(57)【要約】【課題】  真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）（すなわち、正しいＮ−末端アミノ酸配列を有する）であり、完全長であり、そして均一である成熟ＴＦＰＩを産生すること。【解決手段】  第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を産生する方法であって、  （ａ）複製可能なクローニングビヒクルで形質転換された酵母細胞を、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質の産生に好適な条件下でインキュベートする工程であって、該複製可能なクローン化ビヒクルが、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質が、該酵母細胞内で保持される、工程；  （ｂ）該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を含む該形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程；  （ｃ）該不溶性画分の第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を単離する工程  を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）複製可能なクローニングビヒクルで形質転換された酵母細胞を、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質の産生に好適な条件下でインキュベートする工程であって、該複製可能なクローン化ビヒクルが、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質が、該酵母細胞内で保持される、工程；
（ｂ）該第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を含む該形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程；
（ｃ）該不溶性画分の第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質の産生方法に関し、さらに詳細には組織因子活性インヒビター（ＴＦＰＩ）、および組織因子活性インヒビター２（ＴＦＰＩ−２）、およびそれらの変異体の酵母細胞内での産生、ならびに酵母細胞内からのこのようなポリペプチドの単離に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織因子活性インヒビター（ＴＦＰＩ）は、少なくとも２つの方法で凝固カスケードを阻害する：第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体の形成を阻害する方法、および第Ｘａ因子の活性部位に結合することによる方法である。ＴＦＰＩの１次配列（これはｃＤＮＡ配列から推測した）は、３つのクニッツ型酵素インヒビタードメインを含むことが示されている。これらのドメインの第１は、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体の阻害に必要とされる。第２のクニッツ型ドメインは、第Ｘａ因子の阻害のために必要とされる。第３のクニッツ型ドメインの機能は知られていない。ＴＦＰＩの酵素活性は知られておらず、そして化学量論的な方法（すなわち、１つのＴＦＰＩ  クニッツ型ドメインが１つのプロテアーゼ分子活性部位に結合する）でそのプロテアーゼ標的を阻害すると考えられている。ＴＦＰＩのカルボキシ末端は、ヘパリン結合およびリン脂質との相互作用により、細胞表面局在化の役割を有すると考えられている。ＴＦＰＩはまた、リポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）、組織因子インヒビター（ＴＦＩ）、および外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）としても知られている。
【０００３】
成熟ＴＦＰＩは、負帯電性アミノ末端および正帯電性カルボキシ末端を有する２７６個の長さのアミノ酸である。ＴＦＰＩは、１８個のシステイン残基を含有し、そして正しく折り畳まれた場合、９個のジスルフィド架橋を形成する。一次配列はまた、３つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  Ｎ−結合グリコシル化コンセンサス部位、および１４５位，１９５位、および２５６位に位置するアスパラギン残基を含有する。成熟ＴＦＰＩの炭水化物成分は、タンパク質の質量の約３０％である。しかし、タンパク質分解マッピングからのデータおよびマススペクトルデータは、炭水化物部分が不均一であることを示す。ＴＦＰＩはまた、タンパク質の２位のセリン残基で、種々の程度にリン酸化されることが見出されている。リン酸化はＴＦＰＩ機能に影響しないようである。
【０００４】
ＴＦＰＩは、致死的なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）敗血症ショックのヒヒモデルにおいて、死亡を防ぐことが示されている。Ｃｒｅａｓｅｙら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９１：２８５０−２８６０（１９９３）。致死量のＥ．  Ｃｏｌｉの注入直後に、６ｍｇ／ｋｇ体重でＴＦＰＩを投与すると、５匹のコントロール動物についての平均生存時間（３９．９時間）と比較して、全５匹のＴＦＰＩ−処置動物は生存し、そして生活の質が有意に改善された。ＴＦＰＩの投与はまた、Ｅ  ｃｏｌｉ敗血症標的器官（腎臓、副腎、および肺を含む）において通常観察される凝固応答の有意な減弱、細胞傷害の種々の評価の有意な低下および病因の有意な減少が生じる。
【０００５】
その凝血阻害特性により、ＴＦＰＩはまた、微少血管の手術における凝血の際の血栓症を防ぐために用いられ得る。例えば、米国特許第５，２７６，０１５号は、微少血管の吻合の血栓形成を減少させる方法（ここでは、ＴＦＰＩは、微少血管の再構築と同時に、微少血管の吻合部位に投与される）におけるＴＦＰＩの使用を開示する。
【０００６】
近年、ＴＦＰＩとの高度な構造の同一性を有する他のタンパク質が同定されている。Ｓｐｒｅｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３３５３−３３５７（１９９４）。このタンパク質（ＴＦＰＩ−２と呼ぶ）の推定２次構造は、３つのクニッツ型ドメイン、９個のシステイン−システイン結合、および酸性アミノ末端、および塩基性カルボキシ末端テールを有するＴＦＰＩと実質的に同一である。ＴＦＰＩ−２の３つのクニッツ型ドメインは、それぞれＴＦＰＩのクニッツ型ドメイン１、２、および３と、４３％、３５％、および５３％の一次配列の同一性を示す。組換えＴＦＰＩ−２は、第ＶＩＩａ因子／組織因子のアミド分解活性を強く示す。対照的に、ＴＦＰＩ−２は、第Ｘａ因子アミド分解活性が弱いインヒビターである。
【０００７】
ＴＦＰＩは、ヒト血漿およびヒト組織培養細胞（ＨｅｐＧ２、Ｃｈａｎｇ肝臓、およびＳＫ  肝腫瘍細胞を含む）から単離されている。組換えＴＦＰＩは、マウスＣ１２７細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびヒトＳＫ肝腫瘍細胞中で発現されている。マウスＣ１２７細胞由来の組換えＴＦＰＩは、動物モデルにおいて、組織因子により誘導される凝固を阻害することが示されている。しかし、多くの場合、哺乳類細胞において産生されるＴＦＰＩは、タンパク質分解切断により分解される。タンパク質はほとんどの場合、アルギニン（８３位および１９９位）で切断される。
