(57)【要約】  【課題】  短時間でサイトカインを誘発させることができるサイトカイン誘発剤を提供することにある。  【解決手段】  リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸、ミリストレイン酸などの二重結合を１〜３個有する炭素数８〜２４の不飽和脂肪酸およびそのモノアシルグリセリドからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とするサイトカイン誘発剤である。前記サイトカインとしては、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８（ケモカイン）、ＩＬ‐１８、ＴＮＦα、ＩＦＮαまたはＩＦＮγが例示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重結合を１〜３個有する炭素数８〜２４の不飽和脂肪酸およびそのモノアシルグリセリドからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とするサイトカイン誘発剤。
【請求項２】
前記不飽和脂肪酸の炭素数が１１〜１８である請求項１記載のサイトカイン誘発剤。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸がリノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸およびミリストレイン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１または２に記載のサイトカイン誘発剤。
【請求項４】
前記モノアシルグリセリドが、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸およびミリストレイン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の不飽和脂肪酸のモノアシルグリセリドである請求項１〜３のいずれかに記載のサイトカイン誘発剤。
【請求項５】
サイトカインがIL‐6、IL‐8（ケモカイン）、IL‐18、TNFα、IFNαまたはIFNγである請求項１〜４のいずれかに記載のサイトカイン誘発剤。
【請求項６】
注射剤の形態で使用される請求項１〜５のいずれかに記載のサイトカイン誘発剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの発現を誘発するサイトカイン誘発剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインとは、細胞が産生するタンパク質であり、それに対するレセプターを持つ細胞に作用し、細胞の増殖、分化、機能発現などを行うものの総称である。サイトカインとしては、以下のような特徴がある（下記非特許文献１より引用）。
１）糖タンパク質である。
２）微量で作用する。
３）主として産生された局所で作用するが、一部のサイトカインは血流を介して遠隔臓器に運ばれて作用する。
４）多様な生理活性を有する。
５）異なるサイトカインが同一の生理活性を有する。
６）サイトカインのネットワークを有する。
７）インヒビターが存在する。
【０００３】
サイトカインの作用としては、前記した細胞の増殖、分化、機能を発現することによって、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用などが知られている。
【０００４】
ところで、特許文献１には、ジグリセリドを有効成分とする免疫増強剤が記載されている。特許文献１の実施例には、マウスに経口投与したところ、トリグリセリドに比較して遅延型過敏反応を増強させることが示されている。
【０００５】
【非特許文献１】南木敏宏, 宮坂信之, 「サイトカインとサイトカイン受容体の多様性と機能」，最新医学 57: 831-839,2002
【特許文献１】特開平６‐２４７８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、短時間でサイトカインを誘発させることができるサイトカイン誘発剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の脂肪酸またはそのモノアシルグリセリドにサイトカインの発現を誘発する機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明のサイトカイン誘発剤は、二重結合を１〜３個有する炭素数８〜２４、好ましくは炭素数１１〜１８の不飽和脂肪酸およびそのモノアシルグリセリドからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする。従来からサイトカインについては数多くの報告があるが、上記の脂肪酸またはモノアシルグリセリドにサイトカインを誘発する機能があることは知られていない。
【０００９】
前記不飽和脂肪酸は、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸およびミリストレイン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種であるのがよい。また、前記モノアシルグリセリドは、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸およびミリストレイン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の不飽和脂肪酸のモノアシルグリセリドであるのがよい。
【００１０】
前記サイトカインとしては、IL（インターロイキン、以下同じ）‐6、IL‐8（ケモカイン）、IL‐18、TNF（腫瘍壊死因子）α、IFN（インターフェロン、以下同じ）αまたはIFNγが挙げられる。
【００１１】
