(57)【要約】【課題】  Thermus属細菌内で実用上十分に高い転写活性を示すプロモーター配列、Thermus属細菌内で機能できる転写終結配列、Thermus属細菌内で外来遺伝子を高レベルで発現できる発現ベクターおよびこの発現ベクターを用いた効率的なタンパク質生産方法を提供する。【解決手段】  5'末端側からTTTCTCTの塩基配列及びAAACCTの塩基配列を含むプロモーター配列、又はTTTATTCの塩基配列及びTACCGTの塩基配列を含むプロモーター配列。配列番号１又は２に記載の塩基配列からなる転写終結配列。これらは、高度好熱性であるThermus属細菌内で機能させる発現ベクターの構成要素として使用するためのものである。本発明の発現ベクターは、Thermus属細菌内で複製するのを妨げない位置に、上記のプロモーター、及び転写終結配列が挿入されている。【選択図】  図２
2005261360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'末端側から、TTTCTCTの塩基配列及びAAACCTの塩基配列を含む、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列。
【請求項２】
TTTCTCTの塩基配列とAAACCTの塩基配列との間に15〜18塩基からなる配列が存在する請求項１に記載のプロモーター配列。
【請求項３】
31塩基以下の大きさである請求項１又は２に記載のプロモーター。
【請求項４】
5'末端側から、TTTATTCの塩基配列及びTACCGTの塩基配列を含む、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列。
【請求項５】
TTTATTCの塩基配列とTACCGTの塩基配列との間に15〜18塩基からなる配列が存在する請求項４に記載のプロモーター配列。
【請求項６】
31塩基以下の大きさである請求項４又は５に記載のプロモーター。
【請求項７】
配列番号１に記載の塩基配列からなる、Thermus属細菌内で機能させるための転写終結配列。
【請求項８】
配列番号２に記載の塩基配列からなる、Thermus属細菌内で機能させるための転写終結配列。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列又は請求項４〜６のいずれかに記載のプロモーター配列と、請求項７又は８に記載の転写終結配列とを含む、Thermus属細菌内で機能させるための発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列又は請求項４〜６のいずれかに記載のプロモーター配列と、請求項７又は８に記載の転写終結配列との間であって、このプロモーター配列及び転写終結配列の支配下の位置に外来遺伝子が挿入された請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターをThermus属細菌に導入し、さらにこのThermus属細菌を培養する工程と、培養物から外来遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Thermus属細菌細胞内で機能できるプロモーター配列、Thermus属細菌細胞内で機能できる転写終結配列、これらを含むThermus属細菌用の発現ベクター、外来遺伝子を有する組換え発現ベクター、並びにこの組換え発現ベクターを用いたタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、37℃で生育する常温性菌においては、例えば大腸菌では、遺伝子導入系の確立により、遺伝子組換えが行われている。また、60℃以下で生育する中等度好熱菌を宿主とするファージを用いた遺伝子導入系は存在する。
【０００３】
70℃以上で生育する高度好熱菌であるThermus属細菌は、高温環境下での耐熱性蛋白質の生産などに有用な細菌である。Thermus属細菌については、本出願人が、Thermus属細菌に感染できる好熱性ファージφIN93を発見し（特許文献１）、外来遺伝子を組み込んだファージφIN93を用いてThermus属細菌を形質転換する方法（特許文献２）を報告している。
【０００４】
しかし、特許文献２に記載の方法では、Thermus属細菌に感染できる好熱性ファージのDNA中の、転写活性の高いプロモーター配列の位置、転写終結配列の位置は確認されていなかった。従って、目的とするタンパク質を大量に生産するまでには至っていなかった。
【０００５】
また、我々は、特許文献３において、Thermus属細菌内で高い転写活性を示すプロモーター配列としてGACTTCを含む塩基配列を報告している。また、Thermus属細菌内で高い翻訳活性を示すリボソーム結合配列としてTTTGGAGGを含む塩基配列を報告している。
