(57)【要約】【課題】  新規な金属錯体タンパク質複合体、新規な水素化反応触媒を提供する。【解決手段】  本発明の金属錯体タンパク質複合体は、キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに、ロジウム、ルテニウム及びパラジウムからなる群より選ばれた一種の金属に配位子が配位してなる金属錯体を挿入した構造を有するものである。この金属錯体タンパク質複合体は、例えば水中でオレフィンの水素化反応触媒として機能するため、水溶性基質の水素化に利用することができるし、有機溶媒を使う場合に比べて環境面でも有利である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに、ロジウム、ルテニウム及びパラジウムからなる群より選ばれた一種の金属に配位子が配位してなる金属錯体を挿入した構造を有する、金属錯体タンパク質複合体。
【請求項２】
前記タンパク質類は、前記金属錯体の金属が配位可能なアミノ酸残基又は前記金属錯体の配位子と非共有結合可能なアミノ酸残基を前記キャビティーに有するタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体である、請求項１に記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項３】
前記タンパク質類は、ヘムを含むタンパク質からヘムを除くことによりヘムの存在していた部位をキャビティーにしたタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体である、請求項１又は２に記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項４】
前記タンパク質類は、アポミオグロビン、アポヘモグロビン、アポヘムオキシゲナーゼ、アポカタラーゼ、アポシトクロム、アポフェリチン又はそれらの変異体である、請求項１〜３のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項５】
前記タンパク質類は、アポミオグロビンの６４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンを変異させたアポミオグロビン変異体である、請求項４に記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項６】
前記金属錯体は、ロジウムにホスフィノ基を有する化合物が配位子してなる錯体である、請求項１〜５のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項７】
前記金属錯体は、ロジウムにジフェニルホスフィノ基を少なくとも２つ有する化合物が配位してなる錯体である、請求項６に記載の金属錯体タンパク質複合体。
【請求項８】
前記金属錯体は、式（１）を配位子とする、請求項６に記載の金属錯体タンパク質複合体。
Ｒ1Ｒ2Ｐ−Ｊ−ＰＲ3Ｒ4  …（１）
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、すべて同じであっても一部同じであってもすべて異なっていてもよい炭素数１〜１０の置換もしくは非置換の炭化水素または置換もしくは非置換のフェニルであり、Ｊは、炭素数１〜１０の置換もしくは非置換の炭化水素またはベンゼン環内の２つの炭素を示す。）
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の金属錯体タンパク質複合体であって、水中でオレフィンの水素化を促進する機能を有する水素化触媒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な金属錯体タンパク質複合体及び水素化触媒に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、本発明者は、酵素貯蔵タンパク質であるミオグロビン（Ｍｂ）からヘムを除いたアポミオグロビン（ａｐｏ−Ｍｂ）のキャビティーに、マンガンのシッフ塩基錯体を非共有結合的に挿入した金属錯体タンパク質複合体を提案している。例えば、マンガンにＮ，Ｎ’−ビス（サリチリデン）−１，２−フェニレンジアミンを配位させた金属錯体をアポミオグロビンのキャビティーに保持した金属錯体タンパク質複合体を合成し、この種の複合体がチオアニソールの不斉酸化反応に有用であることを報告している（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】第１６回生体機能関連シンポジウム講演要旨集、「１Ｓ１−１１  アポミオグロビンキャビティーへの金属錯体挿入による人工酵素の構築」（２００１年９月発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、この種の金属錯体タンパク質複合体の研究は緒に就いたばかりであり、例えばこの種の金属錯体タンパク質複合体において水素化反応に有用なものは未だ報告がなされていない。
【０００４】