上記化合物はヒトの血管内皮細胞と結合することにより短時間（通常、１〜２４時間程度）でサイトカインが誘発されるものと考えられる。このため、例えば静注することで誘発されたサイトカインによりマクロファージが活性化されターゲット（例えば癌）を攻撃することができ、あるいは免疫増強などの効果が認められる。従って、本発明のサイトカイン誘発剤は、輸液製剤を含む注射剤の形態で使用される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、特定の脂肪酸またはそのモノアシルグリセリドを投与することにより、サイトカインの発現を短時間で誘発することができるという効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳述する。
本発明において使用される不飽和脂肪酸としては、例えばリノレン酸などのトリエン酸、リノール酸などのジエン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、ウンデシレン酸、シスバクセン酸、バクセン酸、エルカ酸などのモノエン酸などの、二重結合を１〜３個有する炭素数８〜２４、好ましくは炭素数１１〜１８の不飽和脂肪酸が代表例として挙げられる。好ましくは、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸またはミリストレイン酸を使用するのがよい。不飽和脂肪酸はシス型およびトランス型のいずれであっても使用可能である。
【００１４】
また、モノアシルグリセリドとしては、前記した不飽和脂肪酸のモノアシルグリセリドが挙げられ、特にリノール酸、リノレン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸またはミリストレイン酸の各モノアシルグリセリドを使用するのがよい。かかるモノアシルグリセリドの製造方法は特に制限されず、例えば前記不飽和脂肪酸をグリセリンとエステル化反応させ、ついでモノアシルグリセリドを単離する方法を採用することができる。また、前記不飽和脂肪酸およびそのモノアシルグリセリドは、単独で使用する他、必要に応じて２種以上を混合して使用することができる。
【００１５】
前記した特定の不飽和脂肪酸またはそのモノアシルグリセリドは、各種サイトカインの発現を誘発することにより細胞の増殖、分化、機能発現などを行うことによって、免疫賦活、抗癌作用などの多彩な作用を発揮する。以下に、本発明のサイトカイン誘発剤によって誘発される主なサイトカインを例示する。
【００１６】
（1）ＩＬ‐６
ＩＬ‐６はＴ細胞、Ｂ細胞、単球などだけでなく、繊維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、腎メサンギウムなどさまざまな細胞から産生され、Ｔ細胞の増殖およびＣＴＬへの分化、造血幹細胞の増殖および分化、巨核球の分化誘導による血小板増加、肝細胞刺激因子としてＣＲＰなどの急性炎症タンパク質の誘導、メサンギウム細胞、ケラチノサイト、破骨細胞などの増殖因子としての働きなど多彩な生理活性を持つサイトカインである（Akira S., et al., Interleukin-6 in biology and medicine. Adv. Immunol. 54: 1-78, 1993）。
【００１７】
（2）ＩＬ‐８
ＩＬ‐８はＣＸＣケモカインに属し、好中球浸潤を惹起する（阿部達, 総論〜サイトカインとは何か〜. 医学ジャーナル 36:647-652, 2000）。ケモカインは白血球の走化・活性化能を持つ塩基性低分子のサイトカインであり、構造や機能が類似したケモカイン分子が多数発見され、ケモカインスーパーファミリーと総称されている（Yosie O., et al., Chemokines in immunity. Adv. Immunol. 78: 57-110, 2001）。
【００１８】
（3）ＩＬ‐１８
ＩＬ‐１８はＩＬ‐１類似の３次構造（βシートによる樽構造）を持ち、その受容体とシグナル伝達経路はＩＬ‐１およびToll-like receptor (TLR)と類似している（山村昌弘, ＩＬ‐１８と炎症性疾患. 最新医学 57:873-879, 2002）。ＩＬ‐１８は発見当初ＩＦＮ‐γ誘導因子と呼ばれたように、ＩＬ‐１２と相乗的にさまざまな細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、マクロファージ、樹状細胞）に作用して協力にIFN-γの産生を誘導する（Okamura H, Tsutsui H., Komatsu T. et al., Cloning of a new cytokine that induces IFN-γproduction by T cells. Nature 378:88-, 1995、Yoshimoto T., Okamura H., Tagawa Y. et al., Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE productin by induction of interferon-γ production from activated B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3948-, 1997、Yoshimoto T., Takeda K., Tanaka T. et al., IL-12 up-regulates IL-18R expression on T cells, Th1 cells and B cells: Synergism with IL-18 for IFN-γ production. J. Immunol. 161:3400-, 1998 および Nakanishi K., Yoshimoto T., H. and Okamura H., Interleukin-18 regulates both Th1 and Th2 responses. Annu. Rev. Immunol. 19:423-, 2001）。
【００１９】
