(57)【要約】【課題】  尿細管に傷害がある腎機能障害を持ち、又は癌や感染症の大量化学療法を行う患者の腎機能障害を有効に予防・治療する。【解決手段】  白血球細胞であるＣＤ４５受容体細胞とＣＤ３４受容体細胞を、好ましくは細胞数組成において前者を４５％以上、後者を１％以上含有する腎機能障害予防・治療用細胞製剤。ヒトの末梢血幹細胞発現を抗癌剤や顆粒球刺激因子の投与により刺激した後、採血及び白血球分離操作により、例えば採取源である患者に使用するものとして、上記の腎機能障害予防・治療用細胞製剤を製造する方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球細胞であるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を含有することを特徴とする腎機能障害予防・治療用細胞製剤。
【請求項２】
前記細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が４５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が１％以上であることを特徴とする請求項１に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤。
【請求項３】
前記細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が９５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が２％以上であることを特徴とする請求項１に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤。
【請求項４】
ヒトの末梢血幹細胞発現を刺激したもとで、採血及び白血球分離操作によりＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を採取し、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の細胞製剤を製造することを特徴とする腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項５】
前記細胞製剤が、その採取源である患者に対して使用されるものであることを特徴とする請求項４に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項６】
前記の末梢血幹細胞発現を刺激する手段が、抗癌剤の投与及び／又は顆粒球刺激因子の投与であることを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項７】
前記抗癌剤の適宜な日数にわたる投与の後、白血球数の回復期を捉えて前記顆粒球刺激因子の適宜な日数にわたる投与を行うことを特徴とする請求項６に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項８】
前記抗癌剤の投与期間中、２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、かつ適宜な間隔で腎機能（Ｃｃｒ）のチェックを行うことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項９】
前記採血及び白血球分離操作を、血液中の白血球数（ＷＢＣ）が４０００／ｍｍ３  を超え、又は、血小板数（ＰＴＬ）が１００００００／ｍｍ３  を超えた時点で開始することを特徴とする請求項４〜請求項８のいずれかに記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項１０】
前記採血及び白血球分離操作において、少なくとも、血液成分分離装置を用いたアフェレーシスによる単核球分画の採取と、多血小板血漿及び赤血球の除去と、フローサイトメトリーによるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の算定とを行うことを特徴とする請求項４〜請求項９のいずれかに記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法。
【請求項１１】
以下の（１）及び／又は（２）に該当する患者に対して、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤を投与することを特徴とする腎機能障害の予防・治療方法。
（１）尿細管に傷害がある腎機能障害を持つ。
（２）癌あるいは感染症の大量化学療法を行っている。
【請求項１２】
前記大量化学療法を行う患者に対して２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、かつ腎機能（Ｃｃｒ）のチェック結果を指標として腎機能障害予防・治療用細胞製剤の投与時期を決定することを特徴とする請求項１１に記載の腎機能障害の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の白血球細胞を含有し、癌や感染症の化学療法に伴う腎不全等の尿細管に傷害があると考えられる腎機能障害に対して特に有効な腎機能障害予防・治療用細胞製剤に関する。
【０００２】
又、本発明は、実質的に無害な一定の投薬プロトコールに従って抗癌剤や顆粒球刺激因子をヒトに投与することにより末梢血幹細胞の発現を誘発し、採血及び白血球分離操作によって、上記した特定の白血球細胞を含有する細胞製剤を得る腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法に関する。
【０００３】
