(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡタイピングに用いられる検体試料に含まれるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を選択的に増幅することができるプライマーおよびプライマーセットを提供すること。【解決手段】本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーは、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるものである：（ａ）特定な塩基配列およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド、および、（ｂ）前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと同一のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅することができる、オリゴヌクレオチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマー：
（ａ）  下記配列１〜７およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド：
配列１（ＡＭＰＤＲ１）：５’  ＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴ（配列番号１）、
配列２（ＡＭＰＤＲ２）：５’  ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号２）、
配列３（ＡＭＰＤＲ３）：５’  ＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴ（配列番号３）、
配列４（ＡＭＰＤＲ４）：５’  ＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡ（配列番号４）、
配列５（ＡＭＰＤＲ９）：５’  ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴ（配列番号５）、
配列６（ＡＭＰＤＲ１０）：５’  ＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣ（配列番号６）、および
配列７（ＡＭＰＤＲＢ）：５’  ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号７）、
（ｂ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと同一のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅することができる、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列１〜７が、タグをさらに付加された配列からなる、請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマー。
【請求項３】
前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、下記配列８〜１４およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマー：
配列８（ＴＡＧＡＭＰＤＲ１）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴ（配列番号８）、
配列９（ＴＡＧＡＭＰＤＲ２）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号９）、
配列１０（ＴＡＧＡＭＰＤＲ３）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴ（配列番号１０）、
配列１１（ＴＡＧＡＭＰＤＲ４）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡ（配列番号１１）、
配列１２（ＴＡＧＡＭＰＤＲ９）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴ（配列番号１２）、
配列１３（ＴＡＧＡＭＰＤＲ１０）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣ（配列番号１３）、および
配列１４（ＴＡＧＡＭＰＤＲＢ）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号１４）。
【請求項４】
請求項１に記載のプライマーを少なくとも２種含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項５】
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１〜６およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の請求項１に記載のプライマーと、
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の請求項１に記載のプライマーと
を含んでなる、請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項６】
（１）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第１のプライマーと
（２）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第２のプライマーと
（３）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第３のプライマーと
（４）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第４のプライマーと
（５）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列５およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第５のプライマーと
（６）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列６およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第６のプライマーと
（７）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の第７のプライマーと
を少なくとも含んでなる、請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項７】
請求項３に記載のプライマーを少なくとも２種含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項８】
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列８〜１３およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の請求項３に記載のプライマーと、
