(57)【要約】      （修正有）【課題】マクロファージ遊走阻止活性を容易に利用できるポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター及び形質転換体、マクロファージ遊走阻止因子を大量生産することが容易なマクロファージ遊走阻止因子の製造方法、並びにマクロファージ遊走阻止因子に対して結合する抗体を提供する。【解決手段】ポリヌクレオチドは旋毛虫由来の特定な塩基配列を備えている。ポリペプチドは前記ポリヌクレオチドによりコードされる。組換えベクターは前記ポリヌクレオチドを発現ベクターに組込んだものである。形質転換体は前記組換えベクターを導入することにより形質転換された細胞である。マクロファージ遊走阻止因子の製造方法は、前記形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から前記ポリペプチドを精製する。抗体は、前記ポリペプチドを抗原として作製される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクターであって、
前記ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの末端に標識ペプチドをコードするヌクレオチドが組込まれていることを特徴とする組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを導入することにより形質転換された形質転換体。
【請求項５】
マクロファージ遊走阻止因子を製造する方法であって、
請求項４に記載の形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から請求項１に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを精製することを特徴とするマクロファージ遊走阻止因子の製造方法。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたマクロファージ遊走阻止因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＭＩＦ）に関する知見に基づいて発明されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、マクロファージ遊走阻止因子の製造方法及び抗体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マクロファージ遊走阻止因子は、マクロファージの遊走を阻止することで、マクロファージによる免疫応答を誘導するリンホカインであり、ある抗原に感作したリンパ球が、再びその抗原に接触すると産生・分泌される。近年、マクロファージ遊走阻止因子がグルタチオンＳトランスフェラーゼと相同性があり、解毒作用を有することが明らかになった。また、エンドトキシンショック時に下垂体前葉から分泌される等、内分泌系や細胞の分化増殖等にも関与していることが報告されている。（非特許文献１参照）
【０００３】
【非特許文献１】
日経バイオ最新用語辞典  第５版、日経ＢＰ社、２００２年９月１７日、８０７頁。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、本発明者らにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓが産生する新規なマクロファージ遊走阻止因子のクローニングに成功した結果なされたものである。その目的とするところは、マクロファージ遊走阻止活性を容易に利用することができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えベクター及び形質転換体を提供することにある。別の目的とするところは、マクロファージ遊走阻止活性を発揮するマクロファージ遊走阻止因子を大量生産することが容易なマクロファージ遊走阻止因子の製造方法を提供することにある。その他の目的とするところは、マクロファージ遊走阻止因子に対して結合することができる抗体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。
【０００６】
請求項２に記載の発明のポリペプチドは、請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされるものである。
請求項３に記載の発明の組換えベクターは、請求項１に記載のポリヌクレオチドが発現可能となるように組込まれた組換えベクターであって、前記ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームの末端に標識ペプチドをコードするヌクレオチドが組込まれていることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項４に記載の発明の形質転換体は、請求項３に記載の組換えベクターを導入することにより形質転換されたものである。
請求項５に記載の発明のマクロファージ遊走阻止因子の製造方法は、マクロファージ遊走阻止因子を製造する方法であって、請求項４に記載の形質転換体を増殖させた後、該形質転換体から請求項１に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを精製することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項６に記載の発明の抗体は、請求項２に記載のポリペプチドに結合するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の第一のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列からなるものである。これら第一のポリヌクレオチドは、いずれもマクロファージ遊走阻止活性を有するポリペプチド（マクロファージ遊走阻止因子；ＭＩＦ）をコードする。前記実質的に同一の塩基配列とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。
