(57)【要約】  【課題】被験者の動脈硬化や生活習慣病を検討する上で、新たな要素となり得る生体指標を見出し、この指標による動脈硬化等の検出手段を提供すること。  【解決手段】脂質代謝に関連する要素のうち、ヒトアポリポ蛋白質J が、動脈の状態、特に、動脈血管のしなやかさと非常に良く連関する指標として用いることができることを見出した。すなわち、ヒトアポリポ蛋白質Jに対する抗体、さらに、この抗体を用いたヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法を提供することにより、動脈硬化についての新たな評価を行うことを可能とし、上記の課題を解決するに至った。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアポリポ蛋白質Jに対する抗体。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ヒトアポリポ蛋白質Jβ鎖に対して特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項２または３に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を用いて、検体中のヒトアポリポ蛋白質Jを定量検出することにより、被験者の動脈硬化を診断する、ヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法。
【請求項６】
動脈硬化の診断が、動脈血管のしなやかさの診断である、請求項５記載のヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５または６記載のヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体を１種以上含む、ヒトアポリポ蛋白質Jの検出用キット。
【請求項９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項８記載のヒトアポリポ蛋白質Jの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の生体物質に対する抗体、および、これを用いて当該生体物質を検出することにより、被験者の健康状態を判定することができる、生体物質の検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
高密度リポ蛋白質（HDL）は多くの疫学的調査により冠動脈疾患に対して予防的に作用していることが知られている。しかしながら、HDLの冠動脈疾患の予防作用、あるいは抗動脈硬化作用の機序については未だ明確でない。HDLの抗動脈硬化は、HDLを構成しているアポリポ蛋白質[例えば、アポリポ蛋白質AI(Apo AI)]などのリポ蛋白質構成蛋白質や血液中でHDLに結合している蛋白質[例えばアポリポ蛋白質E(Apo E)、アポリポ蛋白質F(Apo F)、アポリポ蛋白質J(Apo J)、ヒトパラオキソナーゼ(PON)、血小板活性化因子加水分解酵素(PAF-AH)など]、あるいはHDLに結合または作用し、HDLの粒子サイズ、構造、機能を変化させる作用をもつ蛋白質[例えばレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ(LCAT)、リポプロテインリパーゼ(LPL)、肝性リパーゼ(HTGL)、コレステリルエステル転送蛋白質(CETP)、リン脂質転送蛋白質(PLTP)など]の働きによると考えられている。すなわち、前者のHDL結合蛋白質は脂質の抗酸化作用、あるいは末梢細胞に蓄積した余剰のコレステロールを細胞から引き抜く作用を有し、後者のHDLに作用する蛋白質は引き抜かれたコレステロールを肝臓へと戻す作用（コレステロール逆転送系）に促進的に働く、あるいは細胞からコレステロールを引き抜く作用を持つアクセプターを産生するのに働いていると考えられる。これらのHDLに結合する蛋白質、およびHDLに作用する蛋白質の相乗作用により生体内でのコレステロール逆転送系を働かせ、抗動脈硬化的に作用していると思われる。
【０００３】
このような、脂質代謝に関連する要素のうちいくつかは、自覚症状として認められ難い、動脈硬化の進行等を検出するための指標として用いられている。特に、血清脂質検査は以前より一般的に行われているが、さらに鋭敏な動脈硬化等に関する知見を得るために種々の要素を、動脈硬化等を検出するための指標として用いる試みがなされている［例えば、特開平１１−３４６７８２号公報（特許文献１）、特開２０００−３３３６７４号公報（特許文献２）、特開２００１−６６３１４号公報（特許文献３）等］。
【特許文献１】特開平１１−３４６７８２号公報
【特許文献２】特開２０００−３３３６７４号公報
【特許文献３】特開２００１−６６３１４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
種々の生活習慣病の罹患者は、動脈硬化を伴っていることが多く、動脈硬化を簡便に検出することができれば、生活習慣病の罹患や増悪の可能性を予見して、適切な処置を施すことが可能になる。また、動脈硬化が、脂質代謝と深く係わっていることも知られており、血清ＬＤＬコレステロール値や、ＨＤＬコレステロール値等を動脈硬化の関連指標とすることは、一般的な健康診断等においても行われている。しかしながら、動脈硬化といっても、実は、多様な要因が複雑に関連しており、例えば、動脈硬化の現象面として、動脈壁の肥厚（形態面）と動脈血管のしなやかさの減退（機能面）の少なくとも２面から、動脈の状態を検討して、被験者の状態を把握することが望ましいと考えられる。
【０００５】