更に本発明は、癌や感染症の化学療法を行う際に重大な問題となる腎機能障害併発の予防を目的として、あるいは尿細管に傷害があると考えられる腎機能障害の治療を目的として、上記の腎機能障害予防・治療用細胞製剤を自己移植又は他者移植の形態で患者に投与する、腎機能障害の予防・治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
人間の死亡原因となる各種疾患の内でも、癌、感染症及び循環器障害は極めて重要である。そして近年、抗癌剤や抗生物質の目覚ましい開発に伴い、癌や感染症に対する化学療法の進歩は著しい。しかし一方で、これらの化学療法の副作用として腎機能障害を併発すると言う問題も生じている。
【０００５】
このような問題は、抗癌剤や抗生物質が標的たる体細胞や感染微生物のみならず正常な体細胞にも作用すると言う事情から、化学療法の宿命であると言える。特に最近は、顕著な化学療法効果を追求するために抗癌剤や抗生物質を大量に投与し、あるいは多剤併用を行う傾向にある。従って特に癌の化学療法において、副作用としての腎機能障害も高頻度化、重篤化する傾向がある。
【０００６】
例えば、造血系の悪性腫瘍、乳癌、卵巣腫瘍、精巣腫瘍等においては、新たな抗癌剤や多剤併用化学療法の開発とそれらの臨床応用により、長期生存や治癒の可能性も出てきている。しかし同時に、抗癌剤の正常細胞に対する殺細胞性に基づく障害や、更に２次的に血流を介した各種の障害を併発する危険性も高くなっている。そして化学療法に伴う合併症の中でも、腎機能障害においては化学療法の継続や患者の生命を脅かすような重篤な症状も多く見られ、放置することのできない重大な問題となっている。
【０００７】
このような問題に対して、現状では、点滴用輸液の調節や利尿剤の利用等によって腎機能障害の予防を図り、あるいは腎機能障害の自然回復を待つしか方法がない。より具体的に言えば、抗癌剤投与前には十分な腎機能評価を行い、抗癌剤投与後に腎機能評価を最低でも週１回は行う必要がある。既に腎機能障害の見られる患者では、腎毒性の強い抗癌剤の投与を避けたり、抗癌剤の大量投与をできるだけ避ける配慮が必要である。抗癌剤の大量投与を回避できない場合には、大量の輸液及び利尿剤投与を行い、尿細管障害を起こさないようにする配慮が求められる。又、抗癌剤であるメトトレキサートを用いる場合には、尿のアルカリ化を図ることも重要である。しかし結局のところは、これらの対策は腎機能障害を積極的に治癒又は改善するものではなく、腎機能障害の予防策又は対症療法であるに過ぎない。
【０００８】
一方、各種の免疫機能障害が原因となって起こる２次的な腎機能障害については、幾つかの改善方法が報告されている。
【０００９】
【非特許文献１】"Treament of severe systemic lupus erythematosuswith high-dose chemotherapy and haemopoietic stem-cell transplantation: a phase 1 study", Traynor AE, Schroeder J, Rosa RM, Cheng D, StefkaJ, Mujais S, Baker S, Burt RK,  Lancet. 2000 Aug 26;356(9231):701-7.
【非特許文献２】"High-dose chemotherapy and autologous peripheralblood stem cell transplantation in patients with multiple myeloma andrenal insufficiency", Ballster OF, Tummala R, Janssen WE, Fields KK,Hiemenz JW, Goldstein SC, Perkins JB, Sullivan DM, Rosen R, SacksteinR, Zorsky P, Saez R, Elfenbein GJ,  Bone Marrow Transplant. 1997 Oct;20(8):653-6
【非特許文献３】"Rapid reversal of nephrotic syndrome due toprimary systemic AL amyloidosis after VAD and subsequent high-dosechemotherapy with autologous stem cell support", Sezer O, Schmid P,Shweigert M, Heider U, Eucker J, Harder H, Sinha P, Radtke H,Possinger K,  Bone Marrow Transplant. 1999 May;23(9):967-9
【非特許文献４】"Stem cells in renal biology: Bone marrowtransplantation for the treatment of IgA nephropathy", Imasawa T,Utsunomiya Y,  Exp. Nephrol. 2002;10(1):51-8  例えば上記の非特許文献１〜非特許文献３においては、それぞれ、 SLE腎症、骨髄腫、アミロイド腎症が原因である２次的な腎機能障害を末梢血幹細胞の投与により改善させる方法が報告されている。又、上記の非特許文献４においては、 IgA腎症が原因である２次的な腎機能障害を骨髄移植により改善させる方法が報告されている。
【００１０】
しかし、上記非特許文献１〜非特許文献４においては、いずれも免疫機能障害に基づく腎機能障害を対象としている。免疫学的機序により生じる腎機能障害とは、具体的には糸球体疾患、即ち、炎症である糸球体腎炎や、基底膜が障害され血中の物質が漏出するネフローゼ症候群を意味する。
【００１１】
これに対して、癌の化学療法等に伴って発症する腎機能障害とは、抗癌剤の細胞毒性が直接に作用して起こる尿細管の障害であり、しかも、単なる機能障害ではなく、尿細管の細胞／組織の破壊や脱落を伴う組織「傷害」であると考えられる。
