(57)【要約】    【課題】  エバネッセント波により蛍光物質を励起し、生じた発光強度により、液体試料中の特定成分を測定するにあたり、光導波路自体から発生する蛍光及び試料中の共存物質による蛍光に基づくバックグランドノイズを十分に低めることができ、液体試料中の特定成分を高感度かつ高精度に測定する方法を提供する。    【解決手段】  光導波路内に励起光を導入し、内部反射させることにより生じたエバネッセント波により、光導波路の表面近傍に拘束されれており、液体試料中の特定成分との複合体中の蛍光物質を励起し、生じた発光の強度の増減により液体試料中の特定成分を測定する方法において、励起光を照射した後、１０マイクロ秒以後に発光強度を測定する、液体試料中の成分の光学的測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路内に励起光を導入し、内部反射させることにより生じるエバネッセント波によって、光導波路の表面近傍に拘束されている、液体試料中の特定成分との複合体中の蛍光物質を励起し、生じる発光強度の増減により液体試料中の特定成分を測定する方法において、
励起光照射後１０マイクロ秒以後の発光強度を測定することによって試料中の成分を測定する、液体試料中の成分の光学的測定方法。
【請求項２】
前記蛍光物質が希土類金属錯体であることを特徴とする、請求項１に記載の光学的測定方法。
【請求項３】
前記希土類金属が、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、ガドリウム及びネオジウムからなる群から選択された少なくとも１種である、請求項２に記載の光学的測定方法。
【請求項４】
前記蛍光物質が重合体粒子に含有されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学的測定方法。
【請求項５】
励起光照射後、２００マイクロ秒以後の発光強度を測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学的測定方法。
【請求項６】
前記液体試料中の特定成分が、グリコヘモグロビンである、請求項１〜５のいずれかに記載の光学的測定方法。
【請求項７】
単一の光導波路を用い、複数の試料をＢＦ分離しないで連続的に測定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の光学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中の成分を光学的に測定する方法に関し、より詳細には、エバネッセント波により液体試料中の特定成分との複合体中の蛍光物質を励起し、生じた発光の強度の増減により液体試料中の特定成分、例えば、蛋白質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類またはその他の有機化合物等を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、エバネッセント波を用いて、抗原抗体反応により拘束された蛍光物質を励起し、生じた発光の強度を測定することにより、免疫反応の程度を測定する蛍光測定法が知られている。この種の測定方法では、光導波路に励起光学を導入し、励起光学を全反射させながら光導波路中を伝播させることにより、エバネッセント波が発生させられる。そして、抗原抗体反応により光導波路近傍に拘束された蛍光物質がエバネッセント波により励起され、励起された蛍光物質から生じた光が光導波路から出射され、出射された光の強度を測定することにより、免疫反応の程度が測定される。
【０００３】
下記の特許文献１には、この種の光学的測定方法の一例が開示されている。ここでは、光導波路自体が励起されることにより生じた光により測定精度が低下する問題を解決する手段として、６５０ｎｍ近傍に吸収のピークを有する蛍光物質を用い、かつ６３５ｎｍ付近の波長の励起光を用いている。
【０００４】
他方、下記の特許文献２においては、複数の蛍光染料を測定する方法が開示されている。特許文献２に記載の測定方法では、試料内の蛍光染料を検出する装置の光導波路にレーザー光を導入する。そして、試料に含まれている蛍光染料がレーザー光のエバネッセント成分により励起され、蛍光が検出される。特許文献２に記載の方法では、励起光の波長が４８８ｎｍの場合に、５２０ｎｍの波長の蛍光を検出する例、並びに有機系染料ＣＹ５を検出するにあたり、励起光の波長６３３ｎｍとした場合に、測定する蛍光の波長を６７０ｎｍとした例が開示されている。
