(57)【要約】【課題】  ドラックデリバリー担体、遺伝子導入用担体、診断薬用担体に用いられる生分解性、液晶性、自己組織性を有するポリリジン誘導体及び、親水性ポリリジンへ疎水性基を容易に導入する製造方法の提供。【解決手段】  ステロイド骨格を導入したポリリジン。陰イオン界面活性剤とポリリジンの複合体を有機溶媒中で反応させることを特徴とするポリリジン誘導体の製造方法。【選択図】       なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド骨格を導入したポリリジン。
【請求項２】
陰イオン界面活性剤とポリリジンの複合体を有機溶媒中で反応させることを特徴とするポリリジン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドラックデリバリー担体、遺伝子導入用担体、診断薬用担体に用いられる生分解性、液晶性、自己組織性を有するポリリジン誘導体及び、親水性ポリリジンへ疎水性基を容易に導入する製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）には、高分子の微粒子を応用する研究が盛んに行われている。ポリＮ−ビニル化合物をグラフト鎖とするグラフトポリマーの微粒子によるＤＤＳの記載がある（例えば、特許文献１参照。）。また、ポリアクリル酸もしくはそのエステル、またはポリメタクリル酸もしくはそのエステルをグラフト鎖とするグラフトポリマーの微粒子によるＤＤＳの記載がある（例えば、特許文献２参照。）。
これ等のものは、水溶性マクロモノマーと疎水性マクロモノマーを分散重合させることにより、表面に水溶性マクロモノマーが局在し内部に疎水性マクロモノマーが局在するナノパーティクルとなる。しかしこれらの合成高分子は生分解性に乏しい問題があった。
【０００３】
液晶は液体でありながら異方性を有する興味深い材料であるが、生分解性、生体適合性となどの見地からの研究は殆どされていない。一方、両親媒性高分子の自己組織化は、ドラックキャリヤーや遺伝子担体導入への応用が期待されている。液晶性微粒はその構造転換によりドラックリリースが可能となる新規のキャリヤーとなる可能性がある。
両親媒性を駆動力とした自己組織化としては、プルランにコレステロールを導入したものが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。このプルランのコレステロール部分修飾体は２０から３０ｎｍのナノ粒子を形成し、粒子内部にタンパク質を含有することが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
一方、ポリスチレンとポリアクリル酸からなる重合体も自己組織化することがＥｉｓｅｎｂｅｒｇ等によって発表されている（例えば、非特許文献３参照。）。この様な親水性セグメントと疎水性セグメントをもつ高分子の自己組織化微粒子の発明がある（例えば、特許文献３参照。）。この発明では、疎水性セグメントとして生体内分解性ポリマーを親水性ポリマーとしてポリアミノ酸であるブロックコポリマーを調製し、徐放性に優れた薬物担体になると記載されている。
【０００５】
静電相互作用による自己組織化としてはα-ポリリジンのポリエチレングリコール修飾体とポリアスパラギン酸のポリエチレングリコール修飾体からなる微粒子の報告がある（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００６】
【特許文献１】特開平８−２６８９１６号公報
【特許文献２】特開平９−８７２０４号公報
【特許文献３】特願平１１-１０３４２号公報
【非特許文献１】K,Akiyoshi et al. Chem.lett,9,1727(1992)
【非特許文献２】http://www.nof.co.jp
【非特許文献３】Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ等,Science,268,1728(2000)
【非特許文献４】K,Kataoka等,Science,283,65(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前述した静電相互作用による自己組織化では、最低限カチオン性高分子とアニオン性高分子の２種類が必要であり合成経路が煩雑である点や、形成される粒子がイオン強度やｐＨの影響を大きく受ける可能性がある。