また、ＩＬ‐１８はＩＬ‐１２の非存在下ではまったく異なる作用を示す。すなわち、ＩＬ‐１８はＣＤ４+Ｔ細胞や好塩基球、マスト細胞に作用してＴｈ２サイトカインであるＩＬ‐４とＩＬ‐１３の産生を誘導する（Yoshimoto T., Tsutsui H., Tominaga K. et al., Interleukin-18 (IL-18), although anti-allergic when administered with IL-12, stimulates IL-4 and histamine release by basophils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13962-, 1999 および Yoshimoto T., Mizutani H., Tsutsui H. et al., IL-18 induction of IgE : Dependence on CD4+T cells, IL-4 and STAT6. Nat. Immunol. 1:132-, 2000）。
【００２０】
更に、ＩＬ‐１８はＴ細胞やＮＫ細胞表面のFas-ligandの発現を上昇させ、Fas分子を発現している細胞にアポトーシスを誘導する可能性も指摘されている（小野聡, 望月英隆, インターロイキン18（IL-18）―感染防御，腫瘍免疫からみたIL-18の役割. 医学のあゆみ 200:1095-1096, 2002）。
【００２１】
Ｔｈ１系サイトカインを誘導するＩＬ‐１８のようなサイトカインは細胞性免疫を高め、感染防御因子としての重要な役割を果たしていると考えられ、また、侵襲後の免疫能低下に対してIL-18を投与することにより免疫機能が賦活され、その後の感染性侵襲に対して抵抗力が増すことも認められている（小野聡, 望月英隆, インターロイキン18（IL-18）―感染防御，腫瘍免疫からみたIL-18の役割. 医学のあゆみ 200:1095-1096, 2002）。更に、ＩＬ‐１８は肉腫（sarcoma）、神経芽細胞腫（neuroblastoma）、黒色腫（melanoma）に対して抗腫瘍作用があることが指摘されている（小野聡, 望月英隆, インターロイキン18（IL-18）―感染防御，腫瘍免疫からみたIL-18の役割. 医学のあゆみ 200:1095-1096, 2002）。
【００２２】
（4）ＴＮＦα
ＴＮＦαは、好中球や血管内皮細胞を活性化し、活性化好中球の血管内皮細胞への粘着を促進させる。
【００２３】
（5）ＩＦＮ
ＩＦＮは抗ウイルス作用のあるサイトカインとして注目され、その後、免疫系においては多くの免疫反応を制御することが明らかとなった。更に、多くの腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果が明らかにされ、抗腫瘍剤としても腎癌などに臨床応用されている。造血器腫瘍の中では、特に有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、成人T細胞性白血病および多発性骨髄腫に対して有用とされている（北村聖, サイトカインの臨床応用. 実験医学 18:2181-2188, 2000）。また、難治性の突発性血小板減少性紫斑病やリウマチ性の自己免疫疾患に有効であるとの報告もある（北村聖, サイトカインの臨床応用. 実験医学 18:2181-2188, 2000）。
【００２４】
本発明誘発剤はヒトの血管内皮細胞と結合することによりサイトカインが誘発されることから、輸液製剤、ワンショット注射液などの注射剤の形態で使用するのが好ましい。注射剤は、液剤、乳剤、懸濁剤等のいずれでもよく、これらは殺菌されかつ血液と等張であるのが好ましい。注射剤の調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が使用可能である。なお、この場合、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、ぶどう糖、グリセリン等を含有させてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。脂肪乳剤の場合、Ｏ／Ｗ型またはＷ/Ｏ/Ｗ型エマルジョンの形態で使用することができる。
【００２５】
本発明誘発剤は、有効成分である前記化合物を１〜５０％程度（ｗ／ｖ％である。以下同じ）、好ましくは５〜３０％含有しているのがよいが、特に限定されるものではない。
本発明誘発剤の投与量は、通常、成人において、有効成分である前記化合物が１〜７０ｇ／日程度であるのが適当であるが、年齢、体重、症状などにより増減することはいうまでもない。
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。
【実施例１】
【００２７】
この試験は、本発明化合物を利用して培養維持したヒト大動脈血管内皮細胞のサイトカインmRNA発現を調べたものであり、以下の通り実施された。
【００２８】
（１）測定項目
サイトカインとIL-6、IL-8、IL-18、TNFα、IFNαおよびIFNγのそれぞれのmRNAを測定した。これらサイトカインは、それぞれ以下の通りジーンバンク（GenBank）に登録されており、それらの各塩基配列は登録されたそれらに従うものである。また、mRNAの定量は、下記表１に示す各配列のプライマー対およびプローブを用いて(開始コドンの位置は、登録された各塩基配列に従うものである)、RT-PCR(Real-time quantitative reverse transcription-polymerase reaction)により実施した。各プライマーおよびプローブは、自動DNA合成機を用いて作成した。
【表１】
2005194222.tif 000002
尚、対照としてハウスキーピング遺伝子であるベータアクチン(β-actin)について同一試験を実施した。
【００２９】
（２）被験物質および対照物質
a）対照物質
名称：アミノフリード
製造元：株式会社大塚製薬工場
b）陽性対照
名称：リポポリサッカライド(LPS)
製造元：シグマ社（Sigma Chemical Co.）
【００３０】
（３）培養細胞
ヒト正常大動脈血管内皮細胞
英名：Aortic Endothelial Cells
起源：大動脈
供給源：BioWhittaker, Inc.