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の請求項３に記載のプライマーと
を含んでなる、請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項９】
（８）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列８およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第８のプライマーと
（９）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列９およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第９のプライマーと
（１０）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１０およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第１０のプライマーと
（１１）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第１１のプライマーと
（１２）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第１２のプライマーと
（１３）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第１３のプライマーと
（１４）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の第１４のプライマーと
を少なくとも含んでなる、請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いる遺伝子増幅反応によって得られる核酸試料と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング法。
【請求項１１】
遺伝子増幅反応がポリメラーゼ増幅反応である、請求項１０に記載のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング法。
【請求項１２】
請求項４〜９のいずれか一項に記載のプライマーセットと、
ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブと
を少なくとも含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子タイピング用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ヒト白血球抗原））のタイピングに用いられるプライマーに関する。詳しくは本発明は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原の遺伝子型のタイピングに用いられる核酸試料の調製に有用なプライマーに関する。
【０００２】
従来技術
近年、臓器移植の分野は長足の進歩を遂げ、その成功率も徐々に上がってきている。移植の成功率は、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかに大きく依存する。ヒトの主要組織適合性抗原であるＨＬＡは、免疫系において自己または非自己の識別に重要な役割を果たしている分子であり、機能を持つ蛋白質の中で最も高度な多型性を示す。ＨＬＡ分子をコードしている遺伝子は第６番染色体上にあり、主な遺伝子座としてクラスＩ抗原であるＨＬＡ−Ａ座、ＨＬＡ−Ｂ座およびＨＬＡ−Ｃ座、クラスＩＩ抗原であるＨＬＡ−ＤＲ座およびＨＬＡ−ＤＱ座が存在する。それぞれの遺伝子座について数十から数百種類の対立遺伝子が報告されており、非血縁者間において各遺伝子座の対立遺伝子がすべて一致する確率は非常に低い。したがって、移植を成功させるためには、より正確かつ迅速にＨＬＡの型をタイピングできることが重要である。
【０００３】
従来、ＨＬＡのタイピングは抗体を用いて行われてきた。しかしながら、抗体はその供給源を経済的にほぼ限られている。また、モノクローナル抗体を得ることが困難なこともある。このため、優れた品質の抗体を安定して充分量得ることは困難なことがある。この問題はＨＬＡの中でも特にクラスＩＩ抗原について顕著とである。
【０００４】
抗体を用いる検査法に代わって、特異性の面で安定的であり、かつ、検査用の試薬の供給が制限されない、遺伝子によるタイピング法が研究され、種々の方法が提案されている。一方で、例えば日本骨髄バンク等のような、世界中で骨髄や腎臓を中心として臓器移植ネットワークが徐々に規模を拡大してきている。そのため、試薬による量的制限のない遺伝子タイピング法であって、大量の検体を低コストでタイピングできるものが求められている。
【０００５】
遺伝子タイピング法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が提案されている（例えば、今日の移植ＶＯＬ．７  ＳＵＰＰＬ  １９９４（非特許文献１）参照）。また、単一クラスＩＩ  ＨＬＡ遺伝子座のＤＮＡ配列に対して実質的に相補的である標識されたＤＮＡ配列を含んでなる、ＨＬＡタイプ分け用の、該遺伝子座に対して特異的なＤＮＡプローブからなる試薬が提案されている（例えば、特許第２８５９８７４号公報（特許文献１）参照）。
さらに、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子型を決定する方法およびプローブに関する技術（例えば、特開平６−７８８００号公報（特許文献２）参照）、および、ＨＬＡ−ＤＱＢ１タイピングを決定するためのヌクレオチドプローブに関する技術（例えば、特表２０００−５１１４３０号公報（特許文献３）参照）も報告されている。
【０００６】
上記種々の提案にもかかわらず、より簡便かつ精度の高い方法への希求が依然として存在している。骨髄バンク事業等におけるスクリーニングにおいて、不可欠な条件としては、例えば下記の事項が挙げられる：
（１）  操作が簡易で、かつ大量検体処理に適していること、
（２）  対象の集団に見られるほぼ全てのタイプを検出できること、
（３）  分類のレベルが適当で、最終検査の実施対象を実用上支障のない程度の数に絞り込むこと、および
（４）  作業量、試薬のコスト等とのバランスが取れていること。
【０００７】
本発明者らは先に、１６種類のプローブを用いたＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング法を提案している（例えば、特開平８−３０８５９６号公報（特許文献４）参照）。
しかしながら、ＨＬＡ−ＤＲ座には、ＤＲＢ１遺伝子、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＲＢ６遺伝子およびＤＲＢ７遺伝子が存在し、これらの遺伝子は互いに極めて配列が類似している。このため、これらの内のいずれかの目的遺伝子を増幅する場合、目的遺伝子だけでなく配列が類似する他の遺伝子も同時に増幅されてしまうことがある。その結果、精度の高いタイピングを行うことが困難な場合があった。また、これらＨＬＡ−ＤＲ座の個々の遺伝子、例えば、ＤＲＢ１遺伝子のみを選択的に増幅できたという報告も、本発明者らの知る限り依然としてなされていない。
