(57)【要約】【課題】光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を、より高い光学純度で安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）【化１】2005027552.tif 000032で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）【化２】2005027552.tif 000033で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造する（式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
2005027552.tif 000030
で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化２】
2005027552.tif 000031
で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法（一般式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）。
【請求項２】
エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）に示すタンパク質である、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】
エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒ１〜Ｒ５が全て水素原子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を用いて、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体の炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元して、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸は医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である。（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸は、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を不斉触媒で還元して得られることが報告されているが（例えば、特許文献１または非特許文献１参照）、生成物の光学純度は３０〜６０％ｅ．ｅ．前後と低かった。
【０００３】
エノエートレダクターゼは、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合を還元する反応を触媒する酵素であるが、例えば、クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）などの微生物でその存在が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。エノエートレダクターゼ活性を有する微生物を利用した各種エノエートの不斉還元が報告されているが（例えば、非特許文献３参照）、エノエートのうち、２位の炭素がヒドロキシメチル化された２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に関しては、エノエートレダクターゼを用いた不斉還元の報告例は無かった。
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−２２９９０７号公報
【非特許文献１】Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ，  ｖｏｌ．  ３，  ｐ１９１，  １９９８
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２７６，  Ｎｏ．  ８，  ｐ５７７９−５７８７，  ２００１
【非特許文献３】Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２０，  ｐ８１７，  １９９８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を、より高い光学純度で安価かつ簡便に製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法について鋭意検討した結果、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が、原料となる２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体の不斉還元反応を触媒することを見出した。さらに、該タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換細胞を作製し、該細胞、該細胞の調製物、または該細胞を培養して得られた培養液を、原料となる２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に作用させることにより、高い光学純度かつ高濃度で目的物である（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を得られることを見出した。以上によって、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  下記一般式（Ｉ）
【化３】
2005027552.tif 000002
で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を作用させて、下記一般式（ＩＩ）
【化４】
2005027552.tif 000003
で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を生成させることを特徴とする、一般式（ＩＩ）で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法（一般式（Ｉ）、（ＩＩ）中、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す）。
（２）  エノエートレダクターゼが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質である、（１）の製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（３）  エノエートレダクターゼを含む細胞が、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞である、（１）の製造方法。
（４）  エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを染色体上に組み込むことによって形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（５）  エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が、前記ＤＮＡを含むベクターで形質転換された細胞である、（３）の製造方法。
（６）  エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ａ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または
（Ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質。
（７）  エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが以下の（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）に示すＤＮＡである、（３）〜（５）のいずれかの製造方法：
（Ｄ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または
（Ｅ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列またはその相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｆ）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなり、かつ一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）  一般式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物において、Ｒ１〜Ｒ５が全て水素原子であることを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかの製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、エノエートレダクターゼまたはそれを含む細胞、同細胞の調製物もしくは同細胞を培養して得られた培養液を、反応基質である下記一般式（Ｉ）
【化５】
2005027552.tif 000004
で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に作用させることにより、該化合物の炭素・炭素二重結合を不斉還元させ、下記一般式（ＩＩ）
【化６】
2005027552.tif 000005
で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造する。
【０００９】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す。
【００１０】
ここで、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。これらの中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。また、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。これらの中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
【００１１】
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシル基等が挙げられる。したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換されたアルキル基として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、トリフルオロメチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。また、置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００１２】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ１〜Ｒ５はそれぞれ独立してハロゲン原子であってもよいが、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
【００１３】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のＲ１〜Ｒ５は、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルコキシ基であり、より好ましくは水素原子である。
【００１４】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、例えば２−ヒドロキシメチル桂皮酸等が挙げられる。上記一般式（Ｉ）で表される化合物は、欧州特許第９０６９０１号明細書、欧州特許第９３７７１０号明細書、仏国特許発明第２７７２０２７号明細書等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
