(57)【要約】【課題】分離膜の目詰まりの進行に先行して目詰まり原因細菌を容易に、正確にかつ迅速に検出することができ、検出結果により原因細菌に対する抑制処理を施すことができ、これにより分離膜の目詰まりを効率よく防止することができる分離膜の目詰まり防止方法、そのための目詰まり原因細菌の検出方法および核酸断片を提供する。【解決手段】活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりを防止する方法であって、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつ１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことを特徴とする分離膜の目詰まり防止方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりを防止する方法であって、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことを特徴とする分離膜の目詰まり防止方法。
【請求項２】
活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりの原因となる細菌を検出する方法であって、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
【請求項３】
標的となる１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡが、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列、またはこれらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
【請求項５】
リゾビウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片。
【請求項６】
請求項４または５記載の核酸断片からなる膜目詰まり細菌検出用ＰＣＲプライマー。
【請求項７】
請求項４または５記載の核酸断片を標識物質で標識した膜目詰まり細菌検出用プローブ。
【請求項８】
請求項４または５記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片からリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
【請求項９】
請求項７記載の標識プローブとＰＣＲを行った試料とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にしてリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
【請求項１０】
全細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出できる核酸プライマーに標識してＰＣＲ反応を行い、合成されたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析を行うことによって、リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
【請求項１１】
請求項８ないし１０記載の方法で検出されたリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌に対する抑制処理を施すことを特徴とする分離膜の目詰まり防止方法。
【請求項１２】
抑制処理が負荷条件または処理条件の変更によるものである請求項１または１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜に発生する目詰まりの防止方法、目詰まり原因細菌の検出方法および核酸断片に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
有機性廃水の生物処理方法としての活性汚泥法は、廃水を活性汚泥と混合して曝気し、混合液を固液分離して活性汚泥と処理液とを分離している。固液分離の手段として従来は、沈澱分離によって汚泥と処理水の分離が行われていた。この方法では混合液中の活性汚泥濃度を高くできないという問題点があったが、近年、膜分離技術の発達によって、浸漬型の分離膜が汚泥分離に利用されるようになってきた。分離膜としては、限外ろ過膜、ＭＦ膜等の半透膜が用いられ、その材質はポリアミド、ポリスルフォンなど種々の材質の半透膜が用いられている。これらの分離膜はモジュールとして曝気槽または固液分離槽内の混合液中に浸漬し、モジュールを吸引することにより分離膜を通して処理水を分離している。
【０００３】
しかしながら、このような膜分離プロセスでは分離膜の目詰まりが著しくなり、透過流束が低下して運転が不可能になってしまうケースがある。目詰まりの原因として、無機物による目詰まりのほかに、微生物の付着による目詰まりが考えられる。従来は目詰まりの原因を解明することなく、沈降性の指標であるＳＶＩや粘度を指標にして運転条件を制御していたが、その指標の数値が悪くなった場合は、すでに手遅れであり、目詰まり防止対策が間に合わない。
【０００４】
微生物の付着による分離膜の目詰まりは、汚泥中の微生物あるいは微生物の出す粘質物が原因であることが多いが、従来は目詰まりがどのような微生物によって引き起こされるかは明らかにされていなかった。このため微生物のモニタリングのように先行指標として利用できるものがなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、分離膜の目詰まりの進行に先行して目詰まり原因細菌を容易に、正確にかつ迅速に検出することができ、検出結果により原因細菌に対する抑制処理を施すことができ、これにより分離膜の目詰まりを効率よく防止することができる分離膜の目詰まり防止方法、そのための目詰まり原因細菌の検出方法および核酸断片を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は次の分離膜の目詰まり防止方法、目詰まり原因細菌の検出方法および核酸断片である。
