(57)【要約】【課題】  膜タンパク質を脂質二重膜に再構成させた状態で、リガンド分子との相互作用を非標識で精度高く解析するための、簡便で汎用性の高い方法を提供する。【解決手段】  膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を解析するための方法であって、リガンド分子を含有する泳動バッファー溶液をキャピラリーに充填し、中性マーカーをキャピラリーに注入した後、さらに、脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質をキャピラリーに注入し、キャピラリー電気泳動を行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を解析するための方法であって、リガンド分子を含有する泳動バッファー溶液をキャピラリーに充填し、中性マーカーをキャピラリーに注入した後、さらに、脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質をキャピラリーに注入し、キャピラリー電気泳動を行うことを特徴とする膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法。
【請求項２】
中性マーカーのキャピラリーへの注入後、緩衝ゾーンを設け、続いて脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質をキャピラリーに注入してキャピラリー電気泳動を行う請求項１の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法。
【請求項３】
泳動バッファー溶液は、3-（N-モルホリノ）-プロパンスルホン酸とする請求項１または２のいずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法。
【請求項４】
キャピラリーは、内表面をアクリルアミドゲルでコーティングして用いる請求項１ないし３のいずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法。
【請求項５】
脂質二重膜として、リポソームを用いる請求項１ないし４のいずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を検出、解析するための方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、アフィニティーキャピラリー電気泳動により、膜に再構成された膜タンパク質とリガンド分子との相互作用を検出、解析する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特定の物質による中毒やアレルギー症状は、生物活性物質と生体内標的分子の相互作用によって引き起こされることが知られている。一般に、生物活性物質は、標的細胞の膜タンパク質に結合することにより細胞膜中に濃縮され、次いで細胞膜中で標的分子に結合し、複合体として生物活性を発現する（文献１）。したがって、生物活性物質の作用機序を本質的に理解するためには、（ａ）生物活性物質の膜中への濃縮段階、（ｂ）膜中での標的分子への結合段階、（ｃ）形成される複合体による活性発現段階、の３段階について各々検討する必要がある。
【０００３】
とくに生物活性物質の膜タンパク質に対する相互作用を解析することができれば、生体内における中毒症状やアレルギー症状の発現機構の解明、各種予防薬や治療薬の開発等に向けた重要な知見が得られるものと期待される。
【０００４】
これまでに、紫外可視吸収スペクトルや円二色性スペクトル等の分光学的データからタンパク質の立体構造を明らかにし、それらをもとに分子間相互作用を解析する方法が検討されている（文献１）。しかし、このような分光学的手法では、バックグラウンドを低減させるために夾雑物を除去する必要があり、標的タンパク質の供給量や純度が問題となる場合があった。また、精製された標的タンパク質を使用するため、膜に再構成された状態での膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を精度高く評価することはできなかった。
【０００５】
そこで、例えば、遺伝子工学的技術により膜タンパク質を細胞膜表面に発現させて用いる例が報告されているが、糖タンパク質のように翻訳語の修飾が活性に大きく寄与する場合もあるため、操作が複雑となり、汎用性も低いという問題があった。
【０００６】
また、放射性同位体を用いて膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を観測する方法も研究されているが、放射性同位体の維持管理に特殊な施設を要する、廃棄物処理に多額の費用と手間を必要とする、人体や環境に与える影響が完全に理解されていない等の問題があった（文献２）。
