(57)【要約】【課題】            生体抗菌ペプチドとして、新規なデフェンシンを提供すること、ならびに該新規なデフェンシンを有効成分とするインフルエンザ感染防御剤を提供する。【解決手段】          次のアミノ酸配列式（Ｉ）：Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕで示される新規デフェンシンであり、かかるアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンを有効成分とするインフルエンザウイルス感染防御剤である。また、インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を鼻腔粘膜投与することによる、インフルエンザウイルス感染防御作用を有する上記の新規デフェンシンの誘導方法である。【選択図】          図２
2005075819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列式（Ｉ）：
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ
で示される新規デフェンシン。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列に対して、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する新規デフェンシン。
【請求項３】
請求項１に記載のアミノ酸配列式（Ｉ）、あるいはそのアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する新規デフェンシンを有効成分とするインフルエンザウイルス感染防御剤。
【請求項４】
インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をマウス鼻腔粘膜に接種し、擬似呼吸器インフルエンザ感染症を誘発させることによりマウス気管に誘導される請求項１に記載のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシン。
【請求項５】
インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を鼻腔粘膜投与することによる、インフルエンザウイルス感染防御作用を有する請求項１に記載のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンの誘導方法。
【請求項６】
インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むワクチンを投与し、請求項１に記載のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンを誘導させることによるインフルエンザウイルス感染の防御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染予防作用を有する抗菌ペプチドの一種である新規なデフェンシンに関し、より詳細には、インフルエンザウイルス感染防御作用を有する新規なデフェンシンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトには細菌等の外部からの攻撃を排除する先天的な免疫反応のメカニズムが備わっている。この先天的な免疫反応の構成要素の一つとして、生体由来の抗菌ペプチド（anti-microbial peptide）類の分泌、すなわち、通常はα−デフェンシンの分泌が挙げられている（非特許文献１）。例えば、細菌感染の危険を感じた場合には、β−デフェンシンなど、いくつかのタイプの抗菌ペプチドが上皮表面において産生され、病原体となり得るものに対する先天性免疫エフェクターとして作用していることが知られている。
【０００３】
このデフェンシン類は、細菌、カビなどの微生物に対して殺菌活性を有する塩基性の抗菌ペプチドであり、好中球やマクロファージの細胞内顆粒に存在するものである。ヒトにおいては、多くの場合２９〜３４のアミノ酸残基からなるペプチドであり、その殺菌作用は、微生物細胞膜構造の破壊により殺菌的に作用するものと考えられている。
【０００４】
この抗菌ペプチドであるデフェンシンの産生は、腸管上皮細胞で行われていることが種々報告されている（非特許文献２）が、我々は、インフルエンザ等の呼吸器ウイルス感染症においても、先天的な免疫機能が働き、デフェンシンを誘発しているものと考え、そのデフェンシンを誘発するワクチンを提供するべく種々検討をしてきている。
【０００５】
インフルエンザ感染症については、感染後の有効な治療手段がなく、各種抗生物質に頼っているのが現状である。そのため、インフルエンザ感染予防が有効なものであり、感染予防のためのワクチンが種々提案されている。しかしながら、現在認可されているインフルエンザワクチンには、以下のような限界があり、その年その年のインフルエンザの流行に追いつかなくなっているのが現状である。
【０００６】
例えば、インフルエンザウイルス（特にＡ型インフルエンザウイルス）では抗原変異が顕著に生じ、それまで使用されていたワクチン（すなわち、それまでに獲得された感染）により生じている抗体では中和されないウイルスが発生することが頻繁であり、ワクチンの効果が一シーズンのみに終わることが多い。
【０００７】
また、表面糖タンパク質（ヘマグルチニン［赤血球凝集素；ＨＡ］およびノイラミニダーゼ［ＮＡ］）をコードする遺伝子の点突然変異（抗原連続変異）、抗原の不連続変異により免疫学的に異なる新規のウイルス株が生じることが頻繁に生じている。その一方で、現行のワクチンによる免疫は、細胞媒介免疫を基礎にした異種群株間共通免疫ではなく、同種株特異性抗体媒介免疫を引き出すに過ぎないことから、流行する株とワクチン株とが異なると効き目が全く無いことになる。
【０００８】
あるいは、インフルエンザウイルスの優勢流行株が、ある年からその翌年にかけて有意に不連続変異または連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため、免疫は毎年実施しなければならないという欠点もある。血球凝集阻止（ＨＩ）および中和の抗体は数ヶ月〜数年存続し、その後次第に低減することが報告されている。しかし、そのような低減が見られない場合でも、年に１度の免疫化が推奨されている。なぜなら、ワクチン接種後その年内に抗体力価が低減する可能性があるからである。それどころか、高齢者のように一シーズン中に２回ワクチン接種を行うことがよいとされている場合もある。
