(57)【要約】【課題】好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するための、電気穿孔法に替わる新規な方法を提供することが本発明の課題である。【解決手段】本発明により、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するためのベクター、及びそのベクターを使用した遺伝子移入方法が提供された。本発明の方法は、好熱性藍色細菌と遺伝子移入ベクターとの間の相同組み換えによる自然形質転換により、ベクターの遺伝子を好熱性藍色細菌のゲノムに組み込むことからなる。本発明の方法は、内在性遺伝子の機能を損なうことなく、好熱性藍色細菌への簡便な遺伝子移入を可能とするものである。更に本発明の遺伝子移入方法を応用することにより、好熱性藍色細菌の細胞内において目的とする有用蛋白質の大量発現系を構築したり、生物発光レポーター系を利用して目的とする遺伝子の転写活性を好熱性藍色細菌の細胞内で定量化する系を構築することが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性藍色細菌のゲノムに由来する遺伝子移入標的部位の両側に位置する相同領域、当該相同領域に挟まれた部位に位置する抗生物質耐性選択マーカー遺伝子及びクローニング部位、並びに当該抗生物質耐性選択マーカー遺伝子の両端に位置する転写終結配列からなることを特徴とする、遺伝子移入ベクター。
【請求項２】
前記遺伝子移入標的部位が、好熱性藍色細菌の相同領域上に存在し、かつ隣接している内在遺伝子の3’側非翻訳領域同士が向かい合っている部位であることを特徴とする、遺伝子移入ベクター。
【請求項３】
前記遺伝子移入標的部位が、好熱性藍色細菌のTS1Te領域、TS2Te領域、TS3Te領域及びTS4Te領域からなる群より選択されたことを特徴とする、請求項１記載の遺伝子移入ベクター。
【請求項４】
前記抗生物質耐性選択マーカー遺伝子が、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びストレプトマイシン耐性遺伝子からなる群より選択されたことを特徴とする、請求項１記載の遺伝子移入ベクター。
【請求項５】
前記耐熱性カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス・ステアロサーモフィラスのカナマイシン不活性化酵素の耐熱性変異体をコードし、かつ好熱性藍色細菌のコドン使用頻度に最適化された遺伝子であることを特徴とする、請求項４記載の遺伝子移入ベクター。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか一つの請求項記載の遺伝子移入ベクターを、相同組み換えによる自然形質転換により好熱性藍色細菌に移入することを特徴とする、好熱性藍色細菌へ遺伝子を移入する方法。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１記載の塩基配列からなることを特徴とする、塩基配列。
（ｂ）耐熱性のカナマイシン不活性化酵素としての機能を有する蛋白質をコードする、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項８】
請求項１記載の遺伝子移入ベクターにおいて、前記クローニング部位に、産生させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子とその上流に位置して当該目的蛋白質をコードする遺伝子の発現を活性化する転写調節領域を含む大量発現カセットが更に挿入されていることを特徴とする、蛋白質大量産生用ベクター。
【請求項９】
前記転写調節領域が好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーターであることを特徴とする、請求項８記載の蛋白質大量産生用ベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の蛋白質大量産生用ベクターを相同組み換えによる自然形質転換により好熱性藍色細菌に移入し、よって前記目的蛋白質を好熱性藍色細菌の細胞内で発現させることを特徴とする、好熱性藍色細菌において蛋白質を産生させる方法。
【請求項１１】
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーター。
（ｃ）配列表の配列番号２記載の塩基配列からなることを特徴とする、塩基配列。
（ｄ）好熱性藍色細菌において下流に存在する構造遺伝子の転写を活性化するプロモーター機能を有する、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【請求項１２】
請求項１記載の遺伝子移入ベクターにおいて、前記クローニング部位に、遺伝子発現を測定しようとする目的遺伝子の転写調節領域とその下流に位置する耐熱性生物発光レポーター遺伝子を含む発光レポーター遺伝子カセットが更に挿入されていることを特徴とする、遺伝子発現定量用ベクター。
【請求項１３】
前記耐熱性生物発光レポーター遺伝子がゼノラブダス・ルミネッセンス（Xenorhabdus luminescence）由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABであることを特徴とする、請求項１２記載の遺伝子発現定量用ベクター。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３記載の遺伝子発現定量用ベクターを、相同組み換えによる自然形質転換により好熱性藍色細菌に移入し、よって前記の耐熱性生物発光レポーター遺伝子がコードする耐熱性生物発光レポーター蛋白質を好熱性藍色細菌の細胞内で発現させ、発現した当該耐熱性生物発光レポーター蛋白質と発光基質の反応により生じる生物発光を検出することを特徴とする、好熱性藍色細菌において遺伝子発現を定量する方法。
【請求項１５】
前記発光基質がn-デカナールであることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
定常期の状態にある好熱性藍色細菌の細胞懸濁液に、凍結防止剤としてメタノールを添加し、メタノールを含む当該細胞懸濁液を急速に凍結し、-150℃又はそれ以下の温度で保存することを特徴とする、好熱性藍色細菌の凍結保存方法。
【請求項１７】
凍結した好熱性藍色細菌の細胞を急速に解凍して培養することにより当該細胞を再生することを特徴とする、好熱性藍色細菌の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するためのベクター、及びそのベクターを使用した遺伝子移入方法に関するものである。本発明の方法により、好熱性藍色細菌と遺伝子移入ベクターとの間の相同組み換えによる自然形質転換により、ベクターの遺伝子を好熱性藍色細菌のゲノムに移入することができる。
【背景技術】
【０００２】
好熱性藍色細菌（Thermosynechococcus）は、植物系の代謝産物や耐熱性蛋白質などを大量生産するための宿主細胞として、有用なツールであることが知られている。そのような目的に好熱性藍色細菌を使用するために、当該細胞へ遺伝子移入する手段として、電気穿孔法を用いることが従来において一般的であった（U.Muhlenhoff and F.Chauvat, 1996, Molecular and General Genetics, 252, p93-100：非特許文献１）。電気穿孔法においては、電気パルス刺激によって微小な穿孔が細胞に生じることによって外来遺伝子が細胞内に移入され、宿主細胞のゲノムへ組み込むことができる。
【０００３】
電気穿孔法を用いた遺伝子導入方法は本技術分野で汎用されている、優れた方法である。しかし、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入する目的で使用するにあたって、下記のような問題点を有している。
（1）電気パルスを細胞に与えるための高価な装置（遺伝子導入装置）を必要とする。
（2）遺伝子移入の効率が低い。
（3）実験操作が非常に煩雑であり、高度な技術を必要とする。
（4）遺伝子が移入された遺伝子移入株を得るまでに、3〜4週間もの長時間を要する。
