(57)【要約】【課題】抗体等の生体由来物捕獲分子を基板に固定化し生体由来物の検出に用いる、より感度の高い生体由来物検出用基板を提供する。【解決手段】生体由来物を捕捉および固定し、その捕捉および固定した生体由来物を検出するのに用いる基板であって、少なくとも１方の表面が超親水性基を有するポリマーで被覆されており、生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子が該超親水性ポリマー鎖上及び又は鎖間に入り込むポリマーを介して固定されていることを特徴とする生体由来物検出用基板。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来物を捕捉および固定し、その捕捉および固定した生体由来物を検出するのに用いる基板であって、少なくとも１方の表面が超親水性基を有するポリマーで被覆されており、生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子が該超親水性ポリマー鎖上及び又は鎖間に入り込むポリマーを介して固定されていることを特徴とする生体由来物検出用基板。
【請求項２】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質、及びステロイド類から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも1つを含む複合体である請求項１記載の生体由来物の検出用基板。
【請求項３】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、抗体である請求項１又は２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項４】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、レクチン蛋白である請求項１又は２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項５】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、アプタマーである請求項１又は２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項６】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、酵素である請求項１又は２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項７】
生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が細胞の構成体の一部又は細胞である請求項１又は２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項８】
超親水性基がリン脂質由来である請求項１〜７いずれか記載の生体由来物検出用基板。
【請求項９】
超親水性基を有するポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体及び／又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体である請求項８記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１０】
生体由来物が核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質、及びステロイド類から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも1つを含む複合体である請求項１〜９いずれか記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１１】
生体由来物が細胞の構成体の一部又は細胞である請求項１〜９いずれか記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１２】
生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子が静電的結合又は共有結合によりポリマーに固定されている請求項１〜１１いずれか記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１３】
生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体に静電的結合又は共有結合を有する官能基を導入することによりなされている請求項１２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１４】
生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定がポリカチオン性ポリマー上になされている請求項１２記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１５】
ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリオルニチン、及びポリリジンの中から選ばれる少なくとも１つである請求項１４記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１６】
生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定が、基板上でスポット状になされており、規則性をもって配列されている請求項１〜１５いずれか記載の生体由来物検出用基板。
【請求項１７】