【０００８】
組換えＴＦＰＩの非グリコシル化形態もまた、米国特許第５，２１２，０９１号に開示されているように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞から産生され、そして単離される。ＴＦＰＩのこの形態は、ウシ第Ｘａ因子の阻害、およびヒト組織因子により誘導される血漿中の凝固の阻害に活性であることが示されている。いくつかのアッセイにおいては、Ｅ．  ｃｏｌｉ産生ＴＦＰＩは、ＳＫ肝腫瘍細胞由来のＴＦＰＩよりも活性であることが示されている。しかし、Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞中で産生されるＴＦＰＩは、多くの場合、タンパク質の不均一性を増加させる方法で改変される。これらの改変としては、タンパク質分解性分解、カルバミル化、およびＮ−末端改変が挙げられる。ＴＦＰＩの異なる形態はまた、Ｅ．  ｃｏｌｉリボソームによる不適切な内部翻訳開始から生じるることが見出され得る。
【０００９】
酵母細胞培養培地からのＴＦＰＩの精製方法は、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８：１３３４４−１３３５１（１９９３）に開示されている。これらの場合、組換えＴＦＰＩは酵母細胞から分泌される。このようなプロトコールで回収されるＴＦＰＩはまた、多くの場合、不均一である。これは、おそらく、タンパク質分解性分解および種々のグリコシル化のためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このため、当該技術分野においては、真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）（すなわち、正しいＮ−末端アミノ酸配列を有する）であり、完全長であり、そして均一である成熟ＴＦＰＩを産生する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質（ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ−２を含む）、ならびにその変異タンパク質を産生する方法、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質の産生に適切な条件下で、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む複製可能なクローニングビヒクルで形質転換した酵母細胞をインキュベートする工程（ここで、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質は、酵母細胞中に残存する）、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質を含有する形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程、および不溶性画分中に含有される第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質を単離する工程を包含する方法に関する。第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質をコードするＤＮＡは、インフレームで第２のヌクレオチド配列の直後に続き、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は共に融合ペプチドをコードする。融合ペプチドは、酵母細胞中で切断され、真正第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質を産生し得る。第２のヌクレオチド配列は、ユビキチンをコードし得る。酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来であり得、そしてＶＨ６、ＡＢ１２２、およびＪＳＣ３１０からなる群から選択される遺伝子型を有し得る。
【００１２】
本発明はまた、本発明の方法により産生される第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質に関する。第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質がＴＦＰＩの変異タンパク質である場合、ＴＦＰＩの変異タンパク質は、クニッツ型ドメイン１のＰ１−反応部位にアルギニンを有し得る。
【００１３】
（摘要）
（項目１）  第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）複製可能なクローニングビヒクルで形質転換された酵母細胞を、上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質の産生に好適な条件下でインキュベートする工程であって、上記複製可能なクローン化ビヒクルが、上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質が、上記酵母細胞内で保持される、工程；
（ｂ）上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を含む上記形質転換された酵母細胞の不溶性画分を調製する工程；
（ｃ）上記不溶性画分の第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を単離する工程
を包含する、方法。
（項目２）  上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質をコードするＤＮＡが、インフレームで第２のヌクレオチド配列のすぐ後に位置し、上記第１および上記第２のヌクレオチド配列が、一緒になって融合ペプチドをコードし、上記融合ペプチドが、上記酵母細胞内で切断され、真正の第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質を産生し得る、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記第２のヌクレオチド配列がユビキチンをコードする、項目２に記載の方法。
（項目４）  上記複製可能なクローニングビヒクルが配列番号１を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）  上記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属である、項目１に記載の方法。
（項目６）  上記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種であり、ＶＨ６、ＡＢ１２２、およびＪＳＣ３１０からなる群から選択される遺伝子型を有する、項目５に記載の方法。
（項目７）  項目１に記載の方法により調製される第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質。
（項目８）  上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質がＴＦＰＩである、項目１に記載の方法。
（項目９）  上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質がＴＦＰＩ−２である、項目１に記載の方法。
（項目１０）  上記第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質がクニッツ型ドメイン１のＰ１反応性部位にアルギニンを有するＴＦＰＩの変異体である、項目１に記載の方法。
