(57)【要約】【課題】生体適合性を有し、血中滞留性を有し、しかもＳＯＤ活性を備えているＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂおよびその生成方法を提供すること。【解決手段】カチオン化ポルフィリンの金属錯体（またはカチオン化金属ポルフィリン錯体）を合成し、これを用いてヘモグロビンを再構成し、その後ポリエチレングリコールを修飾することにより生成されたことを特徴とする。【選択図】      図１
2005027512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン化ポルフィリンの金属錯体（またはカチオン化金属ポルフィリン錯体）を合成し、これを用いてヘモグロビンを再構成し、その後ポリエチレングリコールを修飾することにより生成されたことを特徴とするＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成ヘモグロビン。
【請求項２】
前記の金属錯体の金属は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等からなり、前記カチオン化ポルフィリンの金属錯体は、金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）、金属［｛１，３，５，８テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）等からなることを特徴とする請求項１に記載のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成ヘモグロビン。
【請求項３】
カチオン化ポルフィリンの金属錯体（またはカチオン化金属ポルフィリン錯体）を合成し、これを用いてヘモグロビンを再構成し、その後ポリエチレングリコールを修飾することにより生成することを特徴とするＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成ヘモグロビンの生成方法。
【請求項４】
前記の金属錯体の金属は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等からなり、前記カチオン化ポルフィリンの金属錯体は、金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）、金属［｛１，３，５，８テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）等からなることを特徴とする請求項３に記載のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成ヘモグロビンの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素種（ＲＯＳ）を消去する能力を持つスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）が発揮するＳＯＤ活性と類似の活性を発揮することのできるＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成ヘモグロビン（以下、ヘモグロビンをＨｂと略す）およびその生成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】
一般に、生体内においてスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−・）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（Ｏ２−・）等の生体内のＲＯＳ等のが発生すると、ＤＮＡ、蛋白質、糖、脂質、血管等が損傷を受けてしまう。
【０００３】
正常な生体内においては、これらのＲＯＳ等を消去する能力を持つＳＯＤ、カタラーゼ等の酵素が存在し、恒常的に細胞が守られるようになっている。しかし、疾患を有する時には、恒常性バランスが崩れ、生体内においてそれらの酵素が減少しているために、ＲＯＳ等が過剰に発生し、疾患の一層の悪化を促進することになる。
【０００４】
そこで、ＳＯＤのような天然の酵素と同様に体内に吸収されやすく、ＲＯＳを消去できる能力のある物質の開発が望まれていた。
【０００５】
本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、生体適合性を有し、血中滞留性を有し、しかもＳＯＤ活性を備えているＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂおよびその生成方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、Ｏ２−・消去系酵素であるＳＯＤと同様のＳＯＤ活性を発揮することのできる模倣（モデル化）に関して鋭意研究し、ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂを生成してそのＳＯＤ活性を評価して、同物質が生体適合性を有し、血中滞留が可能であり、ＳＯＤ活性を示すことを発見して本発明を完成させた。
【０００７】
このようにして完成された本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂは、カチオン化ポルフィリンの金属錯体（またはカチオン化金属ポルフィリン錯体）を合成し、これを用いてＨｂを再構成し、その後ポリエチレングリコールを修飾することにより生成されたことを特徴とする。このように構成されている本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂによれば、生体適合性を有し、血中滞留性を有し、しかも優れたＳＯＤ活性を備えているものとなる。
【０００８】
なお、前記の金属錯体の金属は、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等からなり、前記カチオン化ポルフィリンの金属錯体は、金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）、金属［｛１，３，５，８テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）等とするとよい。このように金属錯体の金属を設定することにより、更に優れた生体適合性、血中滞留性およびＳＯＤ活性を備えているものとなる。