【０００６】
しかし、これらの配列を用いて発現ベクターを構築し、Thermus属細菌内で実際にタンパク質を発現させてみると、その発現量は実用上十分なものではなかった。
【特許文献１】特開平7-67633号公報
【特許文献２】特開2000-287686号公報
【特許文献３】特開2003-9879号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Thermus属細菌内で実用上十分に高い転写活性を示すプロモーター配列、Thermus属細菌内で機能できる転写終結配列、Thermus属細菌内で外来遺伝子を高いレベルで発現できる発現ベクターおよびこの発現ベクターを用いた効率的なタンパク質生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(1)  ファージφIN93を感染させたThermus aquaticus TZ2株培養液からmRNAを抽出し、これを鋳型としたプライマーエクステンション法を行い、ファージφIN93DNAの既知の全塩基配列から、mRNAの開始点を決定した。さらに、その上流-35塩基及び-10塩基の領域に見られたATリッチな塩基配列を、プロモーターの-35領域及び-10領域であると予測した。
【０００９】
実際には、このようにして予測されたプロモーター配列がタンパク質を発現させることができるとは限らない。このような状況の下で、プライマーエクステンション法により予測された上記プロモーター配列を含む発現ベクターは、Thermus属細菌内で外来遺伝子を高レベルで発現させた。
(2)  また、mRNAの開始点の上流には前の転写単位の終結配列が存在する。これを考慮して、ファージφIN93DNAの既知の全塩基配列から、コンピューターソフトウェアを用いて特異なパリンドローム構造の配列を含む配列番号１及び２の各配列を転写終結配列と予測した。
【００１０】
このようにして予測された転写終結配列は、実際には、転写を終結させる機能を有さない場合も多い。このような状況の下で、配列番号１及び2の各配列を外来遺伝子をコードする配列の直後に組み込んだ発現ベクターは、Thermus属細菌内で外来遺伝子を単独で発現させた。即ち、配列番号１及び２の配列はThermus属細菌内で機能する転写終結因子であった。
【００１１】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の、プロモーター配列、転写終結配列、発現ベクター、及びタンパク質の生産方法を提供する。
【００１２】
項１．  5'末端側から、TTTCTCTの塩基配列及びAAACCTの塩基配列を含む、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列。
【００１３】
項２．  TTTCTCTの塩基配列とAAACCTの塩基配列との間に15〜18塩基からなる配列が存在する項１に記載のプロモーター配列。
【００１４】
項３．  31塩基以下の大きさである項１又は２に記載のプロモーター。
【００１５】
項４．  5'末端側から、TTTATTCの塩基配列及びTACCGTの塩基配列を含む、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列。
【００１６】
項５．  TTTATTCの塩基配列とTACCGTの塩基配列との間に15〜18塩基からなる配列が存在する項４に記載のプロモーター配列。
【００１７】
項６．  31塩基以下の大きさである項４又は５に記載のプロモーター。
【００１８】
項７．  配列番号１に記載の塩基配列からなる、Thermus属細菌内で機能させるための転写終結配列。
【００１９】
項８．  配列番号２に記載の塩基配列からなる、Thermus属細菌内で機能させるための転写終結配列。
【００２０】
項９．  項１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列又は項４〜６のいずれかに記載のプロモーター配列と、項７又は８に記載の転写終結配列とを含む、Thermus属細菌内で機能させるための発現ベクター。
【００２１】
項１０．  項１〜３のいずれかに記載のプロモーター配列又は項４〜６のいずれかに記載のプロモーター配列と、項７又は８に記載の転写終結配列との間であって、このプロモーター配列及び転写終結配列の支配下の位置に外来遺伝子が挿入された項９に記載の発現ベクター。
【００２２】
