(57)【要約】【課題】滴定の終点を目視に依らず検出できる還元糖の測定方法及び測定装置を提供する。【解決手段】還元糖との反応後に残存する２価銅イオンをキレート剤でキレートし、滴定の終点を電気的測定で検出する。また、電気的測定に用いる電極として、耐久性に優れた双白金つの型電極や複合白金電極を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、
該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、
該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、
該亜酸化銅酸化工程後の反応液中に既知濃度のヨウ素還元剤を徐々に加えて該反応液中に残存する該ヨウ素量を容量滴定し、電気的測定によって該容量滴定の終点を検出することで該容量滴定に要した該ヨウ素還元剤量を測定するヨウ素還元剤測定工程と、を備え、
該チオ硫酸ナトリウム測定工程で測定された該チオ硫酸ナトリウム量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする還元糖測定方法。
【請求項２】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、
該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、
該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、
該亜酸化銅酸化工程後の反応液に該反応液に残存する該ヨウ素に対して過剰量となる所定量のヨウ素還元剤を加え、該反応液中に残存する該ヨウ素を還元するヨウ素還元工程と、
該キレート工程後から該ヨウ素還元工程後の何れかの反応液にヨウ化カリウムを加えるヨウ化カリウム添加工程と、
該ヨウ化カリウムが添加された反応液中の該ヨウ化カリウムを電気分解して徐々にヨウ素を生成させて反応液中に残存する該ヨウ素還元剤量を電量滴定し、電気的測定によって該電量滴定の終点を検出することで該電量滴定に要した該ヨウ素量を測定するヨウ素測定工程と、を備え、
該ヨウ素測定工程で測定されたヨウ素量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする還元糖測定方法。
【請求項３】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、
該亜酸化銅生成工程後の反応液を煮沸しつつ既知濃度の標準還元糖溶液を徐々に加えて該反応液中に残存する該２価銅イオン量を容量滴定し、電気的測定によって該容量滴定の終点を検出することで該容量滴定に要した該標準還元糖量を測定する標準還元糖測定工程と、を備え、
該標準還元糖測定工程で測定された標準還元糖量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする還元糖測定方法。
【請求項４】
前記一定煮沸条件は、前記水溶液を２分３０秒以内に沸騰させた後に３分間沸騰させ、その後１分間急冷する条件である請求項１または請求項２に記載の還元糖測定方法。
【請求項５】
前記一定煮沸条件は、前記水溶液を２分３０秒以内に沸騰させた後に３分間沸騰させる条件である請求項３に記載の還元糖測定方法。
【請求項６】
前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムおよびジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸から選ばれる少なくとも１種である請求項１または請求項２記載の還元糖測定方法。
【請求項７】
前記電気的測定は、反応液の分極電流と分極電位差と酸化還元電位との少なくとも１種を測定する請求項１または請求項３記載の還元糖測定方法。
【請求項８】
前記電気的測定は、反応液の分極電流と分極電位差との少なくとも１種を測定する請求項２記載の還元糖測定方法。
【請求項９】
前記ヨウ素還元剤はチオ硫酸ナトリウムである請求項１または請求項２記載の還元糖測定方法。
【請求項１０】
前記還元糖量は、前記亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて算出される請求項１または請求項２記載の還元糖測定方法。
【請求項１１】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、によって得られた反応液中に、既知濃度のヨウ素還元剤を徐々に加えて該反応液中に残存する該ヨウ素量を容量滴定する際に、該反応液の酸化還元電位と分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定して該容量滴定の終点を検出するための、複合白金電極と双白金つの型電極との少なくとも一方をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする還元糖測定装置。
【請求項１２】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、該亜酸化銅酸化工程後の反応液に該反応液に残存する該ヨウ素に対して過剰量となる所定量のヨウ素還元剤を加え、該反応液中に残存する該ヨウ素を還元するヨウ素還元工程と、該キレート工程後から該ヨウ素還元工程後の何れかの反応液にヨウ化カリウムを加えるヨウ化カリウム添加工程と、によって得られた反応液中に所定電流を印加して該ヨウ化カリウムを電気分解し徐々にヨウ素を生成させるための双白金渦巻型電極をもつ電気分解手段と、該ヨウ素によって反応液中に残存する該ヨウ素還元剤量を電量滴定する際に、該反応液の分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定して該電量滴定の終点を検出するための、双白金つの型電極をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする還元糖測定装置。
【請求項１３】
定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程によって得られた反応液を、煮沸しつつ既知濃度の標準還元糖溶液を徐々に加えて該反応液中に残存する該２価銅イオン量を容量滴定する際に、該反応液の酸化還元電位と分極電流との少なくとも一種を測定して該容量滴定の終点を検出するための、複合白金電極と双白金つの型電極との少なくとも一方をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする還元糖測定装置。
【請求項１４】
さらに、前記終点から算出された前記反応液中の前記ヨウ素還元剤量から前記還元糖試料中の還元糖量を算出する演算手段を備える請求項１１または請求項１２記載の還元糖測定装置。
【請求項１５】
さらに、前記終点から算出された前記標準還元糖量から前記還元糖試料中の還元糖量を算出する演算手段を備える請求項１３に記載の還元糖測定装置。
【請求項１６】
前記演算手段は、前記亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて、前記還元糖試料中の還元糖量を算出する請求項１４記載の還元糖測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は還元糖試料中の還元糖を測定する還元糖の測定方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元糖の測定方法としては従来より種々の方法が開発されており、一般にはアルカリ性銅試薬法が用いられている。アルカリ性銅試薬法は、還元糖試料中のグルコースやフルクトースといった還元糖をアルカリ条件下で銅試薬と煮沸反応させ、生成する亜酸化銅（酸化第１銅、Ｃｕ2Ｏ）や残存する２価銅イオン量から還元糖量を算出する方法である（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
生成する亜酸化銅から還元糖量を算出する代表的な方法としてはソモギー法が挙げられる。また、残存する２価銅イオン量から還元糖量を算出する代表的な方法としてはフェーリングレーマンシュール法が挙げられる。その他、銅イオンと還元糖の反応後にさらに還元糖を追加して、反応液中に残存する２価銅イオンを全て亜酸化銅にまで還元して、反応液中の銅イオンを全て亜酸化銅に還元するのに要する還元糖の総量と追加した還元糖の量から還元糖試料中の還元糖量を算出する方法（レインエイノン定容法）もある。
【０００４】
これらの方法はいずれも滴定操作が必要である。そして、滴定の終点の判定は、ヨウ素でんぷん反応やメチレンブルーの青色の退色を目視で判断することによっておこなわれているために、測定に熟練した操作が必要とされる問題があった。さらに、還元糖を算出するためには別途換算表や検量線や予備滴定が必要であるために自動化ができず、測定には長時間を要するとともに煩雑な操作を要する問題があった。
【０００５】
ここで、滴定の終点を目視以外の方法で検出する方法としては、一般に、検知電極にて反応液中の電位差等を測定し、当量点付近の急激な変化を電気信号として取り出す電気的測定法（電気滴定法）が用いられている。しかし、上述したアルカリ性銅試薬法においては、反応液中に残存する２価銅イオンが検知電極と電気化学的に反応するために、終点の検出が銅イオンにより干渉されて、正確な測定値が得られない場合がある。
【０００６】
さらに、アルカリ性銅試薬法では、還元糖と銅イオンとの反応を煮沸条件下で反応させるとともに、反応をアルカリ条件下でおこなうために強アルカリの試薬を用いる。このため、一般的な電極では電極の劣化が生じて性能が低下するために、終点を正確に検出することができない問題があった。
【非特許文献１】福井作蔵著  「生物化学実験法１  還元糖の定量法」  学会出版センター  １９６９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、滴定の終点を目視に依らず検出でき、還元糖を容易かつ正確に測定することのできる還元糖の測定方法及び測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１発明の還元糖測定方法は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、該亜酸化銅酸化工程後の反応液中に既知濃度のヨウ素還元剤を徐々に加えて該反応液中に残存する該ヨウ素量を容量滴定し、電気的測定によって該容量滴定の終点を検出することで該容量滴定に要した該ヨウ素還元剤量を測定するヨウ素還元剤測定工程ヨウ素還元剤測定工程と、を備え、該ヨウ素還元剤測定工程で測定された該ヨウ素還元剤量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする。
