(57)【要約】【課題】  アリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるダイオキシン類を簡便に大量検体の迅速な測定等が可能とするダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母ならびにそれを用いたダイオキシン類の検出方法を提供することにある。【解決の手段】  酵母をアリルハイドロカーボン受容体およびアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーターを発現するよう組み換え、ダイオキシン等がアリルハイドロカーボン受容体に結合した場合に、レポーター遭伝子が発現するよう形質転換した酵母を樹立した。この形質転換酵母を含有して成るダイオキシン類検出・測定用試薬を作成し、この試薬と増殖培地を備えるダイオキシン類検出・測定キットを開発した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン受容体結合DNAシスエレメント配列をレポーター遺伝子の上流に挿入した配列をゲノム内に組み込んだ酵母を、レポーター遺伝子遺伝子活性化ドメイン融合アリルヒドロカーボン受容体およびアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーター発現遺伝子で形質転換してなる形質転換酵母。
【請求項２】
レポーター遺伝子遺伝子活性化ドメイン融合アリルヒドロカーボン受容体およびダイオキシン受容体核トランスロケーターを恒常的に発現し、ダイオキシン類と複合体を形成し、ダイオキシン受容体結合DNAシスエレメント配列DNAへの結合を介して、その下流にあるレポーター遺伝子を発現することを特徴とする請求項１に記載形質転換酵母。
【請求項３】
転写活性化ドメインがGAL4であることを特徴とする請求項１又は２に記載の形質転換酵母。
【請求項４】
レポーター遺伝子LacＺおよびＨＩＳ３である請求項１又は２に記載の形質転換酵母。  
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１つの項に記載の形質転換酵母を含有することを特徴とする試薬。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１つの項に記載の形質転換酵母を含有する試薬と、形質転換酵母用増殖培地を備えることを特徴とするダイオキシン類検出・測定用キット。
【請求項７】
検体を請求項１ないし５のいずれか１つの項に記載の形質転換酵母に接触させ、当該形質転換酵母に組み込んだレポーター遺伝子の転写活性を検出することを特徴とするダイオキシン類検出スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１ないし５のいずれか１つの項に記載の形質転換酵母を含有するダイオキシン類定量分析方法であって、増殖した酵母のATP量よりダイオキシン類濃度を測定することを特徴とするダイオキシン類検出・測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アリルハイドロカーボン受容体のリガンド定性法であり、ダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母ならびにそれを用いたダイオキシン類の検出、定量およびスクリーニング方法である。  詳細には、アリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母を含んだダイオキシン類検出・測定用試薬およびキットならびにこれらを利用したダイオキシン類の検出、測定およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境汚染物質であるダイオキシンは産業廃棄物、種々の化学製品、生活に利用されたプラスチック製品などのごみ処理の際に発生する。近年になり、ごみ処理の増加に伴い、土壌、河川、大気など環境中にはすでに多量のダイオキシン類が排出されている。環境中のダイオキシンの処理は重要な問題であり、環境中の汚染状況、あるいは動植物の汚染状況を把握して、必要な対策を講じる必要がある。  環境保全および健康上の安全性を確保するために土壌、海水等の環境中、植物、魚介類等の生物体内又は人体に蓄積したダイオキシン類の濃度を精度良く測定することは、極めて重要である。さらに新規および既知のいわゆる環境汚染物質がダイオキシン様作用を有するか否かを調べるためのダイオキシン類検出方法の確立も急務である。
【０００３】
ダイオキシン類は微量な量で人体に影響を与えることが知られており、ダイオキシン類を検出し、その濃度を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメーター（GC-MS）等の大型分析機器を用いた個別成分定量方法が従来から用いられている。
