(57)【要約】【課題】  アルツハイマー病のモデルとなる新規なトランスジェニックマウスの提供。【解決手段】  その生殖細胞及び体細胞が、p25コード配列に作用可能に連結されたニューロン特異的エノラーゼプロモーターを含んで成る組換えDNAを含んで成り、そして増加した脳の細胞体中の全tau、増加した脳のtauリン酸化又は増加した神経フィラメントＨリン酸化、又はニューロンの増加した銀染色を有するトランスジェニックマウス、あるいは当該トランスジェニックマウスと同じ性質を維持しているその子孫。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その生殖細胞及び体細胞が、p25コード配列に作用可能に連結されたニューロン特異的エノラーゼプロモーターを含む組換えDNAを含んで成り、そして増加した脳の細胞体中の全tau、増加した脳のtauリン酸化、増加した神経フィラメントＨリン酸化、又はニューロンの増加した銀染色を有するトランスジェニックマウス、あるいは当該トランスジェニックマウスと同じ性質を維持しているその子孫。
【請求項２】
前記p25コード配列がcDNAである請求項１に記載のトランスジェニックマウス又はその子孫。
【請求項３】
前記cDNAが配列番号４の配列を有する請求項２に記載のトランスジェニックマウス又はその子孫。
【請求項４】
p25ポリペプチドを阻害する化合物の能力を決定するための方法であって：
(a) 請求項１〜３のいずれか１項に記載のマウスに注目の化合物を投与し；そして
(b) 前記マウスの脳における物理的特徴又は挙動特徴の変化を、化合物が投与されていないマウスにおけるそれらの特徴との比較において観察する；
段階を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ２５ポリペプチド、すなわちタンパク質キナーゼｃｄｋ５の活性化因子をコードするトランスジーンを有する、トランスジェニック非ヒト動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳類細胞を提供する。本発明はまた、ｐ２５ポリペプチドをコードするトランスジーンを含んで成り、そしてｐ２５の機能的過剰発現をさらに含んで成る非ヒト動物及び細胞、そのようなトランスジェニック細胞及び動物を生成するために使用されるｐ２５トランスジーン及び標的化構造体、ヒトｐ２５ポリペプチド配列をコードするトランスジーン、及び医薬スクリーニングにおいて及び神経変性疾病、たとえばアルツハイマー病及びｐ２５／ｃｄｋ５生化学をインビボ  モデリングのための商業的研究用動物としてトランスジェニック動物を用いるための方法を提供する。
【０００２】
本明細書中に、多くの文献が引用されている。それらの文献は完全に引用により組み込まれる。文献の完全な列挙は明細書後部に示される。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、意識機能の損失により特徴づけられる進行性神経変性疾患である。ＡＤにおける主要神経病理学的損傷は、アミロイド局面及び神経細線維錯綜体（ＮＦＴ）である。アミロイド局面は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来する、３９〜４２個の長さのアミノ酸のアミロイドβ（Ａβ）ペプチドから主に構成される（１に参照される）。ＮＦＴは、疾病を有さない脳において主にリン酸化されていない状態で存在するエピトープで高リン酸化されている微小管結合タンパク質ｔａｕから構成される（２〜４）。それらの損傷が患者において観察されるニューロン損失及び痴呆において演じるそれぞれの役割は、論争中のままである。
【０００４】
ＮＦＴ形成の正確な機構は明白ではないが、しかし多くの実験室からの研究は、ｔａｕの高リン酸化が重要な現象であり得ることを示唆している。対合されたらせんフィラメント（ＰＨＦ）が、ＮＦＴの基本単位である。ｔａｕのアミノ及びカルボキシ末端で集中されるセリン又はトレオニン残基、続くプロリン残基（ＳＰ又はＴＰ）エピトープでの高リン酸化は、微小管のための親和性の損失、及び細胞質ｔａｕの濃度の推定される同時上昇をもたらす（５〜８）。しかしながら、続くプロリンではなく、セリン２６２でのｔａｕのリン酸化はまた、微小管のための親和性を低めることができる（９）。精製されたｔａｕによるインビトロ実験は、内因性カチオン( たとえばｍＲＮＡ、硫酸ヘパリン  プロテオグリカン) の存在下で、ｔａｕがＡＤ脳に見られるＰＨＦとは区別できない構造を形成するために重合することを示す（１０，１１）。
【０００５】
インビトロでのＰＨＦのカチオン−依存性形成は、ｔａｕのリン酸化状態に無関係であり、従ってＰＨＦ形成の開始における許容できるキー現象がｔａｕの細胞質濃度の上昇であり得ることを示唆する。この仮説の支持においては、最近の証拠（１２〜１４）は、前頭側頭骨痴呆及び染色体１７に連結するパーキンソン病(FTDP-17）と呼ばれる遺伝された痴呆の形に対する感受性に関連するｔａｕ遺伝子における突然変異が微小管のためのｔａｕの親和性を低めることを示す（１５）。従って、高リン酸化のようなそれらの突然変異は、細胞質ｔａｕ濃度の上昇をもたらすことができる。内因性カチオンの存在下で、この上昇は、ＰＨＦ形成、続くＮＦＴアセンブリー、究極的には、ニューロンの死を可能にすると推定される。
【０００６】
他のリンタンパク質に関しては、ｔａｕのリン酸化状態はタンパク質キナーゼ及びタンパク質ホスファターゼ活性の合計である。従って、ＡＤにおけるｔａｕの高リン酸化は、キナーゼ活性の上昇又はホスファターゼ活性の低下による。多くのタンパク質キナーゼはインビトロにおいてＡＤ−関連エピトープでｔａｕをリン酸化するが（１６，１７）、それらのわずか２種、すなわちＧＳＫ３ｂ及びｃｄｋ５が哺乳類脳から微小管と共に同時精製されている（１８）。本発明者の知識によれば、それらの２種のキナーゼのみが、哺乳類細胞中に異種的にトランスフェクトされる場合、ｔａｕをリン酸化するであろう（１９，２４）。本発明者は、ｃｄｋ５対ＧＳＫ３ｂを選択し、ここで後者はエネルギー代謝において役割を演じ、そしてすべての細胞において活性形で発現され、そしてｃｄｋ５はニューロンにおいてのみ活性である（下記参照のこと）。
【０００７】
キナーゼ  ｃｄｋ５は、サイクリン−依存性タンパク質キナーゼ  ファミリーのメンバーであり、そしてほぼすべての細胞において発現される（２５，２６）。ｃｄｋファミリーの他のメンバーとは異なって、ｃｄｋ５を活性化する、知られているサイクリンは存在しない。むしろ、ｃｄｋ５の正のアロステリック  レギュレーターは、ｐ３５（２７）、ｐ３５のアミノ末端タンパク質分解フラグメント、たとえばｐ２５、ｐ２３又はｐ２１（２８，２９）、及びｐ３９（３０）である。それらのタンパク質はサイクリンに対して最少のアミノ酸配列相同性を共有するが（２７〜２９）、しかしコンピューター  モデリング及び生化学実験は、p25/35によるｃｄｋ５の活性化の機構がｃｄｋ２のサイクリンＡ活性化の機構に類似することを示唆する（３１〜３３）。
【０００８】
