(57)【要約】  【課題】  本発明は、感染性ウイルス自体により引き起こされる細胞傷害活性を有さず且つ効率的に目的物質を導入する物質導入剤を提供することを課題とする。  【解決手段】  本発明によって、目的物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖脂質および生理活性物質などの天然または合成の物質）が封入されたリポソームの表面にウイルスコートタンパク質が保持されたリポソーム（活性ゲノソーム）が提供される。本発明の活性ゲノソームによって、目的物質を標的細胞へ効率的に導入することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質が封入されたリポソームの表面にウイルスコートタンパク質が保持された、活性ゲノソーム。
【請求項２】
ウイルスコートタンパク質が、酸性条件下においてリポソームの表面に保持されることができるウイルスコートタンパク質である、請求項１に記載の活性ゲノソーム。
【請求項３】
ウイルスコートタンパク質が、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科およびレトロウイルス科から選択される少なくとも１種に由来するタンパク質である、請求項１〜２に記載の活性ゲノソーム。
【請求項４】
ウイルスコートタンパク質が、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに由来するタンパク質である、請求項１〜３に記載の活性ゲノソーム。
【請求項５】
リポソームが、複合脂質およびステロール類からなる群から選択される少なくとも１種から構成される、請求項１〜４に記載の活性ゲノソーム。
【請求項６】
リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、動物由来のステロール（コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、セレブロシド、スフィンゴシン、スフィンガニン、セラミドおよびガングリオシドからなる群より選択される少なくとも１種から構成される、請求項１〜５に記載の活性ゲノソーム。
【請求項７】
リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールを含み、必要に応じてガングリオシドをさらに含む、請求項１〜６に記載の活性ゲノソーム。
【請求項８】
リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールおよびガングリオシドからなり、そのモル比がホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン：コレステロール：ガングリオシド＝５：０．１〜３：１〜５：０〜３である、請求項１〜７に記載の活性ゲノソーム。
【請求項９】
リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールおよびガングリオシドからなり、そのモル比がホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン：コレステロール：ガングリオシド＝５：１：３：１である、請求項１〜８に記載の活性ゲノソーム。
【請求項１０】
（ａ）目的物質と脂質の混合液から、該目的物質を封入したリポソームを作製する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られたリポソームの表面にウイルスコートタンパク質を保持させる工程
を包含する、請求項１〜９に記載の活性ゲノソームの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９に記載の活性ゲノソームを含む、物質導入剤。
【請求項１２】
請求項１〜９に記載の活性ゲノソームを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
さらに薬学的に許容される担体を含む請求項１２の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的物質を封入するリポソームの表面にウイルスコートタンパク質を保持する活性ゲノソームに関する。このような活性ゲノソームは、研究用試薬あるいは医薬として有用である。
【背景技術】
【０００２】
今まで、遺伝子またはタンパク質の機能解析あるいは治療の研究または治療のために、種々の物質を細胞内へ導入するための様々な方法が開発されてきた。
【０００３】
物質導入法の代表的なものとして、遺伝子を標的細胞に導入する遺伝子導入法がある。これらの遺伝子導入法は、主に、リポソーム法（非特許文献１）、リポフェクション法（非特許文献２）、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの化学・物理的手段を用いる導入方法と、ウイルスを利用する生物学的手段とに大別され、いずれも利用されている。
【０００４】
しかし、生物学的手段の１つであるウイルスを利用する方法は、遺伝子導入効率が高い利点がある反面、ウイルスが小さいのでサイズの大きい遺伝子の導入に適応できないという問題や、感染性のウイルス自体によって標的細胞の変性死が引き起こされるという問題を抱えている。さらに、レトロウイルスが使用される場合（非特許文献３）、必須遺伝子の不活性化または疾患遺伝子（例えば、癌遺伝子）の活性化が引き起こされる危険性がある。
【０００５】
化学・物理的手段の１つであるリポソーム法は、比較的大きなサイズの遺伝子を封入できるという利点、リポソーム膜の脂質が生体膜と類似する脂質によって構成されることが多く、細胞膜や細胞内器官と相互作用しやすく且つ抗原性や細胞毒性が低いという利点がある反面、遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。また、カチオン性脂質からなるリポソームを用いる場合（特許文献１）、遺伝子導入効率は高いものの、細胞毒性が強いという大きな欠点を有する。
【特許文献１】特開平２−１３５０９２号公報
【非特許文献１】Ｒ．Ｆｒａｌｅｙら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」第２５５巻、第１０４３１頁（１９８０年）
【非特許文献２】Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」第８４巻、第７４１３頁（１９８７年）
【非特許文献３】Ｃ．Ｌ．Ｃｅｐｋｏら、「Ｃｅｌｌ」第３７巻、第１０５３頁（１９８４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、感染性ウイルス自体により引き起こされる細胞傷害活性を有さず、ポリカチオン性脂質試薬が示す細胞毒性を有さず、且つ効率的に目的物質を導入する物質導入剤を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明は、遺伝子治療を必要とする疾患に罹患する動物の組織または臓器の特定細胞に、選択的、効率的、且つ安全に目的物質を導入するための薬学的組成物を提供することをさらなる課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、脂質膜微小運搬体であるリポソームに目的物質を封入し、更にリポソームの表面にウイルスコートタンパク質を保持させることによって、高い導入効率を有し、且つ標的細胞に対する高い細胞特異性、細胞結合性および細胞膜融合能を有する物質導入剤としたものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記の各項に係る発明を提供するものである。
項１．目的物質が封入されたリポソームの表面にウイルスコートタンパク質が保持された、活性ゲノソーム。