【０００９】
また、ワクチンの有効性には改善の余地がある。なぜなら、次シーズンのワクチンの開発は、次の流行株を予測することに依存しているが、このような予測には不正確性が伴い、ワクチンに用いる株と実際に野外で流行するものとが余り適合しないということが起こっている。さらに、新型株が生じた場合には、予測されたワクチンは無効であることが多い。例えば、１９９２〜１９９３年のインフルエンザ流行シーズン中に起きたように、新規のＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２型）の出現に対して、既存のワクチンによる防御は不十分であった。
【００１０】
【非特許文献１】R.I. Lehrer, et al., Cell, 64, 229-230(1991)
【非特許文献２】P. Fehlbaum, et al., PNAS, 97(23), 12723-12728(2000)
【００１１】
本発明者等は、インフルエンザウイルス感染防御のためのワクチンを開発するべく、先天的な免疫機能として作用する生体抗菌ペプチドであるデフェンシンを誘導するワクチンを提供するべく種々検討してきている。その過程で、ｄｓＲＮＡ（double-stranded ＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ）であるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を鼻腔粘膜に接種し、擬似インフルエンザ感染症を誘導させ、抗菌ペプチドであるデフェンシンの分泌の有無を検討してきたところ、上気組織からこれまで知られていない抗菌ペプチドであるデフェンシンを単離することに成功した。
【００１２】
新たに単離されたデフェンシンは、これまで知られているデフェンシン類とはそのアミノ酸配列が異なり、全く新たなアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドであった。また、その新たに単離したデフェンシンを用いてインフルエンザウイルス感染に対する抑制作用を検討したところ、極めて良好なウイルス感染抑制効果を示すことを確認した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明は、生体抗菌ペプチドとしてこれまで知られていない新規なデフェンシンを提供すること、ならびに該新規なデフェンシンを有効成分とするインフルエンザ感染防御剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、
次のアミノ酸配列式（Ｉ）（配列番号２）：
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ
で示される新規デフェンシンである。
【００１５】
また本発明は、上記のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンを有効成分とするインフルエンザウイルス感染防御剤である。
さらに本発明は、インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をマウス鼻腔粘膜に接種し、擬似呼吸器インフルエンザ感染症を誘発させることによりマウス気管に誘導される上記のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンでもある。
【００１６】
さらにまた本発明は、この新たに単離された上記のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される抗菌ペプチドであるデフェンシンを誘導することによりインフルエンザウイルス感染防御方法を提供するものでもあり、具体的には、インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を鼻腔粘膜投与することによる、インフルエンザウイルス感染防御作用を有する上記のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンの誘導方法であり、また、インデューサーとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むワクチンを投与し、上記のアミノ酸配列式（Ｉ）で示される新規デフェンシンを誘導させることによるインフルエンザウイルス感染の防御方法である。
【００１７】
なお、本発明の範囲には、上記のアミノ酸配列式（Ｉ）に対し、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列も包含される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、これまで知られていなかった生体抗菌ペプチドである新規なデフェンシンを提供するものであり、かかるデフェンシンはインフルエンザウイルス感染時の、先天性免疫エフェクターとしてインフルエンザウイルスに対し、殺菌作用を示すものである。
したがって、これまで有効なインフルエンザウイルス感染防御剤が無かった現状下では、極めて効果的なインフルエンザウイルス感染防御剤となり得るものである。
【００１９】
また、抗菌活性を有する新規なデフェンシンの誘導は、ｄｓＲＮＡ（double-stranded ＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ）であるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を鼻腔粘膜に接種することにより行われることより、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をインデューサーとする極めて効果的なインフルエンザワクチンを提供することができ、その医療上の効果は多大なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に本発明について、実施例に代え、デフェンシンの誘導、その同定の詳細を説明することにより、さらに具体的に説明していく。