【非特許文献１】Maarten, P.H. et al. Biochemistry 1975, 14, 2962-2968
【非特許文献２】Ritchie, J.M. et al. J. Physiol. 1976, 261, 477-494
【非特許文献３】本田  進、寺部  茂／編「キャピラリー電気泳動の基礎と実際」講談社サイエンティフィク（1998）
【非特許文献４】Duffy, D.F. et al. Anal. Chem 2001, 73, 1855-1861
【非特許文献５】Avila, C.F. et al. Anal. Biochem. 2000, 277, 196-205
【非特許文献６】Try, A.C. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1997, 2911-2917
【非特許文献７】Cho, Y.R. et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 5229-5232
【非特許文献８】Hjerten, S. J. Chromatogr. 1985, 347, 191-198
【非特許文献９】Chu, Y.H. et al. J. Org. Chem. 1992, 57, 3524-3525
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
膜タンパク質を単独で用いる評価系では、実際の細胞における現象が再現されず、また、天然物誘導体や合成中間体等の生物活性物質の中には、膜タンパク質との相互作用発現能が低いものもあるため、このようなリガンド分子についても膜タンパク質との相互作用を精度高く評価できる新たな方法が望まれていた。
【０００８】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、膜タンパク質を脂質二重膜に再構成させた状態で、リガンド分子との相互作用を非標識で精度高く解析するための簡便で汎用性の高い方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、膜タンパク質とリガンド分子の相互作用を解析するための方法であって、リガンド分子を含有する泳動バッファー溶液をキャピラリーに充填し、中性マーカーをキャピラリーに注入した後、さらに、脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質をキャピラリーに注入し、キャピラリー電気泳動を行うことを特徴とする膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法を提供する。
【００１０】
この出願の発明は、第２には、中性マーカーのキャピラリーへの注入後、緩衝ゾーンを設け、続いて脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質をキャピラリーに注入してキャピラリー電気泳動を行う前記の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法を提供する。
【００１１】
さらに、この出願の発明は、第３には、泳動バッファー溶液を、3-（モルホリノ）-プロパンスルホン酸とする前記いずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法を、また、第４には、キャピラリーを、内表面をアクリルアミドゲルでコーティングされたものとする前記いずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法を提供する。
【００１２】
そして、この出願の発明は、第５には、脂質二重膜として、リポソームを用いる前記いずれかの膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
膜タンパク質を脂質二重膜に再構成させた状態で、リガンド分子との相互作用を精度高く解析するための簡便で汎用性の高い方法が提供される
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
キャピラリー電気泳動は、中空のキャピラリー中に満たした緩衝液に電位差を与えて生じる電気浸透流と、試料物質の総電荷に依存する電気泳動度によって試料の分離、分析を可能にする方法であり、とくにイオン性の物質に対しては、特徴的な分離能を示すことが知られている。キャピラリー電気泳動では、分子の固定化、標識化を行うことなく分子間相互作用を観測できることから、とくに近年注目を集めている。
【００１５】
