(57)【要約】【課題】小核計数試験系の効率化および試験精度を向上する。【解決手段】細胞の画像データに対して、閾値Ｔｏに基づき２値化処理を行い外郭２値データを生成し、閾値ＴＩに基づき２値化処理を行い内核２値データを生成する２値化処理部３１２と、外郭２値データ及び内核２値データに対して、ラベリングを行い外郭ラベリングデータと内核ラベリングデータを生成するラベリング部３１４と、外郭ラベリングデータ及び内核ラベリングデータとに基づき外郭真円度及び内核真円度を算出する真円度計算部３１５と、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、対応付けデータと、外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、正常細胞数と小核保有細胞数を計数する判定・計数部３１６とを備える。【選択図】      図４
2005283490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータに、
染色された細胞の画像データに対して、第１の閾値に基づき第１の２値化処理を行い前記細胞の外郭を外郭以外の部分と識別する外郭２値データを生成し、
前記細胞の画像データに対して、第２の閾値に基づき第２の２値化処理を行い前記細胞の内核を内核以外の部分と識別する内核２値データを生成し、
前記外郭２値データのうち、各外郭を他の外郭と識別する第１のラベリング処理を行い外郭ラベリングデータを生成し、
前記内核２値データのうち、各内核を他の内核と識別する第２のラベリング処理を行い内核ラベリングデータを生成し、
前記外郭ラベリングデータに基づき各外郭について外郭真円度を算出し、
前記内核ラベリングデータに基づき各内核について内核真円度を算出し、
前記外郭ラベリングデータと前記内核ラベリングデータとの相対位置に基づき、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、
前記対応付けデータと、前記外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、
前記判定結果に基づき正常間期細胞数と小核保有細胞数を計数する
処理を実行させるための小核自動計数プログラム。
【請求項２】
前記判定は、前記外郭に対応する内核の数が１つかそれ以上か否かを判定する処理を含むことを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項３】
前記判定は、前記外郭に対応する内核の数が１つでかつ前記内核の内核真円度が正常値の場合、正常間期細胞であると判定することを特徴とする請求項２に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項４】
前記判定は、前記外郭が共通する複数の内核のうち、いずれかの内核の面積が他の内核の面積に対して第１の値を超えるか否かを判定し、第１の値以下である場合には正常間期細胞でないと判定することを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項５】
前記判定は、前記外郭が共通する複数の内核のうち、いずれかの内核の面積が他の内核の面積に対して第１の値を超えるか否かを判定し、第１の値以上である場合には観察対象外でないと判定することを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項６】
前記判定は、前記内核の内核真円度が異常値の場合、観察対象外と判定することを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項７】
前記判定は、前記外郭真円度が異常値であって、かつ該外郭に内核が２つ以上対応付けられている場合には、複数の細胞が含まれていると判定することを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項８】
前記判定で、複数の細胞が含まれていると判定された場合、該複数の細胞中の各内核を単独の細胞として前記判定を繰り返すことを特徴とする請求項７に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項９】
前記判定で、正常間期細胞でなく、かつ小核保有細胞でない観察対象外と判定された場合、観察対象外とされた細胞部分を他の部分と区別して表示部に表示させ、入力部により選択された正常間期細胞及び小核保有細胞の別に基づき細胞種類を決定することを特徴とする請求項１に記載の小核自動計数プログラム。
【請求項１０】
コンピュータに、
染色された細胞の画像データに対して、第１の閾値に基づき第１の２値化処理を行い前記細胞の外郭を外郭以外の部分と識別する外郭２値データを生成し、
前記細胞の画像データに対して、第２の閾値に基づき第２の２値化処理を行い前記細胞の内核を内核以外の部分と識別する内核２値データを生成し、
前記外郭２値データのうち、各外郭を他の外郭と識別する第１のラベリング処理を行い外郭ラベリングデータを生成し、