【００１２】
即ち、非特許文献１〜非特許文献４が対象とする糸球体疾患と、化学療法等に起因する尿細管傷害とは、共に腎臓の障害ではあるが、発症原因、障害組織及び障害の内容が全く異なる。従って、非特許文献１〜非特許文献４の方法は、化学療法等に伴って発症する腎機能障害（尿細管傷害）の改善のためには参考とならない。又、非特許文献１〜非特許文献３で用いる末梢血幹細胞は、糸球体疾患の改善を考慮したものであり、尿細管傷害の改善に有効であるとは考え難い。
【００１３】
更に、非特許文献４のように骨髄移植を行う方法では、ａ）移植に必要な量の骨髄の採取には全身麻酔を余儀なくされる、ｂ）一旦骨髄を空にした後、点滴静注した骨髄液の造血幹細胞を骨髄に定着・増殖させて造血を回復させるが、その回復（約１ケ月を要する）が遅い、ｃ）白血病細胞は末梢血中よりも骨髄中にある傾向が強いと言われるので、骨髄移植によって腫瘍細胞が混入する危険性が相対的に高い、等の問題が指摘される。
【００１４】
【非特許文献５】"Bone marrow stem cells contribute to repair ofthe ischemically injured renal tubule", Kale S, Karihaloo A, Clark PR,Kashgarian M, Krause DS, Cantley LG,  J. Clin. Invest. 2003  次に、上記の非特許文献５においては、非免疫性腎機能障害機序のモデルとして虚血再環流ラットを用いて、放射線照射による骨髄障害群（ BMA）と、これに対して骨髄移植を行った群（ BMA-SCT）と、放射線照射していない骨髄非障害群（ Comtrol）とについて腎機能を比較・評価している。しかし、要するに非特許文献４の場合と同様に骨髄移植法であり、内容的に腎機能改善ではなく病体解明に関するものである。
【００１５】
【非特許文献６】"Endothelial disfunction in ischemic acute renalfailure: Rescue by transplanted endothelial cells", Brodsky SV,Yamamoto T, Tada T, Kim B, Chen J, Kajiya F, Goligorsky MS,Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F1140-F1149(2002)  又、上記の非特許文献６においては、非特許文献５の場合と同様に虚血再環流ラットを対象とするが、ヒト臍帯血管内皮細胞を頸動脈から注入して、再環流後２４時間の腎機能として尿細管周囲の毛細血管の血流を測定し、血流障害を減弱させたことを報告している。即ち、分化細胞であるヒト臍帯血管内皮細胞を用いている点、腎循環障害を対象としている点等が指摘される。
【００１６】
【特許文献１】特表２０００−５０８６３３号公報  更に、上記の特許文献１においては、幹細胞周期を調節するため、及び化学療法後の末梢血細胞再生を促進するため、幹細胞調節因子として「Ｃ末端疎水性ドメインが置換又は欠失されているヘモグロビンα鎖を含むポリペプチド」を単離及び使用する方法を開示している。即ち、化学療法後の末梢血細胞の再生に着目したものではあるが、具体的にはタンパク質製剤の利用に関するもので、しかも特段に腎機能障害に焦点を当てたものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ところで、医学の現状における一般論として、複雑な構成と形状を有する糸球体の再生は不可能であるが、比較的単純な管腔形態を有する尿細管は再生可能であるとされている。従って、前記のような非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害（尿細管傷害）を好適な幹細胞の利用によって改善できる可能性を予見することができる。但し、患者におけるストレスや各種のリスクが大きく改善に長期間を要する骨髄移植のような方法は別として、前記した各種の非特許文献や特許文献に見られるように、非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害を、患者負担の少ない簡易な方法により短期間に改善できる具体的手段は、未だ提案されていない。
【００１８】
そこで本発明は、このような効果を期待できる腎機能障害予防・治療用細胞製剤と、その製造方法と、腎機能障害の予防・治療方法とを提供することを、解決すべき技術的課題とする。本願発明者は、非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害の改善に有効な幹細胞（白血球細胞）の具体的な種類を解明し、更にその実質的に無害で効率的な採取方法を開発して、上記の技術的課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、白血球細胞であるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を含有する、腎機能障害予防・治療用細胞製剤である。
【００２０】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が４５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が１％以上である、腎機能障害予防・治療用細胞製剤である。
【００２１】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明に係る細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が９５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が２％以上である、腎機能障害予防・治療用細胞製剤である。