（5）遺伝子移入に伴って好熱性藍色細菌の内在遭伝子が破壊されてしまう。
（6）好熱性藍色細菌の生育に最適な温度で遺伝子移入株を維持培養することが出来ない。
そのために、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するための有用かつ簡便な方法が求められている。
【０００４】
好熱性藍色細菌において、上記の問題点を解決することを可能とするような優れた遺伝子移入方法やそれに利用できるベクターが開発されたならば、その技術は種々の目的のために応用することが可能であると考えられる。例えば、好熱性藍色細菌への遺伝子移入するための良い方法が開発されたならば、目的とする有用な蛋白質を大量発現できる好適な蛋白質発現系を、好熱性藍色細菌において構築するための新たな途が開かれると思われる。
【０００５】
SugiuraとInoueらは、（M. Sugiura and Y. Inoue, 1999, Plant and Cell Physiology, 40:1219-1231：非特許文献２）好熱性藍色細菌のPsbC蛋白質（CP43蛋白質）のC末端に６個ヒスチジン残基を融合させた蛋白質（His-tagged CP43蛋白質）を好熱性藍色細菌の細胞内で発現させ、これを抽出・精製することを報告している。しかしこの報告では、His-tagged CP43蛋白質をコードする遺伝子コード領域は本来のpsbC遺伝子プロモーター（転写調節配列）によって転写されるため、元々のpsbC遺伝子から翻訳されるCP43蛋白質と同程度の蛋白質量しか生産されず、大量の蛋白質を得ることができない。
【０００６】
また、His-tagged CP43蛋白質をコードする遺伝子コード領域は、好熱性藍色細菌のゲノム上のpsbC遺伝子コード領域と置き換えることによって移入されているため、他の遺伝子座でHis-tagged CP43蛋白質を発現させることができない。さらにこの方法で任意の蛋白質を生産させようと試みた場合、目的の蛋白質をコードする遺伝子をpsbC遺伝子座へ挿入することになり、結果としてpsbC遺伝子を破壊してしまう。psbC遺伝子は光合成に重要な遺伝子の一つであるため、psbC遺伝子の破壊は大きな問題となる。このように、His-tagged CP43蛋白質を用いた系を実用化するに至るにはまだ改善の余地がある。
【０００７】
更に、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するための方法やそれに利用できるベクターは、当該細菌における生物発光レポーター系の開発にも応用できる可能性がある。KondoとIshiuraらは、常温性藍色細菌における生物発光レポーター系（T. Kondo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5672-5676; S. Aoki et al., 1995, Journal of Bacteriology, 177:5606-5611：非特許文献３）を報告した。これらの報告では、常温性発光細菌Vibrio harveyiのルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABの上流にレポートする遺伝子のプロモーターを接続して発光レポーター遺伝子カセットを作製し、これを常温性藍色細菌のゲノムへ遺伝子移入し、レポートしたい遺伝子のプロモーターの転写活性を生物発光として簡便に検出・定量化することに成功している。
【０００８】
また、常温性発光細菌のルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABやホタルのルシフェラーゼ遺伝子LUCも、Vibrio harveyiのluxAB遺伝子と同様に常温性藍色細菌の生物発光レポーター遺伝子として利用することが可能である。しかしながら、これらの常温性生物種のルシフェラーゼは好熱性藍色細菌の生育に適した高温条件下では熱失活してしまうため、好熱性藍色細菌の生物発光レポーターとして利用することは困難である。よって常温性藍色細菌における上記の知見に関わらず、好熱性藍色細菌において生物発光レポーター系を構築することの要請は今でもある。
【０００９】
【非特許文献１】U.Muhlenhoff and F.Chauvat, 1996, Molecular and General Genetics, 252, p93-100
【非特許文献２】M. Sugiura and Y. Inoue, 1999, Plant and Cell Physiology, 40:1219-1231
【非特許文献３】T. Kondo et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5672-5676; S. Aoki et al., 1995, Journal of Bacteriology, 177:5606-5611
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、好熱性藍色細菌の内在遭伝子を破壊することなく、簡便な手段で高い効率でもって好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するための、新規な方法を提供することが本発明の課題である。また、当該細菌内における外来性蛋白質の大量発現系を構築することや、生物発光レポーター系を開発することなどにより、好熱性藍色細菌の上記遺伝子移入方法の有用性を高めて種々の目的に応用することも本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、好熱性藍色細菌が細胞外のDNAを自然に細胞内に取り込む能力を持っていることを発見した。そこで、このDNA取り込み活性を利用することで、高価な装置を必要とせず簡便に細胞内へ任意の遺伝子を導入し、相同組換えによってこの遭伝子をゲノムへ組み込むことを可能ではないかと考えて検討を行った。その結果、遺伝子の取り込みとゲノムへの組込みに最適な条件を検討することで、より効率的な遺伝子移入を可能とする遺伝子移入法を確立した。
【００１２】
また本発明者らは、好熱性藍色細菌の内在遺伝子を破壊することなく遺伝子を組込むことを可能とする部位（遺伝子移入標的部位）をゲノム上に4カ所見いだした。そして、これらの部位へ相同組換えによって任意の遭伝子を組み込むことを可能とする、12種類の遺伝子移入ベクターを開発した。
【００１３】
更に本発明者らは、新規な耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（kmTe遺伝子）の人工合成を行った。kmTe遺伝子がコードする蛋白質は耐熱性の蛋白質であり、当該遺伝子をカナマイシン耐性選択マーカー遺伝子として利用することで、好熱性藍色細菌の遺伝子移入株の選択培養と維持培養を52℃以上で行うことが可能となった。当該遺伝子は、その塩基配列が好熱性藍色細菌のコドン使用頻度に最適化されている。kmTe遺伝子を選択マーカー遺伝子として利用することで、好熱性藍色細菌の遺伝子移入の効率をさらに向上させることに成功した。
【００１４】
上記の遺伝子移入方法は種々の用途に応用することが可能である。本発明者らは、遺伝子移入ベクターに好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーターなどの適切なプロモーターの下流に任意の遺伝子を挿入した蛋白質大量発現用ベクターを作製し、このベクターを好熱性藍色細菌に移入することにより、好熱性藍色細菌の細胞内で目的とする蛋白質を大量に産生させた。よって本発明により、好熱性藍色細菌の細胞内において目的とする蛋白質を大量発現させるための系が確立された。
【００１５】
