(57)【要約】【課題】  構造色変化に基づく簡便な光学的手段によって高精度に被検物を検出し得る方法とシステムを提供すること。【解決手段】  本発明によって提供される検出方法では、被検物（１）と特異的に結合する受容体（２）と、該受容体に対して可逆的に結合し得る捕捉物質（３）であって該被検物が存在する所定の条件下において該受容体の遊離が助長され得る捕捉物質とを備えた構造色評価用デバイス（２０）を使用する。このデバイスを構成する基材（１０）の表面には、前記受容体を捕捉した状態の前記捕捉物質が構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層が形成されている。そして、試料中の被検物の存在に応じて前記表面層から受容体が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートし、受容体の遊離に基づく構造色の変化の度合いを光学的に調べる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる特定の被検物を検出する方法であって、以下の工程：
該被検物と特異的に結合する受容体と、該受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって該被検物が存在する所定の条件下において該受容体の遊離が助長され得る捕捉物質とを備えた構造色評価用デバイスを用意する工程、ここで該デバイスを構成する基材の表面に、前記受容体を捕捉した状態の前記捕捉物質が構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層が形成されている；
前記デバイスに試料を付与するとともに、該試料中の被検物の存在に応じて前記表面層から受容体が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートする工程；及び
前記インキュベートした後の前記基材の表面層について、前記受容体の遊離に基づく構造色の変化の度合いを調べる工程；
を包含する方法。
【請求項２】
前記基材に備えられる受容体として、検出対象の被検物よりも分子サイズの大きい物質が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料として液体試料が使用され、該液体試料が基材表面層に接触した状態で前記インキュベートが行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記構造色の変化の度合いは、前記インキュベートの前後で測定した前記基材表面層における反射スペクトルの比較に基づいて決定される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料中に含まれる特定の被検物を光学的に検出するデバイスであって、
構造色評価用基材と、前記被検物と特異的に結合する受容体と、前記受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって前記被検物が存在する所定の条件下においては前記受容体の遊離が助長され得る捕捉物質と、を備えており、
ここで、前記捕捉物質は前記基材の表面に構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層を形成しており、前記受容体は該表面層を構成する捕捉物質に捕捉された状態で該基材上に配置されている、デバイス。
【請求項６】
前記受容体として検出対象の被検物よりも分子サイズの大きい物質を備える、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
試料中に含まれる特定の被検物を光学的に検出するデバイスを製造するのに用いられるキットであって、
構造色評価用基材と、前記被検物と特異的に結合する受容体と、前記受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって前記被検物が存在する所定の条件下においては前記受容体の遊離が助長され得る捕捉物質と、を備えており、
ここで、前記基材の表面には前記捕捉物質が構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層が形成されており、前記受容体は該表面層が形成された基材とは独立に保存可能な形態で装備されている、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的手段によって被検物を検出する方法に関する。詳しくは、構造色の変化に基づく被検物の検出方法に関し、そのような検出方法を実施し得る検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノテクノロジーの進展に伴って、構造性発色即ち構造色の変化に基づいて被検物を検出する方法が注目されている。構造色とは光の反射等により表現される発色であり、被処理物の微細構造（典型的にはナノオーダーの微細構造）による光の干渉（例えば、薄膜干渉や多層膜干渉による干渉色）、回折（回折格子）、光散乱等によるものが知られている。これら構造色変化に基づく方法では、顔料等の色素を用いないため、迅速で簡単な検出方法ならびに簡素な構成の検出システムの実現が期待されている。
