(57)【要約】【課題】  基板上の特定の場所における特定の生体関連物質を高感度に検出かつ識別する新規な手法を提供する。【解決手段】  探針の表面が生体関連物質で修飾され、かつ、発生した熱量を検出する機構を有する走査型プローブ顕微鏡を用いて上記の操作を行う。前記生体関連物質がタンパク質であり、前記探針の表面に化学的に結合している。前記熱量を検出する機構がカンチレバーの反りを変位検出のレーザーにより検出するバイメタル方式を利用した機構、カンチレバーの熱起電力の変化を検出する熱電対方式を利用した機構、またはカンチレバーの電気抵抗の変化を検出する抵抗線方式を利用した機構である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料表面に接近させて走査するための探針を有する走査型プローブ顕微鏡であって、
前記探針の表面が生体関連物質で修飾され、かつ、前記探針により前記探針と前記試料表面の間に生じる熱量を検出する機構が備わっていることを特徴とする走査型プローブ顕微鏡。
【請求項２】
前記生体関連物質が前記探針の表面に化学的に結合していることを特徴とする請求項１に記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項３】
前記生体関連物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項４】
前記タンパク質が抗原抗体反応を起こす抗原または抗体のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項５】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの反りを変位検出のレーザーにより検出するバイメタル方式を利用した機構であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項６】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの熱起電力の変化を検出する熱電対方式を利用した機構であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項７】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの電気抵抗の変化を検出する抵抗線方式を利用した機構であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡。
【請求項８】
探針を試料表面に接近させて走査し、前記探針と前記試料表面の間に生じる熱量を測定する走査型プローブ顕微鏡に用いる探針であって、
前記探針の表面が生体関連物質で修飾され、かつ、前記探針により前記熱量を検出する機構が備わっていることを特徴とする走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項９】
前記生体関連物質が前記探針の表面に化学的に結合していることを特徴とする請求項８に記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１０】
前記生体関連物質がタンパク質であることを特徴とする請求項８または９のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１１】
前記タンパク質が抗原抗体反応を起こす抗原または抗体のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１２】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの反りを変位検出のレーザーにより検出するバイメタル方式を利用した機構であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１３】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの熱起電力の変化を検出する熱電対方式を利用した機構であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１４】
前記熱量を検出する機構がカンチレバーの電気抵抗の変化を検出する抵抗線方式を利用した機構であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載の走査型プローブ顕微鏡用探針。
【請求項１５】
複数の生体関連物質を基板上に固定してなる試料について、前記複数の生体関連物質の中から特定の生体関連物質を検出する方法であって、
探針の表面が前記特定の生体関連物質に特異的に反応する生体関連物質で修飾され、かつ、前記特異的反応の反応熱を走査型プローブ顕微鏡により検出することを特徴とする生体関連物質の検出方法。
【請求項１６】
前記生体関連物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１５に記載の生体関連物質の検出方法。
【請求項１７】
前記タンパク質が抗原抗体反応を起こす抗原および抗体の組み合わせであることを特徴とする請求項１６に記載の生体関連物質の検出方法。
【請求項１８】
少なくとも水を含む液中において行う請求項１５〜１７のいずれかに記載の生体関連物質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡用探針とそれらを用いた生体関連物質の検出方法に関する。詳しくは、本発明は、微量熱量を検出できるカンチレバーを用いてタンパク質を高感度に検出かつ識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型プローブ顕微鏡（Scanning Probe Microscope；ＳＰＭ）は微小サイズの先端曲率半径をもつ探針を試料表面のごく近傍まで接近させ、探針−試料間の距離を一定に保ちながら試料表面を走査し、探針−試料に働く相互作用を検出する手法である。探針−試料間に流れるトンネル電流を検出する走査型トンネル顕微鏡（Scanning Tunneling Microscope；ＳＴＭ）、探針−試料間に働く原子間力を検出する原子間力顕微鏡（Atomic Force Microscope；ＡＦＭ）などが一般的に知られている。ＳＰＭは微小領域の形状評価のほかに熱量、摩擦力、磁気力、表面電位、粘弾性などの物理量も評価でき、その機能の多様化とともに応用範囲が拡大している。
