(57)【要約】【課題】  本発明は、骨格筋の量および赤筋の割合を調節している原因物質を解明し、この機能を利用して、筋組織の重量及び／又は組成の調節をできるようにするものであり、筋組織の重量及び／又は組成の調節するための剤（組成物）、そのためのスクリーニング方法などを提供する。【解決手段】  本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質が、筋組織の重量や組成を調節する重要な機能を担っていることを初めて見出したものであり、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を調節することによる、筋組織の重量や組成の調節を提供するものである。即ち、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤からなる筋組織の重量及び／又は組成の調節剤に関する。また、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質を用いた、骨格筋の組成及び量を調節する薬剤のスクリーニング方法に関するものである。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤からなる筋組織の重量及び／又は組成の調節剤。
【請求項２】
筋組織が骨格筋である請求項１に記載の調節剤。
【請求項３】
筋組織の組成の調節が、赤筋と白筋の割合の調節である請求項１又は２に記載の調節剤。
【請求項４】
筋組織の重量及び／又は組成の調節が、筋重量の減少や筋量の減少がひき起こす疾患の治療・予防である請求項１〜３のいずれかに記載の調節剤。（糖尿病や肥満）の
【請求項５】
筋重量の減少や筋量の減少がひき起こす疾患が、糖尿病や肥満である請求項４に記載の調節剤。
【請求項６】
ＦＯＸＯ１タンパク質の機能調節剤が、
(a)ＦＯＸＯ１蛋白質の発現量を減少させる；
(b)ＦＯＸＯ１蛋白質の転写活性を減少させる；又は、
(c)ＦＯＸＯ１蛋白質とＰＧＣ１αの結合を減少させる；
のいずれかの活性を有するものである請求項１〜５のいずれかに記載の調節剤。
【請求項７】
筋組織の細胞または動物個体に被験物質を作用させ、筋組織の細胞におけるＦＯＸＯ１タンパク質の活性を測定することからなる、筋組織の重量や組成の調節に有効な物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
筋組織が、骨格筋である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
筋組織の重量や組成の調節に有効な物質が、筋組織の重量の減少、又は筋量の減少がひき起こす疾患の治療・予防に有効な物質である請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＯＸＯ１タンパク質の活性が、以下の（ａ）〜（ｃ）、
（ａ）ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量を減少させる；
（ｂ）ＦＯＸＯ１タンパク質の転写活性を減少させる；
（ｃ）ＦＯＸＯ１タンパク質とＰＧＣ１αの結合を減少させる；
のいずれか１つ以上を満たすものである請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＦＯＸＯ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、ＦＯＸＯ１蛋白質を骨格筋で過剰に発現するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
動物が、マウスである請求項１１に記載のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質が、筋組織の重量や組成を調節する重要な機能を担っていることを初めて見出したものであり、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を調節することによる、筋組織の重量や組成の調節を提供するものである。即ち、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤からなる筋組織の重量及び／又は組成の調節剤に関する。また、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質を用いた、骨格筋の組成及び量を調節する薬剤のスクリーニング方法に関するものである。さらに、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、ＦＯＸＯ１蛋白質を骨格筋で過剰に発現するヒト以外のトランスジェニック動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は、平滑筋や心筋などの不随意筋とは異なり、その大部分は随意筋であり、ヒトの運動器官として機能している。骨格筋は、多数の筋線維からできており、筋線維は約１５ｃｍにも達する非常に長い骨格筋細胞からできている。このような骨格筋には、大きく分けて２種類のものがあり、そのひとつは赤筋（タイプＩ、遅筋）とよばれる筋であり、ミトコンドリアや、ヘモグロビンによく似たミオグロビンが多数存在するために赤色のように見える筋である。他のひとつは白筋（タイプII、速筋）と呼ばれる筋であり、赤筋に比べてミオグロビンもミトコンドリアも少ない筋である。赤筋はマラソンなどのような有酸素運動を長時間する運動に適している。これはミトコンドリアが豊富でＴＣＡ回路が活発であり、またミオグロビンの量が多く、酸素運搬が活発であるからである。さらに、赤筋はクレアチンキナーゼの活性が高くエネルギーを多く産生しうる。一方、白筋は無呼吸運動、短距離走に適している。白筋は解糖作用のよるＡＴＰを主なエネルギー源としている。
【０００３】
このように、骨格筋には、持続的な運動に適している赤筋と、瞬発的な運動にてきしている白筋があるが、赤筋と白筋の割合は常に一定ではなく、運動神経の活性の変化により生理学的に制御されている。例えば、持久的な運動を長期間継続することにより赤筋の割合および量は増加する。また、寝たきりや宇宙船での無重力が継続することにより筋量は減少し、赤筋と白筋の割合の変化が起こされることが知られる（非特許文献１参照）。
また、糖尿病患者と肥満者の筋肉では赤筋の割合が低いという報告がある（非特許文献２及び３参照）。赤筋（遅筋）と白筋（速筋）の割合を決定する機構を解明することはエネルギー消費の分子理解につながり、高齢者の主要な疾患である生活習慣病研究の観点から意義があると考えられる
このように、赤筋と白筋の量や割合の決定の機構はスポーツ科学、医学において長い謎であったが、最近、その一端が明らかになった。
【０００４】
このような赤筋と白筋の割合の変化は、カルシウムシグナル伝達系、並びにカルシネウリン（calcineurin）およびキナーゼ依存性カルモヂュリン（calmodulin-dependent kinase（ＣａＭＫ））などが関与していることが報告されている（非特許文献４及び５参照）。
これらのシグナルにより、Ｍｅｆ２やＮＦＡＴの機能が活性化され、赤筋に特異的な遺伝子の発現が促進されると考えられている。また、近年になって、ＰＧＣ−１αを発現するトランスジェニックマウスにおいて、マウスの白筋のミトコンドリアが活性化され、赤筋に変化したことから、ＰＧＣ−１αが赤筋の形成を誘導することが報告された（非特許文献６参照）。
即ち、赤筋の増加にＰＧＣ−１α蛋白質が関与していることが明らかにされてきたのである。
【０００５】
一方、フォークヘッド型転写因子のサブタイプとして、ＦＯＸＯ１（ＦＫＨＲ）、ＦＯＸＯ４（ＡＦＸ）及びＦＯＸＯ３ａ（ＦＫＨＲＬ１）などが知られている（非特許文献７及び８参照）。ＦＯＸＯファミリーは、細胞の代謝、細胞周期、及びアポトーシスなどの、細胞の様々な機能を調節する転写因子である。特に、ＦＯＸＯ１は最初、横紋筋肉腫細胞からクローニングされた転写因子であり、他の転写因子であるＰＡＸ３と共に染色体の転座により、異常な融合タンパク質を生ずる。さらに、ＦＯＸＯ１は、細胞の分化を調節し、ＦＯＸＯ１の構成的な活性型は、脂肪前駆細胞の分化を抑制し、筋芽細胞の筋管の融合を促進する。
