(57)【要約】【課題】タンパク質又はペプチドのＮ末端に効率よくスルホン酸基を導入する方法、タンパク質又はペプチドを質量分析によって簡便且つ効率的に解析することができる方法、及び効率よくタンパク質又はペプチドのＮ末端をスルホン酸誘導体化するための中間体を提供する。【解決手段】タンパク質又はペプチドのＮ末端に、ジスルフィド基含有化合物を反応させ、前記Ｎ末端が前記化合物により修飾されたタンパク質又はペプチドを得る工程と、修飾されたタンパク質又はペプチドにおいて、ジスルフィド結合を開裂させてスルホン酸基に変換することにより、修飾されたタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する工程とを含む、タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。得られたスルホン酸誘導体を質量分析にてアミノ酸配列を決定する方法。Ｎ末端アミノ基がジスルフィド基含有基で修飾されたタンパク質又はペプチド。【選択図】図１
2005139174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質又はペプチドのＮ末端に、ジスルフィド基を含有する化合物Ａを反応させることにより、前記Ｎ末端が前記化合物Ａにより修飾されたタンパク質又はペプチドを得る修飾工程と、
前記ジスルフィド基のジスルフィド結合を開裂させてスルホン酸基に変換することにより、前記修飾されたタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する開裂工程とを含む、タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項２】
前記化合物Ａが、前記タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基を有する、請求項１に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項３】
前記タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基が、カルボキシル基、イソチオシアネート基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基、及びテトラフルオロスルホフェノキシカルボニル基からなる群から選ばれる、請求項２に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項４】
前記開裂工程におけるスルホン酸基への変換を、前記ジスルフィド結合を酸化的に開裂することによって行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項５】
前記開裂工程におけるスルホン酸基への変換を、前記ジスルフィド結合を還元的に開裂し、その後、酸化反応することによって行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項６】
前記修飾工程の前に、前記タンパク質又はペプチドの側鎖アミノ基を保護する保護工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項７】
前記保護工程において、前記側鎖アミノ基をグアニジノ化することによって保護する、請求項６に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項８】
前記修飾工程の後、前記開裂工程の前に、
前記化合物Ａによって修飾されたタンパク質又はペプチドを断片化することにより、前記タンパク質又はペプチドのＮ末端に由来し且つ前記化合物Ａによって修飾された１種のＮ末端ペプチドフラグメントと、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメントとを得る断片化工程と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメントを前記その他のペプチドフラグメントから分離することにより選択的に回収する分離工程とをさらに含み、
前記開裂工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント中の前記化合物Ａに由来するジスルフィド結合を開裂させてスルホン酸基に変換することにより、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項９】
前記修飾工程において、まず、固相支持体がさらに前記化合物Ａに結合した固定化型化合物Ａを用意し、次に、前記固定化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記固定化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項１０】
前記修飾工程において、まず、固相支持体がさらに前記化合物Ａに結合した固定化型化合物Ａを用意し、次に、前記固定化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記固定化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得て、
前記断片化工程において、前記固定化型化合物Ａによって修飾されたＮ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントを得て、
前記分離工程において、前記その他のペプチドフラグメントを溶出させることにより前記Ｎ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収し、
前記開裂工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメントのジスルフィド結合を開裂させることによって、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、請求項８に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項１１】