本発明は、新規な金属錯体タンパク質複合体を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、新規な水素化反応触媒を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、新規な金属錯体タンパク質複合体を見い出した。すなわち、本発明の金属錯体タンパク質複合体は、キャビティーを持つタンパク質類の該キャビティーに、ロジウム、ルテニウム及びパラジウムからなる群より選ばれた一種の金属に配位子が配位してなる金属錯体を挿入した構造を有するものである。この金属錯体タンパク質複合体は、例えば水中でオレフィンの水素化反応触媒として機能するため、水溶性基質の水素化に利用することができるし、有機溶媒を使う場合に比べて環境面でも有利である。
【０００６】
本発明の金属錯体タンパク質複合体の合成方法としては、幾つかの方法が考えられるが、代表的には以下の２通りの方法がある。一つは、キャビティーを持つタンパク質類のキャビティーに金属錯体を挿入する方法であり、もう一つは、キャビティーを持つタンパク質類が存在する系内に、キャビティーに挿入しようとする金属錯体の製造原料（反応することにより金属錯体となるもの）を入れてその系内で金属錯体を合成すると同時にキャビティーに金属錯体を挿入する方法である。前者の方法としては、例えば、キャビティーを持つタンパク質類と金属錯体とをタンパク質類と金属との当量比が１：０．５〜１００、好ましくは１：１．１〜２となるように混合することが挙げられる。このときの溶媒としては、水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒、水−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合溶媒、水−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）混合溶媒、水のみなどが好ましく、そのうち水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒が特に好ましい。また、混合時の温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜４℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜３０分が好ましい。また、後者の方法としては、例えば、タンパク質類と金属との当量比が１：０．５〜１００、好ましくは１：１．１〜２となるように混合することが挙げられる。このときの溶媒としては、水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒、水−ＤＭＦ混合溶媒、水−ＤＭＳＯ混合溶媒、水のみなどが好ましく、そのうち水−アセトン混合溶媒、水−メタノール混合溶媒が特に好ましい。また、混合時の温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜４℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜１時間が好ましい。これら以外の方法として、担体に担持されたタンパク質類のキャビティーに前記２通りの方法のいずれかを用いて金属錯体を挿入する方法や、一旦金属錯体タンパク質複合体を調製したあと金属錯体の配位子を別の配位子に交換する方法を採用してもよい。
【０００７】
本発明に用いられるタンパク質類としては、例えば、金属錯体の金属が配位可能なアミノ酸残基又は金属錯体の配位子と非共有結合可能なアミノ酸残基をキャビティーに有するタンパク質、タンパク質多量体又はそれらの変異体であってもよいし、ヘムを含むタンパク質からヘムを除くことによりヘムの存在していた部位をキャビティーにしたものであってもよい。具体的には、アポミオグロビン、アポヘモグロビン、アポヘムオキシゲナーゼ、アポカタラーゼ、アポシトクロム、アポフェリチン又はそれらの変異体などが挙げられる。なお、「アポ」とは、補因子又は補欠分子族などが欠損しているタンパク質を表す接頭語であり、アポミオグロビン、アポヘモグロビン等はヘムが欠損しており、アポフェリチンは鉄イオンが欠損している。また、タンパク質類の変異体としては、タンパク質類のキャビティーに挿入された金属錯体の化学反応場に影響を与える位置のアミノ酸残基を化学反応に適したアミノ酸残基に変異させたものが好ましい。例えばアポミオグロビンの変異体としては、アポミオグロビン（１５３個のアミノ酸よりなるポリペプチド鎖）の６４番目、７１番目、９３番目、１０７番目などのアミノ酸残基を変異させたものが挙げられ、特に６４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ６４）をグリシンやアラニンのようにヒスチジンより小さなアミノ酸残基に変異させたものが好ましい。
【０００８】
本発明に用いられる金属錯体としては、タンパク質類のキャビティーに位置するアミノ酸残基と金属が配位するか又は配位子が非共有結合するものであれば特に限定されないが、ホスフィノ基を有する化合物を配位子とする金属錯体が好ましく、ジフェニルホスフィノ基を少なくとも２つ有する化合物を配位子とする金属錯体が特に好ましい。式（１）はこのような配位子の一例である。
【０００９】
Ｒ1Ｒ2Ｐ−Ｊ−ＰＲ3Ｒ4  …（１）
（式中、Ｒ1〜Ｒ4は、すべて同じであっても一部同じであってもすべて異なっていてもよい炭素数１〜１０の置換もしくは非置換の炭化水素または置換もしくは非置換のフェニルであり、Ｊは、炭素数１〜１０の置換もしくは非置換の炭化水素またはベンゼン環内の２つの炭素を示す。）