（項目１１）  項目１０に記載の方法により調製される第ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク質。
【発明の効果】
【００１４】
真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）（すなわち、正しいＮ−末端アミノ酸配列を有する）であり、完全長であり、そして均一である成熟ＴＦＰＩを産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用する用語「第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質」は、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体に結合して、それにより、この複合体の機能を阻害することができ、さらに、第Ｘａ因子に結合して、それにより、その機能を阻害することができるタンパク質を意味する。完全長の成熟ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ−２およびそれらの変異タンパク質は、この用語に包含される。好ましくは、この因子ＶＩＩａ／ＴＦ／Ｘａ結合タンパクは、ＴＦＰＩである。
【００１６】
今回、酵母内における第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク、具体的には、ＴＦＰＩ（ここで、このＴＦＰＩは分泌されないが、不溶性の画分でこの細胞内に保持される）を生成することにより、真性で（すなわち、正しいＮ−末端アミノ酸配列を有する）完全長の同種ＴＦＰＩが回収されることを見出した。本明細書中で使用される用語「ＴＦＰＩ」は、ＧｉｒａｒｄらのＮａｔｕｒｅ、３３８、５１８〜５２０（１９８９年）に記述のように、２７６アミノ酸ポリペプチドを意味する。本明細書中で使用される用語「ＴＦＰＩ−２」は、ＳｐｒｅｃｈｅｒらのＰｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３３５３〜３３５７（１９９４年）に記述のように、２１３アミノ酸ポリペプチドを意味する。
【００１７】
第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパクを生成するために本発明で使用できる酵母発現系は、当業者に周知である。このような発現系は、最低限、酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合できかつコード配列（例えば、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２をコードするＤＮＡ）のｍＲＮＡへの下流側（５’〜３’）への転写を開始できるＤＮＡ配列である酵母プロモーターを必要とする。このプロモーターは、ここでは、通常、このコード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含有する。酵母プロモーターは、ここではまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、もし存在するなら、通常、この転写開始領域と比べて、その構造遺伝子から遠位（すなわち、さらに上流）にある。このＵＡＳはまた、発現の調節を支配する。調節された発現は、正または負のいずれかであり得、それにより、望ましいように、転写が増大または低減される。
【００１８】
酵母は、活性の代謝経路を有する発酵微生物であり、従って、この代謝経路の酵素をコードする配列は、本発明の目的上、特に有用なプロモーター配列を提供する。例として、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）  （ＥＰＯ公報第２８４０４４号）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）  （ＥＰＯ公報第３２９２０３号）が包含される。この酵母ＰＨＯ５遺伝子は、酸性ホスファターゼをコードし、ＭｙａｎｏｈａｒａらのＰｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：１（１９８３）に記述されているが、また、本発明に有用なプロモーター配列を提供する。
【００１９】
さらに、天然に生じない合成プロモーターもまた、本明細書に記載の酵母プロモーターとして機能する。例えば、ある酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、他の酵母プロモーターの転写活性化領域と結合し得、ハイブリッドプロモーターを作り出す。このようなハイブリッドプロモーターの例には、米国特許第４，８７６，１９７号および第４，８８０，７３４号に記述のように、このＧＡＰ転写活性化領域と結合したＡＤＨ調節配列が包含され、これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている。ハイブリッドプロモーターの他の例には、ＥＰＯ公報第１６４５５６号に記述のように、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターであって、解糖酵素遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合わせたものが包含される。さらに、酵母プロモーターには、天然に生じる非酵母由来のプロモーターであって、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し転写を開始する能力を有するものが挙げられ得る。このようなプロモーターの例には、以下の参考文献に記述のものが包含される：
【００２０】
【化１】
2005348744.tif 000002
酵母発現系における融合タンパクの生成は、本発明の目的上、好ましい。さらに具体的には、内因性酵母タンパク質または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質のコード配列の５’末端に融合される。発現すると、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合体を提供する。例えば、この酵母またはヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、このＴＦＰＩ遺伝子の５’末端にて結合し得、得られる融合タンパクは、酵母内で発現した。この２つのアミノ酸配列の接合部におけるＤＮＡ配列は、切断可能な部位をコードしてもしなくても良い。例えば、ＥＰＯ公報第１９６  ０５６号を参照せよ。好ましくは、この部位は切断可能である。好ましい融合タンパク質は、ユビキチン−ＴＦＰＩ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、好ましくは、プロセシング酵素のための部位を保持するユビキチン配列を用いて作成される。この部位により、ユビキチン特異的なプロセシングプロテアーゼが、この所望のポリペプチド由来のユビキチンを切断することが可能になる。従って、この方法を通じて、真性（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）アミノ末端を有する成熟第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／第Ｘａ因子結合タンパク質が、酵母細胞内で産生され得、そして酵母細胞内から単離され得る。ユビキチンタンパク質融合技術の使用は、Ｂａｒｒら、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、１９９１）、３７〜４６頁で概説されている。