タンパク質は、特定のpH領域においてイオン性を示すことから、キャピラリー電気泳動による分離、解析に適した試料といえる。また、キャピラリー電気泳動では、紫外吸収および／または蛍光により物質を検出することから、最適条件下では10-12Mの希薄なアミノ酸濃度でも検出が可能であるとの報告もあり（文献３）、生体物質のように大量の試料の供給が困難な場合でも精度高い検出が期待できる。
【００１６】
これまでに、キャピラリー電気泳動を用いてリポソームの検出を行った報告はあるものの（文献４）、キャピラリー電気泳動により脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質とリガンド分子との相互作用を解析した例は、報告されていない。
【００１７】
この出願の発明者らは、このようなキャピラリー電気泳動の特徴を生かし、自由溶液中、生体内に近い系で膜タンパク質とリガンド分子との相互作用を精度高く解析する方法を構築すべく鋭意研究を行った。そして、リガンド分子を含有する泳動バッファー溶液をキャピラリーに充填し、中性マーカーをキャピラリーに注入した後、脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質を注入してキャピラリー電気泳動を行うことにより、任意の膜タンパク質に対するリガンド分子の相互作用の有無を精度高く検出したり、結合定数を解析したりできることを見出し、この出願の発明に至ったものである。
【００１８】
この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法では、まず、泳動バッファー溶液にリガンド分子を添加し、これをキャピラリーに充填する。このとき、泳動バッファーは膜タンパク質をイオン性とするために適当なpH範囲に調整されたものであればよく、とくに限定されない。具体的には、リン酸バッファー、DTT（ジチオトレイトール）、TCA（トリクロロ酢酸）、TBE（Tris、ホウ酸、EDTA）、TAE（Tris、EDTA、氷酢酸）、MOPS（4-モルホリンプロパンスルホン酸）等の一般に入手や扱いが容易なものが例示される。この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法では、測定試料として脂質二重膜に再構成されたタンパク質を用いるが、脂質二重膜は中性付近で大きな電荷を有するため、泳動バッファーは、正確なpH調整が可能なものを選択することが望ましい。したがって、上に例示した各種の泳動バッファーの中でも、MOPSが好ましい。
【００１９】
また、泳動バッファー中のリガンド分子の濃度は、とくに限定されない。特定のリガンド分子が各種の膜タンパク質に対してどのように相互作用するかについて検討する場合には、一定濃度のリガンド分子溶液を用いればよく、特定のリガンド分子と膜タンパク質の結合定数を解析する場合には、各濃度（例えば0〜100μM）のリガンド分子溶液を準備し、各リガンド分子濃度におけるキャピラリー電気泳動を行えばよい。
【００２０】
さらに、この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法において使用される中性マーカーは、電気浸透流の大きさを測定するためのものであり、イオン性や電荷を有さない物質であればよく、とくに限定されない。具体的には、メシチルオキシド（(CH3)2C=CHCOCH3）、ｐ−メトキシベンジルアルコール等が例示される。中でも分子量がより小さく他の分子と非特異的相互作用の少ないメシチルオキシドが好ましい。
【００２１】
この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法では、リガンド分子を含有する泳動バッファーをキャピラリーに充填し、そのキャピラリーに中性マーカーを適量注入した後、さらに測定試料として脂質二重膜に再構成させた膜タンパク質を注入して電気泳動を行うが、中性マーカーと測定試料は、連続して注入してもよいし、中性マーカー注入直後に短時間の電気泳動を行い、次いで測定試料を注入してもよい。前者の場合には、中性マーカーゾーンと測定試料ゾーンは隣接することになり、後者の場合には、中性マーカーゾーンと測定試料ゾーンの間に緩衝ゾーンが設けられる。例えば、中性マーカーが測定試料中の物質（膜タンパク質または脂質二重膜成分）と相互作用する場合には、目的とする膜タンパク質とリガンド分子の相互作用について正確な測定結果が得られ難くなるため、緩衝ゾーンを設けることが望ましい。これにより、目的とする膜タンパク質−リガンド分子相互作用以外の相互作用による測定誤差を解消することが可能となる。
【００２２】