例えば、特許文献１には、糖応答性高分子ゲルを糖含有溶液と接触させることによって該ゲルの構造色を変化させるとともにその変化の度合いを反射スペクトルの変化として観測することによって該供試溶液中の糖濃度を検出する方法が記載されている。
また、特許文献２には、光学的特性を与える表面を有する基質と、該基質表面によって支持されている薄膜状中間層と、当該中間層に固定された受容物質（被検物と結合する物質）とを有する薄膜デバイスであって、被検物が該受容物質に結合したときにその結果として薄膜状中間層または光学的厚みに生ずる変化から当該被検体の存在又は量が検出できるように上記受容物質が濃密に上記薄膜状中間層に固定されていることを特徴とする薄膜デバイスが記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２７１９５号公報
【特許文献２】特開２００４−４５４２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、特殊な材料（糖応答性高分子ゲル）を使用する方法であって用途が限定されており、汎用性に欠ける。また、特許文献２に記載の方法は、基板上に形成された薄膜部分に濃密に受容物質（例えば抗体）を付着させる必要があり、これによってデバイスの製造コスト高となり得るとともにデバイス毎に受容物質の保持量が異なり得る。このことは被検物の検出精度の低下の要因となり得るため好ましくない。
【０００５】
本発明は、構造色に基づく検出方法及び検出システムにおける上記従来の課題を解決すべく創出されたものであり、構造色変化に基づいて精度よく被検物を検出し得る汎用的な方法を提供することを目的とする。また、そのような検出方法を好適に行い得る検出システム（検出方法に使用する物品を含む）を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、従来とは異なる手段・プロセスによって、試料中に含まれる特定の被検物を光学的に検出する方法を提供する。
すなわち、ここで開示される被検物検出方法は、目的とする被検物と特異的に結合する受容体と、該受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって該被検物が存在する所定の条件下において該受容体の遊離が助長され得る捕捉物質とを備えた構造色評価用デバイスを用意する工程を含む。ここで、該デバイスを構成する基材の表面に、前記受容体を捕捉した状態の前記捕捉物質が構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層が形成されていることを特徴とする。さらに本方法は、前記デバイスに試料を付与するとともに、該試料中の被検物の存在に応じて前記表面層から受容体が遊離し得る条件で該デバイスと試料をインキュベートする工程と、前記インキュベートした後の前記基材の表面層について、前記受容体の遊離に基づく構造色の変化の度合いを調べる工程を包含する。
【０００７】
本明細書において「受容体」とは、検出対象とする特定の被検物に対して特異的（選択的）に結合し得る物質を指す用語であり、特定の形態のものに限定されない。被検物との関係において高い結合定数を有する物質、例えば、特定の抗原抗体反応に関与する抗原（ネイティブな抗原物質の他に種々の断片を含む）と抗体（ネイティブな抗体物質の他に種々の修飾体や断片を含む）のいずれか一方（即ち他方は被検物であり得る）は、ここでいう受容体に含まれる典型例である。
また、ここで「捕捉物質」とは、選定した受容体に対して種々の結合機構（例えば水素結合、疎水性結合）によってある程度の特異性（選択性）をもって可逆的な結合を起こすが、その結合力（典型的な指標として結合定数が挙げられる。）は目的とする被検物と該受容体との間の結合力（結合定数）に及ばないものをいう。例えば、特定の抗原に対する抗体を受容体とした場合、該抗原のエピトープと構造上類似する部位を有する構造類似体（いわゆるアナログ）は、ここでいう捕捉物質になり得る。例えば、高い結合定数を有するアビジン−ビオチン複合体に関して、より低い結合定数の複合体をアビジンとの間で形成し得るビオチン類似体（例えば後述するデチオビオチン）は、ここでいう捕捉物質に該当する典型例である。
