(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＰＡＲ活性を調節することにより、脂質及びグルコース代謝を制御するのに有効なポリペプチド、及びそれを含む薬剤組成物を提供する。【解決手段】ロイコトリエンＢ４を還元するのではではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元するものである、特定の配列を有する単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの発現を阻害するための２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコトリエンＢ４を還元するのではではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元するものである、配列番号１の配列を有する単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも８０％一致する配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項３】
配列番号１と少なくとも９０％一致する配列を有する、請求項２に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項４】
ポリペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項５】
１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケト  ＰＧＥ２、１５−ケト  ＰＧＥ１、１５−ケト  ＰＧＦ２α、または１５−ケト  ＰＧＦ１αである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項６】
１５−ケトプロスタグランジンは、１５−ケト  ＰＧＥ２である、請求項５に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物に特異的に結合する抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ポリリボヌクレオチドの第一の鎖及びポリリボヌクレオチドの第二の鎖を有し、該第一の鎖は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼをコード化する核酸の１９〜４９番目の連続ヌクレオチドと同じであり、該第二の鎖は、第一の鎖と相補的である、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの発現を阻害するための２本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項１０】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼは、ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨである、請求項９に記載のリボ核酸。
【請求項１１】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼは、ＰＧＲ２／ＺＡＤＨ１である、請求項９に記載のリボ核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロスタグランジン  レダクターゼに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、脂質及びグルコース代謝を調節する核受容体群に属するものである。ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δの、３種の哺乳動物のＰＰＡＲが同定されている。植物由来の脂肪酸またはそれらの代謝誘導体のいずれかによって活性化されると、ＰＰＡＲは、転写のカスケードを誘発して、脂質及びグルコース代謝の変化を生じる。例えば、活性化されると、脂肪組織中で非常に発現するＰＰＡＲ−γは、グルコースの取り込みを促進して、血中のグルコースレベルを下げる。
【０００３】
脂質及びグルコース代謝での役割を考えると、ＰＰＡＲは、疾患、例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、炎症疾患、及び癌の治療のためのターゲットとして期待される。合成ＰＰＡＲ−γのアゴニスト、即ち、アバンディア（ＡＶＡＮＤＩＡ）は、ＩＩ型糖尿病を治療するのに使用されており、他の合成ＰＰＡＲ−αのアゴニスト、即ち、フィブレート（Ｆｉｂｒａｔｅ）は、異常脂質血症を治療するのに使用されている（例えば、非特許文献１〜２参照）。しかしながら、ほとんどのＰＰＡＲ治療剤は、有効性が限られており、副作用がかなりある。
【０００４】
したがって、ＰＰＡＲ活性を調節することにより、脂質及びグルコース代謝を制御するのにより有効な薬剤を開発する必要がある。
【非特許文献１】Ｌｅｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  （１９９５）  ２７０：１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】Ｆｒｕｃｈａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｄｏｌ．  （１９９９）  １０：２４５−２５７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、ＰＰＡＲ活性を調節することにより、脂質及びグルコース代謝を制御するのに有効なポリペプチド、及びそれを含む薬剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的は、（１）ロイコトリエンＢ４を還元するのではではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元するものである、配列番号１の配列を有する単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物；（２）上記単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物に特異的に結合する抗体；及び（３）ポリリボヌクレオチドの第一のストランド及びポリリボヌクレオチドの第二のストランドを有し、該第一の鎖は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼをコード化する核酸の１９〜４９番目の連続ヌクレオチドと同じであり、該第二の鎖は、第一の鎖と相補的である、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの発現を阻害するための２本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）によって達成される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＰＡＲ活性を調節することができる。