【０００３】
タンパク質を高密度に集積したプロテイン（タンパク質）チップの解析手法として、抗原抗体反応の特異性を利用した様々な手法が用いられている。その中でも蛍光抗体染色法が最も広く利用されている。
【０００４】
蛍光抗体染色法はＦＩＴＣ(Fluorescein isothiocyanate；緑色蛍光)やＴＲＩＴＣ (Tetramethyl Rhodamine isothiocyanate；赤橙色蛍光）などの蛍光色素で標識した抗体（蛍光抗体）を細胞あるいは組織標本と反応させる。対応する抗原が存在すれば、蛍光抗体はその抗原と特異的に結合する。結合しなかった余分の蛍光抗体は洗い流し、抗原と結合した蛍光抗体の蛍光を蛍光顕微鏡により観察する（直接法）。また、抗原に特異的な一次抗体を反応させた後、一次抗体に特異的な二次抗体を反応させ、抗原・一次抗体・二次抗体の結合物を形成させる（間接法）こともある。この場合は二次抗体を蛍光標識する。蛍光抗体染色法により標的抗原の存在を迅速、的確かつ簡便に知ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光標識による検出は１分子検出が可能なほど高感度である。しかしながら、蛍光標識によるタンパク質の失活、基板への非特異吸着などの問題点が指摘されている。
【０００６】
本発明は、前記の課題を解決するもので、基板上の特定の場所における特定の生体関連物質を高感度に検出かつ識別する新規な手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題について鋭意検討した結果、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、本発明の生体関連物質の検出方法は、探針の表面が前記生体関連物質と相互作用する物質で修飾され、かつ、前記探針により微量な熱量を検出する機構が備わっていることを特徴とする走査型プローブ顕微鏡である。
【０００９】
また、本発明は、前記熱量を検出する機構が、カンチレバーの反りを変位検出のレーザーにより検出するバイメタル方式またはカンチレバーの熱起電力の変化を検出する熱電対方式またはカンチレバーの電気抵抗の変化を検出する抵抗線方式を利用した機構のいずれかであることを特徴とする走査型プローブ顕微鏡である。
【発明の効果】
【００１０】
特定の生体関連物質を高感度に検出かつ識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、カンチレバー表面を生体関連物質と相互作用する物質で修飾し、これらが作用した際の熱量の変化をモニターすることにより当該生体関連物質を検出することを特徴としている。
【００１３】
本発明でいう生体関連物質とは、
（１）オリゴデオキシヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）などのＤＮＡ
（２）ＲＮＡ
（３）タンパク質
である。とりわけ、その生体関連物質はタンパク質であることが好ましい。
【００１４】
本発明で使用するカンチレバーの構成として
（１）バイメタル方式
（２）熱電対方式
（３）抵抗線方式
が挙げられる。
【００１５】
（１）の方式では、シリコンまたは窒化シリコン製のカンチレバーの片面に金またはアルミニウム等の金属薄膜をコーティングしたものを用いる。これらのカンチレバーはカンチレバーの材質と蒸着金属との熱膨張率の差によりバイメタルとして動作する。熱膨張率がカンチレバーの材質と大きく異なる金属を選択することで、バイメタルとして動作したときの発生力を大きくすることができる。典型的なカンチレバーの熱容量は３ｎＪ／Ｋと非常に小さいことから高感度かつ高速の熱量検出が可能であり、熱量の検出下限は２０ｆＪと見積もられている。バイメタル方式では熱量変化によるカンチレバーの反りを変位検出のレーザーにより検出する。
【００１６】
（２）の方式では、細線熱電対を先鋭化してカンチレバーとしたもの、シリコンまたは窒化シリコン製のV字型カンチレバーの各辺に異なる金属を蒸着して先端部に熱電対接点を形成したもの、シリコンまたは窒化シリコン製のカンチレバー上に２種類の金属を間に絶縁層を挟んだ形で薄膜状にコーティングして先端部に微小熱電対接点を形成したものなどを用いる。熱電対方式では熱起電力の変化を検出することにより微量熱量を検出する。
【００１７】
（３）の方式では、直径数μｍの白金細線をカンチレバーとして利用した細線式、シリコンまたは窒化シリコン製カンチレバー先端に金属抵抗膜を取り付けた薄膜式があり、いずれも電気抵抗の変化から微量熱量を検出する。
【００１８】
本発明において、ある特定のタンパク質（抗原）と特異的に相互作用する物質（抗体）として、ＨｙＨＥＬ−１０のＦａｂ抗体、抗ＢＳＡ抗体などが例示される。
【００１９】
本発明では上記いずれかのカンチレバーを用い、ある特定のタンパク質（抗原）と特異的に相互作用する物質（抗体）をカンチレバー先端に自己組織膜状に結合させる。カンチレバー先端に結合させた抗体と親和性の高い抗原が基板上に存在すると、カンチレバー上の抗体と基板上の抗原は相互作用（抗原抗体反応）を起こす。このときの微量な発熱または吸熱をカンチレバーにより検出することで抗原の検出、識別、定量が可能になる。また、基板上の各々の場所で熱量の検出を行うことにより、基板上の抗原種のマッピングも可能である。一般的な抗原と抗体の結合エネルギーはΔH=−５０〜１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ程度であるので、バイメタル方式のカンチレバーを用いた場合、理論的な熱量の検出限界が２０ｆＪと見積もられているため、３〜６×１０４分子（５０〜１００ｚｅｐｔｍｏｌ）あれば検出可能である。また、抗体分子の相補的決定領域の一部を変えて抗原と抗体の結合エネルギーを増加させることで、検出感度の更なる向上が期待できる。これらの反応は通常、液中で行うのが一般的であるが、抗原と抗体の相互作用が検出できれば、環境を液中に限定しない。ここでいう液とは標準状態で液体であるものをいう。通常、液として純水、リン酸塩などの塩を含むｐＨが中性に近い水溶液、アルコール類などを使用する。
