(57)【要約】【課題】  特殊な保持手段を用いることなく、保持手段上の複数の生体試料のうちから導入物質が導入された生体試料を確実に探し出すことのできる生体試料観察方法及び装置を提供する。【解決手段】  保持手段である観察容器１上に、導入物質の導入を行う細胞２と共に指標部２０を配置し、導入物質の導入を行う細胞２と指標部２０との相対位置を記憶しておき、細胞２への導入物質の導入を行って観察容器１を再度セットし直した後、指標部２０を見つけてその座標を求め、その指標部２０の座標と前記記憶しておいた相対位置とから導入物質が導入された細胞２を探して観察する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
保持手段上に配置された生体試料のうちの任意の生体試料に導入物質を導入し、前記保持手段の配置が変化した後に、前記導入物質が導入された前記生体試料を観察する生体試料観察方法において、
前記保持手段上に指標部を設定する手順と、
前記導入を行う前記生体試料と前記指標部との相対位置を取得して記憶する手順と、
前記保持手段の配置が変化した後、前記指標部の位置を検出し、その求めた指標部の位置と記憶しておいた前記相対位置とを用いることにより、前記導入が行われた前記生体試料の位置を求める手順と、
を含むことを特徴とする生体試料観察方法。
【請求項２】
前記指標部は、前記保持手段上の任意の前記生体試料に対して物理的な操作を行なって形成されることを特徴とする請求項１に記載の生体試料観察方法。
【請求項３】
前記指標部は、前記保持手段上の任意の前記生体試料に対して導入物質を導入して形成されることを特徴とする請求項１に記載の生体試料観察方法。
【請求項４】
前記指標部の形成のために前記生体試料に導入する前記導入物質は、発色物質を含むことを特徴とする請求項３に記載の生体試料観察方法。
【請求項５】
前記発色物質は、前記生体試料に蛍光タンパク質を発現させることが可能な遺伝子を含むことを特徴とする請求項４に記載の生体試料観察方法。
【請求項６】
前記指標部は、前記指標部の形成のために前記導入を行った前記生体試料のうちの、前記導入を行った部分であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の生体試料観察方法。
【請求項７】
前記指標部は、前記導入を行った複数の前記生体試料が周囲に配置された部分の内側であることを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の生体試料観察方法。
【請求項８】
前記指標部は、前記保持手段上の所定の前記生体試料を取り除いて形成されることを特徴とする請求項２に記載の生体試料観察方法。
【請求項９】
前記指標部の形成のために、前記所定の生体試料に対して毒性を持つ物質を導入することにより、前記生体試料にダメージを与えて当該生体試料を除去することを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項１０】
前記所定の生体試料に対して光を照射することにより、当該生体試料を除去することを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項１１】
前記光には、紫外線が含まれていることを特徴とする請求項１０に記載の生体試料観察方法。
【請求項１２】
前記保持手段には、光触媒層が形成されていることを特徴とする請求項１０または請求項１１のいずれかに記載の生体試料観察方法。
【請求項１３】
前記光触媒層は、可視光型光触媒を含むことを特徴とする請求項１２に記載の生体試料観察方法。
【請求項１４】
前記光触媒層は、前記指標部が形成される部分に形成されることを特徴とする請求項１２または請求項１３のいずれかに記載の生体試料観察方法。
【請求項１５】
前記所定の生体試料に対して電圧を印加することにより、前記生体試料にダメージを与えて当該生体試料を除去することを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項１６】
前記生体試料を操作することが可能な導電性の操作手段と、前記保持手段に入れられた溶液とが、互いに相反する電極に夫々接続されると共に、前記所定の生体試料が前記溶液に接触しており、
前記電極により、前記溶液と前記操作手段とを介して、当該生体試料に対して電圧を印加することを特徴とする請求項１５に記載の生体試料観察方法。
【請求項１７】
前記生体試料を操作することが可能な操作手段を操作することにより、所定の前記生体試料を除去することを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項１８】
前記操作手段を操作して前記生体試料内の特定器官を刺すことにより前記生体試料にダメージを与えて当該生体試料を除去することを特徴とする請求項１７に記載の生体試料観察方法。
【請求項１９】
前記指標部は、前記保持手段上の所定の前記生体試料を除去した部分であることを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項２０】
前記指標部は、前記保持手段上において周囲の前記生体試料が除去された、前記生体試料の残存部分であることを特徴とする請求項８に記載の生体試料観察方法。
【請求項２１】
前記指標部は、前記保持手段上に指標物質を置くことによって形成されることを特徴とする請求項１に記載の生体試料観察方法。