さらに、近年になって、ＦＯＸＯ１のノックアウトマウスが作成された。ＦＯＸＯ１の片方のアレルが欠損した場合には、脂肪細胞におけるインスリン感受性遺伝子の発現を促進し、肝臓での糖新生遺伝子の発現を抑制することにより、インスリン感受性を改善し、インスリン耐性マウスにおける糖尿病の症状を軽減させたことが報告されている（非特許文献９参照）。また、本発明者らは、ＦＯＸＯ１が、エネルギーが欠乏した状態の骨格筋、例えば、絶食させたマウスやストレプトゾトシン（streptozotocin）で誘発した糖尿病やトレッドミルで走らせた後のような状態の骨格筋で発現誘導していることを報告してきた（非特許文献１０参照）。このように、ＦＯＸＯ１について、インビボやインビトロでの多数の研究がなされてきたが、骨格筋におけるＦＯＸＯ１の生理学的役割は未だに未解明であった。
また、ＰＧＣ−１αとフォークヘッド型転写因子のＦＯＸＯ１蛋白質が、肝臓において複合体を形成し、遺伝子の発現を制御していることが報告された（非特許文献１１参照）。前述してきたように、ＰＧＣ−１αは赤筋を増やすことが知られているが、しかしＦＯＸＯ１や関連タンパクの骨格筋での生理的役割は解明されていない。
【０００６】
【非特許文献１】Berchtold, M. W., Brinkmeier, H., and Muntener, M. (2000) Physiol. Rev. 80, 1215-1265
【非特許文献２】Gaster M et al, Diabetes. 2001, 50:1324-9
【非特許文献３】Tanner CJ et al, Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002, 282:E1191-6
【非特許文献４】Chin, E. R., Olson, E. N., Richardson, J. A., Yang, Q., Humphries, C., Shelton, J. M., Wu, H., Zhu, W., Bassel-Duby, R., and Williams, R. S. (1998) Genes Dev. 12, 2499-2509
【非特許文献５】Wu, H., Naya, F. J., McKinsey, T. A., Mercer, B., Shelton, J. M., Chin, E. R., Simard, A. R., Michel, R. N., Bassel-Duby, R., Olson, E. N., and Williams, R. S. (2000) EMBO J. 19, 1963-1973
【非特許文献６】Lin, J., Wu, H., Tarr, P. T., Zhang, C. Y., Wu, Z., Boss, O., Michael, L. F., Puigserver, P., Isotani, E., Olson, E. N., et al. (2002) Nature 418, 797-801
【非特許文献７】Anderson, M. J., Viars, C. S., Czekay, S., Cavenee, W. K., and Arden, K. C. (1998) Genomics 47, 187-199
【非特許文献８】Kaestner, K. H., Knochel, W., and Martinez, D. E. (2000) Genes Dev. 14, 142-146
【非特許文献９】Nakae, J., Biggs, W. H. 3rd., Kitamura, T., Cavenee, W. K., Wright, C. V., Arden, K. C., and Accili, D. (2002) Nat. Genet. 32, 245-253
【非特許文献１０】Kamei, Y., Mizukami, J., Miura, S., Suzuki, M., Takahashi, N., Kawada, T., Taniguchi, T., and Ezaki, O. (2003) FEBS Lett. 536, 232-236
【非特許文献１１】Puigserver, P., Rhee, J., Donovan, J., Walkey, C. J., Yoon, J. C., Oriente, F., Kitamura, Y., Altomonte, J., Dong, H., Accili, D., and Spiegelman, B. M. (2003) Nature 423, 550-555
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
骨格筋は糖取込みに重要で、またエネルギー消費がさかんな器官である。骨格筋の量および赤筋の割合を増加させることは、糖尿病および肥満の病態の改善につながると考えられる。しかしながら、骨格筋の量および赤筋の割合の調節の正確な機構は未だ明らかにされていない。骨格筋の量および赤筋の割合を決定する機構を解明し、薬剤開発のスクリーニングの指標となる系を確立することが求められている。
即ち、本発明は、骨格筋の量および赤筋の割合を調節している原因物質を解明し、この機能を利用して、筋組織の重量及び／又は組成の調節をできるようにするものであり、筋組織の重量及び／又は組成の調節するための剤（組成物）、そのためのスクリーニング方法などを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
赤筋の増加にＰＧＣ−１αが関与していることが報告され（非特許文献６参照）、そして、肝臓においてはＰＧＣ−１αとＦＯＸＯ１が複合体を形成していることも報告されてきた（非特許文献１１参照）。しかし、ＦＯＸＯ１と赤筋との関連性については未だ解明されていないので、本発明者らは、筋肉の赤筋と白筋の量・割合の決定において、ＦＯＸＯ１が関わっているかもしれないと予想し、その可能性を調べるためにＦＯＸＯ１を筋肉で発現するトランスジェニックマウスを作成して検討することにした。
この結果、驚くべきことにＦＯＸＯ１の過剰発現型のマウスの筋肉は赤ではなく、明らかに白っぽくなっていた。ジーンチップ解析をすると赤筋のアイソフォームの一群の発現が下がっており、組織観察によりヒラメ筋など、もともと赤い筋肉であるにもかかわらず、赤筋の量が顕著に下がっていた。このことはＦＯＸＯ１は筋肉の赤筋、白筋を決定する役割を担う新たな重要な分子であることを示す。また、ＰＧＣ−１αの発現の促進も観察されたが、赤筋の増加が見られないことから、ＦＯＸＯ１タンパク質が筋組織の重量や組成を決定する上で決定的な機能を果たしていることを見出した。
即ち、本発明者らは、ＦＯＸＯ１タンパク質により、筋組織の重量や組成が調節されており、ＦＯＸＯ１の発現量や活性を調節することにより、筋組織の重量や組成を調節することができることを初めて見出し、本発明に至った。
【０００９】
即ち、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤からなる筋組織の重量及び／又は組成の調節剤に関する。
に記載の調節剤。
また、本発明は、筋組織の細胞または動物個体に被験物質を作用させ、筋組織の細胞におけるＦＯＸＯ１タンパク質の活性を測定することからなる、筋組織の重量や組成の調節に有効な物質をスクリーニングする方法に関する。
さらに、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、ＦＯＸＯ１蛋白質を骨格筋で過剰に発現するヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。
【００１０】