【００１０】
また、この実質的に同一の塩基配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対し僅かに異なるアミノ酸配列をコードするものであって、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドがマクロファージ遊走阻止活性を有するものまでが含まれる。例えば、ＰＣＲ反応により配列番号１で表される塩基配列を増幅したＰＣＲ産物も前記実質的に同一の概念に含まれる。このとき、前記実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するのが望ましい。以下、配列番号１で表される塩基配列又はその配列と実質的に同一の配列からなるポリヌクレオチドを、ＰＮ１と記載する。
【００１１】
実施形態の第二のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１）の塩基配列を含有するものであり、例えば該ポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター等が挙げられる。即ち、この第二のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、前記第一のポリヌクレオチドの場合と全く同様のことを意味する。以下、ＰＮ１の塩基配列を含有する第二のポリヌクレオチドをＰＮ１＋と記載する。
【００１２】
実施形態の第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１）の塩基配列の一部を含有するものであり、第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１）の塩基配列の一部からなるものであってもよい。なお、この第三のポリヌクレオチドは、前記第一のポリヌクレオチドの塩基配列のうち連続した一連の部分配列を含有している。即ち、この第三のポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列の一部、又はその配列と実質的に同一の塩基配列を含有するものである。前記実質的に同一の塩基配列とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列をコードするものを意味する。また、この実質的に同一の塩基配列としては、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列の一部に対して、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するものであってもよい。以下、ＰＮ１の塩基配列の一部を含有する第三のポリヌクレオチドをＰＮ１ｐと記載する。
【００１３】
これら第一から第三のポリヌクレオチドはいずれも、一本鎖ＤＮＡや二本鎖ＤＮＡ等のＤＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡやｍＲＮＡ等のＲＮＡの形態で利用される。また、アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの形態で利用することもできる。これら第一から第三のポリヌクレオチドは、その全長又はその一部をサザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等に用いられる標識用のプローブとして利用することができる。また、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）に利用することもできる。
【００１４】
配列番号１で表される塩基配列は、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓからクローニングされたＭＩＦの遺伝子配列であり、全長３４５塩基の塩基配列からなる。この塩基配列は、１〜３４２番目までの３４２塩基（１１４アミノ酸）からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、３４３〜３４５番目までの終止コドンとを備えている。さらに、この塩基配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる分子量１２．５ｋＤａのポリペプチドをコードする。該ポリペプチドは、マクロファージ遊走阻止活性を有するタンパク（ＭＩＦ）である。
【００１５】
実施形態の第一のポリペプチドは、前記第一のポリヌクレオチド（ＰＮ１）によりコードされるアミノ酸配列からなるものであり、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。これら第一のポリペプチドは、マクロファージ遊走阻止活性を有している。
【００１６】
実施形態の第二のポリペプチドは、前記第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１＋）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第二のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドの５’末端又は３’末端（好ましくは３’末端）に融合ペプチド（ポリペプチド）が融合されたものである。前記融合ペプチドとしては、第二のポリヌクレオチドを導入した形質転換体を用いて第二のポリペプチドを産生させたときそのポリペプチドの精製が容易となることから、オリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、チオレドキシン（ＴＲＸ）等の標識ペプチドが好適に用いられる。また、前記融合ペプチドとしては、スクリーニング等に利用するのが容易であることから、種々のレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子の遺伝子産物を用いてもよい。この第二のポリペプチドも、マクロファージ遊走阻止活性を有している。