【００２１】
通常、酵母により認識される転写終止配列は、その翻訳終止コドンに対して３’に位置する調節領域であり、このプロモーターと共に、このコード配列に隣接する。これらの配列は、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指示する。遺伝子に由来の酵母認識終止配列（例えば、α−因子および解糖酵素をコードするもの）は、ここで使用され得る。
【００２２】
通常、上記成分は、プロモーター、必要に応じてリーダー、配列をコードする第ＶＩＩａ因子／ＴＦ／Ｘａ因子結合タンパク、および転写終止配列を含有し、発現構築物に組み立てられる。本明細書に記載の発現構築物は、レプリコン、例えば、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に維持され得る染色体外のエレメント（例えば、プラスミド）において維持され得る。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、それゆえ、例えば、発現のために酵母において、そしてクローニングおよび増幅のために原核細胞宿主において、それを維持することが可能になる。本明細書において有用なこのような酵母細菌シャトルベクターの例には、以下が包含される：Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、（１９７９）Ｇｅｎｅ８：１７−２４に記載のＹＥｐ２４；Ｂｒａｋｅら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６に記載のｐＣｌ／１；およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、（１９８２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５８：１５７に記載のＹＲｐ１７。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に、約５〜約２００の範囲、通常、約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して、選択され得る。例えば、Ｂｒａｋｅら（上記）を参照せよ。
【００２３】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母ゲノムに組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、このベクターが組み込むことを可能にする酵母染色体と相同な少なくとも１つの配列を含有し、好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含有する。組み込みは、ベクター中および酵母染色体中の相同ＤＮＡ間の組換えにより生じると思われる。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０１：２２８〜２４５（１９８３）に記載されているように、組み込みベクターは、このベクター内に包含するための適切な相同配列を選択することにより、酵母中の特定の遺伝子座に方向づけられ得る。  １またはそれ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく、産生される組換えタンパク質のレベルに影響を及ぼす。Ｒｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：６７５０（１９８３）。ベクターに含有される染色体配列は、ベクター中の単一セグメントとして生じ得るか（このベクター全体の組み込みが起こる）、またはこの染色体中の隣接セグメントと相同でそして、このベクター中の発現構築物に隣接する２つのセグメントとして生じ得るか（その結果、この発現構築物だけの安定な組み込みが起こり得る）、いずれかであり得る。
【００２４】
通常、染色体外および組み込み発現構築物は、形質転換された酵母株の選択を可能にする選択マーカーを含有し得る。選択マーカーには、酵母宿主において発現し得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７）、およびＧ４１８耐性遺伝子が挙げられ得る。これらは、酵母細胞において、それぞれ、ツニカマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を与える。さらに、適切な選択マーカーはまた、毒性化合物（例えば、金属）の存在下にて、酵母に増殖する能力を提供し得る。例えば、ＣＵＰ１が存在することにより、銅イオンの存在下での酵母の増殖が可能となる（Ｂｕｔｔら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ．  ５１：３５１（１９８７）に記載されている）。
【００２５】
あるいは、上記成分は、一緒に集めて形質転換ベクターに組立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、選択マーカーから構成され、このマーカーは、上記のように、レプリコン中で維持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである。
【００２６】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンかまたは組み込みベクターのいずれかであるが、形質転換のために、多くの酵母に対して開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母に対して開発されている：
【００２７】
【化２】
2005348744.tif 000003
酵母細胞を形質転換するために本明細書中で使用され得る形質転換手順には、以下に記述されるようにエレクトロポレーションが挙げられる：
【００２８】
【化３】
2005348744.tif 000004
他の手順には、スフェロプラストの形質転換またはアルカリカチオン処理した無傷細胞の形質転換が挙げられる。このような手順は、例えば、以下に記述されている：
【００２９】
【化４】
2005348744.tif 000005
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２の変異タンパク質もまた、本発明の方法に従って、調製できる。この定義の範囲内に入る変異タンパク質には、以下が挙げられる：（ａ）分子のコンフォメーションを実質的に変えない１個〜５個の保存的アミノ酸置換を有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２変異タンパク質；（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化の３つの部位の１以上を除去するアミノ酸置換を有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２変異タンパク質；（ｃ）ＴＦＰＩの残基をＴＦＰＩ−２の対応する残基に変える１個〜５個のアミノ酸置換を有するＴＦＰＩ変異タンパク質；（ｄ）ＴＦＰＩ−２の残基をＴＦＰＩの対応する残基に変える１個〜５個のアミノ酸置換を有するＴＦＰＩ−２変異タンパク質；（ｅ）１以上のクニッツ型ドメインにて、Ｐ１反応性部位にアミノ酸置換を有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２変異タンパク質；および（ｆ）１以上のクニッツ型ドメインにて、Ｐ１反応性部位の５個のアミノ酸内の位置にアミノ酸置換を有するＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２変異タンパク質。好ましい実施態様では、ＴＦＰＩの第一のクニッツ型ドメイン［配列番号１］のＰ１反応性部位のリジン残基は、アルギニンで置き換えられる。この変異タンパク質は、以下の配列を有する：