項２．ウイルスコートタンパク質が、酸性条件下においてリポソームの表面に保持されることができるウイルスコートタンパク質である、項１に記載の活性ゲノソーム。
項３．ウイルスコートタンパク質が、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科およびレトロウイルス科から選択される少なくとも１種に由来するタンパク質である、項１〜２に記載の活性ゲノソーム。
項４．ウイルスコートタンパク質が、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルスまたは狂犬病ウイルスに由来するタンパク質である、項１〜３に記載の活性ゲノソーム。
項５．リポソームが、複合脂質およびステロール類からなる群から選択される少なくとも１種から構成される、項１〜４に記載の活性ゲノソーム。
項６．リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、動物由来のステロール（コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、セレブロシド、スフィンゴシン、スフィンガニン、セラミドおよびガングリオシドからなる群より選択される少なくとも１種から構成される、項１〜５に記載の活性ゲノソーム。
項７．リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールを含み、必要に応じてガングリオシドをさらに含む、項１〜６に記載の活性ゲノソーム。
項８．リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールおよびガングリオシドからなり、そのモル比がホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン：コレステロール：ガングリオシド＝５：０．１〜３：１〜５：０〜３である、項１〜７に記載の活性ゲノソーム。
項９．リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロールおよびガングリオシドからなり、そのモル比がホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン：コレステロール：ガングリオシド＝５：１：３：１である、項１〜８に記載の活性ゲノソーム。
項１０．
（ａ）目的物質と脂質の混合液から、該目的物質を封入したリポソームを作製する工程、および
（ｂ）工程（ａ）において得られたリポソームの表面にウイルスコートタンパク質を保持させる工程
を包含する、項１〜９に記載の活性ゲノソームの製造方法。
項１１．項１〜９に記載の活性ゲノソームを含む、物質導入剤。
項１２．項１〜９に記載の活性ゲノソームを含む、薬学的組成物。
項１３．さらに薬学的に許容される担体を含む項１２の薬学的組成物。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本明細書中で使用される用語「ゲノソーム（ｇｅｎｏｓｏｍｅ）」は、目的物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖脂質および生理活性物質などの天然または合成の物質）が封入されたリポソームをいう。
【００１２】
本明細書中で使用される用語「活性ゲノソーム」は、ゲノソームの表面にウイルスコートタンパク質がさらに保持されたものをいう。このとき、ウイルスコートタンパク質は、リポソームの表面に一部組み込まれた状態でもよいし、リポソームに付着した状態でもよい。
【００１３】
本明細書中で使用される用語「目的物質」は、標的細胞（宿主細胞）への導入が意図される物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、多糖類、糖脂質および生理活性物質などの天然または合成の物質）である。
【００１４】
本明細書中で使用される用語「表面」は、外表面をいう。
【００１５】
本明細書中で使用される用語「変異」は、核酸配列またはアミノ酸配列中の１つ以上の塩基またはアミノ酸の置換、欠失、または付加をいう。
【００１６】
リポソーム
リポソームは、複合脂質（グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質など）およびステロール類からなる群から選択される少なくとも１種から構成される。
【００１７】
リポソームを構成する複合脂質およびステロール類としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、動物由来のステロール（コレステロール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、セレブロシド、スフィンゴシン、スフィンガニン、セラミドおよびガングリオシド（これらに限定されない）からなる群より選択される少なくとも一種が例示され、好ましくは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルセリン、さらに好ましくは、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルセリンおよびガングリオシドが例示される。
【００１８】
リン脂質に代えて、リゾリン脂質が用いられても良い。
【００１９】
リポソームの構成成分のモル比は、リポソームを安定に形成できる比率であれば特に限定されない。例えば、ホスファチジルコリン：ホスファチジルセリン：コレステロール：ガングリオシド＝５：０．１〜３：１〜５：０〜３、好ましくは、５：０．５〜２：２〜５：０．５〜２、さらに好ましくは、約５：１：３：１である。
【００２０】
本発明のリポソームを調製する方法としては、当業者によく知られている一般的な製法が使用できる。例えば、凍結融解法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２１２、１８６（１９８１））、超音波処理法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、９４、１３６７（１９８０））、エタノール注入法（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６６、６２１（１９７５））、エーテル注入法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４４３、６２９（１９７５）またはＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３０８、２５０（１９７８））、フレンチプレス法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、９９、２１０（１９７９））、コール酸（界面活性剤）法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４５５、３２２（１９７６））、カルシウム融合法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３９４、４８３（１９７８））、逆相蒸発法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ、７５、４１９４（１９７８））、ガラスフィルターを用いた方法（Ｔｈｉｒｄ  ＵＳ−Ｊａｐａｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（１９９５））など多くの方法が挙げられるが、これらに限定されない。さらに必要に応じて、このような方法により調製されたリポソームは、目的物質を封入し得且つ標的細胞内へ容易に取り込まれ得るサイズ（１μｍ以下、好ましくは５００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約１００ｎｍのサイズ）を有するものに選別される。選別方法は、慣例的な方法が使用される。例えば、フィルター濾過法（これらに限定されない）が挙げられる。
