(57)【要約】【課題】転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳、分解等によって多重制御を受けている、ガン遺伝子、サイトカインなど細胞外部からのシグナルにより生理作用が開始する有害な因子群を体内から除去するために、これらに作用する薬剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡの切断及び再結合に対する被験物質による影響を測定すること、特に、スクリーニング系に蛋白質及びトポイソメラーゼＩが共存し、該トポイソメラーゼＩにより、前記ＲＮＡの再結合が行われることを特徴とする、前記ＲＮＡの安定性を減少させる物質のスクリーニング方法。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡの切断及び再結合に対する被験物質による影響を測定することから成る、前記ＲＮＡの安定性を減少させる物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
スクリーニング系に蛋白質及びトポイソメラーゼＩが共存し、該トポイソメラーゼＩにより、前記ＲＮＡの再結合が行われることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を２〜７個有するＲＮＡであることを特徴とする、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＲＮＡ全体の塩基数が３０〜８０個であることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列が配列番号１に示されたものである、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡが合成ＲＮＡであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡがｍＲＮＡであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＲＮＡが標識物質により標識されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
標識物質が放射性物質であることを特徴とする、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
蛋白質が、ウシ血清アルブミン又はＨＩＶ−１ヌクレオカプシド蛋白（Ｐ７）であることを特徴とする、請求項２ないし９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
トポイソメラーゼＩが真核細胞由来であることを特徴とする、請求項２ないし１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
トポイソメラーゼＩがヒト細胞由来であることを特徴とする、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
トポイソメラーゼＩが組み換え蛋白質であることを特徴とする、請求項２ないし１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
所定時間内に切断されたＲＮＡを定量することにより、ＲＮＡの切断及び再結合に対する被験物質による影響を測定することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により同定される化合物。
【請求項１６】
ｍＲＮＡ安定化機構を阻害する作用を有する、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
癌遺伝子、サイトカイン、又はウイルス複製の阻害効果を有する、請求項１５又は１６記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１５、１６又は１７記載の化合物を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１９】
悪性腫瘍、自己免疫疾患、及び感染症に対する、予防又は治療効果を有する、請求項１８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌遺伝子及びサイトカイン等の有害因子のｍＲＮＡを標的とし、それを不安定化させることにより、有害因子を生体から除去したり、その機能を阻害する物質のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガン遺伝子、サイトカインなど細胞外部からのシグナルにより生理作用が開始する因子群は細胞の機能に与える影響が大きく、短時間での制御を正確にするために転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳、分解等によって多重制御を受けている。具体的にはこれらの因子はそのｍＲＮＡの３’非翻訳領域にＡＵＵＵＡの繰り返し配列、又は、Ａ、Ｕに富む配列（ＡＵ配列、又はＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＡＲＥ）を有し、基本的に不安定なｍＲＮＡとして転写される。これらの不安定なｍＲＮＡは、転写を増強するシグナルが有るときのみに安定性が上昇し、翻訳を経て蛋白質として有効に機能する。以上の知見は、例えば、以下の非特許文献１又は非特許文献２に記載されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｃｈｅｎ  ＣＹ，  Ｓｈｙｕ  ＡＢ．：ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ
ｉｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９５  Ｎｏｖ；２０（１１）：４６５−７０
【非特許文献２】
Ｃｈｅｎ  ＣＹ，  Ｘｕ  Ｎ，  Ｓｈｙｕ  ＡＢ．：Ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＨｕＲ  ｉｎ
ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．
Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２  Ｏｃｔ；２２（２０）：７２６８−７８
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしこれら因子の中には細胞にとって有害であるものも多く存在する為に、各種疾患の予防・治療上、これら有害因子を生体から取り除く必要がある。従って、当該技術分野において、この為の有効な方法・手段の開発が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