（１）  活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりを防止する方法であって、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことを特徴とする分離膜の目詰まり防止方法。
（２）  活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりの原因となる細菌を検出する方法であって、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
（３）  標的となる１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡが、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつものである上記（１）または（２）記載の方法。
（４）  リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列、またはこれらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片。
（５）  リゾビウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片。
（６）  上記（４）または（５）記載の核酸断片からなる膜目詰まり細菌検出用ＰＣＲプライマー。
（７）  上記（４）または（５）記載の核酸断片を標識物質で標識した膜目詰まり細菌検出用プローブ。
（８）  上記（４）または（５）記載の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片からリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
（９）  上記（７）記載の標識プローブとＰＣＲを行った試料とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にしてリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
（１０）  全細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出できる核酸プライマーに標識してＰＣＲ反応を行い、合成されたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析を行うことによって、リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することを特徴とする分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法。
（１１）  上記（８）ないし（１０）記載の方法で検出されたリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌に対する抑制処理を施すことを特徴とする分離膜の目詰まり防止方法。
（１２）  抑制処理が負荷条件または処理条件の変更によるものである上記（１）または（１１）記載の方法。
【０００７】
本発明において、目詰まり防止の対象となる分離膜は、活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜である。活性汚泥は、有機性廃水の生物処理方法において廃水と混合して曝気し、有機物を分解するための好気性微生物を含む活性汚泥である。活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜は、モジュールとして曝気槽または固液分離槽内の混合液中に浸漬し、モジュールを吸引することにより分離膜を通して処理水を分離するように構成される。分離膜としては、限外ろ過膜、ＭＦ膜等の半透膜が用いられ、その材質はポリアミド、ポリスルフォンなど種々の材質の半透膜が対象となる。
【０００８】
有機性廃水の好気性生物処理方法として広く採用されている活性汚泥処理法では、好気性微生物が増殖し、その作用により有機物が分解される。正常な処理状態では、シュードモナスに属する細菌が優勢となって有機物が分解され、固液分離性のよい汚泥が生成する。この状態では、汚泥は沈降分離によって容易に分離でき、分離性悪化による汚泥の流出は少ない。この状態の汚泥は膜分離によっても容易に分離でき、分離膜の目詰まりはほとんど発生せず、透過流束（ｆｌｕｘ）の低下も少ない。
【０００９】
ところが負荷条件、環境条件、処理条件等が変動して、活性汚泥を構成する生物相が変化することにより、汚泥の固液分離性が悪化して汚泥が流出し、処理に必要な汚泥が確保できなくなるとともに、処理水質が悪化することが知られている。汚泥を分離膜で分離する場合における分離膜の目詰まりの原因についてはあまり検討されていないが、微生物が原因の場合は、負荷条件、環境条件、処理条件等が変動して、活性汚泥を構成する生物相が変化しているものと考えられる。
【００１０】
前述のように、従来は原因微生物の探求は行われていなかったが、その理由の１つとして原因微生物の単離が困難であることが挙げられる。分離膜の目詰まりが激しくなり、透過流束が低下したときの曝気槽の活性汚泥を遠心分離したところ、沈降した汚泥と上澄みとの界面に白っぽいゲル状のペレットが分離した。このペレットを分離して顕微鏡観察したところ、単一種の微生物が観察され、これが目詰まりの原因微生物であると認められた。このペレットの微生物をシャーレで培養することを試みたが、コロニーが形成されず、微生物を単離できなかったため、原因微生物の同定を行うことができなかった。