【請求項２２】
前記生体試料には細胞が含まれることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の生体試料観察方法。
【請求項２３】
保持手段上に配置された生体試料のうちの任意の生体試料に導入物質を導入し、前記保持手段の配置が変化した後に、前記導入物質が導入された前記生体試料を観察することが可能な生体試料観察装置において、
前記導入が行われた前記生体試料と、前記保持手段上に設定される指標部との相対位置を取得して記憶する記憶手段と、
前記保持手段の配置が変化した後、前記指標部の位置を検出して、その検出した指標部の位置と前記相対位置とを用いることにより、前記導入が行われた前記生体試料の位置を求める位置演算手段と、
を備えることを特徴とする生体試料観察装置。
【請求項２４】
前記位置演算手段によって求めた前記導入が行われた前記生体試料の位置に基づいて、前記生体試料を観察するための観察光学系を、前記導入が行われた前記生体試料を観察することが可能な位置まで移動させることが可能な位置制御手段をさらに備えることを特徴とする請求項２３に記載の生体試料観察装置。
【請求項２５】
前記保持手段上に指標部を形成する指標部形成手段をさらに含むことを特徴とする請求項２３または請求項２４のいずれかに記載の生体試料観察装置。
【請求項２６】
前記生体試料には細胞が含まれることを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれかに記載の生体試料観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、導入針等の導入手段によって細胞等の生体試料内にＤＮＡ等の導入物質を入れ、所定時間の経過後にその物質を導入した生体試料の変化等を調べる生体試料観察方法及び観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞等の生体試料内にＤＮＡ等の物質を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ジーンガン、エレクトロポレーション、ウィルスベクター法等がある。これらの方法は、個々の細胞を選択して細胞内に物質を導入することができない。これに対し、マイクロインジェクション法は、一つ一つの細胞を選択して物質を導入することが可能な方法である。しかし、マイクロインジェクション法は、選択した細胞に物質を導入できるものの、操作の習熟に時間がかかり、また、一つずつの処理となるため、多くの細胞に対して物質を導入することが難しかった。
【０００３】
そこで、マイクロインジェクション法について技術開発が行われている。
例えば、特許文献１には、細胞固定板上に細胞径よりも小さな孔を規則正しく二次元的に配列して、その各孔に細胞を置き、導入物質を導入するための導入針を前記細胞固定板に対して位置制御するようにしたマイクロインジェクション装置が記載されている。
【０００４】
しかし、この装置で採用する細胞観察方法は、専用の細胞固定板に細胞を一つずつ置いてゆくものであるため、ディッシュ等の培養のための一般的な保持手段を用いることができない。このため、導入物質を導入した細胞を通常の細胞培養と同条件下でそのまま培養することが難しく、専用のインキュベータを設ける等の対策をしなければならない。
【０００５】
これに対し、特許文献２に記載されるような生体試料観察方法が案出されている。
この文献に記載されている観察方法は、生体試料群を配置した観察容器等の保持手段を走査ステージの上に設置し、保持手段内の生体試料をカメラによって撮像してその画像をコンピュータに入力し、撮像画像と観察者による操作指示に基づいてコンピュータによって位置データの取り込みや、走査ステージや導入針、観察光学系等の位置制御を行うようになっている。そして、この生体試料観察方法の場合、コンピュータによる位置データの取り込みは、保持手段に予め形成してある基準標線と生体試料の位置データとのセットで行ない、生体試料への物質導入を完了した保持手段を一旦ステージから外して同保持手段を再度ステージに設置したときにも対象の生体試料を容易に見つけられるようになっている。即ち、この生体試料観察方法は、生体試料への物質導入時に保持手段の基準標線と生体試料の位置データとを読み込んでコンピュータに記憶させておき、保持手段を再度設置したときに、基準標線に対する対象の生体試料の相対位置から対象の生体試料の位置を割り出すものである。
【特許文献１】特許第２６２４７１９号公報
【特許文献２】特許第２５５３１５０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、この特許文献２に記載の生体試料観察方法においては、精密に基準標線を記した専用の保持手段（観察容器）を用いる必要があるため、基準標線のない一般的な保持手段をそのまま使用することができない。さらに、基準標線上に生体試料があると、基準標線が見えなくなったり、見え難くなったりする。したがって、このような生体試料観察方法の場合、例え専用の保持手段を使ったとしても、生体試料の播種状態や増殖状態によっては、基準標線の位置データを取り込むことができない場合があり、また、保持手段の変更に対して即座に対応することも困難である。
【０００７】