よって、本発明が解決すべき課題は、被験者の動脈硬化や生活習慣病を検討する上で、新たな要素となり得る生体指標を見出し、この指標による動脈硬化等の検出手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、鋭意検討の結果、脂質代謝に関連する要素のうち、ヒトアポリポ蛋白質J が、驚くべきことに、動脈の状態、特に、動脈血管のしなやかさと非常に良く連関する指標として用いることができることを見出して本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明者は、ヒトアポリポ蛋白質Jに対する抗体を提供し、さらに、この抗体を用いたヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法を提供することで、動脈の状態を、動脈血管のしなやかさの面から評価することが可能であることを見出した。
【０００８】
このように、本発明は、ヒトアポリポ蛋白質J（以下、アポリポ蛋白質JをApo Jともいう)対する抗体（以下、本抗体ともいう）を提供し、本抗体を用いて、検体中のヒトアポリポ蛋白質Jを定量検出することにより、被験者の動脈硬化を診断する、ヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【０００９】
本抗体は、上述のように、ヒトApo Jに対する抗体、すなわち、ヒトApo Jに対するモノクローナル抗体、または、ポリクローナル抗体である。
【００１０】
このような本抗体を製造するための前提条件として、免疫抗原として用いるヒトApo Jが必要である。
【００１１】
Apo Jは、クラステリンとも呼ばれ、血液中では、ＨＤＬを構成するアポリポ蛋白質の一つで、それぞれ分子量約４０ｋDaのα鎖とβ鎖の、ジスルフィド結合による約８０ｋDaのヘテロダイマー蛋白質として存在している。Apo Jは、特に、脳における発現量が多く、他に、精巣、卵巣、肝臓における発現が認められている。Apo Jを含有するＨＤＬは、脂肪含量が少なく、細胞からのコレステロールを引き抜く働きがあると考えられている。
【００１２】
ヒトApo Jは、天然物として、ヒト血漿から分離して調製することができる。すなわち、ヒト血漿より、常法、例えば、超遠心法や塩析等により得られる、含Apo J粗画分に、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常公知の精製法を施して、精製ヒトApo Jを製造することができる（例えば、Choi  et al.,J Immu Methods. 131, 1990, 159-163)。
【００１３】
このようにして得た精製ヒトApo Jを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。
【００１４】
また、遺伝子工学的な手法を用いて、ヒトApo Jの組み換え蛋白質を得て、これを、本抗体を製造するための免疫抗原とすることができる。
【００１５】
当該組み換え蛋白質は、既知のヒトApo J遺伝子の塩基配列(例えば、アクセッション番号J02908（ｃＤＮＡ)）を参考にして、遺伝子増幅用プライマーを調製し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、ヒトApo J遺伝子を遺伝子増幅産物として得て、これをクローニングすることにより得たクローンより産生されるヒトApo Jの組み換え蛋白質を、上述した通常公知の精製法により精製することにより、本抗体を製造するための免疫抗原として用いることが可能なヒトApo J組み換え蛋白質とすることができる。また、上記のヒトApo J遺伝子の塩基配列を一部改変した、ヒトApo J一部改変遺伝子がコードする改変組み換え蛋白質も、ヒトApo Jに対する免疫抗原としての性質を失わない限り可能である。
【００１６】
なお、ここで使用される免疫抗原としてのヒトApo Jは、必ずしもヒトApo Jの全部である必要はなく、その一部の断片ペプチドであってもよい。特に、ヒトApo Jは、α鎖とβ鎖で構成されており、当該α鎖またはβ鎖を免疫抗原とすることができる。
【００１７】
ヒトApo Jの一部の断片ペプチドは、ヒトApo J遺伝子の一部断片がコードするヒトApo J断片や、ヒトApo Jのプロテアーゼ処理物、ホスファイト−トリエステル法(Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)) 等を用いた固相法や液相法による化学合成ペプチド等として免疫抗原として用いることができる。
【００１８】
このようにして得られる上記のヒトApo Jにおいて、特に、免疫抗原として用いるヒトApo Jが小分子の一部ペプチドである場合には、本抗体の免疫反応性を向上させるために、ハプテンを結合させることができる。
【００１９】
このハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００２０】
上記のペプチドとハプテンを結合させるために、架橋剤を用いることができる。かかる架橋剤は、選択するハプテンの種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ハプテンとして、傘貝ヘモシアニンを選択する場合には、ｍ−マレイニミドベンジル−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）等を用いることができる。なお、選択する架橋剤の種類に応じて、必要な処理を、上記のペプチドに施すことができる。例えば、上記のＭＢＳを架橋剤として用いる場合には、結合反応に必要なスルフィド結合を有するシステイン残基を、上記ペプチドの両末端のいずれかに付加することが必要である。また、選択したペプチドにおけるシステイン残基は、これを他のアミノ酸に置換するか、保護基を結合させることによって保護することが好ましい。