前記内核２値データのうち、各内核を他の内核と識別する第２のラベリング処理を行い内核ラベリングデータを生成し、
前記外郭ラベリングデータに基づき各外郭について外郭真円度を算出し、
前記内核ラベリングデータに基づき各内核について内核真円度を算出し、
前記外郭ラベリングデータと前記内核ラベリングデータとの相対位置に基づき、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、
前記対応付けデータと、前記外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、
前記判定結果に基づき正常間期細胞数と小核保有細胞数を計数する
処理を実行させるための小核自動計数プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項１１】
染色された細胞の画像データに対して、第１の閾値に基づき第１の２値化処理を行い前記細胞の外郭を外郭以外の部分と識別する外郭２値データを生成し、前記細胞の画像データに対して、第２の閾値に基づき第２の２値化処理を行い前記細胞の内核を内核以外の部分と識別する内核２値データを生成する２値化処理部と、
前記外郭２値データのうち、各外郭を他の外郭と識別する第１のラベリング処理を行い外郭ラベリングデータを生成し、前記内核２値データのうち、各内核を他の内核と識別する第２のラベリング処理を行い内核ラベリングデータを生成するラベリング部と、
前記外郭ラベリングデータに基づき各外郭について外郭真円度を算出し、前記内核ラベリングデータに基づき各内核について内核真円度を算出する真円度計算部と、
前記外郭ラベリングデータと前記内核ラベリングデータとの相対位置に基づき、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、前記対応付けデータと、前記外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、前記判定結果に基づき正常間期細胞数と小核保有細胞数を計数する判定計数部と
を具備してなることを特徴とする小核自動計数装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の小核の数を自動で計数する小核自動計数プログラム、プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体及び小核自動計数装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝毒性試験は、短期かつ簡便な前臨床安全性試験の一つとして、医薬品・農薬・化粧品・動物薬等の多くの化学物質の安全性評価をする上で重要な位置を占めている。
【０００３】
とりわけ、インビトロ（in vitro）での小核試験は、染色体異常試験の代替試験、あるいは簡便試験として位置づけられ、近年ＩＷＧＴ（International Workshop on Genotoxicity Test Procedures）においてその重要性が唱えられ、英国の遺伝毒性諮問委員会であるUK COM(Committee on Mutagenicity of Chemicals in Food,Comsumer Products and the Environment)において推奨試験種に選択され、ＯＥＣＤ試験種として収載準備が進められている等、注目が高まっている。
【０００４】
この小核試験は、物質の変異原性試験として位置づけられる。この小核試験は、細胞中の染色体が物質によって切断され、その切断断片が細胞分裂時に、主核とは別の小さな核として生じたものを計数する。この小核を有する細胞が多いことは、その物質は変異原性が強いという指標となるものである。
【０００５】
従来、この小核試験の測定解析機器は存在しないため、測定者が顕微鏡を覗いて、細胞中に小核が存在するか否か目視により直接測定する方法しかなかったため、作業の煩雑さ、長時間の作業を要し、作業者に多大な負担を強いていた。また、測定結果には、観察者の間における個人差が認められてしまう。
【０００６】
また、既存のカメラ方式測定機器でも測定は可能であるが、一つの細胞中に複数の小核があると、異常は一つと判断するにもかかわらず、複数の異常としてカウントするため、本来の測定基準とは異なってしまう。
【０００７】
例えば、現在市販されているインビトロ小核自動計数システムとして、カールツァイス社製のＩＳＩＳが存在する。このＩＳＩＳは、サイトカラシンＢを加えた系で、かつギムザ染色した細胞のみを観察対象としている。そのため、近年の主流と考えられているサイトカラシンＢを使用せず、アクリジンオレンジ染色により観察する試験方法を用いての計数への対応はできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、従来のインビトロ小核自動計数手法は、マニュアルによる測定では、作業の煩雑さ、長時間の作業を要し、作業者に多大な負担を強いており、さらに測定の個人差が問題となっていた。また、既存のカメラ方式測定機器でも測定は可能であるが、測定精度がかなり悪く、利用はできるものではなかった。