前記修飾工程において、まず、ビオチニル基がさらに前記化合物Ａに結合したビオチニル化型化合物Ａを用意し、次に、前記ビオチニル化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記ビオチニル化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項１２】
前記修飾工程において、まず、ビオチニル基がさらに前記化合物Ａに結合したビオチニル化型化合物Ａを用意し、次に、前記ビオチニル化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記ビオチニル化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得て、
前記断片化工程において、前記ビオチニル化型化合物Ａによって修飾されたＮ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントを得て、
前記分離工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメントをアビジンが固定化された固相支持体に吸着させて、前記その他のペプチドフラグメントを溶出させることにより、前記支持体に吸着したＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収し、
前記開裂工程において、前記吸着したＮ末端ペプチドフラグメントのジスルフィド結合を開裂させることによって、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、請求項８に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を用いて得られたタンパク質又はペプチドのスルホン酸誘導体を、質量分析することによって前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１４】
Ｎ末端アミノ基がジスルフィド基含有基で修飾されたタンパク質又はペプチド。
【請求項１５】
前記ジスルフィド基含有基に、さらに固相支持体が結合している、請求項１４に記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項１６】
前記ジスルフィド基含有基に、さらにビオチニル基が結合している、請求項１４に記載のタンパク質又はペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析装置において、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体にする方法として、スルホン酸やスルホニル基を有する化合物を直接タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることが行われている。しかし、このような方法では、反応種が強酸性基を有するために、タンパク質又はペプチドのＮ末端への反応効率に問題があった。
【０００３】
また、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol 96, PP7131-7136, June 1999には、２−スルホ安息香酸環状酸無水物やクロロスルホニルアセチルクロリドなどの試薬を用いてペプチドのＮ末端にスルホン酸基を導入する方法が記載されている。しかし、この方法では、トリプシンペプチドを用いて上記試薬を作用させるため、Ｎ末端フラグメントを選択的に回収することができず、タンパク質又はペプチドのＮ末端フラグメントのみをスルホン酸誘導体にすることができない。
【非特許文献１】プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America）、第９６巻、１９９９年６月、ｐ．７１３１−７１３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の第一の目的は、タンパク質又はペプチドのＮ末端に効率よくスルホン酸基を導入することによりスルホン酸誘導体化する方法を提供することにある。この目的においては、タンパク質又はペプチドのＮ末端フラグメントを選択的に回収しつつスルホン酸誘導体化することができ且つ質量分析する場合に有用な方法を提供する。  
【０００５】
本発明の第二の目的は、タンパク質又はペプチドを質量分析によって簡便に且つ効率的に解析することができる方法を提供することにある。この目的においては、タンパク質又はペプチドのＮ末端フラグメントをスルホン酸誘導体として選択的に回収し、マススペクトルにおいてｙイオン系列を検出することにより、簡便に且つ効率的に解析することができる方法を提供する。
【０００６】
本発明の第三の目的は、効率よくタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化するための中間体を提供することにある。この目的においては、Ｎ末端ペプチドフラグメントの選択的回収及び質量分析を行うために有用な中間体を提供する。
【０００７】
本発明には、以下の発明が含まれる。
１．以下の（１）〜（１１）の発明は、タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法に関する。
【０００８】
下記（１）は、化合物Ａを用いた修飾工程と、開裂工程とを行う形態を示す。
（１）タンパク質又はペプチドのＮ末端に、ジスルフィド基を含有する化合物Ａを反応させることにより、前記Ｎ末端が前記化合物Ａにより修飾されたタンパク質又はペプチドを得る修飾工程と、
前記ジスルフィド基のジスルフィド結合を開裂させてスルホン酸基に変換することにより、前記修飾されたタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する開裂工程とを含む、タンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【０００９】