タンパク質ｐ２５／３５はニューロンにおいて主に発現され、これはほとんどのｃｄｋ５活性がニューロン構造において濃縮されることを意味する（２７，２８）。タンパク質ｐ３５は細胞内で比較的短い半減期を有し、そして急速に、偏在し、このことは、ニューロンにおけるｃｄｋ５活性の強い調節を示す（３４）。キナーゼｃｄｋ５は、ｃｄｋ５ノックアウト  マウスの異常皮質発生（corticogenesis）及び周期性致死（３５）、及びニューロン移動における障害及びｃｄｋ５ノックアウト  マウスにおける初期死亡（３６）により明らかなように、ニューロン生長において中枢的役割を演じる。ゲッ歯動物における生長研究においては、ｃｄｋ５のピーク触媒活性がＥ１１又は１２で生じ、神経発生におけるｃｄｋ５の役割の更なる支持を導く（３７，３８）。
【０００９】
さらに、一次培養されたニューロンにおいては、ｃｄｋ５／ｐ３５が生長錐状体に局在化し、軸索生長における役割を示唆する（３９）。最近、ｃｄｋ５活性を調節できるシグナル化経路の証拠が出現している。たとえば、cdk5/p35がＲａｃと相互作用し、そしてＰＡＫ活性を調節し（４０）、そして小脳ニューロンのラミニン増強された生長がｐ３５発現の抑制により中断され、そしてそれらは軸索生長及び形質膜力学における推定される役割と一致する。それらは、細胞骨格タンパク質、たとえばｔａｕ（４２〜４５）及び神経フィラメント（４６〜４８）、シナプス小胞タンパク質、たとえばシナプシン及びMunc-18 （４９，５０）、及び網膜芽タンパク質（５１）を包含する。それにもかかわらず、cdk5/p35活性を調節するシグナル  トランスダクション経路の明白な情況も、成熟脳における両cdk5/p35の役割も解明されていない。
【００１０】
ＡＤにおけるｔａｕの高リン酸化を担当するタンパク質キナーゼの明白な情況もまた欠失している。しかしながら、ｃｄｋ５が病理学的役割を演じることができる証拠は累積している。たとえば、インビトロ研究において、ｃｄｋ５は、ｔａｕの８種までの異なったエピトープ、たとえばＡＤに関連し、そして微小管のためのｔａｕの親和性を低めることが知られているをれらのエピトープをリン酸化するであろう（４２〜４５）. さらに、哺乳類細胞中へのｔａｕによるcdk5/p25の異種同時トランスフェクションもまた、いくつかのそれらのエピトープのリン酸化をもたらす（２４）。最終的に、免疫組織学的証拠は、ｃｄｋ５がＡＤ脳におけるＮＦＴに最も近いことを示唆する（５２，５３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＡＤ病原に関与する基礎の生化学的現象をさらに定義するために使用され得るアルツハイマー病の実験モデルの開発が非常に所望される。そのようなモデルは、ＡＤの変性路を変える剤についてスクリーンするために、１回の適用において使用され得る。たとえば、ＡＤのモデルシステムは、ＡＤの病原を誘発し又は促進する環境因子についてスクリーンするために使用され得る。他方では、実験モデルは、ＡＤの進行を阻害し、妨げ又は後退せしめる剤についてスクリーンするために使用され得る。そのようなモデルは、ＡＤの防止、抑制又は後退において効果的である医薬を開発するために使用され得る。
【００１２】
ヒト及び成熟した非ヒト霊長類のみが、ＡＤのいずれかの病理学的特徴を進行せしめる。霊長類を使用することの費用及び困難性、及びＡＤ病理学を開発するために必要とされる時間の長さは、そのような動物に対する集中的な研究を非常に高価なものにする。ゲッ歯動物は、極端な年齢でさえ、ＡＤを生長せしめない。ある処理がｔａｕの高リン酸化及び／又はｔａｕのリン酸化に関連するニューロンの死をもたらす種々の報告にもかかわらず、ｔａｕの高リン酸化及び関連するニューロンの死を生成できるトランスジェニック非ヒト動物についての必要性が当業界において存在する。
【００１３】
上記に基づいて、ｔａｕの高リン酸化及びニューロン細胞の死を生成する非ヒト細胞及び非ヒト動物についての必要性が存在することは明らかである。従って、哺乳類細胞、特に胚幹細胞中にトランスジーン及び相同組換え構造体をトランスファーするための方法及び組成物を提供することが、本発明の目的である。ｐ２５、すなわちｃｄｋ５の活性化因子の高められた発現をもたらすトランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を提供することがまた、本発明の目的である。高リン酸化されたｔａｕ及び関連されたニューロンの死の生成を阻害し又は妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするためにインビボ  システムとしてのそのようなトランスジェニック動物の適用が、本発明のさらなる興味ある１つである。
【００１４】
ｔａｕのリン酸化及び関連するニューロンの死を阻害し又は妨げる能力のための試験化合物をスクリーニングするための方法及びシステムを提供することが所望される。特に、ｃｄｋ５/ ｐ２５の阻害にそのような方法及びシステムを基づくことが所望され、試験化合物がｃｄｋ５/ ｐ２５により介在されるｔａｕのリン酸化を阻止する場合、その試験化合物はまた、ニューロンの死もまた阻止する。そのような方法及びトランスジェニック動物は、多数の試験化合物をスクリーニングするための急速で、経済的で且つ適切な手段を提供するはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ｃｄｋ５活性の上昇がＡＤ―関連エピトープでのｔａｕの高リン酸化をもたらすかどうか、及びこの高リン酸化がニューロンの死を導くかどうかを決定するために、マウスの脳においてヒトｐ２５を過剰発現した。ｐ２５トランスジェニック  マウスの脳においては、ｔａｕ及び神経フィラメントの両者が高リン酸化され、そして錯綜体 (tangle）−様封入体を有する多くの銀―陽性ニューロンが存在する。それらの結果は、ｃｄｋ５の活性化因子の過剰発現が、ＡＤに見出されるそれらに非常に類似する、ｔａｕ及び神経フィラメント  リン酸化並びに銀一陽性ニューロンを生成するのに十分であることを示す。ｐ２５トランスジェニック  マウスは、ＡＤに見出される神経細線維病理及びニューロンのモデルとして作用することができる。
【００１６】
１つの態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝子コード配列のｐ２５コード配列に作用可能に連結されたラット  ニューロン特異的エノラーゼを含んで成る組換えＤＮＡに向けられる。
好ましい態様においては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコードする前記配列がゲノムＤＮＡに向けられる。
もう１つの態様においては、本発明は、前記ｐ２５フラグメントをコードする前記配列がｃＤＮＡである組換えＤＮＡに向けられる。
さらにもう１つの好ましい態様においては、本発明は、前記配列が配列番号４の配列である組換えＤＮＡに向けられる。
【００１７】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＤＮＡを含んでなるベクターに向けられる。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の組換えＤＮＡを含んで成る真核細胞系に向けられる。