そこでこの発明は、特殊な保持手段を用いることなく、保持手段上の複数の生体試料のうちの、導入物質が導入された生体試料を確実に探し出すことのできる生体試料観察方法及び観察装置を提供しようとするものである。さらには、生体試料の播種状態や、増殖状態に影響されずに基準となる位置のデータを取り込むことができる生体試料観察方法及び観察装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、この発明は、保持手段上に配置された生体試料のうちの任意の生体試料に導入物質を導入し、前記保持手段の配置が変化した後に、前記導入物質が導入された前記生体試料を観察する生体試料観察方法において、前記保持手段上に指標部を設定する手順と、前記導入を行う前記生体試料と前記指標部との相対位置を取得して記憶する手順と、前記保持手段の配置が変化した後、前記指標部の位置を検出し、その求めた指標部の位置と記憶しておいた前記相対位置とを用いることにより、前記導入が行われた前記生体試料の位置を求める手順と、を含むようにした。
【０００９】
この発明の場合、保持手段上に、導入物質の導入を行う生体試料と共に指標部を配置して、両者の相対位置を記憶しておき、物質導入を完了した保持手段を一旦移動させ、その後に保持手段を再度設置し直したときに現在の指標部の位置と記憶してある相対位置とから導入物質が導入された生体試料を探し出すため、基準標線等のない通常の保持手段であっても、保持手段の再配置後に導入物質の導入された生体試料を確実に見つけることができる。
【００１０】
前記指標部は、保持手段上の任意の前記生体試料に対して物理的な操作を行なって形成することが望ましく、このように生体試料レベルでの物理的な操作によって指標部を形成した場合には、指標部の位置精度を高めることができる。
【００１１】
前記指標部は、例えば、保持手段上の任意の生体試料に対して導入物質を導入することによって形成することができ、このように生体試料への物質の導入によって指標部を形成するようにした場合には、導入物質の導入を行うのと同じ装置で同様に作業を行うことができるため、指標部の形成が容易になる。
【００１２】
前記指標部の形成のために生体試料に導入する導入物質は発色物質を含むことが望ましく、このように発色物質を含む物質を導入するようにした場合には、発色物質を含む物質を導入した生体試料と他の生体試料とを色に違いによって容易に識別することが可能となる。発色物質としては、例えば、生体試料に蛍光を発せられるタンパク質を発現させることが可能な遺伝子を含むもの等を用いることができる。
【００１３】
また、前記指標部は、指標部形成用の物質を導入した生体試料部分のうちの、導入を行った部分であっても、周囲の生体試料に指標部形成用の物質を導入した内側部分であっても良い。
【００１４】
前記指標部は、生体試料に物質を導入するばかりでなく、保持手段上の所定の生体試料を取り除いて形成するようにしても良く、この場合も、基準標線等のない保持手段上に確実に指標部を形成することができる。
【００１５】
生体試料を取り除く方法としては、例えば、保持手段上の所定の生体試料に毒性を持つ物質を導入し、その毒性によって生体試料にダメージを与えて生体試料を除去するようにしても良い。この場合、生体試料に毒性を持つ物質を導入した後には、ダメージを受けた生体試料が観察容器から自然に剥れるため、一つの生体試料に対する操作を１回で済ませることができる。
【００１６】
また、生体試料を取り除く別の方法としては、所定の生体試料に対して光を照射することにより、当該生体試料を除去するようにしても良い。この場合には、生体試料を針で刺すときのように物体を生体試料に直接接触させるものではないため、生体試料を取り除くための操作が非常に簡単になる。
【００１７】
このとき生体試料に照射する光は紫外線を含むものであっても良く、このように紫外線を含む光を用いた場合には、生体試料のＤＮＡに効果的に損傷を与え、より効果的に生体試料にダメージを与えることができる。
【００１８】
また、光を照射して生体試料を取り除く場合、保持手段に予め光触媒層を形成しておくようにしても良い。このようにした場合には、光の照射によって光触媒層の表面が親水性となり、生体試料が容易に剥れるようになる。
【００１９】
前記光触媒層は可視光型光触媒で構成するようにしても良い。このように可視光型光触媒を用いた場合には、周囲の生体試料への紫外線によるダメージを低減させることができる。
【００２０】
また、前記光触媒層は指標部が形成される部分に形成するようにしても良い。このように、指標部が形成される部分に光触媒層を形成した場合には、光を極端に集光することなく、光触媒層の形成部が含まれる範囲に光を照射しさえすれば良いため、対象の生体試料に対する高倍率の集光や高精度な位置合わせが不要となる。また、生体試料の増殖や移動によって指標部となる生体試料の位置がずれても、再度、光を照射することにより指標部を容易に再形成することが可能になる。
【００２１】
生体試料を取り除くさらに別の方法としては、所定の生体試料に対して電圧を印加することにより、生体試料にダメージを与えて当該生体試料を除去するようにしても良い。この場合、電圧を印加するだけで確実に生体試料を取り除くことができる。具体的には、例えば、生体試料を操作することが可能な操作手段を設け、この操作手段と保持手段内の溶液とを互いに相反する電極に夫々接続すると共に、前記所定の生体試料を前記溶液に接触させ、前記操作手段と溶液を介して当該生体試料に電圧を印加するようにしても良い。