【００２２】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、ヒトの末梢血幹細胞発現を刺激したもとで、採血及び白血球分離操作によりＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を採取し、第１発明〜第３発明のいずれかに係る細胞製剤を製造する、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２３】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第４発明に係る細胞製剤が、その採取源である患者に対して使用されるものである、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２４】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記の第４発明又は第５発明に係る末梢血幹細胞発現を刺激する手段が、抗癌剤の投与及び／又は顆粒球刺激因子の投与である、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２５】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第６発明に係る抗癌剤の適宜な日数にわたる投与の後、白血球数の回復期を捉えて前記顆粒球刺激因子の適宜な日数にわたる投与を行う、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２６】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る抗癌剤の投与期間中、２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、かつ適宜な間隔で腎機能（Ｃｃｒ）のチェックを行う、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２７】
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第４発明〜第８発明のいずれかに係る採血及び白血球分離操作を、血液中の白血球数（ＷＢＣ）が４０００／ｍｍ３  を超え、又は、血小板数（ＰＴＬ）が１００００００／ｍｍ３  を超えた時点で開始する、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２８】
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第４発明〜第９発明のいずれかに係る採血及び白血球分離操作において、少なくとも、血液成分分離装置を用いたアフェレーシス（血液体外循環）による単核球分画の採取と、多血小板血漿及び赤血球の除去と、フローサイトメトリーによるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の算定とを行う、腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法である。
【００２９】
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、以下の（１）及び／又は（２）に該当する患者に対して、第１発明〜第３発明のいずれかに記載の腎機能障害予防・治療用細胞製剤を投与する、腎機能障害の予防・治療方法である。
（１）尿細管に傷害がある腎機能障害を持つ。
（２）癌あるいは感染症の大量化学療法を行っている。
【００３０】
（第１２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、前記第１１発明に係る大量化学療法を行う患者に対して、２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、かつ腎機能（Ｃｃｒ）のチェック結果を指標として腎機能障害予防・治療用細胞製剤の投与時期を決定する、腎機能障害の予防・治療方法である。
【発明の効果】
【００３１】
（第１発明の効果）
第１発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤は、腎機能障害の予防又は治療のために非常に有効である。腎機能障害の種類は特に限定されず、例えば、各種の免疫機能障害が原因となって起こる２次的な腎機能障害（炎症である糸球体腎炎や、基底膜が障害され血中の物質が漏出するネフローゼ症候群等）にも有効であると考えられる。しかしながら、特に注目されるのは、尿細管に傷害があると考えられる腎機能障害の予防又は治療に有効である点である。
【００３２】
最近は、抗癌剤や抗生物質の大量投与や多剤併用等の副作用として腎機能障害が頻発化・重篤化する傾向があり、しかもこれらの腎機能障害は非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害であって、尿細管傷害に起因していると考えられる。従来、このような腎機能障害の対策としては、点滴用輸液の調節や利尿剤の利用等の対症療法的な手段しかなかったので、第１発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の有効かつ適切な利用が望まれる。
【００３３】
第１発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤が、腎機能障害、とりわけ尿細管傷害に有効である理由は未だ完全には解明されていないが、恐らくは、幹細胞であるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞が特定の相乗的な働きを示し、比較的単純な管腔形態を有する尿細管の傷害を治癒して健全な尿細管を再生させるのではないか、と考えられる。