項１１．  項１０に記載の発現ベクターをThermus属細菌に導入し、さらにこのThermus属細菌を培養する工程と、培養物から外来遺伝子がコードするタンパク質を回収する工程とを含むタンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によると、好熱性細菌であるThermus属細菌を用いて、高温環境下で効率良くタンパク質を生産することができる。また、Thermus属細菌は一般に70℃以上の高温環境下でも生存できることから、70℃以上の高温下でも機能する耐熱性タンパク質を高温環境下で生産することにより、このタンパク質およびこれをコードする遺伝子の耐熱性構造を維持したままでタンパク質を生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）プロモーター
本発明の第１のプロモーターは、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列であって、5'末端側から、TTTCTCTの塩基配列及びAAACCTの塩基配列を含むものである。TTTCTCTの塩基配列は-35領域と称される領域であり、AAACCTの塩基配列は-10領域と称される領域である。
【００２５】
同様に、本発明の第２のプロモーター配列は、Thermus属細菌内で機能させるためのプロモーター配列であって、5'末端側から、TTTATTCの塩基配列及びTACCGTの塩基配列を含むものである。TTTATTCの塩基配列は-35領域と称される領域であり、TACCGTの塩基配列は-10領域と称される領域である。
【００２６】
第１及び第２のプロモーターにおいて、-35領域の配列と-10領域の配列との間には、通常15〜18塩基程度、好ましくは16〜17塩基程度の塩基配列が挿入されている。
【００２７】
また、本発明の第１及び第２のプロモーター配列は、上記-35領域配列及び-10領域配列を含み、通常、31塩基以下からなり、好ましくは30塩基以下からなる。
【００２８】
本発明のプロモーターとしては、代表的には、ファージφIN93DNAの全塩基配列（日本DNAデータバンクにおけるアクセッション番号：AB063393)中に存在し、上記の-35領域配列及び-10領域配列を含む28〜31塩基程度の塩基配列が挙げられる。
【００２９】
本発明のプロモーターは化学合成により得ることができる。また、ファージφIN93DNAを鋳型として、このDNAの塩基配列に基づき設計されたプライマーを用いたPCRによっても得ることができる。
【００３０】
本発明のプロモーターを機能させるThermus属細菌は特に限定されないが、代表的な種として、Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus nonproteolyticus、Thermus ruber、Thermus filiformisなどを例示できる。本発明のプロモーターは、特にThermus aquaticus内で機能させるのに好適に使用できる。
（ＩＩ）転写終結因子
本発明の転写終結配列は、Thermus属細菌内で機能させるための転写終結配列であって、配列番号１に記載の塩基配列からなるもの、及び配列番号２に記載の塩基配列からなるものが包含される。
【００３１】
本発明の転写終結配列は、GCリッチなステムとループとを有する高次構造を与えるパリンドローム構造を採っている。
（ＩＩＩ）発現ベクター
本発明の発現ベクターは、Thermus属細菌内で機能させるための発現ベクターであって、本発明の第１のプロモーター配列又は第２のプロモーター配列と、本発明の第２の転写終結配列又は第２の転写終結配列とを含むものである。
【００３２】
本発明の発現ベクターは、通常、Thermus属細菌内で自律複製するための起点を有する。複製のための塩基配列としては、代表的には、ファージφIN93に由来するものが挙げられる。
【００３３】
また、上記プロモーター配列と転写終結配列との間には、通常、Thermus属細菌内で機能できるリボゾーム結合配列(SD配列）を有していればよい。このようなリボソーム結合配列としては、代表的には、ファージφIN93に由来するもの、例えば、TTTGGAGGを含む配列が挙げられる。
【００３４】
本発明の発現ベクターの大きさは、２〜30kbp程度であることが好ましい。この範囲であれば、複製及び外来遺伝子の発現に必要な領域を含むとともに、良好なDNA導入効率が得られる。
【００３５】
本発明の発現ベクターを機能させるThermus属細菌の種類は前述した通りである。本発明の発現ベクターは、特にThermus aquaticus内で機能させるのに好適に使用できる。
【００３６】
本発明の発現ベクターは、Thermus属細菌内で複製できる複製開始点を含むDNA断片（例えば、ファージφIN93のDNAの複製起点を含む断片）に、本発明のプロモーター及び転写終結配列を挿入し、好ましくはさらにSD配列を挿入することにより得ることができる。
【００３７】