更に本発明者らはこの遺伝子移入ベクターに、好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーターの下流でゼノラブダス・ルミネッセンス（Xenorhabdus luminescence）由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABなどの生物発光レポーター遺伝子を挿入したベクターを作製し、このベクターを好熱性藍色細菌に移入し、生物発光レポーター遺伝子から産生される蛋白質と発光基質との反応を検出することにより、好熱性藍色細菌の細胞内で遺伝子発現を定量化することに成功した。この生物発光レポーター系は、好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーターのみならず、発現量を測定しようとする任意の転写調節配列について適用でき、好熱性藍色細菌の細胞内で目的遺伝子の転写活性の定量化を可能とするものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、好熱性藍色細菌へ遺伝子移入するためのベクター、及びそのベクターを使用した遺伝子移入方法が提供された。本発明の方法は、好熱性藍色細菌と遺伝子移入ベクターとの間の相同組み換えによる自然形質転換により、ベクターの遺伝子を好熱性藍色細菌のゲノムに組み込むことからなる。本発明の方法は、内在性遺伝子の機能を損なうことなく、好熱性藍色細菌への簡便な遺伝子移入を可能とするものである。また本発明の方法を応用することにより、当該細菌の細胞内において目的とする蛋白質を大量発現する系を構築することができる。更に、本発明の方法で生物発光レポーター系を好熱性藍色細菌に移入することにより、目的遺伝子の発現活性を細胞内で定量化することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の遺伝子移入ベクターは、好熱性藍色細菌のゲノムに由来する遺伝子移入標的部位の両側に位置する相同領域、当該相同領域に挟まれた部位に位置する抗生物質耐性選択マーカー遺伝子及びクローニング部位、並びに当該抗生物質耐性選択マーカー遺伝子の両端に位置する転写終結配列からなる。
【００１８】
本発明者は、好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位（符号１）として好適な部位を、4カ所（TS1Te、TS2Te、TS3Te、TS4Te）見出した。好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位と、その近傍の遺伝子構造と遺伝子移入ベクターを図１から図４に示す。なお図１はTS1Teを、図２はTS2Teを、図３はTS3Teを、図４はTS4Teをそれぞれ示す。上記４ヶ所の部位は、後に詳細に述べるように、好熱性藍色細菌の相同領域（符号４）上に存在する隣接遺伝子の3’側非翻訳領域同士が向かい合っているために、遺伝子移入標的部位（符号１）として特に好ましい。遺伝子移入ベクター（符号3）上において、ゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）の両側に相同領域（符号4）が存在しているために、ベクターと好熱性藍色細菌の間で相同組換えが起こることにより、好熱性藍色細菌に外来DNAを移入することができる。なお本発明の遺伝子移入ベクター（符号3）は直鎖状の構造をとることもあるし、あるいは環状の構造をとることもあるが、直鎖状でも環状でも相同組み換えを起こして外来DNAを移入することができる。
【００１９】
図１から図４において、符号２はかずさDNA研究所において達成されたゲノムプロジュクトで付与された推定遺伝子番号を示す。なおその推定遺伝子番号により示すと、TS1Teはtlr0806とtlr0807の間の領域であり、TS2Teはtlr1844とtlr1845の間の領域であり、TS3Teはtlr10455とtlr10456の間の領域であり、TS4Teはtlr10485とtlr10486の間の領域である。
【００２０】
本発明の遺伝子移入ベクター（符号3）上の相同領域（符号4）に挟まれた部位に、抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5）が存在することにより、相同組換えが起こった好熱性藍色細菌の細胞（遺伝子移入株）を選択することが可能である。即ち、遺伝子移入株は移入された抗生物質耐性選択マーカー遺伝子に対応した抗生物質に対して耐性を示すので、抗生物質を含む培地で培養を行うことにより、遺伝子移入が起こった株を選択することができる。抗生物質耐性選択マーカー遺伝子としては、例えば、本発明で新規に開発した耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（kmTe）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cm）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（aadA）などを使用することができるが、他の抗生物質耐性選択マーカー遺伝子も適宜使用することができる。
【００２１】
また、本発明において好適な態様として、遺伝子移入ベクター（符号3）上の抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5）に隣接して存在するクローニング部位（符号6）に、任意の外来遺伝子を予めクローン化しておくことが可能である。それにより任意の外来遺伝子を、ゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）へ抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5）と同時に移入することができる。
【００２２】
ここで移入するべき任意の外来遺伝子は、好ましくは、有用な植物代謝産物や耐熱性蛋白質などをコードする遺伝子である。これらの遺伝子を好熱性藍色細菌の細胞に移入することにより、当該宿主細胞において、それらの蛋白質を大量に生産させることが可能となる。このような遺伝子の例として光合成関連遺伝子や時計遺伝子などを挙げることが可能であり、それによって、宿主細胞にそれらの蛋白質を作製させて様々な有用な蛋白質を得ることができる。しかし、本発明において移入するべき遺伝子の範囲は、上記において挙げた例に限定されるものではない。
【００２３】
なお本発明において、抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5）の両端に転写終結配列（符号７）を付けることは好ましく、当該転写終結配列がT4ファージ由来の転写終結配列（T4転写終結配列）であることは特に好ましい。転写終結配列（符号７）が存在することにより２つの利点を得ることができる。１つの利点は、薬剤耐性遺伝子に隣接している相同領域上に存在する遺伝子からの転写が薬剤耐性遺伝子に及ぶことを阻止すると共に、薬剤耐性遺伝子からの転写が相同領域上の遺伝子へ及ぶことを阻止することができるというものである。もう一つの利点は、薬剤耐性遺伝子に隣接するクローニング部位へ組み込んだ外来遺伝子の転写の影響が、薬剤耐性遺伝子に及ぶことを阻止するというものである。
【００２４】
なお下記の実施例においては、上記の４つの遺伝子移入標的部位（TS1Te、TS2Te、TS3Te、TS4Te）を利用して相同組み換えを行っている。しかし、内在遺伝子の相同領域上に存在し、隣接している内在遺伝子の3’側非翻訳領域同士が向かい合っている領域ならば、他の部位も、好熱性藍色細菌に遺伝子移入を行うための標的部位(符号1)として使用することができる。
【００２５】
隣接する内在遺伝子の存在様式としては、（１）転写方向が同一で遺伝子が隣り合う場合、（２）遺伝子の5’側（転写開始側）同士が向かい合う場合、（３）転写方向が同一な遺伝子が共転写される場合（オペロン構造をとる場合）、（４）遺伝子の3’側（転写終結側）同士が向かい合う場合、の３つの場合が考えられる。上記（１）から（４）の場合を図示した模式図を図５に示す。なお図５において、遺伝子１と遺伝子２は好熱性藍色細菌のゲノム上で隣接している内在遺伝子である。図５から判るように、上記（１）と（２）の場合には、遺伝子の間の塩基配列には遺伝子の転写調節領域が含まれている。従って蛋白質をコードしていない場所であっても、外来DNAを導入することによって遺伝子の調節に深刻な影響を及ぼす影響が高いと考えられる。
【００２６】