一方、発明者らは１９９０年初頭より一貫してレトロウイルス、ＪＣウイルスの研究を継続しており、ウイルス脳症の治療法の確立を目指して研究を遂行している。その過程の中で、発明者らはＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡの安定性が宿主細胞のトポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）Ｉによって調節されていること、ウイルス発芽によって安定制御機構が解除され、急速にＲＮＡのＵＡまたはＣＡ間にニック（切れ目）が入ること、ニックが入ったゲノムＲＮＡはｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉによって再結合することを見出した。そこでＡＵＵＵＡの繰り返し配列を含むＲＮＡを合成し、その切断様式を調べたところ蛋白等の存在下で、ＵＡ間で急速に切断されることが判明した。
【０００６】
従って、このような有害因子のｍＲＮＡを標的とし、それを不安定化させることにより有害因子を生体から取り除く物質を見出す方法、即ち、このようなＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＲＥ）を含む合成ＲＮＡの切断と再結合をモニターするｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉを用いたアッセイは、不安定ｍＲＮＡを有するガン遺伝子、サイトカイン、ウイルス複製の阻害薬のスクリーニングとして応用可能であり、腫瘍性疾患、免疫病、及び感染症等の治療薬の開発に重要な役割を果たすと予想される。
【０００７】
本発明は、以上の知見に基づき完成したものである。
即ち、本発明は、まず第一に、ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡの切断及び再結合に対する被験物質による影響を測定することから成る、前記ＲＮＡの安定性を減少させる物質のスクリーニング方法、に係る。
ここで、「ＲＮＡの安定性を減少させる」物質とは、その作用機序を問わず、ＲＮＡの安定性を阻害し、抑制する効果又は作用を有する物質を意味する。例えば、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの切断を促進したり、トポイソメラーゼＩによるｍＲＮＡの切断の阻害活性を抑制したり、又は、トポイソメラーゼＩによる切断されたｍＲＮＡの再結合活性を阻害したりすることのできる物質を意味する。
【０００８】
本発明は第二の態様として、上記のスクリーニング方法により同定される化合物、特に、ｍＲＮＡ安定化機構を阻害する作用を有する化合物であり、癌遺伝子、サイトカイン、又はウイルス複製の阻害効果を有する化合物自体に係る。
更に、本発明は、このような化合物を有効成分として含む医薬組成物にも係る。このような医薬組成物は、各種疾患、例えば、悪性腫瘍（癌）、自己免疫疾患、感染症等の予防、治療等に有効に使用することが出来る。
【０００９】
【発明の実施の形態】
より具体的には、本発明方法においては、スクリーニング系に蛋白質及びトポイソメラーゼＩが共存し、該トポイソメラーゼＩにより、前記ＲＮＡの再結合が行われることを特徴とする。
【００１０】
本発明方法で使用する、ＡＵＵＵＡ配列からなる繰り返し配列を有するＲＮＡとしては、例えば、ＡＵＵＵＡ配列を好ましくは、２〜７個、より好ましくは、５〜７個有するＲＮＡであり、全体の長さとしては、好ましくは、３０〜８０塩基、より好ましくは、６０〜８０塩基のものである。かかるＲＮＡの代表例として、配列番号１に示されたＲＮＡ配列を挙げることができる。
上記ＲＮＡは当業者に公知の任意の適当な方法で調製することが出来、例えば、適当な培養細胞などから分離・精製されたｍＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡからポリメラーゼ反応を用いて調製したＲＮＡ、又は合成ＲＮＡである。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法においては、所定時間内に切断されたＲＮＡを定量することにより、ＲＮＡの切断及び再結合に対する被験物質による影響を測定することができる。従って、上記ＲＮＡは、放射性物質及び酵素等の当業者に公知の適当な標識物質により標識されていることが好ましい。かかる標識化及び標識されたＲＮＡの測定は、標識物質の種類に応じて、当業者が容易に実施することが出来る。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法においては、トポイソメラーゼＩ以外に少なくとも一種の別の蛋白質共存させることが好ましい。かかる蛋白質は、トポイソメラーゼＩの機能を抑制又は阻害したり、被験物質の活性に阻害等の影響を与えるものでない限り、特に制限はない。このような蛋白質の具体例として、ウシ血清アルブミン、及びＨＩＶ−１ヌクレオカプシド蛋白（Ｐ７）を挙げることができる。
【００１３】
本発明方法で使用するトポイソメラーゼＩに特に制限はないが、好ましくは、真核細胞由来、特に、ヒトに有効な物質をスクリーニングする為には、２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞等のヒト細胞由来であることが好ましい。
トポイソメラーゼＩは、これら細胞から当業者に公知の任意の方法で精製された天然のもの、又は、トポイソメラーゼＩをコードする遺伝子によって形質転換された適当な宿主細胞で発現される組み換え蛋白質である。
これらの精製方法、及び形質転換細胞の調製並びに組み換え蛋白質の発現も当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、当業者に公知の各種溶液を用いる測定系で実施することが可能である。該溶液は緩衝剤によって適当なｐＨの範囲に維持される。スクリーニングを実施する溶液中の、トポイソメラーゼＩ、別の蛋白質、トポイソメラーゼＩ、及び、その他の適当な助剤の各濃度は、溶液の種類、各物質の種類等の測定系における各種因子に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１５】
実施例１
ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＡＲＥ）  ＲＮＡの切断と再結合のモニター方法
ＡＲＥ  ＲＮＡ  合成
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｍＲＮＡは３’非アミノ酸コード領域にＡＲＥを有する。ＧＭ−ＣＳＦ  ＡＲＥをＲＮＡとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するため、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ認識領域を含む下記のｏｌｉｇｏ  ＤＮＡを合成した。合成したＤＮＡからｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）法によって二本鎖ＤＮＡを作成した。尚、ＰＣＲの条件は、９５℃で３分の後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒を３０サイクルであった。
【００１６】
更に、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＲＮＡ（配列番号１）を合成した。このとき５’末端にＧＭ−ＣＳＦ  ＡＲＥにないＧＧＧＡシークエンスを付加した。ＤＮａｓｅ処理後、５’末端をアイソトープラベルする前処理として、ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにより脱燐酸化した。その後フェノール処理、エタノール沈殿により酵素を不活化し、５’末端をＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅと３２ＰガンマＡＴＰによりラベルした。ラベルしたＲＮＡを８Ｍ  ｕｒｅａを含むアクリルアミドゲルで泳導展開し、切断されてない分子を抽出後、フェノール処理、エタノール沈殿を行った。