【００１１】
そこで上記のペレットを分離して後記の実施例のとおり１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定したところ、配列番号１の塩基配列が得られ、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌であると認められた。リゾビウム属細菌は土壌細菌である根粒菌の一種であり、粘質物を出すものと考えられ、分離膜に付着することにより目詰まりが発生する。配列番号１の塩基配列は、リゾビウム属の目詰まり原因細菌の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を示しており、このような塩基配列を有する細菌が存在する系では分離膜の目詰まりが発生する。分離膜の目詰まりは、このような配列番号１の塩基配列を有する細菌に限らず、リゾビウム属に属する近縁の細菌によっても発生する。本発明では、このような分離膜の目詰まり原因細菌を検出し、その増殖を抑制することにより、分離膜の目詰まりを防止する。
【００１２】
本発明の分離膜の目詰まり防止方法は、このようなリゾビウム属に属する膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした核酸の分析法で検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことにより、分離膜の目詰まり防止する方法である。標的となる１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡは、配列番号１の塩基配列のものが対象となるが、これと近縁のものでもよく、このため配列番号１と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつものも対象とすることができる。
【００１３】
このような目詰まり防止のために行われる原因細菌の検出方法は、活性汚泥と処理液とを分離するための分離膜の目詰まりの原因となる細菌を検出する方法であり、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした核酸の分析法で原因細菌を検出する。検出の試料としては、活性汚泥または膜付着物のどちらでもよいが、曝気槽、固液分離槽等の混合液中の活性汚泥を試料として原因細菌の検出を行うと、原因細菌が優勢となる前にこれを検出して抑制することができ好ましい。
【００１４】
標的となる１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとして、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつものを標的とした核酸の分析法で分析することにより、リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することができる。このような１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的とする核酸の分析法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）などがある。
【００１５】
このような検出に用いられる本発明の核酸断片は、リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸断片であって、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列、これらの塩基配列と９０％以上のホモロジーを有する塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸断片、またはリゾビウム属細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡに優先的にハイブリダイズする１０〜５０のヌクレオチドからなる核酸断片であって、少なくとも１０個の連続する塩基配列が、配列番号２〜９のいずれかの塩基配列と同じ塩基配列である核酸断片（以下、それぞれの配列番号の核酸断片およびその変形の核酸断片を含めて、それぞれの配列番号の核酸断片等という）である。
【００１６】
上記の配列番号２〜９の核酸断片はいずれも、配列番号１の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の一部分に相当する塩基配列であって、リゾビウム属の目詰まり原因細菌に特有部分の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列の核酸断片である。これらの配列番号２〜９の核酸断片の配列番号１の塩基配列中における位置は図１に示される。配列番号２〜９の核酸断片は等、リゾビウム属の目詰まり原因細菌の核酸から切り取り、あるいは公知の方法により化学的に合成することができる。
【００１７】
このような配列番号２〜９の核酸断片およびその変形の核酸断片を含む核酸断片等はいずれも、目詰まり膜細菌検出用のＰＣＲプライマーとして用いることができるほか、標識物質で標識した核酸断片を膜目詰まり細菌検出用プローブとして用いて、目詰まり原因細菌を検出することもできる。プライマーとして用いる場合およびプローブとして用いる場合とも、上記の核酸断片の単独または組み合わせで用いてもよく、また上記の核酸断片と他の核酸断片との組み合わせで用いてもよい。
【００１８】