下記（２）及び（３）は、（１）における化合物Ａの構造について示す。
（２）前記化合物Ａが、前記タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基を有する、前記（１）に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
（３）前記タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基が、カルボキシル基、イソチオシアネート基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基、及びテトラフルオロスルホフェノキシカルボニル基からなる群から選ばれる、（２）に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１０】
下記（４）及び（５）は、（１）における開裂工程について示す。
（４）前記開裂工程におけるスルホン酸基への変換を、前記ジスルフィド結合を酸化的に開裂することによって行う、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
（５）前記開裂工程におけるスルホン酸基への変換を、前記ジスルフィド結合を還元的に開裂し、その後、酸化反応することによって行う、前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１１】
下記（６）及び（７）は、（１）における修飾工程の前に保護工程を行う形態を示す。
（６）前記修飾工程の前に、前記タンパク質又はペプチドの側鎖アミノ基を保護する保護工程をさらに含む、前記（１）〜（５）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
（７）前記保護工程において、前記側鎖アミノ基をグアニジノ化することによって保護する、前記（６）に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１２】
下記（８）は、（１）において、修飾工程の後、開裂工程の前に、断片化工程及び分離工程を行う形態を示す。
（８）前記修飾工程の後、前記開裂工程の前に、
前記化合物Ａによって修飾されたタンパク質又はペプチドを断片化することにより、前記タンパク質又はペプチドのＮ末端に由来し且つ前記化合物Ａによって修飾された１種のＮ末端ペプチドフラグメントと、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント以外の１種又は複数種のその他のペプチドフラグメントとを得る断片化工程と、
前記Ｎ末端ペプチドフラグメントを前記その他のペプチドフラグメントから分離することにより選択的に回収する分離工程とをさらに含み、
前記開裂工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメント中の前記化合物Ａに由来するジスルフィド結合を開裂させてスルホン酸基に変換することにより、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、前記（１）〜（７）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１３】
下記（９）及び（１０）は、固定化型化合物Ａを用いる形態を示す。
（９）前記修飾工程において、まず、固相支持体がさらに前記化合物Ａに結合した固定化型化合物Ａを用意し、次に、前記固定化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記固定化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
（１０）前記修飾工程において、まず、固相支持体がさらに前記化合物Ａに結合した固定化型化合物Ａを用意し、次に、前記固定化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記固定化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得て、
前記断片化工程において、前記固定化型化合物Ａによって修飾されたＮ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントを得て、
前記分離工程において、前記その他のペプチドフラグメントを溶出させることにより前記Ｎ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収し、
前記開裂工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメントのジスルフィド結合を開裂させることによって、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、前記（８）に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１４】
下記（１１）及び（１２）は、ビオチニル化型化合物Ａを用いる形態を示す。
（１１）前記修飾工程において、まず、ビオチニル基がさらに前記化合物Ａに結合したビオチニル化型化合物Ａを用意し、次に、前記ビオチニル化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記ビオチニル化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得る、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
（１２）前記修飾工程において、まず、ビオチニル基がさらに前記化合物Ａに結合したビオチニル化型化合物Ａを用意し、次に、前記ビオチニル化型化合物Ａを、タンパク質又はペプチドのＮ末端に反応させることにより、前記ビオチニル化型化合物Ａによって前記Ｎ末端が修飾されたタンパク質又はペプチドを得て、