【００２２】
生体試料を取り除く別の方法としては、生体試料を操作することが可能な操作手段を操作することにより、所定の前記生体試料を除去するようにしても良い。具体的には、例えば、操作手段を操作して前記生体試料内の特定器官を刺すことにより前記生体試料にダメージを与えて当該生体試料を除去するようにしても良い。この場合も、ダメージを受けた生体試料が保持手段から自然に剥れるため、一つの生体試料に対する操作を一回で済ませることができる。しかも、操作手段の操作で生体試料を取り除くため、生体試料に導入物質を導入するのと同じ装置をそのまま用いることができる。
【００２３】
生体試料を取り除く方法は以上のように何種かあるが、観察容器内に形成する指標部は、生体試料を取り除いた部分であっても、周囲を取り除いた生体試料残存部分であっても良い。
【００２４】
また、前記指標部は、蛍光ビーズや、色素を含んだゲル等の指標物質を保持手段上に置くことによって形成するようにしても良い。この場合、指標物質を保持手段上に置くだけ良いため、指標部の形成が容易になる。
【００２５】
尚、以上の観察方法で扱う生体試料は細胞であっても良い。
【００２６】
前述の方法を実施するための装置の発明は、保持手段上に配置された生体試料のうちの任意の生体試料に導入物質を導入し、前記保持手段の配置が変化した後に、前記導入物質が導入された前記生体試料の位置を求め、その生体試料を観察することが可能な生体試料観察装置において、前記導入が行われた前記生体試料と、前記保持手段上に設定される指標部との相対位置を取得して記憶する記憶手段と、前記保持手段の配置が変化した後、前記指標部の位置を検出して、その検出した指標部の位置と前記相対位置とを用いることにより、前記導入が行われた前記生体試料の位置を求める位置演算手段と、を備えた構成とした。
【００２７】
この発明の装置では、導入物質が導入された生体試料と指標部との相対位置データを記憶手段が記憶し、培養等の後に保持手段を再度配置し直したときに、位置演算手段が現在の指標部の位置と記憶手段から呼び出した相対位置データとから導入物質を導入した生体試料の位置を求める。
【００２８】
また、この装置は、前記位置演算手段によって求めた前記導入が行われた生体試料の位置に基づいて、前記生体試料を観察するための観察光学系を、前記導入が行われた生体試料を観察することが可能な位置まで移動させることが可能な位置制御手段をさらに備えるものであっても良い。この場合、位置演算手段で求めた結果に応じて位置制御手段が観察光学系を移動させるため、観察光学系は観察対象の生体試料の位置に正確に位置合わせされる。
【００２９】
また、この発明の装置は、保持手段上に指標部を形成する指標部形成手段をさらに含むものであっても良く、さらに、扱う生体試料は細胞であっても良い。
【発明の効果】
【００３０】
この発明は、生体試料が配置された保持手段上に指標部を設定し、導入物質の導入を行った生体試料と指標部との相対位置を求めて記憶しておき、保持手段の配置が変化した後には、新たに求めた指標部の位置と、記憶してあった相対位置とから導入物質の導入を行った生体試料の位置を求めるため、特殊な観察容器等を用いることなく、しかも、生体試料の播種状態や増殖状態の影響を受けることなく、導入物質の導入を行った生体試料を確実に探し出すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
次に、この発明の実施形態を図面に基づいて説明する。尚、以下の実施形態では、生体試料の一例として細胞を用いている。
【００３２】
図１は、この発明にかかる生体試料観察装置の概略構成を示すものである。同図において、１は、底部上面に細胞２を播種したディッシュ状の観察容器（この発明における保持手段の一例）であり、この観察容器１は生体試料観察装置の走査ステージ３上にセットされる。走査ステージ３上の観察容器１を配置する位置には図示しない開口部が設けられ、この開口部を通して走査ステージ３の下方側から観察容器１上の細胞２を観察できるようになっている。この細胞２の観察は、走査ステージ３の下方に配置された顕微鏡の対物レンズ４を通して行なわれるが、対物レンズ４は倍率の異なるものがレボルバー５に複数取り付けられており、レボルバー５の回転によって倍率（視野範囲）を適宜換えられるようになっている。
【００３３】
走査ステージ３の上方側には、導入針６を保持するホルダ７が昇降駆動ユニット８と粗動ユニット９を介して配置されている。粗動ユニット９はホルダ７を必要に応じて導入位置と退避位置の間で大きく進退作動させ、昇降駆動ユニット８は細胞２に導入針６を刺すとき等に緻密な制御でホルダ７を昇降作動させる。また、走査ステージ３上には、観察容器１の設置部を取り囲むように針交換ユニット１０と導入物質の保持ユニット１１、さらに洗浄ユニット１２が配置されている。針交換ユニット１０はラック内に複数の交換用の導入針６が配列状に規則正しく配置されており、保持ユニット１１は、夫々異なる導入物質を入れた複数の小容器１３が同様にラック内に配置されている。導入針６は針交換ユニット１０部分で適宜別の交換用の導入針６と交換され、導入物質は保持ユニット１１部分で選択された小容器１３において導入針６に保持される。また、洗浄ユニット１２は、導入針６の先端部を洗浄するためのものであり、例えば、使用した導入針６の先端部から導入物質等を取り除く場合等に用いられる。