【００２１】
リポソームは、通常中性条件下において会合するので、酸性条件下において調製されることが望ましい。
【００２２】
目的物質
リポソームに封入される目的物質は、特に限定されない。例えば、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、ペプチド（例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド）、タンパク質、多糖類、糖脂質および生理活性物質などの天然または合成の材料、あるいはこれらの組み合わせ（これらに限定されない）が挙げられる。
【００２３】
目的物質が核酸である場合、該核酸は、特に限定されず、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチジーンＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＡＮ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ前駆体、人工的に合成された核酸、核酸誘導体または遺伝子工学的に連結可能なこれらの組み合わせ（これらに限定されない）が挙げられる。これらは、必要に応じて、任意の発現ベクター、転写エレメント、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）をコードする配列、精製を容易にするポリペプチド（例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ）をコードする配列または人工的に合成された核酸（これらに限定されない）を連結したものであってもよい。発現ベクターとしては、特に限定されないが、宿主細胞の種に適した発現ベクターが望ましい。例えば、動物用発現ベクターである。動物用発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２、ｐＩＮＤ／Ｖ５−ＨｉｓおよびｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（これらに限定されない）が挙げられる。
【００２４】
目的物質がタンパク質である場合、該タンパク質は、特に限定されず、例えば、酵素、抗体分子、細胞内シグナル伝達関連物質、微生物毒素などが挙げられる。
【００２５】
目的物質が生理活性物質である場合、該生理活性物質は、特に限定されず、例えば、抗癌剤、抗腫瘍剤、ホルモン、薬物、サイトカインなどが挙げられる。
【００２６】
目的物質の形状は、リポソームに封入可能な形状であれば、特に限定されない。目的物質が核酸である場合、例えば、環状プラスミド（スーパーコイル状または非スーパーコイル状のものを含む）、フラグメント、一本鎖、二本鎖などの形状をとり得る。好ましくは、リポソームに容易に封入可能なように小さく折り畳まれた形状（例えば、スーパーコイル状）である。
【００２７】
リポソームに封入される目的物質のサイズは、リポソームに封入可能なサイズであれば、特に限定されず、例えば、５００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下、最も好ましくは１０ｎｍ以下である。目的物質が核酸である場合、該核酸のサイズは、例えば、５００ｋｂ以下、好ましくは２００ｋｂ以下、より好ましくは１００ｋｂ以下、さらにより好ましくは５０ｋｂ以下、最も好ましくは１０ｋｂ以下である。
【００２８】
リポソームに封入される核酸の分子数に対するウイルスコートタンパク質の分子数の比率は、核酸：タンパク質＝１：１〜２０００、好ましくは１：１〜５００、さらに好ましくは１：１０〜２００、さらにより好ましくは１：２０〜１００である。タンパク質の比率が小さすぎると、標的細胞に対する特異性が低下する可能性がある。
【００２９】
ウイルスコートタンパク質
ウイルスコートタンパク質は、特に限定されないが、好ましくは、酸性条件下においてリポソームの表面に保持されるものである。酸性条件が好ましい理由は、コートタンパク質のコンフォメーションが酸性条件下で変化してリポソーム膜に正しく挿入されると推定されるからである。このようなウイルスコートタンパク質としては、ラブドウイルス科、ヘルペスウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、フィロウイルス科、コロナウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科およびレトロウイルス科（これらに限定されない）から選択される少なくとも１種である。
【００３０】
本発明の１つの局面において、ウイルスコートタンパク質は、リポソームの表面への保持力、標的細胞への選択性、標的細胞への結合性、標的細胞への膜融合性、標的細胞内における分解能などを改変するために、慣例的な方法によって改変されてもよい。
【００３１】
本発明の１つの局面において、ウイルスコートタンパク質は、糖タンパク質（Ｇタンパク質）である。
【００３２】
本発明の１つの局面において、ウイルスコートタンパク質は、その一部がリポソームに組み込まれることによって、リポソームの表面に保持される。
【００３３】
また、ウイルスコートタンパク質は、標的細胞の種類に応じて、選択され得る。
【００３４】
本発明の１つの実施形態において、広範囲な細胞の標的化が意図される場合、宿主域の広いウイルスコートタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス）が使用される。このような宿主域の広いウイルスコートタンパク質は、しばしば、細胞選択性があまり要求されない場面において（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける研究用試薬として）使用される。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、狭い範囲の細胞の標的化が意図される場合、宿主域の狭いウイルスコートタンパク質（例えば、狂犬病ウイルス）が使用される。このような宿主域の狭いウイルスコートタンパク質は、しばしば、高い細胞選択性が要求される場面において（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬学的組成物として）使用される。
【００３６】
標的細胞（宿主細胞）
標的細胞は、特に限定されず、例えば、動物細胞（動物由来の樹立細胞を含む）が挙げられる。動物細胞としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス、イヌ、ネコ、トリ、カエル、トカゲ、魚、昆虫の細胞（これらに限定されない）が挙げられる。樹立細胞としては、例えば、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｍＬｕ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、Ｆ９細胞、ＫＢ細胞、ＦＬ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＭＴ−４細胞（これらに限定されない）が挙げられる。
【００３７】
担体
本発明の１つの実施形態において、本発明の活性ゲノソームを含む物質導入剤は、適切な担体をさらに含む。このような担体としては、例えば、緩衝液、等張化剤、着色剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤（これらに限定されない）が挙げられる。
【００３８】