前記断片化工程において、前記ビオチニル化型化合物Ａによって修飾されたＮ末端ペプチドフラグメントと前記その他のペプチドフラグメントを得て、
前記分離工程において、前記Ｎ末端ペプチドフラグメントをアビジンが固定化された固相支持体に吸着させて、前記その他のペプチドフラグメントを溶出させることにより、前記支持体に吸着したＮ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収し、
前記開裂工程において、前記吸着したＮ末端ペプチドフラグメントのジスルフィド結合を開裂させることによって、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントを得る、前記（８）に記載のタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法。
【００１５】
２．以下の（１３）の発明は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法に関する。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法を用いて得られたタンパク質又はペプチドのスルホン酸誘導体を、質量分析することによって前記タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００１６】
３．以下の（１４）〜（１６）の発明は、修飾されたタンパク質又はペプチドに関する。
（１４）Ｎ末端アミノ基がジスルフィド基含有基で修飾されたタンパク質又はペプチド。
（１５）前記ジスルフィド基含有基に、さらに固相支持体が結合している、前記（１４）に記載のタンパク質又はペプチド。
（１６）前記ジスルフィド基含有基に、さらにビオチニル基が結合している、前記（１４）に記載のタンパク質又はペプチド。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によると、タンパク質又はペプチドのＮ末端に効率よくスルホン酸基を導入することによりスルホン酸誘導体化する方法を提供することができる。また、タンパク質又はペプチドのＮ末端フラグメントを選択的に回収しつつスルホン酸誘導体化することができ且つ質量分析する場合に有用な方法を提供することができる。
【００１８】
本発明によると、タンパク質又はペプチドを質量分析によって簡便に且つ効率的に解析することができる方法を提供することができる。また、タンパク質又はペプチドのＮ末端フラグメントをスルホン酸誘導体として選択的に回収し、マススペクトルにおいてｙイオン系列を検出することにより、簡便に且つ効率的に解析することができる方法を提供することができる。
【００１９】
本発明によると、効率よくタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化するための中間体を提供することができる。また、Ｎ末端ペプチドフラグメントの選択的回収及び質量分析を行うために有用な中間体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
第一に、本発明は、タンパク質又はペプチドのＮ末端にスルホン酸基を形成することによりスルホン酸誘導体化する方法である。本発明の方法においては、タンパク質又はペプチドのＮ末端をジスルフィド基を含有する化合物(化合物Ａ)によって修飾する修飾工程と、ジスルフィド基を開裂してスルホン酸基に変換する開裂工程とを含み、場合により、修飾工程の前に保護工程を、修飾工程と開裂工程との間に断片化工程及び分離工程を含む。
【００２１】
［保護工程］
発明の方法においては、修飾工程に先立ち、スルホン酸誘導体化すべきタンパク質又はペプチドの、側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基の側鎖アミノ基を保護するための保護工程を行うことができる。側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としては、ε−アミノ基を有するリジン残基やδ−アミノ基を有するオルニチン残基などが挙げられる。保護工程においては、側鎖アミノ基だけに選択的に反応し、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ基には反応しない方法を、特に限定することなく用いることができる。例えば、グアニジノ化反応によってアミノ基をグアニジノ基で保護する方法を行うことが好ましい。グアニジノ化反応は、例えばリジン残基をホモアルギニン残基へ、オルニチン残基をアルギニン残基へ変換する。このことによって、側鎖アミノ基が保護されたタンパク質又はペプチドを得る。
【００２２】
側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基としてリジンのみを含むペプチドのモデルをグアニジノ化によって保護する例を挙げ、本工程を下記式１に示す。式中、ａ〜ｌは、側鎖アミノ基を有しないアミノ酸残基を表す。
【００２３】
【化１】
2005139174.tif 000003
【００２４】
グアニジノ化反応は上記式１に示すように、側鎖アミノ基（−ＮＨ２）を、グアニジノ基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）に変換する。グアニジノ化試薬としては、Ｏ−メチルウレア、Ｓ−メチルイソチオウレア、１−グアニルー３，５−ジメチルピラゾール等を用いるとよい。実際には、例えば、アンモニア水等の塩基性溶液に解析すべきタンパク質及びグアニジノ化試薬を混合して反応を行う。このようにして、側鎖アミノ基がグアニジノ基で保護されたタンパク質又はペプチドが得られる。
上記保護工程においては、側鎖アミノ基だけが選択的に保護され、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ基は保護されないため、修飾工程において選択的に前記Ｎ末端アミノ基を修飾することができる。
【００２５】
［修飾工程］