上記の核酸断片のうち、配列番号２〜７の核酸断片等はプライマーとして用いるのが好ましい。ＰＣＲプライマーとして用いる場合は、配列番号２と３、配列番号４と５、および配列番号６と７の核酸断片等をそれぞれプライマーペアとし、それぞれの一方例えば配列番号２、４、６そのままの配列の核酸断片を一方のプライマー例えばアッパープライマーとし、他方例えば配列番号３、５、７と相補的な配列の核酸断片を他方のプライマー例えばロアープライマーとし、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつ１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、それぞれのプライマーペア間の塩基配列を有する核酸断片を増幅して得ることができ、リゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することができる。半定量的な検出にはブロックＰＣＲを利用できるが、さらに定量性の高い検出を行う場合は、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを利用するのが好ましい。
【００１９】
上記の配列番号８〜９の核酸断片等は標識物質で標識しプローブとして用いるのが好ましい。配列番号２〜７の核酸断片等をプライマーとしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行う際、配列番号８〜９の核酸断片等を標識物質で標識しプローブとして用いると、ＰＣＲの過程における増幅の状態が検出できるので好ましい。この場合、配列番号８〜９と相補的な配列の核酸断片を標識物質で標識しプローブとして用いると、ＰＣＲにより増幅される核酸断片にハイブリダイズするため、標識物質を検出することにより、ＰＣＲの過程における増幅の状態が検出できる。標識をつけたプローブとしては、核酸断片を放射性元素、酵素、蛍光物質または化学物質等の標識物質を結合させて標識した核酸断片を用いることができる。
【００２０】
配列番号２〜９の核酸断片等は、プライマーとしても、プローブとしても用いることもできるほか、プライマーとプローブを兼用することもできる。単にプローブとして用いる核酸断片等は、標識物質を５’末端または３’末端のどちらに付けてもよいが、プライマーと兼用する核酸断片等は、標識物質を５’末端に付け、３’末端は遊離の状態にしておくことにより、３’末端側への核酸の伸長を許容することができる。プローブ専用として用いる核酸断片等の５’末端に標識物質を付けた場合は、３’末端を燐酸等でブロックしてＰＣＲを行うことにより、３’末端側への核酸の伸長を阻止することができる。３’末端をブロックしてプローブ専用として用いる核酸断片等は、１本鎖の核酸にハイブリダイズして検出されるが、ＰＣＲの進行によりプライマーから核酸が伸長するのに伴ってはじき飛ばされ、サイクルの進行により１本鎖になった核酸に再度ハイブリダイズして検出される。プライマー専用として用いる核酸断片等は、標識を付けないで用いることができる。
【００２１】
本発明の目詰まり原因細菌の検出方法では、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出する。分析試料としては、活性汚泥または膜付着物のどちらでもよいが、活性汚泥を試料とし時間間隔をおいて分析すると、増殖が少ない段階から経時的に活性汚泥中の目詰まり細菌の棲息状況が分かるので、それらの増殖が少ない段階で対処でき好ましい。この場合、処理系から活性汚泥を採取して、公知の方法で核酸を抽出して分析試料とすることができる。膜付着物を分析試料とする場合は、分離膜から付着物を集めて分析試料とすることができる。
【００２２】
ＰＣＲで膜目詰まり細菌を検出する場合は、上記の核酸断片をプライマーとし、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、合成された核酸断片から配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することにより、分離膜の目詰まり原因細菌の検出を行う。この場合、標識プローブとＰＣＲを行った試料とを接触させてＲＮＡまたはＤＮＡハイブリダイゼーションを行った後、標識を指標にして検出することにより、容易にリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することができる。
【００２３】
Ｔ−ＲＦＬＰ解析膜目詰まり細菌を検出する場合は、ユニバーサルプライマー、すなわち全細菌の１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出できる核酸プライマーに標識してＰＣＲ反応を行い、合成されたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、Ｔ−ＲＦＬＰ解析を行うことによって、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出することができる。特定の制限酵素による切断位置は、それぞれの細菌によって異なるので、ＰＣＲ産物の特定位置例えば末端に標識をつけ、切断された核酸断片の長さを測定することによりそれぞれの細菌を検出することができる。この場合、ユニバーサルプライマーを用いることにより、全細菌の中から配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつ細菌を検出することができるが、配列番号２〜９の核酸断片等をプライマーとして用いることもできる。
【００２４】
本発明の分離膜の目詰まり防止方法は、上記の方法で検出されたリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことにより分離膜の目詰まりを防止する方法である。膜目詰まり細菌に対する抑制処理としては、抗菌剤による処理など、公知の細菌の増殖を抑制する処理が採用できるが、活性汚泥の活性を低下させない処理が好ましく、負荷条件または処理条件の変更により細膜目詰まり菌の増殖を抑制できるのであれば、そのような抑制処理が好ましい。リゾビウム属の膜目詰まり細菌の場合、低温で増殖するので、処理温度を上げるなどの処理条件の変更により菌の増殖を抑制できる。