さらに、本発明の発現ベクターは、本発明のプロモーターと本発明の転写終結配列との間であって、このプロモーター及び転写終結配列の支配下の位置に、外来遺伝子を含むことができる。外来遺伝子を発現させるための開始コドンは、-10領域から例えば６塩基又はそれより下流に位置していればよく、好ましくは６〜25塩基程度下流に位置していればよい。また、外来遺伝子は、リボソーム結合部位の下流のこれにより支配可能な位置に挿入されていればよい。
【００３８】
外来遺伝子は特に限定されず、任意の遺伝子を挿入できるが、好ましくは耐熱性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３９】
耐熱性タンパク質をコードする遺伝子とは、40℃以上、好ましくは50℃、より好ましくは60℃以上、特に70℃以上の温度下でも活性を保持できるタンパク質をコードする遺伝子を意味する。具体的には、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子、耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子、耐熱性グルタミナーゼ遺伝子、耐熱性プロテアーゼ遺伝子などの熱安定性酵素をコードする遺伝子、熱ショックタンパク質をコードする遺伝子、groEL遺伝子、groES遺伝子、dnaK遺伝子、hsp70遺伝子などが挙げられる。
【００４０】
Thermus属細菌内で増殖できるファージDNA中に本発明のプロモーター配列、リボソーム結合配列、外来遺伝子、及び本発明の転写終結配列を組込む場合は、これらは、ファージが菌に感染後、複製増殖するのに影響の無い領域に組み込めばよい。
（ＩＶ）タンパク質の生産方法
外来遺伝子を挿入した本発明の発現ベクターを用いて、この外来遺伝子がコードするタンパク質を生産するに当たっては、先ず、例えばThermus属細菌と発現ベクターとの共培養によるトランスフェクションにより、発現ベクターをThermus属細菌に導入すればよい。
【００４１】
Thermus属細菌としては、Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermus nonproteolyticus、Thermus ruber、Thermus filiformisなどが挙げられる。特に、Thermus aquaticusが好ましい。
【００４２】
トランスフェクションは、例えば、Thermus属細菌の終夜培養菌液を新たな培地に接種し、菌液の濁度がOD660（660nmで測定した場合のOptical  Density）=0.1〜0.2程度になった時点で、組換え発現ベクターを、菌液1ml当たり50〜100ng程度添加し、さらに培養することにより行うことができる。
【００４３】
Thermus属細菌を培養するための培地は公知のものを使用できるが、代表的には、A2培地（0.1%トリプトンおよび0.1%酵母抽出液を含むCastenholtzの基礎塩溶液、(pH7.5):Brock,T.D.およびFreez,H.,(1969)J.Bacteriol.98,289-297）が挙げられる。Castenholtzの基礎塩溶液は、蒸留水1リットルにニトリロ三酢酸(1g)、CaSO4・2H2O(0.6g)、MgSO4・7H2O(1.0g)、NaCl(0.08g)、KNO3(1.03g)、NaNO3 (6.89g)、Na2HPO4 (1.11g)、FeCl3 (0.28g)、Nitsch微量元素溶液が含まれるものである。Nitsch微量元素溶液は、蒸留水1リットルにH2SO4 (0.5ml)、MnSO4・H2O（2.2g)、ZnSO4・７H2O(0.5g)、H3BO3 (0.5g)、CuSO4（0.016g）、Na2MoO4・2H2O(0.025g)、CoCl2・6H2O(0.046g)を溶解したものである。
【００４４】
培養温度は、60〜80℃程度の範囲内で、使用菌株の至適生育温度及び外来遺伝子の耐熱性を考慮して定めればよい。培養時間は４〜20時間程度とすればよい。
【００４５】
発現ベクターが溶菌サイクルで外来遺伝子を発現させるものである場合は、発現ベクターをThermus属細菌と共培養することによりトランスフェクションさせ、さらに溶菌するまで培養を継続すればよい。例えば、Thermus属細菌のA2培地による終夜培養菌液を新たなA2培地に接種し、菌液の濁度がOD660（660nmで測定した場合のOptical  Density）=0.1〜0.2程度になった時点で、組換えベクターを、菌液1ml当たり50〜100ng程度添加し、さらに、同様の条件で4時間程度培養すればよい。培養温度は、60〜80℃程度の範囲で、使用菌株の至適生育温度及び外来遺伝子の耐熱性を考慮して最適温度を定めればよい。
回収工程