【００２１】
本抗体を製造するために、上述のようにして得られる免疫抗原で免疫される動物も、特に限定されるものではなく、マウス、ラット等を広く用いることが可能であり、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００２２】
本抗体が、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるにかかわらず、免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫抗原を免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
【００２３】
より、具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に、２週間程度毎に、上記手法により数回投与することにより免疫を行う。
【００２４】
ポリクローナル抗体は、このように、上記免疫抗原により免疫を行った動物の抗血清として得ることができる。
【００２５】
モノクローナル抗体は、当該免疫動物の、例えば、脾臓細胞を免疫細胞として用い、この免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により得られる、本抗体をモノクローナル抗体として産生するハイブリドーマにより得ることができる。
【００２６】
上記の骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等を用いることができる。
【００２７】
上記免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler,G. and
Milstein,C.,Nature,256,495(1975)）等に準じて行うことができる。
【００２８】
より具体的には、この細胞融合は、通常公知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行い、ハイブリドーマを調製する。
【００２９】
所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン及びチミジン）培地で培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行うことができる。このようにして得られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
【００３０】
目的とするモノクローナル抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検索法に従い行うことができる。
【００３１】
このようにして得られるヒトApo Jを認識するモノクローナル抗体である本抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
【００３２】
このハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の採取は、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得る方法や、用いるハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用いることができる。
【００３３】
なお、インビトロで免疫細胞をヒトApo J又はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることで、所望のモノクローナル抗体を得ることもできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53,261(1982)；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,1149(1983））。
【００３４】
また、上記のようにして得られるモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。
【００３５】
上述のようにして得られる本抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）は、ヒトApo Jに特異反応性を有する抗体である。なお、この「ヒトApo Jに特異反応性を有する」とは、本抗体は、少なくとも、ヒトApo Jに対しては交差反応性を示すという意味である。
【００３６】
このような性質の本抗体は、後述するように、臨床において用い得ることは勿論のこと、ヒトApo J自体の分離・精製のための試薬としても極めて有用である。
【００３７】
本抗体についてのさらに具体的な内容は、実施例において後述する。このようにして得られる本抗体を、必要に応じて標識物質で標識して、後述する本発明に係わる測定方法等において用いることができる。
【００３８】
かかる標識物質は、その標識物質単独で又はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキシダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００３９】
これらの標識物質による、本抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いることができる。
【００４０】