【０００９】
また、本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの生成方法は、カチオン化ポルフィリンの金属錯体（またはカチオン化金属ポルフィリン錯体）を合成し、これを用いてヘモグロビンを再構成し、その後ポリエチレングリコールを修飾することにより生成することを特徴とする。
【００１０】
また、前記の金属錯体の金属としては、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、モリブデン（Ｍｏ）、クロム（Ｃｒ）、イリジウム（Ｉｒ）等からなり、前記カチオン化ポルフィリンの金属錯体は、金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）、金属［｛１，３，５，８テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）等とするとよい。
【００１１】
このように構成されている本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの生成方法によれば、前記のような生体適合性を有し、血中滞留性を有し、しかも優れたＳＯＤ活性を備えているＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂを確実に生成することができるという画期的な効果を奏することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図１を例に説明する。
【００１３】
図１は本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの一つの生成方法の工程を示している。
【００１４】
本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂについて、その生成方法に従って説明する。
【００１５】
まず、各種のカチオン化ポルフィリンの金属錯体［金属錯体の金属は、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｉｒ等］を合成する。特に、図１の場合は、各種のカチオン化ポルフィリンのＦｅまたはＭｎの錯体を合成する場合を示している。
【００１６】
また、前記カチオン化ポルフィリンの金属錯体は、ＭＴ２ＭＰｙＰ、ＭＴ４ＭＰｙＰ、ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ等である。図１の場合は一例としてＭｎＴ２ＭＰｙＰを合成している。
【００１７】
次に、図１の工程（ａ）に示すように、これらのカチオン化ポルフィリンの金属錯体を用いてＨｂを再構成する。図１は一例としてカチオン化ポルフィリンの金属錯体としてＭｎＴ２ＭＰｙＰを用いた場合を示している。
【００１８】
次に、図１の工程（ｂ）に示すように、カチオン化ポルフィリンの金属錯体を用いて再構成された再構成Ｈｂをピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ）さらにＰＥＧによって修飾して、本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂを生成する。図１は一例としてカチオン化ポルフィリンの金属錯体としてＭｎＴ２ＭＰｙＰを用いた場合を示している。
【００１９】
比較例として、カチオン化ポルフィリンの金属錯体を用いて再構成された再構成ＨｂおよびそれをＰＬＰによって修飾したものも合成した。
【００２０】
このようにして得られたＰＥＧ修飾再構成Ｈｂ等のＳＯＤ活性評価として、ストップドフロー分光光度計を用いてＯ２−・消失曲線からＳＯＤ活性の指標となる不均化反応速度定数（ｋ  ｃａｔ）を求めて評価し、さらに、チトクロームｃ法より阻害率（ＩＣ）の５０％おける薬剤濃度（ＩＣ５０）を求めて評価した。
【００２１】
本発明のＰＥＧ修飾再構成Ｈｂは、十分なＳＯＤ活性を備えており、Ｈｂの分子量を２倍近くにまで増やすことができ、Ｈ２Ｏ２に対する安定性も向上させることができるという優れた傾向を示した。
【００２２】
次に、本発明の実施例を説明する。
【００２３】
実施例１：ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの合成（１）：ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂの合成
まず、金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）、｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）等の合成は、（１）Ｋ．Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２３，２４５３（１９８４）、（２）Ａ．Ｄ．Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．，３２，２４４３（１９７０）、（３）Ｔ，Ｙｏｎｅｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，２９８８（１９７０）、（４）Ｐ．Ｈａｍｂｒｉｇｈｔ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１５，２３１４（１９７６）等を参考に合成した。ここでは、一例として、金属にＭｎを用いたＭｎＴ２ＭＰｙＰの合成を以下に示す。プロピオン酸５００ｍｌ中に２−ピリジルカルボキシアルデヒド１５ｍｌを加えて加温し、１００℃になった後にピロール１２ｍｌを加えて１時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、中和および洗浄を行った。その後、カラムクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、クロロホルム）等で生成し、５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン（収率７．０８％）を得た。