【００３０】
【化５】
2005348744.tif 000006
【００３１】
【化６】
2005348744.tif 000007
（配列番号３）。
【００３２】
同様に、この変異タンパク質は、ＴＦＰＩ−２変異タンパク質（ここで、ＴＦＰＩ−２の第二のクニッツ型のドメインのＰ１反応性部位内のグルタメート残基は、アルギニンで置き換えられている）でもあり得る。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩ−２の変異タンパク質（ここで、Ｎ−結合糖鎖形成に対する１個またはそれ以上のコンセンサス部位は、このような認識を防止するように変性されている）の生成および単離もまた、本発明の方法の範囲内に入る。ＴＦＰＩは、３個のこのようなコンセンサス配列を有し、この配列は、例えば、このコンセンサス部位のセリンまたはスレオニンをアラニンに置き換えることにより、変性してもよい。同様に、ＴＦＰＩ−２の変異タンパク質（ここで、成熟ＴＦＰＩ−２の９６位置のセリン残基および／または成熟ＴＦＰＩ−２の１５０位置のスレオニン残基は、アラニンで置換されている）もまた、調製し得る。ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２の配列に比べて保存アミノ酸置換を含有する変異タンパク質は、本発明に従って、生成し単離し得る。最終的に、ＴＦＰＩの変異タンパク質（ここで、このＴＦＰＩ配列に通常見出されるアミノ酸は、一定部位に対するＴＦＰＩ−２の対応アミノ酸で置換されている）およびＴＦＰＩ−２の変異タンパク質（ここで、このＴＦＰＩ配列に通常見出されるアミノ酸は、一定部位に対するＴＦＰＩの対応アミノ酸で置換されている）の生成および単離は、本発明の範囲内に入る。
【００３３】
変異タンパク質は、当業者に公知の方法を用いて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ−２をコードする組換えクローニングビヒクルの配列の適切な変異誘発により調製され得る。変異誘発技術には、部位特異的変異誘発が挙げられるが、それに限定されない。部位特異的変異誘発は、当該分野で公知の多くの方法を用いて行い得る。これらの技術は、例えば、Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９：４２３（１９８５）に記載され、この技術のいくつかの改良法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４、Ｅ部、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編（１９８７）、１７、１８、１９および２０章に記載されている。部位特異的変異誘発は、Ｇａｐｐｅｄ  Ｄｕｐｌｅｘの部位特異的突然変異誘発法を用いても実施し得る。この一般的な手順は、Ｋｒａｍｅｒらにより、上記のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの１７章に記述されている。核酸配列ＰＣＲ技術（オーバーラップＰＣＲを包含する）において点変異を作製する他の技術は、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ、ＳｎｉｎｓｋｙおよびＷｈｉｔｅ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）に記載されている。
【００３４】
（調剤および投与）
本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、敗血症性ショックの治療および予防に治療上効果的な濃度で投与され得る。この目的を遂げるために、好ましくは、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは静脈内へ投与される。この投与を遂げる方法は当業者に公知である。
【００３５】
患者への投与前、調剤は本発明の方法により調製されたＬＡＣＩに添加され得る。液体調剤が用いられ得る。例えば、これらの調剤としては、油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が挙げられ得る。調剤に用いられ得る炭化水素としては、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンのような糖類または糖アルコールが挙げられる。糖類またはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合溶液を含み得る。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素と定義され、そしてガラクチトール（ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。糖類または糖アルコールが水性調製物中で可溶である限りは、用いられる量に固定された制限はない。好ましくは、糖類または糖アルコール濃度は１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間であり、より好ましくは２．０と６．０ｗ／ｖ％との間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）体のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好適なポリマーとしては、平均分子量２，０００と３，０００との間のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量３，０００と５，０００との間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液のｐＨ変化を最小にする組成の緩衝液を用いることもまた好ましい。ほとんどの任意の生理緩衝液が用いられ得るが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液またはそれらの混合物が好ましい。最も好ましいのは、クエン酸緩衝液である。さらに、硫酸の使用は調剤の調製には避けるべきである。好ましくは、濃度は０．０１〜０．３Ｍである。調剤に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。
【００３６】
加えて、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、例えば、循環半減期を延長させるために、ポリマーを共有結合することで化学修飾され得る。好適なポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号に示され、これらは全てそのまま本明細書中で参考として援用される。好適なポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水に可溶であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（ここでＲは水素、またはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であり得る）を有する。好ましくは、保護基は１個と８個との間の炭素を有し、より好ましくは保護基はメチル基である。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１と１，０００との間、より好ましくは２と５００との間である。好ましくは、ＰＥＧは１０００と４０，０００との間の平均分子量を有し、より好ましくは２０００と２０，０００との間であり、最も好ましくは３，０００と１２，０００との間である。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、より好ましくはそれは１個の末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基は好ましく活性化されて、インヒビター上の遊離アミノ基と反応する。しかし、反応基のタイプおよび量は共有結合ＰＥＧ／ＬＡＣＩを形成させるために変えられ得ることが理解される。
