(57)【要約】【課題】  希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα−ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を提供すること。【解決手段】  メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質のメイラード反応複合体。タンパク質がα−ラクトアルブミンである。食品に対する抗酸化活性を改善する性質を有するメイラード反応複合体である。該メイラード反応複合体からなる高い抗酸化作用をもつ機能性素材。該メイラード反応複合体を有効成分として含む抗酸化剤。該メイラード反応複合体を含む食品。【選択図】        図１
2005261356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質のメイラード反応複合体。
【請求項２】
タンパク質がα−ラクトアルブミンである請求項１のメイラード反応複合体。
【請求項３】
食品に対する抗酸化活性を改善する性質を有する請求項１または２のメイラード反応複合体。
【請求項４】
請求項１、２または３のメイラード反応複合体からなる高い抗酸化作用をもつ機能性素材。
【請求項５】
請求項１、２または３のメイラード反応複合体を有効成分として含む抗酸化剤。
【請求項６】
請求項１、２または３のメイラード反応複合体を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、希少糖D−アロースとα−ラクトアルブミンのメイラード反応複合体、それを有効成分として含む抗酸化剤、またはそれを含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元糖とタンパク質を混合して加熱すると、タンパク質のアミノ基と糖のカルボニル基でメイラード反応により共有結合が形成され、複合体が形成される。この複合体は様々な機能特性を有している。
このメイラード反応産物（MRP）は一般にかなりの抗酸化性と抗変異原性を持つ（非特許文献１〜４）。加熱の間にMRPが形成したり、外からMRPを添加したりする時に、脂質の酸化速度は著しく遅くなる（非特許文献５、６）。MRPはモデル脂質および実際の食品系で天然有機化合物の酸化的分解を抑え、食品加工品の酸化安定性を向上する（非特許文献７〜１０）。したがって、MRPは高い抗酸化作用をもつ機能性素材として食品加工への利用が見込まれている。
【０００３】
最近、希少糖がさまざまな機能をもつゆえに大きな注目を集めている。例えば、グリコシダーゼの阻害（非特許文献１１）、低カロリー甘味料、増量剤（非特許文献１２〜１４）、加熱ゲル形成増強剤（非特許文献１５  Sun et al. 2004）、ラット肝臓移植における免疫抑制効果改善（非特許文献１６）があげられる。ArnoldらはD-アロースや希少ケトヘキソースが分化した好中球産生の抑制や白血病の治療に有効であることを示唆している（特許文献１）。しかしながら、D−アロースは自然界には稀にしか存在しない希少糖であり、化学的方法で合成するのは困難であったため、試験研究には利用が難しかった。最近、D−プシコースがD−フルクトースからD−タガトース-３-エピメラーゼを用いて大量に生産されるようになり（非特許文献１７）、そして、D−アロースはD−プシコースからL−ラムノースイソメラーゼを用いて生産できるようになり（非特許文献１８）、希少糖の機能性研究やさまざまな利用が可能となってきた。
【０００４】
【特許文献１】US pat. No. 5620960, 1997
【非特許文献１】Eichner et al. (1981) Progressive Food Nutrition Science, 5, 441-451.
【非特許文献２】Aneseet et al.（1993） Italian Journal of Food Science, 5, 75-79．
【非特許文献２】Nicoli et al. (1997) Cancer Letters, 114, 71-74.
【非特許文献４】Yun, G. C et al.  (1993) Food Chemistry, 47, 11-15.
【非特許文献５】Severini et al. (1994) Development on Food Engineering (pp. 289-291)
【非特許文献６】Bressa et al (1996) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 692-695.
【非特許文献７】Wijewickreme, A.N et al. (1997) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4571-4576.
【非特許文献８】Wijewickreme, A. N et al. (1997) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4577-4583.
【非特許文献９】Namiki, M. (1990) Critical Review of Food Science Nutrition, 19, 273-276.
【非特許文献１０】McGookin et al.(1991) Journal of Dairy Research, 58, 313-320.
【非特許文献１１】Muniruzzaman et al. (1996) Glycobiology, 6, 795-803.
【非特許文献１２】Livesey et al.(1996) Journal of Nutrition, 126, 1601-1609.
【非特許文献１３】Levin et al(1995) American Journal of Clinical Nutrition, 62 (suppl), 1161-1168.
【非特許文献１４】Matsuo et al.(2002) Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo), 48, 77-80.
【非特許文献１５】Sun et al. 2004
【非特許文献１６】Hossain et al. (2000) Transplantation Proceedings, 32, 2021-2023.
【非特許文献１７】Takeshita, K et al. (2000) Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 453-455.