代理店：旭テクノグラス株式会社
【００３１】
（４）試薬および器具
ヒト正常大動脈血管内皮細胞用培地：BioWhittaker, Inc.製、代理店；旭テクノグラス株式会社
生理食塩液：株式会社大塚製薬工場製
注射用水：大塚蒸留水（株式会社大塚製薬工場製）
RNaseフリーの蒸留水：和光純薬工業株式会社製
Rneasy Mini Kit(50)：キアゲン株式会社製
QIAshredder(50)：キアゲン株式会社製
Yeast tRNA：GIBCO BRL製
TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit：Applied Biosystems製
TaqManβ-actin Control Reagents：Applied Biosystems製(製品番号401846)
Micro Amp Optical 96-well Plate：Applied Biosystems製
Optical Adhesive Covers：Applied Biosystems製
Optical Cover Compression Pads：Applied Biosystems
24ウエル平底プレート：旭テクノグラス社製(コラーゲンタイプIコート)
Trypan blue：Flow Laboratories LTD. 製(0.4% solution in 0.85% saline)
24well平底プレート：旭テクノグラス株式会社製
β-メルカプトエタノール：Sigma Chemical Co. 製
【００３２】
（５）群構成
コントロール群はアミノフリード希釈液を試験液とし、陽性対照群はLPS群とした。また、使用した被験物質は以下の通りである。
(a)オレイン酸
(b)リノール酸
(c)リノレン酸
(d)リノール酸のモノアシルグリセリド
(e)リノレン酸のモノアシルグリセリド
(f)ウンデシレン酸のモノアシルグリセリド
(g)ミリストレイン酸のモノアシルグリセリド
・コントロール群：2％のDMSO（ジメチルスルホキシド、以下同じ）を含むアミノフリード希釈液
・陽性対照群：10ng/mLのLPS入りの2％のDMSOを含むアミノフリード希釈液
被験物質はDMSOに溶解後、アミノフリード希釈液で50倍希釈した。
【００３３】
（６）試験液の調製
＜コントロール溶液（DMSO入りアミノフリード希釈液）の調製＞
アミノフリードの浸透圧比は約3のため、アミノフリード10mLを50mL Conical Tubeに分取し、注射用水20mLを添加し、アミノフリード希釈液とした。更に2％濃度となるようにDMSOを添加し、コントロール溶液（DMSO入りアミノフリード希釈液）とした。
＜LPS入り溶液の調製＞
5mgのLPSを2％のDMSOを含む生理食塩液50mLで溶解し、100μg/mL溶液とした。さらに、2％のDMSOを含む生理食塩液で希釈し、100ng/mL溶液を調製する。その後2％のDMSOを含むアミノフリード希釈液で10倍希釈した。
＜化合物を溶かした溶液の調製＞
各化合物をDMSOに溶かしアミノフリード希釈液で50倍希釈し、400μM溶液を調製した。ただし、オレイン酸については350μM溶液である。
【００３４】
（７）ヒト大動脈血管内皮細胞の培養
細胞を２４ウエルのプレートに1〜4×104 cells/400μL／ウエルずつ分注し、37℃の条件下、CO2インキュベーターで培養し、プレート上に40〜70％まで増殖した時点で曝露試験に用いた。
【００３５】
（８）曝露条件
細胞は各ウエル毎に400μLの培地液量で培養することから、同量の試験液に交換し、その後4時間試験液に曝露した。
【００３６】
（９）全（Total） RNAの調製
全RNAの抽出は次の通り行った。なお、抽出操作は全て室温で行った。即ち、曝露開始４時間の時点で、24ウエルプレートの各ウエルから培地を吸引除去した。次に、各ウエルにβ-メルカプトエタノールを含むRLT溶液(RLT溶液(Rneasy Mini Kit(50)として供給)：β‐メルカプトエタノール=１００：１)を400μLずつ添加し、ピペッティングし、添加したβ‐メルカプトエタノールを含むＲＬＴ溶液を各ウエルから集めその全量をQIAshredderカラムに添加し、15,000回転/分で2分間遠心した。溶出液350μLを分取し、これに等量の70%エタノール溶液を添加した。