【特許文献１】特許第３３６２２０６号
【特許文献２】特許第３１８７３８６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の方法では、励起光と蛍光との波長差（ストークスシフト）が十分な大きさではなく、測定感度及び測定精度を十分に高めることができないという問題があった。
【０００６】
他方、特許文献２に記載の方法においても、上記ストークスシフトが小さく、ＣＹ５は蛍光寿命が短いため、光導波路及び試料中に共存する蛍光物質の影響を大きく受けがちであった。従って、測定感度を十分に高めることができなかった。試料中の成分を高感度で測定しようとする場合、光導波路自体から発生する蛍光以外に、試料中に含まれる標識物としての蛍光染料以外に蛍光を発生する物質の存在が問題となる。
【０００７】
特に、血液試料中の成分を測定する場合には、各種蛋白質、核酸、ヘモグロビンなどにより、また、場合によっては投与された薬物によって大きな蛍光が発生し、測定感度が低くくならざるを得なかった。
【０００８】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、励起光を光導波路に導入し、内部反射させる事により生じたエバネッセント波により光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質を励起し、生じる発光の強度により液体試料中の特定成分を測定する方法において、光導波路自体から発生する蛍光及び試料中に存在する標識物としての蛍光物質以外の物質に由来する蛍光を無視し得る程度に低減でき、光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質を極めて高い感度で測定することができる光学的測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、光導波路内に励起光を導入し、内部反射させることにより生じるエバネッセント波によって、光導波路の表面近傍に拘束されている、液体試料中の特定成分との複合体中の蛍光物質を励起し、生じる発光強度の増減により液体試料中の特定成分を測定する方法において、励起光照射後１０マイクロ秒以後の発光強度を測定することによって試料中の成分を測定することを特徴とする。
【００１０】
本発明の光学的測定方法では、好ましくは、蛍光物質として希土類金属錯体が用いられる。
【００１１】
本発明に係る光学的測定では、好ましくは、上記希土類金属が、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、ガドリウム及びネオジウムからなる群から選択された少なくとも１種である。
【００１２】
本発明に係る光学的測定方法では、好ましくは、上記蛍光物質が重合体粒子に含有されている。
【００１３】
本発明に係る光学的測定方法のより限定的な局面では、励起光照射後、２００マイクロ秒以後の発光強度を測定する。
【００１４】
本発明に係る光学的測定方法のある特定の局面では、上記液体試料中の特定成分がグリコヘモグロビンである。
【００１５】
本発明に係る光学的測定方法では、液体試料をＢＦ分離してもよく、ＢＦ分離しなくともよい。また、ＢＦ分離しない方法では、好ましくは、単一の光導波路上において、複数の試料が連続的に測定される。。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る液体試料中の成分の光学的測定方法では、エバネッセント波により光導波路の表面近傍に拘束された液体試料中の成分との複合体中の蛍光物質が励起され、生じた発光の強度の増減により、液体試料中の成分が測定されるが、励起光学を照射後、１０マイクロ秒以後の発光強度を測定することにより、試料中の成分が測定される。光導波路自体及び試料中に共存する測定成分以外の物質により蛍光の寿命は比較的短く、１０マイクロ秒までにその発生強度が速やかに減衰する。本発明では、励起光照射後、１０マイクロ秒以後の発光強度を測定するため、このような光導波路や試料中に共存している蛍光性物質によるバックグランドノイズを十分に低めることができ、それによって液体試料中の特定の成分の測定感度を効果的に高めることができる。
【００１７】