【０００９】
第２発明の還元糖測定方法は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、該亜酸化銅酸化工程後の反応液に該反応液に残存する該ヨウ素に対して過剰量となる所定量のヨウ素還元剤を加え、該反応液中に残存する該ヨウ素を還元するヨウ素還元工程と、該キレート工程後から該ヨウ素還元工程後の何れかの反応液にヨウ化カリウムを加えるヨウ化カリウム添加工程と、該ヨウ化カリウムが添加された反応液中の該ヨウ化カリウムを電気分解して徐々にヨウ素を生成させて反応液中に残存する該ヨウ素還元剤量を電量滴定し、電気的測定によって該電量滴定の終点を検出することで該電量滴定に要した該ヨウ素量を測定するヨウ素測定工程と、を備え、該ヨウ素測定工程で測定されたヨウ素量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする。
【００１０】
第３発明の還元糖測定方法は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液を煮沸しつつ既知濃度の標準還元糖溶液を徐々に加えて該反応液中に残存する該２価銅イオン量を容量滴定し、電気的測定によって該容量滴定の終点を検出することで該容量滴定に要した該標準還元糖量を測定する標準還元糖測定工程と、を備え、該標準還元糖測定工程で測定された標準還元糖量から該還元糖試料中の還元糖量を算出することを特徴とする。
【００１１】
第１発明および第２発明の還元糖測定方法において、上記一定煮沸条件は、上記水溶液を２分３０秒以内に沸騰させた後に３分間沸騰させ、その後１分間急冷する条件であることが好ましい。
【００１２】
第３発明の還元糖測定方法において、上記一定煮沸条件は、上記水溶液を２分３０秒以内に沸騰させた後に３分間沸騰させる条件であることが好ましい。
【００１３】
第１発明および第２発明の還元糖測定方法において、上記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムおよびジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１４】
第１発明または第３発明の還元糖測定方法において、電気的測定は、反応液の分極電流と分極電位差と酸化還元電位との少なくとも１種を測定することが好ましい。
【００１５】
第２発明の還元糖測定方法において、電気的測定は、反応液の分極電流と分極電位差との少なくとも１種を測定することが好ましい。
【００１６】
第１発明または第２発明の還元糖測定方法において、上記ヨウ素還元剤はチオ硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００１７】
第１発明または第２発明の還元糖測定方法において、上記還元糖量は、上記亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて算出されることが好ましい。
【００１８】
第４発明の還元糖測定装置は、第１発明の還元糖測定方法によって還元糖を測定するための装置である。第４発明の還元糖測定装置は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、によって得られた反応液中に、既知濃度のヨウ素還元剤を徐々に加えて該反応液中に残存する該ヨウ素量を容量滴定する際に、該反応液の酸化還元電位と分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定して該容量滴定の終点を検出するための、複合白金電極と双白金つの型電極との少なくとも一方をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする。
【００１９】
第５発明の還元糖測定装置は、第２発明の還元糖測定方法によって還元糖を測定するための装置である。第５発明の還元糖測定装置は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程と、該亜酸化銅生成工程後の反応液に該反応液に残存する該２価銅イオンに対して過剰量となるキレート剤を加え、該反応液中に残存する該２価銅イオンをキレートするキレート工程と、該キレート工程後の反応液に該亜酸化銅に対して過剰量となる所定量のヨウ素を加え、該ヨウ素で該反応液中の該亜酸化銅を酸化する亜酸化銅酸化工程と、該亜酸化銅酸化工程後の反応液に該反応液に残存する該ヨウ素に対して過剰量となる所定量のヨウ素還元剤を加え、該反応液中に残存する該ヨウ素を還元するヨウ素還元工程と、該キレート工程後から該ヨウ素還元工程後の何れかの反応液にヨウ化カリウムを加えるヨウ化カリウム添加工程と、によって得られた反応液中に所定電流を印加して該ヨウ化カリウムを電気分解し徐々にヨウ素を生成させるための双白金渦巻型電極をもつ電気分解手段と、該ヨウ素によって反応液中に残存する該チオ硫酸ナトリウム量を電量滴定する際に、該反応液の分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定して該電量滴定の終点を検出するための、双白金つの型電極をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする。
【００２０】
第６発明の還元糖測定装置は、第３発明の還元糖測定方法によって還元糖を測定するための装置である。第６発明の還元糖測定装置は、定量測定すべき還元糖試料に該還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させて亜酸化銅を生成させる亜酸化銅生成工程によって得られた反応液を、煮沸しつつ既知濃度の標準還元糖溶液を徐々に加えて該反応液中に残存する該２価銅イオン量を容量滴定する際に、該反応液の酸化還元電位と分極電流との少なくとも一種を測定して該容量滴定の終点を検出するための、複合白金電極と双白金つの型電極との少なくとも一方をもつ滴定量測定手段を備えることを特徴とする。
【００２１】
第４発明および第５発明の還元糖測定装置は、さらに、上記終点から算出された上記反応液中の上記チオ硫酸ナトリウム量から上記還元糖試料中の還元糖量を算出する演算手段を備えることが好ましい。そして、この演算手段は、上記亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて上記還元糖試料中の還元糖量を算出することが望ましい。
【００２２】
第６発明の還元糖測定装置は、さらに、上記終点から算出された上記標準還元糖量から該還元糖試料中の還元糖量を算出する演算手段を備えることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
滴定の終点を目視によらずに検出する方法としては、上述した電気滴定法が優れている。しかし、上述したように、アルカリ性銅試薬法を用いる場合には、反応液中に残存する２価銅イオンの存在により正確な測定値が得られない問題や、煮沸条件下で強アルカリとともに使用することで電極の性能が劣化するために終点を正確に検出することができない問題がある。
【００２４】
本発明の発明者らは、鋭意研究の結果、反応液中に２価銅イオンをキレートするキレート剤を添加することで、亜酸化銅生成工程後に反応液中に残存する２価銅イオンが検知電極と電気化学的に反応することを抑制し、反応液中に残存する２価銅イオンが還元糖の測定に与える影響を低減できることを見いだした。
【００２５】
また本発明の発明者らは、アルカリ性銅試薬法における２価銅イオンと還元糖との反応が、従来知られている反応機構とは異なる反応機構によることを見いだした。このことにより、換算表や検量線を要さずに滴定の終点から還元糖量を算出することが可能となった。
【００２６】
すなわち従来は、アルカリ性銅試薬法における２価銅イオンと還元糖との反応時には、２モルの２価銅イオンが１モルの還元糖とのみ反応して２モルの亜酸化銅が生成すると考えられていた。しかし、この反応機構を基に還元糖量を算出する場合には正確な値が得られないために、従来は換算表や検量線を用いて還元糖量を算出していた。このため、上述したように還元糖測定に長時間を要するとともに煩雑な操作を要する問題があった。
【００２７】
本発明の発明者らは鋭意研究の結果、２価銅イオンと還元糖との反応時には約１０モルの銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することを見いだした。この反応機構は明らかではないが、おそらく、２価銅イオンは還元糖の酸化剤であると同時に触媒的作用を果たし、２価銅イオンと還元糖との反応には反応液中や空気中の酸素が関与していると考えられ、下に示す化１式のような反応が生じていると考えられる。
【００２８】
【化１】
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【００２９】
この新たな反応機構を基に還元糖量を算出することで、換算表や検量線等を用いずに正確な還元糖量を得ることが可能となり、還元糖測定に要する時間を短縮できるとともに還元糖測定を簡易な操作でおこなうことが可能となる。
【００３０】
第１発明及び第２発明の還元糖測定方法では、反応液中に残存する２価銅イオンをキレート剤によりキレートすることで、２価銅イオンが検知電極に与える影響を低減して電気滴定法により正確な終点を検出することが可能となる。また、電気滴定法により終点を検出することで、還元糖量を簡便かつ正確に測定することが可能となる。そして、この場合、２価銅イオンと還元糖との反応時には約１０モルの銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて、滴定により得られた亜酸化銅量から還元糖試料中の還元糖量を算出することで、換算表や検量線を用いることなく正確な還元糖量を得ることが可能となる。
【００３１】
また、第２発明の還元糖測定方法では、通常用いられる容量滴定にかえて電量滴定を用いることで、容量滴定の際に必要な滴定剤用の送液装置等を必要とせず、滴定に要する装置を小型化することが可能となる。
【００３２】
また、第３発明の還元糖測定方法では、電気滴定法により終点を検出することで、第１発明及び第２発明と同様に還元糖量を簡便かつ正確に測定することが可能となる。
【００３３】
そして、第４発明から第６発明の還元糖測定装置では、電気滴定用の検出電極として、耐久性に優れた双白金つの型電極や複合白金電極を用いることで、アルカリ性銅試薬法を用いつつ電気滴定法で還元糖を測定する還元糖測定装置の耐久性を向上することができる。また、このうち第５発明の還元糖測定装置では、電量滴定用の電解電極として耐久性に優れた双白金渦巻型電極を用いることで、同様に、還元糖測定装置の耐久性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