ホスフィン配位子としては、特に限定されないが、例えば、ビス（ジフェニルホスフィノ）メタン、ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、ビス（ジフェニルホスフィノ）プロパン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ペンタン、ビス（ジフェニルホスフィノ）ヘキサン、１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）ベンゼン、ビス（ジメチルホスフィノ）メタン、ビス（ジメチルホスフィノ）エタン、ビス（ジメチルホスフィノ）プロパン、ビス（ジメチルホスフィノ）ブタン、ビス（ジメチルホスフィノ）ペンタン、ビス（ジメチルホスフィノ）ヘキサン、１，２−ビス（ジメチルホスフィノ）ベンゼンなどのほか、ビス（ジフェニルホスフィノ）化合物中のフェニルに含まれる１以上の水素をアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、ハロゲンなどの置換基で置換したものが挙げられる。これらのホスフィン配位子は、ロジウム錯体やパラジウム錯体の配位子に用いることが好ましい。
【００１０】
また、ホスフィン配位子以外の配位子としては、例えば、金属とメタロセン系化合物を形成する環状ジエンや芳香族化合物が挙げられる。このような環状ジエンとしては、例えば、シクロペンタジエン、シクロオクタジエン及びこれらの骨格を有し１以上の水素がアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基、ハロゲンなどの置換基で置換されたものが挙げられ、芳香族化合物としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン及びこれらの骨格を有し１以上の水素がアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、カルボキシル基などの置換基で置換されたもの、具体的にはトルエン、キシレン、イソプロピルベンゼン、イソブチルベンゼン、ｏ−，ｍ−又はｐ−イソプロピルトルエン（シメン）、ｏ−，ｍ−又はｐ−イソブチルトルエンなどが挙げられる。これらの配位子は、ルテニウム錯体に用いることが好ましい。
【００１１】
本発明の水素化触媒は、上述した金属錯体タンパク質複合体からなるものであり、水中で水素化を促進する機能を有するものである。この水素化触媒の使用量は、反応容器や経済性によって異なるが、反応基質とのモル比Ｓ／Ｃ（Ｓは基質、Ｃは触媒）が１０〜１００００、特に５０〜５０００の範囲で用いることが好ましい。反応基質は、水素化される部位を有する化合物であれば特に限定されないが、水中で水素化するため水溶性であることが好ましい。水素化反応の溶媒としては、水系の溶媒であれば特に限定されないが、例えば、水、水と低級アルコール（メタノール、エタノールなど）の混合溶媒、水と低級ケトン（アセトン、メチルエチルケトンなど）の混合溶媒、水とＤＭＦの混合溶媒、水とＤＭＳＯの混合溶媒などが挙げられる。反応温度は−１０〜２００℃、特に１℃〜５０℃が好ましく、混合時間は０．５分〜２４時間、特に５分〜１０時間が好ましい。この水素化反応は、反応形式がバッチ式においても連続式においても実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明を実施するための最良の形態を実施例を用いて説明する。なお、以下の実施例の説明中、「ｃｏｄ」は１，５−シクロオクタジエンの略であり、「ｄｐｐｅ」は１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンの略であり、「ｄｐｐｂ」は１，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタンの略である。
【実施例１】
【００１３】
＜ロジウム錯体の合成−その１＞
Ｒｈ（Ｉ）（ｃｏｄ）（ｄｐｐｅ）は公知文献(Brown, J. M. et al.,  Journal of Organometallic Chemistry, 1981, vol216, p263-276)を参考にして合成した。即ち、［Ｒｈ（ｃｏｄ）Ｃｌ］2（９９ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）とＡｇＢＦ4（８０ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、アセトン中で３時間撹拌し、固体のｄｐｐｅ（１５９ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加え、赤色の溶液を得た。赤色の上清を取り、３ｍｌまで濃縮しエーテル（２０ｍｌ）を加えると黄色の沈殿が得られた。エーテルで洗浄し、濃縮乾固させて目的物であるＲｈ（Ｉ）（ｃｏｄ）（ｄｐｐｅ）・ＢＦ4を得た。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（電子スプレー式イオン化法を用いた飛行時間型質量分析）：［Ｒｈ（Ｉ）（ｃｏｄ）（ｄｐｐｅ）］+ ｍ／ｚ６０９．１０（計算値６０９．１４），［Ｒｈ（Ｉ）（ｄｐｐｅ）（ＣＨ3ＯＨ）］+ ｍ／ｚ５３３．０３（計算値５３３．３８），［Ｒｈ（ｄｐｐｅ）］+ ｍ／ｚ５０１．０２（計算値５０１．０４）。
【実施例２】
【００１４】
＜ロジウム錯体の合成−その２＞
Ｒｈ（Ｉ）（ｃｏｄ）（ｄｐｐｂ）はアルドリッチ社より購入した。製品名は［１，４−ビス（ジフェニルホスフィノ）ブタン］（１，５−シクロオクタジエン）ロジウム  テトラフルオロ硼酸塩である。
【実施例３】
【００１５】