【００２５】
リゾビウム属細菌による膜分離の目詰まりが著しくなるのは、活性汚泥中のリゾビウム属細菌の優占度が著しく上昇したときに起きるため、活性汚泥を試料とする分析を継続的に行うことにより、この細菌の優占度が少ない時点で目詰まり原因細菌を検出し、細菌の増殖を抑制する対策をとれば、目詰まりによる膜分離装置の運転不可によるトラブルは未然に防げる。汚泥内に目詰まり原因菌がいるか否かを調査する場合、配列番号１の塩基配列またはこれと９０％以上のホモロジーを有する塩基配列をもつリゾビウム属細菌と相同性の高い１６ＳｒＤＮＡが検出されれば、目詰まりの可能性はさらに高くなる。
【００２６】
この場合、リゾビウム属細菌のＤＮＡを対象とした微生物分析技術によれば、目詰まり原因細菌を正確に捉えることができるとともに、その検出感度は高い。また定量性があるため、目詰まり原因細菌が増えている悪い状態か、または減っている回復状態かも早い段階で判断できる。そのため目詰まりによる運転不能を未然に防いだり、目詰まり原因細菌が減っている状態にあるか否かを調べて、講じた対策が適切であるか等の評価も可能となり、最終的には適切な対応策の発見につながることになる。
【００２７】
このようにして遺伝子レベルで定期的に分析を行い、目詰まり原因細菌の濃度が高かったり、高くなる傾向がみられたら、運転条件変更等による細菌の増殖を抑制する対応を行うことにより、目詰まり未然に防止することができる。この場合、水温が低下するとリゾビウム属細菌が増殖するので、冬期に目詰まり問題が起きた場合は、処理系の水温を上昇させるような対策をとることにより、著しい目詰まりを未然に防ぐことができる。このように目詰まり原因細菌を検出し、モニタリングすることによって、膜分離の工程がある生物処理装置での膜の目詰まりを未然に防いだり、最小限に止めることが可能となる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の分離膜の目詰まり防止方法によれば、活性汚泥または膜付着物中におけるリゾビウム属の膜目詰まり細菌およびこれと近縁な細菌を、１６ＳｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを標的にした分析法で検出し、検出された細菌に対する抑制処理を施すことにより、分離膜の目詰まりの進行に先行して目詰まり原因細菌を容易に、正確にかつ迅速に検出することができ、検出結果により原因細菌に対する抑制処理を施すことができ、これにより分離膜の目詰まりを効率よく防止することができる。
【００２９】
本発明の分離膜の目詰まり原因細菌の検出方法によれば、分離膜の目詰まりの進行に先行して目詰まり原因細菌を容易に、正確にかつ迅速に検出することができ、これにより目詰まりの進行に先行して原因細菌に対する抑制処理を施すことが可能になる。
本発明の核酸断片によれば、上記の目詰まり原因細菌の検出を可能にすることができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００３１】
実施例１：（配列番号１の塩基配列決定）：
活性汚泥と処理液とを分離膜で分離している浸漬型膜分離装置を有する有機性廃水の生物処理槽において、分離膜の目詰まりが激しくなり透過流束が低下した状態の活性汚泥１ｍＬを採取して２ｍＬ容のチューブに入れ、８０００  ｘ  ｇにて４℃で１５分間を遠心分離したところ、沈降した汚泥と上澄みとの界面に白っぽいゲル状のペレットが分離した。このペレットを分離して顕微鏡観察したところ、単一種の微生物が観察され、これが目詰まりの原因微生物であると認められた。このペレットの微生物をシャーレで培養することを試みたが、コロニーが形成されず、微生物を単離できなかったため、原因微生物の同定を行うことができなかった。
【００３２】
（ＤＮＡ抽出法）：
上記のペレット５０μＬを分離して２ｍＬ容のチューブに入れ、そのチューブにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ［ｐＨ  ８．０］，  １００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ  ［ｐＨ  ８．０］，  １００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ［ｐＨ  ８．０］，  １．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  （１０  ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温、再び上記のＢｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００  ｘ  ｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００  ｘ  ｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、５０μＬのＴＥ（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解し、スピンカラムにて精製を行ってＤＮＡを抽出した。
【００３３】
（塩基配列の決定）：