【０００９】
本発明は上記課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、小核計数試験系の効率化および試験精度を向上する小核自動計数プログラム、プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体及び小核自動計数装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のある観点によれば、コンピュータに、染色された細胞の画像データに対して、第１の閾値に基づき第１の２値化処理を行い前記細胞の外郭を外郭以外の部分と識別する外郭２値データを生成し、前記細胞の画像データに対して、第２の閾値に基づき第２の２値化処理を行い前記細胞の内核を内核以外の部分と識別する内核２値データを生成し、前記外郭２値データのうち、各外郭を他の外郭と識別する第１のラベリング処理を行い外郭ラベリングデータを生成し、前記内核２値データのうち、各内核を他の内核と識別する第２のラベリング処理を行い内核ラベリングデータを生成し、前記外郭ラベリングデータに基づき各外郭について外郭真円度を算出し、前記内核ラベリングデータに基づき各内核について内核真円度を算出し、前記外郭ラベリングデータと前記内核ラベリングデータとの相対位置に基づき、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、前記対応付けデータと、前記外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、前記判定結果に基づき正常間期細胞数と小核保有細胞数を計数する処理を実行させるための小核自動計数プログラムが提供される。
【００１１】
また、本発明の別の観点によれば、上記小核自動計数プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。
【００１２】
また、さらに本発明の別の観点によれば、染色された細胞の画像データに対して、第１の閾値に基づき第１の２値化処理を行い前記細胞の外郭を外郭以外の部分と識別する外郭２値データを生成し、前記細胞の画像データに対して、第２の閾値に基づき第２の２値化処理を行い内核を内核以外の部分と識別する内核２値データを生成する２値化処理部と、前記外郭２値データのうち、各外郭を他の外郭と識別する第１のラベリング処理を行い外郭ラベリングデータを生成し、前記内核２値データのうち、各内核を他の内核と識別する第２のラベリング処理を行い内核ラベリングデータを生成するラベリング部と、前記外郭ラベリングデータに基づき各外郭について外郭真円度を算出し、前記内核ラベリングデータに基づき各内核について内核真円度を算出する真円度計算部と、前記外郭ラベリングデータと前記内核ラベリングデータとの相対位置に基づき、外郭とその外郭に含まれる内核とを対応付けた対応付けデータを生成し、前記対応付けデータと、前記外郭真円度と、内核真円度とに基づき、各外郭に対応する細胞が正常間期細胞に該当するか否かと、小核保有細胞に該当するか否かを判定し、前記判定結果に基づき正常間期細胞数と小核保有細胞数を計数する判定計数部とを具備してなることを特徴とする小核自動計数装置が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、小核計数試験系を効率化し試験精度を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。  
図１は本発明の一実施形態に係る小核自動計数システム１００の全体構成を示す図である。この小核自動計数システム１００は、顕微鏡装置４０と、この顕微鏡装置４０に接続ケーブル５０を用いて接続された小核自動計数装置３０からなる。
【００１５】
図２は、自動計数の対象とする小核の細胞分裂の概要を説明するための図である。図２に示すように、（ｓ１０１）の細胞質２０１中に核２０２を保有する細胞について、（ｓ１０２ａ）に進み染色体２０３が生成される。さらに（ｓ１０３ａ）のサイクルで、細胞分裂が生じて２つの核２０４が生成され、（ｓ１０４ａ）で２つの通常細胞２０５，２０６になる。これは、通常の場合の細胞分裂である。これに対して、突然変異が生じる場合、（ｓ１０１）のサイクルから（ｓ１０２ｂ）のサイクルに進み染色体２０３が生成される。この際に、被験物質の影響により、染色体の切断断片２０７が生じている。さらに、（ｓ１０３ｂ）のサイクルで細胞分裂が生じると、（ｓ１０４ｂ）で２つの細胞２０８，２０９になる。この場合、２つの細胞中の細胞２０８に小核２１０が観察される。本実施形態は、この小核の細胞が複数ある場合でも、小核を保有する細部数を１つと正確にカウントすることのできる小核自動計数装置が提供される。
【００１６】