目的とするタンパク質が菌体内に分泌されるものである場合は、菌体を超音波破砕、ホモジナイズのような公知の方法で破砕し、破砕液から目的タンパク質を回収すればよい。
【００４６】
また、目的タンパク質が培地中に分泌されるものである場合、及び目的タンパク質が溶菌により培地中に放出されるものである場合は、培養液を回収することにより目的タンパク質を回収できる。特に、溶菌サイクルで外来遺伝子を発現させるファージベクターを用いる場合は、溶菌により培養液中に目的タンパク質が放出されるため、培養液を回収すればよい。
【００４７】
さらに、培養液から、塩析、各種クロマトグラフィーなどの公知のタンパク質精製手段により目的タンパク質を精製してもよい。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
1）プロモーターの位置の決定
m‐RNAを抽出して、解析することで、ファージφIN93DNA上に存在する2箇所のプロモーターの位置を決定した。
【００４８】
まず、ファージφIN93を、宿主であるThermus aquaticus TZ2株に感染させることにより、TZ2の菌体内で発現するファージφIN93由来のm‐RNAを抽出した。
【００４９】
ファージφIN93の感染は、ファージφIN93液10μl（107pfu/ml）を、A2培地で培養したThermus aquaticus TZ2株の培養液5ml（OD= 0.2）に添加して、70℃で培養することにより行った。ファージφIN93液を添加して30分〜1時間（菌体内でm‐RNAが合成されている時間）培養後、3000rpmで遠心して集菌した。菌体は直ちにRNA抽出キット（Biorad社製、AquaPure RNAキット）のマニュアルに従ってm‐RNAを抽出した。
【００５０】
次に抽出したm‐RNAを鋳型として、プライマーエクステンション法により、m‐RNAの開始点を決定し、更にその上流10塩基、及び35塩基近傍に見られるAT豊富な塩基配列を、それぞれプロモーター-35領域、及び-10領域と決定した。
【００５１】
プライマーエクステンションは、Primer Extension System-AMV Reverse Transcriptase(Promega社製)を用いて、マニュアルに従ってPrimer Extension反応を行った。Primerとして、ファージφIN93DNAの配列を基に、5'末端をビオチンラベルした各種DNAオリゴマーを合成して反応を行った。
【００５２】
また、上記の各種ビオチンラベル化したPrimerを用いて、ファージφIN93DNAを鋳型として、シークエンス反応（TOYOBO社製）をマニュアルに従って行った。シークエンス反応後、シークエンス用ゲル電気泳動装置（日本エイドー社製）を用いて、サンプルを電気泳動した（8％ポリアクリルアミドゲル、電圧2000V一定、4時間電気泳動）。ビオチンラベルされた同一のPrimerで反応したPrimer Extension反応サンプルとシークエンス反応サンプルを、ゲル上に隣接させてアプライして電気泳動を行った。
【００５３】
電気泳動後、ゲルを乾燥させろ紙に固定して、X線フィルムにより露光させて現像することにより各バンドを検出した。Primer Extension反応で得られるm‐RNAを鋳型として合成されたバンドの位置と一致するシークエンス反応の塩基のバンドを解析することにより、ファージφIN93DNA上のm‐RNAの開始点を解析した。その結果、Primerとして用いたGCCTGAAGGGCCCGCTCC(配列番号：３）、GATTGCCGCCGTGTCCG(配列番号：４）の2本のPrimerに対して、Primer Extension反応により各々特異的な一つのバンドが検出され、DDBJ/EMBL/GenBankデーターベースに登録したファージφIN93DNA の全塩基配列（Accession number AB063393）のデータから、m‐RNAの開始点を決定した（図1）。
【００５４】
また、その上流10塩基、及び35塩基近傍に見られるAT豊富な塩基配列のプロモーターの-35領域、及び-10領域を見出し決定した。2箇所のプロモーターの配列と位置は、下記の通りである（図2）。
A．-35領域が（5'側のTの位置：2381（これはアクセッション番号：AB063393のファージφIN93DNAの全塩基配列における位置。以下、同様である。）)TTTCTCTで、-10領域が（5'側のAの位置：2403）AAACCTの配列からなるプロモーター配列
B. -35領域が（5'側のTの位置：5594）TTTATTCで、-10領域が（5'側のTの位置：5618）TACCGTの配列からなるプロモーター配列
2）転写終結配列の位置決定
