配列が含まれるので、ＰＣＲで得られたそれぞれのヌクレオチド断片中のＴ７プロモーター配列を利用し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、ジゴキシゲニンラベルＲＮＡプローブを作製した。
【００５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法はＲｏｃｈｅ社添付プロトコールに従った。組織切片を以下の溶液に浸し前処理を行った。すなわち、キシレンに１０分間２回（脱パラフィン）、１００％エタノールに３分間２回、９５％エタノールに３分間２回、７０％エタノールに３分間２回、５０％エタノールに３分間２回、３０％エタノールに３分間２回（水和）、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  含む０．１  ％  Ｔｗｅｅｎ−２０）に５分間（リンス）、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０  μｇ／ｍｌ  ＰＢＳＴ溶液）に１０分間（蛋白質分解）、ＰＢＳＴに５分間（リンス）、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＢＳＴ溶液）に１０分間（固定化）、ＰＢＳＴに５分間３回（リンス）の浸漬を行った。
【００５８】
ハイブリダイゼーションソリューション（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてモイスチャーチャンバー内４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った後、変性させたジゴキシゲニンでラベルしたプローブを用いて４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションを実施した。スライドを２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣでそれぞれ１５分間２回洗浄、ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを用いて室温で１時間のブロッキングを行った後、アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（２μｌ／ｍｌ）を４℃で１６時間反応させた。
【００５９】
その後マレイン酸バッファーで１５分間４回室温で洗浄し、検出バッファー（Ｒｏｃｈｅ社）で５分間平衡化させ、発色基質であるＮＢＴ／ＢＣＩＰを加えて室温で２時間発色させた。再びマレイン酸バッファーで軽く洗浄した後、封入剤で封入し、光学顕微鏡で鏡顕した。
【００６０】
その結果、３２人の乳癌患者由来の乳癌組織、特にその上皮細胞において、Ｌｉｂ遺伝子の強い発現が確認された。正常組織３例では、Ｌｉｂ遺伝子の発現はみられなかった。
【実施例３】
【００６１】
（抗ヒトＬｉｂ蛋白質ポリクローナル抗体の作製）
抗原部位として、ヒトＬｉｂアミノ酸配列の第４８０番目〜第４９９番目のアミノ酸配列、すなわちＥＶＰＳＹＰＥＴＰＷＹＰＤＴＰＳＹＰＤＴ（アミノ酸一文字表記による。配列番号１参照）からなるポリペプチドを用いた。
【００６２】
抗原の作製は、上記２０アミノ酸配列をＦｍｏｃ法により直鎖ペプチド合成し、キャリア蛋白質ＫＬＨをグルタルアルデヒド法にて結合させた。
【００６３】
免疫は、ウサギ（ニュージーランドホワイト種）に、上記抗原４００μｇを初回はフロイント完全アジュバントを混合して皮下注射し、２回目以降は抗原２００μｇとフロイント不完全アジュバントとを混合したものを２週間おきに免疫注射した（合計５回）。
【００６４】
全採血後、プロテインＡカラムを用いてＩｇＧ精製を実施した。
【００６５】
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）にヒトＬｉｂ遺伝子（Ｃ末端側にＨｉｓ×６を付加）を導入して樹立したホルモン誘導型Ｌｉｂ遺伝子発現細胞株を用い、発現誘導前、発現誘導後の細胞溶解液を作製し、精製抗Ｌｉｂペプチド抗体ＩｇＧを用いてウエスタンブロッティングを行い、抗体反応性を確認した（図１Ａ）。同一のメンブレンについて抗体ストリッピング後、抗Ｈｉｓ抗体（インビトロジェン社製  Ｃ端Ｈｉｓタグ認識抗体）を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ、抗Ｌｉｂ抗体を用いた場合と同様に、Ｌｉｂ遺伝子発現誘導後の細胞のみで同分子量（約７５ｋＤａ）の位置にシグナルが確認できた（図１Ｂ）。なお、Ｌｉｂ遺伝子産物はアミノ酸分子量計算上６４ｋＤａとなるが、グリコシレーションの影響で高分子に推移することが脱糖鎖実験で確認されている。
【００６６】
このことから、抗Ｌｉｂ抗体は発現誘導されるリコンビナントＬｉｂ蛋白質を特異的に認識することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】同一個体由来の正常組織と癌組織におけるＬｉｂ遺伝子の発現の比較を示す図である。ＢＡＳ２０００による画像データを示す。図中下部のＮおよびＴはそれぞれ、正常組織由来および癌組織由来サンプルのドットであることを示す。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞から樹立したホルモン誘導型Ｌｉｂ遺伝子発現細胞株にエクジソンを添加することでＬｉｂ遺伝子の発現誘導を行った。発現誘導前（レーン１）、発現誘導後（レーン２）の細胞溶解液を４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、抗Ｌｉｂ抗体（図１Ａ）および抗Ｈｉｓ抗体（図１Ｂ）を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。矢印はＬｉｂ蛋白質のバンドを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１：Ｌｉｂ蛋白質に対する抗体の作成に有用なＬｉｂ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号２：Ｌｉｂ遺伝子に対するプローブとして用いることができるＬｉｂ遺伝子の部分配列。
配列番号３：Ｌｉｂ遺伝子に対するプローブ作製に有用なＬｉｂ遺伝子の部分配列。
配列番号４：アンチセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたＤＮＡ。
配列番号５：アンチセンスプローブ作製用プライマーとして設計されたＤＮＡ。
配列番号６：センスプローブ作成用プライマーとして設計されたＤＮＡ。
配列番号７：センスプローブ作成用プライマーとして設計されたＤＮＡ。
【図１】
2005075795.tif 000004
【図２】
2005075795.tif 000005
【配列表】
2005075795000001.app