また、本発明において、蛍光物質として希土類金属錯体を用いた場合には、希土類金属錯体の蛍光の寿命が長く、ストークスシフトが大きいため、本発明において、励起光照射後、１０マイクロ秒以後に発光強度を測定することにより、試料中の特定成分に結合された蛍光物質である希土類金属錯体による蛍光を確実に測定することができる。
【００１８】
特に、希土類金属が、ユウロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、ガドリウム及びネオジウムからなる群から選択された少なくとも１種である場合には、上記蛍光体の寿命がより一層長くなり、本発明に従ってバックグランドノイズを効果的に低減した状態で測定成分由来の発光強度を測定することができる。
【００１９】
また、本発明においては、上記蛍光物質が重合体粒子中に分散されている場合には、液体試料中に希土類金属錯体が溶解されている場合に比べて、液体試料中の共存物質による蛍光強度の低下が生じ難い。従って、より一層感度を高めることができる。
【００２０】
本発明において、励起光照射後、２００マイクロ秒以後の発光強度を測定する場合には、より一層バックグランドノイズを低減することができる。
【００２１】
本発明に係る液体試料中の成分の光学的測定方法では、様々な液体試料中の成分を測定することができるが、該成分がグリコヘモグロビンである場合には、本発明に従って、例えば血液試料などの液体試料中におけるグリコヘモグロビンの強度を高感度で測定することができる。
【００２２】
本発明に係る光学的測定方法において、単一の光導波路を用いて複数の試料をＢＦ分離を行わないで測定する場合には、複数の試料中の成分を連続的に効率良く測定することができる。このように、ＢＦ分離を行わない場合、液体試料中に共存する蛍光物質の影響が大きくなり、バックグランドノイズが高くなる。しかしながら、本発明では、蛍光寿命の長い蛍光物質を用いることにより、バックグランドノイズの影響を低減することができる。
【００２３】
従って、ＢＦ分離を行わない簡便な操作で、本発明によれば液体試料中の成分を測定するとができる。そして、ＢＦ分離を行わない場合には、複数の試料を単一の光導波路を用いて連続的に測定することができ、それによって液体試料中の成分の測定作業を効率良く行うことかできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。
【００２５】
本発明に係る光学的測定方法では、上記光導波路としては、励起光を導入し、内部反射させることにより、エバネッセント波を生じさせ得る適宜の材料からなる光導波路を用いることができる。このような光導波路としては、例えば、樹脂プレートまたはガラスプレートを用いることができる。
【００２６】
ガラスプレートを光導波路として用いる場合、例えば３５０ｎｍ近傍の短波長光を、厚み０．５ｍｍ〜数ｍｍのガラスプレートに全反射率の角度で入射させ、伝播させればよい。励起光の光源としては、特に限定されないが、単色のレーザーまたはＬＥＤを用いることができる。上記光源から生じた光は、例えばプリズムを介して上記光導波路に結合すればよい。
【００２７】
光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質は、伝播されてきた励起光のエバネッセントフィールドによって励起される。液体試料中に含まれる第１成分に特異的な反応体で光導波路表面を被覆し、該被覆表面を該試料に暴露し、該第１成分との反応で形成された複合体層を形成させる。該複合体、及び該複合体に対して液体試料中の第２成分が相互作用した事を蛍光の強度を測定することにより知ることができる。
【００２８】
なお、蛍光物質による標識は、液体試料中に含まれる第１成分と同じ成分を蛍光標識す
してもよく、あにいは上記第２成分を蛍光標識してもよい。
【００２９】
光導波路上の上記反応体は、光導波路上に１ヶ所設けられてもよく、複数ヶ所に設けられてもよい。複数ヶ所に反応体が設けられる場合、任意の間隔を隔てて反応体を設ければよい。
【００３０】
エバネッセントフィールドにより励起された蛍光物質から生じた蛍光は、光導波路に対して所定の位置に位置決めされた検出器により検出すればよい。検出器としては、例えば、フォトダイオードアレイ、ＣＣＤアレイまたは光電子倍増管などの光電変換装置を用いることができる。
【００３１】
