(57)【要約】【課題】  調製の手間、時間、及びコストの点から、簡便に、迅速に、効率よく、且つ低廉に核酸を固相担体に固定化する方法を提供すること。【解決手段】  親水性ポリマーと、少なくとも当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液（I）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液（II）を接触させる工程を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーと、少なくとも当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を接触させる工程
を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。
【請求項２】
親水性ポリマーと、少なくとも当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子と、親水性ポリマー又は架橋試薬のいずれか一方とを溶解又は分散した溶液又は分散液（II’）を、前記工程を経た固相担体表面に接触させる工程
を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。
【請求項３】
親水性ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（I’）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を接触させる工程
を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。
【請求項４】
親水性ポリマーを溶解又は分散した溶液（I’）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに
当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II”）を接触させる工程
を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法。
【請求項５】
前記溶液又は分散液（I）又は（I’）中の、前記親水性ポリマー又は架橋試薬と反応する官能基を、前記の固相担体表面に予め導入するための表面処理工程を更に含む、請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記の親水性ポリマーが正電荷を有することを特徴とする、請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液又は分散液（II）、（II’）、又は（II”）を前記固相担体表面に接触させる工程後、当該固相担体を加熱する工程を更に含む請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が、ＤＮＡであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８の方法により製造されたＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体表面への核酸の固定化方法、及びＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報の解析、例えば遺伝子の突然変異の解析、疾病の予知や診断、ウイルスのタイピング等を行うための、核酸解析技術が近年大幅に進歩している。例えば、数百個乃至数万個のＤＮＡプローブを格子状に２次元的に配列させ、試料溶液中の核酸をこのアレイ上でハイブリダイズさせることで、複数の遺伝子の情報を一括して検出するＤＮＡマイクロアレイや、ＤＮＡチップと呼ばれるシステムが普及し始めている。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップの技術は、標的核酸とその配列に相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによりハイブリッドの形態を分析する方法が開発されたことに基礎をおくものである。そしてＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡチップにおいては、多数の核酸分子を固相担体表面に整列して固定化する必要があることから、効率よく、且つ精度良く核酸分子を固定化する技術が重要となる。
【０００４】
核酸を固相担体表面に固定化する方法には、固相担体表面上で直接核酸を合成するオン・チップ法と、あらかじめ調製しておいた核酸ＤＮＡ分子を固相担体表面に固定化する方法とがある（例えば特許文献１を参照）。
【０００５】
オン・チップ法においては、固定化する核酸がｃDNAやPCR産物である場合には、これらの固定化用DNAを固定化する前に、固相担体表面をポリ陽イオンで表面処理しておき、DNAの荷電を利用してDNAと固相担体表面との間で静電的な結合を生じさせ、ついで余分な荷電をブロッキングする手段がとられている。より具体的には、光照射で選択的に除去される保護基を使用し、更に半導体製造に利用されるフォトリソグラフィ技術と固相合成技術との組み合わせを使用して行う、選択的合成方法（マスキング技術）が利用される。