抽出したＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；  ９４℃，２分に続き、第１段階；９４℃，２０秒、第２段階；５５℃，３０秒、第３段階；７２℃，２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃，７分を行った。この際プライマーは、ユニバーサルプライマーとしてほとんどの細菌の全域１６ＳｒＤＮＡを合成するためによく利用されているＢａｃｔ００１１（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）およびＢａｃｔ１４９２（５’−ＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ  −３’）を使用した。合成された約１４５０ベースの１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりシーケンスモードで解析して決定し、配列番号１の塩基配列を得た。本塩基配列は、上記プライマーに挟まれた１６ＳｒＤＮＡ部分の塩基配列であり、リゾビウム属の細菌であると認められた。これにより本汚泥は、ほぼ完全にリゾビウム細菌で優占化されており、抽出ＤＮＡはリゾビウム細菌由来であると判断できた。
【００３４】
実施例２：（配列番号２〜９の核酸断片の作成）：
配列番号１の塩基配列からリゾビウム属の目詰まり原因細菌に特有な配列部分をコンピュータで予測し、化学合成により配列番号２〜９の核酸断片を作成した。
上記により作成した配列番号２〜９の核酸断片の塩基配列を表１に示す。また配列番号１の核酸断片の全体の塩基配列を図１に示し、その中の配列番号２〜９の核酸断片の塩基配列の位置を図１に矢印で示す。
【００３５】
表１  膜目詰まり菌細菌を検出するために利用した核酸の塩基配列
【表１】
2005000082.tif 000002
【００３６】
実施例３：（ブロックＰＣＲによる原因細菌の検出）：
（ＤＮＡの抽出）
活性汚泥サンプル０．５ｍＬを２ｍＬ容のチューブに入れた。８０００  ｘ  ｇにて４℃で１５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。さらにそのチューブにＺｉｒｃｏｎｉａ／Ｓｉｌｉｃａ  Ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍｍ）１ｍＬおよびＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ［ｐＨ  ８．０］，  １００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ  ［ｐＨ  ８．０］，  １００  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ［ｐＨ  ８．０］，  １．５  Ｍ  ＮａＣｌ  ）１ｍＬを加え、細胞破砕機Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒで２分間処理した。次に凍結融解を３回繰り返した後、１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  （１０  ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にて３０分間保温した。この液に、２５０μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、６５℃で２時間保温、再び上記のＢｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ処理を行った。その後８０００  ｘ  ｇにて室温で１０分間遠心分離し、上清を採取した。上清はクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加後、室温で６０分間静置、８０００  ｘ  ｇにて室温で２０分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿は７０％エタノールで洗浄後、乾燥させ、５０μＬのＴＥ（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解し、スピンカラムにて精製を行った。この抽出ＤＮＡを利用して下記の通りＰＣＲ反応を行い目詰まり原因菌リゾビウム属細菌の挙動を調査した。
【００３７】
（ブロックＰＣＲ）：
配列番号２のＫＷＩ−Ｒｈｉ８６の核酸断片と、配列番号３のＫＷＩ−Ｒｈｉ５１１の相補の核酸断片とをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；９４℃，２分に続き、第１段階；９４℃，２０秒、第２段階；５５℃，３０秒、第３段階；７２℃，３０秒を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；７２℃，７分を行った。ＰＣＲ増幅によってリゾビウム属細菌が検出された。
【００３８】
実施例４：（ブロックＰＣＲ）：
同様に、配列番号４のＫＷＩ−Ｒｈｉ４９２の核酸断片と、配列番号５のＫＷＩ−Ｒｈｉ７５１の相補の核酸断片のプライマーペアを用いたＰＣＲを行ったところ、ＰＣＲ増幅によってリゾビウム属細菌が検出された。
【００３９】
実施例５：（ブロックＰＣＲ）：
同様に、配列番号６のＫＷＩ−Ｒｈｉ７３８の核酸断片と、配列番号８のＫＷＩ−Ｒｈｉ１１７７の相補の核酸断片のプライマーペアを用いたＰＣＲを行ったところ、同様にＰＣＲ増幅によってリゾビウム属細菌が検出された。
【００４０】
実施例６：（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによる１６ＳｒＤＮＡの定量）
浸漬型膜分離装置が導入されている活性汚泥装置から、汚泥を定期的に採取し、その汚泥の中に含有されている目詰まり原因菌リゾビウム属細菌の濃度測定を行った。