また、ここで「構造色の変化」とは、種々の光学的手段によって測定可能な被処理物の微細構造の変化に基づく構造性発色の変化（典型的には構造変化に基づく光の波長変化）であればよく、視認し得るかし得ないかは問題とされない。
【０００８】
上記構成の本発明の検出方法では、構造色を測定する基材（デバイス）表面に、上述したような内容の捕捉物質から成る表面層を先ず形成し、更に該表面層上に目的の被検物に対する受容体を配置することを特徴とする。
そして、本方法では、試料に含まれる被検物との相互作用によってインキュベート中に受容体の基材表面からの遊離が行われる。かかる受容体の遊離により基材表面層の微細構造が変化し、その変化を構造色の変化として評価する。
このため、被検物が基材表面に付着（結合）することに基づいた構造色の変化を測定する従来の方法とは異なり、本発明の方法では、試料中の被検物の量に応じた構造色の変化の度合いを比較的大きくすることができる。即ち、本構成の方法では、構造色の変化が予め基材に捕捉してあった受容体の遊離に基づいているため、被検物自体の大きさや被検物の基材への結合形態に影響を受け難い。従って、本構成の検出方法によると、構造色測定によって、高精度且つ簡便に目的とする被検物を定性的又は定量的に検出することができる。
【０００９】
好ましくは、前記基材に備えられる受容体として、検出対象の被検物よりも分子サイズの大きい物質が使用される。この態様の方法によると、小さい分子サイズの被検物であっても、それよりも大きい受容体が遊離してデバイス表面の構造色が変化することから、より高感度、高精度に被検物を検出することができる。
特に好ましくは、前記使用する受容体が鎖状分子構造を有するものであることを特徴とする。鎖状分子構造（棒状構造や螺旋状構造を含む。）を有する受容体であると、基材表面の捕捉物質に捕捉された状態では該受容体の鎖状分子構造が規則的に配列して成る膜構造が形成され得る。そして、被検物の存在によって受容体が捕捉物質から遊離した状態では、そのような膜構造の変化によって顕著な構造色の変化が実現され得る。このため、本構成の方法によると、より高精度な被検物検出を簡便な構造色測定によって行うことができる。
【００１０】
好ましくは、前記試料として目的の被検物が含まれ得る液体試料が使用され、該液体試料が基材表面層に接触した状態で前記インキュベートが行われる。この態様によると、捕捉物質からの受容体の遊離が助長され、容易に構造色変化を生じさせることができる。
【００１１】
また、好ましくは、前記構造色の変化の度合いは、前記インキュベートの前後で測定した前記基材表面層における反射スペクトルの比較に基づいて決定される。この態様によると、構造色の変化を簡便に測定することができる。
【００１２】
また、本発明は、他の側面として、ここで開示される検出方法を実施するのに好適なシステム（測定装置）及び該システムを構成するのに用いられる器具を提供する。
本発明は、試料中に含まれる特定の被検物を光学的に検出するデバイスを提供する。このデバイスは、構造色評価用基材と、前記被検物と特異的に結合する受容体と、前記受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって前記被検物が存在する所定の条件下においては前記受容体の遊離が助長され得る捕捉物質とを備える。このデバイスでは、前記捕捉物質は前記基材の表面に構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層を形成しており、前記受容体は該表面層を構成する捕捉物質に捕捉された状態で該基材上に配置されている。
かかる構成のデバイスによると、ここで開示される検出方法を好適に実施することができる。
【００１３】
好ましくは前記受容体として検出対象の被検物よりも分子サイズの大きい物質を備えており、特に好ましくは鎖状分子構造を有する受容体を備えている。
このような構成のデバイスは、高精度且つ簡便に光学的に被検物を検出することができる。
【００１４】
また、本発明は、試料中に含まれる特定の被検物を光学的に検出するデバイスを製造するのに用いられるキット（即ち、いくつかの構成要素の組み合わせ品）を提供する。このキットは、構造色評価用基材と、前記被検物と特異的に結合する受容体と、前記受容体に対して可逆的に結合し得る該受容体の捕捉物質であって前記被検物が存在する所定の条件下においては前記受容体の遊離が助長され得る捕捉物質とを備える。このキットでは、前記基材の表面には前記捕捉物質が構造色を測定可能なように規則的に配列して成る表面層が形成されている。このキットでは、前記受容体は該表面層が形成された基材とは独立に保存可能な形態で装備されている。