【０００４】
GC-MS法は測定装置が高価なことと、測定サンプルの測定系にかける前処置が複雑なために、測定日数が掛かり、検体処理数が少なかった。そのため、測定施設は限られており、測定費用が高額であった。しかしながら、解析を必要とする検体数は多数であり、迅速で、高感度、低コストの測定法の開発が望まれている。一方で、化学物質のスクリーニング法は形質転換酵母を用いた、既知のDNA配列に結合する蛋白質を検出するワンハイブリッドシステムによるホルモン又はホルモン様物質の簡易法が知られている
【０００５】
【非特許文献１】「ダイオキシン類に係る土壌調査測定マニュアル（H12.1）」
【非特許文献２】「環境省ホームページ、インターネット                        URL:http://www.env.go.jp/chemi/dioxin/guide.html」
【非特許文献３】「もっと知りたい  環境ホルモンとダイオキシン  （環境総合研                            究所編）」
【特許文献１】「特開２００１−３９４０５９参照」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来の技術の有する課題を解決するために、アリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるダイオキシン類を簡便に大量検体の迅速な測定等が可能とするダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母ならびにそれを用いたダイオキシン類の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、酵母をアリルハイドロカーボン受容体およびダイオキシン受容体核トランスロケーターを発現するよう組み換え、更にこの発現した受容体および受容体核トランスロケーターにダイオキシン等アリルハイドロカーボン受容体のリガンドが結合した場合に、レポーター遭伝子が発現するよう形質転換することにより、簡便にダイオキシン類をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、ダイオキシン受容体に対するおとり配列をレポーター遺伝子の上流に挿入した配列をゲノム内に組み込んだ酵母を、レボーター遭伝子活性化ドメイン融合アリルハイドロカーボン受容体および受容体核トランスロケーター発現遭伝子で形質転換してなる形質転換酵母を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、上記形質転換酵母を含有することを特徴とする試薬を提供するものである。
【００１０】
また、本発明のダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母は、産生するアミノ酸あるいは核酸が、ヒスチジンあるいはウラシルであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母は、産生されたレポーターが、該形質転換酵母自体の増殖に必須なヒスチジンあるいはβ―ガラクトシダーゼを産生することを特徴とする。
【００１２】
本発明のダイオキシン類検出・測定用キットは、上記本発明のダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母と形質転換酵母用増殖培地を備える。
【００１３】
本発明のダイオキシン類検出方法は、上記本発明のダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母と、検体を作用させ、増殖した酵母数を培養液の濁度を測定することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のダイオキシン類検出方法は、上記本発明のダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母と、試料とを接触させ、産生されたβ―ガラクトシダー活性あるいは蛋白質を測定することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明のダイオキシン類定量分析方法は、上記本発明のダイオキシン類検出方法を用い、増殖した酵母のATP量よりダイオキシン類濃度を測定することを特徴とする。
【００１６】