アルカリ性銅試薬法には、上述したとおり種々の方法があるが、還元糖試料中の還元糖濃度によってそれぞれ適する方法がある。このうちソモギー法やソモギー法を改良したソモギー変法は、比較的還元糖の含量が低い還元糖試料中の還元糖量を測定する場合に適した方法である。
【００３５】
ソモギー法やソモギー変法は、２価銅イオンと還元糖との反応によって生成した亜酸化銅をヨウ素で酸化し滴定するヨードメトリーを含む方法であるため、ヨードメトリーの終点を電気滴定の一般的な方法である酸化還元電位の変化等によって検出することができると考えられる。さらに、ソモギー法では２価銅イオンが同モルのアルドース及びケトースと反応することから、還元糖の総量を単一の係数で算出することができる。
【００３６】
第１発明の還元糖の測定方法は、ソモギー法を改良した方法であり、亜酸化銅生成工程において、定量測定すべき還元糖試料に、この還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンを配合したアルカリ性水溶液を一定煮沸条件下で反応させて、還元糖試料中の還元糖を２価銅イオンによって還元して亜酸化銅を生成させる。この亜酸化銅生成工程は、ソモギー法等の一般的なアルカリ性銅試薬法に沿った方法でおこなうことができ、例えば、水に硫酸銅や塩化第２銅等を溶解させることで、反応液中に２価銅イオンを生成させ、さらに、反応液に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を加えることで反応液をアルカリ性水溶液とすることができる。
【００３７】
ここで、反応液のｐＨは１０〜１１．５程度であることが好ましい。また、還元糖試料中の還元糖をすべて還元するために反応液中の２価銅イオン量は還元糖量に対して過剰である必要があり、キレート剤を残存する２価銅イオン量に対して過剰となる量添加するために反応液中の２価銅イオン量は所定量である必要がある。
【００３８】
また、一定煮沸条件とは、反応液中の還元糖が全て２価銅イオンと反応する条件であり、例えば、アルカリ性水溶液を２分３０秒以内に沸騰させた後に正確に３分間沸騰させ、その後１分間急冷する条件や、沸騰温浴中で１０分間加熱した後に５分間冷却する条件等の、ソモギー法やソモギー変法で一般に用いられる既知の種々の煮沸条件を用いることができる。なお、アルカリ性水溶液を２分以内に沸騰させた後に正確に３分間沸騰させ、その後１分間急冷する条件を用いる場合には、還元糖と２価銅イオンとの反応に要する時間を短縮できる利点がある。なお、還元糖と２価銅イオンとの反応によって生じた亜酸化銅は、空気中の酸素で酸化され易いために、煮沸後の反応液は急冷することが好ましい。急冷の条件としては、反応液の温度を５分以内に室温にまで低下させる条件が好ましく、反応液の温度を１分以内に室温にまで低下させる条件が望ましい。
【００３９】
キレート工程では、亜酸化銅生成工程後の反応液に過剰量のキレート剤を加えることで、反応液中に残存する２価銅イオンをキレートする。ここでいうキレート剤の過剰量とは、反応液中に残存する２価銅イオンに対して過剰となる量をいう。キレート剤は、２価金属イオンとキレート型化合物を作るものであれば良く、例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）やジエチレントリアミン-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−五酢酸（ＤＰＴＡ）が好ましく用いられる。
【００４０】
そして、亜酸化銅酸化工程では、キレート工程後の反応液に過剰量となる所定量のヨウ素を加え、このヨウ素で反応液中の亜酸化銅を酸化する。ここでいうヨウ素の過剰量とは、反応液中の亜酸化銅に対して過剰となる量をいう。
【００４１】
反応液中に過剰量のヨウ素を加える方法としては、例えば、反応液中に過剰量のヨウ素酸カリウム溶液およびヨウ化カリウム溶液を加えて、ヨウ素酸カリウムとヨウ化カリウムとの反応によって過剰量のヨウ素を生成させる方法を用いることもできる。また、反応液中に過剰量のヨウ化カリウムを加えて、ヨウ化カリウムを電気分解して過剰量のヨウ素を生成させる方法を用いることもできる。さらに、これに限らず既知の種々の方法を用いることもできる。
【００４２】
ヨウ素還元剤測定工程では、亜酸化銅酸化工程後の反応液中に既知濃度のヨウ素還元剤を徐々に加えて反応液中に残存するヨウ素量を容量滴定し、電気的測定によって終点を検出することで容量滴定に要したヨウ素還元剤量を測定する。ヨウ素還元剤としては、チオ硫酸ナトリウムやシュウ酸ナトリウム等が好ましく用いられる。
【００４３】
また、ここでいう電気的測定としては、例えば、反応液の酸化還元電位を測定する方法等の既知の種々の方法を用いることができる。また、反応液の分極電流や分極電位差等を測定する方法を用いても良い。これらの方法によると、分極の変化、すなわち、正負両極と電解質の界面における電荷移動の遅れや、電極近傍での物質移動の遅れなどによる起因する過電圧の変化を利用して終点を検出できる。
【００４４】
第１発明の還元糖測定方法において、還元糖試料中の還元糖量を算出する方法を以下に例示する。
【００４５】
先ず、ヨウ素還元剤測定工程で測定されたヨウ素還元剤量から亜酸化銅生成工程で生成した亜酸化銅量を算出する。すなわち、
（１）ヨウ素還元剤測定工程で検出された終点を基に、ヨウ素還元剤測定工程で反応液に加えたヨウ素還元剤量を測定し、
（２）ヨウ素還元剤測定工程で反応液に加えたヨウ素還元剤量から、亜酸化銅酸化工程後の反応液に残存するヨウ素量を算出し、
（３）亜酸化銅酸化工程後の反応液に残存するヨウ素量と亜酸化銅酸化工程で反応液に加えたヨウ素量とから、亜酸化銅酸化工程で亜酸化銅と反応したヨウ素量を算出し、
（４）亜酸化銅酸化工程で亜酸化銅と反応したヨウ素量から、亜酸化銅生成工程で生成した亜酸化銅量を算出する。
【００４６】
次に、亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づく換算係数を用いて、上記（１）〜（４）で算出された亜酸化銅量から還元糖試料中の還元糖量を算出する。
【００４７】
ここで、第１発明の還元糖測定方法においては、キレート工程において亜酸化銅生成工程後の反応液中に残存する２価銅イオンがキレートされるため、終点を電気的測定で検出する際にも２価銅イオンと検出電極とが反応することはなく、終点を正確に検出することができる。
【００４８】
また、亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて還元糖試料中の還元糖量を算出する場合には、換算表や検量線を要さずに滴定の終点から還元糖量を算出することが可能になる。
【００４９】
第２発明の還元糖測定方法は、第１発明で用いた容量滴定にかえて電量滴定を用いる方法である。電量滴定では、目的成分を含む電解液を定電流で電気分解することで目的成分を反応液中に徐々に加える。そして、滴定の終点に達するまでの電解時間を測定し、電気分解の際の電流の大きさと電解時間との積から電気分解に要した電気量を求めて、ファラデーの法則により目的成分の生成量を算出する。したがって電量滴定によると、容量滴定のように滴定剤を反応液中に送液する送液装置等を要さない利点がある。
【００５０】
この第２発明の還元糖測定方法においては、亜酸化銅生成工程、キレート工程および亜酸化銅酸化工程は第１発明の還元糖測定方法と同じである。
【００５１】
第２発明の還元糖測定方法において、ヨウ素還元工程では、亜酸化銅酸化工程後の反応液に残存するヨウ素に対して過剰量となる所定量のヨウ素還元剤を加えて反応液中に残存するヨウ素を還元する。また、ヨウ素還元剤は第１発明と同様に溶液状で加えても良いし、あるいはその他種々の状態で加えても良い。
【００５２】
ヨウ化カリウム添加工程では、キレート工程後〜ヨウ素還元工程後の何れかの反応液にヨウ化カリウムを加える。ここで、例えば、亜酸化銅酸化工程でヨウ素酸カリウムとヨウ化カリウムとからヨウ素を生成させる場合には、亜酸化銅酸化工程で加えるヨウ化カリウムの量をヨウ素酸カリウムに対して過剰量にすることで、反応液中にヨウ化カリウムが残存する。また、例えば亜酸化銅酸化工程でヨウ化カリウムを電気分解してヨウ素を生成させる場合にも、亜酸化銅酸化工程で加えるヨウ化カリウム量を電気分解に要する量に対して過剰にすることで、反応液中にヨウ化カリウムが残存する。
【００５３】
また、キレート工程前の反応液にヨウ化カリウムを加えると、後述する副反応が生じてヨウ化カリウムからヨウ素が生成するために、ヨウ化カリウムの添加は少なくともキレート工程後に行う。
【００５４】
ヨウ素測定工程では、ヨウ化カリウムが添加された反応液中のヨウ化カリウムを電気分解して、反応液中に徐々にヨウ素を生成させる。そしてこのヨウ素によってヨウ素還元工程後の反応液に残存するヨウ素還元剤を電量滴定する。なお、この滴定の終点は上述した第１発明と同様に電気的測定によって検出する。
【００５５】
ヨウ化カリウムの電気分解によってヨウ素が生成する反応は、以下に示す化２式及び化３式に基づく。すなわち、化２式に示されるようにヨウ化カリウムが反応液に溶解して生じたヨウ素イオンが、化３式に示されるように電気分解されてヨウ素が生成する。
【００５６】
【化２】
2005283294.tif 000004
【００５７】
【化３】
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【００５８】
第２発明の還元糖測定方法において、還元糖試料中の還元糖量を算出する方法を以下に例示する。
【００５９】
先ず、ヨウ素測定工程で測定されたヨウ素量から亜酸化銅生成工程で生成した亜酸化銅量を算出する。すなわち、
（１）ヨウ素測定工程で検出された終点を基にヨウ素測定工程で生成したヨウ素量を測定し、
（２）ヨウ素測定工程で生成したヨウ素量から、ヨウ素還元工程後の反応液中に残存するヨウ素還元剤量を算出し、
（３）ヨウ素還元工程後の反応液に残存するヨウ素還元剤量から、ヨウ素還元工程でヨウ素と反応したヨウ素還元剤量を算出し、
（４）ヨウ素還元工程でヨウ素と反応したヨウ素還元剤量から、亜酸化銅酸化工程後の反応液に残存するヨウ素量を算出し、
（５）亜酸化銅酸化工程後の反応液に残存するヨウ素量と亜酸化銅酸化工程で反応液に加えたヨウ素量から、亜酸化銅酸化工程で亜酸化銅と反応したヨウ素量を算出し、
（６）亜酸化銅酸化工程で亜酸化銅と反応したヨウ素量から、亜酸化銅生成工程で生成した亜酸化銅量を算出する。
【００６０】
次に、亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づく換算係数を用いて、上記（１）〜（６）で算出された亜酸化銅量から還元糖試料中の還元糖量を算出する。
【００６１】