【００２１】
本明細書においては、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定めた３文字標記ならびに１文字表記により表記する。
【００２２】
本発明者等は、インフルエンザウイルスの感染予防としてのワクチンを提供するべく、第一に、ウイルス感染時における抗菌ペプチドの誘導（分泌）を検討した。ｄｓＲＮＡ（double-stranded ＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ）は、生理的な状態では生体に存在せず、ウイルス感染の時のみ存在するものである。そのため、ウイルス感染の擬似的な状況を二本鎖ＲＮＡの投与で作り出すことが可能となる。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、ポリイノシン酸（ｐＩ）とポリシチジン酸（ｐＣ）とを含む二本鎖ＲＮＡであり、このＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を経鼻接種させることにより、擬似インフルエンザ感染症を誘発させた。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の接種濃度は、１ｍｇ／ｍＬ、片鼻５μＬずつマウス１匹当たり合計１０μＬのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を投与した。
【００２３】
細菌感染による擬似的症状になり得る対照として、リポ多糖類（リポポリサッカライド：ＬＰＳ）を、１ｍｇ／ｍＬ、１０μＬを投与した。なおリポ多糖は、通常グラム陰性細菌表菌のペプチドグリカンを取囲む外膜の重要な構成成分であり、これを投与することにより擬似的な細菌感染症を誘発することができるものである。
【００２４】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳを経鼻接種後、３０分ごとにマウスの気管を採取し、組織よりｍＲＮＡを抽出し（抽出には、Promega Total RNA extraction kitを使用した）、逆転写反応（Quiagen omniscript RT kitを使用）の後、マウスβ−デフェンシン群のmbd-1、mbd-2、mbd-3に対するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。
そのうち、mbd-2およびmbd-3に関しては、配列の類似したファミリーの遺伝子でも増幅可能にするためにファミリーに共通する配列部分のプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。
【００２５】
その結果、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）経鼻接種後１時間後から４時間後にかけて、mbd3とmbd3ファミリーの発現を同定するプライマーセットで、２２０ｂｐと１５０ｂｐの２種類の大きな遺伝子が増幅された。
この遺伝子の増幅は、対照としたＬＰＳ経鼻接種群には見られず、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）経鼻接種群に特異的に認められた。
その電気泳動図を、図１として示す。
【００２６】
増幅された約２２０ｂｐのＤＮＡ断片は、アミノ酸配列分析（シークエンス）によりmbd-3、mbd-4が含まれていることが判明した。
また、約１５０ｂｐのＤＮＡ断片の増幅も認められ、アミノ酸配列分析（シークエンス）の結果今まで知られていない、アミノ酸残基３６個からなる新しいデフェンシンであることが確認された。
【００２７】
なお、ＤＮＡ増幅に用いたプライマーは、以下のとおりのものである
Forward: CAGTCATGAGGATCCATTAC
Reverse: CATGGAGGAGCAAATTCTGG
【００２８】
得られた新規なデフェンシンのＤＮＡ配列は、以下の配列式（ＩＩ）（配列番号１）で示されるものであった。
ATGAGGATCCATTACCTTCTGTTCTCATTTCTCCTGGTGTTGCTGTCTCCATTTGCA
GCTTTTAGCCCTCAAATGCTGCAAGATATAATAGAGAAGAAGACAAAGATCCTGTG
AACCAAAGAAAACACCAGAATTTGCTCCTCCATGA
【００２９】
また、そのアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列式（Ｉ）（配列番号２）：
Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ
で示される以下のものであった。
【００３０】
その相同性を検索したところ、mbd-7に相同性をもち、中ほどの配列が飛んでいるものであった。その点を次表１に示した。
【００３１】
【表１】
2005075819.tif 000003
【００３２】
これらの遺伝子の増幅は，ＬＰＳ接種では認められず、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激（接種）したときにのみに認められるものであった。
このことから、この新規なデフェンシンは、ウイルス感染の防御に作用している可能性が高く、呼吸器ウイルス感染症、特にインフルエンザウイルス感染症の予防に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）が有効に用いられることが示唆された。
【００３３】
そこで、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の経鼻接種によるインフルエンザウイルスの感染防御について検討を行った。
以下に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の経鼻接種によるインフルエンザウイルスの感染防御の実際を示す。
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および対照としてＬＰＳを経鼻接種し、接種６時間後、１日後、３日後、７日後に、１００pfuのＰＲ−８インフルエンザウイルスを経鼻感染させ、その３日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価を測定した。