生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子を固定したポリマーを含有及び又は溶解させた溶液を超親水性基を有するポリマーが被覆された基板表面に接触させる工程を含む、請求項１〜１６いずれか記載の生体由来物検出用基板の製造方法。
【請求項１８】
（１）活性基を有するポリマーを溶液に溶解する工程、
（２）（１）の溶液に生体由来物を捕捉する分子又は超分子を溶解する工程、
（３）（２）の溶液のポリマーの活性基を不活化させる工程、及び（４）超親水性基を有するポリマーで被覆された基板表面に、（３）の溶液を接触させる工程、を含むことを特徴とする請求項１〜１６いずれか記載の生体由来物検出用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的に生体由来物を捕捉する分子を用いて、生体由来物を検出するのに使用する基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞機能の発現状況や各種ストレスへの応答性をみる場合、各々の機能またはストレス応答に係る遺伝子の発現状況や蛋白の発現状況をみることによって、目的が達成される。また、近年盛んに研究されている再生医療の分野では、細胞の分化の状態をみるために、遺伝子や蛋白の発現やさらに細胞表面にある糖鎖の発現をみることが重要となってきている。
【０００３】
また、病気の診断においては、例えば癌の診断では、細胞内の癌遺伝子の発現状況やその他マーカーとなる蛋白の発現状況をみることが検討されまた、実際に行なわれている。従来、これらマーカーとなる生体由来物の検出には、電気泳動を基本とした、ノーザンブロットやウェスタンブロット、免疫検査ではELISA法が用いられてきた。しかし、これらの方法は、サンプルの調製から結果が出るまでに多くの手間と時間を要し、また一度に検出できるマーカーの数も限られている。
【０００４】
そこで近年、ゲノムの解析技術の発展と共に、多くのマーカーを迅速に、少量のサンプルで検出を行なおうとする動きが盛んであり、１つの基板上に、多種類のDNAをスポット状に搭載したDNAマイクロアレイが実用化され、基礎研究分野において広く使用されるようになってきている。また、蛋白を基板上に搭載したプロテインマイクロアレイも検討されてきている。
【０００５】
マイクロアレイの作製方法について記載する。広く用いられている方法は、合成されたオリゴDNAやｍRNAから逆転写することで得られるｃDNAを基板上に点着して固定する方法である。オリゴDNAやｃDNAを溶解した溶液をピンの先端につけ、言わばスタンピングのように、基板表面に点着する方法である。この方法では、単に基板にDNA溶解液を点着しても、DNAを基板表面に固定化することは難しく、基板表面にDNAを固定するための処理を予め施すことになる。例えば、長いDNAであるｃDNAの固定では、基板表面にポリリジンやポリエチレンイミンなどをコートしプラスチャージを付与することで、マイナスチャージをもつDNAを静電的に固定化する方法が広く用いられている（非特許文献１）。
【０００６】
オリゴＤＮＡの固定ではDNAの長さが短くいため、静電的な固定ではDNAの固定が難しく、共有結合により固定される。共有結合により基板表面にDNAを固定する方法としては、オリゴDNA末端に反応性活性基を導入し、一方基板表面にオリゴDNAに導入した反応活性基と反応する反応活性基を導入し、共有結合を形成させてオリゴDNAを固定する方法が用いられる（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。共有結合を形成して固定するオリゴDNAに導入する反応性官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどが用いられている。固相担体の表面処理には、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種のシランカップリング剤が用いられている。このような共有結合による固定により、オリゴDNAを基板表面に強固に安定に固定することができる。
【０００７】
また、DNAマイクロアレイ技術を蛋白の検出に応用した、プロテインマイクロアレイの検討が行なわれている。プロテインマイクロアレイは、蛋白を基板上にスポットし、スポットされた蛋白に対して特異的に結合する生体由来物を検出しようとするものである。
最も代表的プロテインマイクロアレイの例としては、抗体を基板上に点着し、生体由来の蛋白の検出に用いるものが検討されている。測定原理しては、ELISA法に準じており、検出の際に用いる酵素標識抗体の代わりに抗体に標識を行い、サンドイッチ法を用いるなどして、点着したスポットにおける蛍光強度をスキャナーにより読み取る方法などが検討されている。
【０００８】
基板への抗体や蛋白の固定方法は、従来のELISA法に準じた方法が用いられる。蛋白は比較的基板表面に吸着しやすく、基板への蛋白の基板への固定化は容易である。蛋白が吸着しやすい材質としては、ポリスチレンが挙げられ、ELISA用のプレートには広く使用されている。
安定に、蛋白を固定化する場合には、上述のDNAマイクロアレイと同様に共有結合を形成させて蛋白を固定化させる方法が用いられる。蛋白は
アミノ基やSH基が豊富でありこれらの活性基を利用して共有結合を形成させ安定して固定化することができる。
【０００９】
DNAマイクロアレイおよびプロテインマイクロアレイでは、高い検出感度が切望されている。基板上にDNAや蛋白を安定して固定化できても、高い検出感度を得ることは難しい。抗体の場合、強固に基板表面に固定化してしまうと抗原との反応効率が悪くなり、感度を落とす要因になる。また、蛋白を固定化する能力が高いということは、蛋白の非特異的吸着を惹起することとなり、バックグラウンドを押し上げる要因となってしまう。
【００１０】