ここで、第２発明の還元糖測定方法においては、第１発明の還元糖測定方法と同様に、キレート工程において反応液中に残存する２価銅イオンがキレートされることによって、終点を正確に検出することができる。
【００６２】
また、亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて還元糖試料中の還元糖量を算出する場合には、換算表や検量線を要さずに滴定の終点から還元糖量を算出することが可能になる。
【００６３】
第３発明の還元糖の測定方法は、レインエイノン定容法を改良した方法である。上述したソモギー法等が、反応液中の還元糖濃度が比較的低濃度である場合に好ましく用いられるに対して、レインエイノン定容法では反応液中の還元糖濃度が比較的高濃度である場合に好ましく用いられる。一般に製糖業界では、還元糖含量の高い還元糖試料を測定する場合が多く、例えば、総量５０ｍｌの反応液中に数十ｍｇの還元糖が含まれる場合等があるため、レインエイノン定容法が広く用いられている。また、レインエイノン定容法は製糖業界で国際的な公定法（Ｍｅｔｈｏｄ  ＧＳ１／３／７−３（１９９４））であるため、レインエイノン定容法を基にした第３発明の還元糖測定方法は、公定法に準拠した方法となる。
【００６４】
レインエイノン定容法は、２価銅イオンと還元糖との反応で生成する亜酸化銅と残存する２価銅イオン量とを区別して測定するのではなく、２価銅イオンを全て亜酸化銅にまで還元するのに要する還元糖量から、還元糖試料中の還元糖量を算出する方法である。このレインエイノン定容法には還元糖と２価銅イオンとの反応しか関与しないため、レインエイノン定容法は極めてシンプルで直接的な方法といえる。
【００６５】
第３発明の還元糖測定方法では、亜酸化銅生成工程において、定量測定すべき還元糖試料とこの還元糖試料に対して過剰量となる所定量の２価銅イオンとを含むアルカリ性水溶液を煮沸条件下で反応させる。２価銅イオンの生成源は、第１発明と同様に硫酸銅等の種々のものを用いることができる。なお、第３発明においては亜酸化銅生成工程後に行う標準還元糖測定工程でも引き続き煮沸条件下で反応を進行させるために、亜酸化銅生成工程における煮沸条件は、第１発明や第２発明の煮沸条件とは異なり、煮沸後の急冷を含まなくても良い。本第３発明の煮沸条件としては、その他、レインエイノン定容法で通常用いられる煮沸条件を用いても良い。
【００６６】
標準還元糖測定工程では、亜酸化銅生成工程後の反応液を煮沸しつつ既知濃度の還元糖溶液である標準還元糖溶液を徐々に加えて、反応液中に残存する２価銅イオン量を容量滴定し、電気的測定によって終点を検出することで容量滴定に要した標準還元糖量を測定する。本第３発明の還元糖測定方法において、電気的測定は上述した第１発明の場合と同様におこなえばよい。
【００６７】
亜酸化銅生成工程において２価銅イオンは還元糖に対して過剰量添加されているため、亜酸化銅生成工程後の反応液中には２価銅イオンが残存する。したがって、亜酸化銅生成工程後の反応液にさらに標準還元糖溶液を加えることで、２価銅イオン量を容量滴定することができる。
【００６８】
なお、本第３発明の還元糖測定方法で用いる標準還元糖溶液は、還元糖試料と同じ試料から調製したものであっても良いし、異なる試料から調製したものであっても良い。例えば、標準還元糖溶液として、既知量の還元糖を含む試料を水等に溶解させて調製した既知濃度の還元糖溶液を用いる場合には、アルカリ性水溶液中の２価銅イオン量と、標準還元糖溶液中に含まれる還元糖量とから、還元糖試料に含まれる還元糖量を算出できる。
【００６９】
また、還元糖試料と同じ未知量の還元糖を含む試料から標準還元糖溶液を調製する場合には、アルカリ性水溶液中の２価銅イオンの量から、標準還元糖溶液に含まれる還元糖量と還元糖試料中に含まれる還元糖量との和が算出され、標準還元糖溶液の濃度と還元糖試料の量（還元糖試料として液体状のものを用いる場合にはその濃度）とから、還元糖試料に含まれる還元糖の量が算出できる。
【００７０】
第３発明の還元糖測定方法において、還元糖試料中の還元糖量を算出する方法を以下に例示する。
【００７１】
先ず、標準還元糖測定工程で検出された終点から標準還元糖測定工程で加えた生成した亜酸化銅量を算出する。すなわち、
（１）予め、反応液中の２価銅イオンを完全に消費する還元糖量（以下、所要還元糖総量と呼ぶ）を算出しておき、
（２）標準還元糖測定工程で得られた終点を基に、標準還元糖測定工程で加えた還元糖量を算出し、
（３）予め算出しておいた所要還元糖総量と、還元糖量標準還元糖測定工程で加えた標準還元糖量との差から、反応液中の還元糖量、すなわち、還元糖試料中の還元糖量を算出する。
【００７２】
第３発明の還元糖測定方法によると、滴定の終点を電気的測定によって検出することから終点の検出を目視に依らずおこなうことができる。また、例えば予め所要還元糖総量を算出しておく際に、約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて還元糖量を算出すれば、所要還元糖総量を容易かつ正確に算出することができる。
【００７３】
ここで、従来のレインエイノン定容法では、標準還元糖測定工程後の反応液の総量が約７５ｍｌとなるように容量滴定をおこなうことが定められていた。しかし、標準還元糖測定工程後の反応液の総量を約７５ｍｌとするためには、還元糖試料溶液毎に予め予備滴定をおこない、還元糖試料溶液中の還元糖量を予め調整しておく必要がある。例えば還元糖試料溶液中の還元糖量が多すぎて標準還元糖測定工程後の反応液の総量が７５ｍｌを大きく上回るような場合には還元糖試料溶液を希釈する必要がある。また、還元糖試料溶液中の還元糖量が少なすぎて標準還元糖測定工程後の反応液の総量が７５ｍｌを大きく下回るようであれば、還元糖試料溶液に既知量の還元糖を補填した後に再度予備滴定をおこなう必要がある。また、標準還元糖測定工程後の反応液の総量が７５ｍｌをさらに大きく上回る場合やさらに大きく下回る場合には、還元糖試料溶液を再度調製して、再度予備滴定をおこなう必要がある。このような操作は非常に煩雑であるために、還元糖の測定が遅延する事情があった。さらに、予備滴定の結果に応じて希釈等の操作が必要になるために、自動滴定装置等を用いた分析操作を行うことができない事情もあった。
【００７４】
そこで、標準還元糖測定工程後の反応液の総量が約７５ｍｌである場合と、７５ｍｌを大きく上回る場合や大きく下回る場合とで、２価銅イオンを還元するのに要する還元糖の量がどの程度変化するかを検証した。
【００７５】
先ず、後述する実施例５で用いた銅試薬と同じ銅試薬２０ｍｌに２５ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４５ｍｌ、５０ｍｌ、５５ｍｌ、６５ｍｌの各量の蒸留水を加えて試験１〜７の２価銅イオンを含む水溶液を調製した。この試験１〜７の水溶液中の２価銅イオン量を、１０ｍｇ／ｍｌの標準還元糖溶液によって滴定した。そして、水溶液中の２価銅イオンを還元するのに要した還元糖量と反応液の総量とを比較した。その結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
表１に示すように、反応液の総量が７５ｍｌでなくても、最終液量が７５ｍｌ±２０ｍｌで、同量の銅試薬を還元するのに要する還元糖の総量はほぼ１０３ｍｇであった。このように、反応液の総量が７５ｍｌでなくても、還元糖試料の濃度を正確に算出することが可能であることがわかる。
【００７８】
なお、第１発明〜第３発明の還元糖測定方法において、還元糖試料が還元糖以外の成分を多く含むような場合には、既知の方法によってタンパク質、脂肪、色素等に代表される還元糖以外の成分を除去することが好ましい。
【００７９】
第４発明の還元糖測定装置は、第１発明の還元糖測定方法によって還元糖を測定するための装置である。第４発明の還元糖測定装置は、第１発明の還元糖測定方法におけるヨウ素還元剤測定工程で容量滴定の終点を検出するための滴定量測定手段を備える。この滴定量測定手段は、反応液の酸化還元電位と分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定するための、双白金つの型電極と複合白金電極との少なくとも一方をもつ。滴定量測定手段は、双白金つの型電極と複合白金電極との少なくとも一方（以下、検出電極と呼ぶ）のみを備えるものであっても良いし、検出電極で検知した電流や電圧を表示するための表示手段等を備えるものであっても良い。また、これ以外にも既知の自動滴定装置に設けられる既知の種々の手段を設けることもできる。
【００８０】
双白金つの型電極は、互いに離間して配置された２本の白金線を持つ電極であり、上述した反応液の分極電位差や分極電流を検出することができる。
【００８１】
複合白金電極は、白金からなり、内部に比較極を備えた電極であり、上述した反応液の酸化還元電位を検出することができる。
【００８２】
第４発明の還元糖測定装置では、検出電極として双白金つの型電極や複合白金電極の少なくとも一方を備えることで、電気的方法を用いた終点検出をおこなうことができる。そして双白金つの型電極や複合白金電極は耐久性に優れた電極であるため、一般的な電極を用いた場合と異なり、煮沸されたアルカリ性の反応液の電流や電位差を測定しても電極の劣化等が生じにくく、滴定の終点を正確に検出することができる。このうち、双白金つの型電極は特に耐久性に優れることから、特に好ましく用いられる。
【００８３】
第４発明の還元糖測定装置には、滴定量測定手段以外にも、反応液を収容するための収容容器を設けてもよいし、反応液を煮沸するための加熱手段や加熱手段による加熱時間や加熱温度を制御する加熱制御手段、煮沸後の反応液を冷却するための冷却手段等を設けてもよい。なお、冷却手段としては、例えば冷水を反応液が収容された収容容器の外側に循環させるような手段や、反応液中に冷水を注入する手段等に代表されるの種々の既知の手段を用いることができる。また第１発明のキレート工程で反応液にキレート剤を加えるためのキレート剤添加手段や、第１発明の亜酸化銅酸化工程で反応液にヨウ素を加えるためのヨウ素添加手段を設けても良い。さらに、第１発明のヨウ素還元剤測定工程で反応液中にヨウ素還元剤を滴下するための滴下手段や送液装置を設けてもよい。その他、ヨウ素還元剤測定工程で検知電極により検知された電流や電圧をもとに滴定の終点を判定したり、終点を基に還元糖量を算出するための演算手段を設けてもよい。演算手段と送液手段とを接続して、演算手段によって送液手段の駆動を制御してもよい。さらに、測定後に検出電極を電気化学的にクリーニングできるクリーニング手段を備えても良い。また、これ以外にも、既知の自動滴定装置に設けられる既知の種々の手段を設けることができる。
【００８４】