転写終結配列は、m‐RNAの合成終了に関わるため合成終了地点に存在し、本発明の転写終結配列は、その2次構造におけるステム部分が連続してGC結合した特異なパリンドローム構造をとっているものである。ファージφIN93DNA上で決定された上記2箇所のプロモーターからは、隣接してm‐RNAが合成される。
【００５５】
A.のプロモーターとB.のプロモーターとは隣接したプロモーターであったため、B.のプロモーターの前には、A．のプロモーターから合成されたm‐RNAの転写終結配列が存在することが予想された。また、A．のプロモーターの前にも、未だ確認されていないが、プロモーターから合成されるm‐RNAがあることから、必ず転写終結配列が存在することが予想された。GENETYX-WIN(ソフトウエアー開発社製)による情報処理ソフトウエアーで、特異なパリンドローム構造をとる塩基配列を検索し、予想される転写終結配列の存在する位置により転写終結配列を2箇所決定した。
【００５６】
１カ所には、図３(a)に示す転写終結配列（ステムの開始、及び終了の位置：ファージφIN93のDNAにおける2323番目、及び 2345番目の位置）が見出された。もう１箇所には、図3(b)に示すように、連続して２つのパリンドローム構造が存在する配列であって、第１のステムの開始、及び終了の位置が、ファージφIN93のDNAの5516番目、及び 5544番目の位置にあり、第２のステムの開始、及び終了の位置が、ファージφIN93のDNAの5560番目の位置、及び 5588番目の位置にあるものが見出された。
【００５７】
3）好熱性ファージφIN93のプロモーターを利用した発現ベクターの作製方法
Thermus属細菌を宿主とするファージφIN93由来の本発明のプロモーター配列、およびファージφIN93由来の本発明の転写終結配列の間に外来遺伝子を有し、この外来遺伝子がこのプロモーター配列およびこの転写終結配列の支配下の位置に存在する組換え発現ベクターを作製した。作製手順を図４を参照して以下に説明する。
(i)  プロモーター配列およびSD配列（翻訳活性の高いリボソーム結合配列）を含み、以下の配列の5’末端をPstIおよび3’末端をAgeIの制限酵素末端にした合成リンカーを作成した。
CTGCAGGGGGCACTTCGCCCGGGCACTTCGCCCGGGAGAAGCGGCCCA
PstI
AAACTCCCAAGCGCCCCGGCGTATCTCCGGGGCGCTTCGCTCTTTATTCC
-35
CCCATCGCCCCCCGCCTACCGTGGGCGGCAGAATTTGGAGGT
-10              SD配列
GG ACCGGT（配列番号５）
AgeI
(ii)  このDNA断片を、緑色蛍光タンパク質の遺伝子であるGFP遺伝子を保有するpBlue-GFP（pBluescriptSK+にGFP遺伝子が組み込まれている）のPstI/AgeI サイトにクローニングするため、PstI/AgeI で切断後、上記の合成リンカーを加えてリガーゼ反応を行なった。使用した制限酵素、リガーゼは、宝酒造社製を使用し反応は添付マニュアルに従った。リガーゼ反応したDNAを大腸菌JM109のコンピーテントセルにトランスフォーメーションし、50μg/ml濃度のアンピシリンを含むLB寒天培地で培養（37℃）することで、目的の合成リンかーを組み込んだコロニーを選択することができた（pBlue-GFPpro （1））。
(iii)  次に、ファージφIN93 DNAにinsertion sequence（IS）が組み込まれたreφIN93DNAのIS内に以下の(iv)に示すEcoRIサイトと図3(a)に示す転
写終結配列を含む合成リンカーを導入するため、IS内の制限酵素サイトBsRGIとAflIIで切断した。
(iv)  EcoRIサイト及び本発明の転写終結配列を含む合成DNAリンカー
であって、両端にBsRGIの制限酵素サイトとAflIIの制限酵素
サイトとを有するものを合成した。
TGTACAGACTGATTCGACTTGTTCACTTCGCCCGGGCAAACCGCCCGGGCGT
BsrGI     EcoRI                転写終結配列
TCCGGCTTAAG(配列番号６）
AflII
(v)  (iii) の合成リンカーと(iv)の合成リンカーとをリガーゼ反応により連結した後、Thermus aquaticus TZ株へトランスフェクションを行った。トランスフェクションの方法は、A2培地を用いて、Thermus aquaticus TZ株を70℃で一晩前培養し、その培養液50μlを5mlのA2培地に植菌し直し、同様に70℃で本培養を行った。濁度としてOD=0.2(波長660nmで測定)に増殖した段階で、上記リガーゼ反応後のDNA（全量約100ｎｇ）を添加し、2.5時間で同様の条件で培養を行った。
【００５８】