一方（４）の場合には、遺伝子１と遺伝子２の転写終結領域の間に外来DNAを導入することになるので、この領域に外来DNAを導入しても、遺伝子１と遺伝子２の機能が損なわれることはない。これを考えると、本発明において使用できる遺伝子移入標的部位(符号1)はTS1Te、TS2Te、TS3TeあるいはTS4Teに限定されるものではなく、相同領域上で隣接している内在遺伝子の3’側非翻訳領域同士が向かい合っている部位である限り、他の部位を適宜選択して使用することもできる。このような部位を、例えば、かずさDNA研究所のゲノムプロジュクトで得られた知見を基にして選択することができる。
【００２７】
また本発明で人工合成されたkmTe遺伝子は、好熱性細菌であるバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）のプラスミドであるpTB19にコードされているカナマイシン不活性化酵素（カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ）の耐熱性変異体（M．Matsumuraら、1984．Journal of Bacteriology，160：413−420）アミノ酸配列を基にして作製されたものである。kmTe遺伝子は上記のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。しかし、kmTe遺伝子は好熱性藍色細菌のコドン使用頻度に最適な塩基配列となるように人工的に完全合成した遺伝子であって、天然には存在しない遺伝子である。
【００２８】
一般的にコドン使用頻度は各々の生物において異なっているが、その差が大きい場合には、外来遺伝子を導入しても宿主細胞内で十分な蛋白質が翻訳されない可能性がある。上記のカナマイシン不活性化酵素の耐熱性変異体のコドン使用頻度は、好熱性藍色細菌のコドン使用頻度と大きく異なっており、耐熱性変異体のオリジナルの遺伝子を好熱性藍色細菌の細胞内に移入しても、カナマイシン耐性を獲得できるだけの量の蛋白質を得ることができない可能性が高かった。そのために、本発明においてはカナマイシン不活性化酵素の耐熱性変異体の塩基配列を改変し、好熱性藍色細菌のコドン使用頻度に最適化させた。
【００２９】
kmTeの塩基配列と、それがコードするカナマイシン不活性化酵素（カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ）の耐熱性変異体のアミノ酸配列を、図６と配列表の配列番号１に示す。なお図６において、符号８はkmTe遺伝子の開始コドンを、符号９はkmTe遺伝子の停止コドンを示す。kmTe遺伝子は、好熱性藍色細菌の細胞内で効率的に蛋白質に翻訳されるため、好熱性藍色細菌にカナマイシン耐性を付与することができる。また、kmTe遺伝子がコードするカナマイシン不活性化酵素は耐熱性の変異蛋白質であるため、好熱性藍色細菌を40〜60℃の高温条件下でカナマイシン耐性株として選択培養することが可能である。
【００３０】
なお配列表の配列番号１記載の塩基配列以外にも、耐熱性のカナマイシン不活性化酵素をコードし、かつ好熱性藍色細菌のコドン使用頻度に最適化されている塩基配列が存在している可能性がある。本発明においてそのような塩基配列を有する遺伝子を使用することも可能であり、配列表の配列番号１記載の塩基配列において、その一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列も、耐熱性のカナマイシン不活性化酵素としての機能を有する蛋白質をコードする限り、本発明の範囲内である。なお、ここで「一部」とは１塩基から数塩基程度を意味するものであり、かかる範囲の変異であれば、耐熱性のカナマイシン不活性化酵素としての機能を保持した上で塩基配列の改変を行うことができる。
【００３１】
好熱性藍色細菌の細胞と、上記の遺伝子伝子移入ベクターとを混合することにより、好熱性藍色細菌の細胞内に当該遺伝子移入ベクターを取り込ませて自然形質転換を起こすことができる。細胞内へ取り込まれた遺伝子移入ベクターは、ゲノム上の遺伝子移入標的部位近傍との間で相同組換えを引き起こし、これによって遺伝子移入がなされる。
【００３２】
本発明の方法は、従来法と比較して以下の利点を有しており、好熱性藍色細菌に遺伝子移入をするための優れた方法である。
(1) 高価な装置を必要としない。
(2) 遺伝子移入の効率が従来法と比較して17倍以上高い。
(3) 操作が非常に簡便であり高度な技術を必要としない。
(4) 遺伝子が移入された細胞（遺伝子移入株）を得るまでの時間が8〜11日間であり、従来法と比較して時間を大幅に短縮できる。
(5) 好熱性藍色細菌に内在する遺伝子を破壊することなく任意の遺伝子を移入できる。
(6) 好熱性藍色細菌の生育に最適な温度またはそれに近似した温度で、遺伝子移入株の選択培養と維持培養とを行うことができる。
【００３３】
更に本発明者らは、好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子のプロモーター配列が非常に強力な転写活性を持つことを発見した。その知見を利用して、好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子プロモーターを目的の蛋白質をコードする遺伝子のmRNAを転写させるためのプロモーターとして利用し、本発明の遺伝子移入方法を用いて好熱性藍色細菌の細胞内で時計蛋白質KaiC蛋白質を大量産生させることに成功した。
【００３４】
上記の方法を用いて他の目的蛋白質を大量産生させることも可能であり、遺伝子移入ベクターのクローニング部位に、産生させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子と、その上流にその目的蛋白質をコードする遺伝子の発現を活性化する転写調節領域を結合させて成る大量発現カセットを更に挿入することにより、蛋白質大量産生用ベクターを構築することができる。そして、その蛋白質大量産生用ベクターを相同組み換えによる自然形質転換により好熱性藍色細菌に移入してその目的遺伝子がコードする目的蛋白質を好熱性藍色細菌内で発現させることにより、好熱性藍色細菌において外来蛋白質を産生させることもできる。
【００３５】
なおpsbA1遺伝子は、藍色細菌の光化学系IIの反応中心であるD1蛋白質をコードしている遺伝子であり、psbA1,A2など複数のサブタイプが知られている。そして本発明において使用したpsbA1遺伝子プロモーターはそのサブタイプの一つであるpsbA1遺伝子の上流に存在する転写調節領域であるが、該プロモーターは高温条件下で作用する強力なプロモーターであるために、好熱性藍色細菌の細胞内で目的蛋白質を大量に産生させるという目的に適している。psbA1遺伝子プロモーターの塩基配列を配列表の配列番号２と図７に示す。なお図７において、四角で囲まれている部分はpsbA1遺伝子の翻訳開始コドンを示す。
【００３６】
本発明においてpsbA1遺伝子プロモーター以外の有用なプロモーターを使用することも可能であり、他のプロモーターを用いた実施態様を排除するものではない。また、配列表の配列番号２記載の塩基配列において、その一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列も、好熱性藍色細菌において下流に存在する構造遺伝子の転写を活性化するプロモーター機能を有する限り、本発明の範囲内である。なお、ここで「一部」とは１塩基から数塩基程度を意味するものであり、かかる範囲の変異であれば、下流に存在する構造遺伝子の転写を活性化するプロモーターとしての機能を保持した上で塩基配列の改変を行うことができる。
【００３７】
なお、好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子に関連する知見は、Motoki et al., Plant Physiol. (1995) 108:1305-1306などにおいて報告されている。しかし、Motokiらの文献は構造遺伝子と読み枠によりコードされた蛋白質に関する報告であり、プロモーター活性について述べたものではない。
【００３８】