したがって、より選択性の高い高精度なタイピング法の開発が依然として望まれている。
【０００８】
なお上記記載中で挙げられた文献を下記に列記する。
【０００９】
【非特許文献１】
今日の移植  ＶＯＬ．７  ＳＵＰＰＬ  １９９４
【特許文献１】
特許第２８５９８７４号公報
【特許文献２】
特開平６−７８８００号公報
【特許文献３】
特表２０００−５１１４３０号公報
【特許文献４】
特開平８−３０８５９６号公報
【００１０】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子以外の他のＨＬＡ−ＤＲ座の遺伝子、例えば、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＲＢ６遺伝子、およびＤＲＢ７遺伝子を増幅することなく、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のみを特異的に増幅することができる増幅用プライマーを見出した。このとき、プライマーとしては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原として存在する１３種類のもの全てを増幅し得るプライマー群を見出した。これらのプライマーを使用することによって、ＨＬＡタイピングに用いられる検体試料をより高い精度を得ることができ、その結果、従来に比べてより精度の高いＨＬＡタイピングを迅速に行うことが可能であった。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１１】
よって本発明は、ＨＬＡタイピングに用いられる検体試料に含まれるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を選択的に増幅することができるプライマーおよびプライマーセットを提供することをその目的とする。
【００１２】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーは、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるものである：
（ａ）  下記配列１〜７およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド：
配列１（ＡＭＰＤＲ１）：５’  ＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴ（配列番号１）、
配列２（ＡＭＰＤＲ２）：５’  ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号２）、
配列３（ＡＭＰＤＲ３）：５’  ＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴ（配列番号３）、
配列４（ＡＭＰＤＲ４）：５’  ＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡ（配列番号４）、
配列５（ＡＭＰＤＲ９）：５’  ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴ（配列番号５）、
配列６（ＡＭＰＤＲ１０）：５’  ＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣ（配列番号６）、および
配列７（ＡＭＰＤＲＢ）：５’  ＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号７）、
（ｂ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと同一のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅することができる、オリゴヌクレオチド。
【００１３】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーセットは、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーを少なくとも２種含んでなる。
【００１４】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるプライマーセットは、
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１〜６およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと、
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと
を含んでなる。
【００１５】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング法は、本発明によるプライマーセットを用いる遺伝子増幅反応によって得られる核酸試料と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００１６】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子タイピング用キットは、本発明によるプライマーセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブとを少なくとも含んでなる。
【００１７】
本発明のプライマーによれば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子以外の他のＨＬＡ−ＤＲ座の遺伝子、例えば、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＲＢ６遺伝子、およびＤＲＢ７遺伝子を増幅することなく、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のみを選択的に増幅することができる。すなわち、被験者由来のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡ、と本発明によるプライマーがハイブリダイズすることにより、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を特異的に増幅することができる。また本発明によれば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原として存在する１３種類のもの全てを増幅することができる。さらに本発明によるプライマーによれば、複数のプライマーを使用した場合に通常懸念されるプライマーダイマーの形成もない。このため、本発明によれば、ＨＬＡタイピングに用いられる検体試料をより高い精度を得ることができる。その結果、本発明によれば、従来に比べてより迅速で、かつより精度の高いＨＬＡタイピングを行うことができる。
【００１８】
【発明の具体的説明】
プライマー