修飾工程においては、スルホン酸誘導体化すべきタンパク質又はペプチド、若しくは、上記保護工程によって得られた保護されたタンパク質又はペプチド（以下、単にタンパク質又はペプチドと表記する。）のＮ末端を、化合物Ａ（ジスルフィド基含有化合物）によって修飾する。
【００２６】
本発明の方法における化合物Ａは、タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基とジスルフィド基とを有する化合物である。Ｎ末端と反応することができる官能基としては、通常カルボキシル基が選択される。この他に、イソチオシアネート基などの活性基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基、及びテトラフルオロスルホフェノキシカルボニル基などの活性エステル基であっても良い。化合物Ａは、さらにスルホン酸基を有していても良い。スルホン酸基は、上記Ｎ末端と反応することができる官能基に結合していても良い。またジスルフィド基は、化合物Ａの主鎖の一部を構成する。化合物Ａの例としては、ＡＥＤＰ（３−（［２−アミノエチル］ジチオ）プロピオン酸塩酸塩）、シスチン誘導体などが挙げられる。
【００２７】
本工程においては、タンパク質又はペプチドと上記化合物Ａとを、塩基の存在下、縮合剤を用いて反応させることができる。縮合剤としては、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどが挙げられる。縮合剤の量は、例えばタンパク質又はペプチドに対して１〜５０当量用いることができる。塩基としては、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−エチルモルホリンなどが挙げられる。塩基の量は、例えば、タンパク質又はペプチドに対して１〜５０当量用いることができる。上記試薬は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２８】
またこの反応で用いられる溶媒としては、ジメチルホルムアミド、蒸留水、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。有機溶媒は、任意の濃度で用いることができる。また反応条件としては、例えば０〜７０℃で０．１〜２４時間で反応させることができる。これらの条件は、当業者が適宜決定することができる。
【００２９】
化合物Ａが、タンパク質又はペプチドのＮ末端と反応することができる官能基として前述したような活性基を有する場合は、縮合剤を用いずに、pH6.5〜8.0のリン酸緩衝液などの水系緩衝液中で、０〜７０℃、０．１〜２４時間で反応させることができる。
【００３０】
本発明の方法においては、上記固相支持体がさらに化合物Ａに結合したもの（固定化型化合物Ａとする。）を用いても良い。このような固相支持体としては、上記化合物Ａの主鎖における、タンパク質又はペプチドのＮ末端との反応点以外の部分と結合可能な官能基を有する固相支持体を特に限定することなく用いることができる。例えば、上記官能基を有する樹脂などを用いることができる。化合物ＡとしてＡＥＤＰを用いた場合は、イソチオシアネートガラスビーズなどを用いることができる。このとき、イソチオシアネートガラスビーズとＡＥＤＰとを、塩基性条件下で反応させることによって固定化を行うことができる。なお固定化された化合物Ａにおいては、ジスルフィド基は主鎖の一部を構成している。
【００３１】
ＡＥＤＰをイソチオシアネートガラスビーズに固定化させて固定化型化合物Ａを調製し、この固定化型化合物Ａを用いてペプチドのＮ末端を修飾する例を挙げ、本工程を下記式２に示す。下記式２においては、修飾されるペプチドはあらかじめグアニジノ化により保護されている。下記式２が示すように、修飾されたペプチドは、Ｎ末端がＡＥＤＰをリンカーとして固相支持体に結合している。
【００３２】
【化２】
2005139174.tif 000004
【００３３】
また一方、化合物Ａに、さらに固相支持体に特異的に結合することができる基が結合したものを用いても良い。このような基としては、上記化合物Ａの主鎖における、タンパク質又はペプチドのＮ末端との反応点以外の部分と結合することができる基と、固定支持体に特異的に結合することができる官能基との両方を有するものを特に限定することなく用いることができる。例えば、アビジンを固定化させた支持体に特異的に結合することができるビオチニル基などが挙げられる。このようにビオチニル基がさらに化合物Ａに結合したもの（ビオチニル化型化合物）は、上記化合物Ａとビオチン酸誘導体とを反応させることによって調製すると良い。なおビオチニル化型化合物Ａにおいては、ジスルフィド基は主鎖の一部を構成している。
【００３４】
ビオチニル基が結合したＡＥＤＰをビオチニル化型化合物Ａとして用いることによってペプチドのＮ末端を修飾する例を挙げ、本工程を下記式３に示す。下記式３においては、修飾されるペプチドはあらかじめグアニジノ化により保護されている。
【００３５】
【化３】
2005139174.tif 000005
【００３６】
以上のようにして、Ｎ末端が化合物Ａによって修飾されたタンパク質又はペプチドを得ることができる。本発明の方法は、従来法のようにタンパク質又はペプチドのＮ末端に直接スルホン酸誘導体を導入しないため、Ｎ末端への反応効率という点においてより優れている。
【００３７】
［断片化工程及び分離工程］
本発明の方法においては、前述の修飾工程の後、後述の開裂工程の前に、タンパク質又はペプチドを断片化しても良い（断片化工程）。断片化工程においては、断片化により、スルホン酸誘導体化すべきペプチドのＮ末端に由来する１種のＮ末端ペプチドフラグメントと、１種又は複数種のその他のペプチドフラグメントに分解される。Ｎ末端ペプチドフラグメントのＮ末端は、前述の修飾工程における化合物Ａに由来するジスルフィド結合を有している。
【００３８】