さらに、本発明は、検体を上記形質転換酵母に作用させ、アリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるダイオキシン類の検出用キットならびにスクリーニング法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の形質転換酵母は、当該酵母に組込んだアリルハイドロカーボン受容体すなわちダイオキシン受容体にダイオキシン様物質が結合し、レポーター遺伝子の転写活性を冗進するので、この転写活性を調べることによりアリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるダイオキシン類の存在を調べることができる。また、必要であれば濁度計や比色計による定量も可能であり、酵母内のＡＴＰをルシフェラーゼアッセイ法により測定することによりダイオキシン量の数値化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、基本的には、ワンハイブリッドシステム（One−hybrid systeｍ）の改良法である。ワンハイブリッドシステムとは、形質転換酵母を利用し、既知のDNA配列に結合する蛋白質を検出する遺伝子解析手段である。このワンハイブリッドシステムでは、上流に既知のDNA配列を複数個直列に挿入したレポーター遺伝子を酵母ゲノム内に組込み、組換え酵母体を作成する。次いで、その組換え酵母を活性化ドメインと蛋白質を融合させた活性化ドメイン融合蛋白質発現遭伝子ライブラリーでさらに形質転換することにより形質転換酵母を作成する。形質転換酵母内で発現された活性化ドメイン融合蛋白質とDNA配列が結合すると立体構造が変化し、活性化ドメインによりレポーター遭伝子の転写活性が亢進される。このレポーター遺伝子の転写活性を検出することにより、DNA配列に結合する蛋白質が検出することができるというものである。
【００１９】
核内受容体はリガンドと結合して、転写活性因子としての作用が現れる。転写活性因子である核内受容体の多くがDNA結合ドメインと活性化ドメインからなり、DNA結合ドメインが特異的なプロモ-ターＤＮＡ配列に結合し、活性化ドメインがRNAポリメラーゼII複合体を形成することにより、下流の遺伝子が転写される。ここで、各ドメインは独立したモジュールとして働き、各ドメインは他のタンパク質と融合タンパク質を形成してもそのドメインの機能は保持される。
【００２０】
本発明はリガンドと結合して初めて転写活性を発現する核内受容体の特性を利用したものである。
以下、本発明のアリルハイドロカーボン受容体のリガンド定性法、すなわちダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母について詳細に説明する。
【００２１】
本発明のアリルハイドロカーボン受容体のリガンド定性法、すなわちダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母はまず、レポーター遺伝子の上流にダイオキシン受容体であるアリルハイドロカーボン受容体に結合する既知のDNA配列を３ないし４個直列に挿入して作成した遭伝子すなわちレポーター遺伝子を酵母ゲノム内に組込む。次いで、その組換え酵母を活性化ドメインとアリルハイドロカーボン受容体との融合タンパクを発現する遭伝子とアリルハイドロカーボン受容体と結合するダイオキシン受容体核トランスロケーター遺伝子との融合タンパクを発現する遭伝子で形質転換することにより作製される。
【００２２】
本発明の組換え酵母の作製において、アリルハイドロカーボン受容体に結合するDNA配列は下記のものが挙げられる（「Bio Science  新用語ライブラリー」転写因子第2版）、羊土社、P130−P133  (1999))。
アリルハイドロカーボン受容体（ダイオキシン受容体）の結合ドメインDNA（DRE）：5’−TNGCGTG−3’            
【００２３】
このＤＮＡ配列は2本鎖として、更にこれを２個以上、すなわち３個あるいは４個を直列に結合させたものがよい。
【００２４】
産生されるレポーター遺伝子としては、形質転換酵母の増殖に必須なアミノ酸を合成する遺伝子ＨIS３が望ましい。詳しくは後述するが、産生されるアミノ酸を含まない選択培地を存在させ、そこにダイオキシン類が存在すると、形質転換酵母の増殖が確認されるからである。また、レポーター遺伝子を発現させて、レポーター蛋白質を産生させてもよい。
【００２５】
特に、レポーター遺伝子として、アミノ酸の合成とレポーター蛋白質の２つの遺伝子を組込むとデュアルアッセイが可能であり、簡便性、試験精度の向上につながる。例えば、レポーター遺伝子としてHIS3とLacZの両方を組込むと形質転換酵母がヒスチジンを含まない培地で増殖することと、β−ガラクトシダーゼ活性を示すことの両方を指標としたスクリーニングが可能になる。
【００２６】
更に、レポーター発現遺伝子を酵母に組み込み、組換え酵母を得るためには、ベクターが利用されるが、そのベクターとしては、pHISi、pHISi‐1、pLacZi（いずれもクロンテック社製）等、上記レポーター遺伝子を予め組み込んだベクターが好ましい。
【００２７】
なお、レポーター発現遭伝子を酵母に組込む際には、上記ベクターを直鎖化してから導入することが好ましい。プラスミドを直鎖化するのは、環状のまま導入すると培養途中で脱落する可能性が高く、安定性に欠けることが予想され、スクリーニング法自体の安定性に影響を及ぼし、得られる潮定結果の信頼性に影響するためである。ベクターを直鎖化する方法としてはＸhoIまたはNcoI等による制限酵素処理が挙げられる。