【００３４】
（第２発明の効果）
上記した第１発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤は、有効成分としてＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞が含有されている限りにおいて有効な効果を期待できるが、細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が４５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が１％以上である場合に、腎機能障害の予防及び治療効果が特に著しい。
【００３５】
（第３発明の効果）
腎機能障害予防・治療用細胞製剤の細胞数組成において、ＣＤ４５受容体細胞が９５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が２％以上である場合に、腎機能障害の予防及び治療効果がとりわけ著しい。
【００３６】
（第４発明の効果）
第４発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法によって、第１発明〜第３発明の細胞製剤を効率的に製造することができる。しかも、この製造方法においては、要するに、ヒトの末梢血幹細胞発現を刺激するプロセスと、採血及び白血球分離のプロセスからなるので、前記した骨髄移植法のように、例えば全身麻酔、造血回復期間の長期化、腫瘍細胞の混入の危険性などと言うヒトに対する大きなストレスやリスクの負荷を避けることができる。
【００３７】
（第５発明の効果）
上記した第４発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法によって製造された細胞製剤は、血液型の適合等の配慮のもとで、その採取源であるヒト以外のヒトに対して使用できることはもち論であるが、その採取源であるヒト自身のために使用することが、より好ましい。
【００３８】
（第６発明の効果）
末梢血幹細胞の発現を刺激する手段は、その目的を安全に達成できる限りにおいて限定されないが、例えば抗癌剤の投与、及び／又は、顆粒球刺激因子の投与を好ましく例示することができる。抗癌剤の投与と顆粒球刺激因子の投与とを共に行うことが、特に好ましい。
【００３９】
抗癌剤や顆粒球刺激因子の投与プロトコールは、対象者が健常人である場合や疾患を持つ患者である場合等に応じて、その対象者に無用のストレスやリスクを与えないような、実質的に無害なプロトコールに従うことが望ましい。
【００４０】
（第７発明の効果）
上記の第６発明において、抗癌剤の投与と顆粒球刺激因子の投与とを共に行う場合、まず抗癌剤の適宜な日数にわたる投与を行い、その後白血球数の回復期を捉えて顆粒球刺激因子の適宜な日数にわたる投与を行う、と言うプロトコールに従うことが、対象者に対するストレスやリスクの回避の見地からも、目的とするＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の効率的製造の見地からも、とりわけ好ましい。
【００４１】
（第８発明の効果）
この腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法における抗癌剤の投与は、癌の予防や治療のためではなく細胞製剤の製造を目的とするから、無理な投薬プロトコールによる腎機能の悪化は避ける必要がある。従って、抗癌剤の投与期間中は、第８発明のように、利尿管理を行うと共に、適宜な間隔でクレアチンクリアランス（Ｃｃｒ）を測定して腎機能のチェックを行うことが好ましい。
【００４２】
（第９発明の効果）
ヒトに抗癌剤や顆粒球刺激因子等を投与して末梢血幹細胞発現を刺激する一定のプロトコールにおいて、末梢血幹細胞の発現量には一定の経時的変化が見られることが分かっている。従って、より多量のＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞をより効率的に採取できるタイミングを知るためには、血液中の白血球数（ＷＢＣ）又は血小板数（ＰＴＬ）を指標とすることが合理的である。
【００４３】
より具体的には、第９発明のように、血液中の白血球数が４０００／ｍｍ３  を超え、又は血液中の血小板数が１００００００／ｍｍ３  を超えた時点で採血及び白血球分離操作を開始することが好ましい。
【００４４】
（第１０発明の効果）
採血及び白血球分離操作は、例えば実験室的なマニュアル操作によって行っても良いが、これらの一連の操作を自動的に行える各種の血液成分分離装置が市場に提供されており、それを利用した方が便利である。そして、通常の採血及び白血球分離操作においては、単核球分画の採取プロセスと、多血小板血漿及び赤血球の除去プロセスとを含む。これらは血液成分分離装置を用いたアフェレーシスによって容易に実行できる。
【００４５】
又、ＣＤ４５受容体細胞とＣＤ３４受容体細胞を含む分画を得た後は、例えばフローサイトメトリーによって、その分画におけるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の個数（／ｍｍ３  ）、及び／又は、細胞数組成（総細胞個数中の当該細胞個数のパーセンテージ）を算定しておくことが好ましい。
【００４６】
（第１１発明の効果）
第１１発明は、第１発明〜第３発明に係る細胞製剤を用いて腎機能障害の予防又は治療を行う方法であって、その対象となる患者は、尿細管に傷害がある腎機能障害を持ち、及び／又は、癌あるいは感染症の大量化学療法を行っている者である。この予防・治療方法により、尿細管に傷害がある腎機能障害の顕著な改善効果、あるいは癌や感染症の大量化学療法に伴う腎機能障害の顕著な予防効果を期待することができる。