もう１つの態様においては、本発明は、その生殖細胞及び体細胞が本発明の組換えＤＮＡを発現する、トランスジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。
好ましい態様においては、本発明は、マウスであるトランスジェニック非ヒト動物、又はその子孫に向けられる。
さらなる態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現により特徴づけられる疾病を有する動物を処理するための方法に向けられ、ここで前記方法は、治療的有効量の前記ｐ２５フラグメントのインヒビターを投与することを含んで成る。
【００１８】
もう１つの態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を阻害する化合物の能力を決定するための方法に向けられ、ここで前記方法は、
ａ. 前記の組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して組み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物を作出し；
ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物に成長せしめ；
ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合物を投与し；そして
ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定する；
段階を含んで成る。
【００１９】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、ヒトｃｄｋ５遺伝子のｐ２５フラグメントの発現を阻害する化合物の能力を決定するためのデーターを生成するための方法に向けられ、この方法は、
ａ. 前記組換えＤＮＡを動物の胚幹細胞中に安定して組み込むことによって、トランスジェニック非ヒト動物を作出し；
ｂ. 前記胚幹細胞を成熟トランスジェニック非ヒト動物に成長せしめ；
ｃ. 前記トランスジェニック非ヒト動物に、注目の化合物を投与し；
ｄ. 前記化合物による前記ｐ２５の阻害を測定し；そして
ｅ. 前記阻害に由来するデータを用いて前記ｐ２５フラグメントを阻害することができる化合物を合成する；
段階を含んで成る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１は、（Ａ）ｐ２５及びp35/39（Ｌ．Ｈ．Tsai, Harvard Medical School Cambridge, ＭＡの贈与物）に対して特異的な抗体によりプローブされた、３種の野生型マウスからの扁桃（１）、視床（２）及び皮質（３）のウェスターンブロット、並びに（Ｂ）上記と同じ抗体によりプローブされた３種のｐ２５トランスジェニック  マウスからの扁桃（１）、視床（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを示す。
トランスジーンｐ２５の発現は、トランスジェニック  マウスにおいて明らかであるが、しかし野生型マウスにおいては明らかでない。
【００２１】
図２は、扁桃の吻部分において特異的なＡＴ−８（ｔａｕのホスホ−セリン２０２／２０５を特異的に認識する市販の抗体）に対して免疫陽性の生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス脳を示す。付随する軸索を有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。いくつかの暗褐色の陽性細胞がこの部分に見出される。
図３は、扁桃の吻部分においてＡＴ−８に対して最小の陽性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は、二次抗体のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
【００２２】
図４は、扁桃の吻部分においてPHF-13（ｔａｕのホスホ−セリン３９６／４０４を認識する抗体：Dr. V. Lee, U.of Pennsylvania からの贈与物）免疫陽性を示す生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス脳を示す。厚くされた軸索（矢印）を有するニューロン細胞体は陽性である。可能な膨張された／萎縮された軸索を有するニューロン細胞体（矢印）は陽性である。
図５は、扁桃の吻部分においてPHF-13に対して最小の陽性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。細胞体は二次抗体のために非特異的な陽性（矢印）を示す。
【００２３】
図６は、扁桃の吻部分（矢印により示される）のいくつかの細胞体における全ｔａｕ（Accurate Chemical and Scientific Corp Westbury, N.Y.から市販される合計のｔａｕを認識する抗体）に対して免疫陽性の生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス脳を示す。
図７は、扁桃の吻部分の軸索においてｔａｕに対して免疫陽性の生後４ヶ月の野生型マウス脳を示す。
図８は、SMI-34（リン酸化された神経フィラメントＨタンパク質を認識する市販の抗体）と反応された生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス脳を示す。陽性細胞（矢印）は、扁桃の吻部分に見出される。
図９は、生後４ヶ月の野生型マウス脳の扁桃の吻部分における最少のＳＭＩ−３４軸索陽性を示す。
【００２４】
図１０は、生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス脳の扁桃の吻部分における銀一陽性（破壊された細胞骨格及びニューロン細胞死の表示）細胞体（矢印）を示す。
図１１は、生後４ヶ月の野生型マウスの扁桃の吻部分における軸索の最小銀陽性を示す。
図１２は、生後５ヶ月のトランスジェニック  マウスの脊髄において銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索（矢印）を示す。
図１３は、生後５ヶ月のトランスジェニック  マウスの脊髄においてSMI-34陽性を示すいくつかの拡張された軸索（矢印）を示す。
図１４は、生後６ヶ月の野生型マウスの脊髄における正常な軸索がSMI-34に対して陰性であることを示す。
【００２５】