【００２８】
一方、上記の組換え酵母から形質転換酵母を作成するために使用されるダイオキシン受容体であるアリルハイドロカーボン受容体とアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーターの遺伝子としては、（Eur.J.Biochem 242.512-518）等により周知である。また、ダイオキシン受容体であるアリルハイドロカーボン受容体とアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーターの遺伝子のアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失もしくは置換されたアミノ酸配列から成りたつ蛋白質も同様の機能を有する蛋白質として用いることができる。
【００２９】
また、上記ホルモン受容体との融合タンパクを得るためのレポーター遺伝子活性化ドメインとしては、前記レポーター遺伝子を活性化することができるものであれば特に制限されない。レポーター達伝子活性化ドメインの例としてはGAL4、VP16（「酵母による達伝子実験法」、羊土社、P85−98、（1994））等が挙げられる．
【００３０】
この融合タンパク発現遼伝子を組換え酵母に組み込み、形質転換酵母を作成するために使用されるベクターとしては、PGAD424ベクター、PGBKT7ベクター（共にクロンテック社製）等が利用される。
【００３１】
このようにして作製された形質転換酵母は、その細胞内に融合タンパクを発現するが、その状態では、融合タンパクはDNA配列には結合せず、レポーター遺伝子の転写活性を引き起こさない。しかし、この融合タンパクに外因性の化学物質またはホルモン様物質がリガンドとして結合すると、それがゲノ
ム中のDNAと結合して立体構造が変化し、活性化ドメインによりレポーター遺伝子の転写活性が亢進される。
【００３２】
従って、ある検体を上記形質転換酵母と接触させた場合に、レポーター遭伝子の転写活性の冗進が検出されれば、この検体中に含まれる化学物質がダイオキシン作用を示すことを意味し、更にこの転写活性を定量することにより当該化学物質がダイオキシンとしての活性をどの程度有するのか測定することができる。このシステムの概略図を図1に示す。
【００３３】
本発明で使用される酵母ゲノムにアリルハイドロカーボン受容体結合DNA配列とレポーター遺伝子とを有する酵母を、アリルハイドロカーボン受容体融合タンパクおよびアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーターで形質転換した形質転換酵母の具体的な調製手順を以下に示す。
【００３４】
ゲノム中にアリルハイドロカーボン受容体結合DNA配列（DRE）とレポーター逮伝子とを有する組換え酵母を作製するには、まず、最初にDNA配列（DRE）を合成し、これを直列に複数個結合させ、次いでこれをレポーター逮伝子を有するベクター（pHISi）とライダーションさせてプラスミド（pHISi４DRE）を作成し、常法により辞母のゲノム中のHIS3遺伝子部位に導入する。更に、上記のpHISi４DREを導入した酵母にpHISi3EREと同様に合成されたpLacZi４DREを組み込み、組換え酵母を得る。
【００３５】
一方、融合タンパク発現遺伝子は、形質転換した際にレポーター遺伝子活性化ドメインとの融合蛋白質が発現されるように、レポーター遭伝子活性化ドメインを組込んだベクター（pGAD424）に、アリルハイドロカーボン受容体のcDNAとアリルハイドロカーボン受容体核トランスロケーターcDNAを組込み、プラスミドDNAを調製する。
【００３６】
また、上記ホルモン受容体との融合タンパクを得るためのレポーター遺伝子活性化ドメインとしては、前記レポーター遺伝子を活性化することができるものであれば特に制限されない。レポーター逮伝子活性化ドメインの例としてはGAL4、VP16（「酵母による逓伝子実験法」、羊土社、P85−98．、（1９94））などが挙げられる。
【００３７】
この融合タンパク発現遺伝子を組換え酵母に組み込み、形質転換酵母を作成するために使用されるベクターとしては、PGAD424ベクター、PGBKT7ベクター（共にクロンテック社製）等が利用される。
【００３８】
上記のようにして得られた本発明の形質転換酵母は、ダイオキシン類検出・測定用試薬として使用することができる。このような試薬にするには、例えば、上記のようにして得られた形質転換酵母を凍結乾燥等により乾燥させればよい。
【００３９】
特に本発明の形質転換辞母の好ましい利用の例としては、上記形質転換酵母と形質転換酵母増殖用培地を組合せたダイオキシン様物質測定用キットを挙げることができる。このようなキットとしては、前記酵母を凍結乾燥により乾燥させてタブレット状にしたもの、および前記培地を予め試験用アンプルに封入しすぐに使用可能としたものが好ましい。