＜ロジウム錯体アポミオグロビン複合体の合成−その１（図１参照）＞
以下の作業は全て４℃で行った。まず、公知文献(T.Matsui et al. J.Am.Chem.Soc., 1999, vol121, p9952-9957)に従って、ミオグロビンの６４番目のアミノ酸残基であるヒスチジンをアラニンに変異させた。このように変異させたミオグロビンをＳＷ  Ｈ６４Ａ  Ｍｂと称する。次に、公知文献(F.Ascole et al. Method Enzymol. 1981, vol76, p72-87)に記載された酸−ブタノン法に従ってＳＷ  Ｈ６４Ａ  Ｍｂをアポ化をし、１ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー液（ｐＨ７．０）で各２時間透析することにより、アポミオグロビンを得た。このアポミオグロビンをａｐｏ−Ｈ６４Ａ  Ｍｂと称する。次に、ａｐｏ−Ｈ６４Ａ  Ｍｂを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー液（ｐＨ７．０）（３８５μＭ，１８ｍｌ）に入れ、ここへＲｈがＭｂに対して１．５当量となるように実施例１で得たロジウム錯体のアセトン溶液（１０ｍＭ，１．０３８ｍｌ）を撹拌しながら加え、１０分間、４℃静置した。続いて、この混合溶液を１０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー液（ｐＨ６．０）１Ｌで一夜透析した。このようにして再構成したロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｄｐｐｅ）・ａｐｏ−Ｈ６４Ａ  Ｍｂを、Ｇ２５，Ｇ５０（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー液（ｐＨ７．０））を用いてゲルろ過することにより精製した。複合体の同定は、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＵＶ−ｖｉｓ、原子吸光法によって行った。このときのＭＳ分析値は１７７６４．８であり、計算値１７７６５．４とよく一致していた。また、ＵＶ−ｖｉｓ分析では吸収極大波長が２５９．５ｎｍとなり、ａｐｏ−Ｈ６４Ａ  Ｍｂの吸収極大波長（２８０ｎｍ）より低波長にシフトした。原子吸光分析によりＲｈの濃度を求めたところ１．７７ｍＭと決定できた。なお、Ｇ２５はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇ５０はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０  Ｍｅｄｉｕｍ（いずれもアマシャムバイオサイエンス社製）の略である（以下同じ）。
【実施例４】
【００１６】
＜ロジウム錯体アポミオグロビン複合体の合成−その２（図１参照）＞
ミオグロビンを変異させずにそのまま用いた以外は、実施例３と同様にしてロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｄｐｐｅ）・ａｐｏ−Ｍｂを得た。このときのＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析値は１７８２９．９であり、計算値１７８３１．１とよく一致していた。また、ＵＶ−ｖｉｓ分析では吸収極大波長が２７４．５ｎｍとなり、ａｐｏ−Ｍｂの吸収極大波長（２８０ｎｍ）より低波長にシフトした。原子吸光分析によりＲｈの濃度を求めたところ１．１３ｍＭと決定できた。
【実施例５】
【００１７】
＜ロジウム錯体アポミオグロビン複合体の合成−その３（図１参照）＞
実施例１で得たロジウム錯体の代わりに実施例２で得たロジウム錯体を用いた以外は、実施例４と同様にしてロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｄｐｐｂ）・ａｐｏ−Ｍｂを得た。このときのＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析値は１７８５９．８であり、計算値１７８５９．２とよく一致していた。
【実施例６】
【００１８】
＜ロジウム錯体アポミオグロビン複合体の合成−その４（図１参照）＞
ここでは、ロジウム錯体アポミオグロビン複合体の別法の実施例について説明する。この別法は、アポミオグロビンの存在下でロジウム錯体をｉｎ  ｓｉｔｕで合成してロジウム錯体アポミオグロビン複合体を合成する方法である。まず、ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ  Ｍｂ（６４番目のヒスチジンをアスパラギン酸で変異させたもの）の５ｍＭ酢酸アンモニウム溶液（２０μＭ，２００μｌ）に［Ｒｈ（ｃｏｄ）Ｃｌ］2のアセトン溶液（２ｍＭ，２μｌ）（ＲｈはＭｂに対して２当量）、ｄｐｐｅのアセトン溶液（２ｍＭ，４μｌ）を加え、１時間、４℃で静置させ、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳを測定した。得られたマススペクトル（１７８０８．０）は、ｃｏｄが脱離したＲｈ（Ｉ）（ｄｐｐｅ）とａｐｏ−Ｈ６４ＤＭｂによる複合体の計算値（１７８０９．１）とよい一致を示した。
【実施例７】
【００１９】
＜オレフィンの水素化反応−その１＞