本発明者らは、ブレンナンらによるヒトα−骨格筋アクチンプロモーター（Brennan, K. J., and Hardeman, E. C. (1993) J. Biol. Chem. 268, 719-725）を用いて、ヒトＦＯＸＯ１を骨格筋において発現するトランスジェニックマウスを作成した。導入した５ｋｂの遺伝子構築物を図１に模式図で示す。遺伝子部分はエキソン１とイントロン含み、その５’末端側にはウシ成長ホルモンのポリアデニルサイトを含有している。この遺伝子構築物をマイクロインジェクション法によりマウスに導入して、トランスジェニックマウスを作成した。得られたＦＯＸＯ１過剰発現型トランスジェニックマウスの２系統を、それぞれ「Ａ１マウス」及び「Ａ２マウス」と命名した。
これらのマウスについてＦＯＸＯ１遺伝子の発現をサザンブロットで検出した。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の各レーンは左側から、野生型、Ａ１マウス、Ａ２マウスをそれぞれ示す。各写真の下側の数値は、サザンブロットの結果をオートラジオグラフィーのデンシトメーターのスキャニングにより推定したコピー数を示す。その結果、Ａ１マウスには２コピーが導入され、Ａ２マウスには１０コピーが導入されたことがわかった。
【００１１】
次に、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したトランスジェニックマウスのＦＯＸＯ１遺伝子の発現をノーザンブロットにより検定した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の上段は、ヒトＦＯＸＯ１の発現であり、下段はＧａｄｄ４５αで再ハイブリダイズした結果を示す。各段のLine A1はＡ１マウスであり、Line A2はＡ２マウスであり、Controlは野生型を示す。２８Ｓは２８ＳリボソームＲＮＡであり、陽性コントロールとして示す。各レーンは、左側から脳、灰色脂肪組織（ＢＡＴ）、心臓、腎臓、肝臓、肺、腓腹筋（Gastro.）、四頭筋（Quadri.）、白色脂肪組織（ＷＡＴ）をそれぞれ示す。各レーンのＲＮＡの量は２０μｇである。この結果、骨格筋においては約３．５ｋｂのところに導入した遺伝子のブロットを確認することができた。図３では骨格筋として腓腹筋（Gastro.）、及び四頭筋（Quadri.）（注：４個の頭を有する筋で、大腿四頭筋及びふくろはぎの腓腹四頭筋をいう。）のみを示しているが、発現は前脛骨筋（ＴＡ）、長指伸筋（ＥＤＬ）及びヒラメ筋においても導入した遺伝子の発現を確認することができた。
次に、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現を確認するために、ヒトＦＯＸＯ１及びマウスＦＯＸＯ１に反応する抗体を用いてイムノブロットを行った。抽出されたタンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗体で染色した。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の各レーンは左側から、野生型、Ａ１マウス、Ａ２マウスをそれぞれ示す。各写真の下側の数値は、サザンブロットの結果をオートラジオグラフィーのデンシトメーターのスキャニングにより推定した発現量を野生型を１００とした相対値で示す。その結果、Ａ１マウスでは約２．２倍の発現が見られ、Ａ２マウスでは約３倍の発現が見られた。
次にこれらのマウスを解剖してその所見を観察した。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５の左側はＡ１マウスと野生型の場合であり、右側はＡ２マウスと野生型の場合である。図５のそれぞれの上段は野生型であり、下段は遺伝子導入マウスである。図５の各写真の左側から前脛骨筋（ＴＡ）、長指伸筋（ＥＤＬ）及びヒラメ筋（Ｓｏｌ）である。Ａ１マウスについては８月齢を、Ａ２マウス及びコントロールの同腹子については６月齢を、解剖し足の骨格筋を取り出した。前脛骨筋（ＴＡ）は赤筋と白筋を含有し、長指伸筋（ＥＤＬ）は白筋が豊富であり、ヒラメ筋（Ｓｏｌ）は赤筋が豊富な筋である。この結果、前脛骨筋及びヒラメ筋において、コントロールの同腹子よりもＦＯＸＯ１遺伝子導入マウスのほうが、サイズが小さく、色も白色がかっていた。
【００１２】
ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスは、コントロールの野生型マウスに比べて小さく、足も細かったので、これらのマウスの体重を調べた。ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスは、雄も雌も野生型に比べて約１０％軽かった。さらに、デュアルエネルギーＸ線アブソープションメトリー（ＤＥＸＡ）を用いて、赤身体重（脂肪を除いた体重）を測定した。測定は、Ａ１マウスについては５月齢を、Ａ２マウス及びコントロールの同腹子については４月齢で行った。結果を次の表１に示す。
【００１３】
【表１】
2005261203.tif 000002
【００１４】
表１の数値は平均±標準偏差で示す。＊はｐ＜０．０５で、＊＊はｐ＜０．０１で、＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差があることを示す。
体重及び赤身体重は、コントロールの野生型に比べて、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスのほうが雄も雌も軽かった。しかし、全体重に対する脂肪の比率（脂肪率）は、両者で大きな相違は見られなかった。即ち、両者の体重の相違は、脂肪によるのではなく、赤身、即ち筋の量による相違である。このことは、図５に示したように、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスでは骨格筋自体が小さく、色も白味がかっており、しかもＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスはえさの消費率も少なかった。なお、表１には併せて血液代謝（乳酸、グルコース）、及びインスリンレベルを示す。
【００１５】
次に、トランスジェニックマウスにおける遺伝子発現の変化を調べるために、骨格筋のＲＮＡを用いたマイクロアレーによる分析を行った。ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス及び野生型の各の４月齢の雄の骨格筋から３サンプルを取り、１２４８９種の遺伝子を含有するアフィメトリックスＭＧＵ７４Ａマイクロアレー（Affymetrix MGU74A microarray）でハイブリダイズさせ、アフィメトリックス遺伝子チップ３．１（Affymetrix Gene Chip 3.1）のソフトを用いて解析した。解析した１２４８９の遺伝子のうち、野生型は２５００種が、Ａ１マウスは２４９０種が、Ａ２マウスは２５１０種が実質的に発現していた。これらを、すでに報告されている分類法により（Adams, MD, et al., (1995) Nature 377, 3-174）分類した。結果を次の表２に示す。
【００１６】
【表２】
2005261203.tif 000003
【００１７】
表２中のカテゴリー及びサブカテゴリーは従来の分類法による。変化における↑／↓印は、野生型に比べて有意に増加／減少していたことを示す。比較のために、絶食による遺伝子の発現の変化を表２の右側に添付している。表２中の絶食実験の平均偏差の欄の「Absence」はマイクロアレーのソフトを用いて計算した遺伝子の転写が無かったことを示す。
ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスのＡ１系統もＡ２系統も、２２種の遺伝子において、その発現が減少していたことがわかった。表２に記載の遺伝子は、上から、Ａ１系統のマウスにおいて、これらの遺伝子の発現量の変化の多い順に従って並べられている。変化量の計算は、プローブアレーにおける各の転写の表示の相対的変化を示すものとして行われた。平均変化（average difference）の値は、各々の遺伝子の存在量のマーカーとなっている。