【００１７】
合成ＲＮＡ
配列番号１：
５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＵＡＡ  ＵＡＵ  ＵＵＡ  ＵＡＵ  ＡＵＵ  ＵＡＵ  ＡＵＵ  ＵＵＵ  ＡＡＡ  ＡＵＡ  ＵＵＵ  ＡＵＵ  ＵＡＵ  ＵＵＡ  ＵＵＵ  ＡＵＵ  ＵＡＡ  ＧＵＵ  ＣＡＵ  Ａ−３’
【００１８】
Ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ
配列番号２：
ＧＭＣＳＦＴ７−Ｆ：５’−ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  Ａ−３’（ｎｔ．  ６４１−６７８，  ６１  ＭＥＲ）
配列番号３：
ＧＭＣＳＦ−Ｒ：５’−ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ−３’  （ｎｔ．  ６４１−６８０，  ６０  ＭＥＲ）
【００１９】
ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ及びミュータント蛋白の精製
ヒトｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  （ｗｔ）は２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞から細胞核を調整しＦＰＬＣ（アマシャムファルマシア）を使用し精製した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９７：５９３−５９９，  ２００２）。また組換えヒトｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ及びＲＮＡライゲース活性を失わせた組換えｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ  （Ｋ５３２Ａ）はそれぞれ組換えバキュロウイルスを作成し、昆虫細胞において発現させ、精製した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９７：５９３−５９９，  ２００２）。実際の阻害剤のスクリーニングはヒトｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ（ｗｔ）だけで実施することができる。
【００２０】
ＡＲＥ  ＲＮＡとｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉの反応
アイソトープラベルしたＡＲＥ  ＲＮＡ  ５０  ｎｇ，  １００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０），  ＥＤＴＡ  ０．５  ｍＭを３分間９５℃でインキュベートした。氷上に３分間放置し、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ  （ＲＮａｓｅ，  ＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ），  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩまたはＫ５３２Ａを１μｇ／ｍｌ加え全量を１００  μｌとして０，  １０，  ２５，  ５０分間３７℃でインキュベートした。それぞれのポイントで２０μｌ採取し、０．５％  ＳＤＳを含むｆｏｒｍａｍｉｄｅ液を１０μｌ加え９５℃で２分間インキュベートし氷上に放置した。８Ｍ  ｕｒｅａを含むアクリルアミドゲルによって泳動展開し、アイソトープ用画像定量機器（ＦＬＡ２０００  Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ）により基質の変化を解析した。
【００２１】
切断分子の基質総量に対する割合を算出し、各時間の変化を図１に示した。Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  （ｗｔ）  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉ存在下ではＲＮＡライゲース活性を持たない変異体ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩであるＫ５３２Ａ存在下に比べ、基質ＲＮＡが安定化していることが分かる。ｗｔ存在下にＲＮＡの切断を顕著に促進する化合物は、各種シグナルに敏感でｍＲＮＡの安定性を上昇させて機能するような因子群の機能を阻害する可能性が強いと予測される。
【００２２】
【発明の効果】
癌遺伝子及びサイトカインなど不安定性ｍＲＮＡがＡＲＥに依存してＲＮＡの崩壊を招いていることは判明していたが、本発明者はこのＡＲＥ  ＲＮＡ自体が蛋白等の存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏで速やかにＵＡ間に切断を起こしていくことを見出した。さらにＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ同様、ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩのＲＮＡライゲース活性が顕著に切断を阻害しＲＮＡを安定化することも見出した。またＡＲＥを比較的安定なｍＲＮＡの３’に結合すると細胞内でｍＲＮＡの安定性が減少すること、ＡＲＥがあるときのみＲＮＡライゲースのないｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉの細胞での発現がＡＲＥを含むｍＲＮＡの安定化をさらに減少させることを見出しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングされたコンパウンドの作用を培養細胞において確認することもできると考えられる。
以上の現象を利用して化合物のスクリーニングを行うことにより、不安定性ｍＲＮＡ安定化機構を阻害し結果的に癌遺伝子、サイトカインの作用を抑制することのできる化合物（薬剤）が見出されると考える。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法において見い出された化合物は培養細胞においてＡＲＥを含むｍＲＮＡの安定性と細胞毒性を調べることにより実用性を確認することができる。
こうして得られた化合物は局所的に生体に悪影響を及ぼすシグナル因子群を広範に抑制することにより、悪性腫瘍、自己免疫疾患、感染症等を標的とした薬剤開発につながると考えられる。
【００２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、切断されたＲＮＡ分子の基質総量に対する割合を算出し、各時間の変化を示したグラフである。
【図１】
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