第５発明の還元糖測定装置は、第２発明の還元糖測定方法によって還元糖の測定をおこなうための装置である。この還元糖測定装置は、第２発明におけるヨウ素測定工程でヨウ素を電解生成させるための電気分解手段と、第２発明におけるヨウ素測定工程で反応液の分極電流と分極電位差との少なくとも一種を測定するための滴定量測定手段とを備える。
【００８５】
滴定量測定手段は、上述した第４発明の還元糖測定装置の滴定量測定手段と同様のものを用いることができる。
【００８６】
電気分解手段は双白金渦巻型電極をもつ。この双白金渦巻型電極は、白金線が渦巻状に丸められてなる２つの電極が互いに離間して配置されたものであり、白金線が渦巻状に丸められていることで、電極の表面積が大きくなったものである。この双白金渦巻型電極は、定電流を供給することで反応液中に加えられたヨウ化カリウムを電気分解してヨウ素を生成させることができる。電気分解手段は、双白金渦巻型電極のみを備えるものであっても良いし、双白金渦巻型電極の出力電流等を表示するための表示手段等を備えるものであっても良い。そして、測定後に双白金渦巻型電極を電気化学的にクリーニングできるクリーニング手段を備えていることが望ましい。
【００８７】
第５発明の還元糖測定装置では、検出電極として双白金つの型電極を備えることで、上述した第４発明と同様に、電気的方法を用いた終点検出をおこなうとともに、滴定の終点を正確に検出することができる。さらに、電気分解手段を備えることで、滴定のための滴下手段や送液装置等を別途設けたり、滴下手段や送液装置等を本発明の還元糖測定装置以外に別途用意する必要が無くなる。そして、電気分解手段のうちヨウ素を電解生成するための双白金渦巻型電極は上述した双白金つの型電極等と同様に耐久性に優れた電極であるために、反応液中にヨウ素を安定して供給することができる。なお、この第５発明の還元糖測定装置にも、上述した第４発明の還元糖測定装置と同様に加熱手段等を設けてもよい。
【００８８】
第６発明の還元糖測定装置は、第３発明の還元糖測定方法によって還元糖の測定をおこなうための装置である。この還元糖測定装置は、第３発明における標準還元糖測定工程で反応液の酸化還元電位と分極電流との少なくとも一種を測定するための滴定量測定手段を備える。滴定量測定手段は、上述した第４発明の還元糖測定装置の滴定量測定手段と同様のものを用いることができる。
【００８９】
第６発明の還元糖測定装置では、第４発明の還元糖測定装置と同様に、電気的方法を用いた終点検出をおこなうことができ、双白金つの型電極や複合白金電極の優れた耐久性に起因して滴定の終点を正確に検出することができる。特に、双白金つの型電極は上述したように非常に優れた耐久性を発揮するために、滴定の終点をより正確に検出することができる。
【００９０】
ここで、第３発明の還元糖測定方法では、煮沸下で滴定をする必要があるために、検出電極には特に高い耐久性が要求される。そして、検出電極として酸化還元電極を用いる場合には、酸化還元電極をクリーニングできるクリーニング手段を備えていることが好ましい。このうち双白金つの型電極は、構造が簡単であるため耐久性とクリーニングのし易さとを兼ね備えており、特に好ましく用いられる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明の還元糖測定方法および測定装置を例を挙げて説明する。
【００９２】
（実施例１）
実施例１は第１発明および第４発明に関する実施例である。本実施例において還元糖測定に用いた還元糖測定装置を図１に示す。
【００９３】
本実施例１の還元糖測定装置１は、検出電極としての複合白金電極２をもつ滴定量測定手段３をもつ。滴定量測定手段３は、さらに、測定後に複合白金電極２を電気化学的にクリーニングするクリーニング手段（図示せず）を備えている。クリーニング手段は、硫酸酸性化で滴定とは逆方向に電流を流すものである。
【００９４】
また、本実施例１の還元糖測定装置１は、反応液５を収容するための第１の収容容器６、反応液５を煮沸するための加熱手段７、反応液５を冷却するための冷却手段９、ヨウ素還元剤としてのチオ硫酸ナトリウム溶液８を反応液５中に滴下するための自動滴定手段１０、および、複合白金電極２に接続され複合白金電極２によって検知された酸化還元電位をもとに滴定の終点を判定し、さらに、終点を基に還元糖量を算出する演算手段１１を備えている。このうち、加熱手段７はホットスターラであり、冷却手段９は冷却水を収容容器６の表面に接触させるための冷却管である。また、演算手段１１はマイクロコンピュータである。また、収容容器６は反応液５を収容する容器部１２と容器部１２の開口を覆う蓋部１３とからなり、蓋部１３には攪拌子１５が取りつけられている。この攪拌子１５は、容器部１２に反応液５が収容される容器部１２の開口が蓋部１３で閉じられると、反応液５中に挿入されるようになっており、加熱手段７のホットスターラにより回転して反応液５を攪拌する。
【００９５】
加熱手段７には、反応液５の温度を検知する温度検知手段１６が接続されるとともに、加熱手段７による加熱時間と加熱温度とを制御する加熱制御手段（図示せず）が接続されている。
【００９６】
また、自動滴定手段１０には、チオ硫酸ナトリウム溶液８を収容するための第２の収容容器１７、反応液５中にチオ硫酸ナトリウム溶液８を滴下するための滴下手段１８、および、第２の収容容器１７中のチオ硫酸ナトリウム溶液８を滴下手段１８に送る送液手段２０が設けられている。自動滴定手段１０は演算手段１１に接続され、演算手段１１で滴定の終点が検出されると信号を受けて送液装置２０の駆動が停止するようになっている。
【００９７】
本実施例１において、還元糖の測定は以下のようにおこなった。
【００９８】
Ａ．試薬の調製
（ａ）０．５Ｎのヨウ素酸カリウム溶液の調製
４４５．８ｍｇのヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ3）を精密にはかり、水に溶かして２５．０ｍｌとし、０．５Ｎのヨウ素酸カリウム溶液とした。
【００９９】
（ｂ）銅試薬の調製
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ７１ｇと酒石酸カリウムナトリウム４０ｇとを水約４００ｍｌに溶かし、次に１ＮのＮａＯＨ溶液１００ｍｌを加えて、かき混ぜながら、液面にまで達する漏斗を用いてＣｕＳＯ4溶液（１０ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏに水を加えて全量を１００ｍｌにしたもの）８０ｍｌを加えた。次に、４１０ｇのＮａ2ＳＯ4・１０Ｈ2Ｏを加えて溶かし、０．５Ｎのヨウ素酸カリウム溶液１８ｍｌを加えて水で１０００ｍｌにした。これを１〜２日間放置した後に濾過して着色瓶に貯えた。
【０１００】
（ｃ）２．５％ＫＩ溶液の調製
２．５ｇのＫＩをはかりとり、微量のＮａ2ＣＯ3溶液を加えるとともに水に溶かして全量を１００ｍｌにして２．５％（ｗ／ｖ）ＫＩ溶液とした。
【０１０１】
（ｄ）還元糖試料溶液の調製
還元糖試料溶液として、以下の試料溶液１〜６を調製した。試料溶液１〜５はグルコースとフルクトースとを１：１の重量比で混合した還元糖試料を含む溶液であり、試料溶液６は還元糖を含まない水溶液（水）である。試料溶液１の還元糖濃度は０．４μｍｏｌ／ｍｌ、試料溶液２の還元糖濃度は０．８μｍｏｌ／ｍｌ、試料溶液３の還元糖濃度は１．２μｍｏｌ／ｍｌ、試料溶液４の還元糖濃度は１．６μｍｏｌ／ｍｌ、試料溶液５の還元糖濃度は２．０μｍｏｌ／ｍｌ、試料溶液６の還元糖濃度は０μｍｏｌ／ｍｌであった。
【０１０２】
（ｅ）０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液の調製
市販の０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム標準液を準備した。
【０１０３】
Ｂ．還元糖量の測定
（亜酸化銅生成工程）
収容容器６に銅試薬５ｍｌを入れ、還元糖試料溶液５ｍｌと水を加えて全量を１０ｍｌとして還元糖試料と２価銅イオンとを含むアルカリ性水溶液を調製した。次に、このアルカリ性水溶液を加熱手段によって２分以内に沸騰させるとともに正確に３分間沸騰させた。この亜酸化銅生成工程で、２価銅イオンと還元糖試料中の還元糖とが反応して亜酸化銅が生成した。その後冷却手段９によって反応液を１分間急冷し、さらに、その後に２Ｎ硫酸５ｍｌを加えた。
【０１０４】
（キレート工程）
亜酸化銅生成工程後の反応液に、１００ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｎａを加えた。このＥＤＴＡ−２Ｎａによって反応液中に残存する２価銅イオンがキレートされた。
【０１０５】
（亜酸化銅酸化工程）
キレート工程後の反応液に１００ｍｇのヨウ化カリウムを添加した。このヨウ化カリウムと銅試薬に予め含まれているヨウ素酸カリウムとによってヨウ素が生成し、生成したヨウ素によって反応液中の亜酸化銅が酸化された。
【０１０６】
（ヨウ素還元剤測定工程）
亜酸化銅酸化工程後の反応液に、総液量５０ｍｌとなるように水を加えた。次いで、攪拌子１５により反応液を攪拌しつつ、自動滴定手段１０によって０．０１Ｎのチオ硫酸ナトリウム溶液を反応液に滴下し、反応液中に残存するヨウ素を容量滴定した。このとき、指示電極である複合白金電極２によって反応液中の酸化還元電位を測定した。このときの酸化還元電位を演算手段１１に送信し、演算手段１１にて酸化還元電位の変化によって滴定の終点を検出した。
【０１０７】
亜酸化銅生成工程からヨウ素還元剤測定工程までの操作をおこなった後に、演算手段１１にて、ヨウ素還元剤測定工程で滴定に要したチオ硫酸ナトリウム量を基に、試料６の場合のチオ硫酸ナトリウム滴定量との差からチオ硫酸ナトリウム減少量（ｍｏｌ）を算出した。
【０１０８】
試料溶液１の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５．６μｍｏｌ、試料溶液２の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は１７．４μｍｏｌ、試料溶液３の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は３０．６μｍｏｌ、試料溶液４の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は４３．０μｍｏｌ、試料溶液５の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５６．８μｍｏｌであった。また、還元糖を含まない試料溶液６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は０μｍｏｌであった。ここで、チオ硫酸ナトリウム減少量とは、各々の滴定に要したチオ硫酸ナトリウム量を、予め加えたヨウ素全量を還元するのに要するチオ硫酸ナトリウム量からひいた値を指す。
【０１０９】