この出願の発明の解析方法は、脂質二重膜に再構成された膜タンパク質に対するリガンド分子の相互作用を検出、解析できるものであるが、膜タンパク質を再構成する脂質二重膜としては、天然由来のものや、細胞膜モデルとして用いられるリン脂質二重膜小胞（リポソーム）、もしくはリン脂質と界面活性剤をある一定の比で混合する円盤状ミセル（バイセル）が適用できる。とくに、リポソームは、調製が容易な上、膜の内側と外側が存在するため、より生体膜モデルに近く、構造や組成が明確なことから、電気泳動結果の解析が簡便となり好ましい。膜タンパク質のリポソームへの再構成は、例えば、ホスファチジルコリンと膜タンパク質成分を混合し、溶媒を除去した後泳動バッファーを加え、凍結融解およびエクストルーダーにより行うことができる。
【００２３】
この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法は、泳動バッファー、中性マーカー、泳動条件等を適宜選択することにより、各種の膜タンパク質とリガンド分子の組み合わせについて適用できるものである。膜タンパク質は、その活性部位にアルキル鎖を結合することにより、リポソームに再構成できるようになる。一方、リガンド分子は、水溶性でありイオン性を示す分子であればどのようなものでもよい。脂質二重膜に対する膜タンパク質の濃度はとくに限定されないが、例えば、0.1〜20wt%程度とすることができる。また、リガンド分子の濃度については、前記のとおりである。
【００２４】
なお、以上のとおりのこの出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法において、電気泳動の結果からタンパク質とリガンド分子の結合定数を算出する方法は、以下のとおりである。
【００２５】
キャピラリー電気泳動において、溶融シリカキャピラリー中に注入された試料は固有の電荷と分子量に応じた静電的引力を受けて対極へ引き寄せられる。その静電的引力によって生じる電気泳動移動度（μ）は、電気的に中性の試料のピーク出現時間（t0）と、試料のピーク出現時間（t）によって定められ、次のような式で示される。
【００２６】
μ＝L×l×（1/t−1/t0）／V
（ただし、Lはキャピラリーの全長、lは注入口から検出器までの長さ、Vは印加電圧を表す）
各々が固有の分子量と電荷を有するリガンドとレセプターが系内に存在するとき、それらは、分子間に固有な結合定数に従って複合体を形成する。キャピラリー中の物質は、前記のとおり、電気浸透流存在下では分子量に基づく泳動抵抗と静電引力によって移動することから、複合体はリガンド、レセプターのいずれとも異なる独自の移動度を有することになる。
【００２７】
リガンドをリガンド分子、レセプターを膜タンパク質とするとき、膜タンパク質の移動度（μP）およびリガンド分子の移動度（μL）ならびに膜タンパク質−リガンド分子複合体の移動度（μC）はそれぞれ次のように表される。
【００２８】
μP＝CZ／M2/3
μL＝Lz／m2/3
μC＝C(Z±z)／(M＋m)2/3
（ただし、CおよびLは移動度定数を示し、Mおよびmは各々膜タンパク質およびリガンド分子の重量、Zおよびzは各々膜タンパク質およびリガンド分子の電荷を示す）
一方、一般に結合定数（Kb）は次のように表される（文献５）。
【００２９】
Kb＝[P・L]／[P][L]
（ただし、[P]は膜タンパク質の濃度、[L]はリガンド分子の濃度、[P・L]は膜タンパク質−リガンド分子の複合体の濃度を表す）
タンパク質は特定のpH範囲でイオン性を示すことから、中性マーカーとは異なった移動度を示し、次のようにΔtが定義される。
【００３０】
Δt＝tP−tM
（ただし、tPは膜タンパク質の移動時間、tMは中性マーカーの移動時間を示す）
また、膜タンパク質はリガンド分子存在下において膜タンパク質−リガンド分子複合体を形成し、それぞれ異なった移動度をもつことから、δ△tLが定義される。
【００３１】
δ△tL＝△tL−△tL=0
（ただし、△tLはリガンド濃度Lにおける膜タンパク質−リガンド分子複合体の△tを表し、ΔtL=0は膜タンパク質−リガンド分子複合体の△tを表す）
ここで、Rfを次のように定める。
【００３２】
Rf＝δ△tL／δ△tLmax
＝[P・L]／([P]＋[P・L])
（ただし、δ△tLmaxはδ△tLの最大値を表す）
整理すると、
Rf＝Kb[P][L]／([P]＋Kb[P][L])
＝Kb[L]／(1＋Kb[L])
展開すると
Rf／[L]＝Kb−KbRf
(δ△tL/δΔLmax)／[L]＝Kb−Kb(δ△tL／δ△tLmax）
δ△tL/[L]＝Kb×δ△tLmax−Kb×δ△tL
が得られる。
【００３３】
したがって、この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法では、電気泳動により得られるδ△tLを横軸に、δ△tL/[L]を縦軸にプロットすれば、その傾きから膜タンパク質とリガンド分子の結合定数を求めることができる。
【００３４】
以下、実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例１】