ＦＯＸＯ１遺伝子が導入されて発現が減少した遺伝子が最も多いカテゴリーは、細胞構造（cell structure）である。減少した１９遺伝子のうちの９種は細胞構造に属する遺伝子であった。また、ＦＯＸＯ１の導入により発現が促進された遺伝子もあったが、これらは各種のカテゴリーに分散していた。
【００１８】
この結果、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの骨格筋では、ミオシンのアイソフォーム（表２の１，４及び６番）、トロポニンのアイソフォーム（表２の２，５及び７番）、トロポミオシンの遅筋タイプ（表２の１３番）、ミオグロブリン（表２の１２番）などの赤筋（タイプＩ）の構造タンパク質に関連する遺伝子の発現が減少していた。これは、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの骨格筋が白味がかって見えたこと（図５参照）とよく一致している。また、赤筋（タイプＩ）ではミトコンドリアが白筋よりも多いが、マイクロアレーにおいては、ミトコンドリアに関連する遺伝子、即ち電子伝達系に関連する遺伝子の発現には格別の相違は見られなかった。さらに、白筋（タイプII）のアイソフォームの遺伝子の発現についても格別の相違は見られなかった。
【００１９】
以上のマイクロアレーの分析に基づいて、赤筋や白筋のマーカーとなる遺伝子についてノーザンブロットを行った。結果を図６に図面に代わる写真で示す。ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスのＡ１系統及びＡ２系統、並びに野生型の四頭筋から抽出した全ＲＮＡ（各レーン２０μｇ）を用いた。図６の左側にハイブリダイズに使用した遺伝子名を示し、右側にデンシトメトリーによる相対値（野生型を１００とする。）を示す。各膜に同じサンプルが使用されたことを、２８ＳリボソームＲＮＡのエチジウムブロマイドを用いた染色により確認した。各レーンはそれぞれのマウスからのサンプルを示す。
この結果、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスにおいては、ＦＯＸＯ４やＦＯＸＯ３αなどのＦＯＸＯファミリーのｍＲＮＡには格別の影響を及ぼしていないことがわかった。マイクロアレーの結果示された、トロポニンＣ（遅筋型）（表２の２番）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ−２）（表２の６番）、トロポニンＴ（遅筋型）（表２の７番）、ミオグロビン（表２の１２番）、及びミトコンドリア型クレアチンキナーゼ（mitochondrial creatine kinase （ｍｔＣＫ））（表２の１５番）などの赤筋（タイプＩ）のタンパク質の遺伝子の発現の減少が確認された。一方、赤筋（タイプＩ）に豊富に存在することがしられている、チトクロームｃオキシダーゼII及びIV（ＣＯＸII及びIV）、ＦＯＦ１−ＡＴＰａｓｅなどのミトコンドリアの電子伝達系を構成する遺伝子の発現レベルには大きな変化は見られなかった。また、トロポニンＩ（速筋型）、トロポニンＴ（速筋型）及びミオシン（速筋型）の遺伝子の発現は野生型と大きな変化は無かった。
さらに、赤筋の生成に関連性があると報告されているＭｅｆ２、ＮＦＡＴ、ＣａＭＫ、及びＰＧＣ−１αについても検討した。ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスにおいては、ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡレベルが増加している（図６のレーンＡ２参照）。しかし、Ｍｅｆ２ｃ及びＣａＭＫについては、遺伝子の発現レベルは減少していた。このことから、ＦＯＸＯ１によって媒介される赤筋（タイプＩ）の遺伝子の発現抑制は、部分的にはＭｅｆ２ｃ及びＣａＭＫによって制御されていると考えられる。
【００２０】
次に、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの組織学的検討を行った。ｐＨの相違により、赤筋（タイプＩ）と白筋（タイプII）におけるアクトミオシンＡＴＰａｓｅ（Actmyosin ATPase）を区別することができる。即ち、ｐＨ１０．６では、白筋（タイプII）の筋細線維を十分に染色することができるが、赤筋（タイプＩ）は染色されない。また、ｐＨ４．３では、赤筋（タイプＩ）の筋細線維を十分に染色することができる（Berchtold, M. W., et al., (2000) Physiol. Rev. 80, 1215-1265）。
３月齢のＡ２マウス及び野生型の同腹子の、それぞれから骨格筋（ヒラメ筋）を取り出しｐＨ４．３又はｐＨ１０．５で、ＡＴＰａｓｅの染色をした。この横断面を顕微鏡で観察した。結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７の上段はｐＨ４．３での染色（赤筋）の結果を示し、下段はｐＨ１０．５での染色（白筋）の結果を示す。図７の左側はコントロールの野生型であり、右側はＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス（Ａ２系統）を示す。図７中のバーは５０μを示す。
この結果、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスでは赤筋が大きく減少していることがわかった。
【００２１】
また、細胞の大きさも、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスでは細くなっていることがわかる。これらの断面積の測定結果は、
Ａ１系統；ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス      １１．５±０．８μｍ２
コントロールマウス                    ２０．０±２．７μｍ２
Ａ２系統；ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス        ９．８±０．５μｍ２
コントロールマウス                    １４．１±１．９μｍ２
であった。また、赤筋（タイプＩ）の割合は少なくなっており、
Ａ１系統；ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス      ２８．６±１．３％
コントロールマウス                    ３７．８±２．２％
Ａ２系統；ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス      ２０．２±２．３％
コントロールマウス                    ４０．４±２．０％
であった。
【００２２】
ミオグロブリン（赤筋に豊富に存在する。）の抗体による免疫学的な組織学による実験結果は、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの骨格筋において赤筋（タイプＩ）が減少していることを明瞭に示した。しかしながら、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの骨格筋のサンプルには、ミトコンドリアの異常、グリコーゲンの蓄積、空胞の形成、及び筋線維の退化などの構造的な異常は無かった。
【００２３】
次に、マウスの運動機能を回転車による運動について検討した。９〜１０週齢の雌のマウスを用いて、直径２０ｃｍの回転車による自発的運動を６日間行わせ、その累積の回転数を記録した。各サンプル数は３〜６匹である。結果を図８にグラフ化して示す。図８の横軸は日数であり、縦軸は累積回転数を示す。各グラフの白抜きはコントロールの野生型であり、黒抜きはＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスである。図８の左側は、Ａ１系統の場合であり、右側はＡ２系統の場合である。図８には雌の結果を示してあるが、雄についても同様な結果が得られた。