【非特許文献１８】Bhuiyan et al. (1998) Journal of Fermentation and Bioengineering, 85, 539-541.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗酸化活性をもつメイラード反応産物（MRP）のような通常の食品に含まれる成分を利用するという方向に強い関心が持たれている。通常用いられている還元糖からのMRPがある程度の抗酸化活性を持つことは知られているが、タンパク質への非酵素的糖付加によるD−アロースの付加が通常の還元糖付加と同様あるいはそれ以上の作用を持つかどうかについては実験的な裏付けのある結論はでていない。
本発明は、従来、熱安定性、乳化性、起泡性、ゲル形成性、抗酸化活性のような食品に対する機能特性を改善することが示されてきた糖付加タンパク質として、メイラード反応に希少糖D−アロースを用いることにより、希少糖D−アロースそのもの特定の機能特性を付与するとともに、従来知られている食品に対する機能特性、特に抗酸化性を一層改善することができるタンパク質−糖複合体を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα−ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を提供することを目的とする。
また、本発明は、それを高い抗酸化作用をもつ機能性素材として用いること、あるいはそれを有効成分として含む抗酸化剤、またはそれを含む食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、糖付加タンパク質の構造と機能の相関を理解するために、希少アルドヘキソースであるD−アロースをメイラード反応によりα-LA に付加した時に抗酸化活性（テトラゾリウム塩（XTT）還元性、ラジカルカチオン(ABTS＋)捕捉活性）がどれぐらい増加するかを対照糖であるD−グルコースやD−フルクトースと比較検討することにより、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質のメイラード反応複合体を要旨とする。
【０００８】
タンパク質がα−ラクトアルブミンであり、その場合の本発明は、メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとα-ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を要旨とする。
【０００９】
食品に対する抗酸化活性を改善する性質を有しており、その場合本発明は、メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、食品に対する抗酸化活性を改善する性質を有する、希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα-ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を要旨とする。
【００１０】
また、本発明は、メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα-ラクトアルブミンのメイラード反応複合体からなる高い抗酸化作用をもつ機能性素材を要旨とする。
【００１１】
また、本発明は、メイラード反応により希少糖D−アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα-ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を有効成分として含む抗酸化剤を要旨とする。
【００１２】
さらにまた、本発明は、メイラード反応により希少糖D-アロースの抗酸化活性が高められた、希少糖D−アロースとタンパク質、好ましくはα-ラクトアルブミンのメイラード反応複合体を含む食品を要旨とする。
【発明の効果】
【００１３】
遊離のD−アロースが抗酸化能をもつこと、その機能を利用した生理活性の用途も研究が進んでいる。本発明は、このD−アロースにアルブミンを結合させる方法によって得られた複合体が遊離のD−アロースよりも高い抗酸化能を持つことを明らかとしたものである。
希少糖D−アロースそのもの特定の機能特性を付与するとともに、従来知られている糖付加タンパク質の食品に対する機能特性を一層改善することができるタンパク質−糖複合体を提供すること、ならびにそれらを、抗酸化剤、高い抗酸化作用をもつ機能性素材、食品に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で用いる希少糖D−アロースについて説明する。
D−アロースは、希少糖研究の中で特に各種生理活性を有することが判明してきた希少糖である。希少糖とは、自然界に微量にしか存在しない単糖および糖アルコールと定義づけることができる。自然界に多量に存在する単糖は、D−グルコース、D−フラクトース、D−ガラクトース、D−マンノース、D−リボース、D−キシロース、L−アラビノースの７種類あり、それ以外の単糖は全て希少糖である。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖と考えられる。本発明で分離回収の対象となるD−アロース（D−アロヘキソース）は、アルドース（アルドヘキソース）に分類されるアロースのD体であり、融点が178℃の六炭糖（C6H12O6）である。