本発明の１つの実施形態において、本発明の活性ゲノソームを含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。このような担体としては、例えば、緩衝液、等張化剤、着色剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤（これらに限定されない）が挙げられる。
【００３９】
疾患
本発明の物質導入剤が適用される疾患は、外来遺伝子の導入によって症状が治癒または改善される可能性を有するものであれば、特に限定されない。一例として、遺伝病（例えば、アデニンデアミナーゼ欠損症、筋ジストロフィー、糖原病、ムコ多糖症、α−１アンチトリプシン欠損症、慢性肉芽腫症、嚢胞性線維症、家族性高コレステロール血症、ファンコニー貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症、ＡＤＡ欠損によるＳＣＩＤ、伴性ＳＣＩＤ、白血球接着欠損症、血友病、Ｃａｎａｖａｎ病、脳梁萎縮、ファブリー病、筋萎縮性側索硬化症）、癌または腫瘍（例えば、ｐ５３、ｍｙｃ、ｆｏｓなどの癌原遺伝子によって引き起こされる癌または腫瘍、癌抑制遺伝子の変異によって引き起こされる癌または腫瘍）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００４０】
本発明は、感染性ウイルスそのものではなくウイルスコートタンパク質をリポソームの表面に保持させることによって、安全且つ導入効率の高い物質導入剤を提供する。
【００４１】
すなわち、本発明は、感染性ウイルス自体が引き起こす種々の現象（細胞の機能障害、細胞の変性死など）を回避しつつ、ウイルスタンパク質の有利な性質（標的細胞に対する高い選択性、結合性および膜融合性）を有し、且つリポソームがもつ利点（スーパーコイル状の比較的大きな核酸を導入できる利点、細胞膜や細胞内器官と相互作用し易い利点など）を有する活性ゲノソームを提供する。
【００４２】
本発明の活性ゲノソームは、そのリポソームが、例えば、複合脂質およびステロール類から構成されているため、従来のポリカチオン性脂質試薬（例えば、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ））がもつ細胞毒性を示さない。また、本発明の活性ゲノソームは、そのリポソーム表面にウイルスコートタンパク質を保持しているため、従来の中性リポソームよりも非常に高い物質導入活性を示し、ポリカチオン性脂質試薬にも匹敵し得る物質導入活性を示す。
【００４３】
さらに、本発明は、宿主細胞の種類に応じて種々のウイルスコートタンパク質から適切なものを選択することができるという利点を有する。それゆえ、研究者または医療従事者の要望に応え、様々な物質導入剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下に本発明の実施例を示すが、これらの実施例は単なる例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４５】
細胞培養
ＢＨＫ−２１細胞は、乳児ハムスターの腎臓に由来する線維芽様細胞株であり、様々な種のウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含む）に対して高い感受性を示す。ＣＯＳ−７細胞は、ＳＶ４０  Ｔ抗原を構成的に発現する形質転換されたサルの細胞株である。
【００４６】
ウイルス
ニュージャージー血清型のＶＳＶのＢＨＫに馴化した非病原性亜株（ＢＨＫ−ａｄａｐｔｅｄ  ａｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｓｕｂｓｔｒａｉｎ）をＢＨＫ細胞で培養した（Ｋａｗａｉ，  Ａ．１９７７．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｂｉｅｓ  ｖａｒｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２４：  ８２６−８３５．）。ウイルス量（感染価）は、ＢＨＫ−２１細胞の単層培養を用いてアッセイした。
【００４７】
ウイルス精製
Ｋａｗａｉ，  Ａ．１９７７．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２４：  ８２６−８３５．において記載されるとおり、ＶＳＶ−感染ＢＨＫ−２１細胞の培養液からビリオンを精製した：簡潔に述べると、培養液を高速遠心（３０分間、４，０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃）し、透明な上清を回収し、その後６．５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；＃６０００）を用いて沈殿させ、次いで２５，０００ｒｐｍにて、９０分間、２０％スクロースクッションを通して超遠心し、ウイルス粒子をペレットとした。このウイルスペレットを低塩等張緩衝液（ＳＴＥ；１０％スクロース、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）中に懸濁した。１０％  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した後、これを使用まで−７０℃にて保存した。
【００４８】
ＶＳＶビリオンからのＧタンパク質の抽出
室温にて、１０分間、１％  オクチルグルコシドのＳＴＥ緩衝液を用いて精製ビリオンを処理し、次いで、可溶化されたウイルスＧタンパク質をビリオンのコア画分から分離するために、遠心管中の２０％スクロースクッション上へ置き、４０，０００ｒｐｍにて、９０分間、４℃にて超遠心した。次に、Ｇタンパク質を含む上清を回収し、５％  スクロース／ＰＢＳ（−）に対して透析し、続いてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃２０，０００を用い、透析膜を介して部分的な脱水による濃縮を行った。
【００４９】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルをサンプル溶解緩衝液中に溶解し（Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．  １９７０．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：８６０−６８５）、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへアプライした。電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色し、ろ紙の上で乾燥した。
【００５０】
抗体
精製ウイルスタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ゲルから抽出した変性Ｇタンパク質を用いて、ウサギを数回免疫することにより、ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対するウサギ抗血清を調製した。
【００５１】
プラスミドＤＮＡ
遺伝子導入実験のモデルとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（これは、ＳＶ４０  ｏｒｉ配列を含むゆえにＳＶ４０  Ｔ抗原−陽性細胞（すなわち、ＣＯＳ−７細胞）中においてＥＧＦＰ遺伝子の発現を増強させることができる）を使用した。プラスミドＤＮＡをＢＳＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；  ｐＨ７．６）中に、１〜１０μｇ／μｌの濃度で溶解し、使用まで−７０℃にて保存した。ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用い、１％  アガロースゲル中で、プラスミドＤＮＡの電気泳動分析を行った（ここで、サイズマーカーとしてラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ消化物を共に電気泳動した）。このゲルをＴＡＥ緩衝液中のエチジウムブロマイドで染色した。