【００３７】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノ、ジ、トリグリセリドにおいて、例えば、動物およびヒトにおいて天然に存在する同様の骨格だからである。それゆえ、この分枝鎖は必ずしも体内で外来因子としてみなされない。ＰＯＧはＰＥＧと同様の範囲の好適な分子量を有する。ＰＯＧの構造はＫｎａｕｆら、１９８８，  Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１５０６４−１５０７０中に示され、そしてＰＯＧ／タンパク質接合体の説明が米国特許第４，７６６，１０６号に見出される。これらは両方ともそのまま本明細書中で参考として援用される。
【００３８】
液体薬学的組成物の調製後、それは分解の防止および無菌保存のために、好ましくは凍結乾燥される。液体組成物の凍結乾燥法は当業者に公知である。使用直前に、組成物は添加成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンゲル溶液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成され得る。再構成によって、好ましくは、組成物は、当業者に公知の方法を用いて被験体に投与される。
【００３９】
（感染個体への投与）
本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは敗血症または敗血症性ショックの哺乳動物を治療するのに有用である。一般に、状態は、高熱（＞３８．５℃）または低体温（＞３５．５℃）、低血圧、頻呼吸（＞２０呼吸／分）、頻拍（＞１００拍／分）、白血球増加症（＞１５，０００細胞／ｍｍ３）、および血小板減少症（＜１００，０００血小板／ｍｍ３）により特徴付けられる。好ましくは、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、以下のように被験体が敗血症であると疑われれば直ちに投与される；フィブリノーゲンの２０％を上回る降下（ｄｒｏｐ）またはフィブリン分裂産物の出現の提示、被験体の体温の上昇、および敗血症性ショックに関連する白血球増加症および低血圧の診断。上述の場合、静脈内投与が好ましい。一般的に、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは１μｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で、より好ましくは２０μｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇと７ｍｇ／ｋｇとの間の用量で与えられる。好ましくは、ボーラス投与として与えられ、ボーラス投与後４〜６時間循環レベルを１０〜２０倍まで増加させる。継続的な注入もまたボーラス投与後に用いられ得る。そうであれば、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、５μｇ／ｋｇ／分と２０μｇ／ｋｇ／分との間の用量で、より好ましくは７μｇ／ｋｇ／分と１５μｇ／ｋｇ／分との間の用量で注入され得る。
【００４０】
本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、敗血症性ショックの治療に効果的である他の薬剤と組み合わせて与えられ得る。例えば、以下のものが本発明の方法により調製されたＬＡＣＩと組み合わせて投与され得る：根元的な細菌感染を治療し得る抗生物質；細菌細胞壁成分に対するモノクローナル抗体；敗血症経路に関与するサイトカイン（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１、γ−インターフェロン、およびインターロイキン−８を含むがこれらに制限されない）と複合体を形成し得るモノクローナル抗体および可溶性レセプター；および一般に、敗血症経路中のサイトカインまたは補体タンパク質と相互作用し得、それらの効果を減少させ、かつ敗血症または敗血症性ショックを減衰させる任意の薬剤またはタンパク質。
【００４１】
本発明に有用な抗生物質は一般的な部類の内の以下を含む：βラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖類（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサミド（ｎａｐｔｈａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド（ｓｕｌｆａｎｙｌａｒｎｉｄｅｓ）由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５−ニトロ−２−フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質のさらなる改良体は、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｙｍｅｒ（編）、２巻、７８２〜１０３６頁（１９７８）および３巻、１〜７８頁、Ｚｉｎｓｓｅｒ、ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ、１７版、Ｗ．  Ｊｏｋｌｉｋら（編）２３５〜２７７頁（１９８０）、またはＤｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、２７版、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９８８）中に見出され得る。
【００４２】
本発明の方法により調製されたＬＡＣＩと組み合わせられ得る他の薬剤としては、敗血症経路に関与するサイトカインに対するモノクローナル抗体（ＰＣＴ  ＵＳ９０／０７４１１に示されるような、ＩＬ−６またはＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体）；米国特許第４，６０３，１０６に示されるような、ＴＮＦに対するモノクローナル抗体；ＰＣＴ  ＵＳ９０／０３２６６およびＰＣＴ  ＵＳ９３／０６１２０に示されるような、ＴＮＦプロホルモン産生細胞からの成熟ＴＮＦプロホルモンを切断するタンパク質のインヒビター；ＰＣＴ  ＵＳ９１／０２４６０に示されるような、ＩＬ−１のアンタゴニスト；ＰＣＴ  ＵＳ９０／００３２１に示されるような、アクチビンのようなＩＬ−６サイトカイン作用のインヒビター；およびＩＬ−１のような種々のサイトカインのレセプターに基づくインヒビターが挙げられる。補体タンパク質に対する抗体または補体タンパク質の小分子インヒビターもまた用いられ得る。
【００４３】
一般的に、本発明の方法により調製されたＬＡＣＩは、損傷、外傷、内毒素、ＴＮＦ、ガン、ＩＬ−１、または他の薬剤もしくは状態により引き起こされる組織因子のアップレギュレーションにより生じる疾患に有用であり得る。