光導波路表面における反応は、抗原抗体反応であってもよく、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどであってもよく、そのメカニズムは特に限定されてない。また、本発明に係る光学的測定方法における測定対象物としての測定の成分としては、様々な成分が挙げられ、例えば、蛋白質、ペプチド、核酸、核酸塩基及びその誘導体、ヌクレオチド、ホルモン、糖類またはその他の有機化合物などが挙げられる。
【００３２】
フルオレセインやローダミンなどの有機蛍光色素は大きな量子収率と強い蛍光を発するが、励起光と蛍光の波長差、すなわちストークスシフトが小さく、かつ蛍光寿命は数ナノ秒程度である。従って、試料中の共存物質や光導波路自体による蛍光、並びに励起光の散乱光の影響を大きく受けるという問題がある。
【００３３】
これに対し、本発明では、蛍光寿命が長い蛍光物質が用いられる。すなわち、本発明においては、励起光照射後１０マイクロ秒以後の発光強度が測定されるが、１０マイクロ秒以後の蛍光寿命を有する蛍光物質が用いられる。このような蛍光物質としては、蛍光寿命か長いものであれば特に限定されない。上記のような蛍光寿命の長い蛍光物質としては、例えば、希土類金属錯体、あるいは長残光性の蓄光性蛍光粒子などが挙げられる。
【００３４】
希土類金属錯体は励起光と蛍光の波長差が大きく、蛍光寿命は数百マイクロ秒以上である。長残光性の蓄光蛍光粒子の蛍光寿命はさらに長い。
【００３５】
希土類金属錯体を構成する希土類金属としては、スカンジウムもしくはイットリウム、又はランタノイド族に属する金属、すなわち、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、もしくはルテチウムを挙げることができ、好ましくは、ユウロピウム、サマリウム、テルビウム、又はジスプロシウムを用いることができる。
【００３６】
前記希土類金属と共に錯体を形成するリガンドとしては、前記希土類金属と一緒になって蛍光発生可能な希土類金属錯体を形成することができる限り、特に限定されるものではないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）類、４，７−ビス−（クロロスルフォフェニル）−１，１０−フェナントロリン−２，９−ジカルボキシリックアシッド（ＢＣＰＤＡ）、又は４，４’−ビス（１”，１”，１”，２”，２”，３”，３”−ヘプタフルオロ−４”，６”−ヘキサンジオン−６”−イル）−クロロスルホ−ο−テルフェニル（ＢＨＨＣＴ）が挙げられる。また、ヘキサフルオロアセチルアセトン（ＨＦＡ）、トリフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＰＯ）、ジフェニルスルホキシド（ＤＰＳＯ）、１，１０−フェナントロリン（Ｐｈｅｎ）などが挙げられる。
【００３７】
本発明では、好ましくは、上記蛍光体は重合体粒子中に含有される。蛍光体を重合体粒子中に含有させた場合には、液体試料中に蛍光物質を溶解させた場合に比べて、液体試料
中の共存物質による蛍光強度の低下を抑制することができ、望ましい。
【００３８】
蛍光体を含有する蛍光体含有光重合体粒子は、常法によって調製することができる。例えば、蛍光体としての希土類金属錯体、重合開始剤、及び安定化剤を含む重合性モノマー溶液を乳化剤の存在下で水中で乳化し、ラジカル重合する方法が挙げられる。また、各種分散剤の存在下で懸濁重合を行う方法も可能である。
【００３９】
液体試料中の共存物質の影響をより効果的に抑制するには、重合体粒子の粒径は小さいものが好ましく、より具体的には、１００ｎｍ以下であることか望ましい。重合体粒子の粒径を小さくするには、重合時に小さなモノマー滴を作ればよく、ホモジナイザー、超音波破砕機、マイクロミキサー、マイクロチャンネルなどを用いることにより達成され得る。また、重合体粒子の粒径ばらつきは小さいことが望ましく、例えば、ＣＶで１０％以下であることが望ましい。
【００４０】
蛍光体含有重合体粒子を用いる場合、該蛍光体含有重合体粒子中における蛍光物質の含有量は、蛍光物質及び重合体の組成に応じて適宜選択すればよい。通常、５〜８０重量％が好ましく、より好ましくは１５〜６０重量％である。５重量％以下では、蛍光物質が十分な量含有されていないため、測定感度を高めることができず、８０重量％を超えると、重合体粒子に蛍光体を含有させた効果が十分に得られないことがある。蛍光体含有重合体粒子の粒子径は、適宜選択されるが、通常、０．０４〜５μｍとすることが好ましく、より好ましくは０．０３〜０．２μｍである。
【００４１】