【００４７】
（第１２発明の効果）
上記した第１１発明における大量化学療法を行う患者に対しては、第１２発明のように、利尿管理を行うと共に、適宜な間隔でクレアチンクリアランスを測定して腎機能のチェックを行うことが、より好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
次に、本願の第１発明〜第１２発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。
【００４９】
〔腎機能障害予防・治療用細胞製剤〕
周知のように、ＣＤ４５受容体細胞とは、白血球を染める抗体であるＣＤ４５に対して陽性の反応を示す白血球細胞であり、ＣＤ３４受容体細胞とは、末梢血幹細胞を染める抗体であるＣＤ３４に対して陽性の反応を示す白血球細胞である。これらのＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞は、幹細胞の一種であることが知られている。
【００５０】
本発明に係る腎機能障害予防・治療用細胞製剤は、少なくとも上記のＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を含有する細胞製剤であり、その製造方法もしくは調製方法としては、前記の第４発明〜第１０発明の方法が好ましいが、他の方法により製造又は調製されたものを含む。
【００５１】
細胞製剤において、ＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の細胞数組成、即ち単位量の細胞製剤中における総細胞個数中の当該細胞個数のパーセンテージは限定されない。但し、ＣＤ４５受容体細胞が４５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が１％以上であることが好ましく、ＣＤ４５受容体細胞が９５％以上、ＣＤ３４受容体細胞が２％以上であることが更に好ましい。従って、本発明の細胞製剤中には、一定の組成比で、上記の有効成分たる２種の白血球細胞以外の白血球細胞や、その他の種類の血液系の細胞又は血液系以外の体細胞が混入していることがある。なお、赤血球、顆粒球や血小板等は細胞製剤の粘性を高くすると言う不具合があるため、なるべく除外しておいたほうが良い。
【００５２】
本発明に係る細胞製剤には、例えばヒトアルブミン付加ＣＰ−１溶液を付加する場合のように、細胞製剤の保存性又は安定性を高めたり、有効成分たる白血球細胞を保護したりするために、任意の成分を添加することができる。このような添加剤として、他に５％ＤＭＳＯ、６％ハイドロジエチルスターチ等を例示することができる。又、本発明の細胞製剤は、他の血液製剤の場合と同様に、温度の一定した冷暗所に保管することが好ましい。
【００５３】
本発明に係る細胞製剤の用途は限定されない。一般的には、任意の腎機能障害の予防又は治療のために使用される。腎機能障害には、 SLE腎症、骨髄腫、アミロイド腎症等の各種の免疫機能障害が原因となって起こる２次的な腎機能障害も含まれるし、非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害（例えば、尿細管傷害に起因する腎機能障害）も含まれる。最も好ましい用途が、非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害の治療又は予防（例えば、癌等の大量化学療法の実施に伴う腎機能障害の予防）である。
【００５４】
〔腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法〕
本発明の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法は、少なくとも、ヒトの末梢血幹細胞発現を刺激する工程と、採血及び白血球分離操作によりＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を採取する工程とを含むものである。ここに、上記の対象者たる「ヒト」とは健常人であることが好ましいが、製造した細胞製剤を対象者自身に投与する「自己使用」の場合には、一定の疾患を持っていてもやむを得ない。その場合、特に対象者が腎機能障害を持っている場合、対象者に対する後述のプロトコールの設計には、特段の慎重な配慮が要求される。
【００５５】
末梢血幹細胞発現を刺激する手段は、対象者に対する医療上のストレスやリスクを配慮したもとで、特段に限定されない。但し、抗癌剤の投与、及び／又は、顆粒球刺激因子の投与が特に有効である。抗癌剤や顆粒球刺激因子の種類は限定されず、必要な考慮事項の検討のもとに適宜に選択することができる。
【００５６】
一般的な抗癌剤としてはカーボプラチン（Carboplatin ：例えば、バラプラチン、ＣＢＤＣＡ、抗悪性腫瘍プラチナ剤等の商品名で提供されている）、エトポシド（Etoposide ：植物性アルカロイド Podophylotoxine系抗癌剤である。例えば、ＶＩＰ１６、ベプシド、ラステット等の商品名で提供されている）、シクロフォスファミド（Cyclophosphamide：アルキル化剤 Nitrogenmutard 系抗癌剤である。例えばエンドキサチン等の商品名で提供されている）、ミトキサントロン（ＭＩＴ：Mitoxantrone）、ドキソルビシン（ＤＸＲ：Doxorubicin ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ：Vincristine ）、プレドニゾロン（ＰＳＬ：Prednisolone）、シタラビン（ＣＡ：Cytarabine）、ダウノルビシン（ＤＮＲ：Daunorubicin）、６−チオグアニン（６−ＴＧ：6-Thioguanine ）、アクラルビシン（ＡＣＲ：Aclarubicin ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ：5-Fluorouracil）、メトトレキサート（ＭＴＸ：Methotrexate）、シスプラチン（ＣＤＤＰ：Cisplatin ）等を例示することができる。