【００３４】
また、走査ステージ３は図示しない駆動装置によって水平方向（ＸＹ方向）の任意位置に自由に操作される。この走査ステージ３の駆動装置は、前記ホルダ７の駆動部（粗動ユニット９、及び、昇降駆動ユニット８）と共に走査コントロールユニット１４を介してコンピュータ１５によって制御される。顕微鏡のレボルバー５等は同様に顕微鏡コントロールユニット１６を介してコンビュータ１５によって制御される。また、対物レンズ４を通して観察される観察画像はカメラ１７によって取り込まれ、コンピュータ１５を通してディスプレイ１８に表示されるようになっている。
【００３５】
コンビュータ１５には、生体試料観察装置の各部を制御するプログラムが組み込まれており、そのプログラムによって走査ステージ３や導入針６の位置制御、画像処理による細胞２の座標の割り出し、保存等を実行する。
【００３６】
観察容器１上には、図１，図２に示すように複数の細胞２が群状に密集して配置されている。この群状に密集した細胞２の種類は一種類のもののみであっても、数種類が混在したものであっても良い。そして、観察容器１内の細胞２には目印となる指標部２０が形成される。この実施形態の場合、指標部２０は２ヶ所設けられ、この各指標部２０は細胞２に発色物質等の目印となる物質を導入することによって形成される。発色物質は、例えば、抗体染色薬、標識用蛍光色素、蛍光タンパク質を発現する遺伝子等が採用可能である。また、密集した細胞２内に設ける指標部２０は、図２（Ａ）に示すように指標部２０とすべき細胞２に目印となる物質を導入しても、逆に、図２（Ｂ）に示すように指標部２０とすべき細胞２の周囲の細胞に目印となる物質を導入するようにしても良い。尚、図２中（Ａ），（Ｂ）中、斜線を入れた細胞は目印となる物質を導入したものを示す。
【００３７】
また、指標部２０とする細胞２の数は一つでも良いが、指標部２０を後に見つけ易くするために図２（Ａ），図２（Ｂ）に示すように二つ以上であることが好ましい。さらに、指標部２０とする細胞の種類は一種であっても複数種であっても良い。指標部となる細胞の存在する範囲、または、後に導入物質を導入する細胞の範囲は、少なくとも一つの対物レンズ４を通した観察光学系の視野範囲内に入るように設定することが望ましい。レボルバー５に取り付けられる対物レンズ４の倍率は通常５〜１００倍程度のものが複数種取り付けられるが、前述のように設定することにより、レボルバー５の回転によって選択されるいずれかの対物レンズ４は対象範囲の細胞２を確実にディスプレイ１８上に映し出すことが可能になる。
【００３８】
また、この実施形態の場合、観察容器１上の細胞への目印となる物質の導入は、前述した生体試料観察装置の導入針６で行うようになっており、操作ステージ３上の保持ユニット１１には導入物質と共に発色物質等の目印となる物質が小容器１３に入れて配置されている。
【００３９】
また、細胞内に導入される導入物質は、例えばＤＮＡやその断片等であるが、その導入物質の導入は観察容器１上の指標部２０となる細胞以外の細胞に対して行う。
【００４０】
この生体試料観察装置によって物質導入と観察を行う場合、予め、走査ステージ３上の針交換ユニット１０と保持ユニット１１に夫々必要な導入針６と導入物質を用意しておき、底部上面に細胞２を播種した観察容器１を走査ステージ３上の所定位置に設置する。
【００４１】
次に、この状態で適当な対物レンズ４（例えば、２０倍）を選び、観察容器１上の指標部２０を形成しようとする細胞範囲を視野範囲内に入れる。ここで、指標部２０とする細胞２をコンピュータ１５に指示すると、コンピュータ１５は以下のようにして目印となる物質の導入と指標部２０の座標の取得を行う。
【００４２】
即ち、目印となる物質の導入は、まず、操作ステージ３とホルダ７の位置制御によって針交換ユニット１０上にホルダ７を移動させ、針交換ユニット１０の所定の導入針６をホルダ７に取り付ける。そして、この後にホルダ７を保持ユニット１１上に移動させ、導入針６に発色物質等の目印となる物質を保持させる。この後に、ホルダ７を観察容器１内の目的の細胞２上に移動させ、さらに、ホルダ７を下降させ、導入針６に保持されている発色物質等の物質を細胞２内に導入する。この導入針６による物質の保持と導入は必要回数繰り返される。この実施形態の場合、密集した細胞２上に指標部２０が二箇所設けられるため、観察容器１上の別の細胞エリアに同様の処理が繰り返される。また、このようにして指標部２０が形成されると、その指標部２０の重心座標が画像処理によって取得され、コンピュータ１５の記録保持部に保存される。また、導入針６は次の導入物質の導入に備えて、別の導入針６と交換、若しくは、洗浄ユニット１２にて洗浄される。
【００４３】
次に、観察容器１上の目的とする細胞２に対して導入物質の導入を行うが、この導入物質の導入は基本的に前記の指標部２０を形成するための物質の導入と同様にして行なわれる。つまり、導入物質を導入しようとする細胞２のエリアを視野範囲内に入れ、その状態で導入を行う個々の細胞２をコンピュータ１５に指定すると、コンピュータ１５による制御によって導入針６に所定の導入物質を保持させ、その導入針６によって導入物質を目的とする細胞２内に導入する。この導入物質の導入は対象とする細胞２に必要回数行なわれるが、導入物質を導入する一連の細胞２は予めまとめて指定するようにしても良い。尚、細胞２に導入する導入物質を変更するときには、導入針６を別のものと交換、若しくは、洗浄ユニット１２にて洗浄する。導入針６を交換した場合には、導入針６を戻した針交換ユニット１０内のポジションがコンピュータ１５の記録保持部に保存される。