この結果、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスでは、大幅な運動機能の低下が見られた。これは、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスにおいては、骨格筋の量及び赤筋（タイプＩ）の遺伝子の発現が減少した結果、継続的な運動を維持することができなくなったためであると考えられる。
【００２４】
次に、内在性のＦＯＸＯ１の発現と赤筋（タイプＩ）の筋細線維遺伝子の発現の関係を検討した。ＦＯＸＯ１は絶食しているマウスの骨格筋において、最も発現増加しているので（Kamei, Y., et al., (2003) FEBS Lett. 536, 232-236）、絶食したマウス（４８時間）によるマイクロアレー分析を行った。Ｇａｄｄ４５αの発現は絶食により４．７倍になった。絶食によって遺伝子の発現が変化した結果は、表２の右側に記載されている。絶食により、ＦＯＸＯ１の発現の減少だけでなく、多くの遺伝子の発現が減少した。
絶食したマウスの骨格筋によるノーザンブロットを行った。マウスを３グループに分け、第１のグループは通常どおり食事をさせ（コントロール）、第２のグループは４８時間絶食させ、第３のグループは４８時間絶食させた後、８時間食事を与えた（refed）。それぞれのマウスの骨格筋（四頭筋）からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロットを行った。結果を図９に図面に代わる写真で示す。図９の右側はハイブリダイズさせた遺伝子名を示し、各レーンは個々のマウスからの結果を示す。図９中の数値は、デンシトメーターによる相対値である。
この結果、４８時間の絶食により、内在性のＦＯＸＯ１及びＧａｄｄ４５α遺伝子の発現は減少したが、その後回復した。トロポニンＣ（遅筋型）、ＭＬＣ−２（遅筋型）、トロポニンＴ（遅筋型）、及びミオグロビンの遺伝子発現が、絶食により多少減少した。ＰＧＣ−１αの発現も絶食により発現増加されるので、ＰＧＣ−１αの増加が、絶食中の内在性のＦＯＸＯ１の増加による赤筋（タイプＩ）遺伝子の発現の減少を弱めているのであろう。
【００２５】
以上のことから、本発明のＦＯＸＯ１の機能をまとめて模式的に示したのが、図１０である。ＦＯＸＯ１は、赤筋（タイプＩ）の筋細線維の形成における負の調節因子である。その作用は、ＦＯＸＯ１の増加は、赤筋（タイプＩ）の筋細線維の増加に寄与するＭｅｆ２ｃやＣａＭＫの産生を減少させる。さらに、ＦＯＸＯ１は、ＰＧＣ−１αのミトコンドリアの生理活性ではなく、赤筋（タイプＩ）の遺伝子の発現を減らす方向に作用し、両者が競合してＰＧＣ−１αの作用を妨害する。また、カルシウムシグナル伝達系の活性化は、ＰＩ３ＫとＡｋｔ経路を活性化し、ＦＯＸＯ１のリン酸化を促進するために、ＦＯＸＯ１の核外への放出やＦＯＸＯ１の分解が促進され、その結果ＦＯＸＯ１の作用が抑制される。この結果として、赤筋（タイプＩ）の遺伝子の発現の抑制が解除されることになる。
【００２６】
以上に示してきた実験結果に基づき、骨格筋におけるＦＯＸＯ１の発現の増加は筋肉量の減少および赤筋量の減少と関連することが示された。すなわち、これらのデータはヒトの筋肉量の減少の予防および治療に利用できることを示している。ＦＯＸＯ１経路の骨格筋での不活性化は赤筋の減少がひき起こす疾患、例えば、老人性の筋萎縮症（サルコペニア）、糖尿病や肥満などの予防や治療のドラッグデザインの新しいストラテジーになると考えられる。つまり骨格筋でのＦＯＸＯ１を介する転写を下げる薬物は筋肉の増加に効果があると考えられる。ひとつの方法は骨格筋でのＦＯＸＯ１遺伝子発現の誘導の抑制である。他の方法としてはＦＯＸＯ１と他のタンパクＰＧＣ−１αなどとのタンパクータンパク相互作用を引き離すことである。
【００２７】
本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質が、骨格筋の重量や、大きさ、組成などを調節する重要な機能をになっていることを初めて明らかにしたものであり、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量やその活性を調節することにより、筋組織の重量や組成を調節することができることを開示するものである。
したがって、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤からなる筋組織の重量及び／又は組成の調節剤を提供するものである。本発明のＦＯＸＯ１タンパク質としては、ＦＯＸＯ１の全長のタンパク質若しくは活性を有する部分長のタンパク質であってもよく、また、当該タンパク質をコードする遺伝子として生体に導入してもよい。遺伝子の導入法としては、ウイルスなどをベクターとして使用する公知の方法を採用することができる。
また、本発明のＦＯＸＯ１タンパク質の機能調節剤としては、生体内におけるＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を調節できるものであれば特に制限はない。例えば、アンチセンス遺伝子を導入してタンパク質の発現を抑制してもよいし、ＦＯＸＯ１の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を採用することもできる。また、ＦＯＸＯ１の機能を促進又は阻害する合成化学物質を投与することも可能である。また、ＦＯＸＯ１タンパク質の機能の調節としては、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現を促進又は抑制するものや、活性を亢進又は阻害するものが挙げられる。より、詳細には、ＦＯＸＯ１タンパク質の機能調節剤が、
(a)ＦＯＸＯ１蛋白質の発現量を減少させる；
(b)ＦＯＸＯ１蛋白質の転写活性を減少させる；又は、
(c)ＦＯＸＯ１蛋白質とＰＧＣ−１αの結合を減少させる；
のいずれかの活性を有するものが挙げられる。具体的には、例えば、発現量を減少させるものとしては、アンチセンス遺伝子などが挙げられる。転写活性を減少させるものとしては、ＦＯＸＯ１は、カルシウムシグナルによりリン酸化されて、核外に放出されたり、分解されたりすることから、カルシウムシグナル伝達を亢進する物質などが挙げられる。さらに、ＦＯＸＯ１蛋白質とＰＧＣ−１αの結合を減少させるものとしては、ＦＯＸＯ１蛋白質やＰＧＣ１αタンパク質とより強い親和性を有する化学物質などが挙げられる。
【００２８】
本発明の筋組織の重量及び／又は組成の調節剤は、生体内におけるＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を亢進又は阻害することにより、筋組織、例えば骨格筋の重量や組成を調節できるものである。前記の実験例において説明してきたように、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を亢進することにより、筋組織の重量が減少し、組成としては赤筋が減少し、白筋が増加することになるので、筋肉体質を通常の体質に戻す場合や、過剰の筋肉が疾患の原因となっている場合などに適用することができる。また反対に、ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量や活性を阻害することにより、筋組織の重量が増加し、組成としては、赤筋が増加し、白筋が減少することになるので、糖尿病や肥満などの筋重量の減少や筋量の減少がひき起こす疾患の予防や治療に有効である。また、ダイエット用の食品添加物などとしても使用可能である。
本発明の筋組織の重量及び／又は組成の調節剤は、有効成分としてのＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物として提供することができる。製薬上許容される担体としては、製薬上において使用される各種の担体、例えば、賦形剤、溶媒、安定化剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、有効成分の性状に応じて、経口投与、非経口投与などの各種の投与方法を採用することができる。