【００５２】
プラスミドＤＮＡ−含有リポソームの調製
リポソームの調製のために、クロロホルム中に溶解されたホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびコレステロールを、モル比５：１：４（合計１，２６０μｇ）で混合し、ナス型ガラスフラスコ中でエバポレーションした。この脂質を０．３４ｍｌのＤＮＡ含有ＢＳＳ緩衝液（５μｇ  ＤＮＡ／μｌ）中に懸濁した。２０分間、３７℃にてインキュベーションした後、このＤＮＡ−脂質混合物を凍結させ（液体窒素に入れ、すぐに取り出す）、次いで解凍（５５℃にて、１０分間インキュベーション）する操作を３回繰り返し、この間にプラスミドＤＮＡを脂質小胞（リポソーム）中に封入（カプセル化）した。その後、この混合物を種々のポアサイズ（最初に１０μｍ、次いで２μｍ、次いで０．６５μｍ、そして０．４５μｍ）のポリカーボネートフィルターを順々に通して濾過し、徐々にリポソームのサイズを小さくした。動的光散乱分光光度計（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＤＬＳ）を使用して、計算のためのサイズマーカーとしてポリスチレンラテックスビーズ（直径１μｍ）を用いて、リポソーム粒子のサイズの分布を調べた。
【００５３】
ＶＳＶ  Ｇでコーティングした活性ゲノソームのアセンブリー
ＤＮＡ−含有リポソーム（５０〜１００μｇＤＮＡ）の懸濁液とＶＳＶ  Ｇタンパク質調製物（２０〜４０μｇタンパク質）を混合し、ｐＨ５．５にて（１／１０容積のｐＨ４．５の８００ｍＭクエン酸を添加することにより調製した）３０分間氷上においた後、１５分間３７℃にてインキュベーションした。１／４容積のｐＨ７．８の１Ｍ  クエン酸ナトリウム液を添加することによって、酸性度をｐＨ７．４に戻した。次いで、ゲノソームを、ＢＳＳ緩衝液で調製した１０％、２０％および４５％のスクロース液を重層した密度勾配を通して超遠心（２２，０００ｒｐｍにて、３時間）することによって、精製した（ゲノソームは２０％および４５％スクロース層の中間層から回収された）。
【００５４】
電子顕微鏡
スクロース密度勾配から回収したゲノソーム調製物の少量のアリコートをＦｏｒｍｖａｒ−ｃａｒｂｏｎでコートしたグリッド上にのせ、４％  酢酸ウラニルでネガティブ染色した。イムノゴールド染色では、グリッド上に吸着させたゲノソーム粒子を、最初にウサギ抗−ＶＳＶ  Ｇ抗体または正常ウサギ血清と共にインキュベートし、次いでゴールドコロイド（５ｎｍ）結合二次抗体と共にインキュベーションし、その後ネガティブ染色した。試験片をＪＯＥＬ  ＪＥＭ−１２００ＥＸ  ＩＩ透過電子顕微鏡のもとで調べ、撮影した。
【００５５】
遺伝子導入アッセイ
希釈したゲノソーム懸濁液をＣＯＳ−７細胞単層培養の培地へ滴下する（すなわち、接種する）ことによって、ゲノソームに媒介される遺伝子導入活性をアッセイした。ゲノソームを接種した培養液を４８時間３７℃にてインキュベーションした、ＰＢＳ中の１０％  ホルマリンで固定した後、ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ蛍光顕微鏡下において蛍光陽性細胞の数を数えることによって、遺伝子導入率を決定した。抗ＶＳＶ抗体によるブロッキングを調べるために、ゲノソーム懸濁液を種々の希釈率の抗体と共に、１時間、３７℃にて、インキュベーションした。サンプルの残余遺伝子導入活性を上記のようにアッセイした。塩化アンモニウムを遺伝子導入アッセイの培地へ２０ｍＭで添加することによって、塩化アンモニウムの影響を調べた（Ｓｐｅｒｔｉ，Ｆ．，  Ｓｅｇａｎｔｉ，Ｌ．，  Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｆ．Ｍ．，  Ｔｉｎａｒｉ，Ａ．，  Ｄｏｎｅｌｌｉ，Ｇ．，  ａｎｄ  Ｏｒｓｉ，Ｎ．１９８７．Ｅｎｔｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．６８：３８７−３９９）。
【００５６】
他の効率の高い遺伝子導入剤と比較するために、ポリカチオンリポソーム（すなわち、リポフェクタミン剤；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。１μｇ  プラスミドＤＮＡを１０μｌの試薬と混合し、ＣＯＳ−７細胞の培地へ滴下した。２日間のインキュベーションの後、ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ蛍光顕微鏡によって、蛍光陽性細胞の割合を決定した。
【００５７】
リポソームの組成を変えた場合の遺伝子導入活性の比較
リポソームの成分であるホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ガングリオシド（ＧＭ1）のモル比を変えた場合の遺伝子導入活性について比較した。まず、前述された方法に従って、各成分のモル比がＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ＝５：１：４  、  ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ：ＧＭ1＝５：１：３：１  、  ＰＣ：Ｃｈｏｌ＝１：１  、  ＰＣ：ＧＭ1：Ｃｈｏｌ＝５：１：４となるようにゲノソームを調製した。さらに、前述の方法に従って、ＶＳＶ  Ｇでコーティングした活性ゲノソームを作製し、各ゲノソームサンプルについて遺伝子導入活性を測定した。
【００５８】
結果
１）ビリオンからのＶＳＶ  Ｇタンパク質の抽出
本発明者は、最初に、精製ビリオンを使用し、高度に精製されたＶＳＶ  Ｇタンパク質調製物を得るための条件およびプロトコルを確立した。種々の塩濃度の下で１％  オクチルグルコシドを用いてビリオンを崩壊し、そしてビリオンの不溶性部分（ビリオンコアおよびヌクレオカプシド）を超遠心により取り除いた。Ｇタンパク質を含有する上清を回収し、そしてＰＥＧ＃２０，０００を用いる透析法によって濃縮し（上記を参照のこと）、次いで、それらを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で泳動した。図１に示されるように、低い塩濃度においてのみ、Ｍタンパク質がビリオンコアに固く結合されたままでＧタンパク質のみが可溶化された。従って、以下の実験では、Ｍを含まないＧタンパク質調製物をこのような塩を含まない条件下において獲得し、さらなる実験に使用した。
【００５９】
２）プラスミドＤＮＡを封入したリポソームの調製
リポソームおよびゲノソームの遺伝子導入活性をモニターするために、プラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。先ず、ＤＮＡおよび脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびコレステロールが５：１：４のモル比で混合される）の混合物を繰り返し凍結融解する方法によって、プラスミドＤＮＡをリポソームへ封入した。次いで、この混合物を、種々のポアサイズ（１０μｍ、２μｍ、０．６５μｍ、そして０．４５μｍ）の一連のプラスチックフィルターを通す連続的な濾過にかけ、徐々にリポソームの粒子サイズを２００ｎｍより小さい直径にした。ＤＬＳフォトメーターによって、これらの手順によって調製したリポソームのサイズについて調べた。図２Ａは、産物の例を示し、大半の粒子が約７０〜１００ｎｍの直径を有することを示している。
【００６０】