断片化の方法としては化学的断片化や酵素による消化などを行うと良い。化学的断片化を行う場合、ＢｒＣＮ等を用いると良い。酵素による消化を行う場合、例えばグアニジノ化されたタンパク質又はペプチドはリジン残基を有しないため、酵素としてはＬｙｓ−Ｃ以外のエンドプロテアーゼを用いることができる。本発明の方法においては、解析すべきタンパク質に応じて、質量分析装置などで分析が容易な長さのＮ末端ペプチドフラグメントを生成する酵素を選択することが可能である。例えば、トリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ等が用いられる。この酵素消化は、通常の方法を用いて行う。
【００３９】
前述の断片化工程を行った後は、Ｎ末端ペプチドフラグメントとその他のペプチドフラグメントとを分離する（分離工程）。分離工程においては、Ｎ末端ペプチドフラグメントを選択的に回収すると良い。このとき、Ｎ末端ペプチドフラグメントの修飾基の性質に応じて、当業者が適宜分離手段を決定することができる。
【００４０】
例えば、上記修飾工程において化合物Ａとして固相支持体に固定化されたＡＥＤＰを用いた場合の断片化工程及び分離工程を下記式４に示す。
【００４１】
【化４】
2005139174.tif 000006
【００４２】
上記式４においては、断片化工程においてｅ残基のＣ末端とｈ残基のＣ末端を分解するエンドプロテアーゼを用いた例を示している。断片化が行われると、固相支持体に結合したＮ末端ペプチドフラグメントと、固相支持体に結合していないその他のペプチドフラグメントとが得られる。そして、分離工程において支持体を洗浄すると、その他のペプチドフラグメントが溶出し、Ｎ末端ペプチドフラグメントを支持体に結合した形で回収することができる。
【００４３】
また例えば、上記修飾工程においてビオチニル化型化合物Ａとしてビオチン誘導体を結合させたＡＥＤＰを用いた場合の断片化工程及び分離工程を下記式５に示す。
【００４４】
【化５】
2005139174.tif 000007
【００４５】
上記式５においては、ｅ残基のＣ末端とｈ残基のＣ末端を分解するエンドプロテアーゼを用いた例を示している。断片化が行われると、ビオチンを有するＮ末端ペプチドフラグメントと、ビオチンを有しないその他のペプチドフラグメントとが得られる。そして、分離工程においてこの混合物を、アビジンが結合した固相支持体を充填したアビジンカラムに吸着させると、Ｎ末端ペプチドフラグメントがアビジンカラムに吸着し、その他のペプチドフラグメントはカラムに吸着しない。さらにアビジンカラムをリン酸緩衝液などで洗浄すると、その他のペプチドフラグメントはカラムから溶出し、Ｎ末端ペプチドフラグメントをアビジンカラムに吸着した形で回収することができる。
【００４６】
このようにして、上記工程によってＮ末端ペプチドフラグメントのみを回収することができる。回収されたＮ末端ペプチドフラグメントは前述の修飾工程に用いた化合物Ａに由来する修飾基が結合している。
【００４７】
［開裂工程］
上記修飾工程又は上記分離工程によって得られた、Ｎ末端が化合物Ａに由来する修飾基が結合したタンパク質又はペプチドは、以下に述べる開裂工程に供する。本工程においては、ジスルフィド結合を開裂することによってジスルフィド基をスルホン酸基に変換する。
【００４８】
ジスルフィド結合の開裂は酸化的又は還元的に行うことができる。酸化的開裂は、過ギ酸酸化法などの通常の方法によって行うことができる。これにより、スルフィド基がスルホン酸基に変換される。一方、還元的開裂においては、ジチオスレイトールなどを用いる通常の方法によって還元を行うことによりスルフィド基をチオール基に変換し、さらに過ギ酸などを用いて酸化を行うことによりチオール基をスルホン酸基に変換することができる。
【００４９】
例えば、上記修飾工程において固定化型化合物Ａとして固相支持体に固定化されたＡＥＤＰを用いた場合の本工程を下記式６に示す。下記式６が示すように、ジスルフィド結合の開裂によってスルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントが得られる。
【００５０】
【化６】
2005139174.tif 000008
【００５１】
また例えば、上記修飾工程においてビオチニル化型化合物Ａとしてビオチニル基が結合したＡＥＤＰを用いた場合の本工程を下記式７に示す。下記式７が示すように、ジスルフィド結合の開裂によってスルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドフラグメントが得られる。
【００５２】
【化７】
2005139174.tif 000009
【００５３】
以上のようにして、タンパク質又はペプチドのＮ末端にスルホン酸基が導入された誘導体が得られる。Ｎ末端ペプチドフラグメントの回収率の観点からは、本発明の方法はジスルフィド結合を開裂させることによりＮ末端フラグメントを回収するため、例えばアビジン−ビオチン結合を解離させることによって回収するよりも、Ｎ末端フラグメントの回収率が高い。また、本発明の方法によって得られたタンパク質又はペプチドのスルホン酸誘導体は、質量分析装置による解析に供することができ、アミノ酸配列の決定などが行われる。このとき、タンパク質又はペプチドにおけるスルホン酸基の存在によりフラグメントイオンが発生しやすくなる。
【００５４】
第二に本発明は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定法である。この方法は、すでに述べたタンパク質又はペプチドをスルホン酸誘導体化する方法を用いて得られたＮ末端ペプチドのスルホン酸誘導体を質量分析の試料として用い、これを質量分析することによって行う。このとき、スルホン酸誘導体化されたＮ末端ペプチドは、そのスルホン酸基の存在によって、ＰＳＤ解析においてｙイオン系列が検出される。従ってアミノ酸配列決定が効率的且つ容易になる。
【００５５】