【００１５】
このD−アロースの製法としては、D−アロン酸ラクトンをナトリウムアマルガムで還元する方法による製法や、また、シェイクワット・ホセイン・プイヤン等による「ジャーナル・オブ・ファンメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング」第85巻、539ないし541頁（1993年）において記載されている、L−ラムノース・イソメラーゼを用いてD−プシコースから合成する製法がある。さらに近年では、特開2002-17392号公報に記載されている。D−プシコースを含有する溶液にD−キシロース・イソメラーゼを作用させて、D−プシコースからD−アロースを生成する製法が発明されている。特開2002-17392号公報に記載されている製法によれば、D−アロースを生成する場合には、未反応のD−プシコースと共に、新たに生成したD−アロースを含有している酵素反応液として得られる。
D−アロースに変換可能な基質を酵素反応でD−アロースに変換する際に用いる酵素の種類は限定されないが、本発明ではD−プシコースからD−アロースを生産することができる酵素「L−ラムノースイソメラーゼ」を好ましいものとして例示される。L−ラムノースイソメラーゼは、「ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」第85巻、539乃至541頁（1998年）で発表された公知酵素である。L−ラムノースからL−ラムニュロースへの異性化反応ならびにL−ラムニュロースからL−ラムノースへの異性化を触媒する酵素である。L−ラムノースイソメラーゼは、D−アロースとD−プシコースの間の異性化にも作用するので、D−プシコースからD−アロースを生産することができる酵素である。
L−ラムノースイソメラーゼは、Pseudomonas stutzerii 由来の酵素が例示できるが、その由来、起源を問わず、天然であろうと遺伝子組換え型であろうと、何れの酵素も利用できる。上記のPseudomonas stutzeriiに属する菌株（172a）は、上記文献に記載された公知菌であり、香川大学農学部生物資源食糧化学科 何森健研究室に保存されている。Ｌ−ラムノースイソメラーゼは各種の微生物から容易に入手が可能である。財団法人発酵研究所から同一のPseudomonas stutzeriiは得られる。Pseudomonas stutzerii IFO 3773, Pseudomonas stutzerii IFO 13596 が同一の活性を持っていると思われる。通常、得られた培養菌体からL−ラムノースイソメラーゼを抽出し、そのままで反応に用いることができるが、本発明では固定化した形態で用いる。固定化の対象とするL−ラムノースイソメラーゼそのものは、使用目的に応じて、必ずしも高純度に精製されたものでなくてもよく、粗酵素であっても用いることができる。粗酵素の具体的例としては、上記のL−ラムノースイソメラーゼ産生能を有する微生物自体を、また、その培養物や部分精製した培養物を用いることができる。
このようなＤ−アロースは単糖としてそのまま利用できるほか、必要に応じて各種の誘導体として用いることも期待される。
【００１６】
D−アロースをメイラード反応によりタンパク質に糖付加した複合体が食品に対してどのような機能特性の改善性を有するかについても、期待しうる。これまでの多くの研究によって、糖付加タンパク質が熱安定性、乳化性、起泡性、ゲル形成性のような食品に対する機能特性を改善することが示されており、メイラード反応は食品科学の分野では極めて重要な特性である。タンパク質のリシン残基のアミノ基と還元糖との間の非酵素的相互作用は複雑な反応ネットワークからなり、大きなタンパク質凝集体形成と食品の味、香り、色を与える低分子物質の形成とからなり、希少糖D−アロースを用いたメイラード反応による凝集体形成、低分子物質の形成のいずれの観点からも食品に対する機能特性改善に寄与することは明らかである。D−アロースが付加したα-ラクトアルブミンの抗酸化性において著しい効果を与えた結果は、食品に対する抗酸化性を改善する性質を有することが、低分子物質の形成は食品の味、香り、色を与える性質を有することが、それぞれ期待されるのである。
【００１７】
従来、熱安定性、乳化性、起泡性、ゲル形成性、抗酸化性のような食品に対する機能特性を改善することが示されてきた糖付加タンパク質として、新しい生理活性が見いだされているD−アロースについて、メイラード反応に希少糖D−アロースを用いることにより、希少糖プシコースそのもの特定の機能特性を付与するとともに、従来知られている食品に対する機能特性を一層改善することができるタンパク質−糖複合体を提供することができる。