【００４４】
また、導入物質の導入を行なった細胞２はコンピュータ１５によって画像処理され、その画像処理で取得した各座標はコンピュータ１５の記録保持部に保存される。
【００４５】
導入物質を導入された細胞２は、培養に適した環境に一定時間置く必要があるため、以上のようにして細胞２への導入物質の導入を終えた観察容器１は走査ステージ３から取り外され、インキュベータで保管される。そして、一定時間インキュベータでの培養を終えた観察容器１は観察のために生体試料観察装置の走査ステージ３上に再セットされる。
【００４６】
生体試料観察装置では、この状態から培養前の指標部２０と導入物質を導入した細胞の位置データをコンピュータ１５上で呼び出す一方、指標部２０を観察光学系の視野範囲内に入れ、ディスプレイ１８上にその画像を適切なサイズで映し出す。この作業では、まず観察容器１上の複数の培養細胞２の中から指標部２０を見つけ出す必要があるが、指標部２０の細胞２（図２（Ａ）の場合）、若しくは、その周囲の細胞２（図２（Ｂ）の場合）には発色物質等の目印となる物質が埋め込まれているため、観察者は指標部２０を容易に見つけ出すことができる。
【００４７】
次に、この状態から観察者が指標部２０の座標の取得をコンピュータ１５に指示すると、コンピュータ１５は画像処理によって現在の指標部２０の座標を取得する。この実施形態では、細胞２内に指標部２０を二ヶ所設定しているため、同様にして二ヶ所の指標部２０の座標を取得する。つづいて、コンピュータ１５に保存されている各物質導入細胞２の相対座標データと、現在取得した指標部２０の座標に基づき現在の各物質導入細胞２の座標を演算によって求める。
【００４８】
即ち、コンピュータ１５には、既に培養前の指標部２０と、物質を導入した細胞２の座標が夫々記憶されており、このことは指標部２０に対する物質を導入した細胞２の相対位置が記憶されていることと同じであるため、この段階で現在の指標部２０の座標に物質を導入した細胞２の相対座標を加算することによって物質を導入した細胞２の座標を求めることができる。尚、この実施形態の場合、指標部２０が二ヶ所設定されているため、観察容器１の再セット時に回転方向のずれがあってもこのずれをコンピュータ１５による演算によって修正することができる。しかし、観察容器１の回転方向のずれを無くすことができる場合には、指標部２０は一ヶ所のみであっても良い。
【００４９】
こうして、物質を導入した細胞２の位置がコンピュータ１５によって割り出されると、コンピュータ１５はその各細胞２が観察光学系の光軸上に来るように順次走査ステージ３を位置制御する。これにより物質を導入した細胞２が観察光学系の視野範囲内に入り、その細胞２がディスプレイ１８上に画像として映し出される。この結果、観察者は対象とする細胞の様子を観察することができる。
【００５０】
以上で説明したこの生体試料観察方法は、観察容器１上の任意の細胞内に発色物質等の目印となる物質を埋め込むことによって指標部２０を作り、その指標部２０の座標と導入物質を導入した細胞２の相対位置データを記憶させ、培養後に再度設置し直したときの観察容器１上の実際の指標部２０の座標に、前記相対位置データを加算して導入物質を導入した細胞２の位置を割り出せるようにしたことから、基準標線のある特別な観察容器を用いなくても、再設置後に目的の細胞２を速やかに映像として捉えることができる。したがって、この生体試料観察方法を採用した場合には、既存の観察容器をそのまま用いることもできるため、観察内容の変更等にも即座に対応することができる。
【００５１】
また、この生体試料観察方法では、観察対象の細胞２を個別に分離させずに観察容器１上で培養しているため、細胞間の距離を通常の培養と同じ条件に維持することができる。このため、導入物質を導入した細胞２間の相互作用の影響も観察することが可能となる。
【００５２】
また、観察容器１内の任意の細胞２に発色物質を導入して指標部２０を形成した場合には、色の違いによって細胞を識別できるため、指標部２０の選択や指定がより容易になる。
【００５３】
ここで、この発明の生体試料観察方法の実施に用いた上記の生体試料観察装置の主要構成を記すと以下のようになる。
（ａ）記憶手段
この記憶手段は、培養前の段階において、指標部２０と導入物質が導入された細胞２との相対位置データを記憶する手段であり、主にコンピュータ１５の記憶保持部が担っている。上記の説明では培養前に指標部２０と導入物質を導入した細胞２を夫々コンピュータ１５に記憶するように記載したが、これは後に指標部２０に対する観察対象の細胞２の相対位置として再現できるものであれば、データや保存のかたちはどのようなものであっても良い。
（ｂ）位置演算手段
この位置演算手段は、培養後に観察容器１を走査ステージ３上に再度設置したときの実際の指標部２０の座標と、記憶手段で記憶してある相対位置データとから導入物質を導入した細胞２の座標を演算によって求める手段であり、主にコンピュータ１５の演算部が担っている。
（ｃ）位置制御手段
この位置制御手段は、位置演算手段で求めた座標に基づいて、観察容器１の再設置後に、観察光学系の光軸に対して目的の細胞２を正確な位置に相対移動させる手段であり、コンピュータ１５の制御部と走査ステージ３の駆動部等が主に担っている。