本発明によるプライマーは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子の増幅に用いられるものである。ここで増幅とは、プライマーを起点として開始されるＤＮＡの合成反応を伴う遺伝子の増幅のことをいう。例えばこのような遺伝子増幅反応としては、ポリメラーゼ増幅反応、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＴＡＳ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＳＤＡ（ｓｔａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が挙げられる。本発明においては、遺伝子増幅反応としては、ポリメラーゼ増幅反応、例えばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＴＡＳ、ＳＤＡが好ましい。
【００１９】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーは、前記したように、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる：
（ａ）  配列１〜７およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなる、オリゴヌクレオチド：
（ｂ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドと同一のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅することができる、オリゴヌクレオチド。
【００２０】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、プライマー配列とその相補鎖との二本鎖の融解温度（℃）および溶液の塩濃度等に依存して決定できる。プライマー配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等）。
【００２１】
本発明において、「（ａ）のオリゴヌクレオチドと同一のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅することができる」とは、（ａ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅することができるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子と同一の遺伝子を増幅することができると、当業者により認められたと評価されることをいう。例えば、後述する実施例と同様の条件において増幅反応を実施した場合に、現実に増幅反応が認められたと当業者に評価されることをいう。
【００２２】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーにおいて、前記配列１〜７は、タグをさらに付加された配列からなる。
ここでタグとは、プライマー間の増幅ムラをなくし、プライマーによる増幅効率を均一化できるものであれば、いずれの配列および塩基数を有するものであってもよいが、通常は、タグの塩基数は５〜２５塩基、好ましくは１０〜２０塩基、より好ましくは１５塩基である。
またタグの配列は、タグが前記したようなものである限り、ＧＡＴＣからなるものであれば特に制限はない。ただし、プライマー内でパリンドロームな配列を持たないものが望ましい。
該タグの具体例としては、後述する配列８〜１４の５’末端側の１５塩基が挙げられる。
【００２３】
本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドは、下記配列８〜１４およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである：
配列８（ＴＡＧＡＭＰＤＲ１）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴ（配列番号８）、
配列９（ＴＡＧＡＭＰＤＲ２）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ（配列番号９）、
配列１０（ＴＡＧＡＭＰＤＲ３）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴ（配列番号１０）、
配列１１（ＴＡＧＡＭＰＤＲ４）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡ（配列番号１１）、
配列１２（ＴＡＧＡＭＰＤＲ９）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣＴＣＴＧＴＴ（配列番号１２）、
配列１３（ＴＡＧＡＭＰＤＲ１０）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣ（配列番号１３）、および
配列１４（ＴＡＧＡＭＰＤＲＢ）：５’  ＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＣＣＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴ（配列番号１４）。
【００２４】
前記した本発明によるプライマーは、被験者由来のＤＮＡを増幅できるものであれば、いずれかの態様にしたがって標識されていてもよい。
標識化の方法としては、例えば、
（イ）目的核酸に標識物を直接導入する方法、
（ロ）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法、および
（ハ）標識化された単位核酸の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して目的核酸に相当する核酸あるいは目的核酸と相補的な核酸を合成する方法
などが具体例として挙げられる。
【００２５】
前記（イ）の目的核酸に標識物を直接導入する方法としては、目的核酸に光反応でビオチン誘導体を導入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ７４５  （１９８５）〕、目的核酸をスルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出する方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ３４６６−３４７０  （１９８４）〕などが、操作の簡便性、迅速性の点から好ましい。
【００２６】
前記（ロ）および（ハ）の方法としては、特定の核酸配列を増幅する方法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，  ８，  ２９１  （１９９０）  〕を利用することができる。これらの方法は目的核酸を増幅するという点で特に注目されているが、それのみならず、比較的簡単に目的核酸に相当する合成核酸あるいは目的核酸と相補的な合成核酸を標識化できる点でも利用価値が高い。例えば、ＰＣＲ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０，  １３５０−１３５４  （１９８５）〕にあっては、標識したプライマーを利用するか、あるいは、標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，  ６，  １１９７  （１９８８）〕にあっては、同様に標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオチドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくことによって伸長生成物または増幅生成物を標識することができる。特に（ロ）の方法が本発明にあっては好ましい。