このため、本発明のポリヌクレオチドは、疾患、例えば、ＩＩ型糖尿病、肥満、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、炎症疾患、及び癌をはじめとするＰＰＡＲが関連する病気（ＰＰＡＲ関連疾患）を治療するための薬剤として期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、患者にＰＰＡＲ活性の調節によりＰＰＡＲが関連する病気（ＰＰＡＲ関連疾患）を治療する方法に関するものである。
【０００９】
一発明の形態によると、本発明は、ロイコトリエンＢ４ではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元する単離されたポリペプチドを提供するものである。プロスタグランジン（ＰＧ）は、中心環及び様々な不飽和度を有する側鎖を有する生理学的なメディエイター群に属するものである。１５−ケトプロスタグランジンの種類は、特に制限されないが、例えば、１５−ケト  ＰＧＥ２、１５−ケト  ＰＧＥ１、１５−ケト  ＰＧＦ２α、及び１５−ケト  ＰＧＦ１αなどが挙げられ、１５−ケト  ＰＧＥ２が好ましい。この際、生理学的なメディエイターの他の群に属する、ロイコトリエンは、中心環を持たないという点でプロスタグランジンとは異なるものである。
【００１０】
他の発明の形態によると、本発明は、上記したポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、また、上記したポリペプチドのフラグメントに結合するものであってもよい。
【００１１】
さらに他の発明の形態によると、本発明は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現を阻害するための、２本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及びこれをコード化するＤＮＡベクターを提供する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼとは、プロスタグランジンのΔ１３２重結合を還元することにより１５−ケトプロスタグランジンの１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンに変換するのを触媒する酵素を意味する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼは、特に制限されないが、例えば、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ／ロイコトリエン  Ｂ４  １２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ（ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨ）及び亜鉛結合性アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＰＧＲ２／ＺＡＤＨ１）などが挙げられる。ｄｓＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドの２本の鎖を有する。第一の鎖は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼをコード化する核酸の１９〜４９番目の連続ヌクレオチドと同じである。第二の鎖は、第一の鎖と相補的である。好ましくは、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端が１〜４番目のヌクレオチドのオーバーハングを有する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼは、ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨまたはＰＧＲ２／ＺＡＤＨ１であってもよい。
【００１２】
本発明はまた、ＩＩ型糖尿病、肥満、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、炎症疾患、及び癌等のＰＰＡＲ関連疾患の治療方法を包含するものである。本方法は、患者に、有効量の１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ調節剤を投与する段階を有する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ調節剤とは、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの活性または発現に影響を与える分子または分子の複合体を意味する。調節剤は、１５−ケトプロスタグランジンであってもよい。また、調節剤は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの活性または発現のいずれかを抑制する阻害剤であってもよく、例えば、上記したｄｓＲＮＡが挙げられる。
【００１３】
以下、本発明をより詳細に説明するが、本発明のさらに他の目的、特徴および特質は、以後の説明および添付図面に例示される好ましい実施の形態を参酌することによって、明らかになるであろう。
【００１４】