【０００６】
一方、予め調製しておいた核酸分子を固相担体表面へ固定化する方法の場合、固定化する核酸分子側に固相担体表面との共有結合用の官能基を導入しておき、また、固相担体表面側にも当該官能基と対になって反応する官能基を有するように表面処理を予め行っておき、両方の官能基同士の間で共有結合させる手段がとられている。そして一般的には表面処理がなされた固相担体表面と、固定化用の核酸分子との間に、スペーサーやクロスリンカーを介在させて固定が行われている。
【特許文献１】特開２０００-２９５９９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、オン・チップ法は、調製に手間と時間がかかり、更にポリ陽イオンが固相担体からはがれやすいといった問題がある。一方、予め調製しておいた核酸分子を固定化する方法においては、固定化する核酸分子に官能基や、スペーサー又はクロスリンカーを導入する点において手間と時間、そしてコストがかかるといった欠点が存在している。更にこの方法においては、固相担体表面上に核酸分子を一分子ずつしか固定化できないことに起因して、感度不足となる問題点も存在する。
従って、調製の手間、時間、及びコストの点から、簡便に、迅速に、効率よく、且つ低廉に核酸を固相担体に固定化する方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記の問題点に鑑み鋭意研究を進めたところ、固定化する核酸分子を固相担体表面上で３次元的な配置をとらせることにより、上記の欠点が克服されることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
より具体的には本発明は、親水性ポリマーと、少なくとも当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を接触させる工程を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法に係るものである。
【００１０】
本発明は更に、親水性ポリマーと、少なくとも当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子と、親水性ポリマー又は架橋試薬のいずれか一方とを溶解又は分散した溶液又は分散液（II’）を、前記工程を経た固相担体表面に接触させる工程を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法に係るものである。
【００１１】
また本発明は、親水性ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（I’）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を接触させる工程を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法に係るものである。
【００１２】
更に本発明は、親水性ポリマーを溶解又は分散した溶液（I’）を、核酸固定用の固相担体表面に接触させる工程、並びに当該工程を経た固相担体表面に、固定化用核酸分子、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II”）を接触させる工程を含む、固相担体表面への核酸分子固定化方法に係るものである。
【００１３】
本発明においては、前記溶液又は分散液（I）又は（I’）中の、前記親水性ポリマー又は架橋試薬と反応する官能基を、前記の固相担体表面に予め導入するための表面処理工程を更に含むことが好ましい。そして前記の親水性ポリマーは、正電荷を有することが好ましい。また、前記溶液又は分散液（II）、（II’）、又は（II”）を前記固相担体表面に接触させる工程後、当該固相担体を加熱する工程を更に含むことが好ましい。本発明においては、前記核酸分子がＤＮＡであることが好ましい。
【００１４】
本発明は更に、本発明の核酸分子固定化方法を利用して製造される、ＤＮＡチップに係るものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の核酸分子固定化方法によれば、固相担体表面に、親水性ポリマーを含む３次元的な複合体が形成され、その複合体に核酸分子が結合しているため、固定化担体の単位面積当たりの核酸分子固定化量の増大が生じる。この固定化量の増大により、目的とする核酸分子の検出の感度を上げることが可能となる。更に親水性ポリマーを含む複合体の形成は、架橋試薬との反応により簡便に行うことができ、簡便な方法で表面処理を施しておいた固相担体への形成が行えることから、調製の手間も時間もコストも低減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図１乃至４は、本発明の一の態様を示すものである。これらの図においては、親水性ポリマーと、当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、予備処理を施しておいた核酸固定用固相担体表面に接触させ、次に、固定化する核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液（II）を、前記工程により溶液（I）と接触させておいた固相担体表面に接触させることによって、固相担体表面に３次元的（網目状）に核酸分子を固定化する方法が示されている。