（実施例２）
実施例２の還元糖測定装置は、指示電極が双白金つの型電極であること以外は実施例１の還元糖測定装置と同じものである。また、実施例２の還元糖測定方法は、ヨウ素還元剤測定工程で反応液中の分極電位差の変化により滴定の終点を検出した以外は実施例１と同じ方法である。
【０１１０】
本実施例２の還元糖測定方法において、分極の電位差が急激に変化した時点を終点と判断した。実施例２において、試料溶液１の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は４．６μｍｏｌ、試料溶液２の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は１６．４μｍｏｌ、試料溶液３の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は２９．０μｍｏｌ、試料溶液４の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は４１．２μｍｏｌ、試料溶液５の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５２．８μｍｏｌであった。また、還元糖を含まない試料溶液６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は０μｍｏｌであった。
【０１１１】
（実施例３）
実施例３の還元糖測定装置は実施例２の還元糖測定装置と同じものであり、実施例３の還元糖測定方法は、ヨウ素還元剤測定工程で反応液中の分極電流の変化により滴定の終点を検出した以外は実施例１と同じ方法である。
【０１１２】
本実施例３の還元糖測定方法において、分極の電流が生じた時点を終点と判断した。実施例３において、試料溶液１の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５．２μｍｏｌ、試料溶液２の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は１４．２μｍｏｌ、試料溶液３の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は２８．０μｍｏｌ、試料溶液４の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は４１．４μｍｏｌ、試料溶液５の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５３．２μｍｏｌであった。また、還元糖を含まない試料溶液６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は０μｍｏｌであった。
【０１１３】
（比較例１）
比較例１の還元糖の測定方法は、ソモギー法にしたがって目視で終点を決定する方法である。本比較例１において還元糖量の測定は以下のようにおこなった。
【０１１４】
Ａ．試薬の調製
実施例１と同じ銅試薬、２．５％ＫＩ溶液、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液および実施例１〜３と同じ還元糖試料溶液１〜試料溶液６を準備した。
【０１１５】
Ｂ．還元糖量の測定
ビーカーに還元糖試料溶液５ｍｌと銅試薬５ｍｌとを入れ、水を加えて全量を１０ｍｌとして還元糖試料と２価銅イオンとを含むアルカリ性水溶液を調製した。次に、このアルカリ性水溶液を激しく沸騰している水浴中に浸した。本比較例１においてアルカリ性水溶液の加熱時間は３分間とした。加熱終了後、反応液を冷水で冷却した後に２．５％ＫＩ溶液２ｍｌを徐々に加えた。ついで５ｍｌの２ＮのＨ2ＳＯ4を素早く加え、振り混ぜて沈殿を完全に溶解した。その後に、１％デンプン試薬１ｍｌを指示薬として、０．０１Ｎのチオ硫酸ナトリウム溶液で析出したＩ2を滴定した。滴定の終点は目視にて反応液の色の変化を検出した。
【０１１６】
滴定終了後、予め準備した検量線に基づいて、滴定に要したチオ硫酸ナトリウム量から還元糖試料溶液中の還元糖量を算出した。そして算出されたチオ硫酸ナトリウム量を基に、試料６の場合のチオ硫酸ナトリウム滴定量との差からチオ硫酸ナトリウム減少量（ｍｏｌ）を算出した。
【０１１７】
比較例１の還元糖試験方法で算出された試料溶液１の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は７．３μｍｏｌ、試料溶液２の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は１８．８μｍｏｌ、試料溶液３の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は３２．２μｍｏｌ、試料溶液４の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は４４．８μｍｏｌ、試料溶液５の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は５７．３μｍｏｌであった。また、還元糖を含まない試料溶液６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量は０μ当量であった。
【０１１８】
（実施例１〜３の方法と比較例１の方法との比較）
電気的測定により検出された終点と、従来おこなわれていた目視による終点との差異を検証するために、実施例１で還元糖試料溶液１〜６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量と、比較例１で還元糖試料溶液１〜６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量とを比較した。実施例１及び比較例１におけるチオ硫酸ナトリウム減少量を表すグラフを図２に示す。図中、縦軸はチオ硫酸ナトリウム減少量（μｍｏｌ）を示し、横軸は還元糖試料溶液中に入れた還元糖の量（μｍｏｌ）を示す。図２に示すように、実施例１の本発明の還元糖測定方法におけるチオ硫酸ナトリウム減少量は、比較例１の従来の還元糖測定方法とほぼ一致した値であった。このことから、本発明の還元糖測定方法で測定される還元糖量はソモギー法による従来の還元糖測定方法で測定される還元糖量とほぼ一致することがわかった。
【０１１９】
また、分極電流の変化により検出された終点と、分極電圧の変化により検出された終点とを比較するために、実施例２で還元糖試料溶液１〜６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウム減少量と、実施例３で還元糖試料溶液１〜６の還元糖を測定した際のチオ硫酸ナトリウムの減少量とを比較した。実施例２及び実施例３におけるチオ硫酸ナトリウム減少量を表すグラフを図３に示す。図中、縦軸はチオ硫酸ナトリウム減少量（μｍｏｌ）を示し、横軸は還元糖試料溶液中に入れた還元糖の量（μｍｏｌ）を示す。
【０１２０】
図３に示すように、分極電位差の変化によって終点を検出した場合（実施例２）も、分極電流の変化によって終点を検出した場合（実施例３）も、ほぼ同程度のチオ硫酸ナトリウム減少量を示した。また、このチオ硫酸ナトリウム減少量は、図２に示される実施例１及び比較例１のチオ硫酸ナトリウム減少量とほぼ一致した。このことから、酸化還元電位の変化によって終点を検出する場合に限らず、分極電位差の変化や分極電流の変化によって終点を検出した場合にも、還元糖の測定値は従来の還元糖測定方法で測定される測定値とほぼ一致した値が得られることが判った。
【０１２１】
さらに、図２および図３に示される結果から、何れの場合にも、２価銅イオンと還元糖との反応時には約１０モルの銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成する化学量論が成り立っていることがわかる。
【０１２２】
したがって、還元糖試料中に含まれる還元糖量は、亜酸化銅生成工程の反応液中で約１０モルの２価銅イオンが２モルの還元糖と反応して５モルの亜酸化銅が生成することに基づいて算出すればよく、換算表や検量線等を要さずに還元糖の測定を容易かつ迅速におこなうことができることがわかる。
【０１２３】
なお、参考までに、双白金つの型電極を用いた際の終点付近の分極電流の変化および分極電位差の変化を表すグラフを図４に示す。図４中（Ａ）は終点付近の分極電流の変化を表すグラフであり、図中、縦軸は分極電流（μＡ）を表し、横軸は経過時間を表し、矢印は終点を表す。また、図４中（Ｂ）は終点付近の分極電位差の変化を表すグラフであり、図中、縦軸は分極電位差（ｍＶ）を表し、横軸は経過時間を表し、矢印は終点を表す。図４に示されるように、何れの方法でも終点は鋭いピークとしてあらわれるために、終点の検出は容易におこなわれる。
【０１２４】
（実施例４）
実施例４は第２発明および第５発明に関する実施例である。本実施例において還元糖測定に用いた還元糖測定装置を図５に示す。
【０１２５】
本実施例４の還元糖測定装置２１は、双白金つの型電極２２をもつ滴定量測定手段２３と、双白金渦巻型電極２５をもつ電気分解手段２６を持つ。滴定量測定手段２３は、実施例１の還元糖測定装置と同じクリーニング手段（図示せず）を備えている。
【０１２６】
また、本実施例４の還元糖測定装置２１は、反応液２７を収容するための収容容器２８、実施例１のものと同じ加熱手段３０、実施例１のものと同じ冷却手段２９、双白金渦巻型電極２５に定電流を印加する定電流電源３１、および、双白金つの型電極２２に接続され双白金つの型電極２２によって検知された分極電流をもとに電量滴定の終点を判定し、さらに、終点を基に還元糖量を算出する演算手段３２を備えている。
【０１２７】
また、収容容器２８は反応液２７を収容する容器部３３と容器部３３の開口を覆う蓋部３５とからなり、蓋部３５には攪拌子３６と、攪拌子３６を回転させるための駆動手段（図示せず）が取りつけられている。この攪拌子３６は、容器部３３に反応液２７が収容される容器部３３の開口が蓋部３５で閉じられると、反応液中２７に挿入されるようになっており、駆動手段により回転して反応液２７を攪拌する。
【０１２８】
また、収容容器２８内には図示しない窒素ガス供給手段から延びるノズル３７が挿入されており、後述するヨウ素測定工程直前に窒素ガス供給手段から反応液２７中に窒素ガスが供給されるようになっている。
【０１２９】
加熱手段３０には、実施例１のものと同じ温度検知手段３８と加熱制御手段（図示せず）とが接続されている。また、定電流電源３１には双白金渦巻型電極２５が接続されており、この定源流電源３１は演算手段３２に接続されている。定電流電源３１による双白金渦巻型電極２５への電流の印加は、演算手段３２によって制御されている。また双白金つの型電極２２は演算手段３２と接続され、複合白金電極２２により検知された酸化還元電位は演算手段３２に送られる。