また、本発明の筋組織の重量及び／又は組成の調節剤は、有効成分としてのＦＯＸＯ１タンパク質又はその機能調節剤、及び食品として許容される担体とからなる食品組成物として提供することができる。食品として許容される担体としては、前記した製薬上において使用される各種の担体、例えば、賦形剤、溶媒、安定化剤などだけでなく、各種の食品素材や、加工食品などが挙げられる。
【００２９】
また、本発明は、筋組織の細胞または動物個体に被験物質を作用させ、筋組織の細胞におけるＦＯＸＯ１タンパク質の活性を測定することからなる、筋組織の重量や組成の調節に有効な物質をスクリーニングする方法を提供するものである。本発明のこの方法は、ＦＯＸＯ１タンパク質の活性を測定することを特徴とするものであり、試験方法は公知のスクリーニング試験法に準じて行うことができる。スクリーニング系としては、インビトロであっても、インビボであってもよいが、細胞として筋組織の細胞、好ましくは骨格筋の細胞、例えば筋細線維を有する細胞又は細胞系を使用する。
本発明の方法におけるＦＯＸＯ１タンパク質の活性を測定する方法としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）、
（ａ）ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量を減少させる；
（ｂ）ＦＯＸＯ１タンパク質の転写活性を減少させる；
（ｃ）ＦＯＸＯ１タンパク質とＰＧＣ１αの結合を減少させる；
のいずれか１つ以上の量を測定することが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＦＯＸＯ１タンパク質の発現量を低下させる測定方法としては、例えば、培養筋肉細胞に被験物質を添加する。判定にはＦＯＸＯ１の遺伝子発現をその転写産物（ｍＲＮＡや蛋白質）の量を公知の方法によって測定することによって行なうことができる。例えば、定量的なＲＴ−ＰＣＲやノーザンブロッテイング、発現産物に対する抗体を用いたウエスタンブロッテイングなどである。この方法によって見つかったＦＯＸＯ１の発現量を減少させる分子は赤筋の減少がひき起こす疾患の治療薬の有効成分物質の候補化合物となりうる。
また、ＦＯＸＯ１とＰＧＣ１αとの結合を低下させる測定方法としては、例えば、蛋白質相互作用の分析法を例示することができる。例えば、ＰＧＣ１αをＧＳＴと融合したコンストラクト（発現ベクター）を文献の記載に従い３５Ｓ−ＦＯＸＯ１（プロメガ、ＴＮＴ）と共にインキュベートした後、洗浄し、結合した３５Ｓ−ＦＯＸＯ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、オートラジオグラフに供する。これによりＦＯＸＯ１とＰＧＣ１αとの結合が観察できる。この反応チューブに候補物質を作用させ、結合を低下させる分子は骨格筋の組成及び量を改善する薬剤の有効成分物質の候補化合物となりうる。
【００３０】
また、本発明は、ＦＯＸＯ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに保有し、ＦＯＸＯ１蛋白質を骨格筋で過剰に発現するヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明のＦＯＸＯ１タンパク質をコードする遺伝子としては、ヒトの遺伝子が好ましいが、これに限定されるものではない。本発明のトランスジェニック動物は、ＦＯＸＯ１蛋白質を骨格筋で過剰に発現することを特徴するものであり、このために骨格筋での発現を誘発することができるプロモーターを使用することが好ましい。また、本発明のトランスジェニック動物への遺伝子の導入方法としては、マイクロインジェクション法などの公知の手法を使用することができる。導入される遺伝子は、１コピー以上であれば特に制限はないが、過剰発現のためには３コピー以上、好ましくは５コピー以上の導入が挙げられる。また、遺伝子が導入される動物としては、ヒト以外の動物であればよいが、好ましくは哺乳動物、たとえば、マウス、ラット、ウサギなどが挙げられる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、筋組織の重量、大きさ、機能などを決定するタンパク質がＦＯＸＯ１であることを解明したものであり、本発明により、筋組織の重量や組成の異常による各種の疾患の治療や予防が可能になるだけでなく、肥満の防止やダイエットにおける有効成分としても期待されるものである。
また、本発明のスクリーニング方法によりＰＧＣ１α-ＦＯＸＯ１複合体に作用し、赤筋の減少がひき起こす疾患（糖尿病や肥満）の改善薬として有効であると考えられる化合物を同定することが可能となる。すなわち、本発明によって、ＰＧＣ１α-ＦＯＸＯ１の相互作用を指標として骨格筋の組成及び量を改善する薬剤成分をスクリーニングする方法と、この方法によって特定された物質を有効成分とする新規薬剤が提供される。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
トランスジェニックマウスの作成
ヒト骨格筋アクチンプロモーターは、ブレンナンらの文献（Brennan, K. J., and Hardeman, E. C. (1993) J. Biol. Chem. 268, 719-725）に記載のものを用いた。ヒトＦＯＸＯ１のｃＤＮＡは本発明者らの報告したもの（非特許文献１０参照）を用いた。常法に従って、図１に示す遺伝子を構築した。
マウスの受精卵をＣ５７ＢＬ／６マウスから採取し、これに構築した遺伝子をマイクロインジェクション法で２ｎｇ／μＬ導入した。マウスを２２℃で人工光中で飼育した。
【実施例２】
【００３４】
ＲＮＡの分析
ノーザンブロットは、亀井らの方法（非特許文献１０参照）に従って行った。実験に使用したプローブは、以下に記載するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法により調製した。
Ｇａｄｄ４５  α  （Genbank accession number,以下、同じ。U00937)
(forward)   5’-TCGCACTTGC AATATGACTT-3’,
(reverse)   5’-CGGATGCCAT CACCGTTCCG-3',
トロポニンＣ（遅筋型）（troponin C (遅筋型)）  （M29793),
(forward)   5'-AGCTGCGGTA GAACAGTTGA-3',
(reverse)   5'-TCACCTGTGG CCTGCAGCAT-3',
ミオシン軽鎖２（myosin light chain 2） (MLC-2 遅筋型, M91602),
(forward)   5'-GAGTTCAAGG AAGCCTTCAC-3',
(reverse)   5'- CTGCGAACAT CTGGTCGATC-3',
トロポニンＴ（troponin T (遅筋型)）  (AV213431),
(forward)   5'-TTCTGTCCAA CATGGGAGCT-3'
(reverse)   5'-TCGGAATTTC TGGGCGTGGC-3',
ミオグロビン（myoglobin）  (X04405),
(forward)   5'-CACCATGGGG CTCAGTGATG-3'
(reverse)   5'-CTCAGCCCTG GAAGCCTAGC-3',
ミトコンドリアクレアチンキナーゼ （mitochondrial creatine kinase）                                                           (mtCK, AV250974),
(forward)   5'-AAAGGAAGTG GAACGATTAA-3'
(reverse)   5'- TTGATGTCTT GGCCTCTCTC-3'.