重合体粒子を形成する高分子としては、ビニル系ポリマー、オレフイン系ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリイミド、ポリシロキサン、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポルスルフィドなどの粒子を挙げることができ、これらの粒子は官能性基含有ポリマーであってもよい。
【００４２】
特に好ましいポリマー粒子は、ビニル系ポリマーあるいは官能性基含有ビニル系ポリマーの粒子である。前記ビニル系ポリマーあるいは官能性基含有ビニル系ポリマーの主成分をなすビニル系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ｏ−ビニルトルエン、ｍ−ビニルトルエン、ｐ−ビニルトルエン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニル化合物；（メタ）アクリル酸、クロトン酸等の不飽和カルボン酸類；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、ｉ−プロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリレート類；（メタ）アクリロニトリル、シアン化ビニルデン等のシアン化ビニル化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ふっ化ビニル、ふっ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化合物等を挙げることができる。これらのビニル系モノマーのうち、芳香族ビニル化合物、（メタ）アクリレート類が好ましい。
【００４３】
前記ビニル系モノマーは、単独でまたは２種以上を混合して使用することができる。
【００４４】
また、官能性基含有ビニル系ポリマーにおける官能性基としては、例えば、カルボキシル基、水酸基、メルカプト基、アミノ基、置換アミノ基、エポキシ基等を挙げることができる。官能性基含有ビニル系ポリマーは、前記不飽和カルボン酸類を（共）重合する方法のほか、官能性基を含有しない前記ビニル系モノマーを官能性基を含有する他のビニル系モノマーと共重合する方法、不飽和カルボン酸類以外の前記ビニル系モノマーの（共）重
合体に官能性基を導入する方法等により製造することができる。
【００４５】
本発明の光学的測定方法による発光強度の測定は、上述した光電変換装置により行われる。この場合、液体試料中の共存物質や光導波路自体により生じた蛍光の影響を低減するために、励起光照射後、１０マイクロ秒以後に発光強度を測定する。１０マイクロ秒以後のある程度の時間にわたり、発光強度を測定し、その平均値、あるいは積分値により発光強度を求めてもよい。この場合の経過時間は任意に設定し得るが、通常、１０マイクロ秒以後〜数百マイクロ秒以後の間にわたって発光強度を測定すればよい。さらに、より好ましくは、試料中の共存物質や光導波路から発生するバックグランドノイズをより効果的に抑制するには、励起光照射後、２００マイクロ秒以後に発光強度を測定すればよい。
【００４６】
本発明の光学的測定方法によれば、液体試料中に含まれる種々の成分を、安価な装置で、迅速に、かつ高感度に、さらに簡便に測定することができる。従って、本発明の光学的測定方法は、血液試料中の各種成分の測定、あるいは環境汚染物質等のモニタリングにも好適に用いることができる。
【００４７】
従来、検査センターや中規模以上の病院で臨床アッセイ法による検査がなされていたが、本発明の測定方法によって、安価な装置で迅速に、高感度に精度よく簡便に測定する事が可能になり、個人レベルでの開業医でも十分に検査が可能となる。従って受診療におとずれた患者がその場で検査結果を知ることが可能となり、通院回数とそれに要する時間・費用を削減でき、かつ国の医療費を削減することができる。
【００４８】
また、本発明の測定方法は特に血液試料中のグリコヘモグロビンを測定する方法にも適切である。
【００４９】
グリコ ヘモグロビン（ＧＨｂ）は、ヘモグロビン 分子に様々な糖類（最も一般的にはグルコース）が結合して生成する一連の少量のヘモグロビン 成分を意味する。ヒト赤血
球は、グルコースを自由に浸透させる。各赤血球内で、ＧＨｂは周囲のグルコース濃度に正比例した速度で生成する。グルコースとヘモグロビン との反応は、非酵素的で不可逆