【００３５】
〔モデル系の構築〕
以下の実施例では、リガンド分子として、抗生物質として知られているグリコペプチド系抗生物質バンコマイシン（1）を、膜タンパク質のモデルとして、バンコマイシン（1）と相互作用する細胞壁生合成前駆体モデルペプチド（2）を用いた。
【００３６】
【化１】
2005043284.tif 000002
バンコマイシン（1）はグラム陽性菌に強力に作用する抗生物質として知られており、細胞壁の主成分であるペプチドグリカンの生合成を阻害することで抗菌活性を発現するものとされている。また、D-Ala-D-AlaをC末端に含むようなペプチドがバンコマイシン（1）と相互作用することにより活性が発現されることが明らかになっており、3残基および4残基のペプチド鎖についてはその結合定数も見積もられている（文献６）。また、モデルペプチド（2）は、アミノ酸6残基とN末端にアシル基を有することによりミセル系に再構成出来ることが報告されている。
〔機器〕
以下の実施例においては、次の機器を使用した。
キャピラリー電気泳動装置：P/ACE MDQ（BeckmanCoulter）
HPLCシステム
ポンプ：JASCO PU980（日本分光）
UV吸収検出器：JASCO UV970（日本分光）
MALDI−MS：KOMPACT MALDI4（島津製作所）
紫外可視分光光度計：JASCO V550（日本分光）
超純水製造装置：MILLIPORE Milli−Q Jr.（日本ミリポア）
ペプチド自動合成機：Pioneer peptide synthesis system（Applied Biosystems）
高速冷却遠心分離器：Avanti J 25（Beckman Coulter）
高速冷却遠心分離器：Himac CT-13R（日立）
恒温槽：Thermo mate BF200（ヤマト科学）
電気泳動用パワーサプライ：Power Pac 200（BIO−RAD）
電気泳動システム：Mini−PROTEIN II Ready Gel Cell（BIO−RAD）
NMR：JEOL JNM−A500（日本電子）、Brucker DRX−500（日本ブルカー）
（なお、化学シフトはCHD2ODのピークをδ3.35（CD30D）として内部標準とした。）
FAB−MS：JMS−MS 700P（日本電子）
pH測定器：PH/ION METER F−23（堀場製作所）
〔試薬〕
また、試薬は次のものを使用した。
【００３７】
アクリルアミド（電気泳動用）：（和光純薬）
過硫酸アンモニウム（電気泳動用）：（和光純薬）
メタクリル酸トリメトキシシリルプロピル：（東京化成）
リン酸二水素ナトリウム：（関東化学）
リン酸水素ニナトリウム：（関東化学）
3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸：（ナカライテスク）
リン脂質B-テストワコー：（和光純薬）
バンコマイシン：（シグマ-アルドリッチ）
メシチルオキシド：（東京化成）
ジメチルホルムアミド（ペプチド合成用）：（関東化学）
N-エチルジイソプロピルアミン：（和光純薬）
ピペリジン：（関東化学）
HOBt（ペプチド合成用）：（Novabiochem）
HBm（ペプチド合成用）：（Novabiochem）
固相合成用樹脂：PAC-PEG-PS樹脂（Novabiochem）
Fmoc-D-アラニン：（Novabiochem）
Fmoc-L-アラニン：（Novabiochem）
Fmoc-グリシン：（Novabiochem）
Fmoc-γ-N(Ac)-L-リジン：（Novabiochem）
Fmoc-α-(OtBu)-D-グルタミン酸：（渡辺化学工業）
無水カプリン酸：（東京化成）
トリフルオロ酢酸：（関東化学）
UV測定用デイスポーザブルキュペット：（BIO−RAD）
マイクロフィルター：マイレクス-GP（PES，孔径 0．22μm）（日本ミリポア）
キャピラリー：溶融シリカキャピラリー（TSPO75375, 内径 75±3μm, 外径 363±12μm）（Polymicrotechnologies）
＜参考例１＞
バンコマイシン（1）と、モデルペプチド（2）の相互作用を観察した。
（１）  モデルペプチド（2）の合成
次の反応式（Ａ）に従い、自動合成機を用いた固相合成法によりペプチドを合成した。
【００３８】
【化２】
2005043284.tif 000003
（ａ）Fmoc-D-Ala結合樹脂の調製
PAC-PEG-PS樹脂476 mg（ヒドロキシ基当量100μmol）を、30 mLの脱水DMFおよび10 mLのジクロロメタンでそれぞれ一回ずつ洗浄した。これを30mLの脱水DMFに懸濁し、Fmoc-D-Ala-OH（130 mg，420μmol）を加えた。続いてDCC（86 mg，420μmol）、DMAP（8.8 mg，72μmol）を加え、DMF中で室温中1時間撹拝した。
【００３９】