すなわち、本発明らの属する香川医科大学、香川大学農学部では「単糖」に着目し、単糖に生理活性はないかという切り口で研究を進めている。本発明の背景としては、香川大学の農学部の方で希少糖の生産に関する網羅的な研究が長年積み重ねられてきて、近年になり一部の希少糖の大量生産技術が確立されたことが挙げられる。香川医科大学においても糖に生理活性を探求する研究が数年前から開始されていた。その両者がドッキングした形で、香川大学農学部で生産された希少糖（単糖）を用いて生理活性を探求する研究が、1999年から地域先導研究として開始され、さまざまな生理活性を有することが発見されてきている。
【００１８】
本発明で用いるタンパク質について説明する。メイラード反応は、タンパク質などのアミノ基と糖の配糖体形成能を有する水酸基との間に起こる反応と定義され、本発明は、糖としてD−アロースを用いるものであり、D−アロースの配糖体形成能を有する水酸基を有するタンパク質であれば何でもよい。好ましいタンパク質として、α-ラクトアルブミン（α-LA）を例示することができる。
通常のモデルタンパク質としては牛血清アルブミンがメイラード反応によく用いられるが、ここでは牛乳中に含まれる比較的分子量の小さな（14179 Da）球状タンパク質α−ラクトアルブミン（α-LA）を用いている。小さなタンパク質はメイラード反応中の糖付加進行状況をマススペクトル等により解析しやすいこと（Humeny et al.（2002）Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2153-2160.）、α-LAは乳糖合成酵素の特異的成分であるためか他の乳タンパク質よりも比較的すみやかに糖付加反応が進行する（Nacka et al. .(1998) Journal of Protein Chemistry, 17, 495-503.）。
本発明では、タンパク質としてα-ラクトアルブミン（α-LA）を用いて、メイラード反応糖付加α−ラクトアルブミンの抗酸化性などをモニターすることとする。
【００１９】
メイラード反応は、タンパク質のリシン残基のアミノ基と還元糖との間の非酵素的相互作用（反応）である。この糖アミノ縮合反応を第一段階として、ついで分解反応を生じ、種々の反応活性なカルボニル化合物やレダクタントを経て含窒素褐色物質が形成される。この反応は乳製品、菓子、果実、果汁、味噌、醤油、味醂などの食品に関係が深く、褐変化、カラメル香の発生、二酸化炭素の発生などを生じる。タンパク質とＤ−アロースの反応条件は、タンパク質とＤ−アロースの混合物を可溶化した後、凍結乾燥し、均一な粉末を調製する。乾燥粉末を低水分活性下、５５℃で４日間保温し複合体形成する。タンパク質とＤ−アロースの混合物は実施例ではモル比で１：２０になるように調製したが、これに限定されるものではない。
【００２０】
希少糖D−アロースを用いたメイラード反応修飾タンパク質について説明する。
還元糖とタンパク質を混合して加熱すると、タンパク質のアミノ基と糖のカルボニル基でメイラード反応により共有結合が形成され、複合体が形成される。この複合体は様々な機能特性を有している。本実施例では、希少糖D−アロース及び対照糖D−フルクトース、D−グルコースで修飾したα−ラクトアルブミン（α-La）の抗酸化作用及び活性酸素消去作用について調べた。α-LaはD−アロース及び二つの対照糖（D−フルクトース、D−グルコース）とともに乾燥状態で50℃、相対湿度55%で48時間保温した。メイラード反応度を評価するためにα-Laの遊離アミノ基量、共有結合による複合体形成度、蛍光強度を調べた。
遊離アミノ基の変化：タンパク質の糖付加は還元糖とタンパク質の遊離アミノ基との間に起き、シッフ塩基を形成する (Singh, R et al. (2001) Diabetologia, 44, 129-146.) 。有効性アミノ基を定量し、D−アロースは他の糖（D−グルコース、D−フルクトース）に比べてタンパク質との高い反応性を示した。
【００２１】
糖−タンパク質複合体の特徴：質量分析計は正確なタンパク質分子量を与えるため、糖−タンパク質複合体形成における変化を同定できる。D−フルクトースを付加したα-LAの場合、1分子から4分子のD−フルクトースが結合していることが明らかとなった。D−グルコース、D−アロースとのα-LA複合体の場合、D−グルコース-α-LA では2から10分子のD−グルコースが、D−アロースα-LAでは3から11分子のD−アロースが結合していた。質量分析の結果は遊離アミノ基の減少と一致している。これらの結果より、D−アロースはD−グルコースよりもタンパク質とより反応しやすく、D−アロースはタンパク質に付加されやすいことが分かった。   
蛍光強度の増加：糖付加α-LAにおける蛍光物質の形成速度はD−アロースの方が他の糖よりもかなり高かった。保温時間と蛍光物質形成との正の相関はすべての糖について明瞭であり、保温時間が長くなるとより蛍光物質が形成される。   
糖付加タンパク質のXTT還元性： 3種の還元糖のα-LAへの付加により形成されたMRPは保温時間にしたがってXTT還元性を示した。糖付加により生じたXTT 還元性は付加した糖の種類により変動した。３つの還元糖のうちD−アロースとのMRPが最も高いXTT還元性を示した。
【００２２】