図３は本実施形態に係る小核自動計数処理のフローチャートを示す図である。まず、スライドガラスを作成する（ｓ１）。そして、作成されたスライドガラスの標本を染色する（ｓ２）。より具体的には、外郭に相当する細胞質と、内核に相当する小核や染色体とを、これら外郭及び内核以外の部分とは別の色に染色し、かつ細胞質と、小核及び染色体とを別の色に染色する手法が用いられる。より具体的には、例えばアクリジンオレンジ染色が用いられるが、これに限定されるものではない。次いで、染色した標本を含むスライドガラスを顕微鏡にセットする（ｓ３）。一方、顕微鏡装置４０を制御するための初期設定情報を入力部を用いて入力し、顕微鏡装置４０に出力する（ｓ４）。顕微鏡装置４０は、取得した初期設定情報で設定された条件に基づき画像データを取り込み小核自動計数装置３０に出力する（ｓ５）。ここで、画像データの取り込み及び出力までは、顕微鏡装置４０を用いて実現可能である。次に、小核自動計数装置３０を用いて計数処理を実行する（ｓ６）。得られた計数処理結果は小核自動計数装置３０の表示部に表示する（ｓ７）。
【００１７】
図４は上記（ｓ６）の計数処理を実現する小核自動計数装置３０の全体構成を示す図である。図４に示すように、小核自動計数装置３０は、処理部３１と、表示部３２と、入力部３３と、記憶部３４とからなる。
【００１８】
処理部３１は、例えばＣＰＵや画像処理プロセッサなどで実現される。表示部３２は、処理部３１での演算結果等を表示するディスプレイなどで実現される。入力部３３は、マウスやキーボードなどのユーザインタフェースなどで実現されるが、他の端末等からのデータを受信して処理部３１に出力することで、入力機能を実現してもよい。記憶部３４は、光、磁気等の記録方式でデータを記憶するデバイスにより実現されるが、ＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ−ＲＯＭなどの記録媒体でもよい。この場合、記憶部３４には、記録媒体からのデータ読み出し及び記録媒体へのデータ書込を行う記録媒体読取／書込装置を備える。
【００１９】
処理部３１は、画像データ取得部３１０と、フィルタリング部３１１と、２値化処理部３１２と、膨張収縮処理部３１３と、ラベリング部３１４と、真円度計算部３１５と、判定・計数部３１６と、顕微鏡制御部３１７とを備える。記憶部３４から読み出されたプログラムが実行されることにより、処理部３１がこれら各部３１０〜３１７として機能する。記憶部３４は、処理部３１を各部３１０〜３１７として機能させるプログラムや、処理部３１で用いられる各種データを格納し、処理部３１からのアクセスに応じて適宜読み出し可能である。
【００２０】
顕微鏡制御部３１７は、顕微鏡装置４０に測定条件などを含む初期設定情報を与え、顕微鏡装置４０を制御する。図５は顕微鏡制御部３１７により表示部３２に表示された初期設定情報入力画面の一例を示す図である。図５に示すように、例えば観察及び計数の日付、試験番号、スライド番号、担当者、観察倍率などの測定条件を入力部３３を用いて入力する。入力部３３により「ＯＫ」５２が選択されると、顕微鏡制御部３１７は表示部３２に観察画面を表示し、また初期設定情報のうちの観察倍率等の顕微鏡装置４０を制御するための制御データを顕微鏡装置４０に送信する。
【００２１】
図６は観察画面の一例を示す図である。初期設定情報６１と、画像番号６８と、測定結果６２と、顕微鏡画面６３が表示される。
【００２２】
測定結果６２は、測定開始時間、正常間期細胞数、小核保有細胞数、合計細胞数、総合計細胞数からなる。入力部３３を用いて「測定開始」６４を選択すると測定開始指令が顕微鏡制御部３１７から顕微鏡装置４０に送信され、測定が開始される。「確認」６５を選択すると、判定・計数部３１６は計測結果を記憶部３４に保存する。また、この保存により、測定結果６２の総合計細胞数に計測結果が蓄積されるとともに、計数結果がクリアされる。「再測定」６６を選択すると、既に取得した顕微鏡画面６３についての計数を再度行う。
【００２３】
なお、この図６の例では、計数終了後の観察画面例を示しており、他のステータスでは観察画面は若干異なる。測定開始前には、未だ顕微鏡画像を取得していないので、顕微鏡画面６３が表示されない。あるいは、撮像中の動的な顕微鏡画像を顕微鏡画面６３に表示しておいてもよい。また、未だ測定を開始しておらず、計数もしていないので、測定結果６２も得られていないため表示されない。測定開始後計数前は、測定開始時間が表示され、また測定の対象とする顕微鏡画面６３が表示される。測定結果６２は得られていないため表示されない。
【００２４】
画像データ取得部３１０は、顕微鏡装置４０で撮像した顕微鏡画像を受信する。
【００２５】
フィルタリング部３１１は、画像データ取得部３１０で取得された顕微鏡の画像データに対してフィルタリングを用いて各画素データを変換しフィルタ画像データを得る。フィルタの一例として、例えばソーベルフィルタが用いられる。このソーベルフィルタによるフィルタリングにより、画像データのうちの外郭部分の画素は赤色の画素データに、内包核は緑色の画素データに変換される。より具体的には、フィルタリング部３１１は、画像を一定区間ごとに分け、その区画で、一定の大きさ毎に各色相の出現率を取得し、少ない出現率の色相を近似色でより高い出現率の色相に置換する。その結果、全体的に滑らかな画像になり、雑音が除去される。この色の違いを用いて、外郭と内核をそれぞれ抽出する。
【００２６】