反応終了後、10 mLの脱水DMFおよびジクロロメタンでそれぞれ一回ずつ樹脂を洗浄した。
【００４０】
（ｂ）Fmocアッセイによるアミノ酸結合量の確認
Fmoc-アミノ酸を結合した樹脂を10.7 mgとり、100μLの30 %ピペリジン/DMF中に加え、30分間静置した。900μLのエタノールを加えて得られた溶液の300 nmにおける吸収を測定し、樹脂上のアミノ酸当量を、次の式にしたがって算出した。
【００４１】
アミノ酸結合量（mmol/g）＝3．05×A300／m
（ただし、A300は300 nmにおける吸光度、mは樹脂の質量（mg）を表す。）
なお、ここでは、A300＝0.6277であり、アミノ酸結合量は0.179 mmol/g（収率 85 %）であった。
【００４２】
（ｃ）Gly-L-Ala-δ-D-Glu-Lys(Ac)-D-Ala-D-Alaの合成（文献７）
Fmoc-D-Ala-OH（77.8 mg，245.0μmol）、Fmoc-bs(Ac)-OH（100.8 mg, 245.61μmol）、Fmoc-α-(OtBu)-D-Glu-OH（104.25 g, 250.3μmol）、Fmoc-L-Ala-OH（76.27 mg, 254.6μmol）、Fmoc-Gly-OH（72.84 mg, 250.0μmol）を配列順に装置に導入した。また、0.1 M HOBt、HBTU/DMF溶液と0.1 M DIEA/DMF溶液を所定の位置に配置した。
【００４３】
樹脂（345.9 mg, D-Ala等量 62μmol）をDMF（10 mL）で膨潤させて反応容器に充填し、数回の洗浄により平衡化した。次いで、アミノ酸1等量にHOBtを4当量、HBTUを4当量加え、60分間反応させた。1アミノ酸残基を縮合するごとに20 %ピペリジン/DMF溶液を5.O mL/minで5分間流し、Fmocの脱保護を行った。これを繰り返して目的ペプチド鎖を得た後、メタノールで洗浄し、樹脂を反応容器から取り出して真空下で溶媒を留去した。
【００４４】
さらに、この樹脂にクリーべッジカクテル（95:5 TFA-超純水混合溶液、15 mL）を加え、室温中1時間30分撹拝し、これをフィルターろ過して樹脂を除いた。得られた粗ペプチド溶液は溶媒を除去したのち、少量のクリーべッジカクテルで再溶解し、50 mLのファルコンチューブに移した。ここにエーテル（50mL）を加え、-20℃で静置することによってGly-L-Ala-δ-D-Glu-Lys(Ac)-D-Ala-D-Alaの沈殿を得た。
【００４５】
上清を遠心分離（5000 rpm, 5 min, 4℃）で除いた後、HPLC（溶媒  0 min: メタノール/0.1 % TFA水溶液 = 3/7; 0-60 min: linear gradient メタノール/0.1 % TFA水溶液 = 10/0; 60-90 min: 100 %メタノール、カラム： COSMOSIL 5C18AR-II 20 X 250 mm（ナカライテスク）、流速: 5 mL/min、UV検出波長: 210 nm）にて精製し、NMR、FAB-MS、MALDI-MSにて構造を確認した。
【００４６】
構造解析の結果は次のとおりであった。
【００４７】
1H−NMR(CD30D)： 84.41(m, 2H), 4.32(m, 2H), 4.19(t, 1H, J=2.5 Hz), 3.66(t, 2H, J=4.5 Hz), 3.11(t, 2H, J=7.O Hz), 2.30(t, 2H, J=4.5 Hz), 2.20(m, 2H), 1.88(s, 3H), 1.36(m, 9H), 1.32(m, 6H)．
HRMS（FAB）calcd for C24H42N7O10 587．29 [(M+H)+] 588.3993 found 588.3005, Δ+1.2mmu．
（ｄ）CH3-(CH2)-CO-Gly-L-Ala-δ-D-Glu-Lys(Ac)-D-Ala-D-Alaの合成（文献７）
Gly-L-Ala-δ-D-Glu-Lys(Ac)-D-Ala-D-Ala-OH（10.7 mg, 18μmol）をピリジン500μLに溶解し、無水カプリン酸（47.4 mg, 47μmol）を加えて室温で30分撹拝した。濃縮液をHPLCで精製し、目的のアシル化体を得た（6.8 mg, 9.2μmol, 収率 51 %）。
【００４８】
構造解析の結果は次のとおりであった。
【００４９】
NMR(CD30D): δ4.37(m, 4H), 3.97(t,1H J=3 Hz), 3.69(d, 1H, J=11.0 Hz), 3.15(t, 2H, J=7.5 Hz), 2.27(m, 4H), 1.91(s, 3H), 1.61(q, 2H, J=7 Hz)，1.50(m,2H), 1.40(m, 9H), 1.31(m, 18H), 0．89 (t, 3H, J=7.0).