【００１７】
（固相担体とその予備処理）
図１は、表面処理を施した固相担体表面１００が示されている。この表面処理は、その固相担体の表面の特性に応じて行われる何れかの表面処理方法により行うことができる。本発明の実施に当たって好ましい固定担体の例としては、透明なガラス、シリコン、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールAのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのポリマー類を挙げることができるが、固相担体としてはガラス及びシリコンが特に好ましい。これは表面処理の容易さや、蛍光スキャニング装置による解析の容易さのためである。更に、シリカ表面層を有するガラスも好適に利用することができる。
【００１８】
固相担体の大きさは、分析器に収容することのできる大きさであれば特に限定されることはないが、通常は０．５〜１０ｃｍ  Ｘ  ０．５〜１０ｃｍの範囲である。また、厚さに関しては、１００乃至２０００μｍの範囲にあることが好ましい。
固相担体の形状は、通常のアッセイ系においては板状であるが、アッセイ系の設計によっては、板状以外の形状、例えばビーズ状、管状や、棒状のものなどとすることも可能である。
【００１９】
固相担体がガラスである場合には、例えばシランカップリング剤１０１等を、当業者に知られる条件で使用してガラス表面の処理を行うことができる。より具体的には、固相担体を、シランカップリング剤に浸漬し、固相担体表面に当該シランカップリング剤を結合させ、適宜、固相担体を加熱して当該結合をより強固なものとする。表面処理は、このような操作により固相担体表面への核酸分子の固定化前に予め施しておくことによってもできるが、表面処理がすでになされている固相担体が入手できる場合は、それを利用することもできる。
【００２０】
表面処理を行うためのシランカップリング剤１０１中の官能基１０２は、後の工程で使用される溶液又は分散液（I）又は（I’）、及び溶液又は分散液（II）、（II’）又は（II”）、特に溶液又は分散液（I）又は（I’）中に含まれる親水性ポリマー及び/又は架橋試薬と反応するものであることが好ましい。シランカップリング剤１０１中の官能基１０２の種類としては、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基を挙げることができるが、使用する親類性ポリマー及び架橋試薬に存在する官能基と共有結合可能なものであれば、これらに限定されず、当業者が目的に応じて適宜選択できるものである。
【００２１】
（第一工程）
図１に示されるように予備処理を施した固相担体表面に対しては次に、親水性ポリマー１０３と、当該親水性ポリマー１０３を架橋する架橋試薬１０７とを媒体に溶解又は分散した溶液（I）を接触させる。親水性ポリマー１０３と架橋試薬１０７とは、媒体に溶解又は分散させると反応して架橋する。この架橋反応は迅速に開始するものであることが望ましいが、製造工程によっては、触媒を添加したり、加熱処理や紫外線暴露によって反応を促進するようなものとすることも可能である。予備処理を施してある固相担体表面に対して、親水性ポリマー１０３と架橋試薬１０７との溶液又は分散液を接触させると、固相担体表面に存在するシランカップリング剤中の官能基１０２と、架橋試薬１０７中の未反応の官能基との間で反応が生じ、３次元（網目状）構造をとった複合体１１０を形成する。（図４参照）。なお、溶液の固相担体表面への接触は、当該技術分野で知られるスポッター装置などを利用して行うことができる。
【００２２】
（親水性ポリマー）
ここで使用する親水性ポリマー１０３は、その分子内において、固定化用核酸分子中の官能基と反応する官能基を有することが必要である。より具体的には、核酸分子がＤＮＡである場合には、図２に示されるようにＤＮＡ中のリン酸基部分の負電荷と静電結合するための、正に帯電した官能基１０４を有することが好ましい。そして官能基１０４は、親水性ポリマー１０３のアルキル主鎖１０９からの分岐鎖として、溶媒中において分子表面に突出していることが好ましい。
【００２３】
更に親水性ポリマー１０３は、架橋試薬１０７中の官能基１０８と反応する官能基１０５を一分子当たり二つ以上有することが必要である。架橋試薬１０７の官能基１０８と反応する官能基１０５は、核酸分子と反応するのに使用される官能基１０４と同一とすることも可能である。その場合には、親水性ポリマー１０３中の官能基１０４（１０５）の数は、３以上である必要がある。
【００２４】
親水性ポリマー１０３中の官能基１０４の種類は使用する架橋試薬１０７の種類によって決まるものであり、この組み合わせは当業者らには明らかなものであるが、その例としては、アミノ基-NHSエステル基、マレイミド基-ＳＨ基、イミドエステル基-アミノ基、などの組み合わせを挙げることができる。これらの中でも、アミノ基-NHSエステル基の組み合わせが好ましく、この場合には、固定する核酸分子の末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。