好熱性藍色細菌細胞内における蛋白質の大量発現の概要図を図８に示す。まず、転写調節領域（符号10）（例えば、好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子のプロモーター配列）の下流に、産生させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子（符号11）を接続した大量発現カセットを、本発明の遺伝子移入ベクターに組み込むことにより蛋白質大量産生用ベクター（符号12）を作る。そして、その蛋白質大量産生用ベクター（符号12）を自然形質転換法によって好熱性藍色細菌のゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）へ遺伝子移入する。遺伝子移入した好熱性藍色細菌の細胞（蛋白質大量発現株）では、転写調節領域（符号10）の強力な転写活性によって目的蛋白質をコードするmRNA（符号13）が大量に転写され、そのmRNAからは大量の目的蛋白質（符号14）が翻訳される。
【００３９】
好熱性藍色細菌内に存在する目的蛋白質（符号14）を精製・単離することで、その目的蛋白質を大量に得ることができる。すなわち、本発明で開発された好熱性藍色細菌の蛋白質大量発現系を用いることで、任意の蛋白質を大量発現させることが可能である。また、蛋白質大量発現株の作製に本発明の遺伝子移入ベクターおよび類似構造のベクターを使用することで、内在遺伝子が破壊されることはない。大量発現させる目的蛋白質としては、耐熱性蛋白質や植物系の有用蛋白質、例えば光合成関連蛋白質や時計蛋白質などを挙げることが可能である。しかしそれのみに限定されるものではなく、開発した蛋白質大量発現系を幅広く適用することが可能である。
【００４０】
本発明者らは、ゼノラブダス・ルミネッセンス由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxAB（Xl luxAB）を好熱性藍色細菌の生物発光レポーター遺伝子として利用して生物発光の測定方法を最適化することで、好熱性藍色細菌が生育可能な比較的高温な温度条件下において、生物発光による遺伝子発現をリアルタイムで検出・定量化することに成功した。下記の実施例において、psbA1遺伝子プロモーター配列の存在下にXl luxABを接続してXl LuxA蛋白質とXl LuxB蛋白質の発現を、n-デカナールを発光基質として検出したところ、psbA1プロモーター配列は生物時計に支配されているために、日周パターンに従った発光パターンが検出された。
【００４１】
同様の方法を用いて他の転写調節領域の転写活性を定量化することも可能であり、本発明の遺伝子移入ベクターのクローニング部位に、遺伝子発現を測定しようとする目的遺伝子の転写調節領域の下流に耐熱性生物発光レポーター遺伝子を結合させた発光レポーター遺伝子カセットを更に挿入することにより、遺伝子発現定量用ベクターを構築することができる。そして、その遺伝子発現定量用ベクターを自然形質転換による相同組み換えにより好熱性藍色細菌に移入し、耐熱性の生物発光レポーター遺伝子がコードする耐熱性生物発光レポーター蛋白質を好熱性藍色の細菌内で発現させ、発現した耐熱性生物発光レポーター蛋白質と発光基質の反応により生じる生物発光を検出することにより、好熱性藍色細菌において遺伝子発現を定量化することもできる。ここで耐熱性生物発光レポーター遺伝子は、好ましくはゼノラブダス・ルミネッセンス（Xenorhabdus luminescence）由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABであり、発光基質は好ましくはn-デカナールである。
【００４２】
なお、上記の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABとは、発光細菌であるゼノラブダス・ルミネッセンスのルシフェラーゼをコードする遺伝子であり、luxA遺伝子とluxB遺伝子は、それぞれルシフェラーゼのαサブユニットとβサブユニットをコードしている。ゼノラブダス・ルミネッセンスのluxA遺伝子とluxB遺伝子についての知見はR.Szittener and E.Meighen J.Biol.Chem. (1990) 265:16581-16587において報告されており、その塩基配列も上記文献中で開示されている。下記の実施例において使用した耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。
【００４３】
好熱性藍色細菌細胞内における生物発光レポーター系の概要図を図９に示す。遺伝子発現を測定しようとする目的遺伝子の転写調節領域（符号15）の下流に、耐熱性生物発光レポーター遺伝子（符号16）（例えば、ゼノラブダス・ルミネッセンス由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxAB（Xl luxAB））を接続した発光レポーター遺伝子カセットを本発明の遺伝子移入ベクターに組み込んで、遺伝子発現定量用ベクター（符号17）を作り、自然形質転換法によって、その遺伝子発現定量用ベクター（符号17）を好熱性藍色細菌のゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）へ遺伝子移入する。
【００４４】
遺伝子移入した好熱性藍色細菌の細胞（生物発光レポーター株）では、遺伝子発現を測定しようとする遺伝子の転写調節領域（符号15）の転写活性に従ってXl luxABなどの生物発光レポーター遺伝子のmRNA（符号18）が転写され、そのmRNAからは耐熱性バクテリアルシフェラーゼ蛋白質のサブユニットであるXl LuxA蛋白質とXl LuxB蛋白質など、生物発光レポーター蛋白質（符号19）が翻訳される。細胞外からバクテリアルシフェラーゼの発光基質を投与することで、好熱性藍色細菌の細胞内で生物発光が発生する。発生した生物発光を光電子増倍管で検出し、目的遺伝子の転写活性を生物発光量としてリアルタイムで定量化することが可能である。
【００４５】
ここで使用する生物発光の検出装置の例としては、特願2003-060069に記載の生物発光測定装置などが挙げられる。この方法においては生物発光レポーター株の作製に本発明の遺伝子移入ベクターを使用するために、内在遺伝子の破壊は伴わないという利点を有する。遺伝子発現を生物発光として定量化する目的遺伝子としては、好熱性藍色細菌自身の遺伝子や植物系の有用遺伝子など、例えば光合成関連遺伝子や時計遺伝子などを挙げることが可能であり、これらの目的遺伝子の転写調節領域を生物発光レポーター遺伝子の上流に挿入することにより、生物発光レポーター系を用いて種々の目的遺伝子の遺伝子発現を定量化することができる。また、生物発光レポーター系の一般的な特徴として、細胞を破壊することなく生かしたままで高精度かつ高時間分解能に遺伝子発現をリアルタイム測定することが可能である。
【００４６】
上記で述べた様に、実施例においては生物発光生物発光のレポーター遺伝子としてはゼノラブダス・ルミネッセンス由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxAB（Xl luxAB）を使用している。しかしそれに限定されるものではなく、ゼノラブダス・ルミネッセンスの近縁種に由来する他のルシフェラーゼ遺伝子オペロンも使用することが可能であり、そのような実施態様も本発明の範囲内である。また発光基質として下記の実施例ではn-デカナールを使用しているが、それに限定されるものではなく、他の発光基質を適宜使用することも可能である。
【００４７】
ところで、好熱性藍色細菌の細胞を保持する方法としてこれまで継代培養が一般に用いられてきた。しかし、細菌類では世代交代の時間が極めて短時間であるため、ゲノムDNAの複製時に一定の確率で生じる変異が時間経過とともに蓄積し、結果として元の細胞とは異なった遺伝子型の細胞が生じてしまい、安定に保持することは事実上不可能であった。これに対して凍結保存法では、細胞を凍結状態で休眠させることで細胞を遺伝学的に安定に保持することが可能である。従来の継代培養による株の維持の模式図を図１０（１）に、本発明の凍結保存による株の維持の模式図を図１０（２）に、それぞれ示す。なお図１０において、丸印は元の遺伝子型の細胞を、×印は継代培養の過程でゲノム上の遺伝子に変異が生じた細胞を、三角印は継代培養の過程でゲノム上の別の遺伝子に変異が生じた細胞をそれぞれ示す。
【００４８】