【０１３０】
本実施例において還元糖の測定は以下のようにおこなった。
【０１３１】
Ａ．試薬の調製
実施例１と同じ銅試薬および還元糖試料溶液を準備した。
【０１３２】
Ｂ．還元糖の測定
（亜酸化銅生成工程）
収容容器３３に還元糖試料溶液５ｍｌと銅試薬５ｍｌを入れ、水を加え全量を１０ｍｌとして還元糖試料と２価銅イオンとを含むアルカリ性水溶液を調製した。次に、このアルカリ性水溶液を加熱手段３０で２分以内に沸騰させるとともに正確に３分間沸騰させた。この亜酸化銅生成工程で、２価銅イオンと還元糖試料中の還元糖とが反応して亜酸化銅が生成した。その後、冷却手段２９により反応液を１分間急冷した。さらに、その後に２Ｎ硫酸５ｍｌを加えた。
【０１３３】
（キレート工程）
亜酸化銅生成工程後の反応液に、１００ｍｇのＥＤＴＡ−２Ｎａを加えた。このＥＤＴＡ−２Ｎａによって反応液中に残存する２価銅イオンがキレートされた。
【０１３４】
（亜酸化銅酸化工程）
キレート工程後の反応液に、１００ｍｇのヨウ化カリウムを加えた。このヨウ化カリウムは銅試薬中に含まれ予め反応液中に加えられているヨウ素酸カリウムと反応し、ヨウ素が生成した。そして、生成したヨウ素によって反応液中の亜酸化銅が酸化した。
【０１３５】
（ヨウ素還元工程）
亜酸化銅酸化工程後の反応液にノズル３７より反応液中に窒素ガスを導入しつつ一分間脱気し、その後に０．０１Ｎのチオ硫酸ナトリウム溶液１０．５ｍｌを加えた。ここで加えたチオ硫酸ナトリウムによって反応液中に残存するヨウ素が還元された。
【０１３６】
（ヨウ化カリウム添加工程）
亜酸化銅酸化工程において、添加されたヨウ化カリウムの量はヨウ素酸カリウムの量に対して過剰であるため、ヨウ素還元工程後の反応液中にはヨウ化カリウムが残存した。
【０１３７】
（ヨウ素測定工程）
ヨウ化カリウム添加工程後、定電流電源３１より双白金渦巻型電極２５に定電流（２４．１２ｍＡ）を印加し、反応液中のヨウ化カリウムを電気分解した。この電気分解によってヨウ素が生成し、生成したヨウ素によって反応液に残存するチオ硫酸ナトリウム量を電量滴定した。そして、反応液中の分極電流を双白金つの型電極２２によって測定することで電量滴定の終点を検出し、電量滴定に要したヨウ素量を測定した。
【０１３８】
先ず、亜酸化銅生成工程〜ヨウ素測定工程が終了した後に、ヨウ素測定工程における電量滴定の終点を基に、演算手段３２にて、反応液中に残存するチオ硫酸ナトリウムを酸化するために必要な量のヨウ素を生成させるのに要する電気量（電解電極に印加された電流量と電解時間との積算値、以下積算電気量と呼ぶ）を算出した。
【０１３９】
積算電気量と各試料溶液中に含まれる還元糖量（理論値）との関係を表すグラフを図６に示す。図６に示される還元糖量は、各々の試料溶液中に含まれると考えられる還元糖量の理論値である。図６に示されるように、還元糖量と積算電気量との間には比例関係が成立した。したがって、電量滴定によって得られた終点から算出された積算電気量を基に還元糖量を算出できることがわかる。
【０１４０】
（ＥＤＴＡ−２Ｎａ添加量の検討）
ＥＤＴＡ−２Ｎａの最適な添加量を検討した。上述したように、電気的測定で終点を検出する場合には、亜酸化銅生成工程後の反応液中に残存する２価銅イオンの影響で正確な測定値が得られない場合がある。したがって、２価銅イオンをキレートするためのキレート剤には最適な添加量がある。本試験において、銅試薬は実施例１と同じものを用い、還元糖試料溶液は実施例１と同じ試料溶液５を用い、ＥＤＴＡ−２Ｎａの量を０ｍｇ、４０ｍｇ、６０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇとかえて、実施例４の方法により還元糖の測定をおこなった。その結果、図７に示すように、積算電気量はＥＤＴＡ−２Ｎａの添加量の増加に伴って減少し、ＥＤＴＡ−２Ｎａを８０ｍｇ以上添加すると一定となった。したがって、５ｍｌの銅試薬（銅イオン含有量１６０μｍｏｌ）と５ｍｌの還元糖溶液（試験溶液５、還元糖含有量１０μｍｏｌ）とを亜酸化銅生成工程で反応させる場合、キレート工程で添加するＥＤＴＡ−２Ｎａの量は８０ｍｇ以上が好ましいことが判った。
【０１４１】
なお、実施例１と同じ銅試薬と実施例１と同じ還元糖溶液である試料溶液１〜６とを反応させ、ＥＤＴＡ−２Ｎａを添加しなかったこと以外は実施例４の還元糖測定方法と同じ方法で測定をおこなった場合には、図８に示すように積算電気量は一定しなかった。
【０１４２】
（ヨウ化カリウム添加量の検討）
実施例４の還元糖測定方法において電気分解によってヨウ素を生成させるために添加するヨウ化カリウムの添加量を検討した。通常、電量滴定においては電解の電流効率を１００％にする必要があるため、ヨウ化カリウムは総量５０ｍｌの反応液中に１ｇ前後含まれるようにする必要があると考えられる。ところが、２価銅イオンが存在すると、電気分解に関係なく、ヨウ化カリウム濃度の増加に伴ってヨウ素が生成する現象が観察された。これは、反応液中で化４式に示される副反応が生じているためと考えられる。
【０１４３】
【化４】
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【０１４４】
参考までに、ヨウ化カリウムの添加量の増加とヨウ素量との関係を表すグラフを図９に示す。図９に示すグラフは、詳しくは、種々の量のヨウ化カリウムと２価銅イオンとを含む水溶液をチオ硫酸ナトリウムで滴定した時のチオ硫酸ナトリウムの滴定量とヨウ化カリウムの添加量との関係を表すグラフである。水溶液中のヨウ化カリウムの量は、０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、６００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２５００ｍｇであり、ヨウ素酸カリウムを含まないこと以外は実施例１と同様に調製された。そして、銅試薬５ｍｌを加えることで、水溶液中に２価銅イオンを加えた 。図９によると、ヨウ化カリウムの添加量が増加するとチオ硫酸ナトリウムの滴定量が増加することから、反応液中にヨウ素量が生成していることがわかる。
【０１４５】
このように、電気分解に関係なく反応液中にヨウ素が生成することで、例えば０．２μｍｏｌ程度の還元糖を含む低濃度の還元糖を測定する際には、反応液中のヨウ化カリウム量が多くなると還元糖の検出精度が低下する場合がある。
【０１４６】
一方、通常のソモギー法では総量約５０ｍｌの反応液に含まれるヨウ化カリウムが５０ｍｇ程度に設定されているために、上述した２価銅イオンによるヨウ素の生成は抑えられるが、電流効率が悪くなるために終点の検出精度が低下する問題がある。反応液中に含まれるヨウ化カリウムの最適な量は、総量５０ｍｌの反応液中にヨウ化カリウムが８０ｍｇ〜１２０ｍｇ含まれる範囲であり、ヨウ化カリウムが１００ｍｇ含まれる場合が特に好ましい。反応液中のヨウ化カリウムの量がこの範囲であれば、上述した副反応による影響をおさえつつ電量滴定を精度良くおこなうことができる。
【０１４７】
（実施例５）
実施例５は第３発明及び第６発明に関する実施例である。本実施例５の還元糖測定装置を模式的に表す図を図１０に示す。
【０１４８】
本実施例５の還元糖測定装置４０は、実施例１のものと同じ滴定量測定手段４１を備える。また、本実施例５の還元糖測定装置４０は、実施例１のものと同じ第１の収容容器４２、加熱手段４３、および、複合白金電極４５に接続され複合白金電極４５によって検知された酸化還元電位をもとに滴定の終点を判定し、さらに、終点を基に還元糖量を算出する演算手段４６を備えている。そして自動滴定手段４７は、第２の収容容器４８に標準還元糖溶液５０が収容されるとともに反応液５１中に標準還元糖溶液５０を滴下すること以外は実施例１と同じものである。
【０１４９】
Ａ．試薬の調整
（ａ）銅試薬の調製
１３８．５６ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏを正確に秤量し、水に溶解した。この溶液を２Ｌ容メスフラスコに全量移し入れ、２０℃において水で定容して混合し溶液Ａとした。
【０１５０】
別に、６９２．１８ｇのＫＮａＣ4Ｈ4Ｏ6と２００ｇのＮａＯＨとを各々秤量し、約５００ｍｌの水に溶解した。この溶液を冷却後、２Ｌ容メスフラスコに移し、２０℃において水で定容にまで希釈し、混合して溶液Ｂとした。
【０１５１】
ガラス棒で攪拌しながら溶液Ａを溶液Ｂに注ぎ、等容量の両用液を混合して銅試薬を調製した。
【０１５２】
（ｂ）標準還元糖溶液の調製
グルコースとフルクトースとを１：１の重量比で混合した還元糖１０００ｍｇを水に溶かして全量１００ｍｌとし、１０ｍｇ／ｍｌの標準還元糖溶液を調製した。
【０１５３】
Ｂ．還元糖の測定
（亜酸化銅生成工程）
還元糖試料溶液として上述した標準還元糖溶液を用いた。
先ず、第１の収容容器４２に銅試薬２０ｍｌを入れたものを１０個準備し、このうち一つには標準還元糖溶液を加えず、残りの各第１の収容容器４２中には、上述した標準還元糖溶液を０．５ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、８ｍｌ、１０ｍｌで加えた。そして、各々の第１の収容容器４２には、さらに水４５ｍｌを加えて全量を６５〜７５ｍｌとした。この作業で、還元糖試料と２価銅イオンとを含むアルカリ性水溶液７〜１６が調製された。なお、各アルカリ性水溶液に含まれる還元糖量は、アルカリ性水溶液７が５ｍｇ、アルカリ性水溶液８が１０ｍｇ、アルカリ性水溶液９が２０ｍｇ、アルカリ性水溶液１０が３０ｍｇ、アルカリ性水溶液１１が４０ｍｇ、アルカリ性水溶液１２が５０ｍｇ、アルカリ性水溶液１３が６０ｍｇ、アルカリ性水溶液１４が８０ｍｇ、アルカリ性水溶液１５が１００ｍｇ、アルカリ性水溶液１６が０ｍｇであった。
【０１５４】
次に、このアルカリ性水溶液を加熱手段で２分以内に沸騰させるとともに正確に３分間沸騰させた。この亜酸化銅生成工程で、２価銅イオンと還元糖試料中の還元糖とが反応して亜酸化銅が生成した。
【０１５５】
（標準還元糖測定工程）
加熱手段４３により亜酸化銅生成工程後の反応液を煮沸しつつ、自動滴定手段４７により反応液中に標準還元糖溶液５０を徐々に加えて、反応液中に残存する２価銅イオンを容量滴定した。そして、複合白金電極４５により反応液中の酸化還元電位を測定し、演算手段４６にて酸化還元電位の変化を検出することで、滴定の終点を検出した。
【０１５６】
標準還元糖測定工程終了後、演算手段４６にて、標準還元糖測定工程で測定された標準還元糖量をもとに上述した方法に基づいて各試料溶液中の還元糖量を算出した。
【０１５７】
各液量の還元糖試料溶液を含むアルカリ性水溶液７〜１２およびアルカリ性水溶液１６中に含まれる還元糖量の理論値（以下、試料溶液の理論還元糖量と呼ぶ）と、標準還元糖測定工程で加えた標準還元糖溶液に含まれる還元糖量の理論値（以下、標準還元糖溶液の理論還元糖量）との和を、試料溶液毎に比較するグラフを図１１に示す。試料溶液の理論還元糖量と標準還元糖溶液の理論還元糖量との和は、各濃度の試料溶液でほぼ等しかった。