【００２５】
なお上記した以外にも親水性ポリマー１０３中の当該官能基は、核酸分子と、その相補的配列を有する核酸分子との間でのハイブリダイゼーションを阻害しないものであり、尚且つ核酸分子との結合のための相互作用が強いものであることが望ましい。
また、親水性ポリマー１０３は、加熱処理や紫外線暴露により核酸分子と共有結合するように、分子内にアルキル基１０９を有するものであることが望ましい。
【００２６】
本発明において使用することが可能な親水性ポリマー１０３の具体例としては、分子量が１０3乃至１０6の範囲のものであることが好ましい。この範囲を越えるものは、粘性が増大するために固定化用核酸分子の結合へ悪影響を及ぼすために好ましくない。より具体的には、ポリＬリジン、ポリＬグルタミン酸等を挙げることができる。
【００２７】
（架橋試薬）
本発明において使用する架橋試薬１０７は、表面処理された固相担体の表面において、親水性ポリマー１０３同士の３次元（網目状）構造体を構築するために使用されるものであり、図３に示されるようにアルキル主鎖１０９から分子表面に突出した官能基１０８を二つ以上有するものとなっている。架橋試薬の具体例としては、DSS（Disuccinimidyl Suberate）、SMCC（Succinimidyl 4-[N-maleimido methyl]-cyclohexane-1-carboxylate）等を挙げることができる。親水性ポリマー１０３がポリLリジンである場合には、架橋試薬１０７としてはDSS、SMCC等を使用することが好ましい。この場合、ポリLリジン中のアミノ基がDSS中のNHSエステル基と反応して共有結合を生じる。
【００２８】
（親水性ポリマーと架橋試薬との混合比）
溶液又は分散液（I）中における親水性ポリマー１０３と架橋試薬１０７との混合比は、これらの反応後においても、未反応の官能基が当該架橋試薬中に残存しているような比率とすることが望ましい。より具体的には、親水性ポリマーと架橋試薬の各官能基総数の比率は、１：２〜１：１０００の範囲内であることが好ましい。
【００２９】
溶液（I）において親水性ポリマー１０３と架橋試薬１０７とを溶解又は分散させるのに使用する媒体としては、水、アルコール、及びジメチルスルホオキシド、並びにこれらの中から選択した２種類以上のものの混合物等を挙げることができる。何れの媒体を使用するかは、当業者が目的に応じて容易に選択できるものである。
【００３０】
（第二工程）
第一工程の後、固定化用核酸分子１０６、親水性ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を、固相担体表面に接触させる工程を行う。この工程のうち、固定化用核酸分子１０６、親水性ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７を媒体中に溶解又は分散させると、上記の第一工程におけるように、互いに反応して、親水性ポリマー１０３と架橋試薬１０７とが結合し、更に固定化用核酸分子１０６と親水性ポリマー１０３とが結合することにより、複合体１１１が形成される。この反応は、第一工程と同様に、触媒等を介在させて行ったり、加熱したり、更に親水性ポリマーや架橋試薬中にアルキル鎖が存在する場合には、紫外線による処理を行って、架橋を更に行うことも可能である。このような、架橋を促進させるための加熱処理などは、溶液又は分散液（II）を固相担体表面に接触させた後に行う。これらの操作の後、適宜、固相担体表面の洗浄を行い、結合しなかったポリマー類や核酸分子を除去する。
【００３１】
図５の上部は、溶液又は分散液（II）中における核酸分子１０６、親水性ポリマー１０３、及び架橋試薬１０７の構造的関係を示すものである。この図においては、核酸分子１０６が親水性ポリマー１０３と静電的に結合している構造体同士が、架橋試薬１０７により更に高次の構造体（複合体１１１）が形成されている。このようにして形成された複合体１１１（黒丸）は、溶液又は分散液（I）中の構成要素により形成された複合体１１０（白丸）と、溶液又は分散液（II）中の架橋試薬１０７の未反応の官能基を介し、超高次構造体を形成する（図５下部）。この超高次構造体は、溶液（I）の構成要素から構成される１の高次構造体につき、溶液又は分散液（II）の構成要素から構成される１又はｎ個の高次構造体と結合している。
【００３２】
溶液又は分散液（II）に含まれる架橋試薬１０７の、溶液又は分散液中の割合（モル比）を調整することにより、複合体１１０の一つあたりの複合体１１１の量比を調整することが可能となる。
【００３３】
（固定化用核酸分子）