好熱性藍色細菌の細胞の凍結保存に関する従来例としては唯一、U. MuhlenhoffとF. Chauvatの報告（U. Muhlenhoff and F. Chauvat, 1996, Molecular and General Genetics, 252:93-100）が挙げられる。この報告においては凍結保存を-80℃で行っているが、-80℃における細胞の凍結保存は氷結晶が不安定なために、長期間の保存には適さない。また上記報告においては凍結保存温度以外の条件は全く記載されていない。実際に本発明者らがMuhlenhoffとChauvatの方法で好熱性藍色細菌の細胞の凍結保存を追試したが、細胞の生存率、保存可能期間ともに実用的ではなかった。
【００４９】
そこで本発明者らは、好熱性藍色細菌の細胞を遺伝学的に安定な凍結状態で長期間に渡って高生存率で保持するための凍結保存の条件を決定した。開発した凍結保存法によって-150℃という超低温条件下で、野生型の細胞のみならず遺伝子移入や遺伝子破壊を行った細胞、変異株の細胞などを長期間に渡って遺伝学的に安定に保持することが可能となった。
【００５０】
よって本発明は、好熱性藍色細菌の細胞の凍結保存方法も与えるものである。定常期の状態にある好熱性藍色細菌の懸濁液に、凍結防止剤としてメタノールを添加し、メタノールを含む当該懸濁液を急速に凍結し、-150℃又はそれ以下の温度で保存することにより、好熱性藍色細菌を１年以上安定に凍結保存することができる。ここで「急速に凍結」とは長時間かけて自然凍結させるという態様を除く意味であり、好ましくは好熱性藍色細菌の培養液を分注したバイアルを-80℃などの低温に冷却したエタノールバス中などにおいて、長くても20分以内という短時間において凍結させるものである。そしてそのように急速に凍結した後に、-150℃又はそれ以下という超低温で長期保存することは、本発明において好ましい。また白色光の連続照射を行って好熱性藍色細菌を安定な定常期に揃えることにより凍結保存によるダメージを緩和することができる。更に凍結防止剤であるメタノールを添加することにより、凍結時に細胞に損傷を与えることなしに、氷結晶を作らせることができると思われる。メタノールの濃度は0.1から20％の範囲内、好ましくは0.5から10%の範囲内、更に好ましくは2から6%の範囲内であるが、メタノールの濃度はそれに限定されるものではない。
【００５１】
また、そのようにして凍結保存された好熱性藍色細菌は、急速に解凍して培養することにより細胞の障害を与えることなく再生することができる。よって本発明はかかる細胞の再生方法も提供するものである。より具体的には、25℃くらいの恒温槽中でバイアルのまま急速に解凍することにより好熱性藍色細菌を再生することができる。ここで「急速に解凍」とは長時間かけて自然解凍するという態様を除く意味であり、長くても20分以内という短時間において解凍させるものである。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例において本発明を更に詳しく述べるが、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００５３】
（自然形質転換法による好熱性藍色細菌への遺伝子移入）
TS1Teの遺伝子標的部位に、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（kmTe）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cm）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（aadA）を組み込んだ遺伝子移入ベクターを構築した。TS2TeからTS4Teの遺伝子標的部位についても、抗生物質耐性遺伝子を組み込んだベクターを同様に構築した。
【００５４】
好熱性藍色細菌の細胞を、0.8×109細胞/mlに達するまでBG-11液体培地で培養を行った。培養した細胞を1,500gで5分間、室温で遠心して集菌を行い、集菌した細胞をBG-11液体培地に懸濁して細胞濃度を2.5×1010細胞/mlに調整した。40μlの細胞懸濁液（細胞109個に相当）と2μlの遺伝子移入ベクターとを混合し、45℃で4時間静置した。
【００５５】
90mm径の丸形シャーレに入れた40mlのBG-11固体培地上に上記の混合液42μlを播種し、播種した細胞を3μmol/m2sの白色光の連続照射下、45℃の条件下で24時間静置培養した。更に固体培地の底から200μlの抗生物質を投与した。なおここで投与した抗生物質の最終濃度は、カナマイシン75μg/ml、クロラムフェニコール2.5μg/ml、ストレプトマイシン7.5μg/mlであった。そして、細胞を3μmol/m2sの白色光の連続照射、45℃または52℃の条件下で7〜10日間静置培養した。
【００５６】
その遺伝子移入の結果を表１に示す。抗生物質耐性選択マーカー遺伝子として耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（kmTe）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cm）、ストレプトマイシン耐性遺伝子（aadA）のいずれを用いた場合でも、好熱性藍色細菌ゲノム上の4カ所の遺伝子移入標的部位へ遺伝子移入が可能であった。また、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子（kmTe）を用いた場合では、遺伝子移入操作直後の固体培地上での選択培養を52℃で行うことが可能であり、得られた遺伝子移入株の維持培養を60℃までの高温条件下で行うことも可能であった。また、いずれの遺伝子移入ベクターを用いた場合も、遺伝子移入操作開始から遺伝子移入株を得るまでの期間は8〜11日間であり、従来法の3〜4過間と比較して大幅に時間を短縮することが可能であった。
【００５７】
【表１】
2005006640.tif 000002
【００５８】
（時計蛋白質KaiCの好熱性藍色細菌の細胞内における大量発現）
本発明の遺伝子移入系を用いて、時計蛋白質KaiCを好熱性藍色細菌の細胞内において大量発現させることを試みた。KaiC蛋白質大量発現カセット移入ベクターの構造を図１１に示す。好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子のプロモーター領域（符号20）の下流に好熱性藍色細菌の時計蛋白質KaiCをコードするkaiC遺伝子のコード領域（符号21）を接続し、さらにKaiCコード領域の下流には大腸菌のrrnB遺伝子の転写終結配列（符号22）を接続し、上記の３つの要素（符号20、符号21、符号22）から構成されるKaiC蛋白質大量発現カセットを作製した。このKaiC蛋白質大量発現カセットを遺伝子移入ベクターpTS1Te/kmTeのクローニング部位に組み込んで、KaiC蛋白質大量発現カセット移入ベクター（符号23）を作製した。そしてこのKaiC蛋白質大量発現カセット移入ベクター（符号23）を、本発明の自然形質転換法によって好熱性藍色細菌の野生株のゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）へ遺伝子移入した。
【００５９】
この遺伝子移入では、KaiC蛋白質大量発現カセット移入ベクター（符号23）と遺伝子移入標的部位１近傍の相同領域（符号4）との間で相同組換が起こることで、抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5）（本実施例では耐熱性カナマイシン耐性遺伝子kmTe）とKaiC蛋白質過剰発現カセットが遺伝子移入標的部位１（符号1）に組み込まれる。KaiC蛋白質大量発現カセットを遺伝子移入した好熱性藍色細菌（KaiC蛋白質大量発現株）の細胞では、好熱性藍色細菌由来のpsbA1遺伝子プロモーター領域（符号20）の強力な転写活性によってkaiC mRNAが大量に転写され、大量のKaiC蛋白質が翻訳される。
【００６０】