【００２０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。以下に示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はかかる具体的形態に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
バイメタル製カンチレバーの作製
市販のシリコン製のカンチレバー片面に金を約４００ｎｍ蒸着した。シリコン、金の熱膨張率はそれぞれ３×１０−６／Ｋ、１４．２×１０−６／Ｋであるため、カンチレバーの温度が上がると熱膨張率の小さなシリコンの方にカンチレバーが曲がり、このカンチレバーはバイメタルとして動作する。このカンチレバーをデジタル・インスツルメンツ（Digital Instruments）社製のＳＰＭに装着して純水を満たした液中セル中に浸漬し、ヒーターで純水の温度を上げていくとカンチレバーのたわみが検出され、バイメタルとして動作することが確認できた。
【実施例２】
【００２２】
実施例１で作製したカンチレバー先端の修飾
ＨｙＨＥＬ−１０をペプシンにより抗原結合部分（fragment antigen binding；Ｆａｂ）と結晶性部分（fragment crystallizable；Ｆｃ）に分解した。次に、ｐＨ４．７前後の水溶液中でＨｙＨＥＬ−１０のＦａｂ抗体と１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩を反応させて、Ｆａｂ抗体のＣ末端をカルボジイミド化した。さらに８−アミノオクチルチオールを反応させ、Ｆａｂ抗体のC末端にチオール基を導入した。この溶液に実施例１で作製したカンチレバーを浸漬し、金−チオール結合によりＨｙＨＥＬ−１０のＦａｂ抗体をカンチレバー表面に自己組織膜状に固定化した。
【実施例３】
【００２３】
１種類の抗原試料の作製
ＨｙＨＥＬ−１０と特異的に反応するリソチーム(lysozyme)抗原のC末端を実施例２と同様の方法でチオール修飾した。チオール修飾したリソチーム(lysozyme)の溶液をマイクロピペットにより金基板上に約３００μφの大きさでスポッティングし、金−チオール結合によりリソチーム(lysozyme)を金基板上に固定化した。
【実施例４】
【００２４】
１種類の抗原の検出
実施例２で作製したカンチレバーをデジタル・インスツルメンツ(Digital Instruments)社製のＳＰＭに装着して純水を満たした液中セル中に浸漬し、実施例３で作製した抗原試料の測定を行った。その結果、抗原が存在しない領域ではカンチレバーの変位は観測されず、抗原が存在する領域でのみカンチレバーの変位が観測された。これは、基板上の抗原とカンチレバー上の抗体が抗原抗体反応を起こし、反応により発生した熱量がカンチレバーにより検出されたことを示す。
【実施例５】
【００２５】
２種類の抗原試料の作製
ＨｙＨＥＬ−１０と特異的に反応するリソチーム(lysozyme)抗原、ＨｙＨＥＬ−１０と反応しないＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）抗原それぞれのC末端を実施例２と同様の方法でチオール修飾した。チオール修飾したリソチーム(lysozyme)、ＢＳＡそれぞれの溶液をマイクロピペットにより約３００μφの大きさで金基板上にスポッティングし、金−チオール結合によりリソチーム(lysozyme)、ＢＳＡを金基板上に固定化した。
【実施例６】
【００２６】
２種類の抗原の識別
実施例２で作製したカンチレバーをデジタル・インスツルメンツ(Digital Instruments)社製のＳＰＭに装着して純水を満たした液中セル中に浸漬し、実施例５で作製した抗原試料の測定を行った。その結果、リソチーム(lysozyme)が存在する領域ではカンチレバーの変位が観測されたが、ＢＳＡが存在する領域ではカンチレバーの変位は観測されず、２種の抗原の識別ができた。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
生体関連物質、特にタンパク質を高感度で検出し、識別できるので、タンパク質チップの解析手法として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１で作製したバイメタル製のカンチレバーの断面図である。
【図２】実施例２において抗体分子で修飾したカンチレバー先端の模式図である。
【図３】実施例５で作製した２種類の抗原リソチーム(lysozyme)、ＢＳＡ試料の模式図である。図中の７は測定の基点であり、図中の各点は測定ポイントを表す。測定結果は図４で表される。
【図４】実施例６の測定による結果を示すグラフである。横軸は基点から測定ポイントまでの距離を表し、縦軸は検出したカンチレバーの変位量を表す。各データは数回測定を行った平均値を示す。
【符号の説明】
【００２９】
１  シリコン
２  金
３  ＨｙＨＥＬ−１０のＦａｂ抗体
４  金蒸着基板
５  ＢＳＡ抗原
６  リソチーム(lysozyme)抗原
７  測定点（測定の基点）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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