【００１５】
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下のものであり、具体的には、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸等が挙げられる。
【００１６】
エノエートレダクターゼは、一般には、エノエート（ｅｎｏａｔｅ）の炭素・炭素二重結合の還元反応を触媒する酵素をいう（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２０，  ｐ８１７，  １９９８）が、本発明においては、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体の炭素・炭素二重結合を不斉還元して（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を生成する活性を有する酵素をいう。ここで、生成する（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の光学純度は、７０％  ｅ．ｅ．以上であることが好ましく、９０％  ｅ．ｅ．以上であることがより好ましく、９５  ％  ｅ．ｅ．以上であることが特に好ましい。このような活性は、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を基質として含有し、さらにＮＡＤＨを補酵素として含有する反応系において、ＮＡＤＨの減少初速度を測定することにより測定することができる。
【００１７】
本発明の製造方法において用いることのできるエノエートレダクターゼとしては、例えば、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。これらはそれぞれ、ムーレラ  サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、クロストリジウム  アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のエノエートレダクターゼである。
【００１８】
また、本発明においては、これらのホモログであって、前記の酵素活性を有するものを用いてもよい。ホモログとは、例えば、前記活性を害さない範囲内において配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列に一個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。ここで数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
【００１９】
また、前記ホモログは、配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。ちなみに上記タンパク質のホモロジー検索は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋやＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴなどのプログラムを用いて行うことができる。配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋを対象にＢＬＡＳＴ  ｐｒｏｇｒａｍによりホモロジー検索を行った結果、配列番号２の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＡＡ７１０８６）と５９％の相同性を示し、配列番号４の配列はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ由来２−ｅｎｏａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＡＡ７１０８６）と４９％の相同性を示した。また、配列番号２と配列番号４の配列は互いに５０％の相同性を示した。
【００２０】
本発明の製造法に用いるエノエートレダクターゼは、エノエートレダクターゼの一部又は全部をコードする遺伝子の塩基配列を元にして作製したプローブを用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物からエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを単離した後、該ＤＮＡを大腸菌などの宿主に発現させることによって得ることができる。また、エノエートレダクターゼ活性を有する微生物、例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌やムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌の菌体から精製することによって得ることもできる。細菌の菌体からエノエートレダクターゼを取得する方法としては、例えば、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ９７，  ｐ１０３（１９７９）に記載の方法を参考に行うことができる。
【００２１】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌としては、例えばクロストリジウム  アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有しており、ムーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌としては、例えばムーレラ  サーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４株が、本発明に好適に利用できるエノエートレダクターゼを有している。前者はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）に記載されており、該ＡＴＣＣから入手できる。また、後者はＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  （Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ））のオンラインカタログ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）に記載されており、該ＤＳＭＺから入手可能である。
【００２２】
本発明の製造方法においては、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体をエノエートレダクターゼの精製酵素と反応させてもよいが、エノエートレダクターゼを含む細胞、同細胞の調製物、または同細胞を培養して得られた培養液を、２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に反応させて、（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を製造してもよい。エノエートレダクターゼを含む細胞としては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞が好ましい。
【００２３】
この場合、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号２または４のアミノ酸配列を有するエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と５０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、一般式（Ｉ）で表される２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体を一般式（ＩＩ）で表される光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。また、本発明製造法においては、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡのホモログであって、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いてもよい。
【００２４】
ここで、ホモログとは、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列に１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列及びその相補鎖からなるＤＮＡを含む。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１０個以下である。
【００２５】
また、ホモログは、配列番号１または３の塩基配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、エノエートレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、プローブＤＮＡを用いて、ストリンジェントな条件下で、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を行うことにより得られるＤＮＡを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法およびプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００２６】
エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。まず、エノエートレダクターゼを上記の方法等により微生物菌体等から精製した後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析する。Ｎ末端アミノ酸配列解析は、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により精製タンパク質を切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製した後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析して複数のアミノ酸配列を決めることにより行う。決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマーを用い、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡの一部（ＤＮＡ断片）を得ることができる。さらに、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから、前記のＤＮＡ断片をプローブに用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
また、前記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、配列が決定された領域の外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、エノエートレダクターゼ生産微生物株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応により環化させたＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｓｅ  ＰＣＲ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｖｏｌ．  １２０，ｐ６２１−６２３（１９８８））を行うことにより、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることも可能である。
【００２８】
なおエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することによって得ることもできる。
【００２９】