また、本抗体（標識されたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化抗体として、後述する本発明に係わる測定方法等に用いることもできる。
【００４１】
さらに、本抗体は、必要に応じて、不溶性担体に固定化して用いることができる。かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。
【００４２】
これらの不溶性担体における、本抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体において既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４３】
Ｂ．本検出方法
本検出方法は、上述したように、本抗体を用いて、検体中のヒトアポリポ蛋白質Jを定量検出することにより、被験者の動脈硬化を診断する、ヒトアポリポ蛋白質Jの検出方法である。
【００４４】
このような本検出方法の様態としては、例えばエンザイムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、フルオロメトリーによる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができるが、一般的には、エンザイムイムノアッセイ法による解析による方法を選択することが望ましい。 エンザイムイムノアッセイ法は、酵素免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。エンザイムイムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする"heterogeneous enzyme immunoassay"と、このＢ／Ｆ分離を必要としない"homogeneous enzyme immunoassay"とに大別される。本検出方法においては、これらのうち、一般的に測定感度が高いといわれる、前者の"heterogeneous enzyme immunoassay"を選択することが好ましく、イムノソルベントを用いる、"enzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）”を選択することがさらに好ましい。
【００４５】
より具体的な検出態様として、いわゆるサンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができる。かかるサンドイッチ法は、特に、操作上の簡便性、経済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考慮すると、特に好ましい検出態様の一つである。
【００４６】
このサンドイッチ法を行うに際しては、本抗体が、９６穴マイクロプレートに代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレートに固定化された、固定化抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチンにより標識された、本抗体を用いることが好ましい。
【００４７】
サンドイッチ法は、少なくとも、下記(a) 及び(b) の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法である。
【００４８】
(a) 不溶性担体に、本発明モノクローナル抗体を固定化した、固定化抗体に、血液検体等の検体を反応させる工程。
【００４９】
この工程(a) においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の検体は、固定化抗体から除去される。
【００５０】
(b)  固定化抗体と、試料中のヒトApo Jとの結合により形成される、抗原抗体複合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等により標識された本抗体を反応させる工程。
【００５１】
この工程(b) においては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識された本抗体は、固定化抗体から除去される。
【００５２】
また、この工程(b) においては、反応させた第２抗体における標識物質の種類に応じた標識シグナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。例えば、標識物質としてビオチンを選択した場合には、アビジンやストレプトアビジンを用いて、標識シグナルを顕在化させることができる。また、例えば、標識物質として、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、その基質を必要に応じて発色物質と共に添加して、標識シグナルを顕在化することができる。
【００５３】
このようにして、顕在化した発色シグナルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特定手段を用いて検出することで、所望する検体中のヒトApo Jの検出を行うことができる。
【００５４】
なお、本検出方法において用いられる検体は、本来、ヒトApo Jが存在する検体であれば特に限定されないが、本検出方法が、動脈硬化に関連する事項について判定する方法であることや、本発明の臨床検査としての適応等を考慮すると、血漿等の血液検体であることが好ましい。
【００５５】
本検出方法の検出対象である、検体中のヒトApo J量は、被検者の動脈硬化の進展度合いの有力な指標となる。すなわち、本検出方法により検出された検体中のヒトApo Jの異常により、検体提供者の動脈硬化を判定する、本検出方法が提供される。