第三に本発明は、Ｎ末端アミノ基がジスルフィド基含有基で修飾されたタンパク質又はペプチドである。ジスルフィド基は、本発明の化合物の主鎖の一部を構成する。この化合物は、上述の本発明の方法における修飾工程に記載された方法によって得ることができる。この化合物におけるジスルフィド基含有基は、上記修飾工程に記載された方法において用いられる化合物Ａに由来する基である。この化合物Ａは、上記修飾工程に記載したように、固相支持体に固定化したものや、ビオチニル基に結合したものを用いることができる。従って、上記修飾工程に記載の方法により得られる本発明の化合物においては、ジスルフィド結合含有基として、固相支持体に結合したものや、ビオチニル基に結合したものなどが挙げられる。本発明の化合物の例を下記構造式(I)及び(II)に示す。式中、ａ〜ｌはアミノ酸残基を表し、丸印は固相支持体を表す。
【００５６】
【化８】
2005139174.tif 000010
【００５７】
本発明の化合物は、タンパク質又はペプチドのＮ末端にスルホン酸基が導入されたスルホン酸誘導体を得るための中間体として好ましく用いられる。すなわち、上述の本発明の方法における開裂工程に述べたようにジスルフィド結合を開裂することによって、容易にかつ効率よくスルホン酸誘導体へ変換することができる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。以下、特に断りのない限り、「％」は重量％を表す。また、図１〜４のマススペクトルにおいては、横軸に質量／電荷（Mass/Charge）を表し、縦軸にイオンピークの相対強度（%Int.）を表す。
【００５９】
＜実施例１＞
［化合物Ａが結合した支持体の調製］
イソチオシアネートガラスビーズ glass isothiocyanate resin（シグマ社製）１０mgをＤＭＦで洗浄した後、１００μlのＤＭＦに懸濁し、４．６μmolのＡＥＤＰ（３−（［２−アミノエチル］ジチオ）プロピオン酸塩酸塩）と０．５μlのＮ−メチルモルホリンとを加え、室温で３０分反応させた。その後、ＤＭＦ及び蒸留水で洗浄し、得られた支持体を以下の修飾反応に使用した。
【００６０】
［ペプチドの修飾とジスルフィド結合の開裂、及び質量分析装置での測定］
ペプチド試料としてラミニンペンタペプチド（（株）ペプチド研究所社製）を使用した。ラミニンペンタペプチドは、ラミニンの癌抑制部位の配列を有するペプチドがアミド化されたもので、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。前記配列においては、Ｃ末端のカルボキシル基がアミド化されており、アミド化されたＣ末端を-NH2を付して表記している。
【００６１】
上述のようにして調製した支持体３mgを蒸留水３０μlに懸濁し、５００nmolのＥＤＣと５００nmolのトリエチルアミンを加え室温で３０分間放置した後、あらかじめ５μl（１nmol/μl）のラミニンペンタペプチドと５００nmolのトリエチルアミンを混合し室温で３０分間放置していたものを加え３０分間反応を行った。反応終了後、蒸留水で洗浄して未反応の試薬を除去した。ここに、別途ギ酸と３０重量％過酸化水素水を１９：１（体積比）の割合で混合し室温で２時間反応させて調製した過ギ酸２０μlを加えて密封し、４℃で１時間反応させた。反応終了後、反応液の上清を回収し、蒸留水を加え凍結乾燥を行った。上記試料を０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液で再溶解し、ZipTipC18（ミリポア社製）で脱塩した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析を行った。
【００６２】
図１にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのスペクトルを示す。図１が示すように、ラミニンペンタペプチドのスルホン酸誘導体が７３１．０３(m/z)に検出され、目的物が生成していることが確認された。また、図２に、７３１．３５(m/z)をプレカーサイオンとしたＰＳＤスペクトルを示す。図２が示すように、ペプチドのＣ末端を含むｙ系列イオン（ｙ２〜ｙ５）が検出され、ペプチドのＮ末端から４残基までの構造が確認された。
【００６３】
＜実施例２＞
タンパク質試料としてLysozymeを用い、還元アルキル化及びグアニジノ化、ジスルフィド基含有化合物によるＮ末端の修飾、トリプシン消化、アビジンビーズを用いたＮ末端フラグメントの吸着、及び過ギ酸酸化によるジスルフィド結合の酸化的開裂を行うことによって、LysozymeのN末端フラグメントをスルホン酸誘導体として選択的に回収した例を示す。
【００６４】
Lysozyme（EC 3.2.1.17 from Chicken Egg White：SIGMA社製）を、100 pmol/μLの濃度になるように蒸留水に溶解した。このうち10 μLを直径8 mmの円形にカットしたPVDF膜（Polyvinylidene difloride menbrane：日本ジェネティクス社製 ）に滴下し、乾燥させた。
【００６５】
［還元−アルキル化］
タンパク質サンプルをアプライしたPVDF膜を1.5 mLのプラスティックチューブに入れ、10 mM ジチオスレイトール(DTT)を含む100 mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 (v/v))混合液1 mlを加え、56℃で1時間反応させた。反応終了後、加えられた上記混合液を上記チューブから除去し、55 mM ヨードアセトアミドを含む100 mM NH4HCO3水溶液と、アセトニトリルとの(8:2 (v/v))混合液１mlをチューブに加え、遮光して室温で４５分間反応させた。反応終了後、上記チューブからPVDF膜を取り出し、100mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００６６】
［グアジニノ化（側鎖アミノ基の保護）］
上記還元−アルキル化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mlのチューブに入れ、0.85 M ヘミ硫酸O-メチルイソウレア（O-methylisourea hemisulfate：ワコーケミカル社製）を含む７N アンモニア水と、アセトニトリルとの(8:2 (v/v))混合液1 mlを加え、65℃で30分間反応させた。上記チューブからPVDF膜を取り出し、100 mlの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００６７】