一般的に、本明細書に使用される命名法、及び下記に記載される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及びハイブリダイゼーション、生化学、組織学及び免疫細胞化学における実験方法は、当業界においてよく知られており、そして通常に記載されるものである。標準技法が、組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養、トランスジーン組み込み、ウェスタ−ンブロット、免疫細胞化学及び組織学的技法、たとえば銀染色のために使用される。前記技法及び方法は一般的に、当業界における従来の方法、及び本明細書中に提供される種々の一般的な引例に従って実施される。そこにおける方法は、当業界においてよく知られており、そして読者の便利さのために供給される。そこに含まれるすべての情報は、引用により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
前述の目的によれば、本発明の１つの観点においては、トランスジェニック非ヒト動物において異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成るトランスジーンの少なくとも１つのコピーを有する非ヒト動物が提供される。前記異種ポリペプチドは、ｐ３５サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）調節タンパク質の切断された部分である（２７，２８）。その切断された異種ポリペプチドは、除去される最初の９８個のＮ−末端アミノ酸を有し、そして約25,000ドルトンの分子量を有する。この新規ポリペプチドは、ｐ２５として言及されるであろう。
【００２７】
典型的には、非ヒト  トランスジェニックであり、そして異種遺伝子はヒトｐ２５配列である。トランスジーンは典型的には、ニューロンにおいて細胞型特異的態様で宿主トランスジェニックの哺乳類において発現を方向づけるシス−作用性調節配列に作用可能に連結されているｃＤＮＡ配列である。典型的には、トランスジーンは、ランダムな標的化されていない態様で宿主染色体中に組み込まれるであろう。さらに、本発明は、染色体位置中に非相同的に又は相同的に組み込まれる、本発明の異種ｐ２５配列トランスジーン又は遺伝子標的化ベクターの少なくとも１つのコピーを有する非ヒト  トランスジェニック動物がｐ２５切断されたポリペプチドを発現することを提供する。
【００２８】
トランスジェニック動物は典型的には、１つの細胞胚の前核中へのマイクロジェクションによるトランスジーンの導入、又は胚幹（ＥＳ）細胞のエレクトロポレーション、リポフェクション又はウィルストランスフェクションによる宿主細胞中への標的化ベクターの導入により生成される。ｐ２５ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物は、疾病のモデルとしての使用、及び小分子、タンパク質及びポリヌクレオチドを包含する可能性ある治療用化合物のスクリーニングへの使用のために適切である。本発明はまた、確立された細胞系、又は非ヒト  トランスジェニック動物、たとえばニューロンから直接的に確立された一次細胞系の形質転換により誘導される非ヒト又はヒト細胞系を提供する。
【００２９】
トランスジェニック非ヒト動物が、他の疾病モデル、薬物スクリーン又は他の用途として作用する新規動物を生成するために、トランスジェニック技術により又は他のトランスジェニック又は天然に存在する動物との従来の対合を通して追加の遺伝子修飾を有することができることは明白である。これは、ＥＳ細胞における遺伝子標的化を通してのネズミ内因性ｐ３５遺伝子の不活性化、及びヒトｐ２５異種ポリペプチドの発現のための好ましい宿主になる、得られるネズミｐ３５−欠失マウスを包含する。
【００３０】
そのような異種トランスジーンは、典型的には前核注入（pronuclear injection）により誘導されるトランスジェニック動物における非相同染色体位置に組み込まれ得、又はネズミｐ３５遺伝子を不活性化し、そして異種ヒトｐ２５配列の発現を方向づけるために、連結された配列を付加するための方法によるＥＳ細胞における遺伝子標的化により組み込まれ得る。
【００３１】
一般的に、本発明は、サイクリン依存性キナーゼ５（ｃｄｋ５）のアロステリック活性化因子である、ヒトｐ２５ポリペプチド、すなわちｐ３５のタンパク質分解フラグメントを発現するトランスジェニック動物の生成及び特徴化のための方法を包含する。トランスジェニック動物は、内因性相同体の存在下でこのヒトタンパク質を発現する。この技法及び方法は、当業界において通常の方法であると一般的に見なされる確立されたプロトコールに従って実施され、そして引例は本明細書内に提供される。タンパク質キナーゼｃｄｋ５は、アロステリック活性化因子、たとえばｐ３５又はｐ２５と会合される場合、インビトロにおいて及び完全な細胞においてｔａｕをリン酸化することが文献に報告されている。
【００３２】
このようにして生成されたトランスジェニック  マウスは、神経変性状態、たとえばアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、発作、外傷性脳腫瘍、Pick病、軸索ジストロフィー、多発性硬化症、運動ニューロン病及び旧小脳変性及び神経変性疾患における高リン酸化されたｔａｕの形成においてヒトｐ２５の役割を確定する。ヒトｐ２５タンパク質を発現する他のトランスジェニック動物、たとえばラット、ハムスター、テンジュクネズミ及びウサギが容易に得られることは明らかである。ヒトｐ２５タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、発現及びｔａｕリン酸化のレベルについてモニターされ得る。
【００３３】
異なった条件下で、発現のレベル及びｔａｕリン酸化の程度はそのような動物モデルにおいて阻害されるであろうことが理解されるであろう。特に、ヒトｐ２５タンパク質の活性を阻害する治療剤のスクリーニングは動物モデルにおいて非常に促進されるであろう。影響されたトランスジェニック動物からの細胞系（たとえば、ニューロン）の生長が、ヒトｐ２５タンパク質の生化学的及び薬理学的分析が評価され得る処理量を改良するであろうことは明らかである。
【００３４】
ｐ２５過剰発現のための特に好ましい動物モデルは、上記のようにｐ２５を発現するトランスジェニック動物である。そのようなトランスジェニック動物、特に本発明のトランスジェニック  マウスは、高い量のｐ２５及び高リン酸化されたｔａｕ、及び本発明の方法に従って検出され得るニューロンの死を生成する。本発明によれば、ｐ２５の過剰発現は、そのような動物において内因性ｐ２５発現に等しいか又はそれよりも高いであろう。さらに、ｐ２５過剰発現のこのレベルは、野生型動物において最少であるｔａｕ高リン酸化をもたらす。そのような高められたｐ２５レベルにより、ｔａｕの高リン酸化及びニューロンの死のモニターは非常に促進される。特に、ｔａｕリン酸化を阻害するための化合物及び他の治療剤についてのスクリーニングは、本発明のｐ２５を過剰発現する動物において非常に単純化される。
【００３５】
トランスジェニック性であり、そしてｐ２５を過剰発現する試験動物、たとえば試験マウスに剤が投与される。ｐ２５を過剰発現するトランスジェニック  マウスを生成するための特定の技法は下記に記載される。ｐ２５を過剰発現する他のトランスジェニック動物、たとえばラット、ハムスター、テンジュクネズミ、ウサギ及び同様のものが容易に達成され得ることが理解されるであろう。この開示を考慮する場、試験動物におけるｔａｕの高リン酸化に対する試験化合物の効果が、試験動物からの種々の検体において測定され得る。