【００１７】
実施形態の第三のポリペプチドは、前記第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１ｐ）によりコードされるアミノ酸配列からなるものである。この第三のポリペプチドは、前記第一のポリペプチドのアミノ酸配列のうち連続した一連の部分配列を含有するものである。この第三のポリペプチドは、抗体作製のための抗原やプロテインチップ（マイクロアレイ）等に利用され得る。
【００１８】
実施形態の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ１＋又はＰＮ１ｐ）をプラスミドベクターやレトロウィルスベクター等の種々の発現ベクター内に発現可能となるように組込んだものである。この組換えベクターは、公知のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）タンパク合成系を利用して前記ポリペプチドを製造することができる。
【００１９】
実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞等の種々の宿主細胞内に導入して該細胞を形質転換することにより得られる。なお、前記宿主細胞としては、マクロファージ遊走阻止活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１やＰＮ１＋等がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、大腸菌や酵母等の微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。
【００２０】
実施形態のマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の製造方法は、形質転換体を増殖させる増殖工程と、その増殖工程で増殖した形質転換体からＭＩＦを精製する精製工程とを備えている。前記形質転換体としては、前記第一又は第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１又はＰＮ１＋）が発現可能となるように組込まれた組換えベクターを導入して形質転換した細胞が用いられる。この形質転換体としては、マクロファージ遊走阻止活性の低下を抑えつつ、ＰＮ１又はＰＮ１＋がコードするポリペプチドを迅速かつ容易に大量生産できることから、微生物を用いるのが好ましく、大量生産に特に適していることから大腸菌を用いるのが最も好ましい。また、前記組換えベクター内に導入されるポリヌクレオチドとしては、精製工程が容易であることから、前記標識ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する第二のポリヌクレオチドであるのが好ましい。
【００２１】
前記精製工程は、前記形質転換体により産生されたポリペプチドをクロマトグラフィー等の分離精製技術を用いて精製する工程である。この精製工程では、前記形質転換体が産生するポリペプチドを効率的に精製し得る任意の分離精製技術が適用されるが、前記標識ペプチドと特異的に結合するアフィニティクロマトグラフィーを用いてＭＩＦを精製するのが最も好ましい。なお、前記形質転換体により産生されたポリペプチドを精製した後、該ポリペプチドから標識ペプチドを分離させてＭＩＦのみを単離する操作を行うとよい。
【００２２】
実施形態の抗体は、前記第一、第二又は第三のポリペプチド、好ましくは第一又は第三のポリペプチドを抗原として作製されるものであり、ＭＩＦに特異的に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が挙げられる。前記モノクローナル抗体はハイブリドーマにより容易かつ大量に供給され得る。この抗体は、ＭＩＦに特異的に結合してその生理活性を抑制することにより炎症作用を抑える効果を発揮し得ることから、抗炎症薬、自己免疫疾患等の免疫病治療薬に好適に利用される。また、旋毛虫の存在を検出するための検出用ツールやプロテインチップ等に利用してもよい。
【００２３】
実施形態の医薬品としては、抗炎症薬、自己免疫疾患等の免疫病治療薬、抗癌剤、又は旋毛虫による感染症を治療するための感染症治療薬が挙げられる。
抗炎症薬又は免疫病治療薬は、前記抗体を有効成分として含有するものであり、抗ＭＩＦ抗体を有効成分とする公知の抗炎症薬等と同様の作用機序によって、感作リンパ球等が産生するＭＩＦと前記抗体とが結合して炎症反応を抑える働きをする。また、前記有効成分としては、前記アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡであってもよく、それらポリヌクレオチドが発現可能に挿入された組換えベクター（特に自己免疫疾患の遺伝子治療薬の場合）であってもよい。
【００２４】
抗癌剤は、マクロファージ遊走阻止活性を有する前記第一又は第二のポリペプチド、好ましくは大量生産が容易であることから前記ＭＩＦの製造方法により製造されたＭＩＦを有効成分として含有するものであり、腫瘍の増殖や転移を抑えて抗癌作用を発揮し得る。また、前記有効成分としては、前記第一又は第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１若しくはＰＮ１＋）であってもよく、それらポリヌクレオチドが発現可能に挿入された組換えベクター（特に遺伝子治療薬の場合）であってもよい。
【００２５】
感染症治療薬は、前記ＭＩＦの発現抑制、又は該ＭＩＦの活性阻害を引き起こすことにより、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の治療を行うものである。この感染症治療薬は、前記第一若しくは第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１若しくはＰＮ１ｐ）に対するアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、或いは前記抗体を有効成分として含有する。