ブロックコポリマーの両親媒性による粒子は、親水性モノマーと疎水性モノマーの重合が困難であり工業的レベルでの製造に課題が残る。特に特願平１１-１０３４２では生分解性ポリマーとポリアミノ酸の両方を有機合成的に製造することが必要であり製造方法が多段になっている点が問題である。
プルランのコレステロール修飾体はタンパク質の保持力として疎水性相互作用しかなく、イオン性物質を効果的に保持する能力が不足している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、イプシロンポリリジンにステロイド骨格を導入することにより良好な自己組織化能力の発現と液晶の形成を確認した。また陰イオン界面活性剤を共存させ疎水性基を効率的に導入する方法を見出し本発明に到達した。
【０００９】
本発明は下記の構成からなる。
（１）ステロイド骨格を導入したポリリジン。
（２）陰イオン界面活性剤とポリリジンの複合体を有機溶媒中で反応させることを特徴とするポリリジン誘導体の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
ポリリジンにステロイド骨格を導入した物質は、液晶性を示すことと、自己組織形成能があることが確認された。
この物質は、それ自体でナノ粒子を形成する点で静電相互作用によるナノ粒子よりも容易に調製することが可能である。また、ブロックコポリマーのように複雑な反応によらず製造でき、構造制御も容易である。
プルランとコレステロールの誘導体に比べて、イオン交換基を持つことから、疎水性相互作用だけでなく静電的相互作用による強い吸着力をもつためより幅広い範囲の物質を保持できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のステロイド骨格を導入したポリリジンは、ポリリジンのアミノ基に共有結合を介してステロイド骨格が導入されたものである。
【００１２】
本発明で使用されるポリリジンは、ポリリジンの鎖状ポリマーであり、α-ポリリジン、ε-ポリリジン、α、εのミックスされたポリリジンで構わない。ε-ポリリジンは、発酵生産により製造され化学合成品よりも安価である点、食品添加剤として長年使用されており安全性が高い点などから最も好ましく使用できる。
【００１３】
本発明で使用されるステロイド骨格を有する化合物としては、コレステロール、ジオスゲニン、胆汁酸類があげられるが、経済性の観点と疎水性の強さの観点からコレステロールが好ましく使用できる。
【００１４】
本願第２の発明は、陰イオン界面活性剤とポリリジンの複合体を有機溶媒中で反応させることを特徴とするポリリジン誘導体の製造方法である。
【００１５】
本発明で用いられる陰イオン界面活性剤は、炭化水素のスルホン酸誘導体が使用できるが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）が好ましく使用できる。
【００１６】
本発明で使用される有機溶媒としては、クロロホルム、４塩化炭素、メチレンクロライドなどのハロゲン化炭化水素類、ジオキサン、ジエチルエーテルなどのエーテル類、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキサイドなどが使用可能であるが、特にDMFは本発明で好ましく使用できる。
【実施例１】
【００１７】
１．合成方法 
ＤＭＦ中でポリリジンのＳＤＳの複合体1.84  Unit mmolとコハク酸コレステロールエステル（ＣＨＳ）1.84mmolにN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）0.181mmol及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールモノハイドレイト（ＨＯＢｔ）1.84mmolを２４時間、８０℃で反応させた。反応により生じた沈殿物を濾過により回収し、クロロホルムに溶解させた。このクロロホルム溶液に蒸留水を加え２相系溶液とした。この溶液を分液漏斗に注ぎ、乳濁状になるまで激しく振り静置した。再び完全に２相に分離した状態で、クロロホルム相のみを取り出し、減圧により濃縮し、アセトン中に再沈澱させた。形成した沈殿物は遠心分離により回収し、減圧乾燥した。以上の工程でポリリジンのコレステロール修飾物を得た。
【実施例２】
【００１８】
ＤＣＣ量を0.918mmolに変えたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。