【００４０】
本発明において使用される形質転換酵母用増殖培地としては、前記したように前記酵母が増殖可能なものであれば何れでも構わないが、酵母に組込まれたレポーター遺伝子が活性化され転写活性が亢進された際に、増殖あるいは活性を損なわないような選択培地の使用が好ましい。このような選択培地としては、SD−His／−Leu／−Ura（「酵母による遺伝子実験法」、羊土社、P85−98、（1994））が挙げられる。また、レポーター逮伝子の発現により、酵母の生育に必要な物質が発現する場合は、この物質を含まない培地を利用することにより、単に酵母の生育状態からダイオキシン類の存在を検出することが可能となるので便利である。
【００４１】
前記キットの使用方法は、例えばヒスチジンを含まない培地を入れた試験用アンプルに、検体と乾燥状態の形質転換酵母（レポーター遺伝子としてヒスチジン遭伝子を使用）を接種し、これを30℃程度の温度で3日以上培養し、その培地の濁度をA６００の吸光度を測定することによってダイオキシン様物質を検出する方法を挙げることができる。この方法では、酵母の生育に必要なヒスチジンは、レポーター逮伝子が発現した場合にのみ供給されるので、酵母の増殖による濁度とダイオキシン類の量が比例することになる。
【００４２】
また、ダイオキシン類の濃度と酵母に含まれるATP量に相関関係があること、即ちダイオキシン類の濃度と増殖した酵母の量と酵母に含まれるATP量に相関関係があることを見出した。かかる相関関係から増殖した酵母のATP量を測定することにより、ダイオキシン類を検出し、またその濃度を測定することができる。ＡＴＰ量は市販の細胞内のＡＴＰ量に比例した発光シグナルを測定するキットを用いて測定することができる。
【００４３】
さらにまた、産生されたレポーター蛋白質であるβガラクトシダーゼを測定することによりダイオキシン類の検出やダイオキシン類の濃度を測定することもできる。
【００４４】
このように、本発明の形質転換酵母は、当該酵母に組込んだダイオキシン受容体が対応するダイオキシン類と結合し、レポーター遺伝子の転写活性を亢進するので、この転写活性を調べることによりダイオキシン類の存在を調べることができる。
【００４５】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
（ａ）酵母の選抜
酵母株として、YM4271（クローンテック社製；Genotype:MATa,ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,leu2-3,112,trp1-901,tyr1-501,gal4-Δ512,gal80-Δ538,ade5::hisG(Liu et at.,1991)）を使用した。この酵母を、YPD寒天プレート培地（1% bacto-yeast extract,1% bacto-yeast-pepton（共にディフコ社製）、2%グルコース（和光純薬製））に塗布し、コロニーを形成させた。３日間の培養後、径2mm以下のコロニーは変異が起きている可能性があるため、以後用いなかった。増殖が良好なコロニーを選択し、さらに2%デキストロースを含んだYPD培養液にて１晩振とう培養し、50%グリセロール中に保存した。この酵母を以後に用いた。
【００４７】
（ｂ）結合エレメントプライマーの作成
アリルハイドロカーボン受容体すなわちダイオキシン受容体結合配列（DRE）を作成するため下記に示すプライマーをDNA合成機にて作成した。
＜  DRE作成用プライマー  ＞
5'-GATCCCTGGGGGCATTGCGTGACATA-3'
（BamHI切断部位を含んだセンス鎖）
5'-GATCTTATGTCACGCAATGCCCCCAG-3'
（BglII切断部位を含んだアンチセンス鎖）
【００４８】
（ｃ）結合エレメントのタンデムリピートの作成
次いで、このプライマーを90℃で3分間、65℃で10分間および37℃で10分間インキュベーションし、その後4℃に冷却し、2本鎖DNAを作成した。作成したDNAを1％アガロースゲル電気泳動で分離、精製した。
【００４９】
（ｄ）pTK1×DREの作成
BamHIとBglIIで制限酵素処理をしたpTK(BioTechniques 23(3),436-438(1997).)と1×DREをライゲーションさせ、大腸菌（DH-5α）にケミカルヒートショック法にてトランスフォームした。LBAプレート（LB+Ampicillin 50／μl）に塗布し、一晩培養の後、コロニーをピックアップし、LB培養液中で一晩培養した。Mini Prep Kit（Qiagen社製）にてDNAを抽出し、BglIIとBamHIで制限酵素処理をし、挿入の確認をした。さらに、シークエンス377（ABI社製）によりpTKベクターの挿入の塩基配列を確認した。
【００５０】