【００２６】
実施形態の検査用キットとしては、ヒトや家畜等が旋毛虫症に罹患しているか否かを検査（診断）するための診断キット、又は食肉や食肉加工品等に対する食品検査を行うための食品検査キットが挙げられる。これらの検査用キットは、ヒト、家畜、食肉、食肉加工品等から採取した検査用サンプルに、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓが産生するＭＩＦが存在するか否かを検査することにより診断又は食品検査を行うものである。また、この検査用キットによれば、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓが産生するＭＩＦの存在を検査することもできる。これらの検査用キットとしては、遺伝子検査キット又はタンパク検査キットが挙げられる。
【００２７】
遺伝子検査キットは、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ１＋又はＰＮ１ｐ）、好ましくは第一又は第三のポリヌクレオチドを検出用プローブとして利用するものである。この遺伝子検査キットとしては、ＤＮＡチップ、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからＤＮＡチップが最も好適に適用される。
【００２８】
タンパク検査キットは、前記第一、第二若しくは第三のポリペプチド（検査用サンプルとしてヒトや家畜の血清が用いられる）、又は前記抗体を検出用ツールとして利用するものである。このタンパク検査キットとしては、免疫沈降反応、ゲル内二重拡散法、免疫電気泳動法、定量沈降反応、放射免疫定量法、酵素免疫定量法、ウェスタンブロッティング、プロテインチップ等の公知の検査技術が適用され、迅速かつ簡便に検査を行うことができることからプロテインチップが最も好適に適用される。
【００２９】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  実施形態のポリヌクレオチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓよりクローニングされた配列番号１で表される新規な塩基配列に基づいて提供されたものである。第一及び第二のポリヌクレオチド（ＰＮ１及びＰＮ１＋）は、いずれもマクロファージ遊走阻止活性を有する（第一又は第二の）ポリペプチドをコードしていることから、抗炎症作用を発揮する抗炎症薬又は免疫病治療薬として利用することができる。
【００３０】
一方、第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１ｐ）は、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡチップ、検査用プローブ等の感染症治療薬や検査用キットに好適に利用することができる。同様に、第三のポリペプチドは、抗体作製やプロテインチップ等の検査用キットに好適に利用することができる。従って、これら第三のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓによる感染症の早期発見や効果的な治療や予防に役立てることによって、感染症の拡大を容易に抑えることができる。
【００３１】
・  実施形態の組換えベクターは、第一、第二又は第三のポリヌクレオチド（ＰＮ１、ＰＮ１＋又はＰＮ１ｐ）が発現可能となるように組込まれたものである。実施形態の形質転換体は、前記組換えベクターが導入されたものである。これら組換えベクター及び形質転換体は、前記第一、第二又は第三のポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを大量生産するのに著しく適していることから、医薬品や検査用キット等の原材料を容易かつ大量に提供することができる。また、取り扱いや保存が極めて容易である。
【００３２】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜ＲＴ−ＰＣＲによるＭＩＦ遺伝子の存在確認と発現量の定量＞
旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ１３）の成虫、新生幼虫、１５日齢筋肉幼虫及び３５日齢筋肉幼虫より、ＴＲＩＺＯＬ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ）を用いてトータルＲＮＡを単離した後、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下でＤＮａｓｅ処理を行った。続いて、前記トータルＲＮＡを精製した後、ＲＮａｓｅフリー水に溶解させた。前記精製後のトータルＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＩＦに相当すると考えられる遺伝子（以下、便宜的にＭＩＦ遺伝子と記載する）をクローニングした。
【００３３】
即ち、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）を用いて前記精製後のトータルＲＮＡをマニュアルに準拠しつつ逆転写させて逆転写物を得た。なお、前記逆転写物は、前記トータルＲＮＡ３μｇ及び０．５μｇ／μｌのオリゴｄＴ（１２−１８）１μｌをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  チューブに入れ、ＲＮａｓｅフリー水にてチューブ内の全量を３３μｌにした後、３７℃６０分間、続いて９０℃５分間インキュベートすることにより作製した。次に、配列番号３で表される５’センスＰＣＲプライマーと、配列番号４で表される３’アンチセンスＰＣＲプライマーとを用いて前記逆転写物をＰＣＲ増幅した。なお、前記配列番号３で表されるＰＣＲプライマーは他種生物のＭＩＦの開始コドンを含む５’末端とＢａｍＨＩ認識配列（最初の１０塩基）とを含み、前記配列番号４で表されるＰＣＲプライマーは他種生物のＭＩＦの終止コドンを含む３’末端とＥｃｏＲＩ認識配列（最初の１０塩基）とを含むものである。