【００５６】
本検出方法においては、動脈硬化が進展していなければ、検体中のヒトApo J量が正常値（４０μg/ml程度）であるが、動脈硬化が進展している場合には、量的に高い値を示すことによって、動脈硬化の判定がなされる。
【００５７】
すなわち、本検出方法により、血液検体等の検体中のヒトApo J量が、正常値よりも多ければ、動脈硬化の進展が認められることを判定可能である。
【００５８】
本検出方法は、特に、動脈壁の機能的な変化、具体的には、動脈血管のしなやかさの減退に対して鋭敏である。つまり、動脈壁に肥厚と硬化を併せて認められる場合は勿論のこと、動脈壁の肥厚の前段階としての硬化や、動脈の肥厚とは無関係の硬化をも検出することが可能である。従来、動脈血管のしなやかさは、動脈における脈波の伝搬速度等により評価されていたが、本検出方法により、血液検査等のみにより、簡便に評価可能となった。
【００５９】
本検出方法で、「動脈硬化陽性」と判定された検体提供者に対して、具体的な症状、例えば、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞等が現れる前に、適切な処置を行うことが可能であり、予防医学上、極めて有用な方法である。
【００６０】
本発明においては、本抗体を、本検出方法において用いるための、本抗体を含む動脈硬化判定用キットも提供される（以下、本キットともいう）。
【００６１】
本キットにおいては、本抗体を、検体中のヒトApo Jの検出のために供するための要素、例えば、前記の標識された本抗体や固定化された本抗体等が含まれ得る。
【００６２】
本キットは、本検出方法に対応して、サンドイッチ法やフルオロメトリーによる判定や検出を容易に行い得る構成のキットであることが好ましい。
【発明の効果】
【００６３】
本発明により、動脈硬化の度合い、特に、動脈血管のしなやかさを評価可能な、ヒトApo Jの検出方法、および、当該検出方法に用いるための抗体と、これを構成要素として含む検出用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
以下、実施例により、本発明を実施するための最良の形態を記載するが、これは、本発明の技術的範囲を限定的に解釈することを目的とするものではない。
【００６５】
１．ヒトApo J蛋白質の精製
Choiら(J Immu Methods. 131, 1990, 159-163)の方法を参考に一部改変して行った。
【００６６】
ヒト血漿にポリエチレングリコール(M.W. 3,500、シグマ  アルドリッチ)を最終濃度12%になるように加え、撹拌した後に8,000 rpm、4℃、20分遠心(BECKMAN JA-21)し、上清を回収する。更に回収した上清にポリエチレングリコールを最終濃度25%になるように加え、撹拌し遠心後、沈殿を回収した。
【００６７】
回収した沈殿を10mM Tris-HCl, pH 7.4/ 1mM EDTA緩衝液(Tris/EDTA緩衝液)に溶解し、あらかじめTris/EDTA緩衝液にて平衡化したDEAE Sepharose (Amersham biosciences) 2.6 × 40 cmに添加し、0〜0.5 M NaClの直線的濃度勾配にて溶出した。この結果、ヒトApo Jは、NaCl濃度0.1〜0.3 Mで溶出された。
【００６８】
溶出されたDEAE Sepharose画分を回収し、1M硫酸アンモニウム含有Tris/EDTA緩衝液にて透析(4℃、16時間)を行った。透析後、あらかじめ1M硫酸アンモニウム含有Tris/EDTA緩衝液にて平衡化したPhenyl Sepharose (Amersham biosciences) 1.6 × 40 cmに添加し、1〜0M 硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配の後、dH2Oにて溶出した。ヒトApo Jは、dH2Oの画分に溶出された。
【００６９】
溶出されたPhenyl Sepharose画分を、10mM リン酸緩衝液(pH 7.4)による透析(4℃、16時間)を行った。あらかじめ10 mM リン酸緩衝液(pH 7.4)にて平衡化したHydroxyapatite (Bio Rad) 1.0 × 20 cmに添加し、10〜250mM リン酸の直線的濃度勾配にて溶出した。ヒトApo Jは、リン酸濃度50〜150 mMで溶出された。
【００７０】
溶出されたHydroxyapatite画分を、Tris/EDTA緩衝液にて透析(4℃、16時間)を行った。透析後、あらかじめTris/EDTA緩衝液にて平衡化したBlue agarose （シグマ・アルドリッチ）1.0 × 3 cmに添加し、非結合分画を回収した。ヒトApo Jは、非結合画分に溶出された。
【００７１】
Blue agarose非結合画分を、あらかじめTris/EDTA緩衝液にて平衡化したSephacryl S-200 2.6 × 60 cm (Amersham biosciences)に添加し、流速毎分0.5mlにて分離した。ヒトApo Jは、フラクション20〜26に溶出された(図１：ゲル濾過カラム溶出画分における泳動像)。このようにして、得られた画分を最終的に抗原として用いた。
【００７２】
２．ヒトApo J cDNAのクローニング、リコンビナント蛋白質の作製、および精製