【００３６】
ｔａｕの高リン酸化に対する試験剤の効果は、試験動物からの種々の検体において測定され得る。すべての場合、試験化合物の不在下で試験動物におけるｔａｕリン酸化及びニューロン死のレベル特性を示す対照値を得ることが必要であろう。動物が殺される場合、ｐ２５を過剰発現するようトランスジェニック的に修飾されているが、しかしｔａｕリン酸化又はニューロン死のレベルに影響を及ぼすことが予測されるいずれかの試験化合物又はいずれかの他の物質の投与を受けていない他の試験動物からの平均値又は典型的な値にそのような対照値を基づかせることが必要であろう。
【００３７】
そのような対照レベルが決定されると、試験化合物が試験動物に投与され、ここで平均対照値からの偏差は、試験化合物が動物におけるｔａｕリン酸化又はニューロン死に対する効果を有したことを示す。陽性、すなわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理においてたぶん有益であると思われる試験物質は、ｔａｕリン酸化又は、ニューロン死のレベルを、好ましくは少なくとも２０％及び最も好ましくは８０％低めることができるものであろう。さらに、ｐ２５を過剰に発現し、そしてｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェニック動物において対合されたヘリカル又は直鎖フィラメント形成が存在する。
【００３８】
それらの場合、試験化合物が試験動物に投与され、そしてフィラメント形成の低下が化合物への暴露の結果としてモニターされ得る。さらに、ｐ２５を過剰発現し、そしてｔａｕ高リン酸化を示すトランスジェニック動物において行動性変更が存在する。それらの場合、試験化合物の不在下で試験動物において運動性仕事（たとえば、運動活動の測定）を実施する生存動物から対照値を得ることが必要である。野生型マウスとトランスジェニック  マウスとの間の差異は、化合物の効果のための結果基準として作用するであろう。
【００３９】
そのような対照レベルが決定されると、試験化合物が追加の試験動物に投与され、ここで野生型マウスとトランスジェニック  マウスとの間の差異の低下又は逆転が、試験化合物が測定される運動試験に対し効果を有することを示唆する。陽性であると思われる、すなわちＡＤ又は他の神経変性疾患の処理においてたぶん有益であると思われる試験物質は、好ましくは、トランスジェニック動物における運動異常性を野生型マウスに見出されるレベルに逆転するか又は実質的に逆転するか、又は、好ましくは変性できるそれらの物質であろう。
【００４０】
試験剤は、細胞培養物又は動物に添加される場合、細胞又は動物の生存性に悪影響を与えないであろう、いずれかの小分子、タンパク質、多糖類、デオキシまたはリボヌクレオチド、又はいずれかのそれらの組み合わせとして定義されるであろう。ヒトｐ２５発現及びｔａｕリン酸化のレベルを変える剤は、可能性ある治療剤としてのさらなる評価のための候補体として見なされるであろう。試験化合物は、典型的には、１ng／kg〜１００mg／kg, 通常１０μg ／kg〜３２mg／kgの用量で、トランスジェニック動物に投与されるであろう。
【００４１】
ｔａｕのリン酸化を阻害することができる試験化合物は、動物及びヒトにおいてリン酸化を阻止する能力のさらなる決定のための候補体として見なされる。ｔａｕリン酸化の阻害は、cdk5/p25活性が少なくとも一部、阻止され、ｔａｕをリン酸化するために入手できるcdk5/p25の量を低めることを示す。
【００４２】
本発明はさらに、上記方法により選択された化合物を組み込み、そして医薬的に許容できるキャリヤーを含む医薬組成物を含んで成る。そのような医薬組成物は、本発明の方法により同定される少なくとも１つの化合物の治療量又は予防量を含むべきである。医薬的に許容できるキャリヤーは、意図される宿主に化合物を供給するのに適切ないずれかの適合する非毒性物質であり得る。無菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性団体が、キャリヤーとして使用され得る。
【００４３】
医薬的に許容得きるアジュバンド、緩衝剤、分散剤、及び同様のものがまた、医薬組成物中に組み込まれ得る。活性剤を組み込む医薬組成物の調製は、医学及び化学文献に十分に記載されている。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 16th Ed., 1982（この開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
上記医薬組成物は、宿主への全身性投与、たとえば非経口、局所及び経口投与のために適切である。医薬組成物は、非経口、すなわち皮下、筋肉内又は静脈内投与され得る。従って、本発明は、上記のように、許容できるキャリヤーにおける同定された化合物の医薬的に許容できる溶液を含んで成る、宿主への投与のための組成物を供給する。
【００４４】
商業的な研究及びスクリーニング使用：
ｐ２５をコードするトランスジーンを含んで成る非ヒト動物は、ｔａｕのリン酸化及びニューロン死を妨げ又は低める効果を有する剤についてスクリーンするために商業的に使用され得る。そのような剤は、他の神経変性疾患の中でＡＤ及びｔａｕの高リン酸化を処理するための医薬物質として開発され得る。たとえば、Donehower など（５４）のｐ５３ノックアウト  マウスは、発癌物質のスクリーニングのための商業的生成物及び同様のものとして広い許容性を見出した。
【００４５】
本発明のトランスジェニック動物は異常ｔａｕリン酸化をふし、そして医薬スクリーニングのために、及び神経変性疾患、及びｃｄｋ５／ｐ２５及びｔａｕ生化学のための疾病モデルとして使用され得る。そのような動物は、ｔａｕ高リン酸化に影響を及ぼす化合物を同定するために多くの用途を有するが、但しそれらだけには制限されず；１つの変法においては、そりにより、剤は候補体医薬剤として同定される。トランスジェニック動物はまた、ｃｄｋ５又はｐ２５の発現及び／又は安定性を調節する剤を開発するためにも使用され得る；そのような剤は神経変性疾患を処理するための治療剤として作用することができる。
【００４６】
本発明のｐ２５発現マウスはまた、ｔａｕ−関連病理（たとえば、ＡＤ，Pick病、パーキンソン病、染色体１７２関連する前側頭葉痴呆、発作、外傷性脳損傷、軽い認識障害及び同様のもの）を研究するための疾病モデルとしても作用することができる。そのようなトランスジェニック動物は、特に、研究者に市販され得る。
一般的な用語で発明を記載してきたが、現在、特定の例が言及される。それらの例は本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００４７】