次に、上記の生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン１００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液１００ｍｌをアルゴン（Ａｒ）置換した後、酢酸マンガン・四水和物３７０ｍｇを加えて、Ａｒ下で３時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、抽出、減圧乾燥等を行い、マンガン｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン｝（収率７５．２％）を得た。次に、上記のマンガン｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン｝２００ｍｇとｐ−トルエンスルホン酸メチルを１２ｍｌを反応させた（１２０℃、５時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー［（１）酸性アルミナおよび（２）塩基性アルミナ、メタノール］を行い、目的物質であるＭｎＴ４ＭＰｙＰ（収率９０％）を得た。他の金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）および他の金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）の合成も上記と同様に合成した。
【００２４】
再構成Ｈｂの合成は、Ｍ．Ｙｕａｓａ，Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｕ．Ｍｉｄｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．Ｎａｇａｏｋａ，Ｊ．Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉ．，５２，１４９（２００３）を参考に合成した。一例として、ＭｎＴ２ＭＰｙＰを含む再構成Ｈｂの合成を以下に示す。氷浴中でＨｂ０．５ｇ（７．７５μｍｏｌ）をｐＨ７．０の０．３Ｍリン酸緩衝溶液３０ｍｌに溶解させ、１Ｎ塩酸を用いてｐＨを２．３〜２．５に調整した後、２−ブタノン５０ｍｌを加えて抽出した。下層の水層について同様な抽出（数回）、透析（ＶＩＳＫＡＳＥ  ＳＡＬＥＳ  ＣＯＲＰ．Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｔｕｂｉｎｇ  ＵＣ８−３２−２５、ｐＨ７．０、０．３Ｍリン酸緩衝溶液）等を行い、アポ化Ｈｂ溶液を得た。次に、ＵＶ−ｖｉｓ測定で濃度算出したアポ化Ｈｂ溶液にＭｎＴ２ＭＰｙＰ（アポ化Ｈｂのモル濃度の４０倍）を加えて氷浴中で撹拌し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．０〜７．５に調整して超音波照射（２０分）し、さらに、４℃で４時間撹拌した。ＵＶ−ｖｉｓ測定で再構成の確認後、透析、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ、トヨパールＨＷ−５５Ｆ）等により精製し、ＭｎＴ２ＭＰｙＰにより再構成されたＨｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ、収率８３％）を得た。他の再構成Ｈｂの合成も上記と同様に合成した。
【００２５】
ＰＬＰおよびＰＥＧの再構成Ｈｂへの修飾は、岩下雄二、  化学、  ４３、４４０（１９８８）を参考に合成した。一例として、ＰＬＰおよびＰＥＧで修飾したＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂの合成を以下に示す。（１）まず、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ溶液（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ４．６５μｍｏｌ）をアルゴンで脱気した後、ピリドキサール−５−リン酸１水和物２．４６ｍｇ（９．３μｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム１．７ｍｇ（４６．５μｍｏｌ）を加えて３０分間反応させた。さらに、透析、ＧＰＣ等より精製し、ＰＬＰを修飾したＭｎＴ２ＭＰｙＰで再構成されたＨｂ（ＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ、収率９３％）を合成した。他のＰＬＰ修飾再構成Ｈｂの合成も同様に行った。（２）次に、数平均分子量７５００のＰＥＧ１００ｇ（０．０１３３ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶解させ、無水コハク酸３ｇ（０．０３ｍｏｌ）を加え１００℃で３時間反応させた。その後、室温になるまで放置し、ろ過した。さらに、洗浄、減圧乾燥して末端にカルボキシル基をもつＰＥＧ（ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、収率９１％）を得た。さらに、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ９８．５ｇ（０．０１２８ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶解させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド２．９５ｇ（０．０２５７ｍｏｌ）とジシクロヘキシルカルボジイミド５．２９ｇ（０．０２５７ｍｏｌ）を加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応、冷却後、ろ過、洗浄、減圧乾燥して末端にコハク酸イミドのエステルをもつ活性化ＰＥＧ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ＰＥＧ、収率８６％）を得た。（３）最後に、（１）で得られたＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ溶液に（２）で得られたＡｃｔｉｖａｔｅｄ−ＰＥＧ０．４ｇ（４６．５ｍｏｌ）を加え、アルゴン下１時間反応させた。反応後、４℃で２時間放置し、未反応ＰＥＧをろ過し、さらに、透析、ＧＰＣ等より精製し、ＰＥＧおよびＰＬＰを修飾したＭｎＴ２ＭＰｙＰで再構成されたＨｂ（ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ、収率８６％）を合成した。他のＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの合成も上記と同様に合成した。