HRMS（FAB）calcd for C34H59N7O11Na [(M+Na)+] 764.4170  found 764.4129, Δ-4.1 mmu．
（２）  検量線の作成
脂質の定量は、リン脂質B-テストワコーによって行った。まず、試験管に990μLの定量用バッファー（ホスホリバーゼD O.36 umit/μL, コリンオキシダーゼ 1.7 unit/mL, ペルオキシダーゼ4.3 unit/mL, 4-アミノアンチピリン 0.74 mM, フェノール 5.3 mM, Tris 50 mM, pH 8.0）を加え、10μLの試料を入れた。これを37℃で10分間インキュベートし、505 nmにおけるUV吸収を測定した。また、コントロール溶液として、脂質濃度が3g/L、1.5 g/L、0.75g/Lの溶液を調製し、これらを用いて検量線を作成した。
【００５０】
以下、キャピラリー電気泳動の実験では、1.0〜1.5 g/Lの濃度のサンプルを用い、この検量線をもとに試料の濃度を算出した。
（３）  キャピラリー電気泳動による結合定数の評価
まず、バンコマイシン（1）とモデルペプチド（2）の相互作用を、脂質を含まない系で解析した。
【００５１】
リン酸バッファー（11.2 mM, pH 7.7）に、あらかじめ5 mM程度のメタノール溶液として保存しておいたモデルペプチド（2）を加え、得られた1.28 mMのペプチド溶液を順次希釈することによって640μM、320μM、128μM、64μM、32μM、16μM、0μMの溶液を調製した。
【００５２】
これを2 mLのバイアルに入れ、泳動槽とした。同様に洗浄用0.1 M NaOHおよび超純水を用意した。また、中性マーカーであるメシチルオキシドは1 %(v/v)溶液になるように泳動バッファーで希釈して用いた。
【００５３】
続いて、50μMのバンコマイシン溶液を調製し、注入試料とした。なお、すべてのサンプル、泳動バッファーは孔径0.22μmのマイクロフィルターを通した後に使用した。
【００５４】
泳動条件は次のとおりとした。
【００５５】
泳動バッファー：リン酸バッファー（11.2 mM，pH 7.7）
キャピラリー：溶融シリカキャピラリー、内径75μm、実効長30 cm、全長40 cm
UV検出波長：214 nm
印加電圧：30 kV
温度：15℃
また、実験プログラムは次のとおりとした。
【００５６】
泳動バッファーによる洗浄：Pressure 20 psi/1 min
マーカーの注入：Pressure 0.1 psi/1 sec
バンコマイシン溶液の注入：Pressure O.5 psi/5sec
電気泳動：30 kV/3 mim
キャピラリー洗浄（0.1M NaOH）：Pressure 20 psi/1 min
キャピラリー洗浄（超純水）：Pressure 20 psi/1 min
結果を表１に示した。
【００５７】
【表１】
2005043284.tif 000004
表１より、バンコマイシン（1）の泳動時間がモデルペプチド（2）の濃度に依存して変化することが確認された。そこで、この結果をスキャッチャードプロットしたところ、図１に示したとおりの結果が得られた。これより、バンコマイシン（1）とモデルペプチド（2）の結合定数がグラフの傾きとして得られた。
【００５８】
とくに、文献値（Kb = 8.9 X 105 M-1）（文献５）と良く一致したことから、バンコマイシン（1）とモデルペプチド（2）の相互作用が精度よく検出できることが確認された。
＜実施例１＞
次に、リポソームを含む系におけるバンコマイシン（1）とモデルペプチド（2）を脂質二重膜共存下で観測した。
（１）  モデルペプチド（2）のリポソームへの再構成
卵黄ホスフアチジルコリン（6 mg）とモデルペプチド（2）（380μg, 512 mmol）を混合し、エバボレータで溶媒を留去した。真空下で2時間以上乾燥し、泳動バッファーを加えて懸濁させた後、凍結融解を10回繰り返し、孔径100 nmのフィルター（AVANTI, LFM-100）を装着したエクストルーダー（AVANTI, LF-10）を用いてサイジングし、SUVを調製した。
【００５９】
続いて、再構成されていない分子を除くためにペリスタリックポンプを用いてゲルろ過を行った（担体：BioGel A-5m（BIO-RAD，アガロースゲル）、カラム：φ1.O cm X 20 cm、流速：1 mL/min）。
【００６０】
調製したリポソームは、4℃で保存し、調製してから1週間以内に実験に供した。