蛋白の非特異的吸着を抑える方法として、超親水性表面を形成する方法が、開示されている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、この基板表面上では、DNAや蛋白の安定した固定がおこなえず、従って十分な検体検出の感度を得ることは出来なかった。
【非特許文献１】Schena, M. et al, Science, 270, 467-470(1995)
【非特許文献２】「蛋白質・核酸・酵素」、43、2004-2011(1998);
【非特許文献３】Lamture, J.B. et al., Nucl. Acids Res., 22, 2121-2125(1994
【非特許文献４】Guo, Z. et al., Nucl. Acids Res., 22,5456-5465(1994)）
【特許文献１】特開２００３−１３０８８２号公報
【特許文献１】国際公開００／０３９５８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、基板に抗体を始めとする生体由来物を特異的に捕捉する分子や超分子を安定に固定し、その特異的結合性を利用し目的とする生体由来物を検出する手法において、高い感度で検出が可能な生体由来物検出用基板を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、表面が生体由来物に対し低親和性および又は無吸着性を有する超親水性基を有するポリマー層を基板表面に形成したのち、ポリマー上に抗体をはじめとする生体由来物を特異的に捕獲する分子を予め固定しかたちで、超親水性基を有するポリマー層と接触させることにより、超親水性基を有するポリマーの生体由来物に対する非特異的な吸着を抑える作用を保持し、かつ抗体等の特異的捕獲性能を向上させることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
即ち本発明は、
（１）  生体由来物を捕捉および固定し、その捕捉および固定した生体由来物を検出するのに用いる基板であって、少なくとも１方の表面が超親水性基を有するポリマーで被覆されており、生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子が該超親水性ポリマー鎖上及び又は鎖間に入り込むポリマーを介して固定されていることを特徴とする生体由来物検出用基板、
（２）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質、及びステロイド類から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも1つを含む複合体である（１）の生体由来物の検出用基板、
（３）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、抗体である（１）又は（２）の生体由来物検出用基板、
（４）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、レクチン蛋白である（１）又は（２）の生体由来物検出用基板、
（５）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、アプタマーである（１）又は（２）の生体由来物検出用基板、
（６）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が、酵素である（１）又は（２）の生体由来物検出用基板、
（７）  生体由来物を特異的に捕捉する分子又は超分子が細胞の構成体の一部又は細胞である（１）又は（２）の生体由来物検出用基板、
（８）  超親水性基がリン脂質由来であることを特徴とする（１）〜（７）いずれかの生体由来物検出用基板、
（９）  超親水性基を有するポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体及び／又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体である（８）の生体由来物検出用基板、
（１０）  生体由来物が核酸、ペプチド、蛋白、糖鎖、脂質、及びステロイド類から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも1つを含む複合体である（１）〜（９）いずれかの生体由来物検出用基板、
（１１）  生体由来物が細胞の構成体の一部又は細胞である（１）〜（９）いずれかの生体由来物検出用基板、
（１２）  生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子が静電的結合又は共有結合によりポリマーに固定されている（１）〜（１１）いずれかの生体由来物検出用基板、
（１３）  生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン含有成分の共重合体に静電的結合又は共有結合を有する官能基を導入することによりなされている（１２）の生体由来物検出用基板、
（１４）  生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定がポリカチオン性ポリマー上になされている（１２）の生体由来物検出用基板、
（１５）  ポリカチオン性ポリマーがポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリオルニチン、及びポリリジンの中から選ばれる少なくとも１つである（１４）の生体由来物検出用基板、
（１６）  生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子の固定が、基板上でスポット状になされており、規則性をもって配列されている（１）〜（１５）いずれかの生体由来物検出用基板、
（１７） 生体由来物を特異的に捕捉をする分子又は超分子を固定したポリマーを含有及び又は溶解させた溶液を超親水性基を有するポリマーが被覆された基板表面に接触させる工程を含む、（１）〜（１６）いずれかの生体由来物検出用基板の製造方法、