かかる構成のキットによると、ここで開示される検出方法を行う前に上述のデバイスを容易に製造することができる。
【００１５】
好ましくは前記受容体として検出対象の被検物よりも分子サイズの大きい物質を備えており、特に好ましくは鎖状分子構造を有する受容体を備えている。
このような構成のキットは、高精度且つ簡便に光学的に被検物を検出し得るデバイスを製造し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している内容以外の技術的事項であって本発明の実施に必要な事項は、従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書及び図面によって開示されている技術内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
【００１７】
本発明の検出方法は、構造色の測定によって所定の被検物（検査対象物質）を検出する方法であればよく、定性的であると定量的であるとを問わない。検出対象の試料は、種々の形態（例えば、液体、蒸気、固体、粉体、ゲル）であり得るが、好ましくは液体試料である。例えば、人又は他の生物、自然界或いは人工物から採取した液体試料（血液その他の体液、樹液、海水、陸水、食品又は化学品に含まれる液体、天然又は人工の油脂類、等）、或いは非液状試料を適当な溶媒に溶解又は分散して調製した液体試料を必要に応じて適宜希釈又は濃縮して利用することができる。例えば、本発明の検出方法は、人を含む哺乳類の体液中に含まれる有害物質（例えばウイルスや細菌等の微生物を起源とするタンパク質、核酸、毒素）或いは自然界に含まれる有害物質（例えば内分泌攪乱物質即ち環境ホルモンとして疑われる種々の有機塩素化合物や高分子化合物）を簡便な光学的手段によって検出することができる。
【００１８】
本発明の検出方法に使用するデバイスは、構造色の変化を測定し得る構成のデバイスであればよく、基材の材質や形状に特に制限はない。限定はしないが、基材表面層における薄膜干渉又は多層膜干渉による構造色の変化を利用する場合には、基材表面層において干渉光を生じさせ易く光反射性のよい基材、例えば表面に酸化シリコン膜を備えたシリコン基板が好適な一例として挙げられる。或いは、基材を透過した光の回折による構造色の変化を利用する場合には、光透過性のよい基材、例えば石英基板が例示される。
基材の表面（測定する構造色を発現させる部位）の形状は構造色の測定に適当であれば特に制限はないが、スペクトル観測の観点からフラットな表面形状が好ましい。従って、ここで開示されるデバイスの好適な一態様は、平板形状の基材（基板）を含むことを特徴とする。
【００１９】
構造色は、いずれの原理によるものでもよい。例えば、基材上に形成された薄膜又は多層膜においての当該膜に照射され反射された光の干渉に基づく構造色が典型例として挙げられる。或いは、基材上に規則的に配列された物質群においての波長に依存した方向性のある光の回折に基づく構造色が他の典型例として挙げられる。これら構造色の発生機構や他の構造色の発生機構（例えば光の散乱に基づく構造色）は、技術常識であり、本発明の開示に特に必要がないため、構造色自体についてのこれ以上の詳細な説明を省略する。
【００２０】
構造色の測定手段は特に限定されない。基材上の構造変化を的確に検知し得る手段が好ましい。ここで開示される方法では、典型的には基材（デバイス）表面層の構造変化、即ち反射する光の干渉及び／又は回折による構造色の変化を測定する。この場合における好適な測定手段の一つは、反射スペクトルの測定である。この種の反射スペクトルは、種々の光源、分光器、光検出器等を備えた反射率測定装置を使用することによって容易に測定することができる。
【００２１】
構造色を発現させるため、好ましくは、所望する捕捉物質を使用して基材の表面に該捕捉物質が規則的に配列して成る表面層を構成する。例えば、捕捉物質から成る単分子層を形成することが好ましい。この目的には、鎖状分子構造を有する捕捉物質（後述する実施例参照）の採用が好ましい。捕捉物質は、基材表面に種々の結合機構（例えば、疎水性結合、水素結合、共有結合、イオン結合）で結合（固定）させることができる。
例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ法（ＬＢ法）に基づいて、比較的長いアルキル（或いはアルケニル又はアルキニル）鎖を有する高分子化合物を基材表面に規則的に配列し、それら鎖間のファンデルワールス力によって高密度及び高配向の単分子層（即ち自己組織化単分子層；self-assembled monolayer)を形成することができる。
【００２２】