該液を10秒間、3回攪拌後、Rneasy Mini spinカラムに添加し、12,000回転/分で30秒間遠心し、コレクションチューブ内の溶出液を吸引除去した。次いで、コレクションチューブに700μLのRW1溶液(Rneasy Mini Kit(50)として供給)を添加し、12,000回転/分で30秒間遠心後、コレクションチューブを取りかえた。このコレクションチューブに500μLのRPE溶液(Rneasy Mini Kit(50)として供給)を添加し、12,000回転／分で30秒間遠心し、コレクションチューブ内の溶出液を吸引除去した。コレクションチューブに更に500μLのRPE溶液を添加し、15,000回転/分で2分間遠心後、1.5mLのコレクションチューブに交換し、該チューブ内に50μLのRnase free water(Rneasy Mini Kit(50)として供給)を添加し、10,000回転/分で1分間遠心して全RNAを溶出させた。溶出液は50μg／mLのYeast tRNA液を用いて5倍希釈して測定用全RNA溶液とした。尚、50μg／mLのYeast tRNA液は、Yeast tRNAをRNaseフリーの蒸留水で希釈して調製した。
【００３７】
（１０）mRNAの測定 
ABI PRISMTM7700 Sequence Detection Systemを利用してハウスキーピング遺伝子（β-アクチン）、サイトカインの各mRNAを、以下の通り定量した。
【００３８】
RT-PCRは、300nM フォワードプライマー、900nM リバースプライマーおよび200nM TaqMan プローブを含むTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kitを用いて、50μL/tubeの系で行った。全RNA溶液は5μLを使用した。PCR条件としては、48℃で30分間、その後95℃で10分間保温した後、95℃で15秒間、60℃で1分間のサイクルを40回行う条件とした。各サイクルごとに蛍光強度を測定した。反応容器はMicro Amp Optical 96-well Plateを、カバーはOptical Adhesive Covers、カバーの上にのせるパットはOptical Cover Compression Padsを用いた。
なお、β‐アクチンの測定の場合は、TaqManβ-actin Control Reagents （300nM Forward Primer、300nM Reverse Primerおよび200nM TaqMan Probe）を用いた。
【００３９】
（１１）結果の計算方法および統計処理
β-アクチンのmRNAを内在性コントロールとした。各mRNAの定量値は、ΔCt法（Nishimura, M., Yaguri, H., Yoshitsugu, H., Naito, S. & Satoh, T., (2003) Yakugaku Zasshi, 123, 369-375）にて算出した。試験は２回行った。定量値は4時間曝露におけるコントロール群のmRNA値に対する相対値で示す。
【００４０】
（１２）結果および考察
得られた結果を表２から表７に示す。結果はコントロールの値を１とした時の相対値で示し、1.5倍以上の値を有意な値とした。また、陽性対照として10ng／mLのLPS入りの溶液を用いている。
【００４１】
各表に示される結果から次のことが判る。即ち、表２に示している化合物により、IL-6のmRNA発現量は顕著に増加した。表３に示している化合物により、IL-8のmRNA発現量は顕著に増加した。表４に示している化合物により、IL-18のmRNA発現量は顕著に増加した。表５に示している化合物により、TNFαのmRNA発現量は顕著に増加した。表６に示している化合物により、IFNαのmRNA発現量は顕著に増加した。表７に示している化合物により、IFNγのmRNA発現量は顕著に増加した。しかも、これらのサイトカインのmRNAは４時間の曝露で発現している。
【００４２】
【表２】
2005194222.tif 000003
【００４３】
【表３】
2005194222.tif 000004
【００４４】
【表４】
2005194222.tif 000005
【００４５】
【表５】
2005194222.tif 000006
【００４６】
【表６】
2005194222.tif 000007
【００４７】
【表７】
2005194222.tif 000008