（１８）（1）活性基を有するポリマーを溶液に溶解する工程，
（2）（1）の溶液に生体由来物を捕捉する分子又は超分子を溶解する工程、
（3）（2）の溶液のポリマーの活性基を不活化させる工程、
及び（4）超親水性基を有するポリマーで被覆された基板表面に、（3）の溶液を接触させる工程、を含む（１）〜（１６）いずれかの生体由来物検出用基板の製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の生体由来物検出用基板によれば、捕捉分子や超分子の検出目的である生体由来物の捕捉効率が高くなり、かつ非特異的な吸着が抑えられることから、高い感度での生体由来物の検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の生体由来検出用基板について詳細に説明する。
まず、本発明に使用する基板の形状であるが、DNAマイクロアレイ、プロテインマイクロアレイ等スライドグラス状のもの、基板に微細な流路を施し、流路中で反応および検出を行なういわゆるマイクロフルイディクス用の基板、また従来ELISAで用いられている９６や３８４のウェルを有するマルチウェルプレートさらには、ビーズ状のものでも良い。
【００１６】
基板の材質であるが、不透過性および耐水性を有するものであれば基本的には制限はない。このような材質としては、ガラスおよびプラスチック、金属類が挙げられる。
【００１７】
さらに、捕獲した生体由来物の検出に何を用いるかで、基板の材質に制限が加わるが、蛍光により検出を行なう場合は、蛍光が発しないことが必要である。このような材質としてはガラスが好適であり、さらには蛍光を発しないプラスチックが好適であり、蛍光を発しないプラスチックとしてETFEや飽和環状ポリオレフィンなどが挙げられる。
吸光度による検出を行なう場合は、透明性を有することが必要であり、このような材質としては、ガラスが好適であり、さらには透明性を有するプラスチックが好適であり、このようなプラスチックとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリカーボネート等が挙げられるが、ポリスチレンが安価であり好適である。
【００１８】
また、マイクロフルイディクスへ応用する場合は、微細流路の加工性が容易に行なえることが必要であることから、このような材質としては、ガラス、プラスチックさらには金属が挙げられる、超微細な加工基板ではフォトリソグラフに用いるシリコンウェハーにも適応が可能である。マイクロフルイディクスにおいても、上記と同様に検出方法により、蛍光性、透明性により材質を選択する必要がある。
【００１９】
次に、超親水性基を有するポリマー層について説明する。超親水性基を有するポリマーを基板にコートすると、基板表面に超親水性が付与される。この基板表面への超親水性の付与により、蛋白をはじめ、核酸、糖鎖など生体由来物の吸着が抑えられる。超親水性基を有するポリマーとしては、抗血栓性を有することでも知られている、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを成分として含有する重合体が、核酸、蛋白や糖蛋白、さらには細胞の吸着や接着が非常に少なく好適である。
【００２０】
超親水性基を有するポリマー層の形成方法について、上述の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートする場合を例に記載する。まず２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体を適当な溶液に溶解し、この溶液中に基板を浸漬又は基板表面に溶液を噴霧することなどにより、基板表面と溶液を接触させ、基板表面にポリマー層を形成する。この、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体のホスホリルコリン部分は超親水性であり、その他部分は疎水性を有しており、基板表面が疎水性であれば、配向してホスホコリン部分が基板表面に配列することにより、基板表面は超親水性を有することになる。このように超親水性を付与された基板表面へは、蛋白をはじめとする生体由来物の吸着が殆どない。また、このポリマーは無色でありまた蛍光を発しないため、呈色や蛍光による検出においてバックグラウンドをほぼ完璧に抑えることが可能である。
【００２１】
このような、生体由来物が全く吸着せず、バックグラウンドを抑制できる表面に、抗体やDNAを固定する方法について記載する。蛋白や核酸を全く吸着しない表面であるから、生体由来物を捕捉する核酸や蛋白の固定は、そのままではできない。従来の手法のように、基板表面に核酸や蛋白を固定化するための活性基を導入して、核酸や抗体溶液を基板表面に接触させれば、核酸や抗体の固定はできるようになる。しかし、反応活性基を表面に導入するということは、せっかく付与した基板表面の核酸や蛋白に対する無吸着性を失わせることになり、核酸や抗体を固定化後、ブロッキングのような活性基を失活させ、蛋白や核酸などの非特異的吸着を施す必要がある。さらに、核酸や抗体を表面に固定化した後、ブロッキング操作を行なっても、高い感度を保持して蛋白や核酸の非特異的吸着を完全に阻止することは困難である。
【００２２】
そこで発明者は、予め捕獲分子を別のポリマーに固定しておき、このポリマーを生体由来物に対する非吸着性を有する超親水性ポリマー中に絡ませることにより捕獲分子の固定化を行い、基板表面に形成された超親水性ポリマー表面の無吸着性を完全に保持しながら、蛋白や核酸を固定化することが可能であり、固定化され抗体や核酸の特異的な捕捉能も向上することを見出した。
【００２３】
超親水性ポリマー表面が形成された基板表面への、蛋白や核酸等の固定化について記載する。
【００２４】