好ましくはカップリング剤（典型的にはシランカップリング剤）等を使用して捕捉物質を基材表面に化学結合することができる。例えば、シリコン基板の表面に形成された酸化シリコン膜のような、基材の無機酸化物表面に適当な表面処理を施して該表面に反応性基（例えばシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）、水酸基、その他の親水性基）を導入し、例えば一般式：Ｘ−Ｒ−Ｓｉ−Ｚ３（式中のＸは有機材料と結合可能なアミノ基、ビニル基、エポキシ基等の官能基、Ｒはアルキル基、Ｚは各々独立してアルコキシル基又はハロゲン）で表されるような適当なシランカップリング剤を用いることによって、有機物である捕捉物質を当該無機酸化物表面上に強固に化学結合させることができる。この場合、反応性基の量が無機酸化物表面に十分に存在すれば、該シランカップリング剤のアルキル鎖によって一方向に規則的に配列する単分子層が形成される。
【００２３】
本発明の検出方法で用いられる受容体は、検出対象である被検物の内容に応じて適宜選択される。例えば、被検物が試料中に含まれる抗原物質（例えば種々の毒素や菌体を構成するタンパク質）である場合は、抗体又は抗体の断片（例えばＦａｂフラグメント）であり得る。また、被検物が試料中に含まれるポリヌクレオチド（例えば種々の病原ウイルスが有するＤＮＡ又はＲＮＡ）である場合は、該ポリヌクレオチド（二本鎖の場合はいずれか一方のヌクレオチド鎖）の少なくとも一部の塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。これらの他、特定のタンパク質を被検物とする場合、該タンパク質と特異的に結合する（即ち高い結合定数を示す）物質（リガンド）を受容体とすることができる。例えば、種々の酵素とその基質（又は該基質と拮抗するアナログ化合物）の関係、種々のホルモンとそのレセプターの関係、種々の核酸結合性タンパク質とその標的核酸との関係において、いずれかが被検物となり、いずれかが受容体であり得る。一典型例としてアビジンとビオチンの関係が挙げられる。
【００２４】
本発明の検出方法で用いられる捕捉物質は、所定の条件下において、所定の受容体に対して可逆的に結合し得る一方で、該条件下において被検物が存在する場合には該受容体の該捕捉物質からの遊離が容易に行われる（活発化され得る）物質である。捕捉物質は、被検物及び受容体の種類や性質に応じて適宜選択すればよく、特に制限はない。
この種の捕捉物質として、典型的には、目的とする被検物と化学構造が類似する物質（アナログ）であって該物質の受容体との結合定数が被検物と受容体との結合定数よりも低いものが採用され得る。酵素、ホルモン等のタンパク質を被検物とし、それに対する補酵素基質、レセプター等を受容体とする場合には、それら被検物タンパク質よりも結合定数の低い構造のアナログタンパク質を用いるとよい。
例えば、図１に示すように、ビオチン(biotin)１を被検物とし、アビジン(avidin)２を受容体とする系において、ビオチン１と構造類似の化合物であって該化合物とアビジン２との結合定数がビオチン／アビジンの結合定数よりも低い物質、例えば図示するようなデチオビオチン(dethiobiotin)３は、本発明の実施においての捕捉物質として使用され得る一好適例である。
あるいは、特定の塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を被検物とし、それと相補する塩基配列のポリヌクレオチドを受容体とする系において、塩基配列の受容体に対する相同性が被検物たる核酸よりも低いポリヌクレオチド（即ち被検物の核酸よりも受容体に対してハイブリダイズし難いポリヌクレオチド）を捕捉物質として使用し得る。
捕捉物質からの受容体の遊離のされ易さは、インキュベート条件を適宜調節することによって容易に決定することができる。例えば、試料が液体であり、受容体及び捕捉物質がタンパク質、核酸である場合（典型的には、これらの結合がファンデルワールス力や水素結合によるもの）には、塩濃度や処理温度を変化させることによって、捕捉物質からの受容体の遊離の程度（速度）を調整することができる。
【００２５】
ここで開示される検出方法の大まかな手順と機構を図２に示す。本発明の検出方法では、図２（ａ）に示すように、先ず、構造色評価を行い得る適当な基材（例えば表面に酸化シリコン膜を備えたシリコン基板）１０の表面の少なくとも構造色測定に関わる部分に規則的に配列した状態で捕捉物質（図では上述のデチオビオチン）３を結合させる。典型的にはシランカップリング剤等を利用して基材１０表面に結合したスペーサー（架橋分子）４を介して捕捉物質（デチオビオチン）３を結合（固着）させる。これにより、基材１０表面に捕捉物質３から成る（好ましくはスペーサー４によって一方向に配向した）単分子層が形成される。かかる単分子層は、所定のスペクトル（可視光波長域に反射光強度の最大値又は最小値又はその両者を有するスペクトル）を呈する。