ABTS＋消去活性の進展：ABTS法はMRPのラジカルカチオンの還元を測定することにより抗酸化活性として表される。糖付加はタンパク質に抗酸化活性をもたらし、その強さは保温時間と還元糖の種類に依存している。ラジカル消去活性の傾向はXTT還元性と一致しており、D−アロースを付加したタンパク質は高いラジカル消去活性と強い還元力を持っていることが分かった。それゆえ、食品タンパク質と希少糖D−アロースから形成された強い抗酸化力をもつ糖付加タンパク質が新たな機能性食品素材として認知される可能性が高いと思われる。 
糖付加タンパク質の抗酸化性評価：メイラード反応生成物（MRP）の抗酸化性を評価するために48時間保温した糖付加タンパク質をTEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）により評価した。TroloxはビタミンE類似体であり、抗酸化作用を有する。Trolox の濃度を変えてABTSラジカルを消去する能力を調べて、ABTS吸光度の減少とTrolox量との関係を示すことが出来る。そして、糖付加タンパク質のラジカル消去能すなわち抗酸化性をTrolox相当量として表すことが出来る。D−アロース付加α-LAは３つのMRPのうち最も良い抗酸化剤であることを示している。また、新たな抗酸化化合物の抗酸化能を予測するためにはTEAC法が適していると考えられた。
【００２３】
以上まとめると、α-Laのアミノ基とD−アロースのカルボニル基との反応程度と蛍光物質の生成は対照糖よりも著しく高かった。三つの還元糖のうちではD−アロースで修飾したα-Laにおいて、テトラゾリウム塩（XTT）還元性及びラジカルカチオン(ABTS＋)消去作用がいずれも最も高い値を示した。また、保温時間の経過に伴う複合体の抗酸化作用の変化はメイラード反応の進行程度と密接な関連を示し、D−アロースとα-Laの複合体はより優れた抗酸化特性を有することが明らかになった。したがって、D−アロースを付加したタンパク質は強い抗酸化作用を有する機能性食品素材として加工食品に利用できると考えられる。
以上の通り、２つの通常の糖であるD−グルコースとD−フルクトースと比べるとD−アロースはタンパク質のアミノ基との縮合を介した反応において高い共有結合性と早い反応速度を示した。D−アロースを付加したα−LA は高いXTT還元性を有し、高いラジカル消去作用を有していることから強い抗酸化活性を持つことが明らかになった。実験に供した３つの糖とタンパク質から得られるMRP（メイラード反応生成物）のうちD−アロースのものが良い抗酸化剤であることTEAC評価により分かった。抗酸化活性はMRPの蛍光強度の増加に伴い増加し、この蛍光強度は用いた糖と保温時間に依存することも分かった。
【００２４】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
〔目的〕
主目的は希少アルドヘキソースであるD−アロースをメイラード反応によりα-LA（α-ラクトアルブミン）に付加した時に抗酸化活性（テトラゾリウム塩（XTT）還元性、ラジカルカチオン(ABTS＋)捕捉活性）がどれぐらい増加するかを対照糖であるD−グルコースやD−フルクトースと比較検討することにある。
〔材料と方法〕
１  材料
D−アロースは香川希少糖クラスター（Lot No. KAI001-09-011）から、α-LA (bovine milk, Type 1,), K2S2O8 and XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-  5-carboxanilide], Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic aid)はSigma-Aldrich より、 ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)], Menadione (2-methyl-1, 4-naphthoquinone) crotonaldehyde, OPA (o-Phthalaldehyde), D-グルコース、D−フルクトースは和光純薬より購入した。 
【００２６】
２  糖付加タンパク質の調製
糖付加は希少糖D−アロースと二つの対照糖D−グルコース、D−フルクトースを用いて行った。α-LAを10 mM 炭酸緩衝液 (pH 9.0) に5% (w/v) 濃度になるように溶解し、還元糖を0.82%（タンパク質重量の16.4%相当）添加した。この糖の量はモル数の１３倍のモル数に相当し、また、α-LAの遊離アミノ基と等モルに相当する。α-LAと糖混合溶液を凍結乾燥し、粉末の状態で温度50°C 、相対湿度55%で48時間まで恒温恒湿機（LHL-113, エスペック社）において加熱した。この実験のコントロールとして糖を加えないで加熱したα-LAを用いた。 
【００２７】
３  遊離アミノ基の測定
α-LAの遊離アミノ基量はOPA法 （Fayle et al. 2001）により測定した。2 mg/ml α-LA を含む試料50 μLに OPA 試薬1 ml を加えた。室温で添加2分後に340 nm における吸光度を測定した。0.25-2.00 mM グリシンを標準物質として用いて検量線を作成した。タンパク質の量はLowry 法（1951）により測定した。
【００２８】
４  MALDI/TOF質量分析