蛋白や抗体を固定化するのに使用するポリマーは、固定化の対象が生体由来であり殆どが水溶性であることおよび、基板表面が超親水性であることから、水溶性を有するものが好適である。水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリリジン、ポリエチレンイミンなどが上られ、また
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をベースポリマーにもちいてもよい。ポリエチレンイミンやポリリジンは、プラス電荷をもち、静電的に核酸や蛋白を固定することが可能である。
【００２５】
活性基をもたないポリマーには、核酸や蛋白を固定するための活性基を
導入し用いる。活性基としては、静電的に核酸や蛋白を固定するもの、又は共有結合を形成し固定するもの、あるいは特異的な相互作用によるもの等が挙げられ、具体的には、活性基としては、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、チオール基、水酸基、カルボキシル基、ニトロ基、スルホン基、酸無水物、カルボジイミド基、ビニル基、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリル基、スクシンイミド基、マレイミド基、イソシアナート基イソシアチオナート基、ヒヂラジド基、アジド基、ビオチン誘導体、アビジン誘導体、リン酸基、アズラクトン基、ニトリル基、アミド基、イミノ基、ニトレン基、アセチル基などを用いることが出来。好ましくは、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、チオール基、カルボジイミド基、酸無水物である。
【００２６】
次に、実際の核酸や蛋白の固定化の手順について記載する。
まず、活性基を有するポリマーを純水中あるいはPBS（−）等の水溶液バッファー中に溶解させる。溶液の粘度等を調節するなどの目的でエタノール等を加えても良い。ポリマーの濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌが好適であり、抗体など生体由来物を捕獲する分子および超分子の濃度により調節する。
【００２７】
次に、固定化を行なう蛋白あるいは核酸をポリマー濃度と同等量から１００分の１量程度を上記ポリマー溶液中に加え、しばらく攪拌する、この時点でポリマーに蛋白等が固定される。この蛋白の固定化の過程でポリマー上の活性基が全て蛋白あるいは核酸と反応してれば、非特異的吸着は起こらないが、固定する蛋白の構造等により、活性基が残存する可能性がある、活性基が残存していると、非特異的吸着が起こり、検出の際バックを挙げることになるため、活性基の不活化を行なう。
【００２８】
不活化は上記蛋白溶液中で行い、化学的に反応性を有する活性基であれば、その化学的反応性を失活させる処理を行なう。例えば、アルデヒド基であれば、還元処理を施すことで反応性を失活させる。また、BSAなどを溶液に加え、暫く攪拌することにより、活性基を塞ぎ不活化し、非特異的吸着を抑えることができる。
【００２９】
次に、調製した上記溶液を、超親水性基を有するポリマー層を表面導入された基板表面に接触させる。接触は、基板形状が９６ウェルプレートのようにウェルを有するものであれば、上記溶液をウェルに分注し放置した後、溶液を排除し、洗浄を行なう。
【００３０】
基板の形状が、スライドガラス状で有る場合は、ピン等を用いて上記溶液を基板表面に付着させ放置し、洗浄を行なう。
【００３１】
以上のようにして、超親水性基を有するポリマー層上に、抗体等の生体由来物を捕捉する分子が固定される。このようにして抗体等の生体由来物を固定化した生体由来物検出用基板は、非特異的な蛋白などの吸着が起こらないことから、検出におけるバックグラウンドの上昇がなく、かつ抗原抗体反応の効率が高く、高い検出感度を得るこことができる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）    ガラス製スライド表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有するガラス製基板を得た。一方、PBS（−）中にポリリジンを１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、続いて抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し、続いて１０μｇ／ｍｌ濃度でBSAを添加し３０分攪拌し、抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した、スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３３】
（実施例２）
ガラス製スライド表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有するガラス製基板を得た。一方、PBS（−）中にポリリジンを１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、続いて抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し、続いてグルタルアルデヒドを１μｇ／ｍｌ加え３０分攪拌したのち、１０μｇ／ｍｌ濃度でBSAを添加し３０分攪拌し、抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３４】
（実施例３）
飽和環状ポリオレフィン製スライド成形品表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有する飽和環状ポリオレフィン製基板を得た。一方、PBS（−）中にポリリジンを１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、続いて抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し、続いて１０μｇ／ｍｌ濃度でBSAを添加し３０分攪拌し、抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有する飽和環状ポリオレフィン製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３５】