野生株及びKaiC蛋白質大量発現株のそれぞれの細胞から全蛋白質を抽出して、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲルをCBB（Coomassie Brilliant Blue）染色することで蛋白質を視覚化した。また、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の全蛋白質をナイロン膜に転写し、抗KaiC蛋白質抗体を用いたウエスタン解析によってKaiC蛋白質の検出を行った。CBB染色とウエスタン解析の結果を、図１２の右図と左図にそれぞれ示す。その結果、KaiC大量発現株ではKaiC蛋白質と思われる分子量の蛋白質が大量に生産されていた。また、抗KaiC蛋白質抗体を用いたウエスタン解析から、KaiC大量発現株では野生株よりも極めて多量のKaiC蛋白質が検出された。
【００６１】
更にウエスタン解析で検出したKaiC蛋白質のシグナル強度と既知量のKaiC蛋白質のシグナル強度との比較から、野生株とKaiC蛋白質大量発現株のKaiC蛋白質発現量を定量・比較した（表２）。表２の結果より、KaiC大量発現株では野生株と比較して約19倍のKaiC蛋白質が生産されており、KaiC大量発現株細胞中の全蛋白質の約４分の１をKaiC蛋白質が占めていた。以上の結果から、本発明の方法によって、任意の蛋白質を好熱性藍色細菌の細胞内で大量に生産させることが可能であることが実証された。
【００６２】
【表２】
2005006640.tif 000003
【００６３】
（好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子の発現パターンの生物発光による定量化）
本発明の遺伝子移入系を用いて、psbA1遺伝子のプロモーター領域の存在下に耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxABを遺伝子移入することにより、生物発光により転写活性を定量化することを試みた。発光レポーター遺伝子カセット移入ベクターの構造を図１３に示す。好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子のプロモーター領域（符号20）の下流にゼノラブダス・ルミネッセンス由来の耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxAB（Xl luxAB；符号24）を接続して、符号20と24の要素から構成されるpsbA1発光レポーター遺伝子カセットを作製した。このpsbA1発光レポーター遺伝子カセットを遺伝子移入ベクターpTS2Te/kmTeのクローニング部位に組み込んでpsbA1発光レポーター遺伝子カセット移入ベクター（符号25）を作製した。このpsbA1発光レポーター遺伝子カセット移入ベクター（符号25）を自然形質転換法によって、好熱性藍色細菌の野生株のゲノム上の遺伝子移入標的部位（符号1）へ遺伝子移入した。
【００６４】
この遺伝子移入では、psbA1発光レポーター遺伝子カセット移入ベクター（符号25）と遺伝子移入標的部位２近傍の相同領域（符号4）との間で相同組換が起こることで、抗生物質耐性選択マーカー遺伝子（符号5：本実施例では耐熱性カナマイシン耐性遺伝子kmTe）とpsbA1発光レポーター遺伝子カセットとが遺伝子移入標的部位（符号1）に組み込まれる。
【００６５】
psbA1発光レポーター遺伝子カセットを遺伝子移入したpsbA1発光レポーター株の細胞では、psbA1遺伝子プロモーターの転写活性に従って耐熱性バクテリアルシフェラーゼ蛋白質が生産される。好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子の転写活性は日周変動し概日リズムを示すので、psbA1発光レポーター株に発光基質を投与すれば、日周変動性の生物発光リズムが観察される。生物発光の測定は、好熱性藍色細菌を固体培地上でコロニーとして培養しつつ測定を行う方法（固体培養法）と液体培地で培養しつつ測定を行う方法（液体培養法）の２通りの方法を最適化した。以下に最適化した２通りの方法のそれぞれについて述べる。ただし、以下の方法に類似した方法によっても生物発光の測定を行うことは可能である。
【００６６】
固体培養法
好熱性藍色細菌の生物発光レポーター株の細胞を55 ℃、50μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下、BG-11固体培地上で培養しコロニーを形成させた。96穴プレート（PerkinElmer Life Sciences社のCulturePlate-96またはその類似品）のウェルに20μlのBG-11液体培地を入れ、そのウェルに内径6mmのガラス管でBG-11固体培地ごと切り出した好熱性藍色細菌のコロニー（１個または複数個）を入れた。そして、好熱性藍色細菌のコロニーを入れたウェルに近接した別のウェルにサラダ油または機械油で0.1 %に溶かしたn-デカナールを20μl入れ、96穴プレートをプレートシール（PerkinElmer Life Sciences社のTopSeal-Aまたはその類似品）で密閉した。
【００６７】
バクテリアルシフェラーゼの発光基質であるn-デカナールは、揮発性であり、プレート内で揮発して気相から好熱性藍色細菌の細胞へ投与される。この96穴プレートを12時間の暗条件下、30〜43 ℃で静置した。この暗条件下での静置は、概日リズムの測定の場合には生物時計をリセットするために必要であるが、それ以外の場合には必ずしも必要ではない。暗黒下で静置後の96穴プレートを生物発光測定装置にセットし、30〜43 ℃、50μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下（連続明条件下）で好熱性藍色細菌の細胞を培養しつつ生物発光を測定した。ただし、概日リズムの測定の場合には、測定時の温度は暗黒下での静置と同一の温度で行った。
【００６８】
生物発光の検出は、96穴プレートを暗黒下に３分間静置して好熱性藍色細菌のクロロフィルの蛍光の減衰を待った後、光電子増倍管を使用して暗黒下で行った。生物発光を検出後の96穴プレートは、再び連続明条件下に戻した。この生物発光の検出は、一定時間ごとに繰り返し行った。
【００６９】
液体培養法
好熱性藍色細菌の生物発光レポーター株の細胞を55 ℃、50μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下（連続明条件下）、BG-11液体培地中で定常期（2×109 cells/ml）まで振盪培養した。そして、暗黒下で12時間振盪培養した。この暗黒下での振盪培養は、概日リズムの測定の場合には生物時計をリセットするために必要であるが、それ以外の場合には必ずしも必要ではない。暗黒下で振盪培養後の細胞を再び連続明条件下へ戻してさらに振盪培養した。一定時間ごとに培養液の一部（150μl）を96穴プレート（PerkinElmer Life Sciences社のCulturePlate-96またはその類似品）のウェルに移し、10μlの0.1 % n-デカナールを加えて混合し、プレートシール（PerkinElmer Life Sciences社のTopSeal-Aまたはその類似品）で密閉した。
【００７０】
バクテリアルシフェラーゼの発光基質であるn-デカナールは、サラダ油または機械油で0.1 %に溶かして使用した。96穴プレートを30℃、50μmol m-2 s-1の白色光照射下で1時間静置した後、生物発光を測定した。生物発光の検出は、96穴プレートを暗黒下に３分間静置し、好熱性藍色細菌のクロロフィルの蛍光の減衰を待った後、光電子増倍管を使用して暗黒下で行った。
【００７１】
先に述べた方法によって、好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子の発現を生物発光としてリアルタイムに定量するためのpsbA1発光レポーター株を作製し、その生物発光を測定した。好熱性藍色細菌のpsbA1遺伝子の発現は生物時計によって支配され日周変動する。41℃でpsbA1発光レポーター株を培養しつつ生物発光を先に述べた固体培養法で測定した結果を図１４に示す。測定開始後、psbA1発光レポーター株は日周変動を伴った明確な生物発光パターンを示し、その生物発光パターンは、少なくとも10日間持続した。
【００７２】