MALDI/TOF（matrix-assisted laser desorption-ionization/time of flight）質量分析はBruker Autoflex（Bruker Daltonics, Germary）を用いてlinear検出法（positive ion mode, N2 レーザー）により行った。サンプル（100 pmol/μL）をTA溶液（0.1% trifluoroacetic acid with 33% acetonitrile）で1/10に希釈し、その1 μLを4 μLのマトリックス溶液（TA 溶液中でsinapinic acidを飽和にしたもの）と混合した。このうちの1 μLをステンレスターゲット板にスポットし、風乾し、質量分析に供した。外部標準として低分子標準タンパク質混合物を用いた。
【００２９】
５  蛍光強度の測定
糖付加α-LAの蛍光強度 (FI) は励起波長350 nm、蛍光波長420 nmにおいて日立F-2500 分光蛍光光度計を用いて行った。サンプルは10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) に2 mg/mlになるように溶かし、FI は任意蛍光単位(AU)に対し相対蛍光強度として示した。 
【００３０】
６  テトラゾリウム塩（XTT）還元性測定 
XTT還元性測定はShimamuraら(2000)の方法により、96ウェルタイタープレート上で行った。XTT 溶液は飽和menadioneを含む0.2 M リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0) で調製した。
それぞれのウェルに40 μL サンプル(5%)を入れ、次いで60 μL の0.5 mM XTT 溶液を加えた。15秒間撹拌後、490 nmと570 nmの吸光度の差をプレートリーダー(Model 550, Bio-Rad)により測定した、これを0分後の値とした。20分後 同様に測定し、吸光度の差の増加をサンプルのXTT還元性とした。 
【００３１】
７  ABTS ラジカルカチオンの消去活性
ABTS ラジカルカチオン法 (Pellegrini et al. 1999) はMRPの遊離ラジカル消去効果を評価するために用いられている。ABTS＋はABTSにK2S2O8 を加えることにより生じる。ABTS＋ 溶液は10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.4) に最終の吸光度が734 nmにおいて0.7 ± 0.02 になるように希釈した。MRPのラジカル消去活性は溶液を混合後、室温で20秒〜1分後の退色割合により測定した。ABTS＋ 溶液の吸光度はゆっくりではあるがサンプルを加えなくとも減少するために、適当な溶媒ブランクを測定ごとに用いた。 
【００３２】
８  Trolox equivalent 抗酸化活性
異なる濃度(標準範囲0〜20 μM)のTrolox（可溶性ビタミンE類似体）を用意して検量線を作成した。Trolox equivalent 抗酸化活性(TEAC)はすべての測定可能なサンプルについてABTS＋消去能を比較するために用いた。
２−６から２−８のすべての測定は 少なくとも同一のもの３サンプルについて3回行い、その平均を求めた。平均値を図にプロットし、標準偏差を計算した。
【００３３】
〔結果及び考察〕
１  遊離アミノ基の変化 
タンパク質の糖付加は還元糖とタンパク質の遊離アミノ基との間に起き、シッフ塩基を形成する (Singh, Barden, Mori & Beilin, 2001) 。有効性アミノ基を定量するためには還元糖の存在下でα-LA を48時間まで保温し、OPA法で測定した。α-LAはN末端アミノ基を含め13個の反応性アミノ基を有する。すべての測定値は天然のα-LA 13個のアミノ基に対する相対％でもって示した。加温コントロール（糖無添加）では48時間まで加熱しても遊離アミノ基の量に変化は見られなかった（図１）。糖付加タンパク質サンプルにおいては24時間までに遊離アミノ基は著しく減少した。24時間保温でD−アロース、D−グルコース、D−フルクトースの遊離アミノ基はそれぞれ56.8%、46.9% 、15.3% 減少した。この結果、D−アロースは他の糖に比べてタンパク質との高い反応性を示した。
【００３４】
２  糖−タンパク質複合体の特徴 
質量分析計は正確なタンパク質分子量を与えるため、糖−タンパク質複合体形成における変化を同定できる。本研究において還元糖のα-LAへの結合すなわち複合体形成を定性的に研究するにはMALDI/TOF質量分析が適した方法である。天然α-LA の質量は14179 ± 2.6 Daあり、48時間糖無添加で保温したコントロールα-LA の質量は天然α-LA とほとんど同じであった。加温処理はα-LAの質量に影響を与えないことが分かった。還元糖存在下で保温したα-LAは初期段階でも著しい質量増加が見られた。24時間保温したα-LA の質量はかなり増加し、糖付加に応じて増加した質量パターンを示した。異なる還元糖を付加したα-LAの24時間後の質量分布を図2に示した。１分子の還元糖の付加により162 Da質量が増加し、α-LAへの糖付加数は天然のα-LA質量との差 (ΔM)を計算することにより求められる。ここで見られた質量変化162 Daは 以前に報告されたタンパク質への糖付加の結果(Lapollaet al. 2000)と一致する。