本発明は、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ群の一つである、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ２（ＰＧＲ−２）の発見に基づくものである。予想されなかったことに、ＰＰＡＲ活性は、その基質や阻害剤によって調節できることを見出した。これらの基質及び阻害剤は、ＩＩ型糖尿病、肥満、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、炎症疾患、及び癌等のＰＰＡＲ関連疾患を治療するのに有用である。
【００１５】
本発明は、ロイコトリエンＢ４ではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元する配列番号１の配列を有する単離されたポリペプチド、または上記ポリペプチドの機能的な等価物に関する。以下に、そのアミノ酸配列（配列番号１）及び推定されるヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
単離されたポリペプチドとは、天然の分子を実質的に含まないポリペプチドを意味し、乾燥質量で少なくとも７５％（即ち、７５〜１００％）が純粋なものである。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミド電気泳動、またはＨＰＬＣ分析などの、適当な標準的な方法によって測定されうる。本発明の単離されたポリペプチドは、天然源から精製されてあるいは組換えＤＮＡ技術によって若しくは化学的な方法によって製造されてもよい。「機能的な等価物」ということばは、ロイコトリエンＢ４ではなく、１５−ケトプロスタグランジンを還元できる配列番号１の単離されたポリペプチドの変異体を意味し、例えば、一以上の点変異を有するタンパク質、一以上の挿入のあるタンパク質、一以上の欠失を有するタンパク質、若しくは一以上のトランケーションを有するタンパク質、または上記のいずれかの組み合わせを有するタンパク質がある。一実施態様においては、本発明の単離されたポリペプチドまたはその機能的な等価物は、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％、または８０〜１００％の他の数値）が配列番号１と一致する配列を有する。また、本発明のポリペプチド／タンパク質は、融合タンパク質であってもよい。
【００１８】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ活性とは、１５−ケトプロスタグランジンの１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンへの酵素による変換を意味する。その比活性の測定方法は特に制限されず、公知と同様の方法が使用できるが、例えば、下記方法に従って測定される。１０μｇのアッセイされるべきタンパク質調製物を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、及び０．５７ｍＭ  １５−ケト  ＰＧＥ２を含む反応緩衝液中で３７℃でインキュベートする。暗室中で３７℃で１０分間、反応を行ない、７００μｌの５０ｍＭ  フタル酸水素カリウム、及び１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む緩衝液（ｐＨ  ３．０）を添加することによって反応を終了する。７９０μＭ  インドニトロテロラゾリウムクロライド(indonitrotetrazolium chloride)、６０μＭ  フェナゼンメトスルフェート(phenazene methosulfate)、及び１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む、発色試薬を２００μｌ用いて、未反応のＮＡＤＰＨを酸化する。４９０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて測定する。順次希釈した量のＮＡＤＰＨを含む反応緩衝液を用いて、標準曲線を得る。９０ｎｍｏｌｅ／ｍｉｎ．ｍｇタンパク質以上の比活性がある際には、そのポリペプチドは１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ活性を有するとされる。
【００１９】
上記ヌクレオチド配列である、配列番号２は、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用できる。ヌクレオチド配列とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体を意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成できる。核酸分子は、１本鎖または２本鎖のいずれであってもよいが、好ましくは２本鎖である。タンパク質の発現を目的として、核酸を適当な調節配列に操作により連結して、発現ベクターを得てもよい。ベクターとは、予め連結した他の核酸を輸送できる核酸を意味する。ベクターは、自立複製可能なものであってもあるいは宿主ＤＮＡ中に組み込まれるものであってもよい。ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、プラスミド、コスミド、及びウィルスベクーが挙げられる。ベクターは、宿主細胞中で核酸が発現するのに適する形態のヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、ベクターは、一以上の調節配列が操作により発現しようとしている核酸配列に連結したものを含むものである。「調節配列」は、特に制限されず、公知の調節配列が同様にして使用できるが、例えば、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現または制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）などが挙げられる。調節配列としてはまた、ヌクレオチド配列の構成性発現を生じさせる配列、さらには組織特異的な調節および／または誘導配列がある。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって異なりうる。ベクターの発現を宿主細胞に導入することによって、本発明のポリペプチドを生産できる。上記核酸を含む宿主細胞もまた、本発明の範囲に包含される。