上記培養液と指示菌とを50℃〜60℃に保温した約1.0％寒天を含むA2培地と混ぜて、3％寒天を含むA2培地プレート上に塗布し、70℃、1晩培養することでプラークを形成させた。得られたプラークからDNAを抽出し解析することでreφIN93DNAに合成DNAリンカーを導入したファージプラークを得ることができた（reφIN93ter（3））。
【００５９】
ここで用いたA2培地は、0.1% tryptone (Difco),及び0.1% yeast extract (Difco) を含む Castenholtz 基礎塩培地であって、 pH= 7.5に調整された培地である。
(vi)  (i)で作製したpBlue-GFPpro （1）に含まれるpromoter及び翻訳活性の高いリボソーム結合配列と下流のGFP遺伝子領域全てをreφIN93ter（2）に導入するため、reφIN93ter（2）とpBlue-GFPpro （1）とをEcoRIで
切断し、リガーゼ反応により両者を連結した後、Thermus aquaticus TZ株へトランスフェクションを行った。トランスフェクションの方法は、上述の方法で行った。得られたプラークをUV照射すると、reφIN93ter（2）に導入されたGFP遺伝子が発現したプラークのみが緑色蛍光タンパク質を生産し発光することから、目的の領域が導入されたreφIN93ter（3）を得ることができた。
＜GFP遺伝子の発現レベルの比較＞
(vi)で作製したreφIN93ter（3）で形質転換したThermus aquaticus TZ2株、及びGFP遺伝子を挿入した従来の発現ベクターpKM18で形質転換したThermus aquaticus TZ2株について、モデル遺伝子であるGFP遺伝子の発現量を測定した。
【００６０】
pKM18の構築方法を図５を参照して説明する。pKM18にPstI制限酵素サイトを導入する目的で、pKM18のNdeIサイトにリンカーを挿入して、GFP遺伝子（ｐGFPuv 東洋紡社から販売）をPstI及びEcoRIに組み込み、Km耐性遺伝子と置き換え、Thermus thermophilus HB27に形質転換して、GFP遺伝子組換え株を単離した。GFP遺伝子組換え株（pKM18-GFP保有株）は、UV照射下で容易に蛍光を発することからA2培地上で単離した。
【００６１】
また、GFPの発現量の比較は、蛍光スペクトルメーターを使用して、480nmで励起させて、510nmの蛍光を測定した。pKM18-GFPを保有する上記のThermus thermophilus HB27株をA2培地5mlで10時間培養してその培養液を蛍光スペクトルメーターのセルに入れて計測した。また、開発したreφIN93（GFP遺伝子組換えファージ）は、Thermus aquaticus TZ2をA2培地5ml で4時間培養後に、reφIN93ファージを添加して感染させ6時間培養した。培養液を同様に蛍光スペクトルメーターのセルに入れて計測した。
【００６２】
結果を図６に示す。図６から明らかなように、reφIN93ter（3）で形質転換したThermus aquaticus TZ2株は、GFP遺伝子の発現量が、GFP遺伝子を挿入した従来の発現ベクターのそれの約3倍であった。
【００６３】
この発現ベクターreφIN93ter（3)を用いてThermus菌の中で、モデル遺伝子のGFP遺伝子の替わりに中等度、高度、超好熱菌由来の耐熱性遺伝子をφIN93 terにより発現させて、耐熱性タンパクを大量に生産することが可能である。reφIN93ter（3）は、ファージが菌に感染後、複製増殖するのに影響の無い領域にφIN93の遺伝子の一部と、その上流にpromoter配列、及び翻訳活性の高いリボソーム結合配列（SD配列）を含む断片を導入しているため、融合タンパクの形で外来の遺伝子を発現できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】プライマーエクステンション反応の産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図２】本発明のプロモーターの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の転写終結配列の立体構造を示す図である。
【図４】本発明の発現ベクターの１例の構築手順を示す図である。
【図５】従来のThermus属細菌用の発現ベクターであるpKM18の構築方法を説明する図である。
【図６】本発明の発現ベクターと従来の発現ベクターとの間でモデル遺伝子の発現量を比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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