【００４４】
本発明は以下の実施例に言及することにより例証される。この実施例は特に有益な実施態様を記載する。しかし、これら実施態様は例示であって、いかなるようにも発明を制限するものとして解釈されるものではない。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
シャトルベクターｐＢＳ２４が、Ｂａｒｒら、ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＆  ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ  ＦＯＲ  ｒＤＮＡ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９９１），  ５１〜６４頁）に記載される。ｐＢＳ２４ＵｂはｐＢＳ２４．１の誘導体であり、そして唯一のＢａｍ  ＨＩおよびＳａｌ  Ｉ制限部位、グルコース制御可能ＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーター、および合成ユビキチン（Ｕｂ）遺伝子を側面に有する発現カセットを含む。Ｕｂ融合体の構築のために、唯一のＳｓｔ  ＩＩ部位をＵｂ遺伝子の３’末端に作成する。Ｓｓｔ  ＩＩ部位の存在により、ユビキチン融合ペプチドを発現するヌクレオチド配列のインフレーム挿入が可能になる。挿入は合成ＤＮＡアダプターまたはＰＣＲ法の使用に従って遂げられ得る。いずれの場合も、５’結合配列は：
ARG      GLY    GLY
Ｃ  ＣＧＣ  ＧＧＹ  ＧＧＣ
Ｇ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＧ
SstII
（配列番号４）
であり、そして３’クローニング部位（Ｓａｌ  Ｉ）は終止コドンの３’末端に可能な限り近接すべきである。
【００４６】
ＰＣＲを、図３に示される１５．４ｋｂプラスミドｐＬＡＣＩ  ４．１におけるユビキチン／ＴＦＰＩ遺伝子融合の構築に用いた。ＴＦＰＩをコードする核酸を、プライマーＬＡＣＩ４およびＬＡＣＩ３で標準的なＰＣＲ手順を用いて増幅させた。ＬＡＣＩ４は成熟ＴＦＰＩをコードする核酸の５’末端の１０ヌクレオチドとハイブリダイズし、そしてまたＳｓｔ  ＩＩ制限部位を伴うユビキチン配列を含む。ＬＡＣＩ３は成熟ＴＦＰＩをコードする核酸の３’末端の１５ヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてまたＳａｌ  Ｉ制限部位を伴う後続配列（ｔｒａｉｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。これらプライマーの配列は以下のとおりである：
ＬＡＣＩ４  ＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧ  （配列番号５）
ＬＡＣＩ３  ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣ    （配列番号６）
増幅後、ＰＣＲ産物を酵素の製造者により特定される条件を用いてＳａｌ  ＩおよびＳｓｔ  ＩＩにより消化した。次いで、消化ＰＣＲ産物を上記のようにｐＢＳ２４Ｕｂにクローン化し、  ｐＬＡＣＩ  ４．１を生成した。
【００４７】
ｐＬＡＣＩ  ４．１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの３株の形質転換に用いた：ＶＨ６（ＭＡＴ  α，  ｃｉｒ゜，  ｌｅｕ−２−１１２，−３，  ｕｒａ３，  ＦｏＡ，  ｐｅｐ４：：Ｈｉｓ３）、ＡＢ１２２（ＭＡＴ  α，  ｃｉｒ゜，  ｌｅｕ２，  ｕｒａ３−５２，  ｐｒｂ１−１１１２，  ｐｅｐ４−３，  ｐｒｅ１−４０７）、およびＪＳＣ３１０（ＡＢ１２２と同様、＋ＡＤＲ１過剰発現）。ＶＨ６形質転換体は総タンパク質の約５％のレベルのＴＦＰＩを産生し、ＡＢ１２２形質転換体は総タンパク質の約１０％のレベルのＴＦＰＩを産生し、そしてＪＳＣ３１０形質転換体は総タンパク質の約１５％のレベルのＴＦＰＩを産生した。ＴＦＰＩの安定性は、ユビキチン融合体として合成され、そしてユビキチンの除去後Ｎ末端にアスパラギン酸を有するタンパク質が酵母細胞中で不安定（例えば、半減期＜３分）であることが示される先行の研究を考慮すると、いくらか意外である。Ｆｉｎｌｅｙ，「Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  （１９９２）を参照のこと。
【００４８】
（実施例２）
（パートＡ）
ＴＦＰＩを、米国特許第５，２１２，０９１号（これは本明細書中に参考として援用される）、特に、第９〜１０欄において開示される方法により、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＶＨ６細胞から精製した。不溶性画分（膜画分とも呼ぶ）を、ＴＥＮ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．８；  ５０ｍＭ  ＮａＣｌ；  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌガラスビーズ抽出によって調製した。この画分由来の全タンパク質の約３μｇを、１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、そしてニトロセルロースメンブレンに移した。ニトロセルロースブロットを、成熟ＴＦＰＩペプチド配列の初めの１５アミノ酸に対して生成されたウサギポリクローナル抗血清でプローブした。得られるブロット（図５）により、均一の完全長ＴＦＰＩの有意なバンドが示される。不溶性画分へのＴＦＰＩの発現をまた、比較のクマシー染色した１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図４を参照のこと）を用いて確認した。ＴＦＰＩタンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミド、またはＴＦＰＩタンパク質をコードするＤＮＡを含有しない同一のプラスミドを有する酵母細胞を増殖させた。約１０μｇの酵母全細胞溶解物または２つの培養物由来の不溶性画分を、ゲルに載せた。ＴＦＰＩ産生プラスミドを有する培養物から調製したレーンにおいてのみ、唯一の３６ｋＤバンドが検出された。
【００４９】
スルホン化およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)分画を、米国特許第５，２１２，０９１号において詳述されるように行った。単離されたＴＦＰＩの再折り畳みをまた、本質的に記載されるように行った。但し、透析は、５Ｍ尿素、０．３Ｍ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ  ７．８，  ０．０４％  ＮＰ４０，  ２ｍＭ  Ｌ−システイン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、室温で４〜６時間、次いで４℃で一晩行い、その後、透析バッグを２Ｍ尿素、１ｍＭ  Ｌ−システインに移して４℃で４８時間おいた。Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)分画については、再折り畳みされたＴＦＰＩを、カラムに載せる前に２Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中で平衡化させた。洗浄緩衝液は、２Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．２５Ｍ  ＮａＣｌを含有し、そしてＴＦＰＩを２Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．８Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液で段階溶出した。ＴＦＰＩを含有する画分をプールし、そしてＰＢＳ／１．５Ｍ尿素に対して、４℃で一晩、透析した。