D−フルクトースを付加したα-LAの場合は２つの主ピークすなわちm/z 14341.5 (ΔM = 162.5) と14502.3 (ΔM = 323.3)であり、D−フルクトースが1分子ないしは2分子結合していることが分かった。主ピークの他に微量のピーク14665.5 (ΔM = 486.5) と 14827.6 Da (ΔM = 648.6)が見られ、1分子から4分子のD−フルクトースが結合していることが明らかとなった。
D−グルコース、D−アロースとのα-LA複合体の場合、天然α-LAピーク14179 Da は消失し、すべてのα-LA分子はD−グルコース、D−アロースを結合していた（図２）。また、D−グルコース、D−アロースとのα-LA複合体はより高分子のものとなり、D−グルコース−α−LA では2から10分子のD−グルコースが、D−アロースα-LAでは3から11分子のD−アロースが結合していた。主ピークはD−グルコース−α−LAでは m/z 15153.2 (ΔM = 974.2)、D−アロースα-LAでは15478.4 (ΔM = 1299.4 Da) であり、それぞれ6分子のD−グルコース、8分子のD−アロースを結合していた。質量分析の結果は遊離アミノ基の減少と一致している。これらの結果より、D−アロースはD−グルコースよりもタンパク質とより反応しやすく、D−アロースはタンパク質に付加されやすいことが分かった。 
【００３５】
３  蛍光強度の増加 
種々の糖付加α-LAの蛍光強度の増加を図3に示した。コントロールサンプルは48時間の保温においても蛍光物質の形成は見られなかった。一方、糖付加サンプルにおいてはかなりの蛍光物質の形成が見られた。糖付加α-LAにおける蛍光物質の形成速度はD−アロースの方が他の糖よりもかなり高かった。保温時間と蛍光物質形成との正の相関はすべての糖について明瞭であり、保温時間が長くなるとより蛍光物質が形成される。 
【００３６】
４  糖付加タンパク質のXTT還元性 
3種の還元糖のα-LAへの付加により形成されたMRPのXTT還元性の結果を図4に示した。すべての糖付加α-LAは保温時間にしたがってXTT還元性を示した。一方、コントロールサンプルは48時間保温にわたって変化は見られなかった。したがって、タンパク質自身ではXTT還元性は示さないが、糖を付加することにより還元性を示すようになったと考えられる。糖付加により生じたXTT 還元性は付加した糖の種類により変動した。３つの還元糖のうちD−アロースとのMRPが最も高いXTT還元性を示した。このような希少糖を付加したタンパク質が通常の還元糖を付加したタンパク質よりも高い還元性を示すことが推測される。XTT分析がメイラード反応の程度を測定するのみではなく、DNAストランドの切断のような生理活性をも観察できることが示されている (Shimamura, T et al. (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 1204-1209.，Shimamura, T et al. (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 6227-6229.)。本研究においてXTT還元性と蛍光強度の間に高い相関(R2 = 0.94) が見られ、メーラード反応の進行とMRPの還元性との間に重要な関連を示唆している。 
【００３７】
５  ABTS＋消去活性の進展
ABTS法はMRPのラジカルカチオンの還元を測定することにより抗酸化活性として表される。測定値は734 nmにおける吸光度の相対減少分（％）として示される。図５にコントロールサンプルと糖付加サンプル(最終濃度14 μM)の保温時間経過におけるラジカル消去活性についての効果を示した。コントロールサンプルのABTS＋ラジカルカチオン消去活性は48時間保温しても11%であり、タンパク質はごく弱い活性をもっているのみであった。一方、糖付加タンパク質は極めて強いラジカル消去活性を有していた。D−アロースを付加したα-LAでは高い消去活性を示し、48時間の保温で53.5%にも達した。D−グルコースやD−フルクトースを付加したα-LAでは消去活性が22.5%、 29.0%であり、D−アロースを付加したα-LA よりも低い値であった。これらの結果より、糖付加はタンパク質に抗酸化活性をもたらし、その強さは保温時間と還元糖の種類に依存している。ラジカル消去活性の傾向はXTT還元性と一致しており、D−アロースを付加したタンパク質は高いラジカル消去活性と強い還元力を持っていることが分かった。それゆえ、食品タンパク質と希少糖D−アロースから形成された強い抗酸化力をもつ糖付加タンパク質が新たな機能性食品素材として認知される可能性が高いと思われる。 
【００３８】
６  糖付加タンパク質の抗酸化性評価 
メイラード反応生成物（MRP）の抗酸化性を評価するために48時間保温した糖付加タンパク質をTEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）により評価した。TroloxはビタミンE類似体であり、抗酸化作用を有する。Trolox の濃度を変えてABTSラジカルを消去する能力を調べて、ABTS吸光度の減少とTrolox量との関係を示すことが出来る。そして、糖付加タンパク質のラジカル消去能すなわち抗酸化性をTrolox相当量として表すことが出来る。図６Aおよび図６Bにはコントロールサンプルと糖付加タンパク質の1分間測定と6分間測定のTEACをそれぞれ示した。