【００５７】
一般的な顆粒球刺激因子としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＳＣＦ等を例示することができる。
【００５８】
末梢血幹細胞発現を刺激する手段として抗癌剤の投与、及び顆粒球刺激因子の投与を行う場合、投与のプロトコールは特に限定されないが、好ましくは、抗癌剤の適宜な日数にわたる投与の後、白血球数の回復期を捉えて前記顆粒球刺激因子の適宜な日数にわたる投与を行うことが好ましい。ここに、抗癌剤の投与日数は例えば３〜７日程度とすることができ、白血球数の回復期としては例えば抗癌剤の投与終了後１週間〜２週間を経過した時点とすることができ、顆粒球刺激因子の投与日数は例えば５〜１０日程度とすることができる。
【００５９】
末梢血幹細胞発現を刺激する手段として抗癌剤の投与を行う期間中においては、点滴用輸液の調節や利尿剤の利用等によって２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、適宜な間隔でクレアチンクリアランス（Ｃｃｒ）を測定して、腎機能のチェックを行うことが望ましい。
【００６０】
対象者の血液中に末梢血幹細胞を発現させた後に、採血及び白血球分離操作を行い、ＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞を採取する。この採血及び白血球分離操作を開始するタイミングは、ケース・バイ・ケースで任意かつ適宜に判断すべき問題であるが、一つの有効な指標として、対象者の血液中の白血球数（ＷＢＣ）が４０００／ｍＬを超えた時点、又は血小板数（ＰＴＬ）が１００００００／ｍＬを超えた時点を例示することができる。ＷＢＣ又はＰＴＬにおけるこれらの数値は、末梢血幹細胞の十分な発現を示唆しているからである。
【００６１】
採血及び白血球分離操作を行う方法は、可能な範囲で任意に決定すれば良いが、例えば、血液成分分離装置を用いたアフェレーシスによる単核球分画の採取と、多血小板血漿及び赤血球の除去と、フローサイトメトリーによるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の算定とを行うことが好ましい。
【００６２】
アフェレーシス（血液体外循環）とは、一般的には、血液透析療法では除去できない高分子量のタンパク質等が病因物質となる種々の疾患に対して行う体外循環治療を言うが、ここで言うアフェレーシスとは、対象者の血液を体外循環させて血液成分分離装置に通し、ターゲットであるＣＤ４５受容体細胞とＣＤ３４受容体細胞とを効率的かつ大量に採取する手法を言う。
【００６３】
又、フローサイトメトリーによるＣＤ４５受容体細胞及びＣＤ３４受容体細胞の算定方法は良く知られた事項であるが、その内容を以下に簡単に説明すると、 Radiofrequency ／ Direct Current 法にて細胞サイズを２次元に展開すると、未熟な細胞ほど下方へ展開されるので、上記のＣＤ３４受容体細胞等は下方領域に示されるのである。
【００６４】
〔腎機能障害の予防・治療方法〕
本発明に係る腎機能障害の予防・治療方法は、尿細管に傷害がある腎機能障害を持ち、及び／又は、癌あるいは感染症の大量化学療法を行っている患者に対して、上記の腎機能障害予防・治療用細胞製剤を投与する方法である。前記の腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法において抗癌剤等を末梢血幹細胞発現の刺激手段として投与する場合とは異なり、この場合には、使用する抗癌剤や抗生物質の種類、投与量、投与期間等は、化学療法のプロトコールに従って決定される事項である。
【００６５】
このような化学療法のプロトコールに対して、細胞製剤の投与の時期や投与量をどのように設定してプロトコールに組み込むかと言う点は、ケース・バイ・ケースで適宜に決定される。但し、一般的には、大量化学療法の実施直後〜数日後に細胞製剤を投与することが、コストパフォーマンスも含めて最も効果的であると考えられる。腎機能障害予防・治療用細胞製剤の投与回数や投与量は必要に応じて決定すべき事項であり、一律には規定できない。
【００６６】
本発明に係る腎機能障害の予防・治療方法において、癌あるいは感染症の大量化学療法の実施期間中においては、点滴用輸液の調節や利尿剤の利用等によって２０００〜３０００ｍＬ／ｄａｙを目標として利尿管理を行い、適宜な間隔でクレアチンクリアランス（Ｃｃｒ）あるいは尿中ＮＡＧ又はβ２  ＭＧを測定して、腎機能のチェックを行うことが望ましい。
【実施例】
【００６７】
次に、本発明に係る実施例１及び実施例２を説明する。これらの実施例が本発明の技術的範囲を限定するものでないことは、もちろんである。
【００６８】
実施例１として、癌患者に対して、図１（ａ）のプロトコールに従い抗癌剤や顆粒球刺激因子の投与等を行った。実施例１の直接の目的は、癌の治療そのものではなく、本発明に係る腎機能障害予防・治療用細胞製剤を自己使用のために調製する点にある。従って、実施例１では抗癌剤等の投与量は比較的低減されている。そして実施例２は同じ癌患者に対する抗癌剤の大量化学療法であって、図１（ｂ）に示すように、そのプロトコール中に実施例１で調製した細胞製剤の投与を組み込んだものである。
【００６９】
（実施例１：腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造）