その結果を図２に示した。
【００３４】
図に示すように、接種後６時間と１日後で有意なウイルス価の抑制が観察された。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）投与群では、その抑制効果は３日後にも及んでいた。
以上の結果から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、インフルエンザウイルスの抑制に効果があり、このウイスル抑制効果はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）から誘導される抗菌ペプチドが関与しているものであり、特に、アミノ酸配列式（２）で示される。新規なデフェンシンが関与しているものと判断される。
【００３５】
式（Ｉ）で示される新規なデフェンシンは、アミノ酸残基が３６個の比較的分子量の小さなペプチドであるため、通常の液相法または固相法により容易に合成することができる。また本発明のデフェンシンは、塩基性ペプチドであるため、慣用技術により適当な酸付加塩に変換することができる。これらのペプチドまたはその酸付加塩を、製剤学上慣用されている適当な添加剤と共に製剤化し、錠剤、カプセル化剤、散剤、あるいは、粘膜用の噴霧などの形態で投与しうる形態で製剤化することができる。
【００３６】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をインデューサーとして、ワクチンとすることもできる。ワクチン化の技術は、当該技術分野で慣用されている技術を用いて、ワクチンとすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上記載のように、本発明はこれまで知られていなかった生体抗菌ペプチドとして新規なデフェンシンを提供するものであり、かかるデフェンシンは優れたインフルエンザウイルス感染防御作用を有している。したがって、かかる新規なデフェンシンを有効成分とするインフルエンザ感染防御剤が提供され、またかかるデフェンシンを誘導するワクチンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）経鼻接種群と、対照であるＬＰＳ経鼻接種群における接種後のその電気泳動図である。
【図２】Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）および対照としてＬＰＳを経鼻接種し、接種６時間後、１日後、３日後、７日後にＰＲ−８インフルエンザウイルスを経鼻感染させ、その３日後における鼻腔洗浄液中のウイルス価の結果を示した図である。  Ａは、ＬＰＳを経鼻接種した場合、ＢはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を接種した場合の結果である。
【００３９】
SEQUENCE LISTING
<110>  Masami, Moriyama 
<120>  Novel Defensin
<130>  MY-395
<160>  4     
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  148
<212>  DNA
<213>  mouse trachea
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(114)
<223>  
<400>  1
atg agg atc cat tac ctt ctg ttc tca ttt ctc ctg gtg ttg ctg tct       48
1               5                   10                  15              
cca ttt gca gct ttt agc cct caa atg ctg caa gat ata ata gag aag       96
20                  25                  30                  
aag aca aag atc ctg tga accaaagaaa acaccagaat ttgctcctcc atga        148
35                                                              
<210>  2
<211>  37
<212>  PRT
<213>  mouse trachea
<400>  2
Met Arg Ile His Tyr Leu Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Leu Leu Ser 
1               5                   10                  15      
Pro Phe Ala Ala Phe Ser Pro Gln Met Leu Gln Asp Ile Ile Glu Lys 
20                  25                  30          
Lys Thr Lys Ile Leu 
35          
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  unkown: artificial Sequebce:primer
<400>  3
cagtcatgag gatccattac                                                 20
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  unkown: artificial Sequebce:primer
<400>  4
catggaggag caaattctgg                                                 20
【図１】
2005075819.tif 000004
【図２】
2005075819.tif 000005