トロポニンＴ（速筋型）  （troponin T (速筋型)）  (L48989)
(forward)   5'-CAGCAAAGAA TTCGCGCTGA-3'
(reverse)   5'-GGCCTTCTTG CTGTGCTTCT-3',
トロポニンＣ  （troponin C (速筋型)）  (AV083137)
(forward)   5'-GTTCAAGGCT GCCTTTGACA-3'
(reverse)   5'-ACGCCCTCCA TCATCTTCAG-3',
ＭＬＣ（速筋型）        （MLC (速筋型)）  (U77943)
(forward)   5'-AGGGATGGCA TTATCGACAA-3'
(reverse)   5'-CAGATGTTCT TGTAGTCCAC-3',
トロポニンＩ（速筋型）  （troponin I (速筋型)）   (J04992)
(forward)   5'-AGGAAAGCCG CCGAGAATCT-3'
(reverse)   5'-TACTGGGGAA GTGGGCAGTT-3',
また、ＣＯＸＩＩ，ＣＯＸＩＶ、及びＭｅｆ２ｃのｃＤＮＡプローブは、ミウラらの方法（Miura, S., et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, 31385-31390）に従って調製した。ＮＦＡＴ（IMAGE clone 4109469)及びＣａＭＫ  ＩＩβ（IMAGE clone 5014712)のｃＤＮＡプローブは、インビトロジェン社（Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)）から購入した。
【実施例３】
【００３５】
トランスジェニックマウスの体重などの測定
マウスをペンタバルビタールナトリウム（Nembutal (0.08 mg/g body weight, Abbot Laboratories, Chicago, IL)）で麻酔して、デュアルエネルギーＸ線アブソーピションメトリー（dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) (Nagy 2000)）を装着したルナＰＩＸＩムス２デンシトメーター（Lunar PIXI mus2 densitometer (Lunar Corporation, Madison, WI)）でスキャンして測定した。
結果を表１に示す。
【実施例４】
【００３６】
免疫ブロッティング
ハーンらの方法（Hahn, C. G., et al., (1990) Anal. Biochem. 190, 193-197）に準じて、骨格筋から遠心分離によりタンパク質を抽出した。得られたタンパク質抽出物（３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動によりイムノビロンＰ（Immobilon P (Millipore, Bedford, MA)）へ転写した。第１次抗体として、ヤギ抗ＦＯＸＯ１  ＩｇＧ(N-18, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA)を1:1000で使用し、第２次抗体として抗ヤギＩｇＧ抗体と西洋わさびパーオキシダーゼの複合体を1:1000で使用して、イムノブロットを行った。バンドは、化学発光システム（Amersham Biosciences Corp. Piscataway, NJ）により可視化できるようにされている。
結果を図４に示す。
【実施例５】
【００３７】
組織学的分析
骨格筋（ヒラメ筋）のサンプルを液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させ、断面が得られるように横に切断された切片をヘマトキシリン／エオシンとＡＴＰａｓｅ（Ogilvie, R. W., et al., (1990) Stain. Technol. 65, 231-241）で染色した。骨格筋細胞における赤筋（タイプＩ）の割合及びその大きさ（面積）は、ｐＨ４．３におけるＡＴＰａｓｅで染色されたサンプルについて、各エリアが９００ｍｍ２のセクッションをランダムに６箇所選び、各セクッションの細胞数を数えて行った。
【実施例６】
【００３８】
血液の分析
食餌を与えている状態のマウスの尻尾から、ホルモンと代謝物を測定するために血液サンプルを採取した。
免疫反応性のインスリンを、インスリンアッセイキット(Morinaga, Kanagawa, Japan)を用いて測定した。遊離脂肪酸はＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー(WAKO, Osaka, Japan)を用いて測定した。乳酸は乳酸用試薬(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)を用いて、またグルコースはＴＩＤＥＸグルコースアナライザー(Sankyo, Tokyo, Japan)をそれぞれ用いて測定した。
結果を表１に示す。
【実施例７】
【００３９】
回転車による運動活性の測定
各マウスをそれぞれの飼育箱(9 x 22 x 9 cm)で飼育した。各飼育箱には回転車(直径20cm, Shinano Co., Tokyo, Japan)が取り付けられており、この回転車の回転数を磁気スイッチで測定し、結果をカウンターに記録した。１日毎の回転数の積算値を６日間記録した。
結果を図８に示す。
【実施例８】
【００４０】
ｃＤＮＡのマイクロアレーによる分析
ｍＲＮＡ精製キット(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて各グループの３匹のマウスの全ＲＮＡから、それぞれのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。１μｇのｍＲＮＡから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターサイトを含有するＴ７−（ｄＴ）２４プライマー(Amersham)で、２本鎖のｃＤＮＡ(Superscript Choice System, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を調製した。１μｇのｃＤＮＡから、アフィメトリックスＭＧＵ７４ＡマイクロアレーにハイブリダイズされているバイオアレーハイイールドＲＮＡトランスクリプトを用いて、１６時間、４５℃で、６０ｒｐｍの一定の回転をしながら、ビオチン化相補ＲＮＡを調製した。チップを洗浄して、アフィメトリックスジーンチップ３．１のソフトウエアーのｔＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコールに従って、ストレプトアビジン−フィコエリスリン(10 μg/ml, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)及びビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン(3 μg/ml, Vector Laboratories, Burlingame, CA)で染色した。トランスジェニック群の蛍光強度を各群の全チップの蛍光強度を標準化して野生型に対して正規化した。全チップの蛍光強度を直接比較できるように、平均の強度を１００に設定した。データはファイルメーカープロ(File Maker, Inc., Santa Clara, CA)で処理した。
コントロールのマウスに比較してＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの骨格筋における遺伝子の発現レベルの変化を見るために、ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスの２つの系統について発現が顕著に増加又は減少した遺伝子をリスト化し、これを検討した。遺伝子の発現の変化は、使用したソフトウエアーによって定義させ、次の５つに分類した。増加した、わずかに増加した、変化無し、わずかに減少した、減少した、の５つに分類した。定量的な変化は、プローブアレーの各転写物の相対的な変化の指標として計算された。異なって発現する遺伝子（Differentially expressed genes）は、次の基準に基づいて同定した。平均発現量（average difference）が１５０を超えるものであること。いくつかのマーカーを用いて、このソフトウエアーで計算された平均発現量（average difference）、各遺伝子の転写の存在又は非存在を指示することを示す。平均発現量（average difference）の値は、各遺伝子のマーカーであり、ミスマッチのオリゴヌクレオチドの２０セットに対して、２５−ｍｅｒの完全マッチのオリゴヌクレオチドのハイブリダイズの強度を比較して、アフィメトリックスジーンチップ３．１のソフトウエアーによる計算結果から得られた値である。