【００５０】
この方法によって再生された産物のＮ末端配列決定は、以下の正確な配列を与えた：
【００５１】
【化７】
2005348744.tif 000008
（配列番号６）。この配列は真正の成熟ＴＦＰＩに、９０％を越える純度で対応する。
【００５２】
再生された産物をまた、第Ｘａ因子アミド分解（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ）アッセイおよびプロトロンビン凝固時間アッセイ（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｉｍｅ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ）（両方とも、Ｗｕｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：１６０９６  （１９９０）に記載されている）で試験して、活性を評価した。これらのアッセイからのデータを、図１Ａおよび図１Ｂにそれぞれ示す。ＰＢＳ緩衝液を第Ｘａ因子阻害アッセイにおいてコントロールとして使用し、そしてＰＢＳ緩衝液ならびに正常なヒト血清（ＮＨＳ）をプロトロンビン凝固アッセイにおいてコントロールとして使用した。酵母産生のＴＦＰＩは、約２０ｎｇ／ｍｌの５０％阻害濃度で、第Ｘａ因子活性を阻害し、そしてプロトロンビン凝固アッセイでは１μｇ／ｍｌの阻害濃度を示した。これらの結果は、本発明の方法によって産生されるＴＦＰＩが、生物学的に活性であることを示している。
【００５３】
（実施例３）
本発明の方法をまた、大規模（すなわち、１０リットル以上のバッチ）でＴＦＰＩを産生するために使用した。酵母ＡＢ１２２株をｐＬＡＣＩ４．１で形質転換し、そしてアミノ酸を含まないＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）を含有し、８７ｍｇ／ＬのＬ−アデニン、４３．５ｍｇ／ＬのＬ−トリプトファン、４３．５ｍｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、４３．５ｍｇ／ＬのＬ−アルギニン、４３．５ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、６５．２ｍｇ／ＬのＬ−チロシン、１０９ｍｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、６５．２ｍｇ／ＬのＬ−リジン、および８％のグルコースを補充した選択培地中で増殖させた。形質転換された細胞のアリコートを、グリセロールを１５％になるように添加して−７０℃で貯蔵することによって保存した。ｐＬＡＣＩ４．１で形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＢ１２２株は、１９９４年７月１９日にＡＴＣＣに寄託されており、寄託番号７４２９１が与えられている。
【００５４】
１０リットルの発酵槽のための接種物を、１％ｖ／ｖの凍結された形質転換培養物を前段落において記載したような新鮮な選択培地に添加することによって調製した。次いで、接種物を振とうフラスコ中で２４時間〜４８時間増殖させた。次いで、接種物を、１０リットルの発酵容器の内容物に０．５％ｖ／ｖ添加した。容器中の培地は、滅菌の前に以下の成分を含んだ：
タストン  １５４  イースト  エクストラクト：  １０ｇ／Ｌ
カゼイン  ペプトン：  ２０ｇ／Ｌ
アンチフォーム：  ０．３ｍｌ／Ｌ
クエン酸：  ４ｍＭ
ＫＨ２ＰＯ４：  ２０ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：  ５０ｍＭ
ＭｎＳＯ４：  ２０μＭ
ＺｎＳＯ４：  ２０μＭ
Ｈ３ＢＯ３：  １００μＭ
ＣｏＣｌ２：  １０μＭ
Ｎａ２ＭｏＯ４：  １０μＭ
ＣｕＳＯ４：  ２μＭ
グリセロール：  ３０ｇ／Ｌ。
【００５５】
次いで、発酵容器の内容物をインサイチュで滅菌し、そして以下の滅菌成分を添加して培地を完全にした：
ＭｇＳＯ４：  ２０ｍＭ
ＦｅＣｌ３：  １００μＭ
グルコース：  ２０ｇ／Ｌ
ピロキシジンＨＣｌ：  ５ｍｇ／Ｌ
チアミンＨＣｌ：  １０ｍｇ／Ｌ
Ｄ−ビオチン：  ０．１ｍｇ／Ｌ
Ｃａパントテン酸：  １０ｍｇ／Ｌ
ミオ−イノシトール：  ４００ｍｇ／Ｌ。
【００５６】
発酵容器での細胞の増殖の間、培地を３０℃の温度に維持した。ＮａＯＨまたはリン酸を必要に応じて添加することによって、ｐＨ６．０を維持した。６００ｒ．ｐ．ｍで振とうを開始し、そして必要に応じて増加させて、Ｄ．Ｏ＞３０％を維持した。通気は１ｖｖｍ空気であった。接種の１５時間後に開始し、滅菌グルコース（２５％ｗ／ｖ）と滅菌グリセロール（６．８％ｗ／ｖ）の混合液を発酵槽に０．１ｍｌ／分／Ｌの速度で添加した。３９時間で、この混合液の添加速度を０．０５ｍｌ／分／Ｌに減少させた。培養を９６時間後に終結させた。ＴＦＰＩ（１ｍｇ／ｍｌ）のピーク発現は、接種後７２時間までに生じた。
【００５７】
上述の議論および実施例は、本発明を例証するのみであり、当業者には、本発明が他の方法で行われ得ること、そして本発明は請求の範囲を参照することによってのみ規定されることが理解される。さらに、前述の明細書において引用される全ての参考文献、特許、および特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の方法によって産生されるＴＦＰＩの活性を示す。
【図２】図２は、ＴＦＰＩタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む複製可能なクローニングビヒクル（ｐＬＡＣＩ  ４．１と命名する）の概略図を示す。
【図３】図３は、本発明の方法で真正１次配列を含むＴＦＰＩを産生するために用いられるユビキチンＴＦＰＩ融合タンパク質をコードする配列（配列番号１）を示す。
【図４】図４は、最初の精製の後の酵母細胞中の不溶性画分に含有されるＴＦＰＩのクマシー染色ＰＡＧＥゲルを示す。
【００５９】
（配列表）
【００６０】
【化８】
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【００６１】
【化９】
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【００６２】
【化１０】
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【００６３】
【化１１】
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【００６４】
【化１２】
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【００６５】
【化１３】
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【００６６】
【化１４】
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【００６７】
【化１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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