宿主細胞としては、上記核酸を導入発現できるものであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌細胞(E. coli cells)、Ｓｆ９昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスの発現ベクターを用いる）、酵母細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられる。例えば、Goeddel, (1990) Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CAを参照。本発明のポリペプチドを製造する方法は特に制限されないが、上記を目的として、本発明の核酸がコード化するポリペプチドを発現できる条件下で適当な培地中で宿主細胞を培養して、培養細胞または細胞の培養液からポリペプチドを精製する方法が使用できる。または、ヌクレオチド配列を、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてin vivoで転写、翻訳してもよい。
【００２０】
上記ポリペプチドは、動物中で抗体を得るのに使用できる。抗体は、ポリペプチドのフラグメントから得てもよい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体ならびにこれらのフラグメントを動物中で作製する方法は、当該分野において既知である。例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照。「抗体」ということばは、完全な分子、さらにはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、及びｄＡｂ（ドメイン抗体；Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544）等の、これらのフラグメントをも包含する。
【００２１】
抗体の作製方法は、特に制限されないが、例えば、下記方法が好ましく使用できる。しかしながら、下記方法に限定されるものではない。本発明のポリペプチドを、ＫＬＨ等の、キャリアタンパク質にカップリングして、アジュバントと混合し、さらにこれを宿主動物に注射する。次に、この動物中で生成した抗体を、ペプチドアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。この際使用される宿主動物は、特に制限されないが、一般的には、ウサギ、マウス、モルモット、及びラットが使用される。様々なアジュバントが免疫反応を向上するために使用でき、アジュバントの種類は、宿主の種によって異なり、特に制限されないが、例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノール等の界面活性物質などが挙げられる。有用なヒト用アジュバントは、特に制限されないが、例えば、ＢＣＧ(bacille Calmette-Guerin)及びコリネバクテリウム-パルヴム(Corynebacterium parvum)がある。
【００２２】
抗体分子の異種集団である、ポリクローナル抗体は、免疫処置された被験者の血清中に存在する。本発明のポリペプチドに対する抗体の均質な集団である、モノクローナル抗体の作製方法は特に制限されないが、通常、標準的なハイブリドーマ技術を用いて調製できる（例えば、Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 511; Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292; and Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.を参照）。特に、モノクローナル抗体は、Kohler et al. (1975) Nature 256, 495及び米国特許第４，３７６，１１０号に記載される技術などの培養液中で連続的細胞継代系によって抗体分子を産生する技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad Sci. USA 80, 2026)；及びＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)等の技術によって得られる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリンクラス及び、ならびにこれらのサブクラスのいずれであってもよい。本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、in vitroで培養されてあるいはin vivoで培養されてもよい。in vivoでのモノクローナル抗体を高力価で産生できることが、特に有用な生産方法である。
【００２３】
加えて、「キメラ抗体」の製造を目的として開発された技術を使用してもよい。例えば、Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 及び Takeda et al. (1984) Nature 314:452を参照。キメラ抗体は、マウスのモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリンの定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。または、一本鎖抗体の製造に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号及び第４，７０４，６９２号）を、単鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリーを作製するために適用してもよい。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および短鎖フラグメントを連結することによって形成される。さらに、抗体フラグメントは、既知の方法によって得られ、特に制限されない。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって製造できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって得られるＦａｂフラグメントがある。抗体はまた、既知の方法によってヒト化されてもよい。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体を、商業的にヒト化してもよい(Scotgene, Scotland; and Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.)。形質転換動物中で発現する完全ヒト抗体(fully human antibody)等の、完全ヒト抗体もまた本発明に包含される（例えば、Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13；及び米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号を参照）。