【００３４】
その結果、ＰＣＲ増幅により前記逆転写物からＭＩＦ遺伝子の配列が増幅されたことが確認された。また、旋毛虫Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ４１３）についても、前記Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓの場合と全く同様の作業を行ってＭＩＦ遺伝子をクローニングしたところ、同様にＭＩＦ遺伝子の配列が増幅されたことが確認された。
【００３５】
次に、前記各旋毛虫の成虫、新生幼虫、被嚢形成前筋肉幼虫（ｐｒｅ−ｃｙｓｔ）又は被嚢形成後筋肉幼虫（ｐｏｓｔ−ｃｙｓｔ）から上記と同様にそれぞれトータルＲＮＡを単離してＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、発現量における若干の差異は見られるものの全てのステージの旋毛虫でＭＩＦ遺伝子が発現していたことが確認された。なお、このＲＴ−ＰＣＲにおいては、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）を増幅するためのプライマーを同時に用いて行い、該Ｇ３ＰＤＨの発現量を指標に前記ＭＩＦ遺伝子の発現量を確認した。
【００３６】
＜ＭＩＦ遺伝子がコードするリコンビナントタンパクの発現と精製＞
上記各旋毛虫の３５日齢筋肉幼虫から作製したｃＤＮＡライブラリーを、配列番号３及び４で表される一対のＰＣＲプライマーにてＰＣＲ増幅することにより増幅フラグメントを得た。次に、得られた増幅フラグメントをプラスミドベクター（ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ）に挿入した後、該ベクターを大腸菌ＪＭ１０９細胞内に導入して形質転換細胞を作製した。続いて、前記形質転換細胞を増殖させた後にプラスミドベクターを精製し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて該ベクター内に挿入されたＤＮＡを単離した後、ｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングした。
【００３７】
次に、前記サブクローニングされたｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に導入して形質転換した後、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎａｓｉｄｅ）に３７℃で３時間曝すことにより、ポリヒスチジン融合リコンビナントタンパクの発現を誘導した。続いて、前記リコンビナントタンパクの発現が誘導された細胞を１０ｍＭイミダゾール含有２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で超音波処理にて破壊した後、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を用いて前記リコンビナントタンパクを精製した。ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）にて尿素を取り除いた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて前記リコンビナントタンパクの発現を確認した。その結果、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓのいずれの場合にも、１６．５ｋＤａ（４ｋＤａのベクター由来ポリペプチドが含まれている）の単一の濃い染色バンドが確認された。
【００３８】
＜ＭＩＦ遺伝子の配列決定＞
上記サブクローニングされたｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクターを精製し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び自動シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ＬＩＣ−４２００，  Ａｌｏｋａ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）にて塩基配列を決定した。その結果、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ４１３）の増幅フラグメントは全長３４５ｂｐの塩基配列からなり、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ１３）の増幅フラグメントは配列番号１で表される全長３４５ｂｐの塩基配列からなることが示された。さらに、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓの増幅フラグメントは１１５アミノ酸からなる１２．３ｋＤａのタンパクをコードすることが推定され、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓの増幅フラグメントは配列番号２で表される１１５アミノ酸からなる１２．５ｋＤａのタンパクをコードすることが推定された。
【００３９】
なお、前記２種類の塩基配列間のホモロジーは９１％、前記２種類のアミノ酸配列間のホモロジーは８６％であった。また、前記Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓの増幅フラグメントの推定アミノ酸配列についてホモロジー検索したところ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ、ヒト及びマウスＭＩＦに対してそれぞれ、５７％、４４％、４１％及び４０％のホモロジーがあったことが示された。
【００４０】
＜リコンビナントタンパクを用いた抗血清の作製と免疫染色＞