当業者であれば、配列番号１または配列番号３に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ｖｏｌ．  １０，  ｐ６４８７  （１９８２），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ｖｏｌ．  １００，  ｐ４４８（１９８３），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＰＣＲ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐ２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、挿入及び／または付加変異を導入することにより、本発明の製造法に用いることのできるエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。
【００３０】
また、配列番号２または４のアミノ酸配列の全部またはその一部や、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を元に、例えばＧｅｎＢａｎｋやＤＤＢＪ等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡホモログの塩基配列情報を手に入れることも可能である。当業者であれば、この塩基配列情報を元に寄託菌株（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ等から入手可能）からのＰＣＲ等によりエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを手に入れることが可能である。
【００３１】
さらに、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡは、配列番号１または３の塩基配列の全部または一部を有するＤＮＡをプローブに用いて、エノエートレダクターゼ活性を有する任意の微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。ここで、「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
【００３２】
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記のようにして単離された、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、エノエートレダクターゼ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換された細胞を培養することにより、エノエートレダクターゼを該細胞から得ることができる。形質転換細胞は、公知の宿主細胞の染色体ＤＮＡにエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによっても得ることができる。
【００３４】
形質転換細胞の作製方法としては、具体的には、微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中に、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを組み込み、構築された発現ベクターを該微生物中に導入するか、もしくは、直接宿主ゲノム中にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００３５】
このとき、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡが宿主微生物中で発現可能なプロモーターを含んでいない場合には、適当なプロモーターをエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込む必要がある。さらに、ターミネーターを３’側下流に組み込むことが好ましい。このプロモーター及びターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば特に限定されず、これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター及びターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８・遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．  ｖｏｌ．  ４３，ｐ７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ  ｖｏｌ．  ８，ｐ４２３−４８８（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３６】
本発明のエノエートレダクターゼを発現させるための形質転換の対象となる宿主微生物としては、宿主自体が本反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはなく、具体的には以下に示すような微生物を挙げることができる。
【００３７】
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００３８】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
【００３９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００４０】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などに属する宿主ベクター系の確立されているカビ。
【００４１】
上記微生物の中で宿主として好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であり、特に好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である。
【００４２】
形質転換細胞作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、「モレキュラークローニング第２版」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、参照）。
【００４３】
以下、具体的に、好ましい宿主微生物、各微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００４４】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどが挙げられ、プロモーターとしては、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００４５】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどを挙げることができ、また、染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００４６】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）などで確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．  ２６，ｐ２７３−８２（１９８３））を挙げることができる。
【００４７】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ  ｖｏｌ．  ３９，ｐ２８１（１９８５））などのプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００４８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．  １９６，ｐ１７５（１９８４））などのプラスミドベクターが挙げられる。
【００４９】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５０】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．  ６，ｐ８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクターを挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５１】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  ７，ｐ２８３−２８７（１９８９））。
【００５２】
また、上記以外でも、各種微生物に応じた宿主ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が確立されており、特に蚕を用いた昆虫などの動物中（Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．  ３１５，  ｐ５９２−５９４  （１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系、及び大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽などの無細胞タンパク質合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
【００５３】
本発明の製造方法においては、反応基質である２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体にエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を作用させてもよい。形質転換細胞は、反応液中でそのまま作用させてもよいが、該細胞の調製物、例えば、該細胞をアセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トルエン等の有機溶媒や界面活性剤により処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体細胞調製物、該形質転換細胞中の本発明の酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したものを作用させてもよい。
【００５４】
本発明の製造方法においては、反応液に補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨを添加するのが好ましい。添加濃度は、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．０１〜１０ｍＭである。これらの補酵素を添加する場合には、ＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋をＮＡＤＨへの再生させることが生産効率向上のため好ましく、再生方法としては、
（ｉ）  宿主微生物自体のＮＡＤ＋還元能を利用する方法、
（ｉｉ）  ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその調製物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素（再生酵素）を反応系内に添加する方法、または
（ｉｉｉ）形質転換細胞を作製するに当たり、ＮＡＤＨの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子をエノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと同時に宿主に導入する方法、が挙げられる。
【００５５】
このうち、上記（ｉ）の方法においては、反応系にグルコースやエタノール、２−プロパノール、ギ酸などを添加することが好ましい。
【００５６】