【実施例３】
【００１９】
ＤＣＣ量を1.840mmolに変えたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。
【実施例４】
【００２０】
ＤＣＣ量を9.180mmolに変えたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。
【実施例５】
【００２１】
ＤＣＣ量を18.40mmolに変えたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。
【実施例６】
【００２２】
ＤＣＣ量を36.70mmolに変えたこと以外は実施例１と同様の操作を行った。なお、実施例１〜６の一覧を表１に示した。
【００２３】
【表１】
2005139129.tif 000002
【００２４】
２．測定方法
赤外吸収スペクトル（ＩＲスペクトル）
赤外吸収スペクトルはパーキンエルマー社製のSpectrum One FT-IR spectrometerを用いて、ATR法により直接測定した。
図１に実施例６と原料のＩＲスペクトルを示した。実施例６のスペクトルはＣＨＳ由来のエステル（Ｃ＝Ｏ）とポリリジン由来のアミドＩ、IIが観察された。
【００２５】
プロトンＮＭＲ
2005139129.tif 000003
図２に実施例６と原料のプロトンＮＭＲを示した。実施例６のＮＭＲスペクトルに、ポリリジンのα炭素のプロトンはαアミノ基が置換されたピークと置換されていないピークの２種類が観察された。
【００２６】
溶解性の試験
各種の溶媒に各実施例のサンプルを加えて溶解性を確認した。評価は目視でおこない、溶解（+）、不溶（-）、分散（+-）の３状態を観察した。表２にその結果を示した。
【００２７】
【表２】
2005139129.tif 000004
【００２８】
偏光顕微鏡観察による液晶性の確認
液晶性の確認は、試料を２枚のガラス板に挟み込み、ホットステージにより毎分１０℃の昇温速度で加熱しながら、olympus社製の生物顕微鏡を用いて直交偏光子下で行った。
図３に実施例６について調査した偏向写真をしめした。２２０℃でスメクチックＡ相に起因するファンシェープ模様が観察された。
【００２９】
小角Ｘ線回折によるスメクチック厚の測定
小角Ｘ線回折測定はRIGAKU社製のローター式Ｘ線発生装置を用いて、200mA,40kVの加速電力で加速した電子を銅に当てることにより発生するKα線を多重ミラー型のモノクロメータで単色化することにより得られたＸ線を試料に照射し、散乱されるＸ線をゴニオメータで回折角スキャンすることにより検出することで行った。
図４に実施例６のスメクチック相の厚さを測定した結果を示した。実施例６の相の厚さは５０Åと測定され、ＣＨＳの２７．９Åとは明らかに違うことが解った。
【００３０】
自己組織化挙動の観察
10mgの試料を１mlのテトラヒドロフランに溶解し、この溶液に1mlの蒸留水を少しずつ滴下し、乳濁液を得た。この乳濁液を遠心分離して、上澄み液を除去した後、蒸留水を加え、超音波を照射し、再び乳濁液を得た。この乳濁液を再び遠心分離して、上澄み液を除去した後、蒸留水を加え、超音波を照射し、再び乳濁液を得た。乳濁液をSEM用ステージに載せ減圧乾燥し、金をスパッタリングした後、HITACHI S-4100H SEMを用いて、SEM観察を行った。
乳濁液をコロジオンコートした銅メッシュの上に載せ、減圧乾燥した後、Hitachi H-700Hを用いて、TEM観察を行った。
図５に実施例６から調製したＳＥＭ、ＴＥＭの顕微鏡写真を示した。自己組織化による粒子構造が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ポリリジンのコレステロール修飾体のＩＲスペクトルである。
【図２】ポリリジンのコレステロール修飾体のプロトンＮＭＲスペクトルである。
【図３】ポリリジンのコレステロール修飾体の偏向顕微鏡観察による液晶性を示す写真である。
【図４】ポリリジンのコレステロール修飾体の小角Ｘ回折測定を示したものである。
【図５】ポリリジンのコレステロール修飾体の自己組織化物の（ａ）ＴＥＭ、（ｂ）ＳＥＭの顕微鏡写真である。
【図１】
2005139129.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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