【００２７】
ここで使用する標識物質とは、ハイブリダイゼーション操作後にこの物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等から、また本発明の効果を最もよく享有するものとして、非放射性の標識物質が好ましい。
【００２８】
非放射性の標識物質としては、例えばビオチン、２，４‐ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド等〕、４‐フルオロ‐７‐ニトロベンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらによりオリゴヌクレオチドを標識する場合は、いずれも公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）により、標識化を行うことができる。また、ヌクレオチド三リン酸を標識する場合は公知手段〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８０，  ４０４５  （１９８３）  、特開昭６３−１５２３６４公報〕に準じて行うか、市販品を利用することができる。
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、この核酸試料の標識は標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ＰＣＲ法によって増幅と同時に行われるのが好ましい。
【００３０】
本発明によるプライマーはいずれも、慣用の方法、例えばＤＮＡ合成機などを用いて化学的に合成する方法、より調製することができる。
【００３１】
プライマーセット
本発明によるプライマーセットは、前記した本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーを少なくとも２種含んでなる。本発明によるプライマーセットは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅に用いられる。
【００３２】
本発明の好ましい態様によれば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子増幅用プライマーセットは、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、前記配列８〜１４およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、プライマーを少なくとも２種含んでなる。
【００３３】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明によるプライマーセットは、
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１〜６およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと、
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと
を含んでなる。
【００３４】
本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、本発明によるプライマーセットは、
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列８〜１３およびそれらの相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと、
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマーと
を含んでなる。
【００３５】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原は、１３種類存在するし、具体的には、ＤＲＢ１＊０１、ＤＲＢ１＊０３、ＤＲＢ１＊０４、ＤＲＢ１＊０７、ＤＲＢ１＊０８、ＤＲＢ１＊０９、ＤＲＢ１＊１０、ＤＲＢ１＊１１、ＤＲＢ１＊１２、ＤＲＢ１＊１３、ＤＲＢ１＊１４、ＤＲＢ１＊１５、およびＤＲＢ１＊１６が存在する。このため、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を正確にタイピングするためには、これらすべてを増幅できることが必要である。本発明のプライマーによれば、これら１３種類のＤＲＢ１抗原を調製することができる。そして本発明によるプライマーセットを使用することにより、これらこれら１３種類のＤＲＢ１抗原の調製をより容易に行うことができる。
【００３６】
本発明のプライマーセットに用いられるプライマーは、本発明によるプライマーを少なくとも２種以上含むものであれば、特に制限はないが、下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のような増幅を可能とする本発明によるプライマーの組み合わせを含むのが好ましい：
（Ｄ１）ＤＲＢ１＊０１を特異的に増幅できるもの、
（Ｄ２）ＤＲＢ１＊０７、ＤＲＢ１＊１５、およびＤＲＢ１＊１６グループを特異的に増幅できるもの、
（Ｄ３）ＤＲＢ１＊０３、ＤＲＢ１＊０８、ＤＲＢ１＊１１、ＤＲＢ１＊１２、ＤＲＢ１＊１３、およびＤＲＢ１＊１４グループを特異的に増幅できるもの、
（Ｄ４）ＤＲＢ１＊０４を特異的に増幅できるもの、
（Ｄ５）ＤＲＢ１＊０９を特異的に増幅できるもの、および
（Ｄ６）ＤＲＢ１＊１０を特異的に増幅できるもの。
【００３７】
（Ｄ１）：  ＤＲＢ１＊０１を特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット１ａ、およびプライマーセット１ｂが挙げられる。
プライマーセット１ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット１ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列８およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００３８】
（Ｄ２）：  ＤＲＢ１＊０７、ＤＲＢ１＊１５、およびＤＲＢ１＊１６グループを特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット２ａ、およびプライマーセット２ｂが挙げられる。
プライマーセット２ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット２ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列９およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００３９】
（Ｄ３）：  ＤＲＢ１＊０３、ＤＲＢ１＊０８、ＤＲＢ１＊１１、ＤＲＢ１＊１２、ＤＲＢ１＊１３およびＤＲＢ１＊１４グループを特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット３ａ、およびプライマーセット３ｂが挙げられる。