前述と同様に抽出したＤＮＡ溶液をＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）にて１０倍に希釈した後、１μＬをテンプレートにＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲをロッシュ・ダイアグノスティック株式会社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）を利用して行った。その際、アッパープライマーとしては配列番号２のＫＷＩ−Ｒｈｉ８６を、ローワープライマーとしては配列番号３のＫＷＩ−Ｒｈｉ５１１と相補的な核酸を利用した。また、ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号８のＫＷＩ−Ｒｈｉ１６３と相補的な核酸の３’末端をＦＩＴＣにて標識したもの、および配列番号のＫＷＩ−  Ｒｈｉ１３７の相補的な核酸の３’末端をリン酸化し、５’末端をＬＣＲｅｄ６４０にて標識したものを利用した。ＰＣＲ反応にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓキット（商標）を利用した。反応条件は表２に示すとおりである。
【００４１】
表２  ハイブリダイゼーション法の運転条件
【表２】
2005000082.tif 000003
【００４２】
（結果）
浸漬型膜分離装置を冬季１１月から膜Ｆｌｕｘ  ０．５ｍ／ｍ２・日で運転していたところ、翌年１月より、膜Ｆｌｕｘ  が低下し始めたため、１月から１週間おきにリゾビウム細菌の１６ＳｒＤＮＡの汚泥中濃度（ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）を上記のように測定した。その結果、１月４日には４  ｘ  １０６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであったものが、１月１１日には８  ｘ  １０７ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１月１８日には５  ｘ  １０８ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬと増加していることが明らかとなった。
そこで、その時期の水温を調査した結果、１月４日には１８℃あったものが、１１日には１５℃、１８日には１３℃まで低下しており、水温低下が目詰まり原因菌であるリゾビウム細菌を増加させている因子であると判断し、加温を１月２０日から開始した。水温は１８℃に設定した。
その後、リゾビウム細菌の濃度は低下し１０７ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬのレベルに下がり、Ｆｌｕｘの低下も停止した。
【００４３】
実施例７：（Ｔ−ＲＦＬＰによる検出）：
実施例６のＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲと並行して、目詰まり原因菌であるリゾビウム細菌をＴ−ＲＦＬＰによって検出した例を示す。
上記の通り抽出したＤＮＡをテンプレートにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｒｅ−ｈｅａｔｉｎｇ；  ９４℃，２分に続き、第１段階；９４℃，２０秒、第２段階；５５℃，３０秒、第３段階；７２℃，２分を３０サイクル繰り返し、Ｐｏｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；  ７２℃，７分を行った。この際、プライマーはユニバーサルプライマーのＢａｃｔ００１１（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）の５’末端を６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（６−ＦＡＭ）で標識したもの、およびＢａｃｔ１４９２（５’−ＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ  −３’）を使用した。ＰＣＲ増幅産物は適量を制限酵素ＢｓｔＵＩにより、（ＣＧＣＧ）の位置で切断した。切断した１６ＳｒＤＮＡはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒによりＧｅｎｅ  Ｓｃａｎモードで解析して得たＴ−ＲＦＬＰ（０〜５５０ｂａｓｅｓの範囲）のピークデータを図２に示す。
【００４４】
図２において、８７ベースの位置に検出されるピーク（黒塗り）が目詰まり原因菌であるリゾビウム細菌であり、ピークの積分値がそれぞれの細菌の分量を示す。図２の各チャートは１月４日、１月１１日、１月１８日のデータを示し、１月４日から１月１１日、１月１８日に至るに従って次第にリゾビウム細菌が優勢になっていることが分かる。
このように、Ｔ−ＲＦＬＰによっても検出が可能であり、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲとどちらを使っても目詰まり菌のモニタリングができることが分かる。
【００４５】
【配列表】
2005000082.tif 000004
2005000082.tif 000005
2005000082.tif 000006
2005000082.tif 000007
2005000082.tif 000008
2005000082.tif 000009
2005000082.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、２による核酸断片の塩基配列を示す配列図である。
【図２】実施例７の結果を示すピークデータのチャートである。
【図１】
2005000082.tif 000011
【図２】
2005000082.tif 000012