（ｄ）指標部形成手段
この指標部形成手段は、保持手段である観察容器１内に指標部２０を形成する手段であり、導入針６やホルダ７、走査コントロールユニット１４等によって構成されている。
【００５４】
ところで、以上で説明した実施形態は、観察容器１上の任意の細胞に発色物質等の目印となる物質を導入して指標部２０を形成したものであるが、観察容器１上の密集した細胞２の中から幾つかの細胞２を取り除いて指標部２０を形成することも可能である。以下、細胞２を取り除いて指標部２０を形成する幾つかの実施形態について説明する。
【００５５】
まず、一つは、観察容器１上の密集した細胞２の中から幾つかの細胞２を操作手段である針によって任意形状に剥がし、図４（Ａ）に示すように、その剥がした部分を指標部２０としたものである。この場合、剥がす細胞２の数は一つでも良いが、見つけ易さの点等から二個以上であることが好ましい。また、針で取り除く細胞２の種類も一種類であっても良いし、二種類以上であっても良い。
【００５６】
ただし、細胞２を取り除いて指標部２０とする範囲の大きさは、装置の観察光学系の視野範囲内に入り、ディスプレイ１８の画像に映し出せるようにする必要がある。観察光学系の視野は、レボルバー５を回転させることで対物レンズ４の倍率を変えることができるが、いずれかの対物レンズ４を選択したときに、細胞２を取り除いた範囲全体が確実に映し出されるようにする。
【００５７】
そして、針の操作による細胞２の除去は図１に示した細胞観察装置によって行うことができる。つまり、導入物質を導入する導入針６の代わりにホルダ７に操作手段である除去用の針を取り付け、その状態で走査ステージ３を移動させて位置決めした後に、ホルダ７を位置制御することによって針で細胞２を取り除くようにすれば良い。
【００５８】
また、前述した実施形態と同様にコンピュータ１５によって取得される指標部２０の座標は、指標部２０の重心位置の座標とする。
【００５９】
さらに、ここでは観察容器１上の密集した細胞２の中から幾つかの細胞２を針によって任意形状に剥がし、その剥がした部分を指標部２０としたが、図３、及び、図４（Ｂ）に示すように、観察容器１上の密集した細胞２の中からある細胞２の周域細胞を針３０によって剥がし、中心側に残った細胞残存部を指標部２０としても良い。この場合も、中心側に残す細胞２の数は一つでも良いが二個以上であることが望ましい．
【００６０】
また、別の実施形態としては、細胞２を観察容器１から針３０によって直接剥がすのに代え、細胞毒性を示す物質を細胞２内に導入することによってその細胞２にダメージを与え、それによって細胞２を観察容器１から取り除くことも可能である。細胞毒性を示す物質としては、例えば、生体消毒薬（ポビドンヨード製剤、グルコン酸クロルヘキシジン製剤、塩化ベンザルコニウム製剤）、エンドトキシン（リポ多糖体）、界面活性剤等が挙げられる。細胞毒性を示す物質を細胞２内に導入する操作は、図１に示した生体試料観察装置において導入針６に細胞毒性を示す物質を保持させ、ホルダ７の位置制御によってその導入針６を細胞２に刺すようにしても良い。
【００６１】
この実施形態の場合、細胞２に細胞毒性を示す物質を導入して細胞２にダメージを与えるとその細胞２が自然に剥がれるため、一つの細胞２への操作が一回で済むという利点がある。
【００６２】
さらに、別の実施形態としては、細胞２内の核や核小体、ゴルジ体、ミトコンドリアのような特定器官を針によって刺し、それによって細胞２にダメージを与えるようにしても良い。この場合、細胞の特定器官を刺す針は導入物質を導入する導入針６を用いても良いが、それよりも径の太い針を用いて細胞自体を刺すようにしても良い。この場合も、図１に示した生体試料観察装置を使用することができるうえ、細胞２の特定器官を針で刺して細胞２にダメージを与えるとその細胞２が自然に剥がれるため、一つの細胞２への操作が一回で済む。
【００６３】
また、観察容器１内の細胞２を任意形状に取り除く別の方法としては、図５に示すように取り除く細胞２に光３１を集光して照射するようにしても良い。この場合、照射する光３１は紫外線であればさらに有効である。尚、図中３３は、観察容器１内に入れた細胞培養液である。また、図１に示した生体試料観察装置に光３１を照射する機器を設置すれば、細胞２に導入物質を導入する前段階において、同じ装置で観察容器１内に指標部２０を形成することができる。このように光を使う場合には、針を細胞２に直接接触させる場合に比較して煩雑な操作が不要となるという利点がある。
【００６４】
ガラス等の表面に酸化チタンのような光触媒があると照明光にわずかに含まれる紫外線によって、酸化還元反応が生じ、ガラス等の表面の有機物が分解され親水性となる。したがって、この原理を利用し、図６に示すように観察容器１の底部上面に予め酸化チタン等の光触媒３２を塗布しておき、その上に細胞２を配置した後に、密集した細胞２のうちの指標部２０を形成する位置に紫外線を含む光３１を照射するようにしても良い。この場合には、観察容器１上の光３１を照射した部分が親水性となり、その結果、細胞２が接着している部分に培養液が３３がしみ込み、細胞２が剥れることとなる。尚、可視光型の光触媒を用いた場合には、紫外線を用いなくても良いため、紫外線照射のための特別な光源が必要でないうえ、紫外線による周囲の細胞のダメージを無くすことができる。
【００６５】