【００２４】
２本鎖のリボ核酸（ｄｓＲＮＡ）もまた本発明に包含される。このｄｓＲＮＡは、１５−ケトプロスタグランジン-Δ13-レダクターゼの発現を阻害するのに使用できる。ゆえに、患者にｄｓＲＮＡを投与することによって、ＰＰＡＲ関連疾患を治療することができる。「ｄｓＲＮＡ」ということばは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知のプロセスである、標的のＲＮＡ配列の分解により遺伝子の発現を沈黙させる(silence)２本鎖のリボ核酸を意味する。ＲＮＡｉは、広範な動物モデル（例えば、Ｃ．エレガンス(C. elegans)、ゼブラフィッシュ、及びマウス胚）で及び他の生体系システム（例えば、外植されたニワトリの神経細胞及び哺乳動物の細胞培養物）で遺伝子の発現を沈黙させるのに使用されている。例えば、ＷＯ  ９９／３２６１９、ＷＯ  ００／４４９１４、ＷＯ  ００／４４９１４、ＷＯ  ００／４４８９５、ＷＯ  ００／６３３６４、及びＷＯ  ０１／３６６４６  Ａ１を参照。
【００２５】
本発明のＲＮＡは、当該分野において既知の技術によって合成できる。例えば、Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45、及びBrennan, 米国特許第６，００１，３１１号を参照。また、ＲＮＡは、標準的な技術を用いて発現ベクターから転写され、また、単離されてもよい。本発明のＲＮＡまたはベクターは、当該分野において既知の方法を用いて標的細胞にデリバリーされうる。例えば、Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2, 139を参照。例えば、ＲＮＡまたはベクターを、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、または生体付着性マイクロスフェア(bioadhesive microsphere)を用いて細胞中に導入してもよい。または、ＲＮＡまたはベクターを、直接注射することによってまたは輸液ポンプを用いて局所的にデリバリーしてもよい。他のアプローチとしては、例えば、コンジュゲート(conjugate)及び生分解性ポリマーを用いて、様々な輸送及びキャリアシステムを使用することがある。
【００２６】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの活性または発現を調節することによって、ＰＰＡＲ関連疾患を治療することができる。「治療」とは、治療効果を付与する、例えば、ＰＰＡＲ関連疾患、このような疾患の症状、またはこのような疾患になりやすい素因を治癒する(cure)、緩和する(relieve)、変える(alter)、これらに影響を与える(affect)、これらを改善する(ameliorate)、または予防することを目的として、ＰＰＡＲ関連疾患を罹患している、このような疾患の症状のある、またはこのような疾患になりやすい素因のある患者に、一以上の上記１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ調節剤、即ち、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの基質及び阻害剤を、投与することを意味する。「有効量」とは、処置される患者に治療効果を付与するのに必要な量を意味する。１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼとしては、１５−ケト  ＰＧＥ２、１５−ケト  ＰＧＥ１、１５−ケト  ＰＧＦ２α、１５−ケト  ＰＧＦ１α、及びこれらの構造の類似体があり、好ましくは１５−ケト  ＰＧＥ２である。
【００２７】
ＰＰＡＲ関連疾患(disease)（または不全(disorder)若しくは症状(condition)）の例としては、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、低グルコース耐性(low glucose tolerance)、シンドロームＸ(Syndrome X)、インスリン耐性、肥満、脂質不全(lipid disorder)、異常脂質血症、高脂質血症、高血糖症、トリグリセリド過剰血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高ＬＤＬレベル、アテローム性動脈硬化症（及びその続発症、例えば、アンギナ、跛行、心臓麻痺または心臓発作など）、血管の再狭窄、過敏性腸症候群、炎症疾患（例えば、炎症性大腸炎、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、変形性関節症、多発性硬化症、喘息、脈管炎、虚血／再潅流傷害、凍傷、または成人呼吸窮迫症候群等）、膵炎、神経変性疾患、網膜症、腫瘍性症(neoplastic conditions)、癌（例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、若しくは結腸癌、または脂肪肉腫等の脂肪細胞癌等）、血管形成、アルツハイマー病、皮膚不全（例えば、座瘡、乾癬、皮膚炎、湿疹、または角化症等）、高血圧、卵巣の高アンドロゲン血症、骨粗鬆症、及び骨減少症などが挙げられる。しかしながら、上記に制限されるものではない。
【００２８】