２値化処理部３１２は、フィルタリング部３１１で生成されたフィルタ画像データに対して２値化処理を行い２値化データを得る。この２値化処理は、外郭の２値化処理と内核の２値化処理の２種類について行われる。いずれの２値化処理についても、例えば明度や色相により指定された指定色とフィルタ画像データの色情報とを比較することにより行われる。すなわち、色相の近似値と明度の近似値を求めておく。そして、明度に関しては、色相の差異に比較して緩やかな判定基準を設けておき、ある程度明るさが違った場合でも近似色の場合は外郭パターンまたは内核パターンであると判定する。これにより、明るさの違いをある程度吸収した処理が実現される。
【００２７】
外郭の２値化処理は、赤の指定色を用いた近似色判定により行う。この赤の近似色判定では、赤色とそれ以外の色との境界を示す最低認識色を表す外郭閾値ＴＯを用いる。具体的には、フィルタ画像データ中の各画素値Ｐ（ｘ、ｙ）と外郭閾値ＴＯとを比較し、Ｐ（ｘ、ｙ）≧ＴＯの場合は、外郭パターンに該当することを示すデータとして例えば“白”を、Ｐ（ｘ、ｙ）＜ＴＯの場合は、例えば外郭パターンに該当するデータとして例えば“黒”を対応付ける。もちろん、２値は白と黒で表現されなくてもよい。このように、外郭パターンの可否を示すデータが２値化により外郭２値データとして生成される。これは、パターンがはっきりした部分は明るく、ぼんやりとした部分は暗くなる性質を利用している。
【００２８】
内核の２値化処理は、緑の指定色を用いた近似色判定により行う。この緑の近似色半値では、緑色とそれ以外の色との境界を示す最低認識色を表す内核閾値ＴＩを用いる。具体的には、フィルタ画像データ中の各画素値Ｐ（ｘ、ｙ）と内核閾値ＴＩとを比較し、Ｐ（ｘ、ｙ）≧ＴＩの場合は、内核パターンに該当することを示すデータとして例えばそのままの色、すなわち“緑”を、Ｐ（ｘ、ｙ）＜ＴＩの場合は、内核パターンに該当しないことを示すデータとして例えば“黒”を対応付ける。もちろん、２値は緑と黒で表現されなくてもよい。このように、内核パターンの可否を示すデータが２値化により内核２値データとして生成される。これは、外郭の２値化処理と同様に、パターンがはっきりした部分は明るく、ぼんやりとした部分は暗くなる性質を利用している。
【００２９】
ここでは、外郭パターン、内核パターンの判定ともに、閾値を１つずつ設定する場合を示したが、これに限定されない。上限値と下限値をそれぞれ定めておく閾値を２つ利用する手法をとれば、更に精緻な２値化が実現できる。すなわち、外郭及び内核ともに、ある色範囲を定めておき、その色範囲に属するか否かの判定により２値化してもよい。さらに複雑な判定基準を設けてもよいことはもちろんである。
【００３０】
なお、望ましくは、この内核の２値化処理は、２値化処理部３１２で得られた外郭２値データを参照し、フィルタ画像データ中の外郭パターンの位置のみについて行う。すなわち、２値化処理部３１２で得られた外郭２値データのうち、外郭パターンの領域内と認識された範囲（画素）についてのみ内核の２値化処理を行う。これにより、処理負担を軽減することができる。なお、後述する膨張収縮処理部３１３で得られる膨張収縮処理済みの外郭２値データを参照してもよい。
【００３１】
膨張収縮処理部３１３は、得られた外郭２値データ及び内核２値データのそれぞれについて膨張・収縮処理を行い、２値データ中に存在する細かいゴミなど（雑音データ）を消去する。例えば、内核として取得した部分を膨張処理し、取り損ね等により生じた穴を消す処理を行う。その後、収縮処理し、処理前とほぼ同様のデータに戻す。これにより、雑音が除去でき、外郭あるいは内核でないものを外郭あるいは内核と認識してカウントする等の誤りを低減することができる。なお、この膨張・収縮処理のみならず、他の手法による雑音除去を組み合わせてもよい。例えば、２値化された外郭２値データあるいは内核２値データのうち、外郭パターン中あるいは内核パターン中の平均色を算出し、この平均色の値が予め定めた閾値よりも低い、すなわち色が所定よりも薄い場合には、欠陥として登録することもできる。これにより、適切な２値化やラベリングができないデータを排除することができ、測定精度が向上する。
【００３２】
ラベリング部３１４は、雑音除去後の外郭２値データ及び内核２値データを８近傍判定によりラベリングを行い外郭ラベリングデータ及び内核ラベリングデータを生成する。
【００３３】
外郭ラベリングデータの生成では、処理対象とする画素が外郭パターンに該当する場合に、まずその画素に第１の外郭を示す第１外郭ラベルを付す。次に、この画素の近傍（ここでは８近傍）に外郭パターンと判定された画素があれば、その画素に第１の外郭を示す第１外郭ラベルを同様に付す。すなわち、注目する画素の周囲８画素、あるいは範囲に内核がある場合、同じラベルとして扱う。一方、この画素の近傍に外郭パターンと判定された画素がなければ、その画素には第１外郭ラベルを付さずに、新たに別の第２の外郭ラベルを付す。このようにして、外郭とその近傍に含まれるパターンを含めて１つのラベルを付すことにより、外郭とその近傍に含まれるパターンをグループ化することができる。
【００３４】
内核ラベリングデータの生成も、外郭ラベリングデータの生成と同様の手法による。