また、上記（ｉｉ）の方法においては、上記再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体調製物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等に代表される担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の再生酵素を用いても良い。この場合、上記再生酵素の使用量としては、具体的には、本発明のエノエートレダクターゼに比較して、酵素活性で０．０１〜１００倍、好ましくは０．５〜２０倍程度となるよう添加する。また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である２−ヒドロキシメチル桂皮酸誘導体に対して、０．１〜２０倍モル当量、好ましくは１〜５倍モル当量添加する。
【００５７】
また、上記（ｉｉｉ）の方法においては、エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡと上記再生酵素類のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一のベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主を形質転換する方法、及び両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法を用いることができるが、両ＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換する方法の場合、両ベクター同士の不和合性を考慮してベクターを選択する必要がある。単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００５８】
本発明の製造方法は、例えば、反応基質、本発明の形質転換細胞および／または該形質転換細胞調製物、並びに、必要に応じて添加された各種補酵素及びその再生システムを含有する、水性媒体中または該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことができる。
【００５９】
本発明製造法において反応基質となる一般式（Ｉ）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜３０％ｗ／ｖの範囲で用いることができる。反応基質は、反応開始時に一括して添加しても良いが、酵素の基質阻害があった場合の影響を減らすという点や生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することが望ましい。
【００６０】
上記、水性媒体としては、水又は緩衝液が挙げられ、また、有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができる。
【００６１】
本発明の方法は例えば、４〜６０℃、好ましくは１０〜４５℃の反応温度で、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行うことができる。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。また、エノエートレダクターゼの酸素による失活を防ぐため、反応液中に亜硫酸ナトリウムを添加したり、反応液を窒素やアルゴンガス等でシールすることにより、酸素の除去を行うことも効果的である。
【００６２】
本発明の方法により生成する（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸は、反応終了後、反応液中の菌体やタンパク質を遠心分離、膜処理などにより分離した後に、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、晶析等のなどを適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６４】
（１）ムーレラ  サーモオートトロフィカ由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
ムーレラ  サーモオートトロフィカ由来のエノエートレダクターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＣＡＡ７６０８２、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ１６１３６  ＲＥＧＩＯＮ：４７．．２０５０、配列番号１）を元に配列番号５および６に記載のプライマーを合成した。これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ムーレラ  サーモオートトロフィカＤＳＭ１９７４のゲノムＤＮＡ  ２５ｎｇ、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６５】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ    Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ    ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）  により精製後回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法により形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＭｔＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号１の塩基配列と一致した。
【００６６】
（２）クロストリジウム  アセトブチリカム由来のエノエートレダクターゼ遺伝子で形質転換された形質転換細胞の作製
クロストリジウム  アセトブチリカム由来の２−ｅｎｏａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＫ８１３０２、配列番号２）をコードするＤＮＡ配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ００７８３４  ＲＥＧＩＯＮ：  ８５９．．２８５３、配列番号４）を元に配列番号７および８に記載のプライマーを合成し、これらのプライマーを各１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、クロストリジウム  アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡ  ２５ｎｇ  、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−用１０×緩衝液（東洋紡績社製）５μＬ、ＫＯＤ  −ｐｌｕｓ−  １ユニット（東洋紡績社製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、１５秒）、アニール（５７℃、３０秒）、伸長（６８℃、２分）を３０サイクルで、ＰＴＣ−２００（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。
【００６７】
上記反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ    Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ    ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製後、回収した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩで消化したｐＵＣ１１８に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を熱ショック法により形質転換した。形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育させ、コロニーダイレクトＰＣＲを行い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするＤＮＡ断片が挿入されていると考えられる形質転換細胞を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＰｒｅｐＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを精製し、ｐＵＣＣａＥＲ１とした。プラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列をダイターミネーター法により解析したところ、挿入されたＤＮＡ断片は、配列番号３の塩基配列と一致した。
【００６８】
（３）エノエートレダクターゼをコードするＤＮＡで形質転換された大腸菌を用いた（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の合成
上記（１）、（２）で得られた形質転換細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）、０．１ｍＭイソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地でアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で３０時間生育させた。得られた菌体ブロス５ｍＬを遠心分離により集菌して菌体を得た後、下記に示す方法により、２−ヒドロキシメチル桂皮酸を基質として該菌体の還元活性を確認した。なお、２−ヒドロキシメチル桂皮酸は公知の方法（欧州特許第９０６９０１号明細書等、参照）により合成して用いた。
【００６９】
上記菌体に２００μＬの反応液（０．６ｇ／Ｌ  ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母社製）、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  グルコース、０．２ｇ／Ｌグルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬社製、７６ｕｎｉｔ／ｍｇ）、１０ｍＭ  ２−ヒドロキシメチル桂皮酸）を添加後、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）による嫌気条件下、３７℃で２０時間反応させた。１０μＬの６Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を終了し、酢酸エチルで抽出し、濃縮後２−プロパノールに溶解して２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸を定量した。
【００７０】
定量は２−プロパノール溶液を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５ＰＹＥ  （ナカライテスク社製）  ４０℃
溶離液：０．０５％（ｖ／ｖ）  リン酸水溶液／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
また、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の光学純度は特開平１１−１０６３６３号公報に記載の方法で測定することができる。この結果、ｐＵＣＭｔＥＲ１を形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の収量は３５．７μｇであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。また、ｐＵＣＣａＥＲ１を形質転換した大腸菌を用いた場合の（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の収量は１１４μｇであり、光学純度は９９％  ｅ．ｅ．以上であった。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によって、医薬、農薬等の中間体原料として産業上有用な化合物である光学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸を高い光学純度で得ることが可能になった。
【００７２】
【配列表】
2005027552.tif 000006
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