ＰＰＡＲ関連疾患を治療することを目的として、１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ調節剤及び製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物を、このような治療の必要のある患者に投与できる。この際薬剤組成物の投与方法は特に制限されないが、例えば、経口で、静脈内輸注によって、または皮下に、筋肉内に、鞘内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、若しくは肺内に注射若しくは移植することによって、投与することができる。
【００２９】
本薬剤組成物は、無毒な許容できる希釈剤または溶剤における溶液または懸濁液として使用されてもよい。このような場合において、溶液としては、１，３−ブタンジオールにおける溶液がある。使用できる許容できるベヒクルや溶剤は、特に制限されず、公知のものが使用できるが、具体的には、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液などがある。加えて、不揮発性油もまた、従来溶剤または懸濁媒質として使用されており、これも同様にして使用でき、この際、不揮発性油としては、特に制限されないが、例えば、合成モノまたはジグリセリドがある。オレイン酸等の脂肪酸及びそのグリセリド誘導体などが、注入物質の調製に有用であり、さらには天然の製薬上許容できる油もまた使用でき、例えば、オリーブ油またはヒマシ油があり、これらは特にポリオキシエチル化された形態が好ましい。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖のアルコール希釈剤若しくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または同様の分散剤を含むものであってもよい。または、他の一般的に使用されている界面活性剤、例えば、ツイーン若しくはスパン、または製薬上許容できる固体、液体または他の剤形の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤若しくはバイオアベイラビリティエンハンサー(bioavailability enhancer)を、配合目的で使用してもよい。
【００３０】
必要な投与量は、投与経路；配合物の性質；患者の病気の性質；患者のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別；投与される他の薬剤；ならびに主治医の判断などによって異なる。適当な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇである。様々な利用できる組成物及び様々な投与経路の異なる有効性を考慮すると、必要な投与量は広範に変化しうると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該分野において既知の最適に関する標準的な経験上の手順を用いて調節できる。特に経口によるデリバリーでは、適当なデリバリーベヒクル（例えば、ポリマーミクロ粒子または移植可能な装置）への組成物のカプセル化により、デリバリー効率が上がる。
【００３１】
上記したような薬剤組成物は、公知の方法を用いて異なる投与経路に応じた投与形態に配合されてもよい。例えば、経口投与用途では、薬剤組成物を、カプセル、ゲルシール、または錠剤に配合しうる。カプセルは、ゼラチンまたはセルロース等の標準的な製薬上許容できる材料を含んでもよい。錠剤は、組成物を固体キャリア及び潤滑剤と混合したものを圧縮することなどによって、公知の方法に従って配合できる。固体キャリアは、特に制限されず、公知の固体キャリアが使用できるが、例えば、デンプン及び糖ベントナイト(sugar bentonite)などがある。本組成物はまた、結合剤、例えば、ラクトースまたはマンニトール、公知の充填剤及びタブレット化剤を含むハードシェルタブレットまたはカプセルの形態で投与されてもよい。本薬剤組成物は、非経口経路と介して投与されてもよい。非経口投与形態の例としては、活性剤の水溶液、等張生理食塩水若しくは５％グルコース溶液、または他の公知の製薬上許容できる賦形剤などが挙げられる。シクロデキストリン、または当該分野において既知の他の可溶化剤を、治療剤のデリバリーを目的とした薬剤用の賦形剤として使用してもよい。
【００３２】
上記薬剤組成物の有効性は、in vitro及びin vivoの双方で評価されうる。簡単にいうと、薬剤組成物によるin vitroでの１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ活性または発現の阻害能を試験してもよい。in vivoでの研究では、薬剤組成物を動物（例えば、マウスモデル）に注射した後、その治療効果を評価してもよい。得られた結果に基づいて、適切な投与量範囲及び投与経路を決定できる。
【実施例】
【００３３】
以下の具体的な実施例は、単に例示のためのものであり、本願の開示の残りの部分をいかようにも限定するものではないと解釈されるべきである。また、本技術分野の当業者であれば、本明細書中の記載に基づき、さらなる労力を費やすことなく、本発明を完全な範囲で実施可能であると解される。本明細書中の引用文献は全て、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００３４】
新規な１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼの同定
脂質生成時にアップレギュレートされる遺伝子を同定するために、マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いて、ｍＲＮＡ差次的発現分析を行った。脂質生成を誘導するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１μＭデキサメタゾンで処理し、３７℃にて１０日間増殖させた。誘導１０日目に回収した３Ｔ３−Ｌ１細胞においては、１９９個のヌクレオチドフラグメントが単離され、高度に発現していることがわかった。当該フラグメントの配列については、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の２つのエントリー、すなわちＡＫ０２１０３３およびＡＫ０２０６６６のセグメントと同一であることを確認した。
【００３５】