また、制限酵素（Ｓａｌ  Ｉ）を用いるエンドヌクレアーゼ消化に対する耐性を試験することによって、このリポソーム懸濁液がＤＮＡをリポソーム内に封入しているかどうかについて試験した。図３Ａは、スーパーコイル状ＤＮＡの内容物に関するかぎり、約三分の一のプラスミドＤＮＡが消化に対して耐性であり、一方Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下において全てのＤＮＡが消化されたことを示した。これは、ＤＮＡのこのようなＳａｌ  Ｉ耐性フラクションがリポソーム中へ封入（カプセル化）されることを示唆する。この結果によって、ＤＮＡの約三分の一がリポソームに受動的に封入されることが示唆される。
【００６１】
３）ＶＳＶ  Ｇタンパク質でコーティングされたゲノソームの調製およびアッセイ
ｐＨ７．４またはｐＨ５．５において、リポソーム懸濁液と濃縮Ｇタンパク質抽出物とを混合することにより、Ｇタンパク質でコーティングされたゲノソームを調製した。両方のアセンブリー条件について、ＣＯＳ−７細胞培養において、ゲノソーム産物の遺伝子導入活性をアッセイした。その結果、２つのアセンブリー条件（ｐＨ７．４およびｐＨ５．５）の間で、活性が大きく異なることが示された。図４Ａに示されるように、酸性条件下において作製されたゲノソームは、中性ｐＨにおいて作製されたゲノソームよりも３０倍以上高い遺伝子導入活性を示した。本発明者は、さらに、ＶＳＶ  Ｇタンパク質およびプラスミドＤＮＡ調製物を様々なモル比で混合することによって、最も活性なゲノソームを得るためのＶＳＶ  Ｇタンパク質の最適量について検討した。遺伝子導入活性は、大体Ｇタンパク質の含有率に比例しているが、Ｇタンパク質とプラスミドＤＮＡとのモル比が２０〜２５：１まで増加したときに、平衡に達した（図４Ｂ）。
【００６２】
酸性条件下において作製したゲノソームについて不連続的なスクロース密度勾配を通す超遠心によって部分的に精製した後、さらに調査した。図５−１Ａは、２０％〜４５％スクロース層に集まったｐＨ５．５．において作製されたゲノソームのバンドを示す。勾配を７つのフラクションに分画し、その各々をプラスミドＤＮＡとＶＳＶ  Ｇタンパク質との比率および遺伝子導入活性について調べた。図５−１Ｂ、図５−１Ｃおよび図５−１Ｄにおいて示されるように、最も高い遺伝子導入活性は、フラクション＃５において見出された。また、各フラクションの活性は、ＤＮＡの含有率ではなく、Ｇタンパク質の含有率に比例していた。上部のフラクション（＃１〜＃３）において検出されたＤＮＡは、カプセル化されなかった遊離プラスミドＤＮＡであると考えられ、Ｓａｌ  Ｉ消化を受けやすかった（データは示されない）。
【００６３】
図２Ｂは、フラクション＃５におけるゲノソームのサイズ分布の例示であり、ほとんどの粒子が約７０〜１４０ｎｍの直径を有することを示唆する。図３は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下において、ほとんどのＤＮＡが消化された一方で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の非存在下において、ゲノソームフラクション（＃５）におけるプラスミドＤＮＡの大部分がＳａｌ  Ｉ消化に耐性であったことを示した。これは、ゲノソームと行動を共にしているＤＮＡがゲノソームの内部にカプセル化されていたことを示唆する（ゲノソームフラクション中のＳａｌ  Ｉ感受性ＤＮＡは、ＶＳＶ  Ｇに結合する遊離ＤＮＡであると思われる）。ゲノソームフラクションは、４％  酢酸ウラニルを用いた染色の後、透過電子顕微鏡下で観察された。その結果、ゲノソームフラクションは直径４０ｎｍ〜１４０ｎｍの様々なサイズの球形粒子を含み、その多くがスパイク様突起物（ｓｐｉｋｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）をもつことが実証された（図６−１Ａの挿入図）。この点は、抗ＶＳＶ  Ｇタンパク質抗体を用いる金コロイド染色によってさらに確かめられ、金の顆粒がゲノソーム全体に渡って検出されることが示された（図６−２Ｂ）。
【００６４】
４）ＶＳＶ  ＧでコーティングされたゲノソームのＶＳＶ  Ｇ媒介遺伝子導入活性についての証明
コントロール実験のために、裸のプラスミドＤＮＡを不連続的なスクロース勾配において超遠心したところ、このような遊離プラスミドＤＮＡは、ほとんど、上層フラクションから回収された（ほとんどは、フラクション＃２および＃３中に存在していた（図５−１Ｅ））。ＤＮＡを封入しただけの裸のリポソームは、フラクション＃２〜＃４に分布していることが見出され（大部分は、フラクション＃３および＃４中に見出されていた）、これらのいずれも遺伝子導入活性を示さなかった（データは示されない）。遊離Ｇタンパク質サンプルは、下層フラクションへ沈降することが示され、（＃５〜＃６；大部分は、フラクション＃６である（図５−１Ｆ））、これによって、Ｇタンパク質三量体がゲノソームよりもやや密度の高い微小顆粒を形成することが示された。裸のプラスミドＤＮＡをＶＳＶ  Ｇタンパク質と混合したとき、ＤＮＡの一部がＧタンパク質と結合するため、スクロース密度勾配においてより広く分布するのが観察された。しかしながら、このことによって、ＧＦＰ遺伝子発現を高めるという結果はもたらされなかった（図５−２Ｇ、図５−２Ｈおよび図５−２Ｉ）。
【００６５】
次に、裸のプラスミドＤＮＡをＶＳＶ  Ｇタンパク質および空のリポソームと混合し、ｐＨ５．５にてインキュベーションし、次いでスクロース勾配を通す超遠心を行った。遠心の後、勾配を７つのフラクションに分け、その各々を、遺伝子導入活性、ＤＮＡの含有量、およびＧタンパク質について調べた。ＶＳＶ  Ｇタンパク質は、空のリポソームとＤＮＡの両方と相互作用するようであり（すなわち、後者について、プラスミドＤＮＡの分布はフラクション＃５および＃６にまで拡大されたが（図５−２Ｇ））、どのフラクションにおいても、遺伝子導入活性はほとんど観察されなかった（図５−２Ｊ、図５−２Ｋおよび図５−２Ｌ））。
【００６６】
これらのコントロール実験から、発明者は、裸のプラスミドＤＮＡとＶＳＶ  Ｇタンパク質との結合はＣＯＳ−７細胞におけるＧＦＰ遺伝子発現のために有効でないと考えた（他方、ＤＮＡが封入された裸のリポソームは、通常、いくつか（０．００３％以下）の細胞を蛍光陽性にする）。そしてＶＳＶ  ＧをコーティングされたＤＮＡ封入型リポソーム（ゲノソーム）のみが高効率なＧＦＰ遺伝子導入活性を示した。ＶＳＶ  Ｇタンパク質のリポソーム膜への挿入は、遺伝子導入活性を１０，０００倍以上も増大させた［ゲノソーム接種培養において、約３７％の細胞がＧＦＰ蛍光陽性であり、そしてリポソーム接種培養において、わずか３〜５個（０．００１〜０．００１７％）の細胞のみが陽性であったので、ＶＳＶ  によって媒介される遺伝子導入活性の増大量は、単純計算によると、２０，０００〜３０，０００倍である；図７］。発明者は、次に、最も有効なゲノソーム調製物のＧＦＰ遺伝子導入活性を他の遺伝子導入法のものと比較した。図７に示されるように、その効率は、ポリカチオン性脂質試薬（リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって行われたものにだいたい匹敵していた。このことは、同量（１μｇ）のｐＥＧＦＰ−Ｎ１  ＤＮＡを用いてトランスフェクションした場合の、ＧＦＰ蛍光の２．５倍高い発現を示す。
【００６７】
次いで、本発明者は、抗ＶＳＶ  Ｇ抗血清およびＮＨ4ＣｌがＶＳＶ  Ｇによってコーティングされたゲノソームの遺伝子導入活性に及ぼす影響について調べた。抗血清を用いてゲノソームを前処理することによって、遺伝子導入活性が大きく減少した。このことは、活性がＶＳＶ  Ｇタンパク質によって媒介されていることを示唆する。また、ゲノソーム接種した培養物を２０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌで処理した場合、活性は、ほとんど完全にブロックされた（図８および図９）。この結果、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の酸性ｐＨ依存的な膜融合活性（Ｓｕｐｅｒｔｉ，Ｆら、１９８７．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３８７−３９９）がレシピエント細胞への遺伝子導入に関与することが示された。