【００３５】
真円度計算部３１５は、ラベリング部３１４で得られた外郭ラベリングデータに基づき外郭の真円度（以下、外郭真円度と呼ぶ）を計算する。また、真円度計算部３１５は、ラベリング部３１４で得られた内核ラベリングデータに基づき内核の真円度（以下、内核真円度と呼ぶ）を計算する。
【００３６】
判定・計数部３１６は、ラベリング部３１４で得られた外郭ラベリングデータ及び内核ラベリングデータと、真円度計算部３１５で得られた外郭真円度及び内核真円度とに基づき、外郭ラベルごとに小核の判定処理を行う。そして、得られた判定処理結果を外郭ラベルごとに計数し、計数結果を得る。得られた計数結果は表示部３２に表示される。
【００３７】
この小核の判定処理は、具体的には以下のような判定基準１〜５で行われる。
【００３８】
判定基準１．内核が１つの場合は正常間期細胞。
【００３９】
判定基準２．内核が２つ以上で、そのうちの１つの内核の面積Ｓ１が他の内核の面積Ｓ２Ｓ３、…の１／４以下の場合、小核保有細胞。
【００４０】
判定基準３．内核が２つ以上で、そのうちの１つの内核の面積Ｓ１が他の内核の面積Ｓ２Ｓ３、…の１／４を超える場合であって、この関係が他の内核についても成立する場合、観察対象外の細胞。
【００４１】
判定基準４．内核のコロニーの１つ以上の内核真円度が異常値の場合、観察対象外の細胞。
【００４２】
判定基準５．外郭のコロニーの外郭真円度が異常値で、かつ内核コロニーが２つ以上の場合、内核のコロニーの１つ１つは各々が単独の細胞。さらにいえば、判定基準１で、正常間期細胞と判定する基準として、内核真円度が正常値であることが必要である。
【００４３】
なお、判定基準２．及び３．で、面積の比は１／４を基準の一例として示したが、１／４以外でも種々設定可能である。
【００４４】
上述した判定基準１〜５にしたがった判定処理を以下具体的に説明する。
【００４５】
まず、外郭ラベリングデータ及び内核ラベリングデータに基づき、各外郭ラベルについて、その外郭ラベルに含まれる内核ラベルを抽出する。この内核ラベルの抽出は、外郭ラベルと各内核ラベルとの相対位置及び大きさを比較判定することにより得られる。例えば、外郭ラベルの位置のいずれかに内核ラベルが一致している場合、その外郭ラベルに含まれる内核ラベルであるとして、両者を対応付けることができる。このような対応付けにより得られた外郭−内核対応付けデータの一例を図７に示す。図７に示すように、外郭ラベルを識別する情報に、内核ラベルを識別する情報が対応付けられている。同図では、外郭ラベル１〜６に、内核ラベル１〜１５が対応付けられて示されている。
【００４６】
次に、得られた外郭−内核対応付けデータに基づき１つの外郭ラベルの内核数を計数する。さらに、得られた各内核について、内核面積Ｓを算出する。
【００４７】
そして、内核が１つで、内核真円値が異常値の場合、観察対象外であると判定する。内核が１つで、内核真円値が正常値の場合、正常間期細胞であると判定する。  
内核が２つ以上の場合で、いずれかの内核真円値が異常値の場合、観察対象外であると判定する。  
内核が２つ以上の場合で、そのうちの１つの内核の面積Ｓ１が他の内核の面積Ｓ２Ｓ３、…の１／４以下の場合、正常間期細胞ではなく、また、観察対象外ではなく、小核保有細胞であると判定する。  
内核が２つ以上の場合で、そのうちの１つの内核の面積Ｓ１が他の内核の面積Ｓ２Ｓ３、…の１／４を超える場合であって、この関係が他の内核についても成立する場合、観察対象外の細胞であると判定する。  
内核が２つ以上の場合で、さらに、外郭ラベルの外郭真円度が異常値の場合、その外郭ラベルが内包するコロニー１つ１つを単独の細胞として認識する。すなわちこの場合、さらに、各コロニーに外郭ラベルを割り当てる。そして、この新たに割り当てられた外郭ラベルごとに、これに対応する内核ラベルを上記に示したのと同様の処理で算出する。そして、新たに外郭−内核対応付けデータを定義し直す。図８は、新たに定義し直した外郭−内核対応付けデータを示す。図７で１つの外郭ラベル６と、この外郭ラベル６に対応付けられていた内核ラベル９〜１５は、図８では、５つの外郭ラベル６−１〜６−５にそれぞれ１つあるいは２つずつ対応付けられている。このように与えられた各外郭ラベル１〜５及び６−１〜６−５の各々が、１つの細胞とみなされる。そして、新たに定義された外郭−内核対応付けデータのうち、外郭ラベル６−１〜６−５に対して、上記判定基準１〜４を適用する。
【００４８】
以上の判定基準により得られた判定結果を図９に示す。図９に示すように、単に小核を内包する細胞か、観察対象外細胞か、正常間期細胞かを判定できるのみならず、従来では肉眼でも観察対象外とされていたような、複数の内核が重なりを持って確認されるようなまとまった細胞についても正確に判定できる。
【００４９】
次に、以上のように得られた判定結果の各種類の細胞数を計数する。これにより、正常間期細胞、観察対象外細胞、小核保有細胞の個数が得られる。得られた細胞数は、表示部３２に表示される。図１０は計数結果の表示例を示す図である。図１０の例では、測定指示ごとの計測結果が開始時間、画像番号、正常間期細胞数、小核保有細胞数、合計細胞数、総合計細胞数、観察対象外細胞数、カラーバランスデータについて得られている。合計細胞数は、正常間期細胞数、小核保有細胞数を加算した値が示される。