ヒト肝臓よりmRNAを精製し、RT-PCR法 にて、ヒトApo J αサブユニット(1-194アミノ酸残基)、βサブユニット(195-416アミノ酸残基)及び全長のcDNAを増幅し、クローニングした。得られたcDNAのシーケンシングを行い、ヒトApo J cDNA(アクセッション番号J02908)と相違ないことを確認した。得られたそれぞれのヒトApo J cDNAを、大腸菌発現ベクターpQE-30(Qiagen)に挿入し、ベクターpQE-30/Apo J-α、pQE-30/Apo J-β、pQE-30/Apo J-全長を得た。それぞれのベクターを大腸菌株JM109に導入し、大腸菌JM109/Apo J-α、 JM109/Apo J-β、JM109/Apo J-全長を得た。それぞれの組替え大腸菌株を、50μg/mlアンピシリンを含むTB培地にて培養し、1mM IPTGにより、組み換えヒトApo J（以下、rhApo Jともいう）の発現を誘導した。培養液を遠心(5,000rpm、5min、4℃)し、rhApo Jを発現した大腸菌を沈殿させた。沈殿した菌体は、2% Triton X-100、および0.5M NaCl含有50mM リン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁後、氷上にてソニケーションにより破砕し、遠心(15,000rpm、30min、4℃)し、rhApo Jを含む沈殿を回収した。沈殿は、7M Urea、10mM 2-メルカプトエタノール、10mM Imidazole、および0.5M NaCl含有50mM リン酸緩衝液(pH8.0)に懸濁後、氷上にてソニケーションにより抽出し、遠心(15,000rpm、30min、4℃)し、rhApo Jを含む上清を回収した。上清は、同50mMリン酸緩衝液(pH8.0)にて平衡化したNi-NTA agarose(Qiagen)に結合させた。
【００７３】
溶出は、7M Urea、10mM 2-メルカプトエタノール、250mM Imidazole、および0.5M NaCl含有50mM リン酸緩衝液(pH8.0)にて行い、溶出画分を精製rhApo J-α、rhApo J-β、及びrhApo J-全長とした。
【００７４】
3. ヒトApo Jに対するポリクローナル抗体の作製
rhApo J-全長を、SDS-PAGE後、CBB染色し、rhApo J-全長に相当する約45kDaのバンドを切り出した。得られたゲル断片を、PBSで洗浄後、PBS中で粉砕し、rhApo J懸濁液を得た。rhApo J懸濁液を等量のフロインド完全アジュバントで乳化し、rhApo J-全長0.3mg相当量を、ウサギ皮下に投与した。その後、2週間毎に3回、等量のフロインド不完全アジュバントで乳化したrhApo J懸濁液のrhApo J-全長0.15mg相当量を、ウサギ皮下に投与した。最終投与の1週間後に採血を行い、血清を遠心分離した。得られた血清を、抗ヒトApo Jポリクローナル抗体とした。
【００７５】
４．ヒトApo J蛋白質の対するモノクローナル抗体の作製
精製したヒトApo J(25μg)を、等量のフロイント完全アジュバンドと混和し、7週齢のBalb/cマウス(雌)の腹腔に免役した。2週間後、フロイント不完全アジュバンドを用いて同様に追加免疫を行い、それ以降は、２週間に１回、計４回免疫した。最終免疫３日後のマウスの脾細胞を、マウスミエローマ細胞(SP2/0-Ag14)と混和し、50％ポリエチレングリコール(平均分子量1500)含有PBS溶液を用いて細胞融合を行った。融合後、細胞をRPMI1640培地に、ウェル当たり5 × 105個の割合になるように浮遊させ、96ウェルプレートに捲いた。翌日からHAT試薬を添加し、７日間選択培養を行った。各ハイブリドーマの培養上清中のヒトApo Jに対する特異的モノクローナル抗体の産生は、精製ヒトApo J、またはrhApo Jを固相化したELISA法でスクリーニングを行った。すなわち、各ウェル当たりに50 ngの精製Apo J、またはrhApo Jを固相化し、100 μLの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液(0.1% Tween 20含有PBS)で洗浄し、4,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗マウスIgG抗体を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、洗浄液にてウェルを5回洗浄し、100μLの発色溶液(0.012%過酸化水素、0.4mg/ml OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride、シグマ・アルドリッチ)含有クエン酸・リン酸緩衝液 、pH 5.0)を添加後、室温下で30分反応させ、反応は2N硫酸を添加し、停止した。反応停止後、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。1.0以上の吸光度を示すハイブリドーマ培養上清を陽性とした。また、陽性のハイブリドーマ培養上清はウエスタンブロット法にて精製Apo Jに対する反応性を確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを選別した。
【００７６】
ウエスタンブロット法は、10%SDSポリアクリルアミド電気泳動にて1レーンあたり0.5μgの精製ヒトApo J、またはrhApo Jを分離し、PVDF膜(Millipore)に転写した。転写した膜は、5%スキムミルクを含むPBSにて4℃、一晩静置した。0.1%Tween 20含有PBS(洗浄液)にて2回洗浄後、洗浄液にて10倍から100倍に希釈した各モノクローナル抗体を室温下、2時間反応させる。反応後、洗浄液にて5回洗浄した後、0.05μg/mlの西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を室温下、２時間反応させる。反応後、洗浄液にて5回洗浄した後、化学発光試薬(PerkinElmer)を用い、X線フィルム(Kodak)を感光させ、特異バンドを検出した。