当該遺伝子のコード領域に対応する全長ｃＤＮＡ配列を、マウスＰＧＲ−２と命名した。以下のように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から当該配列を単離し、クローニングした。ＰＧＲ−２  ｃＤＮＡについてはＰＣＲにて増幅し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社製）によりｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ社製）中にライゲーションした。ＰＧＲ−２  ｃＤＮＡ増幅用のフォワードおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ、５’−ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＡ−３’（配列番号３）、および５’−ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  Ｇ−３’（配列番号４）であった。次いで、得られた構築物（ｐＴＥ−ＰＧＲ−２）をＴ７およびＳＰ６ポリメラーゼにより配列決定した。次いで、ＰＧＲ−２オープンリーディングフレームのコード領域を、発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（ストラタジーン社製）にサブクローニングした。ｐＦＬＡＧ−ＰＧＲ−２を構築するために、テンプレートとしてのｐＴＥ−ＰＧＲ−２、並びにプライマーとしての２つのオリゴヌクレオチドである５’−ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＴＡ−３’（配列番号５）および５’−ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  Ｔ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＧＲ−２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを得た。次いで、こうして得られたＰＣＲ産物をｐＣＭＶ−Ｔａｇ２ＢのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位に導入して、ｐＦＬＡＧ／ＰＧＲ−２の融合構築物を得た。最後に、ＳｍａＩおよびＸｈｏＩ（ファルマシア社製）を用いて切断されたｐＧＥＸ−４Ｔ−３ベクター中に、ｐＦＬＡＧ／ＰＧＲ−２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをライゲーションすることにより、ｐＧＥＸ−ＰＧＲ−２構築物を調製した。
【００３６】
マウスＰＧＲ−２の推定アミノ酸配列、すなわち配列番号１は、上述したとおりである。当該マウスＰＧＲ−２は、２つのタンパク質に相同であることがわかった：（１）ヒトＺＡＤＨ１（ジーンバンク登録番号：ＮＭ１５２４４４）（相同性：〜９２％）、および（２）ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨまたはＰＧＲ−１（相同性：〜５４％）。
【００３７】
３Ｔ３−Ｌ１細胞において、ＰＧＲ−２の発現は脂質生成時に増加した。最大の発現は脂質生成誘導の６日後に観察された。この時点では、脂肪細胞中に脂質滴が高度に蓄積していることが観察された。ＰＧＲ−２の組織分布を決定した。ＰＧＲ−２は、脂肪組織において高度に発現していた。ホモ接合性およびヘテロ接合性ｄｂ／ｄｂマウスの双方において、大網脂肪（ｏｍｅｎｔａｌ  ｆａｔ）におけるＰＧＲ−２  ｍＲＮＡの量は野生型マウスよりも有意に高かった。
【００３８】
標準的な手法に従い、ＧＳＴ融合タンパク質として、大腸菌においてマウスＰＧＲ−２を組換え発現させた。こうして得られた組換えＰＧＲ−２タンパク質を、基質特異性および酵素速度論を決定するために用いた。
【００３９】
酵素活性については、以下のように決定した。１０μｇの組換えマウスＰＧＲ−２タンパク質を、０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、および０，５７ｍＭ  １５−ケトＰＧＥ２を含有する反応緩衝液中で３７℃にてインキュベートした。反応は暗所で３７℃にて１０分間行い、５０ｍＭフタル酸水素カリウムおよび１％トゥイーン２０を含有する緩衝液（ｐＨ３．０）を７００μＬ添加することにより、反応を停止させた。７９０μＭの塩化インドニトロテトラゾリウム、６０μＭのメト硫酸フェナゼン、および１％トゥイーン２０を含有する着色剤を２００μＬ添加して、未反応のＮＡＤＰＨを酸化させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。一連の希釈された量のＮＡＤＰＨを含有する反応緩衝液を用いて、標準線を作成した。
【００４０】
１５−ケトＰＧＥ２を６種のプロスタグランジン基質（うち３種は下流の代謝物）、またはロイコトリエンＢ４に置き換えたこと以外は、上述の手法により、ＰＧＲ−２の基質特異性を決定した。１５−ケトＰＧＥ１、１５−ケトＰＧＥ１α、および１５−ケトＰＧＦ２αは、ＰＧＲ−２と特異的に反応した。これに対し、６−ケトＰＧＦ１、ＰＧＦ２、１１ｂ−ＰＧＦ２α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＤ２、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２、およびロイコトリエンＢ４からは比活性は検出されなかった。
【００４１】
速度論の研究によれば、ＰＧＲ−２は、１５−ケトＰＧＥ２の１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２への、続いて１５−ケトＰＧＦ１、１５−ケトＰＧＥ１、および１５−ケトＰＧＦ２への変換を最も効率的に触媒することが示された。ＰＧＲ／ＬＴＢ４ＤＨとは異なり、ＰＧＲ−２は、補因子として、ＮＡＤＨよりもＮＡＤＰＨをずっと効率的に用いていた。
【００４２】
３Ｔ３−Ｌ１細胞において、ＰＧＲ−２のタンパク質発現レベルは脂質生成時にアップレギュレートされた。ＰＧＲ−２タンパク質の最大レベルは、完全に分化した脂肪細胞において検出された。脂質生成の初期段階では、ＰＰＡＲ−γが顕著に誘導された。低いＰＧＲ−２の発現は、前脂肪細胞の核に局在化していた。より高いＰＧＲ−２の発現は、分化した脂肪細胞の細胞質に分布していた。