【００６８】
５）リポソームの組成を変えた場合の遺伝子導入活性の比較
本発明者らは、さらに、リポソームの成分であるホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ガングリオシド（ＧＭ1）のモル比を変えた場合の本発明ゲノソームの遺伝子導入活性を調べた。ガングリオシドを添加した場合（ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ：ＧＭ1＝５：１：３：１）の遺伝子導入活性は、コントロール（ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ＝５：１：４）と比較して、約２倍であった。ホスファチジルセリンを除いた場合（ＰＣ：Ｃｈｏｌ＝１：１）あるいはホスファチジルセリンの代わりにガングリオシドを加えた場合（ＰＣ：ＧＭ1：Ｃｈｏｌ＝５：１：４）の遺伝子導入活性は、コントロールの場合と比較して非常に低い遺伝子導入活性しか示さなかった（図１０）。
【００６９】
リポソームの成分をＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ＝５：１．５：４、ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ＝５：０．７：４、ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ：ＧＭ1＝５：１：３：０．７、ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ：ＧＭ1＝５：１．５：３：１に変えて、上記のように実験を行うことにより、目的遺伝子を宿主細胞へ導入することができる。
【実施例２】
【００７０】
水疱性口内炎ウイルスのコートタンパク質に代えて狂犬病ウイルスのコートタンパク質を用い、宿主細胞としてＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ−７細胞のほかに、神経組織あるいは横紋筋肉組織の器官培養あるいは組織培養を用い、実施例１と同様の実験を行うことにより、神経細胞あるいは横紋筋肉細胞などへ特異的に目的遺伝子を導入することができる。
【実施例３】
【００７１】
水疱性口内炎ウイルスのウイルスコートタンパク質に代えて、以下の表１に示すウイルスコートタンパク質を用い、実施例１と同様の実験を行うことによって、宿主に目的遺伝子を導入することができる。
【００７２】
【表１】
2005139140.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明に従って、汎用されている物質をリポソームに封入し、さらに該リポソームの表面へ適切なウイルスコートタンパク質を保持させることによって、研究または医療のための物質導入剤を作製することができる。
【００７４】
あるいは、本発明に従って、実施機関（研究所、病院など）から委託されたサンプルを封入し、さらに該リポソームの表面へ適切な（あるいは、要望された）ウイルスコートタンパク質を保持させることによって、研究または医療のための物質導入剤を作製することができる。
【００７５】
また、本発明の物質導入剤を疾患に罹患するまたは罹患する恐れのある患者に投与することによって、その疾患の治療または予防を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）の抽出に最適な条件の調査。室温にて、様々な塩濃度［すなわち、０、３０、１５０または５００ｍＭ  ＮａＣｌ（０および３０ｍＭ  ＮａＣｌのサンプルについて、適量の濃縮スクロース溶液を添加し、抽出用緩衝液の浸透圧（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を調整した）］下において、１％  オクチルグルコシドを用いて、精製ＶＳウイルス（２００μｇタンパク質／ｍｌ）を抽出した。次に、各サンプル（４ｍｌ）を２０％スクロースクッション／ＳＴＥ上へ置き、９０分間、４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて、４℃において、遠心した。上清を回収し、ＰＢＳ（−）に対して２４時間透析した（この間、透析緩衝液を定期的にフレッシュなＰＢＳ（−）と交換した。最終的に、それらを、ＰＥＧ＃２００００の粉末を用いて透析バッグを通して部分的に脱水し、その体積を１ｍｌまで減少させた。次いで、その一部を用いて１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＣＢ染色を行い、上記の濃縮した上清中のＧタンパク質含有率について調べた。レーン１：分子量マーカー；レーン２：未処理の全ビリオン；レーン３、４、５および６：それぞれ１、３０、１５０および５００ｍＭ  ＮａＣｌである。
【図２】リポソームおよびコーティングされたゲノソームの粒子サイズ分布。プラスミドＤＮＡを封入したリポソーム（Ａ）およびＶＳＶ  Ｇ−コーティングしたゲノソーム（Ｂ）をＤＬＳ分光計へアプライした。粒子サイズの分布をヒストグラム中に図示した。平均サイズは、リポソームおよびゲノソームについて、それぞれ８４．２ｎｍおよび１３６．３ｎｍであった。
【図３】リポソームおよびゲノソームへのプラスミドＤＮＡの封入についての証拠。先ず、プラスミドＤＮＡを実施例において記載されるようにリポソームへ封入し、そして続いて、異なるポアサイズ（１０μｍ、２μｍ、０．６μｍ、そして最後に０．４５μｍ）の連続するプラスチックフィルターを通して、濾過した。その後、得られたリポソーム調製物を、ｐＨ５．５において、精製ＶＳＶ  Ｇタンパク質と２０：１のモル比（Ｇ対ＤＮＡ）で混合し、さらに１時間３７℃にてインキュベーションし、その後１Ｍ  クエン酸ソーダ緩衝液を添加することによって、ｐＨを７．４まで戻した。その後不連続的なスクロース勾配を通して、２２，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて、３時間、４℃にて、遠心した。ゲノソーム調製物を２０％〜４５％の間のスクロース層から回収した。それらＤＮＡ封入についてのエンドヌクレアーゼ消化に対する耐性の獲得を指標として、以下のように調査した：リポソーム調製物（Ａ）およびゲノソームフラクション（Ｂ）から得られた少量のアリコートを、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  の存在下または非存在下において、ＳａｌＩで消化した。５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％  ＳＤＳを添加することによって反応を停止した後、サンプルを１％  アガロースゲル中で泳動した。レーン１：未処理；レーン２：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のみで処理；レーン３：Ｓａｌ  Ｉのみで処理：レーン４：０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下におにてＳａｌ  Ｉで処理。