（ｅ）pTK2×DREおよびpTK4×DREの作成
pTKをBglIIとNdeIで制限酵素処理をし、pTK1×DREをBamHIとNdeIで制限酵素処理をし、それぞれのBglIIとNdeI断片とBamHIとNdeI断片をライゲーションさせ、pTK2×DREベクターを作成した。
次いで、pTK2×DREベクターの挿入をシークエンスで確認後、BglIIとBamHIで制限処理をし、pTK2×DREベクターの作成と同様にライゲーションさせ、pTK4×DREベクターを作成した。pTK4×DREベクターの挿入についてもシークエンスで確認した。
【００５１】
（ｆ）  pHISiおよびplacZiへの4×DREエレメントの組込み
pTKプラスミドよりDNAを抽出し、制限酵素処理をした後、DNA断片にT4ポリメラーゼ処理をして平滑断片とした。その後、pHISiおよびpLacZiをSmaIにより制限酵素処理をして、DNA制限酵素切断端を平滑にした。
【００５２】
（ｇ）  ベクターとDNA断片をライゲーションさせ、pLacZi4×DREおよびpHISi4×DREを作成した。
遺伝子導入用のプラスミドとして、目的のエレメントの組込みが成功したプラスミドについては、大腸菌を用いて遺伝子増殖した後、DNAを調整した。
【００５３】
（ｈ）AhR、ARNTのGAL4ADとの融合蛋白質の作成
一方で、pGAD424ベクターにAhR、ARNTをGAL4ADの融合蛋白が産生されるようにAhRおよびARNTのcDNAをPCRにより増幅し、制限酵素EcoRIでpGAD424に組込み、プラスミドDNAを遺伝子導入用として精製調整した。
【００５４】
（i）酵母ゲノムへの組込み
pHISi4×DREをXhoIで制限酵素処理をし、placZi4×DREをNcoIで制限酵素処理をしてプラスミドを直鎖化した。50 mlの2%デキストロースを含んだYPD（ディフコ社製：ペプトン20 g/L、酵母抽出物10 g/L（pH 5.8））中で（ａ）で選択した酵母を一晩培養した。翌日、新しい300 mlの2%デキストロースを含んだYPD中に、上記培養液を吸光度A６００が0.3になるように加えた。これを３時間培養した後、3000 rpmで5分間遠心して酵母を集めた。この酵母を水で懸濁し、さらに3000 rpmで5分間遠心して酵母を集めた。この酵母を1.5 mLのＴＥ／100 mM LiAcで懸濁し、酵母懸濁液とした。得られた酵母懸濁液0.1 mLに対し、0.1μgのpHISi4×DREベクターおよびキャリアDNAとして、サーモンスパーム（シグマ社製）0.1gを加えた。得られた懸濁液に40% PEG/100 mM LiAc（和光純薬製）0.6 mLを加え、30℃で30分間振とう培養した。得られた培養液に、70 μLのDMSOを加え、次いで、42℃で15分間ヒートショックを加えた後、これを氷上で5分間冷却した。さらに、これを14000 rpmで5分間遠心し、酵母を集め、得られた酵母ペレットを0.5 mLのTE（和光純薬製：10 mM Tris-HCl(pH7.5)、1 mM EDTA）に懸濁し、pHISi4×DRE組換え酵母懸濁液を得た。このpHISi4×DRE組換え酵母懸濁液について、再度、ベクターpHISi4×DREを組込んだのと同様の操作を繰り返し、pLacZi4×DREを組込んだ。
【００５５】
（ｊ）レポーター遺伝子組込み酵母のHIS3およびlacZの発現の確認
遺伝子導入の後、pHISi4株はSD/-His寒天培地、pLacZi株はSD/-Ura選択寒天培地にまいた。4〜5日培養の後、2〜3ｍｍのコロニーが出現するまで培養した。SD/-His寒天培地はSD-His 0 mM 3AT、SD/-His 15 mM 3AT、SD/-His 45 mM3AT、SD/-His 60 mM 3ATの選択培地にて至適3AT（1 M 3-amino-1,2,4-triazole）濃度を決定した。一方、SD/-Ura選択寒天培地は、β−ガラクトシダーゼアッセイをした。
【００５６】
（ｋ）レポーター遺伝子組込み株を用いたスクリーニング用酵母の作成
得られたpHISi4×DREとpLacZ4×DREの双方を有する組換え酵母を、選択培地（SD/-HIS/-Leu/Ura/30 mM 3AT）で4〜5日培養し、2〜3ｍｍのコロニーを集めた。酵母に、（ｈ）で調整したpGAD424AhR融合蛋白発現遺伝子とpGAD424ARNT融合蛋白発現遺伝子を導入し、形質転換して、本例の形質転換酵母を得た。
【実施例２】
【００５７】
形質転換酵母の感度の検討：
得られた形質転換酵母の株を30℃で１晩、選択培地SD/-His/Leu/Ura/30 mM3ATで培養した。培養液を選択培養液SD/-His/-Leu/Ura/30 mM 3ATで希釈し、OD600の吸光度を0.１に調整した。アリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるβ−ナフトフラボンはDMSOに溶解し、１０−１M〜1×10−7Mの希釈系列を調製した。  液体培養液にこれを培養液の1000分の１量を添加し、２日間の液体培地培養の後、増殖した酵母の濁度を測定した。吸光光度計によりA600における吸光光度を測定した。結果を図２に示す。