【００４３】
内因性のヒトＰＰＡＲ−αおよび−γを発現しているヒトＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＰＰＡＲ−γの転写の制御に対するＰＧＲ−２発現の効果についても調査した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞においてＰＧＲ−２が過剰発現すると、ＰＰＡＲ媒介性の転写活性が抑制されることがわかった。この転写活性はまた、Ｈｅｐ３Ｂ細胞がＰＰＡＲ−γアゴニスト、すなわち、ＢＲＬ４９６５３によって刺激された後であっても抑制された。３Ｔ３−Ｌ１細胞についても、同様の結果が得られた。
【００４４】
プロスタグランジン
脂肪細胞におけるＰＰＡＲ−γ活性に対するプロスタグランジンの効果を調査した。細胞の分化を誘導する培地で処理した後、１４μＭの１５−ケトＰＧＥ２、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２、１５−ケトＰＧＦ２α、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２α、または４．５μＭのＰＰＡＲ−γアゴニストであるＢＲＬ４９６５３を用いて、脂質生成の２日目から４日目まで３Ｔ３−Ｌ１細胞を処理した。Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  （１９９５）  ８３：８０３−８１２を参照。６日目に、観察のためにオイルレッドＯを用いて脂質滴の凝集体を染色した。１５−ケトＰＧＥ２は、ＢＲＬ４９６５３と同等のレベルで脂質生成を効率的に促進した。２日間の分化誘導後、３Ｔ３−Ｌ１細胞を、レポーター遺伝子を用いてトランスフェクトした。１５−ケトＰＧＥ２および１５−ケトＰＧＦ２αの双方が、内因性のＰＰＡＲ活性を有意に促進した。これに対し、対応する下流の代謝物、すなわち、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＥ２および１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＦ２αは、ＰＰＡＲ活性を増加させなかった。
【００４５】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を、酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合した、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γまたはＰＰＡＲ−δのリガンド結合ドメインとともに、３Ｔ３−Ｌ１細胞にトランスフェクトした。１５−ケトＰＧＥ２および１５−ケトＰＧＧＦ２αは、ＰＰＡＲ−γ、およびより低い程度ではあるが、ＰＰＡＲ−αを活性化した。
【００４６】
１５−ケトＰＧＥ２の、脂質生成特異的なＰＰＡＲ−γの標的遺伝子、すなわち、ＩＲＳ−１および−２の誘導能を評価した。３Ｔ３−Ｌ１細胞において、充分な量のＰＰＡＲ−γ１およびＰＰＡＲ−γ２タンパク質は、インスリンおよびデキサメタゾンで処理された場合に検出され、メチルイソブチルキサンチン（ＭＩＸ）単独で処理した場合には検出されなかった。インスリンおよびデキサメタゾンとともに１５−ケトＰＧＥ２およびＭＩＸを添加すると、ＰＰＡＲ−γ１およびＰＰＡＲ−γ２の発現が有意に促進された。１５−ケトＰＧＥ２およびＢＲＬ４９６５３は、ＭＩＸの不存在下においても、脂肪細胞特異的マーカーであるａＰ２の発現を強力に誘導した。インスリンおよびデキサメタゾンの存在下では、ＢＲＬ４９６５３処理によりＩＲＳ−２の発現が劇的に増加した。１５−ケトＰＧＥ２は、ＭＩＸと同等のレベルで当該発現を促進した。インスリン／デキサメタゾン、またはＭＩＸのいずれかにより、ＩＲＳ−１の発現が誘導された。１５−ケトＰＧＥ２およびＢＲＬ４９６５３などのＰＰＡＲ−γのリガンドでは、ＩＲＳ−１タンパク質の量は増加しなかった。
【００４７】
１５−ケトプロスタグランジン−Δ１３−レダクターゼ阻害剤
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）アプローチを用いて、ＰＧＲ−２の発現を沈黙させた(silence)。２つの小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２本鎖、すなわち、ｇａｇｕｕｃａｇｕｕｕａｃｃｇｇａｕｇ（配列番号７）およびｇｕｕｃａａｇｕｇａｇｇａｃｕｃｕｕｕ（配列番号８）をまずアニーリングさせ、次いで３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞または分化した前脂肪細胞中にオリゴフェクトアミン（インビトロジェン社製）を用いたトランスフェクションにより導入した。ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションにより、ＰＧＲ−２の発現が減少した。他の実験では、ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションにより、ＰＰＡＲ−γの転写活性が増加した。よって、ＲＮＡ干渉によるＰＧＲ−２発現の抑制を介して、ＰＰＡＲ−γ活性を調節することが可能である。
【００４８】
他の実施形態
本明細書に開示した全ての特徴は、任意に組み合わせて用いられうる。本明細書に開示したそれぞれの特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成する他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明確に特記しない限り、開示したそれぞれの特徴は、均等な、または類似の一連の一般的な特徴の単なる例に過ぎない。
【００４９】
上記の記載から、当業者であれば容易に本発明の本質的な特徴を確定することができ、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明を様々に変更および修飾して、種々の用途および条件に適応させうる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲に含まれる。
【配列表】
2005348733000001.app