実施例３で得られたロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｄｐｐｅ）・ａｐｏ−Ｈ６４Ａ  Ｍｂを用いてアクリル酸の水素化反応を以下のようにして行った。まず、精製した複合体のＲｈ濃度を原子吸光法により決定した。次に、アクリル酸の水素化につき、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＤ７．０）中で［Ｒｈ］／［基質］＝１／１００、温度３５℃、水素の圧力５ａｔｍという条件で、５時間反応を行った。具体的な実験方法はオートクレーブにロジウム錯体アポミオグロビン複合体水溶液（０．５ｍＭ，１ｍｌ，０．５μｍｏｌ）を入れ、アクリル酸水溶液（５０ｍＭ，１ｍｌ，５０μｍｏｌ）を加え、オートクレーブ内を水素ガスで置換し、先の反応条件で反応を行い、プロピオン酸を得た。この反応後、1Ｈ−ＮＭＲによりターンオーバー数を求めたところ、０．６８ｈ-1であった。なお、ｐＤは−ｌｏｇ10［Ｄ+］（Ｄは重水素）である。
【実施例８】
【００２０】
＜オレフィンの水素化反応−その２＞
実施例４で得られたロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｄｐｐｅ）・ａｐｏ−Ｍｂを用いてアクリルアミドの水素化反応を実施例７と同様にして行い、プロピオンアミドを得た。反応後、1Ｈ−ＮＭＲによりターンオーバー数を求めたところ、０．６０ｈ-1であった。
【実施例９】
【００２１】
＜その他＞
図２（ａ）〜（ｄ）に示す式に基づいて、各種の金属錯体タンパク質複合体を合成した。ここでのアポミオグロビンは、ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ  Ｍｂを使用した。得られた金属錯体タンパク質複合体のＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳの値を同図２中に示した。以下に、それぞれの具体的な実験手順を説明する。
【００２２】
図２（ａ）：ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ溶液（２１２μＭ，１４ｍｌ）に［Ｒｈ（ｃｏｄ）Ｃｌ］2アセトン溶液（１０ｍＭ，１５０μｌ）を加え、１０分間４℃で静置させた。続いてこの混合溶液を１０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー液（ｐＨ６．０）で一夜透析した。このようにして再構成したロジウム錯体アポミオグロビン複合体Ｒｈ（ｃｏｄ）・ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ  ＭｂをＧ２５，Ｇ５０を用いてゲルろ過することにより精製した。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析値は１７５１６．６であり、計算値１７５１９．１とよい一致を示した。
【００２３】
図２（ｂ）：金属錯体として、Ｐｄ（ｄｐｐｅ）Ｃｌ2とＡｇＢＦ4をＤＭＦ中で混合させてＣｌを脱離させたＰｄ（ｄｐｐｅ）ＤＭＦ溶液を用いた以外は、図２（ａ）と同様にしてパラジウムアポミオグロビン複合体Ｐｄ（ｄｐｐｅ）・ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ  Ｍｂを得た。このときのＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析値は１７８１４．８であり、計算値１７８１２．０とよい一致を示した。
【００２４】
図２（ｃ）：ａｐｏ−Ｈ６４Ｄ  Ｍｂ  ５ｍＭ  酢酸アンモニウム溶液（２０μＭ，２００μｌ）にジクロロ（ｐ−シメン）ルテニウム，ダイマーのメタノール溶液を２当量加え、１時間４℃で静置させた後、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳを測定した。ＭＳの分析値は１７５４４．３であり、計算値１７５４３．４とよい一致を示した。
【００２５】
図２（ｄ）：ジクロロ（ｐ−シメン）ルテニウム，ダイマーのメタノール溶液（１０ｍＭ，１００μｌ）と１，８−ジアミノナフタレンのメタノール溶液（２０ｍＭ，１００μｌ）を室温で混合し、１分間撹拌し、一晩室温で放置した混合溶液を金属錯体溶液とした以外は、図２（ｃ）と同様にしてルテニウムアポミオグロビン複合体を得た。このときのＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析値は１７７００．９であり、計算値１７６９９．６とよい一致を示した。
【００２６】
また、アポシトクロムｃを用いた複合体の例を以下に示す。アポシトクロムｃと塩化ルテニウム（ｐ−シメン）（４−メチル−１，２−ベンゼンジアミン）を１：１又は１：２の割合で混合し、１０分以上氷上に置いた。その後、酢酸アンモニウムバッファー（５ｍＭ，ｐＨ６．８，４℃）で１２時間透析し、酢酸アンモニウムバッファー（５ｍＭ，ｐＨ６．８，４℃）で平衡化したＧ５０ゲルろ過カラムに通してルテニウム（ｐ−シメン）（４−メチル−１，２−ベンゼンジアミン）／アポシトクロムｃ複合体を精製した。ＭＳ分析値は１２０９７．１で、この複合体の計算値１２０９８とほぼ一致した。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例３〜６の説明図である。
【図２】合成した各種金属錯体タンパク質複合体の説明図である。
【図１】
2005075799.tif 000002
【図２】
2005075799.tif 000003