次いで、基材１０に、目的とする被検物に対する受容体（図では上述のアビジン）２を添加し、適当な条件下でインキュベートすることによって基材１０上の捕捉物質３から成る層（好ましくは単分子層）に受容体２を捕捉させる。捕捉物質３が単分子層のように規則的に配列している場合は、典型的には、図２（ｂ）に示されるように、そこに捕捉される受容体２についても、構造色評価を行い得るように規則的に配列した状態で基材表面に配置され得る。従って、この状態の基材１０表面は、所定のスペクトル（可視光波長域に反射光強度の最大値又は最小値又はその両者を有するスペクトル）を呈する。
このようにして本発明のデバイス２０が製造される。本発明により提供されるキットには、典型的にはこのようなデバイスを検出方法実施前に構築し得るように、上記捕捉物質３結合済みの基材１０と、該基材１０とは独立して保存可能な形態（例えば、受容体として好適な分子構造（形状）を維持し得るように好適な塩を含む溶液状態或いは凍結乾燥された粉末状態）でストックされた受容体２を含む。
【００２６】
そして、かかる構成のデバイス２０に被検物（図では上述のビオチン）１を含み得る試料を付与し、図２（ｃ）に示すように、該試料中の被検物１の存在に応じて基材１０の表面層から受容体２が遊離し得る適当な条件で該デバイス２０と試料をインキュベート（即ち、反応状態を保持）するとよい。かかるインキュベーション（所定時間の処理継続）によって、図示するように、被検物１との高い結合定数を有する受容体２が被検物１の存在に応じて基材表面層の捕捉物質３から遊離し、典型的には試料中の被検物１と結合する。これにより、図示されるように、基材１０表面の微細構造が変化し、該変化（即ち図２（ｂ）に示す状態から図２（ｃ）に示す状態への変化）は構造色の変化として光学的に検知することができる。
なお、かかる構造色の変化は、従来公知の種々の光学的技法によって検知することができる。例えば、反射スペクトルの測定、吸収スペクトルの測定等は市販の光学機器（分光光度計等）を使用することで容易に実現することができる（後述の実施例参照）。従って、本発明によって提供され得る検出システムは、ここで開示される構造色評価用デバイスを使用するとともに、該デバイスの構造色の変化を光学的に測定し得る種々の装置を包含し得る。例えば、種々の光源、分光光度計、該光度計によって得られたデータを解析する解析装置（コンピュータ）を備えることができる。また、構造色評価用デバイスをインキュベートし得る種々のインキュベーター（例えば恒温器）を備えることができる。これらシステムの構成要素は、被検物及び／又は試料の性状に応じて好適なものを採用すればよい。
【００２７】
ここで開示される方法によると、試料中に被検物が存在することに基づくデバイス（基材表面層）における構造色の変化を簡便な光学的手段によって容易に検知することができる。即ち、ここで開示される検出方法によると、構造色の変化の度合いを調べることによって、試料中に含まれる被検物を容易に定性的に検出することができる。
また、例えば、予め相互に異なる既知量の被検物を含むいくつかの標準試料を用いて各標準試料における構造色変化の度合いを調べておき、それらデータより検量線を作成しておくことによって、測定対象の試料中の被検物を定量的に測定することができる。
【００２８】
また、ここで開示される方法では、受容体の分子構造を大きくすることによって、被検物の検出感度を向上させることができる。即ち、所定の条件下で遊離される受容体のサイズが大きいほど、当該受容体の遊離前と比べて構造色発現に関与する基材の表面構造の変化が大きくなる。換言すれば、僅かな量の受容体の遊離であっても、構造色の変化（例えば反射スペクトルの変化率）の度合いが大きくなり、そのことを光学的手段によって検知し易くなる。例えば、図３に模式的に示すように、上述のアビジン２のような受容体分子を鎖状分子（例えば長鎖脂肪酸、或いはパラフィン系、オレフィン系及びアセチレン系炭化水素のような脂肪族化合物）５で修飾することによって、基材１０上での規則的な配列を維持しつつ分子サイズの大きい修飾受容体６を得ることができる。このような形態の受容体６を用いることによって、従来の構造色変化（即ち基材上への被検物吸着に基づく構造色変化）を採用する検出方法とは異なり、検出対象とする被検物１の分子（又は粒子）サイズが小さい場合であっても、それに代替して被検物１よりも格段に大きい受容体６の遊離による構造色変化を基礎とするため、当該小さいサイズの被検物１の存在を高感度（高精度）に検出することができる。