（２）  アクリルアミドによるキャピラリー内壁のコーティング（文献８）
溶融シリカのキャピラリーに次のようなプログラムで溶液を流し、アクリルアミドをコーティングした。
【００６１】
1 M NaOH：pressure 20 psi/15 min
溶液A（0.4 %(w/w)メタクリル酸トリメトキシシリルプロピル、0.4 %(w/w)酢酸の
アセトニトリル溶液）：pressure 20 psi/60 min
アセトニトリル：pressure 20 psi/15 min
超純水：pressure 20 psi/15min
溶液B（3 %(w/w)アクリルアミド、0.4 %(w/w)過硫酸アンモニウム、0.16 %(v/v)
テトラメチルエチレンジアミンの超純水溶液）：Pressure 20 psi/10min
30 min静置
超純水：pressure 20 psi/15 min
なお、コーティングの前後で、メシチルオキシドの泳動時間が2割程度長くなることを確認し、コーティングの完了とした。
（３）  キャピラリー電気泳動による結合定数の評価（文献９）
必要量のMOPSを超純水に溶かし、塩酸または水酸化ナトリウム水溶液でpHを調節した。得られたMOPSバッファー（50mM, pH6.7）にバンコマイシン（1）を加えて162.0μMの溶液
を調製し、これを順次希釈することによって81.0μM、40.5μM、20.3μM、10.1μM、5.1μM、2.5μM、1.3μM、0.6μM、0μMの溶液を得た。これらを各々2 mLバイアルに入れ、泳動槽とした。同様に、洗浄用超純水を用意した。また、中性マーカーであるメシチルオキシドは1 % (v/v)溶液になるように泳動バッファーで希釈して用いた。
【００６２】
次いで、（１）で調製したリポソーム懸濁液を注入試料とした。なお、リポソーム懸渇液を除くすべてのサンプルは孔径0.22μmのマイクロフィルターを通した後に使用した。
【００６３】
また、電気泳動の条件は次のとおりとした。
【００６４】
キャピラリー：ポリアクリルアミドコーティングキャピラリー
（内径75μm、実効長30 cm、全長40 cm
UV検出波長：280 nm
印加電圧：30 kV
キャピラリー設定温度：25℃
また、実験プログラムは以下のとおりとした
泳動バッファーによる洗浄：pressure 20 psi/1 min
マーカーの注入：pressure 0.1 psi/1.0 sec
緩衝ゾーンの設定：30 kV/0.5 min
バンコマイシン溶液の注入：pressure O.5 psi/5.0 sec
電気泳動：30 kV/5 mim
キャピラリー洗浄（超純水）：pressure 20 psi/1 min
緩衝ゾーンの設定によるマーカーの移動時間は0.416分であったことから、補正を加えて計算を行った。結果を表２に示した。
【００６５】
【表２】
2005043284.tif 000005
また、この結果をスキャッチャードプロットしたところ、図２に示したとおりの結果が得られた。これより、バンコマイシン（1）とリポソームに再構成された状態でのモデルペプチド（2）の結合定数がグラフの傾きとして得られた。
【００６６】
結果は、Kb = 1.34 X 105 M-1となり、リポソームの非存在下で行った参考例１の結果とよく一致した。また、表面プラズモン共鳴法を用いて算出された値（8.9×105 M-1）（文献５）ともよく一致した。
【００６７】
これより、本願発明の方法により、脂質二重膜に再構成させたモデルペプチドとそれと相互作用するリガンド分子との結合定数が精度高く得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、膜タンパク質を脂質二重膜に再構成させた状態で、リガンド分子との相互作用を精度高く解析するための簡便で汎用性の高い方法が提供される。この出願の発明の膜タンパク質−リガンド分子相互作用解析方法では、キャピラリー電気泳動装置を用いるため、標識を必要とせず、簡便で比較的安価な方法であるといえ、有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】この出願の発明の参考例における電気泳動結果のスキャッチャードプロットを示した図である。
【図２】この出願の発明の実施例における電気泳動結果のスキャッチャードプロットを示した図である。
【図１】
2005043284.tif 000006
【図２】
2005043284.tif 000007