【００５０】
なお、上記実施形態では、正常間期細胞、観察対象外細胞、小核保有細胞の個数を表示する例として示したが、これに限定されない。観察対象外の細胞については、肉眼による観察により正常間期細胞と小核保有細胞との別を観察者が入力部３３を用いて指定してもよい。この場合、判定・計数部３１６はさらに、観察対象外細胞と判定された外郭及び内核について、他の部分と区別可能な色に変換して表示部３２に表示する観察者は、この表示部３２に表示された画面を参照しながら、正常間期細胞と小核保有細胞との別を判断し、入力部３３を用いて指定する。外郭ラベルの細胞種類は、判定・計数部３１６により、指定された細胞種類で更新される。図１１は細胞種類が更新された外郭−内核対応付けデータである。図１１に示すように、細胞種類に「観察対象外」が対応付けられていた部分が、入力部３３で入力された正常間期細胞あるいは小核保有細胞に更新されている。
【００５１】
判定・計数部３１６は、この新たな外郭−内核対応付けデータに基づき再度上記計数処理を行い、正常間期細胞と小核保有細胞との個数を計数する。得られた計数結果は表示部３２に表示される。なお、この際に、さらに、測定指令ごとに集計されていた計数結果をさらにスライドごとに集計して表示することもできる。図１２はスライドごとに表示された計測結果の一例を示す図である。図１２に示すように、スライド番号、日付、総正常間期細胞数、総小核保有細胞数、総合計細胞数により計測結果が示される。すなわち、同一のスライド番号が割り当てられ複数の測定開始時間についての正常間期細胞数が集計されて総正常間期細胞数が算出される（図１０の最終開始時間の行参照）。同様に、同一のスライド番号が割り当てられ複数の測定開始時間についての小核保有細胞数が集計されて総小核保有細胞数が算出される（図１０の最終開始時間の行参照）。そして、これら総正常間期細胞数と総小核保有細胞数とが加算されて総合計細胞数が得られる（図１０の最終開始時間の行参照）。
【００５２】
図１３は、上記各処理の推移例を示す図である。図１３に示すように、はじめに顕微鏡制御部３１７により表示部３２に図５の初期設定情報入力画面が表示される（ｓ１３１）。この初期設定情報入力画面で入力部３３を用いて日付、試験番号、スライド番号、担当者、観察倍率（対物）からなる初期設定情報を入力し（ｓ１３２ａ）、「ＯＫ」５１を選択すると（ｓ１３３）、図６の観察画面が表示される（ｓ１３４）。初期設定情報入力画面で入力部３３を用いて「終了」５２を選択すると（ｓ１３２ｂ）、アプリケーションが終了する。
【００５３】
観察画面で、「測定終了」６７を選択すると顕微鏡制御部３１７により表示部３２に図５の初期設定情報入力画面が再度表示される。観察画面では、初期設定情報入力画面で入力した初期設定情報６１と、測定時に取得した顕微鏡画像を識別する画像番号６８が表示される（ｓ１３６，ｓ１３７）。この観察画面で「測定開始」６４を選択すると測定が開始され（ｓ１３８）、開始時間、正常間期細胞数、小核保有細胞数、合計細胞数、総合計細胞数からなる測定結果６２が表示部３２に表示される（ｓ１３９ａ〜ｓ１３９ｅ）。開始時間は、処理部３１に内蔵された時計により「測定開始」６４が選択されたときの時刻が自動表示される。さらに、観察画面で、「確認」６５を選択すると（ｓ１４０）、判定・計数部３１６は図１０や図１２に示すような計測結果を例えばＣＳＶ形式で記憶部３４に保存する（ｓ１４１）。この保存と同時に、画像番号、正常間期細胞数、小核保有細胞数、合計細胞数の値がクリアされる。また、総合計細胞数が観察画面上で自動更新された値が表示される（ｓ１４２）。この総合計細胞数を画面上で確認した後（ｓ１４３）、再度観察画面で「測定開始」６４を選択することにより、測定を開始できる。
【００５４】
なお、「確認」６５を押さずに「再測定」６６を選択すると（ｓ１４４）、再度の計測がなされる。
【００５５】
以上説明したように、コンピュータを用いた自動計数と肉眼による精緻な計数とを組み合わせた計数装置が提供される。例えば、図１４に示す模式図に示したような細胞が観察される場合、いずれの細胞も精度よく計数できる。図１４において、１４１〜１４８は正常間期細胞の顕微鏡画像の模式図であり、１５１〜１６０は小核保有細胞の顕微鏡画像の模式図である。図１４において、従来手法では、肉眼および自動計数のいずれの手法においても、正常間期細胞１４１及び１４２のみが容易に観察可能であり、また小核保有細胞１５１〜１５３のみが容易に観察可能であった。これに対して、正常間期細胞１４３〜１４８と、小核保有細胞１５４〜１６０は、小核の数を誤って計数する可能性が高かった。本実施形態の手法によれば、正常間期細胞１４３〜１４８や小核保有細胞１５４〜１６０のように、どうしても自動計数に適さないものについては細胞種類を「観察対象外」としておき、肉眼による計数で補うことにより、極めて精度の高い計数が可能となる。大部分の細胞は、正常間期細胞１４１及び１４２や、小核保有細胞１５１〜１５３として自動計数し、これに漏れたわずかな観察対象外細胞として、正常間期細胞１４３〜１４８や小核保有細胞１５４〜１６０のような対象を肉眼計数することにより、効率的な計数が可能となる。