なお、受容体の修飾方法は、使用する受容体（被検物との結合に関与するコア部分）の性状に応じて異なるため、特に制限されない。受容体の種類に応じて従来公知の種々の修飾技法を採用すればよい。例えば、従来技法によって、タンパク質受容体を長鎖脂肪酸で修飾（結合）することができる。
【００２９】
以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
本実施例では、シリコン及び酸化シリコン表面膜から成る構造色プレートを基材とし、図４（１）〜（４）に示す化合物を採用して、構造色変化に基づくビオチン検出用デバイスを製造した。
【００３０】
＜構造色プレートの作製＞
シリコンウェハ（面方位(100)、ｎ−タイプ、厚さ０．５ｍｍ、片面研磨、株式会社ニラコ製品）をガラス切りで適当なサイズに切断し、アセトン及び硝酸に２４時間浸漬して洗浄した。続いて、電気炉を用いて一定温度（９５０〜１１２０℃）で３時間アニールを行うことにより、シリコン表面の酸化層の膜厚を増大させ、表面にシラノール基（反応性水酸基：−ＯＨ）を有するプレート１００を得た（図５）。得られたプレート表面において温度に依存した構造性発色が認められた。
【００３１】
次に、０．５質量％の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（3-aminopropyl-trimethoxysilane；図４（１）に示すＡＰＴＭＳ；信越化学工業（株）製品）水溶液に上記プレートを室温で３０分間浸漬し、続いて１１０℃で２０分間熱処理した。これにより、図５に示すように、上記プレート１００表面にシランカップリング剤（ＡＰＴＭＳ）を固定し、プレート表面に末端アミノ基を導入した。
次に、グルタルアルデヒド（glutaraldehyde；図４（２）に示すＧＡ；シグマ・アルドリッチ社製品）の０．１Ｍエタノール溶液、及び２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）（2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylenediamine)；図４（３）に示すＥＤＢＥＤ；シグマ・アルドリッチ社製品）の０．０１Ｍエタノール溶液にそれぞれ２４時間ずつプレート１００を浸漬し、図５に示すような、ＧＡ及びＥＤＢＥＤが鎖状に連結してその末端にアミノ基を有するスペーサーから成る単分子膜をプレート表面に形成した。
【００３２】
＜スクシンイミド基を有するデチオビオチンの作製＞
２１４ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＤ−デチオビオチン（D-dethiobiotin；シグマ・アルドリッチ社製品）と、１２７ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide；和光純薬工業（株）製品）とを、１ｍＬのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド(N,N'-dimethylformamide；ＤＭＦ）に溶かした。その溶液を０℃に保持しながら２０６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide)を加えた。１時間の反応後、室温に戻して更に２４時間反応を継続した。その後、生成したＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジウレア(N,N'-dicyclohexylcarbodiurea)を濾過によって取り除き、濾液を真空乾燥した後に２−プロパノールに溶解させた。この際生じた黄色の不純物は濾過して取り除いた。
そして、濾液を氷水で冷やすことにより、白色の沈殿物としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド・デチオビオチンの塩(N- hydroxysuccinimide-dethiobiotinate)が得られた（図４（４）参照）。その沈殿物を冷えた２−プロパノールで洗浄し、次いで乾燥した。この塩の収量は１３０ｍｇ、収率６１％であった。
【００３３】
＜構造色プレートへのデチオビオチンの結合＞
次に、プレート１００の表面に形成したスペーサーの末端アミノ基に、上記得られたＮ−ヒドロキシスクシンイミド・デチオビオチネートを結合させた。即ち、０．０１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド・デチオビオチネート含有ＤＭＦ溶液を調製し、その溶液に上記作製したプレート１００を室温で２４時間浸漬した。そして、ＤＭＦとエタノールでの洗浄後、真空乾燥した。これにより、図５の最下欄に示すように、長鎖状のスペーサーを介して本実施例に係る捕捉物質であるデチオビオチンが表面に結合したプレート１００を得た。