【図４】ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソーム調製のための条件。Ａ．酸性および中性ｐＨ条件下で調製されたゲノソームの遺伝子導入活性の比較。ＶＳＶ  ＧでコーティングされたゲノソームをｐＨ７．５およびｐＨ５．５において作製し、そしてＣＯＳ−７細胞培養におけるそれらのＧＦＰ遺伝子導入活性についてアッセイした。活性を、フォーカス数／プラスミドＤＮＡ（μｇ）として表した。Ｂ．ゲノソームの効率的なアセンブリーのためのプラスミドＤＮＡとＶＳＶ  Ｇタンパク質との間の最適なモル比についての調査。プラスミドＤＮＡを封入したリポソームを様々な量（１：１から１：５０までの範囲のプラスミドＤＮＡ対Ｇタンパク質のモル比）のＶＳＶ  Ｇタンパク質とｐＨ５．５において混合することによって、ＶＳＶ  Ｇでコーティングされたゲノソームを調製した。それらの遺伝子導入活性をアッセイし、そして比活性（すなわち、１μｇ  ＤＮＡ当たりの蛍光陽性細胞の数）として表した。ｘ軸は、プラスミドＤＮＡ対ＶＳＶ  Ｇタンパク質のモル比を示す。
【図５−１】ＶＳＶ  Ｇタンパク質でコーティングされたゲノソームのキャラクタライゼーション。Ａ〜Ｄ．酸性条件下で作製されたゲノソーム調製物（１．８ｍｌ）を不連続的なスクロース勾配［１０％  スクロース（１．０ｍｌ）、２０％  スクロース（１．０ｍｌ）、および４５％  スクロース（０．８ｍｌ）からなる］上へのせた。２２，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて、３時間、４℃にて遠心した後、明瞭なバンドが、２０％〜４５％スクロース層の間の中間面に相当する位置において見られた（Ａ）。このグラディエントを７つのフラクション［最上部から最下部へ１．５ｍｌ、０．４ｍｌ、０．４ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌ、０．６ｍｌおよび０．５ｍｌ］に分画した。各フラクションをＤＮＡ（Ｂ）およびＧタンパク質（Ｃ）の含有率ならびに遺伝子導入活性（Ｄ）について、試験した。レーン１〜７：最上部から最下部までのフラクション。先ず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）（ＣＢＢ）を用いる染色によって、Ｇタンパク質の検出を行った。一連の各フラクションの２倍希釈液のＣＢＢ染色によって、半定量的な検出を行った。Ｅ．裸のプラスミドＤＮＡを、ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームについて記載した方法に類似する方法によって、試験した。不連続的なスクロース密度勾配を通した遠心の後に、そのグラディエントを分画し、アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡの分布について試験した。Ｆ．ＶＳＶ  Ｇタンパク質をスクロース濃度勾配を通して遠心し、７つのフラクションに分画し、その各々をＧタンパク質の含有率についてアッセイした。Ｇタンパク質の大部分は、ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームよりも幾分か密度の高い下のフラクションにおいて検出された。
【図５−２】ＶＳＶ  Ｇタンパク質でコーティングされたゲノソームのキャラクタライゼーション。Ｇ〜Ｉ．裸のＤＮＡをＶＳＶ  Ｇタンパク質と混合し、そしてスクロースの密度勾配を通して遠心し、さらに７つのフラクションに分画し、そしてＤＮＡ（Ｇ）およびＧタンパク質（Ｈ）の含有量、ならびにＧＦＰ遺伝子導入活性（Ｉ）についてアッセイした（ＤＮＡの分布は、おそらくそのＧタンパク質と結合するものがあるため、少し低いフラクションにまで広がっている）。Ｊ〜Ｌ．ＤＮＡおよびＶＳＶ  Ｇタンパク質を空のリポソームと混合し、そしてｐＨ５．５に暴露した。ｐＨを中性に戻した後、この混合物を、スクロース密度勾配を通して遠心し、さらにこれを７つのフラクションへ分画し、ＤＮＡ（Ｊ）およびＧタンパク質（Ｋ）の含有量、ならびにＧＦＰ遺伝子発現（Ｌ）についてアッセイした。
【図６−１】ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームの電子顕微鏡研究。４％  酢酸ウラニルによってネガティブ染色されたＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームを透過電子顕微鏡によって観察した。Ａ．ＶＳＶ  Ｇスパイク状突起物をもつ様々な大きさの球状粒子が観察された（棒線は、２００ｎｍを示す）。挿入図は、より高倍率において、スパイク状突起物に覆われた約８０ｎｍおよび１００ｎｍの大きさの代表的な粒子を示す（棒線は、１００ｎｍを示す）。
【図６−２】ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームの電子顕微鏡研究。Ｂ．ネガティブ染色の前に、抗ＶＳＶ  Ｇタンパク質抗体および５ｎｍ−ゴールドコロイドと共にインキュベーションすることによって、ゲノソームをイムノゴールド染色した（棒線は、１００ｎｍを示す）。Ｃ．ゲノソームのサイズ分布のヒストグラム。図６Ａ中の計２２７ゲノソームについて、各粒子の直径を測定した後、頻度を計算し、８．５ｎｍ間隔でプロットした。
【図７】ＶＳＶ  Ｇ−ゲノソームと正に帯電したリポフェクションシステムとの間の遺伝子導入活性の比較。ＶＳＶ  Ｇでコーティングされたゲノソームの具体的な遺伝子導入活性（すなわち、プラスミド１μｇ当たりの導入された蛍光陽性細胞の数）をリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の遺伝子導入活性、ならびにコントロールとして裸のプラスミドＤＮＡおよびＧ−ｆｒｅｅリポソームの遺伝子導入活性と比較した。
【図８】ＶＳＶ  Ｇでコーティングされたゲノソームの外来遺伝子導入活性の増大におけるＶＳＶ  Ｇタンパク質の関与についての証明。抗ＶＳＶ  Ｇ抗血清を用いる実験のために、ゲノソームを種々の希釈率（すなわち、１：３３、１：１００および１：３００）の抗血清とインキュベーションした。ＮＨ4Ｃｌを用いて処理する場合、ゲノソーム接種ＣＯＳ−７細胞培養を２０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ含有培地と共にインキュベーションした。４８時間のインキュベーション後、未処理（コントロール）の培養および処理した培養を１０％  ホルマリンで固定し、蛍光陽性細胞の頻度について試験した。各条件について、蛍光陽性細胞の数を未処理のコントロール細胞の数（１００％）で割ることによって、相対的な活性（％）を計算した。２０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ処理培養物において、蛍光陽性細胞はほとんど検出されなかった（すなわち、５×１０5個の細胞中に数個以下であった）。
【図９】ＶＳＶ  Ｇゲノソームの遺伝子導入活性の写真比較。写真撮影のために、ゲノソームを接種された未処理のコントロール（Ａ）およびＮＨ4Ｃｌで処理された培養物（Ｂ）およびリポフェクタミン媒体により遺伝子導入された培養物（Ｃ）（これらは、図８に記載されるものと同じである）を使用した。
【図１０】リポソームの組成を変えた場合の遺伝子導入活性の比較。リポソームの成分であるホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ガングリオシド（ＧＭ1）のモル比を変えた場合の本発明ゲノソームの遺伝子導入活性を調べた。コントロール（ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ＝５：１：４）、ガングリオシドを添加した場合（ＰＣ：ＰＳ：Ｃｈｏｌ：ＧＭ1＝５：１：３：１）、ホスファチジルセリンを除いた場合（ＰＣ：Ｃｈｏｌ＝１：１）、ホスファチジルセリンの代わりにガングリオシドを加えた場合（ＰＣ：ＧＭ1：Ｃｈｏｌ＝５：１：４）について、本発明の遺伝子導入活性を比較した。
【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図９】
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