【００７７】
さらに、選別したハイブリドーマは、HT試薬を添加したRPMI1640培地にて各ウェル0.5個の細胞になるように調整し、96ウェルプレートに播き、同様のスクリーニングによる選別操作を３回繰り返し、精製ヒトApo Jに対する特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。
【００７８】
最終的に、精製ヒトApo J、またはrhApo Jを固相化したマイクロプレートを用いたELISA法、およびヒト血漿、精製ヒトApo J、またはrhApo J対するウェスタンブロット法により選別し、陽性クローンは、精製ヒトApo Jに対するモノクローナル抗体産生クローンが１１クローンであった。
【００７９】
得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からの抗体の作製、および精製は以下のとおりである。
【００８０】
Balb/cマウス(雌)に一匹あたりハイブリドーマ細胞106〜107個/ 0.5mlを腹腔内に注入した。注入10日後、マウスを開腹し腹水を採取した。得られた腹水は、遠心にて得られた上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。さらに、4℃、10,000 × gで10分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液(3M塩化ナトリウム、1.5Mグリシン溶液、pH8.9)に溶解し、プロテインAセファロースと混和し、4℃で一晩転倒混和した。結合させたプロテインAセファロースをカラムに充填し、結合溶液を6倍容量用いて洗浄後、溶出溶液(0.1 M クエン酸溶液、pH4.0)で1mlずつ溶出した。溶出された画分は、2 M トリス溶液 (pH10.0) 0.1mlで中和した。各溶出画分の吸光度(280 nm)を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収し、PBSにて透析(4℃、一晩)し、精製モノクローナル抗体を得た。
【００８１】
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプは、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット（ベーリンガー）を用い、キットに添付されている操作手順に準じて測定した。精製ヒトApo Jに対するモノクローナル抗体産生クローンは、IgG1(６クローン)、IgG２a(２クローン)及びIgG2b(３クローン)であった。
【００８２】
抗体の特異性は、抗原（精製ヒトApo J)に対するウエスタンブロット法にて（図２）、および抗原（精製ヒトApo J)を固相化したプレートを用いたELISA法による抗体希釈曲線を作成して確認した(図３)。
【００８３】
各抗体のヒトApo Jα、および、β鎖に対する反応性を、大腸菌により強制発現させたrhApo Jを用いてウエスタンブロットにて確認した。得られた１１クローンは、rhApo Jα鎖(３クローン)、または、rhApo Jβ鎖(８クローン)に反応することが確認された。
【００８４】
なお、rhApo Jβ鎖に対して反応するモノクローナル抗体（３C11）を産生するハイブリドーマは、「mouse hybridoma J-3C11」(FERM P-19493)として、また、モノクローナル抗体（4H8）を産生するハイブリドーマは、「mouse hybridoma J-4H8」(FERM P-19494)として、独立行政法人産業技術総合研究所において寄託されている。
【００８５】
5. ビオチン化モノクローナル抗体の作製
上述のようにして得た、精製抗Apo Jヒトモノクローナル抗体（4H8） 1mgを、0.1 M NaHCO3 (pH8.3)溶液にて4℃、16時間透析を行った。60μgのNHS-biotin(ピアス)を、DMSOに溶解したものを加えて撹拌し、室温にて4時間反応させた。PBS(5L)にて4℃、約16時間透析を行い、ビオチン化モノクローナル抗体を得た。
【００８６】
6．ヒト血漿中Apo J蛋白質定量測定系の構築
96穴マイクロプレートに、0.05% NaN3含有PBSにて希釈した各固相化抗体溶液(2.5μg/ml)を、各ウェル100μLずつ加え、4℃、一晩静置し固相化した。各ウェルの溶液を捨て、ペーパータオルなどで液を完全に除いた。BSA(シグマ  アルドリッチ)をPBSにて溶解したブロッキング溶液を、各ウェル200μLずつ加えて、室温下、2時間静置した。各ウェルを、洗浄液(0.1% Tween 20/PBS)300μLで２回洗浄した。洗浄液にてあらかじめ希釈した測定試料(精製ヒトApo JもしくはrhApo J、rhApo J培養上清、コントロール血漿および測定血漿検体)を、100μLずつ加えて、室温下、2時間静置した。洗浄液で各ウェルを5回洗浄した。洗浄液で希釈したビオチン標識抗体溶液(0.５μg/ml)を、各ウェルに100μLずつ加え、室温下、2時間静置した。洗浄液で、各ウェルを5回洗浄後、洗浄液で希釈したペルオキシダーゼ標識アビジン溶液(0.05μg/ml) 100μLを加えて、室温下、1時間静置した。反応後、洗浄液で各ウェルを5回洗浄後、使用直前に調整した発色溶液発色溶液(0.012%過酸化水素/0.4 mg/ml OPD (O-phenylenediamine dihydrochloride)/クエン酸・リン酸緩衝液 pH 5.0)を各ウェルに100μLずつ加え、室温下、0.5時間発色し、反応停止液(2N H2SO4溶液) 25μLを各ウェルに加え、反応を停止した。波長492nmの吸光度で、マイクロプレートリーダーを用いて測定を行った。