【００５８】
さらに、β−ガラクトシダーゼアッセイをした。すなわち、酵母培養液をマイクロチューブに分注し、遠心後、酵母に300μLのＺ緩衝液（Na2HPO4,NaH2PO4,KCl,MgSO4）を加えた。さらに、150μlのアッセイ液（クローンテック社製：Z buffer/X-gal solution）を加え、37℃で３時間インキュベートした。１Ｍ炭酸ナトリウムで反応を停止し、OD420で吸光度を測定した。得られた結果を図３に示すが、形質転換酵母のβ−ナフトフラボンの最少検出濃度は10−４Ｍであった。  図２および３から、本発明の酵母のアリルハイドロカーボン受容体のリガンドであるβ−ナフトフラボンに反応性があり、本酵母をダイオキシン検出・測定用試薬に利用できることが明らかとなった。
【実施例３】
【００５９】
形質転換酵母のメチルコランスレン濃度依存性の検討：
形質転換酵母の株を30℃で１晩、選択培地SD/-His/Leu/Ura/30 mM3ATで培養した。培養液を選択培養液SD/-His/-Leu/30 mM 3ATで希釈し、OD600の吸光度を0.1に調整した。ダイオキシン受容体のリガンドで、メチルコランレンはDMSOに溶解し、1×10−19M〜1×10−12Mの希釈系列を調製した。液体培養液にこれを培養液の1000分の１量を添加し、２日間の液体培地培養の後、増殖した酵母の濁度を測定した。吸光光度計によりA600における吸光光度を測定した。得られた結果を図４に示す。形質転換酵母のメチルコランレンの最少検出濃度は10−20Ｍであった。
【実施例４】
【００６０】
形質転換酵母の数とルシフェラーゼ活性の相関：
形質転換酵母の株を30℃で１晩、選択培地SD/-His/Leu/Uraで培養した。培養液を選択培養液SD/-His/-Leu/で希釈し、OD600の吸光度を１．０に調整した。段階希釈により各希釈濃度の酵母培養液を作成した。ルシフェラーゼ活性と酵母との相関は正の相関関係があった。ルシフェラーゼ活性はCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社）をもちいた。結果を図５示す。
【実施例５】
【００６１】
メチルコランスレン濃度とルシフェラーゼ活性の相関：
形質転換酵母の株を30℃で１晩、選択培地SD/-His/Leu/Ura30 mM3ATで培養した。培養液を選択培養液SD/-His/-Leu/30 mM3ATで希釈し、OD600の吸光度を０．１に調整した。ダイオキシン受容体のリガンドで、メチルコランレンはDMSOに溶解し、1×10−19M〜1×10−12Mの希釈系列を調製した。液体培養液にこれを培養液の1000分の１量を添加し、２日間の液体培地培養の後、増殖した酵母をマイクロチューブに集め遠心した。酵母のルシフェラーゼ活性は同様にCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社）をもちいて測定した。得られた結果を図６に示す。形質転換酵母のメチルコランレンの濃度は10−１９Ｍからルシフェラーゼ活性は増加した。メチルコランスレンを添加した培養液で増殖した酵母のルシフェラーゼ活性を測定することにより、ダイオキシン類を検出し、またその濃度を予測することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
ダイオキシン類による汚染や蓄積を詳細に調査するに際して、大量検体の迅速な測定等が可能であり、生物学的影響評価が可能なダイオキシン類検出・測定用形質転換酵母ならびにそれを用いたダイオキシン類の検出、測定およびスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】形質転換酵母によるダイオキシン類の検出・測定方法の概略図
【図２】形質転換酵母のβ−ナフトフラボン感度を示す図。Ａ６００は波長６００              における吸光光度である。
【図３】形質転換酵母のβ−ナフトフラボン濃度に対するレポーター蛋白質である                β−ガラクトシダーゼ活性の測定結果である。
【図４】形質転換酵母のメチルコランスレン濃度による酵母の増殖性の検討結果で                ある。
【図５】形質転換酵母の数とＡＴＰとの相関を示す図である。酵母数はＡ６００値              でＡＴＰ量はルシフェラーゼ活性で示した。
【図６】形質転換酵母のメチルコランスレン濃度とＡＴＰ量の相関を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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