対象者である癌患者は、精巣等に癌の原発巣を有し、あるいは更に肺、肝臓、腹膜等への転移癌を有する１８名である。これらの癌患者に対して、第１日から第５日にわたり、Ｃｉｓ（抗癌剤：前記したシスプラチン）とＶＩＰ１６（抗癌剤：前記したエトポシド）とを投与した。１日当たりの投与量はＣｉｓが１００ｍｇ／ｍ２  、ＶＩＰ１６が２０ｍｇ／ｍ２  であった。これとは別に、第２日から第１６日にわたり、抗癌剤であるブレオマイシンを３０ｍｇ／ｂｏｄｙ投与した。なお、第１日から第７日にわたり、毎日、２０００〜３０００ｍＬの利尿を確保した。
【００７０】
第１日の抗癌剤の投与開始以来、各患者の血中における白血球数（ＷＢＣ）の推移をトレースしていると、詳細なデータの提示は省略するが、全体的に最初の数日間はＷＢＣが低下傾向にあるが、第１２日ないし第１３日に白血球数の回復期を迎えた。そこで、第１４日から顆粒球刺激因子Ｇ−ＣＳＦ（商品名：ノイアップ）の投与を開始した。その投与量は、５ｍｇ／ｋｇ i.v. である。
【００７１】
Ｇ−ＣＳＦの投与開始後において更に各患者のＷＢＣをトレースしていると、全体的に第１８日頃からＷＢＣが顕著な増大傾向を見せ始め、第２１日にはＷＢＣが４０００／μＬを超える患者も出て来た。このため、Ｇ−ＣＳＦの投与を第２１日で終了し、この時点（図示のプロトコール中において、「ＰＢＳＣＨ」の表記で示す）で対象者から採血して白血球分離操作を行った。
【００７２】
上記採血及び白血球分離操作においては、Fresenius HemoCare Inc. 製の連続血液成分分離装置 AS104, AS.TEC204 を用い、各患者について２回のアフェレーシスを行った。１回のアフェレーシスでは、約３時間かけて１０〜１５Ｌの血液を処理して単核球分画を採取し、バック遠沈法にて多血小板血漿と赤血球を除去して Buffy Coat を回収し、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を付加した。これに２５％ヒトアルブミン付加ＣＰ−１溶液を等量付加した後、細胞製剤として凍結バッグに分注し、−８０°Ｃにて保存した。
【００７３】
（実施例２：腎機能障害の予防・治療）
実施例２を示す図１（ｂ）のプロトコールにおいては、便宜的に、実施例１で調製した細胞製剤を投与する日を基準日（第０日）として表記している。従って、図１（ｂ）中の例えば「−６」との表記は、「第−６日」、即ち基準日の６日前を意味する。又、図１（ｂ）のプロトコールにおける最初の抗癌剤投与日である第−８日は、前記図１（ａ）のプロトコールにおける「ＰＢＳＣＨ」の日から適宜な間隔をおいている。
【００７４】
まず、各患者に対して第−１０〜第−９日頃から毎日２０００〜３０００ｍＬの利尿を確保する利尿管理に入った。そして、第−８日、第−６日及び第−４日にそれぞれ、５００ｍｇ／ｍ２  ＣＢＤＣＡ（抗癌剤：前記カーボプラチン）と、４００ｍｇ／ｍ２  のＶＩＰ１６とを投与した。又、第−６日及び第−４日にそれぞれ、Ｃｙｃ（抗癌剤シクロフォスファミド）を５００ｍｇ／ｋｇ投与した。
【００７５】
次に、各患者に対して、第０日において、前記実施例１で調製し保存しておいた自己由来の細胞製剤を投与した。投与形態は点滴静注により、又、投与量は実施例１で調製した全量である。
【００７６】
各患者の腎機能を、所定の時期にクレアチンクリアランス（Ｃｃｒ）を測定したチェックした。所定の時期とは、図１（ｂ）のプロトコール中に「Ｃｃｒ」の表記で示すように、大量化学療法の開始直前（ before HDCT）、大量化学療法の終了直後（after HDCT）、細胞製剤投与後１週間以内（ within 1 week after PBSCT）、及び、細胞製剤を投与した日から２週間後（ 2 week after PBSCT ）である。これらのＣｃｒの測定結果を図２の棒グラフに示す。図２において、縦軸はＣｃｒの測定値を示し、各棒グラフは上記のそれぞれの時期における各患者のＣｃｒ測定値の平均値と標準偏差を表している。
【００７７】
図２より明らかなように、腎機能は、大量化学療法の開始前に比較して抗癌剤の投与直後には低下の傾向を認め、細胞製剤の投与後１週間から２週間には有意に改善した。更に、詳細なデータの提示は省略するが、数名の患者において尿細管尿中マーカーとしてのβ２  ＭＧが著名な改善を示した。例えば、１０８μｇ／Ｌの改善を示した患者や、１３５μｇ／Ｌの改善を示した患者が見られた。
【００７８】
以上の結果から、癌の大量化学療法は尿細管細胞に細胞毒性に作用することが裏付けられ、又、そのような腎機能の悪化（非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害）に対して、本発明に係る細胞製剤の投与が非常に有効であることが判明した。なお、本発明の細胞製剤は、Ｃｃｒが改善したことにより糸球体に作用したことが推測され、又、尿中β２  ＭＧが改善したことにより尿細管に作用したことが推測される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によって、新たな腎機能障害予防・治療用細胞製剤及びその製造方法と、この腎機能障害予防・治療用細胞製剤を用いた腎機能障害の予防・治療方法が提供される。これらは、従来において有効な対処手段がなかった非免疫性で直接細胞毒性の腎機能障害に対する有効な効果をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１（ａ）は腎機能障害予防・治療用細胞製剤の製造方法におけるプロトコールの１例を示し、図１（ｂ）は腎機能障害の予防・治療方法におけるプロトコールの１を示す。
【００８１】
【図２】実施例における腎機能の改善をＣｃｒの測定値により示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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