溶液又は分散液（II）に溶解又は分散させる固定化用核酸分子は、検出しようとする核酸分子に相補的な配列を有するものである。固定化核酸分子の固相担体表面への固定化は、１０2乃至１０5種類/ｃｍ2の範囲にあることが望ましい。１スポット当たりの核酸分子の量は、１乃至１０-15モルの範囲にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好ましい。固相担体表面におけるスポットの間隔は、スポットする溶液が水性ベースである場合には１.５ｍｍ以下であることが好ましく、より具体的には３００μｍ未満の範囲にあることが好ましい。スポットする各ドットの大きさは、直径が３００μｍ未満の範囲であればよく、スポットする溶液の量は、１００ｐL乃至１μLの範囲にあることが好ましく、特に１乃至１００ｎLの範囲にあることが好ましい。
【００３４】
上記においては、本発明の一の態様である、親水性ポリマーと、当該親水性ポリマーを架橋する架橋試薬とを媒体に溶解又は分散した溶液又は分散液（I）を、予備処理を施しておいた核酸固定用固相担体表面に接触し、次に、固定化する核酸分子、親水性ポリマー、及び架橋試薬を溶解又は分散した溶液又は分散液（II）を、前記工程により溶液又は分散液（I）と接触しておいた固相担体表面に接触させることによって、固相担体表面に３次元的（網目状）に核酸分子を固定化する方法を用いて本発明の実施の形態について説明したが、本発明の他の実施形態のものの実施に関しては、本質的に上記の説明を参酌すれば行うことができる。
【００３５】
例えば、上記した方法における溶液又は分散液（II）の代わりに、固定化用核酸分子と、親水性ポリマー又は架橋試薬のいずれか一方とを溶解又は分散した溶液又は分散液（II’）を使用する場合には、溶液又は分散液（II’）の調製時に、親水性ポリマー又は架橋試薬の何れかを溶解又は分散させる以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
また、上記溶液又は分散液（I）の代わりに、親水性ポリマーを溶解又は分散し溶液又は分散液（I’）使用する場合には、溶液又は分散液（I’）の調製時に、親水性ポリマーを溶解又は分散するのみで、架橋試薬を導入しないこと以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
更に、上記溶液又は分散液（I）、及び上記溶液又は分散液（II）の代わりに、溶液又は分散液（I’）及び溶液又は分散液（II’）を使用する場合には、溶液又は分散液（I’）の調製時に、親水性ポリマーを溶解又は分散するのみで、架橋試薬を導入せず、更に溶液又は分散液（II’）の調製時に、親水性ポリマー又は架橋試薬の何れかを溶解又は分散させる以外は、上記の方法と実質的に同一の条件で実施すればよい。
【００３６】
本発明は更に、本発明の核酸分子固定化方法により製造された固相担体をも提供する。特に、固定化用核酸分子がDNAであるものは、いわゆるDNAチップとして核酸の検出に使われるものとして知られている。
【００３７】
本願発明の核酸固定化方法において使用される担体自体は、特に限定されるものではなく、通常のＤＮＡチップの製造に使用される担体を利用することができる。しかしながら、本発明の核酸固定化方法を実施する場合には、ＤＮＡチップの製造に使用する、構造が複雑で高価な担体を使用せずに、ガラス基板などの安価なものを使用することができ、その場合には従来のＤＮＡチップと比較してコスト面での利点がある。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の核酸分子固定化方法によれば、固相担体表面に、親水性ポリマーを含む３次元的な複合体が形成され、その複合体に核酸分子が結合しているため、固定化担体の単位面積当たりの核酸分子固定化量の増大が生じる。この固定化量の増大により、目的とする核酸分子の検出の感度を上げることが可能となる。更に親水性ポリマーを含む複合体の形成は、架橋試薬との反応により簡便に行うことができ、簡便な方法で表面処理を施しておいた固相担体への形成が行えることから、調製の手間も時間もコストも低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】この図は、表面処理工程を経た固相担体表面の状態を模式的に示したものである。
【図２】この図は、親水性ポリマーの構造、及び親水性ポリマーと核酸分子との関係の一態様を模式的に示したものである。
【図３】この図は、架橋試薬の構造を模式的に示したものである。
【図４】この図は、親水性ポリマー及び架橋試薬を溶解又は分散させた溶液又は分散液により、固相担体表面を処理した後の固相担体表面の状態を模式的に示したものである。
【図５】この図は、本発明の一の態様により、固相担体表面に核酸を固定化した状態を模式的に示したものである。
【符号の説明】
【００４０】
１００・・・固相担体、１０１・・・シランカップリング剤、１０２・・・シランカップリング剤中の官能基、１０３・・・親水性ポリマー、１０４・・・親水性ポリマー中の官能基（１）、１０５・・・親水性ポリマー中の官能基（２）、１０６・・・核酸分子（ＤＮＡ）、１０７・・・架橋試薬、１０８・・・架橋試薬中の官能基、１０９・・・アルキル鎖、１１０・・・複合体（核酸分子非含有）、１１１・・・複合体（核酸分子含有）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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