【００２６】
実施例２：ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの合成（２）：ＰＥＧ修飾ＦｅＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂの合成
金属にＦｅをＦｅＴ２ＭＰｙＰより成るＰＥＧ修飾ＦｅＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂを合成した。第一に、鉄｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＦｅＴ２ＭＰｙＰ）の合成は、実施例１と同様に、（１）Ｋ．Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２３，２４５３（１９８４）、（２）Ａ．Ｄ．Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｎｕｃｌ．Ｃｈｅｍ．，３２，２４４３（１９７０）、（３）Ｔ，Ｙｏｎｅｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，２９８８（１９７０）、（４）Ｐ．Ｈａｍｂｒｉｇｈｔ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１５，２３１４（１９７６）等を参考に合成した。プロピオン酸５００ｍｌを１００℃まで攪拌・加熱後、２−ピリジルカルボキシアルデヒド１５ｍｌ（０．１５８ｍｏｌ）を加えた。その後、ピロール１２ｍｌ（０．１７３ｍｏｌ）を注射器で少しずつ滴下し、１００℃で１時間還流を行って環化縮合した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。中和、洗浄およびカラムクロマトグラフィー（アルミナｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、クロロホルム）等を行い、生成物である５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン（収率４．４％）を得た。次に、アルゴン雰囲気下でジメチルホルムアミド（１５０ｍｌ）に５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン０．２ｇ（３．２×１０−４ｍｏｌ）を加えて溶解させ、さらに、鉄０．２ｇと４８％臭化水素酸５ｍｌより得た臭化鉄（ＦｅＢｒ２）を加えて４時間還流した。反応後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムカラムクロマトグラフィー（アルミナ  ｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、メタノール）等を行い、前駆体の鉄｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン｝（収量０．２１ｇ）を得た。次に、ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中に鉄｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン｝０．１ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸メチル６ｍｌを加え，１３０℃、５時間還流した。還流後、室温まで放冷し、溶媒を留去した。抽出、カラムクロマトグラフィー（アルミナ  ｂａｓｉｃ  ｔｙｐｅ  Ｉ、メタノール）等行い、目的物質であるＦｅＴ２ＭＰｙＰ（収率９１％）を得た。第二に、再構成Ｈｂの合成は、Ｍ．Ｙｕａｓａ，Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｕ．Ｍｉｄｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．Ｎａｇａｏｋａ，Ｊ．Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉ．，５２，１４９（２００３）を参考に実施例１と同様に合成した。第三に、ＰＬＰおよびＰＥＧの再構成Ｈｂへの修飾は、岩下雄二、  化学、  ４３、４４０（１９８８）を参考に実施例１と同様に合成した。最終的に、ＰＥＧおよびＰＬＰを修飾してＦｅＴ２ＭＰｙＰを再構成したＨｂ（ＰＥＧ修飾ＦｅＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ）を合成した。
【００２７】
実施例３：ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの合成（３）：ＰＥＧ修飾ＭｎＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ再構成Ｈｂの合成
ＰＥＧ修飾ＭｎＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ再構成Ｈｂを合成した。第一に、ＥＣ法［例えば、Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｈ．Ｎｉｓｈｉｄｅ，Ｈ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｒ．Ｙｏｕｎｇ，ａｎｄＣ．Ｋ．Ｃｈａｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９８４，９９１等］に基づき、１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（カルボキシルエチル）｝ポルフィリン（プロトホルフィリンＩＸ）１ｇとクロロギ酸エチル２ｍｌをテトラヒドロフラン／トリエチルアミン（２５０／３ｍｌ）中、０℃、１時間反応させ、酸クロライド体を得た。この酸クロライド体と４−アミノピリジン１．６８ｇを同一条件で２時間反応させ、さらに、室温で終夜反応させた。反応後、エバポレーション、カラムクロマトグラフィー［シリカゲル、メタノール／クロロホルム（１／９）］等を行い、｛１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−ピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン（収率６８．