的、かつゆっくりと進むため、赤血球の寿命（１２０日）の間に総ヘモグロビン の一部
分しか糖化しない。その結果、ＧＨｂを測定することにより、長期血糖値のモニタリングに用いることができる、血糖値の重みつき「移動」平均が得られ、過去２〜３ヶ月間の平均血糖値の正確な指標となる。糖尿病患者における血糖値管理が、ＧＨｂの測定の最も重要な臨床応用である。
【００５０】
ヘモグロビン  Ａ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）はある特有の型のグリコヘモグロビンで、糖尿病に関する最も重要なヘモグロビン種である。ＨｂＡ１ｃの総ヘモグロビン量は、非糖尿病患者では約３〜６％で、管理をあまり行っていない糖尿病患者では２０％以上である。ＨｂＡ１ｃでは、グルコースがヘモグロビンＡの一方または両方のβ鎖のアミノ末端バリン残基に結合している。ＨｂＡ１ｃは、電荷の差で分子を分離する方法により、非糖化ヘモグロビン から分離することができる。尿および血糖値を含む、糖尿病の血糖管理を評価
する従来法は変動する可能性があり、糖濃度の経時情報を示さず、また、食事により劇的な影響を受けるため限られた価値しかない。しかしＧＨｂの測定は、対象者の過去２〜３ヶ月間の平均血糖値の正確な指標となり、糖尿病患者は血糖値管理に対する長期的目標達成のあらましを把握できる。
【００５１】
臨床アッセイ法では、電荷の差または構造上の特徴のいずれかに基づいてＧＨｂを総ヘモグロビンから分離する。この分離は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により一般的に行われている。
【００５２】
ＨＰＬＣによる臨床アッセイ法は広く普及しており、検査センター及び検査室を保有する中規模以上の病院において実施されている。他に、多量の検体処理に適した免疫測定法（免疫阻害比濁法、ラテックス凝集法、酵素免疫測定法）などが知られている。
【００５３】
本発明に係る光学的測定方法によるグリコヘモグロビンの測定方法は、上述した各種免疫測定法による測定法にくらべて、簡便であり、安価であり、かつ小型の自動装置を用いて、短時間で高感度かつ高精度に測定することができる。
【００５４】
従来の上述した免疫測定法による測定値と、ＨＰＬＣ法による測定値の間には、相関があるため、一般には、補正式により免疫測定法による測定値が、ＨＰＬＣ法の測定値に換算される。
【００５５】
本発明に係る光学的測定方法により得られた測定値についても、同様に、ＨＰＬＣ法の測定値に換算することができる。
【００５６】
次に、具体的な実施例につき説明する。
【００５７】
（実施例１）
１）ヒトヘモグロビン及びヒトグリコヘモグロビンＡ１Ｃに対するモノクローナル抗体の作製
ヒトヘモグロビン、及びヒトグリコヘモグロビンＡ１Ｃをフロイントコンプリートアジュバントに十分に分散させこの１００μｌでＢａｌｂ／ｃマウスに２週間おきに４回免疫
した。この免疫マウスの脾臓を摘出し、これより脾細胞を１０６個得た。それをマウスミエローマ細胞とＰＥＧの存在下で融合させ培養した。増殖した細胞の上清を採取しＥＬＩＳＡ法により各抗体の有無を調べた。該抗体が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、各抗体を産生している細胞を確認した。これにより得られた細胞を大量に培養し、マウス腹腔中に注射した。２週間後より３日おきに腹水を採取し、目的の各モノクローナル抗体（ＩｇＧ）を得た。
【００５８】
２）蛍光体重合粒子の作製及び、抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１Ｃ抗体吸着蛍光重合粒子
ガラス製フラスコ中に水８０重量部、ドデシルスルホン酸ナトリウム１．５部を溶解した。これを撹拌しながら、スチレン２０重量部、希土類金属錯体３重量部、ＡＩＢＮ０．１５重量部を混合したモノマー溶液を滴下し、乳化した。これを冷却しながら、クリアミックスと超音波破砕器で分散させた。その後、窒素置換した後、温水につけ、撹拌しながら反応液温度を８０度まで昇温し、約８時間継続した。蛍光体重合微粒子は体積平均粒子径が０．１２μｍでＣＶは９％であった。
【００５９】
抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１Ｃ抗体を１ｍｇ／ｍｌになるように、０．０５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解させた。蛍光重合体粒子を同緩衝液で３回洗浄した後、粒子濃度が１％になるように同緩衝液に分散させた。この分散液１ｍｌに対し、抗体溶液０．５ｍｌを加え、３５℃で１時間攪拌した。その後、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１％を１ｍｌ加え、常温で１時間攪拌後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×１時間）を行い、同リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。この遠心分離、洗浄を３回行い、同リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）を２ｍｌ加え、超音波ホモジナイザーで粒子を分散させた。
【００６０】
３）光導波路の被覆
光導波路として厚み１ｍｍのガラスプレートを用いた。ガラスプレートをエタノールに３０分間浸漬後、蒸留水で洗浄した。抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体を１ｍｇ／
ｍｌになるように０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、これをガラスプレート表面に浸し、３０℃で１時間静置した。これを同トリス緩衝液に浸し洗浄した後、リン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１％をガラスプレートの同一表面に浸し、３０℃で１時間静置する事によって、抗体に被覆されていないガラスプレート表面を被覆した。そして、同リン酸食塩緩衝液に浸し洗浄した後、使用するまで、同緩衝液中に４℃で保存した。
【００６１】
４）試料との反応
溶血試薬としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００が０．１重量％で、不安定型糖化ヘモグロビン
除去試薬としてテトラポリリン酸が０．１重量％に溶解した０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。
【００６２】
血液試料としては、採血後、直ちに全血１ｍｌに対して血液抗凝固剤としてフッ化ナトリウムを１０ｍｇの割合で添加した。この３μｌを上記溶血試薬で１５０倍に希釈したものを希釈血液試料とした。
【００６３】
この希釈血液試料に、抗ヒトグリコヘモグロビンＡ１Ｃモノクローナル抗体吸着蛍光重合粒子を所定量加え、混合した後、５分間静置した。この混合液５０μｌを、抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体で被覆したガラスプレートに滴下した。
【００６４】
５）測定
試料を滴下したガラスプレートを光導波路として装置にセットした。３６０ｎｍのレーザー光を全反射する角度でガラスプレートのサイドからレンズを介して入射し、試料を滴下した部分にエバネッセンスフィールドを発生させる。発光した波長６００ｎｍ近傍の光を、光照射後、１０マイクロ秒から１１０マイクロ秒までの光量を検出した。
【００６５】
結果を下記の表１に示す。
【００６６】
（実施例２）
測定に際し、光照射後、２０マイクロ秒から１２０マイクロ秒までの光量を測定したことを除いては、実施例１と同様とした。
【００６７】
結果を下記の表１に示す。
【００６８】
（実施例３）
測定に際し、光照射後、１０００マイクロ秒から２０００マイクロ秒までの光量を測定したことを除いては、実施例１と同様とした。
【００６９】
結果を下記の表１に示す。
【００７０】
（比較例１）
測定に際し、光照射後、光照射直後から１００マイクロ秒までの光量を測定したことを除いては、実施例１と同様とした。
【００７１】
結果を下記の表１に示す。
【００７２】
【表１】
2005091054.tif 000002
【００７３】
表１における検出相対強度が、上記実施例により測定された光の相対強度である。また、表１におけるＡ１ｃ値＊とは、ＨＰＬＣ法で同一試料を測定した場合の値である。
【００７４】
表１から明らかなように、ＨＰＬＣ法により測定された値と、実施例で測定された検出相対強度との間に十分な相関があることがわかる。従って、上記本実施例で測定された検出相対強度を、表１に示すＨＰＬＣ法で得られたＡ１ｃ値＊に換算し、本発明に係る測定方法におけるＡ１ｃ値とすることができる。