プライマーセット３ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット３ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１０およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００４０】
（Ｄ４）：  ＤＲＢ１＊０４を特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット４ａ、およびプライマーセット４ｂが挙げられる。
プライマーセット４ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット４ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００４１】
（Ｄ５）：  ＤＲＢ１＊０９を特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット５ａ、およびプライマーセット５ｂが挙げられる。
プライマーセット５ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列５およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット５ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００４２】
（Ｄ６）：  ＤＲＢ１＊１０を特異的に増幅できるプライマーの組み合わせとしては、下記のプライマーセット６ａ、およびプライマーセット６ｂが挙げられる。
プライマーセット６ａ：
（ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列６およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ｉｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
プライマーセット６ｂ：
（Ｉ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー、および
（ＩＩ）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、少なくとも１種の本発明によるプライマー。
【００４３】
前記プライマーセット１ａ〜６ｂは、２以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
本発明のさらに好ましい態様によれば、下記（１）〜（７）のプライマーを少なくとも含んでなる、プライマーセットが提供される：
（１）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１のプライマー）、
（２）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第２のプライマー）、
（３）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第３のプライマー）、
（４）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第４のプライマー）、
（５）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列５およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第５のプライマー）、
（６）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列６およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第６のプライマー）、および
（７）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列７およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第７のプライマー）。
本発明の別のさらに好ましい態様によれば、下記（８）〜（１４）のプライマーを少なくとも含んでなる、プライマーセットが提供される：
【００４５】
（８）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列８およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第８のプライマー）、
（９）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列９およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第９のプライマー）、
（１０）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１０およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１０のプライマー）、
（１１）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１１およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１１のプライマー）、
（１２）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１２およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１２のプライマー）、
（１３）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１３およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１３のプライマー）、および
（１４）  前記（ａ）のオリゴヌクレオチドが、配列１４およびその相補鎖からなる群より選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、本発明によるプライマー（第１４のプライマー）。
【００４６】
タイピング方法
前記したように、本発明によるプライマーは、ＨＬＡタイピング、詳しくはＨＬＡ−ＤＲ座のタイピングにおいて用いられる核酸試料、特にＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子、を選択的にかつ高精度で調製することができるものである。すなわち、被験者由来のＤＮＡ、好ましくは白血球より抽出されたＤＮＡと、本発明によるプライマーとがハイブリダイズし、増幅反応が進行することにより、所望のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を特異的に増幅することができる。増幅された抗原遺伝子について、慣用のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子タイピング用プローブを用い、それらの相補性の有無を検出することによって、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピングを行うことができる。
【００４７】