（実施例４）
飽和環状ポリオレフィン製スライド成形品表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有する飽和環状ポリオレフィン製基板を得た。一方、PBS（−）中にポリリジンを１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、続いて抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し、続いてグルタルアルデヒドを１μｇ／ｍｌ加え３０分攪拌したのち、１０μｇ／ｍｌ濃度でBSAを添加し３０分攪拌し、抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有する飽和環状ポリオレフィン製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３６】
（比較例１）
ガラス製スライド表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有するガラス製基板を得た。一方、PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３７】
（比較例２）
飽和環状ポリオレフィン製スライド成形品表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体をコートし、超親水性表面を有する飽和環状ポリオレフィン製基板を得た。一方、PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３８】
（比較例３）
ガラス製スライド表面にポリリジンをコートし、抗体固定化用基板を得た。一方、PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行なった。続いて、ＰＢＳ（−）中に１μｇ／ｍｌの濃度でBSAを溶解させたブロッキング溶液中に室温で１時間浸漬放置した後、純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００３９】
（比較例４）
ガラス製スライド表面にポリリジンをコートし、続いてＰＢＳ（−）中にグルタルアルデヒドを１μｇ／ｍｌを溶解させた溶液中に３０分浸漬したのち、洗浄を行い乾燥させ、抗体固定化用基板を得た。一方、PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、３０分攪拌し抗体溶液を調製した。続いて、ピン径５００μｍのピンを装着したピン方式のスポッターにより調製した抗体溶液を超親水性表面を有するガラス製基板上に点着した。スポットは２ｃｍ×２ｃｍのエリアの中に２５個点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行なった。続いて、ＰＢＳ（−）中に１μｇ／ｍｌの濃度でBSAを溶解させたブロッキング溶液中に室温で１時間浸漬放置した後、純水中に浸漬し洗浄を行い、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。
【００４０】
（感度評価試験）
ＰＢＳ（−）中にラットアルブミンを０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの濃度に溶解しラットアルブミン溶液を調製した。コントロール溶液としてＰＢＳ（−）のみを溶解したものを調製した。各濃度のラットアルブミン溶液およびコントロール溶液を実施例１〜４および比較例１〜４のラットアルブミン検出する生体由来物検出基板のスポットエリア内に５０μｌ分注し、２０μｍのギャップを設けたDNAチップ用ハイブリカバーでカバーし、湿度を１００％に保ったインキュベーターの中に放置した。カバーを除き０．０５％TWEENを含むＰＢＳ（−）中で振とうさせながら洗浄を行い、続いてローダミンを標識した抗ラットアルブミン抗体溶液（１μｇ／ｍｌでＰＢＳ（−）に溶解）を、スポットエリア内に５０μｌ分注し、２０μｍのギャップを設けたDNAチップ用ハイブリカバーでカバーし、湿度を１００％に保ったインキュベーターの中に放置した。その後カバーを除き０．０５％TWEENを含むＰＢＳ（−）中で振とうさせながら洗浄を行った。最後に超純水で軽く洗浄した後、遠心により、基板上の水滴を除いた。共焦点レーザースキャナーで、基板上の蛍光スポットの強度を測定した。ラットアルブミン溶液の各濃度について実施例１の基板のスポット蛍光強度を１００とした、相対強度を表１に示す。ラットアルブミン溶液の各濃度について、実施例１の基板上で測定されたスポットの蛍光強度のSN比を１００としたSN比の比較を表２に示す。ここでＳ／Ｎ比とは、コントロールであるＰＢＳ（−）溶液を抗原溶液として用いた際の各基板上の蛍光スポット強度で各ラットアルブミン濃度溶液を抗原溶液として用いた蛍光強度を除して算出した。
【００４１】
【表１】
2005037331.tif 000002
【００４２】
【表２】
2005037331.tif 000003
【００４３】
表１から、実施例１〜４の基板ではスポットにおける蛍光強度が高く感度が高いことが明白である。表２からも実施例１〜４の基板ではS／Ｎ比が高く検出感度が高いことが明白である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
プロテインマイクロアレイ等の生体由来物検出用基板の供給において、より感度の高い基板の供給が可能になる。