［タンパク質N末端の修飾］
上記グアニジノ化処理して得られたPVDF膜を、別途用意した1.5 mLのチューブに入れ、10 mM Sulfo-NHS-SS-biotin （スルホスクシンイミジル−２−（ビオチンアミド）エチル−１，３−ジチオプロピオネートsulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-
1,3-dithiopropionate：Pierce社製、下記構造式(III)）を含む0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）とアセトニトリルとの(8:2 (v/v))混合液を100μL加え、37℃で１時間反応させた。反応終了後、上記チューブからPVDF膜を取り出し、100 mLの蒸留水の入ったビーカに入れ、10分間攪拌してPVDF膜を洗浄した。洗浄後、PVDF膜を乾燥させた。
【００６８】
【化９】
2005139174.tif 000011
【００６９】
［トリプシン消化］
上記修飾処理を行った後のPVDF膜を、別途用意した1.5 mLの消化用チューブに入れ、1 μgのトリプシンを含む100 mM NH4HCO3、5 mM CaCl2水溶液とアセトニトリルとの(2:8 (v/v))混合液100 μLを加え、37℃で一晩消化を行った。
【００７０】
［PVDF膜からの消化ペプチドの抽出］
上記消化終了後、消化用チューブから上記反応液を取り出して、別途用意した1.5mlの回収用チューブに回収した。消化用チューブ内に残ったPVDF膜に0.1% TFAとアセトニトリルとの（4:6 v/v）混合液を150 μL加え、60℃で2時間放置することによりPVDF膜からの消化ペプチドの抽出を行った。得られた抽出溶液を、上記回収用チューブに回収した。消化ペプチドの抽出及び抽出溶液の回収の一連の操作を再度繰り返した。回収液を遠心濃縮機により乾固した。得られた乾燥消化ペプチドを、0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.2）10μLに再溶解した。
【００７１】
参考のため、この溶解した消化ペプチド溶液2μLをZipTipTM C18（MILLIPORE社製）を用いて脱塩し、MALDI MSで分析した。このとき得られたマススペクトルを図３に示す。図３が示すように、1037.66 (m/z)のピーク（矢印）が、リジン残基がグアジニノ化され、N末端がBio-NH(CH2)2-SS-(CH2)2-CO基（Bio：ビオチニル基）で修飾されたN末端ペプチドフラグメント（Bio-NH(CH2)2-SS-(CH2)2-CO-Hor-Val-Phe-Gly-Arg
；配列番号２； Bio：ビオチニル基、Hor：ホモアルギニン残基）に相当する。Ｎ末端ペプチドフラグメントとともに、その他のトリプシン消化ペプチド、すなわち還元アルキル化およびグアジニノ化されたLysozymeの内部配列由来のトリプシン消化ペプチドが多数検出された。
【００７２】
［N末端ペプチドフラグメントの選択的回収］
（i）アビジン樹脂の調製
SoftLinkTM Softlease Avidin Resin（Promega社製）10 μLを1.5mlのチューブにとり、0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.2）500μLを加えて攪拌した後、遠心分離により樹脂を沈殿させ、上清を除去した。リン酸緩衝液の添加、撹拌、遠心分離及び上清除去の一連の操作を３回繰り返し、アビジン樹脂の洗浄及び平衡化を行った。
【００７３】
（ii）N末端フラグメントの選択的回収と溶出
溶解した消化ペプチドの残りを、調製したアビジン樹脂にアプライした。室温で15分間攪拌し、Ｎ末端ペプチドフラグメントのアビジン樹脂への吸着を行った。吸着終了後、アビジン樹脂を120μLの0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.2）で３回洗浄し、N末端ペプチドフラグメント以外のペプチドを除去した。別途、ギ酸と３０重量％過酸化水素水とを19:1(v/v)の割合で混合し室温で2時間放置して過ギ酸を調整した。その後アビジン樹脂に、調製した過ギ酸10μLをアビジン樹脂に添加して4℃で1時間攪拌し、上清を回収して凍結乾燥することによって、乾固したＮ末端ペプチドフラグメントのスルホン酸誘導体を得た。乾固したスルホン酸誘導体を0.1% TFA水溶液10μLで再溶解させてZipTipTM C18を用いて脱塩し、MALDI MSで分析を行った。このとき得られたマススペクトルを図４に示す。図４が示すように、図３で検出されたＮ末端ペプチドフラグメントのスルホン酸誘導体に相当する784.37 (m/z)のピークが特異的に検出された。このことから、LysozymeのＮ末端ペプチドフラグメントがスルホン酸誘導体として選択的に回収されたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本実施例１で得たMALDI-TOF MSスペクトルである。
【図２】本実施例１で得たPSDスペクトルである。
【図３】本実施例２で参考のために得たMALDI-TOF MSスペクトルである。
【図４】本実施例２で得たMALDI-TOF MSスペクトルである。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１は、ラミニンの癌抑制部位の配列を有するペプチドがアミド化されたものである。
配列番号２は、リシン残基におけるグアニジノ化及びＮ末端における修飾を受けたリゾチームの配列の一部である。
【図１】
2005139174.tif 000012
【図２】
2005139174.tif 000013
【図３】
2005139174.tif 000014
【図４】
2005139174.tif 000015
【配列表】
2005139174000001.app