【００５６】
図１５は、実際に撮像された顕微鏡画像の模式図である。図１５に示すように、複数の外郭が観察される中で、外郭を中心にラベリングによりブロック１７１〜１７３によりグループ化されているのが分かる。
【００５７】
これらブロック１７１〜１７３中の外郭及び内核の位置関係に基づき外郭と内核を対応付け、上記判定基準１〜５に基づき判定を行うことで、小核保有細胞、正常間期細胞及び観察対象外の別を高精度で判定および計数できる。
【００５８】
ブロック１７１内の細胞は正常間期細胞と判定されたため、ブロック１７１の外枠は例えば赤で表示する。ブロック１７２内の細胞は小核保有細胞と判定されたため、ブロック１７２内の外枠は赤とは異なる色、例えば青色で表示する。ブロック１７３内の細胞は観察対象外と判定されたため、赤及び青とは異なる色、例えば緑色で表示する。また、符号が付されていない他のブロックについての特に言及していないが、すべて正常間期細胞であるから、外枠は赤で表示する。
【００５９】
このように、細胞種類の違いに応じて異なる色で表示する。例えばブロックの色から、観察対象外と判定されたことを知る観察者は、入力部３３を用いて細胞種類を入力しあるいは選択する。そして、選択された細胞種類に更新される。
【００６０】
以上説明したように、本実施形態の小核自動計数システムによれば、肉眼観察で得られるのと同様の計数結果が得られる。また、労力の軽減、測定時間の短縮を図ることができる。
【００６１】
本実施形態の画像解析処理装置の導入による小核誘発細胞の自動計数によれば、以下の条件を満たす場合であっても効率よくかつ精度の高い小核の計数が可能である。
【００６２】
・単核（サイトカラシンＢ非使用）を対象とすること  
・アクリジンオレンジ蛍光染色を対象とすること  
なお、全自動による連続操作により、画像取り込み処理をマニュアル化しておくのが望ましい。
【００６３】
本発明は上記実施形態に限定されるものではない。小核自動計数装置３０と顕微鏡装置４０との接続は有線接続でも無線接続でもよい。また、図４に示す判定及び計数処理はほんの一例にすぎず種々変更可能である。例えば、フィルタリング部３１１でフィルタリングしない画像データを２値化してもよい。また、膨張収縮処理部３１３における膨張・収縮処理を行わない２値データに基づくラベリングを行ってもよい。また、小核の形状が真円とは異なる形状が通常な細胞を計数する場合には、真円度計算部３１５の代わりにその細胞の小核の形状を近似した形状との類似の度合いを計算し、得られた類似度を判定に用いてもよい。また、図３に示した処理フローはほんの一例にすぎず、処理目的や処理対象に応じて種々変更可能である。また、図５，６，図１０及び図１２に示した画面例は一例にすぎず、必要に応じてその構成を変更可能である。また、図１３の処理フローは一例にすぎず、当業者の通常の創作能力の範囲で種々処理順序や処理項目を変更可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
以上説明したようにこの発明は、小核を自動で計数する小核自動計数プログラム、プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体及び小核自動計数装置の技術分野に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の一実施形態に係る小核自動計数システムの全体構成を示す図。
【図２】同実施形態に係る小核異常判定の概念図。
【図３】同実施形態に係る小核自動計数処理のフローチャートを示す図。
【図４】同実施形態に係る小核自動計数装置の全体構成を示す図。
【図５】同実施形態に係る初期設定情報入力画面の一例を示す図。
【図６】同実施形態に係る観察画面の一例を示す図。
【図７】同実施形態に係る外郭−内核対応付けデータの一例を示す図。
【図８】同実施形態に係る外郭ラベルを定義し直した外郭−内核対応付けデータの一例を示す図。
【図９】同実施形態に係る判定結果の一例を示す図。
【図１０】同実施形態に係る計測結果の一例を示す図。
【図１１】同実施形態に係る異常表示を更新した判定結果の一例を示す図。
【図１２】同実施形態に係る計測結果の別の一例を示す図。
【図１３】同実施形態に係る各処理の推移例を示す図。
【図１４】同実施形態に係る観察細胞を模式的に示した図。
【図１５】同実施形態に係る顕微鏡画像を模式的に示した図。
【符号の説明】
【００６６】
３０…小核自動計数装置、３１…処理部、３２…表示部、３３…入力部、３４…記憶部、４０…顕微鏡装置、５０…接続ケーブル、３１１…フィルタリング部、３１２…２値化処理部、３１３…膨張収縮処理部、３１４…ラベリング部、３１５…真円度計算部、３１６…判定・計数部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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