よって、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング法は、本発明によるプライマーセットを用いる遺伝子増幅反応によって得られる核酸試料と、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブとの相補性の有無を検出することを含んでなる。
【００４８】
ここで「核酸試料」とは、前記した本発明によるプライマーセットを用いて、遺伝子増幅反応を行うことによって得られる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子を含む核酸試料のことをいい、通常、検体から採取された白血球を含む試料に基づいて、本発明によるプライマーセットを利用し、目的とするＤＲＢ１抗原遺伝子を増幅せることにより得られるものである。該核酸試料を作成する方法は、慣用の方法を適用することができる。
【００４９】
また「ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブ」とは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピングを行うことができるプローブとして、公知のプローブであれば、本発明においてはいずれのものも使用可能である。具体例を挙げると、例えば、特開平８−３０８５９６号公報に記載されているプローブなどが挙げられる。
【００５０】
本発明において、前記配列と核酸試料との相補性の有無を検出する操作は、存在する標識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
【００５１】
ここで、目的核酸に存在する標識が直接検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標識核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸から切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に応じた方法によって検出操作を行なう。また、標識が間接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばビオチン，ハプテンなどの特異的結合反応のリガンドである場合、一般的にそれらの検出に用いられているように、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジンまたは抗体）を使用して検出操作を行う。
【００５２】
タイピング用キット
本発明の別の態様によれば、本発明によるプライマーセットと、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子のタイピング用プローブとを少なくとも含んでなる、ＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原遺伝子タイピング用キットが提供される。
【００５３】
前記プローブは、特開平５−１９２１９８号公報に記載の方法によって、固相、好ましくはマイクロタイタープレートに一本鎖核酸として固定化してタイピングに利用されてもよい。このとき固定化される核酸は前記プローブ配列以外の任意の配列をさらに含んでいてもよい。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５５】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子特異的増幅
ＤＲＢ１遺伝子、ＤＲＢ３遺伝子、ＤＲＢ４遺伝子、ＤＲＢ５遺伝子、ＤＲＢ６遺伝子、ＤＲＢ７遺伝子をそれぞれクローニングしたプラスミド溶液（２０ｆｇ／μｌ）を用いて検討を行なった。前記ＤＲＢ遺伝子はいずれも健常者（社内ボランティア）より入手した。
これらのプラスミド溶液２μｌをそれぞれＰＣＲ反応液２０μｌに加えて、ＰＣＲを行なった。
このとき、ＰＣＲ反応液の組成は、各プライマーＴＡＧＡＭＰＤＲ１、ＴＡＧＡＭＰＤＲ２、ＴＡＧＡＭＰＤＲ３、ＴＡＧＡＭＰＤＲ４、ＴＡＧＡＭＰＤＲ９、ＴＡＧＡＭＰＤＲ１０をそれぞれ４ｐｍｏｌ／２０μｌ、ＴＡＧＡＭＰＤＲＢ８ｐｍｏｌ／２０μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ  ２単位／２０μｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ８ｍｍｏｌ／２０μｌ、２ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭ  硫酸アンモニウム、５％ＤＭＳＯ、および、８０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）であった。
なお使用したプライマーは、Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋにより化学合成して得られたものであった。
ＰＣＲの操作は、９６℃で３分加熱後、９６℃で１５秒の熱変性工程／６２℃で１５秒のアニーリング工程／７２℃で１５秒の伸長工程という３段階の温度サイクルを４０回繰り返して実施した。
【００５６】
ＰＣＲによる遺伝子増幅は、ＰＣＲ後の反応液５μｌを３％アガロースゲル上で電気泳動を行ない、ＤＮＡのバンドの有無を確認することによって、判定した。
【００５７】
結果は図１に示されるとおりであった。
図中、レーン１〜７は、ＤＲＢ１遺伝子をクローニングしたプラスミド溶液を用いたものであった。レーン１〜７は、遺伝子サンプルを採取した個体がそれぞれ異なるものであった。
図中、レーン８〜１５についてはそれぞれ、レーン８はＤＲＢ３遺伝子（ＤＲＢ３＊０１０１）、レーン９はＤＲＢ３遺伝子（ＤＲＢ３＊０２０２）、レーン１０はＤＲＢ３遺伝子（ＤＲＢ３＊０３０１１）、レーン１１はＤＲＢ４遺伝子（ＤＲＢ４＊０１０３）、レーン１２はＤＲＢ５遺伝子（ＤＲＢ５＊０１０１）、レーン１３はＤＲＢ５遺伝子（ＤＲＢ５＊０２０２）、レーン１４はＤＲＢ６遺伝子（ＤＲＢ６＊０１０１）、およびレーン１５はＤＲＢ７遺伝子（ＤＲＢ７＊０１０１１）をクローニングしたプラスミド溶液を用いたものであった。
【００５８】
ＤＲＢ１遺伝子がクローニングされたプラスミドでは、増幅を示すバンドが確認された（レーン１〜７）。
しかしながらそれ以外のＤＲＢ３、４、５、６および７遺伝子の場合は、増幅を示すバンドは確認されなかった（レーン８〜１５）。
【００５９】
【配列表】
2005000069.tif 000002
2005000069.tif 000003
2005000069.tif 000004
2005000069.tif 000005
2005000069.tif 000006
2005000069.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例の結果を示す図である。すなわち、本発明によるプライマーセットを用いて、ＤＲＢ遺伝子のＰＣＲによる遺伝子増幅を行った結果を示す電気泳動写真である。図中、レーン１〜７は、ＤＲＢ１遺伝子をクローニングしたプラスミド溶液を用いたものである。図中、レーン８〜１５はそれぞれ、レーン８〜１０はＤＲＢ３遺伝子、レーン１１はＤＲＢ４遺伝子、レーン１２はＤＲＢ５遺伝子、レーン１３はＤＲＢ５遺伝子、レーン１４はＤＲＢ６遺伝子、およびレーン１５はＤＲＢ７遺伝子をクローニングしたプラスミド溶液を用いたものである。
【図１】
2005000069.tif 000008