D−アロース付加α-LA (7.0 μM) のTEACは１分間で1.38 ± 0.03、６分間で2.33 ± 0.04 であった。一方、D−フルクトース付加α-LA (7.0 μM) ではそれぞれ 0.81 ± 0.06、1.82 ± 0.09、D−グルコース付加α-LAではそれぞれ0.82 ± 0.02、1.87 ± 0.05でありD−アロース付加タンパク質の方がかなり高いTEACを示した。10.5 and 14.0 μMの若干高い濃度では7.0 μM よりも全体的に若干低い値ではあったが、D−アロースを付加したタンパク質の方がTEACが高い値であった。このことはD−アロース付加α-LAは３つのMRPのうち最も良い抗酸化剤であることを示している。また、新たな抗酸化化合物の抗酸化能を予測するためにはTEAC法が適していると考えられた。
【００３９】
〔結論〕 
２つの通常の糖であるD−グルコースとD−フルクトースと比べるとD−アロースはタンパク質のアミノ基との縮合を介した反応において高い共有結合性と早い反応速度を示した。D−アロースを付加したα-LA は高いXTT還元性を有し、高いラジカル消去作用を有していることから強い抗酸化活性を持つことが明らかになった。実験に供した３つの糖とタンパク質から得られるMRP（メイラード反応生成物）のうちD−アロースのものが良い抗酸化剤であることTEAC評価により分かった。抗酸化活性はMRPの蛍光強度の増加に伴い増加し、この蛍光強度は用いた糖と保温時間に依存することも分かった。D−アロースを付加した抗酸化活性の高いタンパク質は食品の機能性素材として働くと考えられるが、その応用に関してはさらに研究を進める必要がある。また、D−アロース付加タンパク質を加水分解して得られるペプチドにも同様な抗酸化活性が認められるかどうかについても今後検討する必要がある。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
D−アロースを付加した抗酸化活性の高いタンパク質は食品の機能性素材として働くと考えられるが、その応用に関してはさらに研究を進める必要がある。また、D−アロース付加タンパク質を加水分解して得られるペプチドにも同様な抗酸化活性が認められるかどうかについても今後検討する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】糖無添加のコントロールα-LAと３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LAにおける遊離アミノ基の保温における変化。保温は50°C、相対湿度55% 、48時間行い、2 mg/mlのタンパク質の遊離アミノ基はOPA法により定量した。すべての測定は少なくとも３つのサンプルを用いてそれぞれ３回行った。
【図２】コントロールサンプルと３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LA のMALDI-TOF質量分析パターン。保温は50°C、相対湿度55% 、24時間行った。ピークに記した数字はα-LA に結合した糖の数である。
【図３】３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LA の蛍光強度。保温は50°C、相対湿度55% 、48時間行った。2 mg/mlのタンパク質を用いて測定を行った。すべての測定は少なくとも３つのサンプルを用いてそれぞれ３回行った。
【図４】３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LA のXTT還元性。保温は50°C、相対湿度55% 、12-48時間行った。5%のタンパク質を用いて測定を行った。すべての測定は少なくとも３つのサンプルを用いてそれぞれ３回行い、平均値±標準偏差(n = 9)を示した。
【図５】３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LA のABTSラジカル消去活性。保温は50°C、相対湿度55% 、12-48時間行った。14 μMのタンパク質を用いて測定を行った。すべての測定は少なくとも３つのサンプルを用いてそれぞれ３回行い、平均値±標準偏差(n = 9)を示した。
【図６】３つの還元糖（D−フルクトース、D−グルコース、D−アロース）を付加したα-LA のTrolox相当抗酸化活性（TEAC）。TEAC値は1分間（A）と6分間（B）測定したもの。保温は50°C、相対湿度55% 、48時間行った。タンパク質試料の濃度はそれぞれ左から7.0、10.5、14.0 μMである。すべての測定は少なくとも３つのサンプルを用いてそれぞれ３回行い、平均値±標準偏差(n = 9)を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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