前記精製されたリコンビナントタンパクとフロイントの完全アジュバントとを１：１で混合した混合物約５０μｇをＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した後、同リコンビナントタンパクとフロイントの不完全アジュバントとを１：１で混合した混合物約５０μｇを３週間毎に２回注射した。最後の注射から１０日後に常法に従って血清を採取することにより抗血清を得た。なお、前記抗血清は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ４１３）と、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ（ＩＳＳ１３）との両方について作製した。
【００４１】
次に、前記抗血清を用いてウェスタンブロッティングを行った。即ち、上記両旋毛虫の成虫の粗抽出物、３５日齢筋肉幼虫の粗抽出物、筋肉幼虫の排泄・分泌物（ｅｘｃｒｅｔｏｒｙ−ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、及び前記リコンビナントタンパクをそれぞれ１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した後、ニトロセルロース膜に転移させた。なお、前記粗抽出物は、Ｗｕ，  Ｚ．，  Ｉ．  Ｎａｇａｎｏ，  ａｎｄ  Ｙ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ．  １９９９．  Ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｌａｒｖａｅ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １１８：  ６１５−６２２．の方法に従って準備した。また、前記ニトロセルロース膜は同じものを２枚作製した。
【００４２】
続いて、一方のニトロセルロース膜を前記一方の抗血清（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）とアルカリフォスファターゼ標識化マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）とによってウェスタンブロッティングしたところ、成虫の粗抽出物、３５日齢筋肉幼虫の粗抽出物及びリコンビナントタンパクがそれぞれ染色された。また、他方のニトロセルロース膜を前記他方の抗血清（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓ）とアルカリフォスファターゼ標識化マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）とによってウェスタンブロッティングしたところ、全く同様な結果が得られた。従って、前記２種類の抗血清はそれぞれ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓが産生する天然タンパクに対して特異的に結合するとともに、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ及びＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｉｒａｌｉｓの両方に交差反応性があることが示された。
【００４３】
＜リコンビナントタンパクのマクロファージ遊走阻止活性の確認＞
マクロファージを含む単核細胞の遊走を誘起することが知られているセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５を用いて、上記２種類のリコンビナントタンパクの活性をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で調べた。即ち、０．５μｇ／ｍｌの各リコンビナントタンパク溶液（溶媒はリン酸緩衝液）にセファデックスＧ−２５を添加して混合させた後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植した。なお、前記リコンビナントタンパクを含まないものをマウスに移植したものをコントロールとして用いた。２日後、各マウスの組織切片をマクロファージに結合する抗体（ａｎｔｉ  Ｆ４／８０  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＣＯＳＭＯ  ＢＩＯ  ＣＯ．  ＬＴＤ）で免疫染色するとともに、同組織切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。その結果、コントロールではセファデックスビーズの周囲にマクロファージが集積していたのが明確に確認されたが、リコンビナントタンパク溶液を含むセファデックスビーズを移植した組織では前記集積がほとんど見られなかった。従って、前記各リコンビナントタンパクはインビボでマクロファージ遊走阻止活性を発揮することが確認された。
【００４４】
なお、この明細書において、ポリヌクレオチドとは１０個以上のヌクレオチドからなるものを指し、ポリペプチドとは１０個以上のアミノ酸からなるものを指すものとする。
【００４５】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明のポリヌクレオチド、請求項２に記載の発明のポリヌクレオチド、請求項３に記載の発明の組換えベクター、及び請求項４に記載の発明の形質転換体によれば、マクロファージ遊走阻止活性を容易に利用することができる。
【００４６】
請求項５に記載の発明のマクロファージ遊走阻止因子の製造方法によれば、マクロファージ遊走阻止活性を発揮するマクロファージ遊走阻止因子を大量生産することが容易である。請求項６に記載の発明の抗体によれば、マクロファージ遊走阻止因子に対して結合することができる。
【００４７】
【配列表】
2005000071.tif 000002
2005000071.tif 000003
2005000071.tif 000004
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