４％）を得た。次に、｛１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−ピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン２００ｍｇを含むジメチルホルムアミド溶液２００ｍｌをＡｒ置換した後、酢酸マンガン・四水和物６８６ｍｇを加えて、アルゴン下で６時間還流した。反応後、放冷、エバポレーション、洗浄、減圧乾燥等を行い、マンガン｛１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−ピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン（収率４５．７％）を得た。次に、上記のマンガン錯体２００ｍｇとｐ−トルエンスルホン酸メチルを９ｍｌを反応させた（１４０℃、６時間）。反応後、放冷、抽出等を行い、カラムクロマトグラフィー（酸性アルミナ、メタノール）を行い、目的物質であるＭｎＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ（３７．５％）を得た。第二に、再構成Ｈｂの合成は、Ｍ．Ｙｕａｓａ，Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｕ．Ｍｉｄｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．Ｎａｇａｏｋａ，Ｊ．Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉ．，５２，１４９（２００３）を参考に実施例１と同様に合成した。第三に、ＰＬＰおよびＰＥＧの再構成Ｈｂへの修飾は、岩下雄二、  化学、  ４３、４４０（１９８８）を参考に実施例１と同様に合成した。最終的に、ＰＥＧおよびＰＬＰを修飾してＭｎＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍを再構成したＨｂ（ＰＥＧ修飾ＭｎＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ再構成Ｈｂ）を合成した。
【００２８】
実施例４：ＥＧ修飾再構成ＨｂのＳＯＤ活性評価（その１）：チトクロームｃ法による検討
ＰＥＧ修飾再構成ＨｂのＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２−・消去活性）をＭｃｃｏｒｄ、ＦｒｉｄｏｖｉｃｈらおよびＢｕｔｌｅｒらのチトクロームｃ法により評価した［（１）Ｊ．Ｍ．Ｍｃｃｏｒｄ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）および（２）Ｊ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｋｏｐｅｎｏｌ，Ｅ．Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，１０７４７（１９８２）］。具体的には下記のように行った。金属ポルフィリン濃度で１０００μＭ以下のＰＥＧ修飾再構成Ｈｂ溶液（Ａ溶液）を５水準以上調製した。次に，０．３ｍＭキサンチン水溶液、６０μＭチトクロームｃ水溶液およびｐＨ７．８、３０ｍＭリン酸緩衝水溶液を各２０ｍｌ加え、さらに、純水２４ｍｌを加えて混合溶液（Ｂ溶液）を得た。このＢ溶液２．１ｍｌにＡ溶液０．３ｍｌと純水０．２ｍｌを加えて放置（２５℃、１０ｍｉｎ）した。放置後の混合溶液に７μｇ／ｍｌカタラーゼ水溶液０．１ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）水溶液０．３ｍｌをすばやく混合して５５０ｎｍ（フェロチトクロームｃ生成に基づく吸収ピーク）におけるＵＶ−ｖｉｓの経時測定を行った（最終的な試験溶液の各成分の濃度は、金属ポルフィリン錯体０〜１００μＭ、キサンチン０．０５ｍＭ、ＸＯＤ２．５Ｕ／ｍｌ、チトクロームｃ１０μＭおよびカタラーゼ０．２３μｇ／ｍｌである。）。また、ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂ無添加系（ブランク）でも同様に測定した。これらＵＶ−ｖｉｓの経時測定における「時間−５５０ｎｍでの吸光度」の関係よりＰＥＧ修飾再構成Ｈｂ無添加系および添加系でのフェロチトクロームｃ生成速度（ｖｉおよびｖｏ）を求め、さらに、阻害率（ＩＣ）＝１−（ｖｉ／ｖｏ）の式より阻害率（ＩＣ）を算出し、最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度−ＩＣ」の関係よりＩＣ＝５０％おける金属ポルフィリン濃度（ＩＣ５０）を求めてこれをＳＯＤ活性の指標とした（ＩＣ５０が小さいほど高いＳＯＤ活性を示す）。なお、参照として再構成していないＰＥＧ修飾Ｈｂ、Ｈｂ、アポ化したＨｂ（金属ポルフィリン錯体のないＨｂ）等についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
【００２９】
表１に各種金属ポルフィリン錯体系のＩＣ５０を示す。なお、ＨｂのＩＣ５０＝２５．０はＹｕａｓａらの文献値である［Ｍ．Ｙｕａｓａ，Ａ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｕ．Ｍｉｄｏｒｉｋａｗａ，Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．Ｎａｇａｏｋａ，Ｊ．Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉ．，５２，１４９（２００３）］。どのＰＥＧ修飾再構成のＩＣ５０もＰＥＧ修飾Ｈｂ、Ｈｂ、アポ化したＨｂ（金属ポルフィリン錯体のないＨｂ）等のそれらよりも小さくなり、効果的なＳＯＤ活性を示している。
【００３０】
【表１】
2005027512.tif 000003
【００３１】
実施例５：ＰＥＧ修飾再構成ＨｂのＳＯＤ活性評価（その２）：ストップドフロー法による検討
ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂ（ここでは、ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂを検討し、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂ−ＰＥＧと略記する）のＳＯＤ活性（すなわち、Ｏ２−・消去活性）をＲｉｌｅｙらのストップドフロー法により評価した［Ｄ．Ｐ．Ｒｉｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．Ｒｉｖｅｒｓ，ａｎｄＲ．Ｈ．Ｗｅｉｓｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６，３４４（１９９１）］。具体的には下記のように行った。３６℃において、Ｏ２−・発生源である超酸化カリウムを含むジメチルスルホキシド溶液と各種濃度のＰＥＧ修飾再構成Ｈｂを含むＨ８．１、６０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液を急速混合し、Ｏ２−・に基づく２４５ｎｍの吸光度の減衰（Ｏ２−・消失反応の減衰曲線）を経時的に測定した。この減衰曲線より「ｌｎ（吸光度）−時間」の関係を求め、さらに、この関係の傾きより見かけの速度定数を算出した。最終的に、「金属ポルフィリン錯体濃度−見かけの速度定数」関係の傾きよりＯ２−・消失反応の速度定数（ｋｃａｔ）を求めた。なお、参照としてＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂ−ＰＬＰと略記する）、ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂと略記する）等についても同様にＳＯＤ活性を評価した。
【００３２】
表２に各種金属ポルフィリン錯体系のｋｃａｔを示す。なお、チトクロームｃ法の結果（ＩＣ５０）も合わせて示す。ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂ−ＰＥＧ）、ＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂ−ＰＬＰ）およびＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ（ＭｎＴ２ＭＰｙＰ−Ｈｂ）のｋｃａｔも１０６オーダーとなり、ＳＯＤ活性を示している。
【００３３】
【表２】
2005027512.tif 000004
【００３４】
実施例６：ＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの過酸化水素耐性
一般に、大過剰の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）存在下において、高分子マトリックスの無い低分子系の金属ポルフィリン錯体はポルフィリン環が露出しているため、Ｈ２Ｏ２と頻度高く相互作用するので分解し易く、高分子系は分解し難い［Ｒ．Ｆ．Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂ．Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１，１０２６（１９７９）］。ここで、ＰＥＧ修飾再構成ＨｂのＨ２Ｏ２耐性をＵＶ−ｖｉｓ測定より検討した。すなわち、Ｈ２Ｏ２との相互作用および分解に基づくポルフィリン錯体Ｓｏｒｅｔ帯吸収ピーク（４６３ｎｍ）の減衰曲線測定およびその減衰曲線からの半減期（ｔ１／２）の算出より評価した。なお、参照として、ＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ、  ＭｎＴ４ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ、Ｈｂ、ＭｎＴ４ＭＰｙＰ、銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）の結果も合わせて示す。また、試料の調製は実施例１〜３に基づき、Ｈ２Ｏ２濃度は金属ポルフィリン錯体濃度に対して大過剰の１０００倍とした。
【００３５】
これらの結果を表３に示す。これより、ｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ＝ＭｎＴ４ＭＰｙＰ＜Ｈｂ＝ＭｎＴ４ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ＝ＰＬＰ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂ＝ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂの順に増加した。ＰＥＧ修飾ＭｎＴ２ＭＰｙＰ再構成Ｈｂのｔ１／２はＣｕ／Ｚｎ−ＳＯＤのそれに比べて大きく、Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤに比べてＨ２Ｏ２耐性を有することが示唆された。
【００３６】
【表３】
2005027512.tif 000005
【００３７】
なお、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、必要に応じて変更することができる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂおよびその生成方法は、このように構成され作用するものであるので、生体適合性を有し、血中滞留性を有し、しかもＳＯＤ活性を備えているという優れた効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＳＯＤ活性を有するＰＥＧ修飾再構成Ｈｂの生成方法の工程を示す説明図
【図２】カチオン化金属ポルフィリン錯体の一例である金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（２−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ２ＭＰｙＰ）を示す化学式
【図３】カチオン化金属ポルフィリン錯体の一例である金属｛５，１０，１５，２０−テトラキス（４−メチルピリジル）ポルフィリン｝（ＭＴ４ＭＰｙＰ）を示す化学式
【図４】カチオン化金属ポルフィリン錯体の一例である金属［｛１，３，５，８−テトラメチル−２，４−ジビニル−６，７−ジ（４−メチルピリジルアミドエチル）｝ポルフィリン］（ＭＰＰＩＸ−ＤＭＰｙＡｍ）を示す化学式
【図１】
2005027512.tif 000006
【図２】
2005027512.tif 000007
【図３】
2005027512.tif 000008
【図４】
2005027512.tif 000009