プラスミドpNSE-p25（ラット  ニューロン特異的エノラーゼ  プロモーター、ヒトｐ２５トランスジーン）は次の４種の異なった源からのＤＮＡ、すなわちラット  ニューロン特異的エノラーゼ  プロモーター；ｐ３５タンパク質のｐ２５触媒フラグメントのためのヒトｃＤＮＡ；ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；及び市販のプラスミド  ベクター、を含む。トランスジーンは、pNSE-p25のBam HI制限酵素消化により単離される。この制限消化物は、プラスミド  クローニング  ベクター  pSP72(2462bp）（Promega, Madison, WI）からNSE-p25 トランスジーン（3212bp）を開放する。
【００４８】
ラット  ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター配列は1826bp（配列番号１）であり、そしてトランスジェニック  マウスのニューロンにおいてＤＮＡコード配列を効果的に発現することが示されている（５５）。ヒトｐ２５配列のためのコード領域は、633bp （配列番号２）である。３−プライム未翻訳及びＳＶ４０ポリアデニル化配列は、688bp （配列番号３）である。
【００４９】
マイクロインジェクトされたNSE-p25 トランスジーンは、3212bp（配列番号４）である。連結、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ合成反応、一本鎖フィルイン反応、及び実施される細菌形質転換を包含する、組換えＤＮＡの酵素反応は、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: Alaboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989により記載されるような十分に確立された方法である。
【００５０】
SV40ポリアデニル化配列（配列番号３）を、Xba I およびBst I 部位で市販のプラスミドpSP72 （配列番号５）中にクローン化した。pSP-SVpAと称するこのプラスミドは、NSE-p25 トランスジーン  プラスミドの構成のための主鎖ベクターとして作用した。ヒトｐ２５触媒性フラグメントのためのｃＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて誘導した。ヒトｐ３５の十分な長さのｃＤＮＡを、ｐ２５挿入体の増幅のための鋳型として使用した。本発明者は、PfizerのDr. David Auperin からのｐ３５鋳型ＤＮＡを受け；ヒトｐ３５配列を、Pfast Bac 1,すなわちバキュロウィルス発現ベクター（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD ）のEcoR I部位中にクローン化した。
【００５１】
ＰＣＲプライマーを、トランスジーン構成を促進するためにコード配列外にNot I 制限部位を有するよう消化した。前方向プライマーはまた、ＧＣＣに隣接して新規ＡＴＧ開始コドンを導入した（ヒトｐ３５配列の位置９９でのAla コドン) 。プライマー（５―プライムから３―プライムの配向で提供される）は、ｐ２５−前方向：GCGGCCGCATGGCCCAGCCCCCACCGGCCCAGCCGCCTGCA （配列番号６）、及びｐ２５−逆方向：CTCCTCCTAGGCCTGGAATCGGTGAGGCGGCCGC（配列番号７）であった。
【００５２】
ＡＴＧは導入された開始コドンであり、ＴＧＡは停止コドンであり、そしてGCGGCCGCはＰＣＲプライマーに付加されたNot I 制限部位である。得られるＰＣＲ生成物は、構成されたＡＴＧ開始部位（配列番号２）Not I クローニング部位の付加からの追加の１５bpと共に、完全な633bp のヒトp25 cDNA配列を含む648bp である。その648bp のフラグメントを、最終トランスジーンにおいて挿入体として使用する前、配列の確認のためにpCR2.1（Invitrogen, Carisbad, CA）中にサブクローン化した。
【００５３】
確かめられた648bp のNot I フラグメントを、プラスミドpSP-SVpA:25 を生成するpSP-SVpAのNot I 制限部位中に連結した。ラット  ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターを、Dr. J. G. Sutcliffe of the Research Institute of Scripps Clinic (La Jolla, CA ）から得られたプラスミドpNSE-lacZ から単離した。ラットＮＳＥプロモーター配列（配列番号１）を、ＰＮＳＥ−LacZプラスミドのEcoR I及びHind III制限消化により単離した。1.8kb のフラグメントを、アガロース  ゲル電気泳動により抽出し、そして精製した。制限酵素により精製された5'―プライム単鎖オーバーハングをクレノウ反応によりフィルインし、二本鎖ブラント末端を有するラットＮＳＥプロモーター  フラグメントを生成した。
【００５４】
1826bpのラットＮＳＥブラント末端プロモーター  フラグメントは、pSP-SVpA:p25のSma 1 制限部位中に連結されたフラグメント末端であった。pSP-SVpA:p25内でのラットＮＳＥプロモータの正しい配向を、Bam HI及びＸho Iの二重制限消化物により確かめた。正しい配向を有するプラスミドを、pNSE-p25として命名した。3212bpのNSE-p25 トランスジーン（配列番号４）の完全な配列を、ＡＢＩにより概略される標準の色素―ターミネーター化学プロトコールを用いて、自動化されたABI 373 配列決定機（Foster City, CA ）により分析し、そして確かめた。すべてのプラスミドは、DH5 α細菌細胞（Gibco BRL Gaithersburg MD ）において増殖された。
【００５５】
ヒトｐ２５を過剰発現するトランスジェニック マウスの生成：
3212bpのNSE-p25 トランスジーンＤＮＡフラグメントを、Bam ＨＩ制限エンドヌクレアーゼ反応によりpNSE-p25 プラスミドから切除した。3.2 kbp のフラグメントを、１％のアガロース  ゲルにおける電気泳動（FMC Bioproducts, Rockland ME）の後、電気溶出（５０Ｖ，３時間）により単離した。フラグメントをさらに、ネズミ胚へのマイクロインジェクションの前、ＤＮＡ精製について製造業者により確立されたプロトコールに従って、Schleicher and Schuell (Keene, NH) Elutip-d カラム上で精製した。
【００５６】
前核マイクロインジェクションによるトランスジェニック  マウスの生成を、Hogan, B. など、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1994 に概略されるような公開された方法により実施した。FVB/N 株（Charles River Labs, Wilmington, MA）のＦ１雌マウスからの前核階段の胚を、妊娠した、雌馬の血清からの５国際単位（ＩＵ）卵胞刺激ホルモン（Sigma ST Louis, MO）及び2.5 I.U.のヒト絨毛性性線刺激ホルモン（Sigma ）による超排卵の後に得た。
【００５７】