結果を表２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、動物、特にヒトにおける筋組織、特に骨格筋の量や組成を決定する因子を解明したものであり、筋組織の異常に起因する各種の疾患の治療や予防に有用であるだけでなく、肥満などに対するダイエットにおいても有用なものである。したがって、本発明は、各種の疾患の治療や予防のための医薬の製造や、ダイエットの保健食品の製造に利用可能である。また、本発明は、このような医薬や食品添加物の有効成分をスクリーニングする方法を提供するものであり、新たな有効成分の研究や開発にも利用され、産業上極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本発明のトランスジェニックマウスの作成に使用した遺伝子構築物を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明のトランスジェニックマウスについてＦＯＸＯ１遺伝子の発現をサザンブロットで検出した結果を示す図面に代わる写真である。図２の各レーンは左側から、野生型、Ａ１マウス、Ａ２マウスをそれぞれ示す。各写真の下側の数値は、サザンブロットの結果をオートラジオグラフィーのデンシトメーターのスキャニングにより推定したコピー数を示す。
【図３】図３は、本発明のトランスジェニックマウスのＦＯＸＯ１遺伝子の発現をノーザンブロットにより検定した結果を示す図面に代わる写真である。図３の上段は、ヒトＦＯＸＯ１の発現であり、下段はＧａｄｄ４５αで再ハイブリダイズした結果を示す。各段のLine A1はＡ１マウスであり、Line A2はＡ２マウスであり、Controlは野生型を示す。２８Ｓは２８ＳリボソームＲＮＡであり、ＲＮＡ量のコントロールとして示す。各レーンは、左側から脳、灰色脂肪組織（ＢＡＴ）、心臓、腎臓、肝臓、肺、腓腹筋（Gastro.）、四頭筋（Quadri.）、白色脂肪組織（ＷＡＴ）をそれぞれ示す。
【図４】図４は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるＦＯＸＯ１タンパク質の発現を確認するために、ヒトＦＯＸＯ１及びマウスＦＯＸＯ１に反応する抗体を用いてイムノブロットを行った結果を示す図面に代わる写真である。図４の各レーンは左側から、野生型、Ａ１マウス、Ａ２マウスをそれぞれ示す。各写真の下側の数値は、サザンブロットの結果をオートラジオグラフィーのデンシトメーターのスキャニングにより推定した発現量を野生型を１００とした相対値で示す。
【図５】図５は、本発明のトランスジェニックマウスを解剖してその所見を観察した結果を示す図面に代わる写真である。図５の左側はＡ１マウスと野生型の場合であり、右側はＡ２マウスと野生型の場合である。図５のそれぞれの上段は野生型であり、下段は遺伝子導入マウスである。図５の各写真の左側から前脛骨筋（ＴＡ）、長指伸筋（ＥＤＬ）及びヒラメ筋（Ｓｏｌ）である。
【図６】図６は、本発明のトランスジェニックマウスの遺伝子の発現について、赤筋や白筋のマーカーとなる遺伝子についてノーザンブロットを行った結果を示す図面に代わる写真である。ＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスのＡ１系統及びＡ２系統、並びに野生型の四頭筋から抽出した全ＲＮＡ（各レーン２０μｇ）を用いた。図６の左側にハイブリダイズに使用した遺伝子名を示し、右側にデンシトメトリーによる相対値（野生型を１００とする。）を示す。
【図７】図７は、３月齢のＡ２マウス及び野生型の同腹子の、それぞれから骨格筋（ヒラメ筋）を取り出しｐＨ４．３又はｐＨ１０．５で、ＡＴＰａｓｅ染色した。この横断面を顕微鏡で観察した結果を示す図面に代わる写真である。図７の上段はｐＨ４．３での染色（赤筋）の結果を示し、下段はｐＨ１０．５での染色（白筋）の結果を示す。図７の左側はコントロールの野生型であり、右側はＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウス（Ａ２系統）を示す。図７中のバーは５０μｍを示す。
【図８】図８は、９〜１０週齢の雌のマウスを用いて、直径２０ｃｍの回転車による運動を６日間行わせ、その累積の回転数を記録した結果を示すグラフである。図８の横軸は日数であり、縦軸は累積回転数を示す。各グラフの白抜きはコントロールの野生型であり、黒抜きはＦＯＸＯ１遺伝子を導入したマウスである。図８の左側は、Ａ１系統の場合であり、右側はＡ２系統の場合である。
【図９】図９は、絶食したマウスを３グループに分け、第１のグループは通常どおり摂食をさせ（コントロール）、第２のグループは４８時間絶食させ、第３のグループは４８時間絶食させた後、８時間えさを与えた（refed）。それぞれのマウスの骨格筋（四頭筋）からＲＮＡを抽出して、ノーザンブロットを行った結果を示す図面に代わる写真である。図９の右側はハイブリダイズさせた遺伝子名を示し、各レーンは個々のマウスからの結果を示す。図９中の数値は、デンシトメーターによる相対値である。
【図１０】図１０は、本発明の結果をまとめてＦＯＸＯ１とＰＧＣ−１αの機能の概要を模式化して示したものである。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１は、Ｇａｄｄ４５  α（Genbank accession number,以下同様  U00937)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号２は、 Ｇａｄｄ４５  α（Genbank accession number,  U00937)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号３は、トロポニンＣ遅筋型（M29793)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号４は、トロポニンＣ遅筋型（M29793)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号５は、ミオシン軽鎖２(MLC-2 遅筋型, M91602)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号６は、ミオシン軽鎖２(MLC-2 遅筋型, M91602)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号７は、トロポニンＴ遅筋型(AV213431)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号８は、トロポニンＴ遅筋型(AV213431)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号９は、ミオグロビン(X04405)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１０は、ミオグロビン(X04405)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号１１は、ミトコンドリアクレアチンキナーゼ(AV250974)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１２は、ミトコンドリアクレアチンキナーゼ(AV250974)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号１３は、トロポニンＴ速筋型(L48989)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１４は、トロポニンＴ速筋型(L48989)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号１５は、トロポニンＣ速筋型(AV083137)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１６は、トロポニンＣ速筋型(AV083137)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号１７は、ＭＬＣ速筋型(U77943)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１８は、ＭＬＣ速筋型(U77943)のリバースプライマーの配列を示す。
配列番号１９は、トロポニンＩ速筋型(J04992)のフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号２０は、トロポニンＩ速筋型(J04992)のリバースプライマーの配列を示す。
【図１】
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【図８】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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