また、前記の光触媒３２は、図７に示すように観察容器１上の指標部２０とする位置にだけ、スポット的に塗布するようにしても良い。この場合、指標部２０となるエリアが含まれるようにしさえすれば、図７に示すように大きく集光することなく広範囲の細胞２に光３１を照射することが可能になる。したがって、高倍率の集光や照射位置の高精度な位置合わせが不要となるため、設備の簡素化と作業の容易化が可能となる。また、細胞２の増殖や移動によって指標部２０となる細胞２の位置がずれても、再度、光３１を照射することにより指標部２０を容易に再形成することが可能になる。
【００６６】
また、観察容器１内の細胞２を任意形状に取り除くさらに別の方法としては、図８に示すように電源３５の相反する電極に接続された導電性の針３６（操作手段）と電極棒３７を設け、電極棒３７を観察容器１内の細胞培養液３３に接続した状態で、導電性の針３６を指標部となるエリアの細胞２に接触、若しくは、近接させ、或いは、挿通して、針３６と細胞培養液３３の間に電圧を印加するようにしても良い。この場合、針３６を通して細胞２に電圧を印加すると、その細胞２の細胞膜に損傷が生じ、そうしてダメージを受けた細胞２が観察容器１上から取り除かれる。
【００６７】
この電圧の印加によって細胞２を取り除く方法を採用する場合も、図１に示した生体試料観察装置を用いることができる。つまり，電圧を印加する針３６を装置のホルダ７に取り付け、ホルダ７の位置制御によって針３６を目標細胞２に接触、近接、若しくは、刺すことができる。
【００６８】
以上では、観察容器１上の細胞２を取り除いて指標部２０を形成する幾つかの実施形態を説明したが、これらは細胞２を取り除いた部分を指標部２０とするばかりでなく、逆に周囲の細胞２を取り除いて中心部の残った細胞２を指標部２０とすることも可能である。
【００６９】
このように観察容器１内の細胞２を取り除いて指標部２０を形成する場合にも、発色物質のような目印となる物質を細胞２に埋め込む場合と同様、基準標線のない通常の観察容器１を用いて導入物質を導入した細胞２を確実に見つけ出すことができる。したがって、この実施形態の場合も種々の観察に即座に対応することができる。
【００７０】
以上説明した実施形態は、観察容器１内の細胞２に発色物質のような目印となる物質を導入し、或いは、一部の細胞２を観察容器１から剥がして目印としたが、図９に示すように観察容器１内の密集した細胞２の群の中に、蛍光ビーズや、色素を含んだゲル等の指標物質４０を置いて指標部２０とするようにしても良い。
【００７１】
このように細胞２の群内に指標物質４０を置く場合には、図１に示す装置の走査ステージ３上の保持ユニット１１に指標物質４０を小容器１３に入れて配置しておき、前述の発色物質を導入する実施形態と同様に導入針６に指標物質４０を保持させ、その導入針６によって細胞２の群内に指標物質４０を置くようにしても良い。この場合も、指標物質４０を置いて形成する指標部２０は一ヶ所であっても良いが、二ヶ所以上設定しても良い。こうして、細胞２の群の中に設定された指標部２０は前述した実施形態と同様に画像処理によって座標を割り出し、コンピュータ１５の記録保持部に保存される。
【００７２】
この実施形態の場合も、前述の実施形態と同様にして所定の細胞２に導入物質の導入を行い、その導入を行った細胞２の座標を指標部２０の座標と共にコンピュータ１５に保存し、細胞培養後に観察容器１を再セットしたときに、導入物質を導入した細胞２を探し出すのに用いる。この細胞２を探し出す工程は前述の実施形態と同様であるためここでは説明は省略する。
【００７３】
この実施形態では、観察容器１内の細胞２の群の中に指標物質４０を置いて指標部２０を形成したが、前述した他の実施形態と同様に基準標線のある特別な観察容器を必要としないため、通常の細胞培養と同様の観察容器１を用いて種々の観察に即座に対応することができる。そして、指標物質４０として発色物質を用いた場合には、指標部２０を多くの細胞２の中から認識し易くなる。
【００７４】
尚、以上で説明した実施形態においては、生体試料の一例として細胞を用いたが、この発明にかかる観察方法と観察装置で扱う生体試料は細胞に限らず、例えば、細菌類や微生物、卵等であっても良い。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】この発明の一実施形態を示す生体試料観察装置の概略構成図。
【図２】同実施形態を示す観察容器内の細胞の模式的な平面図（Ａ），（Ｂ）。
【図３】この発明の他の実施形態を示すものであり、指標部の形成工程を示す模式的な斜視図。
【図４】同実施形態を示す観察容器内の細胞の模式的な斜視図（Ａ），（Ｂ）。
【図５】この発明の他の実施形態を示す模式的な側面図。
【図６】この発明の他の実施形態を示す模式的な側面図。
【図７】この発明の他の実施形態を示す模式的な側面図。
【図８】この発明の他の実施形態を示す模式的な側面図。
【図９】この発明の他の実施形態を示す模式的な側面図。
【符号の説明】
【００７６】
１  観察容器
２  細胞
６  導入針
２０  指標部
３０  針（操作手段）
３１  光
３２  光触媒
３３  細胞培養液（溶液）
３６  導電性の針
４０  指標物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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