【００３４】
＜構造色プレート表面のデチオビオチンへのアビジンの捕捉＞
上記のようにして得られたプレート１００の表面に、本実施例に係る受容体であるアビジンを結合させた。即ち、１×１０−５Ｍのアビジン（avidin；シグマ・アルドリッチ社製品）を含むリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）を調製した。このバッファーにプレート１００を室温で２４時間浸漬した。その後、プレート１００をバッファーから引き上げ、超純水で洗浄した。これにより、本実施例に係る構造色評価用デバイスを得た。
【００３５】
＜ビオチン添加によるアビジンの遊離＞
被検物として１×１０−８Ｍのビオチン（biotin；東京化成工業（株）製品）を含むリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）を調製した。このバッファーにプレート１００を室温で２４時間浸漬することによりインキュベートした。その後、プレート１００をバッファーから引き上げ、超純水で洗浄した。なお、アビジンの変性を防ぐため、この作業はプレートを常に乾燥させることなく行った。
【００３６】
＜反射スペクトルの測定＞
市販の紫外可視分光光度計（日本分光（株）製品、型式：Ｖ−５５０）と絶対反射率測定装置（日本分光（株）製品、型式：ＡＲＳ−４７４）とを用いた紫外可視反射スペクトル測定によって、本実施例に係るデバイスの性能を評価した。比較対照としてビオチン含有バッファーに浸漬する前のプレートについても同様に反射スペクトルを測定した。具体的には、プレート（デバイス）を絶対反射率測定用ホルダに入射角１０°で固定し、室温で測定した。この測定で得られたスペクトルから未処理のシリコンのスペクトルを除算することによって、構造色のみに起因するスペクトルを得た。
図６は、その結果を示すスペクトル・ダイアグラムである。図中の細い破線がビオチン含有バッファーに浸漬した後の反射スペクトルを示しており、太い実線がビオチン含有バッファーに浸漬する前の反射スペクトルを示している。かかるスペクトル図から明らかなように、プレートを浸漬することによって、受容体であるアビジンが遊離してプレート表面層の構造が変化し、該変化を構造色の変化（典型的には光干渉の変化に基づく。）として検知することができた。ここでは、可視光反射スペクトルの長波長シフト（色変化）が確認された。具体的には、ビオチン含有試料とのインキュベートによって、波長約１２ｎｍの長波長シフトが確認された。
【００３７】
以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。また、本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組み合わせによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組み合わせに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成するものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の検出方法の測定原理を模式的に示す説明図である。
【図２】本発明の検出方法に用いるデバイスの微視的状態を模式的に示す説明図であり、（１）は基材表面に捕捉物質が配置された状態、（２）はその捕捉物質に受容体が捕捉された状態、（３）は被検物の存在によって受容体が捕捉物質から遊離した状態を示している。
【図３】本発明の検出方法及びデバイスの好適な一実施形態を模式的に示す説明図である。
【図４】一実施例に係る本発明のデバイスを製造するのに用いられた４種類の化合物（１）〜（４）の構造式をそれぞれ示す説明図である。
【図５】一実施例に係る本発明のデバイスの製造手順を模式的に説明するフロー図である。
【図６】一実施例に係る検出結果を示す反射スペクトルのダイアグラムであり、横軸は波長（λ：ｎｍ）、縦軸は反射率（reflectivity）を示す。
【符号の説明】
【００３９】
１  被検物（ビオチン）
２  受容体（アビジン）
３  捕捉物質（デチオビオチン）
４  スペーサー（架橋分子）
１０，１００  基材
２０  構造色評価用デバイス
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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