また、図１５には様々な温度条件下におけるpsbA1発光レポーター株の生物発光パターンを示す。図１５の55℃と60℃では先に述べた液体培養法で、それ以外の温度では固体培養法で生物発光の測定を行った。psbA1発光レポーター株はいずれの温度条件下でも明確な日周変動を伴った発光パターンを示した。以上の結果から、本発明の方法によって任意の遺伝子の好熱性藍色細菌細胞内での発現を広範囲な温度条件下で生物発光としてリアルタイムで定量化することが可能であることが実証された。
【００７３】
（好熱性藍色細菌野生株の細胞の凍結保存）
好熱性藍色細菌の細胞の凍結保存は以下の方法で行った。なお、以下の方法は、野生株のみならず遺伝子移入株や突然変異株の細胞に対しても適用することが可能である。まず、100 ml容のエルレンマイヤーフラスコに入れた50 mlのBG-11液体培地に好熱性藍色細菌の細胞を接種し、55℃、50μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下（連続明条件下）、180 rpm/minで定常期（2×109 cells/ml）まで振盪培養した。次に、培養液4.8 mlを15 ml容の試験管に移し、0.22μlのフィルターで滅菌した99.5 %のメタノールを200μl加えて緩やかに混合した。
【００７４】
そして1 mlの培養液を1.5 ml容の凍結保存用バイアル（NALGENE社の5000-SYSTEM 100クライオバイアルまたはその類似品）に移し、-80℃にあらかじめ冷却しておいたエタノールバスに入れて急速凍結した。凍結した細胞は、-150℃の超低温フリーザー（三洋メディカル社のモデルMDF-1155ATまたはその類似品）または液体窒素に入れて凍結したまま保存した。
【００７５】
凍結した好熱性藍色細菌の細胞の再生は以下の方法で行った。なお、以下の方法は、野生株のみならず遺伝子移入株や突然変異株の細胞に対しても適用することが可能である。まず、凍結保存した細胞は、-150℃の超低温フリーザーまたは液体窒素から凍結保存チューブに入れたまま速やかに25℃の恒温槽に15分間入れて急速解凍した。完全に解凍した細胞をBG-11固体培地上に播種し、52℃、5μmol m-2 s-1の弱白色光の連続照射下で2日間静置培養し、さらに52℃、50μmol m-2 s-1の白色光の連続照射下で静置培養を行い、コロニーを形成させることにより、再生を行った。
【００７６】
好熱性藍色細菌の野生株の細胞を従来法と、先に述べた本発明で最適化した方法との２通りの方法で凍結保存し、保存から約１週間後の細胞の生存率を比較した（表３）。また、本発明の方法で凍結保存した野生株の細胞の保存から約１年後の生存率も表２に示した。凍結保存した細胞の生存率は、凍結保存前と凍結保存後の細胞をそれぞれBG-11固体培地上でコロニー形成させ、そのコロニー数を比較することで算出した。従来法では、約１週間の凍結保存にもかかわらず、細胞の生存率は0.1 %と極めて低かった。これに対して本発明の方法では、保存から約１週間後の生存率は約90 %と従来法の約900倍の高効率であった。また、本発明の方法で約１年保存した細胞であっても生存率は約77 %と非常に高い生存率を維持していた。以上の結果から、本発明で最適化した凍結保存法は、１年以上の長期間に渡って、好熱性藍色細菌の細胞を高生存率で保存することが可能であることが実証された。
【００７７】
【表３】
2005006640.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の遺伝子移入方法およびそれに用いられるベクターは、好熱性藍色細菌において種々の用途に応用することができる。例えば本発明の遺伝子移入方法を用いて、好熱性藍色細菌の細胞内で有用な目的蛋白質を大量に発現させることが可能である。また、本発明の移入方法を用いて発光レポーター遺伝子カセットを好熱性藍色細菌に移入することにより、好熱性藍色細菌の細胞内において目的とする遺伝子の転写活性を定量化することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位であるTS1Teとその近傍の遺伝子構造、及びTS1Teを含む遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図２】図２は、好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位であるTS2Teとその近傍の遺伝子構造、及びTS2Teを含む遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図３】図３は、好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位であるTS3Teとその近傍の遺伝子構造、及びTS3Teを含む遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図４】図４は、好熱性藍色細菌の遺伝子移入標的部位であるTS4Teとその近傍の遺伝子構造、及びTS4Teを含む遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図５】図５は、隣接する２つの内在遺伝子の存在様式を図示した模式図である。
【図６】図６は、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子の塩基配列と、それがコードするカナマイシン不活性化酵素の耐熱性変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】図７は、好熱性藍色細菌のpsbA遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図８】図８は、好熱性藍色細菌細胞内での蛋白質大量発現系の概要を示す図である。
【図９】図９は、好熱性藍色細菌細胞における生物発光レポーター系の概要を示す図である。
【図１０】図１０は、従来の継代培養による株の維持と、本発明の凍結保存による株の維持を示す模式図である。
【図１１】図１１は、KaiC大量発現のための遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図１２】図１２は、好熱性藍色細菌細胞の野生株とKaiC大量発現株から抽出した全蛋白質のCBB染色とウエスタン解析の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、psbA1発光レポーター遺伝子カセットを移入するための遺伝子移入ベクターを示す図である。
【図１４】図１４は、psbA1発光レポーター遺伝子カセットを移入された好熱性藍色細菌細胞の生物発光レポーター株の生物発光パターンを示す図である。
【図１５】図１５は、生物発光レポーター株の生物発光パターンを種々の温度で示した図である。
【符号の説明】
【００８０】
1   遺伝子移入標的部位
2   遺伝子移入標的部位近傍に存在する遺伝子の推定遺伝子番号（かずさDNA研究所によって達成されたゲノムプロジェクトで付与された推定遺伝子番号）
3   遺伝子移入ベクター
4   相同領域
5   抗生物質耐性選択マーカー遺伝子
6   クローニング部位
7   転写終結配列
8   KmTe遺伝子の開始コドン
9   KmTe遺伝子の停止コドン
10  転写調節領域
11  産生させようとする目的蛋白質をコードする遺伝子
12  蛋白質大量産生用ベクター
13  目的蛋白質をコードするmRNA
14  目的蛋白質
15  遺伝子発現を測定しようとする目的遺伝子の転写調節領域
16  耐熱性生物発光レポーター遺伝子
17  遺伝子発現定量用ベクター
18  生物発光レポーター遺伝子のmRNA
19  生物発光レポーター蛋白質
20  psbA1遺伝子のプロモーター領域
21  時計遺伝子kaiCのコード領域
22  大腸菌のrrnB遺伝子の転写終結配列
23  KaiC蛋白質大量発現カセット移入ベクター
24  ゼノラブダス・ルミネッセンスの耐熱性バクテリアルシフェラーゼ遺伝子オペロンluxAB
25   psbA1発光レポーター遺伝子カセット移入ベクター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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