実際のマイクロインジェクション方法は、Wagner, T.など、（５６）により記載されるようにして実施され、但し胚は、胚の生長のために擬似妊娠CD-1受容体雌（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）に、すぐに移行された、再移植現象に起因するマウスを、生後３週で尾の生検から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によりNSE-p25 トランスジーンの存在について試験した。ＮＳＥ―ｐ２５トランスジーンの存在について陽性を示したマウスと、反対の性別の野生型FVB/N マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）とを支配した。
【００５８】
それらの交配の子孫を、生後３週での尾の生検から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析又はサザンブロット分析により生殖系伝達について試験した。トランスジェニック系を、７匹の創始体トランスジェニック  マウスから生成し、そしてNSE-p25 トランスジーンの存在についてＰＣＲ遺伝子分離することによって維持した。
下記実験を、挿入されたトランスジーンのためにヘテロ接合性のマウスにおいて実施した。それらのマウスは、FVB/N 野生型動物とトランスジーン挿入体について陽性のマウスとを交尾し、そしてNSE-p25 トランスジーン配列の存在についてＰＣＲにより子孫をスクリーンすることによって誘導された。
【００５９】
ｐ２５タンパク質の過剰発現の検出：
ウェスターンブロット：
生後１又は４ヶ月のトランスジェニック（Ｔｇ）及び野生型（ｗｔ）マウスからの完全な脳を取り出し、そして液体窒素において凍結した。扁桃、視床及び皮質を切除し、そして１mlの溶解緩衝液において均質化した（３７に記載のようにして）。サンプルを１０分間、煮沸し、そして次に、13,000rpm で遠心分離した。その得られる上清液のタンパク質濃度を、Pierce BCA法（BCA micro Protein assay,カタログ番号23225, Pierce, Rockford ILL ）により決定した。
【００６０】
個々のサンプル１０μg を、ＳＤＳポリアクリルアミド  ゲル上で電気泳動（５７）、そしてウェスターンブロット分析のためにProBlott タンパク質紙に移した（Western blotting protocols, ECL Detection, Amergham Life Science Arlington Heights, ILL (1995)）。非特異的部位を、トリス−緩衝溶液（20mMのトリス塩基、127 ｍＭのNaCl, 3.8mMno HCl, pH7.6; Sigma ）中、５％脱脂粉乳においてブロットをインキュベートすることによって阻止した。一次抗体を、５％脱脂粉乳／TBS-T において希釈した。ブロットを、希釈された抗体溶液に配置し、そして２３℃で１時間、回転せしめた。
【００６１】
次に、ウェスターンブロットを、TBS-T により３０分間、洗浄した。ホースラディシュ  ペルオキシダーゼ結合された二次抗体を、５％脱脂粉乳／TBS-T により希釈した。ブロットを、二次抗体溶液と共にインキュベートし、そして２３℃で４５分間、回転せしめた。次に、ブロットをTBS-T により３０分間、洗浄した。等体積のAmersham's ＥＣＬ展開溶液Ａ及びＢを一緒に混合した。ウェスターンブロットを、その展開溶液において１分間インキュベートした。ブロットを、SaranRラップにより包装し、そしてイメージング  フィルム（Kodak Rochester N.Y. X-OMAT AR, カタログ番号１６５１４５４）に暴露した。
【００６２】
３匹のマウスからの扁桃（１）、視床（２）及び皮質（３）のウェスターンブロットを、ｐ２５及びp35/39（L.H. Tsai, Harvard Medical School の贈与物、図１（Ａ））に対して特異的な抗体によりプローブした。p35/39の検出は明らかであるが、ｐ２５は野生型マウスは検出されない。同じ分析がトランスジェニック  マウスにおいて行われる場合（図１（Ｂ））、ｐ３５の構成的発現の他に、ｐ２５の強い発現が検出される。それらの結果は、トランスジーンの発現がｐ２５トランスジェニック動物において強いことを確証する。
【００６３】
銀染色体及びＳＭＩ ３４免疫組織化学：
予定通りに殺されたマウスから集められた組織を１０％の中性―緩衝化されたホルマリン又は４％のパラホルムアルデヒドにより現場灌流−固定し、そして死亡したマウスから集められた組織をホルマリンに含浸固定した。固定化に続いて、整えられた組織を等級化されたアルコールにより脱水し、そしてパラフィンにより埋包した。脳の標準の断面を、The Mouse Brain in Stereotaxic Coodinates (Franklin and Paxinos, 1997 ) における図への類似性により同定した。パラフィン断面（８μｍの厚さ）を、変性されたBielschowsky銀染色により染色し、そしてリン酸化された神経フィラメントに対して向けられた抗体（SMI 34；Stemberger Monoclonals, Inc Lutherville, MD から市販されている) により免疫組織化学的に染色した。
【００６４】
免疫組織化学：
免疫組織化学研究のために、トランスジェニック及び野生型マウスを、ナトリウム  ペントソルビタールにより深く麻酔し（60mg/kg, i.p. ）、そして0.9%のNaClを含む0.1 Ｍのリン酸ナトリウム（ＰＢＳ, 7.4 ）20ml, 続いて0.1Mのリン酸ナトリウム（ＰＢ, 7.4 ）緩衝液中、固定剤含有４％パラホルムアルデヒド30mlにより大動脈を通して灌流した。脳を除去し、ＰＢＳ含有２０％スクロールにおいて４８時間、凍結保護し、微紛砕されたドライアイスの層において凍結し、そして次に、スライドするミクロトーム上で３５ミクロンの断片に切断した。１８の連続した断片の１つを、0.1 ＭのＰＢに集め、そして下記のようにして、免疫組織化学のために処理した。
【００６５】
免疫組織化学のために、断片を、0.9%のNaCl及び0.1%のTriton Ｘ−100 を50mMのトリス緩衝液（ｐＨ7.4 ）(TBS) において１時間インキュベートした。次に、断片をＴＢＳにより洗浄し、そして抗体ビークル（ＴＢＳ中４％ヤギ又はウマ血清、0.1% Triton X-100 ）において１時間インキュベートした。ＴＢＳによる追加の洗浄の後、断片を一次抗体を含むビークルにおいて４℃で一晩インキュベートした。
【００６６】
一次抗体における一晩のインキュベーションに続いて、断片をＴＢＳにより洗浄し、ビオチニル化されたウマ抗―マウス又はやぎ抗―ウサギ抗体（Vector Labs, Burlingame, CA による）を含むビークルにおいて１時間インキュベートし、ＴＢＳにより洗浄し、そして次に、ＡＢＣ／ホースラディシュ  ペルオキシダーゼ試薬（Vecter Labs, Burlingame, CA ）を含むＴＢＳにおいて１時間インキュベートした。