【０１５８】
試料溶液７〜１２および試料溶液１６の理論還元糖量と、標準還元糖測定工程で検出された滴定の終点を基に算出された還元糖量（試料溶液の実測還元糖量）との関係を表すグラフを図１２に示す。図１２に示されるグラフから、試料溶液の理論還元糖量が５ｍｇ〜５０ｍｇの範囲において、試料溶液の理論還元糖量と実測還元糖量とがほぼ一致することがわかる。このことから、本実施例３の還元糖測定方法によると、還元糖試料溶液中の還元糖量が正確に測定できることがわかる。
【０１５９】
上述したレインエイノン定容法では、標準還元糖測定工程後の反応液の総量が７５ｍｌになるように、予め予備滴定をおこなってアルカリ性水溶液中に添加する還元糖試料の量を調整していた。これは、２価銅イオンと反応すべき還元糖の大半を亜酸化銅生成工程において煮沸条件下で反応させておくことで、還元糖の反応条件を一定にして、還元糖の測定を高精度におこなうためである。しかし本実施例の結果から、同じ量の２価銅イオンと反応する還元糖の総量は、２価銅イオンと反応すべき還元糖の大半を亜酸化銅生成工程で反応させる場合にも、標準還元糖測定工程で反応させる場合にもほぼ等しいことがわかった。したがって、本第３発明の還元糖測定方法によると、従来のレインエイノン定容法にように測定に煩雑な操作を要さず、還元糖量を正確に測定できることがわかる。また従来のレインエイノン定容法では、還元糖測定に予備滴定が必要であったため、測定の自動化ができない問題があったが、本発明の方法では予備滴定が必要でなくなることから、測定の自動化が可能になる。さらに、上述したように還元糖測定装置４０の電極として耐久性の高い複合白金電極４５を用いたことで、滴定の終点を電気化学的方法で検出できるようになり、還元糖の測定をより容易かつ正確におこなうことが可能になる。
【０１６０】
さらに、銅試薬中に含まれる２価銅イオン量と還元糖量との当量関係から、還元糖１ｍｏｌは、酸化剤である２価銅イオン５ｍｏｌと反応することがわかる。
【０１６１】
なお、参考までに、複合白金電極を用いた際の終点付近の酸化還元電位の変化を表すグラフを図１３に示す。図中、左側縦軸は酸化還元電位（Ｖ）を表し右側縦軸は酸化還元電位の一次微分値を表す。また図中横軸は、経過時間を表し、矢印は終点を表す。
【０１６２】
標準還元糖溶液による容量滴定の終点に達すると、酸化還元電位が急激に変化するため、終点を容易に検出することができる。また、酸化還元電位の一次微分値ではこの変化はより顕著であるため、例えば、演算手段にて酸化還元電位を一次微分することで、より正確に終点を検出することができる。
【０１６３】
さらに、このとき反応液中にメチレンブルー溶液を加えておくと２５０秒後にメチレンブルーの退色があらわれた。メチレンブルーの退色があらわれた経過時間と酸化還元電位の一次微分値の最大値があらわれる経過時間とは完全に一致するため、酸化還元電位の変化によって、滴定の終点を鋭敏かつ精度よく検出できることがわかる。
【０１６４】
さらに、検知電極として複合白金電極にかえて双白金つの型電極を用いた際の終点付近の分極電流の変化を表すグラフを図１４に示す。図中、縦軸は分極電流の大きさμＡを示し、横軸は経過時間を示す。図１４に示されるように、分極電流の変化によるる分極電流法でも終点を鋭敏に検出することができる。
【０１６５】
検知電極として双白金つの型電極を用いた場合の試料溶液９、１１、１３〜１６の理論還元糖量と実測還元糖量との関係および、検知電極として複合白金電極を用いた場合の試料溶液９、１１、１３〜１６の理論還元糖量と実測還元糖量との関係を表すグラフを図１５に示す。還元糖量が１００ｍｇ以下の範囲では、検知電極として複合白金電極を用いた場合にも双白金つの型電極を用いた場合にも、理論還元糖量と実測還元糖量とがほぼ一致した。したがって、検知電極として複合白金電極を用いる場合にも、双白金つの型電極を用いる場合にも、還元糖量を高精度に測定できることがわかる。
【０１６６】
（実施例６）
実施例５は第３発明及び第６発明に関する実施例である。本実施例では、還元糖試料として、黒砂糖、きび砂糖、三温糖、上白糖、グラニュー糖、水飴、しょうゆ、はちみつ、および、ワイン（赤、甘口）を用いた以外は、実施例５と同じ方法で還元糖の測定をおこなった。
【０１６７】
（比較例２）
比較例２は従来のレインエイノン定容法を用いて、実施例６と同じ還元糖試料中の還元糖量を測定した実施例である。
【０１６８】
Ａ．試薬の調整
（ａ）銅試薬の調製
実施例５と同じ銅試薬を用いた。
【０１６９】
（ｂ）メチレンブルー溶液の調製
メチレンブルー１ｇを１００ｍｌの水にとかし、メチレンブルー溶液とした。
【０１７０】
（ｃ）標準還元糖溶液の調製
実施例５と同じ標準還元糖溶液を用いた。
【０１７１】
Ｂ．還元糖の測定
（予備滴定工程）
先ず、各還元糖試料を量りとり、水に溶かして各還元糖試料溶液を調製した。各還元糖試料溶液を１５ｍｌと、銅試薬（所謂フェーリング試薬）２０ｍｌと、蒸留水３５ｍｌとを２００ｍｌ容三角フラスコにとり、全容量が７４ｍｌになるように標準還元糖溶液を加えた。この三角フラスコに、少量の粉末沸石と数滴の消泡剤（流動パラフィン）とを加え、溶液を穏やかに揺り動かしながら混合した。この三角フラスコを加熱器に乗せ、溶液が沸騰点に達するまで待った。このとき、予め水が室温から沸騰し始めるまでに要する時間が２．５分±５秒間になるように、加熱器の出力を設定しておいた。沸騰点に達した時点でタイマを始動させ、溶液を正確に２分間沸騰させた。沸騰させた後に、メチレンブルー溶液を４滴加え、ビュレットに入れておいた標準還元糖溶液をゆっくり滴下して、メチレンブルーの青色が消失した時点を滴定の終点とした。滴定後の反応液の総量が約７５ｍｌにならなかった場合には、還元糖試料の濃度を調整して、滴定後の反応液の総量が約７５ｍｌになるようにした。
【０１７２】
（本滴定工程）
予備滴定工程で濃度を調整した各還元糖試料溶液を１５ｍｌと、銅試薬（所謂フェーリング試薬）２０ｍｌと、蒸留水３５ｍｌとを２００ｍｌ容三角フラスコにとり、全容量が７４ｍｌになるように標準還元糖溶液を加えた。この三角フラスコに、少量の粉末沸石と数滴の消泡剤（流動パラフィン）とを加え、溶液を穏やかに揺り動かしながら混合した。この三角フラスコを加熱器に乗せ、溶液が沸騰点に達するまで待った。このとき、予め水が室温から沸騰し始めるまでに要する時間が２．５分±５秒間になるように、加熱器の出力を設定しておいた。沸騰点に達した時点でタイマを始動させ、溶液を正確に２分間沸騰させた。沸騰させた後に、メチレンブルー溶液を４滴加え、ビュレットに入れておいた標準還元糖溶液をゆっくり滴下して、メチレンブルーの青色が消失した時点を滴定の終点とした。
【０１７３】
（実施例６の方法と比較例２の方法との比較）
第３発明の還元糖測定方法と従来のレインエイノン定容法との相関を検証するために、実施例６の還元糖測定方法で測定された各還元糖試料中の還元糖量と、比較例２の還元糖測定方法で測定された各還元糖試料中の還元糖量とを比較した。実施例６および比較例２で測定された各還元糖試料中の還元糖量を表２に示す。
【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
表２に示されるように、第３発明の還元糖測定方法である実施例６の方法で測定された還元糖の量と、従来のレインエイノン定容法である比較例２の方法で測定された還元糖の量とはほぼ一致した。この事から、第３発明の還元糖測定方法によると、従来のレインエイノン定容法よりも著しく簡易な操作で従来のレインエイノン定容法と同程度に精度高く還元糖量を測定できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】実施例１の還元糖測定装置を表す模式図である。
【図２】実施例１及び比較例１の還元糖測定方法におけるチオ硫酸ナトリウム減少量を表すグラフである。
【図３】実施例２及び実施例３の還元糖測定方法におけるチオ硫酸ナトリウム減少量を表すグラフである。
【図４】双白金つの型電極を用いた際の終点付近の分極電流の変化および分極電位差の変化を表すグラフである。
【図５】実施例４の還元糖測定装置を模式的に表す図である。
【図６】ＥＤＴＡ−２Ｎａ添加時の積算電気量と各試料溶液中に含まれる還元糖量（理論値）との関係を表すグラフである。
【図７】積算電気量とＥＤＴＡ−２Ｎａの添加量との関係を表すグラフである。
【図８】ＥＤＴＡ−２Ｎａ非添加時の積算電気量と各試料溶液中に含まれる還元糖量（理論値）との関係を表すグラフである。
【図９】ヨウ化カリウムの添加量の増加とヨウ素量との関係を表すグラフである。
【図１０】実施例５の還元糖測定装置を模式的に表す図である。
【図１１】試料溶液７〜１２および試料溶液１６の理論還元糖量と標準還元糖溶液の理論還元糖量との和を、試料溶液毎に比較するグラフである。
【図１２】試料溶液７〜１２および試料溶液１６の理論還元糖量と試料溶液の実測還元糖量との関係を表すグラフである。
【図１３】検出電極として複合白金電極を用いた際の終点付近の酸化還元電位の変化を表すグラフである。
【図１４】検出電極として双白金つの型電極を用いた際の終点付近の分極電流の変化を表すグラフである。
【図１５】検知電極として双白金つの型電極を用いた場合の試料溶液９、１１、１３〜１６の理論還元糖量と実測還元糖量との関係および、検知電極として複合白金電極を用いた場合の試料溶液９、１１、１３〜１６の理論還元糖量と実測還元糖量との関係を表すグラフである。
【符号の説明】
【０１７７】
１：還元糖測定装置  ２：複合白金電極  ３：滴定量測定手段  ５：反応液  ６：第１の収容容器  ７：加熱手段  ８：チオ硫酸ナトリウム溶液  １０：自動滴定手段  １１：演算手段１  １２：容器部  １３：蓋部  １５：攪拌子  １６：温度検知手段  １７：第２の収容容器  １８：滴下手段  ２０：送液手段
２１：還元糖測定装置  ２２：双白金つの型電極  ２３：滴定量測定手段  ２５：双白金渦巻型電極  ２６：電気分解手段  ２７：反応液  ２８：収容容器  ３０：加熱手段  ３１：定電流電源  ３２：演算手段  ３３：容器部  ３５：蓋部  ３６：攪拌子  ３７：窒素導入ノズル  ３８：温度検知手段
４０：還元糖測定装置  ４１：滴定量測定手段  ４２：収容容器  ４３：加熱手段  ４５：複合白金電極  ４６：演算手段  ４７：自動滴定手段  ４８：第２の収容容器  ５０：標準還元糖溶液  ５１：反応液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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