【００８７】
精製ヒトApo Jを用いた標準曲線を図４に示した。また、精製ヒトApo J（Ａ）、およびヒト血漿（Ｂ）に対する反応性を図５（Ａ）（Ｂ）に示した。これらの結果より、本サンドウィッチELISAにおける反応性は、精製ヒトApo J、およびヒト血漿において同等であることが示された。
【００８８】
７．ヒト血漿中Apo J蛋白質量と動脈硬化症との関連
ヒトApo Jと動脈硬化症の関連を調べるために、ヒト血漿中Apo  J蛋白質量と、動脈硬化症の指標である、１）血圧、２）超音波エコーにて求めた総頸動脈内膜中膜複合体厚の最大値(max IMT)、および、３）脈波伝播速度計にて測定した脈波伝播速度(PWV)との関連について検討した。
【００８９】
動脈硬化症の指標として、総頸動脈血管壁の内膜中膜複合体厚（肥厚度、厚み）が測定されている。
【００９０】
頸動脈血管に存在する血管内腔が隆起した部位（動脈硬化層、プラークともいう）と血圧は、動脈硬化層の存在により、収縮期血圧の高値、あるいは拡張期血圧の低値が認められる傾向があることが知られている。
【００９１】
一方、脈波伝播速度は、動脈伸展性（しなやかさ）の指標で、動脈の老化度、動脈硬化の進行度の指標として用いられている。すなわち、動脈血管の硬化に伴い、脈波伝播速度が増加することが知られている。
【００９２】
健常者(特に自覚症状がない者）６２名（平均年齢６１．４±８．４歳）について、血漿中のヒトApoJ濃度と共に、血圧、頸動脈肥厚度、および脈波伝播速度を測定し、これらの被験者のヒトApo J濃度と、動脈硬化症との関連について検討した。その結果、ヒトApo J濃度は平均血圧、および脈波伝播速度とそれぞれ正の相関を示していた（図６（１）（２））。これは、血漿ヒトApo J濃度は、動脈硬化症の進展に伴い増加する傾向があることを示している。さらに、収縮期血圧、拡張期血圧、脈圧とも有意な相関が認められた。
【００９３】
さらに、ヒトApo J濃度が、年齢および血圧と正相関することから、年齢、平均血圧で補正し、max IMTとPWVとの関連について検討した。
【００９４】
なお、頸動脈内膜中膜複合体厚（IMT）の測定は、両側頸動脈を高解像度超音波測定装置（Power Vision 6000、東芝製）にて、7.5 MHzプローブを用い観察した。Conventional IMT(C-IMT)は総頸動脈分岐部より心臓側1-3 cmで、プラークを除いた平均的な部位の遠位側内膜中膜複合体厚を三方向より計測し、その平均値とした。また、両側総頸動脈を見える範囲ですべて観察し、プラークを含めて最も厚い部分のIMTを最大IMT（max IMT）として測定した。
【００９５】
また、脈波伝播速度は、血圧脈波検査装置（フォルムPWV/ABI、日本コーリン社製）を用いて、収縮期血圧、拡張期血圧とともに、上腕動脈-足首動脈間脈波速度（brachial-ankle PWV, baPWV）を自動測定した。
【００９６】
max IMTとPWVはその程度を３段階に分類して調べると、max IMTでは、ヒトApo J濃度はLow max IMT群で45.5±4.8μｇ／ｍｌ、Middle max IMT群で46.6±5.3μｇ／ｍｌ、High max IMT群で47.5±7.0μｇ／ｍｌであり、ヒトApo J濃度とmax IMTとの関係においては有意な関連は認められなかった（図７（１））。一方、PWVでは、ヒトApo J濃度はLow PWV群で41.9±2.3μｇ／ｍｌ、Middle PWV群で46.6±5.2μｇ／ｍｌ、High PWV群で49.4±4.7μｇ／ｍｌであり、ヒトApo J濃度は正常群であるLow PWV群に比して、Middle PWV群とHigh PWV群は有意（P<0.01）に高値であることが示された（図７（２））。
【００９７】
これは、ヒトApo Jが、動脈の形態的変化、すなわち総頸動脈壁厚とは相関せず、動脈の機能的変化、すなわち脈波伝播速度の増加に相関していることを示唆している。このことから血中のヒトApo J蛋白質量を測定することが、新しい動脈硬化の指標となりうることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明により、動脈硬化を検出することが容易になり、本発明は、特に予防医学上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】最終的に精製されたヒトApo Jを、分子量と共に示した図面である。
【図２】本抗体（モノクローナル抗体）の特異性を、精製されたヒトApo Jおよびヒト血漿に対するウエスタンブロット法を用いて確認した結果を示す図面である。
【図３】本抗体（モノクローナル抗体）の特異性を、抗原（精製ヒトApo J）を固相化したプレートを用いたELISA法により、抗体希釈曲線を作成して確認した結果を示す図面である。
【図４】精製ヒトApo Jに対して、本抗体（モノクローナル抗体）を用いて描いた標準曲線である。
【図５】精製ヒトApo J、および、ヒト血漿に対する、本抗体（モノクローナル抗体）の反応性を示した図面である。
【図６】血中のヒトApoJ濃度の、平均血圧および脈波伝播速度との相関を示した図面である。
【図７】血中のヒトApoJ濃度の、頸動脈内膜中膜複合体厚と脈波伝播速度との相関を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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