【００６７】
ＴＢＳによる追加の洗浄の後、免疫局在化生成物を、0.04% のジアミノベンジン（ＤＡＢ）及び0.003%のH2O2を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（pH 7.6）において３〜５分間、断片を展開することによって可視化した。続いて、断片をトリス緩衝液により洗浄し、スライド上に固定し、そしてＤＰＸ（Fluka, Ronkokome, NY）を用いて、脱水し、そしてカバーガラスにより被覆した。
【００６８】
抗体：
ＡＴ−８：
１：1,000 (200ng／ml) で使用される；リン酸化されたヒトｔａｕのser 202 及びthr 205 を認識するマウスモノクローナル抗体（Innogenetics, Inc. Zwij+ndrecht (Beigium) ）。
ＰＨＦ−１３：
１：20,000で使用される；リン酸化されたヒトｔａｕのser 396 及びthr404を認識するモノクローナル抗体（V. Lee, University of Pennsylvaniaからの贈与物）。
【００６９】
抗−ＴＡＵ：
１：7,000 で使用される；全ｔａｕを認識するウサギ  モノクローナル（Accurate Chemical and Scientific Corp Westbury, NY）。
ＳＭＩ３４：
１：1000で使用される；リン酸化された神経フィラメントＨを認識するマウス
モノクローナル（Stemberger Monoclonals, Inc., Lutherville, MD ）。
【００７０】
生後４ヶ月のトランスジェニック  マウス及び野生型マウスからの脳を、免疫組織化学により、ｔａｕ及び神経フィラメント  ホスホエピトープの存在について比較した。それぞれ、リン酸化されたSer-202 及びThr-205 、並びにSer-396, 404を認識するAT-8及びPHF-13モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物の外部カプセル（示されていない）に隣接する、扁桃（それぞれ図２及び４）、視床／視床下部及び皮質におけるニューロンをラベルするが、しかし野生型動物の対応する領域におけるニューロンをラベルしなかった（図３及び５）。
【００７１】
さらに、全ｔａｕについての染色はｐ２５トランスジェニック動物における多くの細胞体を示し（図６）、そして主として軸索及び非常に少数の細胞体が野生型マウスにおいてラベルされた（図７）。リン酸化された神経フィラメントＨを認識するモノクローナル抗体（SMI 34）はまた、トランスジェニック  マウスのそれらの３種の脳領域及び脊髄において高められた免疫染色性を示すが（扁桃が図８に示される）、しかし野生型においてはそれを示さなかった。それら３種のすべてのマーカーは、年齢相当の対照に比較して、アルツハイマー脳においては高められることが知られている。
【００７２】
アルツハイマー脳においては、変更されたｔａｕタンパク質を含むニューロンにおける病理学的変化が、銀に基づく染色法を用いて同定されてきた。本発明は、本発明のトランスジェニック  マウスにおいて、上記と同じ３種の脳領域及び脊髄におけるニューロンが改良されたBielschowsky 銀染色法を用いて、陽性の標識を示すことを見出した（扁桃、図１０）。この染色は再び、野生型対照動物においては不在であった（図１１）。本発明者はまた、トランスジェニック  マウスの脊髄における明らかな拡大された軸索において、銀染色し、そしてリン酸化された神経フィラメントＨの上昇を検出し（それぞれ、図１２及び１３）、ところが野生型マウスにおいては、軸索は予測される大きさのものであり、そして神経フィラメント染色は正常であった（図１４）。
【００７３】
ＡＴ−８免疫反応性に関しては、扁桃におけるほとんどのラベルされたニューロンは、しばしば膨張したジストロフィー小丘及びねじ曲げられた軸索を伴って、十分に定義された、濃く染色する体を示した（図２）。まれではあるが、同定されていない細胞の拡散ラベリングが見られ、そして時おり、大グリア細胞又は小グリア細胞形態を有する細胞がラベルされた。外部カプセルに隣接する皮質においては、ＡＴ−８染色の大部分は、断面的に存在する場合、しばしば軸索を付随して、強くラベルされたニューロン細胞体に見出された。視床／視床下部染色は、他の断片に見られるような両ニューロン染色と共に、より多様であった。
【００７４】
ｐ２５ Tg マウスからの脳及び脊髄の組織学的試験は、脳又は脊髄のニューロン及び軸索における変化を示したが（ｎ＝１９）、しかし１０種の年齢相当の野生型対照からのそれらの組織においては変化を示さなかった。軸索変化は、脊髄（頸部及び胸部）において最も明白であり、そして２０〜５０μｍの直径への軸索原形質の著しい拡張から構成された。拡張された軸索は、銀染色し、そしてリン酸化された神経フィラメントH により満たされた（図１２，１３）。影響された脊髄の一定の横断面は一般的に、白色質のすべての索間に分布される１０〜１００の染色は、影響された軸索のエミリン鞘の内部部分の溶解を示した（記載されていない）。
【００７５】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】これは、（Ａ）ｐ２５及びｐ３５／３９に対して特異的な抗体によりプローブされた３種の野生型マウスからのウェスターンブロット；（Ｂ）同じ抗体によりプローブされた３種のトランスジェニック  マウスからのウェスターンブロットを示す。
【図２】これは、扁桃の吻部分において特異的なＡｔ−８に対して免疫陽性のトランスジェニック  マウス脳を示す。
【図３】これは、扁桃の吻部分においてＡＴ−８に対して最小陽性の野生型マウス脳を示す。
【図４】これは、扁桃の吻部分においてＰＨＦ―１３に対して免疫陽性のトランスジェニック  マウス脳を示す。
【図５】これは、扁桃の吻部分においてＰＨＦ―１３に対して最小陽性の野生型マウス脳を示す。
【図６】これは、扁桃の吻部分のいくつかの細胞体における全ｔａｕに対して免疫陽性のトランスジェネック  マウス脳を示す。
【図７】これは、扁桃の吻部分の軸索においてｔａｕに対して免疫陽性の野生型マウス脳を示す。
【図８】これは、ＳＭＩ−３４により反応されたトランスジェニック  マウス脳を示す。
【図９】これは、野生型マウス脳の扁桃の吻部分における最小のＳＭＩ−３４軸索陽性を示す。
【図１０】これは、トランスジェニック  マウス脳の扁桃の吻部分における銀−陽性細胞体を示す。
【図１１】これは、野生型マウス脳の扁桃の吻部分における軸索の最小銀陽性を示す。
【図１２】これは、トランスジェニック  マウスの脊髄において銀陽性を示すいくつかの拡張された軸索を示す。
【図１３】これは、トランスジェニック  マウスの脊髄においてＳＭＩ−３４陽性を示すいくつかの拡張された軸索を示す。
【図１４】これは、野生型マウスの脊髄における正常な軸索がＳＭＩ−３４に対して陰性であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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